Wiki FKKT - User contributions [en]

Povezava sintezne in sistemske biologije za in vivo encimatiko

2025-05-12T12:01:36Z

Gaja Starc: /* In vivo določanje parametrov za fitoen sintazo iz bakterije Pantoea ananas (PaCrtB) */

Izhodiščni članek: [https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/39322757/ Combining systems and synthetic biology for in vivo enzymology]

== Uvod ==
Določanje kinetičnih parametrov encimov najpogosteje temelji na merjenju reakcijske hitrosti ob spreminjanju koncentracije substrata. Pri tem razpon koncentracij substrata običajno obsega vsaj 2 velikostna reda. Na ta način je mogoče določiti afiniteto encima do substrata, ki jo opredeljuje Michaelis-Mentenina konstanta (''KM''), in aktivnost encima, ki jo določata maksimalna reakcijska hitrost (''vmax'') in pretvorbeno število (''kcat''). Klasičen pristop določanja kinetičnih parametrov vključuje izvedbo reakcije v ''in vitro'' pogojih, ki se močno razlikujejo od tistih v notranjosti celice. Namesto heterogene in nagnetene raztopine različnih makromolekul in organelov se reakcije običajno izvaja na (delno) čistih proteinskih vzorcih, ki so del razredčene puferske raztopine. Poleg tega v celicah razmejitve in kompartmentalizcija vplivajo na variacije v koncentraciji substrata, produkta in spremembe difuzijskih koeficientov. Problem predstavlja tudi ''in vitro'' študij membranskih in multimernih proteinov. Običajno jih je zahtevno očistiti, optimizacija testov aktivnosti pa je kompleksna, saj pogosto zahteva prisotnost umetnih membran. Pogoste so tudi razlike med rezultati pridobljenimi v sistemih, kjer se substrat dodaja v reakcijsko mešanico v primerjavi s tistimi pri katerih je substrat pridobljen iz metabolizma [1].

== Karotenoidna sintezna pot ==
Razumevanje encimske kinetike je pomembno za celostno razumevanje metabolnih poti. Velik pomen pa ima tudi za razumevanje encimskih poti, ki se uporabljajo v industrijskih procesih. Primer takšne poti je karotenoidna sintezna pot [1]. Karotenoidna pot nativno poteka v različnih organizmih – denimo v nekaterih rastlinah, bakterijah in glivah. Številni rastlinski apokarotenoidi, ki so produkt encimskih cepitev karotenoidov, obsegajo pigmente, arome in spojine z vonjem, ki se pogosto uporabljajo v prehranski industriji [2]. V kvasovki ''Saccharomyces cerevisiae'' nativno ne poteka je pa sintetična pot v tej industrijsko pomembni biotehnološki šasiji zanimiva na področjih vse od proizvodnje hrane do zdravil [1].
Številni encimi udeleženi v karotenoidno pot so povezani z membrano (ang. membrane-associated), kar otežuje študij kinetike pripadajočih reakcij. Dva izmed encimov pri katerih je študij v ''in vitro'' pogojih otežen sta fitoen sintaza (CrtB; EC 2.5.1.32) in fitoen desaturaza (CrtI; EC 1.3.99.31). Fitoen sintaza je prvi encim sintetične poti in hkrati encim, ki predstavlja ozko grlo v sintezi karotenoidov v rastlinah. Encim katalizira kondenzacijo 2 molekul geranilgeranil pirofosfata (GGPP), ki sta obrnjeni ena proti drugi (ang. head-to-head), pri čemer nastane fitoen. Sintezi fitoena sledijo tri nenasičenja, rezultat katerih je molekula likopena. Pri rastlinah in cianobakterijah so v pretvorbo udeleženi štirje encimi, pri nefotosintetskih bakterijah in glivah pa le en - fitoen deasturaza [1, 2].

== Zasnova in namen ==
Castaño-Cerezo ''et al'' so za razvoj novega sistema za ''in vivo'' encimatiko posegli po orodjih sintezne in sistemske biologije. Sintezno biologijo so uporabili za namen spreminjanja moči promotorjev in števila kopij zapisov za posamezne encime, kar jim je omogočilo variiranje koncentracije substrata direktno v celicah preko spreminjanja koncentracije encima udeleženega v njegovo sintezo. Sistemska biologija jim je preko integracije rezultatov genomike, proteomike in metabolomike omogočila vpogled v interakcije in celovitost procesov v bioloških sistemih [1].

== Priprava sevov ==
Pristop so uporabili za študij sintetične karotenoidne poti v ''Saccharomyces cerevisiae''. Za namen študija encimov udeleženih v karotenoidno pot so vzpostavili seve kvasovk, ki omogočajo variacijo v količini substrata GGPP. Seve so pripravili s spreminjanjem seva CEN.PK2-1C. Pred pripravo tovrstnih sevov so sintezo GGPP povečali z upravljanjem nativne terpenske poti. Na ta način so pripravili sev yENZ15 v katerem sta zapis za farnezil pirofosfat (FPP) sintazo (''ERG20'') in skrajšana oblika zapisa za 3-hidroksi-3-metilglutaril-koencim A reduktazo 1 (''tHMG1'') močno konstitutivno izražena. Poleg tega pa vsebuje delecijo zapisa za glavno fosfatazo, ki odstranjuje pirofosfatne skupine iz GGPP in FPP. Sledila je vzpostavitev treh različnih integracijskih kaset, ki so vsebovale različne mikrobne GGPP sintaze pod različnimi konstitutivnimi promotorji, ki so jih integrirali v genom yENZ15. Tako so proizvedli set sevov ustvarjenih za sintezo razpona koncentracij GGPP. Koncentracija GGPP je v pripravljenih sevih variirala za faktor 38, njihove hitrosti rasti so bile primerljive (0,40±0,03 h-1), kar kaže na odsotnost sprememb v fiziologiji sevov [1].

Vsaka merjena koncentracija substrata je izvirala iz specifično pripravljenega seva, kjer je zapis za encim udeležen v sintezo substrata izražen na določeni ravni. Seve so nato gojili v pogojih dinamičnega ravnotežja (eksponentna rast), kjer pretok (ang. flux; analog hitrosti reakcije) in koncentracije metabolitov ostajajo konstantni. Stabilnost zaradi vzpostavljenega dinamičnega ravnotežja tako omogoča natančno meritev pretoka reakcije [1].

== ''In vivo'' določanje parametrov za fitoen sintazo iz bakterije ''Pantoea ananas'' (PaCrtB) ==
Za določitev optimalne koncentracije encima za izvedbo kinetičnih testov so izvedli simulacije, pri katerih so upoštevali tri različne koncentracije encima (nizko, srednjo in visoko) pri širokem razponu v pretoku nastajanja substrata (ang. substrate-producing flux). Nato so analogen pristop uporabili tudi za določanje nasičenosti encima s substratom. Izbrali so tri različne konstitutivne promotorje – TEFmut2 za nizko, PGI1 za srednje in PDC1 za močno izražanje ''crtB''. Skladno z rezultati simulacij je koncentracija GGPP padala z višanjem aktivnosti PaCrtB, ob močnejšem izražanju PaCrtB pa je naraščal pretok nastajanja fitoena. Previsoka koncentracija PaCrtB je ovirala nasičenje encima s substratom in s tem onemogočila določitev kinetičnih parametrov. Nizka koncentracija pa je zaradi počasnega nastajanja fitoena otežila natančnost meritev, saj je bila koncentracija nastalega fitoena prenizka za natančno kvantifikacijo. Natančno meritev so dosegli le pri srednjem izražanju encima, zato so za nadaljnje meritve uporabili promotor PGI1 [1].

V vzpostavljenih sevih so dosegli 167× variacijo v koncentraciji GGPP. Dosegli so tudi delno nasičenje, kar je vodilo v nelinearen odnos med pretokom nastajanja fitoena in koncentracijo GGPP, ki je značilen tudi za klasične ''in vitro'' eksperimente. S prileganjem rezultatov na ireverzibilen Michaelis-Mentenin model so določilo natančne ocene kinetičnih parametrov ''K1/2cell'' (19±3 µM),''vmaxcell'' (849±71 µM/h). Afiniteta PaCrtB do GGPP je bila višja od ''in vitro'' določene (''KM'' = 41 µM), kar kaže na pomen določanja parametrov direktno v celicah [1, 3]. Pretvorbeno število 6±1 s−1, ki so ga pridobili na osnovi meritev koncentracije encima s pomočjo kvantitativne proteomike (42 nM) v sevih, kjer je PaCrtB pod kontrolo promotorja PGI1, pa je primerljiva ''in vitro'' vrednostim za encim ''Pantoea agglomerans'' [1].

== ''In vivo'' karakterizacija fitoen desaturaz ==
Najbolj zamuden del predstavljenega pristopa zajema molekulsko kloniranje in inženiring velikega števila različnih sevov. Zato so si sistem zamislili na način, ki omogoča enostavno recikliranje in uporabo sevov za analizo encimov, ki v metabolni poti nastopijo kasneje. Pripravljene seve so spremenili z integracijo ''crtB'' pod nadzorom promotorja PDC1, ki omogoča močno izražanje. Tako so dosegli 430× razpon v koncentraciji fitoena, kar jim je omogočilo ''in vivo'' študij naslednjega encima v metabolni poti. Želeli so določiti kinetične parametre treh pogosto uporabljenih fitoen desaturaz – CrtI iz bakterije ''P. ananas'' (PaCrtI), za katero so objavljeni ''in vitro'' encimski parametri, in CrtI iz gliv ''Phaffia rhodozyma'' (starejše ''Xanthophyllomyces dendrorhous'', XdCrtI) in ''Blakeslea trispora'' (BtCrtI), ki se pogosto uporabljata za sintezo karotenoidov, vendar kinetični parametri zanju še niso bili določeni. Za izražanje vsake izmed njih so uporabili drugačen promotor, v povezavi s z relativnimi zmožnostmi sinteze likopena v ''Saccharomyces cerevisiae''. Uporaba primernega promotorja je bila še posebej pomembna ob uporabi encima BtCrtI. Visoke koncentracije te fitoen desaturaze so v eksponentni fazi vodile v celično smrt zaradi tvorbe kristalov likopena. Prav tako je bil BtCrtI edini encim, koncentracija katerega je bila odvisna od koncentracije fitoena (koncentracija encima je bila višja v prisotnosti nižje koncentracije substrata). Kljub višji koncentraciji PaCrtI (uporaba promotorja TDH3), v primerjavi z obema fitoen desaturazama gliv, je bila hitrost nastajanja likopena ob uporabi tega encima približno 10× nižja kot pri ostalih dveh. Koncentracija fitoena je bila v tem primeru prenizka za nasičenje, kljub večjem razponu koncentracij substrata kot v ''in vitro'' raziskavah. Rezultate si lahko interpretiramo kot razliko v afiniteti encimov, ki so znotraj celice vezani na membrane in tistih udeleženih v ''in vitro'' encimskih reakcijah. Razlike pa so lahko tudi posledica dostopnosti substrata, vpliva drugih metabolnih poti, ki se v celici odvijajo hkrati itn. Tudi v tem primeru so rezultate prilegali na ireverzibilen Michaelis-Mentenin model, določili pa so le vrednosti ''K1/2cell'' in ''vmaxcell'' za fitoen desaturazi iz gliv (pri PaCrtI so eksperimentalni podatki omogočali le določitev spodnje meje). Maksimalna hitrost reakcije je bila pri BtCrtI (309±22 µM·h−1) približno 2× višja kot pri XdCrtI. Prav tako je imel ta encim približno 9× višjo afiniteto do substrata (41±12 µM) [1].

== Zaključek ==
V sklopu raziskave so Castaño-Cerezo ''et al'' uspešno določili ''in vivo'' analoge Michaelis-Menteninih parametrov za fitoen sintazo PaCrtB in osvetlili razlike med ''in vivo'' ter ''in vitro'' parametri. S pomočjo istega nabora sevov so uspešno določili še encimske parametre dveh izmed treh analiziranih fitoen desaturaz. Uporabljena metoda torej ponuja možnost za optimizacijo naravnih in sintetičnih sinteznih poti ''in vivo''. Vseeno je potrebno pridobljene parametre (tako kot v ''in vitro'' testih), bolj kot konstanto, obravnavati kot funkcijo mikrookolja v katerem se encimi nahajajo [1].

== Literatura ==
[1] S. Castaño-Cerezo, A. Chamas, H. Kulyk, C. Treitz, F. Bellvert, A. Tholey, V. Galéote, C. Camarasa, S. Heux, L. F. Garcia-Alles, idr.: Combining systems and synthetic biology for in vivo enzymology. EMBO J. 2024, 43, 5169–5185.

[2] J. López, D. Bustos, C. Camilo, N. Arenas, P. A. Saa, E. Agosin: Engineering Saccharomyces cerevisiae for the Overproduction of β-Ionone and Its Precursor β-Carotene. Front. Bioeng. Biotechnol. 2020, 8.

[3] U. Neudert, I. M. Martı́nez-Férez, P. D. Fraser, G. Sandmann: Expression of an active phytoene synthase from Erwinia uredovora and biochemical properties of the enzyme. Biochim. Biophys. Acta BBA - Lipids Lipid Metab. 1998, 1392, 51–58.

Povezava sintezne in sistemske biologije za in vivo encimatiko

2025-05-12T10:28:07Z

Gaja Starc:

Izhodiščni članek: [https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/39322757/ Combining systems and synthetic biology for in vivo enzymology]

== Uvod ==
Določanje kinetičnih parametrov encimov najpogosteje temelji na merjenju reakcijske hitrosti ob spreminjanju koncentracije substrata. Pri tem razpon koncentracij substrata običajno obsega vsaj 2 velikostna reda. Na ta način je mogoče določiti afiniteto encima do substrata, ki jo opredeljuje Michaelis-Mentenina konstanta (''KM''), in aktivnost encima, ki jo določata maksimalna reakcijska hitrost (''vmax'') in pretvorbeno število (''kcat''). Klasičen pristop določanja kinetičnih parametrov vključuje izvedbo reakcije v ''in vitro'' pogojih, ki se močno razlikujejo od tistih v notranjosti celice. Namesto heterogene in nagnetene raztopine različnih makromolekul in organelov se reakcije običajno izvaja na (delno) čistih proteinskih vzorcih, ki so del razredčene puferske raztopine. Poleg tega v celicah razmejitve in kompartmentalizcija vplivajo na variacije v koncentraciji substrata, produkta in spremembe difuzijskih koeficientov. Problem predstavlja tudi ''in vitro'' študij membranskih in multimernih proteinov. Običajno jih je zahtevno očistiti, optimizacija testov aktivnosti pa je kompleksna, saj pogosto zahteva prisotnost umetnih membran. Pogoste so tudi razlike med rezultati pridobljenimi v sistemih, kjer se substrat dodaja v reakcijsko mešanico v primerjavi s tistimi pri katerih je substrat pridobljen iz metabolizma [1].

== Karotenoidna sintezna pot ==
Razumevanje encimske kinetike je pomembno za celostno razumevanje metabolnih poti. Velik pomen pa ima tudi za razumevanje encimskih poti, ki se uporabljajo v industrijskih procesih. Primer takšne poti je karotenoidna sintezna pot [1]. Karotenoidna pot nativno poteka v različnih organizmih – denimo v nekaterih rastlinah, bakterijah in glivah. Številni rastlinski apokarotenoidi, ki so produkt encimskih cepitev karotenoidov, obsegajo pigmente, arome in spojine z vonjem, ki se pogosto uporabljajo v prehranski industriji [2]. V kvasovki ''Saccharomyces cerevisiae'' nativno ne poteka je pa sintetična pot v tej industrijsko pomembni biotehnološki šasiji zanimiva na področjih vse od proizvodnje hrane do zdravil [1].
Številni encimi udeleženi v karotenoidno pot so povezani z membrano (ang. membrane-associated), kar otežuje študij kinetike pripadajočih reakcij. Dva izmed encimov pri katerih je študij v ''in vitro'' pogojih otežen sta fitoen sintaza (CrtB; EC 2.5.1.32) in fitoen desaturaza (CrtI; EC 1.3.99.31). Fitoen sintaza je prvi encim sintetične poti in hkrati encim, ki predstavlja ozko grlo v sintezi karotenoidov v rastlinah. Encim katalizira kondenzacijo 2 molekul geranilgeranil pirofosfata (GGPP), ki sta obrnjeni ena proti drugi (ang. head-to-head), pri čemer nastane fitoen. Sintezi fitoena sledijo tri nenasičenja, rezultat katerih je molekula likopena. Pri rastlinah in cianobakterijah so v pretvorbo udeleženi štirje encimi, pri nefotosintetskih bakterijah in glivah pa le en - fitoen deasturaza [1, 2].

== Zasnova in namen ==
Castaño-Cerezo ''et al'' so za razvoj novega sistema za ''in vivo'' encimatiko posegli po orodjih sintezne in sistemske biologije. Sintezno biologijo so uporabili za namen spreminjanja moči promotorjev in števila kopij zapisov za posamezne encime, kar jim je omogočilo variiranje koncentracije substrata direktno v celicah preko spreminjanja koncentracije encima udeleženega v njegovo sintezo. Sistemska biologija jim je preko integracije rezultatov genomike, proteomike in metabolomike omogočila vpogled v interakcije in celovitost procesov v bioloških sistemih [1].

== Priprava sevov ==
Pristop so uporabili za študij sintetične karotenoidne poti v ''Saccharomyces cerevisiae''. Za namen študija encimov udeleženih v karotenoidno pot so vzpostavili seve kvasovk, ki omogočajo variacijo v količini substrata GGPP. Seve so pripravili s spreminjanjem seva CEN.PK2-1C. Pred pripravo tovrstnih sevov so sintezo GGPP povečali z upravljanjem nativne terpenske poti. Na ta način so pripravili sev yENZ15 v katerem sta zapis za farnezil pirofosfat (FPP) sintazo (''ERG20'') in skrajšana oblika zapisa za 3-hidroksi-3-metilglutaril-koencim A reduktazo 1 (''tHMG1'') močno konstitutivno izražena. Poleg tega pa vsebuje delecijo zapisa za glavno fosfatazo, ki odstranjuje pirofosfatne skupine iz GGPP in FPP. Sledila je vzpostavitev treh različnih integracijskih kaset, ki so vsebovale različne mikrobne GGPP sintaze pod različnimi konstitutivnimi promotorji, ki so jih integrirali v genom yENZ15. Tako so proizvedli set sevov ustvarjenih za sintezo razpona koncentracij GGPP. Koncentracija GGPP je v pripravljenih sevih variirala za faktor 38, njihove hitrosti rasti so bile primerljive (0,40±0,03 h-1), kar kaže na odsotnost sprememb v fiziologiji sevov [1].

Vsaka merjena koncentracija substrata je izvirala iz specifično pripravljenega seva, kjer je zapis za encim udeležen v sintezo substrata izražen na določeni ravni. Seve so nato gojili v pogojih dinamičnega ravnotežja (eksponentna rast), kjer pretok (ang. flux; analog hitrosti reakcije) in koncentracije metabolitov ostajajo konstantni. Stabilnost zaradi vzpostavljenega dinamičnega ravnotežja tako omogoča natančno meritev pretoka reakcije [1].

== ''In vivo'' določanje parametrov za fitoen sintazo iz bakterije ''Pantoea ananas'' (PaCrtB) ==
Za določitev optimalne koncentracije encima za izvedbo kinetičnih testov so izvedli simulacije, pri katerih so upoštevali tri različne koncentracije encima (nizko, srednjo in visoko) pri širokem razponu v pretoku nastajanja produkta (ang. substrate-producing flux). Nato so analogen pristop uporabili tudi za določanje nasičenosti encima s substratom. Izbrali so tri različne konstitutivne promotorje – TEFmut2 za nizko, PGI1 za srednje in PDC1 za močno izražanje ''crtB''. Skladno z rezultati simulacij je koncentracija GGPP padala z višanjem aktivnosti PaCrtB, ob močnejšem izražanju PaCrtB pa je naraščal pretok nastajanja fitoena. Previsoka koncentracija PaCrtB je ovirala nasičenje encima s substratom in s tem onemogočila določitev kinetičnih parametrov. Nizka koncentracija pa je zaradi počasnega nastajanja fitoena otežila natančnost meritev, saj je bila koncentracija nastalega fitoena prenizka za natančno kvantifikacijo. Natančno meritev so dosegli le pri srednjem izražanju encima, zato so za nadaljnje meritve uporabili promotor PGI1 [1].

V vzpostavljenih sevih so dosegli 167× variacijo v koncentraciji GGPP. Dosegli so tudi delno nasičenje, kar je vodilo v nelinearen odnos med pretokom nastajanja fitoena in koncentracijo GGPP, ki je značilen tudi za klasične ''in vitro'' eksperimente. S prileganjem rezultatov na ireverzibilen Michaelis-Mentenin model so določilo natančne ocene kinetičnih parametrov ''K1/2cell'' (19±3 µM),''vmaxcell'' (849±71 µM/h). Afiniteta PaCrtB do GGPP je bila višja od ''in vitro'' določene (''KM'' = 41 µM), kar kaže na pomen določanja parametrov direktno v celicah [1, 3]. Pretvorbeno število 6±1 s−1, ki so ga pridobili na osnovi meritev koncentracije encima s pomočjo kvantitativne proteomike (42 nM) v sevih, kjer je PaCrtB pod kontrolo promotorja PGI1, pa je primerljiva ''in vitro'' vrednostim za encim ''Pantoea agglomerans'' [1].

== ''In vivo'' karakterizacija fitoen desaturaz ==
Najbolj zamuden del predstavljenega pristopa zajema molekulsko kloniranje in inženiring velikega števila različnih sevov. Zato so si sistem zamislili na način, ki omogoča enostavno recikliranje in uporabo sevov za analizo encimov, ki v metabolni poti nastopijo kasneje. Pripravljene seve so spremenili z integracijo ''crtB'' pod nadzorom promotorja PDC1, ki omogoča močno izražanje. Tako so dosegli 430× razpon v koncentraciji fitoena, kar jim je omogočilo ''in vivo'' študij naslednjega encima v metabolni poti. Želeli so določiti kinetične parametre treh pogosto uporabljenih fitoen desaturaz – CrtI iz bakterije ''P. ananas'' (PaCrtI), za katero so objavljeni ''in vitro'' encimski parametri, in CrtI iz gliv ''Phaffia rhodozyma'' (starejše ''Xanthophyllomyces dendrorhous'', XdCrtI) in ''Blakeslea trispora'' (BtCrtI), ki se pogosto uporabljata za sintezo karotenoidov, vendar kinetični parametri zanju še niso bili določeni. Za izražanje vsake izmed njih so uporabili drugačen promotor, v povezavi s z relativnimi zmožnostmi sinteze likopena v ''Saccharomyces cerevisiae''. Uporaba primernega promotorja je bila še posebej pomembna ob uporabi encima BtCrtI. Visoke koncentracije te fitoen desaturaze so v eksponentni fazi vodile v celično smrt zaradi tvorbe kristalov likopena. Prav tako je bil BtCrtI edini encim, koncentracija katerega je bila odvisna od koncentracije fitoena (koncentracija encima je bila višja v prisotnosti nižje koncentracije substrata). Kljub višji koncentraciji PaCrtI (uporaba promotorja TDH3), v primerjavi z obema fitoen desaturazama gliv, je bila hitrost nastajanja likopena ob uporabi tega encima približno 10× nižja kot pri ostalih dveh. Koncentracija fitoena je bila v tem primeru prenizka za nasičenje, kljub večjem razponu koncentracij substrata kot v ''in vitro'' raziskavah. Rezultate si lahko interpretiramo kot razliko v afiniteti encimov, ki so znotraj celice vezani na membrane in tistih udeleženih v ''in vitro'' encimskih reakcijah. Razlike pa so lahko tudi posledica dostopnosti substrata, vpliva drugih metabolnih poti, ki se v celici odvijajo hkrati itn. Tudi v tem primeru so rezultate prilegali na ireverzibilen Michaelis-Mentenin model, določili pa so le vrednosti ''K1/2cell'' in ''vmaxcell'' za fitoen desaturazi iz gliv (pri PaCrtI so eksperimentalni podatki omogočali le določitev spodnje meje). Maksimalna hitrost reakcije je bila pri BtCrtI (309±22 µM·h−1) približno 2× višja kot pri XdCrtI. Prav tako je imel ta encim približno 9× višjo afiniteto do substrata (41±12 µM) [1].

== Zaključek ==
V sklopu raziskave so Castaño-Cerezo ''et al'' uspešno določili ''in vivo'' analoge Michaelis-Menteninih parametrov za fitoen sintazo PaCrtB in osvetlili razlike med ''in vivo'' ter ''in vitro'' parametri. S pomočjo istega nabora sevov so uspešno določili še encimske parametre dveh izmed treh analiziranih fitoen desaturaz. Uporabljena metoda torej ponuja možnost za optimizacijo naravnih in sintetičnih sinteznih poti ''in vivo''. Vseeno je potrebno pridobljene parametre (tako kot v ''in vitro'' testih), bolj kot konstanto, obravnavati kot funkcijo mikrookolja v katerem se encimi nahajajo [1].

== Literatura ==
[1] S. Castaño-Cerezo, A. Chamas, H. Kulyk, C. Treitz, F. Bellvert, A. Tholey, V. Galéote, C. Camarasa, S. Heux, L. F. Garcia-Alles, idr.: Combining systems and synthetic biology for in vivo enzymology. EMBO J. 2024, 43, 5169–5185.

[2] J. López, D. Bustos, C. Camilo, N. Arenas, P. A. Saa, E. Agosin: Engineering Saccharomyces cerevisiae for the Overproduction of β-Ionone and Its Precursor β-Carotene. Front. Bioeng. Biotechnol. 2020, 8.

[3] U. Neudert, I. M. Martı́nez-Férez, P. D. Fraser, G. Sandmann: Expression of an active phytoene synthase from Erwinia uredovora and biochemical properties of the enzyme. Biochim. Biophys. Acta BBA - Lipids Lipid Metab. 1998, 1392, 51–58.

Povezava sintezne in sistemske biologije za in vivo encimatiko

2025-05-12T10:26:33Z

Gaja Starc:

Izhodiščni članek: [https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/39322757/ Combining systems and synthetic biology for in vivo enzymology]

== Uvod ==
Določanje kinetičnih parametrov encimov najpogosteje temelji na merjenju reakcijske hitrosti ob spreminjanju koncentracije substrata. Pri tem razpon koncentracij substrata običajno obsega vsaj 2 velikostna reda. Na ta način je mogoče določiti afiniteto encima do substrata, ki jo opredeljuje Michaelis-Mentenina konstanta (''KM''), in aktivnost encima, ki jo določata maksimalna reakcijska hitrost (''vmax'') in pretvorbeno število (''kcat''). Klasičen pristop določanja kinetičnih parametrov vključuje izvedbo reakcije v ''in vitro'' pogojih, ki se močno razlikujejo od tistih v notranjosti celice. Namesto heterogene in nagnetene raztopine različnih makromolekul in organelov se reakcije običajno izvaja na (delno) čistih proteinskih vzorcih, ki so del razredčene puferske raztopine. Poleg tega v celicah razmejitve in kompartmentalizcija vplivajo na variacije v koncentraciji substrata, produkta in spremembe difuzijskih koeficientov. Problem predstavlja tudi ''in vitro'' študij membranskih in multimernih proteinov. Običajno jih je zahtevno očistiti, optimizacija testov aktivnosti pa je kompleksna, saj pogosto zahteva prisotnost umetnih membran. Pogoste so tudi razlike med rezultati pridobljenimi v sistemih, kjer se substrat dodaja v reakcijsko mešanico v primerjavi s tistimi pri katerih je substrat pridobljen iz metabolizma [1].

== Karotenoidna sintezna pot ==
Razumevanje encimske kinetike je pomembno za celostno razumevanje metabolnih poti. Velik pomen pa ima tudi za razumevanje encimskih poti, ki se uporabljajo v industrijskih procesih. Primer takšne poti je karotenoidna sintezna pot [1]. Karotenoidna pot nativno poteka v različnih organizmih – denimo v nekaterih rastlinah, bakterijah in glivah. Številni rastlinski apokarotenoidi, ki so produkt encimskih cepitev karotenoidov, obsegajo pigmente, arome in spojine z vonjem, ki se pogosto uporabljajo v prehranski industriji [2]. V kvasovki ''Saccharomyces cerevisiae'' nativno ne poteka je pa sintetična pot v tej industrijsko pomembni biotehnološki šasiji zanimiva na področjih vse od proizvodnje hrane do zdravil [1].
Številni encimi udeleženi v karotenoidno pot so povezani z membrano (ang. membrane-associated), kar otežuje študij kinetike pripadajočih reakcij. Dva izmed encimov pri katerih je študij v ''in vitro'' pogojih otežen sta fitoen sintaza (CrtB; EC 2.5.1.32) in fitoen desaturaza (CrtI; EC 1.3.99.31). Fitoen sintaza je prvi encim sintetične poti in hkrati encim, ki predstavlja ozko grlo v sintezi karotenoidov v rastlinah. Encim katalizira kondenzacijo 2 molekul geranilgeranil pirofosfata (GGPP), ki sta obrnjeni ena proti drugi (ang. head-to-head), pri čemer nastane fitoen. Sintezi fitoena sledijo tri nenasičenja, rezultat katerih je molekula likopena. Pri rastlinah in cianobakterijah so v pretvorbo udeleženi štirje encimi, pri nefotosintetskih bakterijah in glivah pa le en - fitoen deasturaza [1, 2].

== Zasnova in namen ==
Castaño-Cerezo ''et al'' so za razvoj novega sistema za ''in vivo'' encimatiko posegli po orodjih sintezne in sistemske biologije. Sintezno biologijo so uporabili za namen spreminjanja moči promotorjev in števila kopij zapisov za posamezne encime, kar jim je omogočilo variiranje koncentracije substrata direktno v celicah preko spreminjanja koncentracije encima udeleženega v njegovo sintezo. Sistemska biologija jim je preko integracije rezultatov genomike, proteomike in metabolomike omogočila vpogled v interakcije in celovitost procesov v bioloških sistemih [1].

== Priprava sevov ==
Pristop so uporabili za študij sintetične karotenoidne poti v ''Saccharomyces cerevisiae''. Za namen študija encimov udeleženih v karotenoidno pot so vzpostavili seve kvasovk, ki omogočajo variacijo v količini substrata GGPP. Seve so pripravili s spreminjanjem seva CEN.PK2-1C. Pred pripravo tovrstnih sevov so sintezo GGPP povečali z upravljanjem nativne terpenske poti. Na ta način so pripravili sev yENZ15 v katerem sta zapis za farnezil pirofosfat (FPP) sintazo (''ERG20'') in skrajšana oblika zapisa za 3-hidroksi-3-metilglutaril-koencim A reduktazo 1 (''tHMG1'') močno konstitutivno izražena. Poleg tega pa vsebuje delecijo zapisa za glavno fosfatazo, ki odstranjuje pirofosfatne skupine iz GGPP in FPP. Sledila je vzpostavitev treh različnih integracijskih kaset, ki so vsebovale različne mikrobne GGPP sintaze pod različnimi konstitutivnimi promotorji, ki so jih integrirali v genom yENZ15. Tako so proizvedli set sevov ustvarjenih za sintezo razpona koncentracij GGPP. Koncentracija GGPP je v pripravljenih sevih variirala za faktor 38, njihove hitrosti rasti so bile primerljive (0,40±0,03 h-1), kar kaže na odsotnost sprememb v fiziologiji sevov [1].

Vsaka merjena koncentracija substrata je izvirala iz specifično pripravljenega seva, kjer je zapis za encim udeležen v sintezo substrata izražen na določeni ravni. Seve so nato gojili v pogojih dinamičnega ravnotežja (eksponentna rast), kjer pretok (ang. flux; analog hitrosti reakcije) in koncentracije metabolitov ostajajo konstantni. Stabilnost zaradi vzpostavljenega dinamičnega ravnotežja tako omogoča natančno meritev pretoka reakcije [1].

== ''In vivo'' določanje parametrov za fitoen sintazo iz bakterije ''Pantoea ananas'' (PaCrtB) ==
Za določitev optimalne koncentracije encima za izvedbo kinetičnih testov so izvedli simulacije, pri katerih so upoštevali tri različne koncentracije encima (nizko, srednjo in visoko) pri širokem razponu v pretoku nastajanja produkta (ang. substrate-producing flux). Nato so analogen pristop uporabili tudi za določanje nasičenosti encima s substratom. Izbrali so tri različne konstitutivne promotorje – TEFmut2 za nizko, PGI1 za srednje in PDC1 za močno izražanje ''crtB''. Skladno z rezultati simulacij je koncentracija GGPP padala z višanjem aktivnosti PaCrtB, ob močnejšem izražanju PaCrtB pa je naraščal pretok nastajanja fitoena. Previsoka koncentracija PaCrtB je ovirala nasičenje encima s substratom in s tem onemogočila določitev kinetičnih parametrov. Nizka koncentracija pa je zaradi počasnega nastajanja fitoena otežila natančnost meritev, saj je bila koncentracija nastalega fitoena prenizka za natančno kvantifikacijo. Natančno meritev so dosegli le pri srednjem izražanju encima, zato so za nadaljnje meritve uporabili promotor PGI1 [1].

V vzpostavljenih sevih so dosegli 167× variacijo v koncentraciji GGPP. Dosegli so tudi delno nasičenje, kar je vodilo v nelinearen odnos med pretokom nastajanja fitoena in koncentracijo GGPP, ki je značilen tudi za klasične ''in vitro'' eksperimente. S prileganjem rezultatov na ireverzibilen Michaelis-Mentenin model so določilo natančne ocene kinetičnih parametrov ''K1/2cell'' (19±3 µM),''vmaxcell'' (849±71 µM/h). Afiniteta PaCrtB do GGPP je bila višja od ''in vitro'' določene (''KM'' = 41 µM), kar kaže na pomen določanja parametrov direktno v celicah [1, 3]. Pretvorbeno število 6±1 s−1, ki so ga pridobili na osnovi meritev koncentracije encima s pomočjo kvantitativne proteomike (42 nM) v sevih, kjer je PaCrtB pod kontrolo promotorja PGI1, pa je primerljiva ''in vitro'' vrednostim za encim ''Pantoea agglomerans'' [1].

== ''In vivo'' karakterizacija fitoen desaturaz ==
Najbolj zamuden del predstavljenega pristopa zajema molekulsko kloniranje in inženiring velikega števila različnih sevov. Zato so si sistem zamislili na način, ki omogoča enostavno recikliranje in uporabo sevov za analizo encimov, ki v metabolni poti nastopijo kasneje. Pripravljene seve so spremenili z integracijo ''crtB'' pod nadzorom promotorja PDC1, ki omogoča močno izražanje. Tako so dosegli 430× razpon v koncentraciji fitoena, kar jim je omogočilo ''in vivo'' študij naslednjega encima v metabolni poti. Želeli so določiti kinetične parametre treh pogosto uporabljenih fitoen desaturaz – CrtI iz bakterije ''P. ananas'' (PaCrtI), za katero so objavljeni ''in vitro'' encimski parametri, in CrtI iz gliv ''Phaffia rhodozyma'' (starejše ''Xanthophyllomyces dendrorhous'', XdCrtI) in ''Blakeslea trispora'' (BtCrtI), ki se pogosto uporabljata za sintezo karotenoidov, vendar kinetični parametri zanju še niso bili določeni. Za izražanje vsake izmed njih so uporabili drugačen promotor, v povezavi s z relativnimi zmožnostmi sinteze likopena v ''Saccharomyces cerevisiae''. Uporaba primernega promotorja je bila še posebej pomembna ob uporabi encima BtCrtI. Visoke koncentracije te fitoen desaturaze so v eksponentni fazi vodile v celično smrt zaradi tvorbe kristalov likopena. Prav tako je bil BtCrtI edini encim, koncentracija katerega je bila odvisna od koncentracije fitoena (koncentracija encima je bila višja v prisotnosti nižje koncentracije substrata). Kljub višji koncentraciji PaCrtI (uporaba promotorja TDH3), v primerjavi z obema fitoen desaturazama gliv, je bila hitrost nastajanja likopena ob uporabi tega encima približno 10× nižja kot pri ostalih dveh. Koncentracija fitoena je bila v tem primeru prenizka za nasičenje, kljub večjem razponu koncentracij substrata kot v ''in vitro'' raziskavah. Rezultate si lahko interpretiramo kot razliko v afiniteti encimov, ki so znotraj celice vezani na membrane in tistih udeleženih v ''in vitro'' encimskih reakcijah. Razlike pa so lahko tudi posledica dostopnosti substrata, vpliva drugih metabolnih poti, ki se v celici odvijajo hkrati itn. Tudi v tem primeru so rezultate prilegali na ireverzibilen Michaelis-Mentenin model, določili pa so le vrednosti ''K1/2cell'' in ''vmaxcell'' za fitoen desaturazi iz gliv (pri PaCrtI so eksperimentalni podatki omogočali le določitev spodnje meje). Maksimalna hitrost reakcije je bila pri BtCrtI (309±22 µM·h−1) približno 2× višja kot pri XdCrtI. Prav tako je imel ta encim približno 9× višjo afiniteto do substrata (41±12 µM)[1].

== Zaključek ==
V sklopu raziskave so Castaño-Cerezo ''et al'' uspešno določili ''in vivo'' analoge Michaelis-Menteninih parametrov za fitoen sintazo PaCrtB in osvetlili razlike med ''in vivo'' ter ''in vitro'' parametri. S pomočjo istega nabora sevov so uspešno določili še encimske parametre dveh izmed treh analiziranih fitoen desaturaz. Uporabljena metoda torej ponuja možnost za optimizacijo naravnih in sintetičnih sinteznih poti ''in vivo''. Vseeno je potrebno pridobljene parametre (tako kot v ''in vitro'' testih), bolj kot konstanto, obravnavati kot funkcijo mikrookolja v katerem se encimi nahajajo.

== Literatura ==
[1] S. Castaño-Cerezo, A. Chamas, H. Kulyk, C. Treitz, F. Bellvert, A. Tholey, V. Galéote, C. Camarasa, S. Heux, L. F. Garcia-Alles, idr.: Combining systems and synthetic biology for in vivo enzymology. EMBO J. 2024, 43, 5169–5185.

[2] J. López, D. Bustos, C. Camilo, N. Arenas, P. A. Saa, E. Agosin: Engineering Saccharomyces cerevisiae for the Overproduction of β-Ionone and Its Precursor β-Carotene. Front. Bioeng. Biotechnol. 2020, 8.

[3] U. Neudert, I. M. Martı́nez-Férez, P. D. Fraser, G. Sandmann: Expression of an active phytoene synthase from Erwinia uredovora and biochemical properties of the enzyme. Biochim. Biophys. Acta BBA - Lipids Lipid Metab. 1998, 1392, 51–58.

Povezava sintezne in sistemske biologije za in vivo encimatiko

2025-05-11T21:58:45Z

Gaja Starc: /* Uvod */

Izhodiščni članek: [https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/39322757/ Combining systems and synthetic biology for in vivo enzymology]

== Uvod ==
Določanje kinetičnih parametrov encimov najpogosteje temelji na merjenju reakcijske hitrosti ob spreminjanju koncentracije substrata. Pri tem razpon koncentracij substrata običajno obsega vsaj 2 velikostna reda. Na ta način je mogoče določiti afiniteto encima do substrata, ki jo opredeljuje Michaelis-Mentenina konstanta (''KM''), in aktivnost encima, ki jo določata maksimalna reakcijska hitrost (''vmax'') in pretvorbeno število (''kcat''). Klasičen pristop določanja kinetičnih parametrov vključuje izvedbo reakcije v ''in vitro'' pogojih, ki se močno razlikujejo od tistih v notranjosti celice. Namesto heterogene in nagnetene raztopine različnih makromolekul in organelov se reakcije običajno izvaja na (delno) čistih proteinskih vzorcih, ki so del razredčene puferske raztopine. Poleg tega v celicah razmejitve in kompartmentalizcija vplivajo na variacije v koncentraciji substrata, produkta in spremembe difuzijskih koeficientov. Problem predstavlja tudi ''in vitro'' študij membranskih in multimernih proteinov. Običajno jih je zahtevno očistiti, optimizacija testov aktivnosti pa je kompleksna, saj pogosto zahteva prisotnost umetnih membran. Pogoste so tudi razlike med rezultati pridobljenimi v sistemih, kjer se substrat dodaja v reakcijsko mešanico v primerjavi s tistimi pri katerih je substrat pridobljen iz metabolizma [1].

== Karotenoidna sintezna pot ==
Razumevanje encimske kinetike je pomembno za celostno razumevanje metabolnih poti. Velik pomen pa ima tudi za razumevanje encimskih poti, ki se uporabljajo v industrijskih procesih. Primer takšne poti je karotenoidna sintezna pot [1]. Karotenoidna pot nativno poteka v različnih organizmih – denimo v nekaterih rastlinah, bakterijah in glivah. Številni rastlinski apokarotenoidi, ki so produkt encimskih cepitev karotenoidov, obsegajo pigmente, arome in spojine z vonjem, ki se pogosto uporabljajo v prehranski industriji [2]. V kvasovki ''Saccharomyces cerevisiae'' nativno ne poteka je pa sintetična pot v tej industrijsko pomembni biotehnološki šasiji zanimiva na področjih vse od proizvodnje hrane do zdravil [1].
Številni encimi udeleženi v karotenoidno pot so povezani z membrano (ang. membrane-associated), kar otežuje študij kinetike pripadajočih reakcij. Dva izmed encimov pri katerih je študij v in vitro pogojih otežen sta fitoen sintaza (CrtB; EC 2.5.1.32) in fitoen desaturaza (CrtI; EC 1.3.99.31). Fitoen sintaza je prvi encim sintetične poti in hkrati encim, ki predstavlja ozko grlo v sintezi karotenoidov v rastlinah. Encim katalizira kondenzacijo 2 molekul geranilgeranil pirofosfata (GGPP), ki sta obrnjeni ena proti drugi (ang. head-to-head), pri čemer nastane fitoen. Sintezi fitoena sledijo tri nenasičenja, rezultat katerih je molekula likopena. Pri rastlinah in cianobakterijah so v pretvorbo udeleženi štirje encimi, pri nefotosintetskih bakterijah in glivah pa le en - fitoen deasturaza [1, 2].

== Zasnova in namen ==
Castaño-Cerezo ''et al'' so za razvoj novega sistema za ''in vivo'' encimatiko posegli po orodjih sintezne in sistemske biologije. Sintezno biologijo so uporabili za namen spreminjanja moči promotorjev in števila kopij zapisov za posamezne encime, kar jim je omogočilo variiranje koncentracije substrata direktno v celicah preko spreminjanja koncentracije encima udeleženega v njegovo sintezo. Sistemska biologija jim je preko integracije rezultatov genomike, proteomike in metabolomike omogočila vpogled v interakcije in celovitost procesov v bioloških sistemih [1].

== Priprava sevov ==
Pristop so uporabili za študij sintetične karotenoidne poti v ''Saccharomyces cerevisiae''. Za namen študija encimov udeleženih v karotenoidno pot so vzpostavili seve kvasovk, ki omogočajo variacijo v količini substrata GGPP. Seve pripravili s spreminjanjem CEN.PK2-1C. Pred pripravo tovrstnih sevov so sintezo GGPP povečali z upravljanjem nativne terpenske poti. Na ta način so pripravili sev yENZ15 v katerem sta zapis za farnezil pirofosfat (FPP) sintazo (''ERG20'') in skrajšana oblika zapisa za 3-hidroksi-3-metilglutaril-koencim A reduktazo 1 (''tHMG1'') močno konstitutivno izražena. Poleg tega pa vsebuje delecijo zapisa za glavno fosfatazo, ki je odstranjuje pirofosfatne skupine iz GGPP in FPP. Sledila je vzpostavitev treh različnih integracijskih kaset, ki so vsebovale različne mikrobne GGPP sintaze pod različnimi konstitutivnimi promotorji, ki so jih integrirali v genom yENZ15. Tako so proizvedli set sevov ustvarjenih za sintezo razpona koncentracij GGPP. Koncentracija GGPP je v pripravljenih sevih variirala za faktor 38, njihove hitrosti rasti so bile primerljive (0,40±0,03 h-1), kar kaže na odsotnost sprememb v fiziologiji sevov [1].

Vsaka merjena koncentracija substrata izvira iz specifično pripravljenega seva, kjer je zapis za encim udeležen v sintezo substrata izražen na določeni ravni. Seve so nato gojili v pogojih dinamičnega ravnotežja (eksponentna rast), kjer pretok (ang. flux; analog hitrosti reakcije) in koncentracije metabolitov ostajajo konstantne. Stabilnost zaradi vzpostavljenega dinamičnega ravnotežja tako omogoča natančno meritev pretočnosti reakcije [1].

== ''In vivo'' določanje parametrov za fitoen sintazo iz bakterije ''Pantoea ananas'' (PaCrtB) ==
Za določitev optimalne koncentracije encima za izvedbo kinetičnih testov so izvedli simulacije pri katerih so upoštevali tri različne koncentracije encima (nizko, srednjo in visoko) pri širokem razponu pretoka nastajanja produkta (ang. substrate-producing flux). Nato so analogen pristop uporabili tudi za določanje nasičenosti encima s substratom. Izbrali so tri različne konstitutivne promotorje – TEFmut2 za nizko, PGI1 za srednje in PDC1 za visoko izražanje ''crtB''. Skladno z rezultati simulacij je koncentracija GGPP padala z višanjem aktivnosti PaCrtB, ob močnejšem izražanju PaCrtB pa je naraščal pretok nastajanja fitoena. Previsoka koncentracija PaCrtB je ovirala nasičenje encima s substratom in s tem onemogočila določitev kinetičnih parametrov. Nizka koncentracija pa je zaradi počasnega nastajanja fitoena otežila natančnost meritev, saj je bila koncentracija nastalega fitoena prenizka za natančno kvantifikacijo. Natančno meritev so dosegli le pri srednjem izražanju encima, zato so za nadaljnje meritve uporabili promotor PGI1 [1].

V vzpostavljenih sevih so dosegli 167× variacijo v koncentraciji GGPP. Dosegli so tudi delno nasičenje, kar je vodilo v nelinearen odnos med pretokom nastajanja fitoena in koncentracijo GGPP, ki je značilen tudi za klasične ''in vitro'' eksperimente. S prileganjem rezultatov na ireverzibilen Michaelis-Mentenin model so določilo natančne ocene kinetičnih parametrov ''K1/2cell'' (19 ± 3 µM),''vmaxcell'' (849 ± 71 µM/h). Afiniteta PaCrtB do GGPP je bila višja od ''in vitro'' določene (''KM'' = 41 µM), kar kaže na pomemen določanja parametrov direktno v celicah [1, 3]. Pretvorbeno število 6 ± 1 s−1, ki so ga pridobili na osnovi meritev koncentracije encima s pomočjo kvantitativne proteomike (42 nM) v sevih, kjer je PaCrtB pod kontrolo promotorja PGI1 pa je primerljiva ''in vitro'' vrednostim za encim ''Pantoea agglomerans'' [1].

== ''In vivo'' karakterizacija fitoen desaturaz ==
Najbolj zamuden del predstavljenega pristopa zajema molekulsko kloniranje in inženiring velikega števila različnih sevov. Zato so si sistem zamislili na način, ki omogoča enostavno recikliranje in uporabo sevov za analizo encimov, ki v metabolni poti nastopijo kasneje. Pripravljene seve so spremenili z integracijo ''crtB'' pod nadzorom promotorja PDC1, ki omogoča močno izražanje. Tako so dosegli 430× razpon v koncentraciji fitoena, kar jim je omogočilo ''in vivo'' študij naslednjega encima v metabolni poti. Želeli so določiti kinetične parametre treh pogosto uporabljenih fitoen desaturaz – CrtI iz bakterije ''P. ananas'' (PaCrtI), za katero so objavljeni ''in vitro'' encimski parametri, in CrtI iz gliv ''Phaffia rhodozyma'' (starejše ''Xanthophyllomyces dendrorhous'', XdCrtI) in ''Blakeslea trispora'' (BtCrtI), ki se pogosto uporabljata za sintezo karotenoidov, vendar kinetični parametri zanju še niso bili določeni. Za izražanje vsake izmed njih so uporabili drugačen promotor, v povezavi s z relativnimi zmožnostmi sinteze likopena v ''Saccharomyces cerevisiae''. Uporaba primernega promotorja je bila še posebej pomembna ob uporabi encima BtCrtI. Visoke koncentracije te fitoen desaturaze so v eksponentni fazi vodile v celično smrt zaradi tvorbe kristalov likopena. Prav tako je bil BtCrtI edini encim, koncentracija katerega je bila odvisna od koncentracije fitoena (koncentracija encima je bila višja v prisotnosti nižje koncentracije substrata). Kljub višji koncentraciji PaCrtI (uporaba promotorja TDH3) v primerjavi z obema fitoen desaturazama gliv je bila hitrost nastajanja likopena ob uporabi tega encima približno 10× nižja kot pri ostalih dveh. Koncentracija fitoena je bila v tem primeru prenizka za nasičenje, kljub večjem razponu koncentracij substrata kot v ''in vitro'' raziskavah. Rezultate si lahko interpretiramo kot razliko v afiniteti encimov, ki so znotraj celice vezani na membrane in tistimi udeleženimi v ''in vitro'' encimski reakciji. Razlike pa so lahko tudi posledica dostopnosti substrata, vpliva drugih metabolnih poti, ki se v celici odvijajo hkrati itn. Tudi v tem primeru so rezultate prilegali na ireverzibilen Michaelis-Mentenin model, določili pa so le vrednosti ''K1/2cell''in ''vmaxcell'' za fitoen desaturazi iz gliv (pri PaCrtI so eksperimentalni podatki omogočali le določitev spodnje meje). Maksimalna hitrost reakcije je bila pri BtCrtI (309 ± 22 µM·h−1) približno 2× višja kot pri XdCrtI. Prav tako je imel ta encim približno 9× višjo afiniteto do substrata (41 ± 12 µM)[1].

== Zaključek ==
V sklopu raziskave so Castaño-Cerezo ''et al'' uspešno določili ''in vivo'' analoge Michaelis-Menteninih parametrov za fitoen sintetazo PaCrtB in osvetlili razlike med ''in vivo'' ter ''in vitro'' parametri. S pomočjo istega nabora sevov so uspešno določili še encimske parametre dveh izmed treh analiziranih fitoen desaturaz. Uporabljena metoda torej ponuja možnost za optimizacijo naravnih in sintetičnih sinteznih poti ''in vivo''. Vseeno je potrebno pridobljene parametre (tako kot v ''in vitro'' testih), bolj kot konstanto, obravnavati kot funkcijo mikrookolja v katerem se encimi nahajajo.

== Literatura ==
[1] S. Castaño-Cerezo, A. Chamas, H. Kulyk, C. Treitz, F. Bellvert, A. Tholey, V. Galéote, C. Camarasa, S. Heux, L. F. Garcia-Alles, idr.: Combining systems and synthetic biology for in vivo enzymology. EMBO J. 2024, 43, 5169–5185.

[2] J. López, D. Bustos, C. Camilo, N. Arenas, P. A. Saa, E. Agosin: Engineering Saccharomyces cerevisiae for the Overproduction of β-Ionone and Its Precursor β-Carotene. Front. Bioeng. Biotechnol. 2020, 8.

[3] U. Neudert, I. M. Martı́nez-Férez, P. D. Fraser, G. Sandmann: Expression of an active phytoene synthase from Erwinia uredovora and biochemical properties of the enzyme. Biochim. Biophys. Acta BBA - Lipids Lipid Metab. 1998, 1392, 51–58.

Povezava sintezne in sistemske biologije za in vivo encimatiko

2025-05-11T21:57:39Z

Gaja Starc: /* Literatura */

Izhodiščni članek: [https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/39322757/ Combining systems and synthetic biology for in vivo enzymology]

== Uvod ==
Določanje kinetičnih parametrov encimov najpogosteje temelji na merjenju reakcijske hitrosti ob spreminjanju koncentracije substrata. Pri tem razpon koncentracij substrata običajno obsega vsaj 2 velikostna reda. Na ta način je mogoče določiti afiniteto encima do substrata, ki jo opredeljuje Michaelis-Mentenina konstanta (''KM'') in aktivnost encima, ki jo določata maksimalna reakcijska hitrost (''vmax'') in pretvorbeno število (''kcat''). Klasičen pristop določanja kinetičnih parametrov vključuje izvedbo reakcije v ''in vitro'' pogojih, ki se močno razlikujejo od tistih v notranjosti celice. Namesto heterogene in nagnetene raztopine različnih makromolekul in organelov se reakcije običajno izvaja na (delno) čistih proteinskih vzorcih, ki so del razredčene puferske raztopine. Poleg tega v celicah razmejitve in kompartmentalizcija vplivajo na variacije v koncentraciji substrata, produkta in spremembe difuzijskih koeficientov. Problem predstavlja tudi ''in vitro'' študij membranskih in multimernih proteinov. Običajno jih je zahtevno očistiti, optimizacija testov aktivnosti pa je kompleksna, saj pogosto zahteva prisotnost umetnih membran. Pogoste so tudi razlike med rezultati pridobljenimi v sistemih, kjer se substrat dodaja v reakcijsko mešanico v primerjavi s tistimi pri katerih je substrat pridobljen iz metabolizma [1].

== Karotenoidna sintezna pot ==
Razumevanje encimske kinetike je pomembno za celostno razumevanje metabolnih poti. Velik pomen pa ima tudi za razumevanje encimskih poti, ki se uporabljajo v industrijskih procesih. Primer takšne poti je karotenoidna sintezna pot [1]. Karotenoidna pot nativno poteka v različnih organizmih – denimo v nekaterih rastlinah, bakterijah in glivah. Številni rastlinski apokarotenoidi, ki so produkt encimskih cepitev karotenoidov, obsegajo pigmente, arome in spojine z vonjem, ki se pogosto uporabljajo v prehranski industriji [2]. V kvasovki ''Saccharomyces cerevisiae'' nativno ne poteka je pa sintetična pot v tej industrijsko pomembni biotehnološki šasiji zanimiva na področjih vse od proizvodnje hrane do zdravil [1].
Številni encimi udeleženi v karotenoidno pot so povezani z membrano (ang. membrane-associated), kar otežuje študij kinetike pripadajočih reakcij. Dva izmed encimov pri katerih je študij v in vitro pogojih otežen sta fitoen sintaza (CrtB; EC 2.5.1.32) in fitoen desaturaza (CrtI; EC 1.3.99.31). Fitoen sintaza je prvi encim sintetične poti in hkrati encim, ki predstavlja ozko grlo v sintezi karotenoidov v rastlinah. Encim katalizira kondenzacijo 2 molekul geranilgeranil pirofosfata (GGPP), ki sta obrnjeni ena proti drugi (ang. head-to-head), pri čemer nastane fitoen. Sintezi fitoena sledijo tri nenasičenja, rezultat katerih je molekula likopena. Pri rastlinah in cianobakterijah so v pretvorbo udeleženi štirje encimi, pri nefotosintetskih bakterijah in glivah pa le en - fitoen deasturaza [1, 2].

== Zasnova in namen ==
Castaño-Cerezo ''et al'' so za razvoj novega sistema za ''in vivo'' encimatiko posegli po orodjih sintezne in sistemske biologije. Sintezno biologijo so uporabili za namen spreminjanja moči promotorjev in števila kopij zapisov za posamezne encime, kar jim je omogočilo variiranje koncentracije substrata direktno v celicah preko spreminjanja koncentracije encima udeleženega v njegovo sintezo. Sistemska biologija jim je preko integracije rezultatov genomike, proteomike in metabolomike omogočila vpogled v interakcije in celovitost procesov v bioloških sistemih [1].

== Priprava sevov ==
Pristop so uporabili za študij sintetične karotenoidne poti v ''Saccharomyces cerevisiae''. Za namen študija encimov udeleženih v karotenoidno pot so vzpostavili seve kvasovk, ki omogočajo variacijo v količini substrata GGPP. Seve pripravili s spreminjanjem CEN.PK2-1C. Pred pripravo tovrstnih sevov so sintezo GGPP povečali z upravljanjem nativne terpenske poti. Na ta način so pripravili sev yENZ15 v katerem sta zapis za farnezil pirofosfat (FPP) sintazo (''ERG20'') in skrajšana oblika zapisa za 3-hidroksi-3-metilglutaril-koencim A reduktazo 1 (''tHMG1'') močno konstitutivno izražena. Poleg tega pa vsebuje delecijo zapisa za glavno fosfatazo, ki je odstranjuje pirofosfatne skupine iz GGPP in FPP. Sledila je vzpostavitev treh različnih integracijskih kaset, ki so vsebovale različne mikrobne GGPP sintaze pod različnimi konstitutivnimi promotorji, ki so jih integrirali v genom yENZ15. Tako so proizvedli set sevov ustvarjenih za sintezo razpona koncentracij GGPP. Koncentracija GGPP je v pripravljenih sevih variirala za faktor 38, njihove hitrosti rasti so bile primerljive (0,40±0,03 h-1), kar kaže na odsotnost sprememb v fiziologiji sevov [1].

Vsaka merjena koncentracija substrata izvira iz specifično pripravljenega seva, kjer je zapis za encim udeležen v sintezo substrata izražen na določeni ravni. Seve so nato gojili v pogojih dinamičnega ravnotežja (eksponentna rast), kjer pretok (ang. flux; analog hitrosti reakcije) in koncentracije metabolitov ostajajo konstantne. Stabilnost zaradi vzpostavljenega dinamičnega ravnotežja tako omogoča natančno meritev pretočnosti reakcije [1].

== ''In vivo'' določanje parametrov za fitoen sintazo iz bakterije ''Pantoea ananas'' (PaCrtB) ==
Za določitev optimalne koncentracije encima za izvedbo kinetičnih testov so izvedli simulacije pri katerih so upoštevali tri različne koncentracije encima (nizko, srednjo in visoko) pri širokem razponu pretoka nastajanja produkta (ang. substrate-producing flux). Nato so analogen pristop uporabili tudi za določanje nasičenosti encima s substratom. Izbrali so tri različne konstitutivne promotorje – TEFmut2 za nizko, PGI1 za srednje in PDC1 za visoko izražanje ''crtB''. Skladno z rezultati simulacij je koncentracija GGPP padala z višanjem aktivnosti PaCrtB, ob močnejšem izražanju PaCrtB pa je naraščal pretok nastajanja fitoena. Previsoka koncentracija PaCrtB je ovirala nasičenje encima s substratom in s tem onemogočila določitev kinetičnih parametrov. Nizka koncentracija pa je zaradi počasnega nastajanja fitoena otežila natančnost meritev, saj je bila koncentracija nastalega fitoena prenizka za natančno kvantifikacijo. Natančno meritev so dosegli le pri srednjem izražanju encima, zato so za nadaljnje meritve uporabili promotor PGI1 [1].

V vzpostavljenih sevih so dosegli 167× variacijo v koncentraciji GGPP. Dosegli so tudi delno nasičenje, kar je vodilo v nelinearen odnos med pretokom nastajanja fitoena in koncentracijo GGPP, ki je značilen tudi za klasične ''in vitro'' eksperimente. S prileganjem rezultatov na ireverzibilen Michaelis-Mentenin model so določilo natančne ocene kinetičnih parametrov ''K1/2cell'' (19 ± 3 µM),''vmaxcell'' (849 ± 71 µM/h). Afiniteta PaCrtB do GGPP je bila višja od ''in vitro'' določene (''KM'' = 41 µM), kar kaže na pomemen določanja parametrov direktno v celicah [1, 3]. Pretvorbeno število 6 ± 1 s−1, ki so ga pridobili na osnovi meritev koncentracije encima s pomočjo kvantitativne proteomike (42 nM) v sevih, kjer je PaCrtB pod kontrolo promotorja PGI1 pa je primerljiva ''in vitro'' vrednostim za encim ''Pantoea agglomerans'' [1].

== ''In vivo'' karakterizacija fitoen desaturaz ==
Najbolj zamuden del predstavljenega pristopa zajema molekulsko kloniranje in inženiring velikega števila različnih sevov. Zato so si sistem zamislili na način, ki omogoča enostavno recikliranje in uporabo sevov za analizo encimov, ki v metabolni poti nastopijo kasneje. Pripravljene seve so spremenili z integracijo ''crtB'' pod nadzorom promotorja PDC1, ki omogoča močno izražanje. Tako so dosegli 430× razpon v koncentraciji fitoena, kar jim je omogočilo ''in vivo'' študij naslednjega encima v metabolni poti. Želeli so določiti kinetične parametre treh pogosto uporabljenih fitoen desaturaz – CrtI iz bakterije ''P. ananas'' (PaCrtI), za katero so objavljeni ''in vitro'' encimski parametri, in CrtI iz gliv ''Phaffia rhodozyma'' (starejše ''Xanthophyllomyces dendrorhous'', XdCrtI) in ''Blakeslea trispora'' (BtCrtI), ki se pogosto uporabljata za sintezo karotenoidov, vendar kinetični parametri zanju še niso bili določeni. Za izražanje vsake izmed njih so uporabili drugačen promotor, v povezavi s z relativnimi zmožnostmi sinteze likopena v ''Saccharomyces cerevisiae''. Uporaba primernega promotorja je bila še posebej pomembna ob uporabi encima BtCrtI. Visoke koncentracije te fitoen desaturaze so v eksponentni fazi vodile v celično smrt zaradi tvorbe kristalov likopena. Prav tako je bil BtCrtI edini encim, koncentracija katerega je bila odvisna od koncentracije fitoena (koncentracija encima je bila višja v prisotnosti nižje koncentracije substrata). Kljub višji koncentraciji PaCrtI (uporaba promotorja TDH3) v primerjavi z obema fitoen desaturazama gliv je bila hitrost nastajanja likopena ob uporabi tega encima približno 10× nižja kot pri ostalih dveh. Koncentracija fitoena je bila v tem primeru prenizka za nasičenje, kljub večjem razponu koncentracij substrata kot v ''in vitro'' raziskavah. Rezultate si lahko interpretiramo kot razliko v afiniteti encimov, ki so znotraj celice vezani na membrane in tistimi udeleženimi v ''in vitro'' encimski reakciji. Razlike pa so lahko tudi posledica dostopnosti substrata, vpliva drugih metabolnih poti, ki se v celici odvijajo hkrati itn. Tudi v tem primeru so rezultate prilegali na ireverzibilen Michaelis-Mentenin model, določili pa so le vrednosti ''K1/2cell''in ''vmaxcell'' za fitoen desaturazi iz gliv (pri PaCrtI so eksperimentalni podatki omogočali le določitev spodnje meje). Maksimalna hitrost reakcije je bila pri BtCrtI (309 ± 22 µM·h−1) približno 2× višja kot pri XdCrtI. Prav tako je imel ta encim približno 9× višjo afiniteto do substrata (41 ± 12 µM)[1].

== Zaključek ==
V sklopu raziskave so Castaño-Cerezo ''et al'' uspešno določili ''in vivo'' analoge Michaelis-Menteninih parametrov za fitoen sintetazo PaCrtB in osvetlili razlike med ''in vivo'' ter ''in vitro'' parametri. S pomočjo istega nabora sevov so uspešno določili še encimske parametre dveh izmed treh analiziranih fitoen desaturaz. Uporabljena metoda torej ponuja možnost za optimizacijo naravnih in sintetičnih sinteznih poti ''in vivo''. Vseeno je potrebno pridobljene parametre (tako kot v ''in vitro'' testih), bolj kot konstanto, obravnavati kot funkcijo mikrookolja v katerem se encimi nahajajo.

== Literatura ==
[1] S. Castaño-Cerezo, A. Chamas, H. Kulyk, C. Treitz, F. Bellvert, A. Tholey, V. Galéote, C. Camarasa, S. Heux, L. F. Garcia-Alles, idr.: Combining systems and synthetic biology for in vivo enzymology. EMBO J. 2024, 43, 5169–5185.

[2] J. López, D. Bustos, C. Camilo, N. Arenas, P. A. Saa, E. Agosin: Engineering Saccharomyces cerevisiae for the Overproduction of β-Ionone and Its Precursor β-Carotene. Front. Bioeng. Biotechnol. 2020, 8.

[3] U. Neudert, I. M. Martı́nez-Férez, P. D. Fraser, G. Sandmann: Expression of an active phytoene synthase from Erwinia uredovora and biochemical properties of the enzyme. Biochim. Biophys. Acta BBA - Lipids Lipid Metab. 1998, 1392, 51–58.

Povezava sintezne in sistemske biologije za in vivo encimatiko

2025-05-11T21:57:27Z

Gaja Starc:

Izhodiščni članek: [https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/39322757/ Combining systems and synthetic biology for in vivo enzymology]

== Uvod ==
Določanje kinetičnih parametrov encimov najpogosteje temelji na merjenju reakcijske hitrosti ob spreminjanju koncentracije substrata. Pri tem razpon koncentracij substrata običajno obsega vsaj 2 velikostna reda. Na ta način je mogoče določiti afiniteto encima do substrata, ki jo opredeljuje Michaelis-Mentenina konstanta (''KM'') in aktivnost encima, ki jo določata maksimalna reakcijska hitrost (''vmax'') in pretvorbeno število (''kcat''). Klasičen pristop določanja kinetičnih parametrov vključuje izvedbo reakcije v ''in vitro'' pogojih, ki se močno razlikujejo od tistih v notranjosti celice. Namesto heterogene in nagnetene raztopine različnih makromolekul in organelov se reakcije običajno izvaja na (delno) čistih proteinskih vzorcih, ki so del razredčene puferske raztopine. Poleg tega v celicah razmejitve in kompartmentalizcija vplivajo na variacije v koncentraciji substrata, produkta in spremembe difuzijskih koeficientov. Problem predstavlja tudi ''in vitro'' študij membranskih in multimernih proteinov. Običajno jih je zahtevno očistiti, optimizacija testov aktivnosti pa je kompleksna, saj pogosto zahteva prisotnost umetnih membran. Pogoste so tudi razlike med rezultati pridobljenimi v sistemih, kjer se substrat dodaja v reakcijsko mešanico v primerjavi s tistimi pri katerih je substrat pridobljen iz metabolizma [1].

== Karotenoidna sintezna pot ==
Razumevanje encimske kinetike je pomembno za celostno razumevanje metabolnih poti. Velik pomen pa ima tudi za razumevanje encimskih poti, ki se uporabljajo v industrijskih procesih. Primer takšne poti je karotenoidna sintezna pot [1]. Karotenoidna pot nativno poteka v različnih organizmih – denimo v nekaterih rastlinah, bakterijah in glivah. Številni rastlinski apokarotenoidi, ki so produkt encimskih cepitev karotenoidov, obsegajo pigmente, arome in spojine z vonjem, ki se pogosto uporabljajo v prehranski industriji [2]. V kvasovki ''Saccharomyces cerevisiae'' nativno ne poteka je pa sintetična pot v tej industrijsko pomembni biotehnološki šasiji zanimiva na področjih vse od proizvodnje hrane do zdravil [1].
Številni encimi udeleženi v karotenoidno pot so povezani z membrano (ang. membrane-associated), kar otežuje študij kinetike pripadajočih reakcij. Dva izmed encimov pri katerih je študij v in vitro pogojih otežen sta fitoen sintaza (CrtB; EC 2.5.1.32) in fitoen desaturaza (CrtI; EC 1.3.99.31). Fitoen sintaza je prvi encim sintetične poti in hkrati encim, ki predstavlja ozko grlo v sintezi karotenoidov v rastlinah. Encim katalizira kondenzacijo 2 molekul geranilgeranil pirofosfata (GGPP), ki sta obrnjeni ena proti drugi (ang. head-to-head), pri čemer nastane fitoen. Sintezi fitoena sledijo tri nenasičenja, rezultat katerih je molekula likopena. Pri rastlinah in cianobakterijah so v pretvorbo udeleženi štirje encimi, pri nefotosintetskih bakterijah in glivah pa le en - fitoen deasturaza [1, 2].

== Zasnova in namen ==
Castaño-Cerezo ''et al'' so za razvoj novega sistema za ''in vivo'' encimatiko posegli po orodjih sintezne in sistemske biologije. Sintezno biologijo so uporabili za namen spreminjanja moči promotorjev in števila kopij zapisov za posamezne encime, kar jim je omogočilo variiranje koncentracije substrata direktno v celicah preko spreminjanja koncentracije encima udeleženega v njegovo sintezo. Sistemska biologija jim je preko integracije rezultatov genomike, proteomike in metabolomike omogočila vpogled v interakcije in celovitost procesov v bioloških sistemih [1].

== Priprava sevov ==
Pristop so uporabili za študij sintetične karotenoidne poti v ''Saccharomyces cerevisiae''. Za namen študija encimov udeleženih v karotenoidno pot so vzpostavili seve kvasovk, ki omogočajo variacijo v količini substrata GGPP. Seve pripravili s spreminjanjem CEN.PK2-1C. Pred pripravo tovrstnih sevov so sintezo GGPP povečali z upravljanjem nativne terpenske poti. Na ta način so pripravili sev yENZ15 v katerem sta zapis za farnezil pirofosfat (FPP) sintazo (''ERG20'') in skrajšana oblika zapisa za 3-hidroksi-3-metilglutaril-koencim A reduktazo 1 (''tHMG1'') močno konstitutivno izražena. Poleg tega pa vsebuje delecijo zapisa za glavno fosfatazo, ki je odstranjuje pirofosfatne skupine iz GGPP in FPP. Sledila je vzpostavitev treh različnih integracijskih kaset, ki so vsebovale različne mikrobne GGPP sintaze pod različnimi konstitutivnimi promotorji, ki so jih integrirali v genom yENZ15. Tako so proizvedli set sevov ustvarjenih za sintezo razpona koncentracij GGPP. Koncentracija GGPP je v pripravljenih sevih variirala za faktor 38, njihove hitrosti rasti so bile primerljive (0,40±0,03 h-1), kar kaže na odsotnost sprememb v fiziologiji sevov [1].

Vsaka merjena koncentracija substrata izvira iz specifično pripravljenega seva, kjer je zapis za encim udeležen v sintezo substrata izražen na določeni ravni. Seve so nato gojili v pogojih dinamičnega ravnotežja (eksponentna rast), kjer pretok (ang. flux; analog hitrosti reakcije) in koncentracije metabolitov ostajajo konstantne. Stabilnost zaradi vzpostavljenega dinamičnega ravnotežja tako omogoča natančno meritev pretočnosti reakcije [1].

== ''In vivo'' določanje parametrov za fitoen sintazo iz bakterije ''Pantoea ananas'' (PaCrtB) ==
Za določitev optimalne koncentracije encima za izvedbo kinetičnih testov so izvedli simulacije pri katerih so upoštevali tri različne koncentracije encima (nizko, srednjo in visoko) pri širokem razponu pretoka nastajanja produkta (ang. substrate-producing flux). Nato so analogen pristop uporabili tudi za določanje nasičenosti encima s substratom. Izbrali so tri različne konstitutivne promotorje – TEFmut2 za nizko, PGI1 za srednje in PDC1 za visoko izražanje ''crtB''. Skladno z rezultati simulacij je koncentracija GGPP padala z višanjem aktivnosti PaCrtB, ob močnejšem izražanju PaCrtB pa je naraščal pretok nastajanja fitoena. Previsoka koncentracija PaCrtB je ovirala nasičenje encima s substratom in s tem onemogočila določitev kinetičnih parametrov. Nizka koncentracija pa je zaradi počasnega nastajanja fitoena otežila natančnost meritev, saj je bila koncentracija nastalega fitoena prenizka za natančno kvantifikacijo. Natančno meritev so dosegli le pri srednjem izražanju encima, zato so za nadaljnje meritve uporabili promotor PGI1 [1].

V vzpostavljenih sevih so dosegli 167× variacijo v koncentraciji GGPP. Dosegli so tudi delno nasičenje, kar je vodilo v nelinearen odnos med pretokom nastajanja fitoena in koncentracijo GGPP, ki je značilen tudi za klasične ''in vitro'' eksperimente. S prileganjem rezultatov na ireverzibilen Michaelis-Mentenin model so določilo natančne ocene kinetičnih parametrov ''K1/2cell'' (19 ± 3 µM),''vmaxcell'' (849 ± 71 µM/h). Afiniteta PaCrtB do GGPP je bila višja od ''in vitro'' določene (''KM'' = 41 µM), kar kaže na pomemen določanja parametrov direktno v celicah [1, 3]. Pretvorbeno število 6 ± 1 s−1, ki so ga pridobili na osnovi meritev koncentracije encima s pomočjo kvantitativne proteomike (42 nM) v sevih, kjer je PaCrtB pod kontrolo promotorja PGI1 pa je primerljiva ''in vitro'' vrednostim za encim ''Pantoea agglomerans'' [1].

== ''In vivo'' karakterizacija fitoen desaturaz ==
Najbolj zamuden del predstavljenega pristopa zajema molekulsko kloniranje in inženiring velikega števila različnih sevov. Zato so si sistem zamislili na način, ki omogoča enostavno recikliranje in uporabo sevov za analizo encimov, ki v metabolni poti nastopijo kasneje. Pripravljene seve so spremenili z integracijo ''crtB'' pod nadzorom promotorja PDC1, ki omogoča močno izražanje. Tako so dosegli 430× razpon v koncentraciji fitoena, kar jim je omogočilo ''in vivo'' študij naslednjega encima v metabolni poti. Želeli so določiti kinetične parametre treh pogosto uporabljenih fitoen desaturaz – CrtI iz bakterije ''P. ananas'' (PaCrtI), za katero so objavljeni ''in vitro'' encimski parametri, in CrtI iz gliv ''Phaffia rhodozyma'' (starejše ''Xanthophyllomyces dendrorhous'', XdCrtI) in ''Blakeslea trispora'' (BtCrtI), ki se pogosto uporabljata za sintezo karotenoidov, vendar kinetični parametri zanju še niso bili določeni. Za izražanje vsake izmed njih so uporabili drugačen promotor, v povezavi s z relativnimi zmožnostmi sinteze likopena v ''Saccharomyces cerevisiae''. Uporaba primernega promotorja je bila še posebej pomembna ob uporabi encima BtCrtI. Visoke koncentracije te fitoen desaturaze so v eksponentni fazi vodile v celično smrt zaradi tvorbe kristalov likopena. Prav tako je bil BtCrtI edini encim, koncentracija katerega je bila odvisna od koncentracije fitoena (koncentracija encima je bila višja v prisotnosti nižje koncentracije substrata). Kljub višji koncentraciji PaCrtI (uporaba promotorja TDH3) v primerjavi z obema fitoen desaturazama gliv je bila hitrost nastajanja likopena ob uporabi tega encima približno 10× nižja kot pri ostalih dveh. Koncentracija fitoena je bila v tem primeru prenizka za nasičenje, kljub večjem razponu koncentracij substrata kot v ''in vitro'' raziskavah. Rezultate si lahko interpretiramo kot razliko v afiniteti encimov, ki so znotraj celice vezani na membrane in tistimi udeleženimi v ''in vitro'' encimski reakciji. Razlike pa so lahko tudi posledica dostopnosti substrata, vpliva drugih metabolnih poti, ki se v celici odvijajo hkrati itn. Tudi v tem primeru so rezultate prilegali na ireverzibilen Michaelis-Mentenin model, določili pa so le vrednosti ''K1/2cell''in ''vmaxcell'' za fitoen desaturazi iz gliv (pri PaCrtI so eksperimentalni podatki omogočali le določitev spodnje meje). Maksimalna hitrost reakcije je bila pri BtCrtI (309 ± 22 µM·h−1) približno 2× višja kot pri XdCrtI. Prav tako je imel ta encim približno 9× višjo afiniteto do substrata (41 ± 12 µM)[1].

== Zaključek ==
V sklopu raziskave so Castaño-Cerezo ''et al'' uspešno določili ''in vivo'' analoge Michaelis-Menteninih parametrov za fitoen sintetazo PaCrtB in osvetlili razlike med ''in vivo'' ter ''in vitro'' parametri. S pomočjo istega nabora sevov so uspešno določili še encimske parametre dveh izmed treh analiziranih fitoen desaturaz. Uporabljena metoda torej ponuja možnost za optimizacijo naravnih in sintetičnih sinteznih poti ''in vivo''. Vseeno je potrebno pridobljene parametre (tako kot v ''in vitro'' testih), bolj kot konstanto, obravnavati kot funkcijo mikrookolja v katerem se encimi nahajajo.

== Literatura ==
[1] S. Castaño-Cerezo, A. Chamas, H. Kulyk, C. Treitz, F. Bellvert, A. Tholey, V. Galéote, C. Camarasa, S. Heux, L. F. Garcia-Alles, idr.: Combining systems and synthetic biology for in vivo enzymology. EMBO J. 2024, 43, 5169–5185.
[2] J. López, D. Bustos, C. Camilo, N. Arenas, P. A. Saa, E. Agosin: Engineering Saccharomyces cerevisiae for the Overproduction of β-Ionone and Its Precursor β-Carotene. Front. Bioeng. Biotechnol. 2020, 8.
[3] U. Neudert, I. M. Martı́nez-Férez, P. D. Fraser, G. Sandmann: Expression of an active phytoene synthase from Erwinia uredovora and biochemical properties of the enzyme. Biochim. Biophys. Acta BBA - Lipids Lipid Metab. 1998, 1392, 51–58.

Povezava sintezne in sistemske biologije za in vivo encimatiko

2025-05-11T21:54:31Z

Gaja Starc:

Izhodiščni članek: [https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/39322757/ Combining systems and synthetic biology for in vivo enzymology]

== Uvod ==
Določanje kinetičnih parametrov encimov najpogosteje temelji na merjenju reakcijske hitrosti ob spreminjanju koncentracije substrata. Pri tem razpon koncentracij substrata običajno obsega vsaj 2 velikostna reda. Na ta način je mogoče določiti afiniteto encima do substrata, ki jo opredeljuje Michaelis-Mentenina konstanta (''KM'') in aktivnost encima, ki jo določata maksimalna reakcijska hitrost (''vmax'') in pretvorbeno število (''kcat''). Klasičen pristop določanja kinetičnih parametrov vključuje izvedbo reakcije v ''in vitro'' pogojih, ki se močno razlikujejo od tistih v notranjosti celice. Namesto heterogene in nagnetene raztopine različnih makromolekul in organelov se reakcije običajno izvaja na (delno) čistih proteinskih vzorcih, ki so del razredčene puferske raztopine. Poleg tega v celicah razmejitve in kompartmentalizcija vplivajo na variacije v koncentraciji substrata, produkta in spremembe difuzijskih koeficientov. Problem predstavlja tudi ''in vitro'' študij membranskih in multimernih proteinov. Običajno jih je zahtevno očistiti, optimizacija testov aktivnosti pa je kompleksna, saj pogosto zahteva prisotnost umetnih membran. Pogoste so tudi razlike med rezultati pridobljenimi v sistemih, kjer se substrat dodaja v reakcijsko mešanico v primerjavi s tistimi pri katerih je substrat pridobljen iz metabolizma [1].

== Karotenoidna sintezna pot ==
Razumevanje encimske kinetike je pomembno za celostno razumevanje metabolnih poti. Velik pomen pa ima tudi za razumevanje encimskih poti, ki se uporabljajo v industrijskih procesih. Primer takšne poti je karotenoidna sintezna pot [1]. Karotenoidna pot nativno poteka v različnih organizmih – denimo v nekaterih rastlinah, bakterijah in glivah. Številni rastlinski apokarotenoidi, ki so produkt encimskih cepitev karotenoidov, obsegajo pigmente, arome in spojine z vonjem, ki se pogosto uporabljajo v prehranski industriji [2]. V kvasovki ''Saccharomyces cerevisiae'' nativno ne poteka je pa sintetična pot v tej industrijsko pomembni biotehnološki šasiji zanimiva na področjih vse od proizvodnje hrane do zdravil [1].
Številni encimi udeleženi v karotenoidno pot so povezani z membrano (ang. membrane-associated), kar otežuje študij kinetike pripadajočih reakcij. Dva izmed encimov pri katerih je študij v in vitro pogojih otežen sta fitoen sintaza (CrtB; EC 2.5.1.32) in fitoen desaturaza (CrtI; EC 1.3.99.31). Fitoen sintaza je prvi encim sintetične poti in hkrati encim, ki predstavlja ozko grlo v sintezi karotenoidov v rastlinah. Encim katalizira kondenzacijo 2 molekul geranilgeranil pirofosfata (GGPP), ki sta obrnjeni ena proti drugi (ang. head-to-head), pri čemer nastane fitoen. Sintezi fitoena sledijo tri nenasičenja, rezultat katerih je molekula likopena. Pri rastlinah in cianobakterijah so v pretvorbo udeleženi štirje encimi, pri nefotosintetskih bakterijah in glivah pa le en - fitoen deasturaza [1, 2].

== Zasnova in namen ==
Castaño-Cerezo ''et al'' so za razvoj novega sistema za ''in vivo'' encimatiko posegli po orodjih sintezne in sistemske biologije. Sintezno biologijo so uporabili za namen spreminjanja moči promotorjev in števila kopij zapisov za posamezne encime, kar jim je omogočilo variiranje koncentracije substrata direktno v celicah preko spreminjanja koncentracije encima udeleženega v njegovo sintezo. Sistemska biologija jim je preko integracije rezultatov genomike, proteomike in metabolomike omogočila vpogled v interakcije in celovitost procesov v bioloških sistemih [1].

== Priprava sevov ==
Pristop so uporabili za študij sintetične karotenoidne poti v ''Saccharomyces cerevisiae''. Za namen študija encimov udeleženih v karotenoidno pot so vzpostavili seve kvasovk, ki omogočajo variacijo v količini substrata GGPP. Seve pripravili s spreminjanjem CEN.PK2-1C. Pred pripravo tovrstnih sevov so sintezo GGPP povečali z upravljanjem nativne terpenske poti. Na ta način so pripravili sev yENZ15 v katerem sta zapis za farnezil pirofosfat (FPP) sintazo (''ERG20'') in skrajšana oblika zapisa za 3-hidroksi-3-metilglutaril-koencim A reduktazo 1 (''tHMG1'') močno konstitutivno izražena. Poleg tega pa vsebuje delecijo zapisa za glavno fosfatazo, ki je odstranjuje pirofosfatne skupine iz GGPP in FPP. Sledila je vzpostavitev treh različnih integracijskih kaset, ki so vsebovale različne mikrobne GGPP sintaze pod različnimi konstitutivnimi promotorji, ki so jih integrirali v genom yENZ15. Tako so proizvedli set sevov ustvarjenih za sintezo razpona koncentracij GGPP. Koncentracija GGPP je v pripravljenih sevih variirala za faktor 38, njihove hitrosti rasti so bile primerljive (0,40±0,03 h-1), kar kaže na odsotnost sprememb v fiziologiji sevov [1].

Vsaka merjena koncentracija substrata izvira iz specifično pripravljenega seva, kjer je zapis za encim udeležen v sintezo substrata izražen na določeni ravni. Seve so nato gojili v pogojih dinamičnega ravnotežja (eksponentna rast), kjer pretok (ang. flux; analog hitrosti reakcije) in koncentracije metabolitov ostajajo konstantne. Stabilnost zaradi vzpostavljenega dinamičnega ravnotežja tako omogoča natančno meritev pretočnosti reakcije [1].

== ''In vivo'' določanje parametrov za fitoen sintazo iz bakterije ''Pantoea ananas'' (PaCrtB) ==

Za določitev optimalne koncentracije encima za izvedbo kinetičnih testov so izvedli simulacije pri katerih so upoštevali tri različne koncentracije encima (nizko, srednjo in visoko) pri širokem razponu pretoka nastajanja produkta (ang. substrate-producing flux). Nato so analogen pristop uporabili tudi za določanje nasičenosti encima s substratom. Izbrali so tri različne konstitutivne promotorje – TEFmut2 za nizko, PGI1 za srednje in PDC1 za visoko izražanje ''crtB''. Skladno z rezultati simulacij je koncentracija GGPP padala z višanjem aktivnosti PaCrtB, ob močnejšem izražanju PaCrtB pa je naraščal pretok nastajanja fitoena. Previsoka koncentracija PaCrtB je ovirala nasičenje encima s substratom in s tem onemogočila določitev kinetičnih parametrov. Nizka koncentracija pa je zaradi počasnega nastajanja fitoena otežila natančnost meritev, saj je bila koncentracija nastalega fitoena prenizka za natančno kvantifikacijo. Natančno meritev so dosegli le pri srednjem izražanju encima, zato so za nadaljnje meritve uporabili promotor PGI1 [1].

V vzpostavljenih sevih so dosegli 167× variacijo v koncentraciji GGPP. Dosegli so tudi delno nasičenje, kar je vodilo v nelinearen odnos med pretokom nastajanja fitoena in koncentracijo GGPP, ki je značilen tudi za klasične ''in vitro'' eksperimente. S prileganjem rezultatov na ireverzibilen Michaelis-Mentenin model so določilo natančne ocene kinetičnih parametrov ''K1/2cell'' (19 ± 3 µM),''vmaxcell'' (849 ± 71 µM/h). Afiniteta PaCrtB do GGPP je bila višja od ''in vitro'' določene (''KM'' = 41 µM), kar kaže na pomemen določanja parametrov direktno v celicah [1, 3]. Pretvorbeno število 6 ± 1 s−1, ki so ga pridobili na osnovi meritev koncentracije encima s pomočjo kvantitativne proteomike (42 nM) v sevih, kjer je PaCrtB pod kontrolo promotorja PGI1 pa je primerljiva ''in vitro'' vrednostim za encim ''Pantoea agglomerans'' [1].

== ''In vivo'' karakterizacija fitoen desaturaz ==
Najbolj zamuden del predstavljenega pristopa zajema molekulsko kloniranje in inženiring velikega števila različnih sevov. Zato so si sistem zamislili na način, ki omogoča enostavno recikliranje in uporabo sevov za analizo encimov, ki v metabolni poti nastopijo kasneje. Pripravljene seve so spremenili z integracijo ''crtB'' pod nadzorom promotorja PDC1, ki omogoča močno izražanje. Tako so dosegli 430× razpon v koncentraciji fitoena, kar jim je omogočilo ''in vivo'' študij naslednjega encima v metabolni poti. Želeli so določiti kinetične parametre treh pogosto uporabljenih fitoen desaturaz – CrtI iz bakterije ''P. ananas'' (PaCrtI), za katero so objavljeni ''in vitro'' encimski parametri, in CrtI iz gliv ''Phaffia rhodozyma'' (starejše ''Xanthophyllomyces dendrorhous'', XdCrtI) in ''Blakeslea trispora'' (BtCrtI), ki se pogosto uporabljata za sintezo karotenoidov, vendar kinetični parametri zanju še niso bili določeni. Za izražanje vsake izmed njih so uporabili drugačen promotor, v povezavi s z relativnimi zmožnostmi sinteze likopena v ''Saccharomyces cerevisiae''. Uporaba primernega promotorja je bila še posebej pomembna ob uporabi encima BtCrtI. Visoke koncentracije te fitoen desaturaze so v eksponentni fazi vodile v celično smrt zaradi tvorbe kristalov likopena. Prav tako je bil BtCrtI edini encim, koncentracija katerega je bila odvisna od koncentracije fitoena (koncentracija encima je bila višja v prisotnosti nižje koncentracije substrata). Kljub višji koncentraciji PaCrtI (uporaba promotorja TDH3) v primerjavi z obema fitoen desaturazama gliv je bila hitrost nastajanja likopena ob uporabi tega encima približno 10× nižja kot pri ostalih dveh. Koncentracija fitoena je bila v tem primeru prenizka za nasičenje, kljub večjem razponu koncentracij substrata kot v ''in vitro'' raziskavah. Rezultate si lahko interpretiramo kot razliko v afiniteti encimov, ki so znotraj celice vezani na membrane in tistimi udeleženimi v ''in vitro'' encimski reakciji. Razlike pa so lahko tudi posledica dostopnosti substrata, vpliva drugih metabolnih poti, ki se v celici odvijajo hkrati itn. Tudi v tem primeru so rezultate prilegali na ireverzibilen Michaelis-Mentenin model, določili pa so le vrednosti ''K1/2cell''in ''vmaxcell'' za fitoen desaturazi iz gliv (pri PaCrtI so eksperimentalni podatki omogočali le določitev spodnje meje). Maksimalna hitrost reakcije je bila pri BtCrtI (309 ± 22 µM·h−1) približno 2× višja kot pri XdCrtI. Prav tako je imel ta encim približno 9× višjo afiniteto do substrata (41 ± 12 µM).

Povezava sintezne in sistemske biologije za in vivo encimatiko

2025-05-11T21:47:52Z

Gaja Starc:

Povezava sintezne in sistemske biologije za in vivo encimatiko

2025-05-11T21:37:05Z

Gaja Starc: /* Priprava sevov */

Povezava sintezne in sistemske biologije za in vivo encimatiko

2025-05-11T21:36:52Z

Gaja Starc: /* Priprava sevov */

Povezava sintezne in sistemske biologije za in vivo encimatiko

2025-05-11T21:36:11Z

Gaja Starc: /* Priprava sevov */

Povezava sintezne in sistemske biologije za in vivo encimatiko

2025-05-11T21:34:59Z

Gaja Starc: /* Priprava sevov */

Povezava sintezne in sistemske biologije za in vivo encimatiko

2025-05-11T21:33:54Z

Gaja Starc:

Povezava sintezne in sistemske biologije za in vivo encimatiko

2025-05-11T21:27:42Z

Gaja Starc:

Povezava sintezne in sistemske biologije za in vivo encimatiko

2025-05-11T21:23:40Z

Gaja Starc: /* Uvod */

Povezava sintezne in sistemske biologije za in vivo encimatiko

2025-05-11T21:23:15Z

Gaja Starc:

Povezava sintezne in sistemske biologije za in vivo encimatiko

2025-05-11T21:11:29Z

Gaja Starc: Created page with "Izhodiščni članek: [https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/39322757/ Combining systems and synthetic biology for in vivo enzymology] == Uvod =="

Izhodiščni članek: [https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/39322757/ Combining systems and synthetic biology for in vivo enzymology]

== Uvod ==

Seminarji SB 2024/25

2025-05-11T21:07:18Z

Gaja Starc:

V študijskem letu 2024/25 študenti in študentke pri Sintezni biologiji predstavljajo naslednje teme:

RAZISKOVALNI ČLANKI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Inženiring_umetnih_medvrstnih_promotorjev_z_različnimi_transkripcijskimi_močmi Inženiring umetnih medvrstnih promotorjev z različnimi transkripcijskimi močmi] (Miljan Trajković)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Preprečevanje_nastanka_multimerov_pogosto_uporabljenih_plazmidov_v_sintezni_biologiji Preprečevanje nastanka multimerov pogosto uporabljenih plazmidov v sintezni biologiji] (Lev Jošt)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Priprava_Nicotiane_benthamiane_za_proizvodnjo_krisoeriola_z_uporabo_tehnik_sintezne_biologije Priprava ''Nicotiane benthamiane'' za proizvodnjo krisoeriola z uporabo tehnik sintezne biologije] (Nika Frelih)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Gensko_spremenjeni_receptorji_za_komunikacijo_med_celicami_preko_topnih_signalov_in_zaznavanje_bolezni Gensko spremenjeni receptorji za komunikacijo med celicami preko topnih signalov in zaznavanje bolezni] (Zara Bunc)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Nadzor_nad_izražanjem_heterolognih_genov_pri_Bdellovibrio_bacteriovorus_z_uporabo_sintezne_biologije Nadzor nad izražanjem heterolognih genov pri Bdellovibrio bacteriovorus z uporabo sintezne biologije] (Živa Flego)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Uporaba_konzorcija_kvasovk_za_de_novo_biosintezo_rastlinskih_lignanov Uporaba konzorcija kvasovk za de novo biosintezo rastlinskih lignanov] (Urša Lah)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sonogenetsko_nadzorovane_gensko_spremenjene_celice_za_zdravljenje_raka_v_mišjih_tumorskih_modelih Sonogenetsko nadzorovane gensko spremenjene celice za zdravljenje raka v mišjih tumorskih modelih] (Pia Mencin)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Združitev_difuzijskega_modela_in_transformerja_za_sintezo_izboljšanih_promotorjev_ter_napoved_moči_sintetičnih_promotorjev_z_uporabo_globokega_učenja Združitev difuzijskega modela in transformerja za sintezo izboljšanih promotorjev ter napoved moči sintetičnih promotorjev z uporabo globokega učenja] (Tinkara Korošec)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Z_dvojno_svetlobo_nadzirani_kokulturni_sistem_omogoča_uravnavanje_sestave_populacije Z dvojno svetlobo nadzirani sistem omogoča uravnavanje sestave populacije] (Ula Mikoš)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Načrtovanje_močnih_inducibilnih_sinteznih_promotorjev_v_kvasovkah Načrtovanje močnih inducibilnih sinteznih promotorjev v kvasovkah] (Bor Kunstelj)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Metabolni_inženiring_E._coli_za_izboljšano_produkcijo_diolov_iz_acetata Metabolni inženiring ''E. coli'' za izboljšano produkcijo diolov iz acetata] (Teo Trost)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Inkorporacija_fotosintetsko_aktivnih_kloroplastov_iz_alg_v_kultivirane_celice_sesalcev_kot_pot_k_fotosintezi_pri_Živalih Inkorporacija fotosintetsko aktivnih kloroplastov iz alg v kultivirane celice sesalcev kot pot k fotosintezi pri živalih] (Peter Gričar Vintar)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Izgradnja_metabolične_poti_za_biosintezo_treonina_iz_etilen_glikola Izgradnja metabolične poti za biosintezo treonina iz etilen glikola] (Tinkara Butara)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Povezava_sintezne_in_sistemske_biologije_za_in_vivo_encimatiko Povezava sintezne in sistemske biologije za ''in vivo'' encimatiko] (Gaja Starc)

NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/SynPlode SynPlode] (Leila Bohorč)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/PETal:_izdelovanje_eteričnega_olja_sandalovine_iz_PET_plastike PETal: izdelovanje eteričnega olja sandalovine iz PET plastike] (Lara Krampač)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/PET_TWINS:_Praktična_uporaba_PETaze_za_učinkovitejše_recikliranje_plastike PET TWINS: Praktična uporaba PETaze za učinkovitejše recikliranje plastike] (Tina Urh)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/CAU-China:_Nodulska_tovarna_DHA_in_EPA CAU-China: Nodulska tovarna DHA in EPA] (Luka Fink)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/nuCloud:_Nov_oblak_za_shranjevanje_podatkov_na_osnovi_nukleotidov nuCloud: Nov oblak za shranjevanje podatkov na osnovi nukleotidov] (Aleš Poljanšek)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Nova_metoda_diagnosticiranja_multiple_skleroze_-_miRADAR Nova metoda diagnosticiranja multiple skleroze - miRADAR] (Petja Premrl)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Biostimulant_za_rast_rastlin_na_Luni_–_BioMoon Biostimulant za rast rastlin na Luni – BioMoon] (Žan Žnidar)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=CAPTURE:_Boj_proti_oku%C5%BEbam_s_Pseudomonas_aeruginosa_z_nosilci_protimikrobnih_peptidov&action=edit&redlink=1 Boj proti okužbam s Pseudomonas aeruginosa z nosilci protimikrobnih peptidov - CAPTURE] (Metka Rus)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/REPARO REPARO] (Lina Kopač)

Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Povzetek je treba objaviti dva dni pred predstavitvijo do polnoči (za seminarje v torek torej najkasneje v ponedeljek). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo približno 5-minutna razprava.

Terminski razpored bo razviden iz preglednice na strežniku Google Drive.

Kako je videti končni seznam seminarjev, lahko preverite pri lanskem letniku: [[Seminarji_SB_2023/24]].

Seminarji SB 2024/25

2025-05-11T21:06:40Z

Gaja Starc:

V študijskem letu 2024/25 študenti in študentke pri Sintezni biologiji predstavljajo naslednje teme:

RAZISKOVALNI ČLANKI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Inženiring_umetnih_medvrstnih_promotorjev_z_različnimi_transkripcijskimi_močmi Inženiring umetnih medvrstnih promotorjev z različnimi transkripcijskimi močmi] (Miljan Trajković)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Preprečevanje_nastanka_multimerov_pogosto_uporabljenih_plazmidov_v_sintezni_biologiji Preprečevanje nastanka multimerov pogosto uporabljenih plazmidov v sintezni biologiji] (Lev Jošt)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Priprava_Nicotiane_benthamiane_za_proizvodnjo_krisoeriola_z_uporabo_tehnik_sintezne_biologije Priprava ''Nicotiane benthamiane'' za proizvodnjo krisoeriola z uporabo tehnik sintezne biologije] (Nika Frelih)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Gensko_spremenjeni_receptorji_za_komunikacijo_med_celicami_preko_topnih_signalov_in_zaznavanje_bolezni Gensko spremenjeni receptorji za komunikacijo med celicami preko topnih signalov in zaznavanje bolezni] (Zara Bunc)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Nadzor_nad_izražanjem_heterolognih_genov_pri_Bdellovibrio_bacteriovorus_z_uporabo_sintezne_biologije Nadzor nad izražanjem heterolognih genov pri Bdellovibrio bacteriovorus z uporabo sintezne biologije] (Živa Flego)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Uporaba_konzorcija_kvasovk_za_de_novo_biosintezo_rastlinskih_lignanov Uporaba konzorcija kvasovk za de novo biosintezo rastlinskih lignanov] (Urša Lah)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sonogenetsko_nadzorovane_gensko_spremenjene_celice_za_zdravljenje_raka_v_mišjih_tumorskih_modelih Sonogenetsko nadzorovane gensko spremenjene celice za zdravljenje raka v mišjih tumorskih modelih] (Pia Mencin)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Združitev_difuzijskega_modela_in_transformerja_za_sintezo_izboljšanih_promotorjev_ter_napoved_moči_sintetičnih_promotorjev_z_uporabo_globokega_učenja Združitev difuzijskega modela in transformerja za sintezo izboljšanih promotorjev ter napoved moči sintetičnih promotorjev z uporabo globokega učenja] (Tinkara Korošec)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Z_dvojno_svetlobo_nadzirani_kokulturni_sistem_omogoča_uravnavanje_sestave_populacije Z dvojno svetlobo nadzirani sistem omogoča uravnavanje sestave populacije] (Ula Mikoš)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Načrtovanje_močnih_inducibilnih_sinteznih_promotorjev_v_kvasovkah Načrtovanje močnih inducibilnih sinteznih promotorjev v kvasovkah] (Bor Kunstelj)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Metabolni_inženiring_E._coli_za_izboljšano_produkcijo_diolov_iz_acetata Metabolni inženiring ''E. coli'' za izboljšano produkcijo diolov iz acetata] (Teo Trost)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Inkorporacija_fotosintetsko_aktivnih_kloroplastov_iz_alg_v_kultivirane_celice_sesalcev_kot_pot_k_fotosintezi_pri_Živalih Inkorporacija fotosintetsko aktivnih kloroplastov iz alg v kultivirane celice sesalcev kot pot k fotosintezi pri živalih] (Peter Gričar Vintar)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Izgradnja_metabolične_poti_za_biosintezo_treonina_iz_etilen_glikola Izgradnja metabolične poti za biosintezo treonina iz etilen glikola] (Tinkara Butara)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Povezava_sintezne_in_sistemske_biologije_za_in_vivo_encimatiko Povezava sintezne in sistemske biologije za in vivo encimatiko] (Gaja Starc)

NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/SynPlode SynPlode] (Leila Bohorč)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/PETal:_izdelovanje_eteričnega_olja_sandalovine_iz_PET_plastike PETal: izdelovanje eteričnega olja sandalovine iz PET plastike] (Lara Krampač)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/PET_TWINS:_Praktična_uporaba_PETaze_za_učinkovitejše_recikliranje_plastike PET TWINS: Praktična uporaba PETaze za učinkovitejše recikliranje plastike] (Tina Urh)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/CAU-China:_Nodulska_tovarna_DHA_in_EPA CAU-China: Nodulska tovarna DHA in EPA] (Luka Fink)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/nuCloud:_Nov_oblak_za_shranjevanje_podatkov_na_osnovi_nukleotidov nuCloud: Nov oblak za shranjevanje podatkov na osnovi nukleotidov] (Aleš Poljanšek)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Nova_metoda_diagnosticiranja_multiple_skleroze_-_miRADAR Nova metoda diagnosticiranja multiple skleroze - miRADAR] (Petja Premrl)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Biostimulant_za_rast_rastlin_na_Luni_–_BioMoon Biostimulant za rast rastlin na Luni – BioMoon] (Žan Žnidar)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=CAPTURE:_Boj_proti_oku%C5%BEbam_s_Pseudomonas_aeruginosa_z_nosilci_protimikrobnih_peptidov&action=edit&redlink=1 Boj proti okužbam s Pseudomonas aeruginosa z nosilci protimikrobnih peptidov - CAPTURE] (Metka Rus)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/REPARO REPARO] (Lina Kopač)

Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Povzetek je treba objaviti dva dni pred predstavitvijo do polnoči (za seminarje v torek torej najkasneje v ponedeljek). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo približno 5-minutna razprava.

Terminski razpored bo razviden iz preglednice na strežniku Google Drive.

Kako je videti končni seznam seminarjev, lahko preverite pri lanskem letniku: [[Seminarji_SB_2023/24]].

Funkcije nekodirajoče RNA, ki je po izvoru transpozonska

2022-05-01T20:56:19Z

Gaja Starc: /* Aktivne dolge nekodirajoče RNA (lncRNA), ki so po izvoru transpozonske */

==Uvod==

Transpozicijski elementi (TE) predstavljajo pomemben dejavnik genomske kompleksnosti evkariontov. Pomembni so zaradi funkcije premikanja po DNA, ki pomembno vpliva na evolucijsko ločevanje organizmov, kratkoročno pa lahko predstavlja genomsko nestabilnost. Vplivajo tudi na aktivnost transkripcije genov v njihovi bližini s spreminjanjem njihovih epigenetskih značilnosti ali položaja regulatornih elementov.

V našem seminarju se bomo osredotočili na TE, ki predstavljajo izvor funkcionalnih dolgih ali kratkih nekodirajočih RNA pri rastlinah. Njihova funkcija je povezana s ''trans'' regulacijo aktivnosti genov na transkripcijskem in post-transkripcijskem nivoju. ''Trans'' regulacija je delovanje molekul na oddaljene dele genoma preko drugih, vmesnih molekul.

TE se lahko nahajajo v nekodirajočih delih DNA, kjer običajno nimajo večjega učinka, ali pa v neposredni bližini genov. Slednji močno vplivajo na nivo transkripcije bližnjih genov. Poleg tega lahko TE vplivajo na epigenetske značilnosti bližnjih regij DNA in še tako vplivajo na izražanje genov. Zato so rastline razvile številne mehanizme za zmanjševanje vpliva TE na ali v bližini genov in omejitev traspozicijskih premikov na ta mesta.

TE so pomemben izvor nekodirajočih RNA. Pri rastlinah so to predvsem dolge in kratke nekodirajoče RNA (lncRNA, smRNA), ki predstavljajo glavni regulator izražanja genov. lncRNA molekule večinoma nastanejo s pomočjo encima RNA polimeraza II (RNAPII), alternativno pa z rastlinsko specifičnimi polimerazami (RNAPIV, RNAPV). lncRNA molekule z interakcijami s proteini in tvorbo dupleksov z DNA ali RNA zmanjšajo izražanje genov na nivoju transkripcije. Druga možnost je, da lncRNA prepozna specifičen DICER protein, ki tvori več smRNA, ki sodelujejo pri utišanju genov.

==Aktivne male RNA, ki so po izvoru transpozonske==

'''Po izvoru transpozonske male interferenčne RNA (siRNA), ki povzročijo metilacijo DNA in nastanek heterokromatina na mestih TE ter utišajo njihovo transkripcijo (het-siRNA)'''

V normalnih pogojih je večina TE utišanih z metilacijo. Mehanizem metilacije je od RNA odvisna DNA metilacija (RdDM). Začne se, ko od RNA odvisna RNA polimeraza 2 (RDR2) prepozna na novo nastale RNA iz TE, nastale z delovanjem encima RNAPIV in jih spremni v dsRNA molekule. Protein DICER - LIKE 3 (DCL3) jih nato procesira v 24 nt siRNA, prenese v citoplazmo in naloži na ARGONAUTE4 (AGO4) ali na AGO3 in AGO6 proteine. AGO4 s siRNA molekulami se vrne v jedro, tam prepozna RNAPV transkripte s komplementarnim zaporedjem. Po interakciji teh dveh RNA zaporedij se na kompleks veže posebna DNA metiltransferaza (DOMAINS REARRANGED METHYTRANSFERASE 2, DRM2). Ta povzroči metilacijo TE, iz katerih te RNA izvirajo. Posledica tega je kondenzacija kromatina in trajno utišanje TE. Pri utišanju sodeluje tudi DNA topoizomeraza 1α, encim, ki spreminja topologijo DNA. V tem procesu olajša tvorbo lncRNA molekul z RNAPV, približanje in vezavo AGO4 ter metilacijo H3K9 (H3K9me2). To nakazuje, da tudi organizacija DNA vpliva na utišanje TE. Ta mehanizem utišanja je za rastline pomemben kot odgovor na stres in za prenos epigenetskih informacij na potomce. Večkrat se zgodi, da se TE vrine v ali v bližino gena. Če na te TE deluje RdDM, se poleg TE metilirajo tudi ti geni. Metilacija po navadi povzroči utišanje genov, zato lahko predstavlja težavo pri preživetju rastline.

Het-siRNA lahko delujejo ''trans''. Pri ''Arabidopsis thaliana'' se v normalnih pogojih sintetizirajo het-siRNA molekule iz pericentromernih TE. Te prepoznajo in utišajo oddaljene gene za proteine, ki ob okužbi prepoznajo molekule pogosto prisotne v patogenih (PATTERN RECOGNITION RECEPTORS, PRRs) in proteine vnetnega odziva ter prirojenega imunskega odziva (NUCLEOTIDE-BINDING LEUCIN-RICH REPEAT PROTEINS, NLRs). Ob okužbi s ''Pseudomonas syringae'' (Gram negativna bakterija), pride najprej do povišanega izražanja pericentromernih TE. Sledi RdDM, poveazana z akumulacijo het-siRNA, ki metilacijo usmerjajo na izvorne TE. To povzroči zmanjšanje represije obrambnih genov in večjo odpornost na patogen.

'''Epigenetsko aktivne siRNA (easiRNA), ki izvirajo iz TE in delujejo ''trans'''''

Pri ''Arabidopsis'' je večina TE epigenetsko utišanih s 24 nt het-siRNA. Aktivacija prepisovanja utišanih TE se odraža v nastanku 21-22 nt easiRNA. Pri tem 21 nt miRNA, ki je naložena na AGO1, sproži cepitev TE prepisa, kar omogoči združitev kompleksa RDR6/SGS3. Ta kompleks pomaga prepoznati mRNA prepis TE in nastanek dsRNA. DLC2 in DLC4 nato omogočita procesiranje dsRNA, kar je ključno za nastanek 21-22 nt easiRNA. easiRNA, naložene na AGO1, lahko nato sodelujejo pri utišanju tarčne mRNA ali TE prepisa na post-transkripcijskem nivoju. Druga možnost je, da AGO2 naloži 21-22 nt easiRNA, kar sproži netipično od proteina NERD odvisno RdDM TGS (ang. transcriptional gene silencing) pot. V primeru, ko AGO6 naloži easiRNA, pa to sproži značilno RdDM, ki vodi v utišanje TE.

'''TE kot vir novih smRNA'''

Majhne obrnjene ponovitve TE (MITE) so kratki neavtonomni TE s končnimi regijami obrnjenih ponovitev. Ti elementi, ki so bili najprej opisani v rastlinah, so pretežno vstavljeni v z geni bogate regije in navadno vplivajo na izražanje sosednjih genov. Poleg regulacije izražanja genov z insercijo ali epigenetskimi modifikacijami, lahko MITE postane vir smRNA. MITE med transkripcijo proizvedejo komplementarno RNA, ki se lahko zvije v steblo-zanka podobno sekundarno strukturo, ki je dovzetna za procesiranje z DCL3. V tem primeru pride do procesiranja lncRNA s strani DCL3 v 24 nt het-siRNA molekule, ki po običajni poti sprožijo metilacijo ''cis'' ali ''trans'', kar povzroči epigenetsko utišanje tarčnega lokusa. V rižu se od DCL3 odvisna 24 nt smRNA, ki izvira iz MITE, akumulira zaradi abiotskega stresa, kar pozitivno regulira ABA (abscizinska kislina) signaliziranje in odziv na stres.

Mutacije v zaporedju MITE vodijo tudi do nepopolnih struktur steblo-zanka, kar je lastnost miRNA prekurzorjev. To je spodbudilo razmišljanje, da so MITE verjeten evolucijski izvor miRNA lokusa. To podpira dejstvo, da se novonastale miRNA vežejo na MITE in druge TE lokuse, kar bi razložilo, zakaj se nekateri prekurzorji miRNA procesirajo tako v 21 nt kot 24 nt zvrsti. Ta ideja je dodatno podprta z ugotovitvijo, da lahko nekateri prekurzorji miRNA, ki jih prepozna DCL3, proizvajajo 24 nt siRNA in inducirajo metilacijo svojih ali tujih lokusov, kar kaže na izvor iz TE. Nadaljnja analiza potencialnega izvora miRNA genov iz TE je pokazala, da so MITE zelo dovzetne za udomačitev v miRNA prekurzorje. Spreminjanje miRNA v odvisnosti od MITE lahko tako predstavlja novosti v odzivu rastlin na razne patogene.

==Aktivne dolge nekodirajoče RNA (lncRNA), ki so po izvoru transpozonske==

'''TE kot vir fiziološko aktivnih lncRNA'''

Z RNA sekvenciranjem pri koruzi so identificirali več kot 23 000 možnih lncRNA. Okoli 65 % izmed njih je kazalo podobnost s TE, temeljito opazovanje TE in lncRNA v 40 vrstah rastlin pa je razkrilo več kot 14 000 prekrivanj med lncRNA lokusi in TE. lncRNA, ki izvirajo iz TE, so večinoma povezane z retrotranspozoni in povečanim številom le-teh v genomu. Aktivirane lncRNA se pretežno prepisujejo iz demetiliranih TE regij, zlasti iz dolgih vmesnih jedrnih elementov (LINE), ki so del retrotranspozonov.

Mnoge izmed lncRNA, ki izvirajo iz TE, so prepisno odzivne na sol, ABA in mraz. Različno izražanje lncRNA naj bi bilo povezano z dinamiko metilacije DNA, ki omogoča neofunkcionalizacijo nekodirajočih prepisov. Dokazali so, da je znotraj vrste ''Arabidopsis'' transkripcija velikega števila lncRNA odvisna od ekotipa. Zbirka lncRNA rastline, ki je direktno odvisna od prepisne aktivnosti TE, pa predstavlja značilnosti nedavnega razhajanja med vrstami ali celo znotraj iste vrste.

'''Dolge nekodirajoče RNA, ki izvirajo iz TE, kot regulatorji malih RNA in proteinov'''

TE sodelujejo pri tvorbi smRNA, lahko pa zavirajo njihovo aktivnost. MIKKI, nekodirajoč prepis retrotranspozonskega izvora, ki se aktivno prepisuje v koreninah riža, vsebuje nepopolno tarčno mesto miRNA171. miRNA171 destabilizira mRNA, ki zapisujejo za družino SCARECROW-u podobnih transkripcijskh faktorjev specifičnih za korenine. MIKKI deluje kot miRNA vaba - vsebuje vezavna mesta za miRNA in povzroči njeno degradacijo. S svojim delovanjem povzroči kopičenje SCARECROW-u podobnih mRNA v koreninah in tako spodbuja pravilen razvoj korenin. Medgenska lncRNA INDUCED BY PHOSPHATE STARVATION 1 (IPS1) pri ''Arabidopsis'' je komplementarna s pomanjkanjem fosfata inducirani miRNA399, vključuje pa neujemajočo zanko na pričakovanem miRNA cepitvenem mestu, ki preprečuje razgradnjo IPS1 in ga pretvori v vabo za miRNA399.

lncRNA, ki izvirajo iz TE, lahko uravnavajo izražanje genov preko interakcije s proteini. Kratek razpršeni jedrni element SB1 (SB1 SINE) pri oljni ogrščici uravnava biogenezo miRNA z oviranjem dsRNA vezavnega proteina HYPONASTIC LEAVES1 (HYL1). Po transkripciji se SB1 prepis, ki izvira iz SINE, zvije v lasnično sekundarno strukturo, ki spominja na prekurzorsko miRNA. Na strukturo se veže HYL1, ki posledično ne more sodelovati v kompleksu procesiranja miRNA. Pri rastlinah, ki izražajo SB1 SINE, so pogoste okvare v razvoju in akumulaciji miRNA. Ta fenotip lahko povežemo z ektopičnim prekomernim izražanjem SINE, vendar pa kaže tudi na vpliv TE pri tvorbi miRNA v specifičnih razvojnih fazah in okoljskih razmerah.

'''Dolge nekodirajoče RNA, ki izvirajo iz TE, kot potencialni regulatorji konformacije kromatina'''

Biosintezne poti številnih rastlinskih produktov vključujejo gene organizirane v skupke. Takšna organizacija genoma naj bi izvirala iz podvojevanja genov, njihove premestitve in neofunkcionalizacije. Pri ''Arabidopsis'' se biosintetski skupki genov pojavljajo v regijah genoma bogatih s TE, s TE uravnana rekombinacija pa sodeluje pri njihovi tvorbi in koregulaciji. Obširna analiza rastlinskih genomov je pokazala vlogo transpozicije MITE pri tvorbi biosintetskih skupkov pri evdikotih. Pri ''Arabidopsis'' lncRNA MARneral Silencing (MARS) nadzoruje epigenetsko aktivacijo regije, ki jo obdaja in tako vpliva na izražanje genov marneralnega skupka ter posledično na kalitev semen. MARS kot odziv na ABA zvabi LIKEHETEROCHROMATIN PROTEIN 1 (LHP1) stran od skupka in spodbudi tvorbo kromatinske zanke, ki približa lokus MARNERAL SYNTHASE 1 (MRN1) oddaljenemu od ABA odvisnemu ojačevalnemu zaporedju.

Nekatere lncRNA preko komplementanosti zaporedij tvorijo DNA-RNA duplekse (R-zanke) in sprožijo transkripcijsko samozaviranje ali alternativno izrezovanje. lncRNA AUXIN-REGULATED PROMOTER LOOP (APOLO) prepozna več neodvisnih tarčnih lokusov znotraj genoma ''Arabidopsis''. S tvorbo R-zanke zvabi LIKEHETEROCHROMATIN PROTEIN 1
(LHP1) stran od kromatina in tako uravnava njegovo lokalno 3D konformacijo.

lncRNA, ki izvirajo iz MITE, lahko z insercijo v bližino kodirajočega gena, regulirajo 3D konformacijo kromatina, kar v odvisnosti od celičnega tipa, uravnava transkripcijsko aktivnost sosednjih genov. Transkripcija lncRNA ncW6 z RNAPII povzroči tvorbo het-siRNA, kar sproži metilacijo lokusa HaWRKY6. Te epigenetske spremembe stabilizirajo tvorbo tkivno specifičnih kromatinskih zank. V listih tvorba znotrajgenske zanke zavira transkripcijo gena HaWRKY6, kromatinska zanka v kličnih listih pa omogoča učinkovito recikliranje RNAPII in tako povečuje transkripcijo HaWRKY6. Podobno deluje tudi epigenetsko utišanje represorja cvetenja FLOWERING LOCUS C (FLC) med vernalizacijo. Izpostavitev mrazu inducira lncRNA COLDWRAP, ki posredno povzroči kompaktiranje kromatina, kar služi kot točka sidranja pri tvorbi znotrajgenske kromatinske zanke med promotorjem in 3' koncem prvega introna. Nastala zanka ovira procesivnost RNAPII, in povzroči epigenetsko utišanje FLC.

==Zaključek==

V zadnjih desetletjih so identificirali pomembno vlogo ncRNA pri uravnavanju izražanja genov na različnih nivojih. Identifikacija in karakterizacija ncRNA sta ključni pri razumevanju njihove vloge v adaptivni evoluciji. Boljše razumevanje dinamične akumulacije s TE povezanih smRNA in lncRNA kot odziv na zunanje dražljaje pa bo osvetlilo pomen nekodirajočega genoma pri medsebojnem vplivu med rastlino in okoljem. TE, ki so jih do nedavnega opisovali kot sebično DNA, niso spremenili svoje narave, šele zdaj pa začenjamo razumevati njihovo funkcijo v genomu.

==Viri in literatura==

1. Ariel, Federico D., and Pablo A. Manavella. ‘When Junk DNA Turns Functional: Transposon-Derived Non-Coding RNAs in Plants’. ''Journal of Experimental Botany'', edited by James Murray, vol. 72, no. 11, May 2021, pp. 4132–43. ''DOI.org (Crossref)'', https://doi.org/10.1093/jxb/erab073.

2. Cambiagno, Damián A., et al. ‘Immune Receptor Genes and Pericentromeric Transposons as Targets of Common Epigenetic Regulatory Elements’. ''The Plant Journal'', vol. 96, no. 6, Dec. 2018, pp. 1178–90. ''DOI.org (Crossref)'', https://doi.org/10.1111/tpj.14098.

3. Cho, Jungnam. ‘Transposon-Derived Non-Coding RNAs and Their Function in Plants’. ''Frontiers in Plant Science'', vol. 9, May 2018, p. 600. ''DOI.org (Crossref)'', https://doi.org/10.3389/fpls.2018.00600.

4. Cho, Jungnam, and Jerzy Paszkowski. ‘Regulation of Rice Root Development by a Retrotransposon Acting as a MicroRNA Sponge’. ''ELife'', edited by Christian S. Hardtke, vol. 6, Aug. 2017, p. e30038. ''eLife'', https://doi.org/10.7554/eLife.30038.

5. McCue, Andrea D., et al. “Gene Expression and Stress Response Mediated by the Epigenetic Regulation of a Transposable Element Small RNA.” ''PLoS Genetics'', edited by Tetsuji Kakutani, vol. 8, no. 2, Feb. 2012, p. e1002474. ''DOI.org (Crossref)'', https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1002474.

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Funkcije nekodirajoče RNA, ki je po izvoru transpozonska

2022-05-01T19:47:29Z

Gaja Starc: /* Aktivne dolge nekodirajoče RNA (lncRNA), ki so po izvoru transpozonske */

==Uvod==

Transpozicijski elementi (TE) predstavljajo pomemben dejavnik genomske kompleksnosti evkariontov. Pomembni so zaradi funkcije premikanja po DNA, ki pomembno vpliva na evolucijsko ločevanje organizmov, kratkoročno pa lahko predstavlja genomsko nestabilnost. Vplivajo tudi na aktivnost transkripcije genov v njihovi bližini s spreminjanjem njihovih epigenetskih značilnosti ali položaja regulatornih elementov.

V našem seminarju se bomo osredotočili na TE, ki predstavljajo izvor funkcionalnih dolgih ali kratkih nekodirajočih RNA pri rastlinah. Njihova funkcija je povezana s ''trans'' regulacijo aktivnosti genov na transkripcijskem in post-transkripcijskem nivoju. ''Trans'' regulacija je delovanje molekul na oddaljene dele genoma preko drugih, vmesnih molekul.

TE se lahko nahajajo v nekodirajočih delih DNA, kjer običajno nimajo večjega učinka, ali pa v neposredni bližini genov. Slednji močno vplivajo na nivo transkripcije bližnjih genov. Poleg tega lahko TE vplivajo na epigenetske značilnosti bližnjih regij DNA in še tako vplivajo na izražanje genov. Zato so rastline razvile številne mehanizme za zmanjševanje vpliva TE na ali v bližini genov in omejitev traspozicijskih premikov na ta mesta.

TE so pomemben izvor nekodirajočih RNA. Pri rastlinah so to predvsem dolge in kratke nekodirajoče RNA (lncRNA, smRNA), ki predstavljajo glavni regulator izražanja genov. lncRNA molekule večinoma nastanejo s pomočjo encima RNA polimeraza II (RNAPII), alternativno pa z rastlinsko specifičnimi polimerazami (RNAPIV, RNAPV). lncRNA molekule z interakcijami s proteini in tvorbo dupleksov z DNA ali RNA zmanjšajo izražanje genov na nivoju transkripcije. Druga možnost je, da lncRNA prepozna specifičen DICER protein, ki tvori več smRNA, ki sodelujejo pri utišanju genov.

==Aktivne male RNA, ki so po izvoru transpozonske==

'''Po izvoru transpozonske male interferenčne RNA (siRNA), ki povzročijo metilacijo DNA in nastanek heterokromatina na mestih TE ter utišajo njihovo transkripcijo (het-siRNA)'''

V normalnih pogojih je večina TE utišanih z metilacijo. Mehanizem metilacije je od RNA odvisna DNA metilacija (RdDM). Začne se, ko od RNA odvisna RNA polimeraza 2 (RDR2) prepozna na novo nastale RNA iz TE, nastale z delovanjem encima RNAPIV in jih spremni v dsRNA molekule. Protein DICER - LIKE 3 (DCL3) jih nato procesira v 24 nt siRNA, prenese v citoplazmo in naloži na ARGONAUTE4 (AGO4) ali na AGO3 in AGO6 proteine. AGO4 s siRNA molekulami se vrne v jedro, tam prepozna RNAPV transkripte s komplementarnim zaporedjem. Po interakciji teh dveh RNA zaporedij se na kompleks veže posebna DNA metiltransferaza (DOMAINS REARRANGED METHYTRANSFERASE 2, DRM2). Ta povzroči metilacijo TE, iz katerih te RNA izvirajo. Posledica tega je kondenzacija kromatina in trajno utišanje TE. Pri utišanju sodeluje tudi DNA topoizomeraza 1α, encim, ki spreminja topologijo DNA. V tem procesu olajša tvorbo lncRNA molekul z RNAPV, približanje in vezavo AGO4 ter metilacijo H3K9 (H3K9me2). To nakazuje, da tudi organizacija DNA vpliva na utišanje TE. Ta mehanizem utišanja je za rastline pomemben kot odgovor na stres in za prenos epigenetskih informacij na potomce. Večkrat se zgodi, da se TE vrine v ali v bližino gena. Če na te TE deluje RdDM, se poleg TE metilirajo tudi ti geni. Metilacija po navadi povzroči utišanje genov, zato lahko predstavlja težavo pri preživetju rastline.

Het-siRNA lahko delujejo ''trans''. Pri ''Arabidopsis thaliana'' se v normalnih pogojih sintetizirajo het-siRNA molekule iz pericentromernih TE. Te prepoznajo in utišajo oddaljene gene za proteine, ki ob okužbi prepoznajo molekule pogosto prisotne v patogenih (PATTERN RECOGNITION RECEPTORS, PRRs) in proteine vnetnega odziva ter prirojenega imunskega odziva (NUCLEOTIDE-BINDING LEUCIN-RICH REPEAT PROTEINS, NLRs). Ob okužbi s ''Pseudomonas syringae'' (Gram negativna bakterija), pride najprej do povišanega izražanja pericentromernih TE. Sledi RdDM, poveazana z akumulacijo het-siRNA, ki metilacijo usmerjajo na izvorne TE. To povzroči zmanjšanje represije obrambnih genov in večjo odpornost na patogen.

'''Epigenetsko aktivne siRNA (easiRNA), ki izvirajo iz TE in delujejo ''trans'''''

Pri ''Arabidopsis'' je večina TE epigenetsko utišanih s 24 nt het-siRNA. Aktivacija prepisovanja utišanih TE se odraža v nastanku 21-22 nt easiRNA. Pri tem 21 nt miRNA, ki je naložena na AGO1, sproži cepitev TE prepisa, kar omogoči združitev kompleksa RDR6/SGS3. Ta kompleks pomaga prepoznati mRNA prepis TE in nastanek dsRNA. DLC2 in DLC4 nato omogočita procesiranje dsRNA, kar je ključno za nastanek 21-22 nt easiRNA. easiRNA, naložene na AGO1, lahko nato sodelujejo pri utišanju tarčne mRNA ali TE prepisa na post-transkripcijskem nivoju. Druga možnost je, da AGO2 naloži 21-22 nt easiRNA, kar sproži netipično od proteina NERD odvisno RdDM TGS (ang. transcriptional gene silencing) pot. V primeru, ko AGO6 naloži easiRNA, pa to sproži značilno RdDM, ki vodi v utišanje TE.

'''TE kot vir novih smRNA'''

Majhne obrnjene ponovitve TE (MITE) so kratki neavtonomni TE s končnimi regijami obrnjenih ponovitev. Ti elementi, ki so bili najprej opisani v rastlinah, so pretežno vstavljeni v z geni bogate regije in navadno vplivajo na izražanje sosednjih genov. Poleg regulacije izražanja genov z insercijo ali epigenetskimi modifikacijami, lahko MITE postane vir smRNA. MITE med transkripcijo proizvedejo komplementarno RNA, ki se lahko zvije v steblo-zanka podobno sekundarno strukturo, ki je dovzetna za procesiranje z DCL3. V tem primeru pride do procesiranja lncRNA s strani DCL3 v 24 nt het-siRNA molekule, ki po običajni poti sprožijo metilacijo ''cis'' ali ''trans'', kar povzroči epigenetsko utišanje tarčnega lokusa. V rižu se od DCL3 odvisna 24 nt smRNA, ki izvira iz MITE, akumulira zaradi abiotskega stresa, kar pozitivno regulira ABA (abscizinska kislina) signaliziranje in odziv na stres.

Mutacije v zaporedju MITE vodijo tudi do nepopolnih struktur steblo-zanka, kar je lastnost miRNA prekurzorjev. To je spodbudilo razmišljanje, da so MITE verjeten evolucijski izvor miRNA lokusa. To podpira dejstvo, da se novonastale miRNA vežejo na MITE in druge TE lokuse, kar bi razložilo, zakaj se nekateri prekurzorji miRNA procesirajo tako v 21 nt kot 24 nt zvrsti. Ta ideja je dodatno podprta z ugotovitvijo, da lahko nekateri prekurzorji miRNA, ki jih prepozna DCL3, proizvajajo 24 nt siRNA in inducirajo metilacijo svojih ali tujih lokusov, kar kaže na izvor iz TE. Nadaljnja analiza potencialnega izvora miRNA genov iz TE je pokazala, da so MITE zelo dovzetne za udomačitev v miRNA prekurzorje. Spreminjanje miRNA v odvisnosti od MITE lahko tako predstavlja novosti v odzivu rastlin na razne patogene.

==Aktivne dolge nekodirajoče RNA (lncRNA), ki so po izvoru transpozonske==

'''TE kot vir fiziološko aktivnih lncRNA'''

Z RNA sekvenciranjem pri koruzi so identificirali več kot 23 000 možnih lncRNA. Okoli 65 % izmed njih je kazalo podobnost s TE, temeljito opazovanje TE in lncRNA v 40 vrstah rastlin pa je razkrilo več kot 14 000 prekrivanj med lncRNA lokusi in TE. lncRNA, ki izvirajo iz TE, so večinoma povezane z retrotranspozoni in povečanim številom le-teh v genomu. Aktivirane lncRNA se pretežno prepisujejo iz demetiliranih TE regij, zlasti iz dolgih vmesnih jedrnih elementov (LINE), ki so del retrotranspozonov.

Mnoge izmed lncRNA, ki izvirajo iz TE, so prepisno odzivne na sol, ABA in mraz. Različno izražanje lncRNA naj bi bilo povezano z dinamiko metilacije DNA, ki omogoča neofunkcionalizacijo nekodirajočih prepisov. Dokazali so, da je znotraj vrste ''Arabidopsis'' transkripcija velikega števila lncRNA odvisna od ekotipa. Zbirka lncRNA rastline, ki je direktno odvisna od prepisne aktivnosti TE, pa predstavlja značilnosti nedavnega razhajanja med vrstami ali celo znotraj iste vrste.

'''Dolge nekodirajoče RNA, ki izvirajo iz TE, kot regulatorji malih RNA in proteinov'''

TE sodelujejo pri tvorbi smRNA, lahko pa zavirajo njihovo aktivnost. MIKKI, nekodirajoč prepis retrotranspozonskega izvora, ki se aktivno prepisuje v koreninah riža, vsebuje nepopolno tarčno mesto miRNA171. miRNA171 destabilizira mRNA, ki zapisujejo za družino SCARECROW-u podobnih transkripcijskh faktorjev specifičnih za korenine. MIKKI deluje kot miRNA vaba - vsebuje vezavna mesta za miRNA in povzroči njeno degradacijo. S svojim delovanjem povzroči kopičenje SCARECROW-u podobnih mRNA v koreninah in tako spodbuja pravilen razvoj korenin. Medgenska lncRNA INDUCED BY PHOSPHATE STARVATION 1 (IPS1) pri ''Arabidopsis'' je komplementarna s pomanjkanjem fosfata inducirani miRNA399, vključuje pa neujemajočo zanko na pričakovanem miRNA cepitvenem mestu, ki preprečuje razgradnjo IPS1 in ga pretvori v vabo za miRNA399.

lncRNA, ki izvirajo iz TE, lahko uravnavajo izražanje genov preko interakcije s proteini. Kratek razpršeni jedrni element SB1 (SB1 SINE) pri oljni ogrščici uravnava biogenezo miRNA z oviranjem dsRNA vezavnega proteina HYPONASTIC LEAVES1 (HYL1). Po transkripciji se SB1 prepis, ki izvira iz SINE, zvije v lasnično sekundarno strukturo, ki spominja na prekurzorsko miRNA. Na strukturo se veže HYL1, ki posledično ne more sodelovati v kompleksu procesiranja miRNA. Pri rastlinah, ki izražajo SB1 SINE, so pogoste okvare v razvoju in akumulaciji miRNA. Ta fenotip lahko povežemo z ektopičnim prekomernim izražanjem SINE, vendar pa kaže tudi na vpliv TE pri tvorbi miRNA v specifičnih razvojnih fazah in okoljskih razmerah.

'''Dolge nekodirajoče RNA, ki izvirajo iz TE, kot potencialni regulatorji konformacije kromatina'''

Biosintezne poti številnih rastlinskih produktov vključujejo gene organizirane v skupke. Takšna organizacija genoma naj bi izvirala iz podvojevanja genov, njihove premestitve in neofunkcionalizacije. Pri ''Arabidopsis'' se biosintetski skupki genov pojavljajo v regijah genoma bogatih s TE, s TE uravnana rekombinacija pa sodeluje pri njihovi tvorbi in koregulaciji. Obširna analiza rastlinskih genomov je pokazala vlogo transpozicije MITE pri tvorbi biosintetskih skupkov pri evdikotih. Pri ''Arabidopsis'' lncRNA MARneral Silencing (MARS) nadzoruje epigenetsko aktivacijo regije, ki jo obdaja in tako vpliva na izražanje genov marneralnega skupka ter posledično na kalitev semen. MARS kot odziv na ABA zvabi LIKEHETEROCHROMATIN PROTEIN 1 (LHP1) stran od skupka in spodbudi tvorbo kromatinske zanke, ki približa lokus MARNERAL SYNTHASE 1 (MRN1) oddaljenemu od ABA odvisnemu ojačevalnemu zaporedju.

Nekatere lncRNA preko komplementanosti zaporedij tvorijo DNA-RNA duplekse (R-zanke) in sprožijo transkripcijsko samozaviranje ali alternativno izrezovanje. lncRNA AUXIN-REGULATED PROMOTER LOOP (APOLO) prepozna več neodvisnih tarčnih lokusov znotraj genoma ''Arabidopsis''. S tvorbo R-zanke zvabi LIKEHETEROCHROMATIN PROTEIN 1
(LHP1) stran od kromatina in tako uravnava njegovo lokalno 3D konformacijo.

lncRNA, ki izvirajo iz MITE, lahko z insercijo v bližino kodirajočega gena, regulirajo 3D konformacijo kromatina, kar v odvisnosti od celičnega tipa, uravnava transkripcijsko aktivnost sosednjih genov. RNAPII transkripcija lncRNA ncW6, ki izvira iz MITE, povzroči tvorbo het-siRNA, kar sproži metilacijo lokusa HaWRKY6. Te epigenetske spremembe stabilizirajo tvorbo tkivno specifičnih kromatinskih zank. V listih tvorba znotrajgenske zanke zavira transkripcijo gena HaWRKY6, kromatinska zanka v kličnih listih pa omogoča učinkovito recikliranje RNAPII in tako povečuje transkripcijo HaWRKY6. Podobno deluje tudi epigenetsko utišanje represorja cvetenja FLOWERING LOCUS C (FLC) med vernalizacijo. Izpostavitev mrazu inducira lncRNA COLDWRAP, ki posredno povzroči kompaktiranje kromatina, kar služi kot točka sidranja pri tvorbi znotrajgenske kromatinske zanke med promotorjem in 3' koncem prvega introna. Nastala zanka ovira procesivnost RNAPII, in povzroči epigenetsko utišanje FLC.

==Zaključek==

V zadnjih desetletjih so identificirali pomembno vlogo ncRNA pri uravnavanju izražanja genov na različnih nivojih. Identifikacija in karakterizacija ncRNA sta ključni pri razumevanju njihove vloge v adaptivni evoluciji. Boljše razumevanje dinamične akumulacije s TE povezanih smRNA in lncRNA kot odziv na zunanje dražljaje pa bo osvetlilo pomen nekodirajočega genoma pri medsebojnem vplivu med rastlino in okoljem. TE, ki so jih do nedavnega opisovali kot sebično DNA, niso spremenili svoje narave, šele zdaj pa začenjamo razumevati njihovo funkcijo v genomu.

==Viri in literatura==

1. Ariel, Federico D., and Pablo A. Manavella. ‘When Junk DNA Turns Functional: Transposon-Derived Non-Coding RNAs in Plants’. ''Journal of Experimental Botany'', edited by James Murray, vol. 72, no. 11, May 2021, pp. 4132–43. ''DOI.org (Crossref)'', https://doi.org/10.1093/jxb/erab073.

2. Cambiagno, Damián A., et al. ‘Immune Receptor Genes and Pericentromeric Transposons as Targets of Common Epigenetic Regulatory Elements’. ''The Plant Journal'', vol. 96, no. 6, Dec. 2018, pp. 1178–90. ''DOI.org (Crossref)'', https://doi.org/10.1111/tpj.14098.

3. Cho, Jungnam. ‘Transposon-Derived Non-Coding RNAs and Their Function in Plants’. ''Frontiers in Plant Science'', vol. 9, May 2018, p. 600. ''DOI.org (Crossref)'', https://doi.org/10.3389/fpls.2018.00600.

4. Cho, Jungnam, and Jerzy Paszkowski. ‘Regulation of Rice Root Development by a Retrotransposon Acting as a MicroRNA Sponge’. ''ELife'', edited by Christian S. Hardtke, vol. 6, Aug. 2017, p. e30038. ''eLife'', https://doi.org/10.7554/eLife.30038.

5. McCue, Andrea D., et al. “Gene Expression and Stress Response Mediated by the Epigenetic Regulation of a Transposable Element Small RNA.” ''PLoS Genetics'', edited by Tetsuji Kakutani, vol. 8, no. 2, Feb. 2012, p. e1002474. ''DOI.org (Crossref)'', https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1002474.

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Funkcije nekodirajoče RNA, ki je po izvoru transpozonska

2022-05-01T19:46:35Z

Gaja Starc: /* Aktivne dolge nekodirajoče RNA (lncRNA), ki so po izvoru transpozonske */

==Uvod==

Transpozicijski elementi (TE) predstavljajo pomemben dejavnik genomske kompleksnosti evkariontov. Pomembni so zaradi funkcije premikanja po DNA, ki pomembno vpliva na evolucijsko ločevanje organizmov, kratkoročno pa lahko predstavlja genomsko nestabilnost. Vplivajo tudi na aktivnost transkripcije genov v njihovi bližini s spreminjanjem njihovih epigenetskih značilnosti ali položaja regulatornih elementov.

V našem seminarju se bomo osredotočili na TE, ki predstavljajo izvor funkcionalnih dolgih ali kratkih nekodirajočih RNA pri rastlinah. Njihova funkcija je povezana s ''trans'' regulacijo aktivnosti genov na transkripcijskem in post-transkripcijskem nivoju. ''Trans'' regulacija je delovanje molekul na oddaljene dele genoma preko drugih, vmesnih molekul.

TE se lahko nahajajo v nekodirajočih delih DNA, kjer običajno nimajo večjega učinka, ali pa v neposredni bližini genov. Slednji močno vplivajo na nivo transkripcije bližnjih genov. Poleg tega lahko TE vplivajo na epigenetske značilnosti bližnjih regij DNA in še tako vplivajo na izražanje genov. Zato so rastline razvile številne mehanizme za zmanjševanje vpliva TE na ali v bližini genov in omejitev traspozicijskih premikov na ta mesta.

TE so pomemben izvor nekodirajočih RNA. Pri rastlinah so to predvsem dolge in kratke nekodirajoče RNA (lncRNA, smRNA), ki predstavljajo glavni regulator izražanja genov. lncRNA molekule večinoma nastanejo s pomočjo encima RNA polimeraza II (RNAPII), alternativno pa z rastlinsko specifičnimi polimerazami (RNAPIV, RNAPV). lncRNA molekule z interakcijami s proteini in tvorbo dupleksov z DNA ali RNA zmanjšajo izražanje genov na nivoju transkripcije. Druga možnost je, da lncRNA prepozna specifičen DICER protein, ki tvori več smRNA, ki sodelujejo pri utišanju genov.

==Aktivne male RNA, ki so po izvoru transpozonske==

'''Po izvoru transpozonske male interferenčne RNA (siRNA), ki povzročijo metilacijo DNA in nastanek heterokromatina na mestih TE ter utišajo njihovo transkripcijo (het-siRNA)'''

V normalnih pogojih je večina TE utišanih z metilacijo. Mehanizem metilacije je od RNA odvisna DNA metilacija (RdDM). Začne se, ko od RNA odvisna RNA polimeraza 2 (RDR2) prepozna na novo nastale RNA iz TE, nastale z delovanjem encima RNAPIV in jih spremni v dsRNA molekule. Protein DICER - LIKE 3 (DCL3) jih nato procesira v 24 nt siRNA, prenese v citoplazmo in naloži na ARGONAUTE4 (AGO4) ali na AGO3 in AGO6 proteine. AGO4 s siRNA molekulami se vrne v jedro, tam prepozna RNAPV transkripte s komplementarnim zaporedjem. Po interakciji teh dveh RNA zaporedij se na kompleks veže posebna DNA metiltransferaza (DOMAINS REARRANGED METHYTRANSFERASE 2, DRM2). Ta povzroči metilacijo TE, iz katerih te RNA izvirajo. Posledica tega je kondenzacija kromatina in trajno utišanje TE. Pri utišanju sodeluje tudi DNA topoizomeraza 1α, encim, ki spreminja topologijo DNA. V tem procesu olajša tvorbo lncRNA molekul z RNAPV, približanje in vezavo AGO4 ter metilacijo H3K9 (H3K9me2). To nakazuje, da tudi organizacija DNA vpliva na utišanje TE. Ta mehanizem utišanja je za rastline pomemben kot odgovor na stres in za prenos epigenetskih informacij na potomce. Večkrat se zgodi, da se TE vrine v ali v bližino gena. Če na te TE deluje RdDM, se poleg TE metilirajo tudi ti geni. Metilacija po navadi povzroči utišanje genov, zato lahko predstavlja težavo pri preživetju rastline.

Het-siRNA lahko delujejo ''trans''. Pri ''Arabidopsis thaliana'' se v normalnih pogojih sintetizirajo het-siRNA molekule iz pericentromernih TE. Te prepoznajo in utišajo oddaljene gene za proteine, ki ob okužbi prepoznajo molekule pogosto prisotne v patogenih (PATTERN RECOGNITION RECEPTORS, PRRs) in proteine vnetnega odziva ter prirojenega imunskega odziva (NUCLEOTIDE-BINDING LEUCIN-RICH REPEAT PROTEINS, NLRs). Ob okužbi s ''Pseudomonas syringae'' (Gram negativna bakterija), pride najprej do povišanega izražanja pericentromernih TE. Sledi RdDM, poveazana z akumulacijo het-siRNA, ki metilacijo usmerjajo na izvorne TE. To povzroči zmanjšanje represije obrambnih genov in večjo odpornost na patogen.

'''Epigenetsko aktivne siRNA (easiRNA), ki izvirajo iz TE in delujejo ''trans'''''

Pri ''Arabidopsis'' je večina TE epigenetsko utišanih s 24 nt het-siRNA. Aktivacija prepisovanja utišanih TE se odraža v nastanku 21-22 nt easiRNA. Pri tem 21 nt miRNA, ki je naložena na AGO1, sproži cepitev TE prepisa, kar omogoči združitev kompleksa RDR6/SGS3. Ta kompleks pomaga prepoznati mRNA prepis TE in nastanek dsRNA. DLC2 in DLC4 nato omogočita procesiranje dsRNA, kar je ključno za nastanek 21-22 nt easiRNA. easiRNA, naložene na AGO1, lahko nato sodelujejo pri utišanju tarčne mRNA ali TE prepisa na post-transkripcijskem nivoju. Druga možnost je, da AGO2 naloži 21-22 nt easiRNA, kar sproži netipično od proteina NERD odvisno RdDM TGS (ang. transcriptional gene silencing) pot. V primeru, ko AGO6 naloži easiRNA, pa to sproži značilno RdDM, ki vodi v utišanje TE.

'''TE kot vir novih smRNA'''

Majhne obrnjene ponovitve TE (MITE) so kratki neavtonomni TE s končnimi regijami obrnjenih ponovitev. Ti elementi, ki so bili najprej opisani v rastlinah, so pretežno vstavljeni v z geni bogate regije in navadno vplivajo na izražanje sosednjih genov. Poleg regulacije izražanja genov z insercijo ali epigenetskimi modifikacijami, lahko MITE postane vir smRNA. MITE med transkripcijo proizvedejo komplementarno RNA, ki se lahko zvije v steblo-zanka podobno sekundarno strukturo, ki je dovzetna za procesiranje z DCL3. V tem primeru pride do procesiranja lncRNA s strani DCL3 v 24 nt het-siRNA molekule, ki po običajni poti sprožijo metilacijo ''cis'' ali ''trans'', kar povzroči epigenetsko utišanje tarčnega lokusa. V rižu se od DCL3 odvisna 24 nt smRNA, ki izvira iz MITE, akumulira zaradi abiotskega stresa, kar pozitivno regulira ABA (abscizinska kislina) signaliziranje in odziv na stres.

Mutacije v zaporedju MITE vodijo tudi do nepopolnih struktur steblo-zanka, kar je lastnost miRNA prekurzorjev. To je spodbudilo razmišljanje, da so MITE verjeten evolucijski izvor miRNA lokusa. To podpira dejstvo, da se novonastale miRNA vežejo na MITE in druge TE lokuse, kar bi razložilo, zakaj se nekateri prekurzorji miRNA procesirajo tako v 21 nt kot 24 nt zvrsti. Ta ideja je dodatno podprta z ugotovitvijo, da lahko nekateri prekurzorji miRNA, ki jih prepozna DCL3, proizvajajo 24 nt siRNA in inducirajo metilacijo svojih ali tujih lokusov, kar kaže na izvor iz TE. Nadaljnja analiza potencialnega izvora miRNA genov iz TE je pokazala, da so MITE zelo dovzetne za udomačitev v miRNA prekurzorje. Spreminjanje miRNA v odvisnosti od MITE lahko tako predstavlja novosti v odzivu rastlin na razne patogene.

==Aktivne dolge nekodirajoče RNA (lncRNA), ki so po izvoru transpozonske==

'''TE kot vir fiziološko aktivnih lncRNA'''

Z RNA sekvenciranjem pri koruzi so identificirali več kot 23 000 možnih lncRNA. Okoli 65 % izmed njih je kazalo podobnost s TE, temeljito opazovanje TE in lncRNA v 40 vrstah rastlin pa je razkrilo več kot 14 000 prekrivanj med lncRNA lokusi in TE. lncRNA, ki izvirajo iz TE, so večinoma povezane z retrotranspozoni in povečanim številom le-teh v genomu. Aktivirane lncRNA se pretežno prepisujejo iz demetiliranih TE regij, zlasti iz dolgih vmesnih jedrnih elementov (LINE), ki so del retrotranspozonov.

Mnoge izmed lncRNA, ki izvirajo iz TE, so prepisno odzivne na sol, ABA in mraz. Različno izražanje lncRNA naj bi bilo povezano z dinamiko metilacije DNA, ki omogoča neofunkcionalizacijo nekodirajočih prepisov. Dokazali so, da je znotraj vrste ''Arabidopsis'' transkripcija velikega števila lncRNA odvisna od ekotipa. Zbirka lncRNA rastline, ki je direktno odvisna od prepisne aktivnosti TE, pa predstavlja značilnosti nedavnega razhajanja med vrstami ali celo znotraj iste vrste.

'''Dolge nekodirajoče RNA, ki izvirajo iz TE, kot regulatorji malih RNA in proteinov'''

TE sodelujejo pri tvorbi smRNA, lahko pa zavirajo njihovo aktivnost. MIKKI, nekodirajoč prepis retrotranspozonskega izvora, ki se aktivno prepisuje v koreninah riža, vsebuje nepopolno tarčno mesto miRNA171. miRNA171 destabilizira mRNA, ki zapisujejo za družino SCARECROW-u podobnih transkripcijskh faktorjev specifičnih za korenine. MIKKI deluje kot miRNA vaba - vsebuje vezavna mesta za miRNA in povzroči njeno degradacijo. S svojim delovanjem povzroči kopičenje SCARECROW-u podobnih mRNA v koreninah in tako spodbuja pravilen razvoj korenin. Medgenska lncRNA INDUCED BY PHOSPHATE STARVATION 1 (IPS1) pri ''Arabidopsis'' je komplementarna s pomanjkanjem fosfata inducirani miRNA399, vključuje pa neujemajočo zanko na pričakovanem miRNA cepitvenem mestu, ki preprečuje razgradnjo IPS1 in ga pretvori v vabo za miRNA399.

lncRNA, ki izvirajo iz TE, lahko uravnavajo izražanje genov preko interakcije s proteini. Kratek razpršeni jedrni element SB1 (SB1 SINE) pri oljni ogrščici uravnava biogenezo miRNA z oviranjem dsRNA vezavnega proteina HYPONASTIC LEAVES1 (HYL1). Po transkripciji se SB1 prepis, ki izvira iz SINE, zvije v lasnično sekundarno strukturo, ki spominja na prekurzorsko miRNA. Na strukturo se veže HYL1, ki posledično ne more sodelovati v kompleksu procesiranja miRNA. Pri rastlinah, ki izražajo SB1 SINE, so pogoste okvare v razvoju in akumulaciji miRNA. Ta fenotip lahko povežemo z ektopičnim prekomernim izražanjem SINE, vendar pa kaže tudi na vpliv TE pri tvorbi miRNA v specifičnih razvojnih fazah in okoljskih razmerah.

'''Dolge nekodirajoče RNA, ki izvirajo iz TE, kot potencialni regulatorji konformacije kromatina'''

Biosintezne poti številnih rastlinskih produktov vključujejo gene organizirane v skupke. Takšna organizacija genoma naj bi izvirala iz podvojevanja genov, njihove premestitve in neofunkcionalizacije. Pri ''Arabidopsis'' se biosintetski skupki genov pojavljajo v regijah genoma bogatih s TE, s TE uravnana rekombinacija pa sodeluje pri njihovi tvorbi in koregulaciji. Obširna analiza rastlinskih genomov je pokazala vlogo transpozicije MITE pri tvorbi biosintetskih skupkov pri evdikotih. Pri ''Arabidopsis'' lncRNA MARneral Silencing (MARS) nadzoruje epigenetsko aktivacijo regije, ki jo obdaja in tako vpliva na izražanje genov marneralnega skupka ter posledično na kalitev semen. MARS kot odziv na ABA zvabi LIKEHETEROCHROMATIN PROTEIN 1 (LHP1) stran od skupka in spodbudi tvorbo kromatinske zanke, ki približa lokus MARNERAL SYNTHASE 1 (MRN1) oddaljenemu od ABA odvisnemu ojačevalnemu zaporedju.

Nekatere lncRNA preko komplementanosti zaporedij tvorijo DNA-RNA duplekse (R-zanke) in sprožijo transkripcijsko samozaviranje ali alternativno izrezovanje. lncRNA AUXIN-REGULATED PROMOTER LOOP (APOLO) prepozna več neodvisnih tarčnih lokusov znotraj genoma ''Arabidopsis''. S tvorbo R-zanke zvabi LIKEHETEROCHROMATIN PROTEIN 1
(LHP1) stran od kromatina in tako uravnava njegovo lokalno 3D konformacijo.

lncRNA, ki izvirajo iz MITE, lahko z insercijo v bližino kodirajočega gena, regulirajo 3D konformacijo kromatina, kar v odvisnosti od celičnega tipa, uravnava transkripcijsko aktivnost sosednjih genov. RNAPII transkripcija lncRNA ncW6, ki izvira iz MITE, povzroči tvorbo v het-siRNA, kar sproži metilacijo lokusa HaWRKY6. Te epigenetske spremembe stabilizirajo tvorbo tkivno specifičnih kromatinskih zank. V listih tvorba znotrajgenske zanke zavira transkripcijo gena HaWRKY6, kromatinska zanka v kličnih listih pa omogoča učinkovito recikliranje RNAPII in tako povečuje transkripcijo HaWRKY6. Podobno deluje tudi epigenetsko utišanje represorja cvetenja FLOWERING LOCUS C (FLC) med vernalizacijo. Izpostavitev mrazu inducira lncRNA COLDWRAP, ki posredno povzroči kompaktiranje kromatina, kar služi kot točka sidranja pri tvorbi znotrajgenske kromatinske zanke med promotorjem in 3' koncem prvega introna. Nastala zanka ovira procesivnost RNAPII, in povzroči epigenetsko utišanje FLC.

==Zaključek==

V zadnjih desetletjih so identificirali pomembno vlogo ncRNA pri uravnavanju izražanja genov na različnih nivojih. Identifikacija in karakterizacija ncRNA sta ključni pri razumevanju njihove vloge v adaptivni evoluciji. Boljše razumevanje dinamične akumulacije s TE povezanih smRNA in lncRNA kot odziv na zunanje dražljaje pa bo osvetlilo pomen nekodirajočega genoma pri medsebojnem vplivu med rastlino in okoljem. TE, ki so jih do nedavnega opisovali kot sebično DNA, niso spremenili svoje narave, šele zdaj pa začenjamo razumevati njihovo funkcijo v genomu.

==Viri in literatura==

1. Ariel, Federico D., and Pablo A. Manavella. ‘When Junk DNA Turns Functional: Transposon-Derived Non-Coding RNAs in Plants’. ''Journal of Experimental Botany'', edited by James Murray, vol. 72, no. 11, May 2021, pp. 4132–43. ''DOI.org (Crossref)'', https://doi.org/10.1093/jxb/erab073.

2. Cambiagno, Damián A., et al. ‘Immune Receptor Genes and Pericentromeric Transposons as Targets of Common Epigenetic Regulatory Elements’. ''The Plant Journal'', vol. 96, no. 6, Dec. 2018, pp. 1178–90. ''DOI.org (Crossref)'', https://doi.org/10.1111/tpj.14098.

3. Cho, Jungnam. ‘Transposon-Derived Non-Coding RNAs and Their Function in Plants’. ''Frontiers in Plant Science'', vol. 9, May 2018, p. 600. ''DOI.org (Crossref)'', https://doi.org/10.3389/fpls.2018.00600.

4. Cho, Jungnam, and Jerzy Paszkowski. ‘Regulation of Rice Root Development by a Retrotransposon Acting as a MicroRNA Sponge’. ''ELife'', edited by Christian S. Hardtke, vol. 6, Aug. 2017, p. e30038. ''eLife'', https://doi.org/10.7554/eLife.30038.

5. McCue, Andrea D., et al. “Gene Expression and Stress Response Mediated by the Epigenetic Regulation of a Transposable Element Small RNA.” ''PLoS Genetics'', edited by Tetsuji Kakutani, vol. 8, no. 2, Feb. 2012, p. e1002474. ''DOI.org (Crossref)'', https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1002474.

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Funkcije nekodirajoče RNA, ki je po izvoru transpozonska

2022-05-01T19:43:38Z

Gaja Starc: /* Aktivne dolge nekodirajoče RNA (lncRNA), ki so po izvoru transpozonske */

==Uvod==

Transpozicijski elementi (TE) predstavljajo pomemben dejavnik genomske kompleksnosti evkariontov. Pomembni so zaradi funkcije premikanja po DNA, ki pomembno vpliva na evolucijsko ločevanje organizmov, kratkoročno pa lahko predstavlja genomsko nestabilnost. Vplivajo tudi na aktivnost transkripcije genov v njihovi bližini s spreminjanjem njihovih epigenetskih značilnosti ali položaja regulatornih elementov.

V našem seminarju se bomo osredotočili na TE, ki predstavljajo izvor funkcionalnih dolgih ali kratkih nekodirajočih RNA pri rastlinah. Njihova funkcija je povezana s ''trans'' regulacijo aktivnosti genov na transkripcijskem in post-transkripcijskem nivoju. ''Trans'' regulacija je delovanje molekul na oddaljene dele genoma preko drugih, vmesnih molekul.

TE se lahko nahajajo v nekodirajočih delih DNA, kjer običajno nimajo večjega učinka, ali pa v neposredni bližini genov. Slednji močno vplivajo na nivo transkripcije bližnjih genov. Poleg tega lahko TE vplivajo na epigenetske značilnosti bližnjih regij DNA in še tako vplivajo na izražanje genov. Zato so rastline razvile številne mehanizme za zmanjševanje vpliva TE na ali v bližini genov in omejitev traspozicijskih premikov na ta mesta.

TE so pomemben izvor nekodirajočih RNA. Pri rastlinah so to predvsem dolge in kratke nekodirajoče RNA (lncRNA, smRNA), ki predstavljajo glavni regulator izražanja genov. lncRNA molekule večinoma nastanejo s pomočjo encima RNA polimeraza II (RNAPII), alternativno pa z rastlinsko specifičnimi polimerazami (RNAPIV, RNAPV). lncRNA molekule z interakcijami s proteini in tvorbo dupleksov z DNA ali RNA zmanjšajo izražanje genov na nivoju transkripcije. Druga možnost je, da lncRNA prepozna specifičen DICER protein, ki tvori več smRNA, ki sodelujejo pri utišanju genov.

==Aktivne male RNA, ki so po izvoru transpozonske==

'''Po izvoru transpozonske male interferenčne RNA (siRNA), ki povzročijo metilacijo DNA in nastanek heterokromatina na mestih TE ter utišajo njihovo transkripcijo (het-siRNA)'''

V normalnih pogojih je večina TE utišanih z metilacijo. Mehanizem metilacije je od RNA odvisna DNA metilacija (RdDM). Začne se, ko od RNA odvisna RNA polimeraza 2 (RDR2) prepozna na novo nastale RNA iz TE, nastale z delovanjem encima RNAPIV in jih spremni v dsRNA molekule. Protein DICER - LIKE 3 (DCL3) jih nato procesira v 24 nt siRNA, prenese v citoplazmo in naloži na ARGONAUTE4 (AGO4) ali na AGO3 in AGO6 proteine. AGO4 s siRNA molekulami se vrne v jedro, tam prepozna RNAPV transkripte s komplementarnim zaporedjem. Po interakciji teh dveh RNA zaporedij se na kompleks veže posebna DNA metiltransferaza (DOMAINS REARRANGED METHYTRANSFERASE 2, DRM2). Ta povzroči metilacijo TE, iz katerih te RNA izvirajo. Posledica tega je kondenzacija kromatina in trajno utišanje TE. Pri utišanju sodeluje tudi DNA topoizomeraza 1α, encim, ki spreminja topologijo DNA. V tem procesu olajša tvorbo lncRNA molekul z RNAPV, približanje in vezavo AGO4 ter metilacijo H3K9 (H3K9me2). To nakazuje, da tudi organizacija DNA vpliva na utišanje TE. Ta mehanizem utišanja je za rastline pomemben kot odgovor na stres in za prenos epigenetskih informacij na potomce. Večkrat se zgodi, da se TE vrine v ali v bližino gena. Če na te TE deluje RdDM, se poleg TE metilirajo tudi ti geni. Metilacija po navadi povzroči utišanje genov, zato lahko predstavlja težavo pri preživetju rastline.

Het-siRNA lahko delujejo ''trans''. Pri ''Arabidopsis thaliana'' se v normalnih pogojih sintetizirajo het-siRNA molekule iz pericentromernih TE. Te prepoznajo in utišajo oddaljene gene za proteine, ki ob okužbi prepoznajo molekule pogosto prisotne v patogenih (PATTERN RECOGNITION RECEPTORS, PRRs) in proteine vnetnega odziva ter prirojenega imunskega odziva (NUCLEOTIDE-BINDING LEUCIN-RICH REPEAT PROTEINS, NLRs). Ob okužbi s ''Pseudomonas syringae'' (Gram negativna bakterija), pride najprej do povišanega izražanja pericentromernih TE. Sledi RdDM, poveazana z akumulacijo het-siRNA, ki metilacijo usmerjajo na izvorne TE. To povzroči zmanjšanje represije obrambnih genov in večjo odpornost na patogen.

'''Epigenetsko aktivne siRNA (easiRNA), ki izvirajo iz TE in delujejo ''trans'''''

Pri ''Arabidopsis'' je večina TE epigenetsko utišanih s 24 nt het-siRNA. Aktivacija prepisovanja utišanih TE se odraža v nastanku 21-22 nt easiRNA. Pri tem 21 nt miRNA, ki je naložena na AGO1, sproži cepitev TE prepisa, kar omogoči združitev kompleksa RDR6/SGS3. Ta kompleks pomaga prepoznati mRNA prepis TE in nastanek dsRNA. DLC2 in DLC4 nato omogočita procesiranje dsRNA, kar je ključno za nastanek 21-22 nt easiRNA. easiRNA, naložene na AGO1, lahko nato sodelujejo pri utišanju tarčne mRNA ali TE prepisa na post-transkripcijskem nivoju. Druga možnost je, da AGO2 naloži 21-22 nt easiRNA, kar sproži netipično od proteina NERD odvisno RdDM TGS (ang. transcriptional gene silencing) pot. V primeru, ko AGO6 naloži easiRNA, pa to sproži značilno RdDM, ki vodi v utišanje TE.

'''TE kot vir novih smRNA'''

Majhne obrnjene ponovitve TE (MITE) so kratki neavtonomni TE s končnimi regijami obrnjenih ponovitev. Ti elementi, ki so bili najprej opisani v rastlinah, so pretežno vstavljeni v z geni bogate regije in navadno vplivajo na izražanje sosednjih genov. Poleg regulacije izražanja genov z insercijo ali epigenetskimi modifikacijami, lahko MITE postane vir smRNA. MITE med transkripcijo proizvedejo komplementarno RNA, ki se lahko zvije v steblo-zanka podobno sekundarno strukturo, ki je dovzetna za procesiranje z DCL3. V tem primeru pride do procesiranja lncRNA s strani DCL3 v 24 nt het-siRNA molekule, ki po običajni poti sprožijo metilacijo ''cis'' ali ''trans'', kar povzroči epigenetsko utišanje tarčnega lokusa. V rižu se od DCL3 odvisna 24 nt smRNA, ki izvira iz MITE, akumulira zaradi abiotskega stresa, kar pozitivno regulira ABA (abscizinska kislina) signaliziranje in odziv na stres.

Mutacije v zaporedju MITE vodijo tudi do nepopolnih struktur steblo-zanka, kar je lastnost miRNA prekurzorjev. To je spodbudilo razmišljanje, da so MITE verjeten evolucijski izvor miRNA lokusa. To podpira dejstvo, da se novonastale miRNA vežejo na MITE in druge TE lokuse, kar bi razložilo, zakaj se nekateri prekurzorji miRNA procesirajo tako v 21 nt kot 24 nt zvrsti. Ta ideja je dodatno podprta z ugotovitvijo, da lahko nekateri prekurzorji miRNA, ki jih prepozna DCL3, proizvajajo 24 nt siRNA in inducirajo metilacijo svojih ali tujih lokusov, kar kaže na izvor iz TE. Nadaljnja analiza potencialnega izvora miRNA genov iz TE je pokazala, da so MITE zelo dovzetne za udomačitev v miRNA prekurzorje. Spreminjanje miRNA v odvisnosti od MITE lahko tako predstavlja novosti v odzivu rastlin na razne patogene.

==Aktivne dolge nekodirajoče RNA (lncRNA), ki so po izvoru transpozonske==

'''TE kot vir fiziološko aktivnih lncRNA'''

Z RNA sekvenciranjem pri koruzi so identificirali več kot 23 000 možnih lncRNA. Okoli 65 % izmed njih je kazalo podobnost s TE, temeljito opazovanje TE in lncRNA v 40 vrstah rastlin pa je razkrilo več kot 14 000 prekrivanj med lncRNA lokusi in TE. lncRNA, ki izvirajo iz TE, so večinoma povezane z retrotranspozoni in povečanim številom le-teh v genomu. Aktivirane lncRNA se pretežno prepisujejo iz demetiliranih TE regij, zlasti iz dolgih vmesnih jedrnih elementov (LINE), ki so del retrotranspozonov.

Mnoge izmed lncRNA, ki izvirajo iz TE, so prepisno odzivne na sol, ABA in mraz. Različno izražanje lncRNA naj bi bilo povezano z dinamiko metilacije DNA, ki omogoča neofunkcionalizacijo nekodirajočih prepisov. Dokazali so, da je znotraj vrste ''Arabidopsis'' transkripcija velikega števila lncRNA odvisna od ekotipa. Zbirka lncRNA rastline, ki je direktno odvisna od prepisne aktivnosti TE, pa predstavlja značilnosti nedavnega razhajanja med vrstami ali celo znotraj iste vrste.

'''Dolge nekodirajoče RNA, ki izvirajo iz TE, kot regulatorji malih RNA in proteinov'''

TE sodelujejo pri tvorbi smRNA, lahko pa zavirajo njihovo aktivnost. MIKKI, nekodirajoč prepis retrotranspozonskega izvora, ki se aktivno prepisuje v koreninah riža, vsebuje nepopolno tarčno mesto miRNA171. miRNA171 destabilizira mRNA, ki zapisujejo za družino SCARECROW-u podobnih transkripcijskh faktorjev specifičnih za korenine. MIKKI deluje kot miRNA vaba - vsebuje vezavna mesta za miRNA in povzroči njeno degradacijo. S svojim delovanjem povzroči kopičenje SCARECROW-u podobnih mRNA v koreninah in tako spodbuja pravilen razvoj korenin. Medgenska lncRNA INDUCED BY PHOSPHATE STARVATION 1 (IPS1) pri ''Arabidopsis'' je komplementarna s pomanjkanjem fosfata inducirani miRNA399, vključuje pa neujemajočo zanko na pričakovanem miRNA cepitvenem mestu, ki preprečuje razgradnjo IPS1 in ga pretvori v vabo za miRNA399.

lncRNA, ki izvirajo iz TE, lahko uravnavajo izražanje genov preko interakcije s proteini. Kratek razpršeni jedrni element SB1 (SB1 SINE) pri oljni ogrščici uravnava biogenezo miRNA z oviranjem dsRNA vezavnega proteina HYPONASTIC LEAVES1 (HYL1). Po transkripciji se SB1 prepis, ki izvira iz SINE, zvije v lasnično sekundarno strukturo, ki spominja na prekurzorsko miRNA. Na strukturo se veže HYL1, ki posledično ne more sodelovati v kompleksu procesiranja miRNA. Pri rastlinah, ki izražajo SB1 SINE, so pogoste okvare v razvoju in akumulaciji miRNA. Ta fenotip lahko povežemo z ektopičnim prekomernim izražanjem SINE, vendar pa kaže tudi na vpliv TE pri tvorbi miRNA v specifičnih razvojnih fazah in okoljskih razmerah.

'''Dolge nekodirajoče RNA, ki izvirajo iz TE, kot potencialni regulatorji konformacije kromatina'''

Biosintezne poti številnih rastlinskih produktov vključujejo gene organizirane v skupke. Takšna organizacija genoma naj bi izvirala iz podvojevanja genov, njihove premestitve in neofunkcionalizacije. Pri ''Arabidopsis'' se biosintetski skupki genov pojavljajo v regijah genoma bogatih s TE, s TE uravnana rekombinacija pa sodeluje pri njihovi tvorbi in koregulaciji. Obširna analiza rastlinskih genomov je pokazala vlogo transpozicije MITE pri tvorbi biosintetskih skupkov pri evdikotih. Pri ''Arabidopsis'' lncRNA MARneral Silencing (MARS) nadzoruje epigenetsko aktivacijo regije, ki jo obdaja in tako vpliva na izražanje genov marneralnega skupka ter posledično na kalitev semen. MARS kot odziv na ABA zvabi LIKEHETEROCHROMATIN PROTEIN 1 (LHP1) stran od skupka in spodbudi tvorbo kromatinske zanke, ki približa lokus MARNERAL SYNTHASE 1 (MRN1) oddaljenemu od ABA odvisnemu ojačevalnemu zaporedju.

Nekatere lncRNA preko komplementanosti zaporedij tvorijo DNA-RNA duplekse (R-zanke) in sprožijo transkripcijsko samozaviranje ali alternativno izrezovanje. lncRNA AUXIN-REGULATED PROMOTER LOOP (APOLO) prepozna več neodvisnih tarčnih lokusov znotraj genoma ''Arabidopsis''. S tvorbo R-zanke zvabi LIKEHETEROCHROMATIN PROTEIN 1
(LHP1) stran od kromatina in tako uravnava njegovo lokalno 3D konformacijo.

lncRNA, ki izvirajo iz MITE, lahko z insercijo v bližino kodirajočega gena, regulirajo 3D konformacijo kromatina, kar v odvisnosti od celičnega tipa, uravnava transkripcijsko aktivnost sosednjih genov. RNAPII transkripcija lncRNA ncW6, ki izvira iz MITE, povzroči tvorbo v het-siRNA, kar povzroči metilacijo lokusa HaWRKY6. Te epigenetske spremembe povzročijo tvorbo tkivno specifičnih kromatinskih zank. V listih tvorba znotrajgenske zanke zavira transkripcijo gena HaWRKY6, kromatinska zanka v kličnih listih pa omogoča učinkovito recikliranje RNAPII in tako povečuje transkripcijo HaWRKY6. Podobno deluje tudi epigenetsko utišanje represorja cvetenja FLOWERING LOCUS C (FLC) med vernalizacijo. Izpostavitev mrazu inducira lncRNA COLDWRAP, ki posredno povzroči kompaktiranje kromatina, kar služi kot točka sidranja pri tvorbi znotrajgenske kromatinske zanke med promotorjem in 3' koncem prvega introna. Nastala zanka ovira procesivnost RNAPII, in povzroči epigenetsko utišanje FLC.

==Zaključek==

V zadnjih desetletjih so identificirali pomembno vlogo ncRNA pri uravnavanju izražanja genov na različnih nivojih. Identifikacija in karakterizacija ncRNA sta ključni pri razumevanju njihove vloge v adaptivni evoluciji. Boljše razumevanje dinamične akumulacije s TE povezanih smRNA in lncRNA kot odziv na zunanje dražljaje pa bo osvetlilo pomen nekodirajočega genoma pri medsebojnem vplivu med rastlino in okoljem. TE, ki so jih do nedavnega opisovali kot sebično DNA, niso spremenili svoje narave, šele zdaj pa začenjamo razumevati njihovo funkcijo v genomu.

==Viri in literatura==

1. Ariel, Federico D., and Pablo A. Manavella. ‘When Junk DNA Turns Functional: Transposon-Derived Non-Coding RNAs in Plants’. ''Journal of Experimental Botany'', edited by James Murray, vol. 72, no. 11, May 2021, pp. 4132–43. ''DOI.org (Crossref)'', https://doi.org/10.1093/jxb/erab073.

2. Cambiagno, Damián A., et al. ‘Immune Receptor Genes and Pericentromeric Transposons as Targets of Common Epigenetic Regulatory Elements’. ''The Plant Journal'', vol. 96, no. 6, Dec. 2018, pp. 1178–90. ''DOI.org (Crossref)'', https://doi.org/10.1111/tpj.14098.

3. Cho, Jungnam. ‘Transposon-Derived Non-Coding RNAs and Their Function in Plants’. ''Frontiers in Plant Science'', vol. 9, May 2018, p. 600. ''DOI.org (Crossref)'', https://doi.org/10.3389/fpls.2018.00600.

4. Cho, Jungnam, and Jerzy Paszkowski. ‘Regulation of Rice Root Development by a Retrotransposon Acting as a MicroRNA Sponge’. ''ELife'', edited by Christian S. Hardtke, vol. 6, Aug. 2017, p. e30038. ''eLife'', https://doi.org/10.7554/eLife.30038.

5. McCue, Andrea D., et al. “Gene Expression and Stress Response Mediated by the Epigenetic Regulation of a Transposable Element Small RNA.” ''PLoS Genetics'', edited by Tetsuji Kakutani, vol. 8, no. 2, Feb. 2012, p. e1002474. ''DOI.org (Crossref)'', https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1002474.

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Funkcije nekodirajoče RNA, ki je po izvoru transpozonska

2022-05-01T19:34:59Z

Gaja Starc: /* Aktivne dolge nekodirajoče RNA (lncRNA), ki so po izvoru transpozonske */

==Uvod==

Transpozicijski elementi (TE) predstavljajo pomemben dejavnik genomske kompleksnosti evkariontov. Pomembni so zaradi funkcije premikanja po DNA, ki pomembno vpliva na evolucijsko ločevanje organizmov, kratkoročno pa lahko predstavlja genomsko nestabilnost. Vplivajo tudi na aktivnost transkripcije genov v njihovi bližini s spreminjanjem njihovih epigenetskih značilnosti ali položaja regulatornih elementov.

V našem seminarju se bomo osredotočili na TE, ki predstavljajo izvor funkcionalnih dolgih ali kratkih nekodirajočih RNA pri rastlinah. Njihova funkcija je povezana s ''trans'' regulacijo aktivnosti genov na transkripcijskem in post-transkripcijskem nivoju. ''Trans'' regulacija je delovanje molekul na oddaljene dele genoma preko drugih, vmesnih molekul.

TE se lahko nahajajo v nekodirajočih delih DNA, kjer običajno nimajo večjega učinka, ali pa v neposredni bližini genov. Slednji močno vplivajo na nivo transkripcije bližnjih genov. Poleg tega lahko TE vplivajo na epigenetske značilnosti bližnjih regij DNA in še tako vplivajo na izražanje genov. Zato so rastline razvile številne mehanizme za zmanjševanje vpliva TE na ali v bližini genov in omejitev traspozicijskih premikov na ta mesta.

TE so pomemben izvor nekodirajočih RNA. Pri rastlinah so to predvsem dolge in kratke nekodirajoče RNA (lncRNA, smRNA), ki predstavljajo glavni regulator izražanja genov. lncRNA molekule večinoma nastanejo s pomočjo encima RNA polimeraza II (RNAPII), alternativno pa z rastlinsko specifičnimi polimerazami (RNAPIV, RNAPV). lncRNA molekule z interakcijami s proteini in tvorbo dupleksov z DNA ali RNA zmanjšajo izražanje genov na nivoju transkripcije. Druga možnost je, da lncRNA prepozna specifičen DICER protein, ki tvori več smRNA, ki sodelujejo pri utišanju genov.

==Aktivne male RNA, ki so po izvoru transpozonske==

'''Po izvoru transpozonske male interferenčne RNA (siRNA), ki povzročijo metilacijo DNA in nastanek heterokromatina na mestih TE ter utišajo njihovo transkripcijo (het-siRNA)'''

V normalnih pogojih je večina TE utišanih z metilacijo. Mehanizem metilacije je od RNA odvisna DNA metilacija (RdDM). Začne se, ko od RNA odvisna RNA polimeraza 2 (RDR2) prepozna na novo nastale RNA iz TE, nastale z delovanjem encima RNAPIV in jih spremni v dsRNA molekule. Protein DICER - LIKE 3 (DCL3) jih nato procesira v 24 nt siRNA, prenese v citoplazmo in naloži na ARGONAUTE4 (AGO4) ali na AGO3 in AGO6 proteine. AGO4 s siRNA molekulami se vrne v jedro, tam prepozna RNAPV transkripte s komplementarnim zaporedjem. Po interakciji teh dveh RNA zaporedij se na kompleks veže posebna DNA metiltransferaza (DOMAINS REARRANGED METHYTRANSFERASE 2, DRM2). Ta povzroči metilacijo TE, iz katerih te RNA izvirajo. Posledica tega je kondenzacija kromatina in trajno utišanje TE. Pri utišanju sodeluje tudi DNA topoizomeraza 1α, encim, ki spreminja topologijo DNA. V tem procesu olajša tvorbo lncRNA molekul z RNAPV, približanje in vezavo AGO4 ter metilacijo H3K9 (H3K9me2). To nakazuje, da tudi organizacija DNA vpliva na utišanje TE. Ta mehanizem utišanja je za rastline pomemben kot odgovor na stres in za prenos epigenetskih informacij na potomce. Večkrat se zgodi, da se TE vrine v ali v bližino gena. Če na te TE deluje RdDM, se poleg TE metilirajo tudi ti geni. Metilacija po navadi povzroči utišanje genov, zato lahko predstavlja težavo pri preživetju rastline.

Het-siRNA lahko delujejo ''trans''. Pri ''Arabidopsis thaliana'' se v normalnih pogojih sintetizirajo het-siRNA molekule iz pericentromernih TE. Te prepoznajo in utišajo oddaljene gene za proteine, ki ob okužbi prepoznajo molekule pogosto prisotne v patogenih (PATTERN RECOGNITION RECEPTORS, PRRs) in proteine vnetnega odziva ter prirojenega imunskega odziva (NUCLEOTIDE-BINDING LEUCIN-RICH REPEAT PROTEINS, NLRs). Ob okužbi s ''Pseudomonas syringae'' (Gram negativna bakterija), pride najprej do povišanega izražanja pericentromernih TE. Sledi RdDM, poveazana z akumulacijo het-siRNA, ki metilacijo usmerjajo na izvorne TE. To povzroči zmanjšanje represije obrambnih genov in večjo odpornost na patogen.

'''Epigenetsko aktivne siRNA (easiRNA), ki izvirajo iz TE in delujejo ''trans'''''

Pri ''Arabidopsis'' je večina TE epigenetsko utišanih s 24 nt het-siRNA. Aktivacija prepisovanja utišanih TE se odraža v nastanku 21-22 nt easiRNA. Pri tem 21 nt miRNA, ki je naložena na AGO1, sproži cepitev TE prepisa, kar omogoči združitev kompleksa RDR6/SGS3. Ta kompleks pomaga prepoznati mRNA prepis TE in nastanek dsRNA. DLC2 in DLC4 nato omogočita procesiranje dsRNA, kar je ključno za nastanek 21-22 nt easiRNA. easiRNA, naložene na AGO1, lahko nato sodelujejo pri utišanju tarčne mRNA ali TE prepisa na post-transkripcijskem nivoju. Druga možnost je, da AGO2 naloži 21-22 nt easiRNA, kar sproži netipično od proteina NERD odvisno RdDM TGS (ang. transcriptional gene silencing) pot. V primeru, ko AGO6 naloži easiRNA, pa to sproži značilno RdDM, ki vodi v utišanje TE.

'''TE kot vir novih smRNA'''

Majhne obrnjene ponovitve TE (MITE) so kratki neavtonomni TE s končnimi regijami obrnjenih ponovitev. Ti elementi, ki so bili najprej opisani v rastlinah, so pretežno vstavljeni v z geni bogate regije in navadno vplivajo na izražanje sosednjih genov. Poleg regulacije izražanja genov z insercijo ali epigenetskimi modifikacijami, lahko MITE postane vir smRNA. MITE med transkripcijo proizvedejo komplementarno RNA, ki se lahko zvije v steblo-zanka podobno sekundarno strukturo, ki je dovzetna za procesiranje z DCL3. V tem primeru pride do procesiranja lncRNA s strani DCL3 v 24 nt het-siRNA molekule, ki po običajni poti sprožijo metilacijo ''cis'' ali ''trans'', kar povzroči epigenetsko utišanje tarčnega lokusa. V rižu se od DCL3 odvisna 24 nt smRNA, ki izvira iz MITE, akumulira zaradi abiotskega stresa, kar pozitivno regulira ABA (abscizinska kislina) signaliziranje in odziv na stres.

Mutacije v zaporedju MITE vodijo tudi do nepopolnih struktur steblo-zanka, kar je lastnost miRNA prekurzorjev. To je spodbudilo razmišljanje, da so MITE verjeten evolucijski izvor miRNA lokusa. To podpira dejstvo, da se novonastale miRNA vežejo na MITE in druge TE lokuse, kar bi razložilo, zakaj se nekateri prekurzorji miRNA procesirajo tako v 21 nt kot 24 nt zvrsti. Ta ideja je dodatno podprta z ugotovitvijo, da lahko nekateri prekurzorji miRNA, ki jih prepozna DCL3, proizvajajo 24 nt siRNA in inducirajo metilacijo svojih ali tujih lokusov, kar kaže na izvor iz TE. Nadaljnja analiza potencialnega izvora miRNA genov iz TE je pokazala, da so MITE zelo dovzetne za udomačitev v miRNA prekurzorje. Spreminjanje miRNA v odvisnosti od MITE lahko tako predstavlja novosti v odzivu rastlin na razne patogene.

==Aktivne dolge nekodirajoče RNA (lncRNA), ki so po izvoru transpozonske==

'''TE kot vir fiziološko aktivnih lncRNA'''

Z RNA sekvenciranjem pri koruzi so identificirali več kot 23 000 možnih lncRNA. Okoli 65 % izmed njih je kazalo podobnost s TE, temeljito opazovanje TE in lncRNA v 40 vrstah rastlin pa je razkrilo več kot 14 000 prekrivanj med lncRNA lokusi in TE. lncRNA, ki izvirajo iz TE, so večinoma povezane z retrotranspozoni in povečanim številom le-teh v genomu. Aktivirane lncRNA se pretežno prepisujejo iz demetiliranih TE regij, zlasti iz dolgih vmesnih jedrnih elementov (LINE), ki so del retrotranspozonov.

Mnoge izmed lncRNA, ki izvirajo iz TE, so prepisno odzivne na sol, ABA in mraz. Različno izražanje lncRNA naj bi bilo povezano z dinamiko metilacije DNA, ki omogoča neofunkcionalizacijo nekodirajočih prepisov. Dokazali so, da je znotraj vrste ''Arabidopsis'' transkripcija velikega števila lncRNA odvisna od ekotipa. Zbirka lncRNA rastline, ki je direktno odvisna od prepisne aktivnosti TE, pa predstavlja značilnosti nedavnega razhajanja med vrstami ali celo znotraj iste vrste.

'''Dolge nekodirajoče RNA, ki izvirajo iz TE, kot regulatorji malih RNA in proteinov'''

TE sodelujejo pri tvorbi smRNA, lahko pa zavirajo njihovo aktivnost. MIKKI, nekodirajoč prepis retrotranspozonskega izvora, ki se aktivno prepisuje v koreninah riža, vsebuje nepopolno tarčno mesto miRNA171. miRNA171 destabilizira mRNA, ki zapisujejo za družino SCARECROW-u podobnih transkripcijskh faktorjev specifičnih za korenine. MIKKI deluje kot miRNA vaba - vsebuje vezavna mesta za miRNA in povzroči njeno degradacijo. S svojim delovanjem povzroči kopičenje SCARECROW-u podobnih mRNA v koreninah in tako spodbuja pravilen razvoj korenin. Medgenska lncRNA INDUCED BY PHOSPHATE STARVATION 1 (IPS1) pri ''Arabidopsis'' je komplementarna s pomanjkanjem fosfata inducirani miRNA399, vključuje pa neujemajočo zanko na pričakovanem miRNA cepitvenem mestu, ki preprečuje razgradnjo IPS1 in ga pretvori v vabo za miRNA399.

lncRNA, ki izvirajo iz TE, lahko uravnavajo izražanje genov preko interakcije s proteini. Kratek razpršeni jedrni element SB1 (SB1 SINE) pri oljni ogrščici uravnava biogenezo miRNA z oviranjem dsRNA vezavnega proteina HYPONASTIC LEAVES1 (HYL1). Po transkripciji se SB1 prepis, ki izvira iz SINE, zvije v lasnično sekundarno strukturo, ki spominja na prekurzorsko miRNA. Na strukturo se veže HYL1, ki posledično ne more sodelovati v kompleksu procesiranja miRNA. Pri rastlinah, ki izražajo SB1 SINE, so pogoste okvare v razvoju in akumulaciji miRNA. Ta fenotip lahko povežemo z ektopičnim prekomernim izražanjem SINE, vendar pa kaže tudi na vpliv TE pri tvorbi miRNA v specifičnih razvojnih fazah in okoljskih razmerah.

'''Dolge nekodirajoče RNA, ki izvirajo iz TE, kot potencialni regulatorji konformacije kromatina'''

Biosintezne poti številnih rastlinskih produktov vključujejo gene organizirane v skupke. Takšna organizacija genoma naj bi izvirala iz podvojevanja genov, njihove premestitve in neofunkcionalizacije. Pri ''Arabidopsis'' se biosintetski skupki genov pojavljajo v regijah genoma bogatih s TE, s TE uravnana rekombinacija pa sodeluje pri njihovi tvorbi in koregulaciji. Obširna analiza rastlinskih genomov je pokazala vlogo transpozicije MITE pri tvorbi biosintetskih skupkov pri evdikotih. Pri ''Arabidopsis'' lncRNA MARneral Silencing (MARS) nadzoruje epigenetsko aktivacijo regije, ki jo obdaja in tako vpliva na izražanje genov marneralnega skupka ter posledično na kalitev semen. MARS kot odziv na ABA zvabi LIKEHETEROCHROMATIN PROTEIN 1 (LHP1) stran od skupka in spodbudi tvorbo kromatinske zanke, ki približa lokus MARNERAL SYNTHASE 1 (MRN1) oddaljenemu od ABA odvisnemu ojačevalnemu zaporedju.

Nekatere lncRNA preko komplementanosti zaporedij tvorijo DNA-RNA duplekse (R-zanke) in sprožijo transkripcijsko samozaviranje ali alternativno izrezovanje. lncRNA AUXIN-REGULATED PROMOTER LOOP (APOLO) prepozna več neodvisnih tarčnih lokusov znotraj genoma ''Arabidopsis''. S tvorbo R-zanke zvabi LIKEHETEROCHROMATIN PROTEIN 1
(LHP1) stran od kromatina in tako uravnava njegovo lokalno 3D konformacijo.

lncRNA, ki izvirajo iz MITE, lahko z insercijo v bližino kodirajočega gena, regulirajo 3D konformacijo kromatina, kar v odvisnosti od celičnega tipa, uravnava transkripcijsko aktivnost sosednjih genov. V listih tvorba znotrajgenske zanke zavira transkripcijo gena HaWRKY6, kromatinska zanka v kličnih listih pa omogoča učinkovito recikliranje RNAPII in tako povečuje transkripcijo HaWRKY6. Podobno deluje tudi epigenetsko utišanje represorja cvetenja FLOWERING LOCUS C (FLC) med vernalizacijo. Izpostavitev mrazu inducira lncRNA COLDWRAP, ki posredno povzroči kompaktiranje kromatina, kar služi kot točka sidranja pri tvorbi znotrajgenske kromatinske zanke med promotorjem in 3' koncem prvega introna. Nastala zanka ovira procesivnost RNAPII, in povzroči epigenetsko utišanje FLC.

==Zaključek==

V zadnjih desetletjih so identificirali pomembno vlogo ncRNA pri uravnavanju izražanja genov na različnih nivojih. Identifikacija in karakterizacija ncRNA sta ključni pri razumevanju njihove vloge v adaptivni evoluciji. Boljše razumevanje dinamične akumulacije s TE povezanih smRNA in lncRNA kot odziv na zunanje dražljaje pa bo osvetlilo pomen nekodirajočega genoma pri medsebojnem vplivu med rastlino in okoljem. TE, ki so jih do nedavnega opisovali kot sebično DNA, niso spremenili svoje narave, šele zdaj pa začenjamo razumevati njihovo funkcijo v genomu.

==Viri in literatura==

1. Ariel, Federico D., and Pablo A. Manavella. ‘When Junk DNA Turns Functional: Transposon-Derived Non-Coding RNAs in Plants’. ''Journal of Experimental Botany'', edited by James Murray, vol. 72, no. 11, May 2021, pp. 4132–43. ''DOI.org (Crossref)'', https://doi.org/10.1093/jxb/erab073.

2. Cambiagno, Damián A., et al. ‘Immune Receptor Genes and Pericentromeric Transposons as Targets of Common Epigenetic Regulatory Elements’. ''The Plant Journal'', vol. 96, no. 6, Dec. 2018, pp. 1178–90. ''DOI.org (Crossref)'', https://doi.org/10.1111/tpj.14098.

3. Cho, Jungnam. ‘Transposon-Derived Non-Coding RNAs and Their Function in Plants’. ''Frontiers in Plant Science'', vol. 9, May 2018, p. 600. ''DOI.org (Crossref)'', https://doi.org/10.3389/fpls.2018.00600.

4. Cho, Jungnam, and Jerzy Paszkowski. ‘Regulation of Rice Root Development by a Retrotransposon Acting as a MicroRNA Sponge’. ''ELife'', edited by Christian S. Hardtke, vol. 6, Aug. 2017, p. e30038. ''eLife'', https://doi.org/10.7554/eLife.30038.

5. McCue, Andrea D., et al. “Gene Expression and Stress Response Mediated by the Epigenetic Regulation of a Transposable Element Small RNA.” ''PLoS Genetics'', edited by Tetsuji Kakutani, vol. 8, no. 2, Feb. 2012, p. e1002474. ''DOI.org (Crossref)'', https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1002474.

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Funkcije nekodirajoče RNA, ki je po izvoru transpozonska

2022-05-01T19:10:16Z

Gaja Starc: /* Aktivne dolge nekodirajoče RNA (lncRNA), ki so po izvoru transpozonske */

==Uvod==

Transpozicijski elementi (TE) predstavljajo pomemben dejavnik genomske kompleksnosti evkariontov. Pomembni so zaradi funkcije premikanja po DNA, ki pomembno vpliva na evolucijsko ločevanje organizmov, kratkoročno pa lahko predstavlja genomsko nestabilnost. Vplivajo tudi na aktivnost transkripcije genov v njihovi bližini s spreminjanjem njihovih epigenetskih značilnosti ali položaja regulatornih elementov.

V našem seminarju se bomo osredotočili na TE, ki predstavljajo izvor funkcionalnih dolgih ali kratkih nekodirajočih RNA pri rastlinah. Njihova funkcija je povezana s ''trans'' regulacijo aktivnosti genov na transkripcijskem in post-transkripcijskem nivoju. ''Trans'' regulacija je delovanje molekul na oddaljene dele genoma preko drugih, vmesnih molekul.

TE se lahko nahajajo v nekodirajočih delih DNA, kjer običajno nimajo večjega učinka, ali pa v neposredni bližini genov. Slednji močno vplivajo na nivo transkripcije bližnjih genov. Poleg tega lahko TE vplivajo na epigenetske značilnosti bližnjih regij DNA in še tako vplivajo na izražanje genov. Zato so rastline razvile številne mehanizme za zmanjševanje vpliva TE na ali v bližini genov in omejitev traspozicijskih premikov na ta mesta.

TE so pomemben izvor nekodirajočih RNA. Pri rastlinah so to predvsem dolge in kratke nekodirajoče RNA (lncRNA, smRNA), ki predstavljajo glavni regulator izražanja genov. lncRNA molekule večinoma nastanejo s pomočjo encima RNA polimeraza II (RNAPII), alternativno pa z rastlinsko specifičnimi polimerazami (RNAPIV, RNAPV). lncRNA molekule z interakcijami s proteini in tvorbo dupleksov z DNA ali RNA zmanjšajo izražanje genov na nivoju transkripcije. Druga možnost je, da lncRNA prepozna specifičen DICER protein, ki tvori več smRNA, ki sodelujejo pri utišanju genov.

==Aktivne male RNA, ki so po izvoru transpozonske==

'''Po izvoru transpozonske male interferenčne RNA (siRNA), ki povzročijo metilacijo DNA in nastanek heterokromatina na mestih TE ter utišajo njihovo transkripcijo (het-siRNA)'''

V normalnih pogojih je večina TE utišanih z metilacijo. Mehanizem metilacije je od RNA odvisna DNA metilacija (RdDM). Začne se, ko od RNA odvisna RNA polimeraza 2 (RDR2) prepozna na novo nastale RNA iz TE, nastale z delovanjem encima RNAPIV in jih spremni v dsRNA molekule. Protein DICER - LIKE 3 (DCL3) jih nato procesira v 24 nt siRNA, prenese v citoplazmo in naloži na ARGONAUTE4 (AGO4) ali na AGO3 in AGO6 proteine. AGO4 s siRNA molekulami se vrne v jedro, tam prepozna RNAPV transkripte s komplementarnim zaporedjem. Po interakciji teh dveh RNA zaporedij se na kompleks veže posebna DNA metiltransferaza (DOMAINS REARRANGED METHYTRANSFERASE 2, DRM2). Ta povzroči metilacijo TE, iz katerih te RNA izvirajo. Posledica tega je kondenzacija kromatina in trajno utišanje TE. Pri utišanju sodeluje tudi DNA topoizomeraza 1α, encim, ki spreminja topologijo DNA. V tem procesu olajša tvorbo lncRNA molekul z RNAPV, približanje in vezavo AGO4 ter metilacijo H3K9 (H3K9me2). To nakazuje, da tudi organizacija DNA vpliva na utišanje TE. Ta mehanizem utišanja je za rastline pomemben kot odgovor na stres in za prenos epigenetskih informacij na potomce. Večkrat se zgodi, da se TE vrine v ali v bližino gena. Če na te TE deluje RdDM, se poleg TE metilirajo tudi ti geni. Metilacija po navadi povzroči utišanje genov, zato lahko predstavlja težavo pri preživetju rastline.

Het-siRNA lahko delujejo ''trans''. Pri ''Arabidopsis thaliana'' se v normalnih pogojih sintetizirajo het-siRNA molekule iz pericentromernih TE. Te prepoznajo in utišajo oddaljene gene za proteine, ki ob okužbi prepoznajo molekule pogosto prisotne v patogenih (PATTERN RECOGNITION RECEPTORS, PRRs) in proteine vnetnega odziva ter prirojenega imunskega odziva (NUCLEOTIDE-BINDING LEUCIN-RICH REPEAT PROTEINS, NLRs). Ob okužbi s ''Pseudomonas syringae'' (Gram negativna bakterija), pride najprej do povišanega izražanja pericentromernih TE. Sledi RdDM, poveazana z akumulacijo het-siRNA, ki metilacijo usmerjajo na izvorne TE. To povzroči zmanjšanje represije obrambnih genov in večjo odpornost na patogen.

'''Epigenetsko aktivne siRNA (easiRNA), ki izvirajo iz TE in delujejo ''trans'''''

Pri ''Arabidopsis'' je večina TE epigenetsko utišanih s 24 nt het-siRNA. Aktivacija prepisovanja utišanih TE se odraža v nastanku 21-22 nt easiRNA. Pri tem 21 nt miRNA, ki je naložena na AGO1, sproži cepitev TE prepisa, kar omogoči združitev kompleksa RDR6/SGS3. Ta kompleks pomaga prepoznati mRNA prepis TE in nastanek dsRNA. DLC2 in DLC4 nato omogočita procesiranje dsRNA, kar je ključno za nastanek 21-22 nt easiRNA. easiRNA, naložene na AGO1, lahko nato sodelujejo pri utišanju tarčne mRNA ali TE prepisa na post-transkripcijskem nivoju. Druga možnost je, da AGO2 naloži 21-22 nt easiRNA, kar sproži netipično od proteina NERD odvisno RdDM TGS (ang. transcriptional gene silencing) pot. V primeru, ko AGO6 naloži easiRNA, pa to sproži značilno RdDM, ki vodi v utišanje TE.

'''TE kot vir novih smRNA'''

Majhne obrnjene ponovitve TE (MITE) so kratki neavtonomni TE s končnimi regijami obrnjenih ponovitev. Ti elementi, ki so bili najprej opisani v rastlinah, so pretežno vstavljeni v z geni bogate regije in navadno vplivajo na izražanje sosednjih genov. Poleg regulacije izražanja genov z insercijo ali epigenetskimi modifikacijami, lahko MITE postane vir smRNA. MITE med transkripcijo proizvedejo komplementarno RNA, ki se lahko zvije v steblo-zanka podobno sekundarno strukturo, ki je dovzetna za procesiranje z DCL3. V tem primeru pride do procesiranja lncRNA s strani DCL3 v 24 nt het-siRNA molekule, ki po običajni poti sprožijo metilacijo ''cis'' ali ''trans'', kar povzroči epigenetsko utišanje tarčnega lokusa. V rižu se od DCL3 odvisna 24 nt smRNA, ki izvira iz MITE, akumulira zaradi abiotskega stresa, kar pozitivno regulira ABA (abscizinska kislina) signaliziranje in odziv na stres.

Mutacije v zaporedju MITE vodijo tudi do nepopolnih struktur steblo-zanka, kar je lastnost miRNA prekurzorjev. To je spodbudilo razmišljanje, da so MITE verjeten evolucijski izvor miRNA lokusa. To podpira dejstvo, da se novonastale miRNA vežejo na MITE in druge TE lokuse, kar bi razložilo, zakaj se nekateri prekurzorji miRNA procesirajo tako v 21 nt kot 24 nt zvrsti. Ta ideja je dodatno podprta z ugotovitvijo, da lahko nekateri prekurzorji miRNA, ki jih prepozna DCL3, proizvajajo 24 nt siRNA in inducirajo metilacijo svojih ali tujih lokusov, kar kaže na izvor iz TE. Nadaljnja analiza potencialnega izvora miRNA genov iz TE je pokazala, da so MITE zelo dovzetne za udomačitev v miRNA prekurzorje. Spreminjanje miRNA v odvisnosti od MITE lahko tako predstavlja novosti v odzivu rastlin na razne patogene.

==Aktivne dolge nekodirajoče RNA (lncRNA), ki so po izvoru transpozonske==

'''TE kot vir fiziološko aktivnih lncRNA'''

Z RNA sekvenciranjem pri koruzi so identificirali več kot 23 000 možnih lncRNA. Okoli 65 % izmed njih je kazalo podobnost s TE, temeljito opazovanje TE in lncRNA v 40 vrstah rastlin pa je razkrilo več kot 14 000 prekrivanj med lncRNA lokusi in TE. lncRNA, ki izvirajo iz TE, so večinoma povezane z retrotranspozoni in povečanim številom le-teh v genomu. Aktivirane lncRNA se pretežno prepisujejo iz demetiliranih TE regij, zlasti iz dolgih vmesnih jedrnih elementov (LINE), ki so del retrotranspozonov.

Mnoge izmed lncRNA, ki izvirajo iz TE, so prepisno odzivne na sol, ABA in mraz. Različno izražanje lncRNA naj bi bilo povezano z dinamiko metilacije DNA, ki omogoča neofunkcionalizacijo nekodirajočih prepisov. Dokazali so, da je znotraj vrste ''Arabidopsis'' transkripcija velikega števila lncRNA odvisna od ekotipa. Zbirka lncRNA rastline, ki je direktno odvisna od prepisne aktivnosti TE, pa predstavlja značilnosti nedavnega razhajanja med vrstami ali celo znotraj iste vrste.

'''Dolge nekodirajoče RNA, ki izvirajo iz TE, kot regulatorji malih RNA in proteinov'''

TE sodelujejo pri tvorbi smRNA, lahko pa zavirajo njihovo aktivnost. MIKKI, nekodirajoč prepis retrotranspozonskega izvora, ki se aktivno prepisuje v koreninah riža, vsebuje nepopolno tarčno mesto miRNA171. miRNA171 destabilizira mRNA, ki zapisujejo za družino SCARECROW-u podobnih transkripcijskh faktorjev specifičnih za korenine. MIKKI deluje kot miRNA vaba - vsebuje vezavna mesta za miRNA in povzroči njeno degradacijo. S svojim delovanjem povzroči kopičenje SCARECROW-u podobnih mRNA v koreninah in tako spodbuja pravilen razvoj korenin. Medgenska lncRNA INDUCED BY PHOSPHATE STARVATION 1 (IPS1) pri ''Arabidopsis'' je komplementarna s pomanjkanjem fosfata inducirani miRNA399, vključuje pa neujemajočo zanko na pričakovanem miRNA cepitvenem mestu, ki preprečuje razgradnjo IPS1 in ga pretvori v vabo za miRNA399.

lncRNA, ki izvirajo iz TE, lahko uravnavajo izražanje genov preko interakcije s proteini. Kratek razpršeni jedrni element SB1 (SB1 SINE) pri oljni ogrščici uravnava biogenezo miRNA z oviranjem dsRNA vezavnega proteina HYPONASTIC LEAVES1 (HYL1). Po transkripciji se SB1 prepis, ki izvira iz SINE, zvije v lasnično sekundarno strukturo, ki spominja na prekurzorsko miRNA. Na strukturo se veže HYL1, ki posledično ne more sodelovati v kompleksu procesiranja miRNA. Pri rastlinah, ki izražajo SB1 SINE, so pogoste okvare v razvoju in akumulaciji miRNA. Ta fenotip lahko povežemo z ektopičnim prekomernim izražanjem SINE, vendar pa kaže tudi na vpliv TE pri tvorbi miRNA v specifičnih razvojnih fazah in okoljskih razmerah.

'''Dolge nekodirajoče RNA, ki izvirajo iz TE, kot potencialni regulatorji konformacije kromatina'''

Biosintezne poti številnih rastlinskih produktov vključujejo gene organizirane v skupke. Takšna organizacija genoma naj bi izvirala iz podvojevanja genov, njihove premestitve in neofunkcionalizacije. Pri ''Arabidopsis'' se biosintetski skupki genov pojavljajo v regijah genoma bogatih s TE, s TE uravnana rekombinacija pa sodeluje pri njihovi tvorbi in koregulaciji. Obširna analiza rastlinskih genomov je pokazala vlogo transpozicije MITE pri tvorbi biosintetskih skupkov pri evdikotih. Pri ''Arabidopsis'' lncRNA MARneral Silencing (MARS) nadzoruje epigenetsko aktivacijo regije, ki jo obdaja in tako vpliva na izražanje genov marneralnega skupka ter posledično na kalitev semen. MARS kot odziv na ABA zvabi LIKEHETEROCHROMATIN PROTEIN 1 (LHP1) stran od skupka in spodbudi tvorbo kromatinske zanke, ki približa lokus MARNERAL SYNTHASE 1 (MRN1) oddaljenemu od ABA odvisnemu ojačevalnemu zaporedju.

Nekatere lncRNA preko komplementanosti zaporedij tvorijo DNA-RNA duplekse (R-zanke) in sprožijo transkripcijsko samozaviranje ali alternativno izrezovanje. lncRNA AUXIN-REGULATED PROMOTER LOOP (APOLO) prepozna več neodvisnih tarčnih lokusov znotraj genoma ''Arabidopsis''. S tvorbo R-zanke zvabi LIKEHETEROCHROMATIN PROTEIN 1
(LHP1) stran od kromatina in tako uravnava njegovo lokalno 3D konformacijo.

lncRNA, ki izvira iz MITE, z insercijo v bližino kodirajočega gena, regulira 3D konformacijo kromatina, kar v odvisnosti od celičnega tipa, uravnava transkripcijsko aktivnost sosednjih genov. V listih tvorba znotrajgenske zanke zavira transkripcijo gena HaWRKY6, kromatinska zanka v kličnih listih pa omogoča učinkovito recikliranje RNAPII in tako povečuje transkripcijo HaWRKY6. Podobno deluje tudi epigenetsko utišanje represorja cvetenja FLOWERING LOCUS C (FLC) med vernalizacijo. Izpostavitev mrazu inducira lncRNA COLDWRAP, ki posredno povzroči kompaktiranje kromatina, kar služi kot točka sidranja pri tvorbi znotrajgenske kromatinske zanke med promotorjem in 3' koncem prvega introna. Nastala zanka ovira procesivnost RNAPII, in povzroči epigenetsko utišanje FLC.

==Zaključek==

V zadnjih desetletjih so identificirali pomembno vlogo ncRNA pri uravnavanju izražanja genov na različnih nivojih. Identifikacija in karakterizacija ncRNA sta ključni pri razumevanju njihove vloge v adaptivni evoluciji. Boljše razumevanje dinamične akumulacije s TE povezanih smRNA in lncRNA kot odziv na zunanje dražljaje pa bo osvetlilo pomen nekodirajočega genoma pri medsebojnem vplivu med rastlino in okoljem. TE, ki so jih do nedavnega opisovali kot sebično DNA, niso spremenili svoje narave, šele zdaj pa začenjamo razumevati njihovo funkcijo v genomu.

==Viri in literatura==

1. Ariel, Federico D., and Pablo A. Manavella. ‘When Junk DNA Turns Functional: Transposon-Derived Non-Coding RNAs in Plants’. ''Journal of Experimental Botany'', edited by James Murray, vol. 72, no. 11, May 2021, pp. 4132–43. ''DOI.org (Crossref)'', https://doi.org/10.1093/jxb/erab073.

2. Cambiagno, Damián A., et al. ‘Immune Receptor Genes and Pericentromeric Transposons as Targets of Common Epigenetic Regulatory Elements’. ''The Plant Journal'', vol. 96, no. 6, Dec. 2018, pp. 1178–90. ''DOI.org (Crossref)'', https://doi.org/10.1111/tpj.14098.

3. Cho, Jungnam. ‘Transposon-Derived Non-Coding RNAs and Their Function in Plants’. ''Frontiers in Plant Science'', vol. 9, May 2018, p. 600. ''DOI.org (Crossref)'', https://doi.org/10.3389/fpls.2018.00600.

4. Cho, Jungnam, and Jerzy Paszkowski. ‘Regulation of Rice Root Development by a Retrotransposon Acting as a MicroRNA Sponge’. ''ELife'', edited by Christian S. Hardtke, vol. 6, Aug. 2017, p. e30038. ''eLife'', https://doi.org/10.7554/eLife.30038.

5. McCue, Andrea D., et al. “Gene Expression and Stress Response Mediated by the Epigenetic Regulation of a Transposable Element Small RNA.” ''PLoS Genetics'', edited by Tetsuji Kakutani, vol. 8, no. 2, Feb. 2012, p. e1002474. ''DOI.org (Crossref)'', https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1002474.

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Funkcije nekodirajoče RNA, ki je po izvoru transpozonska

2022-05-01T18:55:27Z

Gaja Starc: /* Aktivne dolge nekodirajoče RNA (lncRNA), ki so po izvoru transpozonske */

==Uvod==

Transpozicijski elementi (TE) predstavljajo pomemben dejavnik genomske kompleksnosti evkariontov. Pomembni so zaradi funkcije premikanja po DNA, ki pomembno vpliva na evolucijsko ločevanje organizmov, kratkoročno pa lahko predstavlja genomsko nestabilnost. Vplivajo tudi na aktivnost transkripcije genov v njihovi bližini s spreminjanjem njihovih epigenetskih značilnosti ali položaja regulatornih elementov.

V našem seminarju se bomo osredotočili na TE, ki predstavljajo izvor funkcionalnih dolgih ali kratkih nekodirajočih RNA pri rastlinah. Njihova funkcija je povezana s ''trans'' regulacijo aktivnosti genov na transkripcijskem in post-transkripcijskem nivoju. ''Trans'' regulacija je delovanje molekul na oddaljene dele genoma preko drugih, vmesnih molekul.

TE se lahko nahajajo v nekodirajočih delih DNA, kjer običajno nimajo večjega učinka, ali pa v neposredni bližini genov. Slednji močno vplivajo na nivo transkripcije bližnjih genov. Poleg tega lahko TE vplivajo na epigenetske značilnosti bližnjih regij DNA in še tako vplivajo na izražanje genov. Zato so rastline razvile številne mehanizme za zmanjševanje vpliva TE na ali v bližini genov in omejitev traspozicijskih premikov na ta mesta.

TE so pomemben izvor nekodirajočih RNA. Pri rastlinah so to predvsem dolge in kratke nekodirajoče RNA (lncRNA, smRNA), ki predstavljajo glavni regulator izražanja genov. lncRNA molekule večinoma nastanejo s pomočjo encima RNA polimeraza II (RNAPII), alternativno pa z rastlinsko specifičnimi polimerazami (RNAPIV, RNAPV). lncRNA molekule z interakcijami s proteini in tvorbo dupleksov z DNA ali RNA zmanjšajo izražanje genov na nivoju transkripcije. Druga možnost je, da lncRNA prepozna specifičen DICER protein, ki tvori več smRNA, ki sodelujejo pri utišanju genov.

==Aktivne male RNA, ki so po izvoru transpozonske==

'''Po izvoru transpozonske male interferenčne RNA (siRNA), ki povzročijo metilacijo DNA in nastanek heterokromatina na mestih TE ter utišajo njihovo transkripcijo (het-siRNA)'''

V normalnih pogojih je večina TE utišanih z metilacijo. Mehanizem metilacije je od RNA odvisna DNA metilacija (RdDM). Začne se, ko od RNA odvisna RNA polimeraza 2 (RDR2) prepozna na novo nastale RNA iz TE, nastale z delovanjem encima RNAPIV in jih spremni v dsRNA molekule. Protein DICER - LIKE 3 (DCL3) jih nato procesira v 24 nt siRNA, prenese v citoplazmo in naloži na ARGONAUTE4 (AGO4) ali na AGO3 in AGO6 proteine. AGO4 s siRNA molekulami se vrne v jedro, tam prepozna RNAPV transkripte s komplementarnim zaporedjem. Po interakciji teh dveh RNA zaporedij se na kompleks veže posebna DNA metiltransferaza (DOMAINS REARRANGED METHYTRANSFERASE 2, DRM2). Ta povzroči metilacijo TE, iz katerih te RNA izvirajo. Posledica tega je kondenzacija kromatina in trajno utišanje TE. Pri utišanju sodeluje tudi DNA topoizomeraza 1α, encim, ki spreminja topologijo DNA. V tem procesu olajša tvorbo lncRNA molekul z RNAPV, približanje in vezavo AGO4 ter metilacijo H3K9 (H3K9me2). To nakazuje, da tudi organizacija DNA vpliva na utišanje TE. Ta mehanizem utišanja je za rastline pomemben kot odgovor na stres in za prenos epigenetskih informacij na potomce. Večkrat se zgodi, da se TE vrine v ali v bližino gena. Če na te TE deluje RdDM, se poleg TE metilirajo tudi ti geni. Metilacija po navadi povzroči utišanje genov, zato lahko predstavlja težavo pri preživetju rastline.

Het-siRNA lahko delujejo ''trans''. Pri ''Arabidopsis thaliana'' se v normalnih pogojih sintetizirajo het-siRNA molekule iz pericentromernih TE. Te prepoznajo in utišajo oddaljene gene za proteine, ki ob okužbi prepoznajo molekule pogosto prisotne v patogenih (PATTERN RECOGNITION RECEPTORS, PRRs) in proteine vnetnega odziva ter prirojenega imunskega odziva (NUCLEOTIDE-BINDING LEUCIN-RICH REPEAT PROTEINS, NLRs). Ob okužbi s ''Pseudomonas syringae'' (Gram negativna bakterija), pride najprej do povišanega izražanja pericentromernih TE. Sledi RdDM, poveazana z akumulacijo het-siRNA, ki metilacijo usmerjajo na izvorne TE. To povzroči zmanjšanje represije obrambnih genov in večjo odpornost na patogen.

'''Epigenetsko aktivne siRNA (easiRNA), ki izvirajo iz TE in delujejo ''trans'''''

Pri ''Arabidopsis'' je večina TE epigenetsko utišanih s 24 nt het-siRNA. Aktivacija prepisovanja utišanih TE se odraža v nastanku 21-22 nt easiRNA. Pri tem 21 nt miRNA, ki je naložena na AGO1, sproži cepitev TE prepisa, kar omogoči združitev kompleksa RDR6/SGS3. Ta kompleks pomaga prepoznati mRNA prepis TE in nastanek dsRNA. DLC2 in DLC4 nato omogočita procesiranje dsRNA, kar je ključno za nastanek 21-22 nt easiRNA. easiRNA, naložene na AGO1, lahko nato sodelujejo pri utišanju tarčne mRNA ali TE prepisa na post-transkripcijskem nivoju. Druga možnost je, da AGO2 naloži 21-22 nt easiRNA, kar sproži netipično od proteina NERD odvisno RdDM TGS (ang. transcriptional gene silencing) pot. V primeru, ko AGO6 naloži easiRNA, pa to sproži značilno RdDM, ki vodi v utišanje TE.

'''TE kot vir novih smRNA'''

Majhne obrnjene ponovitve TE (MITE) so kratki neavtonomni TE s končnimi regijami obrnjenih ponovitev. Ti elementi, ki so bili najprej opisani v rastlinah, so pretežno vstavljeni v z geni bogate regije in navadno vplivajo na izražanje sosednjih genov. Poleg regulacije izražanja genov z insercijo ali epigenetskimi modifikacijami, lahko MITE postane vir smRNA. MITE med transkripcijo proizvedejo komplementarno RNA, ki se lahko zvije v steblo-zanka podobno sekundarno strukturo, ki je dovzetna za procesiranje z DCL3. V tem primeru pride do procesiranja lncRNA s strani DCL3 v 24 nt het-siRNA molekule, ki po običajni poti sprožijo metilacijo ''cis'' ali ''trans'', kar povzroči epigenetsko utišanje tarčnega lokusa. V rižu se od DCL3 odvisna 24 nt smRNA, ki izvira iz MITE, akumulira zaradi abiotskega stresa, kar pozitivno regulira ABA (abscizinska kislina) signaliziranje in odziv na stres.

Mutacije v zaporedju MITE vodijo tudi do nepopolnih struktur steblo-zanka, kar je lastnost miRNA prekurzorjev. To je spodbudilo razmišljanje, da so MITE verjeten evolucijski izvor miRNA lokusa. To podpira dejstvo, da se novonastale miRNA vežejo na MITE in druge TE lokuse, kar bi razložilo, zakaj se nekateri prekurzorji miRNA procesirajo tako v 21 nt kot 24 nt zvrsti. Ta ideja je dodatno podprta z ugotovitvijo, da lahko nekateri prekurzorji miRNA, ki jih prepozna DCL3, proizvajajo 24 nt siRNA in inducirajo metilacijo svojih ali tujih lokusov, kar kaže na izvor iz TE. Nadaljnja analiza potencialnega izvora miRNA genov iz TE je pokazala, da so MITE zelo dovzetne za udomačitev v miRNA prekurzorje. Spreminjanje miRNA v odvisnosti od MITE lahko tako predstavlja novosti v odzivu rastlin na razne patogene.

==Aktivne dolge nekodirajoče RNA (lncRNA), ki so po izvoru transpozonske==

'''TE kot vir fiziološko aktivnih lncRNA'''

Z RNA sekvenciranjem pri koruzi so identificirali več kot 23 000 možnih lncRNA. Okoli 65 % izmed njih je kazalo podobnost s TE, temeljito opazovanje TE in lncRNA v 40 vrstah rastlin pa je razkrilo več kot 14 000 prekrivanj med lncRNA lokusi in TE. lncRNA, ki izvirajo iz TE, so večinoma povezane z retrotranspozoni in povečanim številom le-teh v genomu. Aktivirane lncRNA se pretežno prepisujejo iz demetiliranih TE regij, zlasti iz dolgih vmesnih jedrnih elementov (LINE), ki so del retrotranspozonov.

Mnoge izmed lncRNA, ki izvirajo iz TE, so prepisno odzivne na sol, ABA in mraz. Različno izražanje lncRNA naj bi bilo povezano z dinamiko metilacije DNA, ki omogoča neofunkcionalizacijo nekodirajočih prepisov. Dokazali so, da je znotraj vrste ''Arabidopsis'' transkripcija velikega števila lncRNA odvisna od ekotipa. Zbirka lncRNA rastline, ki je direktno odvisna od prepisne aktivnosti TE, pa predstavlja značilnosti nedavnega razhajanja med vrstami ali celo znotraj iste vrste.

'''Dolge nekodirajoče RNA, ki izvirajo iz TE, kot regulatorji malih RNA in proteinov'''

TE sodelujejo pri tvorbi smRNA, lahko pa zavirajo njihovo aktivnost. MIKKI, nekodirajoč prepis retrotranspozonskega izvora, ki se aktivno prepisuje v koreninah riža, vsebuje nepopolno tarčno mesto miRNA171. miRNA171 destabilizira mRNA, ki zapisujejo za družino SCARECROW-u podobnih transkripcijskh faktorjev specifičnih za korenine. MIKKI deluje kot miRNA vaba - vsebuje vezavna mesta za miRNA in povzroči njeno degradacijo. S svojim delovanjem povzroči kopičenje SCARECROW-u podobnih mRNA v koreninah in tako spodbuja pravilen razvoj korenin. Medgenska lncRNA INDUCED BY PHOSPHATE STARVATION 1 (IPS1) pri ''Arabidopsis'' je komplementarna s pomanjkanjem fosfata inducirani miRNA399, vključuje pa neujemajočo zanko na pričakovanem miRNA cepitvenem mestu, ki preprečuje razgradnjo IPS1 in ga pretvori v vabo za miRNA399.

lncRNA, ki izvirajo iz TE, lahko uravnavajo izražanje genov preko interakcije s proteini. Kratek razpršeni jedrni element SB1 (SB1 SINE) pri oljni ogrščici uravnava biogenezo miRNA z oviranjem dsRNA vezavnega proteina HYPONASTIC LEAVES1 (HYL1). Po transkripciji se SB1 prepis, ki izvira iz SINE, zvije v lasnično sekundarno strukturo, ki spominja na prekurzorsko miRNA. Na strukturo se veže HYL1, ki posledično ne more sodelovati v kompleksu procesiranja miRNA. Pri rastlinah, ki izražajo SB1 SINE, so pogoste okvare v razvoju in akumulaciji miRNA. Ta fenotip lahko povežemo z ektopičnim prekomernim izražanjem SINE, vendar pa kaže tudi na vpliv TE pri tvorbi miRNA v specifičnih razvojnih fazah in okoljskih razmerah.

'''Dolge nekodirajoče RNA, ki izvirajo iz TE, kot potencialni regulatorji konformacije kromatina'''

Biosintezne poti številnih rastlinskih produktov vključujejo gene organizirane v skupke. Takšna organizacija genoma naj bi izvirala iz podvojevanja genov, njihove premestitve in neofunkcionalizacije. Pri ''Arabidopsis'' se biosintetski skupki genov pojavljajo v regijah genoma bogatih s TE, s TE uravnana rekombinacija pa sodeluje pri njihovi tvorbi in koregulaciji. Obširna analiza rastlinskih genomov je pokazala vlogo transpozicije MITE pri tvorbi biosintetskih skupkov pri evdikotih.

Nekatere lncRNA preko komplementanosti zaporedij tvorijo DNA-RNA duplekse (R-zanke) in sprožijo transkripcijsko samozaviranje ali alternativno izrezovanje. lncRNA AUXIN-REGULATED PROMOTER LOOP (APOLO) prepozna več neodvisnih tarčnih lokusov znotraj genoma ''Arabidopsis''. S tvorbo R-zanke zvabi LIKEHETEROCHROMATIN PROTEIN 1
(LHP1) stran od kromatina in tako uravnava njegovo lokalno 3D konformacijo.

lncRNA, ki izvira iz MITE, z insercijo v bližino kodirajočega gena, regulira 3D konformacijo kromatina, kar v odvisnosti od celičnega tipa, uravnava transkripcijsko aktivnost sosednjih genov. V listih tvorba znotrajgenske zanke zavira transkripcijo gena HaWRKY6, kromatinska zanka v kličnih listih pa omogoča učinkovito recikliranje RNAPII in tako povečuje transkripcijo HaWRKY6. Podobno deluje tudi epigenetsko utišanje represorja cvetenja FLOWERING LOCUS C (FLC) med vernalizacijo. Izpostavitev mrazu inducira lncRNA COLDWRAP, ki posredno povzroči kompaktiranje kromatina, kar služi kot točka sidranja pri tvorbi znotrajgenske kromatinske zanke med promotorjem in 3' koncem prvega introna. Nastala zanka ovira procesivnost RNAPII, in povzroči epigenetsko utišanje FLC.

==Zaključek==

V zadnjih desetletjih so identificirali pomembno vlogo ncRNA pri uravnavanju izražanja genov na različnih nivojih. Identifikacija in karakterizacija ncRNA sta ključni pri razumevanju njihove vloge v adaptivni evoluciji. Boljše razumevanje dinamične akumulacije s TE povezanih smRNA in lncRNA kot odziv na zunanje dražljaje pa bo osvetlilo pomen nekodirajočega genoma pri medsebojnem vplivu med rastlino in okoljem. TE, ki so jih do nedavnega opisovali kot sebično DNA, niso spremenili svoje narave, šele zdaj pa začenjamo razumevati njihovo funkcijo v genomu.

==Viri in literatura==

1. Ariel, Federico D., and Pablo A. Manavella. ‘When Junk DNA Turns Functional: Transposon-Derived Non-Coding RNAs in Plants’. ''Journal of Experimental Botany'', edited by James Murray, vol. 72, no. 11, May 2021, pp. 4132–43. ''DOI.org (Crossref)'', https://doi.org/10.1093/jxb/erab073.

2. Cambiagno, Damián A., et al. ‘Immune Receptor Genes and Pericentromeric Transposons as Targets of Common Epigenetic Regulatory Elements’. ''The Plant Journal'', vol. 96, no. 6, Dec. 2018, pp. 1178–90. ''DOI.org (Crossref)'', https://doi.org/10.1111/tpj.14098.

3. Cho, Jungnam. ‘Transposon-Derived Non-Coding RNAs and Their Function in Plants’. ''Frontiers in Plant Science'', vol. 9, May 2018, p. 600. ''DOI.org (Crossref)'', https://doi.org/10.3389/fpls.2018.00600.

4. Cho, Jungnam, and Jerzy Paszkowski. ‘Regulation of Rice Root Development by a Retrotransposon Acting as a MicroRNA Sponge’. ''ELife'', edited by Christian S. Hardtke, vol. 6, Aug. 2017, p. e30038. ''eLife'', https://doi.org/10.7554/eLife.30038.

5. McCue, Andrea D., et al. “Gene Expression and Stress Response Mediated by the Epigenetic Regulation of a Transposable Element Small RNA.” ''PLoS Genetics'', edited by Tetsuji Kakutani, vol. 8, no. 2, Feb. 2012, p. e1002474. ''DOI.org (Crossref)'', https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1002474.

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Funkcije nekodirajoče RNA, ki je po izvoru transpozonska

2022-05-01T18:29:05Z

Gaja Starc: /* Aktivne dolge nekodirajoče RNA (lncRNA), ki so po izvoru transpozonske */

==Uvod==

Transpozicijski elementi (TE) predstavljajo pomemben dejavnik genomske kompleksnosti evkariontov. Pomembni so zaradi funkcije premikanja po DNA, ki pomembno vpliva na evolucijsko ločevanje organizmov, kratkoročno pa lahko predstavlja genomsko nestabilnost. Vplivajo tudi na aktivnost transkripcije genov v njihovi bližini s spreminjanjem njihovih epigenetskih značilnosti ali položaja regulatornih elementov.

V našem seminarju se bomo osredotočili na TE, ki predstavljajo izvor funkcionalnih dolgih ali kratkih nekodirajočih RNA pri rastlinah. Njihova funkcija je povezana s ''trans'' regulacijo aktivnosti genov na transkripcijskem in post-transkripcijskem nivoju. ''Trans'' regulacija je delovanje molekul na oddaljene dele genoma preko drugih, vmesnih molekul.

TE se lahko nahajajo v nekodirajočih delih DNA, kjer običajno nimajo večjega učinka, ali pa v neposredni bližini genov. Slednji močno vplivajo na nivo transkripcije bližnjih genov. Poleg tega lahko TE vplivajo na epigenetske značilnosti bližnjih regij DNA in še tako vplivajo na izražanje genov. Zato so rastline razvile številne mehanizme za zmanjševanje vpliva TE na ali v bližini genov in omejitev traspozicijskih premikov na ta mesta.

TE so pomemben izvor nekodirajočih RNA. Pri rastlinah so to predvsem dolge in kratke nekodirajoče RNA (lncRNA, smRNA), ki predstavljajo glavni regulator izražanja genov. lncRNA molekule večinoma nastanejo s pomočjo encima RNA polimeraza II (RNAPII), alternativno pa z rastlinsko specifičnimi polimerazami (RNAPIV, RNAPV). lncRNA molekule z interakcijami s proteini in tvorbo dupleksov z DNA ali RNA zmanjšajo izražanje genov na nivoju transkripcije. Druga možnost je, da lncRNA prepozna specifičen DICER protein, ki tvori več smRNA, ki sodelujejo pri utišanju genov.

==Aktivne male RNA, ki so po izvoru transpozonske==

'''Po izvoru transpozonske male interferenčne RNA (siRNA), ki povzročijo metilacijo DNA in nastanek heterokromatina na mestih TE ter utišajo njihovo transkripcijo (het-siRNA)'''

V normalnih pogojih je večina TE utišanih z metilacijo. Mehanizem metilacije je od RNA odvisna DNA metilacija (RdDM). Začne se, ko od RNA odvisna RNA polimeraza 2 (RDR2) prepozna na novo nastale RNA iz TE, nastale z delovanjem encima RNAPIV in jih spremni v dsRNA molekule. Protein DICER - LIKE 3 (DCL3) jih nato procesira v 24 nt siRNA, prenese v citoplazmo in naloži na ARGONAUTE4 (AGO4) ali na AGO3 in AGO6 proteine. AGO4 s siRNA molekulami se vrne v jedro, tam prepozna RNAPV transkripte s komplementarnim zaporedjem. Po interakciji teh dveh RNA zaporedij se na kompleks veže posebna DNA metiltransferaza (DOMAINS REARRANGED METHYTRANSFERASE 2, DRM2). Ta povzroči metilacijo TE, iz katerih te RNA izvirajo. Posledica tega je kondenzacija kromatina in trajno utišanje TE. Pri utišanju sodeluje tudi DNA topoizomeraza 1α, encim, ki spreminja topologijo DNA. V tem procesu olajša tvorbo lncRNA molekul z RNAPV, približanje in vezavo AGO4 ter metilacijo H3K9 (H3K9me2). To nakazuje, da tudi organizacija DNA vpliva na utišanje TE. Ta mehanizem utišanja je za rastline pomemben kot odgovor na stres in za prenos epigenetskih informacij na potomce. Večkrat se zgodi, da se TE vrine v ali v bližino gena. Če na te TE deluje RdDM, se poleg TE metilirajo tudi ti geni. Metilacija po navadi povzroči utišanje genov, zato lahko predstavlja težavo pri preživetju rastline.

Het-siRNA lahko delujejo ''trans''. Pri ''Arabidopsis thaliana'' se v normalnih pogojih sintetizirajo het-siRNA molekule iz pericentromernih TE. Te prepoznajo in utišajo oddaljene gene za proteine, ki ob okužbi prepoznajo molekule pogosto prisotne v patogenih (PATTERN RECOGNITION RECEPTORS, PRRs) in proteine vnetnega odziva ter prirojenega imunskega odziva (NUCLEOTIDE-BINDING LEUCIN-RICH REPEAT PROTEINS, NLRs). Ob okužbi s ''Pseudomonas syringae'' (Gram negativna bakterija), pride najprej do povišanega izražanja pericentromernih TE. Sledi RdDM, poveazana z akumulacijo het-siRNA, ki metilacijo usmerjajo na izvorne TE. To povzroči zmanjšanje represije obrambnih genov in večjo odpornost na patogen.

'''Epigenetsko aktivne siRNA (easiRNA), ki izvirajo iz TE in delujejo ''trans'''''

Pri ''Arabidopsis'' je večina TE epigenetsko utišanih s 24 nt het-siRNA. Aktivacija prepisovanja utišanih TE se odraža v nastanku 21-22 nt easiRNA. Pri tem 21 nt miRNA, ki je naložena na AGO1, sproži cepitev TE prepisa, kar omogoči združitev kompleksa RDR6/SGS3. Ta kompleks pomaga prepoznati mRNA prepis TE in nastanek dsRNA. DLC2 in DLC4 nato omogočita procesiranje dsRNA, kar je ključno za nastanek 21-22 nt easiRNA. easiRNA, naložene na AGO1, lahko nato sodelujejo pri utišanju tarčne mRNA ali TE prepisa na post-transkripcijskem nivoju. Druga možnost je, da AGO2 naloži 21-22 nt easiRNA, kar sproži netipično od proteina NERD odvisno RdDM TGS (ang. transcriptional gene silencing) pot. V primeru, ko AGO6 naloži easiRNA, pa to sproži značilno RdDM, ki vodi v utišanje TE.

'''TE kot vir novih smRNA'''

Majhne obrnjene ponovitve TE (MITE) so kratki neavtonomni TE s končnimi regijami obrnjenih ponovitev. Ti elementi, ki so bili najprej opisani v rastlinah, so pretežno vstavljeni v z geni bogate regije in navadno vplivajo na izražanje sosednjih genov. Poleg regulacije izražanja genov z insercijo ali epigenetskimi modifikacijami, lahko MITE postane vir smRNA. MITE med transkripcijo proizvedejo komplementarno RNA, ki se lahko zvije v steblo-zanka podobno sekundarno strukturo, ki je dovzetna za procesiranje z DCL3. V tem primeru pride do procesiranja lncRNA s strani DCL3 v 24 nt het-siRNA molekule, ki po običajni poti sprožijo metilacijo ''cis'' ali ''trans'', kar povzroči epigenetsko utišanje tarčnega lokusa. V rižu se od DCL3 odvisna 24 nt smRNA, ki izvira iz MITE, akumulira zaradi abiotskega stresa, kar pozitivno regulira ABA (abscizinska kislina) signaliziranje in odziv na stres.

Mutacije v zaporedju MITE vodijo tudi do nepopolnih struktur steblo-zanka, kar je lastnost miRNA prekurzorjev. To je spodbudilo razmišljanje, da so MITE verjeten evolucijski izvor miRNA lokusa. To podpira dejstvo, da se novonastale miRNA vežejo na MITE in druge TE lokuse, kar bi razložilo, zakaj se nekateri prekurzorji miRNA procesirajo tako v 21 nt kot 24 nt zvrsti. Ta ideja je dodatno podprta z ugotovitvijo, da lahko nekateri prekurzorji miRNA, ki jih prepozna DCL3, proizvajajo 24 nt siRNA in inducirajo metilacijo svojih ali tujih lokusov, kar kaže na izvor iz TE. Nadaljnja analiza potencialnega izvora miRNA genov iz TE je pokazala, da so MITE zelo dovzetne za udomačitev v miRNA prekurzorje. Spreminjanje miRNA v odvisnosti od MITE lahko tako predstavlja novosti v odzivu rastlin na razne patogene.

==Aktivne dolge nekodirajoče RNA (lncRNA), ki so po izvoru transpozonske==

'''TE kot vir fiziološko aktivnih lncRNA'''

Z RNA sekvenciranjem pri koruzi so identificirali več kot 23 000 možnih lncRNA. Okoli 65 % izmed njih je kazalo podobnost s TE, temeljito opazovanje TE in lncRNA v 40 vrstah rastlin pa je razkrilo več kot 14 000 prekrivanj med lncRNA lokusi in TE. lncRNA, ki izvirajo iz TE, so večinoma povezane z retrotranspozoni in povečanim številom le-teh v genomu. Aktivirane lncRNA se pretežno prepisujejo iz demetiliranih TE regij, zlasti iz dolgih vmesnih jedrnih elementov (LINE), ki so del retrotranspozonov.

Mnoge izmed lncRNA, ki izvirajo iz TE, so prepisno odzivne na sol, ABA in mraz. Različno izražanje lncRNA naj bi bilo povezano z dinamiko metilacije DNA, ki omogoča neofunkcionalizacijo nekodirajočih prepisov. Dokazali so, da je znotraj vrste ''Arabidopsis'' transkripcija velikega števila lncRNA odvisna od ekotipa. Zbirka lncRNA rastline, ki je direktno odvisna od prepisne aktivnosti TE, pa predstavlja značilnosti nedavnega razhajanja med vrstami ali celo znotraj iste vrste.

'''Dolge nekodirajoče RNA, ki izvirajo iz TE, kot regulatorji malih RNA in proteinov'''

TE sodelujejo pri tvorbi smRNA, lahko pa zavirajo njihovo aktivnost. MIKKI, nekodirajoč prepis retrotranspozonskega izvora, ki se aktivno prepisuje v koreninah riža, vsebuje nepopolno tarčno mesto miRNA171. miRNA171 destabilizira mRNA, ki zapisujejo za družino SCARECROW-u podobnih transkripcijskh faktorjev specifičnih za korenine. MIKKI deluje kot miRNA vaba - vsebuje vezavna mesta za miRNA in povzroči njeno degradacijo. S svojim delovanjem povzroči kopičenje SCARECROW-u podobnih mRNA v koreninah in tako spodbuja pravilen razvoj korenin. Medgenska lncRNA INDUCED BY PHOSPHATE STARVATION 1 (IPS1) pri ''Arabidopsis'' je komplementarna s pomanjkanjem fosfata inducirani miRNA399, vključuje pa neujemajočo zanko na pričakovanem miRNA cepitvenem mestu, ki preprečuje razgradnjo IPS1 in ga pretvori v vabo za miRNA399.

lncRNA, ki izvirajo iz TE, lahko uravnavajo izražanje genov preko interakcije s proteini. Kratek razpršeni jedrni element SB1 (SB1 SINE) pri oljni ogrščici uravnava biogenezo miRNA z destabilizacijo dsRNA vezavnega proteina HYPONASTIC LEAVES1 (HYL1). Po transkripciji se SB1 prepis, ki izvira iz SINE, zvije v lasnično sekundarno strukturo, ki spominja na prekurzorsko miRNA. Na strukturo se veže HYL1, ki posledično ne more sodelovati v kompleksu procesiranja miRNA. Pri rastlinah, ki izražajo SB1 SINE, so pogoste okvare v razvoju in akumulaciji miRNA. Ta fenotip lahko povežemo z ektopičnim prekomernim izražanjem SINE, vendar pa kaže tudi na vpliv TE pri tvorbi miRNA v specifičnih razvojnih fazah in okoljskih razmerah.

'''Dolge nekodirajoče RNA, ki izvirajo iz TE, kot potencialni regulatorji konformacije kromatina'''

Biosintezne poti številnih rastlinskih produktov vključujejo gene organizirane v skupke. Takšna organizacija genoma naj bi izvirala iz podvojevanja genov, njihove premestitve in neofunkcionalizacije. Pri ''Arabidopsis'' se biosintetski skupki genov pojavljajo v regijah genoma bogatih s TE, s TE uravnana rekombinacija pa sodeluje pri njihovi tvorbi in koregulaciji. Obširna analiza rastlinskih genomov je pokazala vlogo transpozicije MITE pri tvorbi biosintetskih skupkov pri evdikotih.

Nekatere lncRNA preko komplementanosti zaporedij tvorijo DNA-RNA duplekse (R-zanke) in sprožijo transkripcijsko samozaviranje ali alternativno izrezovanje. lncRNA AUXIN-REGULATED PROMOTER LOOP (APOLO) prepozna več neodvisnih tarčnih lokusov znotraj genoma ''Arabidopsis''. S tvorbo R-zanke zvabi LIKEHETEROCHROMATIN PROTEIN 1
(LHP1) stran od kromatina in tako uravnava njegovo lokalno 3D konformacijo.

lncRNA, ki izvira iz MITE, z insercijo v bližino kodirajočega gena, regulira 3D konformacijo kromatina, kar v odvisnosti od celičnega tipa, uravnava transkripcijsko aktivnost sosednjih genov. V listih tvorba znotrajgenske zanke zavira transkripcijo gena HaWRKY6, kromatinska zanka v kličnih listih pa omogoča učinkovito recikliranje RNAPII in tako povečuje transkripcijo HaWRKY6. Podobno deluje tudi epigenetsko utišanje represorja cvetenja FLOWERING LOCUS C (FLC) med vernalizacijo. Izpostavitev mrazu inducira lncRNA COLDWRAP, ki posredno povzroči kompaktiranje kromatina, kar služi kot točka sidranja pri tvorbi znotrajgenske kromatinske zanke med promotorjem in 3' koncem prvega introna. Nastala zanka ovira procesivnost RNAPII, in povzroči epigenetsko utišanje FLC.

==Zaključek==

V zadnjih desetletjih so identificirali pomembno vlogo ncRNA pri uravnavanju izražanja genov na različnih nivojih. Identifikacija in karakterizacija ncRNA sta ključni pri razumevanju njihove vloge v adaptivni evoluciji. Boljše razumevanje dinamične akumulacije s TE povezanih smRNA in lncRNA kot odziv na zunanje dražljaje pa bo osvetlilo pomen nekodirajočega genoma pri medsebojnem vplivu med rastlino in okoljem. TE, ki so jih do nedavnega opisovali kot sebično DNA, niso spremenili svoje narave, šele zdaj pa začenjamo razumevati njihovo funkcijo v genomu.

==Viri in literatura==

1. Ariel, Federico D., and Pablo A. Manavella. ‘When Junk DNA Turns Functional: Transposon-Derived Non-Coding RNAs in Plants’. ''Journal of Experimental Botany'', edited by James Murray, vol. 72, no. 11, May 2021, pp. 4132–43. ''DOI.org (Crossref)'', https://doi.org/10.1093/jxb/erab073.

2. Cambiagno, Damián A., et al. ‘Immune Receptor Genes and Pericentromeric Transposons as Targets of Common Epigenetic Regulatory Elements’. ''The Plant Journal'', vol. 96, no. 6, Dec. 2018, pp. 1178–90. ''DOI.org (Crossref)'', https://doi.org/10.1111/tpj.14098.

3. Cho, Jungnam. ‘Transposon-Derived Non-Coding RNAs and Their Function in Plants’. ''Frontiers in Plant Science'', vol. 9, May 2018, p. 600. ''DOI.org (Crossref)'', https://doi.org/10.3389/fpls.2018.00600.

4. Cho, Jungnam, and Jerzy Paszkowski. ‘Regulation of Rice Root Development by a Retrotransposon Acting as a MicroRNA Sponge’. ''ELife'', edited by Christian S. Hardtke, vol. 6, Aug. 2017, p. e30038. ''eLife'', https://doi.org/10.7554/eLife.30038.

5. McCue, Andrea D., et al. “Gene Expression and Stress Response Mediated by the Epigenetic Regulation of a Transposable Element Small RNA.” ''PLoS Genetics'', edited by Tetsuji Kakutani, vol. 8, no. 2, Feb. 2012, p. e1002474. ''DOI.org (Crossref)'', https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1002474.

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Funkcije nekodirajoče RNA, ki je po izvoru transpozonska

2022-05-01T18:22:06Z

Gaja Starc: /* Aktivne dolge nekodirajoče RNA (lncRNA), ki so po izvoru transpozonske */

==Uvod==

Transpozicijski elementi (TE) predstavljajo pomemben dejavnik genomske kompleksnosti evkariontov. Pomembni so zaradi funkcije premikanja po DNA, ki pomembno vpliva na evolucijsko ločevanje organizmov, kratkoročno pa lahko predstavlja genomsko nestabilnost. Vplivajo tudi na aktivnost transkripcije genov v njihovi bližini s spreminjanjem njihovih epigenetskih značilnosti ali položaja regulatornih elementov.

V našem seminarju se bomo osredotočili na TE, ki predstavljajo izvor funkcionalnih dolgih ali kratkih nekodirajočih RNA pri rastlinah. Njihova funkcija je povezana s ''trans'' regulacijo aktivnosti genov na transkripcijskem in post-transkripcijskem nivoju. ''Trans'' regulacija je delovanje molekul na oddaljene dele genoma preko drugih, vmesnih molekul.

TE se lahko nahajajo v nekodirajočih delih DNA, kjer običajno nimajo večjega učinka, ali pa v neposredni bližini genov. Slednji močno vplivajo na nivo transkripcije bližnjih genov. Poleg tega lahko TE vplivajo na epigenetske značilnosti bližnjih regij DNA in še tako vplivajo na izražanje genov. Zato so rastline razvile številne mehanizme za zmanjševanje vpliva TE na ali v bližini genov in omejitev traspozicijskih premikov na ta mesta.

TE so pomemben izvor nekodirajočih RNA. Pri rastlinah so to predvsem dolge in kratke nekodirajoče RNA (lncRNA, smRNA), ki predstavljajo glavni regulator izražanja genov. lncRNA molekule večinoma nastanejo s pomočjo encima RNA polimeraza II (RNAPII), alternativno pa z rastlinsko specifičnimi polimerazami (RNAPIV, RNAPV). lncRNA molekule z interakcijami s proteini in tvorbo dupleksov z DNA ali RNA zmanjšajo izražanje genov na nivoju transkripcije. Druga možnost je, da lncRNA prepozna specifičen DICER protein, ki tvori več smRNA, ki sodelujejo pri utišanju genov.

==Aktivne male RNA, ki so po izvoru transpozonske==

'''Po izvoru transpozonske male interferenčne RNA (siRNA), ki povzročijo metilacijo DNA in nastanek heterokromatina na mestih TE ter utišajo njihovo transkripcijo (het-siRNA)'''

V normalnih pogojih je večina TE utišanih z metilacijo. Mehanizem metilacije je od RNA odvisna DNA metilacija (RdDM). Začne se, ko od RNA odvisna RNA polimeraza 2 (RDR2) prepozna na novo nastale RNA iz TE, nastale z delovanjem encima RNAPIV in jih spremni v dsRNA molekule. Protein DICER - LIKE 3 (DCL3) jih nato procesira v 24 nt siRNA, prenese v citoplazmo in naloži na ARGONAUTE4 (AGO4) ali na AGO3 in AGO6 proteine. AGO4 s siRNA molekulami se vrne v jedro, tam prepozna RNAPV transkripte s komplementarnim zaporedjem. Po interakciji teh dveh RNA zaporedij se na kompleks veže posebna DNA metiltransferaza (DOMAINS REARRANGED METHYTRANSFERASE 2, DRM2). Ta povzroči metilacijo TE, iz katerih te RNA izvirajo. Posledica tega je kondenzacija kromatina in trajno utišanje TE. Pri utišanju sodeluje tudi DNA topoizomeraza 1α, encim, ki spreminja topologijo DNA. V tem procesu olajša tvorbo lncRNA molekul z RNAPV, približanje in vezavo AGO4 ter metilacijo H3K9 (H3K9me2). To nakazuje, da tudi organizacija DNA vpliva na utišanje TE. Ta mehanizem utišanja je za rastline pomemben kot odgovor na stres in za prenos epigenetskih informacij na potomce. Večkrat se zgodi, da se TE vrine v ali v bližino gena. Če na te TE deluje RdDM, se poleg TE metilirajo tudi ti geni. Metilacija po navadi povzroči utišanje genov, zato lahko predstavlja težavo pri preživetju rastline.

Het-siRNA lahko delujejo ''trans''. Pri ''Arabidopsis thaliana'' se v normalnih pogojih sintetizirajo het-siRNA molekule iz pericentromernih TE. Te prepoznajo in utišajo oddaljene gene za proteine, ki ob okužbi prepoznajo molekule pogosto prisotne v patogenih (PATTERN RECOGNITION RECEPTORS, PRRs) in proteine vnetnega odziva ter prirojenega imunskega odziva (NUCLEOTIDE-BINDING LEUCIN-RICH REPEAT PROTEINS, NLRs). Ob okužbi s ''Pseudomonas syringae'' (Gram negativna bakterija), pride najprej do povišanega izražanja pericentromernih TE. Sledi RdDM, poveazana z akumulacijo het-siRNA, ki metilacijo usmerjajo na izvorne TE. To povzroči zmanjšanje represije obrambnih genov in večjo odpornost na patogen.

'''Epigenetsko aktivne siRNA (easiRNA), ki izvirajo iz TE in delujejo ''trans'''''

Pri ''Arabidopsis'' je večina TE epigenetsko utišanih s 24 nt het-siRNA. Aktivacija prepisovanja utišanih TE se odraža v nastanku 21-22 nt easiRNA. Pri tem 21 nt miRNA, ki je naložena na AGO1, sproži cepitev TE prepisa, kar omogoči združitev kompleksa RDR6/SGS3. Ta kompleks pomaga prepoznati mRNA prepis TE in nastanek dsRNA. DLC2 in DLC4 nato omogočita procesiranje dsRNA, kar je ključno za nastanek 21-22 nt easiRNA. easiRNA, naložene na AGO1, lahko nato sodelujejo pri utišanju tarčne mRNA ali TE prepisa na post-transkripcijskem nivoju. Druga možnost je, da AGO2 naloži 21-22 nt easiRNA, kar sproži netipično od proteina NERD odvisno RdDM TGS (ang. transcriptional gene silencing) pot. V primeru, ko AGO6 naloži easiRNA, pa to sproži značilno RdDM, ki vodi v utišanje TE.

'''TE kot vir novih smRNA'''

Majhne obrnjene ponovitve TE (MITE) so kratki neavtonomni TE s končnimi regijami obrnjenih ponovitev. Ti elementi, ki so bili najprej opisani v rastlinah, so pretežno vstavljeni v z geni bogate regije in navadno vplivajo na izražanje sosednjih genov. Poleg regulacije izražanja genov z insercijo ali epigenetskimi modifikacijami, lahko MITE postane vir smRNA. MITE med transkripcijo proizvedejo komplementarno RNA, ki se lahko zvije v steblo-zanka podobno sekundarno strukturo, ki je dovzetna za procesiranje z DCL3. V tem primeru pride do procesiranja lncRNA s strani DCL3 v 24 nt het-siRNA molekule, ki po običajni poti sprožijo metilacijo ''cis'' ali ''trans'', kar povzroči epigenetsko utišanje tarčnega lokusa. V rižu se od DCL3 odvisna 24 nt smRNA, ki izvira iz MITE, akumulira zaradi abiotskega stresa, kar pozitivno regulira ABA (abscizinska kislina) signaliziranje in odziv na stres.

Mutacije v zaporedju MITE vodijo tudi do nepopolnih struktur steblo-zanka, kar je lastnost miRNA prekurzorjev. To je spodbudilo razmišljanje, da so MITE verjeten evolucijski izvor miRNA lokusa. To podpira dejstvo, da se novonastale miRNA vežejo na MITE in druge TE lokuse, kar bi razložilo, zakaj se nekateri prekurzorji miRNA procesirajo tako v 21 nt kot 24 nt zvrsti. Ta ideja je dodatno podprta z ugotovitvijo, da lahko nekateri prekurzorji miRNA, ki jih prepozna DCL3, proizvajajo 24 nt siRNA in inducirajo metilacijo svojih ali tujih lokusov, kar kaže na izvor iz TE. Nadaljnja analiza potencialnega izvora miRNA genov iz TE je pokazala, da so MITE zelo dovzetne za udomačitev v miRNA prekurzorje. Spreminjanje miRNA v odvisnosti od MITE lahko tako predstavlja novosti v odzivu rastlin na razne patogene.

==Aktivne dolge nekodirajoče RNA (lncRNA), ki so po izvoru transpozonske==

'''TE kot vir fiziološko aktivnih lncRNA'''

Z RNA sekvenciranjem pri koruzi so identificirali več kot 23 000 možnih lncRNA. Okoli 65 % izmed njih je kazalo podobnost s TE, temeljito opazovanje TE in lncRNA v 40 vrstah rastlin pa je razkrilo več kot 14 000 prekrivanj med lncRNA lokusi in TE. lncRNA, ki izvirajo iz TE, so večinoma povezane z retrotranspozoni in povečanim številom le-teh v genomu. Aktivirane lncRNA se pretežno prepisujejo iz demetiliranih TE regij, zlasti iz dolgih vmesnih jedrnih elementov (LINE), ki so del retrotranspozonov.

Mnoge izmed lncRNA, ki izvirajo iz TE, so prepisno odzivne na sol, ABA in mraz. Različno izražanje lncRNA naj bi bilo povezano z dinamiko metilacije DNA, ki omogoča neofunkcionalizacijo nekodirajočih prepisov. Dokazali so, da je znotraj vrste ''Arabidopsis'' transkripcija velikega števila lncRNA odvisna od ekotipa. Zbirka lncRNA rastline, ki je direktno odvisna od prepisne aktivnosti TE, pa predstavlja značilnosti nedavnega razhajanja med vrstami ali celo znotraj iste vrste.

'''Dolge nekodirajoče RNA, ki izvirajo iz TE, kot regulatorji malih RNA in proteinov'''

TE sodelujejo pri tvorbi smRNA, lahko pa zavirajo njihovo aktivnost. MIKKI, nekodirajoč prepis retrotranspozonskega izvora, ki se aktivno prepisuje v koreninah riža, vsebuje nepopolno tarčno mesto miRNA171. miRNA171 destabilizira mRNA, ki zapisujejo za družino SCARECROW-u podobnih transkripcijskh faktorjev specifičnih za korenine. MIKKI deluje kot miRNA vaba - vsebuje vezavna mesta za miRNA in povzroči njeno degradacijo. S svojim delovanjem povzroči kopičenje SCARECROW-u podobnih mRNA v koreninah in tako spodbuja pravilen razvoj korenin. Medgenska lncRNA INDUCED BY PHOSPHATE STARVATION 1 (IPS1) pri ''Arabidopsis'' je komplementarna s pomanjkanjem fosfata inducirani miRNA399, vključuje pa neujemajočo zanko na pričakovanem miRNA cepitvenem mestu, ki preprečuje razgradnjo IPS1 in ga pretvori v vabo za miRNA399.

lncRNA, ki izvirajo iz TE, lahko uravnavajo izražanje genov preko interakcije s proteini. Kratek razpršeni jedrni element SB1 (SB1 SINE) pri oljni ogrščici uravnava biogenezo miRNA z destabilizacijo dsRNA vezavnega proteina HYPONASTIC LEAVES1 (HYL1). Po transkripciji se SB1 prepis, ki izvira iz SINE, zvije v lasnično sekundarno strukturo, ki spominja na prekurzorsko miRNA. Na strukturo se veže HYL1, ki posledično ne more sodelovati v kompleksu procesiranja miRNA. Pri rastlinah, ki izražajo SB1 SINE, so pogoste okvare v razvoju in akumulaciji miRNA. Ta fenotip lahko povežemo z ektopičnim prekomernim izražanjem SINE, vendar pa kaže tudi na vpliv TE pri tvorbi miRNA v specifičnih razvojnih fazah in okoljskih razmerah.

Prepisi, ki izvirajo iz retrotranspozona LINE1, vplivajo na preoblikovanje kromatina in tako uravnavajo transkripcijsko aktivnost tarčnih genov. Pri sesalcih lahko prepisi LINE1 RNA, locirani na intronih, različno rekrutirajo RNA-vezavne protein (RBP), ki so vključeni v alternativno izrezovanje intronov. lncRNA, ki izvirajo iz evolucijsko mladih LINE1 in so locirani daleč od eksonov, preferenčno prepoznajo zaviralne RBP. Starejši LINE, ki so locirani bližje eksonom, pa preferenčno vežejo RBP, ki spodbujajo procesiranje RNA in sodelujejo pri tkivno specifičnem alternativnem izrezovanju intronov.

'''Dolge nekodirajoče RNA, ki izvirajo iz TE, kot potencialni regulatorji konformacije kromatina'''

Biosintezne poti številnih rastlinskih produktov vključujejo gene organizirane v skupke. Takšna organizacija genoma naj bi izvirala iz podvojevanja genov, njihove premestitve in neofunkcionalizacije. Pri ''Arabidopsis'' se biosintetski skupki genov pojavljajo v regijah genoma bogatih s TE, s TE uravnana rekombinacija pa sodeluje pri njihovi tvorbi in koregulaciji. Obširna analiza rastlinskih genomov je pokazala vlogo transpozicije MITE pri tvorbi biosintetskih skupkov pri evdikotih.

Nekatere lncRNA preko komplementanosti zaporedij tvorijo DNA-RNA duplekse (R-zanke) in sprožijo transkripcijsko samozaviranje ali alternativno izrezovanje. lncRNA AUXIN-REGULATED PROMOTER LOOP (APOLO) prepozna več neodvisnih tarčnih lokusov znotraj genoma ''Arabidopsis''. S tvorbo R-zanke zvabi LIKEHETEROCHROMATIN PROTEIN 1
(LHP1) stran od kromatina in tako uravnava njegovo lokalno 3D konformacijo.

lncRNA, ki izvira iz MITE, z insercijo v bližino kodirajočega gena, regulira 3D konformacijo kromatina, kar v odvisnosti od celičnega tipa, uravnava transkripcijsko aktivnost sosednjih genov. V listih tvorba znotrajgenske zanke zavira transkripcijo gena HaWRKY6, kromatinska zanka v kličnih listih pa omogoča učinkovito recikliranje RNAPII in tako povečuje transkripcijo HaWRKY6. Podobno deluje tudi epigenetsko utišanje represorja cvetenja FLOWERING LOCUS C (FLC) med vernalizacijo. Izpostavitev mrazu inducira lncRNA COLDWRAP, ki posredno povzroči kompaktiranje kromatina, kar služi kot točka sidranja pri tvorbi znotrajgenske kromatinske zanke med promotorjem in 3' koncem prvega introna. Nastala zanka ovira procesivnost RNAPII, in povzroči epigenetsko utišanje FLC.

==Zaključek==

V zadnjih desetletjih so identificirali pomembno vlogo ncRNA pri uravnavanju izražanja genov na različnih nivojih. Identifikacija in karakterizacija ncRNA sta ključni pri razumevanju njihove vloge v adaptivni evoluciji. Boljše razumevanje dinamične akumulacije s TE povezanih smRNA in lncRNA kot odziv na zunanje dražljaje pa bo osvetlilo pomen nekodirajočega genoma pri medsebojnem vplivu med rastlino in okoljem. TE, ki so jih do nedavnega opisovali kot sebično DNA, niso spremenili svoje narave, šele zdaj pa začenjamo razumevati njihovo funkcijo v genomu.

==Viri in literatura==

1. Ariel, Federico D., and Pablo A. Manavella. ‘When Junk DNA Turns Functional: Transposon-Derived Non-Coding RNAs in Plants’. ''Journal of Experimental Botany'', edited by James Murray, vol. 72, no. 11, May 2021, pp. 4132–43. ''DOI.org (Crossref)'', https://doi.org/10.1093/jxb/erab073.

2. Cambiagno, Damián A., et al. ‘Immune Receptor Genes and Pericentromeric Transposons as Targets of Common Epigenetic Regulatory Elements’. ''The Plant Journal'', vol. 96, no. 6, Dec. 2018, pp. 1178–90. ''DOI.org (Crossref)'', https://doi.org/10.1111/tpj.14098.

3. Cho, Jungnam. ‘Transposon-Derived Non-Coding RNAs and Their Function in Plants’. ''Frontiers in Plant Science'', vol. 9, May 2018, p. 600. ''DOI.org (Crossref)'', https://doi.org/10.3389/fpls.2018.00600.

4. Cho, Jungnam, and Jerzy Paszkowski. ‘Regulation of Rice Root Development by a Retrotransposon Acting as a MicroRNA Sponge’. ''ELife'', edited by Christian S. Hardtke, vol. 6, Aug. 2017, p. e30038. ''eLife'', https://doi.org/10.7554/eLife.30038.

5. McCue, Andrea D., et al. “Gene Expression and Stress Response Mediated by the Epigenetic Regulation of a Transposable Element Small RNA.” ''PLoS Genetics'', edited by Tetsuji Kakutani, vol. 8, no. 2, Feb. 2012, p. e1002474. ''DOI.org (Crossref)'', https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1002474.

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Talk:Funkcije nekodirajoče RNA, ki je po izvoru transpozonska

2022-05-01T15:36:01Z

Gaja Starc:

Miha Razdevšek - Uvod; Po izvoru transpozonske male interferenčne RNA (siRNA), ki povzročijo metilacijo DNA in nastanek heterokromatina na mestih TE ter utišajo njihovo transkripcijo (het-siRNA)

Tinkara Butara - Epigenetsko aktivne siRNA (easiRNA), ki izvirajo iz TE in delujejo ''trans''; TE kot vir novih smRNA; TE kot vir fiziološko aktivnih lncRNA

Gaja Starc - Dolge nekodirajoče RNA, ki izvirajo iz TE, kot regulatorji malih RNA in proteinov; Dolge nekodirajoče RNA, ki izvirajo iz TE, kot potencialni regulatorji konformacije kromatina; Zaključek

Funkcije nekodirajoče RNA, ki je po izvoru transpozonska

2022-05-01T15:35:40Z

Gaja Starc: /* Aktivne dolge nekodirajoče RNA (lncRNA), ki so po izvoru transpozonske */

==Uvod==

Transpozicijski elementi (TE) predstavljajo pomemben dejavnik genomske kompleksnosti evkariontov. Pomembni so zaradi funkcije premikanja po DNA, ki pomembno vpliva na evolucijsko ločevanje organizmov, kratkoročno pa lahko predstavlja genomsko nestabilnost. Vplivajo tudi na aktivnost transkripcije genov v njihovi bližini s spreminjanjem njihovih epigenetskih značilnosti ali položaja regulatornih elementov.

V našem seminarju se bomo osredotočili na TE, ki predstavljajo izvor funkcionalnih dolgih ali kratkih nekodirajočih RNA pri rastlinah. Njihova funkcija je povezana s ''trans'' regulacijo aktivnosti genov na transkripcijskem in post-transkripcijskem nivoju. ''Trans'' regulacija je delovanje molekul na oddaljene dele genoma preko drugih, vmesnih molekul.

TE se lahko nahajajo v nekodirajočih delih DNA, kjer običajno nimajo večjega učinka, ali pa v neposredni bližini genov. Slednji močno vplivajo na nivo transkripcije bližnjih genov. Poleg tega lahko TE vplivajo na epigenetske značilnosti bližnjih regij DNA in še tako vplivajo na izražanje genov. Zato so rastline razvile številne mehanizme za zmanjševanje vpliva TE na ali v bližini genov in omejitev traspozicijskih premikov na ta mesta.

TE so pomemben izvor nekodirajočih RNA. Pri rastlinah so to predvsem dolge in kratke nekodirajoče RNA (lncRNA, smRNA), ki predstavljajo glavni regulator izražanja genov. lncRNA molekule večinoma nastanejo s pomočjo encima RNA polimeraza II (RNAPII), alternativno pa z rastlinsko specifičnimi polimerazami (RNAPIV, RNAPV). lncRNA molekule z interakcijami s proteini in tvorbo dupleksov z DNA ali RNA zmanjšajo izražanje genov na nivoju transkripcije. Druga možnost je, da lncRNA prepozna specifičen DICER protein, ki tvori več smRNA, ki sodelujejo pri utišanju genov.

==Aktivne male RNA, ki so po izvoru transpozonske==

'''Po izvoru transpozonske male interferenčne RNA (siRNA), ki povzročijo metilacijo DNA in nastanek heterokromatina na mestih TE ter utišajo njihovo transkripcijo (het-siRNA)'''

V normalnih pogojih je večina TE utišanih z metilacijo. Mehanizem metilacije je od RNA odvisna DNA metilacija (RdDM). Začne se, ko od RNA odvisna RNA polimeraza 2 (RDR2) prepozna na novo nastale RNA iz TE, nastale z delovanjem encima RNAPIV in jih spremni v dsRNA molekule. Protein DICER - LIKE 3 (DCL3) jih nato procesira v 24 nt siRNA, prenese v citoplazmo in naloži na ARGONAUTE4 (AGO4) ali na AGO3 in AGO6 proteine. AGO4 s siRNA molekulami se vrne v jedro, tam prepozna RNAPV transkripte s komplementarnim zaporedjem. Po interakciji teh dveh RNA zaporedij se na kompleks veže posebna DNA metiltransferaza (DOMAINS REARRANGED METHYTRANSFERASE 2, DRM2). Ta povzroči metilacijo TE, iz katerih te RNA izvirajo. Posledica tega je kondenzacija kromatina in trajno utišanje TE. Pri utišanju sodeluje tudi DNA topoizomeraza 1α, encim, ki spreminja topologijo DNA. V tem procesu olajša tvorbo lncRNA molekul z RNAPV, približanje in vezavo AGO4 ter metilacijo H3K9 (H3K9me2). To nakazuje, da tudi organizacija DNA vpliva na utišanje TE. Ta mehanizem utišanja je za rastline pomemben kot odgovor na stres in za prenos epigenetskih informacij na potomce. Večkrat se zgodi, da se TE vrine v ali v bližino gena. Če na te TE deluje RdDM, se poleg TE metilirajo tudi ti geni. Metilacija po navadi povzroči utišanje genov, zato lahko predstavlja težavo pri preživetju rastline.

Het-siRNA lahko delujejo ''trans''. Pri ''Arabidopsis thaliana'' se v normalnih pogojih sintetizirajo het-siRNA molekule iz pericentromernih TE. Te prepoznajo in utišajo oddaljene gene za proteine, ki ob okužbi prepoznajo molekule pogosto prisotne v patogenih (PATTERN RECOGNITION RECEPTORS, PRRs) in proteine vnetnega odziva ter prirojenega imunskega odziva (NUCLEOTIDE-BINDING LEUCIN-RICH REPEAT PROTEINS, NLRs). Ob okužbi s ''Pseudomonas syringae'' (Gram negativna bakterija), pride najprej do povišanega izražanja pericentromernih TE. Sledi RdDM, poveazana z akumulacijo het-siRNA, ki metilacijo usmerjajo na izvorne TE. To povzroči zmanjšanje represije obrambnih genov in večjo odpornost na patogen.

'''Epigenetsko aktivne siRNA (easiRNA), ki izvirajo iz TE in delujejo ''trans'''''

Pri ''Arabidopsis'' je večina TE epigenetsko utišanih s 24 nt het-siRNA. Aktivacija prepisovanja utišanih TE se odraža v nastanku 21-22 nt easiRNA. Pri tem 21 nt miRNA, ki je naložena na AGO1, sproži cepitev TE prepisa, kar omogoči združitev kompleksa RDR6/SGS3. Ta kompleks pomaga prepoznati mRNA prepis TE in nastanek dsRNA. DLC2 in DLC4 nato omogočita procesiranje dsRNA, kar je ključno za nastanek 21-22 nt easiRNA. easiRNA, naložene na AGO1, lahko nato sodelujejo pri utišanju tarčne mRNA ali TE prepisa na post-transkripcijskem nivoju. Druga možnost je, da AGO2 naloži 21-22 nt easiRNA, kar sproži netipično od proteina NERD odvisno RdDM TGS (ang. transcriptional gene silencing) pot. V primeru, ko AGO6 naloži easiRNA, pa to sproži značilno RdDM, ki vodi v utišanje TE.

'''TE kot vir novih smRNA'''

Majhne obrnjene ponovitve TE (MITE) so kratki neavtonomni TE s končnimi regijami obrnjenih ponovitev. Ti elementi, ki so bili najprej opisani v rastlinah, so pretežno vstavljeni v z geni bogate regije in navadno vplivajo na izražanje sosednjih genov. Poleg regulacije izražanja genov z insercijo ali epigenetskimi modifikacijami, lahko MITE postane vir smRNA. MITE med transkripcijo proizvedejo komplementarno RNA, ki se lahko zvije v steblo-zanka podobno sekundarno strukturo, ki je dovzetna za procesiranje z DCL3. V tem primeru pride do procesiranja lncRNA s strani DCL3 v 24 nt het-siRNA molekule, ki po običajni poti sprožijo metilacijo ''cis'' ali ''trans'', kar povzroči epigenetsko utišanje tarčnega lokusa. V rižu se od DCL3 odvisna 24 nt smRNA, ki izvira iz MITE, akumulira zaradi abiotskega stresa, kar pozitivno regulira ABA (abscizinska kislina) signaliziranje in odziv na stres.

Mutacije v zaporedju MITE vodijo tudi do nepopolnih struktur steblo-zanka, kar je lastnost miRNA prekurzorjev. To je spodbudilo razmišljanje, da so MITE verjeten evolucijski izvor miRNA lokusa. To podpira dejstvo, da se novonastale miRNA vežejo na MITE in druge TE lokuse, kar bi razložilo, zakaj se nekateri prekurzorji miRNA procesirajo tako v 21 nt kot 24 nt zvrsti. Ta ideja je dodatno podprta z ugotovitvijo, da lahko nekateri prekurzorji miRNA, ki jih prepozna DCL3, proizvajajo 24 nt siRNA in inducirajo metilacijo svojih ali tujih lokusov, kar kaže na izvor iz TE. Nadaljnja analiza potencialnega izvora miRNA genov iz TE je pokazala, da so MITE zelo dovzetne za udomačitev v miRNA prekurzorje. Spreminjanje miRNA v odvisnosti od MITE lahko tako predstavlja novosti v odzivu rastlin na razne patogene.

==Aktivne dolge nekodirajoče RNA (lncRNA), ki so po izvoru transpozonske==

'''TE kot vir fiziološko aktivnih lncRNA'''

Z RNA sekvenciranjem pri koruzi so identificirali več kot 23 000 možnih lncRNA. Okoli 65 % izmed njih je kazalo podobnost s TE, temeljito opazovanje TE in lncRNA v 40 vrstah rastlin pa je razkrilo več kot 14 000 prekrivanj med lncRNA lokusi in TE. lncRNA, ki izvirajo iz TE, so večinoma povezane z retrotranspozoni in povečanim številom le-teh v genomu. Aktivirane lncRNA se pretežno prepisujejo iz demetiliranih TE regij, zlasti iz dolgih vmesnih jedrnih elementov (LINE), ki so del retrotranspozonov.

Mnoge izmed lncRNA, ki izvirajo iz TE, so prepisno odzivne na sol, ABA in mraz. Različno izražanje lncRNA naj bi bilo povezano z dinamiko metilacije DNA, ki omogoča neofunkcionalizacijo nekodirajočih prepisov. Dokazali so, da je znotraj vrste ''Arabidopsis'' transkripcija velikega števila lncRNA odvisna od ekotipa. Zbirka lncRNA rastline, ki je direktno odvisna od prepisne aktivnosti TE, pa predstavlja značilnosti nedavnega razhajanja med vrstami ali celo znotraj iste vrste.

'''Dolge nekodirajoče RNA, ki izvirajo iz TE, kot regulatorji malih RNA in proteinov'''

TE sodelujejo pri tvorbi smRNA, lahko pa zavirajo njihovo aktivnost. MIKKI, nekodirajoč prepis retrotranspozonskega izvora, ki se aktivno prepisuje v koreninah riža, vsebuje nepopolno tarčno mesto miRNA171. miRNA171 destabilizira mRNA, ki zapisujejo za družino SCARECROW-u podobnih transkripcijskh faktorjev specifičnih za korenine. MIKKI deluje kot miRNA vaba - vsebuje vezavna mesta za miRNA in povzroči njeno degradacijo. S svojim delovanjem povzroči kopičenje SCARECROW-u podobnih mRNA v koreninah in tako spodbuja pravilen razvoj korenin. Medgenska lncRNA INDUCED BY PHOSPHATE STARVATION 1 (IPS1) pri ''Arabidopsis'' je komplementarna s pomanjkanjem fosfata inducirani miRNA399, vključuje pa neujemajočo zanko na pričakovanem miRNA cepitvenem mestu, ki preprečuje razgradnjo IPS1 in ga pretvori v vabo za miRNA399.

lncRNA, ki izvirajo iz TE, lahko uravnavajo izražanje genov preko interakcije s proteini. Kratek razpršeni jedrni element SB1 (SB1 SINE) pri oljni ogrščici uravnava biogenezo miRNA z destabilizacijo dsRNA vezavnega proteina HYPONASTIC LEAVES1 (HYL1). Po transkripciji se SB1 prepis, ki izvira iz SINE, zvije v lasnično sekundarno strukturo, ki spominja na prekurzorsko miRNA. Na strukturo se veže HYL1, ki posledično ne more sodelovati v kompleksu procesiranja miRNA. Pri rastlinah, ki izražajo SB1 SINE, so pogoste okvare v razvoju in akumulaciji miRNA. Ta fenotip lahko povežemo z ektopičnim prekomernim izražanjem SINE, vendar pa kaže tudi na vpliv TE pri tvorbi miRNA v specifičnih razvojnih fazah in okoljskih razmerah.

Prepisi, ki izvirajo iz retrotranspozona LINE, vplivajo na preoblikovanje kromatina in tako uravnavajo transkripcijsko aktivnost tarčnih genov. Pri sesalcih lahko prepisi LINE1 RNA, locirani na intronih, različno rekrutirajo RNA-vezavne protein (RBP), ki so vključeni v alternativno izrezovanje intronov. lncRNA, ki izvirajo iz evolucijsko mladih LINE1 in so locirani daleč od eksonov, preferenčno prepoznajo zaviralne RBP. Starejši LINE, ki so locirani bližje eksonom, pa preferenčno vežejo RBP, ki spodbujajo procesiranje RNA in sodelujejo pri tkivno specifičnem alternativnem izrezovanju intronov.

'''Dolge nekodirajoče RNA, ki izvirajo iz TE, kot potencialni regulatorji konformacije kromatina'''

Biosintezne poti številnih rastlinskih produktov vključujejo gene organizirane v skupke. Takšna organizacija genoma naj bi izvirala iz podvojevanja genov, njihove premestitve in neofunkcionalizacije. Pri ''Arabidopsis'' se biosintetski skupki genov pojavljajo v regijah genoma bogatih s TE, s TE uravnana rekombinacija pa sodeluje pri njihovi tvorbi in koregulaciji. Obširna analiza rastlinskih genomov je pokazala vlogo transpozicije MITE pri tvorbi biosintetskih skupkov pri evdikotih.

Nekatere lncRNA preko komplementanosti zaporedij tvorijo DNA-RNA duplekse (R-zanke) in sprožijo transkripcijsko samozaviranje ali alternativno izrezovanje. lncRNA AUXIN-REGULATED PROMOTER LOOP (APOLO) prepozna več neodvisnih tarčnih lokusov znotraj genoma ''Arabidopsis''. S tvorbo R-zanke zvabi LIKEHETEROCHROMATIN PROTEIN 1
(LHP1) stran od kromatina in tako uravnava njegovo lokalno 3D konformacijo.

lncRNA, ki izvira iz MITE, z insercijo v bližino kodirajočega gena, regulira 3D konformacijo kromatina, kar v odvisnosti od celičnega tipa, uravnava transkripcijsko aktivnost sosednjih genov. V listih tvorba znotrajgenske zanke zavira transkripcijo gena HaWRKY6, kromatinska zanka v kličnih listih pa omogoča učinkovito recikliranje RNAPII in tako povečuje transkripcijo HaWRKY6. Podobno deluje tudi epigenetsko utišanje represorja cvetenja FLOWERING LOCUS C (FLC) med vernalizacijo. Izpostavitev mrazu inducira lncRNA COLDWRAP, ki posredno povzroči kompaktiranje kromatina, kar služi kot točka sidranja pri tvorbi znotrajgenske kromatinske zanke med promotorjem in 3' koncem prvega introna. Nastala zanka ovira procesivnost RNAPII, in povzroči epigenetsko utišanje FLC.

==Zaključek==

V zadnjih desetletjih so identificirali pomembno vlogo ncRNA pri uravnavanju izražanja genov na različnih nivojih. Identifikacija in karakterizacija ncRNA sta ključni pri razumevanju njihove vloge v adaptivni evoluciji. Boljše razumevanje dinamične akumulacije s TE povezanih smRNA in lncRNA kot odziv na zunanje dražljaje pa bo osvetlilo pomen nekodirajočega genoma pri medsebojnem vplivu med rastlino in okoljem. TE, ki so jih do nedavnega opisovali kot sebično DNA, niso spremenili svoje narave, šele zdaj pa začenjamo razumevati njihovo funkcijo v genomu.

==Viri in literatura==

1. Ariel, Federico D., and Pablo A. Manavella. ‘When Junk DNA Turns Functional: Transposon-Derived Non-Coding RNAs in Plants’. ''Journal of Experimental Botany'', edited by James Murray, vol. 72, no. 11, May 2021, pp. 4132–43. ''DOI.org (Crossref)'', https://doi.org/10.1093/jxb/erab073.

2. Cambiagno, Damián A., et al. ‘Immune Receptor Genes and Pericentromeric Transposons as Targets of Common Epigenetic Regulatory Elements’. ''The Plant Journal'', vol. 96, no. 6, Dec. 2018, pp. 1178–90. ''DOI.org (Crossref)'', https://doi.org/10.1111/tpj.14098.

3. Cho, Jungnam. ‘Transposon-Derived Non-Coding RNAs and Their Function in Plants’. ''Frontiers in Plant Science'', vol. 9, May 2018, p. 600. ''DOI.org (Crossref)'', https://doi.org/10.3389/fpls.2018.00600.

4. Cho, Jungnam, and Jerzy Paszkowski. ‘Regulation of Rice Root Development by a Retrotransposon Acting as a MicroRNA Sponge’. ''ELife'', edited by Christian S. Hardtke, vol. 6, Aug. 2017, p. e30038. ''eLife'', https://doi.org/10.7554/eLife.30038.

5. McCue, Andrea D., et al. “Gene Expression and Stress Response Mediated by the Epigenetic Regulation of a Transposable Element Small RNA.” ''PLoS Genetics'', edited by Tetsuji Kakutani, vol. 8, no. 2, Feb. 2012, p. e1002474. ''DOI.org (Crossref)'', https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1002474.

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Funkcije nekodirajoče RNA, ki je po izvoru transpozonska

2022-05-01T13:43:33Z

Gaja Starc: /* Aktivne male RNA, ki so po izvoru transpozonske */

==Uvod==

Transpozicijski elementi (TE) predstavljajo pomemben dejavnik genomske kompleksnosti evkariontov. Pomembni so zaradi funkcije premikanja po DNA, ki pomembno vpliva na evolucijsko ločevanje organizmov, kratkoročno pa lahko predstavlja genomsko nestabilnost. Vplivajo tudi na aktivnost transkripcije genov v njihovi bližini s spreminjanjem njihovih epigenetskih značilnosti ali položaja regulatornih elementov.

V našem seminarju se bomo osredotočili na TE, ki predstavljajo izvor funkcionalnih dolgih ali kratkih nekodirajočih RNA pri rastlinah. Njihova funkcija je povezana s ''trans'' regulacijo aktivnosti genov na transkripcijskem in post-transkripcijskem nivoju. ''Trans'' regulacija je delovanje molekul na oddaljene dele genoma preko drugih, vmesnih molekul. Dolge nekodirajoče RNA iz TE spreminjajo izražanje genov z vezavo na proteine, razgrajevanjem majhnih RNA in tvorbo dupleksov z DNA ali RNA.

TE se lahko nahajajo v nekodirajočih delih DNA, kjer običajno nimajo večjega učinka, ali pa v neposredni bližini genov. Slednji močno vplivajo na nivo transkripcije bližnjih genov. Poleg tega lahko TE vplivajo na epigenetske značilnosti bližnjih regij DNA in še tako vplivajo na izražanje genov. Zato so rastline razvile številne mehanizme za zmanjševanje vpliva TE na ali v bližini genov in omejitev traspozicijskih premikov na ta mesta.

TE so pomemben izvor nekodirajočih RNA. Pri rastlinah so to predvsem dolge in kratke nekodirajoče RNA (lncRNA, smRNA), ki predstavljajo glavni regulator izražanja genov. lncRNA molekule večinoma nastanejo s pomočjo encima RNA polimeraza II (RNAPII) alternativno pa z rastlinsko specifičnimi polimerazami (RNAPIV, RNAPV). lncRNA molekule z interakcijami s proteini, DNA ali RNA utišajo izražanje genov na nivoju transkripcije. Druga možnost je, da lncRNA prepoznajo specifičen DICER protein, ki tvori več smRNA, ki sodelujejo pri utišanju genov.

==Aktivne male RNA, ki so po izvoru transpozonske==

'''Po izvoru transpozonske male interferenčne RNA (siRNA), ki povzročijo metilacijo DNA in nastanek heterokromatina na mestih TE ter utišajo njihovo transkripcijo (het-siRNA)'''

V normalnih pogojih je večina TE utišanih z metilacijo. Mehanizem metilacije je od RNA odvisna DNA metilacija (RdDM). Začne se, ko od RNA odvisna RNA polimeraza 2 (RDR2) prepozna na novo nastale RNA iz TE, nastale z delovanjem encima RNAPIV in jih spremni v dsRNA molekule. Protein DICER - LIKE 3 (DCL3) jih nato procesira v 24 nt siRNA, prenese v citoplazmo in naloži na ARGONAUTE4 (AGO4) ali na AGO3 in AGO6 proteine. AGO4 s siRNA molekulami se vrne v jedro, tam prepozna RNAPV transkripte s komplementarnim zaporedjem. Po interakciji teh dveh RNA zaporedij se na kompleks veže posebna DNA metiltransferaza (DOMAINS REARRANGED METHYTRANSFERASE 2, DRM2). Ta povzroči metilacijo TE, iz katerih te RNA izvirajo. Posledica tega je kondenzacija kromatina in trajno utišanje TE. Pri utišanju sodeluje tudi DNA topoizomeraza 1α, encim, ki spreminja topologijo DNA. V tem procesu olajša tvorbo lncRNA molekul z RNAPV, približanje in vezavo AGO4 ter metilacijo H3K9 (H3K9me2). To nakazuje, da tudi organizacija DNA vpliva na utišanje TE. Ta mehanizem utišanja je za rastline pomemben kot odgovor na stres in za prenos epigenetskih informacij na potomce. Večkrat se zgodi, da se TE vrine v ali v bližino gena. Če na te TE deluje RdDM, se poleg TE metilirajo tudi ti geni. Metilacija po navadi predstavlja utišanje genov, zato lahko predstavlja težavo pri preživetju rastline.

Het-siRNA lahko delujejo ''trans''. Pri ''Arabidopsis thaliana'' se v normalnih pogojih sintetizirajo het-siRNA molekule iz pericentromernih TE. Te prepoznajo in utišajo oddaljene gene za proteine, ki ob okužbi prepoznajo molekule pogosto prisotne v patogenih (PATTERN RECOGNITION RECEPTORS, PRRs) in proteine vnetnega odziva ter prirojenega imunskega odziva (NUCLEOTIDE-BINDING LEUCIN-RICH REPEAT PROTEINS, NLRs). Ob okužbi s ''Pseudomonas syringae'' (Gram negativna bakterija), pride najprej do povišanega izražanja pericentromernih TE. Sledi RdDM, poveazana z akumulacijo het-siRNA, ki metilacijo usmerjajo na izvorne TE. To povzroči zmanjšanje represije obrambnih genov in večjo odpornost na patogen.

'''Epigenetsko aktivne siRNA (easiRNA), ki izvirajo iz TE in delujejo ''trans'''''

Pri ''Arabidopsis'' je večina TE epigenetsko utišanih s 24 nt het-siRNA. Aktivacija prepisovanja utišanih TE se odraža v nastanku 21-22 nt easiRNA. Pri tem 21 nt miRNA, ki je naložena na AGO1, sproži cepitev TE prepisa, kar omogoči združitev kompleksa RDR6/SGS3. Ta kompleks pomaga prepoznati mRNA prepis TE in nastanek dsRNA. DLC2 in DLC4 nato omogočita procesiranje dsRNA, kar je ključno za nastanek 21-22 nt easiRNA. easiRNA, naložene na AGO1, lahko nato sodelujejo pri utišanju tarčne mRNA ali TE prepisa na post-transkripcijskem nivoju. Druga možnost je, da AGO2 naloži 21-22 nt easiRNA, kar sproži netipično od proteina NERD odvisno RdDM TGS (ang. transcriptional gene silencing) pot. V primeru, ko AGO6 naloži easiRNA, pa to sproži značilno RdDM, ki vodi v utišanje TE.

'''TE kot vir novih smRNA'''

Majhne obrnjene ponovitve TE (MITE) so kratki neavtonomni TE s končnimi regijami obrnjenih ponovitev. Ti elementi, ki so bili najprej opisani v rastlinah, so pretežno vstavljeni v z geni bogate regije in navadno vplivajo na izražanje sosednjih genov. Poleg regulacije izražanja genov z insercijo ali epigenetskimi modifikacijami, lahko MITE postane vir smRNA. MITE med transkripcijo proizvedejo komplementarno RNA, ki se lahko zvije v steblo-zanka podobno sekundarno strukturo, ki je dovzetna za procesiranje z DCL3. V tem primeru pride do procesiranja lncRNA s strani DCL3 v 24 nt het-siRNA molekule, ki po običajni poti sprožijo metilacijo ''cis'' ali ''trans'', kar povzroči epigenetsko utišanje tarčnega lokusa. V rižu se od DCL3 odvisna 24 nt smRNA, ki izvira iz MITE, akumulira zaradi abiotskega stresa, kar pozitivno regulira ABA (abscizinska kislina) signaliziranje in odziv na stres.

Mutacije v zaporedju MITE vodijo tudi do nepopolnih struktur steblo-zanka, kar je lastnost miRNA prekurzorjev. To je spodbudilo razmišljanje, da so MITE verjeten evolucijski izvor miRNA lokusa. To podpira dejstvo, da se novonastale miRNA vežejo na MITE in druge TE lokuse, kar bi razložilo, zakaj se nekateri prekurzorji miRNA procesirajo tako v 21 nt kot 24 nt zvrsti. Ta ideja je dodatno podprta z ugotovitvijo, da lahko nekateri prekurzorji miRNA, ki jih prepozna DCL3, proizvajajo 24 nt siRNA in inducirajo metilacijo svojih ali tujih lokusov, kar kaže na izvor iz TE. Nadaljnja analiza potencialnega izvora miRNA genov iz TE je pokazala, da so MITE zelo dovzetne za udomačitev v miRNA prekurzorje. Spreminjanje miRNA v odvisnosti od MITE lahko tako predstavlja novosti v odzivu rastlin na razne patogene.

==Aktivne dolge nekodirajoče RNA (lncRNA), ki so po izvoru transpozonske==

'''TE kot vir fiziološko aktivnih lncRNA'''

Z RNA sekvenciranjem pri koruzi so identificirali več kot 23 000 možnih lncRNA. Okoli 65 % izmed njih je kazalo podobnost s TE, temeljito opazovanje TE in lncRNA v 40 vrstah rastlin pa je razkrilo več kot 14 000 prekrivanj med lncRNA lokusi in TE. lncRNA, ki izvirajo iz TE, so večinoma povezane z retrotranspozoni in povečanim številom le-teh v genomu. Aktivirane lncRNA se pretežno prepisujejo iz demetiliranih TE regij, zlasti iz dolgih vmesnih jedrnih elementov (LINEs), ki so del retrotranspozonov.

Mnoge izmed lncRNA, ki izvirajo iz TE, so prepisno odzivne na sol, ABA in mraz. Različno izražanje lncRNA naj bi bilo povezano z dinamiko metilacije DNA, ki omogoča neofunkcionalizacijo nekodirajočih prepisov. Dokazali so, da je znotraj vrste ''Arabidopsis'' transkripcija velikega števila lncRNA odvisna od ekotipa. Zbirka lncRNA rastline, ki je direktno odvisna od prepisne aktivnosti TE, pa predstavlja značilnosti nedavnega razhajanja med vrstami ali celo znotraj iste vrste.

'''Dolge nekodirajoče RNA, ki izvirajo iz TE, kot regulatorji majhnih RNA in proteinov'''

TE sodelujejo pri tvorbi smRNA, lahko pa zavirajo njihovo aktivnost. MIKKI, nekodirajoč prepis retrotranspozonskega izvora, ki se aktivno prepisuje v koreninah riža, vsebuje nepopolno tarčno mesto miRNA171. miRNA171 destabilizira mRNA, ki zapisujejo za družino SCARECROW-u podobnih transkripcijskh faktorjev specifičnih za korenine. MIKKI deluje kot miRNA vaba - vsebuje vezavna mesta za miRNA in povzroči njeno degradacijo. S svojim delovanjem povzroči kopičenje SCARECROW-u podobnih mRNA v koreninah in tako spodbuja pravilen razvoj korenin. Medgenska lncRNA INDUCED BY PHOSPHATE STARVATION 1 (IPS1) pri ''Arabidopsis'' je komplementarna s pomanjkanjem fosfata inducirani miRNA399, vključuje pa neujemajočo zanko na pričakovanem miRNA cepitvenem mestu, ki preprečuje razgradnjo IPS1 in ga pretvori v vabo za miRNA399.

lncRNA, ki izvirajo iz TE, lahko uravnavajo izražanje genov preko interakcije s proteini. Kratek razpršeni jedrni element SB1 (SB1 SINE) pri oljni ogrščici uravnava biogenezo miRNA z destabilizacijo dsRNA vezavnega proteina HYPONASTIC LEAVES1 (HYL1). Po transkripciji se SB1 prepis, ki izvira iz SINE, zvije v lasnično sekundarno strukturo, ki spominja na prekurzorsko miRNA. Na strukturo se veže HYL1, ki posledično ne more sodelovati v kompleksu procesiranja miRNA. Pri rastlinah, ki izražajo SB1 SINE, so pogoste okvare v razvoju in akumulaciji miRNA. Ta fenotip lahko povežemo z ektopičnim prekomernim izražanjem SINE, vendar pa kaže tudi na vpliv TE pri tvorbi miRNA v specifičnih razvojnih fazah in okoljskih razmerah.

Prepisi, ki izvirajo iz retrotranspozona LINE, vplivajo na preoblikovanje kromatina in tako uravnavajo transkripcijsko aktivnost tarčnih genov. Pri sesalcih lahko prepisi LINE1 RNA, locirani na intronih, različno rekrutirajo RNA-vezavne protein (RBP), ki so vključeni v alternativno izrezovanje intronov. lncRNA, ki izvirajo iz evolucijsko mladih LINE1 in so locirani daleč od eksonov, preferenčno prepoznajo zaviralne RBP. Starejši LINE, ki so locirani bližje eksonom, pa preferenčno vežejo RBP, ki spodbujajo procesiranje RNA in sodelujejo pri tkivno specifičnem alternativnem izrezovanju intronov.

'''Dolge nekodirajoče RNA, ki izvirajo iz TE, kot potencialni regulatorji konformacije kromatina'''

Biosintezne poti številnih rastlinskih produktov vključujejo gene organizirane v skupke. Takšna organizacija genoma naj bi izvirala iz podvojevanja genov, njihove premestitve in neofunkcionalizacije. Pri ''Arabidopsis'' se biosintetski skupki genov pojavljajo v regijah genoma bogatih s TE, s TE uravnana rekombinacija pa sodeluje pri njihovi tvorbi in koregulaciji. Obširna analiza rastlinskih genomov je pokazala vlogo transpozicije MITE pri tvorbi biosintetskih skupkov pri evdikotih.

Nekatere lncRNA preko komplementanosti zaporedij tvorijo DNA-RNA duplekse (R-zanke) in sprožijo transkripcijsko samozaviranje ali alternativno izrezovanje. lncRNA AUXIN-REGULATED PROMOTER LOOP (APOLO) prepozna več neodvisnih tarčnih lokusov znotraj genoma ''Arabidopsis''. S tvorbo R-zanke zvabi LIKEHETEROCHROMATIN PROTEIN 1
(LHP1) stran od kromatina in tako uravnava njegovo lokalno 3D konformacijo.

lncRNA, ki izvira iz MITE, z insercijo v bližino kodirajočega gena, regulira 3D konformacijo kromatina, kar v odvisnosti od celičnega tipa, uravnava transkripcijsko aktivnost sosednjih genov. V listih tvorba znotrajgenske zanke zavira transkripcijo gena HaWRKY6, kromatinska zanka v kličnih listih pa omogoča učinkovito recikliranje RNAPII in tako povečuje transkripcijo HaWRKY6. Podobno deluje tudi epigenetsko utišanje represorja cvetenja FLOWERING LOCUS C (FLC) med vernalizacijo. Izpostavitev mrazu inducira lncRNA COLDWRAP, ki posredno povzroči kompaktiranje kromatina, kar služi kot točka sidranja pri tvorbi znotrajgenske kromatinske zanke med promotorjem in 3' koncem prvega introna. Nastala zanka ovira procesivnost RNAPII, in povzroči epigenetsko utišanje FLC.

==Zaključek==

V zadnjih desetletjih so identificirali pomembno vlogo ncRNA pri uravnavanju izražanja genov na različnih nivojih. Identifikacija in karakterizacija ncRNA sta ključni pri razumevanju njihove vloge v adaptivni evoluciji. Boljše razumevanje dinamične akumulacije s TE povezanih smRNA in lncRNA kot odziv na zunanje dražljaje pa bo osvetlilo pomen nekodirajočega genoma pri medsebojnem vplivu med rastlino in okoljem. TE, ki so jih do nedavnega opisovali kot sebično DNA, niso spremenili svoje narave, šele zdaj pa začenjamo razumevati njihovo funkcijo v genomu.

==Viri in literatura==

1. Ariel, Federico D., and Pablo A. Manavella. ‘When Junk DNA Turns Functional: Transposon-Derived Non-Coding RNAs in Plants’. ''Journal of Experimental Botany'', edited by James Murray, vol. 72, no. 11, May 2021, pp. 4132–43. ''DOI.org (Crossref)'', https://doi.org/10.1093/jxb/erab073.

2. Cambiagno, Damián A., et al. ‘Immune Receptor Genes and Pericentromeric Transposons as Targets of Common Epigenetic Regulatory Elements’. ''The Plant Journal'', vol. 96, no. 6, Dec. 2018, pp. 1178–90. ''DOI.org (Crossref)'', https://doi.org/10.1111/tpj.14098.

3. Cho, Jungnam. ‘Transposon-Derived Non-Coding RNAs and Their Function in Plants’. ''Frontiers in Plant Science'', vol. 9, May 2018, p. 600. ''DOI.org (Crossref)'', https://doi.org/10.3389/fpls.2018.00600.

4. Cho, Jungnam, and Jerzy Paszkowski. ‘Regulation of Rice Root Development by a Retrotransposon Acting as a MicroRNA Sponge’. ''ELife'', edited by Christian S. Hardtke, vol. 6, Aug. 2017, p. e30038. ''eLife'', https://doi.org/10.7554/eLife.30038.

5. McCue, Andrea D., et al. “Gene Expression and Stress Response Mediated by the Epigenetic Regulation of a Transposable Element Small RNA.” ''PLoS Genetics'', edited by Tetsuji Kakutani, vol. 8, no. 2, Feb. 2012, p. e1002474. ''DOI.org (Crossref)'', https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1002474.

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Funkcije nekodirajoče RNA, ki je po izvoru transpozonska

2022-05-01T13:41:50Z

Gaja Starc: /* Aktivne male RNA, ki so po izvoru transpozonske */

==Uvod==

Transpozicijski elementi (TE) predstavljajo pomemben dejavnik genomske kompleksnosti evkariontov. Pomembni so zaradi funkcije premikanja po DNA, ki pomembno vpliva na evolucijsko ločevanje organizmov, kratkoročno pa lahko predstavlja genomsko nestabilnost. Vplivajo tudi na aktivnost transkripcije genov v njihovi bližini s spreminjanjem njihovih epigenetskih značilnosti ali položaja regulatornih elementov.

V našem seminarju se bomo osredotočili na TE, ki predstavljajo izvor funkcionalnih dolgih ali kratkih nekodirajočih RNA pri rastlinah. Njihova funkcija je povezana s ''trans'' regulacijo aktivnosti genov na transkripcijskem in post-transkripcijskem nivoju. ''Trans'' regulacija je delovanje molekul na oddaljene dele genoma preko drugih, vmesnih molekul. Dolge nekodirajoče RNA iz TE spreminjajo izražanje genov z vezavo na proteine, razgrajevanjem majhnih RNA in tvorbo dupleksov z DNA ali RNA.

TE se lahko nahajajo v nekodirajočih delih DNA, kjer običajno nimajo večjega učinka, ali pa v neposredni bližini genov. Slednji močno vplivajo na nivo transkripcije bližnjih genov. Poleg tega lahko TE vplivajo na epigenetske značilnosti bližnjih regij DNA in še tako vplivajo na izražanje genov. Zato so rastline razvile številne mehanizme za zmanjševanje vpliva TE na ali v bližini genov in omejitev traspozicijskih premikov na ta mesta.

TE so pomemben izvor nekodirajočih RNA. Pri rastlinah so to predvsem dolge in kratke nekodirajoče RNA (lncRNA, smRNA), ki predstavljajo glavni regulator izražanja genov. lncRNA molekule večinoma nastanejo s pomočjo encima RNA polimeraza II (RNAPII) alternativno pa z rastlinsko specifičnimi polimerazami (RNAPIV, RNAPV). lncRNA molekule z interakcijami s proteini, DNA ali RNA utišajo izražanje genov na nivoju transkripcije. Druga možnost je, da lncRNA prepoznajo specifičen DICER protein, ki tvori več smRNA, ki sodelujejo pri utišanju genov.

==Aktivne male RNA, ki so po izvoru transpozonske==

'''Po izvoru transpozonske male interferenčne RNA (siRNA), ki povzročijo metilacijo DNA in nastanek heterokromatina na mestih TE ter utišajo njihovo transkripcijo (het-siRNA)'''

V normalnih pogojih je večina TE utišanih z metilacijo. Mehanizem metilacije je od RNA odvisna DNA metilacija (RdDM). Začne se, ko od RNA odvisna RNA polimeraza 2 (RDR2) prepozna na novo nastale RNA iz TE, nastale z delovanjem encima RNAPIV in jih spremni v dsRNA molekule. Protein DICER - LIKE 3 (DCL3) jih nato procesira v 24 nt siRNA, prenese v citoplazmo in naloži na ARGONAUTE4 (AGO4) ali na AGO3 in AGO6 proteine. AGO4 s siRNA molekulami se vrne v jedro, tam prepozna RNAPV transkripte s komplementarnim zaporedjem. Po interakciji teh dveh RNA zaporedij se na kompleks veže posebna DNA metiltransferaza (DOMAINS REARRANGED METHYTRANSFERASE 2, DRM2). Ta povzroči metilacijo TE, iz katerih te RNA izvirajo. Posledica tega je kondenzacija kromatina in trajno utišanje TE. Pri utišanju sodeluje tudi DNA topoizomeraza 1α, encim, ki spreminja topologijo DNA. V tem procesu olajša tvorbo lncRNA molekul z RNAPV, približanje in vezavo AGO4 ter metilacijo H3K9 (H3K9me2). To nakazuje, da tudi organizacija DNA vpliva na utišanje TE. Ta mehanizem utišanja je za rastline pomemben kot odgovor na stres in za prenos epigenetskih informacij na potomce. Večkrat se zgodi, da se TE vrine v ali v bližino gena. Če na te TE deluje RdDM, se poleg TE metilirajo tudi ti geni. Metilacija po navadi predstavlja utišanje genov, zato lahko predstavlja težavo pri preživetju rastline.

Het-siRNA lahko delujejo ''trans''. Pri ''Arabidopsis thaliana'' se v normalnih pogojih sintetizirajo het-siRNA molekule iz pericentromernih TE. Te prepoznajo in utišajo oddaljene gene za proteine, ki ob okužbi prepoznajo molekule pogosto prisotne v patogenih (PATTERN RECOGNITION RECEPTORS, PRRs) in proteine vnetnega odziva ter prirojenega imunskega odziva (NUCLEOTIDE-BINDING LEUCIN-RICH REPEAT PROTEINS, NLRs). Ob okužbi s ''Pseudomonas syringae'' (Gram negativna bakterija), pride najprej do povišanega izražanja pericentromernih TE. Sledi RdDM, poveazana z akumulacijo het-siRNA, ki metilacijo usmerjajo na izvorne TE. To povzroči zmanjšanje represije obrambnih genov in večjo odpornost na patogen.

'''Epigenetsko aktivne siRNA (easiRNA), ki izvirajo iz TE in delujejo ''trans'''''

Pri ''Arabidopsis'' je večina TE epigenetsko utišanih s 24 nt het-siRNA. Aktivacija prepisovanja utišanih TE se odraža v nastanku 21-22 nt easiRNA. Pri tem 21 nt miRNA, ki je naložena na AGO1, sproži cepitev TE prepisa, kar omogoči združitev kompleksa RDR6/SGS3. Ta kompleks pomaga prepoznati mRNA prepis TE in nastanek dsRNA. DLC2 in DLC4 nato omogočita procesiranje dsRNA, kar je ključno za nastanek 21-22 nt easiRNA. easiRNA, naložene na AGO1, lahko nato sodelujejo pri utišanju tarčne mRNA ali TE prepisa na post-transkripcijskem nivoju. Druga možnost je, da AGO2 naloži 21-22 nt easiRNA, kar sproži netipično od proteina NERD odvisno RdDM TGS (ang. transcriptional gene silencing) pot. V primeru, ko AGO6 naloži easiRNA, pa to sproži značilno RdDM, ki vodi v utišanje TE.

'''TE kot vir novih smRNA'''

Majhne obrnjene ponovitve TE (MITE) so kratki neavtonomni TE s končnimi regijami obrnjenih ponovitev. Ti elementi, ki so bili najprej opisani v rastlinah, so pretežno vstavljeni v z geni bogate regije in navadno vplivajo na izražanje sosednjih genov. Poleg regulacije izražanja genov z insercijo ali epigenetskimi modifikacijami, lahko MITE postane vir smRNA. MITE med transkripcijo proizvedejo komplementarno RNA, ki se lahko zvije v steblo-zanka podobno sekundarno strukturo, ki je dovzetna za procesiranje z DCL3. V tem primeru pride do procesiranja lncRNA s strani DCL3 v 24 nt het-siRNA molekule, ki po običajni poti sprožijo metilacijo cis ali trans, kar povzroči epigenetsko utišanje tarčnega lokusa. V rižu se od DCL3 odvisna 24 nt smRNA, ki izvira iz MITE, akumulira zaradi abiotskega stresa, kar pozitivno regulira ABA (abscizinska kislina) signaliziranje in odziv na stres.

Mutacije v zaporedju MITE vodijo tudi do nepopolnih struktur steblo-zanka, kar je lastnost miRNA prekurzorjev. To je spodbudilo razmišljanje, da so MITE verjeten evolucijski izvor miRNA lokusa. To podpira dejstvo, da se novonastale miRNA vežejo na MITE in druge TE lokuse, kar bi razložilo, zakaj se nekateri prekurzorji miRNA procesirajo tako v 21 nt kot 24 nt zvrsti. Ta ideja je dodatno podprta z ugotovitvijo, da lahko nekateri prekurzorji miRNA, ki jih prepozna DCL3, proizvajajo 24 nt siRNA in inducirajo metilacijo svojih ali tujih lokusov, kar kaže na izvor iz TE. Nadaljnja analiza potencialnega izvora miRNA genov iz TE je pokazala, da so MITE zelo dovzetne za udomačitev v miRNA prekurzorje. Spreminjanje miRNA v odvisnosti od MITE lahko tako predstavlja novosti v odzivu rastlin na razne patogene.

==Aktivne dolge nekodirajoče RNA (lncRNA), ki so po izvoru transpozonske==

'''TE kot vir fiziološko aktivnih lncRNA'''

Z RNA sekvenciranjem pri koruzi so identificirali več kot 23 000 možnih lncRNA. Okoli 65 % izmed njih je kazalo podobnost s TE, temeljito opazovanje TE in lncRNA v 40 vrstah rastlin pa je razkrilo več kot 14 000 prekrivanj med lncRNA lokusi in TE. lncRNA, ki izvirajo iz TE, so večinoma povezane z retrotranspozoni in povečanim številom le-teh v genomu. Aktivirane lncRNA se pretežno prepisujejo iz demetiliranih TE regij, zlasti iz dolgih vmesnih jedrnih elementov (LINEs), ki so del retrotranspozonov.

Mnoge izmed lncRNA, ki izvirajo iz TE, so prepisno odzivne na sol, ABA in mraz. Različno izražanje lncRNA naj bi bilo povezano z dinamiko metilacije DNA, ki omogoča neofunkcionalizacijo nekodirajočih prepisov. Dokazali so, da je znotraj vrste ''Arabidopsis'' transkripcija velikega števila lncRNA odvisna od ekotipa. Zbirka lncRNA rastline, ki je direktno odvisna od prepisne aktivnosti TE, pa predstavlja značilnosti nedavnega razhajanja med vrstami ali celo znotraj iste vrste.

'''Dolge nekodirajoče RNA, ki izvirajo iz TE, kot regulatorji majhnih RNA in proteinov'''

TE sodelujejo pri tvorbi smRNA, lahko pa zavirajo njihovo aktivnost. MIKKI, nekodirajoč prepis retrotranspozonskega izvora, ki se aktivno prepisuje v koreninah riža, vsebuje nepopolno tarčno mesto miRNA171. miRNA171 destabilizira mRNA, ki zapisujejo za družino SCARECROW-u podobnih transkripcijskh faktorjev specifičnih za korenine. MIKKI deluje kot miRNA vaba - vsebuje vezavna mesta za miRNA in povzroči njeno degradacijo. S svojim delovanjem povzroči kopičenje SCARECROW-u podobnih mRNA v koreninah in tako spodbuja pravilen razvoj korenin. Medgenska lncRNA INDUCED BY PHOSPHATE STARVATION 1 (IPS1) pri ''Arabidopsis'' je komplementarna s pomanjkanjem fosfata inducirani miRNA399, vključuje pa neujemajočo zanko na pričakovanem miRNA cepitvenem mestu, ki preprečuje razgradnjo IPS1 in ga pretvori v vabo za miRNA399.

lncRNA, ki izvirajo iz TE, lahko uravnavajo izražanje genov preko interakcije s proteini. Kratek razpršeni jedrni element SB1 (SB1 SINE) pri oljni ogrščici uravnava biogenezo miRNA z destabilizacijo dsRNA vezavnega proteina HYPONASTIC LEAVES1 (HYL1). Po transkripciji se SB1 prepis, ki izvira iz SINE, zvije v lasnično sekundarno strukturo, ki spominja na prekurzorsko miRNA. Na strukturo se veže HYL1, ki posledično ne more sodelovati v kompleksu procesiranja miRNA. Pri rastlinah, ki izražajo SB1 SINE, so pogoste okvare v razvoju in akumulaciji miRNA. Ta fenotip lahko povežemo z ektopičnim prekomernim izražanjem SINE, vendar pa kaže tudi na vpliv TE pri tvorbi miRNA v specifičnih razvojnih fazah in okoljskih razmerah.

Prepisi, ki izvirajo iz retrotranspozona LINE, vplivajo na preoblikovanje kromatina in tako uravnavajo transkripcijsko aktivnost tarčnih genov. Pri sesalcih lahko prepisi LINE1 RNA, locirani na intronih, različno rekrutirajo RNA-vezavne protein (RBP), ki so vključeni v alternativno izrezovanje intronov. lncRNA, ki izvirajo iz evolucijsko mladih LINE1 in so locirani daleč od eksonov, preferenčno prepoznajo zaviralne RBP. Starejši LINE, ki so locirani bližje eksonom, pa preferenčno vežejo RBP, ki spodbujajo procesiranje RNA in sodelujejo pri tkivno specifičnem alternativnem izrezovanju intronov.

'''Dolge nekodirajoče RNA, ki izvirajo iz TE, kot potencialni regulatorji konformacije kromatina'''

Biosintezne poti številnih rastlinskih produktov vključujejo gene organizirane v skupke. Takšna organizacija genoma naj bi izvirala iz podvojevanja genov, njihove premestitve in neofunkcionalizacije. Pri ''Arabidopsis'' se biosintetski skupki genov pojavljajo v regijah genoma bogatih s TE, s TE uravnana rekombinacija pa sodeluje pri njihovi tvorbi in koregulaciji. Obširna analiza rastlinskih genomov je pokazala vlogo transpozicije MITE pri tvorbi biosintetskih skupkov pri evdikotih.

Nekatere lncRNA preko komplementanosti zaporedij tvorijo DNA-RNA duplekse (R-zanke) in sprožijo transkripcijsko samozaviranje ali alternativno izrezovanje. lncRNA AUXIN-REGULATED PROMOTER LOOP (APOLO) prepozna več neodvisnih tarčnih lokusov znotraj genoma ''Arabidopsis''. S tvorbo R-zanke zvabi LIKEHETEROCHROMATIN PROTEIN 1
(LHP1) stran od kromatina in tako uravnava njegovo lokalno 3D konformacijo.

lncRNA, ki izvira iz MITE, z insercijo v bližino kodirajočega gena, regulira 3D konformacijo kromatina, kar v odvisnosti od celičnega tipa, uravnava transkripcijsko aktivnost sosednjih genov. V listih tvorba znotrajgenske zanke zavira transkripcijo gena HaWRKY6, kromatinska zanka v kličnih listih pa omogoča učinkovito recikliranje RNAPII in tako povečuje transkripcijo HaWRKY6. Podobno deluje tudi epigenetsko utišanje represorja cvetenja FLOWERING LOCUS C (FLC) med vernalizacijo. Izpostavitev mrazu inducira lncRNA COLDWRAP, ki posredno povzroči kompaktiranje kromatina, kar služi kot točka sidranja pri tvorbi znotrajgenske kromatinske zanke med promotorjem in 3' koncem prvega introna. Nastala zanka ovira procesivnost RNAPII, in povzroči epigenetsko utišanje FLC.

==Zaključek==

V zadnjih desetletjih so identificirali pomembno vlogo ncRNA pri uravnavanju izražanja genov na različnih nivojih. Identifikacija in karakterizacija ncRNA sta ključni pri razumevanju njihove vloge v adaptivni evoluciji. Boljše razumevanje dinamične akumulacije s TE povezanih smRNA in lncRNA kot odziv na zunanje dražljaje pa bo osvetlilo pomen nekodirajočega genoma pri medsebojnem vplivu med rastlino in okoljem. TE, ki so jih do nedavnega opisovali kot sebično DNA, niso spremenili svoje narave, šele zdaj pa začenjamo razumevati njihovo funkcijo v genomu.

==Viri in literatura==

1. Ariel, Federico D., and Pablo A. Manavella. ‘When Junk DNA Turns Functional: Transposon-Derived Non-Coding RNAs in Plants’. ''Journal of Experimental Botany'', edited by James Murray, vol. 72, no. 11, May 2021, pp. 4132–43. ''DOI.org (Crossref)'', https://doi.org/10.1093/jxb/erab073.

2. Cambiagno, Damián A., et al. ‘Immune Receptor Genes and Pericentromeric Transposons as Targets of Common Epigenetic Regulatory Elements’. ''The Plant Journal'', vol. 96, no. 6, Dec. 2018, pp. 1178–90. ''DOI.org (Crossref)'', https://doi.org/10.1111/tpj.14098.

3. Cho, Jungnam. ‘Transposon-Derived Non-Coding RNAs and Their Function in Plants’. ''Frontiers in Plant Science'', vol. 9, May 2018, p. 600. ''DOI.org (Crossref)'', https://doi.org/10.3389/fpls.2018.00600.

4. Cho, Jungnam, and Jerzy Paszkowski. ‘Regulation of Rice Root Development by a Retrotransposon Acting as a MicroRNA Sponge’. ''ELife'', edited by Christian S. Hardtke, vol. 6, Aug. 2017, p. e30038. ''eLife'', https://doi.org/10.7554/eLife.30038.

5. McCue, Andrea D., et al. “Gene Expression and Stress Response Mediated by the Epigenetic Regulation of a Transposable Element Small RNA.” ''PLoS Genetics'', edited by Tetsuji Kakutani, vol. 8, no. 2, Feb. 2012, p. e1002474. ''DOI.org (Crossref)'', https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1002474.

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Funkcije nekodirajoče RNA, ki je po izvoru transpozonska

2022-05-01T13:39:26Z

Gaja Starc: /* Uvod */

==Uvod==

Transpozicijski elementi (TE) predstavljajo pomemben dejavnik genomske kompleksnosti evkariontov. Pomembni so zaradi funkcije premikanja po DNA, ki pomembno vpliva na evolucijsko ločevanje organizmov, kratkoročno pa lahko predstavlja genomsko nestabilnost. Vplivajo tudi na aktivnost transkripcije genov v njihovi bližini s spreminjanjem njihovih epigenetskih značilnosti ali položaja regulatornih elementov.

V našem seminarju se bomo osredotočili na TE, ki predstavljajo izvor funkcionalnih dolgih ali kratkih nekodirajočih RNA pri rastlinah. Njihova funkcija je povezana s ''trans'' regulacijo aktivnosti genov na transkripcijskem in post-transkripcijskem nivoju. ''Trans'' regulacija je delovanje molekul na oddaljene dele genoma preko drugih, vmesnih molekul. Dolge nekodirajoče RNA iz TE spreminjajo izražanje genov z vezavo na proteine, razgrajevanjem majhnih RNA in tvorbo dupleksov z DNA ali RNA.

TE se lahko nahajajo v nekodirajočih delih DNA, kjer običajno nimajo večjega učinka, ali pa v neposredni bližini genov. Slednji močno vplivajo na nivo transkripcije bližnjih genov. Poleg tega lahko TE vplivajo na epigenetske značilnosti bližnjih regij DNA in še tako vplivajo na izražanje genov. Zato so rastline razvile številne mehanizme za zmanjševanje vpliva TE na ali v bližini genov in omejitev traspozicijskih premikov na ta mesta.

TE so pomemben izvor nekodirajočih RNA. Pri rastlinah so to predvsem dolge in kratke nekodirajoče RNA (lncRNA, smRNA), ki predstavljajo glavni regulator izražanja genov. lncRNA molekule večinoma nastanejo s pomočjo encima RNA polimeraza II (RNAPII) alternativno pa z rastlinsko specifičnimi polimerazami (RNAPIV, RNAPV). lncRNA molekule z interakcijami s proteini, DNA ali RNA utišajo izražanje genov na nivoju transkripcije. Druga možnost je, da lncRNA prepoznajo specifičen DICER protein, ki tvori več smRNA, ki sodelujejo pri utišanju genov.

==Aktivne male RNA, ki so po izvoru transpozonske==

'''Po izvoru transpozonske male interferenčne RNA (siRNA), ki povzročijo metilacijo DNA in nastanek heterokromatina na mestih TE ter utišajo njihovo transkripcijo (het-siRNA)'''

V normalnih pogojih je večina TE utišanih z metilacijo. Mehanizem metilacije je od RNA odvisna DNA metilacija (RdDM). Začne se, ko od RNA odvisna RNA polimeraza 2 (RDR2) prepozna na novo nastale RNA iz TE, nastale z delovanjem encima RNAPIV in jih spremni v dsRNA molekule. Protein DICER - LIKE 3 (DCL3) jih nato procesira v 24 nt siRNA, prenese v citoplazmo in naloži na ARGONAUTE4 (AGO4) ali na AGO3 in AGO6 proteine. AGO4 s siRNA molekulami se vrne v jedro, tam prepozna RNAPV transkripte s komplementarnim zaporedjem. Po interakciji teh dveh RNA zaporedij se na kompleks veže posebna DNA metiltransferaza (DOMAINS REARRANGED METHYTRANSFERASE 2, DRM2). Ta povzroči metilacijo TE, iz katerih te RNA izvirajo. Posledica tega je kondenzacija kromatina in trajno utišanje TE. Pri utišanju sodeluje tudi DNA topoizomeraza 1α, encim, ki spreminja topologijo DNA. V tem procesu olajša tvorbo lncRNA molekul z RNAPV, približanje in vezavo AGO4 ter metilacijo H3K9 (H3K9me2). To nakazuje, da tudi organizacija DNA vpliva na utišanje TE. Ta mehanizem utišanja je za rastline pomemben kot odgovor na stres in za prenos epigenetskih informacij na potomce. Večkrat se zgodi, da se TE vrine v ali v bližino gena. Če na te TE deluje RdDM, se poleg TE metilirajo tudi ti geni. Metilacija po navadi predstavlja utišanje genov, zato lahko predstavlja težavo pri preživetju rastline.

Het-siRNA lahko delujejo ''trans''. Pri ''Arabidopsis thaliana'' se v normalnih pogojih sintetizirajo het-siRNA molekule iz pericentromernih TE. Te prepoznajo in utišajo oddaljene gene za proteine, ki ob okužbi prepoznajo molekule pogosto prisotne v patogenih (PATTERN RECOGNITION RECEPTORS, PRRs) in proteine vnetnega odziva ter prirojenega imunskega odziva (NUCLEOTIDE-BINDING LEUCIN-RICH REPEAT PROTEINS, NLRs). Ob okužbi s ''Pseudomonas syringae'' (Gram negativna bakterija), pride najprej do povišanega izražanja pericentromernih TE. Sledi RdDM, poveazana z akumulacijo het-siRNA, ki metilacijo usmerjajo na izvorne TE. To povzroči zmanjšanje represije obrambnih genov in večjo odpornost na patogen.

'''Epigenetsko aktivne siRNA (easiRNA), ki izvirajo iz TE in delujejo ''trans'''''

Pri Arabidopsis je večina TE epigenetsko utišanih s 24 nt het-siRNA. Aktivacija prepisovanja utišanih TE se odraža v nastanku 21-22 nt easiRNA. Pri tem 21 nt miRNA, ki je naložena na AGO1, sproži cepitev TE prepisa, kar omogoči združitev kompleksa RDR6/SGS3. Ta kompleks pomaga prepoznati mRNA prepis TE in nastanek dsRNA. DLC2 in DLC4 nato omogočita procesiranje dsRNA, kar je ključno za nastanek 21-22 nt easiRNA. easiRNA, naložene na AGO1, lahko nato sodelujejo pri utišanju tarčne mRNA ali TE prepisa na post-transkripcijskem nivoju. Druga možnost je, da AGO2 naloži 21-22 nt easiRNA, kar sproži netipično od proteina NERD odvisno RdDM TGS (ang. transcriptional gene silencing) pot. V primeru, ko AGO6 naloži easiRNA, pa to sproži značilno RdDM, ki vodi v utišanje TE.

'''TE kot vir novih smRNA'''

Majhne obrnjene ponovitve TE (MITE) so kratki neavtonomni TE s končnimi regijami obrnjenih ponovitev. Ti elementi, ki so bili najprej opisani v rastlinah, so pretežno vstavljeni v z geni bogate regije in navadno vplivajo na izražanje sosednjih genov. Poleg regulacije izražanja genov z insercijo ali epigenetskimi modifikacijami, lahko MITE postane vir smRNA. MITE med transkripcijo proizvedejo komplementarno RNA, ki se lahko zvije v steblo-zanka podobno sekundarno strukturo, ki je dovzetna za procesiranje z DCL3. V tem primeru pride do procesiranja lncRNA s strani DCL3 v 24 nt het-siRNA molekule, ki po običajni poti sprožijo metilacijo cis ali trans, kar povzroči epigenetsko utišanje tarčnega lokusa. V rižu se od DCL3 odvisna 24 nt smRNA, ki izvira iz MITE, akumulira zaradi abiotskega stresa, kar pozitivno regulira ABA (abscizinska kislina) signaliziranje in odziv na stres.

Mutacije v zaporedju MITE vodijo tudi do nepopolnih struktur steblo-zanka, kar je lastnost miRNA prekurzorjev. To je spodbudilo razmišljanje, da so MITE verjeten evolucijski izvor miRNA lokusa. To podpira dejstvo, da se novonastale miRNA vežejo na MITE in druge TE lokuse, kar bi razložilo, zakaj se nekateri prekurzorji miRNA procesirajo tako v 21 nt kot 24 nt zvrsti. Ta ideja je dodatno podprta z ugotovitvijo, da lahko nekateri prekurzorji miRNA, ki jih prepozna DCL3, proizvajajo 24 nt siRNA in inducirajo metilacijo svojih ali tujih lokusov, kar kaže na izvor iz TE. Nadaljnja analiza potencialnega izvora miRNA genov iz TE je pokazala, da so MITE zelo dovzetne za udomačitev v miRNA prekurzorje. Spreminjanje miRNA v odvisnosti od MITE lahko tako predstavlja novosti v odzivu rastlin na razne patogene.

==Aktivne dolge nekodirajoče RNA (lncRNA), ki so po izvoru transpozonske==

'''TE kot vir fiziološko aktivnih lncRNA'''

Z RNA sekvenciranjem pri koruzi so identificirali več kot 23 000 možnih lncRNA. Okoli 65 % izmed njih je kazalo podobnost s TE, temeljito opazovanje TE in lncRNA v 40 vrstah rastlin pa je razkrilo več kot 14 000 prekrivanj med lncRNA lokusi in TE. lncRNA, ki izvirajo iz TE, so večinoma povezane z retrotranspozoni in povečanim številom le-teh v genomu. Aktivirane lncRNA se pretežno prepisujejo iz demetiliranih TE regij, zlasti iz dolgih vmesnih jedrnih elementov (LINEs), ki so del retrotranspozonov.

Mnoge izmed lncRNA, ki izvirajo iz TE, so prepisno odzivne na sol, ABA in mraz. Različno izražanje lncRNA naj bi bilo povezano z dinamiko metilacije DNA, ki omogoča neofunkcionalizacijo nekodirajočih prepisov. Dokazali so, da je znotraj vrste ''Arabidopsis'' transkripcija velikega števila lncRNA odvisna od ekotipa. Zbirka lncRNA rastline, ki je direktno odvisna od prepisne aktivnosti TE, pa predstavlja značilnosti nedavnega razhajanja med vrstami ali celo znotraj iste vrste.

'''Dolge nekodirajoče RNA, ki izvirajo iz TE, kot regulatorji majhnih RNA in proteinov'''

TE sodelujejo pri tvorbi smRNA, lahko pa zavirajo njihovo aktivnost. MIKKI, nekodirajoč prepis retrotranspozonskega izvora, ki se aktivno prepisuje v koreninah riža, vsebuje nepopolno tarčno mesto miRNA171. miRNA171 destabilizira mRNA, ki zapisujejo za družino SCARECROW-u podobnih transkripcijskh faktorjev specifičnih za korenine. MIKKI deluje kot miRNA vaba - vsebuje vezavna mesta za miRNA in povzroči njeno degradacijo. S svojim delovanjem povzroči kopičenje SCARECROW-u podobnih mRNA v koreninah in tako spodbuja pravilen razvoj korenin. Medgenska lncRNA INDUCED BY PHOSPHATE STARVATION 1 (IPS1) pri ''Arabidopsis'' je komplementarna s pomanjkanjem fosfata inducirani miRNA399, vključuje pa neujemajočo zanko na pričakovanem miRNA cepitvenem mestu, ki preprečuje razgradnjo IPS1 in ga pretvori v vabo za miRNA399.

lncRNA, ki izvirajo iz TE, lahko uravnavajo izražanje genov preko interakcije s proteini. Kratek razpršeni jedrni element SB1 (SB1 SINE) pri oljni ogrščici uravnava biogenezo miRNA z destabilizacijo dsRNA vezavnega proteina HYPONASTIC LEAVES1 (HYL1). Po transkripciji se SB1 prepis, ki izvira iz SINE, zvije v lasnično sekundarno strukturo, ki spominja na prekurzorsko miRNA. Na strukturo se veže HYL1, ki posledično ne more sodelovati v kompleksu procesiranja miRNA. Pri rastlinah, ki izražajo SB1 SINE, so pogoste okvare v razvoju in akumulaciji miRNA. Ta fenotip lahko povežemo z ektopičnim prekomernim izražanjem SINE, vendar pa kaže tudi na vpliv TE pri tvorbi miRNA v specifičnih razvojnih fazah in okoljskih razmerah.

Prepisi, ki izvirajo iz retrotranspozona LINE, vplivajo na preoblikovanje kromatina in tako uravnavajo transkripcijsko aktivnost tarčnih genov. Pri sesalcih lahko prepisi LINE1 RNA, locirani na intronih, različno rekrutirajo RNA-vezavne protein (RBP), ki so vključeni v alternativno izrezovanje intronov. lncRNA, ki izvirajo iz evolucijsko mladih LINE1 in so locirani daleč od eksonov, preferenčno prepoznajo zaviralne RBP. Starejši LINE, ki so locirani bližje eksonom, pa preferenčno vežejo RBP, ki spodbujajo procesiranje RNA in sodelujejo pri tkivno specifičnem alternativnem izrezovanju intronov.

'''Dolge nekodirajoče RNA, ki izvirajo iz TE, kot potencialni regulatorji konformacije kromatina'''

Biosintezne poti številnih rastlinskih produktov vključujejo gene organizirane v skupke. Takšna organizacija genoma naj bi izvirala iz podvojevanja genov, njihove premestitve in neofunkcionalizacije. Pri ''Arabidopsis'' se biosintetski skupki genov pojavljajo v regijah genoma bogatih s TE, s TE uravnana rekombinacija pa sodeluje pri njihovi tvorbi in koregulaciji. Obširna analiza rastlinskih genomov je pokazala vlogo transpozicije MITE pri tvorbi biosintetskih skupkov pri evdikotih.

Nekatere lncRNA preko komplementanosti zaporedij tvorijo DNA-RNA duplekse (R-zanke) in sprožijo transkripcijsko samozaviranje ali alternativno izrezovanje. lncRNA AUXIN-REGULATED PROMOTER LOOP (APOLO) prepozna več neodvisnih tarčnih lokusov znotraj genoma ''Arabidopsis''. S tvorbo R-zanke zvabi LIKEHETEROCHROMATIN PROTEIN 1
(LHP1) stran od kromatina in tako uravnava njegovo lokalno 3D konformacijo.

lncRNA, ki izvira iz MITE, z insercijo v bližino kodirajočega gena, regulira 3D konformacijo kromatina, kar v odvisnosti od celičnega tipa, uravnava transkripcijsko aktivnost sosednjih genov. V listih tvorba znotrajgenske zanke zavira transkripcijo gena HaWRKY6, kromatinska zanka v kličnih listih pa omogoča učinkovito recikliranje RNAPII in tako povečuje transkripcijo HaWRKY6. Podobno deluje tudi epigenetsko utišanje represorja cvetenja FLOWERING LOCUS C (FLC) med vernalizacijo. Izpostavitev mrazu inducira lncRNA COLDWRAP, ki posredno povzroči kompaktiranje kromatina, kar služi kot točka sidranja pri tvorbi znotrajgenske kromatinske zanke med promotorjem in 3' koncem prvega introna. Nastala zanka ovira procesivnost RNAPII, in povzroči epigenetsko utišanje FLC.

==Zaključek==

V zadnjih desetletjih so identificirali pomembno vlogo ncRNA pri uravnavanju izražanja genov na različnih nivojih. Identifikacija in karakterizacija ncRNA sta ključni pri razumevanju njihove vloge v adaptivni evoluciji. Boljše razumevanje dinamične akumulacije s TE povezanih smRNA in lncRNA kot odziv na zunanje dražljaje pa bo osvetlilo pomen nekodirajočega genoma pri medsebojnem vplivu med rastlino in okoljem. TE, ki so jih do nedavnega opisovali kot sebično DNA, niso spremenili svoje narave, šele zdaj pa začenjamo razumevati njihovo funkcijo v genomu.

==Viri in literatura==

1. Ariel, Federico D., and Pablo A. Manavella. ‘When Junk DNA Turns Functional: Transposon-Derived Non-Coding RNAs in Plants’. ''Journal of Experimental Botany'', edited by James Murray, vol. 72, no. 11, May 2021, pp. 4132–43. ''DOI.org (Crossref)'', https://doi.org/10.1093/jxb/erab073.

2. Cambiagno, Damián A., et al. ‘Immune Receptor Genes and Pericentromeric Transposons as Targets of Common Epigenetic Regulatory Elements’. ''The Plant Journal'', vol. 96, no. 6, Dec. 2018, pp. 1178–90. ''DOI.org (Crossref)'', https://doi.org/10.1111/tpj.14098.

3. Cho, Jungnam. ‘Transposon-Derived Non-Coding RNAs and Their Function in Plants’. ''Frontiers in Plant Science'', vol. 9, May 2018, p. 600. ''DOI.org (Crossref)'', https://doi.org/10.3389/fpls.2018.00600.

4. Cho, Jungnam, and Jerzy Paszkowski. ‘Regulation of Rice Root Development by a Retrotransposon Acting as a MicroRNA Sponge’. ''ELife'', edited by Christian S. Hardtke, vol. 6, Aug. 2017, p. e30038. ''eLife'', https://doi.org/10.7554/eLife.30038.

5. McCue, Andrea D., et al. “Gene Expression and Stress Response Mediated by the Epigenetic Regulation of a Transposable Element Small RNA.” ''PLoS Genetics'', edited by Tetsuji Kakutani, vol. 8, no. 2, Feb. 2012, p. e1002474. ''DOI.org (Crossref)'', https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1002474.

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Funkcije nekodirajoče RNA, ki je po izvoru transpozonska

2022-05-01T13:38:29Z

Gaja Starc: /* Uvod */

==Uvod==

Transpozicijski elementi (TE) predstavljajo pomemben dejavnik genomske kompleksnosti evkariontov. Pomembni so zaradi funkcije premikanja po DNA, ki pomembno vpliva na evolucijsko ločevanje organizmov, kratkoročno pa lahko predstavlja genomsko nestabilnost. Vplivajo tudi na aktivnost transkripcije genov v njihovi bližini s spreminjanjem njihovih epigenetskih značilnosti ali položaja regulatornih elementov.

V našem seminarju se bomo osredotočili na TE, ki predstavljajo izvor funkcionalnih dolgih ali kratkih nekodirajočih RNA pri rastlinah. Njihova funkcija je povezana s ''trans'' regulacijo aktivnosti genov na transkripcijskem in post-transkripcijskem nivoju. ''Trans'' regulacija je delovanje molekul na oddaljene dele genoma preko drugih, vmesnih molekul. Dolge nekodirajoče RNA iz TE spreminjajo izražanje genov z vezavo na proteine, razgrajevanjem majhnih RNA in tvorbo dupleksov z DNA ali RNA.

TE se lahko nahajajo v nekodirajočih delih DNA, kjer običajno nimajo večjega učinka, ali pa v neposredni bližini genov. Slednji močno vplivajo na nivo transkripcije bližnjih genov. Poleg tega lahko TE vplivajo na epigenetske značilnosti bližnjih regij DNA in tako dodatno vplivajo na izražanje genov. Zato so rastline razvile številne mehanizme za zmanjševanje vpliva TE na ali v bližini genov in omejitev traspozicijskih premikov na ta mesta.

TE so pomemben izvor nekodirajočih RNA. Pri rastlinah so to predvsem dolge in kratke nekodirajoče RNA (lncRNA, smRNA), ki predstavljajo glavni regulator izražanja genov. lncRNA molekule večinoma nastanejo s pomočjo encima RNA polimeraza II (RNAPII) alternativno pa z rastlinsko specifičnimi polimerazami (RNAPIV, RNAPV). lncRNA molekule z interakcijami s proteini, DNA ali RNA utišajo izražanje genov na nivoju transkripcije. Druga možnost je, da lncRNA prepoznajo specifičen DICER protein, ki tvori več smRNA, ki sodelujejo pri utišanju genov.

==Aktivne male RNA, ki so po izvoru transpozonske==

'''Po izvoru transpozonske male interferenčne RNA (siRNA), ki povzročijo metilacijo DNA in nastanek heterokromatina na mestih TE ter utišajo njihovo transkripcijo (het-siRNA)'''

V normalnih pogojih je večina TE utišanih z metilacijo. Mehanizem metilacije je od RNA odvisna DNA metilacija (RdDM). Začne se, ko od RNA odvisna RNA polimeraza 2 (RDR2) prepozna na novo nastale RNA iz TE, nastale z delovanjem encima RNAPIV in jih spremni v dsRNA molekule. Protein DICER - LIKE 3 (DCL3) jih nato procesira v 24 nt siRNA, prenese v citoplazmo in naloži na ARGONAUTE4 (AGO4) ali na AGO3 in AGO6 proteine. AGO4 s siRNA molekulami se vrne v jedro, tam prepozna RNAPV transkripte s komplementarnim zaporedjem. Po interakciji teh dveh RNA zaporedij se na kompleks veže posebna DNA metiltransferaza (DOMAINS REARRANGED METHYTRANSFERASE 2, DRM2). Ta povzroči metilacijo TE, iz katerih te RNA izvirajo. Posledica tega je kondenzacija kromatina in trajno utišanje TE. Pri utišanju sodeluje tudi DNA topoizomeraza 1α, encim, ki spreminja topologijo DNA. V tem procesu olajša tvorbo lncRNA molekul z RNAPV, približanje in vezavo AGO4 ter metilacijo H3K9 (H3K9me2). To nakazuje, da tudi organizacija DNA vpliva na utišanje TE. Ta mehanizem utišanja je za rastline pomemben kot odgovor na stres in za prenos epigenetskih informacij na potomce. Večkrat se zgodi, da se TE vrine v ali v bližino gena. Če na te TE deluje RdDM, se poleg TE metilirajo tudi ti geni. Metilacija po navadi predstavlja utišanje genov, zato lahko predstavlja težavo pri preživetju rastline.

Het-siRNA lahko delujejo ''trans''. Pri ''Arabidopsis thaliana'' se v normalnih pogojih sintetizirajo het-siRNA molekule iz pericentromernih TE. Te prepoznajo in utišajo oddaljene gene za proteine, ki ob okužbi prepoznajo molekule pogosto prisotne v patogenih (PATTERN RECOGNITION RECEPTORS, PRRs) in proteine vnetnega odziva ter prirojenega imunskega odziva (NUCLEOTIDE-BINDING LEUCIN-RICH REPEAT PROTEINS, NLRs). Ob okužbi s ''Pseudomonas syringae'' (Gram negativna bakterija), pride najprej do povišanega izražanja pericentromernih TE. Sledi RdDM, poveazana z akumulacijo het-siRNA, ki metilacijo usmerjajo na izvorne TE. To povzroči zmanjšanje represije obrambnih genov in večjo odpornost na patogen.

'''Epigenetsko aktivne siRNA (easiRNA), ki izvirajo iz TE in delujejo ''trans'''''

Pri Arabidopsis je večina TE epigenetsko utišanih s 24 nt het-siRNA. Aktivacija prepisovanja utišanih TE se odraža v nastanku 21-22 nt easiRNA. Pri tem 21 nt miRNA, ki je naložena na AGO1, sproži cepitev TE prepisa, kar omogoči združitev kompleksa RDR6/SGS3. Ta kompleks pomaga prepoznati mRNA prepis TE in nastanek dsRNA. DLC2 in DLC4 nato omogočita procesiranje dsRNA, kar je ključno za nastanek 21-22 nt easiRNA. easiRNA, naložene na AGO1, lahko nato sodelujejo pri utišanju tarčne mRNA ali TE prepisa na post-transkripcijskem nivoju. Druga možnost je, da AGO2 naloži 21-22 nt easiRNA, kar sproži netipično od proteina NERD odvisno RdDM TGS (ang. transcriptional gene silencing) pot. V primeru, ko AGO6 naloži easiRNA, pa to sproži značilno RdDM, ki vodi v utišanje TE.

'''TE kot vir novih smRNA'''

Majhne obrnjene ponovitve TE (MITE) so kratki neavtonomni TE s končnimi regijami obrnjenih ponovitev. Ti elementi, ki so bili najprej opisani v rastlinah, so pretežno vstavljeni v z geni bogate regije in navadno vplivajo na izražanje sosednjih genov. Poleg regulacije izražanja genov z insercijo ali epigenetskimi modifikacijami, lahko MITE postane vir smRNA. MITE med transkripcijo proizvedejo komplementarno RNA, ki se lahko zvije v steblo-zanka podobno sekundarno strukturo, ki je dovzetna za procesiranje z DCL3. V tem primeru pride do procesiranja lncRNA s strani DCL3 v 24 nt het-siRNA molekule, ki po običajni poti sprožijo metilacijo cis ali trans, kar povzroči epigenetsko utišanje tarčnega lokusa. V rižu se od DCL3 odvisna 24 nt smRNA, ki izvira iz MITE, akumulira zaradi abiotskega stresa, kar pozitivno regulira ABA (abscizinska kislina) signaliziranje in odziv na stres.

Mutacije v zaporedju MITE vodijo tudi do nepopolnih struktur steblo-zanka, kar je lastnost miRNA prekurzorjev. To je spodbudilo razmišljanje, da so MITE verjeten evolucijski izvor miRNA lokusa. To podpira dejstvo, da se novonastale miRNA vežejo na MITE in druge TE lokuse, kar bi razložilo, zakaj se nekateri prekurzorji miRNA procesirajo tako v 21 nt kot 24 nt zvrsti. Ta ideja je dodatno podprta z ugotovitvijo, da lahko nekateri prekurzorji miRNA, ki jih prepozna DCL3, proizvajajo 24 nt siRNA in inducirajo metilacijo svojih ali tujih lokusov, kar kaže na izvor iz TE. Nadaljnja analiza potencialnega izvora miRNA genov iz TE je pokazala, da so MITE zelo dovzetne za udomačitev v miRNA prekurzorje. Spreminjanje miRNA v odvisnosti od MITE lahko tako predstavlja novosti v odzivu rastlin na razne patogene.

==Aktivne dolge nekodirajoče RNA (lncRNA), ki so po izvoru transpozonske==

'''TE kot vir fiziološko aktivnih lncRNA'''

Z RNA sekvenciranjem pri koruzi so identificirali več kot 23 000 možnih lncRNA. Okoli 65 % izmed njih je kazalo podobnost s TE, temeljito opazovanje TE in lncRNA v 40 vrstah rastlin pa je razkrilo več kot 14 000 prekrivanj med lncRNA lokusi in TE. lncRNA, ki izvirajo iz TE, so večinoma povezane z retrotranspozoni in povečanim številom le-teh v genomu. Aktivirane lncRNA se pretežno prepisujejo iz demetiliranih TE regij, zlasti iz dolgih vmesnih jedrnih elementov (LINEs), ki so del retrotranspozonov.

Mnoge izmed lncRNA, ki izvirajo iz TE, so prepisno odzivne na sol, ABA in mraz. Različno izražanje lncRNA naj bi bilo povezano z dinamiko metilacije DNA, ki omogoča neofunkcionalizacijo nekodirajočih prepisov. Dokazali so, da je znotraj vrste ''Arabidopsis'' transkripcija velikega števila lncRNA odvisna od ekotipa. Zbirka lncRNA rastline, ki je direktno odvisna od prepisne aktivnosti TE, pa predstavlja značilnosti nedavnega razhajanja med vrstami ali celo znotraj iste vrste.

'''Dolge nekodirajoče RNA, ki izvirajo iz TE, kot regulatorji majhnih RNA in proteinov'''

TE sodelujejo pri tvorbi smRNA, lahko pa zavirajo njihovo aktivnost. MIKKI, nekodirajoč prepis retrotranspozonskega izvora, ki se aktivno prepisuje v koreninah riža, vsebuje nepopolno tarčno mesto miRNA171. miRNA171 destabilizira mRNA, ki zapisujejo za družino SCARECROW-u podobnih transkripcijskh faktorjev specifičnih za korenine. MIKKI deluje kot miRNA vaba - vsebuje vezavna mesta za miRNA in povzroči njeno degradacijo. S svojim delovanjem povzroči kopičenje SCARECROW-u podobnih mRNA v koreninah in tako spodbuja pravilen razvoj korenin. Medgenska lncRNA INDUCED BY PHOSPHATE STARVATION 1 (IPS1) pri ''Arabidopsis'' je komplementarna s pomanjkanjem fosfata inducirani miRNA399, vključuje pa neujemajočo zanko na pričakovanem miRNA cepitvenem mestu, ki preprečuje razgradnjo IPS1 in ga pretvori v vabo za miRNA399.

lncRNA, ki izvirajo iz TE, lahko uravnavajo izražanje genov preko interakcije s proteini. Kratek razpršeni jedrni element SB1 (SB1 SINE) pri oljni ogrščici uravnava biogenezo miRNA z destabilizacijo dsRNA vezavnega proteina HYPONASTIC LEAVES1 (HYL1). Po transkripciji se SB1 prepis, ki izvira iz SINE, zvije v lasnično sekundarno strukturo, ki spominja na prekurzorsko miRNA. Na strukturo se veže HYL1, ki posledično ne more sodelovati v kompleksu procesiranja miRNA. Pri rastlinah, ki izražajo SB1 SINE, so pogoste okvare v razvoju in akumulaciji miRNA. Ta fenotip lahko povežemo z ektopičnim prekomernim izražanjem SINE, vendar pa kaže tudi na vpliv TE pri tvorbi miRNA v specifičnih razvojnih fazah in okoljskih razmerah.

Prepisi, ki izvirajo iz retrotranspozona LINE, vplivajo na preoblikovanje kromatina in tako uravnavajo transkripcijsko aktivnost tarčnih genov. Pri sesalcih lahko prepisi LINE1 RNA, locirani na intronih, različno rekrutirajo RNA-vezavne protein (RBP), ki so vključeni v alternativno izrezovanje intronov. lncRNA, ki izvirajo iz evolucijsko mladih LINE1 in so locirani daleč od eksonov, preferenčno prepoznajo zaviralne RBP. Starejši LINE, ki so locirani bližje eksonom, pa preferenčno vežejo RBP, ki spodbujajo procesiranje RNA in sodelujejo pri tkivno specifičnem alternativnem izrezovanju intronov.

'''Dolge nekodirajoče RNA, ki izvirajo iz TE, kot potencialni regulatorji konformacije kromatina'''

Biosintezne poti številnih rastlinskih produktov vključujejo gene organizirane v skupke. Takšna organizacija genoma naj bi izvirala iz podvojevanja genov, njihove premestitve in neofunkcionalizacije. Pri ''Arabidopsis'' se biosintetski skupki genov pojavljajo v regijah genoma bogatih s TE, s TE uravnana rekombinacija pa sodeluje pri njihovi tvorbi in koregulaciji. Obširna analiza rastlinskih genomov je pokazala vlogo transpozicije MITE pri tvorbi biosintetskih skupkov pri evdikotih.

Nekatere lncRNA preko komplementanosti zaporedij tvorijo DNA-RNA duplekse (R-zanke) in sprožijo transkripcijsko samozaviranje ali alternativno izrezovanje. lncRNA AUXIN-REGULATED PROMOTER LOOP (APOLO) prepozna več neodvisnih tarčnih lokusov znotraj genoma ''Arabidopsis''. S tvorbo R-zanke zvabi LIKEHETEROCHROMATIN PROTEIN 1
(LHP1) stran od kromatina in tako uravnava njegovo lokalno 3D konformacijo.

lncRNA, ki izvira iz MITE, z insercijo v bližino kodirajočega gena, regulira 3D konformacijo kromatina, kar v odvisnosti od celičnega tipa, uravnava transkripcijsko aktivnost sosednjih genov. V listih tvorba znotrajgenske zanke zavira transkripcijo gena HaWRKY6, kromatinska zanka v kličnih listih pa omogoča učinkovito recikliranje RNAPII in tako povečuje transkripcijo HaWRKY6. Podobno deluje tudi epigenetsko utišanje represorja cvetenja FLOWERING LOCUS C (FLC) med vernalizacijo. Izpostavitev mrazu inducira lncRNA COLDWRAP, ki posredno povzroči kompaktiranje kromatina, kar služi kot točka sidranja pri tvorbi znotrajgenske kromatinske zanke med promotorjem in 3' koncem prvega introna. Nastala zanka ovira procesivnost RNAPII, in povzroči epigenetsko utišanje FLC.

==Zaključek==

V zadnjih desetletjih so identificirali pomembno vlogo ncRNA pri uravnavanju izražanja genov na različnih nivojih. Identifikacija in karakterizacija ncRNA sta ključni pri razumevanju njihove vloge v adaptivni evoluciji. Boljše razumevanje dinamične akumulacije s TE povezanih smRNA in lncRNA kot odziv na zunanje dražljaje pa bo osvetlilo pomen nekodirajočega genoma pri medsebojnem vplivu med rastlino in okoljem. TE, ki so jih do nedavnega opisovali kot sebično DNA, niso spremenili svoje narave, šele zdaj pa začenjamo razumevati njihovo funkcijo v genomu.

==Viri in literatura==

1. Ariel, Federico D., and Pablo A. Manavella. ‘When Junk DNA Turns Functional: Transposon-Derived Non-Coding RNAs in Plants’. ''Journal of Experimental Botany'', edited by James Murray, vol. 72, no. 11, May 2021, pp. 4132–43. ''DOI.org (Crossref)'', https://doi.org/10.1093/jxb/erab073.

2. Cambiagno, Damián A., et al. ‘Immune Receptor Genes and Pericentromeric Transposons as Targets of Common Epigenetic Regulatory Elements’. ''The Plant Journal'', vol. 96, no. 6, Dec. 2018, pp. 1178–90. ''DOI.org (Crossref)'', https://doi.org/10.1111/tpj.14098.

3. Cho, Jungnam. ‘Transposon-Derived Non-Coding RNAs and Their Function in Plants’. ''Frontiers in Plant Science'', vol. 9, May 2018, p. 600. ''DOI.org (Crossref)'', https://doi.org/10.3389/fpls.2018.00600.

4. Cho, Jungnam, and Jerzy Paszkowski. ‘Regulation of Rice Root Development by a Retrotransposon Acting as a MicroRNA Sponge’. ''ELife'', edited by Christian S. Hardtke, vol. 6, Aug. 2017, p. e30038. ''eLife'', https://doi.org/10.7554/eLife.30038.

5. McCue, Andrea D., et al. “Gene Expression and Stress Response Mediated by the Epigenetic Regulation of a Transposable Element Small RNA.” ''PLoS Genetics'', edited by Tetsuji Kakutani, vol. 8, no. 2, Feb. 2012, p. e1002474. ''DOI.org (Crossref)'', https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1002474.

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Funkcije nekodirajoče RNA, ki je po izvoru transpozonska

2022-05-01T13:35:52Z

Gaja Starc: /* Viri in literatura */

==Uvod==

Transpozicijski elementi (TE) predstavljajo pomemben dejavnik genomske kompleksnosti evkariontov. Pomembni so zaradi funkcije premikanja po DNA, ki pomembno vpliva na evolucijsko ločevanje organizmov, kratkoročno pa lahko predstavlja genomsko nestabilnost. Vplivajo tudi na aktivnost transkripcije genov v njihovi bližini s spreminjanjem njihovih epigenetskih značilnosti ali položaja regulatornih elementov.

V našem seminarju se bomo osredotočili na TE, ki predstavljajo izvor funkcionalnih dolgih ali kratkih nekodirajočih RNA pri rastlinah. Njihova funkcija je povezana s trans regulacijo aktivnosti genov na transkripcijskem in post-transkripcijskem nivoju. ''Trans'' regulacija je delovanje molekul na oddaljene dele genoma preko drugih, vmesnih molekul. Dolge nekodirajoče RNA iz TE spreminjajo izražanje genov z vezavo na proteine, razgrajevanjem majhnih RNA in tvorbo dupleksov z DNA ali RNA.

TE se lahko nahajajo v nekodirajočih delih DNA, kjer običajno nimajo večjega učinka, ali pa v neposredni bližini genov. Slednji močno vplivajo na nivo transkripcije bližnjih genov. Poleg tega lahko TE vplivajo na epigenetske značilnosti bližnjih regij DNA in tako dodatno vplivajo na izražanje genov. Zato so rastline razvile številne mehanizme za zmanjševanje vpliva TE na ali v bližini genov in omejitev traspozicijskih premikov na ta mesta.

TE so pomemben izvor nekodirajočih RNA. Pri rastlinah so to predvsem dolge in kratke nekodirajoče RNA (lncRNA, smRNA), ki predstavljajo glavni regulator izražanja genov. lncRNA molekule večinoma nastanejo s pomočjo encima RNA polimeraza II (RNAPII) alternativno pa z rastlinsko specifičnimi polimerazami (RNAPIV, RNAPV). lncRNA molekule z interakcijami s proteini, DNA ali RNA utišajo izražanje genov na nivoju transkripcije. Druga možnost je, da lncRNA prepoznajo specifičen DICER protein, ki tvori več smRNA, ki sodelujejo pri utišanju genov.

==Aktivne male RNA, ki so po izvoru transpozonske==

'''Po izvoru transpozonske male interferenčne RNA (siRNA), ki povzročijo metilacijo DNA in nastanek heterokromatina na mestih TE ter utišajo njihovo transkripcijo (het-siRNA)'''

V normalnih pogojih je večina TE utišanih z metilacijo. Mehanizem metilacije je od RNA odvisna DNA metilacija (RdDM). Začne se, ko od RNA odvisna RNA polimeraza 2 (RDR2) prepozna na novo nastale RNA iz TE, nastale z delovanjem encima RNAPIV in jih spremni v dsRNA molekule. Protein DICER - LIKE 3 (DCL3) jih nato procesira v 24 nt siRNA, prenese v citoplazmo in naloži na ARGONAUTE4 (AGO4) ali na AGO3 in AGO6 proteine. AGO4 s siRNA molekulami se vrne v jedro, tam prepozna RNAPV transkripte s komplementarnim zaporedjem. Po interakciji teh dveh RNA zaporedij se na kompleks veže posebna DNA metiltransferaza (DOMAINS REARRANGED METHYTRANSFERASE 2, DRM2). Ta povzroči metilacijo TE, iz katerih te RNA izvirajo. Posledica tega je kondenzacija kromatina in trajno utišanje TE. Pri utišanju sodeluje tudi DNA topoizomeraza 1α, encim, ki spreminja topologijo DNA. V tem procesu olajša tvorbo lncRNA molekul z RNAPV, približanje in vezavo AGO4 ter metilacijo H3K9 (H3K9me2). To nakazuje, da tudi organizacija DNA vpliva na utišanje TE. Ta mehanizem utišanja je za rastline pomemben kot odgovor na stres in za prenos epigenetskih informacij na potomce. Večkrat se zgodi, da se TE vrine v ali v bližino gena. Če na te TE deluje RdDM, se poleg TE metilirajo tudi ti geni. Metilacija po navadi predstavlja utišanje genov, zato lahko predstavlja težavo pri preživetju rastline.

Het-siRNA lahko delujejo ''trans''. Pri ''Arabidopsis thaliana'' se v normalnih pogojih sintetizirajo het-siRNA molekule iz pericentromernih TE. Te prepoznajo in utišajo oddaljene gene za proteine, ki ob okužbi prepoznajo molekule pogosto prisotne v patogenih (PATTERN RECOGNITION RECEPTORS, PRRs) in proteine vnetnega odziva ter prirojenega imunskega odziva (NUCLEOTIDE-BINDING LEUCIN-RICH REPEAT PROTEINS, NLRs). Ob okužbi s ''Pseudomonas syringae'' (Gram negativna bakterija), pride najprej do povišanega izražanja pericentromernih TE. Sledi RdDM, poveazana z akumulacijo het-siRNA, ki metilacijo usmerjajo na izvorne TE. To povzroči zmanjšanje represije obrambnih genov in večjo odpornost na patogen.

'''Epigenetsko aktivne siRNA (easiRNA), ki izvirajo iz TE in delujejo ''trans'''''

Pri Arabidopsis je večina TE epigenetsko utišanih s 24 nt het-siRNA. Aktivacija prepisovanja utišanih TE se odraža v nastanku 21-22 nt easiRNA. Pri tem 21 nt miRNA, ki je naložena na AGO1, sproži cepitev TE prepisa, kar omogoči združitev kompleksa RDR6/SGS3. Ta kompleks pomaga prepoznati mRNA prepis TE in nastanek dsRNA. DLC2 in DLC4 nato omogočita procesiranje dsRNA, kar je ključno za nastanek 21-22 nt easiRNA. easiRNA, naložene na AGO1, lahko nato sodelujejo pri utišanju tarčne mRNA ali TE prepisa na post-transkripcijskem nivoju. Druga možnost je, da AGO2 naloži 21-22 nt easiRNA, kar sproži netipično od proteina NERD odvisno RdDM TGS (ang. transcriptional gene silencing) pot. V primeru, ko AGO6 naloži easiRNA, pa to sproži značilno RdDM, ki vodi v utišanje TE.

'''TE kot vir novih smRNA'''

Majhne obrnjene ponovitve TE (MITE) so kratki neavtonomni TE s končnimi regijami obrnjenih ponovitev. Ti elementi, ki so bili najprej opisani v rastlinah, so pretežno vstavljeni v z geni bogate regije in navadno vplivajo na izražanje sosednjih genov. Poleg regulacije izražanja genov z insercijo ali epigenetskimi modifikacijami, lahko MITE postane vir smRNA. MITE med transkripcijo proizvedejo komplementarno RNA, ki se lahko zvije v steblo-zanka podobno sekundarno strukturo, ki je dovzetna za procesiranje z DCL3. V tem primeru pride do procesiranja lncRNA s strani DCL3 v 24 nt het-siRNA molekule, ki po običajni poti sprožijo metilacijo cis ali trans, kar povzroči epigenetsko utišanje tarčnega lokusa. V rižu se od DCL3 odvisna 24 nt smRNA, ki izvira iz MITE, akumulira zaradi abiotskega stresa, kar pozitivno regulira ABA (abscizinska kislina) signaliziranje in odziv na stres.

Mutacije v zaporedju MITE vodijo tudi do nepopolnih struktur steblo-zanka, kar je lastnost miRNA prekurzorjev. To je spodbudilo razmišljanje, da so MITE verjeten evolucijski izvor miRNA lokusa. To podpira dejstvo, da se novonastale miRNA vežejo na MITE in druge TE lokuse, kar bi razložilo, zakaj se nekateri prekurzorji miRNA procesirajo tako v 21 nt kot 24 nt zvrsti. Ta ideja je dodatno podprta z ugotovitvijo, da lahko nekateri prekurzorji miRNA, ki jih prepozna DCL3, proizvajajo 24 nt siRNA in inducirajo metilacijo svojih ali tujih lokusov, kar kaže na izvor iz TE. Nadaljnja analiza potencialnega izvora miRNA genov iz TE je pokazala, da so MITE zelo dovzetne za udomačitev v miRNA prekurzorje. Spreminjanje miRNA v odvisnosti od MITE lahko tako predstavlja novosti v odzivu rastlin na razne patogene.

==Aktivne dolge nekodirajoče RNA (lncRNA), ki so po izvoru transpozonske==

'''TE kot vir fiziološko aktivnih lncRNA'''

Z RNA sekvenciranjem pri koruzi so identificirali več kot 23 000 možnih lncRNA. Okoli 65 % izmed njih je kazalo podobnost s TE, temeljito opazovanje TE in lncRNA v 40 vrstah rastlin pa je razkrilo več kot 14 000 prekrivanj med lncRNA lokusi in TE. lncRNA, ki izvirajo iz TE, so večinoma povezane z retrotranspozoni in povečanim številom le-teh v genomu. Aktivirane lncRNA se pretežno prepisujejo iz demetiliranih TE regij, zlasti iz dolgih vmesnih jedrnih elementov (LINEs), ki so del retrotranspozonov.

Mnoge izmed lncRNA, ki izvirajo iz TE, so prepisno odzivne na sol, ABA in mraz. Različno izražanje lncRNA naj bi bilo povezano z dinamiko metilacije DNA, ki omogoča neofunkcionalizacijo nekodirajočih prepisov. Dokazali so, da je znotraj vrste ''Arabidopsis'' transkripcija velikega števila lncRNA odvisna od ekotipa. Zbirka lncRNA rastline, ki je direktno odvisna od prepisne aktivnosti TE, pa predstavlja značilnosti nedavnega razhajanja med vrstami ali celo znotraj iste vrste.

'''Dolge nekodirajoče RNA, ki izvirajo iz TE, kot regulatorji majhnih RNA in proteinov'''

TE sodelujejo pri tvorbi smRNA, lahko pa zavirajo njihovo aktivnost. MIKKI, nekodirajoč prepis retrotranspozonskega izvora, ki se aktivno prepisuje v koreninah riža, vsebuje nepopolno tarčno mesto miRNA171. miRNA171 destabilizira mRNA, ki zapisujejo za družino SCARECROW-u podobnih transkripcijskh faktorjev specifičnih za korenine. MIKKI deluje kot miRNA vaba - vsebuje vezavna mesta za miRNA in povzroči njeno degradacijo. S svojim delovanjem povzroči kopičenje SCARECROW-u podobnih mRNA v koreninah in tako spodbuja pravilen razvoj korenin. Medgenska lncRNA INDUCED BY PHOSPHATE STARVATION 1 (IPS1) pri ''Arabidopsis'' je komplementarna s pomanjkanjem fosfata inducirani miRNA399, vključuje pa neujemajočo zanko na pričakovanem miRNA cepitvenem mestu, ki preprečuje razgradnjo IPS1 in ga pretvori v vabo za miRNA399.

lncRNA, ki izvirajo iz TE, lahko uravnavajo izražanje genov preko interakcije s proteini. Kratek razpršeni jedrni element SB1 (SB1 SINE) pri oljni ogrščici uravnava biogenezo miRNA z destabilizacijo dsRNA vezavnega proteina HYPONASTIC LEAVES1 (HYL1). Po transkripciji se SB1 prepis, ki izvira iz SINE, zvije v lasnično sekundarno strukturo, ki spominja na prekurzorsko miRNA. Na strukturo se veže HYL1, ki posledično ne more sodelovati v kompleksu procesiranja miRNA. Pri rastlinah, ki izražajo SB1 SINE, so pogoste okvare v razvoju in akumulaciji miRNA. Ta fenotip lahko povežemo z ektopičnim prekomernim izražanjem SINE, vendar pa kaže tudi na vpliv TE pri tvorbi miRNA v specifičnih razvojnih fazah in okoljskih razmerah.

Prepisi, ki izvirajo iz retrotranspozona LINE, vplivajo na preoblikovanje kromatina in tako uravnavajo transkripcijsko aktivnost tarčnih genov. Pri sesalcih lahko prepisi LINE1 RNA, locirani na intronih, različno rekrutirajo RNA-vezavne protein (RBP), ki so vključeni v alternativno izrezovanje intronov. lncRNA, ki izvirajo iz evolucijsko mladih LINE1 in so locirani daleč od eksonov, preferenčno prepoznajo zaviralne RBP. Starejši LINE, ki so locirani bližje eksonom, pa preferenčno vežejo RBP, ki spodbujajo procesiranje RNA in sodelujejo pri tkivno specifičnem alternativnem izrezovanju intronov.

'''Dolge nekodirajoče RNA, ki izvirajo iz TE, kot potencialni regulatorji konformacije kromatina'''

Biosintezne poti številnih rastlinskih produktov vključujejo gene organizirane v skupke. Takšna organizacija genoma naj bi izvirala iz podvojevanja genov, njihove premestitve in neofunkcionalizacije. Pri ''Arabidopsis'' se biosintetski skupki genov pojavljajo v regijah genoma bogatih s TE, s TE uravnana rekombinacija pa sodeluje pri njihovi tvorbi in koregulaciji. Obširna analiza rastlinskih genomov je pokazala vlogo transpozicije MITE pri tvorbi biosintetskih skupkov pri evdikotih.

Nekatere lncRNA preko komplementanosti zaporedij tvorijo DNA-RNA duplekse (R-zanke) in sprožijo transkripcijsko samozaviranje ali alternativno izrezovanje. lncRNA AUXIN-REGULATED PROMOTER LOOP (APOLO) prepozna več neodvisnih tarčnih lokusov znotraj genoma ''Arabidopsis''. S tvorbo R-zanke zvabi LIKEHETEROCHROMATIN PROTEIN 1
(LHP1) stran od kromatina in tako uravnava njegovo lokalno 3D konformacijo.

lncRNA, ki izvira iz MITE, z insercijo v bližino kodirajočega gena, regulira 3D konformacijo kromatina, kar v odvisnosti od celičnega tipa, uravnava transkripcijsko aktivnost sosednjih genov. V listih tvorba znotrajgenske zanke zavira transkripcijo gena HaWRKY6, kromatinska zanka v kličnih listih pa omogoča učinkovito recikliranje RNAPII in tako povečuje transkripcijo HaWRKY6. Podobno deluje tudi epigenetsko utišanje represorja cvetenja FLOWERING LOCUS C (FLC) med vernalizacijo. Izpostavitev mrazu inducira lncRNA COLDWRAP, ki posredno povzroči kompaktiranje kromatina, kar služi kot točka sidranja pri tvorbi znotrajgenske kromatinske zanke med promotorjem in 3' koncem prvega introna. Nastala zanka ovira procesivnost RNAPII, in povzroči epigenetsko utišanje FLC.

==Zaključek==

V zadnjih desetletjih so identificirali pomembno vlogo ncRNA pri uravnavanju izražanja genov na različnih nivojih. Identifikacija in karakterizacija ncRNA sta ključni pri razumevanju njihove vloge v adaptivni evoluciji. Boljše razumevanje dinamične akumulacije s TE povezanih smRNA in lncRNA kot odziv na zunanje dražljaje pa bo osvetlilo pomen nekodirajočega genoma pri medsebojnem vplivu med rastlino in okoljem. TE, ki so jih do nedavnega opisovali kot sebično DNA, niso spremenili svoje narave, šele zdaj pa začenjamo razumevati njihovo funkcijo v genomu.

==Viri in literatura==

1. Ariel, Federico D., and Pablo A. Manavella. ‘When Junk DNA Turns Functional: Transposon-Derived Non-Coding RNAs in Plants’. ''Journal of Experimental Botany'', edited by James Murray, vol. 72, no. 11, May 2021, pp. 4132–43. ''DOI.org (Crossref)'', https://doi.org/10.1093/jxb/erab073.

2. Cambiagno, Damián A., et al. ‘Immune Receptor Genes and Pericentromeric Transposons as Targets of Common Epigenetic Regulatory Elements’. ''The Plant Journal'', vol. 96, no. 6, Dec. 2018, pp. 1178–90. ''DOI.org (Crossref)'', https://doi.org/10.1111/tpj.14098.

3. Cho, Jungnam. ‘Transposon-Derived Non-Coding RNAs and Their Function in Plants’. ''Frontiers in Plant Science'', vol. 9, May 2018, p. 600. ''DOI.org (Crossref)'', https://doi.org/10.3389/fpls.2018.00600.

4. Cho, Jungnam, and Jerzy Paszkowski. ‘Regulation of Rice Root Development by a Retrotransposon Acting as a MicroRNA Sponge’. ''ELife'', edited by Christian S. Hardtke, vol. 6, Aug. 2017, p. e30038. ''eLife'', https://doi.org/10.7554/eLife.30038.

5. McCue, Andrea D., et al. “Gene Expression and Stress Response Mediated by the Epigenetic Regulation of a Transposable Element Small RNA.” ''PLoS Genetics'', edited by Tetsuji Kakutani, vol. 8, no. 2, Feb. 2012, p. e1002474. ''DOI.org (Crossref)'', https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1002474.

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Funkcije nekodirajoče RNA, ki je po izvoru transpozonska

2022-05-01T12:19:39Z

Gaja Starc: /* Viri in literatura */

==Uvod==

Transpozicijski elementi (TE) predstavljajo pomemben dejavnik genomske kompleksnosti evkariontov. Pomembni so zaradi funkcije premikanja po DNA, ki pomembno vpliva na evolucijsko ločevanje organizmov, kratkoročno pa lahko predstavlja genomsko nestabilnost. Vplivajo tudi na aktivnost transkripcije genov v njihovi bližini s spreminjanjem njihovih epigenetskih značilnosti ali položaja regulatornih elementov.

V našem seminarju se bomo osredotočili na TE, ki predstavljajo izvor funkcionalnih dolgih ali kratkih nekodirajočih RNA pri rastlinah. Njihova funkcija je povezana s trans regulacijo aktivnosti genov na transkripcijskem in post-transkripcijskem nivoju. ''Trans'' regulacija je delovanje molekul na oddaljene dele genoma preko drugih, vmesnih molekul. Dolge nekodirajoče RNA iz TE spreminjajo izražanje genov z vezavo na proteine, razgrajevanjem majhnih RNA in tvorbo dupleksov z DNA ali RNA.

TE se lahko nahajajo v nekodirajočih delih DNA, kjer običajno nimajo večjega učinka, ali pa v neposredni bližini genov. Slednji močno vplivajo na nivo transkripcije bližnjih genov. Poleg tega lahko TE vplivajo na epigenetske značilnosti bližnjih regij DNA in tako dodatno vplivajo na izražanje genov. Zato so rastline razvile številne mehanizme za zmanjševanje vpliva TE na ali v bližini genov in omejitev traspozicijskih premikov na ta mesta.

TE so pomemben izvor nekodirajočih RNA. Pri rastlinah so to predvsem dolge in kratke nekodirajoče RNA (lncRNA, smRNA), ki predstavljajo glavni regulator izražanja genov. lncRNA molekule večinoma nastanejo s pomočjo encima RNA polimeraza II (RNAPII) alternativno pa z rastlinsko specifičnimi polimerazami (RNAPIV, RNAPV). lncRNA molekule z interakcijami s proteini, DNA ali RNA utišajo izražanje genov na nivoju transkripcije. Druga možnost je, da lncRNA prepoznajo specifičen DICER protein, ki tvori več smRNA, ki sodelujejo pri utišanju genov.

==Aktivne majhne RNA, ki so po izvoru transpozonske==

'''Po izvoru transpozonske male interferenčne RNA (siRNA), ki povzročijo metilacijo DNA in nastanek heterokromatina na mestih TE ter utišajo njihovo transkripcijo (het-siRNA)'''

V normalnih pogojih je večina TE utišanih z metilacijo. Mehanizem metilacije je od RNA odvisna DNA metilacija (RdDM). Začne se, ko od RNA odvisna RNA polimeraza 2 (RDR2) prepozna na novo nastale RNA iz TE, nastale z delovanjem encima RNAPIV in jih spremni v dsRNA molekule. Protein DICER - LIKE 3 (DCL3) jih nato procesira v 24 nt siRNA, prenese v citoplazmo in naloži na ARGONAUTE4 (AGO4) ali na AGO3 in AGO6 proteine. AGO4 s siRNA molekulami se vrne v jedro, tam prepozna RNAPV transkripte s komplementarnim zaporedjem. Po interakciji teh dveh RNA zaporedij se na kompleks veže posebna DNA metiltransferaza (DOMAINS REARRANGED METHYTRANSFERASE 2, DRM2). Ta povzroči metilacijo TE, iz katerih te RNA izvirajo. Posledica tega je kondenzacija kromatina in trajno utišanje TE. Pri utišanju sodeluje tudi DNA topoizomeraza 1α, encim, ki spreminja topologijo DNA. V tem procesu olajša tvorbo lncRNA molekul z RNAPV, približanje in vezavo AGO4 ter metilacijo H3K9 (H3K9me2). To nakazuje, da tudi organizacija DNA vpliva na utišanje TE. Ta mehanizem utišanja je za rastline pomemben kot odgovor na stres in za prenos epigenetskih informacij na potomce. Večkrat se zgodi, da se TE vrine v ali v bližino gena. Če na te TE deluje RdDM, se poleg TE metilirajo tudi ti geni. Metilacija po navadi predstavlja utišanje genov, zato lahko predstavlja težavo pri preživetju rastline.

Het-siRNA lahko delujejo ''trans''. Pri ''Arabidopsis thaliana'' se v normalnih pogojih sintetizirajo het-siRNA molekule iz pericentromernih TE. Te prepoznajo in utišajo oddaljene gene za proteine, ki ob okužbi prepoznajo molekule pogosto prisotne v patogenih (PATTERN RECOGNITION RECEPTORS, PRRs) in proteine vnetnega odziva ter prirojenega imunskega odziva (NUCLEOTIDE-BINDING LEUCIN-RICH REPEAT PROTEINS, NLRs). Ob okužbi s ''Pseudomonas syringae'' (Gram negativna bakterija), pride najprej do povišanega izražanja pericentromernih TE. Sledi RdDM, poveazana z akumulacijo het-siRNA, ki metilacijo usmerjajo na izvorne TE. To povzroči zmanjšanje represije obrambnih genov in večjo odpornost na patogen.

'''Epigenetsko aktivne siRNA (easiRNA), ki izvirajo iz TE in delujejo ''trans'''''

Pri Arabidopsis je večina TE epigenetsko utišanih s 24 nt het-siRNA. Aktivacija prepisovanja utišanih TE se odraža v nastanku 21-22 nt easiRNA. Pri tem 21 nt miRNA, ki je naložena na AGO1, sproži cepitev TE prepisa, kar omogoči združitev kompleksa RDR6/SGS3. Ta kompleks pomaga prepoznati mRNA prepis TE in nastanek dsRNA. DLC2 in DLC4 nato omogočita procesiranje dsRNA, kar je ključno za nastanek 21-22 nt easiRNA. easiRNA, naložene na AGO1, lahko nato sodelujejo pri utišanju tarčne mRNA ali TE prepisa na post-transkripcijskem nivoju. Druga možnost je, da AGO2 naloži 21-22 nt easiRNA, kar sproži netipično od proteina NERD odvisno RdDM TGS (ang. transcriptional gene silencing) pot. V primeru, ko AGO6 naloži easiRNA, pa to sproži značilno RdDM, ki vodi v utišanje TE.

'''TE kot vir novih smRNA'''

Majhne obrnjene ponovitve TE (MITE) so kratki neavtonomni TE s končnimi regijami obrnjenih ponovitev. Ti elementi, ki so bili najprej opisani v rastlinah, so pretežno vstavljeni v z geni bogate regije in navadno vplivajo na izražanje sosednjih genov. Poleg regulacije izražanja genov z insercijo ali epigenetskimi modifikacijami, lahko MITE postane vir smRNA. MITE med transkripcijo proizvedejo komplementarno RNA, ki se lahko zvije v steblo-zanka podobno sekundarno strukturo, ki je dovzetna za procesiranje z DCL3. V tem primeru pride do procesiranja lncRNA s strani DCL3 v 24 nt het-siRNA molekule, ki po običajni poti sprožijo metilacijo cis ali trans, kar povzroči epigenetsko utišanje tarčnega lokusa. V rižu se od DCL3 odvisna 24 nt smRNA, ki izvira iz MITE, akumulira zaradi abiotskega stresa, kar pozitivno regulira ABA (abscizinska kislina) signaliziranje in odziv na stres.

Mutacije v zaporedju MITE vodijo tudi do nepopolnih struktur steblo-zanka, kar je lastnost miRNA prekurzorjev. To je spodbudilo razmišljanje, da so MITE verjeten evolucijski izvor miRNA lokusa. To podpira dejstvo, da se novonastale miRNA vežejo na MITE in druge TE lokuse, kar bi razložilo, zakaj se nekateri prekurzorji miRNA procesirajo tako v 21 nt kot 24 nt zvrsti. Ta ideja je dodatno podprta z ugotovitvijo, da lahko nekateri prekurzorji miRNA, ki jih prepozna DCL3, proizvajajo 24 nt siRNA in inducirajo metilacijo svojih ali tujih lokusov, kar kaže na izvor iz TE. Nadaljnja analiza potencialnega izvora miRNA genov iz TE je pokazala, da so MITE zelo dovzetne za udomačitev v miRNA prekurzorje. Spreminjanje miRNA v odvisnosti od MITE lahko tako predstavlja novosti v odzivu rastlin na razne patogene.

==Aktivne dolge nekodirajoče RNA (lncRNA), ki so po izvoru transpozonske==

'''TE kot vir fiziološko aktivnih lncRNA'''

Z RNA sekvenciranjem pri koruzi so identificirali več kot 23 000 možnih lncRNA. Okoli 65 % izmed njih je kazalo podobnost s TE, temeljito opazovanje TE in lncRNA v 40 vrstah rastlin pa je razkrilo več kot 14 000 prekrivanj med lncRNA lokusi in TE. lncRNA, ki izvirajo iz TE, so večinoma povezane z retrotranspozoni in povečanim številom le-teh v genomu. Aktivirane lncRNA se pretežno prepisujejo iz demetiliranih TE regij, zlasti iz dolgih vmesnih jedrnih elementov (LINEs), ki so del retrotranspozonov.

Mnoge izmed lncRNA, ki izvirajo iz TE, so prepisno odzivne na sol, ABA in mraz. Različno izražanje lncRNA naj bi bilo povezano z dinamiko metilacije DNA, ki omogoča neofunkcionalizacijo nekodirajočih prepisov. Dokazali so, da je znotraj vrste ''Arabidopsis'' transkripcija velikega števila lncRNA odvisna od ekotipa. Zbirka lncRNA rastline, ki je direktno odvisna od prepisne aktivnosti TE, pa predstavlja značilnosti nedavnega razhajanja med vrstami ali celo znotraj iste vrste.

'''Dolge nekodirajoče RNA, ki izvirajo iz TE, kot regulatorji majhnih RNA in proteinov'''

TE sodelujejo pri tvorbi smRNA, lahko pa zavirajo njihovo aktivnost. MIKKI, nekodirajoč prepis retrotranspozonskega izvora, ki se aktivno prepisuje v koreninah riža, vsebuje nepopolno tarčno mesto miRNA171. miRNA171 destabilizira mRNA, ki zapisujejo za družino SCARECROW-u podobnih transkripcijskh faktorjev specifičnih za korenine. MIKKI deluje kot miRNA vaba - vsebuje vezavna mesta za miRNA in povzroči njeno degradacijo. S svojim delovanjem povzroči kopičenje SCARECROW-u podobnih mRNA v koreninah in tako spodbuja pravilen razvoj korenin. Medgenska lncRNA INDUCED BY PHOSPHATE STARVATION 1 (IPS1) pri ''Arabidopsis'' je komplementarna s pomanjkanjem fosfata inducirani miRNA399, vključuje pa neujemajočo zanko na pričakovanem miRNA cepitvenem mestu, ki preprečuje razgradnjo IPS1 in ga pretvori v vabo za miRNA399.

lncRNA, ki izvirajo iz TE, lahko uravnavajo izražanje genov preko interakcije s proteini. Kratek razpršeni jedrni element SB1 (SB1 SINE) pri oljni ogrščici uravnava biogenezo miRNA z destabilizacijo dsRNA vezavnega proteina HYPONASTIC LEAVES1 (HYL1). Po transkripciji se SB1 prepis, ki izvira iz SINE, zvije v lasnično sekundarno strukturo, ki spominja na prekurzorsko miRNA. Na strukturo se veže HYL1, ki posledično ne more sodelovati v kompleksu procesiranja miRNA. Pri rastlinah, ki izražajo SB1 SINE, so pogoste okvare v razvoju in akumulaciji miRNA. Ta fenotip lahko povežemo z ektopičnim prekomernim izražanjem SINE, vendar pa kaže tudi na vpliv TE pri tvorbi miRNA v specifičnih razvojnih fazah in okoljskih razmerah.

Prepisi, ki izvirajo iz retrotranspozona LINE, vplivajo na preoblikovanje kromatina in tako uravnavajo transkripcijsko aktivnost tarčnih genov. Pri sesalcih lahko prepisi LINE1 RNA, locirani na intronih, različno rekrutirajo RNA-vezavne protein (RBP), ki so vključeni v alternativno izrezovanje intronov. lncRNA, ki izvirajo iz evolucijsko mladih LINE1 in so locirani daleč od eksonov, preferenčno prepoznajo zaviralne RBP. Starejši LINE, ki so locirani bližje eksonom, pa preferenčno vežejo RBP, ki spodbujajo procesiranje RNA in sodelujejo pri tkivno specifičnem alternativnem izrezovanju intronov.

'''Dolge nekodirajoče RNA, ki izvirajo iz TE, kot potencialni regulatorji konformacije kromatina'''

Biosintezne poti številnih rastlinskih produktov vključujejo gene organizirane v skupke. Takšna organizacija genoma naj bi izvirala iz podvojevanja genov, njihove premestitve in neofunkcionalizacije. Pri ''Arabidopsis'' se biosintetski skupki genov pojavljajo v regijah genoma bogatih s TE, s TE uravnana rekombinacija pa sodeluje pri njihovi tvorbi in koregulaciji. Obširna analiza rastlinskih genomov je pokazala vlogo transpozicije MITE pri tvorbi biosintetskih skupkov pri evdikotih.

Nekatere lncRNA preko komplementanosti zaporedij tvorijo DNA-RNA duplekse (R-zanke) in sprožijo transkripcijsko samozaviranje ali alternativno izrezovanje. lncRNA AUXIN-REGULATED PROMOTER LOOP (APOLO) prepozna več neodvisnih tarčnih lokusov znotraj genoma ''Arabidopsis''. S tvorbo R-zanke zvabi LIKEHETEROCHROMATIN PROTEIN 1
(LHP1) stran od kromatina in tako uravnava njegovo lokalno 3D konformacijo.

lncRNA, ki izvira iz MITE, z insercijo v bližino kodirajočega gena, regulira 3D konformacijo kromatina, kar v odvisnosti od celičnega tipa, uravnava transkripcijsko aktivnost sosednjih genov. V listih tvorba znotrajgenske zanke zavira transkripcijo gena HaWRKY6, kromatinska zanka v kličnih listih pa omogoča učinkovito recikliranje RNAPII in tako povečuje transkripcijo HaWRKY6. Podobno deluje tudi epigenetsko utišanje represorja cvetenja FLOWERING LOCUS C (FLC) med vernalizacijo. Izpostavitev mrazu inducira lncRNA COLDWRAP, ki posredno povzroči kompaktiranje kromatina, kar služi kot točka sidranja pri tvorbi znotrajgenske kromatinske zanke med promotorjem in 3' koncem prvega introna. Nastala zanka ovira procesivnost RNAPII, in povzroči epigenetsko utišanje FLC.

==Zaključek==

V zadnjih desetletjih so identificirali pomembno vlogo ncRNA pri uravnavanju izražanja genov na različnih nivojih. Identifikacija in karakterizacija ncRNA sta ključni pri razumevanju njihove vloge v adaptivni evoluciji. Boljše razumevanje dinamične akumulacije s TE povezanih smRNA in lncRNA kot odziv na zunanje dražljaje pa bo osvetlilo pomen nekodirajočega genoma pri medsebojnem vplivu med rastlino in okoljem. TE, ki so jih do nedavnega opisovali kot sebično DNA, niso spremenili svoje narave, šele zdaj pa začenjamo razumevati njihovo funkcijo v genomu.

==Viri in literatura==

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Funkcije nekodirajoče RNA, ki je po izvoru transpozonska

2022-05-01T12:17:39Z

Gaja Starc: /* Zaključek */

==Uvod==

Transpozicijski elementi (TE) predstavljajo pomemben dejavnik genomske kompleksnosti evkariontov. Pomembni so zaradi funkcije premikanja po DNA, ki pomembno vpliva na evolucijsko ločevanje organizmov, kratkoročno pa lahko predstavlja genomsko nestabilnost. Vplivajo tudi na aktivnost transkripcije genov v njihovi bližini s spreminjanjem njihovih epigenetskih značilnosti ali položaja regulatornih elementov.

V našem seminarju se bomo osredotočili na TE, ki predstavljajo izvor funkcionalnih dolgih ali kratkih nekodirajočih RNA pri rastlinah. Njihova funkcija je povezana s trans regulacijo aktivnosti genov na transkripcijskem in post-transkripcijskem nivoju. ''Trans'' regulacija je delovanje molekul na oddaljene dele genoma preko drugih, vmesnih molekul. Dolge nekodirajoče RNA iz TE spreminjajo izražanje genov z vezavo na proteine, razgrajevanjem majhnih RNA in tvorbo dupleksov z DNA ali RNA.

TE se lahko nahajajo v nekodirajočih delih DNA, kjer običajno nimajo večjega učinka, ali pa v neposredni bližini genov. Slednji močno vplivajo na nivo transkripcije bližnjih genov. Poleg tega lahko TE vplivajo na epigenetske značilnosti bližnjih regij DNA in tako dodatno vplivajo na izražanje genov. Zato so rastline razvile številne mehanizme za zmanjševanje vpliva TE na ali v bližini genov in omejitev traspozicijskih premikov na ta mesta.

TE so pomemben izvor nekodirajočih RNA. Pri rastlinah so to predvsem dolge in kratke nekodirajoče RNA (lncRNA, smRNA), ki predstavljajo glavni regulator izražanja genov. lncRNA molekule večinoma nastanejo s pomočjo encima RNA polimeraza II (RNAPII) alternativno pa z rastlinsko specifičnimi polimerazami (RNAPIV, RNAPV). lncRNA molekule z interakcijami s proteini, DNA ali RNA utišajo izražanje genov na nivoju transkripcije. Druga možnost je, da lncRNA prepoznajo specifičen DICER protein, ki tvori več smRNA, ki sodelujejo pri utišanju genov.

==Aktivne majhne RNA, ki so po izvoru transpozonske==

'''Po izvoru transpozonske male interferenčne RNA (siRNA), ki povzročijo metilacijo DNA in nastanek heterokromatina na mestih TE ter utišajo njihovo transkripcijo (het-siRNA)'''

V normalnih pogojih je večina TE utišanih z metilacijo. Mehanizem metilacije je od RNA odvisna DNA metilacija (RdDM). Začne se, ko od RNA odvisna RNA polimeraza 2 (RDR2) prepozna na novo nastale RNA iz TE, nastale z delovanjem encima RNAPIV in jih spremni v dsRNA molekule. Protein DICER - LIKE 3 (DCL3) jih nato procesira v 24 nt siRNA, prenese v citoplazmo in naloži na ARGONAUTE4 (AGO4) ali na AGO3 in AGO6 proteine. AGO4 s siRNA molekulami se vrne v jedro, tam prepozna RNAPV transkripte s komplementarnim zaporedjem. Po interakciji teh dveh RNA zaporedij se na kompleks veže posebna DNA metiltransferaza (DOMAINS REARRANGED METHYTRANSFERASE 2, DRM2). Ta povzroči metilacijo TE, iz katerih te RNA izvirajo. Posledica tega je kondenzacija kromatina in trajno utišanje TE. Pri utišanju sodeluje tudi DNA topoizomeraza 1α, encim, ki spreminja topologijo DNA. V tem procesu olajša tvorbo lncRNA molekul z RNAPV, približanje in vezavo AGO4 ter metilacijo H3K9 (H3K9me2). To nakazuje, da tudi organizacija DNA vpliva na utišanje TE. Ta mehanizem utišanja je za rastline pomemben kot odgovor na stres in za prenos epigenetskih informacij na potomce. Večkrat se zgodi, da se TE vrine v ali v bližino gena. Če na te TE deluje RdDM, se poleg TE metilirajo tudi ti geni. Metilacija po navadi predstavlja utišanje genov, zato lahko predstavlja težavo pri preživetju rastline.

Het-siRNA lahko delujejo ''trans''. Pri ''Arabidopsis thaliana'' se v normalnih pogojih sintetizirajo het-siRNA molekule iz pericentromernih TE. Te prepoznajo in utišajo oddaljene gene za proteine, ki ob okužbi prepoznajo molekule pogosto prisotne v patogenih (PATTERN RECOGNITION RECEPTORS, PRRs) in proteine vnetnega odziva ter prirojenega imunskega odziva (NUCLEOTIDE-BINDING LEUCIN-RICH REPEAT PROTEINS, NLRs). Ob okužbi s ''Pseudomonas syringae'' (Gram negativna bakterija), pride najprej do povišanega izražanja pericentromernih TE. Sledi RdDM, poveazana z akumulacijo het-siRNA, ki metilacijo usmerjajo na izvorne TE. To povzroči zmanjšanje represije obrambnih genov in večjo odpornost na patogen.

'''Epigenetsko aktivne siRNA (easiRNA), ki izvirajo iz TE in delujejo ''trans'''''

Pri Arabidopsis je večina TE epigenetsko utišanih s 24 nt het-siRNA. Aktivacija prepisovanja utišanih TE se odraža v nastanku 21-22 nt easiRNA. Pri tem 21 nt miRNA, ki je naložena na AGO1, sproži cepitev TE prepisa, kar omogoči združitev kompleksa RDR6/SGS3. Ta kompleks pomaga prepoznati mRNA prepis TE in nastanek dsRNA. DLC2 in DLC4 nato omogočita procesiranje dsRNA, kar je ključno za nastanek 21-22 nt easiRNA. easiRNA, naložene na AGO1, lahko nato sodelujejo pri utišanju tarčne mRNA ali TE prepisa na post-transkripcijskem nivoju. Druga možnost je, da AGO2 naloži 21-22 nt easiRNA, kar sproži netipično od proteina NERD odvisno RdDM TGS (ang. transcriptional gene silencing) pot. V primeru, ko AGO6 naloži easiRNA, pa to sproži značilno RdDM, ki vodi v utišanje TE.

'''TE kot vir novih smRNA'''

Majhne obrnjene ponovitve TE (MITE) so kratki neavtonomni TE s končnimi regijami obrnjenih ponovitev. Ti elementi, ki so bili najprej opisani v rastlinah, so pretežno vstavljeni v z geni bogate regije in navadno vplivajo na izražanje sosednjih genov. Poleg regulacije izražanja genov z insercijo ali epigenetskimi modifikacijami, lahko MITE postane vir smRNA. MITE med transkripcijo proizvedejo komplementarno RNA, ki se lahko zvije v steblo-zanka podobno sekundarno strukturo, ki je dovzetna za procesiranje z DCL3. V tem primeru pride do procesiranja lncRNA s strani DCL3 v 24 nt het-siRNA molekule, ki po običajni poti sprožijo metilacijo cis ali trans, kar povzroči epigenetsko utišanje tarčnega lokusa. V rižu se od DCL3 odvisna 24 nt smRNA, ki izvira iz MITE, akumulira zaradi abiotskega stresa, kar pozitivno regulira ABA (abscizinska kislina) signaliziranje in odziv na stres.

Mutacije v zaporedju MITE vodijo tudi do nepopolnih struktur steblo-zanka, kar je lastnost miRNA prekurzorjev. To je spodbudilo razmišljanje, da so MITE verjeten evolucijski izvor miRNA lokusa. To podpira dejstvo, da se novonastale miRNA vežejo na MITE in druge TE lokuse, kar bi razložilo, zakaj se nekateri prekurzorji miRNA procesirajo tako v 21 nt kot 24 nt zvrsti. Ta ideja je dodatno podprta z ugotovitvijo, da lahko nekateri prekurzorji miRNA, ki jih prepozna DCL3, proizvajajo 24 nt siRNA in inducirajo metilacijo svojih ali tujih lokusov, kar kaže na izvor iz TE. Nadaljnja analiza potencialnega izvora miRNA genov iz TE je pokazala, da so MITE zelo dovzetne za udomačitev v miRNA prekurzorje. Spreminjanje miRNA v odvisnosti od MITE lahko tako predstavlja novosti v odzivu rastlin na razne patogene.

==Aktivne dolge nekodirajoče RNA (lncRNA), ki so po izvoru transpozonske==

'''TE kot vir fiziološko aktivnih lncRNA'''

Z RNA sekvenciranjem pri koruzi so identificirali več kot 23 000 možnih lncRNA. Okoli 65 % izmed njih je kazalo podobnost s TE, temeljito opazovanje TE in lncRNA v 40 vrstah rastlin pa je razkrilo več kot 14 000 prekrivanj med lncRNA lokusi in TE. lncRNA, ki izvirajo iz TE, so večinoma povezane z retrotranspozoni in povečanim številom le-teh v genomu. Aktivirane lncRNA se pretežno prepisujejo iz demetiliranih TE regij, zlasti iz dolgih vmesnih jedrnih elementov (LINEs), ki so del retrotranspozonov.

Mnoge izmed lncRNA, ki izvirajo iz TE, so prepisno odzivne na sol, ABA in mraz. Različno izražanje lncRNA naj bi bilo povezano z dinamiko metilacije DNA, ki omogoča neofunkcionalizacijo nekodirajočih prepisov. Dokazali so, da je znotraj vrste ''Arabidopsis'' transkripcija velikega števila lncRNA odvisna od ekotipa. Zbirka lncRNA rastline, ki je direktno odvisna od prepisne aktivnosti TE, pa predstavlja značilnosti nedavnega razhajanja med vrstami ali celo znotraj iste vrste.

'''Dolge nekodirajoče RNA, ki izvirajo iz TE, kot regulatorji majhnih RNA in proteinov'''

TE sodelujejo pri tvorbi smRNA, lahko pa zavirajo njihovo aktivnost. MIKKI, nekodirajoč prepis retrotranspozonskega izvora, ki se aktivno prepisuje v koreninah riža, vsebuje nepopolno tarčno mesto miRNA171. miRNA171 destabilizira mRNA, ki zapisujejo za družino SCARECROW-u podobnih transkripcijskh faktorjev specifičnih za korenine. MIKKI deluje kot miRNA vaba - vsebuje vezavna mesta za miRNA in povzroči njeno degradacijo. S svojim delovanjem povzroči kopičenje SCARECROW-u podobnih mRNA v koreninah in tako spodbuja pravilen razvoj korenin. Medgenska lncRNA INDUCED BY PHOSPHATE STARVATION 1 (IPS1) pri ''Arabidopsis'' je komplementarna s pomanjkanjem fosfata inducirani miRNA399, vključuje pa neujemajočo zanko na pričakovanem miRNA cepitvenem mestu, ki preprečuje razgradnjo IPS1 in ga pretvori v vabo za miRNA399.

lncRNA, ki izvirajo iz TE, lahko uravnavajo izražanje genov preko interakcije s proteini. Kratek razpršeni jedrni element SB1 (SB1 SINE) pri oljni ogrščici uravnava biogenezo miRNA z destabilizacijo dsRNA vezavnega proteina HYPONASTIC LEAVES1 (HYL1). Po transkripciji se SB1 prepis, ki izvira iz SINE, zvije v lasnično sekundarno strukturo, ki spominja na prekurzorsko miRNA. Na strukturo se veže HYL1, ki posledično ne more sodelovati v kompleksu procesiranja miRNA. Pri rastlinah, ki izražajo SB1 SINE, so pogoste okvare v razvoju in akumulaciji miRNA. Ta fenotip lahko povežemo z ektopičnim prekomernim izražanjem SINE, vendar pa kaže tudi na vpliv TE pri tvorbi miRNA v specifičnih razvojnih fazah in okoljskih razmerah.

Prepisi, ki izvirajo iz retrotranspozona LINE, vplivajo na preoblikovanje kromatina in tako uravnavajo transkripcijsko aktivnost tarčnih genov. Pri sesalcih lahko prepisi LINE1 RNA, locirani na intronih, različno rekrutirajo RNA-vezavne protein (RBP), ki so vključeni v alternativno izrezovanje intronov. lncRNA, ki izvirajo iz evolucijsko mladih LINE1 in so locirani daleč od eksonov, preferenčno prepoznajo zaviralne RBP. Starejši LINE, ki so locirani bližje eksonom, pa preferenčno vežejo RBP, ki spodbujajo procesiranje RNA in sodelujejo pri tkivno specifičnem alternativnem izrezovanju intronov.

'''Dolge nekodirajoče RNA, ki izvirajo iz TE, kot potencialni regulatorji konformacije kromatina'''

Biosintezne poti številnih rastlinskih produktov vključujejo gene organizirane v skupke. Takšna organizacija genoma naj bi izvirala iz podvojevanja genov, njihove premestitve in neofunkcionalizacije. Pri ''Arabidopsis'' se biosintetski skupki genov pojavljajo v regijah genoma bogatih s TE, s TE uravnana rekombinacija pa sodeluje pri njihovi tvorbi in koregulaciji. Obširna analiza rastlinskih genomov je pokazala vlogo transpozicije MITE pri tvorbi biosintetskih skupkov pri evdikotih.

Nekatere lncRNA preko komplementanosti zaporedij tvorijo DNA-RNA duplekse (R-zanke) in sprožijo transkripcijsko samozaviranje ali alternativno izrezovanje. lncRNA AUXIN-REGULATED PROMOTER LOOP (APOLO) prepozna več neodvisnih tarčnih lokusov znotraj genoma ''Arabidopsis''. S tvorbo R-zanke zvabi LIKEHETEROCHROMATIN PROTEIN 1
(LHP1) stran od kromatina in tako uravnava njegovo lokalno 3D konformacijo.

lncRNA, ki izvira iz MITE, z insercijo v bližino kodirajočega gena, regulira 3D konformacijo kromatina, kar v odvisnosti od celičnega tipa, uravnava transkripcijsko aktivnost sosednjih genov. V listih tvorba znotrajgenske zanke zavira transkripcijo gena HaWRKY6, kromatinska zanka v kličnih listih pa omogoča učinkovito recikliranje RNAPII in tako povečuje transkripcijo HaWRKY6. Podobno deluje tudi epigenetsko utišanje represorja cvetenja FLOWERING LOCUS C (FLC) med vernalizacijo. Izpostavitev mrazu inducira lncRNA COLDWRAP, ki posredno povzroči kompaktiranje kromatina, kar služi kot točka sidranja pri tvorbi znotrajgenske kromatinske zanke med promotorjem in 3' koncem prvega introna. Nastala zanka ovira procesivnost RNAPII, in povzroči epigenetsko utišanje FLC.

==Zaključek==

V zadnjih desetletjih so identificirali pomembno vlogo ncRNA pri uravnavanju izražanja genov na različnih nivojih. Identifikacija in karakterizacija ncRNA sta ključni pri razumevanju njihove vloge v adaptivni evoluciji. Boljše razumevanje dinamične akumulacije s TE povezanih smRNA in lncRNA kot odziv na zunanje dražljaje pa bo osvetlilo pomen nekodirajočega genoma pri medsebojnem vplivu med rastlino in okoljem. TE, ki so jih do nedavnega opisovali kot sebično DNA, niso spremenili svoje narave, šele zdaj pa začenjamo razumevati njihovo funkcijo v genomu.

==Viri in literatura==

Funkcije nekodirajoče RNA, ki je po izvoru transpozonska

2022-05-01T12:14:39Z

Gaja Starc: /* Aktivne dolge nekodirajoče RNA (lncRNA), ki so po izvoru transpozonske */

==Uvod==

Transpozicijski elementi (TE) predstavljajo pomemben dejavnik genomske kompleksnosti evkariontov. Pomembni so zaradi funkcije premikanja po DNA, ki pomembno vpliva na evolucijsko ločevanje organizmov, kratkoročno pa lahko predstavlja genomsko nestabilnost. Vplivajo tudi na aktivnost transkripcije genov v njihovi bližini s spreminjanjem njihovih epigenetskih značilnosti ali položaja regulatornih elementov.

V našem seminarju se bomo osredotočili na TE, ki predstavljajo izvor funkcionalnih dolgih ali kratkih nekodirajočih RNA pri rastlinah. Njihova funkcija je povezana s trans regulacijo aktivnosti genov na transkripcijskem in post-transkripcijskem nivoju. ''Trans'' regulacija je delovanje molekul na oddaljene dele genoma preko drugih, vmesnih molekul. Dolge nekodirajoče RNA iz TE spreminjajo izražanje genov z vezavo na proteine, razgrajevanjem majhnih RNA in tvorbo dupleksov z DNA ali RNA.

TE se lahko nahajajo v nekodirajočih delih DNA, kjer običajno nimajo večjega učinka, ali pa v neposredni bližini genov. Slednji močno vplivajo na nivo transkripcije bližnjih genov. Poleg tega lahko TE vplivajo na epigenetske značilnosti bližnjih regij DNA in tako dodatno vplivajo na izražanje genov. Zato so rastline razvile številne mehanizme za zmanjševanje vpliva TE na ali v bližini genov in omejitev traspozicijskih premikov na ta mesta.

TE so pomemben izvor nekodirajočih RNA. Pri rastlinah so to predvsem dolge in kratke nekodirajoče RNA (lncRNA, smRNA), ki predstavljajo glavni regulator izražanja genov. lncRNA molekule večinoma nastanejo s pomočjo encima RNA polimeraza II (RNAPII) alternativno pa z rastlinsko specifičnimi polimerazami (RNAPIV, RNAPV). lncRNA molekule z interakcijami s proteini, DNA ali RNA utišajo izražanje genov na nivoju transkripcije. Druga možnost je, da lncRNA prepoznajo specifičen DICER protein, ki tvori več smRNA, ki sodelujejo pri utišanju genov.

==Aktivne majhne RNA, ki so po izvoru transpozonske==

'''Po izvoru transpozonske male interferenčne RNA (siRNA), ki povzročijo metilacijo DNA in nastanek heterokromatina na mestih TE ter utišajo njihovo transkripcijo (het-siRNA)'''

V normalnih pogojih je večina TE utišanih z metilacijo. Mehanizem metilacije je od RNA odvisna DNA metilacija (RdDM). Začne se, ko od RNA odvisna RNA polimeraza 2 (RDR2) prepozna na novo nastale RNA iz TE, nastale z delovanjem encima RNAPIV in jih spremni v dsRNA molekule. Protein DICER - LIKE 3 (DCL3) jih nato procesira v 24 nt siRNA, prenese v citoplazmo in naloži na ARGONAUTE4 (AGO4) ali na AGO3 in AGO6 proteine. AGO4 s siRNA molekulami se vrne v jedro, tam prepozna RNAPV transkripte s komplementarnim zaporedjem. Po interakciji teh dveh RNA zaporedij se na kompleks veže posebna DNA metiltransferaza (DOMAINS REARRANGED METHYTRANSFERASE 2, DRM2). Ta povzroči metilacijo TE, iz katerih te RNA izvirajo. Posledica tega je kondenzacija kromatina in trajno utišanje TE. Pri utišanju sodeluje tudi DNA topoizomeraza 1α, encim, ki spreminja topologijo DNA. V tem procesu olajša tvorbo lncRNA molekul z RNAPV, približanje in vezavo AGO4 ter metilacijo H3K9 (H3K9me2). To nakazuje, da tudi organizacija DNA vpliva na utišanje TE. Ta mehanizem utišanja je za rastline pomemben kot odgovor na stres in za prenos epigenetskih informacij na potomce. Večkrat se zgodi, da se TE vrine v ali v bližino gena. Če na te TE deluje RdDM, se poleg TE metilirajo tudi ti geni. Metilacija po navadi predstavlja utišanje genov, zato lahko predstavlja težavo pri preživetju rastline.

Het-siRNA lahko delujejo ''trans''. Pri ''Arabidopsis thaliana'' se v normalnih pogojih sintetizirajo het-siRNA molekule iz pericentromernih TE. Te prepoznajo in utišajo oddaljene gene za proteine, ki ob okužbi prepoznajo molekule pogosto prisotne v patogenih (PATTERN RECOGNITION RECEPTORS, PRRs) in proteine vnetnega odziva ter prirojenega imunskega odziva (NUCLEOTIDE-BINDING LEUCIN-RICH REPEAT PROTEINS, NLRs). Ob okužbi s ''Pseudomonas syringae'' (Gram negativna bakterija), pride najprej do povišanega izražanja pericentromernih TE. Sledi RdDM, poveazana z akumulacijo het-siRNA, ki metilacijo usmerjajo na izvorne TE. To povzroči zmanjšanje represije obrambnih genov in večjo odpornost na patogen.

'''Epigenetsko aktivne siRNA (easiRNA), ki izvirajo iz TE in delujejo ''trans'''''

Pri Arabidopsis je večina TE epigenetsko utišanih s 24 nt het-siRNA. Aktivacija prepisovanja utišanih TE se odraža v nastanku 21-22 nt easiRNA. Pri tem 21 nt miRNA, ki je naložena na AGO1, sproži cepitev TE prepisa, kar omogoči združitev kompleksa RDR6/SGS3. Ta kompleks pomaga prepoznati mRNA prepis TE in nastanek dsRNA. DLC2 in DLC4 nato omogočita procesiranje dsRNA, kar je ključno za nastanek 21-22 nt easiRNA. easiRNA, naložene na AGO1, lahko nato sodelujejo pri utišanju tarčne mRNA ali TE prepisa na post-transkripcijskem nivoju. Druga možnost je, da AGO2 naloži 21-22 nt easiRNA, kar sproži netipično od proteina NERD odvisno RdDM TGS (ang. transcriptional gene silencing) pot. V primeru, ko AGO6 naloži easiRNA, pa to sproži značilno RdDM, ki vodi v utišanje TE.

'''TE kot vir novih smRNA'''

Majhne obrnjene ponovitve TE (MITE) so kratki neavtonomni TE s končnimi regijami obrnjenih ponovitev. Ti elementi, ki so bili najprej opisani v rastlinah, so pretežno vstavljeni v z geni bogate regije in navadno vplivajo na izražanje sosednjih genov. Poleg regulacije izražanja genov z insercijo ali epigenetskimi modifikacijami, lahko MITE postane vir smRNA. MITE med transkripcijo proizvedejo komplementarno RNA, ki se lahko zvije v steblo-zanka podobno sekundarno strukturo, ki je dovzetna za procesiranje z DCL3. V tem primeru pride do procesiranja lncRNA s strani DCL3 v 24 nt het-siRNA molekule, ki po običajni poti sprožijo metilacijo cis ali trans, kar povzroči epigenetsko utišanje tarčnega lokusa. V rižu se od DCL3 odvisna 24 nt smRNA, ki izvira iz MITE, akumulira zaradi abiotskega stresa, kar pozitivno regulira ABA (abscizinska kislina) signaliziranje in odziv na stres.

Mutacije v zaporedju MITE vodijo tudi do nepopolnih struktur steblo-zanka, kar je lastnost miRNA prekurzorjev. To je spodbudilo razmišljanje, da so MITE verjeten evolucijski izvor miRNA lokusa. To podpira dejstvo, da se novonastale miRNA vežejo na MITE in druge TE lokuse, kar bi razložilo, zakaj se nekateri prekurzorji miRNA procesirajo tako v 21 nt kot 24 nt zvrsti. Ta ideja je dodatno podprta z ugotovitvijo, da lahko nekateri prekurzorji miRNA, ki jih prepozna DCL3, proizvajajo 24 nt siRNA in inducirajo metilacijo svojih ali tujih lokusov, kar kaže na izvor iz TE. Nadaljnja analiza potencialnega izvora miRNA genov iz TE je pokazala, da so MITE zelo dovzetne za udomačitev v miRNA prekurzorje. Spreminjanje miRNA v odvisnosti od MITE lahko tako predstavlja novosti v odzivu rastlin na razne patogene.

==Aktivne dolge nekodirajoče RNA (lncRNA), ki so po izvoru transpozonske==

'''TE kot vir fiziološko aktivnih lncRNA'''

Z RNA sekvenciranjem pri koruzi so identificirali več kot 23 000 možnih lncRNA. Okoli 65 % izmed njih je kazalo podobnost s TE, temeljito opazovanje TE in lncRNA v 40 vrstah rastlin pa je razkrilo več kot 14 000 prekrivanj med lncRNA lokusi in TE. lncRNA, ki izvirajo iz TE, so večinoma povezane z retrotranspozoni in povečanim številom le-teh v genomu. Aktivirane lncRNA se pretežno prepisujejo iz demetiliranih TE regij, zlasti iz dolgih vmesnih jedrnih elementov (LINEs), ki so del retrotranspozonov.

Mnoge izmed lncRNA, ki izvirajo iz TE, so prepisno odzivne na sol, ABA in mraz. Različno izražanje lncRNA naj bi bilo povezano z dinamiko metilacije DNA, ki omogoča neofunkcionalizacijo nekodirajočih prepisov. Dokazali so, da je znotraj vrste ''Arabidopsis'' transkripcija velikega števila lncRNA odvisna od ekotipa. Zbirka lncRNA rastline, ki je direktno odvisna od prepisne aktivnosti TE, pa predstavlja značilnosti nedavnega razhajanja med vrstami ali celo znotraj iste vrste.

'''Dolge nekodirajoče RNA, ki izvirajo iz TE, kot regulatorji majhnih RNA in proteinov'''

TE sodelujejo pri tvorbi smRNA, lahko pa zavirajo njihovo aktivnost. MIKKI, nekodirajoč prepis retrotranspozonskega izvora, ki se aktivno prepisuje v koreninah riža, vsebuje nepopolno tarčno mesto miRNA171. miRNA171 destabilizira mRNA, ki zapisujejo za družino SCARECROW-u podobnih transkripcijskh faktorjev specifičnih za korenine. MIKKI deluje kot miRNA vaba - vsebuje vezavna mesta za miRNA in povzroči njeno degradacijo. S svojim delovanjem povzroči kopičenje SCARECROW-u podobnih mRNA v koreninah in tako spodbuja pravilen razvoj korenin. Medgenska lncRNA INDUCED BY PHOSPHATE STARVATION 1 (IPS1) pri ''Arabidopsis'' je komplementarna s pomanjkanjem fosfata inducirani miRNA399, vključuje pa neujemajočo zanko na pričakovanem miRNA cepitvenem mestu, ki preprečuje razgradnjo IPS1 in ga pretvori v vabo za miRNA399.

lncRNA, ki izvirajo iz TE, lahko uravnavajo izražanje genov preko interakcije s proteini. Kratek razpršeni jedrni element SB1 (SB1 SINE) pri oljni ogrščici uravnava biogenezo miRNA z destabilizacijo dsRNA vezavnega proteina HYPONASTIC LEAVES1 (HYL1). Po transkripciji se SB1 prepis, ki izvira iz SINE, zvije v lasnično sekundarno strukturo, ki spominja na prekurzorsko miRNA. Na strukturo se veže HYL1, ki posledično ne more sodelovati v kompleksu procesiranja miRNA. Pri rastlinah, ki izražajo SB1 SINE, so pogoste okvare v razvoju in akumulaciji miRNA. Ta fenotip lahko povežemo z ektopičnim prekomernim izražanjem SINE, vendar pa kaže tudi na vpliv TE pri tvorbi miRNA v specifičnih razvojnih fazah in okoljskih razmerah.

Prepisi, ki izvirajo iz retrotranspozona LINE, vplivajo na preoblikovanje kromatina in tako uravnavajo transkripcijsko aktivnost tarčnih genov. Pri sesalcih lahko prepisi LINE1 RNA, locirani na intronih, različno rekrutirajo RNA-vezavne protein (RBP), ki so vključeni v alternativno izrezovanje intronov. lncRNA, ki izvirajo iz evolucijsko mladih LINE1 in so locirani daleč od eksonov, preferenčno prepoznajo zaviralne RBP. Starejši LINE, ki so locirani bližje eksonom, pa preferenčno vežejo RBP, ki spodbujajo procesiranje RNA in sodelujejo pri tkivno specifičnem alternativnem izrezovanju intronov.

'''Dolge nekodirajoče RNA, ki izvirajo iz TE, kot potencialni regulatorji konformacije kromatina'''

Biosintezne poti številnih rastlinskih produktov vključujejo gene organizirane v skupke. Takšna organizacija genoma naj bi izvirala iz podvojevanja genov, njihove premestitve in neofunkcionalizacije. Pri ''Arabidopsis'' se biosintetski skupki genov pojavljajo v regijah genoma bogatih s TE, s TE uravnana rekombinacija pa sodeluje pri njihovi tvorbi in koregulaciji. Obširna analiza rastlinskih genomov je pokazala vlogo transpozicije MITE pri tvorbi biosintetskih skupkov pri evdikotih.

Nekatere lncRNA preko komplementanosti zaporedij tvorijo DNA-RNA duplekse (R-zanke) in sprožijo transkripcijsko samozaviranje ali alternativno izrezovanje. lncRNA AUXIN-REGULATED PROMOTER LOOP (APOLO) prepozna več neodvisnih tarčnih lokusov znotraj genoma ''Arabidopsis''. S tvorbo R-zanke zvabi LIKEHETEROCHROMATIN PROTEIN 1
(LHP1) stran od kromatina in tako uravnava njegovo lokalno 3D konformacijo.

lncRNA, ki izvira iz MITE, z insercijo v bližino kodirajočega gena, regulira 3D konformacijo kromatina, kar v odvisnosti od celičnega tipa, uravnava transkripcijsko aktivnost sosednjih genov. V listih tvorba znotrajgenske zanke zavira transkripcijo gena HaWRKY6, kromatinska zanka v kličnih listih pa omogoča učinkovito recikliranje RNAPII in tako povečuje transkripcijo HaWRKY6. Podobno deluje tudi epigenetsko utišanje represorja cvetenja FLOWERING LOCUS C (FLC) med vernalizacijo. Izpostavitev mrazu inducira lncRNA COLDWRAP, ki posredno povzroči kompaktiranje kromatina, kar služi kot točka sidranja pri tvorbi znotrajgenske kromatinske zanke med promotorjem in 3' koncem prvega introna. Nastala zanka ovira procesivnost RNAPII, in povzroči epigenetsko utišanje FLC.

==Zaključek==

V zadnjih desetletjih so identificirali pomembno vlogo ncRNA pri uravnavanju izražanja genov na različnih nivojih. Identifikacija in karakterizacija ncRNA sta ključni pri razumevanju njihove vloge v adaptivni evoluciji. Boljše razumevanje dinamične akumulacije s TE povezanih smRNA in lncRNA kot odziv na zunanje dražljaje pa bo osvetlilo pomen nekodirajočega genoma pri medsebojnem vplivu med rastlino in okoljem. TE, ki so jih do nedavnega opisovali kot sebično DNA, niso spremenili svoje narave, šele zdaj pa začenjamo razumevati njihovo funkcijo v genomu.

Funkcije nekodirajoče RNA, ki je po izvoru transpozonska

2022-05-01T12:12:29Z

Gaja Starc: /* Aktivne dolge nekodirajoče RNA (lncRNA), ki so po izvoru transpozonske */

==Uvod==

Transpozicijski elementi (TE) predstavljajo pomemben dejavnik genomske kompleksnosti evkariontov. Pomembni so zaradi funkcije premikanja po DNA, ki pomembno vpliva na evolucijsko ločevanje organizmov, kratkoročno pa lahko predstavlja genomsko nestabilnost. Vplivajo tudi na aktivnost transkripcije genov v njihovi bližini s spreminjanjem njihovih epigenetskih značilnosti ali položaja regulatornih elementov.

V našem seminarju se bomo osredotočili na TE, ki predstavljajo izvor funkcionalnih dolgih ali kratkih nekodirajočih RNA pri rastlinah. Njihova funkcija je povezana s trans regulacijo aktivnosti genov na transkripcijskem in post-transkripcijskem nivoju. ''Trans'' regulacija je delovanje molekul na oddaljene dele genoma preko drugih, vmesnih molekul. Dolge nekodirajoče RNA iz TE spreminjajo izražanje genov z vezavo na proteine, razgrajevanjem majhnih RNA in tvorbo dupleksov z DNA ali RNA.

TE se lahko nahajajo v nekodirajočih delih DNA, kjer običajno nimajo večjega učinka, ali pa v neposredni bližini genov. Slednji močno vplivajo na nivo transkripcije bližnjih genov. Poleg tega lahko TE vplivajo na epigenetske značilnosti bližnjih regij DNA in tako dodatno vplivajo na izražanje genov. Zato so rastline razvile številne mehanizme za zmanjševanje vpliva TE na ali v bližini genov in omejitev traspozicijskih premikov na ta mesta.

TE so pomemben izvor nekodirajočih RNA. Pri rastlinah so to predvsem dolge in kratke nekodirajoče RNA (lncRNA, smRNA), ki predstavljajo glavni regulator izražanja genov. lncRNA molekule večinoma nastanejo s pomočjo encima RNA polimeraza II (RNAPII) alternativno pa z rastlinsko specifičnimi polimerazami (RNAPIV, RNAPV). lncRNA molekule z interakcijami s proteini, DNA ali RNA utišajo izražanje genov na nivoju transkripcije. Druga možnost je, da lncRNA prepoznajo specifičen DICER protein, ki tvori več smRNA, ki sodelujejo pri utišanju genov.

==Aktivne majhne RNA, ki so po izvoru transpozonske==

'''Po izvoru transpozonske male interferenčne RNA (siRNA), ki povzročijo metilacijo DNA in nastanek heterokromatina na mestih TE ter utišajo njihovo transkripcijo (het-siRNA)'''

V normalnih pogojih je večina TE utišanih z metilacijo. Mehanizem metilacije je od RNA odvisna DNA metilacija (RdDM). Začne se, ko od RNA odvisna RNA polimeraza 2 (RDR2) prepozna na novo nastale RNA iz TE, nastale z delovanjem encima RNAPIV in jih spremni v dsRNA molekule. Protein DICER - LIKE 3 (DCL3) jih nato procesira v 24 nt siRNA, prenese v citoplazmo in naloži na ARGONAUTE4 (AGO4) ali na AGO3 in AGO6 proteine. AGO4 s siRNA molekulami se vrne v jedro, tam prepozna RNAPV transkripte s komplementarnim zaporedjem. Po interakciji teh dveh RNA zaporedij se na kompleks veže posebna DNA metiltransferaza (DOMAINS REARRANGED METHYTRANSFERASE 2, DRM2). Ta povzroči metilacijo TE, iz katerih te RNA izvirajo. Posledica tega je kondenzacija kromatina in trajno utišanje TE. Pri utišanju sodeluje tudi DNA topoizomeraza 1α, encim, ki spreminja topologijo DNA. V tem procesu olajša tvorbo lncRNA molekul z RNAPV, približanje in vezavo AGO4 ter metilacijo H3K9 (H3K9me2). To nakazuje, da tudi organizacija DNA vpliva na utišanje TE. Ta mehanizem utišanja je za rastline pomemben kot odgovor na stres in za prenos epigenetskih informacij na potomce. Večkrat se zgodi, da se TE vrine v ali v bližino gena. Če na te TE deluje RdDM, se poleg TE metilirajo tudi ti geni. Metilacija po navadi predstavlja utišanje genov, zato lahko predstavlja težavo pri preživetju rastline.

Het-siRNA lahko delujejo ''trans''. Pri ''Arabidopsis thaliana'' se v normalnih pogojih sintetizirajo het-siRNA molekule iz pericentromernih TE. Te prepoznajo in utišajo oddaljene gene za proteine, ki ob okužbi prepoznajo molekule pogosto prisotne v patogenih (PATTERN RECOGNITION RECEPTORS, PRRs) in proteine vnetnega odziva ter prirojenega imunskega odziva (NUCLEOTIDE-BINDING LEUCIN-RICH REPEAT PROTEINS, NLRs). Ob okužbi s ''Pseudomonas syringae'' (Gram negativna bakterija), pride najprej do povišanega izražanja pericentromernih TE. Sledi RdDM, poveazana z akumulacijo het-siRNA, ki metilacijo usmerjajo na izvorne TE. To povzroči zmanjšanje represije obrambnih genov in večjo odpornost na patogen.

'''Epigenetsko aktivne siRNA (easiRNA), ki izvirajo iz TE in delujejo ''trans'''''

Pri Arabidopsis je večina TE epigenetsko utišanih s 24 nt het-siRNA. Aktivacija prepisovanja utišanih TE se odraža v nastanku 21-22 nt easiRNA. Pri tem 21 nt miRNA, ki je naložena na AGO1, sproži cepitev TE prepisa, kar omogoči združitev kompleksa RDR6/SGS3. Ta kompleks pomaga prepoznati mRNA prepis TE in nastanek dsRNA. DLC2 in DLC4 nato omogočita procesiranje dsRNA, kar je ključno za nastanek 21-22 nt easiRNA. easiRNA, naložene na AGO1, lahko nato sodelujejo pri utišanju tarčne mRNA ali TE prepisa na post-transkripcijskem nivoju. Druga možnost je, da AGO2 naloži 21-22 nt easiRNA, kar sproži netipično od proteina NERD odvisno RdDM TGS (ang. transcriptional gene silencing) pot. V primeru, ko AGO6 naloži easiRNA, pa to sproži značilno RdDM, ki vodi v utišanje TE.

'''TE kot vir novih smRNA'''

Majhne obrnjene ponovitve TE (MITE) so kratki neavtonomni TE s končnimi regijami obrnjenih ponovitev. Ti elementi, ki so bili najprej opisani v rastlinah, so pretežno vstavljeni v z geni bogate regije in navadno vplivajo na izražanje sosednjih genov. Poleg regulacije izražanja genov z insercijo ali epigenetskimi modifikacijami, lahko MITE postane vir smRNA. MITE med transkripcijo proizvedejo komplementarno RNA, ki se lahko zvije v steblo-zanka podobno sekundarno strukturo, ki je dovzetna za procesiranje z DCL3. V tem primeru pride do procesiranja lncRNA s strani DCL3 v 24 nt het-siRNA molekule, ki po običajni poti sprožijo metilacijo cis ali trans, kar povzroči epigenetsko utišanje tarčnega lokusa. V rižu se od DCL3 odvisna 24 nt smRNA, ki izvira iz MITE, akumulira zaradi abiotskega stresa, kar pozitivno regulira ABA (abscizinska kislina) signaliziranje in odziv na stres.

Mutacije v zaporedju MITE vodijo tudi do nepopolnih struktur steblo-zanka, kar je lastnost miRNA prekurzorjev. To je spodbudilo razmišljanje, da so MITE verjeten evolucijski izvor miRNA lokusa. To podpira dejstvo, da se novonastale miRNA vežejo na MITE in druge TE lokuse, kar bi razložilo, zakaj se nekateri prekurzorji miRNA procesirajo tako v 21 nt kot 24 nt zvrsti. Ta ideja je dodatno podprta z ugotovitvijo, da lahko nekateri prekurzorji miRNA, ki jih prepozna DCL3, proizvajajo 24 nt siRNA in inducirajo metilacijo svojih ali tujih lokusov, kar kaže na izvor iz TE. Nadaljnja analiza potencialnega izvora miRNA genov iz TE je pokazala, da so MITE zelo dovzetne za udomačitev v miRNA prekurzorje. Spreminjanje miRNA v odvisnosti od MITE lahko tako predstavlja novosti v odzivu rastlin na razne patogene.

==Aktivne dolge nekodirajoče RNA (lncRNA), ki so po izvoru transpozonske==

'''TE kot vir fiziološko aktivnih lncRNA'''

Z RNA sekvenciranjem pri koruzi so identificirali več kot 23 000 možnih lncRNA. Okoli 65 % izmed njih je kazalo podobnost s TE, temeljito opazovanje TE in lncRNA v 40 vrstah rastlin pa je razkrilo več kot 14 000 prekrivanj med lncRNA lokusi in TE. lncRNA, ki izvirajo iz TE, so večinoma povezane z retrotranspozoni in povečanim številom le-teh v genomu. Aktivirane lncRNA se pretežno prepisujejo iz demetiliranih TE regij, zlasti iz dolgih vmesnih jedrnih elementov (LINEs), ki so del retrotranspozonov.

Mnoge izmed lncRNA, ki izvirajo iz TE, so prepisno odzivne na sol, ABA in mraz. Različno izražanje lncRNA naj bi bilo povezano z dinamiko metilacije DNA, ki omogoča neofunkcionalizacijo nekodirajočih prepisov. Dokazali so, da je znotraj vrste ''Arabidopsis'' transkripcija velikega števila lncRNA odvisna od ekotipa. Zbirka lncRNA rastline, ki je direktno odvisna od prepisne aktivnosti TE, pa predstavlja značilnosti nedavnega razhajanja med vrstami ali celo znotraj iste vrste.

'''Dolge nekodirajoče RNA, ki izvirajo iz TE, kot regulatorji majhnih RNA in proteinov'''

TE sodelujejo pri tvorbi smRNA, lahko pa zavirajo njihovo aktivnost. MIKKI, nekodirajoč prepis retrotranspozonskega izvora, ki se aktivno prepisuje v koreninah riža, vsebuje nepopolno tarčno mesto miRNA171. miRNA171 destabilizira mRNA, ki zapisujejo za družino SCARECROW-u podobnih transkripcijskh faktorjev specifičnih za korenine. MIKKI deluje kot miRNA vaba - vsebuje vezavna mesta za miRNA in povzroči njeno degradacijo. S svojim delovanjem povzroči kopičenje SCARECROW-u podobnih mRNA v koreninah in tako spodbuja pravilen razvoj korenin. Medgenska lncRNA INDUCED BY PHOSPHATE STARVATION 1 (IPS1) pri ''Arabidopsis'' je komplementarna s pomanjkanjem fosfata inducirani miRNA399, vključuje pa neujemajočo zanko na pričakovanem miRNA cepitvenem mestu, ki preprečuje razgradnjo IPS1 in ga pretvori v vabo za miRNA399.

lncRNA, ki izvirajo iz TE, lahko uravnavajo izražanje genov preko interakcije s proteini. Kratek razpršeni jedrni element SB1 (SB1 SINE) pri oljni ogrščici uravnava biogenezo miRNA z destabilizacijo dsRNA vezavnega proteina HYPONASTIC LEAVES1 (HYL1). Po transkripciji se SB1 prepis, ki izvira iz SINE, zvije v lasnično sekundarno strukturo, ki spominja na prekurzorsko miRNA. Na strukturo se veže HYL1, ki posledično ne more sodelovati v kompleksu procesiranja miRNA. Pri rastlinah, ki izražajo SB1 SINE, so pogoste okvare v razvoju in akumulaciji miRNA. Ta fenotip lahko povežemo z ektopičnim prekomernim izražanjem SINE, vendar pa kaže tudi na vpliv TE pri tvorbi miRNA v specifičnih razvojnih fazah in okoljskih razmerah.

Prepisi, ki izvirajo iz retrotranspozona LINE, vplivajo na preoblikovanje kromatina in tako uravnavajo transkripcijsko aktivnost tarčnih genov. Pri sesalcih lahko prepisi LINE1 RNA, locirani na intronih, različno rekrutirajo RNA-vezavne protein (RBP), ki so vključeni v alternativno izrezovanje intronov. lncRNA, ki izvirajo iz evolucijsko mladih LINE1 in so locirani daleč od eksonov, preferenčno prepoznajo zaviralne RBP. Starejši LINE, ki so locirani bližje eksonom, pa preferenčno vežejo RBP, ki spodbujajo procesiranje RNA in sodelujejo pri tkivno specifičnem alternativnem izrezovanju intronov.

Funkcije nekodirajoče RNA, ki je po izvoru transpozonska

2022-05-01T12:10:57Z

Gaja Starc: /* Aktivne dolge nekodirajoče RNA (lncRNA), ki so po izvoru transpozonske */

Funkcije nekodirajoče RNA, ki je po izvoru transpozonska

2022-05-01T12:09:26Z

Gaja Starc: /* Aktivne majhne RNA, ki so po izvoru transpozonske */

Funkcije nekodirajoče RNA, ki je po izvoru transpozonska

2022-05-01T12:09:16Z

Gaja Starc: /* Aktivne dolge nekodirajoče RNA (lncRNA), ki so po izvoru transpozonske */

Funkcije nekodirajoče RNA, ki je po izvoru transpozonska

2022-05-01T12:09:00Z

Gaja Starc: /* Aktivne dolge nekodirajoče RNA (lncRNA), ki so po izvoru transpozonske */

Talk:Funkcije nekodirajoče RNA, ki je po izvoru transpozonska

2022-05-01T11:54:11Z

Gaja Starc: New page: Miha Razdevšek - Uvod; Po izvoru transpozonske male interferenčne RNA (siRNA), ki povzročijo metilacijo DNA in nastanek heterokromatina na mestih TE ter utišajo njihovo transkripcijo (...

Miha Razdevšek - Uvod; Po izvoru transpozonske male interferenčne RNA (siRNA), ki povzročijo metilacijo DNA in nastanek heterokromatina na mestih TE ter utišajo njihovo transkripcijo (het-siRNA)

Tinkara Butara - Epigenetsko aktivne siRNA (easiRNA), ki izvirajo iz TE in delujejo ''trans''; TE kot vir novih smRNA; TE kot vir fiziološko aktivnih lncRNA

Gaja Starc - Dolge nekodirajoče RNA, ki izvirajo iz TE, kot regulatorji majhnih RNA in proteinov; Dolge nekodirajoče RNA, ki izvirajo iz TE, kot potencialni regulatorji konformacije kromatina; Zaključek

Funkcije nekodirajoče RNA, ki je po izvoru transpozonska

2022-05-01T11:33:53Z

Gaja Starc: /* Aktivne majhne RNA, ki so po izvoru transpozonske */

Funkcije nekodirajoče RNA, ki je po izvoru transpozonska

2022-05-01T11:32:33Z

Gaja Starc: /* Aktivne majhne RNA, ki so po izvoru transpozonske */

Funkcije nekodirajoče RNA, ki je po izvoru transpozonska

2022-05-01T11:30:24Z

Gaja Starc: /* Aktivne majhne RNA, ki so po izvoru transpozonske */

Funkcije nekodirajoče RNA, ki je po izvoru transpozonska

2022-05-01T11:29:59Z

Gaja Starc: /* Uvod */

Funkcije nekodirajoče RNA, ki je po izvoru transpozonska

2022-05-01T11:29:07Z

Gaja Starc: /* Aktivne majhne RNA, ki so po izvoru transpozonske */

Funkcije nekodirajoče RNA, ki je po izvoru transpozonska

2022-05-01T10:35:41Z

Gaja Starc: New page: ==Uvod== Transpozicijski elementi (TE) predstavljajo pomemben dejavnik genomske kompleksnosti evkariontov. Pomembni so zaradi funkcije premikanja po DNA, ki pomembno vpliva na evolucijsko...