Wiki FKKT - User contributions [en]

A flexible , modular and versatile part assembly toolkit for gene cluster engineering in Streptomyces

2024-05-21T09:30:50Z

Ena Kartal: Created page with "Izhodiščni članek: [https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2405805X23001102?via%3Dihub#bib10] == Introduction == One of the most used species of bacteria in the industry is Streptomyces, it has found use in the production of natural products such as immunosuppressants, antibiotics, herbicides and antitumor drugs. With the recent development in genome sequencing, a large unused pool of gene clusters(BGCs) was discovered in Streptomyces, which have the p..."

Izhodiščni članek: [https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2405805X23001102?via%3Dihub#bib10]

== Introduction ==
One of the most used species of bacteria in the industry is Streptomyces, it has found use in the production of natural products such as immunosuppressants, antibiotics, herbicides and antitumor drugs. With the recent development in genome sequencing, a large unused pool of gene clusters(BGCs) was discovered in Streptomyces, which have the potential to lead to new bioactive compounds. So far attempts to activate said BGCs have been made using cloning and refactoring, heterologous expression in order to overcome limitations posed by individual activation methods. This approach is sadly limited by the lack of standard and versatile toolkits and assembly technologies.
Despite the fact that genetic engineering has been used to boost the production of secondary metabolites in Streptomyces for decades using vector platforms (such as pIJ family), these vectors systems are mainly limited to single genes and they also are incompatible with advanced standards such as Biobrick and Golden Gate. In order to fix all of these issues, they decided to design a flexible and modular DNA assembly strategy that allows easy exchange of plasmid copy numbers, selection marker genes, integration sites, regulatory and catalytic parts of gene clusters. Furthermore it enables cloning and editing of different-sized gene clusters using various cloning methods such as CATCH (Cas9-Assisted Targeting of CHromosome segments) and yeast homologous recombination based DNA assembly.

== Materials and methods ==
Throughout this study they used Escherichia coli EPI300 for molecular cloning and plasmid propagation and E.coli ET12567/pUZ8002 was used for E. coli-Streptomyces conjugation. The strains were grown at 37 °C in LB medium (10g/L tryptone, 5g/L yeast extract and 10g/L NaCl) with the corresponding antibiotic. At the same time they also used S. coelicolor, S. albus and S/ lividans strains which were cultures on MS medium (20g/L soybean flour, 20g/L mannitol and 20g/L agar) which were used for sporulation and conjugation. S. venezuelae was used for the same purpose and grown in MYM medium (4.2 g/L (D-(+)-maltose monohydrate, 4 g/L yeast extract, 4 g/L malt extract, and 20 g/L agar). The antibiotics they used were ampicillin, thiostrepton, apramycin, hygromycin, spectinomycin.

They introduced the vectors into four Streptomyces species by conjugation using standard procedure and selected exconjugants on MS or MYM agar with nalidixic acid and the appropriate antibiotic.

They used two plasmids pTHS-XGSN* and pPAS-PT as basic vectors to carry the T7 RNA polymerase and T7 promoters. To boost the expression of T7 RNAP they replaced four rare TTA leu codonds with CTC leu. The T7 RNAP* fragment amplified with T7 RNAP*-F and T7 RNAP*-R primers was cloned using the Golden Gate method into pTHS-XGSN*. Using OLMA (Oligonucleotide Linkers-Mediated Assemble) they constructed the pPAS-PT7(x) series plasmids in their lab. They inserted the pTHS-T7 RNAP* cassette into the chromosome of S. albus J1074 and in the resulting strains pPAS-PT7 was introduced which carries the T7 promoters. The strains were grown in TSB medium and after adding cumate to the medium the expression of T7 RNAP* would be activated. As a positive control they used a kasOp* promoter inserted into pPAP-PT to generate pPAS-kasOp* plasmid.

== Results ==
To get around the problem of activating the silent gene clusters due to lack of the ability to manipulate multiple regulatory and multiple catalytic parts in a cross-species manner, they developed a modular and versatile DNA assembly toolkit for gene cluster engineering. All vectors in the toolkit include a cargo part(part 1) and an essential part(part 2). The cargo part is composed of the cloning sites of the regulatory and catalytic parts while the essential part is responsible for the replication origins of the plasmid, selection marker genes in E. coli, yeast and Streptomyces.

The cargo part has two transcription terminators T1 and T2 and also contains a multiple cloning site (MCS). The MCS was designed in a specific way to allow compatibility with standard cloning system. It was designed as follows: I-SceI–EcoRI–XbaI–BsaI-BsaI–SpeI–PstI–I-SceI. EcoRI, SpeI, XbaI and PstI sites allow biobrick assembly, and two BsaI sites allow Golden Gate assembly, while the two homing endonucleases I – SceI sites are suitable for exchanging large fragments.
The essential part is made up of four modules that are arranged in the same order in all vector:
1- Integration/replication module in Streptomyces:
2- Antibiotic markers;
3- Replication module in E. coli;
4- Replication module in yeast.
As a result they constructed 10 basic vectors (shown below in figure 2). Large DNA gene clusters are more stable in a low-copy vector, so their toolkit includes:
1- pPAB and BAC replicons for large sized gene clusters >50kb
2- pPAS, pVHS and pTHS with pSC101 replicon for medium sized <50kb
3- pPAP, pVSP, pTSP and pIATP with p15A replicons for <30kb
4- pIATU with pUC replicon for small size gene clusters <10kb
The vectors were conjugated from E. coli to the different strains of Streptomyces in order to test the conjugation frenquency. S. Lividans TK24 was found resistant to spectinomycin hence the plasmids with the spectinomycin antibiotic marker cannot be used.
The toolkit is compatible with a wide range of DNA assembly approaches, BioBrick, Golden Gate, CRISPR/Cas9-based methods.
A. Biobrick – by digesting the donor part with SpeI and EcoRI and the target vector by EcoRI and XbaI, they can be ligated using T4 DNA ligase and generate the recombinant plasmid.
B. Golden Gate – PCR product or fragment is inserted in the donor vector flanked by specific four-base overhangs and BsaI resctriction site which can then be assembled into the vector backbone containing two BsaI restriction site. (also works with double stranded DNA oligos)

Controlled gene expression is necessary for improvement of secondary metabolite production and in order to facilitate gene expression optimization they developed a rapid, simple and standardized gene expression assembly vectors based on pTHS. Three of which are constituve (pTHS-XGe, pTHS-XGk, pTHS-XG23) and one is an inducible expression vector compatible with Golden Gate (pTHS-XGSN containing a tight cumate-inducible promoter PcymR*.

Actinorhodin (ACT) is a blue pigment produced by S. coelicolor M145 encoded by the act gene cluster. They cloned the act gene cluster (26kb) in pPAB vector using CATCH. The correct recombinant plasmids were verified by PCR and restriction enzyme digestion. It was predicted that the act gene cluster has five biosynthetic operons and two regulatory genes, so in order to improve the production of actinorhodin the network of the cluster was refactored by inserting well-characteried promoters P1-P2 to control actVA and actVI operons, P3 promoter for actII-orf2 and P4-P5 for actIII and actI operons. Editing the gene cluster was done by digesting the pPab-act with Cas9 and sgRNAs in vitro then they were co transformed into yeast together with DNA cassettes and homology arms matching each digestion site.

== Conclusion ==
They made a toolkit that allows manipulation and optimization of large gene clusters and have proven it to be effective and successful to clone and refactor the act BGC, improving the production of actinorhodin. Using this toolkit they have provided an efficient promoter screening system that works for both assembly and testing of promoters, they hope that in the future more strains of actinomyces can be tested and expand the application of their toolkit.

== Literatura ==
[1] Z. Liu, Y. Zhao, C. Huang, Y. Luo Recent advances in silent gene cluster activation in streptomyces Front Bioeng Biotechnol, 9 (2021), Article 632230, 10.3389/fbioe.2021.632230

[2] W. Wang, G. Zheng, Y. Lu Recent advances in strategies for the cloning of natural product biosynthetic gene clusters Front Bioeng Biotechnol, 9 (2021), Article 692797, 10.3389/fbioe.2021.692797

[3] W.J. Jiang, X.J. Zhao, T. Gabrieli, C.B. Lou, Y. Ebenstein, T.F. Zhu Cas9-Assisted Targeting of CHromosome segments CATCH enables one-step targeted cloning of large gene clusters
Nat Commun, 6 (2015), 10.1038/ncomms9101

[4] M. Bierman, R. Logan, K. O'Brien, E.T. Seno, R.N. Rao, B.E. Schoner Plasmid cloning vectors for the conjugal transfer of DNA from Escherichia coli to Streptomyces spp Gene, 116 (1992), pp. 43-49, 10.1016/0378-1119(92)90627-2

[5] C. Aubry, J.L. Pernodet, S. Lautru Modular and integrative vectors for synthetic biology applications in streptomyces spp Appl Environ Microbiol, 85 (2019), 10.1128/AEM.00485-19

Seminarji SB 2023/24

2024-05-21T09:15:32Z

Ena Kartal:

V študijskem letu 2023/24 študenti in študentke pri Sintezni biologiji predstavljajo naslednje teme:

RAZISKOVALNI ČLANKI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sinteznobiološki_pristop_k_sestavljanju_in_ponovnemu_zagonu_klinično_pomembnih_fagov_Pseudomonas_aeruginosa Sinteznobiološki pristop k sestavljanju in ponovnemu zagonu klinično pomembnih fagov ''Pseudomonas aeruginosa''] (Bor Krajnik)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Optogenetsko_prostorsko_vzorčenje_kooperacije_pri_glivah_kvasovkah Optogenetsko prostorsko vzorčenje kooperacije pri glivah kvasovkah] (Martin Stanonik)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sintetična_celična_linija_za_inducibilno_pakiranje_virusa_influence_A Sintetična celična linija za inducibilno pakiranje virusa influence A] (Klara Razboršek)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Uporaba_sesalskega_RNA-vezavnega_proteina_Musashi-1_kot_alosterično_reguliranega_translacijskega_represorja_v_E._coli Uporaba sesalskega RNA-vezavnega proteina Musashi-1 kot alosterično reguliranega translacijskega represorja v ''E. coli''] (Marko Kovačić)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Kaskadno_ojačano_genetsko_vezje_za_detekcijo_glivnih_patogenov Kaskadno ojačano genetsko vezje za detekcijo glivnih patogenov] (Jakob Tomšič)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sintetična_mRNA-stikala_s_povratno_zanko,_ki_omogočajo_zaznavanje_miRNA Sintetična mRNA-stikala s povratno zanko, ki omogočajo zaznavanje miRNA] (Ana Pervanja)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Molekularni_nabor_navzkrižno_hranjenih_sevov_za_pripravo_sintetičnih_skupnosti_kvasovk Molekularni nabor navzkrižno hranjenih sevov za pripravo sintetičnih skupnosti kvasovk] (Teja Spruk)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Inženiring_dinamike_rasti_sesalskih_celic_za_bioproizvodnjo Inženiring dinamike rasti sesalskih celic za bioproizvodnjo] (Zarja Rožanc)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Inženirane_mRNA-ribosomske_fuzije_za_lažjo_biosintezo_selenoproteinov Inženirane mRNA-ribosomske fuzije za lažjo biosintezo selenoproteinov] (Kostadin Mitkov)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Razvoj_novih_binarnih_ekspresijskih_sistemov_za_sintezno_biologijo_rastlin Razvoj novih binarnih ekspresijskih sistemov za sintezno biologijo rastlin] (Alliana Kolar)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Kombinatorična_biosinteza_terpenoidov_v_kvasovkah Kombinatorična biosinteza terpenoidov v kvasovkah] (Jan Kogovšek)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Identifikacija_genov,_ki_se_odzivajo_na_stres_kislega_okolja_in_inženiring_odpornosti_na_kislo_okolje_v_cianobakteriji_Synechococcus_elongatus_PCC_7942 Identifikacija genov, ki se odzivajo na stres kislega okolja in inženiring odpornosti na kislo okolje v cianobakteriji ''Synechococcus elongatus'' PCC 7942] (Ela Kovač)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Vse_v_enem-IQ_preklopna_stikala_z_veliko_vsestranskostjo_za_natančno_nastavitev_izražanja_transgenov_v_sesalskih_celicah_in_tkivih Vse v enem-IQ preklopna stikala z veliko vsestranskostjo za natančno nastavitev izražanja transgenov v sesalskih celicah in tkivih] (Ena Kartal)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Podenote_E3_ligaznega_kompleksa_kot_degroni_za_učinkovito_degradacijo_citosolnih,_jedrnih_in_membranskih_proteinov Podenote E3 ligaznega kompleksa kot degroni za učinkovito degradacijo citosolnih, jedrnih in membranskih proteinov] (David Valte)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Razvoj_robustnega_sistema_genetskega_biozadrževanja_kvasovk_s_stikalom_za_stabilnost_proteinov Razvoj robustnega sistema genetskega biozadrževanja kvasovk s stikalom za stabilnost proteinov] (Mark Loborec)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Reprogramiranje_z_doksiciklinom_inducibilnega_genskega_stikala_za_bakterijsko_posredovano_terapijo Reprogramiranje z doksiciklinom inducibilnega genskega stikala za bakterijsko posredovano terapijo] (Špela Sotlar)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/A_flexible_,_modular_and_versatile_part_assembly_toolkit_for_gene_cluster_engineering_in_Streptomyces A flexible, modular and versatile part assembly toolkit for gene cluster engineering in Streptomyces] (Damjan Pop Stefanija)

NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/PhaseOut Biološka proizvodnja bioplastike] (Sašo Jakob)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BeeYeast Inženiring kvasovk za boj proti virusnim okužbam čebel] (Mateja Milošević)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Cellect Cellect - Fenotipsko stabilne celične linije] (Lucija Voga)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/oPHAelia oPHAelia - Inovativna rešitev za zmanjšanje onesnaževanja s plastiko] (Irina Kostadinoska)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/ReMixHD ReMixHD - Recikliranje mešanih plastičnih odpadkov] (Ema Kavčič)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/DARWINS DARWINS - Usmerjena posodobitev proteinov Ago z idealno proteinsko termično stabilnostjo] (Rahela Petrovčič)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/PET-2-Protein PET-2-Protein - Proizvodnja mikrobnih proteinov iz polietilen tereftalata] (Zala Perko)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/48C_Cadmium_catcher_LBP 48C Cadmium catcher LBP- Proizvodnja bioterapevtika za vezavo kadmija] (Maja Deutsch)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Proteus Proteus - Sistem za ciljanje onkogenov in induciranje piroptoze] (Gašper Struna)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Silinker Silinker] (Nuša Brdnik)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sublimestone Sublimestone - uporaba bakterij za ohranjanje kulturne dediščine] (Ana Maučec)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/LAMPS LAMPS - sistem svetlečih alg] (Rebeka Jerina)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/FluoroLoop#Problematika_PFAS FluoroLoop] (Eva Vene)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/OASYS OASYS - Diagnostični pripomoček za klinično depresijo] (Ajda Dedič)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/OTTER OTTER - Optimizirana tehnika za načrtovanje in karakterizacijo RNA-stikal] (Luka Hafner)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Li+on_Switch Li+on Switch] (Hana Glavnik)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/DRIP DRIP] (Klara Ažbe)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/B.HOME (Luša Karner)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Methanivore Methanivore] (Anja Moškrič)
----

Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Povzetek je treba objaviti dva dni pred predstavitvijo do polnoči (za seminarje v sredo torej v ponedeljek). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo približno 5-minutna razprava.

Terminski razpored je razviden iz preglednice na strežniku Google Drive.

Kako je videti seznam seminarjev, lahko preverite pri lanskem letniku: [[Seminarji_SB_2022/23]].

Vse v enem-IQ preklopna stikala z veliko vsestranskostjo za natančno nastavitev izražanja transgenov v sesalskih celicah in tkivih

2024-05-15T15:27:55Z

Ena Kartal:

== Uvod ==
Doslej razvita transgena stikala izkoriščajo zunanje dražljaje, ki jih lahko spreminjamo, kot so hormoni, kemikalije, težke kovine, toplota, svetloba ipd. Med genskimi stikali, ki so odvisni od majhnih molekul, je sistem Tet-On/Off (izkorišča tetraciklin ali njegove derivate, kot sta doksiciklin in minociklin) veljalo za najmočnejšo metodo za induciranje izražanja transgenov. Pogosto opažena nesprejemljiva stopnja pušččanja tega sistema poskušali so odpraviti z uporabo enovektorskega pristopa optimiziranega za proizvodnjo lentivirusa. Sistem 'vse v enem' Tet-Off je zmanjšal bazalno puščanje, vendar na račun moči indukcije transgena. Zaradi tega so razvili represibilni binarni transgenski indukcijski sistem, stikalo Q (ali SIQ), pridobljeno iz glive Neurospora crassa. SIQ ni pokazalo nobenega puščanja pri izražanju transgena v celicah sesalcev, hkrati pa je ohranjalo visoko občutljivost na kemični induktor [1], [2].

Za izdelavo novega SIQ so uporabljali vektor pENTR-EUI. Pred tem so dokazali, da je bilo singularno gensko stikalo (EUI) na osnovi Gal4/UAS uspešno implementirano za transgensko indukcijo v človeških celičnih linijah, vendar je transgenska inducibilnost sistema Gal4/UAS na splošno šibkejša ter je zelo občutljiv na metilacijo, kar lahko provzroči utišanje transgena po zaporednih generacijah. Na osnovi tega so za izdelavo novega sistema uporabili podoben vektor z uvedbo določenih sprememb, kot je recimo takoimenovani pogonski modul, ki je ključen za izražanje komponent potrebnih za vezavo na elemente ojačevalca 13 x QUAS, ki nato inducirajo transkripcijo transgena le, če ga stimulirajo kemični dražljaji. Končni vektor pSIQ je bil zasnovan tako, da izgubi tako pUC ori kot dva izbirna markerja po rekombinaciji z vektorjem pAd/PL-DEST za pripravo adenovirusa [1].

== SIQ omogoča enostavno ustvarjanje stabilnih celičnih linij ==
Vektor pSIQ vsebuje prepoznavno meto serin integraze (phiC31) attB, ki omogoča generiranje stabilnih celičnih linij z rekombinacijo na osnovi integraze. V preskusni vektor so kot transgen vstavili zapis za EGFP, ki je odvisen od odmerka tebufenozida (Teb). S kontransfekcijo vektora pSIQ, ki kodira transgen EGFP, z ekspresijskim vektorjem integraze v HEK293-attP-Bla celicah so potrdili njihovo pravilno implantacijo na mesto attP gostiteljskega genoma. Potem so dokazali, da je raven izražanja EGFP naraščala z neprekinjenim dodajanjem Teb in je dosegla plato po 48 urah. Poleg tega vzpostavljena celična linija se je odzvala izključno na eksogene kemične dražljaje, kar so dokazali z opaženo postopno zmanjševanje ravni EGFP po odstranitvi Teb. Natančnost SIQ so dokazali tudi z generiranjem druge stabilne celične linije s istim transgenom in vsemi komponentami SIQ razen pogonskega modula (CMV-QFDBD-2x AD*-VP16*-EcR-poly(A)). Čeprav je prišlo do integracije na identičen attP lokus HEK293-attP-Bla celičnih linij, te brez pogonskega modula niso pokazale nobenega odziva na dražljaje z uporabo Teb. Pomembno je omeniti tudi to, da je SIQ-EGFP brez dodajanja Teb prikazala le zanemarljivo raven izražanja EGFP [1], [3], [4].

==Preklopno stikalo SIQ lahko preuredimo v sistem za dostavo genov posredovani z adenovirusi==

Sistemi za dostavo genov, posredovani z adenovirusi, so bili v veliki meri uporabljeni za klinične aplikacije. Glavna pomanjkljivost virusnega vektorja je to, da kaže sposobnost okužbe širokega sprektra celičnih linij. Poleg tega narava adenovirusa je taka, da ne pride do integracije v genom gostiteljskega organizma, kar sčasoma privede do zmanjševanja ravni virusnega genoma v celicah. Da bi olajšali učinkovito dostavo pSIQ v celice, ki kažejo zelo nizko učinkovitost transfekcije, so uporabili adenovirusni pakirni sistem. Vektor pSIQ z EGFP so in vitro integrirali z vektorjem pAd/PL-DEST. Poleg tega pripravili so tudi adenovirusni vektor pENTR-EUI, ki se odziva na Teb. pENTR-EUI, ki nosi zapis za EGFP, je bil uporabljen za proizvodnjo adenovirusa (Ad/EUI-EGFP) po združitvi s vektorjem pAd/PL-DEST. Izražanje EGFP v pENTR-EUI je bilo kontrolirano z sistemom Gal4/UAS, kar je služilo kot kontrola za primerjavo sistema SIQ. Po različnih eksperimentih so dokazali, da je bil potreben vsaj 10x višji MOI (razmerje med številom transducirajočih vektorjev in številom celic) Ad/EUI-EGFP, da bi dosegli enakovreden odziv celic, okuženih z Ad/SQI-EGFP[5].
Poročali so, da je intravensko injiciran adenovirus zelo nalezljiv za jetra, kamor virus najprej pride preko jetrne vene in se infiltrira v jetrne celice [6]. Da bi preverili ali je Ad/SIQ-EGFP, ki so ga uporabljali za okužbo keratinocitov HaCaT, uporaben tudi v raziskavah in vivo, so v repno veno miši injicirali 100 µL adenovirusa s povečano koncentracijo virusnih delcev. Po 24 urah okužbe z Ad/SIQ-EGFP so enkrat dnevno v 24-urnih intervalih z intraperitonealno injekcijo vbrizgali 100 µL PBS ali enako količino Teb (1mmol/L) raztopljenega v PBS. En dan po injiciranju kemičnega dražljaja so eviscerirali jetra, da bi preverili izražanje EGFP. Kot je bilo pričakovano samo pri jetrih, ki so bila okužena z virusom so pokazale pozitiven odziv na Teb za razliko od jeter, ki niso bila okužena. Še pomembnejše je bilo opažanje, da okužba z virusom v odsotnosti zdravljenja s Teb ni provzročila nobene zaznavne ekspresije EGFP. Pomembno je omeniti tudi to, da pri miših z virusno okužbo z uporabo Ad/SIQ-EGFP niso odkrili nobenih opaznih okvar jeter, niti po dolgotrajnem rednem dajanju Teb 3 tedne. Treba je omeniti, da preklopno stikalo SIQ presega sistem EUI, ki temelji na Gal4/UAS, in je primerljiv s konstitutivnim ekspresijskim sistemom, ki izhaja iz CMV in vivo [7].
==Sofisticirano transgensko preklapljanje lahko dosežemo s kombinacijo SIQ in genskega stikala cumate==

Čeprav je SIQ pokazal svojo visoko vsestranskost v celičnih linijah, pridobljenih iz človeka, obstaja proctor za izboljšave z vključitvijo drugih genskih regulacijskih elementov, ki jih je mogoče nadzorovati z drugimi kemičnimi ligandi. To vključuje recimo razvoj ortogonalnega genskega stikala, kjer lahko dva ali več različnih induktorjev uravnava izražanje transgena, ne da bi se med seboj motili. Na splošno kemičnih genskih stikal ni mogoče na hitro izklopiti zaradi dolgotrajnih učinkov kemičnih induktorjev na transgen. Da bi dosegli pospešeno supresijo ekspresije tarčnega gena, so v preklopno stikalo SIQ uvedli od kumata odvisen transgenski represor [8].
Gensko stikalo na osnovi kumata je sestavljeno iz dveh glavnih komponent: represorskega modula CymR in zaporedja CuO, na katero se veže CymR in inhibira ekspresijo transgena. Kumat (4-izopropilbenzojska kislina) se neposredno veže na CymR in ga loči od CuO, kar provzroči derepresijo transgenske ekspresije. Golnilno zaporedje pSIQ so povezali s CymR preko zaporedja peptida 2A P2A ter so CuO, dolžine 28 baznih parvov, dodali neposredno pred mestom začetka transkripcije transgena pSIQ. Takšna ureditev omogoča hkratno izražanje gonilnega zaporedja SIQ in represorja CymR. Ta konstrukt imenovali so pSIQmate, ki je bil sestavljen iz 9001 nukleotida.
Da bi preizkusili odzivnost SIQmate na oba induktorja, so začasno transficirali celice HEK293 z pSIQmate-EGFP in jih nato obdelali s Teb ali kumatom posamično, pa tudi v kombinaciji. Rezultati obdelave celic so pokazali, da je prišlo do florescence EGFP samo v primerih uporabe obeh kemikalij sočasno. Poleg tega pokazalo se je, da so kloni, ki so bili obdelani samo s Teb, pokazali obrobno povišanje fluorescenčnih signalov. Ti signali niso bili dovolj močni, da bi jih lahko zaznali s fluorescenčno mikroskopijo in so zaradi tega naredili ponovno kvantifikacijo ampak z merjenjem aktivnosti luciferaze. Ta pojav je verjetno posledica občasnega odvajanja CymR od CuO ne glede na kumat, kar je pogost pojav med regulatorji transkripcije [9].
Po ponovni kvantifikaciji z merjenjem aktivnosti luciferaze, je SIQmate pokazal znatno nižjo občutljivost na kemične dražljaje v primerjavi s SIQ (približno 0,2-kratna razlika). Iz the razlogov obstaja možnost potrebe nadaljnje optimizacije za povečanje robustnosti transgenske aktivacije v sistemu SIQmate.

==Zaključek==
Obstaja več meril, ki jih je treba upoštevati, preden se oblikuje novo, kemično zasnovano transgensko preklopno stikalo. Vsak sistem za regulacijo transgenov ne sme biti toksičen za celice in organizme, mora biti izjemno občutljiv in natančno moduliran s pravilnim odmerkom spojin, ki delujejo kot kemični dražljaji.
Usodna napaka binarne lasnosti transgenskih preklopnih stikal je, da je težko pričakovati, da bo dosegla enakomerno dostavo dveh ločenih vektorjev v ciljne celice in tkiva hkrati. Posledica tega je nastajajoča populacija celic z neenakomerno porazdeljenimi plazmidi. Čeprav se lahko raziskovalci izognejo proizvodnji neželene heterogene populacije celic z vzpostavitvijo stabilne celične linije, je to naporen in dolgotrajen proces [10]. Zato bi bila izdelava zanesljivega in vsestranskega singularnega transgenskega stikala zaželena na področju predkliničnih in bioloških raziskav. Dokazali so, da je preklopno stikalo SIQ boljše od EUI Sistema na osnovi Gal4/UAS v smislu večje občutljivosti na kemične dražljaje, nižje bazalne ekspresije in večje vsestranskosti. Takšen sistem najde široko uporabo, vključno s poskusi prehodne transfekcije, vzpostavitvijo stabilnih celičnih linij in proizvodnjo adenovirusa, pri čemer je za vse potreben le en krog subkloniranja transgenov v pSIQ.

==Literatura==

[1] J. Hong et al., “All-in-one IQ toggle switches with high versatilities for fine-tuning of transgene expression in mammalian cells and tissues,” Mol Ther Methods Clin Dev, vol. 32, no. 1, p. 101202, Mar. 2024, doi: 10.1016/j.omtm.2024.101202.

[2] E. Vigna et al., “Robust and Efficient Regulation of Transgene Expression in Vivo by Improved Tetracycline-Dependent Lentiviral Vectors,” Molecular Therapy, vol. 5, no. 3, pp. 252–261, Mar. 2002, doi: 10.1006/mthe.2002.0542.

[3] C.-A. Lo, A. W. Greben, and B. E. Chen, “Generating stable cell lines with quantifiable protein production using CRISPR/Cas9-mediated knock-in,” Biotechniques, vol. 62, no. 4, pp. 165–174, Apr. 2017, doi: 10.2144/000114534.

[4] C. A. Merrick, J. Zhao, and S. J. Rosser, “Serine Integrases: Advancing Synthetic Biology,” ACS Synth Biol, vol. 7, no. 2, pp. 299–310, Feb. 2018, doi: 10.1021/acssynbio.7b00308.

[5] J. T. Bulcha, Y. Wang, H. Ma, P. W. L. Tai, and G. Gao, “Viral vector platforms within the gene therapy landscape,” Signal Transduct Target Ther, vol. 6, no. 1, p. 53, Feb. 2021,
doi: 10.1038/s41392-021-00487-6.

[6] S. J. Duncan et al., “Infection of Mouse Liver by Human Adenovirus Type 5,” Journal of General Virology, vol. 40, no. 1, pp. 45–61, Jul. 1978, doi: 10.1099/0022-1317-40-1-45.

[7] S. Lee et al., “Ecdysone Receptor-based Singular Gene Switches for Regulated Transgene Expression in Cells and Adult Rodent Tissues,” Mol Ther Nucleic Acids, vol. 5, p. e367, 2016, doi: 10.1038/mtna.2016.74.

[8] A. Mullick et al., “The cumate gene-switch: a system for regulated expression in mammalian cells,” BMC Biotechnol, vol. 6, no. 1, p. 43, 2006, doi: 10.1186/1472-6750-6-43.

[9] A. Raj and A. van Oudenaarden, “Nature, Nurture, or Chance: Stochastic Gene Expression and Its Consequences,” Cell, vol. 135, no. 2, pp. 216–226, Oct. 2008, doi: 10.1016/j.cell.2008.09.050.

[10] Y. Suzuki and Y. Suzuki, “Gene Regulatable Lentiviral Vector System,” in Viral Gene Therapy, InTech, 2011. doi: 10.5772/18155.

Vse v enem-IQ preklopna stikala z veliko vsestranskostjo za natančno nastavitev izražanja transgenov v sesalskih celicah in tkivih

2024-05-15T15:22:25Z

Ena Kartal: Created blank page

Seminarji SB 2023/24

2024-05-15T15:21:16Z

Ena Kartal:

V študijskem letu 2023/24 študenti in študentke pri Sintezni biologiji predstavljajo naslednje teme:

RAZISKOVALNI ČLANKI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sinteznobiološki_pristop_k_sestavljanju_in_ponovnemu_zagonu_klinično_pomembnih_fagov_Pseudomonas_aeruginosa Sinteznobiološki pristop k sestavljanju in ponovnemu zagonu klinično pomembnih fagov ''Pseudomonas aeruginosa''] (Bor Krajnik)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Optogenetsko_prostorsko_vzorčenje_kooperacije_pri_glivah_kvasovkah Optogenetsko prostorsko vzorčenje kooperacije pri glivah kvasovkah] (Martin Stanonik)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sintetična_celična_linija_za_inducibilno_pakiranje_virusa_influence_A Sintetična celična linija za inducibilno pakiranje virusa influence A] (Klara Razboršek)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Uporaba_sesalskega_RNA-vezavnega_proteina_Musashi-1_kot_alosterično_reguliranega_translacijskega_represorja_v_E._coli Uporaba sesalskega RNA-vezavnega proteina Musashi-1 kot alosterično reguliranega translacijskega represorja v ''E. coli''] (Marko Kovačić)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Kaskadno_ojačano_genetsko_vezje_za_detekcijo_glivnih_patogenov Kaskadno ojačano genetsko vezje za detekcijo glivnih patogenov] (Jakob Tomšič)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sintetična_mRNA-stikala_s_povratno_zanko,_ki_omogočajo_zaznavanje_miRNA Sintetična mRNA-stikala s povratno zanko, ki omogočajo zaznavanje miRNA] (Ana Pervanja)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Molekularni_nabor_navzkrižno_hranjenih_sevov_za_pripravo_sintetičnih_skupnosti_kvasovk Molekularni nabor navzkrižno hranjenih sevov za pripravo sintetičnih skupnosti kvasovk] (Teja Spruk)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Inženiring_dinamike_rasti_sesalskih_celic_za_bioproizvodnjo Inženiring dinamike rasti sesalskih celic za bioproizvodnjo] (Zarja Rožanc)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Inženirane_mRNA-ribosomske_fuzije_za_lažjo_biosintezo_selenoproteinov Inženirane mRNA-ribosomske fuzije za lažjo biosintezo selenoproteinov] (Kostadin Mitkov)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Razvoj_novih_binarnih_ekspresijskih_sistemov_za_sintezno_biologijo_rastlin Razvoj novih binarnih ekspresijskih sistemov za sintezno biologijo rastlin] (Alliana Kolar)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Kombinatorična_biosinteza_terpenoidov_v_kvasovkah Kombinatorična biosinteza terpenoidov v kvasovkah] (Jan Kogovšek)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Identifikacija_genov,_ki_se_odzivajo_na_stres_kislega_okolja_in_inženiring_odpornosti_na_kislo_okolje_v_cianobakteriji_Synechococcus_elongatus_PCC_7942 Identifikacija genov, ki se odzivajo na stres kislega okolja in inženiring odpornosti na kislo okolje v cianobakteriji ''Synechococcus elongatus'' PCC 7942] (Ela Kovač)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Vse_v_enem-IQ_preklopna_stikala_z_veliko_vsestranskostjo_za_natančno_nastavitev_izražanja_transgenov_v_sesalskih_celicah_in_tkivih Vse v enem-IQ preklopna stikala z veliko vsestranskostjo za natančno nastavitev izražanja transgenov v sesalskih celicah in tkivih] (Ena Kartal)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Podenote_E3_ligaznega_kompleksa_kot_degroni_za_učinkovito_degradacijo_citosolnih,_jedrnih_in_membranskih_proteinov Podenote E3 ligaznega kompleksa kot degroni za učinkovito degradacijo citosolnih, jedrnih in membranskih proteinov] (David Valte)

NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/PhaseOut Biološka proizvodnja bioplastike] (Sašo Jakob)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BeeYeast Inženiring kvasovk za boj proti virusnim okužbam čebel] (Mateja Milošević)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Cellect Cellect - Fenotipsko stabilne celične linije] (Lucija Voga)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/oPHAelia oPHAelia - Inovativna rešitev za zmanjšanje onesnaževanja s plastiko] (Irina Kostadinoska)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/ReMixHD ReMixHD - Recikliranje mešanih plastičnih odpadkov] (Ema Kavčič)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/DARWINS DARWINS - Usmerjena posodobitev proteinov Ago z idealno proteinsko termično stabilnostjo] (Rahela Petrovčič)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/PET-2-Protein PET-2-Protein - Proizvodnja mikrobnih proteinov iz polietilen tereftalata] (Zala Perko)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/48C_Cadmium_catcher_LBP 48C Cadmium catcher LBP- Proizvodnja bioterapevtika za vezavo kadmija] (Maja Deutsch)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Proteus Proteus - Sistem za ciljanje onkogenov in induciranje piroptoze] (Gašper Struna)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Silinker Silinker] (Nuša Brdnik)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sublimestone Sublimestone - uporaba bakterij za ohranjanje kulturne dediščine] (Ana Maučec)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/LAMPS LAMPS - sistem svetlečih alg] (Rebeka Jerina)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/FluoroLoop#Problematika_PFAS FluoroLoop] (Eva Vene)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/OASYS OASYS - Diagnostični pripomoček za klinično depresijo] (Ajda Dedič)
----

Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Povzetek je treba objaviti dva dni pred predstavitvijo do polnoči (za seminarje v sredo torej v ponedeljek). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo približno 5-minutna razprava.

Terminski razpored je razviden iz preglednice na strežniku Google Drive.

Kako je videti seznam seminarjev, lahko preverite pri lanskem letniku: [[Seminarji_SB_2022/23]].

Main Page

2024-05-12T14:52:54Z

Ena Kartal:

Izhodiščni članek: [https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2329050124000184?via%3Dihub#bib15# All-in-one IQ toggle switches with high versatilities for fine-tuning of transgene expression in mammalian cells and tissues]

== Uvod ==
Doslej razvita transgena stikala izkoriščajo zunanje dražljaje, ki jih lahko spreminjamo, kot so hormoni, kemikalije, težke kovine, toplota, svetloba ipd. Med genskimi stikali, ki so odvisni od majhnih molekul, je sistem Tet-On/Off (izkorišča tetraciklin ali njegove derivate, kot sta doksiciklin in minociklin) veljalo za najmočnejšo metodo za induciranje izražanja transgenov. Pogosto opažena nesprejemljiva stopnja pušččanja tega sistema poskušali so odpraviti z uporabo enovektorskega pristopa optimiziranega za proizvodnjo lentivirusa. Sistem 'vse v enem' Tet-Off je zmanjšal bazalno puščanje, vendar na račun moči indukcije transgena. Zaradi tega so razvili represibilni binarni transgenski indukcijski sistem, stikalo Q (ali SIQ), pridobljeno iz glive Neurospora crassa. SIQ ni pokazalo nobenega puščanja pri izražanju transgena v celicah sesalcev, hkrati pa je ohranjalo visoko občutljivost na kemični induktor [1,2].

Za izdelavo novega SIQ so uporabljali vektor pENTR-EUI. Pred tem so dokazali, da je bilo singularno gensko stikalo (EUI) na osnovi Gal4/UAS uspešno implementirano za transgensko indukcijo v človeških celičnih linijah, vendar je transgenska inducibilnost sistema Gal4/UAS na splošno šibkejša ter je zelo občutljiv na metilacijo, kar lahko provzroči utišanje transgena po zaporednih generacijah. Na osnovi tega so za izdelavo novega sistema uporabili podoben vektor z uvedbo določenih sprememb, kot je recimo takoimenovani pogonski modul, ki je ključen za izražanje komponent potrebnih za vezavo na elemente ojačevalca 13 x QUAS, ki nato inducirajo transkripcijo transgena le, če ga stimulirajo kemični dražljaji. Končni vektor pSIQ je bil zasnovan tako, da izgubi tako pUC ori kot dva izbirna markerja po rekombinaciji z vektorjem pAd/PL-DEST za pripravo adenovirusa [1].

== SIQ omogoča enostavno ustvarjanje stabilnih celičnih linij ==
Vektor pSIQ vsebuje prepoznavno meto serin integraze (phiC31) attB, ki omogoča generiranje stabilnih celičnih linij z rekombinacijo na osnovi integraze. V preskusni vektor so kot transgen vstavili zapis za EGFP, ki je odvisen od odmerka tebufenozida (Teb). S kontransfekcijo vektora pSIQ, ki kodira transgen EGFP, z ekspresijskim vektorjem integraze v HEK293-attP-Bla celicah so potrdili njihovo pravilno implantacijo na mesto attP gostiteljskega genoma. Potem so dokazali, da je raven izražanja EGFP naraščala z neprekinjenim dodajanjem Teb in je dosegla plato po 48 urah. Poleg tega vzpostavljena celična linija se je odzvala izključno na eksogene kemične dražljaje, kar so dokazali z opaženo postopno zmanjševanje ravni EGFP po odstranitvi Teb. Natančnost SIQ so dokazali tudi z generiranjem druge stabilne celične linije s istim transgenom in vsemi komponentami SIQ razen pogonskega modula (CMV-QFDBD-2x AD*-VP16*-EcR-poly(A)). Čeprav je prišlo do integracije na identičen attP lokus HEK293-attP-Bla celičnih linij, te brez pogonskega modula niso pokazale nobenega odziva na dražljaje z uporabo Teb. Pomembno je omeniti tudi to, da je SIQ-EGFP brez dodajanja Teb prikazala le zanemarljivo raven izražanja EGFP [1,3,4].

== Preklopno stikalo SIQ lahko preuredimo v sistem za dostavo genov posredovani z adenovirusi ==
Sistemi za dostavo genov, posredovani z adenovirusi, so bili v veliki meri uporabljeni za klinične aplikacije. Glavna pomanjkljivost virusnega vektorja je to, da kaže sposobnost okužbe širokega sprektra celičnih linij. Poleg tega narava adenovirusa je taka, da ne pride do integracije v genom gostiteljskega organizma, kar sčasoma privede do zmanjševanja ravni virusnega genoma v celicah. Da bi olajšali učinkovito dostavo pSIQ v celice, ki kažejo zelo nizko učinkovitost transfekcije, so uporabili adenovirusni pakirni sistem. Vektor pSIQ z EGFP so in vitro integrirali z vektorjem pAd/PL-DEST. Poleg tega pripravili so tudi adenovirusni vektor pENTR-EUI, ki se odziva na Teb. pENTR-EUI, ki nosi zapis za EGFP, je bil uporabljen za proizvodnjo adenovirusa (Ad/EUI-EGFP) po združitvi s vektorjem pAd/PL-DEST. Izražanje EGFP v pENTR-EUI je bilo kontrolirano z sistemom Gal4/UAS, kar je služilo kot kontrola za primerjavo sistema SIQ. Po različnih eksperimentih so dokazali, da je bil potreben vsaj 10x višji MOI (razmerje med številom transducirajočih vektorjev in številom celic) Ad/EUI-EGFP, da bi dosegli enakovreden odziv celic, okuženih z Ad/SQI-EGFP [5].

Poročali so, da je intravensko injiciran adenovirus zelo nalezljiv za jetra, kamor virus najprej pride preko jetrne vene in se infiltrira v jetrne celice [6]. Da bi preverili ali je Ad/SIQ-EGFP, ki so ga uporabljali za okužbo keratinocitov HaCaT, uporaben tudi v raziskavah in vivo, so v repno veno miši injicirali 100 µL adenovirusa s povečano koncentracijo virusnih delcev. Po 24 urah okužbe z Ad/SIQ-EGFP so enkrat dnevno v 24-urnih intervalih z intraperitonealno injekcijo vbrizgali 100 µL PBS ali enako količino Teb (1mmol/L) raztopljenega v PBS. En dan po injiciranju kemičnega dražljaja so eviscerirali jetra, da bi preverili izražanje EGFP. Kot je bilo pričakovano samo pri jetrih, ki so bila okužena z virusom so pokazale pozitiven odziv na Teb za razliko od jeter, ki niso bila okužena. Še pomembnejše je bilo opažanje, da okužba z virusom v odsotnosti zdravljenja s Teb ni provzročila nobene zaznavne ekspresije EGFP. Pomembno je omeniti tudi to, da pri miših z virusno okužbo z uporabo Ad/SIQ-EGFP niso odkrili nobenih opaznih okvar jeter, niti po dolgotrajnem rednem dajanju Teb 3 tedne. Treba je omeniti, da preklopno stikalo SIQ presega sistem EUI, ki temelji na Gal4/UAS, in je primerljiv s konstitutivnim ekspresijskim sistemom, ki izhaja iz CMV in vivo [7].

== Sofisticirano transgensko preklapljanje lahko dosežemo s kombinacijo SIQ in genskega stikala cumate ==
Čeprav je SIQ pokazal svojo visoko vsestranskost v celičnih linijah, pridobljenih iz človeka, obstaja proctor za izboljšave z vključitvijo drugih genskih regulacijskih elementov, ki jih je mogoče nadzorovati z drugimi kemičnimi ligandi. To vključuje recimo razvoj ortogonalnega genskega stikala, kjer lahko dva ali več različnih induktorjev uravnava izražanje transgena, ne da bi se med seboj motili. Na splošno kemičnih genskih stikal ni mogoče na hitro izklopiti zaradi dolgotrajnih učinkov kemičnih induktorjev na transgen. Da bi dosegli pospešeno supresijo ekspresije tarčnega gena, so v preklopno stikalo SIQ uvedli od kumata odvisen transgenski represor [8].

Gensko stikalo na osnovi kumata je sestavljeno iz dveh glavnih komponent: represorskega modula CymR in zaporedja CuO, na katero se veže CymR in inhibira ekspresijo transgena. Kumat (4-izopropilbenzojska kislina) se neposredno veže na CymR in ga loči od CuO, kar provzroči derepresijo transgenske ekspresije. Golnilno zaporedje pSIQ so povezali s CymR preko zaporedja peptida 2A P2A ter so CuO, dolžine 28 baznih parvov, dodali neposredno pred mestom začetka transkripcije transgena pSIQ. Takšna ureditev omogoča hkratno izražanje gonilnega zaporedja SIQ in represorja CymR. Ta konstrukt imenovali so pSIQmate, ki je bil sestavljen iz 9001 nukleotida.

Da bi preizkusili odzivnost SIQmate na oba induktorja, so začasno transficirali celice HEK293 z pSIQmate-EGFP in jih nato obdelali s Teb ali kumatom posamično, pa tudi v kombinaciji. Rezultati obdelave celic so pokazali, da je prišlo do florescence EGFP samo v primerih uporabe obeh kemikalij sočasno. Poleg tega pokazalo se je, da so kloni, ki so bili obdelani samo s Teb, pokazali obrobno povišanje fluorescenčnih signalov. Ti signali niso bili dovolj močni, da bi jih lahko zaznali s fluorescenčno mikroskopijo in so zaradi tega naredili ponovno kvantifikacijo ampak z merjenjem aktivnosti luciferaze. Ta pojav je verjetno posledica občasnega odvajanja CymR od CuO ne glede na kumat, kar je pogost pojav med regulatorji transkripcije [9].

Po ponovni kvantifikaciji z merjenjem aktivnosti luciferaze, je SIQmate pokazal znatno nižjo občutljivost na kemične dražljaje v primerjavi s SIQ (približno 0,2-kratna razlika). Iz the razlogov obstaja možnost potrebe nadaljnje optimizacije za povečanje robustnosti transgenske aktivacije v sistemu SIQmate.

== Zaključek ==
Obstaja več meril, ki jih je treba upoštevati, preden se oblikuje novo, kemično zasnovano transgensko preklopno stikalo. Vsak sistem za regulacijo transgenov ne sme biti toksičen za celice in organizme, mora biti izjemno občutljiv in natančno moduliran s pravilnim odmerkom spojin, ki delujejo kot kemični dražljaji [10].

Usodna napaka binarne lasnosti transgenskih preklopnih stikal je, da je težko pričakovati, da bo dosegla enakomerno dostavo dveh ločenih vektorjev v ciljne celice in tkiva hkrati. Posledica tega je nastajajoča populacija celic z neenakomerno porazdeljenimi plazmidi. Čeprav se lahko raziskovalci izognejo proizvodnji neželene heterogene populacije celic z vzpostavitvijo stabilne celične linije, je to naporen in dolgotrajen proces [10]. Zato bi bila izdelava zanesljivega in vsestranskega singularnega transgenskega stikala zaželena na področju predkliničnih in bioloških raziskav. Dokazali so, da je preklopno stikalo SIQ boljše od EUI Sistema na osnovi Gal4/UAS v smislu večje občutljivosti na kemične dražljaje, nižje bazalne ekspresije in večje vsestranskosti. Takšen sistem najde široko uporabo, vključno s poskusi prehodne transfekcije, vzpostavitvijo stabilnih celičnih linij in proizvodnjo adenovirusa, pri čemer je za vse potreben le en krog subkloniranja transgenov v pSIQ.

== Literatura ==
[1] J. Hong et al., “All-in-one IQ toggle switches with high versatilities for fine-tuning of transgene expression in mammalian cells and tissues,” Mol Ther Methods Clin Dev, vol. 32, no. 1, p. 101202, Mar. 2024, doi: 10.1016/j.omtm.2024.101202.
[2] E. Vigna et al., “Robust and Efficient Regulation of Transgene Expression in Vivo by Improved Tetracycline-Dependent Lentiviral Vectors,” Molecular Therapy, vol. 5, no. 3, pp. 252–261, Mar. 2002, doi: 10.1006/mthe.2002.0542.
[3] C.-A. Lo, A. W. Greben, and B. E. Chen, “Generating stable cell lines with quantifiable protein production using CRISPR/Cas9-mediated knock-in,” Biotechniques, vol. 62, no. 4, pp. 165–174, Apr. 2017, doi: 10.2144/000114534.
[4] C. A. Merrick, J. Zhao, and S. J. Rosser, “Serine Integrases: Advancing Synthetic Biology,” ACS Synth Biol, vol. 7, no. 2, pp. 299–310, Feb. 2018, doi: 10.1021/acssynbio.7b00308.
[5] J. T. Bulcha, Y. Wang, H. Ma, P. W. L. Tai, and G. Gao, “Viral vector platforms within the gene therapy landscape,” Signal Transduct Target Ther, vol. 6, no. 1, p. 53, Feb. 2021, doi: 10.1038/s41392-021-00487-6.
[6] S. J. Duncan et al., “Infection of Mouse Liver by Human Adenovirus Type 5,” Journal of General Virology, vol. 40, no. 1, pp. 45–61, Jul. 1978, doi: 10.1099/0022-1317-40-1-45.
[7] S. Lee et al., “Ecdysone Receptor-based Singular Gene Switches for Regulated Transgene Expression in Cells and Adult Rodent Tissues,” Mol Ther Nucleic Acids, vol. 5, p. e367, 2016, doi: 10.1038/mtna.2016.74.
[8] A. Mullick et al., “The cumate gene-switch: a system for regulated expression in mammalian cells,” BMC Biotechnol, vol. 6, no. 1, p. 43, 2006, doi: 10.1186/1472-6750-6-43.
[9] A. Raj and A. van Oudenaarden, “Nature, Nurture, or Chance: Stochastic Gene Expression and Its Consequences,” Cell, vol. 135, no. 2, pp. 216–226, Oct. 2008, doi: 10.1016/j.cell.2008.09.050.
[10] Y. Suzuki and Y. Suzuki, “Gene Regulatable Lentiviral Vector System,” in Viral Gene Therapy, InTech, 2011. doi: 10.5772/18155.

Main Page

2024-05-12T14:51:11Z

Ena Kartal:

Izhodiščni članek: [https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2329050124000184?via%3Dihub#bib15]

== Uvod ==
Doslej razvita transgena stikala izkoriščajo zunanje dražljaje, ki jih lahko spreminjamo, kot so hormoni, kemikalije, težke kovine, toplota, svetloba ipd. Med genskimi stikali, ki so odvisni od majhnih molekul, je sistem Tet-On/Off (izkorišča tetraciklin ali njegove derivate, kot sta doksiciklin in minociklin) veljalo za najmočnejšo metodo za induciranje izražanja transgenov. Pogosto opažena nesprejemljiva stopnja pušččanja tega sistema poskušali so odpraviti z uporabo enovektorskega pristopa optimiziranega za proizvodnjo lentivirusa. Sistem 'vse v enem' Tet-Off je zmanjšal bazalno puščanje, vendar na račun moči indukcije transgena. Zaradi tega so razvili represibilni binarni transgenski indukcijski sistem, stikalo Q (ali SIQ), pridobljeno iz glive Neurospora crassa. SIQ ni pokazalo nobenega puščanja pri izražanju transgena v celicah sesalcev, hkrati pa je ohranjalo visoko občutljivost na kemični induktor [1,2].

Za izdelavo novega SIQ so uporabljali vektor pENTR-EUI. Pred tem so dokazali, da je bilo singularno gensko stikalo (EUI) na osnovi Gal4/UAS uspešno implementirano za transgensko indukcijo v človeških celičnih linijah, vendar je transgenska inducibilnost sistema Gal4/UAS na splošno šibkejša ter je zelo občutljiv na metilacijo, kar lahko provzroči utišanje transgena po zaporednih generacijah. Na osnovi tega so za izdelavo novega sistema uporabili podoben vektor z uvedbo določenih sprememb, kot je recimo takoimenovani pogonski modul, ki je ključen za izražanje komponent potrebnih za vezavo na elemente ojačevalca 13 x QUAS, ki nato inducirajo transkripcijo transgena le, če ga stimulirajo kemični dražljaji. Končni vektor pSIQ je bil zasnovan tako, da izgubi tako pUC ori kot dva izbirna markerja po rekombinaciji z vektorjem pAd/PL-DEST za pripravo adenovirusa [1].

== SIQ omogoča enostavno ustvarjanje stabilnih celičnih linij ==
Vektor pSIQ vsebuje prepoznavno meto serin integraze (phiC31) attB, ki omogoča generiranje stabilnih celičnih linij z rekombinacijo na osnovi integraze. V preskusni vektor so kot transgen vstavili zapis za EGFP, ki je odvisen od odmerka tebufenozida (Teb). S kontransfekcijo vektora pSIQ, ki kodira transgen EGFP, z ekspresijskim vektorjem integraze v HEK293-attP-Bla celicah so potrdili njihovo pravilno implantacijo na mesto attP gostiteljskega genoma. Potem so dokazali, da je raven izražanja EGFP naraščala z neprekinjenim dodajanjem Teb in je dosegla plato po 48 urah. Poleg tega vzpostavljena celična linija se je odzvala izključno na eksogene kemične dražljaje, kar so dokazali z opaženo postopno zmanjševanje ravni EGFP po odstranitvi Teb. Natančnost SIQ so dokazali tudi z generiranjem druge stabilne celične linije s istim transgenom in vsemi komponentami SIQ razen pogonskega modula (CMV-QFDBD-2x AD*-VP16*-EcR-poly(A)). Čeprav je prišlo do integracije na identičen attP lokus HEK293-attP-Bla celičnih linij, te brez pogonskega modula niso pokazale nobenega odziva na dražljaje z uporabo Teb. Pomembno je omeniti tudi to, da je SIQ-EGFP brez dodajanja Teb prikazala le zanemarljivo raven izražanja EGFP [1,3,4].

== Preklopno stikalo SIQ lahko preuredimo v sistem za dostavo genov posredovani z adenovirusi ==
Sistemi za dostavo genov, posredovani z adenovirusi, so bili v veliki meri uporabljeni za klinične aplikacije. Glavna pomanjkljivost virusnega vektorja je to, da kaže sposobnost okužbe širokega sprektra celičnih linij. Poleg tega narava adenovirusa je taka, da ne pride do integracije v genom gostiteljskega organizma, kar sčasoma privede do zmanjševanja ravni virusnega genoma v celicah. Da bi olajšali učinkovito dostavo pSIQ v celice, ki kažejo zelo nizko učinkovitost transfekcije, so uporabili adenovirusni pakirni sistem. Vektor pSIQ z EGFP so in vitro integrirali z vektorjem pAd/PL-DEST. Poleg tega pripravili so tudi adenovirusni vektor pENTR-EUI, ki se odziva na Teb. pENTR-EUI, ki nosi zapis za EGFP, je bil uporabljen za proizvodnjo adenovirusa (Ad/EUI-EGFP) po združitvi s vektorjem pAd/PL-DEST. Izražanje EGFP v pENTR-EUI je bilo kontrolirano z sistemom Gal4/UAS, kar je služilo kot kontrola za primerjavo sistema SIQ. Po različnih eksperimentih so dokazali, da je bil potreben vsaj 10x višji MOI (razmerje med številom transducirajočih vektorjev in številom celic) Ad/EUI-EGFP, da bi dosegli enakovreden odziv celic, okuženih z Ad/SQI-EGFP [5].

Poročali so, da je intravensko injiciran adenovirus zelo nalezljiv za jetra, kamor virus najprej pride preko jetrne vene in se infiltrira v jetrne celice [6]. Da bi preverili ali je Ad/SIQ-EGFP, ki so ga uporabljali za okužbo keratinocitov HaCaT, uporaben tudi v raziskavah in vivo, so v repno veno miši injicirali 100 µL adenovirusa s povečano koncentracijo virusnih delcev. Po 24 urah okužbe z Ad/SIQ-EGFP so enkrat dnevno v 24-urnih intervalih z intraperitonealno injekcijo vbrizgali 100 µL PBS ali enako količino Teb (1mmol/L) raztopljenega v PBS. En dan po injiciranju kemičnega dražljaja so eviscerirali jetra, da bi preverili izražanje EGFP. Kot je bilo pričakovano samo pri jetrih, ki so bila okužena z virusom so pokazale pozitiven odziv na Teb za razliko od jeter, ki niso bila okužena. Še pomembnejše je bilo opažanje, da okužba z virusom v odsotnosti zdravljenja s Teb ni provzročila nobene zaznavne ekspresije EGFP. Pomembno je omeniti tudi to, da pri miših z virusno okužbo z uporabo Ad/SIQ-EGFP niso odkrili nobenih opaznih okvar jeter, niti po dolgotrajnem rednem dajanju Teb 3 tedne. Treba je omeniti, da preklopno stikalo SIQ presega sistem EUI, ki temelji na Gal4/UAS, in je primerljiv s konstitutivnim ekspresijskim sistemom, ki izhaja iz CMV in vivo [7].

== Sofisticirano transgensko preklapljanje lahko dosežemo s kombinacijo SIQ in genskega stikala cumate ==
Čeprav je SIQ pokazal svojo visoko vsestranskost v celičnih linijah, pridobljenih iz človeka, obstaja proctor za izboljšave z vključitvijo drugih genskih regulacijskih elementov, ki jih je mogoče nadzorovati z drugimi kemičnimi ligandi. To vključuje recimo razvoj ortogonalnega genskega stikala, kjer lahko dva ali več različnih induktorjev uravnava izražanje transgena, ne da bi se med seboj motili. Na splošno kemičnih genskih stikal ni mogoče na hitro izklopiti zaradi dolgotrajnih učinkov kemičnih induktorjev na transgen. Da bi dosegli pospešeno supresijo ekspresije tarčnega gena, so v preklopno stikalo SIQ uvedli od kumata odvisen transgenski represor [8].

Gensko stikalo na osnovi kumata je sestavljeno iz dveh glavnih komponent: represorskega modula CymR in zaporedja CuO, na katero se veže CymR in inhibira ekspresijo transgena. Kumat (4-izopropilbenzojska kislina) se neposredno veže na CymR in ga loči od CuO, kar provzroči derepresijo transgenske ekspresije. Golnilno zaporedje pSIQ so povezali s CymR preko zaporedja peptida 2A P2A ter so CuO, dolžine 28 baznih parvov, dodali neposredno pred mestom začetka transkripcije transgena pSIQ. Takšna ureditev omogoča hkratno izražanje gonilnega zaporedja SIQ in represorja CymR. Ta konstrukt imenovali so pSIQmate, ki je bil sestavljen iz 9001 nukleotida.

Da bi preizkusili odzivnost SIQmate na oba induktorja, so začasno transficirali celice HEK293 z pSIQmate-EGFP in jih nato obdelali s Teb ali kumatom posamično, pa tudi v kombinaciji. Rezultati obdelave celic so pokazali, da je prišlo do florescence EGFP samo v primerih uporabe obeh kemikalij sočasno. Poleg tega pokazalo se je, da so kloni, ki so bili obdelani samo s Teb, pokazali obrobno povišanje fluorescenčnih signalov. Ti signali niso bili dovolj močni, da bi jih lahko zaznali s fluorescenčno mikroskopijo in so zaradi tega naredili ponovno kvantifikacijo ampak z merjenjem aktivnosti luciferaze. Ta pojav je verjetno posledica občasnega odvajanja CymR od CuO ne glede na kumat, kar je pogost pojav med regulatorji transkripcije [9].

Po ponovni kvantifikaciji z merjenjem aktivnosti luciferaze, je SIQmate pokazal znatno nižjo občutljivost na kemične dražljaje v primerjavi s SIQ (približno 0,2-kratna razlika). Iz the razlogov obstaja možnost potrebe nadaljnje optimizacije za povečanje robustnosti transgenske aktivacije v sistemu SIQmate.

== Zaključek ==
Obstaja več meril, ki jih je treba upoštevati, preden se oblikuje novo, kemično zasnovano transgensko preklopno stikalo. Vsak sistem za regulacijo transgenov ne sme biti toksičen za celice in organizme, mora biti izjemno občutljiv in natančno moduliran s pravilnim odmerkom spojin, ki delujejo kot kemični dražljaji [10].

Usodna napaka binarne lasnosti transgenskih preklopnih stikal je, da je težko pričakovati, da bo dosegla enakomerno dostavo dveh ločenih vektorjev v ciljne celice in tkiva hkrati. Posledica tega je nastajajoča populacija celic z neenakomerno porazdeljenimi plazmidi. Čeprav se lahko raziskovalci izognejo proizvodnji neželene heterogene populacije celic z vzpostavitvijo stabilne celične linije, je to naporen in dolgotrajen proces [10]. Zato bi bila izdelava zanesljivega in vsestranskega singularnega transgenskega stikala zaželena na področju predkliničnih in bioloških raziskav. Dokazali so, da je preklopno stikalo SIQ boljše od EUI Sistema na osnovi Gal4/UAS v smislu večje občutljivosti na kemične dražljaje, nižje bazalne ekspresije in večje vsestranskosti. Takšen sistem najde široko uporabo, vključno s poskusi prehodne transfekcije, vzpostavitvijo stabilnih celičnih linij in proizvodnjo adenovirusa, pri čemer je za vse potreben le en krog subkloniranja transgenov v pSIQ.

== Literatura ==
[1] J. Hong et al., “All-in-one IQ toggle switches with high versatilities for fine-tuning of transgene expression in mammalian cells and tissues,” Mol Ther Methods Clin Dev, vol. 32, no. 1, p. 101202, Mar. 2024, doi: 10.1016/j.omtm.2024.101202.
[2] E. Vigna et al., “Robust and Efficient Regulation of Transgene Expression in Vivo by Improved Tetracycline-Dependent Lentiviral Vectors,” Molecular Therapy, vol. 5, no. 3, pp. 252–261, Mar. 2002, doi: 10.1006/mthe.2002.0542.
[3] C.-A. Lo, A. W. Greben, and B. E. Chen, “Generating stable cell lines with quantifiable protein production using CRISPR/Cas9-mediated knock-in,” Biotechniques, vol. 62, no. 4, pp. 165–174, Apr. 2017, doi: 10.2144/000114534.
[4] C. A. Merrick, J. Zhao, and S. J. Rosser, “Serine Integrases: Advancing Synthetic Biology,” ACS Synth Biol, vol. 7, no. 2, pp. 299–310, Feb. 2018, doi: 10.1021/acssynbio.7b00308.
[5] J. T. Bulcha, Y. Wang, H. Ma, P. W. L. Tai, and G. Gao, “Viral vector platforms within the gene therapy landscape,” Signal Transduct Target Ther, vol. 6, no. 1, p. 53, Feb. 2021, doi: 10.1038/s41392-021-00487-6.
[6] S. J. Duncan et al., “Infection of Mouse Liver by Human Adenovirus Type 5,” Journal of General Virology, vol. 40, no. 1, pp. 45–61, Jul. 1978, doi: 10.1099/0022-1317-40-1-45.
[7] S. Lee et al., “Ecdysone Receptor-based Singular Gene Switches for Regulated Transgene Expression in Cells and Adult Rodent Tissues,” Mol Ther Nucleic Acids, vol. 5, p. e367, 2016, doi: 10.1038/mtna.2016.74.
[8] A. Mullick et al., “The cumate gene-switch: a system for regulated expression in mammalian cells,” BMC Biotechnol, vol. 6, no. 1, p. 43, 2006, doi: 10.1186/1472-6750-6-43.
[9] A. Raj and A. van Oudenaarden, “Nature, Nurture, or Chance: Stochastic Gene Expression and Its Consequences,” Cell, vol. 135, no. 2, pp. 216–226, Oct. 2008, doi: 10.1016/j.cell.2008.09.050.
[10] Y. Suzuki and Y. Suzuki, “Gene Regulatable Lentiviral Vector System,” in Viral Gene Therapy, InTech, 2011. doi: 10.5772/18155.

Seminarji SB 2023/24

2024-05-12T08:57:53Z

Ena Kartal:

V študijskem letu 2023/24 študenti in študentke pri Sintezni biologiji predstavljajo naslednje teme:

RAZISKOVALNI ČLANKI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sinteznobiološki_pristop_k_sestavljanju_in_ponovnemu_zagonu_klinično_pomembnih_fagov_Pseudomonas_aeruginosa Sinteznobiološki pristop k sestavljanju in ponovnemu zagonu klinično pomembnih fagov ''Pseudomonas aeruginosa''] (Bor Krajnik)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Optogenetsko_prostorsko_vzorčenje_kooperacije_pri_glivah_kvasovkah Optogenetsko prostorsko vzorčenje kooperacije pri glivah kvasovkah] (Martin Stanonik)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sintetična_celična_linija_za_inducibilno_pakiranje_virusa_influence_A Sintetična celična linija za inducibilno pakiranje virusa influence A] (Klara Razboršek)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Uporaba_sesalskega_RNA-vezavnega_proteina_Musashi-1_kot_alosterično_reguliranega_translacijskega_represorja_v_E._coli Uporaba sesalskega RNA-vezavnega proteina Musashi-1 kot alosterično reguliranega translacijskega represorja v ''E. coli''] (Marko Kovačić)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Kaskadno_ojačano_genetsko_vezje_za_detekcijo_glivnih_patogenov Kaskadno ojačano genetsko vezje za detekcijo glivnih patogenov] (Jakob Tomšič)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sintetična_mRNA-stikala_s_povratno_zanko,_ki_omogočajo_zaznavanje_miRNA Sintetična mRNA-stikala s povratno zanko, ki omogočajo zaznavanje miRNA] (Ana Pervanja)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Molekularni_nabor_navzkrižno_hranjenih_sevov_za_pripravo_sintetičnih_skupnosti_kvasovk Molekularni nabor navzkrižno hranjenih sevov za pripravo sintetičnih skupnosti kvasovk] (Teja Spruk)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Inženiring_dinamike_rasti_sesalskih_celic_za_bioproizvodnjo Inženiring dinamike rasti sesalskih celic za bioproizvodnjo] (Zarja Rožanc)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Inženirane_mRNA-ribosomske_fuzije_za_lažjo_biosintezo_selenoproteinov Inženirane mRNA-ribosomske fuzije za lažjo biosintezo selenoproteinov] (Kostadin Mitkov)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Razvoj_novih_binarnih_ekspresijskih_sistemov_za_sintezno_biologijo_rastlin Razvoj novih binarnih ekspresijskih sistemov za sintezno biologijo rastlin] (Alliana Kolar)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Kombinatorična_biosinteza_terpenoidov_v_kvasovkah Kombinatorična biosinteza terpenoidov v kvasovkah] (Jan Kogovšek)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Identifikacija_genov,_ki_se_odzivajo_na_stres_kislega_okolja_in_inženiring_odpornosti_na_kislo_okolje_v_cianobakteriji_Synechococcus_elongatus_PCC_7942 Identifikacija genov, ki se odzivajo na stres kislega okolja in inženiring odpornosti na kislo okolje v cianobakteriji ''Synechococcus elongatus'' PCC 7942] (Ela Kovač)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/ Vse v enem - IQ preklopna stikala z veliko vsestranskostjo za natančno nastavitev izražanja transgenov v celicah in tkivih seselacev] (Ena Kartal)

NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/PhaseOut Biološka proizvodnja bioplastike] (Sašo Jakob)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BeeYeast Inženiring kvasovk za boj proti virusnim okužbam čebel] (Mateja Milošević)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Cellect Cellect - Fenotipsko stabilne celične linije] (Lucija Voga)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/oPHAelia oPHAelia - Inovativna rešitev za zmanjšanje onesnaževanja s plastiko] (Irina Kostadinoska)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/ReMixHD ReMixHD - Recikliranje mešanih plastičnih odpadkov] (Ema Kavčič)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/DARWINS DARWINS - Usmerjena posodobitev proteinov Ago z idealno proteinsko termično stabilnostjo] (Rahela Petrovčič)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/PET-2-Protein PET-2-Protein - Proizvodnja mikrobnih proteinov iz polietilen tereftalata] (Zala Perko)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/48C_Cadmium_catcher_LBP 48C Cadmium catcher LBP- Proizvodnja bioterapevtika za vezavo kadmija] (Maja Deutsch)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Proteus Proteus - Sistem za ciljanje onkogenov in induciranje piroptoze] (Gašper Struna)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Silinker Silinker] (Nuša Brdnik)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sublimestone Sublimestone - uporaba bakterij za ohranjanje kulturne dediščine] (Ana Maučec)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/LAMPS LAMPS - sistem svetlečih alg] (Rebeka Jerina)
----

Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Povzetek je treba objaviti dva dni pred predstavitvijo do polnoči (za seminarje v sredo torej v ponedeljek). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo približno 5-minutna razprava.

Terminski razpored je razviden iz preglednice na strežniku Google Drive.

Kako je videti seznam seminarjev, lahko preverite pri lanskem letniku: [[Seminarji_SB_2022/23]].

Seminarji SB 2023/24

2024-05-12T08:57:15Z

Ena Kartal:

V študijskem letu 2023/24 študenti in študentke pri Sintezni biologiji predstavljajo naslednje teme:

RAZISKOVALNI ČLANKI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sinteznobiološki_pristop_k_sestavljanju_in_ponovnemu_zagonu_klinično_pomembnih_fagov_Pseudomonas_aeruginosa Sinteznobiološki pristop k sestavljanju in ponovnemu zagonu klinično pomembnih fagov ''Pseudomonas aeruginosa''] (Bor Krajnik)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Optogenetsko_prostorsko_vzorčenje_kooperacije_pri_glivah_kvasovkah Optogenetsko prostorsko vzorčenje kooperacije pri glivah kvasovkah] (Martin Stanonik)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sintetična_celična_linija_za_inducibilno_pakiranje_virusa_influence_A Sintetična celična linija za inducibilno pakiranje virusa influence A] (Klara Razboršek)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Uporaba_sesalskega_RNA-vezavnega_proteina_Musashi-1_kot_alosterično_reguliranega_translacijskega_represorja_v_E._coli Uporaba sesalskega RNA-vezavnega proteina Musashi-1 kot alosterično reguliranega translacijskega represorja v ''E. coli''] (Marko Kovačić)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Kaskadno_ojačano_genetsko_vezje_za_detekcijo_glivnih_patogenov Kaskadno ojačano genetsko vezje za detekcijo glivnih patogenov] (Jakob Tomšič)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sintetična_mRNA-stikala_s_povratno_zanko,_ki_omogočajo_zaznavanje_miRNA Sintetična mRNA-stikala s povratno zanko, ki omogočajo zaznavanje miRNA] (Ana Pervanja)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Molekularni_nabor_navzkrižno_hranjenih_sevov_za_pripravo_sintetičnih_skupnosti_kvasovk Molekularni nabor navzkrižno hranjenih sevov za pripravo sintetičnih skupnosti kvasovk] (Teja Spruk)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Inženiring_dinamike_rasti_sesalskih_celic_za_bioproizvodnjo Inženiring dinamike rasti sesalskih celic za bioproizvodnjo] (Zarja Rožanc)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Inženirane_mRNA-ribosomske_fuzije_za_lažjo_biosintezo_selenoproteinov Inženirane mRNA-ribosomske fuzije za lažjo biosintezo selenoproteinov] (Kostadin Mitkov)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Razvoj_novih_binarnih_ekspresijskih_sistemov_za_sintezno_biologijo_rastlin Razvoj novih binarnih ekspresijskih sistemov za sintezno biologijo rastlin] (Alliana Kolar)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Kombinatorična_biosinteza_terpenoidov_v_kvasovkah Kombinatorična biosinteza terpenoidov v kvasovkah] (Jan Kogovšek)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Identifikacija_genov,_ki_se_odzivajo_na_stres_kislega_okolja_in_inženiring_odpornosti_na_kislo_okolje_v_cianobakteriji_Synechococcus_elongatus_PCC_7942 Identifikacija genov, ki se odzivajo na stres kislega okolja in inženiring odpornosti na kislo okolje v cianobakteriji ''Synechococcus elongatus'' PCC 7942] (Ela Kovač)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Vse v enem - IQ preklopna stikala z veliko vsestranskostjo za natančno nastavitev izražanja transgenov v celicah in tkivih seselacev] (Ena Kartal)

NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/PhaseOut Biološka proizvodnja bioplastike] (Sašo Jakob)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BeeYeast Inženiring kvasovk za boj proti virusnim okužbam čebel] (Mateja Milošević)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Cellect Cellect - Fenotipsko stabilne celične linije] (Lucija Voga)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/oPHAelia oPHAelia - Inovativna rešitev za zmanjšanje onesnaževanja s plastiko] (Irina Kostadinoska)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/ReMixHD ReMixHD - Recikliranje mešanih plastičnih odpadkov] (Ema Kavčič)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/DARWINS DARWINS - Usmerjena posodobitev proteinov Ago z idealno proteinsko termično stabilnostjo] (Rahela Petrovčič)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/PET-2-Protein PET-2-Protein - Proizvodnja mikrobnih proteinov iz polietilen tereftalata] (Zala Perko)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/48C_Cadmium_catcher_LBP 48C Cadmium catcher LBP- Proizvodnja bioterapevtika za vezavo kadmija] (Maja Deutsch)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Proteus Proteus - Sistem za ciljanje onkogenov in induciranje piroptoze] (Gašper Struna)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Silinker Silinker] (Nuša Brdnik)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sublimestone Sublimestone - uporaba bakterij za ohranjanje kulturne dediščine] (Ana Maučec)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/LAMPS LAMPS - sistem svetlečih alg] (Rebeka Jerina)
----

Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Povzetek je treba objaviti dva dni pred predstavitvijo do polnoči (za seminarje v sredo torej v ponedeljek). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo približno 5-minutna razprava.

Terminski razpored je razviden iz preglednice na strežniku Google Drive.

Kako je videti seznam seminarjev, lahko preverite pri lanskem letniku: [[Seminarji_SB_2022/23]].

Seminarji SB 2023/24

2024-04-13T11:01:09Z

Ena Kartal:

OPHAelia

2024-04-13T10:48:14Z

Ena Kartal: Created page with "oPHAelia je projekt ekipe iz Tesalije, ki je leta 2023 tekmovala na iGEM sinteznem tekmovanju. Predtavitev projekta je dostopna na povezavi https://2023.igem.wiki/thessaly == Uvod == Na svetovni lestvici proizvodnje oljčnega olja je Grčija na tretjem mestu, saj proizvede 18 % svetovnega oljčnega olja. Tesalija kot majhna regija proizvede manj kot 10 % grškega oljčnega olja. Glavni problem pri proizvodnji oljčnega olja je odpadna voda – (ang. Olive Oil Mill Was..."

oPHAelia je projekt ekipe iz Tesalije, ki je leta 2023 tekmovala na iGEM sinteznem tekmovanju. Predtavitev projekta je dostopna na povezavi https://2023.igem.wiki/thessaly

== Uvod ==
Na svetovni lestvici proizvodnje oljčnega olja je Grčija na tretjem mestu, saj proizvede 18 % svetovnega oljčnega olja. Tesalija kot majhna regija proizvede manj kot 10 % grškega oljčnega olja. Glavni problem pri proizvodnji oljčnega olja je odpadna voda – (ang. Olive Oil Mill Wastewater – OMW), strupeni stranski produkt, ki močno ogroža okolje. Na vsak 1 kg oljčnega olja nastane 1.25 kg OMW. V Grčiji letna proizvodnja OMW dosega približno 2,5 milijona kubičnih metrov [1].
OMW je temno rjave barve, kisle narave, z vrednostmi pH v razponu od 2 do 6 in oddaja močno oster in škodljiv vonj, tudi na dolge razdalje in zlasti med obdobji proizvodnje oljčnega olja. Predstavlja kompleksna zmes, sestavljena iz različnih organskih in anorganskih spojin, zaradi česar je pomembna okoljska skrb. OMW je sestavljena iz fenolnih spojin, kot so hidroksitirozol, protokatehuinska, p-kumarinska kislina, vaniljeva in kofeinska kislina, za katero je značilna kemijska potreba po kisiku - COD 30–320 g/L in biokemijska potreba po kisiku - BOD 35–132 g/L. Ko se sprosti v vodna telesa, kot so potoki ali reke, se lahko zmanjša razpoložljivost kisika, kar poruši ravnovesje celotnega ekosistema. Poleg tega, ko se neobdelan OMW odloži v zemljo, negativno vpliva na njeno poroznost. Posledično sta ovirana razvoj favne in dihanje korenin, kar vpliva na splošno zdravje tal [1].

== Rešitev ==
Da bi odpravili problem z odpadne vode oljčnega olja, je iGEM ekipa iz Tesalije oblikovala sistem oPHAelia – sistem zasnovan na sintetični konzorcij dveh bakterij za učinkovito bioremediacijo OMW in njegovo biopretvorbo v izdelek visoke vrednosti. Sistem temelji na vzajemno koristni simbiozi dveh bakterij: Escherichia coli (E. coli) in Pseudomonas putida (P. putida).
Prvi gostiteljski organizem, uporabljen v sintetičnem konzorciju, je E. coli, natančneje sev DH5-alfa, derivat seva K-12, da bi ustvarili genetske konstrukte. Sev E. coli BL21-DE3 je eden od šasijskih organizmov, ki so bili vključeni v sintetični konzorcij. Specifični sev, derivat seva E. coli B, je bil uporabljen za izražanje zasnovanih konstruktov za proizvodnjo bistvenih proteinov za detoksikacije oljčne odpadne vode (OMW), nastajanje in izločanje prostih maščobnih kislin (ang. Free Fatty Acids - FFA) [1].
P. putida, robustna bakterija z edinstvenim razgradljivim metabolizmom, bo pretvorila monomerne fenolne spojine (fenolne kisline), sladkorje (predvsem glukozo) in proste maščobne kisline iz E. coli v izdelek visoke vrednosti s posebnimi sistemi, povzročenimi s substratom. Poleg tega je zelo pomembna tudi predelava izdelka. Zato v P. putida so integrirali programabilni sistem za lizo na osnovi lizocima za učinkovito in cenovno ugodno zbiranje končnega izdelka.
Predlagana je bila izgradnja sintetičnega konzorcija med sevi P. putida KT2440 in E. coli za povečanje kopičenja PHA. Sintetični konzorciji širijo obseg metaboličnega inženiringa in sistemu zagotavljajo številne prednosti v procesu detoksikacije in proizvodnji polihidroksialkanoate - PHA, saj se procesi delijo med dvema bakterijama, kar ima za posledico manjši presnovni stres in izboljša proizvodnjo, PHA. Ta dvojni bakterijski pristop omogoča celovit proces detoksikacije, ki cilja na več organskih sestavin OMW hkrati [1].
Polihidroksialkanoati (PHA) so skupina biološko razgradljivih poliestrov, ki jih lahko bakterije in arheje kopičijo v svojih celicah pod posebnimi stresnimi pogoji in služijo kot sredstvo za shranjevanje ogljika in energije. Poleg tega biopolimeri imajo podobne mehanske in fizikalne lastnosti kot različne sintetične plastike, kot sta polipropilen in polistiren. Predstavljajo trajnostni način za boj proti onesnaževanju s plastiko, saj lahko bioplastika na osnovi PHA za razliko od tradicionalne plastike, ki ima življenjsko dobo med 100 in 1000 let, razpade na vodo (H2O) in ogljikov dioksid (CO2) v 20 do 45 dneh, če je v odprtem okolju primerna vlaga, kisik in zadostno število mikrobov [3].

== Mehanizem delovanja ==
E. coli bo pod določenimi pogoji proizvajala in izločala lakazo gliv bele trohnobe za razgradnjo polimernih fenolnih spojin (tanini, lignani, katehol melaninski polimeri), frakcije prisotne v OMW. Poleg tega bo E. coli prednostno izkoriščala med drugim tudi sladkorje, kot so arabinoza, ksiloza in galaktoza, ki jih P. putida ne more katabolizirati, in izločala proste maščobne kisline. Izražanje acetil-CoA karboksilaze in acil-ACP tioesteraze iz rastline Ricinus communis v E. coli bo olajšalo zagotavljanje dolgoverižnih maščobnih kislin za P. putida, s čimer bo spodbudilo proizvodnjo srednje dolgih PHA (mcl-PHA), sestavljeni iz monomerov s 6-14 ogljikovimi atomi [2]. Da bi zagotovili natančen nadzor teh genetskih sistemov, so vključili dodatna regulacijska vezja, kot je regulacijsko vezje z negativno povratno zvezo, ki temelji na senzorju-aktivatorju na osnovi malonil-CoA [1].

== Cilj ==
Cilj oPHAelia je poudariti prednosti in pomagati pri prehodu na uporabo PHA kot alternativo plastiki na osnovi nafte, ki ne le pomaga zmanjšati vpliv onesnaževanja s plastiko na okolje, ampak tudi ustvarja nove priložnosti za industrijo, da sprejme bolj okolju prijazne materiale.

== Oblikovanje sistema ==
Da bi olajšali razumevanje, so sistem razdelili na štiri glavne osi: razstrupljanje OMW, proizvodnja PHA, predelava PHA in nazadnje vidik biološke varnosti, ki zagotavlja biološko zadrževanje gensko spremenjenih bakterij, vsa dejanja, h katerim prispevata obe bakteriji [1].

P. putida proizvaja PHA po dveh poteh, ena z uporabo virov ogljika, povezanih s PHA, in druga pot, ki uporablja vire ogljika, ki niso povezani s PHA. Razvili so dve regulacijski vezji, katerih cilj je izražanje ključnih encimov iz obeh poti, kar na koncu vodi do kopičenja osrednjega prekurzorja PHA (R)-3-hidroksiacil-CoA, substrata za obe polimerazi PHA. E. coli je bila zasnovana za učinkovito proizvodnjo in izločanje prostih maščobnih kislin s prefinjenim sistemom negativne povratne informacije, ki temelji na malonil-CoA in heterologni ekspresiji rastlinske acil-ACP tioesteraze. Malonil-CoA se sintetizira iz acetil-CoA z acetil-CoA karboksilazo, ki jo kodira accABCD (acc). Da bi povečali oskrbo z malonil-CoA in hkrati preprečili škodljive učinke čezmernega izražanja acc, so razvili sistem, ki lahko zazna ravni malonil-CoA in uravnava izražanje acc. Okrevanje PHA so omogočili s pomočjo sistema za lizo na osnovi lizocima za obnovitev PHA, ki ga uravnava ekspresijski sistem MekR / PmekA. Sistem deluje tako da metil etil keton (MEK) se veže na regulatorni protein MekR in kot kompleks povzroči indukcijo PmekA, ki aktivira transkripcijo lizocima. Ko je preveden, se lizocim premakne v periplazmatski prostor in povzroči razpad celične strukture.
Eden glavnih ciljev je bil zagotoviti varnost sistema, kar pomeni, da bi bil v nadzorovanem okolju (bioreaktor) in ne bi preživel zunaj njega. To je mogoče doseči tako z mehansko zasnovo bioreaktorja kot z biološko zasnovo, ki so jo razvili na podlagi mehanizmov soodvisnosti in dvojne avksotrofije. Sistem dvojne avksotrofije in lize deluje tako da P. putida nosi modifikacije za prekomerno proizvodnjo in izločanje aminokisline Trp, medtem ko E. Coli prekomerno proizvaja in izloča Tyr. Ko se MekR/PmekA aktivira, se P. putida lizira in tako ne more več zagotavljati Trp E. coli, posledično mikrobni konzorcij propade [1].

== Delovanje sistema ==
Prvi korak postopka vključuje zbiranje oljčne odpadne vode (OMW) iz mlinov za oljčno olje in njen transport v objekt za bioremediacijo. V tem objektu bo nameščen specializiran bioreaktor, ki bo olajšal proces detoksikacije in optimiziral rast in aktivnost sintetičnega konzorcija. Primarni namen bioreaktorja je ustvariti nadzorovano okolje, ki zagotavlja idealne pogoje za rast P. putida in E. coli, ključnih mikroorganizmov, ki sodelujejo v procesu. Parametri, kot so temperatura, pH, razpoložljivost hranil in ravni kisika, bodo skrbno regulirani, da se zagotovi, da proces detoksikacije deluje z največjo učinkovitostjo. Ko bo postopek detoksikacije končan, bodo nastale PHA dostavljene podjetjem za bioplastiko. Po detoksikaciji in proizvodnji PHA je potrebno detoksicirano vodo ločiti od bakterij, ki vsebujejo granule. Biomasa se s filtrirno stiskalnico loči od OMW in prenese v rezervoar. PHA se pridobivajo iz biomase. Pred začetkom ekstrakcije s topilom je treba dodati etanol, za optimizacijo končne čistosti PHA z odstranitvijo lipidov in drugih v etanolu topnih komponent, ki niso PHA. Naslednji korak je ekstrakcija s topilom, z etanolom obdelana biomasa se zmeša z majhnimi odmerki metil etil ketona (MEK). Dodatek MEK aktivira sistem za lizo na osnovi lizocima v P. putida, kar olajša ekstrakcijo zrnc PHA. Frakcija PHA-topilo loči se od biomase s centrifugiranjem. Po pridobitvi posušenih in prečiščenih PHA je potreben dodaten postopek ekstrudiranja za njihovo pretvorbo v pelete. Mešanica aditivov in surove plastike se prenese v peletizer, kjer se predela v pelete [1].

== Zaključek ==
Z eksperimenti in oblikovanjem samega sistema so potrdili, da so bakterijski sintetični konzorciji zelo močna in pomembna naprava v procesu bioremedijacije. Tudi da sam proces bioremedijacije predstavlja zelo pomemben v reševanju onesnaževanja s plastiko in lokalnih odpadkov, kot je odpadna voda oljčnega olja, s katerimi se pogosto nepravilno ravna [1].

== Viri ==
[1] Thessaly iGEM 2023. Pridobljeno s: https://2023.igem.wiki/thessaly [Dostopano 7 april 2024]

[2] Qin, R., Zhu, Y., Ai, M., & Jia, X. (2022). Reconstruction and optimization of a Pseudomonas putida-Escherichia coli microbial consortium for mcl-PHA production from lignocellulosic biomass. Frontiers in bioengineering and biotechnology, 10, 1023325.

[3] Acharjee, S. A., Bharali, P., Gogoi, B., Sorhie, V., Walling, B., & Alemtoshi (2023). PHA-Based Bioplastic: a Potential Alternative to Address Microplastic Pollution. Water, air, and soil pollution, 234(1), 21.

Seminarji SB 2023/24

2024-04-13T09:23:59Z

Ena Kartal:

Seminarji SB 2023/24

2024-04-13T09:17:19Z

Ena Kartal:

TE pri vnetnih boleznih

2022-05-08T10:32:59Z

Ena Kartal: /* HETEROGENOST INSERCIJSKIH PREFERENC IN PORAZDELITEV RETROTRANSPOZONOV MED RAZLIČNIMI POPULACIJAMI */

== UVOD ==

Transpozicijski elementi (TE) so mobilni elementi DNA, ki se lahko replicirajo in vstavijo na različne lokacije znotraj gostiteljskega genoma. Retrotranspozoni so transpozicijski elementi, ki se mobilizirajo preko RNA intermediatov s pomočjo reverzne transkriptaze. HERV in LINE-1 sta dve glavni vrsti retrotranspozonov. Njuni inserciji sta se kopičili skozi evolucijo, dokler so se gostiteljski genomi razvijali in z uporabo različnih dejavnikov so zavirali njuni aktivnosti. Znanstveniki so odkrili, da transpozicijski elementi bolj prispevajo k patogenezi človeških bolezni, kot so do takrat mislili.

== TRANSPOZICIJSKI ELEMENTI ==

Transpozicijski elemnti obsegajo vsaj 45% človeškega genoma, medtem ko kodirajoče zaporedje zasede manj kot 3% genoma. Razvrščamo jih kot transpozoni, ki so ves čas v obliki DNA (II razred) in retrotranspozoni, ki za izvedbo traspozicije potrebujejo RNA-intermediat (I razred). Transpozoni II razreda delujejo po mehanizmu „izreži in prilepi“, pri čemer se zaporedje s pomočjo encima transpozaze izreže iz ene regije in integrira v drugo določeno regijo v genomu. Retrotranspozoni pa delujejo po mehanizmu „kopiraj in prilepi“ kar omogoča aktivnim retrotranspozonim, da ohranijo svojo prvotno lokacijo v genomu, medtem ko kopičijo število kopij drugje. Te retrotranspozone pa lahko razdelimo v dve skupini LTR in ne-LTR. V LTR skupino pa uvrščamo človeške endogene retroviruse (HERV) in retrotranspozone pri sesalcih (MaLR). Ne-LTR pa razvrčamo v dva podtipa: LINE (Long Interspersed Nuclear Elements) in SINE (Short Interspersed Nuclear Elements).

=== HERV ===

HERV retrotranspozoni imajo podobno genomsko strukturo kot eksogeni retrovirusi, kot je HIV. Ti retrotranspozoni poleg LTR zaporedja vključujejo regije gag, pol in env. Gen gag kodira proteine za ovojnico retrotranspozonskega delca. Pol pa prestavlja gen za reverzno transkriptazo, integrazo in proteazo. HERV vsebuje tudi gen, ki kodira protein env oziroma ostanek njihovega eksogenega retrovirusnega izvora pred vstavitvijo in endogenizacijo v zarodne celice. Pokazalo se je, da transkripcijsko aktivne poddružine HERV prispevajo k različnim patofiziološkim motnjam. Leta 1993 so prišli do ugotovitve, da dodatek virusa herpes simpleksa tipa 1 (HSV-1) celicam izoliranim od bolnika z multiplo sklerozo, povzroči močno stimulacijo aktivnosti specifične reverzne transkriptaze. Iz tega so sklepali da je prvotno zaporedje retrovirusa, povezaneg z multiplo sklerozo (MSRV), zelo zastopano v človeški DNA in tako odkrili poddružine skupine HERV, ki prispevajo k patologiji različnih nevroloških motnjah.

=== LINE-1 RETROTRANSPOZONI ===

Transpozoni LINE-1 so avtonomni retrotranspozoni, ki jih vsebuje človeški genom. Večina kopij LINE-1 je nepremičnih i njih ni mogoče retrotransponirati, bodisi zaradi 5' skrajšanja ali inverzij, uvedenih v zaporedje. Retrotranspozicijsko kompetentna LINE-1 ( RC LINE-1) je dolga 6kb in vsebuje 5' neprevedeno regijo (5' UTR), dva odprta bralna okvirja ( ORF1/2) in 3' UTR, prekinjeno s poli-A repom. ORF 1 predstavlja gen za protein, ki ima aktivnost spremenljevalca nukleinske kisline in RNA vezavno domeno. ORF2 kodira protein z encimsko aktivnostjo, ki je potreben za retrotranspozicijo LINE-1. ORF2p ima tako aktivnosti endonukleaze (EN) kot reverzne transkriptaze (RT). Transkripcija LINE-1 se začne na promotorju RNA olimeraze II ali natačneje znotraj prvih 100 baznih parov 5' UTR. Potem ko je prepisana, poliadenilirana LINE-1 mRNA se izvozi v citoplazmo, kjer se združi z proteini ORF1 in ORF2 in tvorijo komleks z ribonukleotidi (RNP). Potem se uvozi v jedro, da se začne obratna transkripcija in integracija. EN zareže spodnjo verigo DNA in izpostavi 3' OH, ki služi kot primer za RT za nastanek cDNA iz LINE-1 mRNA.

=== HETEROGENOST INSERCIJSKIH PREFERENC IN PORAZDELITEV RETROTRANSPOZONOV MED RAZLIČNIMI POPULACIJAMI ===

Po različnih študijah so ugotovili, da pri integracji LINE1 ne ciljajo na izražene gene, odprt kromatin, ampak se namesto tega povezujejo z replikacijo DNA gostitelja. Te ugotovitve zagotavljajo prve namige, da sta integracija LINE-1 in replikacija DNK lahko mehansko povezani. Obstaja heterogenost v porazdelitvi endogenih retrotranspozonov po različnih človeških populacijah: od prisotnosti/odsotnosti transpozona do polimorfizmov posameznih nukleotidov (SNP). Polimorfizmi pri vstavitvah retroelementov nastanejo bodisi v zarodni liniji bodisi zgodaj v embrionalnem razvoju. To omogoča genomski mozaizem znotraj določeneg posameznika ko kar med različnimi človeškimi populacijami.

== CELIČNI VPLIVI RETROTRANSPOZICIJE LINE-1 ==

Retrotranspozoni LINE-1 ustvarjajo strukturno nestabilnost znotraj genoma in posledično motijo izražanje gostiteljskega gena. Vstavitve LINE-1 lahko generirajo napačno spojene ali prezgodaj okrnjene transkripte, spodbujajo prekinitev transkripcije ali celo spodbujajo spremembe našega epigenoma. Retrotranspozoni, ki prispevajo k genomski variaciji, spreminjajo ekspresijo gostiteljskega gena na epigenetski, transkripcijski in translacijski ravni.

== CELIČNI ODZIVI NA RETROTRANSPOZICIJE ==
Glede na to, da lahko retroelementi vplivajo na celico na veliko načinov, se je gostiteljski genom razvil tako, da uporablja različne odzive za zaviranje njihove aktivnosti. Transkripcijsko represijo dosežemo z represivnimi epigenetskimi modifikacijami, kot je npr. metilacija DNA. Znatna hipometilacija med embriogenezo je povezana z višjimi stopnjami retrotranspozicije. V mišjih zarodkih, ki so bili izjemno hipometilirani, se genomska integriteta vzdržuje s pomočjo faktorja CAF-1, ki zamenja histon 3.3 s histonom 3.1/3.2, ki deluje kot represivni modifikator in ščiti zarodek od retrotranspozicijske aktivnosti. Ker transpozicijski elementi vsebujejo tudi vezavna mesta za transkripcijske faktorje, to omogoča specifično transkripcijsko regulacijo, kot način transkripcijske represije. Kruppel-associated box (KRAB), ki vsebuje proteine cinkovih prstov (KZFP), so ključni regulatorji transpozicijske aktivnosti, ki se vežejo na regulatorna zaporedja TE in zavirajo izražanje TE v zgodnjih zarodkih.

Post-transkripcijska regulacija LINE-1 elementov z majhnimi RNA kot so miRNA ali piRNA, je še en celični odziv na retrotranspozicijo. Majhne RNA molekule lahko delujejo preko tarčne razgradnje RNA. Od RNA induciran kompleks za utišanje (RISC) z uporabo endonukleolitične cepitve razgrajuje TE transkriptov in, če je Dicer protein, ki je sestaven del RISC kompleksa, mutiran, povzroča povečano transkripcijo LINE-1 elementov. Odkrili so da miRNA-128 omejuje aktivnost LINE-1 preko dveh mehanizmov: lahko direktno cilja na ORF2 RNA za razgradnjo ali cilja na 3’-UTR zaporedje kofaktorja TNPO1, ki olajša transport kompleksa LINE-1 RNP v jedro. piRNA so pomembni zaviralci aktivnosti TE v zarodni liniji. Vzajemno delujejo s poddružino PIWI nukleaz Argonaute in cepijo TE transkripte v citoplazmi.

LINE-1 RNP kompleks, ki je retrotranspozicijski intermediat, je tudi tarča za razgradnjo. Protein cinkovega prsta (ZAP) se veže z LINE-1 mRNA v citoplazemskih stresnih granulah, povzroči zgubljanje integritete RNP kompleksa in zavira retrotranspozicijo LINE-1. TUT7, ki je uridil transferaza, prenaša ostanke uridina na LINE-1 mRNA v citoplazmi, nato MOV10, ki je helikaza, premakne ORF1p, da omogoči uridilacijo in posledično zavirajo reverzne transkripcije ORF2p v jedru. Družina encimov APOBEC zavirajo retrotranspozijo, najverjetneje z destabilizacijo kompleksa RNP. Kljub številnim gostiteljskim mehanizmom za zaviranje retrotranspozicije, de novo insercije so še vedno prisotne v somatskih tkivih z znatno retrotranspozicijo v nevronskih linijah.

== LINE-1 V RAZVOJU PRI MOŽGANIH ==

Najzgodnejši dokumentirani primer somatske retrotranspozicije in vivo je bil v mišjih možganih. Nekaj let pozneje so odkrili endogeno LINE-1 mRNA v nevronskih matičnih celicah izoliranih iz možganov človeških plodov. S pomočjo RC-seq, visoko zmogljivo metodo sekvenciranja, ki cilja na 3’ in 5’ konca LINE-1, ki so jo uporabili na DNA ekstrahirane iz različnih tkiv, identificirali so bistveno več kopij ORF2 in LINE-1 CNV v hipokampusu v primerjavi s srcem in jetri istega posameznika. Zanimivo je, da so v nedavni analizi 24 hipokampalnih nevronov odkrili, da se somatske insercije, ki se pojavijo med nevrodiferenciacijo v matične celice človeškega zarodka, lahko pojavijo zaradi mutacije v Ying Yang 1 (YY1) vezavnem mestu za transkripcijski faktor. YY1 vezavno mesto v promotorski regiji LINE-1 posreduje pri metilaciji CpG otočkov in epigenetski represiji. Retrotranspozicija med nevronskim razvojem lahko prispeva k nevronski raznolikosti, saj omogoča varijacijo genomske DNA od celice do celice.

== MOBILNI ELEMENTI IN NEVRODEGENERATIVNE BOLEZNI ==

Amiotrofična lateralna skleroza(ALS) je nevrodegenerativna bolezen, za katero je značilna izguba zgornjih in spodnjih motoričnih nevronov. . Številne študije so ugotovile prisotnost retrovirusne aktivnosti reverzne transkriptaze v serumu bolnikov z ALS. V kortikalnih piramidnih in hrbteničnih nevronih v posmrtnem možganskem tkivu bolnikov z ALS opazimo večjo ekspresijo HERV K-Env ki je močni imunopatogeni protein ovojnice . Aktivacija gena za HERV-K posledično zmanjšuje dolžino dendrita in tudi razvejanost in kompleksnost motoričnih nevronov transgenih miši. Še ni znano, kaj sproži izražanje HERV-K pri odraslih nevronih.

Aktivacija retrotranspozona je bila povezana tudi s sporadično obliko Alzheimerjeve bolezni, vendar so raziskave pokazale nedosledne rezultate o tem, ali so LINE-1 povišane pri bolnikih. V nevronih bolnikov so odkrili mozaične genomske rekombinacije znotraj gena, povezanega z Alzheimerjevo boleznijo, amiloidnega prekurzorskega proteina (APP). Te različice niso imele introničnih zaporedij in so bile imenovane "genomske cDNA" (gencDNA). Predpostavili so da izvirajo iz RNA in da zahtevajo endogeno aktivnost reverzne transkriptaze da se vstavijo v prelome dvojnih verig.

Pri pojavi Parkinsonove bolezni (PD) je odkrito pet različnih strukturnih variacij v genu PRKN (parkin RBR E3 ubiquitin protein ligase). Predvideva se, da se strukturne variacije pojavijo z nealelno homologno rekombinacijo. LTR in ne-LTR retrotranspozonske sekvence so bile identificirane znotraj dveh kilobaz od točke prekinitve delecije. To lahko pomeni da so delecije morda nastale zaradi retrotranspozicije. Povezava med aktivacijo retrotranspozona pri nevrodegenerativnih boleznih ni v celoti ugotovljena.

== TRANSPOZICIJSKI ELEMENTI IN VNETJA ==

Malo je znanega o prispevku transpozonih elementov k imunskim odzivom. Ko imamo prisotno DNA v citoplazmi npr. virusno DNA, sproži se aktivacija poti cGAS-STING. cGAS-STING posledično proizvaja interferone, ki sprožijo vnetni odziv. Interferonski odzivi so lahko mehansko povezani z deregulacijo proizvodnje retrotranspozona.
Vse je več dokazov, da imajo transpozoni vlogo pri sprožitvi nevroinflamacije. Detekcija endogene nukleinske kisline s strani imunskega sistema je v osnovah številnih avtoimunskih bolezni. Retrotranspozoni so povezani z boleznimi kot so Multiple skleroza in Aicardi-Goutièresovim sindromom, kot glavni vnetni efektorji.

Multipla skleroza je kronična avtoimunska bolezen, ki prizadene osrednje živčevje in za katero ni znanega zdravila. Za bolezen so značilne lezije v beli snovi, ki vodijo do razgradnje krvno-možganske pregrade in aksonskih motenj po hrbtenjači. Izražanje HERV proteina se šteje za dejavnik za napredovanje bolezni. Iz supernatantov celične kulture vzorcev bolnikov so izolirani retrovirusima podobni delci, in je bilo dokazano da izvirajo iz elementov HERV.

Pri sistemskom eritematoznem lupusu je ugotovljena povišana transkripcija HERV. V študijah so pokazali da so ravni ekspresije mRNA HERV-E v celicah CD4+ T lupusa višje kot v zdravih celicah. Še ni znan popoln prispevek aktivnosti HERV.

Motnje avtističnega spectra so razvojne motnje, ki ovirajo komunikacijo in vedenje. Ugotovljeno je da je pri bolnikih bila zmanjšanja metilacija in povečano izražanje LINE-1 v možganih. Vse je več dokazov da lahko kronično vnetje prispeva k simptomatologiji avtizma.

Rettov sindrom je X-povezana progresivna nevrorazvojna motnja z avtističnimi značilnostmi. Pri Rettovom sindromu imamo prisotne različne mutacije v metil CpG vezavnem proteinu-2 (MeCP2). Analizirani vzorci možganskega tkiva ob smrti so pokazali višje genomske sekvence LINE-1 ORF2 pri bolnikih.

Aicardi-Goutièresov sindrom je progresivna vnetna motnja, ki prizadene novorojenčke in ima za posledico hudo duševno in telesno prizadetost ter močno skrajšano življenjsko dobo. Lahko nastane zaradi mutacij v TREX1(three-prime repair exonuclease 1). TREX1 deluje tako, da razgradi dvoverižno DNA(dsDNA)/enoverižno DNA(ssDNA). Mutacije v genu povzročijo znatno kopičenje vrst DNA v citoplazmi, ki sprožijo prirojen imunski odziv, kot je indukcija interferona. Večina teh vrst DNA je sestavljena iz citoplazemske ssDNA LINE-1. V nevronskih celicah mišjih s pomanjkanjem TREX-1 se izrazilo 70 % več elementov LINE-1Hs.

== VIRI IN LITERATURA ==

[1] Saleh, Aurian, et al. “Transposable Elements, Inflammation, and Neurological Disease.” Frontiers in Neurology, vol. 10, 2019. Frontiers, https://www.frontiersin.org/article/10.3389/fneur.2019.00894.

[2] Volkman HE, Stetson DB. The enemy within: endogenous retroelements and autoimmune disease. Nat Immunol. (2014) 15:415–22. doi: 10.1038/ni.2872

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

TE pri vnetnih boleznih

2022-05-08T10:31:32Z

Ena Kartal: /* HERV */

== UVOD ==

Transpozicijski elementi (TE) so mobilni elementi DNA, ki se lahko replicirajo in vstavijo na različne lokacije znotraj gostiteljskega genoma. Retrotranspozoni so transpozicijski elementi, ki se mobilizirajo preko RNA intermediatov s pomočjo reverzne transkriptaze. HERV in LINE-1 sta dve glavni vrsti retrotranspozonov. Njuni inserciji sta se kopičili skozi evolucijo, dokler so se gostiteljski genomi razvijali in z uporabo različnih dejavnikov so zavirali njuni aktivnosti. Znanstveniki so odkrili, da transpozicijski elementi bolj prispevajo k patogenezi človeških bolezni, kot so do takrat mislili.

== TRANSPOZICIJSKI ELEMENTI ==

Transpozicijski elemnti obsegajo vsaj 45% človeškega genoma, medtem ko kodirajoče zaporedje zasede manj kot 3% genoma. Razvrščamo jih kot transpozoni, ki so ves čas v obliki DNA (II razred) in retrotranspozoni, ki za izvedbo traspozicije potrebujejo RNA-intermediat (I razred). Transpozoni II razreda delujejo po mehanizmu „izreži in prilepi“, pri čemer se zaporedje s pomočjo encima transpozaze izreže iz ene regije in integrira v drugo določeno regijo v genomu. Retrotranspozoni pa delujejo po mehanizmu „kopiraj in prilepi“ kar omogoča aktivnim retrotranspozonim, da ohranijo svojo prvotno lokacijo v genomu, medtem ko kopičijo število kopij drugje. Te retrotranspozone pa lahko razdelimo v dve skupini LTR in ne-LTR. V LTR skupino pa uvrščamo človeške endogene retroviruse (HERV) in retrotranspozone pri sesalcih (MaLR). Ne-LTR pa razvrčamo v dva podtipa: LINE (Long Interspersed Nuclear Elements) in SINE (Short Interspersed Nuclear Elements).

=== HERV ===

HERV retrotranspozoni imajo podobno genomsko strukturo kot eksogeni retrovirusi, kot je HIV. Ti retrotranspozoni poleg LTR zaporedja vključujejo regije gag, pol in env. Gen gag kodira proteine za ovojnico retrotranspozonskega delca. Pol pa prestavlja gen za reverzno transkriptazo, integrazo in proteazo. HERV vsebuje tudi gen, ki kodira protein env oziroma ostanek njihovega eksogenega retrovirusnega izvora pred vstavitvijo in endogenizacijo v zarodne celice. Pokazalo se je, da transkripcijsko aktivne poddružine HERV prispevajo k različnim patofiziološkim motnjam. Leta 1993 so prišli do ugotovitve, da dodatek virusa herpes simpleksa tipa 1 (HSV-1) celicam izoliranim od bolnika z multiplo sklerozo, povzroči močno stimulacijo aktivnosti specifične reverzne transkriptaze. Iz tega so sklepali da je prvotno zaporedje retrovirusa, povezaneg z multiplo sklerozo (MSRV), zelo zastopano v človeški DNA in tako odkrili poddružine skupine HERV, ki prispevajo k patologiji različnih nevroloških motnjah.

=== LINE-1 RETROTRANSPOZONI ===

Transpozoni LINE-1 so avtonomni retrotranspozoni, ki jih vsebuje človeški genom. Večina kopij LINE-1 je nepremičnih i njih ni mogoče retrotransponirati, bodisi zaradi 5' skrajšanja ali inverzij, uvedenih v zaporedje. Retrotranspozicijsko kompetentna LINE-1 ( RC LINE-1) je dolga 6kb in vsebuje 5' neprevedeno regijo (5' UTR), dva odprta bralna okvirja ( ORF1/2) in 3' UTR, prekinjeno s poli-A repom. ORF 1 predstavlja gen za protein, ki ima aktivnost spremenljevalca nukleinske kisline in RNA vezavno domeno. ORF2 kodira protein z encimsko aktivnostjo, ki je potreben za retrotranspozicijo LINE-1. ORF2p ima tako aktivnosti endonukleaze (EN) kot reverzne transkriptaze (RT). Transkripcija LINE-1 se začne na promotorju RNA olimeraze II ali natačneje znotraj prvih 100 baznih parov 5' UTR. Potem ko je prepisana, poliadenilirana LINE-1 mRNA se izvozi v citoplazmo, kjer se združi z proteini ORF1 in ORF2 in tvorijo komleks z ribonukleotidi (RNP). Potem se uvozi v jedro, da se začne obratna transkripcija in integracija. EN zareže spodnjo verigo DNA in izpostavi 3' OH, ki služi kot primer za RT za nastanek cDNA iz LINE-1 mRNA.

=== HETEROGENOST INSERCIJSKIH PREFERENC IN PORAZDELITEV RETROTRANSPOZONOV MED RAZLIČNIMI POPULACIJAMI ===

Po različnih študijah so ugotovili, da pri integracji LINE1 ne ciljajo na izražene gene, odprt kromatin, ampak se namesto tega povezujejo z replikacijo DNK gostitelja. Te ugotovitve zagotavljajo prve namige, da sta integracija LINE-1 in replikacija DNK lahko mehansko povezani. Obstaja heterogenost v porazdelitvi endogenih retrotranspozonov po različnih človeških populacijah: od prisotnosti/odsotnosti transpozona do polimorfizmov posameznih nukleotidov (SNP). Polimorfizmi pri vstavitvah retroelementov nastanejo bodisi v zarodni liniji bodisi zgodaj v embrionalnem razvoju. To omogoča genomski mozaizem znotraj določeneg posameznika ko kar med različnimi človeškimi populacijami.

== CELIČNI VPLIVI RETROTRANSPOZICIJE LINE-1 ==

Retrotranspozoni LINE-1 ustvarjajo strukturno nestabilnost znotraj genoma in posledično motijo izražanje gostiteljskega gena. Vstavitve LINE-1 lahko generirajo napačno spojene ali prezgodaj okrnjene transkripte, spodbujajo prekinitev transkripcije ali celo spodbujajo spremembe našega epigenoma. Retrotranspozoni, ki prispevajo k genomski variaciji, spreminjajo ekspresijo gostiteljskega gena na epigenetski, transkripcijski in translacijski ravni.

== CELIČNI ODZIVI NA RETROTRANSPOZICIJE ==
Glede na to, da lahko retroelementi vplivajo na celico na veliko načinov, se je gostiteljski genom razvil tako, da uporablja različne odzive za zaviranje njihove aktivnosti. Transkripcijsko represijo dosežemo z represivnimi epigenetskimi modifikacijami, kot je npr. metilacija DNA. Znatna hipometilacija med embriogenezo je povezana z višjimi stopnjami retrotranspozicije. V mišjih zarodkih, ki so bili izjemno hipometilirani, se genomska integriteta vzdržuje s pomočjo faktorja CAF-1, ki zamenja histon 3.3 s histonom 3.1/3.2, ki deluje kot represivni modifikator in ščiti zarodek od retrotranspozicijske aktivnosti. Ker transpozicijski elementi vsebujejo tudi vezavna mesta za transkripcijske faktorje, to omogoča specifično transkripcijsko regulacijo, kot način transkripcijske represije. Kruppel-associated box (KRAB), ki vsebuje proteine cinkovih prstov (KZFP), so ključni regulatorji transpozicijske aktivnosti, ki se vežejo na regulatorna zaporedja TE in zavirajo izražanje TE v zgodnjih zarodkih.

Post-transkripcijska regulacija LINE-1 elementov z majhnimi RNA kot so miRNA ali piRNA, je še en celični odziv na retrotranspozicijo. Majhne RNA molekule lahko delujejo preko tarčne razgradnje RNA. Od RNA induciran kompleks za utišanje (RISC) z uporabo endonukleolitične cepitve razgrajuje TE transkriptov in, če je Dicer protein, ki je sestaven del RISC kompleksa, mutiran, povzroča povečano transkripcijo LINE-1 elementov. Odkrili so da miRNA-128 omejuje aktivnost LINE-1 preko dveh mehanizmov: lahko direktno cilja na ORF2 RNA za razgradnjo ali cilja na 3’-UTR zaporedje kofaktorja TNPO1, ki olajša transport kompleksa LINE-1 RNP v jedro. piRNA so pomembni zaviralci aktivnosti TE v zarodni liniji. Vzajemno delujejo s poddružino PIWI nukleaz Argonaute in cepijo TE transkripte v citoplazmi.

LINE-1 RNP kompleks, ki je retrotranspozicijski intermediat, je tudi tarča za razgradnjo. Protein cinkovega prsta (ZAP) se veže z LINE-1 mRNA v citoplazemskih stresnih granulah, povzroči zgubljanje integritete RNP kompleksa in zavira retrotranspozicijo LINE-1. TUT7, ki je uridil transferaza, prenaša ostanke uridina na LINE-1 mRNA v citoplazmi, nato MOV10, ki je helikaza, premakne ORF1p, da omogoči uridilacijo in posledično zavirajo reverzne transkripcije ORF2p v jedru. Družina encimov APOBEC zavirajo retrotranspozijo, najverjetneje z destabilizacijo kompleksa RNP. Kljub številnim gostiteljskim mehanizmom za zaviranje retrotranspozicije, de novo insercije so še vedno prisotne v somatskih tkivih z znatno retrotranspozicijo v nevronskih linijah.

== LINE-1 V RAZVOJU PRI MOŽGANIH ==

Najzgodnejši dokumentirani primer somatske retrotranspozicije in vivo je bil v mišjih možganih. Nekaj let pozneje so odkrili endogeno LINE-1 mRNA v nevronskih matičnih celicah izoliranih iz možganov človeških plodov. S pomočjo RC-seq, visoko zmogljivo metodo sekvenciranja, ki cilja na 3’ in 5’ konca LINE-1, ki so jo uporabili na DNA ekstrahirane iz različnih tkiv, identificirali so bistveno več kopij ORF2 in LINE-1 CNV v hipokampusu v primerjavi s srcem in jetri istega posameznika. Zanimivo je, da so v nedavni analizi 24 hipokampalnih nevronov odkrili, da se somatske insercije, ki se pojavijo med nevrodiferenciacijo v matične celice človeškega zarodka, lahko pojavijo zaradi mutacije v Ying Yang 1 (YY1) vezavnem mestu za transkripcijski faktor. YY1 vezavno mesto v promotorski regiji LINE-1 posreduje pri metilaciji CpG otočkov in epigenetski represiji. Retrotranspozicija med nevronskim razvojem lahko prispeva k nevronski raznolikosti, saj omogoča varijacijo genomske DNA od celice do celice.

== MOBILNI ELEMENTI IN NEVRODEGENERATIVNE BOLEZNI ==

Amiotrofična lateralna skleroza(ALS) je nevrodegenerativna bolezen, za katero je značilna izguba zgornjih in spodnjih motoričnih nevronov. . Številne študije so ugotovile prisotnost retrovirusne aktivnosti reverzne transkriptaze v serumu bolnikov z ALS. V kortikalnih piramidnih in hrbteničnih nevronih v posmrtnem možganskem tkivu bolnikov z ALS opazimo večjo ekspresijo HERV K-Env ki je močni imunopatogeni protein ovojnice . Aktivacija gena za HERV-K posledično zmanjšuje dolžino dendrita in tudi razvejanost in kompleksnost motoričnih nevronov transgenih miši. Še ni znano, kaj sproži izražanje HERV-K pri odraslih nevronih.

Aktivacija retrotranspozona je bila povezana tudi s sporadično obliko Alzheimerjeve bolezni, vendar so raziskave pokazale nedosledne rezultate o tem, ali so LINE-1 povišane pri bolnikih. V nevronih bolnikov so odkrili mozaične genomske rekombinacije znotraj gena, povezanega z Alzheimerjevo boleznijo, amiloidnega prekurzorskega proteina (APP). Te različice niso imele introničnih zaporedij in so bile imenovane "genomske cDNA" (gencDNA). Predpostavili so da izvirajo iz RNA in da zahtevajo endogeno aktivnost reverzne transkriptaze da se vstavijo v prelome dvojnih verig.

Pri pojavi Parkinsonove bolezni (PD) je odkrito pet različnih strukturnih variacij v genu PRKN (parkin RBR E3 ubiquitin protein ligase). Predvideva se, da se strukturne variacije pojavijo z nealelno homologno rekombinacijo. LTR in ne-LTR retrotranspozonske sekvence so bile identificirane znotraj dveh kilobaz od točke prekinitve delecije. To lahko pomeni da so delecije morda nastale zaradi retrotranspozicije. Povezava med aktivacijo retrotranspozona pri nevrodegenerativnih boleznih ni v celoti ugotovljena.

== TRANSPOZICIJSKI ELEMENTI IN VNETJA ==

Malo je znanega o prispevku transpozonih elementov k imunskim odzivom. Ko imamo prisotno DNA v citoplazmi npr. virusno DNA, sproži se aktivacija poti cGAS-STING. cGAS-STING posledično proizvaja interferone, ki sprožijo vnetni odziv. Interferonski odzivi so lahko mehansko povezani z deregulacijo proizvodnje retrotranspozona.
Vse je več dokazov, da imajo transpozoni vlogo pri sprožitvi nevroinflamacije. Detekcija endogene nukleinske kisline s strani imunskega sistema je v osnovah številnih avtoimunskih bolezni. Retrotranspozoni so povezani z boleznimi kot so Multiple skleroza in Aicardi-Goutièresovim sindromom, kot glavni vnetni efektorji.

Multipla skleroza je kronična avtoimunska bolezen, ki prizadene osrednje živčevje in za katero ni znanega zdravila. Za bolezen so značilne lezije v beli snovi, ki vodijo do razgradnje krvno-možganske pregrade in aksonskih motenj po hrbtenjači. Izražanje HERV proteina se šteje za dejavnik za napredovanje bolezni. Iz supernatantov celične kulture vzorcev bolnikov so izolirani retrovirusima podobni delci, in je bilo dokazano da izvirajo iz elementov HERV.

Pri sistemskom eritematoznem lupusu je ugotovljena povišana transkripcija HERV. V študijah so pokazali da so ravni ekspresije mRNA HERV-E v celicah CD4+ T lupusa višje kot v zdravih celicah. Še ni znan popoln prispevek aktivnosti HERV.

Motnje avtističnega spectra so razvojne motnje, ki ovirajo komunikacijo in vedenje. Ugotovljeno je da je pri bolnikih bila zmanjšanja metilacija in povečano izražanje LINE-1 v možganih. Vse je več dokazov da lahko kronično vnetje prispeva k simptomatologiji avtizma.

Rettov sindrom je X-povezana progresivna nevrorazvojna motnja z avtističnimi značilnostmi. Pri Rettovom sindromu imamo prisotne različne mutacije v metil CpG vezavnem proteinu-2 (MeCP2). Analizirani vzorci možganskega tkiva ob smrti so pokazali višje genomske sekvence LINE-1 ORF2 pri bolnikih.

Aicardi-Goutièresov sindrom je progresivna vnetna motnja, ki prizadene novorojenčke in ima za posledico hudo duševno in telesno prizadetost ter močno skrajšano življenjsko dobo. Lahko nastane zaradi mutacij v TREX1(three-prime repair exonuclease 1). TREX1 deluje tako, da razgradi dvoverižno DNA(dsDNA)/enoverižno DNA(ssDNA). Mutacije v genu povzročijo znatno kopičenje vrst DNA v citoplazmi, ki sprožijo prirojen imunski odziv, kot je indukcija interferona. Večina teh vrst DNA je sestavljena iz citoplazemske ssDNA LINE-1. V nevronskih celicah mišjih s pomanjkanjem TREX-1 se izrazilo 70 % več elementov LINE-1Hs.

== VIRI IN LITERATURA ==

[1] Saleh, Aurian, et al. “Transposable Elements, Inflammation, and Neurological Disease.” Frontiers in Neurology, vol. 10, 2019. Frontiers, https://www.frontiersin.org/article/10.3389/fneur.2019.00894.

[2] Volkman HE, Stetson DB. The enemy within: endogenous retroelements and autoimmune disease. Nat Immunol. (2014) 15:415–22. doi: 10.1038/ni.2872

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

TE pri vnetnih boleznih

2022-05-08T10:29:07Z

Ena Kartal: /* LINE-1 RETROTRANSPOZONI */

== UVOD ==

Transpozicijski elementi (TE) so mobilni elementi DNA, ki se lahko replicirajo in vstavijo na različne lokacije znotraj gostiteljskega genoma. Retrotranspozoni so transpozicijski elementi, ki se mobilizirajo preko RNA intermediatov s pomočjo reverzne transkriptaze. HERV in LINE-1 sta dve glavni vrsti retrotranspozonov. Njuni inserciji sta se kopičili skozi evolucijo, dokler so se gostiteljski genomi razvijali in z uporabo različnih dejavnikov so zavirali njuni aktivnosti. Znanstveniki so odkrili, da transpozicijski elementi bolj prispevajo k patogenezi človeških bolezni, kot so do takrat mislili.

== TRANSPOZICIJSKI ELEMENTI ==

Transpozicijski elemnti obsegajo vsaj 45% človeškega genoma, medtem ko kodirajoče zaporedje zasede manj kot 3% genoma. Razvrščamo jih kot transpozoni, ki so ves čas v obliki DNA (II razred) in retrotranspozoni, ki za izvedbo traspozicije potrebujejo RNA-intermediat (I razred). Transpozoni II razreda delujejo po mehanizmu „izreži in prilepi“, pri čemer se zaporedje s pomočjo encima transpozaze izreže iz ene regije in integrira v drugo določeno regijo v genomu. Retrotranspozoni pa delujejo po mehanizmu „kopiraj in prilepi“ kar omogoča aktivnim retrotranspozonim, da ohranijo svojo prvotno lokacijo v genomu, medtem ko kopičijo število kopij drugje. Te retrotranspozone pa lahko razdelimo v dve skupini LTR in ne-LTR. V LTR skupino pa uvrščamo človeške endogene retroviruse (HERV) in retrotranspozone pri sesalcih (MaLR). Ne-LTR pa razvrčamo v dva podtipa: LINE (Long Interspersed Nuclear Elements) in SINE (Short Interspersed Nuclear Elements).

=== HERV ===

HERV retrotranspozoni imajo podobno genomsko strukturo kot eksogeni retrovirusi, kot je HIV. Ti retrotranspozoni poleg LTR zaporedja vključujejo regije gag, pol in env. Gen gag kodira proteine za ovojnico retrotranspozonskega delca. Pol pa prestavlja gen za reverzno transkriptazo, integrazo in proteazo. HERV vsebuje tudi gen, ki kodira protein env oziroma ostanek njihovega eksogenega retrovirusnega izvora pred vstavitvijo in endogenizacijo v zarodne celice. Pokazalo se je, da transkripcijsko aktivne poddružine HERV prispevajo k različnim patofiziološkim motnjam. Leta 1993 so prišli do ugotovitve, da dodatek virusa herpes simpleksa tipa 1 (HSV-1) celicam izoliranim od bolnika z multiplo sklerozo, povzroči močno stimulacijo aktivnosti specifične reverzne transkriptaze. Iz tega so sklepali da je prvotno zaporedje retrovirusa, povezaneg z multiplo sklerozo (MSRV), zelo zastopano v človeški DNK in tako odkrili poddružine skupine HERV, ki prispevajo k patologiji različnih nevroloških motnjah.

=== LINE-1 RETROTRANSPOZONI ===

Transpozoni LINE-1 so avtonomni retrotranspozoni, ki jih vsebuje človeški genom. Večina kopij LINE-1 je nepremičnih i njih ni mogoče retrotransponirati, bodisi zaradi 5' skrajšanja ali inverzij, uvedenih v zaporedje. Retrotranspozicijsko kompetentna LINE-1 ( RC LINE-1) je dolga 6kb in vsebuje 5' neprevedeno regijo (5' UTR), dva odprta bralna okvirja ( ORF1/2) in 3' UTR, prekinjeno s poli-A repom. ORF 1 predstavlja gen za protein, ki ima aktivnost spremenljevalca nukleinske kisline in RNA vezavno domeno. ORF2 kodira protein z encimsko aktivnostjo, ki je potreben za retrotranspozicijo LINE-1. ORF2p ima tako aktivnosti endonukleaze (EN) kot reverzne transkriptaze (RT). Transkripcija LINE-1 se začne na promotorju RNA olimeraze II ali natačneje znotraj prvih 100 baznih parov 5' UTR. Potem ko je prepisana, poliadenilirana LINE-1 mRNA se izvozi v citoplazmo, kjer se združi z proteini ORF1 in ORF2 in tvorijo komleks z ribonukleotidi (RNP). Potem se uvozi v jedro, da se začne obratna transkripcija in integracija. EN zareže spodnjo verigo DNA in izpostavi 3' OH, ki služi kot primer za RT za nastanek cDNA iz LINE-1 mRNA.

=== HETEROGENOST INSERCIJSKIH PREFERENC IN PORAZDELITEV RETROTRANSPOZONOV MED RAZLIČNIMI POPULACIJAMI ===

Po različnih študijah so ugotovili, da pri integracji LINE1 ne ciljajo na izražene gene, odprt kromatin, ampak se namesto tega povezujejo z replikacijo DNK gostitelja. Te ugotovitve zagotavljajo prve namige, da sta integracija LINE-1 in replikacija DNK lahko mehansko povezani. Obstaja heterogenost v porazdelitvi endogenih retrotranspozonov po različnih človeških populacijah: od prisotnosti/odsotnosti transpozona do polimorfizmov posameznih nukleotidov (SNP). Polimorfizmi pri vstavitvah retroelementov nastanejo bodisi v zarodni liniji bodisi zgodaj v embrionalnem razvoju. To omogoča genomski mozaizem znotraj določeneg posameznika ko kar med različnimi človeškimi populacijami.

== CELIČNI VPLIVI RETROTRANSPOZICIJE LINE-1 ==

Retrotranspozoni LINE-1 ustvarjajo strukturno nestabilnost znotraj genoma in posledično motijo izražanje gostiteljskega gena. Vstavitve LINE-1 lahko generirajo napačno spojene ali prezgodaj okrnjene transkripte, spodbujajo prekinitev transkripcije ali celo spodbujajo spremembe našega epigenoma. Retrotranspozoni, ki prispevajo k genomski variaciji, spreminjajo ekspresijo gostiteljskega gena na epigenetski, transkripcijski in translacijski ravni.

== CELIČNI ODZIVI NA RETROTRANSPOZICIJE ==
Glede na to, da lahko retroelementi vplivajo na celico na veliko načinov, se je gostiteljski genom razvil tako, da uporablja različne odzive za zaviranje njihove aktivnosti. Transkripcijsko represijo dosežemo z represivnimi epigenetskimi modifikacijami, kot je npr. metilacija DNA. Znatna hipometilacija med embriogenezo je povezana z višjimi stopnjami retrotranspozicije. V mišjih zarodkih, ki so bili izjemno hipometilirani, se genomska integriteta vzdržuje s pomočjo faktorja CAF-1, ki zamenja histon 3.3 s histonom 3.1/3.2, ki deluje kot represivni modifikator in ščiti zarodek od retrotranspozicijske aktivnosti. Ker transpozicijski elementi vsebujejo tudi vezavna mesta za transkripcijske faktorje, to omogoča specifično transkripcijsko regulacijo, kot način transkripcijske represije. Kruppel-associated box (KRAB), ki vsebuje proteine cinkovih prstov (KZFP), so ključni regulatorji transpozicijske aktivnosti, ki se vežejo na regulatorna zaporedja TE in zavirajo izražanje TE v zgodnjih zarodkih.

Post-transkripcijska regulacija LINE-1 elementov z majhnimi RNA kot so miRNA ali piRNA, je še en celični odziv na retrotranspozicijo. Majhne RNA molekule lahko delujejo preko tarčne razgradnje RNA. Od RNA induciran kompleks za utišanje (RISC) z uporabo endonukleolitične cepitve razgrajuje TE transkriptov in, če je Dicer protein, ki je sestaven del RISC kompleksa, mutiran, povzroča povečano transkripcijo LINE-1 elementov. Odkrili so da miRNA-128 omejuje aktivnost LINE-1 preko dveh mehanizmov: lahko direktno cilja na ORF2 RNA za razgradnjo ali cilja na 3’-UTR zaporedje kofaktorja TNPO1, ki olajša transport kompleksa LINE-1 RNP v jedro. piRNA so pomembni zaviralci aktivnosti TE v zarodni liniji. Vzajemno delujejo s poddružino PIWI nukleaz Argonaute in cepijo TE transkripte v citoplazmi.

LINE-1 RNP kompleks, ki je retrotranspozicijski intermediat, je tudi tarča za razgradnjo. Protein cinkovega prsta (ZAP) se veže z LINE-1 mRNA v citoplazemskih stresnih granulah, povzroči zgubljanje integritete RNP kompleksa in zavira retrotranspozicijo LINE-1. TUT7, ki je uridil transferaza, prenaša ostanke uridina na LINE-1 mRNA v citoplazmi, nato MOV10, ki je helikaza, premakne ORF1p, da omogoči uridilacijo in posledično zavirajo reverzne transkripcije ORF2p v jedru. Družina encimov APOBEC zavirajo retrotranspozijo, najverjetneje z destabilizacijo kompleksa RNP. Kljub številnim gostiteljskim mehanizmom za zaviranje retrotranspozicije, de novo insercije so še vedno prisotne v somatskih tkivih z znatno retrotranspozicijo v nevronskih linijah.

== LINE-1 V RAZVOJU PRI MOŽGANIH ==

Najzgodnejši dokumentirani primer somatske retrotranspozicije in vivo je bil v mišjih možganih. Nekaj let pozneje so odkrili endogeno LINE-1 mRNA v nevronskih matičnih celicah izoliranih iz možganov človeških plodov. S pomočjo RC-seq, visoko zmogljivo metodo sekvenciranja, ki cilja na 3’ in 5’ konca LINE-1, ki so jo uporabili na DNA ekstrahirane iz različnih tkiv, identificirali so bistveno več kopij ORF2 in LINE-1 CNV v hipokampusu v primerjavi s srcem in jetri istega posameznika. Zanimivo je, da so v nedavni analizi 24 hipokampalnih nevronov odkrili, da se somatske insercije, ki se pojavijo med nevrodiferenciacijo v matične celice človeškega zarodka, lahko pojavijo zaradi mutacije v Ying Yang 1 (YY1) vezavnem mestu za transkripcijski faktor. YY1 vezavno mesto v promotorski regiji LINE-1 posreduje pri metilaciji CpG otočkov in epigenetski represiji. Retrotranspozicija med nevronskim razvojem lahko prispeva k nevronski raznolikosti, saj omogoča varijacijo genomske DNA od celice do celice.

== MOBILNI ELEMENTI IN NEVRODEGENERATIVNE BOLEZNI ==

Amiotrofična lateralna skleroza(ALS) je nevrodegenerativna bolezen, za katero je značilna izguba zgornjih in spodnjih motoričnih nevronov. . Številne študije so ugotovile prisotnost retrovirusne aktivnosti reverzne transkriptaze v serumu bolnikov z ALS. V kortikalnih piramidnih in hrbteničnih nevronih v posmrtnem možganskem tkivu bolnikov z ALS opazimo večjo ekspresijo HERV K-Env ki je močni imunopatogeni protein ovojnice . Aktivacija gena za HERV-K posledično zmanjšuje dolžino dendrita in tudi razvejanost in kompleksnost motoričnih nevronov transgenih miši. Še ni znano, kaj sproži izražanje HERV-K pri odraslih nevronih.

Aktivacija retrotranspozona je bila povezana tudi s sporadično obliko Alzheimerjeve bolezni, vendar so raziskave pokazale nedosledne rezultate o tem, ali so LINE-1 povišane pri bolnikih. V nevronih bolnikov so odkrili mozaične genomske rekombinacije znotraj gena, povezanega z Alzheimerjevo boleznijo, amiloidnega prekurzorskega proteina (APP). Te različice niso imele introničnih zaporedij in so bile imenovane "genomske cDNA" (gencDNA). Predpostavili so da izvirajo iz RNA in da zahtevajo endogeno aktivnost reverzne transkriptaze da se vstavijo v prelome dvojnih verig.

Pri pojavi Parkinsonove bolezni (PD) je odkrito pet različnih strukturnih variacij v genu PRKN (parkin RBR E3 ubiquitin protein ligase). Predvideva se, da se strukturne variacije pojavijo z nealelno homologno rekombinacijo. LTR in ne-LTR retrotranspozonske sekvence so bile identificirane znotraj dveh kilobaz od točke prekinitve delecije. To lahko pomeni da so delecije morda nastale zaradi retrotranspozicije. Povezava med aktivacijo retrotranspozona pri nevrodegenerativnih boleznih ni v celoti ugotovljena.

== TRANSPOZICIJSKI ELEMENTI IN VNETJA ==

Malo je znanega o prispevku transpozonih elementov k imunskim odzivom. Ko imamo prisotno DNA v citoplazmi npr. virusno DNA, sproži se aktivacija poti cGAS-STING. cGAS-STING posledično proizvaja interferone, ki sprožijo vnetni odziv. Interferonski odzivi so lahko mehansko povezani z deregulacijo proizvodnje retrotranspozona.
Vse je več dokazov, da imajo transpozoni vlogo pri sprožitvi nevroinflamacije. Detekcija endogene nukleinske kisline s strani imunskega sistema je v osnovah številnih avtoimunskih bolezni. Retrotranspozoni so povezani z boleznimi kot so Multiple skleroza in Aicardi-Goutièresovim sindromom, kot glavni vnetni efektorji.

Multipla skleroza je kronična avtoimunska bolezen, ki prizadene osrednje živčevje in za katero ni znanega zdravila. Za bolezen so značilne lezije v beli snovi, ki vodijo do razgradnje krvno-možganske pregrade in aksonskih motenj po hrbtenjači. Izražanje HERV proteina se šteje za dejavnik za napredovanje bolezni. Iz supernatantov celične kulture vzorcev bolnikov so izolirani retrovirusima podobni delci, in je bilo dokazano da izvirajo iz elementov HERV.

Pri sistemskom eritematoznem lupusu je ugotovljena povišana transkripcija HERV. V študijah so pokazali da so ravni ekspresije mRNA HERV-E v celicah CD4+ T lupusa višje kot v zdravih celicah. Še ni znan popoln prispevek aktivnosti HERV.

Motnje avtističnega spectra so razvojne motnje, ki ovirajo komunikacijo in vedenje. Ugotovljeno je da je pri bolnikih bila zmanjšanja metilacija in povečano izražanje LINE-1 v možganih. Vse je več dokazov da lahko kronično vnetje prispeva k simptomatologiji avtizma.

Rettov sindrom je X-povezana progresivna nevrorazvojna motnja z avtističnimi značilnostmi. Pri Rettovom sindromu imamo prisotne različne mutacije v metil CpG vezavnem proteinu-2 (MeCP2). Analizirani vzorci možganskega tkiva ob smrti so pokazali višje genomske sekvence LINE-1 ORF2 pri bolnikih.

Aicardi-Goutièresov sindrom je progresivna vnetna motnja, ki prizadene novorojenčke in ima za posledico hudo duševno in telesno prizadetost ter močno skrajšano življenjsko dobo. Lahko nastane zaradi mutacij v TREX1(three-prime repair exonuclease 1). TREX1 deluje tako, da razgradi dvoverižno DNA(dsDNA)/enoverižno DNA(ssDNA). Mutacije v genu povzročijo znatno kopičenje vrst DNA v citoplazmi, ki sprožijo prirojen imunski odziv, kot je indukcija interferona. Večina teh vrst DNA je sestavljena iz citoplazemske ssDNA LINE-1. V nevronskih celicah mišjih s pomanjkanjem TREX-1 se izrazilo 70 % več elementov LINE-1Hs.

== VIRI IN LITERATURA ==

[1] Saleh, Aurian, et al. “Transposable Elements, Inflammation, and Neurological Disease.” Frontiers in Neurology, vol. 10, 2019. Frontiers, https://www.frontiersin.org/article/10.3389/fneur.2019.00894.

[2] Volkman HE, Stetson DB. The enemy within: endogenous retroelements and autoimmune disease. Nat Immunol. (2014) 15:415–22. doi: 10.1038/ni.2872

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

TE pri vnetnih boleznih

2022-05-08T10:13:07Z

Ena Kartal: /* TRANSPOZICIJSKI ELEMENTI */

== UVOD ==

Transpozicijski elementi (TE) so mobilni elementi DNA, ki se lahko replicirajo in vstavijo na različne lokacije znotraj gostiteljskega genoma. Retrotranspozoni so transpozicijski elementi, ki se mobilizirajo preko RNA intermediatov s pomočjo reverzne transkriptaze. HERV in LINE-1 sta dve glavni vrsti retrotranspozonov. Njuni inserciji sta se kopičili skozi evolucijo, dokler so se gostiteljski genomi razvijali in z uporabo različnih dejavnikov so zavirali njuni aktivnosti. Znanstveniki so odkrili, da transpozicijski elementi bolj prispevajo k patogenezi človeških bolezni, kot so do takrat mislili.

== TRANSPOZICIJSKI ELEMENTI ==

Transpozicijski elemnti obsegajo vsaj 45% človeškega genoma, medtem ko kodirajoče zaporedje zasede manj kot 3% genoma. Razvrščamo jih kot transpozoni, ki so ves čas v obliki DNA (II razred) in retrotranspozoni, ki za izvedbo traspozicije potrebujejo RNA-intermediat (I razred). Transpozoni II razreda delujejo po mehanizmu „izreži in prilepi“, pri čemer se zaporedje s pomočjo encima transpozaze izreže iz ene regije in integrira v drugo določeno regijo v genomu. Retrotranspozoni pa delujejo po mehanizmu „kopiraj in prilepi“ kar omogoča aktivnim retrotranspozonim, da ohranijo svojo prvotno lokacijo v genomu, medtem ko kopičijo število kopij drugje. Te retrotranspozone pa lahko razdelimo v dve skupini LTR in ne-LTR. V LTR skupino pa uvrščamo človeške endogene retroviruse (HERV) in retrotranspozone pri sesalcih (MaLR). Ne-LTR pa razvrčamo v dva podtipa: LINE (Long Interspersed Nuclear Elements) in SINE (Short Interspersed Nuclear Elements).

=== HERV ===

HERV retrotranspozoni imajo podobno genomsko strukturo kot eksogeni retrovirusi, kot je HIV. Ti retrotranspozoni poleg LTR zaporedja vključujejo regije gag, pol in env. Gen gag kodira proteine za ovojnico retrotranspozonskega delca. Pol pa prestavlja gen za reverzno transkriptazo, integrazo in proteazo. HERV vsebuje tudi gen, ki kodira protein env oziroma ostanek njihovega eksogenega retrovirusnega izvora pred vstavitvijo in endogenizacijo v zarodne celice. Pokazalo se je, da transkripcijsko aktivne poddružine HERV prispevajo k različnim patofiziološkim motnjam. Leta 1993 so prišli do ugotovitve, da dodatek virusa herpes simpleksa tipa 1 (HSV-1) celicam izoliranim od bolnika z multiplo sklerozo, povzroči močno stimulacijo aktivnosti specifične reverzne transkriptaze. Iz tega so sklepali da je prvotno zaporedje retrovirusa, povezaneg z multiplo sklerozo (MSRV), zelo zastopano v človeški DNK in tako odkrili poddružine skupine HERV, ki prispevajo k patologiji različnih nevroloških motnjah.

=== LINE-1 RETROTRANSPOZONI ===

Transpozoni LINE-1 so avtonomni retrotranspozoni, ki jih vsebuje človeški genom. Večina kopij LINE-1 je nepremičnih i njih ni mogoče retrotransponirati, bodisi zaradi 5' skrajšanja ali inverzij, uvedenih v zaporedje. Retrotranspozicijsko kompetentna LINE-1 ( RC LINE-1) je dolga 6kb in vsebuje 5' neprevedeno regijo (5' UTR), dva odprta bralna okvirja ( ORF1/2) in 3' UTR, prekinjeno s poli-A repom. ORF 1 predstavlja gen za protein, ki ima aktivnost spremenljevalca nukleinske kisline in RNA vezavno domeno. ORF2 kodira protein z encimsko aktivnostjo, ki je potreben za retrotranspozicijo LINE-1. ORF2p ima tako aktivnosti endonukleaze (EN) kot reverzne transkriptaze (RT). Transkripcija LINE-1 se začne na promotorju RNA olimeraze II ali natačneje znotraj prvih 100 baznih parov 5' UTR. Potem ko je prepisana, poliadenilirana LINE-1 mRNA se izvozi v citoplazmo, kjer se združi z proteini ORF1 in ORF2 in tvorijo komleks z ribonukleotidi (RNP). Potem se uvozi v jedro, da se začne obratna transkripcija in integracija. EN zareže spodnjo verigo DNK in izpostavi 3' OH, ki služi kot primer za RT za nastanek cDNA iz LINE-1 mRNA.

Heterogenost insercijskih preferenc in porazdelitev retrotranspozonov med različnimi populacijami:
Po različnih študijah so ugotovili, da pri integracji LINE1 ne ciljajo na izražene gene, odprt kromatin, ampak se namesto tega povezujejo z replikacijo DNK gostitelja. Te ugotovitve zagotavljajo prve namige, da sta integracija LINE-1 in replikacija DNK lahko mehansko povezani. Obstaja heterogenost v porazdelitvi endogenih retrotranspozonov po različnih človeških populacijah: od prisotnosti/odsotnosti transpozona do polimorfizmov posameznih nukleotidov (SNP). Polimorfizmi pri vstavitvah retroelementov nastanejo bodisi v zarodni liniji bodisi zgodaj v embrionalnem razvoju. To omogoča genomski mozaizem znotraj določeneg posameznika ko kar med različnimi človeškimi populacijami.

== CELIČNI VPLIVI RETROTRANSPOZICIJE LINE-1 ==

Retrotranspozoni LINE-1 ustvarjajo strukturno nestabilnost znotraj genoma in posledično motijo izražanje gostiteljskega gena. Vstavitve LINE-1 lahko generirajo napačno spojene ali prezgodaj okrnjene transkripte, spodbujajo prekinitev transkripcije ali celo spodbujajo spremembe našega epigenoma. Retrotranspozoni, ki prispevajo k genomski variaciji, spreminjajo ekspresijo gostiteljskega gena na epigenetski, transkripcijski in translacijski ravni.

== CELIČNI ODZIVI NA RETROTRANSPOZICIJE ==
Glede na to, da lahko retroelementi vplivajo na celico na veliko načinov, se je gostiteljski genom razvil tako, da uporablja različne odzive za zaviranje njihove aktivnosti. Transkripcijsko represijo dosežemo z represivnimi epigenetskimi modifikacijami, kot je npr. metilacija DNA. Znatna hipometilacija med embriogenezo je povezana z višjimi stopnjami retrotranspozicije. V mišjih zarodkih, ki so bili izjemno hipometilirani, se genomska integriteta vzdržuje s pomočjo faktorja CAF-1, ki zamenja histon 3.3 s histonom 3.1/3.2, ki deluje kot represivni modifikator in ščiti zarodek od retrotranspozicijske aktivnosti. Ker transpozicijski elementi vsebujejo tudi vezavna mesta za transkripcijske faktorje, to omogoča specifično transkripcijsko regulacijo, kot način transkripcijske represije. Kruppel-associated box (KRAB), ki vsebuje proteine cinkovih prstov (KZFP), so ključni regulatorji transpozicijske aktivnosti, ki se vežejo na regulatorna zaporedja TE in zavirajo izražanje TE v zgodnjih zarodkih.

Post-transkripcijska regulacija LINE-1 elementov z majhnimi RNA kot so miRNA ali piRNA, je še en celični odziv na retrotranspozicijo. Majhne RNA molekule lahko delujejo preko tarčne razgradnje RNA. Od RNA induciran kompleks za utišanje (RISC) z uporabo endonukleolitične cepitve razgrajuje TE transkriptov in, če je Dicer protein, ki je sestaven del RISC kompleksa, mutiran, povzroča povečano transkripcijo LINE-1 elementov. Odkrili so da miRNA-128 omejuje aktivnost LINE-1 preko dveh mehanizmov: lahko direktno cilja na ORF2 RNA za razgradnjo ali cilja na 3’-UTR zaporedje kofaktorja TNPO1, ki olajša transport kompleksa LINE-1 RNP v jedro. piRNA so pomembni zaviralci aktivnosti TE v zarodni liniji. Vzajemno delujejo s poddružino PIWI nukleaz Argonaute in cepijo TE transkripte v citoplazmi.

LINE-1 RNP kompleks, ki je retrotranspozicijski intermediat, je tudi tarča za razgradnjo. Protein cinkovega prsta (ZAP) se veže z LINE-1 mRNA v citoplazemskih stresnih granulah, povzroči zgubljanje integritete RNP kompleksa in zavira retrotranspozicijo LINE-1. TUT7, ki je uridil transferaza, prenaša ostanke uridina na LINE-1 mRNA v citoplazmi, nato MOV10, ki je helikaza, premakne ORF1p, da omogoči uridilacijo in posledično zavirajo reverzne transkripcije ORF2p v jedru. Družina encimov APOBEC zavirajo retrotranspozijo, najverjetneje z destabilizacijo kompleksa RNP. Kljub številnim gostiteljskim mehanizmom za zaviranje retrotranspozicije, de novo insercije so še vedno prisotne v somatskih tkivih z znatno retrotranspozicijo v nevronskih linijah.

== LINE-1 V RAZVOJU PRI MOŽGANIH ==

Najzgodnejši dokumentirani primer somatske retrotranspozicije in vivo je bil v mišjih možganih. Nekaj let pozneje so odkrili endogeno LINE-1 mRNA v nevronskih matičnih celicah izoliranih iz možganov človeških plodov. S pomočjo RC-seq, visoko zmogljivo metodo sekvenciranja, ki cilja na 3’ in 5’ konca LINE-1, ki so jo uporabili na DNA ekstrahirane iz različnih tkiv, identificirali so bistveno več kopij ORF2 in LINE-1 CNV v hipokampusu v primerjavi s srcem in jetri istega posameznika. Zanimivo je, da so v nedavni analizi 24 hipokampalnih nevronov odkrili, da se somatske insercije, ki se pojavijo med nevrodiferenciacijo v matične celice človeškega zarodka, lahko pojavijo zaradi mutacije v Ying Yang 1 (YY1) vezavnem mestu za transkripcijski faktor. YY1 vezavno mesto v promotorski regiji LINE-1 posreduje pri metilaciji CpG otočkov in epigenetski represiji. Retrotranspozicija med nevronskim razvojem lahko prispeva k nevronski raznolikosti, saj omogoča varijacijo genomske DNA od celice do celice.

== MOBILNI ELEMENTI IN NEVRODEGENERATIVNE BOLEZNI ==

Amiotrofična lateralna skleroza(ALS) je nevrodegenerativna bolezen, za katero je značilna izguba zgornjih in spodnjih motoričnih nevronov. . Številne študije so ugotovile prisotnost retrovirusne aktivnosti reverzne transkriptaze v serumu bolnikov z ALS. V kortikalnih piramidnih in hrbteničnih nevronih v posmrtnem možganskem tkivu bolnikov z ALS opazimo večjo ekspresijo HERV K-Env ki je močni imunopatogeni protein ovojnice . Aktivacija gena za HERV-K posledično zmanjšuje dolžino dendrita in tudi razvejanost in kompleksnost motoričnih nevronov transgenih miši. Še ni znano, kaj sproži izražanje HERV-K pri odraslih nevronih.
Aktivacija retrotranspozona je bila povezana tudi s sporadično obliko Alzheimerjeve bolezni, vendar so raziskave pokazale nedosledne rezultate o tem, ali so LINE-1 povišane pri bolnikih. V nevronih bolnikov so odkrili mozaične genomske rekombinacije znotraj gena, povezanega z Alzheimerjevo boleznijo, amiloidnega prekurzorskega proteina (APP). Te različice niso imele introničnih zaporedij in so bile imenovane "genomske cDNA" (gencDNA). Predpostavili so da izvirajo iz RNA in da zahtevajo endogeno aktivnost reverzne transkriptaze da se vstavijo v prelome dvojnih verig.
Pri pojavi Parkinsonove bolezni (PD) je odkrito pet različnih strukturnih variacij v genu PRKN (parkin RBR E3 ubiquitin protein ligase). Predvideva se, da se strukturne variacije pojavijo z nealelno homologno rekombinacijo. LTR in ne-LTR retrotranspozonske sekvence so bile identificirane znotraj dveh kilobaz od točke prekinitve delecije. To lahko pomeni da so delecije morda nastale zaradi retrotranspozicije. Povezava med aktivacijo retrotranspozona pri nevrodegenerativnih boleznih ni v celoti ugotovljena.

== TRANSPOZICIJSKI ELEMENTI IN VNETJA ==

Malo je znanega o prispevku transpozonih elementov k imunskim odzivom, ki so izvzeti za virusne okužbe. Ko iamo prisotno DNA v citoplazmi npr. virusno DNA, sproži se aktivacija poti cGAS-STING. cGAS-STING posledično proizvaja interferone, ki sprožijo vnetni odziv. Interferonski odzivi so lahko mehansko povezani z deregulacijo proizvodnje retrotranspozona.
Vse je več dokazov, da imajo transpozoni vlogo pri sprožitvi nevroinflamacije. Detekcija endogene nukleinske kisline s strani imunskega sistema je v osnovah številnih avtoimunskih bolezni. Retrotranspozoni so povezani z boleznimi kot so Multiple skleroza in Aicardi-Goutièresovim sindromom, kot glavni vnetni efektorji.
Multipla skleroza je kronična avtoimunska bolezen, ki prizadene osrednje živčevje in za katero ni znanega zdravila. Za bolezen so značilne lezije v beli snovi, ki vodijo do razgradnje krvno-možganske pregrade in aksonskih motenj po hrbtenjači. Izražanje HERV proteina se šteje za dejavnik za napredovanje bolezni. Iz supernatantov celične kulture vzorcev bolnikov so izolirani retrovirusima podobni delci, in je bilo dokazano da izvirajo iz elementov HERV.
Pri sistemskom eritematoznem lupusu je ugotovljena povišana transkripcija HERV. V študijah so pokazali da so ravni ekspresije mRNA HERV-E v celicah CD4+ T lupusa višje kot v zdravih celicah. Še ni znan popoln prispevek aktivnosti HERV.
Motnje avtističnega spectra so razvojne motnje, ki ovirajo komunikacijo in vedenje. Ugotovljeno je da je pri bolnikih bila zmanjšanja metilacija in povečano izražanje LINE-1 v možganih. Vse je več dokazov da lahko kronično vnetje prispeva k simptomatologiji avtizma.
Rettov sindrom je X-povezana progresivna nevrorazvojna motnja z avtističnimi značilnostmi. Pri Rettovom sindromu imamo prisotne različne mutacije v metil CpG vezavnem proteinu-2 (MeCP2). Analizirani vzorci možganskega tkiva ob smrti so pokazali višje genomske sekvence LINE-1 ORF2 pri bolnikih.
Aicardi-Goutièresov sindrom je progresivna vnetna motnja, ki prizadene novorojenčke in ima za posledico hudo duševno in telesno prizadetost ter močno skrajšano življenjsko dobo. Lahko nastane zaradi mutacij v TREX1(three-prime repair exonuclease 1). TREX1 deluje tako, da razgradi dvoverižno DNA(dsDNA)/enoverižno DNA(ssDNA). Mutacije v genu povzročijo znatno kopičenje vrst DNA v citoplazmi, ki sprožijo prirojen imunski odziv, kot je indukcija interferona. Večina teh vrst DNA je sestavljena iz citoplazemske ssDNA LINE-1. V nevronskih celicah mišjih s pomanjkanjem TREX-1 se izrazilo 70 % več elementov LINE-1Hs .

TE pri vnetnih boleznih

2022-05-08T10:07:21Z

Ena Kartal: /* TRANSPOZICIJSKI ELEMENTI IN VNETJA */

== UVOD ==

Transpozicijski elementi (TE) so mobilni elementi DNA, ki se lahko replicirajo in vstavijo na različne lokacije znotraj gostiteljskega genoma. Retrotranspozoni so transpozicijski elementi, ki se mobilizirajo preko RNA intermediatov s pomočjo reverzne transkriptaze. HERV in LINE-1 sta dve glavni vrsti retrotranspozonov. Njuni inserciji sta se kopičili skozi evolucijo, dokler so se gostiteljski genomi razvijali in z uporabo različnih dejavnikov so zavirali njuni aktivnosti. Znanstveniki so odkrili, da transpozicijski elementi bolj prispevajo k patogenezi človeških bolezni, kot so do takrat mislili.

== TRANSPOZICIJSKI ELEMENTI ==

Transpozicijski elemnti obsegajo vsaj 45% človeškega genoma, medtem ko kodirajoče zaporedje zasede manj kot 3% genoma. Razvrščamo jih kot transpozoni, ki o ves čas v obliki DNA (II razred) in retrotranspozoni, ki za izvedbo traspozicije potrebujejo RNA-intermediat (I razred). Transpozoni II razreda delujejo po mehanizmu „izreži in prilepi“, pri čemer se zaporedje s pomočjo encima transpozaze izreže iz ene regije in integrira v drugo določeno regijo v genomu. Retrotranspozoni pa delujejo po mehanizmu „kopiraj in prilepi“ kar omogoča aktivnim retrotranspozonim, da ohanijo svojo prvotno lokacijo v genomu, medtem ko kopičijo število kopij drugje. Te retrotranspozone pa lahko razdelimo v dve skupini LTR in ne-LTR. V LTR skupino pa uvrščamo človeške endogene retroviruse (HERV) in retrotranspozone pri sesalcih (MaLR). Ne-LTR pa razvrčamo v dva podtipa: LINE (Long Interspersed Nuclear Elements) in SINE (Short Interspersed Nuclear Elements).

=== HERV ===

HERV retrotranspozoni imajo podobno genomsko strukturo kot eksogeni retrovirusi, kot je HIV. Ti retrotranspozoni poleg LTR zaporedja vključujejo regije gag, pol in env. Gen gag kodira proteine za ovojnico retrotranspozonskega delca. Pol pa prestavlja gen za reverzno transkriptazo, integrazo in proteazo. HERV vsebuje tudi gen, ki kodira protein env oziroma ostanek njihovega eksogenega retrovirusnega izvora pred vstavitvijo in endogenizacijo v zarodne celice. Pokazalo se je, da transkripcijsko aktivne poddružine HERV prispevajo k različnim patofiziološkim motnjam. Leta 1993 so prišli do ugotovitve, da dodatek virusa herpes simpleksa tipa 1 (HSV-1) celicam izoliranim od bolnika z multiplo sklerozo, povzroči močno stimulacijo aktivnosti specifične reverzne transkriptaze. Iz tega so sklepali da je prvotno zaporedje retrovirusa, povezaneg z multiplo sklerozo (MSRV), zelo zastopano v človeški DNK in tako odkrili poddružine skupine HERV, ki prispevajo k patologiji različnih nevroloških motnjah.

=== LINE-1 RETROTRANSPOZONI ===

Transpozoni LINE-1 so avtonomni retrotranspozoni, ki jih vsebuje človeški genom. Večina kopij LINE-1 je nepremičnih i njih ni mogoče retrotransponirati, bodisi zaradi 5' skrajšanja ali inverzij, uvedenih v zaporedje. Retrotranspozicijsko kompetentna LINE-1 ( RC LINE-1) je dolga 6kb in vsebuje 5' neprevedeno regijo (5' UTR), dva odprta bralna okvirja ( ORF1/2) in 3' UTR, prekinjeno s poli-A repom. ORF 1 predstavlja gen za protein, ki ima aktivnost spremenljevalca nukleinske kisline in RNA vezavno domeno. ORF2 kodira protein z encimsko aktivnostjo, ki je potreben za retrotranspozicijo LINE-1. ORF2p ima tako aktivnosti endonukleaze (EN) kot reverzne transkriptaze (RT). Transkripcija LINE-1 se začne na promotorju RNA olimeraze II ali natačneje znotraj prvih 100 baznih parov 5' UTR. Potem ko je prepisana, poliadenilirana LINE-1 mRNA se izvozi v citoplazmo, kjer se združi z proteini ORF1 in ORF2 in tvorijo komleks z ribonukleotidi (RNP). Potem se uvozi v jedro, da se začne obratna transkripcija in integracija. EN zareže spodnjo verigo DNK in izpostavi 3' OH, ki služi kot primer za RT za nastanek cDNA iz LINE-1 mRNA.

Heterogenost insercijskih preferenc in porazdelitev retrotranspozonov med različnimi populacijami:
Po različnih študijah so ugotovili, da pri integracji LINE1 ne ciljajo na izražene gene, odprt kromatin, ampak se namesto tega povezujejo z replikacijo DNK gostitelja. Te ugotovitve zagotavljajo prve namige, da sta integracija LINE-1 in replikacija DNK lahko mehansko povezani. Obstaja heterogenost v porazdelitvi endogenih retrotranspozonov po različnih človeških populacijah: od prisotnosti/odsotnosti transpozona do polimorfizmov posameznih nukleotidov (SNP). Polimorfizmi pri vstavitvah retroelementov nastanejo bodisi v zarodni liniji bodisi zgodaj v embrionalnem razvoju. To omogoča genomski mozaizem znotraj določeneg posameznika ko kar med različnimi človeškimi populacijami.

== CELIČNI VPLIVI RETROTRANSPOZICIJE LINE-1 ==

Retrotranspozoni LINE-1 ustvarjajo strukturno nestabilnost znotraj genoma in posledično motijo izražanje gostiteljskega gena. Vstavitve LINE-1 lahko generirajo napačno spojene ali prezgodaj okrnjene transkripte, spodbujajo prekinitev transkripcije ali celo spodbujajo spremembe našega epigenoma. Retrotranspozoni, ki prispevajo k genomski variaciji, spreminjajo ekspresijo gostiteljskega gena na epigenetski, transkripcijski in translacijski ravni.

== CELIČNI ODZIVI NA RETROTRANSPOZICIJE ==
Glede na to, da lahko retroelementi vplivajo na celico na veliko načinov, se je gostiteljski genom razvil tako, da uporablja različne odzive za zaviranje njihove aktivnosti. Transkripcijsko represijo dosežemo z represivnimi epigenetskimi modifikacijami, kot je npr. metilacija DNA. Znatna hipometilacija med embriogenezo je povezana z višjimi stopnjami retrotranspozicije. V mišjih zarodkih, ki so bili izjemno hipometilirani, se genomska integriteta vzdržuje s pomočjo faktorja CAF-1, ki zamenja histon 3.3 s histonom 3.1/3.2, ki deluje kot represivni modifikator in ščiti zarodek od retrotranspozicijske aktivnosti. Ker transpozicijski elementi vsebujejo tudi vezavna mesta za transkripcijske faktorje, to omogoča specifično transkripcijsko regulacijo, kot način transkripcijske represije. Kruppel-associated box (KRAB), ki vsebuje proteine cinkovih prstov (KZFP), so ključni regulatorji transpozicijske aktivnosti, ki se vežejo na regulatorna zaporedja TE in zavirajo izražanje TE v zgodnjih zarodkih.
Post-transkripcijska regulacija LINE-1 elementov z majhnimi RNA kot so miRNA ali piRNA, je še en celični odziv na retrotranspozicijo. Majhne RNA molekule lahko delujejo preko tarčne razgradnje RNA. Od RNA induciran kompleks za utišanje (RISC) z uporabo endonukleolitične cepitve razgrajuje TE transkriptov in, če je Dicer protein, ki je sestaven del RISC kompleksa, mutiran, povzroča povečano transkripcijo LINE-1 elementov. Odkrili so da miRNA-128 omejuje aktivnost LINE-1 preko dveh mehanizmov: lahko direktno cilja na ORF2 RNA za razgradnjo ali cilja na 3’-UTR zaporedje kofaktorja TNPO1, ki olajša transport kompleksa LINE-1 RNP v jedro. piRNA so pomembni zaviralci aktivnosti TE v zarodni liniji. Vzajemno delujejo s poddružino PIWI nukleaz Argonaute in cepijo TE transkripte v citoplazmi.
LINE-1 RNP kompleks, ki je retrotranspozicijski intermediat, je tudi tarča za razgradnjo. Protein cinkovega prsta (ZAP) se veže z LINE-1 mRNA v citoplazemskih stresnih granulah, povzroči zgubljanje integritete RNP kompleksa in zavira retrotranspozicijo LINE-1. TUT7, ki je uridil transferaza, prenaša ostanke uridina na LINE-1 mRNA v citoplazmi, nato MOV10, ki je helikaza, premakne ORF1p, da omogoči uridilacijo in posledično zavirajo reverzne transkripcije ORF2p v jedru. Družina encimov APOBEC zavirajo retrotranspozijo, najverjetneje z destabilizacijo kompleksa RNP. Kljub številnim gostiteljskim mehanizmom za zaviranje retrotranspozicije, de novo insercije so še vedno prisotne v somatskih tkivih z znatno retrotranspozicijo v nevronskih linijah.

== LINE-1 V RAZVOJU PRI MOŽGANIH ==

Najzgodnejši dokumentirani primer somatske retrotranspozicije in vivo je bil v mišjih možganih. Nekaj let pozneje so odkrili endogeno LINE-1 mRNA v nevronskih matičnih celicah izoliranih iz možganov človeških plodov. S pomočjo RC-seq, visoko zmogljivo metodo sekvenciranja, ki cilja na 3’ in 5’ konca LINE-1, ki so jo uporabili na DNA ekstrahirane iz različnih tkiv, identificirali so bistveno več kopij ORF2 in LINE-1 CNV v hipokampusu v primerjavi s srcem in jetri istega posameznika. Zanimivo je, da so v nedavni analizi 24 hipokampalnih nevronov odkrili, da se somatske insercije, ki se pojavijo med nevrodiferenciacijo v matične celice človeškega zarodka, lahko pojavijo zaradi mutacije v Ying Yang 1 (YY1) vezavnem mestu za transkripcijski faktor. YY1 vezavno mesto v promotorski regiji LINE-1 posreduje pri metilaciji CpG otočkov in epigenetski represiji. Retrotranspozicija med nevronskim razvojem lahko prispeva k nevronski raznolikosti, saj omogoča varijacijo genomske DNA od celice do celice.

== MOBILNI ELEMENTI IN NEVRODEGENERATIVNE BOLEZNI ==

Amiotrofična lateralna skleroza(ALS) je nevrodegenerativna bolezen, za katero je značilna izguba zgornjih in spodnjih motoričnih nevronov. . Številne študije so ugotovile prisotnost retrovirusne aktivnosti reverzne transkriptaze v serumu bolnikov z ALS. V kortikalnih piramidnih in hrbteničnih nevronih v posmrtnem možganskem tkivu bolnikov z ALS opazimo večjo ekspresijo HERV K-Env ki je močni imunopatogeni protein ovojnice . Aktivacija gena za HERV-K posledično zmanjšuje dolžino dendrita in tudi razvejanost in kompleksnost motoričnih nevronov transgenih miši. Še ni znano, kaj sproži izražanje HERV-K pri odraslih nevronih.
Aktivacija retrotranspozona je bila povezana tudi s sporadično obliko Alzheimerjeve bolezni, vendar so raziskave pokazale nedosledne rezultate o tem, ali so LINE-1 povišane pri bolnikih. V nevronih bolnikov so odkrili mozaične genomske rekombinacije znotraj gena, povezanega z Alzheimerjevo boleznijo, amiloidnega prekurzorskega proteina (APP). Te različice niso imele introničnih zaporedij in so bile imenovane "genomske cDNA" (gencDNA). Predpostavili so da izvirajo iz RNA in da zahtevajo endogeno aktivnost reverzne transkriptaze da se vstavijo v prelome dvojnih verig.
Pri pojavi Parkinsonove bolezni (PD) je odkrito pet različnih strukturnih variacij v genu PRKN (parkin RBR E3 ubiquitin protein ligase). Predvideva se, da se strukturne variacije pojavijo z nealelno homologno rekombinacijo. LTR in ne-LTR retrotranspozonske sekvence so bile identificirane znotraj dveh kilobaz od točke prekinitve delecije. To lahko pomeni da so delecije morda nastale zaradi retrotranspozicije. Povezava med aktivacijo retrotranspozona pri nevrodegenerativnih boleznih ni v celoti ugotovljena.

== TRANSPOZICIJSKI ELEMENTI IN VNETJA ==

Malo je znanega o prispevku transpozonih elementov k imunskim odzivom, ki so izvzeti za virusne okužbe. Ko iamo prisotno DNA v citoplazmi npr. virusno DNA, sproži se aktivacija poti cGAS-STING. cGAS-STING posledično proizvaja interferone, ki sprožijo vnetni odziv. Interferonski odzivi so lahko mehansko povezani z deregulacijo proizvodnje retrotranspozona.
Vse je več dokazov, da imajo transpozoni vlogo pri sprožitvi nevroinflamacije. Detekcija endogene nukleinske kisline s strani imunskega sistema je v osnovah številnih avtoimunskih bolezni. Retrotranspozoni so povezani z boleznimi kot so Multiple skleroza in Aicardi-Goutièresovim sindromom, kot glavni vnetni efektorji.
Multipla skleroza je kronična avtoimunska bolezen, ki prizadene osrednje živčevje in za katero ni znanega zdravila. Za bolezen so značilne lezije v beli snovi, ki vodijo do razgradnje krvno-možganske pregrade in aksonskih motenj po hrbtenjači. Izražanje HERV proteina se šteje za dejavnik za napredovanje bolezni. Iz supernatantov celične kulture vzorcev bolnikov so izolirani retrovirusima podobni delci, in je bilo dokazano da izvirajo iz elementov HERV.
Pri sistemskom eritematoznem lupusu je ugotovljena povišana transkripcija HERV. V študijah so pokazali da so ravni ekspresije mRNA HERV-E v celicah CD4+ T lupusa višje kot v zdravih celicah. Še ni znan popoln prispevek aktivnosti HERV.
Motnje avtističnega spectra so razvojne motnje, ki ovirajo komunikacijo in vedenje. Ugotovljeno je da je pri bolnikih bila zmanjšanja metilacija in povečano izražanje LINE-1 v možganih. Vse je več dokazov da lahko kronično vnetje prispeva k simptomatologiji avtizma.
Rettov sindrom je X-povezana progresivna nevrorazvojna motnja z avtističnimi značilnostmi. Pri Rettovom sindromu imamo prisotne različne mutacije v metil CpG vezavnem proteinu-2 (MeCP2). Analizirani vzorci možganskega tkiva ob smrti so pokazali višje genomske sekvence LINE-1 ORF2 pri bolnikih.
Aicardi-Goutièresov sindrom je progresivna vnetna motnja, ki prizadene novorojenčke in ima za posledico hudo duševno in telesno prizadetost ter močno skrajšano življenjsko dobo. Lahko nastane zaradi mutacij v TREX1(three-prime repair exonuclease 1). TREX1 deluje tako, da razgradi dvoverižno DNA(dsDNA)/enoverižno DNA(ssDNA). Mutacije v genu povzročijo znatno kopičenje vrst DNA v citoplazmi, ki sprožijo prirojen imunski odziv, kot je indukcija interferona. Večina teh vrst DNA je sestavljena iz citoplazemske ssDNA LINE-1. V nevronskih celicah mišjih s pomanjkanjem TREX-1 se izrazilo 70 % več elementov LINE-1Hs .

TE pri vnetnih boleznih

2022-05-08T10:06:40Z

Ena Kartal: /* HERV */

== UVOD ==

Transpozicijski elementi (TE) so mobilni elementi DNA, ki se lahko replicirajo in vstavijo na različne lokacije znotraj gostiteljskega genoma. Retrotranspozoni so transpozicijski elementi, ki se mobilizirajo preko RNA intermediatov s pomočjo reverzne transkriptaze. HERV in LINE-1 sta dve glavni vrsti retrotranspozonov. Njuni inserciji sta se kopičili skozi evolucijo, dokler so se gostiteljski genomi razvijali in z uporabo različnih dejavnikov so zavirali njuni aktivnosti. Znanstveniki so odkrili, da transpozicijski elementi bolj prispevajo k patogenezi človeških bolezni, kot so do takrat mislili.

== TRANSPOZICIJSKI ELEMENTI ==

Transpozicijski elemnti obsegajo vsaj 45% človeškega genoma, medtem ko kodirajoče zaporedje zasede manj kot 3% genoma. Razvrščamo jih kot transpozoni, ki o ves čas v obliki DNA (II razred) in retrotranspozoni, ki za izvedbo traspozicije potrebujejo RNA-intermediat (I razred). Transpozoni II razreda delujejo po mehanizmu „izreži in prilepi“, pri čemer se zaporedje s pomočjo encima transpozaze izreže iz ene regije in integrira v drugo določeno regijo v genomu. Retrotranspozoni pa delujejo po mehanizmu „kopiraj in prilepi“ kar omogoča aktivnim retrotranspozonim, da ohanijo svojo prvotno lokacijo v genomu, medtem ko kopičijo število kopij drugje. Te retrotranspozone pa lahko razdelimo v dve skupini LTR in ne-LTR. V LTR skupino pa uvrščamo človeške endogene retroviruse (HERV) in retrotranspozone pri sesalcih (MaLR). Ne-LTR pa razvrčamo v dva podtipa: LINE (Long Interspersed Nuclear Elements) in SINE (Short Interspersed Nuclear Elements).

=== HERV ===

HERV retrotranspozoni imajo podobno genomsko strukturo kot eksogeni retrovirusi, kot je HIV. Ti retrotranspozoni poleg LTR zaporedja vključujejo regije gag, pol in env. Gen gag kodira proteine za ovojnico retrotranspozonskega delca. Pol pa prestavlja gen za reverzno transkriptazo, integrazo in proteazo. HERV vsebuje tudi gen, ki kodira protein env oziroma ostanek njihovega eksogenega retrovirusnega izvora pred vstavitvijo in endogenizacijo v zarodne celice. Pokazalo se je, da transkripcijsko aktivne poddružine HERV prispevajo k različnim patofiziološkim motnjam. Leta 1993 so prišli do ugotovitve, da dodatek virusa herpes simpleksa tipa 1 (HSV-1) celicam izoliranim od bolnika z multiplo sklerozo, povzroči močno stimulacijo aktivnosti specifične reverzne transkriptaze. Iz tega so sklepali da je prvotno zaporedje retrovirusa, povezaneg z multiplo sklerozo (MSRV), zelo zastopano v človeški DNK in tako odkrili poddružine skupine HERV, ki prispevajo k patologiji različnih nevroloških motnjah.

=== LINE-1 RETROTRANSPOZONI ===

Transpozoni LINE-1 so avtonomni retrotranspozoni, ki jih vsebuje človeški genom. Večina kopij LINE-1 je nepremičnih i njih ni mogoče retrotransponirati, bodisi zaradi 5' skrajšanja ali inverzij, uvedenih v zaporedje. Retrotranspozicijsko kompetentna LINE-1 ( RC LINE-1) je dolga 6kb in vsebuje 5' neprevedeno regijo (5' UTR), dva odprta bralna okvirja ( ORF1/2) in 3' UTR, prekinjeno s poli-A repom. ORF 1 predstavlja gen za protein, ki ima aktivnost spremenljevalca nukleinske kisline in RNA vezavno domeno. ORF2 kodira protein z encimsko aktivnostjo, ki je potreben za retrotranspozicijo LINE-1. ORF2p ima tako aktivnosti endonukleaze (EN) kot reverzne transkriptaze (RT). Transkripcija LINE-1 se začne na promotorju RNA olimeraze II ali natačneje znotraj prvih 100 baznih parov 5' UTR. Potem ko je prepisana, poliadenilirana LINE-1 mRNA se izvozi v citoplazmo, kjer se združi z proteini ORF1 in ORF2 in tvorijo komleks z ribonukleotidi (RNP). Potem se uvozi v jedro, da se začne obratna transkripcija in integracija. EN zareže spodnjo verigo DNK in izpostavi 3' OH, ki služi kot primer za RT za nastanek cDNA iz LINE-1 mRNA.

Heterogenost insercijskih preferenc in porazdelitev retrotranspozonov med različnimi populacijami:
Po različnih študijah so ugotovili, da pri integracji LINE1 ne ciljajo na izražene gene, odprt kromatin, ampak se namesto tega povezujejo z replikacijo DNK gostitelja. Te ugotovitve zagotavljajo prve namige, da sta integracija LINE-1 in replikacija DNK lahko mehansko povezani. Obstaja heterogenost v porazdelitvi endogenih retrotranspozonov po različnih človeških populacijah: od prisotnosti/odsotnosti transpozona do polimorfizmov posameznih nukleotidov (SNP). Polimorfizmi pri vstavitvah retroelementov nastanejo bodisi v zarodni liniji bodisi zgodaj v embrionalnem razvoju. To omogoča genomski mozaizem znotraj določeneg posameznika ko kar med različnimi človeškimi populacijami.

== CELIČNI VPLIVI RETROTRANSPOZICIJE LINE-1 ==

Retrotranspozoni LINE-1 ustvarjajo strukturno nestabilnost znotraj genoma in posledično motijo izražanje gostiteljskega gena. Vstavitve LINE-1 lahko generirajo napačno spojene ali prezgodaj okrnjene transkripte, spodbujajo prekinitev transkripcije ali celo spodbujajo spremembe našega epigenoma. Retrotranspozoni, ki prispevajo k genomski variaciji, spreminjajo ekspresijo gostiteljskega gena na epigenetski, transkripcijski in translacijski ravni.

== CELIČNI ODZIVI NA RETROTRANSPOZICIJE ==
Glede na to, da lahko retroelementi vplivajo na celico na veliko načinov, se je gostiteljski genom razvil tako, da uporablja različne odzive za zaviranje njihove aktivnosti. Transkripcijsko represijo dosežemo z represivnimi epigenetskimi modifikacijami, kot je npr. metilacija DNA. Znatna hipometilacija med embriogenezo je povezana z višjimi stopnjami retrotranspozicije. V mišjih zarodkih, ki so bili izjemno hipometilirani, se genomska integriteta vzdržuje s pomočjo faktorja CAF-1, ki zamenja histon 3.3 s histonom 3.1/3.2, ki deluje kot represivni modifikator in ščiti zarodek od retrotranspozicijske aktivnosti. Ker transpozicijski elementi vsebujejo tudi vezavna mesta za transkripcijske faktorje, to omogoča specifično transkripcijsko regulacijo, kot način transkripcijske represije. Kruppel-associated box (KRAB), ki vsebuje proteine cinkovih prstov (KZFP), so ključni regulatorji transpozicijske aktivnosti, ki se vežejo na regulatorna zaporedja TE in zavirajo izražanje TE v zgodnjih zarodkih.
Post-transkripcijska regulacija LINE-1 elementov z majhnimi RNA kot so miRNA ali piRNA, je še en celični odziv na retrotranspozicijo. Majhne RNA molekule lahko delujejo preko tarčne razgradnje RNA. Od RNA induciran kompleks za utišanje (RISC) z uporabo endonukleolitične cepitve razgrajuje TE transkriptov in, če je Dicer protein, ki je sestaven del RISC kompleksa, mutiran, povzroča povečano transkripcijo LINE-1 elementov. Odkrili so da miRNA-128 omejuje aktivnost LINE-1 preko dveh mehanizmov: lahko direktno cilja na ORF2 RNA za razgradnjo ali cilja na 3’-UTR zaporedje kofaktorja TNPO1, ki olajša transport kompleksa LINE-1 RNP v jedro. piRNA so pomembni zaviralci aktivnosti TE v zarodni liniji. Vzajemno delujejo s poddružino PIWI nukleaz Argonaute in cepijo TE transkripte v citoplazmi.
LINE-1 RNP kompleks, ki je retrotranspozicijski intermediat, je tudi tarča za razgradnjo. Protein cinkovega prsta (ZAP) se veže z LINE-1 mRNA v citoplazemskih stresnih granulah, povzroči zgubljanje integritete RNP kompleksa in zavira retrotranspozicijo LINE-1. TUT7, ki je uridil transferaza, prenaša ostanke uridina na LINE-1 mRNA v citoplazmi, nato MOV10, ki je helikaza, premakne ORF1p, da omogoči uridilacijo in posledično zavirajo reverzne transkripcije ORF2p v jedru. Družina encimov APOBEC zavirajo retrotranspozijo, najverjetneje z destabilizacijo kompleksa RNP. Kljub številnim gostiteljskim mehanizmom za zaviranje retrotranspozicije, de novo insercije so še vedno prisotne v somatskih tkivih z znatno retrotranspozicijo v nevronskih linijah.

== LINE-1 V RAZVOJU PRI MOŽGANIH ==

Najzgodnejši dokumentirani primer somatske retrotranspozicije in vivo je bil v mišjih možganih. Nekaj let pozneje so odkrili endogeno LINE-1 mRNA v nevronskih matičnih celicah izoliranih iz možganov človeških plodov. S pomočjo RC-seq, visoko zmogljivo metodo sekvenciranja, ki cilja na 3’ in 5’ konca LINE-1, ki so jo uporabili na DNA ekstrahirane iz različnih tkiv, identificirali so bistveno več kopij ORF2 in LINE-1 CNV v hipokampusu v primerjavi s srcem in jetri istega posameznika. Zanimivo je, da so v nedavni analizi 24 hipokampalnih nevronov odkrili, da se somatske insercije, ki se pojavijo med nevrodiferenciacijo v matične celice človeškega zarodka, lahko pojavijo zaradi mutacije v Ying Yang 1 (YY1) vezavnem mestu za transkripcijski faktor. YY1 vezavno mesto v promotorski regiji LINE-1 posreduje pri metilaciji CpG otočkov in epigenetski represiji. Retrotranspozicija med nevronskim razvojem lahko prispeva k nevronski raznolikosti, saj omogoča varijacijo genomske DNA od celice do celice.

== MOBILNI ELEMENTI IN NEVRODEGENERATIVNE BOLEZNI ==

Amiotrofična lateralna skleroza(ALS) je nevrodegenerativna bolezen, za katero je značilna izguba zgornjih in spodnjih motoričnih nevronov. . Številne študije so ugotovile prisotnost retrovirusne aktivnosti reverzne transkriptaze v serumu bolnikov z ALS. V kortikalnih piramidnih in hrbteničnih nevronih v posmrtnem možganskem tkivu bolnikov z ALS opazimo večjo ekspresijo HERV K-Env ki je močni imunopatogeni protein ovojnice . Aktivacija gena za HERV-K posledično zmanjšuje dolžino dendrita in tudi razvejanost in kompleksnost motoričnih nevronov transgenih miši. Še ni znano, kaj sproži izražanje HERV-K pri odraslih nevronih.
Aktivacija retrotranspozona je bila povezana tudi s sporadično obliko Alzheimerjeve bolezni, vendar so raziskave pokazale nedosledne rezultate o tem, ali so LINE-1 povišane pri bolnikih. V nevronih bolnikov so odkrili mozaične genomske rekombinacije znotraj gena, povezanega z Alzheimerjevo boleznijo, amiloidnega prekurzorskega proteina (APP). Te različice niso imele introničnih zaporedij in so bile imenovane "genomske cDNA" (gencDNA). Predpostavili so da izvirajo iz RNA in da zahtevajo endogeno aktivnost reverzne transkriptaze da se vstavijo v prelome dvojnih verig.
Pri pojavi Parkinsonove bolezni (PD) je odkrito pet različnih strukturnih variacij v genu PRKN (parkin RBR E3 ubiquitin protein ligase). Predvideva se, da se strukturne variacije pojavijo z nealelno homologno rekombinacijo. LTR in ne-LTR retrotranspozonske sekvence so bile identificirane znotraj dveh kilobaz od točke prekinitve delecije. To lahko pomeni da so delecije morda nastale zaradi retrotranspozicije. Povezava med aktivacijo retrotranspozona pri nevrodegenerativnih boleznih ni v celoti ugotovljena.

== TRANSPOZICIJSKI ELEMENTI IN VNETJA ==

Malo je znanega o prispevku transpozonih elementov k imunskim odzivom, ki so izvzeti za virusne okužbe. Ko iamo prisotno DNA v citoplazmi npr. virusno DNA, sproži se aktivacija poti cGAS-STING. cGAS-STING posledično proizvaja interferone, ki sprožijo vnetni odziv. Interferonski odzivi so lahko mehansko povezani z deregulacijo proizvodnje retrotranspozona.
Vse je več dokazov, da imajo transpozoni vlogo pri sprožitvi nevroinflamacije. Detekcija endogene nukleinske kisline s strani imunskega sistema je v osnovah številnih avtoimunskih bolezni. Retrotranspozoni so povezani z boleznimi kot so Multiple skleroza in Aicardi-Goutièresovim sindromom, kot glavni vnetni efektorji.
Multipla skleroza je kronična avtoimunska bolezen, ki prizadene osrednje živčevje in za katero ni znanega zdravila. Za bolezen so značilne lezije v beli snovi, ki vodijo do razgradnje krvno-možganske pregrade in aksonskih motenj po hrbtenjači. Izražanje HERV proteina se šteje za dejavnik za napredovanje bolezni. Iz supernatantov celične kulture vzorcev bolnikov so izolirani retrovirusima podobni delci, in je bilo dokazano da izvirajo iz elementov HERV.
Pri sistemskom eritematoznem lupusu je ugotovljena povišana transkripcija HERV. V študijah so pokazali da so ravni ekspresije mRNA HERV-E v celicah CD4+ T lupusa višje kot v zdravih celicah. Še ni znan popoln prispevek aktivnosti HERV.
Motnje avtističnega spectra so razvojne motnje, ki ovirajo komunikacijo in vedenje. Ugotovljeno je da je pri bolnikih bila zmanjšanja metilacija in povečano izražanje LINE-1 v možganih. Vse je več dokazov da lahko kronično vnetje prispeva k simptomatologiji avtizma.
Rettov sindrom je X-povezana progresivna nevrorazvojna motnja z avtističnimi značilnostmi. Pri Rettovom sindromu imamo prisotne različne mutacije v metil CpG vezavnem proteinu-2 (MeCP2). Analizirani vzorci možganskega tkiva ob smrti so pokazali višje genomske sekvence LINE-1 ORF2 pri bolnikih.
Aicardi-Goutièresov sindrom je progresivna vnetna motnja, ki prizadene novorojenčke in ima za posledico hudo duševno in telesno prizadetost ter močno skrajšano življenjsko dobo. Lahko nastane zaradi mutacij v TREX1(three-prime repair exonuclease 1). TREX1 deluje tako, da razgradi dvoverižno DNA(dsDNA)/enoverižno DNA(ssDNA). Mutacije v genu povzročijo znatno kopičenje vrst DNA v citoplazmi, ki sprožijo prirojen imunski odziv, kot je indukcija interferona. Večina teh vrst DNA je sestavljena iz citoplazemske ssDNA LINE-1. V nevronskih celicah mišjih s pomanjkanjem TREX-1 se izrazilo 70 % več elementov LINE-1Hs .

Transpozicijski elementi

2022-05-08T09:24:39Z

Ena Kartal:

Seminarji pri Molekularni biologiji v študijskem letu 2021/22 obravnavajo odkritje, mehanizem in vlogo transpozicijskih elementov pri prokariontih in evkariontih. Okvirni naslovi teme so navedeni na spodnjem seznamu.

Vse teme temeljijo na preglednih člankih, kar pomeni, da obravnavajo zaključene teme, na katerih je bilo opravljenega že veliko dela. Zato je smiselno, da vsako temo obdelajo po trije študenti. Vsaka skupina mora pripraviti povzetek seminarja z vsaj 1200 besedami in ne več kot 1800 besedami in ga objaviti na tem wikiju. Povzetek ne vsebuje slikovnega gradiva, lahko pa vključuje povezave do slik in videov na spletu. Navedite do 5 ključnih virov (ti ne štejejo v vsoto 1200–1800 besed), ki ste jih uporabili.

Vsaka skupina mora objaviti povzetek seminarja na wikiju najkasneje 24 h pred predstavitvijo svojega seminarja. Kateri del povzetka je napisal kdo, navedite v zavihku 'discussion'. Predstavitev naj bo dolga 15–20 minut, temu pa bo sledila razprava (pribl. 5 minut). Vsak član skupine mora predstaviti en del seminarja, pri čemer mora biti delo enakomerno razdeljeno med vse. Osredotočite se na osnovno temo, ki ste si jo izbrali, in vključite le malo splošnega uvoda, ki naj zgolj umesti vašo temo v kontekst transpozicijskih elementov.

Seminarske predstavitve bodo potekale predvidoma od 19.4. do 9.5. V tem času ne bo klasičnih predavanj, torej bodo tako ponedeljkovi kot torkovi termini namenjeni seminarjem.

Vsebina seminarjev je izpitna snov. Iz teme seminarjev je ~10 % vprašanj na izpitu (oz. 10 % točk dobite za odgovore iz snovi seminarjev).

Razdelitev seminarjev je potekala v okolju Google Drive, kjer so (bile) navedene povezave do izhodiščnih člankov, s katerimi lahko začnete iskanje literature. Večinoma navedeni viri ne zadoščajo, da bi pripravili kvaliteten 15-minutni seminar, zato boste morali pregledati tudi nekaj primarnih virov (raziskovalnih člankov), ki jih boste poiskali sami oz. jih boste našli citirane v preglednih člankih. Vaši seminarji naj se osredotočijo na osnovno temo iz naslova in naj nimajo dolgih splošnih uvodov. Seminarji si bodo namreč sledili dokaj hitro en za drugim), tako da boste osnove hitro osvojili in jih ni treba ponavljati.

Ko boste pripravljali povzetek, naslov teme na spodnjem seznamu povežite z novo wiki stranjo, ki bo vsebovala povzetek. Na koncu besedila povzetka (pod viri) v novo vrstico dodajte oznako: <nowiki>[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]</nowiki>. Primer, kako so bili urejeni seminarji v prejšnjih letih, si lahko ogledate na strani [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Molekularna_biologija_koronavirusov Molekularna biologija koronavirusov (2020/21)].

Poglavja za seminarje so:

# [[Odkritje transpozicijskih elementov pri bakterijah]] (Teja Spruk, Urša Štefan, Urša Zevnik) 
# [[Klasifikacija transpozicijskih elementov in pregled načina delovanja]] (Klara Ažbe, Pia Trošt, Ana Maučec) 
# [[Katalitični mehanizem transpozaz]] (Nuša Brdnik, Mark Loborec, Maj Priveršek) 
# [[Transpozoni kot prenašalci odpornosti bakterij proti antibiotikom]] (Ana Kastelic, Lev Jošt, Gašper Struna) 

----

# [[Pomen retroelementov v mikrobnih genomih]] (Ema Kavčič, Špela Rapuš, Ivana Vukšinić) 
# [[Integracija transpozonov pri kvasovkah]] (Katja Resnik, Pia Špehar, Zarja Weingerl) 
# [[Retrotranspozoni LINE-1 in dejavniki, ki uravnavajo njihovo delovanje]] (Ana Kodra, Neža Lanišek, Gašper Možina) 
# [[TE kot regulatorji transkripcije]] (Marko Kovačić, Nik Vidmar, David Valte) 

----

# [[Interakcije transpozon – gostitelj]] (Maja Deutsch, Sara Jerič, Martin Stanonik) 
# [[Sodobni pogled na TE pri koruzi]] (Špela Sotlar, Tina Zajec, Žan Žnidar) 
# [[Vloga TE pri razvoju zarodka]] (Pia Sotlar, Petja Premrl, Pia Mencin) 
# [[Transpozoni in rak]] (Maša Mencigar, Alliana Kolar, Klara Kočman) 

----

# [[Uporabna vrednost transpozonov za gensko zdravljenje]] (Jan Kogovšek, Lana Kores, Klara Razboršek) 
# [[Biotehnološka uporaba transpozicijskega mehanizma: primer Sleeping Beauty]] (Neža Peternel, Andraž Rotar, Nuša Kos Thaler) 
# [[Funkcije nekodirajoče RNA, ki je po izvoru transpozonska]] (Tinkara Butara, Miha Razdevšek, Gaja Starc) 
# [[TE kot gonilo sprememb v genomu pšenice]] (Ela Kovač, Tina Urh, Metka Rus) 

----

# [[TE pri mentalnih boleznih]] (Tina Javeršek, Hana Glavnik, Jan Trebušak) 
# [[TE pri vnetnih boleznih]] (Kostadin Mitkov, Ena Kartal, Nataša Vujović) 

----

# Preferenčna integracijska mesta retrotranspozona Tf1 v genomu kvasovke ''Schizosaccharomyces pombe''[[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Preferen%C4%8Dna_integracijska_mesta_retrotranspozona_Tf1_v_genomu_kvasovke_%27%27Schizosaccharomyces_pombe%27%27]]