Wiki FKKT - User contributions [en]

Odkritje in opis regij CRISPR in Cas (do leta ~2002)

2019-04-14T18:26:53Z

Eva Gartner: /* Prvo odkritje */

==Uvod==

Analize celotnih genomov organizmov so znanstvenikom omogočile primerjavo le teh med posameznimi organizmi. Rezultati raziskav so pokazali, da so pri velikem številu prokariontov prisotna ponavljajoča zaporedja. Ta so lahko daljša ( do 100 kbp), ki jim pogosto pripisujejo kakšno biološko pomembno funkcijo ali pa krajša, sestavljena iz le nekaj nukleotidov . Slednje delimo na zaporedna ponavljajoča zaporedja, pri katerih so si enote, ki se ponavljajo sosednje in prekinjena ponavljajoča zaporedja, pri katerih so med posameznimi ponavljajočimi se zaporedji heterogene prekinitvene sekvence različnih dolžin. Naš seminar se osredotoča na odkritje obstoja posebne družine prekinjenih ponavljajočih zaporedij, ki so jih kasneje poimenovali zaporedja CRISPR.

==Prvo odkritje==

Odkritje prvih ponavljajočih se zaporedij je bilo povsem naključno. Leta 1987 je skupina znanstvenikov na čelu z Yoshizumi Ishinom naredila raziskavo, pri katerem so želeli indetificirati protein, odgovoren za pretvorbo izocima alkalna fosfataza pri organizmu ''Escherichia coli''
(celice K-12). Uspelo jim je sekvencirati 1,7 kbp dolg fragment DNA v katerem se je med drugim nahajal gen iap, za katerega so sklepali, da zapisuje preiskovani protein. Najprej so pripravili plazmidne vektorje v katere so klonirali tarčni DNA fragment , nato pa so ga po razgradnji na manjše fragmente prenesli v vektor M13, saj je za sekvenciranje po Sangerjevi metodi potrebna enoverižna DNA. Nukleotidno zaporedje so določili z gelsko elektroforezo in avtoradiografijo. Med sekvenciranjem DNA fragmenta so na njegovem 3΄ koncu opazili nenavadno strukturo. Navzdol po genomu od gena iap se je nahajalo pet močno homolognih sekvenc, sestavljenih iz 29 nukleotidov, znotraj katerih je bilo palindromsko zaporedje 14 bp, med njimi pa so bile prekinitve iz 32 nukleotidov. Že nekaj let pred tem odkritjem, leta 1984, so pri raziskavi na bakterijah ''E. coli'' in ''Salmonella enterica'' opazili palindromska zaporedja, ki so jim pripisali funkcijo stabilizacije mRNA, vendar ob primerjavi niso našli nobene podobnosti med temi zaporedji in na novo odkritimi zaporedji . To odkritje je bilo tako skrivnostno, da so ga omenili celo v razpravi na koncu članka, čeprav takrat še niso razumeli njihove biološke funkcije. Znanost v času te raziskave še ni bila tako razvita in niso poznali danes razvitih metod sekvenciranja in kloniranja DNA fragmentov, zato je bil celoten postopek dolgotrajen. Več mesecev so potrebovali, da so natančno določili ponavljajoče zaporedje. Težave jim je povzročala predvsem sekundarna struktura, ki je nastala zaradi palindromskega zaporedja. Neverjetno je, da bi lahko z danes poznano tehnologijo npr. s polimerazno verižno reakcijo enako regijo posekvencirali v enem dnevu.

Temu odkritju je kmalu sledilo še več odkritij enakih ponavljajočih zaporedij pri različnih sevih ''E. coli'' in nekaterih ostalih bakterijah ( npr. ''Salmonella typhimurium'' in ''Shigela dysenteriae''). Do pomembnega odkritja so leta 1993 prišli tudi nizozemski znanstveniki, ki so prekinjena ponavljajoča zaporedja našli pri preučevanju bakterije ''Mycobacterium tuberculosis''. S prmerjavo majhnega dela te regije mnogih različnih sevov so preučevali pojav polimorfizma ponavljajočih zaporedij pri omenjeni bakteriji, ki so posledica genetskih prerazporeditev. Na podlagi polimorfizma so razvili metodo za njihovo identifikacijo.

V prvih letih raziskovanja je bilo javno dostopnih zelo malo podatkov o sekvenciranih genomih, zato so prekinjena ponavljajoča zaporedja opazili pri relativno majhnem številu organizmov. Ob razvoju novih tehnik sekvenciranja pa je bilo teh podatkov vedno več, čemur so sledila tudi vedno večja odkritja na tem področju.

==Odkritje regij CRISPR pri arhejah (1993–2000)==

Pri arhejah je takšna zaporedja prvi opazil Francisco Juan Martinez Mojica, ki je kot del mikrobiološke skupine na Univerzi Alicante v Španiji raziskoval regulatorne mehanizme haloarhej in njihovo prilagajanje na spremembe v okolju. Preučevani organizem je bil ''Haloferax mediterranei'' – haloarheja, ki živi v okoljih, kjer slanost doseže tudi 20–25 %. Mojica se je pri raziskovanju usmeril na gensko še nekategorizirane regije genoma ''H. mediterranei'', ki so bile predvidoma zaradi spremembe v slanosti okolja podvržene nekakšnim DNA-modifikacijam. Vendar pa so pri sekvenciranju in genski analizi teh regij naleteli na nepričakovan vzorec. Avtoradiogram je pokazal DNA-segmente, dolge približno 30 bp, ki se ponavljajo na konstantnih razdaljah. Po dodatnem sekvenciranju regij so odkrili prisotnost vsaj 14 skoraj popolnoma ohranjenih ponovitev, vsaka ponovitev pa je vključevala kratko obrnjeno palindromsko ponovitev. Ponavljajoči vzorci so se nahajali na nekodirajočem območju genoma, poleg ORF (»open reading frames«), ki niso bili homologni nobenemu do takrat znanemu proteinu. Poleg tega pa so pri ponavljajočih se regijah zaznali številne transkripte RNA, kar nakazuje na visoko procesirano RNA iz teh regij. Čeprav so bila takšna ponavljajoča zaporedja opažena že pri nekaterih bakterijah (''Escherichia coli'', ''Mycobacterium spp''.), so bila pri tem eksperimentu prvič videna pri arhejah.

Medtem ko so za bakterijske ponovitve takrat le predvidevali o njihovi biološki funkciji, npr. regulacija sosednjih genov, so biološke funkcije TREPs (Tandem REPeats) pri arhejah tudi eksperimentalno raziskovali. TREP-zaporedja so našli v kromosomu in plazmidu ''H. mediterranei'' in sorodni haloarheji – ''Haloferax volcanii''. Zaradi možnosti genske manipulacije so pri celicah ''H. volcanii'' raziskovali učinek prisotnosti rekombinantnega plazmida, ki je vseboval fragmente TREP. Dve hipotezi o biološki funkciji TREPs so takoj ovrgli, in sicer njihovo vlogo pri rekombinaciji DNA in regulaciji sosednjih genov. Nesmiselno bi bilo predvidevati, da bi bile tako velike genske strukture povezane zgolj z regulacijo transkripcije nekaj genov. Predpostavili pa so, da morajo TREPs igrati pomembno vlogo pri celičnem ciklu. Prisotni so namreč v največjih in najverjetneje najpomembnejših replikonih celice. Poleg tega je prisotnost dodatnih kopij TREP (vstavljene v gostujočo celico s pomočjo vektorja) povzročila zmanjšano preživetje celic in spremembo v sestavi DNA, kar podpira hipotezo, da imajo TREPs pomembno vlogo pri ločevanju replikonov. Zaradi visoke ohranjenosti TREPs med vrstami haloarhej in prisotnosti zelo podobnih struktur pri ''E. coli'' pa so lahko ugibali, da imajo TREPs univerzalno oz. podobno vlogo pri organizmih, kjer so jih odkrili.

Za dokaz zgornjih predvidevanj o biološki funkciji TREPs so bile seveda potrebne dodatne študije na haloarhejah, za katere pa Mojica ni dobil finančne podpore. Poskuse je zato moral nadaljevati na ''E. coli'', kjer enaki eksperimenti kot prej na ''H. volcanii'' niso dali željenih rezultatov. Dodatne raziskave niso podale nobenega dokaza o vpletenosti ponavljajočih se zaporedij v ločitveni aparat, iz rezultatov pa bi lahko sklepali, da bi zaporedja lahko služila kot nekakšna mesta za kooperativno vezavo na celične strukture, npr. na citoplazemsko membrano, ali proteine, vplivali pa bi lahko tudi na strukturo DNA.

Leta 1995 je bil objavljen prvi celoten genom prostoživečega organizma, s čimer se je začela nova doba v biologiji. Pospešeno sekvenciranje je pripomoglo k nastanku dodatnih zbirk prokariontskih genomov, na podlagi česar je leta 1996 lahko nastalo prvo celovito poročilo o konstantno ponavljajočih se regijah v celotnem genomu. Do konca stoletja so podobna zaporedja odkrili še v 12 vrstah arhej in bakterij.

==F. Mojica (2000)==

Povečano število znanih genomov bakterij in arhej je pospešilo raziskave o motivih zaporedij DNA. Francisco Mojica je leta 2000 potrdil prisotnost ponavljajočih zaporedij v prokariontih, katero so s kolegi predstavili kot posebno družino prokariontskih zaporedij pod imenom SRSR (short regularly spaced repeats). Z analizami so ugotovili, da so SRSR prisotni znotraj genomov večine arhej ter različnih skupin bakterij in tako predstavljajo eno najbolj razširjenih družin v prokariontskih genomih. Ugotovili so, da so SRSR zaporedja znotraj enega genoma precej homogena, pojavljajo pa se tudi podobnosti razporeditve med organizmi, ki izhajajo iz skupnega prednika ter podobnosti znotraj posameznih domen.
V tej raziskavi je bilo ključno odkritje pojav kratkih palindromskih zaporedij v dodatnih organizmih in s tem vpeljava nove družine nukleotidnih zaporedij, za katero je značilno da so ločena s stalno dolgimi prekinitvenimi zaporedji. Čeprav so odkrili podobna zaporedja znotraj genomov različnih prokariontov, niso vedeli, če ima ta družina zaporedij tudi skupno funkcijo v vseh prokariontih.

==R. Jansen (2002)==

Novo imenovana družina zaporedij je spodbudila raziskave na Nizozemskem pod vodstvom Ruuda Jansena. Z računalniško analizo so želeli določiti lokacije SRSR v do tedaj znanih prokariontskih genomih. Izbirali so posamezna SRSR zaporedja bakterij in arhej, ter jih primerjali s celotnimi genomi prokariontov. Primerjali so tudi prekinitvena zaporedja, ki so med SRSR, ter prišli do spoznanja, da so tako SRSR kot prekinitvena zaporedja večinoma unikatna za genom posamezne vrste. V nadaljevanju so zato iskali nove lokacije SRSR na podlagi njihovega motiva ponavljanja, ki pa je bil zanje značilen v vseh do tedaj odkritih zaporedij – kratka palindromska zaporedja alternirajo s prekinitvenimi zaporedji stalnih dolžin. Z analizami so v več organizmih odkrili tudi prisotnost daljših zaporedij na enem koncu SRSR in predpostavili, da daljše zaporedje in SRSR skupaj predstavljata eno enoto. Ta zaporedja pred SRSR so poimenovali vodilna zaporedja, ki so si glede na zaporedje baz podobna le znotraj enega genoma, vendar pa imajo nekatere splošne skupne lastnosti. Nimajo odprtega bralnega okvirja, torej ne vsebujejo zaporedja, ki bi kodiralo za proteine, poleg tega pa pogosto vsebujejo sosledje enakih nukleotidov in na splošno velik delež adenina in timina.

Nova odkrtija so znanstvenike gnala k dodatnem raziskovanju, vendar so ugotovili, da so bila v preteklosti v tisku uporabljena različna poimenovanja za novo odkrit motiv ponavljanja znotraj DNA. V namen poenotenja sta zato Jansen in Mojica leta 2002 vpeljala novo ime, ki je ostalo v uporabi do danes – CRISPR (clustered regularly spaced palindromic repeats). Ob vpeljavi novega imena je Jansen s kolegi odkril tudi novo lastnost CRISPR zaporedij. S primerjavo genov ob CRISPR zaporedjih so odkrili pogosto prisotnost štirih genov, ki jih niso našli v prokariontih brez CRISPR regij. Skupino novo odkritih genov so poimenovali cas (CRISPR associated genes), posamezne gene pa od Cas1 do Cas4. V tej raziskavi še niso identificirali točne funkcije vseh cas genov, so pa predpostavili vlogi genov Cas3 in Cas4. Analiza aminokislinskih ostankov teh dveh proteinov je pokazala homolognost med Cas3 in helikazo ter med Cas4 in RecB eksonukleazo.

==Znane lastnosti CRISPR zaporedij do leta 2002==

Do leta 2002 so CRISPR zaporedja odkrili v več kot 40 različnih prokariontih. Znano je, da gre za kratka zaporedja dolga od 21 do 37 baznih parov, ki so ločena s prekinitvenimi zaporedji, dolgimi 32 baznih parov. Pred kratkim zaporedjem se nahajajo daljše zaporedje dolgo nekaj sto baznih parov, ki so ga poimenovali vodilno zaporedje in skupina genov, ki so jih poimenovali cas. V letu 2002 so torej že poznali splošno strukturo regije CRISPR, še vedno pa niso poznali izvora zaporedij ter njihove vloge v organizmu.

==Viri in literatura==

*Mojica, F. J., Rodriguez-Valera, F. The discovery of CRISPR in archaea and bacteria, The FEBS Journal, 2016, 283(17), 3162-9

*Mojica, F. J., Ferrer, C., Juez, G., Rodriguez-Valera, F. Long stretches of short tandem repeats are present in the largest replicons of the Archaea Haloferax mediterranei and Haloferax volcanii and could be involved in replicon partitioning, Molecular Biology (1995), 17(1), 85-93

*Ishino Y, Shinagawa H, Makino K, Amemura M, Nakata A. 1987. Nucleotide sequence of the iap gene, responsible for alkaline phosphatase isozyme conversion in Escherichia coli, and identification of the gene product. Journal of Bacteriol 169:5429 –5433

*Ishino Y., Krupovic M., Forterre, P. 2018. History of CRISPR-Cas from Encounter with a Mysterious Repeated Sequence to Genome Editing Technology. Journal of Bacteriol 200(7): 17-58

*Jansen R., van Embden J.D.A, Gaastra W., Schouls L.M., 2002. Identification of genes that are asociated with DNA repeats in prokaryotes. Molecular Microbiology 43(6), 1565-1575

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Odkritje in opis regij CRISPR in Cas (do leta ~2002)

2019-04-14T17:18:03Z

Eva Gartner: /* Prvo odkritje */

==Uvod==

Analize celotnih genomov organizmov so znanstvenikom omogočile primerjavo le teh med posameznimi organizmi. Rezultati raziskav so pokazali, da so pri velikem številu prokariontov prisotna ponavljajoča zaporedja. Ta so lahko daljša ( do 100 kbp), ki jim pogosto pripisujejo kakšno biološko pomembno funkcijo ali pa krajša, sestavljena iz le nekaj nukleotidov . Slednje delimo na zaporedna ponavljajoča zaporedja, pri katerih so si enote, ki se ponavljajo sosednje in prekinjena ponavljajoča zaporedja, pri katerih so med posameznimi ponavljajočimi se zaporedji heterogene prekinitvene sekvence različnih dolžin. Naš seminar se osredotoča na odkritje obstoja posebne družine prekinjenih ponavljajočih zaporedij, ki so jih kasneje poimenovali zaporedja CRISPR.

==Prvo odkritje==

Odkritje prvih ponavljajočih se zaporedij je bilo povsem naključno. Leta 1987 je skupina znanstvenikov na čelu z Yoshizumi Ishinom naredila raziskavo, pri katerem so želeli indetificirati protein, odgovoren za pretvorbo izocima alkalna fosfataza pri organizmu ''Escherichia coli''
(celice K-12). Uspelo jim je sekvencirati 1,7 kbp dolg fragment DNA v katerem se je med drugim nahajal gen iap, za katerega so sklepali, da zapisuje preiskovani protein. Najprej so pripravili plazmidne vektorje v katere so klonirali tarčni DNA fragment , nato pa so ga po razgradnji na manjše fragmente prenesli v vektor M13, saj je za sekvenciranje po Sangerjevi metodi potrebna enoverižna DNA. Nukleotidno zaporedje so določili z gelsko elektroforezoin avtoradiografijo. Med sekvenciranjem DNA fragmenta so na njegovem 3΄ koncu opazili nenavadno strukturo. Navzdol po genomu od gena iap se je nahajalo pet močno homolognih sekvenc, sestavljenih iz 29 nukleotidov, znotraj katerih je bilo palindromsko zaporedje 14 bp, med njimi pa so bile prekinitve iz 32 nukleotidov. Že nekaj let pred tem odkritjem, leta 1984, so pri raziskavi na bakterijah ''E. coli'' in ''Salmonella enterica'' opazili palindromska zaporedja, ki so jim pripisali funkcijo stabilizacije mRNA, vendar ob primerjavi niso našli nobene podobnosti med temi zaporedji in na novo odkritimi zaporedji . To odkritje je bilo tako skrivnostno, da so ga omenili celo v razpravi na koncu članka, čeprav takrat še niso razumeli njihove biološke funkcije. Znanost v času te raziskave še ni bila tako razvita in niso poznali danes razvitih metod sekvenciranja in kloniranja DNA fragmentov, zato je bil celoten postopek dolgotrajen. Več mesecev so potrebovali, da so natančno določili ponavljajoče zaporedje. Težave jim je povzročala predvsem sekundarna struktura, ki je nastala zaradi palindromskega zaporedja. Neverjetno je, da bi lahko z danes poznano tehnologijo npr. s polimerazno verižno reakcijo enako regijo posekvencirali v enem dnevu.

Temu odkritju je kmalu sledilo še več odkritij enakih ponavljajočih zaporedij pri različnih sevih ''E. coli'' in nekaterih ostalih bakterijah ( npr. ''Salmonella typhimurium'' in ''Shigela dysenteriae''). Do pomembnega odkritja so leta 1993 prišli tudi nizozemski znanstveniki, ki so prekinjena ponavljajoča zaporedja našli pri preučevanju bakterije ''Mycobacterium tuberculosis''. S prmerjavo majhnega dela te regije mnogih različnih sevov so preučevali pojav polimorfizma ponavljajočih zaporedij pri omenjeni bakteriji, ki so posledica genetskih prerazporeditev. Na podlagi polimorfizma so razvili metodo za njihovo identifikacijo.

V prvih letih raziskovanja je bilo javno dostopnih zelo malo podatkov o sekvenciranih genomih, zato so prekinjena ponavljajoča zaporedja opazili pri relativno majhnem številu organizmov. Ob razvoju novih tehnik sekvenciranja pa je bilo teh podatkov vedno več, čemur so sledila tudi vedno večja odkritja na tem področju.

==Odkritje regij CRISPR pri arhejah (1993–2000)==

Pri arhejah je takšna zaporedja prvi opazil Francisco Juan Martinez Mojica, ki je kot del mikrobiološke skupine na Univerzi Alicante v Španiji raziskoval regulatorne mehanizme haloarhej in njihovo prilagajanje na spremembe v okolju. Preučevani organizem je bil ''Haloferax mediterranei'' – haloarheja, ki živi v okoljih, kjer slanost doseže tudi 20–25 %. Mojica se je pri raziskovanju usmeril na gensko še nekategorizirane regije genoma ''H. mediterranei'', ki so bile predvidoma zaradi spremembe v slanosti okolja podvržene nekakšnim DNA-modifikacijam. Vendar pa so pri sekvenciranju in genski analizi teh regij naleteli na nepričakovan vzorec. Avtoradiogram je pokazal DNA-segmente, dolge približno 30 bp, ki se ponavljajo na konstantnih razdaljah. Po dodatnem sekvenciranju regij so odkrili prisotnost vsaj 14 skoraj popolnoma ohranjenih ponovitev, vsaka ponovitev pa je vključevala kratko obrnjeno palindromsko ponovitev. Ponavljajoči vzorci so se nahajali na nekodirajočem območju genoma, poleg ORF (»open reading frames«), ki niso bili homologni nobenemu do takrat znanemu proteinu. Poleg tega pa so pri ponavljajočih se regijah zaznali številne transkripte RNA, kar nakazuje na visoko procesirano RNA iz teh regij. Čeprav so bila takšna ponavljajoča zaporedja opažena že pri nekaterih bakterijah (''Escherichia coli'', ''Mycobacterium spp''.), so bila pri tem eksperimentu prvič videna pri arhejah.

Medtem ko so za bakterijske ponovitve takrat le predvidevali o njihovi biološki funkciji, npr. regulacija sosednjih genov, so biološke funkcije TREPs (Tandem REPeats) pri arhejah tudi eksperimentalno raziskovali. TREP-zaporedja so našli v kromosomu in plazmidu ''H. mediterranei'' in sorodni haloarheji – ''Haloferax volcanii''. Zaradi možnosti genske manipulacije so pri celicah ''H. volcanii'' raziskovali učinek prisotnosti rekombinantnega plazmida, ki je vseboval fragmente TREP. Dve hipotezi o biološki funkciji TREPs so takoj ovrgli, in sicer njihovo vlogo pri rekombinaciji DNA in regulaciji sosednjih genov. Nesmiselno bi bilo predvidevati, da bi bile tako velike genske strukture povezane zgolj z regulacijo transkripcije nekaj genov. Predpostavili pa so, da morajo TREPs igrati pomembno vlogo pri celičnem ciklu. Prisotni so namreč v največjih in najverjetneje najpomembnejših replikonih celice. Poleg tega je prisotnost dodatnih kopij TREP (vstavljene v gostujočo celico s pomočjo vektorja) povzročila zmanjšano preživetje celic in spremembo v sestavi DNA, kar podpira hipotezo, da imajo TREPs pomembno vlogo pri ločevanju replikonov. Zaradi visoke ohranjenosti TREPs med vrstami haloarhej in prisotnosti zelo podobnih struktur pri ''E. coli'' pa so lahko ugibali, da imajo TREPs univerzalno oz. podobno vlogo pri organizmih, kjer so jih odkrili.

Za dokaz zgornjih predvidevanj o biološki funkciji TREPs so bile seveda potrebne dodatne študije na haloarhejah, za katere pa Mojica ni dobil finančne podpore. Poskuse je zato moral nadaljevati na ''E. coli'', kjer enaki eksperimenti kot prej na ''H. volcanii'' niso dali željenih rezultatov. Dodatne raziskave niso podale nobenega dokaza o vpletenosti ponavljajočih se zaporedij v ločitveni aparat, iz rezultatov pa bi lahko sklepali, da bi zaporedja lahko služila kot nekakšna mesta za kooperativno vezavo na celične strukture, npr. na citoplazemsko membrano, ali proteine, vplivali pa bi lahko tudi na strukturo DNA.

Leta 1995 je bil objavljen prvi celoten genom prostoživečega organizma, s čimer se je začela nova doba v biologiji. Pospešeno sekvenciranje je pripomoglo k nastanku dodatnih zbirk prokariontskih genomov, na podlagi česar je leta 1996 lahko nastalo prvo celovito poročilo o konstantno ponavljajočih se regijah v celotnem genomu. Do konca stoletja so podobna zaporedja odkrili še v 12 vrstah arhej in bakterij.

==F. Mojica (2000)==

Povečano število znanih genomov bakterij in arhej je pospešilo raziskave o motivih zaporedij DNA. Francisco Mojica je leta 2000 potrdil prisotnost ponavljajočih zaporedij v prokariontih, katero so s kolegi predstavili kot posebno družino prokariontskih zaporedij pod imenom SRSR (short regularly spaced repeats). Z analizami so ugotovili, da so SRSR prisotni znotraj genomov večine arhej ter različnih skupin bakterij in tako predstavljajo eno najbolj razširjenih družin v prokariontskih genomih. Ugotovili so, da so SRSR zaporedja znotraj enega genoma precej homogena, pojavljajo pa se tudi podobnosti razporeditve med organizmi, ki izhajajo iz skupnega prednika ter podobnosti znotraj posameznih domen.
V tej raziskavi je bilo ključno odkritje pojav kratkih palindromskih zaporedij v dodatnih organizmih in s tem vpeljava nove družine nukleotidnih zaporedij, za katero je značilno da so ločena s stalno dolgimi prekinitvenimi zaporedji. Čeprav so odkrili podobna zaporedja znotraj genomov različnih prokariontov, niso vedeli, če ima ta družina zaporedij tudi skupno funkcijo v vseh prokariontih.

==R. Jansen (2002)==

Novo imenovana družina zaporedij je spodbudila raziskave na Nizozemskem pod vodstvom Ruuda Jansena. Z računalniško analizo so želeli določiti lokacije SRSR v do tedaj znanih prokariontskih genomih. Izbirali so posamezna SRSR zaporedja bakterij in arhej, ter jih primerjali s celotnimi genomi prokariontov. Primerjali so tudi prekinitvena zaporedja, ki so med SRSR, ter prišli do spoznanja, da so tako SRSR kot prekinitvena zaporedja večinoma unikatna za genom posamezne vrste. V nadaljevanju so zato iskali nove lokacije SRSR na podlagi njihovega motiva ponavljanja, ki pa je bil zanje značilen v vseh do tedaj odkritih zaporedij – kratka palindromska zaporedja alternirajo s prekinitvenimi zaporedji stalnih dolžin. Z analizami so v več organizmih odkrili tudi prisotnost daljših zaporedij na enem koncu SRSR in predpostavili, da daljše zaporedje in SRSR skupaj predstavljata eno enoto. Ta zaporedja pred SRSR so poimenovali vodilna zaporedja, ki so si glede na zaporedje baz podobna le znotraj enega genoma, vendar pa imajo nekatere splošne skupne lastnosti. Nimajo odprtega bralnega okvirja, torej ne vsebujejo zaporedja, ki bi kodiralo za proteine, poleg tega pa pogosto vsebujejo sosledje enakih nukleotidov in na splošno velik delež adenina in timina.

Nova odkrtija so znanstvenike gnala k dodatnem raziskovanju, vendar so ugotovili, da so bila v preteklosti v tisku uporabljena različna poimenovanja za novo odkrit motiv ponavljanja znotraj DNA. V namen poenotenja sta zato Jansen in Mojica leta 2002 vpeljala novo ime, ki je ostalo v uporabi do danes – CRISPR (clustered regularly spaced palindromic repeats). Ob vpeljavi novega imena je Jansen s kolegi odkril tudi novo lastnost CRISPR zaporedij. S primerjavo genov ob CRISPR zaporedjih so odkrili pogosto prisotnost štirih genov, ki jih niso našli v prokariontih brez CRISPR regij. Skupino novo odkritih genov so poimenovali cas (CRISPR associated genes), posamezne gene pa od Cas1 do Cas4. V tej raziskavi še niso identificirali točne funkcije vseh cas genov, so pa predpostavili vlogi genov Cas3 in Cas4. Analiza aminokislinskih ostankov teh dveh proteinov je pokazala homolognost med Cas3 in helikazo ter med Cas4 in RecB eksonukleazo.

==Znane lastnosti CRISPR zaporedij do leta 2002==

Do leta 2002 so CRISPR zaporedja odkrili v več kot 40 različnih prokariontih. Znano je, da gre za kratka zaporedja dolga od 21 do 37 baznih parov, ki so ločena s prekinitvenimi zaporedji, dolgimi 32 baznih parov. Pred kratkim zaporedjem se nahajajo daljše zaporedje dolgo nekaj sto baznih parov, ki so ga poimenovali vodilno zaporedje in skupina genov, ki so jih poimenovali cas. V letu 2002 so torej že poznali splošno strukturo regije CRISPR, še vedno pa niso poznali izvora zaporedij ter njihove vloge v organizmu.

==Viri in literatura==

*Mojica, F. J., Rodriguez-Valera, F. The discovery of CRISPR in archaea and bacteria, The FEBS Journal, 2016, 283(17), 3162-9

*Mojica, F. J., Ferrer, C., Juez, G., Rodriguez-Valera, F. Long stretches of short tandem repeats are present in the largest replicons of the Archaea Haloferax mediterranei and Haloferax volcanii and could be involved in replicon partitioning, Molecular Biology (1995), 17(1), 85-93

*Ishino Y, Shinagawa H, Makino K, Amemura M, Nakata A. 1987. Nucleotide sequence of the iap gene, responsible for alkaline phosphatase isozyme conversion in Escherichia coli, and identification of the gene product. Journal of Bacteriol 169:5429 –5433

*Ishino Y., Krupovic M., Forterre, P. 2018. History of CRISPR-Cas from Encounter with a Mysterious Repeated Sequence to Genome Editing Technology. Journal of Bacteriol 200(7): 17-58

*Jansen R., van Embden J.D.A, Gaastra W., Schouls L.M., 2002. Identification of genes that are asociated with DNA repeats in prokaryotes. Molecular Microbiology 43(6), 1565-1575

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Odkritje in opis regij CRISPR in Cas (do leta ~2002)

2019-04-14T17:13:38Z

Eva Gartner: /* Prvo odkritje */

==Uvod==

Analize celotnih genomov organizmov so znanstvenikom omogočile primerjavo le teh med posameznimi organizmi. Rezultati raziskav so pokazali, da so pri velikem številu prokariontov prisotna ponavljajoča zaporedja. Ta so lahko daljša ( do 100 kbp), ki jim pogosto pripisujejo kakšno biološko pomembno funkcijo ali pa krajša, sestavljena iz le nekaj nukleotidov . Slednje delimo na zaporedna ponavljajoča zaporedja, pri katerih so si enote, ki se ponavljajo sosednje in prekinjena ponavljajoča zaporedja, pri katerih so med posameznimi ponavljajočimi se zaporedji heterogene prekinitvene sekvence različnih dolžin. Naš seminar se osredotoča na odkritje obstoja posebne družine prekinjenih ponavljajočih zaporedij, ki so jih kasneje poimenovali zaporedja CRISPR.

==Prvo odkritje==

Odkritje prvih ponavljajočih se zaporedij je bilo povsem naključno. Leta 1987 je skupina znanstvenikov na čelu z Yoshizumi Ishinom naredila raziskavo, pri katerem so želeli indetificirati protein, odgovoren za pretvorbo izocima alkalna fosfataza pri organizmu ''Escherichia coli''
(celice K-12). Uspelo jim je sekvencirati 1,7 kbp dolg fragment DNA v katerem se je med drugim nahajal gen iap, za katerega so sklepali, da zapisuje preiskovani protein. Najprej so pripravili plazmidne vektorje v katere so klonirali tarčni DNA fragment , nato pa so ga po razgradnji na manjše fragmente prenesli v vektor M13, saj je za sekvenciranje po Sangerjevi metodi potrebna enoverižna DNA. Nukleotidno zaporedje so določili z avtoradiografijo. Med sekvenciranjem DNA fragmenta so na njegovem 3΄ koncu opazili nenavadno strukturo. Navzdol po genomu od gena iap se je nahajalo pet močno homolognih sekvenc, sestavljenih iz 29 nukleotidov, znotraj katerih je bilo palindromsko zaporedje 14 bp, med njimi pa so bile prekinitve iz 32 nukleotidov. Že nekaj let pred tem odkritjem, leta 1984, so pri raziskavi na bakterijah ''E. coli'' in ''Salmonella enterica'' opazili palindromska zaporedja, ki so jim pripisali funkcijo stabilizacije mRNA, vendar ob primerjavi niso našli nobene podobnosti med temi zaporedji in na novo odkritimi zaporedji . To odkritje je bilo tako skrivnostno, da so ga omenili celo v razpravi na koncu članka, čeprav takrat še niso razumeli njihove biološke funkcije. Znanost v času te raziskave še ni bila tako razvita in niso poznali danes razvitih metod sekvenciranja in kloniranja DNA fragmentov, zato je bil celoten postopek dolgotrajen. Več mesecev so potrebovali, da so natančno določili ponavljajoče zaporedje. Težave jim je povzročala predvsem sekundarna struktura, ki je nastala zaradi palindromskega zaporedja. Neverjetno je, da bi lahko z danes poznano tehnologijo npr. s polimerazno verižno reakcijo enako regijo posekvencirali v enem dnevu.

Temu odkritju je kmalu sledilo še več odkritij enakih ponavljajočih zaporedij pri različnih sevih ''E. coli'' in nekaterih ostalih bakterijah ( npr. ''Salmonella typhimurium'' in ''Shigela dysenteriae''). Do pomembnega odkritja so leta 1993 prišli tudi nizozemski znanstveniki, ki so prekinjena ponavljajoča zaporedja našli pri preučevanju bakterije ''Mycobacterium tuberculosis''. S prmerjavo majhnega dela te regije mnogih različnih sevov so preučevali pojav polimorfizma ponavljajočih zaporedij pri omenjeni bakteriji, ki so posledica genetskih prerazporeditev. Na podlagi polimorfizma so razvili metodo za njihovo identifikacijo.

V prvih letih raziskovanja je bilo javno dostopnih zelo malo podatkov o sekvenciranih genomih, zato so prekinjena ponavljajoča zaporedja opazili pri relativno majhnem številu organizmov. Ob razvoju novih tehnik sekvenciranja pa je bilo teh podatkov vedno več, čemur so sledila tudi vedno večja odkritja na tem področju.

==Odkritje regij CRISPR pri arhejah (1993–2000)==

Pri arhejah je takšna zaporedja prvi opazil Francisco Juan Martinez Mojica, ki je kot del mikrobiološke skupine na Univerzi Alicante v Španiji raziskoval regulatorne mehanizme haloarhej in njihovo prilagajanje na spremembe v okolju. Preučevani organizem je bil ''Haloferax mediterranei'' – haloarheja, ki živi v okoljih, kjer slanost doseže tudi 20–25 %. Mojica se je pri raziskovanju usmeril na gensko še nekategorizirane regije genoma ''H. mediterranei'', ki so bile predvidoma zaradi spremembe v slanosti okolja podvržene nekakšnim DNA-modifikacijam. Vendar pa so pri sekvenciranju in genski analizi teh regij naleteli na nepričakovan vzorec. Avtoradiogram je pokazal DNA-segmente, dolge približno 30 bp, ki se ponavljajo na konstantnih razdaljah. Po dodatnem sekvenciranju regij so odkrili prisotnost vsaj 14 skoraj popolnoma ohranjenih ponovitev, vsaka ponovitev pa je vključevala kratko obrnjeno palindromsko ponovitev. Ponavljajoči vzorci so se nahajali na nekodirajočem območju genoma, poleg ORF (»open reading frames«), ki niso bili homologni nobenemu do takrat znanemu proteinu. Poleg tega pa so pri ponavljajočih se regijah zaznali številne transkripte RNA, kar nakazuje na visoko procesirano RNA iz teh regij. Čeprav so bila takšna ponavljajoča zaporedja opažena že pri nekaterih bakterijah (''Escherichia coli'', ''Mycobacterium spp''.), so bila pri tem eksperimentu prvič videna pri arhejah.

Medtem ko so za bakterijske ponovitve takrat le predvidevali o njihovi biološki funkciji, npr. regulacija sosednjih genov, so biološke funkcije TREPs (Tandem REPeats) pri arhejah tudi eksperimentalno raziskovali. TREP-zaporedja so našli v kromosomu in plazmidu ''H. mediterranei'' in sorodni haloarheji – ''Haloferax volcanii''. Zaradi možnosti genske manipulacije so pri celicah ''H. volcanii'' raziskovali učinek prisotnosti rekombinantnega plazmida, ki je vseboval fragmente TREP. Dve hipotezi o biološki funkciji TREPs so takoj ovrgli, in sicer njihovo vlogo pri rekombinaciji DNA in regulaciji sosednjih genov. Nesmiselno bi bilo predvidevati, da bi bile tako velike genske strukture povezane zgolj z regulacijo transkripcije nekaj genov. Predpostavili pa so, da morajo TREPs igrati pomembno vlogo pri celičnem ciklu. Prisotni so namreč v največjih in najverjetneje najpomembnejših replikonih celice. Poleg tega je prisotnost dodatnih kopij TREP (vstavljene v gostujočo celico s pomočjo vektorja) povzročila zmanjšano preživetje celic in spremembo v sestavi DNA, kar podpira hipotezo, da imajo TREPs pomembno vlogo pri ločevanju replikonov. Zaradi visoke ohranjenosti TREPs med vrstami haloarhej in prisotnosti zelo podobnih struktur pri ''E. coli'' pa so lahko ugibali, da imajo TREPs univerzalno oz. podobno vlogo pri organizmih, kjer so jih odkrili.

Za dokaz zgornjih predvidevanj o biološki funkciji TREPs so bile seveda potrebne dodatne študije na haloarhejah, za katere pa Mojica ni dobil finančne podpore. Poskuse je zato moral nadaljevati na ''E. coli'', kjer enaki eksperimenti kot prej na ''H. volcanii'' niso dali željenih rezultatov. Dodatne raziskave niso podale nobenega dokaza o vpletenosti ponavljajočih se zaporedij v ločitveni aparat, iz rezultatov pa bi lahko sklepali, da bi zaporedja lahko služila kot nekakšna mesta za kooperativno vezavo na celične strukture, npr. na citoplazemsko membrano, ali proteine, vplivali pa bi lahko tudi na strukturo DNA.

Leta 1995 je bil objavljen prvi celoten genom prostoživečega organizma, s čimer se je začela nova doba v biologiji. Pospešeno sekvenciranje je pripomoglo k nastanku dodatnih zbirk prokariontskih genomov, na podlagi česar je leta 1996 lahko nastalo prvo celovito poročilo o konstantno ponavljajočih se regijah v celotnem genomu. Do konca stoletja so podobna zaporedja odkrili še v 12 vrstah arhej in bakterij.

==F. Mojica (2000)==

Povečano število znanih genomov bakterij in arhej je pospešilo raziskave o motivih zaporedij DNA. Francisco Mojica je leta 2000 potrdil prisotnost ponavljajočih zaporedij v prokariontih, katero so s kolegi predstavili kot posebno družino prokariontskih zaporedij pod imenom SRSR (short regularly spaced repeats). Z analizami so ugotovili, da so SRSR prisotni znotraj genomov večine arhej ter različnih skupin bakterij in tako predstavljajo eno najbolj razširjenih družin v prokariontskih genomih. Ugotovili so, da so SRSR zaporedja znotraj enega genoma precej homogena, pojavljajo pa se tudi podobnosti razporeditve med organizmi, ki izhajajo iz skupnega prednika ter podobnosti znotraj posameznih domen.
V tej raziskavi je bilo ključno odkritje pojav kratkih palindromskih zaporedij v dodatnih organizmih in s tem vpeljava nove družine nukleotidnih zaporedij, za katero je značilno da so ločena s stalno dolgimi prekinitvenimi zaporedji. Čeprav so odkrili podobna zaporedja znotraj genomov različnih prokariontov, niso vedeli, če ima ta družina zaporedij tudi skupno funkcijo v vseh prokariontih.

==R. Jansen (2002)==

Novo imenovana družina zaporedij je spodbudila raziskave na Nizozemskem pod vodstvom Ruuda Jansena. Z računalniško analizo so želeli določiti lokacije SRSR v do tedaj znanih prokariontskih genomih. Izbirali so posamezna SRSR zaporedja bakterij in arhej, ter jih primerjali s celotnimi genomi prokariontov. Primerjali so tudi prekinitvena zaporedja, ki so med SRSR, ter prišli do spoznanja, da so tako SRSR kot prekinitvena zaporedja večinoma unikatna za genom posamezne vrste. V nadaljevanju so zato iskali nove lokacije SRSR na podlagi njihovega motiva ponavljanja, ki pa je bil zanje značilen v vseh do tedaj odkritih zaporedij – kratka palindromska zaporedja alternirajo s prekinitvenimi zaporedji stalnih dolžin. Z analizami so v več organizmih odkrili tudi prisotnost daljših zaporedij na enem koncu SRSR in predpostavili, da daljše zaporedje in SRSR skupaj predstavljata eno enoto. Ta zaporedja pred SRSR so poimenovali vodilna zaporedja, ki so si glede na zaporedje baz podobna le znotraj enega genoma, vendar pa imajo nekatere splošne skupne lastnosti. Nimajo odprtega bralnega okvirja, torej ne vsebujejo zaporedja, ki bi kodiralo za proteine, poleg tega pa pogosto vsebujejo sosledje enakih nukleotidov in na splošno velik delež adenina in timina.

Nova odkrtija so znanstvenike gnala k dodatnem raziskovanju, vendar so ugotovili, da so bila v preteklosti v tisku uporabljena različna poimenovanja za novo odkrit motiv ponavljanja znotraj DNA. V namen poenotenja sta zato Jansen in Mojica leta 2002 vpeljala novo ime, ki je ostalo v uporabi do danes – CRISPR (clustered regularly spaced palindromic repeats). Ob vpeljavi novega imena je Jansen s kolegi odkril tudi novo lastnost CRISPR zaporedij. S primerjavo genov ob CRISPR zaporedjih so odkrili pogosto prisotnost štirih genov, ki jih niso našli v prokariontih brez CRISPR regij. Skupino novo odkritih genov so poimenovali cas (CRISPR associated genes), posamezne gene pa od Cas1 do Cas4. V tej raziskavi še niso identificirali točne funkcije vseh cas genov, so pa predpostavili vlogi genov Cas3 in Cas4. Analiza aminokislinskih ostankov teh dveh proteinov je pokazala homolognost med Cas3 in helikazo ter med Cas4 in RecB eksonukleazo.

==Znane lastnosti CRISPR zaporedij do leta 2002==

Do leta 2002 so CRISPR zaporedja odkrili v več kot 40 različnih prokariontih. Znano je, da gre za kratka zaporedja dolga od 21 do 37 baznih parov, ki so ločena s prekinitvenimi zaporedji, dolgimi 32 baznih parov. Pred kratkim zaporedjem se nahajajo daljše zaporedje dolgo nekaj sto baznih parov, ki so ga poimenovali vodilno zaporedje in skupina genov, ki so jih poimenovali cas. V letu 2002 so torej že poznali splošno strukturo regije CRISPR, še vedno pa niso poznali izvora zaporedij ter njihove vloge v organizmu.

==Viri in literatura==

*Mojica, F. J., Rodriguez-Valera, F. The discovery of CRISPR in archaea and bacteria, The FEBS Journal, 2016, 283(17), 3162-9

*Mojica, F. J., Ferrer, C., Juez, G., Rodriguez-Valera, F. Long stretches of short tandem repeats are present in the largest replicons of the Archaea Haloferax mediterranei and Haloferax volcanii and could be involved in replicon partitioning, Molecular Biology (1995), 17(1), 85-93

*Ishino Y, Shinagawa H, Makino K, Amemura M, Nakata A. 1987. Nucleotide sequence of the iap gene, responsible for alkaline phosphatase isozyme conversion in Escherichia coli, and identification of the gene product. Journal of Bacteriol 169:5429 –5433

*Ishino Y., Krupovic M., Forterre, P. 2018. History of CRISPR-Cas from Encounter with a Mysterious Repeated Sequence to Genome Editing Technology. Journal of Bacteriol 200(7): 17-58

*Jansen R., van Embden J.D.A, Gaastra W., Schouls L.M., 2002. Identification of genes that are asociated with DNA repeats in prokaryotes. Molecular Microbiology 43(6), 1565-1575

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Odkritje in opis regij CRISPR in Cas (do leta ~2002)

2019-04-14T16:49:02Z

Eva Gartner: /* Prvo odkritje */

==Uvod==

Analize celotnih genomov organizmov so znanstvenikom omogočile primerjavo le teh med posameznimi organizmi. Rezultati raziskav so pokazali, da so pri velikem številu prokariontov prisotna ponavljajoča zaporedja. Ta so lahko daljša ( do 100 kbp), ki jim pogosto pripisujejo kakšno biološko pomembno funkcijo ali pa krajša, sestavljena iz le nekaj nukleotidov . Slednje delimo na zaporedna ponavljajoča zaporedja, pri katerih so si enote, ki se ponavljajo sosednje in prekinjena ponavljajoča zaporedja, pri katerih so med posameznimi ponavljajočimi se zaporedji heterogene prekinitvene sekvence različnih dolžin. Naš seminar se osredotoča na odkritje obstoja posebne družine prekinjenih ponavljajočih zaporedij, ki so jih kasneje poimenovali zaporedja CRISPR.

==Prvo odkritje==

Odkritje prvih ponavljajočih se zaporedij je bilo povsem naključno. Leta 1987 je skupina znanstvenikov na čelu z Yoshizumi Ishinom naredila raziskavo, pri katerem so želeli indetificirati protein, odgovoren za pretvorbo izocima alkalna fosfataza pri organizmu ''Escherichia coli''
(celice K-12). Uspelo jim je sekvencirati 1,7 kbp dolg fragment DNA v katerem se je med drugim nahajal gen iap, za katerega so sklepali, da zapisuje preiskovani protein. Najprej so pripravili plazmidne vektorje v katere so klonirali tarčni DNA fragment , nato pa so ga po razgradnji na manjše fragmente prenesli v vektor M13, v katerem je potekalo sekvenciranje po Sangerjevi metodi. Nukleotidno zaporedje so določili z avtoradiografijo. Med sekvenciranjem DNA fragmenta so na njegovem 3΄ koncu opazili nenavadno strukturo. Navzdol po genomu od gena iap se je nahajalo pet močno homolognih sekvenc, sestavljenih iz 29 nukleotidov, znotraj katerih je bilo palindromsko zaporedje 14 bp, med njimi pa so bile prekinitve iz 32 nukleotidov. Že nekaj let pred tem odkritjem, leta 1984, so pri raziskavi na bakterijah ''E. coli'' in ''Salmonella enterica'' opazili palindromska zaporedja, ki so jim pripisali funkcijo stabilizacije mRNA, vendar ob primerjavi niso našli nobene podobnosti med temi zaporedji in na novo odkritimi zaporedji . To odkritje je bilo tako skrivnostno, da so ga omenili celo v razpravi na koncu članka, čeprav takrat še niso razumeli njihove biološke funkcije. Znanost v času te raziskave še ni bila tako razvita in niso poznali danes razvitih metod sekvenciranja in kloniranja DNA fragmentov, zato je bil celoten postopek dolgotrajen. Več mesecev so potrebovali, da so natančno določili ponavljajoče zaporedje. Težave jim je povzročala predvsem sekundarna struktura, ki je nastala zaradi palindromskega zaporedja. Neverjetno je, da bi lahko z danes poznano tehnologijo npr. s polimerazno verižno reakcijo enako regijo posekvencirali v enem dnevu.

Temu odkritju je kmalu sledilo še več odkritij enakih ponavljajočih zaporedij pri različnih sevih ''E. coli'' in nekaterih ostalih bakterijah ( npr. ''Salmonella typhimurium'' in ''Shigela dysenteriae''). Do pomembnega odkritja so leta 1993 prišli tudi nizozemski znanstveniki, ki so prekinjena ponavljajoča zaporedja našli pri preučevanju bakterije ''Mycobacterium tuberculosis''. S prmerjavo majhnega dela te regije mnogih različnih sevov so preučevali pojav polimorfizma ponavljajočih zaporedij pri omenjeni bakteriji, ki so posledica genetskih prerazporeditev. Na podlagi polimorfizma so razvili metodo za njihovo identifikacijo.

V prvih letih raziskovanja je bilo javno dostopnih zelo malo podatkov o sekvenciranih genomih, zato so prekinjena ponavljajoča zaporedja opazili pri relativno majhnem številu organizmov. Ob razvoju novih tehnik sekvenciranja pa je bilo teh podatkov vedno več, čemur so sledila tudi vedno večja odkritja na tem področju.

==Odkritje regij CRISPR pri arhejah (1993–2000)==

Pri arhejah je takšna zaporedja prvi opazil Francisco Juan Martinez Mojica, ki je kot del mikrobiološke skupine na Univerzi Alicante v Španiji raziskoval regulatorne mehanizme haloarhej in njihovo prilagajanje na spremembe v okolju. Preučevani organizem je bil ''Haloferax mediterranei'' – haloarheja, ki živi v okoljih, kjer slanost doseže tudi 20–25 %. Mojica se je pri raziskovanju usmeril na gensko še nekategorizirane regije genoma ''H. mediterranei'', ki so bile predvidoma zaradi spremembe v slanosti okolja podvržene nekakšnim DNA-modifikacijam. Vendar pa so pri sekvenciranju in genski analizi teh regij naleteli na nepričakovan vzorec. Avtoradiogram je pokazal DNA-segmente, dolge približno 30 bp, ki se ponavljajo na konstantnih razdaljah. Po dodatnem sekvenciranju regij so odkrili prisotnost vsaj 14 skoraj popolnoma ohranjenih ponovitev, vsaka ponovitev pa je vključevala kratko obrnjeno palindromsko ponovitev. Ponavljajoči vzorci so se nahajali na nekodirajočem območju genoma, poleg ORF (»open reading frames«), ki niso bili homologni nobenemu do takrat znanemu proteinu. Poleg tega pa so pri ponavljajočih se regijah zaznali številne transkripte RNA, kar nakazuje na visoko procesirano RNA iz teh regij. Čeprav so bila takšna ponavljajoča zaporedja opažena že pri nekaterih bakterijah (''Escherichia coli'', ''Mycobacterium spp''.), so bila pri tem eksperimentu prvič videna pri arhejah.

Medtem ko so za bakterijske ponovitve takrat le predvidevali o njihovi biološki funkciji, npr. regulacija sosednjih genov, so biološke funkcije TREPs (Tandem REPeats) pri arhejah tudi eksperimentalno raziskovali. TREP-zaporedja so našli v kromosomu in plazmidu ''H. mediterranei'' in sorodni haloarheji – ''Haloferax volcanii''. Zaradi možnosti genske manipulacije so pri celicah ''H. volcanii'' raziskovali učinek prisotnosti rekombinantnega plazmida, ki je vseboval fragmente TREP. Dve hipotezi o biološki funkciji TREPs so takoj ovrgli, in sicer njihovo vlogo pri rekombinaciji DNA in regulaciji sosednjih genov. Nesmiselno bi bilo predvidevati, da bi bile tako velike genske strukture povezane zgolj z regulacijo transkripcije nekaj genov. Predpostavili pa so, da morajo TREPs igrati pomembno vlogo pri celičnem ciklu. Prisotni so namreč v največjih in najverjetneje najpomembnejših replikonih celice. Poleg tega je prisotnost dodatnih kopij TREP (vstavljene v gostujočo celico s pomočjo vektorja) povzročila zmanjšano preživetje celic in spremembo v sestavi DNA, kar podpira hipotezo, da imajo TREPs pomembno vlogo pri ločevanju replikonov. Zaradi visoke ohranjenosti TREPs med vrstami haloarhej in prisotnosti zelo podobnih struktur pri ''E. coli'' pa so lahko ugibali, da imajo TREPs univerzalno oz. podobno vlogo pri organizmih, kjer so jih odkrili.

Za dokaz zgornjih predvidevanj o biološki funkciji TREPs so bile seveda potrebne dodatne študije na haloarhejah, za katere pa Mojica ni dobil finančne podpore. Poskuse je zato moral nadaljevati na ''E. coli'', kjer enaki eksperimenti kot prej na ''H. volcanii'' niso dali željenih rezultatov. Dodatne raziskave niso podale nobenega dokaza o vpletenosti ponavljajočih se zaporedij v ločitveni aparat, iz rezultatov pa bi lahko sklepali, da bi zaporedja lahko služila kot nekakšna mesta za kooperativno vezavo na celične strukture, npr. na citoplazemsko membrano, ali proteine, vplivali pa bi lahko tudi na strukturo DNA.

Leta 1995 je bil objavljen prvi celoten genom prostoživečega organizma, s čimer se je začela nova doba v biologiji. Pospešeno sekvenciranje je pripomoglo k nastanku dodatnih zbirk prokariontskih genomov, na podlagi česar je leta 1996 lahko nastalo prvo celovito poročilo o konstantno ponavljajočih se regijah v celotnem genomu. Do konca stoletja so podobna zaporedja odkrili še v 12 vrstah arhej in bakterij.

==F. Mojica (2000)==

Povečano število znanih genomov bakterij in arhej je pospešilo raziskave o motivih zaporedij DNA. Francisco Mojica je leta 2000 potrdil prisotnost ponavljajočih zaporedij v prokariontih, katero so s kolegi predstavili kot posebno družino prokariontskih zaporedij pod imenom SRSR (short regularly spaced repeats). Z analizami so ugotovili, da so SRSR prisotni znotraj genomov večine arhej ter različnih skupin bakterij in tako predstavljajo eno najbolj razširjenih družin v prokariontskih genomih. Ugotovili so, da so SRSR zaporedja znotraj enega genoma precej homogena, pojavljajo pa se tudi podobnosti razporeditve med organizmi, ki izhajajo iz skupnega prednika ter podobnosti znotraj posameznih domen.
V tej raziskavi je bilo ključno odkritje pojav kratkih palindromskih zaporedij v dodatnih organizmih in s tem vpeljava nove družine nukleotidnih zaporedij, za katero je značilno da so ločena s stalno dolgimi prekinitvenimi zaporedji. Čeprav so odkrili podobna zaporedja znotraj genomov različnih prokariontov, niso vedeli, če ima ta družina zaporedij tudi skupno funkcijo v vseh prokariontih.

==R. Jansen (2002)==

Novo imenovana družina zaporedij je spodbudila raziskave na Nizozemskem pod vodstvom Ruuda Jansena. Z računalniško analizo so želeli določiti lokacije SRSR v do tedaj znanih prokariontskih genomih. Izbirali so posamezna SRSR zaporedja bakterij in arhej, ter jih primerjali s celotnimi genomi prokariontov. Primerjali so tudi prekinitvena zaporedja, ki so med SRSR, ter prišli do spoznanja, da so tako SRSR kot prekinitvena zaporedja večinoma unikatna za genom posamezne vrste. V nadaljevanju so zato iskali nove lokacije SRSR na podlagi njihovega motiva ponavljanja, ki pa je bil zanje značilen v vseh do tedaj odkritih zaporedij – kratka palindromska zaporedja alternirajo s prekinitvenimi zaporedji stalnih dolžin. Z analizami so v več organizmih odkrili tudi prisotnost daljših zaporedij na enem koncu SRSR in predpostavili, da daljše zaporedje in SRSR skupaj predstavljata eno enoto. Ta zaporedja pred SRSR so poimenovali vodilna zaporedja, ki so si glede na zaporedje baz podobna le znotraj enega genoma, vendar pa imajo nekatere splošne skupne lastnosti. Nimajo odprtega bralnega okvirja, torej ne vsebujejo zaporedja, ki bi kodiralo za proteine, poleg tega pa pogosto vsebujejo sosledje enakih nukleotidov in na splošno velik delež adenina in timina.

Nova odkrtija so znanstvenike gnala k dodatnem raziskovanju, vendar so ugotovili, da so bila v preteklosti v tisku uporabljena različna poimenovanja za novo odkrit motiv ponavljanja znotraj DNA. V namen poenotenja sta zato Jansen in Mojica leta 2002 vpeljala novo ime, ki je ostalo v uporabi do danes – CRISPR (clustered regularly spaced palindromic repeats). Ob vpeljavi novega imena je Jansen s kolegi odkril tudi novo lastnost CRISPR zaporedij. S primerjavo genov ob CRISPR zaporedjih so odkrili pogosto prisotnost štirih genov, ki jih niso našli v prokariontih brez CRISPR regij. Skupino novo odkritih genov so poimenovali cas (CRISPR associated genes), posamezne gene pa od Cas1 do Cas4. V tej raziskavi še niso identificirali točne funkcije vseh cas genov, so pa predpostavili vlogi genov Cas3 in Cas4. Analiza aminokislinskih ostankov teh dveh proteinov je pokazala homolognost med Cas3 in helikazo ter med Cas4 in RecB eksonukleazo.

==Znane lastnosti CRISPR zaporedij do leta 2002==

Do leta 2002 so CRISPR zaporedja odkrili v več kot 40 različnih prokariontih. Znano je, da gre za kratka zaporedja dolga od 21 do 37 baznih parov, ki so ločena s prekinitvenimi zaporedji, dolgimi 32 baznih parov. Pred kratkim zaporedjem se nahajajo daljše zaporedje dolgo nekaj sto baznih parov, ki so ga poimenovali vodilno zaporedje in skupina genov, ki so jih poimenovali cas. V letu 2002 so torej že poznali splošno strukturo regije CRISPR, še vedno pa niso poznali izvora zaporedij ter njihove vloge v organizmu.

==Viri in literatura==

*Mojica, F. J., Rodriguez-Valera, F. The discovery of CRISPR in archaea and bacteria, The FEBS Journal, 2016, 283(17), 3162-9

*Mojica, F. J., Ferrer, C., Juez, G., Rodriguez-Valera, F. Long stretches of short tandem repeats are present in the largest replicons of the Archaea Haloferax mediterranei and Haloferax volcanii and could be involved in replicon partitioning, Molecular Biology (1995), 17(1), 85-93

*Ishino Y, Shinagawa H, Makino K, Amemura M, Nakata A. 1987. Nucleotide sequence of the iap gene, responsible for alkaline phosphatase isozyme conversion in Escherichia coli, and identification of the gene product. Journal of Bacteriol 169:5429 –5433

*Ishino Y., Krupovic M., Forterre, P. 2018. History of CRISPR-Cas from Encounter with a Mysterious Repeated Sequence to Genome Editing Technology. Journal of Bacteriol 200(7): 17-58

*Jansen R., van Embden J.D.A, Gaastra W., Schouls L.M., 2002. Identification of genes that are asociated with DNA repeats in prokaryotes. Molecular Microbiology 43(6), 1565-1575

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Odkritje in opis regij CRISPR in Cas (do leta ~2002)

2019-04-14T16:29:23Z

Eva Gartner: /* Prvo odkritje */

==Uvod==

Analize celotnih genomov organizmov so znanstvenikom omogočile primerjavo le teh med posameznimi organizmi. Rezultati raziskav so pokazali, da so pri velikem številu prokariontov prisotna ponavljajoča zaporedja. Ta so lahko daljša ( do 100 kbp), ki jim pogosto pripisujejo kakšno biološko pomembno funkcijo ali pa krajša, sestavljena iz le nekaj nukleotidov . Slednje delimo na zaporedna ponavljajoča zaporedja, pri katerih so si enote, ki se ponavljajo sosednje in prekinjena ponavljajoča zaporedja, pri katerih so med posameznimi ponavljajočimi se zaporedji heterogene prekinitvene sekvence različnih dolžin. Naš seminar se osredotoča na odkritje obstoja posebne družine prekinjenih ponavljajočih zaporedij, ki so jih kasneje poimenovali zaporedja CRISPR.

==Prvo odkritje==

Odkritje prvih ponavljajočih se zaporedij je bilo povsem naključno. Leta 1987 je skupina znanstvenikov na čelu z Yoshizumi Ishinom naredila raziskavo, pri katerem so želeli indetificirati protein, odgovoren za pretvorbo izocima alkalna fosfataza pri organizmu ''Escherichia coli''
(celice K-12). Uspelo jim je sekvencirati 1,7 kbp dolg fragment DNA v katerem se je med drugim nahajal gen iap, za katerega so sklepali, da zapisuje preiskovani protein. Najprej so pripravili plazmidne vektorje v katere so klonirali tarčni DNA fragment , nato pa so ga po razgradnji na manjše fragmente prenesli v vektor M13mp19, v katerem je potekalo sekvenciranje po Sangerjevi metodi. Nukleotidno zaporedje so določili z avtoradiografijo. Med sekvenciranjem DNA fragmenta so na njegovem 3΄ koncu opazili nenavadno strukturo. Navzdol po genomu od gena iap se je nahajalo pet močno homolognih sekvenc, sestavljenih iz 29 nukleotidov, znotraj katerih je bilo palindromsko zaporedje 14 bp, med njimi pa so bile prekinitve iz 32 nukleotidov. Že nekaj let pred tem odkritjem, leta 1984, so pri raziskavi na bakterijah ''E. coli'' in ''Salmonella enterica'' opazili palindromska zaporedja, ki so jim pripisali funkcijo stabilizacije mRNA, vendar ob primerjavi niso našli nobene podobnosti med temi zaporedji in na novo odkritimi zaporedji . To odkritje je bilo tako skrivnostno, da so ga omenili celo v razpravi na koncu članka, čeprav takrat še niso razumeli njihove biološke funkcije. Znanost v času te raziskave še ni bila tako razvita in niso poznali danes razvitih metod sekvenciranja in kloniranja DNA fragmentov, zato je bil celoten postopek dolgotrajen. Več mesecev so potrebovali, da so natančno določili ponavljajoče zaporedje. Težave jim je povzročala predvsem sekundarna struktura, ki je nastala zaradi palindromskega zaporedja. Neverjetno je, da bi lahko z danes poznano tehnologijo npr. s polimerazno verižno reakcijo enako regijo posekvencirali v enem dnevu.

Temu odkritju je kmalu sledilo še več odkritij enakih ponavljajočih zaporedij pri različnih sevih ''E. coli'' in nekaterih ostalih bakterijah ( npr. ''Salmonella typhimurium'' in ''Shigela dysenteriae''). Do pomembnega odkritja so leta 1993 prišli tudi nizozemski znanstveniki, ki so prekinjena ponavljajoča zaporedja našli pri preučevanju bakterije ''Mycobacterium tuberculosis''. S prmerjavo majhnega dela te regije mnogih različnih sevov so preučevali pojav polimorfizma ponavljajočih zaporedij pri omenjeni bakteriji, ki so posledica genetskih prerazporeditev. Na podlagi polimorfizma so razvili metodo za njihovo identifikacijo.

V prvih letih raziskovanja je bilo javno dostopnih zelo malo podatkov o sekvenciranih genomih, zato so prekinjena ponavljajoča zaporedja opazili pri relativno majhnem številu organizmov. Ob razvoju novih tehnik sekvenciranja pa je bilo teh podatkov vedno več, čemur so sledila tudi vedno večja odkritja na tem področju.

==Odkritje regij CRISPR pri arhejah (1993–2000)==

Pri arhejah je takšna zaporedja prvi opazil Francisco Juan Martinez Mojica, ki je kot del mikrobiološke skupine na Univerzi Alicante v Španiji raziskoval regulatorne mehanizme haloarhej in njihovo prilagajanje na spremembe v okolju. Preučevani organizem je bil ''Haloferax mediterranei'' – haloarheja, ki živi v okoljih, kjer slanost doseže tudi 20–25 %. Mojica se je pri raziskovanju usmeril na gensko še nekategorizirane regije genoma ''H. mediterranei'', ki so bile predvidoma zaradi spremembe v slanosti okolja podvržene nekakšnim DNA-modifikacijam. Vendar pa so pri sekvenciranju in genski analizi teh regij naleteli na nepričakovan vzorec. Avtoradiogram je pokazal DNA-segmente, dolge približno 30 bp, ki se ponavljajo na konstantnih razdaljah. Po dodatnem sekvenciranju regij so odkrili prisotnost vsaj 14 skoraj popolnoma ohranjenih ponovitev, vsaka ponovitev pa je vključevala kratko obrnjeno palindromsko ponovitev. Ponavljajoči vzorci so se nahajali na nekodirajočem območju genoma, poleg ORF (»open reading frames«), ki niso bili homologni nobenemu do takrat znanemu proteinu. Poleg tega pa so pri ponavljajočih se regijah zaznali številne transkripte RNA, kar nakazuje na visoko procesirano RNA iz teh regij. Čeprav so bila takšna ponavljajoča zaporedja opažena že pri nekaterih bakterijah (''Escherichia coli'', ''Mycobacterium spp''.), so bila pri tem eksperimentu prvič videna pri arhejah.

Medtem ko so za bakterijske ponovitve takrat le predvidevali o njihovi biološki funkciji, npr. regulacija sosednjih genov, so biološke funkcije TREPs (Tandem REPeats) pri arhejah tudi eksperimentalno raziskovali. TREP-zaporedja so našli v kromosomu in plazmidu ''H. mediterranei'' in sorodni haloarheji – ''Haloferax volcanii''. Zaradi možnosti genske manipulacije so pri celicah ''H. volcanii'' raziskovali učinek prisotnosti rekombinantnega plazmida, ki je vseboval fragmente TREP. Dve hipotezi o biološki funkciji TREPs so takoj ovrgli, in sicer njihovo vlogo pri rekombinaciji DNA in regulaciji sosednjih genov. Nesmiselno bi bilo predvidevati, da bi bile tako velike genske strukture povezane zgolj z regulacijo transkripcije nekaj genov. Predpostavili pa so, da morajo TREPs igrati pomembno vlogo pri celičnem ciklu. Prisotni so namreč v največjih in najverjetneje najpomembnejših replikonih celice. Poleg tega je prisotnost dodatnih kopij TREP (vstavljene v gostujočo celico s pomočjo vektorja) povzročila zmanjšano preživetje celic in spremembo v sestavi DNA, kar podpira hipotezo, da imajo TREPs pomembno vlogo pri ločevanju replikonov. Zaradi visoke ohranjenosti TREPs med vrstami haloarhej in prisotnosti zelo podobnih struktur pri ''E. coli'' pa so lahko ugibali, da imajo TREPs univerzalno oz. podobno vlogo pri organizmih, kjer so jih odkrili.

Za dokaz zgornjih predvidevanj o biološki funkciji TREPs so bile seveda potrebne dodatne študije na haloarhejah, za katere pa Mojica ni dobil finančne podpore. Poskuse je zato moral nadaljevati na ''E. coli'', kjer enaki eksperimenti kot prej na ''H. volcanii'' niso dali željenih rezultatov. Dodatne raziskave niso podale nobenega dokaza o vpletenosti ponavljajočih se zaporedij v ločitveni aparat, iz rezultatov pa bi lahko sklepali, da bi zaporedja lahko služila kot nekakšna mesta za kooperativno vezavo na celične strukture, npr. na citoplazemsko membrano, ali proteine, vplivali pa bi lahko tudi na strukturo DNA.

Leta 1995 je bil objavljen prvi celoten genom prostoživečega organizma, s čimer se je začela nova doba v biologiji. Pospešeno sekvenciranje je pripomoglo k nastanku dodatnih zbirk prokariontskih genomov, na podlagi česar je leta 1996 lahko nastalo prvo celovito poročilo o konstantno ponavljajočih se regijah v celotnem genomu. Do konca stoletja so podobna zaporedja odkrili še v 12 vrstah arhej in bakterij.

==F. Mojica (2000)==

Povečano število znanih genomov bakterij in arhej je pospešilo raziskave o motivih zaporedij DNA. Francisco Mojica je leta 2000 potrdil prisotnost ponavljajočih zaporedij v prokariontih, katero so s kolegi predstavili kot posebno družino prokariontskih zaporedij pod imenom SRSR (short regularly spaced repeats). Z analizami so ugotovili, da so SRSR prisotni znotraj genomov večine arhej ter različnih skupin bakterij in tako predstavljajo eno najbolj razširjenih družin v prokariontskih genomih. Ugotovili so, da so SRSR zaporedja znotraj enega genoma precej homogena, pojavljajo pa se tudi podobnosti razporeditve med organizmi, ki izhajajo iz skupnega prednika ter podobnosti znotraj posameznih domen.
V tej raziskavi je bilo ključno odkritje pojav kratkih palindromskih zaporedij v dodatnih organizmih in s tem vpeljava nove družine nukleotidnih zaporedij, za katero je značilno da so ločena s stalno dolgimi prekinitvenimi zaporedji. Čeprav so odkrili podobna zaporedja znotraj genomov različnih prokariontov, niso vedeli, če ima ta družina zaporedij tudi skupno funkcijo v vseh prokariontih.

==R. Jansen (2002)==

Novo imenovana družina zaporedij je spodbudila raziskave na Nizozemskem pod vodstvom Ruuda Jansena. Z računalniško analizo so želeli določiti lokacije SRSR v do tedaj znanih prokariontskih genomih. Izbirali so posamezna SRSR zaporedja bakterij in arhej, ter jih primerjali s celotnimi genomi prokariontov. Primerjali so tudi prekinitvena zaporedja, ki so med SRSR, ter prišli do spoznanja, da so tako SRSR kot prekinitvena zaporedja večinoma unikatna za genom posamezne vrste. V nadaljevanju so zato iskali nove lokacije SRSR na podlagi njihovega motiva ponavljanja, ki pa je bil zanje značilen v vseh do tedaj odkritih zaporedij – kratka palindromska zaporedja alternirajo s prekinitvenimi zaporedji stalnih dolžin. Z analizami so v več organizmih odkrili tudi prisotnost daljših zaporedij na enem koncu SRSR in predpostavili, da daljše zaporedje in SRSR skupaj predstavljata eno enoto. Ta zaporedja pred SRSR so poimenovali vodilna zaporedja, ki so si glede na zaporedje baz podobna le znotraj enega genoma, vendar pa imajo nekatere splošne skupne lastnosti. Nimajo odprtega bralnega okvirja, torej ne vsebujejo zaporedja, ki bi kodiralo za proteine, poleg tega pa pogosto vsebujejo sosledje enakih nukleotidov in na splošno velik delež adenina in timina.

Nova odkrtija so znanstvenike gnala k dodatnem raziskovanju, vendar so ugotovili, da so bila v preteklosti v tisku uporabljena različna poimenovanja za novo odkrit motiv ponavljanja znotraj DNA. V namen poenotenja sta zato Jansen in Mojica leta 2002 vpeljala novo ime, ki je ostalo v uporabi do danes – CRISPR (clustered regularly spaced palindromic repeats). Ob vpeljavi novega imena je Jansen s kolegi odkril tudi novo lastnost CRISPR zaporedij. S primerjavo genov ob CRISPR zaporedjih so odkrili pogosto prisotnost štirih genov, ki jih niso našli v prokariontih brez CRISPR regij. Skupino novo odkritih genov so poimenovali cas (CRISPR associated genes), posamezne gene pa od Cas1 do Cas4. V tej raziskavi še niso identificirali točne funkcije vseh cas genov, so pa predpostavili vlogi genov Cas3 in Cas4. Analiza aminokislinskih ostankov teh dveh proteinov je pokazala homolognost med Cas3 in helikazo ter med Cas4 in RecB eksonukleazo.

==Znane lastnosti CRISPR zaporedij do leta 2002==

Do leta 2002 so CRISPR zaporedja odkrili v več kot 40 različnih prokariontih. Znano je, da gre za kratka zaporedja dolga od 21 do 37 baznih parov, ki so ločena s prekinitvenimi zaporedji, dolgimi 32 baznih parov. Pred kratkim zaporedjem se nahajajo daljše zaporedje dolgo nekaj sto baznih parov, ki so ga poimenovali vodilno zaporedje in skupina genov, ki so jih poimenovali cas. V letu 2002 so torej že poznali splošno strukturo regije CRISPR, še vedno pa niso poznali izvora zaporedij ter njihove vloge v organizmu.

==Viri in literatura==

*Mojica, F. J., Rodriguez-Valera, F. The discovery of CRISPR in archaea and bacteria, The FEBS Journal, 2016, 283(17), 3162-9

*Mojica, F. J., Ferrer, C., Juez, G., Rodriguez-Valera, F. Long stretches of short tandem repeats are present in the largest replicons of the Archaea Haloferax mediterranei and Haloferax volcanii and could be involved in replicon partitioning, Molecular Biology (1995), 17(1), 85-93

*Ishino Y, Shinagawa H, Makino K, Amemura M, Nakata A. 1987. Nucleotide sequence of the iap gene, responsible for alkaline phosphatase isozyme conversion in Escherichia coli, and identification of the gene product. Journal of Bacteriol 169:5429 –5433

*Ishino Y., Krupovic M., Forterre, P. 2018. History of CRISPR-Cas from Encounter with a Mysterious Repeated Sequence to Genome Editing Technology. Journal of Bacteriol 200(7): 17-58

*Jansen R., van Embden J.D.A, Gaastra W., Schouls L.M., 2002. Identification of genes that are asociated with DNA repeats in prokaryotes. Molecular Microbiology 43(6), 1565-1575

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Odkritje in opis regij CRISPR in Cas (do leta ~2002)

2019-04-14T16:08:05Z

Eva Gartner: /* Prvo odkritje */

==Uvod==

Analize celotnih genomov organizmov so znanstvenikom omogočile primerjavo le teh med posameznimi organizmi. Rezultati raziskav so pokazali, da so pri velikem številu prokariontov prisotna ponavljajoča zaporedja. Ta so lahko daljša ( do 100 kbp), ki jim pogosto pripisujejo kakšno biološko pomembno funkcijo ali pa krajša, sestavljena iz le nekaj nukleotidov . Slednje delimo na zaporedna ponavljajoča zaporedja, pri katerih so si enote, ki se ponavljajo sosednje in prekinjena ponavljajoča zaporedja, pri katerih so med posameznimi ponavljajočimi se zaporedji heterogene prekinitvene sekvence različnih dolžin. Naš seminar se osredotoča na odkritje obstoja posebne družine prekinjenih ponavljajočih zaporedij, ki so jih kasneje poimenovali zaporedja CRISPR.

==Prvo odkritje==

Odkritje prvih ponavljajočih se zaporedij je bilo povsem naključno. Leta 1987 je skupina znanstvenikov na čelu z Yoshizumi Ishinom naredila raziskavo, pri katerem so želeli indetificirati protein, odgovoren za pretvorbo izocima alkalna fosfataza pri organizmu ''Escherichia coli''
(celice K-12). Uspelo jim je sekvencirati 1,7 kbp dolg fragment DNA v katerem se je med drugim nahajal gen iap, za katerega so sklepali, da zapisuje preiskovani protein. Najprej so pripravili plazmidne vektorje v katere so klonirali tarčni DNA fragment , nato pa so ga po razgradnji na manjše fragmente prenesli v vektor M13, v katerem je potekalo sekvenciranje po Sangerjevi metodi. Nukleotidno zaporedje so določili z avtoradiografijo. Med sekvenciranjem DNA fragmenta so na njegovem 3΄ koncu opazili nenavadno strukturo. Navzdol po genomu od gena iap se je nahajalo pet močno homolognih sekvenc, sestavljenih iz 29 nukleotidov, znotraj katerih je bilo palindromsko zaporedje 14 bp, med njimi pa so bile prekinitve iz 32 nukleotidov. Že nekaj let pred tem odkritjem, leta 1984, so pri raziskavi na bakterijah ''E. coli'' in ''Salmonella enterica'' opazili palindromska zaporedja, ki so jim pripisali funkcijo stabilizacije mRNA, vendar ob primerjavi niso našli nobene podobnosti med temi zaporedji in na novo odkritimi zaporedji . To odkritje je bilo tako skrivnostno, da so ga omenili celo v razpravi na koncu članka, čeprav takrat še niso razumeli njihove biološke funkcije. Znanost v času te raziskave še ni bila tako razvita in niso poznali danes razvitih metod sekvenciranja in kloniranja DNA fragmentov, zato je bil celoten postopek dolgotrajen. Več mesecev so potrebovali, da so natančno določili ponavljajoče zaporedje. Težave jim je povzročala predvsem sekundarna struktura, ki je nastala zaradi palindromskega zaporedja. Neverjetno je, da bi lahko z danes poznano tehnologijo npr. s polimerazno verižno reakcijo enako regijo posekvencirali v enem dnevu.

Temu odkritju je kmalu sledilo še več odkritij enakih ponavljajočih zaporedij pri različnih sevih ''E. coli'' in nekaterih ostalih bakterijah ( npr. ''Salmonella typhimurium'' in ''Shigela dysenteriae''). Do pomembnega odkritja so leta 1993 prišli tudi nizozemski znanstveniki, ki so prekinjena ponavljajoča zaporedja našli pri preučevanju bakterije ''Mycobacterium tuberculosis''. S prmerjavo majhnega dela te regije mnogih različnih sevov so preučevali pojav polimorfizma ponavljajočih zaporedij pri omenjeni bakteriji, ki so posledica genetskih prerazporeditev. Na podlagi polimorfizma so razvili metodo za njihovo identifikacijo.

V prvih letih raziskovanja je bilo javno dostopnih zelo malo podatkov o sekvenciranih genomih, zato so prekinjena ponavljajoča zaporedja opazili pri relativno majhnem številu organizmov. Ob razvoju novih tehnik sekvenciranja pa je bilo teh podatkov vedno več, čemur so sledila tudi vedno večja odkritja na tem področju.

==Odkritje regij CRISPR pri arhejah (1993–2000)==

Pri arhejah je takšna zaporedja prvi opazil Francisco Juan Martinez Mojica, ki je kot del mikrobiološke skupine na Univerzi Alicante v Španiji raziskoval regulatorne mehanizme haloarhej in njihovo prilagajanje na spremembe v okolju. Preučevani organizem je bil ''Haloferax mediterranei'' – haloarheja, ki živi v okoljih, kjer slanost doseže tudi 20–25 %. Mojica se je pri raziskovanju usmeril na gensko še nekategorizirane regije genoma ''H. mediterranei'', ki so bile predvidoma zaradi spremembe v slanosti okolja podvržene nekakšnim DNA-modifikacijam. Vendar pa so pri sekvenciranju in genski analizi teh regij naleteli na nepričakovan vzorec. Avtoradiogram je pokazal DNA-segmente, dolge približno 30 bp, ki se ponavljajo na konstantnih razdaljah. Po dodatnem sekvenciranju regij so odkrili prisotnost vsaj 14 skoraj popolnoma ohranjenih ponovitev, vsaka ponovitev pa je vključevala kratko obrnjeno palindromsko ponovitev. Ponavljajoči vzorci so se nahajali na nekodirajočem območju genoma, poleg ORF (»open reading frames«), ki niso bili homologni nobenemu do takrat znanemu proteinu. Poleg tega pa so pri ponavljajočih se regijah zaznali številne transkripte RNA, kar nakazuje na visoko procesirano RNA iz teh regij. Čeprav so bila takšna ponavljajoča zaporedja opažena že pri nekaterih bakterijah (''Escherichia coli'', ''Mycobacterium spp''.), so bila pri tem eksperimentu prvič videna pri arhejah.

Medtem ko so za bakterijske ponovitve takrat le predvidevali o njihovi biološki funkciji, npr. regulacija sosednjih genov, so biološke funkcije TREPs (Tandem REPeats) pri arhejah tudi eksperimentalno raziskovali. TREP-zaporedja so našli v kromosomu in plazmidu ''H. mediterranei'' in sorodni haloarheji – ''Haloferax volcanii''. Zaradi možnosti genske manipulacije so pri celicah ''H. volcanii'' raziskovali učinek prisotnosti rekombinantnega plazmida, ki je vseboval fragmente TREP. Dve hipotezi o biološki funkciji TREPs so takoj ovrgli, in sicer njihovo vlogo pri rekombinaciji DNA in regulaciji sosednjih genov. Nesmiselno bi bilo predvidevati, da bi bile tako velike genske strukture povezane zgolj z regulacijo transkripcije nekaj genov. Predpostavili pa so, da morajo TREPs igrati pomembno vlogo pri celičnem ciklu. Prisotni so namreč v največjih in najverjetneje najpomembnejših replikonih celice. Poleg tega je prisotnost dodatnih kopij TREP (vstavljene v gostujočo celico s pomočjo vektorja) povzročila zmanjšano preživetje celic in spremembo v sestavi DNA, kar podpira hipotezo, da imajo TREPs pomembno vlogo pri ločevanju replikonov. Zaradi visoke ohranjenosti TREPs med vrstami haloarhej in prisotnosti zelo podobnih struktur pri ''E. coli'' pa so lahko ugibali, da imajo TREPs univerzalno oz. podobno vlogo pri organizmih, kjer so jih odkrili.

Za dokaz zgornjih predvidevanj o biološki funkciji TREPs so bile seveda potrebne dodatne študije na haloarhejah, za katere pa Mojica ni dobil finančne podpore. Poskuse je zato moral nadaljevati na ''E. coli'', kjer enaki eksperimenti kot prej na ''H. volcanii'' niso dali željenih rezultatov. Dodatne raziskave niso podale nobenega dokaza o vpletenosti ponavljajočih se zaporedij v ločitveni aparat, iz rezultatov pa bi lahko sklepali, da bi zaporedja lahko služila kot nekakšna mesta za kooperativno vezavo na celične strukture, npr. na citoplazemsko membrano, ali proteine, vplivali pa bi lahko tudi na strukturo DNA.

Leta 1995 je bil objavljen prvi celoten genom prostoživečega organizma, s čimer se je začela nova doba v biologiji. Pospešeno sekvenciranje je pripomoglo k nastanku dodatnih zbirk prokariontskih genomov, na podlagi česar je leta 1996 lahko nastalo prvo celovito poročilo o konstantno ponavljajočih se regijah v celotnem genomu. Do konca stoletja so podobna zaporedja odkrili še v 12 vrstah arhej in bakterij.

==F. Mojica (2000)==

Povečano število znanih genomov bakterij in arhej je pospešilo raziskave o motivih zaporedij DNA. Francisco Mojica je leta 2000 potrdil prisotnost ponavljajočih zaporedij v prokariontih, katero so s kolegi predstavili kot posebno družino prokariontskih zaporedij pod imenom SRSR (short regularly spaced repeats). Z analizami so ugotovili, da so SRSR prisotni znotraj genomov večine arhej ter različnih skupin bakterij in tako predstavljajo eno najbolj razširjenih družin v prokariontskih genomih. Ugotovili so, da so SRSR zaporedja znotraj enega genoma precej homogena, pojavljajo pa se tudi podobnosti razporeditve med organizmi, ki izhajajo iz skupnega prednika ter podobnosti znotraj posameznih domen.
V tej raziskavi je bilo ključno odkritje pojav kratkih palindromskih zaporedij v dodatnih organizmih in s tem vpeljava nove družine nukleotidnih zaporedij, za katero je značilno da so ločena s stalno dolgimi prekinitvenimi zaporedji. Čeprav so odkrili podobna zaporedja znotraj genomov različnih prokariontov, niso vedeli, če ima ta družina zaporedij tudi skupno funkcijo v vseh prokariontih.

==R. Jansen (2002)==

Novo imenovana družina zaporedij je spodbudila raziskave na Nizozemskem pod vodstvom Ruuda Jansena. Z računalniško analizo so želeli določiti lokacije SRSR v do tedaj znanih prokariontskih genomih. Izbirali so posamezna SRSR zaporedja bakterij in arhej, ter jih primerjali s celotnimi genomi prokariontov. Primerjali so tudi prekinitvena zaporedja, ki so med SRSR, ter prišli do spoznanja, da so tako SRSR kot prekinitvena zaporedja večinoma unikatna za genom posamezne vrste. V nadaljevanju so zato iskali nove lokacije SRSR na podlagi njihovega motiva ponavljanja, ki pa je bil zanje značilen v vseh do tedaj odkritih zaporedij – kratka palindromska zaporedja alternirajo s prekinitvenimi zaporedji stalnih dolžin. Z analizami so v več organizmih odkrili tudi prisotnost daljših zaporedij na enem koncu SRSR in predpostavili, da daljše zaporedje in SRSR skupaj predstavljata eno enoto. Ta zaporedja pred SRSR so poimenovali vodilna zaporedja, ki so si glede na zaporedje baz podobna le znotraj enega genoma, vendar pa imajo nekatere splošne skupne lastnosti. Nimajo odprtega bralnega okvirja, torej ne vsebujejo zaporedja, ki bi kodiralo za proteine, poleg tega pa pogosto vsebujejo sosledje enakih nukleotidov in na splošno velik delež adenina in timina.

Nova odkrtija so znanstvenike gnala k dodatnem raziskovanju, vendar so ugotovili, da so bila v preteklosti v tisku uporabljena različna poimenovanja za novo odkrit motiv ponavljanja znotraj DNA. V namen poenotenja sta zato Jansen in Mojica leta 2002 vpeljala novo ime, ki je ostalo v uporabi do danes – CRISPR (clustered regularly spaced palindromic repeats). Ob vpeljavi novega imena je Jansen s kolegi odkril tudi novo lastnost CRISPR zaporedij. S primerjavo genov ob CRISPR zaporedjih so odkrili pogosto prisotnost štirih genov, ki jih niso našli v prokariontih brez CRISPR regij. Skupino novo odkritih genov so poimenovali cas (CRISPR associated genes), posamezne gene pa od Cas1 do Cas4. V tej raziskavi še niso identificirali točne funkcije vseh cas genov, so pa predpostavili vlogi genov Cas3 in Cas4. Analiza aminokislinskih ostankov teh dveh proteinov je pokazala homolognost med Cas3 in helikazo ter med Cas4 in RecB eksonukleazo.

==Znane lastnosti CRISPR zaporedij do leta 2002==

Do leta 2002 so CRISPR zaporedja odkrili v več kot 40 različnih prokariontih. Znano je, da gre za kratka zaporedja dolga od 21 do 37 baznih parov, ki so ločena s prekinitvenimi zaporedji, dolgimi 32 baznih parov. Pred kratkim zaporedjem se nahajajo daljše zaporedje dolgo nekaj sto baznih parov, ki so ga poimenovali vodilno zaporedje in skupina genov, ki so jih poimenovali cas. V letu 2002 so torej že poznali splošno strukturo regije CRISPR, še vedno pa niso poznali izvora zaporedij ter njihove vloge v organizmu.

==Viri in literatura==

*Mojica, F. J., Rodriguez-Valera, F. The discovery of CRISPR in archaea and bacteria, The FEBS Journal, 2016, 283(17), 3162-9

*Mojica, F. J., Ferrer, C., Juez, G., Rodriguez-Valera, F. Long stretches of short tandem repeats are present in the largest replicons of the Archaea Haloferax mediterranei and Haloferax volcanii and could be involved in replicon partitioning, Molecular Biology (1995), 17(1), 85-93

*Ishino Y, Shinagawa H, Makino K, Amemura M, Nakata A. 1987. Nucleotide sequence of the iap gene, responsible for alkaline phosphatase isozyme conversion in Escherichia coli, and identification of the gene product. Journal of Bacteriol 169:5429 –5433

*Ishino Y., Krupovic M., Forterre, P. 2018. History of CRISPR-Cas from Encounter with a Mysterious Repeated Sequence to Genome Editing Technology. Journal of Bacteriol 200(7): 17-58

*Jansen R., van Embden J.D.A, Gaastra W., Schouls L.M., 2002. Identification of genes that are asociated with DNA repeats in prokaryotes. Molecular Microbiology 43(6), 1565-1575

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Odkritje in opis regij CRISPR in Cas (do leta ~2002)

2019-04-14T13:14:59Z

Eva Gartner: /* Prvo odkritje */

==Uvod==

Analize celotnih genomov organizmov so znanstvenikom omogočile primerjavo le teh med posameznimi organizmi. Rezultati raziskav so pokazali, da so pri velikem številu prokariontov prisotna ponavljajoča zaporedja. Ta so lahko daljša ( do 100 kbp), ki jim pogosto pripisujejo kakšno biološko pomembno funkcijo ali pa krajša, sestavljena iz le nekaj nukleotidov . Slednje delimo na zaporedna ponavljajoča zaporedja, pri katerih so si enote, ki se ponavljajo sosednje in prekinjena ponavljajoča zaporedja, pri katerih so med posameznimi ponavljajočimi se zaporedji heterogene prekinitvene sekvence različnih dolžin. Naš seminar se osredotoča na odkritje obstoja posebne družine prekinjenih ponavljajočih zaporedij, ki so jih kasneje poimenovali zaporedja CRISPR.

==Prvo odkritje==

Odkritje prvih ponavljajočih se zaporedij je bilo povsem naključno. Leta 1987 je skupina znanstvenikov na čelu z Yoshizumi Ishinom naredila raziskavo, pri katerem so želeli indetificirati protein, odgovoren za pretvorbo izocima alkalna fosfataza pri organizmu ''Escherichia coli''
(celice K-12). Uspelo jim je sekvencirati 1,7 kbp dolg fragment DNA v katerem se je med drugim nahajal gen iap, za katerega so sklepali, da zapisuje preiskovani protein. Najprej so pripravili plazmidne vektorje v katere so klonirali tarčni DNA fragment , nato pa so ga po razgradnji na manjše fragmente prenesli v vektor M13, v katerem je potekalo sekvenciranje po Sangerjevi metodi. Nukleotidno zaporedje so določili z avtoradiografijo. Med sekvenciranjem DNA fragmenta so na njegovem 3΄ koncu opazili nenavadno strukturo. Navzdol po genomu od gena iap se je nahajalo pet močno homolognih sekvenc, sestavljenih iz 29 nukleotidov, znotraj katerih je bilo palindromsko zaporedje 14 bp, med njimi pa so bile prekinitve iz 32 nukleotidov. Že nekaj let pred tem odkritjem, leta 1984, so pri raziskavi na bakterijah ''E. coli'' in ''Salmonella enterica'' opazili palindromska zaporedja, ki so jim pripisali funkcijo stabilizacije mRNA, vendar ob primerjavi niso našli nobene podobnosti med temi zaporedji in na novo odkritimi zaporedji . To odkritje je bilo tako skrivnostno, da so ga omenili celo v razpravi na koncu članka, čeprav takrat še niso razumeli njihove biološke funkcije. Znanost v času te raziskave še ni bila tako razvita in niso poznali danes razvitih metod sekvenciranja in kloniranja DNA fragmentov, zato je bil celoten postopek dolgotrajen. Več mesecev so potrebovali, da so natančno določili ponavljajoče zaporedje. Težave jim je povzročala predvsem sekundarna struktura, ki je nastala zaradi palindromskega zaporedja. Neverjetno je, da bi lahko z danes poznano tehnologijo npr. s polimerazno verižno reakcijo enako regijo posekvencirali v enem dnevu.

Temu odkritju je kmalu sledilo še več odkritij enakih ponavljajočih zaporedij pri različnih sevih ''E. coli'' in nekaterih ostalih bakterijah ( npr. ''Salmonella typhimurium'' in ''Shigela dysenteriae''). Do pomembnega odkritja so leta 1993 prišli tudi nizozemski znanstveniki, ki so prekinjena ponavljajoča zaporedja našli pri preučevanju bakterije ''Mycobacterium tuberculosis''. Prepoznali so veliko raznolikost zaporedij med posameznimi sevi bakterije in to uporabili za njihovo identifikacijo.

V prvih letih raziskovanja je bilo javno dostopnih zelo malo podatkov o sekvenciranih genomih, zato so prekinjena ponavljajoča zaporedja opazili pri relativno majhnem številu organizmov. Ob razvoju novih tehnik sekvenciranja pa je bilo teh podatkov vedno več, čemur so sledila tudi vedno večja odkritja na tem področju.

==Odkritje regij CRISPR pri arhejah (1993–2000)==

Pri arhejah je takšna zaporedja prvi opazil Francisco Juan Martinez Mojica, ki je kot del mikrobiološke skupine na Univerzi Alicante v Španiji raziskoval regulatorne mehanizme haloarhej in njihovo prilagajanje na spremembe v okolju. Preučevani organizem je bil ''Haloferax mediterranei'' – haloarheja, ki živi v okoljih, kjer slanost doseže tudi 20–25 %. Mojica se je pri raziskovanju usmeril na gensko še nekategorizirane regije genoma ''H. mediterranei'', ki so bile predvidoma zaradi spremembe v slanosti okolja podvržene nekakšnim DNA-modifikacijam. Vendar pa so pri sekvenciranju in genski analizi teh regij naleteli na nepričakovan vzorec. Avtoradiogram je pokazal DNA-segmente, dolge približno 30 bp, ki se ponavljajo na konstantnih razdaljah. Po dodatnem sekvenciranju regij so odkrili prisotnost vsaj 14 skoraj popolnoma ohranjenih ponovitev, vsaka ponovitev pa je vključevala kratko obrnjeno palindromsko ponovitev. Ponavljajoči vzorci so se nahajali na nekodirajočem območju genoma, poleg ORF (»open reading frames«), ki niso bili homologni nobenemu do takrat znanemu proteinu. Poleg tega pa so pri ponavljajočih se regijah zaznali številne transkripte RNA, kar nakazuje na visoko procesirano RNA iz teh regij. Čeprav so bila takšna ponavljajoča zaporedja opažena že pri nekaterih bakterijah (''Escherichia coli'', ''Mycobacterium spp''.), so bila pri tem eksperimentu prvič videna pri arhejah.

Medtem ko so za bakterijske ponovitve takrat le predvidevali o njihovi biološki funkciji, npr. regulacija sosednjih genov, so biološke funkcije TREPs (Tandem REPeats) pri arhejah tudi eksperimentalno raziskovali. TREP-zaporedja so našli v kromosomu in plazmidu ''H. mediterranei'' in sorodni haloarheji – ''Haloferax volcanii''. Zaradi možnosti genske manipulacije so pri celicah ''H. volcanii'' raziskovali učinek prisotnosti rekombinantnega plazmida, ki je vseboval fragmente TREP. Dve hipotezi o biološki funkciji TREPs so takoj ovrgli, in sicer njihovo vlogo pri rekombinaciji DNA in regulaciji sosednjih genov. Nesmiselno bi bilo predvidevati, da bi bile tako velike genske strukture povezane zgolj z regulacijo transkripcije nekaj genov. Predpostavili pa so, da morajo TREPs igrati pomembno vlogo pri celičnem ciklu. Prisotni so namreč v največjih in najverjetneje najpomembnejših replikonih celice. Poleg tega je prisotnost dodatnih kopij TREP (vstavljene v gostujočo celico s pomočjo vektorja) povzročila zmanjšano preživetje celic in spremembo v sestavi DNA, kar podpira hipotezo, da imajo TREPs pomembno vlogo pri ločevanju replikonov. Zaradi visoke ohranjenosti TREPs med vrstami haloarhej in prisotnosti zelo podobnih struktur pri ''E. coli'' pa so lahko ugibali, da imajo TREPs univerzalno oz. podobno vlogo pri organizmih, kjer so jih odkrili.

Za dokaz zgornjih predvidevanj o biološki funkciji TREPs so bile seveda potrebne dodatne študije na haloarhejah, za katere pa Mojica ni dobil finančne podpore. Poskuse je zato moral nadaljevati na ''E. coli'', kjer enaki eksperimenti kot prej na ''H. volcanii'' niso dali željenih rezultatov. Dodatne raziskave niso podale nobenega dokaza o vpletenosti ponavljajočih se zaporedij v ločitveni aparat, iz rezultatov pa bi lahko sklepali, da bi zaporedja lahko služila kot nekakšna mesta za kooperativno vezavo na celične strukture, npr. na citoplazemsko membrano, ali proteine, vplivali pa bi lahko tudi na strukturo DNA.

Leta 1995 je bil objavljen prvi celoten genom prostoživečega organizma, s čimer se je začela nova doba v biologiji. Pospešeno sekvenciranje je pripomoglo k nastanku dodatnih zbirk prokariontskih genomov, na podlagi česar je leta 1996 lahko nastalo prvo celovito poročilo o konstantno ponavljajočih se regijah v celotnem genomu. Do konca stoletja so podobna zaporedja odkrili še v 12 vrstah arhej in bakterij.

==F. Mojica (2000)==

Povečano število znanih genomov bakterij in arhej je pospešilo raziskave o motivih zaporedij DNA. Francisco Mojica je leta 2000 potrdil prisotnost ponavljajočih zaporedij v prokariontih, katero so s kolegi predstavili kot posebno družino prokariontskih zaporedij pod imenom SRSR (short regularly spaced repeats). Z analizami so ugotovili, da so SRSR prisotni znotraj genomov večine arhej ter različnih skupin bakterij in tako predstavljajo eno najbolj razširjenih družin v prokariontskih genomih. Ugotovili so, da so SRSR zaporedja znotraj enega genoma precej homogena, pojavljajo pa se tudi podobnosti razporeditve med organizmi, ki izhajajo iz skupnega prednika ter podobnosti znotraj posameznih domen.
V tej raziskavi je bilo ključno odkritje pojav kratkih palindromskih zaporedij v dodatnih organizmih in s tem vpeljava nove družine nukleotidnih zaporedij, za katero je značilno da so ločena s stalno dolgimi prekinitvenimi zaporedji. Čeprav so odkrili podobna zaporedja znotraj genomov različnih prokariontov, niso vedeli, če ima ta družina zaporedij tudi skupno funkcijo v vseh prokariontih.

==R. Jansen (2002)==

Novo imenovana družina zaporedij je spodbudila raziskave na Nizozemskem pod vodstvom Ruuda Jansena. Z računalniško analizo so želeli določiti lokacije SRSR v do tedaj znanih prokariontskih genomih. Izbirali so posamezna SRSR zaporedja bakterij in arhej, ter jih primerjali s celotnimi genomi prokariontov. Primerjali so tudi prekinitvena zaporedja, ki so med SRSR, ter prišli do spoznanja, da so tako SRSR kot prekinitvena zaporedja večinoma unikatna za genom posamezne vrste. V nadaljevanju so zato iskali nove lokacije SRSR na podlagi njihovega motiva ponavljanja, ki pa je bil zanje značilen v vseh do tedaj odkritih zaporedij – kratka palindromska zaporedja alternirajo s prekinitvenimi zaporedji stalnih dolžin. Z analizami so v več organizmih odkrili tudi prisotnost daljših zaporedij na enem koncu SRSR in predpostavili, da daljše zaporedje in SRSR skupaj predstavljata eno enoto. Ta zaporedja pred SRSR so poimenovali vodilna zaporedja, ki so si glede na zaporedje baz podobna le znotraj enega genoma, vendar pa imajo nekatere splošne skupne lastnosti. Nimajo odprtega bralnega okvirja, torej ne vsebujejo zaporedja, ki bi kodiralo za proteine, poleg tega pa pogosto vsebujejo sosledje enakih nukleotidov in na splošno velik delež adenina in timina.

Nova odkrtija so znanstvenike gnala k dodatnem raziskovanju, vendar so ugotovili, da so bila v preteklosti v tisku uporabljena različna poimenovanja za novo odkrit motiv ponavljanja znotraj DNA. V namen poenotenja sta zato Jansen in Mojica leta 2002 vpeljala novo ime, ki je ostalo v uporabi do danes – CRISPR (clustered regularly spaced palindromic repeats). Ob vpeljavi novega imena je Jansen s kolegi odkril tudi novo lastnost CRISPR zaporedij. S primerjavo genov ob CRISPR zaporedjih so odkrili pogosto prisotnost štirih genov, ki jih niso našli v prokariontih brez CRISPR regij. Skupino novo odkritih genov so poimenovali cas (CRISPR associated genes), posamezne gene pa od Cas1 do Cas4. V tej raziskavi še niso identificirali točne funkcije vseh cas genov, so pa predpostavili vlogi genov Cas3 in Cas4. Analiza aminokislinskih ostankov teh dveh proteinov je pokazala homolognost med Cas3 in helikazo ter med Cas4 in RecB eksonukleazo.

==Znane lastnosti CRISPR zaporedij do leta 2002==

Do leta 2002 so CRISPR zaporedja odkrili v več kot 40 različnih prokariontih. Znano je, da gre za kratka zaporedja dolga od 21 do 37 baznih parov, ki so ločena s prekinitvenimi zaporedji, dolgimi 32 baznih parov. Pred kratkim zaporedjem se nahajajo daljše zaporedje dolgo nekaj sto baznih parov, ki so ga poimenovali vodilno zaporedje in skupina genov, ki so jih poimenovali cas. V letu 2002 so torej že poznali splošno strukturo regije CRISPR, še vedno pa niso poznali izvora zaporedij ter njihove vloge v organizmu.

==Viri in literatura==

*Mojica, F. J., Rodriguez-Valera, F. The discovery of CRISPR in archaea and bacteria, The FEBS Journal, 2016, 283(17), 3162-9

*Mojica, F. J., Ferrer, C., Juez, G., Rodriguez-Valera, F. Long stretches of short tandem repeats are present in the largest replicons of the Archaea Haloferax mediterranei and Haloferax volcanii and could be involved in replicon partitioning, Molecular Biology (1995), 17(1), 85-93

*Ishino Y, Shinagawa H, Makino K, Amemura M, Nakata A. 1987. Nucleotide sequence of the iap gene, responsible for alkaline phosphatase isozyme conversion in Escherichia coli, and identification of the gene product. Journal of Bacteriol 169:5429 –5433

*Ishino Y., Krupovic M., Forterre, P. 2018. History of CRISPR-Cas from Encounter with a Mysterious Repeated Sequence to Genome Editing Technology. Journal of Bacteriol 200(7): 17-58

*Jansen R., van Embden J.D.A, Gaastra W., Schouls L.M., 2002. Identification of genes that are asociated with DNA repeats in prokaryotes. Molecular Microbiology 43(6), 1565-1575

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Odkritje in opis regij CRISPR in Cas (do leta ~2002)

2019-04-14T10:51:11Z

Eva Gartner: /* Prvo odkritje */

==Uvod==

Analize celotnih genomov organizmov so znanstvenikom omogočile primerjavo le teh med posameznimi organizmi. Rezultati raziskav so pokazali, da so pri velikem številu prokariontov prisotna ponavljajoča zaporedja. Ta so lahko daljša ( do 100 kbp), ki jim pogosto pripisujejo kakšno biološko pomembno funkcijo ali pa krajša, sestavljena iz le nekaj nukleotidov . Slednje delimo na zaporedna ponavljajoča zaporedja, pri katerih so si enote, ki se ponavljajo sosednje in prekinjena ponavljajoča zaporedja, pri katerih so med posameznimi ponavljajočimi se zaporedji heterogene prekinitvene sekvence različnih dolžin. Naš seminar se osredotoča na odkritje obstoja posebne družine prekinjenih ponavljajočih zaporedij, ki so jih kasneje poimenovali zaporedja CRISPR.

==Prvo odkritje==

Odkritje prvih ponavljajočih se zaporedij je bilo povsem naključno. Leta 1987 je skupina znanstvenikov na čelu z Yoshizumi Ishinom naredila raziskavo, pri katerem so želeli indetificirati protein, odgovoren za pretvorbo izocima alkalna fosfataza pri organizmu ''Escherichia coli''
(celice K-12). Uspelo jim je sekvencirati 1,7 kbp dolg fragment DNA v katerem se je med drugim nahajal gen iap, za katerega so sklepali, da zapisuje preiskovani protein. Najprej so pripravili plazmidne vektorje v katere so klonirali tarčni DNA fragment , nato pa so ga po razgradnji na manjše fragmente prenesli v vektor M13, v katerem je potekalo sekvenciranje po Sangerjevi metodi. Nukleotidno zaporedje so določili z avtoradiografijo. Med sekvenciranjem DNA fragmenta so na njegovem 3΄ koncu opazili nenavadno strukturo. Navzdol po genomu od gena iap se je nahajalo pet močno homolognih sekvenc, sestavljenih iz 29 nukleotidov, znotraj katerih je bilo palindromsko zaporedje 14 bp, med njimi pa so bile prekinitve iz 32 nukleotidov. Že nekaj let pred tem odkritjem, leta 1984, so pri raziskavi na bakterijah ''E. coli'' in ''Salmonella enterica'' opazili palindromska zaporedja, ki so jim pripisali funkcijo stabilizacije mRNA, vendar ob primerjavi niso našli nobene podobnosti med temi zaporedji in na novo odkritimi zaporedji . To odkritje je bilo tako skrivnostno, da so ga omenili celo v razpravi na koncu članka, čeprav takrat še niso razumeli njihove biološke funkcije. Znanost v času te raziskave še ni bila tako razvita in niso poznali danes razvitih metod sekvenciranja in kloniranja DNA fragmentov, zato je bil celoten postopek dolgotrajen. Več mesecev so potrebovali, da so natančno določili ponavljajoče zaporedje. Težave jim je povzročala predvsem sekundarna struktura, ki jo je tvorilo palindromsko zaporedje. Neverjetno je, da bi lahko z danes poznano tehnologijo npr. s polimerazno verižno reakcijo enako regijo posekvencirali v enem dnevu.

Temu odkritju je kmalu sledilo še več odkritij enakih ponavljajočih zaporedij pri različnih sevih ''E. coli'' in nekaterih ostalih bakterijah ( npr. ''Salmonella typhimurium'' in ''Shigela dysenteriae''). Do pomembnega odkritja so leta 1993 prišli tudi nizozemski znanstveniki, ki so prekinjena ponavljajoča zaporedja našli pri preučevanju bakterije ''Mycobacterium tuberculosis''. Prepoznali so veliko raznolikost zaporedij med posameznimi sevi bakterije in to uporabili za njihovo identifikacijo.

V prvih letih raziskovanja je bilo javno dostopnih zelo malo podatkov o sekvenciranih genomih, zato so prekinjena ponavljajoča zaporedja opazili pri relativno majhnem številu organizmov. Ob razvoju novih tehnik sekvenciranja pa je bilo teh podatkov vedno več, čemur so sledila tudi vedno večja odkritja na tem področju.

==Odkritje regij CRISPR pri arhejah (1993–2000)==

Pri arhejah je takšna zaporedja prvi opazil Francisco Juan Martinez Mojica, ki je kot del mikrobiološke skupine na Univerzi Alicante v Španiji raziskoval regulatorne mehanizme haloarhej in njihovo prilagajanje na spremembe v okolju. Preučevani organizem je bil ''Haloferax mediterranei'' – haloarheja, ki živi v okoljih, kjer slanost doseže tudi 20–25 %. Mojica se je pri raziskovanju usmeril na gensko še nekategorizirane regije genoma ''H. mediterranei'', ki so bile predvidoma zaradi spremembe v slanosti okolja podvržene nekakšnim DNA-modifikacijam. Vendar pa so pri sekvenciranju in genski analizi teh regij naleteli na nepričakovan vzorec. Avtoradiogram je pokazal DNA-segmente, dolge približno 30 bp, ki se ponavljajo na konstantnih razdaljah. Po dodatnem sekvenciranju regij so odkrili prisotnost vsaj 14 skoraj popolnoma ohranjenih ponovitev, vsaka ponovitev pa je vključevala kratko obrnjeno palindromsko ponovitev. Ponavljajoči vzorci so se nahajali na nekodirajočem območju genoma, poleg ORF (»open reading frames«), ki niso bili homologni nobenemu do takrat znanemu proteinu. Poleg tega pa so pri ponavljajočih se regijah zaznali številne transkripte RNA, kar nakazuje na visoko procesirano RNA iz teh regij. Čeprav so bila takšna ponavljajoča zaporedja opažena že pri nekaterih bakterijah (''Escherichia coli'', ''Mycobacterium spp''.), so bila pri tem eksperimentu prvič videna pri arhejah.

Medtem ko so za bakterijske ponovitve takrat le predvidevali o njihovi biološki funkciji, npr. regulacija sosednjih genov, so biološke funkcije TREPs (Tandem REPeats) pri arhejah tudi eksperimentalno raziskovali. TREP-zaporedja so našli v kromosomu in plazmidu ''H. mediterranei'' in sorodni haloarheji – ''Haloferax volcanii''. Zaradi možnosti genske manipulacije so pri celicah ''H. volcanii'' raziskovali učinek prisotnosti rekombinantnega plazmida, ki je vseboval fragmente TREP. Dve hipotezi o biološki funkciji TREPs so takoj ovrgli, in sicer njihovo vlogo pri rekombinaciji DNA in regulaciji sosednjih genov. Nesmiselno bi bilo predvidevati, da bi bile tako velike genske strukture povezane zgolj z regulacijo transkripcije nekaj genov. Predpostavili pa so, da morajo TREPs igrati pomembno vlogo pri celičnem ciklu. Prisotni so namreč v največjih in najverjetneje najpomembnejših replikonih celice. Poleg tega je prisotnost dodatnih kopij TREP (vstavljene v gostujočo celico s pomočjo vektorja) povzročila zmanjšano preživetje celic in spremembo v sestavi DNA, kar podpira hipotezo, da imajo TREPs pomembno vlogo pri ločevanju replikonov. Zaradi visoke ohranjenosti TREPs med vrstami haloarhej in prisotnosti zelo podobnih struktur pri ''E. coli'' pa so lahko ugibali, da imajo TREPs univerzalno oz. podobno vlogo pri organizmih, kjer so jih odkrili.

Za dokaz zgornjih predvidevanj o biološki funkciji TREPs so bile seveda potrebne dodatne študije na haloarhejah, za katere pa Mojica ni dobil finančne podpore. Poskuse je zato moral nadaljevati na ''E. coli'', kjer enaki eksperimenti kot prej na ''H. volcanii'' niso dali željenih rezultatov. Dodatne raziskave niso podale nobenega dokaza o vpletenosti ponavljajočih se zaporedij v ločitveni aparat, iz rezultatov pa bi lahko sklepali, da bi zaporedja lahko služila kot nekakšna mesta za kooperativno vezavo na celične strukture, npr. na citoplazemsko membrano, ali proteine, vplivali pa bi lahko tudi na strukturo DNA.

Leta 1995 je bil objavljen prvi celoten genom prostoživečega organizma, s čimer se je začela nova doba v biologiji. Pospešeno sekvenciranje je pripomoglo k nastanku dodatnih zbirk prokariontskih genomov, na podlagi česar je leta 1996 lahko nastalo prvo celovito poročilo o konstantno ponavljajočih se regijah v celotnem genomu. Do konca stoletja so podobna zaporedja odkrili še v 12 vrstah arhej in bakterij.

==F. Mojica (2000)==

Povečano število znanih genomov bakterij in arhej je pospešilo raziskave o motivih zaporedij DNA. Francisco Mojica je leta 2000 potrdil prisotnost ponavljajočih zaporedij v prokariontih, katero so s kolegi predstavili kot posebno družino prokariontskih zaporedij pod imenom SRSR (short regularly spaced repeats). Z analizami so ugotovili, da so SRSR prisotni znotraj genomov večine arhej ter različnih skupin bakterij in tako predstavljajo eno najbolj razširjenih družin v prokariontskih genomih. Ugotovili so, da so SRSR zaporedja znotraj enega genoma precej homogena, pojavljajo pa se tudi podobnosti razporeditve med organizmi, ki izhajajo iz skupnega prednika ter podobnosti znotraj posameznih domen.
V tej raziskavi je bilo ključno odkritje pojav kratkih palindromskih zaporedij v dodatnih organizmih in s tem vpeljava nove družine nukleotidnih zaporedij, za katero je značilno da so ločena s stalno dolgimi prekinitvenimi zaporedji. Čeprav so odkrili podobna zaporedja znotraj genomov različnih prokariontov, niso vedeli, če ima ta družina zaporedij tudi skupno funkcijo v vseh prokariontih.

==R. Jansen (2002)==

Novo imenovana družina zaporedij je spodbudila raziskave na Nizozemskem pod vodstvom Ruuda Jansena. Z računalniško analizo so želeli določiti lokacije SRSR v do tedaj znanih prokariontskih genomih. Izbirali so posamezna SRSR zaporedja bakterij in arhej, ter jih primerjali s celotnimi genomi prokariontov. Primerjali so tudi prekinitvena zaporedja, ki so med SRSR, ter prišli do spoznanja, da so tako SRSR kot prekinitvena zaporedja večinoma unikatna za genom posamezne vrste. V nadaljevanju so zato iskali nove lokacije SRSR na podlagi njihovega motiva ponavljanja, ki pa je bil zanje značilen v vseh do tedaj odkritih zaporedij – kratka palindromska zaporedja alternirajo s prekinitvenimi zaporedji stalnih dolžin. Z analizami so v več organizmih odkrili tudi prisotnost daljših zaporedij na enem koncu SRSR in predpostavili, da daljše zaporedje in SRSR skupaj predstavljata eno enoto. Ta zaporedja pred SRSR so poimenovali vodilna zaporedja, ki so si glede na zaporedje baz podobna le znotraj enega genoma, vendar pa imajo nekatere splošne skupne lastnosti. Nimajo odprtega bralnega okvirja, torej ne vsebujejo zaporedja, ki bi kodiralo za proteine, poleg tega pa pogosto vsebujejo sosledje enakih nukleotidov in na splošno velik delež adenina in timina.

Nova odkrtija so znanstvenike gnala k dodatnem raziskovanju, vendar so ugotovili, da so bila v preteklosti v tisku uporabljena različna poimenovanja za novo odkrit motiv ponavljanja znotraj DNA. V namen poenotenja sta zato Jansen in Mojica leta 2002 vpeljala novo ime, ki je ostalo v uporabi do danes – CRISPR (clustered regularly spaced palindromic repeats). Ob vpeljavi novega imena je Jansen s kolegi odkril tudi novo lastnost CRISPR zaporedij. S primerjavo genov ob CRISPR zaporedjih so odkrili pogosto prisotnost štirih genov, ki jih niso našli v prokariontih brez CRISPR regij. Skupino novo odkritih genov so poimenovali cas (CRISPR associated genes), posamezne gene pa od Cas1 do Cas4. V tej raziskavi še niso identificirali točne funkcije vseh cas genov, so pa predpostavili vlogi genov Cas3 in Cas4. Analiza aminokislinskih ostankov teh dveh proteinov je pokazala homolognost med Cas3 in helikazo ter med Cas4 in RecB eksonukleazo.

==Znane lastnosti CRISPR zaporedij do leta 2002==

Do leta 2002 so CRISPR zaporedja odkrili v več kot 40 različnih prokariontih. Znano je, da gre za kratka zaporedja dolga od 21 do 37 baznih parov, ki so ločena s prekinitvenimi zaporedji, dolgimi 32 baznih parov. Pred kratkim zaporedjem se nahajajo daljše zaporedje dolgo nekaj sto baznih parov, ki so ga poimenovali vodilno zaporedje in skupina genov, ki so jih poimenovali cas. V letu 2002 so torej že poznali splošno strukturo regije CRISPR, še vedno pa niso poznali izvora zaporedij ter njihove vloge v organizmu.

==Viri in literatura==

*Mojica, F. J., Rodriguez-Valera, F. The discovery of CRISPR in archaea and bacteria, The FEBS Journal, 2016, 283(17), 3162-9

*Mojica, F. J., Ferrer, C., Juez, G., Rodriguez-Valera, F. Long stretches of short tandem repeats are present in the largest replicons of the Archaea Haloferax mediterranei and Haloferax volcanii and could be involved in replicon partitioning, Molecular Biology (1995), 17(1), 85-93

*Ishino Y, Shinagawa H, Makino K, Amemura M, Nakata A. 1987. Nucleotide sequence of the iap gene, responsible for alkaline phosphatase isozyme conversion in Escherichia coli, and identification of the gene product. Journal of Bacteriol 169:5429 –5433

*Yoshizumi Ishino, Mart Krupovic, Patrick Forterre. 2018. History of CRISPR-Cas from Encounter with a Mysterious Repeated Sequence to Genome Editing Technology. Journal of Bacteriol 200(7): 17-58

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Odkritje in opis regij CRISPR in Cas (do leta ~2002)

2019-04-14T10:49:25Z

Eva Gartner: /* Prvo odkritje */

==Uvod==

Analize celotnih genomov organizmov so znanstvenikom omogočile primerjavo le teh med posameznimi organizmi. Rezultati raziskav so pokazali, da so pri velikem številu prokariontov prisotna ponavljajoča zaporedja. Ta so lahko daljša ( do 100 kbp), ki jim pogosto pripisujejo kakšno biološko pomembno funkcijo ali pa krajša, sestavljena iz le nekaj nukleotidov . Slednje delimo na zaporedna ponavljajoča zaporedja, pri katerih so si enote, ki se ponavljajo sosednje in prekinjena ponavljajoča zaporedja, pri katerih so med posameznimi ponavljajočimi se zaporedji heterogene prekinitvene sekvence različnih dolžin. Naš seminar se osredotoča na odkritje obstoja posebne družine prekinjenih ponavljajočih zaporedij, ki so jih kasneje poimenovali zaporedja CRISPR.

==Prvo odkritje==

Odkritje prvih ponavljajočih se zaporedij je bilo povsem naključno. Leta 1987 je skupina znanstvenikov na čelu z Yoshizumi Ishinom naredila raziskavo, pri katerem so želeli indetificirati protein, odgovoren za pretvorbo izocima alkalna fosfataza pri organizmu ''Escherichia coli''
(celice K-12). Uspelo jim je sekvencirati 1,7 kbp dolg fragment DNA v katerem se je med drugim nahajal gen iap, za katerega so sklepali, da zapisuje preiskovani protein. Najprej so pripravili plazmidne vektorje v katere so klonirali tarčni DNA fragment , nato pa so ga, po razgradnji na manjše fragmente, prenesli v vektor M13, v katerem je potekalo sekvenciranje po Sangerjevi metodi. Nukleotidno zaporedje so določili z avtoradiografijo. Med sekvenciranjem DNA fragmenta so na njegovem 3΄ koncu opazili nenavadno strukturo. Navzdol po genomu od gena iap se je nahajalo pet močno homolognih sekvenc, sestavljenih iz 29 nukleotidov, znotraj katerih je bilo palindromsko zaporedje 14 bp, med njimi pa so bile prekinitve iz 32 nukleotidov. Že nekaj let pred tem odkritjem, leta 1984, so pri raziskavi na bakterijah ''E. coli'' in ''Salmonella enterica'' opazili palindromska zaporedja, ki so jim pripisali funkcijo stabilizacije mRNA, vendar ob primerjavi niso našli nobene podobnosti med temi zaporedji in na novo odkritimi zaporedji . To odkritje je bilo tako skrivnostno, da so ga omenili celo v razpravi na koncu članka, čeprav takrat še niso razumeli njihove biološke funkcije. Znanost v času te raziskave še ni bila tako razvita in niso poznali danes razvitih metod sekvenciranja in kloniranja DNA fragmentov, zato je bil celoten postopek dolgotrajen. Več mesecev so potrebovali, da so natančno določili ponavljajoče zaporedje. Težave jim je povzročala predvsem sekundarna struktura, ki jo je tvorilo palindromsko zaporedje. Neverjetno je, da bi lahko z danes poznano tehnologijo npr. s polimerazno verižno reakcijo enako regijo posekvencirali v enem dnevu.

Temu odkritju je kmalu sledilo še več odkritij enakih ponavljajočih zaporedij pri različnih sevih ''E. coli'' in nekaterih ostalih bakterijah ( npr. ''Salmonella typhimurium'' in ''Shigela dysenteriae''). Do pomembnega odkritja so leta 1993 prišli tudi nizozemski znanstveniki, ki so prekinjena ponavljajoča zaporedja našli pri preučevanju bakterije ''Mycobacterium tuberculosis''. Prepoznali so veliko raznolikost zaporedij med posameznimi sevi bakterije in to uporabili za njihovo identifikacijo.

V prvih letih raziskovanja je bilo javno dostopnih zelo malo podatkov o sekvenciranih genomih, zato so prekinjena ponavljajoča zaporedja opazili pri relativno majhnem številu organizmov. Ob razvoju novih tehnik sekvenciranja pa je bilo teh podatkov vedno več, čemur so sledila tudi vedno večja odkritja na tem področju.

==Odkritje regij CRISPR pri arhejah (1993–2000)==

Pri arhejah je takšna zaporedja prvi opazil Francisco Juan Martinez Mojica, ki je kot del mikrobiološke skupine na Univerzi Alicante v Španiji raziskoval regulatorne mehanizme haloarhej in njihovo prilagajanje na spremembe v okolju. Preučevani organizem je bil ''Haloferax mediterranei'' – haloarheja, ki živi v okoljih, kjer slanost doseže tudi 20–25 %. Mojica se je pri raziskovanju usmeril na gensko še nekategorizirane regije genoma ''H. mediterranei'', ki so bile predvidoma zaradi spremembe v slanosti okolja podvržene nekakšnim DNA-modifikacijam. Vendar pa so pri sekvenciranju in genski analizi teh regij naleteli na nepričakovan vzorec. Avtoradiogram je pokazal DNA-segmente, dolge približno 30 bp, ki se ponavljajo na konstantnih razdaljah. Po dodatnem sekvenciranju regij so odkrili prisotnost vsaj 14 skoraj popolnoma ohranjenih ponovitev, vsaka ponovitev pa je vključevala kratko obrnjeno palindromsko ponovitev. Ponavljajoči vzorci so se nahajali na nekodirajočem območju genoma, poleg ORF (»open reading frames«), ki niso bili homologni nobenemu do takrat znanemu proteinu. Poleg tega pa so pri ponavljajočih se regijah zaznali številne transkripte RNA, kar nakazuje na visoko procesirano RNA iz teh regij. Čeprav so bila takšna ponavljajoča zaporedja opažena že pri nekaterih bakterijah (''Escherichia coli'', ''Mycobacterium spp''.), so bila pri tem eksperimentu prvič videna pri arhejah.

Medtem ko so za bakterijske ponovitve takrat le predvidevali o njihovi biološki funkciji, npr. regulacija sosednjih genov, so biološke funkcije TREPs (Tandem REPeats) pri arhejah tudi eksperimentalno raziskovali. TREP-zaporedja so našli v kromosomu in plazmidu ''H. mediterranei'' in sorodni haloarheji – ''Haloferax volcanii''. Zaradi možnosti genske manipulacije so pri celicah ''H. volcanii'' raziskovali učinek prisotnosti rekombinantnega plazmida, ki je vseboval fragmente TREP. Dve hipotezi o biološki funkciji TREPs so takoj ovrgli, in sicer njihovo vlogo pri rekombinaciji DNA in regulaciji sosednjih genov. Nesmiselno bi bilo predvidevati, da bi bile tako velike genske strukture povezane zgolj z regulacijo transkripcije nekaj genov. Predpostavili pa so, da morajo TREPs igrati pomembno vlogo pri celičnem ciklu. Prisotni so namreč v največjih in najverjetneje najpomembnejših replikonih celice. Poleg tega je prisotnost dodatnih kopij TREP (vstavljene v gostujočo celico s pomočjo vektorja) povzročila zmanjšano preživetje celic in spremembo v sestavi DNA, kar podpira hipotezo, da imajo TREPs pomembno vlogo pri ločevanju replikonov. Zaradi visoke ohranjenosti TREPs med vrstami haloarhej in prisotnosti zelo podobnih struktur pri ''E. coli'' pa so lahko ugibali, da imajo TREPs univerzalno oz. podobno vlogo pri organizmih, kjer so jih odkrili.

Za dokaz zgornjih predvidevanj o biološki funkciji TREPs so bile seveda potrebne dodatne študije na haloarhejah, za katere pa Mojica ni dobil finančne podpore. Poskuse je zato moral nadaljevati na ''E. coli'', kjer enaki eksperimenti kot prej na ''H. volcanii'' niso dali željenih rezultatov. Dodatne raziskave niso podale nobenega dokaza o vpletenosti ponavljajočih se zaporedij v ločitveni aparat, iz rezultatov pa bi lahko sklepali, da bi zaporedja lahko služila kot nekakšna mesta za kooperativno vezavo na celične strukture, npr. na citoplazemsko membrano, ali proteine, vplivali pa bi lahko tudi na strukturo DNA.

Leta 1995 je bil objavljen prvi celoten genom prostoživečega organizma, s čimer se je začela nova doba v biologiji. Pospešeno sekvenciranje je pripomoglo k nastanku dodatnih zbirk prokariontskih genomov, na podlagi česar je leta 1996 lahko nastalo prvo celovito poročilo o konstantno ponavljajočih se regijah v celotnem genomu. Do konca stoletja so podobna zaporedja odkrili še v 12 vrstah arhej in bakterij.

==F. Mojica (2000)==

Povečano število znanih genomov bakterij in arhej je pospešilo raziskave o motivih zaporedij DNA. Francisco Mojica je leta 2000 potrdil prisotnost ponavljajočih zaporedij v prokariontih, katero so s kolegi predstavili kot posebno družino prokariontskih zaporedij pod imenom SRSR (short regularly spaced repeats). Z analizami so ugotovili, da so SRSR prisotni znotraj genomov večine arhej ter različnih skupin bakterij in tako predstavljajo eno najbolj razširjenih družin v prokariontskih genomih. Ugotovili so, da so SRSR zaporedja znotraj enega genoma precej homogena, pojavljajo pa se tudi podobnosti razporeditve med organizmi, ki izhajajo iz skupnega prednika ter podobnosti znotraj posameznih domen.
V tej raziskavi je bilo ključno odkritje pojav kratkih palindromskih zaporedij v dodatnih organizmih in s tem vpeljava nove družine nukleotidnih zaporedij, za katero je značilno da so ločena s stalno dolgimi prekinitvenimi zaporedji. Čeprav so odkrili podobna zaporedja znotraj genomov različnih prokariontov, niso vedeli, če ima ta družina zaporedij tudi skupno funkcijo v vseh prokariontih.

==R. Jansen (2002)==

Novo imenovana družina zaporedij je spodbudila raziskave na Nizozemskem pod vodstvom Ruuda Jansena. Z računalniško analizo so želeli določiti lokacije SRSR v do tedaj znanih prokariontskih genomih. Izbirali so posamezna SRSR zaporedja bakterij in arhej, ter jih primerjali s celotnimi genomi prokariontov. Primerjali so tudi prekinitvena zaporedja, ki so med SRSR, ter prišli do spoznanja, da so tako SRSR kot prekinitvena zaporedja večinoma unikatna za genom posamezne vrste. V nadaljevanju so zato iskali nove lokacije SRSR na podlagi njihovega motiva ponavljanja, ki pa je bil zanje značilen v vseh do tedaj odkritih zaporedij – kratka palindromska zaporedja alternirajo s prekinitvenimi zaporedji stalnih dolžin. Z analizami so v več organizmih odkrili tudi prisotnost daljših zaporedij na enem koncu SRSR in predpostavili, da daljše zaporedje in SRSR skupaj predstavljata eno enoto. Ta zaporedja pred SRSR so poimenovali vodilna zaporedja, ki so si glede na zaporedje baz podobna le znotraj enega genoma, vendar pa imajo nekatere splošne skupne lastnosti. Nimajo odprtega bralnega okvirja, torej ne vsebujejo zaporedja, ki bi kodiralo za proteine, poleg tega pa pogosto vsebujejo sosledje enakih nukleotidov in na splošno velik delež adenina in timina.

Nova odkrtija so znanstvenike gnala k dodatnem raziskovanju, vendar so ugotovili, da so bila v preteklosti v tisku uporabljena različna poimenovanja za novo odkrit motiv ponavljanja znotraj DNA. V namen poenotenja sta zato Jansen in Mojica leta 2002 vpeljala novo ime, ki je ostalo v uporabi do danes – CRISPR (clustered regularly spaced palindromic repeats). Ob vpeljavi novega imena je Jansen s kolegi odkril tudi novo lastnost CRISPR zaporedij. S primerjavo genov ob CRISPR zaporedjih so odkrili pogosto prisotnost štirih genov, ki jih niso našli v prokariontih brez CRISPR regij. Skupino novo odkritih genov so poimenovali cas (CRISPR associated genes), posamezne gene pa od Cas1 do Cas4. V tej raziskavi še niso identificirali točne funkcije vseh cas genov, so pa predpostavili vlogi genov Cas3 in Cas4. Analiza aminokislinskih ostankov teh dveh proteinov je pokazala homolognost med Cas3 in helikazo ter med Cas4 in RecB eksonukleazo.

==Znane lastnosti CRISPR zaporedij do leta 2002==

Do leta 2002 so CRISPR zaporedja odkrili v več kot 40 različnih prokariontih. Znano je, da gre za kratka zaporedja dolga od 21 do 37 baznih parov, ki so ločena s prekinitvenimi zaporedji, dolgimi 32 baznih parov. Pred kratkim zaporedjem se nahajajo daljše zaporedje dolgo nekaj sto baznih parov, ki so ga poimenovali vodilno zaporedje in skupina genov, ki so jih poimenovali cas. V letu 2002 so torej že poznali splošno strukturo regije CRISPR, še vedno pa niso poznali izvora zaporedij ter njihove vloge v organizmu.

==Viri in literatura==

*Mojica, F. J., Rodriguez-Valera, F. The discovery of CRISPR in archaea and bacteria, The FEBS Journal, 2016, 283(17), 3162-9

*Mojica, F. J., Ferrer, C., Juez, G., Rodriguez-Valera, F. Long stretches of short tandem repeats are present in the largest replicons of the Archaea Haloferax mediterranei and Haloferax volcanii and could be involved in replicon partitioning, Molecular Biology (1995), 17(1), 85-93

*Ishino Y, Shinagawa H, Makino K, Amemura M, Nakata A. 1987. Nucleotide sequence of the iap gene, responsible for alkaline phosphatase isozyme conversion in Escherichia coli, and identification of the gene product. Journal of Bacteriol 169:5429 –5433

*Yoshizumi Ishino, Mart Krupovic, Patrick Forterre. 2018. History of CRISPR-Cas from Encounter with a Mysterious Repeated Sequence to Genome Editing Technology. Journal of Bacteriol 200(7): 17-58

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Odkritje in opis regij CRISPR in Cas (do leta ~2002)

2019-04-14T10:48:45Z

Eva Gartner: /* Prvo odkritje */

==Uvod==

Analize celotnih genomov organizmov so znanstvenikom omogočile primerjavo le teh med posameznimi organizmi. Rezultati raziskav so pokazali, da so pri velikem številu prokariontov prisotna ponavljajoča zaporedja. Ta so lahko daljša ( do 100 kbp), ki jim pogosto pripisujejo kakšno biološko pomembno funkcijo ali pa krajša, sestavljena iz le nekaj nukleotidov . Slednje delimo na zaporedna ponavljajoča zaporedja, pri katerih so si enote, ki se ponavljajo sosednje in prekinjena ponavljajoča zaporedja, pri katerih so med posameznimi ponavljajočimi se zaporedji heterogene prekinitvene sekvence različnih dolžin. Naš seminar se osredotoča na odkritje obstoja posebne družine prekinjenih ponavljajočih zaporedij, ki so jih kasneje poimenovali zaporedja CRISPR.

==Prvo odkritje==

Odkritje prvih ponavljajočih se zaporedij je bilo povsem naključno. Leta 1987 je skupina znanstvenikov na čelu z Yoshizumi Ishinom naredila raziskavo, pri katerem so želeli indetificirati protein, odgovoren za pretvorbo izocima alkalna fosfataza pri organizmu ''Escherichia coli''
(celice K-12). Uspelo jim je sekvencirati 1,7 kbp dolg fragment DNA v katerem se je med drugim nahajal gen iap, za katerega so sklepali, da zapisuje preiskovani protein. Najprej so pripravili plazmidne vektorje v katere so klonirali tarčni DNA fragment , nato pa so ga, po razgradnji na manjše fragmente, prenesli v vektor M13, v katerem je potekalo sekvenciranje po Sangerjevi metodi. Nukleotidno zaporedje so določili z avtoradiografijo. Med sekvenciranjem DNA fragmenta so na njegovem 3΄ koncu opazili nenavadno strukturo. Navzdol po genomu od gena iap se je nahajalo pet močno homolognih sekvenc, sestavljenih iz 29 nukleotidov, znotraj katerih je bilo palindromsko zaporedje 14 bp, med njimi pa so bile prekinitve iz 32 nukleotidov. Že nekaj let pred tem odkritjem, leta 1984, so pri raziskavi na bakterijah ''E. coli'' in ''Salmonella enterica'' opazili palindromska zaporedja, ki so jim pripisali funkcijo stabilizacije mRNA, vendar ob primerjavi niso našli nobene podobnosti med temi zaporedji in na novo odkritimi zaporedji . To odkritje je bilo tako skrivnostno, da so ga omenili celo v razpravi na koncu članka, čeprav takrat še niso razumeli njihove biološke funkcije. Znanost v času te raziskave še ni bila tako razvita in niso poznali danes razvitih metod sekvenciranja, zato je bil celoten postopek dolgotrajen. Več mesecev so potrebovali, da so natančno določili ponavljajoče zaporedje. Težave jim je povzročala predvsem sekundarna struktura, ki jo je tvorilo palindromsko zaporedje. Neverjetno je, da bi lahko z danes poznano tehnologijo npr. s polimerazno verižno reakcijo enako regijo posekvencirali v enem dnevu.

Temu odkritju je kmalu sledilo še več odkritij enakih ponavljajočih zaporedij pri različnih sevih ''E. coli'' in nekaterih ostalih bakterijah ( npr. ''Salmonella typhimurium'' in ''Shigela dysenteriae''). Do pomembnega odkritja so leta 1993 prišli tudi nizozemski znanstveniki, ki so prekinjena ponavljajoča zaporedja našli pri preučevanju bakterije ''Mycobacterium tuberculosis''. Prepoznali so veliko raznolikost zaporedij med posameznimi sevi bakterije in to uporabili za njihovo identifikacijo.

V prvih letih raziskovanja je bilo javno dostopnih zelo malo podatkov o sekvenciranih genomih, zato so prekinjena ponavljajoča zaporedja opazili pri relativno majhnem številu organizmov. Ob razvoju novih tehnik sekvenciranja pa je bilo teh podatkov vedno več, čemur so sledila tudi vedno večja odkritja na tem področju.

==Odkritje regij CRISPR pri arhejah (1993–2000)==

Pri arhejah je takšna zaporedja prvi opazil Francisco Juan Martinez Mojica, ki je kot del mikrobiološke skupine na Univerzi Alicante v Španiji raziskoval regulatorne mehanizme haloarhej in njihovo prilagajanje na spremembe v okolju. Preučevani organizem je bil ''Haloferax mediterranei'' – haloarheja, ki živi v okoljih, kjer slanost doseže tudi 20–25 %. Mojica se je pri raziskovanju usmeril na gensko še nekategorizirane regije genoma ''H. mediterranei'', ki so bile predvidoma zaradi spremembe v slanosti okolja podvržene nekakšnim DNA-modifikacijam. Vendar pa so pri sekvenciranju in genski analizi teh regij naleteli na nepričakovan vzorec. Avtoradiogram je pokazal DNA-segmente, dolge približno 30 bp, ki se ponavljajo na konstantnih razdaljah. Po dodatnem sekvenciranju regij so odkrili prisotnost vsaj 14 skoraj popolnoma ohranjenih ponovitev, vsaka ponovitev pa je vključevala kratko obrnjeno palindromsko ponovitev. Ponavljajoči vzorci so se nahajali na nekodirajočem območju genoma, poleg ORF (»open reading frames«), ki niso bili homologni nobenemu do takrat znanemu proteinu. Poleg tega pa so pri ponavljajočih se regijah zaznali številne transkripte RNA, kar nakazuje na visoko procesirano RNA iz teh regij. Čeprav so bila takšna ponavljajoča zaporedja opažena že pri nekaterih bakterijah (''Escherichia coli'', ''Mycobacterium spp''.), so bila pri tem eksperimentu prvič videna pri arhejah.

Medtem ko so za bakterijske ponovitve takrat le predvidevali o njihovi biološki funkciji, npr. regulacija sosednjih genov, so biološke funkcije TREPs (Tandem REPeats) pri arhejah tudi eksperimentalno raziskovali. TREP-zaporedja so našli v kromosomu in plazmidu ''H. mediterranei'' in sorodni haloarheji – ''Haloferax volcanii''. Zaradi možnosti genske manipulacije so pri celicah ''H. volcanii'' raziskovali učinek prisotnosti rekombinantnega plazmida, ki je vseboval fragmente TREP. Dve hipotezi o biološki funkciji TREPs so takoj ovrgli, in sicer njihovo vlogo pri rekombinaciji DNA in regulaciji sosednjih genov. Nesmiselno bi bilo predvidevati, da bi bile tako velike genske strukture povezane zgolj z regulacijo transkripcije nekaj genov. Predpostavili pa so, da morajo TREPs igrati pomembno vlogo pri celičnem ciklu. Prisotni so namreč v največjih in najverjetneje najpomembnejših replikonih celice. Poleg tega je prisotnost dodatnih kopij TREP (vstavljene v gostujočo celico s pomočjo vektorja) povzročila zmanjšano preživetje celic in spremembo v sestavi DNA, kar podpira hipotezo, da imajo TREPs pomembno vlogo pri ločevanju replikonov. Zaradi visoke ohranjenosti TREPs med vrstami haloarhej in prisotnosti zelo podobnih struktur pri ''E. coli'' pa so lahko ugibali, da imajo TREPs univerzalno oz. podobno vlogo pri organizmih, kjer so jih odkrili.

Za dokaz zgornjih predvidevanj o biološki funkciji TREPs so bile seveda potrebne dodatne študije na haloarhejah, za katere pa Mojica ni dobil finančne podpore. Poskuse je zato moral nadaljevati na ''E. coli'', kjer enaki eksperimenti kot prej na ''H. volcanii'' niso dali željenih rezultatov. Dodatne raziskave niso podale nobenega dokaza o vpletenosti ponavljajočih se zaporedij v ločitveni aparat, iz rezultatov pa bi lahko sklepali, da bi zaporedja lahko služila kot nekakšna mesta za kooperativno vezavo na celične strukture, npr. na citoplazemsko membrano, ali proteine, vplivali pa bi lahko tudi na strukturo DNA.

Leta 1995 je bil objavljen prvi celoten genom prostoživečega organizma, s čimer se je začela nova doba v biologiji. Pospešeno sekvenciranje je pripomoglo k nastanku dodatnih zbirk prokariontskih genomov, na podlagi česar je leta 1996 lahko nastalo prvo celovito poročilo o konstantno ponavljajočih se regijah v celotnem genomu. Do konca stoletja so podobna zaporedja odkrili še v 12 vrstah arhej in bakterij.

==F. Mojica (2000)==

Povečano število znanih genomov bakterij in arhej je pospešilo raziskave o motivih zaporedij DNA. Francisco Mojica je leta 2000 potrdil prisotnost ponavljajočih zaporedij v prokariontih, katero so s kolegi predstavili kot posebno družino prokariontskih zaporedij pod imenom SRSR (short regularly spaced repeats). Z analizami so ugotovili, da so SRSR prisotni znotraj genomov večine arhej ter različnih skupin bakterij in tako predstavljajo eno najbolj razširjenih družin v prokariontskih genomih. Ugotovili so, da so SRSR zaporedja znotraj enega genoma precej homogena, pojavljajo pa se tudi podobnosti razporeditve med organizmi, ki izhajajo iz skupnega prednika ter podobnosti znotraj posameznih domen.
V tej raziskavi je bilo ključno odkritje pojav kratkih palindromskih zaporedij v dodatnih organizmih in s tem vpeljava nove družine nukleotidnih zaporedij, za katero je značilno da so ločena s stalno dolgimi prekinitvenimi zaporedji. Čeprav so odkrili podobna zaporedja znotraj genomov različnih prokariontov, niso vedeli, če ima ta družina zaporedij tudi skupno funkcijo v vseh prokariontih.

==R. Jansen (2002)==

Novo imenovana družina zaporedij je spodbudila raziskave na Nizozemskem pod vodstvom Ruuda Jansena. Z računalniško analizo so želeli določiti lokacije SRSR v do tedaj znanih prokariontskih genomih. Izbirali so posamezna SRSR zaporedja bakterij in arhej, ter jih primerjali s celotnimi genomi prokariontov. Primerjali so tudi prekinitvena zaporedja, ki so med SRSR, ter prišli do spoznanja, da so tako SRSR kot prekinitvena zaporedja večinoma unikatna za genom posamezne vrste. V nadaljevanju so zato iskali nove lokacije SRSR na podlagi njihovega motiva ponavljanja, ki pa je bil zanje značilen v vseh do tedaj odkritih zaporedij – kratka palindromska zaporedja alternirajo s prekinitvenimi zaporedji stalnih dolžin. Z analizami so v več organizmih odkrili tudi prisotnost daljših zaporedij na enem koncu SRSR in predpostavili, da daljše zaporedje in SRSR skupaj predstavljata eno enoto. Ta zaporedja pred SRSR so poimenovali vodilna zaporedja, ki so si glede na zaporedje baz podobna le znotraj enega genoma, vendar pa imajo nekatere splošne skupne lastnosti. Nimajo odprtega bralnega okvirja, torej ne vsebujejo zaporedja, ki bi kodiralo za proteine, poleg tega pa pogosto vsebujejo sosledje enakih nukleotidov in na splošno velik delež adenina in timina.

Nova odkrtija so znanstvenike gnala k dodatnem raziskovanju, vendar so ugotovili, da so bila v preteklosti v tisku uporabljena različna poimenovanja za novo odkrit motiv ponavljanja znotraj DNA. V namen poenotenja sta zato Jansen in Mojica leta 2002 vpeljala novo ime, ki je ostalo v uporabi do danes – CRISPR (clustered regularly spaced palindromic repeats). Ob vpeljavi novega imena je Jansen s kolegi odkril tudi novo lastnost CRISPR zaporedij. S primerjavo genov ob CRISPR zaporedjih so odkrili pogosto prisotnost štirih genov, ki jih niso našli v prokariontih brez CRISPR regij. Skupino novo odkritih genov so poimenovali cas (CRISPR associated genes), posamezne gene pa od Cas1 do Cas4. V tej raziskavi še niso identificirali točne funkcije vseh cas genov, so pa predpostavili vlogi genov Cas3 in Cas4. Analiza aminokislinskih ostankov teh dveh proteinov je pokazala homolognost med Cas3 in helikazo ter med Cas4 in RecB eksonukleazo.

==Znane lastnosti CRISPR zaporedij do leta 2002==

Do leta 2002 so CRISPR zaporedja odkrili v več kot 40 različnih prokariontih. Znano je, da gre za kratka zaporedja dolga od 21 do 37 baznih parov, ki so ločena s prekinitvenimi zaporedji stalnih dolžin. Pred kratkim zaporedjem se nahajajo daljše zaporedje dolgo nekaj sto baznih parov, ki so ga poimenovali vodilno zaporedje in skupina genov, ki so jih poimenovali cas. V letu 2002 so torej že poznali splošno strukturo regije CRISPR, še vedno pa niso poznali izvora zaporedij ter njihove vloge v organizmu.

==Viri in literatura==

*Mojica, F. J., Rodriguez-Valera, F. The discovery of CRISPR in archaea and bacteria, The FEBS Journal, 2016, 283(17), 3162-9

*Mojica, F. J., Ferrer, C., Juez, G., Rodriguez-Valera, F. Long stretches of short tandem repeats are present in the largest replicons of the Archaea Haloferax mediterranei and Haloferax volcanii and could be involved in replicon partitioning, Molecular Biology (1995), 17(1), 85-93

*Ishino Y, Shinagawa H, Makino K, Amemura M, Nakata A. 1987. Nucleotide sequence of the iap gene, responsible for alkaline phosphatase isozyme conversion in Escherichia coli, and identification of the gene product. Journal of Bacteriol 169:5429 –5433

*Yoshizumi Ishino, Mart Krupovic, Patrick Forterre. 2018. History of CRISPR-Cas from Encounter with a Mysterious Repeated Sequence to Genome Editing Technology. Journal of Bacteriol 200(7): 17-58

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Odkritje in opis regij CRISPR in Cas (do leta ~2002)

2019-04-14T08:48:35Z

Eva Gartner: /* Prvo odkritje */

==Uvod==

Analize celotnih genomov organizmov so znanstvenikom omogočile primerjavo le teh med posameznimi organizmi. Rezultati raziskav so pokazali, da so pri velikem številu prokariontov prisotna ponavljajoča zaporedja. Ta so lahko daljša ( do 100 kbp), ki jim pogosto pripisujejo kakšno biološko pomembno funkcijo ali pa krajša, sestavljena iz le nekaj nukleotidov . Slednje delimo na zaporedna ponavljajoča zaporedja, pri katerih so si enote, ki se ponavljajo sosednje in prekinjena ponavljajoča zaporedja, pri katerih so med posameznimi ponavljajočimi se zaporedji heterogene prekinitvene sekvence različnih dolžin. Naš seminar se osredotoča na odkritje obstoja posebne družine prekinjenih ponavljajočih zaporedij, ki so jih kasneje poimenovali zaporedja CRISPR.

==Prvo odkritje==

Odkritje prvih ponavljajočih se zaporedij je bilo povsem naključno. Leta 1987 je skupina znanstvenikov na čelu z Yoshizumi Ishinom naredila raziskavo, pri katerem so želeli indetificirati protein, odgovoren za pretvorbo izocima alkalna fosfataza pri organizmu Escherichia coli
(celice K-12). Uspelo jim je sekvencirati 1,7 kbp dolg fragment DNA v katerem se je med drugim nahajal gen iap, za katerega so sklepali, da zapisuje preiskovani protein. Tarčno DNA so najprej klonirali in prenesli v vektor M13, v katerem je potekalo sekvenciranje po Sangerjevi metodi. Med sekvenciranjem DNA fragmenta so na njegovem 3΄ koncu opazili nenavadno strukturo. Navzdol po genomu od gena iap se je nahajalo pet močno homolognih sekvenc, sestavljenih iz 29 nukleotidov, znotraj katerih je bilo palindromsko zaporedje 14 bp, med njimi pa so bile prekinitve iz 32 nukleotidov. Že nekaj let pred tem odkritjem, leta 1984, so pri raziskavi na bakterijah E. coli in Salmonella enterica opazili palindromska zaporedja, ki so jim pripisali funkcijo stabilizacije mRNA, vendar ob primerjavi niso našli nobene podobnosti med temi zaporedji in na novo odkritimi zaporedji . To odkritje je bilo tako skrivnostno, da so ga omenili celo v razpravi na koncu članka, čeprav takrat še niso razumeli njihove biološke funkcije. Znanost v času te raziskave še ni bila tako razvita in niso poznali danes razvitih metod sekvenciranja, zato je bil celoten postopek dolgotrajen. Več mesecev so potrebovali, da so natančno določili ponavljajoče zaporedje. Težave jim je povzročala predvsem sekundarna struktura, ki jo je tvorilo palindromsko zaporedje. Neverjetno je, da bi lahko z danes poznano tehnologijo npr. s polimerazno verižno reakcijo enako regijo posekvencirali v enem dnevu.

Temu odkritju je kmalu sledilo še več odkritij enakih ponavljajočih zaporedij pri različnih sevih E. coli in nekaterih ostalih bakterijah ( npr. Salmonella typhimurium in Shigela dysenteriae). Do pomembnega odkritja so leta 1993 prišli tudi nizozemski znanstveniki, ki so prekinjena ponavljajoča zaporedja našli pri preučevanju bakterije Mycobacterium tuberculosis. Prepoznali so veliko raznolikost zaporedij med posameznimi sevi bakterije in to uporabili za njihovo identifikacijo.

V prvih letih raziskovanja je bilo javno dostopnih zelo malo podatkov o sekvenciranih genomih, zato so prekinjena ponavljajoča zaporedja opazili pri relativno majhnem številu organizmov. Ob razvoju novih tehnik sekvenciranja pa je bilo teh podatkov vedno več, čemur so sledila tudi vedno večja odkritja na tem področju.

==Odkritje regij CRISPR pri arhejah (1993–2000)==

Pri arhejah je takšna zaporedja prvi opazil Francisco Juan Martinez Mojica, ki je kot del mikrobiološke skupine na Univerzi Alicante v Španiji raziskoval regulatorne mehanizme haloarhej in njihovo prilagajanje na spremembe v okolju. Preučevani organizem je bil Haloferax mediterranei – haloarheja, ki živi v okoljih, kjer slanost doseže tudi 20–25 %. Mojica se je pri raziskovanju usmeril na gensko še nekategorizirane regije genoma H. mediterranei, ki so bile predvidoma zaradi spremembe v slanosti okolja podvržene nekakšnim DNA-modifikacijam. Vendar pa so pri sekvenciranju in genski analizi teh regij naleteli na nepričakovan vzorec. Avtoradiogram je pokazal DNA-segmente, dolge približno 30 bp, ki se ponavljajo na konstantnih razdaljah. Po dodatnem sekvenciranju regij so odkrili prisotnost vsaj 14 skoraj popolnoma ohranjenih ponovitev, vsaka ponovitev pa je vključevala kratko obrnjeno palindromsko ponovitev. Ponavljajoči vzorci so se nahajali na nekodirajočem območju genoma, poleg ORF (»open reading frames«), ki niso bili homologni nobenemu do takrat znanemu proteinu. Poleg tega pa so pri ponavljajočih se regijah zaznali številne transkripte RNA, kar nakazuje na visoko procesirano RNA iz teh regij. Čeprav so bila takšna ponavljajoča zaporedja opažena že pri nekaterih bakterijah (Escherichia coli, Mycobacterium spp.), so bila pri tem eksperimentu prvič videna pri arhejah.

Medtem ko so za bakterijske ponovitve takrat le predvidevali o njihovi biološki funkciji, npr. regulacija sosednjih genov, so biološke funkcije TREPs (Tandem REPeats) pri arhejah tudi eksperimentalno raziskovali. TREP-zaporedja so našli v kromosomu in plazmidu H. mediterranei in sorodni haloarheji – Haloferax volcanii. Zaradi možnosti genske manipulacije so pri celicah H. volcanii raziskovali učinek prisotnosti rekombinantnega plazmida, ki je vseboval fragmente TREP. Dve hipotezi o biološki funkciji TREPs so takoj ovrgli, in sicer njihovo vlogo pri rekombinaciji DNA in regulaciji sosednjih genov. Nesmiselno bi bilo predvidevati, da bi bile tako velike genske strukture povezane zgolj z regulacijo transkripcije nekaj genov. Predpostavili pa so, da morajo TREPs igrati pomembno vlogo pri celičnem ciklu. Prisotni so namreč v največjih in najverjetneje najpomembnejših replikonih celice. Poleg tega je prisotnost dodatnih kopij TREP (vstavljene v gostujočo celico s pomočjo vektorja) povzročila zmanjšano preživetje celic in spremembo v sestavi DNA, kar podpira hipotezo, da imajo TREPs pomembno vlogo pri ločevanju replikonov. Zaradi visoke ohranjenosti TREPs med vrstami haloarhej in prisotnosti zelo podobnih struktur pri E. coli pa so lahko ugibali, da imajo TREPs univerzalno oz. podobno vlogo pri organizmih, kjer so jih odkrili.

Za dokaz zgornjih predvidevanj o biološki funkciji TREPs so bile seveda potrebne dodatne študije na haloarhejah, za katere pa Mojica ni dobil finančne podpore. Poskuse je zato moral nadaljevati na E. coli, kjer enaki eksperimenti kot prej na H. volcanii niso dali željenih rezultatov. Dodatne raziskave niso podale nobenega dokaza o vpletenosti ponavljajočih se zaporedij v ločitveni aparat, iz rezultatov pa bi lahko sklepali, da bi zaporedja lahko služila kot nekakšna mesta za kooperativno vezavo na celične strukture, npr. na citoplazemsko membrano, ali proteine, vplivali pa bi lahko tudi na strukturo DNA.

Leta 1995 je bil objavljen prvi celoten genom prostoživečega organizma, s čimer se je začela nova doba v biologiji. Pospešeno sekvenciranje je pripomoglo k nastanku dodatnih zbirk prokariontskih genomov, na podlagi česar je leta 1996 lahko nastalo prvo celovito poročilo o konstantno ponavljajočih se regijah v celotnem genomu. Do konca stoletja so podobna zaporedja odkrili še v 12 vrstah arhej in bakterij.

==F. Mojica et al. (2000)==

V nadaljnjih letih se je večalo število znanih genomov bakterij in arhej, kar je pospešilo raziskave o motivih zaporedij DNA. Tako je skupina znanstvenikov pod vodstvom Francisca Mojice potrdila prisotnost ponavljajočih zaporedij v prokariontih, ki so jo predstavili kot posebno družino prokariontskih zaporedij pod imenom SRSR (short regularly spaced repeats). Z analizami so ugotovili, da so SRSR prisotni znotraj genomov večine arhej ter različnih skupin bakterij in tako predstavljajo eno najbolj razširjenih družin v prokariontskih genomih. Ugotovili so, da so SRSR zaporedja znotraj enega genoma precej homogena, pojavljajo pa se tudi določene podobnosti med organizmi, ki izhajajo iz skupnega prednika ter podobnosti znotraj posameznih domen.
V tej raziskavi je bilo ključno odkritje pojav kratkih palindromskih zaporedij v dodatnih organizmih in s tem vpeljava nove družine nukleotidnih zaporedij, za katero je značilno da so ločena s stalno dolgimi prekinitvenimi zaporedji. Čeprav so odkrili podobna zaporedja znotraj genomov različnih prokariontov, niso vedeli, če ima ta družina zaporedij tudi skupno funkcijo v vseh prokariontih.

==Jansen et al. (2002)==

Na Nizozemskem je v naslednjih letih Ruud Jansen dodatno preučeval družino SRSR. Z računalniško analizo so želeli določiti lokacije SRSR v do tedaj znanih prokariontskih genomih. Izbirali so posamezna SRSR zaporedja bakterij in arhej, ter jih primerjali s celotnimi genomi prokariontov. Primerjali so tudi prekinitvena zaporedja, ki so med SRSR, ter prišli do spoznanja, da so tako SRSR kot prekinitvena zaporedja večinoma unikatna za genom posamezne vrste. V nadaljevanju so zato iskali nove lokacije SRSR na podlagi njihovega motiva ponavljanja, ki pa je bil zanje značilen v vseh do tedaj odkritih zaporedij – kratka palindromska zaporedja alternirajo s prekinitvenimi zaporedji stalnih dolžin. Z analizami so v več organizmih odkrili tudi prisotnost daljših zaporedij na enem koncu SRSR in predpostavili, da daljše zaporedje in SRSR skupaj predstavljata eno enoto. Ta zaporedja pred SRSR so poimenovali vodilna zaporedja, ki so si glede na zaporedje baz podobna le znotraj enega genoma, vendar pa imajo nekatere splošne skupne lastnosti. Nimajo odprtega bralnega okvirja, torej ne vsebujejo zaporedja, ki bi kodiralo za proteine, poleg tega pa pogosto vsebujejo sosledje enakih nukleotidov in na splošno velik delež adenina in timina.

Ta nova odkritja so spodbudila dodatne raziskave, vendar so znanstveniki ugotovili, da so bila v preteklosti v tisku uporabljena različna poimenovanja za novo odkrit motiv ponavljanja znotraj DNA. V namen poenotenja sta zato Jansen in Mojica leta 2002 vpeljala novo ime, ki je ostalo v uporabi do danes – CRISPR (clustered regularly spaced palindromic repeats). Ob vpeljavi novega imena je Jansen s kolegi odkril tudi novo lastnost CRISPR zaporedij. S primerjavo genov ob CRISPR zaporedjih so odkrili pogosto prisotnost štirih genov, ki jih niso našli v prokariontih brez CRISPR regij. Skupino novo odkritih genov so poimenovali cas (CRISPR associated genes), posamezne gene pa od Cas1 do Cas4. V tej raziskavi še niso identificirali točne funkcije vseh cas genov, so pa predpostavili vlogi genov Cas3 in Cas4. Analiza aminokislinskih ostankov teh dveh proteinov je pokazala homolognost med Cas3 in helikazo ter med Cas4 in RecB eksonukleazo.

==Znane lastnosti CRISPR zaporedij do leta 2002==

Do leta 2002 so CRISPR zaporedja odkrili v več kot 40 različnih prokariontih. Znano je, da gre za kratka zaporedja dolga od 21 do 37 baznih parov, ki so ločena s prekinitvenimi zaporedji stalnih dolžin. Pred kratkim zaporedjem se nahajajo daljše zaporedje dolgo nekaj sto baznih parov, ki so ga poimenovali vodilno zaporedje in skupina genov, ki so jih poimenovali cas. V letu 2002 so torej že poznali splošno strukturo regije CRISPR, še vedno pa niso poznali izvora zaporedij ter njihove vloge v organizmu.

==Viri in literatura==

*Mojica, F. J., Rodriguez-Valera, F. The discovery of CRISPR in archaea and bacteria, The FEBS Journal, 2016, 283(17), 3162-9

*Mojica, F. J., Ferrer, C., Juez, G., Rodriguez-Valera, F. Long stretches of short tandem repeats are present in the largest replicons of the Archaea Haloferax mediterranei and Haloferax volcanii and could be involved in replicon partitioning, Molecular Biology (1995), 17(1), 85-93

*Ishino Y, Shinagawa H, Makino K, Amemura M, Nakata A. 1987. Nucleotide sequence of the iap gene, responsible for alkaline phosphatase isozyme conversion in Escherichia coli, and identification of the gene product. Journal of Bacteriol 169:5429 –5433

*Yoshizumi Ishino, Mart Krupovic, Patrick Forterre. 2018. History of CRISPR-Cas from Encounter with a Mysterious Repeated Sequence to Genome Editing Technology. Journal of Bacteriol 200(7): 17-58

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Odkritje in opis regij CRISPR in Cas (do leta ~2002)

2019-04-14T08:33:26Z

Eva Gartner: /* Viri in literatura */

==Uvod==

Analize celotnih genomov organizmov so znanstvenikom omogočile primerjavo le teh med posameznimi organizmi. Rezultati raziskav so pokazali, da so pri velikem številu prokariontov prisotna ponavljajoča zaporedja. Ta so lahko daljša ( do 100 kbp), ki jim pogosto pripisujejo kakšno biološko pomembno funkcijo ali pa krajša, sestavljena iz le nekaj nukleotidov . Slednje delimo na zaporedna ponavljajoča zaporedja, pri katerih so si enote, ki se ponavljajo sosednje in prekinjena ponavljajoča zaporedja, pri katerih so med posameznimi ponavljajočimi se zaporedji heterogene prekinitvene sekvence različnih dolžin. Naš seminar se osredotoča na odkritje obstoja posebne družine prekinjenih ponavljajočih zaporedij, ki so jih kasneje poimenovali zaporedja CRISPR.

==Prvo odkritje==

Odkritje prvih ponavljajočih se zaporedij je bilo povsem naključno. Leta 1987 je skupina znanstvenikov na čelu z Yoshizumi Ishinom naredila raziskavo, pri katerem so želeli indetificirati protein, odgovoren za pretvorbo izocima alkalna fosfataza pri organizmu Escherichia coli
(celice K-12). Uspelo jim je sekvencirati 1,7 kbp dolg fragment DNA v katerem se je med drugim nahajal gen iap, za katerega so sklepali, da zapisuje preiskovani protein. Tarčno DNA so najprej klonirali in prenesli v vektor M13, v katerem je potekalo sekvenciranje po Sangerjevi metodi. Med sekvenciranjem DNA fragmenta so na njegovem 3΄ koncu opazili nenavadno strukturo. Navzdol po genomu od gena iap se je nahajalo pet močno homolognih sekvenc, sestavljenih iz 29 nukleotidov, znotraj katerih je bilo palindromsko zaporedje 14 bp, med njimi pa so bile prekinitve iz 32 nukleotidov. Že nekaj let pred tem odkritjem, leta 1984, so pri raziskavi na bakterijah E. coli in Salmonella enterica opazili palindromska zaporedja, ki so jim pripisali funkcijo stabilizacije mRNA, vendar ob primerjavi niso našli nobene podobnosti med temi zaporedji in na novo odkritimi zaporedji . To odkritje je bilo tako skrivnostno, da so ga omenili celo v razpravi na koncu članka, čeprav takrat še niso razumeli njihove biološke funkcije. Znanost v času te raziskave še ni bila tako razvita in niso poznali danes razvitih metod sekvenciranja, zato je bil celoten postopek dolgotrajen. Več mesecev so potrebovali, da so natančno določili ponavljajoče zaporedje. Težave jim je povzročala predvsem sekundarna struktura, ki jo je tvorilo palindromsko zaporedje. Neverjetno je, da bi lahko z danes poznano tehnologijo npr. s polimerazno verižno reakcijo enako regijo posekvencirali v enem dnevu.

Temu odkritju je kmalu sledilo še več odkritij enakih ponavljajočih zaporedij pri različnih sevih E. coli in nekaterih ostalih bakterijah ( npr. Salmonella typhimurium in Shigela dysenteriae). Do pomembnega odkritja so leta 1993 prišli tudi nizozemski znanstveniki, ki so prekinjena ponavljajoča zaporedja našli pri preučevanju bakterije Mycobacterium tuberculosis. Prepoznali so veliko raznolikost zaporedij med posameznimi sevi bakterije in to uporabili za njihovo identifikacijo.

V prvih letih raziskovanja je bilo javno dostopnih zelo malo podatkov o sekvenciranih genomih, zato so prekinjena ponavljajoča zaporedja opazili pri relativno majhnem številu organizmov. Ob razvoju novih tehnik sekvenciranja pa je bilo teh podatkov vedno več, čemur so sledila tudi vedno večja odkritja na področju ponavljajočih prekinjenih zaporedij.

==Odkritje regij CRISPR pri arhejah (1993–2000)==

Pri arhejah je takšna zaporedja prvi opazil Francisco Juan Martinez Mojica, ki je kot del mikrobiološke skupine na Univerzi Alicante v Španiji raziskoval regulatorne mehanizme haloarhej in njihovo prilagajanje na spremembe v okolju. Preučevani organizem je bil Haloferax mediterranei – haloarheja, ki živi v okoljih, kjer slanost doseže tudi 20–25 %. Mojica se je pri raziskovanju usmeril na gensko še nekategorizirane regije genoma H. mediterranei, ki so bile predvidoma zaradi spremembe v slanosti okolja podvržene nekakšnim DNA-modifikacijam. Vendar pa so pri sekvenciranju in genski analizi teh regij naleteli na nepričakovan vzorec. Avtoradiogram je pokazal DNA-segmente, dolge približno 30 bp, ki se ponavljajo na konstantnih razdaljah. Po dodatnem sekvenciranju regij so odkrili prisotnost vsaj 14 skoraj popolnoma ohranjenih ponovitev, vsaka ponovitev pa je vključevala kratko obrnjeno palindromsko ponovitev. Ponavljajoči vzorci so se nahajali na nekodirajočem območju genoma, poleg ORF (»open reading frames«), ki niso bili homologni nobenemu do takrat znanemu proteinu. Poleg tega pa so pri ponavljajočih se regijah zaznali številne transkripte RNA, kar nakazuje na visoko procesirano RNA iz teh regij. Čeprav so bila takšna ponavljajoča zaporedja opažena že pri nekaterih bakterijah (Escherichia coli, Mycobacterium spp.), so bila pri tem eksperimentu prvič videna pri arhejah.

Medtem ko so za bakterijske ponovitve takrat le predvidevali o njihovi biološki funkciji, npr. regulacija sosednjih genov, so biološke funkcije TREPs (Tandem REPeats) pri arhejah tudi eksperimentalno raziskovali. TREP-zaporedja so našli v kromosomu in plazmidu H. mediterranei in sorodni haloarheji – Haloferax volcanii. Zaradi možnosti genske manipulacije so pri celicah H. volcanii raziskovali učinek prisotnosti rekombinantnega plazmida, ki je vseboval fragmente TREP. Dve hipotezi o biološki funkciji TREPs so takoj ovrgli, in sicer njihovo vlogo pri rekombinaciji DNA in regulaciji sosednjih genov. Nesmiselno bi bilo predvidevati, da bi bile tako velike genske strukture povezane zgolj z regulacijo transkripcije nekaj genov. Predpostavili pa so, da morajo TREPs igrati pomembno vlogo pri celičnem ciklu. Prisotni so namreč v največjih in najverjetneje najpomembnejših replikonih celice. Poleg tega je prisotnost dodatnih kopij TREP (vstavljene v gostujočo celico s pomočjo vektorja) povzročila zmanjšano preživetje celic in spremembo v sestavi DNA, kar podpira hipotezo, da imajo TREPs pomembno vlogo pri ločevanju replikonov. Zaradi visoke ohranjenosti TREPs med vrstami haloarhej in prisotnosti zelo podobnih struktur pri E. coli pa so lahko ugibali, da imajo TREPs univerzalno oz. podobno vlogo pri organizmih, kjer so jih odkrili.

Za dokaz zgornjih predvidevanj o biološki funkciji TREPs so bile seveda potrebne dodatne študije na haloarhejah, za katere pa Mojica ni dobil finančne podpore. Poskuse je zato moral nadaljevati na E. coli, kjer enaki eksperimenti kot prej na H. volcanii niso dali željenih rezultatov. Dodatne raziskave niso podale nobenega dokaza o vpletenosti ponavljajočih se zaporedij v ločitveni aparat, iz rezultatov pa bi lahko sklepali, da bi zaporedja lahko služila kot nekakšna mesta za kooperativno vezavo na celične strukture, npr. na citoplazemsko membrano, ali proteine, vplivali pa bi lahko tudi na strukturo DNA.

Leta 1995 je bil objavljen prvi celoten genom prostoživečega organizma, s čimer se je začela nova doba v biologiji. Pospešeno sekvenciranje je pripomoglo k nastanku dodatnih zbirk prokariontskih genomov, na podlagi česar je leta 1996 lahko nastalo prvo celovito poročilo o konstantno ponavljajočih se regijah v celotnem genomu. Do konca stoletja so podobna zaporedja odkrili še v 12 vrstah arhej in bakterij.

==F. Mojica et al. (2000)==

V nadaljnjih letih se je večalo število znanih genomov bakterij in arhej, kar je pospešilo raziskave o motivih zaporedij DNA. Tako je skupina znanstvenikov pod vodstvom Francisca Mojice potrdila prisotnost ponavljajočih zaporedij v prokariontih, ki so jo predstavili kot posebno družino prokariontskih zaporedij pod imenom SRSR (short regularly spaced repeats). Z analizami so ugotovili, da so SRSR prisotni znotraj genomov večine arhej ter različnih skupin bakterij in tako predstavljajo eno najbolj razširjenih družin v prokariontskih genomih. Ugotovili so, da so SRSR zaporedja znotraj enega genoma precej homogena, pojavljajo pa se tudi določene podobnosti med organizmi, ki izhajajo iz skupnega prednika ter podobnosti znotraj posameznih domen.
V tej raziskavi je bilo ključno odkritje pojav kratkih palindromskih zaporedij v dodatnih organizmih in s tem vpeljava nove družine nukleotidnih zaporedij, za katero je značilno da so ločena s stalno dolgimi prekinitvenimi zaporedji. Čeprav so odkrili podobna zaporedja znotraj genomov različnih prokariontov, niso vedeli, če ima ta družina zaporedij tudi skupno funkcijo v vseh prokariontih.

==Jansen et al. (2002)==

Na Nizozemskem je v naslednjih letih Ruud Jansen dodatno preučeval družino SRSR. Z računalniško analizo so želeli določiti lokacije SRSR v do tedaj znanih prokariontskih genomih. Izbirali so posamezna SRSR zaporedja bakterij in arhej, ter jih primerjali s celotnimi genomi prokariontov. Primerjali so tudi prekinitvena zaporedja, ki so med SRSR, ter prišli do spoznanja, da so tako SRSR kot prekinitvena zaporedja večinoma unikatna za genom posamezne vrste. V nadaljevanju so zato iskali nove lokacije SRSR na podlagi njihovega motiva ponavljanja, ki pa je bil zanje značilen v vseh do tedaj odkritih zaporedij – kratka palindromska zaporedja alternirajo s prekinitvenimi zaporedji stalnih dolžin. Z analizami so v več organizmih odkrili tudi prisotnost daljših zaporedij na enem koncu SRSR in predpostavili, da daljše zaporedje in SRSR skupaj predstavljata eno enoto. Ta zaporedja pred SRSR so poimenovali vodilna zaporedja, ki so si glede na zaporedje baz podobna le znotraj enega genoma, vendar pa imajo nekatere splošne skupne lastnosti. Nimajo odprtega bralnega okvirja, torej ne vsebujejo zaporedja, ki bi kodiralo za proteine, poleg tega pa pogosto vsebujejo sosledje enakih nukleotidov in na splošno velik delež adenina in timina.

Ta nova odkritja so spodbudila dodatne raziskave, vendar so znanstveniki ugotovili, da so bila v preteklosti v tisku uporabljena različna poimenovanja za novo odkrit motiv ponavljanja znotraj DNA. V namen poenotenja sta zato Jansen in Mojica leta 2002 vpeljala novo ime, ki je ostalo v uporabi do danes – CRISPR (clustered regularly spaced palindromic repeats). Ob vpeljavi novega imena je Jansen s kolegi odkril tudi novo lastnost CRISPR zaporedij. S primerjavo genov ob CRISPR zaporedjih so odkrili pogosto prisotnost štirih genov, ki jih niso našli v prokariontih brez CRISPR regij. Skupino novo odkritih genov so poimenovali cas (CRISPR associated genes), posamezne gene pa od Cas1 do Cas4. V tej raziskavi še niso identificirali točne funkcije vseh cas genov, so pa predpostavili vlogi genov Cas3 in Cas4. Analiza aminokislinskih ostankov teh dveh proteinov je pokazala homolognost med Cas3 in helikazo ter med Cas4 in RecB eksonukleazo.

==Znane lastnosti CRISPR zaporedij do leta 2002==

Do leta 2002 so CRISPR zaporedja odkrili v več kot 40 različnih prokariontih. Znano je, da gre za kratka zaporedja dolga od 21 do 37 baznih parov, ki so ločena s prekinitvenimi zaporedji stalnih dolžin. Pred kratkim zaporedjem se nahajajo daljše zaporedje dolgo nekaj sto baznih parov, ki so ga poimenovali vodilno zaporedje in skupina genov, ki so jih poimenovali cas. V letu 2002 so torej že poznali splošno strukturo regije CRISPR, še vedno pa niso poznali izvora zaporedij ter njihove vloge v organizmu.

==Viri in literatura==

*Mojica, F. J., Rodriguez-Valera, F. The discovery of CRISPR in archaea and bacteria, The FEBS Journal, 2016, 283(17), 3162-9

*Mojica, F. J., Ferrer, C., Juez, G., Rodriguez-Valera, F. Long stretches of short tandem repeats are present in the largest replicons of the Archaea Haloferax mediterranei and Haloferax volcanii and could be involved in replicon partitioning, Molecular Biology (1995), 17(1), 85-93

*Ishino Y, Shinagawa H, Makino K, Amemura M, Nakata A. 1987. Nucleotide sequence of the iap gene, responsible for alkaline phosphatase isozyme conversion in Escherichia coli, and identification of the gene product. Journal of Bacteriol 169:5429 –5433

*Yoshizumi Ishino, Mart Krupovic, Patrick Forterre. 2018. History of CRISPR-Cas from Encounter with a Mysterious Repeated Sequence to Genome Editing Technology. Journal of Bacteriol 200(7): 17-58

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Odkritje in opis regij CRISPR in Cas (do leta ~2002)

2019-04-14T08:32:27Z

Eva Gartner: /* Viri in literatura */

==Uvod==

Analize celotnih genomov organizmov so znanstvenikom omogočile primerjavo le teh med posameznimi organizmi. Rezultati raziskav so pokazali, da so pri velikem številu prokariontov prisotna ponavljajoča zaporedja. Ta so lahko daljša ( do 100 kbp), ki jim pogosto pripisujejo kakšno biološko pomembno funkcijo ali pa krajša, sestavljena iz le nekaj nukleotidov . Slednje delimo na zaporedna ponavljajoča zaporedja, pri katerih so si enote, ki se ponavljajo sosednje in prekinjena ponavljajoča zaporedja, pri katerih so med posameznimi ponavljajočimi se zaporedji heterogene prekinitvene sekvence različnih dolžin. Naš seminar se osredotoča na odkritje obstoja posebne družine prekinjenih ponavljajočih zaporedij, ki so jih kasneje poimenovali zaporedja CRISPR.

==Prvo odkritje==

Odkritje prvih ponavljajočih se zaporedij je bilo povsem naključno. Leta 1987 je skupina znanstvenikov na čelu z Yoshizumi Ishinom naredila raziskavo, pri katerem so želeli indetificirati protein, odgovoren za pretvorbo izocima alkalna fosfataza pri organizmu Escherichia coli
(celice K-12). Uspelo jim je sekvencirati 1,7 kbp dolg fragment DNA v katerem se je med drugim nahajal gen iap, za katerega so sklepali, da zapisuje preiskovani protein. Tarčno DNA so najprej klonirali in prenesli v vektor M13, v katerem je potekalo sekvenciranje po Sangerjevi metodi. Med sekvenciranjem DNA fragmenta so na njegovem 3΄ koncu opazili nenavadno strukturo. Navzdol po genomu od gena iap se je nahajalo pet močno homolognih sekvenc, sestavljenih iz 29 nukleotidov, znotraj katerih je bilo palindromsko zaporedje 14 bp, med njimi pa so bile prekinitve iz 32 nukleotidov. Že nekaj let pred tem odkritjem, leta 1984, so pri raziskavi na bakterijah E. coli in Salmonella enterica opazili palindromska zaporedja, ki so jim pripisali funkcijo stabilizacije mRNA, vendar ob primerjavi niso našli nobene podobnosti med temi zaporedji in na novo odkritimi zaporedji . To odkritje je bilo tako skrivnostno, da so ga omenili celo v razpravi na koncu članka, čeprav takrat še niso razumeli njihove biološke funkcije. Znanost v času te raziskave še ni bila tako razvita in niso poznali danes razvitih metod sekvenciranja, zato je bil celoten postopek dolgotrajen. Več mesecev so potrebovali, da so natančno določili ponavljajoče zaporedje. Težave jim je povzročala predvsem sekundarna struktura, ki jo je tvorilo palindromsko zaporedje. Neverjetno je, da bi lahko z danes poznano tehnologijo npr. s polimerazno verižno reakcijo enako regijo posekvencirali v enem dnevu.

Temu odkritju je kmalu sledilo še več odkritij enakih ponavljajočih zaporedij pri različnih sevih E. coli in nekaterih ostalih bakterijah ( npr. Salmonella typhimurium in Shigela dysenteriae). Do pomembnega odkritja so leta 1993 prišli tudi nizozemski znanstveniki, ki so prekinjena ponavljajoča zaporedja našli pri preučevanju bakterije Mycobacterium tuberculosis. Prepoznali so veliko raznolikost zaporedij med posameznimi sevi bakterije in to uporabili za njihovo identifikacijo.

V prvih letih raziskovanja je bilo javno dostopnih zelo malo podatkov o sekvenciranih genomih, zato so prekinjena ponavljajoča zaporedja opazili pri relativno majhnem številu organizmov. Ob razvoju novih tehnik sekvenciranja pa je bilo teh podatkov vedno več, čemur so sledila tudi vedno večja odkritja na področju ponavljajočih prekinjenih zaporedij.

==Odkritje regij CRISPR pri arhejah (1993–2000)==

Pri arhejah je takšna zaporedja prvi opazil Francisco Juan Martinez Mojica, ki je kot del mikrobiološke skupine na Univerzi Alicante v Španiji raziskoval regulatorne mehanizme haloarhej in njihovo prilagajanje na spremembe v okolju. Preučevani organizem je bil Haloferax mediterranei – haloarheja, ki živi v okoljih, kjer slanost doseže tudi 20–25 %. Mojica se je pri raziskovanju usmeril na gensko še nekategorizirane regije genoma H. mediterranei, ki so bile predvidoma zaradi spremembe v slanosti okolja podvržene nekakšnim DNA-modifikacijam. Vendar pa so pri sekvenciranju in genski analizi teh regij naleteli na nepričakovan vzorec. Avtoradiogram je pokazal DNA-segmente, dolge približno 30 bp, ki se ponavljajo na konstantnih razdaljah. Po dodatnem sekvenciranju regij so odkrili prisotnost vsaj 14 skoraj popolnoma ohranjenih ponovitev, vsaka ponovitev pa je vključevala kratko obrnjeno palindromsko ponovitev. Ponavljajoči vzorci so se nahajali na nekodirajočem območju genoma, poleg ORF (»open reading frames«), ki niso bili homologni nobenemu do takrat znanemu proteinu. Poleg tega pa so pri ponavljajočih se regijah zaznali številne transkripte RNA, kar nakazuje na visoko procesirano RNA iz teh regij. Čeprav so bila takšna ponavljajoča zaporedja opažena že pri nekaterih bakterijah (Escherichia coli, Mycobacterium spp.), so bila pri tem eksperimentu prvič videna pri arhejah.

Medtem ko so za bakterijske ponovitve takrat le predvidevali o njihovi biološki funkciji, npr. regulacija sosednjih genov, so biološke funkcije TREPs (Tandem REPeats) pri arhejah tudi eksperimentalno raziskovali. TREP-zaporedja so našli v kromosomu in plazmidu H. mediterranei in sorodni haloarheji – Haloferax volcanii. Zaradi možnosti genske manipulacije so pri celicah H. volcanii raziskovali učinek prisotnosti rekombinantnega plazmida, ki je vseboval fragmente TREP. Dve hipotezi o biološki funkciji TREPs so takoj ovrgli, in sicer njihovo vlogo pri rekombinaciji DNA in regulaciji sosednjih genov. Nesmiselno bi bilo predvidevati, da bi bile tako velike genske strukture povezane zgolj z regulacijo transkripcije nekaj genov. Predpostavili pa so, da morajo TREPs igrati pomembno vlogo pri celičnem ciklu. Prisotni so namreč v največjih in najverjetneje najpomembnejših replikonih celice. Poleg tega je prisotnost dodatnih kopij TREP (vstavljene v gostujočo celico s pomočjo vektorja) povzročila zmanjšano preživetje celic in spremembo v sestavi DNA, kar podpira hipotezo, da imajo TREPs pomembno vlogo pri ločevanju replikonov. Zaradi visoke ohranjenosti TREPs med vrstami haloarhej in prisotnosti zelo podobnih struktur pri E. coli pa so lahko ugibali, da imajo TREPs univerzalno oz. podobno vlogo pri organizmih, kjer so jih odkrili.

Za dokaz zgornjih predvidevanj o biološki funkciji TREPs so bile seveda potrebne dodatne študije na haloarhejah, za katere pa Mojica ni dobil finančne podpore. Poskuse je zato moral nadaljevati na E. coli, kjer enaki eksperimenti kot prej na H. volcanii niso dali željenih rezultatov. Dodatne raziskave niso podale nobenega dokaza o vpletenosti ponavljajočih se zaporedij v ločitveni aparat, iz rezultatov pa bi lahko sklepali, da bi zaporedja lahko služila kot nekakšna mesta za kooperativno vezavo na celične strukture, npr. na citoplazemsko membrano, ali proteine, vplivali pa bi lahko tudi na strukturo DNA.

Leta 1995 je bil objavljen prvi celoten genom prostoživečega organizma, s čimer se je začela nova doba v biologiji. Pospešeno sekvenciranje je pripomoglo k nastanku dodatnih zbirk prokariontskih genomov, na podlagi česar je leta 1996 lahko nastalo prvo celovito poročilo o konstantno ponavljajočih se regijah v celotnem genomu. Do konca stoletja so podobna zaporedja odkrili še v 12 vrstah arhej in bakterij.

==F. Mojica et al. (2000)==

V nadaljnjih letih se je večalo število znanih genomov bakterij in arhej, kar je pospešilo raziskave o motivih zaporedij DNA. Tako je skupina znanstvenikov pod vodstvom Francisca Mojice potrdila prisotnost ponavljajočih zaporedij v prokariontih, ki so jo predstavili kot posebno družino prokariontskih zaporedij pod imenom SRSR (short regularly spaced repeats). Z analizami so ugotovili, da so SRSR prisotni znotraj genomov večine arhej ter različnih skupin bakterij in tako predstavljajo eno najbolj razširjenih družin v prokariontskih genomih. Ugotovili so, da so SRSR zaporedja znotraj enega genoma precej homogena, pojavljajo pa se tudi določene podobnosti med organizmi, ki izhajajo iz skupnega prednika ter podobnosti znotraj posameznih domen.
V tej raziskavi je bilo ključno odkritje pojav kratkih palindromskih zaporedij v dodatnih organizmih in s tem vpeljava nove družine nukleotidnih zaporedij, za katero je značilno da so ločena s stalno dolgimi prekinitvenimi zaporedji. Čeprav so odkrili podobna zaporedja znotraj genomov različnih prokariontov, niso vedeli, če ima ta družina zaporedij tudi skupno funkcijo v vseh prokariontih.

==Jansen et al. (2002)==

Na Nizozemskem je v naslednjih letih Ruud Jansen dodatno preučeval družino SRSR. Z računalniško analizo so želeli določiti lokacije SRSR v do tedaj znanih prokariontskih genomih. Izbirali so posamezna SRSR zaporedja bakterij in arhej, ter jih primerjali s celotnimi genomi prokariontov. Primerjali so tudi prekinitvena zaporedja, ki so med SRSR, ter prišli do spoznanja, da so tako SRSR kot prekinitvena zaporedja večinoma unikatna za genom posamezne vrste. V nadaljevanju so zato iskali nove lokacije SRSR na podlagi njihovega motiva ponavljanja, ki pa je bil zanje značilen v vseh do tedaj odkritih zaporedij – kratka palindromska zaporedja alternirajo s prekinitvenimi zaporedji stalnih dolžin. Z analizami so v več organizmih odkrili tudi prisotnost daljših zaporedij na enem koncu SRSR in predpostavili, da daljše zaporedje in SRSR skupaj predstavljata eno enoto. Ta zaporedja pred SRSR so poimenovali vodilna zaporedja, ki so si glede na zaporedje baz podobna le znotraj enega genoma, vendar pa imajo nekatere splošne skupne lastnosti. Nimajo odprtega bralnega okvirja, torej ne vsebujejo zaporedja, ki bi kodiralo za proteine, poleg tega pa pogosto vsebujejo sosledje enakih nukleotidov in na splošno velik delež adenina in timina.

Ta nova odkritja so spodbudila dodatne raziskave, vendar so znanstveniki ugotovili, da so bila v preteklosti v tisku uporabljena različna poimenovanja za novo odkrit motiv ponavljanja znotraj DNA. V namen poenotenja sta zato Jansen in Mojica leta 2002 vpeljala novo ime, ki je ostalo v uporabi do danes – CRISPR (clustered regularly spaced palindromic repeats). Ob vpeljavi novega imena je Jansen s kolegi odkril tudi novo lastnost CRISPR zaporedij. S primerjavo genov ob CRISPR zaporedjih so odkrili pogosto prisotnost štirih genov, ki jih niso našli v prokariontih brez CRISPR regij. Skupino novo odkritih genov so poimenovali cas (CRISPR associated genes), posamezne gene pa od Cas1 do Cas4. V tej raziskavi še niso identificirali točne funkcije vseh cas genov, so pa predpostavili vlogi genov Cas3 in Cas4. Analiza aminokislinskih ostankov teh dveh proteinov je pokazala homolognost med Cas3 in helikazo ter med Cas4 in RecB eksonukleazo.

==Znane lastnosti CRISPR zaporedij do leta 2002==

Do leta 2002 so CRISPR zaporedja odkrili v več kot 40 različnih prokariontih. Znano je, da gre za kratka zaporedja dolga od 21 do 37 baznih parov, ki so ločena s prekinitvenimi zaporedji stalnih dolžin. Pred kratkim zaporedjem se nahajajo daljše zaporedje dolgo nekaj sto baznih parov, ki so ga poimenovali vodilno zaporedje in skupina genov, ki so jih poimenovali cas. V letu 2002 so torej že poznali splošno strukturo regije CRISPR, še vedno pa niso poznali izvora zaporedij ter njihove vloge v organizmu.

==Viri in literatura==

*Mojica, F. J., Rodriguez-Valera, F. The discovery of CRISPR in archaea and bacteria, The FEBS Journal, 2016, 283(17), 3162-9

*Mojica, F. J., Ferrer, C., Juez, G., Rodriguez-Valera, F. Long stretches of short tandem repeats are present in the largest replicons of the Archaea Haloferax mediterranei and Haloferax volcanii and could be involved in replicon partitioning, Molecular Biology (1995), 17(1), 85-93

*Ishino Y, Shinagawa H, Makino K, Amemura M, Nakata A. 1987. Nucleotide sequence of the iap gene, responsible for alkaline phosphatase isozyme conversion in Escherichia coli, and identification of the gene product. Journal of Bacteriol 169:5429 –5433

*Yoshizumi Ishino, Mart Krupovic, Patrick Forterre. 2018. History of CRISPR-Cas from Encounter with a Mysterious Repeated Sequence to Genome Editing Technology. Journal of Bacteriol 200:7

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Odkritje in opis regij CRISPR in Cas (do leta ~2002)

2019-04-14T08:31:36Z

Eva Gartner: /* Viri in literatura */

==Uvod==

Analize celotnih genomov organizmov so znanstvenikom omogočile primerjavo le teh med posameznimi organizmi. Rezultati raziskav so pokazali, da so pri velikem številu prokariontov prisotna ponavljajoča zaporedja. Ta so lahko daljša ( do 100 kbp), ki jim pogosto pripisujejo kakšno biološko pomembno funkcijo ali pa krajša, sestavljena iz le nekaj nukleotidov . Slednje delimo na zaporedna ponavljajoča zaporedja, pri katerih so si enote, ki se ponavljajo sosednje in prekinjena ponavljajoča zaporedja, pri katerih so med posameznimi ponavljajočimi se zaporedji heterogene prekinitvene sekvence različnih dolžin. Naš seminar se osredotoča na odkritje obstoja posebne družine prekinjenih ponavljajočih zaporedij, ki so jih kasneje poimenovali zaporedja CRISPR.

==Prvo odkritje==

Odkritje prvih ponavljajočih se zaporedij je bilo povsem naključno. Leta 1987 je skupina znanstvenikov na čelu z Yoshizumi Ishinom naredila raziskavo, pri katerem so želeli indetificirati protein, odgovoren za pretvorbo izocima alkalna fosfataza pri organizmu Escherichia coli
(celice K-12). Uspelo jim je sekvencirati 1,7 kbp dolg fragment DNA v katerem se je med drugim nahajal gen iap, za katerega so sklepali, da zapisuje preiskovani protein. Tarčno DNA so najprej klonirali in prenesli v vektor M13, v katerem je potekalo sekvenciranje po Sangerjevi metodi. Med sekvenciranjem DNA fragmenta so na njegovem 3΄ koncu opazili nenavadno strukturo. Navzdol po genomu od gena iap se je nahajalo pet močno homolognih sekvenc, sestavljenih iz 29 nukleotidov, znotraj katerih je bilo palindromsko zaporedje 14 bp, med njimi pa so bile prekinitve iz 32 nukleotidov. Že nekaj let pred tem odkritjem, leta 1984, so pri raziskavi na bakterijah E. coli in Salmonella enterica opazili palindromska zaporedja, ki so jim pripisali funkcijo stabilizacije mRNA, vendar ob primerjavi niso našli nobene podobnosti med temi zaporedji in na novo odkritimi zaporedji . To odkritje je bilo tako skrivnostno, da so ga omenili celo v razpravi na koncu članka, čeprav takrat še niso razumeli njihove biološke funkcije. Znanost v času te raziskave še ni bila tako razvita in niso poznali danes razvitih metod sekvenciranja, zato je bil celoten postopek dolgotrajen. Več mesecev so potrebovali, da so natančno določili ponavljajoče zaporedje. Težave jim je povzročala predvsem sekundarna struktura, ki jo je tvorilo palindromsko zaporedje. Neverjetno je, da bi lahko z danes poznano tehnologijo npr. s polimerazno verižno reakcijo enako regijo posekvencirali v enem dnevu.

Temu odkritju je kmalu sledilo še več odkritij enakih ponavljajočih zaporedij pri različnih sevih E. coli in nekaterih ostalih bakterijah ( npr. Salmonella typhimurium in Shigela dysenteriae). Do pomembnega odkritja so leta 1993 prišli tudi nizozemski znanstveniki, ki so prekinjena ponavljajoča zaporedja našli pri preučevanju bakterije Mycobacterium tuberculosis. Prepoznali so veliko raznolikost zaporedij med posameznimi sevi bakterije in to uporabili za njihovo identifikacijo.

V prvih letih raziskovanja je bilo javno dostopnih zelo malo podatkov o sekvenciranih genomih, zato so prekinjena ponavljajoča zaporedja opazili pri relativno majhnem številu organizmov. Ob razvoju novih tehnik sekvenciranja pa je bilo teh podatkov vedno več, čemur so sledila tudi vedno večja odkritja na področju ponavljajočih prekinjenih zaporedij.

==Odkritje regij CRISPR pri arhejah (1993–2000)==

Pri arhejah je takšna zaporedja prvi opazil Francisco Juan Martinez Mojica, ki je kot del mikrobiološke skupine na Univerzi Alicante v Španiji raziskoval regulatorne mehanizme haloarhej in njihovo prilagajanje na spremembe v okolju. Preučevani organizem je bil Haloferax mediterranei – haloarheja, ki živi v okoljih, kjer slanost doseže tudi 20–25 %. Mojica se je pri raziskovanju usmeril na gensko še nekategorizirane regije genoma H. mediterranei, ki so bile predvidoma zaradi spremembe v slanosti okolja podvržene nekakšnim DNA-modifikacijam. Vendar pa so pri sekvenciranju in genski analizi teh regij naleteli na nepričakovan vzorec. Avtoradiogram je pokazal DNA-segmente, dolge približno 30 bp, ki se ponavljajo na konstantnih razdaljah. Po dodatnem sekvenciranju regij so odkrili prisotnost vsaj 14 skoraj popolnoma ohranjenih ponovitev, vsaka ponovitev pa je vključevala kratko obrnjeno palindromsko ponovitev. Ponavljajoči vzorci so se nahajali na nekodirajočem območju genoma, poleg ORF (»open reading frames«), ki niso bili homologni nobenemu do takrat znanemu proteinu. Poleg tega pa so pri ponavljajočih se regijah zaznali številne transkripte RNA, kar nakazuje na visoko procesirano RNA iz teh regij. Čeprav so bila takšna ponavljajoča zaporedja opažena že pri nekaterih bakterijah (Escherichia coli, Mycobacterium spp.), so bila pri tem eksperimentu prvič videna pri arhejah.

Medtem ko so za bakterijske ponovitve takrat le predvidevali o njihovi biološki funkciji, npr. regulacija sosednjih genov, so biološke funkcije TREPs (Tandem REPeats) pri arhejah tudi eksperimentalno raziskovali. TREP-zaporedja so našli v kromosomu in plazmidu H. mediterranei in sorodni haloarheji – Haloferax volcanii. Zaradi možnosti genske manipulacije so pri celicah H. volcanii raziskovali učinek prisotnosti rekombinantnega plazmida, ki je vseboval fragmente TREP. Dve hipotezi o biološki funkciji TREPs so takoj ovrgli, in sicer njihovo vlogo pri rekombinaciji DNA in regulaciji sosednjih genov. Nesmiselno bi bilo predvidevati, da bi bile tako velike genske strukture povezane zgolj z regulacijo transkripcije nekaj genov. Predpostavili pa so, da morajo TREPs igrati pomembno vlogo pri celičnem ciklu. Prisotni so namreč v največjih in najverjetneje najpomembnejših replikonih celice. Poleg tega je prisotnost dodatnih kopij TREP (vstavljene v gostujočo celico s pomočjo vektorja) povzročila zmanjšano preživetje celic in spremembo v sestavi DNA, kar podpira hipotezo, da imajo TREPs pomembno vlogo pri ločevanju replikonov. Zaradi visoke ohranjenosti TREPs med vrstami haloarhej in prisotnosti zelo podobnih struktur pri E. coli pa so lahko ugibali, da imajo TREPs univerzalno oz. podobno vlogo pri organizmih, kjer so jih odkrili.

Za dokaz zgornjih predvidevanj o biološki funkciji TREPs so bile seveda potrebne dodatne študije na haloarhejah, za katere pa Mojica ni dobil finančne podpore. Poskuse je zato moral nadaljevati na E. coli, kjer enaki eksperimenti kot prej na H. volcanii niso dali željenih rezultatov. Dodatne raziskave niso podale nobenega dokaza o vpletenosti ponavljajočih se zaporedij v ločitveni aparat, iz rezultatov pa bi lahko sklepali, da bi zaporedja lahko služila kot nekakšna mesta za kooperativno vezavo na celične strukture, npr. na citoplazemsko membrano, ali proteine, vplivali pa bi lahko tudi na strukturo DNA.

Leta 1995 je bil objavljen prvi celoten genom prostoživečega organizma, s čimer se je začela nova doba v biologiji. Pospešeno sekvenciranje je pripomoglo k nastanku dodatnih zbirk prokariontskih genomov, na podlagi česar je leta 1996 lahko nastalo prvo celovito poročilo o konstantno ponavljajočih se regijah v celotnem genomu. Do konca stoletja so podobna zaporedja odkrili še v 12 vrstah arhej in bakterij.

==F. Mojica et al. (2000)==

V nadaljnjih letih se je večalo število znanih genomov bakterij in arhej, kar je pospešilo raziskave o motivih zaporedij DNA. Tako je skupina znanstvenikov pod vodstvom Francisca Mojice potrdila prisotnost ponavljajočih zaporedij v prokariontih, ki so jo predstavili kot posebno družino prokariontskih zaporedij pod imenom SRSR (short regularly spaced repeats). Z analizami so ugotovili, da so SRSR prisotni znotraj genomov večine arhej ter različnih skupin bakterij in tako predstavljajo eno najbolj razširjenih družin v prokariontskih genomih. Ugotovili so, da so SRSR zaporedja znotraj enega genoma precej homogena, pojavljajo pa se tudi določene podobnosti med organizmi, ki izhajajo iz skupnega prednika ter podobnosti znotraj posameznih domen.
V tej raziskavi je bilo ključno odkritje pojav kratkih palindromskih zaporedij v dodatnih organizmih in s tem vpeljava nove družine nukleotidnih zaporedij, za katero je značilno da so ločena s stalno dolgimi prekinitvenimi zaporedji. Čeprav so odkrili podobna zaporedja znotraj genomov različnih prokariontov, niso vedeli, če ima ta družina zaporedij tudi skupno funkcijo v vseh prokariontih.

==Jansen et al. (2002)==

Na Nizozemskem je v naslednjih letih Ruud Jansen dodatno preučeval družino SRSR. Z računalniško analizo so želeli določiti lokacije SRSR v do tedaj znanih prokariontskih genomih. Izbirali so posamezna SRSR zaporedja bakterij in arhej, ter jih primerjali s celotnimi genomi prokariontov. Primerjali so tudi prekinitvena zaporedja, ki so med SRSR, ter prišli do spoznanja, da so tako SRSR kot prekinitvena zaporedja večinoma unikatna za genom posamezne vrste. V nadaljevanju so zato iskali nove lokacije SRSR na podlagi njihovega motiva ponavljanja, ki pa je bil zanje značilen v vseh do tedaj odkritih zaporedij – kratka palindromska zaporedja alternirajo s prekinitvenimi zaporedji stalnih dolžin. Z analizami so v več organizmih odkrili tudi prisotnost daljših zaporedij na enem koncu SRSR in predpostavili, da daljše zaporedje in SRSR skupaj predstavljata eno enoto. Ta zaporedja pred SRSR so poimenovali vodilna zaporedja, ki so si glede na zaporedje baz podobna le znotraj enega genoma, vendar pa imajo nekatere splošne skupne lastnosti. Nimajo odprtega bralnega okvirja, torej ne vsebujejo zaporedja, ki bi kodiralo za proteine, poleg tega pa pogosto vsebujejo sosledje enakih nukleotidov in na splošno velik delež adenina in timina.

Ta nova odkritja so spodbudila dodatne raziskave, vendar so znanstveniki ugotovili, da so bila v preteklosti v tisku uporabljena različna poimenovanja za novo odkrit motiv ponavljanja znotraj DNA. V namen poenotenja sta zato Jansen in Mojica leta 2002 vpeljala novo ime, ki je ostalo v uporabi do danes – CRISPR (clustered regularly spaced palindromic repeats). Ob vpeljavi novega imena je Jansen s kolegi odkril tudi novo lastnost CRISPR zaporedij. S primerjavo genov ob CRISPR zaporedjih so odkrili pogosto prisotnost štirih genov, ki jih niso našli v prokariontih brez CRISPR regij. Skupino novo odkritih genov so poimenovali cas (CRISPR associated genes), posamezne gene pa od Cas1 do Cas4. V tej raziskavi še niso identificirali točne funkcije vseh cas genov, so pa predpostavili vlogi genov Cas3 in Cas4. Analiza aminokislinskih ostankov teh dveh proteinov je pokazala homolognost med Cas3 in helikazo ter med Cas4 in RecB eksonukleazo.

==Znane lastnosti CRISPR zaporedij do leta 2002==

Do leta 2002 so CRISPR zaporedja odkrili v več kot 40 različnih prokariontih. Znano je, da gre za kratka zaporedja dolga od 21 do 37 baznih parov, ki so ločena s prekinitvenimi zaporedji stalnih dolžin. Pred kratkim zaporedjem se nahajajo daljše zaporedje dolgo nekaj sto baznih parov, ki so ga poimenovali vodilno zaporedje in skupina genov, ki so jih poimenovali cas. V letu 2002 so torej že poznali splošno strukturo regije CRISPR, še vedno pa niso poznali izvora zaporedij ter njihove vloge v organizmu.

==Viri in literatura==

*Mojica, F. J., Rodriguez-Valera, F. The discovery of CRISPR in archaea and bacteria, The FEBS Journal, 2016, 283(17), 3162-9

*Mojica, F. J., Ferrer, C., Juez, G., Rodriguez-Valera, F. Long stretches of short tandem repeats are present in the largest replicons of the Archaea Haloferax mediterranei and Haloferax volcanii and could be involved in replicon partitioning, Molecular Biology (1995), 17(1), 85-93

*Ishino Y, Shinagawa H, Makino K, Amemura M, Nakata A. 1987. Nucleotide sequence of the iap gene, responsible for alkaline phosphatase
isozyme conversion in Escherichia coli, and identification of the gene
product. Journal of Bacteriol 169:5429 –5433

*Yoshizumi Ishino, Mart Krupovic, Patrick Forterre. 2018. History of CRISPR-Cas from Encounter with a Mysterious Repeated Sequence to Genome Editing Technology. Journal of Bacteriol 200:7

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Odkritje in opis regij CRISPR in Cas (do leta ~2002)

2019-04-14T08:19:01Z

Eva Gartner: /* Viri in literatura */

==Uvod==

Analize celotnih genomov organizmov so znanstvenikom omogočile primerjavo le teh med posameznimi organizmi. Rezultati raziskav so pokazali, da so pri velikem številu prokariontov prisotna ponavljajoča zaporedja. Ta so lahko daljša ( do 100 kbp), ki jim pogosto pripisujejo kakšno biološko pomembno funkcijo ali pa krajša, sestavljena iz le nekaj nukleotidov . Slednje delimo na zaporedna ponavljajoča zaporedja, pri katerih so si enote, ki se ponavljajo sosednje in prekinjena ponavljajoča zaporedja, pri katerih so med posameznimi ponavljajočimi se zaporedji heterogene prekinitvene sekvence različnih dolžin. Naš seminar se osredotoča na odkritje obstoja posebne družine prekinjenih ponavljajočih zaporedij, ki so jih kasneje poimenovali zaporedja CRISPR.

==Prvo odkritje==

Odkritje prvih ponavljajočih se zaporedij je bilo povsem naključno. Leta 1987 je skupina znanstvenikov na čelu z Yoshizumi Ishinom naredila raziskavo, pri katerem so želeli indetificirati protein, odgovoren za pretvorbo izocima alkalna fosfataza pri organizmu Escherichia coli
(celice K-12). Uspelo jim je sekvencirati 1,7 kbp dolg fragment DNA v katerem se je med drugim nahajal gen iap, za katerega so sklepali, da zapisuje preiskovani protein. Tarčno DNA so najprej klonirali in prenesli v vektor M13, v katerem je potekalo sekvenciranje po Sangerjevi metodi. Med sekvenciranjem DNA fragmenta so na njegovem 3΄ koncu opazili nenavadno strukturo. Navzdol po genomu od gena iap se je nahajalo pet močno homolognih sekvenc, sestavljenih iz 29 nukleotidov, znotraj katerih je bilo palindromsko zaporedje 14 bp, med njimi pa so bile prekinitve iz 32 nukleotidov. Že nekaj let pred tem odkritjem, leta 1984, so pri raziskavi na bakterijah E. coli in Salmonella enterica opazili palindromska zaporedja, ki so jim pripisali funkcijo stabilizacije mRNA, vendar ob primerjavi niso našli nobene podobnosti med temi zaporedji in na novo odkritimi zaporedji . To odkritje je bilo tako skrivnostno, da so ga omenili celo v razpravi na koncu članka, čeprav takrat še niso razumeli njihove biološke funkcije. Znanost v času te raziskave še ni bila tako razvita in niso poznali danes razvitih metod sekvenciranja, zato je bil celoten postopek dolgotrajen. Več mesecev so potrebovali, da so natančno določili ponavljajoče zaporedje. Težave jim je povzročala predvsem sekundarna struktura, ki jo je tvorilo palindromsko zaporedje. Neverjetno je, da bi lahko z danes poznano tehnologijo npr. s polimerazno verižno reakcijo enako regijo posekvencirali v enem dnevu.

Temu odkritju je kmalu sledilo še več odkritij enakih ponavljajočih zaporedij pri različnih sevih E. coli in nekaterih ostalih bakterijah ( npr. Salmonella typhimurium in Shigela dysenteriae). Do pomembnega odkritja so leta 1993 prišli tudi nizozemski znanstveniki, ki so prekinjena ponavljajoča zaporedja našli pri preučevanju bakterije Mycobacterium tuberculosis. Prepoznali so veliko raznolikost zaporedij med posameznimi sevi bakterije in to uporabili za njihovo identifikacijo.

V prvih letih raziskovanja je bilo javno dostopnih zelo malo podatkov o sekvenciranih genomih, zato so prekinjena ponavljajoča zaporedja opazili pri relativno majhnem številu organizmov. Ob razvoju novih tehnik sekvenciranja pa je bilo teh podatkov vedno več, čemur so sledila tudi vedno večja odkritja na področju ponavljajočih prekinjenih zaporedij.

==Odkritje regij CRISPR pri arhejah (1993–2000)==

Pri arhejah je takšna zaporedja prvi opazil Francisco Juan Martinez Mojica, ki je kot del mikrobiološke skupine na Univerzi Alicante v Španiji raziskoval regulatorne mehanizme haloarhej in njihovo prilagajanje na spremembe v okolju. Preučevani organizem je bil Haloferax mediterranei – haloarheja, ki živi v okoljih, kjer slanost doseže tudi 20–25 %. Mojica se je pri raziskovanju usmeril na gensko še nekategorizirane regije genoma H. mediterranei, ki so bile predvidoma zaradi spremembe v slanosti okolja podvržene nekakšnim DNA-modifikacijam. Vendar pa so pri sekvenciranju in genski analizi teh regij naleteli na nepričakovan vzorec. Avtoradiogram je pokazal DNA-segmente, dolge približno 30 bp, ki se ponavljajo na konstantnih razdaljah. Po dodatnem sekvenciranju regij so odkrili prisotnost vsaj 14 skoraj popolnoma ohranjenih ponovitev, vsaka ponovitev pa je vključevala kratko obrnjeno palindromsko ponovitev. Ponavljajoči vzorci so se nahajali na nekodirajočem območju genoma, poleg ORF (»open reading frames«), ki niso bili homologni nobenemu do takrat znanemu proteinu. Poleg tega pa so pri ponavljajočih se regijah zaznali številne transkripte RNA, kar nakazuje na visoko procesirano RNA iz teh regij. Čeprav so bila takšna ponavljajoča zaporedja opažena že pri nekaterih bakterijah (Escherichia coli, Mycobacterium spp.), so bila pri tem eksperimentu prvič videna pri arhejah.

Medtem ko so za bakterijske ponovitve takrat le predvidevali o njihovi biološki funkciji, npr. regulacija sosednjih genov, so biološke funkcije TREPs (Tandem REPeats) pri arhejah tudi eksperimentalno raziskovali. TREP-zaporedja so našli v kromosomu in plazmidu H. mediterranei in sorodni haloarheji – Haloferax volcanii. Zaradi možnosti genske manipulacije so pri celicah H. volcanii raziskovali učinek prisotnosti rekombinantnega plazmida, ki je vseboval fragmente TREP. Dve hipotezi o biološki funkciji TREPs so takoj ovrgli, in sicer njihovo vlogo pri rekombinaciji DNA in regulaciji sosednjih genov. Nesmiselno bi bilo predvidevati, da bi bile tako velike genske strukture povezane zgolj z regulacijo transkripcije nekaj genov. Predpostavili pa so, da morajo TREPs igrati pomembno vlogo pri celičnem ciklu. Prisotni so namreč v največjih in najverjetneje najpomembnejših replikonih celice. Poleg tega je prisotnost dodatnih kopij TREP (vstavljene v gostujočo celico s pomočjo vektorja) povzročila zmanjšano preživetje celic in spremembo v sestavi DNA, kar podpira hipotezo, da imajo TREPs pomembno vlogo pri ločevanju replikonov. Zaradi visoke ohranjenosti TREPs med vrstami haloarhej in prisotnosti zelo podobnih struktur pri E. coli pa so lahko ugibali, da imajo TREPs univerzalno oz. podobno vlogo pri organizmih, kjer so jih odkrili.

Za dokaz zgornjih predvidevanj o biološki funkciji TREPs so bile seveda potrebne dodatne študije na haloarhejah, za katere pa Mojica ni dobil finančne podpore. Poskuse je zato moral nadaljevati na E. coli, kjer enaki eksperimenti kot prej na H. volcanii niso dali željenih rezultatov. Dodatne raziskave niso podale nobenega dokaza o vpletenosti ponavljajočih se zaporedij v ločitveni aparat, iz rezultatov pa bi lahko sklepali, da bi zaporedja lahko služila kot nekakšna mesta za kooperativno vezavo na celične strukture, npr. na citoplazemsko membrano, ali proteine, vplivali pa bi lahko tudi na strukturo DNA.

Raziskovanje ponavljajočih se zaporedij je torej za kratek čas obstalo na mrtvi točki. Med leti 1987 in 1995 so bile prosto dostopne zbirke zaporedij redke, konstanta ponavljajoča se zaporedja so bila opažena le pri že zgoraj navedenih organizmih. Vendar pa so se zaradi izboljšanja tehnik sekvenciranja razmere močno spremenile. Leta 1995 je bil objavljen prvi celoten genom prostoživečega organizma, s čimer se je začela nova doba v biologiji. Pospešeno sekvenciranje je pripomoglo k nastanku dodatnih zbirk prokariontskih genomov, na podlagi česar je leta 1996 lahko nastalo prvo celovito poročilo o konstantno ponavljajočih se regijah v celotnem genomu. Do konca stoletja so podobna zaporedja odkrili še v 12 vrstah arhej in bakterij.

==F. Mojica et al. (2000)==

V nadaljnjih letih se je večalo število znanih genomov bakterij in arhej, kar je pospešilo raziskave o motivih zaporedij DNA. Tako je skupina znanstvenikov pod vodstvom Francisca Mojice potrdila prisotnost ponavljajočih zaporedij v prokariontih, ki so jo predstavili kot posebno družino prokariontskih zaporedij pod imenom SRSR (short regularly spaced repeats). Z analizami so ugotovili, da so SRSR prisotni znotraj genomov večine arhej ter različnih skupin bakterij in tako predstavljajo eno najbolj razširjenih družin v prokariontskih genomih. Ugotovili so, da so SRSR zaporedja znotraj enega genoma precej homogena, pojavljajo pa se tudi določene podobnosti med organizmi, ki izhajajo iz skupnega prednika ter podobnosti znotraj posameznih domen.
V tej raziskavi je bilo ključno odkritje pojav kratkih palindromskih zaporedij v dodatnih organizmih in s tem vpeljava nove družine nukleotidnih zaporedij, za katero je značilno da so ločena s stalno dolgimi prekinitvenimi zaporedji. Čeprav so odkrili podobna zaporedja znotraj genomov različnih prokariontov, niso vedeli, če ima ta družina zaporedij tudi skupno funkcijo v vseh prokariontih.

==Jansen et al. (2002)==

Na Nizozemskem je v naslednjih letih Ruud Jansen dodatno preučeval družino SRSR. Z računalniško analizo so želeli določiti lokacije SRSR v do tedaj znanih prokariontskih genomih. Izbirali so posamezna SRSR zaporedja bakterij in arhej, ter jih primerjali s celotnimi genomi prokariontov. Primerjali so tudi prekinitvena zaporedja, ki so med SRSR, ter prišli do spoznanja, da so tako SRSR kot prekinitvena zaporedja večinoma unikatna za genom posamezne vrste. V nadaljevanju so zato iskali nove lokacije SRSR na podlagi njihovega motiva ponavljanja, ki pa je bil zanje značilen v vseh do tedaj odkritih zaporedij – kratka palindromska zaporedja alternirajo s prekinitvenimi zaporedji stalnih dolžin. Z analizami so v več organizmih odkrili tudi prisotnost daljših zaporedij na enem koncu SRSR in predpostavili, da daljše zaporedje in SRSR skupaj predstavljata eno enoto. Ta zaporedja pred SRSR so poimenovali vodilna zaporedja, ki so si glede na zaporedje baz podobna le znotraj enega genoma, vendar pa imajo nekatere splošne skupne lastnosti. Nimajo odprtega bralnega okvirja, torej ne vsebujejo zaporedja, ki bi kodiralo za proteine, poleg tega pa pogosto vsebujejo sosledje enakih nukleotidov in na splošno velik delež adenina in timina.

Ta nova odkritja so spodbudila dodatne raziskave, vendar so znanstveniki ugotovili, da so bila v preteklosti v tisku uporabljena različna poimenovanja za novo odkrit motiv ponavljanja znotraj DNA. V namen poenotenja sta zato Jansen in Mojica leta 2002 vpeljala novo ime, ki je ostalo v uporabi do danes – CRISPR (clustered regularly spaced palindromic repeats). Ob vpeljavi novega imena je Jansen s kolegi odkril tudi novo lastnost CRISPR zaporedij. S primerjavo genov ob CRISPR zaporedjih so odkrili pogosto prisotnost štirih genov, ki jih niso našli v prokariontih brez CRISPR regij. Skupino novo odkritih genov so poimenovali cas (CRISPR associated genes), posamezne gene pa od Cas1 do Cas4. V tej raziskavi še niso identificirali točne funkcije vseh cas genov, so pa predpostavili vlogi genov Cas3 in Cas4. Analiza aminokislinskih ostankov teh dveh proteinov je pokazala homolognost med Cas3 in helikazo ter med Cas4 in RecB eksonukleazo.

==Znane lastnosti CRISPR zaporedij do leta 2002==

Do leta 2002 so CRISPR zaporedja odkrili v več kot 40 različnih prokariontih. Znano je, da gre za kratka zaporedja dolga od 21 do 37 baznih parov, ki so ločena s prekinitvenimi zaporedji stalnih dolžin. Pred kratkim zaporedjem se nahajajo daljše zaporedje dolgo nekaj sto baznih parov, ki so ga poimenovali vodilno zaporedje in skupina genov, ki so jih poimenovali cas. V letu 2002 so torej že poznali splošno strukturo regije CRISPR, še vedno pa niso poznali izvora zaporedij ter njihove vloge v organizmu.

==Viri in literatura==

*Mojica, F. J., Rodriguez-Valera, F., The discovery of CRISPR in archaea and bacteria, The FEBS Journal, 2016, 283(17), 3162-9

*Mojica, F. J., Ferrer, C., Juez, G., Rodriguez-Valera, F., Long stretches of short tandem repeats are present in the largest replicons of the Archaea Haloferax mediterranei and Haloferax volcanii and could be involved in replicon partitioning, Molecular Biology (1995), 17(1), 85-93

*Ishino Y, Shinagawa H, Makino K, Amemura M, Nakata A. 1987. Nucleotide sequence of the iap gene, responsible for alkaline phosphatase
isozyme conversion in Escherichia coli, and identification of the gene
product. J Bacteriol 169:5429 –5433

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

BIO2 Povzetki seminarjev 2018

2018-10-16T12:28:15Z

Eva Gartner: /* Eva Gartner: Wnt signalizacija in njena vloga pri srčni fibrozi */

===Karmen Mlinar: Signalizacija in odzivi na abiotski stres pri rastlinah===
Rastline živijo v stalno spreminjajočem se okolju, ki je pogosto neugodno in stresno za njihovo rast in razvoj. Primer abiotskega stresa so suša, ekstremne temperature, slanost tal, pomanjkanje hranil v prsti ipd. Rastline lahko stres preživijo tako, da se mu prilagodijo ali pa izognejo. V nasprotnem primeru so obsojene na smrt. Identificiranih je le malo senzorjev, ki zaznavajo stres. Pri signalizaciji odzivov na stresna okolja pogosto sodeluje družina kinaz SnRK, ki zaznajo spremembe v energijskem statusu rastline, ki jih povzroči stres. Znane so tri poddružine SnRKs: SnRK1s, ki sodelujejo pri uravnavanju metabolizma, SnRK2s, ki sodelujejo pri osmotskem stresu in ABA signalizaciji, in SnRK3s, ki so ključni regulatorji ionske homeostaze pri spopadanju s solnim stresom. Pri ionskem stresu pogosto problem predstavlja Na+. Pri njegovi signalizaciji je ključna SOS signalna pot. Signalizacija temperaturnega stresa se začne s spremembami v fluidnosti membrane, kar zaznajo integralni membranski proteini. Pri signalizaciji pogosto sodelujejo tudi MAPKs, CPKs in stresni hormon ABA, pomembno vlogo pa nosijo sekundarni sporočevalci kot sta kalcij in ROS. Vse to stremi k vzpostavitvi ionske in vodne homeostaze ter celične stabilnosti v stresnem okolju. Z razumevanjem signalizacije stresa in odzivov, ki sledijo, bomo lahko izboljšali odpornost pridelkov na stres in s tem zagotovili kmetijsko stabilnost in preskrbo s hrano za rastoče svetovno prebivalstvo.

===Aljaž Bratina: Pomen različnih signalnih poti pri staranju===
Staranje je postopna izguba fiziološke integritete in vodi v prizadeto funkcionalnost ter povečano možnost za smrt. Hitremu staranju nasprotna je dolgoživost, to je stanje, v katerem organizem ne izgublja funkcionalnosti ali jo izgublja počasneje. Staranje lahko opredelimo z devetimi splošnimi lastnostmi, ki jih opazimo v večini organizmov. Pri preučevanju staranja opazujemo organizem C. elegans, ki lahko med razvojem v primeru neugodnih razmer razvije stanje dauer, v katerem je razvoj ustavljen in je tako organizem sposoben preživeti dalj časa. Pri regulaciji staranja in dolgoživosti so pomembne mnoge celične signalne poti, kot del njih pa predvsem jedrni receptorji, ki uravnavajo prepisovanje genov, ki imajo vpliv na hitrost staranja oz. vzdrževanje dolgoživosti. V seminarski nalogi so opisane štiri pomembne signalne poti in njihov vpliv na staranje. Pri prvi je pomemben jedrni receptor DAF-12, ki za svoje delovanje potrebuje steroid DA. Neugodne razmere ga deaktivirajo, kar vodi v razvoj stanja dauer. Na dolgoživost pozitivno vpliva tudi aktiviran kompleks NSBP-1 in jedrnega receptorja DAF-16, ki sta del signalne poti IIS. To pot regulira tudi količina holesterola v celici. Dolgoživost povzročajo tudi prekinitveni post, pri katerem se aktivira jedrni receptor AP-1, pa tudi odstranitev zarodnih celic, ki poleg prej omenjene DAF-12 in DAF-16 aktivira tudi nekatere druge receptorje, npr. NHR-80 in NH3-49.

===Eva Gartner: Wnt signalizacija in njena vloga pri srčni fibrozi===
Wnt signalizacija zajema skupino signalnih poti, ki jih regulirajo wnt proteini. Ti se vežejo na posebne receptorje v membrani celice, preko katerih se signal prenese v notranjost. Wnt signalizacijo sestavljajo tri glavne signalizacijske poti: kanonična wnt pot, ki vključuje protein β-katenin, nekanonična (PCP) pot in nekanonična pot, ki sodeluje pri regulaciji kalcija. Vse poti se začnejo z vezavo wnt-liganda na transmembranske Fz receptorje in prenosom signala do znotrajceličnega proteina Dsh. Od tu naprej se poti razcepijo vsaka v svojo smer. Wnt signalizacija sodeluje v mnogih procesih, potrebnih za normalen razvoj organizma, kot so npr. razmnoževanje, specializacija in migracije celic. Prisotnost regulacije z wnt signalizacijo so odkrili tudi pri srčni fibrozi in z njo povezanih boleznih in poškodbah srca. V zdravih celicah wnt signalizacija navadno ni prisotna. Izraz fibroza se nanaša na povečanje količine zunajceličnega matriksa, zaradi česar postane srčna mišica otrdela in krčenje manj intenzivno. Pride do prekomerne namnožitve fibroblastov in diferenciacije v miofibroblaste, ki so fenotipsko med fibroblasti in mišičnimi celicami. Kljub številnim raziskavam, ki dokazujejo vpletenost wnt signalizacije v razvoju fibroze, natančni mehanizmi vseh signalnih poti še vedno niso znani. Potrebne so še nadaljnje raziskave za razumevanje zapletene celične komunikacije in odkritje novih terapevtskih možnosti.

BIO2 Povzetki seminarjev 2018

2018-10-16T12:15:50Z

Eva Gartner: /* Eva Gartner: Wnt signalizacija in njena vloga pri srčni fibrozi */

===Karmen Mlinar: Signalizacija in odzivi na abiotski stres pri rastlinah===
Rastline živijo v stalno spreminjajočem se okolju, ki je pogosto neugodno in stresno za njihovo rast in razvoj. Primer abiotskega stresa so suša, ekstremne temperature, slanost tal, pomanjkanje hranil v prsti ipd. Rastline lahko stres preživijo tako, da se mu prilagodijo ali pa izognejo. V nasprotnem primeru so obsojene na smrt. Identificiranih je le malo senzorjev, ki zaznavajo stres. Pri signalizaciji odzivov na stresna okolja pogosto sodeluje družina kinaz SnRK, ki zaznajo spremembe v energijskem statusu rastline, ki jih povzroči stres. Znane so tri poddružine SnRKs: SnRK1s, ki sodelujejo pri uravnavanju metabolizma, SnRK2s, ki sodelujejo pri osmotskem stresu in ABA signalizaciji, in SnRK3s, ki so ključni regulatorji ionske homeostaze pri spopadanju s solnim stresom. Pri ionskem stresu pogosto problem predstavlja Na+. Pri njegovi signalizaciji je ključna SOS signalna pot. Signalizacija temperaturnega stresa se začne s spremembami v fluidnosti membrane, kar zaznajo integralni membranski proteini. Pri signalizaciji pogosto sodelujejo tudi MAPKs, CPKs in stresni hormon ABA, pomembno vlogo pa nosijo sekundarni sporočevalci kot sta kalcij in ROS. Vse to stremi k vzpostavitvi ionske in vodne homeostaze ter celične stabilnosti v stresnem okolju. Z razumevanjem signalizacije stresa in odzivov, ki sledijo, bomo lahko izboljšali odpornost pridelkov na stres in s tem zagotovili kmetijsko stabilnost in preskrbo s hrano za rastoče svetovno prebivalstvo.

===Aljaž Bratina: Pomen različnih signalnih poti pri staranju===
Staranje je postopna izguba fiziološke integritete in vodi v prizadeto funkcionalnost ter povečano možnost za smrt. Hitremu staranju nasprotna je dolgoživost, to je stanje, v katerem organizem ne izgublja funkcionalnosti ali jo izgublja počasneje. Staranje lahko opredelimo z devetimi splošnimi lastnostmi, ki jih opazimo v večini organizmov. Pri preučevanju staranja opazujemo organizem C. elegans, ki lahko med razvojem v primeru neugodnih razmer razvije stanje dauer, v katerem je razvoj ustavljen in je tako organizem sposoben preživeti dalj časa. Pri regulaciji staranja in dolgoživosti so pomembne mnoge celične signalne poti, kot del njih pa predvsem jedrni receptorji, ki uravnavajo prepisovanje genov, ki imajo vpliv na hitrost staranja oz. vzdrževanje dolgoživosti. V seminarski nalogi so opisane štiri pomembne signalne poti in njihov vpliv na staranje. Pri prvi je pomemben jedrni receptor DAF-12, ki za svoje delovanje potrebuje steroid DA. Neugodne razmere ga deaktivirajo, kar vodi v razvoj stanja dauer. Na dolgoživost pozitivno vpliva tudi aktiviran kompleks NSBP-1 in jedrnega receptorja DAF-16, ki sta del signalne poti IIS. To pot regulira tudi količina holesterola v celici. Dolgoživost povzročajo tudi prekinitveni post, pri katerem se aktivira jedrni receptor AP-1, pa tudi odstranitev zarodnih celic, ki poleg prej omenjene DAF-12 in DAF-16 aktivira tudi nekatere druge receptorje, npr. NHR-80 in NH3-49.

===Eva Gartner: Wnt signalizacija in njena vloga pri srčni fibrozi===
Wnt signalizacija zajema skupino signalnih poti, ki jih regulirajo wnt proteini. Ti se vežejo na posebne receptorje v membrani celice, preko katerih se signal prenese v notranjost. Wnt signalizacijo sestavljajo tri glavne signalizacijske poti: kanonična wnt pot, ki vključuje protein β-katenin, nekanonična (PCP) pot in nekanonična pot, ki sodeluje pri regulaciji kalcija. Vse poti se začnejo z vezavo wnt-liganda na transmembranske Fz receptorje in prenosom signala do znotrajceličnega proteina Dsh. Od tu naprej se poti razcepijo vsaka v svojo smer. Wnt signalizacija sodeluje v mnogih procesih, potrebnih za normalen razvoj organizma, kot so npr. razmnoževanje, specializacija in migracije celic. Prisotnost regulacije z wnt signalizacijo so odkrili tudi pri srčni fibrozi in z njo tesno povezanih boleznih in poškodbah srca. v zdravih celicah wnt signalizacija navadno ni prisotna. Izraz fibroza se nanaša na povečanje količine zunajceličnega matriksa, zaradi česar postane srčna mišica otrdela in krčenje manj intenzivno. Pride do prekomerne namnožitve fibroblastov in diferenciacije v miofibroblaste, ki so fenotipsko med fibroblasti in mišičnimi celicami. Kljub številnim raziskavam, ki dokazujejo vpletenost wnt signalizacije v razvoju fibroze, natančni mehanizmi vseh signalnih poti še vedno niso znani. Potrebne so še nadaljnje raziskave za razumevanje zapletene celične komunikacije in odkritje novih terapevtskih možnosti.

BIO2 Povzetki seminarjev 2018

2018-10-15T16:46:26Z

Eva Gartner:

===Karmen Mlinar: Signalizacija in odzivi na abiotski stres pri rastlinah===
Rastline živijo v stalno spreminjajočem se okolju, ki je pogosto neugodno in stresno za njihovo rast in razvoj. Primer abiotskega stresa so suša, ekstremne temperature, slanost tal, pomanjkanje hranil v prsti ipd. Rastline lahko stres preživijo tako, da se mu prilagodijo ali pa izognejo. V nasprotnem primeru so obsojene na smrt. Identificiranih je le malo senzorjev, ki zaznavajo stres. Pri signalizaciji odzivov na stresna okolja pogosto sodeluje družina kinaz SnRK, ki zaznajo spremembe v energijskem statusu rastline, ki jih povzroči stres. Znane so tri poddružine SnRKs: SnRK1s, ki sodelujejo pri uravnavanju metabolizma, SnRK2s, ki sodelujejo pri osmotskem stresu in ABA signalizaciji, in SnRK3s, ki so ključni regulatorji ionske homeostaze pri spopadanju s solnim stresom. Pri ionskem stresu pogosto problem predstavlja Na+. Pri njegovi signalizaciji je ključna SOS signalna pot. Signalizacija temperaturnega stresa se začne s spremembami v fluidnosti membrane, kar zaznajo integralni membranski proteini. Pri signalizaciji pogosto sodelujejo tudi MAPKs, CPKs in stresni hormon ABA, pomembno vlogo pa nosijo sekundarni sporočevalci kot sta kalcij in ROS. Vse to stremi k vzpostavitvi ionske in vodne homeostaze ter celične stabilnosti v stresnem okolju. Z razumevanjem signalizacije stresa in odzivov, ki sledijo, bomo lahko izboljšali odpornost pridelkov na stres in s tem zagotovili kmetijsko stabilnost in preskrbo s hrano za rastoče svetovno prebivalstvo.

===Aljaž Bratina: Pomen različnih signalnih poti pri staranju===
Staranje je postopna izguba fiziološke integritete in vodi v prizadeto funkcionalnost ter povečano možnost za smrt. Hitremu staranju nasprotna je dolgoživost, to je stanje, v katerem organizem ne izgublja funkcionalnosti ali jo izgublja počasneje. Staranje lahko opredelimo z devetimi splošnimi lastnostmi, ki jih opazimo v večini organizmov. Pri preučevanju staranja opazujemo organizem C. elegans, ki lahko med razvojem v primeru neugodnih razmer razvije stanje dauer, v katerem je razvoj ustavljen in je tako organizem sposoben preživeti dalj časa. Pri regulaciji staranja in dolgoživosti so pomembne mnoge celične signalne poti, kot del njih pa predvsem jedrni receptorji, ki uravnavajo prepisovanje genov, ki imajo vpliv na hitrost staranja oz. vzdrževanje dolgoživosti. V seminarski nalogi so opisane štiri pomembne signalne poti in njihov vpliv na staranje. Pri prvi je pomemben jedrni receptor DAF-12, ki za svoje delovanje potrebuje steroid DA. Neugodne razmere ga deaktivirajo, kar vodi v razvoj stanja dauer. Na dolgoživost pozitivno vpliva tudi aktiviran kompleks NSBP-1 in jedrnega receptorja DAF-16, ki sta del signalne poti IIS. To pot regulira tudi količina holesterola v celici. Dolgoživost povzročajo tudi prekinitveni post, pri katerem se aktivira jedrni receptor AP-1, pa tudi odstranitev zarodnih celic, ki poleg prej omenjene DAF-12 in DAF-16 aktivira tudi nekatere druge receptorje, npr. NHR-80 in NH3-49.

===Eva Gartner: Wnt signalizacija in njena vloga pri srčni fibrozi===
Wnt signalizacija zajema skupino signalnih poti, ki jih regulirajo wnt proteini. Ti se vežejo na posebne receptorje v membrani celice, s čimer se signal prenese v notranjost. Wn signalizacijo sestavljajo tri glavne signalizacijske poti: kanonična wnt pot, ki vključuje protein β-katenin, nekanonična (PCP) pot in nekanonična pot, ki sodeluje pri regulaciji kalcija. Vse poti se začnejo z vezavo wnt-liganda na transmembranske Fz receptorje in prenosom signala do znotrajceličnega proteina Dsh. Od tu naprej se poti razcepijo vsaka v svojo smer. Wnt signalizacija sodeluje v mnogih procesih, potrebnih za normalen razvoj organizma, kot so npr. razmnoževanje, specializacija in migracije celic. Prisotnost regulacije z wnt signalizacijo so odkrili tudi pri srčni fibrozi in z njo tesno povezanih boleznih in poškodbah srca. Izraz fibroza se nanaša na povečanje količine zunajceličnega matriksa, zaradi česar postane srčna mišica otrdela in krčenje manj intenzivno. Pride do prekomerne namnožitve fibroblastov in diferenciacije v miofibroblaste, ki so fenotipsko med fibroblasti in mišičnimi celicami. Kljub številnim raziskavam, ki dokazujejo vpletenost wnt signalizacije v razvoju fibroze, natančni mehanizmi vseh signalnih poti še vedno niso znani. Potrebne so še nadaljnje raziskave za razumevanje zapletene celične komunikacije in odkritje novih terapevtskih možnosti.

BIO2 Povzetki seminarjev 2018

2018-10-15T16:42:19Z

Eva Gartner:

===Karmen Mlinar: Signalizacija in odzivi na abiotski stres pri rastlinah===
Rastline živijo v stalno spreminjajočem se okolju, ki je pogosto neugodno in stresno za njihovo rast in razvoj. Primer abiotskega stresa so suša, ekstremne temperature, slanost tal, pomanjkanje hranil v prsti ipd. Rastline lahko stres preživijo tako, da se mu prilagodijo ali pa izognejo. V nasprotnem primeru so obsojene na smrt. Identificiranih je le malo senzorjev, ki zaznavajo stres. Pri signalizaciji odzivov na stresna okolja pogosto sodeluje družina kinaz SnRK, ki zaznajo spremembe v energijskem statusu rastline, ki jih povzroči stres. Znane so tri poddružine SnRKs: SnRK1s, ki sodelujejo pri uravnavanju metabolizma, SnRK2s, ki sodelujejo pri osmotskem stresu in ABA signalizaciji, in SnRK3s, ki so ključni regulatorji ionske homeostaze pri spopadanju s solnim stresom. Pri ionskem stresu pogosto problem predstavlja Na+. Pri njegovi signalizaciji je ključna SOS signalna pot. Signalizacija temperaturnega stresa se začne s spremembami v fluidnosti membrane, kar zaznajo integralni membranski proteini. Pri signalizaciji pogosto sodelujejo tudi MAPKs, CPKs in stresni hormon ABA, pomembno vlogo pa nosijo sekundarni sporočevalci kot sta kalcij in ROS. Vse to stremi k vzpostavitvi ionske in vodne homeostaze ter celične stabilnosti v stresnem okolju. Z razumevanjem signalizacije stresa in odzivov, ki sledijo, bomo lahko izboljšali odpornost pridelkov na stres in s tem zagotovili kmetijsko stabilnost in preskrbo s hrano za rastoče svetovno prebivalstvo.

===Aljaž Bratina: Pomen različnih signalnih poti pri staranju===
Staranje je postopna izguba fiziološke integritete in vodi v prizadeto funkcionalnost ter povečano možnost za smrt. Hitremu staranju nasprotna je dolgoživost, to je stanje, v katerem organizem ne izgublja funkcionalnosti ali jo izgublja počasneje. Staranje lahko opredelimo z devetimi splošnimi lastnostmi, ki jih opazimo v večini organizmov. Pri preučevanju staranja opazujemo organizem C. elegans, ki lahko med razvojem v primeru neugodnih razmer razvije stanje dauer, v katerem je razvoj ustavljen in je tako organizem sposoben preživeti dalj časa. Pri regulaciji staranja in dolgoživosti so pomembne mnoge celične signalne poti, kot del njih pa predvsem jedrni receptorji, ki uravnavajo prepisovanje genov, ki imajo vpliv na hitrost staranja oz. vzdrževanje dolgoživosti. V seminarski nalogi so opisane štiri pomembne signalne poti in njihov vpliv na staranje. Pri prvi je pomemben jedrni receptor DAF-12, ki za svoje delovanje potrebuje steroid DA. Neugodne razmere ga deaktivirajo, kar vodi v razvoj stanja dauer. Na dolgoživost pozitivno vpliva tudi aktiviran kompleks NSBP-1 in jedrnega receptorja DAF-16, ki sta del signalne poti IIS. To pot regulira tudi količina holesterola v celici. Dolgoživost povzročajo tudi prekinitveni post, pri katerem se aktivira jedrni receptor AP-1, pa tudi odstranitev zarodnih celic, ki poleg prej omenjene DAF-12 in DAF-16 aktivira tudi nekatere druge receptorje, npr. NHR-80 in NH3-49.

===Eva Gartner: Wnt signalizacija in njena vloga pri srčni fibrozi
Wnt signalizacija zajema skupino signalnih poti, ki jih regulirajo wnt proteini. Ti se vežejo na posebne receptorje v membrani celice, s čimer se signal prenese v notranjost. Wn signalizacijo sestavljajo tri glavne signalizacijske poti: kanonična wnt pot, ki vključuje protein β-katenin, nekanonična (PCP) pot in nekanonična pot, ki sodeluje pri regulaciji kalcija. Vse poti se začnejo z vezavo wnt-liganda na transmembranske Fz receptorje in prenosom signala do znotrajceličnega proteina Dsh. Od tu naprej se poti razcepijo vsaka v svojo smer. Wnt signalizacija sodeluje v mnogih procesih, potrebnih za normalen razvoj organizma, kot so npr. razmnoževanje, specializacija in migracije celic. Prisotnost regulacije z wnt signalizacijo so odkrili tudi pri srčni fibrozi in z njo tesno povezanih boleznih in poškodbah srca. Izraz fibroza se nanaša na povečanje količine zunajceličnega matriksa, zaradi česar postane srčna mišica otrdela in krčenje manj intenzivno. Pride do prekomerne namnožitve fibroblastov in diferenciacije v miofibroblaste, ki so fenotipsko med fibroblasti in mišičnimi celicami. Kljub številnim raziskavam, ki dokazujejo vpletenost wnt signalizacije v razvoju fibroze, natančni mehanizmi vseh signalnih poti še vedno niso znani. Potrebne so še nadaljnje raziskave za razumevanje zapletene celične komunikacije in odkritje novih terapevtskih možnosti.

BIO2 Seminar 2018

2018-10-11T20:13:31Z

Eva Gartner: /* Seznam seminarjev */

= Biokemijski seminar =
doc. dr. Gregor Gunčar, K2.022

== Seznam seminarjev ==
{| {{table}}
| align="left" style="background:#f0f0f0;"|'''ime in priimek'''
| align="left" style="background:#f0f0f0;"|'''poglavje'''
| align="left" style="background:#f0f0f0;"|'''naslov seminarja'''
| align="left" style="background:#f0f0f0;"|'''recenzent 1'''
| align="left" style="background:#f0f0f0;"|'''recenzent 2'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''datum oddaje'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''datum recenzije'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''datum predstavitve'''
|-
| Eva Gartner || 12 || Wnt signalizacija in njena vloga pri srčni fibrozi || Anamarija Agnič || Anastasija Nechevska || 15/10/2018 || 16/10/2018 || 17/10/2018
|-
| Aljaž Bratina || 12 || Staranje in lipidne signalne molekule || Lara Drinovec || Liza Ulčakar || 15/10/2018 || 16/10/2018 || 17/10/2018
|-
| Karmen Mlinar || 12 || Signalizacija in odzivi na abiotski stres v rastlinah || Luka Gnidovec || Maja Škof || 15/10/2018 || 16/10/2018 || 17/10/2018
|-
| Tina Zavodnik || 12 || moj naslov || Jernej Imperl || Ajda Godec || 19/10/2018 || 22/10/2018 || 24/10/2018
|-
| Meta Kodrič || 12 || moj naslov || Laura Gašperšič || Neža Blaznik || 19/10/2018 || 22/10/2018 || 24/10/2018
|-
| Neža Žerjav || 12 || Vloga kaspaz pri nekrozi || Nika Boštic || Urša Štrancar || 19/10/2018 || 22/10/2018 || 24/10/2018
|-
| Doroteja Armič || 14-15 || Regulacija količine fruktoza-2,6-bisfosfata v celici || Eva Gartner || Anamarija Agnič || 02/11/2018 || 05/11/2018 || 07/11/2018
|-
| Sanja Stanković || 14-15 || moj naslov || Aljaž Bratina || Lara Drinovec || 02/11/2018 || 05/11/2018 || 07/11/2018
|-
| Martina Lokar || 14-15 || Mehanizmi biotinilacije proteinov || Karmen Mlinar || Luka Gnidovec || 02/11/2018 || 05/11/2018 || 07/11/2018
|-
| Marko Pavleković || 16 || moj naslov || Tina Zavodnik || Jernej Imperl || 09/11/2018 || 12/11/2018 || 14/11/2018
|-
| Valeriya Musina || 16 || moj naslov || Meta Kodrič || Laura Gašperšič || 09/11/2018 || 12/11/2018 || 14/11/2018
|-
| Tina Kolenc Milavec || 16 || moj naslov || Neža Žerjav || Nika Boštic || 09/11/2018 || 12/11/2018 || 14/11/2018
|-
| Andrej Špenko || 17 || moj naslov || Doroteja Armič || Eva Gartner || 16/11/2018 || 19/11/2018 || 21/11/2018
|-
| Tadej Medved || 17 || moj naslov || Sanja Stanković || Aljaž Bratina || 16/11/2018 || 19/11/2018 || 21/11/2018
|-
| Klementina Polanec || 17 || moj naslov || Martina Lokar || Karmen Mlinar || 16/11/2018 || 19/11/2018 || 21/11/2018
|-
| Rebeka Dajčman || 17 || moj naslov || Marko Pavleković || Tina Zavodnik || 16/11/2018 || 19/11/2018 || 21/11/2018
|-
| Sumeja Kudelić || 18 || moj naslov || Valeriya Musina || Meta Kodrič || 23/11/2018 || 26/11/2018 || 28/11/2018
|-
| Matija Ruparčič || 18 || moj naslov || Tina Kolenc Milavec || Neža Žerjav || 23/11/2018 || 26/11/2018 || 28/11/2018
|-
| Maks Kumek || 18 || moj naslov || Andrej Špenko || Doroteja Armič || 23/11/2018 || 26/11/2018 || 28/11/2018
|-
| Anže Šumah || 19 || moj naslov || Tadej Medved || Sanja Stanković || 30/11/2018 || 03/12/2018 || 05/12/2018
|-
| Barbara Jaklič || 19 || moj naslov || Klementina Polanec || Martina Lokar || 30/11/2018 || 03/12/2018 || 05/12/2018
|-
| Gašper Anton Komatar || 19 || moj naslov || Rebeka Dajčman || Marko Pavleković || 30/11/2018 || 03/12/2018 || 05/12/2018
|-
| Praznik Liza || 19 || moj naslov || Sumeja Kudelić || Valeriya Musina || 30/11/2018 || 03/12/2018 || 05/12/2018
|-
| Lara Hrvatin || 20 || moj naslov || Matija Ruparčič || Tina Kolenc Milavec || 07/12/2018 || 10/12/2018 || 12/12/2018
|-
| Sonja Gabrijelčič || 20 || moj naslov || Maks Kumek || Andrej Špenko || 07/12/2018 || 10/12/2018 || 12/12/2018
|-
| Anastasija Nechevska || 20 || moj naslov || Anže Šumah || Tadej Medved || 07/12/2018 || 10/12/2018 || 12/12/2018
|-
| Liza Ulčakar || 21 || moj naslov || Barbara Jaklič || Klementina Polanec || 14/12/2018 || 17/12/2018 || 19/12/2018
|-
| Maja Škof || 21 || moj naslov || Gašper Anton Komatar || Rebeka Dajčman || 14/12/2018 || 17/12/2018 || 19/12/2018
|-
| Ajda Godec || 21 || moj naslov || Praznik Liza || Sumeja Kudelić || 14/12/2018 || 17/12/2018 || 19/12/2018
|-
| Neža Blaznik || 22 || moj naslov || Lara Hrvatin || Matija Ruparčič || 04/01/2019 || 07/01/2019 || 09/01/2019
|-
| Urša Štrancar || 22 || moj naslov || Sonja Gabrijelčič || Maks Kumek || 04/01/2019 || 07/01/2019 || 09/01/2019
|-
| Anamarija Agnič || 22 || moj naslov || Anastasija Nechevska || Anže Šumah || 04/01/2019 || 07/01/2019 || 09/01/2019
|-
| Lara Drinovec || 23 || moj naslov || Liza Ulčakar || Barbara Jaklič || 04/01/2019 || 07/01/2019 || 09/01/2019
|-
| Luka Gnidovec || 23 || moj naslov || Maja Škof || Gašper Anton Komatar || 11/01/2019 || 14/01/2019 || 16/01/2019
|-
| Jernej Imperl || 23 || moj naslov || Ajda Godec || Praznik Liza || 11/01/2019 || 14/01/2019 || 16/01/2019
|-
| Laura Gašperšič || 23 || moj naslov || Neža Blaznik || Lara Hrvatin || 11/01/2019 || 14/01/2019 || 16/01/2019
|-
| Nika Boštic || 23 || moj naslov || Urša Štrancar || Sonja Gabrijelčič || 11/01/2019 || 14/01/2019 || 16/01/2019
|}

*številka v okencu za temo pomeni poglavje v Lehningerju, v katerega naj izbrana tema spada
Sporočite mi morebitne napake ali če vas nisem razporedil.

== Gradivo za predavanja ==
Gradivo za predavanja in seminarje najdete na http://bio.ijs.si/~zajec/bio2/
username: bio2
password: samozame

==Naloga==
'''Vaša naloga za seminar je: '''
Samostojno pripraviti seminar o seminarski temi, ki vam je bila dodeljena. Za osnovo morate vzeti pregledni članek iz revije, ki ima faktor vpliva nad 5 (npr. [http://www.sciencedirect.com/science/journal/09680004/ TIBS]. Poiskati morate še vsaj tri znanstvene članke, ki se nanašajo na opisano temo in jih uporabiti kot podlago za seminarsko nalogo! Članki so dostopni [http://93.174.95.27/scimag/ tukaj].

Za pripravo seminarja velja naslednje: 
* [[BIO2 Povzetki seminarjev 2017|Povzetek seminarja]] opišete na wikiju '''v 200 besedah''' (+- dvajset besed) - najkasneje do dne ko morate oddati seminar recenzentom.
* Povezavo do povzetka vnesete v tabelo seminarjev tekočega letnika.
* Seminar pripravite v obliki seminarske naloge na ~5-12 straneh A4 (pisava 12, enojni razmak, 2,5 cm robovi). Zelo pomembno je, da je obseg od 2700 do 3000 besed , a ne več kot 3500 besed. Seminarska naloga mora vsebovati najmanj tri slike. Eno sliko morate narisati sami in to pod sliko posebej označiti. Slika mora imeti legendo in v besedilu mora biti na ustreznem mestu sklic na sliko. 
* Seminar oddajte do datuma oddaje, ki je naveden v tabeli v elektronski obliki z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/ tega obrazca].
* Vsi seminarji so v elektronski obliki dostopni [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/bioseminar/ tukaj].
* Recenzenti do dneva določenega v tabeli določijo popravke (v elektronski obliki) in podajo oceno pisnega dela. Popravljen seminar oddajte z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/ tega obrazca].
* Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Za predstavitev je na voljo 20 minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni.
* Predstavitvi sledi razprava. Recenzenti podajo oceno predstavitve in postavijo najmanj dve vprašanji.Vsi ostali morajo postaviti še dve dodatni vprašanji v toku celega seminarskega obdobja. Vprašanja, ki ste jih postavili vpišite na [https://docs.google.com/forms/d/e/1FAIpQLSdV9OFlNzI3XyS8FRGnuIbG89gwH_36uwz29ocigV--2CXSbQ/viewform tukaj].
* Na dan predstavitve morate docentu še pred predstavitvijo oddati končno (popravljeno) in natisnjeno verzijo seminarja v enem izvodu, elektronsko verzijo seminarja in predstavitev pa oddati na strežnik na dan predstavitve do polnoči.
* Seminarska naloga in povzetek morajo biti v slovenskem jeziku, razen za študente, katerih materni jezik ni slovenščina. Ti lahko oddajo seminar v angleškem jeziku.

==Imena datotek==
Prosim vas, da vse datoteke, ki mi jih pošiljate poimenujete po naslednjem receptu:
* 312_BIO_Priimek_Ime.doc(x) za seminar, npr. 312_BIO_Guncar_Gregor.docx
* 312_BIO_Priimek_ime_final.doc(x) za končno verzijo seminarja
* 312_BIO_Priimek_Ime_rec_Priimek2.doc(x) za recenzijo, kjer je Priimek2 priimek recenzenta, npr. 312_BIO_Guncar_Gregor_rec_Scott.docx (če se pišete Scott in odajate recenzijo za seminar, ki ga je napisal Gunčar)
* 312_BIO_Priimek_Ime.ppt(x) za prezentacijo, npr 312_BIO_Guncar_Gregor.pptx
* 312_BIO_Priimek_ime_poprava.doc(x) za popravljeno končno verzijo seminarja, če so popravki manjši

==Ocenjevanje seminarjev==
Recenzenti ocenijo seminar tako, da izpolnijo [https://docs.google.com/forms/d/1EQDYwFO-DEzZ2R7jf8DhLqIeV4FFxRd3-ScceEASpt4/viewform recenzentsko poročilo] na spletu. Recenzentsko poročilo morate oddati najkasneje do 21:00, en dan pred predstavitvijo seminarja.

== Mnenje o predstavitvi ==
Vsak posameznik odda svoje mnenje o predstavitvi takoj po predstavitvi z online glasovanjem.

==Urejanje spletnih strani na wikiju==
Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''

==Citiranje virov==
Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se držite ene same. V seminarskih nalogah in diplomskih nalogah FKKT uprabljajte shemo citiranja, ki je pobarvana zeleno.
Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati.
Za citate v naravoslovju je najpogostejše citiranje po pravilniku ISO 690. [http://www.zveza-zotks.si/gzm/dokumenti/literatura.html Pravila], ki upoštevajo omenjeni standard, so pripravili pri ZTKS. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati. 
'''Citiranje knjig:''' 
Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica. 
Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN. 

Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005. 
Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4. 
Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.).

'''Citiranje člankov:''' 
Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani. 
Lartigue, C., Glass, J. I., Alperovich, N., Pieper, R., Parmar, P. P., Hutchison III, C. A., Smith, H. O. in Venter, J. C.
Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, 317, str. 632-638.

Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole: 
Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani. 
Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.

Revija Science uporablja skrajšani zapis: 
C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007) 

V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne). Navesti morate tudi vse avtorje dela, razen v primeru, ko jih je 10 ali več. Takrat navedite le prvih devet, za ostale pa uporabite okrajšavo in sod. (in sodelavci). Pred zadnjim avtorjem naj bo vedno besedica "in".

'''Citiranje spletnih virov:''' 
Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov 
strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life 
Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.

TBK2017 Povzetki seminarjev

2018-05-13T17:25:47Z

Eva Gartner: /* Ana Scott: Naslov seminarja */

[[TBK2017-seminar|Nazaj na osnovno stran]]
===Ana Scott: Naslov seminarja===
Tekst ....

'''Uroš Prešern: Nukleaza, ki povzroči partanatos oziroma od PARP-1 odvisno celično smrt'''

Partanatos je ena izmed vrst celične smrti, ki nastopi zaradi prevelike aktivnosti poli(ADP-riboza) polimeraze 1 (PARP-1) v jedru. Pogost je v primeru možganske kapi, infarkta in nevrodegenerativnih boleznih, zaradi česar bi boljše poznavanje samega procesa omogočilo razvoj novih načinov zdravljenja teh obolenj. V predhodnih raziskavah so ugotovili, da partanatos nastopi, ko molekule poli-ADP-riboze, ki jih PARP-1 sintetizira, preidejo iz jedra v citosol, kjer aktivirajo premestitev indukcijskega faktorja apoptoze (AIF) iz mitohondrijev v jedro. Temu sledi razrez DNA. Nukleaza, ki povzroči razrez DNA, je bila do nedavnega manjkajoči člen v partanatosu. Skupini raziskovalcev je uspelo odkriti, da je iskana nukleaza inhibitorni dejavnik migracije makrofagov (MIF). Pokazali so, da se med partanatosom MIF veže na AIF in se skupaj z njim premesti v jedro, kjer povzroči fragmentacijo DNA. Inhibicija nukleazne aktivnosti MIF se je v modelu možganske kapi pri miših odrazila v 75-odstotnem zmanjšanju volumna prizadetega tkiva, pospešeno pa je bilo tudi okrevanje. Rezultati raziskave odpirajo potencialne možnosti za zdravljenje akutnih in kroničnih nevroloških bolezni, v katerih nastopi partanatos.

'''Doroteja Armič: Pretvorba mišjih fibroblastov v pluripotentne matične celice s pomočjo tehnologije CRISPR'''

Pluripotentne matične celice so še nediferencirane celice, ki imajo sposobnost, da se diferencirajo v skoraj vse tipe celic. Poznamo več vrst pluripotentnih matičnih celic. Ene izmed njih so inducirane pluripotentne matične celice (celice iPS). To so pluripotentne celice, ki jih umetno dediferencirajo iz odraslih somatskih celic. Leta 2006 so odkrili postopek pridobivanja celic iPS iz mišjih fibroblastov. Ugotovili so, da so za reprogramiranje somatskih celic najpomembnejši štirje transkripcijski dejavniki, in sicer Oct4, Sox2, Klf4 in c-Myc. Letos pa je skupini znanstvenikov uspelo odkriti nov, bolj enostaven postopek pridobivanja celic iPS. Ugotovili so namreč, da lahko sprožijo njihov nastanek že z aktivacijo enega samega gena – Oct4 ali Sox2. Aktivacija Sox2-promotorja oziroma Oct4-promotorja in Oct4-ojačevalca hkrati pa nato povzroči aktivacijo ostalih genov, ki sodelujejo pri vzpostavitvi pluripotentnosti v celicah. Za aktivacijo genov so uporabili tehnologijo CRISPR. Primerjali so uporabo dveh sistemov – dCas9-SunTag-VP64 in dCas9-SunTag-p300core. V obeh primerih so dobili primerljive rezultate. Uporaba celic iPS je pomembna v regenerativni medicini, saj lahko zamenja uporabo človeških embrionalnih matičnih celic. Z uporabo celic iPS, generiranih iz pacientovih lastnih celic, ne bi prišlo do zavrnitvenih reakcij, prav tako pa bi se izognili etičnih pomislekov. Znanstveniki predvidevajo, da lahko tehnologija reprogramiranja celic, ki so jo uporabili na mišjih celicah, z manjšimi spremembami deluje tudi na človeških celicah.

'''Dea Simonič: Sprožilci avtoimunskih bolezni in vzroki za nekontrolirano širjenje le-teh po telesu'''

Avtoimunska bolezen je bolezen, ki nastane zaradi pretiranega odziva imunskega sistema na celice, ki so last organizma. Veliko vlogo pri nastanku avtoimunske bolezni imajo limfociti B, ki omogočajo humoralni imunski odziv. Transkripcijski faktor T-bet v limfocitih B povzroči razvoj ABC, te celice so pa »pogon« avtoimunske bolezni. Avtoimunska bolezen se v veliki večini primerov razširi po telesu . Vzrok tega so ravno limfociti B, ki razširijo svoj napad po telesu in pride do širjenja epitopa. Ta proces se začne, ko imunski sistem napade antigene na drugih delih telesa, ki jih na začetku ni hotel uničiti. Telo začne pospeševano uničevati lastna tkiva. Da bi razumeli, zakaj pride do tega mehanizma so raziskovalci uporabili fluorescenčne markerje beljakovin, ki razlikujejo različne celične skupke limfocitov B (oziroma germinalne centre), na miših obolelih z lupusom. V germinalnih centrih limfociti B »tekmujejo« med sabo, kateri bo naredil najboljše protitelo, ki bo nevtraliziralo zaznano grožnjo. Te germinalne skupke so s pomočjo markerjev zaznali kot 10 različnih barv. Po tednu ali dveh začne prevladovati ena sama barva. Ta germinalni skupek je ustvaril najboljše protitelo in skupaj z ostalimi limfociti aktiviral avtoimunski protinapad. S to študijo so raziskovalci naredili velik korak v smer zaustavitve oziroma zdravljenja avtoimunske bolezni.

'''Valeriya Musina: Metalopeptid bakrov(II) fenantrolin tarčno onemogoči delovanje mitohondrijev v matičnih celicah raka dojke'''

Uničenje mitohondrijev je eden najbolj obetavnih pristopov pri razvoju novih zdravil proti raku. Znanstveniki so sintetizirali peptid, ki vsebuje baker, ki ga zlahka sprejmejo mitohondriji v matičnih celicah raka dojk, kjer le ta učinkovito povzroča apoptozo. Rakaste celice, ki imajo povečani metabolizem, ne samo, da vsebujejo več mitohondrijev kot zdrave celice, temveč so te tudi drugačni, strukturno in funkcionalno. Zaradi posebnih značilnosti in njihove odločilne vloge v presnovi celic so maligne mitohondrije pomembne tarčej za nove terapevtske spojine. Mitohondrije je možno uničiti z uvajanjem sredstev za proizvajanje reaktivnih vrst kisika (ROS). Te reaktivne spojine ovirajo metabolizem mitohondrijev. Kot močan ROS generator je bila predlagana organokovinska spojina bakrov(II) fenantrolin. Za dostavo in prenos skozi zunanjo membrano mitohondrija pa so bakrov(II) fenantrolin vezali na specifičen peptid, ki prodira v mitohondrije. Preizkusi so bili izvedeni z dvema celicnima linijama raka dojke, ena celična linija je vsebovala matične celice raka dojk. Rezultati so bili : odvisna od količine odmerka izguba sposobnosti za preživetje, razpad membran mitohondrijev, nastanek ROS in slabši metabolizma mitohondrijev. Zdravilo je bolj vplivalo na matične celice raka, kar je bilo razloženo z večjo vsebnostjo mitohondrijev. Ta študija izpostavlja potencial metalopeptida tako za dostavo kot tudi za uničenje mitohondrijev, zlasti v matičnih celicah raka.

'''Neža Štremfelj: Delovanje inzulinskih receptorjev'''

Človeški inzulinski receptorji igrajo pomembno vlogo v človeškem telesu. Signalizacija z inzulinskimi receptorji igra ključno vlogo pri regulaciji metabolizma in pri rasti v večceličnih organizmih. Nepravilno delovanje inzulinskih receptorjev je povezano z mnogimi hujšimi obolenji, na primer z rakavim obolenjem, diabetesom in Alzheimerjevo boleznijo.
Glavna ideja raziskave, ki jo opisuje članek, ki sem si ga izbrala za osnovo moje seminarske naloge je, da vezava inzulina na inzulinski receptor preoblikuje zunajcelični del transmembranskih proteinov (ektodomeno) receptorja iz U-konformacije v T-konformacijo. Prerazporeditev v ektodomeni se razširi tudi na transmembranske domene, ki so, ko je receptor neaktiviran pomaknjene narazen, ob vezavi inzulina pa se pomaknejo skupaj, kar omogoči fosforilizacijo tirozin kinaze v citoplazmi. Pri transmembranski signalizaciji z inzulinskim receptorjem poleg dimerizacije z vezavo liganda pride tudi do strukturnih sprememb znotraj receptorskega dimera.

'''Marko Pavleković: Prehajanje imunskih celic, povzročiteljic multiple skleroze, skozi krvno-možgansko pregrado'''

Multipla skleroza je avtoimunska bolezen, pri kateri limfociti napadejo živčne celice in jih demielinizirajo ter tako škodujejo prenosu signalov med nevroni. Iz predhodnih raziskav so odkrili, da sta za multiplo sklerozo najbolj krivi celiti pomagalki T 1 in T 17. Da bi prišli do centralnega živčnega sistema morata celici najprej prečkati vaskularno pregrado. Kako to dosežeta so raziskovali znanstveniki z univerze v Kolumbiji in z univerze v Kaliforniji. Z dvo-fotonsko mikroskopijo so opazovali tesne stike pri miših obolelih za eksperimentalnim avtoimunskim encefalomielitisom, ki je živalski primer multiple skleroze. Ugotovili so, da krvno-možgansko pregrado preideta na dva različna načina: s transcitozo in skozi prekinjene tesne stike med endotelnimi celicami. S pomočjo miši, ki jim je primanjkovalo kaveol (kaveolina1) pa so dokazali, da za prehod do centralnega živčnega sistema celica T 1 izkorišča transcitozo, medtem ko celica T 17 prehaja skozi prekinjene tesne stike. Te ugotovitve bi lahko močno pomagale pri nadaljnjem zdravljenju bolezni, kjer bi se osredotočili na preprečevanje dostopa imunskih celic do centralnega živčnega sistema.

'''Rebeka Dajčman: več mehanizmov poganja dinamiko kalcijevega signala okoli lasersko povzročene rane epitelija'''

Kalcij igra ključno vlogo pri skoraj vseh procesih v celici. Razni signali, kot je na primer sinteza RNA in DNA ali pa migracija celic, je posledica spremembe intracelularne koncentracije kalcija. Spremembo koncentracije lahko zaznamo z merjenjem intenzivnosti fluorescentne svetlobe, ki jo oddajajo GCaMP proteini. Če celice poškodujemo z laserskim mehurčkom, ustvarimo rano, ki je podobna udarcu. Sledijo trije mehanizmi signaliziranja, ki so odvisni od velikosti rane. Takoj po poškodbi celične membrane uide kalcij iz ekstracelularne tekočine v citosol, kjer se koncentracija kalcija dvigne. Kalcij nato skupaj s signalnimi molekulami difundira v okoliške celice in temu pravimo prvi val oz. takojšnji odziv. Po 45 sekundah mu sledi drugi močnejši valj, ki pa se širi počasneje, ker skozi membrano prehajajo večji signalni proteini. Ti signali sprožijo sistemski odziv na poškodbo, ki poskrbi, da se celice v najkrajšem možnem času regenerirajo. Da pri regeneraciji povrhnjice kože ne nastanejo brazgotine poskušamo v tkivo, ki je bilo poškodovano, vstaviti lasne mešičke. Ti pripomorejo k nastajanju maščobe in tako preprečijo brazgotinjenje. Če se poškoduje žilna stena pa sistem poskrbi za nastanek strdkov, ki so sestavljeni iz krvnih celic in fibrina. Trombociti navijejo fibrin v toge zvitke in ti se s pomočjo posebnih encimov raztopijo v krvi. Nova odkritja o celičnemu celjenju pripomorejo k hitrejšemu in učinkovitejšemu celjenju ran.

'''Gašper Anton Komatar: Tvorba kompleksa receptorjev ApoER2, ephirinB2 in AMPAR, ki jih povezuje GRIP1, sodeluje pri vorbi spomina'''

LTP ali dolgoročna potenciacija pomeni povečanje sinaptične moči za dolgo časa in ker gre pri tvorbi spominov prav za povečanje sinaptične aktivnosti, je med znanstveniki priznan kot najverjetnejši model učenja in tvorbe spomina na celični ravni. Med LTP se poveča število receptorjev AMPA v postsinaptični membrani, kar še dodatno poveča sinaptično moč.
Kakšen je mehanizem in katere molekule sodelujejo pri prenosu in vgradnji AMPAR v postsinaptično membrano, to je bilo glavno vprašanje raziskovalcev v članku, ki sem si ga izbral za seminarsko nalogo. Že dlje časa je bilo znano, da ephirinB2, ApoER2 in Reelin sodelujejo pri razvoju možganov kot regulatorji migracije nevronov. Znanstveniki so preverili, če sodelujejo tudi pri procesih prenosa in vgradnje AMPAR v membrano. S tehniko knockout (inaktivacija določenih genov) ter z imunoprecepcijo, so selektivno inhibirali interakcije med proteini, rezultate pa so beležili s fluorescentnimi analizami in prenosom western. Ugotovili so, da tvorba kompleksa multiplih receptorjev ApoER2/ephirinB2/AMPAR in GRIP1 povzroči vgradnjo tega AMPAR na membrano dendrita in sproži signalne kaskade, ki regulirajo vgradnjo novih AMPAR. Ko je bila interakcija med temi proteini inhibirana, so bili nevroni nezmožni reagirati na spremembe v njihovem omrežju, kar je zmanjšano sinaptično aktivnost. To pomeni, da skupki teh proteinov vzdržujejo oz. ojačajo sinaptično aktivnost. S tem so znanstveniki dokazali, da zgoraj omenjen kompleks receptorjev zares sodeluje pri tvorbi spominov.

'''Laura Gašperšič: Alzheimerjeva bolezen: povrnitev zmožnosti pomnjenja z inhibicijo interakcije med Sp3 in HDAC2'''

Pri Alzheimerjevi bolezni je glavni simptom okvara spomina, do česar pride zaradi utišanja genov, ki sodelujejo pri tvorbi novih spominov. Do utišanja pride zaradi deacetilacije histonov, ki jo povzročijo encimi histonske deacetilaze (HDAC). Pri utišanju genov za tvorbo spominov je najpomembnejši HDAC2. Njegova raven je pri bolnikih z Alzheimerjevo boleznijo povišana. Encimi HDAC so si po zgradbi podobni, poleg tega tvori en encim več različnih kompleksov, kar lahko pri inhibiciji encimov HDAC sproži tudi stranske učinke. Raziskovalci so zato želeli najti molekulo, s katero se HDAC2 veže na promotorje genov za učenje in spomin. S prvimi raziskavami so določili 3 najbolj verjetne proteine: Tdp2, Sap30 in Sp3, z meritvami pa so ugotovili, da Sp3 vpliva na delovanje sinapse. V nadaljnjih raziskavah so dokazali, da kompleks med HDAC2 in Sp3 v bolezenskem stanju z vezavo na promotorje negativno uravnava izražanje genov povezanih z delovanjem sinapse. V zadnjem delu raziskave so želeli določiti del HDAC2, ki se veže na Sp3 in inhibirati nastanek kompleksa med HDAC2 in Sp3. Ugotovili so, da se na Sp3 veže C-konec HDAC2. C-končni fragment HDAC2 se že sam veže na Sp3, s čimer se zmanjša število kompleksov med HDAC2 in Sp3 na promotorjih. Fragment HDAC2 pa se ne veže na druge proteine, s katerimi HDAC nadzorujejo druge pomembne procese. Izražanje C-končnega fragmenta HDAC2 torej predstavlja obetaven način, s katerim bi lahko zdravili nevrološke bolezni povezane z okvarami spomina.

'''Maja Škof: Pomen S-proteinov pri prilagajanju koronavirusov na okolje'''

Koronavirusi so razširjeni po vsem svetu in največkrat povzročajo okužbe dihal pri ljudeh in živalih. Spadajo med RNA viruse, za katere je značilna visoka stopnja genskih mutacij, kar jim omogoča, da se uspešno prilagajajo na okolje. S-proteini so trimerni proteini, s katerimi se koronavirusi vežejo na gostiteljsko celico, nato pa sprožijo spojitev virusne in celične membrane, kar omoči, da virusna RNA preide v celico. S-proteini so sestavljeni iz dveh podenot, S1 in S2. Pri vezavi na celični protein sodeluje zunanji del podenote S1, ki je v obliki treh podaljšanih zank (receptorsko-vezavne zanke). Med aminokislinami S-proteina in receptorskega proteina se vzpostavijo medmolekulske vezi, nato pa podenota S2 sproži spojitev s celično membrano. S1 je tudi glavna tarča protiteles, ki preprečujejo virusu, da bi vstopil v celico. A protitelo, ki se uspešno veže na sev virusa, ob ponovni okužbi virusa ne prepozna več. To je posledica naključnih genskih mutacij. Analiza genomov koronavirusov, izoliranih v zadnjih 50-ih letih, je pokazala, da se receptorsko-vezavne zanke S-proteinon med seboj občutno razlikujejo. Kar 73% aminokislin na receptorsko-vezavnih zankah variira. Odstotek je ravno dovolj velik, da se koronavirusi še vedno lahko vežejo na receptor, protitelesa pa jih ne zaznajo več.

'''Tadej Medved: Identifikacija vezavnih mest proteinov WASP na aktinski ojedritveni kompleks Arp2/3'''

Ključnega pomena za procese, kot so celično gibanje in endocitoza, so aktinski filamenti. Nastanek in prerazporeditev le-teh nadzorujejo določeni proteinski kompleksi; za razvejane aktinske filamente je to Arp2/3. Le-ta je sestavljen iz več podenot; najpomembnejši sta Arp2 in Arp3, ki sta po strukturi podobni aktinu. Na Arp2/3 se vežejo proteini družine WASP, ki spravijo proteinski kompleks v konformacijo, pri kateri lahko dejansko vrši nastanek novih filamentov. Za vse WASP-e velja, da se na Arp2/3 vežejo z odsekom VCA(verprolin, central, acidic), a do podatkov o strukturah takšnih vezi se znanost še ni dokopala. S pomočjo "cross-linking" masne spektrometrije in "reversed phase liquid" kromatografije je pred kratkim nastal model, ki zadovoljivo opisuje mesta, na katera se vežejo WASP-i. Vezava namreč poteka na dveh mestih: na hrbtni strani Arp2/3 in na spodnji strani kompleksa, pri Arp2 in poddomeno ARPC1. Na Arp2/3 se pri WASP-u veže odsek CA, konec odseka V pa ostaja prost za vezavo aktina. Izkazalo se je, da se za uspešno nukleacijo aktina vezavni mesti za aktin in CA ne smeta prekrivati; odsek WASP C pa je še zlasti pomemben za aktivacijo Arp2/3.

'''Tina Zavodnik: Disfunkcionalni mitohondriji s pomočjo ROS zavirajo translacijsko aktivnost'''

Mitohondriji so zelo kompleksni organeli, ki za normalno opravljanje svojih funkcij potrebujejo številne proteine. Večina teh proteinov se sintetizira v citoplazmi, nato pa so uvoženi nazaj v mitohondrije. Ob morebitni okvari transportnih mehanizmov in posledično okvarjenih mitohondrijih pa pride do akumulacije proteinov v citoplazmi, kar poruši celično ravnovesje. Skupina znanstvenikov iz Nemčije in Poljske pa je odkrila mehanizem, ki poškodovanim mitohondrijem omogoča nadzor nad sintezo proteinov z induciranjem reverzibilnih sprememb na translacijskem mehanizmu. Kot signal uporabijo ROS, ki povzroči oksidacijo tiolov na peptidih, ki so sestavni deli translacijskega mehanizma. Do odkritja so prišli s kvantitativno analizo cisteinskih ostankov oz. tiolnih skupin na proteomu kvasovke Saccharomyces cerevisia ter izdelali obsežno zbirko oksidacijskih stanj peptidov, ki so vsebovali tiolne skupine. Analizo so ponovili še na gojenih celicah kvasovke, ki so bile izpostavljene induciranemu oksidativnemu stresu s pomočjo H2O2, ter na mutiranih celicah z disfunkcionalnimi mitohondriji. Pri obojih so zaznali povečano oksidacijo Cys-peptidov in zmanjšano translacijsko aktivnost. Z odstranitvijo stresorskega faktorja pa se je translacijska aktivnost delno do popolnoma obnovila, kar dokazuje, da je oksidacija peptidov, ki so del mehanizmov za sintetiziranje novih proteinov, reverzibilen proces. Cisteinski ostanki torej delujejo kot nekakšni senzorji za ROS in ob oksidativnem stresu inhibirajo sintetiziranje novih proteinov.

'''Tina Kolenc Milavec: Vezava kalcija na karboksilni konec α-sinukleina uravnava interakcije med sinaptičnimi vezikli'''

Alfa-sinuklein je majhen, v vodi topen protein brez stabilne terciarne strukture, ki ga genetsko in nevropatološko povezujejo s Parkinsonovo boleznijo, o njegovi vlogi pri razvoju bolezni pa še marsikaj ni znano. Nahaja se predvsem v živčnih končičih, kjer je ravnovesje med α-sinukleinom raztopljenim v citosolu in tistim vezanim na fosfolipidni dvosloj močno regulirano. Ker se α-sinuklein nahaja na območju, kjer koncentracija kalcija ves čas močno niha, so raziskovalci Lautenschläger ''et al.'' predpostavili, da je normalna fiziološka funkcija α-sinukleina odvisna od kalcija. Da bi bolje razumeli funkcijo tega proteina, so v raziskavi izvedli več ''ex vivo'' ter ''in vitro'' eksperimentov, s katerimi so skušali ugotoviti predvsem to, kako se α-sinuklein veže na membrano sinaptičnega vezikla ter kako koncentraciji kalcija in α-sinukleina vplivata na homeostazo sinaptičnih veziklov ter na združevanje α-sinukleina v fibrilarne skupke. Povečana koncentracija kalcija in/ali α-sinukleina namreč pod določenimi pogoji povzroča toksičnost in posledično celično smrt, saj α-sinuklein oligomerizira ter tvori dolge in debele netopne fibrile, ki so del Lewyjevih telesc – citoplazemskih vključkov, značilnih za Parkinsonovo bolezen. Iz medicinskega stališča pa je zanimiva ugotovitev, da isradipin (antagonist kalicevih kanalčkov) preprečuje fibrilizacijo, saj znižuje znotrajcelično koncentracijo kalcija, kar odpira nove možnosti za razvoj zdravil proti Parkinsonovi bolezni.

'''Anže Šumah: Razvoj genskega senzorja za uničevanje celic s pomanjkanjem proteina p53'''

Protein p53 je tumorski zatiralec (tumor supresor), ki je zaradi svoje nadvse pomembne vloge pri ohranjanju celovitosti celičnega genoma pogosto deležen naziva »varuh genoma«. V normalnih primerih je izražanje tega proteina na nizki ravni, v primeru celičnega stresa pa deluje kot prepisovalni dejavnik, ki uravnava izražanje genov, ki so vključeni v nadzor celičnega cikla, popravljanje DNA in apoptozo. Ugotovili so, da je okoli 50 % vseh človeških oblik raka povezanih z mutacijami gena TP53 (gena za sintezo p53), zato so v raziskavi želeli razviti genski senzor, ki bi bil sposoben uničiti celice, ki ne sintetizirajo p53 (so rakave). Na podlagi promotorjev, ki jih p53 kot prepisovalni dejavnik zavira ali aktivira, so razvili senzor, ki v primeru pomanjkanja p53 sintetizira protein »Herpes simplex virus thymidine kinase« (HSV-TK), preko katerega lahko z zdravilom Ganciclovir uničimo rakasto celico, ki je brez p53. V primeru, da je p53 prisoten (je celica »zdrava«), pa je sinteza HSV-TK zavirana preko različnih mehanizmov. Senzor so najprej testirali na celični kulturi HCT116 (rakaste človeške črevesne celice) s fluorescentnima proteinskima markerjema, nato pa še v živih organizmih, in sicer golih miših brez imunosti. Tako so dokazali tako in vitro kot tudi in vivo uporabnost izdelanega genskega senzorja, ki bi ga bilo mogoče uporabiti v terapevtske namene.

'''Liza Praznik: Vpliv šaperonov Skp in SurA na zvijanje izvenmembranskih proteinov FhuA v terciarno strukturo'''

Naloga posebne vrste proteinov, imenovanih šaperoni je, da preoblikujejo polipeptidne verige v terciarno strukturo, v kateri so ti zmožni aktivnega delovanja. Delovanje in odzivanje šaperonov na različne dejavnike je še dokaj neznano, zato je skupina znanstvenikov Univerze v Baslu raziskovalo šaperona Skp in SurA, holdaz, ki delujeta na protein FhuA. Ta se nahaja na zunanji membrani gram negativnih bakterij, kjer služi kot receptor za ferikrom in tvori obliko beta-sodčka. Z večkratnimi ponovitvami poskusov so ugotovili, da se v prisotnosti obeh šaperonov struktura proteina, vgrajenega v membrano, ne podere, če jo delno razvijemo, ne glede na to, do katere stopnje. Šaperona sta obenem zmožna delno razvit protein preoblikovati nazaj v funkcionalno obliko, ki omogoča ponovno delovanje v membrani. Naloga obeh šaperonov je, da zadržujeta zvit polipeptid v dinamični, termodinamsko najugodnejši konformaciji, s katero se posamezni beta-zavoji polipeptida lahko vstavljajo v membrano. Ugotovljeno pa je bilo, da je šaperon SurA pri tem znatno učinkovitejši. Rezultati raziskave omogočajo boljši vpogled v mehanizme delovanja šaperonov in nakazujejo, kako pomembni so za učinkovito delovanje proteinov.

'''Urša Štrancar: Predstavitev združitve avtofagosoma in lizosoma s pomočjo para fret'''

Mitofagija je kataboličen proces razgradnje mitohondrijev s pomočjo encimov v lizosomih, pri čemer se neuporabni deli mitohondrija razgradijo in reciklirajo. Da bi tak proces lahko opazovali in ga podrobno preučili, so znanstveniki v eksperimentu ob raziskovanju mitofagije uporabili eno novejših metod za prikaz celičnih procesov v živih celicah, par FRET, ki temelji na visoki vezavni afiniteti med dvema sintetičnima molekulama (kromoforoma) CB[7]-Cy3 in AdA-Cy5. Konfokalna laserska skenirna mikroskopija je pokazala, da sta bili molekuli CB[7]-Cy3 in AdA-Cy5 najprej intracelularno ločeni in zbrani v mitohondriju oz. lizosomu, nato pa sta po združitvi lizosoma in mitohondrija tvorili kompleks gost-gostitelj, prikazan kot fluorescenčni signal para FRET, ki ga človeško oko ob opazovanju na mikroskopu lahko zazna. Ta ugotovitev pa ni prikazala le zelo stabilne vezi med CB[7] in AdA v živi celici, temveč je potrdila tudi, da par FRET lahko prikaže dinamične procese spajanja celičnih organelov v mitofagiji. Kompleks, ki ga tvorita zgoraj navedeni molekuli, prav tako ni citotoksičen, zato je zelo uporaben za raziskovanje procesa mitofagije, nadaljno pa tudi procesov avtofagije v drugih celičnih organelih.

'''Neža Žerjav: Dodajanje enega samega nukleotida omejuje aktivnost človeške telomeraze'''

Telomeraza je vrsta DNA-polimeraze, ki na konce kromosomov dodaja nukleotidna zaporedja (GGTTAG) ob pomoči matrične RNA. Procesivni katabolni cikel telomeraze sestavljajo translokacija matrice, dodajanje prvega nukleotida in dodajanje preostalih petih nukleotdov. Zanimanje znanstvenikov je vzbudila zaradi počasnega delovanja v primerjavi z ostalimi DNA-polimerazami. Za pojasnitev mehanizma, ki omejuje njeno delovanje, so znanstveniki raziskovali vpliv prekinitvenega signala matrične RNA na visoko Michaelisovo konstanto prvega nukleotida, odvisnost procesivnosti in hitrosti telomeraze v odvisnosti od koncentracije dGTP, vpliv spremenjenega prvega nukleotida in posledice odstranitve prekinitvenega signala. Prišli so do zaključka, da prekinitveni signal povzroča počasnejše dodajanje prvega nukleotida v telomerno zaporedje, kar zmanjša procesivnost in hitrost telomeraze, ki pa ju lahko lahko povečano s povečano koncentracijo ustreznega deoksinukleozid fosfata.

'''Aljaž Bratina: Intrinzična destabilizacija ribosoma'''

Sinteza proteinov v celici poteka na ribosomih, ki so sestavljeni iz dveh podenot. Med prevajanjem RNA (translacija) se genski zapis pretvori v zaporedje aminokislin, ki se zvijejo v protein. Polipeptidno verigo, ki nastaja na ribosomu, in je vezana na tRNA, imenujemo nascenti polipeptid. Hitrost translacije ni vedno enaka in je podvržena mnogim anomalijam. Včasih se od ribosoma predčasno odcepi tRNA z vezanim nascentnim polipeptidom, lahko pa določeno zaporedje v nascentnem polipeptidu celo povzroči disociacijo ribosoma na dve podenoti in s tem prekine sintezo proteina. To imenujemo intrinzična destabilizacija ribosoma (IRD). IRD-inducirajoče zaporedje je ponavadi sestavljeno iz negativno nabitih aminokislin (aspartata in glutamata) ali prolina v različnih kombinacijah. Ugotovljeno je bilo, da nekatera zaporedja povzročajo IRD le in vitro, druga pa tudi in vivo. To pomeni, da ribosom vsebuje nek mehanizem, ki IRD zavira. To je protein bL31, ki povezuje podenoti ribosoma in s tem stabilizira ribosom. Celica IRD izkorišča tudi za nadzorovanje koncentracije magnezijevih ionov. Večja kot je ta koncentracija, manj proteina MgtA (prenašalec Mg2+) se bo tvorilo. Pomembno vlogo pri tem razmerju ima MgtL, polipeptid, ki je kodiran tik pred MgtA, in vsebuje IRD zaporedje. IRD je raziskana le na prokariontskih organizmih, vendar je možno, da je ta proces prisoten tudi v evkariontih.

'''Anamarija Agnič: ATP-aza P4 s premeščanjem fosfolipidov uravnava uvihanost membrane'''

ATP-azo P4 uvrščamo v skupino membranskih proteinov, ki ob hidrolizi ATP sodelujejo pri vzdrževanju asimetrične porazdelitve lipidov v membrani; omogočajo npr. prenos membranskih fosfolipidov fosfatidilserina in fosfatidiletanolamina iz monomolekularnega sloja celične membrane na zunajcelični strani v monomolekularni sloj membrane na citosolni strani membrane. Spremembe v razporeditvi lipidov v dvosloju, ki jih povzročajo flipaze, so ključnega pomena za deformacijo membrane, česar dokaz je bil tudi temeljni znanstveni problem skupine celičnih biologov iz univerze v Kjotu. V okviru raziskave so znanstveniki preko sistema, ki na membrano iz citoplazme inducirano veže t.i. domene Bin/amphiphysin/Rvs (domene BAR), natančno opazovali stopnje membranske tubulacije. S fluorescirajočimi molekulami so označili citosolne proteine BAR, ki so občutljivi na ukrivljenost membrane, in opazovali njihovo obnašanje. Povečana aktivnost flipaze za fosfatidilholin ATP10A, ki sodi v družino ATP-az P4, je zaradi vzpostavljene neuravnovešenosti med lipidnima slojema omogočila vezavo domen BAR ter s tem spodbudila proces membranske tubulacije. Povečana aktivnost flipaze ATP10A, ki omogoči uvihanost celične membrane, velja za enega pomembnih gonilnih mehanizmov endocitoze. Plazmalema drastično spreminja obliko tudi med celičnimi migracijami, invazijo rakastih celic, celično delitvijo, sprejemanjem hrane in vstopom patogenov ter virusov v celico. Ta raziskava je prvi dokaz, da imajo spremembe v trans-lipidnem dvosloju, ki jih povzročijo ATP-aze P4, pri deformiranju bioloških membran pomembno vlogo.

'''Simona Gorgievska: Optical tools to detect metabolic changes linked to diseases'''

Metabolic changes in cell can occur at the earliest stages of disease. In most cases, knowledge of those signals is limited, since we usually detect diseases only after it has done significant damage. Now, a team led by engineers at Tufts University School of Engineering has opened a window into the cell by developing an optical tool that can read metabolism at subcellular resolution, without having to perturb cells with contrasts agents or destroy them to conduct assays.The method is based on the fluorescence of two important coenzymes (biomolecules that work in concert with enzymes) when excited by a laser beam. The coenzymes –nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) and Flavin adenine dinucleotide (FAD) are involved in a large number of metabolic pathways in every cell. In order to find out the specific metabolic pathways affected by disease or stress, scientists have looked at three parameters. Those are: the ratio of FAD and NADH, the fluorescence “fade” of NADH and the organization of mitochondria as revealed by the spatial distribution of NADH within a cell (the energy producing “batteries” of the cell). The first parameter-the relative amounts of FAD to NADH -can reveal how well the cell is consuming oxygen, metabolizing sugars, or producing or breaking down fat molecules. The second parameter -the fluorescence "fade" of NADH -reveals details about the local environment of the NADH. The third parameter -the spatial distribution of NADH in the cells -shows how the mitochondria split and fuse in response to cellular growth and stress.

'''Matej Jereb: Gradnja človeške pluripotentne matične celice v funkcionalno skeletno mišično tkivo'''

V študiji so razvili prvo popolnoma delujočo 3D skeletno mišično vlakno iz človeške pluripotentne matične celice. Z uporabo štirih različnih hPSC virov so razvili ponovljivo metodo za generacijo miogenskih celic prednic (iMPC), ki so sposobne učinkovite diferenciacije v večcelične miotubule v 2D kulturi. Če je gojena v 3D okolju hidrogela se iMPC strukturno preoblikuje tako, da tvori poravnano funkcionalno skeletno mišično vlakno (iSKM vretena), ki se lahko skrči in kot odgovor na električno ali nevrotransmitersko stimulacijo prenaša kalcijeve ione (Ca2+). V obdobju štirih tednov so 3D iSKM vretena doživela hipertrofijo miotubulov in funkcionalno izboljšanje ter naprednejšo stopnjo miogenske diferenciacije v primerjavi z 2D kulturo enake starosti. Pokazali so tudi, da se da iSKM vretena uspešno implantirati. Poskusi na miših nakazujejo potencial za uporabo teh metod in vitro in in vivo.

'''Neža Blaznik: Glikozilirana sialična kislina na protitelesu IgA inhibira virus influence tipa A'''

Nekateri virusi za vezavo na gostiteljsko celico uporabljajo receptorje, ki so glikozilirani s sialično kislino. V to skupino virusov spada tudi virus tipa influence A, ki povzroča gripo. Virus se prek glikoproteina hemaglutinina veže na sialično kislino v receptorjih in tako okuži gostiteljsko celico. Protitelesa imunoglobulini G (IgG), ki se uporabljajo v cepivih za gripo, imajo glikozilirane polipeptidne verige in prav tako vsebujejo nekaj sialične kisline, vendar je vsebnost sialične kisline v imunoglobulinih A (IgA) veliko večja. Znanstveniki so primerjali delovanje dveh tipov IgG in IgA na enega izmed tipov virusa influenze A (H5N3). Ugotovili so, da oba tipa IgA nevtralizirata virus v večji meri kot IgG, poleg tega pa so s križanjem komponent obeh imunoglobulinov tudi določili domeno na IgA, ki največ prispeva k povečani nevtralizaciji virusa. S tem so torej ugotovili, da glikozilirana sialična kislina na IgA inhibira virus influence tipa A, saj se veže še na dodatno mesto virusa in tako blokira povezavo med virusom in gostiteljsko telesno celico. To znanje je uporabno v razvoju novih cepiv proti gripi, vendar zaradi same zahtevnosti testiranja IgA in vivo, želijo znanstveniki v prihodnosti sintetizirati protitelo tipa IgG, ki bi vsebovalo del verige IgA, ter tako združiti prednost obeh protiteles.

'''Liza Ulčakar: Kombinirana DNA-RNA/neoantigen nanocepiva - učinkovita imunoterapevtska metoda'''

Cepiva proti raku postajajo vedno bolj raziskana tema. Znanstveniki so zato sintetizirali kombinirano zdravilo, ki vsebuje CpG (kratka enoverižna DNA), shRNA in rakave neoantigene. CpG deluje kot imunostimulator, saj se veže na receptor TLR9 v membrani endosomov antigen prezentirajočih celic in sproži imunski odgovor na rakave celice. shRNA preko RNA-interference preprečuje translacijo transkripcijskega faktorja STAT3, ki deluje imunosupresivno. Da bi zdravilo nemoteno potovalo po limfnem sistemu in prehajalo v celice, so sintetizirali kopolimer PPT-g-PEG, ki je skrčil kombinirano zdravilo. Cepivo so najprej preizkusili in vitro in ugotovili, da cepivo deluje imunostimulativno - antigen prezentirajoče celice so začele sproščati več citokinov, proizvodnja proteina STAT3 se je zmanjšala. Nato so poskus ponovili še in vivo, miših, ki so bile okužene z adenokarcinomom debelega črevesa. Mišim so nato odstranili organe z metastazami in opazili, da se je tumor pri miših, ki so bile zdravljene s kombiniranim zdravilom v primerjavi z mišmi, ki zdravila niso dobile, močno zmanjšal.

'''Matija Ruparčič: Od strupenih kompleksov do zlatih zrnc s ''Cupriavidus mellidurans'''''

Kakor voda, ogljik in dušik, tudi zlato kroži v naravi. Eden izmed organizmov, ki to omogoča, je ''Cupriavidus metallidurans''. Ta betaproteobakterija je skozi čas razvila vrsto mehanizmov, ki jo ščitijo pred velikimi koncentracijami težkih kovin. Problem pa se pojavi, ko je v prsteh prisotno zlato. To namreč inhibira glavno črpalko bakrovih ionov CupA in tako vodi do sinergistične toksičnosti bakra in zlata. Bakterija črpalk za zlato nima, zato je morala razviti mehanizem, ki bi preprečil sam vstop zlata v citoplazmo. Ker imajo bakterije, ki živijo v prsteh z večjo koncentracijo Au, v povprečju večje število encima CopA, ki ga skupaj z drugimi proteini kodirajo geni ''copABCD'', so se znanstveniki osredotočili nanj. Ugotovili so, da so produkti genov ''copABCD'' zasluženi za povečano odpornost na Cu/Au mešanice, CopA pa poleg Cu(I) oksidira tudi Au(I) ione v Au(III), nato pa pomaga pri redukciji le-teh do Au(0) nanodelcev. Rezultati raziskave tako predstavljajo nov korak k popolnemu razumevanju biogeokemičnega cikla zlata.

'''Jernej Imperl: Optimizacija protimikrobnih peptidov s pomočjo virtualnih metod'''

Gramnegativne bakterije premorejo vrsto mehanizmov za obrambo pred antibiotiki in s časom so na mnoge od njih postale celo imune. Skupaj z dejstvom, da je proizvodnja novih antibiotikov zapleten in drag proces, lahko predstavljajo resno dolgoročno grožnjo. Da bi bakterije "presenetili", so se znanstveniki obrnili na izdelavo protimikrobnih peptidov po šabloni peptidov rastlinskega izvora, ki se zaradi zapletene zgradbe na trgu še ne uporabljajo, a so znani v tradicionalni medicini že zelo dolgo časa. Peptid sadeža guave, Pg-AMP1, v osnovni obliki neugodnega za komercialno rabo, so s pomočjo računalniškega algoritma, ki posnema proces evolucije, in funkcije, ki peptide ovrednoti na podlagi verjetnosti tvorbe vijačnic, postopoma spreminjali in optimizirali. S simulacijo, ki so jo zagnali kar 100-krat, vsakič z naborom 250 začetnih peptidov, so uspeli odkriti guavanin 2, prvaka med stotimi kandidati vsake od simulacij, ki se je izkazal za učinkovitega proti gramnegativnim bakterijam in neškodljiv za človeške celice. Uspešnost guavanina 2 in njegova pomenljiva drugačnost od že obstoječih protimikrobnih peptidov nakazuje obetaven korak za nadaljnjo raziskovanje antibiotikov rastlinskega izvora.

'''Tiana Karmen Kokalj: B-1a limfociti spodbudijo oligodendrogenezo med razvojem možganov'''

Oligodendrociti so celice v centralnem živčnem sistemu, ki tvorijo mielinske ovojnice aksonov. Imajo ključno vlogo v razvoju in delovanju možganov, kar ima tudi limfni sistem, specifično periferni limfociti. Specifično T celice sodelujejo pri spominu, med embrionalnim razvojem pa prehaja v možgane diferenciirana oblika teh, B-1a celice. Te že v embrionalni fazi dozorijo in dosežejo največjo količino tik po rojstvu. Iz krvi v možgane prehajajo preko signalnega kompleksa CXCL13-CXCR5. Ko so enkrat te celice v možganih pa vidimo, da vplivajo na oligodendrogenezo, saj je kultivacija živčnih matičnih celic z B-1a celicami pokazala večji delež zrelih oligodendrocitov. B-1a celice direktno vplivajo na oligodendrogenezo s spodbuditvijo razmnoževanje oligodendrocitskih predhodnih celic (OPC) preko IgM-Fcα/µR signalizacije. B.1a celice izločajo IgM - polireaktivna protitelesa, ki se vežejo na Fcα/µR, katerega izražajo OPC, ki veže Fc regijo IgM. Delež B-1a celic v možganih pa pada s starostjo, zato predvidevajo da imajo največjo vlogo pri razmnoževanju oligodendrocitov, pri spontani obnovitvi mielinskih ovojnic pa naj ne bi imeli velikega pomena. Študija tega procesa lahko pripomore k boljšem razumevanju in preučevanju nevrorazvojnih motenj.

'''Ana Menegalija: METTL3 nova potencialna terapevtska tarča pri akutni mieloični levkemiji'''

Rak je skupek bolezni, za katere je značilna nenormalna celična rast, lahko pa imajo tudi sposobnost naselitve v drugih tkivih. Ena izmed hujših oblik raka je akutna mieloična levkemija (AML), za katero je zaradi mesta in oblike razvoja težko najti zanesljivo metodo zdravljenja. Raziskave potekajo v smeri preučevanja metiltransferaz pri razvoju celic AML. Metiltransferaze so enimi, ki na substrat pripnejo metilno skupino. Med njih spada tudi METTL3, ki ima pomembno vlogo v celicah AML. Z metiliranjem RNA namreč pospešuje hitrost translacije v proteine in s tem pripomore k proliferaciji levkemičnih celic. Dokazano je bilo, da se s prekinitvijo katalitične aktivnosti METTL3 celice AML ne razvijajo več, kar pomeni, da je mehanizem METTL3 nujno potreben za preživetje celic. Tako metilacije RNA ni in je translacija upočasnjena. Hkrati je bilo ugotovljeno tudi, da METTL3 nima nobenega vpliva na zdrave embrionalne in primarne hematopoetske celice v primerjavi s kontrolo, zaradi česar bi bil primeren za tarčno zdravljenje AML. Študija je pripomogla k razumevanju vloge METTL3 v levkemičnih celicah in posledično k iskanju potencialnih zdravil za akutno mieloično levkemijo.

'''Barbara Jaklič: I-motif DNA strukture nastajajo tudi v jedrih človeških celic'''

Prva znana in najpogostejša strukturna oblika DNA je dvojna vijačnica, katere model sta predlagala Watson in Crick. Je desnosučna, sestavljena iz velikega in malega žleba, imenujemo pa jo A-DNA. Poleg te oblike sta dobro proučeni še B-DNA, ki je prav tako desnosučna, vendar dehidrirana in zato bolj stisnjena, in Z-DNA, ki pa je levosučna in dodatno zvita struktura v sintetičnih verigah DNA. Znano pa je, da lahko DNA in vitro tvori tudi drugačne inter- in intramolekularne sekundarne strukture, med katerimi je najbolj raziskana G-quadruplex (G4) v regijah genoma bogatih z gvaninom. Nekoliko manj poznana je struktura imenovana »intercalated motif« (i-motif), ki nastaja v regijah bogatih s citozinom. Sestavljajo jo štiri verige, povezane z vrinjenimi baznimi pari delno protoniranega in nevtralnega citozina (C+:C). Za to strukturo predvidevajo, da sodeluje pri uravnavanju replikacije in transkripcije, vendar je njen obstoj in vivo dolgo ostajal dvomljiv zaradi stabilizacije v kislem pH. V raziskavi so karakterizirali protitelesni fragment iMab, ki se zelo specifično in z veliko afiniteto veže na strukturo i-motif, in s tem dokazali njeno prisotnost v jedrih človeških celic. Preučili so tudi stabilnost i-motif strukture v različnih pH razmerah in fazah celičnega cikla ter s tem omogočili nadaljnje raziskave na področju regulacijske in biološke vloge te strukture v človeških celicah.

'''Meta Kodrič: Naključna izboljšava bakterijskega encima za razgradnjo plastike'''

Plastika je kot lahek, trpežen, cenovno ugoden in nerazgradljiv material zelo priročna za vsakodnevno rabo, a ravno njena biološka nerazgradljivost predstavlja velik globalni problem, s katerim se spopadamo v zadnjih desetletjih. Za plastenke in embalažo se uporablja plastika narejena iz semiaromatičnega poliestra poli(etilen tereftalata) oz. PET. Do sedaj poznani načini razgradnje njegovih močnih in težko dostopnih esterskih vezi so dragi, produkti, ki pri tem nastanejo, pa prav tako škodljivi za okolje kot plastika sama. V iskanju učinkovitejših metod znanstveniki med drugim preučujejo mikroorganizme, ki so skozi desetletja onesnaževanja okolja s plastiko razvili uspešne mehanizme za njeno razgradnjo. Raziskovalci inštituta Portsmouth so pod drobnogled vzeli encim PETazo leta 2016 odkrite bakterije Ideonella sakaiensis 201-F6. Primerjali so ga s podobnimi α/β-hidrolazami, ki so prav tako sposobne depolimerizirati PET, le v manjši meri. Na podlagi razlik v strukturah preučevanih encimov so ustvarili mutante PETaze, ki so bili v določenih lastnostih bolj podobni encimom s slabšo sposobnostjo razgrajevanja PET. Kljub predpostavki, da bodo takšni mutanti manj učinkoviti od PETaze, se je na veliko presenečenje eden izmed mutantov izkazal za bolj učinkovitega. Tako mutant kot PETaza sta se dobro odrezala tudi pri razgradnji semiaromatičnega poliestra PEF, pri depolimerizaciji alifatskih poliestrov pa sta bila neučinkovita. Študija tako nakazuje, da se z nadaljnjim preučevanjem α/β-hidrolaz odpirajo možnosti sinteze še učinkovitejših encimov, ki bi jih nekoč lahko uporabljali pri razgradnji plastike v industrijskem merilu.

'''Eva Gartner: Vloga neobičajnega prohibitina pri regulaciji mitohondrijskega membranskega potenciala in razvoju malarije.'''

Malárija, starinsko tudi močvirska mrzlica, je nalezljiva bolezen, ki jo povzročajo nekatere vrste zajedavskih praživali iz razreda trosovcev, plazmodiji. Življenjski krog plazmodija sestavljajo tri stopnje: okužba človeka s sporozoiti, nespolno razmnoževanje, ki poteka v človeku, ter spolno razmnoževanje, ki poteka v komarju. Za zdravljenje malarije se uporabljajo različni antibiotiki in antimalariki, vendar se je zaradi vse večje odpornosti parazitov pojavila potreba po novih zdravilih. Znanstveniki so v raziskavi odkrili protein v mitohondriju parazita, ki bi lahko bil tarča za novo zdravilo. Pomanjkanje tega proteina oslabi nespolno razmnoževanje, nujno pa je potreben predvsem pri spolnem razmnoževanju. Razlog za neuspešen spolni razvoj je vse večja depolarizacija mitohondrija, ki pa je ključen organel za preživetje parazita, saj dovaja energijo za vse celične procese. Ob odsotnosti proteina prenašanje okužbe ni mogoče. Ta protein pa ima še eno prednost in sicer, da ni prisoten v človeku, ki mu zato onesposobljenost delovanja proteina ne škodi.

TBK2018-seminar

2018-05-09T19:55:59Z

Eva Gartner: /* Seznam seminarjev */

= Temelji biokemije- seminar =

Seminarje vodi prof. dr. Brigita Lenarčič. Seminarji so obvezni.

Ocena seminarjev (6-10) predstavlja enako število odstotkov, ki se prišteje h končni pisni oceni izpita.
Stran na strežniku s seminarskimi nalogami je zaščitena.
Uporabniško ime je: tbk, password pa: samozame## "##" sta dve številki, ki ju izveste na predavanjih.
Tudi za urejanje Wiki strani potrebujete geslo, ki se od zgornjega razlikuje. Postopek pridobitve Wiki uporabniškega imena in gesla je opisan [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Main_Page tukaj].

== Seznam seminarjev ==

{| border="1" cellpadding="4" cellspacing="0" style="border:#c9c9c9 1px solid; margin: 1em 1em 1em 0; border-collapse: collapse;"
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Ime in priimek'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Naslov seminarja'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Povezava'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Rok za oddajo'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Rok za recenzijo'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Datum predstavitve'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 1'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 2'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 3'''
|-
| Anna Scott||Moj naslov v slovenščini||http://www.bioscirep.org/content/36/1/e00291.long||28.10.||05.11.||07.11.||r1||r2||r3
|-
| Doroteja Armič || Pretvorba mišjih fibroblastov v pluripotentne matične celice s pomočjo tehnologije CRISPR || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/01/180118162449.htm || 27.02. || 02.03. || 05.03. || Martina Lokar || Liza Ulčakar || Zoja Siter
|-
| Valeriya Musina || Metalopeptid bakrov(II) fenantrolin tarčno onemogoči delovanje mitohondrijev v matičnih celicah raka dojke || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/12/171213124751.htm || 27.02. || 02.03. || 05.03. || Nika Boštic || Tiana Karmen Kokalj || Aljaž Bratina
|-
| Dea Simonič || Sprožilci avtoimunskih bolezni in vzroki za nekontrolirano širjenje le-teh po telesu ||https://www.sciencedaily.com/releases/2017/08/170824141207.htm|| 27.02. || 02.03. || 05.03. || Sumeja Kudelić || Jernej Imperl || Anamarija Agnič
|-
| Neža Štremfelj ||Delovanje inzulinskih receptorjev||https://www.sciencedaily.com/releases/2018/02/180219103256.htm|| 27.02. || 02.03. || 05.03. || Luka Gnidovec || Matija Ruparčič || Simona Gorgievska
|-
| Gašper Komatar || Tvorba kompleksa receptorjev ApoER2, ephirinB2 in AMPAR, ki jih povezuje GRIP1, sodeluje pri tvorbi spomina || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/10/171009093207.htm || 06.03. || 09.03. || 12.03. || Lara Hrvatin || Tiana Karmen Kokalj || Matej Jereb
|-
| Marko Pavleković || Prehajanje imunskih celic, povzročiteljic multiple skleroze, skozi krvno-možgansko pregrado || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/11/171121155811.htm || 06.03. || 09.03. || 12.03. || Klementina Polanec || Meta Kodrič || Lara Drinovec
|-
| Laura Gašperšič || Alzheimerjeva bolezen: povrnitev zmožnosti pomnjenja z inhibicijo interakcije med Sp3 in HDAC2 || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/08/170808150001.htm || 06.03. || 09.03. || 12.03. || Karmen Mlinar || Ana Menegalija || Maks Kumek
|-
| Rebeka Dajčman || Več mehanizmov poganja dinamiko kalcijevega signala okoli lasersko povzročene rane epitelija || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/10/171003124646.htm || 06.03. || 09.03. || 12.03. || Ula Nikolaja Ratajec || Andreja Marija Belič || Neža Blaznik
|-
| Maja Škof || Pomen S-proteinov pri prilagajanju koronavirusov na okolje. || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/11/171127105937.htm || 13.03. || 16.03. || 19.03. || Doroteja Armič || Barbara Jaklič || Liza Ulčakar
|-
| Tina Kolenc Milavec || Vezava kalcija na karboksilni konec α-sinukleina uravnava interakcije med sinaptičnimi vezikli || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/02/180219071758.htm || 13.03. || 16.03. || 19.03. || Valeriya Musina || Eva Gartner || Jana Rajchevska
|-
| Tina Zavodnik || Disfunkcionalni mitohondriji s pomočjo ROS zavirajo translacijsko aktivnost || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/02/180202112629.htm || 13.03. || 16.03. || 19.03. || Dea Simonič || Martina Lokar || Jernej Imperl
|-
| Tadej Medved || Identifikacija vezavnih mest proteinov WASP na aktinski ojedritveni kompleks Arp2/3 || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/03/180305130632.htm || 13.03. || 16.03. || 19.03. || Neža Štremfelj || Nika Boštic || Matija Ruparčič
|-
| Bogdan Jovićević || || || 20.03. || 23.03. || 26.03. || Laura Gašperšič || Lara Hrvatin || Ana Menegalija
|-
| Polona Kalan || || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/02/180214111055.htm || 20.03. || 23.03. || 26.03. || Rebeka Dajčman || Klementina Polanec || Andreja Marija Belič
|-
| Liza Praznik ||Vpliv šaperono Skp in SurA na zvijanje proteinov FhuA v terciarno strukturo ||https://www.sciencedaily.com/releases/2015/09/150907113757.htm || 20.03. || 23.03. || 26.03. || Maja Škof || Karmen Mlinar || Barbara Jaklič
|-
| Anže Šumah || Razvoj genskega senzorja za uničevanje celic s pomanjkanjem proteina p53 || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/11/171114104201.htm || 20.03. || 23.03. || 26.03. || Tina Kolenc Milavec || Ula Nikolaja Ratajec || Eva Gartner
|-
| Neža Žerjav|| Dodajanje enega samega nukleotida omejuje aktivnost človeške telomeraze ||https://www.sciencedaily.com/releases/2018/02/180227142114.htm || 03.04. || 06.04. || 09.04. || Tina Zavodnik || Doroteja Armič || Martina Lokar
|-
| Urša Štrancar || Predstavitev združitve avtofagosoma in lizosoma s pomočjo supermolekularnega para FRET || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/02/180219103254.htm || 03.04. || 06.04. || 09.04. || Tadej Medved || Valeriya Musina || Nika Boštic
|-
| Zoja Siter || || || 03.04. || 06.04. || 09.04. || Neža Žerjav || Dea Simonič || Sumeja Kudelić
|-
| Aljaž Bratina || Intrinzična destabilizacija ribosoma || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/11/171120101314.htm || 03.04. || 06.04. || 09.04. || Anastasija Nechevska || Neža Štremfelj || Luka Gnidovec
|-
| Anamarija Agnič || ATP-aza P4 s premeščanjem fosfolipidov uravnava uvihanost membrane || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/03/180329141014.htm || 10.04. || 13.04. || 16.04. || Bogdan Jovićević || Sumeja Kudelić || Lara Hrvatin
|-
| Simona Gorgievska || Optical tools to detect metabolic changes linked to disease || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/03/180307161351.htm|| 10.04. || 13.04. || 16.04. || Polona Kalan || Marko Pavleković || Klementina Polanec
|-
| Matej Jereb || Gradnja človeške pluripotentne matične celice v funkcionalno skeletno mišično tkivo|| https://www.sciencedaily.com/releases/2018/01/180109104707.htm || 10.04. || 13.04. || 16.04. || Liza Praznik || Laura Gašperšič || Karmen Mlinar
|-
| Lara Drinovec || Tavrin pomaga obnoviti zaradi multiple skleroze poškodovane celice || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/12/171208143024.htm || 10.04. || 13.04. || 16.04. || Anže Šumah || Rebeka Dajčman || Ula Nikolaja Ratajec
|-
| Maks Kumek || Dinamični izvor sprememb specifčne toplote v encimsko kataliziranih reakcijah || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/03/180321090854.htm || 17.04. || 20.04. || 23.04. || Marko Pavleković || Maja Škof || Doroteja Armič
|-
| Neža Blaznik || Glikozilirana sialična kislina na protitelesu IgA inhibira virus influence tipa A || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/04/180403111203.htm || 17.04. || 20.04. || 23.04. || Urša Štrancar || Tina Kolenc Milavec || Valeriya Musina
|-
| Liza Ulčakar || Kombinirana DNA-RNA/antigen nanocepiva - učinkovita imunoterapevtska metoda ||https://www.sciencedaily.com/releases/2017/11/171129163851.htm || 17.04. || 20.04. || 23.04. || Zoja Siter || Tina Zavodnik || Dea Simonič
|-
| Anastasija Nechevska || || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/03/180319155730.htm || 17.04. || 20.04. || 23.04. || Aljaž Bratina || Tadej Medved || Neža Štremfelj
|-
| Jernej Imperl || Optimizacija protimikrobnih peptidov s pomočjo virtualnih metod || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/04/180416085922.htm || 23.04. || 26.04. || 07.05. || Anamarija Agnič || Neža Žerjav || Luka Gnidovec
|-
| Matija Ruparčič || Od strupenih kompleksov do zlatih zrnc s ''Cupriavidus metallidurans'' || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/01/180131095453.htm || 23.04. || 26.04. || 07.05. || Simona Gorgievska || Anastasija Nechevska || Marko Pavleković
|-
| Tiana Karmen Kokalj || B-1a limfociti spodbujajo oligodendrogenezo med razvojem možganov || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/03/180313091702.htm || 23.04. || 26.04. || 07.05. || Matej Jereb || Bogdan Jovićević || Laura Gašperšič
|-
| Meta Kodrič || || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/04/180416155619.htm || 23.04. || 26.04. || 07.05. || Lara Drinovec || Polona Kalan || Rebeka Dajčman
|-
| Ana Menegalija || METTL3 nova potencialna terapevtska tarča pri akutni mieloični levkemiji || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/11/171127135838.htm || 08.05. || 11.05. || 14.05. || Maks Kumek || Liza Praznik || Maja Škof
|-
| Andreja Marija Belič || || || 08.05. || 11.05. || 14.05. || Neža Blaznik || Anže Šumah || Tina Kolenc Milavec
|-
| Barbara Jaklič || I-motif DNA strukture nastajajo tudi v jedrih človeških celic || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/04/180423135054.htm || 08.05. || 11.05. || 14.05. || Liza Ulčakar || Meta Kodrič || Tina Zavodnik
|-
| Eva Gartner ||Vloga neobičajnega prohibitina pri regulaciji mitohondrijskega membranskega potenciala in razvoju malarije. ||https://www.sciencedaily.com/releases/2018/04/180418111615.htm || 08.05. || 11.05. || 14.05. || Gašper Komatar || Urša Štrancar || Tadej Medved
|-
| Martina Lokar || || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/03/180301144138.htm || 15.05. || 18.05. || 21.05. || Jernej Imperl || Zoja Siter || Neža Žerjav
|-
| Nika Boštic || ||https://www.sciencedaily.com/releases/2017/10/171030154424.htm || 15.05. || 18.05. || 21.05. || Matija Ruparčič || Aljaž Bratina || Anastasija Nechevska
|-
| Sumeja Kudelić || ||https://www.sciencedaily.com/releases/2017/12/171221122927.htm || 15.05. || 18.05. || 21.05. || Tiana Karmen Kokalj || Anamarija Agnič || Bogdan Jovićević
|-
| Luka Gnidovec || ||https://www.sciencedaily.com/releases/2017/11/171102124907.htm || 15.05. || 18.05. || 21.05. || Meta Kodrič || Simona Gorgievska || Polona Kalan
|-
| Lara Hrvatin || || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/01/180117131129.htm || 22.05. || 25.05. || 28.05. || Ana Menegalija || Matej Jereb || Liza Praznik
|-
| Klementina Polanec || || || 22.05. || 25.05. || 28.05. || Andreja Marija Belič || Lara Drinovec || Anže Šumah
|-
| Karmen Mlinar || || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/05/180501085533.htm || 22.05. || 25.05. || 28.05. || Barbara Jaklič || Maks Kumek || Gašper Komatar
|-
| Ula Nikolaja Ratajec || || || 22.05. || 25.05. || 28.05. || Eva Gartner || Neža Blaznik || Urša Štrancar
|-
| rezerva || || || 29.05. || 01.06. || 04.06. || || ||
|}

==Naloga==
* samostojno pripraviti seminar, katerega tema je novica iz področja biokemije na portalu [http://www.sciencedaily.com ScienceDaily], ki je bila objavljena kasneje kot 1. avgusta 2016. Osnova za seminar naj bo znanstveni članek, ki je podlaga za to novico. Poleg tega članka za seminar uporabite še najmanj pet drugih virov, od teh vsaj še dva druga znanstvena članka, ki se navezujeta na to vsebino.
* članke na temo lahko iščete [https://scholar.google.com/ z Google učenjakom].
* naslov izbrane teme in povezavo do novice vpišite v tabelo seminarjev takoj ko ste si izbrali temo, najkasneje pa en teden pred rokom za oddajo
* [[TBK2017 Povzetki seminarjev|Povzetek seminarja]] opišete na wikiju v približno 200 besedah - najkasneje do dne, ko morate oddati seminar recenzentom.
* Povezavo do povzetka vnesete v tabelo seminarjev tekočega letnika.
* Seminar pripravite v obliki seminarske naloge (pisava Cambria, font 11, enojni razmak, 2,5 cm robovi; tekst naj obsega okoli 1000 besed), vsebuje naj 1-2 sliki. Slika mora imeti legendo in v besedilu mora biti na ustreznem mestu sklic na sliko. Vse uporabljene vire citirajte v tekstu, kot npr. (Nobel, 2010), na koncu pa navedite točen seznam literature, kot je opisano spodaj!
*Celotni seminar naj obsega 2 strani A4 formata (po možnosti dvostransko tiskanje).
* Seminar oddajte do datuma oddaje, ki je naveden v tabeli v elektronski obliki z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/tbk/poslji/ tega obrazca].
* vsi seminarji so v elektronski obliki dostopni [http://bio.ijs.si/~zajec/tbk/poslji//bioseminar/ tukaj].
* Recenzenti do dneva določenega v tabeli določijo popravke in podajo oceno pisnega dela, v predpisanem formatu elektronskega obrazca na internetu.
* Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Za predstavitev je na voljo 12 minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni. Prvi recenzent vodi predstavitve in razpravo ter skrbi za to, da vse poteka v zastavljenih časovnih okvirih.
* Predstavitvi sledi razprava do 8 minut. Sledijo vprašanja prisotnih, recenzenti postavijo vsak vsaj dve vprašanji in na koncu podajo oceno predstavitve.
* En dan pred predstavitvijo na strežnik oddajte tudi končno verzijo. Na dan predstavitve morate oddati tudi končno (popravljeno) in natisnjeno verzijo seminarja v enem izvodu.
* Seminarska naloga in povzetek na wikiju morajo biti v slovenskem jeziku!

==Imena datotek==
Prosim vas, da vse datoteke, ki jih pošiljate poimenujete po spodnjih pravilih. Ne uporabljajte ČŽŠčžš!
Poslati morate naslednje datoteke:
* TBK_2018_Priimek_Ime.doc(x) za seminar, npr. TBK_2017_Guncar_Gregor.docx
* TBK_2018_Priimek_ime_final.doc(x) za končno verzijo seminarja
* TBK_2018_Priimek_Ime_rec_Priimek2.doc(x) za recenzijo, kjer je Priimek2 priimek recenzenta, npr. TBK_2017_Guncar_Gregor_rec_Scott.docx (če se pišete Scott in odajate recenzijo za seminar, ki ga je napisal Gunčar)
* TBK_2018_Priimek_Ime.ppt(x) za prezentacijo, npr TBK_2017_Guncar_Gregor.pptx
* TBK_2018_Priimek_Ime_clanek.pdf za datoteko PDF, ki vsebuje izvirni članek, npr. TBK_2017_Guncar_Gregor_clanek.pdf

==Ocenjevanje seminarjev==
Recenzenti ocenijo seminar tako, da izpolnijo [[https://docs.google.com/forms/d/1Hdg2OHCyG24qwLTnFt09yZTng46RIwaIiUqnKOdsJxQ/viewform recenzentsko poročilo]] na spletu.

== Mnenje o predstavitvi ==
Vsak posameznik '''mora''' oceniti seminar tako, da odda svoje [https://docs.google.com/forms/d/1VvE-jaKikfiDO5Gdybqgp9mf_0uJZfBbIK8PLXKDaS0/viewform mnenje] najkasneje v enem tednu po predstavitvi. Kdor na seminarju ni bil prisoten, mnenja '''ne sme''' oddati.

==Urejanje spletnih strani na wikiju==
Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''

==Faktor vpliva==
Faktor vpliva (angl. impact factor) neke revije pove, kolikokrat so bili v poprečju citirani članki v tej reviji v dveh letih skupaj pred objavo tega faktorja. Faktorje vpliva za posamezno revijo lahko najdete v [http://www.cobiss.si/scripts/cobiss?command=CONNECT&base=JCR COBISS-u]. V polje "Naslov revije" vnesite ime revije za katero želite izvedeti faktor vpliva in pritisnite na gumb POIŠČI. V skrajnem desnem stolpcu se bodo izpisali faktorji vpliva za revije, ki ustrezajo vašim iskalnim kriterijem. Zadetkov za posamezno revijo je več zato, ker so navedeni faktorji vpliva za posamezno leto. Za tekoče leto faktorji vpliva še niso objavljeni, zato se orientirajte po faktorjih vpliva zadnjih par let. Če faktorja vpliva za vašo izbrano revijo ne najdete v bazi COBISS, potem izberite članek iz kakšne druge revije.

==Citiranje virov==Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se v seminarju držite ene same. Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati. '''Citiranje knjig:''' Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica. Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN. Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005. Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4. Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.). '''Citiranje člankov:''' Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani. Lartigue C. ''et al''. Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, letn. 317, str. 632-638.Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole: Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani. Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.Revija Science uporablja skrajšani zapis: C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007) V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne). '''Citiranje spletnih virov:''' Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.

TBK2018-seminar

2018-05-05T14:29:04Z

Eva Gartner: /* Seznam seminarjev */

= Temelji biokemije- seminar =

Seminarje vodi prof. dr. Brigita Lenarčič. Seminarji so obvezni.

Ocena seminarjev (6-10) predstavlja enako število odstotkov, ki se prišteje h končni pisni oceni izpita.
Stran na strežniku s seminarskimi nalogami je zaščitena.
Uporabniško ime je: tbk, password pa: samozame## "##" sta dve številki, ki ju izveste na predavanjih.
Tudi za urejanje Wiki strani potrebujete geslo, ki se od zgornjega razlikuje. Postopek pridobitve Wiki uporabniškega imena in gesla je opisan [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Main_Page tukaj].

== Seznam seminarjev ==

{| border="1" cellpadding="4" cellspacing="0" style="border:#c9c9c9 1px solid; margin: 1em 1em 1em 0; border-collapse: collapse;"
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Ime in priimek'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Naslov seminarja'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Povezava'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Rok za oddajo'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Rok za recenzijo'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Datum predstavitve'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 1'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 2'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 3'''
|-
| Anna Scott||Moj naslov v slovenščini||http://www.bioscirep.org/content/36/1/e00291.long||28.10.||05.11.||07.11.||r1||r2||r3
|-
| Doroteja Armič || Pretvorba mišjih fibroblastov v pluripotentne matične celice s pomočjo tehnologije CRISPR || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/01/180118162449.htm || 27.02. || 02.03. || 05.03. || Martina Lokar || Liza Ulčakar || Zoja Siter
|-
| Valeriya Musina || Metalopeptid bakrov(II) fenantrolin tarčno onemogoči delovanje mitohondrijev v matičnih celicah raka dojke || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/12/171213124751.htm || 27.02. || 02.03. || 05.03. || Nika Boštic || Tiana Karmen Kokalj || Aljaž Bratina
|-
| Dea Simonič || Sprožilci avtoimunskih bolezni in vzroki za nekontrolirano širjenje le-teh po telesu ||https://www.sciencedaily.com/releases/2017/08/170824141207.htm|| 27.02. || 02.03. || 05.03. || Sumeja Kudelić || Jernej Imperl || Anamarija Agnič
|-
| Neža Štremfelj ||Delovanje inzulinskih receptorjev||https://www.sciencedaily.com/releases/2018/02/180219103256.htm|| 27.02. || 02.03. || 05.03. || Luka Gnidovec || Matija Ruparčič || Simona Gorgievska
|-
| Gašper Komatar || Tvorba kompleksa receptorjev ApoER2, ephirinB2 in AMPAR, ki jih povezuje GRIP1, sodeluje pri tvorbi spomina || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/10/171009093207.htm || 06.03. || 09.03. || 12.03. || Lara Hrvatin || Tiana Karmen Kokalj || Matej Jereb
|-
| Marko Pavleković || Prehajanje imunskih celic, povzročiteljic multiple skleroze, skozi krvno-možgansko pregrado || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/11/171121155811.htm || 06.03. || 09.03. || 12.03. || Klementina Polanec || Meta Kodrič || Lara Drinovec
|-
| Laura Gašperšič || Alzheimerjeva bolezen: povrnitev zmožnosti pomnjenja z inhibicijo interakcije med Sp3 in HDAC2 || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/08/170808150001.htm || 06.03. || 09.03. || 12.03. || Karmen Mlinar || Ana Menegalija || Maks Kumek
|-
| Rebeka Dajčman || Več mehanizmov poganja dinamiko kalcijevega signala okoli lasersko povzročene rane epitelija || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/10/171003124646.htm || 06.03. || 09.03. || 12.03. || Ula Nikolaja Ratajec || Andreja Marija Belič || Neža Blaznik
|-
| Maja Škof || Pomen S-proteinov pri prilagajanju koronavirusov na okolje. || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/11/171127105937.htm || 13.03. || 16.03. || 19.03. || Doroteja Armič || Barbara Jaklič || Liza Ulčakar
|-
| Tina Kolenc Milavec || Vezava kalcija na karboksilni konec α-sinukleina uravnava interakcije med sinaptičnimi vezikli || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/02/180219071758.htm || 13.03. || 16.03. || 19.03. || Valeriya Musina || Eva Gartner || Jana Rajchevska
|-
| Tina Zavodnik || Disfunkcionalni mitohondriji s pomočjo ROS zavirajo translacijsko aktivnost || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/02/180202112629.htm || 13.03. || 16.03. || 19.03. || Dea Simonič || Martina Lokar || Jernej Imperl
|-
| Tadej Medved || Identifikacija vezavnih mest proteinov WASP na aktinski ojedritveni kompleks Arp2/3 || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/03/180305130632.htm || 13.03. || 16.03. || 19.03. || Neža Štremfelj || Nika Boštic || Matija Ruparčič
|-
| Bogdan Jovićević || || || 20.03. || 23.03. || 26.03. || Laura Gašperšič || Lara Hrvatin || Ana Menegalija
|-
| Polona Kalan || || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/02/180214111055.htm || 20.03. || 23.03. || 26.03. || Rebeka Dajčman || Klementina Polanec || Andreja Marija Belič
|-
| Liza Praznik ||Vpliv šaperono Skp in SurA na zvijanje proteinov FhuA v terciarno strukturo ||https://www.sciencedaily.com/releases/2015/09/150907113757.htm || 20.03. || 23.03. || 26.03. || Maja Škof || Karmen Mlinar || Barbara Jaklič
|-
| Anže Šumah || Razvoj genskega senzorja za uničevanje celic s pomanjkanjem proteina p53 || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/11/171114104201.htm || 20.03. || 23.03. || 26.03. || Tina Kolenc Milavec || Ula Nikolaja Ratajec || Eva Gartner
|-
| Neža Žerjav|| Dodajanje enega samega nukleotida omejuje aktivnost človeške telomeraze ||https://www.sciencedaily.com/releases/2018/02/180227142114.htm || 03.04. || 06.04. || 09.04. || Tina Zavodnik || Doroteja Armič || Martina Lokar
|-
| Urša Štrancar || Predstavitev združitve avtofagosoma in lizosoma s pomočjo supermolekularnega para FRET || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/02/180219103254.htm || 03.04. || 06.04. || 09.04. || Tadej Medved || Valeriya Musina || Nika Boštic
|-
| Zoja Siter || || || 03.04. || 06.04. || 09.04. || Neža Žerjav || Dea Simonič || Sumeja Kudelić
|-
| Aljaž Bratina || Intrinzična destabilizacija ribosoma || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/11/171120101314.htm || 03.04. || 06.04. || 09.04. || Anastasija Nechevska || Neža Štremfelj || Luka Gnidovec
|-
| Anamarija Agnič || ATP-aza P4 s premeščanjem fosfolipidov uravnava uvihanost membrane || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/03/180329141014.htm || 10.04. || 13.04. || 16.04. || Bogdan Jovićević || Sumeja Kudelić || Lara Hrvatin
|-
| Simona Gorgievska || Optical tools to detect metabolic changes linked to disease || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/03/180307161351.htm|| 10.04. || 13.04. || 16.04. || Polona Kalan || Marko Pavleković || Klementina Polanec
|-
| Matej Jereb || Gradnja človeške pluripotentne matične celice v funkcionalno skeletno mišično tkivo|| https://www.sciencedaily.com/releases/2018/01/180109104707.htm || 10.04. || 13.04. || 16.04. || Liza Praznik || Laura Gašperšič || Karmen Mlinar
|-
| Lara Drinovec || Tavrin pomaga obnoviti zaradi multiple skleroze poškodovane celice || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/12/171208143024.htm || 10.04. || 13.04. || 16.04. || Anže Šumah || Rebeka Dajčman || Ula Nikolaja Ratajec
|-
| Maks Kumek || Dinamični izvor sprememb specifčne toplote v encimsko kataliziranih reakcijah || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/03/180321090854.htm || 17.04. || 20.04. || 23.04. || Marko Pavleković || Maja Škof || Doroteja Armič
|-
| Neža Blaznik || Glikozilirana sialična kislina na protitelesu IgA inhibira virus influence tipa A || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/04/180403111203.htm || 17.04. || 20.04. || 23.04. || Urša Štrancar || Tina Kolenc Milavec || Valeriya Musina
|-
| Liza Ulčakar || Kombinirana DNA-RNA/antigen nanocepiva - učinkovita imunoterapevtska metoda ||https://www.sciencedaily.com/releases/2017/11/171129163851.htm || 17.04. || 20.04. || 23.04. || Zoja Siter || Tina Zavodnik || Dea Simonič
|-
| Anastasija Nechevska || || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/03/180319155730.htm || 17.04. || 20.04. || 23.04. || Aljaž Bratina || Tadej Medved || Neža Štremfelj
|-
| Jernej Imperl || Optimizacija protimikrobnih peptidov s pomočjo virtualnih metod || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/04/180416085922.htm || 23.04. || 26.04. || 07.05. || Anamarija Agnič || Neža Žerjav || Luka Gnidovec
|-
| Matija Ruparčič || Od strupenih kompleksov do zlatih zrnc s ''Cupriavidus metallidurans'' || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/01/180131095453.htm || 23.04. || 26.04. || 07.05. || Simona Gorgievska || Anastasija Nechevska || Marko Pavleković
|-
| Tiana Karmen Kokalj || B-1a limfociti spodbujajo oligodendrogenezo med razvojem možganov || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/03/180313091702.htm || 23.04. || 26.04. || 07.05. || Matej Jereb || Bogdan Jovićević || Laura Gašperšič
|-
| Meta Kodrič || || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/04/180416155619.htm || 23.04. || 26.04. || 07.05. || Lara Drinovec || Polona Kalan || Rebeka Dajčman
|-
| Ana Menegalija || || || 08.05. || 11.05. || 14.05. || Maks Kumek || Liza Praznik || Maja Škof
|-
| Andreja Marija Belič || || || 08.05. || 11.05. || 14.05. || Neža Blaznik || Anže Šumah || Tina Kolenc Milavec
|-
| Barbara Jaklič || || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/02/180220161201.htm || 08.05. || 11.05. || 14.05. || Liza Ulčakar || Meta Kodrič || Tina Zavodnik
|-
| Eva Gartner || ||https://www.sciencedaily.com/releases/2018/04/180418111615.htm || 08.05. || 11.05. || 14.05. || Gašper Komatar || Urša Štrancar || Tadej Medved
|-
| Martina Lokar || || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/03/180301144138.htm || 15.05. || 18.05. || 21.05. || Jernej Imperl || Zoja Siter || Neža Žerjav
|-
| Nika Boštic || || || 15.05. || 18.05. || 21.05. || Matija Ruparčič || Aljaž Bratina || Anastasija Nechevska
|-
| Sumeja Kudelić || ||https://www.sciencedaily.com/releases/2017/12/171221122927.htm || 15.05. || 18.05. || 21.05. || Tiana Karmen Kokalj || Anamarija Agnič || Bogdan Jovićević
|-
| Luka Gnidovec || ||https://www.sciencedaily.com/releases/2017/11/171102124907.htm || 15.05. || 18.05. || 21.05. || Meta Kodrič || Simona Gorgievska || Polona Kalan
|-
| Lara Hrvatin || || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/01/180117131129.htm || 22.05. || 25.05. || 28.05. || Ana Menegalija || Matej Jereb || Liza Praznik
|-
| Klementina Polanec || || || 22.05. || 25.05. || 28.05. || Andreja Marija Belič || Lara Drinovec || Anže Šumah
|-
| Karmen Mlinar || || || 22.05. || 25.05. || 28.05. || Barbara Jaklič || Maks Kumek || Gašper Komatar
|-
| Ula Nikolaja Ratajec || || || 22.05. || 25.05. || 28.05. || Eva Gartner || Neža Blaznik || Urša Štrancar
|-
| rezerva || || || 29.05. || 01.06. || 04.06. || || ||
|}

==Naloga==
* samostojno pripraviti seminar, katerega tema je novica iz področja biokemije na portalu [http://www.sciencedaily.com ScienceDaily], ki je bila objavljena kasneje kot 1. avgusta 2016. Osnova za seminar naj bo znanstveni članek, ki je podlaga za to novico. Poleg tega članka za seminar uporabite še najmanj pet drugih virov, od teh vsaj še dva druga znanstvena članka, ki se navezujeta na to vsebino.
* članke na temo lahko iščete [https://scholar.google.com/ z Google učenjakom].
* naslov izbrane teme in povezavo do novice vpišite v tabelo seminarjev takoj ko ste si izbrali temo, najkasneje pa en teden pred rokom za oddajo
* [[TBK2017 Povzetki seminarjev|Povzetek seminarja]] opišete na wikiju v približno 200 besedah - najkasneje do dne, ko morate oddati seminar recenzentom.
* Povezavo do povzetka vnesete v tabelo seminarjev tekočega letnika.
* Seminar pripravite v obliki seminarske naloge (pisava Cambria, font 11, enojni razmak, 2,5 cm robovi; tekst naj obsega okoli 1000 besed), vsebuje naj 1-2 sliki. Slika mora imeti legendo in v besedilu mora biti na ustreznem mestu sklic na sliko. Vse uporabljene vire citirajte v tekstu, kot npr. (Nobel, 2010), na koncu pa navedite točen seznam literature, kot je opisano spodaj!
*Celotni seminar naj obsega 2 strani A4 formata (po možnosti dvostransko tiskanje).
* Seminar oddajte do datuma oddaje, ki je naveden v tabeli v elektronski obliki z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/tbk/poslji/ tega obrazca].
* vsi seminarji so v elektronski obliki dostopni [http://bio.ijs.si/~zajec/tbk/poslji//bioseminar/ tukaj].
* Recenzenti do dneva določenega v tabeli določijo popravke in podajo oceno pisnega dela, v predpisanem formatu elektronskega obrazca na internetu.
* Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Za predstavitev je na voljo 12 minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni. Prvi recenzent vodi predstavitve in razpravo ter skrbi za to, da vse poteka v zastavljenih časovnih okvirih.
* Predstavitvi sledi razprava do 8 minut. Sledijo vprašanja prisotnih, recenzenti postavijo vsak vsaj dve vprašanji in na koncu podajo oceno predstavitve.
* En dan pred predstavitvijo na strežnik oddajte tudi končno verzijo. Na dan predstavitve morate oddati tudi končno (popravljeno) in natisnjeno verzijo seminarja v enem izvodu.
* Seminarska naloga in povzetek na wikiju morajo biti v slovenskem jeziku!

==Imena datotek==
Prosim vas, da vse datoteke, ki jih pošiljate poimenujete po spodnjih pravilih. Ne uporabljajte ČŽŠčžš!
Poslati morate naslednje datoteke:
* TBK_2018_Priimek_Ime.doc(x) za seminar, npr. TBK_2017_Guncar_Gregor.docx
* TBK_2018_Priimek_ime_final.doc(x) za končno verzijo seminarja
* TBK_2018_Priimek_Ime_rec_Priimek2.doc(x) za recenzijo, kjer je Priimek2 priimek recenzenta, npr. TBK_2017_Guncar_Gregor_rec_Scott.docx (če se pišete Scott in odajate recenzijo za seminar, ki ga je napisal Gunčar)
* TBK_2018_Priimek_Ime.ppt(x) za prezentacijo, npr TBK_2017_Guncar_Gregor.pptx
* TBK_2018_Priimek_Ime_clanek.pdf za datoteko PDF, ki vsebuje izvirni članek, npr. TBK_2017_Guncar_Gregor_clanek.pdf

==Ocenjevanje seminarjev==
Recenzenti ocenijo seminar tako, da izpolnijo [[https://docs.google.com/forms/d/1Hdg2OHCyG24qwLTnFt09yZTng46RIwaIiUqnKOdsJxQ/viewform recenzentsko poročilo]] na spletu.

== Mnenje o predstavitvi ==
Vsak posameznik '''mora''' oceniti seminar tako, da odda svoje [https://docs.google.com/forms/d/1VvE-jaKikfiDO5Gdybqgp9mf_0uJZfBbIK8PLXKDaS0/viewform mnenje] najkasneje v enem tednu po predstavitvi. Kdor na seminarju ni bil prisoten, mnenja '''ne sme''' oddati.

==Urejanje spletnih strani na wikiju==
Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''

==Faktor vpliva==
Faktor vpliva (angl. impact factor) neke revije pove, kolikokrat so bili v poprečju citirani članki v tej reviji v dveh letih skupaj pred objavo tega faktorja. Faktorje vpliva za posamezno revijo lahko najdete v [http://www.cobiss.si/scripts/cobiss?command=CONNECT&base=JCR COBISS-u]. V polje "Naslov revije" vnesite ime revije za katero želite izvedeti faktor vpliva in pritisnite na gumb POIŠČI. V skrajnem desnem stolpcu se bodo izpisali faktorji vpliva za revije, ki ustrezajo vašim iskalnim kriterijem. Zadetkov za posamezno revijo je več zato, ker so navedeni faktorji vpliva za posamezno leto. Za tekoče leto faktorji vpliva še niso objavljeni, zato se orientirajte po faktorjih vpliva zadnjih par let. Če faktorja vpliva za vašo izbrano revijo ne najdete v bazi COBISS, potem izberite članek iz kakšne druge revije.

==Citiranje virov==Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se v seminarju držite ene same. Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati. '''Citiranje knjig:''' Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica. Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN. Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005. Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4. Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.). '''Citiranje člankov:''' Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani. Lartigue C. ''et al''. Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, letn. 317, str. 632-638.Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole: Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani. Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.Revija Science uporablja skrajšani zapis: C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007) V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne). '''Citiranje spletnih virov:''' Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.