Wiki FKKT - User contributions [en]

Translacijski nadzor izražanja encima odstranjevalca preko s toksinom induciranega miRNA stikala

2021-05-17T21:18:03Z

Ernestinalavrih:

''Povzeto po članku:'' [https://www.nature.com/articles/s41598-021-81679-6 Pollak, Nina M., Justin J. Cooper-White, in Joanne Macdonald. 2021. „Translational control of enzyme scavenger expression with toxin-induced micro RNA switches“. Scientific Reports.]

== '''Uvod''' ==
Sinetzna biologija se je izkazala kot primerna tehnika za uporabo na prokariontskih celicah, medtem ko uporaba na evkariontskih organizmih peša. Do sedaj so identificirali le en tip ribostikala oz. ribosomskega stikala (tiamin pirofosfat), ki je primeren za evkariontske celice, medtem ko pri prokariontskih poznamo preko 40 različnih tipov takšnih stikal (Mccown idr. 2017). Na ravni evkariontske transkripcije poročajo predvsem o regulaciji preko modificiranih promotorjev, ki sodelujejo pri prepisu (Dalchau idr. 2018). Na postranskripcijski ravni pa se v študijah načeloma odločajo za regulacijo in kontrolo preko mikro-RNA. miRNA so endogene, enoverižne RNA, ki uravnavajo izražanje genov in so pomembne pri številnih fizioloških in patoloških procesih kot so celična rast, diferenciacija, razvoj in apoptoza. Zaradi napisanega predstavljajo odlične kandidate za načrtovanje stikal; orodij sintezne biologije za gensko regulacijo in posledično aplikacijo pri višjih evkariontih (Pollak, Cooper-White, in Macdonald 2021).

V izbrani študiji so za aplikacijo detoksifikacijskih orodij sintezne biologije za terapevtske namene uporabili miRNA stikalo. To uravnava izražanje encima odstranjevalca oz. čistilca (angl. ''scavenger'') v prisotnosti določene toksične male molekule. V opisani študiji je bil za prikaz koncepta encima odstranjevalca izbran citokrom P450 1A2 (kasneje imenovan CYP1A2). Znano je, da naddružina citokromov P450 igra pomembno vlogo pri zmanjševanju škodljivih vplivov različnih toksinov. Presnavljajo približno 60 % farmacevtskih spojin, citokrom P450 1A2 pa metabolizira razne farmacevtsko pomembne učinkovine, med drugim večino teofilina, ki se uporablja za zdravljenje vseh oblik astme, kroničnega obstruktivnega bronhitisa, pljučnega emfizema in pljučne hipertenzije (Gong, Du, in Du 2018). V študiji so za delovanje miRNA stikala uporabili visoko specifičen aptamer, ki se je z visoko afiniteto vezal na teofilin.

== '''Rezultati''' ==
== Kontrola znotrajcelične aktivacije encima odstranjevalca ==
V raziskavi so izkoristili že obstoječi celični interferenčni sistem in načrtovali miRNA stikalo, ki s svojim delovanjem prilagaja izražanje encima CYP1A2. Za izvedbo eksperimenta je bila uporabljena celična linija HEK-293. Utišanje gena CYP1A2 je povzročila miRNA, ki ima v svojo sekvenco vgrajen aptamer, ki se sicer veže na toksin (teofilin). Če je teofilin prisoten, se aptamer nanj veže, spremeni se sekundarna struktura miRNA, s čimer se primarno miRNA zamaskira, da ne pride do encimske predelave (ki jo sicer izvede proteinski kompleks Drosha) do prekurzorske miRNA. Rezultat tega je povečano izražanje encima CYP1A2. Encimsko aktivnost CYP1A2 so v študiji posredno merili preko detekcije luciferina. Encim CYP1A2 pretvori dodan substrat luciferin-1A2 v prekurzor luciferina, ki se s pomočjo D-cisteina (ki je prisoten v detekcijskem reagentu in dodan celicam) pretovri v luciferin, ki omogoči sistem za enostavno odčitavanje encimske aktivnosti.
Pri identifikaciji miRNA sekvenc za regulacijo izražanja CYP1A2 so v študiji s pomočjo osnovnih pravil in navodil za načrtovanje miRNA najprej skonstruirali 5 različnih sekvenc, ki ciljajo CYP1A2 (miR-30a-C). Na podlagi teh so osnovali miRNA stikala, ki so bila zaradi dodane sekvence aptamera odzivna na teofilin (miR-30a-CT). Nadalje so iz podatkovnih baz ''miRbase'' in ''miRWalk Version 3'' pridobili v naravi že obstoječo miRNA (miR-378a) in jo z integracijo sekvence aptamera v osrednji del modificirali v miRNA stikalo (miR-378a-CT).

== Utišanje izražanja CYP1A2 z miRNA ==
Po vzpostavitvi optimalnega izražanja encima CYP1A2 v uporabljenih HEK-293 celični liniji so preučevali sposobnost utišanja izražanja s strani prej opisanih miRNA sekvenc. 3 od 5 načrtovanih miRNA (miR-30a-C-45, 325 in 544) so uspele statistično značilno znižati luminiscenčno aktivnost (na od 38 % do 51 % preostanek aktivnosti). Prav tako se je izkazal, da že v naravi obstoječa miRNA (miR-378a) statistično značilno zniža aktivnost encima CYP1A2 (27 % preostanka luminiscenčne aktivnosti v primerjavi z ne utišano aktivnostjo). S tem so potrdili uspešnost sistema za načrtovanja miRNA s pomočjo baz podatkov, ki hranijo sekvence v naravi obstoječih miRNA. S tem se v prihodnje želi nadomesti načrtovanje več različnih sintetičnih miRNA z identifikacijo le ene, v naravni že prisotne miRNA.

== Kontrola sinteze encima CYP1A2 z miRNA stikali, ki se odzivajo na toksin ==
Za nadaljnjo raziskavo določanja učinkovitosti miRNA stikal (miR-30a-CT in miR-378a-CT), ki se odzivajo na teofilin, sta bili izbrani 2 sekvenci miRNA, ki sta najučinkoviteje utišali izražanje CYP1A2 (miR-30a-C-325 in miR-378a-C). Z različnimi koncentracijami teofilina (0-10 mM) so preko znotrajcelične aktivnosti encima odstranjevalca ocenili sposobnost regulacije z miRNA stikali. Pričakovano so se na prisotnost teofilina odzvala samo miRNA stikala z integrirano sekvenco aptamera za teofilin (miRNA-CT) in inducirala encimsko aktivnost CYP1A2, ki je bila merjena preko luminiscence. V odsotnosti teofilina so miRNA stikala prav tako pričakovano povzročila nižjo aktivnost encima odstranjevalca (preostala aktivnosti 36 % - 40 % ). V prisotnosti teofilina so opazili statistično značilno povečanje (1,8 x) aktivnosti encima CYP1A2 v celicah, ki so vsebovale miRNA s sekvenco aptamera za teofilin (miR-30a-CT) v primerjavi s celicami z miRNA brez sekvence za aptamer (miR-30a-C).

== Časovno odvisna kontrola izražanja CYP1A2 ==
Po vzpostavitvi aktivacije CYP1A2 z miRNA stikalom so v študiji raziskali dinamične lastnosti izbranih stikal. Celice s plazmidi z miRNA stikali so 2 dni inkubairali v prisotnosti 2 mM teofilina, da so teofilin odzivna miRNA stikala prešla v vklopljeno stanje (angl. ''on''). Sledila je odstranitev teofilina in ponovno 2 dnevna inkubacija, da so stikala prešla v izklopljeno stanje (angl. ''off''). Po odstranitvi teofilina je prišlo do znižanja izražanja encima odstranjevalca, kar dokazuje, da so uporabljena miRNA stikala reverzibilna. Večje znižanje encimske aktivnosti (- 29 %) je bilo opaženo pri uporabi naravno prisotne miRNA (miR- 378-CT) v primerjavi s sintetično načrtovano miRNA (miR-30a-CT) (- 11 %).

== '''Zaključki'''==
V opisani študiji so dokazali, da lahko izvajajo kontrolo izražanja encimov odstranjevalcev z uporabo regulatornega sistema na osnovi miRNA stikal, ki se odzivajo na prisotne toksine. Rezultati prikazujejo, da postranskripcijska regulacija genov z miRNA stikali lahko producira detoksifikacijsko funkcijo, ki temelji na znotrajceličnem molekularnem dogodku. Predvidevajo, da ima imenovana detoksifikacijska funkcija v prihodnosti lahko širok spekter uporabe; v personalizirani medicini, spremljanju stanja v okolju, obrambi pred onesnaženjem ...

Kontrola izražanja genov na molekularnem nivoju je ključno orodje za bioračunalništvo in bioinformatiko in z miRNA stikali inducirana translacijska kontrola predstavlja dober sistem za izvajanje takšnega nadzora pri evkariontih. Prednost programiranja celičnih funkcij z omenjenim sistemom je predvsem v hitrem odzivnem času na zunanje signale (npr. toksine).

Znano je, da so sekundarne strukture - zanke na koncih miRNA – ključne za regulacijsko delovanje molekule. V študiji so se zato odločili, da sekvenco aptamera za teofilin vstavijo v osrednji del miRNA in se s tem izognejo poseganju v ohranjeneno območje končnih zank. Dodatek male molekule, v tem primeru teofilina, onemogoči kasnejše procesiranje in obdelavo miRNA. Domnevajo, da je to posledica strukturnih sprememb, ki onemogočijo obdelavo s strani encimskih kompleksov Drosha in Dicer, kar prepreči nastanek kompleksa RISC z zrelo miRNA.

Omenjen sistem, ki temelji na miRNA, lahko v vklopljenjem stanju (angl. ''on'') spodbudi izražanje genov blizu njihovega maksimuma izražanja, medtem ko v izklopljenem stanju (angl. ''off'') prihaja do ti. puščanja, kar se kaže v večjem ali manjšem izražanju genov, ki ni enak ničelnemu izražanju. V primeru umetno vgrajenega stikala, ki se odziva na teofilin in pomaga pri detoksifikaciji pacienta, bi se to kazalo v določenih koncentracijah encima CYP1A2, sintetiziranega v neaktivnem oz. izklopljenem stanju stikala, kar v študiji imenujejo puščanje (angl. ''leakage''). Te majhne koncentracije bi sicer lahko okrepile naravno aktivnost encimov naddružine citokromov P450 v jetrih. V primeru, da bi bil pacient zaradi nujnega zdravljenja astme izpostavljen toksičnim koncentracijam teofilina [> 100 μM], bi se vgrajeno stikalo aktiviralo in povečalo detoksifikacijsko funkcijo in poskreblo za hitrejše razstrupljanje telesa.

Rezultati študije so potrdili, da je evolucijsko zasnovana miRNA (ta, ki je v naravi že prisotna) pri encimski aktivaciji v prisotnosti induktorja (v obliki toksina) učinkovitejša kot sintetično načrtovane različice miRNA. Iskanje že obstoječih in v naravi prisotnih miRNA je preposto, saj temelji na brezplačnih spletnih bazah podatkov in orodjih za predikcijo. miRNA-378a, ki je bila iz baz podatkov izbrana v tej raziskavi, je med različnimi vrstami sesalcev zelo ohranjena (vključno z ljudmi, mišmi in podganami) in bi zato moral delovati v različnih sesalčjih celicah. V članku predvidevajo, da naj bi sistem miRNA stikal deloval pri vseh vrstah, ki posedujejo nujne encimske in neencimske komponente za obdelavo miRNA, kot sta npr. encima Drosha in Dicer (Pollak, Cooper-White, in Macdonald 2021).

== '''Viri'''==
Dalchau, Neil idr. 2018. „Computing with biological switches and clocks“. Natural Computing.

Gong, Li Li, Li Da Du, in Guan Hua Du. 2018. „Theophylline“. V Natural Small Molecule Drugs from Plants,.

Mccown, Phillip J. idr. 2017. „Riboswitch diversity and distribution“. RNA.

Pollak, Nina M., Justin J. Cooper-White, in Joanne Macdonald. 2021. „Translational control of enzyme scavenger expression with toxin-induced micro RNA switches“. Scientific Reports.

Translacijski nadzor izražanja encima odstranjevalca preko s toksinom induciranega miRNA stikala

2021-05-17T21:15:57Z

Ernestinalavrih:

''Povzeto po članku:'' [https://www.nature.com/articles/s41598-021-81679-6 Pollak, Nina M., Justin J. Cooper-White, in Joanne Macdonald. 2021. „Translational control of enzyme scavenger expression with toxin-induced micro RNA switches“. Scientific Reports.]

== '''Uvod''' ==
Sinetzna biologija se je izkazala kot primerna tehnika za uporabo na prokariontskih celicah, medtem ko uporaba na evkariontskih organizmih peša. Do sedaj so identificirali le en tip ribostikala oz. ribosomskega stikala (tiamin pirofosfat), ki je primeren za evkariontske celice, medtem ko pri prokariontskih poznamo preko 40 različnih tipov takšnih stikal (Mccown idr. 2017). Na ravni evkariontske transkripcije poročajo predvsem o regulaciji preko modificiranih promotorjev, ki sodelujejo pri prepisu (Dalchau idr. 2018). Na postranskripcijski ravni pa se v študijah načeloma odločajo za regulacijo in kontrolo preko mikro-RNA. miRNA so endogene, enoverižne RNA, ki uravnavajo izražanje genov in so pomembne pri številnih fizioloških in patoloških procesih kot so celična rast, diferenciacija, razvoj in apoptoza. Zaradi napisanega predstavljajo odlične kandidate za načrtovanje stikal; orodij sintezne biologije za gensko regulacijo in posledično aplikacijo pri višjih evkariontih (Pollak, Cooper-White, in Macdonald 2021).

V izbrani študiji so za aplikacijo detoksifikacijskih orodij sintezne biologije za terapevtske namene uporabili miRNA stikalo. To uravnava izražanje encima odstranjevalca oz. čistilca (angl. scavenger) v prisotnosti določene toksične male molekule. V opisani študiji je bil za prikaz koncepta encima odstranjevalca izbran citokrom P450 1A2 (kasneje imenovan CYP1A2). Znano je, da naddružina citokromov P450 igra pomembno vlogo pri zmanjševanju škodljivih vplivov različnih toksinov. Presnavljajo približno 60 % farmacevtskih spojin, citokrom P450 1A2 pa metabolizira razne farmacevtsko pomembne učinkovine, med drugim večino teofilina, ki se uporablja za zdravljenje vseh oblik astme, kroničnega obstruktivnega bronhitisa, pljučnega emfizema in pljučne hipertenzije (Gong, Du, in Du 2018). V študiji so za delovanje miRNA stikala uporabili visoko specifičen aptamer, ki se je z visoko afiniteto vezal na teofilin.

== '''Rezultati''' ==
== Kontrola znotrajcelične aktivacije encima odstranjevalca ==
V raziskavi so izkoristili že obstoječi celični interferenčni sistem in načrtovali miRNA stikalo, ki s svojim delovanjem prilagaja izražanje encima CYP1A2. Za izvedbo eksperimenta je bila uporabljena celična linija HEK-293. Utišanje gena CYP1A2 je povzročila miRNA, ki ima v svojo sekvenco vgrajen aptamer, ki se sicer veže na toksin (teofilin). Če je teofilin prisoten, se aptamer nanj veže, spremeni se sekundarna struktura miRNA, s čimer se primarno miRNA zamaskira, da ne pride do encimske predelave (ki jo sicer izvede proteinski kompleks Drosha) do prekurzorske miRNA. Rezultat tega je povečano izražanje encima CYP1A2. Encimsko aktivnost CYP1A2 so v študiji posredno merili preko detekcije luciferina. Encim CYP1A2 pretvori dodan substrat luciferin-1A2 v prekurzor luciferina, ki se s pomočjo D-cisteina (ki je prisoten v detekcijskem reagentu in dodan celicam) pretovri v luciferin, ki omogoči sistem za enostavno odčitavanje encimske aktivnosti.
Pri identifikaciji miRNA sekvenc za regulacijo izražanja CYP1A2 so v študiji s pomočjo osnovnih pravil in navodil za načrtovanje miRNA najprej skonstruirali 5 različnih sekvenc, ki ciljajo CYP1A2 (miR-30a-C). Na podlagi teh so osnovali miRNA stikala, ki so bila zaradi dodane sekvence aptamera odzivna na teofilin (miR-30a-CT). Nadalje so iz podatkovnih baz ''miRbase'' in ''miRWalk Version 3'' pridobili v naravi že obstoječo miRNA (miR-378a) in jo z integracijo sekvence aptamera v osrednji del modificirali v miRNA stikalo (miR-378a-CT).

== Utišanje izražanja CYP1A2 z miRNA ==
Po vzpostavitvi optimalnega izražanja encima CYP1A2 v uporabljenih HEK-293 celični liniji so preučevali sposobnost utišanja izražanja s strani prej opisanih miRNA sekvenc. 3 od 5 načrtovanih miRNA (miR-30a-C-45, 325 in 544) so uspele statistično značilno znižati luminiscenčno aktivnost (na od 38 % do 51 % preostanek aktivnosti). Prav tako se je izkazal, da že v naravi obstoječa miRNA (miR-378a) statistično značilno zniža aktivnost encima CYP1A2 (27 % preostanka luminiscenčne aktivnosti v primerjavi z ne utišano aktivnostjo). S tem so potrdili uspešnost sistema za načrtovanja miRNA s pomočjo baz podatkov, ki hranijo sekvence v naravi obstoječih miRNA. S tem se v prihodnje želi nadomesti načrtovanje več različnih sintetičnih miRNA z identifikacijo le ene, v naravni že prisotne miRNA.

== Kontrola sinteze encima CYP1A2 z miRNA stikali, ki se odzivajo na toksin ==
Za nadaljnjo raziskavo določanja učinkovitosti miRNA stikal (miR-30a-CT in miR-378a-CT), ki se odzivajo na teofilin, sta bili izbrani 2 sekvenci miRNA, ki sta najučinkoviteje utišali izražanje CYP1A2 (miR-30a-C-325 in miR-378a-C). Z različnimi koncentracijami teofilina (0-10 mM) so preko znotrajcelične aktivnosti encima odstranjevalca ocenili sposobnost regulacije z miRNA stikali. Pričakovano so se na prisotnost teofilina odzvala samo miRNA stikala z integrirano sekvenco aptamera za teofilin (miRNA-CT) in inducirala encimsko aktivnost CYP1A2, ki je bila merjena preko luminiscence. V odsotnosti teofilina so miRNA stikala prav tako pričakovano povzročila nižjo aktivnost encima odstranjevalca (preostala aktivnosti 36 % - 40 % ). V prisotnosti teofilina so opazili statistično značilno povečanje (1,8 x) aktivnosti encima CYP1A2 v celicah, ki so vsebovale miRNA s sekvenco aptamera za teofilin (miR-30a-CT) v primerjavi s celicami z miRNA brez sekvence za aptamer (miR-30a-C).

== Časovno odvisna kontrola izražanja CYP1A2 ==
Po vzpostavitvi aktivacije CYP1A2 z miRNA stikalom so v študiji raziskali dinamične lastnosti izbranih stikal. Celice s plazmidi z miRNA stikali so 2 dni inkubairali v prisotnosti 2 mM teofilina, da so teofilin odzivna miRNA stikala prešla v vklopljeno stanje (angl. on). Sledila je odstranitev teofilina in ponovno 2 dnevna inkubacija, da so stikala prešla v izklopljeno stanje (angl. off). Po odstranitvi teofilina je prišlo do znižanja izražanja encima odstranjevalca, kar dokazuje, da so uporabljena miRNA stikala reverzibilna. Večje znižanje encimske aktivnosti (- 29 %) je bilo opaženo pri uporabi naravno prisotne miRNA (miR- 378-CT) v primerjavi s sintetično načrtovano miRNA (miR-30a-CT) (- 11 %).

== '''Zaključki'''==
V opisani študiji so dokazali, da lahko izvajajo kontrolo izražanja encimov odstranjevalcev z uporabo regulatornega sistema na osnovi miRNA stikal, ki se odzivajo na prisotne toksine. Rezultati prikazujejo, da postranskripcijska regulacija genov z miRNA stikali lahko producira detoksifikacijsko funkcijo, ki temelji na znotrajceličnem molekularnem dogodku. Predvidevajo, da ima imenovana detoksifikacijska funkcija v prihodnosti lahko širok spekter uporabe; v personalizirani medicini, spremljanju stanja v okolju, obrambi pred onesnaženjem ...

Kontrola izražanja genov na molekularnem nivoju je ključno orodje za bioračunalništvo in bioinformatiko in z miRNA stikali inducirana translacijska kontrola predstavlja dober sistem za izvajanje takšnega nadzora pri evkariontih. Prednost programiranja celičnih funkcij z omenjenim sistemom je predvsem v hitrem odzivnem času na zunanje signale (npr. toksine).

Znano je, da so sekundarne strukture - zanke na koncih miRNA – ključne za regulacijsko delovanje molekule. V študiji so se zato odločili, da sekvenco aptamera za teofilin vstavijo v osrednji del miRNA in se s tem izognejo poseganju v ohranjeneno območje končnih zank. Dodatek male molekule, v tem primeru teofilina, onemogoči kasnejše procesiranje in obdelavo miRNA. Domnevajo, da je to posledica strukturnih sprememb, ki onemogočijo obdelavo s strani encimskih kompleksov Drosha in Dicer, kar prepreči nastanek kompleksa RISC z zrelo miRNA.

Omenjen sistem, ki temelji na miRNA, lahko v vklopljenjem stanju (angl. on) spodbudi izražanje genov blizu njihovega maksimuma izražanja, medtem ko v izklopljenem stanju (angl. off) prihaja do ti. puščanja, kar se kaže v večjem ali manjšem izražanju genov, ki ni enak ničelnemu izražanju. V primeru umetno vgrajenega stikala, ki se odziva na teofilin in pomaga pri detoksifikaciji pacienta, bi se to kazalo v določenih koncentracijah encima CYP1A2, sintetiziranega v neaktivnem oz. izklopljenem stanju stikala, kar v študiji imenujejo puščanje (angl. leakage). Te majhne koncentracije bi sicer lahko okrepile naravno aktivnost encimov naddružine citokromov P450 v jetrih. V primeru, da bi bil pacient zaradi nujnega zdravljenja astme izpostavljen toksičnim koncentracijam teofilina [> 100 μM], bi se vgrajeno stikalo aktiviralo in povečalo detoksifikacijsko funkcijo in poskreblo za hitrejše razstrupljanje telesa.

Rezultati študije so potrdili, da je evolucijsko zasnovana miRNA (ta, ki je v naravi že prisotna) pri encimski aktivaciji v prisotnosti induktorja (v obliki toksina) učinkovitejša kot sintetično načrtovane različice miRNA. Iskanje že obstoječih in v naravi prisotnih miRNA je preposto, saj temelji na brezplačnih spletnih bazah podatkov in orodjih za predikcijo. miRNA-378a, ki je bila iz baz podatkov izbrana v tej raziskavi, je med različnimi vrstami sesalcev zelo ohranjena (vključno z ljudmi, mišmi in podganami) in bi zato moral delovati v različnih sesalčjih celicah. V članku predvidevajo, da naj bi sistem miRNA stikal deloval pri vseh vrstah, ki posedujejo nujne encimske in neencimske komponente za obdelavo miRNA, kot sta npr. encima Drosha in Dicer (Pollak, Cooper-White, in Macdonald 2021).

== '''Viri'''==
Dalchau, Neil idr. 2018. „Computing with biological switches and clocks“. Natural Computing.

Gong, Li Li, Li Da Du, in Guan Hua Du. 2018. „Theophylline“. V Natural Small Molecule Drugs from Plants,.

Mccown, Phillip J. idr. 2017. „Riboswitch diversity and distribution“. RNA.

Pollak, Nina M., Justin J. Cooper-White, in Joanne Macdonald. 2021. „Translational control of enzyme scavenger expression with toxin-induced micro RNA switches“. Scientific Reports.

Translacijski nadzor izražanja encima odstranjevalca preko s toksinom induciranega miRNA stikala

2021-05-17T21:15:26Z

Ernestinalavrih: /* Zaključki */

''Povzeto po članku:'' [https://www.nature.com/articles/s41598-021-81679-6]

== '''Uvod''' ==
Sinetzna biologija se je izkazala kot primerna tehnika za uporabo na prokariontskih celicah, medtem ko uporaba na evkariontskih organizmih peša. Do sedaj so identificirali le en tip ribostikala oz. ribosomskega stikala (tiamin pirofosfat), ki je primeren za evkariontske celice, medtem ko pri prokariontskih poznamo preko 40 različnih tipov takšnih stikal (Mccown idr. 2017). Na ravni evkariontske transkripcije poročajo predvsem o regulaciji preko modificiranih promotorjev, ki sodelujejo pri prepisu (Dalchau idr. 2018). Na postranskripcijski ravni pa se v študijah načeloma odločajo za regulacijo in kontrolo preko mikro-RNA. miRNA so endogene, enoverižne RNA, ki uravnavajo izražanje genov in so pomembne pri številnih fizioloških in patoloških procesih kot so celična rast, diferenciacija, razvoj in apoptoza. Zaradi napisanega predstavljajo odlične kandidate za načrtovanje stikal; orodij sintezne biologije za gensko regulacijo in posledično aplikacijo pri višjih evkariontih (Pollak, Cooper-White, in Macdonald 2021).

V izbrani študiji so za aplikacijo detoksifikacijskih orodij sintezne biologije za terapevtske namene uporabili miRNA stikalo. To uravnava izražanje encima odstranjevalca oz. čistilca (angl. scavenger) v prisotnosti določene toksične male molekule. V opisani študiji je bil za prikaz koncepta encima odstranjevalca izbran citokrom P450 1A2 (kasneje imenovan CYP1A2). Znano je, da naddružina citokromov P450 igra pomembno vlogo pri zmanjševanju škodljivih vplivov različnih toksinov. Presnavljajo približno 60 % farmacevtskih spojin, citokrom P450 1A2 pa metabolizira razne farmacevtsko pomembne učinkovine, med drugim večino teofilina, ki se uporablja za zdravljenje vseh oblik astme, kroničnega obstruktivnega bronhitisa, pljučnega emfizema in pljučne hipertenzije (Gong, Du, in Du 2018). V študiji so za delovanje miRNA stikala uporabili visoko specifičen aptamer, ki se je z visoko afiniteto vezal na teofilin.

== '''Rezultati''' ==
== Kontrola znotrajcelične aktivacije encima odstranjevalca ==
V raziskavi so izkoristili že obstoječi celični interferenčni sistem in načrtovali miRNA stikalo, ki s svojim delovanjem prilagaja izražanje encima CYP1A2. Za izvedbo eksperimenta je bila uporabljena celična linija HEK-293. Utišanje gena CYP1A2 je povzročila miRNA, ki ima v svojo sekvenco vgrajen aptamer, ki se sicer veže na toksin (teofilin). Če je teofilin prisoten, se aptamer nanj veže, spremeni se sekundarna struktura miRNA, s čimer se primarno miRNA zamaskira, da ne pride do encimske predelave (ki jo sicer izvede proteinski kompleks Drosha) do prekurzorske miRNA. Rezultat tega je povečano izražanje encima CYP1A2. Encimsko aktivnost CYP1A2 so v študiji posredno merili preko detekcije luciferina. Encim CYP1A2 pretvori dodan substrat luciferin-1A2 v prekurzor luciferina, ki se s pomočjo D-cisteina (ki je prisoten v detekcijskem reagentu in dodan celicam) pretovri v luciferin, ki omogoči sistem za enostavno odčitavanje encimske aktivnosti.
Pri identifikaciji miRNA sekvenc za regulacijo izražanja CYP1A2 so v študiji s pomočjo osnovnih pravil in navodil za načrtovanje miRNA najprej skonstruirali 5 različnih sekvenc, ki ciljajo CYP1A2 (miR-30a-C). Na podlagi teh so osnovali miRNA stikala, ki so bila zaradi dodane sekvence aptamera odzivna na teofilin (miR-30a-CT). Nadalje so iz podatkovnih baz ''miRbase'' in ''miRWalk Version 3'' pridobili v naravi že obstoječo miRNA (miR-378a) in jo z integracijo sekvence aptamera v osrednji del modificirali v miRNA stikalo (miR-378a-CT).

== Utišanje izražanja CYP1A2 z miRNA ==
Po vzpostavitvi optimalnega izražanja encima CYP1A2 v uporabljenih HEK-293 celični liniji so preučevali sposobnost utišanja izražanja s strani prej opisanih miRNA sekvenc. 3 od 5 načrtovanih miRNA (miR-30a-C-45, 325 in 544) so uspele statistično značilno znižati luminiscenčno aktivnost (na od 38 % do 51 % preostanek aktivnosti). Prav tako se je izkazal, da že v naravi obstoječa miRNA (miR-378a) statistično značilno zniža aktivnost encima CYP1A2 (27 % preostanka luminiscenčne aktivnosti v primerjavi z ne utišano aktivnostjo). S tem so potrdili uspešnost sistema za načrtovanja miRNA s pomočjo baz podatkov, ki hranijo sekvence v naravi obstoječih miRNA. S tem se v prihodnje želi nadomesti načrtovanje več različnih sintetičnih miRNA z identifikacijo le ene, v naravni že prisotne miRNA.

== Kontrola sinteze encima CYP1A2 z miRNA stikali, ki se odzivajo na toksin ==
Za nadaljnjo raziskavo določanja učinkovitosti miRNA stikal (miR-30a-CT in miR-378a-CT), ki se odzivajo na teofilin, sta bili izbrani 2 sekvenci miRNA, ki sta najučinkoviteje utišali izražanje CYP1A2 (miR-30a-C-325 in miR-378a-C). Z različnimi koncentracijami teofilina (0-10 mM) so preko znotrajcelične aktivnosti encima odstranjevalca ocenili sposobnost regulacije z miRNA stikali. Pričakovano so se na prisotnost teofilina odzvala samo miRNA stikala z integrirano sekvenco aptamera za teofilin (miRNA-CT) in inducirala encimsko aktivnost CYP1A2, ki je bila merjena preko luminiscence. V odsotnosti teofilina so miRNA stikala prav tako pričakovano povzročila nižjo aktivnost encima odstranjevalca (preostala aktivnosti 36 % - 40 % ). V prisotnosti teofilina so opazili statistično značilno povečanje (1,8 x) aktivnosti encima CYP1A2 v celicah, ki so vsebovale miRNA s sekvenco aptamera za teofilin (miR-30a-CT) v primerjavi s celicami z miRNA brez sekvence za aptamer (miR-30a-C).

== Časovno odvisna kontrola izražanja CYP1A2 ==
Po vzpostavitvi aktivacije CYP1A2 z miRNA stikalom so v študiji raziskali dinamične lastnosti izbranih stikal. Celice s plazmidi z miRNA stikali so 2 dni inkubairali v prisotnosti 2 mM teofilina, da so teofilin odzivna miRNA stikala prešla v vklopljeno stanje (angl. on). Sledila je odstranitev teofilina in ponovno 2 dnevna inkubacija, da so stikala prešla v izklopljeno stanje (angl. off). Po odstranitvi teofilina je prišlo do znižanja izražanja encima odstranjevalca, kar dokazuje, da so uporabljena miRNA stikala reverzibilna. Večje znižanje encimske aktivnosti (- 29 %) je bilo opaženo pri uporabi naravno prisotne miRNA (miR- 378-CT) v primerjavi s sintetično načrtovano miRNA (miR-30a-CT) (- 11 %).

== '''Zaključki'''==
V opisani študiji so dokazali, da lahko izvajajo kontrolo izražanja encimov odstranjevalcev z uporabo regulatornega sistema na osnovi miRNA stikal, ki se odzivajo na prisotne toksine. Rezultati prikazujejo, da postranskripcijska regulacija genov z miRNA stikali lahko producira detoksifikacijsko funkcijo, ki temelji na znotrajceličnem molekularnem dogodku. Predvidevajo, da ima imenovana detoksifikacijska funkcija v prihodnosti lahko širok spekter uporabe; v personalizirani medicini, spremljanju stanja v okolju, obrambi pred onesnaženjem ...

Kontrola izražanja genov na molekularnem nivoju je ključno orodje za bioračunalništvo in bioinformatiko in z miRNA stikali inducirana translacijska kontrola predstavlja dober sistem za izvajanje takšnega nadzora pri evkariontih. Prednost programiranja celičnih funkcij z omenjenim sistemom je predvsem v hitrem odzivnem času na zunanje signale (npr. toksine).

Znano je, da so sekundarne strukture - zanke na koncih miRNA – ključne za regulacijsko delovanje molekule. V študiji so se zato odločili, da sekvenco aptamera za teofilin vstavijo v osrednji del miRNA in se s tem izognejo poseganju v ohranjeneno območje končnih zank. Dodatek male molekule, v tem primeru teofilina, onemogoči kasnejše procesiranje in obdelavo miRNA. Domnevajo, da je to posledica strukturnih sprememb, ki onemogočijo obdelavo s strani encimskih kompleksov Drosha in Dicer, kar prepreči nastanek kompleksa RISC z zrelo miRNA.

Omenjen sistem, ki temelji na miRNA, lahko v vklopljenjem stanju (angl. on) spodbudi izražanje genov blizu njihovega maksimuma izražanja, medtem ko v izklopljenem stanju (angl. off) prihaja do ti. puščanja, kar se kaže v večjem ali manjšem izražanju genov, ki ni enak ničelnemu izražanju. V primeru umetno vgrajenega stikala, ki se odziva na teofilin in pomaga pri detoksifikaciji pacienta, bi se to kazalo v določenih koncentracijah encima CYP1A2, sintetiziranega v neaktivnem oz. izklopljenem stanju stikala, kar v študiji imenujejo puščanje (angl. leakage). Te majhne koncentracije bi sicer lahko okrepile naravno aktivnost encimov naddružine citokromov P450 v jetrih. V primeru, da bi bil pacient zaradi nujnega zdravljenja astme izpostavljen toksičnim koncentracijam teofilina [> 100 μM], bi se vgrajeno stikalo aktiviralo in povečalo detoksifikacijsko funkcijo in poskreblo za hitrejše razstrupljanje telesa.

Rezultati študije so potrdili, da je evolucijsko zasnovana miRNA (ta, ki je v naravi že prisotna) pri encimski aktivaciji v prisotnosti induktorja (v obliki toksina) učinkovitejša kot sintetično načrtovane različice miRNA. Iskanje že obstoječih in v naravi prisotnih miRNA je preposto, saj temelji na brezplačnih spletnih bazah podatkov in orodjih za predikcijo. miRNA-378a, ki je bila iz baz podatkov izbrana v tej raziskavi, je med različnimi vrstami sesalcev zelo ohranjena (vključno z ljudmi, mišmi in podganami) in bi zato moral delovati v različnih sesalčjih celicah. V članku predvidevajo, da naj bi sistem miRNA stikal deloval pri vseh vrstah, ki posedujejo nujne encimske in neencimske komponente za obdelavo miRNA, kot sta npr. encima Drosha in Dicer (Pollak, Cooper-White, in Macdonald 2021).

== '''Viri'''==
Dalchau, Neil idr. 2018. „Computing with biological switches and clocks“. Natural Computing.

Gong, Li Li, Li Da Du, in Guan Hua Du. 2018. „Theophylline“. V Natural Small Molecule Drugs from Plants,.

Mccown, Phillip J. idr. 2017. „Riboswitch diversity and distribution“. RNA.

Pollak, Nina M., Justin J. Cooper-White, in Joanne Macdonald. 2021. „Translational control of enzyme scavenger expression with toxin-induced micro RNA switches“. Scientific Reports.

Translacijski nadzor izražanja encima odstranjevalca preko s toksinom induciranega miRNA stikala

2021-05-17T21:15:00Z

Ernestinalavrih: /* Uvod */

''Povzeto po članku:'' [https://www.nature.com/articles/s41598-021-81679-6]

== '''Uvod''' ==
Sinetzna biologija se je izkazala kot primerna tehnika za uporabo na prokariontskih celicah, medtem ko uporaba na evkariontskih organizmih peša. Do sedaj so identificirali le en tip ribostikala oz. ribosomskega stikala (tiamin pirofosfat), ki je primeren za evkariontske celice, medtem ko pri prokariontskih poznamo preko 40 različnih tipov takšnih stikal (Mccown idr. 2017). Na ravni evkariontske transkripcije poročajo predvsem o regulaciji preko modificiranih promotorjev, ki sodelujejo pri prepisu (Dalchau idr. 2018). Na postranskripcijski ravni pa se v študijah načeloma odločajo za regulacijo in kontrolo preko mikro-RNA. miRNA so endogene, enoverižne RNA, ki uravnavajo izražanje genov in so pomembne pri številnih fizioloških in patoloških procesih kot so celična rast, diferenciacija, razvoj in apoptoza. Zaradi napisanega predstavljajo odlične kandidate za načrtovanje stikal; orodij sintezne biologije za gensko regulacijo in posledično aplikacijo pri višjih evkariontih (Pollak, Cooper-White, in Macdonald 2021).

V izbrani študiji so za aplikacijo detoksifikacijskih orodij sintezne biologije za terapevtske namene uporabili miRNA stikalo. To uravnava izražanje encima odstranjevalca oz. čistilca (angl. scavenger) v prisotnosti določene toksične male molekule. V opisani študiji je bil za prikaz koncepta encima odstranjevalca izbran citokrom P450 1A2 (kasneje imenovan CYP1A2). Znano je, da naddružina citokromov P450 igra pomembno vlogo pri zmanjševanju škodljivih vplivov različnih toksinov. Presnavljajo približno 60 % farmacevtskih spojin, citokrom P450 1A2 pa metabolizira razne farmacevtsko pomembne učinkovine, med drugim večino teofilina, ki se uporablja za zdravljenje vseh oblik astme, kroničnega obstruktivnega bronhitisa, pljučnega emfizema in pljučne hipertenzije (Gong, Du, in Du 2018). V študiji so za delovanje miRNA stikala uporabili visoko specifičen aptamer, ki se je z visoko afiniteto vezal na teofilin.

== '''Rezultati''' ==
== Kontrola znotrajcelične aktivacije encima odstranjevalca ==
V raziskavi so izkoristili že obstoječi celični interferenčni sistem in načrtovali miRNA stikalo, ki s svojim delovanjem prilagaja izražanje encima CYP1A2. Za izvedbo eksperimenta je bila uporabljena celična linija HEK-293. Utišanje gena CYP1A2 je povzročila miRNA, ki ima v svojo sekvenco vgrajen aptamer, ki se sicer veže na toksin (teofilin). Če je teofilin prisoten, se aptamer nanj veže, spremeni se sekundarna struktura miRNA, s čimer se primarno miRNA zamaskira, da ne pride do encimske predelave (ki jo sicer izvede proteinski kompleks Drosha) do prekurzorske miRNA. Rezultat tega je povečano izražanje encima CYP1A2. Encimsko aktivnost CYP1A2 so v študiji posredno merili preko detekcije luciferina. Encim CYP1A2 pretvori dodan substrat luciferin-1A2 v prekurzor luciferina, ki se s pomočjo D-cisteina (ki je prisoten v detekcijskem reagentu in dodan celicam) pretovri v luciferin, ki omogoči sistem za enostavno odčitavanje encimske aktivnosti.
Pri identifikaciji miRNA sekvenc za regulacijo izražanja CYP1A2 so v študiji s pomočjo osnovnih pravil in navodil za načrtovanje miRNA najprej skonstruirali 5 različnih sekvenc, ki ciljajo CYP1A2 (miR-30a-C). Na podlagi teh so osnovali miRNA stikala, ki so bila zaradi dodane sekvence aptamera odzivna na teofilin (miR-30a-CT). Nadalje so iz podatkovnih baz ''miRbase'' in ''miRWalk Version 3'' pridobili v naravi že obstoječo miRNA (miR-378a) in jo z integracijo sekvence aptamera v osrednji del modificirali v miRNA stikalo (miR-378a-CT).

== Utišanje izražanja CYP1A2 z miRNA ==
Po vzpostavitvi optimalnega izražanja encima CYP1A2 v uporabljenih HEK-293 celični liniji so preučevali sposobnost utišanja izražanja s strani prej opisanih miRNA sekvenc. 3 od 5 načrtovanih miRNA (miR-30a-C-45, 325 in 544) so uspele statistično značilno znižati luminiscenčno aktivnost (na od 38 % do 51 % preostanek aktivnosti). Prav tako se je izkazal, da že v naravi obstoječa miRNA (miR-378a) statistično značilno zniža aktivnost encima CYP1A2 (27 % preostanka luminiscenčne aktivnosti v primerjavi z ne utišano aktivnostjo). S tem so potrdili uspešnost sistema za načrtovanja miRNA s pomočjo baz podatkov, ki hranijo sekvence v naravi obstoječih miRNA. S tem se v prihodnje želi nadomesti načrtovanje več različnih sintetičnih miRNA z identifikacijo le ene, v naravni že prisotne miRNA.

== Kontrola sinteze encima CYP1A2 z miRNA stikali, ki se odzivajo na toksin ==
Za nadaljnjo raziskavo določanja učinkovitosti miRNA stikal (miR-30a-CT in miR-378a-CT), ki se odzivajo na teofilin, sta bili izbrani 2 sekvenci miRNA, ki sta najučinkoviteje utišali izražanje CYP1A2 (miR-30a-C-325 in miR-378a-C). Z različnimi koncentracijami teofilina (0-10 mM) so preko znotrajcelične aktivnosti encima odstranjevalca ocenili sposobnost regulacije z miRNA stikali. Pričakovano so se na prisotnost teofilina odzvala samo miRNA stikala z integrirano sekvenco aptamera za teofilin (miRNA-CT) in inducirala encimsko aktivnost CYP1A2, ki je bila merjena preko luminiscence. V odsotnosti teofilina so miRNA stikala prav tako pričakovano povzročila nižjo aktivnost encima odstranjevalca (preostala aktivnosti 36 % - 40 % ). V prisotnosti teofilina so opazili statistično značilno povečanje (1,8 x) aktivnosti encima CYP1A2 v celicah, ki so vsebovale miRNA s sekvenco aptamera za teofilin (miR-30a-CT) v primerjavi s celicami z miRNA brez sekvence za aptamer (miR-30a-C).

== Časovno odvisna kontrola izražanja CYP1A2 ==
Po vzpostavitvi aktivacije CYP1A2 z miRNA stikalom so v študiji raziskali dinamične lastnosti izbranih stikal. Celice s plazmidi z miRNA stikali so 2 dni inkubairali v prisotnosti 2 mM teofilina, da so teofilin odzivna miRNA stikala prešla v vklopljeno stanje (angl. on). Sledila je odstranitev teofilina in ponovno 2 dnevna inkubacija, da so stikala prešla v izklopljeno stanje (angl. off). Po odstranitvi teofilina je prišlo do znižanja izražanja encima odstranjevalca, kar dokazuje, da so uporabljena miRNA stikala reverzibilna. Večje znižanje encimske aktivnosti (- 29 %) je bilo opaženo pri uporabi naravno prisotne miRNA (miR- 378-CT) v primerjavi s sintetično načrtovano miRNA (miR-30a-CT) (- 11 %).

== '''Zaključki'''==
V opisani študiji so dokazali, da lahko izvajajo kontrolo izražanja encimov odstranjevalcev z uporabo regulatornega sistema na osnovi miRNA stikal, ki se odzivajo na prisotne toksine. Rezultati prikazujejo, da postranskripcijska regulacija genov z miRNA stikali lahko producira detoksifikacijsko funkcijo, ki temelji na znotrajceličnem molekularnem dogodku. Predvidevajo, da ima imenovana detoksifikacijska funkcija v prihodnosti lahko širok spekter uporabe; v personalizirani medicini, spremljanju stanja v okolju, obrambi pred onesnaženjem ...
Kontrola izražanja genov na molekularnem nivoju je ključno orodje za bioračunalništvo in bioinformatiko in z miRNA stikali inducirana translacijska kontrola predstavlja dober sistem za izvajanje takšnega nadzora pri evkariontih. Prednost programiranja celičnih funkcij z omenjenim sistemom je predvsem v hitrem odzivnem času na zunanje signale (npr. toksine).
Znano je, da so sekundarne strukture - zanke na koncih miRNA – ključne za regulacijsko delovanje molekule. V študiji so se zato odločili, da sekvenco aptamera za teofilin vstavijo v osrednji del miRNA in se s tem izognejo poseganju v ohranjeneno območje končnih zank. Dodatek male molekule, v tem primeru teofilina, onemogoči kasnejše procesiranje in obdelavo miRNA. Domnevajo, da je to posledica strukturnih sprememb, ki onemogočijo obdelavo s strani encimskih kompleksov Drosha in Dicer, kar prepreči nastanek kompleksa RISC z zrelo miRNA.
Omenjen sistem, ki temelji na miRNA, lahko v vklopljenjem stanju (angl. on) spodbudi izražanje genov blizu njihovega maksimuma izražanja, medtem ko v izklopljenem stanju (angl. off) prihaja do ti. puščanja, kar se kaže v večjem ali manjšem izražanju genov, ki ni enak ničelnemu izražanju. V primeru umetno vgrajenega stikala, ki se odziva na teofilin in pomaga pri detoksifikaciji pacienta, bi se to kazalo v določenih koncentracijah encima CYP1A2, sintetiziranega v neaktivnem oz. izklopljenem stanju stikala, kar v študiji imenujejo puščanje (angl. leakage). Te majhne koncentracije bi sicer lahko okrepile naravno aktivnost encimov naddružine citokromov P450 v jetrih. V primeru, da bi bil pacient zaradi nujnega zdravljenja astme izpostavljen toksičnim koncentracijam teofilina [> 100 μM], bi se vgrajeno stikalo aktiviralo in povečalo detoksifikacijsko funkcijo in poskreblo za hitrejše razstrupljanje telesa.
Rezultati študije so potrdili, da je evolucijsko zasnovana miRNA (ta, ki je v naravi že prisotna) pri encimski aktivaciji v prisotnosti induktorja (v obliki toksina) učinkovitejša kot sintetično načrtovane različice miRNA. Iskanje že obstoječih in v naravi prisotnih miRNA je preposto, saj temelji na brezplačnih spletnih bazah podatkov in orodjih za predikcijo. miRNA-378a, ki je bila iz baz podatkov izbrana v tej raziskavi, je med različnimi vrstami sesalcev zelo ohranjena (vključno z ljudmi, mišmi in podganami) in bi zato moral delovati v različnih sesalčjih celicah. V članku predvidevajo, da naj bi sistem miRNA stikal deloval pri vseh vrstah, ki posedujejo nujne encimske in neencimske komponente za obdelavo miRNA, kot sta npr. encima Drosha in Dicer (Pollak, Cooper-White, in Macdonald 2021).

== '''Viri'''==
Dalchau, Neil idr. 2018. „Computing with biological switches and clocks“. Natural Computing.

Gong, Li Li, Li Da Du, in Guan Hua Du. 2018. „Theophylline“. V Natural Small Molecule Drugs from Plants,.

Mccown, Phillip J. idr. 2017. „Riboswitch diversity and distribution“. RNA.

Pollak, Nina M., Justin J. Cooper-White, in Joanne Macdonald. 2021. „Translational control of enzyme scavenger expression with toxin-induced micro RNA switches“. Scientific Reports.

Translacijski nadzor izražanja encima odstranjevalca preko s toksinom induciranega miRNA stikala

2021-05-17T21:14:27Z

Ernestinalavrih: New page: ''Povzeto po članku:'' [https://www.nature.com/articles/s41598-021-81679-6] == '''Uvod''' == Sinetzna biologija se je izkazala kot primerna tehnika za uporabo na prokariontskih celicah, ...

''Povzeto po članku:'' [https://www.nature.com/articles/s41598-021-81679-6]

== '''Uvod''' ==
Sinetzna biologija se je izkazala kot primerna tehnika za uporabo na prokariontskih celicah, medtem ko uporaba na evkariontskih organizmih peša. Do sedaj so identificirali le en tip ribostikala oz. ribosomskega stikala (tiamin pirofosfat), ki je primeren za evkariontske celice, medtem ko pri prokariontskih poznamo preko 40 različnih tipov takšnih stikal (Mccown idr. 2017). Na ravni evkariontske transkripcije poročajo predvsem o regulaciji preko modificiranih promotorjev, ki sodelujejo pri prepisu (Dalchau idr. 2018). Na postranskripcijski ravni pa se v študijah načeloma odločajo za regulacijo in kontrolo preko mikro-RNA. miRNA so endogene, enoverižne RNA, ki uravnavajo izražanje genov in so pomembne pri številnih fizioloških in patoloških procesih kot so celična rast, diferenciacija, razvoj in apoptoza. Zaradi napisanega predstavljajo odlične kandidate za načrtovanje stikal; orodij sintezne biologije za gensko regulacijo in posledično aplikacijo pri višjih evkariontih (Pollak, Cooper-White, in Macdonald 2021).
V izbrani študiji so za aplikacijo detoksifikacijskih orodij sintezne biologije za terapevtske namene uporabili miRNA stikalo. To uravnava izražanje encima odstranjevalca oz. čistilca (angl. scavenger) v prisotnosti določene toksične male molekule. V opisani študiji je bil za prikaz koncepta encima odstranjevalca izbran citokrom P450 1A2 (kasneje imenovan CYP1A2). Znano je, da naddružina citokromov P450 igra pomembno vlogo pri zmanjševanju škodljivih vplivov različnih toksinov. Presnavljajo približno 60 % farmacevtskih spojin, citokrom P450 1A2 pa metabolizira razne farmacevtsko pomembne učinkovine, med drugim večino teofilina, ki se uporablja za zdravljenje vseh oblik astme, kroničnega obstruktivnega bronhitisa, pljučnega emfizema in pljučne hipertenzije (Gong, Du, in Du 2018). V študiji so za delovanje miRNA stikala uporabili visoko specifičen aptamer, ki se je z visoko afiniteto vezal na teofilin.

== '''Rezultati''' ==
== Kontrola znotrajcelične aktivacije encima odstranjevalca ==
V raziskavi so izkoristili že obstoječi celični interferenčni sistem in načrtovali miRNA stikalo, ki s svojim delovanjem prilagaja izražanje encima CYP1A2. Za izvedbo eksperimenta je bila uporabljena celična linija HEK-293. Utišanje gena CYP1A2 je povzročila miRNA, ki ima v svojo sekvenco vgrajen aptamer, ki se sicer veže na toksin (teofilin). Če je teofilin prisoten, se aptamer nanj veže, spremeni se sekundarna struktura miRNA, s čimer se primarno miRNA zamaskira, da ne pride do encimske predelave (ki jo sicer izvede proteinski kompleks Drosha) do prekurzorske miRNA. Rezultat tega je povečano izražanje encima CYP1A2. Encimsko aktivnost CYP1A2 so v študiji posredno merili preko detekcije luciferina. Encim CYP1A2 pretvori dodan substrat luciferin-1A2 v prekurzor luciferina, ki se s pomočjo D-cisteina (ki je prisoten v detekcijskem reagentu in dodan celicam) pretovri v luciferin, ki omogoči sistem za enostavno odčitavanje encimske aktivnosti.
Pri identifikaciji miRNA sekvenc za regulacijo izražanja CYP1A2 so v študiji s pomočjo osnovnih pravil in navodil za načrtovanje miRNA najprej skonstruirali 5 različnih sekvenc, ki ciljajo CYP1A2 (miR-30a-C). Na podlagi teh so osnovali miRNA stikala, ki so bila zaradi dodane sekvence aptamera odzivna na teofilin (miR-30a-CT). Nadalje so iz podatkovnih baz ''miRbase'' in ''miRWalk Version 3'' pridobili v naravi že obstoječo miRNA (miR-378a) in jo z integracijo sekvence aptamera v osrednji del modificirali v miRNA stikalo (miR-378a-CT).

== Utišanje izražanja CYP1A2 z miRNA ==
Po vzpostavitvi optimalnega izražanja encima CYP1A2 v uporabljenih HEK-293 celični liniji so preučevali sposobnost utišanja izražanja s strani prej opisanih miRNA sekvenc. 3 od 5 načrtovanih miRNA (miR-30a-C-45, 325 in 544) so uspele statistično značilno znižati luminiscenčno aktivnost (na od 38 % do 51 % preostanek aktivnosti). Prav tako se je izkazal, da že v naravi obstoječa miRNA (miR-378a) statistično značilno zniža aktivnost encima CYP1A2 (27 % preostanka luminiscenčne aktivnosti v primerjavi z ne utišano aktivnostjo). S tem so potrdili uspešnost sistema za načrtovanja miRNA s pomočjo baz podatkov, ki hranijo sekvence v naravi obstoječih miRNA. S tem se v prihodnje želi nadomesti načrtovanje več različnih sintetičnih miRNA z identifikacijo le ene, v naravni že prisotne miRNA.

== Kontrola sinteze encima CYP1A2 z miRNA stikali, ki se odzivajo na toksin ==
Za nadaljnjo raziskavo določanja učinkovitosti miRNA stikal (miR-30a-CT in miR-378a-CT), ki se odzivajo na teofilin, sta bili izbrani 2 sekvenci miRNA, ki sta najučinkoviteje utišali izražanje CYP1A2 (miR-30a-C-325 in miR-378a-C). Z različnimi koncentracijami teofilina (0-10 mM) so preko znotrajcelične aktivnosti encima odstranjevalca ocenili sposobnost regulacije z miRNA stikali. Pričakovano so se na prisotnost teofilina odzvala samo miRNA stikala z integrirano sekvenco aptamera za teofilin (miRNA-CT) in inducirala encimsko aktivnost CYP1A2, ki je bila merjena preko luminiscence. V odsotnosti teofilina so miRNA stikala prav tako pričakovano povzročila nižjo aktivnost encima odstranjevalca (preostala aktivnosti 36 % - 40 % ). V prisotnosti teofilina so opazili statistično značilno povečanje (1,8 x) aktivnosti encima CYP1A2 v celicah, ki so vsebovale miRNA s sekvenco aptamera za teofilin (miR-30a-CT) v primerjavi s celicami z miRNA brez sekvence za aptamer (miR-30a-C).

== Časovno odvisna kontrola izražanja CYP1A2 ==
Po vzpostavitvi aktivacije CYP1A2 z miRNA stikalom so v študiji raziskali dinamične lastnosti izbranih stikal. Celice s plazmidi z miRNA stikali so 2 dni inkubairali v prisotnosti 2 mM teofilina, da so teofilin odzivna miRNA stikala prešla v vklopljeno stanje (angl. on). Sledila je odstranitev teofilina in ponovno 2 dnevna inkubacija, da so stikala prešla v izklopljeno stanje (angl. off). Po odstranitvi teofilina je prišlo do znižanja izražanja encima odstranjevalca, kar dokazuje, da so uporabljena miRNA stikala reverzibilna. Večje znižanje encimske aktivnosti (- 29 %) je bilo opaženo pri uporabi naravno prisotne miRNA (miR- 378-CT) v primerjavi s sintetično načrtovano miRNA (miR-30a-CT) (- 11 %).

== '''Zaključki'''==
V opisani študiji so dokazali, da lahko izvajajo kontrolo izražanja encimov odstranjevalcev z uporabo regulatornega sistema na osnovi miRNA stikal, ki se odzivajo na prisotne toksine. Rezultati prikazujejo, da postranskripcijska regulacija genov z miRNA stikali lahko producira detoksifikacijsko funkcijo, ki temelji na znotrajceličnem molekularnem dogodku. Predvidevajo, da ima imenovana detoksifikacijska funkcija v prihodnosti lahko širok spekter uporabe; v personalizirani medicini, spremljanju stanja v okolju, obrambi pred onesnaženjem ...
Kontrola izražanja genov na molekularnem nivoju je ključno orodje za bioračunalništvo in bioinformatiko in z miRNA stikali inducirana translacijska kontrola predstavlja dober sistem za izvajanje takšnega nadzora pri evkariontih. Prednost programiranja celičnih funkcij z omenjenim sistemom je predvsem v hitrem odzivnem času na zunanje signale (npr. toksine).
Znano je, da so sekundarne strukture - zanke na koncih miRNA – ključne za regulacijsko delovanje molekule. V študiji so se zato odločili, da sekvenco aptamera za teofilin vstavijo v osrednji del miRNA in se s tem izognejo poseganju v ohranjeneno območje končnih zank. Dodatek male molekule, v tem primeru teofilina, onemogoči kasnejše procesiranje in obdelavo miRNA. Domnevajo, da je to posledica strukturnih sprememb, ki onemogočijo obdelavo s strani encimskih kompleksov Drosha in Dicer, kar prepreči nastanek kompleksa RISC z zrelo miRNA.
Omenjen sistem, ki temelji na miRNA, lahko v vklopljenjem stanju (angl. on) spodbudi izražanje genov blizu njihovega maksimuma izražanja, medtem ko v izklopljenem stanju (angl. off) prihaja do ti. puščanja, kar se kaže v večjem ali manjšem izražanju genov, ki ni enak ničelnemu izražanju. V primeru umetno vgrajenega stikala, ki se odziva na teofilin in pomaga pri detoksifikaciji pacienta, bi se to kazalo v določenih koncentracijah encima CYP1A2, sintetiziranega v neaktivnem oz. izklopljenem stanju stikala, kar v študiji imenujejo puščanje (angl. leakage). Te majhne koncentracije bi sicer lahko okrepile naravno aktivnost encimov naddružine citokromov P450 v jetrih. V primeru, da bi bil pacient zaradi nujnega zdravljenja astme izpostavljen toksičnim koncentracijam teofilina [> 100 μM], bi se vgrajeno stikalo aktiviralo in povečalo detoksifikacijsko funkcijo in poskreblo za hitrejše razstrupljanje telesa.
Rezultati študije so potrdili, da je evolucijsko zasnovana miRNA (ta, ki je v naravi že prisotna) pri encimski aktivaciji v prisotnosti induktorja (v obliki toksina) učinkovitejša kot sintetično načrtovane različice miRNA. Iskanje že obstoječih in v naravi prisotnih miRNA je preposto, saj temelji na brezplačnih spletnih bazah podatkov in orodjih za predikcijo. miRNA-378a, ki je bila iz baz podatkov izbrana v tej raziskavi, je med različnimi vrstami sesalcev zelo ohranjena (vključno z ljudmi, mišmi in podganami) in bi zato moral delovati v različnih sesalčjih celicah. V članku predvidevajo, da naj bi sistem miRNA stikal deloval pri vseh vrstah, ki posedujejo nujne encimske in neencimske komponente za obdelavo miRNA, kot sta npr. encima Drosha in Dicer (Pollak, Cooper-White, in Macdonald 2021).

== '''Viri'''==
Dalchau, Neil idr. 2018. „Computing with biological switches and clocks“. Natural Computing.

Gong, Li Li, Li Da Du, in Guan Hua Du. 2018. „Theophylline“. V Natural Small Molecule Drugs from Plants,.

Mccown, Phillip J. idr. 2017. „Riboswitch diversity and distribution“. RNA.

Pollak, Nina M., Justin J. Cooper-White, in Joanne Macdonald. 2021. „Translational control of enzyme scavenger expression with toxin-induced micro RNA switches“. Scientific Reports.

Seminarji SB 2020/21

2021-05-17T13:36:48Z

Ernestinalavrih:

[http://www.example.com link title]V študijskem letu 2020/21 študentje 1. letnika predstavljajo naslednje teme:

RAZISKOVALNI ČLANKI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) 

# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Proizvodnja_1,3-propandiola_iz_različnih_ogljikovodikov_po_nenaravni_poti_preko_3-hidroksipropanojske_kisline Proizvodnja 1,3-propandiola iz različnih ogljikovodikov po nenaravni poti preko 3-hidroksipropanojske kisline] (Liza Ulčakar) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Doseganje_asimetri%C4%8Dnosti_in_asimetri%C4%8Dne_delitve_pri_E._coli Doseganje asimetričnosti in asimetrične delitve pri E. coli] (Aljaž Bratina) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Zmanj%C5%A1ana_procesivnost_ribosomov_v_sistemu_PURE Zmanjšana procesivnost ribosomov v sistemu PURE] (Tina Kolenc Milavec) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Na%C4%8Drtovana_pot_zvijanja_proteinskih_origamijev Načrtovana pot zvijanja proteinskih origamijev] (Anamarija Agnič) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/U%C4%8Dinkovita_svetlobno_inducibilna_Dre_rekombinaza_za_%C4%8Dasovno_in_prostorsko_celi%C4%8Dno_specifi%C4%8Dno_urejanje_genoma_v_mi%C5%A1jih_modelih#VIRI Učinkovita svetlobno inducibilna Dre rekombinaza za časovno in prostorsko celično specifično urejanje genoma v mišjih modelih] (Nika Mikulič Vernik) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Vzpostavitev_termometra_tRNA_za_dolo%C4%8Danje_temperature_optimalne_rasti_mikroorganizmov Vzpostavitev termometra tRNA za določanje temperature optimalne rasti mikroorganizmov] (Urša Štrancar) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Racionalna_zasnova_minimalnih_sinteti%C4%8Dnih_promotorjev_za_rastline#Construction_of_plasmids Racionalna zasnova minimalnih sintetičnih promotorjev za rastline] (Almina Tahirović) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Reverzibilna_toplotna_regulacija_za_bifunkcionalno_dinamično_uravnavanje_izražanja_genov_v_E._coli Reverzibilna toplotna regulacija za bifunkcionalno dinamično uravnavanje izražanja genov v E. coli] (Urška Fajdiga) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sinteti%C4%8Dna_optogenetska_naprava_na_osnovi_BRET_za_pulzirajo%C4%8Do_ekspresijo_transgena%2C_ki_omogo%C4%8Da_glukozno_homeostazo_pri_mi%C5%A1ih Sintetična optogenetska naprava na osnovi BRET za pulzirajočo ekspresijo transgena, ki omogoča glukozno homeostazo pri miših] (Paula Horvat) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Hkratna_karakterizacija_več_različnih_racionalno_načrtovanih_promotorskih_arhitektur Vpogled v kombinatorno logiko z IPTG induciranih sistemov] (Urška Zagorc) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Ponovno_določanje_specifičnosti_izven_citoplazme_aktivnih_sigma_faktorjev Ponovno določanje specifičnosti izven citoplazme aktivnih sigma faktorjev] (Eva Keber) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Hierarhi%C4%8Dno_sestavljanje_asimetri%C4%8Dnih_ikozaedri%C4%8Dnih_virusnih_kapsid Hierarhično sestavljanje asimetričnih ikozaedričnih virusnih kapsid] (Urška Pečarič Strnad) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Avtomatizirano_oblikovanje_sintezne_mikrobne_zdru%C5%BEbe Avtomatizirano oblikovanje sintezne mikrobne združbe] (Urša Lovše) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Regulacija_stopnje_izra%C5%BEanja_z_L-arabinozo_v_ekspresijskem_sistemu_T7_z_razklopljeno_rastjo Regulacija stopnje izražanja z L-arabinozo v ekspresijskem sistemu T7 z razklopljeno rastjo] (Maruša Mišmaš) 
# [[Oblikovanje sintetičnega faga iz P. aeruginosa z reduciranim genomom|Oblikovanje sintetičnega faga iz ''P. aeruginosa'' z reduciranim genomom]] (Martina Lokar) 
# [[Sintetični promotorji za indukcijo imunskih celic v tumorskem mikrookolju]] (Saša Slabe) 
#[[Uravnavanje izražanja genov s pomočjo nanoteles in njihov vpliv na epigenetski spomin]] (Sara Laznik) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Priprava_humanih_CAR_imunskih_celic_z_napredno_logiko_in_porazdeljenim_računalništvom Priprava humanih CAR imunskih celic z napredno logiko in porazdeljenim računalništvom] (Tjaša Mlakar) 
# [[Utišanje genov na osnovi majhnih protismernih DNA omogoča manipulacijo in replikacijo genoma bakteriofagov v brezceličnem sistemu]] (Anže Karlek) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Translacijski_nadzor_izražanja_encima_odstranjevalca_preko_s_toksinom_induciranega_miRNA_stikala Translacijski nadzor izražanja encima odstranjevalca preko s toksinom induciranega miRNA stikala] (Ernestina Lavrih) 

NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.) 

# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/RESHAPE_-_spreminjanje_morfologije_nitastih_gliv RESHAPE - spreminjanje morfologije nitastih gliv] (Špela Supej) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/The_Chlamy_Cleaner:_razgradnja_pesticida_z_zeleno_algo The Chlamy Cleaner: razgradnja pesticida z zeleno algo] (Doroteja Armič) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/TheraPUFA:_nazalni_probiotik_proti_okužbam_in_vnetjem TheraPUFA- nazalni probiotik proti okužbam in vnetjem] (Barbara Slapnik) 
# [[S-POP: Modularni biosenzor za zaznavanje obstojnih organskih onesnaževal v okoljskih vodah]] (Tadej Medved) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/MARS-magnetni_sistem_za_recikliranje_ATP MARS-magnetni sistem za recikliranje ATP] (David Miškić) 
# [[B.O.T.: Bakterijska oscilacijska terapija za zdravljenje kolorektalnega raka]] (Neža Pavko) 
# [[Rapidemic razvoj novega kompleta za hitro diagnostiko na mestu oskrbe]] (Mirsad Mešić) 
# [[iGEMINI: Kvasovke kot prehransko dopolnilo v vesolju]] (Klementina Polanec) 
# [[Antea-Glyphosate: Detekcija in razgradnja glifosata]] (Jernej Imperl) 
# [[NANOFLEX: Standardiziran, prilagodljiv in priročen celični biosenzor]] (Martin Špendl) 
# [[FlavoFlow: ribogojniška zaščita pred okužbami rib]] (Mateja Žvipelj) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/samoreplicirajoč_COVID-19_test Samoreplicirajoč COVID-19-test] (Irma Zeljković) 
# [[Renervate: Polimer za zdravljenje poškodb hrbtenjače]] (Sabina Sladič Oblak) 
 
----

Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Povzetek je treba objaviti dva dni pred predstavitvijo do polnoči (za seminarje v sredo torej v ponedeljek). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo razprava, ki praviloma ne bo daljša od 5 minut.

Metabolno inženirstvo bakterije Escherichia coli za pridobivanje floroglucinola iz acetata

2021-05-12T08:18:28Z

Ernestinalavrih: /* Eksperiment in rezultati */

==Uvod==

Rastline imajo veliko sposobnost sinteze aromatskih spojin, med katerimi prevladujejo fenolne spojine. Pripisujemo jim različne fiziološke in farmakološke aktivnosti: protimikrobni učinek, so antioksidanti … Floroglucinol je ena izmed fenolnih spojin s protivirusnim in protivnetnim delovanjem. Mnogi derivati floroglucinola imajo znatno farmakološko aktivnost in so široko uporabljeni v farmaciji (Straessler 2010). Trenutno je kemijska sinteza glavna metoda za produkcijo floroglucinola, a ima nekaj slabosti. Določeni substrati, ki se uporabljajo pri sintezi (TNT – trinitrotoluen, anilin …) so lahko vnetljive in eksplozivne ter toksične spojine. Kemijska sinteza je torej lahko nevarna in škodljiva okolju. V opisani študiji so se raziskovalci odločili slediti trendu mikrobne biosinteze različnih produktov, ki je v določeni meri bolj enostavna in okolju prijazna. V gensko spremenjenem sevu E. Coli so uspešno biosintetizirali floroglucinol, vir ogljika pa je bil relativno poceni acetat (Yu idr. 2020).

==Eksperiment in rezultati==

Ker je znano, da so fenolne spojine toksične za mikroorganizme (Lima idr. 2016), so v študiji najprej preverili toksičnost floroglucinola za uporabljen sev E. Coli BL21(DE3). Bakterije so gojili v gojišču M9Y na 30 °C in dodali od 0 do 5 g/L floroglucinola. Rast celic so potrdili z merjenjem OD600. Po 24 urah je v primerjavi s sevom, ki mu v gojišče ni bil dodan floroglucinol in sevom, ki mu je bil dodan 1 g/L floroglucinola, izmerjena OD600 vrednost padla za 1,43 krat. Rezultati so potrdili, da je spojina imela zaviralen učinek na rast celic, a se ta z višanjem koncentracije spojine ni zviševal. Iz tega je sledilo, da je sev zadovoljivo toleriral najvišjo koncentracijo floroglucinola, 5 g/L.
Omenjen sev E. Coli so modificirali, da je proizvajala floroglucinol. Gen za floroglucinol sintazo (phlD) so pridobili iz genoma bakterije Pseudomonas fluorescens s pomočjo verižne reakcije s polimerazo (PCR) s prekrivajočima oligonukleotidoma. Encim floroglucinol sintaza pretvarja endogeni metabolit E. Coli malonil-CoA do floroglucinola. Količna prekurzorja malonil-CoA je bila glavni limitni element produkcije floroglucinola, zato so acetil-CoA karboksilazo, ki katalizira nepovratno karboksilacijo acetil-CoA v malonil-CoA, prekomerno izrazili, da je zagotavljala zalogo prekurzorja. Rezultati so potrdili, da je prekomerno izražanje omenjenega encima pospešilo in povečalo proizvodnjo floroglucinola.
Sledilo je načrtovanje dveh različnih biosinteznih poti za proizvodnjo želene spojine iz acetata. V primeru prve poti acetil-CoA sintaza katalizira pretvorbo acetata do acetil-CoA. Pri drugi poti sta udeležena dva encima, fosfotransacetilaza in acetat kinaza, ki prav tako katalizirata pretvorbo acetata do acetil-CoA. Encimi obeh poti so bili prekomerno izraženi. Rezultati so pokazali, da je acetat ustrezen vir ogljika in da ima biosintezna pot preko encimov fosfotransacetilaza in acetat kinaza večjo kapaciteto produkcije aceitl-CoA kot pot, ki jo katalizira acetil-CoA sintaza.

Znano je, da so ustrezni kodoni nujni za uspešno izražanje želenega proteina, kar pomeni, da manj pogosti kodoni znižajo izražanje (Sørensen 2001). S sistemom CRISPR/Cas9 so utišali gen GltA, katerega produkt katalizira pretvorbo oksaloacetat in acetil-CoA (iz acetata) v citrat, ki je vključen v ciklus citronske kisline. Utišanje so dosegli z zamenjavo pogostih kodonov za levcin z manj pogostim, CTA kodonom, in ustvarili večje število sevov z različnim številom zamenjav. Rezultati nakazujejo, da so uspešno utišali gen in s tem dosegli večjo preusmeritev toka ogljika v smer produkcije floroglucinola in manj v smer ciklusa citronske kisline.

==Zaključek==

Namen študije je bil biosinteza floroglucinola iz acetata, saj je ta alternativa dražjim virom ogljika (glukoza, lakotza, saharoza …). V študij zaključujejo, da za produkcijo koristnih spojin obstajajo še cenejši viri ogljika, ki se jih pridobi še lažje (melasa, glicerol, agrikulturni odpadki …), s čimer se znižajo stroški, hkrati pa se odpre še možnost ponovne uporabe odpadkov.
Proizvodnjo floroglucinola iz acetata so v opisani študiji sicer dosegli, a sam izkoristek acetata limitira produkcijo, saj rezultati kažejo, da višja koncentracija acetata ne korelira z višjo količino proizvedenega floroglucinola, kar namiguje na to, da presežka acetata gostiteljska bakterija ni mogla izkoristit. Potrebno bi bilo povečati asimilacijo acetata, kjer je verjetno efektivna strategija proteinski inžiniring encimov, ki sodelujejo (acetil-CoA sintaza, fosfotransacetilaza, acetat kinaza).

==Viri==

Lima, Valéria N. idr. 2016. „Antimicrobial and enhancement of the antibiotic activity by phenolic compounds: Gallic acid, caffeic acid and pyrogallol“. Microbial Pathogenesis.

Sørensen, Michael A. 2001. „Charging levels of four tRNA species in Escherichia coli Rel+ and Rel- strains during amino acid starvation: A simple model for the effect of ppGpp on translational accuracy“. Journal of Molecular Biology.

Straessler, Nicholas A. 2010. „Synthesis of trinitroaromatics using alternative mixed acid nitration conditions“. Synthetic Communications.

Yu, Shengzhu idr. 2020. „Metabolic engineering of E. coli for producing phloroglucinol from acetate“. Applied Microbiology and Biotechnology.

Metabolno inženirstvo bakterije Escherichia coli za pridobivanje floroglucinola iz acetata

2021-05-12T08:18:13Z

Ernestinalavrih: /* Viri */

==Uvod==

Rastline imajo veliko sposobnost sinteze aromatskih spojin, med katerimi prevladujejo fenolne spojine. Pripisujemo jim različne fiziološke in farmakološke aktivnosti: protimikrobni učinek, so antioksidanti … Floroglucinol je ena izmed fenolnih spojin s protivirusnim in protivnetnim delovanjem. Mnogi derivati floroglucinola imajo znatno farmakološko aktivnost in so široko uporabljeni v farmaciji (Straessler 2010). Trenutno je kemijska sinteza glavna metoda za produkcijo floroglucinola, a ima nekaj slabosti. Določeni substrati, ki se uporabljajo pri sintezi (TNT – trinitrotoluen, anilin …) so lahko vnetljive in eksplozivne ter toksične spojine. Kemijska sinteza je torej lahko nevarna in škodljiva okolju. V opisani študiji so se raziskovalci odločili slediti trendu mikrobne biosinteze različnih produktov, ki je v določeni meri bolj enostavna in okolju prijazna. V gensko spremenjenem sevu E. Coli so uspešno biosintetizirali floroglucinol, vir ogljika pa je bil relativno poceni acetat (Yu idr. 2020).

==Eksperiment in rezultati==

Ker je znano, da so fenolne spojine toksične za mikroorganizme (Lima idr. 2016), so v študiji najprej preverili toksičnost floroglucinola za uporabljen sev E. Coli BL21(DE3). Bakterije so gojili v gojišču M9Y na 30 °C in dodali od 0 do 5 g/L floroglucinola. Rast celic so potrdili z merjenjem OD600. Po 24 urah je v primerjavi s sevom, ki mu v gojišče ni bil dodan floroglucinol in sevom, ki mu je bil dodan 1 g/L floroglucinola, izmerjena OD600 vrednost padla za 1,43 krat. Rezultati so potrdili, da je spojina imela zaviralen učinek na rast celic, a se ta z višanjem koncentracije spojine ni zviševal. Iz tega je sledilo, da je sev zadovoljivo toleriral najvišjo koncentracijo floroglucinola, 5 g/L.
Omenjen sev E. Coli so modificirali, da je proizvajala floroglucinol. Gen za floroglucinol sintazo (phlD) so pridobili iz genoma bakterije Pseudomonas fluorescens s pomočjo verižne reakcije s polimerazo (PCR) s prekrivajočima oligonukleotidoma. Encim floroglucinol sintaza pretvarja endogeni metabolit E. Coli malonil-CoA do floroglucinola. Količna prekurzorja malonil-CoA je bila glavni limitni element produkcije floroglucinola, zato so acetil-CoA karboksilazo, ki katalizira nepovratno karboksilacijo acetil-CoA v malonil-CoA, prekomerno izrazili, da je zagotavljala zalogo prekurzorja. Rezultati so potrdili, da je prekomerno izražanje omenjenega encima pospešilo in povečalo proizvodnjo floroglucinola.
Sledilo je načrtovanje dveh različnih biosinteznih poti za proizvodnjo želene spojine iz acetata. V primeru prve poti acetil-CoA sintaza katalizira pretvorbo acetata do acetil-CoA. Pri drugi poti sta udeležena dva encima, fosfotransacetilaza in acetat kinaza, ki prav tako katalizirata pretvorbo acetata do acetil-CoA. Encimi obeh poti so bili prekomerno izraženi. Rezultati so pokazali, da je acetat ustrezen vir ogljika in da ima biosintezna pot preko encimov fosfotransacetilaza in acetat kinaza večjo kapaciteto produkcije aceitl-CoA kot pot, ki jo katalizira acetil-CoA sintaza.
Znano je, da so ustrezni kodoni nujni za uspešno izražanje želenega proteina, kar pomeni, da manj pogosti kodoni znižajo izražanje (Sørensen 2001). S sistemom CRISPR/Cas9 so utišali gen GltA, katerega produkt katalizira pretvorbo oksaloacetat in acetil-CoA (iz acetata) v citrat, ki je vključen v ciklus citronske kisline. Utišanje so dosegli z zamenjavo pogostih kodonov za levcin z manj pogostim, CTA kodonom, in ustvarili večje število sevov z različnim številom zamenjav. Rezultati nakazujejo, da so uspešno utišali gen in s tem dosegli večjo preusmeritev toka ogljika v smer produkcije floroglucinola in manj v smer ciklusa citronske kisline.

==Zaključek==

Namen študije je bil biosinteza floroglucinola iz acetata, saj je ta alternativa dražjim virom ogljika (glukoza, lakotza, saharoza …). V študij zaključujejo, da za produkcijo koristnih spojin obstajajo še cenejši viri ogljika, ki se jih pridobi še lažje (melasa, glicerol, agrikulturni odpadki …), s čimer se znižajo stroški, hkrati pa se odpre še možnost ponovne uporabe odpadkov.
Proizvodnjo floroglucinola iz acetata so v opisani študiji sicer dosegli, a sam izkoristek acetata limitira produkcijo, saj rezultati kažejo, da višja koncentracija acetata ne korelira z višjo količino proizvedenega floroglucinola, kar namiguje na to, da presežka acetata gostiteljska bakterija ni mogla izkoristit. Potrebno bi bilo povečati asimilacijo acetata, kjer je verjetno efektivna strategija proteinski inžiniring encimov, ki sodelujejo (acetil-CoA sintaza, fosfotransacetilaza, acetat kinaza).

==Viri==

Lima, Valéria N. idr. 2016. „Antimicrobial and enhancement of the antibiotic activity by phenolic compounds: Gallic acid, caffeic acid and pyrogallol“. Microbial Pathogenesis.

Sørensen, Michael A. 2001. „Charging levels of four tRNA species in Escherichia coli Rel+ and Rel- strains during amino acid starvation: A simple model for the effect of ppGpp on translational accuracy“. Journal of Molecular Biology.

Straessler, Nicholas A. 2010. „Synthesis of trinitroaromatics using alternative mixed acid nitration conditions“. Synthetic Communications.

Yu, Shengzhu idr. 2020. „Metabolic engineering of E. coli for producing phloroglucinol from acetate“. Applied Microbiology and Biotechnology.

Metabolno inženirstvo bakterije Escherichia coli za pridobivanje floroglucinola iz acetata

2021-05-12T08:17:43Z

Ernestinalavrih:

==Uvod==

Rastline imajo veliko sposobnost sinteze aromatskih spojin, med katerimi prevladujejo fenolne spojine. Pripisujemo jim različne fiziološke in farmakološke aktivnosti: protimikrobni učinek, so antioksidanti … Floroglucinol je ena izmed fenolnih spojin s protivirusnim in protivnetnim delovanjem. Mnogi derivati floroglucinola imajo znatno farmakološko aktivnost in so široko uporabljeni v farmaciji (Straessler 2010). Trenutno je kemijska sinteza glavna metoda za produkcijo floroglucinola, a ima nekaj slabosti. Določeni substrati, ki se uporabljajo pri sintezi (TNT – trinitrotoluen, anilin …) so lahko vnetljive in eksplozivne ter toksične spojine. Kemijska sinteza je torej lahko nevarna in škodljiva okolju. V opisani študiji so se raziskovalci odločili slediti trendu mikrobne biosinteze različnih produktov, ki je v določeni meri bolj enostavna in okolju prijazna. V gensko spremenjenem sevu E. Coli so uspešno biosintetizirali floroglucinol, vir ogljika pa je bil relativno poceni acetat (Yu idr. 2020).

==Eksperiment in rezultati==

Ker je znano, da so fenolne spojine toksične za mikroorganizme (Lima idr. 2016), so v študiji najprej preverili toksičnost floroglucinola za uporabljen sev E. Coli BL21(DE3). Bakterije so gojili v gojišču M9Y na 30 °C in dodali od 0 do 5 g/L floroglucinola. Rast celic so potrdili z merjenjem OD600. Po 24 urah je v primerjavi s sevom, ki mu v gojišče ni bil dodan floroglucinol in sevom, ki mu je bil dodan 1 g/L floroglucinola, izmerjena OD600 vrednost padla za 1,43 krat. Rezultati so potrdili, da je spojina imela zaviralen učinek na rast celic, a se ta z višanjem koncentracije spojine ni zviševal. Iz tega je sledilo, da je sev zadovoljivo toleriral najvišjo koncentracijo floroglucinola, 5 g/L.
Omenjen sev E. Coli so modificirali, da je proizvajala floroglucinol. Gen za floroglucinol sintazo (phlD) so pridobili iz genoma bakterije Pseudomonas fluorescens s pomočjo verižne reakcije s polimerazo (PCR) s prekrivajočima oligonukleotidoma. Encim floroglucinol sintaza pretvarja endogeni metabolit E. Coli malonil-CoA do floroglucinola. Količna prekurzorja malonil-CoA je bila glavni limitni element produkcije floroglucinola, zato so acetil-CoA karboksilazo, ki katalizira nepovratno karboksilacijo acetil-CoA v malonil-CoA, prekomerno izrazili, da je zagotavljala zalogo prekurzorja. Rezultati so potrdili, da je prekomerno izražanje omenjenega encima pospešilo in povečalo proizvodnjo floroglucinola.
Sledilo je načrtovanje dveh različnih biosinteznih poti za proizvodnjo želene spojine iz acetata. V primeru prve poti acetil-CoA sintaza katalizira pretvorbo acetata do acetil-CoA. Pri drugi poti sta udeležena dva encima, fosfotransacetilaza in acetat kinaza, ki prav tako katalizirata pretvorbo acetata do acetil-CoA. Encimi obeh poti so bili prekomerno izraženi. Rezultati so pokazali, da je acetat ustrezen vir ogljika in da ima biosintezna pot preko encimov fosfotransacetilaza in acetat kinaza večjo kapaciteto produkcije aceitl-CoA kot pot, ki jo katalizira acetil-CoA sintaza.
Znano je, da so ustrezni kodoni nujni za uspešno izražanje želenega proteina, kar pomeni, da manj pogosti kodoni znižajo izražanje (Sørensen 2001). S sistemom CRISPR/Cas9 so utišali gen GltA, katerega produkt katalizira pretvorbo oksaloacetat in acetil-CoA (iz acetata) v citrat, ki je vključen v ciklus citronske kisline. Utišanje so dosegli z zamenjavo pogostih kodonov za levcin z manj pogostim, CTA kodonom, in ustvarili večje število sevov z različnim številom zamenjav. Rezultati nakazujejo, da so uspešno utišali gen in s tem dosegli večjo preusmeritev toka ogljika v smer produkcije floroglucinola in manj v smer ciklusa citronske kisline.

==Zaključek==

Namen študije je bil biosinteza floroglucinola iz acetata, saj je ta alternativa dražjim virom ogljika (glukoza, lakotza, saharoza …). V študij zaključujejo, da za produkcijo koristnih spojin obstajajo še cenejši viri ogljika, ki se jih pridobi še lažje (melasa, glicerol, agrikulturni odpadki …), s čimer se znižajo stroški, hkrati pa se odpre še možnost ponovne uporabe odpadkov.
Proizvodnjo floroglucinola iz acetata so v opisani študiji sicer dosegli, a sam izkoristek acetata limitira produkcijo, saj rezultati kažejo, da višja koncentracija acetata ne korelira z višjo količino proizvedenega floroglucinola, kar namiguje na to, da presežka acetata gostiteljska bakterija ni mogla izkoristit. Potrebno bi bilo povečati asimilacijo acetata, kjer je verjetno efektivna strategija proteinski inžiniring encimov, ki sodelujejo (acetil-CoA sintaza, fosfotransacetilaza, acetat kinaza).

==Viri==

Lima, Valéria N. idr. 2016. „Antimicrobial and enhancement of the antibiotic activity by phenolic compounds: Gallic acid, caffeic acid and pyrogallol“. Microbial Pathogenesis.
Sørensen, Michael A. 2001. „Charging levels of four tRNA species in Escherichia coli Rel+ and Rel- strains during amino acid starvation: A simple model for the effect of ppGpp on translational accuracy“. Journal of Molecular Biology.
Straessler, Nicholas A. 2010. „Synthesis of trinitroaromatics using alternative mixed acid nitration conditions“. Synthetic Communications.
Yu, Shengzhu idr. 2020. „Metabolic engineering of E. coli for producing phloroglucinol from acetate“. Applied Microbiology and Biotechnology.

Metabolno inženirstvo bakterije Escherichia coli za pridobivanje floroglucinola iz acetata

2021-05-12T08:16:06Z

Ernestinalavrih: New page: Metabolno inženirstvo bakterije Escherichia coli za pridobivanje floroglucinola iz acetata Uvod Rastline imajo veliko sposobnost sinteze aromatskih spojin, med katerimi prevladujejo feno...

Metabolno inženirstvo bakterije Escherichia coli za pridobivanje floroglucinola iz acetata
Uvod
Rastline imajo veliko sposobnost sinteze aromatskih spojin, med katerimi prevladujejo fenolne spojine. Pripisujemo jim različne fiziološke in farmakološke aktivnosti: protimikrobni učinek, so antioksidanti … Floroglucinol je ena izmed fenolnih spojin s protivirusnim in protivnetnim delovanjem. Mnogi derivati floroglucinola imajo znatno farmakološko aktivnost in so široko uporabljeni v farmaciji (Straessler 2010). Trenutno je kemijska sinteza glavna metoda za produkcijo floroglucinola, a ima nekaj slabosti. Določeni substrati, ki se uporabljajo pri sintezi (TNT – trinitrotoluen, anilin …) so lahko vnetljive in eksplozivne ter toksične spojine. Kemijska sinteza je torej lahko nevarna in škodljiva okolju. V opisani študiji so se raziskovalci odločili slediti trendu mikrobne biosinteze različnih produktov, ki je v določeni meri bolj enostavna in okolju prijazna. V gensko spremenjenem sevu E. Coli so uspešno biosintetizirali floroglucinol, vir ogljika pa je bil relativno poceni acetat (Yu idr. 2020).

Eksperiment in rezultati
Ker je znano, da so fenolne spojine toksične za mikroorganizme (Lima idr. 2016), so v študiji najprej preverili toksičnost floroglucinola za uporabljen sev E. Coli BL21(DE3). Bakterije so gojili v gojišču M9Y na 30 °C in dodali od 0 do 5 g/L floroglucinola. Rast celic so potrdili z merjenjem OD600. Po 24 urah je v primerjavi s sevom, ki mu v gojišče ni bil dodan floroglucinol in sevom, ki mu je bil dodan 1 g/L floroglucinola, izmerjena OD600 vrednost padla za 1,43 krat. Rezultati so potrdili, da je spojina imela zaviralen učinek na rast celic, a se ta z višanjem koncentracije spojine ni zviševal. Iz tega je sledilo, da je sev zadovoljivo toleriral najvišjo koncentracijo floroglucinola, 5 g/L.
Omenjen sev E. Coli so modificirali, da je proizvajala floroglucinol. Gen za floroglucinol sintazo (phlD) so pridobili iz genoma bakterije Pseudomonas fluorescens s pomočjo verižne reakcije s polimerazo (PCR) s prekrivajočima oligonukleotidoma. Encim floroglucinol sintaza pretvarja endogeni metabolit E. Coli malonil-CoA do floroglucinola. Količna prekurzorja malonil-CoA je bila glavni limitni element produkcije floroglucinola, zato so acetil-CoA karboksilazo, ki katalizira nepovratno karboksilacijo acetil-CoA v malonil-CoA, prekomerno izrazili, da je zagotavljala zalogo prekurzorja. Rezultati so potrdili, da je prekomerno izražanje omenjenega encima pospešilo in povečalo proizvodnjo floroglucinola.
Sledilo je načrtovanje dveh različnih biosinteznih poti za proizvodnjo želene spojine iz acetata. V primeru prve poti acetil-CoA sintaza katalizira pretvorbo acetata do acetil-CoA. Pri drugi poti sta udeležena dva encima, fosfotransacetilaza in acetat kinaza, ki prav tako katalizirata pretvorbo acetata do acetil-CoA. Encimi obeh poti so bili prekomerno izraženi. Rezultati so pokazali, da je acetat ustrezen vir ogljika in da ima biosintezna pot preko encimov fosfotransacetilaza in acetat kinaza večjo kapaciteto produkcije aceitl-CoA kot pot, ki jo katalizira acetil-CoA sintaza.
Znano je, da so ustrezni kodoni nujni za uspešno izražanje želenega proteina, kar pomeni, da manj pogosti kodoni znižajo izražanje (Sørensen 2001). S sistemom CRISPR/Cas9 so utišali gen GltA, katerega produkt katalizira pretvorbo oksaloacetat in acetil-CoA (iz acetata) v citrat, ki je vključen v ciklus citronske kisline. Utišanje so dosegli z zamenjavo pogostih kodonov za levcin z manj pogostim, CTA kodonom, in ustvarili večje število sevov z različnim številom zamenjav. Rezultati nakazujejo, da so uspešno utišali gen in s tem dosegli večjo preusmeritev toka ogljika v smer produkcije floroglucinola in manj v smer ciklusa citronske kisline.

Zaključek

Namen študije je bil biosinteza floroglucinola iz acetata, saj je ta alternativa dražjim virom ogljika (glukoza, lakotza, saharoza …). V študij zaključujejo, da za produkcijo koristnih spojin obstajajo še cenejši viri ogljika, ki se jih pridobi še lažje (melasa, glicerol, agrikulturni odpadki …), s čimer se znižajo stroški, hkrati pa se odpre še možnost ponovne uporabe odpadkov.
Proizvodnjo floroglucinola iz acetata so v opisani študiji sicer dosegli, a sam izkoristek acetata limitira produkcijo, saj rezultati kažejo, da višja koncentracija acetata ne korelira z višjo količino proizvedenega floroglucinola, kar namiguje na to, da presežka acetata gostiteljska bakterija ni mogla izkoristit. Potrebno bi bilo povečati asimilacijo acetata, kjer je verjetno efektivna strategija proteinski inžiniring encimov, ki sodelujejo (acetil-CoA sintaza, fosfotransacetilaza, acetat kinaza).

Viri
Lima, Valéria N. idr. 2016. „Antimicrobial and enhancement of the antibiotic activity by phenolic compounds: Gallic acid, caffeic acid and pyrogallol“. Microbial Pathogenesis.
Sørensen, Michael A. 2001. „Charging levels of four tRNA species in Escherichia coli Rel+ and Rel- strains during amino acid starvation: A simple model for the effect of ppGpp on translational accuracy“. Journal of Molecular Biology.
Straessler, Nicholas A. 2010. „Synthesis of trinitroaromatics using alternative mixed acid nitration conditions“. Synthetic Communications.
Yu, Shengzhu idr. 2020. „Metabolic engineering of E. coli for producing phloroglucinol from acetate“. Applied Microbiology and Biotechnology.

MBT seminarji 2021

2021-05-12T08:15:28Z

Ernestinalavrih:

Seminarji iz Molekularne biotehnologije so letos organizirani tako, da vsak študent (praviloma v paru, lahko pa tudi samostojno) obdela temo s področja cepiv proti virusu SARS-CoV-2 in o tem pripravi kratek poljudno napisan povzetek. Ta del seminarjev je predstavljen na [[protikovidna cepiva|ločeni strani]].
V drugem delu vsak študent predstavi nek raziskovalni dosežek s širšega področja molekularne biotehnologije. Seznam tem in predstavitev za študijsko leto 2020/21 je predstavljen tu.

Povzetke morate objaviti do torka do polnoči v tednu, ko imate seminar (v četrtek). Angleški naslov prevedite tudi v slovenščino - to bo naslov povzetka, ki ga objavite na posebni strani, tako kot so to naredili kolegi pred vami (oz. predlani).

Način vnosa:

The importance of ''Arabidopsis'' glutathione peroxidase 8 for protecting ''Arabidopsis'' plant and ''E. coli'' cells against oxidative stress (A. Gaber; GM Crops & Food 5(1), 2014; http://dx.doi.org/10.4161/gmcr.26979) Pomen glutation peroksidaze 8 iz repnjakovca za zaščito rastline ''Arabidopsis thaliana'' in bakterije ''Escherichia coli'' pred oksidativnim stresom. Janez Novak (28.2.) 
(slovenski naslov povežite z novo stranjo, na kateri bo povzetek)

----

Naslovi odobrenih člankov po temah:

'''Farmacevtsko pomembni proteini''' 
# Development of Antibody-Fragment-Producing Rice for Neutralization of Human Norovirus (A. Sasou ''et. al''; Frontiers in Plant Science 12, 2021; https://doi.org/10.3389/fpls.2021.639953). [[Proizvodnja riža za sintezo fragmentov protiteles proti humanemu norovirusu.]] Mateja Žvipelj (11.3.)
# A New Plant Expression System for Producing Pharmaceutical Proteins (N. Abd-Aziz ''et. al''; Molecular Biotechnology 62, 2020; https://doi.org/10.1007/s12033-020-00242-2). [[Razvoj ekspresijskega sistema za proizvodnjo farmacevtskih proteinov v rastlini Mucuna bracteata]]. Jernej Imperl (18.3.)
# Development of a Recombinant Monospecific Anti-PLGF Bivalent Nanobody and Evaluation of it in Angiogenesis Modulation (A. Nikooharf "et all"; Molecular Biotechnology 62, 2020; https://link.springer.com/article/10.1007/s12033-020-00275-7#additional-information) [[Razvoj rekombinantnih monospecifičnih bivalentnih nanoteles proti PLGF-u]]. Nika Zaveršek (18.3.)

'''Cepiva''' 
# Development of a DNA Vaccine for Melanoma Metastasis by Inhalation Based on an Analysis of Transgene Expression Characteristics of Naked pDNA and a Ternary Complex in Mouse Lung Tissues (Kodama ''et.al'';Pharmaceutics 12,2020; https://www.mdpi.com/1999-4923/12/6/540#framed_div_cited_count) [[ Razvoj DNA cepiva proti metastazam melanoma z vdihavanjem na podlagi analize značilnosti transgene ekspresije gole pDNA in trojni kompleks v mišjem pljučnem tkivu]]. Paula Horvat (25.3.) 
# An AMA1/MSP119 Adjuvanted Malaria Transplastomic Plant‑Based Vaccine Induces Immune Responses in Test Animals (Evelia M. Milán‑Noris ''et. al''; Molecular Biotechnology 62, 2020; https://doi.org/10.1007/s12033-020-00271-x) [[V rastlinah proizvedeno transplastomsko antimalarijsko cepivo z AMA1/MSP119 in dodanim adjuvansom inducira imunski odziv v testnih živalih]]. Neža Pavko (25.3.) 

'''Gensko spremenjene rastline''' 
# A wheat cysteine-rich receptor-like kinase confers broad-spectrum resistance against Septoria tritici blotch (C. Saintenac ''et al.''; Nat. Commun. 12, 2021, https://doi.org/10.1038/s41467-020-20685-0). [[Receptorju podobna kinaza bogata s cisteini, pšenici daje odpornost proti širokemu spektru pegavosti Septoria tritici]]. Andrej Race (7.4.)
# RNAi silenced ζ-carotene desaturase developed variegated tomato transformants with increased phytoene content (M. A. Babu ''et. al''; Plant Growth Regul. 93, 2021; https://doi.org/10.1007/s10725-020-00678-1). [[Vpliv utišanja ζ-karoten desaturaze na vsebnost karotenoidov v gensko spremenjenih paradižnikih]]. Peter Škrinjar (7.4.)

'''Gensko spremenjene živali in celične linije''' 
# Engineering carotenoid production in mammalian cells for nutritionally enhanced cell-cultured foods (A. J. Stout "et. al"; Metabolic Engineering 62, 2020; https://doi.org/10.1016/j.ymben.2020.07.011). [[Razvoj proizvodnje karotenoidov v sesalskih celicah za prehransko izboljšano celično pridobljeno meso]]. Urša Lovše (8.4.)
# Efficient photoactivatable Dre recombinase for cell type-specific spatiotemporal control of genome engineering in the mouse (H. Li ''et. al''; Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 117(52), 2021; https://doi.org/10.1073/pnas.2003991117). [[Priprava fotoinducibilne rekombinaze Dre kot orodje za prostorsko in časovno odvisno urejanje genoma v specifičnih mišjih celicah.]] Matija Ruparčič (8.4.)

'''Nizkomolekularni biotehnološki produkti''' 
# Fermentative N-Methylanthranilate Production by Engineered ''Corynebacterium glutamicum''. (T. Walter ''et. al.''; Microorganisms 8(6), 2020; https://doi.org/10.3390/microorganisms8060866). [[Fermentativna proizvodnja N-metilantranilata z inženirsko spremenjeno Corynebacterium glutamicum]]. Saša Slabe (14.4.)
# Efficient Biosynthesis of Vanillin from Isoeugenol by Recombinant Isoeugenol Monooxygenase from ''Pseudomonas nitroreducens'' Jin1. (Wang Q, Wu X, Lu X, He Y, Ma B, Xu Y. Efficient Biosynthesis of Vanillin from Isoeugenol by Recombinant Isoeugenol Monooxygenase from Pseudomonas nitroreducens Jin1. Appl Biochem Biotechnol. 2021:1116-1128. doi:10.1007/s12010-020-03478-5). [[Učinkovita biosinteza vanilina iz izoevgenola z uporabo rekombinantne izoevgenol monooksigenaze Jin1 iz bakterije Pseudomonas nitroreducens]]. Luka Gnidovec (15.4.)
# One-pot production of butyl butyrate from glucose using a cognate “diamond-shaped” ''E. coli'' consortium (J. P. Sinumvayo "et. al"; Bioresources and Bioprocessing 8, 2021; https://bioresourcesbioprocessing.springeropen.com/articles/10.1186/s40643-021-00372-8#Sec9). [[Proizvodnja butil butirata iz glukoze z uporabo "diamantnega" konzorcija E. coli]] Liza Ulčakar (15.4.)

'''Biotehnološki polimeri''' 
# Biotechnologically produced fucosylated oligosaccharides inhibit the binding of human noroviruses to their natural receptors (S. M. Derya et al., “Biotechnologically produced fucosylated oligosaccharides inhibit the binding of human noroviruses to their natural receptors,” ''J. Biotechnol.'', vol. 318, no. April, pp. 31–38, 2020, doi: 10.1016/j.jbiotec.2020.05.001). [[Inhibicija vezave humanega norovirusa na naravni receptor z biotehnološko proizvedenimi fukoziliranimi oligosaharidi]] Anže Karlek (21.4.)
# Complete biosynthesis of a sulfated chondroitin in ''Escherichia coli'' (Badri, A., ''et al''; Nature communications 12 (2021); https://doi.org/10.1038/s41467-021-21692-5). [[Popolna biosinteza hondroitin sulfata v E. coli]] Ana Maklin (22.4.)
# Optimization of cultivation medium and cyclic fed-batch fermentation strategy for enhanced polyhydroxyalkanoate production by Bacillus thuringiensis using a glucose-rich hydrolyzate (Singh et al. Bioresour. Bioprocess. (2021) 8:11, https://doi.org/10.1186/s40643-021-00361-x) [[Optimizacija fermentacijske proizvodnje PHA-bioplastike z b. thuringiensis in z glukozo bogatimi hidrolizati]] Urban Hribar (22.4.)

'''Biotehnološko pridobljeni encimi''' 
# Engineering a carboxypeptidase from ''Aspergillus niger'' M00988 by mutation to increase its ability in high Fischer ratio oligopeptide preparation (Xiong K., Liu J., Wang X., Sun B., Zhang Y., Zhao Z., Pei P., & Li X.; Journal of Biotechnology, 330, 1–8, 2021, https://doi.org/10.1016/j.jbiotec.2021.02.015). [[Priprava karboksipeptidaze iz glive Aspergillus niger M00988 za izboljšanje priprave oligopeptidov z visokim Fischerjevim razmerjem]] Urška Fajdiga (5.5.)
# Cell-Based High-Throughput Screening Protocol for Discovering Antiviral Inhibitors Against SARS-COV-2 Main Protease (3CLpro) (Rothan, H.A., Teoh, T.C; Mol Biotechnol 63, 240–248 (2021); https://doi.org/10.1007/s12033-021-00299-7) [[Visoko zmogljiv presejalni protokol na osnovi celic za raziskovanje antivirusnih inhibitorjev proti Sars-Cov-2 glavni proteazi (3CLpro)]] Mirsad Mešić (6.5.)
# A novel cold-active type I pullulanase from a hot-spring metagenome for effective debranching and production of resistant starch (M. Thakur ''et al''.; Bioresource Technology 320, 2021; https://doi.org/10.1016/j.biortech.2020.124288). [[Pri nizkih temperaturah aktivna pululanaza tipa I iz metagenoma vročih vrelcev omogoča učinkovito klestenje in proizvodnjo odpornega škroba]] Martina Lokar (6.5.)

'''Metabolno inženirstvo v biotehnologiji''' 
# Production of Tyrian purple indigoid dye from tryptophan in ''Escherichia coli'' (J. Lee ''et al.''; Nat. Chem. Biol. 17, 2021; https://doi.org/10.1038/s41589-020-00684-4). [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Proizvodnja_%C5%A1krlatnega_indigoidnega_barvila_iz_triptofana_v_bakteriji_Escherichia_coli Proizvodnja škrlatnega indigoidnega barvila iz triptofana v bakteriji ''Escherichia coli''] Jerneja Nimac (12.5.)
# Development of ''Pseudomonas asiatica'' as a host for the production of 3-hydroxypropionic acid from glycerol (T. Thi Nguyen et al., Bioresource Technology, vol. 329, 2021; https://doi.org/10.1016/j.biortech.2021.124867). [[Razvoj gostiteljskega organizma Pseudomonas asiatica za proizvodnjo 3-hidroksipropionske kisline iz glicerola]] Urška Pečarič Strnad (12.5.)
# Generation of an engineered food-grade ''Lactococcus lactis'' strain for production of an antimicrobial peptide: ''in vitro'' and ''in silico'' evaluation (A. Tanhaeian ''et. al''; BMC Biotechnol. 20(1), 2020; https://doi.org/10.1186/s12896-020-00612-3). [[Priprava in ovrednotenje novega seva bakterij Lactococcus lactis za proizvodnjo protimikrobnega peptida]]. Klementina Polanec (13.5.)
# Metabolic engineering of ''E. coli'' for producing phloroglucinol from acetate (S. Yu et. al; Applied Microbiology and Biotechnology. 2020; https://doi.org/10.1007/s00253-020-10591-2). [[Metabolno inženirstvo bakterije Escherichia coli za pridobivanje floroglucinola iz acetata]]. Ernestina Lavrih (13.5.)

'''Biomasa in biogoriva''' 
# Željka Erić (19.5.)
# Karin Dobravc Škof (20.5.)
# Katja Doberšek (20.5.)

'''Okoljski vidiki biotehnologije in bioremediacija''' 
# Almina Tahirović (26.5.)
# Eva Keber (27.5.)
# Nina Lukančič (27.5.)

Značilnosti cepiva CanSino (Ad5)

2021-04-14T18:29:05Z

Ernestinalavrih:

Ad5-nCoV oz. Convidecia je cepivo proti okužbi z novim koronavirusom, ki so ga razvili v kitajskem podjetju CanSino Biologics inc. v sodelovanju s pekingškim Inštitutom za biotehnologjo in kitajsko Vojaško akademijo za medicino. Je vektorsko cepivo na osnovi nereplicirajočega adenovirusnega vektorja tipa 5, ki nosi DNA zapis za rekombinantno beljakovino bodice iz virusa Sars-CoV-2. Cepivo naj bi 28 dni po cepljenju zagotavljalo 65,28 % zaščito pred okužbo. Cepivo se injicira v mišico, posameznik prejme 1 odmerek cepiva s 5x10^10 virusnimi delci. Hrani se v hladilniku (2-8 °C) [1]. Cepivo je odobreno na Kitajskem, Madžarskem, v Pakistanu, Mehiki in Čilu (april 2021).

Uporabljen adenovirusni vektor vsebuje delecijo zgodnjih genov E1 in E3. V odsotnosti genov E1 se virus ne more razmnoževati, z izbrisom regije E3 pa se prepreči lizo gostiteljske celice. V rekombinantni vektor sta bila klonirana gen za beljakovino bodice in gen za signalni peptid za tkivni aktivator plazminogena (za povečano izražanje v sesalskih celicah) [1].

Po cepljenju gensko spremenjeni adenovirusi vstopijo v gostiteljske celice, kjer v jedro sprostijo rekombinantno DNA. Nastanejo beljakovine bodice in posledično imunski odgovor na njih [2].

V primeru predhodne okužbe z adenovirusi se pojavi problem predobstoječe imunosti. Adenovirusi so imunogeni že sami po sebi, zato so po okužbi z njimi prisotne spominske celice. Nevtralizirajoča protitelesa proti adenovirusom že v majhnih koncentracijah okrnijo privzem vektorja v gostiteljske celice, kar posledično pomeni zmanjšan specifični imunski odziv na transgeni produkt (tj. beljakovina bodice) 3.
Imunogenost in učinkovitost so sprva preverjali na miših in dihurjih, pri čemer so različne skupine prejemale različno visoke odmerke cepiva intranazalno ali intramuskularno. Po cepljenju so jih okužili s SARS-CoV-2 in ugotovili, da so bili odmerki zadostni za zaščito pred okužbo s korona virusom, pri čemer se je intranazalno odmerjanje izkazalo kot bolj učinkovito [1].

V 1. fazi kliničnih študij je sodelovalo 108 zdravih prostovoljcev, stari med 18 in 60 let. Razdeljeni so bili v 3 skupine, vsaka je prejela višji odmerek cepiva intramuskularno v roko: 5x10^10 virusnih delcev/0,5 mL; 1 × 10^11 virusnih delcev/mL; 1,5 × 10^11 virusnih delcev/1,5 mL. Po vseh odmerkih so se že 14 dni po cepljenju pojavil zadostni imunski odziv in ker ni bilo prijavljenih hudih negativnih stranskih učinkov, so lahko nadaljevali z 2. fazo kliničnih študij [1,4].

V 2. fazi je sodelovalo je 508 zdravih prostovoljcev: 253 oseb je prejemalo 1x1011 virusnih delcev, 129 oseb 5x1010 virusnih delcev, 126 oseb pa placebo. Cepivo so prejeli intramuskularno v roko. Oba odmerka cepiva sta sprožila celični ali humoralni imunski odziv, do 28 dni po prejemu cepiva. Stranski učinki, o katerih so poročali udeleženci, so bili blagi do zmerni - najpogosteje povišana telesna temperatura, glavobol in/ali bolečina na mestu injiciranja. Manjši odmerek (5x10^10 virusnih delcev) je spodbudil dovoljšen imunski odziv in malenkost blažje stranske učinke, zato so ta odmerek tudi določili kot varnega in učinkovitega [4].
3. faza kliničnih študij še vedno poteka – ko bodo znani rezultati, bomo več vedeli o dejanski učinkovitosti cepiva na dolgi rok in sposobnosti preprečevanja prenosa okužbe.

== Viri ==
1. Wu, S. et al. A single dose of an adenovirus-vectored vaccine provides protection against SARS-CoV-2 challenge. Nat. Commun. (2020) doi:10.1038/s41467-020-17972-1.

2. Tatsis, N. & Ertl, H. C. J. Adenoviruses as vaccine vectors. Molecular Therapy (2004) doi:10.1016/j.ymthe.2004.07.013.

3. Fausther-Bovendo, H. & Kobinger, G. P. Pre-existing immunity against Ad vectors: Humoral, cellular, and innate response, what’s important? Human Vaccines and Immunotherapeutics (2014) doi:10.4161/hv.29594.

4. Zhu, F. C. et al. Immunogenicity and safety of a recombinant adenovirus type-5-vectored COVID-19 vaccine in healthy adults aged 18 years or older: a randomised, double-blind, placebo-controlled, phase 2 trial. Lancet 396, 479–488 (2020).

Značilnosti cepiva CanSino (Ad5)

2021-04-14T18:27:47Z

Ernestinalavrih:

AD5-nCOV oz. Convidecia je cepivo proti okužbi z novim koronavirusom, ki so ga razvili v kitajskem podjetju CanSino Biologics inc. v sodelovanju s pekingškim Inštitutom za biotehnologjo in kitajsko Vojaško akademijo za medicino. Je vektorsko cepivo na osnovi nereplicirajočega adenovirusnega vektorja tipa 5, ki nosi DNA zapis za rekombinantno beljakovino bodice iz virusa Sars-CoV-2. Cepivo naj bi 28 dni po cepljenju zagotavljalo 65,28 % zaščito pred okužbo. Cepivo se injicira v mišico, posameznik prejme 1 odmerek cepiva s 5x10^10 virusnimi delci. Hrani se v hladilniku (2-8 °C) [1]. Cepivo je odobreno na Kitajskem, Madžarskem, v Pakistanu, Mehiki in Čilu (april 2021).

Uporabljen adenovirusni vektor vsebuje delecijo zgodnjih genov E1 in E3. V odsotnosti genov E1 se virus ne more razmnoževati, z izbrisom regije E3 pa se prepreči lizo gostiteljske celice. V rekombinantni vektor sta bila klonirana gen za beljakovino bodice in gen za signalni peptid za tkivni aktivator plazminogena (za povečano izražanje v sesalskih celicah) [1].

Po cepljenju gensko spremenjeni adenovirusi vstopijo v gostiteljske celice, kjer v jedro sprostijo rekombinantno DNA. Nastanejo beljakovine bodice in posledično imunski odgovor na njih [2].

V primeru predhodne okužbe z adenovirusi se pojavi problem predobstoječe imunosti. Adenovirusi so imunogeni že sami po sebi, zato so po okužbi z njimi prisotne spominske celice. Nevtralizirajoča protitelesa proti adenovirusom že v majhnih koncentracijah okrnijo privzem vektorja v gostiteljske celice, kar posledično pomeni zmanjšan specifični imunski odziv na transgeni produkt (tj. beljakovina bodice) 3.
Imunogenost in učinkovitost so sprva preverjali na miših in dihurjih, pri čemer so različne skupine prejemale različno visoke odmerke cepiva intranazalno ali intramuskularno. Po cepljenju so jih okužili s SARS-CoV-2 in ugotovili, da so bili odmerki zadostni za zaščito pred okužbo s korona virusom, pri čemer se je intranazalno odmerjanje izkazalo kot bolj učinkovito [1].

V 1. fazi kliničnih študij je sodelovalo 108 zdravih prostovoljcev, stari med 18 in 60 let. Razdeljeni so bili v 3 skupine, vsaka je prejela višji odmerek cepiva intramuskularno v roko: 5x1010 virusnih delcev/0,5 mL; 1 × 1011 virusnih delcev/mL; 1,5 × 1011 virusnih delcev/1,5 mL. Po vseh odmerkih so se že 14 dni po cepljenju pojavil zadostni imunski odziv in ker ni bilo prijavljenih hudih negativnih stranskih učinkov, so lahko nadaljevali z 2. fazo kliničnih študij [1,4].

V 2. fazi je sodelovalo je 508 zdravih prostovoljcev: 253 oseb je prejemalo 1x1011 virusnih delcev, 129 oseb 5x1010 virusnih delcev, 126 oseb pa placebo. Cepivo so prejeli intramuskularno v roko. Oba odmerka cepiva sta sprožila celični ali humoralni imunski odziv, do 28 dni po prejemu cepiva. Stranski učinki, o katerih so poročali udeleženci, so bili blagi do zmerni - najpogosteje povišana telesna temperatura, glavobol in/ali bolečina na mestu injiciranja. Manjši odmerek (5x1010 virusnih delcev) je spodbudil dovoljšen imunski odziv in malenkost blažje stranske učinke, zato so ta odmerek tudi določili kot varnega in učinkovitega [4].
3. faza kliničnih študij še vedno poteka – ko bodo znani rezultati, bomo več vedeli o dejanski učinkovitosti cepiva na dolgi rok in sposobnosti preprečevanja prenosa okužbe.

== Viri ==
1. Wu, S. et al. A single dose of an adenovirus-vectored vaccine provides protection against SARS-CoV-2 challenge. Nat. Commun. (2020) doi:10.1038/s41467-020-17972-1.

2. Tatsis, N. & Ertl, H. C. J. Adenoviruses as vaccine vectors. Molecular Therapy (2004) doi:10.1016/j.ymthe.2004.07.013.

3. Fausther-Bovendo, H. & Kobinger, G. P. Pre-existing immunity against Ad vectors: Humoral, cellular, and innate response, what’s important? Human Vaccines and Immunotherapeutics (2014) doi:10.4161/hv.29594.

4. Zhu, F. C. et al. Immunogenicity and safety of a recombinant adenovirus type-5-vectored COVID-19 vaccine in healthy adults aged 18 years or older: a randomised, double-blind, placebo-controlled, phase 2 trial. Lancet 396, 479–488 (2020).

Značilnosti cepiva CanSino (Ad5)

2021-04-14T18:26:40Z

Ernestinalavrih:

AD5-nCOV oz. Convidecia je cepivo proti okužbi z novim koronavirusom, ki so ga razvili v kitajskem podjetju CanSino Biologics inc. v sodelovanju s pekingškim Inštitutom za biotehnologjo in kitajsko Vojaško akademijo za medicino. Je vektorsko cepivo na osnovi nereplicirajočega adenovirusnega vektorja tipa 5, ki nosi DNA zapis za rekombinantno beljakovino bodice iz virusa Sars-CoV-2. Cepivo naj bi 28 dni po cepljenju zagotavljalo 65,28 % zaščito pred okužbo. Cepivo se injicira v mišico, posameznik prejme 1 odmerek cepiva s 5x10^10 virusnimi delci. Hrani se v hladilniku (2-8 °C) 1. Cepivo je odobreno na Kitajskem, Madžarskem, v Pakistanu, Mehiki in Čilu (april 2021).

Uporabljen adenovirusni vektor vsebuje delecijo zgodnjih genov E1 in E3. V odsotnosti genov E1 se virus ne more razmnoževati, z izbrisom regije E3 pa se prepreči lizo gostiteljske celice. V rekombinantni vektor sta bila klonirana gen za beljakovino bodice in gen za signalni peptid za tkivni aktivator plazminogena (za povečano izražanje v sesalskih celicah) 1.

Po cepljenju gensko spremenjeni adenovirusi vstopijo v gostiteljske celice, kjer v jedro sprostijo rekombinantno DNA. Nastanejo beljakovine bodice in posledično imunski odgovor na njih 2.

V primeru predhodne okužbe z adenovirusi se pojavi problem predobstoječe imunosti. Adenovirusi so imunogeni že sami po sebi, zato so po okužbi z njimi prisotne spominske celice. Nevtralizirajoča protitelesa proti adenovirusom že v majhnih koncentracijah okrnijo privzem vektorja v gostiteljske celice, kar posledično pomeni zmanjšan specifični imunski odziv na transgeni produkt (tj. beljakovina bodice) 3.
Imunogenost in učinkovitost so sprva preverjali na miših in dihurjih, pri čemer so različne skupine prejemale različno visoke odmerke cepiva intranazalno ali intramuskularno. Po cepljenju so jih okužili s SARS-CoV-2 in ugotovili, da so bili odmerki zadostni za zaščito pred okužbo s korona virusom, pri čemer se je intranazalno odmerjanje izkazalo kot bolj učinkovito1.

V 1. fazi kliničnih študij je sodelovalo 108 zdravih prostovoljcev, stari med 18 in 60 let. Razdeljeni so bili v 3 skupine, vsaka je prejela višji odmerek cepiva intramuskularno v roko: 5x1010 virusnih delcev/0,5 mL; 1 × 1011 virusnih delcev/mL; 1,5 × 1011 virusnih delcev/1,5 mL. Po vseh odmerkih so se že 14 dni po cepljenju pojavil zadostni imunski odziv in ker ni bilo prijavljenih hudih negativnih stranskih učinkov, so lahko nadaljevali z 2. fazo kliničnih študij1,4.

V 2. fazi je sodelovalo je 508 zdravih prostovoljcev: 253 oseb je prejemalo 1x1011 virusnih delcev, 129 oseb 5x1010 virusnih delcev, 126 oseb pa placebo. Cepivo so prejeli intramuskularno v roko. Oba odmerka cepiva sta sprožila celični ali humoralni imunski odziv, do 28 dni po prejemu cepiva. Stranski učinki, o katerih so poročali udeleženci, so bili blagi do zmerni - najpogosteje povišana telesna temperatura, glavobol in/ali bolečina na mestu injiciranja. Manjši odmerek (5x1010 virusnih delcev) je spodbudil dovoljšen imunski odziv in malenkost blažje stranske učinke, zato so ta odmerek tudi določili kot varnega in učinkovitega4.
3. faza kliničnih študij še vedno poteka – ko bodo znani rezultati, bomo več vedeli o dejanski učinkovitosti cepiva na dolgi rok in sposobnosti preprečevanja prenosa okužbe.

== Viri ==
1. Wu, S. et al. A single dose of an adenovirus-vectored vaccine provides protection against SARS-CoV-2 challenge. Nat. Commun. (2020) doi:10.1038/s41467-020-17972-1.

2. Tatsis, N. & Ertl, H. C. J. Adenoviruses as vaccine vectors. Molecular Therapy (2004) doi:10.1016/j.ymthe.2004.07.013.

3. Fausther-Bovendo, H. & Kobinger, G. P. Pre-existing immunity against Ad vectors: Humoral, cellular, and innate response, what’s important? Human Vaccines and Immunotherapeutics (2014) doi:10.4161/hv.29594.

4. Zhu, F. C. et al. Immunogenicity and safety of a recombinant adenovirus type-5-vectored COVID-19 vaccine in healthy adults aged 18 years or older: a randomised, double-blind, placebo-controlled, phase 2 trial. Lancet 396, 479–488 (2020).

Značilnosti cepiva CanSino (Ad5)

2021-04-14T18:25:50Z

Ernestinalavrih:

AD5-nCOV oz. Convidecia je cepivo proti okužbi z novim koronavirusom, ki so ga razvili v kitajskem podjetju CanSino Biologics inc. v sodelovanju s pekingškim Inštitutom za biotehnologjo in kitajsko Vojaško akademijo za medicino. Je vektorsko cepivo na osnovi nereplicirajočega adenovirusnega vektorja tipa 5, ki nosi DNA zapis za rekombinantno beljakovino bodice iz virusa Sars-CoV-2. Cepivo naj bi 28 dni po cepljenju zagotavljalo 65,28 % zaščito pred okužbo. Cepivo se injicira v mišico, posameznik prejme 1 odmerek cepiva s 5x10^10 virusnimi delci. Hrani se v hladilniku (2-8 °C) 1. Cepivo je odobreno na Kitajskem, Madžarskem, v Pakistanu, Mehiki in Čilu (april 2021).

Uporabljen adenovirusni vektor vsebuje delecijo zgodnjih genov E1 in E3. V odsotnosti genov E1 se virus ne more razmnoževati, z izbrisom regije E3 pa se prepreči lizo gostiteljske celice. V rekombinantni vektor sta bila klonirana gen za beljakovino bodice in gen za signalni peptid za tkivni aktivator plazminogena (za povečano izražanje v sesalskih celicah) 1.

Po cepljenju gensko spremenjeni adenovirusi vstopijo v gostiteljske celice, kjer v jedro sprostijo rekombinantno DNA. Nastanejo beljakovine bodice in posledično imunski odgovor na njih 2.

V primeru predhodne okužbe z adenovirusi se pojavi problem predobstoječe imunosti. Adenovirusi so imunogeni že sami po sebi, zato so po okužbi z njimi prisotne spominske celice. Nevtralizirajoča protitelesa proti adenovirusom že v majhnih koncentracijah okrnijo privzem vektorja v gostiteljske celice, kar posledično pomeni zmanjšan specifični imunski odziv na transgeni produkt (tj. beljakovina bodice) 3.
Imunogenost in učinkovitost so sprva preverjali na miših in dihurjih, pri čemer so različne skupine prejemale različno visoke odmerke cepiva intranazalno ali intramuskularno. Po cepljenju so jih okužili s SARS-CoV-2 in ugotovili, da so bili odmerki zadostni za zaščito pred okužbo s korona virusom, pri čemer se je intranazalno odmerjanje izkazalo kot bolj učinkovito1.

V 1. fazi kliničnih študij je sodelovalo 108 zdravih prostovoljcev, stari med 18 in 60 let. Razdeljeni so bili v 3 skupine, vsaka je prejela višji odmerek cepiva intramuskularno v roko: 5x1010 virusnih delcev/0,5 mL; 1 × 1011 virusnih delcev/mL; 1,5 × 1011 virusnih delcev/1,5 mL. Po vseh odmerkih so se že 14 dni po cepljenju pojavil zadostni imunski odziv in ker ni bilo prijavljenih hudih negativnih stranskih učinkov, so lahko nadaljevali z 2. fazo kliničnih študij1,4.

V 2. fazi je sodelovalo je 508 zdravih prostovoljcev: 253 oseb je prejemalo 1x1011 virusnih delcev, 129 oseb 5x1010 virusnih delcev, 126 oseb pa placebo. Cepivo so prejeli intramuskularno v roko. Oba odmerka cepiva sta sprožila celični ali humoralni imunski odziv, do 28 dni po prejemu cepiva. Stranski učinki, o katerih so poročali udeleženci, so bili blagi do zmerni - najpogosteje povišana telesna temperatura, glavobol in/ali bolečina na mestu injiciranja. Manjši odmerek (5x1010 virusnih delcev) je spodbudil dovoljšen imunski odziv in malenkost blažje stranske učinke, zato so ta odmerek tudi določili kot varnega in učinkovitega4.
3. faza kliničnih študij še vedno poteka – ko bodo znani rezultati, bomo več vedeli o dejanski učinkovitosti cepiva na dolgi rok in sposobnosti preprečevanja prenosa okužbe.

== Viri ==
1. Wu, S. et al. A single dose of an adenovirus-vectored vaccine provides protection against SARS-CoV-2 challenge. Nat. Commun. (2020) doi:10.1038/s41467-020-17972-1.
2. Tatsis, N. & Ertl, H. C. J. Adenoviruses as vaccine vectors. Molecular Therapy (2004) doi:10.1016/j.ymthe.2004.07.013.
3. Fausther-Bovendo, H. & Kobinger, G. P. Pre-existing immunity against Ad vectors: Humoral, cellular, and innate response, what’s important? Human Vaccines and Immunotherapeutics (2014) doi:10.4161/hv.29594.
4. Zhu, F. C. et al. Immunogenicity and safety of a recombinant adenovirus type-5-vectored COVID-19 vaccine in healthy adults aged 18 years or older: a randomised, double-blind, placebo-controlled, phase 2 trial. Lancet 396, 479–488 (2020).

Značilnosti cepiva CanSino (Ad5)

2021-04-14T18:25:11Z

Ernestinalavrih:

AD5-nCOV oz. Convidecia je cepivo proti okužbi z novim koronavirusom, ki so ga razvili v kitajskem podjetju CanSino Biologics inc. v sodelovanju s pekingškim Inštitutom za biotehnologjo in kitajsko Vojaško akademijo za medicino. Je vektorsko cepivo na osnovi nereplicirajočega adenovirusnega vektorja tipa 5, ki nosi DNA zapis za rekombinantno beljakovino bodice iz virusa Sars-CoV-2. Cepivo naj bi 28 dni po cepljenju zagotavljalo 65,28 % zaščito pred okužbo. Cepivo se injicira v mišico, posameznik prejme 1 odmerek cepiva s 5x10^10 virusnimi delci. Hrani se v hladilniku (2-8 °C) 1. Cepivo je odobreno na Kitajskem, Madžarskem, v Pakistanu, Mehiki in Čilu (april 2021).
Uporabljen adenovirusni vektor vsebuje delecijo zgodnjih genov E1 in E3. V odsotnosti genov E1 se virus ne more razmnoževati, z izbrisom regije E3 pa se prepreči lizo gostiteljske celice. V rekombinantni vektor sta bila klonirana gen za beljakovino bodice in gen za signalni peptid za tkivni aktivator plazminogena (za povečano izražanje v sesalskih celicah) 1.
Po cepljenju gensko spremenjeni adenovirusi vstopijo v gostiteljske celice, kjer v jedro sprostijo rekombinantno DNA. Nastanejo beljakovine bodice in posledično imunski odgovor na njih 2.
V primeru predhodne okužbe z adenovirusi se pojavi problem predobstoječe imunosti. Adenovirusi so imunogeni že sami po sebi, zato so po okužbi z njimi prisotne spominske celice. Nevtralizirajoča protitelesa proti adenovirusom že v majhnih koncentracijah okrnijo privzem vektorja v gostiteljske celice, kar posledično pomeni zmanjšan specifični imunski odziv na transgeni produkt (tj. beljakovina bodice) 3.
Imunogenost in učinkovitost so sprva preverjali na miših in dihurjih, pri čemer so različne skupine prejemale različno visoke odmerke cepiva intranazalno ali intramuskularno. Po cepljenju so jih okužili s SARS-CoV-2 in ugotovili, da so bili odmerki zadostni za zaščito pred okužbo s korona virusom, pri čemer se je intranazalno odmerjanje izkazalo kot bolj učinkovito1.
V 1. fazi kliničnih študij je sodelovalo 108 zdravih prostovoljcev, stari med 18 in 60 let. Razdeljeni so bili v 3 skupine, vsaka je prejela višji odmerek cepiva intramuskularno v roko: 5x1010 virusnih delcev/0,5 mL; 1 × 1011 virusnih delcev/mL; 1,5 × 1011 virusnih delcev/1,5 mL. Po vseh odmerkih so se že 14 dni po cepljenju pojavil zadostni imunski odziv in ker ni bilo prijavljenih hudih negativnih stranskih učinkov, so lahko nadaljevali z 2. fazo kliničnih študij1,4.
V 2. fazi je sodelovalo je 508 zdravih prostovoljcev: 253 oseb je prejemalo 1x1011 virusnih delcev, 129 oseb 5x1010 virusnih delcev, 126 oseb pa placebo. Cepivo so prejeli intramuskularno v roko. Oba odmerka cepiva sta sprožila celični ali humoralni imunski odziv, do 28 dni po prejemu cepiva. Stranski učinki, o katerih so poročali udeleženci, so bili blagi do zmerni - najpogosteje povišana telesna temperatura, glavobol in/ali bolečina na mestu injiciranja. Manjši odmerek (5x1010 virusnih delcev) je spodbudil dovoljšen imunski odziv in malenkost blažje stranske učinke, zato so ta odmerek tudi določili kot varnega in učinkovitega4.
3. faza kliničnih študij še vedno poteka – ko bodo znani rezultati, bomo več vedeli o dejanski učinkovitosti cepiva na dolgi rok in sposobnosti preprečevanja prenosa okužbe.

== Viri ==
1. Wu, S. et al. A single dose of an adenovirus-vectored vaccine provides protection against SARS-CoV-2 challenge. Nat. Commun. (2020) doi:10.1038/s41467-020-17972-1.
2. Tatsis, N. & Ertl, H. C. J. Adenoviruses as vaccine vectors. Molecular Therapy (2004) doi:10.1016/j.ymthe.2004.07.013.
3. Fausther-Bovendo, H. & Kobinger, G. P. Pre-existing immunity against Ad vectors: Humoral, cellular, and innate response, what’s important? Human Vaccines and Immunotherapeutics (2014) doi:10.4161/hv.29594.
4. Zhu, F. C. et al. Immunogenicity and safety of a recombinant adenovirus type-5-vectored COVID-19 vaccine in healthy adults aged 18 years or older: a randomised, double-blind, placebo-controlled, phase 2 trial. Lancet 396, 479–488 (2020).

Značilnosti cepiva CanSino (Ad5)

2021-04-14T18:23:28Z

Ernestinalavrih: New page: AD5-nCOV oz. Convidecia je cepivo proti okužbi z novim koronavirusom, ki so ga razvili v kitajskem podjetju CanSino Biologics inc. v sodelovanju s pekingškim Inštitutom za biotehnologjo...

AD5-nCOV oz. Convidecia je cepivo proti okužbi z novim koronavirusom, ki so ga razvili v kitajskem podjetju CanSino Biologics inc. v sodelovanju s pekingškim Inštitutom za biotehnologjo in kitajsko Vojaško akademijo za medicino. Je vektorsko cepivo na osnovi nereplicirajočega adenovirusnega vektorja tipa 5, ki nosi DNA zapis za rekombinantno beljakovino bodice iz virusa Sars-CoV-2. Cepivo naj bi 28 dni po cepljenju zagotavljalo 65,28 % zaščito pred okužbo. Cepivo se injicira v mišico, posameznik prejme 1 odmerek cepiva s 5x10^10 virusnimi delci. Hrani se v hladilniku (2-8 °C) 1. Cepivo je odobreno na Kitajskem, Madžarskem, v Pakistanu, Mehiki in Čilu (april 2021).
Uporabljen adenovirusni vektor vsebuje delecijo zgodnjih genov E1 in E3. V odsotnosti genov E1 se virus ne more razmnoževati, z izbrisom regije E3 pa se prepreči lizo gostiteljske celice. V rekombinantni vektor sta bila klonirana gen za beljakovino bodice in gen za signalni peptid za tkivni aktivator plazminogena (za povečano izražanje v sesalskih celicah) 1.
Po cepljenju gensko spremenjeni adenovirusi vstopijo v gostiteljske celice, kjer v jedro sprostijo rekombinantno DNA. Nastanejo beljakovine bodice in posledično imunski odgovor na njih 2.
V primeru predhodne okužbe z adenovirusi se pojavi problem predobstoječe imunosti. Adenovirusi so imunogeni že sami po sebi, zato so po okužbi z njimi prisotne spominske celice. Nevtralizirajoča protitelesa proti adenovirusom že v majhnih koncentracijah okrnijo privzem vektorja v gostiteljske celice, kar posledično pomeni zmanjšan specifični imunski odziv na transgeni produkt (tj. beljakovina bodice) 3.
Imunogenost in učinkovitost so sprva preverjali na miših in dihurjih, pri čemer so različne skupine prejemale različno visoke odmerke cepiva intranazalno ali intramuskularno. Po cepljenju so jih okužili s SARS-CoV-2 in ugotovili, da so bili odmerki zadostni za zaščito pred okužbo s korona virusom, pri čemer se je intranazalno odmerjanje izkazalo kot bolj učinkovito1.
V 1. fazi kliničnih študij je sodelovalo 108 zdravih prostovoljcev, stari med 18 in 60 let. Razdeljeni so bili v 3 skupine, vsaka je prejela višji odmerek cepiva intramuskularno v roko: 5x1010 virusnih delcev/0,5 mL; 1 × 1011 virusnih delcev/mL; 1,5 × 1011 virusnih delcev/1,5 mL. Po vseh odmerkih so se že 14 dni po cepljenju pojavil zadostni imunski odziv in ker ni bilo prijavljenih hudih negativnih stranskih učinkov, so lahko nadaljevali z 2. fazo kliničnih študij1,4.
V 2. fazi je sodelovalo je 508 zdravih prostovoljcev: 253 oseb je prejemalo 1x1011 virusnih delcev, 129 oseb 5x1010 virusnih delcev, 126 oseb pa placebo. Cepivo so prejeli intramuskularno v roko. Oba odmerka cepiva sta sprožila celični ali humoralni imunski odziv, do 28 dni po prejemu cepiva. Stranski učinki, o katerih so poročali udeleženci, so bili blagi do zmerni - najpogosteje povišana telesna temperatura, glavobol in/ali bolečina na mestu injiciranja. Manjši odmerek (5x1010 virusnih delcev) je spodbudil dovoljšen imunski odziv in malenkost blažje stranske učinke, zato so ta odmerek tudi določili kot varnega in učinkovitega4.
3. faza kliničnih študij še vedno poteka – ko bodo znani rezultati, bomo več vedeli o dejanski učinkovitosti cepiva na dolgi rok in sposobnosti preprečevanja prenosa okužbe.

1. Wu, S. et al. A single dose of an adenovirus-vectored vaccine provides protection against SARS-CoV-2 challenge. Nat. Commun. (2020) doi:10.1038/s41467-020-17972-1.
2. Tatsis, N. & Ertl, H. C. J. Adenoviruses as vaccine vectors. Molecular Therapy (2004) doi:10.1016/j.ymthe.2004.07.013.
3. Fausther-Bovendo, H. & Kobinger, G. P. Pre-existing immunity against Ad vectors: Humoral, cellular, and innate response, what’s important? Human Vaccines and Immunotherapeutics (2014) doi:10.4161/hv.29594.
4. Zhu, F. C. et al. Immunogenicity and safety of a recombinant adenovirus type-5-vectored COVID-19 vaccine in healthy adults aged 18 years or older: a randomised, double-blind, placebo-controlled, phase 2 trial. Lancet 396, 479–488 (2020).

Protikovidna cepiva

2021-04-14T18:20:00Z

Ernestinalavrih:

Študentski seminar pri predmetu Molekularna biotehnologija 2020/21 
Univerza v Ljubljani, Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo 
Magistrski študij Biokemija 

Seminar pripravljajo študentje 1. in 2. letnika magistrskega študija. Kratki povzetki morajo biti napisani na taki ravni zahtevnosti, da so razumljivi širši javnosti. Predstavitve seminarjev (6 oz. 12 minut) imajo splošen uvod in strokovno nadaljevanje. Vsebina temelji na javno dostopnih podatkih v času priprave seminarja. Po zadnji seminarski predstavitvi bomo predvidoma izdali zbornih povzetkov, ki bo vključeval tudi slikovne razlage. Poleg tega seminarja morajo študentje pripraviti tudi daljšo predstavitev teme iz znanstvene literature.

Razpored predstavitev:

# [[Molekularnobiološke značilnosti SARS-CoV-2 in aktualni mutanti (južnoafriški, britanski, nigerijski,...)]] - 11.3. (12 min) 
# [[Interakcija SARS-CoV-2 s tarčno celico]] - 11.3. (6 min) 
# [[Značilnosti cepiva proizvajalca Moderna (mRNA)]] - 18.3. (12 min) 
# [[Rezultati kliničnih testiranj cepiva proizvajalca Moderna (mRNA) ]] - 18.3.(6 min) 
# [[Značilnosti cepiva proizvajalca AstraZeneca / Oxford University (ChAdOx1)]] - 25.3. (12 min) 
# [[Rezultati kliničnih testiranj proizvajalca AstraZeneca / Oxford University (ChAdOx1)]] - 25.3. (6 min) 
# [[Značilnosti cepiva proizvajalca Pfizer / BioNTech (mRNA)]] - 1.4. (12 min) 
# [[Rezultati kliničnih testiranj cepiva proizvajalca Pfizer / BioNTech (mRNA)]] - 1.4. (12 min) 
# [[Značilnosti cepiva proizvajalca Johnson&Johnson / Jennsen (Ad26)]] - 8.4. (6 min) 
# [[Opuščena cepiva: Merck (IAVI, Themix), Imperial College London, Univ. of Queensland]] - 8.4. (12 min) 
# [[Značilnosti cepiva Sputnik V (Gamaleya) (Ad26, Ad5)]] - 15.4. (12 min) 
# [[Značilnosti cepiva CanSino (Ad5)]] - 15.4. (12 min) 
# Značilnosti cepiv Sinopharm in Sinovac (inaktivirano) - 22.4. (12 min) 
# Značilnosti cepiva Bharat Biotech (inaktivirano) - 22.4. (12 min) 
# Značilnosti cepiva Novavax (proteinsko) - 6.5. (12 min) 
# Značilnosti cepiva Vector Institute (proteinsko) - 6.5. (6 min) 
# Značilnosti cepiva EpiVacCorona (peptidno) - 13.5. (6 min) 
nerazporejeno:
# Značilnosti cepiva Zyadus Cadilla (DNA) - 13.5. 
# Značilnosti cepiva COVAXX / UBI (peptidno) - 20.5. 
 
----
Povezava do [https://www.youtube.com/watch?v=K3odScka55A videa z razlago] o načinu določanja učinkovitosti cepiv in o (ne)smislu primerjanja teh vrednosti (Vox).

MBT seminarji 2021

2021-03-10T19:10:56Z

Ernestinalavrih:

BNT-seminar

2021-03-09T07:52:29Z

Ernestinalavrih:

= Bionanotehnologija 2021- seminar =
doc. dr. Gregor Gunčar, K2.022

== Seznam seminarjev ==

{| {{table}}
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Vpisna številka'''
30170005 
30019057 
30170131 
30170078 
30170177 
30019063 
30170103 
30170002 
30200319 
30200309 
30200320 
30019056 
30200311 
30200306 
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''datum predstavitve'''
16.3.2021 
30.3.2021 
6.4.2021 
6.4.2021 
13.4.2021 
20.4.2021 
4.5.2021 
4.5.2021 
23.3.2021 
20.4.2020 
6.4.2021 
4.5.2021 
11.5.2021 
18.5.2021 
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''recenzent1'''
Anamarija Agnič 
Barbara Slapnik 
Tina Kolenc Milavec 
Klementina Polanec 
Martin Špendl 
Sara Laznik 
Martina Lokar 
Doroteja Armič 
Martin Špendl 
Saša Slabe 
Mateja Žvipelj 
Špela Supej 
Urška Fajdiga 
Ernestina Lavrih 
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''recenzent2'''
Urška Pečarič Strnad 
Sara Laznik 
Luka Gnidovec 
Irma Zeljković 
Jernej Imperl 
Urša Lovše 
Mateja Žvipelj 
Neža Pavko 
Almina Tahirović 
Nika Mikulič Vernik 
Urška Fajdiga 
Saša Slabe 
Klementina Polanec 
Tjaša Mlakar 
|-

==Naloga==
Pripravite projektno nalogo iz področja Bionanotehnologije. Najpomembnejša je originalna ideja za nek izvedljiv projekt, ki pa mora biti takšen, da pritegne investitorje. Ker je pomembno tudi kako boste to naredili, morate predstaviti tudi metodo in ne samo ideje. Natančno morate vedeti, kako boste projekt izvedli.

Predlagana struktura teksta:
* Uvod
* Predstavitev problema, znanstvena izhodišča, cilji
* Izvedba projekta, metodologija, tehnike, materiali, vprašanja, hipoteze
* Literatura

Za pripravo seminarja velja naslednje: 
* Elektronska verzija seminarja: avtor, naslov projekta, razširjeni povzetek projekta- 350-400 besed (brez literature) in grafični povzetek (čez približno pol strani). Vse naj bo na maksimalno dveh straneh, a ne sme vsebovati manj kot 350 besed (sem se ne šteje literatura).
* Elektronsko verzijo seminarja oddajte en dan pred predstavitvijo, kasneje pa boste vsebino še prekopirali na za to določeno spletno stran, predstavitev pa eno uro pred seminarjem na [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/ strežnik].
* Vsi seminarji so v elektronski obliki dostopni [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/bioseminar/ tukaj].
* Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Za predstavitev je na voljo XY minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni.
* Predstavitvi sledi razprava. Recenzenta morate predlagati vsaj eno izboljšavo predstavljenega projekta.

==Imena datotek==
Prosim vas, da vse datoteke poimenujete po naslednjem modelu:
* 20_nano_Priimek.doc za seminar, npr. 20_nano_Craik_Venter.doc
* 20_nano_Priimek.ppt za prezentacijo, npr. 20_nano_Craik_Venter.ppt

==Urejanje spletnih strani na wikiju==
Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''

==Citiranje virov==
Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se držite ene same. V seminarskih nalogah in diplomskih nalogah FKKT uprabljajte shemo citiranja, ki je pobarvana zeleno.
Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati.
Za citate v naravoslovju je najpogostejše citiranje po pravilniku ISO 690. [http://www.zveza-zotks.si/gzm/dokumenti/literatura.html Pravila], ki upoštevajo omenjeni standard, so pripravili pri ZTKS. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati. 
'''Citiranje knjig:''' 
Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica. 
Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN. 

Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005. 
Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4. 
Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.).

'''Citiranje člankov:''' 
Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani. 
Lartigue, C., Glass, J. I., Alperovich, N., Pieper, R., Parmar, P. P., Hutchison III, C. A., Smith, H. O. in Venter, J. C.
Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, 317, str. 632-638.

Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole: 
Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani. 
Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.

Revija Science uporablja skrajšani zapis: 
C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007) 

V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne). Navesti morate tudi vse avtorje dela, razen v primeru, ko jih je 10 ali več. Takrat navedite le prvih devet, za ostale pa uporabite okrajšavo in sod. (in sodelavci). Pred zadnjim avtorjem naj bo vedno besedica "in".

'''Citiranje spletnih virov:''' 
Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov 
strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life 
Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.

BNT-seminar

2021-03-09T07:51:37Z

Ernestinalavrih:

= Bionanotehnologija 2021- seminar =
doc. dr. Gregor Gunčar, K2.022

== Seznam seminarjev ==

{| {{table}}
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Vpisna številka'''
30170005 
30019057 
30170131 
30170078 
30170177 
30019063 
30170103 
30170002 
30200319 
30200309 
30200320 
30019056 
30200311 
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''datum predstavitve'''
16.3.2021 
30.3.2021 
6.4.2021 
6.4.2021 
13.4.2021 
20.4.2021 
4.5.2021 
4.5.2021 
23.3.2021 
20.4.2020 
6.4.2021 
4.5.2021 
11.5.2021 
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''recenzent1'''
Anamarija Agnič 
Barbara Slapnik 
Tina Kolenc Milavec 
Klementina Polanec 
Martin Špendl 
Sara Laznik 
Martina Lokar 
Doroteja Armič 
Martin Špendl 
Saša Slabe 
Mateja Žvipelj 
Špela Supej 
Urška Fajdiga 
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''recenzent2'''
Urška Pečarič Strnad 
Sara Laznik 
Luka Gnidovec 
Irma Zeljković 
Jernej Imperl 
Urša Lovše 
Mateja Žvipelj 
Neža Pavko 
Almina Tahirović 
Nika Mikulič Vernik 
Urška Fajdiga 
Saša Slabe 
Klementina Polanec 
|-

==Naloga==
Pripravite projektno nalogo iz področja Bionanotehnologije. Najpomembnejša je originalna ideja za nek izvedljiv projekt, ki pa mora biti takšen, da pritegne investitorje. Ker je pomembno tudi kako boste to naredili, morate predstaviti tudi metodo in ne samo ideje. Natančno morate vedeti, kako boste projekt izvedli.

Predlagana struktura teksta:
* Uvod
* Predstavitev problema, znanstvena izhodišča, cilji
* Izvedba projekta, metodologija, tehnike, materiali, vprašanja, hipoteze
* Literatura

Za pripravo seminarja velja naslednje: 
* Elektronska verzija seminarja: avtor, naslov projekta, razširjeni povzetek projekta- 350-400 besed (brez literature) in grafični povzetek (čez približno pol strani). Vse naj bo na maksimalno dveh straneh, a ne sme vsebovati manj kot 350 besed (sem se ne šteje literatura).
* Elektronsko verzijo seminarja oddajte en dan pred predstavitvijo, kasneje pa boste vsebino še prekopirali na za to določeno spletno stran, predstavitev pa eno uro pred seminarjem na [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/ strežnik].
* Vsi seminarji so v elektronski obliki dostopni [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/bioseminar/ tukaj].
* Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Za predstavitev je na voljo XY minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni.
* Predstavitvi sledi razprava. Recenzenta morate predlagati vsaj eno izboljšavo predstavljenega projekta.

==Imena datotek==
Prosim vas, da vse datoteke poimenujete po naslednjem modelu:
* 20_nano_Priimek.doc za seminar, npr. 20_nano_Craik_Venter.doc
* 20_nano_Priimek.ppt za prezentacijo, npr. 20_nano_Craik_Venter.ppt

==Urejanje spletnih strani na wikiju==
Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''

==Citiranje virov==
Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se držite ene same. V seminarskih nalogah in diplomskih nalogah FKKT uprabljajte shemo citiranja, ki je pobarvana zeleno.
Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati.
Za citate v naravoslovju je najpogostejše citiranje po pravilniku ISO 690. [http://www.zveza-zotks.si/gzm/dokumenti/literatura.html Pravila], ki upoštevajo omenjeni standard, so pripravili pri ZTKS. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati. 
'''Citiranje knjig:''' 
Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica. 
Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN. 

Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005. 
Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4. 
Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.).

'''Citiranje člankov:''' 
Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani. 
Lartigue, C., Glass, J. I., Alperovich, N., Pieper, R., Parmar, P. P., Hutchison III, C. A., Smith, H. O. in Venter, J. C.
Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, 317, str. 632-638.

Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole: 
Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani. 
Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.

Revija Science uporablja skrajšani zapis: 
C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007) 

V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne). Navesti morate tudi vse avtorje dela, razen v primeru, ko jih je 10 ali več. Takrat navedite le prvih devet, za ostale pa uporabite okrajšavo in sod. (in sodelavci). Pred zadnjim avtorjem naj bo vedno besedica "in".

'''Citiranje spletnih virov:''' 
Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov 
strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life 
Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.

BNT-seminar

2021-03-09T07:50:18Z

Ernestinalavrih:

= Bionanotehnologija 2021- seminar =
doc. dr. Gregor Gunčar, K2.022

== Seznam seminarjev ==

{| {{table}}
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Vpisna številka'''
30170005 
30019057 
30170131 
30170078 
30170177 
30019063 
30170103 
30170002 
30200319 
30200309 
30200320 
30019056 
30200311 
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''datum predstavitve'''
16.3.2021 
30.3.2021 
6.4.2021 
6.4.2021 
13.4.2021 
20.4.2021 
4.5.2021 
4.5.2021 
23.3.2021 
20.4.2020 
6.4.2021 
4.5.2021 
11.5.2021 
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''recenzent1'''
Anamarija Agnič 
Barbara Slapnik 
Tina Kolenc Milavec 
Klementina Polanec 
Martin Špendl 
Sara Laznik 
Martina Lokar 
Doroteja Armič 
Martin Špendl 
Saša Slabe 
Mateja Žvipelj 
Špela Supej 
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''recenzent2'''
Urška Pečarič Strnad 
Sara Laznik 
Luka Gnidovec 
Irma Zeljković 
Jernej Imperl 
Urša Lovše 
Mateja Žvipelj 
Neža Pavko 
Almina Tahirović 
Nika Mikulič Vernik 
Urška Fajdiga 
Saša Slabe 
Ernestina Lavrih 
|-

==Naloga==
Pripravite projektno nalogo iz področja Bionanotehnologije. Najpomembnejša je originalna ideja za nek izvedljiv projekt, ki pa mora biti takšen, da pritegne investitorje. Ker je pomembno tudi kako boste to naredili, morate predstaviti tudi metodo in ne samo ideje. Natančno morate vedeti, kako boste projekt izvedli.

Predlagana struktura teksta:
* Uvod
* Predstavitev problema, znanstvena izhodišča, cilji
* Izvedba projekta, metodologija, tehnike, materiali, vprašanja, hipoteze
* Literatura

Za pripravo seminarja velja naslednje: 
* Elektronska verzija seminarja: avtor, naslov projekta, razširjeni povzetek projekta- 350-400 besed (brez literature) in grafični povzetek (čez približno pol strani). Vse naj bo na maksimalno dveh straneh, a ne sme vsebovati manj kot 350 besed (sem se ne šteje literatura).
* Elektronsko verzijo seminarja oddajte en dan pred predstavitvijo, kasneje pa boste vsebino še prekopirali na za to določeno spletno stran, predstavitev pa eno uro pred seminarjem na [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/ strežnik].
* Vsi seminarji so v elektronski obliki dostopni [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/bioseminar/ tukaj].
* Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Za predstavitev je na voljo XY minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni.
* Predstavitvi sledi razprava. Recenzenta morate predlagati vsaj eno izboljšavo predstavljenega projekta.

==Imena datotek==
Prosim vas, da vse datoteke poimenujete po naslednjem modelu:
* 20_nano_Priimek.doc za seminar, npr. 20_nano_Craik_Venter.doc
* 20_nano_Priimek.ppt za prezentacijo, npr. 20_nano_Craik_Venter.ppt

==Urejanje spletnih strani na wikiju==
Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''

==Citiranje virov==
Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se držite ene same. V seminarskih nalogah in diplomskih nalogah FKKT uprabljajte shemo citiranja, ki je pobarvana zeleno.
Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati.
Za citate v naravoslovju je najpogostejše citiranje po pravilniku ISO 690. [http://www.zveza-zotks.si/gzm/dokumenti/literatura.html Pravila], ki upoštevajo omenjeni standard, so pripravili pri ZTKS. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati. 
'''Citiranje knjig:''' 
Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica. 
Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN. 

Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005. 
Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4. 
Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.).

'''Citiranje člankov:''' 
Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani. 
Lartigue, C., Glass, J. I., Alperovich, N., Pieper, R., Parmar, P. P., Hutchison III, C. A., Smith, H. O. in Venter, J. C.
Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, 317, str. 632-638.

Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole: 
Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani. 
Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.

Revija Science uporablja skrajšani zapis: 
C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007) 

V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne). Navesti morate tudi vse avtorje dela, razen v primeru, ko jih je 10 ali več. Takrat navedite le prvih devet, za ostale pa uporabite okrajšavo in sod. (in sodelavci). Pred zadnjim avtorjem naj bo vedno besedica "in".

'''Citiranje spletnih virov:''' 
Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov 
strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life 
Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.