Wiki FKKT - User contributions [en]

Prenos plazmidov s konjugacijo med gramnegativnimi bakterijami

2024-05-05T20:45:36Z

Doment:

=Uvod=
Bakterijska konjugacija je mehanizem horizontalnega prenosa genov, ki vključuje konjugacijski pilus in T4SS. T4SS (bakterijski izločevalni sistem tipa IV) je izločevalni proteinski kompleks, najden v gram-negativnih ter gram-pozitivnih bakterijah in arhejah, ki omogoča prenos proteinov in DNA skozi celično membrano.
‎

=Procesi v donorski celici=
Sposobnost donorske celice, da izvede konjugacijo, omogoča izražanje genov za prenos, ki so zapisani v tra regiji plazmida. Te geni kodirajo vse proteinske faktorje, ki so vključeni pri izdelavi konjugacijskega pilusa in T4SS potrebnega za formacijo paritvenega para. Prav tako so pomembne komponente relaksosoma, ki so potrebne za pripravo plazmida pred prenosom.
Različna morfologija pilusov celicam omogoča konjugacijo v tekočini ali na trdni površini. F plazmid nosi zapis za tanek prožen pilus, ki ima cevasto strukturo s premerom okoli 8 μm in dolžino do 20 μm. Sestavljen je iz edinstvene proteinske podenote – F pilin oz. TraA.
‎ 
Donorske celice proizvajajo prožne piluse, ki so nenehno podvrženi ciklom iztegovanja in umikanja, s čimer preiskujejo okolico, ne glede na prisotnost prejemnih celic. Po vzpostavitvi stika s prejemno celico, pa retrakcija pilusa potegne celici skupaj in posledično se vzpostavi paritveni par.
‎ 
Iniciacija konjugacije zahteva sestavo in aktivnost proteinskega kompleksa relaksosoma, ki omogoča preoblikovanje plazmida pred njegovim prenosom. Preoblikovanje zajema rezanje na specifičnem mestu in verigi - na delu nic, ki se nahaja na začetku tra genov (oriT) in rezanje enoverižne DNA (T-veriga), ki bo kasneje prenešena. Ti dve reakciji izvede TraI relaksaza, protein, ki je sestavljen iz transesterazne domene, ta katalizira reakcijo reza in DNA helikazne domene, ki odvije plazmidno DNA. Aktivnost TraI nadzorujejo pomožni proteini, kot so IHF (integration host factor) – faktor integracije gostitelja in plazmidna proteina TraY in TraM, ki imata izrazito vlogo v formaciji relaksosoma in aktivnost pri oriT.
‎ 
Nastali nukleoproteinski kompleks, sestavljen iz T-verige in kovalentno vezanega TraI, se mora prenesti do konjugativnih por za prenos. To omogočajo sklopitveni proteini tipa IV (T4CP), ki so zasidrani v celični membrani in neposredno komunicirajo z relaksosomom. Tvorijo heksamerne strukture na T-verigi, ki se aktivno prenesejo skozi konjugacijske pore med prenosom.
‎ 
Ekspresijo tra genov regulirajo številni faktorji kot so plazmidni proteini, proteini gostiteljske celice, stopnja celičnega cikla in okoljske razmere. Večina tra genov je zbranih v enem operonu, ki jih kontrolira PY promotor. Ekspresija transfernih genov sledi specifični regulatorni kaskadi, ki se začne s proizvodnjo traJ proteina, ki aktivira PY promotor in transkripcijo tra operona. Najprej se prepiše traJ, ki kodira regulatorni protein TraJ, ta aktivira PM promotor, kar povzroči produkcijo traM proteina relaksosoma. Ta regulatorna kaskada tako povzroči izražanje vseh genov, ki so vključeni v izdelavo konjugacijskega pilusa, T4SS in relaksosoma.
‎ 
Nekatere gram-negativne bakterije ekspresijo tra genov regulira z mehanizmom zaznavnaje kvoruma (QS – quorum-sensing). Bakterije zaznavajo in sproščajo signalne molekule, imenovane avtoinduktorji, katerih koncentracija se poveča glede na gostoto celic. Gram-negativne bakterije kot avtoinduktorje uporabljajo acilirane homoserin laktone (AHL). Zaznavanje minimalne koncentracije AHL vodi do spremembe izražanja genov.
‎ 
Ekspresija tra genov je nadzorovana s kompleksnimi regulatornimi procesi, ki vključujejo aktivnost plazmidnih in kromosomskih faktorjev donorske celice. Ta regulacija omogoča nadzor za učinkovitost konjugacije v povezavi z življenjskim ciklom plazmida in fiziologijo gostitelja kot odziv na okoljske razmere in populacijske interakcije.

=Procesi v prejemni celici=
==Cirkulacija plazmida==
ssDNA v prejemno celico vstopi tako, da jo hkrati potiska sklopitveni protein tipa 4 donorske celice (del T4SS) in vleče relaksaza prejemnika. Ko sta oba konca lineariziranega plzamida prisotna v prejemniku ju skupaj združi relaksaza in nastane cirkularna oblika.

==Zaščita tuje DNA pred obrambo prejemnika==
Po vstopu plazmida v celico (v enoverižni DNA) se lahko aktivirajo bakterijski zaščitni mehanizmi proti tuji DNA in plazmidi so tako morali razviti mehanizme, ki preprečijo njhovo uničenje. Proti restrikcijskemu modifikacijskemu sistemu, ki napade nemetilirane ssDNA molekule, delujeta proteina ArdA in ArdB ki inhibirata restrikcijske endonukelaze tako da ponazarjata DNA zaporedje in se vežeta na aktivno mesto encima, protein ArdC pa aktivno mesto blokira. Naseldnji pomemben obrambni mehanizem je CRISPR-Cas, ki zagotavlja zaščito pred bakteriofagi, pred kratkim pa je bilo ugotovljeno, da ščiti tudi pred plazmidi. Tukaj nastopijo anti-CRISPR proteini, ki inhibirajo encim Cas9, kodirajo pa jih plamidni loki. Še eden način obrambe pred CRISPR-Cas je, da konjugativni plazmidi kodirajo sistem Bet/Exo, ki popravlja “škodo” (ločitve dvojne vijačnice), ki jo povzroča obrambni mehanizem.

==Naloge vodilnih genov==
Vodilni geni ležijo na delu, plazmida, ki je najprej transportiran v prejemno celico. Prva je bila omenjena regija Frpo, ki vsebuje zapise za rna polimeraze, njena transkripcija pa se začenja takoj po vstopu plazmida v celico. Drugi izmed proteinov je Psib (Plasmid SOS inibition) ki, kot že ime pove, inhibira proces SOS. Ta proces se sproži ob večji koncentraciji ssDNA , ki je načeloma povezana s celičnimi poškodbami in lahko privede do degradacije ssDNA, ali pa celo do celične smrti. Zadnji izmed omenjenih proteinov je SSBC oz. v primeru F plazmida gre za njegov homolog SSBp , ki se nespecifično veže na ssDNA in preprečuje njeno degradacijo, hkrati pa pospešuje delovanje polimeraz II in III, ki so odgovorne za pretvorbo ssDNA v dsDNA.

==Vzdrževanje plazmida==
Za vzdrževanje plazmida sta pomembna procesa replikacija in segregacija. Bakterije, ki so med seboj sorodstveno oddaljene, ne omogočajo replikacije plazmida v prejemni celici. Nekateri plazmidi, npr. RK2, modulirajo procese replikacije, glede na specifike prejemnika. Drugi pomemben vidik vzdrževanja je torej segregacija oz. enakomerna porazdelitev plazmida po hčerinskih celicah po delitvi. To kontrolirajo mehanizmi, ki jih zapisujejo plazmidi z majhnimi kopirnimi števili. Še en vidik vzdrževanja je kromosomska integracija, kjer npr. F plazmid potrebuje vstavitveno zaporedje (IS oz. insertion sequence) in homologno rekombinacijo z RecA, da se integrira v bakterijski genom .

==Fenotipska konverzija konjugiranih celic==
Zadnji pomemben vidik procesa konjugacije v prejemni celici je fenotipska konverzija. Iz energetskega vidika je pomembno, da celice ki že vsebujejo plazmid, niso prejemnice istega plazmida. V ta namen, sta na F plazmidu gena za TraT in TraS, ki celici nudita imunost na konjugacijo z istim plazmidom. TraT je zunanjmembranski protein, ki preprečuje, da bi se celici združili v paritveni sklop, tako da ta sklop destabilizira, če pa se paritveni sklopi le vzpostavijo, pa TraS onemogoča prehod ssDNA iz donorske v prejemno celico. Plazmidi seveda vsebujejo tudi gene, pomembne za preživetje, npr. Gene za virulenco, tvorbo biofilma, odpornost na antibiotike ali pa spremembe v metabolnih procesih.

=Konjugacija v naravnih habitatih: primer bakterijskih biofilmov=
Znano je, da prenos genov s konjugacijo prispeva h genetski dinamiki bakterijskih populacij, ki živijo v različnih okoljih, vključno s tlemi, na površinah rastlin, v vodi in odpadnih vodah, pa tudi v bakterijskih skupnostih, povezanih z rastlinskimi ali živalskimi gostitelji. Bakterije na splošno veljajo za planktonske enocelične organizme, vendar v naravnem in kliničnem okolju pogosto živijo v kompleksnih strukturah, imenovanih biofilmi. Biofilmi nudijo bakterijam zavetje pred zunanjimi nevarnostmi, vendar je bilo tudi predlagano, da nudijo nišo, ki olajša širjenje determinant odpornosti na zdravila s konjugacijo
===Biofilm kot niša, ki spodbuja konjugacijo bakterij===
Organizacija sestavin matriksa biofilma vpliva na hitrost prenosa plazmidov. Polisaharidi lahko na primer omejijo difuzijo DNA in ovirajo stik med celicami dajalkami in prejemnicami. Zunajcelična DNA (eDNA) deluje kot skupni adhezin, ki približa celice za konjugacijo. Tako različne sestave matriksa ustvarjajo različna mikrookolja, ki vplivajo na pretok genov s konjugativno izmenjavo.
===Vpliv strukture biofilma na konjugacijo===
Učinkovitost konjugacije je odvisna od arhitekturne strukture biofilmov, na katero vplivajo dejavniki, kot so bakterijske vrste in okoljski pogoji. Glede na mikroskopske študije poteka konjugacija predvsem na robovih biofilmov, kar kaže na majhen prodor v globlje plasti. Kljub temu znanju ostaja še vedno negotovo, kako kemični gradienti znotraj teh skupnosti vplivajo na presnovo bakterij in genetsko raznolikost, zlasti ko gre za njihovo povezavo s konjugacijo.
===Vpliv konjugativnih plazmidov na tvorbo biofilma===
Konjugirani plazmidi, ki pogosto nosijo gene za spodbujanje pritrjevanja na površino, prav tako povečujejo nastanek biofilma. Ko je plazmid v gostiteljski celici, lahko spremeni izražanje genov in s tem vpliva na zgradbo in zorenje biofilmov. Vendar je treba mehanizme, ki so vključeni v te spremembe, še naprej raziskovati, zlasti med različnimi vrstami gostiteljev.
===Vpliv zdravljenja z antibiotiki na konjugacijo v biofilmih===
Na dinamiko biofilma in prenos genov vpliva zdravljenje z antibiotiki. Antibiotiki pod najnižjimi inhibitornimi koncentracijami (sub-MIC) lahko spodbujajo nastanek ali povečajo pogostost konjugativnih dogodkov, hkrati pa z bolj odpornimi skupnostmi povečujejo odpornost proti protimikrobnim sredstvom. Poskusi slikanja v realnem času razkrivajo, da antibiotiki morda služijo predvsem kot gonilna sila za selekcijo po prenosu in ne kot neposredni spodbujevalci konjugacije. Zdravljenje z antibiotiki spremeni strukturo biofilma in tako vpliva na učinkovitost prenosa plazmidov. Nekatera zdravila motijo komunikacijo med celicami ali zavirajo proizvodnjo matriksa, kar vpliva na pogostost konjugacije in prostorsko razporeditev v biofilmu. Po drugi strani pa nekateri antibiotiki povzročijo lizo bakterijskih celic v biofilmih, pri čemer se sproščajo prosti fragmenti DNA v okolje, kjer jih lahko prevzamejo druge bakterije z naravno sposobnostjo ali procesi transformacije. Zato imajo protimikrobna sredstva dvojno vlogo, in sicer kot modulatorji genske izmenjave znotraj biofilmov in kot gonilna sila za horizontalni prenos genov med različnimi vrstami ali rodovi.Razumevanje teh odnosov je pomembno za razvoj strategij za obvladovanje okužb, povezanih z biofilmskimi skupnostmi, ki so odporne proti več zdravilom. Mikrofluidika se lahko uporablja za preučevanje, kako se geni širijo v biofilmih. Nedavna študija je pokazala, da je način, kako se geni premikajo skozi biofilm, nadzorovan z njegovo strukturo. Dejstvo, da lahko zaradi njih bakterije, odporne na antibiotike, bolj verjetno delijo gene za odpornost, pomeni, da moramo razumeti, kako zdravila vplivajo na prenos genov znotraj teh kolonij.

=Viri=
1. C. Virolle, K. Goldlust, S. Djermoun, S. Bigot in C. Lesterlin, '' Plasmid Transfer by Conjugation in Gram-Negative Bacteria: From the Cellular to the Community Level'', Genes (Basel), 11(11), 1239, oct. 2020, doi: 10.3390/genes11111239
‎ 
2. M.B. Miller, B. Bassler, ''Quorum Sensing in Bacteria''. Annu Rev Microbiol: 55, 165-199, 2001, doi: 10.1146/annurev.micro.55.1.165
‎ 
3. Mahendra C, Christie KA, Osuna BA, Pinilla-Redondo R, Kleinstiver BP, Bondy-Denomy J. Broad-spectrum anti-CRISPR proteins facilitate horizontal gene transfer [published correction appears in Nat Microbiol. 2020 Jun;5(6):872]. Nat Microbiol. 2020;5(4):620-629. doi:10.1038/s41564-020-0692-2
‎ 
4. Murga R, Miller JM, Donlan RM. Biofilm formation by gram-negative bacteria on central venous catheter connectors: effect of conditioning films in a laboratory model. J Clin Microbiol. 2001;39(6):2294-2297. doi:10.1128/JCM.39.6.2294-2297.2001

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Prenos plazmidov s konjugacijo med gramnegativnimi bakterijami

2024-05-05T18:31:15Z

Doment:

Prenos plazmidov s konjugacijo med gramnegativnimi bakterijami

2024-05-05T18:28:09Z

Doment:

Prenos plazmidov s konjugacijo med gramnegativnimi bakterijami

2024-05-05T16:19:36Z

Doment: /* Fenotipska konverzija konjugiranih celic */

=Uvod=
=Procesi v donorski celici=
Bakterijska konjugacija je mehanizem horizontalnega prenosa genov, ki vključuje konjugacijski pilus in T4SS. T4SS (bakterijski izločevalni sistem tipa IV) je izločevalni proteinski kompleks, najden v gram-negativnih ter gram-pozitivnih bakterijah in arhejah, ki omogoča prenos proteinov in DNA skozi celično membrano.
‎ 
Sposobnost donorske celice, da izvede konjugacijo, omogoča izražanje genov za prenos, ki so zapisani v tra regiji plazmida. Te geni kodirajo vse proteinske faktorje, ki so vključeni pri izdelavi konjugacijskega pilusa in T4SS potrebnega za formacijo paritvenega para. Prav tako so pomembne komponente relaksosoma, ki so potrebne za pripravo plazmida pred prenosom.
Različna morfologija pilusov celicam omogoča konjugacijo v tekočini ali na trdni površini. F plazmid nosi zapis za tanek prožen pilus, ki ima cevasto strukturo s premerom okoli 8 μm in dolžino do 20 μm. Sestavljen je iz edinstvene proteinske podenote – F pilin oz. TraA.
‎ 
Donorske celice proizvajajo prožne piluse, ki so nenehno podvrženi ciklom iztegovanja in umikanja, s čimer preiskujejo okolico, ne glede na prisotnost prejemnih celic. Po vzpostavitvi stika s prejemno celico, pa retrakcija pilusa potegne celici skupaj in posledično se vzpostavi paritveni par.
‎ 
Iniciacija konjugacije zahteva sestavo in aktivnost proteinskega kompleksa relaksosoma, ki omogoča preoblikovanje plazmida pred njegovim prenosom. Preoblikovanje zajema rezanje na specifičnem mestu in verigi - na delu nic, ki se nahaja na začetku tra genov (oriT) in rezanje enoverižne DNA (T-veriga), ki bo kasneje prenešena. Te dve reakciji izvede TraI relaksaza, protein, ki je sestavljen iz transesterazne domene, ta katalizira reakcijo reza in DNA helikazne domene, ki odvije plazmidno DNA. Aktivnost TraI nadzorujejo pomožni proteini, kot so IHF (integration host factor) – faktor integracije gostitelja in plazmidna proteina TraY in TraM, ki imata izrazito vlogo v formaciji relaksosoma in aktivnost pri oriT.
‎ 
Nastali nukleoproteinski kompleks, sestavljen iz T-verige in kovalentno vezanega TraI, se mora prenesti do konjugativnih por za prenos. To omogočajo sklopitveni proteini tipa IV (T4CP), ki so zasidrani v celični membrani in neposredno komunicirajo z relaksosomom. Tvorijo heksamerne strukture na T-verigi, ki se aktivno prenesejo skozi konjugacijske pore med prenosom.
‎ 
Ekspresijo tra genov regulirajo številni faktorji kot so plazmidni proteini, proteini gostiteljske celice, stopnja celičnega cikla in okoljske razmere. Večina tra genov je zbranih v enem operonu, ki jih kontrolira PY promotor. Ekspresija transfernih genov sledi specifični regulatorni kaskadi, ki se začne s proizvodnjo traJ proteina, ki aktivira PY promotor in transkripcijo tra operona. Najprej se prepiše traJ, ki kodira regulatorni protein TraJ, ta aktivira PM promotor, kar povzroči produkcijo traM proteina relaksosoma. Ta regulatorna kaskada tako povzroči izražanje vseh genov, ki so vključeni v izdelavo konjugacijskega pilusa, T4SS in relaksosoma.
‎ 
Nekatere gram-negativne bakterije ekspresijo tra genov regulira z mehanizmom zaznavnaje kvoruma (QS – quorum-sensing). Bakterije zaznavajo in sproščajo signalne molekule, imenovane avtoinduktorji, katerih koncentracija se poveča glede na gostoto celic. Gram-negativne bakterije kot avtoinduktorje uporabljajo acilirane homoserin laktone (AHL). Zaznavanje minimalne koncentracije AHL vodi do spremembe izražanja genov.
‎ 
Ekspresija tra genov je nadzorovana s kompleksnimi regulatornimi procesi, ki vključujejo aktivnost plazmidnih in kromosomskih faktorjev donorske celice. Ta regulacija omogoča nadzor za učinkovitost konjugacije v povezavi z življenjskim ciklom plazmida in fiziologijo gostitelja kot odziv na okoljske razmere in populacijske interakcije.

=Procesi v prejemni celici=
==Cirkulacija plazmida==
ssDNA v prejemno celico vstopi tako, da jo hkrati potiska sklopitveni protein tipa 4 donorske celice (del T4SS) in vleče relaksaza prejemnika. Ko sta oba konca lineariziranega plzamida prisotna v prejemniku ju skupaj združi relaksaza in nastane cirkularna oblika.

==Zaščita tuje DNA pred obrambo prejemnika==
Po vstopu plazmida v celico (v enoverižni DNA) se lahko aktivirajo bakterijski zaščitni mehanizmi proti tuji DNA in plazmidi so tako morali razviti mehanizme, ki preprečijo njhovo uničenje. Proti restrikcijskemu modifikacijskemu sistemu, ki napade nemetilirane ssDNA molekule, delujeta proteina ArdA in ArdB ki inhibirata restrikcijske endonukelaze tako da ponazarjata DNA zaporedje in se vežeta na aktivno mesto encima, protein ArdC pa aktivno mesto blokira. Naseldnji pomemben obrambni mehanizem je CRISPR-Cas, ki zagotavlja zaščito pred bakteriofagi, pred kratkim pa je bilo ugotovljeno, da ščiti tudi pred plazmidi. Tukaj nastopijo anti-CRISPR proteini, ki inhibirajo encim Cas9, kodirajo pa jih plamidni loki. Še eden način obrambe pred CRISPR-Cas je, da konjugativni plazmidi kodirajo sistem Bet/Exo, ki popravlja “škodo” (ločitve dvojne vijačnice), ki jo povzroča obrambni mehanizem.

==Naloge vodilnih genov==
Vodilni geni ležijo na delu, plazmida, ki je najprej transportiran v prejemno celico. Prva je bila omenjena regija Frpo, ki vsebuje zapise za rna polimeraze, njena transkripcija pa se začenja takoj po vstopu plazmida v celico. Drugi izmed proteinov je Psib (Plasmid SOS inibition) ki, kot že ime pove, inhibira proces SOS. Ta proces se sproži ob večji koncentraciji ssDNA , ki je načeloma povezana s celičnimi poškodbami in lahko privede do degradacije ssDNA, ali pa celo do celične smrti. Zadnji izmed omenjenih proteinov je SSBC oz. v primeru F plazmida gre za njegov homolog SSBp , ki se nespecifično veže na ssDNA in preprečuje njeno degradacijo, hkrati pa pospešuje delovanje polimeraz II in III, ki so odgovorne za pretvorbo ssDNA v dsDNA.

==Vzdrževanje plazmida==
Za vzdrževanje plazmida sta pomembna procesa replikacija in segregacija. Bakterije, ki so med seboj sorodstveno oddaljene, ne omogočajo replikacije plazmida v prejemni celici. Nekateri plazmidi, npr. RK2, modulirajo procese replikacije, glede na specifike prejemnika. Drugi pomemben vidik vzdrževanja je torej segregacija oz. enakomerna porazdelitev plazmida po hčerinskih celicah po delitvi. To kontrolirajo mehanizmi, ki jih zapisujejo plazmidi z majhnimi kopirnimi števili. Še en vidik vzdrževanja je kromosomska integracija, kjer npr. F plazmid potrebuje vstavitveno zaporedje (IS oz. insertion sequence) in homologno rekombinacijo z RecA, da se integrira v bakterijski genom .

==Fenotipska konverzija konjugiranih celic==
Zadnji pomemben vidik procesa konjugacije v prejemni celici je fenotipska konverzija. Iz energetskega vidika je pomembno, da celice ki že vsebujejo plazmid, niso prejemnice istega plazmida. V ta namen, sta na F plazmidu gena za TraT in TraS, ki celici nudita imunost na konjugacijo z istim plazmidom. TraT je zunanjmembranski protein, ki preprečuje, da bi se celici združili v paritveni sklop, tako da ta sklop destabilizira, če pa se paritveni sklopi le vzpostavijo, pa TraS onemogoča prehod ssDNA iz donorske v prejemno celico. Plazmidi seveda vsebujejo tudi gene, pomembne za preživetje, npr. Gene za virulenco, tvorbo biofilma, odpornost na antibiotike ali pa spremembe v metabolnih procesih.

=Konjugacija v naravnih habitatih: primer bakterijskih biofilmov=
Znano je, da prenos genov s konjugacijo prispeva h genetski dinamiki bakterijskih populacij, ki živijo v različnih okoljih, vključno s tlemi, na površinah rastlin, v vodi in odpadnih vodah, pa tudi v bakterijskih skupnostih, povezanih z rastlinskimi ali živalskimi gostitelji. Bakterije na splošno veljajo za planktonske enocelične organizme, vendar v naravnem in kliničnem okolju pogosto živijo v kompleksnih strukturah, imenovanih biofilmi. Biofilmi nudijo bakterijam zavetje pred zunanjimi nevarnostmi, vendar je bilo tudi predlagano, da nudijo nišo, ki olajša širjenje determinant odpornosti na zdravila s konjugacijo
===Biofilm kot niša, ki spodbuja konjugacijo bakterij===
Organizacija sestavin matriksa biofilma vpliva na hitrost prenosa plazmidov. Polisaharidi lahko na primer omejijo difuzijo DNA in ovirajo stik med celicami dajalkami in prejemnicami. Zunajcelična DNA (eDNA) deluje kot skupni adhezin, ki približa celice za konjugacijo. Tako različne sestave matriksa ustvarjajo različna mikrookolja, ki vplivajo na pretok genov s konjugativno izmenjavo.
===Vpliv strukture biofilma na konjugacijo===
Učinkovitost konjugacije je odvisna od arhitekturne strukture biofilmov, na katero vplivajo dejavniki, kot so bakterijske vrste in okoljski pogoji. Glede na mikroskopske študije poteka konjugacija predvsem na robovih biofilmov, kar kaže na majhen prodor v globlje plasti. Kljub temu znanju ostaja še vedno negotovo, kako kemični gradienti znotraj teh skupnosti vplivajo na presnovo bakterij in genetsko raznolikost, zlasti ko gre za njihovo povezavo s konjugacijo.
===Vpliv konjugativnih plazmidov na tvorbo biofilma===
Konjugirani plazmidi, ki pogosto nosijo gene za spodbujanje pritrjevanja na površino, prav tako povečujejo nastanek biofilma. Ko je plazmid v gostiteljski celici, lahko spremeni izražanje genov in s tem vpliva na zgradbo in zorenje biofilmov. Vendar je treba mehanizme, ki so vključeni v te spremembe, še naprej raziskovati, zlasti med različnimi vrstami gostiteljev.
===Vpliv zdravljenja z antibiotiki na konjugacijo v biofilmih===
Na dinamiko biofilma in prenos genov vpliva zdravljenje z antibiotiki. Antibiotiki pod najnižjimi inhibitornimi koncentracijami (sub-MIC) lahko spodbujajo nastanek ali povečajo pogostost konjugativnih dogodkov, hkrati pa z bolj odpornimi skupnostmi povečujejo odpornost proti protimikrobnim sredstvom. Poskusi slikanja v realnem času razkrivajo, da antibiotiki morda služijo predvsem kot gonilna sila za selekcijo po prenosu in ne kot neposredni spodbujevalci konjugacije. Zdravljenje z antibiotiki spremeni strukturo biofilma in tako vpliva na učinkovitost prenosa plazmidov. Nekatera zdravila motijo komunikacijo med celicami ali zavirajo proizvodnjo matriksa, kar vpliva na pogostost konjugacije in prostorsko razporeditev v biofilmu. Po drugi strani pa nekateri antibiotiki povzročijo lizo bakterijskih celic v biofilmih, pri čemer se sproščajo prosti fragmenti DNA v okolje, kjer jih lahko prevzamejo druge bakterije z naravno sposobnostjo ali procesi transformacije. Zato imajo protimikrobna sredstva dvojno vlogo, in sicer kot modulatorji genske izmenjave znotraj biofilmov in kot gonilna sila za horizontalni prenos genov med različnimi vrstami ali rodovi.Razumevanje teh odnosov je pomembno za razvoj strategij za obvladovanje okužb, povezanih z biofilmskimi skupnostmi, ki so odporne proti več zdravilom. Mikrofluidika se lahko uporablja za preučevanje, kako se geni širijo v biofilmih. Nedavna študija je pokazala, da je način, kako se geni premikajo skozi biofilm, nadzorovan z njegovo strukturo. Dejstvo, da lahko zaradi njih bakterije, odporne na antibiotike, bolj verjetno delijo gene za odpornost, pomeni, da moramo razumeti, kako zdravila vplivajo na prenos genov znotraj teh kolonij.

=Viri=
1. C. Virolle, K. Goldlust, S. Djermoun, S. Bigot in C. Lesterlin, '' Plasmid Transfer by Conjugation in Gram-Negative Bacteria: From the Cellular to the Community Level'', Genes (Basel), 11(11), 1239, oct. 2020, doi: 10.3390/genes11111239
‎ 
2. M.B. Miller, B. Bassler, ''Quorum Sensing in Bacteria''. Annu Rev Microbiol: 55, 165-199, 2001, doi: 10.1146/annurev.micro.55.1.165

Prenos plazmidov s konjugacijo med gramnegativnimi bakterijami

2024-05-05T16:19:13Z

Doment: /* Vzdrževanje plazmida */

=Uvod=
=Procesi v donorski celici=
Bakterijska konjugacija je mehanizem horizontalnega prenosa genov, ki vključuje konjugacijski pilus in T4SS. T4SS (bakterijski izločevalni sistem tipa IV) je izločevalni proteinski kompleks, najden v gram-negativnih ter gram-pozitivnih bakterijah in arhejah, ki omogoča prenos proteinov in DNA skozi celično membrano.
‎ 
Sposobnost donorske celice, da izvede konjugacijo, omogoča izražanje genov za prenos, ki so zapisani v tra regiji plazmida. Te geni kodirajo vse proteinske faktorje, ki so vključeni pri izdelavi konjugacijskega pilusa in T4SS potrebnega za formacijo paritvenega para. Prav tako so pomembne komponente relaksosoma, ki so potrebne za pripravo plazmida pred prenosom.
Različna morfologija pilusov celicam omogoča konjugacijo v tekočini ali na trdni površini. F plazmid nosi zapis za tanek prožen pilus, ki ima cevasto strukturo s premerom okoli 8 μm in dolžino do 20 μm. Sestavljen je iz edinstvene proteinske podenote – F pilin oz. TraA.
‎ 
Donorske celice proizvajajo prožne piluse, ki so nenehno podvrženi ciklom iztegovanja in umikanja, s čimer preiskujejo okolico, ne glede na prisotnost prejemnih celic. Po vzpostavitvi stika s prejemno celico, pa retrakcija pilusa potegne celici skupaj in posledično se vzpostavi paritveni par.
‎ 
Iniciacija konjugacije zahteva sestavo in aktivnost proteinskega kompleksa relaksosoma, ki omogoča preoblikovanje plazmida pred njegovim prenosom. Preoblikovanje zajema rezanje na specifičnem mestu in verigi - na delu nic, ki se nahaja na začetku tra genov (oriT) in rezanje enoverižne DNA (T-veriga), ki bo kasneje prenešena. Te dve reakciji izvede TraI relaksaza, protein, ki je sestavljen iz transesterazne domene, ta katalizira reakcijo reza in DNA helikazne domene, ki odvije plazmidno DNA. Aktivnost TraI nadzorujejo pomožni proteini, kot so IHF (integration host factor) – faktor integracije gostitelja in plazmidna proteina TraY in TraM, ki imata izrazito vlogo v formaciji relaksosoma in aktivnost pri oriT.
‎ 
Nastali nukleoproteinski kompleks, sestavljen iz T-verige in kovalentno vezanega TraI, se mora prenesti do konjugativnih por za prenos. To omogočajo sklopitveni proteini tipa IV (T4CP), ki so zasidrani v celični membrani in neposredno komunicirajo z relaksosomom. Tvorijo heksamerne strukture na T-verigi, ki se aktivno prenesejo skozi konjugacijske pore med prenosom.
‎ 
Ekspresijo tra genov regulirajo številni faktorji kot so plazmidni proteini, proteini gostiteljske celice, stopnja celičnega cikla in okoljske razmere. Večina tra genov je zbranih v enem operonu, ki jih kontrolira PY promotor. Ekspresija transfernih genov sledi specifični regulatorni kaskadi, ki se začne s proizvodnjo traJ proteina, ki aktivira PY promotor in transkripcijo tra operona. Najprej se prepiše traJ, ki kodira regulatorni protein TraJ, ta aktivira PM promotor, kar povzroči produkcijo traM proteina relaksosoma. Ta regulatorna kaskada tako povzroči izražanje vseh genov, ki so vključeni v izdelavo konjugacijskega pilusa, T4SS in relaksosoma.
‎ 
Nekatere gram-negativne bakterije ekspresijo tra genov regulira z mehanizmom zaznavnaje kvoruma (QS – quorum-sensing). Bakterije zaznavajo in sproščajo signalne molekule, imenovane avtoinduktorji, katerih koncentracija se poveča glede na gostoto celic. Gram-negativne bakterije kot avtoinduktorje uporabljajo acilirane homoserin laktone (AHL). Zaznavanje minimalne koncentracije AHL vodi do spremembe izražanja genov.
‎ 
Ekspresija tra genov je nadzorovana s kompleksnimi regulatornimi procesi, ki vključujejo aktivnost plazmidnih in kromosomskih faktorjev donorske celice. Ta regulacija omogoča nadzor za učinkovitost konjugacije v povezavi z življenjskim ciklom plazmida in fiziologijo gostitelja kot odziv na okoljske razmere in populacijske interakcije.

=Procesi v prejemni celici=
==Cirkulacija plazmida==
ssDNA v prejemno celico vstopi tako, da jo hkrati potiska sklopitveni protein tipa 4 donorske celice (del T4SS) in vleče relaksaza prejemnika. Ko sta oba konca lineariziranega plzamida prisotna v prejemniku ju skupaj združi relaksaza in nastane cirkularna oblika.

==Zaščita tuje DNA pred obrambo prejemnika==
Po vstopu plazmida v celico (v enoverižni DNA) se lahko aktivirajo bakterijski zaščitni mehanizmi proti tuji DNA in plazmidi so tako morali razviti mehanizme, ki preprečijo njhovo uničenje. Proti restrikcijskemu modifikacijskemu sistemu, ki napade nemetilirane ssDNA molekule, delujeta proteina ArdA in ArdB ki inhibirata restrikcijske endonukelaze tako da ponazarjata DNA zaporedje in se vežeta na aktivno mesto encima, protein ArdC pa aktivno mesto blokira. Naseldnji pomemben obrambni mehanizem je CRISPR-Cas, ki zagotavlja zaščito pred bakteriofagi, pred kratkim pa je bilo ugotovljeno, da ščiti tudi pred plazmidi. Tukaj nastopijo anti-CRISPR proteini, ki inhibirajo encim Cas9, kodirajo pa jih plamidni loki. Še eden način obrambe pred CRISPR-Cas je, da konjugativni plazmidi kodirajo sistem Bet/Exo, ki popravlja “škodo” (ločitve dvojne vijačnice), ki jo povzroča obrambni mehanizem.

==Naloge vodilnih genov==
Vodilni geni ležijo na delu, plazmida, ki je najprej transportiran v prejemno celico. Prva je bila omenjena regija Frpo, ki vsebuje zapise za rna polimeraze, njena transkripcija pa se začenja takoj po vstopu plazmida v celico. Drugi izmed proteinov je Psib (Plasmid SOS inibition) ki, kot že ime pove, inhibira proces SOS. Ta proces se sproži ob večji koncentraciji ssDNA , ki je načeloma povezana s celičnimi poškodbami in lahko privede do degradacije ssDNA, ali pa celo do celične smrti. Zadnji izmed omenjenih proteinov je SSBC oz. v primeru F plazmida gre za njegov homolog SSBp , ki se nespecifično veže na ssDNA in preprečuje njeno degradacijo, hkrati pa pospešuje delovanje polimeraz II in III, ki so odgovorne za pretvorbo ssDNA v dsDNA.

==Vzdrževanje plazmida==
Za vzdrževanje plazmida sta pomembna procesa replikacija in segregacija. Bakterije, ki so med seboj sorodstveno oddaljene, ne omogočajo replikacije plazmida v prejemni celici. Nekateri plazmidi, npr. RK2, modulirajo procese replikacije, glede na specifike prejemnika. Drugi pomemben vidik vzdrževanja je torej segregacija oz. enakomerna porazdelitev plazmida po hčerinskih celicah po delitvi. To kontrolirajo mehanizmi, ki jih zapisujejo plazmidi z majhnimi kopirnimi števili. Še en vidik vzdrževanja je kromosomska integracija, kjer npr. F plazmid potrebuje vstavitveno zaporedje (IS oz. insertion sequence) in homologno rekombinacijo z RecA, da se integrira v bakterijski genom .

==Fenotipska konverzija konjugiranih celic==
=Konjugacija v naravnih habitatih: primer bakterijskih biofilmov=
Znano je, da prenos genov s konjugacijo prispeva h genetski dinamiki bakterijskih populacij, ki živijo v različnih okoljih, vključno s tlemi, na površinah rastlin, v vodi in odpadnih vodah, pa tudi v bakterijskih skupnostih, povezanih z rastlinskimi ali živalskimi gostitelji. Bakterije na splošno veljajo za planktonske enocelične organizme, vendar v naravnem in kliničnem okolju pogosto živijo v kompleksnih strukturah, imenovanih biofilmi. Biofilmi nudijo bakterijam zavetje pred zunanjimi nevarnostmi, vendar je bilo tudi predlagano, da nudijo nišo, ki olajša širjenje determinant odpornosti na zdravila s konjugacijo
===Biofilm kot niša, ki spodbuja konjugacijo bakterij===
Organizacija sestavin matriksa biofilma vpliva na hitrost prenosa plazmidov. Polisaharidi lahko na primer omejijo difuzijo DNA in ovirajo stik med celicami dajalkami in prejemnicami. Zunajcelična DNA (eDNA) deluje kot skupni adhezin, ki približa celice za konjugacijo. Tako različne sestave matriksa ustvarjajo različna mikrookolja, ki vplivajo na pretok genov s konjugativno izmenjavo.
===Vpliv strukture biofilma na konjugacijo===
Učinkovitost konjugacije je odvisna od arhitekturne strukture biofilmov, na katero vplivajo dejavniki, kot so bakterijske vrste in okoljski pogoji. Glede na mikroskopske študije poteka konjugacija predvsem na robovih biofilmov, kar kaže na majhen prodor v globlje plasti. Kljub temu znanju ostaja še vedno negotovo, kako kemični gradienti znotraj teh skupnosti vplivajo na presnovo bakterij in genetsko raznolikost, zlasti ko gre za njihovo povezavo s konjugacijo.
===Vpliv konjugativnih plazmidov na tvorbo biofilma===
Konjugirani plazmidi, ki pogosto nosijo gene za spodbujanje pritrjevanja na površino, prav tako povečujejo nastanek biofilma. Ko je plazmid v gostiteljski celici, lahko spremeni izražanje genov in s tem vpliva na zgradbo in zorenje biofilmov. Vendar je treba mehanizme, ki so vključeni v te spremembe, še naprej raziskovati, zlasti med različnimi vrstami gostiteljev.
===Vpliv zdravljenja z antibiotiki na konjugacijo v biofilmih===
Na dinamiko biofilma in prenos genov vpliva zdravljenje z antibiotiki. Antibiotiki pod najnižjimi inhibitornimi koncentracijami (sub-MIC) lahko spodbujajo nastanek ali povečajo pogostost konjugativnih dogodkov, hkrati pa z bolj odpornimi skupnostmi povečujejo odpornost proti protimikrobnim sredstvom. Poskusi slikanja v realnem času razkrivajo, da antibiotiki morda služijo predvsem kot gonilna sila za selekcijo po prenosu in ne kot neposredni spodbujevalci konjugacije. Zdravljenje z antibiotiki spremeni strukturo biofilma in tako vpliva na učinkovitost prenosa plazmidov. Nekatera zdravila motijo komunikacijo med celicami ali zavirajo proizvodnjo matriksa, kar vpliva na pogostost konjugacije in prostorsko razporeditev v biofilmu. Po drugi strani pa nekateri antibiotiki povzročijo lizo bakterijskih celic v biofilmih, pri čemer se sproščajo prosti fragmenti DNA v okolje, kjer jih lahko prevzamejo druge bakterije z naravno sposobnostjo ali procesi transformacije. Zato imajo protimikrobna sredstva dvojno vlogo, in sicer kot modulatorji genske izmenjave znotraj biofilmov in kot gonilna sila za horizontalni prenos genov med različnimi vrstami ali rodovi.Razumevanje teh odnosov je pomembno za razvoj strategij za obvladovanje okužb, povezanih z biofilmskimi skupnostmi, ki so odporne proti več zdravilom. Mikrofluidika se lahko uporablja za preučevanje, kako se geni širijo v biofilmih. Nedavna študija je pokazala, da je način, kako se geni premikajo skozi biofilm, nadzorovan z njegovo strukturo. Dejstvo, da lahko zaradi njih bakterije, odporne na antibiotike, bolj verjetno delijo gene za odpornost, pomeni, da moramo razumeti, kako zdravila vplivajo na prenos genov znotraj teh kolonij.

=Viri=
1. C. Virolle, K. Goldlust, S. Djermoun, S. Bigot in C. Lesterlin, '' Plasmid Transfer by Conjugation in Gram-Negative Bacteria: From the Cellular to the Community Level'', Genes (Basel), 11(11), 1239, oct. 2020, doi: 10.3390/genes11111239
‎ 
2. M.B. Miller, B. Bassler, ''Quorum Sensing in Bacteria''. Annu Rev Microbiol: 55, 165-199, 2001, doi: 10.1146/annurev.micro.55.1.165

Prenos plazmidov s konjugacijo med gramnegativnimi bakterijami

2024-05-05T16:18:52Z

Doment: /* Naloge vodilnih genov */

=Uvod=
=Procesi v donorski celici=
Bakterijska konjugacija je mehanizem horizontalnega prenosa genov, ki vključuje konjugacijski pilus in T4SS. T4SS (bakterijski izločevalni sistem tipa IV) je izločevalni proteinski kompleks, najden v gram-negativnih ter gram-pozitivnih bakterijah in arhejah, ki omogoča prenos proteinov in DNA skozi celično membrano.
‎ 
Sposobnost donorske celice, da izvede konjugacijo, omogoča izražanje genov za prenos, ki so zapisani v tra regiji plazmida. Te geni kodirajo vse proteinske faktorje, ki so vključeni pri izdelavi konjugacijskega pilusa in T4SS potrebnega za formacijo paritvenega para. Prav tako so pomembne komponente relaksosoma, ki so potrebne za pripravo plazmida pred prenosom.
Različna morfologija pilusov celicam omogoča konjugacijo v tekočini ali na trdni površini. F plazmid nosi zapis za tanek prožen pilus, ki ima cevasto strukturo s premerom okoli 8 μm in dolžino do 20 μm. Sestavljen je iz edinstvene proteinske podenote – F pilin oz. TraA.
‎ 
Donorske celice proizvajajo prožne piluse, ki so nenehno podvrženi ciklom iztegovanja in umikanja, s čimer preiskujejo okolico, ne glede na prisotnost prejemnih celic. Po vzpostavitvi stika s prejemno celico, pa retrakcija pilusa potegne celici skupaj in posledično se vzpostavi paritveni par.
‎ 
Iniciacija konjugacije zahteva sestavo in aktivnost proteinskega kompleksa relaksosoma, ki omogoča preoblikovanje plazmida pred njegovim prenosom. Preoblikovanje zajema rezanje na specifičnem mestu in verigi - na delu nic, ki se nahaja na začetku tra genov (oriT) in rezanje enoverižne DNA (T-veriga), ki bo kasneje prenešena. Te dve reakciji izvede TraI relaksaza, protein, ki je sestavljen iz transesterazne domene, ta katalizira reakcijo reza in DNA helikazne domene, ki odvije plazmidno DNA. Aktivnost TraI nadzorujejo pomožni proteini, kot so IHF (integration host factor) – faktor integracije gostitelja in plazmidna proteina TraY in TraM, ki imata izrazito vlogo v formaciji relaksosoma in aktivnost pri oriT.
‎ 
Nastali nukleoproteinski kompleks, sestavljen iz T-verige in kovalentno vezanega TraI, se mora prenesti do konjugativnih por za prenos. To omogočajo sklopitveni proteini tipa IV (T4CP), ki so zasidrani v celični membrani in neposredno komunicirajo z relaksosomom. Tvorijo heksamerne strukture na T-verigi, ki se aktivno prenesejo skozi konjugacijske pore med prenosom.
‎ 
Ekspresijo tra genov regulirajo številni faktorji kot so plazmidni proteini, proteini gostiteljske celice, stopnja celičnega cikla in okoljske razmere. Večina tra genov je zbranih v enem operonu, ki jih kontrolira PY promotor. Ekspresija transfernih genov sledi specifični regulatorni kaskadi, ki se začne s proizvodnjo traJ proteina, ki aktivira PY promotor in transkripcijo tra operona. Najprej se prepiše traJ, ki kodira regulatorni protein TraJ, ta aktivira PM promotor, kar povzroči produkcijo traM proteina relaksosoma. Ta regulatorna kaskada tako povzroči izražanje vseh genov, ki so vključeni v izdelavo konjugacijskega pilusa, T4SS in relaksosoma.
‎ 
Nekatere gram-negativne bakterije ekspresijo tra genov regulira z mehanizmom zaznavnaje kvoruma (QS – quorum-sensing). Bakterije zaznavajo in sproščajo signalne molekule, imenovane avtoinduktorji, katerih koncentracija se poveča glede na gostoto celic. Gram-negativne bakterije kot avtoinduktorje uporabljajo acilirane homoserin laktone (AHL). Zaznavanje minimalne koncentracije AHL vodi do spremembe izražanja genov.
‎ 
Ekspresija tra genov je nadzorovana s kompleksnimi regulatornimi procesi, ki vključujejo aktivnost plazmidnih in kromosomskih faktorjev donorske celice. Ta regulacija omogoča nadzor za učinkovitost konjugacije v povezavi z življenjskim ciklom plazmida in fiziologijo gostitelja kot odziv na okoljske razmere in populacijske interakcije.

=Procesi v prejemni celici=
==Cirkulacija plazmida==
ssDNA v prejemno celico vstopi tako, da jo hkrati potiska sklopitveni protein tipa 4 donorske celice (del T4SS) in vleče relaksaza prejemnika. Ko sta oba konca lineariziranega plzamida prisotna v prejemniku ju skupaj združi relaksaza in nastane cirkularna oblika.

==Zaščita tuje DNA pred obrambo prejemnika==
Po vstopu plazmida v celico (v enoverižni DNA) se lahko aktivirajo bakterijski zaščitni mehanizmi proti tuji DNA in plazmidi so tako morali razviti mehanizme, ki preprečijo njhovo uničenje. Proti restrikcijskemu modifikacijskemu sistemu, ki napade nemetilirane ssDNA molekule, delujeta proteina ArdA in ArdB ki inhibirata restrikcijske endonukelaze tako da ponazarjata DNA zaporedje in se vežeta na aktivno mesto encima, protein ArdC pa aktivno mesto blokira. Naseldnji pomemben obrambni mehanizem je CRISPR-Cas, ki zagotavlja zaščito pred bakteriofagi, pred kratkim pa je bilo ugotovljeno, da ščiti tudi pred plazmidi. Tukaj nastopijo anti-CRISPR proteini, ki inhibirajo encim Cas9, kodirajo pa jih plamidni loki. Še eden način obrambe pred CRISPR-Cas je, da konjugativni plazmidi kodirajo sistem Bet/Exo, ki popravlja “škodo” (ločitve dvojne vijačnice), ki jo povzroča obrambni mehanizem.

==Naloge vodilnih genov==
Vodilni geni ležijo na delu, plazmida, ki je najprej transportiran v prejemno celico. Prva je bila omenjena regija Frpo, ki vsebuje zapise za rna polimeraze, njena transkripcija pa se začenja takoj po vstopu plazmida v celico. Drugi izmed proteinov je Psib (Plasmid SOS inibition) ki, kot že ime pove, inhibira proces SOS. Ta proces se sproži ob večji koncentraciji ssDNA , ki je načeloma povezana s celičnimi poškodbami in lahko privede do degradacije ssDNA, ali pa celo do celične smrti. Zadnji izmed omenjenih proteinov je SSBC oz. v primeru F plazmida gre za njegov homolog SSBp , ki se nespecifično veže na ssDNA in preprečuje njeno degradacijo, hkrati pa pospešuje delovanje polimeraz II in III, ki so odgovorne za pretvorbo ssDNA v dsDNA.

==Vzdrževanje plazmida==
==Fenotipska konverzija konjugiranih celic==
=Konjugacija v naravnih habitatih: primer bakterijskih biofilmov=
Znano je, da prenos genov s konjugacijo prispeva h genetski dinamiki bakterijskih populacij, ki živijo v različnih okoljih, vključno s tlemi, na površinah rastlin, v vodi in odpadnih vodah, pa tudi v bakterijskih skupnostih, povezanih z rastlinskimi ali živalskimi gostitelji. Bakterije na splošno veljajo za planktonske enocelične organizme, vendar v naravnem in kliničnem okolju pogosto živijo v kompleksnih strukturah, imenovanih biofilmi. Biofilmi nudijo bakterijam zavetje pred zunanjimi nevarnostmi, vendar je bilo tudi predlagano, da nudijo nišo, ki olajša širjenje determinant odpornosti na zdravila s konjugacijo
===Biofilm kot niša, ki spodbuja konjugacijo bakterij===
Organizacija sestavin matriksa biofilma vpliva na hitrost prenosa plazmidov. Polisaharidi lahko na primer omejijo difuzijo DNA in ovirajo stik med celicami dajalkami in prejemnicami. Zunajcelična DNA (eDNA) deluje kot skupni adhezin, ki približa celice za konjugacijo. Tako različne sestave matriksa ustvarjajo različna mikrookolja, ki vplivajo na pretok genov s konjugativno izmenjavo.
===Vpliv strukture biofilma na konjugacijo===
Učinkovitost konjugacije je odvisna od arhitekturne strukture biofilmov, na katero vplivajo dejavniki, kot so bakterijske vrste in okoljski pogoji. Glede na mikroskopske študije poteka konjugacija predvsem na robovih biofilmov, kar kaže na majhen prodor v globlje plasti. Kljub temu znanju ostaja še vedno negotovo, kako kemični gradienti znotraj teh skupnosti vplivajo na presnovo bakterij in genetsko raznolikost, zlasti ko gre za njihovo povezavo s konjugacijo.
===Vpliv konjugativnih plazmidov na tvorbo biofilma===
Konjugirani plazmidi, ki pogosto nosijo gene za spodbujanje pritrjevanja na površino, prav tako povečujejo nastanek biofilma. Ko je plazmid v gostiteljski celici, lahko spremeni izražanje genov in s tem vpliva na zgradbo in zorenje biofilmov. Vendar je treba mehanizme, ki so vključeni v te spremembe, še naprej raziskovati, zlasti med različnimi vrstami gostiteljev.
===Vpliv zdravljenja z antibiotiki na konjugacijo v biofilmih===
Na dinamiko biofilma in prenos genov vpliva zdravljenje z antibiotiki. Antibiotiki pod najnižjimi inhibitornimi koncentracijami (sub-MIC) lahko spodbujajo nastanek ali povečajo pogostost konjugativnih dogodkov, hkrati pa z bolj odpornimi skupnostmi povečujejo odpornost proti protimikrobnim sredstvom. Poskusi slikanja v realnem času razkrivajo, da antibiotiki morda služijo predvsem kot gonilna sila za selekcijo po prenosu in ne kot neposredni spodbujevalci konjugacije. Zdravljenje z antibiotiki spremeni strukturo biofilma in tako vpliva na učinkovitost prenosa plazmidov. Nekatera zdravila motijo komunikacijo med celicami ali zavirajo proizvodnjo matriksa, kar vpliva na pogostost konjugacije in prostorsko razporeditev v biofilmu. Po drugi strani pa nekateri antibiotiki povzročijo lizo bakterijskih celic v biofilmih, pri čemer se sproščajo prosti fragmenti DNA v okolje, kjer jih lahko prevzamejo druge bakterije z naravno sposobnostjo ali procesi transformacije. Zato imajo protimikrobna sredstva dvojno vlogo, in sicer kot modulatorji genske izmenjave znotraj biofilmov in kot gonilna sila za horizontalni prenos genov med različnimi vrstami ali rodovi.Razumevanje teh odnosov je pomembno za razvoj strategij za obvladovanje okužb, povezanih z biofilmskimi skupnostmi, ki so odporne proti več zdravilom. Mikrofluidika se lahko uporablja za preučevanje, kako se geni širijo v biofilmih. Nedavna študija je pokazala, da je način, kako se geni premikajo skozi biofilm, nadzorovan z njegovo strukturo. Dejstvo, da lahko zaradi njih bakterije, odporne na antibiotike, bolj verjetno delijo gene za odpornost, pomeni, da moramo razumeti, kako zdravila vplivajo na prenos genov znotraj teh kolonij.

=Viri=
1. C. Virolle, K. Goldlust, S. Djermoun, S. Bigot in C. Lesterlin, '' Plasmid Transfer by Conjugation in Gram-Negative Bacteria: From the Cellular to the Community Level'', Genes (Basel), 11(11), 1239, oct. 2020, doi: 10.3390/genes11111239
‎ 
2. M.B. Miller, B. Bassler, ''Quorum Sensing in Bacteria''. Annu Rev Microbiol: 55, 165-199, 2001, doi: 10.1146/annurev.micro.55.1.165

Prenos plazmidov s konjugacijo med gramnegativnimi bakterijami

2024-05-05T16:18:25Z

Doment: /* Zaščita tuje DNA pred obrambo prejemnika */

=Uvod=
=Procesi v donorski celici=
Bakterijska konjugacija je mehanizem horizontalnega prenosa genov, ki vključuje konjugacijski pilus in T4SS. T4SS (bakterijski izločevalni sistem tipa IV) je izločevalni proteinski kompleks, najden v gram-negativnih ter gram-pozitivnih bakterijah in arhejah, ki omogoča prenos proteinov in DNA skozi celično membrano.
‎ 
Sposobnost donorske celice, da izvede konjugacijo, omogoča izražanje genov za prenos, ki so zapisani v tra regiji plazmida. Te geni kodirajo vse proteinske faktorje, ki so vključeni pri izdelavi konjugacijskega pilusa in T4SS potrebnega za formacijo paritvenega para. Prav tako so pomembne komponente relaksosoma, ki so potrebne za pripravo plazmida pred prenosom.
Različna morfologija pilusov celicam omogoča konjugacijo v tekočini ali na trdni površini. F plazmid nosi zapis za tanek prožen pilus, ki ima cevasto strukturo s premerom okoli 8 μm in dolžino do 20 μm. Sestavljen je iz edinstvene proteinske podenote – F pilin oz. TraA.
‎ 
Donorske celice proizvajajo prožne piluse, ki so nenehno podvrženi ciklom iztegovanja in umikanja, s čimer preiskujejo okolico, ne glede na prisotnost prejemnih celic. Po vzpostavitvi stika s prejemno celico, pa retrakcija pilusa potegne celici skupaj in posledično se vzpostavi paritveni par.
‎ 
Iniciacija konjugacije zahteva sestavo in aktivnost proteinskega kompleksa relaksosoma, ki omogoča preoblikovanje plazmida pred njegovim prenosom. Preoblikovanje zajema rezanje na specifičnem mestu in verigi - na delu nic, ki se nahaja na začetku tra genov (oriT) in rezanje enoverižne DNA (T-veriga), ki bo kasneje prenešena. Te dve reakciji izvede TraI relaksaza, protein, ki je sestavljen iz transesterazne domene, ta katalizira reakcijo reza in DNA helikazne domene, ki odvije plazmidno DNA. Aktivnost TraI nadzorujejo pomožni proteini, kot so IHF (integration host factor) – faktor integracije gostitelja in plazmidna proteina TraY in TraM, ki imata izrazito vlogo v formaciji relaksosoma in aktivnost pri oriT.
‎ 
Nastali nukleoproteinski kompleks, sestavljen iz T-verige in kovalentno vezanega TraI, se mora prenesti do konjugativnih por za prenos. To omogočajo sklopitveni proteini tipa IV (T4CP), ki so zasidrani v celični membrani in neposredno komunicirajo z relaksosomom. Tvorijo heksamerne strukture na T-verigi, ki se aktivno prenesejo skozi konjugacijske pore med prenosom.
‎ 
Ekspresijo tra genov regulirajo številni faktorji kot so plazmidni proteini, proteini gostiteljske celice, stopnja celičnega cikla in okoljske razmere. Večina tra genov je zbranih v enem operonu, ki jih kontrolira PY promotor. Ekspresija transfernih genov sledi specifični regulatorni kaskadi, ki se začne s proizvodnjo traJ proteina, ki aktivira PY promotor in transkripcijo tra operona. Najprej se prepiše traJ, ki kodira regulatorni protein TraJ, ta aktivira PM promotor, kar povzroči produkcijo traM proteina relaksosoma. Ta regulatorna kaskada tako povzroči izražanje vseh genov, ki so vključeni v izdelavo konjugacijskega pilusa, T4SS in relaksosoma.
‎ 
Nekatere gram-negativne bakterije ekspresijo tra genov regulira z mehanizmom zaznavnaje kvoruma (QS – quorum-sensing). Bakterije zaznavajo in sproščajo signalne molekule, imenovane avtoinduktorji, katerih koncentracija se poveča glede na gostoto celic. Gram-negativne bakterije kot avtoinduktorje uporabljajo acilirane homoserin laktone (AHL). Zaznavanje minimalne koncentracije AHL vodi do spremembe izražanja genov.
‎ 
Ekspresija tra genov je nadzorovana s kompleksnimi regulatornimi procesi, ki vključujejo aktivnost plazmidnih in kromosomskih faktorjev donorske celice. Ta regulacija omogoča nadzor za učinkovitost konjugacije v povezavi z življenjskim ciklom plazmida in fiziologijo gostitelja kot odziv na okoljske razmere in populacijske interakcije.

=Procesi v prejemni celici=
==Cirkulacija plazmida==
ssDNA v prejemno celico vstopi tako, da jo hkrati potiska sklopitveni protein tipa 4 donorske celice (del T4SS) in vleče relaksaza prejemnika. Ko sta oba konca lineariziranega plzamida prisotna v prejemniku ju skupaj združi relaksaza in nastane cirkularna oblika.

==Zaščita tuje DNA pred obrambo prejemnika==
Po vstopu plazmida v celico (v enoverižni DNA) se lahko aktivirajo bakterijski zaščitni mehanizmi proti tuji DNA in plazmidi so tako morali razviti mehanizme, ki preprečijo njhovo uničenje. Proti restrikcijskemu modifikacijskemu sistemu, ki napade nemetilirane ssDNA molekule, delujeta proteina ArdA in ArdB ki inhibirata restrikcijske endonukelaze tako da ponazarjata DNA zaporedje in se vežeta na aktivno mesto encima, protein ArdC pa aktivno mesto blokira. Naseldnji pomemben obrambni mehanizem je CRISPR-Cas, ki zagotavlja zaščito pred bakteriofagi, pred kratkim pa je bilo ugotovljeno, da ščiti tudi pred plazmidi. Tukaj nastopijo anti-CRISPR proteini, ki inhibirajo encim Cas9, kodirajo pa jih plamidni loki. Še eden način obrambe pred CRISPR-Cas je, da konjugativni plazmidi kodirajo sistem Bet/Exo, ki popravlja “škodo” (ločitve dvojne vijačnice), ki jo povzroča obrambni mehanizem.

==Naloge vodilnih genov==
==Vzdrževanje plazmida==
==Fenotipska konverzija konjugiranih celic==
=Konjugacija v naravnih habitatih: primer bakterijskih biofilmov=
Znano je, da prenos genov s konjugacijo prispeva h genetski dinamiki bakterijskih populacij, ki živijo v različnih okoljih, vključno s tlemi, na površinah rastlin, v vodi in odpadnih vodah, pa tudi v bakterijskih skupnostih, povezanih z rastlinskimi ali živalskimi gostitelji. Bakterije na splošno veljajo za planktonske enocelične organizme, vendar v naravnem in kliničnem okolju pogosto živijo v kompleksnih strukturah, imenovanih biofilmi. Biofilmi nudijo bakterijam zavetje pred zunanjimi nevarnostmi, vendar je bilo tudi predlagano, da nudijo nišo, ki olajša širjenje determinant odpornosti na zdravila s konjugacijo
===Biofilm kot niša, ki spodbuja konjugacijo bakterij===
Organizacija sestavin matriksa biofilma vpliva na hitrost prenosa plazmidov. Polisaharidi lahko na primer omejijo difuzijo DNA in ovirajo stik med celicami dajalkami in prejemnicami. Zunajcelična DNA (eDNA) deluje kot skupni adhezin, ki približa celice za konjugacijo. Tako različne sestave matriksa ustvarjajo različna mikrookolja, ki vplivajo na pretok genov s konjugativno izmenjavo.
===Vpliv strukture biofilma na konjugacijo===
Učinkovitost konjugacije je odvisna od arhitekturne strukture biofilmov, na katero vplivajo dejavniki, kot so bakterijske vrste in okoljski pogoji. Glede na mikroskopske študije poteka konjugacija predvsem na robovih biofilmov, kar kaže na majhen prodor v globlje plasti. Kljub temu znanju ostaja še vedno negotovo, kako kemični gradienti znotraj teh skupnosti vplivajo na presnovo bakterij in genetsko raznolikost, zlasti ko gre za njihovo povezavo s konjugacijo.
===Vpliv konjugativnih plazmidov na tvorbo biofilma===
Konjugirani plazmidi, ki pogosto nosijo gene za spodbujanje pritrjevanja na površino, prav tako povečujejo nastanek biofilma. Ko je plazmid v gostiteljski celici, lahko spremeni izražanje genov in s tem vpliva na zgradbo in zorenje biofilmov. Vendar je treba mehanizme, ki so vključeni v te spremembe, še naprej raziskovati, zlasti med različnimi vrstami gostiteljev.
===Vpliv zdravljenja z antibiotiki na konjugacijo v biofilmih===
Na dinamiko biofilma in prenos genov vpliva zdravljenje z antibiotiki. Antibiotiki pod najnižjimi inhibitornimi koncentracijami (sub-MIC) lahko spodbujajo nastanek ali povečajo pogostost konjugativnih dogodkov, hkrati pa z bolj odpornimi skupnostmi povečujejo odpornost proti protimikrobnim sredstvom. Poskusi slikanja v realnem času razkrivajo, da antibiotiki morda služijo predvsem kot gonilna sila za selekcijo po prenosu in ne kot neposredni spodbujevalci konjugacije. Zdravljenje z antibiotiki spremeni strukturo biofilma in tako vpliva na učinkovitost prenosa plazmidov. Nekatera zdravila motijo komunikacijo med celicami ali zavirajo proizvodnjo matriksa, kar vpliva na pogostost konjugacije in prostorsko razporeditev v biofilmu. Po drugi strani pa nekateri antibiotiki povzročijo lizo bakterijskih celic v biofilmih, pri čemer se sproščajo prosti fragmenti DNA v okolje, kjer jih lahko prevzamejo druge bakterije z naravno sposobnostjo ali procesi transformacije. Zato imajo protimikrobna sredstva dvojno vlogo, in sicer kot modulatorji genske izmenjave znotraj biofilmov in kot gonilna sila za horizontalni prenos genov med različnimi vrstami ali rodovi.Razumevanje teh odnosov je pomembno za razvoj strategij za obvladovanje okužb, povezanih z biofilmskimi skupnostmi, ki so odporne proti več zdravilom. Mikrofluidika se lahko uporablja za preučevanje, kako se geni širijo v biofilmih. Nedavna študija je pokazala, da je način, kako se geni premikajo skozi biofilm, nadzorovan z njegovo strukturo. Dejstvo, da lahko zaradi njih bakterije, odporne na antibiotike, bolj verjetno delijo gene za odpornost, pomeni, da moramo razumeti, kako zdravila vplivajo na prenos genov znotraj teh kolonij.

=Viri=
1. C. Virolle, K. Goldlust, S. Djermoun, S. Bigot in C. Lesterlin, '' Plasmid Transfer by Conjugation in Gram-Negative Bacteria: From the Cellular to the Community Level'', Genes (Basel), 11(11), 1239, oct. 2020, doi: 10.3390/genes11111239
‎ 
2. M.B. Miller, B. Bassler, ''Quorum Sensing in Bacteria''. Annu Rev Microbiol: 55, 165-199, 2001, doi: 10.1146/annurev.micro.55.1.165

Prenos plazmidov s konjugacijo med gramnegativnimi bakterijami

2024-05-05T16:18:08Z

Doment: /* Cirkulacija plazmida */

=Uvod=
=Procesi v donorski celici=
Bakterijska konjugacija je mehanizem horizontalnega prenosa genov, ki vključuje konjugacijski pilus in T4SS. T4SS (bakterijski izločevalni sistem tipa IV) je izločevalni proteinski kompleks, najden v gram-negativnih ter gram-pozitivnih bakterijah in arhejah, ki omogoča prenos proteinov in DNA skozi celično membrano.
‎ 
Sposobnost donorske celice, da izvede konjugacijo, omogoča izražanje genov za prenos, ki so zapisani v tra regiji plazmida. Te geni kodirajo vse proteinske faktorje, ki so vključeni pri izdelavi konjugacijskega pilusa in T4SS potrebnega za formacijo paritvenega para. Prav tako so pomembne komponente relaksosoma, ki so potrebne za pripravo plazmida pred prenosom.
Različna morfologija pilusov celicam omogoča konjugacijo v tekočini ali na trdni površini. F plazmid nosi zapis za tanek prožen pilus, ki ima cevasto strukturo s premerom okoli 8 μm in dolžino do 20 μm. Sestavljen je iz edinstvene proteinske podenote – F pilin oz. TraA.
‎ 
Donorske celice proizvajajo prožne piluse, ki so nenehno podvrženi ciklom iztegovanja in umikanja, s čimer preiskujejo okolico, ne glede na prisotnost prejemnih celic. Po vzpostavitvi stika s prejemno celico, pa retrakcija pilusa potegne celici skupaj in posledično se vzpostavi paritveni par.
‎ 
Iniciacija konjugacije zahteva sestavo in aktivnost proteinskega kompleksa relaksosoma, ki omogoča preoblikovanje plazmida pred njegovim prenosom. Preoblikovanje zajema rezanje na specifičnem mestu in verigi - na delu nic, ki se nahaja na začetku tra genov (oriT) in rezanje enoverižne DNA (T-veriga), ki bo kasneje prenešena. Te dve reakciji izvede TraI relaksaza, protein, ki je sestavljen iz transesterazne domene, ta katalizira reakcijo reza in DNA helikazne domene, ki odvije plazmidno DNA. Aktivnost TraI nadzorujejo pomožni proteini, kot so IHF (integration host factor) – faktor integracije gostitelja in plazmidna proteina TraY in TraM, ki imata izrazito vlogo v formaciji relaksosoma in aktivnost pri oriT.
‎ 
Nastali nukleoproteinski kompleks, sestavljen iz T-verige in kovalentno vezanega TraI, se mora prenesti do konjugativnih por za prenos. To omogočajo sklopitveni proteini tipa IV (T4CP), ki so zasidrani v celični membrani in neposredno komunicirajo z relaksosomom. Tvorijo heksamerne strukture na T-verigi, ki se aktivno prenesejo skozi konjugacijske pore med prenosom.
‎ 
Ekspresijo tra genov regulirajo številni faktorji kot so plazmidni proteini, proteini gostiteljske celice, stopnja celičnega cikla in okoljske razmere. Večina tra genov je zbranih v enem operonu, ki jih kontrolira PY promotor. Ekspresija transfernih genov sledi specifični regulatorni kaskadi, ki se začne s proizvodnjo traJ proteina, ki aktivira PY promotor in transkripcijo tra operona. Najprej se prepiše traJ, ki kodira regulatorni protein TraJ, ta aktivira PM promotor, kar povzroči produkcijo traM proteina relaksosoma. Ta regulatorna kaskada tako povzroči izražanje vseh genov, ki so vključeni v izdelavo konjugacijskega pilusa, T4SS in relaksosoma.
‎ 
Nekatere gram-negativne bakterije ekspresijo tra genov regulira z mehanizmom zaznavnaje kvoruma (QS – quorum-sensing). Bakterije zaznavajo in sproščajo signalne molekule, imenovane avtoinduktorji, katerih koncentracija se poveča glede na gostoto celic. Gram-negativne bakterije kot avtoinduktorje uporabljajo acilirane homoserin laktone (AHL). Zaznavanje minimalne koncentracije AHL vodi do spremembe izražanja genov.
‎ 
Ekspresija tra genov je nadzorovana s kompleksnimi regulatornimi procesi, ki vključujejo aktivnost plazmidnih in kromosomskih faktorjev donorske celice. Ta regulacija omogoča nadzor za učinkovitost konjugacije v povezavi z življenjskim ciklom plazmida in fiziologijo gostitelja kot odziv na okoljske razmere in populacijske interakcije.

=Procesi v prejemni celici=
==Cirkulacija plazmida==
ssDNA v prejemno celico vstopi tako, da jo hkrati potiska sklopitveni protein tipa 4 donorske celice (del T4SS) in vleče relaksaza prejemnika. Ko sta oba konca lineariziranega plzamida prisotna v prejemniku ju skupaj združi relaksaza in nastane cirkularna oblika.

==Zaščita tuje DNA pred obrambo prejemnika==
==Naloge vodilnih genov==
==Vzdrževanje plazmida==
==Fenotipska konverzija konjugiranih celic==
=Konjugacija v naravnih habitatih: primer bakterijskih biofilmov=
Znano je, da prenos genov s konjugacijo prispeva h genetski dinamiki bakterijskih populacij, ki živijo v različnih okoljih, vključno s tlemi, na površinah rastlin, v vodi in odpadnih vodah, pa tudi v bakterijskih skupnostih, povezanih z rastlinskimi ali živalskimi gostitelji. Bakterije na splošno veljajo za planktonske enocelične organizme, vendar v naravnem in kliničnem okolju pogosto živijo v kompleksnih strukturah, imenovanih biofilmi. Biofilmi nudijo bakterijam zavetje pred zunanjimi nevarnostmi, vendar je bilo tudi predlagano, da nudijo nišo, ki olajša širjenje determinant odpornosti na zdravila s konjugacijo
===Biofilm kot niša, ki spodbuja konjugacijo bakterij===
Organizacija sestavin matriksa biofilma vpliva na hitrost prenosa plazmidov. Polisaharidi lahko na primer omejijo difuzijo DNA in ovirajo stik med celicami dajalkami in prejemnicami. Zunajcelična DNA (eDNA) deluje kot skupni adhezin, ki približa celice za konjugacijo. Tako različne sestave matriksa ustvarjajo različna mikrookolja, ki vplivajo na pretok genov s konjugativno izmenjavo.
===Vpliv strukture biofilma na konjugacijo===
Učinkovitost konjugacije je odvisna od arhitekturne strukture biofilmov, na katero vplivajo dejavniki, kot so bakterijske vrste in okoljski pogoji. Glede na mikroskopske študije poteka konjugacija predvsem na robovih biofilmov, kar kaže na majhen prodor v globlje plasti. Kljub temu znanju ostaja še vedno negotovo, kako kemični gradienti znotraj teh skupnosti vplivajo na presnovo bakterij in genetsko raznolikost, zlasti ko gre za njihovo povezavo s konjugacijo.
===Vpliv konjugativnih plazmidov na tvorbo biofilma===
Konjugirani plazmidi, ki pogosto nosijo gene za spodbujanje pritrjevanja na površino, prav tako povečujejo nastanek biofilma. Ko je plazmid v gostiteljski celici, lahko spremeni izražanje genov in s tem vpliva na zgradbo in zorenje biofilmov. Vendar je treba mehanizme, ki so vključeni v te spremembe, še naprej raziskovati, zlasti med različnimi vrstami gostiteljev.
===Vpliv zdravljenja z antibiotiki na konjugacijo v biofilmih===
Na dinamiko biofilma in prenos genov vpliva zdravljenje z antibiotiki. Antibiotiki pod najnižjimi inhibitornimi koncentracijami (sub-MIC) lahko spodbujajo nastanek ali povečajo pogostost konjugativnih dogodkov, hkrati pa z bolj odpornimi skupnostmi povečujejo odpornost proti protimikrobnim sredstvom. Poskusi slikanja v realnem času razkrivajo, da antibiotiki morda služijo predvsem kot gonilna sila za selekcijo po prenosu in ne kot neposredni spodbujevalci konjugacije. Zdravljenje z antibiotiki spremeni strukturo biofilma in tako vpliva na učinkovitost prenosa plazmidov. Nekatera zdravila motijo komunikacijo med celicami ali zavirajo proizvodnjo matriksa, kar vpliva na pogostost konjugacije in prostorsko razporeditev v biofilmu. Po drugi strani pa nekateri antibiotiki povzročijo lizo bakterijskih celic v biofilmih, pri čemer se sproščajo prosti fragmenti DNA v okolje, kjer jih lahko prevzamejo druge bakterije z naravno sposobnostjo ali procesi transformacije. Zato imajo protimikrobna sredstva dvojno vlogo, in sicer kot modulatorji genske izmenjave znotraj biofilmov in kot gonilna sila za horizontalni prenos genov med različnimi vrstami ali rodovi.Razumevanje teh odnosov je pomembno za razvoj strategij za obvladovanje okužb, povezanih z biofilmskimi skupnostmi, ki so odporne proti več zdravilom. Mikrofluidika se lahko uporablja za preučevanje, kako se geni širijo v biofilmih. Nedavna študija je pokazala, da je način, kako se geni premikajo skozi biofilm, nadzorovan z njegovo strukturo. Dejstvo, da lahko zaradi njih bakterije, odporne na antibiotike, bolj verjetno delijo gene za odpornost, pomeni, da moramo razumeti, kako zdravila vplivajo na prenos genov znotraj teh kolonij.

=Viri=
1. C. Virolle, K. Goldlust, S. Djermoun, S. Bigot in C. Lesterlin, '' Plasmid Transfer by Conjugation in Gram-Negative Bacteria: From the Cellular to the Community Level'', Genes (Basel), 11(11), 1239, oct. 2020, doi: 10.3390/genes11111239
‎ 
2. M.B. Miller, B. Bassler, ''Quorum Sensing in Bacteria''. Annu Rev Microbiol: 55, 165-199, 2001, doi: 10.1146/annurev.micro.55.1.165

Prenos plazmidov s konjugacijo med gramnegativnimi bakterijami

2024-05-05T12:49:17Z

Doment:

=Uvod=
=Procesi v donorski celici=
=Procesi v prejemni celici=
==Cirkulacija plazmida==
==Zaščita tuje DNA pred obrambo prejemnika==
==Naloge vodilnih genov==
==Vzdrževanje plazmida==
==Fenotipska konverzija konjugiranih celic==
=Konjugacija v naravnih habitatih: primer bakterijskih biofilmov=
=Viri=

Prenos plazmidov s konjugacijo med gramnegativnimi bakterijami

2024-05-05T12:48:02Z

Doment: /* Procesi v prejemni celici */

Prenos plazmidov s konjugacijo med gramnegativnimi bakterijami

2024-05-05T12:42:19Z

Doment: Created page with "=Uvod= =Procesi v donorski celici= =Procesi v prejemni celici="

=Uvod=
=Procesi v donorski celici=
=Procesi v prejemni celici=

Molekularna biologija plazmidov

2024-05-05T12:37:55Z

Doment:

Seminarji pri Molekularni biologiji v študijskem letu 2023/24 obravnavajo plazmide, ki jih sicer biokemiki poznamo predvsem kot vektorje v DNA-tehnologiji. Pregledali bomo njihovo klasifikacijo, načine podvojevanja in razporejanja v hčerinske celice, njihov prenos s konjugacijo, pomen pri širjenju odpornosti proti antibiotikom. Na koncu si bomo ogledali še nekaj primerov uporabe plazmidov na različnih biotehnoloških in medicinskih področjih. Okvirni naslovi tem so navedeni na spodnjem seznamu.

Vse teme temeljijo na preglednih člankih, kar pomeni, da obravnavajo zaključene teme, na katerih je bilo opravljenega že veliko dela. Zato praviloma vsako temo obdelajo po trije študenti. Vsaka skupina mora pripraviti povzetek seminarja z vsaj 1200 besedami in ne več kot 1800 besedami in ga objaviti na tem wikiju. Povzetek ne vsebuje slikovnega gradiva, lahko pa vključuje povezave do slik in videov na spletu. Navedite do 5 ključnih virov (ti ne štejejo v vsoto 1200–1800 besed), ki ste jih uporabili. Če izjemoma seminar pripravita dva študenta, je obseg povzetka 1000-1500 besed, če je študent sam, pa 800-1200 besed.

Vsaka skupina mora objaviti povzetek seminarja na wikiju najkasneje 24 h pred predstavitvijo svojega seminarja. Kateri del povzetka je napisal kdo, navedite v zavihku 'discussion'. Predstavitev naj bo dolga 15–20 minut, temu pa bo sledila razprava (pribl. 5 minut). Vsak član skupine mora predstaviti en del seminarja, pri čemer mora biti delo enakomerno razdeljeno med vse. Osredotočite se na osnovno temo, ki ste si jo izbrali, in vključite le malo splošnega uvoda, kjer je mogoče pa izpostavite ključne razlike v procesih med bakterijami, evkarionti in arhejami. Če seminar predstavljata dva študenta, imata na voljo 12-15 minut, če je študent sam, pa 8-10 minut.

Seminarske predstavitve bodo potekale med 24. aprilom in 15. majem 2024. V tem času ne bo klasičnih predavanj, torej bodo tako ponedeljkovi kot sredini termini namenjeni seminarjem.

Vsebina seminarjev je izpitna snov. Iz teme seminarjev je ~10 % vprašanj na izpitu (oz. ~10 % točk dobite za odgovore iz snovi seminarjev).

Razdelitev seminarjev je potekala v okolju Google Drive, kjer so (bile) navedene povezave do izhodiščnih člankov, s katerimi lahko začnete iskanje literature. Večinoma navedeni viri ne zadoščajo, da bi pripravili kvaliteten 15-minutni seminar, zato boste morali pregledati tudi nekaj primarnih virov (raziskovalnih člankov), ki jih boste poiskali sami oz. jih boste našli citirane v preglednih člankih. Vaši seminarji naj se osredotočijo na osnovno temo iz naslova in naj nimajo dolgih splošnih uvodov. Seminarji si bodo namreč sledili dokaj hitro en za drugim, tako da boste osnove hitro osvojili in jih ni treba ponavljati.

Ko boste pripravljali povzetek, naslov teme na spodnjem seznamu povežite z novo wiki stranjo, ki bo vsebovala povzetek. Na koncu besedila povzetka (pod viri) v novo vrstico dodajte oznako: <nowiki>[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]</nowiki>. Primer, kako so bili urejeni seminarji v prejšnjih letih, si lahko ogledate na strani [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Molekularna_biologija_koronavirusov Molekularna biologija koronavirusov (2020/21)].

Seznam tem in referenti:

24. april: 
# [[Klasifikacija plazmidov]] (Jan Hvalec, Tjaša Lešnik, Nika Makuc) 
# [[Replikacija plazmidov po mehanizmu téta]] (Nika Janc, Špela Puhov, Lara Ferjančič) 
# [[Replikacija plazmidov po principu kotalečega se kroga]] (Tinkara Robek, Lara Pajnhart, Tina Kosovel) 

6. maj: 
# [[Interakcije plazmid - kromosom]] (Špela Longar, Tiara Pšeničnik, Anita Mulalić) 
# [[Razporejanje plazmidov v hčerinski celici]] (Karin Kunstelj, Brina Klinar, Nina Cankar) 
# [[Prenos plazmidov s konjugacijo med gramnegativnimi bakterijami]] (Lana Bajec, Vid Kozel, Domen Trontelj)
# [[Konjugacijski prenos plazmidov pri bakteriji Bacillus subtilis]] (Mark Frantar, Simon Kristl, Andraž Snedec) 
# [[Modeli konjugacije med črevesnimi bakterijami]] (Peter Gričar Vintar, Maj Dular) 

8. maj: 
# [[Širjenje odpornosti proti antibiotikom med talnimi bakterijami]] (Debora Kociper, Uma Jordan Ferbežar, Dan Kolnik) 
# [[Vloga plazmidov v bakterijski evoluciji]] (Klara Kolenc, Veronika Trobiš, Teja Mohar) 
# Pomen plazmida Ti za patogenost agrobakterij

13. maj: 
# [[Vloga plazmidov pri virulenčnosti klamidij]] (Nik Matek, Mark Varlamov, Anže Perc) 
# Kriptični plazmidi v človeških prebavilih
# Vloga plazmidov pri kvarjenju piva, ki ga povzročajo mlečne bakterije
# Plazmidna DNA pri zdravljenju tumorjev
# Plazmidni replikoni v farmacevtski industriji

15. maj: 
# Atipična sistema segregacije pri plazmidih z nizkim številom kopij

BIO2 Povzetki seminarjev 2023

2023-10-25T06:33:26Z

Doment: /* POVZETKI SEMINARJEV BIOKEMIJA 2023/24 */

= POVZETKI SEMINARJEV BIOKEMIJA 2023/24 =
==Anja Kokol - Pomen kompertmentalizirane signalizacije v membranskih raftih pri razvoju raka==
Raziskovanje lipidnih raftov, membranskih domen, bogatih s holesterolom in sfingolipidi, je izboljšalo razumevanje celične membrane pri signalni transdukciji. Te sortirne platforme igrajo ključno vlogo pri kompartmentalizaciji signalnih poti in s tem spodbujajo ali zavirajo preživetje, smrt in metastazo tumorskih celic. Transformirane celice vsebujejo višjo raven znotrajceličnega holesterola in s tem posledično več membranskih raftov. Rafti so, zraven prenosa signalov, pomembni za aktivacijo receptorjev, endocitozo, znotrajcelični promet in organizacijo z lipidi in proteini. V obliki lipidnih lupin zagotavljajo proteinom, ki so jih tako ločili od ostalih, primerno mikrookolje in s pomočjo takšnega mehanizma vklopijo ali izklopijo določene poti prenosa signala. Na celične procese pomembno vpliva asimetrija holesterola v plazemski membrani, ki se vzdržuje z aktivnim transportom holesterola iz notranjega v zunanji del. Zaradi prenosa signala po lipidnih raftih lahko pride do prekomerne ekspresije in aktivacije številnih poti in sistemov rastnih faktorjev, kar pripomore k razvoju tumorja. Eden od njih je tudi aktivator signalne poti PI3K/AKT, ki je pomemben udeleženec pri nastanku raka. Značilnost sesalskih celic je prisotnost receptorjev smrti na njihovi površini. Ti zagotavljajo sposobnost apoptoze. Ligandi receptorjev smrti sprožijo značilno signalizacijo preko oligomerizacije receptorjev, kar posledično povzroči rekrutiranje specializiranih adapterskih proteinov znotraj lipidnih raftov. S preučevanjem membranskih raftov se je rodil tudi koncept CASMER, s pomočjo katerega se je razvila nova ideja zdravljenja raka.

==Vid Kozel - Vloga onkogenov in tumor zavirajočih genov pri razvoju raka==
Onkogeni kodirajo okvarjene proteine ter s tem povzročajo tumorje. Nastanejo iz spremenjenih proto-onkogenov. Za naše zdravje so zelo nevarni, saj spodbujajo delovanje procesov, ki vodijo do raka. Aktivirajo se zaradi genetske spremembe proto-onkogenov, najpogosteje do tega pride zaradi točkovnih mutacij; mutacije z večjo funkcionalnostjo, kromosomske translokacije, virusna integracija, epigenetske spremembe, spremembe regulatornih proteinov. Tumor zavirajoči geni ali tumorski supresorji tvorijo regulatorne proteine, ki preprečujejo delitev rakavih celic ter spodbujajo popravljanje DNA. Aktivirajo se s transkripcijsko aktivacijo, posttranslacijskimi modifikacijami ali interakcijami med proteini. Njihova glavna naloga je vzdrževanje genoma, prav tako pa preprečujejo nenadzorovano rast celic.
Pot RAS-RAF-MEK-ERK je signalna pot onkogenov, ki ima vlogo pri rasti, delitvi, preživetju in diferenciaciji celic. Njena nenormalna aktivacija lahko povzroči nastanek tumorjev. Pot se začne z aktivacijo RAS, do katere pride zaradi zunajceličnih signalov. RAS potem aktivira še RAF in sproži kaskado fosforilacije. Nato se aktivira MEK, ki sproži dvojno fosforilacijo in aktivira ERK, aktivacija le-te pa vodi do razmnoževanja, preživetja ali diferenciacije celic.
TP53 je gen, ki kodira tumor supresorski protein p53, ta pa zatira tumorje. Na poškodbe DNA odgovarja tako, da ustavi celični cikel ter nato popravi DNA, sproži apoptozo ali pa senescenco. Njegovo delovanje inhibira MDM2, ki ga lahko dodatno stabilizira MDM4. Ob mutacijah na TP53, ter posledično na P53, ta izgubi sposobnost obrambe proti tumorjem.
Z ugotavljanjem mutacij onkogenov/tumorskih supresorjev, ali s tem da ti služijo kot biomarkerji, lahko zdravniki napovejo verjetno napredovanje raka ter izberejo ustrezno zdravljenje.

==Nina Majerle - Z G-proteini sklopljeni vzorčno prepoznavni receptorji izraženi v nevtrofilcih==
Nevtrofilci so najpogostejši levkociti v človeški krvi in so ključnega pomena za pravilno delovanje imunskega sistema. Na površini izražajo različne receptorje, ki prepoznavajo molekulske vzorce tipične za patogene organizme in za poškodovane gostiteljske celice. Ti receptorji so ključnega pomena za delovanje nevtrofilcev, saj jim omogočajo regulacijo vnetnega odziva, diferenciacijo, priklic drugih celic imunskega sistema in fagocitozo. Mnogi od teh receptorjev pripadajo družini z G-proteini sklopljenih receptorjev. GPCR-ji imajo značilno strukturo sedmih α-vijačnic, prenos signala prek GPCR-jev pa največkrat poteka preko heterotrimernih G-proteinov. Seminarska naloga obravnava tako splošne značilnosti GPCR-jev, kot tudi podrobneje opiše mehanizme delovanja in funkcije nekaterih bolj znanih GPCR-jev izraženih na membranah nevtrofilcev, ki delujejo po principu vzorčnega prepoznavanja: družina formil peptidnih receptorjev (FPRs), purinergični receptor P2Y2R in dva člana družine receptorjev prostih maščobnih kislin FFA2R in GPR84. Poleg tega prek relevantnih primerov razlaga nekatere ključne pojme in koncepte v biokemiji kot so ortosterično vezavno mesto, alosterični receptorski modulatorji, vzorčno prepoznavanje, homologna in heterologna desenzibilizacija, receptorska transaktivacija, funkcionalna selektivnost in pa tudi pojme, ki se nanašajo na same nevtrofilce kot sta kemotaksija in primiranje. Na koncu se seminarska naloga naveže še na uporabnost poznavanja strukture in delovanja GPCR-jev izraženih v nevtrofilcih pri zdravljenju različnih imunskih obolenj.

==Jakob Urh Veler - Gvanilil ciklaze kot ključni receptorji in encimi pri celični biosignalizaciji==
Družina proteinov gvanilat ciklaze/gvanilil ciklaze (GC) v svoji katalitični domeni ciklizirajo GTP v cGMP. Ciklični GMP je sekundarni sporočevalec. Z nadaljno kaskado vpliva na protein kinaze (cGK), fosfodiesteraze (PDE) in ionske kanalčke (CNG). So pomembne za pravilno delovanje več organskih sistemov. Glede na strukturne, funkcionalne in regulatorne značilnosti GC delimo na membranske (mGC/pGC) in topne (sGC) oblike. Poznamo tipične in atipične sGC. Po priporočeni nomenklaturi poznamo 7 tipov mGC: MG-A, MG-B, MG-C, MG-D, MG-E, MG-F in MG-G. Vlogo encima in receptorja opravljajo topne gvanilil ciklaze v citosolu in membranske na celični membrani. Aktivirane so lahko tudi z endogenim NO, O2, HCO3-, natriuretskimi hormoni in s Ca2+-vezanimi proteini. V nadaljevanju podrobneje opisana aktivacija sGC z NO ter aktivacija GC-A z atrijskim natriuretskim hormonom (ANF). Z manipulacijo genov za zapis gvanilil ciklaz so odkrili njihove vloge v celicah in pomen specifičnih domen. Z različno stopnjo izražanja izoencimov je v celicah visoka diverziteta GC, zato je to mrežo signalizacije brez in vivo opazovanja zahtevno raziskovati. Približno 60 let že raziskujejo gvanilil ciklaze. Razumevanje te signalne poti je ključnega pomena za zdravljenje določenih bolezenskih stanj, saj imajo zdravila več tarčnih mest za delovanje.

==Domen Trontelj - G protein sklopljeni receptorji v fiziologiji okusa in farmakologiji==
G protein sklopljeni receptorji (GPCR), predstavljajo največjo družino receptorjev pri sesalcih in so ključni za uravnavanje večine fizioloških funkcij. Poleg posredovanja pri zaznavi vonja in vida, so prav tako prenašalci signala treh osnovnih okusov- sladko, umami in grenko, prav tako pa so ključnega pomena pri zaznavanju okusa kokumi. Nahajajo se v specializiranih okuševalnih celicah (TRC) znotraj brbončic. Tip I okuševalnih GPCR-jev (TAS1R) so heterodimerni kompleksi, ki skužijo kot receptorji za sladko (TAS1R2/TAS1R3) ali umami (TAS1R1/TAS1R3) okus, medtem ko Tip II obsega monomerne receptorje za grenak okus ali pa kokumi/kalcijeve receptorje.
Receptorji za sladko, umami in kokumi delijo strukturne podobnosti, saj vsebujejo več mest za vezavo agonistov z izrazito selektivnostjo, medtem ko večina grenkih receptorjev vsebuje le eno vezavno mesto, ki neselektivno sprejme veliko različnih ligandov. Vezava agonistov na receptor aktivira sekundarnih prenašalce, kar privede do vdora kalcija, to vodi do depolarizacije celice in na koncu sprostitve nevrotransmiterja.
Kljub nedavnim napredkom na področju raziskav konformacijskih sprememb, potrebnih za aktivacijo receptorja, ostaja še veliko nerešenih. V zadnjih letih so različni pristopi, ki združujejo heterologno izražanje, mutagenezo, homologno modeliranje in knockout študije na miših, skupaj ponudili vpogled v strukturo in pozicijo vezavnih mest za ligande in mehanizme ortosterične in alosterične modulacije.