Wiki FKKT - User contributions [en]

Seminarji SB 2021/22

2022-05-09T21:56:34Z

Ekanalec:

V študijskem letu 2021/22 študentje pri Sintezni biologiji predstavljajo naslednje teme:

RAZISKOVALNI ČLANKI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) 

# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Kombinatori%C4%8Dni_pristopi_pri_na%C4%8Drtovanju_medproteinskih_interakcij%2C_uravnavanih_s_svetlobnimi_stikali Kombinatorični pristopi pri načrtovanju medproteinskih interakcij, uravnavanih s svetlobnimi stikali] (Neža Žerjav)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/De_novo_na%C4%8Drtovanje_transkripcijskega_faktorja_za_uporabo_v_progesteronskem_biosenzorju ''De novo'' načrtovanje transkripcijskega faktorja za uporabo v progesteronskem biosenzorju] (Polona Skrt)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Prozdravila_na_osnovi_siRNA%2C_ki_aktivirajo_RNA-interferenco_kot_odziv_na_prisotnost_specifi%C4%8Dnega_RNA-biomarkerja Prozdravila na osnovi siRNA, ki aktivirajo RNA-interferenco kot odziv na prisotnost specifičnega RNA-biomarkerja] (Tina Zavodnik)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Bifunkcionalno_optogenetsko_stikalo_za_izboljšanje_proizvodnje_šikimske_kisline_v_E._coli Bifunkcionalno optogenetsko stikalo za izboljšanje proizvodnje šikimske kisline v ''E. coli''] (Meta Kodrič)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Inžiniring_in_izkoriščanje_sintetične_alosterije_luciferaze_NanoLuc Inžiniring in izkoriščanje sintetične alosterije luciferaze NanoLuc] (Rebeka Dajčman)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Modularen_RNA_interferenčni_sistem_za_regulacijo_multipleksnih_genov Modularen RNA interferenčni sistem za regulacijo multipleksnih genov] (Marko Pavleković)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Označevanje_bioloških_celic_za_zanesljivo_celično_inženirstvo Označevanje bioloških celic za zanesljivo celično inženirstvo] (Neža Blaznik)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Z_biosenzorjem_usmerjen_inžiniring_Cupriavidus_necator_H16_za_avtotrofno_proizvodnjo_manitola Z biosenzorjem usmerjen inženiring ''Cupriavidus necator'' H16 za avtotrofno proizvodnjo manitola] (Teo Nograšek)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/CelloSelect_%E2%80%93_sinteti%C4%8Dna_celobiozna_presnovna_pot_za_izbor_stabilnih_transgenih_celi%C4%8Dnih_linij_CHO CelloSelect – sintetična celobiozna presnovna pot za izbor stabilnih transgenih celičnih linij CHO] (Nika Vegelj)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Hipersensitiven_genetsko_kodiran_fluorescen%C4%8Dni_indikator_%28roGFP2-Prx1%29_za_kontinuirno_merjenje_znotrajceli%C4%8Dnega_H2O2_med_mikro-kultivacijo_celic#Literatura Hipersensitiven genetsko kodiran fluorescenčni indikator (roGFP2-Prx1) za kontinuirno merjenje znotrajceličnega H2O2 med mikro-kultivacijo celic] (Eva Kanalec)

NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.) 

# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/MIBOM_-_biokompatibilni_material_iz_školjk MIBOM - biokompatibilni material iz školjk] (Manca Osolin) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BOOM_V_-_bakterijski_membranski_vezikli_za_zaščito_rastlin_pred_patogeni BOOM V - bakterijski membranski vezikli za zaščito rastlin pred patogeni] (Eva Gartner) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/LET.IT.BEE_-_paradižnik,_katerega_cvetovi_razgradijo_insekticid LET.IT.BEE - paradižnik, katerega cvetovi razgradijo insekticid] (Barbara Jaklič) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Kissed_by_light_-_sistem_proti_oku%C5%BEbi_opeklin Kissed by light - sistem proti okužbi opeklin] (Nina Varda)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Gutail_Floractory_-_probiotične_bakterije_za_zaščito_črevesja_pred_vnetji Gutail Floractory - probiotične bakterije za zaščito črevesja pred vnetji] (Karmen Mlinar)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/AptaVita_-_diagnostika_pomanjkanja_vitaminov_z_aptacimi AptaVita - diagnostika pomanjkanja vitaminov z aptacimi] (Valeriya Musina)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/P.L.A.N.T._-_rastlinski_detekcijski_sistem_za_bojne_strupe P.L.A.N.T. - rastlinski detekcijski sistem za bojne strupe] (Tina Logonder)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Kolorimetrični_sistem_za_zaznavanje_virusov_na_podlagi_G_-_kvadrupleksov Kolorimetrični sistem za zaznavanje virusov na podlagi G-kvadrupleksov] (Nastja Feguš)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Aprifreeze Aprifreeze - zaščita marelic pred spomladanskimi pozebami] (Laura Gašperšič) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/OpenPlast_-_kloroplastni_brezcelični_sistemi_za_hitrejšo_karakterizacijo_genetskih_delov OpenPlast - kloroplastni brezcelični sistemi za hitrejšo karakterizacijo genetskih delov] (Kim Glavič) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/PHEAST_-_P._pastoris_za_odstranjevanje_metana PHEAST - ''P. pastoris'' za odstranjevanje metana] (Ana Potočnik) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/ELIXIO_-Mikrobni_konzorcij_za_vonj_po_vijolicah ELIXIO Mikrobni konzorcij za vonj po vijolicah] (Ajda Godec) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Agrobactory_593_-_Modularna_bakterijska_platforma_za_pripravo_biopesticidov Agrobactory 593 - Modularna bakterijska platforma za pripravo biopesticidev] (Tim Nograšek) 
----

Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Povzetek je treba objaviti dva dni pred predstavitvijo do polnoči (za seminarje v sredo torej v ponedeljek). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo razprava, ki praviloma ne bo daljša od 5 minut.

Hipersensitiven genetsko kodiran fluorescenčni indikator (roGFP2-Prx1) za kontinuirno merjenje znotrajceličnega H2O2 med mikro-kultivacijo celic

2022-05-09T21:54:46Z

Ekanalec: /* Literatura */

Izhodiščni članek:[https://bio-protocol.org/e4317 V. Gast, V. Siewers, M. Molin: A Hypersensitive Genetically Encoded Fluorescent Indicator (RoGFP2-Prx1) Enables Continuous Measurement of Intracellular H2O2 during Cell Micro-Cultivation. Bio Protoc. 2022, 12, 1–12.]
==Uvod ==
Saccharomyces cerevisiae je zelo pogosto uporabljena kvasovka v industriji, pogosto pa se jo uporablja tudi kot modelni organizem za namen proučevanja evkariontske celične biologije. In za slednji namen je bila uporabljena tudi v tem članku, ko so proučevali nastajanje in kopičenje znotrajceličnega H2O2. [1]
Dokazano je bilo, da v primeru izražanja velike količine rekombinantnih proteinov (npr. v biofarmacevtski industriji) vpliva na metabolizem celice, v kateri se protein izraža. To v kombinaciji s pogoji v bioreaktorju (prisotnost hidrodinamske sile in nehomogenost) lahko povzroča stresne pogoje v celicah. Celica se na visoko raven izražanja rekombinantnih pogojev prilagodi s povečanjem proizvodnje energije, to pa lahko vodi do porasta nastajanja reaktivnih kisikovih zvrsti (ROS). Kopičenje znotraj celičnih ROS lahko moti celično aktivnost [2]. ROS nastajajo pri nepopolni redukciji kisika v vodo, ena izmed takih zvrsti je tudi H2O2. V evkariontskih celicah večina H2O2 nastaja v mitohondrijih, poleg tega pa je pomemben vir H2O2 tudi proizvodnja sekretornih proteinov. H2O2 se v tem primeru tvori kot posledica tvorjenja in razpadanja disulfidnih vezi pri proteinih, še preden te zavzamejo končno obliko. To se dogaja tudi pri proizvodnji rekombinantnih proteinov, kjer je cilj proizvodnja velike količine sekretornih proteinov. Povečana tvorba sekretonih proteinov tako lahko povzroči povišano proizvodnjo H2O2 in s tem potencialni oksidativni stres. [1]
Protein kinaza Gcn2 pa je lahko aktiviran tudi ob dodatku H2O2 v medij. Gcn2 pri Saccharomyces cerevisiae ima pomembno vlogo pri aminokislinskem stradanju. Molekula tRNA, ki ne vsebuje aminokisline aktivira Gcn2, ki nato fosforilira translacijski indikacijski faktor eIF2a, kar vodi v zmanjšanje iniciacije translacije [3].
V preteklosti so za merjenje reaktivnih kisikovih zvrsti (ROS) uporabljali različna ROS-občutljiva barvila. Taka barvila so nedefinirano specifična in imajo slabo ločljivost tako prostorsko kot časovno. Nova tehnologija, z genetsko kodiranimi fluorescenčni indikatorji (GEFI), pa omenjenih pomanjkljivosti nimajo. GEFI so fluorescenčni biosenzorji, ki omogočajo spremljanje celičnih procesov v realnem času, med drugim tudi spremljanje spojin kot je H2O2. Zaradi metod merjenja in zaznavanja H2O2 je proučevaje teh procesov precej zapleteno. Sicer pa je dostopnih vse več genetsko kodiranih fluorescenčnih indikatorjev (GEFIs), ki lahko specifično zaznavajo nizke koncentracije znotrajceličnega vodikovega peroksida. V tem članku so uporabili GEFI senzor, ki je sestavljen iz dveh fuzijskih proteinov; prvi jeH2O2- reaktiven perokisredoksin (npr. pri kvasovkah Prx1), drugi fuzijski protein pa je roGFP (zeleni fluorescenčni protein). [1].
==Rezultati==
V članku je predstavljen protokol uporabe senzorja roGFP2-Prx1 in vivo za merjenje citosolnega H2O2 med kontinuirno mikro-kultivacijo Saccharomyces cerevisiae v BioLectorju (Mp2 Labs). Protokol je bil uspešno uporabljen za detekcijo sprememb na ravni citosolnega H2O2 v Saccharomyces cerevisiae, ki nastaja zaradi proizvajanja rekombinantnih proteinov. Pričakovano je, da bi bil senzor uporaben tudi za merjenje H2O2 iz drugih virov, ne le zgolj pri proizvodnji rekombinantih proteinov [1].
Zanimala jih je tudi raven protein kinaze Gcn2 pri proizvodnji rekombinantnega proteina. Zato so v študiji preučevali ali kinazo Gcn2 lahko aktivira tudi endogeni H2O2, ki nastaja pri proizvodnji rekombinantnih proteinov in ali bi odstranitev kinaze vplivala na citosolni H2O2 ter na učinkovitost proizvodnje rekombinantnih proteinov [1].
===Genetsko kodirani fluorescenčni indikator roGFP-Prx1===
Osnova za specifičnost GEFI senzorja, ki so ga uporabili v tem protokolu, dosežejo z uporabo dveh fuzijskih proteinov, ki skupaj tvorita redoks par. Eden od fuzijskih proteinov je H2O2- reaktivna perokisredoksin (npr. pri kvasovkah Prx1), drugi fuzijski protein pa je roGFP (zeleni fluorescenčni protein). roGFP2 je izboljšan GFP, ima dve cisteina v neposredni bližini kromofora. Ob nastajanju ali razpadanju disulfidnih vezi med omenjenima cisteinoma pride do spremembe protonacijskega stanja kromofora, kar spremeni valovno dolžino vzbujanja. Pri reakciji H2O2 dva cisteina na Prx1 tvorita disulfidno vez, ki nato reagira z cisteini na roGFP2 ter tvori mešano disulfidno vez. Tvorba te notranje disulfdne vezi med Prx1 in roGFP2 je razlog za spremembo valovne dolžine vzbujanja. Vrh vzbujanja za roGFP2 je pri 488 nm v reducirani obliki, v oksidirani obliki pa je vrh vzbujanjapri 400 nm. Funkcionalnost in občutljivost senzorjev v celicah so testirali z dodajanjem endogenega H2O2 in reducirnega sredstva (DTT) v medij. Senzor roGFP-Prx1 zaznava tako reduktivne kot oksidativne spremembe v zunajceličnem okolju [1].
===Priprava sevov Saccharomyces cerevisiae z roGFP-Prx1===
Pri eksperimentu so uporabili Saccharomyces cerevisiae sev B184ura3∆ in plazmida pRS416-TEF1-roGFP2-PRX1 ter kontrolni plazmid pRS416M1-TEF1. Kontroli plazmid je bil skonstruiran tako, da so mu odstranili vsa restrikcijska mesta razen BamHI in EcoRI. Navedene plazmide so s transformacijo vnesli Saccharomyces cerevisiae. Tako pripravljene celice so gojili na minimalnem gojišču brez uracila (SD-URA agar plošče) [1].
Mikro-kultivacijo so izvajali v BioLector I (Mp2 Labs). BioLectore je sistem, ki temelji na standardnem formatu mikrotitrskih plošč z 48 vdolbinicami, ki pa hkrati omogoča merjenje različnih parametrov, med katerimi je tudi fluorescenca molekul. Ta sistem je omogočil spremljanje stanja v realnem času [4].
===Določanje vrednosti znotrajceličnega H2O2===
Analizirali so podatke štirih vzorčenih sevov Saccharomyces cerevisiae:
*B184 (zapis za rekombinantni protein amilazo in vsebuje gen za Gcn2)
*B184 gcn2∆ (zapis za rekombnantni protein amilazo in ne vsebuje gena za Gcn2)
*B184 kontrolni plazmid (ne vsebuje zapisa za rekombinantni protein in vsebuje gen za Gcn2)
*B184 gcn2∆ kontrolni plazmid (ne vsebuje zapisa za rekombinantni protein in ne vsebuje gena za Gcn2)
Za analizo so bili uporabljeni podatki, kjer je bilo pri UV-GFP in GFP povečanje vsaj za 100 in pri OD620 povečanje vsaj za 20. Podali so grafe za OD620, UV-GFP in GFP v odvisnosti od časa, na katerih so med seboj primerjali podatke za zgoraj navedene seve [1].
Fluorescenca izmerjena pri sevu s kontrolnim plazmidom ustreza avtoflurescenci posameznega plazmida. Zato je te vrednosti potrebno odšteti od vrednosti izmerjenih pri sevih, ki vsebujejo plazmid, ki nosi zapis za senzor. Nato pa določimo razmerje Ox/Red. Maksimum vzbujanja roGFP2 v reducirani obliki je pri 488 nm, v oksidirani obliki pa je maksimum vzbujanja roGFP2 pri 400 nm. Razmerje Ox/red dobimo z deljenjem signala pri 400 nm z signalom pri 488 nm. V nestresnih pogojih endogeni H2O2 na bazalni ravni je to razmerje blizu ena [1].
Sev, ki vsebuje zapis za rekombinantni protein (amilazo) in hkrati vsebuje gen za protein kinazo Gcn2 je imel skozi celoten čas gojenja razmerje Ox/Red višje kot kontrolni sev, ki je vseboval gen za protein kinazo Gcn2, ni pa vseboval zapisa za rekombinantni protein. To nakazuje na višjo raven H2O2 v citosolu, ki je nastajal kot posledica izražanja rekombinantnega proteina [1].
Sev, ki so vsebovali gen za protein kinazo Gcn2 so primerjali s setom sevov, ki nista vsebovala zapisa za ta gen. Eden izmed teh dveh sevov je vseboval zapis za rekombinanti protein (amilazo), drugi sev pa je bil kontroli in zapisa za rekombinantni protein ni vseboval. Odstranitev gena za protein kinazo Gcn2 je vodila do zmanjšanja vsebnosti citosolnega H2O2 v sevu, ki proizvaja rekombinantni protein, kljub temu da je bilo v tem primeru izraženo dvakrat več proteina kot pri sevu, ki je vseboval gen za Gcn2. Pri kontrolnih sevih, ki nimata zapisa za rekombinantni protein pa prisotnost oziroma odsotnost gena za protein kinazo Gcn2, ni bilo bistvene razlike v razmerju Ox/Red [1].
==Zaključek ==
Indikator roGFP2-Prx1, se uporablja za določanje znotrajceličnega H2O2, ki nastaja kot posledica izražanja rekombinantnih proteinov oziroma drugih dejavnikov v celici, ki povzročajo nastajanje ROS. V primerjavi z ROS-občutljivimi barvili, ki so jih uporabljali v preteklosti, omogočajo genetsko kodiranih fluorescenčnih indikatorjev (GEFI) natančnejše, relativno hitro in ob enem tudi enostavnejše spremljanje procesov v realnem času. V članku je opisan protokol za uporabo indikatorja roGFP-Prx1 v kvasovki Saccharomyces cerevisiae. Ugotavljali pa so tudi kakšen je vpliv prisotnosti gena za protein, kinazo Gcn2. Za tega se je izkazalo, da odsotnost tega gena povzroči nižjo raven citosolnega H2O2.
==Literatura ==
[1] V. Gast, V. Siewers, M. Molin: A Hypersensitive Genetically Encoded Fluorescent Indicator (RoGFP2-Prx1) Enables Continuous Measurement of Intracellular H2O2 during Cell Micro-Cultivation. Bio Protoc. 2022, 12, 1–12.

[2] V. Chevallier, M. R. Andersen, L. Malphettes: Oxidative Stress-Alleviating Strategies to Improve Recombinant Protein Production in CHO Cells. Biotechnol. Bioeng. 2018, 117, 1172–1186.

[3] B. A. Castilho, R. Shanmugam, R. C. Silva, R. Ramesh, B. M. Himme, E. Sattlegger: Keeping the EIF2 Alpha Kinase Gcn2 in Check. Biochim. Biophys. Acta - Mol. Cell Res. 2014, 1843, 1948–1968.

[4] Biolector. Mp2 Labs. https://www.m2p-labs.com/bioreactors/biolector-modules/. (dostop: 5.5.2022)

Hipersensitiven genetsko kodiran fluorescenčni indikator (roGFP2-Prx1) za kontinuirno merjenje znotrajceličnega H2O2 med mikro-kultivacijo celic

2022-05-09T21:54:00Z

Ekanalec: New page: Izhodiščni članek:[https://bio-protocol.org/e4317 V. Gast, V. Siewers, M. Molin: A Hypersensitive Genetically Encoded Fluorescent Indicator (RoGFP2-Prx1) Enables Continuous Measurement...

Izhodiščni članek:[https://bio-protocol.org/e4317 V. Gast, V. Siewers, M. Molin: A Hypersensitive Genetically Encoded Fluorescent Indicator (RoGFP2-Prx1) Enables Continuous Measurement of Intracellular H2O2 during Cell Micro-Cultivation. Bio Protoc. 2022, 12, 1–12.]
==Uvod ==
Saccharomyces cerevisiae je zelo pogosto uporabljena kvasovka v industriji, pogosto pa se jo uporablja tudi kot modelni organizem za namen proučevanja evkariontske celične biologije. In za slednji namen je bila uporabljena tudi v tem članku, ko so proučevali nastajanje in kopičenje znotrajceličnega H2O2. [1]
Dokazano je bilo, da v primeru izražanja velike količine rekombinantnih proteinov (npr. v biofarmacevtski industriji) vpliva na metabolizem celice, v kateri se protein izraža. To v kombinaciji s pogoji v bioreaktorju (prisotnost hidrodinamske sile in nehomogenost) lahko povzroča stresne pogoje v celicah. Celica se na visoko raven izražanja rekombinantnih pogojev prilagodi s povečanjem proizvodnje energije, to pa lahko vodi do porasta nastajanja reaktivnih kisikovih zvrsti (ROS). Kopičenje znotraj celičnih ROS lahko moti celično aktivnost [2]. ROS nastajajo pri nepopolni redukciji kisika v vodo, ena izmed takih zvrsti je tudi H2O2. V evkariontskih celicah večina H2O2 nastaja v mitohondrijih, poleg tega pa je pomemben vir H2O2 tudi proizvodnja sekretornih proteinov. H2O2 se v tem primeru tvori kot posledica tvorjenja in razpadanja disulfidnih vezi pri proteinih, še preden te zavzamejo končno obliko. To se dogaja tudi pri proizvodnji rekombinantnih proteinov, kjer je cilj proizvodnja velike količine sekretornih proteinov. Povečana tvorba sekretonih proteinov tako lahko povzroči povišano proizvodnjo H2O2 in s tem potencialni oksidativni stres. [1]
Protein kinaza Gcn2 pa je lahko aktiviran tudi ob dodatku H2O2 v medij. Gcn2 pri Saccharomyces cerevisiae ima pomembno vlogo pri aminokislinskem stradanju. Molekula tRNA, ki ne vsebuje aminokisline aktivira Gcn2, ki nato fosforilira translacijski indikacijski faktor eIF2a, kar vodi v zmanjšanje iniciacije translacije [3].
V preteklosti so za merjenje reaktivnih kisikovih zvrsti (ROS) uporabljali različna ROS-občutljiva barvila. Taka barvila so nedefinirano specifična in imajo slabo ločljivost tako prostorsko kot časovno. Nova tehnologija, z genetsko kodiranimi fluorescenčni indikatorji (GEFI), pa omenjenih pomanjkljivosti nimajo. GEFI so fluorescenčni biosenzorji, ki omogočajo spremljanje celičnih procesov v realnem času, med drugim tudi spremljanje spojin kot je H2O2. Zaradi metod merjenja in zaznavanja H2O2 je proučevaje teh procesov precej zapleteno. Sicer pa je dostopnih vse več genetsko kodiranih fluorescenčnih indikatorjev (GEFIs), ki lahko specifično zaznavajo nizke koncentracije znotrajceličnega vodikovega peroksida. V tem članku so uporabili GEFI senzor, ki je sestavljen iz dveh fuzijskih proteinov; prvi jeH2O2- reaktiven perokisredoksin (npr. pri kvasovkah Prx1), drugi fuzijski protein pa je roGFP (zeleni fluorescenčni protein). [1].
==Rezultati==
V članku je predstavljen protokol uporabe senzorja roGFP2-Prx1 in vivo za merjenje citosolnega H2O2 med kontinuirno mikro-kultivacijo Saccharomyces cerevisiae v BioLectorju (Mp2 Labs). Protokol je bil uspešno uporabljen za detekcijo sprememb na ravni citosolnega H2O2 v Saccharomyces cerevisiae, ki nastaja zaradi proizvajanja rekombinantnih proteinov. Pričakovano je, da bi bil senzor uporaben tudi za merjenje H2O2 iz drugih virov, ne le zgolj pri proizvodnji rekombinantih proteinov [1].
Zanimala jih je tudi raven protein kinaze Gcn2 pri proizvodnji rekombinantnega proteina. Zato so v študiji preučevali ali kinazo Gcn2 lahko aktivira tudi endogeni H2O2, ki nastaja pri proizvodnji rekombinantnih proteinov in ali bi odstranitev kinaze vplivala na citosolni H2O2 ter na učinkovitost proizvodnje rekombinantnih proteinov [1].
===Genetsko kodirani fluorescenčni indikator roGFP-Prx1===
Osnova za specifičnost GEFI senzorja, ki so ga uporabili v tem protokolu, dosežejo z uporabo dveh fuzijskih proteinov, ki skupaj tvorita redoks par. Eden od fuzijskih proteinov je H2O2- reaktivna perokisredoksin (npr. pri kvasovkah Prx1), drugi fuzijski protein pa je roGFP (zeleni fluorescenčni protein). roGFP2 je izboljšan GFP, ima dve cisteina v neposredni bližini kromofora. Ob nastajanju ali razpadanju disulfidnih vezi med omenjenima cisteinoma pride do spremembe protonacijskega stanja kromofora, kar spremeni valovno dolžino vzbujanja. Pri reakciji H2O2 dva cisteina na Prx1 tvorita disulfidno vez, ki nato reagira z cisteini na roGFP2 ter tvori mešano disulfidno vez. Tvorba te notranje disulfdne vezi med Prx1 in roGFP2 je razlog za spremembo valovne dolžine vzbujanja. Vrh vzbujanja za roGFP2 je pri 488 nm v reducirani obliki, v oksidirani obliki pa je vrh vzbujanjapri 400 nm. Funkcionalnost in občutljivost senzorjev v celicah so testirali z dodajanjem endogenega H2O2 in reducirnega sredstva (DTT) v medij. Senzor roGFP-Prx1 zaznava tako reduktivne kot oksidativne spremembe v zunajceličnem okolju [1].
===Priprava sevov Saccharomyces cerevisiae z roGFP-Prx1===
Pri eksperimentu so uporabili Saccharomyces cerevisiae sev B184ura3∆ in plazmida pRS416-TEF1-roGFP2-PRX1 ter kontrolni plazmid pRS416M1-TEF1. Kontroli plazmid je bil skonstruiran tako, da so mu odstranili vsa restrikcijska mesta razen BamHI in EcoRI. Navedene plazmide so s transformacijo vnesli Saccharomyces cerevisiae. Tako pripravljene celice so gojili na minimalnem gojišču brez uracila (SD-URA agar plošče) [1].
Mikro-kultivacijo so izvajali v BioLector I (Mp2 Labs). BioLectore je sistem, ki temelji na standardnem formatu mikrotitrskih plošč z 48 vdolbinicami, ki pa hkrati omogoča merjenje različnih parametrov, med katerimi je tudi fluorescenca molekul. Ta sistem je omogočil spremljanje stanja v realnem času [4].
===Določanje vrednosti znotrajceličnega H2O2===
Analizirali so podatke štirih vzorčenih sevov Saccharomyces cerevisiae:
*B184 (zapis za rekombinantni protein amilazo in vsebuje gen za Gcn2)
*B184 gcn2∆ (zapis za rekombnantni protein amilazo in ne vsebuje gena za Gcn2)
*B184 kontrolni plazmid (ne vsebuje zapisa za rekombinantni protein in vsebuje gen za Gcn2)
*B184 gcn2∆ kontrolni plazmid (ne vsebuje zapisa za rekombinantni protein in ne vsebuje gena za Gcn2)
Za analizo so bili uporabljeni podatki, kjer je bilo pri UV-GFP in GFP povečanje vsaj za 100 in pri OD620 povečanje vsaj za 20. Podali so grafe za OD620, UV-GFP in GFP v odvisnosti od časa, na katerih so med seboj primerjali podatke za zgoraj navedene seve [1].
Fluorescenca izmerjena pri sevu s kontrolnim plazmidom ustreza avtoflurescenci posameznega plazmida. Zato je te vrednosti potrebno odšteti od vrednosti izmerjenih pri sevih, ki vsebujejo plazmid, ki nosi zapis za senzor. Nato pa določimo razmerje Ox/Red. Maksimum vzbujanja roGFP2 v reducirani obliki je pri 488 nm, v oksidirani obliki pa je maksimum vzbujanja roGFP2 pri 400 nm. Razmerje Ox/red dobimo z deljenjem signala pri 400 nm z signalom pri 488 nm. V nestresnih pogojih endogeni H2O2 na bazalni ravni je to razmerje blizu ena [1].
Sev, ki vsebuje zapis za rekombinantni protein (amilazo) in hkrati vsebuje gen za protein kinazo Gcn2 je imel skozi celoten čas gojenja razmerje Ox/Red višje kot kontrolni sev, ki je vseboval gen za protein kinazo Gcn2, ni pa vseboval zapisa za rekombinantni protein. To nakazuje na višjo raven H2O2 v citosolu, ki je nastajal kot posledica izražanja rekombinantnega proteina [1].
Sev, ki so vsebovali gen za protein kinazo Gcn2 so primerjali s setom sevov, ki nista vsebovala zapisa za ta gen. Eden izmed teh dveh sevov je vseboval zapis za rekombinanti protein (amilazo), drugi sev pa je bil kontroli in zapisa za rekombinantni protein ni vseboval. Odstranitev gena za protein kinazo Gcn2 je vodila do zmanjšanja vsebnosti citosolnega H2O2 v sevu, ki proizvaja rekombinantni protein, kljub temu da je bilo v tem primeru izraženo dvakrat več proteina kot pri sevu, ki je vseboval gen za Gcn2. Pri kontrolnih sevih, ki nimata zapisa za rekombinantni protein pa prisotnost oziroma odsotnost gena za protein kinazo Gcn2, ni bilo bistvene razlike v razmerju Ox/Red [1].
==Zaključek ==
Indikator roGFP2-Prx1, se uporablja za določanje znotrajceličnega H2O2, ki nastaja kot posledica izražanja rekombinantnih proteinov oziroma drugih dejavnikov v celici, ki povzročajo nastajanje ROS. V primerjavi z ROS-občutljivimi barvili, ki so jih uporabljali v preteklosti, omogočajo genetsko kodiranih fluorescenčnih indikatorjev (GEFI) natančnejše, relativno hitro in ob enem tudi enostavnejše spremljanje procesov v realnem času. V članku je opisan protokol za uporabo indikatorja roGFP-Prx1 v kvasovki Saccharomyces cerevisiae. Ugotavljali pa so tudi kakšen je vpliv prisotnosti gena za protein, kinazo Gcn2. Za tega se je izkazalo, da odsotnost tega gena povzroči nižjo raven citosolnega H2O2.
==Literatura ==
[1] V. Gast, V. Siewers, M. Molin: A Hypersensitive Genetically Encoded Fluorescent Indicator (RoGFP2-Prx1) Enables Continuous Measurement of Intracellular H2O2 during Cell Micro-Cultivation. Bio Protoc. 2022, 12, 1–12.
[2] V. Chevallier, M. R. Andersen, L. Malphettes: Oxidative Stress-Alleviating Strategies to Improve Recombinant Protein Production in CHO Cells. Biotechnol. Bioeng. 2018, 117, 1172–1186.
[3] B. A. Castilho, R. Shanmugam, R. C. Silva, R. Ramesh, B. M. Himme, E. Sattlegger: Keeping the EIF2 Alpha Kinase Gcn2 in Check. Biochim. Biophys. Acta - Mol. Cell Res. 2014, 1843, 1948–1968.
[4] Biolector. Mp2 Labs. https://www.m2p-labs.com/bioreactors/biolector-modules/. (dostop: 5.5.2022)

Struktura in funkcija končnih zaporedij koronavirusne genomske RNA

2021-05-05T11:27:08Z

Ekanalec:

==Uvod==
Celice, okužene z koronavirusom, vsebujejo 7 do 9 specifičnih virusnih mRNA s 3’ koterminalnimi konci. Vse mRNA molekule imajo na 5' koncih identična vodilna zaporedja, ki so dolga od 70 do 90 nukleotidov, na 3' koncu pa imajo poliA rep. Obstajata dva ključna elementa TRS (TRS; angl. transcriptional regulatory sequence), ki sta prisotna na 3′ koncu vodilnega zaporedja (TRS-L (angl. leader)) ter na 5′ koncu vsakega gena in delujeta kot cis-regulatorja transkripcije. Betakoronavirusi vsebujejo enako heptamerno zaporedje, 5’-UCUAAAC-3’, pri čemer ima SARS-CoV TRS 5’-ACGAAC-3’ kot osrednje zaporedje.

==5' UTR in sekundarne strukture mRNA==
5' neprevedena regija (UTR; angl. untranslated region) je regija na mRNA, ki se nahaja med mestom začetka transkripcije in enim nukleotidom pred začetnim kodonom (običajno je to AUG). Pomembna je pri nadaljnjih translacijskih in transkripcijskih mehanizmih. Včasih je (delno) prevedena v proteinske produkte, ki regulirajo translacijo glavnega kodirnega zaporedja mRNA, v veliko organizmih pa je 5' UTR popolnoma neprevedena in tvori kompleksne sekundarne strukture (dvojno vijačnico, lasne zanke, psevdovozle (PK; angl. pseudoknots) in tetrazanke (angl. tetraloops)), ki sodelujejo pri regulaciji translacije.

Nekatere izmed teh sekundarnih struktur so poimenovane stem-loops (SL). Zanke imajo večinoma obliko lasnih zank, se pa oblike lahko razlikujejo. Njihova vloga je največkrat povečanje strukturne stabilnosti mRNA. Pri virusih, natančneje koronavirusih, so pomembne zanke od SL1 do SL8, ki so bistvene za CoV podvajanje in sintezo virusne RNA. Sekundarne strukture v 5' končnih regijah so v veliki meri ohranjene, čeprav so nukleotidna zaporedja precej različna [https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/26958916/#&gid=article-figures&pid=figure-4-uid-3].

===Zanke SL1, SL2 in SL3===
SL1 ima dvodelno strukturo. Dve pirimidinski bazi delita SL1 zanko na zgornji in spodnji del. Zgornji del je pomemben za učinkovito virusno replikacijo. Spremembe, ki vplivajo na povezovanje baz na tem delu, lahko vplivajo na fenotipe virusa, in so lahko smrtonosne, medtem ko so spremembe na spodnjem delu virusi sposobni preživeti. Genomi, ki imajo spremembe v SL1, niso zmožni sintetizirati negativno polarne subgenomske RNA. Strukturna labilnost spodnje regije SL1 je pomembna za razmnoževanje virusa.

SL2 je najbolj ohranjena sekundarna struktura v 5' UTR. Ima 5 nukleotidov dolgo steblo, sestavljeno iz (C/U) UUG (U/C) in je najbolj ohranjeno zaporedje v 5' UTR. Zamenjava U48 s C ali A (sprememba U48C/U48A) je smrtonosna, virus, ki pa vsebuje spremembo U48G (zamenjava uracila z gvaninom na mestu 48) pa lahko preživi in raste ter izraža t.i. wild type fenotip. SL2 je torej iz strukturnega vidika zelo pomembna za preživetje virusov.

TRS oz. glavno TRS zaporedje nekaterih koronavirusov (npr. Sars-CoV, BCov) se nahaja v SL3 zanki. To zanko bi lahko našli tudi pri MHV virusu, vendar pri 37°C ni stabilna, zato je pri večini poskusov ne opazimo. TRS regija je enoverižna. Glavno TRS zaporedje ima ključno vlogo pri sintezi subgenomske RNA. Da lahko transkripcija poteka, je poleg drugih dejavnikov potrebna minimalna podobnost med TRS-L in TRS-B.

N protein se veže z veliko afiniteto in specifičnostjo na TRS-L. Vsebuje dve strukturno neodvisni RNA vezavni domeni: N-terminalna RNA vezavna domena (NTD; angl. N-terminal domain) in C-terminalna dimerizacijska domena (CTD; angl. C-terminal domain), ki sta povezani s Ser/Arg bogatim členom (angl. linker). Vezava proteina NTD na TRS je ključna za učinkovito sintezo subgenomske RNA.

===Zanke SL4, SL5 in SL6===
SL4 je sestavljena iz dveh delov, SL4A in SL4B. SL4B kot struktura ali kot zaporedje nima pomembnejše vloge pri virusni replikaciji, ampak sama celotna zanka deluje kot vmesnik (angl. spacer) in je pomembna za usmerjanje virusne subgenomske RNA.

SL5 zanka je pomembna pri replikaciji DI RNA (angl. defective interfering RNA) in se razteza od 5' UTR v zaporedje proteina nsp1. Ta protein pri SARS-CoV virusih zavira imunske funkcije gostiteljskega organizma in vpliva na translacijo gostiteljeve mRNA. SL5 ima obliko trifurkatne zanke, sestavljena je iz A, B in C delov in je od vseh zank najdaljša. Napake na SL5C zaradi zamenjave 4 nukleotidov rezultira v viabilnih rekombinantnih virusih z zgolj zmerno poškodovano virusno replikacijo.

SL6 zajema nukleotide 376-446 pri virusu MHV in kodira aminokislinske pozicije 56-79 za protein nsp1. Pri MHV SL6 ni ključnega pomena za virusno replikacijo, spremembe, ki vplivajo na SL6 so bolj pomembne zaradi njihovega vpliva na protein nsp1.

===Zanke PRI SARS-COV-2===
Pri SARS-CoV-2 opazimo zanke od SL1 do SL5, najdena pa je bila tudi manjša zanka med 4 in 5, ki so jo poimenovali SL4.5. Zanka SL1 ni ohranjena pri vseh sevih SARS-CoV-2 virusa. SL2 je primerljiva s SL3 pri BCoV virusu in je vključena v proces replikacije. Zanka (CUUGU) od SL2 je pomembna pri replikaciji MHV, kjer ima obliko U-obrata, medtem ko je pri SARS-CoV-2 v obliki tetra zanke.

SL3 zanka zajema TRS zaporedje. SL4 je razmeroma stabilna in dolga. Sama SL4 je pomembna pri sintezi subgenomskih RNA fragmentov. Na 3' delu 5' UTR je SL5 zanka, ki je bolj kompleksna, sestavljajo jo trije deli: SL5A, SL5B, SL5C. Pri Sars-CoV-2 se na SL5 nahaja nsp1 AUG začetni kodon.

==3' UTR in sekundarne strukture mRNA==
Koronavirusna 3' neprevedena regija (3' UTR) je sestavljena iz 300 do 500 nukleotidov in poliadenilacijskega repa oziroma poliA repa.

Različne študije so z uporabo algoritmov za zlaganje RNA, biokemičnih in funkcijskih študij poskušale preučiti strukturo in funkcijo 3' UTR. 3' UTR vsebujejo cis-delujoče regije, ki se zložijo v sekundarne strukture. Te prispevajo k večji stabilnosti ter sodelujejo pri tvorjenju intramolekularnih in intermolekularnih interakcij. Poleg tega pa ima 3' UTR tako kot tudi 5' UTR pomembno vlogo pri regulaciji RNA replikacije in transkripcije.

===Zanka BSL===
Proti 3' koncu, tik za stop kodonom N gena, se nahaja sekundarna struktura stebelne zanke (BSL; ang. bulged stem loop), ki je pri MHV dolga 68 nukleotidov. BSL ima ključno vlogo pri replikaciji virusne RNA. Štirje kovariantni bazni pari v tej zanki pa so ključni za funkcionalnost te sekundarne strukture.

===Psevdovozel===
Lasna zanka se nahaja od BSL proti 3’ koncu in tvori psevdovozel (PK; angl. pseudoknot - sekundarna struktura z vsaj dvema zankama, kjer se polovica ene zanke vstavi med polovici druge zanke) z BSL. Ta je pri različnih vrstah koronavirusov ohranjena po lokaciji in obliki. Po zaporedju nukleotidov pa se nekoliko razlikuje, kar nakazuje, da bi lahko deloval kot regulatorni kontrolni element.

Za trojni spoj alfa vijačnic S3 je bilo dokazano, da ta pripomore k stabilizaciji strukture psevdovozla. Konformacija psevdovozla je manj stabilna od konformacije dvojne lasne zanke. S3 pa naj bi imela tudi pomembno vlogo pri replikaciji.

Prekrivanje BSL in PK v 5 nukleotidih je razlog, da se te dve strukturi ne moreta hkrati popolnoma zložiti. To nakazuje, da vsak element tvori nadomestne konformacije in v določeni fazi RNA delujeta kot molekularno stikalo sinteze RNA.

===Zanka HVR===
Na primeru MHV je bilo ugotovljeno, da se navzdol od PK nahaja tako imenovana “multi-branch stem loop”. Gre za dolgo hipervariabilno regijo (HVR; angl. hypervariable region), ki v svoji strukturi vsebuje oligonukleotidno zaporedje 5'-GGAAGAGC-3' in je dobro ohranjeno med različnimi vrstami koronavirusov. V strukturi na 3' koncu najdemo tudi trojni spoj alfa vijačnic, ki jih označujemo s S3 in S4 in obdajata lasno zanko (S2-L2).

===Zanka L1===
Zanka 1 (L1; angl. loop-1) se nahaja med BSL in PK. Prihaja do interakcije med L1 in 3' koncem genoma s proteinskim kompleksom (nsp7, nsp8 in nsp9). To povzroči konformacijske spremembe v 3' koncu RNA, kar omogoči tvorbo psevdovozla, ki omogoča vezavo od RNA odvisne RNA-polimeraze (nsp12), helikaze in proteinov nsp14, nsp10. To pa omogoči iniciacijo sinteze negativne verige RNA.

Pri alfakoronavirusih je PK ohranjen, lahko pa je v njihovi strukturi odsotna BSL. Pri gamakoronavirusih je PK prisoten, ni pa znano, kakšna je njegova funkcija. Do tesnega prekrivanja med BSL in PK prihaja samo pri betakoronavirusih. Sekundarna struktura je pri betakoronavirusih ohranjena, čeprav se nukleotidno zaporedje med različnimi betakoronavirusi razlikuje.

==Interakcije med 5’ in 3’ koncema==
Interakcije med 5' in 3' koncema v pozitivno smernih RNA virusih preko RNA-RNA, RNA-protein ali protein-protein interakcij vodijo do cirkulacije genoma s pomočjo N proteina, ki tvori most med 5' in 3' koncema. Lahko pomaga tudi poli a vezavni protein (PABP; angl. poly A binding protein), vezan na 3' poli A rep, preko interakcije z eIF-4G, komponente eIF-4F kapa vezavnega proteina, ki se veže na mRNA kapo na 5’ koncu med translacijo.

Vezava N proteina s strukturo S3 in 15 nukleotidov dolgim poli A repom je dovolj za iniciacijo sinteze negativno smerne verige. Spremembe v 5' in 3' končnih zaporedjih zmanjšajo vezavno afiniteto med N proteinom in obema koncema, kar vpliva na učinkovitost iniciacije sinteze negativno smerne verige.

==Literatura==
*Y. Dong, J. L. Leibowitz: The Structure and Functions of Coronavirus Genomic 3’ and 5’ Ends. Virus Res. 2015, 206, 120–133.
*L. I. Sola, F. Almazán, S. Zúñiga, L. Enjuanes: Continuous and Discontinuous RNA Synthesis in Coronaviruses. Annu. Rev. Virol. 2015, 2, 265–288.
*K. Narayanan, C. Huang, K. Lokugamage, W. Kamitani, T. Ikegami, C.-T. K. Tseng, S. Makino: Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus Nsp1 Suppresses Host Gene Expression, Including That of Type I Interferon, in Infected Cells. J. Virol. 2008, 82, 4471–4479.
*Z. Miao, A. Tidu, G. Eriani, F. Martin: Secondary Structure of the SARS-CoV-2 5’-UTR. RNA Biol. 2021, 18, 447–456.
*C. ‐Y. Lo, T. ‐L. Tsai, C. ‐N. Lin, C. ‐H. Lin, H.‐Y. Wu: Interaction of coronavirus nucleocapsid protein with the 5′‐ and 3′‐ends of the coronavirus genome is involved in genome circularization and negative‐strand RNA synthesis. FEBS J. 2019, 286, 3222-3239

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Struktura in funkcija končnih zaporedij koronavirusne genomske RNA

2021-05-05T11:24:02Z

Ekanalec:

==Uvod==
Celice, okužene z koronavirusom, vsebujejo 7 do 9 specifičnih virusnih mRNA s 3’ koterminalnimi konci. Vse mRNA molekule imajo na 5' koncih identična vodilna zaporedja, ki so dolga od 70 do 90 nukleotidov, na 3' koncu pa imajo poliA rep. Obstajata dva ključna elementa TRS (TRS; angl. transcriptional regulatory sequence), ki sta prisotna na 3′ koncu vodilnega zaporedja (TRS-L (angl. leader)) ter na 5′ koncu vsakega gena in delujeta kot cis-regulatorja transkripcije. Betakoronavirusi vsebujejo enako heptamerno zaporedje, 5’-UCUAAAC-3’, pri čemer ima SARS-CoV TRS 5’-ACGAAC-3’ kot osrednje zaporedje.

==5' UTR in sekundarne strukture mRNA==
5' neprevedena regija (UTR; angl. untranslated region) je regija na mRNA, ki se nahaja med mestom začetka transkripcije in enim nukleotidom pred začetnim kodonom (običajno je to AUG). Pomembna je pri nadaljnjih translacijskih in transkripcijskih mehanizmih. Včasih je (delno) prevedena v proteinske produkte, ki regulirajo translacijo glavnega kodirnega zaporedja mRNA, v veliko organizmih pa je 5' UTR popolnoma neprevedena in tvori kompleksne sekundarne strukture (dvojno vijačnico, lasne zanke, psevdovozle (PK; angl. pseudoknots) in tetrazanke (angl. tetraloops)), ki sodelujejo pri regulaciji translacije.

Nekatere izmed teh sekundarnih struktur so poimenovane stem-loops (SL). Zanke imajo večinoma obliko lasnih zank, se pa oblike lahko razlikujejo. Njihova vloga je največkrat povečanje strukturne stabilnosti mRNA. Pri virusih, natančneje koronavirusih, so pomembne zanke od SL1 do SL8, ki so bistvene za CoV podvajanje in sintezo virusne RNA. Sekundarne strukture v 5' končnih regijah so v veliki meri ohranjene, čeprav so nukleotidna zaporedja precej različna [https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/26958916/#&gid=article-figures&pid=figure-4-uid-3].

===Zanke SL1, SL2 IN SL3===
SL1 ima dvodelno strukturo. Dve pirimidinski bazi delita SL1 zanko na zgornji in spodnji del. Zgornji del je pomemben za učinkovito virusno replikacijo. Spremembe, ki vplivajo na povezovanje baz na tem delu, lahko vplivajo na fenotipe virusa, in so lahko smrtonosne, medtem ko so spremembe na spodnjem delu virusi sposobni preživeti. Genomi, ki imajo spremembe v SL1, niso zmožni sintetizirati negativno polarne subgenomske RNA. Strukturna labilnost spodnje regije SL1 je pomembna za razmnoževanje virusa.

SL2 je najbolj ohranjena sekundarna struktura v 5' UTR. Ima 5 nukleotidov dolgo steblo, sestavljeno iz (C/U) UUG (U/C) in je najbolj ohranjeno zaporedje v 5' UTR. Zamenjava U48 s C ali A (sprememba U48C/U48A) je smrtonosna, virus, ki pa vsebuje spremembo U48G (zamenjava uracila z gvaninom na mestu 48) pa lahko preživi in raste ter izraža t.i. wild type fenotip. SL2 je torej iz strukturnega vidika zelo pomembna za preživetje virusov.

TRS oz. glavno TRS zaporedje nekaterih koronavirusov (npr. Sars-CoV, BCov) se nahaja v SL3 zanki. To zanko bi lahko našli tudi pri MHV virusu, vendar pri 37°C ni stabilna, zato je pri večini poskusov ne opazimo. TRS regija je enoverižna. Glavno TRS zaporedje ima ključno vlogo pri sintezi subgenomske RNA. Da lahko transkripcija poteka, je poleg drugih dejavnikov potrebna minimalna podobnost med TRS-L in TRS-B.

N protein se veže z veliko afiniteto in specifičnostjo na TRS-L. Vsebuje dve strukturno neodvisni RNA vezavni domeni: N-terminalna RNA vezavna domena (NTD; angl. N-terminal domain) in C-terminalna dimerizacijska domena (CTD; angl. C-terminal domain), ki sta povezani s Ser/Arg bogatim členom (angl. linker). Vezava proteina NTD na TRS je ključna za učinkovito sintezo subgenomske RNA.

===Zanke SL4, SL5 IN SL6===
SL4 je sestavljena iz dveh delov, SL4A in SL4B. SL4B kot struktura ali kot zaporedje nima pomembnejše vloge pri virusni replikaciji, ampak sama celotna zanka deluje kot vmesnik (angl. spacer) in je pomembna za usmerjanje virusne subgenomske RNA.

SL5 zanka je pomembna pri replikaciji DI RNA (angl. defective interfering RNA) in se razteza od 5' UTR v zaporedje proteina nsp1. Ta protein pri SARS-CoV virusih zavira imunske funkcije gostiteljskega organizma in vpliva na translacijo gostiteljeve mRNA. SL5 ima obliko trifurkatne zanke, sestavljena je iz A, B in C delov in je od vseh zank najdaljša. Napake na SL5C zaradi zamenjave 4 nukleotidov rezultira v viabilnih rekombinantnih virusih z zgolj zmerno poškodovano virusno replikacijo.

SL6 zajema nukleotide 376-446 pri virusu MHV in kodira aminokislinske pozicije 56-79 za protein nsp1. Pri MHV SL6 ni ključnega pomena za virusno replikacijo, spremembe, ki vplivajo na SL6 so bolj pomembne zaradi njihovega vpliva na protein nsp1.

===Zanke PRI SARS-COV-2===
Pri SARS-CoV-2 opazimo zanke od SL1 do SL5, najdena pa je bila tudi manjša zanka med 4 in 5, ki so jo poimenovali SL4.5. Zanka SL1 ni ohranjena pri vseh sevih SARS-CoV-2 virusa. SL2 je primerljiva s SL3 pri BCoV virusu in je vključena v proces replikacije. Zanka (CUUGU) od SL2 je pomembna pri replikaciji MHV, kjer ima obliko U-obrata, medtem ko je pri SARS-CoV-2 v obliki tetra zanke.

SL3 zanka zajema TRS zaporedje. SL4 je razmeroma stabilna in dolga. Sama SL4 je pomembna pri sintezi subgenomskih RNA fragmentov. Na 3' delu 5' UTR je SL5 zanka, ki je bolj kompleksna, sestavljajo jo trije deli: SL5A, SL5B, SL5C. Pri Sars-CoV-2 se na SL5 nahaja nsp1 AUG začetni kodon.

==3' UTR in sekundarne strukture mRNA==
Koronavirusna 3' neprevedena regija (3' UTR) je sestavljena iz 300 do 500 nukleotidov in poliadenilacijskega repa oziroma poliA repa.

Različne študije so z uporabo algoritmov za zlaganje RNA, biokemičnih in funkcijskih študij poskušale preučiti strukturo in funkcijo 3' UTR. 3' UTR vsebujejo cis-delujoče regije, ki se zložijo v sekundarne strukture. Te prispevajo k večji stabilnosti ter sodelujejo pri tvorjenju intramolekularnih in intermolekularnih interakcij. Poleg tega pa ima 3' UTR tako kot tudi 5' UTR pomembno vlogo pri regulaciji RNA replikacije in transkripcije.

===Zanka BSL===
Proti 3' koncu, tik za stop kodonom N gena, se nahaja sekundarna struktura stebelne zanke (BSL; ang. bulged stem loop), ki je pri MHV dolga 68 nukleotidov. BSL ima ključno vlogo pri replikaciji virusne RNA. Štirje kovariantni bazni pari v tej zanki pa so ključni za funkcionalnost te sekundarne strukture.

===Psevdovozel===
Lasna zanka se nahaja od BSL proti 3’ koncu in tvori psevdovozel (PK; angl. pseudoknot - sekundarna struktura z vsaj dvema zankama, kjer se polovica ene zanke vstavi med polovici druge zanke) z BSL. Ta je pri različnih vrstah koronavirusov ohranjena po lokaciji in obliki. Po zaporedju nukleotidov pa se nekoliko razlikuje, kar nakazuje, da bi lahko deloval kot regulatorni kontrolni element.

Za trojni spoj alfa vijačnic S3 je bilo dokazano, da ta pripomore k stabilizaciji strukture psevdovozla. Konformacija psevdovozla je manj stabilna od konformacije dvojne lasne zanke. S3 pa naj bi imela tudi pomembno vlogo pri replikaciji.

Prekrivanje BSL in PK v 5 nukleotidih je razlog, da se te dve strukturi ne moreta hkrati popolnoma zložiti. To nakazuje, da vsak element tvori nadomestne konformacije in v določeni fazi RNA delujeta kot molekularno stikalo sinteze RNA.

===Zanka HVR===
Na primeru MHV je bilo ugotovljeno, da se navzdol od PK nahaja tako imenovana “multi-branch stem loop”. Gre za dolgo hipervariabilno regijo (HVR; angl. hypervariable region), ki v svoji strukturi vsebuje oligonukleotidno zaporedje 5'-GGAAGAGC-3' in je dobro ohranjeno med različnimi vrstami koronavirusov. V strukturi na 3' koncu najdemo tudi trojni spoj alfa vijačnic, ki jih označujemo s S3 in S4 in obdajata lasno zanko (S2-L2).

===Zanka L1===
Zanka 1 (L1; angl. loop-1) se nahaja med BSL in PK. Prihaja do interakcije med L1 in 3' koncem genoma s proteinskim kompleksom (nsp7, nsp8 in nsp9). To povzroči konformacijske spremembe v 3' koncu RNA, kar omogoči tvorbo psevdovozla, ki omogoča vezavo od RNA odvisne RNA-polimeraze (nsp12), helikaze in proteinov nsp14, nsp10. To pa omogoči iniciacijo sinteze negativne verige RNA.

Pri alfakoronavirusih je PK ohranjen, lahko pa je v njihovi strukturi odsotna BSL. Pri gamakoronavirusih je PK prisoten, ni pa znano, kakšna je njegova funkcija. Do tesnega prekrivanja med BSL in PK prihaja samo pri betakoronavirusih. Sekundarna struktura je pri betakoronavirusih ohranjena, čeprav se nukleotidno zaporedje med različnimi betakoronavirusi razlikuje.

==Interakcije med 5’ IN 3’ koncema==
Interakcije med 5' in 3' koncema v pozitivno smernih RNA virusih preko RNA-RNA, RNA-protein ali protein-protein interakcij vodijo do cirkulacije genoma s pomočjo N proteina, ki tvori most med 5' in 3' koncema. Lahko pomaga tudi poli a vezavni protein (PABP; angl. poly A binding protein), vezan na 3' poli A rep, preko interakcije z eIF-4G, komponente eIF-4F kapa vezavnega proteina, ki se veže na mRNA kapo na 5’ koncu med translacijo.

Vezava N proteina s strukturo S3 in 15 nukleotidov dolgim poli A repom je dovolj za iniciacijo sinteze negativno smerne verige. Spremembe v 5' in 3' končnih zaporedjih zmanjšajo vezavno afiniteto med N proteinom in obema koncema, kar vpliva na učinkovitost iniciacije sinteze negativno smerne verige.

==Literatura==
*Y. Dong, J. L. Leibowitz: The Structure and Functions of Coronavirus Genomic 3’ and 5’ Ends. Virus Res. 2015, 206, 120–133.
*L. I. Sola, F. Almazán, S. Zúñiga, L. Enjuanes: Continuous and Discontinuous RNA Synthesis in Coronaviruses. Annu. Rev. Virol. 2015, 2, 265–288.
*K. Narayanan, C. Huang, K. Lokugamage, W. Kamitani, T. Ikegami, C.-T. K. Tseng, S. Makino: Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus Nsp1 Suppresses Host Gene Expression, Including That of Type I Interferon, in Infected Cells. J. Virol. 2008, 82, 4471–4479.
*Z. Miao, A. Tidu, G. Eriani, F. Martin: Secondary Structure of the SARS-CoV-2 5’-UTR. RNA Biol. 2021, 18, 447–456.
*C. ‐Y. Lo, T. ‐L. Tsai, C. ‐N. Lin, C. ‐H. Lin, H.‐Y. Wu: Interaction of coronavirus nucleocapsid protein with the 5′‐ and 3′‐ends of the coronavirus genome is involved in genome circularization and negative‐strand RNA synthesis. FEBS J. 2019, 286, 3222-3239

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Talk:Struktura in funkcija končnih zaporedij koronavirusne genomske RNA

2021-05-05T11:21:55Z

Ekanalec:

Nika Malečkar: Uvod, Zanke pri SARS-CoV-2, Funkije N proteina (v odstavku Zanke SL1, SL2 in SL3), Interakcije med 5' in 3' koncema

Špela Kladnik: 5' UTR in sekundarne strukture mRNA (Zanke SL1, SL2 in SL3; Zanke SL4, SL5 in SL6)

Eva Kanalec: 3' UTR in sekundarne strukture mRNA (Zanka BSL, Psevdovozel, Zanaka HVR, Zanka L1)

Talk:Struktura in funkcija končnih zaporedij koronavirusne genomske RNA

2021-05-05T11:21:19Z

Ekanalec:

Talk:Struktura in funkcija končnih zaporedij koronavirusne genomske RNA

2021-05-05T11:19:29Z

Ekanalec:

Nika Malečkar: Uvod, Zanke pri SARS-CoV-2, Funkije N protein (v odstavku Zanke SL1, SL2 in SL3), Interakcije med 5' in 3' koncema

Špela Kladnik: 5' UTR in sekundarne strukture mRNA (Zanke SL1, SL2 in SL3; Zanke SL4, SL5 in SL6)

Eva Kanalec: 3' UTR in sekundarne strukture mRNA (Zanka BSL, Psevdovozel, Zanaka HVR, Zanka L)

Talk:Struktura in funkcija končnih zaporedij koronavirusne genomske RNA

2021-05-05T11:19:20Z

Ekanalec:

Nika Malečkar: Uvod, Zanke pri SARS-CoV-2, Funkije N protein(v odstavku Zanke SL1, SL2 in SL3), Interakcije med 5' in 3' koncema

Špela Kladnik: 5' UTR in sekundarne strukture mRNA (Zanke SL1, SL2 in SL3; Zanke SL4, SL5 in SL6)

Eva Kanalec: 3' UTR in sekundarne strukture mRNA (Zanka BSL, Psevdovozel, Zanaka HVR, Zanka L)

Talk:Struktura in funkcija končnih zaporedij koronavirusne genomske RNA

2021-05-05T11:15:38Z

Ekanalec:

Nika Malečkar: Uvod, Zanke pri SARS-CoV-2), Interakcije med 5' in 3' koncema

Špela Kladnik: 5' UTR in sekundarne strukture mRNA (Zanke SL1, SL2 in SL3; Zanke SL4, SL5 in SL6)

Eva Kanalec: 3' UTR in sekundarne strukture mRNA (Zanka BSL, Psevdovozel, Zanaka HVR, Zanka L)

Talk:Struktura in funkcija končnih zaporedij koronavirusne genomske RNA

2021-05-05T11:15:18Z

Ekanalec: New page: Nika Malečkar: Uvod, Zanke pri SARS-CoV-2), Interakcije med 5' in 3' koncema Špela Kladnik: 5' UTR in sekundarne strukture mRNA (Zanke SL1, SL2 in SL3; Zanke SL4, SL5 in SL6) Eva Kanalec...

Nika Malečkar: Uvod, Zanke pri SARS-CoV-2), Interakcije med 5' in 3' koncema
Špela Kladnik: 5' UTR in sekundarne strukture mRNA (Zanke SL1, SL2 in SL3; Zanke SL4, SL5 in SL6)
Eva Kanalec: 3' UTR in sekundarne strukture mRNA (Zanka BSL, Psevdovozel, Zanaka HVR, Zanka L)

Struktura in funkcija končnih zaporedij koronavirusne genomske RNA

2021-05-05T11:07:31Z

Ekanalec: /* 5' UTR in sekundarne strukture mRNA */

==Uvod==
Celice, okužene z koronavirusom, vsebujejo 7 do 9 specifičnih virusnih mRNA s 3’ koterminalnimi konci. Vse mRNA molekule imajo na 5' koncih identična vodilna zaporedja, ki so dolga od 70 do 90 nukleotidov, na 3' koncu pa imajo poliA rep. Obstajata dva ključna elementa TRS (TRS; angl. transcriptional regulatory sequence), ki sta prisotna na 3′ koncu vodilnega zaporedja (TRS-L (angl. leader)) ter na 5′ koncu vsakega gena in delujeta kot cis-regulatorja transkripcije. Betakoronavirusi vsebujejo enako heptamerno zaporedje, 5’-UCUAAAC-3’, pri čemer ima SARS-CoV TRS 5’-ACGAAC-3’ kot osrednje zaporedje.

==5' UTR in sekundarne strukture mRNA==
5' neprevedena regija (UTR; angl. untranslated region) je regija na mRNA, ki se nahaja med mestom začetka transkripcije in enim nukleotidom pred začetnim kodonom (običajno je to AUG). Pomembna je pri nadaljnjih translacijskih in transkripcijskih mehanizmih. Včasih je (delno) prevedena v proteinske produkte, ki regulirajo translacijo glavnega kodirnega zaporedja mRNA, v veliko organizmih pa je 5' UTR popolnoma neprevedena in tvori kompleksne sekundarne strukture (dvojno vijačnico, lasne zanke, psevdovozle (PK; angl. pseudoknots) in tetrazanke (angl. tetraloops)), ki sodelujejo pri regulaciji translacije.

Nekatere izmed teh sekundarnih struktur so poimenovane stem-loops (SL). Zanke imajo večinoma obliko lasnih zank, se pa oblike lahko razlikujejo. Njihova vloga je največkrat povečanje strukturne stabilnosti mRNA. Pri virusih, natančneje koronavirusih, so pomembne zanke od SL1 do SL8, ki so bistvene za CoV podvajanje in sintezo virusne RNA. Sekundarne strukture v 5' končnih regijah so v veliki meri ohranjene, čeprav so nukleotidna zaporedja precej različna [https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/26958916/#&gid=article-figures&pid=figure-4-uid-3].

===Zanke SL1, SL2 IN SL3===
SL1 ima dvodelno strukturo. Dve pirimidinski bazi delita SL1 zanko na zgornji in spodnji del. Zgornji del je pomemben za učinkovito virusno replikacijo. Spremembe, ki vplivajo na povezovanje baz na tem delu, lahko vplivajo na fenotipe virusa, in so lahko smrtonosne, medtem ko so spremembe na spodnjem delu virusi sposobni preživeti. Genomi, ki imajo spremembe v SL1, niso zmožni sintetizirati negativno polarne subgenomske RNA. Strukturna labilnost spodnje regije SL1 je pomembna za razmnoževanje virusa.

SL2 je najbolj ohranjena sekundarna struktura v 5' UTR. Ima 5 nukleotidov dolgo steblo, sestavljeno iz (C/U) UUG (U/C) in je najbolj ohranjeno zaporedje v 5' UTR. Zamenjava U48 s C ali A (sprememba U48C/U48A) je smrtonosna, virus, ki pa vsebuje spremembo U48G (zamenjava uracila z gvaninom na mestu 48) pa lahko preživi in raste ter izraža t.i. wild type fenotip. SL2 je torej iz strukturnega vidika zelo pomembna za preživetje virusov.

TRS oz. glavno TRS zaporedje nekaterih koronavirusov (npr. Sars-CoV, BCov) se nahaja v SL3 zanki. To zanko bi lahko našli tudi pri MHV virusu, vendar pri 37°C ni stabilna, zato je pri večini poskusov ne opazimo. TRS regija je enoverižna. Glavno TRS zaporedje ima ključno vlogo pri sintezi subgenomske RNA. Da lahko transkripcija poteka, je poleg drugih dejavnikov potrebna minimalna podobnost med TRS-L in TRS-B.

N protein se veže z veliko afiniteto in specifičnostjo na TRS-L. Vsebuje dve strukturno neodvisni RNA vezavni domeni: N-terminalna RNA vezavna domena (NTD; angl. N-terminal domain) in C-terminalna dimerizacijska domena (CTD; angl. C-terminal domain), ki sta povezani s Ser/Arg bogatim členom (angl. linker). Vezava proteina NTD na TRS je ključna za učinkovito sintezo subgenomske RNA.

===Zanke SL4, SL5 IN SL6===
SL4 je sestavljena iz dveh delov, SL4A in SL4B. SL4B kot struktura ali kot zaporedje nima pomembnejše vloge pri virusni replikaciji, ampak sama celotna zanka deluje kot vmesnik (angl. spacer) in je pomembna za usmerjanje virusne subgenomske RNA.

SL5 zanka je pomembna pri replikaciji DI RNA (angl. defective interfering RNA) in se razteza od 5' UTR v zaporedje proteina nsp1. Ta protein pri SARS-CoV virusih zavira imunske funkcije gostiteljskega organizma in vpliva na translacijo gostiteljeve mRNA. SL5 ima obliko trifurkatne zanke, sestavljena je iz A, B in C delov in je od vseh zank najdaljša. Napake na SL5C zaradi zamenjave 4 nukleotidov rezultira v viabilnih rekombinantnih virusih z zgolj zmerno poškodovano virusno replikacijo.

SL6 zajema nukleotide 376-446 pri virusu MHV in kodira aminokislinske pozicije 56-79 za protein nsp1. Pri MHV SL6 ni ključnega pomena za virusno replikacijo, spremembe, ki vplivajo na SL6 so bolj pomembne zaradi njihovega vpliva na protein nsp1.

===Zanke PRI SARS-COV-2===
Pri SARS-CoV-2 opazimo zanke od SL1 do SL5, najdena pa je bila tudi manjša zanka med 4 in 5, ki so jo poimenovali SL4.5. Zanka SL1 ni ohranjena pri vseh sevih SARS-CoV-2 virusa. SL2 je primerljiva s SL3 pri BCoV virusu in je vključena v proces replikacije. Zanka (CUUGU) od SL2 je pomembna pri replikaciji MHV, kjer ima obliko U-obrata, medtem ko je pri SARS-CoV-2 v obliki tetra zanke.

SL3 zanka zajema TRS zaporedje. SL4 je razmeroma stabilna in dolga. Sama SL4 je pomembna pri sintezi subgenomskih RNA fragmentov. Na 3' delu 5' UTR je SL5 zanka, ki je bolj kompleksna, sestavljajo jo trije deli: SL5A, SL5B, SL5C. Pri Sars-CoV-2 se na SL5 nahaja nsp1 AUG začetni kodon.

==3' UTR in sekundarne strukture mRNA==
Koronavirusna 3' neprevedena regija (3' UTR) je sestavljena iz 300 do 500 nukleotidov in poliadenilacijskega repa oziroma poliA repa.

Različne študije so z uporabo algoritmov za zlaganje RNA, biokemičnih in funkcijskih študij poskušale preučiti strukturo in funkcijo 3' UTR. 3' UTR vsebujejo cis-delujoče regije, ki se zložijo v sekundarne strukture. Te prispevajo k večji stabilnosti ter sodelujejo pri tvorjenju intramolekularnih in intermolekularnih interakcij. Poleg tega pa ima 3' UTR tako kot tudi 5' UTR pomembno vlogo pri regulaciji RNA replikacije in transkripcije.

===Zanka BSL===
Proti 3' koncu, tik za stop kodonom N gena, se nahaja sekundarna struktura stebelne zanke (BSL; ang. bulged stem loop), ki je pri MHV dolga 68 nukleotidov. BSL ima ključno vlogo pri replikaciji virusne RNA. Štirje kovariantni bazni pari v tej zanki pa so ključni za funkcionalnost te sekundarne strukture.

===Psevdovozel===
Lasna zanka se nahaja od BSL proti 3’ koncu in tvori psevdovozel (PK; angl. pseudoknot - sekundarna struktura z vsaj dvema zankama, kjer se polovica ene zanke vstavi med polovici druge zanke) z BSL. Ta je pri različnih vrstah koronavirusov ohranjena po lokaciji in obliki. Po zaporedju nukleotidov pa se nekoliko razlikuje, kar nakazuje, da bi lahko deloval kot regulatorni kontrolni element.

Za trojni spoj alfa vijačnic S3 je bilo dokazano, da ta pripomore k stabilizaciji strukture psevdovozla. Konformacija psevdovozla je manj stabilna od konformacije dvojne lasne zanke. S3 pa naj bi imela tudi pomembno vlogo pri replikaciji.

Prekrivanje BSL in PK v 5 nukleotidih je razlog, da se te dve strukturi ne moreta hkrati popolnoma zložiti. To nakazuje, da vsak element tvori nadomestne konformacije in v določeni fazi RNA delujeta kot molekularno stikalo sinteze RNA.

===Zanka HVR===
Na primeru MHV je bilo ugotovljeno, da se navzdol od PK nahaja tako imenovana “multi-branch stem loop”. Gre za dolgo hipervariabilno regijo (HVR; angl. hypervariable region), ki v svoji strukturi vsebuje oligonukleotidno zaporedje 5'-GGAAGAGC-3' in je dobro ohranjeno med različnimi vrstami koronavirusov. V strukturi na 3' koncu najdemo tudi trojni spoj alfa vijačnic, ki jih označujemo s S3 in S4 in obdajata lasno zanko (S2-L2).

===Zanka L1===
Zanka 1 (L1; angl. loop-1) se nahaja med BSL in PK. Prihaja do interakcije med L1 in 3' koncem genoma s proteinskim kompleksom (nsp7, nsp8 in nsp9). To povzroči konformacijske spremembe v 3' koncu RNA, kar omogoči tvorbo psevdovozla, ki omogoča vezavo od RNA odvisne RNA-polimeraze (nsp12), helikaze in proteinov nsp14, nsp10. To pa omogoči iniciacijo sinteze negativne verige RNA.

Pri alfakoronavirusih je PK ohranjen, lahko pa je v njihovi strukturi odsotna BSL. Pri gamakoronavirusih je PK prisoten, ni pa znano, kakšna je njegova funkcija. Do tesnega prekrivanja med BSL in PK prihaja samo pri betakoronavirusih. Sekundarna struktura je pri betakoronavirusih ohranjena, čeprav se nukleotidno zaporedje med različnimi betakoronavirusi razlikuje.

==Interakcije med 5’ IN 3’ koncema==
Interakcije med 5' in 3' koncema v pozitivno smernih RNA virusih preko RNA-RNA, RNA-protein ali protein-protein interakcij vodijo do cirkulacije genoma s pomočjo N proteina, ki tvori most med 5' in 3' koncema. Lahko pomaga tudi poli a vezavni protein (PABP; angl. poly A binding protein), vezan na 3' poli A rep, preko interakcije z eIF-4G, komponente eIF-4F kapa vezavnega proteina, ki se veže na mRNA kapo na 5’ koncu med translacijo.

Vezava N proteina s strukturo S3 in 15 nukleotidov dolgim poli A repom je dovolj za iniciacijo sinteze negativno smerne verige. Spremembe v 5' in 3' končnih zaporedjih zmanjšajo vezavno afiniteto med N proteinom in obema koncema, kar vpliva na učinkovitost iniciacije sinteze negativno smerne verige.

==Literatura==
*Y. Dong, J. L. Leibowitz: The Structure and Functions of Coronavirus Genomic 3’ and 5’ Ends. Virus Res. 2015, 206, 120–133.
*L. I. Sola, F. Almazán, S. Zúñiga, L. Enjuanes: Continuous and Discontinuous RNA Synthesis in Coronaviruses. Annu. Rev. Virol. 2015, 2, 265–288.
*K. Narayanan, C. Huang, K. Lokugamage, W. Kamitani, T. Ikegami, C.-T. K. Tseng, S. Makino: Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus Nsp1 Suppresses Host Gene Expression, Including That of Type I Interferon, in Infected Cells. J. Virol. 2008, 82, 4471–4479.
*Z. Miao, A. Tidu, G. Eriani, F. Martin: Secondary Structure of the SARS-CoV-2 5’-UTR. RNA Biol. 2021, 18, 447–456.
*C. ‐Y. Lo, T. ‐L. Tsai, C. ‐N. Lin, C. ‐H. Lin, H.‐Y. Wu: Interaction of coronavirus nucleocapsid protein with the 5′‐ and 3′‐ends of the coronavirus genome is involved in genome circularization and negative‐strand RNA synthesis. FEBS J. 2019, 286, 3222-3239

Struktura in funkcija končnih zaporedij koronavirusne genomske RNA

2021-05-05T11:00:12Z

Ekanalec: /* Interakcije med 5’ IN 3’ koncema */

==Uvod==
Celice, okužene z koronavirusom, vsebujejo 7 do 9 specifičnih virusnih mRNA s 3’ koterminalnimi konci. Vse mRNA molekule imajo na 5' koncih identična vodilna zaporedja, ki so dolga od 70 do 90 nukleotidov, na 3' koncu pa imajo poliA rep. Obstajata dva ključna elementa TRS (TRS; angl. transcriptional regulatory sequence), ki sta prisotna na 3′ koncu vodilnega zaporedja (TRS-L (angl. leader)) ter na 5′ koncu vsakega gena in delujeta kot cis-regulatorja transkripcije. Betakoronavirusi vsebujejo enako heptamerno zaporedje, 5’-UCUAAAC-3’, pri čemer ima SARS-CoV TRS 5’-ACGAAC-3’ kot osrednje zaporedje.

==5' UTR in sekundarne strukture mRNA==
5' neprevedena regija (UTR; angl. untranslated region) je regija na mRNA, ki se nahaja med mestom začetka transkripcije in enim nukleotidom pred začetnim kodonom (običajno je to AUG). Pomembna je pri nadaljnjih translacijskih in transkripcijskih mehanizmih. Včasih je (delno) prevedena v proteinske produkte, ki regulirajo translacijo glavnega kodirnega zaporedja mRNA, v veliko organizmih pa je 5' UTR popolnoma neprevedena in tvori kompleksne sekundarne strukture (dvojno vijačnico, lasne zanke, psevdovozle (PK; angl. pseudoknots) in tetrazanke (angl. tetraloops)), ki sodelujejo pri regulaciji translacije.

Nekatere izmed teh sekundarnih struktur so poimenovane stem-loops (SL). Zanke imajo večinoma obliko lasnih zank, se pa oblike lahko razlikujejo. Njihova vloga je največkrat povečanje strukturne stabilnosti mRNA. Pri virusih, natančneje koronavirusih, so pomembne zanke od SL1 do SL8, ki so bistvene za CoV podvajanje in sintezo virusne RNA. Sekundarne strukture v 5' končnih regijah so v veliki meri ohranjene, čeprav so nukleotidna zaporedja precej različna.

===Zanke SL1, SL2 IN SL3===
SL1 ima dvodelno strukturo. Dve pirimidinski bazi delita SL1 zanko na zgornji in spodnji del. Zgornji del je pomemben za učinkovito virusno replikacijo. Spremembe, ki vplivajo na povezovanje baz na tem delu, lahko vplivajo na fenotipe virusa, in so lahko smrtonosne, medtem ko so spremembe na spodnjem delu virusi sposobni preživeti. Genomi, ki imajo spremembe v SL1, niso zmožni sintetizirati negativno polarne subgenomske RNA. Strukturna labilnost spodnje regije SL1 je pomembna za razmnoževanje virusa.

SL2 je najbolj ohranjena sekundarna struktura v 5' UTR. Ima 5 nukleotidov dolgo steblo, sestavljeno iz (C/U) UUG (U/C) in je najbolj ohranjeno zaporedje v 5' UTR. Zamenjava U48 s C ali A (sprememba U48C/U48A) je smrtonosna, virus, ki pa vsebuje spremembo U48G (zamenjava uracila z gvaninom na mestu 48) pa lahko preživi in raste ter izraža t.i. wild type fenotip. SL2 je torej iz strukturnega vidika zelo pomembna za preživetje virusov.

TRS oz. glavno TRS zaporedje nekaterih koronavirusov (npr. Sars-CoV, BCov) se nahaja v SL3 zanki. To zanko bi lahko našli tudi pri MHV virusu, vendar pri 37°C ni stabilna, zato je pri večini poskusov ne opazimo. TRS regija je enoverižna. Glavno TRS zaporedje ima ključno vlogo pri sintezi subgenomske RNA. Da lahko transkripcija poteka, je poleg drugih dejavnikov potrebna minimalna podobnost med TRS-L in TRS-B.

N protein se veže z veliko afiniteto in specifičnostjo na TRS-L. Vsebuje dve strukturno neodvisni RNA vezavni domeni: N-terminalna RNA vezavna domena (NTD; angl. N-terminal domain) in C-terminalna dimerizacijska domena (CTD; angl. C-terminal domain), ki sta povezani s Ser/Arg bogatim členom (angl. linker). Vezava proteina NTD na TRS je ključna za učinkovito sintezo subgenomske RNA.

===Zanke SL4, SL5 IN SL6===
SL4 je sestavljena iz dveh delov, SL4A in SL4B. SL4B kot struktura ali kot zaporedje nima pomembnejše vloge pri virusni replikaciji, ampak sama celotna zanka deluje kot vmesnik (angl. spacer) in je pomembna za usmerjanje virusne subgenomske RNA.

SL5 zanka je pomembna pri replikaciji DI RNA (angl. defective interfering RNA) in se razteza od 5' UTR v zaporedje proteina nsp1. Ta protein pri SARS-CoV virusih zavira imunske funkcije gostiteljskega organizma in vpliva na translacijo gostiteljeve mRNA. SL5 ima obliko trifurkatne zanke, sestavljena je iz A, B in C delov in je od vseh zank najdaljša. Napake na SL5C zaradi zamenjave 4 nukleotidov rezultira v viabilnih rekombinantnih virusih z zgolj zmerno poškodovano virusno replikacijo.

SL6 zajema nukleotide 376-446 pri virusu MHV in kodira aminokislinske pozicije 56-79 za protein nsp1. Pri MHV SL6 ni ključnega pomena za virusno replikacijo, spremembe, ki vplivajo na SL6 so bolj pomembne zaradi njihovega vpliva na protein nsp1.

===Zanke PRI SARS-COV-2===
Pri SARS-CoV-2 opazimo zanke od SL1 do SL5, najdena pa je bila tudi manjša zanka med 4 in 5, ki so jo poimenovali SL4.5. Zanka SL1 ni ohranjena pri vseh sevih SARS-CoV-2 virusa. SL2 je primerljiva s SL3 pri BCoV virusu in je vključena v proces replikacije. Zanka (CUUGU) od SL2 je pomembna pri replikaciji MHV, kjer ima obliko U-obrata, medtem ko je pri SARS-CoV-2 v obliki tetra zanke.

SL3 zanka zajema TRS zaporedje. SL4 je razmeroma stabilna in dolga. Sama SL4 je pomembna pri sintezi subgenomskih RNA fragmentov. Na 3' delu 5' UTR je SL5 zanka, ki je bolj kompleksna, sestavljajo jo trije deli: SL5A, SL5B, SL5C. Pri Sars-CoV-2 se na SL5 nahaja nsp1 AUG začetni kodon.

==3' UTR in sekundarne strukture mRNA==
Koronavirusna 3' neprevedena regija (3' UTR) je sestavljena iz 300 do 500 nukleotidov in poliadenilacijskega repa oziroma poliA repa.

Različne študije so z uporabo algoritmov za zlaganje RNA, biokemičnih in funkcijskih študij poskušale preučiti strukturo in funkcijo 3' UTR. 3' UTR vsebujejo cis-delujoče regije, ki se zložijo v sekundarne strukture. Te prispevajo k večji stabilnosti ter sodelujejo pri tvorjenju intramolekularnih in intermolekularnih interakcij. Poleg tega pa ima 3' UTR tako kot tudi 5' UTR pomembno vlogo pri regulaciji RNA replikacije in transkripcije.

===Zanka BSL===
Proti 3' koncu, tik za stop kodonom N gena, se nahaja sekundarna struktura stebelne zanke (BSL; ang. bulged stem loop), ki je pri MHV dolga 68 nukleotidov. BSL ima ključno vlogo pri replikaciji virusne RNA. Štirje kovariantni bazni pari v tej zanki pa so ključni za funkcionalnost te sekundarne strukture.

===Psevdovozel===
Lasna zanka se nahaja od BSL proti 3’ koncu in tvori psevdovozel (PK; angl. pseudoknot - sekundarna struktura z vsaj dvema zankama, kjer se polovica ene zanke vstavi med polovici druge zanke) z BSL. Ta je pri različnih vrstah koronavirusov ohranjena po lokaciji in obliki. Po zaporedju nukleotidov pa se nekoliko razlikuje, kar nakazuje, da bi lahko deloval kot regulatorni kontrolni element.

Za trojni spoj alfa vijačnic S3 je bilo dokazano, da ta pripomore k stabilizaciji strukture psevdovozla. Konformacija psevdovozla je manj stabilna od konformacije dvojne lasne zanke. S3 pa naj bi imela tudi pomembno vlogo pri replikaciji.

Prekrivanje BSL in PK v 5 nukleotidih je razlog, da se te dve strukturi ne moreta hkrati popolnoma zložiti. To nakazuje, da vsak element tvori nadomestne konformacije in v določeni fazi RNA delujeta kot molekularno stikalo sinteze RNA.

===Zanka HVR===
Na primeru MHV je bilo ugotovljeno, da se navzdol od PK nahaja tako imenovana “multi-branch stem loop”. Gre za dolgo hipervariabilno regijo (HVR; angl. hypervariable region), ki v svoji strukturi vsebuje oligonukleotidno zaporedje 5'-GGAAGAGC-3' in je dobro ohranjeno med različnimi vrstami koronavirusov. V strukturi na 3' koncu najdemo tudi trojni spoj alfa vijačnic, ki jih označujemo s S3 in S4 in obdajata lasno zanko (S2-L2).

===Zanka L1===
Zanka 1 (L1; angl. loop-1) se nahaja med BSL in PK. Prihaja do interakcije med L1 in 3' koncem genoma s proteinskim kompleksom (nsp7, nsp8 in nsp9). To povzroči konformacijske spremembe v 3' koncu RNA, kar omogoči tvorbo psevdovozla, ki omogoča vezavo od RNA odvisne RNA-polimeraze (nsp12), helikaze in proteinov nsp14, nsp10. To pa omogoči iniciacijo sinteze negativne verige RNA.

Pri alfakoronavirusih je PK ohranjen, lahko pa je v njihovi strukturi odsotna BSL. Pri gamakoronavirusih je PK prisoten, ni pa znano, kakšna je njegova funkcija. Do tesnega prekrivanja med BSL in PK prihaja samo pri betakoronavirusih. Sekundarna struktura je pri betakoronavirusih ohranjena, čeprav se nukleotidno zaporedje med različnimi betakoronavirusi razlikuje.

==Interakcije med 5’ IN 3’ koncema==
Interakcije med 5' in 3' koncema v pozitivno smernih RNA virusih preko RNA-RNA, RNA-protein ali protein-protein interakcij vodijo do cirkulacije genoma s pomočjo N proteina, ki tvori most med 5' in 3' koncema. Lahko pomaga tudi poli a vezavni protein (PABP; angl. poly A binding protein), vezan na 3' poli A rep, preko interakcije z eIF-4G, komponente eIF-4F kapa vezavnega proteina, ki se veže na mRNA kapo na 5’ koncu med translacijo.

Vezava N proteina s strukturo S3 in 15 nukleotidov dolgim poli A repom je dovolj za iniciacijo sinteze negativno smerne verige. Spremembe v 5' in 3' končnih zaporedjih zmanjšajo vezavno afiniteto med N proteinom in obema koncema, kar vpliva na učinkovitost iniciacije sinteze negativno smerne verige.

==Literatura==
*Y. Dong, J. L. Leibowitz: The Structure and Functions of Coronavirus Genomic 3’ and 5’ Ends. Virus Res. 2015, 206, 120–133.
*L. I. Sola, F. Almazán, S. Zúñiga, L. Enjuanes: Continuous and Discontinuous RNA Synthesis in Coronaviruses. Annu. Rev. Virol. 2015, 2, 265–288.
*K. Narayanan, C. Huang, K. Lokugamage, W. Kamitani, T. Ikegami, C.-T. K. Tseng, S. Makino: Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus Nsp1 Suppresses Host Gene Expression, Including That of Type I Interferon, in Infected Cells. J. Virol. 2008, 82, 4471–4479.
*Z. Miao, A. Tidu, G. Eriani, F. Martin: Secondary Structure of the SARS-CoV-2 5’-UTR. RNA Biol. 2021, 18, 447–456.
*C. ‐Y. Lo, T. ‐L. Tsai, C. ‐N. Lin, C. ‐H. Lin, H.‐Y. Wu: Interaction of coronavirus nucleocapsid protein with the 5′‐ and 3′‐ends of the coronavirus genome is involved in genome circularization and negative‐strand RNA synthesis. FEBS J. 2019, 286, 3222-3239

Struktura in funkcija končnih zaporedij koronavirusne genomske RNA

2021-05-05T10:59:59Z

Ekanalec: /* 3' UTR in sekundarne strukture mRNA */

==Uvod==
Celice, okužene z koronavirusom, vsebujejo 7 do 9 specifičnih virusnih mRNA s 3’ koterminalnimi konci. Vse mRNA molekule imajo na 5' koncih identična vodilna zaporedja, ki so dolga od 70 do 90 nukleotidov, na 3' koncu pa imajo poliA rep. Obstajata dva ključna elementa TRS (TRS; angl. transcriptional regulatory sequence), ki sta prisotna na 3′ koncu vodilnega zaporedja (TRS-L (angl. leader)) ter na 5′ koncu vsakega gena in delujeta kot cis-regulatorja transkripcije. Betakoronavirusi vsebujejo enako heptamerno zaporedje, 5’-UCUAAAC-3’, pri čemer ima SARS-CoV TRS 5’-ACGAAC-3’ kot osrednje zaporedje.

==5' UTR in sekundarne strukture mRNA==
5' neprevedena regija (UTR; angl. untranslated region) je regija na mRNA, ki se nahaja med mestom začetka transkripcije in enim nukleotidom pred začetnim kodonom (običajno je to AUG). Pomembna je pri nadaljnjih translacijskih in transkripcijskih mehanizmih. Včasih je (delno) prevedena v proteinske produkte, ki regulirajo translacijo glavnega kodirnega zaporedja mRNA, v veliko organizmih pa je 5' UTR popolnoma neprevedena in tvori kompleksne sekundarne strukture (dvojno vijačnico, lasne zanke, psevdovozle (PK; angl. pseudoknots) in tetrazanke (angl. tetraloops)), ki sodelujejo pri regulaciji translacije.

Nekatere izmed teh sekundarnih struktur so poimenovane stem-loops (SL). Zanke imajo večinoma obliko lasnih zank, se pa oblike lahko razlikujejo. Njihova vloga je največkrat povečanje strukturne stabilnosti mRNA. Pri virusih, natančneje koronavirusih, so pomembne zanke od SL1 do SL8, ki so bistvene za CoV podvajanje in sintezo virusne RNA. Sekundarne strukture v 5' končnih regijah so v veliki meri ohranjene, čeprav so nukleotidna zaporedja precej različna.

===Zanke SL1, SL2 IN SL3===
SL1 ima dvodelno strukturo. Dve pirimidinski bazi delita SL1 zanko na zgornji in spodnji del. Zgornji del je pomemben za učinkovito virusno replikacijo. Spremembe, ki vplivajo na povezovanje baz na tem delu, lahko vplivajo na fenotipe virusa, in so lahko smrtonosne, medtem ko so spremembe na spodnjem delu virusi sposobni preživeti. Genomi, ki imajo spremembe v SL1, niso zmožni sintetizirati negativno polarne subgenomske RNA. Strukturna labilnost spodnje regije SL1 je pomembna za razmnoževanje virusa.

SL2 je najbolj ohranjena sekundarna struktura v 5' UTR. Ima 5 nukleotidov dolgo steblo, sestavljeno iz (C/U) UUG (U/C) in je najbolj ohranjeno zaporedje v 5' UTR. Zamenjava U48 s C ali A (sprememba U48C/U48A) je smrtonosna, virus, ki pa vsebuje spremembo U48G (zamenjava uracila z gvaninom na mestu 48) pa lahko preživi in raste ter izraža t.i. wild type fenotip. SL2 je torej iz strukturnega vidika zelo pomembna za preživetje virusov.

TRS oz. glavno TRS zaporedje nekaterih koronavirusov (npr. Sars-CoV, BCov) se nahaja v SL3 zanki. To zanko bi lahko našli tudi pri MHV virusu, vendar pri 37°C ni stabilna, zato je pri večini poskusov ne opazimo. TRS regija je enoverižna. Glavno TRS zaporedje ima ključno vlogo pri sintezi subgenomske RNA. Da lahko transkripcija poteka, je poleg drugih dejavnikov potrebna minimalna podobnost med TRS-L in TRS-B.

N protein se veže z veliko afiniteto in specifičnostjo na TRS-L. Vsebuje dve strukturno neodvisni RNA vezavni domeni: N-terminalna RNA vezavna domena (NTD; angl. N-terminal domain) in C-terminalna dimerizacijska domena (CTD; angl. C-terminal domain), ki sta povezani s Ser/Arg bogatim členom (angl. linker). Vezava proteina NTD na TRS je ključna za učinkovito sintezo subgenomske RNA.

===Zanke SL4, SL5 IN SL6===
SL4 je sestavljena iz dveh delov, SL4A in SL4B. SL4B kot struktura ali kot zaporedje nima pomembnejše vloge pri virusni replikaciji, ampak sama celotna zanka deluje kot vmesnik (angl. spacer) in je pomembna za usmerjanje virusne subgenomske RNA.

SL5 zanka je pomembna pri replikaciji DI RNA (angl. defective interfering RNA) in se razteza od 5' UTR v zaporedje proteina nsp1. Ta protein pri SARS-CoV virusih zavira imunske funkcije gostiteljskega organizma in vpliva na translacijo gostiteljeve mRNA. SL5 ima obliko trifurkatne zanke, sestavljena je iz A, B in C delov in je od vseh zank najdaljša. Napake na SL5C zaradi zamenjave 4 nukleotidov rezultira v viabilnih rekombinantnih virusih z zgolj zmerno poškodovano virusno replikacijo.

SL6 zajema nukleotide 376-446 pri virusu MHV in kodira aminokislinske pozicije 56-79 za protein nsp1. Pri MHV SL6 ni ključnega pomena za virusno replikacijo, spremembe, ki vplivajo na SL6 so bolj pomembne zaradi njihovega vpliva na protein nsp1.

===Zanke PRI SARS-COV-2===
Pri SARS-CoV-2 opazimo zanke od SL1 do SL5, najdena pa je bila tudi manjša zanka med 4 in 5, ki so jo poimenovali SL4.5. Zanka SL1 ni ohranjena pri vseh sevih SARS-CoV-2 virusa. SL2 je primerljiva s SL3 pri BCoV virusu in je vključena v proces replikacije. Zanka (CUUGU) od SL2 je pomembna pri replikaciji MHV, kjer ima obliko U-obrata, medtem ko je pri SARS-CoV-2 v obliki tetra zanke.

SL3 zanka zajema TRS zaporedje. SL4 je razmeroma stabilna in dolga. Sama SL4 je pomembna pri sintezi subgenomskih RNA fragmentov. Na 3' delu 5' UTR je SL5 zanka, ki je bolj kompleksna, sestavljajo jo trije deli: SL5A, SL5B, SL5C. Pri Sars-CoV-2 se na SL5 nahaja nsp1 AUG začetni kodon.

==3' UTR in sekundarne strukture mRNA==
Koronavirusna 3' neprevedena regija (3' UTR) je sestavljena iz 300 do 500 nukleotidov in poliadenilacijskega repa oziroma poliA repa.

Različne študije so z uporabo algoritmov za zlaganje RNA, biokemičnih in funkcijskih študij poskušale preučiti strukturo in funkcijo 3' UTR. 3' UTR vsebujejo cis-delujoče regije, ki se zložijo v sekundarne strukture. Te prispevajo k večji stabilnosti ter sodelujejo pri tvorjenju intramolekularnih in intermolekularnih interakcij. Poleg tega pa ima 3' UTR tako kot tudi 5' UTR pomembno vlogo pri regulaciji RNA replikacije in transkripcije.

===Zanka BSL===
Proti 3' koncu, tik za stop kodonom N gena, se nahaja sekundarna struktura stebelne zanke (BSL; ang. bulged stem loop), ki je pri MHV dolga 68 nukleotidov. BSL ima ključno vlogo pri replikaciji virusne RNA. Štirje kovariantni bazni pari v tej zanki pa so ključni za funkcionalnost te sekundarne strukture.

===Psevdovozel===
Lasna zanka se nahaja od BSL proti 3’ koncu in tvori psevdovozel (PK; angl. pseudoknot - sekundarna struktura z vsaj dvema zankama, kjer se polovica ene zanke vstavi med polovici druge zanke) z BSL. Ta je pri različnih vrstah koronavirusov ohranjena po lokaciji in obliki. Po zaporedju nukleotidov pa se nekoliko razlikuje, kar nakazuje, da bi lahko deloval kot regulatorni kontrolni element.

Za trojni spoj alfa vijačnic S3 je bilo dokazano, da ta pripomore k stabilizaciji strukture psevdovozla. Konformacija psevdovozla je manj stabilna od konformacije dvojne lasne zanke. S3 pa naj bi imela tudi pomembno vlogo pri replikaciji.

Prekrivanje BSL in PK v 5 nukleotidih je razlog, da se te dve strukturi ne moreta hkrati popolnoma zložiti. To nakazuje, da vsak element tvori nadomestne konformacije in v določeni fazi RNA delujeta kot molekularno stikalo sinteze RNA.

===Zanka HVR===
Na primeru MHV je bilo ugotovljeno, da se navzdol od PK nahaja tako imenovana “multi-branch stem loop”. Gre za dolgo hipervariabilno regijo (HVR; angl. hypervariable region), ki v svoji strukturi vsebuje oligonukleotidno zaporedje 5'-GGAAGAGC-3' in je dobro ohranjeno med različnimi vrstami koronavirusov. V strukturi na 3' koncu najdemo tudi trojni spoj alfa vijačnic, ki jih označujemo s S3 in S4 in obdajata lasno zanko (S2-L2).

===Zanka L1===
Zanka 1 (L1; angl. loop-1) se nahaja med BSL in PK. Prihaja do interakcije med L1 in 3' koncem genoma s proteinskim kompleksom (nsp7, nsp8 in nsp9). To povzroči konformacijske spremembe v 3' koncu RNA, kar omogoči tvorbo psevdovozla, ki omogoča vezavo od RNA odvisne RNA-polimeraze (nsp12), helikaze in proteinov nsp14, nsp10. To pa omogoči iniciacijo sinteze negativne verige RNA.

Pri alfakoronavirusih je PK ohranjen, lahko pa je v njihovi strukturi odsotna BSL. Pri gamakoronavirusih je PK prisoten, ni pa znano, kakšna je njegova funkcija. Do tesnega prekrivanja med BSL in PK prihaja samo pri betakoronavirusih. Sekundarna struktura je pri betakoronavirusih ohranjena, čeprav se nukleotidno zaporedje med različnimi betakoronavirusi razlikuje.

==Interakcije med 5’ IN 3’ koncema==
Interakcije med 5' in 3' koncema v pozitivno smernih RNA virusih preko RNA-RNA, RNA-protein ali protein-protein interakcij vodijo do cirkulacije genoma s pomočjo N proteina, ki tvori most med 5' in 3' koncema. Lahko pomaga tudi poli a vezavni protein (PABP; angl. poly A binding protein), vezan na 3' poli A rep, preko interakcije z eIF-4G, komponente eIF-4F kapa vezavnega proteina, ki se veže na mRNA kapo na 5’ koncu med translacijo.
Vezava N proteina s strukturo S3 in 15 nukleotidov dolgim poli A repom je dovolj za iniciacijo sinteze negativno smerne verige. Spremembe v 5' in 3' končnih zaporedjih zmanjšajo vezavno afiniteto med N proteinom in obema koncema, kar vpliva na učinkovitost iniciacije sinteze negativno smerne verige.

==Literatura==
*Y. Dong, J. L. Leibowitz: The Structure and Functions of Coronavirus Genomic 3’ and 5’ Ends. Virus Res. 2015, 206, 120–133.
*L. I. Sola, F. Almazán, S. Zúñiga, L. Enjuanes: Continuous and Discontinuous RNA Synthesis in Coronaviruses. Annu. Rev. Virol. 2015, 2, 265–288.
*K. Narayanan, C. Huang, K. Lokugamage, W. Kamitani, T. Ikegami, C.-T. K. Tseng, S. Makino: Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus Nsp1 Suppresses Host Gene Expression, Including That of Type I Interferon, in Infected Cells. J. Virol. 2008, 82, 4471–4479.
*Z. Miao, A. Tidu, G. Eriani, F. Martin: Secondary Structure of the SARS-CoV-2 5’-UTR. RNA Biol. 2021, 18, 447–456.
*C. ‐Y. Lo, T. ‐L. Tsai, C. ‐N. Lin, C. ‐H. Lin, H.‐Y. Wu: Interaction of coronavirus nucleocapsid protein with the 5′‐ and 3′‐ends of the coronavirus genome is involved in genome circularization and negative‐strand RNA synthesis. FEBS J. 2019, 286, 3222-3239

Struktura in funkcija končnih zaporedij koronavirusne genomske RNA

2021-05-05T10:58:53Z

Ekanalec: /* 5' UTR in sekundarne strukture mRNA */

==Uvod==
Celice, okužene z koronavirusom, vsebujejo 7 do 9 specifičnih virusnih mRNA s 3’ koterminalnimi konci. Vse mRNA molekule imajo na 5' koncih identična vodilna zaporedja, ki so dolga od 70 do 90 nukleotidov, na 3' koncu pa imajo poliA rep. Obstajata dva ključna elementa TRS (TRS; angl. transcriptional regulatory sequence), ki sta prisotna na 3′ koncu vodilnega zaporedja (TRS-L (angl. leader)) ter na 5′ koncu vsakega gena in delujeta kot cis-regulatorja transkripcije. Betakoronavirusi vsebujejo enako heptamerno zaporedje, 5’-UCUAAAC-3’, pri čemer ima SARS-CoV TRS 5’-ACGAAC-3’ kot osrednje zaporedje.

==5' UTR in sekundarne strukture mRNA==
5' neprevedena regija (UTR; angl. untranslated region) je regija na mRNA, ki se nahaja med mestom začetka transkripcije in enim nukleotidom pred začetnim kodonom (običajno je to AUG). Pomembna je pri nadaljnjih translacijskih in transkripcijskih mehanizmih. Včasih je (delno) prevedena v proteinske produkte, ki regulirajo translacijo glavnega kodirnega zaporedja mRNA, v veliko organizmih pa je 5' UTR popolnoma neprevedena in tvori kompleksne sekundarne strukture (dvojno vijačnico, lasne zanke, psevdovozle (PK; angl. pseudoknots) in tetrazanke (angl. tetraloops)), ki sodelujejo pri regulaciji translacije.

Nekatere izmed teh sekundarnih struktur so poimenovane stem-loops (SL). Zanke imajo večinoma obliko lasnih zank, se pa oblike lahko razlikujejo. Njihova vloga je največkrat povečanje strukturne stabilnosti mRNA. Pri virusih, natančneje koronavirusih, so pomembne zanke od SL1 do SL8, ki so bistvene za CoV podvajanje in sintezo virusne RNA. Sekundarne strukture v 5' končnih regijah so v veliki meri ohranjene, čeprav so nukleotidna zaporedja precej različna.

===Zanke SL1, SL2 IN SL3===
SL1 ima dvodelno strukturo. Dve pirimidinski bazi delita SL1 zanko na zgornji in spodnji del. Zgornji del je pomemben za učinkovito virusno replikacijo. Spremembe, ki vplivajo na povezovanje baz na tem delu, lahko vplivajo na fenotipe virusa, in so lahko smrtonosne, medtem ko so spremembe na spodnjem delu virusi sposobni preživeti. Genomi, ki imajo spremembe v SL1, niso zmožni sintetizirati negativno polarne subgenomske RNA. Strukturna labilnost spodnje regije SL1 je pomembna za razmnoževanje virusa.

SL2 je najbolj ohranjena sekundarna struktura v 5' UTR. Ima 5 nukleotidov dolgo steblo, sestavljeno iz (C/U) UUG (U/C) in je najbolj ohranjeno zaporedje v 5' UTR. Zamenjava U48 s C ali A (sprememba U48C/U48A) je smrtonosna, virus, ki pa vsebuje spremembo U48G (zamenjava uracila z gvaninom na mestu 48) pa lahko preživi in raste ter izraža t.i. wild type fenotip. SL2 je torej iz strukturnega vidika zelo pomembna za preživetje virusov.

TRS oz. glavno TRS zaporedje nekaterih koronavirusov (npr. Sars-CoV, BCov) se nahaja v SL3 zanki. To zanko bi lahko našli tudi pri MHV virusu, vendar pri 37°C ni stabilna, zato je pri večini poskusov ne opazimo. TRS regija je enoverižna. Glavno TRS zaporedje ima ključno vlogo pri sintezi subgenomske RNA. Da lahko transkripcija poteka, je poleg drugih dejavnikov potrebna minimalna podobnost med TRS-L in TRS-B.

N protein se veže z veliko afiniteto in specifičnostjo na TRS-L. Vsebuje dve strukturno neodvisni RNA vezavni domeni: N-terminalna RNA vezavna domena (NTD; angl. N-terminal domain) in C-terminalna dimerizacijska domena (CTD; angl. C-terminal domain), ki sta povezani s Ser/Arg bogatim členom (angl. linker). Vezava proteina NTD na TRS je ključna za učinkovito sintezo subgenomske RNA.

===Zanke SL4, SL5 IN SL6===
SL4 je sestavljena iz dveh delov, SL4A in SL4B. SL4B kot struktura ali kot zaporedje nima pomembnejše vloge pri virusni replikaciji, ampak sama celotna zanka deluje kot vmesnik (angl. spacer) in je pomembna za usmerjanje virusne subgenomske RNA.

SL5 zanka je pomembna pri replikaciji DI RNA (angl. defective interfering RNA) in se razteza od 5' UTR v zaporedje proteina nsp1. Ta protein pri SARS-CoV virusih zavira imunske funkcije gostiteljskega organizma in vpliva na translacijo gostiteljeve mRNA. SL5 ima obliko trifurkatne zanke, sestavljena je iz A, B in C delov in je od vseh zank najdaljša. Napake na SL5C zaradi zamenjave 4 nukleotidov rezultira v viabilnih rekombinantnih virusih z zgolj zmerno poškodovano virusno replikacijo.

SL6 zajema nukleotide 376-446 pri virusu MHV in kodira aminokislinske pozicije 56-79 za protein nsp1. Pri MHV SL6 ni ključnega pomena za virusno replikacijo, spremembe, ki vplivajo na SL6 so bolj pomembne zaradi njihovega vpliva na protein nsp1.

===Zanke PRI SARS-COV-2===
Pri SARS-CoV-2 opazimo zanke od SL1 do SL5, najdena pa je bila tudi manjša zanka med 4 in 5, ki so jo poimenovali SL4.5. Zanka SL1 ni ohranjena pri vseh sevih SARS-CoV-2 virusa. SL2 je primerljiva s SL3 pri BCoV virusu in je vključena v proces replikacije. Zanka (CUUGU) od SL2 je pomembna pri replikaciji MHV, kjer ima obliko U-obrata, medtem ko je pri SARS-CoV-2 v obliki tetra zanke.

SL3 zanka zajema TRS zaporedje. SL4 je razmeroma stabilna in dolga. Sama SL4 je pomembna pri sintezi subgenomskih RNA fragmentov. Na 3' delu 5' UTR je SL5 zanka, ki je bolj kompleksna, sestavljajo jo trije deli: SL5A, SL5B, SL5C. Pri Sars-CoV-2 se na SL5 nahaja nsp1 AUG začetni kodon.

==3' UTR in sekundarne strukture mRNA==
Koronavirusna 3' neprevedena regija (3' UTR) je sestavljena iz 300 do 500 nukleotidov in poliadenilacijskega repa oziroma poliA repa.
Različne študije so z uporabo algoritmov za zlaganje RNA, biokemičnih in funkcijskih študij poskušale preučiti strukturo in funkcijo 3' UTR. 3' UTR vsebujejo cis-delujoče regije, ki se zložijo v sekundarne strukture. Te prispevajo k večji stabilnosti ter sodelujejo pri tvorjenju intramolekularnih in intermolekularnih interakcij. Poleg tega pa ima 3' UTR tako kot tudi 5' UTR pomembno vlogo pri regulaciji RNA replikacije in transkripcije.

===Zanka BSL===
Proti 3' koncu, tik za stop kodonom N gena, se nahaja sekundarna struktura stebelne zanke (BSL; ang. bulged stem loop), ki je pri MHV dolga 68 nukleotidov. BSL ima ključno vlogo pri replikaciji virusne RNA. Štirje kovariantni bazni pari v tej zanki pa so ključni za funkcionalnost te sekundarne strukture.

===Psevdovozel===
Lasna zanka se nahaja od BSL proti 3’ koncu in tvori psevdovozel (PK; angl. pseudoknot - sekundarna struktura z vsaj dvema zankama, kjer se polovica ene zanke vstavi med polovici druge zanke) z BSL. Ta je pri različnih vrstah koronavirusov ohranjena po lokaciji in obliki. Po zaporedju nukleotidov pa se nekoliko razlikuje, kar nakazuje, da bi lahko deloval kot regulatorni kontrolni element.
Za trojni spoj alfa vijačnic S3 je bilo dokazano, da ta pripomore k stabilizaciji strukture psevdovozla. Konformacija psevdovozla je manj stabilna od konformacije dvojne lasne zanke. S3 pa naj bi imela tudi pomembno vlogo pri replikaciji.
Prekrivanje BSL in PK v 5 nukleotidih je razlog, da se te dve strukturi ne moreta hkrati popolnoma zložiti. To nakazuje, da vsak element tvori nadomestne konformacije in v določeni fazi RNA delujeta kot molekularno stikalo sinteze RNA.

===Zanka HVR===
Na primeru MHV je bilo ugotovljeno, da se navzdol od PK nahaja tako imenovana “multi-branch stem loop”. Gre za dolgo hipervariabilno regijo (HVR; angl. hypervariable region), ki v svoji strukturi vsebuje oligonukleotidno zaporedje 5'-GGAAGAGC-3' in je dobro ohranjeno med različnimi vrstami koronavirusov. V strukturi na 3' koncu najdemo tudi trojni spoj alfa vijačnic, ki jih označujemo s S3 in S4 in obdajata lasno zanko (S2-L2).

===Zanka L1===
Zanka 1 (L1; angl. loop-1) se nahaja med BSL in PK. Prihaja do interakcije med L1 in 3' koncem genoma s proteinskim kompleksom (nsp7, nsp8 in nsp9). To povzroči konformacijske spremembe v 3' koncu RNA, kar omogoči tvorbo psevdovozla, ki omogoča vezavo od RNA odvisne RNA-polimeraze (nsp12), helikaze in proteinov nsp14, nsp10. To pa omogoči iniciacijo sinteze negativne verige RNA.

Pri alfakoronavirusih je PK ohranjen, lahko pa je v njihovi strukturi odsotna BSL. Pri gamakoronavirusih je PK prisoten, ni pa znano, kakšna je njegova funkcija. Do tesnega prekrivanja med BSL in PK prihaja samo pri betakoronavirusih. Sekundarna struktura je pri betakoronavirusih ohranjena, čeprav se nukleotidno zaporedje med različnimi betakoronavirusi razlikuje.

==Interakcije med 5’ IN 3’ koncema==
Interakcije med 5' in 3' koncema v pozitivno smernih RNA virusih preko RNA-RNA, RNA-protein ali protein-protein interakcij vodijo do cirkulacije genoma s pomočjo N proteina, ki tvori most med 5' in 3' koncema. Lahko pomaga tudi poli a vezavni protein (PABP; angl. poly A binding protein), vezan na 3' poli A rep, preko interakcije z eIF-4G, komponente eIF-4F kapa vezavnega proteina, ki se veže na mRNA kapo na 5’ koncu med translacijo.
Vezava N proteina s strukturo S3 in 15 nukleotidov dolgim poli A repom je dovolj za iniciacijo sinteze negativno smerne verige. Spremembe v 5' in 3' končnih zaporedjih zmanjšajo vezavno afiniteto med N proteinom in obema koncema, kar vpliva na učinkovitost iniciacije sinteze negativno smerne verige.

==Literatura==
*Y. Dong, J. L. Leibowitz: The Structure and Functions of Coronavirus Genomic 3’ and 5’ Ends. Virus Res. 2015, 206, 120–133.
*L. I. Sola, F. Almazán, S. Zúñiga, L. Enjuanes: Continuous and Discontinuous RNA Synthesis in Coronaviruses. Annu. Rev. Virol. 2015, 2, 265–288.
*K. Narayanan, C. Huang, K. Lokugamage, W. Kamitani, T. Ikegami, C.-T. K. Tseng, S. Makino: Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus Nsp1 Suppresses Host Gene Expression, Including That of Type I Interferon, in Infected Cells. J. Virol. 2008, 82, 4471–4479.
*Z. Miao, A. Tidu, G. Eriani, F. Martin: Secondary Structure of the SARS-CoV-2 5’-UTR. RNA Biol. 2021, 18, 447–456.
*C. ‐Y. Lo, T. ‐L. Tsai, C. ‐N. Lin, C. ‐H. Lin, H.‐Y. Wu: Interaction of coronavirus nucleocapsid protein with the 5′‐ and 3′‐ends of the coronavirus genome is involved in genome circularization and negative‐strand RNA synthesis. FEBS J. 2019, 286, 3222-3239

Struktura in funkcija končnih zaporedij koronavirusne genomske RNA

2021-05-05T10:56:49Z

Ekanalec:

==Uvod==
Celice, okužene z koronavirusom, vsebujejo 7 do 9 specifičnih virusnih mRNA s 3’ koterminalnimi konci. Vse mRNA molekule imajo na 5' koncih identična vodilna zaporedja, ki so dolga od 70 do 90 nukleotidov, na 3' koncu pa imajo poliA rep. Obstajata dva ključna elementa TRS (TRS; angl. transcriptional regulatory sequence), ki sta prisotna na 3′ koncu vodilnega zaporedja (TRS-L (angl. leader)) ter na 5′ koncu vsakega gena in delujeta kot cis-regulatorja transkripcije. Betakoronavirusi vsebujejo enako heptamerno zaporedje, 5’-UCUAAAC-3’, pri čemer ima SARS-CoV TRS 5’-ACGAAC-3’ kot osrednje zaporedje.

==5' UTR in sekundarne strukture mRNA==
5' neprevedena regija (UTR; angl. untranslated region) je regija na mRNA, ki se nahaja med mestom začetka transkripcije in enim nukleotidom pred začetnim kodonom (običajno je to AUG). Pomembna je pri nadaljnjih translacijskih in transkripcijskih mehanizmih. Včasih je (delno) prevedena v proteinske produkte, ki regulirajo translacijo glavnega kodirnega zaporedja mRNA, v veliko organizmih pa je 5' UTR popolnoma neprevedena in tvori kompleksne sekundarne strukture (dvojno vijačnico, lasne zanke, psevdovozle (PK; angl. pseudoknots) in tetrazanke (angl. tetraloops)), ki sodelujejo pri regulaciji translacije.
Nekatere izmed teh sekundarnih struktur so poimenovane stem-loops (SL). Zanke imajo večinoma obliko lasnih zank, se pa oblike lahko razlikujejo. Njihova vloga je največkrat povečanje strukturne stabilnosti mRNA. Pri virusih, natančneje koronavirusih, so pomembne zanke od SL1 do SL8, ki so bistvene za CoV podvajanje in sintezo virusne RNA. Sekundarne strukture v 5' končnih regijah so v veliki meri ohranjene, čeprav so nukleotidna zaporedja precej različna.

===Zanke SL1, SL2 IN SL3===
SL1 ima dvodelno strukturo. Dve pirimidinski bazi delita SL1 zanko na zgornji in spodnji del. Zgornji del je pomemben za učinkovito virusno replikacijo. Spremembe, ki vplivajo na povezovanje baz na tem delu, lahko vplivajo na fenotipe virusa, in so lahko smrtonosne, medtem ko so spremembe na spodnjem delu virusi sposobni preživeti. Genomi, ki imajo spremembe v SL1, niso zmožni sintetizirati negativno polarne subgenomske RNA. Strukturna labilnost spodnje regije SL1 je pomembna za razmnoževanje virusa.
SL2 je najbolj ohranjena sekundarna struktura v 5' UTR. Ima 5 nukleotidov dolgo steblo, sestavljeno iz (C/U) UUG (U/C) in je najbolj ohranjeno zaporedje v 5' UTR. Zamenjava U48 s C ali A (sprememba U48C/U48A) je smrtonosna, virus, ki pa vsebuje spremembo U48G (zamenjava uracila z gvaninom na mestu 48) pa lahko preživi in raste ter izraža t.i. wild type fenotip. SL2 je torej iz strukturnega vidika zelo pomembna za preživetje virusov.
TRS oz. glavno TRS zaporedje nekaterih koronavirusov (npr. Sars-CoV, BCov) se nahaja v SL3 zanki. To zanko bi lahko našli tudi pri MHV virusu, vendar pri 37°C ni stabilna, zato je pri večini poskusov ne opazimo. TRS regija je enoverižna. Glavno TRS zaporedje ima ključno vlogo pri sintezi subgenomske RNA. Da lahko transkripcija poteka, je poleg drugih dejavnikov potrebna minimalna podobnost med TRS-L in TRS-B.
N protein se veže z veliko afiniteto in specifičnostjo na TRS-L. Vsebuje dve strukturno neodvisni RNA vezavni domeni: N-terminalna RNA vezavna domena (NTD; angl. N-terminal domain) in C-terminalna dimerizacijska domena (CTD; angl. C-terminal domain), ki sta povezani s Ser/Arg bogatim členom (angl. linker). Vezava proteina NTD na TRS je ključna za učinkovito sintezo subgenomske RNA.

===Zanke SL4, SL5 IN SL6===
SL4 je sestavljena iz dveh delov, SL4A in SL4B. SL4B kot struktura ali kot zaporedje nima pomembnejše vloge pri virusni replikaciji, ampak sama celotna zanka deluje kot vmesnik (angl. spacer) in je pomembna za usmerjanje virusne subgenomske RNA.
SL5 zanka je pomembna pri replikaciji DI RNA (angl. defective interfering RNA) in se razteza od 5' UTR v zaporedje proteina nsp1. Ta protein pri SARS-CoV virusih zavira imunske funkcije gostiteljskega organizma in vpliva na translacijo gostiteljeve mRNA. SL5 ima obliko trifurkatne zanke, sestavljena je iz A, B in C delov in je od vseh zank najdaljša. Napake na SL5C zaradi zamenjave 4 nukleotidov rezultira v viabilnih rekombinantnih virusih z zgolj zmerno poškodovano virusno replikacijo.
SL6 zajema nukleotide 376-446 pri virusu MHV in kodira aminokislinske pozicije 56-79 za protein nsp1. Pri MHV SL6 ni ključnega pomena za virusno replikacijo, spremembe, ki vplivajo na SL6 so bolj pomembne zaradi njihovega vpliva na protein nsp1.

===Zanke PRI SARS-COV-2===
Pri SARS-CoV-2 opazimo zanke od SL1 do SL5, najdena pa je bila tudi manjša zanka med 4 in 5, ki so jo poimenovali SL4.5. Zanka SL1 ni ohranjena pri vseh sevih SARS-CoV-2 virusa. SL2 je primerljiva s SL3 pri BCoV virusu in je vključena v proces replikacije. Zanka (CUUGU) od SL2 je pomembna pri replikaciji MHV, kjer ima obliko U-obrata, medtem ko je pri SARS-CoV-2 v obliki tetra zanke.
SL3 zanka zajema TRS zaporedje. SL4 je razmeroma stabilna in dolga. Sama SL4 je pomembna pri sintezi subgenomskih RNA fragmentov. Na 3' delu 5' UTR je SL5 zanka, ki je bolj kompleksna, sestavljajo jo trije deli: SL5A, SL5B, SL5C. Pri Sars-CoV-2 se na SL5 nahaja nsp1 AUG začetni kodon.

==3' UTR in sekundarne strukture mRNA==
Koronavirusna 3' neprevedena regija (3' UTR) je sestavljena iz 300 do 500 nukleotidov in poliadenilacijskega repa oziroma poliA repa.
Različne študije so z uporabo algoritmov za zlaganje RNA, biokemičnih in funkcijskih študij poskušale preučiti strukturo in funkcijo 3' UTR. 3' UTR vsebujejo cis-delujoče regije, ki se zložijo v sekundarne strukture. Te prispevajo k večji stabilnosti ter sodelujejo pri tvorjenju intramolekularnih in intermolekularnih interakcij. Poleg tega pa ima 3' UTR tako kot tudi 5' UTR pomembno vlogo pri regulaciji RNA replikacije in transkripcije.

===Zanka BSL===
Proti 3' koncu, tik za stop kodonom N gena, se nahaja sekundarna struktura stebelne zanke (BSL; ang. bulged stem loop), ki je pri MHV dolga 68 nukleotidov. BSL ima ključno vlogo pri replikaciji virusne RNA. Štirje kovariantni bazni pari v tej zanki pa so ključni za funkcionalnost te sekundarne strukture.

===Psevdovozel===
Lasna zanka se nahaja od BSL proti 3’ koncu in tvori psevdovozel (PK; angl. pseudoknot - sekundarna struktura z vsaj dvema zankama, kjer se polovica ene zanke vstavi med polovici druge zanke) z BSL. Ta je pri različnih vrstah koronavirusov ohranjena po lokaciji in obliki. Po zaporedju nukleotidov pa se nekoliko razlikuje, kar nakazuje, da bi lahko deloval kot regulatorni kontrolni element.
Za trojni spoj alfa vijačnic S3 je bilo dokazano, da ta pripomore k stabilizaciji strukture psevdovozla. Konformacija psevdovozla je manj stabilna od konformacije dvojne lasne zanke. S3 pa naj bi imela tudi pomembno vlogo pri replikaciji.
Prekrivanje BSL in PK v 5 nukleotidih je razlog, da se te dve strukturi ne moreta hkrati popolnoma zložiti. To nakazuje, da vsak element tvori nadomestne konformacije in v določeni fazi RNA delujeta kot molekularno stikalo sinteze RNA.

===Zanka HVR===
Na primeru MHV je bilo ugotovljeno, da se navzdol od PK nahaja tako imenovana “multi-branch stem loop”. Gre za dolgo hipervariabilno regijo (HVR; angl. hypervariable region), ki v svoji strukturi vsebuje oligonukleotidno zaporedje 5'-GGAAGAGC-3' in je dobro ohranjeno med različnimi vrstami koronavirusov. V strukturi na 3' koncu najdemo tudi trojni spoj alfa vijačnic, ki jih označujemo s S3 in S4 in obdajata lasno zanko (S2-L2).

===Zanka L1===
Zanka 1 (L1; angl. loop-1) se nahaja med BSL in PK. Prihaja do interakcije med L1 in 3' koncem genoma s proteinskim kompleksom (nsp7, nsp8 in nsp9). To povzroči konformacijske spremembe v 3' koncu RNA, kar omogoči tvorbo psevdovozla, ki omogoča vezavo od RNA odvisne RNA-polimeraze (nsp12), helikaze in proteinov nsp14, nsp10. To pa omogoči iniciacijo sinteze negativne verige RNA.

Pri alfakoronavirusih je PK ohranjen, lahko pa je v njihovi strukturi odsotna BSL. Pri gamakoronavirusih je PK prisoten, ni pa znano, kakšna je njegova funkcija. Do tesnega prekrivanja med BSL in PK prihaja samo pri betakoronavirusih. Sekundarna struktura je pri betakoronavirusih ohranjena, čeprav se nukleotidno zaporedje med različnimi betakoronavirusi razlikuje.

==Interakcije med 5’ IN 3’ koncema==
Interakcije med 5' in 3' koncema v pozitivno smernih RNA virusih preko RNA-RNA, RNA-protein ali protein-protein interakcij vodijo do cirkulacije genoma s pomočjo N proteina, ki tvori most med 5' in 3' koncema. Lahko pomaga tudi poli a vezavni protein (PABP; angl. poly A binding protein), vezan na 3' poli A rep, preko interakcije z eIF-4G, komponente eIF-4F kapa vezavnega proteina, ki se veže na mRNA kapo na 5’ koncu med translacijo.
Vezava N proteina s strukturo S3 in 15 nukleotidov dolgim poli A repom je dovolj za iniciacijo sinteze negativno smerne verige. Spremembe v 5' in 3' končnih zaporedjih zmanjšajo vezavno afiniteto med N proteinom in obema koncema, kar vpliva na učinkovitost iniciacije sinteze negativno smerne verige.

==Literatura==
*Y. Dong, J. L. Leibowitz: The Structure and Functions of Coronavirus Genomic 3’ and 5’ Ends. Virus Res. 2015, 206, 120–133.
*L. I. Sola, F. Almazán, S. Zúñiga, L. Enjuanes: Continuous and Discontinuous RNA Synthesis in Coronaviruses. Annu. Rev. Virol. 2015, 2, 265–288.
*K. Narayanan, C. Huang, K. Lokugamage, W. Kamitani, T. Ikegami, C.-T. K. Tseng, S. Makino: Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus Nsp1 Suppresses Host Gene Expression, Including That of Type I Interferon, in Infected Cells. J. Virol. 2008, 82, 4471–4479.
*Z. Miao, A. Tidu, G. Eriani, F. Martin: Secondary Structure of the SARS-CoV-2 5’-UTR. RNA Biol. 2021, 18, 447–456.
*C. ‐Y. Lo, T. ‐L. Tsai, C. ‐N. Lin, C. ‐H. Lin, H.‐Y. Wu: Interaction of coronavirus nucleocapsid protein with the 5′‐ and 3′‐ends of the coronavirus genome is involved in genome circularization and negative‐strand RNA synthesis. FEBS J. 2019, 286, 3222-3239

Struktura in funkcija končnih zaporedij koronavirusne genomske RNA

2021-05-05T10:53:39Z

Ekanalec: New page: ==Uvod== Celice, okužene z koronavirusom, vsebujejo 7 do 9 specifičnih virusnih mRNA s 3’ koterminalnimi konci. Vse mRNA molekule imajo na 5' koncih identična vodilna zaporedja, ki so...

==Uvod==
Celice, okužene z koronavirusom, vsebujejo 7 do 9 specifičnih virusnih mRNA s 3’ koterminalnimi konci. Vse mRNA molekule imajo na 5' koncih identična vodilna zaporedja, ki so dolga od 70 do 90 nukleotidov, na 3' koncu pa imajo poliA rep. Obstajata dva ključna elementa TRS (TRS; angl. transcriptional regulatory sequence), ki sta prisotna na 3′ koncu vodilnega zaporedja (TRS-L (angl. leader)) ter na 5′ koncu vsakega gena in delujeta kot cis-regulatorja transkripcije. Betakoronavirusi vsebujejo enako heptamerno zaporedje, 5’-UCUAAAC-3’, pri čemer ima SARS-CoV TRS 5’-ACGAAC-3’ kot osrednje zaporedje.

==5' UTR IN SEKUNDARNE STRUKTURE mRNA==
5' neprevedena regija (UTR; angl. untranslated region) je regija na mRNA, ki se nahaja med mestom začetka transkripcije in enim nukleotidom pred začetnim kodonom (običajno je to AUG). Pomembna je pri nadaljnjih translacijskih in transkripcijskih mehanizmih. Včasih je (delno) prevedena v proteinske produkte, ki regulirajo translacijo glavnega kodirnega zaporedja mRNA, v veliko organizmih pa je 5' UTR popolnoma neprevedena in tvori kompleksne sekundarne strukture (dvojno vijačnico, lasne zanke, psevdovozle (PK; angl. pseudoknots) in tetrazanke (angl. tetraloops)), ki sodelujejo pri regulaciji translacije.
Nekatere izmed teh sekundarnih struktur so poimenovane stem-loops (SL). Zanke imajo večinoma obliko lasnih zank, se pa oblike lahko razlikujejo. Njihova vloga je največkrat povečanje strukturne stabilnosti mRNA. Pri virusih, natančneje koronavirusih, so pomembne zanke od SL1 do SL8, ki so bistvene za CoV podvajanje in sintezo virusne RNA. Sekundarne strukture v 5' končnih regijah so v veliki meri ohranjene, čeprav so nukleotidna zaporedja precej različna.

===ZANKE SL1, SL2 IN SL3===
SL1 ima dvodelno strukturo. Dve pirimidinski bazi delita SL1 zanko na zgornji in spodnji del. Zgornji del je pomemben za učinkovito virusno replikacijo. Spremembe, ki vplivajo na povezovanje baz na tem delu, lahko vplivajo na fenotipe virusa, in so lahko smrtonosne, medtem ko so spremembe na spodnjem delu virusi sposobni preživeti. Genomi, ki imajo spremembe v SL1, niso zmožni sintetizirati negativno polarne subgenomske RNA. Strukturna labilnost spodnje regije SL1 je pomembna za razmnoževanje virusa.
SL2 je najbolj ohranjena sekundarna struktura v 5' UTR. Ima 5 nukleotidov dolgo steblo, sestavljeno iz (C/U) UUG (U/C) in je najbolj ohranjeno zaporedje v 5' UTR. Zamenjava U48 s C ali A (sprememba U48C/U48A) je smrtonosna, virus, ki pa vsebuje spremembo U48G (zamenjava uracila z gvaninom na mestu 48) pa lahko preživi in raste ter izraža t.i. wild type fenotip. SL2 je torej iz strukturnega vidika zelo pomembna za preživetje virusov.
TRS oz. glavno TRS zaporedje nekaterih koronavirusov (npr. Sars-CoV, BCov) se nahaja v SL3 zanki. To zanko bi lahko našli tudi pri MHV virusu, vendar pri 37°C ni stabilna, zato je pri večini poskusov ne opazimo. TRS regija je enoverižna. Glavno TRS zaporedje ima ključno vlogo pri sintezi subgenomske RNA. Da lahko transkripcija poteka, je poleg drugih dejavnikov potrebna minimalna podobnost med TRS-L in TRS-B.
N protein se veže z veliko afiniteto in specifičnostjo na TRS-L. Vsebuje dve strukturno neodvisni RNA vezavni domeni: N-terminalna RNA vezavna domena (NTD; angl. N-terminal domain) in C-terminalna dimerizacijska domena (CTD; angl. C-terminal domain), ki sta povezani s Ser/Arg bogatim členom (angl. linker). Vezava proteina NTD na TRS je ključna za učinkovito sintezo subgenomske RNA.

===ZANKE SL4, SL5 IN SL6===
SL4 je sestavljena iz dveh delov, SL4A in SL4B. SL4B kot struktura ali kot zaporedje nima pomembnejše vloge pri virusni replikaciji, ampak sama celotna zanka deluje kot vmesnik (angl. spacer) in je pomembna za usmerjanje virusne subgenomske RNA.
SL5 zanka je pomembna pri replikaciji DI RNA (angl. defective interfering RNA) in se razteza od 5' UTR v zaporedje proteina nsp1. Ta protein pri SARS-CoV virusih zavira imunske funkcije gostiteljskega organizma in vpliva na translacijo gostiteljeve mRNA. SL5 ima obliko trifurkatne zanke, sestavljena je iz A, B in C delov in je od vseh zank najdaljša. Napake na SL5C zaradi zamenjave 4 nukleotidov rezultira v viabilnih rekombinantnih virusih z zgolj zmerno poškodovano virusno replikacijo.
SL6 zajema nukleotide 376-446 pri virusu MHV in kodira aminokislinske pozicije 56-79 za protein nsp1. Pri MHV SL6 ni ključnega pomena za virusno replikacijo, spremembe, ki vplivajo na SL6 so bolj pomembne zaradi njihovega vpliva na protein nsp1.

===ZANKE PRI SARS-COV-2===
Pri SARS-CoV-2 opazimo zanke od SL1 do SL5, najdena pa je bila tudi manjša zanka med 4 in 5, ki so jo poimenovali SL4.5. Zanka SL1 ni ohranjena pri vseh sevih SARS-CoV-2 virusa. SL2 je primerljiva s SL3 pri BCoV virusu in je vključena v proces replikacije. Zanka (CUUGU) od SL2 je pomembna pri replikaciji MHV, kjer ima obliko U-obrata, medtem ko je pri SARS-CoV-2 v obliki tetra zanke.
SL3 zanka zajema TRS zaporedje. SL4 je razmeroma stabilna in dolga. Sama SL4 je pomembna pri sintezi subgenomskih RNA fragmentov. Na 3' delu 5' UTR je SL5 zanka, ki je bolj kompleksna, sestavljajo jo trije deli: SL5A, SL5B, SL5C. Pri Sars-CoV-2 se na SL5 nahaja nsp1 AUG začetni kodon.

==3' UTR IN SEKUNDARNE STRUKTURE mRNA==
Koronavirusna 3' neprevedena regija (3' UTR) je sestavljena iz 300 do 500 nukleotidov in poliadenilacijskega repa oziroma poliA repa.
Različne študije so z uporabo algoritmov za zlaganje RNA, biokemičnih in funkcijskih študij poskušale preučiti strukturo in funkcijo 3' UTR. 3' UTR vsebujejo cis-delujoče regije, ki se zložijo v sekundarne strukture. Te prispevajo k večji stabilnosti ter sodelujejo pri tvorjenju intramolekularnih in intermolekularnih interakcij. Poleg tega pa ima 3' UTR tako kot tudi 5' UTR pomembno vlogo pri regulaciji RNA replikacije in transkripcije.

===ZANKA BSL===
Proti 3' koncu, tik za stop kodonom N gena, se nahaja sekundarna struktura stebelne zanke (BSL; ang. bulged stem loop), ki je pri MHV dolga 68 nukleotidov. BSL ima ključno vlogo pri replikaciji virusne RNA. Štirje kovariantni bazni pari v tej zanki pa so ključni za funkcionalnost te sekundarne strukture.

===PSEVDOVOZEL===
Lasna zanka se nahaja od BSL proti 3’ koncu in tvori psevdovozel (PK; angl. pseudoknot - sekundarna struktura z vsaj dvema zankama, kjer se polovica ene zanke vstavi med polovici druge zanke) z BSL. Ta je pri različnih vrstah koronavirusov ohranjena po lokaciji in obliki. Po zaporedju nukleotidov pa se nekoliko razlikuje, kar nakazuje, da bi lahko deloval kot regulatorni kontrolni element.
Za trojni spoj alfa vijačnic S3 je bilo dokazano, da ta pripomore k stabilizaciji strukture psevdovozla. Konformacija psevdovozla je manj stabilna od konformacije dvojne lasne zanke. S3 pa naj bi imela tudi pomembno vlogo pri replikaciji.
Prekrivanje BSL in PK v 5 nukleotidih je razlog, da se te dve strukturi ne moreta hkrati popolnoma zložiti. To nakazuje, da vsak element tvori nadomestne konformacije in v določeni fazi RNA delujeta kot molekularno stikalo sinteze RNA.

===ZANKA HVR===
Na primeru MHV je bilo ugotovljeno, da se navzdol od PK nahaja tako imenovana “multi-branch stem loop”. Gre za dolgo hipervariabilno regijo (HVR; angl. hypervariable region), ki v svoji strukturi vsebuje oligonukleotidno zaporedje 5'-GGAAGAGC-3' in je dobro ohranjeno med različnimi vrstami koronavirusov. V strukturi na 3' koncu najdemo tudi trojni spoj alfa vijačnic, ki jih označujemo s S3 in S4 in obdajata lasno zanko (S2-L2).

===ZANKA L1===
Zanka 1 (L1; angl. loop-1) se nahaja med BSL in PK. Prihaja do interakcije med L1 in 3' koncem genoma s proteinskim kompleksom (nsp7, nsp8 in nsp9). To povzroči konformacijske spremembe v 3' koncu RNA, kar omogoči tvorbo psevdovozla, ki omogoča vezavo od RNA odvisne RNA-polimeraze (nsp12), helikaze in proteinov nsp14, nsp10. To pa omogoči iniciacijo sinteze negativne verige RNA.

Pri alfakoronavirusih je PK ohranjen, lahko pa je v njihovi strukturi odsotna BSL. Pri gamakoronavirusih je PK prisoten, ni pa znano, kakšna je njegova funkcija. Do tesnega prekrivanja med BSL in PK prihaja samo pri betakoronavirusih. Sekundarna struktura je pri betakoronavirusih ohranjena, čeprav se nukleotidno zaporedje med različnimi betakoronavirusi razlikuje.

==INTERAKCIJE MED 5’ IN 3’ KONCEMA==
Interakcije med 5' in 3' koncema v pozitivno smernih RNA virusih preko RNA-RNA, RNA-protein ali protein-protein interakcij vodijo do cirkulacije genoma s pomočjo N proteina, ki tvori most med 5' in 3' koncema. Lahko pomaga tudi poli a vezavni protein (PABP; angl. poly A binding protein), vezan na 3' poli A rep, preko interakcije z eIF-4G, komponente eIF-4F kapa vezavnega proteina, ki se veže na mRNA kapo na 5’ koncu med translacijo.
Vezava N proteina s strukturo S3 in 15 nukleotidov dolgim poli A repom je dovolj za iniciacijo sinteze negativno smerne verige. Spremembe v 5' in 3' končnih zaporedjih zmanjšajo vezavno afiniteto med N proteinom in obema koncema, kar vpliva na učinkovitost iniciacije sinteze negativno smerne verige.

==Literatura==
*Y. Dong, J. L. Leibowitz: The Structure and Functions of Coronavirus Genomic 3’ and 5’ Ends. Virus Res. 2015, 206, 120–133.
*L. I. Sola, F. Almazán, S. Zúñiga, L. Enjuanes: Continuous and Discontinuous RNA Synthesis in Coronaviruses. Annu. Rev. Virol. 2015, 2, 265–288.
*K. Narayanan, C. Huang, K. Lokugamage, W. Kamitani, T. Ikegami, C.-T. K. Tseng, S. Makino: Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus Nsp1 Suppresses Host Gene Expression, Including That of Type I Interferon, in Infected Cells. J. Virol. 2008, 82, 4471–4479.
*Z. Miao, A. Tidu, G. Eriani, F. Martin: Secondary Structure of the SARS-CoV-2 5’-UTR. RNA Biol. 2021, 18, 447–456.
*C. ‐Y. Lo, T. ‐L. Tsai, C. ‐N. Lin, C. ‐H. Lin, H.‐Y. Wu: Interaction of coronavirus nucleocapsid protein with the 5′‐ and 3′‐ends of the coronavirus genome is involved in genome circularization and negative‐strand RNA synthesis. FEBS J. 2019, 286, 3222-3239

Molekularna biologija koronavirusov

2021-05-05T09:15:38Z

Ekanalec:

Seminarji pri Molekularni biologiji v študijskem letu 2020/21 obravnavajo sorazmerno ozko področje koronavirusov, vendar je to glede na pandemijo virusa SARS-CoV-2 zelo aktualna tema in zato smiselna, da jo podrobneje obdelamo. Za seminarje sem določil 15 poglavij, ki temeljijo na vsaj enem preglednem članku, objavljenem od leta 2015 naprej. Ti članki naj vam bodo izhodišče za pripravo, dopolnite pa jih z novejšimi podatki, predvsem glede povzročitelja bolezni kovid-19.

Vsako poglavje obdelajo praviloma trije študenti. Vsaka skupina mora pripraviti povzetek seminarja v obsegu 1200-1500 besed in ga objaviti na tem wikiju. Povzetek ne vsebuje slikovnega gradiva, lahko pa vključuje povezave do slik in videov na spletu. Navedite do 5 ključnih virov (ti ne štejejo v vsoto 1200 besed), ki ste jih uporabili.

Vsaka skupina mora objaviti povzetek seminarja najkasneje 24 h pred začetkom seminarjev. Kateri del povzetka je napisal kdo, navedite v zavihku 'discussion'.

Pripravite tudi predstavitev, dolgo pribl. 20 minut (tolerančni okvir je 18-22 min.), temu pa bo sledila razprava, dolga 5-10 min. Vsak član skupine mora predstaviti en del seminarja, pri čemer mora biti delo enakomerno razdeljeno med vse. Osredotočite se na osnovno temo, ki ste si jo izbrali in vključite čim manj splošnega uvoda. Ne opisujte potekov bolezni, če to ni nujno zaradi povezave z biokemijskimi značilnostmi virusov! Glede vsebine predstavitve se posvetujte s kolegi, ki bodo predstavljali sorodna poglavja, tako da bo čim manj prekrivanj.

Seminarji se bodo začeli 4.5.2021 po razporedu, ki bo objavljen v spletni učilnici.

Vsebina seminarjev je izpitna snov. Odgovori na vprašanja iz snovi seminarjev predstavljajo ~10 % končnih točk izpita (2-3 vprašanja od ~30).

Poglavja za seminarje so:
# Patogeni koronavirusi: izvor in evolucija (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/30531947/)
# Molekularni vidiki koronavirusov (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/32661197/)
# Način pakiranja RNA pri koronavirusih (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/31505321/)
# Struktura in funkcija končnih zaporedij koronavirusne genomske RNA (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/25736566/)
# Struktura genoma in replikacija RNA pri koronavirusih (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/31967327/ in https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/32833200/)
# Kontinuirna in diskontinuirna sinteza RNA pri koronavirusih (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/26958916/)
# Vloga gostiteljskih faktorjev pri replikaciji koronavirusne RNA (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/28643204/)
# Natančnost replikacije koronavirusne RNA (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/21593585/)
# Mehanizmi dodajanja kape in metilacije koronavirusne RNA (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/26847650/)
# Translacijski procesi pri sintezi koronavirusnih proteinov (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/22535777/ in https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/27712623/)
# Odgovor na stres in uravnavanje translacije pri koronavirusih (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/27384577/)
# RNA-elementi s cis-regulacijsko aktivnostjo pri koronavirusih (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/27712622/)
# Vloga nestrukturnega proteina 1 pri izražanju genov ob okužbi s koronavirusom (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/25432065/
# Vloga koronavirusne endonukleaze pri izogibanju protivirusnemu odgovoru (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/29307596/)
# Mehanizem fuzije koronavirusne membrane kot tarča za protivirusna zdravila (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/32272173/)
----

Za seminar se prijavite tako, da se vpišete v oklepaj za naslovom seminarja, tako kot je prikazano pri izmišljenem ničtem seminarju.
Seminarje bomo izvedli v enakem vrstnem redu, kot so navedeni zgoraj.

0. Analiza koronavirusov v Gallusovi dvorani Cankarjevega doma (Jasna Briški, Timi Pegan, Sanja Todorović) 

# [[Patogeni koronavirusi: izvor in evolucija]] (Nikola Janakievski, Stefanija Ivanova) 
# [[Molekularni vidiki koronavirusov]] (Neža Leskovar, Iva Matić, Anja Moškrič) 
# [[Način pakiranja RNA pri koronavirusih]] (Timotej Sotosek, Erik Putar, Eva Vene) 
# [[Struktura in funkcija končnih zaporedij koronavirusne genomske RNA]] (Špela Kladnik, Nika Malečkar, Eva Kanalec)
# Struktura genoma in replikacija RNA pri koronavirusih (Luka Šegota, Maruša Sernc, Luka Stanković)
# Kontinuirna in diskontinuirna sinteza RNA pri koronavirusih (Jakob Tomšič, Ana Pervanja, Zala Perko)
# Vloga gostiteljskih faktorjev pri replikaciji koronavirusne RNA (Nika Bedrač, Tinkara Božič, Maja Kobal)
# Natančnost replikacije koronavirusne RNA (Evgen Kozole, David Verdel, Petra Sintič)
# Mehanizmi dodajanja kape in metilacije koronavirusne RNA (Nika Perko, Gregor Strniša, Nika Tomsič)
# Translacijski procesi pri sintezi koronavirusnih proteinov (Bor Krajnik, Aljaž Simonič, Luka Hafner)
# Odgovor na stres in uravnavanje translacije pri koronavirusih (Aleksandra Rauter, Nika Banovšek, Laura Unuk, Katharina Carola Pavlin)
# RNA-elementi s cis-regulacijsko aktivnostjo pri koronavirusih (Jan Bregar, Ajda Beltram)
# Vloga nestrukturnega proteina 1 pri izražanju genov ob okužbi s koronavirusom (Srna Anastasovska, Mateja Milosevic)
# Vloga koronavirusne endonukleaze pri izogibanju protivirusnemu odgovoru (Veronika Bračič, Ela Bizjak, Rebeka Jerina)
# Mehanizem fuzije koronavirusne membrane kot tarča za protivirusna zdravila (Manca Pirc, Vid Dobrovoljc, Rahela Repina)

Ko boste pripravljali povzetek, naslov teme na tem, drugem, seznamu povežite z novo wiki stranjo, ki bo vsebovala povzetek. Na koncu besedila povzetka (pod viri) v novo vrstico dodajte oznako: <nowiki>[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]</nowiki> . Zgornji seznam bo po zaključku seminarjev izbrisan. Vire boste navedli na koncu vsakega povzetka, zato za serijo seminarjev ne bodo več pomembni.

Primer, kako so bili urejeni seminarji v prejšnjih letih, si lahko ogledate na strani [[Struktura kromatina]] (2013/14).

#[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Herpesvirusi_in_sorodni_dsDNA_virusi Herpesvirusi in sorodni dsDNA virusi] (Veronika Razpotnik, Ines Medved, Andrej Ivanovski)

Molekularna biologija koronavirusov

2021-03-26T10:06:15Z

Ekanalec:

Seminarji pri Molekularni biologiji v študijskem letu 2020/21 obravnavajo sorazmerno ozko področje koronavirusov, vendar je to glede na pandemijo virusa SARS-CoV-2 zelo aktualna tema in zato smiselna, da jo podrobneje obdelamo. Za seminarje sem določil 15 poglavij, ki temeljijo na vsaj enem preglednem članku, objavljenem od leta 2015 naprej. Ti članki naj vam bodo izhodišče za pripravo, dopolnite pa jih z novejšimi podatki, predvsem glede povzročitelja bolezni kovid-19.

Vsako poglavje obdelajo praviloma trije študenti. Vsaka skupina mora pripraviti povzetek seminarja v obsegu 1200-1500 besed in ga objaviti na tem wikiju. Povzetek ne vsebuje slikovnega gradiva, lahko pa vključuje povezave do slik in videov na spletu. Navedite do 5 ključnih virov (ti ne štejejo v vsoto 1200 besed), ki ste jih uporabili.

Vsaka skupina mora objaviti povzetek seminarja najkasneje 24 h pred začetkom seminarjev. Kateri del povzetka je napisal kdo, navedite v zavihku 'discussion'.

Pripravite tudi predstavitev, dolgo pribl. 20 minut (tolerančni okvir je 18-22 min.), temu pa bo sledila razprava, dolga 5-10 min. Vsak član skupine mora predstaviti en del seminarja, pri čemer mora biti delo enakomerno razdeljeno med vse. Osredotočite se na osnovno temo, ki ste si jo izbrali in vključite čim manj splošnega uvoda. Ne opisujte potekov bolezni, če to ni nujno zaradi povezave z biokemijskimi značilnostmi virusov! Glede vsebine predstavitve se posvetujte s kolegi, ki bodo predstavljali sorodna poglavja, tako da bo čim manj prekrivanj.

Seminarji se bodo začeli 4.5.2021 po razporedu, ki bo objavljen v spletni učilnici.

Vsebina seminarjev je izpitna snov. Odgovori na vprašanja iz snovi seminarjev predstavljajo ~10 % končnih točk izpita (2-3 vprašanja od ~30).

Poglavja za seminarje so:
# Patogeni koronavirusi: izvor in evolucija (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/30531947/)
# Molekularni vidiki koronavirusov (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/32661197/)
# Način pakiranja RNA pri koronavirusih (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/31505321/)
# Struktura in funkcija končnih zaporedij koronavirusne genomske RNA (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/25736566/)
# Struktura genoma in replikacija RNA pri koronavirusih (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/31967327/ in https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/32833200/)
# Kontinuirna in diskontinuirna sinteza RNA pri koronavirusih (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/26958916/)
# Vloga gostiteljskih faktorjev pri replikaciji koronavirusne RNA (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/28643204/)
# Natančnost replikacije koronavirusne RNA (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/21593585/)
# Mehanizmi dodajanja kape in metilacije koronavirusne RNA (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/26847650/)
# Translacijski procesi pri sintezi koronavirusnih proteinov (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/22535777/ in https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/27712623/)
# Odgovor na stres in uravnavanje translacije pri koronavirusih (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/27384577/)
# RNA-elementi s cis-regulacijsko aktivnostjo pri koronavirusih (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/27712622/)
# Vloga nestrukturnega proteina 1 pri izražanju genov ob okužbi s koronavirusom (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/25432065/
# Vloga koronavirusne endonukleaze pri izogibanju protivirusnemu odgovoru (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/29307596/)
# Mehanizem fuzije koronavirusne membrane kot tarča za protivirusna zdravila (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/32272173/)
----

Za seminar se prijavite tako, da se vpišete v oklepaj za naslovom seminarja, tako kot je prikazano pri izmišljenem ničtem seminarju.
Seminarje bomo izvedli v enakem vrstnem redu, kot so navedeni zgoraj.

0. Analiza koronavirusov v Gallusovi dvorani Cankarjevega doma (Jasna Briški, Timi Pegan, Sanja Todorović) 

# Patogeni koronavirusi: izvor in evolucija (Nikola Janakievski, Stefanija Ivanova, )
# Molekularni vidiki koronavirusov (Neža Leskovar, Iva Matić)
# Način pakiranja RNA pri koronavirusih
# Struktura in funkcija končnih zaporedij koronavirusne genomske RNA (Špela Kladnik, Nika Malečkar, Eva Kanalec)
# Struktura genoma in replikacija RNA pri koronavirusih (Luka Šegota, Maruša Sernc, Luka Stanković)
# Kontinuirna in diskontinuirna sinteza RNA pri koronavirusih (Jakob Tomšič, Ana Pervanja, Zala Perko)
# Vloga gostiteljskih faktorjev pri replikaciji koronavirusne RNA (Nika Bedrač, Tinkara Božič, Maja Kobal)
# Natančnost replikacije koronavirusne RNA
# Mehanizmi dodajanja kape in metilacije koronavirusne RNA (Nika Perko, Gregor Strniša, Nika Tomsič)
# Translacijski procesi pri sintezi koronavirusnih proteinov (Bor Krajnik,)
# Odgovor na stres in uravnavanje translacije pri koronavirusih
# RNA-elementi s cis-regulacijsko aktivnostjo pri koronavirusih (Jan Bregar, Ajda Beltram)
# Vloga nestrukturnega proteina 1 pri izražanju genov ob okužbi s koronavirusom
# Vloga koronavirusne endonukleaze pri izogibanju protivirusnemu odgovoru (Veronika Bračič, Ela Bizjak)
# Mehanizem fuzije koronavirusne membrane kot tarča za protivirusna zdravila (Manca Pirc, Vid Dobrovoljc)

Ko boste pripravljali povzetek, naslov teme na tem, drugem, seznamu povežite z novo wiki stranjo, ki bo vsebovala povzetek. Na koncu besedila povzetka (pod viri) v novo vrstico dodajte oznako: <nowiki>[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]</nowiki> . Zgornji seznam bo po zaključku seminarjev izbrisan. Vire boste navedli na koncu vsakega povzetka, zato za serijo seminarjev ne bodo več pomembni.

Primer, kako so bili urejeni seminarji v prejšnjih letih, si lahko ogledate na strani [[Struktura kromatina]] (2013/14).

#[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Herpesvirusi_in_sorodni_dsDNA_virusi Herpesvirusi in sorodni dsDNA virusi] (Veronika Razpotnik, Ines Medved, Andrej Ivanovski)

Molekularna biologija koronavirusov

2021-03-26T09:36:23Z

Ekanalec:

Seminarji pri Molekularni biologiji v študijskem letu 2020/21 obravnavajo sorazmerno ozko področje koronavirusov, kar je glede na pandemijo virusa SARS-CoV-2 zelo aktualna tema. Za seminarje sem določil 15 ožjih področij, ki temeljijo na vsaj enem preglednem članku, objavljenem od leta 2015 naprej. Ti članki naj vam bodo izhodišče za pripravo, dopolnite pa jih z novejšimi podatki, predvsem glede povzročitelja bolezni kovid-19.

Vsako poglavje obdelajo praviloma trije študenti. Vsaka skupina mora pripraviti povzetek seminarja v obsegu 1200-1500 besed in ga objaviti na tem wikiju. Povzetek ne vsebuje slikovnega gradiva, lahko pa vključuje povezave do slik in videov na spletu. Navedite do 5 ključnih virov (ti ne štejejo v vsoto 1200 besed), ki ste jih uporabili.

Vsaka skupina mora objaviti povzetek seminarja najkasneje 24 h pred začetkom seminarjev. Kateri del povzetka je napisal kdo, navedite v zavihku 'discussion'.

Pripravite tudi predstavitev, dolgo pribl. 20 minut (tolerančni okvir je 18-22 min.), temu pa bo sledila razprava, dolga 5-10 min. Vsak član skupine mora predstaviti en del seminarja, pri čemer mora biti delo enakomerno razdeljeno med vse. Osredotočite se na osnovno temo, ki ste si jo izbrali in vključite čim manj splošnega uvoda. Ne opisujte potekov bolezni, če to ni nujno zaradi povezave z biokemijskimi značilnostmi virusov! Glede vsebine predstavitve se posvetujte s kolegi, ki bodo predstavljali sorodna poglavja, tako da bo čim manj prekrivanj.

Seminarji se bodo začeli 4.5.2021 po razporedu, ki bo objavljen v spletni učilnici.

Vsebina seminarjev je izpitna snov. Odgovori na vprašanja iz snovi seminarjev predstavljajo ~10 % končnih točk izpita (2-3 vprašanja od ~30).

Poglavja za seminarje so:
# Patogeni koronavirusi: izvor in evolucija (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/30531947/) (Nikola Janakievski, Stefanija Ivanova, )
# Molekularni vidiki koronavirusov (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/32661197/) (Neža Leskovar)
# Način pakiranja RNA pri koronavirusih (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/31505321/)
# Struktura in funkcija končnih zaporedij koronavirusne genomske RNA (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/25736566/)
# Struktura genoma in replikacija RNA pri koronavirusih (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/31967327/ in https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/32833200/) (Špela Kladnik, Nika Malečkar, Eva Kanalec)
# Kontinuirna in diskontinuirna sinteza RNA pri koronavirusih (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/26958916/) (Jakob Tomšič, Ana Pervanja, Zala Perko)
# Vloga gostiteljskih faktorjev pri replikaciji koronavirusne RNA (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/28643204/) (Tinkara Božič, Nika Bedrač, Maja Kobal)
# Natančnost replikacije koronavirusne RNA (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/21593585/)
# Mehanizmi dodajanja kape in metilacije koronavirusne RNA (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/26847650/) (Nika Perko, Gregor Strniša, Nika Tomsič)
# Translacijski procesi pri sintezi koronavirusnih proteinov (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/22535777/ in https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/27712623/)
# Odgovor na stres in uravnavanje translacije pri koronavirusih (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/27384577/)
# RNA-elementi s cis-regulacijsko aktivnostjo pri koronavirusih (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/27712622/)
# Vloga nestrukturnega proteina 1 pri izražanju genov ob okužbi s koronavirusom (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/25432065/)
# Vloga koronavirusne endonukleaze pri izogibanju protivirusnemu odgovoru (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/29307596/)
# Mehanizem fuzije koronavirusne membrane kot tarča za protivirusna zdravila (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/32272173/)