Wiki FKKT - User contributions [en]

Podenote E3 ligaznega kompleksa kot degroni za učinkovito degradacijo citosolnih, jedrnih in membranskih proteinov

2024-05-13T21:35:29Z

David Valte: /* Literatura */

Izhodiščni članek: [https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acssynbio.3c00588# Subunits of an E3 Ligase Complex as Degrons for Efficient Degradation of Cytosolic, Nuclear, and Membrane Proteins]

== Razgradnja proteinov s proteosomom ==

Večina proteinov v sesalskih celicah se razgradi skozi ubikvitin-proteosomsko pot, ki omogoča negativno kontrolo aktivnosti proteinov. Na lizinske ostanke kovalentno vezani ubikvitini (Ub) služijo, kot signal za 26S proteosom, ki vodi v razgradnjo označenega proteina. Ubikvitinsko post-translacijsko modifikacijo katalizira encimska kaskada, katero sestavljajo proteini E1, E2 ter E3.

E1 ali ubikvitin-aktivacijski protein ob porabi ATP-ja katalizira prvi korak ubikvitinacijske reakcije, tako da aktivira Ub s tvorbo tioesterske vezi s C-koncem Ub. Aktiviran Ub se prenese na ubikvitinski nosilec E2. Tako nastali intermediat E2-Ub interagira z ubikvitin ligazo ali E3, ki katalizira prenos Ub z E2 ter tvorbo nove izopeptidne vezi na lizinskemu ostanku substrata (tarčnega proteina). Za razgradnjo označeni substrati so nato razgrajeni s strani proteosoma.

E3 ligaze služijo kot ključni regulatorji ubikvitin-proteosomske poti, saj kontrolirajo specifičnost in učinkovitost prenosa Ub. Dokaz izredne specifičnosti E3 ligaz je dejstvo, da poznamo preko 600 različnih encimov te vrste. Večina človeških E3 ligaz je tipa RING (ang. really interesting new gene), te ligaze omogočajo direkten prenos Ub iz E2 na substrat brez tvorbe E3-Ub intermediata.

== Sesalske E3 ligaze ==

Primer RING ligaze je sesalski SCF-Skp2 E3 ligazni kompleks, ki je strukturno dobro okarakteriziran. Sestavljajo ga protein cullin 1 (Cul 1), ki deluje kot ogrodje, na katerega se nalagajo drugi proteini - protein Rbx1 (ang. RING-box protein 1), ki se veže na C-konec Cul1, in Skp1 (ang. S-phase kinase-associated protein 1), ki se veže na N-konec Cul1. Medtem ko Rbx1 omogoča izmenjavo E2-Ub intermediata preko domene RING, Cul1 vmesti substrat in E2-Ub v optimalno prostorsko orientacijo za prenos Ub.

Specifičnost E3 ligaz je dodatno okrepljena z vezavo specifičnih adapterskih proteinov, kot je na primer Skp1. Skp1 proteini delujejo kot adapterji, ki omogočajo vezavo drugih proteinov z motivom F škatle (Skp2). Medtem ko je N-konec F-škatle ohranjen in omogoča interakcijo z E3 ligazo, je C-konec manj ohranjen, pri čemer s posledično večjo sekvenčno in konformacijsko variabilnostjo omogoča vezavo vrste različnih substratov.

== Tarčna razgradnja preko genskih fuzij z E3 ligazo ==

Ključen dejavnik uspešnosti prenosa Ub ter nalaganje le-tega in tvorbe poliubikvitinske verige je medsebojna bližina med substratom in E2-Ub. Da bi preverili vpliv bližine substrata in E2, so pripravili genetske fuzije reporterskega proteina luciferaze, ki je služila kot substrat, in ubikvitin konjugirajoči encim E2 R1 (CDC34 E2), ki asociira s SCF (ime izvira iz začetnic Skp, Cul in F-škatla) družino E3 ligaz ter dokazano katalizira nastanek na lizin povezanih poliubikvitinskih verig.

Asociacija substrata s podenotami kompleksa E3 ligaze je prav tako povezana z uspešnostjo razgradnje tarčnega proteina. Da bi raziskali, kako vezava posameznih podenot vpliva na razgradnjo substrata so z luciferazo gensko združili domene E3 ligaznega kompleksa (F-škatlo Skp2, Skp1, Rbx1 in C-terminalni konec Cul1).

Fuzije luciferaze in podenot SCF-Skp2 E3 ligaznega kompleksa so vodile v nižjo raven luciferazne aktivnosti, kar pomeni, da fuzijski konstrukti negativno vplivajo na učinkovitost razgradnje proteinov. Zmanjšano aktivnost luciferaze zaznamo tudi pri vzorcih, kjer sta združena substrat in E2. Najmanjšo aktivnost luciferaze so kazali vzorci s fuzijo substrata in Cul1 ter substrata in F-škatle.

F-škatla, ki se nahaja tudi v proteinu Skp2 je ključna za interakcijo s Skp1 ter nadaljnjo razgradnjo substrata. Skp1 in Skp2 interagirata preko štirih C-terminalnih vijačnic. Da bi dodatno povečali sposobnost razgradnje proteinov s strani Skp1 so uvajali mutacije in odstranjevali povezovalne vijačnice ter pokazali, da je aktivnost luciferaze najnižja v vzorcih, kjer ima Skp2 le eno C-terminalno vijačnico.

Rbx1 se z beta-ploskvijo veže na Cul1, delecije v tej regiji so vodile v povečanje aktivnosti luciferaze v primerjavi z vzorcem brez mutacije. Beta-ploskev Rbx1 očitno vpliva na učinkovitost destabilizacije substrata.
Podenote kompleksa SCF-Skp2 E3 lahko delujejo kot degroni – minimalni elementi v proteinu, ki omogočajo tarčenje substrata za ubikvitinsko-proteosomsko mediirano razgradnjo.

== Preiskovanje posameznih degronov ==

Za preiskovanje posameznih degronov in povezovanje degronov in substrata so uporabili heterodimere obvitih vijačnic (CC). To so strukturni motivi - supervijačnice tipično v obliki dimerov ali trimerov. Dejansko jih lahko sestavlja do 7 alfa-vijačnic. So eden od proteinskih motivov, kjer je odnos med sekvenco in strukturo do velike mere že določen. Omogočajo načrtovanje in sestavljanje modularnih proteinov, ki se odzivajo na pričakovan način.

Zaradi predvidljivega obnašanja CC so te zelo uporabne za zagotavljanje povezanosti določenih proteinov ali proteinskih domen. Da bi preučili posamezne degrone in zagotovili povezanost degronov s substratom (luciferazo) so pripravili genetske fuzije CC s substrati in degroni. Vijačnici v obeh genetskih fuzijah sta si komplementarni oz. imata afiniteto druga z drugo. Uspešna interakcija CC substrata in degrona povzroči padec aktivnosti luciferaze, s tem da se aktivnost luciferaze dodatno zmanjša pri parih CC z nižjimi afinitetami.

Prostorska orientacija substrata glede na ligazni kompleks je izredno pomembna, zato je učinkovitost razgradnje substrata odvisna od rigidnosti povezovalnega zaporedja med CC in proteinom ter med CC in degronom. Povezovalna zaporedja so fleksibilna. Sestavljena so iz glicinskih in serinskih ponovitev, njihova optimalna dolžina je odvisna glede na tip degrona. V splošnem so daljša povezovalna zaporedja med substratom in CC vodila v večjo raven razgradnje. Daljša povezovalna zaporedja med CC in degronom pa so vodile v manjšo raven razgradnje. Fleksibilnost substrata, prav tako kot rigidnost degrona izboljša procesivnost ligaze.

== Fuzije s CC zaradi ugodnih lastnosti teh motivov omogočajo vrsto načinov regulacije razgradnje proteinov: ==

=== Substrat z dvema CC, ki sta povezana z mestom, katerega razgradi TEV proteaza ===

Vezava dveh različnih CC motivov z različnimi funkcijami na substrat omogoča regulacijo razgradnje tarčnega proteina. Zunanja CC veriga ni sposobna vezave na CC degrona in preprečuje interakcijo druge CC substrata, ki bi lahko interagirala z degronom. Delovanje TEV (ang. Tobacco Etch Virus nuclear-inclusion-a endopeptidase) proteaze povzroči odcep in disociacijo »inhibitorne« CC - CC, ki je sposobna interakcije z degronom ni več senčena, zaradi njene izpostavitve pride do ubikvitinacije substrata in posledične razgradnje. Do razgradnje substrata bo prišlo dokler so TEV proteaze aktivne, to pa pomeni, da razgradnja proteinov ne mora biti regulirana v krajših časovnih intervalih.

=== Uporaba majhnih molekul za nadzorovanje razgradnje proteinov ===

FKBP (ang. FK506 binding protein) in FRB (ang. FKBP-rapamycin binding) domeni v prisotnosti rapamicina dimerizirata. To lastnost uporabimo za povezavo degrona z substratom ob prisotnosti majhne molekule. Dimerizacijo degrona in substrata dosežemo s fuzijo substrata s FKBP domeno ter degrona s FRB domeno. Kemična dimerizacija ob prisotnosti rapamicina vodi v ubikvitinacijo substrata.

Prednost uporabe majhne molekule je predvsem v tem, da je njen vnos in njeno izpiranje iz gojišč hitro. Do dimerizacije domen pride že v roku 30 minut.

== Preverjanje sposobnosti razgradnje transmembranskih in jedrnih proteinov ==

Degroni, ki izhajajo iz SCF-Skp2 E3 ligaznega kompleksa, lahko zagotovo razgradijo citosolne proteine. Za aplikacije v raznih terapijah bi bilo zaželeno, da so sposobni razgraditi tudi jedrne in membranske proteine. Destabilizacija membranskih proteinov je posebej zanimiva za terapijo CAR-T (ang. chimeric antigen receptor – T cells), kjer himerni transmembranski celični receptorji omogočajo tarčenje rakavih celic. Povišana količina CAR v teh celicah lahko v nekaterih primerih vodi v neželene stranske učinke zaradi prekomerne aktivacije, kot so npr. citokinske nevihte.

Da bi preverili sposobnost razgraditve transmembranskih proteinov so genetsko združili CAR s fluorescenčnim proteinom in FRB domeno, tako so ob prisotnosti rapamicina lahko spremljali upadanje fluorescence, ki je predstavljala uspešno razgradnjo CAR. Razgradnja proteina je bila manj uspešna, zato so se odločili ustvariti degrone iz drugih ubikvitin ligaznih kompleksov. Degroni iz CRL5-SOCS2 E3 ligaznega kompleksa so omogočili uspešnejšo razgradnjo.

Sposobnost razgradnje proteinov v jedru so preverili z gensko fuzijo luciferaze in degrona z jedrnim lokalizacijskim signalom ter dimerizacijskima domenama. V prisotnosti rapamicina so zaznali destabilizacijo proteinov tudi ko so uporabljali samo degrone iz kompleksa SCF-Skp2 E3.

Degroni iz SCF-Skp2 E3 ligaze so očitno ustrezni za razgradnjo citosolnih in jedrnih proteinov. Zaradi manjše učinkovitosti pri proteinih, ki se nahajajo v membrani degroni, ki izvirajo iz SCF-Skp2 E3 ligaze očitno nimajo lokacijsko nespecifične aktivnosti. Za nastanek bolj univerzalnih degronov so ustvarili proteine, ki poleg Skp1 vsebujejo tudi vezavni motiv škatlo SOCS (ang. suppressor of cytokine signaling). Ta izvira iz CRL5-SOCS2 E3 ligaznega kompleksa in je uporabna za razgraditev membranskih proteinov. Takšen sistem omogoča tarčno razgradnjo proteinov v vseh treh kompartmentih.

== Zaključek ==

Ker so E3 ligaze esencialne v razgradnji proteinov, so visoko ohranjene, kar pomeni, da je metoda uporabna na več različnih celičnih linijah. Inducibilna razgradnja proteinov, katero lahko kontroliramo hitro in učinkovito, bi lahko služila kot zanimiv način za regulacijo in študije proteinskih nivojev v celicah.

== Literatura ==

[1] A. Verbič, T. Lebar, A. Praznik, R. Jerala: Subunits of an E3 Ligase Complex as Degrons for Efficient Degradation of Cytosolic, Nuclear, and Membrane Proteins. ACS Synth Biol 2024, 13, 792–803.

[2] A. L. Boyle: Applications of de novo designed peptides. Peptide Applications in Biomedicine, Biotechnology and Bioengineering 2018, 51–86.

Podenote E3 ligaznega kompleksa kot degroni za učinkovito degradacijo citosolnih, jedrnih in membranskih proteinov

2024-05-13T21:27:36Z

David Valte:

Izhodiščni članek: [https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acssynbio.3c00588# Subunits of an E3 Ligase Complex as Degrons for Efficient Degradation of Cytosolic, Nuclear, and Membrane Proteins]

== Razgradnja proteinov s proteosomom ==

Večina proteinov v sesalskih celicah se razgradi skozi ubikvitin-proteosomsko pot, ki omogoča negativno kontrolo aktivnosti proteinov. Na lizinske ostanke kovalentno vezani ubikvitini (Ub) služijo, kot signal za 26S proteosom, ki vodi v razgradnjo označenega proteina. Ubikvitinsko post-translacijsko modifikacijo katalizira encimska kaskada, katero sestavljajo proteini E1, E2 ter E3.

E1 ali ubikvitin-aktivacijski protein ob porabi ATP-ja katalizira prvi korak ubikvitinacijske reakcije, tako da aktivira Ub s tvorbo tioesterske vezi s C-koncem Ub. Aktiviran Ub se prenese na ubikvitinski nosilec E2. Tako nastali intermediat E2-Ub interagira z ubikvitin ligazo ali E3, ki katalizira prenos Ub z E2 ter tvorbo nove izopeptidne vezi na lizinskemu ostanku substrata (tarčnega proteina). Za razgradnjo označeni substrati so nato razgrajeni s strani proteosoma.

E3 ligaze služijo kot ključni regulatorji ubikvitin-proteosomske poti, saj kontrolirajo specifičnost in učinkovitost prenosa Ub. Dokaz izredne specifičnosti E3 ligaz je dejstvo, da poznamo preko 600 različnih encimov te vrste. Večina človeških E3 ligaz je tipa RING (ang. really interesting new gene), te ligaze omogočajo direkten prenos Ub iz E2 na substrat brez tvorbe E3-Ub intermediata.

== Sesalske E3 ligaze ==

Primer RING ligaze je sesalski SCF-Skp2 E3 ligazni kompleks, ki je strukturno dobro okarakteriziran. Sestavljajo ga protein cullin 1 (Cul 1), ki deluje kot ogrodje, na katerega se nalagajo drugi proteini - protein Rbx1 (ang. RING-box protein 1), ki se veže na C-konec Cul1, in Skp1 (ang. S-phase kinase-associated protein 1), ki se veže na N-konec Cul1. Medtem ko Rbx1 omogoča izmenjavo E2-Ub intermediata preko domene RING, Cul1 vmesti substrat in E2-Ub v optimalno prostorsko orientacijo za prenos Ub.

Specifičnost E3 ligaz je dodatno okrepljena z vezavo specifičnih adapterskih proteinov, kot je na primer Skp1. Skp1 proteini delujejo kot adapterji, ki omogočajo vezavo drugih proteinov z motivom F škatle (Skp2). Medtem ko je N-konec F-škatle ohranjen in omogoča interakcijo z E3 ligazo, je C-konec manj ohranjen, pri čemer s posledično večjo sekvenčno in konformacijsko variabilnostjo omogoča vezavo vrste različnih substratov.

== Tarčna razgradnja preko genskih fuzij z E3 ligazo ==

Ključen dejavnik uspešnosti prenosa Ub ter nalaganje le-tega in tvorbe poliubikvitinske verige je medsebojna bližina med substratom in E2-Ub. Da bi preverili vpliv bližine substrata in E2, so pripravili genetske fuzije reporterskega proteina luciferaze, ki je služila kot substrat, in ubikvitin konjugirajoči encim E2 R1 (CDC34 E2), ki asociira s SCF (ime izvira iz začetnic Skp, Cul in F-škatla) družino E3 ligaz ter dokazano katalizira nastanek na lizin povezanih poliubikvitinskih verig.

Asociacija substrata s podenotami kompleksa E3 ligaze je prav tako povezana z uspešnostjo razgradnje tarčnega proteina. Da bi raziskali, kako vezava posameznih podenot vpliva na razgradnjo substrata so z luciferazo gensko združili domene E3 ligaznega kompleksa (F-škatlo Skp2, Skp1, Rbx1 in C-terminalni konec Cul1).

Fuzije luciferaze in podenot SCF-Skp2 E3 ligaznega kompleksa so vodile v nižjo raven luciferazne aktivnosti, kar pomeni, da fuzijski konstrukti negativno vplivajo na učinkovitost razgradnje proteinov. Zmanjšano aktivnost luciferaze zaznamo tudi pri vzorcih, kjer sta združena substrat in E2. Najmanjšo aktivnost luciferaze so kazali vzorci s fuzijo substrata in Cul1 ter substrata in F-škatle.

F-škatla, ki se nahaja tudi v proteinu Skp2 je ključna za interakcijo s Skp1 ter nadaljnjo razgradnjo substrata. Skp1 in Skp2 interagirata preko štirih C-terminalnih vijačnic. Da bi dodatno povečali sposobnost razgradnje proteinov s strani Skp1 so uvajali mutacije in odstranjevali povezovalne vijačnice ter pokazali, da je aktivnost luciferaze najnižja v vzorcih, kjer ima Skp2 le eno C-terminalno vijačnico.

Rbx1 se z beta-ploskvijo veže na Cul1, delecije v tej regiji so vodile v povečanje aktivnosti luciferaze v primerjavi z vzorcem brez mutacije. Beta-ploskev Rbx1 očitno vpliva na učinkovitost destabilizacije substrata.
Podenote kompleksa SCF-Skp2 E3 lahko delujejo kot degroni – minimalni elementi v proteinu, ki omogočajo tarčenje substrata za ubikvitinsko-proteosomsko mediirano razgradnjo.

== Preiskovanje posameznih degronov ==

Za preiskovanje posameznih degronov in povezovanje degronov in substrata so uporabili heterodimere obvitih vijačnic (CC). To so strukturni motivi - supervijačnice tipično v obliki dimerov ali trimerov. Dejansko jih lahko sestavlja do 7 alfa-vijačnic. So eden od proteinskih motivov, kjer je odnos med sekvenco in strukturo do velike mere že določen. Omogočajo načrtovanje in sestavljanje modularnih proteinov, ki se odzivajo na pričakovan način.

Zaradi predvidljivega obnašanja CC so te zelo uporabne za zagotavljanje povezanosti določenih proteinov ali proteinskih domen. Da bi preučili posamezne degrone in zagotovili povezanost degronov s substratom (luciferazo) so pripravili genetske fuzije CC s substrati in degroni. Vijačnici v obeh genetskih fuzijah sta si komplementarni oz. imata afiniteto druga z drugo. Uspešna interakcija CC substrata in degrona povzroči padec aktivnosti luciferaze, s tem da se aktivnost luciferaze dodatno zmanjša pri parih CC z nižjimi afinitetami.

Prostorska orientacija substrata glede na ligazni kompleks je izredno pomembna, zato je učinkovitost razgradnje substrata odvisna od rigidnosti povezovalnega zaporedja med CC in proteinom ter med CC in degronom. Povezovalna zaporedja so fleksibilna. Sestavljena so iz glicinskih in serinskih ponovitev, njihova optimalna dolžina je odvisna glede na tip degrona. V splošnem so daljša povezovalna zaporedja med substratom in CC vodila v večjo raven razgradnje. Daljša povezovalna zaporedja med CC in degronom pa so vodile v manjšo raven razgradnje. Fleksibilnost substrata, prav tako kot rigidnost degrona izboljša procesivnost ligaze.

== Fuzije s CC zaradi ugodnih lastnosti teh motivov omogočajo vrsto načinov regulacije razgradnje proteinov: ==

=== Substrat z dvema CC, ki sta povezana z mestom, katerega razgradi TEV proteaza ===

Vezava dveh različnih CC motivov z različnimi funkcijami na substrat omogoča regulacijo razgradnje tarčnega proteina. Zunanja CC veriga ni sposobna vezave na CC degrona in preprečuje interakcijo druge CC substrata, ki bi lahko interagirala z degronom. Delovanje TEV (ang. Tobacco Etch Virus nuclear-inclusion-a endopeptidase) proteaze povzroči odcep in disociacijo »inhibitorne« CC - CC, ki je sposobna interakcije z degronom ni več senčena, zaradi njene izpostavitve pride do ubikvitinacije substrata in posledične razgradnje. Do razgradnje substrata bo prišlo dokler so TEV proteaze aktivne, to pa pomeni, da razgradnja proteinov ne mora biti regulirana v krajših časovnih intervalih.

=== Uporaba majhnih molekul za nadzorovanje razgradnje proteinov ===

FKBP (ang. FK506 binding protein) in FRB (ang. FKBP-rapamycin binding) domeni v prisotnosti rapamicina dimerizirata. To lastnost uporabimo za povezavo degrona z substratom ob prisotnosti majhne molekule. Dimerizacijo degrona in substrata dosežemo s fuzijo substrata s FKBP domeno ter degrona s FRB domeno. Kemična dimerizacija ob prisotnosti rapamicina vodi v ubikvitinacijo substrata.

Prednost uporabe majhne molekule je predvsem v tem, da je njen vnos in njeno izpiranje iz gojišč hitro. Do dimerizacije domen pride že v roku 30 minut.

== Preverjanje sposobnosti razgradnje transmembranskih in jedrnih proteinov ==

Degroni, ki izhajajo iz SCF-Skp2 E3 ligaznega kompleksa, lahko zagotovo razgradijo citosolne proteine. Za aplikacije v raznih terapijah bi bilo zaželeno, da so sposobni razgraditi tudi jedrne in membranske proteine. Destabilizacija membranskih proteinov je posebej zanimiva za terapijo CAR-T (ang. chimeric antigen receptor – T cells), kjer himerni transmembranski celični receptorji omogočajo tarčenje rakavih celic. Povišana količina CAR v teh celicah lahko v nekaterih primerih vodi v neželene stranske učinke zaradi prekomerne aktivacije, kot so npr. citokinske nevihte.

Da bi preverili sposobnost razgraditve transmembranskih proteinov so genetsko združili CAR s fluorescenčnim proteinom in FRB domeno, tako so ob prisotnosti rapamicina lahko spremljali upadanje fluorescence, ki je predstavljala uspešno razgradnjo CAR. Razgradnja proteina je bila manj uspešna, zato so se odločili ustvariti degrone iz drugih ubikvitin ligaznih kompleksov. Degroni iz CRL5-SOCS2 E3 ligaznega kompleksa so omogočili uspešnejšo razgradnjo.

Sposobnost razgradnje proteinov v jedru so preverili z gensko fuzijo luciferaze in degrona z jedrnim lokalizacijskim signalom ter dimerizacijskima domenama. V prisotnosti rapamicina so zaznali destabilizacijo proteinov tudi ko so uporabljali samo degrone iz kompleksa SCF-Skp2 E3.

Degroni iz SCF-Skp2 E3 ligaze so očitno ustrezni za razgradnjo citosolnih in jedrnih proteinov. Zaradi manjše učinkovitosti pri proteinih, ki se nahajajo v membrani degroni, ki izvirajo iz SCF-Skp2 E3 ligaze očitno nimajo lokacijsko nespecifične aktivnosti. Za nastanek bolj univerzalnih degronov so ustvarili proteine, ki poleg Skp1 vsebujejo tudi vezavni motiv škatlo SOCS (ang. suppressor of cytokine signaling). Ta izvira iz CRL5-SOCS2 E3 ligaznega kompleksa in je uporabna za razgraditev membranskih proteinov. Takšen sistem omogoča tarčno razgradnjo proteinov v vseh treh kompartmentih.

== Zaključek ==

Ker so E3 ligaze esencialne v razgradnji proteinov, so visoko ohranjene, kar pomeni, da je metoda uporabna na več različnih celičnih linijah. Inducibilna razgradnja proteinov, katero lahko kontroliramo hitro in učinkovito, bi lahko služila kot zanimiv način za regulacijo in študije proteinskih nivojev v celicah.

== Literatura ==

[1] A. Verbič, T. Lebar, A. Praznik, R. Jerala: Subunits of an E3 Ligase Complex as Degrons for Efficient Degradation of Cytosolic, Nuclear, and Membrane Proteins. ACS Synth Biol 2024, 13, 792–803.
[2] A. L. Boyle: Applications of de novo designed peptides. Peptide Applications in Biomedicine, Biotechnology and Bioengineering 2018, 51–86.

Podenote E3 ligaznega kompleksa kot degroni za učinkovito degradacijo citosolnih, jedrnih in membranskih proteinov

2024-05-13T21:05:05Z

David Valte: /* Zaključek */

Izhodiščni članek: [https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acssynbio.3c00588# Subunits of an E3 Ligase Complex as Degrons for Efficient Degradation of Cytosolic, Nuclear, and Membrane Proteins]

== Razgradnja proteinov s proteosomom ==

Večina proteinov v sesalskih celicah se razgradi skozi ubikvitin-proteosomsko pot, ki omogoča negativno kontrolo aktivnosti proteinov. Na lizinske ostanke kovalentno vezani ubikvitini (Ub) služijo, kot signal za 26S proteosom, ki vodi v razgradnjo označenega proteina. Ubikvitinska post-translacijska modifikacija katalizira encimska kaskada, katero sestavljajo proteini E1, E2 ter E3.

E1 ali ubikvitin-aktivacijski protein ob porabi ATP-ja katalizira prvi korak ubikvitinacijske reakcije, tako da aktivira Ub s tvorbo tioesterske vezi s C-koncem Ub. Aktiviran Ub se prenese na ubikvitinski nosilec E2. Tako nastali intermediat E2-Ub interagira z ubikvitin ligazo ali E3, ki katalizira prenos Ub z E2 ter tvorbo nove izopeptidne vezi na lizinskemu ostanku substrata (tarčnega proteina). Za razgradnjo označeni substrati so nato razgrajeni s strani proteosoma.

E3 ligaze služijo kot ključni regulatorji ubikvitin-proteosomske poti, saj kontrolirajo specifičnost in učinkovitost prenosa Ub. Dokaz izredne specifičnosti E3 ligaz je dejstvo, da poznamo preko 600 različnih encimov te vrste. Večina človeških E3 ligaz je tipa RING (ang. really interesting new gene), ki omogočajo direkten prenos Ub iz E2 na substrat brez tvorbe E3-Ub intermediata.

== Sesalske E3 ligaze ==

Primer RING ligaze je sesalski SCF-Skp2 E3 ligazni kompleks, ki je strukturno dobro okarakteriziran. Sestavljajo ga protein cullin 1 (Cul 1), ki deluje kot ogrodje, na katerega se nalagajo drugi proteini - protein Rbx1 (ang. RING-box protein 1), ki se veže na C-konec Cul1, in Skp1 (ang. S-phase kinase-associated protein 1), ki se veže na N-konec Cul1. Medtem ko Rbx1 omogoča izmenjavo E2-Ub intermediata preko domene RING, Cul1 umesti substrat in E2-Ub v optimalno prostorsko orientacijo za prenos Ub.

Specifičnost E3 ligaz je dodatno okrepljena z vezavo specifičnih adapterskih proteinov, kot je na primer Skp1. Skp1 vezavo drugih proteinov z motivom F škatle (Skp2). Medtem ko je N-konec F-škatle ohranjen in omogoča interakcijo z E3 ligazo, je C-konec manj ohranjen, pri čemer s s posledično večjo sekvenčno in konformacijsko variabilnostjo omogoča vezavo vrste različnih substratov.

== Tarčna razgradnja preko genskih fuzij z E3 ligazo ==

Ključen dejavnik uspešnosti prenosa Ub ter nalaganje le-tega in tvorbe poliubikvitinske verige je medsebojna bližina med substratom in E2-Ub. Da bi preverili vpliv bližine substrata in E2, so pripravili genetske fuzije reporterskega proteina luciferaze, ki je služila kot substrat, in ubikvitin konjugirajoči encim E2 R1 (CDC34 E2), ki asociira s SCF (ime izvira iz začetnic Skp, Cul in F-škatla) družino E3 ligaz ter dokazano katalizira nastanek na lizin povezanih poliubikvitinskih verig.

Asociacija substrata s podenotami kompleksa E3 ligaze je prav tako povezana z uspešnostjo razgradnje tarčnega proteina. Da bi raziskali, kako vezava posameznih podenot vpliva na razgradnjo substrata so z luciferazo genetsko združili domene E3 ligaznega kompleksa (F-škatlo Skp2, Skp1, Rbx1 in C-terminalni konec Cul1).

Fuzije luciferaze in podenot SCF-Skp2 E3 ligaznega kompleksa so vodile v manjšo raven luciferazne aktivnosti, kar pomeni, da fuzijski konstrukti negativno vplivajo na učinkovitost razgradnje proteinov. Zmanjšano aktivnost luciferaze zaznamo tudi pri vzorcih, kjer sta združena substrat in E2. Najmanjšo aktivnost luciferaze so kazali vzorci s fuzijo substrata in Cul1 ter substrata in F-škatle.

F-škatla, ki se nahaja tudi v proteinu Skp2 je ključna za interakcijo s Skp1 ter nadaljnjo razgradnjo substrata. Skp1 in Skp2 interagirata preko štirih C-terminalnih vijačnic, Da bi dodatno povečali sposobnost razgradnje proteinov s strani Skp1 so uvajali mutacije in odstranjevali povezovalne vijačnice ter pokazali, da je aktivnost luciferaze najnižja v vzorcih, kjer ima Skp2 le eno C-terminalno vijačnico.

Rbx1 se z beta-ploskvijo veže na Cul1, delecije v tej regiji so vodile v povečanje aktivnosti luciferaze v primerjavi z vzorcem brez mutacije. Beta-ploskev Rbx1 očitno vpliva na učinkovitost destabilizacije substrata.
Podenote kompleksa SCF-Skp2 E3 lahko delujejo kot degroni – minimalni elementi v proteinu, ki omogočajo tarčenje substrata za ubikvitinsko-proteosomsko mediirano razgradnjo.

== Preiskovanje posameznih degronov ==

Za preiskovanje posameznih degronov in povezovanje degronov in substrata so uporabili heterodimere obvitih vijačnic (CC). To so strukturni motivi- supervijačnice tipično v obliki dimerov ali trimerov. Dejansko jih lahko sestavlja do 7 alfa-vijačnic. So eden od proteinskih motivov, kjer je odnos med sekvenco in strukturo do velike mere že določen. Omogočajo načrtovanje in sestavljanje modularnih proteinov, ki se odzivajo na pričakovan način.

Zaradi predvidljivega obnašanja CC so te zelo uporabne za zagotavljanje povezanosti določenih proteinov ali proteinskih domen. Da bi preučili posamezne degrone in zagotovili povezanost degronov s substratom (luciferazo) so pripravili genetske fuzije CC s substrati in degroni. Vijačnici v obeh genetskih fuzijah sta si komplementarni oz. imata afiniteto druga z drugo. Uspešna interakcija CC substrata in degrona povzroči padec aktivnosti luciferaze, s tem da se aktivnost luciferaze dodatno zmanjša pri parih CC z nižjimi afinitetami.

Prostorska orientacija substrata glede na ligazni kompleks je izredno pomembna, zato je učinkovitost razgradnje substrata odvisna od rigidnosti povezovalnega zaporedja med CC in proteinom ter med CC in degronom. Povezovalna zaporedja so fleksibilna. Sestavljena so iz glicinskih in serinskih ponovitev, njihova optimalna dolžina pa je odvisna glede na tip degrona. V splošnem so daljša povezovalna zaporedja med substratom in CC vodila v večjo raven razgradnje. Daljša povezovalna zaporedja med CC in degronom pa so vodile v manjšo raven razgradnje. Fleksibilnost substrata, prav tako kot rigidnost degrona izboljša procesivnost ligaze.

== Fuzije s CC zaradi ugodnih lastnosti teh motivov omogočajo vrsto načinov regulacije razgradnje proteinov: ==

=== Substrat z dvema CC povezanima z mestom, katerega razgradi TEV proteaza ===

Dva različna CC motiva z različnimi funkcijami omogočata regulacijo razgradnje tarčnega proteina. Zunanja CC veriga ni sposobna vezave na CC degrona in preprečuje interakcijo druge CC substrata, ki bi lahko interagirala z degronom. Delovanje TEV (ang. Tobacco Etch Virus nuclear-inclusion-a endopeptidase) proteaze povzroči odcep in disociacijo »inhibitorne« CC - CC, ki je sposobna interakcije z degronom pa ni več senčena, zaradi njene izpostavitve pride do ubikvitinacije substrata in posledične razgradnje. Do razgradnje substrata bo prišlo dokler so TEV proteaze aktivne, to pa pomeni, da razgradnja proteinov ne mora biti regulirana v krajših časovnih intervalih.

=== Uporaba majhnih molekul za nadzorovanje razgradnje proteinov ===

FKBP (ang. FK506 binding protein) in FRB (ang. FKBP-rapamycin binding) domeni v prisotnosti rapamicina dimerizirata. To lastnost uporabimo za povezavo degrona z substratom ob prisotnosti majhne molekule. Dimerizacijo degrona in substrata dosežemo s fuzijo substrata s FKBP domeno ter degrona s FRB domeno. Kemična dimerizacija ob prisotnosti rapamicina vodi v ubikvitinacijo substrata.

Prednost uporabe majhne molekule je predvsem v tem, da je njen vnos in njeno izpiranje iz gojišč hitro. Do dimerizacije domen pride že v roku 30 minut.

== Preverjanje sposobnosti razgradnje transmembranskih in jedrnih proteinov ==

Degroni, ki izhajajo iz SCF-Skp2 E3 ligaznega kompleksa, lahko zagotovo razgradijo citosolne proteine. Za aplikacije v raznih terapijah pa bi bilo zaželeno, da so sposobni razgraditi tudi jedrne in membranske proteine. Destabilizacija membranskih proteinov je posebej zanimiva za terapijo CAR-T (ang. chimeric antigen receptor – T cells), kjer himerni transmembranski celični receptorji omogočajo tarčenje rakavih celic. Povišana količina CAR v teh celicah lahko v nekaterih primerih vodi v neželene stranske učinke zaradi prekomerne aktivacije, kot so npr. citokinske nevihte.

Da bi preverili sposobnost razgraditve transmembranskih proteinov so genetsko združili CAR s fluorescenčnim proteinom in FRB domeno, tako so ob prisotnosti rapamicina lahko spremljali upadanje fluorescence, ki predstavljalo uspešno razgradnjo CAR. Razgraditev proteina je bila manj uspešna, zato so se odločili ustvariti degrone iz drugih ubikvitin ligaznih kompleksov. Degroni iz CRL5-SOCS2 E3 ligaznega kompleksa so omogočili uspešnejšo razgradnjo.

Sposobnost razgraditve proteinov v jedru so preverili z genetsko fuzijo luciferaze in degrona z jedrnim lokalizacijskim signalom ter dimerizacijskima domenama. V prisotnosti rapamicina so zaznali destabilizacijo proteinov tudi ko so uporabljali samo degrone iz kompleksa SCF-Skp2 E3.

Degroni iz SCF-Skp2 E3 ligaze so očitno ustrezni za razgradnjo citosolnih in jedrnih proteinov. Zaradi manjše učinkovitosti pri proteinih, ki se nahajajo v membrani degroni, ki izvirajo iz SCF-Skp2 E3 ligaze očitno nimajo lokacijsko nespecifične aktivnosti. Za nastanek bolj univerzalnih degronov so ustvarili proteine, ki poleg Skp1 vsebujejo tudi vezavni motiv škatlo SOCS (ang. suppressor of cytokine signaling). Ta izvira iz CRL5-SOCS2 E3 ligaznega kompleksa in je uporaben za razgraditev membranskih proteinov. Takšen sistem omogoča tarčno razgradnjo proteinov v vseh treh kompartmentih.

== Zaključek ==

Ker so E3 ligaze zaradi svoje esencialne funkcije v razgradnji proteinov izredno pomembne, so visoko ohranjene, kar pomeni, da je metoda uporabna na več različnih celičnih linijah. Inducibilna razgradnja proteinov, katero lahko kontroliramo hitro in učinkovito, bi lahko služila kot zanimiv način za študije in regulacijo proteinskih nivojev v celicah.

== Literatura ==

[1] A. Verbič, T. Lebar, A. Praznik, R. Jerala: Subunits of an E3 Ligase Complex as Degrons for Efficient Degradation of Cytosolic, Nuclear, and Membrane Proteins. ACS Synth Biol 2024, 13, 792–803.
[2] A. L. Boyle: Applications of de novo designed peptides. Peptide Applications in Biomedicine, Biotechnology and Bioengineering 2018, 51–86.

Podenote E3 ligaznega kompleksa kot degroni za učinkovito degradacijo citosolnih, jedrnih in membranskih proteinov

2024-05-13T21:03:58Z

David Valte: /* Zaključek */

Izhodiščni članek: [https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acssynbio.3c00588# Subunits of an E3 Ligase Complex as Degrons for Efficient Degradation of Cytosolic, Nuclear, and Membrane Proteins]

== Razgradnja proteinov s proteosomom ==

Večina proteinov v sesalskih celicah se razgradi skozi ubikvitin-proteosomsko pot, ki omogoča negativno kontrolo aktivnosti proteinov. Na lizinske ostanke kovalentno vezani ubikvitini (Ub) služijo, kot signal za 26S proteosom, ki vodi v razgradnjo označenega proteina. Ubikvitinska post-translacijska modifikacija katalizira encimska kaskada, katero sestavljajo proteini E1, E2 ter E3.

E1 ali ubikvitin-aktivacijski protein ob porabi ATP-ja katalizira prvi korak ubikvitinacijske reakcije, tako da aktivira Ub s tvorbo tioesterske vezi s C-koncem Ub. Aktiviran Ub se prenese na ubikvitinski nosilec E2. Tako nastali intermediat E2-Ub interagira z ubikvitin ligazo ali E3, ki katalizira prenos Ub z E2 ter tvorbo nove izopeptidne vezi na lizinskemu ostanku substrata (tarčnega proteina). Za razgradnjo označeni substrati so nato razgrajeni s strani proteosoma.

E3 ligaze služijo kot ključni regulatorji ubikvitin-proteosomske poti, saj kontrolirajo specifičnost in učinkovitost prenosa Ub. Dokaz izredne specifičnosti E3 ligaz je dejstvo, da poznamo preko 600 različnih encimov te vrste. Večina človeških E3 ligaz je tipa RING (ang. really interesting new gene), ki omogočajo direkten prenos Ub iz E2 na substrat brez tvorbe E3-Ub intermediata.

== Sesalske E3 ligaze ==

Primer RING ligaze je sesalski SCF-Skp2 E3 ligazni kompleks, ki je strukturno dobro okarakteriziran. Sestavljajo ga protein cullin 1 (Cul 1), ki deluje kot ogrodje, na katerega se nalagajo drugi proteini - protein Rbx1 (ang. RING-box protein 1), ki se veže na C-konec Cul1, in Skp1 (ang. S-phase kinase-associated protein 1), ki se veže na N-konec Cul1. Medtem ko Rbx1 omogoča izmenjavo E2-Ub intermediata preko domene RING, Cul1 umesti substrat in E2-Ub v optimalno prostorsko orientacijo za prenos Ub.

Specifičnost E3 ligaz je dodatno okrepljena z vezavo specifičnih adapterskih proteinov, kot je na primer Skp1. Skp1 vezavo drugih proteinov z motivom F škatle (Skp2). Medtem ko je N-konec F-škatle ohranjen in omogoča interakcijo z E3 ligazo, je C-konec manj ohranjen, pri čemer s s posledično večjo sekvenčno in konformacijsko variabilnostjo omogoča vezavo vrste različnih substratov.

== Tarčna razgradnja preko genskih fuzij z E3 ligazo ==

Ključen dejavnik uspešnosti prenosa Ub ter nalaganje le-tega in tvorbe poliubikvitinske verige je medsebojna bližina med substratom in E2-Ub. Da bi preverili vpliv bližine substrata in E2, so pripravili genetske fuzije reporterskega proteina luciferaze, ki je služila kot substrat, in ubikvitin konjugirajoči encim E2 R1 (CDC34 E2), ki asociira s SCF (ime izvira iz začetnic Skp, Cul in F-škatla) družino E3 ligaz ter dokazano katalizira nastanek na lizin povezanih poliubikvitinskih verig.

Asociacija substrata s podenotami kompleksa E3 ligaze je prav tako povezana z uspešnostjo razgradnje tarčnega proteina. Da bi raziskali, kako vezava posameznih podenot vpliva na razgradnjo substrata so z luciferazo genetsko združili domene E3 ligaznega kompleksa (F-škatlo Skp2, Skp1, Rbx1 in C-terminalni konec Cul1).

Fuzije luciferaze in podenot SCF-Skp2 E3 ligaznega kompleksa so vodile v manjšo raven luciferazne aktivnosti, kar pomeni, da fuzijski konstrukti negativno vplivajo na učinkovitost razgradnje proteinov. Zmanjšano aktivnost luciferaze zaznamo tudi pri vzorcih, kjer sta združena substrat in E2. Najmanjšo aktivnost luciferaze so kazali vzorci s fuzijo substrata in Cul1 ter substrata in F-škatle.

F-škatla, ki se nahaja tudi v proteinu Skp2 je ključna za interakcijo s Skp1 ter nadaljnjo razgradnjo substrata. Skp1 in Skp2 interagirata preko štirih C-terminalnih vijačnic, Da bi dodatno povečali sposobnost razgradnje proteinov s strani Skp1 so uvajali mutacije in odstranjevali povezovalne vijačnice ter pokazali, da je aktivnost luciferaze najnižja v vzorcih, kjer ima Skp2 le eno C-terminalno vijačnico.

Rbx1 se z beta-ploskvijo veže na Cul1, delecije v tej regiji so vodile v povečanje aktivnosti luciferaze v primerjavi z vzorcem brez mutacije. Beta-ploskev Rbx1 očitno vpliva na učinkovitost destabilizacije substrata.
Podenote kompleksa SCF-Skp2 E3 lahko delujejo kot degroni – minimalni elementi v proteinu, ki omogočajo tarčenje substrata za ubikvitinsko-proteosomsko mediirano razgradnjo.

== Preiskovanje posameznih degronov ==

Za preiskovanje posameznih degronov in povezovanje degronov in substrata so uporabili heterodimere obvitih vijačnic (CC). To so strukturni motivi- supervijačnice tipično v obliki dimerov ali trimerov. Dejansko jih lahko sestavlja do 7 alfa-vijačnic. So eden od proteinskih motivov, kjer je odnos med sekvenco in strukturo do velike mere že določen. Omogočajo načrtovanje in sestavljanje modularnih proteinov, ki se odzivajo na pričakovan način.

Zaradi predvidljivega obnašanja CC so te zelo uporabne za zagotavljanje povezanosti določenih proteinov ali proteinskih domen. Da bi preučili posamezne degrone in zagotovili povezanost degronov s substratom (luciferazo) so pripravili genetske fuzije CC s substrati in degroni. Vijačnici v obeh genetskih fuzijah sta si komplementarni oz. imata afiniteto druga z drugo. Uspešna interakcija CC substrata in degrona povzroči padec aktivnosti luciferaze, s tem da se aktivnost luciferaze dodatno zmanjša pri parih CC z nižjimi afinitetami.

Prostorska orientacija substrata glede na ligazni kompleks je izredno pomembna, zato je učinkovitost razgradnje substrata odvisna od rigidnosti povezovalnega zaporedja med CC in proteinom ter med CC in degronom. Povezovalna zaporedja so fleksibilna. Sestavljena so iz glicinskih in serinskih ponovitev, njihova optimalna dolžina pa je odvisna glede na tip degrona. V splošnem so daljša povezovalna zaporedja med substratom in CC vodila v večjo raven razgradnje. Daljša povezovalna zaporedja med CC in degronom pa so vodile v manjšo raven razgradnje. Fleksibilnost substrata, prav tako kot rigidnost degrona izboljša procesivnost ligaze.

== Fuzije s CC zaradi ugodnih lastnosti teh motivov omogočajo vrsto načinov regulacije razgradnje proteinov: ==

=== Substrat z dvema CC povezanima z mestom, katerega razgradi TEV proteaza ===

Dva različna CC motiva z različnimi funkcijami omogočata regulacijo razgradnje tarčnega proteina. Zunanja CC veriga ni sposobna vezave na CC degrona in preprečuje interakcijo druge CC substrata, ki bi lahko interagirala z degronom. Delovanje TEV (ang. Tobacco Etch Virus nuclear-inclusion-a endopeptidase) proteaze povzroči odcep in disociacijo »inhibitorne« CC - CC, ki je sposobna interakcije z degronom pa ni več senčena, zaradi njene izpostavitve pride do ubikvitinacije substrata in posledične razgradnje. Do razgradnje substrata bo prišlo dokler so TEV proteaze aktivne, to pa pomeni, da razgradnja proteinov ne mora biti regulirana v krajših časovnih intervalih.

=== Uporaba majhnih molekul za nadzorovanje razgradnje proteinov ===

FKBP (ang. FK506 binding protein) in FRB (ang. FKBP-rapamycin binding) domeni v prisotnosti rapamicina dimerizirata. To lastnost uporabimo za povezavo degrona z substratom ob prisotnosti majhne molekule. Dimerizacijo degrona in substrata dosežemo s fuzijo substrata s FKBP domeno ter degrona s FRB domeno. Kemična dimerizacija ob prisotnosti rapamicina vodi v ubikvitinacijo substrata.

Prednost uporabe majhne molekule je predvsem v tem, da je njen vnos in njeno izpiranje iz gojišč hitro. Do dimerizacije domen pride že v roku 30 minut.

== Preverjanje sposobnosti razgradnje transmembranskih in jedrnih proteinov ==

Degroni, ki izhajajo iz SCF-Skp2 E3 ligaznega kompleksa, lahko zagotovo razgradijo citosolne proteine. Za aplikacije v raznih terapijah pa bi bilo zaželeno, da so sposobni razgraditi tudi jedrne in membranske proteine. Destabilizacija membranskih proteinov je posebej zanimiva za terapijo CAR-T (ang. chimeric antigen receptor – T cells), kjer himerni transmembranski celični receptorji omogočajo tarčenje rakavih celic. Povišana količina CAR v teh celicah lahko v nekaterih primerih vodi v neželene stranske učinke zaradi prekomerne aktivacije, kot so npr. citokinske nevihte.

Da bi preverili sposobnost razgraditve transmembranskih proteinov so genetsko združili CAR s fluorescenčnim proteinom in FRB domeno, tako so ob prisotnosti rapamicina lahko spremljali upadanje fluorescence, ki predstavljalo uspešno razgradnjo CAR. Razgraditev proteina je bila manj uspešna, zato so se odločili ustvariti degrone iz drugih ubikvitin ligaznih kompleksov. Degroni iz CRL5-SOCS2 E3 ligaznega kompleksa so omogočili uspešnejšo razgradnjo.

Sposobnost razgraditve proteinov v jedru so preverili z genetsko fuzijo luciferaze in degrona z jedrnim lokalizacijskim signalom ter dimerizacijskima domenama. V prisotnosti rapamicina so zaznali destabilizacijo proteinov tudi ko so uporabljali samo degrone iz kompleksa SCF-Skp2 E3.

Degroni iz SCF-Skp2 E3 ligaze so očitno ustrezni za razgradnjo citosolnih in jedrnih proteinov. Zaradi manjše učinkovitosti pri proteinih, ki se nahajajo v membrani degroni, ki izvirajo iz SCF-Skp2 E3 ligaze očitno nimajo lokacijsko nespecifične aktivnosti. Za nastanek bolj univerzalnih degronov so ustvarili proteine, ki poleg Skp1 vsebujejo tudi vezavni motiv škatlo SOCS (ang. suppressor of cytokine signaling). Ta izvira iz CRL5-SOCS2 E3 ligaznega kompleksa in je uporaben za razgraditev membranskih proteinov. Takšen sistem omogoča tarčno razgradnjo proteinov v vseh treh kompartmentih.

== Zaključek ==

== Literatura ==

[1] A. Verbič, T. Lebar, A. Praznik, R. Jerala: Subunits of an E3 Ligase Complex as Degrons for Efficient Degradation of Cytosolic, Nuclear, and Membrane Proteins. ACS Synth Biol 2024, 13, 792–803.
[2] A. L. Boyle: Applications of de novo designed peptides. Peptide Applications in Biomedicine, Biotechnology and Bioengineering 2018, 51–86.

Podenote E3 ligaznega kompleksa kot degroni za učinkovito degradacijo citosolnih, jedrnih in membranskih proteinov

2024-05-13T20:58:00Z

David Valte: /* Fuzije s CC zaradi ugodnih lastnosti teh motivov omogočajo vrsto načinov regulacije razgradnje proteinov: */

Izhodiščni članek: [https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acssynbio.3c00588# Subunits of an E3 Ligase Complex as Degrons for Efficient Degradation of Cytosolic, Nuclear, and Membrane Proteins]

== Razgradnja proteinov s proteosomom ==

Večina proteinov v sesalskih celicah se razgradi skozi ubikvitin-proteosomsko pot, ki omogoča negativno kontrolo aktivnosti proteinov. Na lizinske ostanke kovalentno vezani ubikvitini (Ub) služijo, kot signal za 26S proteosom, ki vodi v razgradnjo označenega proteina. Ubikvitinska post-translacijska modifikacija katalizira encimska kaskada, katero sestavljajo proteini E1, E2 ter E3.

E1 ali ubikvitin-aktivacijski protein ob porabi ATP-ja katalizira prvi korak ubikvitinacijske reakcije, tako da aktivira Ub s tvorbo tioesterske vezi s C-koncem Ub. Aktiviran Ub se prenese na ubikvitinski nosilec E2. Tako nastali intermediat E2-Ub interagira z ubikvitin ligazo ali E3, ki katalizira prenos Ub z E2 ter tvorbo nove izopeptidne vezi na lizinskemu ostanku substrata (tarčnega proteina). Za razgradnjo označeni substrati so nato razgrajeni s strani proteosoma.

E3 ligaze služijo kot ključni regulatorji ubikvitin-proteosomske poti, saj kontrolirajo specifičnost in učinkovitost prenosa Ub. Dokaz izredne specifičnosti E3 ligaz je dejstvo, da poznamo preko 600 različnih encimov te vrste. Večina človeških E3 ligaz je tipa RING (ang. really interesting new gene), ki omogočajo direkten prenos Ub iz E2 na substrat brez tvorbe E3-Ub intermediata.

== Sesalske E3 ligaze ==

Primer RING ligaze je sesalski SCF-Skp2 E3 ligazni kompleks, ki je strukturno dobro okarakteriziran. Sestavljajo ga protein cullin 1 (Cul 1), ki deluje kot ogrodje, na katerega se nalagajo drugi proteini - protein Rbx1 (ang. RING-box protein 1), ki se veže na C-konec Cul1, in Skp1 (ang. S-phase kinase-associated protein 1), ki se veže na N-konec Cul1. Medtem ko Rbx1 omogoča izmenjavo E2-Ub intermediata preko domene RING, Cul1 umesti substrat in E2-Ub v optimalno prostorsko orientacijo za prenos Ub.

Specifičnost E3 ligaz je dodatno okrepljena z vezavo specifičnih adapterskih proteinov, kot je na primer Skp1. Skp1 vezavo drugih proteinov z motivom F škatle (Skp2). Medtem ko je N-konec F-škatle ohranjen in omogoča interakcijo z E3 ligazo, je C-konec manj ohranjen, pri čemer s s posledično večjo sekvenčno in konformacijsko variabilnostjo omogoča vezavo vrste različnih substratov.

== Tarčna razgradnja preko genskih fuzij z E3 ligazo ==

Ključen dejavnik uspešnosti prenosa Ub ter nalaganje le-tega in tvorbe poliubikvitinske verige je medsebojna bližina med substratom in E2-Ub. Da bi preverili vpliv bližine substrata in E2, so pripravili genetske fuzije reporterskega proteina luciferaze, ki je služila kot substrat, in ubikvitin konjugirajoči encim E2 R1 (CDC34 E2), ki asociira s SCF (ime izvira iz začetnic Skp, Cul in F-škatla) družino E3 ligaz ter dokazano katalizira nastanek na lizin povezanih poliubikvitinskih verig.

Asociacija substrata s podenotami kompleksa E3 ligaze je prav tako povezana z uspešnostjo razgradnje tarčnega proteina. Da bi raziskali, kako vezava posameznih podenot vpliva na razgradnjo substrata so z luciferazo genetsko združili domene E3 ligaznega kompleksa (F-škatlo Skp2, Skp1, Rbx1 in C-terminalni konec Cul1).

Fuzije luciferaze in podenot SCF-Skp2 E3 ligaznega kompleksa so vodile v manjšo raven luciferazne aktivnosti, kar pomeni, da fuzijski konstrukti negativno vplivajo na učinkovitost razgradnje proteinov. Zmanjšano aktivnost luciferaze zaznamo tudi pri vzorcih, kjer sta združena substrat in E2. Najmanjšo aktivnost luciferaze so kazali vzorci s fuzijo substrata in Cul1 ter substrata in F-škatle.

F-škatla, ki se nahaja tudi v proteinu Skp2 je ključna za interakcijo s Skp1 ter nadaljnjo razgradnjo substrata. Skp1 in Skp2 interagirata preko štirih C-terminalnih vijačnic, Da bi dodatno povečali sposobnost razgradnje proteinov s strani Skp1 so uvajali mutacije in odstranjevali povezovalne vijačnice ter pokazali, da je aktivnost luciferaze najnižja v vzorcih, kjer ima Skp2 le eno C-terminalno vijačnico.

Rbx1 se z beta-ploskvijo veže na Cul1, delecije v tej regiji so vodile v povečanje aktivnosti luciferaze v primerjavi z vzorcem brez mutacije. Beta-ploskev Rbx1 očitno vpliva na učinkovitost destabilizacije substrata.
Podenote kompleksa SCF-Skp2 E3 lahko delujejo kot degroni – minimalni elementi v proteinu, ki omogočajo tarčenje substrata za ubikvitinsko-proteosomsko mediirano razgradnjo.

== Preiskovanje posameznih degronov ==

Za preiskovanje posameznih degronov in povezovanje degronov in substrata so uporabili heterodimere obvitih vijačnic (CC). To so strukturni motivi- supervijačnice tipično v obliki dimerov ali trimerov. Dejansko jih lahko sestavlja do 7 alfa-vijačnic. So eden od proteinskih motivov, kjer je odnos med sekvenco in strukturo do velike mere že določen. Omogočajo načrtovanje in sestavljanje modularnih proteinov, ki se odzivajo na pričakovan način.

Zaradi predvidljivega obnašanja CC so te zelo uporabne za zagotavljanje povezanosti določenih proteinov ali proteinskih domen. Da bi preučili posamezne degrone in zagotovili povezanost degronov s substratom (luciferazo) so pripravili genetske fuzije CC s substrati in degroni. Vijačnici v obeh genetskih fuzijah sta si komplementarni oz. imata afiniteto druga z drugo. Uspešna interakcija CC substrata in degrona povzroči padec aktivnosti luciferaze, s tem da se aktivnost luciferaze dodatno zmanjša pri parih CC z nižjimi afinitetami.

Prostorska orientacija substrata glede na ligazni kompleks je izredno pomembna, zato je učinkovitost razgradnje substrata odvisna od rigidnosti povezovalnega zaporedja med CC in proteinom ter med CC in degronom. Povezovalna zaporedja so fleksibilna. Sestavljena so iz glicinskih in serinskih ponovitev, njihova optimalna dolžina pa je odvisna glede na tip degrona. V splošnem so daljša povezovalna zaporedja med substratom in CC vodila v večjo raven razgradnje. Daljša povezovalna zaporedja med CC in degronom pa so vodile v manjšo raven razgradnje. Fleksibilnost substrata, prav tako kot rigidnost degrona izboljša procesivnost ligaze.

== Fuzije s CC zaradi ugodnih lastnosti teh motivov omogočajo vrsto načinov regulacije razgradnje proteinov: ==

=== Substrat z dvema CC povezanima z mestom, katerega razgradi TEV proteaza ===

Dva različna CC motiva z različnimi funkcijami omogočata regulacijo razgradnje tarčnega proteina. Zunanja CC veriga ni sposobna vezave na CC degrona in preprečuje interakcijo druge CC substrata, ki bi lahko interagirala z degronom. Delovanje TEV (ang. Tobacco Etch Virus nuclear-inclusion-a endopeptidase) proteaze povzroči odcep in disociacijo »inhibitorne« CC - CC, ki je sposobna interakcije z degronom pa ni več senčena, zaradi njene izpostavitve pride do ubikvitinacije substrata in posledične razgradnje. Do razgradnje substrata bo prišlo dokler so TEV proteaze aktivne, to pa pomeni, da razgradnja proteinov ne mora biti regulirana v krajših časovnih intervalih.

=== Uporaba majhnih molekul za nadzorovanje razgradnje proteinov ===

FKBP (ang. FK506 binding protein) in FRB (ang. FKBP-rapamycin binding) domeni v prisotnosti rapamicina dimerizirata. To lastnost uporabimo za povezavo degrona z substratom ob prisotnosti majhne molekule. Dimerizacijo degrona in substrata dosežemo s fuzijo substrata s FKBP domeno ter degrona s FRB domeno. Kemična dimerizacija ob prisotnosti rapamicina vodi v ubikvitinacijo substrata.

Prednost uporabe majhne molekule je predvsem v tem, da je njen vnos in njeno izpiranje iz gojišč hitro. Do dimerizacije domen pride že v roku 30 minut.

== Zaključek ==

== Zaključek ==

== Literatura ==

[1] A. Verbič, T. Lebar, A. Praznik, R. Jerala: Subunits of an E3 Ligase Complex as Degrons for Efficient Degradation of Cytosolic, Nuclear, and Membrane Proteins. ACS Synth Biol 2024, 13, 792–803.
[2] A. L. Boyle: Applications of de novo designed peptides. Peptide Applications in Biomedicine, Biotechnology and Bioengineering 2018, 51–86.

Podenote E3 ligaznega kompleksa kot degroni za učinkovito degradacijo citosolnih, jedrnih in membranskih proteinov

2024-05-13T20:56:29Z

David Valte:

Podenote E3 ligaznega kompleksa kot degroni za učinkovito degradacijo citosolnih, jedrnih in membranskih proteinov

2024-05-13T20:54:45Z

David Valte: /* Tarčna razgradnja preko genskih fuzij z E3 ligazo */

Podenote E3 ligaznega kompleksa kot degroni za učinkovito degradacijo citosolnih, jedrnih in membranskih proteinov

2024-05-13T20:54:22Z

David Valte: /* Preiskovanje posameznih degronov */

Podenote E3 ligaznega kompleksa kot degroni za učinkovito degradacijo citosolnih, jedrnih in membranskih proteinov

2024-05-13T20:54:07Z

David Valte: /* Tarčna razgradnja preko genskih fuzij z E3 ligazo */

Podenote E3 ligaznega kompleksa kot degroni za učinkovito degradacijo citosolnih, jedrnih in membranskih proteinov

2024-05-13T20:53:54Z

David Valte: /* Razgradnja proteinov s proteosomom */

Podenote E3 ligaznega kompleksa kot degroni za učinkovito degradacijo citosolnih, jedrnih in membranskih proteinov

2024-05-13T20:53:24Z

David Valte: /* Vpliv ponovnega zagona na pojav mutacij */

Podenote E3 ligaznega kompleksa kot degroni za učinkovito degradacijo citosolnih, jedrnih in membranskih proteinov

2024-05-13T20:52:36Z

David Valte: /* Tarčna razgradnja preko genskih fuzij z E3 ligazo */

Podenote E3 ligaznega kompleksa kot degroni za učinkovito degradacijo citosolnih, jedrnih in membranskih proteinov

2024-05-13T20:49:38Z

David Valte: /* Tarčna razgradnja preko genskih fuzij z E3 ligazo */

Podenote E3 ligaznega kompleksa kot degroni za učinkovito degradacijo citosolnih, jedrnih in membranskih proteinov

2024-05-13T20:46:41Z

David Valte: /* Ponovni zagon genoma sestavljenega v S. cerevisiae */

Podenote E3 ligaznega kompleksa kot degroni za učinkovito degradacijo citosolnih, jedrnih in membranskih proteinov

2024-05-13T20:45:48Z

David Valte: /* Sesalske E3 ligaze */

Podenote E3 ligaznega kompleksa kot degroni za učinkovito degradacijo citosolnih, jedrnih in membranskih proteinov

2024-05-13T20:44:40Z

David Valte: /* Sestavljanje genoma bakteriofaga JG024 */

Podenote E3 ligaznega kompleksa kot degroni za učinkovito degradacijo citosolnih, jedrnih in membranskih proteinov

2024-05-13T20:43:40Z

David Valte: /* Uvod */

Podenote E3 ligaznega kompleksa kot degroni za učinkovito degradacijo citosolnih, jedrnih in membranskih proteinov

2024-05-13T19:33:39Z

David Valte: /* Literatura */

Izhodiščni članek: [https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acssynbio.3c00588# Subunits of an E3 Ligase Complex as Degrons for Efficient Degradation of Cytosolic, Nuclear, and Membrane Proteins]

== Uvod ==

== Sestavljanje genoma bakteriofaga JG024 ==

== Ponovni zagon genoma sestavljenega v ''S. cerevisiae'' ==

== Vpliv ponovnega zagona na pojav mutacij ==

== Zaključek ==

== Literatura ==

[1] A. Verbič, T. Lebar, A. Praznik, R. Jerala: Subunits of an E3 Ligase Complex as Degrons for Efficient Degradation of Cytosolic, Nuclear, and Membrane Proteins. ACS Synth Biol 2024, 13, 792–803.
[2] A. L. Boyle: Applications of de novo designed peptides. Peptide Applications in Biomedicine, Biotechnology and Bioengineering 2018, 51–86.

Podenote E3 ligaznega kompleksa kot degroni za učinkovito degradacijo citosolnih, jedrnih in membranskih proteinov

2024-05-13T19:28:09Z

David Valte: /* Literatura */

Izhodiščni članek: [https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acssynbio.3c00588# Subunits of an E3 Ligase Complex as Degrons for Efficient Degradation of Cytosolic, Nuclear, and Membrane Proteins]

== Uvod ==

== Sestavljanje genoma bakteriofaga JG024 ==

== Ponovni zagon genoma sestavljenega v ''S. cerevisiae'' ==

== Vpliv ponovnega zagona na pojav mutacij ==

== Zaključek ==

== Literatura ==

[1] A. Verbič, T. Lebar, A. Praznik, R. Jerala: Subunits of an E3 Ligase Complex as Degrons for Efficient Degradation of Cytosolic, Nuclear, and Membrane Proteins. ACS Synth Biol 2024, 13, 792–803.

Podenote E3 ligaznega kompleksa kot degroni za učinkovito degradacijo citosolnih, jedrnih in membranskih proteinov

2024-05-13T19:22:50Z

David Valte: Created page with "Izhodiščni članek: [https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acssynbio.3c00588# Subunits of an E3 Ligase Complex as Degrons for Efficient Degradation of Cytosolic, Nuclear, and Membrane Proteins] == Uvod == == Sestavljanje genoma bakteriofaga JG024 == == Ponovni zagon genoma sestavljenega v ''S. cerevisiae'' == == Vpliv ponovnega zagona na pojav mutacij == == Zaključek == == Literatura =="

Izhodiščni članek: [https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acssynbio.3c00588# Subunits of an E3 Ligase Complex as Degrons for Efficient Degradation of Cytosolic, Nuclear, and Membrane Proteins]

== Uvod ==

== Sestavljanje genoma bakteriofaga JG024 ==

== Ponovni zagon genoma sestavljenega v ''S. cerevisiae'' ==

== Vpliv ponovnega zagona na pojav mutacij ==

== Zaključek ==

== Literatura ==

Seminarji SB 2023/24

2024-05-13T19:19:26Z

David Valte:

V študijskem letu 2023/24 študenti in študentke pri Sintezni biologiji predstavljajo naslednje teme:

RAZISKOVALNI ČLANKI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sinteznobiološki_pristop_k_sestavljanju_in_ponovnemu_zagonu_klinično_pomembnih_fagov_Pseudomonas_aeruginosa Sinteznobiološki pristop k sestavljanju in ponovnemu zagonu klinično pomembnih fagov ''Pseudomonas aeruginosa''] (Bor Krajnik)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Optogenetsko_prostorsko_vzorčenje_kooperacije_pri_glivah_kvasovkah Optogenetsko prostorsko vzorčenje kooperacije pri glivah kvasovkah] (Martin Stanonik)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sintetična_celična_linija_za_inducibilno_pakiranje_virusa_influence_A Sintetična celična linija za inducibilno pakiranje virusa influence A] (Klara Razboršek)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Uporaba_sesalskega_RNA-vezavnega_proteina_Musashi-1_kot_alosterično_reguliranega_translacijskega_represorja_v_E._coli Uporaba sesalskega RNA-vezavnega proteina Musashi-1 kot alosterično reguliranega translacijskega represorja v ''E. coli''] (Marko Kovačić)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Kaskadno_ojačano_genetsko_vezje_za_detekcijo_glivnih_patogenov Kaskadno ojačano genetsko vezje za detekcijo glivnih patogenov] (Jakob Tomšič)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sintetična_mRNA-stikala_s_povratno_zanko,_ki_omogočajo_zaznavanje_miRNA Sintetična mRNA-stikala s povratno zanko, ki omogočajo zaznavanje miRNA] (Ana Pervanja)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Molekularni_nabor_navzkrižno_hranjenih_sevov_za_pripravo_sintetičnih_skupnosti_kvasovk Molekularni nabor navzkrižno hranjenih sevov za pripravo sintetičnih skupnosti kvasovk] (Teja Spruk)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Inženiring_dinamike_rasti_sesalskih_celic_za_bioproizvodnjo Inženiring dinamike rasti sesalskih celic za bioproizvodnjo] (Zarja Rožanc)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Inženirane_mRNA-ribosomske_fuzije_za_lažjo_biosintezo_selenoproteinov Inženirane mRNA-ribosomske fuzije za lažjo biosintezo selenoproteinov] (Kostadin Mitkov)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Razvoj_novih_binarnih_ekspresijskih_sistemov_za_sintezno_biologijo_rastlin Razvoj novih binarnih ekspresijskih sistemov za sintezno biologijo rastlin] (Alliana Kolar)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Kombinatorična_biosinteza_terpenoidov_v_kvasovkah Kombinatorična biosinteza terpenoidov v kvasovkah] (Jan Kogovšek)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Identifikacija_genov,_ki_se_odzivajo_na_stres_kislega_okolja_in_inženiring_odpornosti_na_kislo_okolje_v_cianobakteriji_Synechococcus_elongatus_PCC_7942 Identifikacija genov, ki se odzivajo na stres kislega okolja in inženiring odpornosti na kislo okolje v cianobakteriji ''Synechococcus elongatus'' PCC 7942] (Ela Kovač)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/ Vse v enem - IQ preklopna stikala z veliko vsestranskostjo za natančno nastavitev izražanja transgenov v celicah in tkivih seselacev] (Ena Kartal)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Podenote_E3_ligaznega_kompleksa_kot_degroni_za_učinkovito_degradacijo_citosolnih,_jedrnih_in_membranskih_proteinov Podenote E3 ligaznega kompleksa kot degroni za učinkovito degradacijo citosolnih, jedrnih in membranskih proteinov] (David Valte)

NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/PhaseOut Biološka proizvodnja bioplastike] (Sašo Jakob)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BeeYeast Inženiring kvasovk za boj proti virusnim okužbam čebel] (Mateja Milošević)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Cellect Cellect - Fenotipsko stabilne celične linije] (Lucija Voga)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/oPHAelia oPHAelia - Inovativna rešitev za zmanjšanje onesnaževanja s plastiko] (Irina Kostadinoska)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/ReMixHD ReMixHD - Recikliranje mešanih plastičnih odpadkov] (Ema Kavčič)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/DARWINS DARWINS - Usmerjena posodobitev proteinov Ago z idealno proteinsko termično stabilnostjo] (Rahela Petrovčič)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/PET-2-Protein PET-2-Protein - Proizvodnja mikrobnih proteinov iz polietilen tereftalata] (Zala Perko)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/48C_Cadmium_catcher_LBP 48C Cadmium catcher LBP- Proizvodnja bioterapevtika za vezavo kadmija] (Maja Deutsch)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Proteus Proteus - Sistem za ciljanje onkogenov in induciranje piroptoze] (Gašper Struna)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Silinker Silinker] (Nuša Brdnik)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sublimestone Sublimestone - uporaba bakterij za ohranjanje kulturne dediščine] (Ana Maučec)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/LAMPS LAMPS - sistem svetlečih alg] (Rebeka Jerina)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/FluoroLoop#Problematika_PFAS FluoroLoop] (Eva Vene)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/OASYS OASYS - Diagnostični pripomoček za klinično depresijo] (Ajda Dedič)
----

Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Povzetek je treba objaviti dva dni pred predstavitvijo do polnoči (za seminarje v sredo torej v ponedeljek). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo približno 5-minutna razprava.

Terminski razpored je razviden iz preglednice na strežniku Google Drive.

Kako je videti seznam seminarjev, lahko preverite pri lanskem letniku: [[Seminarji_SB_2022/23]].

TE kot regulatorji transkripcije

2022-04-24T15:23:23Z

David Valte: /* Funkcije transpozicijskih elementov v cis-regulatornih regijah */

==Uvod==
Transpozicijski elementi (TE), ki sestavljajo velik del evkariontskega genoma, lahko, če se nahajajo v eksonskih predelih gostiteljevega genskega zapisa, bistveno zmanjšajo njegovo evolucijsko sposobnost preživetja, ker delujejo moteče (lahko povzročijo npr. vstavitev start in stop kodonov, premik bralnega okvirja, prehitro terminacijo transkripcije…). S tem zmanjšajo tudi verjetnost za lasten prenos v nove generacije. Ker TE po delovanju spominjajo na parazitski organizem, so se skozi evolucijo razvile strategije, ki preprečujejo preveliko škodo na gostiteljskem organizmu. Prilagajanje je potekalo vzajemno. Gostiteljski organizmi so npr. postali sposobni utišanja transpozicijskih elementov s pomočjo metilacije DNA na CpG otočkih, TE pa so se preferenčno vključevali v intronska zaporedja, saj tam ne delujejo tako moteče. Skozi čas so gostiteljski organizmi postali sposobni uporabe TE v svojo korist. 

Vključitve transpozicijskih elementov v nekodirajoče predele genskega zapisa in njihove mutacije so v veliko primerih povzročile, da so TE izgubili sposobnost transponiranja, pridobili pa so cis in trans-regulatorno aktivnost. Cis-regulatorne regije (CRE) so nekodirajoča zaporedja nukleotidov, ki regulirajo ekspresijo genov na isti verigi DNA. Trans regulacija pa pomeni to, da npr. transkripcijski faktorji prihajajo od drugod oz. so kodirani na eni molekuli DNA, regulirajo pa ekspresijo genov na drugi molekuli DNA. Regulacija transkripcije s TE lahko poteka na več načinov: 

1. V genski zapis lahko vnašajo nova vezavna mesta za transkripcijske faktorje (TF) preko promotorjev, ojačevalcev, utiševalnih in izolatorskih zaporedij. 
2. Lahko modulirajo 3D strukturo kromatina. 
3. Zmožni so kodiranja transkripcijskih faktorjev. 
4. S povezovanjem z represorskimi transkripcijskimi faktorji vplivajo na utišanje sosednjih genov. 
5. Imajo vlogo pri regulatornih nekodirajočih molekulah RNA, ki so pomembni regulatorji transkripcije. 

==Funkcije transpozicijskih elementov v cis-regulatornih regijah ==
Regulatorne sposobnosti cis-regulatornih regij lahko izhajajo iz transpozicijskih elementov. Cis-regulatorne regije tvorijo specifična vezavna mesta za proteine povezane z iniciacijo in regulacijo transkripcije. Primeri nekaterih vrst CRE: 

1. Promotorji so kratka zaporedja DNA, ki vključujejo začetno mesto transkripcije. Ob vezavi ustreznih transkripcijskih faktorjev na promotorsko regijo omogočijo transkripcijo gena. Transpozon AluSp v promotorju gena FCER1G inducira transkripcijo visokoafinitetnega receptorja za Fc regijo IgE. 
2. Ojačevalci so zaporedja, ki jih najdemo pred ali za genom, ki ga regulirajo. Delujejo kooperativno s promotorjem, in sicer tako, da povečajo stopnjo transkripcije, omogočajo pa regulacijo tudi bolj oddaljenih genov. Transpozon AluY v intronu gena CD8 (ta kodira za glikoprotein CD8, ki je pomemben pri celičnih interakcijah znotraj imunskega sistema) deluje kot ojačevalec. 
3. Utiševalna zaporedja vežejo represorje in tako preprečujejo transkripcijo. Transpozicijski elementi so z rekrutiranjem transkripcijskih faktorjev postali sposobni delovati kot utiševalna zaporedja, ki remodelirajo kromatin. Čeprav so heterokromatinski deli revni z geni, so bogati s TE-ji, kar bi lahko pomenilo, da imajo transpozicijski elementi pomembno vlogo pri širjenju heterokromatina. Tako se npr. korepresorski protein TRIM28 veže na vezavno mesto, ki se nahaja na transpozonu ERV in s tem utiša sosednje gene. 
4. Inzulatorji ščitijo gene pred regulatornimi vplivi sosednjih genov. Lahko blokirajo promotorje, ojačevalce in utiševalce. Preprečujejo neprimerne interakcije med sosednjimi kromatinskimi regijami. Transpozon AluSq deluje kot inzulator. Njegova transkripcija ščiti človeški gen HBE1 (ki kodira za istoimenski protein (hemoglobinska podenota epsilon)) pred regulacijo z drugimi promotorji. 

TE-ji uvajajo nova vezavna mesta za TF, ki so v njih lahko prisotna takoj po inserciji v genom ali pa nastanejo de novo s postinsercijskimi mutacijami. Pogosto se mutacije pojavljajo na metiliranih CpG otočkih. Deaminacija teh povzroči zamenjavo citozina s timinom, kar je med drugim povzročilo nastanek številnih vezavnih mest za transkripcijska faktorja cMyc in p53. Vključitev TE-jev zraven že obstoječega vezavnega mesta za transkripcijske faktorje ter točkovne mutacije omogočijo nastanek novih mest za vezavo TF (alternativni promotorji), kar z redundančnostjo omogoča zaščito pred možnimi kasnejšimi mutacijami vezavnih mest. Redundanca dopušča tudi kooperativno delovanje z zunanjimi promotorji, tako se lahko razbremenijo določena vezavna mesta za transkripcijske faktorje. 

==Vpliv transpozicijskih elementov na kromatinsko 3D strukturo==
V interfaznem jedru so deli genoma organizirani v topološko asociirajoče domene (TAD). To so večje domene kromatina, ki so med seboj ločene z izolatorskimi proteini. Ti omejujejo prostor, v katerem lahko različni deli DNA prihajajo v medsebojne stike. Njihova naloga je tudi prostorsko omejevanje interakcij med transkripcijskimi faktorji in ojačevalci ter promotorji. TAD specificirajo funkcije cis regulatornih regij z omejevanjem ojačevalcev, tako da ti aktivirajo le promotorje znotraj iste TAD. Vloga transpozicijskih elementov (TE) pri 3D arhitekturi genoma se je v zadnjih letih začela intenzivno raziskovati. Številne družine TE so namreč obogatene na mejah TAD. Določeni TE naj bi imeli preko tega tudi vlogo pri zvijanju kromosomov, prav tako pa tudi pri kompaktnosti kromatina in posledično tudi pri regulaciji procesov transkripcije. Kot primer pomena transpozicijskih elementov bi izpostavil študijo, ki je odkrila veliko HERV-H na mejah TAD v človeških embrionalnih matičnih celicah (hESCs) in delecija 2 individualnih HERV-H je vodila do izgube kompaktnosti te meje. 

Protein CTCF (11-zinc finger protein) je pomemben pri regulaciji 3D strukture kromatina in procesov transkripcije. Zelo pomemben je pri strukturi mej TAD. Vsebuje motive cinkovega prsta in deluje kot transkripcijski faktor. Sodeluje pri mediaciji nastanka kromatinskih zank in se velikokrat veže na TE. Opaženo je bilo, da so TE razpršili veliko vezavnih mest za protein CTCF in smiselno bi bilo, da bi se tudi meje TAD razpršile, vendar je bilo ugotovljeno, da so te zelo ohranjene. Odkrili so različne mehanizme preprečevanja tvorbe ektopičnih meja TAD. Tako se npr. transpozoni B2SINE, ki imajo veliko vezavnih mest za protein CTCF, lahko povežejo s kompleksom ChAHP, ki torej prepozna isti motiv kot CTCF, a z višjo afiniteto. 

==Kodiranje transkripcijskih faktorjev s transpozicijskimi elementi==
Šele nedavno so prišli do dognanj, da proteini, za katere kodirajo transpozicijski elementi, lahko vplivajo na regulacijo genov. Najdeni so bili številni primeri, v katerih gen za TE kodira transpozazo in hkrati tudi gostiteljski transkripcijski faktor. Fuzija transpozazne DNA-domene z regulatorno domeno transkripcijskega faktorja privede do tvorbe proteinskega kompleksa, ki je sposoben prepoznave ustreznega zaporedja TE na DNA, ker transpozaza prepozna transpozicijski element. Tako se lahko optimizira regulacija ekspresije genov s pomočjo TE. 

==Utišanje transpozicijskih elementov in pomen le-tega pri regulaciji transkripcije==
Organizmi so razvili zmožnost zmanjšanja aktivnosti transpozicijskih elementov, prav tako pa so transpozicijski elementi zmožni obiti gostiteljevo obrambo. Eden od načinov utišanja delovanja TE je metilacija DNA. Demetilacija TE lahko vodi do nepravilne aktivacije sosednjih genov zaradi ojačevalnega potenciala TE. Zato so gostitelji morali razviti mehanizem, ki to kontrolira. Pomemben utiševalni mehanizem TE je metilacija CpG otočkov na DNA. Primer povezave med metilacijo DNA in aktivnostjo iz TE izhajajočih cis regulatornih regij je gen Agouti. Ta daje rjavo obarvanim mišim C57BL/6J rumeno obarvanje na način, ki je odvisen od ravni metilacije promotorja, ki nadzoruje transkripcijo retrotranspozonov IAP. Retrotranspozon IAP pa nadzira ekspresijo gena Agouti in s tem obarvanje miši. 

Drug mehanizem utišanja TE so histonske modifikacije. Primer te epigenetske modifikacije je trimetilacija lizina 9 na histonu H3 (H3K9me3). Pomembno vlogo pri tem ima kompleks HUSH (human silencing hub complex). ATPaza MORC2 in HUSH se povežeta in posledično pride do trimetilacije na histonu 3 na retrotranspozonu LINE1 in tako se retrotranspoznon utiša. LINE1 se nahaja v intronih aktivnih genov. Če so ti trimetilirani, potem se RNA polimeraza II ne more pomikati naprej (motena je elongacija transkripcije), zato se geni ne prepisujejo. 

==Transpozicijski elementi in njihova vloga pri regulatornih nekodirajočih molekulah RNA==
Zaradi napredka v določanju nukleotidnega zaporedja molekul RNA se v zadnjih letih odkriva vedno več nekodirajočih molekul RNA (ncRNA). Te vključujejo tudi regulatorne RNA, med katere spadajo kratke nekodirajoče RNA (sncRNA) in dolge nekodirajoče RNA (lncRNA). Transpozicijski elementi (TE) in regulatorne RNA so tesno povezani, saj velik del nukleotidnega zaporedja regulatornih RNA in njihovih genov ter regulatornih regij predstavljajo TE. Transpozicijski elementi določajo funkcionalne lastnosti različnih tipov ncRNA, kar je ključno za njihovo regulatorno funkcijo pri transkripciji in posttranskripcijskih procesih. 

Transpozicijski elementi dajejo strukturne značilnosti lncRNA, ki jim dajejo sposobnost interakcije z drugimi biološkimi molekulami (DNA, RNA, proteini...). lncRNA imajo lahko tako cis kot tudi trans-regulatorno aktivnost. Pojavlja se veliko hipotez, da TE dajejo funkcionalne domene lncRNA. Primer, ki potrjuje to hipotezo, je interakcija med XIST lncRNA in proteinskim kompleksom PRC2 (polycomb repressive complex 2). XIST lncRNA namreč vključuje transpozicijski element ERVB5 in ravno ta regija predstavlja vezavno mesto za PRC2. PRC2 ima vlogo pri zagotavljanju kompaktnosti kromatina, in sicer tako, da ena izmed njegovih podenot EZH2 (Enhancer of zeste homolog 2) katalizira trimetilacijo lizina 27 na histonu 3 (H3K27me1/2/3), s tem pa povzroči represijo transkripcije določenih genov. Fosforilacija EZH2 in T350 (obe sta podenoti PRC2) s CDK1/2 je ključna za interakcijo PRC2 z lncRNA, ki poteka preko G-kvadrupleskne regije lncRNA, le-ta pa je bogata s transpozoni ERVB5. XIST lncRNA pripelje proteinski kompleks PRC2 do promotorske regije tarčnega gena (npr. tumor supresorskega gena), kjer EZH2 s svojo metiltransferazno aktivnostjo deluje kot represor transkripcije. 
Zanimiv primer povezave med transpozicijskimi elementi in nekodirajočo RNA je regulacija odziva na toplotni šok pri miših. Ta primer kaže tudi na trans-regulatorno vlogo nekodirajoče RNA. Mišja ncRNA, ki izhaja iz retrotranspozona B2 SINE, se v normalnih pogojih veže na regulatorne regije genov, ki se odzivajo na stres, ter tako prepreči njihovo transkripcijo. Pri toplotnem šoku se aktivira protein EZH2, ki pospeši razgradnjo te ncRNA ter tako prepreči inhibicijo transkripcije genov, povezanih s stresom (EZH2 stimulira ribocimsko aktivnost same ncRNA). 

Transpozicijski elementi imajo pomembno vlogo pri procesu transkripcije genov za nekodirajoče RNA, saj so vključeni v številna območja njihovih genov in regulatornih regij. Mesta na genomu, na katerih se nahajajo nukleotidna zaporedja, ki izhajajo iz transpozicijskih elementov, so prisotna tako v promotorjih kot tudi na poliA regijah genov za nekodirajoče RNA. Veliko so jih našli tudi na regijah genov za lncRNA, ki so pomembna za spajanje eksonov oz. izrezovanje intronov (splice donor, splice acceptor). 

Veliko molekul miRNA (spadajo med sncRNA) z vključenimi transpozicijskimi elementi interagira s 3' koncem neprevajajoče regije tarčne mRNA (3' UTR). Preko tega procesa se utiša mRNA. Tako se npr. miR-151, ki vsebuje transpozicijske elemente LINE2, veže na molekulo mRNA, ki kodira za ATPAF1 (ATP synthase mitochondrial F1 complex assembly factor 1), in sicer tako, da se poveže s transpozoni LINE2 na 3' koncu neprevajajoče regije tarčne mRNA. 

Vedno bolj se odkriva tudi vloga transpozicijskih elementov pri tvorbi stabilnejših sekundarnih struktur v nekodirajočih RNA. Raziskava, ki je primerjala lncRNA z vključenimi transpozicijskimi elementi in lncRNA brez vključenih transpozicijskih elementov, je ugotovila, da lncRNA z vključenimi transpozicijskimi elementi tvorijo stabilnejše sekundarne strukture. Analizirali so tudi mesta na lncRNA, ki so vključena v bazno parjenje pri tvorbi sekundarnih struktur in ugotovili, da je okrog 82 % teh mest lociranih v Alu regijah lncRNA. Torej, Alu regije v regulatornih RNA sodelujejo pri intramolekularnem baznem parjenju, kar privede do tvorbe stabilnejših sekundarnih struktur, s tem pa tudi do večje stabilnosti nekodirajočih RNA. To jim omogoči, da lahko bolje opravljajo svoje funkcije regulacije transkripcije. 

==Viri in literatura==

[1]R. Fueyo, J. Judd, C. Feschotte, and J. Wysocka, ‘Roles of transposable elements in the regulation of mammalian transcription’, Nat Rev Mol Cell Biol, pp. 1–17, Feb. 2022, doi: 10.1038/s41580-022-00457-y. 
[2]A. Ali, K. Han, and P. Liang, ‘Role of Transposable Elements in Gene Regulation in the Human Genome’, Life (Basel), vol. 11, no. 2, p. 118, Feb. 2021, doi: 10.3390/life11020118. 
[3]P. J. Wittkopp and G. Kalay, ‘Cis-regulatory elements: molecular mechanisms and evolutionary processes underlying divergence’, Nat Rev Genet, vol. 13, no. 1, Art. no. 1, Jan. 2012, doi: 10.1038/nrg3095. 
[4]A. Hao, Y. Wang, D. B. Stovall, Y. Wang, and G. Sui, ‘Emerging Roles of LncRNAs in the EZH2-regulated Oncogenic Network’, Int. J. Biol. Sci., vol. 17, no. 13, pp. 3268–3280, 2021, doi: 10.7150/ijbs.63488. 
[5]N. Liu et al., ‘Selective silencing of euchromatic L1s revealed by genome-wide screens for L1 regulators’, Nature, vol. 553, no. 7687, Art. no. 7687, Jan. 2018, doi: 10.1038/nature25179. 

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

TE kot regulatorji transkripcije

2022-04-24T13:05:16Z

David Valte: /* Funkcije transpozicijskih elementov v cis-regulatornih regijah */

==Uvod==
Transpozicijski elementi (TE), ki sestavljajo velik del evkariontskega genoma, lahko, če se nahajajo v eksonskih predelih gostiteljevega genskega zapisa, bistveno zmanjšajo njegovo evolucijsko sposobnost preživetja, ker delujejo moteče (lahko povzročijo npr. vstavitev start in stop kodonov, premik bralnega okvirja, prehitro terminacijo transkripcije…). S tem zmanjšajo tudi verjetnost za lasten prenos v nove generacije. Ker TE po delovanju spominjajo na parazitski organizem, so se skozi evolucijo razvile strategije, ki preprečujejo preveliko škodo na gostiteljskem organizmu. Prilagajanje je potekalo vzajemno. Gostiteljski organizmi so npr. postali sposobni utišanja transpozicijskih elementov s pomočjo metilacije DNA na CpG otočkih, TE pa so se preferenčno vključevali v intronska zaporedja, saj tam ne delujejo tako moteče. Skozi čas so gostiteljski organizmi postali sposobni uporabe TE v svojo korist. 

Vključitve transpozicijskih elementov v nekodirajoče predele genskega zapisa in njihove mutacije so v veliko primerih povzročile, da so TE izgubili sposobnost transponiranja, pridobili pa so cis in trans-regulatorno aktivnost. Cis-regulatorne regije (CRE) so nekodirajoča zaporedja nukleotidov, ki regulirajo ekspresijo genov na isti verigi DNA. Trans regulacija pa pomeni to, da npr. transkripcijski faktorji prihajajo od drugod oz. so kodirani na eni molekuli DNA, regulirajo pa ekspresijo genov na drugi molekuli DNA. Regulacija transkripcije s TE lahko poteka na več načinov: 

1. V genski zapis lahko vnašajo nova vezavna mesta za transkripcijske faktorje (TF) preko promotorjev, ojačevalcev, utiševalnih in izolatorskih zaporedij. 
2. Lahko modulirajo 3D strukturo kromatina. 
3. Zmožni so kodiranja transkripcijskih faktorjev. 
4. S povezovanjem z represorskimi transkripcijskimi faktorji vplivajo na utišanje sosednjih genov. 
5. Imajo vlogo pri regulatornih nekodirajočih molekulah RNA, ki so pomembni regulatorji transkripcije. 

==Funkcije transpozicijskih elementov v cis-regulatornih regijah ==
Regulatorne sposobnosti cis-regulatornih regij lahko izhajajo iz transpozicijskih elementov. Cis-regulatorne regije tvorijo specifična vezavna mesta za proteine povezane z iniciacijo in regulacijo transkripcije. Primeri nekaterih vrst CRE: 

1. Promotorji so kratka zaporedja DNA, ki vključujejo začetno mesto transkripcije. Ob vezavi ustreznih transkripcijskih faktorjev na promotorsko regijo omogočijo transkripcijo gena. Transpozon AluSp v promotorju gena FCER1G inducira transkripcijo visokoafinitetnega receptorja za Fc regijo IgE. 
2. Ojačevalci so zaporedja, ki jih najdemo pred ali za genom, ki ga regulirajo. Delujejo kooperativno s promotorjem, in sicer tako, da povečajo stopnjo transkripcije, omogočajo pa regulacijo tudi bolj oddaljenih genov. Transpozon AluY v intronu gena CD8 (ta kodira za glikoprotein CD8, ki je pomemben pri celičnih interakcijah znotraj imunskega sistema) deluje kot ojačevalec. 
3. Utiševalna zaporedja vežejo represorje in tako preprečujejo transkripcijo. Transpozicijski elementi so z rekrutiranjem transkripcijskih faktorjev postali sposobni delovati kot utiševalna zaporedja, ki remodelirajo kromatin. Čeprav so heterokromatinski deli revni z geni, so bogati s TE-ji, kar bi lahko pomenilo, da imajo transpozicijski elementi pomembno vlogo pri širjenju heterokromatina. Tako se npr. korepresorski protein TRIM28 veže na vezavno mesto, ki se nahaja na transpozonu ERV in s tem utiša sosednje gene. 
4. Inzulatorji ščitijo gene pred regulatornimi vplivi sosednjih genov. Lahko blokirajo promotorje, ojačevalce in utiševalce. Preprečujejo neprimerne interakcije med sosednjimi kromatinskimi regijami. Transpozon AluSq deluje kot inzulator. Njegova transkripcija ščiti človeški gen HBE1 (ki kodira za istoimenski protein (hemoglobinska podenota epsilon)) pred regulacijo z drugimi promotorji. 

TE-ji uvajajo nova vezavna mesta za TF, ki so v njih lahko prisotna takoj po inserciji v genom ali pa nastanejo de novo s postinsercijskimi mutacijami. Pogosto se mutacije pojavljajo na metiliranih CpG otočkih. Deaminacija teh povzroči zamenjavo citozina z gvaninom, kar je med drugim povzročilo nastanek številnih vezavnih mest za transkripcijska faktorja cMyc in p53. Vključitev TE-jev zraven že obstoječega vezavnega mesta za transkripcijske faktorje ter točkovne mutacije omogočijo nastanek novih mest za vezavo TF (alternativni promotorji), kar z redundančnostjo omogoča zaščito pred možnimi kasnejšimi mutacijami vezavnih mest. Redundanca dopušča tudi kooperativno delovanje z zunanjimi promotorji, tako se lahko razbremenijo določena vezavna mesta za transkripcijske faktorje. 

==Vpliv transpozicijskih elementov na kromatinsko 3D strukturo==
V interfaznem jedru so deli genoma organizirani v topološko asociirajoče domene (TAD). To so večje domene kromatina, ki so med seboj ločene z izolatorskimi proteini. Ti omejujejo prostor, v katerem lahko različni deli DNA prihajajo v medsebojne stike. Njihova naloga je tudi prostorsko omejevanje interakcij med transkripcijskimi faktorji in ojačevalci ter promotorji. TAD specificirajo funkcije cis regulatornih regij z omejevanjem ojačevalcev, tako da ti aktivirajo le promotorje znotraj iste TAD. Vloga transpozicijskih elementov (TE) pri 3D arhitekturi genoma se je v zadnjih letih začela intenzivno raziskovati. Številne družine TE so namreč obogatene na mejah TAD. Določeni TE naj bi imeli preko tega tudi vlogo pri zvijanju kromosomov, prav tako pa tudi pri kompaktnosti kromatina in posledično tudi pri regulaciji procesov transkripcije. Kot primer pomena transpozicijskih elementov bi izpostavil študijo, ki je odkrila veliko HERV-H na mejah TAD v človeških embrionalnih matičnih celicah (hESCs) in delecija 2 individualnih HERV-H je vodila do izgube kompaktnosti te meje. 

Protein CTCF (11-zinc finger protein) je pomemben pri regulaciji 3D strukture kromatina in procesov transkripcije. Zelo pomemben je pri strukturi mej TAD. Vsebuje motive cinkovega prsta in deluje kot transkripcijski faktor. Sodeluje pri mediaciji nastanka kromatinskih zank in se velikokrat veže na TE. Opaženo je bilo, da so TE razpršili veliko vezavnih mest za protein CTCF in smiselno bi bilo, da bi se tudi meje TAD razpršile, vendar je bilo ugotovljeno, da so te zelo ohranjene. Odkrili so različne mehanizme preprečevanja tvorbe ektopičnih meja TAD. Tako se npr. transpozoni B2SINE, ki imajo veliko vezavnih mest za protein CTCF, lahko povežejo s kompleksom ChAHP, ki torej prepozna isti motiv kot CTCF, a z višjo afiniteto. 

==Kodiranje transkripcijskih faktorjev s transpozicijskimi elementi==
Šele nedavno so prišli do dognanj, da proteini, za katere kodirajo transpozicijski elementi, lahko vplivajo na regulacijo genov. Najdeni so bili številni primeri, v katerih gen za TE kodira transpozazo in hkrati tudi gostiteljski transkripcijski faktor. Fuzija transpozazne DNA-domene z regulatorno domeno transkripcijskega faktorja privede do tvorbe proteinskega kompleksa, ki je sposoben prepoznave ustreznega zaporedja TE na DNA, ker transpozaza prepozna transpozicijski element. Tako se lahko optimizira regulacija ekspresije genov s pomočjo TE. 

==Utišanje transpozicijskih elementov in pomen le-tega pri regulaciji transkripcije==
Organizmi so razvili zmožnost zmanjšanja aktivnosti transpozicijskih elementov, prav tako pa so transpozicijski elementi zmožni obiti gostiteljevo obrambo. Eden od načinov utišanja delovanja TE je metilacija DNA. Demetilacija TE lahko vodi do nepravilne aktivacije sosednjih genov zaradi ojačevalnega potenciala TE. Zato so gostitelji morali razviti mehanizem, ki to kontrolira. Pomemben utiševalni mehanizem TE je metilacija CpG otočkov na DNA. Primer povezave med metilacijo DNA in aktivnostjo iz TE izhajajočih cis regulatornih regij je gen Agouti. Ta daje rjavo obarvanim mišim C57BL/6J rumeno obarvanje na način, ki je odvisen od ravni metilacije promotorja, ki nadzoruje transkripcijo retrotranspozonov IAP. Retrotranspozon IAP pa nadzira ekspresijo gena Agouti in s tem obarvanje miši. 

Drug mehanizem utišanja TE so histonske modifikacije. Primer te epigenetske modifikacije je trimetilacija lizina 9 na histonu H3 (H3K9me3). Pomembno vlogo pri tem ima kompleks HUSH (human silencing hub complex). ATPaza MORC2 in HUSH se povežeta in posledično pride do trimetilacije na histonu 3 na retrotranspozonu LINE1 in tako se retrotranspoznon utiša. LINE1 se nahaja v intronih aktivnih genov. Če so ti trimetilirani, potem se RNA polimeraza II ne more pomikati naprej (motena je elongacija transkripcije), zato se geni ne prepisujejo. 

==Transpozicijski elementi in njihova vloga pri regulatornih nekodirajočih molekulah RNA==
Zaradi napredka v določanju nukleotidnega zaporedja molekul RNA se v zadnjih letih odkriva vedno več nekodirajočih molekul RNA (ncRNA). Te vključujejo tudi regulatorne RNA, med katere spadajo kratke nekodirajoče RNA (sncRNA) in dolge nekodirajoče RNA (lncRNA). Transpozicijski elementi (TE) in regulatorne RNA so tesno povezani, saj velik del nukleotidnega zaporedja regulatornih RNA in njihovih genov ter regulatornih regij predstavljajo TE. Transpozicijski elementi določajo funkcionalne lastnosti različnih tipov ncRNA, kar je ključno za njihovo regulatorno funkcijo pri transkripciji in posttranskripcijskih procesih. 

Transpozicijski elementi dajejo strukturne značilnosti lncRNA, ki jim dajejo sposobnost interakcije z drugimi biološkimi molekulami (DNA, RNA, proteini...). lncRNA imajo lahko tako cis kot tudi trans-regulatorno aktivnost. Pojavlja se veliko hipotez, da TE dajejo funkcionalne domene lncRNA. Primer, ki potrjuje to hipotezo, je interakcija med XIST lncRNA in proteinskim kompleksom PRC2 (polycomb repressive complex 2). XIST lncRNA namreč vključuje transpozicijski element ERVB5 in ravno ta regija predstavlja vezavno mesto za PRC2. PRC2 ima vlogo pri zagotavljanju kompaktnosti kromatina, in sicer tako, da ena izmed njegovih podenot EZH2 (Enhancer of zeste homolog 2) katalizira trimetilacijo lizina 27 na histonu 3 (H3K27me1/2/3), s tem pa povzroči represijo transkripcije določenih genov. Fosforilacija EZH2 in T350 (obe sta podenoti PRC2) s CDK1/2 je ključna za interakcijo PRC2 z lncRNA, ki poteka preko G-kvadrupleskne regije lncRNA, le-ta pa je bogata s transpozoni ERVB5. XIST lncRNA pripelje proteinski kompleks PRC2 do promotorske regije tarčnega gena (npr. tumor supresorskega gena), kjer EZH2 s svojo metiltransferazno aktivnostjo deluje kot represor transkripcije. 
Zanimiv primer povezave med transpozicijskimi elementi in nekodirajočo RNA je regulacija odziva na toplotni šok pri miših. Ta primer kaže tudi na trans-regulatorno vlogo nekodirajoče RNA. Mišja ncRNA, ki izhaja iz retrotranspozona B2 SINE, se v normalnih pogojih veže na regulatorne regije genov, ki se odzivajo na stres, ter tako prepreči njihovo transkripcijo. Pri toplotnem šoku se aktivira protein EZH2, ki pospeši razgradnjo te ncRNA ter tako prepreči inhibicijo transkripcije genov, povezanih s stresom (EZH2 stimulira ribocimsko aktivnost same ncRNA). 

Transpozicijski elementi imajo pomembno vlogo pri procesu transkripcije genov za nekodirajoče RNA, saj so vključeni v številna območja njihovih genov in regulatornih regij. Mesta na genomu, na katerih se nahajajo nukleotidna zaporedja, ki izhajajo iz transpozicijskih elementov, so prisotna tako v promotorjih kot tudi na poliA regijah genov za nekodirajoče RNA. Veliko so jih našli tudi na regijah genov za lncRNA, ki so pomembna za spajanje eksonov oz. izrezovanje intronov (splice donor, splice acceptor). 

Veliko molekul miRNA (spadajo med sncRNA) z vključenimi transpozicijskimi elementi interagira s 3' koncem neprevajajoče regije tarčne mRNA (3' UTR). Preko tega procesa se utiša mRNA. Tako se npr. miR-151, ki vsebuje transpozicijske elemente LINE2, veže na molekulo mRNA, ki kodira za ATPAF1 (ATP synthase mitochondrial F1 complex assembly factor 1), in sicer tako, da se poveže s transpozoni LINE2 na 3' koncu neprevajajoče regije tarčne mRNA. 

Vedno bolj se odkriva tudi vloga transpozicijskih elementov pri tvorbi stabilnejših sekundarnih struktur v nekodirajočih RNA. Raziskava, ki je primerjala lncRNA z vključenimi transpozicijskimi elementi in lncRNA brez vključenih transpozicijskih elementov, je ugotovila, da lncRNA z vključenimi transpozicijskimi elementi tvorijo stabilnejše sekundarne strukture. Analizirali so tudi mesta na lncRNA, ki so vključena v bazno parjenje pri tvorbi sekundarnih struktur in ugotovili, da je okrog 82 % teh mest lociranih v Alu regijah lncRNA. Torej, Alu regije v regulatornih RNA sodelujejo pri intramolekularnem baznem parjenju, kar privede do tvorbe stabilnejših sekundarnih struktur, s tem pa tudi do večje stabilnosti nekodirajočih RNA. To jim omogoči, da lahko bolje opravljajo svoje funkcije regulacije transkripcije. 

==Viri in literatura==

[1]R. Fueyo, J. Judd, C. Feschotte, and J. Wysocka, ‘Roles of transposable elements in the regulation of mammalian transcription’, Nat Rev Mol Cell Biol, pp. 1–17, Feb. 2022, doi: 10.1038/s41580-022-00457-y. 
[2]A. Ali, K. Han, and P. Liang, ‘Role of Transposable Elements in Gene Regulation in the Human Genome’, Life (Basel), vol. 11, no. 2, p. 118, Feb. 2021, doi: 10.3390/life11020118. 
[3]P. J. Wittkopp and G. Kalay, ‘Cis-regulatory elements: molecular mechanisms and evolutionary processes underlying divergence’, Nat Rev Genet, vol. 13, no. 1, Art. no. 1, Jan. 2012, doi: 10.1038/nrg3095. 
[4]A. Hao, Y. Wang, D. B. Stovall, Y. Wang, and G. Sui, ‘Emerging Roles of LncRNAs in the EZH2-regulated Oncogenic Network’, Int. J. Biol. Sci., vol. 17, no. 13, pp. 3268–3280, 2021, doi: 10.7150/ijbs.63488. 
[5]N. Liu et al., ‘Selective silencing of euchromatic L1s revealed by genome-wide screens for L1 regulators’, Nature, vol. 553, no. 7687, Art. no. 7687, Jan. 2018, doi: 10.1038/nature25179. 

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

TE kot regulatorji transkripcije

2022-04-24T13:02:59Z

David Valte: /* Funkcije transpozicijskih elementov v cis-regulatornih regijah */

==Uvod==
Transpozicijski elementi (TE), ki sestavljajo velik del evkariontskega genoma, lahko, če se nahajajo v eksonskih predelih gostiteljevega genskega zapisa, bistveno zmanjšajo njegovo evolucijsko sposobnost preživetja, ker delujejo moteče (lahko povzročijo npr. vstavitev start in stop kodonov, premik bralnega okvirja, prehitro terminacijo transkripcije…). S tem zmanjšajo tudi verjetnost za lasten prenos v nove generacije. Ker TE po delovanju spominjajo na parazitski organizem, so se skozi evolucijo razvile strategije, ki preprečujejo preveliko škodo na gostiteljskem organizmu. Prilagajanje je potekalo vzajemno. Gostiteljski organizmi so npr. postali sposobni utišanja transpozicijskih elementov s pomočjo metilacije DNA na CpG otočkih, TE pa so se preferenčno vključevali v intronska zaporedja, saj tam ne delujejo tako moteče. Skozi čas so gostiteljski organizmi postali sposobni uporabe TE v svojo korist. 

Vključitve transpozicijskih elementov v nekodirajoče predele genskega zapisa in njihove mutacije so v veliko primerih povzročile, da so TE izgubili sposobnost transponiranja, pridobili pa so cis in trans-regulatorno aktivnost. Cis-regulatorne regije (CRE) so nekodirajoča zaporedja nukleotidov, ki regulirajo ekspresijo genov na isti verigi DNA. Trans regulacija pa pomeni to, da npr. transkripcijski faktorji prihajajo od drugod oz. so kodirani na eni molekuli DNA, regulirajo pa ekspresijo genov na drugi molekuli DNA. Regulacija transkripcije s TE lahko poteka na več načinov: 

1. V genski zapis lahko vnašajo nova vezavna mesta za transkripcijske faktorje (TF) preko promotorjev, ojačevalcev, utiševalnih in izolatorskih zaporedij. 
2. Lahko modulirajo 3D strukturo kromatina. 
3. Zmožni so kodiranja transkripcijskih faktorjev. 
4. S povezovanjem z represorskimi transkripcijskimi faktorji vplivajo na utišanje sosednjih genov. 
5. Imajo vlogo pri regulatornih nekodirajočih molekulah RNA, ki so pomembni regulatorji transkripcije. 

==Funkcije transpozicijskih elementov v cis-regulatornih regijah ==
Regulatorne sposobnosti cis-regulatornih regij lahko izhajajo iz transpozicijskih elementov. Cis-regulatorne regije tvorijo specifična vezavna mesta za proteine povezane z iniciacijo in regulacijo transkripcije. Primeri nekaterih vrst CRE: 

1. Promotorji so kratka zaporedja DNA, ki vključujejo začetno mesto transkripcije. Ob vezavi ustreznih transkripcijskih faktorjev na promotorsko regijo omogočijo transkripcijo gena. Transpozon AluSp v promotorju gena FCER1G inducira transkripcijo visokoafinitetnega receptorja za Fc regijo IgE. 
2. Ojačevalci so zaporedja, ki jih najdemo pred ali za genom, ki ga regulirajo. Delujejo kooperativno s promotorjem, in sicer tako, da povečajo stopnjo transkripcije, omogočajo pa regulacijo tudi bolj oddaljenih genov. Transpozon AluY v intronu gena CD8 (ta kodira za glikoprotein CD8, ki je pomemben pri celičnih interakcijah znotraj imunskega sistema) deluje kot ojačevalec. 
3. Utiševalna zaporedja vežejo represorje in tako preprečujejo transkripcijo. Transpozicijski elementi so z rekrutiranjem transkripcijskih faktorjev postali sposobni delovati kot utiševalna zaporedja, ki remodelirajo kromatin. Čeprav so heterokromatinski deli revni z geni, so bogati s TE-ji, kar bi lahko pomenilo, da imajo transpozicijski elementi pomembno vlogo pri širjenju heterokromatina. Tako se npr. korepresorski protein TRIM28 veže na vezavno mesto, ki se nahaja na transpozonu ERV in s tem utiša sosednje gene. 
4. Inzulatorji ščitijo gene pred regulatornimi vplivi sosednjih genov. Lahko blokirajo promotorje, ojačevalce in utiševalce. Preprečujejo neprimerne interakcije med sosednjimi kromatinskimi regijami. Transpozon AluSq deluje kot inzulator. Njegova transkripcija ščiti človeški gen HBE1 (ki kodira za istoimenski protein (hemoglobinska podenota epsilon)) pred regulacijo z drugimi promotorji. 

TE-ji uvajajo nova vezavna mesta za TF, ki so v njih lahko prisotna takoj po inserciji v genom ali pa nastanejo de novo s postinsercijskimi mutacijami. Pogosto se mutacije pojavljajo na metiliranih CpG otočkih. Deaminacija teh povzroči zamenjavo citozina z gvaninom, kar je med drugim povzročilo nastanek številnih vezavnih mest za transkripcijska faktorja cMyc in p53. Vključitev TE-jev zraven že obstoječega vezavnega mesta za transkripcijske faktorje ter točkovne mutacije omogočijo nastanek novih mest za vezavo TF (alternativni promotorji), kar z redundančnostjo omogoča zaščito pred možnimi kasnejšimi mutacijami. Redundanca dopušča tudi kooperativno delovanje z zunanjimi promotorji, saj se lahko tako razbremenijo določena vezavna mesta za transkripcijske faktorje. 

==Vpliv transpozicijskih elementov na kromatinsko 3D strukturo==
V interfaznem jedru so deli genoma organizirani v topološko asociirajoče domene (TAD). To so večje domene kromatina, ki so med seboj ločene z izolatorskimi proteini. Ti omejujejo prostor, v katerem lahko različni deli DNA prihajajo v medsebojne stike. Njihova naloga je tudi prostorsko omejevanje interakcij med transkripcijskimi faktorji in ojačevalci ter promotorji. TAD specificirajo funkcije cis regulatornih regij z omejevanjem ojačevalcev, tako da ti aktivirajo le promotorje znotraj iste TAD. Vloga transpozicijskih elementov (TE) pri 3D arhitekturi genoma se je v zadnjih letih začela intenzivno raziskovati. Številne družine TE so namreč obogatene na mejah TAD. Določeni TE naj bi imeli preko tega tudi vlogo pri zvijanju kromosomov, prav tako pa tudi pri kompaktnosti kromatina in posledično tudi pri regulaciji procesov transkripcije. Kot primer pomena transpozicijskih elementov bi izpostavil študijo, ki je odkrila veliko HERV-H na mejah TAD v človeških embrionalnih matičnih celicah (hESCs) in delecija 2 individualnih HERV-H je vodila do izgube kompaktnosti te meje. 

Protein CTCF (11-zinc finger protein) je pomemben pri regulaciji 3D strukture kromatina in procesov transkripcije. Zelo pomemben je pri strukturi mej TAD. Vsebuje motive cinkovega prsta in deluje kot transkripcijski faktor. Sodeluje pri mediaciji nastanka kromatinskih zank in se velikokrat veže na TE. Opaženo je bilo, da so TE razpršili veliko vezavnih mest za protein CTCF in smiselno bi bilo, da bi se tudi meje TAD razpršile, vendar je bilo ugotovljeno, da so te zelo ohranjene. Odkrili so različne mehanizme preprečevanja tvorbe ektopičnih meja TAD. Tako se npr. transpozoni B2SINE, ki imajo veliko vezavnih mest za protein CTCF, lahko povežejo s kompleksom ChAHP, ki torej prepozna isti motiv kot CTCF, a z višjo afiniteto. 

==Kodiranje transkripcijskih faktorjev s transpozicijskimi elementi==
Šele nedavno so prišli do dognanj, da proteini, za katere kodirajo transpozicijski elementi, lahko vplivajo na regulacijo genov. Najdeni so bili številni primeri, v katerih gen za TE kodira transpozazo in hkrati tudi gostiteljski transkripcijski faktor. Fuzija transpozazne DNA-domene z regulatorno domeno transkripcijskega faktorja privede do tvorbe proteinskega kompleksa, ki je sposoben prepoznave ustreznega zaporedja TE na DNA, ker transpozaza prepozna transpozicijski element. Tako se lahko optimizira regulacija ekspresije genov s pomočjo TE. 

==Utišanje transpozicijskih elementov in pomen le-tega pri regulaciji transkripcije==
Organizmi so razvili zmožnost zmanjšanja aktivnosti transpozicijskih elementov, prav tako pa so transpozicijski elementi zmožni obiti gostiteljevo obrambo. Eden od načinov utišanja delovanja TE je metilacija DNA. Demetilacija TE lahko vodi do nepravilne aktivacije sosednjih genov zaradi ojačevalnega potenciala TE. Zato so gostitelji morali razviti mehanizem, ki to kontrolira. Pomemben utiševalni mehanizem TE je metilacija CpG otočkov na DNA. Primer povezave med metilacijo DNA in aktivnostjo iz TE izhajajočih cis regulatornih regij je gen Agouti. Ta daje rjavo obarvanim mišim C57BL/6J rumeno obarvanje na način, ki je odvisen od ravni metilacije promotorja, ki nadzoruje transkripcijo retrotranspozonov IAP. Retrotranspozon IAP pa nadzira ekspresijo gena Agouti in s tem obarvanje miši. 

Drug mehanizem utišanja TE so histonske modifikacije. Primer te epigenetske modifikacije je trimetilacija lizina 9 na histonu H3 (H3K9me3). Pomembno vlogo pri tem ima kompleks HUSH (human silencing hub complex). ATPaza MORC2 in HUSH se povežeta in posledično pride do trimetilacije na histonu 3 na retrotranspozonu LINE1 in tako se retrotranspoznon utiša. LINE1 se nahaja v intronih aktivnih genov. Če so ti trimetilirani, potem se RNA polimeraza II ne more pomikati naprej (motena je elongacija transkripcije), zato se geni ne prepisujejo. 

==Transpozicijski elementi in njihova vloga pri regulatornih nekodirajočih molekulah RNA==
Zaradi napredka v določanju nukleotidnega zaporedja molekul RNA se v zadnjih letih odkriva vedno več nekodirajočih molekul RNA (ncRNA). Te vključujejo tudi regulatorne RNA, med katere spadajo kratke nekodirajoče RNA (sncRNA) in dolge nekodirajoče RNA (lncRNA). Transpozicijski elementi (TE) in regulatorne RNA so tesno povezani, saj velik del nukleotidnega zaporedja regulatornih RNA in njihovih genov ter regulatornih regij predstavljajo TE. Transpozicijski elementi določajo funkcionalne lastnosti različnih tipov ncRNA, kar je ključno za njihovo regulatorno funkcijo pri transkripciji in posttranskripcijskih procesih. 

Transpozicijski elementi dajejo strukturne značilnosti lncRNA, ki jim dajejo sposobnost interakcije z drugimi biološkimi molekulami (DNA, RNA, proteini...). lncRNA imajo lahko tako cis kot tudi trans-regulatorno aktivnost. Pojavlja se veliko hipotez, da TE dajejo funkcionalne domene lncRNA. Primer, ki potrjuje to hipotezo, je interakcija med XIST lncRNA in proteinskim kompleksom PRC2 (polycomb repressive complex 2). XIST lncRNA namreč vključuje transpozicijski element ERVB5 in ravno ta regija predstavlja vezavno mesto za PRC2. PRC2 ima vlogo pri zagotavljanju kompaktnosti kromatina, in sicer tako, da ena izmed njegovih podenot EZH2 (Enhancer of zeste homolog 2) katalizira trimetilacijo lizina 27 na histonu 3 (H3K27me1/2/3), s tem pa povzroči represijo transkripcije določenih genov. Fosforilacija EZH2 in T350 (obe sta podenoti PRC2) s CDK1/2 je ključna za interakcijo PRC2 z lncRNA, ki poteka preko G-kvadrupleskne regije lncRNA, le-ta pa je bogata s transpozoni ERVB5. XIST lncRNA pripelje proteinski kompleks PRC2 do promotorske regije tarčnega gena (npr. tumor supresorskega gena), kjer EZH2 s svojo metiltransferazno aktivnostjo deluje kot represor transkripcije. 
Zanimiv primer povezave med transpozicijskimi elementi in nekodirajočo RNA je regulacija odziva na toplotni šok pri miših. Ta primer kaže tudi na trans-regulatorno vlogo nekodirajoče RNA. Mišja ncRNA, ki izhaja iz retrotranspozona B2 SINE, se v normalnih pogojih veže na regulatorne regije genov, ki se odzivajo na stres, ter tako prepreči njihovo transkripcijo. Pri toplotnem šoku se aktivira protein EZH2, ki pospeši razgradnjo te ncRNA ter tako prepreči inhibicijo transkripcije genov, povezanih s stresom (EZH2 stimulira ribocimsko aktivnost same ncRNA). 

Transpozicijski elementi imajo pomembno vlogo pri procesu transkripcije genov za nekodirajoče RNA, saj so vključeni v številna območja njihovih genov in regulatornih regij. Mesta na genomu, na katerih se nahajajo nukleotidna zaporedja, ki izhajajo iz transpozicijskih elementov, so prisotna tako v promotorjih kot tudi na poliA regijah genov za nekodirajoče RNA. Veliko so jih našli tudi na regijah genov za lncRNA, ki so pomembna za spajanje eksonov oz. izrezovanje intronov (splice donor, splice acceptor). 

Veliko molekul miRNA (spadajo med sncRNA) z vključenimi transpozicijskimi elementi interagira s 3' koncem neprevajajoče regije tarčne mRNA (3' UTR). Preko tega procesa se utiša mRNA. Tako se npr. miR-151, ki vsebuje transpozicijske elemente LINE2, veže na molekulo mRNA, ki kodira za ATPAF1 (ATP synthase mitochondrial F1 complex assembly factor 1), in sicer tako, da se poveže s transpozoni LINE2 na 3' koncu neprevajajoče regije tarčne mRNA. 

Vedno bolj se odkriva tudi vloga transpozicijskih elementov pri tvorbi stabilnejših sekundarnih struktur v nekodirajočih RNA. Raziskava, ki je primerjala lncRNA z vključenimi transpozicijskimi elementi in lncRNA brez vključenih transpozicijskih elementov, je ugotovila, da lncRNA z vključenimi transpozicijskimi elementi tvorijo stabilnejše sekundarne strukture. Analizirali so tudi mesta na lncRNA, ki so vključena v bazno parjenje pri tvorbi sekundarnih struktur in ugotovili, da je okrog 82 % teh mest lociranih v Alu regijah lncRNA. Torej, Alu regije v regulatornih RNA sodelujejo pri intramolekularnem baznem parjenju, kar privede do tvorbe stabilnejših sekundarnih struktur, s tem pa tudi do večje stabilnosti nekodirajočih RNA. To jim omogoči, da lahko bolje opravljajo svoje funkcije regulacije transkripcije. 

==Viri in literatura==

[1]R. Fueyo, J. Judd, C. Feschotte, and J. Wysocka, ‘Roles of transposable elements in the regulation of mammalian transcription’, Nat Rev Mol Cell Biol, pp. 1–17, Feb. 2022, doi: 10.1038/s41580-022-00457-y. 
[2]A. Ali, K. Han, and P. Liang, ‘Role of Transposable Elements in Gene Regulation in the Human Genome’, Life (Basel), vol. 11, no. 2, p. 118, Feb. 2021, doi: 10.3390/life11020118. 
[3]P. J. Wittkopp and G. Kalay, ‘Cis-regulatory elements: molecular mechanisms and evolutionary processes underlying divergence’, Nat Rev Genet, vol. 13, no. 1, Art. no. 1, Jan. 2012, doi: 10.1038/nrg3095. 
[4]A. Hao, Y. Wang, D. B. Stovall, Y. Wang, and G. Sui, ‘Emerging Roles of LncRNAs in the EZH2-regulated Oncogenic Network’, Int. J. Biol. Sci., vol. 17, no. 13, pp. 3268–3280, 2021, doi: 10.7150/ijbs.63488. 
[5]N. Liu et al., ‘Selective silencing of euchromatic L1s revealed by genome-wide screens for L1 regulators’, Nature, vol. 553, no. 7687, Art. no. 7687, Jan. 2018, doi: 10.1038/nature25179. 

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

TE kot regulatorji transkripcije

2022-04-24T13:00:42Z

David Valte: /* Funkcije transpozicijskih elementov v cis-regulatornih regijah */

==Uvod==
Transpozicijski elementi (TE), ki sestavljajo velik del evkariontskega genoma, lahko, če se nahajajo v eksonskih predelih gostiteljevega genskega zapisa, bistveno zmanjšajo njegovo evolucijsko sposobnost preživetja, ker delujejo moteče (lahko povzročijo npr. vstavitev start in stop kodonov, premik bralnega okvirja, prehitro terminacijo transkripcije…). S tem zmanjšajo tudi verjetnost za lasten prenos v nove generacije. Ker TE po delovanju spominjajo na parazitski organizem, so se skozi evolucijo razvile strategije, ki preprečujejo preveliko škodo na gostiteljskem organizmu. Prilagajanje je potekalo vzajemno. Gostiteljski organizmi so npr. postali sposobni utišanja transpozicijskih elementov s pomočjo metilacije DNA na CpG otočkih, TE pa so se preferenčno vključevali v intronska zaporedja, saj tam ne delujejo tako moteče. Skozi čas so gostiteljski organizmi postali sposobni uporabe TE v svojo korist. 

Vključitve transpozicijskih elementov v nekodirajoče predele genskega zapisa in njihove mutacije so v veliko primerih povzročile, da so TE izgubili sposobnost transponiranja, pridobili pa so cis in trans-regulatorno aktivnost. Cis-regulatorne regije (CRE) so nekodirajoča zaporedja nukleotidov, ki regulirajo ekspresijo genov na isti verigi DNA. Trans regulacija pa pomeni to, da npr. transkripcijski faktorji prihajajo od drugod oz. so kodirani na eni molekuli DNA, regulirajo pa ekspresijo genov na drugi molekuli DNA. Regulacija transkripcije s TE lahko poteka na več načinov: 

1. V genski zapis lahko vnašajo nova vezavna mesta za transkripcijske faktorje (TF) preko promotorjev, ojačevalcev, utiševalnih in izolatorskih zaporedij. 
2. Lahko modulirajo 3D strukturo kromatina. 
3. Zmožni so kodiranja transkripcijskih faktorjev. 
4. S povezovanjem z represorskimi transkripcijskimi faktorji vplivajo na utišanje sosednjih genov. 
5. Imajo vlogo pri regulatornih nekodirajočih molekulah RNA, ki so pomembni regulatorji transkripcije. 

==Funkcije transpozicijskih elementov v cis-regulatornih regijah ==
Regulatorne sposobnosti cis-regulatornih regij lahko izhajajo iz transpozicijskih elementov. Cis-regulatorne regije tvorijo specifična vezavna mesta za proteine povezane z iniciacijo in regulacijo transkripcije. Primeri nekaterih vrst CRE: 

1. Promotorji so kratka zaporedja DNA, ki vključujejo začetno mesto transkripcije. Ob vezavi ustreznih transkripcijskih faktorjev na promotorsko regijo omogočijo transkripcijo gena. Transpozon AluSp v promotorju gena FCER1G inducira transkripcijo visokoafinitetnega receptorja za Fc regijo IgE. 
2. Ojačevalci so zaporedja, ki jih najdemo pred ali za genom, ki ga regulirajo. Delujejo kooperativno s promotorjem, in sicer tako, da povečajo stopnjo transkripcije, omogočajo pa regulacijo tudi bolj oddaljenih genov. Transpozon AluY v intronu gena CD8 (ta kodira za glikoprotein CD8, ki je pomemben pri celičnih interakcijah znotraj imunskega sistema) deluje kot ojačevalec. 
3. Utiševalna zaporedja vežejo represorje in tako preprečujejo transkripcijo. Transpozicijski elementi so z rekrutiranjem transkripcijskih faktorjev postali sposobni delovati kot utiševalna zaporedja, ki remodelirajo kromatin. Čeprav so heterokromatinski deli revni z geni, so bogati s TE-ji, kar bi lahko pomenilo, da imajo transpozicijski elementi pomembno vlogo pri širjenju heterokromatina. Tako se npr. korepresorski protein TRIM28 veže na vezavno mesto, ki se nahaja na transpozonu ERV in s tem utiša sosednje gene. 
4. Inzulatorji ščitijo gene pred regulatornimi vplivi sosednjih genov. Lahko blokirajo promotorje, ojačevalce in utiševalce. Preprečujejo neprimerne interakcije med sosednjimi kromatinskimi regijami. Transpozon AluSq deluje kot inzulator. Njegova transkripcija ščiti človeški gen HBE1 (ki kodira za istoimenski protein (hemoglobinska podenota epsilon)) pred regulacijo z drugimi promotorji. 

TE-ji uvajajo nova vezavna mesta za TF, ki so v njih lahko prisotna takoj po inserciji v genom ali pa nastanejo de novo s postinsercijskimi mutacijami. Pogosto se mutacije pojavljajo na metiliranih CpG otočkih. Deaminacija teh povzroči zamenjavo citozina z gvaninom, kar je med drugim povzročilo nastanek številnih vezavnih mest za transkripcijska faktorja cMyc in p53. Vključitev TE-jev zraven že obstoječega vezavnega mesta za transkripcijske faktorje ter točkovne mutacije omogočijo nastanek novih mest za vezavo TF (alternativni promotorji), kar povzroča zaščito pred možnimi kasnejšimi mutacijami z redundančnostjo. Redundanca dopušča tudi kooperativno delovanje z zunanjimi promotorji, saj se lahko tako razbremenijo določena vezavna mesta za transkripcijske faktorje. 

==Vpliv transpozicijskih elementov na kromatinsko 3D strukturo==
V interfaznem jedru so deli genoma organizirani v topološko asociirajoče domene (TAD). To so večje domene kromatina, ki so med seboj ločene z izolatorskimi proteini. Ti omejujejo prostor, v katerem lahko različni deli DNA prihajajo v medsebojne stike. Njihova naloga je tudi prostorsko omejevanje interakcij med transkripcijskimi faktorji in ojačevalci ter promotorji. TAD specificirajo funkcije cis regulatornih regij z omejevanjem ojačevalcev, tako da ti aktivirajo le promotorje znotraj iste TAD. Vloga transpozicijskih elementov (TE) pri 3D arhitekturi genoma se je v zadnjih letih začela intenzivno raziskovati. Številne družine TE so namreč obogatene na mejah TAD. Določeni TE naj bi imeli preko tega tudi vlogo pri zvijanju kromosomov, prav tako pa tudi pri kompaktnosti kromatina in posledično tudi pri regulaciji procesov transkripcije. Kot primer pomena transpozicijskih elementov bi izpostavil študijo, ki je odkrila veliko HERV-H na mejah TAD v človeških embrionalnih matičnih celicah (hESCs) in delecija 2 individualnih HERV-H je vodila do izgube kompaktnosti te meje. 

Protein CTCF (11-zinc finger protein) je pomemben pri regulaciji 3D strukture kromatina in procesov transkripcije. Zelo pomemben je pri strukturi mej TAD. Vsebuje motive cinkovega prsta in deluje kot transkripcijski faktor. Sodeluje pri mediaciji nastanka kromatinskih zank in se velikokrat veže na TE. Opaženo je bilo, da so TE razpršili veliko vezavnih mest za protein CTCF in smiselno bi bilo, da bi se tudi meje TAD razpršile, vendar je bilo ugotovljeno, da so te zelo ohranjene. Odkrili so različne mehanizme preprečevanja tvorbe ektopičnih meja TAD. Tako se npr. transpozoni B2SINE, ki imajo veliko vezavnih mest za protein CTCF, lahko povežejo s kompleksom ChAHP, ki torej prepozna isti motiv kot CTCF, a z višjo afiniteto. 

==Kodiranje transkripcijskih faktorjev s transpozicijskimi elementi==
Šele nedavno so prišli do dognanj, da proteini, za katere kodirajo transpozicijski elementi, lahko vplivajo na regulacijo genov. Najdeni so bili številni primeri, v katerih gen za TE kodira transpozazo in hkrati tudi gostiteljski transkripcijski faktor. Fuzija transpozazne DNA-domene z regulatorno domeno transkripcijskega faktorja privede do tvorbe proteinskega kompleksa, ki je sposoben prepoznave ustreznega zaporedja TE na DNA, ker transpozaza prepozna transpozicijski element. Tako se lahko optimizira regulacija ekspresije genov s pomočjo TE. 

==Utišanje transpozicijskih elementov in pomen le-tega pri regulaciji transkripcije==
Organizmi so razvili zmožnost zmanjšanja aktivnosti transpozicijskih elementov, prav tako pa so transpozicijski elementi zmožni obiti gostiteljevo obrambo. Eden od načinov utišanja delovanja TE je metilacija DNA. Demetilacija TE lahko vodi do nepravilne aktivacije sosednjih genov zaradi ojačevalnega potenciala TE. Zato so gostitelji morali razviti mehanizem, ki to kontrolira. Pomemben utiševalni mehanizem TE je metilacija CpG otočkov na DNA. Primer povezave med metilacijo DNA in aktivnostjo iz TE izhajajočih cis regulatornih regij je gen Agouti. Ta daje rjavo obarvanim mišim C57BL/6J rumeno obarvanje na način, ki je odvisen od ravni metilacije promotorja, ki nadzoruje transkripcijo retrotranspozonov IAP. Retrotranspozon IAP pa nadzira ekspresijo gena Agouti in s tem obarvanje miši. 

Drug mehanizem utišanja TE so histonske modifikacije. Primer te epigenetske modifikacije je trimetilacija lizina 9 na histonu H3 (H3K9me3). Pomembno vlogo pri tem ima kompleks HUSH (human silencing hub complex). ATPaza MORC2 in HUSH se povežeta in posledično pride do trimetilacije na histonu 3 na retrotranspozonu LINE1 in tako se retrotranspoznon utiša. LINE1 se nahaja v intronih aktivnih genov. Če so ti trimetilirani, potem se RNA polimeraza II ne more pomikati naprej (motena je elongacija transkripcije), zato se geni ne prepisujejo. 

==Transpozicijski elementi in njihova vloga pri regulatornih nekodirajočih molekulah RNA==
Zaradi napredka v določanju nukleotidnega zaporedja molekul RNA se v zadnjih letih odkriva vedno več nekodirajočih molekul RNA (ncRNA). Te vključujejo tudi regulatorne RNA, med katere spadajo kratke nekodirajoče RNA (sncRNA) in dolge nekodirajoče RNA (lncRNA). Transpozicijski elementi (TE) in regulatorne RNA so tesno povezani, saj velik del nukleotidnega zaporedja regulatornih RNA in njihovih genov ter regulatornih regij predstavljajo TE. Transpozicijski elementi določajo funkcionalne lastnosti različnih tipov ncRNA, kar je ključno za njihovo regulatorno funkcijo pri transkripciji in posttranskripcijskih procesih. 

Transpozicijski elementi dajejo strukturne značilnosti lncRNA, ki jim dajejo sposobnost interakcije z drugimi biološkimi molekulami (DNA, RNA, proteini...). lncRNA imajo lahko tako cis kot tudi trans-regulatorno aktivnost. Pojavlja se veliko hipotez, da TE dajejo funkcionalne domene lncRNA. Primer, ki potrjuje to hipotezo, je interakcija med XIST lncRNA in proteinskim kompleksom PRC2 (polycomb repressive complex 2). XIST lncRNA namreč vključuje transpozicijski element ERVB5 in ravno ta regija predstavlja vezavno mesto za PRC2. PRC2 ima vlogo pri zagotavljanju kompaktnosti kromatina, in sicer tako, da ena izmed njegovih podenot EZH2 (Enhancer of zeste homolog 2) katalizira trimetilacijo lizina 27 na histonu 3 (H3K27me1/2/3), s tem pa povzroči represijo transkripcije določenih genov. Fosforilacija EZH2 in T350 (obe sta podenoti PRC2) s CDK1/2 je ključna za interakcijo PRC2 z lncRNA, ki poteka preko G-kvadrupleskne regije lncRNA, le-ta pa je bogata s transpozoni ERVB5. XIST lncRNA pripelje proteinski kompleks PRC2 do promotorske regije tarčnega gena (npr. tumor supresorskega gena), kjer EZH2 s svojo metiltransferazno aktivnostjo deluje kot represor transkripcije. 
Zanimiv primer povezave med transpozicijskimi elementi in nekodirajočo RNA je regulacija odziva na toplotni šok pri miših. Ta primer kaže tudi na trans-regulatorno vlogo nekodirajoče RNA. Mišja ncRNA, ki izhaja iz retrotranspozona B2 SINE, se v normalnih pogojih veže na regulatorne regije genov, ki se odzivajo na stres, ter tako prepreči njihovo transkripcijo. Pri toplotnem šoku se aktivira protein EZH2, ki pospeši razgradnjo te ncRNA ter tako prepreči inhibicijo transkripcije genov, povezanih s stresom (EZH2 stimulira ribocimsko aktivnost same ncRNA). 

Transpozicijski elementi imajo pomembno vlogo pri procesu transkripcije genov za nekodirajoče RNA, saj so vključeni v številna območja njihovih genov in regulatornih regij. Mesta na genomu, na katerih se nahajajo nukleotidna zaporedja, ki izhajajo iz transpozicijskih elementov, so prisotna tako v promotorjih kot tudi na poliA regijah genov za nekodirajoče RNA. Veliko so jih našli tudi na regijah genov za lncRNA, ki so pomembna za spajanje eksonov oz. izrezovanje intronov (splice donor, splice acceptor). 

Veliko molekul miRNA (spadajo med sncRNA) z vključenimi transpozicijskimi elementi interagira s 3' koncem neprevajajoče regije tarčne mRNA (3' UTR). Preko tega procesa se utiša mRNA. Tako se npr. miR-151, ki vsebuje transpozicijske elemente LINE2, veže na molekulo mRNA, ki kodira za ATPAF1 (ATP synthase mitochondrial F1 complex assembly factor 1), in sicer tako, da se poveže s transpozoni LINE2 na 3' koncu neprevajajoče regije tarčne mRNA. 

Vedno bolj se odkriva tudi vloga transpozicijskih elementov pri tvorbi stabilnejših sekundarnih struktur v nekodirajočih RNA. Raziskava, ki je primerjala lncRNA z vključenimi transpozicijskimi elementi in lncRNA brez vključenih transpozicijskih elementov, je ugotovila, da lncRNA z vključenimi transpozicijskimi elementi tvorijo stabilnejše sekundarne strukture. Analizirali so tudi mesta na lncRNA, ki so vključena v bazno parjenje pri tvorbi sekundarnih struktur in ugotovili, da je okrog 82 % teh mest lociranih v Alu regijah lncRNA. Torej, Alu regije v regulatornih RNA sodelujejo pri intramolekularnem baznem parjenju, kar privede do tvorbe stabilnejših sekundarnih struktur, s tem pa tudi do večje stabilnosti nekodirajočih RNA. To jim omogoči, da lahko bolje opravljajo svoje funkcije regulacije transkripcije. 

==Viri in literatura==

[1]R. Fueyo, J. Judd, C. Feschotte, and J. Wysocka, ‘Roles of transposable elements in the regulation of mammalian transcription’, Nat Rev Mol Cell Biol, pp. 1–17, Feb. 2022, doi: 10.1038/s41580-022-00457-y. 
[2]A. Ali, K. Han, and P. Liang, ‘Role of Transposable Elements in Gene Regulation in the Human Genome’, Life (Basel), vol. 11, no. 2, p. 118, Feb. 2021, doi: 10.3390/life11020118. 
[3]P. J. Wittkopp and G. Kalay, ‘Cis-regulatory elements: molecular mechanisms and evolutionary processes underlying divergence’, Nat Rev Genet, vol. 13, no. 1, Art. no. 1, Jan. 2012, doi: 10.1038/nrg3095. 
[4]A. Hao, Y. Wang, D. B. Stovall, Y. Wang, and G. Sui, ‘Emerging Roles of LncRNAs in the EZH2-regulated Oncogenic Network’, Int. J. Biol. Sci., vol. 17, no. 13, pp. 3268–3280, 2021, doi: 10.7150/ijbs.63488. 
[5]N. Liu et al., ‘Selective silencing of euchromatic L1s revealed by genome-wide screens for L1 regulators’, Nature, vol. 553, no. 7687, Art. no. 7687, Jan. 2018, doi: 10.1038/nature25179. 

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

TE kot regulatorji transkripcije

2022-04-24T12:59:06Z

David Valte: /* Funkcije transpozicijskih elementov v cis-regulatornih regijah */

==Uvod==
Transpozicijski elementi (TE), ki sestavljajo velik del evkariontskega genoma, lahko, če se nahajajo v eksonskih predelih gostiteljevega genskega zapisa, bistveno zmanjšajo njegovo evolucijsko sposobnost preživetja, ker delujejo moteče (lahko povzročijo npr. vstavitev start in stop kodonov, premik bralnega okvirja, prehitro terminacijo transkripcije…). S tem zmanjšajo tudi verjetnost za lasten prenos v nove generacije. Ker TE po delovanju spominjajo na parazitski organizem, so se skozi evolucijo razvile strategije, ki preprečujejo preveliko škodo na gostiteljskem organizmu. Prilagajanje je potekalo vzajemno. Gostiteljski organizmi so npr. postali sposobni utišanja transpozicijskih elementov s pomočjo metilacije DNA na CpG otočkih, TE pa so se preferenčno vključevali v intronska zaporedja, saj tam ne delujejo tako moteče. Skozi čas so gostiteljski organizmi postali sposobni uporabe TE v svojo korist. 

Vključitve transpozicijskih elementov v nekodirajoče predele genskega zapisa in njihove mutacije so v veliko primerih povzročile, da so TE izgubili sposobnost transponiranja, pridobili pa so cis in trans-regulatorno aktivnost. Cis-regulatorne regije (CRE) so nekodirajoča zaporedja nukleotidov, ki regulirajo ekspresijo genov na isti verigi DNA. Trans regulacija pa pomeni to, da npr. transkripcijski faktorji prihajajo od drugod oz. so kodirani na eni molekuli DNA, regulirajo pa ekspresijo genov na drugi molekuli DNA. Regulacija transkripcije s TE lahko poteka na več načinov: 

1. V genski zapis lahko vnašajo nova vezavna mesta za transkripcijske faktorje (TF) preko promotorjev, ojačevalcev, utiševalnih in izolatorskih zaporedij. 
2. Lahko modulirajo 3D strukturo kromatina. 
3. Zmožni so kodiranja transkripcijskih faktorjev. 
4. S povezovanjem z represorskimi transkripcijskimi faktorji vplivajo na utišanje sosednjih genov. 
5. Imajo vlogo pri regulatornih nekodirajočih molekulah RNA, ki so pomembni regulatorji transkripcije. 

==Funkcije transpozicijskih elementov v cis-regulatornih regijah ==
Regulatorne sposobnosti cis-regulatornih regij lahko izhajajo iz transpozicijskih elementov. Cis-regulatorne regije tvorijo specifična vezavna mesta za proteine povezane z iniciacijo in regulacijo transkripcije. Primeri nekaterih vrst CRE: 

1. Promotorji so kratka zaporedja DNA, ki vključujejo začetno mesto transkripcije. Ob vezavi ustreznih transkripcijskih faktorjev na promotorsko regijo omogočijo transkripcijo gena. Transpozon AluSp v promotorju gena FCER1G inducira transkripcijo visokoafinitetnega receptorja za Fc regijo IgE. 
2. Ojačevalci so zaporedja, ki jih najdemo pred ali za genom, ki ga regulirajo. Delujejo kooperativno s promotorjem, in sicer tako, da povečajo stopnjo transkripcije, omogočajo pa regulacijo tudi bolj oddaljenih genov. Kot primer bi omenil transpozon AluY v intronu gena CD8 (ta kodira za glikoprotein CD8, ki je pomemben pri celičnih interakcijah znotraj imunskega sistema), za katerega so ugotovili, da deluje kot ojačevalec. 
3. Utiševalna zaporedja vežejo represorje in tako preprečujejo transkripcijo. Transpozicijski elementi so z rekrutiranjem transkripcijskih faktorjev postali sposobni delovati kot utiševalna zaporedja, ki remodelirajo kromatin. Čeprav so heterokromatinski deli revni z geni, so bogati s TE-ji, kar bi lahko pomenilo, da imajo transpozicijski elementi pomembno vlogo pri širjenju heterokromatina. Tako se npr. korepresorski protein TRIM28 veže na vezavno mesto, ki se nahaja na transpozonu ERV in s tem utiša sosednje gene. 
4. Inzulatorji ščitijo gene pred regulatornimi vplivi sosednjih genov. Lahko blokirajo promotorje, ojačevalce in utiševalce. Preprečujejo neprimerne interakcije med sosednjimi kromatinskimi regijami. Transpozon AluSq deluje kot inzulator. Njegova transkripcija ščiti človeški gen HBE1 (ki kodira za istoimenski protein (hemoglobinska podenota epsilon)) pred regulacijo z drugimi promotorji. 

TE-ji uvajajo nova vezavna mesta za TF, ki so v njih lahko prisotna takoj po inserciji v genom ali pa nastanejo de novo s postinsercijskimi mutacijami. Pogosto se mutacije pojavljajo na metiliranih CpG otočkih. Deaminacija teh povzroči zamenjavo citozina z gvaninom, kar je med drugim povzročilo nastanek številnih vezavnih mest za transkripcijska faktorja cMyc in p53. Vključitev TE-jev zraven že obstoječega vezavnega mesta za transkripcijske faktorje ter točkovne mutacije omogočijo nastanek novih mest za vezavo TF (alternativni promotorji), kar povzroča zaščito pred možnimi kasnejšimi mutacijami z redundančnostjo. Redundanca dopušča tudi kooperativno delovanje z zunanjimi promotorji, saj se lahko tako razbremenijo določena vezavna mesta za transkripcijske faktorje. 

==Vpliv transpozicijskih elementov na kromatinsko 3D strukturo==
V interfaznem jedru so deli genoma organizirani v topološko asociirajoče domene (TAD). To so večje domene kromatina, ki so med seboj ločene z izolatorskimi proteini. Ti omejujejo prostor, v katerem lahko različni deli DNA prihajajo v medsebojne stike. Njihova naloga je tudi prostorsko omejevanje interakcij med transkripcijskimi faktorji in ojačevalci ter promotorji. TAD specificirajo funkcije cis regulatornih regij z omejevanjem ojačevalcev, tako da ti aktivirajo le promotorje znotraj iste TAD. Vloga transpozicijskih elementov (TE) pri 3D arhitekturi genoma se je v zadnjih letih začela intenzivno raziskovati. Številne družine TE so namreč obogatene na mejah TAD. Določeni TE naj bi imeli preko tega tudi vlogo pri zvijanju kromosomov, prav tako pa tudi pri kompaktnosti kromatina in posledično tudi pri regulaciji procesov transkripcije. Kot primer pomena transpozicijskih elementov bi izpostavil študijo, ki je odkrila veliko HERV-H na mejah TAD v človeških embrionalnih matičnih celicah (hESCs) in delecija 2 individualnih HERV-H je vodila do izgube kompaktnosti te meje. 

Protein CTCF (11-zinc finger protein) je pomemben pri regulaciji 3D strukture kromatina in procesov transkripcije. Zelo pomemben je pri strukturi mej TAD. Vsebuje motive cinkovega prsta in deluje kot transkripcijski faktor. Sodeluje pri mediaciji nastanka kromatinskih zank in se velikokrat veže na TE. Opaženo je bilo, da so TE razpršili veliko vezavnih mest za protein CTCF in smiselno bi bilo, da bi se tudi meje TAD razpršile, vendar je bilo ugotovljeno, da so te zelo ohranjene. Odkrili so različne mehanizme preprečevanja tvorbe ektopičnih meja TAD. Tako se npr. transpozoni B2SINE, ki imajo veliko vezavnih mest za protein CTCF, lahko povežejo s kompleksom ChAHP, ki torej prepozna isti motiv kot CTCF, a z višjo afiniteto. 

==Kodiranje transkripcijskih faktorjev s transpozicijskimi elementi==
Šele nedavno so prišli do dognanj, da proteini, za katere kodirajo transpozicijski elementi, lahko vplivajo na regulacijo genov. Najdeni so bili številni primeri, v katerih gen za TE kodira transpozazo in hkrati tudi gostiteljski transkripcijski faktor. Fuzija transpozazne DNA-domene z regulatorno domeno transkripcijskega faktorja privede do tvorbe proteinskega kompleksa, ki je sposoben prepoznave ustreznega zaporedja TE na DNA, ker transpozaza prepozna transpozicijski element. Tako se lahko optimizira regulacija ekspresije genov s pomočjo TE. 

==Utišanje transpozicijskih elementov in pomen le-tega pri regulaciji transkripcije==
Organizmi so razvili zmožnost zmanjšanja aktivnosti transpozicijskih elementov, prav tako pa so transpozicijski elementi zmožni obiti gostiteljevo obrambo. Eden od načinov utišanja delovanja TE je metilacija DNA. Demetilacija TE lahko vodi do nepravilne aktivacije sosednjih genov zaradi ojačevalnega potenciala TE. Zato so gostitelji morali razviti mehanizem, ki to kontrolira. Pomemben utiševalni mehanizem TE je metilacija CpG otočkov na DNA. Primer povezave med metilacijo DNA in aktivnostjo iz TE izhajajočih cis regulatornih regij je gen Agouti. Ta daje rjavo obarvanim mišim C57BL/6J rumeno obarvanje na način, ki je odvisen od ravni metilacije promotorja, ki nadzoruje transkripcijo retrotranspozonov IAP. Retrotranspozon IAP pa nadzira ekspresijo gena Agouti in s tem obarvanje miši. 

Drug mehanizem utišanja TE so histonske modifikacije. Primer te epigenetske modifikacije je trimetilacija lizina 9 na histonu H3 (H3K9me3). Pomembno vlogo pri tem ima kompleks HUSH (human silencing hub complex). ATPaza MORC2 in HUSH se povežeta in posledično pride do trimetilacije na histonu 3 na retrotranspozonu LINE1 in tako se retrotranspoznon utiša. LINE1 se nahaja v intronih aktivnih genov. Če so ti trimetilirani, potem se RNA polimeraza II ne more pomikati naprej (motena je elongacija transkripcije), zato se geni ne prepisujejo. 

==Transpozicijski elementi in njihova vloga pri regulatornih nekodirajočih molekulah RNA==
Zaradi napredka v določanju nukleotidnega zaporedja molekul RNA se v zadnjih letih odkriva vedno več nekodirajočih molekul RNA (ncRNA). Te vključujejo tudi regulatorne RNA, med katere spadajo kratke nekodirajoče RNA (sncRNA) in dolge nekodirajoče RNA (lncRNA). Transpozicijski elementi (TE) in regulatorne RNA so tesno povezani, saj velik del nukleotidnega zaporedja regulatornih RNA in njihovih genov ter regulatornih regij predstavljajo TE. Transpozicijski elementi določajo funkcionalne lastnosti različnih tipov ncRNA, kar je ključno za njihovo regulatorno funkcijo pri transkripciji in posttranskripcijskih procesih. 

Transpozicijski elementi dajejo strukturne značilnosti lncRNA, ki jim dajejo sposobnost interakcije z drugimi biološkimi molekulami (DNA, RNA, proteini...). lncRNA imajo lahko tako cis kot tudi trans-regulatorno aktivnost. Pojavlja se veliko hipotez, da TE dajejo funkcionalne domene lncRNA. Primer, ki potrjuje to hipotezo, je interakcija med XIST lncRNA in proteinskim kompleksom PRC2 (polycomb repressive complex 2). XIST lncRNA namreč vključuje transpozicijski element ERVB5 in ravno ta regija predstavlja vezavno mesto za PRC2. PRC2 ima vlogo pri zagotavljanju kompaktnosti kromatina, in sicer tako, da ena izmed njegovih podenot EZH2 (Enhancer of zeste homolog 2) katalizira trimetilacijo lizina 27 na histonu 3 (H3K27me1/2/3), s tem pa povzroči represijo transkripcije določenih genov. Fosforilacija EZH2 in T350 (obe sta podenoti PRC2) s CDK1/2 je ključna za interakcijo PRC2 z lncRNA, ki poteka preko G-kvadrupleskne regije lncRNA, le-ta pa je bogata s transpozoni ERVB5. XIST lncRNA pripelje proteinski kompleks PRC2 do promotorske regije tarčnega gena (npr. tumor supresorskega gena), kjer EZH2 s svojo metiltransferazno aktivnostjo deluje kot represor transkripcije. 
Zanimiv primer povezave med transpozicijskimi elementi in nekodirajočo RNA je regulacija odziva na toplotni šok pri miših. Ta primer kaže tudi na trans-regulatorno vlogo nekodirajoče RNA. Mišja ncRNA, ki izhaja iz retrotranspozona B2 SINE, se v normalnih pogojih veže na regulatorne regije genov, ki se odzivajo na stres, ter tako prepreči njihovo transkripcijo. Pri toplotnem šoku se aktivira protein EZH2, ki pospeši razgradnjo te ncRNA ter tako prepreči inhibicijo transkripcije genov, povezanih s stresom (EZH2 stimulira ribocimsko aktivnost same ncRNA). 

Transpozicijski elementi imajo pomembno vlogo pri procesu transkripcije genov za nekodirajoče RNA, saj so vključeni v številna območja njihovih genov in regulatornih regij. Mesta na genomu, na katerih se nahajajo nukleotidna zaporedja, ki izhajajo iz transpozicijskih elementov, so prisotna tako v promotorjih kot tudi na poliA regijah genov za nekodirajoče RNA. Veliko so jih našli tudi na regijah genov za lncRNA, ki so pomembna za spajanje eksonov oz. izrezovanje intronov (splice donor, splice acceptor). 

Veliko molekul miRNA (spadajo med sncRNA) z vključenimi transpozicijskimi elementi interagira s 3' koncem neprevajajoče regije tarčne mRNA (3' UTR). Preko tega procesa se utiša mRNA. Tako se npr. miR-151, ki vsebuje transpozicijske elemente LINE2, veže na molekulo mRNA, ki kodira za ATPAF1 (ATP synthase mitochondrial F1 complex assembly factor 1), in sicer tako, da se poveže s transpozoni LINE2 na 3' koncu neprevajajoče regije tarčne mRNA. 

Vedno bolj se odkriva tudi vloga transpozicijskih elementov pri tvorbi stabilnejših sekundarnih struktur v nekodirajočih RNA. Raziskava, ki je primerjala lncRNA z vključenimi transpozicijskimi elementi in lncRNA brez vključenih transpozicijskih elementov, je ugotovila, da lncRNA z vključenimi transpozicijskimi elementi tvorijo stabilnejše sekundarne strukture. Analizirali so tudi mesta na lncRNA, ki so vključena v bazno parjenje pri tvorbi sekundarnih struktur in ugotovili, da je okrog 82 % teh mest lociranih v Alu regijah lncRNA. Torej, Alu regije v regulatornih RNA sodelujejo pri intramolekularnem baznem parjenju, kar privede do tvorbe stabilnejših sekundarnih struktur, s tem pa tudi do večje stabilnosti nekodirajočih RNA. To jim omogoči, da lahko bolje opravljajo svoje funkcije regulacije transkripcije. 

==Viri in literatura==

[1]R. Fueyo, J. Judd, C. Feschotte, and J. Wysocka, ‘Roles of transposable elements in the regulation of mammalian transcription’, Nat Rev Mol Cell Biol, pp. 1–17, Feb. 2022, doi: 10.1038/s41580-022-00457-y. 
[2]A. Ali, K. Han, and P. Liang, ‘Role of Transposable Elements in Gene Regulation in the Human Genome’, Life (Basel), vol. 11, no. 2, p. 118, Feb. 2021, doi: 10.3390/life11020118. 
[3]P. J. Wittkopp and G. Kalay, ‘Cis-regulatory elements: molecular mechanisms and evolutionary processes underlying divergence’, Nat Rev Genet, vol. 13, no. 1, Art. no. 1, Jan. 2012, doi: 10.1038/nrg3095. 
[4]A. Hao, Y. Wang, D. B. Stovall, Y. Wang, and G. Sui, ‘Emerging Roles of LncRNAs in the EZH2-regulated Oncogenic Network’, Int. J. Biol. Sci., vol. 17, no. 13, pp. 3268–3280, 2021, doi: 10.7150/ijbs.63488. 
[5]N. Liu et al., ‘Selective silencing of euchromatic L1s revealed by genome-wide screens for L1 regulators’, Nature, vol. 553, no. 7687, Art. no. 7687, Jan. 2018, doi: 10.1038/nature25179. 

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

TE kot regulatorji transkripcije

2022-04-24T12:57:41Z

David Valte: /* Funkcije transpozicijskih elementov v cis-regulatornih regijah */

==Uvod==
Transpozicijski elementi (TE), ki sestavljajo velik del evkariontskega genoma, lahko, če se nahajajo v eksonskih predelih gostiteljevega genskega zapisa, bistveno zmanjšajo njegovo evolucijsko sposobnost preživetja, ker delujejo moteče (lahko povzročijo npr. vstavitev start in stop kodonov, premik bralnega okvirja, prehitro terminacijo transkripcije…). S tem zmanjšajo tudi verjetnost za lasten prenos v nove generacije. Ker TE po delovanju spominjajo na parazitski organizem, so se skozi evolucijo razvile strategije, ki preprečujejo preveliko škodo na gostiteljskem organizmu. Prilagajanje je potekalo vzajemno. Gostiteljski organizmi so npr. postali sposobni utišanja transpozicijskih elementov s pomočjo metilacije DNA na CpG otočkih, TE pa so se preferenčno vključevali v intronska zaporedja, saj tam ne delujejo tako moteče. Skozi čas so gostiteljski organizmi postali sposobni uporabe TE v svojo korist. 

Vključitve transpozicijskih elementov v nekodirajoče predele genskega zapisa in njihove mutacije so v veliko primerih povzročile, da so TE izgubili sposobnost transponiranja, pridobili pa so cis in trans-regulatorno aktivnost. Cis-regulatorne regije (CRE) so nekodirajoča zaporedja nukleotidov, ki regulirajo ekspresijo genov na isti verigi DNA. Trans regulacija pa pomeni to, da npr. transkripcijski faktorji prihajajo od drugod oz. so kodirani na eni molekuli DNA, regulirajo pa ekspresijo genov na drugi molekuli DNA. Regulacija transkripcije s TE lahko poteka na več načinov: 

1. V genski zapis lahko vnašajo nova vezavna mesta za transkripcijske faktorje (TF) preko promotorjev, ojačevalcev, utiševalnih in izolatorskih zaporedij. 
2. Lahko modulirajo 3D strukturo kromatina. 
3. Zmožni so kodiranja transkripcijskih faktorjev. 
4. S povezovanjem z represorskimi transkripcijskimi faktorji vplivajo na utišanje sosednjih genov. 
5. Imajo vlogo pri regulatornih nekodirajočih molekulah RNA, ki so pomembni regulatorji transkripcije. 

==Funkcije transpozicijskih elementov v cis-regulatornih regijah ==
Regulatorne sposobnosti cis-regulatornih regij lahko izhajajo iz transpozicijskih elementov. Cis-regulatorne regije tvorijo specifična vezavna mesta za proteine povezane z iniciacijo in regulacijo transkripcije. Primeri nekaterih vrst CRE: 

1. Promotorji so kratka zaporedja DNA, ki vključujejo začetno mesto transkripcije. Ob vezavi ustreznih transkripcijskih faktorjev na promotorsko regijo omogočijo transkripcijo gena. Kot primer bi omenil transpozon AluSp v promotorju gena FCER1G, ki inducira transkripcijo visokoafinitetnega receptorja za Fc regijo IgE. 
2. Ojačevalci so zaporedja, ki jih najdemo pred ali za genom, ki ga regulirajo. Delujejo kooperativno s promotorjem, in sicer tako, da povečajo stopnjo transkripcije, omogočajo pa regulacijo tudi bolj oddaljenih genov. Kot primer bi omenil transpozon AluY v intronu gena CD8 (ta kodira za glikoprotein CD8, ki je pomemben pri celičnih interakcijah znotraj imunskega sistema), za katerega so ugotovili, da deluje kot ojačevalec. 
3. Utiševalna zaporedja vežejo represorje in tako preprečujejo transkripcijo. Transpozicijski elementi so z rekrutiranjem transkripcijskih faktorjev postali sposobni delovati kot utiševalna zaporedja, ki remodelirajo kromatin. Čeprav so heterokromatinski deli revni z geni, so bogati s TE-ji, kar bi lahko pomenilo, da imajo transpozicijski elementi pomembno vlogo pri širjenju heterokromatina. Tako se npr. korepresorski protein TRIM28 veže na vezavno mesto, ki se nahaja na transpozonu ERV in s tem utiša sosednje gene. 
4. Inzulatorji ščitijo gene pred regulatornimi vplivi sosednjih genov. Lahko blokirajo promotorje, ojačevalce in utiševalce. Preprečujejo neprimerne interakcije med sosednjimi kromatinskimi regijami. Transpozon AluSq deluje kot inzulator. Njegova transkripcija ščiti človeški gen HBE1 (ki kodira za istoimenski protein (hemoglobinska podenota epsilon)) pred regulacijo z drugimi promotorji. 

TE-ji uvajajo nova vezavna mesta za TF, ki so v njih lahko prisotna takoj po inserciji v genom ali pa nastanejo de novo s postinsercijskimi mutacijami. Pogosto se mutacije pojavljajo na metiliranih CpG otočkih. Deaminacija teh povzroči zamenjavo citozina z gvaninom, kar je med drugim povzročilo nastanek številnih vezavnih mest za transkripcijska faktorja cMyc in p53. Vključitev TE-jev zraven že obstoječega vezavnega mesta za transkripcijske faktorje ter točkovne mutacije omogočijo nastanek novih mest za vezavo TF (alternativni promotorji), kar povzroča zaščito pred možnimi kasnejšimi mutacijami z redundančnostjo. Redundanca dopušča tudi kooperativno delovanje z zunanjimi promotorji, saj se lahko tako razbremenijo določena vezavna mesta za transkripcijske faktorje. 

==Vpliv transpozicijskih elementov na kromatinsko 3D strukturo==
V interfaznem jedru so deli genoma organizirani v topološko asociirajoče domene (TAD). To so večje domene kromatina, ki so med seboj ločene z izolatorskimi proteini. Ti omejujejo prostor, v katerem lahko različni deli DNA prihajajo v medsebojne stike. Njihova naloga je tudi prostorsko omejevanje interakcij med transkripcijskimi faktorji in ojačevalci ter promotorji. TAD specificirajo funkcije cis regulatornih regij z omejevanjem ojačevalcev, tako da ti aktivirajo le promotorje znotraj iste TAD. Vloga transpozicijskih elementov (TE) pri 3D arhitekturi genoma se je v zadnjih letih začela intenzivno raziskovati. Številne družine TE so namreč obogatene na mejah TAD. Določeni TE naj bi imeli preko tega tudi vlogo pri zvijanju kromosomov, prav tako pa tudi pri kompaktnosti kromatina in posledično tudi pri regulaciji procesov transkripcije. Kot primer pomena transpozicijskih elementov bi izpostavil študijo, ki je odkrila veliko HERV-H na mejah TAD v človeških embrionalnih matičnih celicah (hESCs) in delecija 2 individualnih HERV-H je vodila do izgube kompaktnosti te meje. 

Protein CTCF (11-zinc finger protein) je pomemben pri regulaciji 3D strukture kromatina in procesov transkripcije. Zelo pomemben je pri strukturi mej TAD. Vsebuje motive cinkovega prsta in deluje kot transkripcijski faktor. Sodeluje pri mediaciji nastanka kromatinskih zank in se velikokrat veže na TE. Opaženo je bilo, da so TE razpršili veliko vezavnih mest za protein CTCF in smiselno bi bilo, da bi se tudi meje TAD razpršile, vendar je bilo ugotovljeno, da so te zelo ohranjene. Odkrili so različne mehanizme preprečevanja tvorbe ektopičnih meja TAD. Tako se npr. transpozoni B2SINE, ki imajo veliko vezavnih mest za protein CTCF, lahko povežejo s kompleksom ChAHP, ki torej prepozna isti motiv kot CTCF, a z višjo afiniteto. 

==Kodiranje transkripcijskih faktorjev s transpozicijskimi elementi==
Šele nedavno so prišli do dognanj, da proteini, za katere kodirajo transpozicijski elementi, lahko vplivajo na regulacijo genov. Najdeni so bili številni primeri, v katerih gen za TE kodira transpozazo in hkrati tudi gostiteljski transkripcijski faktor. Fuzija transpozazne DNA-domene z regulatorno domeno transkripcijskega faktorja privede do tvorbe proteinskega kompleksa, ki je sposoben prepoznave ustreznega zaporedja TE na DNA, ker transpozaza prepozna transpozicijski element. Tako se lahko optimizira regulacija ekspresije genov s pomočjo TE. 

==Utišanje transpozicijskih elementov in pomen le-tega pri regulaciji transkripcije==
Organizmi so razvili zmožnost zmanjšanja aktivnosti transpozicijskih elementov, prav tako pa so transpozicijski elementi zmožni obiti gostiteljevo obrambo. Eden od načinov utišanja delovanja TE je metilacija DNA. Demetilacija TE lahko vodi do nepravilne aktivacije sosednjih genov zaradi ojačevalnega potenciala TE. Zato so gostitelji morali razviti mehanizem, ki to kontrolira. Pomemben utiševalni mehanizem TE je metilacija CpG otočkov na DNA. Primer povezave med metilacijo DNA in aktivnostjo iz TE izhajajočih cis regulatornih regij je gen Agouti. Ta daje rjavo obarvanim mišim C57BL/6J rumeno obarvanje na način, ki je odvisen od ravni metilacije promotorja, ki nadzoruje transkripcijo retrotranspozonov IAP. Retrotranspozon IAP pa nadzira ekspresijo gena Agouti in s tem obarvanje miši. 

Drug mehanizem utišanja TE so histonske modifikacije. Primer te epigenetske modifikacije je trimetilacija lizina 9 na histonu H3 (H3K9me3). Pomembno vlogo pri tem ima kompleks HUSH (human silencing hub complex). ATPaza MORC2 in HUSH se povežeta in posledično pride do trimetilacije na histonu 3 na retrotranspozonu LINE1 in tako se retrotranspoznon utiša. LINE1 se nahaja v intronih aktivnih genov. Če so ti trimetilirani, potem se RNA polimeraza II ne more pomikati naprej (motena je elongacija transkripcije), zato se geni ne prepisujejo. 

==Transpozicijski elementi in njihova vloga pri regulatornih nekodirajočih molekulah RNA==
Zaradi napredka v določanju nukleotidnega zaporedja molekul RNA se v zadnjih letih odkriva vedno več nekodirajočih molekul RNA (ncRNA). Te vključujejo tudi regulatorne RNA, med katere spadajo kratke nekodirajoče RNA (sncRNA) in dolge nekodirajoče RNA (lncRNA). Transpozicijski elementi (TE) in regulatorne RNA so tesno povezani, saj velik del nukleotidnega zaporedja regulatornih RNA in njihovih genov ter regulatornih regij predstavljajo TE. Transpozicijski elementi določajo funkcionalne lastnosti različnih tipov ncRNA, kar je ključno za njihovo regulatorno funkcijo pri transkripciji in posttranskripcijskih procesih. 

Transpozicijski elementi dajejo strukturne značilnosti lncRNA, ki jim dajejo sposobnost interakcije z drugimi biološkimi molekulami (DNA, RNA, proteini...). lncRNA imajo lahko tako cis kot tudi trans-regulatorno aktivnost. Pojavlja se veliko hipotez, da TE dajejo funkcionalne domene lncRNA. Primer, ki potrjuje to hipotezo, je interakcija med XIST lncRNA in proteinskim kompleksom PRC2 (polycomb repressive complex 2). XIST lncRNA namreč vključuje transpozicijski element ERVB5 in ravno ta regija predstavlja vezavno mesto za PRC2. PRC2 ima vlogo pri zagotavljanju kompaktnosti kromatina, in sicer tako, da ena izmed njegovih podenot EZH2 (Enhancer of zeste homolog 2) katalizira trimetilacijo lizina 27 na histonu 3 (H3K27me1/2/3), s tem pa povzroči represijo transkripcije določenih genov. Fosforilacija EZH2 in T350 (obe sta podenoti PRC2) s CDK1/2 je ključna za interakcijo PRC2 z lncRNA, ki poteka preko G-kvadrupleskne regije lncRNA, le-ta pa je bogata s transpozoni ERVB5. XIST lncRNA pripelje proteinski kompleks PRC2 do promotorske regije tarčnega gena (npr. tumor supresorskega gena), kjer EZH2 s svojo metiltransferazno aktivnostjo deluje kot represor transkripcije. 
Zanimiv primer povezave med transpozicijskimi elementi in nekodirajočo RNA je regulacija odziva na toplotni šok pri miših. Ta primer kaže tudi na trans-regulatorno vlogo nekodirajoče RNA. Mišja ncRNA, ki izhaja iz retrotranspozona B2 SINE, se v normalnih pogojih veže na regulatorne regije genov, ki se odzivajo na stres, ter tako prepreči njihovo transkripcijo. Pri toplotnem šoku se aktivira protein EZH2, ki pospeši razgradnjo te ncRNA ter tako prepreči inhibicijo transkripcije genov, povezanih s stresom (EZH2 stimulira ribocimsko aktivnost same ncRNA). 

Transpozicijski elementi imajo pomembno vlogo pri procesu transkripcije genov za nekodirajoče RNA, saj so vključeni v številna območja njihovih genov in regulatornih regij. Mesta na genomu, na katerih se nahajajo nukleotidna zaporedja, ki izhajajo iz transpozicijskih elementov, so prisotna tako v promotorjih kot tudi na poliA regijah genov za nekodirajoče RNA. Veliko so jih našli tudi na regijah genov za lncRNA, ki so pomembna za spajanje eksonov oz. izrezovanje intronov (splice donor, splice acceptor). 

Veliko molekul miRNA (spadajo med sncRNA) z vključenimi transpozicijskimi elementi interagira s 3' koncem neprevajajoče regije tarčne mRNA (3' UTR). Preko tega procesa se utiša mRNA. Tako se npr. miR-151, ki vsebuje transpozicijske elemente LINE2, veže na molekulo mRNA, ki kodira za ATPAF1 (ATP synthase mitochondrial F1 complex assembly factor 1), in sicer tako, da se poveže s transpozoni LINE2 na 3' koncu neprevajajoče regije tarčne mRNA. 

Vedno bolj se odkriva tudi vloga transpozicijskih elementov pri tvorbi stabilnejših sekundarnih struktur v nekodirajočih RNA. Raziskava, ki je primerjala lncRNA z vključenimi transpozicijskimi elementi in lncRNA brez vključenih transpozicijskih elementov, je ugotovila, da lncRNA z vključenimi transpozicijskimi elementi tvorijo stabilnejše sekundarne strukture. Analizirali so tudi mesta na lncRNA, ki so vključena v bazno parjenje pri tvorbi sekundarnih struktur in ugotovili, da je okrog 82 % teh mest lociranih v Alu regijah lncRNA. Torej, Alu regije v regulatornih RNA sodelujejo pri intramolekularnem baznem parjenju, kar privede do tvorbe stabilnejših sekundarnih struktur, s tem pa tudi do večje stabilnosti nekodirajočih RNA. To jim omogoči, da lahko bolje opravljajo svoje funkcije regulacije transkripcije. 

==Viri in literatura==

[1]R. Fueyo, J. Judd, C. Feschotte, and J. Wysocka, ‘Roles of transposable elements in the regulation of mammalian transcription’, Nat Rev Mol Cell Biol, pp. 1–17, Feb. 2022, doi: 10.1038/s41580-022-00457-y. 
[2]A. Ali, K. Han, and P. Liang, ‘Role of Transposable Elements in Gene Regulation in the Human Genome’, Life (Basel), vol. 11, no. 2, p. 118, Feb. 2021, doi: 10.3390/life11020118. 
[3]P. J. Wittkopp and G. Kalay, ‘Cis-regulatory elements: molecular mechanisms and evolutionary processes underlying divergence’, Nat Rev Genet, vol. 13, no. 1, Art. no. 1, Jan. 2012, doi: 10.1038/nrg3095. 
[4]A. Hao, Y. Wang, D. B. Stovall, Y. Wang, and G. Sui, ‘Emerging Roles of LncRNAs in the EZH2-regulated Oncogenic Network’, Int. J. Biol. Sci., vol. 17, no. 13, pp. 3268–3280, 2021, doi: 10.7150/ijbs.63488. 
[5]N. Liu et al., ‘Selective silencing of euchromatic L1s revealed by genome-wide screens for L1 regulators’, Nature, vol. 553, no. 7687, Art. no. 7687, Jan. 2018, doi: 10.1038/nature25179. 

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

TE kot regulatorji transkripcije

2022-04-24T12:56:50Z

David Valte: /* Funkcije transpozicijskih elementov v cis-regulatornih regijah */

==Uvod==
Transpozicijski elementi (TE), ki sestavljajo velik del evkariontskega genoma, lahko, če se nahajajo v eksonskih predelih gostiteljevega genskega zapisa, bistveno zmanjšajo njegovo evolucijsko sposobnost preživetja, ker delujejo moteče (lahko povzročijo npr. vstavitev start in stop kodonov, premik bralnega okvirja, prehitro terminacijo transkripcije…). S tem zmanjšajo tudi verjetnost za lasten prenos v nove generacije. Ker TE po delovanju spominjajo na parazitski organizem, so se skozi evolucijo razvile strategije, ki preprečujejo preveliko škodo na gostiteljskem organizmu. Prilagajanje je potekalo vzajemno. Gostiteljski organizmi so npr. postali sposobni utišanja transpozicijskih elementov s pomočjo metilacije DNA na CpG otočkih, TE pa so se preferenčno vključevali v intronska zaporedja, saj tam ne delujejo tako moteče. Skozi čas so gostiteljski organizmi postali sposobni uporabe TE v svojo korist. 

Vključitve transpozicijskih elementov v nekodirajoče predele genskega zapisa in njihove mutacije so v veliko primerih povzročile, da so TE izgubili sposobnost transponiranja, pridobili pa so cis in trans-regulatorno aktivnost. Cis-regulatorne regije (CRE) so nekodirajoča zaporedja nukleotidov, ki regulirajo ekspresijo genov na isti verigi DNA. Trans regulacija pa pomeni to, da npr. transkripcijski faktorji prihajajo od drugod oz. so kodirani na eni molekuli DNA, regulirajo pa ekspresijo genov na drugi molekuli DNA. Regulacija transkripcije s TE lahko poteka na več načinov: 

1. V genski zapis lahko vnašajo nova vezavna mesta za transkripcijske faktorje (TF) preko promotorjev, ojačevalcev, utiševalnih in izolatorskih zaporedij. 
2. Lahko modulirajo 3D strukturo kromatina. 
3. Zmožni so kodiranja transkripcijskih faktorjev. 
4. S povezovanjem z represorskimi transkripcijskimi faktorji vplivajo na utišanje sosednjih genov. 
5. Imajo vlogo pri regulatornih nekodirajočih molekulah RNA, ki so pomembni regulatorji transkripcije. 

==Funkcije transpozicijskih elementov v cis-regulatornih regijah ==
Regulatorne sposobnosti cis-regulatornih regij lahko izhajajo iz transpozicijskih elementov. Cis-regulatorne regije tvorijo specifična vezavna mesta za proteine povezane z iniciacijo in regulacijo transkripcije. Primeri nekaterih vrst CRE: 

1. Promotorji so kratka zaporedja DNA, ki vključujejo začetno mesto transkripcije. Ob vezavi ustreznih transkripcijskih faktorjev na promotorsko regijo omogočijo transkripcijo gena. Kot primer bi omenil transpozon AluSp v promotorju gena FCER1G, ki inducira transkripcijo visokoafinitetnega receptorja za Fc regijo IgE. 
2. Ojačevalci so zaporedja, ki jih najdemo pred ali za genom, ki ga regulirajo. Delujejo kooperativno s promotorjem, in sicer tako, da povečajo stopnjo transkripcije, omogočajo pa regulacijo tudi bolj oddaljenih genov. Kot primer bi omenil transpozon AluY v intronu gena CD8 (ta kodira za glikoprotein CD8, ki je pomemben pri celičnih interakcijah znotraj imunskega sistema), za katerega so ugotovili, da deluje kot ojačevalec. 
3. Utiševalna zaporedja vežejo represorje in tako preprečujejo transkripcijo. Transpozicijski elementi so z rekrutiranjem transkripcijskih faktorjev postali sposobni delovati kot utiševalna zaporedja, ki remodelirajo kromatin. Čeprav so heterokromatinski deli revni z geni, so bogati s TE-ji, kar bi lahko pomenilo, da imajo transpozicijski elementi pomembno vlogo pri širjenju heterokromatina. Tako se npr. korepresorski protein TRIM28 veže na vezavno mesto, ki se nahaja na transpozonu ERV in s tem utiša sosednje gene. 
4. Inzulatorji ščitijo gene pred regulatornimi vplivi sosednjih genov. Lahko blokirajo promotorje, ojačevalce in utiševalce. Preprečujejo neprimerne interakcije med sosednjimi kromatinskimi regijami. Transpozon AluSq deluje kot inzulator. Njegova transkripcija ščiti človeški gen HBE1 (ki kodira za istoimenski protein) pred regulacijo z drugimi promotorji. 

TE-ji uvajajo nova vezavna mesta za TF, ki so v njih lahko prisotna takoj po inserciji v genom ali pa nastanejo de novo s postinsercijskimi mutacijami. Pogosto se mutacije pojavljajo na metiliranih CpG otočkih. Deaminacija teh povzroči zamenjavo citozina z gvaninom, kar je med drugim povzročilo nastanek številnih vezavnih mest za transkripcijska faktorja cMyc in p53. Vključitev TE-jev zraven že obstoječega vezavnega mesta za transkripcijske faktorje ter točkovne mutacije omogočijo nastanek novih mest za vezavo TF (alternativni promotorji), kar povzroča zaščito pred možnimi kasnejšimi mutacijami z redundančnostjo. Redundanca dopušča tudi kooperativno delovanje z zunanjimi promotorji, saj se lahko tako razbremenijo določena vezavna mesta za transkripcijske faktorje. 

==Vpliv transpozicijskih elementov na kromatinsko 3D strukturo==
V interfaznem jedru so deli genoma organizirani v topološko asociirajoče domene (TAD). To so večje domene kromatina, ki so med seboj ločene z izolatorskimi proteini. Ti omejujejo prostor, v katerem lahko različni deli DNA prihajajo v medsebojne stike. Njihova naloga je tudi prostorsko omejevanje interakcij med transkripcijskimi faktorji in ojačevalci ter promotorji. TAD specificirajo funkcije cis regulatornih regij z omejevanjem ojačevalcev, tako da ti aktivirajo le promotorje znotraj iste TAD. Vloga transpozicijskih elementov (TE) pri 3D arhitekturi genoma se je v zadnjih letih začela intenzivno raziskovati. Številne družine TE so namreč obogatene na mejah TAD. Določeni TE naj bi imeli preko tega tudi vlogo pri zvijanju kromosomov, prav tako pa tudi pri kompaktnosti kromatina in posledično tudi pri regulaciji procesov transkripcije. Kot primer pomena transpozicijskih elementov bi izpostavil študijo, ki je odkrila veliko HERV-H na mejah TAD v človeških embrionalnih matičnih celicah (hESCs) in delecija 2 individualnih HERV-H je vodila do izgube kompaktnosti te meje. 

Protein CTCF (11-zinc finger protein) je pomemben pri regulaciji 3D strukture kromatina in procesov transkripcije. Zelo pomemben je pri strukturi mej TAD. Vsebuje motive cinkovega prsta in deluje kot transkripcijski faktor. Sodeluje pri mediaciji nastanka kromatinskih zank in se velikokrat veže na TE. Opaženo je bilo, da so TE razpršili veliko vezavnih mest za protein CTCF in smiselno bi bilo, da bi se tudi meje TAD razpršile, vendar je bilo ugotovljeno, da so te zelo ohranjene. Odkrili so različne mehanizme preprečevanja tvorbe ektopičnih meja TAD. Tako se npr. transpozoni B2SINE, ki imajo veliko vezavnih mest za protein CTCF, lahko povežejo s kompleksom ChAHP, ki torej prepozna isti motiv kot CTCF, a z višjo afiniteto. 

==Kodiranje transkripcijskih faktorjev s transpozicijskimi elementi==
Šele nedavno so prišli do dognanj, da proteini, za katere kodirajo transpozicijski elementi, lahko vplivajo na regulacijo genov. Najdeni so bili številni primeri, v katerih gen za TE kodira transpozazo in hkrati tudi gostiteljski transkripcijski faktor. Fuzija transpozazne DNA-domene z regulatorno domeno transkripcijskega faktorja privede do tvorbe proteinskega kompleksa, ki je sposoben prepoznave ustreznega zaporedja TE na DNA, ker transpozaza prepozna transpozicijski element. Tako se lahko optimizira regulacija ekspresije genov s pomočjo TE. 

==Utišanje transpozicijskih elementov in pomen le-tega pri regulaciji transkripcije==
Organizmi so razvili zmožnost zmanjšanja aktivnosti transpozicijskih elementov, prav tako pa so transpozicijski elementi zmožni obiti gostiteljevo obrambo. Eden od načinov utišanja delovanja TE je metilacija DNA. Demetilacija TE lahko vodi do nepravilne aktivacije sosednjih genov zaradi ojačevalnega potenciala TE. Zato so gostitelji morali razviti mehanizem, ki to kontrolira. Pomemben utiševalni mehanizem TE je metilacija CpG otočkov na DNA. Primer povezave med metilacijo DNA in aktivnostjo iz TE izhajajočih cis regulatornih regij je gen Agouti. Ta daje rjavo obarvanim mišim C57BL/6J rumeno obarvanje na način, ki je odvisen od ravni metilacije promotorja, ki nadzoruje transkripcijo retrotranspozonov IAP. Retrotranspozon IAP pa nadzira ekspresijo gena Agouti in s tem obarvanje miši. 

Drug mehanizem utišanja TE so histonske modifikacije. Primer te epigenetske modifikacije je trimetilacija lizina 9 na histonu H3 (H3K9me3). Pomembno vlogo pri tem ima kompleks HUSH (human silencing hub complex). ATPaza MORC2 in HUSH se povežeta in posledično pride do trimetilacije na histonu 3 na retrotranspozonu LINE1 in tako se retrotranspoznon utiša. LINE1 se nahaja v intronih aktivnih genov. Če so ti trimetilirani, potem se RNA polimeraza II ne more pomikati naprej (motena je elongacija transkripcije), zato se geni ne prepisujejo. 

==Transpozicijski elementi in njihova vloga pri regulatornih nekodirajočih molekulah RNA==
Zaradi napredka v določanju nukleotidnega zaporedja molekul RNA se v zadnjih letih odkriva vedno več nekodirajočih molekul RNA (ncRNA). Te vključujejo tudi regulatorne RNA, med katere spadajo kratke nekodirajoče RNA (sncRNA) in dolge nekodirajoče RNA (lncRNA). Transpozicijski elementi (TE) in regulatorne RNA so tesno povezani, saj velik del nukleotidnega zaporedja regulatornih RNA in njihovih genov ter regulatornih regij predstavljajo TE. Transpozicijski elementi določajo funkcionalne lastnosti različnih tipov ncRNA, kar je ključno za njihovo regulatorno funkcijo pri transkripciji in posttranskripcijskih procesih. 

Transpozicijski elementi dajejo strukturne značilnosti lncRNA, ki jim dajejo sposobnost interakcije z drugimi biološkimi molekulami (DNA, RNA, proteini...). lncRNA imajo lahko tako cis kot tudi trans-regulatorno aktivnost. Pojavlja se veliko hipotez, da TE dajejo funkcionalne domene lncRNA. Primer, ki potrjuje to hipotezo, je interakcija med XIST lncRNA in proteinskim kompleksom PRC2 (polycomb repressive complex 2). XIST lncRNA namreč vključuje transpozicijski element ERVB5 in ravno ta regija predstavlja vezavno mesto za PRC2. PRC2 ima vlogo pri zagotavljanju kompaktnosti kromatina, in sicer tako, da ena izmed njegovih podenot EZH2 (Enhancer of zeste homolog 2) katalizira trimetilacijo lizina 27 na histonu 3 (H3K27me1/2/3), s tem pa povzroči represijo transkripcije določenih genov. Fosforilacija EZH2 in T350 (obe sta podenoti PRC2) s CDK1/2 je ključna za interakcijo PRC2 z lncRNA, ki poteka preko G-kvadrupleskne regije lncRNA, le-ta pa je bogata s transpozoni ERVB5. XIST lncRNA pripelje proteinski kompleks PRC2 do promotorske regije tarčnega gena (npr. tumor supresorskega gena), kjer EZH2 s svojo metiltransferazno aktivnostjo deluje kot represor transkripcije. 
Zanimiv primer povezave med transpozicijskimi elementi in nekodirajočo RNA je regulacija odziva na toplotni šok pri miših. Ta primer kaže tudi na trans-regulatorno vlogo nekodirajoče RNA. Mišja ncRNA, ki izhaja iz retrotranspozona B2 SINE, se v normalnih pogojih veže na regulatorne regije genov, ki se odzivajo na stres, ter tako prepreči njihovo transkripcijo. Pri toplotnem šoku se aktivira protein EZH2, ki pospeši razgradnjo te ncRNA ter tako prepreči inhibicijo transkripcije genov, povezanih s stresom (EZH2 stimulira ribocimsko aktivnost same ncRNA). 

Transpozicijski elementi imajo pomembno vlogo pri procesu transkripcije genov za nekodirajoče RNA, saj so vključeni v številna območja njihovih genov in regulatornih regij. Mesta na genomu, na katerih se nahajajo nukleotidna zaporedja, ki izhajajo iz transpozicijskih elementov, so prisotna tako v promotorjih kot tudi na poliA regijah genov za nekodirajoče RNA. Veliko so jih našli tudi na regijah genov za lncRNA, ki so pomembna za spajanje eksonov oz. izrezovanje intronov (splice donor, splice acceptor). 

Veliko molekul miRNA (spadajo med sncRNA) z vključenimi transpozicijskimi elementi interagira s 3' koncem neprevajajoče regije tarčne mRNA (3' UTR). Preko tega procesa se utiša mRNA. Tako se npr. miR-151, ki vsebuje transpozicijske elemente LINE2, veže na molekulo mRNA, ki kodira za ATPAF1 (ATP synthase mitochondrial F1 complex assembly factor 1), in sicer tako, da se poveže s transpozoni LINE2 na 3' koncu neprevajajoče regije tarčne mRNA. 

Vedno bolj se odkriva tudi vloga transpozicijskih elementov pri tvorbi stabilnejših sekundarnih struktur v nekodirajočih RNA. Raziskava, ki je primerjala lncRNA z vključenimi transpozicijskimi elementi in lncRNA brez vključenih transpozicijskih elementov, je ugotovila, da lncRNA z vključenimi transpozicijskimi elementi tvorijo stabilnejše sekundarne strukture. Analizirali so tudi mesta na lncRNA, ki so vključena v bazno parjenje pri tvorbi sekundarnih struktur in ugotovili, da je okrog 82 % teh mest lociranih v Alu regijah lncRNA. Torej, Alu regije v regulatornih RNA sodelujejo pri intramolekularnem baznem parjenju, kar privede do tvorbe stabilnejših sekundarnih struktur, s tem pa tudi do večje stabilnosti nekodirajočih RNA. To jim omogoči, da lahko bolje opravljajo svoje funkcije regulacije transkripcije. 

==Viri in literatura==

[1]R. Fueyo, J. Judd, C. Feschotte, and J. Wysocka, ‘Roles of transposable elements in the regulation of mammalian transcription’, Nat Rev Mol Cell Biol, pp. 1–17, Feb. 2022, doi: 10.1038/s41580-022-00457-y. 
[2]A. Ali, K. Han, and P. Liang, ‘Role of Transposable Elements in Gene Regulation in the Human Genome’, Life (Basel), vol. 11, no. 2, p. 118, Feb. 2021, doi: 10.3390/life11020118. 
[3]P. J. Wittkopp and G. Kalay, ‘Cis-regulatory elements: molecular mechanisms and evolutionary processes underlying divergence’, Nat Rev Genet, vol. 13, no. 1, Art. no. 1, Jan. 2012, doi: 10.1038/nrg3095. 
[4]A. Hao, Y. Wang, D. B. Stovall, Y. Wang, and G. Sui, ‘Emerging Roles of LncRNAs in the EZH2-regulated Oncogenic Network’, Int. J. Biol. Sci., vol. 17, no. 13, pp. 3268–3280, 2021, doi: 10.7150/ijbs.63488. 
[5]N. Liu et al., ‘Selective silencing of euchromatic L1s revealed by genome-wide screens for L1 regulators’, Nature, vol. 553, no. 7687, Art. no. 7687, Jan. 2018, doi: 10.1038/nature25179. 

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

TE kot regulatorji transkripcije

2022-04-24T12:55:17Z

David Valte: /* Funkcije transpozicijskih elementov v cis-regulatornih regijah */

==Uvod==
Transpozicijski elementi (TE), ki sestavljajo velik del evkariontskega genoma, lahko, če se nahajajo v eksonskih predelih gostiteljevega genskega zapisa, bistveno zmanjšajo njegovo evolucijsko sposobnost preživetja, ker delujejo moteče (lahko povzročijo npr. vstavitev start in stop kodonov, premik bralnega okvirja, prehitro terminacijo transkripcije…). S tem zmanjšajo tudi verjetnost za lasten prenos v nove generacije. Ker TE po delovanju spominjajo na parazitski organizem, so se skozi evolucijo razvile strategije, ki preprečujejo preveliko škodo na gostiteljskem organizmu. Prilagajanje je potekalo vzajemno. Gostiteljski organizmi so npr. postali sposobni utišanja transpozicijskih elementov s pomočjo metilacije DNA na CpG otočkih, TE pa so se preferenčno vključevali v intronska zaporedja, saj tam ne delujejo tako moteče. Skozi čas so gostiteljski organizmi postali sposobni uporabe TE v svojo korist. 

Vključitve transpozicijskih elementov v nekodirajoče predele genskega zapisa in njihove mutacije so v veliko primerih povzročile, da so TE izgubili sposobnost transponiranja, pridobili pa so cis in trans-regulatorno aktivnost. Cis-regulatorne regije (CRE) so nekodirajoča zaporedja nukleotidov, ki regulirajo ekspresijo genov na isti verigi DNA. Trans regulacija pa pomeni to, da npr. transkripcijski faktorji prihajajo od drugod oz. so kodirani na eni molekuli DNA, regulirajo pa ekspresijo genov na drugi molekuli DNA. Regulacija transkripcije s TE lahko poteka na več načinov: 

1. V genski zapis lahko vnašajo nova vezavna mesta za transkripcijske faktorje (TF) preko promotorjev, ojačevalcev, utiševalnih in izolatorskih zaporedij. 
2. Lahko modulirajo 3D strukturo kromatina. 
3. Zmožni so kodiranja transkripcijskih faktorjev. 
4. S povezovanjem z represorskimi transkripcijskimi faktorji vplivajo na utišanje sosednjih genov. 
5. Imajo vlogo pri regulatornih nekodirajočih molekulah RNA, ki so pomembni regulatorji transkripcije. 

==Funkcije transpozicijskih elementov v cis-regulatornih regijah ==
Regulatorne sposobnosti cis-regulatornih regij lahko izhajajo iz transpozicijskih elementov. Cis-regulatorne regije tvorijo specifična vezavna mesta za proteine povezane z iniciacijo in regulacijo transkripcije. Primeri nekaterih vrst CRE: 

1. Promotorji so kratka zaporedja DNA, ki vključujejo začetno mesto transkripcije. Ob vezavi ustreznih transkripcijskih faktorjev na promotorsko regijo omogočijo transkripcijo gena. Kot primer bi omenil transpozon AluSp v promotorju gena FCER1G, ki inducira transkripcijo visokoafinitetnega receptorja za Fc regijo IgE. 
2. Ojačevalci so zaporedja, ki jih najdemo pred ali za genom, ki ga regulirajo. Delujejo kooperativno s promotorjem, in sicer tako, da povečajo stopnjo transkripcije, omogočajo pa regulacijo tudi bolj oddaljenih genov. Kot primer bi omenil transpozon AluY v intronu gena CD8 (ta kodira za glikoprotein CD8, ki je pomemben pri celičnih interakcijah znotraj imunskega sistema), za katerega so ugotovili, da deluje kot ojačevalec. 
3. Utiševalna zaporedja vežejo represorje in tako preprečujejo transkripcijo. Transpozicijski elementi so z rekrutiranjem transkripcijskih faktorjev postali sposobni delovati kot utiševalna zaporedja, ki remodelirajo kromatin. Čeprav so heterokromatinski deli revni z geni, so bogati s TE-ji, kar bi lahko pomenilo, da imajo transpozicijski elementi pomembno vlogo pri širjenju heterokromatina. Tako se npr. korepresorski protein TRIM28 veže na vezavno mesto, ki se nahaja na transpozonu ERV in s tem utiša sosednje gene. 
4. Inzulatorji ščitijo gene pred regulatornimi vplivi sosednjih genov. Lahko blokirajo promotorje, ojačevalce in utiševalce. Preprečujejo neprimerne interakcije med sosednjimi kromatinskimi regijami. Kot primer bi omenil gen za transpozon AluSq, ki deluje kot inzulator, saj njegova transkripcija ščiti človeški gen HBE1 (ki kodira za istoimenski protein) pred regulacijo z drugimi promotorji. 

TE-ji uvajajo nova vezavna mesta za TF, ki so v njih lahko prisotna takoj po inserciji v genom ali pa nastanejo de novo s postinsercijskimi mutacijami. Pogosto se mutacije pojavljajo na metiliranih CpG otočkih. Deaminacija teh povzroči zamenjavo citozina z gvaninom, kar je med drugim povzročilo nastanek številnih vezavnih mest za transkripcijska faktorja cMyc in p53. Vključitev TE-jev zraven že obstoječega vezavnega mesta za transkripcijske faktorje ter točkovne mutacije omogočijo nastanek novih mest za vezavo TF (alternativni promotorji), kar povzroča zaščito pred možnimi kasnejšimi mutacijami z redundančnostjo. Redundanca dopušča tudi kooperativno delovanje z zunanjimi promotorji, saj se lahko tako razbremenijo določena vezavna mesta za transkripcijske faktorje. 

==Vpliv transpozicijskih elementov na kromatinsko 3D strukturo==
V interfaznem jedru so deli genoma organizirani v topološko asociirajoče domene (TAD). To so večje domene kromatina, ki so med seboj ločene z izolatorskimi proteini. Ti omejujejo prostor, v katerem lahko različni deli DNA prihajajo v medsebojne stike. Njihova naloga je tudi prostorsko omejevanje interakcij med transkripcijskimi faktorji in ojačevalci ter promotorji. TAD specificirajo funkcije cis regulatornih regij z omejevanjem ojačevalcev, tako da ti aktivirajo le promotorje znotraj iste TAD. Vloga transpozicijskih elementov (TE) pri 3D arhitekturi genoma se je v zadnjih letih začela intenzivno raziskovati. Številne družine TE so namreč obogatene na mejah TAD. Določeni TE naj bi imeli preko tega tudi vlogo pri zvijanju kromosomov, prav tako pa tudi pri kompaktnosti kromatina in posledično tudi pri regulaciji procesov transkripcije. Kot primer pomena transpozicijskih elementov bi izpostavil študijo, ki je odkrila veliko HERV-H na mejah TAD v človeških embrionalnih matičnih celicah (hESCs) in delecija 2 individualnih HERV-H je vodila do izgube kompaktnosti te meje. 

Protein CTCF (11-zinc finger protein) je pomemben pri regulaciji 3D strukture kromatina in procesov transkripcije. Zelo pomemben je pri strukturi mej TAD. Vsebuje motive cinkovega prsta in deluje kot transkripcijski faktor. Sodeluje pri mediaciji nastanka kromatinskih zank in se velikokrat veže na TE. Opaženo je bilo, da so TE razpršili veliko vezavnih mest za protein CTCF in smiselno bi bilo, da bi se tudi meje TAD razpršile, vendar je bilo ugotovljeno, da so te zelo ohranjene. Odkrili so različne mehanizme preprečevanja tvorbe ektopičnih meja TAD. Tako se npr. transpozoni B2SINE, ki imajo veliko vezavnih mest za protein CTCF, lahko povežejo s kompleksom ChAHP, ki torej prepozna isti motiv kot CTCF, a z višjo afiniteto. 

==Kodiranje transkripcijskih faktorjev s transpozicijskimi elementi==
Šele nedavno so prišli do dognanj, da proteini, za katere kodirajo transpozicijski elementi, lahko vplivajo na regulacijo genov. Najdeni so bili številni primeri, v katerih gen za TE kodira transpozazo in hkrati tudi gostiteljski transkripcijski faktor. Fuzija transpozazne DNA-domene z regulatorno domeno transkripcijskega faktorja privede do tvorbe proteinskega kompleksa, ki je sposoben prepoznave ustreznega zaporedja TE na DNA, ker transpozaza prepozna transpozicijski element. Tako se lahko optimizira regulacija ekspresije genov s pomočjo TE. 

==Utišanje transpozicijskih elementov in pomen le-tega pri regulaciji transkripcije==
Organizmi so razvili zmožnost zmanjšanja aktivnosti transpozicijskih elementov, prav tako pa so transpozicijski elementi zmožni obiti gostiteljevo obrambo. Eden od načinov utišanja delovanja TE je metilacija DNA. Demetilacija TE lahko vodi do nepravilne aktivacije sosednjih genov zaradi ojačevalnega potenciala TE. Zato so gostitelji morali razviti mehanizem, ki to kontrolira. Pomemben utiševalni mehanizem TE je metilacija CpG otočkov na DNA. Primer povezave med metilacijo DNA in aktivnostjo iz TE izhajajočih cis regulatornih regij je gen Agouti. Ta daje rjavo obarvanim mišim C57BL/6J rumeno obarvanje na način, ki je odvisen od ravni metilacije promotorja, ki nadzoruje transkripcijo retrotranspozonov IAP. Retrotranspozon IAP pa nadzira ekspresijo gena Agouti in s tem obarvanje miši. 

Drug mehanizem utišanja TE so histonske modifikacije. Primer te epigenetske modifikacije je trimetilacija lizina 9 na histonu H3 (H3K9me3). Pomembno vlogo pri tem ima kompleks HUSH (human silencing hub complex). ATPaza MORC2 in HUSH se povežeta in posledično pride do trimetilacije na histonu 3 na retrotranspozonu LINE1 in tako se retrotranspoznon utiša. LINE1 se nahaja v intronih aktivnih genov. Če so ti trimetilirani, potem se RNA polimeraza II ne more pomikati naprej (motena je elongacija transkripcije), zato se geni ne prepisujejo. 

==Transpozicijski elementi in njihova vloga pri regulatornih nekodirajočih molekulah RNA==
Zaradi napredka v določanju nukleotidnega zaporedja molekul RNA se v zadnjih letih odkriva vedno več nekodirajočih molekul RNA (ncRNA). Te vključujejo tudi regulatorne RNA, med katere spadajo kratke nekodirajoče RNA (sncRNA) in dolge nekodirajoče RNA (lncRNA). Transpozicijski elementi (TE) in regulatorne RNA so tesno povezani, saj velik del nukleotidnega zaporedja regulatornih RNA in njihovih genov ter regulatornih regij predstavljajo TE. Transpozicijski elementi določajo funkcionalne lastnosti različnih tipov ncRNA, kar je ključno za njihovo regulatorno funkcijo pri transkripciji in posttranskripcijskih procesih. 

Transpozicijski elementi dajejo strukturne značilnosti lncRNA, ki jim dajejo sposobnost interakcije z drugimi biološkimi molekulami (DNA, RNA, proteini...). lncRNA imajo lahko tako cis kot tudi trans-regulatorno aktivnost. Pojavlja se veliko hipotez, da TE dajejo funkcionalne domene lncRNA. Primer, ki potrjuje to hipotezo, je interakcija med XIST lncRNA in proteinskim kompleksom PRC2 (polycomb repressive complex 2). XIST lncRNA namreč vključuje transpozicijski element ERVB5 in ravno ta regija predstavlja vezavno mesto za PRC2. PRC2 ima vlogo pri zagotavljanju kompaktnosti kromatina, in sicer tako, da ena izmed njegovih podenot EZH2 (Enhancer of zeste homolog 2) katalizira trimetilacijo lizina 27 na histonu 3 (H3K27me1/2/3), s tem pa povzroči represijo transkripcije določenih genov. Fosforilacija EZH2 in T350 (obe sta podenoti PRC2) s CDK1/2 je ključna za interakcijo PRC2 z lncRNA, ki poteka preko G-kvadrupleskne regije lncRNA, le-ta pa je bogata s transpozoni ERVB5. XIST lncRNA pripelje proteinski kompleks PRC2 do promotorske regije tarčnega gena (npr. tumor supresorskega gena), kjer EZH2 s svojo metiltransferazno aktivnostjo deluje kot represor transkripcije. 
Zanimiv primer povezave med transpozicijskimi elementi in nekodirajočo RNA je regulacija odziva na toplotni šok pri miših. Ta primer kaže tudi na trans-regulatorno vlogo nekodirajoče RNA. Mišja ncRNA, ki izhaja iz retrotranspozona B2 SINE, se v normalnih pogojih veže na regulatorne regije genov, ki se odzivajo na stres, ter tako prepreči njihovo transkripcijo. Pri toplotnem šoku se aktivira protein EZH2, ki pospeši razgradnjo te ncRNA ter tako prepreči inhibicijo transkripcije genov, povezanih s stresom (EZH2 stimulira ribocimsko aktivnost same ncRNA). 

Transpozicijski elementi imajo pomembno vlogo pri procesu transkripcije genov za nekodirajoče RNA, saj so vključeni v številna območja njihovih genov in regulatornih regij. Mesta na genomu, na katerih se nahajajo nukleotidna zaporedja, ki izhajajo iz transpozicijskih elementov, so prisotna tako v promotorjih kot tudi na poliA regijah genov za nekodirajoče RNA. Veliko so jih našli tudi na regijah genov za lncRNA, ki so pomembna za spajanje eksonov oz. izrezovanje intronov (splice donor, splice acceptor). 

Veliko molekul miRNA (spadajo med sncRNA) z vključenimi transpozicijskimi elementi interagira s 3' koncem neprevajajoče regije tarčne mRNA (3' UTR). Preko tega procesa se utiša mRNA. Tako se npr. miR-151, ki vsebuje transpozicijske elemente LINE2, veže na molekulo mRNA, ki kodira za ATPAF1 (ATP synthase mitochondrial F1 complex assembly factor 1), in sicer tako, da se poveže s transpozoni LINE2 na 3' koncu neprevajajoče regije tarčne mRNA. 

Vedno bolj se odkriva tudi vloga transpozicijskih elementov pri tvorbi stabilnejših sekundarnih struktur v nekodirajočih RNA. Raziskava, ki je primerjala lncRNA z vključenimi transpozicijskimi elementi in lncRNA brez vključenih transpozicijskih elementov, je ugotovila, da lncRNA z vključenimi transpozicijskimi elementi tvorijo stabilnejše sekundarne strukture. Analizirali so tudi mesta na lncRNA, ki so vključena v bazno parjenje pri tvorbi sekundarnih struktur in ugotovili, da je okrog 82 % teh mest lociranih v Alu regijah lncRNA. Torej, Alu regije v regulatornih RNA sodelujejo pri intramolekularnem baznem parjenju, kar privede do tvorbe stabilnejših sekundarnih struktur, s tem pa tudi do večje stabilnosti nekodirajočih RNA. To jim omogoči, da lahko bolje opravljajo svoje funkcije regulacije transkripcije. 

==Viri in literatura==

[1]R. Fueyo, J. Judd, C. Feschotte, and J. Wysocka, ‘Roles of transposable elements in the regulation of mammalian transcription’, Nat Rev Mol Cell Biol, pp. 1–17, Feb. 2022, doi: 10.1038/s41580-022-00457-y. 
[2]A. Ali, K. Han, and P. Liang, ‘Role of Transposable Elements in Gene Regulation in the Human Genome’, Life (Basel), vol. 11, no. 2, p. 118, Feb. 2021, doi: 10.3390/life11020118. 
[3]P. J. Wittkopp and G. Kalay, ‘Cis-regulatory elements: molecular mechanisms and evolutionary processes underlying divergence’, Nat Rev Genet, vol. 13, no. 1, Art. no. 1, Jan. 2012, doi: 10.1038/nrg3095. 
[4]A. Hao, Y. Wang, D. B. Stovall, Y. Wang, and G. Sui, ‘Emerging Roles of LncRNAs in the EZH2-regulated Oncogenic Network’, Int. J. Biol. Sci., vol. 17, no. 13, pp. 3268–3280, 2021, doi: 10.7150/ijbs.63488. 
[5]N. Liu et al., ‘Selective silencing of euchromatic L1s revealed by genome-wide screens for L1 regulators’, Nature, vol. 553, no. 7687, Art. no. 7687, Jan. 2018, doi: 10.1038/nature25179. 

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

TE kot regulatorji transkripcije

2022-04-24T12:54:51Z

David Valte: /* Funkcije transpozicijskih elementov v cis-regulatornih regijah */

==Uvod==
Transpozicijski elementi (TE), ki sestavljajo velik del evkariontskega genoma, lahko, če se nahajajo v eksonskih predelih gostiteljevega genskega zapisa, bistveno zmanjšajo njegovo evolucijsko sposobnost preživetja, ker delujejo moteče (lahko povzročijo npr. vstavitev start in stop kodonov, premik bralnega okvirja, prehitro terminacijo transkripcije…). S tem zmanjšajo tudi verjetnost za lasten prenos v nove generacije. Ker TE po delovanju spominjajo na parazitski organizem, so se skozi evolucijo razvile strategije, ki preprečujejo preveliko škodo na gostiteljskem organizmu. Prilagajanje je potekalo vzajemno. Gostiteljski organizmi so npr. postali sposobni utišanja transpozicijskih elementov s pomočjo metilacije DNA na CpG otočkih, TE pa so se preferenčno vključevali v intronska zaporedja, saj tam ne delujejo tako moteče. Skozi čas so gostiteljski organizmi postali sposobni uporabe TE v svojo korist. 

Vključitve transpozicijskih elementov v nekodirajoče predele genskega zapisa in njihove mutacije so v veliko primerih povzročile, da so TE izgubili sposobnost transponiranja, pridobili pa so cis in trans-regulatorno aktivnost. Cis-regulatorne regije (CRE) so nekodirajoča zaporedja nukleotidov, ki regulirajo ekspresijo genov na isti verigi DNA. Trans regulacija pa pomeni to, da npr. transkripcijski faktorji prihajajo od drugod oz. so kodirani na eni molekuli DNA, regulirajo pa ekspresijo genov na drugi molekuli DNA. Regulacija transkripcije s TE lahko poteka na več načinov: 

1. V genski zapis lahko vnašajo nova vezavna mesta za transkripcijske faktorje (TF) preko promotorjev, ojačevalcev, utiševalnih in izolatorskih zaporedij. 
2. Lahko modulirajo 3D strukturo kromatina. 
3. Zmožni so kodiranja transkripcijskih faktorjev. 
4. S povezovanjem z represorskimi transkripcijskimi faktorji vplivajo na utišanje sosednjih genov. 
5. Imajo vlogo pri regulatornih nekodirajočih molekulah RNA, ki so pomembni regulatorji transkripcije. 

==Funkcije transpozicijskih elementov v cis-regulatornih regijah ==
Regulatorne sposobnosti cis-regulatornih regij lahko izhajajo iz transpozicijskih elementov. Cis-regulatorne regije tvorijo specifična vezavna mesta za proteine povezane z iniciacijo in regulacijo transkripcije. Primeri nekaterih vrst CRE: 

1. Promotorji so kratka zaporedja DNA, ki vključujejo začetno mesto transkripcije. Ob vezavi ustreznih transkripcijskih faktorjev na promotorsko regijo omogočijo transkripcijo gena. Kot primer bi omenil transpozon AluSp v promotorju gena FCER1G, ki inducira transkripcijo visokoafinitetnega receptorja za Fc regijo IgE. 
2. Ojačevalci so zaporedja, ki jih najdemo pred ali za genom, ki ga regulirajo. Delujejo kooperativno s promotorjem, in sicer tako, da povečajo stopnjo transkripcije, omogočajo pa regulacijo tudi bolj oddaljenih genov. Kot primer bi omenil transpozon AluY v intronu gena CD8 (ta kodira glikoprotein CD8, ki je pomemben pri celičnih interakcijah znotraj imunskega sistema), za katerega so ugotovili, da deluje kot ojačevalec. 
3. Utiševalna zaporedja vežejo represorje in tako preprečujejo transkripcijo. Transpozicijski elementi so z rekrutiranjem transkripcijskih faktorjev postali sposobni delovati kot utiševalna zaporedja, ki remodelirajo kromatin. Čeprav so heterokromatinski deli revni z geni, so bogati s TE-ji, kar bi lahko pomenilo, da imajo transpozicijski elementi pomembno vlogo pri širjenju heterokromatina. Tako se npr. korepresorski protein TRIM28 veže na vezavno mesto, ki se nahaja na transpozonu ERV in s tem utiša sosednje gene. 
4. Inzulatorji ščitijo gene pred regulatornimi vplivi sosednjih genov. Lahko blokirajo promotorje, ojačevalce in utiševalce. Preprečujejo neprimerne interakcije med sosednjimi kromatinskimi regijami. Kot primer bi omenil gen za transpozon AluSq, ki deluje kot inzulator, saj njegova transkripcija ščiti človeški gen HBE1 (ki kodira za istoimenski protein) pred regulacijo z drugimi promotorji. 

TE-ji uvajajo nova vezavna mesta za TF, ki so v njih lahko prisotna takoj po inserciji v genom ali pa nastanejo de novo s postinsercijskimi mutacijami. Pogosto se mutacije pojavljajo na metiliranih CpG otočkih. Deaminacija teh povzroči zamenjavo citozina z gvaninom, kar je med drugim povzročilo nastanek številnih vezavnih mest za transkripcijska faktorja cMyc in p53. Vključitev TE-jev zraven že obstoječega vezavnega mesta za transkripcijske faktorje ter točkovne mutacije omogočijo nastanek novih mest za vezavo TF (alternativni promotorji), kar povzroča zaščito pred možnimi kasnejšimi mutacijami z redundančnostjo. Redundanca dopušča tudi kooperativno delovanje z zunanjimi promotorji, saj se lahko tako razbremenijo določena vezavna mesta za transkripcijske faktorje. 

==Vpliv transpozicijskih elementov na kromatinsko 3D strukturo==
V interfaznem jedru so deli genoma organizirani v topološko asociirajoče domene (TAD). To so večje domene kromatina, ki so med seboj ločene z izolatorskimi proteini. Ti omejujejo prostor, v katerem lahko različni deli DNA prihajajo v medsebojne stike. Njihova naloga je tudi prostorsko omejevanje interakcij med transkripcijskimi faktorji in ojačevalci ter promotorji. TAD specificirajo funkcije cis regulatornih regij z omejevanjem ojačevalcev, tako da ti aktivirajo le promotorje znotraj iste TAD. Vloga transpozicijskih elementov (TE) pri 3D arhitekturi genoma se je v zadnjih letih začela intenzivno raziskovati. Številne družine TE so namreč obogatene na mejah TAD. Določeni TE naj bi imeli preko tega tudi vlogo pri zvijanju kromosomov, prav tako pa tudi pri kompaktnosti kromatina in posledično tudi pri regulaciji procesov transkripcije. Kot primer pomena transpozicijskih elementov bi izpostavil študijo, ki je odkrila veliko HERV-H na mejah TAD v človeških embrionalnih matičnih celicah (hESCs) in delecija 2 individualnih HERV-H je vodila do izgube kompaktnosti te meje. 

Protein CTCF (11-zinc finger protein) je pomemben pri regulaciji 3D strukture kromatina in procesov transkripcije. Zelo pomemben je pri strukturi mej TAD. Vsebuje motive cinkovega prsta in deluje kot transkripcijski faktor. Sodeluje pri mediaciji nastanka kromatinskih zank in se velikokrat veže na TE. Opaženo je bilo, da so TE razpršili veliko vezavnih mest za protein CTCF in smiselno bi bilo, da bi se tudi meje TAD razpršile, vendar je bilo ugotovljeno, da so te zelo ohranjene. Odkrili so različne mehanizme preprečevanja tvorbe ektopičnih meja TAD. Tako se npr. transpozoni B2SINE, ki imajo veliko vezavnih mest za protein CTCF, lahko povežejo s kompleksom ChAHP, ki torej prepozna isti motiv kot CTCF, a z višjo afiniteto. 

==Kodiranje transkripcijskih faktorjev s transpozicijskimi elementi==
Šele nedavno so prišli do dognanj, da proteini, za katere kodirajo transpozicijski elementi, lahko vplivajo na regulacijo genov. Najdeni so bili številni primeri, v katerih gen za TE kodira transpozazo in hkrati tudi gostiteljski transkripcijski faktor. Fuzija transpozazne DNA-domene z regulatorno domeno transkripcijskega faktorja privede do tvorbe proteinskega kompleksa, ki je sposoben prepoznave ustreznega zaporedja TE na DNA, ker transpozaza prepozna transpozicijski element. Tako se lahko optimizira regulacija ekspresije genov s pomočjo TE. 

==Utišanje transpozicijskih elementov in pomen le-tega pri regulaciji transkripcije==
Organizmi so razvili zmožnost zmanjšanja aktivnosti transpozicijskih elementov, prav tako pa so transpozicijski elementi zmožni obiti gostiteljevo obrambo. Eden od načinov utišanja delovanja TE je metilacija DNA. Demetilacija TE lahko vodi do nepravilne aktivacije sosednjih genov zaradi ojačevalnega potenciala TE. Zato so gostitelji morali razviti mehanizem, ki to kontrolira. Pomemben utiševalni mehanizem TE je metilacija CpG otočkov na DNA. Primer povezave med metilacijo DNA in aktivnostjo iz TE izhajajočih cis regulatornih regij je gen Agouti. Ta daje rjavo obarvanim mišim C57BL/6J rumeno obarvanje na način, ki je odvisen od ravni metilacije promotorja, ki nadzoruje transkripcijo retrotranspozonov IAP. Retrotranspozon IAP pa nadzira ekspresijo gena Agouti in s tem obarvanje miši. 

Drug mehanizem utišanja TE so histonske modifikacije. Primer te epigenetske modifikacije je trimetilacija lizina 9 na histonu H3 (H3K9me3). Pomembno vlogo pri tem ima kompleks HUSH (human silencing hub complex). ATPaza MORC2 in HUSH se povežeta in posledično pride do trimetilacije na histonu 3 na retrotranspozonu LINE1 in tako se retrotranspoznon utiša. LINE1 se nahaja v intronih aktivnih genov. Če so ti trimetilirani, potem se RNA polimeraza II ne more pomikati naprej (motena je elongacija transkripcije), zato se geni ne prepisujejo. 

==Transpozicijski elementi in njihova vloga pri regulatornih nekodirajočih molekulah RNA==
Zaradi napredka v določanju nukleotidnega zaporedja molekul RNA se v zadnjih letih odkriva vedno več nekodirajočih molekul RNA (ncRNA). Te vključujejo tudi regulatorne RNA, med katere spadajo kratke nekodirajoče RNA (sncRNA) in dolge nekodirajoče RNA (lncRNA). Transpozicijski elementi (TE) in regulatorne RNA so tesno povezani, saj velik del nukleotidnega zaporedja regulatornih RNA in njihovih genov ter regulatornih regij predstavljajo TE. Transpozicijski elementi določajo funkcionalne lastnosti različnih tipov ncRNA, kar je ključno za njihovo regulatorno funkcijo pri transkripciji in posttranskripcijskih procesih. 

Transpozicijski elementi dajejo strukturne značilnosti lncRNA, ki jim dajejo sposobnost interakcije z drugimi biološkimi molekulami (DNA, RNA, proteini...). lncRNA imajo lahko tako cis kot tudi trans-regulatorno aktivnost. Pojavlja se veliko hipotez, da TE dajejo funkcionalne domene lncRNA. Primer, ki potrjuje to hipotezo, je interakcija med XIST lncRNA in proteinskim kompleksom PRC2 (polycomb repressive complex 2). XIST lncRNA namreč vključuje transpozicijski element ERVB5 in ravno ta regija predstavlja vezavno mesto za PRC2. PRC2 ima vlogo pri zagotavljanju kompaktnosti kromatina, in sicer tako, da ena izmed njegovih podenot EZH2 (Enhancer of zeste homolog 2) katalizira trimetilacijo lizina 27 na histonu 3 (H3K27me1/2/3), s tem pa povzroči represijo transkripcije določenih genov. Fosforilacija EZH2 in T350 (obe sta podenoti PRC2) s CDK1/2 je ključna za interakcijo PRC2 z lncRNA, ki poteka preko G-kvadrupleskne regije lncRNA, le-ta pa je bogata s transpozoni ERVB5. XIST lncRNA pripelje proteinski kompleks PRC2 do promotorske regije tarčnega gena (npr. tumor supresorskega gena), kjer EZH2 s svojo metiltransferazno aktivnostjo deluje kot represor transkripcije. 
Zanimiv primer povezave med transpozicijskimi elementi in nekodirajočo RNA je regulacija odziva na toplotni šok pri miših. Ta primer kaže tudi na trans-regulatorno vlogo nekodirajoče RNA. Mišja ncRNA, ki izhaja iz retrotranspozona B2 SINE, se v normalnih pogojih veže na regulatorne regije genov, ki se odzivajo na stres, ter tako prepreči njihovo transkripcijo. Pri toplotnem šoku se aktivira protein EZH2, ki pospeši razgradnjo te ncRNA ter tako prepreči inhibicijo transkripcije genov, povezanih s stresom (EZH2 stimulira ribocimsko aktivnost same ncRNA). 

Transpozicijski elementi imajo pomembno vlogo pri procesu transkripcije genov za nekodirajoče RNA, saj so vključeni v številna območja njihovih genov in regulatornih regij. Mesta na genomu, na katerih se nahajajo nukleotidna zaporedja, ki izhajajo iz transpozicijskih elementov, so prisotna tako v promotorjih kot tudi na poliA regijah genov za nekodirajoče RNA. Veliko so jih našli tudi na regijah genov za lncRNA, ki so pomembna za spajanje eksonov oz. izrezovanje intronov (splice donor, splice acceptor). 

Veliko molekul miRNA (spadajo med sncRNA) z vključenimi transpozicijskimi elementi interagira s 3' koncem neprevajajoče regije tarčne mRNA (3' UTR). Preko tega procesa se utiša mRNA. Tako se npr. miR-151, ki vsebuje transpozicijske elemente LINE2, veže na molekulo mRNA, ki kodira za ATPAF1 (ATP synthase mitochondrial F1 complex assembly factor 1), in sicer tako, da se poveže s transpozoni LINE2 na 3' koncu neprevajajoče regije tarčne mRNA. 

Vedno bolj se odkriva tudi vloga transpozicijskih elementov pri tvorbi stabilnejših sekundarnih struktur v nekodirajočih RNA. Raziskava, ki je primerjala lncRNA z vključenimi transpozicijskimi elementi in lncRNA brez vključenih transpozicijskih elementov, je ugotovila, da lncRNA z vključenimi transpozicijskimi elementi tvorijo stabilnejše sekundarne strukture. Analizirali so tudi mesta na lncRNA, ki so vključena v bazno parjenje pri tvorbi sekundarnih struktur in ugotovili, da je okrog 82 % teh mest lociranih v Alu regijah lncRNA. Torej, Alu regije v regulatornih RNA sodelujejo pri intramolekularnem baznem parjenju, kar privede do tvorbe stabilnejših sekundarnih struktur, s tem pa tudi do večje stabilnosti nekodirajočih RNA. To jim omogoči, da lahko bolje opravljajo svoje funkcije regulacije transkripcije. 

==Viri in literatura==

[1]R. Fueyo, J. Judd, C. Feschotte, and J. Wysocka, ‘Roles of transposable elements in the regulation of mammalian transcription’, Nat Rev Mol Cell Biol, pp. 1–17, Feb. 2022, doi: 10.1038/s41580-022-00457-y. 
[2]A. Ali, K. Han, and P. Liang, ‘Role of Transposable Elements in Gene Regulation in the Human Genome’, Life (Basel), vol. 11, no. 2, p. 118, Feb. 2021, doi: 10.3390/life11020118. 
[3]P. J. Wittkopp and G. Kalay, ‘Cis-regulatory elements: molecular mechanisms and evolutionary processes underlying divergence’, Nat Rev Genet, vol. 13, no. 1, Art. no. 1, Jan. 2012, doi: 10.1038/nrg3095. 
[4]A. Hao, Y. Wang, D. B. Stovall, Y. Wang, and G. Sui, ‘Emerging Roles of LncRNAs in the EZH2-regulated Oncogenic Network’, Int. J. Biol. Sci., vol. 17, no. 13, pp. 3268–3280, 2021, doi: 10.7150/ijbs.63488. 
[5]N. Liu et al., ‘Selective silencing of euchromatic L1s revealed by genome-wide screens for L1 regulators’, Nature, vol. 553, no. 7687, Art. no. 7687, Jan. 2018, doi: 10.1038/nature25179. 

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

TE kot regulatorji transkripcije

2022-04-24T12:52:32Z

David Valte: /* Uvod */

==Uvod==
Transpozicijski elementi (TE), ki sestavljajo velik del evkariontskega genoma, lahko, če se nahajajo v eksonskih predelih gostiteljevega genskega zapisa, bistveno zmanjšajo njegovo evolucijsko sposobnost preživetja, ker delujejo moteče (lahko povzročijo npr. vstavitev start in stop kodonov, premik bralnega okvirja, prehitro terminacijo transkripcije…). S tem zmanjšajo tudi verjetnost za lasten prenos v nove generacije. Ker TE po delovanju spominjajo na parazitski organizem, so se skozi evolucijo razvile strategije, ki preprečujejo preveliko škodo na gostiteljskem organizmu. Prilagajanje je potekalo vzajemno. Gostiteljski organizmi so npr. postali sposobni utišanja transpozicijskih elementov s pomočjo metilacije DNA na CpG otočkih, TE pa so se preferenčno vključevali v intronska zaporedja, saj tam ne delujejo tako moteče. Skozi čas so gostiteljski organizmi postali sposobni uporabe TE v svojo korist. 

Vključitve transpozicijskih elementov v nekodirajoče predele genskega zapisa in njihove mutacije so v veliko primerih povzročile, da so TE izgubili sposobnost transponiranja, pridobili pa so cis in trans-regulatorno aktivnost. Cis-regulatorne regije (CRE) so nekodirajoča zaporedja nukleotidov, ki regulirajo ekspresijo genov na isti verigi DNA. Trans regulacija pa pomeni to, da npr. transkripcijski faktorji prihajajo od drugod oz. so kodirani na eni molekuli DNA, regulirajo pa ekspresijo genov na drugi molekuli DNA. Regulacija transkripcije s TE lahko poteka na več načinov: 

1. V genski zapis lahko vnašajo nova vezavna mesta za transkripcijske faktorje (TF) preko promotorjev, ojačevalcev, utiševalnih in izolatorskih zaporedij. 
2. Lahko modulirajo 3D strukturo kromatina. 
3. Zmožni so kodiranja transkripcijskih faktorjev. 
4. S povezovanjem z represorskimi transkripcijskimi faktorji vplivajo na utišanje sosednjih genov. 
5. Imajo vlogo pri regulatornih nekodirajočih molekulah RNA, ki so pomembni regulatorji transkripcije. 

==Funkcije transpozicijskih elementov v cis-regulatornih regijah ==
Regulatorne sposobnosti cis-regulatornih regij lahko izhajajo iz transpozicijskih elementov. V splošnem cis-regulatorne regije delujejo tako, da tvorijo specifična vezavna mesta za proteine povezane z iniciacijo in regulacijo transkripcije. Primeri nekaterih vrst CRE: 

1. Promotorji so kratka zaporedja DNA, ki vključujejo začetno mesto transkripcije. Ob vezavi ustreznih transkripcijskih faktorjev na promotorsko regijo omogočijo transkripcijo gena. Kot primer bi omenil transpozon AluSp v promotorju gena FCER1G, ki inducira transkripcijo visokoafinitetnega receptorja za Fc regijo IgE. 
2. Ojačevalci so zaporedja, ki jih najdemo pred ali za genom, ki ga regulirajo. Delujejo kooperativno s promotorjem, in sicer tako, da povečajo stopnjo transkripcije, omogočajo pa regulacijo tudi bolj oddaljenih genov. Kot primer bi omenil transpozon AluY v intronu gena CD8 (ta kodira glikoprotein CD8, ki je pomemben pri celičnih interakcijah znotraj imunskega sistema), za katerega so ugotovili, da deluje kot ojačevalec. 
3. Utiševalna zaporedja vežejo represorje in tako preprečujejo transkripcijo. Transpozicijski elementi so z rekrutiranjem transkripcijskih faktorjev postali sposobni delovati kot utiševalna zaporedja, ki remodelirajo kromatin. Čeprav so heterokromatinski deli revni z geni, so bogati s TE-ji, kar bi lahko pomenilo, da imajo transpozicijski elementi pomembno vlogo pri širjenju heterokromatina. Tako se npr. korepresorski protein TRIM28 veže na vezavno mesto, ki se nahaja na transpozonu ERV in s tem utiša sosednje gene. 
4. Inzulatorji ščitijo gene pred regulatornimi vplivi sosednjih genov. Lahko blokirajo promotorje, ojačevalce in utiševalce. Preprečujejo neprimerne interakcije med sosednjimi kromatinskimi regijami. Kot primer bi omenil gen za transpozon AluSq, ki deluje kot inzulator, saj njegova transkripcija ščiti človeški gen HBE1 (ki kodira za istoimenski protein) pred regulacijo z drugimi promotorji. 

TE-ji uvajajo nova vezavna mesta za TF, ki so v njih lahko prisotna takoj po inserciji v genom ali pa nastanejo de novo s postinsercijskimi mutacijami. Pogosto se mutacije pojavljajo na metiliranih CpG otočkih. Deaminacija teh povzroči zamenjavo citozina z gvaninom, kar je med drugim povzročilo nastanek številnih vezavnih mest za transkripcijska faktorja cMyc in p53. Vključitev TE-jev zraven že obstoječega vezavnega mesta za transkripcijske faktorje ter točkovne mutacije omogočijo nastanek novih mest za vezavo TF (alternativni promotorji), kar povzroča zaščito pred možnimi kasnejšimi mutacijami z redundančnostjo. Redundanca dopušča tudi kooperativno delovanje z zunanjimi promotorji, saj se lahko tako razbremenijo določena vezavna mesta za transkripcijske faktorje. 

==Vpliv transpozicijskih elementov na kromatinsko 3D strukturo==
V interfaznem jedru so deli genoma organizirani v topološko asociirajoče domene (TAD). To so večje domene kromatina, ki so med seboj ločene z izolatorskimi proteini. Ti omejujejo prostor, v katerem lahko različni deli DNA prihajajo v medsebojne stike. Njihova naloga je tudi prostorsko omejevanje interakcij med transkripcijskimi faktorji in ojačevalci ter promotorji. TAD specificirajo funkcije cis regulatornih regij z omejevanjem ojačevalcev, tako da ti aktivirajo le promotorje znotraj iste TAD. Vloga transpozicijskih elementov (TE) pri 3D arhitekturi genoma se je v zadnjih letih začela intenzivno raziskovati. Številne družine TE so namreč obogatene na mejah TAD. Določeni TE naj bi imeli preko tega tudi vlogo pri zvijanju kromosomov, prav tako pa tudi pri kompaktnosti kromatina in posledično tudi pri regulaciji procesov transkripcije. Kot primer pomena transpozicijskih elementov bi izpostavil študijo, ki je odkrila veliko HERV-H na mejah TAD v človeških embrionalnih matičnih celicah (hESCs) in delecija 2 individualnih HERV-H je vodila do izgube kompaktnosti te meje. 

Protein CTCF (11-zinc finger protein) je pomemben pri regulaciji 3D strukture kromatina in procesov transkripcije. Zelo pomemben je pri strukturi mej TAD. Vsebuje motive cinkovega prsta in deluje kot transkripcijski faktor. Sodeluje pri mediaciji nastanka kromatinskih zank in se velikokrat veže na TE. Opaženo je bilo, da so TE razpršili veliko vezavnih mest za protein CTCF in smiselno bi bilo, da bi se tudi meje TAD razpršile, vendar je bilo ugotovljeno, da so te zelo ohranjene. Odkrili so različne mehanizme preprečevanja tvorbe ektopičnih meja TAD. Tako se npr. transpozoni B2SINE, ki imajo veliko vezavnih mest za protein CTCF, lahko povežejo s kompleksom ChAHP, ki torej prepozna isti motiv kot CTCF, a z višjo afiniteto. 

==Kodiranje transkripcijskih faktorjev s transpozicijskimi elementi==
Šele nedavno so prišli do dognanj, da proteini, za katere kodirajo transpozicijski elementi, lahko vplivajo na regulacijo genov. Najdeni so bili številni primeri, v katerih gen za TE kodira transpozazo in hkrati tudi gostiteljski transkripcijski faktor. Fuzija transpozazne DNA-domene z regulatorno domeno transkripcijskega faktorja privede do tvorbe proteinskega kompleksa, ki je sposoben prepoznave ustreznega zaporedja TE na DNA, ker transpozaza prepozna transpozicijski element. Tako se lahko optimizira regulacija ekspresije genov s pomočjo TE. 

==Utišanje transpozicijskih elementov in pomen le-tega pri regulaciji transkripcije==
Organizmi so razvili zmožnost zmanjšanja aktivnosti transpozicijskih elementov, prav tako pa so transpozicijski elementi zmožni obiti gostiteljevo obrambo. Eden od načinov utišanja delovanja TE je metilacija DNA. Demetilacija TE lahko vodi do nepravilne aktivacije sosednjih genov zaradi ojačevalnega potenciala TE. Zato so gostitelji morali razviti mehanizem, ki to kontrolira. Pomemben utiševalni mehanizem TE je metilacija CpG otočkov na DNA. Primer povezave med metilacijo DNA in aktivnostjo iz TE izhajajočih cis regulatornih regij je gen Agouti. Ta daje rjavo obarvanim mišim C57BL/6J rumeno obarvanje na način, ki je odvisen od ravni metilacije promotorja, ki nadzoruje transkripcijo retrotranspozonov IAP. Retrotranspozon IAP pa nadzira ekspresijo gena Agouti in s tem obarvanje miši. 

Drug mehanizem utišanja TE so histonske modifikacije. Primer te epigenetske modifikacije je trimetilacija lizina 9 na histonu H3 (H3K9me3). Pomembno vlogo pri tem ima kompleks HUSH (human silencing hub complex). ATPaza MORC2 in HUSH se povežeta in posledično pride do trimetilacije na histonu 3 na retrotranspozonu LINE1 in tako se retrotranspoznon utiša. LINE1 se nahaja v intronih aktivnih genov. Če so ti trimetilirani, potem se RNA polimeraza II ne more pomikati naprej (motena je elongacija transkripcije), zato se geni ne prepisujejo. 

==Transpozicijski elementi in njihova vloga pri regulatornih nekodirajočih molekulah RNA==
Zaradi napredka v določanju nukleotidnega zaporedja molekul RNA se v zadnjih letih odkriva vedno več nekodirajočih molekul RNA (ncRNA). Te vključujejo tudi regulatorne RNA, med katere spadajo kratke nekodirajoče RNA (sncRNA) in dolge nekodirajoče RNA (lncRNA). Transpozicijski elementi (TE) in regulatorne RNA so tesno povezani, saj velik del nukleotidnega zaporedja regulatornih RNA in njihovih genov ter regulatornih regij predstavljajo TE. Transpozicijski elementi določajo funkcionalne lastnosti različnih tipov ncRNA, kar je ključno za njihovo regulatorno funkcijo pri transkripciji in posttranskripcijskih procesih. 

Transpozicijski elementi dajejo strukturne značilnosti lncRNA, ki jim dajejo sposobnost interakcije z drugimi biološkimi molekulami (DNA, RNA, proteini...). lncRNA imajo lahko tako cis kot tudi trans-regulatorno aktivnost. Pojavlja se veliko hipotez, da TE dajejo funkcionalne domene lncRNA. Primer, ki potrjuje to hipotezo, je interakcija med XIST lncRNA in proteinskim kompleksom PRC2 (polycomb repressive complex 2). XIST lncRNA namreč vključuje transpozicijski element ERVB5 in ravno ta regija predstavlja vezavno mesto za PRC2. PRC2 ima vlogo pri zagotavljanju kompaktnosti kromatina, in sicer tako, da ena izmed njegovih podenot EZH2 (Enhancer of zeste homolog 2) katalizira trimetilacijo lizina 27 na histonu 3 (H3K27me1/2/3), s tem pa povzroči represijo transkripcije določenih genov. Fosforilacija EZH2 in T350 (obe sta podenoti PRC2) s CDK1/2 je ključna za interakcijo PRC2 z lncRNA, ki poteka preko G-kvadrupleskne regije lncRNA, le-ta pa je bogata s transpozoni ERVB5. XIST lncRNA pripelje proteinski kompleks PRC2 do promotorske regije tarčnega gena (npr. tumor supresorskega gena), kjer EZH2 s svojo metiltransferazno aktivnostjo deluje kot represor transkripcije. 
Zanimiv primer povezave med transpozicijskimi elementi in nekodirajočo RNA je regulacija odziva na toplotni šok pri miših. Ta primer kaže tudi na trans-regulatorno vlogo nekodirajoče RNA. Mišja ncRNA, ki izhaja iz retrotranspozona B2 SINE, se v normalnih pogojih veže na regulatorne regije genov, ki se odzivajo na stres, ter tako prepreči njihovo transkripcijo. Pri toplotnem šoku se aktivira protein EZH2, ki pospeši razgradnjo te ncRNA ter tako prepreči inhibicijo transkripcije genov, povezanih s stresom (EZH2 stimulira ribocimsko aktivnost same ncRNA). 

Transpozicijski elementi imajo pomembno vlogo pri procesu transkripcije genov za nekodirajoče RNA, saj so vključeni v številna območja njihovih genov in regulatornih regij. Mesta na genomu, na katerih se nahajajo nukleotidna zaporedja, ki izhajajo iz transpozicijskih elementov, so prisotna tako v promotorjih kot tudi na poliA regijah genov za nekodirajoče RNA. Veliko so jih našli tudi na regijah genov za lncRNA, ki so pomembna za spajanje eksonov oz. izrezovanje intronov (splice donor, splice acceptor). 

Veliko molekul miRNA (spadajo med sncRNA) z vključenimi transpozicijskimi elementi interagira s 3' koncem neprevajajoče regije tarčne mRNA (3' UTR). Preko tega procesa se utiša mRNA. Tako se npr. miR-151, ki vsebuje transpozicijske elemente LINE2, veže na molekulo mRNA, ki kodira za ATPAF1 (ATP synthase mitochondrial F1 complex assembly factor 1), in sicer tako, da se poveže s transpozoni LINE2 na 3' koncu neprevajajoče regije tarčne mRNA. 

Vedno bolj se odkriva tudi vloga transpozicijskih elementov pri tvorbi stabilnejših sekundarnih struktur v nekodirajočih RNA. Raziskava, ki je primerjala lncRNA z vključenimi transpozicijskimi elementi in lncRNA brez vključenih transpozicijskih elementov, je ugotovila, da lncRNA z vključenimi transpozicijskimi elementi tvorijo stabilnejše sekundarne strukture. Analizirali so tudi mesta na lncRNA, ki so vključena v bazno parjenje pri tvorbi sekundarnih struktur in ugotovili, da je okrog 82 % teh mest lociranih v Alu regijah lncRNA. Torej, Alu regije v regulatornih RNA sodelujejo pri intramolekularnem baznem parjenju, kar privede do tvorbe stabilnejših sekundarnih struktur, s tem pa tudi do večje stabilnosti nekodirajočih RNA. To jim omogoči, da lahko bolje opravljajo svoje funkcije regulacije transkripcije. 

==Viri in literatura==

[1]R. Fueyo, J. Judd, C. Feschotte, and J. Wysocka, ‘Roles of transposable elements in the regulation of mammalian transcription’, Nat Rev Mol Cell Biol, pp. 1–17, Feb. 2022, doi: 10.1038/s41580-022-00457-y. 
[2]A. Ali, K. Han, and P. Liang, ‘Role of Transposable Elements in Gene Regulation in the Human Genome’, Life (Basel), vol. 11, no. 2, p. 118, Feb. 2021, doi: 10.3390/life11020118. 
[3]P. J. Wittkopp and G. Kalay, ‘Cis-regulatory elements: molecular mechanisms and evolutionary processes underlying divergence’, Nat Rev Genet, vol. 13, no. 1, Art. no. 1, Jan. 2012, doi: 10.1038/nrg3095. 
[4]A. Hao, Y. Wang, D. B. Stovall, Y. Wang, and G. Sui, ‘Emerging Roles of LncRNAs in the EZH2-regulated Oncogenic Network’, Int. J. Biol. Sci., vol. 17, no. 13, pp. 3268–3280, 2021, doi: 10.7150/ijbs.63488. 
[5]N. Liu et al., ‘Selective silencing of euchromatic L1s revealed by genome-wide screens for L1 regulators’, Nature, vol. 553, no. 7687, Art. no. 7687, Jan. 2018, doi: 10.1038/nature25179. 

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

TE kot regulatorji transkripcije

2022-04-24T12:51:49Z

David Valte: /* Uvod */

==Uvod==
Transpozicijski elementi (TE), ki sestavljajo velik del evkariontskega genoma, lahko, če se nahajajo v eksonskih predelih gostiteljevega genskega zapisa, bistveno zmanjšajo njegovo evolucijsko sposobnost preživetja, ker delujejo moteče (lahko povzročijo npr. vstavitev start in stop kodonov, premik bralnega okvirja, prehitro terminacijo transkripcije,…). S tem zmanjšajo tudi verjetnost za lasten prenos v nove generacije. Ker TE po delovanju spominjajo na parazitski organizem, so se skozi evolucijo razvile strategije, ki preprečujejo preveliko škodo na gostiteljskem organizmu. Prilagajanje je potekalo vzajemno. Gostiteljski organizmi so npr. postali sposobni utišanja transpozicijskih elementov s pomočjo metilacije DNA na CpG otočkih, TE pa so se preferenčno vključevali v intronska zaporedja, saj tam ne delujejo tako moteče. Skozi čas so gostiteljski organizmi postali sposobni uporabe TE v svojo korist. 

Vključitve transpozicijskih elementov v nekodirajoče predele genskega zapisa in njihove mutacije so v veliko primerih povzročile, da so TE izgubili sposobnost transponiranja, pridobili pa so cis in trans-regulatorno aktivnost. Cis-regulatorne regije (CRE) so nekodirajoča zaporedja nukleotidov, ki regulirajo ekspresijo genov na isti verigi DNA. Trans regulacija pa pomeni to, da npr. transkripcijski faktorji prihajajo od drugod oz. so kodirani na eni molekuli DNA, regulirajo pa ekspresijo genov na drugi molekuli DNA. Regulacija transkripcije s TE lahko poteka na več načinov: 

1. V genski zapis lahko vnašajo nova vezavna mesta za transkripcijske faktorje (TF) preko promotorjev, ojačevalcev, utiševalnih in izolatorskih zaporedij. 
2. Lahko modulirajo 3D strukturo kromatina. 
3. Zmožni so kodiranja transkripcijskih faktorjev. 
4. S povezovanjem z represorskimi transkripcijskimi faktorji vplivajo na utišanje sosednjih genov. 
5. Imajo vlogo pri regulatornih nekodirajočih molekulah RNA, ki so pomembni regulatorji transkripcije. 

==Funkcije transpozicijskih elementov v cis-regulatornih regijah ==
Regulatorne sposobnosti cis-regulatornih regij lahko izhajajo iz transpozicijskih elementov. V splošnem cis-regulatorne regije delujejo tako, da tvorijo specifična vezavna mesta za proteine povezane z iniciacijo in regulacijo transkripcije. Primeri nekaterih vrst CRE: 

1. Promotorji so kratka zaporedja DNA, ki vključujejo začetno mesto transkripcije. Ob vezavi ustreznih transkripcijskih faktorjev na promotorsko regijo omogočijo transkripcijo gena. Kot primer bi omenil transpozon AluSp v promotorju gena FCER1G, ki inducira transkripcijo visokoafinitetnega receptorja za Fc regijo IgE. 
2. Ojačevalci so zaporedja, ki jih najdemo pred ali za genom, ki ga regulirajo. Delujejo kooperativno s promotorjem, in sicer tako, da povečajo stopnjo transkripcije, omogočajo pa regulacijo tudi bolj oddaljenih genov. Kot primer bi omenil transpozon AluY v intronu gena CD8 (ta kodira glikoprotein CD8, ki je pomemben pri celičnih interakcijah znotraj imunskega sistema), za katerega so ugotovili, da deluje kot ojačevalec. 
3. Utiševalna zaporedja vežejo represorje in tako preprečujejo transkripcijo. Transpozicijski elementi so z rekrutiranjem transkripcijskih faktorjev postali sposobni delovati kot utiševalna zaporedja, ki remodelirajo kromatin. Čeprav so heterokromatinski deli revni z geni, so bogati s TE-ji, kar bi lahko pomenilo, da imajo transpozicijski elementi pomembno vlogo pri širjenju heterokromatina. Tako se npr. korepresorski protein TRIM28 veže na vezavno mesto, ki se nahaja na transpozonu ERV in s tem utiša sosednje gene. 
4. Inzulatorji ščitijo gene pred regulatornimi vplivi sosednjih genov. Lahko blokirajo promotorje, ojačevalce in utiševalce. Preprečujejo neprimerne interakcije med sosednjimi kromatinskimi regijami. Kot primer bi omenil gen za transpozon AluSq, ki deluje kot inzulator, saj njegova transkripcija ščiti človeški gen HBE1 (ki kodira za istoimenski protein) pred regulacijo z drugimi promotorji. 

TE-ji uvajajo nova vezavna mesta za TF, ki so v njih lahko prisotna takoj po inserciji v genom ali pa nastanejo de novo s postinsercijskimi mutacijami. Pogosto se mutacije pojavljajo na metiliranih CpG otočkih. Deaminacija teh povzroči zamenjavo citozina z gvaninom, kar je med drugim povzročilo nastanek številnih vezavnih mest za transkripcijska faktorja cMyc in p53. Vključitev TE-jev zraven že obstoječega vezavnega mesta za transkripcijske faktorje ter točkovne mutacije omogočijo nastanek novih mest za vezavo TF (alternativni promotorji), kar povzroča zaščito pred možnimi kasnejšimi mutacijami z redundančnostjo. Redundanca dopušča tudi kooperativno delovanje z zunanjimi promotorji, saj se lahko tako razbremenijo določena vezavna mesta za transkripcijske faktorje. 

==Vpliv transpozicijskih elementov na kromatinsko 3D strukturo==
V interfaznem jedru so deli genoma organizirani v topološko asociirajoče domene (TAD). To so večje domene kromatina, ki so med seboj ločene z izolatorskimi proteini. Ti omejujejo prostor, v katerem lahko različni deli DNA prihajajo v medsebojne stike. Njihova naloga je tudi prostorsko omejevanje interakcij med transkripcijskimi faktorji in ojačevalci ter promotorji. TAD specificirajo funkcije cis regulatornih regij z omejevanjem ojačevalcev, tako da ti aktivirajo le promotorje znotraj iste TAD. Vloga transpozicijskih elementov (TE) pri 3D arhitekturi genoma se je v zadnjih letih začela intenzivno raziskovati. Številne družine TE so namreč obogatene na mejah TAD. Določeni TE naj bi imeli preko tega tudi vlogo pri zvijanju kromosomov, prav tako pa tudi pri kompaktnosti kromatina in posledično tudi pri regulaciji procesov transkripcije. Kot primer pomena transpozicijskih elementov bi izpostavil študijo, ki je odkrila veliko HERV-H na mejah TAD v človeških embrionalnih matičnih celicah (hESCs) in delecija 2 individualnih HERV-H je vodila do izgube kompaktnosti te meje. 

Protein CTCF (11-zinc finger protein) je pomemben pri regulaciji 3D strukture kromatina in procesov transkripcije. Zelo pomemben je pri strukturi mej TAD. Vsebuje motive cinkovega prsta in deluje kot transkripcijski faktor. Sodeluje pri mediaciji nastanka kromatinskih zank in se velikokrat veže na TE. Opaženo je bilo, da so TE razpršili veliko vezavnih mest za protein CTCF in smiselno bi bilo, da bi se tudi meje TAD razpršile, vendar je bilo ugotovljeno, da so te zelo ohranjene. Odkrili so različne mehanizme preprečevanja tvorbe ektopičnih meja TAD. Tako se npr. transpozoni B2SINE, ki imajo veliko vezavnih mest za protein CTCF, lahko povežejo s kompleksom ChAHP, ki torej prepozna isti motiv kot CTCF, a z višjo afiniteto. 

==Kodiranje transkripcijskih faktorjev s transpozicijskimi elementi==
Šele nedavno so prišli do dognanj, da proteini, za katere kodirajo transpozicijski elementi, lahko vplivajo na regulacijo genov. Najdeni so bili številni primeri, v katerih gen za TE kodira transpozazo in hkrati tudi gostiteljski transkripcijski faktor. Fuzija transpozazne DNA-domene z regulatorno domeno transkripcijskega faktorja privede do tvorbe proteinskega kompleksa, ki je sposoben prepoznave ustreznega zaporedja TE na DNA, ker transpozaza prepozna transpozicijski element. Tako se lahko optimizira regulacija ekspresije genov s pomočjo TE. 

==Utišanje transpozicijskih elementov in pomen le-tega pri regulaciji transkripcije==
Organizmi so razvili zmožnost zmanjšanja aktivnosti transpozicijskih elementov, prav tako pa so transpozicijski elementi zmožni obiti gostiteljevo obrambo. Eden od načinov utišanja delovanja TE je metilacija DNA. Demetilacija TE lahko vodi do nepravilne aktivacije sosednjih genov zaradi ojačevalnega potenciala TE. Zato so gostitelji morali razviti mehanizem, ki to kontrolira. Pomemben utiševalni mehanizem TE je metilacija CpG otočkov na DNA. Primer povezave med metilacijo DNA in aktivnostjo iz TE izhajajočih cis regulatornih regij je gen Agouti. Ta daje rjavo obarvanim mišim C57BL/6J rumeno obarvanje na način, ki je odvisen od ravni metilacije promotorja, ki nadzoruje transkripcijo retrotranspozonov IAP. Retrotranspozon IAP pa nadzira ekspresijo gena Agouti in s tem obarvanje miši. 

Drug mehanizem utišanja TE so histonske modifikacije. Primer te epigenetske modifikacije je trimetilacija lizina 9 na histonu H3 (H3K9me3). Pomembno vlogo pri tem ima kompleks HUSH (human silencing hub complex). ATPaza MORC2 in HUSH se povežeta in posledično pride do trimetilacije na histonu 3 na retrotranspozonu LINE1 in tako se retrotranspoznon utiša. LINE1 se nahaja v intronih aktivnih genov. Če so ti trimetilirani, potem se RNA polimeraza II ne more pomikati naprej (motena je elongacija transkripcije), zato se geni ne prepisujejo. 

==Transpozicijski elementi in njihova vloga pri regulatornih nekodirajočih molekulah RNA==
Zaradi napredka v določanju nukleotidnega zaporedja molekul RNA se v zadnjih letih odkriva vedno več nekodirajočih molekul RNA (ncRNA). Te vključujejo tudi regulatorne RNA, med katere spadajo kratke nekodirajoče RNA (sncRNA) in dolge nekodirajoče RNA (lncRNA). Transpozicijski elementi (TE) in regulatorne RNA so tesno povezani, saj velik del nukleotidnega zaporedja regulatornih RNA in njihovih genov ter regulatornih regij predstavljajo TE. Transpozicijski elementi določajo funkcionalne lastnosti različnih tipov ncRNA, kar je ključno za njihovo regulatorno funkcijo pri transkripciji in posttranskripcijskih procesih. 

Transpozicijski elementi dajejo strukturne značilnosti lncRNA, ki jim dajejo sposobnost interakcije z drugimi biološkimi molekulami (DNA, RNA, proteini...). lncRNA imajo lahko tako cis kot tudi trans-regulatorno aktivnost. Pojavlja se veliko hipotez, da TE dajejo funkcionalne domene lncRNA. Primer, ki potrjuje to hipotezo, je interakcija med XIST lncRNA in proteinskim kompleksom PRC2 (polycomb repressive complex 2). XIST lncRNA namreč vključuje transpozicijski element ERVB5 in ravno ta regija predstavlja vezavno mesto za PRC2. PRC2 ima vlogo pri zagotavljanju kompaktnosti kromatina, in sicer tako, da ena izmed njegovih podenot EZH2 (Enhancer of zeste homolog 2) katalizira trimetilacijo lizina 27 na histonu 3 (H3K27me1/2/3), s tem pa povzroči represijo transkripcije določenih genov. Fosforilacija EZH2 in T350 (obe sta podenoti PRC2) s CDK1/2 je ključna za interakcijo PRC2 z lncRNA, ki poteka preko G-kvadrupleskne regije lncRNA, le-ta pa je bogata s transpozoni ERVB5. XIST lncRNA pripelje proteinski kompleks PRC2 do promotorske regije tarčnega gena (npr. tumor supresorskega gena), kjer EZH2 s svojo metiltransferazno aktivnostjo deluje kot represor transkripcije. 
Zanimiv primer povezave med transpozicijskimi elementi in nekodirajočo RNA je regulacija odziva na toplotni šok pri miših. Ta primer kaže tudi na trans-regulatorno vlogo nekodirajoče RNA. Mišja ncRNA, ki izhaja iz retrotranspozona B2 SINE, se v normalnih pogojih veže na regulatorne regije genov, ki se odzivajo na stres, ter tako prepreči njihovo transkripcijo. Pri toplotnem šoku se aktivira protein EZH2, ki pospeši razgradnjo te ncRNA ter tako prepreči inhibicijo transkripcije genov, povezanih s stresom (EZH2 stimulira ribocimsko aktivnost same ncRNA). 

Transpozicijski elementi imajo pomembno vlogo pri procesu transkripcije genov za nekodirajoče RNA, saj so vključeni v številna območja njihovih genov in regulatornih regij. Mesta na genomu, na katerih se nahajajo nukleotidna zaporedja, ki izhajajo iz transpozicijskih elementov, so prisotna tako v promotorjih kot tudi na poliA regijah genov za nekodirajoče RNA. Veliko so jih našli tudi na regijah genov za lncRNA, ki so pomembna za spajanje eksonov oz. izrezovanje intronov (splice donor, splice acceptor). 

Veliko molekul miRNA (spadajo med sncRNA) z vključenimi transpozicijskimi elementi interagira s 3' koncem neprevajajoče regije tarčne mRNA (3' UTR). Preko tega procesa se utiša mRNA. Tako se npr. miR-151, ki vsebuje transpozicijske elemente LINE2, veže na molekulo mRNA, ki kodira za ATPAF1 (ATP synthase mitochondrial F1 complex assembly factor 1), in sicer tako, da se poveže s transpozoni LINE2 na 3' koncu neprevajajoče regije tarčne mRNA. 

Vedno bolj se odkriva tudi vloga transpozicijskih elementov pri tvorbi stabilnejših sekundarnih struktur v nekodirajočih RNA. Raziskava, ki je primerjala lncRNA z vključenimi transpozicijskimi elementi in lncRNA brez vključenih transpozicijskih elementov, je ugotovila, da lncRNA z vključenimi transpozicijskimi elementi tvorijo stabilnejše sekundarne strukture. Analizirali so tudi mesta na lncRNA, ki so vključena v bazno parjenje pri tvorbi sekundarnih struktur in ugotovili, da je okrog 82 % teh mest lociranih v Alu regijah lncRNA. Torej, Alu regije v regulatornih RNA sodelujejo pri intramolekularnem baznem parjenju, kar privede do tvorbe stabilnejših sekundarnih struktur, s tem pa tudi do večje stabilnosti nekodirajočih RNA. To jim omogoči, da lahko bolje opravljajo svoje funkcije regulacije transkripcije. 

==Viri in literatura==

[1]R. Fueyo, J. Judd, C. Feschotte, and J. Wysocka, ‘Roles of transposable elements in the regulation of mammalian transcription’, Nat Rev Mol Cell Biol, pp. 1–17, Feb. 2022, doi: 10.1038/s41580-022-00457-y. 
[2]A. Ali, K. Han, and P. Liang, ‘Role of Transposable Elements in Gene Regulation in the Human Genome’, Life (Basel), vol. 11, no. 2, p. 118, Feb. 2021, doi: 10.3390/life11020118. 
[3]P. J. Wittkopp and G. Kalay, ‘Cis-regulatory elements: molecular mechanisms and evolutionary processes underlying divergence’, Nat Rev Genet, vol. 13, no. 1, Art. no. 1, Jan. 2012, doi: 10.1038/nrg3095. 
[4]A. Hao, Y. Wang, D. B. Stovall, Y. Wang, and G. Sui, ‘Emerging Roles of LncRNAs in the EZH2-regulated Oncogenic Network’, Int. J. Biol. Sci., vol. 17, no. 13, pp. 3268–3280, 2021, doi: 10.7150/ijbs.63488. 
[5]N. Liu et al., ‘Selective silencing of euchromatic L1s revealed by genome-wide screens for L1 regulators’, Nature, vol. 553, no. 7687, Art. no. 7687, Jan. 2018, doi: 10.1038/nature25179. 

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

TE kot regulatorji transkripcije

2022-04-24T12:45:27Z

David Valte: /* Kodiranje transkripcijskih faktorjev s transpozicijskimi elementi */

==Uvod==
Transpozicijski elementi (TE), ki sestavljajo velik del evkariontskega genoma, lahko, če se nahajajo v eksonskih predelih gostiteljevega genskega zapisa, bistveno zmanjšajo njegovo evolucijsko sposobnost preživetja, ker delujejo moteče (lahko povzročijo npr. vstavitev start in stop kodonov, premik bralnega okvirja, prehitro terminacijo transkripcije,…). S tem zmanjšajo tudi verjetnost za lasten prenos v nove generacije. Ker TE po delovanju spominjajo na parazitski organizem, so se skozi evolucijo razvile strategije, ki preprečujejo preveliko škodo na gostiteljskem organizmu. Prilagajanje je potekalo vzajemno. Gostiteljski organizmi so npr. postali sposobni utišanja transpozicijskih elementov s pomočjo metilacije DNA na CpG otočkih, TE pa so se preferenčno vključevali v intronska zaporedja, saj tam ne delujejo tako moteče. Skozi čas so gostiteljski organizmi postali sposobni uporabe TE v svojo korist. 

Vključitve transpozicijskih elementov v nekodirajoče predele genskega zapisa in njihove mutacije so v veliko primerih povzročile, da so TE izgubili sposobnost transponiranja, pridobili pa so cis in trans-regulatorno aktivnost. Cis-regulatorne regije (CRE) so nekodirajoča zaporedja nukleotidov, ki regulirajo ekspresijo genov na isti verigi DNA. Trans regulacija pa pomeni predvsem to, da npr. transkripcijski faktorji prihajajo od drugod oz. so kodirani na eni molekuli DNA, regulirajo pa ekspresijo genov na drugi molekuli DNA. Regulacija transkripcije s TE lahko poteka na več načinov: 

1. V genski zapis lahko vnašajo nova vezavna mesta za transkripcijske faktorje (TF) preko promotorjev, ojačevalcev, utiševalnih in izolatorskih zaporedij. 
2. Lahko modulirajo 3D strukturo kromatina. 
3. Zmožni so kodiranja transkripcijskih faktorjev. 
4. S povezovanjem z represorskimi transkripcijskimi faktorji vplivajo na utišanje sosednjih genov. 
5. Imajo vlogo pri regulatornih nekodirajočih molekulah RNA, ki so pomembni regulatorji transkripcije. 

==Funkcije transpozicijskih elementov v cis-regulatornih regijah ==
Regulatorne sposobnosti cis-regulatornih regij lahko izhajajo iz transpozicijskih elementov. V splošnem cis-regulatorne regije delujejo tako, da tvorijo specifična vezavna mesta za proteine povezane z iniciacijo in regulacijo transkripcije. Primeri nekaterih vrst CRE: 

1. Promotorji so kratka zaporedja DNA, ki vključujejo začetno mesto transkripcije. Ob vezavi ustreznih transkripcijskih faktorjev na promotorsko regijo omogočijo transkripcijo gena. Kot primer bi omenil transpozon AluSp v promotorju gena FCER1G, ki inducira transkripcijo visokoafinitetnega receptorja za Fc regijo IgE. 
2. Ojačevalci so zaporedja, ki jih najdemo pred ali za genom, ki ga regulirajo. Delujejo kooperativno s promotorjem, in sicer tako, da povečajo stopnjo transkripcije, omogočajo pa regulacijo tudi bolj oddaljenih genov. Kot primer bi omenil transpozon AluY v intronu gena CD8 (ta kodira glikoprotein CD8, ki je pomemben pri celičnih interakcijah znotraj imunskega sistema), za katerega so ugotovili, da deluje kot ojačevalec. 
3. Utiševalna zaporedja vežejo represorje in tako preprečujejo transkripcijo. Transpozicijski elementi so z rekrutiranjem transkripcijskih faktorjev postali sposobni delovati kot utiševalna zaporedja, ki remodelirajo kromatin. Čeprav so heterokromatinski deli revni z geni, so bogati s TE-ji, kar bi lahko pomenilo, da imajo transpozicijski elementi pomembno vlogo pri širjenju heterokromatina. Tako se npr. korepresorski protein TRIM28 veže na vezavno mesto, ki se nahaja na transpozonu ERV in s tem utiša sosednje gene. 
4. Inzulatorji ščitijo gene pred regulatornimi vplivi sosednjih genov. Lahko blokirajo promotorje, ojačevalce in utiševalce. Preprečujejo neprimerne interakcije med sosednjimi kromatinskimi regijami. Kot primer bi omenil gen za transpozon AluSq, ki deluje kot inzulator, saj njegova transkripcija ščiti človeški gen HBE1 (ki kodira za istoimenski protein) pred regulacijo z drugimi promotorji. 

TE-ji uvajajo nova vezavna mesta za TF, ki so v njih lahko prisotna takoj po inserciji v genom ali pa nastanejo de novo s postinsercijskimi mutacijami. Pogosto se mutacije pojavljajo na metiliranih CpG otočkih. Deaminacija teh povzroči zamenjavo citozina z gvaninom, kar je med drugim povzročilo nastanek številnih vezavnih mest za transkripcijska faktorja cMyc in p53. Vključitev TE-jev zraven že obstoječega vezavnega mesta za transkripcijske faktorje ter točkovne mutacije omogočijo nastanek novih mest za vezavo TF (alternativni promotorji), kar povzroča zaščito pred možnimi kasnejšimi mutacijami z redundančnostjo. Redundanca dopušča tudi kooperativno delovanje z zunanjimi promotorji, saj se lahko tako razbremenijo določena vezavna mesta za transkripcijske faktorje. 

==Vpliv transpozicijskih elementov na kromatinsko 3D strukturo==
V interfaznem jedru so deli genoma organizirani v topološko asociirajoče domene (TAD). To so večje domene kromatina, ki so med seboj ločene z izolatorskimi proteini. Ti omejujejo prostor, v katerem lahko različni deli DNA prihajajo v medsebojne stike. Njihova naloga je tudi prostorsko omejevanje interakcij med transkripcijskimi faktorji in ojačevalci ter promotorji. TAD specificirajo funkcije cis regulatornih regij z omejevanjem ojačevalcev, tako da ti aktivirajo le promotorje znotraj iste TAD. Vloga transpozicijskih elementov (TE) pri 3D arhitekturi genoma se je v zadnjih letih začela intenzivno raziskovati. Številne družine TE so namreč obogatene na mejah TAD. Določeni TE naj bi imeli preko tega tudi vlogo pri zvijanju kromosomov, prav tako pa tudi pri kompaktnosti kromatina in posledično tudi pri regulaciji procesov transkripcije. Kot primer pomena transpozicijskih elementov bi izpostavil študijo, ki je odkrila veliko HERV-H na mejah TAD v človeških embrionalnih matičnih celicah (hESCs) in delecija 2 individualnih HERV-H je vodila do izgube kompaktnosti te meje. 

Protein CTCF (11-zinc finger protein) je pomemben pri regulaciji 3D strukture kromatina in procesov transkripcije. Zelo pomemben je pri strukturi mej TAD. Vsebuje motive cinkovega prsta in deluje kot transkripcijski faktor. Sodeluje pri mediaciji nastanka kromatinskih zank in se velikokrat veže na TE. Opaženo je bilo, da so TE razpršili veliko vezavnih mest za protein CTCF in smiselno bi bilo, da bi se tudi meje TAD razpršile, vendar je bilo ugotovljeno, da so te zelo ohranjene. Odkrili so različne mehanizme preprečevanja tvorbe ektopičnih meja TAD. Tako se npr. transpozoni B2SINE, ki imajo veliko vezavnih mest za protein CTCF, lahko povežejo s kompleksom ChAHP, ki torej prepozna isti motiv kot CTCF, a z višjo afiniteto. 

==Kodiranje transkripcijskih faktorjev s transpozicijskimi elementi==
Šele nedavno so prišli do dognanj, da proteini, za katere kodirajo transpozicijski elementi, lahko vplivajo na regulacijo genov. Najdeni so bili številni primeri, v katerih gen za TE kodira transpozazo in hkrati tudi gostiteljski transkripcijski faktor. Fuzija transpozazne DNA-domene z regulatorno domeno transkripcijskega faktorja privede do tvorbe proteinskega kompleksa, ki je sposoben prepoznave ustreznega zaporedja TE na DNA, ker transpozaza prepozna transpozicijski element. Tako se lahko optimizira regulacija ekspresije genov s pomočjo TE. 

==Utišanje transpozicijskih elementov in pomen le-tega pri regulaciji transkripcije==
Organizmi so razvili zmožnost zmanjšanja aktivnosti transpozicijskih elementov, prav tako pa so transpozicijski elementi zmožni obiti gostiteljevo obrambo. Eden od načinov utišanja delovanja TE je metilacija DNA. Demetilacija TE lahko vodi do nepravilne aktivacije sosednjih genov zaradi ojačevalnega potenciala TE. Zato so gostitelji morali razviti mehanizem, ki to kontrolira. Pomemben utiševalni mehanizem TE je metilacija CpG otočkov na DNA. Primer povezave med metilacijo DNA in aktivnostjo iz TE izhajajočih cis regulatornih regij je gen Agouti. Ta daje rjavo obarvanim mišim C57BL/6J rumeno obarvanje na način, ki je odvisen od ravni metilacije promotorja, ki nadzoruje transkripcijo retrotranspozonov IAP. Retrotranspozon IAP pa nadzira ekspresijo gena Agouti in s tem obarvanje miši. 
Drug mehanizem utišanja TE so histonske modifikacije. Primer te epigenetske modifikacije je trimetilacija lizina 9 na histonu H3 (H3K9me3). Pomembno vlogo pri tem ima kompleks HUSH (human silencing hub complex). ATPaza MORC2 in HUSH se povežeta in posledično pride do trimetilacije na histonu 3 na retrotranspozonu LINE1 in tako se retrotranspoznon utiša. LINE1 se nahaja v intronih aktivnih genov. Če so ti trimetilirani, potem se RNA polimeraza II ne more pomikati naprej (motena je elongacija transkripcije), zato se geni ne prepisujejo. 
==Transpozicijski elementi in njihova vloga pri regulatornih nekodirajočih molekulah RNA==
Zaradi napredka v določanju nukleotidnega zaporedja molekul RNA se v zadnjih letih odkriva vedno več nekodirajočih molekul RNA (ncRNA). Te vključujejo tudi regulatorne RNA, med katere spadajo kratke nekodirajoče RNA (sncRNA) in dolge nekodirajoče RNA (lncRNA). Transpozicijski elementi (TE) in regulatorne RNA so tesno povezani, saj velik del nukleotidnega zaporedja regulatornih RNA in njihovih genov ter regulatornih regij predstavljajo TE. Transpozicijski elementi določajo funkcionalne lastnosti različnih tipov ncRNA, kar je ključno za njihovo regulatorno funkcijo pri transkripciji in posttranskripcijskih procesih. 
Transpozicijski elementi dajejo strukturne značilnosti lncRNA, ki jim dajejo sposobnost interakcije z drugimi biološkimi molekulami (DNA, RNA, proteini...). lncRNA imajo lahko tako cis kot tudi trans-regulatorno aktivnost. Pojavlja se veliko hipotez, da TE dajejo funkcionalne domene lncRNA. Primer, ki potrjuje to hipotezo, je interakcija med XIST lncRNA in proteinskim kompleksom PRC2 (polycomb repressive complex 2). XIST lncRNA namreč vključuje transpozicijski element ERVB5 in ravno ta regija predstavlja vezavno mesto za PRC2. PRC2 ima vlogo pri zagotavljanju kompaktnosti kromatina, in sicer tako, da ena izmed njegovih podenot EZH2 (Enhancer of zeste homolog 2) katalizira trimetilacijo lizina 27 na histonu 3 (H3K27me1/2/3), s tem pa povzroči represijo transkripcije določenih genov. Fosforilacija EZH2 in T350 (obe sta podenoti PRC2) s CDK1/2 je ključna za interakcijo PRC2 z lncRNA, ki poteka preko G-kvadrupleskne regije lncRNA, le-ta pa je bogata s transpozoni ERVB5. XIST lncRNA pripelje proteinski kompleks PRC2 do promotorske regije tarčnega gena (npr. tumor supresorskega gena), kjer EZH2 s svojo metiltransferazno aktivnostjo deluje kot represor transkripcije. 
Zanimiv primer povezave med transpozicijskimi elementi in nekodirajočo RNA je regulacija odziva na toplotni šok pri miših. Ta primer kaže tudi na trans-regulatorno vlogo nekodirajoče RNA. Mišja ncRNA, ki izhaja iz retrotranspozona B2 SINE, se v normalnih pogojih veže na regulatorne regije genov, ki se odzivajo na stres, ter tako prepreči njihovo transkripcijo. Pri toplotnem šoku se aktivira protein EZH2, ki pospeši razgradnjo te ncRNA ter tako prepreči inhibicijo transkripcije genov, povezanih s stresom (EZH2 stimulira ribocimsko aktivnost same ncRNA). 
Transpozicijski elementi imajo pomembno vlogo pri procesu transkripcije genov za nekodirajoče RNA, saj so vključeni v številna območja njihovih genov in regulatornih regij. Mesta na genomu, na katerih se nahajajo nukleotidna zaporedja, ki izhajajo iz transpozicijskih elementov, so prisotna tako v promotorjih kot tudi na poliA regijah genov za nekodirajoče RNA. Veliko so jih našli tudi na regijah genov za lncRNA, ki so pomembna za spajanje eksonov oz. izrezovanje intronov (splice donor, splice acceptor). 
Veliko molekul miRNA (spadajo med sncRNA) z vključenimi transpozicijskimi elementi interagira s 3' koncem neprevajajoče regije tarčne mRNA (3' UTR). Preko tega procesa se utiša mRNA. Tako se npr. miR-151, ki vsebuje transpozicijske elemente LINE2, veže na molekulo mRNA, ki kodira za ATPAF1 (ATP synthase mitochondrial F1 complex assembly factor 1), in sicer tako, da se poveže s transpozoni LINE2 na 3' koncu neprevajajoče regije tarčne mRNA. 
Vedno bolj se odkriva tudi vloga transpozicijskih elementov pri tvorbi stabilnejših sekundarnih struktur v nekodirajočih RNA. Raziskava, ki je primerjala lncRNA z vključenimi transpozicijskimi elementi in lncRNA brez vključenih transpozicijskih elementov, je ugotovila, da lncRNA z vključenimi transpozicijskimi elementi tvorijo stabilnejše sekundarne strukture. Analizirali so tudi mesta na lncRNA, ki so vključena v bazno parjenje pri tvorbi sekundarnih struktur in ugotovili, da je okrog 82 % teh mest lociranih v Alu regijah lncRNA. Torej, Alu regije v regulatornih RNA sodelujejo pri intramolekularnem baznem parjenju, kar privede do tvorbe stabilnejših sekundarnih struktur, s tem pa tudi do večje stabilnosti nekodirajočih RNA. To jim omogoči, da lahko bolje opravljajo svoje funkcije regulacije transkripcije. 
==Viri in literatura==

[1]R. Fueyo, J. Judd, C. Feschotte, and J. Wysocka, ‘Roles of transposable elements in the regulation of mammalian transcription’, Nat Rev Mol Cell Biol, pp. 1–17, Feb. 2022, doi: 10.1038/s41580-022-00457-y. 
[2]A. Ali, K. Han, and P. Liang, ‘Role of Transposable Elements in Gene Regulation in the Human Genome’, Life (Basel), vol. 11, no. 2, p. 118, Feb. 2021, doi: 10.3390/life11020118. 
[3]P. J. Wittkopp and G. Kalay, ‘Cis-regulatory elements: molecular mechanisms and evolutionary processes underlying divergence’, Nat Rev Genet, vol. 13, no. 1, Art. no. 1, Jan. 2012, doi: 10.1038/nrg3095. 
[4]A. Hao, Y. Wang, D. B. Stovall, Y. Wang, and G. Sui, ‘Emerging Roles of LncRNAs in the EZH2-regulated Oncogenic Network’, Int. J. Biol. Sci., vol. 17, no. 13, pp. 3268–3280, 2021, doi: 10.7150/ijbs.63488. 
[5]N. Liu et al., ‘Selective silencing of euchromatic L1s revealed by genome-wide screens for L1 regulators’, Nature, vol. 553, no. 7687, Art. no. 7687, Jan. 2018, doi: 10.1038/nature25179. 

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

TE kot regulatorji transkripcije

2022-04-24T12:45:20Z

David Valte: /* Vpliv transpozicijskih elementov na kromatinsko 3D strukturo */

==Uvod==
Transpozicijski elementi (TE), ki sestavljajo velik del evkariontskega genoma, lahko, če se nahajajo v eksonskih predelih gostiteljevega genskega zapisa, bistveno zmanjšajo njegovo evolucijsko sposobnost preživetja, ker delujejo moteče (lahko povzročijo npr. vstavitev start in stop kodonov, premik bralnega okvirja, prehitro terminacijo transkripcije,…). S tem zmanjšajo tudi verjetnost za lasten prenos v nove generacije. Ker TE po delovanju spominjajo na parazitski organizem, so se skozi evolucijo razvile strategije, ki preprečujejo preveliko škodo na gostiteljskem organizmu. Prilagajanje je potekalo vzajemno. Gostiteljski organizmi so npr. postali sposobni utišanja transpozicijskih elementov s pomočjo metilacije DNA na CpG otočkih, TE pa so se preferenčno vključevali v intronska zaporedja, saj tam ne delujejo tako moteče. Skozi čas so gostiteljski organizmi postali sposobni uporabe TE v svojo korist. 

Vključitve transpozicijskih elementov v nekodirajoče predele genskega zapisa in njihove mutacije so v veliko primerih povzročile, da so TE izgubili sposobnost transponiranja, pridobili pa so cis in trans-regulatorno aktivnost. Cis-regulatorne regije (CRE) so nekodirajoča zaporedja nukleotidov, ki regulirajo ekspresijo genov na isti verigi DNA. Trans regulacija pa pomeni predvsem to, da npr. transkripcijski faktorji prihajajo od drugod oz. so kodirani na eni molekuli DNA, regulirajo pa ekspresijo genov na drugi molekuli DNA. Regulacija transkripcije s TE lahko poteka na več načinov: 

1. V genski zapis lahko vnašajo nova vezavna mesta za transkripcijske faktorje (TF) preko promotorjev, ojačevalcev, utiševalnih in izolatorskih zaporedij. 
2. Lahko modulirajo 3D strukturo kromatina. 
3. Zmožni so kodiranja transkripcijskih faktorjev. 
4. S povezovanjem z represorskimi transkripcijskimi faktorji vplivajo na utišanje sosednjih genov. 
5. Imajo vlogo pri regulatornih nekodirajočih molekulah RNA, ki so pomembni regulatorji transkripcije. 

==Funkcije transpozicijskih elementov v cis-regulatornih regijah ==
Regulatorne sposobnosti cis-regulatornih regij lahko izhajajo iz transpozicijskih elementov. V splošnem cis-regulatorne regije delujejo tako, da tvorijo specifična vezavna mesta za proteine povezane z iniciacijo in regulacijo transkripcije. Primeri nekaterih vrst CRE: 

1. Promotorji so kratka zaporedja DNA, ki vključujejo začetno mesto transkripcije. Ob vezavi ustreznih transkripcijskih faktorjev na promotorsko regijo omogočijo transkripcijo gena. Kot primer bi omenil transpozon AluSp v promotorju gena FCER1G, ki inducira transkripcijo visokoafinitetnega receptorja za Fc regijo IgE. 
2. Ojačevalci so zaporedja, ki jih najdemo pred ali za genom, ki ga regulirajo. Delujejo kooperativno s promotorjem, in sicer tako, da povečajo stopnjo transkripcije, omogočajo pa regulacijo tudi bolj oddaljenih genov. Kot primer bi omenil transpozon AluY v intronu gena CD8 (ta kodira glikoprotein CD8, ki je pomemben pri celičnih interakcijah znotraj imunskega sistema), za katerega so ugotovili, da deluje kot ojačevalec. 
3. Utiševalna zaporedja vežejo represorje in tako preprečujejo transkripcijo. Transpozicijski elementi so z rekrutiranjem transkripcijskih faktorjev postali sposobni delovati kot utiševalna zaporedja, ki remodelirajo kromatin. Čeprav so heterokromatinski deli revni z geni, so bogati s TE-ji, kar bi lahko pomenilo, da imajo transpozicijski elementi pomembno vlogo pri širjenju heterokromatina. Tako se npr. korepresorski protein TRIM28 veže na vezavno mesto, ki se nahaja na transpozonu ERV in s tem utiša sosednje gene. 
4. Inzulatorji ščitijo gene pred regulatornimi vplivi sosednjih genov. Lahko blokirajo promotorje, ojačevalce in utiševalce. Preprečujejo neprimerne interakcije med sosednjimi kromatinskimi regijami. Kot primer bi omenil gen za transpozon AluSq, ki deluje kot inzulator, saj njegova transkripcija ščiti človeški gen HBE1 (ki kodira za istoimenski protein) pred regulacijo z drugimi promotorji. 

TE-ji uvajajo nova vezavna mesta za TF, ki so v njih lahko prisotna takoj po inserciji v genom ali pa nastanejo de novo s postinsercijskimi mutacijami. Pogosto se mutacije pojavljajo na metiliranih CpG otočkih. Deaminacija teh povzroči zamenjavo citozina z gvaninom, kar je med drugim povzročilo nastanek številnih vezavnih mest za transkripcijska faktorja cMyc in p53. Vključitev TE-jev zraven že obstoječega vezavnega mesta za transkripcijske faktorje ter točkovne mutacije omogočijo nastanek novih mest za vezavo TF (alternativni promotorji), kar povzroča zaščito pred možnimi kasnejšimi mutacijami z redundančnostjo. Redundanca dopušča tudi kooperativno delovanje z zunanjimi promotorji, saj se lahko tako razbremenijo določena vezavna mesta za transkripcijske faktorje. 

==Vpliv transpozicijskih elementov na kromatinsko 3D strukturo==
V interfaznem jedru so deli genoma organizirani v topološko asociirajoče domene (TAD). To so večje domene kromatina, ki so med seboj ločene z izolatorskimi proteini. Ti omejujejo prostor, v katerem lahko različni deli DNA prihajajo v medsebojne stike. Njihova naloga je tudi prostorsko omejevanje interakcij med transkripcijskimi faktorji in ojačevalci ter promotorji. TAD specificirajo funkcije cis regulatornih regij z omejevanjem ojačevalcev, tako da ti aktivirajo le promotorje znotraj iste TAD. Vloga transpozicijskih elementov (TE) pri 3D arhitekturi genoma se je v zadnjih letih začela intenzivno raziskovati. Številne družine TE so namreč obogatene na mejah TAD. Določeni TE naj bi imeli preko tega tudi vlogo pri zvijanju kromosomov, prav tako pa tudi pri kompaktnosti kromatina in posledično tudi pri regulaciji procesov transkripcije. Kot primer pomena transpozicijskih elementov bi izpostavil študijo, ki je odkrila veliko HERV-H na mejah TAD v človeških embrionalnih matičnih celicah (hESCs) in delecija 2 individualnih HERV-H je vodila do izgube kompaktnosti te meje. 

Protein CTCF (11-zinc finger protein) je pomemben pri regulaciji 3D strukture kromatina in procesov transkripcije. Zelo pomemben je pri strukturi mej TAD. Vsebuje motive cinkovega prsta in deluje kot transkripcijski faktor. Sodeluje pri mediaciji nastanka kromatinskih zank in se velikokrat veže na TE. Opaženo je bilo, da so TE razpršili veliko vezavnih mest za protein CTCF in smiselno bi bilo, da bi se tudi meje TAD razpršile, vendar je bilo ugotovljeno, da so te zelo ohranjene. Odkrili so različne mehanizme preprečevanja tvorbe ektopičnih meja TAD. Tako se npr. transpozoni B2SINE, ki imajo veliko vezavnih mest za protein CTCF, lahko povežejo s kompleksom ChAHP, ki torej prepozna isti motiv kot CTCF, a z višjo afiniteto. 

==Kodiranje transkripcijskih faktorjev s transpozicijskimi elementi==
Šele nedavno so prišli do dognanj, da proteini, za katere kodirajo transpozicijski elementi, lahko vplivajo na regulacijo genov. Najdeni so bili številni primeri, v katerih gen za TE kodira transpozazo in hkrati tudi gostiteljski transkripcijski faktor. Fuzija transpozazne DNA-domene z regulatorno domeno transkripcijskega faktorja privede do tvorbe proteinskega kompleksa, ki je sposoben prepoznave ustreznega zaporedja TE na DNA, ker transpozaza prepozna transpozicijski element. Tako se lahko optimizira regulacija ekspresije genov s pomočjo TE. 
==Utišanje transpozicijskih elementov in pomen le-tega pri regulaciji transkripcije==
Organizmi so razvili zmožnost zmanjšanja aktivnosti transpozicijskih elementov, prav tako pa so transpozicijski elementi zmožni obiti gostiteljevo obrambo. Eden od načinov utišanja delovanja TE je metilacija DNA. Demetilacija TE lahko vodi do nepravilne aktivacije sosednjih genov zaradi ojačevalnega potenciala TE. Zato so gostitelji morali razviti mehanizem, ki to kontrolira. Pomemben utiševalni mehanizem TE je metilacija CpG otočkov na DNA. Primer povezave med metilacijo DNA in aktivnostjo iz TE izhajajočih cis regulatornih regij je gen Agouti. Ta daje rjavo obarvanim mišim C57BL/6J rumeno obarvanje na način, ki je odvisen od ravni metilacije promotorja, ki nadzoruje transkripcijo retrotranspozonov IAP. Retrotranspozon IAP pa nadzira ekspresijo gena Agouti in s tem obarvanje miši. 
Drug mehanizem utišanja TE so histonske modifikacije. Primer te epigenetske modifikacije je trimetilacija lizina 9 na histonu H3 (H3K9me3). Pomembno vlogo pri tem ima kompleks HUSH (human silencing hub complex). ATPaza MORC2 in HUSH se povežeta in posledično pride do trimetilacije na histonu 3 na retrotranspozonu LINE1 in tako se retrotranspoznon utiša. LINE1 se nahaja v intronih aktivnih genov. Če so ti trimetilirani, potem se RNA polimeraza II ne more pomikati naprej (motena je elongacija transkripcije), zato se geni ne prepisujejo. 
==Transpozicijski elementi in njihova vloga pri regulatornih nekodirajočih molekulah RNA==
Zaradi napredka v določanju nukleotidnega zaporedja molekul RNA se v zadnjih letih odkriva vedno več nekodirajočih molekul RNA (ncRNA). Te vključujejo tudi regulatorne RNA, med katere spadajo kratke nekodirajoče RNA (sncRNA) in dolge nekodirajoče RNA (lncRNA). Transpozicijski elementi (TE) in regulatorne RNA so tesno povezani, saj velik del nukleotidnega zaporedja regulatornih RNA in njihovih genov ter regulatornih regij predstavljajo TE. Transpozicijski elementi določajo funkcionalne lastnosti različnih tipov ncRNA, kar je ključno za njihovo regulatorno funkcijo pri transkripciji in posttranskripcijskih procesih. 
Transpozicijski elementi dajejo strukturne značilnosti lncRNA, ki jim dajejo sposobnost interakcije z drugimi biološkimi molekulami (DNA, RNA, proteini...). lncRNA imajo lahko tako cis kot tudi trans-regulatorno aktivnost. Pojavlja se veliko hipotez, da TE dajejo funkcionalne domene lncRNA. Primer, ki potrjuje to hipotezo, je interakcija med XIST lncRNA in proteinskim kompleksom PRC2 (polycomb repressive complex 2). XIST lncRNA namreč vključuje transpozicijski element ERVB5 in ravno ta regija predstavlja vezavno mesto za PRC2. PRC2 ima vlogo pri zagotavljanju kompaktnosti kromatina, in sicer tako, da ena izmed njegovih podenot EZH2 (Enhancer of zeste homolog 2) katalizira trimetilacijo lizina 27 na histonu 3 (H3K27me1/2/3), s tem pa povzroči represijo transkripcije določenih genov. Fosforilacija EZH2 in T350 (obe sta podenoti PRC2) s CDK1/2 je ključna za interakcijo PRC2 z lncRNA, ki poteka preko G-kvadrupleskne regije lncRNA, le-ta pa je bogata s transpozoni ERVB5. XIST lncRNA pripelje proteinski kompleks PRC2 do promotorske regije tarčnega gena (npr. tumor supresorskega gena), kjer EZH2 s svojo metiltransferazno aktivnostjo deluje kot represor transkripcije. 
Zanimiv primer povezave med transpozicijskimi elementi in nekodirajočo RNA je regulacija odziva na toplotni šok pri miših. Ta primer kaže tudi na trans-regulatorno vlogo nekodirajoče RNA. Mišja ncRNA, ki izhaja iz retrotranspozona B2 SINE, se v normalnih pogojih veže na regulatorne regije genov, ki se odzivajo na stres, ter tako prepreči njihovo transkripcijo. Pri toplotnem šoku se aktivira protein EZH2, ki pospeši razgradnjo te ncRNA ter tako prepreči inhibicijo transkripcije genov, povezanih s stresom (EZH2 stimulira ribocimsko aktivnost same ncRNA). 
Transpozicijski elementi imajo pomembno vlogo pri procesu transkripcije genov za nekodirajoče RNA, saj so vključeni v številna območja njihovih genov in regulatornih regij. Mesta na genomu, na katerih se nahajajo nukleotidna zaporedja, ki izhajajo iz transpozicijskih elementov, so prisotna tako v promotorjih kot tudi na poliA regijah genov za nekodirajoče RNA. Veliko so jih našli tudi na regijah genov za lncRNA, ki so pomembna za spajanje eksonov oz. izrezovanje intronov (splice donor, splice acceptor). 
Veliko molekul miRNA (spadajo med sncRNA) z vključenimi transpozicijskimi elementi interagira s 3' koncem neprevajajoče regije tarčne mRNA (3' UTR). Preko tega procesa se utiša mRNA. Tako se npr. miR-151, ki vsebuje transpozicijske elemente LINE2, veže na molekulo mRNA, ki kodira za ATPAF1 (ATP synthase mitochondrial F1 complex assembly factor 1), in sicer tako, da se poveže s transpozoni LINE2 na 3' koncu neprevajajoče regije tarčne mRNA. 
Vedno bolj se odkriva tudi vloga transpozicijskih elementov pri tvorbi stabilnejših sekundarnih struktur v nekodirajočih RNA. Raziskava, ki je primerjala lncRNA z vključenimi transpozicijskimi elementi in lncRNA brez vključenih transpozicijskih elementov, je ugotovila, da lncRNA z vključenimi transpozicijskimi elementi tvorijo stabilnejše sekundarne strukture. Analizirali so tudi mesta na lncRNA, ki so vključena v bazno parjenje pri tvorbi sekundarnih struktur in ugotovili, da je okrog 82 % teh mest lociranih v Alu regijah lncRNA. Torej, Alu regije v regulatornih RNA sodelujejo pri intramolekularnem baznem parjenju, kar privede do tvorbe stabilnejših sekundarnih struktur, s tem pa tudi do večje stabilnosti nekodirajočih RNA. To jim omogoči, da lahko bolje opravljajo svoje funkcije regulacije transkripcije. 
==Viri in literatura==

[1]R. Fueyo, J. Judd, C. Feschotte, and J. Wysocka, ‘Roles of transposable elements in the regulation of mammalian transcription’, Nat Rev Mol Cell Biol, pp. 1–17, Feb. 2022, doi: 10.1038/s41580-022-00457-y. 
[2]A. Ali, K. Han, and P. Liang, ‘Role of Transposable Elements in Gene Regulation in the Human Genome’, Life (Basel), vol. 11, no. 2, p. 118, Feb. 2021, doi: 10.3390/life11020118. 
[3]P. J. Wittkopp and G. Kalay, ‘Cis-regulatory elements: molecular mechanisms and evolutionary processes underlying divergence’, Nat Rev Genet, vol. 13, no. 1, Art. no. 1, Jan. 2012, doi: 10.1038/nrg3095. 
[4]A. Hao, Y. Wang, D. B. Stovall, Y. Wang, and G. Sui, ‘Emerging Roles of LncRNAs in the EZH2-regulated Oncogenic Network’, Int. J. Biol. Sci., vol. 17, no. 13, pp. 3268–3280, 2021, doi: 10.7150/ijbs.63488. 
[5]N. Liu et al., ‘Selective silencing of euchromatic L1s revealed by genome-wide screens for L1 regulators’, Nature, vol. 553, no. 7687, Art. no. 7687, Jan. 2018, doi: 10.1038/nature25179. 

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

TE kot regulatorji transkripcije

2022-04-24T12:45:06Z

David Valte: /* Funkcije transpozicijskih elementov v cis-regulatornih regijah */

==Uvod==
Transpozicijski elementi (TE), ki sestavljajo velik del evkariontskega genoma, lahko, če se nahajajo v eksonskih predelih gostiteljevega genskega zapisa, bistveno zmanjšajo njegovo evolucijsko sposobnost preživetja, ker delujejo moteče (lahko povzročijo npr. vstavitev start in stop kodonov, premik bralnega okvirja, prehitro terminacijo transkripcije,…). S tem zmanjšajo tudi verjetnost za lasten prenos v nove generacije. Ker TE po delovanju spominjajo na parazitski organizem, so se skozi evolucijo razvile strategije, ki preprečujejo preveliko škodo na gostiteljskem organizmu. Prilagajanje je potekalo vzajemno. Gostiteljski organizmi so npr. postali sposobni utišanja transpozicijskih elementov s pomočjo metilacije DNA na CpG otočkih, TE pa so se preferenčno vključevali v intronska zaporedja, saj tam ne delujejo tako moteče. Skozi čas so gostiteljski organizmi postali sposobni uporabe TE v svojo korist. 

Vključitve transpozicijskih elementov v nekodirajoče predele genskega zapisa in njihove mutacije so v veliko primerih povzročile, da so TE izgubili sposobnost transponiranja, pridobili pa so cis in trans-regulatorno aktivnost. Cis-regulatorne regije (CRE) so nekodirajoča zaporedja nukleotidov, ki regulirajo ekspresijo genov na isti verigi DNA. Trans regulacija pa pomeni predvsem to, da npr. transkripcijski faktorji prihajajo od drugod oz. so kodirani na eni molekuli DNA, regulirajo pa ekspresijo genov na drugi molekuli DNA. Regulacija transkripcije s TE lahko poteka na več načinov: 

1. V genski zapis lahko vnašajo nova vezavna mesta za transkripcijske faktorje (TF) preko promotorjev, ojačevalcev, utiševalnih in izolatorskih zaporedij. 
2. Lahko modulirajo 3D strukturo kromatina. 
3. Zmožni so kodiranja transkripcijskih faktorjev. 
4. S povezovanjem z represorskimi transkripcijskimi faktorji vplivajo na utišanje sosednjih genov. 
5. Imajo vlogo pri regulatornih nekodirajočih molekulah RNA, ki so pomembni regulatorji transkripcije. 

==Funkcije transpozicijskih elementov v cis-regulatornih regijah ==
Regulatorne sposobnosti cis-regulatornih regij lahko izhajajo iz transpozicijskih elementov. V splošnem cis-regulatorne regije delujejo tako, da tvorijo specifična vezavna mesta za proteine povezane z iniciacijo in regulacijo transkripcije. Primeri nekaterih vrst CRE: 

1. Promotorji so kratka zaporedja DNA, ki vključujejo začetno mesto transkripcije. Ob vezavi ustreznih transkripcijskih faktorjev na promotorsko regijo omogočijo transkripcijo gena. Kot primer bi omenil transpozon AluSp v promotorju gena FCER1G, ki inducira transkripcijo visokoafinitetnega receptorja za Fc regijo IgE. 
2. Ojačevalci so zaporedja, ki jih najdemo pred ali za genom, ki ga regulirajo. Delujejo kooperativno s promotorjem, in sicer tako, da povečajo stopnjo transkripcije, omogočajo pa regulacijo tudi bolj oddaljenih genov. Kot primer bi omenil transpozon AluY v intronu gena CD8 (ta kodira glikoprotein CD8, ki je pomemben pri celičnih interakcijah znotraj imunskega sistema), za katerega so ugotovili, da deluje kot ojačevalec. 
3. Utiševalna zaporedja vežejo represorje in tako preprečujejo transkripcijo. Transpozicijski elementi so z rekrutiranjem transkripcijskih faktorjev postali sposobni delovati kot utiševalna zaporedja, ki remodelirajo kromatin. Čeprav so heterokromatinski deli revni z geni, so bogati s TE-ji, kar bi lahko pomenilo, da imajo transpozicijski elementi pomembno vlogo pri širjenju heterokromatina. Tako se npr. korepresorski protein TRIM28 veže na vezavno mesto, ki se nahaja na transpozonu ERV in s tem utiša sosednje gene. 
4. Inzulatorji ščitijo gene pred regulatornimi vplivi sosednjih genov. Lahko blokirajo promotorje, ojačevalce in utiševalce. Preprečujejo neprimerne interakcije med sosednjimi kromatinskimi regijami. Kot primer bi omenil gen za transpozon AluSq, ki deluje kot inzulator, saj njegova transkripcija ščiti človeški gen HBE1 (ki kodira za istoimenski protein) pred regulacijo z drugimi promotorji. 

TE-ji uvajajo nova vezavna mesta za TF, ki so v njih lahko prisotna takoj po inserciji v genom ali pa nastanejo de novo s postinsercijskimi mutacijami. Pogosto se mutacije pojavljajo na metiliranih CpG otočkih. Deaminacija teh povzroči zamenjavo citozina z gvaninom, kar je med drugim povzročilo nastanek številnih vezavnih mest za transkripcijska faktorja cMyc in p53. Vključitev TE-jev zraven že obstoječega vezavnega mesta za transkripcijske faktorje ter točkovne mutacije omogočijo nastanek novih mest za vezavo TF (alternativni promotorji), kar povzroča zaščito pred možnimi kasnejšimi mutacijami z redundančnostjo. Redundanca dopušča tudi kooperativno delovanje z zunanjimi promotorji, saj se lahko tako razbremenijo določena vezavna mesta za transkripcijske faktorje. 

==Vpliv transpozicijskih elementov na kromatinsko 3D strukturo==
V interfaznem jedru so deli genoma organizirani v topološko asociirajoče domene (TAD). To so večje domene kromatina, ki so med seboj ločene z izolatorskimi proteini. Ti omejujejo prostor, v katerem lahko različni deli DNA prihajajo v medsebojne stike. Njihova naloga je tudi prostorsko omejevanje interakcij med transkripcijskimi faktorji in ojačevalci ter promotorji. TAD specificirajo funkcije cis regulatornih regij z omejevanjem ojačevalcev, tako da ti aktivirajo le promotorje znotraj iste TAD. Vloga transpozicijskih elementov (TE) pri 3D arhitekturi genoma se je v zadnjih letih začela intenzivno raziskovati. Številne družine TE so namreč obogatene na mejah TAD. Določeni TE naj bi imeli preko tega tudi vlogo pri zvijanju kromosomov, prav tako pa tudi pri kompaktnosti kromatina in posledično tudi pri regulaciji procesov transkripcije. Kot primer pomena transpozicijskih elementov bi izpostavil študijo, ki je odkrila veliko HERV-H na mejah TAD v človeških embrionalnih matičnih celicah (hESCs) in delecija 2 individualnih HERV-H je vodila do izgube kompaktnosti te meje. 
Protein CTCF (11-zinc finger protein) je pomemben pri regulaciji 3D strukture kromatina in procesov transkripcije. Zelo pomemben je pri strukturi mej TAD. Vsebuje motive cinkovega prsta in deluje kot transkripcijski faktor. Sodeluje pri mediaciji nastanka kromatinskih zank in se velikokrat veže na TE. Opaženo je bilo, da so TE razpršili veliko vezavnih mest za protein CTCF in smiselno bi bilo, da bi se tudi meje TAD razpršile, vendar je bilo ugotovljeno, da so te zelo ohranjene. Odkrili so različne mehanizme preprečevanja tvorbe ektopičnih meja TAD. Tako se npr. transpozoni B2SINE, ki imajo veliko vezavnih mest za protein CTCF, lahko povežejo s kompleksom ChAHP, ki torej prepozna isti motiv kot CTCF, a z višjo afiniteto. 
==Kodiranje transkripcijskih faktorjev s transpozicijskimi elementi==
Šele nedavno so prišli do dognanj, da proteini, za katere kodirajo transpozicijski elementi, lahko vplivajo na regulacijo genov. Najdeni so bili številni primeri, v katerih gen za TE kodira transpozazo in hkrati tudi gostiteljski transkripcijski faktor. Fuzija transpozazne DNA-domene z regulatorno domeno transkripcijskega faktorja privede do tvorbe proteinskega kompleksa, ki je sposoben prepoznave ustreznega zaporedja TE na DNA, ker transpozaza prepozna transpozicijski element. Tako se lahko optimizira regulacija ekspresije genov s pomočjo TE. 
==Utišanje transpozicijskih elementov in pomen le-tega pri regulaciji transkripcije==
Organizmi so razvili zmožnost zmanjšanja aktivnosti transpozicijskih elementov, prav tako pa so transpozicijski elementi zmožni obiti gostiteljevo obrambo. Eden od načinov utišanja delovanja TE je metilacija DNA. Demetilacija TE lahko vodi do nepravilne aktivacije sosednjih genov zaradi ojačevalnega potenciala TE. Zato so gostitelji morali razviti mehanizem, ki to kontrolira. Pomemben utiševalni mehanizem TE je metilacija CpG otočkov na DNA. Primer povezave med metilacijo DNA in aktivnostjo iz TE izhajajočih cis regulatornih regij je gen Agouti. Ta daje rjavo obarvanim mišim C57BL/6J rumeno obarvanje na način, ki je odvisen od ravni metilacije promotorja, ki nadzoruje transkripcijo retrotranspozonov IAP. Retrotranspozon IAP pa nadzira ekspresijo gena Agouti in s tem obarvanje miši. 
Drug mehanizem utišanja TE so histonske modifikacije. Primer te epigenetske modifikacije je trimetilacija lizina 9 na histonu H3 (H3K9me3). Pomembno vlogo pri tem ima kompleks HUSH (human silencing hub complex). ATPaza MORC2 in HUSH se povežeta in posledično pride do trimetilacije na histonu 3 na retrotranspozonu LINE1 in tako se retrotranspoznon utiša. LINE1 se nahaja v intronih aktivnih genov. Če so ti trimetilirani, potem se RNA polimeraza II ne more pomikati naprej (motena je elongacija transkripcije), zato se geni ne prepisujejo. 
==Transpozicijski elementi in njihova vloga pri regulatornih nekodirajočih molekulah RNA==
Zaradi napredka v določanju nukleotidnega zaporedja molekul RNA se v zadnjih letih odkriva vedno več nekodirajočih molekul RNA (ncRNA). Te vključujejo tudi regulatorne RNA, med katere spadajo kratke nekodirajoče RNA (sncRNA) in dolge nekodirajoče RNA (lncRNA). Transpozicijski elementi (TE) in regulatorne RNA so tesno povezani, saj velik del nukleotidnega zaporedja regulatornih RNA in njihovih genov ter regulatornih regij predstavljajo TE. Transpozicijski elementi določajo funkcionalne lastnosti različnih tipov ncRNA, kar je ključno za njihovo regulatorno funkcijo pri transkripciji in posttranskripcijskih procesih. 
Transpozicijski elementi dajejo strukturne značilnosti lncRNA, ki jim dajejo sposobnost interakcije z drugimi biološkimi molekulami (DNA, RNA, proteini...). lncRNA imajo lahko tako cis kot tudi trans-regulatorno aktivnost. Pojavlja se veliko hipotez, da TE dajejo funkcionalne domene lncRNA. Primer, ki potrjuje to hipotezo, je interakcija med XIST lncRNA in proteinskim kompleksom PRC2 (polycomb repressive complex 2). XIST lncRNA namreč vključuje transpozicijski element ERVB5 in ravno ta regija predstavlja vezavno mesto za PRC2. PRC2 ima vlogo pri zagotavljanju kompaktnosti kromatina, in sicer tako, da ena izmed njegovih podenot EZH2 (Enhancer of zeste homolog 2) katalizira trimetilacijo lizina 27 na histonu 3 (H3K27me1/2/3), s tem pa povzroči represijo transkripcije določenih genov. Fosforilacija EZH2 in T350 (obe sta podenoti PRC2) s CDK1/2 je ključna za interakcijo PRC2 z lncRNA, ki poteka preko G-kvadrupleskne regije lncRNA, le-ta pa je bogata s transpozoni ERVB5. XIST lncRNA pripelje proteinski kompleks PRC2 do promotorske regije tarčnega gena (npr. tumor supresorskega gena), kjer EZH2 s svojo metiltransferazno aktivnostjo deluje kot represor transkripcije. 
Zanimiv primer povezave med transpozicijskimi elementi in nekodirajočo RNA je regulacija odziva na toplotni šok pri miših. Ta primer kaže tudi na trans-regulatorno vlogo nekodirajoče RNA. Mišja ncRNA, ki izhaja iz retrotranspozona B2 SINE, se v normalnih pogojih veže na regulatorne regije genov, ki se odzivajo na stres, ter tako prepreči njihovo transkripcijo. Pri toplotnem šoku se aktivira protein EZH2, ki pospeši razgradnjo te ncRNA ter tako prepreči inhibicijo transkripcije genov, povezanih s stresom (EZH2 stimulira ribocimsko aktivnost same ncRNA). 
Transpozicijski elementi imajo pomembno vlogo pri procesu transkripcije genov za nekodirajoče RNA, saj so vključeni v številna območja njihovih genov in regulatornih regij. Mesta na genomu, na katerih se nahajajo nukleotidna zaporedja, ki izhajajo iz transpozicijskih elementov, so prisotna tako v promotorjih kot tudi na poliA regijah genov za nekodirajoče RNA. Veliko so jih našli tudi na regijah genov za lncRNA, ki so pomembna za spajanje eksonov oz. izrezovanje intronov (splice donor, splice acceptor). 
Veliko molekul miRNA (spadajo med sncRNA) z vključenimi transpozicijskimi elementi interagira s 3' koncem neprevajajoče regije tarčne mRNA (3' UTR). Preko tega procesa se utiša mRNA. Tako se npr. miR-151, ki vsebuje transpozicijske elemente LINE2, veže na molekulo mRNA, ki kodira za ATPAF1 (ATP synthase mitochondrial F1 complex assembly factor 1), in sicer tako, da se poveže s transpozoni LINE2 na 3' koncu neprevajajoče regije tarčne mRNA. 
Vedno bolj se odkriva tudi vloga transpozicijskih elementov pri tvorbi stabilnejših sekundarnih struktur v nekodirajočih RNA. Raziskava, ki je primerjala lncRNA z vključenimi transpozicijskimi elementi in lncRNA brez vključenih transpozicijskih elementov, je ugotovila, da lncRNA z vključenimi transpozicijskimi elementi tvorijo stabilnejše sekundarne strukture. Analizirali so tudi mesta na lncRNA, ki so vključena v bazno parjenje pri tvorbi sekundarnih struktur in ugotovili, da je okrog 82 % teh mest lociranih v Alu regijah lncRNA. Torej, Alu regije v regulatornih RNA sodelujejo pri intramolekularnem baznem parjenju, kar privede do tvorbe stabilnejših sekundarnih struktur, s tem pa tudi do večje stabilnosti nekodirajočih RNA. To jim omogoči, da lahko bolje opravljajo svoje funkcije regulacije transkripcije. 
==Viri in literatura==

[1]R. Fueyo, J. Judd, C. Feschotte, and J. Wysocka, ‘Roles of transposable elements in the regulation of mammalian transcription’, Nat Rev Mol Cell Biol, pp. 1–17, Feb. 2022, doi: 10.1038/s41580-022-00457-y. 
[2]A. Ali, K. Han, and P. Liang, ‘Role of Transposable Elements in Gene Regulation in the Human Genome’, Life (Basel), vol. 11, no. 2, p. 118, Feb. 2021, doi: 10.3390/life11020118. 
[3]P. J. Wittkopp and G. Kalay, ‘Cis-regulatory elements: molecular mechanisms and evolutionary processes underlying divergence’, Nat Rev Genet, vol. 13, no. 1, Art. no. 1, Jan. 2012, doi: 10.1038/nrg3095. 
[4]A. Hao, Y. Wang, D. B. Stovall, Y. Wang, and G. Sui, ‘Emerging Roles of LncRNAs in the EZH2-regulated Oncogenic Network’, Int. J. Biol. Sci., vol. 17, no. 13, pp. 3268–3280, 2021, doi: 10.7150/ijbs.63488. 
[5]N. Liu et al., ‘Selective silencing of euchromatic L1s revealed by genome-wide screens for L1 regulators’, Nature, vol. 553, no. 7687, Art. no. 7687, Jan. 2018, doi: 10.1038/nature25179. 

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

TE kot regulatorji transkripcije

2022-04-24T12:44:56Z

David Valte: /* Uvod */

==Uvod==
Transpozicijski elementi (TE), ki sestavljajo velik del evkariontskega genoma, lahko, če se nahajajo v eksonskih predelih gostiteljevega genskega zapisa, bistveno zmanjšajo njegovo evolucijsko sposobnost preživetja, ker delujejo moteče (lahko povzročijo npr. vstavitev start in stop kodonov, premik bralnega okvirja, prehitro terminacijo transkripcije,…). S tem zmanjšajo tudi verjetnost za lasten prenos v nove generacije. Ker TE po delovanju spominjajo na parazitski organizem, so se skozi evolucijo razvile strategije, ki preprečujejo preveliko škodo na gostiteljskem organizmu. Prilagajanje je potekalo vzajemno. Gostiteljski organizmi so npr. postali sposobni utišanja transpozicijskih elementov s pomočjo metilacije DNA na CpG otočkih, TE pa so se preferenčno vključevali v intronska zaporedja, saj tam ne delujejo tako moteče. Skozi čas so gostiteljski organizmi postali sposobni uporabe TE v svojo korist. 

Vključitve transpozicijskih elementov v nekodirajoče predele genskega zapisa in njihove mutacije so v veliko primerih povzročile, da so TE izgubili sposobnost transponiranja, pridobili pa so cis in trans-regulatorno aktivnost. Cis-regulatorne regije (CRE) so nekodirajoča zaporedja nukleotidov, ki regulirajo ekspresijo genov na isti verigi DNA. Trans regulacija pa pomeni predvsem to, da npr. transkripcijski faktorji prihajajo od drugod oz. so kodirani na eni molekuli DNA, regulirajo pa ekspresijo genov na drugi molekuli DNA. Regulacija transkripcije s TE lahko poteka na več načinov: 

1. V genski zapis lahko vnašajo nova vezavna mesta za transkripcijske faktorje (TF) preko promotorjev, ojačevalcev, utiševalnih in izolatorskih zaporedij. 
2. Lahko modulirajo 3D strukturo kromatina. 
3. Zmožni so kodiranja transkripcijskih faktorjev. 
4. S povezovanjem z represorskimi transkripcijskimi faktorji vplivajo na utišanje sosednjih genov. 
5. Imajo vlogo pri regulatornih nekodirajočih molekulah RNA, ki so pomembni regulatorji transkripcije. 

==Funkcije transpozicijskih elementov v cis-regulatornih regijah ==
Regulatorne sposobnosti cis-regulatornih regij lahko izhajajo iz transpozicijskih elementov. V splošnem cis-regulatorne regije delujejo tako, da tvorijo specifična vezavna mesta za proteine povezane z iniciacijo in regulacijo transkripcije. Primeri nekaterih vrst CRE: 
1. Promotorji so kratka zaporedja DNA, ki vključujejo začetno mesto transkripcije. Ob vezavi ustreznih transkripcijskih faktorjev na promotorsko regijo omogočijo transkripcijo gena. Kot primer bi omenil transpozon AluSp v promotorju gena FCER1G, ki inducira transkripcijo visokoafinitetnega receptorja za Fc regijo IgE. 
2. Ojačevalci so zaporedja, ki jih najdemo pred ali za genom, ki ga regulirajo. Delujejo kooperativno s promotorjem, in sicer tako, da povečajo stopnjo transkripcije, omogočajo pa regulacijo tudi bolj oddaljenih genov. Kot primer bi omenil transpozon AluY v intronu gena CD8 (ta kodira glikoprotein CD8, ki je pomemben pri celičnih interakcijah znotraj imunskega sistema), za katerega so ugotovili, da deluje kot ojačevalec. 
3. Utiševalna zaporedja vežejo represorje in tako preprečujejo transkripcijo. Transpozicijski elementi so z rekrutiranjem transkripcijskih faktorjev postali sposobni delovati kot utiševalna zaporedja, ki remodelirajo kromatin. Čeprav so heterokromatinski deli revni z geni, so bogati s TE-ji, kar bi lahko pomenilo, da imajo transpozicijski elementi pomembno vlogo pri širjenju heterokromatina. Tako se npr. korepresorski protein TRIM28 veže na vezavno mesto, ki se nahaja na transpozonu ERV in s tem utiša sosednje gene. 
4. Inzulatorji ščitijo gene pred regulatornimi vplivi sosednjih genov. Lahko blokirajo promotorje, ojačevalce in utiševalce. Preprečujejo neprimerne interakcije med sosednjimi kromatinskimi regijami. Kot primer bi omenil gen za transpozon AluSq, ki deluje kot inzulator, saj njegova transkripcija ščiti človeški gen HBE1 (ki kodira za istoimenski protein) pred regulacijo z drugimi promotorji. 

TE-ji uvajajo nova vezavna mesta za TF, ki so v njih lahko prisotna takoj po inserciji v genom ali pa nastanejo de novo s postinsercijskimi mutacijami. Pogosto se mutacije pojavljajo na metiliranih CpG otočkih. Deaminacija teh povzroči zamenjavo citozina z gvaninom, kar je med drugim povzročilo nastanek številnih vezavnih mest za transkripcijska faktorja cMyc in p53. Vključitev TE-jev zraven že obstoječega vezavnega mesta za transkripcijske faktorje ter točkovne mutacije omogočijo nastanek novih mest za vezavo TF (alternativni promotorji), kar povzroča zaščito pred možnimi kasnejšimi mutacijami z redundančnostjo. Redundanca dopušča tudi kooperativno delovanje z zunanjimi promotorji, saj se lahko tako razbremenijo določena vezavna mesta za transkripcijske faktorje. 

==Vpliv transpozicijskih elementov na kromatinsko 3D strukturo==
V interfaznem jedru so deli genoma organizirani v topološko asociirajoče domene (TAD). To so večje domene kromatina, ki so med seboj ločene z izolatorskimi proteini. Ti omejujejo prostor, v katerem lahko različni deli DNA prihajajo v medsebojne stike. Njihova naloga je tudi prostorsko omejevanje interakcij med transkripcijskimi faktorji in ojačevalci ter promotorji. TAD specificirajo funkcije cis regulatornih regij z omejevanjem ojačevalcev, tako da ti aktivirajo le promotorje znotraj iste TAD. Vloga transpozicijskih elementov (TE) pri 3D arhitekturi genoma se je v zadnjih letih začela intenzivno raziskovati. Številne družine TE so namreč obogatene na mejah TAD. Določeni TE naj bi imeli preko tega tudi vlogo pri zvijanju kromosomov, prav tako pa tudi pri kompaktnosti kromatina in posledično tudi pri regulaciji procesov transkripcije. Kot primer pomena transpozicijskih elementov bi izpostavil študijo, ki je odkrila veliko HERV-H na mejah TAD v človeških embrionalnih matičnih celicah (hESCs) in delecija 2 individualnih HERV-H je vodila do izgube kompaktnosti te meje. 
Protein CTCF (11-zinc finger protein) je pomemben pri regulaciji 3D strukture kromatina in procesov transkripcije. Zelo pomemben je pri strukturi mej TAD. Vsebuje motive cinkovega prsta in deluje kot transkripcijski faktor. Sodeluje pri mediaciji nastanka kromatinskih zank in se velikokrat veže na TE. Opaženo je bilo, da so TE razpršili veliko vezavnih mest za protein CTCF in smiselno bi bilo, da bi se tudi meje TAD razpršile, vendar je bilo ugotovljeno, da so te zelo ohranjene. Odkrili so različne mehanizme preprečevanja tvorbe ektopičnih meja TAD. Tako se npr. transpozoni B2SINE, ki imajo veliko vezavnih mest za protein CTCF, lahko povežejo s kompleksom ChAHP, ki torej prepozna isti motiv kot CTCF, a z višjo afiniteto. 
==Kodiranje transkripcijskih faktorjev s transpozicijskimi elementi==
Šele nedavno so prišli do dognanj, da proteini, za katere kodirajo transpozicijski elementi, lahko vplivajo na regulacijo genov. Najdeni so bili številni primeri, v katerih gen za TE kodira transpozazo in hkrati tudi gostiteljski transkripcijski faktor. Fuzija transpozazne DNA-domene z regulatorno domeno transkripcijskega faktorja privede do tvorbe proteinskega kompleksa, ki je sposoben prepoznave ustreznega zaporedja TE na DNA, ker transpozaza prepozna transpozicijski element. Tako se lahko optimizira regulacija ekspresije genov s pomočjo TE. 
==Utišanje transpozicijskih elementov in pomen le-tega pri regulaciji transkripcije==
Organizmi so razvili zmožnost zmanjšanja aktivnosti transpozicijskih elementov, prav tako pa so transpozicijski elementi zmožni obiti gostiteljevo obrambo. Eden od načinov utišanja delovanja TE je metilacija DNA. Demetilacija TE lahko vodi do nepravilne aktivacije sosednjih genov zaradi ojačevalnega potenciala TE. Zato so gostitelji morali razviti mehanizem, ki to kontrolira. Pomemben utiševalni mehanizem TE je metilacija CpG otočkov na DNA. Primer povezave med metilacijo DNA in aktivnostjo iz TE izhajajočih cis regulatornih regij je gen Agouti. Ta daje rjavo obarvanim mišim C57BL/6J rumeno obarvanje na način, ki je odvisen od ravni metilacije promotorja, ki nadzoruje transkripcijo retrotranspozonov IAP. Retrotranspozon IAP pa nadzira ekspresijo gena Agouti in s tem obarvanje miši. 
Drug mehanizem utišanja TE so histonske modifikacije. Primer te epigenetske modifikacije je trimetilacija lizina 9 na histonu H3 (H3K9me3). Pomembno vlogo pri tem ima kompleks HUSH (human silencing hub complex). ATPaza MORC2 in HUSH se povežeta in posledično pride do trimetilacije na histonu 3 na retrotranspozonu LINE1 in tako se retrotranspoznon utiša. LINE1 se nahaja v intronih aktivnih genov. Če so ti trimetilirani, potem se RNA polimeraza II ne more pomikati naprej (motena je elongacija transkripcije), zato se geni ne prepisujejo. 
==Transpozicijski elementi in njihova vloga pri regulatornih nekodirajočih molekulah RNA==
Zaradi napredka v določanju nukleotidnega zaporedja molekul RNA se v zadnjih letih odkriva vedno več nekodirajočih molekul RNA (ncRNA). Te vključujejo tudi regulatorne RNA, med katere spadajo kratke nekodirajoče RNA (sncRNA) in dolge nekodirajoče RNA (lncRNA). Transpozicijski elementi (TE) in regulatorne RNA so tesno povezani, saj velik del nukleotidnega zaporedja regulatornih RNA in njihovih genov ter regulatornih regij predstavljajo TE. Transpozicijski elementi določajo funkcionalne lastnosti različnih tipov ncRNA, kar je ključno za njihovo regulatorno funkcijo pri transkripciji in posttranskripcijskih procesih. 
Transpozicijski elementi dajejo strukturne značilnosti lncRNA, ki jim dajejo sposobnost interakcije z drugimi biološkimi molekulami (DNA, RNA, proteini...). lncRNA imajo lahko tako cis kot tudi trans-regulatorno aktivnost. Pojavlja se veliko hipotez, da TE dajejo funkcionalne domene lncRNA. Primer, ki potrjuje to hipotezo, je interakcija med XIST lncRNA in proteinskim kompleksom PRC2 (polycomb repressive complex 2). XIST lncRNA namreč vključuje transpozicijski element ERVB5 in ravno ta regija predstavlja vezavno mesto za PRC2. PRC2 ima vlogo pri zagotavljanju kompaktnosti kromatina, in sicer tako, da ena izmed njegovih podenot EZH2 (Enhancer of zeste homolog 2) katalizira trimetilacijo lizina 27 na histonu 3 (H3K27me1/2/3), s tem pa povzroči represijo transkripcije določenih genov. Fosforilacija EZH2 in T350 (obe sta podenoti PRC2) s CDK1/2 je ključna za interakcijo PRC2 z lncRNA, ki poteka preko G-kvadrupleskne regije lncRNA, le-ta pa je bogata s transpozoni ERVB5. XIST lncRNA pripelje proteinski kompleks PRC2 do promotorske regije tarčnega gena (npr. tumor supresorskega gena), kjer EZH2 s svojo metiltransferazno aktivnostjo deluje kot represor transkripcije. 
Zanimiv primer povezave med transpozicijskimi elementi in nekodirajočo RNA je regulacija odziva na toplotni šok pri miših. Ta primer kaže tudi na trans-regulatorno vlogo nekodirajoče RNA. Mišja ncRNA, ki izhaja iz retrotranspozona B2 SINE, se v normalnih pogojih veže na regulatorne regije genov, ki se odzivajo na stres, ter tako prepreči njihovo transkripcijo. Pri toplotnem šoku se aktivira protein EZH2, ki pospeši razgradnjo te ncRNA ter tako prepreči inhibicijo transkripcije genov, povezanih s stresom (EZH2 stimulira ribocimsko aktivnost same ncRNA). 
Transpozicijski elementi imajo pomembno vlogo pri procesu transkripcije genov za nekodirajoče RNA, saj so vključeni v številna območja njihovih genov in regulatornih regij. Mesta na genomu, na katerih se nahajajo nukleotidna zaporedja, ki izhajajo iz transpozicijskih elementov, so prisotna tako v promotorjih kot tudi na poliA regijah genov za nekodirajoče RNA. Veliko so jih našli tudi na regijah genov za lncRNA, ki so pomembna za spajanje eksonov oz. izrezovanje intronov (splice donor, splice acceptor). 
Veliko molekul miRNA (spadajo med sncRNA) z vključenimi transpozicijskimi elementi interagira s 3' koncem neprevajajoče regije tarčne mRNA (3' UTR). Preko tega procesa se utiša mRNA. Tako se npr. miR-151, ki vsebuje transpozicijske elemente LINE2, veže na molekulo mRNA, ki kodira za ATPAF1 (ATP synthase mitochondrial F1 complex assembly factor 1), in sicer tako, da se poveže s transpozoni LINE2 na 3' koncu neprevajajoče regije tarčne mRNA. 
Vedno bolj se odkriva tudi vloga transpozicijskih elementov pri tvorbi stabilnejših sekundarnih struktur v nekodirajočih RNA. Raziskava, ki je primerjala lncRNA z vključenimi transpozicijskimi elementi in lncRNA brez vključenih transpozicijskih elementov, je ugotovila, da lncRNA z vključenimi transpozicijskimi elementi tvorijo stabilnejše sekundarne strukture. Analizirali so tudi mesta na lncRNA, ki so vključena v bazno parjenje pri tvorbi sekundarnih struktur in ugotovili, da je okrog 82 % teh mest lociranih v Alu regijah lncRNA. Torej, Alu regije v regulatornih RNA sodelujejo pri intramolekularnem baznem parjenju, kar privede do tvorbe stabilnejših sekundarnih struktur, s tem pa tudi do večje stabilnosti nekodirajočih RNA. To jim omogoči, da lahko bolje opravljajo svoje funkcije regulacije transkripcije. 
==Viri in literatura==

[1]R. Fueyo, J. Judd, C. Feschotte, and J. Wysocka, ‘Roles of transposable elements in the regulation of mammalian transcription’, Nat Rev Mol Cell Biol, pp. 1–17, Feb. 2022, doi: 10.1038/s41580-022-00457-y. 
[2]A. Ali, K. Han, and P. Liang, ‘Role of Transposable Elements in Gene Regulation in the Human Genome’, Life (Basel), vol. 11, no. 2, p. 118, Feb. 2021, doi: 10.3390/life11020118. 
[3]P. J. Wittkopp and G. Kalay, ‘Cis-regulatory elements: molecular mechanisms and evolutionary processes underlying divergence’, Nat Rev Genet, vol. 13, no. 1, Art. no. 1, Jan. 2012, doi: 10.1038/nrg3095. 
[4]A. Hao, Y. Wang, D. B. Stovall, Y. Wang, and G. Sui, ‘Emerging Roles of LncRNAs in the EZH2-regulated Oncogenic Network’, Int. J. Biol. Sci., vol. 17, no. 13, pp. 3268–3280, 2021, doi: 10.7150/ijbs.63488. 
[5]N. Liu et al., ‘Selective silencing of euchromatic L1s revealed by genome-wide screens for L1 regulators’, Nature, vol. 553, no. 7687, Art. no. 7687, Jan. 2018, doi: 10.1038/nature25179. 

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

TE kot regulatorji transkripcije

2022-04-24T12:43:27Z

David Valte: /* Funkcije transpozicijskih elementov v cis-regulatornih regijah */

==Uvod==
Transpozicijski elementi (TE), ki sestavljajo velik del evkariontskega genoma, lahko, če se nahajajo v eksonskih predelih gostiteljevega genskega zapisa, bistveno zmanjšajo njegovo evolucijsko sposobnost preživetja, ker delujejo moteče (lahko povzročijo npr. vstavitev start in stop kodonov, premik bralnega okvirja, prehitro terminacijo transkripcije,…). S tem zmanjšajo tudi verjetnost za lasten prenos v nove generacije. Ker TE po delovanju spominjajo na parazitski organizem, so se skozi evolucijo razvile strategije, ki preprečujejo preveliko škodo na gostiteljskem organizmu. Prilagajanje je potekalo vzajemno. Gostiteljski organizmi so npr. postali sposobni utišanja transpozicijskih elementov s pomočjo metilacije DNA na CpG otočkih, TE pa so se preferenčno vključevali v intronska zaporedja, saj tam ne delujejo tako moteče. Skozi čas so gostiteljski organizmi postali sposobni uporabe TE v svojo korist. 

Vključitve transpozicijskih elementov v nekodirajoče predele genskega zapisa in njihove mutacije so v veliko primerih povzročile, da so TE izgubili sposobnost transponiranja, pridobili pa so cis in trans-regulatorno aktivnost. Cis-regulatorne regije (CRE) so nekodirajoča zaporedja nukleotidov, ki regulirajo ekspresijo genov na isti verigi DNA. Trans regulacija pa pomeni predvsem to, da npr. transkripcijski faktorji prihajajo od drugod oz. so kodirani na eni molekuli DNA, regulirajo pa ekspresijo genov na drugi molekuli DNA. Regulacija transkripcije s TE lahko poteka na več načinov: 
1. V genski zapis lahko vnašajo nova vezavna mesta za transkripcijske faktorje (TF) preko promotorjev, ojačevalcev, utiševalnih in izolatorskih zaporedij. 
2. Lahko modulirajo 3D strukturo kromatina. 
3. Zmožni so kodiranja transkripcijskih faktorjev. 
4. S povezovanjem z represorskimi transkripcijskimi faktorji vplivajo na utišanje sosednjih genov. 
5. Imajo vlogo pri regulatornih nekodirajočih molekulah RNA, ki so pomembni regulatorji transkripcije. 
==Funkcije transpozicijskih elementov v cis-regulatornih regijah ==
Regulatorne sposobnosti cis-regulatornih regij lahko izhajajo iz transpozicijskih elementov. V splošnem cis-regulatorne regije delujejo tako, da tvorijo specifična vezavna mesta za proteine povezane z iniciacijo in regulacijo transkripcije. Primeri nekaterih vrst CRE: 
1. Promotorji so kratka zaporedja DNA, ki vključujejo začetno mesto transkripcije. Ob vezavi ustreznih transkripcijskih faktorjev na promotorsko regijo omogočijo transkripcijo gena. Kot primer bi omenil transpozon AluSp v promotorju gena FCER1G, ki inducira transkripcijo visokoafinitetnega receptorja za Fc regijo IgE. 
2. Ojačevalci so zaporedja, ki jih najdemo pred ali za genom, ki ga regulirajo. Delujejo kooperativno s promotorjem, in sicer tako, da povečajo stopnjo transkripcije, omogočajo pa regulacijo tudi bolj oddaljenih genov. Kot primer bi omenil transpozon AluY v intronu gena CD8 (ta kodira glikoprotein CD8, ki je pomemben pri celičnih interakcijah znotraj imunskega sistema), za katerega so ugotovili, da deluje kot ojačevalec. 
3. Utiševalna zaporedja vežejo represorje in tako preprečujejo transkripcijo. Transpozicijski elementi so z rekrutiranjem transkripcijskih faktorjev postali sposobni delovati kot utiševalna zaporedja, ki remodelirajo kromatin. Čeprav so heterokromatinski deli revni z geni, so bogati s TE-ji, kar bi lahko pomenilo, da imajo transpozicijski elementi pomembno vlogo pri širjenju heterokromatina. Tako se npr. korepresorski protein TRIM28 veže na vezavno mesto, ki se nahaja na transpozonu ERV in s tem utiša sosednje gene. 
4. Inzulatorji ščitijo gene pred regulatornimi vplivi sosednjih genov. Lahko blokirajo promotorje, ojačevalce in utiševalce. Preprečujejo neprimerne interakcije med sosednjimi kromatinskimi regijami. Kot primer bi omenil gen za transpozon AluSq, ki deluje kot inzulator, saj njegova transkripcija ščiti človeški gen HBE1 (ki kodira za istoimenski protein) pred regulacijo z drugimi promotorji. 

TE-ji uvajajo nova vezavna mesta za TF, ki so v njih lahko prisotna takoj po inserciji v genom ali pa nastanejo de novo s postinsercijskimi mutacijami. Pogosto se mutacije pojavljajo na metiliranih CpG otočkih. Deaminacija teh povzroči zamenjavo citozina z gvaninom, kar je med drugim povzročilo nastanek številnih vezavnih mest za transkripcijska faktorja cMyc in p53. Vključitev TE-jev zraven že obstoječega vezavnega mesta za transkripcijske faktorje ter točkovne mutacije omogočijo nastanek novih mest za vezavo TF (alternativni promotorji), kar povzroča zaščito pred možnimi kasnejšimi mutacijami z redundančnostjo. Redundanca dopušča tudi kooperativno delovanje z zunanjimi promotorji, saj se lahko tako razbremenijo določena vezavna mesta za transkripcijske faktorje. 

==Vpliv transpozicijskih elementov na kromatinsko 3D strukturo==
V interfaznem jedru so deli genoma organizirani v topološko asociirajoče domene (TAD). To so večje domene kromatina, ki so med seboj ločene z izolatorskimi proteini. Ti omejujejo prostor, v katerem lahko različni deli DNA prihajajo v medsebojne stike. Njihova naloga je tudi prostorsko omejevanje interakcij med transkripcijskimi faktorji in ojačevalci ter promotorji. TAD specificirajo funkcije cis regulatornih regij z omejevanjem ojačevalcev, tako da ti aktivirajo le promotorje znotraj iste TAD. Vloga transpozicijskih elementov (TE) pri 3D arhitekturi genoma se je v zadnjih letih začela intenzivno raziskovati. Številne družine TE so namreč obogatene na mejah TAD. Določeni TE naj bi imeli preko tega tudi vlogo pri zvijanju kromosomov, prav tako pa tudi pri kompaktnosti kromatina in posledično tudi pri regulaciji procesov transkripcije. Kot primer pomena transpozicijskih elementov bi izpostavil študijo, ki je odkrila veliko HERV-H na mejah TAD v človeških embrionalnih matičnih celicah (hESCs) in delecija 2 individualnih HERV-H je vodila do izgube kompaktnosti te meje. 
Protein CTCF (11-zinc finger protein) je pomemben pri regulaciji 3D strukture kromatina in procesov transkripcije. Zelo pomemben je pri strukturi mej TAD. Vsebuje motive cinkovega prsta in deluje kot transkripcijski faktor. Sodeluje pri mediaciji nastanka kromatinskih zank in se velikokrat veže na TE. Opaženo je bilo, da so TE razpršili veliko vezavnih mest za protein CTCF in smiselno bi bilo, da bi se tudi meje TAD razpršile, vendar je bilo ugotovljeno, da so te zelo ohranjene. Odkrili so različne mehanizme preprečevanja tvorbe ektopičnih meja TAD. Tako se npr. transpozoni B2SINE, ki imajo veliko vezavnih mest za protein CTCF, lahko povežejo s kompleksom ChAHP, ki torej prepozna isti motiv kot CTCF, a z višjo afiniteto. 
==Kodiranje transkripcijskih faktorjev s transpozicijskimi elementi==
Šele nedavno so prišli do dognanj, da proteini, za katere kodirajo transpozicijski elementi, lahko vplivajo na regulacijo genov. Najdeni so bili številni primeri, v katerih gen za TE kodira transpozazo in hkrati tudi gostiteljski transkripcijski faktor. Fuzija transpozazne DNA-domene z regulatorno domeno transkripcijskega faktorja privede do tvorbe proteinskega kompleksa, ki je sposoben prepoznave ustreznega zaporedja TE na DNA, ker transpozaza prepozna transpozicijski element. Tako se lahko optimizira regulacija ekspresije genov s pomočjo TE. 
==Utišanje transpozicijskih elementov in pomen le-tega pri regulaciji transkripcije==
Organizmi so razvili zmožnost zmanjšanja aktivnosti transpozicijskih elementov, prav tako pa so transpozicijski elementi zmožni obiti gostiteljevo obrambo. Eden od načinov utišanja delovanja TE je metilacija DNA. Demetilacija TE lahko vodi do nepravilne aktivacije sosednjih genov zaradi ojačevalnega potenciala TE. Zato so gostitelji morali razviti mehanizem, ki to kontrolira. Pomemben utiševalni mehanizem TE je metilacija CpG otočkov na DNA. Primer povezave med metilacijo DNA in aktivnostjo iz TE izhajajočih cis regulatornih regij je gen Agouti. Ta daje rjavo obarvanim mišim C57BL/6J rumeno obarvanje na način, ki je odvisen od ravni metilacije promotorja, ki nadzoruje transkripcijo retrotranspozonov IAP. Retrotranspozon IAP pa nadzira ekspresijo gena Agouti in s tem obarvanje miši. 
Drug mehanizem utišanja TE so histonske modifikacije. Primer te epigenetske modifikacije je trimetilacija lizina 9 na histonu H3 (H3K9me3). Pomembno vlogo pri tem ima kompleks HUSH (human silencing hub complex). ATPaza MORC2 in HUSH se povežeta in posledično pride do trimetilacije na histonu 3 na retrotranspozonu LINE1 in tako se retrotranspoznon utiša. LINE1 se nahaja v intronih aktivnih genov. Če so ti trimetilirani, potem se RNA polimeraza II ne more pomikati naprej (motena je elongacija transkripcije), zato se geni ne prepisujejo. 
==Transpozicijski elementi in njihova vloga pri regulatornih nekodirajočih molekulah RNA==
Zaradi napredka v določanju nukleotidnega zaporedja molekul RNA se v zadnjih letih odkriva vedno več nekodirajočih molekul RNA (ncRNA). Te vključujejo tudi regulatorne RNA, med katere spadajo kratke nekodirajoče RNA (sncRNA) in dolge nekodirajoče RNA (lncRNA). Transpozicijski elementi (TE) in regulatorne RNA so tesno povezani, saj velik del nukleotidnega zaporedja regulatornih RNA in njihovih genov ter regulatornih regij predstavljajo TE. Transpozicijski elementi določajo funkcionalne lastnosti različnih tipov ncRNA, kar je ključno za njihovo regulatorno funkcijo pri transkripciji in posttranskripcijskih procesih. 
Transpozicijski elementi dajejo strukturne značilnosti lncRNA, ki jim dajejo sposobnost interakcije z drugimi biološkimi molekulami (DNA, RNA, proteini...). lncRNA imajo lahko tako cis kot tudi trans-regulatorno aktivnost. Pojavlja se veliko hipotez, da TE dajejo funkcionalne domene lncRNA. Primer, ki potrjuje to hipotezo, je interakcija med XIST lncRNA in proteinskim kompleksom PRC2 (polycomb repressive complex 2). XIST lncRNA namreč vključuje transpozicijski element ERVB5 in ravno ta regija predstavlja vezavno mesto za PRC2. PRC2 ima vlogo pri zagotavljanju kompaktnosti kromatina, in sicer tako, da ena izmed njegovih podenot EZH2 (Enhancer of zeste homolog 2) katalizira trimetilacijo lizina 27 na histonu 3 (H3K27me1/2/3), s tem pa povzroči represijo transkripcije določenih genov. Fosforilacija EZH2 in T350 (obe sta podenoti PRC2) s CDK1/2 je ključna za interakcijo PRC2 z lncRNA, ki poteka preko G-kvadrupleskne regije lncRNA, le-ta pa je bogata s transpozoni ERVB5. XIST lncRNA pripelje proteinski kompleks PRC2 do promotorske regije tarčnega gena (npr. tumor supresorskega gena), kjer EZH2 s svojo metiltransferazno aktivnostjo deluje kot represor transkripcije. 
Zanimiv primer povezave med transpozicijskimi elementi in nekodirajočo RNA je regulacija odziva na toplotni šok pri miših. Ta primer kaže tudi na trans-regulatorno vlogo nekodirajoče RNA. Mišja ncRNA, ki izhaja iz retrotranspozona B2 SINE, se v normalnih pogojih veže na regulatorne regije genov, ki se odzivajo na stres, ter tako prepreči njihovo transkripcijo. Pri toplotnem šoku se aktivira protein EZH2, ki pospeši razgradnjo te ncRNA ter tako prepreči inhibicijo transkripcije genov, povezanih s stresom (EZH2 stimulira ribocimsko aktivnost same ncRNA). 
Transpozicijski elementi imajo pomembno vlogo pri procesu transkripcije genov za nekodirajoče RNA, saj so vključeni v številna območja njihovih genov in regulatornih regij. Mesta na genomu, na katerih se nahajajo nukleotidna zaporedja, ki izhajajo iz transpozicijskih elementov, so prisotna tako v promotorjih kot tudi na poliA regijah genov za nekodirajoče RNA. Veliko so jih našli tudi na regijah genov za lncRNA, ki so pomembna za spajanje eksonov oz. izrezovanje intronov (splice donor, splice acceptor). 
Veliko molekul miRNA (spadajo med sncRNA) z vključenimi transpozicijskimi elementi interagira s 3' koncem neprevajajoče regije tarčne mRNA (3' UTR). Preko tega procesa se utiša mRNA. Tako se npr. miR-151, ki vsebuje transpozicijske elemente LINE2, veže na molekulo mRNA, ki kodira za ATPAF1 (ATP synthase mitochondrial F1 complex assembly factor 1), in sicer tako, da se poveže s transpozoni LINE2 na 3' koncu neprevajajoče regije tarčne mRNA. 
Vedno bolj se odkriva tudi vloga transpozicijskih elementov pri tvorbi stabilnejših sekundarnih struktur v nekodirajočih RNA. Raziskava, ki je primerjala lncRNA z vključenimi transpozicijskimi elementi in lncRNA brez vključenih transpozicijskih elementov, je ugotovila, da lncRNA z vključenimi transpozicijskimi elementi tvorijo stabilnejše sekundarne strukture. Analizirali so tudi mesta na lncRNA, ki so vključena v bazno parjenje pri tvorbi sekundarnih struktur in ugotovili, da je okrog 82 % teh mest lociranih v Alu regijah lncRNA. Torej, Alu regije v regulatornih RNA sodelujejo pri intramolekularnem baznem parjenju, kar privede do tvorbe stabilnejših sekundarnih struktur, s tem pa tudi do večje stabilnosti nekodirajočih RNA. To jim omogoči, da lahko bolje opravljajo svoje funkcije regulacije transkripcije. 
==Viri in literatura==

[1]R. Fueyo, J. Judd, C. Feschotte, and J. Wysocka, ‘Roles of transposable elements in the regulation of mammalian transcription’, Nat Rev Mol Cell Biol, pp. 1–17, Feb. 2022, doi: 10.1038/s41580-022-00457-y. 
[2]A. Ali, K. Han, and P. Liang, ‘Role of Transposable Elements in Gene Regulation in the Human Genome’, Life (Basel), vol. 11, no. 2, p. 118, Feb. 2021, doi: 10.3390/life11020118. 
[3]P. J. Wittkopp and G. Kalay, ‘Cis-regulatory elements: molecular mechanisms and evolutionary processes underlying divergence’, Nat Rev Genet, vol. 13, no. 1, Art. no. 1, Jan. 2012, doi: 10.1038/nrg3095. 
[4]A. Hao, Y. Wang, D. B. Stovall, Y. Wang, and G. Sui, ‘Emerging Roles of LncRNAs in the EZH2-regulated Oncogenic Network’, Int. J. Biol. Sci., vol. 17, no. 13, pp. 3268–3280, 2021, doi: 10.7150/ijbs.63488. 
[5]N. Liu et al., ‘Selective silencing of euchromatic L1s revealed by genome-wide screens for L1 regulators’, Nature, vol. 553, no. 7687, Art. no. 7687, Jan. 2018, doi: 10.1038/nature25179. 

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

TE kot regulatorji transkripcije

2022-04-24T12:43:08Z

David Valte:

==Uvod==
Transpozicijski elementi (TE), ki sestavljajo velik del evkariontskega genoma, lahko, če se nahajajo v eksonskih predelih gostiteljevega genskega zapisa, bistveno zmanjšajo njegovo evolucijsko sposobnost preživetja, ker delujejo moteče (lahko povzročijo npr. vstavitev start in stop kodonov, premik bralnega okvirja, prehitro terminacijo transkripcije,…). S tem zmanjšajo tudi verjetnost za lasten prenos v nove generacije. Ker TE po delovanju spominjajo na parazitski organizem, so se skozi evolucijo razvile strategije, ki preprečujejo preveliko škodo na gostiteljskem organizmu. Prilagajanje je potekalo vzajemno. Gostiteljski organizmi so npr. postali sposobni utišanja transpozicijskih elementov s pomočjo metilacije DNA na CpG otočkih, TE pa so se preferenčno vključevali v intronska zaporedja, saj tam ne delujejo tako moteče. Skozi čas so gostiteljski organizmi postali sposobni uporabe TE v svojo korist. 

Vključitve transpozicijskih elementov v nekodirajoče predele genskega zapisa in njihove mutacije so v veliko primerih povzročile, da so TE izgubili sposobnost transponiranja, pridobili pa so cis in trans-regulatorno aktivnost. Cis-regulatorne regije (CRE) so nekodirajoča zaporedja nukleotidov, ki regulirajo ekspresijo genov na isti verigi DNA. Trans regulacija pa pomeni predvsem to, da npr. transkripcijski faktorji prihajajo od drugod oz. so kodirani na eni molekuli DNA, regulirajo pa ekspresijo genov na drugi molekuli DNA. Regulacija transkripcije s TE lahko poteka na več načinov: 
1. V genski zapis lahko vnašajo nova vezavna mesta za transkripcijske faktorje (TF) preko promotorjev, ojačevalcev, utiševalnih in izolatorskih zaporedij. 
2. Lahko modulirajo 3D strukturo kromatina. 
3. Zmožni so kodiranja transkripcijskih faktorjev. 
4. S povezovanjem z represorskimi transkripcijskimi faktorji vplivajo na utišanje sosednjih genov. 
5. Imajo vlogo pri regulatornih nekodirajočih molekulah RNA, ki so pomembni regulatorji transkripcije. 
==Funkcije transpozicijskih elementov v cis-regulatornih regijah ==
Regulatorne sposobnosti cis-regulatornih regij lahko izhajajo iz transpozicijskih elementov. V splošnem cis-regulatorne regije delujejo tako, da tvorijo specifična vezavna mesta za proteine povezane z iniciacijo in regulacijo transkripcije. Primeri nekaterih vrst CRE: 
1. Promotorji so kratka zaporedja DNA, ki vključujejo začetno mesto transkripcije. Ob vezavi ustreznih transkripcijskih faktorjev na promotorsko regijo omogočijo transkripcijo gena. Kot primer bi omenil transpozon AluSp v promotorju gena FCER1G, ki inducira transkripcijo visokoafinitetnega receptorja za Fc regijo IgE. 
2. Ojačevalci so zaporedja, ki jih najdemo pred ali za genom, ki ga regulirajo. Delujejo kooperativno s promotorjem, in sicer tako, da povečajo stopnjo transkripcije, omogočajo pa regulacijo tudi bolj oddaljenih genov. Kot primer bi omenil transpozon AluY v intronu gena CD8 (ta kodira glikoprotein CD8, ki je pomemben pri celičnih interakcijah znotraj imunskega sistema), za katerega so ugotovili, da deluje kot ojačevalec. 
3. Utiševalna zaporedja vežejo represorje in tako preprečujejo transkripcijo. Transpozicijski elementi so z rekrutiranjem transkripcijskih faktorjev postali sposobni delovati kot utiševalna zaporedja, ki remodelirajo kromatin. Čeprav so heterokromatinski deli revni z geni, so bogati s TE-ji, kar bi lahko pomenilo, da imajo transpozicijski elementi pomembno vlogo pri širjenju heterokromatina. Tako se npr. korepresorski protein TRIM28 veže na vezavno mesto, ki se nahaja na transpozonu ERV in s tem utiša sosednje gene. 
4. Inzulatorji ščitijo gene pred regulatornimi vplivi sosednjih genov. Lahko blokirajo promotorje, ojačevalce in utiševalce. Preprečujejo neprimerne interakcije med sosednjimi kromatinskimi regijami. Kot primer bi omenil gen za transpozon AluSq, ki deluje kot inzulator, saj njegova transkripcija ščiti človeški gen HBE1 (ki kodira za istoimenski protein) pred regulacijo z drugimi promotorji. 
TE-ji uvajajo nova vezavna mesta za TF, ki so v njih lahko prisotna takoj po inserciji v genom ali pa nastanejo de novo s postinsercijskimi mutacijami. Pogosto se mutacije pojavljajo na metiliranih CpG otočkih. Deaminacija teh povzroči zamenjavo citozina z gvaninom, kar je med drugim povzročilo nastanek številnih vezavnih mest za transkripcijska faktorja cMyc in p53. Vključitev TE-jev zraven že obstoječega vezavnega mesta za transkripcijske faktorje ter točkovne mutacije omogočijo nastanek novih mest za vezavo TF (alternativni promotorji), kar povzroča zaščito pred možnimi kasnejšimi mutacijami z redundančnostjo. Redundanca dopušča tudi kooperativno delovanje z zunanjimi promotorji, saj se lahko tako razbremenijo določena vezavna mesta za transkripcijske faktorje. 

==Vpliv transpozicijskih elementov na kromatinsko 3D strukturo==
V interfaznem jedru so deli genoma organizirani v topološko asociirajoče domene (TAD). To so večje domene kromatina, ki so med seboj ločene z izolatorskimi proteini. Ti omejujejo prostor, v katerem lahko različni deli DNA prihajajo v medsebojne stike. Njihova naloga je tudi prostorsko omejevanje interakcij med transkripcijskimi faktorji in ojačevalci ter promotorji. TAD specificirajo funkcije cis regulatornih regij z omejevanjem ojačevalcev, tako da ti aktivirajo le promotorje znotraj iste TAD. Vloga transpozicijskih elementov (TE) pri 3D arhitekturi genoma se je v zadnjih letih začela intenzivno raziskovati. Številne družine TE so namreč obogatene na mejah TAD. Določeni TE naj bi imeli preko tega tudi vlogo pri zvijanju kromosomov, prav tako pa tudi pri kompaktnosti kromatina in posledično tudi pri regulaciji procesov transkripcije. Kot primer pomena transpozicijskih elementov bi izpostavil študijo, ki je odkrila veliko HERV-H na mejah TAD v človeških embrionalnih matičnih celicah (hESCs) in delecija 2 individualnih HERV-H je vodila do izgube kompaktnosti te meje. 
Protein CTCF (11-zinc finger protein) je pomemben pri regulaciji 3D strukture kromatina in procesov transkripcije. Zelo pomemben je pri strukturi mej TAD. Vsebuje motive cinkovega prsta in deluje kot transkripcijski faktor. Sodeluje pri mediaciji nastanka kromatinskih zank in se velikokrat veže na TE. Opaženo je bilo, da so TE razpršili veliko vezavnih mest za protein CTCF in smiselno bi bilo, da bi se tudi meje TAD razpršile, vendar je bilo ugotovljeno, da so te zelo ohranjene. Odkrili so različne mehanizme preprečevanja tvorbe ektopičnih meja TAD. Tako se npr. transpozoni B2SINE, ki imajo veliko vezavnih mest za protein CTCF, lahko povežejo s kompleksom ChAHP, ki torej prepozna isti motiv kot CTCF, a z višjo afiniteto. 
==Kodiranje transkripcijskih faktorjev s transpozicijskimi elementi==
Šele nedavno so prišli do dognanj, da proteini, za katere kodirajo transpozicijski elementi, lahko vplivajo na regulacijo genov. Najdeni so bili številni primeri, v katerih gen za TE kodira transpozazo in hkrati tudi gostiteljski transkripcijski faktor. Fuzija transpozazne DNA-domene z regulatorno domeno transkripcijskega faktorja privede do tvorbe proteinskega kompleksa, ki je sposoben prepoznave ustreznega zaporedja TE na DNA, ker transpozaza prepozna transpozicijski element. Tako se lahko optimizira regulacija ekspresije genov s pomočjo TE. 
==Utišanje transpozicijskih elementov in pomen le-tega pri regulaciji transkripcije==
Organizmi so razvili zmožnost zmanjšanja aktivnosti transpozicijskih elementov, prav tako pa so transpozicijski elementi zmožni obiti gostiteljevo obrambo. Eden od načinov utišanja delovanja TE je metilacija DNA. Demetilacija TE lahko vodi do nepravilne aktivacije sosednjih genov zaradi ojačevalnega potenciala TE. Zato so gostitelji morali razviti mehanizem, ki to kontrolira. Pomemben utiševalni mehanizem TE je metilacija CpG otočkov na DNA. Primer povezave med metilacijo DNA in aktivnostjo iz TE izhajajočih cis regulatornih regij je gen Agouti. Ta daje rjavo obarvanim mišim C57BL/6J rumeno obarvanje na način, ki je odvisen od ravni metilacije promotorja, ki nadzoruje transkripcijo retrotranspozonov IAP. Retrotranspozon IAP pa nadzira ekspresijo gena Agouti in s tem obarvanje miši. 
Drug mehanizem utišanja TE so histonske modifikacije. Primer te epigenetske modifikacije je trimetilacija lizina 9 na histonu H3 (H3K9me3). Pomembno vlogo pri tem ima kompleks HUSH (human silencing hub complex). ATPaza MORC2 in HUSH se povežeta in posledično pride do trimetilacije na histonu 3 na retrotranspozonu LINE1 in tako se retrotranspoznon utiša. LINE1 se nahaja v intronih aktivnih genov. Če so ti trimetilirani, potem se RNA polimeraza II ne more pomikati naprej (motena je elongacija transkripcije), zato se geni ne prepisujejo. 
==Transpozicijski elementi in njihova vloga pri regulatornih nekodirajočih molekulah RNA==
Zaradi napredka v določanju nukleotidnega zaporedja molekul RNA se v zadnjih letih odkriva vedno več nekodirajočih molekul RNA (ncRNA). Te vključujejo tudi regulatorne RNA, med katere spadajo kratke nekodirajoče RNA (sncRNA) in dolge nekodirajoče RNA (lncRNA). Transpozicijski elementi (TE) in regulatorne RNA so tesno povezani, saj velik del nukleotidnega zaporedja regulatornih RNA in njihovih genov ter regulatornih regij predstavljajo TE. Transpozicijski elementi določajo funkcionalne lastnosti različnih tipov ncRNA, kar je ključno za njihovo regulatorno funkcijo pri transkripciji in posttranskripcijskih procesih. 
Transpozicijski elementi dajejo strukturne značilnosti lncRNA, ki jim dajejo sposobnost interakcije z drugimi biološkimi molekulami (DNA, RNA, proteini...). lncRNA imajo lahko tako cis kot tudi trans-regulatorno aktivnost. Pojavlja se veliko hipotez, da TE dajejo funkcionalne domene lncRNA. Primer, ki potrjuje to hipotezo, je interakcija med XIST lncRNA in proteinskim kompleksom PRC2 (polycomb repressive complex 2). XIST lncRNA namreč vključuje transpozicijski element ERVB5 in ravno ta regija predstavlja vezavno mesto za PRC2. PRC2 ima vlogo pri zagotavljanju kompaktnosti kromatina, in sicer tako, da ena izmed njegovih podenot EZH2 (Enhancer of zeste homolog 2) katalizira trimetilacijo lizina 27 na histonu 3 (H3K27me1/2/3), s tem pa povzroči represijo transkripcije določenih genov. Fosforilacija EZH2 in T350 (obe sta podenoti PRC2) s CDK1/2 je ključna za interakcijo PRC2 z lncRNA, ki poteka preko G-kvadrupleskne regije lncRNA, le-ta pa je bogata s transpozoni ERVB5. XIST lncRNA pripelje proteinski kompleks PRC2 do promotorske regije tarčnega gena (npr. tumor supresorskega gena), kjer EZH2 s svojo metiltransferazno aktivnostjo deluje kot represor transkripcije. 
Zanimiv primer povezave med transpozicijskimi elementi in nekodirajočo RNA je regulacija odziva na toplotni šok pri miših. Ta primer kaže tudi na trans-regulatorno vlogo nekodirajoče RNA. Mišja ncRNA, ki izhaja iz retrotranspozona B2 SINE, se v normalnih pogojih veže na regulatorne regije genov, ki se odzivajo na stres, ter tako prepreči njihovo transkripcijo. Pri toplotnem šoku se aktivira protein EZH2, ki pospeši razgradnjo te ncRNA ter tako prepreči inhibicijo transkripcije genov, povezanih s stresom (EZH2 stimulira ribocimsko aktivnost same ncRNA). 
Transpozicijski elementi imajo pomembno vlogo pri procesu transkripcije genov za nekodirajoče RNA, saj so vključeni v številna območja njihovih genov in regulatornih regij. Mesta na genomu, na katerih se nahajajo nukleotidna zaporedja, ki izhajajo iz transpozicijskih elementov, so prisotna tako v promotorjih kot tudi na poliA regijah genov za nekodirajoče RNA. Veliko so jih našli tudi na regijah genov za lncRNA, ki so pomembna za spajanje eksonov oz. izrezovanje intronov (splice donor, splice acceptor). 
Veliko molekul miRNA (spadajo med sncRNA) z vključenimi transpozicijskimi elementi interagira s 3' koncem neprevajajoče regije tarčne mRNA (3' UTR). Preko tega procesa se utiša mRNA. Tako se npr. miR-151, ki vsebuje transpozicijske elemente LINE2, veže na molekulo mRNA, ki kodira za ATPAF1 (ATP synthase mitochondrial F1 complex assembly factor 1), in sicer tako, da se poveže s transpozoni LINE2 na 3' koncu neprevajajoče regije tarčne mRNA. 
Vedno bolj se odkriva tudi vloga transpozicijskih elementov pri tvorbi stabilnejših sekundarnih struktur v nekodirajočih RNA. Raziskava, ki je primerjala lncRNA z vključenimi transpozicijskimi elementi in lncRNA brez vključenih transpozicijskih elementov, je ugotovila, da lncRNA z vključenimi transpozicijskimi elementi tvorijo stabilnejše sekundarne strukture. Analizirali so tudi mesta na lncRNA, ki so vključena v bazno parjenje pri tvorbi sekundarnih struktur in ugotovili, da je okrog 82 % teh mest lociranih v Alu regijah lncRNA. Torej, Alu regije v regulatornih RNA sodelujejo pri intramolekularnem baznem parjenju, kar privede do tvorbe stabilnejših sekundarnih struktur, s tem pa tudi do večje stabilnosti nekodirajočih RNA. To jim omogoči, da lahko bolje opravljajo svoje funkcije regulacije transkripcije. 
==Viri in literatura==

[1]R. Fueyo, J. Judd, C. Feschotte, and J. Wysocka, ‘Roles of transposable elements in the regulation of mammalian transcription’, Nat Rev Mol Cell Biol, pp. 1–17, Feb. 2022, doi: 10.1038/s41580-022-00457-y. 
[2]A. Ali, K. Han, and P. Liang, ‘Role of Transposable Elements in Gene Regulation in the Human Genome’, Life (Basel), vol. 11, no. 2, p. 118, Feb. 2021, doi: 10.3390/life11020118. 
[3]P. J. Wittkopp and G. Kalay, ‘Cis-regulatory elements: molecular mechanisms and evolutionary processes underlying divergence’, Nat Rev Genet, vol. 13, no. 1, Art. no. 1, Jan. 2012, doi: 10.1038/nrg3095. 
[4]A. Hao, Y. Wang, D. B. Stovall, Y. Wang, and G. Sui, ‘Emerging Roles of LncRNAs in the EZH2-regulated Oncogenic Network’, Int. J. Biol. Sci., vol. 17, no. 13, pp. 3268–3280, 2021, doi: 10.7150/ijbs.63488. 
[5]N. Liu et al., ‘Selective silencing of euchromatic L1s revealed by genome-wide screens for L1 regulators’, Nature, vol. 553, no. 7687, Art. no. 7687, Jan. 2018, doi: 10.1038/nature25179. 

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

TE kot regulatorji transkripcije

2022-04-24T12:42:43Z

David Valte:

==Uvod==
Transpozicijski elementi (TE), ki sestavljajo velik del evkariontskega genoma, lahko, če se nahajajo v eksonskih predelih gostiteljevega genskega zapisa, bistveno zmanjšajo njegovo evolucijsko sposobnost preživetja, ker delujejo moteče (lahko povzročijo npr. vstavitev start in stop kodonov, premik bralnega okvirja, prehitro terminacijo transkripcije,…). S tem zmanjšajo tudi verjetnost za lasten prenos v nove generacije. Ker TE po delovanju spominjajo na parazitski organizem, so se skozi evolucijo razvile strategije, ki preprečujejo preveliko škodo na gostiteljskem organizmu. Prilagajanje je potekalo vzajemno. Gostiteljski organizmi so npr. postali sposobni utišanja transpozicijskih elementov s pomočjo metilacije DNA na CpG otočkih, TE pa so se preferenčno vključevali v intronska zaporedja, saj tam ne delujejo tako moteče. Skozi čas so gostiteljski organizmi postali sposobni uporabe TE v svojo korist. 

Vključitve transpozicijskih elementov v nekodirajoče predele genskega zapisa in njihove mutacije so v veliko primerih povzročile, da so TE izgubili sposobnost transponiranja, pridobili pa so cis in trans-regulatorno aktivnost. Cis-regulatorne regije (CRE) so nekodirajoča zaporedja nukleotidov, ki regulirajo ekspresijo genov na isti verigi DNA. Trans regulacija pa pomeni predvsem to, da npr. transkripcijski faktorji prihajajo od drugod oz. so kodirani na eni molekuli DNA, regulirajo pa ekspresijo genov na drugi molekuli DNA. Regulacija transkripcije s TE lahko poteka na več načinov: 
1. V genski zapis lahko vnašajo nova vezavna mesta za transkripcijske faktorje (TF) preko promotorjev, ojačevalcev, utiševalnih in izolatorskih zaporedij. 
2. Lahko modulirajo 3D strukturo kromatina. 
3. Zmožni so kodiranja transkripcijskih faktorjev. 
4. S povezovanjem z represorskimi transkripcijskimi faktorji vplivajo na utišanje sosednjih genov. 
5. Imajo vlogo pri regulatornih nekodirajočih molekulah RNA, ki so pomembni regulatorji transkripcije. 
==Funkcije transpozicijskih elementov v cis-regulatornih regijah ==
Regulatorne sposobnosti cis-regulatornih regij lahko izhajajo iz transpozicijskih elementov. V splošnem cis-regulatorne regije delujejo tako, da tvorijo specifična vezavna mesta za proteine povezane z iniciacijo in regulacijo transkripcije. Primeri nekaterih vrst CRE: 
1. Promotorji so kratka zaporedja DNA, ki vključujejo začetno mesto transkripcije. Ob vezavi ustreznih transkripcijskih faktorjev na promotorsko regijo omogočijo transkripcijo gena. Kot primer bi omenil transpozon AluSp v promotorju gena FCER1G, ki inducira transkripcijo visokoafinitetnega receptorja za Fc regijo IgE. 
2. Ojačevalci so zaporedja, ki jih najdemo pred ali za genom, ki ga regulirajo. Delujejo kooperativno s promotorjem, in sicer tako, da povečajo stopnjo transkripcije, omogočajo pa regulacijo tudi bolj oddaljenih genov. Kot primer bi omenil transpozon AluY v intronu gena CD8 (ta kodira glikoprotein CD8, ki je pomemben pri celičnih interakcijah znotraj imunskega sistema), za katerega so ugotovili, da deluje kot ojačevalec. 
3. Utiševalna zaporedja vežejo represorje in tako preprečujejo transkripcijo. Transpozicijski elementi so z rekrutiranjem transkripcijskih faktorjev postali sposobni delovati kot utiševalna zaporedja, ki remodelirajo kromatin. Čeprav so heterokromatinski deli revni z geni, so bogati s TE-ji, kar bi lahko pomenilo, da imajo transpozicijski elementi pomembno vlogo pri širjenju heterokromatina. Tako se npr. korepresorski protein TRIM28 veže na vezavno mesto, ki se nahaja na transpozonu ERV in s tem utiša sosednje gene. 
4. Inzulatorji ščitijo gene pred regulatornimi vplivi sosednjih genov. Lahko blokirajo promotorje, ojačevalce in utiševalce. Preprečujejo neprimerne interakcije med sosednjimi kromatinskimi regijami. Kot primer bi omenil gen za transpozon AluSq, ki deluje kot inzulator, saj njegova transkripcija ščiti človeški gen HBE1 (ki kodira za istoimenski protein) pred regulacijo z drugimi promotorji. 
TE-ji uvajajo nova vezavna mesta za TF, ki so v njih lahko prisotna takoj po inserciji v genom ali pa nastanejo de novo s postinsercijskimi mutacijami. Pogosto se mutacije pojavljajo na metiliranih CpG otočkih. Deaminacija teh povzroči zamenjavo citozina z gvaninom, kar je med drugim povzročilo nastanek številnih vezavnih mest za transkripcijska faktorja cMyc in p53. Vključitev TE-jev zraven že obstoječega vezavnega mesta za transkripcijske faktorje ter točkovne mutacije omogočijo nastanek novih mest za vezavo TF (alternativni promotorji), kar povzroča zaščito pred možnimi kasnejšimi mutacijami z redundančnostjo. Redundanca dopušča tudi kooperativno delovanje z zunanjimi promotorji, saj se lahko tako razbremenijo določena vezavna mesta za transkripcijske faktorje. 

==Vpliv transpozicijskih elementov na kromatinsko 3D strukturo==
V interfaznem jedru so deli genoma organizirani v topološko asociirajoče domene (TAD). To so večje domene kromatina, ki so med seboj ločene z izolatorskimi proteini. Ti omejujejo prostor, v katerem lahko različni deli DNA prihajajo v medsebojne stike. Njihova naloga je tudi prostorsko omejevanje interakcij med transkripcijskimi faktorji in ojačevalci ter promotorji. TAD specificirajo funkcije cis regulatornih regij z omejevanjem ojačevalcev, tako da ti aktivirajo le promotorje znotraj iste TAD. Vloga transpozicijskih elementov (TE) pri 3D arhitekturi genoma se je v zadnjih letih začela intenzivno raziskovati. Številne družine TE so namreč obogatene na mejah TAD. Določeni TE naj bi imeli preko tega tudi vlogo pri zvijanju kromosomov, prav tako pa tudi pri kompaktnosti kromatina in posledično tudi pri regulaciji procesov transkripcije. Kot primer pomena transpozicijskih elementov bi izpostavil študijo, ki je odkrila veliko HERV-H na mejah TAD v človeških embrionalnih matičnih celicah (hESCs) in delecija 2 individualnih HERV-H je vodila do izgube kompaktnosti te meje. 
Protein CTCF (11-zinc finger protein) je pomemben pri regulaciji 3D strukture kromatina in procesov transkripcije. Zelo pomemben je pri strukturi mej TAD. Vsebuje motive cinkovega prsta in deluje kot transkripcijski faktor. Sodeluje pri mediaciji nastanka kromatinskih zank in se velikokrat veže na TE. Opaženo je bilo, da so TE razpršili veliko vezavnih mest za protein CTCF in smiselno bi bilo, da bi se tudi meje TAD razpršile, vendar je bilo ugotovljeno, da so te zelo ohranjene. Odkrili so različne mehanizme preprečevanja tvorbe ektopičnih meja TAD. Tako se npr. transpozoni B2SINE, ki imajo veliko vezavnih mest za protein CTCF, lahko povežejo s kompleksom ChAHP, ki torej prepozna isti motiv kot CTCF, a z višjo afiniteto. 
==Kodiranje transkripcijskih faktorjev s transpozicijskimi elementi==
Šele nedavno so prišli do dognanj, da proteini, za katere kodirajo transpozicijski elementi, lahko vplivajo na regulacijo genov. Najdeni so bili številni primeri, v katerih gen za TE kodira transpozazo in hkrati tudi gostiteljski transkripcijski faktor. Fuzija transpozazne DNA-domene z regulatorno domeno transkripcijskega faktorja privede do tvorbe proteinskega kompleksa, ki je sposoben prepoznave ustreznega zaporedja TE na DNA, ker transpozaza prepozna transpozicijski element. Tako se lahko optimizira regulacija ekspresije genov s pomočjo TE. 
==Utišanje transpozicijskih elementov in pomen le-tega pri regulaciji transkripcije==
Organizmi so razvili zmožnost zmanjšanja aktivnosti transpozicijskih elementov, prav tako pa so transpozicijski elementi zmožni obiti gostiteljevo obrambo. Eden od načinov utišanja delovanja TE je metilacija DNA. Demetilacija TE lahko vodi do nepravilne aktivacije sosednjih genov zaradi ojačevalnega potenciala TE. Zato so gostitelji morali razviti mehanizem, ki to kontrolira. Pomemben utiševalni mehanizem TE je metilacija CpG otočkov na DNA. Primer povezave med metilacijo DNA in aktivnostjo iz TE izhajajočih cis regulatornih regij je gen Agouti. Ta daje rjavo obarvanim mišim C57BL/6J rumeno obarvanje na način, ki je odvisen od ravni metilacije promotorja, ki nadzoruje transkripcijo retrotranspozonov IAP. Retrotranspozon IAP pa nadzira ekspresijo gena Agouti in s tem obarvanje miši. 
Drug mehanizem utišanja TE so histonske modifikacije. Primer te epigenetske modifikacije je trimetilacija lizina 9 na histonu H3 (H3K9me3). Pomembno vlogo pri tem ima kompleks HUSH (human silencing hub complex). ATPaza MORC2 in HUSH se povežeta in posledično pride do trimetilacije na histonu 3 na retrotranspozonu LINE1 in tako se retrotranspoznon utiša. LINE1 se nahaja v intronih aktivnih genov. Če so ti trimetilirani, potem se RNA polimeraza II ne more pomikati naprej (motena je elongacija transkripcije), zato se geni ne prepisujejo. 
==Transpozicijski elementi in njihova vloga pri regulatornih nekodirajočih molekulah RNA==
Zaradi napredka v določanju nukleotidnega zaporedja molekul RNA se v zadnjih letih odkriva vedno več nekodirajočih molekul RNA (ncRNA). Te vključujejo tudi regulatorne RNA, med katere spadajo kratke nekodirajoče RNA (sncRNA) in dolge nekodirajoče RNA (lncRNA). Transpozicijski elementi (TE) in regulatorne RNA so tesno povezani, saj velik del nukleotidnega zaporedja regulatornih RNA in njihovih genov ter regulatornih regij predstavljajo TE. Transpozicijski elementi določajo funkcionalne lastnosti različnih tipov ncRNA, kar je ključno za njihovo regulatorno funkcijo pri transkripciji in posttranskripcijskih procesih. 
Transpozicijski elementi dajejo strukturne značilnosti lncRNA, ki jim dajejo sposobnost interakcije z drugimi biološkimi molekulami (DNA, RNA, proteini...). lncRNA imajo lahko tako cis kot tudi trans-regulatorno aktivnost. Pojavlja se veliko hipotez, da TE dajejo funkcionalne domene lncRNA. Primer, ki potrjuje to hipotezo, je interakcija med XIST lncRNA in proteinskim kompleksom PRC2 (polycomb repressive complex 2). XIST lncRNA namreč vključuje transpozicijski element ERVB5 in ravno ta regija predstavlja vezavno mesto za PRC2. PRC2 ima vlogo pri zagotavljanju kompaktnosti kromatina, in sicer tako, da ena izmed njegovih podenot EZH2 (Enhancer of zeste homolog 2) katalizira trimetilacijo lizina 27 na histonu 3 (H3K27me1/2/3), s tem pa povzroči represijo transkripcije določenih genov. Fosforilacija EZH2 in T350 (obe sta podenoti PRC2) s CDK1/2 je ključna za interakcijo PRC2 z lncRNA, ki poteka preko G-kvadrupleskne regije lncRNA, le-ta pa je bogata s transpozoni ERVB5. XIST lncRNA pripelje proteinski kompleks PRC2 do promotorske regije tarčnega gena (npr. tumor supresorskega gena), kjer EZH2 s svojo metiltransferazno aktivnostjo deluje kot represor transkripcije. 
Zanimiv primer povezave med transpozicijskimi elementi in nekodirajočo RNA je regulacija odziva na toplotni šok pri miših. Ta primer kaže tudi na trans-regulatorno vlogo nekodirajoče RNA. Mišja ncRNA, ki izhaja iz retrotranspozona B2 SINE, se v normalnih pogojih veže na regulatorne regije genov, ki se odzivajo na stres, ter tako prepreči njihovo transkripcijo. Pri toplotnem šoku se aktivira protein EZH2, ki pospeši razgradnjo te ncRNA ter tako prepreči inhibicijo transkripcije genov, povezanih s stresom (EZH2 stimulira ribocimsko aktivnost same ncRNA). 
Transpozicijski elementi imajo pomembno vlogo pri procesu transkripcije genov za nekodirajoče RNA, saj so vključeni v številna območja njihovih genov in regulatornih regij. Mesta na genomu, na katerih se nahajajo nukleotidna zaporedja, ki izhajajo iz transpozicijskih elementov, so prisotna tako v promotorjih kot tudi na poliA regijah genov za nekodirajoče RNA. Veliko so jih našli tudi na regijah genov za lncRNA, ki so pomembna za spajanje eksonov oz. izrezovanje intronov (splice donor, splice acceptor). 
Veliko molekul miRNA (spadajo med sncRNA) z vključenimi transpozicijskimi elementi interagira s 3' koncem neprevajajoče regije tarčne mRNA (3' UTR). Preko tega procesa se utiša mRNA. Tako se npr. miR-151, ki vsebuje transpozicijske elemente LINE2, veže na molekulo mRNA, ki kodira za ATPAF1 (ATP synthase mitochondrial F1 complex assembly factor 1), in sicer tako, da se poveže s transpozoni LINE2 na 3' koncu neprevajajoče regije tarčne mRNA. 
Vedno bolj se odkriva tudi vloga transpozicijskih elementov pri tvorbi stabilnejših sekundarnih struktur v nekodirajočih RNA. Raziskava, ki je primerjala lncRNA z vključenimi transpozicijskimi elementi in lncRNA brez vključenih transpozicijskih elementov, je ugotovila, da lncRNA z vključenimi transpozicijskimi elementi tvorijo stabilnejše sekundarne strukture. Analizirali so tudi mesta na lncRNA, ki so vključena v bazno parjenje pri tvorbi sekundarnih struktur in ugotovili, da je okrog 82 % teh mest lociranih v Alu regijah lncRNA. Torej, Alu regije v regulatornih RNA sodelujejo pri intramolekularnem baznem parjenju, kar privede do tvorbe stabilnejših sekundarnih struktur, s tem pa tudi do večje stabilnosti nekodirajočih RNA. To jim omogoči, da lahko bolje opravljajo svoje funkcije regulacije transkripcije. 
==Viri in literatura==

[1]R. Fueyo, J. Judd, C. Feschotte, and J. Wysocka, ‘Roles of transposable elements in the regulation of mammalian transcription’, Nat Rev Mol Cell Biol, pp. 1–17, Feb. 2022, doi: [[10.1038/s41580-022-00457-y.]] 
[2]A. Ali, K. Han, and P. Liang, ‘Role of Transposable Elements in Gene Regulation in the Human Genome’, Life (Basel), vol. 11, no. 2, p. 118, Feb. 2021, doi: [[10.3390/life11020118.]] 
[3]P. J. Wittkopp and G. Kalay, ‘Cis-regulatory elements: molecular mechanisms and evolutionary processes underlying divergence’, Nat Rev Genet, vol. 13, no. 1, Art. no. 1, Jan. 2012, [[doi: 10.1038/nrg3095.]] 
[4]A. Hao, Y. Wang, D. B. Stovall, Y. Wang, and G. Sui, ‘Emerging Roles of LncRNAs in the EZH2-regulated Oncogenic Network’, Int. J. Biol. Sci., vol. 17, no. 13, pp. 3268–3280, 2021, doi: [[10.7150/ijbs.63488.]] 
[5]N. Liu et al., ‘Selective silencing of euchromatic L1s revealed by genome-wide screens for L1 regulators’, Nature, vol. 553, no. 7687, Art. no. 7687, Jan. 2018, doi: [[10.1038/nature25179.]] 

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

TE kot regulatorji transkripcije

2022-04-24T12:40:54Z

David Valte:

==Uvod==
Transpozicijski elementi (TE), ki sestavljajo velik del evkariontskega genoma, lahko, če se nahajajo v eksonskih predelih gostiteljevega genskega zapisa, bistveno zmanjšajo njegovo evolucijsko sposobnost preživetja, ker delujejo moteče (lahko povzročijo npr. vstavitev start in stop kodonov, premik bralnega okvirja, prehitro terminacijo transkripcije,…). S tem zmanjšajo tudi verjetnost za lasten prenos v nove generacije. Ker TE po delovanju spominjajo na parazitski organizem, so se skozi evolucijo razvile strategije, ki preprečujejo preveliko škodo na gostiteljskem organizmu. Prilagajanje je potekalo vzajemno. Gostiteljski organizmi so npr. postali sposobni utišanja transpozicijskih elementov s pomočjo metilacije DNA na CpG otočkih, TE pa so se preferenčno vključevali v intronska zaporedja, saj tam ne delujejo tako moteče. Skozi čas so gostiteljski organizmi postali sposobni uporabe TE v svojo korist. 

Vključitve transpozicijskih elementov v nekodirajoče predele genskega zapisa in njihove mutacije so v veliko primerih povzročile, da so TE izgubili sposobnost transponiranja, pridobili pa so cis in trans-regulatorno aktivnost. Cis-regulatorne regije (CRE) so nekodirajoča zaporedja nukleotidov, ki regulirajo ekspresijo genov na isti verigi DNA. Trans regulacija pa pomeni predvsem to, da npr. transkripcijski faktorji prihajajo od drugod oz. so kodirani na eni molekuli DNA, regulirajo pa ekspresijo genov na drugi molekuli DNA. Regulacija transkripcije s TE lahko poteka na več načinov: 
1. V genski zapis lahko vnašajo nova vezavna mesta za transkripcijske faktorje (TF) preko promotorjev, ojačevalcev, utiševalnih in izolatorskih zaporedij. 
2. Lahko modulirajo 3D strukturo kromatina. 
3. Zmožni so kodiranja transkripcijskih faktorjev. 
4. S povezovanjem z represorskimi transkripcijskimi faktorji vplivajo na utišanje sosednjih genov. 
5. Imajo vlogo pri regulatornih nekodirajočih molekulah RNA, ki so pomembni regulatorji transkripcije. 
==Funkcije transpozicijskih elementov v cis-regulatornih regijah ==
Regulatorne sposobnosti cis-regulatornih regij lahko izhajajo iz transpozicijskih elementov. V splošnem cis-regulatorne regije delujejo tako, da tvorijo specifična vezavna mesta za proteine povezane z iniciacijo in regulacijo transkripcije. Primeri nekaterih vrst CRE: 
1. Promotorji so kratka zaporedja DNA, ki vključujejo začetno mesto transkripcije. Ob vezavi ustreznih transkripcijskih faktorjev na promotorsko regijo omogočijo transkripcijo gena. Kot primer bi omenil transpozon AluSp v promotorju gena FCER1G, ki inducira transkripcijo visokoafinitetnega receptorja za Fc regijo IgE. 
2. Ojačevalci so zaporedja, ki jih najdemo pred ali za genom, ki ga regulirajo. Delujejo kooperativno s promotorjem, in sicer tako, da povečajo stopnjo transkripcije, omogočajo pa regulacijo tudi bolj oddaljenih genov. Kot primer bi omenil transpozon AluY v intronu gena CD8 (ta kodira glikoprotein CD8, ki je pomemben pri celičnih interakcijah znotraj imunskega sistema), za katerega so ugotovili, da deluje kot ojačevalec. 
3. Utiševalna zaporedja vežejo represorje in tako preprečujejo transkripcijo. Transpozicijski elementi so z rekrutiranjem transkripcijskih faktorjev postali sposobni delovati kot utiševalna zaporedja, ki remodelirajo kromatin. Čeprav so heterokromatinski deli revni z geni, so bogati s TE-ji, kar bi lahko pomenilo, da imajo transpozicijski elementi pomembno vlogo pri širjenju heterokromatina. Tako se npr. korepresorski protein TRIM28 veže na vezavno mesto, ki se nahaja na transpozonu ERV in s tem utiša sosednje gene. 
4. Inzulatorji ščitijo gene pred regulatornimi vplivi sosednjih genov. Lahko blokirajo promotorje, ojačevalce in utiševalce. Preprečujejo neprimerne interakcije med sosednjimi kromatinskimi regijami. Kot primer bi omenil gen za transpozon AluSq, ki deluje kot inzulator, saj njegova transkripcija ščiti človeški gen HBE1 (ki kodira za istoimenski protein) pred regulacijo z drugimi promotorji. 
TE-ji uvajajo nova vezavna mesta za TF, ki so v njih lahko prisotna takoj po inserciji v genom ali pa nastanejo de novo s postinsercijskimi mutacijami. Pogosto se mutacije pojavljajo na metiliranih CpG otočkih. Deaminacija teh povzroči zamenjavo citozina z gvaninom, kar je med drugim povzročilo nastanek številnih vezavnih mest za transkripcijska faktorja cMyc in p53. Vključitev TE-jev zraven že obstoječega vezavnega mesta za transkripcijske faktorje ter točkovne mutacije omogočijo nastanek novih mest za vezavo TF (alternativni promotorji), kar povzroča zaščito pred možnimi kasnejšimi mutacijami z redundančnostjo. Redundanca dopušča tudi kooperativno delovanje z zunanjimi promotorji, saj se lahko tako razbremenijo določena vezavna mesta za transkripcijske faktorje. 

==Vpliv transpozicijskih elementov na kromatinsko 3D strukturo==
V interfaznem jedru so deli genoma organizirani v topološko asociirajoče domene (TAD). To so večje domene kromatina, ki so med seboj ločene z izolatorskimi proteini. Ti omejujejo prostor, v katerem lahko različni deli DNA prihajajo v medsebojne stike. Njihova naloga je tudi prostorsko omejevanje interakcij med transkripcijskimi faktorji in ojačevalci ter promotorji. TAD specificirajo funkcije cis regulatornih regij z omejevanjem ojačevalcev, tako da ti aktivirajo le promotorje znotraj iste TAD. Vloga transpozicijskih elementov (TE) pri 3D arhitekturi genoma se je v zadnjih letih začela intenzivno raziskovati. Številne družine TE so namreč obogatene na mejah TAD. Določeni TE naj bi imeli preko tega tudi vlogo pri zvijanju kromosomov, prav tako pa tudi pri kompaktnosti kromatina in posledično tudi pri regulaciji procesov transkripcije. Kot primer pomena transpozicijskih elementov bi izpostavil študijo, ki je odkrila veliko HERV-H na mejah TAD v človeških embrionalnih matičnih celicah (hESCs) in delecija 2 individualnih HERV-H je vodila do izgube kompaktnosti te meje. 
Protein CTCF (11-zinc finger protein) je pomemben pri regulaciji 3D strukture kromatina in procesov transkripcije. Zelo pomemben je pri strukturi mej TAD. Vsebuje motive cinkovega prsta in deluje kot transkripcijski faktor. Sodeluje pri mediaciji nastanka kromatinskih zank in se velikokrat veže na TE. Opaženo je bilo, da so TE razpršili veliko vezavnih mest za protein CTCF in smiselno bi bilo, da bi se tudi meje TAD razpršile, vendar je bilo ugotovljeno, da so te zelo ohranjene. Odkrili so različne mehanizme preprečevanja tvorbe ektopičnih meja TAD. Tako se npr. transpozoni B2SINE, ki imajo veliko vezavnih mest za protein CTCF, lahko povežejo s kompleksom ChAHP, ki torej prepozna isti motiv kot CTCF, a z višjo afiniteto. 
==Kodiranje transkripcijskih faktorjev s transpozicijskimi elementi==
Šele nedavno so prišli do dognanj, da proteini, za katere kodirajo transpozicijski elementi, lahko vplivajo na regulacijo genov. Najdeni so bili številni primeri, v katerih gen za TE kodira transpozazo in hkrati tudi gostiteljski transkripcijski faktor. Fuzija transpozazne DNA-domene z regulatorno domeno transkripcijskega faktorja privede do tvorbe proteinskega kompleksa, ki je sposoben prepoznave ustreznega zaporedja TE na DNA, ker transpozaza prepozna transpozicijski element. Tako se lahko optimizira regulacija ekspresije genov s pomočjo TE. 
==Utišanje transpozicijskih elementov in pomen le-tega pri regulaciji transkripcije==
Organizmi so razvili zmožnost zmanjšanja aktivnosti transpozicijskih elementov, prav tako pa so transpozicijski elementi zmožni obiti gostiteljevo obrambo. Eden od načinov utišanja delovanja TE je metilacija DNA. Demetilacija TE lahko vodi do nepravilne aktivacije sosednjih genov zaradi ojačevalnega potenciala TE. Zato so gostitelji morali razviti mehanizem, ki to kontrolira. Pomemben utiševalni mehanizem TE je metilacija CpG otočkov na DNA. Primer povezave med metilacijo DNA in aktivnostjo iz TE izhajajočih cis regulatornih regij je gen Agouti. Ta daje rjavo obarvanim mišim C57BL/6J rumeno obarvanje na način, ki je odvisen od ravni metilacije promotorja, ki nadzoruje transkripcijo retrotranspozonov IAP. Retrotranspozon IAP pa nadzira ekspresijo gena Agouti in s tem obarvanje miši. 
Drug mehanizem utišanja TE so histonske modifikacije. Primer te epigenetske modifikacije je trimetilacija lizina 9 na histonu H3 (H3K9me3). Pomembno vlogo pri tem ima kompleks HUSH (human silencing hub complex). ATPaza MORC2 in HUSH se povežeta in posledično pride do trimetilacije na histonu 3 na retrotranspozonu LINE1 in tako se retrotranspoznon utiša. LINE1 se nahaja v intronih aktivnih genov. Če so ti trimetilirani, potem se RNA polimeraza II ne more pomikati naprej (motena je elongacija transkripcije), zato se geni ne prepisujejo. 
==Transpozicijski elementi in njihova vloga pri regulatornih nekodirajočih molekulah RNA==
Zaradi napredka v določanju nukleotidnega zaporedja molekul RNA se v zadnjih letih odkriva vedno več nekodirajočih molekul RNA (ncRNA). Te vključujejo tudi regulatorne RNA, med katere spadajo kratke nekodirajoče RNA (sncRNA) in dolge nekodirajoče RNA (lncRNA). Transpozicijski elementi (TE) in regulatorne RNA so tesno povezani, saj velik del nukleotidnega zaporedja regulatornih RNA in njihovih genov ter regulatornih regij predstavljajo TE. Transpozicijski elementi določajo funkcionalne lastnosti različnih tipov ncRNA, kar je ključno za njihovo regulatorno funkcijo pri transkripciji in posttranskripcijskih procesih. 
Transpozicijski elementi dajejo strukturne značilnosti lncRNA, ki jim dajejo sposobnost interakcije z drugimi biološkimi molekulami (DNA, RNA, proteini...). lncRNA imajo lahko tako cis kot tudi trans-regulatorno aktivnost. Pojavlja se veliko hipotez, da TE dajejo funkcionalne domene lncRNA. Primer, ki potrjuje to hipotezo, je interakcija med XIST lncRNA in proteinskim kompleksom PRC2 (polycomb repressive complex 2). XIST lncRNA namreč vključuje transpozicijski element ERVB5 in ravno ta regija predstavlja vezavno mesto za PRC2. PRC2 ima vlogo pri zagotavljanju kompaktnosti kromatina, in sicer tako, da ena izmed njegovih podenot EZH2 (Enhancer of zeste homolog 2) katalizira trimetilacijo lizina 27 na histonu 3 (H3K27me1/2/3), s tem pa povzroči represijo transkripcije določenih genov. Fosforilacija EZH2 in T350 (obe sta podenoti PRC2) s CDK1/2 je ključna za interakcijo PRC2 z lncRNA, ki poteka preko G-kvadrupleskne regije lncRNA, le-ta pa je bogata s transpozoni ERVB5. XIST lncRNA pripelje proteinski kompleks PRC2 do promotorske regije tarčnega gena (npr. tumor supresorskega gena), kjer EZH2 s svojo metiltransferazno aktivnostjo deluje kot represor transkripcije. 
Zanimiv primer povezave med transpozicijskimi elementi in nekodirajočo RNA je regulacija odziva na toplotni šok pri miših. Ta primer kaže tudi na trans-regulatorno vlogo nekodirajoče RNA. Mišja ncRNA, ki izhaja iz retrotranspozona B2 SINE, se v normalnih pogojih veže na regulatorne regije genov, ki se odzivajo na stres, ter tako prepreči njihovo transkripcijo. Pri toplotnem šoku se aktivira protein EZH2, ki pospeši razgradnjo te ncRNA ter tako prepreči inhibicijo transkripcije genov, povezanih s stresom (EZH2 stimulira ribocimsko aktivnost same ncRNA). 
Transpozicijski elementi imajo pomembno vlogo pri procesu transkripcije genov za nekodirajoče RNA, saj so vključeni v številna območja njihovih genov in regulatornih regij. Mesta na genomu, na katerih se nahajajo nukleotidna zaporedja, ki izhajajo iz transpozicijskih elementov, so prisotna tako v promotorjih kot tudi na poliA regijah genov za nekodirajoče RNA. Veliko so jih našli tudi na regijah genov za lncRNA, ki so pomembna za spajanje eksonov oz. izrezovanje intronov (splice donor, splice acceptor). 
Veliko molekul miRNA (spadajo med sncRNA) z vključenimi transpozicijskimi elementi interagira s 3' koncem neprevajajoče regije tarčne mRNA (3' UTR). Preko tega procesa se utiša mRNA. Tako se npr. miR-151, ki vsebuje transpozicijske elemente LINE2, veže na molekulo mRNA, ki kodira za ATPAF1 (ATP synthase mitochondrial F1 complex assembly factor 1), in sicer tako, da se poveže s transpozoni LINE2 na 3' koncu neprevajajoče regije tarčne mRNA. 
Vedno bolj se odkriva tudi vloga transpozicijskih elementov pri tvorbi stabilnejših sekundarnih struktur v nekodirajočih RNA. Raziskava, ki je primerjala lncRNA z vključenimi transpozicijskimi elementi in lncRNA brez vključenih transpozicijskih elementov, je ugotovila, da lncRNA z vključenimi transpozicijskimi elementi tvorijo stabilnejše sekundarne strukture. Analizirali so tudi mesta na lncRNA, ki so vključena v bazno parjenje pri tvorbi sekundarnih struktur in ugotovili, da je okrog 82 % teh mest lociranih v Alu regijah lncRNA. Torej, Alu regije v regulatornih RNA sodelujejo pri intramolekularnem baznem parjenju, kar privede do tvorbe stabilnejših sekundarnih struktur, s tem pa tudi do večje stabilnosti nekodirajočih RNA. To jim omogoči, da lahko bolje opravljajo svoje funkcije regulacije transkripcije. 
==Viri in literatura==

[1]R. Fueyo, J. Judd, C. Feschotte, and J. Wysocka, ‘Roles of transposable elements in the regulation of mammalian transcription’, Nat Rev Mol Cell Biol, pp. 1–17, Feb. 2022, doi: 10.1038/s41580-022-00457-y. 
[2]A. Ali, K. Han, and P. Liang, ‘Role of Transposable Elements in Gene Regulation in the Human Genome’, Life (Basel), vol. 11, no. 2, p. 118, Feb. 2021, doi: 10.3390/life11020118. 
[3]P. J. Wittkopp and G. Kalay, ‘Cis-regulatory elements: molecular mechanisms and evolutionary processes underlying divergence’, Nat Rev Genet, vol. 13, no. 1, Art. no. 1, Jan. 2012, doi: 10.1038/nrg3095. 
[4]A. Hao, Y. Wang, D. B. Stovall, Y. Wang, and G. Sui, ‘Emerging Roles of LncRNAs in the EZH2-regulated Oncogenic Network’, Int. J. Biol. Sci., vol. 17, no. 13, pp. 3268–3280, 2021, doi: 10.7150/ijbs.63488. 
[5]N. Liu et al., ‘Selective silencing of euchromatic L1s revealed by genome-wide screens for L1 regulators’, Nature, vol. 553, no. 7687, Art. no. 7687, Jan. 2018, doi: 10.1038/nature25179. 

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

TE kot regulatorji transkripcije

2022-04-24T12:32:57Z

David Valte:

==Uvod==
Transpozicijski elementi (TE), ki sestavljajo velik del evkariontskega genoma, lahko, če se nahajajo v eksonskih predelih gostiteljevega genskega zapisa, bistveno zmanjšajo njegovo evolucijsko sposobnost preživetja, ker delujejo moteče (lahko povzročijo npr. vstavitev start in stop kodonov, premik bralnega okvirja, prehitro terminacijo transkripcije,…). S tem zmanjšajo tudi verjetnost za lasten prenos v nove generacije. Ker TE po delovanju spominjajo na parazitski organizem, so se skozi evolucijo razvile strategije, ki preprečujejo preveliko škodo na gostiteljskem organizmu. Prilagajanje je potekalo vzajemno. Gostiteljski organizmi so npr. postali sposobni utišanja transpozicijskih elementov s pomočjo metilacije DNA na CpG otočkih, TE pa so se preferenčno vključevali v intronska zaporedja, saj tam ne delujejo tako moteče. Skozi čas so gostiteljski organizmi postali sposobni uporabe TE v svojo korist. Vključitve transpozicijskih elementov v nekodirajoče predele genskega zapisa in njihove mutacije so v veliko primerih povzročile, da so TE izgubili sposobnost transponiranja, pridobili pa so cis in trans-regulatorno aktivnost. Cis-regulatorne regije (CRE) so nekodirajoča zaporedja nukleotidov, ki regulirajo ekspresijo genov na isti verigi DNA. Trans regulacija pa pomeni predvsem to, da npr. transkripcijski faktorji prihajajo od drugod oz. so kodirani na eni molekuli DNA, regulirajo pa ekspresijo genov na drugi molekuli DNA. Regulacija transkripcije s TE lahko poteka na več načinov: 
1. V genski zapis lahko vnašajo nova vezavna mesta za transkripcijske faktorje (TF) preko promotorjev, ojačevalcev, utiševalnih in izolatorskih zaporedij. 
2. Lahko modulirajo 3D strukturo kromatina. 
3. Zmožni so kodiranja transkripcijskih faktorjev. 
4. S povezovanjem z represorskimi transkripcijskimi faktorji vplivajo na utišanje sosednjih genov. 
5. Imajo vlogo pri regulatornih nekodirajočih molekulah RNA, ki so pomembni regulatorji transkripcije. 
==Funkcije transpozicijskih elementov v cis-regulatornih regijah ==
Regulatorne sposobnosti cis-regulatornih regij lahko izhajajo iz transpozicijskih elementov. V splošnem cis-regulatorne regije delujejo tako, da tvorijo specifična vezavna mesta za proteine povezane z iniciacijo in regulacijo transkripcije. Primeri nekaterih vrst CRE: 
1. Promotorji so kratka zaporedja DNA, ki vključujejo začetno mesto transkripcije. Ob vezavi ustreznih transkripcijskih faktorjev na promotorsko regijo omogočijo transkripcijo gena. Kot primer bi omenil transpozon AluSp v promotorju gena FCER1G, ki inducira transkripcijo visokoafinitetnega receptorja za Fc regijo IgE. 
2. Ojačevalci so zaporedja, ki jih najdemo pred ali za genom, ki ga regulirajo. Delujejo kooperativno s promotorjem, in sicer tako, da povečajo stopnjo transkripcije, omogočajo pa regulacijo tudi bolj oddaljenih genov. Kot primer bi omenil transpozon AluY v intronu gena CD8 (ta kodira glikoprotein CD8, ki je pomemben pri celičnih interakcijah znotraj imunskega sistema), za katerega so ugotovili, da deluje kot ojačevalec. 
3. Utiševalna zaporedja vežejo represorje in tako preprečujejo transkripcijo. Transpozicijski elementi so z rekrutiranjem transkripcijskih faktorjev postali sposobni delovati kot utiševalna zaporedja, ki remodelirajo kromatin. Čeprav so heterokromatinski deli revni z geni, so bogati s TE-ji, kar bi lahko pomenilo, da imajo transpozicijski elementi pomembno vlogo pri širjenju heterokromatina. Tako se npr. korepresorski protein TRIM28 veže na vezavno mesto, ki se nahaja na transpozonu ERV in s tem utiša sosednje gene. 
4. Inzulatorji ščitijo gene pred regulatornimi vplivi sosednjih genov. Lahko blokirajo promotorje, ojačevalce in utiševalce. Preprečujejo neprimerne interakcije med sosednjimi kromatinskimi regijami. Kot primer bi omenil gen za transpozon AluSq, ki deluje kot inzulator, saj njegova transkripcija ščiti človeški gen HBE1 (ki kodira za istoimenski protein) pred regulacijo z drugimi promotorji. 
TE-ji uvajajo nova vezavna mesta za TF, ki so v njih lahko prisotna takoj po inserciji v genom ali pa nastanejo de novo s postinsercijskimi mutacijami. Pogosto se mutacije pojavljajo na metiliranih CpG otočkih. Deaminacija teh povzroči zamenjavo citozina z gvaninom, kar je med drugim povzročilo nastanek številnih vezavnih mest za transkripcijska faktorja cMyc in p53. Vključitev TE-jev zraven že obstoječega vezavnega mesta za transkripcijske faktorje ter točkovne mutacije omogočijo nastanek novih mest za vezavo TF (alternativni promotorji), kar povzroča zaščito pred možnimi kasnejšimi mutacijami z redundančnostjo. Redundanca dopušča tudi kooperativno delovanje z zunanjimi promotorji, saj se lahko tako razbremenijo določena vezavna mesta za transkripcijske faktorje. 

==Vpliv transpozicijskih elementov na kromatinsko 3D strukturo==
V interfaznem jedru so deli genoma organizirani v topološko asociirajoče domene (TAD). To so večje domene kromatina, ki so med seboj ločene z izolatorskimi proteini. Ti omejujejo prostor, v katerem lahko različni deli DNA prihajajo v medsebojne stike. Njihova naloga je tudi prostorsko omejevanje interakcij med transkripcijskimi faktorji in ojačevalci ter promotorji. TAD specificirajo funkcije cis regulatornih regij z omejevanjem ojačevalcev, tako da ti aktivirajo le promotorje znotraj iste TAD. Vloga transpozicijskih elementov (TE) pri 3D arhitekturi genoma se je v zadnjih letih začela intenzivno raziskovati. Številne družine TE so namreč obogatene na mejah TAD. Določeni TE naj bi imeli preko tega tudi vlogo pri zvijanju kromosomov, prav tako pa tudi pri kompaktnosti kromatina in posledično tudi pri regulaciji procesov transkripcije. Kot primer pomena transpozicijskih elementov bi izpostavil študijo, ki je odkrila veliko HERV-H na mejah TAD v človeških embrionalnih matičnih celicah (hESCs) in delecija 2 individualnih HERV-H je vodila do izgube kompaktnosti te meje. 
Protein CTCF (11-zinc finger protein) je pomemben pri regulaciji 3D strukture kromatina in procesov transkripcije. Zelo pomemben je pri strukturi mej TAD. Vsebuje motive cinkovega prsta in deluje kot transkripcijski faktor. Sodeluje pri mediaciji nastanka kromatinskih zank in se velikokrat veže na TE. Opaženo je bilo, da so TE razpršili veliko vezavnih mest za protein CTCF in smiselno bi bilo, da bi se tudi meje TAD razpršile, vendar je bilo ugotovljeno, da so te zelo ohranjene. Odkrili so različne mehanizme preprečevanja tvorbe ektopičnih meja TAD. Tako se npr. transpozoni B2SINE, ki imajo veliko vezavnih mest za protein CTCF, lahko povežejo s kompleksom ChAHP, ki torej prepozna isti motiv kot CTCF, a z višjo afiniteto. 
==Kodiranje transkripcijskih faktorjev s transpozicijskimi elementi==
Šele nedavno so prišli do dognanj, da proteini, za katere kodirajo transpozicijski elementi, lahko vplivajo na regulacijo genov. Najdeni so bili številni primeri, v katerih gen za TE kodira transpozazo in hkrati tudi gostiteljski transkripcijski faktor. Fuzija transpozazne DNA-domene z regulatorno domeno transkripcijskega faktorja privede do tvorbe proteinskega kompleksa, ki je sposoben prepoznave ustreznega zaporedja TE na DNA, ker transpozaza prepozna transpozicijski element. Tako se lahko optimizira regulacija ekspresije genov s pomočjo TE. 
==Utišanje transpozicijskih elementov in pomen le-tega pri regulaciji transkripcije==
Organizmi so razvili zmožnost zmanjšanja aktivnosti transpozicijskih elementov, prav tako pa so transpozicijski elementi zmožni obiti gostiteljevo obrambo. Eden od načinov utišanja delovanja TE je metilacija DNA. Demetilacija TE lahko vodi do nepravilne aktivacije sosednjih genov zaradi ojačevalnega potenciala TE. Zato so gostitelji morali razviti mehanizem, ki to kontrolira. Pomemben utiševalni mehanizem TE je metilacija CpG otočkov na DNA. Primer povezave med metilacijo DNA in aktivnostjo iz TE izhajajočih cis regulatornih regij je gen Agouti. Ta daje rjavo obarvanim mišim C57BL/6J rumeno obarvanje na način, ki je odvisen od ravni metilacije promotorja, ki nadzoruje transkripcijo retrotranspozonov IAP. Retrotranspozon IAP pa nadzira ekspresijo gena Agouti in s tem obarvanje miši. 
Drug mehanizem utišanja TE so histonske modifikacije. Primer te epigenetske modifikacije je trimetilacija lizina 9 na histonu H3 (H3K9me3). Pomembno vlogo pri tem ima kompleks HUSH (human silencing hub complex). ATPaza MORC2 in HUSH se povežeta in posledično pride do trimetilacije na histonu 3 na retrotranspozonu LINE1 in tako se retrotranspoznon utiša. LINE1 se nahaja v intronih aktivnih genov. Če so ti trimetilirani, potem se RNA polimeraza II ne more pomikati naprej (motena je elongacija transkripcije), zato se geni ne prepisujejo. 
==Transpozicijski elementi in njihova vloga pri regulatornih nekodirajočih molekulah RNA==
Zaradi napredka v določanju nukleotidnega zaporedja molekul RNA se v zadnjih letih odkriva vedno več nekodirajočih molekul RNA (ncRNA). Te vključujejo tudi regulatorne RNA, med katere spadajo kratke nekodirajoče RNA (sncRNA) in dolge nekodirajoče RNA (lncRNA). Transpozicijski elementi (TE) in regulatorne RNA so tesno povezani, saj velik del nukleotidnega zaporedja regulatornih RNA in njihovih genov ter regulatornih regij predstavljajo TE. Transpozicijski elementi določajo funkcionalne lastnosti različnih tipov ncRNA, kar je ključno za njihovo regulatorno funkcijo pri transkripciji in posttranskripcijskih procesih. 
Transpozicijski elementi dajejo strukturne značilnosti lncRNA, ki jim dajejo sposobnost interakcije z drugimi biološkimi molekulami (DNA, RNA, proteini...). lncRNA imajo lahko tako cis kot tudi trans-regulatorno aktivnost. Pojavlja se veliko hipotez, da TE dajejo funkcionalne domene lncRNA. Primer, ki potrjuje to hipotezo, je interakcija med XIST lncRNA in proteinskim kompleksom PRC2 (polycomb repressive complex 2). XIST lncRNA namreč vključuje transpozicijski element ERVB5 in ravno ta regija predstavlja vezavno mesto za PRC2. PRC2 ima vlogo pri zagotavljanju kompaktnosti kromatina, in sicer tako, da ena izmed njegovih podenot EZH2 (Enhancer of zeste homolog 2) katalizira trimetilacijo lizina 27 na histonu 3 (H3K27me1/2/3), s tem pa povzroči represijo transkripcije določenih genov. Fosforilacija EZH2 in T350 (obe sta podenoti PRC2) s CDK1/2 je ključna za interakcijo PRC2 z lncRNA, ki poteka preko G-kvadrupleskne regije lncRNA, le-ta pa je bogata s transpozoni ERVB5. XIST lncRNA pripelje proteinski kompleks PRC2 do promotorske regije tarčnega gena (npr. tumor supresorskega gena), kjer EZH2 s svojo metiltransferazno aktivnostjo deluje kot represor transkripcije. 
Zanimiv primer povezave med transpozicijskimi elementi in nekodirajočo RNA je regulacija odziva na toplotni šok pri miših. Ta primer kaže tudi na trans-regulatorno vlogo nekodirajoče RNA. Mišja ncRNA, ki izhaja iz retrotranspozona B2 SINE, se v normalnih pogojih veže na regulatorne regije genov, ki se odzivajo na stres, ter tako prepreči njihovo transkripcijo. Pri toplotnem šoku se aktivira protein EZH2, ki pospeši razgradnjo te ncRNA ter tako prepreči inhibicijo transkripcije genov, povezanih s stresom (EZH2 stimulira ribocimsko aktivnost same ncRNA). 
Transpozicijski elementi imajo pomembno vlogo pri procesu transkripcije genov za nekodirajoče RNA, saj so vključeni v številna območja njihovih genov in regulatornih regij. Mesta na genomu, na katerih se nahajajo nukleotidna zaporedja, ki izhajajo iz transpozicijskih elementov, so prisotna tako v promotorjih kot tudi na poliA regijah genov za nekodirajoče RNA. Veliko so jih našli tudi na regijah genov za lncRNA, ki so pomembna za spajanje eksonov oz. izrezovanje intronov (splice donor, splice acceptor). 
Veliko molekul miRNA (spadajo med sncRNA) z vključenimi transpozicijskimi elementi interagira s 3' koncem neprevajajoče regije tarčne mRNA (3' UTR). Preko tega procesa se utiša mRNA. Tako se npr. miR-151, ki vsebuje transpozicijske elemente LINE2, veže na molekulo mRNA, ki kodira za ATPAF1 (ATP synthase mitochondrial F1 complex assembly factor 1), in sicer tako, da se poveže s transpozoni LINE2 na 3' koncu neprevajajoče regije tarčne mRNA. 
Vedno bolj se odkriva tudi vloga transpozicijskih elementov pri tvorbi stabilnejših sekundarnih struktur v nekodirajočih RNA. Raziskava, ki je primerjala lncRNA z vključenimi transpozicijskimi elementi in lncRNA brez vključenih transpozicijskih elementov, je ugotovila, da lncRNA z vključenimi transpozicijskimi elementi tvorijo stabilnejše sekundarne strukture. Analizirali so tudi mesta na lncRNA, ki so vključena v bazno parjenje pri tvorbi sekundarnih struktur in ugotovili, da je okrog 82 % teh mest lociranih v Alu regijah lncRNA. Torej, Alu regije v regulatornih RNA sodelujejo pri intramolekularnem baznem parjenju, kar privede do tvorbe stabilnejših sekundarnih struktur, s tem pa tudi do večje stabilnosti nekodirajočih RNA. To jim omogoči, da lahko bolje opravljajo svoje funkcije regulacije transkripcije. 
==Viri in literatura==

[1]R. Fueyo, J. Judd, C. Feschotte, and J. Wysocka, ‘Roles of transposable elements in the regulation of mammalian transcription’, Nat Rev Mol Cell Biol, pp. 1–17, Feb. 2022, doi: 10.1038/s41580-022-00457-y. 
[2]A. Ali, K. Han, and P. Liang, ‘Role of Transposable Elements in Gene Regulation in the Human Genome’, Life (Basel), vol. 11, no. 2, p. 118, Feb. 2021, doi: 10.3390/life11020118. 
[3]P. J. Wittkopp and G. Kalay, ‘Cis-regulatory elements: molecular mechanisms and evolutionary processes underlying divergence’, Nat Rev Genet, vol. 13, no. 1, Art. no. 1, Jan. 2012, doi: 10.1038/nrg3095. 
[4]A. Hao, Y. Wang, D. B. Stovall, Y. Wang, and G. Sui, ‘Emerging Roles of LncRNAs in the EZH2-regulated Oncogenic Network’, Int. J. Biol. Sci., vol. 17, no. 13, pp. 3268–3280, 2021, doi: 10.7150/ijbs.63488. 
[5]N. Liu et al., ‘Selective silencing of euchromatic L1s revealed by genome-wide screens for L1 regulators’, Nature, vol. 553, no. 7687, Art. no. 7687, Jan. 2018, doi: 10.1038/nature25179. 

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

TE kot regulatorji transkripcije

2022-04-24T12:25:11Z

David Valte:

==Uvod==
Transpozicijski elementi (TE), ki sestavljajo velik del evkariontskega genoma, lahko, če se nahajajo v eksonskih predelih gostiteljevega genskega zapisa, bistveno zmanjšajo njegovo evolucijsko sposobnost preživetja, ker delujejo moteče (lahko povzročijo npr. vstavitev start in stop kodonov, premik bralnega okvirja, prehitro terminacijo transkripcije,…). S tem zmanjšajo tudi verjetnost za lasten prenos v nove generacije. Ker TE po delovanju spominjajo na parazitski organizem, so se skozi evolucijo razvile strategije, ki preprečujejo preveliko škodo na gostiteljskem organizmu. Prilagajanje je potekalo vzajemno. Gostiteljski organizmi so npr. postali sposobni utišanja transpozicijskih elementov s pomočjo metilacije DNA na CpG otočkih, TE pa so se preferenčno vključevali v intronska zaporedja, saj tam ne delujejo tako moteče. Skozi čas so gostiteljski organizmi postali sposobni uporabe TE v svojo korist. Vključitve transpozicijskih elementov v nekodirajoče predele genskega zapisa in njihove mutacije so v veliko primerih povzročile, da so TE izgubili sposobnost transponiranja, pridobili pa so cis in trans-regulatorno aktivnost. Cis-regulatorne regije (CRE) so nekodirajoča zaporedja nukleotidov, ki regulirajo ekspresijo genov na isti verigi DNA. Trans regulacija pa pomeni predvsem to, da npr. transkripcijski faktorji prihajajo od drugod oz. so kodirani na eni molekuli DNA, regulirajo pa ekspresijo genov na drugi molekuli DNA. Regulacija transkripcije s TE lahko poteka na več načinov:

1. V genski zapis lahko vnašajo nova vezavna mesta za transkripcijske faktorje (TF) preko promotorjev, ojačevalcev, utiševalnih in izolatorskih zaporedij. 
2. Lahko modulirajo 3D strukturo kromatina. 
3. Zmožni so kodiranja transkripcijskih faktorjev. 
4. S povezovanjem z represorskimi transkripcijskimi faktorji vplivajo na utišanje sosednjih genov. 
5. Imajo vlogo pri regulatornih nekodirajočih molekulah RNA, ki so pomembni regulatorji transkripcije. 

==Funkcije transpozicijskih elementov v cis-regulatornih regijah ==
Regulatorne sposobnosti cis-regulatornih regij lahko izhajajo iz transpozicijskih elementov. V splošnem cis-regulatorne regije delujejo tako, da tvorijo specifična vezavna mesta za proteine povezane z iniciacijo in regulacijo transkripcije. Primeri nekaterih vrst CRE:

1. Promotorji so kratka zaporedja DNA, ki vključujejo začetno mesto transkripcije. Ob vezavi ustreznih transkripcijskih faktorjev na promotorsko regijo omogočijo transkripcijo gena. Kot primer bi omenil transpozon AluSp v promotorju gena FCER1G, ki inducira transkripcijo visokoafinitetnega receptorja za Fc regijo IgE. 
2. Ojačevalci so zaporedja, ki jih najdemo pred ali za genom, ki ga regulirajo. Delujejo kooperativno s promotorjem, in sicer tako, da povečajo stopnjo transkripcije, omogočajo pa regulacijo tudi bolj oddaljenih genov. Kot primer bi omenil transpozon AluY v intronu gena CD8 (ta kodira glikoprotein CD8, ki je pomemben pri celičnih interakcijah znotraj imunskega sistema), za katerega so ugotovili, da deluje kot ojačevalec. 
3. Utiševalna zaporedja vežejo represorje in tako preprečujejo transkripcijo. Transpozicijski elementi so z rekrutiranjem transkripcijskih faktorjev postali sposobni delovati kot utiševalna zaporedja, ki remodelirajo kromatin. Čeprav so heterokromatinski deli revni z geni, so bogati s TE-ji, kar bi lahko pomenilo, da imajo transpozicijski elementi pomembno vlogo pri širjenju heterokromatina. Tako se npr. korepresorski protein TRIM28 veže na vezavno mesto, ki se nahaja na transpozonu ERV in s tem utiša sosednje gene. 
4. Inzulatorji ščitijo gene pred regulatornimi vplivi sosednjih genov. Lahko blokirajo promotorje, ojačevalce in utiševalce. Preprečujejo neprimerne interakcije med sosednjimi kromatinskimi regijami. Kot primer bi omenil gen za transpozon AluSq, ki deluje kot inzulator, saj njegova transkripcija ščiti človeški gen HBE1 (ki kodira za istoimenski protein) pred regulacijo z drugimi promotorji. 

TE-ji uvajajo nova vezavna mesta za TF, ki so v njih lahko prisotna takoj po inserciji v genom ali pa nastanejo de novo s postinsercijskimi mutacijami. Pogosto se mutacije pojavljajo na metiliranih CpG otočkih. Deaminacija teh povzroči zamenjavo citozina z gvaninom, kar je med drugim povzročilo nastanek številnih vezavnih mest za transkripcijska faktorja cMyc in p53. Vključitev TE-jev zraven že obstoječega vezavnega mesta za transkripcijske faktorje ter točkovne mutacije omogočijo nastanek novih mest za vezavo TF (alternativni promotorji), kar povzroča zaščito pred možnimi kasnejšimi mutacijami z redundančnostjo. Redundanca dopušča tudi kooperativno delovanje z zunanjimi promotorji, saj se lahko tako razbremenijo določena vezavna mesta za transkripcijske faktorje.

==Vpliv transpozicijskih elementov na kromatinsko 3D strukturo==
V interfaznem jedru so deli genoma organizirani v topološko asociirajoče domene (TAD). To so večje domene kromatina, ki so med seboj ločene z izolatorskimi proteini. Ti omejujejo prostor, v katerem lahko različni deli DNA prihajajo v medsebojne stike. Njihova naloga je tudi prostorsko omejevanje interakcij med transkripcijskimi faktorji in ojačevalci ter promotorji. TAD specificirajo funkcije cis regulatornih regij z omejevanjem ojačevalcev, tako da ti aktivirajo le promotorje znotraj iste TAD. Vloga transpozicijskih elementov (TE) pri 3D arhitekturi genoma se je v zadnjih letih začela intenzivno raziskovati. Številne družine TE so namreč obogatene na mejah TAD. Določeni TE naj bi imeli preko tega tudi vlogo pri zvijanju kromosomov, prav tako pa tudi pri kompaktnosti kromatina in posledično tudi pri regulaciji procesov transkripcije. Kot primer pomena transpozicijskih elementov bi izpostavil študijo, ki je odkrila veliko HERV-H na mejah TAD v človeških embrionalnih matičnih celicah (hESCs) in delecija 2 individualnih HERV-H je vodila do izgube kompaktnosti te meje.

Protein CTCF (11-zinc finger protein) je pomemben pri regulaciji 3D strukture kromatina in procesov transkripcije. Zelo pomemben je pri strukturi mej TAD. Vsebuje motive cinkovega prsta in deluje kot transkripcijski faktor. Sodeluje pri mediaciji nastanka kromatinskih zank in se velikokrat veže na TE. Opaženo je bilo, da so TE razpršili veliko vezavnih mest za protein CTCF in smiselno bi bilo, da bi se tudi meje TAD razpršile, vendar je bilo ugotovljeno, da so te zelo ohranjene. Odkrili so različne mehanizme preprečevanja tvorbe ektopičnih meja TAD. Tako se npr. transpozoni B2SINE, ki imajo veliko vezavnih mest za protein CTCF, lahko povežejo s kompleksom ChAHP, ki torej prepozna isti motiv kot CTCF, a z višjo afiniteto.

==Kodiranje transkripcijskih faktorjev s transpozicijskimi elementi==
Šele nedavno so prišli do dognanj, da proteini, za katere kodirajo transpozicijski elementi, lahko vplivajo na regulacijo genov. Najdeni so bili številni primeri, v katerih gen za TE kodira transpozazo in hkrati tudi gostiteljski transkripcijski faktor. Fuzija transpozazne DNA-domene z regulatorno domeno transkripcijskega faktorja privede do tvorbe proteinskega kompleksa, ki je sposoben prepoznave ustreznega zaporedja TE na DNA, ker transpozaza prepozna transpozicijski element. Tako se lahko optimizira regulacija ekspresije genov s pomočjo TE.

==Utišanje transpozicijskih elementov in pomen le-tega pri regulaciji transkripcije==
Organizmi so razvili zmožnost zmanjšanja aktivnosti transpozicijskih elementov, prav tako pa so transpozicijski elementi zmožni obiti gostiteljevo obrambo. Eden od načinov utišanja delovanja TE je metilacija DNA. Demetilacija TE lahko vodi do nepravilne aktivacije sosednjih genov zaradi ojačevalnega potenciala TE. Zato so gostitelji morali razviti mehanizem, ki to kontrolira. Pomemben utiševalni mehanizem TE je metilacija CpG otočkov na DNA. Primer povezave med metilacijo DNA in aktivnostjo iz TE izhajajočih cis regulatornih regij je gen Agouti. Ta daje rjavo obarvanim mišim C57BL/6J rumeno obarvanje na način, ki je odvisen od ravni metilacije promotorja, ki nadzoruje transkripcijo retrotranspozonov IAP. Retrotranspozon IAP pa nadzira ekspresijo gena Agouti in s tem obarvanje miši.

Drug mehanizem utišanja TE so histonske modifikacije. Primer te epigenetske modifikacije je trimetilacija lizina 9 na histonu H3 (H3K9me3). Pomembno vlogo pri tem ima kompleks HUSH (human silencing hub complex). ATPaza MORC2 in HUSH se povežeta in posledično pride do trimetilacije na histonu 3 na retrotranspozonu LINE1 in tako se retrotranspoznon utiša. LINE1 se nahaja v intronih aktivnih genov. Če so ti trimetilirani, potem se RNA polimeraza II ne more pomikati naprej (motena je elongacija transkripcije), zato se geni ne prepisujejo.

==Transpozicijski elementi in njihova vloga pri regulatornih nekodirajočih molekulah RNA==
Zaradi napredka v določanju nukleotidnega zaporedja molekul RNA se v zadnjih letih odkriva vedno več nekodirajočih molekul RNA (ncRNA). Te vključujejo tudi regulatorne RNA, med katere spadajo kratke nekodirajoče RNA (sncRNA) in dolge nekodirajoče RNA (lncRNA). Transpozicijski elementi (TE) in regulatorne RNA so tesno povezani, saj velik del nukleotidnega zaporedja regulatornih RNA in njihovih genov ter regulatornih regij predstavljajo TE. Transpozicijski elementi določajo funkcionalne lastnosti različnih tipov ncRNA, kar je ključno za njihovo regulatorno funkcijo pri transkripciji in posttranskripcijskih procesih.

Transpozicijski elementi dajejo strukturne značilnosti lncRNA, ki jim dajejo sposobnost interakcije z drugimi biološkimi molekulami (DNA, RNA, proteini...). lncRNA imajo lahko tako cis kot tudi trans-regulatorno aktivnost. Pojavlja se veliko hipotez, da TE dajejo funkcionalne domene lncRNA. Primer, ki potrjuje to hipotezo, je interakcija med XIST lncRNA in proteinskim kompleksom PRC2 (polycomb repressive complex 2). XIST lncRNA namreč vključuje transpozicijski element ERVB5 in ravno ta regija predstavlja vezavno mesto za PRC2. PRC2 ima vlogo pri zagotavljanju kompaktnosti kromatina, in sicer tako, da ena izmed njegovih podenot EZH2 (Enhancer of zeste homolog 2) katalizira trimetilacijo lizina 27 na histonu 3 (H3K27me1/2/3), s tem pa povzroči represijo transkripcije določenih genov. Fosforilacija EZH2 in T350 (obe sta podenoti PRC2) s CDK1/2 je ključna za interakcijo PRC2 z lncRNA, ki poteka preko G-kvadrupleskne regije lncRNA, le-ta pa je bogata s transpozoni ERVB5. XIST lncRNA pripelje proteinski kompleks PRC2 do promotorske regije tarčnega gena (npr. tumor supresorskega gena), kjer EZH2 s svojo metiltransferazno aktivnostjo deluje kot represor transkripcije.
Zanimiv primer povezave med transpozicijskimi elementi in nekodirajočo RNA je regulacija odziva na toplotni šok pri miših. Ta primer kaže tudi na trans-regulatorno vlogo nekodirajoče RNA. Mišja ncRNA, ki izhaja iz retrotranspozona B2 SINE, se v normalnih pogojih veže na regulatorne regije genov, ki se odzivajo na stres, ter tako prepreči njihovo transkripcijo. Pri toplotnem šoku se aktivira protein EZH2, ki pospeši razgradnjo te ncRNA ter tako prepreči inhibicijo transkripcije genov, povezanih s stresom (EZH2 stimulira ribocimsko aktivnost same ncRNA).

Transpozicijski elementi imajo pomembno vlogo pri procesu transkripcije genov za nekodirajoče RNA, saj so vključeni v številna območja njihovih genov in regulatornih regij. Mesta na genomu, na katerih se nahajajo nukleotidna zaporedja, ki izhajajo iz transpozicijskih elementov, so prisotna tako v promotorjih kot tudi na poliA regijah genov za nekodirajoče RNA. Veliko so jih našli tudi na regijah genov za lncRNA, ki so pomembna za spajanje eksonov oz. izrezovanje intronov (splice donor, splice acceptor).

Veliko molekul miRNA (spadajo med sncRNA) z vključenimi transpozicijskimi elementi interagira s 3' koncem neprevajajoče regije tarčne mRNA (3' UTR). Preko tega procesa se utiša mRNA. Tako se npr. miR-151, ki vsebuje transpozicijske elemente LINE2, veže na molekulo mRNA, ki kodira za ATPAF1 (ATP synthase mitochondrial F1 complex assembly factor 1), in sicer tako, da se poveže s transpozoni LINE2 na 3' koncu neprevajajoče regije tarčne mRNA.

Vedno bolj se odkriva tudi vloga transpozicijskih elementov pri tvorbi stabilnejših sekundarnih struktur v nekodirajočih RNA. Raziskava, ki je primerjala lncRNA z vključenimi transpozicijskimi elementi in lncRNA brez vključenih transpozicijskih elementov, je ugotovila, da lncRNA z vključenimi transpozicijskimi elementi tvorijo stabilnejše sekundarne strukture. Analizirali so tudi mesta na lncRNA, ki so vključena v bazno parjenje pri tvorbi sekundarnih struktur in ugotovili, da je okrog 82 % teh mest lociranih v Alu regijah lncRNA. Torej, Alu regije v regulatornih RNA sodelujejo pri intramolekularnem baznem parjenju, kar privede do tvorbe stabilnejših sekundarnih struktur, s tem pa tudi do večje stabilnosti nekodirajočih RNA. To jim omogoči, da lahko bolje opravljajo svoje funkcije regulacije transkripcije.

==Viri in literatura==

[1]R. Fueyo, J. Judd, C. Feschotte, and J. Wysocka, ‘Roles of transposable elements in the regulation of mammalian transcription’, Nat Rev Mol Cell Biol, pp. 1–17, Feb. 2022, doi: 10.1038/s41580-022-00457-y. 
[2]A. Ali, K. Han, and P. Liang, ‘Role of Transposable Elements in Gene Regulation in the Human Genome’, Life (Basel), vol. 11, no. 2, p. 118, Feb. 2021, doi: 10.3390/life11020118. 
[3]P. J. Wittkopp and G. Kalay, ‘Cis-regulatory elements: molecular mechanisms and evolutionary processes underlying divergence’, Nat Rev Genet, vol. 13, no. 1, Art. no. 1, Jan. 2012, doi: 10.1038/nrg3095. 
[4]A. Hao, Y. Wang, D. B. Stovall, Y. Wang, and G. Sui, ‘Emerging Roles of LncRNAs in the EZH2-regulated Oncogenic Network’, Int. J. Biol. Sci., vol. 17, no. 13, pp. 3268–3280, 2021, doi: 10.7150/ijbs.63488. 
[5]N. Liu et al., ‘Selective silencing of euchromatic L1s revealed by genome-wide screens for L1 regulators’, Nature, vol. 553, no. 7687, Art. no. 7687, Jan. 2018, doi: 10.1038/nature25179. 

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

TE kot regulatorji transkripcije

2022-04-24T12:14:26Z

David Valte:

TE kot regulatorji transkripcije

2022-04-24T12:13:32Z

David Valte:

TE kot regulatorji transkripcije

2022-04-24T11:37:52Z

David Valte: Replacing page with '==Naslov== ==Naslov== ==Naslov== ==Naslov== ==Naslov== ==Naslov== primer dodajanja povezave: [https://www.fkkt.uni-lj.si/ naslov slike] primer odebeljenega teks...'

==Naslov==

==Naslov==

==Naslov==

==Naslov==

==Naslov==

==Naslov==

primer dodajanja povezave: [https://www.fkkt.uni-lj.si/ naslov slike]
primer odebeljenega teksta: '''text'''

==Viri in literatura==

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

TE kot regulatorji transkripcije

2022-04-24T09:46:22Z

David Valte:

==Naslov==

Lorem ipsum dolor sit amet, consectetur adipiscing elit, sed do eiusmod tempor incididunt ut labore et dolore magna aliqua. Eget est lorem ipsum dolor sit amet consectetur adipiscing elit. Justo laoreet sit amet cursus sit amet dictum sit amet. Morbi tincidunt ornare massa eget egestas purus viverra accumsan. Ultricies leo integer malesuada nunc vel risus commodo viverra. Auctor elit sed vulputate mi sit amet mauris commodo quis. Sit amet porttitor eget dolor morbi non arcu risus. Etiam non quam lacus suspendisse faucibus interdum posuere. Vel fringilla est ullamcorper eget nulla. Mauris cursus mattis molestie a iaculis at erat pellentesque adipiscing. Aliquet bibendum enim facilisis gravida neque convallis a cras semper.

==Naslov==

Diam in arcu cursus euismod quis viverra. Commodo odio aenean sed adipiscing. Volutpat consequat mauris nunc congue nisi vitae suscipit. Potenti nullam ac tortor vitae purus. Proin sagittis nisl rhoncus mattis rhoncus urna neque viverra. Sagittis id consectetur purus ut faucibus pulvinar elementum. Commodo quis imperdiet massa tincidunt. Quam adipiscing vitae proin sagittis nisl. Duis at tellus at urna. Lobortis mattis aliquam faucibus purus in massa tempor nec feugiat. Molestie at elementum eu facilisis sed odio morbi. Malesuada nunc vel risus commodo viverra. Eu scelerisque felis imperdiet proin fermentum leo. Tempus imperdiet nulla malesuada pellentesque elit. Augue neque gravida in fermentum et sollicitudin ac orci phasellus. Eleifend donec pretium vulputate sapien nec sagittis aliquam. Nibh praesent tristique magna sit amet. Justo donec enim diam vulputate. Sapien et ligula ullamcorper malesuada proin libero nunc consequat interdum.

==Naslov==

primer dodajanja povezave: [https://www.fkkt.uni-lj.si/ naslov slike]
primer odebeljenega teksta: '''text'''

==Naslov==

Elementum eu facilisis sed odio morbi quis commodo odio aenean. Dolor sed viverra ipsum nunc aliquet bibendum. Amet consectetur adipiscing elit ut aliquam purus sit. Id aliquet lectus proin nibh nisl condimentum id venenatis a. Tristique risus nec feugiat in fermentum posuere urna nec tincidunt. Sed risus pretium quam vulputate dignissim. Nunc faucibus a pellentesque sit amet porttitor eget dolor. Pellentesque habitant morbi tristique senectus et netus et malesuada. Ultrices gravida dictum fusce ut placerat orci. Turpis egestas pretium aenean pharetra magna ac placerat vestibulum. Sagittis nisl rhoncus mattis rhoncus urna neque viverra justo nec. Mauris augue neque gravida in fermentum.

==Viri in literatura==

Non diam phasellus vestibulum lorem sed risus ultricies tristique nulla. Non odio euismod lacinia at quis risus sed. Fermentum odio eu feugiat pretium nibh ipsum consequat nisl. Venenatis urna cursus eget nunc scelerisque viverra mauris in aliquam. Elementum sagittis vitae et leo duis ut diam quam nulla. Praesent elementum facilisis leo vel fringilla est ullamcorper. Diam sit amet nisl suscipit adipiscing bibendum est. Eros in cursus turpis massa tincidunt. Non curabitur gravida arcu ac. Ut enim blandit volutpat maecenas. Vel eros donec ac odio tempor orci dapibus. Scelerisque felis imperdiet proin fermentum leo vel orci porta non. Nisl tincidunt eget nullam non nisi est sit. Tristique senectus et netus et malesuada fames. Risus ultricies tristique nulla aliquet enim tortor at. Vitae nunc sed velit dignissim.

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

TE kot regulatorji transkripcije

2022-04-22T22:11:13Z

David Valte:

==Naslov==

Lorem ipsum dolor sit amet, consectetur adipiscing elit, sed do eiusmod tempor incididunt ut labore et dolore magna aliqua. Eget est lorem ipsum dolor sit amet consectetur adipiscing elit. Justo laoreet sit amet cursus sit amet dictum sit amet. Morbi tincidunt ornare massa eget egestas purus viverra accumsan. Ultricies leo integer malesuada nunc vel risus commodo viverra. Auctor elit sed vulputate mi sit amet mauris commodo quis. Sit amet porttitor eget dolor morbi non arcu risus. Etiam non quam lacus suspendisse faucibus interdum posuere. Vel fringilla est ullamcorper eget nulla. Mauris cursus mattis molestie a iaculis at erat pellentesque adipiscing. Aliquet bibendum enim facilisis gravida neque convallis a cras semper.

==Naslov==

Diam in arcu cursus euismod quis viverra. Commodo odio aenean sed adipiscing. Volutpat consequat mauris nunc congue nisi vitae suscipit. Potenti nullam ac tortor vitae purus. Proin sagittis nisl rhoncus mattis rhoncus urna neque viverra. Sagittis id consectetur purus ut faucibus pulvinar elementum. Commodo quis imperdiet massa tincidunt. Quam adipiscing vitae proin sagittis nisl. Duis at tellus at urna. Lobortis mattis aliquam faucibus purus in massa tempor nec feugiat. Molestie at elementum eu facilisis sed odio morbi. Malesuada nunc vel risus commodo viverra. Eu scelerisque felis imperdiet proin fermentum leo. Tempus imperdiet nulla malesuada pellentesque elit. Augue neque gravida in fermentum et sollicitudin ac orci phasellus. Eleifend donec pretium vulputate sapien nec sagittis aliquam. Nibh praesent tristique magna sit amet. Justo donec enim diam vulputate. Sapien et ligula ullamcorper malesuada proin libero nunc consequat interdum.

==Naslov==

primer dodajanja povezave: [https://www.fkkt.uni-lj.si/ naslov slike]

==Naslov==

Elementum eu facilisis sed odio morbi quis commodo odio aenean. Dolor sed viverra ipsum nunc aliquet bibendum. Amet consectetur adipiscing elit ut aliquam purus sit. Id aliquet lectus proin nibh nisl condimentum id venenatis a. Tristique risus nec feugiat in fermentum posuere urna nec tincidunt. Sed risus pretium quam vulputate dignissim. Nunc faucibus a pellentesque sit amet porttitor eget dolor. Pellentesque habitant morbi tristique senectus et netus et malesuada. Ultrices gravida dictum fusce ut placerat orci. Turpis egestas pretium aenean pharetra magna ac placerat vestibulum. Sagittis nisl rhoncus mattis rhoncus urna neque viverra justo nec. Mauris augue neque gravida in fermentum.

==Viri in literatura==

Non diam phasellus vestibulum lorem sed risus ultricies tristique nulla. Non odio euismod lacinia at quis risus sed. Fermentum odio eu feugiat pretium nibh ipsum consequat nisl. Venenatis urna cursus eget nunc scelerisque viverra mauris in aliquam. Elementum sagittis vitae et leo duis ut diam quam nulla. Praesent elementum facilisis leo vel fringilla est ullamcorper. Diam sit amet nisl suscipit adipiscing bibendum est. Eros in cursus turpis massa tincidunt. Non curabitur gravida arcu ac. Ut enim blandit volutpat maecenas. Vel eros donec ac odio tempor orci dapibus. Scelerisque felis imperdiet proin fermentum leo vel orci porta non. Nisl tincidunt eget nullam non nisi est sit. Tristique senectus et netus et malesuada fames. Risus ultricies tristique nulla aliquet enim tortor at. Vitae nunc sed velit dignissim.

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

TE kot regulatorji transkripcije

2022-04-22T21:51:46Z

David Valte: New page: ==Naslov== Lorem ipsum dolor sit amet, consectetur adipiscing elit, sed do eiusmod tempor incididunt ut labore et dolore magna aliqua. Eget est lorem ipsum dolor sit amet consectetur adip...

==Naslov==

Lorem ipsum dolor sit amet, consectetur adipiscing elit, sed do eiusmod tempor incididunt ut labore et dolore magna aliqua. Eget est lorem ipsum dolor sit amet consectetur adipiscing elit. Justo laoreet sit amet cursus sit amet dictum sit amet. Morbi tincidunt ornare massa eget egestas purus viverra accumsan. Ultricies leo integer malesuada nunc vel risus commodo viverra. Auctor elit sed vulputate mi sit amet mauris commodo quis. Sit amet porttitor eget dolor morbi non arcu risus. Etiam non quam lacus suspendisse faucibus interdum posuere. Vel fringilla est ullamcorper eget nulla. Mauris cursus mattis molestie a iaculis at erat pellentesque adipiscing. Aliquet bibendum enim facilisis gravida neque convallis a cras semper.

==Naslov==

Diam in arcu cursus euismod quis viverra. Commodo odio aenean sed adipiscing. Volutpat consequat mauris nunc congue nisi vitae suscipit. Potenti nullam ac tortor vitae purus. Proin sagittis nisl rhoncus mattis rhoncus urna neque viverra. Sagittis id consectetur purus ut faucibus pulvinar elementum. Commodo quis imperdiet massa tincidunt. Quam adipiscing vitae proin sagittis nisl. Duis at tellus at urna. Lobortis mattis aliquam faucibus purus in massa tempor nec feugiat. Molestie at elementum eu facilisis sed odio morbi. Malesuada nunc vel risus commodo viverra. Eu scelerisque felis imperdiet proin fermentum leo. Tempus imperdiet nulla malesuada pellentesque elit. Augue neque gravida in fermentum et sollicitudin ac orci phasellus. Eleifend donec pretium vulputate sapien nec sagittis aliquam. Nibh praesent tristique magna sit amet. Justo donec enim diam vulputate. Sapien et ligula ullamcorper malesuada proin libero nunc consequat interdum.

==Naslov==

Elementum eu facilisis sed odio morbi quis commodo odio aenean. Dolor sed viverra ipsum nunc aliquet bibendum. Amet consectetur adipiscing elit ut aliquam purus sit. Id aliquet lectus proin nibh nisl condimentum id venenatis a. Tristique risus nec feugiat in fermentum posuere urna nec tincidunt. Sed risus pretium quam vulputate dignissim. Nunc faucibus a pellentesque sit amet porttitor eget dolor. Pellentesque habitant morbi tristique senectus et netus et malesuada. Ultrices gravida dictum fusce ut placerat orci. Turpis egestas pretium aenean pharetra magna ac placerat vestibulum. Sagittis nisl rhoncus mattis rhoncus urna neque viverra justo nec. Mauris augue neque gravida in fermentum.

==Viri in literatura==

Non diam phasellus vestibulum lorem sed risus ultricies tristique nulla. Non odio euismod lacinia at quis risus sed. Fermentum odio eu feugiat pretium nibh ipsum consequat nisl. Venenatis urna cursus eget nunc scelerisque viverra mauris in aliquam. Elementum sagittis vitae et leo duis ut diam quam nulla. Praesent elementum facilisis leo vel fringilla est ullamcorper. Diam sit amet nisl suscipit adipiscing bibendum est. Eros in cursus turpis massa tincidunt. Non curabitur gravida arcu ac. Ut enim blandit volutpat maecenas. Vel eros donec ac odio tempor orci dapibus. Scelerisque felis imperdiet proin fermentum leo vel orci porta non. Nisl tincidunt eget nullam non nisi est sit. Tristique senectus et netus et malesuada fames. Risus ultricies tristique nulla aliquet enim tortor at. Vitae nunc sed velit dignissim.

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Transpozicijski elementi

2022-04-22T21:48:08Z

David Valte:

Seminarji pri Molekularni biologiji v študijskem letu 2021/22 obravnavajo odkritje, mehanizem in vlogo transpozicijskih elementov pri prokariontih in evkariontih. Okvirni naslovi teme so navedeni na spodnjem seznamu.

Vse teme temeljijo na preglednih člankih, kar pomeni, da obravnavajo zaključene teme, na katerih je bilo opravljenega že veliko dela. Zato je smiselno, da vsako temo obdelajo po trije študenti. Vsaka skupina mora pripraviti povzetek seminarja z vsaj 1200 besedami in ne več kot 1800 besedami in ga objaviti na tem wikiju. Povzetek ne vsebuje slikovnega gradiva, lahko pa vključuje povezave do slik in videov na spletu. Navedite do 5 ključnih virov (ti ne štejejo v vsoto 1200-1800 besed), ki ste jih uporabili.

Vsaka skupina mora objaviti povzetek seminarja na wikiju najkasneje 24 h pred predstavitvijo svojega seminarja. Kateri del povzetka je napisal kdo, navedite v zavihku 'discussion'. Predstavitev naj bo dolga 15-20 minut, temu pa bo sledila razprava (pribl. 5 minut). Vsak član skupine mora predstaviti en del seminarja, pri čemer mora biti delo enakomerno razdeljeno med vse. Osredotočite se na osnovno temo, ki ste si jo izbrali in vključite le malo splošnega uvoda, ki naj zgolj umesti vašo temo v kontekst transpozicijskih elementov.

Seminarske predstavitve bodo potekale predvidoma od 19.4. do 9.5. V tem času ne bo klasičnih predavanj, torej bodo tako ponedeljkovi kot torkovi termini namenjeni seminarjem.

Vsebina seminarjev je izpitna snov. Iz teme seminarjev je ~10 % vprašanj na izpitu (oz. 10 % točk dobite za odgovore iz snovi seminarjev).

Razdelitev seminarjev je potekala v okolju Google Drive, kjer so (bile) navedene povezave do izhodiščnih člankov, s katerimi lahko začnete iskanje literature. Večinoma navedeni viri ne zadoščajo, da bi pripravili kvaliteten 15-minutni seminar, zato boste morali pregledati tudi nekaj primarnih virov (raziskovalnih člankov), ki jih boste poiskali sami oz. jih boste našli citirane v preglednih člankih. Vaši seminarji naj se osredotočijo na osnovno temo iz naslova in naj nimajo dolgih splošnih uvodov. Seminarji si bodo namreč sledili dokaj hitro en za drugim), tako da boste osnove hitro osvojili in jih ni treba ponavljati.

Ko boste pripravljali povzetek, naslov teme na spodnjem seznamu povežite z novo wiki stranjo, ki bo vsebovala povzetek. Na koncu besedila povzetka (pod viri) v novo vrstico dodajte oznako: <nowiki>[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]</nowiki>. Primer, kako so bili urejeni seminarji v prejšnjih letih, si lahko ogledate na strani [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Molekularna_biologija_koronavirusov Molekularna biologija koronavirusov (2020/21)].

Poglavja za seminarje so:

# [[Odkritje transpozicijskih elementov pri bakterijah]] (Teja Spruk, Urša Štefan, Urša Zevnik) 
# [[Klasifikacija transpozicijskih elementov in pregled načina delovanja]] (Klara Ažbe, Pia Trošt, Ana Maučec) 
# [[Katalitični mehanizem transpozaz]] (Nuša Brdnik, Mark Loborec, Maj Priveršek) 
# [[Transpozoni kot prenašalci odpornosti bakterij proti antibiotikom]] (Ana Kastelic, Lev Jošt, Gašper Struna) 

----

# [[Pomen retroelementov v mikrobnih genomih]] (Ema Kavčič, Špela Rapuš, Ivana Vukšinić) 
# [[Integracija transpozonov pri kvasovkah]] (Katja Resnik, Pia Špehar, Zarja Weingerl) 
# [[Retrotranspozoni LINE-1 in dejavniki, ki uravnavajo njihovo delovanje]] (Ana Kodra, Neža Lanišek, Gašper Možina) 
# [[TE kot regulatorji transkripcije]] (Marko Kovačić, Nik Vidmar, David Valte) 

----

# Interakcije transpozon – gostitelj 
# Sodobni pogled na TE pri koruzi 
# Vloga TE pri razvoju zarodka 
# [[Transpozoni in rak]] (Maša Mencigar, Alliana Kolar, Klara Kočman) 

----

# Uporabna vrednost transpozonov za gensko zdravljenje 
# Biotehnološka uporaba transpozicijskega mehanizma: primer Sleeping Beauty 
# Funkcije nekodirajoče RNA, ki je po izvoru transpozonska 
# TE kot gonilo sprememb v genomu pšenice 

----

# [[TE pri mentalnih boleznih]] (Tina Javeršek, Hana Glavnik, Jan Trebušak) 
# TE pri vnetnih boleznih 

----

# Preferenčna integracijska mesta retrotranspozona Tf1 v genomu kvasovke ''Schizosaccharomyces pombe''

BIO2 Povzetki seminarjev 2021

2021-10-31T19:45:45Z

David Valte: /* POVZETKI SEMINARJEV BIOKEMIJA 2021/22 */

= POVZETKI SEMINARJEV BIOKEMIJA 2021/22 =

==Urša Štefan - Signalizacija STING - obseg delovanja in povezava z rakavimi obolenji==

Pojav dvovijačne DNA v citosolu je v celici največkrat pokazatelj celične abnormalnosti – virusne okužbe, poškodbe dednega materiala, oksidativnega stresa ali rakave transformacije. Celice so zato razvile načine zaznavanja prisotnosti DNA v citosolu. Eden izmed takšnih je signalna pot STING. Protein ciklična GMP-AMP sintetaza po vezavi z DNA sintetizira cGAMP, ki aktivira protein STING, vezan v membrani endoplazmatskega retikuluma. Ta se transportira do Golgijevega aparata, kjer mu vezava kinaze TBK1 omogoča aktivacijo transkripcijskih faktorjev IRF3 in NF-κB za citokine. Poleg odziva na citosolno DNA protein STING sodeluje tudi v regulaciji celičnega metabolizma, celičnega cikla, pri indukciji avtofagije, regulaciji ravni kalcija in kot senzor poškodb DNA. Zaradi svojega velikega obsega delovanja je signalna pot STING tarča razvoja številnih zdravil, ki pa je do zdaj bil le delno uspešen. Članek opiše signalno pot STING, njene funkcije v celici in na kratko povzame vlogo signalne poti pri zdravljenju rakavih obolenj.

==Hana Glavnik - S-glutationilacija proteinov kot globalni inhibitor celičnega metabolizma za zmanjšanje občutljivosti signalov vodikovega peroksida==

S-glutationilacija proteinov ima v celici pomembno vlogo. Ob zvišanju koncentracije reaktivnih kisikovih spojin (ROS), se v celici vzpostavi stanje oksidativnega stresa. Ker so za celico te spojine toksične, je razvila mehanizme, ki ji pomagajo uravnavati njihovo koncentracijo in zaščitijo ostale spojine v celici pred ireverzibilno oksidacijo. Najbolj pomembna spojina med ROS je vodikov peroksid, ki ima poleg toksičnih vplivov tudi lastnosti sekundarnega sporočevalca. Ob nastopu oksidativnega stresa v celici in povišane koncentracije vodikovega peroksida, zaznata signale encima GRX1 in GRX2, ki glutationilirata proteine z vezavo glutationa (GSH) na tiolne skupine cisteinov (-SH) in jih tako zaščitita pred poškodbami. Hkrati se s potekom S-glutationilacije aktivirajo tiste metabolične poti, pri katerih nastajajo antioksidanti, največkrat NADPH, ki pomagajo razgraditi vodikov peroksid in ostale ROS spojine. Tiste poti, pri katerih nastajajo ROS spojine so inhibirane s strani S-glutationilacije, dokler ne pride do signala, ki ga sprejmeta GRX1/2. To sproži njune deglutationilacijske aktivnosti in z deglutationilacijo encimov se stanje v celici se normalizira in metabolične poti lahko potekajo nemoteno.

==Tinkara Butara - Transmembranska signalizacija v bakterijskih kemoreceptorjih==
Kemotaksija je oblika gibanja, kjer se organizem giba k ugodnemu kemijskemu gradientu ali stran od toksičnega oziroma neugodnega. Oblika gibanja je značilna za premikajoče se bakterije in arheje. Kemotaksija igra pomembno vlogo pri iskanju hrane, oblikovanju biofilma in tudi pri patogenezi. Takšno gibanje, s prepoznavanjem različnih kemijskih zvrsti, nadzorujejo kemoreceptorji. To so transmembranski proteini, ki vežejo snovi iz okolice in tako sprožijo nadaljnjo signalizacijo znotraj celice, ta pa vodi do spremembe v rotaciji bička. Vezava ugodne signalne molekule vodi do konformacijskih sprememb v kemoreceptorju, ki preprečijo avtofosforilacijo kinaze CheA, ki omogoča fosforilacijo proteina CheY. Fosforiliran CheY se namreč veže na motor bička in tako spremeni njegovo rotacijo iz nasprotne smeri urinega kazalca v smer urinega kazalca. Ko biček rotira v smeri urinega kazalca to spodbudi naključno gibanje v prostoru, ki na novo orientira bakterijsko celico. Če biček rotira v nasprotni smeri urinega kazalca pa se celica giba naravnost proti ugodnemu kemijskemu gradientu. Prilagoditev na signal nadzorujejo regulatorni proteini (CheR, CheB), za zaključek signala pa je pomemben protein CheZ, ki hidrolizira CheY-P. Kemoreceptorji se nahajajo na polih bakterijske celice in se združujejo v skupke, kar predstavlja dodatno možnost prilagoditve na kemijski signal.

==David Valte - Jedrni hormonski receptorji in izražanje genov==

Jedrni hormonski receptorji (NHR) so poleg g-proteinov, receptorjev z encimsko aktivnostjo in ionskih kanalčkov le še eden od načinov biosignalizacije, ki pa se po načinu delovanja od drugih precej razlikuje. Jedrni hormonski receptorji neposredno vplivajo na transkripcijo in tako posledično tudi na izražanje genov. Z vezavo ligandov, kot so na primer vitamin d, retinoidni hormoni, tiroidni hormoni in steroidi, na receptor, pride na hormonskih receptorjih do konformacijskih sprememb. Spremembe v konformaciji receptorja pa omogočajo interakcije receptorja s specifičnimi sekvencami DNA. Te sekvence imenujemo hormonski odzivni elementi HRE/HREs, HRE se ponavadi nahajajo znotraj promotorja tarčnega gena, na teh mestih NHR delujejo kot aktivatorji transkripcije DNA. Transkripcija DNA povzroči nastanek mRNA z zapisom za nastanek proteinov, katere celica potrebuje, preko teh pa se lahko odzove na zunanje motnje. Prepoznavo zaporedij HRE in vezavo na DNA omogoča specifična sestava jedrnih receptorjev. Te so sestavljeni iz večih domen, vsaka od teh ima specifično funkcijo brez katere delovanje NR ni mogoče. Posebne domene omogočajo prepoznavo HRE, vezavo na DNA in dimerizacijo z drugimi NR. Na hormonske odzivne elemente se lahko NHR vežejo v obliki monomerov, lahko pa se NHR-ji vežejo drug z drugim, tako nastajajo dimeri. Dimeri omogočajo drugačne afinitete za vezavo z DNA.