Wiki FKKT - User contributions [en]

MBT seminarji 2017

2017-04-04T23:24:14Z

Ema Guštin:

'''Seznam seminarjev iz Molekularne biotehnologije v študijskem letu 2016/17'''

Na tej strani je seznam odobrenih člankov za seminar ter povezave do člankov in do povzetkov, ki jih morate objaviti najkasneje do ponedeljka do polnoči v tednu, ko imate seminar (v sredo). Angleški naslov prevedite tudi v slovenščino - to bo naslov povzetka, ki ga objavite na posebni strani, tako kot so to naredili kolegi pred vami (oz. predlani).

Način vnosa:

# The importance of ''Arabidopsis'' glutathione peroxidase 8 for protecting ''Arabidopsis'' plant and ''E. coli'' cells against oxidative stress (A. Gaber; GM Crops & Food 5(1), 2014; http://dx.doi.org/10.4161/gmcr.26979) Pomen glutation peroksidaze 8 iz repnjakovca za zaščito rastline ''Arabidopsis thaliana'' in bakterije ''Escherichia coli'' pred oksidativnim stresom. Janez Novak, 15. marca 2017
(slovenski naslov povežite z novo stranjo, na kateri bo povzetek)

'''Naslovi odobrenih člankov po temah:'''

'''Gensko spremenjene rastline''' (8. marec) 
# Synthesis of bacteriophage lytic proteins against ''Streptococcus pneumoniae'' in the chloroplast of ''Chlamydomonas reinhardtii'' (L. Stoffels ''et al''; Plant Biotechnol. J., 2017; http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/pbi.12703/epdf) [[Sinteza bakteriofagnih litičnih proteinov proti Streptococcus pneumoniae v kloroplastih alge Chlamydomonas reinhardtii]]. Eva Vidak, 8. marec 2017
# Bioengineering of the Plant Culture of ''Capsicum frutescens'' with Vanillin Synthase Gene for the Production of Vanillin (M. Jenn Yang Chee ''et al''; Molecular Biotechnology 59(1), 2017; http://link.springer.com/article/10.1007/s12033-016-9986-2) [[Bioinženiring rastlinske kulture Capsicum frutescens z genom za vanilin sintazo za pridobivanje vanilina]]. Mojca Juteršek, 8. marec 2017
# The production of human glucocerebrosidase in glyco-engineered ''Nicotiana benthamiana'' plants (Limkul, J. ''et al''; Plant Biotechnol J., 2016; http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/pbi.12529/full) [[Proizvodnja človeške glukocerebrozidaze v rastlini Nicotiana benthamiana s spremenjeno glikozilacijo]]. Vita Vidmar, 8. marec 2017

'''Gensko spremenjene živali''' (15. marec) 
# Evaluation of porcine stem cells competence for somatic cell nuclear transfer and production of cloned animals (J. O. Secher; Animal Reproduction Science, 2017;http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0378432016304274) [[Določanje kompetence prašičjih matičnih celic za somatski jedrni prenos in kloniranje živali]]. Jerneja Kocutar, 15. marec 2017
# High-level expression of a novel recombinant human plasminogen activator (rhPA) in the milk of transgenic rabbits and its thrombolytic bioactivity ''in vitro'' (Song, S. ''et al''; Molecular Biology Reports ,2016; https://link-springer-com.nukweb.nuk.uni-lj.si/article/10.1007%2Fs11033-016-4020-0) [[Visoka stopnja izražanja rekombinantnega tkivnega aktivatorja plazminogena v mleku transgenskih zajcev in njegova trombolitična aktivnost in vitro]]. Tjaša Lapanja, 15. marec 2017
# Precision engineering for PRRSV resistance in pigs: Macrophages from genome edited pigs lacking CD163 SRCR5 domain are fully resistant to both PRRSV genotypes while maintaining biological function (C. Burcard ''et al''; PLOS Pathogens 13 (2) 2017; http://journals.plos.org/plospathogens/article?id=10.1371/journal.ppat.1006206) [[Makrofagi iz gensko spremenjenih prašičev z delecijo domene CD163 SRCR5 odporni na okužbo s PRRSV]]. Urška Černe, 15. marec 2017

'''Okolje''' (22. marec) 
# Decorating outer membrane vesicles with organophosphorus hydrolase and cellulose binding domain for organophosphate pesticide degradation (S. Fu-Hsiang ''et al''; Chemical Engineering Journal, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1385894716312815) [[Predstavitev organofosfatne hidrolaze in celuloza vezavne domene na površini veziklov zunanje membrane za razgradnjo organofosfatnih pesticidov]]. Nina Roštan, 22. marec 2017
# Bacterial Exopolysaccharide mediated heavy metal removal: A Review on biosynthesis, mechanism and remediation strategies (P. Gupta in B. Diwan; Biotechnology Reports, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2215017X16301382) [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Odstranjevanje_te%C5%BEkih_kovin_s_pomo%C4%8Djo_bakterijskih_eksopolisaharidov:_biosinteza%2C_mehanizem_in_strategije_remediacije Odstranjevanje težkih kovin s pomočjo bakterijskih eksopolisaharidov: biosinteza, mehanizem in strategije remediacije]. Eva Korošec, 22. marec 2017
# Disulfide isomerase-like protein AtPDIL1–2 is a good candidate for trichlorophenol phytodetoxification (Peng, R.-H. in sod.; Sci. Rep. 7, 2017; http://www.nature.com/articles/srep40130#s1) [[Disulfid izomerazi podoben protein AtPDIL1-2 kot kandidat za fitodetoksifikacijo 2,4,6-triklorofenola]]. Ana Cirnski, 22. marca 2017

'''Terapevtski proteini''' (29. marec) 
# Production of functional human nerve growth factor from the saliva of transgenic mice by using salivary glands as bioreactors (F. Zeng in sodelavci; Scientific Reports 7(41270), 2017; http://www.nature.com/articles/srep41270) [[Proizvodnja humanega živčnega rastnega faktorja v slini transgenskih miši z uporabo žlez slinavk kot bioreaktorjev]]. Neža Levičnik, 29. marca 2017
# Mechano growth factor-C24E, a potential promoting biochemical factor for ligament tissue engineering (Y. Song in sodelavci; Biochemical Engineering Journal 105(2016) 249-263,2016, http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1369703X15300681) [[MGF-C24E, potencialni promovirajoči biokemijski faktor za tkivno inženirstvo ligamentov]] . Peter Prezelj, 29. marca 2017
# Secretion of biologically active pancreatitis-associated protein I (PAP) by genetically modified dairy ''Lactococcus lactis'' NZ9000 in the prevention of intestinal mucositis (R. D. Carvalho ''et al''; Microbial cell factories, 2017; http://microbialcellfactories.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12934-017-0624-x) [[Preprečevanje vnetja sluznice prebavnega trakta z gensko spremenjenimi bakterijami Lactococcus lactis NZ9000, ki izločajo biološko aktivni s pankreatitisom povezani protein I (PAP)]]. Domen Klofutar, 29. marec 2017

'''Protitelesa kot terapevtiki''' (5. april) 
# Therapeutic antibody targeting of indoleamine-2,3-dioxygenase (IDO2) inhibits autoimmune arthritis (L. M. F. Merlo "et al"; Clinical Immunology, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1521661616306052). [[Terapevtska protitelesa proti indolamin 2,3-dioksigenazi zavirajo avtoimunski artritis]]. Ema Guštin, 5. aprila 2017
# Production of a tumor-targeting antibody with a human-compatible glycosylation profile in ''N. benthamiana'' hairy root cultures (C. Lonoce ''et al''; Biotechnology Journal, 2016; http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/biot.201500628/abstract) [[Proizvodnja protitumorskih protiteles s človeku kompatibilnim glikozilacijskim profilom v kulturah koreninskih laskov v Nicotiani benthamiani]]. Jan Rozman, 5.4.2017
# A Therapeutic Antibody for Cancer, Derived from Single Human B Cells (R. T. Bushey ''et al''; Cell Reports 15(7), 2016, http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S221112471630465X) [[Terapevtsko protitelo proti raku, pridobljeno iz človeške B celice]]. Alja Zgonc, 5. april 2017

'''Diagnostiki''' (12. april) 
# Tjaša Košir
# Petra Vivod
# Marija Kisilak

'''Cepiva''' (19. april) 
#Tomaž Rozmarič
#Amadeja Lapornik
#Mojca Hunski

'''Antibiotiki in LMW učinkovine''' (26. april) 
#Vid Jazbec <3 <3
#Zala Gluhić
#Katja Malovrh

'''Male molekule in polimeri''' (3. maj) 
# Engineering of a microbial coculture of ''Escherichia coli'' strains for the biosynthesis of resveratrol (José M. Camacho-Zaragoza ''et al''; Microbal Cell factories 15(163), 2016; https://microbialcellfactories.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12934-016-0562-z) Inženiring mikrobne kokulture dveh sevov ''Escherichia coli'' za biosintezo resveratrola. Petra Tavčar,3. marec 2017
# Tim Božič
# Tajda Buh

'''Encimi''' (10. maj) 
# Production of the renewable extremophile lipase: Valuable biocatalyst with potential usage in food industry (M. Memarpoor-Yazdi ''et al''; Food and Bioproducts Processing 102, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0960308516301900) Proizvodnja obnovljive ekstremofilne lipaze: dragocen biokatalist s potencialno uporabo v industriji hrane. Nataša Traven, 10. maj 2017
# Bine Tršavec
# Simon Bolta

'''Pretvorba biomase''' (17. maj) 
# Inge Sotlar
# Anja Herceg
# The ''Podospora anserina'' lytic polysaccharide monooxygenase PaLPMO9H catalyzes oxidative cleavage of diverse plant cell wall matrix glycans (M. Fanuel ''et al''; Biotechnology for Biofuels, 2017; https://biotechnologyforbiofuels.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13068-017-0749-5). Anja Tanšek, 17. maj 2017

'''Metabolno inženirstvo''' (24. maj) 
# Barbara Dušak
# Tjaša Grum
# Sara Kimm Fuhrmann

'''Biološki viri energije''' (31. maj) 
# Self-regulated 1-butanol production in ''Escherichia coli'' based on the endogenous fermentative control (RC. Wen, CR. Shen; Biotechnol Biofuels, 2016; http://biotechnologyforbiofuels.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13068-016-0680-1) Samoregulirana proizvodnja 1-butanola v ''Escherichia coli'', ki temelji na endogeni kontroli fermentacije. Barbara Lipovšek, 31. maj 2017
# A Ferrocene-Based Conjugated Oligoelectrolyte Catalyzes Bacterial Electrode Respiration (N. D. Kirchhofer in sodelavci; Chem 2, 240-257, 2017; http://www.cell.com/chem/abstract/S2451-9294(17)30001-3). Konjugirani oligoelektrolit na osnovi ferocena katalizira bakterijsko elektrodno respiracijo. Matic Kovačič, 31. maj 2017
#

'''Novi pristopi v molekularni biotehnologiji''' (6. junij) 
# Matjaž Ivanuša
#
#

Nazaj na predmet [[Molekularna_biotehnologija]].

Terapevtska protitelesa proti indolamin 2,3-dioksigenazi zavirajo avtoimunski artritis

2017-04-04T23:22:57Z

Ema Guštin: New page: [http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1521661616306052 Therapeutic antibody targeting of indoleamine-2,3-dioxygenase (IDO2) inhibits autoimmune arthritis] Revmatoidni artrit...

[http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1521661616306052 Therapeutic antibody targeting of indoleamine-2,3-dioxygenase (IDO2) inhibits autoimmune arthritis]

Revmatoidni artritis je avtoimunska bolezen sklepov, za katero še zmeraj ne poznamo povsem učinkovitega zdravljenja. Zdravijo se namreč samo simptomi bolezni, torej predvsem vnetje. Tako revmatoidni artritis kljub skokovitemu razvoju biološkega zdravljenja mnogih bolezni v zadnjih letih ostaja neozdravljiva bolezen.

==Indolamin 2,3-dioksigenaza==
Nedavno je bila kot potencialna tarča za razvoj zdravila proti avtoimunskemu artritisu predlagana indolamin 2,3-dioksigenaza (IDO). Gre za enega od dveh encimov, ki katalizirata prvo izmed reakcij, potrebnih za pretvorbo triptofana v kinurenin; to je hkrati tudi stopnja, ki omejuje hitrost te metabolne poti. IDO je bila v preteklosti že povezana z rakom, in sicer naj bi imela osrednjo vlogo pri sposobnosti rakavih celic, da se izognejo imunskemu odzivu. Njena vloga pri avtoimunskem odzivu pa je manj jasna. Rezultati nekaterih študij na miškah namreč nakazujejo, da IDO zavira imunski odziv, medtem ko drugi nasprotno kažejo, da ga aktivira in s tem prispeva k razvoju bolezni. Kasneje so odkrili, da obstajata dve obliki tega encima, IDO1 in IDO2, ki se v funkciji nekoliko razlikujeta. To je najverjetneje tudi razlog za omenjene nasprotujoče si rezultate.

==Vloga indolamin 2,3-dioksigenaze 2 pri avtoimunskem artritisu==
IDO2 naj bi bila potrebna za aktivacijo celic ubijalk (CD4-pozitivni limfociti T), tvorbo patogenih protiteles in posledičen razvoj revmatoidnega artritisa. Njeno izražanje v antigen-specifičnih limfocitih B mišk brez gena za ta encim je namreč potrebno in hkrati zadostno za razvoj bolezni, kar IDO2 ločuje od IDO1, katere vloga pri avtoimunskem odzivu ostaja nejasna. Terapevtski pristop, usmerjen specifično proti IDO2 tako predstavlja potencialno možnost za obvladovanje oziroma morda tudi zdravljenje avtoimunskega artritisa.

==Priprava in dokaz učinkovitosti protiteles proti IDO2==
Hipotezo o učinkovitosti terapevtskega pristopa, usmerjenega proti IDO2, v boju proti revmatoidnem artritisu so Lauren M. F. Merlo in njeni sodelavci potrdili s predklinično študijo monoklonskih protiteles proti IDO2 na miškah. Pripravili so mišja monoklonska protitelesa, zmožna vstopa v celice, ki so jih nato injicirali v krvni obtok dveh dobro okarakteriziranih tipov mišk za študije artritisa. Miške KRN so modelni organizem, ki kmalu po rojstvu razvije hudo obliko artritisa, ki z mnogo vidikov spominja na revmatoidni artritis pri ljudeh. Drugi model pa so predstavljale miške z artritisom, induciranim s kolagenom. Pokazali so, da so pripravljena protitelesa sposobna vezati tarčo, čeprav je IDO2 znotrajcelični protein, po vezavi pa ga limfociti B preko receptorja FcγRIIb internalizirajo. S tem preprečijo vnetni odziv limfocitov T in B, kar vodi v lajšanje vnetja, in sicer do enake mere kot izbitje gena za IDO2.

==Zaključek==
Raziskava Lauren M. F. Merlo in njenih sodelavcev kaže, da na dveh dobro okarakteriziranih mišjih modelih za študije artritisa monoklonska protitelesa proti indolamin 2,3-dioksigenazi 2 zavirajo aktivacijo limfocitov B in T in tako lajšajo vnetje v prizadetih sklepih. Poleg tega so pokazali, da male molekule, ki prehajajo celično membrano, niso edina terapevtska možnost za znotrajcelične tarče, kar odpira nove možnosti za ciljanje znotrajceličnih posrednikov avtoimunskega odziva.

Nazaj na [[MBT seminarji 2017]].

Terapevtska protitelesa proti indolamin 2,3-dioksigenazi zavirajo avtoimuni artritis

2017-04-04T23:14:01Z

Ema Guštin:

Terapevtska protitelesa proti indolamin 2,3-dioksigenazi zavirajo avtoimuni artritis

2017-04-04T22:36:39Z

Ema Guštin:

[http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1521661616306052 Therapeutic antibody targeting of indoleamine-2,3-dioxygenase (IDO2) inhibits autoimmune arthritis]

Revmatoidni artritis je avtoimunska bolezen sklepov, za katero še zmeraj ne poznamo povsem učinkovitega zdravljenja. Zdravijo se namreč samo simptomi bolezni, torej predvsem vnetje. Tako revmatoidni artritis kljub skokovitemu razvoju biološkega zdravljenja mnogih bolezni v zadnjih letih ostaja neozdravljiva bolezen.

==Indolamin 2,3-dioksigenaza==
Nedavno je bila kot potencialna tarča za razvoj zdravila proti avtoimunskemu artritisu predlagana indolamin 2,3-dioksigenaza (IDO). Gre za enega od dveh encimov, ki katalizirata prvo izmed reakcij, potrebnih za pretvorbo triptofana v kinurenin; to je hkrati tudi stopnja, ki omejuje hitrost te metabolne poti. IDO je bila v preteklosti že povezana z rakom, in sicer naj bi imela osrednjo vlogo pri sposobnosti rakavih celic, da se izognejo imunskemu odzivu. Njena vloga pri avtoimunskem odzivu pa je manj jasna. Rezultati nekaterih študij na miškah namreč nakazujejo, da IDO zavira imunski odziv, medtem ko drugi nasprotno kažejo, da ga aktivira in s tem prispeva k razvoju bolezni. Kasneje so odkrili, da obstajata dve obliki tega encima, IDO1 in IDO2, ki se v funkciji nekoliko razlikujeta. To je najverjetneje tudi razlog za omenjene nasprotujoče si rezultate.

==Vloga indolamin 2,3-dioksigenaze 2 pri avtoimunskem artritisu==
IDO2 naj bi bila potrebna za aktivacijo celic ubijalk (CD4-pozitivni limfociti T), tvorbo patogenih protiteles in posledičen razvoj revmatoidnega artritisa. Njeno izražanje v antigen-specifičnih limfocitih B mišk brez gena za ta encim je namreč potrebno in hkrati zadostno za razvoj bolezni, kar IDO2 ločuje od IDO1, katere vloga pri avtoimunskem odzivu ostaja nejasna. Terapevtski pristop, usmerjen specifično proti IDO2 tako predstavlja potencialno možnost za obvladovanje oziroma morda tudi zdravljenje avtoimunskega artritisa.

==Priprava in dokaz učinkovitosti protiteles proti IDO2==
Hipotezo o učinkovitosti terapevtskega pristopa, usmerjenega proti IDO2, v boju proti revmatoidnem artritisu so Lauren M. F. Merlo in njeni sodelavci potrdili s predklinično študijo monoklonskih protiteles proti IDO2 na miškah. Pripravili so mišja monoklonska protitelesa, ki so jih nato injicirali v krvni obtok dveh dobro okarakteriziranih tipov mišk za študije artritisa.

==Zaključek==
Raziskava Lauren M. F. Merlo in njenih sodelavcev kaže, da na dveh dobro okarakteriziranih mišjih modelih za študije artritisa monoklonska protitelesa proti indolamin 2,3-dioksigenazi 2 zavirajo aktivacijo limfocitov B in T in tako lajšajo vnetje v prizadetih sklepih. Poleg tega so pokazali, da male molekule, ki prehajajo celično membrano, niso edina terapevtska možnost za znotrajcelične tarče, kar odpira nove možnosti za ciljanje znotrajceličnih posrednikov avtoimunskega odziva.

Nazaj na [[MBT seminarji 2017]].

Terapevtska protitelesa proti indolamin 2,3-dioksigenazi zavirajo avtoimuni artritis

2017-04-04T21:46:27Z

Ema Guštin:

[http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1521661616306052 Therapeutic antibody targeting of indoleamine-2,3-dioxygenase (IDO2) inhibits autoimmune arthritis]

Revmatoidni artritis je avtoimuna bolezen sklepov, za katero še zmeraj ne poznamo povsem učinkovitega zdravljenja. Zdravijo se namreč samo simptomi bolezni, torej predvsem vnetje. Tako revmatoidni artritis kljub skokovitemu razvoju biološkega zdravljenja mnogih bolezni v zadnjih letih ostaja neozdravljiva bolezen.

==Indolamin 2,3-dioksigenaza==
Nedavno je bila kot potencialna tarča za razvoj zdravila proti avtoimunemu artritisu predlagana indolamin 2,3-dioksigenaza (IDO). Gre za enega od dveh encimov, ki katalizirata prvo izmed reakcij, potrebnih za pretvorbo triptofana v kinurenin; to je hkrati tudi stopnja, ki omejuje hitrost te metabolne poti. IDO je bila v preteklosti že povezana z rakom, in sicer naj bi imela osrednjo vlogo pri sposobnosti rakavih celic, da se izognejo imunskemu odzivu. Njena vloga pri avtoimunskem odzivu pa je manj jasna. Rezultati nekaterih študij na miškah namreč nakazujejo, da IDO zavira imunski odziv, medtem ko drugi nasprotno kažejo, da ga aktivira in s tem prispeva k razvoju bolezni. Kasneje so odkrili, da obstajata dve obliki tega encima, IDO1 in IDO2, ki se v funkciji nekoliko razlikujeta. To je najverjetneje tudi razlog za omenjene nasprotujoče si rezultate.

==Vloga indolamin 2,3-dioksigenaze 2 pri avtoimunskem artritisu==
IDO2 naj bi bila potrebna za aktivacijo celic ubijalk (CD4-pozitivni limfociti T), tvorbo patogenih protiteles in posledičen razvoj revmatoidnega artritisa. Njeno izražanje v antigen-specifičnih limfocitih B mišk brez gena za ta encim je namreč potrebno in hkrati zadostno za razvoj bolezni, kar IDO2 ločuje od IDO1, katere vloga pri avtoimunskem odzivu ostaja nejasna. Terapevtski pristop, usmerjen specifično proti IDO2 tako predstavlja potencialno možnost za obvladovanje oziroma morda tudi zdravljenje avtoimunega artritisa.

==
To so Lauren M. F. Merlo in njeni sodelavci potrdili s preklinično študijo na miškah, s katero so pokazali učinkovitost monoklonskih protiteles proti IDO2 v boju proti revmatoidnem artritisu.

==Zaključek==
Raziskava Lauren M. F. Merlo in njenih sodelavcev kaže, da na dveh dobro okarakteriziranih mišjih modelih za študije artritisa monoklonska protitelesa proti indolamin 2,3-dioksigenazi 2 zavirajo aktivacijo limfocitov B in T in tako lajšajo vnetje v prizadetih sklepih. Poleg tega so pokazali, da male molekule, ki prehajajo celično membrano, niso edina terapevtska možnost za znotrajcelične tarče, kar odpira nove možnosti za ciljanje znotrajceličnih posrednikov avtoimunskega odziva.

Nazaj na [[MBT seminarji 2017]].

Terapevtska protitelesa proti indolamin 2,3-dioksigenazi zavirajo avtoimuni artritis

2017-04-04T20:26:48Z

Ema Guštin:

Terapevtska protitelesa proti indolamin 2,3-dioksigenazi zavirajo avtoimuni artritis

2017-04-04T20:24:21Z

Ema Guštin:

Terapevtska protitelesa proti indolamin 2,3-dioksigenazi zavirajo avtoimuni artritis

2017-04-04T19:35:22Z

Ema Guštin:

Terapevtska protitelesa proti indolamin 2,3-dioksigenazi zavirajo avtoimuni artritis

2017-04-04T19:19:16Z

Ema Guštin:

Terapevtska protitelesa proti indolamin 2,3-dioksigenazi zavirajo avtoimuni artritis

2017-04-04T19:16:15Z

Ema Guštin:

Terapevtska protitelesa proti indolamin 2,3-dioksigenazi zavirajo avtoimuni artritis

2017-04-04T19:14:07Z

Ema Guštin: New page: [http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/] Revmatoidni artritis je avtoimuna bolezen sklepov, za katero še zmeraj ne poznamo povsem učinkovitega zdravljenja. Zdravijo se namre...

[http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/]

Revmatoidni artritis je avtoimuna bolezen sklepov, za katero še zmeraj ne poznamo povsem učinkovitega zdravljenja. Zdravijo se namreč samo simptomi bolezni, torej predvsem vnetje. Takorevmatoidni artritis kljub skokovitemu razvoju biološkega zdravljenja mnogih bolezni v zadnjih letih ostaja neozdravljiva bolezen.

MBT seminarji 2017

2017-04-04T09:01:15Z

Ema Guštin:

'''Seznam seminarjev iz Molekularne biotehnologije v študijskem letu 2016/17'''

Na tej strani je seznam odobrenih člankov za seminar ter povezave do člankov in do povzetkov, ki jih morate objaviti najkasneje do ponedeljka do polnoči v tednu, ko imate seminar (v sredo). Angleški naslov prevedite tudi v slovenščino - to bo naslov povzetka, ki ga objavite na posebni strani, tako kot so to naredili kolegi pred vami (oz. predlani).

Način vnosa:

# The importance of ''Arabidopsis'' glutathione peroxidase 8 for protecting ''Arabidopsis'' plant and ''E. coli'' cells against oxidative stress (A. Gaber; GM Crops & Food 5(1), 2014; http://dx.doi.org/10.4161/gmcr.26979) Pomen glutation peroksidaze 8 iz repnjakovca za zaščito rastline ''Arabidopsis thaliana'' in bakterije ''Escherichia coli'' pred oksidativnim stresom. Janez Novak, 15. marca 2017
(slovenski naslov povežite z novo stranjo, na kateri bo povzetek)

'''Naslovi odobrenih člankov po temah:'''

'''Gensko spremenjene rastline''' (8. marec) 
# Synthesis of bacteriophage lytic proteins against ''Streptococcus pneumoniae'' in the chloroplast of ''Chlamydomonas reinhardtii'' (L. Stoffels ''et al''; Plant Biotechnol. J., 2017; http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/pbi.12703/epdf) [[Sinteza bakteriofagnih litičnih proteinov proti Streptococcus pneumoniae v kloroplastih alge Chlamydomonas reinhardtii]]. Eva Vidak, 8. marec 2017
# Bioengineering of the Plant Culture of ''Capsicum frutescens'' with Vanillin Synthase Gene for the Production of Vanillin (M. Jenn Yang Chee ''et al''; Molecular Biotechnology 59(1), 2017; http://link.springer.com/article/10.1007/s12033-016-9986-2) [[Bioinženiring rastlinske kulture Capsicum frutescens z genom za vanilin sintazo za pridobivanje vanilina]]. Mojca Juteršek, 8. marec 2017
# The production of human glucocerebrosidase in glyco-engineered ''Nicotiana benthamiana'' plants (Limkul, J. ''et al''; Plant Biotechnol J., 2016; http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/pbi.12529/full) [[Proizvodnja človeške glukocerebrozidaze v rastlini Nicotiana benthamiana s spremenjeno glikozilacijo]]. Vita Vidmar, 8. marec 2017

'''Gensko spremenjene živali''' (15. marec) 
# Evaluation of porcine stem cells competence for somatic cell nuclear transfer and production of cloned animals (J. O. Secher; Animal Reproduction Science, 2017;http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0378432016304274) [[Določanje kompetence prašičjih matičnih celic za somatski jedrni prenos in kloniranje živali]]. Jerneja Kocutar, 15. marec 2017
# High-level expression of a novel recombinant human plasminogen activator (rhPA) in the milk of transgenic rabbits and its thrombolytic bioactivity ''in vitro'' (Song, S. ''et al''; Molecular Biology Reports ,2016; https://link-springer-com.nukweb.nuk.uni-lj.si/article/10.1007%2Fs11033-016-4020-0) [[Visoka stopnja izražanja rekombinantnega tkivnega aktivatorja plazminogena v mleku transgenskih zajcev in njegova trombolitična aktivnost in vitro]]. Tjaša Lapanja, 15. marec 2017
# Precision engineering for PRRSV resistance in pigs: Macrophages from genome edited pigs lacking CD163 SRCR5 domain are fully resistant to both PRRSV genotypes while maintaining biological function (C. Burcard ''et al''; PLOS Pathogens 13 (2) 2017; http://journals.plos.org/plospathogens/article?id=10.1371/journal.ppat.1006206) [[Makrofagi iz gensko spremenjenih prašičev z delecijo domene CD163 SRCR5 odporni na okužbo s PRRSV]]. Urška Černe, 15. marec 2017

'''Okolje''' (22. marec) 
# Decorating outer membrane vesicles with organophosphorus hydrolase and cellulose binding domain for organophosphate pesticide degradation (S. Fu-Hsiang ''et al''; Chemical Engineering Journal, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1385894716312815) [[Predstavitev organofosfatne hidrolaze in celuloza vezavne domene na površini veziklov zunanje membrane za razgradnjo organofosfatnih pesticidov]]. Nina Roštan, 22. marec 2017
# Bacterial Exopolysaccharide mediated heavy metal removal: A Review on biosynthesis, mechanism and remediation strategies (P. Gupta in B. Diwan; Biotechnology Reports, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2215017X16301382) [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Odstranjevanje_te%C5%BEkih_kovin_s_pomo%C4%8Djo_bakterijskih_eksopolisaharidov:_biosinteza%2C_mehanizem_in_strategije_remediacije Odstranjevanje težkih kovin s pomočjo bakterijskih eksopolisaharidov: biosinteza, mehanizem in strategije remediacije]. Eva Korošec, 22. marec 2017
# Disulfide isomerase-like protein AtPDIL1–2 is a good candidate for trichlorophenol phytodetoxification (Peng, R.-H. in sod.; Sci. Rep. 7, 2017; http://www.nature.com/articles/srep40130#s1) [[Disulfid izomerazi podoben protein AtPDIL1-2 kot kandidat za fitodetoksifikacijo 2,4,6-triklorofenola]]. Ana Cirnski, 22. marca 2017

'''Terapevtski proteini''' (29. marec) 
# Production of functional human nerve growth factor from the saliva of transgenic mice by using salivary glands as bioreactors (F. Zeng in sodelavci; Scientific Reports 7(41270), 2017; http://www.nature.com/articles/srep41270) [[Proizvodnja humanega živčnega rastnega faktorja v slini transgenskih miši z uporabo žlez slinavk kot bioreaktorjev]]. Neža Levičnik, 29. marca 2017
# Mechano growth factor-C24E, a potential promoting biochemical factor for ligament tissue engineering (Y. Song in sodelavci; Biochemical Engineering Journal 105(2016) 249-263,2016, http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1369703X15300681) [[MGF-C24E, potencialni promovirajoči biokemijski faktor za tkivno inženirstvo ligamentov]] . Peter Prezelj, 29. marca 2017
# Secretion of biologically active pancreatitis-associated protein I (PAP) by genetically modified dairy ''Lactococcus lactis'' NZ9000 in the prevention of intestinal mucositis (R. D. Carvalho ''et al''; Microbial cell factories, 2017; http://microbialcellfactories.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12934-017-0624-x) [[Preprečevanje vnetja sluznice prebavnega trakta z gensko spremenjenimi bakterijami Lactococcus lactis NZ9000, ki izločajo biološko aktivni s pankreatitisom povezani protein I (PAP)]]. Domen Klofutar, 29. marec 2017

'''Protitelesa kot terapevtiki''' (5. april) 
# Therapeutic antibody targeting of indoleamine-2,3-dioxygenase (IDO2) inhibits autoimmune arthritis (L. M. F. Merlo "et al"; Clinical Immunology, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1521661616306052). Ema Guštin, 5. aprila 2017
# Production of a tumor-targeting antibody with a human-compatible glycosylation profile in ''N. benthamiana'' hairy root cultures (C. Lonoce ''et al''; Biotechnology Journal, 2016; http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/biot.201500628/abstract) [[Proizvodnja protitumorskih protiteles s človeku kompatibilnim glikozilacijskim profilom v kulturah koreninskih laskov v Nicotiani benthamiani]]. Jan Rozman, 5.4.2017
# A Therapeutic Antibody for Cancer, Derived from Single Human B Cells (R. T. Bushey ''et al''; Cell Reports 15(7), 2016, http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S221112471630465X) [[Terapevtsko protitelo proti raku, pridobljeno iz človeške B celice]]. Alja Zgonc, 5. april 2017

'''Diagnostiki''' (12. april) 
# Tjaša Košir
# Petra Vivod
# Marija Kisilak

'''Cepiva''' (19. april) 
#Tomaž Rozmarič
#Amadeja Lapornik
#Mojca Hunski

'''Antibiotiki in LMW učinkovine''' (26. april) 
#Vid Jazbec <3 <3
#Zala Gluhić
#Katja Malovrh

'''Male molekule in polimeri''' (3. maj) 
# Engineering of a microbial coculture of ''Escherichia coli'' strains for the biosynthesis of resveratrol (José M. Camacho-Zaragoza ''et al''; Microbal Cell factories 15(163), 2016; https://microbialcellfactories.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12934-016-0562-z) Inženiring mikrobne kokulture dveh sevov ''Escherichia coli'' za biosintezo resveratrola. Petra Tavčar,3. marec 2017
# Tim Božič
# Tajda Buh

'''Encimi''' (10. maj) 
# Production of the renewable extremophile lipase: Valuable biocatalyst with potential usage in food industry (M. Memarpoor-Yazdi ''et al''; Food and Bioproducts Processing 102, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0960308516301900) Proizvodnja obnovljive ekstremofilne lipaze: dragocen biokatalist s potencialno uporabo v industriji hrane. Nataša Traven, 10. maj 2017
# Bine Tršavec
# Simon Bolta

'''Pretvorba biomase''' (17. maj) 
# Inge Sotlar
# Anja Herceg
# The ''Podospora anserina'' lytic polysaccharide monooxygenase PaLPMO9H catalyzes oxidative cleavage of diverse plant cell wall matrix glycans (M. Fanuel ''et al''; Biotechnology for Biofuels, 2017; https://biotechnologyforbiofuels.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13068-017-0749-5). Anja Tanšek, 17. maj 2017

'''Metabolno inženirstvo''' (24. maj) 
# Barbara Dušak
# Tjaša Grum
# Sara Kimm Fuhrmann

'''Biološki viri energije''' (31. maj) 
# Self-regulated 1-butanol production in ''Escherichia coli'' based on the endogenous fermentative control (RC. Wen, CR. Shen; Biotechnol Biofuels, 2016; http://biotechnologyforbiofuels.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13068-016-0680-1) Samoregulirana proizvodnja 1-butanola v ''Escherichia coli'', ki temelji na endogeni kontroli fermentacije. Barbara Lipovšek, 31. maj 2017
# A Ferrocene-Based Conjugated Oligoelectrolyte Catalyzes Bacterial Electrode Respiration (N. D. Kirchhofer in sodelavci; Chem 2, 240-257, 2017; http://www.cell.com/chem/abstract/S2451-9294(17)30001-3). Konjugirani oligoelektrolit na osnovi ferocena katalizira bakterijsko elektrodno respiracijo. Matic Kovačič, 31. maj 2017
#

'''Novi pristopi v molekularni biotehnologiji''' (6. junij) 
# Matjaž Ivanuša
#
#

Nazaj na predmet [[Molekularna_biotehnologija]].

2017-bionano-seminar

2017-03-18T13:53:23Z

Ema Guštin:

= Bionanotehnologija- seminar =
doc. dr. Gregor Gunčar, K2.022

== Seznam seminarjev ==
{| {{table}}
! Ime in priimek !! Datum predstavitve !! Tema seminarja
|-
! Peter Prezelj
| 22.03.17 || Spreminjanje vsebnosti in karakteristik hranilnih snovi v živilih in pripravljeni hrani z uporabo kovalentnih modifikacij, prečnega povezovanja in encimov
|-
! Boštjan Petrič
| 22.03.17 || Reverzibilno tiskanje s peptidnimi /proteinskimi pigmenti, kovalentno vezanimi na celulozo prek amidne vezi
|-
! Ema Guštin
| 22.03.17 || Nanoprevleka hrustanca za preprečitev osteoartritisa
|-
! Tjaša Lapanja
| 29.03.17 || Modificirana CHO celična linija prilagojena za ultrazvočno indukcijo izražanja proteinov v industrijskih bioreaktorjih
|-
! Maruša Prolič Kalinšek
| 29.03.17 || Senzor za detekcijo Legionella bakterij na osnovi polidiacetilena
|-
! Domen Klofutar
| 29.03.17 || Novi načini prenosa informacij z izrabo kapacitet DNA: Prenos šifrirne in/ali steganografske DNA v ustni votlini preko naravno prisotnih gostiteljev Lactobacillus Casei in Veillonella Parvula
|-
! Simon Bolta
| 05.04.17 || Sinteza inzulina pri sladkornih bolnikih neposredno po povišanju krvnega sladkorja
|-
! Tomaž Rozmarič
| 05.04.17 || Senzor za zaznavo natančne glikozilacije proteinov (npr. eritropoetina)
|-
! Urša Kapš
| 05.04.17 || Nanodelci za strjevanje krvi
|-
! Julija Mazej
| 12.04.17 || opis teme ali naslov
|-
! Nataša Žigante
| 12.04.17 || opis teme ali naslov
|-
! Anja Herceg
| 12.04.17 || opis teme ali naslov
|-
! Mirjam Kmetič
| 19.04.17 || Nanoprotistrup na osnovi nanodelcev, ki vsebujejo inhibitor varespladib
|-
! Mojca Kostanjevec
| 19.04.17 || Tarčno zdravljenje epitelijskih tumorjev (cepiva in si-RNA - EpCAM) z uporabo nanodiskov
|-
! Jan Rozman
| 19.04.17 || Sinteza nealergenega rekombinantnega kazeina za jedilno / biorazgradljivo embalažo
|-
! Barbara Dušak
| 03.05.17 || Izboljšava gojenja mesa n vitro
|-
! Mateja Cigoj
| 03.05.17 || Probiotik z dodatkom nanodelcev za zdravljenje celiakije. Uporaba probiotičnih bakterij, ki izločajo peptidaze za razgradnjo glutena do neimunogenih fragmentov, in nanodelcev, ki vsebujejo modificirane naravne glutenske peptide specifične za HLA-DQ2 receptorje na limfocitih T, ki zavrejo Th1 posredovan avtoimunski odziv na gluten.
|-
! Toni Nagode
| 03.05.17 || Senzor za zaznavo natančne glikozilacije proteinov (npr. eritropoetina)
|-
! Tim Božič
| 10.05.17 || Senzor za zaznavo natančne glikozilacije proteinov (npr. eritropoetina)
|-
! Darja Božič
| 10.05.17 || opis teme ali naslov
|-
! Petra Tavčar
| 10.05.17 || Odstranjevalec škodljivih E-jev in BPA iz kupljenih pijač na osnovi kovalentno pritrjenih protiteles in aptamerov
|-
! Marjeta Horvat
| 17.05.17 || FeO nanodelci za učinkovitejše odpravljanje zobnega kariesa
|-
! Danijela Jošić
| 17.05.17 || Gensko spremenjen Lactobacillus, ki izloča nanodelce z spermicidnim in protimikrobnim delovanjem za dolgotrajno zaščito pred zanositvijo in spolno prenosljivimi boleznimi.
|-
! Tina Kuhar
| 17.05.17 || Flaška za vodo z bionanosenzorjem za takojšnjo zaznavo kvalitete oziroma pitnosti nalite vode.
|-
! Nika Strašek
| 24.05.17 || Uporabniku dostopen diagnostični test za zaznavo okužbe s boreliozo in klopnim meningitisom
|-
! Eva Vidak
| 24.05.17 || Biosenzor za CO na osnovi transkripcijskega faktorja CooA iz bakterije ''Rhodospirillum rubrum''
|-
! Alja Zgonc
| 24.05.17 || Senzor za zaznavanje miRNA v urinu za diagnozo nevrodegenerativnih bolezni
|-
! Zala Gluhić
| 31.05.17 || Varnejše uživanje alkohola z uporabo odorant-binding proteina LUSH.
|-
! Judita Avbelj
| 31.05.17 || Nanonaprava iz bioloških delov, ki z absorbcijo in razgradnjo delcev iz zraka preprečuje različne alergijske reakcije.
|-
! Vid Jazbec
| 31.05.17 || Gensko spremenjene čebele odporne na insekticide.
|-
! Vita Vidmar
| 07.06.17 || 'Hot start' transglutaminaza za popravljanje razcepljenih lasnih konic
|-
! Luka Kavčič
| 07.06.17 || Senzor za zaznavo natančne glikozilacije proteinov (npr. eritropoetina)
|-
! Mojca Juteršek
| 07.06.17 || Senzor za zaznavo natančne glikozilacije proteinov (npr. eritropoetina)
|-
! Bojana Lazović
| 07.06.17 || Poenostavljen pristop k razvoju novih senzorjev FRET (Förster resonance energy transfer)
|-
! Eva Korošec
| 07.06.17 || Tattoo biosenzor za raven alkohola v krvi na osnovi alkohol oksidaze, povezan s pametnim telefonom, računalnikom ali avtomobilskimi ključi.
|-
! Tajda Buh
| 07.06.17 || opis teme ali naslov
|}

== Gradivo za predavanja ==
Gradivo za predavanja najdete v [http://ucilnica.fkkt.uni-lj.si/ spletni učilnici].

==Naloga==
'''Vaša naloga je: '''
Študent pripravi projektno nalogo iz področja Bionanotehnologije. Najpomembnejša je originalna ideja za nek izvedljiv projekt.
Predlagana struktura:
* Uvod
* Predstavitev problema, znanstvena izhodišča, cilji
* Izvedba projekta, metodologija, tehnike, materiali, vprašanja, hipoteze
* Literatura

Za pripravo seminarja velja naslednje: 
* Prva stran seminarja naj vsebuje naslov projekta, avtorje, povzetek (od 130 do 160 besed) in grafični povzetek (čez približno pol strani)
* Seminar pripravite v obliki seminarske naloge (pisava 12, enojni razmak, 2,5 cm robovi). Obseg seminarja naj bo od 2000 do 2500 besed (vključno z literaturo). Seminarska naloga mora vsebovati najmanj tri slike. Slika mora imeti legendo in v besedilu mora biti na ustreznem mestu sklic na sliko. 
* Seminar oddajte do datuma oddaje, ki je naveden v tabeli v elektronski obliki z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/ tega obrazca].
* Vsi seminarji so v elektronski obliki dostopni [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/bioseminar/ tukaj].
* Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Za predstavitev je na voljo 25 minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni.
* Predstavitvi sledi razprava. Recenzenti podajo pripombe k projektu in postavijo po dve vprašanji.
* Na dan predstavitve morate docentu še pred predstavitvijo oddati končno verzijo seminarja v enem izvodu, elektronsko verzijo seminarja in predstavitev pa oddati na strežnik en dan pred predstavitvijo do polnoči.

==Imena datotek==
Prosim vas, da vse datoteke poimenujete po naslednjem receptu:
* 19_nano_Priimek1_Priimek2.doc(x) za seminar, npr. 19_nano_Craik_Venter.docx
* 19_nano_Priimek1_Priimek2.ppt(x) za prezentacijo, npr. 19_nano_Craik_Venter.pptx

==Ocenjevanje seminarjev==
Recenzenti ocenijo seminar tako, da izpolnijo [https://docs.google.com/forms/d/1WdCXoXo1zkRrVlLKIcEV1z_MyhavU-3ERBm9n2oiawI/viewform recenzentsko poročilo] na spletu. Recenzentsko poročilo morate oddati najkasneje do predstavitve seminarja.

== Mnenje o predstavitvi ==
Vsak posameznik '''mora''' oceniti seminar, tako da odda svoje [https://docs.google.com/forms/d/1ToLPn78T9W3G6Hm5hV0mLseFYghiLQMlRPGb0J5zft8/viewform mnenje] najkasneje v sedmih dneh po predstavitvi. Kdor na seminarju ni bil prisoten, mnenja '''ne sme''' oddati.
Na [http://bit.ly/bntmnenja tej strani] lahko preverite, če ste svoje mnenje za določen seminar že oddali in če je bil oddan pravočasno.

==Urejanje spletnih strani na wikiju==
Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''

==Citiranje virov==
Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se držite ene same. V seminarskih nalogah in diplomskih nalogah FKKT uprabljajte shemo citiranja, ki je pobarvana zeleno.
Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati.
Za citate v naravoslovju je najpogostejše citiranje po pravilniku ISO 690. [http://www.zveza-zotks.si/gzm/dokumenti/literatura.html Pravila], ki upoštevajo omenjeni standard, so pripravili pri ZTKS. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati. 
'''Citiranje knjig:''' 
Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica. 
Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN. 

Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005. 
Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4. 
Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.).

'''Citiranje člankov:''' 
Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani. 
Lartigue, C., Glass, J. I., Alperovich, N., Pieper, R., Parmar, P. P., Hutchison III, C. A., Smith, H. O. in Venter, J. C.
Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, 317, str. 632-638.

Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole: 
Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani. 
Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.

Revija Science uporablja skrajšani zapis: 
C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007) 

V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne). Navesti morate tudi vse avtorje dela, razen v primeru, ko jih je 10 ali več. Takrat navedite le prvih devet, za ostale pa uporabite okrajšavo in sod. (in sodelavci). Pred zadnjim avtorjem naj bo vedno besedica "in".

'''Citiranje spletnih virov:''' 
Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov 
strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life 
Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.

2017-bionano-seminar

2017-03-15T21:14:57Z

Ema Guštin:

= Bionanotehnologija- seminar =
doc. dr. Gregor Gunčar, K2.022

== Seznam seminarjev ==
{| {{table}}
! Ime in priimek !! Datum predstavitve !! Tema seminarja
|-
! Peter Prezelj
| 22.03.17 || opis teme ali naslov
|-
! Boštjan Petrič
| 22.03.17 || Reverzibilno tiskanje s peptidnimi /proteinskimi pigmenti, kovalentno vezanimi na celulozo prek amidne vezi
|-
! Ema Guštin
| 22.03.17 || Senzor za zaznavo natančne glikozilacije proteinov (npr. eritropoetina)
|-
! Tjaša Lapanja
| 29.03.17 || opis teme ali naslov
|-
! Maruša Prolič Kalinšek
| 29.03.17 || opis teme ali naslov
|-
! Domen Klofutar
| 29.03.17 || Novi načini prenosa informacij z izrabo kapacitet DNA: Prenos šifrirne in/ali steganografske DNA v ustni votlini preko naravno prisotnih gostiteljev Lactobacillus Casei in Veillonella Parvula
|-
! Simon Bolta
| 05.04.17 || Sinteza inzulina pri sladkornih bolnikih neposredno po povišanju krvnega sladkorja
|-
! Tomaž Rozmarič
| 05.04.17 || Senzor za zaznavo natančne glikozilacije proteinov (npr. eritropoetina)
|-
! Urša Kapš
| 05.04.17 || Nanodelci za strjevanje krvi
|-
! Julija Mazej
| 12.04.17 || opis teme ali naslov
|-
! Nataša Žigante
| 12.04.17 || opis teme ali naslov
|-
! Anja Herceg
| 12.04.17 || opis teme ali naslov
|-
! Mirjam Kmetič
| 19.04.17 || Nanoprotistrup na osnovi nanodelcev, ki vsebujejo inhibitor varespladib
|-
! Mojca Kostanjevec
| 19.04.17 || Tarčno zdravljenje epitelijskih tumorjev (cepiva in si-RNA - EpCAM) z uporabo nanodiskov
|-
! Jan Rozman
| 19.04.17 || Sinteza nealergenega rekombinantnega kazeina za jedilno / biorazgradljivo embalažo
|-
! Barbara Dušak
| 03.05.17 || opis teme ali naslov
|-
! Mateja Cigoj
| 03.05.17 || Probiotik z dodatkom nanodelcev za zdravljenje celiakije. Uporaba probiotičnih bakterij, ki izločajo peptidaze za razgradnjo glutena do neimunogenih fragmentov, in nanodelcev, ki vsebujejo modificirane naravne glutenske peptide specifične za HLA-DQ2 receptorje na limfocitih T, ki zavrejo Th1 posredovan avtoimunski odziv na gluten.
|-
! Toni Nagode
| 03.05.17 || Senzor za zaznavo natančne glikozilacije proteinov (npr. eritropoetina)
|-
! Tim Božič
| 10.05.17 || Senzor za zaznavo natančne glikozilacije proteinov (npr. eritropoetina)
|-
! Darja Božič
| 10.05.17 || opis teme ali naslov
|-
! Petra Tavčar
| 10.05.17 || Odstranjevalec škodljivih E-jev in BPA iz kupljenih pijač na osnovi kovalentno pritrjenih protiteles in aptamerov
|-
! Marjeta Horvat
| 17.05.17 || FeO nanodelci za učinkovitejše odpravljanje zobnega kariesa
|-
! Danijela Jošić
| 17.05.17 || Gensko spremenjen Lactobacillus, ki izloča nanodelce z spermicidnim in protimikrobnim delovanjem za dolgotrajno zaščito pred zanositvijo in spolno prenosljivimi boleznimi.
|-
! Tina Kuhar
| 17.05.17 || Flaška za vodo z bionanosenzorjem za takojšnjo zaznavo kvalitete oziroma pitnosti nalite vode.
|-
! Nika Strašek
| 24.05.17 || Uporabniku dostopen diagnostični test za zaznavo okužbe s boreliozo in klopnim meningitisom
|-
! Eva Vidak
| 24.05.17 || Biosenzor za CO na osnovi transkripcijskega faktorja CooA iz bakterije ''Rhodospirillum rubrum''
|-
! Alja Zgonc
| 24.05.17 || Senzor za zaznavanje miRNA v urinu za diagnozo nevrodegenerativnih bolezni
|-
! Zala Gluhić
| 31.05.17 || Varnejše uživanje alkohola z uporabo odorant-binding proteina LUSH.
|-
! Judita Avbelj
| 31.05.17 || Nanonaprava iz bioloških delov, ki z absorbcijo in razgradnjo delcev iz zraka preprečuje različne alergijske reakcije.
|-
! Vid Jazbec
| 31.05.17 || Gensko spremenjene čebele odporne na insekticide.
|-
! Vita Vidmar
| 07.06.17 || 'Hot start' transglutaminaza za popravljanje razcepljenih lasnih konic
|-
! Luka Kavčič
| 07.06.17 || Senzor za zaznavo natančne glikozilacije proteinov (npr. eritropoetina)
|-
! Mojca Juteršek
| 07.06.17 || Senzor za zaznavo natančne glikozilacije proteinov (npr. eritropoetina)
|-
! Bojana Lazović
| 07.06.17 || opis teme ali naslov
|-
! Eva Korošec
| 07.06.17 || Tattoo biosenzor za raven alkohola v krvi na osnovi alkohol oksidaze, povezan s pametnim telefonom, računalnikom ali avtomobilskimi ključi.
|-
! Tajda Buh
| 07.06.17 || opis teme ali naslov
|}

== Gradivo za predavanja ==
Gradivo za predavanja najdete v [http://ucilnica.fkkt.uni-lj.si/ spletni učilnici].

==Naloga==
'''Vaša naloga je: '''
Študent pripravi projektno nalogo iz področja Bionanotehnologije. Najpomembnejša je originalna ideja za nek izvedljiv projekt.
Predlagana struktura:
* Uvod
* Predstavitev problema, znanstvena izhodišča, cilji
* Izvedba projekta, metodologija, tehnike, materiali, vprašanja, hipoteze
* Literatura

Za pripravo seminarja velja naslednje: 
* Prva stran seminarja naj vsebuje naslov projekta, avtorje, povzetek (od 130 do 160 besed) in grafični povzetek (čez približno pol strani)
* Seminar pripravite v obliki seminarske naloge (pisava 12, enojni razmak, 2,5 cm robovi). Obseg seminarja naj bo od 2000 do 2500 besed (vključno z literaturo). Seminarska naloga mora vsebovati najmanj tri slike. Slika mora imeti legendo in v besedilu mora biti na ustreznem mestu sklic na sliko. 
* Seminar oddajte do datuma oddaje, ki je naveden v tabeli v elektronski obliki z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/ tega obrazca].
* Vsi seminarji so v elektronski obliki dostopni [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/bioseminar/ tukaj].
* Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Za predstavitev je na voljo 25 minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni.
* Predstavitvi sledi razprava. Recenzenti podajo pripombe k projektu in postavijo po dve vprašanji.
* Na dan predstavitve morate docentu še pred predstavitvijo oddati končno verzijo seminarja v enem izvodu, elektronsko verzijo seminarja in predstavitev pa oddati na strežnik en dan pred predstavitvijo do polnoči.

==Imena datotek==
Prosim vas, da vse datoteke poimenujete po naslednjem receptu:
* 19_nano_Priimek1_Priimek2.doc(x) za seminar, npr. 19_nano_Craik_Venter.docx
* 19_nano_Priimek1_Priimek2.ppt(x) za prezentacijo, npr. 19_nano_Craik_Venter.pptx

==Ocenjevanje seminarjev==
Recenzenti ocenijo seminar tako, da izpolnijo [https://docs.google.com/forms/d/1WdCXoXo1zkRrVlLKIcEV1z_MyhavU-3ERBm9n2oiawI/viewform recenzentsko poročilo] na spletu. Recenzentsko poročilo morate oddati najkasneje do predstavitve seminarja.

== Mnenje o predstavitvi ==
Vsak posameznik '''mora''' oceniti seminar, tako da odda svoje [https://docs.google.com/forms/d/1ToLPn78T9W3G6Hm5hV0mLseFYghiLQMlRPGb0J5zft8/viewform mnenje] najkasneje v sedmih dneh po predstavitvi. Kdor na seminarju ni bil prisoten, mnenja '''ne sme''' oddati.
Na [http://bit.ly/bntmnenja tej strani] lahko preverite, če ste svoje mnenje za določen seminar že oddali in če je bil oddan pravočasno.

==Urejanje spletnih strani na wikiju==
Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''

==Citiranje virov==
Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se držite ene same. V seminarskih nalogah in diplomskih nalogah FKKT uprabljajte shemo citiranja, ki je pobarvana zeleno.
Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati.
Za citate v naravoslovju je najpogostejše citiranje po pravilniku ISO 690. [http://www.zveza-zotks.si/gzm/dokumenti/literatura.html Pravila], ki upoštevajo omenjeni standard, so pripravili pri ZTKS. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati. 
'''Citiranje knjig:''' 
Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica. 
Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN. 

Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005. 
Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4. 
Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.).

'''Citiranje člankov:''' 
Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani. 
Lartigue, C., Glass, J. I., Alperovich, N., Pieper, R., Parmar, P. P., Hutchison III, C. A., Smith, H. O. in Venter, J. C.
Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, 317, str. 632-638.

Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole: 
Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani. 
Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.

Revija Science uporablja skrajšani zapis: 
C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007) 

V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne). Navesti morate tudi vse avtorje dela, razen v primeru, ko jih je 10 ali več. Takrat navedite le prvih devet, za ostale pa uporabite okrajšavo in sod. (in sodelavci). Pred zadnjim avtorjem naj bo vedno besedica "in".

'''Citiranje spletnih virov:''' 
Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov 
strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life 
Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.

MBT seminarji 2017

2017-02-28T09:35:56Z

Ema Guštin:

Quantifly

2016-11-29T10:06:24Z

Ema Guštin: /* Zaključek */

[http://2016.igem.org/Team:Ionis_Paris Ionis Paris - Quantifly]

== Uvod ==
V zadnjih letih se ljudje čedalje bolj zavedamo problematike onesnaženosti okolja na različnih nivojih. V zraku so na primer prisotni številni plini in trdni delci s škodljivim vplivom na zdravje ljudi in na okolje, ki nastajajo pri nekaterih naravnih pojavih kot so vulkanski izbruhi, požari in razgradnja organskih snovi, ter predvsem kot posledica človeške dejavnosti (npr. industrija, promet, kmetijstvo in ogrevanje). Hlapne organske spojine (''ang.'' volatile organic compounds, VOS), med katere spadajo nekateri ciklični aromatski ogljikovodiki in aldehidi, sicer predstavljajo le 2 % snovi, ki prispevajo k onesnaženosti zraka, njihov škodljiv vpliv na zdravje ljudi in na okolje pa je zelo velik. Za spremljanje onesnaženosti zraka je na voljo veliko različnih fizikalnih in kemijskih metod, vendar pa zaradi zelo velike raznolikosti onesnaževalnih snovi v zraku njihova detekcija in kvantifikacija še vedno predstavljata izziv. Skupina študentov iz Pariza je v svojem projektu, s katerim je sodelovala na sinteznobiološkem tekmovanju iGEM 2016, izdelala mobilno biološko napravo za zaznavanje in kvantifikacijo nekaterih organskih onesnaževalcev zraka, ki so jo poimenovali Quantifly.

== Biosenzor ==
Biosenzorji so celostne in samostojne merilne naprave oz. sistemi, ki vsebujejo biološko komponento, sposobno prepoznavanja in kvantifikacije specifičnih dražljajev. Lahko gre za makromolekulo, organel, celico ali tkivo. Ključna elementa biosenzorja sta detektor, ki prepozna vhodni dražljaj in reporter, ki sproži izhodni signal.

===Načrtovanje biosenzorja===
Mladi francoski sintezni biologi so izdelali celični, natančneje bakterijski biosenzor. Kot ogrodje za samostojno sestavljen genetski material so uporabili nepatogeni laboratorijski sev bakterijske vrste ''Escherichia coli'', DH5α. S ciljem ustvariti organizem, ki bo zaznal specifičen onesnaževalec zraka in se nanj odzval z oddajanjem bioluminiscenčnega signala, so izdelali genski konstrukt, zgrajen iz konstitutivnega promotorja Pr, gena XylR, inducibilnega promotorja Pu, gena GLuc in plazmidnega ogrodja pSB1C3.

Konstitutivni promotor Pr uravnava izražanje gena za protein XylR, ki izvira iz bakterijske vrste ''Pseudomonas putida''. Ta detektorski protein je sposoben vezave aromatskih ogljikovodikov z metilno skupino (npr. toluen in ksilen). Ko veže tako molekulo, se konformacijsko spremeni, dimerizira in se veže na DNA, ob dimerizaciji dveh dimerov pa kot transkripcijski regulator deluje na promotor Pu. Aktivacija promotorja Pu omogoči transkripcijo gena GLuc, ki kodira za reporterski bioluminiscenčni protein luciferazo iz ceponožca ''Gaussia princeps''. Ta encim katalizira oksidacijo organske spojine koelenterazin, za katerega je visoko specifičen. Pri rekaciji se sprošča modra svetloba z emisijskim maksimumom pri 488 nm.

=== Optimizacija plazmida ===
Da bi dosegli čim boljše delovanje zgoraj opisanega genskega konstrukta, so člani pariške sinteznobiološke ekipe uporabili pred kratkim ustvarjeno prosto dostopno programsko opremo [http://cellocad.org/index.html CelloCAD]. Deluje tako, da genski konstrukt, ki ga vnesemo v program, s pomočjo zmogljivih bioinformatskih orodij preoblikuje v najboljši možen plazmid za izbrano kombinacijo genetskih elementov. Študentje so želeli primerjati delovanje samostojno zasnovanega plazmida s plazmidom, ki ga oblikuje program (npr. območje detekcije in odzivnost). Pri tem so naleteli na oviro, saj je za delovanje programske opreme potrebno vnesti relativne enote promotorjev (''ang.'' relative promoter units, RPU). Na voljo namreč (še) ni nobene podatkovne baze RPU za to razmeroma novo metodo. Tako so nadobudni študentje v upanju, da bo njihovo delo predstavljalo začetek množičnega zbiranja podatkov o RPU, določili RPU za promotorja Pr in Pu. V ta namen so oblikovali serijo biokock, pri čemer so izbrana promotorja povezali z zapisom za zeleni fluorescirajoči protein (''ang.'' green fluorescent protein, GFP). RPU so neposredno povezane z izražanjem GFP v posamezni celici, kar so kvantificirali s pretočnim citometrom.

=== Karakterizacija biosenzorja ===
Člani ekipe so za neposredno potrditev izražanja gena za XylR, uravnavanega z inducibilnim promotorjem Pu, želeli narediti fuzijo transkripcijskega faktorja XylR z rdečim fluorescenčnim proteinom (''ang.'' red fluorescent protein, RFP), vendar pa bi bil tak konstrukt prevelik. Zato so uporabili biokocko, sestavljeno iz promotorja Pr, prvega vezavnega mesta za ribosom (''ang.'' ribosome-binding site, RBS), gena za XylR, drugega RBS, gena za mRFP in terminatorja, ter z dokazom o izražanju RFP posredno potrdili tudi izražanje XylR.

Za karakterizacijo biosenzorja je skupina uporabila toluen, hlapen cikličen aromatski ogljikovodik. Bioluminiscenčne teste so izvedli z različnimi koncentracijami toluena (od 10 ng/l do 10 mg/l) in ob različnih časih po izpostavitvi celic toluenu (1 h do 5,5 h), intenziteto bioluminiscence pa so merili z [https://www.berthold.com/en/bio/monochromator_multilabel_microplate_reader_Mithras2_LB943 monokromatskim čitalcem]. Pokazali so, da niti toluen niti uporabljen sev ''E. coli'' sama po sebi nista bioluminiscenčna. Nato so ugotovili, da uporabljen promotor Pu, ki naj bi bil inducibilen, pušča (tj. do neke mere omogoča izražanje gena, ki ga regulira, tudi ob odsotnosti aktivacijskega signala), vendar pa je bioluminiscenca celic v prisotnosti toluena občutno višja kot ob njegovi odsotnosti, kar za delovanje biosenzorja zadostuje.
Kot časovno točko, v kateri naj bi bilo najbolj smiselno izvesti meritev, so izbrali 5 h 30 min po dodatku toluena. Ker je intenziteta bioluminiscence časovno odvisna, mora biti test vedno izveden ob enakem, natančno odmerjenem času po vzorčenju. Najpomembnejši zaključek karakterizacije je, da je izdelan biosenzor sposoben zanesljive zaznave koncentracij toluena, ki so prisotne v onesnaženem zraku (okoli 10 ng/l), ni pa sposoben zelo natančne kvantifikacije, najverjetneje zaradi variacij v metabolizmu živih organizmov.

== Strojna oprema ==
=== Dron ===
Cilj projekta je bil ustvariti letečo napravo za spremljanje onesnaženosti zraka s hlapnimi organskimi molekulami. V ta namen je ekipa zasnovala in z uporabo 3D-tiskalnika tudi ustvarila dron, ki je sposoben vzorčenja zraka, hkrati pa lahko bakterije prenaša brez tveganja za širjenje teh gensko spremenjenih organizmov v okolje. To zagotavlja majhna steklenička belila, pritrjena pod dron, ki se v primeru nesreče razbije, belilo iz nje pa uniči bakterije. Tehnologija, potrebna za analizo bioluminiscence na terenu, ekipi v okviru tekmovanja iGEM žal ni bila dostopna. Rešitev sicer vidijo v majhni na svetlobo občutljivi celici in mikrofluidnem vezju, ki bi bakterijske celice posamič vodilo mimo nje. Podobno je težje uresničljiva zamisel o daljinskem vodenju drona, ki bi omogočalo avtomatsko kartiranje in učinkovito načrtovanje leta.

=== Epruveta za bakterije ===
Predel v dronu, ki vsebuje bakterije, ne sme dopuščati možnosti njihovega širjenja v okolje, hkrati pa mora bakterijam dovesti zrak, ki ga želimo analizirati. Pariški študentje so v ta namen zasnovali in s 3D-tiskalnikom izdelali epruveto, ki deluje po principu zračne ključavnice. Zamašek namreč vsebuje votel predel med bakterijami in zunanjostjo, preko katerega se brez neposrednega stika med vsebino epruvete in okoljem bakterijam dovaja zunanji zrak. Pred začetkom vzorčenja zraka je zamašek nekoliko dvignjen, s čimer je bakterijam preprečen dostop do kamrice v njem, a ne dovolj, da bi v ta vmesni predel že vstopil zunanji zrak. Nato ustrezne komponente drona zamašek še bolj dvignejo, kar omogoči vdor zraka, katerega onesnaženost nas zanima, v kamrico zamaška. Dno kamrice preprečuje, da bi bile bakterije v notranjosti epruvete že v trenutku vzorčenja izpostavljene zunanjemu zraku. Sledi popolno zaprtje epruvete, pri čemer se zajeti zrak pomeša z bakterijsko kulturo v notranjosti epruvete. Biosenzor v primeru prisotnosti hlapnih organskih spojin v vzorcu zraka začne oddajati bioluminiscenčen signal, katerega intenziteto po določenem času izmerimo.

== Zaključek ==
Ob zaključku projekta študentje predlagajo nekaj izboljšav, ki bi lahko doprinesle h kvaliteti njihovega prototipa. Standardno krivuljo nameravajo izboljšati z meritvami nižjih koncentracij toluena ter določiti najnižjo koncentracijo, ki jo Quantifly zanesljivo zazna. Izvesti nameravajo še eksperimente z ostalimi toluenu podobnimi molekulami kot je npr. ksilen. Iz praktičnih razlogov so v laboratoriju bioluminiscenčne teste izvajali s tekočim toluenom, v prihodnje pa želijo vzpostaviti izolirano hermetično zaprto sobo s hlapi toluena, v kateri bi lahko opravili vzorčenje zraka. Veliko težavo, katere rešitve študentje zaenkrat ne komentirajo, pa predstavljajo variacije v bioluminiscenčnem testu, ki so posledica razlik v metabolizmu živih organizmov.
Kljub nekaterim pomanjkljivostim projekta je bila ekipa v sklopu tekmovanja iGEM 2016 za svoje delo nominirana za najboljši okoljski projekt, najboljšo predstavitev projekta in najbolj uporaben projekt.

== Vir ==
[http://2016.igem.org/Team:Ionis_Paris Wiki stran ekipe Ionis Paris 2016]

[[Seminarji SB 2016/17]]

Quantifly

2016-11-29T10:04:58Z

Ema Guštin: /* Epruveta za bakterije */

[http://2016.igem.org/Team:Ionis_Paris Ionis Paris - Quantifly]

== Uvod ==
V zadnjih letih se ljudje čedalje bolj zavedamo problematike onesnaženosti okolja na različnih nivojih. V zraku so na primer prisotni številni plini in trdni delci s škodljivim vplivom na zdravje ljudi in na okolje, ki nastajajo pri nekaterih naravnih pojavih kot so vulkanski izbruhi, požari in razgradnja organskih snovi, ter predvsem kot posledica človeške dejavnosti (npr. industrija, promet, kmetijstvo in ogrevanje). Hlapne organske spojine (''ang.'' volatile organic compounds, VOS), med katere spadajo nekateri ciklični aromatski ogljikovodiki in aldehidi, sicer predstavljajo le 2 % snovi, ki prispevajo k onesnaženosti zraka, njihov škodljiv vpliv na zdravje ljudi in na okolje pa je zelo velik. Za spremljanje onesnaženosti zraka je na voljo veliko različnih fizikalnih in kemijskih metod, vendar pa zaradi zelo velike raznolikosti onesnaževalnih snovi v zraku njihova detekcija in kvantifikacija še vedno predstavljata izziv. Skupina študentov iz Pariza je v svojem projektu, s katerim je sodelovala na sinteznobiološkem tekmovanju iGEM 2016, izdelala mobilno biološko napravo za zaznavanje in kvantifikacijo nekaterih organskih onesnaževalcev zraka, ki so jo poimenovali Quantifly.

== Biosenzor ==
Biosenzorji so celostne in samostojne merilne naprave oz. sistemi, ki vsebujejo biološko komponento, sposobno prepoznavanja in kvantifikacije specifičnih dražljajev. Lahko gre za makromolekulo, organel, celico ali tkivo. Ključna elementa biosenzorja sta detektor, ki prepozna vhodni dražljaj in reporter, ki sproži izhodni signal.

===Načrtovanje biosenzorja===
Mladi francoski sintezni biologi so izdelali celični, natančneje bakterijski biosenzor. Kot ogrodje za samostojno sestavljen genetski material so uporabili nepatogeni laboratorijski sev bakterijske vrste ''Escherichia coli'', DH5α. S ciljem ustvariti organizem, ki bo zaznal specifičen onesnaževalec zraka in se nanj odzval z oddajanjem bioluminiscenčnega signala, so izdelali genski konstrukt, zgrajen iz konstitutivnega promotorja Pr, gena XylR, inducibilnega promotorja Pu, gena GLuc in plazmidnega ogrodja pSB1C3.

Konstitutivni promotor Pr uravnava izražanje gena za protein XylR, ki izvira iz bakterijske vrste ''Pseudomonas putida''. Ta detektorski protein je sposoben vezave aromatskih ogljikovodikov z metilno skupino (npr. toluen in ksilen). Ko veže tako molekulo, se konformacijsko spremeni, dimerizira in se veže na DNA, ob dimerizaciji dveh dimerov pa kot transkripcijski regulator deluje na promotor Pu. Aktivacija promotorja Pu omogoči transkripcijo gena GLuc, ki kodira za reporterski bioluminiscenčni protein luciferazo iz ceponožca ''Gaussia princeps''. Ta encim katalizira oksidacijo organske spojine koelenterazin, za katerega je visoko specifičen. Pri rekaciji se sprošča modra svetloba z emisijskim maksimumom pri 488 nm.

=== Optimizacija plazmida ===
Da bi dosegli čim boljše delovanje zgoraj opisanega genskega konstrukta, so člani pariške sinteznobiološke ekipe uporabili pred kratkim ustvarjeno prosto dostopno programsko opremo [http://cellocad.org/index.html CelloCAD]. Deluje tako, da genski konstrukt, ki ga vnesemo v program, s pomočjo zmogljivih bioinformatskih orodij preoblikuje v najboljši možen plazmid za izbrano kombinacijo genetskih elementov. Študentje so želeli primerjati delovanje samostojno zasnovanega plazmida s plazmidom, ki ga oblikuje program (npr. območje detekcije in odzivnost). Pri tem so naleteli na oviro, saj je za delovanje programske opreme potrebno vnesti relativne enote promotorjev (''ang.'' relative promoter units, RPU). Na voljo namreč (še) ni nobene podatkovne baze RPU za to razmeroma novo metodo. Tako so nadobudni študentje v upanju, da bo njihovo delo predstavljalo začetek množičnega zbiranja podatkov o RPU, določili RPU za promotorja Pr in Pu. V ta namen so oblikovali serijo biokock, pri čemer so izbrana promotorja povezali z zapisom za zeleni fluorescirajoči protein (''ang.'' green fluorescent protein, GFP). RPU so neposredno povezane z izražanjem GFP v posamezni celici, kar so kvantificirali s pretočnim citometrom.

=== Karakterizacija biosenzorja ===
Člani ekipe so za neposredno potrditev izražanja gena za XylR, uravnavanega z inducibilnim promotorjem Pu, želeli narediti fuzijo transkripcijskega faktorja XylR z rdečim fluorescenčnim proteinom (''ang.'' red fluorescent protein, RFP), vendar pa bi bil tak konstrukt prevelik. Zato so uporabili biokocko, sestavljeno iz promotorja Pr, prvega vezavnega mesta za ribosom (''ang.'' ribosome-binding site, RBS), gena za XylR, drugega RBS, gena za mRFP in terminatorja, ter z dokazom o izražanju RFP posredno potrdili tudi izražanje XylR.

Za karakterizacijo biosenzorja je skupina uporabila toluen, hlapen cikličen aromatski ogljikovodik. Bioluminiscenčne teste so izvedli z različnimi koncentracijami toluena (od 10 ng/l do 10 mg/l) in ob različnih časih po izpostavitvi celic toluenu (1 h do 5,5 h), intenziteto bioluminiscence pa so merili z [https://www.berthold.com/en/bio/monochromator_multilabel_microplate_reader_Mithras2_LB943 monokromatskim čitalcem]. Pokazali so, da niti toluen niti uporabljen sev ''E. coli'' sama po sebi nista bioluminiscenčna. Nato so ugotovili, da uporabljen promotor Pu, ki naj bi bil inducibilen, pušča (tj. do neke mere omogoča izražanje gena, ki ga regulira, tudi ob odsotnosti aktivacijskega signala), vendar pa je bioluminiscenca celic v prisotnosti toluena občutno višja kot ob njegovi odsotnosti, kar za delovanje biosenzorja zadostuje.
Kot časovno točko, v kateri naj bi bilo najbolj smiselno izvesti meritev, so izbrali 5 h 30 min po dodatku toluena. Ker je intenziteta bioluminiscence časovno odvisna, mora biti test vedno izveden ob enakem, natančno odmerjenem času po vzorčenju. Najpomembnejši zaključek karakterizacije je, da je izdelan biosenzor sposoben zanesljive zaznave koncentracij toluena, ki so prisotne v onesnaženem zraku (okoli 10 ng/l), ni pa sposoben zelo natančne kvantifikacije, najverjetneje zaradi variacij v metabolizmu živih organizmov.

== Strojna oprema ==
=== Dron ===
Cilj projekta je bil ustvariti letečo napravo za spremljanje onesnaženosti zraka s hlapnimi organskimi molekulami. V ta namen je ekipa zasnovala in z uporabo 3D-tiskalnika tudi ustvarila dron, ki je sposoben vzorčenja zraka, hkrati pa lahko bakterije prenaša brez tveganja za širjenje teh gensko spremenjenih organizmov v okolje. To zagotavlja majhna steklenička belila, pritrjena pod dron, ki se v primeru nesreče razbije, belilo iz nje pa uniči bakterije. Tehnologija, potrebna za analizo bioluminiscence na terenu, ekipi v okviru tekmovanja iGEM žal ni bila dostopna. Rešitev sicer vidijo v majhni na svetlobo občutljivi celici in mikrofluidnem vezju, ki bi bakterijske celice posamič vodilo mimo nje. Podobno je težje uresničljiva zamisel o daljinskem vodenju drona, ki bi omogočalo avtomatsko kartiranje in učinkovito načrtovanje leta.

=== Epruveta za bakterije ===
Predel v dronu, ki vsebuje bakterije, ne sme dopuščati možnosti njihovega širjenja v okolje, hkrati pa mora bakterijam dovesti zrak, ki ga želimo analizirati. Pariški študentje so v ta namen zasnovali in s 3D-tiskalnikom izdelali epruveto, ki deluje po principu zračne ključavnice. Zamašek namreč vsebuje votel predel med bakterijami in zunanjostjo, preko katerega se brez neposrednega stika med vsebino epruvete in okoljem bakterijam dovaja zunanji zrak. Pred začetkom vzorčenja zraka je zamašek nekoliko dvignjen, s čimer je bakterijam preprečen dostop do kamrice v njem, a ne dovolj, da bi v ta vmesni predel že vstopil zunanji zrak. Nato ustrezne komponente drona zamašek še bolj dvignejo, kar omogoči vdor zraka, katerega onesnaženost nas zanima, v kamrico zamaška. Dno kamrice preprečuje, da bi bile bakterije v notranjosti epruvete že v trenutku vzorčenja izpostavljene zunanjemu zraku. Sledi popolno zaprtje epruvete, pri čemer se zajeti zrak pomeša z bakterijsko kulturo v notranjosti epruvete. Biosenzor v primeru prisotnosti hlapnih organskih spojin v vzorcu zraka začne oddajati bioluminiscenčen signal, katerega intenziteto po določenem času izmerimo.

== Zaključek ==
Ob zaključku projekta študentje predlagajo nekaj izboljšav, ki bi lahko doprinesle h kvaliteti njihovega prototipa. Standardno krivuljo nameravajo izboljšati z meritvami nižjih koncentracij toluena ter določiti najnižjo koncentracijo, ki jo Quantifly natančno zazna. Izvesti nameravajo še eksperimente z ostalimi toluenu podobnimi molekulami kot je npr. ksilen. Iz praktičnih razlogov so v laboratoriju bioluminiscenčne teste izvajali s tekočim toluenom, v prihodnje pa želijo vzpostaviti izolirano hermetično zaprto sobo s hlapi toluena, v kateri bi lahko opravili vzorčenje zraka. Veliko težavo, katere rešitve študentje zaenkrat ne komentirajo, pa predstavljajo variacije v bioluminiscenčnem testu, ki so posledica razlik v metabolizmu živih organizmov.
Kljub nekaterim pomanjkljivostim projekta je bila ekipa v sklopu tekmovanja iGEM 2016 za svoje delo nominirana za najboljši okoljski projekt, najboljšo predstavitev projekta in najbolj uporaben projekt.

== Vir ==
[http://2016.igem.org/Team:Ionis_Paris Wiki stran ekipe Ionis Paris 2016]

[[Seminarji SB 2016/17]]

Quantifly

2016-11-29T10:01:10Z

Ema Guštin: /* Karakterizacija biosenzorja */

[http://2016.igem.org/Team:Ionis_Paris Ionis Paris - Quantifly]

== Uvod ==
V zadnjih letih se ljudje čedalje bolj zavedamo problematike onesnaženosti okolja na različnih nivojih. V zraku so na primer prisotni številni plini in trdni delci s škodljivim vplivom na zdravje ljudi in na okolje, ki nastajajo pri nekaterih naravnih pojavih kot so vulkanski izbruhi, požari in razgradnja organskih snovi, ter predvsem kot posledica človeške dejavnosti (npr. industrija, promet, kmetijstvo in ogrevanje). Hlapne organske spojine (''ang.'' volatile organic compounds, VOS), med katere spadajo nekateri ciklični aromatski ogljikovodiki in aldehidi, sicer predstavljajo le 2 % snovi, ki prispevajo k onesnaženosti zraka, njihov škodljiv vpliv na zdravje ljudi in na okolje pa je zelo velik. Za spremljanje onesnaženosti zraka je na voljo veliko različnih fizikalnih in kemijskih metod, vendar pa zaradi zelo velike raznolikosti onesnaževalnih snovi v zraku njihova detekcija in kvantifikacija še vedno predstavljata izziv. Skupina študentov iz Pariza je v svojem projektu, s katerim je sodelovala na sinteznobiološkem tekmovanju iGEM 2016, izdelala mobilno biološko napravo za zaznavanje in kvantifikacijo nekaterih organskih onesnaževalcev zraka, ki so jo poimenovali Quantifly.

== Biosenzor ==
Biosenzorji so celostne in samostojne merilne naprave oz. sistemi, ki vsebujejo biološko komponento, sposobno prepoznavanja in kvantifikacije specifičnih dražljajev. Lahko gre za makromolekulo, organel, celico ali tkivo. Ključna elementa biosenzorja sta detektor, ki prepozna vhodni dražljaj in reporter, ki sproži izhodni signal.

===Načrtovanje biosenzorja===
Mladi francoski sintezni biologi so izdelali celični, natančneje bakterijski biosenzor. Kot ogrodje za samostojno sestavljen genetski material so uporabili nepatogeni laboratorijski sev bakterijske vrste ''Escherichia coli'', DH5α. S ciljem ustvariti organizem, ki bo zaznal specifičen onesnaževalec zraka in se nanj odzval z oddajanjem bioluminiscenčnega signala, so izdelali genski konstrukt, zgrajen iz konstitutivnega promotorja Pr, gena XylR, inducibilnega promotorja Pu, gena GLuc in plazmidnega ogrodja pSB1C3.

Konstitutivni promotor Pr uravnava izražanje gena za protein XylR, ki izvira iz bakterijske vrste ''Pseudomonas putida''. Ta detektorski protein je sposoben vezave aromatskih ogljikovodikov z metilno skupino (npr. toluen in ksilen). Ko veže tako molekulo, se konformacijsko spremeni, dimerizira in se veže na DNA, ob dimerizaciji dveh dimerov pa kot transkripcijski regulator deluje na promotor Pu. Aktivacija promotorja Pu omogoči transkripcijo gena GLuc, ki kodira za reporterski bioluminiscenčni protein luciferazo iz ceponožca ''Gaussia princeps''. Ta encim katalizira oksidacijo organske spojine koelenterazin, za katerega je visoko specifičen. Pri rekaciji se sprošča modra svetloba z emisijskim maksimumom pri 488 nm.

=== Optimizacija plazmida ===
Da bi dosegli čim boljše delovanje zgoraj opisanega genskega konstrukta, so člani pariške sinteznobiološke ekipe uporabili pred kratkim ustvarjeno prosto dostopno programsko opremo [http://cellocad.org/index.html CelloCAD]. Deluje tako, da genski konstrukt, ki ga vnesemo v program, s pomočjo zmogljivih bioinformatskih orodij preoblikuje v najboljši možen plazmid za izbrano kombinacijo genetskih elementov. Študentje so želeli primerjati delovanje samostojno zasnovanega plazmida s plazmidom, ki ga oblikuje program (npr. območje detekcije in odzivnost). Pri tem so naleteli na oviro, saj je za delovanje programske opreme potrebno vnesti relativne enote promotorjev (''ang.'' relative promoter units, RPU). Na voljo namreč (še) ni nobene podatkovne baze RPU za to razmeroma novo metodo. Tako so nadobudni študentje v upanju, da bo njihovo delo predstavljalo začetek množičnega zbiranja podatkov o RPU, določili RPU za promotorja Pr in Pu. V ta namen so oblikovali serijo biokock, pri čemer so izbrana promotorja povezali z zapisom za zeleni fluorescirajoči protein (''ang.'' green fluorescent protein, GFP). RPU so neposredno povezane z izražanjem GFP v posamezni celici, kar so kvantificirali s pretočnim citometrom.

=== Karakterizacija biosenzorja ===
Člani ekipe so za neposredno potrditev izražanja gena za XylR, uravnavanega z inducibilnim promotorjem Pu, želeli narediti fuzijo transkripcijskega faktorja XylR z rdečim fluorescenčnim proteinom (''ang.'' red fluorescent protein, RFP), vendar pa bi bil tak konstrukt prevelik. Zato so uporabili biokocko, sestavljeno iz promotorja Pr, prvega vezavnega mesta za ribosom (''ang.'' ribosome-binding site, RBS), gena za XylR, drugega RBS, gena za mRFP in terminatorja, ter z dokazom o izražanju RFP posredno potrdili tudi izražanje XylR.

Za karakterizacijo biosenzorja je skupina uporabila toluen, hlapen cikličen aromatski ogljikovodik. Bioluminiscenčne teste so izvedli z različnimi koncentracijami toluena (od 10 ng/l do 10 mg/l) in ob različnih časih po izpostavitvi celic toluenu (1 h do 5,5 h), intenziteto bioluminiscence pa so merili z [https://www.berthold.com/en/bio/monochromator_multilabel_microplate_reader_Mithras2_LB943 monokromatskim čitalcem]. Pokazali so, da niti toluen niti uporabljen sev ''E. coli'' sama po sebi nista bioluminiscenčna. Nato so ugotovili, da uporabljen promotor Pu, ki naj bi bil inducibilen, pušča (tj. do neke mere omogoča izražanje gena, ki ga regulira, tudi ob odsotnosti aktivacijskega signala), vendar pa je bioluminiscenca celic v prisotnosti toluena občutno višja kot ob njegovi odsotnosti, kar za delovanje biosenzorja zadostuje.
Kot časovno točko, v kateri naj bi bilo najbolj smiselno izvesti meritev, so izbrali 5 h 30 min po dodatku toluena. Ker je intenziteta bioluminiscence časovno odvisna, mora biti test vedno izveden ob enakem, natančno odmerjenem času po vzorčenju. Najpomembnejši zaključek karakterizacije je, da je izdelan biosenzor sposoben zanesljive zaznave koncentracij toluena, ki so prisotne v onesnaženem zraku (okoli 10 ng/l), ni pa sposoben zelo natančne kvantifikacije, najverjetneje zaradi variacij v metabolizmu živih organizmov.

== Strojna oprema ==
=== Dron ===
Cilj projekta je bil ustvariti letečo napravo za spremljanje onesnaženosti zraka s hlapnimi organskimi molekulami. V ta namen je ekipa zasnovala in z uporabo 3D-tiskalnika tudi ustvarila dron, ki je sposoben vzorčenja zraka, hkrati pa lahko bakterije prenaša brez tveganja za širjenje teh gensko spremenjenih organizmov v okolje. To zagotavlja majhna steklenička belila, pritrjena pod dron, ki se v primeru nesreče razbije, belilo iz nje pa uniči bakterije. Tehnologija, potrebna za analizo bioluminiscence na terenu, ekipi v okviru tekmovanja iGEM žal ni bila dostopna. Rešitev sicer vidijo v majhni na svetlobo občutljivi celici in mikrofluidnem vezju, ki bi bakterijske celice posamič vodilo mimo nje. Podobno je težje uresničljiva zamisel o daljinskem vodenju drona, ki bi omogočalo avtomatsko kartiranje in učinkovito načrtovanje leta.

=== Epruveta za bakterije ===
Predel v dronu, ki vsebuje bakterije, ne sme dopuščati možnosti njihovega širjenja v okolje, hkrati pa mora bakterijam dovesti zrak, ki ga želimo analizirati. Pariški študentje so v ta namen zasnovali in s 3D-tiskalnikom izdelali epruveto, ki deluje po principu zračne ključavnice. Zamašek namreč vsebuje votel predel med bakterijami in zunanjostjo, preko katerega se brez neposrednega stika med vsebino epruvete in okoljem bakterijam dovaja zunanji zrak. Pred začetkom vzorčenja zraka je zamašek nekoliko dvignjen, s čimer je bakterijam preprečen dostop do kamrice v njem, a ne dovolj, da bi v ta vmesni predel vstopil zunanji zrak. Nato ustrezne komponente drona zamašek še bolj dvignejo, kar omogoči vdor zraka, katerega onesnaženost nas zanima, v kamrico zamaška. Dno kamrice preprečuje, da bi bile bakterije v notranjosti epruvete že v trenutku vzorčenja izpostavljene zunanjemu zraku. Sledi popolno zaprtje epruvete, pri čemer se zajeti zrak pomeša z bakterijsko kulturo v notranjosti epruvete. Biosenzor v primeru prisotnosti hlapnih organskih spojin v vzorcu zraka začne oddajati bioluminiscenčen signal, katerega intenziteto po določenem času izmerimo.

== Zaključek ==
Ob zaključku projekta študentje predlagajo nekaj izboljšav, ki bi lahko doprinesle h kvaliteti njihovega prototipa. Standardno krivuljo nameravajo izboljšati z meritvami nižjih koncentracij toluena ter določiti najnižjo koncentracijo, ki jo Quantifly natančno zazna. Izvesti nameravajo še eksperimente z ostalimi toluenu podobnimi molekulami kot je npr. ksilen. Iz praktičnih razlogov so v laboratoriju bioluminiscenčne teste izvajali s tekočim toluenom, v prihodnje pa želijo vzpostaviti izolirano hermetično zaprto sobo s hlapi toluena, v kateri bi lahko opravili vzorčenje zraka. Veliko težavo, katere rešitve študentje zaenkrat ne komentirajo, pa predstavljajo variacije v bioluminiscenčnem testu, ki so posledica razlik v metabolizmu živih organizmov.
Kljub nekaterim pomanjkljivostim projekta je bila ekipa v sklopu tekmovanja iGEM 2016 za svoje delo nominirana za najboljši okoljski projekt, najboljšo predstavitev projekta in najbolj uporaben projekt.

== Vir ==
[http://2016.igem.org/Team:Ionis_Paris Wiki stran ekipe Ionis Paris 2016]

[[Seminarji SB 2016/17]]

Quantifly

2016-11-29T09:59:41Z

Ema Guštin: /* Optimizacija plazmida */

[http://2016.igem.org/Team:Ionis_Paris Ionis Paris - Quantifly]

== Uvod ==
V zadnjih letih se ljudje čedalje bolj zavedamo problematike onesnaženosti okolja na različnih nivojih. V zraku so na primer prisotni številni plini in trdni delci s škodljivim vplivom na zdravje ljudi in na okolje, ki nastajajo pri nekaterih naravnih pojavih kot so vulkanski izbruhi, požari in razgradnja organskih snovi, ter predvsem kot posledica človeške dejavnosti (npr. industrija, promet, kmetijstvo in ogrevanje). Hlapne organske spojine (''ang.'' volatile organic compounds, VOS), med katere spadajo nekateri ciklični aromatski ogljikovodiki in aldehidi, sicer predstavljajo le 2 % snovi, ki prispevajo k onesnaženosti zraka, njihov škodljiv vpliv na zdravje ljudi in na okolje pa je zelo velik. Za spremljanje onesnaženosti zraka je na voljo veliko različnih fizikalnih in kemijskih metod, vendar pa zaradi zelo velike raznolikosti onesnaževalnih snovi v zraku njihova detekcija in kvantifikacija še vedno predstavljata izziv. Skupina študentov iz Pariza je v svojem projektu, s katerim je sodelovala na sinteznobiološkem tekmovanju iGEM 2016, izdelala mobilno biološko napravo za zaznavanje in kvantifikacijo nekaterih organskih onesnaževalcev zraka, ki so jo poimenovali Quantifly.

== Biosenzor ==
Biosenzorji so celostne in samostojne merilne naprave oz. sistemi, ki vsebujejo biološko komponento, sposobno prepoznavanja in kvantifikacije specifičnih dražljajev. Lahko gre za makromolekulo, organel, celico ali tkivo. Ključna elementa biosenzorja sta detektor, ki prepozna vhodni dražljaj in reporter, ki sproži izhodni signal.

===Načrtovanje biosenzorja===
Mladi francoski sintezni biologi so izdelali celični, natančneje bakterijski biosenzor. Kot ogrodje za samostojno sestavljen genetski material so uporabili nepatogeni laboratorijski sev bakterijske vrste ''Escherichia coli'', DH5α. S ciljem ustvariti organizem, ki bo zaznal specifičen onesnaževalec zraka in se nanj odzval z oddajanjem bioluminiscenčnega signala, so izdelali genski konstrukt, zgrajen iz konstitutivnega promotorja Pr, gena XylR, inducibilnega promotorja Pu, gena GLuc in plazmidnega ogrodja pSB1C3.

Konstitutivni promotor Pr uravnava izražanje gena za protein XylR, ki izvira iz bakterijske vrste ''Pseudomonas putida''. Ta detektorski protein je sposoben vezave aromatskih ogljikovodikov z metilno skupino (npr. toluen in ksilen). Ko veže tako molekulo, se konformacijsko spremeni, dimerizira in se veže na DNA, ob dimerizaciji dveh dimerov pa kot transkripcijski regulator deluje na promotor Pu. Aktivacija promotorja Pu omogoči transkripcijo gena GLuc, ki kodira za reporterski bioluminiscenčni protein luciferazo iz ceponožca ''Gaussia princeps''. Ta encim katalizira oksidacijo organske spojine koelenterazin, za katerega je visoko specifičen. Pri rekaciji se sprošča modra svetloba z emisijskim maksimumom pri 488 nm.

=== Optimizacija plazmida ===
Da bi dosegli čim boljše delovanje zgoraj opisanega genskega konstrukta, so člani pariške sinteznobiološke ekipe uporabili pred kratkim ustvarjeno prosto dostopno programsko opremo [http://cellocad.org/index.html CelloCAD]. Deluje tako, da genski konstrukt, ki ga vnesemo v program, s pomočjo zmogljivih bioinformatskih orodij preoblikuje v najboljši možen plazmid za izbrano kombinacijo genetskih elementov. Študentje so želeli primerjati delovanje samostojno zasnovanega plazmida s plazmidom, ki ga oblikuje program (npr. območje detekcije in odzivnost). Pri tem so naleteli na oviro, saj je za delovanje programske opreme potrebno vnesti relativne enote promotorjev (''ang.'' relative promoter units, RPU). Na voljo namreč (še) ni nobene podatkovne baze RPU za to razmeroma novo metodo. Tako so nadobudni študentje v upanju, da bo njihovo delo predstavljalo začetek množičnega zbiranja podatkov o RPU, določili RPU za promotorja Pr in Pu. V ta namen so oblikovali serijo biokock, pri čemer so izbrana promotorja povezali z zapisom za zeleni fluorescirajoči protein (''ang.'' green fluorescent protein, GFP). RPU so neposredno povezane z izražanjem GFP v posamezni celici, kar so kvantificirali s pretočnim citometrom.

=== Karakterizacija biosenzorja ===
Člani ekipe so za neposredno potrditev izražanja gena za XylR, uravnavanega z inducibilnim promotorjem Pu, želeli narediti fuzijo transkripcijskega faktorja XylR z rdečim fluorescenčnim proteinom (''ang.'' red fluorescent protein, RFP), vendar pa bi bil tak konstrukt prevelik. Zato so uporabili biokocko, sestavljeno iz promotorja Pr, prvega vezavnega mesta za ribosom (''ang.'' ribosome-binding site, RBS), gena za XylR, drugega RBS, gena za mRFP in terminatorja, ter z dokazom o izražanju RFP posredno potrdili tudi izražanje XylR.

Za karakterizacijo biosenzorja je skupina uporabila toluen, hlapen cikličen aromatski ogljikovodik. Bioluminiscenčne teste so izvedli z različnimi koncentracijami toluena (10 ng/l do 10 mg/l) in ob različnih časih po izpostavitvi celic toluenu (1 h do 5,5 h), intenziteto bioluminiscence pa so merili z [https://www.berthold.com/en/bio/monochromator_multilabel_microplate_reader_Mithras2_LB943 monokromatskim čitalcem]. Pokazali so, da niti toluen niti uporabljen sev ''E. coli'' sama po sebi nista bioluminiscenčna. Nato so ugotovili, da uporabljen promotor Pu, ki naj bi bil inducibilen, pušča (tj. do neke mere omogoča izražanje gena, ki ga regulira, tudi ob odsotnosti aktivacijskega signala), vendar pa je bioluminiscenca celic v prisotnosti toluena občutno višja kot ob njegovi odsotnosti, kar za delovanje biosenzorja zadostuje.
Kot časovno točko, v kateri naj bi bilo najbolj smiselno izvesti meritev, so izbrali 5 h 30 min po dodatku toluena. Ker je intenziteta bioluminiscence časovno odvisna, mora biti test vedno izveden ob enakem, natančno odmerjenem času po vzorčenju. Najpomembnejši zaključek karakterizacije je, da je izdelan biosenzor sposoben zanesljive zaznave koncentracij toluena, ki so prisotne v onesnaženem zraku (okoli 10 ng/l), ni pa sposoben zelo natančne kvantifikacije, najverjetneje zaradi variacij v metabolizmu živih organizmov.

== Strojna oprema ==
=== Dron ===
Cilj projekta je bil ustvariti letečo napravo za spremljanje onesnaženosti zraka s hlapnimi organskimi molekulami. V ta namen je ekipa zasnovala in z uporabo 3D-tiskalnika tudi ustvarila dron, ki je sposoben vzorčenja zraka, hkrati pa lahko bakterije prenaša brez tveganja za širjenje teh gensko spremenjenih organizmov v okolje. To zagotavlja majhna steklenička belila, pritrjena pod dron, ki se v primeru nesreče razbije, belilo iz nje pa uniči bakterije. Tehnologija, potrebna za analizo bioluminiscence na terenu, ekipi v okviru tekmovanja iGEM žal ni bila dostopna. Rešitev sicer vidijo v majhni na svetlobo občutljivi celici in mikrofluidnem vezju, ki bi bakterijske celice posamič vodilo mimo nje. Podobno je težje uresničljiva zamisel o daljinskem vodenju drona, ki bi omogočalo avtomatsko kartiranje in učinkovito načrtovanje leta.

=== Epruveta za bakterije ===
Predel v dronu, ki vsebuje bakterije, ne sme dopuščati možnosti njihovega širjenja v okolje, hkrati pa mora bakterijam dovesti zrak, ki ga želimo analizirati. Pariški študentje so v ta namen zasnovali in s 3D-tiskalnikom izdelali epruveto, ki deluje po principu zračne ključavnice. Zamašek namreč vsebuje votel predel med bakterijami in zunanjostjo, preko katerega se brez neposrednega stika med vsebino epruvete in okoljem bakterijam dovaja zunanji zrak. Pred začetkom vzorčenja zraka je zamašek nekoliko dvignjen, s čimer je bakterijam preprečen dostop do kamrice v njem, a ne dovolj, da bi v ta vmesni predel vstopil zunanji zrak. Nato ustrezne komponente drona zamašek še bolj dvignejo, kar omogoči vdor zraka, katerega onesnaženost nas zanima, v kamrico zamaška. Dno kamrice preprečuje, da bi bile bakterije v notranjosti epruvete že v trenutku vzorčenja izpostavljene zunanjemu zraku. Sledi popolno zaprtje epruvete, pri čemer se zajeti zrak pomeša z bakterijsko kulturo v notranjosti epruvete. Biosenzor v primeru prisotnosti hlapnih organskih spojin v vzorcu zraka začne oddajati bioluminiscenčen signal, katerega intenziteto po določenem času izmerimo.

== Zaključek ==
Ob zaključku projekta študentje predlagajo nekaj izboljšav, ki bi lahko doprinesle h kvaliteti njihovega prototipa. Standardno krivuljo nameravajo izboljšati z meritvami nižjih koncentracij toluena ter določiti najnižjo koncentracijo, ki jo Quantifly natančno zazna. Izvesti nameravajo še eksperimente z ostalimi toluenu podobnimi molekulami kot je npr. ksilen. Iz praktičnih razlogov so v laboratoriju bioluminiscenčne teste izvajali s tekočim toluenom, v prihodnje pa želijo vzpostaviti izolirano hermetično zaprto sobo s hlapi toluena, v kateri bi lahko opravili vzorčenje zraka. Veliko težavo, katere rešitve študentje zaenkrat ne komentirajo, pa predstavljajo variacije v bioluminiscenčnem testu, ki so posledica razlik v metabolizmu živih organizmov.
Kljub nekaterim pomanjkljivostim projekta je bila ekipa v sklopu tekmovanja iGEM 2016 za svoje delo nominirana za najboljši okoljski projekt, najboljšo predstavitev projekta in najbolj uporaben projekt.

== Vir ==
[http://2016.igem.org/Team:Ionis_Paris Wiki stran ekipe Ionis Paris 2016]

[[Seminarji SB 2016/17]]

Quantifly

2016-11-29T09:50:51Z

Ema Guštin: /* Uvod */

[http://2016.igem.org/Team:Ionis_Paris Ionis Paris - Quantifly]

== Uvod ==
V zadnjih letih se ljudje čedalje bolj zavedamo problematike onesnaženosti okolja na različnih nivojih. V zraku so na primer prisotni številni plini in trdni delci s škodljivim vplivom na zdravje ljudi in na okolje, ki nastajajo pri nekaterih naravnih pojavih kot so vulkanski izbruhi, požari in razgradnja organskih snovi, ter predvsem kot posledica človeške dejavnosti (npr. industrija, promet, kmetijstvo in ogrevanje). Hlapne organske spojine (''ang.'' volatile organic compounds, VOS), med katere spadajo nekateri ciklični aromatski ogljikovodiki in aldehidi, sicer predstavljajo le 2 % snovi, ki prispevajo k onesnaženosti zraka, njihov škodljiv vpliv na zdravje ljudi in na okolje pa je zelo velik. Za spremljanje onesnaženosti zraka je na voljo veliko različnih fizikalnih in kemijskih metod, vendar pa zaradi zelo velike raznolikosti onesnaževalnih snovi v zraku njihova detekcija in kvantifikacija še vedno predstavljata izziv. Skupina študentov iz Pariza je v svojem projektu, s katerim je sodelovala na sinteznobiološkem tekmovanju iGEM 2016, izdelala mobilno biološko napravo za zaznavanje in kvantifikacijo nekaterih organskih onesnaževalcev zraka, ki so jo poimenovali Quantifly.

== Biosenzor ==
Biosenzorji so celostne in samostojne merilne naprave oz. sistemi, ki vsebujejo biološko komponento, sposobno prepoznavanja in kvantifikacije specifičnih dražljajev. Lahko gre za makromolekulo, organel, celico ali tkivo. Ključna elementa biosenzorja sta detektor, ki prepozna vhodni dražljaj in reporter, ki sproži izhodni signal.

===Načrtovanje biosenzorja===
Mladi francoski sintezni biologi so izdelali celični, natančneje bakterijski biosenzor. Kot ogrodje za samostojno sestavljen genetski material so uporabili nepatogeni laboratorijski sev bakterijske vrste ''Escherichia coli'', DH5α. S ciljem ustvariti organizem, ki bo zaznal specifičen onesnaževalec zraka in se nanj odzval z oddajanjem bioluminiscenčnega signala, so izdelali genski konstrukt, zgrajen iz konstitutivnega promotorja Pr, gena XylR, inducibilnega promotorja Pu, gena GLuc in plazmidnega ogrodja pSB1C3.

Konstitutivni promotor Pr uravnava izražanje gena za protein XylR, ki izvira iz bakterijske vrste ''Pseudomonas putida''. Ta detektorski protein je sposoben vezave aromatskih ogljikovodikov z metilno skupino (npr. toluen in ksilen). Ko veže tako molekulo, se konformacijsko spremeni, dimerizira in se veže na DNA, ob dimerizaciji dveh dimerov pa kot transkripcijski regulator deluje na promotor Pu. Aktivacija promotorja Pu omogoči transkripcijo gena GLuc, ki kodira za reporterski bioluminiscenčni protein luciferazo iz ceponožca ''Gaussia princeps''. Ta encim katalizira oksidacijo organske spojine koelenterazin, za katerega je visoko specifičen. Pri rekaciji se sprošča modra svetloba z emisijskim maksimumom pri 488 nm.

=== Optimizacija plazmida ===
Da bi dosegli čim boljše delovanje zgoraj opisanega genskega konstrukta, so člani pariške sinteznobiološke ekipe uporabili pred kratkim ustvarjeno prosto dostopno programsko opremo [http://cellocad.org/index.html CelloCAD]. Deluje tako, da genski konstrukt, ki ga vnesemo v program, s pomočjo zmogljivih bioinformatskih orodij preoblikuje v najboljši možen plazmid za izbrano kombinacijo genetskih elementov. Študentje so želeli primerjati delovanje samostojno zasnovanega plazmida s plazmidom, ki ga oblikuje program (npr. območje detekcije in odzivnost). Pri tem so naleteli na oviro, saj je za delovanje programske opreme potrebno vnesti relativne enote promotorjev (''ang.'' relative promoter units, RPU). Na voljo namreč (še) ni nobene podatkovne baze RPU za to razmeroma novo metodo. Tako so nadobudni študentje z upanjem, da bo njihovo delo predstavljalo začetek množičnega zbiranja podatkov o RPU, določili RPU za promotorja Pr in Pu. V ta namen so oblikovali serijo biokock, pri čemer so izbrana promotorja povezali z zapisom za zeleni fluorescirajoči protein (''ang.'' green fluorescent protein, GFP). RPU so neposredno povezane z izražanjem GFP v posamezni celici, kar so kvantificirali s pretočnim citometrom.

=== Karakterizacija biosenzorja ===
Člani ekipe so za neposredno potrditev izražanja gena za XylR, uravnavanega z inducibilnim promotorjem Pu, želeli narediti fuzijo transkripcijskega faktorja XylR z rdečim fluorescenčnim proteinom (''ang.'' red fluorescent protein, RFP), vendar pa bi bil tak konstrukt prevelik. Zato so uporabili biokocko, sestavljeno iz promotorja Pr, prvega vezavnega mesta za ribosom (''ang.'' ribosome-binding site, RBS), gena za XylR, drugega RBS, gena za mRFP in terminatorja, ter z dokazom o izražanju RFP posredno potrdili tudi izražanje XylR.

Za karakterizacijo biosenzorja je skupina uporabila toluen, hlapen cikličen aromatski ogljikovodik. Bioluminiscenčne teste so izvedli z različnimi koncentracijami toluena (10 ng/l do 10 mg/l) in ob različnih časih po izpostavitvi celic toluenu (1 h do 5,5 h), intenziteto bioluminiscence pa so merili z [https://www.berthold.com/en/bio/monochromator_multilabel_microplate_reader_Mithras2_LB943 monokromatskim čitalcem]. Pokazali so, da niti toluen niti uporabljen sev ''E. coli'' sama po sebi nista bioluminiscenčna. Nato so ugotovili, da uporabljen promotor Pu, ki naj bi bil inducibilen, pušča (tj. do neke mere omogoča izražanje gena, ki ga regulira, tudi ob odsotnosti aktivacijskega signala), vendar pa je bioluminiscenca celic v prisotnosti toluena občutno višja kot ob njegovi odsotnosti, kar za delovanje biosenzorja zadostuje.
Kot časovno točko, v kateri naj bi bilo najbolj smiselno izvesti meritev, so izbrali 5 h 30 min po dodatku toluena. Ker je intenziteta bioluminiscence časovno odvisna, mora biti test vedno izveden ob enakem, natančno odmerjenem času po vzorčenju. Najpomembnejši zaključek karakterizacije je, da je izdelan biosenzor sposoben zanesljive zaznave koncentracij toluena, ki so prisotne v onesnaženem zraku (okoli 10 ng/l), ni pa sposoben zelo natančne kvantifikacije, najverjetneje zaradi variacij v metabolizmu živih organizmov.

== Strojna oprema ==
=== Dron ===
Cilj projekta je bil ustvariti letečo napravo za spremljanje onesnaženosti zraka s hlapnimi organskimi molekulami. V ta namen je ekipa zasnovala in z uporabo 3D-tiskalnika tudi ustvarila dron, ki je sposoben vzorčenja zraka, hkrati pa lahko bakterije prenaša brez tveganja za širjenje teh gensko spremenjenih organizmov v okolje. To zagotavlja majhna steklenička belila, pritrjena pod dron, ki se v primeru nesreče razbije, belilo iz nje pa uniči bakterije. Tehnologija, potrebna za analizo bioluminiscence na terenu, ekipi v okviru tekmovanja iGEM žal ni bila dostopna. Rešitev sicer vidijo v majhni na svetlobo občutljivi celici in mikrofluidnem vezju, ki bi bakterijske celice posamič vodilo mimo nje. Podobno je težje uresničljiva zamisel o daljinskem vodenju drona, ki bi omogočalo avtomatsko kartiranje in učinkovito načrtovanje leta.

=== Epruveta za bakterije ===
Predel v dronu, ki vsebuje bakterije, ne sme dopuščati možnosti njihovega širjenja v okolje, hkrati pa mora bakterijam dovesti zrak, ki ga želimo analizirati. Pariški študentje so v ta namen zasnovali in s 3D-tiskalnikom izdelali epruveto, ki deluje po principu zračne ključavnice. Zamašek namreč vsebuje votel predel med bakterijami in zunanjostjo, preko katerega se brez neposrednega stika med vsebino epruvete in okoljem bakterijam dovaja zunanji zrak. Pred začetkom vzorčenja zraka je zamašek nekoliko dvignjen, s čimer je bakterijam preprečen dostop do kamrice v njem, a ne dovolj, da bi v ta vmesni predel vstopil zunanji zrak. Nato ustrezne komponente drona zamašek še bolj dvignejo, kar omogoči vdor zraka, katerega onesnaženost nas zanima, v kamrico zamaška. Dno kamrice preprečuje, da bi bile bakterije v notranjosti epruvete že v trenutku vzorčenja izpostavljene zunanjemu zraku. Sledi popolno zaprtje epruvete, pri čemer se zajeti zrak pomeša z bakterijsko kulturo v notranjosti epruvete. Biosenzor v primeru prisotnosti hlapnih organskih spojin v vzorcu zraka začne oddajati bioluminiscenčen signal, katerega intenziteto po določenem času izmerimo.

== Zaključek ==
Ob zaključku projekta študentje predlagajo nekaj izboljšav, ki bi lahko doprinesle h kvaliteti njihovega prototipa. Standardno krivuljo nameravajo izboljšati z meritvami nižjih koncentracij toluena ter določiti najnižjo koncentracijo, ki jo Quantifly natančno zazna. Izvesti nameravajo še eksperimente z ostalimi toluenu podobnimi molekulami kot je npr. ksilen. Iz praktičnih razlogov so v laboratoriju bioluminiscenčne teste izvajali s tekočim toluenom, v prihodnje pa želijo vzpostaviti izolirano hermetično zaprto sobo s hlapi toluena, v kateri bi lahko opravili vzorčenje zraka. Veliko težavo, katere rešitve študentje zaenkrat ne komentirajo, pa predstavljajo variacije v bioluminiscenčnem testu, ki so posledica razlik v metabolizmu živih organizmov.
Kljub nekaterim pomanjkljivostim projekta je bila ekipa v sklopu tekmovanja iGEM 2016 za svoje delo nominirana za najboljši okoljski projekt, najboljšo predstavitev projekta in najbolj uporaben projekt.

== Vir ==
[http://2016.igem.org/Team:Ionis_Paris Wiki stran ekipe Ionis Paris 2016]

[[Seminarji SB 2016/17]]

Quantifly

2016-11-29T09:50:23Z

Ema Guštin: /* Uvod */

[http://2016.igem.org/Team:Ionis_Paris Ionis Paris - Quantifly]

== Uvod ==
V zadnjih letih se ljudje čedalje bolj zavedamo problematike onesnaženosti okolja na različnih nivojih. V zraku so na primer prisotni številni plini in trdni delci s škodljivim vplivom na zdravje ljudi in na okolje, ki nastajajo pri nekaterih naravnih pojavih kot so vulkanski izbruhi, požari in razgradnja organskih snovi, ter predvsem kot posledica človeške dejavnosti (npr. industrija, promet, kmetijstvo in ogrevanje). Hlapne organske spojine (''ang.'' volatile organic compounds, VOS), med katere spadajo nekateri ciklični aromatski ogljikovodiki in aldehidi, sicer predstavljajo le 2 % snovi, ki prispevajo k onesnaženosti zraka, njihov škodljiv vpliv na zdravje ljudi in na okolje pa je zelo velik. Za spremljanje onesnaženosti zraka je na voljo veliko različnih fizikalnih in kemijskih metod, vendar pa zaradi zelo velike raznolikosti onesnaževalnih snovi v zraku njihova detekcija in kvantifikacija še vedno predstavljata izziv. Skupina študentov iz Pariza je v svojem projektu, s katerim je sodelovala na sinteznobiološkem tekmovanju iGEM 2016, izdelala mobilno biološko napravo za zaznavanje in natančno kvantifikacijo nekaterih organskih onesnaževalcev zraka, ki so jo poimenovali Quantifly.

== Biosenzor ==
Biosenzorji so celostne in samostojne merilne naprave oz. sistemi, ki vsebujejo biološko komponento, sposobno prepoznavanja in kvantifikacije specifičnih dražljajev. Lahko gre za makromolekulo, organel, celico ali tkivo. Ključna elementa biosenzorja sta detektor, ki prepozna vhodni dražljaj in reporter, ki sproži izhodni signal.

===Načrtovanje biosenzorja===
Mladi francoski sintezni biologi so izdelali celični, natančneje bakterijski biosenzor. Kot ogrodje za samostojno sestavljen genetski material so uporabili nepatogeni laboratorijski sev bakterijske vrste ''Escherichia coli'', DH5α. S ciljem ustvariti organizem, ki bo zaznal specifičen onesnaževalec zraka in se nanj odzval z oddajanjem bioluminiscenčnega signala, so izdelali genski konstrukt, zgrajen iz konstitutivnega promotorja Pr, gena XylR, inducibilnega promotorja Pu, gena GLuc in plazmidnega ogrodja pSB1C3.

Konstitutivni promotor Pr uravnava izražanje gena za protein XylR, ki izvira iz bakterijske vrste ''Pseudomonas putida''. Ta detektorski protein je sposoben vezave aromatskih ogljikovodikov z metilno skupino (npr. toluen in ksilen). Ko veže tako molekulo, se konformacijsko spremeni, dimerizira in se veže na DNA, ob dimerizaciji dveh dimerov pa kot transkripcijski regulator deluje na promotor Pu. Aktivacija promotorja Pu omogoči transkripcijo gena GLuc, ki kodira za reporterski bioluminiscenčni protein luciferazo iz ceponožca ''Gaussia princeps''. Ta encim katalizira oksidacijo organske spojine koelenterazin, za katerega je visoko specifičen. Pri rekaciji se sprošča modra svetloba z emisijskim maksimumom pri 488 nm.

=== Optimizacija plazmida ===
Da bi dosegli čim boljše delovanje zgoraj opisanega genskega konstrukta, so člani pariške sinteznobiološke ekipe uporabili pred kratkim ustvarjeno prosto dostopno programsko opremo [http://cellocad.org/index.html CelloCAD]. Deluje tako, da genski konstrukt, ki ga vnesemo v program, s pomočjo zmogljivih bioinformatskih orodij preoblikuje v najboljši možen plazmid za izbrano kombinacijo genetskih elementov. Študentje so želeli primerjati delovanje samostojno zasnovanega plazmida s plazmidom, ki ga oblikuje program (npr. območje detekcije in odzivnost). Pri tem so naleteli na oviro, saj je za delovanje programske opreme potrebno vnesti relativne enote promotorjev (''ang.'' relative promoter units, RPU). Na voljo namreč (še) ni nobene podatkovne baze RPU za to razmeroma novo metodo. Tako so nadobudni študentje z upanjem, da bo njihovo delo predstavljalo začetek množičnega zbiranja podatkov o RPU, določili RPU za promotorja Pr in Pu. V ta namen so oblikovali serijo biokock, pri čemer so izbrana promotorja povezali z zapisom za zeleni fluorescirajoči protein (''ang.'' green fluorescent protein, GFP). RPU so neposredno povezane z izražanjem GFP v posamezni celici, kar so kvantificirali s pretočnim citometrom.

=== Karakterizacija biosenzorja ===
Člani ekipe so za neposredno potrditev izražanja gena za XylR, uravnavanega z inducibilnim promotorjem Pu, želeli narediti fuzijo transkripcijskega faktorja XylR z rdečim fluorescenčnim proteinom (''ang.'' red fluorescent protein, RFP), vendar pa bi bil tak konstrukt prevelik. Zato so uporabili biokocko, sestavljeno iz promotorja Pr, prvega vezavnega mesta za ribosom (''ang.'' ribosome-binding site, RBS), gena za XylR, drugega RBS, gena za mRFP in terminatorja, ter z dokazom o izražanju RFP posredno potrdili tudi izražanje XylR.

Za karakterizacijo biosenzorja je skupina uporabila toluen, hlapen cikličen aromatski ogljikovodik. Bioluminiscenčne teste so izvedli z različnimi koncentracijami toluena (10 ng/l do 10 mg/l) in ob različnih časih po izpostavitvi celic toluenu (1 h do 5,5 h), intenziteto bioluminiscence pa so merili z [https://www.berthold.com/en/bio/monochromator_multilabel_microplate_reader_Mithras2_LB943 monokromatskim čitalcem]. Pokazali so, da niti toluen niti uporabljen sev ''E. coli'' sama po sebi nista bioluminiscenčna. Nato so ugotovili, da uporabljen promotor Pu, ki naj bi bil inducibilen, pušča (tj. do neke mere omogoča izražanje gena, ki ga regulira, tudi ob odsotnosti aktivacijskega signala), vendar pa je bioluminiscenca celic v prisotnosti toluena občutno višja kot ob njegovi odsotnosti, kar za delovanje biosenzorja zadostuje.
Kot časovno točko, v kateri naj bi bilo najbolj smiselno izvesti meritev, so izbrali 5 h 30 min po dodatku toluena. Ker je intenziteta bioluminiscence časovno odvisna, mora biti test vedno izveden ob enakem, natančno odmerjenem času po vzorčenju. Najpomembnejši zaključek karakterizacije je, da je izdelan biosenzor sposoben zanesljive zaznave koncentracij toluena, ki so prisotne v onesnaženem zraku (okoli 10 ng/l), ni pa sposoben zelo natančne kvantifikacije, najverjetneje zaradi variacij v metabolizmu živih organizmov.

== Strojna oprema ==
=== Dron ===
Cilj projekta je bil ustvariti letečo napravo za spremljanje onesnaženosti zraka s hlapnimi organskimi molekulami. V ta namen je ekipa zasnovala in z uporabo 3D-tiskalnika tudi ustvarila dron, ki je sposoben vzorčenja zraka, hkrati pa lahko bakterije prenaša brez tveganja za širjenje teh gensko spremenjenih organizmov v okolje. To zagotavlja majhna steklenička belila, pritrjena pod dron, ki se v primeru nesreče razbije, belilo iz nje pa uniči bakterije. Tehnologija, potrebna za analizo bioluminiscence na terenu, ekipi v okviru tekmovanja iGEM žal ni bila dostopna. Rešitev sicer vidijo v majhni na svetlobo občutljivi celici in mikrofluidnem vezju, ki bi bakterijske celice posamič vodilo mimo nje. Podobno je težje uresničljiva zamisel o daljinskem vodenju drona, ki bi omogočalo avtomatsko kartiranje in učinkovito načrtovanje leta.

=== Epruveta za bakterije ===
Predel v dronu, ki vsebuje bakterije, ne sme dopuščati možnosti njihovega širjenja v okolje, hkrati pa mora bakterijam dovesti zrak, ki ga želimo analizirati. Pariški študentje so v ta namen zasnovali in s 3D-tiskalnikom izdelali epruveto, ki deluje po principu zračne ključavnice. Zamašek namreč vsebuje votel predel med bakterijami in zunanjostjo, preko katerega se brez neposrednega stika med vsebino epruvete in okoljem bakterijam dovaja zunanji zrak. Pred začetkom vzorčenja zraka je zamašek nekoliko dvignjen, s čimer je bakterijam preprečen dostop do kamrice v njem, a ne dovolj, da bi v ta vmesni predel vstopil zunanji zrak. Nato ustrezne komponente drona zamašek še bolj dvignejo, kar omogoči vdor zraka, katerega onesnaženost nas zanima, v kamrico zamaška. Dno kamrice preprečuje, da bi bile bakterije v notranjosti epruvete že v trenutku vzorčenja izpostavljene zunanjemu zraku. Sledi popolno zaprtje epruvete, pri čemer se zajeti zrak pomeša z bakterijsko kulturo v notranjosti epruvete. Biosenzor v primeru prisotnosti hlapnih organskih spojin v vzorcu zraka začne oddajati bioluminiscenčen signal, katerega intenziteto po določenem času izmerimo.

== Zaključek ==
Ob zaključku projekta študentje predlagajo nekaj izboljšav, ki bi lahko doprinesle h kvaliteti njihovega prototipa. Standardno krivuljo nameravajo izboljšati z meritvami nižjih koncentracij toluena ter določiti najnižjo koncentracijo, ki jo Quantifly natančno zazna. Izvesti nameravajo še eksperimente z ostalimi toluenu podobnimi molekulami kot je npr. ksilen. Iz praktičnih razlogov so v laboratoriju bioluminiscenčne teste izvajali s tekočim toluenom, v prihodnje pa želijo vzpostaviti izolirano hermetično zaprto sobo s hlapi toluena, v kateri bi lahko opravili vzorčenje zraka. Veliko težavo, katere rešitve študentje zaenkrat ne komentirajo, pa predstavljajo variacije v bioluminiscenčnem testu, ki so posledica razlik v metabolizmu živih organizmov.
Kljub nekaterim pomanjkljivostim projekta je bila ekipa v sklopu tekmovanja iGEM 2016 za svoje delo nominirana za najboljši okoljski projekt, najboljšo predstavitev projekta in najbolj uporaben projekt.

== Vir ==
[http://2016.igem.org/Team:Ionis_Paris Wiki stran ekipe Ionis Paris 2016]

[[Seminarji SB 2016/17]]

Quantifly

2016-11-29T09:27:41Z

Ema Guštin: /* Zaključek */

[http://2016.igem.org/Team:Ionis_Paris Ionis Paris - Quantifly]

== Uvod ==
V zadnjih letih se ljudje čedalje bolj zavedamo problematike onesnaženosti okolja na različnih nivojih. V zraku so na primer prisotni številni plini in trdni delci s škodljivim vplivom na zdravje ljudi in na okolje, ki nastajajo pri nekaterih naravnih pojavih kot so vulkanski izbruhi, požari in razgradnja organskih snovi, ter predvsem kot posledica človeške dejavnosti (npr. industrija, promet, kmetijstvo in ogrevanje). Hlapne organske spojine (''ang.'' volatile organic compounds, VOS), med katere spadajo nekateri ciklični aromatski ogljikovodiki in aldehidi, sicer predstavljajo le 2 % snovi, ki prispevajo k onesnaženosti zraka, njihov škodljiv vpliv na zdravje ljudi in na okolje pa je zelo velik. Za spremljanje onesnaženosti zraka je na voljo veliko različnih fizikalnih in kemijskih metod, vendar pa zaradi zelo velike raznolikosti onesnaževalnih snovi v zraku njihova detekcija in kvantifikacija še vedno predstavljata izziv. Skupina študentov iz Pariza pa je v svojem projektu, s katerim je sodelovala na sinteznobiološkem tekmovanju iGEM 2016, izdelala mobilno biološko napravo za zaznavanje in natančno kvantifikacijo nekaterih organskih onesnaževalcev zraka, ki so jo poimenovali Quantifly.

== Biosenzor ==
Biosenzorji so celostne in samostojne merilne naprave oz. sistemi, ki vsebujejo biološko komponento, sposobno prepoznavanja in kvantifikacije specifičnih dražljajev. Lahko gre za makromolekulo, organel, celico ali tkivo. Ključna elementa biosenzorja sta detektor, ki prepozna vhodni dražljaj in reporter, ki sproži izhodni signal.

===Načrtovanje biosenzorja===
Mladi francoski sintezni biologi so izdelali celični, natančneje bakterijski biosenzor. Kot ogrodje za samostojno sestavljen genetski material so uporabili nepatogeni laboratorijski sev bakterijske vrste ''Escherichia coli'', DH5α. S ciljem ustvariti organizem, ki bo zaznal specifičen onesnaževalec zraka in se nanj odzval z oddajanjem bioluminiscenčnega signala, so izdelali genski konstrukt, zgrajen iz konstitutivnega promotorja Pr, gena XylR, inducibilnega promotorja Pu, gena GLuc in plazmidnega ogrodja pSB1C3.

Konstitutivni promotor Pr uravnava izražanje gena za protein XylR, ki izvira iz bakterijske vrste ''Pseudomonas putida''. Ta detektorski protein je sposoben vezave aromatskih ogljikovodikov z metilno skupino (npr. toluen in ksilen). Ko veže tako molekulo, se konformacijsko spremeni, dimerizira in se veže na DNA, ob dimerizaciji dveh dimerov pa kot transkripcijski regulator deluje na promotor Pu. Aktivacija promotorja Pu omogoči transkripcijo gena GLuc, ki kodira za reporterski bioluminiscenčni protein luciferazo iz ceponožca ''Gaussia princeps''. Ta encim katalizira oksidacijo organske spojine koelenterazin, za katerega je visoko specifičen. Pri rekaciji se sprošča modra svetloba z emisijskim maksimumom pri 488 nm.

=== Optimizacija plazmida ===
Da bi dosegli čim boljše delovanje zgoraj opisanega genskega konstrukta, so člani pariške sinteznobiološke ekipe uporabili pred kratkim ustvarjeno prosto dostopno programsko opremo [http://cellocad.org/index.html CelloCAD]. Deluje tako, da genski konstrukt, ki ga vnesemo v program, s pomočjo zmogljivih bioinformatskih orodij preoblikuje v najboljši možen plazmid za izbrano kombinacijo genetskih elementov. Študentje so želeli primerjati delovanje samostojno zasnovanega plazmida s plazmidom, ki ga oblikuje program (npr. območje detekcije in odzivnost). Pri tem so naleteli na oviro, saj je za delovanje programske opreme potrebno vnesti relativne enote promotorjev (''ang.'' relative promoter units, RPU). Na voljo namreč (še) ni nobene podatkovne baze RPU za to razmeroma novo metodo. Tako so nadobudni študentje z upanjem, da bo njihovo delo predstavljalo začetek množičnega zbiranja podatkov o RPU, določili RPU za promotorja Pr in Pu. V ta namen so oblikovali serijo biokock, pri čemer so izbrana promotorja povezali z zapisom za zeleni fluorescirajoči protein (''ang.'' green fluorescent protein, GFP). RPU so neposredno povezane z izražanjem GFP v posamezni celici, kar so kvantificirali s pretočnim citometrom.

=== Karakterizacija biosenzorja ===
Člani ekipe so za neposredno potrditev izražanja gena za XylR, uravnavanega z inducibilnim promotorjem Pu, želeli narediti fuzijo transkripcijskega faktorja XylR z rdečim fluorescenčnim proteinom (''ang.'' red fluorescent protein, RFP), vendar pa bi bil tak konstrukt prevelik. Zato so uporabili biokocko, sestavljeno iz promotorja Pr, prvega vezavnega mesta za ribosom (''ang.'' ribosome-binding site, RBS), gena za XylR, drugega RBS, gena za mRFP in terminatorja, ter z dokazom o izražanju RFP posredno potrdili tudi izražanje XylR.

Za karakterizacijo biosenzorja je skupina uporabila toluen, hlapen cikličen aromatski ogljikovodik. Bioluminiscenčne teste so izvedli z različnimi koncentracijami toluena (10 ng/l do 10 mg/l) in ob različnih časih po izpostavitvi celic toluenu (1 h do 5,5 h), intenziteto bioluminiscence pa so merili z [https://www.berthold.com/en/bio/monochromator_multilabel_microplate_reader_Mithras2_LB943 monokromatskim čitalcem]. Pokazali so, da niti toluen niti uporabljen sev ''E. coli'' sama po sebi nista bioluminiscenčna. Nato so ugotovili, da uporabljen promotor Pu, ki naj bi bil inducibilen, pušča (tj. do neke mere omogoča izražanje gena, ki ga regulira, tudi ob odsotnosti aktivacijskega signala), vendar pa je bioluminiscenca celic v prisotnosti toluena občutno višja kot ob njegovi odsotnosti, kar za delovanje biosenzorja zadostuje.
Kot časovno točko, v kateri naj bi bilo najbolj smiselno izvesti meritev, so izbrali 5 h 30 min po dodatku toluena. Ker je intenziteta bioluminiscence časovno odvisna, mora biti test vedno izveden ob enakem, natančno odmerjenem času po vzorčenju. Najpomembnejši zaključek karakterizacije je, da je izdelan biosenzor sposoben zanesljive zaznave koncentracij toluena, ki so prisotne v onesnaženem zraku (okoli 10 ng/l), ni pa sposoben zelo natančne kvantifikacije, najverjetneje zaradi variacij v metabolizmu živih organizmov.

== Strojna oprema ==
=== Dron ===
Cilj projekta je bil ustvariti letečo napravo za spremljanje onesnaženosti zraka s hlapnimi organskimi molekulami. V ta namen je ekipa zasnovala in z uporabo 3D-tiskalnika tudi ustvarila dron, ki je sposoben vzorčenja zraka, hkrati pa lahko bakterije prenaša brez tveganja za širjenje teh gensko spremenjenih organizmov v okolje. To zagotavlja majhna steklenička belila, pritrjena pod dron, ki se v primeru nesreče razbije, belilo iz nje pa uniči bakterije. Tehnologija, potrebna za analizo bioluminiscence na terenu, ekipi v okviru tekmovanja iGEM žal ni bila dostopna. Rešitev sicer vidijo v majhni na svetlobo občutljivi celici in mikrofluidnem vezju, ki bi bakterijske celice posamič vodilo mimo nje. Podobno je težje uresničljiva zamisel o daljinskem vodenju drona, ki bi omogočalo avtomatsko kartiranje in učinkovito načrtovanje leta.

=== Epruveta za bakterije ===
Predel v dronu, ki vsebuje bakterije, ne sme dopuščati možnosti njihovega širjenja v okolje, hkrati pa mora bakterijam dovesti zrak, ki ga želimo analizirati. Pariški študentje so v ta namen zasnovali in s 3D-tiskalnikom izdelali epruveto, ki deluje po principu zračne ključavnice. Zamašek namreč vsebuje votel predel med bakterijami in zunanjostjo, preko katerega se brez neposrednega stika med vsebino epruvete in okoljem bakterijam dovaja zunanji zrak. Pred začetkom vzorčenja zraka je zamašek nekoliko dvignjen, s čimer je bakterijam preprečen dostop do kamrice v njem, a ne dovolj, da bi v ta vmesni predel vstopil zunanji zrak. Nato ustrezne komponente drona zamašek še bolj dvignejo, kar omogoči vdor zraka, katerega onesnaženost nas zanima, v kamrico zamaška. Dno kamrice preprečuje, da bi bile bakterije v notranjosti epruvete že v trenutku vzorčenja izpostavljene zunanjemu zraku. Sledi popolno zaprtje epruvete, pri čemer se zajeti zrak pomeša z bakterijsko kulturo v notranjosti epruvete. Biosenzor v primeru prisotnosti hlapnih organskih spojin v vzorcu zraka začne oddajati bioluminiscenčen signal, katerega intenziteto po določenem času izmerimo.

== Zaključek ==
Ob zaključku projekta študentje predlagajo nekaj izboljšav, ki bi lahko doprinesle h kvaliteti njihovega prototipa. Standardno krivuljo nameravajo izboljšati z meritvami nižjih koncentracij toluena ter določiti najnižjo koncentracijo, ki jo Quantifly natančno zazna. Izvesti nameravajo še eksperimente z ostalimi toluenu podobnimi molekulami kot je npr. ksilen. Iz praktičnih razlogov so v laboratoriju bioluminiscenčne teste izvajali s tekočim toluenom, v prihodnje pa želijo vzpostaviti izolirano hermetično zaprto sobo s hlapi toluena, v kateri bi lahko opravili vzorčenje zraka. Veliko težavo, katere rešitve študentje zaenkrat ne komentirajo, pa predstavljajo variacije v bioluminiscenčnem testu, ki so posledica razlik v metabolizmu živih organizmov.
Kljub nekaterim pomanjkljivostim projekta je bila ekipa v sklopu tekmovanja iGEM 2016 za svoje delo nominirana za najboljši okoljski projekt, najboljšo predstavitev projekta in najbolj uporaben projekt.

== Vir ==
[http://2016.igem.org/Team:Ionis_Paris Wiki stran ekipe Ionis Paris 2016]

[[Seminarji SB 2016/17]]

Quantifly

2016-11-29T09:27:23Z

Ema Guštin: /* Zaključek */

[http://2016.igem.org/Team:Ionis_Paris Ionis Paris - Quantifly]

== Uvod ==
V zadnjih letih se ljudje čedalje bolj zavedamo problematike onesnaženosti okolja na različnih nivojih. V zraku so na primer prisotni številni plini in trdni delci s škodljivim vplivom na zdravje ljudi in na okolje, ki nastajajo pri nekaterih naravnih pojavih kot so vulkanski izbruhi, požari in razgradnja organskih snovi, ter predvsem kot posledica človeške dejavnosti (npr. industrija, promet, kmetijstvo in ogrevanje). Hlapne organske spojine (''ang.'' volatile organic compounds, VOS), med katere spadajo nekateri ciklični aromatski ogljikovodiki in aldehidi, sicer predstavljajo le 2 % snovi, ki prispevajo k onesnaženosti zraka, njihov škodljiv vpliv na zdravje ljudi in na okolje pa je zelo velik. Za spremljanje onesnaženosti zraka je na voljo veliko različnih fizikalnih in kemijskih metod, vendar pa zaradi zelo velike raznolikosti onesnaževalnih snovi v zraku njihova detekcija in kvantifikacija še vedno predstavljata izziv. Skupina študentov iz Pariza pa je v svojem projektu, s katerim je sodelovala na sinteznobiološkem tekmovanju iGEM 2016, izdelala mobilno biološko napravo za zaznavanje in natančno kvantifikacijo nekaterih organskih onesnaževalcev zraka, ki so jo poimenovali Quantifly.

== Biosenzor ==
Biosenzorji so celostne in samostojne merilne naprave oz. sistemi, ki vsebujejo biološko komponento, sposobno prepoznavanja in kvantifikacije specifičnih dražljajev. Lahko gre za makromolekulo, organel, celico ali tkivo. Ključna elementa biosenzorja sta detektor, ki prepozna vhodni dražljaj in reporter, ki sproži izhodni signal.

===Načrtovanje biosenzorja===
Mladi francoski sintezni biologi so izdelali celični, natančneje bakterijski biosenzor. Kot ogrodje za samostojno sestavljen genetski material so uporabili nepatogeni laboratorijski sev bakterijske vrste ''Escherichia coli'', DH5α. S ciljem ustvariti organizem, ki bo zaznal specifičen onesnaževalec zraka in se nanj odzval z oddajanjem bioluminiscenčnega signala, so izdelali genski konstrukt, zgrajen iz konstitutivnega promotorja Pr, gena XylR, inducibilnega promotorja Pu, gena GLuc in plazmidnega ogrodja pSB1C3.

Konstitutivni promotor Pr uravnava izražanje gena za protein XylR, ki izvira iz bakterijske vrste ''Pseudomonas putida''. Ta detektorski protein je sposoben vezave aromatskih ogljikovodikov z metilno skupino (npr. toluen in ksilen). Ko veže tako molekulo, se konformacijsko spremeni, dimerizira in se veže na DNA, ob dimerizaciji dveh dimerov pa kot transkripcijski regulator deluje na promotor Pu. Aktivacija promotorja Pu omogoči transkripcijo gena GLuc, ki kodira za reporterski bioluminiscenčni protein luciferazo iz ceponožca ''Gaussia princeps''. Ta encim katalizira oksidacijo organske spojine koelenterazin, za katerega je visoko specifičen. Pri rekaciji se sprošča modra svetloba z emisijskim maksimumom pri 488 nm.

=== Optimizacija plazmida ===
Da bi dosegli čim boljše delovanje zgoraj opisanega genskega konstrukta, so člani pariške sinteznobiološke ekipe uporabili pred kratkim ustvarjeno prosto dostopno programsko opremo [http://cellocad.org/index.html CelloCAD]. Deluje tako, da genski konstrukt, ki ga vnesemo v program, s pomočjo zmogljivih bioinformatskih orodij preoblikuje v najboljši možen plazmid za izbrano kombinacijo genetskih elementov. Študentje so želeli primerjati delovanje samostojno zasnovanega plazmida s plazmidom, ki ga oblikuje program (npr. območje detekcije in odzivnost). Pri tem so naleteli na oviro, saj je za delovanje programske opreme potrebno vnesti relativne enote promotorjev (''ang.'' relative promoter units, RPU). Na voljo namreč (še) ni nobene podatkovne baze RPU za to razmeroma novo metodo. Tako so nadobudni študentje z upanjem, da bo njihovo delo predstavljalo začetek množičnega zbiranja podatkov o RPU, določili RPU za promotorja Pr in Pu. V ta namen so oblikovali serijo biokock, pri čemer so izbrana promotorja povezali z zapisom za zeleni fluorescirajoči protein (''ang.'' green fluorescent protein, GFP). RPU so neposredno povezane z izražanjem GFP v posamezni celici, kar so kvantificirali s pretočnim citometrom.

=== Karakterizacija biosenzorja ===
Člani ekipe so za neposredno potrditev izražanja gena za XylR, uravnavanega z inducibilnim promotorjem Pu, želeli narediti fuzijo transkripcijskega faktorja XylR z rdečim fluorescenčnim proteinom (''ang.'' red fluorescent protein, RFP), vendar pa bi bil tak konstrukt prevelik. Zato so uporabili biokocko, sestavljeno iz promotorja Pr, prvega vezavnega mesta za ribosom (''ang.'' ribosome-binding site, RBS), gena za XylR, drugega RBS, gena za mRFP in terminatorja, ter z dokazom o izražanju RFP posredno potrdili tudi izražanje XylR.

Za karakterizacijo biosenzorja je skupina uporabila toluen, hlapen cikličen aromatski ogljikovodik. Bioluminiscenčne teste so izvedli z različnimi koncentracijami toluena (10 ng/l do 10 mg/l) in ob različnih časih po izpostavitvi celic toluenu (1 h do 5,5 h), intenziteto bioluminiscence pa so merili z [https://www.berthold.com/en/bio/monochromator_multilabel_microplate_reader_Mithras2_LB943 monokromatskim čitalcem]. Pokazali so, da niti toluen niti uporabljen sev ''E. coli'' sama po sebi nista bioluminiscenčna. Nato so ugotovili, da uporabljen promotor Pu, ki naj bi bil inducibilen, pušča (tj. do neke mere omogoča izražanje gena, ki ga regulira, tudi ob odsotnosti aktivacijskega signala), vendar pa je bioluminiscenca celic v prisotnosti toluena občutno višja kot ob njegovi odsotnosti, kar za delovanje biosenzorja zadostuje.
Kot časovno točko, v kateri naj bi bilo najbolj smiselno izvesti meritev, so izbrali 5 h 30 min po dodatku toluena. Ker je intenziteta bioluminiscence časovno odvisna, mora biti test vedno izveden ob enakem, natančno odmerjenem času po vzorčenju. Najpomembnejši zaključek karakterizacije je, da je izdelan biosenzor sposoben zanesljive zaznave koncentracij toluena, ki so prisotne v onesnaženem zraku (okoli 10 ng/l), ni pa sposoben zelo natančne kvantifikacije, najverjetneje zaradi variacij v metabolizmu živih organizmov.

== Strojna oprema ==
=== Dron ===
Cilj projekta je bil ustvariti letečo napravo za spremljanje onesnaženosti zraka s hlapnimi organskimi molekulami. V ta namen je ekipa zasnovala in z uporabo 3D-tiskalnika tudi ustvarila dron, ki je sposoben vzorčenja zraka, hkrati pa lahko bakterije prenaša brez tveganja za širjenje teh gensko spremenjenih organizmov v okolje. To zagotavlja majhna steklenička belila, pritrjena pod dron, ki se v primeru nesreče razbije, belilo iz nje pa uniči bakterije. Tehnologija, potrebna za analizo bioluminiscence na terenu, ekipi v okviru tekmovanja iGEM žal ni bila dostopna. Rešitev sicer vidijo v majhni na svetlobo občutljivi celici in mikrofluidnem vezju, ki bi bakterijske celice posamič vodilo mimo nje. Podobno je težje uresničljiva zamisel o daljinskem vodenju drona, ki bi omogočalo avtomatsko kartiranje in učinkovito načrtovanje leta.

=== Epruveta za bakterije ===
Predel v dronu, ki vsebuje bakterije, ne sme dopuščati možnosti njihovega širjenja v okolje, hkrati pa mora bakterijam dovesti zrak, ki ga želimo analizirati. Pariški študentje so v ta namen zasnovali in s 3D-tiskalnikom izdelali epruveto, ki deluje po principu zračne ključavnice. Zamašek namreč vsebuje votel predel med bakterijami in zunanjostjo, preko katerega se brez neposrednega stika med vsebino epruvete in okoljem bakterijam dovaja zunanji zrak. Pred začetkom vzorčenja zraka je zamašek nekoliko dvignjen, s čimer je bakterijam preprečen dostop do kamrice v njem, a ne dovolj, da bi v ta vmesni predel vstopil zunanji zrak. Nato ustrezne komponente drona zamašek še bolj dvignejo, kar omogoči vdor zraka, katerega onesnaženost nas zanima, v kamrico zamaška. Dno kamrice preprečuje, da bi bile bakterije v notranjosti epruvete že v trenutku vzorčenja izpostavljene zunanjemu zraku. Sledi popolno zaprtje epruvete, pri čemer se zajeti zrak pomeša z bakterijsko kulturo v notranjosti epruvete. Biosenzor v primeru prisotnosti hlapnih organskih spojin v vzorcu zraka začne oddajati bioluminiscenčen signal, katerega intenziteto po določenem času izmerimo.

== Zaključek ==
Ob zaključku projekta študentje predlagajo nekaj izboljšav, ki bi lahko doprinesle h kvaliteti njihovega prototipa. Standardno krivuljo nameravajo izboljšati z meritvami nižjih koncentracij toluena ter določiti najnižjo koncentracijo, ki jo Quantifly natančno zazna. Izvesti nameravajo še eksperimente z ostalimi toluenu podobnimi molekulami kot je npr. ksilen. Iz praktičnih razlogov so v laboratoriju bioluminiscenčne teste izvajali s tekočim toluenom, v prihodnje pa želijo vzpostaviti izolirano hermetično zaprto sobo s hlapi toluena, v kateri bi lahko opravili vzorčenje zraka. Veliko težavo, katere rešitve študentje zaenkrat ne komentirajo, pa predstavljajo variacije v bioluminiscenčnem testu, ki so posledica razlik v metabolizmu živih organizmov.
Kljub pomanjkljivostim projekta je bila ekipa v sklopu tekmovanja iGEM 2016 za svoje delo nominirana za najboljši okoljski projekt, najboljšo predstavitev projekta in najbolj uporaben projekt.

== Vir ==
[http://2016.igem.org/Team:Ionis_Paris Wiki stran ekipe Ionis Paris 2016]

[[Seminarji SB 2016/17]]

Quantifly

2016-11-29T08:12:03Z

Ema Guštin: /* Uvod */

[http://2016.igem.org/Team:Ionis_Paris Ionis Paris - Quantifly]

== Uvod ==
V zadnjih letih se ljudje čedalje bolj zavedamo problematike onesnaženosti okolja na različnih nivojih. V zraku so na primer prisotni številni plini in trdni delci s škodljivim vplivom na zdravje ljudi in na okolje, ki nastajajo pri nekaterih naravnih pojavih kot so vulkanski izbruhi, požari in razgradnja organskih snovi, ter predvsem kot posledica človeške dejavnosti (npr. industrija, promet, kmetijstvo in ogrevanje). Hlapne organske spojine (''ang.'' volatile organic compounds, VOS), med katere spadajo nekateri ciklični aromatski ogljikovodiki in aldehidi, sicer predstavljajo le 2 % snovi, ki prispevajo k onesnaženosti zraka, njihov škodljiv vpliv na zdravje ljudi in na okolje pa je zelo velik. Za spremljanje onesnaženosti zraka je na voljo veliko različnih fizikalnih in kemijskih metod, vendar pa zaradi zelo velike raznolikosti onesnaževalnih snovi v zraku njihova detekcija in kvantifikacija še vedno predstavljata izziv. Skupina študentov iz Pariza pa je v svojem projektu, s katerim je sodelovala na sinteznobiološkem tekmovanju iGEM 2016, izdelala mobilno biološko napravo za zaznavanje in natančno kvantifikacijo nekaterih organskih onesnaževalcev zraka, ki so jo poimenovali Quantifly.

== Biosenzor ==
Biosenzorji so celostne in samostojne merilne naprave oz. sistemi, ki vsebujejo biološko komponento, sposobno prepoznavanja in kvantifikacije specifičnih dražljajev. Lahko gre za makromolekulo, organel, celico ali tkivo. Ključna elementa biosenzorja sta detektor, ki prepozna vhodni dražljaj in reporter, ki sproži izhodni signal.

===Načrtovanje biosenzorja===
Mladi francoski sintezni biologi so izdelali celični, natančneje bakterijski biosenzor. Kot ogrodje za samostojno sestavljen genetski material so uporabili nepatogeni laboratorijski sev bakterijske vrste ''Escherichia coli'', DH5α. S ciljem ustvariti organizem, ki bo zaznal specifičen onesnaževalec zraka in se nanj odzval z oddajanjem bioluminiscenčnega signala, so izdelali genski konstrukt, zgrajen iz konstitutivnega promotorja Pr, gena XylR, inducibilnega promotorja Pu, gena GLuc in plazmidnega ogrodja pSB1C3.

Konstitutivni promotor Pr uravnava izražanje gena za protein XylR, ki izvira iz bakterijske vrste ''Pseudomonas putida''. Ta detektorski protein je sposoben vezave aromatskih ogljikovodikov z metilno skupino (npr. toluen in ksilen). Ko veže tako molekulo, se konformacijsko spremeni, dimerizira in se veže na DNA, ob dimerizaciji dveh dimerov pa kot transkripcijski regulator deluje na promotor Pu. Aktivacija promotorja Pu omogoči transkripcijo gena GLuc, ki kodira za reporterski bioluminiscenčni protein luciferazo iz ceponožca ''Gaussia princeps''. Ta encim katalizira oksidacijo organske spojine koelenterazin, za katerega je visoko specifičen. Pri rekaciji se sprošča modra svetloba z emisijskim maksimumom pri 488 nm.

=== Optimizacija plazmida ===
Da bi dosegli čim boljše delovanje zgoraj opisanega genskega konstrukta, so člani pariške sinteznobiološke ekipe uporabili pred kratkim ustvarjeno prosto dostopno programsko opremo [http://cellocad.org/index.html CelloCAD]. Deluje tako, da genski konstrukt, ki ga vnesemo v program, s pomočjo zmogljivih bioinformatskih orodij preoblikuje v najboljši možen plazmid za izbrano kombinacijo genetskih elementov. Študentje so želeli primerjati delovanje samostojno zasnovanega plazmida s plazmidom, ki ga oblikuje program (npr. območje detekcije in odzivnost). Pri tem so naleteli na oviro, saj je za delovanje programske opreme potrebno vnesti relativne enote promotorjev (''ang.'' relative promoter units, RPU). Na voljo namreč (še) ni nobene podatkovne baze RPU za to razmeroma novo metodo. Tako so nadobudni študentje z upanjem, da bo njihovo delo predstavljalo začetek množičnega zbiranja podatkov o RPU, določili RPU za promotorja Pr in Pu. V ta namen so oblikovali serijo biokock, pri čemer so izbrana promotorja povezali z zapisom za zeleni fluorescirajoči protein (''ang.'' green fluorescent protein, GFP). RPU so neposredno povezane z izražanjem GFP v posamezni celici, kar so kvantificirali s pretočnim citometrom.

=== Karakterizacija biosenzorja ===
Člani ekipe so za neposredno potrditev izražanja gena za XylR, uravnavanega z inducibilnim promotorjem Pu, želeli narediti fuzijo transkripcijskega faktorja XylR z rdečim fluorescenčnim proteinom (''ang.'' red fluorescent protein, RFP), vendar pa bi bil tak konstrukt prevelik. Zato so uporabili biokocko, sestavljeno iz promotorja Pr, prvega vezavnega mesta za ribosom (''ang.'' ribosome-binding site, RBS), gena za XylR, drugega RBS, gena za mRFP in terminatorja, ter z dokazom o izražanju RFP posredno potrdili tudi izražanje XylR.

Za karakterizacijo biosenzorja je skupina uporabila toluen, hlapen cikličen aromatski ogljikovodik. Bioluminiscenčne teste so izvedli z različnimi koncentracijami toluena (10 ng/l do 10 mg/l) in ob različnih časih po izpostavitvi celic toluenu (1 h do 5,5 h), intenziteto bioluminiscence pa so merili z [https://www.berthold.com/en/bio/monochromator_multilabel_microplate_reader_Mithras2_LB943 monokromatskim čitalcem]. Pokazali so, da niti toluen niti uporabljen sev ''E. coli'' sama po sebi nista bioluminiscenčna. Nato so ugotovili, da uporabljen promotor Pu, ki naj bi bil inducibilen, pušča (tj. do neke mere omogoča izražanje gena, ki ga regulira, tudi ob odsotnosti aktivacijskega signala), vendar pa je bioluminiscenca celic v prisotnosti toluena občutno višja kot ob njegovi odsotnosti, kar za delovanje biosenzorja zadostuje.
Kot časovno točko, v kateri naj bi bilo najbolj smiselno izvesti meritev, so izbrali 5 h 30 min po dodatku toluena. Ker je intenziteta bioluminiscence časovno odvisna, mora biti test vedno izveden ob enakem, natančno odmerjenem času po vzorčenju. Najpomembnejši zaključek karakterizacije je, da je izdelan biosenzor sposoben zanesljive zaznave koncentracij toluena, ki so prisotne v onesnaženem zraku (okoli 10 ng/l), ni pa sposoben zelo natančne kvantifikacije, najverjetneje zaradi variacij v metabolizmu živih organizmov.

== Strojna oprema ==
=== Dron ===
Cilj projekta je bil ustvariti letečo napravo za spremljanje onesnaženosti zraka s hlapnimi organskimi molekulami. V ta namen je ekipa zasnovala in z uporabo 3D-tiskalnika tudi ustvarila dron, ki je sposoben vzorčenja zraka, hkrati pa lahko bakterije prenaša brez tveganja za širjenje teh gensko spremenjenih organizmov v okolje. To zagotavlja majhna steklenička belila, pritrjena pod dron, ki se v primeru nesreče razbije, belilo iz nje pa uniči bakterije. Tehnologija, potrebna za analizo bioluminiscence na terenu, ekipi v okviru tekmovanja iGEM žal ni bila dostopna. Rešitev sicer vidijo v majhni na svetlobo občutljivi celici in mikrofluidnem vezju, ki bi bakterijske celice posamič vodilo mimo nje. Podobno je težje uresničljiva zamisel o daljinskem vodenju drona, ki bi omogočalo avtomatsko kartiranje in učinkovito načrtovanje leta.

=== Epruveta za bakterije ===
Predel v dronu, ki vsebuje bakterije, ne sme dopuščati možnosti njihovega širjenja v okolje, hkrati pa mora bakterijam dovesti zrak, ki ga želimo analizirati. Pariški študentje so v ta namen zasnovali in s 3D-tiskalnikom izdelali epruveto, ki deluje po principu zračne ključavnice. Zamašek namreč vsebuje votel predel med bakterijami in zunanjostjo, preko katerega se brez neposrednega stika med vsebino epruvete in okoljem bakterijam dovaja zunanji zrak. Pred začetkom vzorčenja zraka je zamašek nekoliko dvignjen, s čimer je bakterijam preprečen dostop do kamrice v njem, a ne dovolj, da bi v ta vmesni predel vstopil zunanji zrak. Nato ustrezne komponente drona zamašek še bolj dvignejo, kar omogoči vdor zraka, katerega onesnaženost nas zanima, v kamrico zamaška. Dno kamrice preprečuje, da bi bile bakterije v notranjosti epruvete že v trenutku vzorčenja izpostavljene zunanjemu zraku. Sledi popolno zaprtje epruvete, pri čemer se zajeti zrak pomeša z bakterijsko kulturo v notranjosti epruvete. Biosenzor v primeru prisotnosti hlapnih organskih spojin v vzorcu zraka začne oddajati bioluminiscenčen signal, katerega intenziteto po določenem času izmerimo.

== Zaključek ==
Ob zaključku projekta študentje predlagajo nekaj izboljšav, ki bi lahko doprinesle h kvaliteti njihovega prototipa. Standardno krivuljo nameravajo izboljšati z meritvami nižjih koncentracij toluena ter določiti najnižjo koncentracijo, ki jo Quantifly natančno zazna. Izvesti nameravajo še eksperimente z ostalimi toluenu podobnimi molekulami kot je npr. ksilen. Iz praktičnih razlogov so v laboratoriju bioluminiscenčne teste izvajali s tekočim toluenom, v prihodnje pa želijo vzpostaviti izolirano hermetično zaprto sobo s hlapi toluena, v kateri bi lahko opravili vzorčenje zraka. Veliko težavo, katere rešitve študentje zaenkrat ne komentirajo, pa predstavljajo variacijev bioluminiscenčnem testu, ki so posledica razlik v metabolizmu živih organizmov.
Kljub pomanjkljivostim projekta je bila ekipa v sklopu tekmovanja iGEM 2016 za svoje delo nominirana za najboljši okoljski projekt, najboljšo predstavitev projekta in najbolj uporaben projekt.

== Vir ==
[http://2016.igem.org/Team:Ionis_Paris Wiki stran ekipe Ionis Paris 2016]

[[Seminarji SB 2016/17]]

Quantifly

2016-11-29T07:58:26Z

Ema Guštin: /* Uvod */

[http://2016.igem.org/Team:Ionis_Paris Ionis Paris - Quantifly]

== Uvod ==
V zadnjih letih se ljudje čedalje bolj zavedamo problematike onesnaženosti okolja na različnih nivojih. V zraku so na primer prisotni številni plini in trdni delci s škodljivim vplivom na zdravje ljudi in na okolje, ki nastajajo pri nekaterih naravnih pojavih kot so vulkanski izbruhi, požari in razgradnja organskih snovi, ter predvsem kot posledica človeške dejavnosti (npr. industrija, promet, kmetijstvo in ogrevanje). Hlapne organske spojine (''ang.'' volatile organic compounds, VOS), med katere spadajo nekateri ciklični aromatski ogljikovodiki in aldehidi, sicer predstavljajo le 2 % snovi, ki prispevajo k onesnaženosti zraka, njihov škodljiv vpliv na zdravje ljudi in na okolje pa je zelo velik. Za spremljanje onesnaženosti zraka je na voljo veliko različnih fizikalnih in kemijskih metod, vendar pa zaradi zelo velike raznolikosti onesnaževalnih snovi v zraku njihova detekcija in kvantifikacija še vedno predstavljata izziv. Skupina študentov iz Pariza pa je v svojem projektu, s katerim je sodelovala na sinteznobiološkem tekmovanju iGEM 2016, izdelala mobilno biološko napravo za zaznavanje in natančno kvantifikacijo omenjenih organskih onesnaževalcev zraka, ki so jo poimenovali Quantifly.

== Biosenzor ==
Biosenzorji so celostne in samostojne merilne naprave oz. sistemi, ki vsebujejo biološko komponento, sposobno prepoznavanja in kvantifikacije specifičnih dražljajev. Lahko gre za makromolekulo, organel, celico ali tkivo. Ključna elementa biosenzorja sta detektor, ki prepozna vhodni dražljaj in reporter, ki sproži izhodni signal.

===Načrtovanje biosenzorja===
Mladi francoski sintezni biologi so izdelali celični, natančneje bakterijski biosenzor. Kot ogrodje za samostojno sestavljen genetski material so uporabili nepatogeni laboratorijski sev bakterijske vrste ''Escherichia coli'', DH5α. S ciljem ustvariti organizem, ki bo zaznal specifičen onesnaževalec zraka in se nanj odzval z oddajanjem bioluminiscenčnega signala, so izdelali genski konstrukt, zgrajen iz konstitutivnega promotorja Pr, gena XylR, inducibilnega promotorja Pu, gena GLuc in plazmidnega ogrodja pSB1C3.

Konstitutivni promotor Pr uravnava izražanje gena za protein XylR, ki izvira iz bakterijske vrste ''Pseudomonas putida''. Ta detektorski protein je sposoben vezave aromatskih ogljikovodikov z metilno skupino (npr. toluen in ksilen). Ko veže tako molekulo, se konformacijsko spremeni, dimerizira in se veže na DNA, ob dimerizaciji dveh dimerov pa kot transkripcijski regulator deluje na promotor Pu. Aktivacija promotorja Pu omogoči transkripcijo gena GLuc, ki kodira za reporterski bioluminiscenčni protein luciferazo iz ceponožca ''Gaussia princeps''. Ta encim katalizira oksidacijo organske spojine koelenterazin, za katerega je visoko specifičen. Pri rekaciji se sprošča modra svetloba z emisijskim maksimumom pri 488 nm.

=== Optimizacija plazmida ===
Da bi dosegli čim boljše delovanje zgoraj opisanega genskega konstrukta, so člani pariške sinteznobiološke ekipe uporabili pred kratkim ustvarjeno prosto dostopno programsko opremo [http://cellocad.org/index.html CelloCAD]. Deluje tako, da genski konstrukt, ki ga vnesemo v program, s pomočjo zmogljivih bioinformatskih orodij preoblikuje v najboljši možen plazmid za izbrano kombinacijo genetskih elementov. Študentje so želeli primerjati delovanje samostojno zasnovanega plazmida s plazmidom, ki ga oblikuje program (npr. območje detekcije in odzivnost). Pri tem so naleteli na oviro, saj je za delovanje programske opreme potrebno vnesti relativne enote promotorjev (''ang.'' relative promoter units, RPU). Na voljo namreč (še) ni nobene podatkovne baze RPU za to razmeroma novo metodo. Tako so nadobudni študentje z upanjem, da bo njihovo delo predstavljalo začetek množičnega zbiranja podatkov o RPU, določili RPU za promotorja Pr in Pu. V ta namen so oblikovali serijo biokock, pri čemer so izbrana promotorja povezali z zapisom za zeleni fluorescirajoči protein (''ang.'' green fluorescent protein, GFP). RPU so neposredno povezane z izražanjem GFP v posamezni celici, kar so kvantificirali s pretočnim citometrom.

=== Karakterizacija biosenzorja ===
Člani ekipe so za neposredno potrditev izražanja gena za XylR, uravnavanega z inducibilnim promotorjem Pu, želeli narediti fuzijo transkripcijskega faktorja XylR z rdečim fluorescenčnim proteinom (''ang.'' red fluorescent protein, RFP), vendar pa bi bil tak konstrukt prevelik. Zato so uporabili biokocko, sestavljeno iz promotorja Pr, prvega vezavnega mesta za ribosom (''ang.'' ribosome-binding site, RBS), gena za XylR, drugega RBS, gena za mRFP in terminatorja, ter z dokazom o izražanju RFP posredno potrdili tudi izražanje XylR.

Za karakterizacijo biosenzorja je skupina uporabila toluen, hlapen cikličen aromatski ogljikovodik. Bioluminiscenčne teste so izvedli z različnimi koncentracijami toluena (10 ng/l do 10 mg/l) in ob različnih časih po izpostavitvi celic toluenu (1 h do 5,5 h), intenziteto bioluminiscence pa so merili z [https://www.berthold.com/en/bio/monochromator_multilabel_microplate_reader_Mithras2_LB943 monokromatskim čitalcem]. Pokazali so, da niti toluen niti uporabljen sev ''E. coli'' sama po sebi nista bioluminiscenčna. Nato so ugotovili, da uporabljen promotor Pu, ki naj bi bil inducibilen, pušča (tj. do neke mere omogoča izražanje gena, ki ga regulira, tudi ob odsotnosti aktivacijskega signala), vendar pa je bioluminiscenca celic v prisotnosti toluena občutno višja kot ob njegovi odsotnosti, kar za delovanje biosenzorja zadostuje.
Kot časovno točko, v kateri naj bi bilo najbolj smiselno izvesti meritev, so izbrali 5 h 30 min po dodatku toluena. Ker je intenziteta bioluminiscence časovno odvisna, mora biti test vedno izveden ob enakem, natančno odmerjenem času po vzorčenju. Najpomembnejši zaključek karakterizacije je, da je izdelan biosenzor sposoben zanesljive zaznave koncentracij toluena, ki so prisotne v onesnaženem zraku (okoli 10 ng/l), ni pa sposoben zelo natančne kvantifikacije, najverjetneje zaradi variacij v metabolizmu živih organizmov.

== Strojna oprema ==
=== Dron ===
Cilj projekta je bil ustvariti letečo napravo za spremljanje onesnaženosti zraka s hlapnimi organskimi molekulami. V ta namen je ekipa zasnovala in z uporabo 3D-tiskalnika tudi ustvarila dron, ki je sposoben vzorčenja zraka, hkrati pa lahko bakterije prenaša brez tveganja za širjenje teh gensko spremenjenih organizmov v okolje. To zagotavlja majhna steklenička belila, pritrjena pod dron, ki se v primeru nesreče razbije, belilo iz nje pa uniči bakterije. Tehnologija, potrebna za analizo bioluminiscence na terenu, ekipi v okviru tekmovanja iGEM žal ni bila dostopna. Rešitev sicer vidijo v majhni na svetlobo občutljivi celici in mikrofluidnem vezju, ki bi bakterijske celice posamič vodilo mimo nje. Podobno je težje uresničljiva zamisel o daljinskem vodenju drona, ki bi omogočalo avtomatsko kartiranje in učinkovito načrtovanje leta.

=== Epruveta za bakterije ===
Predel v dronu, ki vsebuje bakterije, ne sme dopuščati možnosti njihovega širjenja v okolje, hkrati pa mora bakterijam dovesti zrak, ki ga želimo analizirati. Pariški študentje so v ta namen zasnovali in s 3D-tiskalnikom izdelali epruveto, ki deluje po principu zračne ključavnice. Zamašek namreč vsebuje votel predel med bakterijami in zunanjostjo, preko katerega se brez neposrednega stika med vsebino epruvete in okoljem bakterijam dovaja zunanji zrak. Pred začetkom vzorčenja zraka je zamašek nekoliko dvignjen, s čimer je bakterijam preprečen dostop do kamrice v njem, a ne dovolj, da bi v ta vmesni predel vstopil zunanji zrak. Nato ustrezne komponente drona zamašek še bolj dvignejo, kar omogoči vdor zraka, katerega onesnaženost nas zanima, v kamrico zamaška. Dno kamrice preprečuje, da bi bile bakterije v notranjosti epruvete že v trenutku vzorčenja izpostavljene zunanjemu zraku. Sledi popolno zaprtje epruvete, pri čemer se zajeti zrak pomeša z bakterijsko kulturo v notranjosti epruvete. Biosenzor v primeru prisotnosti hlapnih organskih spojin v vzorcu zraka začne oddajati bioluminiscenčen signal, katerega intenziteto po določenem času izmerimo.

== Zaključek ==
Ob zaključku projekta študentje predlagajo nekaj izboljšav, ki bi lahko doprinesle h kvaliteti njihovega prototipa. Standardno krivuljo nameravajo izboljšati z meritvami nižjih koncentracij toluena ter določiti najnižjo koncentracijo, ki jo Quantifly natančno zazna. Izvesti nameravajo še eksperimente z ostalimi toluenu podobnimi molekulami kot je npr. ksilen. Iz praktičnih razlogov so v laboratoriju bioluminiscenčne teste izvajali s tekočim toluenom, v prihodnje pa želijo vzpostaviti izolirano hermetično zaprto sobo s hlapi toluena, v kateri bi lahko opravili vzorčenje zraka. Veliko težavo, katere rešitve študentje zaenkrat ne komentirajo, pa predstavljajo variacijev bioluminiscenčnem testu, ki so posledica razlik v metabolizmu živih organizmov.
Kljub pomanjkljivostim projekta je bila ekipa v sklopu tekmovanja iGEM 2016 za svoje delo nominirana za najboljši okoljski projekt, najboljšo predstavitev projekta in najbolj uporaben projekt.

== Vir ==
[http://2016.igem.org/Team:Ionis_Paris Wiki stran ekipe Ionis Paris 2016]

[[Seminarji SB 2016/17]]

Quantifly

2016-11-28T21:59:49Z

Ema Guštin: /* Uvod */

[http://2016.igem.org/Team:Ionis_Paris Ionis Paris - Quantifly]

== Uvod ==
V zadnjih letih se ljudje čedalje bolj zavedamo problematike onesnaženosti okolja na različnih nivojih. V zraku so na primer prisotni številni plini in trdni delci s škodljivim vplivom na zdravje ljudi in na okolje, ki nastajajo pri nekaterih naravnih pojavih kot so vulkanski izbruhi, požari in razgradnja organskih snovi, ter predvsem kot posledica človeške dejavnosti (npr. industrija, promet, kmetijstvo in ogrevanje). Hlapne organske spojine, med katere spadajo nekateri ciklični aromatski ogljikovodiki in aldehidi, sicer predstavljajo le 2 % snovi, ki prispevajo k onesnaženosti zraka, njihov škodljiv vpliv na zdravje ljudi in na okolje pa je zelo velik. Za spremljanje onesnaženosti zraka je na voljo veliko različnih fizikalnih in kemijskih metod, vendar pa zaradi zelo velike raznolikosti onesnaževalnih snovi v zraku njihova detekcija in kvantifikacija še vedno predstavljata izziv. Skupina študentov iz Pariza pa je v svojem projektu, s katerim je sodelovala na sinteznobiološkem tekmovanju iGEM 2016, izdelala mobilno biološko napravo za zaznavanje in natančno kvantifikacijo omenjenih organskih onesnaževalcev zraka, ki so jo poimenovali Quantifly.

== Biosenzor ==
Biosenzorji so celostne in samostojne merilne naprave oz. sistemi, ki vsebujejo biološko komponento, sposobno prepoznavanja in kvantifikacije specifičnih dražljajev. Lahko gre za makromolekulo, organel, celico ali tkivo. Ključna elementa biosenzorja sta detektor, ki prepozna vhodni dražljaj in reporter, ki sproži izhodni signal.

===Načrtovanje biosenzorja===
Mladi francoski sintezni biologi so izdelali celični, natančneje bakterijski biosenzor. Kot ogrodje za samostojno sestavljen genetski material so uporabili nepatogeni laboratorijski sev bakterijske vrste ''Escherichia coli'', DH5α. S ciljem ustvariti organizem, ki bo zaznal specifičen onesnaževalec zraka in se nanj odzval z oddajanjem bioluminiscenčnega signala, so izdelali genski konstrukt, zgrajen iz konstitutivnega promotorja Pr, gena XylR, inducibilnega promotorja Pu, gena GLuc in plazmidnega ogrodja pSB1C3.

Konstitutivni promotor Pr uravnava izražanje gena za protein XylR, ki izvira iz bakterijske vrste ''Pseudomonas putida''. Ta detektorski protein je sposoben vezave aromatskih ogljikovodikov z metilno skupino (npr. toluen in ksilen). Ko veže tako molekulo, se konformacijsko spremeni, dimerizira in se veže na DNA, ob dimerizaciji dveh dimerov pa kot transkripcijski regulator deluje na promotor Pu. Aktivacija promotorja Pu omogoči transkripcijo gena GLuc, ki kodira za reporterski bioluminiscenčni protein luciferazo iz ceponožca ''Gaussia princeps''. Ta encim katalizira oksidacijo organske spojine koelenterazin, za katerega je visoko specifičen. Pri rekaciji se sprošča modra svetloba z emisijskim maksimumom pri 488 nm.

=== Optimizacija plazmida ===
Da bi dosegli čim boljše delovanje zgoraj opisanega genskega konstrukta, so člani pariške sinteznobiološke ekipe uporabili pred kratkim ustvarjeno prosto dostopno programsko opremo [http://cellocad.org/index.html CelloCAD]. Deluje tako, da genski konstrukt, ki ga vnesemo v program, s pomočjo zmogljivih bioinformatskih orodij preoblikuje v najboljši možen plazmid za izbrano kombinacijo genetskih elementov. Študentje so želeli primerjati delovanje samostojno zasnovanega plazmida s plazmidom, ki ga oblikuje program (npr. območje detekcije in odzivnost). Pri tem so naleteli na oviro, saj je za delovanje programske opreme potrebno vnesti relativne enote promotorjev (''ang.'' relative promoter units, RPU). Na voljo namreč (še) ni nobene podatkovne baze RPU za to razmeroma novo metodo. Tako so nadobudni študentje z upanjem, da bo njihovo delo predstavljalo začetek množičnega zbiranja podatkov o RPU, določili RPU za promotorja Pr in Pu. V ta namen so oblikovali serijo biokock, pri čemer so izbrana promotorja povezali z zapisom za zeleni fluorescirajoči protein (''ang.'' green fluorescent protein, GFP). RPU so neposredno povezane z izražanjem GFP v posamezni celici, kar so kvantificirali s pretočnim citometrom.

=== Karakterizacija biosenzorja ===
Člani ekipe so za neposredno potrditev izražanja gena za XylR, uravnavanega z inducibilnim promotorjem Pu, želeli narediti fuzijo transkripcijskega faktorja XylR z rdečim fluorescenčnim proteinom (''ang.'' red fluorescent protein, RFP), vendar pa bi bil tak konstrukt prevelik. Zato so uporabili biokocko, sestavljeno iz promotorja Pr, prvega vezavnega mesta za ribosom (''ang.'' ribosome-binding site, RBS), gena za XylR, drugega RBS, gena za mRFP in terminatorja, ter z dokazom o izražanju RFP posredno potrdili tudi izražanje XylR.

Za karakterizacijo biosenzorja je skupina uporabila toluen, hlapen cikličen aromatski ogljikovodik. Bioluminiscenčne teste so izvedli z različnimi koncentracijami toluena (10 ng/l do 10 mg/l) in ob različnih časih po izpostavitvi celic toluenu (1 h do 5,5 h), intenziteto bioluminiscence pa so merili z [https://www.berthold.com/en/bio/monochromator_multilabel_microplate_reader_Mithras2_LB943 monokromatskim čitalcem]. Pokazali so, da niti toluen niti uporabljen sev ''E. coli'' sama po sebi nista bioluminiscenčna. Nato so ugotovili, da uporabljen promotor Pu, ki naj bi bil inducibilen, pušča (tj. do neke mere omogoča izražanje gena, ki ga regulira, tudi ob odsotnosti aktivacijskega signala), vendar pa je bioluminiscenca celic v prisotnosti toluena občutno višja kot ob njegovi odsotnosti, kar za delovanje biosenzorja zadostuje.
Kot časovno točko, v kateri naj bi bilo najbolj smiselno izvesti meritev, so izbrali 5 h 30 min po dodatku toluena. Ker je intenziteta bioluminiscence časovno odvisna, mora biti test vedno izveden ob enakem, natančno odmerjenem času po vzorčenju. Najpomembnejši zaključek karakterizacije je, da je izdelan biosenzor sposoben zanesljive zaznave koncentracij toluena, ki so prisotne v onesnaženem zraku (okoli 10 ng/l), ni pa sposoben zelo natančne kvantifikacije, najverjetneje zaradi variacij v metabolizmu živih organizmov.

== Strojna oprema ==
=== Dron ===
Cilj projekta je bil ustvariti letečo napravo za spremljanje onesnaženosti zraka s hlapnimi organskimi molekulami. V ta namen je ekipa zasnovala in z uporabo 3D-tiskalnika tudi ustvarila dron, ki je sposoben vzorčenja zraka, hkrati pa lahko bakterije prenaša brez tveganja za širjenje teh gensko spremenjenih organizmov v okolje. To zagotavlja majhna steklenička belila, pritrjena pod dron, ki se v primeru nesreče razbije, belilo iz nje pa uniči bakterije. Tehnologija, potrebna za analizo bioluminiscence na terenu, ekipi v okviru tekmovanja iGEM žal ni bila dostopna. Rešitev sicer vidijo v majhni na svetlobo občutljivi celici in mikrofluidnem vezju, ki bi bakterijske celice posamič vodilo mimo nje. Podobno je težje uresničljiva zamisel o daljinskem vodenju drona, ki bi omogočalo avtomatsko kartiranje in učinkovito načrtovanje leta.

=== Epruveta za bakterije ===
Predel v dronu, ki vsebuje bakterije, ne sme dopuščati možnosti njihovega širjenja v okolje, hkrati pa mora bakterijam dovesti zrak, ki ga želimo analizirati. Pariški študentje so v ta namen zasnovali in s 3D-tiskalnikom izdelali epruveto, ki deluje po principu zračne ključavnice. Zamašek namreč vsebuje votel predel med bakterijami in zunanjostjo, preko katerega se brez neposrednega stika med vsebino epruvete in okoljem bakterijam dovaja zunanji zrak. Pred začetkom vzorčenja zraka je zamašek nekoliko dvignjen, s čimer je bakterijam preprečen dostop do kamrice v njem, a ne dovolj, da bi v ta vmesni predel vstopil zunanji zrak. Nato ustrezne komponente drona zamašek še bolj dvignejo, kar omogoči vdor zraka, katerega onesnaženost nas zanima, v kamrico zamaška. Dno kamrice preprečuje, da bi bile bakterije v notranjosti epruvete že v trenutku vzorčenja izpostavljene zunanjemu zraku. Sledi popolno zaprtje epruvete, pri čemer se zajeti zrak pomeša z bakterijsko kulturo v notranjosti epruvete. Biosenzor v primeru prisotnosti hlapnih organskih spojin v vzorcu zraka začne oddajati bioluminiscenčen signal, katerega intenziteto po določenem času izmerimo.

== Zaključek ==
Ob zaključku projekta študentje predlagajo nekaj izboljšav, ki bi lahko doprinesle h kvaliteti njihovega prototipa. Standardno krivuljo nameravajo izboljšati z meritvami nižjih koncentracij toluena ter določiti najnižjo koncentracijo, ki jo Quantifly natančno zazna. Izvesti nameravajo še eksperimente z ostalimi toluenu podobnimi molekulami kot je npr. ksilen. Iz praktičnih razlogov so v laboratoriju bioluminiscenčne teste izvajali s tekočim toluenom, v prihodnje pa želijo vzpostaviti izolirano hermetično zaprto sobo s hlapi toluena, v kateri bi lahko opravili vzorčenje zraka. Veliko težavo, katere rešitve študentje zaenkrat ne komentirajo, pa predstavljajo variacijev bioluminiscenčnem testu, ki so posledica razlik v metabolizmu živih organizmov.
Kljub pomanjkljivostim projekta je bila ekipa v sklopu tekmovanja iGEM 2016 za svoje delo nominirana za najboljši okoljski projekt, najboljšo predstavitev projekta in najbolj uporaben projekt.

== Vir ==
[http://2016.igem.org/Team:Ionis_Paris Wiki stran ekipe Ionis Paris 2016]

[[Seminarji SB 2016/17]]

Quantifly

2016-11-28T21:49:18Z

Ema Guštin: /* Načrtovanje biosenzorja */

[http://2016.igem.org/Team:Ionis_Paris Ionis Paris - Quantifly]

== Uvod ==
V zadnjih letih se ljudje čedalje bolj zavedamo problematike onesnaženosti okolja na različnih nivojih. V zraku so na primer prisotni številni plini in trdni delci s škodljivim vplivom na zdravje ljudi in na okolje, ki nastajajo pri nekaterih naravnih pojavih kot so vulkanski izbruhi, požari in razgradnja organskih snovi, ter predvsem kot posledica človeške dejavnosti (npr. industrija, promet, kmetijstvo in ogrevanje). Hlapne organske spojine, med katere spadajo nekateri ciklični aromatski ogljikovodiki in aldehidi, sicer predstavljajo le 2 % snovi, ki prispevajo k onesnaženosti zraka, njihov škodljiv vpliv na zdravje ljudi in na okolje pa je zelo velik. Skupina študentov iz Pariza je v svojem projektu, s katerim je sodelovala na sinteznobiološkem tekmovanju iGEM 2016, izdelala mobilno napravo za zaznavanje in natančno kvantifikacijo omenjenih organskih onesnaževalcev zraka, ki so jo poimenovali Quantifly.

== Biosenzor ==
Biosenzorji so celostne in samostojne merilne naprave oz. sistemi, ki vsebujejo biološko komponento, sposobno prepoznavanja in kvantifikacije specifičnih dražljajev. Lahko gre za makromolekulo, organel, celico ali tkivo. Ključna elementa biosenzorja sta detektor, ki prepozna vhodni dražljaj in reporter, ki sproži izhodni signal.

===Načrtovanje biosenzorja===
Mladi francoski sintezni biologi so izdelali celični, natančneje bakterijski biosenzor. Kot ogrodje za samostojno sestavljen genetski material so uporabili nepatogeni laboratorijski sev bakterijske vrste ''Escherichia coli'', DH5α. S ciljem ustvariti organizem, ki bo zaznal specifičen onesnaževalec zraka in se nanj odzval z oddajanjem bioluminiscenčnega signala, so izdelali genski konstrukt, zgrajen iz konstitutivnega promotorja Pr, gena XylR, inducibilnega promotorja Pu, gena GLuc in plazmidnega ogrodja pSB1C3.

Konstitutivni promotor Pr uravnava izražanje gena za protein XylR, ki izvira iz bakterijske vrste ''Pseudomonas putida''. Ta detektorski protein je sposoben vezave aromatskih ogljikovodikov z metilno skupino (npr. toluen in ksilen). Ko veže tako molekulo, se konformacijsko spremeni, dimerizira in se veže na DNA, ob dimerizaciji dveh dimerov pa kot transkripcijski regulator deluje na promotor Pu. Aktivacija promotorja Pu omogoči transkripcijo gena GLuc, ki kodira za reporterski bioluminiscenčni protein luciferazo iz ceponožca ''Gaussia princeps''. Ta encim katalizira oksidacijo organske spojine koelenterazin, za katerega je visoko specifičen. Pri rekaciji se sprošča modra svetloba z emisijskim maksimumom pri 488 nm.

=== Optimizacija plazmida ===
Da bi dosegli čim boljše delovanje zgoraj opisanega genskega konstrukta, so člani pariške sinteznobiološke ekipe uporabili pred kratkim ustvarjeno prosto dostopno programsko opremo [http://cellocad.org/index.html CelloCAD]. Deluje tako, da genski konstrukt, ki ga vnesemo v program, s pomočjo zmogljivih bioinformatskih orodij preoblikuje v najboljši možen plazmid za izbrano kombinacijo genetskih elementov. Študentje so želeli primerjati delovanje samostojno zasnovanega plazmida s plazmidom, ki ga oblikuje program (npr. območje detekcije in odzivnost). Pri tem so naleteli na oviro, saj je za delovanje programske opreme potrebno vnesti relativne enote promotorjev (''ang.'' relative promoter units, RPU). Na voljo namreč (še) ni nobene podatkovne baze RPU za to razmeroma novo metodo. Tako so nadobudni študentje z upanjem, da bo njihovo delo predstavljalo začetek množičnega zbiranja podatkov o RPU, določili RPU za promotorja Pr in Pu. V ta namen so oblikovali serijo biokock, pri čemer so izbrana promotorja povezali z zapisom za zeleni fluorescirajoči protein (''ang.'' green fluorescent protein, GFP). RPU so neposredno povezane z izražanjem GFP v posamezni celici, kar so kvantificirali s pretočnim citometrom.

=== Karakterizacija biosenzorja ===
Člani ekipe so za neposredno potrditev izražanja gena za XylR, uravnavanega z inducibilnim promotorjem Pu, želeli narediti fuzijo transkripcijskega faktorja XylR z rdečim fluorescenčnim proteinom (''ang.'' red fluorescent protein, RFP), vendar pa bi bil tak konstrukt prevelik. Zato so uporabili biokocko, sestavljeno iz promotorja Pr, prvega vezavnega mesta za ribosom (''ang.'' ribosome-binding site, RBS), gena za XylR, drugega RBS, gena za mRFP in terminatorja, ter z dokazom o izražanju RFP posredno potrdili tudi izražanje XylR.

Za karakterizacijo biosenzorja je skupina uporabila toluen, hlapen cikličen aromatski ogljikovodik. Bioluminiscenčne teste so izvedli z različnimi koncentracijami toluena (10 ng/l do 10 mg/l) in ob različnih časih po izpostavitvi celic toluenu (1 h do 5,5 h), intenziteto bioluminiscence pa so merili z [https://www.berthold.com/en/bio/monochromator_multilabel_microplate_reader_Mithras2_LB943 monokromatskim čitalcem]. Pokazali so, da niti toluen niti uporabljen sev ''E. coli'' sama po sebi nista bioluminiscenčna. Nato so ugotovili, da uporabljen promotor Pu, ki naj bi bil inducibilen, pušča (tj. do neke mere omogoča izražanje gena, ki ga regulira, tudi ob odsotnosti aktivacijskega signala), vendar pa je bioluminiscenca celic v prisotnosti toluena občutno višja kot ob njegovi odsotnosti, kar za delovanje biosenzorja zadostuje.
Kot časovno točko, v kateri naj bi bilo najbolj smiselno izvesti meritev, so izbrali 5 h 30 min po dodatku toluena. Ker je intenziteta bioluminiscence časovno odvisna, mora biti test vedno izveden ob enakem, natančno odmerjenem času po vzorčenju. Najpomembnejši zaključek karakterizacije je, da je izdelan biosenzor sposoben zanesljive zaznave koncentracij toluena, ki so prisotne v onesnaženem zraku (okoli 10 ng/l), ni pa sposoben zelo natančne kvantifikacije, najverjetneje zaradi variacij v metabolizmu živih organizmov.

== Strojna oprema ==
=== Dron ===
Cilj projekta je bil ustvariti letečo napravo za spremljanje onesnaženosti zraka s hlapnimi organskimi molekulami. V ta namen je ekipa zasnovala in z uporabo 3D-tiskalnika tudi ustvarila dron, ki je sposoben vzorčenja zraka, hkrati pa lahko bakterije prenaša brez tveganja za širjenje teh gensko spremenjenih organizmov v okolje. To zagotavlja majhna steklenička belila, pritrjena pod dron, ki se v primeru nesreče razbije, belilo iz nje pa uniči bakterije. Tehnologija, potrebna za analizo bioluminiscence na terenu, ekipi v okviru tekmovanja iGEM žal ni bila dostopna. Rešitev sicer vidijo v majhni na svetlobo občutljivi celici in mikrofluidnem vezju, ki bi bakterijske celice posamič vodilo mimo nje. Podobno je težje uresničljiva zamisel o daljinskem vodenju drona, ki bi omogočalo avtomatsko kartiranje in učinkovito načrtovanje leta.

=== Epruveta za bakterije ===
Predel v dronu, ki vsebuje bakterije, ne sme dopuščati možnosti njihovega širjenja v okolje, hkrati pa mora bakterijam dovesti zrak, ki ga želimo analizirati. Pariški študentje so v ta namen zasnovali in s 3D-tiskalnikom izdelali epruveto, ki deluje po principu zračne ključavnice. Zamašek namreč vsebuje votel predel med bakterijami in zunanjostjo, preko katerega se brez neposrednega stika med vsebino epruvete in okoljem bakterijam dovaja zunanji zrak. Pred začetkom vzorčenja zraka je zamašek nekoliko dvignjen, s čimer je bakterijam preprečen dostop do kamrice v njem, a ne dovolj, da bi v ta vmesni predel vstopil zunanji zrak. Nato ustrezne komponente drona zamašek še bolj dvignejo, kar omogoči vdor zraka, katerega onesnaženost nas zanima, v kamrico zamaška. Dno kamrice preprečuje, da bi bile bakterije v notranjosti epruvete že v trenutku vzorčenja izpostavljene zunanjemu zraku. Sledi popolno zaprtje epruvete, pri čemer se zajeti zrak pomeša z bakterijsko kulturo v notranjosti epruvete. Biosenzor v primeru prisotnosti hlapnih organskih spojin v vzorcu zraka začne oddajati bioluminiscenčen signal, katerega intenziteto po določenem času izmerimo.

== Zaključek ==
Ob zaključku projekta študentje predlagajo nekaj izboljšav, ki bi lahko doprinesle h kvaliteti njihovega prototipa. Standardno krivuljo nameravajo izboljšati z meritvami nižjih koncentracij toluena ter določiti najnižjo koncentracijo, ki jo Quantifly natančno zazna. Izvesti nameravajo še eksperimente z ostalimi toluenu podobnimi molekulami kot je npr. ksilen. Iz praktičnih razlogov so v laboratoriju bioluminiscenčne teste izvajali s tekočim toluenom, v prihodnje pa želijo vzpostaviti izolirano hermetično zaprto sobo s hlapi toluena, v kateri bi lahko opravili vzorčenje zraka. Veliko težavo, katere rešitve študentje zaenkrat ne komentirajo, pa predstavljajo variacijev bioluminiscenčnem testu, ki so posledica razlik v metabolizmu živih organizmov.
Kljub pomanjkljivostim projekta je bila ekipa v sklopu tekmovanja iGEM 2016 za svoje delo nominirana za najboljši okoljski projekt, najboljšo predstavitev projekta in najbolj uporaben projekt.

== Vir ==
[http://2016.igem.org/Team:Ionis_Paris Wiki stran ekipe Ionis Paris 2016]

[[Seminarji SB 2016/17]]

Quantifly

2016-11-28T21:35:54Z

Ema Guštin: /* Epruveta za bakterije */

[http://2016.igem.org/Team:Ionis_Paris Ionis Paris - Quantifly]

== Uvod ==
V zadnjih letih se ljudje čedalje bolj zavedamo problematike onesnaženosti okolja na različnih nivojih. V zraku so na primer prisotni številni plini in trdni delci s škodljivim vplivom na zdravje ljudi in na okolje, ki nastajajo pri nekaterih naravnih pojavih kot so vulkanski izbruhi, požari in razgradnja organskih snovi, ter predvsem kot posledica človeške dejavnosti (npr. industrija, promet, kmetijstvo in ogrevanje). Hlapne organske spojine, med katere spadajo nekateri ciklični aromatski ogljikovodiki in aldehidi, sicer predstavljajo le 2 % snovi, ki prispevajo k onesnaženosti zraka, njihov škodljiv vpliv na zdravje ljudi in na okolje pa je zelo velik. Skupina študentov iz Pariza je v svojem projektu, s katerim je sodelovala na sinteznobiološkem tekmovanju iGEM 2016, izdelala mobilno napravo za zaznavanje in natančno kvantifikacijo omenjenih organskih onesnaževalcev zraka, ki so jo poimenovali Quantifly.

== Biosenzor ==
Biosenzorji so celostne in samostojne merilne naprave oz. sistemi, ki vsebujejo biološko komponento, sposobno prepoznavanja in kvantifikacije specifičnih dražljajev. Lahko gre za makromolekulo, organel, celico ali tkivo. Ključna elementa biosenzorja sta detektor, ki prepozna vhodni dražljaj in reporter, ki sproži izhodni signal.

===Načrtovanje biosenzorja===
Mladi francoski sintezni biologi so izdelali celični, natančneje bakterijski biosenzor. Kot ogrodje so uporabili nepatogeni laboratorijski sev bakterijske vrste ''Escherichia coli'', DH5α. S ciljem ustvariti organizem, ki bo zaznal specifičen onesnaževalec zraka in se nanj odzval z oddajanjem bioluminiscenčnega signala, so izdelali genski konstrukt, sestavljen iz konstitutivnega promotorja Pr, gena XylR, inducibilnega promotorja Pu, gena GLuc in plazmidnega ogrodja pSB1C3.

Konstitutivni promotor Pr uravnava izražanje gena za protein XylR. Ta detektorski protein je sposoben vezave aromatskih ogljikovodikov z metilno skupino (npr. toluen in ksilen). Ko veže tako molekulo, se konformacijsko spremeni, dimerizira in se veže na DNA, ob dimerizaciji dveh dimerov pa kot transkripcijski regulator deluje na promotor Pu. Aktivacija promotorja Pu omogoči transkripcijo gena GLuc, ki kodira za reporterski bioluminiscenčni protein luciferazo iz organizmov rodu ''Gaussia''. Ta encim katalizira oksidacijo organske spojine koelenterazin, pri čemer se sprošča modra svetloba z emisijskim maksimumom pri 488 nm.

=== Optimizacija plazmida ===
Da bi dosegli čim boljše delovanje zgoraj opisanega genskega konstrukta, so člani pariške sinteznobiološke ekipe uporabili pred kratkim ustvarjeno prosto dostopno programsko opremo [http://cellocad.org/index.html CelloCAD]. Deluje tako, da genski konstrukt, ki ga vnesemo v program, s pomočjo zmogljivih bioinformatskih orodij preoblikuje v najboljši možen plazmid za izbrano kombinacijo genetskih elementov. Študentje so želeli primerjati delovanje samostojno zasnovanega plazmida s plazmidom, ki ga oblikuje program (npr. območje detekcije in odzivnost). Pri tem so naleteli na oviro, saj je za delovanje programske opreme potrebno vnesti relativne enote promotorjev (''ang.'' relative promoter units, RPU). Na voljo namreč (še) ni nobene podatkovne baze RPU za to razmeroma novo metodo. Tako so nadobudni študentje z upanjem, da bo njihovo delo predstavljalo začetek množičnega zbiranja podatkov o RPU, določili RPU za promotorja Pr in Pu. V ta namen so oblikovali serijo biokock, pri čemer so izbrana promotorja povezali z zapisom za zeleni fluorescirajoči protein (''ang.'' green fluorescent protein, GFP). RPU so neposredno povezane z izražanjem GFP v posamezni celici, kar so kvantificirali s pretočnim citometrom.

=== Karakterizacija biosenzorja ===
Člani ekipe so za neposredno potrditev izražanja gena za XylR, uravnavanega z inducibilnim promotorjem Pu, želeli narediti fuzijo transkripcijskega faktorja XylR z rdečim fluorescenčnim proteinom (''ang.'' red fluorescent protein, RFP), vendar pa bi bil tak konstrukt prevelik. Zato so uporabili biokocko, sestavljeno iz promotorja Pr, prvega vezavnega mesta za ribosom (''ang.'' ribosome-binding site, RBS), gena za XylR, drugega RBS, gena za mRFP in terminatorja, ter z dokazom o izražanju RFP posredno potrdili tudi izražanje XylR.

Za karakterizacijo biosenzorja je skupina uporabila toluen, hlapen cikličen aromatski ogljikovodik. Bioluminiscenčne teste so izvedli z različnimi koncentracijami toluena (10 ng/l do 10 mg/l) in ob različnih časih po izpostavitvi celic toluenu (1 h do 5,5 h), intenziteto bioluminiscence pa so merili z [https://www.berthold.com/en/bio/monochromator_multilabel_microplate_reader_Mithras2_LB943 monokromatskim čitalcem]. Pokazali so, da niti toluen niti uporabljen sev ''E. coli'' sama po sebi nista bioluminiscenčna. Nato so ugotovili, da uporabljen promotor Pu, ki naj bi bil inducibilen, pušča (tj. do neke mere omogoča izražanje gena, ki ga regulira, tudi ob odsotnosti aktivacijskega signala), vendar pa je bioluminiscenca celic v prisotnosti toluena občutno višja kot ob njegovi odsotnosti, kar za delovanje biosenzorja zadostuje.
Kot časovno točko, v kateri naj bi bilo najbolj smiselno izvesti meritev, so izbrali 5 h 30 min po dodatku toluena. Ker je intenziteta bioluminiscence časovno odvisna, mora biti test vedno izveden ob enakem, natančno odmerjenem času po vzorčenju. Najpomembnejši zaključek karakterizacije je, da je izdelan biosenzor sposoben zanesljive zaznave koncentracij toluena, ki so prisotne v onesnaženem zraku (okoli 10 ng/l), ni pa sposoben zelo natančne kvantifikacije, najverjetneje zaradi variacij v metabolizmu živih organizmov.

== Strojna oprema ==
=== Dron ===
Cilj projekta je bil ustvariti letečo napravo za spremljanje onesnaženosti zraka s hlapnimi organskimi molekulami. V ta namen je ekipa zasnovala in z uporabo 3D-tiskalnika tudi ustvarila dron, ki je sposoben vzorčenja zraka, hkrati pa lahko bakterije prenaša brez tveganja za širjenje teh gensko spremenjenih organizmov v okolje. To zagotavlja majhna steklenička belila, pritrjena pod dron, ki se v primeru nesreče razbije, belilo iz nje pa uniči bakterije. Tehnologija, potrebna za analizo bioluminiscence na terenu, ekipi v okviru tekmovanja iGEM žal ni bila dostopna. Rešitev sicer vidijo v majhni na svetlobo občutljivi celici in mikrofluidnem vezju, ki bi bakterijske celice posamič vodilo mimo nje. Podobno je težje uresničljiva zamisel o daljinskem vodenju drona, ki bi omogočalo avtomatsko kartiranje in učinkovito načrtovanje leta.

=== Epruveta za bakterije ===
Predel v dronu, ki vsebuje bakterije, ne sme dopuščati možnosti njihovega širjenja v okolje, hkrati pa mora bakterijam dovesti zrak, ki ga želimo analizirati. Pariški študentje so v ta namen zasnovali in s 3D-tiskalnikom izdelali epruveto, ki deluje po principu zračne ključavnice. Zamašek namreč vsebuje votel predel med bakterijami in zunanjostjo, preko katerega se brez neposrednega stika med vsebino epruvete in okoljem bakterijam dovaja zunanji zrak. Pred začetkom vzorčenja zraka je zamašek nekoliko dvignjen, s čimer je bakterijam preprečen dostop do kamrice v njem, a ne dovolj, da bi v ta vmesni predel vstopil zunanji zrak. Nato ustrezne komponente drona zamašek še bolj dvignejo, kar omogoči vdor zraka, katerega onesnaženost nas zanima, v kamrico zamaška. Dno kamrice preprečuje, da bi bile bakterije v notranjosti epruvete že v trenutku vzorčenja izpostavljene zunanjemu zraku. Sledi popolno zaprtje epruvete, pri čemer se zajeti zrak pomeša z bakterijsko kulturo v notranjosti epruvete. Biosenzor v primeru prisotnosti hlapnih organskih spojin v vzorcu zraka začne oddajati bioluminiscenčen signal, katerega intenziteto po določenem času izmerimo.

== Zaključek ==
Ob zaključku projekta študentje predlagajo nekaj izboljšav, ki bi lahko doprinesle h kvaliteti njihovega prototipa. Standardno krivuljo nameravajo izboljšati z meritvami nižjih koncentracij toluena ter določiti najnižjo koncentracijo, ki jo Quantifly natančno zazna. Izvesti nameravajo še eksperimente z ostalimi toluenu podobnimi molekulami kot je npr. ksilen. Iz praktičnih razlogov so v laboratoriju bioluminiscenčne teste izvajali s tekočim toluenom, v prihodnje pa želijo vzpostaviti izolirano hermetično zaprto sobo s hlapi toluena, v kateri bi lahko opravili vzorčenje zraka. Veliko težavo, katere rešitve študentje zaenkrat ne komentirajo, pa predstavljajo variacijev bioluminiscenčnem testu, ki so posledica razlik v metabolizmu živih organizmov.
Kljub pomanjkljivostim projekta je bila ekipa v sklopu tekmovanja iGEM 2016 za svoje delo nominirana za najboljši okoljski projekt, najboljšo predstavitev projekta in najbolj uporaben projekt.

== Vir ==
[http://2016.igem.org/Team:Ionis_Paris Wiki stran ekipe Ionis Paris 2016]

[[Seminarji SB 2016/17]]

Quantifly

2016-11-28T21:08:34Z

Ema Guštin: /* Vir */

[http://2016.igem.org/Team:Ionis_Paris Ionis Paris - Quantifly]

== Uvod ==
V zadnjih letih se ljudje čedalje bolj zavedamo problematike onesnaženosti okolja na različnih nivojih. V zraku so na primer prisotni številni plini in trdni delci s škodljivim vplivom na zdravje ljudi in na okolje, ki nastajajo pri nekaterih naravnih pojavih kot so vulkanski izbruhi, požari in razgradnja organskih snovi, ter predvsem kot posledica človeške dejavnosti (npr. industrija, promet, kmetijstvo in ogrevanje). Hlapne organske spojine, med katere spadajo nekateri ciklični aromatski ogljikovodiki in aldehidi, sicer predstavljajo le 2 % snovi, ki prispevajo k onesnaženosti zraka, njihov škodljiv vpliv na zdravje ljudi in na okolje pa je zelo velik. Skupina študentov iz Pariza je v svojem projektu, s katerim je sodelovala na sinteznobiološkem tekmovanju iGEM 2016, izdelala mobilno napravo za zaznavanje in natančno kvantifikacijo omenjenih organskih onesnaževalcev zraka, ki so jo poimenovali Quantifly.

== Biosenzor ==
Biosenzorji so celostne in samostojne merilne naprave oz. sistemi, ki vsebujejo biološko komponento, sposobno prepoznavanja in kvantifikacije specifičnih dražljajev. Lahko gre za makromolekulo, organel, celico ali tkivo. Ključna elementa biosenzorja sta detektor, ki prepozna vhodni dražljaj in reporter, ki sproži izhodni signal.

===Načrtovanje biosenzorja===
Mladi francoski sintezni biologi so izdelali celični, natančneje bakterijski biosenzor. Kot ogrodje so uporabili nepatogeni laboratorijski sev bakterijske vrste ''Escherichia coli'', DH5α. S ciljem ustvariti organizem, ki bo zaznal specifičen onesnaževalec zraka in se nanj odzval z oddajanjem bioluminiscenčnega signala, so izdelali genski konstrukt, sestavljen iz konstitutivnega promotorja Pr, gena XylR, inducibilnega promotorja Pu, gena GLuc in plazmidnega ogrodja pSB1C3.

Konstitutivni promotor Pr uravnava izražanje gena za protein XylR. Ta detektorski protein je sposoben vezave aromatskih ogljikovodikov z metilno skupino (npr. toluen in ksilen). Ko veže tako molekulo, se konformacijsko spremeni, dimerizira in se veže na DNA, ob dimerizaciji dveh dimerov pa kot transkripcijski regulator deluje na promotor Pu. Aktivacija promotorja Pu omogoči transkripcijo gena GLuc, ki kodira za reporterski bioluminiscenčni protein luciferazo iz organizmov rodu ''Gaussia''. Ta encim katalizira oksidacijo organske spojine koelenterazin, pri čemer se sprošča modra svetloba z emisijskim maksimumom pri 488 nm.

=== Optimizacija plazmida ===
Da bi dosegli čim boljše delovanje zgoraj opisanega genskega konstrukta, so člani pariške sinteznobiološke ekipe uporabili pred kratkim ustvarjeno prosto dostopno programsko opremo [http://cellocad.org/index.html CelloCAD]. Deluje tako, da genski konstrukt, ki ga vnesemo v program, s pomočjo zmogljivih bioinformatskih orodij preoblikuje v najboljši možen plazmid za izbrano kombinacijo genetskih elementov. Študentje so želeli primerjati delovanje samostojno zasnovanega plazmida s plazmidom, ki ga oblikuje program (npr. območje detekcije in odzivnost). Pri tem so naleteli na oviro, saj je za delovanje programske opreme potrebno vnesti relativne enote promotorjev (''ang.'' relative promoter units, RPU). Na voljo namreč (še) ni nobene podatkovne baze RPU za to razmeroma novo metodo. Tako so nadobudni študentje z upanjem, da bo njihovo delo predstavljalo začetek množičnega zbiranja podatkov o RPU, določili RPU za promotorja Pr in Pu. V ta namen so oblikovali serijo biokock, pri čemer so izbrana promotorja povezali z zapisom za zeleni fluorescirajoči protein (''ang.'' green fluorescent protein, GFP). RPU so neposredno povezane z izražanjem GFP v posamezni celici, kar so kvantificirali s pretočnim citometrom.

=== Karakterizacija biosenzorja ===
Člani ekipe so za neposredno potrditev izražanja gena za XylR, uravnavanega z inducibilnim promotorjem Pu, želeli narediti fuzijo transkripcijskega faktorja XylR z rdečim fluorescenčnim proteinom (''ang.'' red fluorescent protein, RFP), vendar pa bi bil tak konstrukt prevelik. Zato so uporabili biokocko, sestavljeno iz promotorja Pr, prvega vezavnega mesta za ribosom (''ang.'' ribosome-binding site, RBS), gena za XylR, drugega RBS, gena za mRFP in terminatorja, ter z dokazom o izražanju RFP posredno potrdili tudi izražanje XylR.

Za karakterizacijo biosenzorja je skupina uporabila toluen, hlapen cikličen aromatski ogljikovodik. Bioluminiscenčne teste so izvedli z različnimi koncentracijami toluena (10 ng/l do 10 mg/l) in ob različnih časih po izpostavitvi celic toluenu (1 h do 5,5 h), intenziteto bioluminiscence pa so merili z [https://www.berthold.com/en/bio/monochromator_multilabel_microplate_reader_Mithras2_LB943 monokromatskim čitalcem]. Pokazali so, da niti toluen niti uporabljen sev ''E. coli'' sama po sebi nista bioluminiscenčna. Nato so ugotovili, da uporabljen promotor Pu, ki naj bi bil inducibilen, pušča (tj. do neke mere omogoča izražanje gena, ki ga regulira, tudi ob odsotnosti aktivacijskega signala), vendar pa je bioluminiscenca celic v prisotnosti toluena občutno višja kot ob njegovi odsotnosti, kar za delovanje biosenzorja zadostuje.
Kot časovno točko, v kateri naj bi bilo najbolj smiselno izvesti meritev, so izbrali 5 h 30 min po dodatku toluena. Ker je intenziteta bioluminiscence časovno odvisna, mora biti test vedno izveden ob enakem, natančno odmerjenem času po vzorčenju. Najpomembnejši zaključek karakterizacije je, da je izdelan biosenzor sposoben zanesljive zaznave koncentracij toluena, ki so prisotne v onesnaženem zraku (okoli 10 ng/l), ni pa sposoben zelo natančne kvantifikacije, najverjetneje zaradi variacij v metabolizmu živih organizmov.

== Strojna oprema ==
=== Dron ===
Cilj projekta je bil ustvariti letečo napravo za spremljanje onesnaženosti zraka s hlapnimi organskimi molekulami. V ta namen je ekipa zasnovala in z uporabo 3D-tiskalnika tudi ustvarila dron, ki je sposoben vzorčenja zraka, hkrati pa lahko bakterije prenaša brez tveganja za širjenje teh gensko spremenjenih organizmov v okolje. To zagotavlja majhna steklenička belila, pritrjena pod dron, ki se v primeru nesreče razbije, belilo iz nje pa uniči bakterije. Tehnologija, potrebna za analizo bioluminiscence na terenu, ekipi v okviru tekmovanja iGEM žal ni bila dostopna. Rešitev sicer vidijo v majhni na svetlobo občutljivi celici in mikrofluidnem vezju, ki bi bakterijske celice posamič vodilo mimo nje. Podobno je težje uresničljiva zamisel o daljinskem vodenju drona, ki bi omogočalo avtomatsko kartiranje in učinkovito načrtovanje leta.

=== Epruveta za bakterije ===
Predel v dronu, ki vsebuje bakterije, ne sme dopuščati možnosti njihovega širjenja v okolje, hkrati pa mora bakterijam dovesti zrak, ki ga želimo analizirati. Pariški študentje so v ta namen zasnovali in s 3D-tiskalnikom izdelali epruveto, ki deluje po principu zračne ključavnice. Vsebuje namreč predel med bakterijami in zunanjostjo, preko katerega se brez neposrednega stika med vsebino epruvete in okoljem bakterijam dovaja zunanji zrak.

== Zaključek ==
Ob zaključku projekta študentje predlagajo nekaj izboljšav, ki bi lahko doprinesle h kvaliteti njihovega prototipa. Standardno krivuljo nameravajo izboljšati z meritvami nižjih koncentracij toluena ter določiti najnižjo koncentracijo, ki jo Quantifly natančno zazna. Izvesti nameravajo še eksperimente z ostalimi toluenu podobnimi molekulami kot je npr. ksilen. Iz praktičnih razlogov so v laboratoriju bioluminiscenčne teste izvajali s tekočim toluenom, v prihodnje pa želijo vzpostaviti izolirano hermetično zaprto sobo s hlapi toluena, v kateri bi lahko opravili vzorčenje zraka. Veliko težavo, katere rešitve študentje zaenkrat ne komentirajo, pa predstavljajo variacijev bioluminiscenčnem testu, ki so posledica razlik v metabolizmu živih organizmov.
Kljub pomanjkljivostim projekta je bila ekipa v sklopu tekmovanja iGEM 2016 za svoje delo nominirana za najboljši okoljski projekt, najboljšo predstavitev projekta in najbolj uporaben projekt.

== Vir ==
[http://2016.igem.org/Team:Ionis_Paris Wiki stran ekipe Ionis Paris 2016]

[[Seminarji SB 2016/17]]

Quantifly

2016-11-28T21:08:19Z

Ema Guštin: /* Vir */

[http://2016.igem.org/Team:Ionis_Paris Ionis Paris - Quantifly]

== Uvod ==
V zadnjih letih se ljudje čedalje bolj zavedamo problematike onesnaženosti okolja na različnih nivojih. V zraku so na primer prisotni številni plini in trdni delci s škodljivim vplivom na zdravje ljudi in na okolje, ki nastajajo pri nekaterih naravnih pojavih kot so vulkanski izbruhi, požari in razgradnja organskih snovi, ter predvsem kot posledica človeške dejavnosti (npr. industrija, promet, kmetijstvo in ogrevanje). Hlapne organske spojine, med katere spadajo nekateri ciklični aromatski ogljikovodiki in aldehidi, sicer predstavljajo le 2 % snovi, ki prispevajo k onesnaženosti zraka, njihov škodljiv vpliv na zdravje ljudi in na okolje pa je zelo velik. Skupina študentov iz Pariza je v svojem projektu, s katerim je sodelovala na sinteznobiološkem tekmovanju iGEM 2016, izdelala mobilno napravo za zaznavanje in natančno kvantifikacijo omenjenih organskih onesnaževalcev zraka, ki so jo poimenovali Quantifly.

== Biosenzor ==
Biosenzorji so celostne in samostojne merilne naprave oz. sistemi, ki vsebujejo biološko komponento, sposobno prepoznavanja in kvantifikacije specifičnih dražljajev. Lahko gre za makromolekulo, organel, celico ali tkivo. Ključna elementa biosenzorja sta detektor, ki prepozna vhodni dražljaj in reporter, ki sproži izhodni signal.

===Načrtovanje biosenzorja===
Mladi francoski sintezni biologi so izdelali celični, natančneje bakterijski biosenzor. Kot ogrodje so uporabili nepatogeni laboratorijski sev bakterijske vrste ''Escherichia coli'', DH5α. S ciljem ustvariti organizem, ki bo zaznal specifičen onesnaževalec zraka in se nanj odzval z oddajanjem bioluminiscenčnega signala, so izdelali genski konstrukt, sestavljen iz konstitutivnega promotorja Pr, gena XylR, inducibilnega promotorja Pu, gena GLuc in plazmidnega ogrodja pSB1C3.

Konstitutivni promotor Pr uravnava izražanje gena za protein XylR. Ta detektorski protein je sposoben vezave aromatskih ogljikovodikov z metilno skupino (npr. toluen in ksilen). Ko veže tako molekulo, se konformacijsko spremeni, dimerizira in se veže na DNA, ob dimerizaciji dveh dimerov pa kot transkripcijski regulator deluje na promotor Pu. Aktivacija promotorja Pu omogoči transkripcijo gena GLuc, ki kodira za reporterski bioluminiscenčni protein luciferazo iz organizmov rodu ''Gaussia''. Ta encim katalizira oksidacijo organske spojine koelenterazin, pri čemer se sprošča modra svetloba z emisijskim maksimumom pri 488 nm.

=== Optimizacija plazmida ===
Da bi dosegli čim boljše delovanje zgoraj opisanega genskega konstrukta, so člani pariške sinteznobiološke ekipe uporabili pred kratkim ustvarjeno prosto dostopno programsko opremo [http://cellocad.org/index.html CelloCAD]. Deluje tako, da genski konstrukt, ki ga vnesemo v program, s pomočjo zmogljivih bioinformatskih orodij preoblikuje v najboljši možen plazmid za izbrano kombinacijo genetskih elementov. Študentje so želeli primerjati delovanje samostojno zasnovanega plazmida s plazmidom, ki ga oblikuje program (npr. območje detekcije in odzivnost). Pri tem so naleteli na oviro, saj je za delovanje programske opreme potrebno vnesti relativne enote promotorjev (''ang.'' relative promoter units, RPU). Na voljo namreč (še) ni nobene podatkovne baze RPU za to razmeroma novo metodo. Tako so nadobudni študentje z upanjem, da bo njihovo delo predstavljalo začetek množičnega zbiranja podatkov o RPU, določili RPU za promotorja Pr in Pu. V ta namen so oblikovali serijo biokock, pri čemer so izbrana promotorja povezali z zapisom za zeleni fluorescirajoči protein (''ang.'' green fluorescent protein, GFP). RPU so neposredno povezane z izražanjem GFP v posamezni celici, kar so kvantificirali s pretočnim citometrom.

=== Karakterizacija biosenzorja ===
Člani ekipe so za neposredno potrditev izražanja gena za XylR, uravnavanega z inducibilnim promotorjem Pu, želeli narediti fuzijo transkripcijskega faktorja XylR z rdečim fluorescenčnim proteinom (''ang.'' red fluorescent protein, RFP), vendar pa bi bil tak konstrukt prevelik. Zato so uporabili biokocko, sestavljeno iz promotorja Pr, prvega vezavnega mesta za ribosom (''ang.'' ribosome-binding site, RBS), gena za XylR, drugega RBS, gena za mRFP in terminatorja, ter z dokazom o izražanju RFP posredno potrdili tudi izražanje XylR.

Za karakterizacijo biosenzorja je skupina uporabila toluen, hlapen cikličen aromatski ogljikovodik. Bioluminiscenčne teste so izvedli z različnimi koncentracijami toluena (10 ng/l do 10 mg/l) in ob različnih časih po izpostavitvi celic toluenu (1 h do 5,5 h), intenziteto bioluminiscence pa so merili z [https://www.berthold.com/en/bio/monochromator_multilabel_microplate_reader_Mithras2_LB943 monokromatskim čitalcem]. Pokazali so, da niti toluen niti uporabljen sev ''E. coli'' sama po sebi nista bioluminiscenčna. Nato so ugotovili, da uporabljen promotor Pu, ki naj bi bil inducibilen, pušča (tj. do neke mere omogoča izražanje gena, ki ga regulira, tudi ob odsotnosti aktivacijskega signala), vendar pa je bioluminiscenca celic v prisotnosti toluena občutno višja kot ob njegovi odsotnosti, kar za delovanje biosenzorja zadostuje.
Kot časovno točko, v kateri naj bi bilo najbolj smiselno izvesti meritev, so izbrali 5 h 30 min po dodatku toluena. Ker je intenziteta bioluminiscence časovno odvisna, mora biti test vedno izveden ob enakem, natančno odmerjenem času po vzorčenju. Najpomembnejši zaključek karakterizacije je, da je izdelan biosenzor sposoben zanesljive zaznave koncentracij toluena, ki so prisotne v onesnaženem zraku (okoli 10 ng/l), ni pa sposoben zelo natančne kvantifikacije, najverjetneje zaradi variacij v metabolizmu živih organizmov.

== Strojna oprema ==
=== Dron ===
Cilj projekta je bil ustvariti letečo napravo za spremljanje onesnaženosti zraka s hlapnimi organskimi molekulami. V ta namen je ekipa zasnovala in z uporabo 3D-tiskalnika tudi ustvarila dron, ki je sposoben vzorčenja zraka, hkrati pa lahko bakterije prenaša brez tveganja za širjenje teh gensko spremenjenih organizmov v okolje. To zagotavlja majhna steklenička belila, pritrjena pod dron, ki se v primeru nesreče razbije, belilo iz nje pa uniči bakterije. Tehnologija, potrebna za analizo bioluminiscence na terenu, ekipi v okviru tekmovanja iGEM žal ni bila dostopna. Rešitev sicer vidijo v majhni na svetlobo občutljivi celici in mikrofluidnem vezju, ki bi bakterijske celice posamič vodilo mimo nje. Podobno je težje uresničljiva zamisel o daljinskem vodenju drona, ki bi omogočalo avtomatsko kartiranje in učinkovito načrtovanje leta.

=== Epruveta za bakterije ===
Predel v dronu, ki vsebuje bakterije, ne sme dopuščati možnosti njihovega širjenja v okolje, hkrati pa mora bakterijam dovesti zrak, ki ga želimo analizirati. Pariški študentje so v ta namen zasnovali in s 3D-tiskalnikom izdelali epruveto, ki deluje po principu zračne ključavnice. Vsebuje namreč predel med bakterijami in zunanjostjo, preko katerega se brez neposrednega stika med vsebino epruvete in okoljem bakterijam dovaja zunanji zrak.

== Zaključek ==
Ob zaključku projekta študentje predlagajo nekaj izboljšav, ki bi lahko doprinesle h kvaliteti njihovega prototipa. Standardno krivuljo nameravajo izboljšati z meritvami nižjih koncentracij toluena ter določiti najnižjo koncentracijo, ki jo Quantifly natančno zazna. Izvesti nameravajo še eksperimente z ostalimi toluenu podobnimi molekulami kot je npr. ksilen. Iz praktičnih razlogov so v laboratoriju bioluminiscenčne teste izvajali s tekočim toluenom, v prihodnje pa želijo vzpostaviti izolirano hermetično zaprto sobo s hlapi toluena, v kateri bi lahko opravili vzorčenje zraka. Veliko težavo, katere rešitve študentje zaenkrat ne komentirajo, pa predstavljajo variacijev bioluminiscenčnem testu, ki so posledica razlik v metabolizmu živih organizmov.
Kljub pomanjkljivostim projekta je bila ekipa v sklopu tekmovanja iGEM 2016 za svoje delo nominirana za najboljši okoljski projekt, najboljšo predstavitev projekta in najbolj uporaben projekt.

== Vir ==
[http://2016.igem.org/Team:Ionis_Paris Wiki stran ekipe Ionis Paris 2016]

[[Seminarji SB 12016/17]]

Quantifly

2016-11-28T13:37:11Z

Ema Guštin: /* Karakterizacija biosenzorja */

[http://2016.igem.org/Team:Ionis_Paris Ionis Paris - Quantifly]

== Uvod ==
V zadnjih letih se ljudje čedalje bolj zavedamo problematike onesnaženosti okolja na različnih nivojih. V zraku so na primer prisotni številni plini in trdni delci s škodljivim vplivom na zdravje ljudi in na okolje, ki nastajajo pri nekaterih naravnih pojavih kot so vulkanski izbruhi, požari in razgradnja organskih snovi, ter predvsem kot posledica človeške dejavnosti (npr. industrija, promet, kmetijstvo in ogrevanje). Hlapne organske spojine, med katere spadajo nekateri ciklični aromatski ogljikovodiki in aldehidi, sicer predstavljajo le 2 % snovi, ki prispevajo k onesnaženosti zraka, njihov škodljiv vpliv na zdravje ljudi in na okolje pa je zelo velik. Skupina študentov iz Pariza je v svojem projektu, s katerim je sodelovala na sinteznobiološkem tekmovanju iGEM 2016, izdelala mobilno napravo za zaznavanje in natančno kvantifikacijo omenjenih organskih onesnaževalcev zraka, ki so jo poimenovali Quantifly.

== Biosenzor ==
Biosenzorji so celostne in samostojne merilne naprave oz. sistemi, ki vsebujejo biološko komponento, sposobno prepoznavanja in kvantifikacije specifičnih dražljajev. Lahko gre za makromolekulo, organel, celico ali tkivo. Ključna elementa biosenzorja sta detektor, ki prepozna vhodni dražljaj in reporter, ki sproži izhodni signal.

===Načrtovanje biosenzorja===
Mladi francoski sintezni biologi so izdelali celični, natančneje bakterijski biosenzor. Kot ogrodje so uporabili nepatogeni laboratorijski sev bakterijske vrste ''Escherichia coli'', DH5α. S ciljem ustvariti organizem, ki bo zaznal specifičen onesnaževalec zraka in se nanj odzval z oddajanjem bioluminiscenčnega signala, so izdelali genski konstrukt, sestavljen iz konstitutivnega promotorja Pr, gena XylR, inducibilnega promotorja Pu, gena GLuc in plazmidnega ogrodja pSB1C3.

Konstitutivni promotor Pr uravnava izražanje gena za protein XylR. Ta detektorski protein je sposoben vezave aromatskih ogljikovodikov z metilno skupino (npr. toluen in ksilen). Ko veže tako molekulo, se konformacijsko spremeni, dimerizira in se veže na DNA, ob dimerizaciji dveh dimerov pa kot transkripcijski regulator deluje na promotor Pu. Aktivacija promotorja Pu omogoči transkripcijo gena GLuc, ki kodira za reporterski bioluminiscenčni protein luciferazo iz organizmov rodu ''Gaussia''. Ta encim katalizira oksidacijo organske spojine koelenterazin, pri čemer se sprošča modra svetloba z emisijskim maksimumom pri 488 nm.

=== Optimizacija plazmida ===
Da bi dosegli čim boljše delovanje zgoraj opisanega genskega konstrukta, so člani pariške sinteznobiološke ekipe uporabili pred kratkim ustvarjeno prosto dostopno programsko opremo [http://cellocad.org/index.html CelloCAD]. Deluje tako, da genski konstrukt, ki ga vnesemo v program, s pomočjo zmogljivih bioinformatskih orodij preoblikuje v najboljši možen plazmid za izbrano kombinacijo genetskih elementov. Študentje so želeli primerjati delovanje samostojno zasnovanega plazmida s plazmidom, ki ga oblikuje program (npr. območje detekcije in odzivnost). Pri tem so naleteli na oviro, saj je za delovanje programske opreme potrebno vnesti relativne enote promotorjev (''ang.'' relative promoter units, RPU). Na voljo namreč (še) ni nobene podatkovne baze RPU za to razmeroma novo metodo. Tako so nadobudni študentje z upanjem, da bo njihovo delo predstavljalo začetek množičnega zbiranja podatkov o RPU, določili RPU za promotorja Pr in Pu. V ta namen so oblikovali serijo biokock, pri čemer so izbrana promotorja povezali z zapisom za zeleni fluorescirajoči protein (''ang.'' green fluorescent protein, GFP). RPU so neposredno povezane z izražanjem GFP v posamezni celici, kar so kvantificirali s pretočnim citometrom.

=== Karakterizacija biosenzorja ===
Člani ekipe so za neposredno potrditev izražanja gena za XylR, uravnavanega z inducibilnim promotorjem Pu, želeli narediti fuzijo transkripcijskega faktorja XylR z rdečim fluorescenčnim proteinom (''ang.'' red fluorescent protein, RFP), vendar pa bi bil tak konstrukt prevelik. Zato so uporabili biokocko, sestavljeno iz promotorja Pr, prvega vezavnega mesta za ribosom (''ang.'' ribosome-binding site, RBS), gena za XylR, drugega RBS, gena za mRFP in terminatorja, ter z dokazom o izražanju RFP posredno potrdili tudi izražanje XylR.

Za karakterizacijo biosenzorja je skupina uporabila toluen, hlapen cikličen aromatski ogljikovodik. Bioluminiscenčne teste so izvedli z različnimi koncentracijami toluena (10 ng/l do 10 mg/l) in ob različnih časih po izpostavitvi celic toluenu (1 h do 5,5 h), intenziteto bioluminiscence pa so merili z [https://www.berthold.com/en/bio/monochromator_multilabel_microplate_reader_Mithras2_LB943 monokromatskim čitalcem]. Pokazali so, da niti toluen niti uporabljen sev ''E. coli'' sama po sebi nista bioluminiscenčna. Nato so ugotovili, da uporabljen promotor Pu, ki naj bi bil inducibilen, pušča (tj. do neke mere omogoča izražanje gena, ki ga regulira, tudi ob odsotnosti aktivacijskega signala), vendar pa je bioluminiscenca celic v prisotnosti toluena občutno višja kot ob njegovi odsotnosti, kar za delovanje biosenzorja zadostuje.
Kot časovno točko, v kateri naj bi bilo najbolj smiselno izvesti meritev, so izbrali 5 h 30 min po dodatku toluena. Ker je intenziteta bioluminiscence časovno odvisna, mora biti test vedno izveden ob enakem, natančno odmerjenem času po vzorčenju. Najpomembnejši zaključek karakterizacije je, da je izdelan biosenzor sposoben zanesljive zaznave koncentracij toluena, ki so prisotne v onesnaženem zraku (okoli 10 ng/l), ni pa sposoben zelo natančne kvantifikacije, najverjetneje zaradi variacij v metabolizmu živih organizmov.

== Strojna oprema ==
=== Dron ===
Cilj projekta je bil ustvariti letečo napravo za spremljanje onesnaženosti zraka s hlapnimi organskimi molekulami. V ta namen je ekipa zasnovala in z uporabo 3D-tiskalnika tudi ustvarila dron, ki je sposoben vzorčenja zraka, hkrati pa lahko bakterije prenaša brez tveganja za širjenje teh gensko spremenjenih organizmov v okolje. To zagotavlja majhna steklenička belila, pritrjena pod dron, ki se v primeru nesreče razbije, belilo iz nje pa uniči bakterije. Tehnologija, potrebna za analizo bioluminiscence na terenu, ekipi v okviru tekmovanja iGEM žal ni bila dostopna. Rešitev sicer vidijo v majhni na svetlobo občutljivi celici in mikrofluidnem vezju, ki bi bakterijske celice posamič vodilo mimo nje. Podobno je težje uresničljiva zamisel o daljinskem vodenju drona, ki bi omogočalo avtomatsko kartiranje in učinkovito načrtovanje leta.

=== Epruveta za bakterije ===
Predel v dronu, ki vsebuje bakterije, ne sme dopuščati možnosti njihovega širjenja v okolje, hkrati pa mora bakterijam dovesti zrak, ki ga želimo analizirati. Pariški študentje so v ta namen zasnovali in s 3D-tiskalnikom izdelali epruveto, ki deluje po principu zračne ključavnice. Vsebuje namreč predel med bakterijami in zunanjostjo, preko katerega se brez neposrednega stika med vsebino epruvete in okoljem bakterijam dovaja zunanji zrak.

== Zaključek ==
Ob zaključku projekta študentje predlagajo nekaj izboljšav, ki bi lahko doprinesle h kvaliteti njihovega prototipa. Standardno krivuljo nameravajo izboljšati z meritvami nižjih koncentracij toluena ter določiti najnižjo koncentracijo, ki jo Quantifly natančno zazna. Izvesti nameravajo še eksperimente z ostalimi toluenu podobnimi molekulami kot je npr. ksilen. Iz praktičnih razlogov so v laboratoriju bioluminiscenčne teste izvajali s tekočim toluenom, v prihodnje pa želijo vzpostaviti izolirano hermetično zaprto sobo s hlapi toluena, v kateri bi lahko opravili vzorčenje zraka. Veliko težavo, katere rešitve študentje zaenkrat ne komentirajo, pa predstavljajo variacijev bioluminiscenčnem testu, ki so posledica razlik v metabolizmu živih organizmov.
Kljub pomanjkljivostim projekta je bila ekipa v sklopu tekmovanja iGEM 2016 za svoje delo nominirana za najboljši okoljski projekt, najboljšo predstavitev projekta in najbolj uporaben projekt.

== Vir ==
[http://2016.igem.org/Team:Ionis_Paris Wiki stran ekipe Ionis Paris 2016]

[[Seminarji SB 12016/17]]

Seminarji SB 12016/17

2016-11-28T13:30:38Z

Ema Guštin: Seminarji SB 12016/17 moved to Seminarji SB 2016/17: There was a minor error in the title

#REDIRECT [[Seminarji SB 2016/17]]

Seminarji SB 2016/17

2016-11-28T13:30:38Z

Ema Guštin: Seminarji SB 12016/17 moved to Seminarji SB 2016/17: There was a minor error in the title

V študijskem letu 2016/17 študentje predstavljajo naslednje teme:

RAZISKOVALNI ČLANKI 
(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.)
# [[Učinkovito ciljanje izraženih in utišanih genov v človeških zarodnih in induciranih pluripotentnih celicah z nukleazami z motivi cinkovih prstov]]. Angelika Vižintin (22. 11. 2016)
# [[Izdelava sintetičnega genoma s pristopom sestavljanja celotnega genoma: Bakteriofag φX174 iz sintetičnih oligonukleotidov]]. Darja Božič (22.11.2016)
# [[Modeliranje sintetične večcelične ure: Represilatorji, sklopljeni z zaznavanjem celične gostote]]. Vita Vidmar (22. 11. 2016)

NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI 
(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.)
#[[Mezenhimske matične celice nove generacije]]. Danijela Jošić (22.11.2016)
#[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Bakterije%2C_ki_kelirajo_bakrove_ione%2C_v_boju_proti_Wilsonovi_bolezni Bakterije, ki kelirajo bakrove ione, v boju proti Wilsonovi bolezni. Simon Bolta (22. 11. 2016)]
#[["Training protein" - PETaze]]. Urša Kapš (29.11.2016)
#[[Plasticure: rešitev za učinkovitejšo razgradnjo plastike]]. Marjeta Horvat (29. 11. 2016)
#[[Quantifly]]. Ema Guštin (29. 11. 2016)
#[[Ecolibrium – razvoj ogrodja za inženiring mešanih kultur]]. Mojca Juteršek (29. 11. 2016)

Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Predstavitev seminarja naj bo dolga 12 minut (10-14). Sledila bo razprava, ki praviloma ne bo daljša od 5 minut.

Quantifly

2016-11-28T01:19:47Z

Ema Guštin: /* Karakterizacija biosenzorja */

[http://2016.igem.org/Team:Ionis_Paris Ionis Paris - Quantifly]

== Uvod ==
V zadnjih letih se ljudje čedalje bolj zavedamo problematike onesnaženosti okolja na različnih nivojih. V zraku so na primer prisotni številni plini in trdni delci s škodljivim vplivom na zdravje ljudi in na okolje, ki nastajajo pri nekaterih naravnih pojavih kot so vulkanski izbruhi, požari in razgradnja organskih snovi, ter predvsem kot posledica človeške dejavnosti (npr. industrija, promet, kmetijstvo in ogrevanje). Hlapne organske spojine, med katere spadajo nekateri ciklični aromatski ogljikovodiki in aldehidi, sicer predstavljajo le 2 % snovi, ki prispevajo k onesnaženosti zraka, njihov škodljiv vpliv na zdravje ljudi in na okolje pa je zelo velik. Skupina študentov iz Pariza je v svojem projektu, s katerim je sodelovala na sinteznobiološkem tekmovanju iGEM 2016, izdelala mobilno napravo za zaznavanje in natančno kvantifikacijo omenjenih organskih onesnaževalcev zraka, ki so jo poimenovali Quantifly.

== Biosenzor ==
Biosenzorji so celostne in samostojne merilne naprave oz. sistemi, ki vsebujejo biološko komponento, sposobno prepoznavanja in kvantifikacije specifičnih dražljajev. Lahko gre za makromolekulo, organel, celico ali tkivo. Ključna elementa biosenzorja sta detektor, ki prepozna vhodni dražljaj in reporter, ki sproži izhodni signal.

===Načrtovanje biosenzorja===
Mladi francoski sintezni biologi so izdelali celični, natančneje bakterijski biosenzor. Kot ogrodje so uporabili nepatogeni laboratorijski sev bakterijske vrste ''Escherichia coli'', DH5α. S ciljem ustvariti organizem, ki bo zaznal specifičen onesnaževalec zraka in se nanj odzval z oddajanjem bioluminiscenčnega signala, so izdelali genski konstrukt, sestavljen iz konstitutivnega promotorja Pr, gena XylR, inducibilnega promotorja Pu, gena GLuc in plazmidnega ogrodja pSB1C3.

Konstitutivni promotor Pr uravnava izražanje gena za protein XylR. Ta detektorski protein je sposoben vezave aromatskih ogljikovodikov z metilno skupino (npr. toluen in ksilen). Ko veže tako molekulo, se konformacijsko spremeni, dimerizira in se veže na DNA, ob dimerizaciji dveh dimerov pa kot transkripcijski regulator deluje na promotor Pu. Aktivacija promotorja Pu omogoči transkripcijo gena GLuc, ki kodira za reporterski bioluminiscenčni protein luciferazo iz organizmov rodu ''Gaussia''. Ta encim katalizira oksidacijo organske spojine koelenterazin, pri čemer se sprošča modra svetloba z emisijskim maksimumom pri 488 nm.

=== Optimizacija plazmida ===
Da bi dosegli čim boljše delovanje zgoraj opisanega genskega konstrukta, so člani pariške sinteznobiološke ekipe uporabili pred kratkim ustvarjeno prosto dostopno programsko opremo [http://cellocad.org/index.html CelloCAD]. Deluje tako, da genski konstrukt, ki ga vnesemo v program, s pomočjo zmogljivih bioinformatskih orodij preoblikuje v najboljši možen plazmid za izbrano kombinacijo genetskih elementov. Študentje so želeli primerjati delovanje samostojno zasnovanega plazmida s plazmidom, ki ga oblikuje program (npr. območje detekcije in odzivnost). Pri tem so naleteli na oviro, saj je za delovanje programske opreme potrebno vnesti relativne enote promotorjev (''ang.'' relative promoter units, RPU). Na voljo namreč (še) ni nobene podatkovne baze RPU za to razmeroma novo metodo. Tako so nadobudni študentje z upanjem, da bo njihovo delo predstavljalo začetek množičnega zbiranja podatkov o RPU, določili RPU za promotorja Pr in Pu. V ta namen so oblikovali serijo biokock, pri čemer so izbrana promotorja povezali z zapisom za zeleni fluorescirajoči protein (''ang.'' green fluorescent protein, GFP). RPU so neposredno povezane z izražanjem GFP v posamezni celici, kar so kvantificirali s pretočnim citometrom.

=== Karakterizacija biosenzorja ===
Člani ekipe so za neposredno potrditev izražanja gena za XylR, uravnavanega z inducibilnim promotorjem Pu, želeli narediti fuzijo transkripcijskega faktorja XylR z rdečim fluorescenčnim proteinom (''ang.'' red fluorescent protein, RFP), vendar pa bi bil tak konstrukt prevelik. Zato so uporabili biokocko, sestavljeno iz promotorja Pr, prvega vezavnega mesta za ribosom (''ang.'' ribosome-binding site, RBS), gena za XylR, drugega RBS, gena za mRFP in terminatorja, ter z dokazom o izražanju RFP posredno potrdili tudi izražanje XylR.

Za karakterizacijo biosenzorja je skupina uporabila toluen, hlapen cikličen aromatski ogljikovodik. Bioluminiscenčne teste so izvedli z različnimi koncentracijami toluena (10 ng/l do 10 mg/l) in ob različnih časih po izpostavitvi celic toluenu (1 h do 5,5 h), intenziteto bioluminiscence pa so merili z [https://www.berthold.com/en/bio/monochromator_multilabel_microplate_reader_Mithras2_LB943 monokromatskim čitalcem]. Pokazali so, da niti toluen niti uporabljen sev ''E. coli'' sama po sebi nista bioluminiscenčna. Ugotovili so tudi, da uporabljen promotor Pu, ki naj bi bil inducibilen, pušča (tj. do neke mere omogoča izražanje gena, ki ga regulira, tudi ob odsotnosti aktivacijskega signala), vendar pa je bioluminiscenca celic v prisotnosti toluena občutno višja kot ob njegovi odsotnosti, kar za delovanje biosenzorja zadostuje.
Kot časovno točko, v kateri naj bi bilo najbolj smiselno izvesti meritev, so izbrali 5 h 30 min po dodatku toluena. Ker je intenziteta bioluminiscence časovno odvisna, mora biti test izveden ob natančno odmerjenem času po vzorčenju. Izdelan biosenzor je sposoben zanesljive zaznave koncentracij toluena, kakršne so prisotne v onesnaženem zraku (okoli 10 ng/l), ni pa sposoben zelo natančne kvantifikacije, najverjetneje zaradi variacij v metabolizmu živih organizmov.

== Strojna oprema ==
=== Dron ===
Cilj projekta je bil ustvariti letečo napravo za spremljanje onesnaženosti zraka s hlapnimi organskimi molekulami. V ta namen je ekipa zasnovala in z uporabo 3D-tiskalnika tudi ustvarila dron, ki je sposoben vzorčenja zraka, hkrati pa lahko bakterije prenaša brez tveganja za širjenje teh gensko spremenjenih organizmov v okolje. To zagotavlja majhna steklenička belila, pritrjena pod dron, ki se v primeru nesreče razbije, belilo iz nje pa uniči bakterije. Tehnologija, potrebna za analizo bioluminiscence na terenu, ekipi v okviru tekmovanja iGEM žal ni bila dostopna. Rešitev sicer vidijo v majhni na svetlobo občutljivi celici in mikrofluidnem vezju, ki bi bakterijske celice posamič vodilo mimo nje. Podobno je težje uresničljiva zamisel o daljinskem vodenju drona, ki bi omogočalo avtomatsko kartiranje in učinkovito načrtovanje leta.

=== Epruveta za bakterije ===
Predel v dronu, ki vsebuje bakterije, ne sme dopuščati možnosti njihovega širjenja v okolje, hkrati pa mora bakterijam dovesti zrak, ki ga želimo analizirati. Pariški študentje so v ta namen zasnovali in s 3D-tiskalnikom izdelali epruveto, ki deluje po principu zračne ključavnice. Vsebuje namreč predel med bakterijami in zunanjostjo, preko katerega se brez neposrednega stika med vsebino epruvete in okoljem bakterijam dovaja zunanji zrak.

== Zaključek ==
Ob zaključku projekta študentje predlagajo nekaj izboljšav, ki bi lahko doprinesle h kvaliteti njihovega prototipa. Standardno krivuljo nameravajo izboljšati z meritvami nižjih koncentracij toluena ter določiti najnižjo koncentracijo, ki jo Quantifly natančno zazna. Izvesti nameravajo še eksperimente z ostalimi toluenu podobnimi molekulami kot je npr. ksilen. Iz praktičnih razlogov so v laboratoriju bioluminiscenčne teste izvajali s tekočim toluenom, v prihodnje pa želijo vzpostaviti izolirano hermetično zaprto sobo s hlapi toluena, v kateri bi lahko opravili vzorčenje zraka. Veliko težavo, katere rešitve študentje zaenkrat ne komentirajo, pa predstavljajo variacijev bioluminiscenčnem testu, ki so posledica razlik v metabolizmu živih organizmov.
Kljub pomanjkljivostim projekta je bila ekipa v sklopu tekmovanja iGEM 2016 za svoje delo nominirana za najboljši okoljski projekt, najboljšo predstavitev projekta in najbolj uporaben projekt.

== Vir ==
[http://2016.igem.org/Team:Ionis_Paris Wiki stran ekipe Ionis Paris 2016]

[[Seminarji SB 12016/17]]

Quantifly

2016-11-28T00:56:43Z

Ema Guštin: /* Karakterizacija biosenzorja */

[http://2016.igem.org/Team:Ionis_Paris Ionis Paris - Quantifly]

== Uvod ==
V zadnjih letih se ljudje čedalje bolj zavedamo problematike onesnaženosti okolja na različnih nivojih. V zraku so na primer prisotni številni plini in trdni delci s škodljivim vplivom na zdravje ljudi in na okolje, ki nastajajo pri nekaterih naravnih pojavih kot so vulkanski izbruhi, požari in razgradnja organskih snovi, ter predvsem kot posledica človeške dejavnosti (npr. industrija, promet, kmetijstvo in ogrevanje). Hlapne organske spojine, med katere spadajo nekateri ciklični aromatski ogljikovodiki in aldehidi, sicer predstavljajo le 2 % snovi, ki prispevajo k onesnaženosti zraka, njihov škodljiv vpliv na zdravje ljudi in na okolje pa je zelo velik. Skupina študentov iz Pariza je v svojem projektu, s katerim je sodelovala na sinteznobiološkem tekmovanju iGEM 2016, izdelala mobilno napravo za zaznavanje in natančno kvantifikacijo omenjenih organskih onesnaževalcev zraka, ki so jo poimenovali Quantifly.

== Biosenzor ==
Biosenzorji so celostne in samostojne merilne naprave oz. sistemi, ki vsebujejo biološko komponento, sposobno prepoznavanja in kvantifikacije specifičnih dražljajev. Lahko gre za makromolekulo, organel, celico ali tkivo. Ključna elementa biosenzorja sta detektor, ki prepozna vhodni dražljaj in reporter, ki sproži izhodni signal.

===Načrtovanje biosenzorja===
Mladi francoski sintezni biologi so izdelali celični, natančneje bakterijski biosenzor. Kot ogrodje so uporabili nepatogeni laboratorijski sev bakterijske vrste ''Escherichia coli'', DH5α. S ciljem ustvariti organizem, ki bo zaznal specifičen onesnaževalec zraka in se nanj odzval z oddajanjem bioluminiscenčnega signala, so izdelali genski konstrukt, sestavljen iz konstitutivnega promotorja Pr, gena XylR, inducibilnega promotorja Pu, gena GLuc in plazmidnega ogrodja pSB1C3.

Konstitutivni promotor Pr uravnava izražanje gena za protein XylR. Ta detektorski protein je sposoben vezave aromatskih ogljikovodikov z metilno skupino (npr. toluen in ksilen). Ko veže tako molekulo, se konformacijsko spremeni, dimerizira in se veže na DNA, ob dimerizaciji dveh dimerov pa kot transkripcijski regulator deluje na promotor Pu. Aktivacija promotorja Pu omogoči transkripcijo gena GLuc, ki kodira za reporterski bioluminiscenčni protein luciferazo iz organizmov rodu ''Gaussia''. Ta encim katalizira oksidacijo organske spojine koelenterazin, pri čemer se sprošča modra svetloba z emisijskim maksimumom pri 488 nm.

=== Optimizacija plazmida ===
Da bi dosegli čim boljše delovanje zgoraj opisanega genskega konstrukta, so člani pariške sinteznobiološke ekipe uporabili pred kratkim ustvarjeno prosto dostopno programsko opremo [http://cellocad.org/index.html CelloCAD]. Deluje tako, da genski konstrukt, ki ga vnesemo v program, s pomočjo zmogljivih bioinformatskih orodij preoblikuje v najboljši možen plazmid za izbrano kombinacijo genetskih elementov. Študentje so želeli primerjati delovanje samostojno zasnovanega plazmida s plazmidom, ki ga oblikuje program (npr. območje detekcije in odzivnost). Pri tem so naleteli na oviro, saj je za delovanje programske opreme potrebno vnesti relativne enote promotorjev (''ang.'' relative promoter units, RPU). Na voljo namreč (še) ni nobene podatkovne baze RPU za to razmeroma novo metodo. Tako so nadobudni študentje z upanjem, da bo njihovo delo predstavljalo začetek množičnega zbiranja podatkov o RPU, določili RPU za promotorja Pr in Pu. V ta namen so oblikovali serijo biokock, pri čemer so izbrana promotorja povezali z zapisom za zeleni fluorescirajoči protein (''ang.'' green fluorescent protein, GFP). RPU so neposredno povezane z izražanjem GFP v posamezni celici, kar so kvantificirali s pretočnim citometrom.

=== Karakterizacija biosenzorja ===
Skupina je za karakterizacijo biosenzorja uporabila toluen, hlapen cikličen aromatski ogljikovodik. S testom vpliva te spojine na preživetje celic so pokazali, da pri koncentracijah nižjih od 0,5 mg/ml toluen ne vpliva na njihovo rastno krivuljo.

Za neposredno potrditev izražanja gena za XylR, uravnavanega z inducibilnim promotorjem Pu, so želeli narediti fuzijo transkripcijskega faktorja XylR z rdečim fluorescenčnim proteinom (''ang.'' red fluorescent protein, RFP), vendar pa bi bil tak konstrukt prevelik. Zato so uporabili biokocko, sestavljeno iz promotorja Pr, prvega vezavnega mesta za ribosom (''ang.'' ribosome-binding site, RBS), gena za XylR, drugega RBS, gena za mRFP in terminatorja, ter z dokazom o izražanju RFP posredno potrdili tudi izražanje XylR.

Bioluminiscenčne teste so izvedli z različnimi koncentracijami toluena (10 ng/l do 10 mg/l) in ob različnih časih po izpostavitvi celic toluenu (1 h do 5,5 h). Intenziteto fluorescence so merili z [https://www.berthold.com/en/bio/monochromator_multilabel_microplate_reader_Mithras2_LB943 monokromatskim čitalcem]. Pokazali so, da niti toluen niti uporabljen sev ''E. coli'' sama po sebi nista bioluminiscenčna.
Nato so primerjali intenziteto bioluminiscence svojega biosenzorja ob odsotnosti toluena in intenziteto bioluminiscence (sicer enakega) kontrolnega konstrukta brez gena za luciferazo ter ugotovili, da promotor Pr pušča. Intenziteta bioluminiscence biosenzorja je bila namreč bistveno večja od kontrolnega vzorca, čeprav se v idealnem primeru ne bi smeli razlikovati. Vendar pa so z nadaljnjimi poskusi pokazali, da je ta bioluminiscenca občutno nižja kot v prisotnosti toluena, kar za delovanje biosenzorja zadostuje.
Sledil je časovni poskus, v katerem so za vsako izmed izbranih koncentracij toluena, dodanega celicam, izvedli meritve intenzitete bioluminiscence v določenih časovnih točkah po izpostavitvi biosenzorja toluenu. Pokazali so, da intenziteta bioluminiscence do časovne točke 5 h 30 min po izpostavitvi celic toluenu pri vzorcih z dodanimi relevantnimi, tj. nižjimi koncentracijami toluena, raste. Čeprav razlika med kontrolnimi in toluenu izpostavljenimi bakterijami postane zelo signifikantna že po treh urah, so zaradi večje zanesljivosti kot optimalen čas merjenja izbrali 5,5 h po dodatku toluena.

== Strojna oprema ==
=== Dron ===
Cilj projekta je bil ustvariti letečo napravo za spremljanje onesnaženosti zraka s hlapnimi organskimi molekulami. V ta namen je ekipa zasnovala in z uporabo 3D-tiskalnika tudi ustvarila dron, ki je sposoben vzorčenja zraka, hkrati pa lahko bakterije prenaša brez tveganja za širjenje teh gensko spremenjenih organizmov v okolje. To zagotavlja majhna steklenička belila, pritrjena pod dron, ki se v primeru nesreče razbije, belilo iz nje pa uniči bakterije. Tehnologija, potrebna za analizo bioluminiscence na terenu, ekipi v okviru tekmovanja iGEM žal ni bila dostopna. Rešitev sicer vidijo v majhni na svetlobo občutljivi celici in mikrofluidnem vezju, ki bi bakterijske celice posamič vodilo mimo nje. Podobno je težje uresničljiva zamisel o daljinskem vodenju drona, ki bi omogočalo avtomatsko kartiranje in učinkovito načrtovanje leta.

=== Epruveta za bakterije ===
Predel v dronu, ki vsebuje bakterije, ne sme dopuščati možnosti njihovega širjenja v okolje, hkrati pa mora bakterijam dovesti zrak, ki ga želimo analizirati. Pariški študentje so v ta namen zasnovali in s 3D-tiskalnikom izdelali epruveto, ki deluje po principu zračne ključavnice. Vsebuje namreč predel med bakterijami in zunanjostjo, preko katerega se brez neposrednega stika med vsebino epruvete in okoljem bakterijam dovaja zunanji zrak.

== Zaključek ==
Ob zaključku projekta študentje predlagajo nekaj izboljšav, ki bi lahko doprinesle h kvaliteti njihovega prototipa. Standardno krivuljo nameravajo izboljšati z meritvami nižjih koncentracij toluena ter določiti najnižjo koncentracijo, ki jo Quantifly natančno zazna. Izvesti nameravajo še eksperimente z ostalimi toluenu podobnimi molekulami kot je npr. ksilen. Iz praktičnih razlogov so v laboratoriju bioluminiscenčne teste izvajali s tekočim toluenom, v prihodnje pa želijo vzpostaviti izolirano hermetično zaprto sobo s hlapi toluena, v kateri bi lahko opravili vzorčenje zraka. Veliko težavo, katere rešitve študentje zaenkrat ne komentirajo, pa predstavljajo variacijev bioluminiscenčnem testu, ki so posledica razlik v metabolizmu živih organizmov.
Kljub pomanjkljivostim projekta je bila ekipa v sklopu tekmovanja iGEM 2016 za svoje delo nominirana za najboljši okoljski projekt, najboljšo predstavitev projekta in najbolj uporaben projekt.

== Vir ==
[http://2016.igem.org/Team:Ionis_Paris Wiki stran ekipe Ionis Paris 2016]

[[Seminarji SB 12016/17]]

Quantifly

2016-11-28T00:28:26Z

Ema Guštin: /* Karakterizacija biosenzorja */

[http://2016.igem.org/Team:Ionis_Paris Ionis Paris - Quantifly]

== Uvod ==
V zadnjih letih se ljudje čedalje bolj zavedamo problematike onesnaženosti okolja na različnih nivojih. V zraku so na primer prisotni številni plini in trdni delci s škodljivim vplivom na zdravje ljudi in na okolje, ki nastajajo pri nekaterih naravnih pojavih kot so vulkanski izbruhi, požari in razgradnja organskih snovi, ter predvsem kot posledica človeške dejavnosti (npr. industrija, promet, kmetijstvo in ogrevanje). Hlapne organske spojine, med katere spadajo nekateri ciklični aromatski ogljikovodiki in aldehidi, sicer predstavljajo le 2 % snovi, ki prispevajo k onesnaženosti zraka, njihov škodljiv vpliv na zdravje ljudi in na okolje pa je zelo velik. Skupina študentov iz Pariza je v svojem projektu, s katerim je sodelovala na sinteznobiološkem tekmovanju iGEM 2016, izdelala mobilno napravo za zaznavanje in natančno kvantifikacijo omenjenih organskih onesnaževalcev zraka, ki so jo poimenovali Quantifly.

== Biosenzor ==
Biosenzorji so celostne in samostojne merilne naprave oz. sistemi, ki vsebujejo biološko komponento, sposobno prepoznavanja in kvantifikacije specifičnih dražljajev. Lahko gre za makromolekulo, organel, celico ali tkivo. Ključna elementa biosenzorja sta detektor, ki prepozna vhodni dražljaj in reporter, ki sproži izhodni signal.

===Načrtovanje biosenzorja===
Mladi francoski sintezni biologi so izdelali celični, natančneje bakterijski biosenzor. Kot ogrodje so uporabili nepatogeni laboratorijski sev bakterijske vrste ''Escherichia coli'', DH5α. S ciljem ustvariti organizem, ki bo zaznal specifičen onesnaževalec zraka in se nanj odzval z oddajanjem bioluminiscenčnega signala, so izdelali genski konstrukt, sestavljen iz konstitutivnega promotorja Pr, gena XylR, inducibilnega promotorja Pu, gena GLuc in plazmidnega ogrodja pSB1C3.

Konstitutivni promotor Pr uravnava izražanje gena za protein XylR. Ta detektorski protein je sposoben vezave aromatskih ogljikovodikov z metilno skupino (npr. toluen in ksilen). Ko veže tako molekulo, se konformacijsko spremeni, dimerizira in se veže na DNA, ob dimerizaciji dveh dimerov pa kot transkripcijski regulator deluje na promotor Pu. Aktivacija promotorja Pu omogoči transkripcijo gena GLuc, ki kodira za reporterski bioluminiscenčni protein luciferazo iz organizmov rodu ''Gaussia''. Ta encim katalizira oksidacijo organske spojine koelenterazin, pri čemer se sprošča modra svetloba z emisijskim maksimumom pri 488 nm.

=== Optimizacija plazmida ===
Da bi dosegli čim boljše delovanje zgoraj opisanega genskega konstrukta, so člani pariške sinteznobiološke ekipe uporabili pred kratkim ustvarjeno prosto dostopno programsko opremo [http://cellocad.org/index.html CelloCAD]. Deluje tako, da genski konstrukt, ki ga vnesemo v program, s pomočjo zmogljivih bioinformatskih orodij preoblikuje v najboljši možen plazmid za izbrano kombinacijo genetskih elementov. Študentje so želeli primerjati delovanje samostojno zasnovanega plazmida s plazmidom, ki ga oblikuje program (npr. območje detekcije in odzivnost). Pri tem so naleteli na oviro, saj je za delovanje programske opreme potrebno vnesti relativne enote promotorjev (''ang.'' relative promoter units, RPU). Na voljo namreč (še) ni nobene podatkovne baze RPU za to razmeroma novo metodo. Tako so nadobudni študentje z upanjem, da bo njihovo delo predstavljalo začetek množičnega zbiranja podatkov o RPU, določili RPU za promotorja Pr in Pu. V ta namen so oblikovali serijo biokock, pri čemer so izbrana promotorja povezali z zapisom za zeleni fluorescirajoči protein (''ang.'' green fluorescent protein, GFP). RPU so neposredno povezane z izražanjem GFP v posamezni celici, kar so kvantificirali s pretočnim citometrom.

=== Karakterizacija biosenzorja ===
Skupina je za karakterizacijo biosenzorja uporabila toluen, hlapen cikličen aromatski ogljikovodik. S testom vpliva te spojine na preživetje celic so pokazali, da pri koncentracijah nižjih od 0,5 mg/ml toluen ne vpliva na njihovo rastno krivuljo.

Za neposredno potrditev izražanja gena za XylR, uravnavanega z inducibilnim promotorjem Pu, so želeli narediti fuzijo transkripcijskega faktorja XylR z rdečim fluorescenčnim proteinom (''ang.'' red fluorescent protein, RFP), vendar pa bi bil tak konstrukt prevelik. Zato so uporabili biokocko, sestavljeno iz promotorja Pr, prvega vezavnega mesta za ribosom (''ang.'' ribosome-binding site, RBS), gena za XylR, drugega RBS, gena za mRFP in terminatorja, ter z dokazom o izražanju RFP posredno potrdili tudi izražanje XylR.

Bioluminiscenčne teste so izvedli z različnimi koncentracijami toluena (10 ng/l do 10 mg/l) in ob različnih časih po izpostavitvi celic toluenu (1 h do 5,5 h). Intenziteto fluorescence so merili z [https://www.berthold.com/en/bio/monochromator_multilabel_microplate_reader_Mithras2_LB943 monokromatskim čitalcem]. Pokazali so, da niti toluen niti uporabljen sev ''E. coli'' sama po sebi nista bioluminiscenčna.
Nato so primerjali intenziteto bioluminiscence svojega biosenzorja ob odsotnosti toluena in intenziteto bioluminiscence (sicer enakega) konstrukta brez gena za luciferazo ter ugotovili, da promotor Pr pušča. Intenziteta bioluminiscence biosenzorja je bila namreč bistveno večja od drugega, kontrolnega vzorca, čeprav se v idealnem primeru ne bi smeli razlikovati. Vendar pa so z nadaljnjimi poskusi pokazali, da je ta bioluminiscenca občutno nižja kot v prisotnosti toluena, kar za delovanje biosenzorja zadostuje.

== Strojna oprema ==
=== Dron ===
Cilj projekta je bil ustvariti letečo napravo za spremljanje onesnaženosti zraka s hlapnimi organskimi molekulami. V ta namen je ekipa zasnovala in z uporabo 3D-tiskalnika tudi ustvarila dron, ki je sposoben vzorčenja zraka, hkrati pa lahko bakterije prenaša brez tveganja za širjenje teh gensko spremenjenih organizmov v okolje. To zagotavlja majhna steklenička belila, pritrjena pod dron, ki se v primeru nesreče razbije, belilo iz nje pa uniči bakterije. Tehnologija, potrebna za analizo bioluminiscence na terenu, ekipi v okviru tekmovanja iGEM žal ni bila dostopna. Rešitev sicer vidijo v majhni na svetlobo občutljivi celici in mikrofluidnem vezju, ki bi bakterijske celice posamič vodilo mimo nje. Podobno je težje uresničljiva zamisel o daljinskem vodenju drona, ki bi omogočalo avtomatsko kartiranje in učinkovito načrtovanje leta.

=== Epruveta za bakterije ===
Predel v dronu, ki vsebuje bakterije, ne sme dopuščati možnosti njihovega širjenja v okolje, hkrati pa mora bakterijam dovesti zrak, ki ga želimo analizirati. Pariški študentje so v ta namen zasnovali in s 3D-tiskalnikom izdelali epruveto, ki deluje po principu zračne ključavnice. Vsebuje namreč predel med bakterijami in zunanjostjo, preko katerega se brez neposrednega stika med vsebino epruvete in okoljem bakterijam dovaja zunanji zrak.

== Zaključek ==
Ob zaključku projekta študentje predlagajo nekaj izboljšav, ki bi lahko doprinesle h kvaliteti njihovega prototipa. Standardno krivuljo nameravajo izboljšati z meritvami nižjih koncentracij toluena ter določiti najnižjo koncentracijo, ki jo Quantifly natančno zazna. Izvesti nameravajo še eksperimente z ostalimi toluenu podobnimi molekulami kot je npr. ksilen. Iz praktičnih razlogov so v laboratoriju bioluminiscenčne teste izvajali s tekočim toluenom, v prihodnje pa želijo vzpostaviti izolirano hermetično zaprto sobo s hlapi toluena, v kateri bi lahko opravili vzorčenje zraka. Veliko težavo, katere rešitve študentje zaenkrat ne komentirajo, pa predstavljajo variacijev bioluminiscenčnem testu, ki so posledica razlik v metabolizmu živih organizmov.
Kljub pomanjkljivostim projekta je bila ekipa v sklopu tekmovanja iGEM 2016 za svoje delo nominirana za najboljši okoljski projekt, najboljšo predstavitev projekta in najbolj uporaben projekt.

== Vir ==
[http://2016.igem.org/Team:Ionis_Paris Wiki stran ekipe Ionis Paris 2016]

[[Seminarji SB 12016/17]]

Quantifly

2016-11-28T00:04:32Z

Ema Guštin: /* Karakterizacija biosenzorja */

[http://2016.igem.org/Team:Ionis_Paris Ionis Paris - Quantifly]

== Uvod ==
V zadnjih letih se ljudje čedalje bolj zavedamo problematike onesnaženosti okolja na različnih nivojih. V zraku so na primer prisotni številni plini in trdni delci s škodljivim vplivom na zdravje ljudi in na okolje, ki nastajajo pri nekaterih naravnih pojavih kot so vulkanski izbruhi, požari in razgradnja organskih snovi, ter predvsem kot posledica človeške dejavnosti (npr. industrija, promet, kmetijstvo in ogrevanje). Hlapne organske spojine, med katere spadajo nekateri ciklični aromatski ogljikovodiki in aldehidi, sicer predstavljajo le 2 % snovi, ki prispevajo k onesnaženosti zraka, njihov škodljiv vpliv na zdravje ljudi in na okolje pa je zelo velik. Skupina študentov iz Pariza je v svojem projektu, s katerim je sodelovala na sinteznobiološkem tekmovanju iGEM 2016, izdelala mobilno napravo za zaznavanje in natančno kvantifikacijo omenjenih organskih onesnaževalcev zraka, ki so jo poimenovali Quantifly.

== Biosenzor ==
Biosenzorji so celostne in samostojne merilne naprave oz. sistemi, ki vsebujejo biološko komponento, sposobno prepoznavanja in kvantifikacije specifičnih dražljajev. Lahko gre za makromolekulo, organel, celico ali tkivo. Ključna elementa biosenzorja sta detektor, ki prepozna vhodni dražljaj in reporter, ki sproži izhodni signal.

===Načrtovanje biosenzorja===
Mladi francoski sintezni biologi so izdelali celični, natančneje bakterijski biosenzor. Kot ogrodje so uporabili nepatogeni laboratorijski sev bakterijske vrste ''Escherichia coli'', DH5α. S ciljem ustvariti organizem, ki bo zaznal specifičen onesnaževalec zraka in se nanj odzval z oddajanjem bioluminiscenčnega signala, so izdelali genski konstrukt, sestavljen iz konstitutivnega promotorja Pr, gena XylR, inducibilnega promotorja Pu, gena GLuc in plazmidnega ogrodja pSB1C3.

Konstitutivni promotor Pr uravnava izražanje gena za protein XylR. Ta detektorski protein je sposoben vezave aromatskih ogljikovodikov z metilno skupino (npr. toluen in ksilen). Ko veže tako molekulo, se konformacijsko spremeni, dimerizira in se veže na DNA, ob dimerizaciji dveh dimerov pa kot transkripcijski regulator deluje na promotor Pu. Aktivacija promotorja Pu omogoči transkripcijo gena GLuc, ki kodira za reporterski bioluminiscenčni protein luciferazo iz organizmov rodu ''Gaussia''. Ta encim katalizira oksidacijo organske spojine koelenterazin, pri čemer se sprošča modra svetloba z emisijskim maksimumom pri 488 nm.

=== Optimizacija plazmida ===
Da bi dosegli čim boljše delovanje zgoraj opisanega genskega konstrukta, so člani pariške sinteznobiološke ekipe uporabili pred kratkim ustvarjeno prosto dostopno programsko opremo [http://cellocad.org/index.html CelloCAD]. Deluje tako, da genski konstrukt, ki ga vnesemo v program, s pomočjo zmogljivih bioinformatskih orodij preoblikuje v najboljši možen plazmid za izbrano kombinacijo genetskih elementov. Študentje so želeli primerjati delovanje samostojno zasnovanega plazmida s plazmidom, ki ga oblikuje program (npr. območje detekcije in odzivnost). Pri tem so naleteli na oviro, saj je za delovanje programske opreme potrebno vnesti relativne enote promotorjev (''ang.'' relative promoter units, RPU). Na voljo namreč (še) ni nobene podatkovne baze RPU za to razmeroma novo metodo. Tako so nadobudni študentje z upanjem, da bo njihovo delo predstavljalo začetek množičnega zbiranja podatkov o RPU, določili RPU za promotorja Pr in Pu. V ta namen so oblikovali serijo biokock, pri čemer so izbrana promotorja povezali z zapisom za zeleni fluorescirajoči protein (''ang.'' green fluorescent protein, GFP). RPU so neposredno povezane z izražanjem GFP v posamezni celici, kar so kvantificirali s pretočnim citometrom.

=== Karakterizacija biosenzorja ===
Skupina je za karakterizacijo biosenzorja uporabila toluen, hlapen cikličen aromatski ogljikovodik. S testom vpliva te spojine na preživetje celic so pokazali, da pri koncentracijah nižjih od 0,5 mg/ml toluen ne vpliva na njihovo rastno krivuljo.

Za neposredno potrditev izražanja gena za XylR, uravnavanega z inducibilnim promotorjem Pu, so želeli narediti fuzijo transkripcijskega faktorja XylR z rdečim fluorescenčnim proteinom (''ang.'' red fluorescent protein, RFP), vendar pa bi bil tak konstrukt prevelik. Zato so uporabili biokocko, sestavljeno iz promotorja Pr, prvega vezavnega mesta za ribosom (''ang.'' ribosome-binding site, RBS), gena za XylR, drugega RBS, gena za mRFP in terminatorja, ter z dokazom o izražanju RFP posredno potrdili tudi izražanje XylR.

Bioluminiscenčne teste so izvedli z različnimi koncentracijami toluena (10 ng/l do 10 mg/l) in ob različnih časih po izpostavitvi celic toluenu (1 h do 5,5 h). Intenziteto fluorescence so merili z [https://www.berthold.com/en/bio/monochromator_multilabel_microplate_reader_Mithras2_LB943 monokromatskim čitalcem].

== Strojna oprema ==
=== Dron ===
Cilj projekta je bil ustvariti letečo napravo za spremljanje onesnaženosti zraka s hlapnimi organskimi molekulami. V ta namen je ekipa zasnovala in z uporabo 3D-tiskalnika tudi ustvarila dron, ki je sposoben vzorčenja zraka, hkrati pa lahko bakterije prenaša brez tveganja za širjenje teh gensko spremenjenih organizmov v okolje. To zagotavlja majhna steklenička belila, pritrjena pod dron, ki se v primeru nesreče razbije, belilo iz nje pa uniči bakterije. Tehnologija, potrebna za analizo bioluminiscence na terenu, ekipi v okviru tekmovanja iGEM žal ni bila dostopna. Rešitev sicer vidijo v majhni na svetlobo občutljivi celici in mikrofluidnem vezju, ki bi bakterijske celice posamič vodilo mimo nje. Podobno je težje uresničljiva zamisel o daljinskem vodenju drona, ki bi omogočalo avtomatsko kartiranje in učinkovito načrtovanje leta.

=== Epruveta za bakterije ===
Predel v dronu, ki vsebuje bakterije, ne sme dopuščati možnosti njihovega širjenja v okolje, hkrati pa mora bakterijam dovesti zrak, ki ga želimo analizirati. Pariški študentje so v ta namen zasnovali in s 3D-tiskalnikom izdelali epruveto, ki deluje po principu zračne ključavnice. Vsebuje namreč predel med bakterijami in zunanjostjo, preko katerega se brez neposrednega stika med vsebino epruvete in okoljem bakterijam dovaja zunanji zrak.

== Zaključek ==
Ob zaključku projekta študentje predlagajo nekaj izboljšav, ki bi lahko doprinesle h kvaliteti njihovega prototipa. Standardno krivuljo nameravajo izboljšati z meritvami nižjih koncentracij toluena ter določiti najnižjo koncentracijo, ki jo Quantifly natančno zazna. Izvesti nameravajo še eksperimente z ostalimi toluenu podobnimi molekulami kot je npr. ksilen. Iz praktičnih razlogov so v laboratoriju bioluminiscenčne teste izvajali s tekočim toluenom, v prihodnje pa želijo vzpostaviti izolirano hermetično zaprto sobo s hlapi toluena, v kateri bi lahko opravili vzorčenje zraka. Veliko težavo, katere rešitve študentje zaenkrat ne komentirajo, pa predstavljajo variacijev bioluminiscenčnem testu, ki so posledica razlik v metabolizmu živih organizmov.
Kljub pomanjkljivostim projekta je bila ekipa v sklopu tekmovanja iGEM 2016 za svoje delo nominirana za najboljši okoljski projekt, najboljšo predstavitev projekta in najbolj uporaben projekt.

== Vir ==
[http://2016.igem.org/Team:Ionis_Paris Wiki stran ekipe Ionis Paris 2016]

[[Seminarji SB 12016/17]]

Quantifly

2016-11-27T23:24:40Z

Ema Guštin: /* Načrtovanje biosenzorja */

Quantifly

2016-11-27T23:23:59Z

Ema Guštin: /* Načrtovanje biosenzorja */

Quantifly

2016-11-27T23:23:22Z

Ema Guštin: /* Biosenzor */

Quantifly

2016-11-27T23:03:40Z

Ema Guštin:

Quantifly

2016-11-27T22:55:48Z

Ema Guštin: /* Epruveta za bakterije */

Quantifly

2016-11-27T22:53:32Z

Ema Guštin: /* Epruveta za bakterije */

Quantifly

2016-11-27T22:42:38Z

Ema Guštin: /* Dron */

Quantifly

2016-11-27T22:00:07Z

Ema Guštin: /* Dron */

Quantifly

2016-11-27T21:51:38Z

Ema Guštin:

Quantifly

2016-11-27T21:42:30Z

Ema Guštin:

Quantifly

2016-11-27T20:57:57Z

Ema Guštin: /* Oblikovanje biosenzorja */

Quantifly

2016-11-27T20:56:26Z

Ema Guštin: /* Optimizacija plazmida */

Quantifly

2016-11-27T19:16:58Z

Ema Guštin: /* Biosenzor */