Wiki FKKT - User contributions [en]

Sporadicate

2023-05-09T20:10:57Z

GasperMozina: /* Samorazgrajujoči plazmid */

Sporadicate je sinteznobiološki projekt v okviru tekmovanja iGEM 2022, ki ga je pripravila skupina študentov iz londonske univerze Imperal College London. Dostopen je na spletnem naslovu [https://2022.igem.wiki/imperial-college-london https://2022.igem.wiki/imperial-college-london.]

= Problem =
Naraščajoče svetovno prebivalstvo zahteva vedno večjo proizvodnjo hrane, zaradi mednarodnih konfliktov, podnebnih ekstremov in gospodarskih kriz, pa je preskrba s hrano vse bolj otežena. Za spopadanje s problemom lakote je nujno zvišanje kmetijske produktivnosti ter razvoj odpornih in trajnostnih sistemov. Bolezni rastlin povzročajo 10-15 odstotni izpad pridelka, od tega pa glivne bolezni predstavljajo kar 70-80 odstotkov. Trenutna uporaba fungicidov je nezadostna, zato so novi ukrepi ključnega pomena. V okviru projekta Sporadicate so želeli razviti nestrupen biofungicid s širokim spektrom delovanja, sestavljen iz sistema bakterij ''B. subtilis'', ki odpravlja časovni zamik med diagnozo in zdravljenjem. Naravni sevi te bakterije so prisotni v talnem mikrobiomu in delujejo kot odlični bioobvladovalci, hkrati pa so popolnoma netoksični za ljudi, živali ali rastline [1].

= Načrt dela =
Projekt je zasnovan na sistemu »sense and response«. Torej, sistem, ki okužbo z glivo zazna in se nanjo tudi ustrezno odzove. Temelji na modificiranju spor ''B. subtilis'' tako, da te na svojem površju izražajo hitinaze, ki lahko razgrajujejo s hitinom bogato zunanjo membrano gliv. Pri procesu nastajajo monomeri hitina, ki delujejo kot univerzalni biomarkerji za vse glivne patogene in sprožijo imunski odziv rastlin. Spore ''B. subtilis'' bi vsebovale tudi mutirani germinantni receptor, ki bi vezal hitinske monomere. Ob vezavi se bi sprožil kaskadni odziv in omogočil reaktivacijo spor in razvoj vegetativnih bakterij. V nekaj minutah se bi bakterije namnožile in začele sproščati protiglivne lipopeptide. Modifikacije na sporah ''B. subtilis'' bi uvajali s pomočjo samorazgradljivih plazmidov – namnožene bakterije tako ne bi vsebovale nobene tuje DNA [1].

= Teoretično ozadje =

== Hitin ==
Raziskovalci so definirali dve optimalni strategiji za biokontrolo rastlin. Biofungicid mora imeti širok spekter protiglivnega delovanja, ali pa mora promovirati rastlinski imunski sistem. Študenti projekta Sporadicate so želeli zasnovati sistem, ki bi lahko naredil oboje in kot primerno tarčno molekulo so izbrali hitin. Hitin je linearni homopolimer z β-(1,4) vezjo povezanih N-acetil-D-glukozaminskih (NAG) monomerov. Predstavlja enega izmed glavnih komponent celične stene gliv in s tem idealen biomarker. Medtem ko rastlinski imunski receptorji hitina v glavnem direktno ne zaznavajo, lahko zaznajo njegove manjše fragmente ali monomere. Te lahko dobimo z delovanjem hitin razgrajujočih encimov hitinaz, ki so vrsta glikozilnih hidrolaz, katere razgrajujejo glikozidne vezi hitinskih polimerov. Večja dostopnost monomerov hitina omogoča induciranje fenomena SAR (systemic acquired resistance) in s tem večjo odpornost rastlin na okužbe [1].

== ''B. subtilis'' ==
Spore ''B. subtilis'' so poceni, vzdržljivi, robustni predstavitveni sistemi, katere lastnosti so idealne za razvoj takšnega sistema. ''B. subtilis'' izkazuje močne protiglivne lastnosti in je s strani FDA-ja označen kot generalno varen, saj ni patogen ali toksikogen do rastlin, živali ali ljudi. Med protiglivnimi defenzivnimi mehanizmi so: produkcija bakteriocinov, produkcija antibiotičnih lipopeptidov, produkcija iturina A, indukcija SAR-a in stimulacija rasti rastlinam simbiotskim glivam. Spore bakterij so zelo odporne na zunanje ekstremne pogoje in kljubujejo visoki temperaturi, UV radiaciji in ekstremnim pH-jem. Ob detekciji primernih nutrientov se hitro vrnejo v vegetativno stanje in se lahko normalno delijo [1].

= Potek dela =

== Hitinski predstavitveni sistem ==
Spore se v procesu sporulacije obdajo z več membranami, med katerimi je biotehnološko najbolj zanimiv t.i. plašč, ki vsebuje več kot 70 različnih proteinov in glikoproteinov. Nekateri izmed njih so se že izkazali kot molekulska predstavitvena sidra, za projekt Sporadicate pa so študenti uporabili strukturni protein CotG. Na sidrni protein CotG so z linkerjem povezali hitinazo ChiS. Gre za eksohitinazo pridobljeno iz organizma ''B. pumilus'', ki poleg hitinazne aktivnosti izkazuje še možnost delovanja kot lizocim. Poleg CotG so testirali še vezavo na sidrni protein CotZ, ki se nahaja v zunanji ovojnici, katera objema plašč spore [1].

== Samorazgrajujoči plazmid ==
Sistem CotG-linker-ChiS naj bi v bakterijske spore uvedli s plazmidom, ki se z germinacijo razgradi. Razgradnjo bi dosegli s sistemom CRISPR-Cas9 tako, da bi pod promotor PsspB, ki se aktivira z germinacijo, vstavili Cas9. Operon bi bil torej sestavljen iz promotorja PsspB, ribosoma optRBS, Cas9 CDS in iz terminatorja B0015. Za dosego večje občutljivosti sistema bi gRNA vstavili izven tega operona pod močan konstitutivni promotor ter s tem zagotovili večjo koncentracijo gRNA ob ekspresiji Cas9. Tarčna gRNA bi bila regija ori vstavljenega plazmida. Operon bi bil torej sestavljen iz konstitutivnega promotorja PlepA, ribosoma RBS2 gRNA CDS, D15 eksonukleaze in terminatorja Spy1 [1].

== Receptor za reaktivacijo spor ==

Mirujoče spore se v metabolično aktivne, vegetativne bakterije spremenijo v procesu germinacije/kaljenja. Točen mehanizem, ki zažene germinacijo še ni pojasnjen, znano pa je, da proces sprožijo hranila, kot so L-alanin, asparagin in enostavni sladkorji. V ''B. subtilis'' poznamo tri receptorje, ki uravnavajo proces germinacije: GerA, GerB in GerK. Medtem ko GerK in GerB za indukcijo potrebujeta več signalov (hranil), GerA lahko sproži popolno germinacijo spore le ob prisotnosti L-alanina. Receptor, ki bi sprožil proces germinacije ob prisotnosti monomerov hitina, so torej osnovali na receptorju GerA. GerA delulje kot vodni in ionski kanalček, ki aktivira germinacijo z rehidracijo spore. Pri načrtovanju so upoštevali, da se L-alanin veže le na podenoto GerAB in tako načrtovali proces mutageneze le na to regijo receptorja. Aminokislinske ostanke, ki dajo receptorju specifičnost, so določili z bioinformatskimi orodji (AlphaFold, Multiple Sequence Alignment). Laboratorijsko testiranje še ni bilo dejansko izvedeno, a načrt vključuje test specifičnosti z 10^8 različnimi kombinacijiami mutiranih proteinov GerA, pri čemer bi uporabljali pozitivno in negativno selekcijo [1].

== Konstrukcija vektorjev, kloniranje in rezultati ==

Pri delu z ''B. subtilis'' so v projektu uporabili SubtiToolKit oz. STK. Gre za »orodje« za manipulacijo gram pozitivnih bakterij, ki je primarno narejeno prav za ''B. subtilis''. Narejeno je po zgledu EcoFlex-a, ki velja za verzatilno Golden Gate orodje za kloniranje v E. coli. STK Golden Gate »orodje« sloni na treh tipIIs restriktazah: Bpil, Bsal in BsmbI.
Za kloniranje osnovnih konstruktov DNA so v projektu kot ogrodje uporabili plazmid pSTK-0-sfGFP. Plazmid vsebuje MCS regijo, selekcijski marker z odpornostjo na kloramfenikol, sfGFP; s katerim lahko prepoznamo uspešne insercije tarčnih regij, sfGFP RBS in ORI. Za ekspresijo proteinov v B. subtilis so uporabili ogrodje STK-EXP-1-sfGFP. Vektor omogoča selekcijo uspešno transformiranih celic z markerjem kloramfenikolom in selekcijo uspešno ustavljenega zaporedja z sfGFP proteinom [1].
CotG so z linkerjem povezali z reakcijo Phusion PCR. Linker so uvedli na 3' konec CotG CDS regije. V skupini so imeli na razpolago hitinazo v dveh delih oz. dveh linearnih fragmentih ChiS_part1 in ChiS_part2. Pred vezavo na 3' konec linkerja je bilo dva dela potrebno povezati. Za ta namen so uporabili »shranjevalni« vektor YTK001 – vektor YTK Golden Gate toolkita. Za vsak del hitinaze so načrtali olige in jim dodali previske, ki se ujemajo z restriktazo BsmBI (komplementarno z MCS regijo YTK001). Po PCR reakciji so s plazmidi transformirali E. coli celice in potrdili uspešnost. Fragmenta CotG-linker in ChiS so v projektu združili v Golden Gate reakciji z Bpil. CDS fragment so vstavili v plazmid skupaj s promotorjem, RBS-jem, GFP-jem in terminatorjem ter dobili funkcionalen transkript CotG-linker-ChiS. S tako sestavljenim plazmidom so (uspešno) transformirali bakterijske celice, a jim s PCR-jem na osnovi kolonije transformacije ni uspelo potrditi.

Konstrukt gRNA je sestavljen iz močnega konstitutivnega promotorja PlepA, RBS-ja TM_RBS2, gRNA CDS in Spy terminatorja. Vse skupaj so klonirali v plazmidno ogrodje STKA 1A. Posamezne biokocke so skupaj povezali z reakcijo Golden Gate. Pri načrtovanju konstrukta eksonukleaze D15 so za pravilno sestavljanje s proteinom Cas9 namesto terminatorja vanj vstavili spacer 0D. Podobno za pravilno sestavljanje končnega konstrukta Cas9 namesto promoterja vsebuje spacer 0A. Tako so dobili 3 transkripcijske enote in do kompletnega konstrukta samorazgrajujočega-se plazmida so potrebovali le še enoto z reporterskim proteinom GFPmut3B. Plazmida, ki bi vseboval TU z GFPmut3B jim zaradi časovnih omejitev ni uspelo sestaviti [1].

= Cilji za prihodnost =

Glavni problem sinteznobioloških izdelkov kot je Sporadicate so omejitve, ki jih prinaša uporaba GSO-jev. Sporadicate sicer naj ne bi vseboval gensko spremenjenih plazmidov v vegetativnih bakterijah, a še vedno lahko pride do nedelovanja mehanizma razgradnje in posledično do razširitve GSO bakterij. Za oceno možnosti takšnega scenarija in potencialne izboljšave produkta bi tako projekt potreboval nadaljnje testiranje na rastlinah in na terenu [1].
Z dodatnimi finančnimi vložki se nameravajo pri projektu posvetiti inženiringu germinantnega receptorja, ki je zaenkrat načrtovan le računalniško.

= Viri =
[1] SPORADICATE https://2022.igem.wiki/imperial-college-london/

Sporadicate

2023-05-09T20:09:18Z

GasperMozina: /* Samorazgrajujoči plazmid */

Sporadicate je sinteznobiološki projekt v okviru tekmovanja iGEM 2022, ki ga je pripravila skupina študentov iz londonske univerze Imperal College London. Dostopen je na spletnem naslovu [https://2022.igem.wiki/imperial-college-london https://2022.igem.wiki/imperial-college-london.]

= Problem =
Naraščajoče svetovno prebivalstvo zahteva vedno večjo proizvodnjo hrane, zaradi mednarodnih konfliktov, podnebnih ekstremov in gospodarskih kriz, pa je preskrba s hrano vse bolj otežena. Za spopadanje s problemom lakote je nujno zvišanje kmetijske produktivnosti ter razvoj odpornih in trajnostnih sistemov. Bolezni rastlin povzročajo 10-15 odstotni izpad pridelka, od tega pa glivne bolezni predstavljajo kar 70-80 odstotkov. Trenutna uporaba fungicidov je nezadostna, zato so novi ukrepi ključnega pomena. V okviru projekta Sporadicate so želeli razviti nestrupen biofungicid s širokim spektrom delovanja, sestavljen iz sistema bakterij ''B. subtilis'', ki odpravlja časovni zamik med diagnozo in zdravljenjem. Naravni sevi te bakterije so prisotni v talnem mikrobiomu in delujejo kot odlični bioobvladovalci, hkrati pa so popolnoma netoksični za ljudi, živali ali rastline [1].

= Načrt dela =
Projekt je zasnovan na sistemu »sense and response«. Torej, sistem, ki okužbo z glivo zazna in se nanjo tudi ustrezno odzove. Temelji na modificiranju spor ''B. subtilis'' tako, da te na svojem površju izražajo hitinaze, ki lahko razgrajujejo s hitinom bogato zunanjo membrano gliv. Pri procesu nastajajo monomeri hitina, ki delujejo kot univerzalni biomarkerji za vse glivne patogene in sprožijo imunski odziv rastlin. Spore ''B. subtilis'' bi vsebovale tudi mutirani germinantni receptor, ki bi vezal hitinske monomere. Ob vezavi se bi sprožil kaskadni odziv in omogočil reaktivacijo spor in razvoj vegetativnih bakterij. V nekaj minutah se bi bakterije namnožile in začele sproščati protiglivne lipopeptide. Modifikacije na sporah ''B. subtilis'' bi uvajali s pomočjo samorazgradljivih plazmidov – namnožene bakterije tako ne bi vsebovale nobene tuje DNA [1].

= Teoretično ozadje =

== Hitin ==
Raziskovalci so definirali dve optimalni strategiji za biokontrolo rastlin. Biofungicid mora imeti širok spekter protiglivnega delovanja, ali pa mora promovirati rastlinski imunski sistem. Študenti projekta Sporadicate so želeli zasnovati sistem, ki bi lahko naredil oboje in kot primerno tarčno molekulo so izbrali hitin. Hitin je linearni homopolimer z β-(1,4) vezjo povezanih N-acetil-D-glukozaminskih (NAG) monomerov. Predstavlja enega izmed glavnih komponent celične stene gliv in s tem idealen biomarker. Medtem ko rastlinski imunski receptorji hitina v glavnem direktno ne zaznavajo, lahko zaznajo njegove manjše fragmente ali monomere. Te lahko dobimo z delovanjem hitin razgrajujočih encimov hitinaz, ki so vrsta glikozilnih hidrolaz, katere razgrajujejo glikozidne vezi hitinskih polimerov. Večja dostopnost monomerov hitina omogoča induciranje fenomena SAR (systemic acquired resistance) in s tem večjo odpornost rastlin na okužbe [1].

== ''B. subtilis'' ==
Spore ''B. subtilis'' so poceni, vzdržljivi, robustni predstavitveni sistemi, katere lastnosti so idealne za razvoj takšnega sistema. ''B. subtilis'' izkazuje močne protiglivne lastnosti in je s strani FDA-ja označen kot generalno varen, saj ni patogen ali toksikogen do rastlin, živali ali ljudi. Med protiglivnimi defenzivnimi mehanizmi so: produkcija bakteriocinov, produkcija antibiotičnih lipopeptidov, produkcija iturina A, indukcija SAR-a in stimulacija rasti rastlinam simbiotskim glivam. Spore bakterij so zelo odporne na zunanje ekstremne pogoje in kljubujejo visoki temperaturi, UV radiaciji in ekstremnim pH-jem. Ob detekciji primernih nutrientov se hitro vrnejo v vegetativno stanje in se lahko normalno delijo [1].

= Potek dela =

== Hitinski predstavitveni sistem ==
Spore se v procesu sporulacije obdajo z več membranami, med katerimi je biotehnološko najbolj zanimiv t.i. plašč, ki vsebuje več kot 70 različnih proteinov in glikoproteinov. Nekateri izmed njih so se že izkazali kot molekulska predstavitvena sidra, za projekt Sporadicate pa so študenti uporabili strukturni protein CotG. Na sidrni protein CotG so z linkerjem povezali hitinazo ChiS. Gre za eksohitinazo pridobljeno iz organizma ''B. pumilus'', ki poleg hitinazne aktivnosti izkazuje še možnost delovanja kot lizocim. Poleg CotG so testirali še vezavo na sidrni protein CotZ, ki se nahaja v zunanji ovojnici, katera objema plašč spore [1].

== Samorazgrajujoči plazmid ==
Sistem CotG-linker-ChiS naj bi v bakterijske spore uvedli s plazmidom, ki se z germinacijo razgradi. Razgradnjo bi dosegli s sistemom CRISPR-Cas9 tako, da bi pod promotor PsspB, ki se aktivira s sporulacijo, vstavili Cas9. Operon bi bil torej sestavljen iz promotorja PsspB, ribosoma optRBS, Cas9 CDS in iz terminatorja B0015. Za dosego večje občutljivosti sistema bi gRNA vstavili izven tega operona pod močan konstitutivni promotor ter s tem zagotovili večjo koncentracijo gRNA ob ekspresiji Cas9. Tarčna gRNA bi bila regija ori vstavljenega plazmida. Operon bi bil torej sestavljen iz konstitutivnega promotorja PlepA, ribosoma RBS2 gRNA CDS, D15 eksonukleaze in terminatorja Spy1 [1].

== Receptor za reaktivacijo spor ==

Mirujoče spore se v metabolično aktivne, vegetativne bakterije spremenijo v procesu germinacije/kaljenja. Točen mehanizem, ki zažene germinacijo še ni pojasnjen, znano pa je, da proces sprožijo hranila, kot so L-alanin, asparagin in enostavni sladkorji. V ''B. subtilis'' poznamo tri receptorje, ki uravnavajo proces germinacije: GerA, GerB in GerK. Medtem ko GerK in GerB za indukcijo potrebujeta več signalov (hranil), GerA lahko sproži popolno germinacijo spore le ob prisotnosti L-alanina. Receptor, ki bi sprožil proces germinacije ob prisotnosti monomerov hitina, so torej osnovali na receptorju GerA. GerA delulje kot vodni in ionski kanalček, ki aktivira germinacijo z rehidracijo spore. Pri načrtovanju so upoštevali, da se L-alanin veže le na podenoto GerAB in tako načrtovali proces mutageneze le na to regijo receptorja. Aminokislinske ostanke, ki dajo receptorju specifičnost, so določili z bioinformatskimi orodji (AlphaFold, Multiple Sequence Alignment). Laboratorijsko testiranje še ni bilo dejansko izvedeno, a načrt vključuje test specifičnosti z 10^8 različnimi kombinacijiami mutiranih proteinov GerA, pri čemer bi uporabljali pozitivno in negativno selekcijo [1].

== Konstrukcija vektorjev, kloniranje in rezultati ==

Pri delu z ''B. subtilis'' so v projektu uporabili SubtiToolKit oz. STK. Gre za »orodje« za manipulacijo gram pozitivnih bakterij, ki je primarno narejeno prav za ''B. subtilis''. Narejeno je po zgledu EcoFlex-a, ki velja za verzatilno Golden Gate orodje za kloniranje v E. coli. STK Golden Gate »orodje« sloni na treh tipIIs restriktazah: Bpil, Bsal in BsmbI.
Za kloniranje osnovnih konstruktov DNA so v projektu kot ogrodje uporabili plazmid pSTK-0-sfGFP. Plazmid vsebuje MCS regijo, selekcijski marker z odpornostjo na kloramfenikol, sfGFP; s katerim lahko prepoznamo uspešne insercije tarčnih regij, sfGFP RBS in ORI. Za ekspresijo proteinov v B. subtilis so uporabili ogrodje STK-EXP-1-sfGFP. Vektor omogoča selekcijo uspešno transformiranih celic z markerjem kloramfenikolom in selekcijo uspešno ustavljenega zaporedja z sfGFP proteinom [1].
CotG so z linkerjem povezali z reakcijo Phusion PCR. Linker so uvedli na 3' konec CotG CDS regije. V skupini so imeli na razpolago hitinazo v dveh delih oz. dveh linearnih fragmentih ChiS_part1 in ChiS_part2. Pred vezavo na 3' konec linkerja je bilo dva dela potrebno povezati. Za ta namen so uporabili »shranjevalni« vektor YTK001 – vektor YTK Golden Gate toolkita. Za vsak del hitinaze so načrtali olige in jim dodali previske, ki se ujemajo z restriktazo BsmBI (komplementarno z MCS regijo YTK001). Po PCR reakciji so s plazmidi transformirali E. coli celice in potrdili uspešnost. Fragmenta CotG-linker in ChiS so v projektu združili v Golden Gate reakciji z Bpil. CDS fragment so vstavili v plazmid skupaj s promotorjem, RBS-jem, GFP-jem in terminatorjem ter dobili funkcionalen transkript CotG-linker-ChiS. S tako sestavljenim plazmidom so (uspešno) transformirali bakterijske celice, a jim s PCR-jem na osnovi kolonije transformacije ni uspelo potrditi.

Konstrukt gRNA je sestavljen iz močnega konstitutivnega promotorja PlepA, RBS-ja TM_RBS2, gRNA CDS in Spy terminatorja. Vse skupaj so klonirali v plazmidno ogrodje STKA 1A. Posamezne biokocke so skupaj povezali z reakcijo Golden Gate. Pri načrtovanju konstrukta eksonukleaze D15 so za pravilno sestavljanje s proteinom Cas9 namesto terminatorja vanj vstavili spacer 0D. Podobno za pravilno sestavljanje končnega konstrukta Cas9 namesto promoterja vsebuje spacer 0A. Tako so dobili 3 transkripcijske enote in do kompletnega konstrukta samorazgrajujočega-se plazmida so potrebovali le še enoto z reporterskim proteinom GFPmut3B. Plazmida, ki bi vseboval TU z GFPmut3B jim zaradi časovnih omejitev ni uspelo sestaviti [1].

= Cilji za prihodnost =

Glavni problem sinteznobioloških izdelkov kot je Sporadicate so omejitve, ki jih prinaša uporaba GSO-jev. Sporadicate sicer naj ne bi vseboval gensko spremenjenih plazmidov v vegetativnih bakterijah, a še vedno lahko pride do nedelovanja mehanizma razgradnje in posledično do razširitve GSO bakterij. Za oceno možnosti takšnega scenarija in potencialne izboljšave produkta bi tako projekt potreboval nadaljnje testiranje na rastlinah in na terenu [1].
Z dodatnimi finančnimi vložki se nameravajo pri projektu posvetiti inženiringu germinantnega receptorja, ki je zaenkrat načrtovan le računalniško.

= Viri =
[1] SPORADICATE https://2022.igem.wiki/imperial-college-london/

Sporadicate

2023-05-09T20:06:45Z

GasperMozina:

Sporadicate je sinteznobiološki projekt v okviru tekmovanja iGEM 2022, ki ga je pripravila skupina študentov iz londonske univerze Imperal College London. Dostopen je na spletnem naslovu [https://2022.igem.wiki/imperial-college-london https://2022.igem.wiki/imperial-college-london.]

= Problem =
Naraščajoče svetovno prebivalstvo zahteva vedno večjo proizvodnjo hrane, zaradi mednarodnih konfliktov, podnebnih ekstremov in gospodarskih kriz, pa je preskrba s hrano vse bolj otežena. Za spopadanje s problemom lakote je nujno zvišanje kmetijske produktivnosti ter razvoj odpornih in trajnostnih sistemov. Bolezni rastlin povzročajo 10-15 odstotni izpad pridelka, od tega pa glivne bolezni predstavljajo kar 70-80 odstotkov. Trenutna uporaba fungicidov je nezadostna, zato so novi ukrepi ključnega pomena. V okviru projekta Sporadicate so želeli razviti nestrupen biofungicid s širokim spektrom delovanja, sestavljen iz sistema bakterij ''B. subtilis'', ki odpravlja časovni zamik med diagnozo in zdravljenjem. Naravni sevi te bakterije so prisotni v talnem mikrobiomu in delujejo kot odlični bioobvladovalci, hkrati pa so popolnoma netoksični za ljudi, živali ali rastline [1].

= Načrt dela =
Projekt je zasnovan na sistemu »sense and response«. Torej, sistem, ki okužbo z glivo zazna in se nanjo tudi ustrezno odzove. Temelji na modificiranju spor ''B. subtilis'' tako, da te na svojem površju izražajo hitinaze, ki lahko razgrajujejo s hitinom bogato zunanjo membrano gliv. Pri procesu nastajajo monomeri hitina, ki delujejo kot univerzalni biomarkerji za vse glivne patogene in sprožijo imunski odziv rastlin. Spore ''B. subtilis'' bi vsebovale tudi mutirani germinantni receptor, ki bi vezal hitinske monomere. Ob vezavi se bi sprožil kaskadni odziv in omogočil reaktivacijo spor in razvoj vegetativnih bakterij. V nekaj minutah se bi bakterije namnožile in začele sproščati protiglivne lipopeptide. Modifikacije na sporah ''B. subtilis'' bi uvajali s pomočjo samorazgradljivih plazmidov – namnožene bakterije tako ne bi vsebovale nobene tuje DNA [1].

= Teoretično ozadje =

== Hitin ==
Raziskovalci so definirali dve optimalni strategiji za biokontrolo rastlin. Biofungicid mora imeti širok spekter protiglivnega delovanja, ali pa mora promovirati rastlinski imunski sistem. Študenti projekta Sporadicate so želeli zasnovati sistem, ki bi lahko naredil oboje in kot primerno tarčno molekulo so izbrali hitin. Hitin je linearni homopolimer z β-(1,4) vezjo povezanih N-acetil-D-glukozaminskih (NAG) monomerov. Predstavlja enega izmed glavnih komponent celične stene gliv in s tem idealen biomarker. Medtem ko rastlinski imunski receptorji hitina v glavnem direktno ne zaznavajo, lahko zaznajo njegove manjše fragmente ali monomere. Te lahko dobimo z delovanjem hitin razgrajujočih encimov hitinaz, ki so vrsta glikozilnih hidrolaz, katere razgrajujejo glikozidne vezi hitinskih polimerov. Večja dostopnost monomerov hitina omogoča induciranje fenomena SAR (systemic acquired resistance) in s tem večjo odpornost rastlin na okužbe [1].

== ''B. subtilis'' ==
Spore ''B. subtilis'' so poceni, vzdržljivi, robustni predstavitveni sistemi, katere lastnosti so idealne za razvoj takšnega sistema. ''B. subtilis'' izkazuje močne protiglivne lastnosti in je s strani FDA-ja označen kot generalno varen, saj ni patogen ali toksikogen do rastlin, živali ali ljudi. Med protiglivnimi defenzivnimi mehanizmi so: produkcija bakteriocinov, produkcija antibiotičnih lipopeptidov, produkcija iturina A, indukcija SAR-a in stimulacija rasti rastlinam simbiotskim glivam. Spore bakterij so zelo odporne na zunanje ekstremne pogoje in kljubujejo visoki temperaturi, UV radiaciji in ekstremnim pH-jem. Ob detekciji primernih nutrientov se hitro vrnejo v vegetativno stanje in se lahko normalno delijo [1].

= Potek dela =

== Hitinski predstavitveni sistem ==
Spore se v procesu sporulacije obdajo z več membranami, med katerimi je biotehnološko najbolj zanimiv t.i. plašč, ki vsebuje več kot 70 različnih proteinov in glikoproteinov. Nekateri izmed njih so se že izkazali kot molekulska predstavitvena sidra, za projekt Sporadicate pa so študenti uporabili strukturni protein CotG. Na sidrni protein CotG so z linkerjem povezali hitinazo ChiS. Gre za eksohitinazo pridobljeno iz organizma ''B. pumilus'', ki poleg hitinazne aktivnosti izkazuje še možnost delovanja kot lizocim. Poleg CotG so testirali še vezavo na sidrni protein CotZ, ki se nahaja v zunanji ovojnici, katera objema plašč spore [1].

== Samorazgrajujoči plazmid ==
Sistem CotG-linker-ChiS naj bi v bakterijske spore uvedli s plazmidom, ki se s sporulacijo razgradi. Razgradnjo bi dosegli s sistemom CRISPR-Cas9 tako, da bi pod promotor PsspB, ki se aktivira s sporulacijo, vstavili Cas9. Operon bi bil torej sestavljen iz promotorja PsspB, ribosoma optRBS, Cas9 CDS in iz terminatorja B0015. Za dosego večje občutljivosti sistema bi gRNA vstavili izven tega operona pod močan konstitutivni promotor ter s tem zagotovili večjo koncentracijo gRNA ob ekspresiji Cas9. Tarčna gRNA bi bila regija ori vstavljenega plazmida. Operon bi bil torej sestavljen iz konstitutivnega promotorja PlepA, ribosoma RBS2 gRNA CDS, D15 eksonukleaze in terminatorja Spy1 [1].

== Receptor za reaktivacijo spor ==

Mirujoče spore se v metabolično aktivne, vegetativne bakterije spremenijo v procesu germinacije/kaljenja. Točen mehanizem, ki zažene germinacijo še ni pojasnjen, znano pa je, da proces sprožijo hranila, kot so L-alanin, asparagin in enostavni sladkorji. V ''B. subtilis'' poznamo tri receptorje, ki uravnavajo proces germinacije: GerA, GerB in GerK. Medtem ko GerK in GerB za indukcijo potrebujeta več signalov (hranil), GerA lahko sproži popolno germinacijo spore le ob prisotnosti L-alanina. Receptor, ki bi sprožil proces germinacije ob prisotnosti monomerov hitina, so torej osnovali na receptorju GerA. GerA delulje kot vodni in ionski kanalček, ki aktivira germinacijo z rehidracijo spore. Pri načrtovanju so upoštevali, da se L-alanin veže le na podenoto GerAB in tako načrtovali proces mutageneze le na to regijo receptorja. Aminokislinske ostanke, ki dajo receptorju specifičnost, so določili z bioinformatskimi orodji (AlphaFold, Multiple Sequence Alignment). Laboratorijsko testiranje še ni bilo dejansko izvedeno, a načrt vključuje test specifičnosti z 10^8 različnimi kombinacijiami mutiranih proteinov GerA, pri čemer bi uporabljali pozitivno in negativno selekcijo [1].

== Konstrukcija vektorjev, kloniranje in rezultati ==

Pri delu z ''B. subtilis'' so v projektu uporabili SubtiToolKit oz. STK. Gre za »orodje« za manipulacijo gram pozitivnih bakterij, ki je primarno narejeno prav za ''B. subtilis''. Narejeno je po zgledu EcoFlex-a, ki velja za verzatilno Golden Gate orodje za kloniranje v E. coli. STK Golden Gate »orodje« sloni na treh tipIIs restriktazah: Bpil, Bsal in BsmbI.
Za kloniranje osnovnih konstruktov DNA so v projektu kot ogrodje uporabili plazmid pSTK-0-sfGFP. Plazmid vsebuje MCS regijo, selekcijski marker z odpornostjo na kloramfenikol, sfGFP; s katerim lahko prepoznamo uspešne insercije tarčnih regij, sfGFP RBS in ORI. Za ekspresijo proteinov v B. subtilis so uporabili ogrodje STK-EXP-1-sfGFP. Vektor omogoča selekcijo uspešno transformiranih celic z markerjem kloramfenikolom in selekcijo uspešno ustavljenega zaporedja z sfGFP proteinom [1].
CotG so z linkerjem povezali z reakcijo Phusion PCR. Linker so uvedli na 3' konec CotG CDS regije. V skupini so imeli na razpolago hitinazo v dveh delih oz. dveh linearnih fragmentih ChiS_part1 in ChiS_part2. Pred vezavo na 3' konec linkerja je bilo dva dela potrebno povezati. Za ta namen so uporabili »shranjevalni« vektor YTK001 – vektor YTK Golden Gate toolkita. Za vsak del hitinaze so načrtali olige in jim dodali previske, ki se ujemajo z restriktazo BsmBI (komplementarno z MCS regijo YTK001). Po PCR reakciji so s plazmidi transformirali E. coli celice in potrdili uspešnost. Fragmenta CotG-linker in ChiS so v projektu združili v Golden Gate reakciji z Bpil. CDS fragment so vstavili v plazmid skupaj s promotorjem, RBS-jem, GFP-jem in terminatorjem ter dobili funkcionalen transkript CotG-linker-ChiS. S tako sestavljenim plazmidom so (uspešno) transformirali bakterijske celice, a jim s PCR-jem na osnovi kolonije transformacije ni uspelo potrditi.

Konstrukt gRNA je sestavljen iz močnega konstitutivnega promotorja PlepA, RBS-ja TM_RBS2, gRNA CDS in Spy terminatorja. Vse skupaj so klonirali v plazmidno ogrodje STKA 1A. Posamezne biokocke so skupaj povezali z reakcijo Golden Gate. Pri načrtovanju konstrukta eksonukleaze D15 so za pravilno sestavljanje s proteinom Cas9 namesto terminatorja vanj vstavili spacer 0D. Podobno za pravilno sestavljanje končnega konstrukta Cas9 namesto promoterja vsebuje spacer 0A. Tako so dobili 3 transkripcijske enote in do kompletnega konstrukta samorazgrajujočega-se plazmida so potrebovali le še enoto z reporterskim proteinom GFPmut3B. Plazmida, ki bi vseboval TU z GFPmut3B jim zaradi časovnih omejitev ni uspelo sestaviti [1].

= Cilji za prihodnost =

Glavni problem sinteznobioloških izdelkov kot je Sporadicate so omejitve, ki jih prinaša uporaba GSO-jev. Sporadicate sicer naj ne bi vseboval gensko spremenjenih plazmidov v vegetativnih bakterijah, a še vedno lahko pride do nedelovanja mehanizma razgradnje in posledično do razširitve GSO bakterij. Za oceno možnosti takšnega scenarija in potencialne izboljšave produkta bi tako projekt potreboval nadaljnje testiranje na rastlinah in na terenu [1].
Z dodatnimi finančnimi vložki se nameravajo pri projektu posvetiti inženiringu germinantnega receptorja, ki je zaenkrat načrtovan le računalniško.

= Viri =
[1] SPORADICATE https://2022.igem.wiki/imperial-college-london/

Sporadicate

2023-05-09T17:52:30Z

GasperMozina: /* Problem */

Sporadicate je sinteznobiološki projekt v okviru tekmovanja iGEM 2022, ki ga je pripravila skupina študentov iz londonske univerze Imperal College London. Dostopen je na spletnem naslovu [https://2022.igem.wiki/imperial-college-london https://2022.igem.wiki/imperial-college-london.]

= Problem =
Naraščajoče svetovno prebivalstvo zahteva vedno večjo proizvodnjo hrane, zaradi mednarodnih konfliktov, podnebnih ekstremov in gospodarskih kriz, pa je preskrba s hrano vse bolj otežena. Za spopadanje s problemom lakote je nujno zvišanje kmetijske produktivnosti ter razvoj odpornih in trajnostnih sistemov. Bolezni rastlin povzročajo 10-15 odstotni izpad pridelka, od tega pa glivne bolezni predstavljajo kar 70-80 odstotkov. Trenutna uporaba fungicidov je nezadostna, zato so novi ukrepi ključnega pomena. V okviru projekta Sporadicate so želeli razviti nestrupen biofungicid s širokim spektrom delovanja, sestavljen iz sistema bakterij ''B. subtilis'', ki odpravlja časovni zamik med diagnozo in zdravljenjem. Naravni sevi te bakterije so prisotni v talnem mikrobiomu in delujejo kot odlični bioobvladovalci, hkrati pa so popolnoma netoksični za ljudi, živali ali rastline [1].

= Načrt dela =
Projekt je zasnovan na sistemu »sense and response«. Torej, sistem, ki okužbo z glivo zazna in se nanjo tudi ustrezno odzove. Temelji na modificiranju spor ''B. subtilis'' tako, da te na svojem površju izražajo hitinaze, ki lahko razgrajujejo s hitinom bogato zunanjo membrano gliv. Pri procesu nastajajo monomeri hitina, ki delujejo kot univerzalni biomarkerji za vse glivne patogene in sprožijo imunski odziv rastlin. Spore ''B. subtilis'' bi vsebovale tudi mutirani germinantni receptor, ki bi vezal hitinske monomere. Ob vezavi se bi sprožil kaskadni odziv in omogočil reaktivacijo spor in razvoj vegetativnih bakterij. V nekaj minutah se bi bakterije namnožile in začele sproščati protiglivne lipopeptide. Modifikacije na sporah ''B. subtilis'' bi uvajali s pomočjo samorazgradljivih plazmidov – namnožene bakterije tako ne bi vsebovale nobene tuje DNA [1].

= Teoretično ozadje =

== Hitin ==
Raziskovalci so definirali dve optimalni strategiji za biokontrolo rastlin. Biofungicid mora imeti širok spekter protiglivnega delovanja, ali pa mora promovirati rastlinski imunski sistem. Študenti projekta Sporadicate so želeli zasnovati sistem, ki bi lahko naredil oboje in kot primerno tarčno molekulo so izbrali hitin. Hitin je linearni homopolimer z β-(1,4) vezjo povezanih N-acetil-D-glukozaminskih (NAG) monomerov. Predstavlja enega izmed glavnih komponent celične stene gliv in s tem idealen biomarker. Medtem ko rastlinski imunski receptorji hitina v glavnem direktno ne zaznavajo, lahko zaznajo njegove manjše fragmente ali monomere. Te lahko dobimo z delovanjem hitin razgrajujočih encimov hitinaz, ki so vrsta glikozilnih hidrolaz, katere razgrajujejo glikozidne vezi hitinskih polimerov. Večja dostopnost monomerov hitina omogoča induciranje fenomena SAR (systemic acquired resistance) in s tem večjo odpornost rastlin na okužbe [1].

== ''B. subtilis'' ==
Spore ''B. subtilis'' so poceni, vzdržljivi, robustni predstavitveni sistemi, katere lastnosti so idealne za razvoj takšnega sistema. ''B. subtilis'' izkazuje močne protiglivne lastnosti in je s strani FDA-ja označen kot generalno varen, saj ni patogen ali toksikogen do rastlin, živali ali ljudi. Med protiglivnimi defenzivnimi mehanizmi so: produkcija bakteriocinov, produkcija antibiotičnih lipopeptidov, produkcija iturina A, indukcija SAR-a in stimulacija rasti rastlinam simbiotskim glivam. Spore bakterij so zelo odporne na zunanje ekstremne pogoje in kljubujejo visoki temperaturi, UV radiaciji in ekstremnim pH-jem. Ob detekciji primernih nutrientov se hitro vrnejo v vegetativno stanje in se lahko normalno delijo [1].

= Potek dela =

== Hitinski predstavitveni sistem ==
Spore se v procesu sporulacije obdajo z več membranami, med katerimi je biotehnološko najbolj zanimiv t.i. plašč, ki vsebuje več kot 70 različnih proteinov in glikoproteinov. Nekateri izmed njih so se že izkazali kot molekulska predstavitvena sidra, za projekt Sporadicate pa so študenti uporabili strukturni protein CotG. Na sidrni protein CotG so z linkerjem povezali hitinazo ChiS. Gre za eksohitinazo pridobljeno iz organizma ''B. pumilus'', ki poleg hitinazne aktivnosti izkazuje še možnost delovanja kot lizocim. Poleg CotG so testirali še vezavo na sidrni protein CotZ, ki se nahaja v zunanji ovojnici, katera objema plašč spore [1].

== Samorazgrajujoči-se plazmid ==
Sistem CotG-linker-ChiS naj bi v bakterijske spore uvedli s plazmidom, ki se s sporulacijo razgradi. Razgradnjo bi dosegli s sistemom CRISPR-Cas9 tako, da bi pod promotor PsspB, ki se aktivira s sporulacijo, vstavili Cas9. Operon bi bil torej sestavljen iz promotorja PsspB, ribosoma optRBS, Cas9 CDS in iz terminatorja B0015. Za dosego večje občutljivosti sistema bi gRNA vstavili izven tega operona pod močan konstitutivni promotor ter s tem zagotovili večjo koncentracijo gRNA ob ekspresiji Cas9. Tarčna gRNA bi bila regija ori vstavljenega plazmida. Operon bi bil torej sestavljen iz konstitutivnega promotorja PlepA, ribosoma RBS2 gRNA CDS, D15 eksonukleaze in terminatorja Spy1 [1].

== Receptor za reaktivacijo spor ==

Mirujoče spore se v metabolično aktivne, vegetativne bakterije spremenijo v procesu germinacije/kaljenja. Točen mehanizem, ki zažene germinacijo še ni pojasnjen, znano pa je, da proces sprožijo hranila, kot so L-alanin, asparagin in enostavni sladkorji. V ''B. subtilis'' poznamo tri receptorje, ki uravnavajo proces germinacije: GerA, GerB in GerK. Medtem ko GerK in GerB za indukcijo potrebujeta več signalov (hranil), GerA lahko sproži popolno germinacijo spore le ob prisotnosti L-alanina. Receptor, ki bi sprožil proces germinacije ob prisotnosti monomerov hitina, so torej osnovali na receptorju GerA. GerA delulje kot vodni in ionski kanalček, ki aktivira germinacijo z rehidracijo spore. Pri načrtovanju so upoštevali, da se L-alanin veže le na podenoto GerAB in tako načrtovali proces mutageneze le na to regijo receptorja. Aminokislinske ostanke, ki dajo receptorju specifičnost, so določili z bioinformatskimi orodji (AlphaFold, Multiple Sequence Alignment). Laboratorijsko testiranje še ni bilo dejansko izvedeno, a načrt vključuje test specifičnosti z 10^8 različnimi kombinacijiami mutiranih proteinov GerA, pri čemer bi uporabljali pozitivno in negativno selekcijo [1].

== Konstrukcija vektorjev, kloniranje in rezultati ==

Pri delu z ''B. subtilis'' so v projektu uporabili SubtiToolKit oz. STK. Gre za »orodje« za manipulacijo gram pozitivnih bakterij, ki je primarno narejeno prav za ''B. subtilis''. Narejeno je po zgledu EcoFlex-a, ki velja za verzatilno Golden Gate orodje za kloniranje v E. coli. STK Golden Gate »orodje« sloni na treh tipIIs restriktazah: Bpil, Bsal in BsmbI.
Za kloniranje osnovnih konstruktov DNA so v projektu kot ogrodje uporabili plazmid pSTK-0-sfGFP. Plazmid vsebuje MCS regijo, selekcijski marker z odpornostjo na kloramfenikol, sfGFP; s katerim lahko prepoznamo uspešne insercije tarčnih regij, sfGFP RBS in ORI. Za ekspresijo proteinov v B. subtilis so uporabili ogrodje STK-EXP-1-sfGFP. Vektor omogoča selekcijo uspešno transformiranih celic z markerjem kloramfenikolom in selekcijo uspešno ustavljenega zaporedja z sfGFP proteinom [1].
CotG so z linkerjem povezali z reakcijo Phusion PCR. Linker so uvedli na 3' konec CotG CDS regije. V skupini so imeli na razpolago hitinazo v dveh delih oz. dveh linearnih fragmentih ChiS_part1 in ChiS_part2. Pred vezavo na 3' konec linkerja je bilo dva dela potrebno povezati. Za ta namen so uporabili »shranjevalni« vektor YTK001 – vektor YTK Golden Gate toolkita. Za vsak del hitinaze so načrtali olige in jim dodali previske, ki se ujemajo z restriktazo BsmBI (komplementarno z MCS regijo YTK001). Po PCR reakciji so s plazmidi transformirali E. coli celice in potrdili uspešnost. Fragmenta CotG-linker in ChiS so v projektu združili v Golden Gate reakciji z Bpil. CDS fragment so vstavili v plazmid skupaj s promotorjem, RBS-jem, GFP-jem in terminatorjem ter dobili funkcionalen transkript CotG-linker-ChiS. S tako sestavljenim plazmidom so (uspešno) transformirali bakterijske celice, a jim s PCR-jem na osnovi kolonije transformacije ni uspelo potrditi.

Konstrukt gRNA je sestavljen iz močnega konstitutivnega promotorja PlepA, RBS-ja TM_RBS2, gRNA CDS in Spy terminatorja. Vse skupaj so klonirali v plazmidno ogrodje STKA 1A. Posamezne biokocke so skupaj povezali z reakcijo Golden Gate. Pri načrtovanju konstrukta eksonukleaze D15 so za pravilno sestavljanje s proteinom Cas9 namesto terminatorja vanj vstavili spacer 0D. Podobno za pravilno sestavljanje končnega konstrukta Cas9 namesto promoterja vsebuje spacer 0A. Tako so dobili 3 transkripcijske enote in do kompletnega konstrukta samorazgrajujočega-se plazmida so potrebovali le še enoto z reporterskim proteinom GFPmut3B. Plazmida, ki bi vseboval TU z GFPmut3B jim zaradi časovnih omejitev ni uspelo sestaviti [1].

= Cilji za prihodnost =

Glavni problem sinteznobioloških izdelkov kot je Sporadicate so omejitve, ki jih prinaša uporaba GSO-jev. Sporadicate sicer naj ne bi vseboval gensko spremenjenih plazmidov v vegetativnih bakterijah, a še vedno lahko pride do nedelovanja mehanizma razgradnje in posledično do razširitve GSO bakterij. Za oceno možnosti takšnega scenarija in potencialne izboljšave produkta bi tako projekt potreboval nadaljnje testiranje na rastlinah in na terenu [1].
Z dodatnimi finančnimi vložki se nameravajo pri projektu posvetiti inženiringu germinantnega receptorja, ki je zaenkrat načrtovan le računalniško.

= Viri =
[1] SPORADICATE https://2022.igem.wiki/imperial-college-london/

Sporadicate

2023-05-09T16:13:19Z

GasperMozina: /* Konstrukcija vektorjev, kloniranja in rezultati */

Sporadicate je sinteznobiološki projekt v okviru tekmovanja iGEM 2022, ki ga je pripravila skupina študentov iz londonske univerze Imperal College London. Dostopen je na spletnem naslovu [https://2022.igem.wiki/imperial-college-london https://2022.igem.wiki/imperial-college-london.]

= Problem =
Naraščajoče svetovno prebivalstvo zahteva vedno večjo proizvodnjo hrane, zaradi mednarodnih konfliktov, podnebnih ekstremov in gospodarskih kriz, pa je preskrba s hrano vse bolj otežena. Za spopadanje s problemom lakote je nujno zvišanje kmetijske produktivnosti ter razvoj odpornih in trajnostnih sistemov. Bolezni rastlin povzročajo 10-15 odstotni izpad pridelka, od tega pa glivne bolezni predstavljajo kar 70-80 odstotkov. Trenutna uporaba fungicidov je nezadostna, zato so novi ukrepi ključnega pomena. V okviru projekta Sporadicate so razvili nestrupen biofungicid s širokim spektrom delovanja, sestavljen iz sistema bakterij ''B. subtilis'', ki odpravlja časovni zamik med diagnozo in zdravljenjem. Naravni sevi te bakterije so prisotni v talnem mikrobiomu in delujejo kot odlični bioobvladovalci, hkrati pa so popolnoma netoksični za ljudi, živali ali rastline [1].

= Načrt dela =
Projekt je zasnovan na sistemu »sense and response«. Torej, sistem, ki okužbo z glivo zazna in se nanjo tudi ustrezno odzove. Temelji na modificiranju spor ''B. subtilis'' tako, da te na svojem površju izražajo hitinaze, ki lahko razgrajujejo s hitinom bogato zunanjo membrano gliv. Pri procesu nastajajo monomeri hitina, ki delujejo kot univerzalni biomarkerji za vse glivne patogene in sprožijo imunski odziv rastlin. Spore ''B. subtilis'' bi vsebovale tudi mutirani germinantni receptor, ki bi vezal hitinske monomere. Ob vezavi se bi sprožil kaskadni odziv in omogočil reaktivacijo spor in razvoj vegetativnih bakterij. V nekaj minutah se bi bakterije namnožile in začele sproščati protiglivne lipopeptide. Modifikacije na sporah ''B. subtilis'' bi uvajali s pomočjo samorazgradljivih plazmidov – namnožene bakterije tako ne bi vsebovale nobene tuje DNA [1].

= Teoretično ozadje =

== Hitin ==
Raziskovalci so definirali dve optimalni strategiji za biokontrolo rastlin. Biofungicid mora imeti širok spekter protiglivnega delovanja, ali pa mora promovirati rastlinski imunski sistem. Študenti projekta Sporadicate so želeli zasnovati sistem, ki bi lahko naredil oboje in kot primerno tarčno molekulo so izbrali hitin. Hitin je linearni homopolimer z β-(1,4) vezjo povezanih N-acetil-D-glukozaminskih (NAG) monomerov. Predstavlja enega izmed glavnih komponent celične stene gliv in s tem idealen biomarker. Medtem ko rastlinski imunski receptorji hitina v glavnem direktno ne zaznavajo, lahko zaznajo njegove manjše fragmente ali monomere. Te lahko dobimo z delovanjem hitin razgrajujočih encimov hitinaz, ki so vrsta glikozilnih hidrolaz, katere razgrajujejo glikozidne vezi hitinskih polimerov. Večja dostopnost monomerov hitina omogoča induciranje fenomena SAR (systemic acquired resistance) in s tem večjo odpornost rastlin na okužbe [1].

== ''B. subtilis'' ==
Spore ''B. subtilis'' so poceni, vzdržljivi, robustni predstavitveni sistemi, katere lastnosti so idealne za razvoj takšnega sistema. ''B. subtilis'' izkazuje močne protiglivne lastnosti in je s strani FDA-ja označen kot generalno varen, saj ni patogen ali toksikogen do rastlin, živali ali ljudi. Med protiglivnimi defenzivnimi mehanizmi so: produkcija bakteriocinov, produkcija antibiotičnih lipopeptidov, produkcija iturina A, indukcija SAR-a in stimulacija rasti rastlinam simbiotskim glivam. Spore bakterij so zelo odporne na zunanje ekstremne pogoje in kljubujejo visoki temperaturi, UV radiaciji in ekstremnim pH-jem. Ob detekciji primernih nutrientov se hitro vrnejo v vegetativno stanje in se lahko normalno delijo [1].

= Potek dela =

== Hitinski predstavitveni sistem ==
Spore se v procesu sporulacije obdajo z več membranami, med katerimi je biotehnološko najbolj zanimiv t.i. plašč, ki vsebuje več kot 70 različnih proteinov in glikoproteinov. Nekateri izmed njih so se že izkazali kot molekulska predstavitvena sidra, za projekt Sporadicate pa so študenti uporabili strukturni protein CotG. Na sidrni protein CotG so z linkerjem povezali hitinazo ChiS. Gre za eksohitinazo pridobljeno iz organizma ''B. pumilus'', ki poleg hitinazne aktivnosti izkazuje še možnost delovanja kot lizocim. Poleg CotG so testirali še vezavo na sidrni protein CotZ, ki se nahaja v zunanji ovojnici, katera objema plašč spore [1].

== Samorazgrajujoči-se plazmid ==
Sistem CotG-linker-ChiS naj bi v bakterijske spore uvedli s plazmidom, ki se s sporulacijo razgradi. Razgradnjo bi dosegli s sistemom CRISPR-Cas9 tako, da bi pod promotor PsspB, ki se aktivira s sporulacijo, vstavili Cas9. Operon bi bil torej sestavljen iz promotorja PsspB, ribosoma optRBS, Cas9 CDS in iz terminatorja B0015. Za dosego večje občutljivosti sistema bi gRNA vstavili izven tega operona pod močan konstitutivni promotor ter s tem zagotovili večjo koncentracijo gRNA ob ekspresiji Cas9. Tarčna gRNA bi bila regija ori vstavljenega plazmida. Operon bi bil torej sestavljen iz konstitutivnega promotorja PlepA, ribosoma RBS2 gRNA CDS, D15 eksonukleaze in terminatorja Spy1 [1].

== Receptor za reaktivacijo spor ==

Mirujoče spore se v metabolično aktivne, vegetativne bakterije spremenijo v procesu germinacije/kaljenja. Točen mehanizem, ki zažene germinacijo še ni pojasnjen, znano pa je, da proces sprožijo hranila, kot so L-alanin, asparagin in enostavni sladkorji. V ''B. subtilis'' poznamo tri receptorje, ki uravnavajo proces germinacije: GerA, GerB in GerK. Medtem ko GerK in GerB za indukcijo potrebujeta več signalov (hranil), GerA lahko sproži popolno germinacijo spore le ob prisotnosti L-alanina. Receptor, ki bi sprožil proces germinacije ob prisotnosti monomerov hitina, so torej osnovali na receptorju GerA. GerA delulje kot vodni in ionski kanalček, ki aktivira germinacijo z rehidracijo spore. Pri načrtovanju so upoštevali, da se L-alanin veže le na podenoto GerAB in tako načrtovali proces mutageneze le na to regijo receptorja. Aminokislinske ostanke, ki dajo receptorju specifičnost, so določili z bioinformatskimi orodji (AlphaFold, Multiple Sequence Alignment). Laboratorijsko testiranje še ni bilo dejansko izvedeno, a načrt vključuje test specifičnosti z 10^8 različnimi kombinacijiami mutiranih proteinov GerA, pri čemer bi uporabljali pozitivno in negativno selekcijo [1].

== Konstrukcija vektorjev, kloniranje in rezultati ==

Pri delu z ''B. subtilis'' so v projektu uporabili SubtiToolKit oz. STK. Gre za »orodje« za manipulacijo gram pozitivnih bakterij, ki je primarno narejeno prav za ''B. subtilis''. Narejeno je po zgledu EcoFlex-a, ki velja za verzatilno Golden Gate orodje za kloniranje v E. coli. STK Golden Gate »orodje« sloni na treh tipIIs restriktazah: Bpil, Bsal in BsmbI.
Za kloniranje osnovnih konstruktov DNA so v projektu kot ogrodje uporabili plazmid pSTK-0-sfGFP. Plazmid vsebuje MCS regijo, selekcijski marker z odpornostjo na kloramfenikol, sfGFP; s katerim lahko prepoznamo uspešne insercije tarčnih regij, sfGFP RBS in ORI. Za ekspresijo proteinov v B. subtilis so uporabili ogrodje STK-EXP-1-sfGFP. Vektor omogoča selekcijo uspešno transformiranih celic z markerjem kloramfenikolom in selekcijo uspešno ustavljenega zaporedja z sfGFP proteinom [1].
CotG so z linkerjem povezali z reakcijo Phusion PCR. Linker so uvedli na 3' konec CotG CDS regije. V skupini so imeli na razpolago hitinazo v dveh delih oz. dveh linearnih fragmentih ChiS_part1 in ChiS_part2. Pred vezavo na 3' konec linkerja je bilo dva dela potrebno povezati. Za ta namen so uporabili »shranjevalni« vektor YTK001 – vektor YTK Golden Gate toolkita. Za vsak del hitinaze so načrtali olige in jim dodali previske, ki se ujemajo z restriktazo BsmBI (komplementarno z MCS regijo YTK001). Po PCR reakciji so s plazmidi transformirali E. coli celice in potrdili uspešnost. Fragmenta CotG-linker in ChiS so v projektu združili v Golden Gate reakciji z Bpil. CDS fragment so vstavili v plazmid skupaj s promotorjem, RBS-jem, GFP-jem in terminatorjem ter dobili funkcionalen transkript CotG-linker-ChiS. S tako sestavljenim plazmidom so (uspešno) transformirali bakterijske celice, a jim s PCR-jem na osnovi kolonije transformacije ni uspelo potrditi.

Konstrukt gRNA je sestavljen iz močnega konstitutivnega promotorja PlepA, RBS-ja TM_RBS2, gRNA CDS in Spy terminatorja. Vse skupaj so klonirali v plazmidno ogrodje STKA 1A. Posamezne biokocke so skupaj povezali z reakcijo Golden Gate. Pri načrtovanju konstrukta eksonukleaze D15 so za pravilno sestavljanje s proteinom Cas9 namesto terminatorja vanj vstavili spacer 0D. Podobno za pravilno sestavljanje končnega konstrukta Cas9 namesto promoterja vsebuje spacer 0A. Tako so dobili 3 transkripcijske enote in do kompletnega konstrukta samorazgrajujočega-se plazmida so potrebovali le še enoto z reporterskim proteinom GFPmut3B. Plazmida, ki bi vseboval TU z GFPmut3B jim zaradi časovnih omejitev ni uspelo sestaviti [1].

= Cilji za prihodnost =

Glavni problem sinteznobioloških izdelkov kot je Sporadicate so omejitve, ki jih prinaša uporaba GSO-jev. Sporadicate sicer naj ne bi vseboval gensko spremenjenih plazmidov v vegetativnih bakterijah, a še vedno lahko pride do nedelovanja mehanizma razgradnje in posledično do razširitve GSO bakterij. Za oceno možnosti takšnega scenarija in potencialne izboljšave produkta bi tako projekt potreboval nadaljnje testiranje na rastlinah in na terenu [1].
Z dodatnimi finančnimi vložki se nameravajo pri projektu posvetiti inženiringu germinantnega receptorja, ki je zaenkrat načrtovan le računalniško.

= Viri =
[1] SPORADICATE https://2022.igem.wiki/imperial-college-london/

Sporadicate

2023-05-09T16:13:08Z

GasperMozina: /* Konstrukcija vektorjev, kloniranja in rezultati */

Sporadicate je sinteznobiološki projekt v okviru tekmovanja iGEM 2022, ki ga je pripravila skupina študentov iz londonske univerze Imperal College London. Dostopen je na spletnem naslovu [https://2022.igem.wiki/imperial-college-london https://2022.igem.wiki/imperial-college-london.]

= Problem =
Naraščajoče svetovno prebivalstvo zahteva vedno večjo proizvodnjo hrane, zaradi mednarodnih konfliktov, podnebnih ekstremov in gospodarskih kriz, pa je preskrba s hrano vse bolj otežena. Za spopadanje s problemom lakote je nujno zvišanje kmetijske produktivnosti ter razvoj odpornih in trajnostnih sistemov. Bolezni rastlin povzročajo 10-15 odstotni izpad pridelka, od tega pa glivne bolezni predstavljajo kar 70-80 odstotkov. Trenutna uporaba fungicidov je nezadostna, zato so novi ukrepi ključnega pomena. V okviru projekta Sporadicate so razvili nestrupen biofungicid s širokim spektrom delovanja, sestavljen iz sistema bakterij ''B. subtilis'', ki odpravlja časovni zamik med diagnozo in zdravljenjem. Naravni sevi te bakterije so prisotni v talnem mikrobiomu in delujejo kot odlični bioobvladovalci, hkrati pa so popolnoma netoksični za ljudi, živali ali rastline [1].

= Načrt dela =
Projekt je zasnovan na sistemu »sense and response«. Torej, sistem, ki okužbo z glivo zazna in se nanjo tudi ustrezno odzove. Temelji na modificiranju spor ''B. subtilis'' tako, da te na svojem površju izražajo hitinaze, ki lahko razgrajujejo s hitinom bogato zunanjo membrano gliv. Pri procesu nastajajo monomeri hitina, ki delujejo kot univerzalni biomarkerji za vse glivne patogene in sprožijo imunski odziv rastlin. Spore ''B. subtilis'' bi vsebovale tudi mutirani germinantni receptor, ki bi vezal hitinske monomere. Ob vezavi se bi sprožil kaskadni odziv in omogočil reaktivacijo spor in razvoj vegetativnih bakterij. V nekaj minutah se bi bakterije namnožile in začele sproščati protiglivne lipopeptide. Modifikacije na sporah ''B. subtilis'' bi uvajali s pomočjo samorazgradljivih plazmidov – namnožene bakterije tako ne bi vsebovale nobene tuje DNA [1].

= Teoretično ozadje =

== Hitin ==
Raziskovalci so definirali dve optimalni strategiji za biokontrolo rastlin. Biofungicid mora imeti širok spekter protiglivnega delovanja, ali pa mora promovirati rastlinski imunski sistem. Študenti projekta Sporadicate so želeli zasnovati sistem, ki bi lahko naredil oboje in kot primerno tarčno molekulo so izbrali hitin. Hitin je linearni homopolimer z β-(1,4) vezjo povezanih N-acetil-D-glukozaminskih (NAG) monomerov. Predstavlja enega izmed glavnih komponent celične stene gliv in s tem idealen biomarker. Medtem ko rastlinski imunski receptorji hitina v glavnem direktno ne zaznavajo, lahko zaznajo njegove manjše fragmente ali monomere. Te lahko dobimo z delovanjem hitin razgrajujočih encimov hitinaz, ki so vrsta glikozilnih hidrolaz, katere razgrajujejo glikozidne vezi hitinskih polimerov. Večja dostopnost monomerov hitina omogoča induciranje fenomena SAR (systemic acquired resistance) in s tem večjo odpornost rastlin na okužbe [1].

== ''B. subtilis'' ==
Spore ''B. subtilis'' so poceni, vzdržljivi, robustni predstavitveni sistemi, katere lastnosti so idealne za razvoj takšnega sistema. ''B. subtilis'' izkazuje močne protiglivne lastnosti in je s strani FDA-ja označen kot generalno varen, saj ni patogen ali toksikogen do rastlin, živali ali ljudi. Med protiglivnimi defenzivnimi mehanizmi so: produkcija bakteriocinov, produkcija antibiotičnih lipopeptidov, produkcija iturina A, indukcija SAR-a in stimulacija rasti rastlinam simbiotskim glivam. Spore bakterij so zelo odporne na zunanje ekstremne pogoje in kljubujejo visoki temperaturi, UV radiaciji in ekstremnim pH-jem. Ob detekciji primernih nutrientov se hitro vrnejo v vegetativno stanje in se lahko normalno delijo [1].

= Potek dela =

== Hitinski predstavitveni sistem ==
Spore se v procesu sporulacije obdajo z več membranami, med katerimi je biotehnološko najbolj zanimiv t.i. plašč, ki vsebuje več kot 70 različnih proteinov in glikoproteinov. Nekateri izmed njih so se že izkazali kot molekulska predstavitvena sidra, za projekt Sporadicate pa so študenti uporabili strukturni protein CotG. Na sidrni protein CotG so z linkerjem povezali hitinazo ChiS. Gre za eksohitinazo pridobljeno iz organizma ''B. pumilus'', ki poleg hitinazne aktivnosti izkazuje še možnost delovanja kot lizocim. Poleg CotG so testirali še vezavo na sidrni protein CotZ, ki se nahaja v zunanji ovojnici, katera objema plašč spore [1].

== Samorazgrajujoči-se plazmid ==
Sistem CotG-linker-ChiS naj bi v bakterijske spore uvedli s plazmidom, ki se s sporulacijo razgradi. Razgradnjo bi dosegli s sistemom CRISPR-Cas9 tako, da bi pod promotor PsspB, ki se aktivira s sporulacijo, vstavili Cas9. Operon bi bil torej sestavljen iz promotorja PsspB, ribosoma optRBS, Cas9 CDS in iz terminatorja B0015. Za dosego večje občutljivosti sistema bi gRNA vstavili izven tega operona pod močan konstitutivni promotor ter s tem zagotovili večjo koncentracijo gRNA ob ekspresiji Cas9. Tarčna gRNA bi bila regija ori vstavljenega plazmida. Operon bi bil torej sestavljen iz konstitutivnega promotorja PlepA, ribosoma RBS2 gRNA CDS, D15 eksonukleaze in terminatorja Spy1 [1].

== Receptor za reaktivacijo spor ==

Mirujoče spore se v metabolično aktivne, vegetativne bakterije spremenijo v procesu germinacije/kaljenja. Točen mehanizem, ki zažene germinacijo še ni pojasnjen, znano pa je, da proces sprožijo hranila, kot so L-alanin, asparagin in enostavni sladkorji. V ''B. subtilis'' poznamo tri receptorje, ki uravnavajo proces germinacije: GerA, GerB in GerK. Medtem ko GerK in GerB za indukcijo potrebujeta več signalov (hranil), GerA lahko sproži popolno germinacijo spore le ob prisotnosti L-alanina. Receptor, ki bi sprožil proces germinacije ob prisotnosti monomerov hitina, so torej osnovali na receptorju GerA. GerA delulje kot vodni in ionski kanalček, ki aktivira germinacijo z rehidracijo spore. Pri načrtovanju so upoštevali, da se L-alanin veže le na podenoto GerAB in tako načrtovali proces mutageneze le na to regijo receptorja. Aminokislinske ostanke, ki dajo receptorju specifičnost, so določili z bioinformatskimi orodji (AlphaFold, Multiple Sequence Alignment). Laboratorijsko testiranje še ni bilo dejansko izvedeno, a načrt vključuje test specifičnosti z 10^8 različnimi kombinacijiami mutiranih proteinov GerA, pri čemer bi uporabljali pozitivno in negativno selekcijo [1].

== Konstrukcija vektorjev, kloniranja in rezultati ==

Pri delu z ''B. subtilis'' so v projektu uporabili SubtiToolKit oz. STK. Gre za »orodje« za manipulacijo gram pozitivnih bakterij, ki je primarno narejeno prav za ''B. subtilis''. Narejeno je po zgledu EcoFlex-a, ki velja za verzatilno Golden Gate orodje za kloniranje v E. coli. STK Golden Gate »orodje« sloni na treh tipIIs restriktazah: Bpil, Bsal in BsmbI.
Za kloniranje osnovnih konstruktov DNA so v projektu kot ogrodje uporabili plazmid pSTK-0-sfGFP. Plazmid vsebuje MCS regijo, selekcijski marker z odpornostjo na kloramfenikol, sfGFP; s katerim lahko prepoznamo uspešne insercije tarčnih regij, sfGFP RBS in ORI. Za ekspresijo proteinov v B. subtilis so uporabili ogrodje STK-EXP-1-sfGFP. Vektor omogoča selekcijo uspešno transformiranih celic z markerjem kloramfenikolom in selekcijo uspešno ustavljenega zaporedja z sfGFP proteinom [1].
CotG so z linkerjem povezali z reakcijo Phusion PCR. Linker so uvedli na 3' konec CotG CDS regije. V skupini so imeli na razpolago hitinazo v dveh delih oz. dveh linearnih fragmentih ChiS_part1 in ChiS_part2. Pred vezavo na 3' konec linkerja je bilo dva dela potrebno povezati. Za ta namen so uporabili »shranjevalni« vektor YTK001 – vektor YTK Golden Gate toolkita. Za vsak del hitinaze so načrtali olige in jim dodali previske, ki se ujemajo z restriktazo BsmBI (komplementarno z MCS regijo YTK001). Po PCR reakciji so s plazmidi transformirali E. coli celice in potrdili uspešnost. Fragmenta CotG-linker in ChiS so v projektu združili v Golden Gate reakciji z Bpil. CDS fragment so vstavili v plazmid skupaj s promotorjem, RBS-jem, GFP-jem in terminatorjem ter dobili funkcionalen transkript CotG-linker-ChiS. S tako sestavljenim plazmidom so (uspešno) transformirali bakterijske celice, a jim s PCR-jem na osnovi kolonije transformacije ni uspelo potrditi.

Konstrukt gRNA je sestavljen iz močnega konstitutivnega promotorja PlepA, RBS-ja TM_RBS2, gRNA CDS in Spy terminatorja. Vse skupaj so klonirali v plazmidno ogrodje STKA 1A. Posamezne biokocke so skupaj povezali z reakcijo Golden Gate. Pri načrtovanju konstrukta eksonukleaze D15 so za pravilno sestavljanje s proteinom Cas9 namesto terminatorja vanj vstavili spacer 0D. Podobno za pravilno sestavljanje končnega konstrukta Cas9 namesto promoterja vsebuje spacer 0A. Tako so dobili 3 transkripcijske enote in do kompletnega konstrukta samorazgrajujočega-se plazmida so potrebovali le še enoto z reporterskim proteinom GFPmut3B. Plazmida, ki bi vseboval TU z GFPmut3B jim zaradi časovnih omejitev ni uspelo sestaviti [1].

= Cilji za prihodnost =

Glavni problem sinteznobioloških izdelkov kot je Sporadicate so omejitve, ki jih prinaša uporaba GSO-jev. Sporadicate sicer naj ne bi vseboval gensko spremenjenih plazmidov v vegetativnih bakterijah, a še vedno lahko pride do nedelovanja mehanizma razgradnje in posledično do razširitve GSO bakterij. Za oceno možnosti takšnega scenarija in potencialne izboljšave produkta bi tako projekt potreboval nadaljnje testiranje na rastlinah in na terenu [1].
Z dodatnimi finančnimi vložki se nameravajo pri projektu posvetiti inženiringu germinantnega receptorja, ki je zaenkrat načrtovan le računalniško.

= Viri =
[1] SPORADICATE https://2022.igem.wiki/imperial-college-london/

Sporadicate

2023-05-09T16:12:58Z

GasperMozina:

Sporadicate je sinteznobiološki projekt v okviru tekmovanja iGEM 2022, ki ga je pripravila skupina študentov iz londonske univerze Imperal College London. Dostopen je na spletnem naslovu [https://2022.igem.wiki/imperial-college-london https://2022.igem.wiki/imperial-college-london.]

= Problem =
Naraščajoče svetovno prebivalstvo zahteva vedno večjo proizvodnjo hrane, zaradi mednarodnih konfliktov, podnebnih ekstremov in gospodarskih kriz, pa je preskrba s hrano vse bolj otežena. Za spopadanje s problemom lakote je nujno zvišanje kmetijske produktivnosti ter razvoj odpornih in trajnostnih sistemov. Bolezni rastlin povzročajo 10-15 odstotni izpad pridelka, od tega pa glivne bolezni predstavljajo kar 70-80 odstotkov. Trenutna uporaba fungicidov je nezadostna, zato so novi ukrepi ključnega pomena. V okviru projekta Sporadicate so razvili nestrupen biofungicid s širokim spektrom delovanja, sestavljen iz sistema bakterij ''B. subtilis'', ki odpravlja časovni zamik med diagnozo in zdravljenjem. Naravni sevi te bakterije so prisotni v talnem mikrobiomu in delujejo kot odlični bioobvladovalci, hkrati pa so popolnoma netoksični za ljudi, živali ali rastline [1].

= Načrt dela =
Projekt je zasnovan na sistemu »sense and response«. Torej, sistem, ki okužbo z glivo zazna in se nanjo tudi ustrezno odzove. Temelji na modificiranju spor ''B. subtilis'' tako, da te na svojem površju izražajo hitinaze, ki lahko razgrajujejo s hitinom bogato zunanjo membrano gliv. Pri procesu nastajajo monomeri hitina, ki delujejo kot univerzalni biomarkerji za vse glivne patogene in sprožijo imunski odziv rastlin. Spore ''B. subtilis'' bi vsebovale tudi mutirani germinantni receptor, ki bi vezal hitinske monomere. Ob vezavi se bi sprožil kaskadni odziv in omogočil reaktivacijo spor in razvoj vegetativnih bakterij. V nekaj minutah se bi bakterije namnožile in začele sproščati protiglivne lipopeptide. Modifikacije na sporah ''B. subtilis'' bi uvajali s pomočjo samorazgradljivih plazmidov – namnožene bakterije tako ne bi vsebovale nobene tuje DNA [1].

= Teoretično ozadje =

== Hitin ==
Raziskovalci so definirali dve optimalni strategiji za biokontrolo rastlin. Biofungicid mora imeti širok spekter protiglivnega delovanja, ali pa mora promovirati rastlinski imunski sistem. Študenti projekta Sporadicate so želeli zasnovati sistem, ki bi lahko naredil oboje in kot primerno tarčno molekulo so izbrali hitin. Hitin je linearni homopolimer z β-(1,4) vezjo povezanih N-acetil-D-glukozaminskih (NAG) monomerov. Predstavlja enega izmed glavnih komponent celične stene gliv in s tem idealen biomarker. Medtem ko rastlinski imunski receptorji hitina v glavnem direktno ne zaznavajo, lahko zaznajo njegove manjše fragmente ali monomere. Te lahko dobimo z delovanjem hitin razgrajujočih encimov hitinaz, ki so vrsta glikozilnih hidrolaz, katere razgrajujejo glikozidne vezi hitinskih polimerov. Večja dostopnost monomerov hitina omogoča induciranje fenomena SAR (systemic acquired resistance) in s tem večjo odpornost rastlin na okužbe [1].

== ''B. subtilis'' ==
Spore ''B. subtilis'' so poceni, vzdržljivi, robustni predstavitveni sistemi, katere lastnosti so idealne za razvoj takšnega sistema. ''B. subtilis'' izkazuje močne protiglivne lastnosti in je s strani FDA-ja označen kot generalno varen, saj ni patogen ali toksikogen do rastlin, živali ali ljudi. Med protiglivnimi defenzivnimi mehanizmi so: produkcija bakteriocinov, produkcija antibiotičnih lipopeptidov, produkcija iturina A, indukcija SAR-a in stimulacija rasti rastlinam simbiotskim glivam. Spore bakterij so zelo odporne na zunanje ekstremne pogoje in kljubujejo visoki temperaturi, UV radiaciji in ekstremnim pH-jem. Ob detekciji primernih nutrientov se hitro vrnejo v vegetativno stanje in se lahko normalno delijo [1].

= Potek dela =

== Hitinski predstavitveni sistem ==
Spore se v procesu sporulacije obdajo z več membranami, med katerimi je biotehnološko najbolj zanimiv t.i. plašč, ki vsebuje več kot 70 različnih proteinov in glikoproteinov. Nekateri izmed njih so se že izkazali kot molekulska predstavitvena sidra, za projekt Sporadicate pa so študenti uporabili strukturni protein CotG. Na sidrni protein CotG so z linkerjem povezali hitinazo ChiS. Gre za eksohitinazo pridobljeno iz organizma ''B. pumilus'', ki poleg hitinazne aktivnosti izkazuje še možnost delovanja kot lizocim. Poleg CotG so testirali še vezavo na sidrni protein CotZ, ki se nahaja v zunanji ovojnici, katera objema plašč spore [1].

== Samorazgrajujoči-se plazmid ==
Sistem CotG-linker-ChiS naj bi v bakterijske spore uvedli s plazmidom, ki se s sporulacijo razgradi. Razgradnjo bi dosegli s sistemom CRISPR-Cas9 tako, da bi pod promotor PsspB, ki se aktivira s sporulacijo, vstavili Cas9. Operon bi bil torej sestavljen iz promotorja PsspB, ribosoma optRBS, Cas9 CDS in iz terminatorja B0015. Za dosego večje občutljivosti sistema bi gRNA vstavili izven tega operona pod močan konstitutivni promotor ter s tem zagotovili večjo koncentracijo gRNA ob ekspresiji Cas9. Tarčna gRNA bi bila regija ori vstavljenega plazmida. Operon bi bil torej sestavljen iz konstitutivnega promotorja PlepA, ribosoma RBS2 gRNA CDS, D15 eksonukleaze in terminatorja Spy1 [1].

== Receptor za reaktivacijo spor ==

Mirujoče spore se v metabolično aktivne, vegetativne bakterije spremenijo v procesu germinacije/kaljenja. Točen mehanizem, ki zažene germinacijo še ni pojasnjen, znano pa je, da proces sprožijo hranila, kot so L-alanin, asparagin in enostavni sladkorji. V ''B. subtilis'' poznamo tri receptorje, ki uravnavajo proces germinacije: GerA, GerB in GerK. Medtem ko GerK in GerB za indukcijo potrebujeta več signalov (hranil), GerA lahko sproži popolno germinacijo spore le ob prisotnosti L-alanina. Receptor, ki bi sprožil proces germinacije ob prisotnosti monomerov hitina, so torej osnovali na receptorju GerA. GerA delulje kot vodni in ionski kanalček, ki aktivira germinacijo z rehidracijo spore. Pri načrtovanju so upoštevali, da se L-alanin veže le na podenoto GerAB in tako načrtovali proces mutageneze le na to regijo receptorja. Aminokislinske ostanke, ki dajo receptorju specifičnost, so določili z bioinformatskimi orodji (AlphaFold, Multiple Sequence Alignment). Laboratorijsko testiranje še ni bilo dejansko izvedeno, a načrt vključuje test specifičnosti z 10^8 različnimi kombinacijiami mutiranih proteinov GerA, pri čemer bi uporabljali pozitivno in negativno selekcijo [1].

== Konstrukcija vektorjev, kloniranja in rezultati ==

Pri delu z ''B. subtilis'' so v projektu uporabili SubtiToolKit oz. STK. Gre za »orodje« za manipulacijo gram pozitivnih bakterij, ki je primarno narejeno prav za ''B. subtilis''. Narejeno je po zgledu EcoFlex-a, ki velja za verzatilno Golden Gate orodje za kloniranje v E. coli. STK Golden Gate »orodje« sloni na treh tipIIs restriktazah: Bpil, Bsal in BsmbI.
Za kloniranje osnovnih konstruktov DNA so v projektu kot ogrodje uporabili plazmid pSTK-0-sfGFP. Plazmid vsebuje MCS regijo, selekcijski marker z odpornostjo na kloramfenikol, sfGFP; s katerim lahko prepoznamo uspešne insercije tarčnih regij, sfGFP RBS in ORI. Za ekspresijo proteinov v B. subtilis so uporabili ogrodje STK-EXP-1-sfGFP. Vektor omogoča selekcijo uspešno transformiranih celic z markerjem kloramfenikolom in selekcijo uspešno ustavljenega zaporedja z sfGFP proteinom [1].
CotG so z linkerjem povezali z reakcijo Phusion PCR. Linker so uvedli na 3' konec CotG CDS regije. V skupini so imeli na razpolago hitinazo v dveh delih oz. dveh linearnih fragmentih ChiS_part1 in ChiS_part2. Pred vezavo na 3' konec linkerja je bilo dva dela potrebno povezati. Za ta namen so uporabili »shranjevalni« vektor YTK001 – vektor YTK Golden Gate toolkita. Za vsak del hitinaze so načrtali olige in jim dodali previske, ki se ujemajo z restriktazo BsmBI (komplementarno z MCS regijo YTK001). Po PCR reakciji so s plazmidi transformirali E. coli celice in potrdili uspešnost. Fragmenta CotG-linker in ChiS so v projektu združili v Golden Gate reakciji z Bpil. CDS fragment so vstavili v plazmid skupaj s promotorjem, RBS-jem, GFP-jem in terminatorjem ter dobili funkcionalen transkript CotG-linker-ChiS. S tako sestavljenim plazmidom so (uspešno) transformirali bakterijske celice, a jim s PCR-jem na osnovi kolonije transformacije ni uspelo potrditi.

Konstrukt gRNA je sestavljen iz močnega konstitutivnega promotorja PlepA, RBS-ja TM_RBS2, gRNA CDS in Spy terminatorja. Vse skupaj so klonirali v plazmidno ogrodje STKA 1A. Posamezne biokocke so skupaj povezali z reakcijo Golden Gate. Pri načrtovanju konstrukta eksonukleaze D15 so za pravilno sestavljanje s proteinom Cas9 namesto terminatorja vanj vstavili spacer 0D. Podobno za pravilno sestavljanje končnega konstrukta Cas9 namesto promoterja vsebuje spacer 0A. Tako so dobili 3 transkripcijske enote in do kompletnega konstrukta samorazgrajujočega-se plazmida so potrebovali le še enoto z reporterskim proteinom GFPmut3B. Plazmida, ki bi vseboval TU z GFPmut3B jim zaradi časovnih omejitev ni uspelo sestaviti.[1].

= Cilji za prihodnost =

Glavni problem sinteznobioloških izdelkov kot je Sporadicate so omejitve, ki jih prinaša uporaba GSO-jev. Sporadicate sicer naj ne bi vseboval gensko spremenjenih plazmidov v vegetativnih bakterijah, a še vedno lahko pride do nedelovanja mehanizma razgradnje in posledično do razširitve GSO bakterij. Za oceno možnosti takšnega scenarija in potencialne izboljšave produkta bi tako projekt potreboval nadaljnje testiranje na rastlinah in na terenu [1].
Z dodatnimi finančnimi vložki se nameravajo pri projektu posvetiti inženiringu germinantnega receptorja, ki je zaenkrat načrtovan le računalniško.

= Viri =
[1] SPORADICATE https://2022.igem.wiki/imperial-college-london/

Sporadicate

2023-05-09T15:51:56Z

GasperMozina: /* Cilji za prihodnost */

Sporadicate je sinteznobiološki projekt v okviru tekmovanja iGEM 2022, ki ga je pripravila skupina študentov iz londonske univerze Imperal College London. Dostopen je na spletnem naslovu [https://2022.igem.wiki/imperial-college-london https://2022.igem.wiki/imperial-college-london.]

= Problem =
Naraščajoče svetovno prebivalstvo zahteva vedno večjo proizvodnjo hrane, zaradi mednarodnih konfliktov, podnebnih ekstremov in gospodarskih kriz, pa je preskrba s hrano vse bolj otežena. Za spopadanje s problemom lakote je nujno zvišanje kmetijske produktivnosti ter razvoj odpornih in trajnostnih sistemov. Bolezni rastlin povzročajo 10-15 odstotni izpad pridelka, od tega pa glivne bolezni predstavljajo kar 70-80 odstotkov. Trenutna uporaba fungicidov je nezadostna, zato so novi ukrepi ključnega pomena. V okviru projekta Sporadicate so razvili nestrupen biofungicid s širokim spektrom delovanja, sestavljen iz sistema bakterij ''B. subtilis'', ki odpravlja časovni zamik med diagnozo in zdravljenjem. Naravni sevi te bakterije so prisotni v talnem mikrobiomu in delujejo kot odlični bioobvladovalci, hkrati pa so popolnoma netoksični za ljudi, živali ali rastline [1].

= Načrt dela =
Projekt je zasnovan na sistemu »sense and response«. Torej, sistem, ki okužbo z glivo zazna in se nanjo tudi ustrezno odzove. Temelji na modificiranju spor ''B. subtilis'' tako, da te na svojem površju izražajo hitinaze, ki lahko razgrajujejo s hitinom bogato zunanjo membrano gliv. Pri procesu nastajajo monomeri hitina, ki delujejo kot univerzalni biomarkerji za vse glivne patogene in sprožijo imunski odziv rastlin. Spore ''B. subtilis'' bi vsebovale tudi mutirani germinantni receptor, ki bi vezal hitinske monomere. Ob vezavi se bi sprožil kaskadni odziv in omogočil reaktivacijo spor in razvoj vegetativnih bakterij. V nekaj minutah se bi bakterije namnožile in začele sproščati protiglivne lipopeptide. Modifikacije na sporah ''B. subtilis'' bi uvajali s pomočjo samorazgradljivih plazmidov – namnožene bakterije tako ne bi vsebovale nobene tuje DNA [1].

= Teoretično ozadje =

== Hitin ==
Raziskovalci so definirali dve optimalni strategiji za biokontrolo rastlin. Biofungicid mora imeti širok spekter protiglivnega delovanja, ali pa mora promovirati rastlinski imunski sistem. Študenti projekta Sporadicate so želeli zasnovati sistem, ki bi lahko naredil oboje in kot primerno tarčno molekulo so izbrali hitin. Hitin je linearni homopolimer z β-(1,4) vezjo povezanih N-acetil-D-glukozaminskih (NAG) monomerov. Predstavlja enega izmed glavnih komponent celične stene gliv in s tem idealen biomarker. Medtem ko rastlinski imunski receptorji hitina v glavnem direktno ne zaznavajo, lahko zaznajo njegove manjše fragmente ali monomere. Te lahko dobimo z delovanjem hitin razgrajujočih encimov hitinaz, ki so vrsta glikozilnih hidrolaz, katere razgrajujejo glikozidne vezi hitinskih polimerov. Večja dostopnost monomerov hitina omogoča induciranje fenomena SAR (systemic acquired resistance) in s tem večjo odpornost rastlin na okužbe [1].

== ''B. subtilis'' ==
Spore ''B. subtilis'' so poceni, vzdržljivi, robustni predstavitveni sistemi, katere lastnosti so idealne za razvoj takšnega sistema. ''B. subtilis'' izkazuje močne protiglivne lastnosti in je s strani FDA-ja označen kot generalno varen, saj ni patogen ali toksikogen do rastlin, živali ali ljudi. Med protiglivnimi defenzivnimi mehanizmi so: produkcija bakteriocinov, produkcija antibiotičnih lipopeptidov, produkcija iturina A, indukcija SAR-a in stimulacija rasti rastlinam simbiotskim glivam. Spore bakterij so zelo odporne na zunanje ekstremne pogoje in kljubujejo visoki temperaturi, UV radiaciji in ekstremnim pH-jem. Ob detekciji primernih nutrientov se hitro vrnejo v vegetativno stanje in se lahko normalno delijo [1].

= Potek dela =

== Hitinski predstavitveni sistem ==
Spore se v procesu sporulacije obdajo z več membranami, med katerimi je biotehnološko najbolj zanimiv t.i. plašč, ki vsebuje več kot 70 različnih proteinov in glikoproteinov. Nekateri izmed njih so se že izkazali kot molekulska predstavitvena sidra, za projekt Sporadicate pa so študenti uporabili strukturni protein CotG. Na sidrni protein CotG so z linkerjem povezali hitinazo ChiS. Gre za eksohitinazo pridobljeno iz organizma ''B. pumilus'', ki poleg hitinazne aktivnosti izkazuje še možnost delovanja kot lizocim. Poleg CotG so testirali še vezavo na sidrni protein CotZ, ki se nahaja v zunanji ovojnici, katera objema plašč spore [1].

== Samorazgrajujoči-se plazmid ==
Sistem CotG-linker-ChiS so v bakterijske spore uvedli s plazmidom, ki se s sporulacijo razgradi. Razgradnjo so dosegli s sistemom CRISPR-Cas9 tako, da so pod promotor PsspB, ki se aktivira s sporulacijo, vstavili Cas9. Operon je bil torej sestavljen iz promotorja PsspB, ribosoma optRBS, Cas9 CDS in iz terminatorja B0015. Za dosego večje občutljivosti sistema so gRNA vstavili izven tega operona pod močan konstitutivni promotor ter s tem zagotovili večjo koncentracijo gRNA ob ekspresiji Cas9. Tarčna gRNA je bila regija ori vstavljenega plazmida. Operon je bil sestavljen iz konstitutivnega promotorja PlepA, ribosoma RBS2 gRNA CDS, D15 eksonukleaze in terminatorja Spy1 [1].

== Receptor za reaktivacijo spor ==

Mirujoče spore se v metabolično aktivne, vegetativne bakterije spremenijo v procesu germinacije/kaljenja. Točen mehanizem, ki zažene germinacijo še ni pojasnjen, znano pa je, da proces sprožijo hranila, kot so L-alanin, asparagin in enostavni sladkorji. V ''B. subtilis'' poznamo tri receptorje, ki uravnavajo proces germinacije: GerA, GerB in GerK. Medtem ko GerK in GerB za indukcijo potrebujeta več signalov (hranil), GerA lahko sproži popolno germinacijo spore le ob prisotnosti L-alanina. Receptor, ki bi sprožil proces germinacije ob prisotnosti monomerov hitina, so torej osnovali na receptorju GerA. GerA delulje kot vodni in ionski kanalček, ki aktivira germinacijo z rehidracijo spore. Pri načrtovanju so upoštevali, da se L-alanin veže le na podenoto GerAB in tako načrtovali proces mutageneze le na to regijo receptorja. Aminokislinske ostanke, ki dajo receptorju specifičnost, so najprej določili z bioinformatskimi orodji (AlphaFold, Multiple Sequence Alignment). Laboratorijsko testiranje še ni bilo dejansko izvedeno, a načrt vključuje test specifičnosti z 10^8 različnimi kombinacijiami mutiranih proteinov GerA, pri čemer bi uporabljali pozitivno in negativno selekcijo [1].

== Konstrukcija vektorjev in proces kloniranja ==

Pri delu z ''B. subtilis'' so v projektu uporabili SubtiToolKit oz. STK. Gre za »orodje« za manipulacijo gram pozitivnih bakterij, ki je primarno narejeno prav za ''B. subtilis''. Narejeno je po zgledu EcoFlex-a, ki velja za verzatilno Golden Gate orodje za kloniranje v E. coli. STK Golden Gate »orodje« sloni na treh tipIIs restriktazah: Bpil, Bsal in BsmbI.
Za kloniranje osnovnih konstruktov DNA so v projektu kot ogrodje uporabili plazmid pSTK-0-sfGFP. Plazmid vsebuje MCS regijo, selekcijski marker z odpornostjo na kloramfenikol, sfGFP; s katerim lahko prepoznamo uspešne insercije tarčnih regij, sfGFP RBS in ORI. Za ekspresijo proteinov v B. subtilis so uporabili ogrodje STK-EXP-1-sfGFP. Vektor omogoča selekcijo uspešno transformiranih celic z markerjem kloramfenikolom in selekcijo uspešno ustavljenega zaporedja z sfGFP proteinom [1].
CotG so z linkerjem povezali z reakcijo Phusion PCR. Linker so uvedli na 3' konec CotG CDS regije. V skupini so imeli na razpolago hitinazo v dveh delih oz. dveh linearnih fragmentih ChiS_part1 in ChiS_part2. Pred vezavo na 3' konec linkerja je bilo dva dela potrebno povezati. Za ta namen so uporabili »shranjevalni« vektor YTK001 – vektor YTK Golden Gate toolkita. Za vsak del hitinaze so načrtali olige in jim dodali previske, ki se ujemajo z restriktazo BsmBI (komplementarno z MCS regijo YTK001). Po PCR reakciji so s plazmidi transformirali E. coli celice in potrdili uspešnost. Fragmenta CotG-linker in ChiS so v projektu združili v Golden Gate reakciji z Bpil. CDS fragment so vstavili v plazmid skupaj s promotorjem, RBS-jem, GFP-jem in terminatorjem ter dobili funkcionalen transkript CotG-linker-ChiS. Konstrukt gRNA je sestavljen iz močnega konstitutivnega promotorja PlepA, RBS-ja TM_RBS2, gRNA CDS in Spy terminatorja. Vse skupaj je klonirano v plazmidno ogrodje STKA 1A. Posamezne biokocke so skupaj povezali z reakcijo Golden Gate. Pri načrtovanju konstrukta eksonukleaze D15 so za pravilno sestavljanje s proteinom Cas9 namesto terminatorja vanj vstavili spacer 0D. Podobno za pravilno sestavljanje končnega konstrukta Cas9 namesto promoterja vsebuje spacer 0A [1].

= Cilji za prihodnost =

Glavni problem sinteznobioloških izdelkov kot je Sporadicate so omejitve, ki jih prinaša uporaba GSO-jev. Sporadicate sicer naj ne bi vseboval gensko spremenjenih plazmidov v vegetativnih bakterijah, a še vedno lahko pride do nedelovanja mehanizma razgradnje in posledično do razširitve GSO bakterij. Za oceno možnosti takšnega scenarija in potencialne izboljšave produkta bi tako projekt potreboval nadaljnje testiranje na rastlinah in na terenu [1].
Z dodatnimi finančnimi vložki se nameravajo pri projektu posvetiti inženiringu germinantnega receptorja, ki je zaenkrat načrtovan le računalniško.

= Viri =
[1] SPORADICATE https://2022.igem.wiki/imperial-college-london/

Sporadicate

2023-05-09T15:47:51Z

GasperMozina: /* Receptor za reaktivacijo spor */

Sporadicate je sinteznobiološki projekt v okviru tekmovanja iGEM 2022, ki ga je pripravila skupina študentov iz londonske univerze Imperal College London. Dostopen je na spletnem naslovu [https://2022.igem.wiki/imperial-college-london https://2022.igem.wiki/imperial-college-london.]

= Problem =
Naraščajoče svetovno prebivalstvo zahteva vedno večjo proizvodnjo hrane, zaradi mednarodnih konfliktov, podnebnih ekstremov in gospodarskih kriz, pa je preskrba s hrano vse bolj otežena. Za spopadanje s problemom lakote je nujno zvišanje kmetijske produktivnosti ter razvoj odpornih in trajnostnih sistemov. Bolezni rastlin povzročajo 10-15 odstotni izpad pridelka, od tega pa glivne bolezni predstavljajo kar 70-80 odstotkov. Trenutna uporaba fungicidov je nezadostna, zato so novi ukrepi ključnega pomena. V okviru projekta Sporadicate so razvili nestrupen biofungicid s širokim spektrom delovanja, sestavljen iz sistema bakterij ''B. subtilis'', ki odpravlja časovni zamik med diagnozo in zdravljenjem. Naravni sevi te bakterije so prisotni v talnem mikrobiomu in delujejo kot odlični bioobvladovalci, hkrati pa so popolnoma netoksični za ljudi, živali ali rastline [1].

= Načrt dela =
Projekt je zasnovan na sistemu »sense and response«. Torej, sistem, ki okužbo z glivo zazna in se nanjo tudi ustrezno odzove. Temelji na modificiranju spor ''B. subtilis'' tako, da te na svojem površju izražajo hitinaze, ki lahko razgrajujejo s hitinom bogato zunanjo membrano gliv. Pri procesu nastajajo monomeri hitina, ki delujejo kot univerzalni biomarkerji za vse glivne patogene in sprožijo imunski odziv rastlin. Spore ''B. subtilis'' bi vsebovale tudi mutirani germinantni receptor, ki bi vezal hitinske monomere. Ob vezavi se bi sprožil kaskadni odziv in omogočil reaktivacijo spor in razvoj vegetativnih bakterij. V nekaj minutah se bi bakterije namnožile in začele sproščati protiglivne lipopeptide. Modifikacije na sporah ''B. subtilis'' bi uvajali s pomočjo samorazgradljivih plazmidov – namnožene bakterije tako ne bi vsebovale nobene tuje DNA [1].

= Teoretično ozadje =

== Hitin ==
Raziskovalci so definirali dve optimalni strategiji za biokontrolo rastlin. Biofungicid mora imeti širok spekter protiglivnega delovanja, ali pa mora promovirati rastlinski imunski sistem. Študenti projekta Sporadicate so želeli zasnovati sistem, ki bi lahko naredil oboje in kot primerno tarčno molekulo so izbrali hitin. Hitin je linearni homopolimer z β-(1,4) vezjo povezanih N-acetil-D-glukozaminskih (NAG) monomerov. Predstavlja enega izmed glavnih komponent celične stene gliv in s tem idealen biomarker. Medtem ko rastlinski imunski receptorji hitina v glavnem direktno ne zaznavajo, lahko zaznajo njegove manjše fragmente ali monomere. Te lahko dobimo z delovanjem hitin razgrajujočih encimov hitinaz, ki so vrsta glikozilnih hidrolaz, katere razgrajujejo glikozidne vezi hitinskih polimerov. Večja dostopnost monomerov hitina omogoča induciranje fenomena SAR (systemic acquired resistance) in s tem večjo odpornost rastlin na okužbe [1].

== ''B. subtilis'' ==
Spore ''B. subtilis'' so poceni, vzdržljivi, robustni predstavitveni sistemi, katere lastnosti so idealne za razvoj takšnega sistema. ''B. subtilis'' izkazuje močne protiglivne lastnosti in je s strani FDA-ja označen kot generalno varen, saj ni patogen ali toksikogen do rastlin, živali ali ljudi. Med protiglivnimi defenzivnimi mehanizmi so: produkcija bakteriocinov, produkcija antibiotičnih lipopeptidov, produkcija iturina A, indukcija SAR-a in stimulacija rasti rastlinam simbiotskim glivam. Spore bakterij so zelo odporne na zunanje ekstremne pogoje in kljubujejo visoki temperaturi, UV radiaciji in ekstremnim pH-jem. Ob detekciji primernih nutrientov se hitro vrnejo v vegetativno stanje in se lahko normalno delijo [1].

= Potek dela =

== Hitinski predstavitveni sistem ==
Spore se v procesu sporulacije obdajo z več membranami, med katerimi je biotehnološko najbolj zanimiv t.i. plašč, ki vsebuje več kot 70 različnih proteinov in glikoproteinov. Nekateri izmed njih so se že izkazali kot molekulska predstavitvena sidra, za projekt Sporadicate pa so študenti uporabili strukturni protein CotG. Na sidrni protein CotG so z linkerjem povezali hitinazo ChiS. Gre za eksohitinazo pridobljeno iz organizma ''B. pumilus'', ki poleg hitinazne aktivnosti izkazuje še možnost delovanja kot lizocim. Poleg CotG so testirali še vezavo na sidrni protein CotZ, ki se nahaja v zunanji ovojnici, katera objema plašč spore [1].

== Samorazgrajujoči-se plazmid ==
Sistem CotG-linker-ChiS so v bakterijske spore uvedli s plazmidom, ki se s sporulacijo razgradi. Razgradnjo so dosegli s sistemom CRISPR-Cas9 tako, da so pod promotor PsspB, ki se aktivira s sporulacijo, vstavili Cas9. Operon je bil torej sestavljen iz promotorja PsspB, ribosoma optRBS, Cas9 CDS in iz terminatorja B0015. Za dosego večje občutljivosti sistema so gRNA vstavili izven tega operona pod močan konstitutivni promotor ter s tem zagotovili večjo koncentracijo gRNA ob ekspresiji Cas9. Tarčna gRNA je bila regija ori vstavljenega plazmida. Operon je bil sestavljen iz konstitutivnega promotorja PlepA, ribosoma RBS2 gRNA CDS, D15 eksonukleaze in terminatorja Spy1 [1].

== Receptor za reaktivacijo spor ==

Mirujoče spore se v metabolično aktivne, vegetativne bakterije spremenijo v procesu germinacije/kaljenja. Točen mehanizem, ki zažene germinacijo še ni pojasnjen, znano pa je, da proces sprožijo hranila, kot so L-alanin, asparagin in enostavni sladkorji. V ''B. subtilis'' poznamo tri receptorje, ki uravnavajo proces germinacije: GerA, GerB in GerK. Medtem ko GerK in GerB za indukcijo potrebujeta več signalov (hranil), GerA lahko sproži popolno germinacijo spore le ob prisotnosti L-alanina. Receptor, ki bi sprožil proces germinacije ob prisotnosti monomerov hitina, so torej osnovali na receptorju GerA. GerA delulje kot vodni in ionski kanalček, ki aktivira germinacijo z rehidracijo spore. Pri načrtovanju so upoštevali, da se L-alanin veže le na podenoto GerAB in tako načrtovali proces mutageneze le na to regijo receptorja. Aminokislinske ostanke, ki dajo receptorju specifičnost, so najprej določili z bioinformatskimi orodji (AlphaFold, Multiple Sequence Alignment). Laboratorijsko testiranje še ni bilo dejansko izvedeno, a načrt vključuje test specifičnosti z 10^8 različnimi kombinacijiami mutiranih proteinov GerA, pri čemer bi uporabljali pozitivno in negativno selekcijo [1].

== Konstrukcija vektorjev in proces kloniranja ==

Pri delu z ''B. subtilis'' so v projektu uporabili SubtiToolKit oz. STK. Gre za »orodje« za manipulacijo gram pozitivnih bakterij, ki je primarno narejeno prav za ''B. subtilis''. Narejeno je po zgledu EcoFlex-a, ki velja za verzatilno Golden Gate orodje za kloniranje v E. coli. STK Golden Gate »orodje« sloni na treh tipIIs restriktazah: Bpil, Bsal in BsmbI.
Za kloniranje osnovnih konstruktov DNA so v projektu kot ogrodje uporabili plazmid pSTK-0-sfGFP. Plazmid vsebuje MCS regijo, selekcijski marker z odpornostjo na kloramfenikol, sfGFP; s katerim lahko prepoznamo uspešne insercije tarčnih regij, sfGFP RBS in ORI. Za ekspresijo proteinov v B. subtilis so uporabili ogrodje STK-EXP-1-sfGFP. Vektor omogoča selekcijo uspešno transformiranih celic z markerjem kloramfenikolom in selekcijo uspešno ustavljenega zaporedja z sfGFP proteinom [1].
CotG so z linkerjem povezali z reakcijo Phusion PCR. Linker so uvedli na 3' konec CotG CDS regije. V skupini so imeli na razpolago hitinazo v dveh delih oz. dveh linearnih fragmentih ChiS_part1 in ChiS_part2. Pred vezavo na 3' konec linkerja je bilo dva dela potrebno povezati. Za ta namen so uporabili »shranjevalni« vektor YTK001 – vektor YTK Golden Gate toolkita. Za vsak del hitinaze so načrtali olige in jim dodali previske, ki se ujemajo z restriktazo BsmBI (komplementarno z MCS regijo YTK001). Po PCR reakciji so s plazmidi transformirali E. coli celice in potrdili uspešnost. Fragmenta CotG-linker in ChiS so v projektu združili v Golden Gate reakciji z Bpil. CDS fragment so vstavili v plazmid skupaj s promotorjem, RBS-jem, GFP-jem in terminatorjem ter dobili funkcionalen transkript CotG-linker-ChiS. Konstrukt gRNA je sestavljen iz močnega konstitutivnega promotorja PlepA, RBS-ja TM_RBS2, gRNA CDS in Spy terminatorja. Vse skupaj je klonirano v plazmidno ogrodje STKA 1A. Posamezne biokocke so skupaj povezali z reakcijo Golden Gate. Pri načrtovanju konstrukta eksonukleaze D15 so za pravilno sestavljanje s proteinom Cas9 namesto terminatorja vanj vstavili spacer 0D. Podobno za pravilno sestavljanje končnega konstrukta Cas9 namesto promoterja vsebuje spacer 0A [1].

= Cilji za prihodnost =

Glavni problem sinteznobioloških izdelkov kot je Sporadicate so omejitve, ki jih prinaša uporaba GSO-jev. Sporadicate sicer naj ne bi vseboval gensko spremenjenih plazmidov v vegetativnih bakterijah, a še vedno lahko pride do nedelovanja mehanizma razgradnje in posledično do razširitve GSO bakterij. Za oceno možnosti takšnega scenarija in potencialne izboljšave produkta bi tako projekt potreboval nadaljnje testiranje na rastlinah in na terenu [1].

= Viri =
[1] SPORADICATE https://2022.igem.wiki/imperial-college-london/

Sporadicate

2023-05-09T15:42:31Z

GasperMozina: /* Konstrukcija vektorjev in proces kloniranja */

Sporadicate je sinteznobiološki projekt v okviru tekmovanja iGEM 2022, ki ga je pripravila skupina študentov iz londonske univerze Imperal College London. Dostopen je na spletnem naslovu [https://2022.igem.wiki/imperial-college-london https://2022.igem.wiki/imperial-college-london.]

= Problem =
Naraščajoče svetovno prebivalstvo zahteva vedno večjo proizvodnjo hrane, zaradi mednarodnih konfliktov, podnebnih ekstremov in gospodarskih kriz, pa je preskrba s hrano vse bolj otežena. Za spopadanje s problemom lakote je nujno zvišanje kmetijske produktivnosti ter razvoj odpornih in trajnostnih sistemov. Bolezni rastlin povzročajo 10-15 odstotni izpad pridelka, od tega pa glivne bolezni predstavljajo kar 70-80 odstotkov. Trenutna uporaba fungicidov je nezadostna, zato so novi ukrepi ključnega pomena. V okviru projekta Sporadicate so razvili nestrupen biofungicid s širokim spektrom delovanja, sestavljen iz sistema bakterij ''B. subtilis'', ki odpravlja časovni zamik med diagnozo in zdravljenjem. Naravni sevi te bakterije so prisotni v talnem mikrobiomu in delujejo kot odlični bioobvladovalci, hkrati pa so popolnoma netoksični za ljudi, živali ali rastline [1].

= Načrt dela =
Projekt je zasnovan na sistemu »sense and response«. Torej, sistem, ki okužbo z glivo zazna in se nanjo tudi ustrezno odzove. Temelji na modificiranju spor ''B. subtilis'' tako, da te na svojem površju izražajo hitinaze, ki lahko razgrajujejo s hitinom bogato zunanjo membrano gliv. Pri procesu nastajajo monomeri hitina, ki delujejo kot univerzalni biomarkerji za vse glivne patogene in sprožijo imunski odziv rastlin. Spore ''B. subtilis'' bi vsebovale tudi mutirani germinantni receptor, ki bi vezal hitinske monomere. Ob vezavi se bi sprožil kaskadni odziv in omogočil reaktivacijo spor in razvoj vegetativnih bakterij. V nekaj minutah se bi bakterije namnožile in začele sproščati protiglivne lipopeptide. Modifikacije na sporah ''B. subtilis'' bi uvajali s pomočjo samorazgradljivih plazmidov – namnožene bakterije tako ne bi vsebovale nobene tuje DNA [1].

= Teoretično ozadje =

== Hitin ==
Raziskovalci so definirali dve optimalni strategiji za biokontrolo rastlin. Biofungicid mora imeti širok spekter protiglivnega delovanja, ali pa mora promovirati rastlinski imunski sistem. Študenti projekta Sporadicate so želeli zasnovati sistem, ki bi lahko naredil oboje in kot primerno tarčno molekulo so izbrali hitin. Hitin je linearni homopolimer z β-(1,4) vezjo povezanih N-acetil-D-glukozaminskih (NAG) monomerov. Predstavlja enega izmed glavnih komponent celične stene gliv in s tem idealen biomarker. Medtem ko rastlinski imunski receptorji hitina v glavnem direktno ne zaznavajo, lahko zaznajo njegove manjše fragmente ali monomere. Te lahko dobimo z delovanjem hitin razgrajujočih encimov hitinaz, ki so vrsta glikozilnih hidrolaz, katere razgrajujejo glikozidne vezi hitinskih polimerov. Večja dostopnost monomerov hitina omogoča induciranje fenomena SAR (systemic acquired resistance) in s tem večjo odpornost rastlin na okužbe [1].

== ''B. subtilis'' ==
Spore ''B. subtilis'' so poceni, vzdržljivi, robustni predstavitveni sistemi, katere lastnosti so idealne za razvoj takšnega sistema. ''B. subtilis'' izkazuje močne protiglivne lastnosti in je s strani FDA-ja označen kot generalno varen, saj ni patogen ali toksikogen do rastlin, živali ali ljudi. Med protiglivnimi defenzivnimi mehanizmi so: produkcija bakteriocinov, produkcija antibiotičnih lipopeptidov, produkcija iturina A, indukcija SAR-a in stimulacija rasti rastlinam simbiotskim glivam. Spore bakterij so zelo odporne na zunanje ekstremne pogoje in kljubujejo visoki temperaturi, UV radiaciji in ekstremnim pH-jem. Ob detekciji primernih nutrientov se hitro vrnejo v vegetativno stanje in se lahko normalno delijo [1].

= Potek dela =

== Hitinski predstavitveni sistem ==
Spore se v procesu sporulacije obdajo z več membranami, med katerimi je biotehnološko najbolj zanimiv t.i. plašč, ki vsebuje več kot 70 različnih proteinov in glikoproteinov. Nekateri izmed njih so se že izkazali kot molekulska predstavitvena sidra, za projekt Sporadicate pa so študenti uporabili strukturni protein CotG. Na sidrni protein CotG so z linkerjem povezali hitinazo ChiS. Gre za eksohitinazo pridobljeno iz organizma ''B. pumilus'', ki poleg hitinazne aktivnosti izkazuje še možnost delovanja kot lizocim. Poleg CotG so testirali še vezavo na sidrni protein CotZ, ki se nahaja v zunanji ovojnici, katera objema plašč spore [1].

== Samorazgrajujoči-se plazmid ==
Sistem CotG-linker-ChiS so v bakterijske spore uvedli s plazmidom, ki se s sporulacijo razgradi. Razgradnjo so dosegli s sistemom CRISPR-Cas9 tako, da so pod promotor PsspB, ki se aktivira s sporulacijo, vstavili Cas9. Operon je bil torej sestavljen iz promotorja PsspB, ribosoma optRBS, Cas9 CDS in iz terminatorja B0015. Za dosego večje občutljivosti sistema so gRNA vstavili izven tega operona pod močan konstitutivni promotor ter s tem zagotovili večjo koncentracijo gRNA ob ekspresiji Cas9. Tarčna gRNA je bila regija ori vstavljenega plazmida. Operon je bil sestavljen iz konstitutivnega promotorja PlepA, ribosoma RBS2 gRNA CDS, D15 eksonukleaze in terminatorja Spy1 [1].

== Receptor za reaktivacijo spor ==

Mirujoče spore se v metabolično aktivne, vegetativne bakterije spremenijo v procesu germinacije/kaljenja. Točen mehanizem, ki zažene germinacijo še ni pojasnjen, znano pa je, da proces sprožijo hranila, kot so L-alanin, asparagin in enostavni sladkorji. V ''B. subtilis'' poznamo tri receptorje, ki uravnavajo proces germinacije: GerA, GerB in GerK. Medtem ko GerK in GerB za indukcijo potrebujeta več signalov (hranil), GerA lahko sproži popolno germinacijo spore le ob prisotnosti L-alanina. Receptor, ki bi sprožil proces germinacije ob prisotnosti monomerov hitina, so torej osnovali na receptorju GerA. GerA delulje kot vodni in ionski kanalček, ki aktivira germinacijo z rehidracijo spore. Pri načrtovanju so upoštevali, da se L-alanin veže le na podenoto GerAB in tako načrtovali proces mutageneze le na to regijo receptorja. Aminokislinske ostanke, ki dajo receptorju specifičnost, so najprej določili z bioinformatskimi orodji (AlphaFold, Multiple Sequence Alignment). Laboratorijsko testiranje so izvedli z 10^8 različnimi kombinacijiami mutiranih proteinov GerA, pri čemer so uporabljali test specifičnosti s pozitivno in negativno selekcijo [1].

== Konstrukcija vektorjev in proces kloniranja ==

Pri delu z ''B. subtilis'' so v projektu uporabili SubtiToolKit oz. STK. Gre za »orodje« za manipulacijo gram pozitivnih bakterij, ki je primarno narejeno prav za ''B. subtilis''. Narejeno je po zgledu EcoFlex-a, ki velja za verzatilno Golden Gate orodje za kloniranje v E. coli. STK Golden Gate »orodje« sloni na treh tipIIs restriktazah: Bpil, Bsal in BsmbI.
Za kloniranje osnovnih konstruktov DNA so v projektu kot ogrodje uporabili plazmid pSTK-0-sfGFP. Plazmid vsebuje MCS regijo, selekcijski marker z odpornostjo na kloramfenikol, sfGFP; s katerim lahko prepoznamo uspešne insercije tarčnih regij, sfGFP RBS in ORI. Za ekspresijo proteinov v B. subtilis so uporabili ogrodje STK-EXP-1-sfGFP. Vektor omogoča selekcijo uspešno transformiranih celic z markerjem kloramfenikolom in selekcijo uspešno ustavljenega zaporedja z sfGFP proteinom [1].
CotG so z linkerjem povezali z reakcijo Phusion PCR. Linker so uvedli na 3' konec CotG CDS regije. V skupini so imeli na razpolago hitinazo v dveh delih oz. dveh linearnih fragmentih ChiS_part1 in ChiS_part2. Pred vezavo na 3' konec linkerja je bilo dva dela potrebno povezati. Za ta namen so uporabili »shranjevalni« vektor YTK001 – vektor YTK Golden Gate toolkita. Za vsak del hitinaze so načrtali olige in jim dodali previske, ki se ujemajo z restriktazo BsmBI (komplementarno z MCS regijo YTK001). Po PCR reakciji so s plazmidi transformirali E. coli celice in potrdili uspešnost. Fragmenta CotG-linker in ChiS so v projektu združili v Golden Gate reakciji z Bpil. CDS fragment so vstavili v plazmid skupaj s promotorjem, RBS-jem, GFP-jem in terminatorjem ter dobili funkcionalen transkript CotG-linker-ChiS. Konstrukt gRNA je sestavljen iz močnega konstitutivnega promotorja PlepA, RBS-ja TM_RBS2, gRNA CDS in Spy terminatorja. Vse skupaj je klonirano v plazmidno ogrodje STKA 1A. Posamezne biokocke so skupaj povezali z reakcijo Golden Gate. Pri načrtovanju konstrukta eksonukleaze D15 so za pravilno sestavljanje s proteinom Cas9 namesto terminatorja vanj vstavili spacer 0D. Podobno za pravilno sestavljanje končnega konstrukta Cas9 namesto promoterja vsebuje spacer 0A [1].

= Cilji za prihodnost =

Glavni problem sinteznobioloških izdelkov kot je Sporadicate so omejitve, ki jih prinaša uporaba GSO-jev. Sporadicate sicer naj ne bi vseboval gensko spremenjenih plazmidov v vegetativnih bakterijah, a še vedno lahko pride do nedelovanja mehanizma razgradnje in posledično do razširitve GSO bakterij. Za oceno možnosti takšnega scenarija in potencialne izboljšave produkta bi tako projekt potreboval nadaljnje testiranje na rastlinah in na terenu [1].

= Viri =
[1] SPORADICATE https://2022.igem.wiki/imperial-college-london/

Sporadicate

2023-05-09T09:16:55Z

GasperMozina: /* Samorazgrajujoči-se plazmid */

Sporadicate je sinteznobiološki projekt v okviru tekmovanja iGEM 2022, ki ga je pripravila skupina študentov iz londonske univerze Imperal College London. Dostopen je na spletnem naslovu [https://2022.igem.wiki/imperial-college-london https://2022.igem.wiki/imperial-college-london.]

= Problem =
Naraščajoče svetovno prebivalstvo zahteva vedno večjo proizvodnjo hrane, zaradi mednarodnih konfliktov, podnebnih ekstremov in gospodarskih kriz, pa je preskrba s hrano vse bolj otežena. Za spopadanje s problemom lakote je nujno zvišanje kmetijske produktivnosti ter razvoj odpornih in trajnostnih sistemov. Bolezni rastlin povzročajo 10-15 odstotni izpad pridelka, od tega pa glivne bolezni predstavljajo kar 70-80 odstotkov. Trenutna uporaba fungicidov je nezadostna, zato so novi ukrepi ključnega pomena. V okviru projekta Sporadicate so razvili nestrupen biofungicid s širokim spektrom delovanja, sestavljen iz sistema bakterij ''B. subtilis'', ki odpravlja časovni zamik med diagnozo in zdravljenjem. Naravni sevi te bakterije so prisotni v talnem mikrobiomu in delujejo kot odlični bioobvladovalci, hkrati pa so popolnoma netoksični za ljudi, živali ali rastline [1].

= Načrt dela =
Projekt je zasnovan na sistemu »sense and response«. Torej, sistem, ki okužbo z glivo zazna in se nanjo tudi ustrezno odzove. Temelji na modificiranju spor ''B. subtilis'' tako, da te na svojem površju izražajo hitinaze, ki lahko razgrajujejo s hitinom bogato zunanjo membrano gliv. Pri procesu nastajajo monomeri hitina, ki delujejo kot univerzalni biomarkerji za vse glivne patogene in sprožijo imunski odziv rastlin. Spore ''B. subtilis'' bi vsebovale tudi mutirani germinantni receptor, ki bi vezal hitinske monomere. Ob vezavi se bi sprožil kaskadni odziv in omogočil reaktivacijo spor in razvoj vegetativnih bakterij. V nekaj minutah se bi bakterije namnožile in začele sproščati protiglivne lipopeptide. Modifikacije na sporah ''B. subtilis'' bi uvajali s pomočjo samorazgradljivih plazmidov – namnožene bakterije tako ne bi vsebovale nobene tuje DNA [1].

= Teoretično ozadje =

== Hitin ==
Raziskovalci so definirali dve optimalni strategiji za biokontrolo rastlin. Biofungicid mora imeti širok spekter protiglivnega delovanja, ali pa mora promovirati rastlinski imunski sistem. Študenti projekta Sporadicate so želeli zasnovati sistem, ki bi lahko naredil oboje in kot primerno tarčno molekulo so izbrali hitin. Hitin je linearni homopolimer z β-(1,4) vezjo povezanih N-acetil-D-glukozaminskih (NAG) monomerov. Predstavlja enega izmed glavnih komponent celične stene gliv in s tem idealen biomarker. Medtem ko rastlinski imunski receptorji hitina v glavnem direktno ne zaznavajo, lahko zaznajo njegove manjše fragmente ali monomere. Te lahko dobimo z delovanjem hitin razgrajujočih encimov hitinaz, ki so vrsta glikozilnih hidrolaz, katere razgrajujejo glikozidne vezi hitinskih polimerov. Večja dostopnost monomerov hitina omogoča induciranje fenomena SAR (systemic acquired resistance) in s tem večjo odpornost rastlin na okužbe [1].

== ''B. subtilis'' ==
Spore ''B. subtilis'' so poceni, vzdržljivi, robustni predstavitveni sistemi, katere lastnosti so idealne za razvoj takšnega sistema. ''B. subtilis'' izkazuje močne protiglivne lastnosti in je s strani FDA-ja označen kot generalno varen, saj ni patogen ali toksikogen do rastlin, živali ali ljudi. Med protiglivnimi defenzivnimi mehanizmi so: produkcija bakteriocinov, produkcija antibiotičnih lipopeptidov, produkcija iturina A, indukcija SAR-a in stimulacija rasti rastlinam simbiotskim glivam. Spore bakterij so zelo odporne na zunanje ekstremne pogoje in kljubujejo visoki temperaturi, UV radiaciji in ekstremnim pH-jem. Ob detekciji primernih nutrientov se hitro vrnejo v vegetativno stanje in se lahko normalno delijo [1].

= Potek dela =

== Hitinski predstavitveni sistem ==
Spore se v procesu sporulacije obdajo z več membranami, med katerimi je biotehnološko najbolj zanimiv t.i. plašč, ki vsebuje več kot 70 različnih proteinov in glikoproteinov. Nekateri izmed njih so se že izkazali kot molekulska predstavitvena sidra, za projekt Sporadicate pa so študenti uporabili strukturni protein CotG. Na sidrni protein CotG so z linkerjem povezali hitinazo ChiS. Gre za eksohitinazo pridobljeno iz organizma ''B. pumilus'', ki poleg hitinazne aktivnosti izkazuje še možnost delovanja kot lizocim. Poleg CotG so testirali še vezavo na sidrni protein CotZ, ki se nahaja v zunanji ovojnici, katera objema plašč spore [1].

== Samorazgrajujoči-se plazmid ==
Sistem CotG-linker-ChiS so v bakterijske spore uvedli s plazmidom, ki se s sporulacijo razgradi. Razgradnjo so dosegli s sistemom CRISPR-Cas9 tako, da so pod promotor PsspB, ki se aktivira s sporulacijo, vstavili Cas9. Operon je bil torej sestavljen iz promotorja PsspB, ribosoma optRBS, Cas9 CDS in iz terminatorja B0015. Za dosego večje občutljivosti sistema so gRNA vstavili izven tega operona pod močan konstitutivni promotor ter s tem zagotovili večjo koncentracijo gRNA ob ekspresiji Cas9. Tarčna gRNA je bila regija ori vstavljenega plazmida. Operon je bil sestavljen iz konstitutivnega promotorja PlepA, ribosoma RBS2 gRNA CDS, D15 eksonukleaze in terminatorja Spy1 [1].

== Receptor za reaktivacijo spor ==

Mirujoče spore se v metabolično aktivne, vegetativne bakterije spremenijo v procesu germinacije/kaljenja. Točen mehanizem, ki zažene germinacijo še ni pojasnjen, znano pa je, da proces sprožijo hranila, kot so L-alanin, asparagin in enostavni sladkorji. V ''B. subtilis'' poznamo tri receptorje, ki uravnavajo proces germinacije: GerA, GerB in GerK. Medtem ko GerK in GerB za indukcijo potrebujeta več signalov (hranil), GerA lahko sproži popolno germinacijo spore le ob prisotnosti L-alanina. Receptor, ki bi sprožil proces germinacije ob prisotnosti monomerov hitina, so torej osnovali na receptorju GerA. GerA delulje kot vodni in ionski kanalček, ki aktivira germinacijo z rehidracijo spore. Pri načrtovanju so upoštevali, da se L-alanin veže le na podenoto GerAB in tako načrtovali proces mutageneze le na to regijo receptorja. Aminokislinske ostanke, ki dajo receptorju specifičnost, so najprej določili z bioinformatskimi orodji (AlphaFold, Multiple Sequence Alignment). Laboratorijsko testiranje so izvedli z 10^8 različnimi kombinacijiami mutiranih proteinov GerA, pri čemer so uporabljali test specifičnosti s pozitivno in negativno selekcijo [1].

== Konstrukcija vektorjev in proces kloniranja ==

Za kloniranje osnovnih konstruktov DNA so v projektu kot ogrodje uporabili plazmid pSTK-0-sfGFP. Plazmid vsebuje MCS regijo, selekcijski marker z odpornostjo na kloramfenikol, sfGFP; s katerim lahko prepoznamo uspešne insercije tarčnih regij, sfGFP RBS in ORI. Za ekspresijo proteinov v B. subtilis so uporabili ogrodje STK-EXP-1-sfGFP. Vektor omogoča selekcijo uspešno transformiranih celic z markerjem kloramfenikolom in selekcijo uspešno ustavljenega zaporedja z sfGFP proteinom [1].
CotG so z linkerjem povezali z reakcijo Phusion PCR. Linker so uvedli na 3' konec CotG CDS regije. V skupini so imeli na razpolago hitinazo v dveh delih oz. dveh linearnih fragmentih ChiS_part1 in ChiS_part2. Pred vezavo na 3' konec linkerja je bilo dva dela potrebno povezati. Za ta namen so uporabili »shranjevalni« vektor YTK001 – vektor YTK Golden Gate toolkita. Za vsak del hitinaze so načrtali olige in jim dodali previske, ki se ujemajo z restriktazo BsmBI (komplementarno z MCS regijo YTK001). Po PCR reakciji so s plazmidi transformirali E. coli celice in potrdili uspešnost. Fragmenta CotG-linker in ChiS so v projektu združili v Golden Gate reakciji z Bpil. CDS fragment so vstavili v plazmid skupaj s promotorjem, RBS-jem, GFP-jem in terminatorjem ter dobili funkcionalen transkript CotG-linker-ChiS. Konstrukt gRNA je sestavljen iz močnega konstitutivnega promotorja PlepA, RBS-ja TM_RBS2, gRNA CDS in Spy terminatorja. Vse skupaj je klonirano v plazmidno ogrodje STKA 1A. Posamezne biokocke so skupaj povezali z reakcijo Golden Gate. Pri načrtovanju konstrukta eksonukleaze D15 so za pravilno sestavljanje s proteinom Cas9 namesto terminatorja vanj vstavili spacer 0D. Podobno za pravilno sestavljanje končnega konstrukta Cas9 namesto promoterja vsebuje spacer 0A [1].

= Cilji za prihodnost =

Glavni problem sinteznobioloških izdelkov kot je Sporadicate so omejitve, ki jih prinaša uporaba GSO-jev. Sporadicate sicer naj ne bi vseboval gensko spremenjenih plazmidov v vegetativnih bakterijah, a še vedno lahko pride do nedelovanja mehanizma razgradnje in posledično do razširitve GSO bakterij. Za oceno možnosti takšnega scenarija in potencialne izboljšave produkta bi tako projekt potreboval nadaljnje testiranje na rastlinah in na terenu [1].

= Viri =
[1] SPORADICATE https://2022.igem.wiki/imperial-college-london/

Sporadicate

2023-05-09T09:15:31Z

GasperMozina: /* B. subtilis */

Sporadicate je sinteznobiološki projekt v okviru tekmovanja iGEM 2022, ki ga je pripravila skupina študentov iz londonske univerze Imperal College London. Dostopen je na spletnem naslovu [https://2022.igem.wiki/imperial-college-london https://2022.igem.wiki/imperial-college-london.]

= Problem =
Naraščajoče svetovno prebivalstvo zahteva vedno večjo proizvodnjo hrane, zaradi mednarodnih konfliktov, podnebnih ekstremov in gospodarskih kriz, pa je preskrba s hrano vse bolj otežena. Za spopadanje s problemom lakote je nujno zvišanje kmetijske produktivnosti ter razvoj odpornih in trajnostnih sistemov. Bolezni rastlin povzročajo 10-15 odstotni izpad pridelka, od tega pa glivne bolezni predstavljajo kar 70-80 odstotkov. Trenutna uporaba fungicidov je nezadostna, zato so novi ukrepi ključnega pomena. V okviru projekta Sporadicate so razvili nestrupen biofungicid s širokim spektrom delovanja, sestavljen iz sistema bakterij ''B. subtilis'', ki odpravlja časovni zamik med diagnozo in zdravljenjem. Naravni sevi te bakterije so prisotni v talnem mikrobiomu in delujejo kot odlični bioobvladovalci, hkrati pa so popolnoma netoksični za ljudi, živali ali rastline [1].

= Načrt dela =
Projekt je zasnovan na sistemu »sense and response«. Torej, sistem, ki okužbo z glivo zazna in se nanjo tudi ustrezno odzove. Temelji na modificiranju spor ''B. subtilis'' tako, da te na svojem površju izražajo hitinaze, ki lahko razgrajujejo s hitinom bogato zunanjo membrano gliv. Pri procesu nastajajo monomeri hitina, ki delujejo kot univerzalni biomarkerji za vse glivne patogene in sprožijo imunski odziv rastlin. Spore ''B. subtilis'' bi vsebovale tudi mutirani germinantni receptor, ki bi vezal hitinske monomere. Ob vezavi se bi sprožil kaskadni odziv in omogočil reaktivacijo spor in razvoj vegetativnih bakterij. V nekaj minutah se bi bakterije namnožile in začele sproščati protiglivne lipopeptide. Modifikacije na sporah ''B. subtilis'' bi uvajali s pomočjo samorazgradljivih plazmidov – namnožene bakterije tako ne bi vsebovale nobene tuje DNA [1].

= Teoretično ozadje =

== Hitin ==
Raziskovalci so definirali dve optimalni strategiji za biokontrolo rastlin. Biofungicid mora imeti širok spekter protiglivnega delovanja, ali pa mora promovirati rastlinski imunski sistem. Študenti projekta Sporadicate so želeli zasnovati sistem, ki bi lahko naredil oboje in kot primerno tarčno molekulo so izbrali hitin. Hitin je linearni homopolimer z β-(1,4) vezjo povezanih N-acetil-D-glukozaminskih (NAG) monomerov. Predstavlja enega izmed glavnih komponent celične stene gliv in s tem idealen biomarker. Medtem ko rastlinski imunski receptorji hitina v glavnem direktno ne zaznavajo, lahko zaznajo njegove manjše fragmente ali monomere. Te lahko dobimo z delovanjem hitin razgrajujočih encimov hitinaz, ki so vrsta glikozilnih hidrolaz, katere razgrajujejo glikozidne vezi hitinskih polimerov. Večja dostopnost monomerov hitina omogoča induciranje fenomena SAR (systemic acquired resistance) in s tem večjo odpornost rastlin na okužbe [1].

== ''B. subtilis'' ==
Spore ''B. subtilis'' so poceni, vzdržljivi, robustni predstavitveni sistemi, katere lastnosti so idealne za razvoj takšnega sistema. ''B. subtilis'' izkazuje močne protiglivne lastnosti in je s strani FDA-ja označen kot generalno varen, saj ni patogen ali toksikogen do rastlin, živali ali ljudi. Med protiglivnimi defenzivnimi mehanizmi so: produkcija bakteriocinov, produkcija antibiotičnih lipopeptidov, produkcija iturina A, indukcija SAR-a in stimulacija rasti rastlinam simbiotskim glivam. Spore bakterij so zelo odporne na zunanje ekstremne pogoje in kljubujejo visoki temperaturi, UV radiaciji in ekstremnim pH-jem. Ob detekciji primernih nutrientov se hitro vrnejo v vegetativno stanje in se lahko normalno delijo [1].

= Potek dela =

== Hitinski predstavitveni sistem ==
Spore se v procesu sporulacije obdajo z več membranami, med katerimi je biotehnološko najbolj zanimiv t.i. plašč, ki vsebuje več kot 70 različnih proteinov in glikoproteinov. Nekateri izmed njih so se že izkazali kot molekulska predstavitvena sidra, za projekt Sporadicate pa so študenti uporabili strukturni protein CotG. Na sidrni protein CotG so z linkerjem povezali hitinazo ChiS. Gre za eksohitinazo pridobljeno iz organizma ''B. pumilus'', ki poleg hitinazne aktivnosti izkazuje še možnost delovanja kot lizocim. Poleg CotG so testirali še vezavo na sidrni protein CotZ, ki se nahaja v zunanji ovojnici, katera objema plašč spore [1].

== Samorazgrajujoči-se plazmid ==
Sistem CotG-linker-ChiS so v bakterijske spore uvedli s plazmidom, ki se s sporulacijo razgradi. Razgradnjo so dosegli s sistemom CRISPR-Cas9 tako, da so pod promotor PsspB, ki se aktivira s sporulacijo, vstavili Cas9. Operon je bil torej sestavljen iz promotorja PsspB, ribosoma optRBS, Cas9 CDS in iz terminatorja B0015. Za dosego večje občutljivosti sistema so gRNA vstavili izven tega operona pod konstitutivni promotor ter s tem zagotovili večjo koncentracijo gRNA ob ekspresiji Cas9. Tarčna gRNA je bila regija ori vstavljenega plazmida. Operon je bil sestavljen iz konstitutivnega promotorja PlepA, ribosoma RBS2 gRNA CDS, D15 eksonukleaze in terminatorja Spy1 [1].

== Receptor za reaktivacijo spor ==

Mirujoče spore se v metabolično aktivne, vegetativne bakterije spremenijo v procesu germinacije/kaljenja. Točen mehanizem, ki zažene germinacijo še ni pojasnjen, znano pa je, da proces sprožijo hranila, kot so L-alanin, asparagin in enostavni sladkorji. V ''B. subtilis'' poznamo tri receptorje, ki uravnavajo proces germinacije: GerA, GerB in GerK. Medtem ko GerK in GerB za indukcijo potrebujeta več signalov (hranil), GerA lahko sproži popolno germinacijo spore le ob prisotnosti L-alanina. Receptor, ki bi sprožil proces germinacije ob prisotnosti monomerov hitina, so torej osnovali na receptorju GerA. GerA delulje kot vodni in ionski kanalček, ki aktivira germinacijo z rehidracijo spore. Pri načrtovanju so upoštevali, da se L-alanin veže le na podenoto GerAB in tako načrtovali proces mutageneze le na to regijo receptorja. Aminokislinske ostanke, ki dajo receptorju specifičnost, so najprej določili z bioinformatskimi orodji (AlphaFold, Multiple Sequence Alignment). Laboratorijsko testiranje so izvedli z 10^8 različnimi kombinacijiami mutiranih proteinov GerA, pri čemer so uporabljali test specifičnosti s pozitivno in negativno selekcijo [1].

== Konstrukcija vektorjev in proces kloniranja ==

Za kloniranje osnovnih konstruktov DNA so v projektu kot ogrodje uporabili plazmid pSTK-0-sfGFP. Plazmid vsebuje MCS regijo, selekcijski marker z odpornostjo na kloramfenikol, sfGFP; s katerim lahko prepoznamo uspešne insercije tarčnih regij, sfGFP RBS in ORI. Za ekspresijo proteinov v B. subtilis so uporabili ogrodje STK-EXP-1-sfGFP. Vektor omogoča selekcijo uspešno transformiranih celic z markerjem kloramfenikolom in selekcijo uspešno ustavljenega zaporedja z sfGFP proteinom [1].
CotG so z linkerjem povezali z reakcijo Phusion PCR. Linker so uvedli na 3' konec CotG CDS regije. V skupini so imeli na razpolago hitinazo v dveh delih oz. dveh linearnih fragmentih ChiS_part1 in ChiS_part2. Pred vezavo na 3' konec linkerja je bilo dva dela potrebno povezati. Za ta namen so uporabili »shranjevalni« vektor YTK001 – vektor YTK Golden Gate toolkita. Za vsak del hitinaze so načrtali olige in jim dodali previske, ki se ujemajo z restriktazo BsmBI (komplementarno z MCS regijo YTK001). Po PCR reakciji so s plazmidi transformirali E. coli celice in potrdili uspešnost. Fragmenta CotG-linker in ChiS so v projektu združili v Golden Gate reakciji z Bpil. CDS fragment so vstavili v plazmid skupaj s promotorjem, RBS-jem, GFP-jem in terminatorjem ter dobili funkcionalen transkript CotG-linker-ChiS. Konstrukt gRNA je sestavljen iz močnega konstitutivnega promotorja PlepA, RBS-ja TM_RBS2, gRNA CDS in Spy terminatorja. Vse skupaj je klonirano v plazmidno ogrodje STKA 1A. Posamezne biokocke so skupaj povezali z reakcijo Golden Gate. Pri načrtovanju konstrukta eksonukleaze D15 so za pravilno sestavljanje s proteinom Cas9 namesto terminatorja vanj vstavili spacer 0D. Podobno za pravilno sestavljanje končnega konstrukta Cas9 namesto promoterja vsebuje spacer 0A [1].

= Cilji za prihodnost =

Glavni problem sinteznobioloških izdelkov kot je Sporadicate so omejitve, ki jih prinaša uporaba GSO-jev. Sporadicate sicer naj ne bi vseboval gensko spremenjenih plazmidov v vegetativnih bakterijah, a še vedno lahko pride do nedelovanja mehanizma razgradnje in posledično do razširitve GSO bakterij. Za oceno možnosti takšnega scenarija in potencialne izboljšave produkta bi tako projekt potreboval nadaljnje testiranje na rastlinah in na terenu [1].

= Viri =
[1] SPORADICATE https://2022.igem.wiki/imperial-college-london/

Sporadicate

2023-05-09T09:14:06Z

GasperMozina: /* Hitin */

Sporadicate je sinteznobiološki projekt v okviru tekmovanja iGEM 2022, ki ga je pripravila skupina študentov iz londonske univerze Imperal College London. Dostopen je na spletnem naslovu [https://2022.igem.wiki/imperial-college-london https://2022.igem.wiki/imperial-college-london.]

= Problem =
Naraščajoče svetovno prebivalstvo zahteva vedno večjo proizvodnjo hrane, zaradi mednarodnih konfliktov, podnebnih ekstremov in gospodarskih kriz, pa je preskrba s hrano vse bolj otežena. Za spopadanje s problemom lakote je nujno zvišanje kmetijske produktivnosti ter razvoj odpornih in trajnostnih sistemov. Bolezni rastlin povzročajo 10-15 odstotni izpad pridelka, od tega pa glivne bolezni predstavljajo kar 70-80 odstotkov. Trenutna uporaba fungicidov je nezadostna, zato so novi ukrepi ključnega pomena. V okviru projekta Sporadicate so razvili nestrupen biofungicid s širokim spektrom delovanja, sestavljen iz sistema bakterij ''B. subtilis'', ki odpravlja časovni zamik med diagnozo in zdravljenjem. Naravni sevi te bakterije so prisotni v talnem mikrobiomu in delujejo kot odlični bioobvladovalci, hkrati pa so popolnoma netoksični za ljudi, živali ali rastline [1].

= Načrt dela =
Projekt je zasnovan na sistemu »sense and response«. Torej, sistem, ki okužbo z glivo zazna in se nanjo tudi ustrezno odzove. Temelji na modificiranju spor ''B. subtilis'' tako, da te na svojem površju izražajo hitinaze, ki lahko razgrajujejo s hitinom bogato zunanjo membrano gliv. Pri procesu nastajajo monomeri hitina, ki delujejo kot univerzalni biomarkerji za vse glivne patogene in sprožijo imunski odziv rastlin. Spore ''B. subtilis'' bi vsebovale tudi mutirani germinantni receptor, ki bi vezal hitinske monomere. Ob vezavi se bi sprožil kaskadni odziv in omogočil reaktivacijo spor in razvoj vegetativnih bakterij. V nekaj minutah se bi bakterije namnožile in začele sproščati protiglivne lipopeptide. Modifikacije na sporah ''B. subtilis'' bi uvajali s pomočjo samorazgradljivih plazmidov – namnožene bakterije tako ne bi vsebovale nobene tuje DNA [1].

= Teoretično ozadje =

== Hitin ==
Raziskovalci so definirali dve optimalni strategiji za biokontrolo rastlin. Biofungicid mora imeti širok spekter protiglivnega delovanja, ali pa mora promovirati rastlinski imunski sistem. Študenti projekta Sporadicate so želeli zasnovati sistem, ki bi lahko naredil oboje in kot primerno tarčno molekulo so izbrali hitin. Hitin je linearni homopolimer z β-(1,4) vezjo povezanih N-acetil-D-glukozaminskih (NAG) monomerov. Predstavlja enega izmed glavnih komponent celične stene gliv in s tem idealen biomarker. Medtem ko rastlinski imunski receptorji hitina v glavnem direktno ne zaznavajo, lahko zaznajo njegove manjše fragmente ali monomere. Te lahko dobimo z delovanjem hitin razgrajujočih encimov hitinaz, ki so vrsta glikozilnih hidrolaz, katere razgrajujejo glikozidne vezi hitinskih polimerov. Večja dostopnost monomerov hitina omogoča induciranje fenomena SAR (systemic acquired resistance) in s tem večjo odpornost rastlin na okužbe [1].

== ''B. subtilis'' ==
Spore ''B. subtilis'' so poceni, vzdržljivi, robustni predstavitveni sistemi, katere lastnosti so idealne za razvoj takšnega sistema. ''B. subtilis'' izkazuje močne protiglivne lastnosti in je s strani FDA-ja označen kot generalno varen, saj ni patogen ali toksikogen do rastlin, živali ali ljudi. Med protiglivnimi defenzivnimi mehanizmi so: produkcija bakteriocinov, produkcija antibiotičnih lipopeptidov, produkcija iturina A, indukcija SAR-a in stimulacija rasti rastlinam simbiotskim glivam. Spore bakterij so zelo odporne na zunanje ekstremne pogoje in kljubujejo visoki temperaturi, UV radiaciji in ekstremnim pH-jem. Ob detekciji primernih nutrientov pa se hitro vrnejo v vegetativno stanje in se lahko delijo [1].

= Potek dela =

== Hitinski predstavitveni sistem ==
Spore se v procesu sporulacije obdajo z več membranami, med katerimi je biotehnološko najbolj zanimiv t.i. plašč, ki vsebuje več kot 70 različnih proteinov in glikoproteinov. Nekateri izmed njih so se že izkazali kot molekulska predstavitvena sidra, za projekt Sporadicate pa so študenti uporabili strukturni protein CotG. Na sidrni protein CotG so z linkerjem povezali hitinazo ChiS. Gre za eksohitinazo pridobljeno iz organizma ''B. pumilus'', ki poleg hitinazne aktivnosti izkazuje še možnost delovanja kot lizocim. Poleg CotG so testirali še vezavo na sidrni protein CotZ, ki se nahaja v zunanji ovojnici, katera objema plašč spore [1].

== Samorazgrajujoči-se plazmid ==
Sistem CotG-linker-ChiS so v bakterijske spore uvedli s plazmidom, ki se s sporulacijo razgradi. Razgradnjo so dosegli s sistemom CRISPR-Cas9 tako, da so pod promotor PsspB, ki se aktivira s sporulacijo, vstavili Cas9. Operon je bil torej sestavljen iz promotorja PsspB, ribosoma optRBS, Cas9 CDS in iz terminatorja B0015. Za dosego večje občutljivosti sistema so gRNA vstavili izven tega operona pod konstitutivni promotor ter s tem zagotovili večjo koncentracijo gRNA ob ekspresiji Cas9. Tarčna gRNA je bila regija ori vstavljenega plazmida. Operon je bil sestavljen iz konstitutivnega promotorja PlepA, ribosoma RBS2 gRNA CDS, D15 eksonukleaze in terminatorja Spy1 [1].

== Receptor za reaktivacijo spor ==

Mirujoče spore se v metabolično aktivne, vegetativne bakterije spremenijo v procesu germinacije/kaljenja. Točen mehanizem, ki zažene germinacijo še ni pojasnjen, znano pa je, da proces sprožijo hranila, kot so L-alanin, asparagin in enostavni sladkorji. V ''B. subtilis'' poznamo tri receptorje, ki uravnavajo proces germinacije: GerA, GerB in GerK. Medtem ko GerK in GerB za indukcijo potrebujeta več signalov (hranil), GerA lahko sproži popolno germinacijo spore le ob prisotnosti L-alanina. Receptor, ki bi sprožil proces germinacije ob prisotnosti monomerov hitina, so torej osnovali na receptorju GerA. GerA delulje kot vodni in ionski kanalček, ki aktivira germinacijo z rehidracijo spore. Pri načrtovanju so upoštevali, da se L-alanin veže le na podenoto GerAB in tako načrtovali proces mutageneze le na to regijo receptorja. Aminokislinske ostanke, ki dajo receptorju specifičnost, so najprej določili z bioinformatskimi orodji (AlphaFold, Multiple Sequence Alignment). Laboratorijsko testiranje so izvedli z 10^8 različnimi kombinacijiami mutiranih proteinov GerA, pri čemer so uporabljali test specifičnosti s pozitivno in negativno selekcijo [1].

== Konstrukcija vektorjev in proces kloniranja ==

Za kloniranje osnovnih konstruktov DNA so v projektu kot ogrodje uporabili plazmid pSTK-0-sfGFP. Plazmid vsebuje MCS regijo, selekcijski marker z odpornostjo na kloramfenikol, sfGFP; s katerim lahko prepoznamo uspešne insercije tarčnih regij, sfGFP RBS in ORI. Za ekspresijo proteinov v B. subtilis so uporabili ogrodje STK-EXP-1-sfGFP. Vektor omogoča selekcijo uspešno transformiranih celic z markerjem kloramfenikolom in selekcijo uspešno ustavljenega zaporedja z sfGFP proteinom [1].
CotG so z linkerjem povezali z reakcijo Phusion PCR. Linker so uvedli na 3' konec CotG CDS regije. V skupini so imeli na razpolago hitinazo v dveh delih oz. dveh linearnih fragmentih ChiS_part1 in ChiS_part2. Pred vezavo na 3' konec linkerja je bilo dva dela potrebno povezati. Za ta namen so uporabili »shranjevalni« vektor YTK001 – vektor YTK Golden Gate toolkita. Za vsak del hitinaze so načrtali olige in jim dodali previske, ki se ujemajo z restriktazo BsmBI (komplementarno z MCS regijo YTK001). Po PCR reakciji so s plazmidi transformirali E. coli celice in potrdili uspešnost. Fragmenta CotG-linker in ChiS so v projektu združili v Golden Gate reakciji z Bpil. CDS fragment so vstavili v plazmid skupaj s promotorjem, RBS-jem, GFP-jem in terminatorjem ter dobili funkcionalen transkript CotG-linker-ChiS. Konstrukt gRNA je sestavljen iz močnega konstitutivnega promotorja PlepA, RBS-ja TM_RBS2, gRNA CDS in Spy terminatorja. Vse skupaj je klonirano v plazmidno ogrodje STKA 1A. Posamezne biokocke so skupaj povezali z reakcijo Golden Gate. Pri načrtovanju konstrukta eksonukleaze D15 so za pravilno sestavljanje s proteinom Cas9 namesto terminatorja vanj vstavili spacer 0D. Podobno za pravilno sestavljanje končnega konstrukta Cas9 namesto promoterja vsebuje spacer 0A [1].

= Cilji za prihodnost =

Glavni problem sinteznobioloških izdelkov kot je Sporadicate so omejitve, ki jih prinaša uporaba GSO-jev. Sporadicate sicer naj ne bi vseboval gensko spremenjenih plazmidov v vegetativnih bakterijah, a še vedno lahko pride do nedelovanja mehanizma razgradnje in posledično do razširitve GSO bakterij. Za oceno možnosti takšnega scenarija in potencialne izboljšave produkta bi tako projekt potreboval nadaljnje testiranje na rastlinah in na terenu [1].

= Viri =
[1] SPORADICATE https://2022.igem.wiki/imperial-college-london/

Sporadicate

2023-05-09T09:13:32Z

GasperMozina: /* Hitin */

Sporadicate je sinteznobiološki projekt v okviru tekmovanja iGEM 2022, ki ga je pripravila skupina študentov iz londonske univerze Imperal College London. Dostopen je na spletnem naslovu [https://2022.igem.wiki/imperial-college-london https://2022.igem.wiki/imperial-college-london.]

= Problem =
Naraščajoče svetovno prebivalstvo zahteva vedno večjo proizvodnjo hrane, zaradi mednarodnih konfliktov, podnebnih ekstremov in gospodarskih kriz, pa je preskrba s hrano vse bolj otežena. Za spopadanje s problemom lakote je nujno zvišanje kmetijske produktivnosti ter razvoj odpornih in trajnostnih sistemov. Bolezni rastlin povzročajo 10-15 odstotni izpad pridelka, od tega pa glivne bolezni predstavljajo kar 70-80 odstotkov. Trenutna uporaba fungicidov je nezadostna, zato so novi ukrepi ključnega pomena. V okviru projekta Sporadicate so razvili nestrupen biofungicid s širokim spektrom delovanja, sestavljen iz sistema bakterij ''B. subtilis'', ki odpravlja časovni zamik med diagnozo in zdravljenjem. Naravni sevi te bakterije so prisotni v talnem mikrobiomu in delujejo kot odlični bioobvladovalci, hkrati pa so popolnoma netoksični za ljudi, živali ali rastline [1].

= Načrt dela =
Projekt je zasnovan na sistemu »sense and response«. Torej, sistem, ki okužbo z glivo zazna in se nanjo tudi ustrezno odzove. Temelji na modificiranju spor ''B. subtilis'' tako, da te na svojem površju izražajo hitinaze, ki lahko razgrajujejo s hitinom bogato zunanjo membrano gliv. Pri procesu nastajajo monomeri hitina, ki delujejo kot univerzalni biomarkerji za vse glivne patogene in sprožijo imunski odziv rastlin. Spore ''B. subtilis'' bi vsebovale tudi mutirani germinantni receptor, ki bi vezal hitinske monomere. Ob vezavi se bi sprožil kaskadni odziv in omogočil reaktivacijo spor in razvoj vegetativnih bakterij. V nekaj minutah se bi bakterije namnožile in začele sproščati protiglivne lipopeptide. Modifikacije na sporah ''B. subtilis'' bi uvajali s pomočjo samorazgradljivih plazmidov – namnožene bakterije tako ne bi vsebovale nobene tuje DNA [1].

= Teoretično ozadje =

== Hitin ==
Raziskovalci so definirali dve optimalni strategiji za biokontrolo rastlin. Biofungicid mora imeti širok spekter protiglivnega delovanja, ali pa mora promovirati rastlinski imunski sistem. Študenti projekta Sporadicate so želeli zasnovati sistem, ki bi lahko naredil oboje in kot primerno tarčno molekulo so izbrali hitin. Hitin je linearni homopolimer z β-(1,4) vezjo povezanih N-acetil-D-glukozaminskih (NAG) monomerov. Predstavlja enega izmed glavnih komponent celične stene gliv in s tem idealen biomarker. Medtem ko rastlinski imunski receptorji hitina direktno ne zaznavajo, lahko zaznajo njegove manjše fragmente ali monomere. Te lahko dobimo z delovanjem hitin razgrajujočih encimov hitinaz, ki so vrsta glikozilnih hidrolaz, katere razgrajujejo glikozidne vezi hitinskih polimerov. Večja dostopnost monomerov hitina omogoča induciranje fenomena SAR (systemic acquired resistance) in s tem večjo odpornost rastlin na okužbe [1].

== ''B. subtilis'' ==
Spore ''B. subtilis'' so poceni, vzdržljivi, robustni predstavitveni sistemi, katere lastnosti so idealne za razvoj takšnega sistema. ''B. subtilis'' izkazuje močne protiglivne lastnosti in je s strani FDA-ja označen kot generalno varen, saj ni patogen ali toksikogen do rastlin, živali ali ljudi. Med protiglivnimi defenzivnimi mehanizmi so: produkcija bakteriocinov, produkcija antibiotičnih lipopeptidov, produkcija iturina A, indukcija SAR-a in stimulacija rasti rastlinam simbiotskim glivam. Spore bakterij so zelo odporne na zunanje ekstremne pogoje in kljubujejo visoki temperaturi, UV radiaciji in ekstremnim pH-jem. Ob detekciji primernih nutrientov pa se hitro vrnejo v vegetativno stanje in se lahko delijo [1].

= Potek dela =

== Hitinski predstavitveni sistem ==
Spore se v procesu sporulacije obdajo z več membranami, med katerimi je biotehnološko najbolj zanimiv t.i. plašč, ki vsebuje več kot 70 različnih proteinov in glikoproteinov. Nekateri izmed njih so se že izkazali kot molekulska predstavitvena sidra, za projekt Sporadicate pa so študenti uporabili strukturni protein CotG. Na sidrni protein CotG so z linkerjem povezali hitinazo ChiS. Gre za eksohitinazo pridobljeno iz organizma ''B. pumilus'', ki poleg hitinazne aktivnosti izkazuje še možnost delovanja kot lizocim. Poleg CotG so testirali še vezavo na sidrni protein CotZ, ki se nahaja v zunanji ovojnici, katera objema plašč spore [1].

== Samorazgrajujoči-se plazmid ==
Sistem CotG-linker-ChiS so v bakterijske spore uvedli s plazmidom, ki se s sporulacijo razgradi. Razgradnjo so dosegli s sistemom CRISPR-Cas9 tako, da so pod promotor PsspB, ki se aktivira s sporulacijo, vstavili Cas9. Operon je bil torej sestavljen iz promotorja PsspB, ribosoma optRBS, Cas9 CDS in iz terminatorja B0015. Za dosego večje občutljivosti sistema so gRNA vstavili izven tega operona pod konstitutivni promotor ter s tem zagotovili večjo koncentracijo gRNA ob ekspresiji Cas9. Tarčna gRNA je bila regija ori vstavljenega plazmida. Operon je bil sestavljen iz konstitutivnega promotorja PlepA, ribosoma RBS2 gRNA CDS, D15 eksonukleaze in terminatorja Spy1 [1].

== Receptor za reaktivacijo spor ==

Mirujoče spore se v metabolično aktivne, vegetativne bakterije spremenijo v procesu germinacije/kaljenja. Točen mehanizem, ki zažene germinacijo še ni pojasnjen, znano pa je, da proces sprožijo hranila, kot so L-alanin, asparagin in enostavni sladkorji. V ''B. subtilis'' poznamo tri receptorje, ki uravnavajo proces germinacije: GerA, GerB in GerK. Medtem ko GerK in GerB za indukcijo potrebujeta več signalov (hranil), GerA lahko sproži popolno germinacijo spore le ob prisotnosti L-alanina. Receptor, ki bi sprožil proces germinacije ob prisotnosti monomerov hitina, so torej osnovali na receptorju GerA. GerA delulje kot vodni in ionski kanalček, ki aktivira germinacijo z rehidracijo spore. Pri načrtovanju so upoštevali, da se L-alanin veže le na podenoto GerAB in tako načrtovali proces mutageneze le na to regijo receptorja. Aminokislinske ostanke, ki dajo receptorju specifičnost, so najprej določili z bioinformatskimi orodji (AlphaFold, Multiple Sequence Alignment). Laboratorijsko testiranje so izvedli z 10^8 različnimi kombinacijiami mutiranih proteinov GerA, pri čemer so uporabljali test specifičnosti s pozitivno in negativno selekcijo [1].

== Konstrukcija vektorjev in proces kloniranja ==

Za kloniranje osnovnih konstruktov DNA so v projektu kot ogrodje uporabili plazmid pSTK-0-sfGFP. Plazmid vsebuje MCS regijo, selekcijski marker z odpornostjo na kloramfenikol, sfGFP; s katerim lahko prepoznamo uspešne insercije tarčnih regij, sfGFP RBS in ORI. Za ekspresijo proteinov v B. subtilis so uporabili ogrodje STK-EXP-1-sfGFP. Vektor omogoča selekcijo uspešno transformiranih celic z markerjem kloramfenikolom in selekcijo uspešno ustavljenega zaporedja z sfGFP proteinom [1].
CotG so z linkerjem povezali z reakcijo Phusion PCR. Linker so uvedli na 3' konec CotG CDS regije. V skupini so imeli na razpolago hitinazo v dveh delih oz. dveh linearnih fragmentih ChiS_part1 in ChiS_part2. Pred vezavo na 3' konec linkerja je bilo dva dela potrebno povezati. Za ta namen so uporabili »shranjevalni« vektor YTK001 – vektor YTK Golden Gate toolkita. Za vsak del hitinaze so načrtali olige in jim dodali previske, ki se ujemajo z restriktazo BsmBI (komplementarno z MCS regijo YTK001). Po PCR reakciji so s plazmidi transformirali E. coli celice in potrdili uspešnost. Fragmenta CotG-linker in ChiS so v projektu združili v Golden Gate reakciji z Bpil. CDS fragment so vstavili v plazmid skupaj s promotorjem, RBS-jem, GFP-jem in terminatorjem ter dobili funkcionalen transkript CotG-linker-ChiS. Konstrukt gRNA je sestavljen iz močnega konstitutivnega promotorja PlepA, RBS-ja TM_RBS2, gRNA CDS in Spy terminatorja. Vse skupaj je klonirano v plazmidno ogrodje STKA 1A. Posamezne biokocke so skupaj povezali z reakcijo Golden Gate. Pri načrtovanju konstrukta eksonukleaze D15 so za pravilno sestavljanje s proteinom Cas9 namesto terminatorja vanj vstavili spacer 0D. Podobno za pravilno sestavljanje končnega konstrukta Cas9 namesto promoterja vsebuje spacer 0A [1].

= Cilji za prihodnost =

Glavni problem sinteznobioloških izdelkov kot je Sporadicate so omejitve, ki jih prinaša uporaba GSO-jev. Sporadicate sicer naj ne bi vseboval gensko spremenjenih plazmidov v vegetativnih bakterijah, a še vedno lahko pride do nedelovanja mehanizma razgradnje in posledično do razširitve GSO bakterij. Za oceno možnosti takšnega scenarija in potencialne izboljšave produkta bi tako projekt potreboval nadaljnje testiranje na rastlinah in na terenu [1].

= Viri =
[1] SPORADICATE https://2022.igem.wiki/imperial-college-london/

Sporadicate

2023-05-09T09:12:49Z

GasperMozina: /* Načrt dela */

Sporadicate je sinteznobiološki projekt v okviru tekmovanja iGEM 2022, ki ga je pripravila skupina študentov iz londonske univerze Imperal College London. Dostopen je na spletnem naslovu [https://2022.igem.wiki/imperial-college-london https://2022.igem.wiki/imperial-college-london.]

= Problem =
Naraščajoče svetovno prebivalstvo zahteva vedno večjo proizvodnjo hrane, zaradi mednarodnih konfliktov, podnebnih ekstremov in gospodarskih kriz, pa je preskrba s hrano vse bolj otežena. Za spopadanje s problemom lakote je nujno zvišanje kmetijske produktivnosti ter razvoj odpornih in trajnostnih sistemov. Bolezni rastlin povzročajo 10-15 odstotni izpad pridelka, od tega pa glivne bolezni predstavljajo kar 70-80 odstotkov. Trenutna uporaba fungicidov je nezadostna, zato so novi ukrepi ključnega pomena. V okviru projekta Sporadicate so razvili nestrupen biofungicid s širokim spektrom delovanja, sestavljen iz sistema bakterij ''B. subtilis'', ki odpravlja časovni zamik med diagnozo in zdravljenjem. Naravni sevi te bakterije so prisotni v talnem mikrobiomu in delujejo kot odlični bioobvladovalci, hkrati pa so popolnoma netoksični za ljudi, živali ali rastline [1].

= Načrt dela =
Projekt je zasnovan na sistemu »sense and response«. Torej, sistem, ki okužbo z glivo zazna in se nanjo tudi ustrezno odzove. Temelji na modificiranju spor ''B. subtilis'' tako, da te na svojem površju izražajo hitinaze, ki lahko razgrajujejo s hitinom bogato zunanjo membrano gliv. Pri procesu nastajajo monomeri hitina, ki delujejo kot univerzalni biomarkerji za vse glivne patogene in sprožijo imunski odziv rastlin. Spore ''B. subtilis'' bi vsebovale tudi mutirani germinantni receptor, ki bi vezal hitinske monomere. Ob vezavi se bi sprožil kaskadni odziv in omogočil reaktivacijo spor in razvoj vegetativnih bakterij. V nekaj minutah se bi bakterije namnožile in začele sproščati protiglivne lipopeptide. Modifikacije na sporah ''B. subtilis'' bi uvajali s pomočjo samorazgradljivih plazmidov – namnožene bakterije tako ne bi vsebovale nobene tuje DNA [1].

= Teoretično ozadje =

== Hitin ==
Raziskovalci so definirali dve optimalni strategiji za biokontrolo rastlin. Biofungicid mora imeti širok spekter protiglivnega delovanja, ali pa mora promovirati rastlinski imunski sistem. Študenti projekta Sporadicate so želeli zasnovati sistem, ki bi lahko naredil oboje in kot primerno tarčno molekulo so izbrali hitin. Hitin je linearni homopolimer z β-(1,4) vezjo povezanih povezanih N-acetil-D-glukozaminskih (NAG) monomerov. Predstavlja enega izmed glavnih komponent celične stene gliv in s tem idealen biomarker. Medtem ko rastlinski imunski receptorji hitina direktno ne zaznavajo, lahko zaznajo njegove manjše fragmente ali monomere. Te lahko dobimo z delovanjem hitin razgrajujočih encimov hitinaz, ki so vrsta glikozilnih hidrolaz, katere razgrajujejo glikozidne vezi hitinskih polimerov. Večja dostopnost monomerov hitina omogoča induciranje fenomena SAR (systemic acquired resistance) in s tem večjo odpornost rastlin na okužbe [1].

== ''B. subtilis'' ==
Spore ''B. subtilis'' so poceni, vzdržljivi, robustni predstavitveni sistemi, katere lastnosti so idealne za razvoj takšnega sistema. ''B. subtilis'' izkazuje močne protiglivne lastnosti in je s strani FDA-ja označen kot generalno varen, saj ni patogen ali toksikogen do rastlin, živali ali ljudi. Med protiglivnimi defenzivnimi mehanizmi so: produkcija bakteriocinov, produkcija antibiotičnih lipopeptidov, produkcija iturina A, indukcija SAR-a in stimulacija rasti rastlinam simbiotskim glivam. Spore bakterij so zelo odporne na zunanje ekstremne pogoje in kljubujejo visoki temperaturi, UV radiaciji in ekstremnim pH-jem. Ob detekciji primernih nutrientov pa se hitro vrnejo v vegetativno stanje in se lahko delijo [1].

= Potek dela =

== Hitinski predstavitveni sistem ==
Spore se v procesu sporulacije obdajo z več membranami, med katerimi je biotehnološko najbolj zanimiv t.i. plašč, ki vsebuje več kot 70 različnih proteinov in glikoproteinov. Nekateri izmed njih so se že izkazali kot molekulska predstavitvena sidra, za projekt Sporadicate pa so študenti uporabili strukturni protein CotG. Na sidrni protein CotG so z linkerjem povezali hitinazo ChiS. Gre za eksohitinazo pridobljeno iz organizma ''B. pumilus'', ki poleg hitinazne aktivnosti izkazuje še možnost delovanja kot lizocim. Poleg CotG so testirali še vezavo na sidrni protein CotZ, ki se nahaja v zunanji ovojnici, katera objema plašč spore [1].

== Samorazgrajujoči-se plazmid ==
Sistem CotG-linker-ChiS so v bakterijske spore uvedli s plazmidom, ki se s sporulacijo razgradi. Razgradnjo so dosegli s sistemom CRISPR-Cas9 tako, da so pod promotor PsspB, ki se aktivira s sporulacijo, vstavili Cas9. Operon je bil torej sestavljen iz promotorja PsspB, ribosoma optRBS, Cas9 CDS in iz terminatorja B0015. Za dosego večje občutljivosti sistema so gRNA vstavili izven tega operona pod konstitutivni promotor ter s tem zagotovili večjo koncentracijo gRNA ob ekspresiji Cas9. Tarčna gRNA je bila regija ori vstavljenega plazmida. Operon je bil sestavljen iz konstitutivnega promotorja PlepA, ribosoma RBS2 gRNA CDS, D15 eksonukleaze in terminatorja Spy1 [1].

== Receptor za reaktivacijo spor ==

Mirujoče spore se v metabolično aktivne, vegetativne bakterije spremenijo v procesu germinacije/kaljenja. Točen mehanizem, ki zažene germinacijo še ni pojasnjen, znano pa je, da proces sprožijo hranila, kot so L-alanin, asparagin in enostavni sladkorji. V ''B. subtilis'' poznamo tri receptorje, ki uravnavajo proces germinacije: GerA, GerB in GerK. Medtem ko GerK in GerB za indukcijo potrebujeta več signalov (hranil), GerA lahko sproži popolno germinacijo spore le ob prisotnosti L-alanina. Receptor, ki bi sprožil proces germinacije ob prisotnosti monomerov hitina, so torej osnovali na receptorju GerA. GerA delulje kot vodni in ionski kanalček, ki aktivira germinacijo z rehidracijo spore. Pri načrtovanju so upoštevali, da se L-alanin veže le na podenoto GerAB in tako načrtovali proces mutageneze le na to regijo receptorja. Aminokislinske ostanke, ki dajo receptorju specifičnost, so najprej določili z bioinformatskimi orodji (AlphaFold, Multiple Sequence Alignment). Laboratorijsko testiranje so izvedli z 10^8 različnimi kombinacijiami mutiranih proteinov GerA, pri čemer so uporabljali test specifičnosti s pozitivno in negativno selekcijo [1].

== Konstrukcija vektorjev in proces kloniranja ==

Za kloniranje osnovnih konstruktov DNA so v projektu kot ogrodje uporabili plazmid pSTK-0-sfGFP. Plazmid vsebuje MCS regijo, selekcijski marker z odpornostjo na kloramfenikol, sfGFP; s katerim lahko prepoznamo uspešne insercije tarčnih regij, sfGFP RBS in ORI. Za ekspresijo proteinov v B. subtilis so uporabili ogrodje STK-EXP-1-sfGFP. Vektor omogoča selekcijo uspešno transformiranih celic z markerjem kloramfenikolom in selekcijo uspešno ustavljenega zaporedja z sfGFP proteinom [1].
CotG so z linkerjem povezali z reakcijo Phusion PCR. Linker so uvedli na 3' konec CotG CDS regije. V skupini so imeli na razpolago hitinazo v dveh delih oz. dveh linearnih fragmentih ChiS_part1 in ChiS_part2. Pred vezavo na 3' konec linkerja je bilo dva dela potrebno povezati. Za ta namen so uporabili »shranjevalni« vektor YTK001 – vektor YTK Golden Gate toolkita. Za vsak del hitinaze so načrtali olige in jim dodali previske, ki se ujemajo z restriktazo BsmBI (komplementarno z MCS regijo YTK001). Po PCR reakciji so s plazmidi transformirali E. coli celice in potrdili uspešnost. Fragmenta CotG-linker in ChiS so v projektu združili v Golden Gate reakciji z Bpil. CDS fragment so vstavili v plazmid skupaj s promotorjem, RBS-jem, GFP-jem in terminatorjem ter dobili funkcionalen transkript CotG-linker-ChiS. Konstrukt gRNA je sestavljen iz močnega konstitutivnega promotorja PlepA, RBS-ja TM_RBS2, gRNA CDS in Spy terminatorja. Vse skupaj je klonirano v plazmidno ogrodje STKA 1A. Posamezne biokocke so skupaj povezali z reakcijo Golden Gate. Pri načrtovanju konstrukta eksonukleaze D15 so za pravilno sestavljanje s proteinom Cas9 namesto terminatorja vanj vstavili spacer 0D. Podobno za pravilno sestavljanje končnega konstrukta Cas9 namesto promoterja vsebuje spacer 0A [1].

= Cilji za prihodnost =

Glavni problem sinteznobioloških izdelkov kot je Sporadicate so omejitve, ki jih prinaša uporaba GSO-jev. Sporadicate sicer naj ne bi vseboval gensko spremenjenih plazmidov v vegetativnih bakterijah, a še vedno lahko pride do nedelovanja mehanizma razgradnje in posledično do razširitve GSO bakterij. Za oceno možnosti takšnega scenarija in potencialne izboljšave produkta bi tako projekt potreboval nadaljnje testiranje na rastlinah in na terenu [1].

= Viri =
[1] SPORADICATE https://2022.igem.wiki/imperial-college-london/

Sporadicate

2023-05-09T09:11:05Z

GasperMozina: /* Načrt dela */

Sporadicate je sinteznobiološki projekt v okviru tekmovanja iGEM 2022, ki ga je pripravila skupina študentov iz londonske univerze Imperal College London. Dostopen je na spletnem naslovu [https://2022.igem.wiki/imperial-college-london https://2022.igem.wiki/imperial-college-london.]

= Problem =
Naraščajoče svetovno prebivalstvo zahteva vedno večjo proizvodnjo hrane, zaradi mednarodnih konfliktov, podnebnih ekstremov in gospodarskih kriz, pa je preskrba s hrano vse bolj otežena. Za spopadanje s problemom lakote je nujno zvišanje kmetijske produktivnosti ter razvoj odpornih in trajnostnih sistemov. Bolezni rastlin povzročajo 10-15 odstotni izpad pridelka, od tega pa glivne bolezni predstavljajo kar 70-80 odstotkov. Trenutna uporaba fungicidov je nezadostna, zato so novi ukrepi ključnega pomena. V okviru projekta Sporadicate so razvili nestrupen biofungicid s širokim spektrom delovanja, sestavljen iz sistema bakterij ''B. subtilis'', ki odpravlja časovni zamik med diagnozo in zdravljenjem. Naravni sevi te bakterije so prisotni v talnem mikrobiomu in delujejo kot odlični bioobvladovalci, hkrati pa so popolnoma netoksični za ljudi, živali ali rastline [1].

= Načrt dela =
Projekt je zasnovan na sistemu »sense and response«. Torej, sistem, ki okužbo z glivo zazna in se nanjo tudi ustrezno odzove. Temelji na modificiranju spor ''B. subtilis'' tako, da te na svojem površju izražajo hitinaze, ki lahko razgrajujejo s hitinom bogato zunanjo membrano gliv. Pri procesu nastajajo monomeri hitina, ki delujejo kot univerzalni biomarkerji za vse glivne patogene in sprožijo imunski odziv rastlin. Spore ''B. subtilis'' bi vsebovale tudi mutirani germinantni receptor, ki bi vezal hitinske monomere. Ob vezavi se bi sprožil kaskadni odziv in omogočil reaktivacijo spor in razvoj vegetativnih bakterij. V nekaj minutah se bi bakterije namnožile in začele sproščati protiglivne lipopeptide. Modifikacije na sporah ''B. subtilis'' bi uvedli s tehnologijo CRISPR, katere elemente bi dostavljali s pomočjo samorazgradljivih plazmidov – namnožene bakterije tako ne bi vsebovale nobene tuje DNA [1].

= Teoretično ozadje =

== Hitin ==
Raziskovalci so definirali dve optimalni strategiji za biokontrolo rastlin. Biofungicid mora imeti širok spekter protiglivnega delovanja, ali pa mora promovirati rastlinski imunski sistem. Študenti projekta Sporadicate so želeli zasnovati sistem, ki bi lahko naredil oboje in kot primerno tarčno molekulo so izbrali hitin. Hitin je linearni homopolimer z β-(1,4) vezjo povezanih povezanih N-acetil-D-glukozaminskih (NAG) monomerov. Predstavlja enega izmed glavnih komponent celične stene gliv in s tem idealen biomarker. Medtem ko rastlinski imunski receptorji hitina direktno ne zaznavajo, lahko zaznajo njegove manjše fragmente ali monomere. Te lahko dobimo z delovanjem hitin razgrajujočih encimov hitinaz, ki so vrsta glikozilnih hidrolaz, katere razgrajujejo glikozidne vezi hitinskih polimerov. Večja dostopnost monomerov hitina omogoča induciranje fenomena SAR (systemic acquired resistance) in s tem večjo odpornost rastlin na okužbe [1].

== ''B. subtilis'' ==
Spore ''B. subtilis'' so poceni, vzdržljivi, robustni predstavitveni sistemi, katere lastnosti so idealne za razvoj takšnega sistema. ''B. subtilis'' izkazuje močne protiglivne lastnosti in je s strani FDA-ja označen kot generalno varen, saj ni patogen ali toksikogen do rastlin, živali ali ljudi. Med protiglivnimi defenzivnimi mehanizmi so: produkcija bakteriocinov, produkcija antibiotičnih lipopeptidov, produkcija iturina A, indukcija SAR-a in stimulacija rasti rastlinam simbiotskim glivam. Spore bakterij so zelo odporne na zunanje ekstremne pogoje in kljubujejo visoki temperaturi, UV radiaciji in ekstremnim pH-jem. Ob detekciji primernih nutrientov pa se hitro vrnejo v vegetativno stanje in se lahko delijo [1].

= Potek dela =

== Hitinski predstavitveni sistem ==
Spore se v procesu sporulacije obdajo z več membranami, med katerimi je biotehnološko najbolj zanimiv t.i. plašč, ki vsebuje več kot 70 različnih proteinov in glikoproteinov. Nekateri izmed njih so se že izkazali kot molekulska predstavitvena sidra, za projekt Sporadicate pa so študenti uporabili strukturni protein CotG. Na sidrni protein CotG so z linkerjem povezali hitinazo ChiS. Gre za eksohitinazo pridobljeno iz organizma ''B. pumilus'', ki poleg hitinazne aktivnosti izkazuje še možnost delovanja kot lizocim. Poleg CotG so testirali še vezavo na sidrni protein CotZ, ki se nahaja v zunanji ovojnici, katera objema plašč spore [1].

== Samorazgrajujoči-se plazmid ==
Sistem CotG-linker-ChiS so v bakterijske spore uvedli s plazmidom, ki se s sporulacijo razgradi. Razgradnjo so dosegli s sistemom CRISPR-Cas9 tako, da so pod promotor PsspB, ki se aktivira s sporulacijo, vstavili Cas9. Operon je bil torej sestavljen iz promotorja PsspB, ribosoma optRBS, Cas9 CDS in iz terminatorja B0015. Za dosego večje občutljivosti sistema so gRNA vstavili izven tega operona pod konstitutivni promotor ter s tem zagotovili večjo koncentracijo gRNA ob ekspresiji Cas9. Tarčna gRNA je bila regija ori vstavljenega plazmida. Operon je bil sestavljen iz konstitutivnega promotorja PlepA, ribosoma RBS2 gRNA CDS, D15 eksonukleaze in terminatorja Spy1 [1].

== Receptor za reaktivacijo spor ==

Mirujoče spore se v metabolično aktivne, vegetativne bakterije spremenijo v procesu germinacije/kaljenja. Točen mehanizem, ki zažene germinacijo še ni pojasnjen, znano pa je, da proces sprožijo hranila, kot so L-alanin, asparagin in enostavni sladkorji. V ''B. subtilis'' poznamo tri receptorje, ki uravnavajo proces germinacije: GerA, GerB in GerK. Medtem ko GerK in GerB za indukcijo potrebujeta več signalov (hranil), GerA lahko sproži popolno germinacijo spore le ob prisotnosti L-alanina. Receptor, ki bi sprožil proces germinacije ob prisotnosti monomerov hitina, so torej osnovali na receptorju GerA. GerA delulje kot vodni in ionski kanalček, ki aktivira germinacijo z rehidracijo spore. Pri načrtovanju so upoštevali, da se L-alanin veže le na podenoto GerAB in tako načrtovali proces mutageneze le na to regijo receptorja. Aminokislinske ostanke, ki dajo receptorju specifičnost, so najprej določili z bioinformatskimi orodji (AlphaFold, Multiple Sequence Alignment). Laboratorijsko testiranje so izvedli z 10^8 različnimi kombinacijiami mutiranih proteinov GerA, pri čemer so uporabljali test specifičnosti s pozitivno in negativno selekcijo [1].

== Konstrukcija vektorjev in proces kloniranja ==

Za kloniranje osnovnih konstruktov DNA so v projektu kot ogrodje uporabili plazmid pSTK-0-sfGFP. Plazmid vsebuje MCS regijo, selekcijski marker z odpornostjo na kloramfenikol, sfGFP; s katerim lahko prepoznamo uspešne insercije tarčnih regij, sfGFP RBS in ORI. Za ekspresijo proteinov v B. subtilis so uporabili ogrodje STK-EXP-1-sfGFP. Vektor omogoča selekcijo uspešno transformiranih celic z markerjem kloramfenikolom in selekcijo uspešno ustavljenega zaporedja z sfGFP proteinom [1].
CotG so z linkerjem povezali z reakcijo Phusion PCR. Linker so uvedli na 3' konec CotG CDS regije. V skupini so imeli na razpolago hitinazo v dveh delih oz. dveh linearnih fragmentih ChiS_part1 in ChiS_part2. Pred vezavo na 3' konec linkerja je bilo dva dela potrebno povezati. Za ta namen so uporabili »shranjevalni« vektor YTK001 – vektor YTK Golden Gate toolkita. Za vsak del hitinaze so načrtali olige in jim dodali previske, ki se ujemajo z restriktazo BsmBI (komplementarno z MCS regijo YTK001). Po PCR reakciji so s plazmidi transformirali E. coli celice in potrdili uspešnost. Fragmenta CotG-linker in ChiS so v projektu združili v Golden Gate reakciji z Bpil. CDS fragment so vstavili v plazmid skupaj s promotorjem, RBS-jem, GFP-jem in terminatorjem ter dobili funkcionalen transkript CotG-linker-ChiS. Konstrukt gRNA je sestavljen iz močnega konstitutivnega promotorja PlepA, RBS-ja TM_RBS2, gRNA CDS in Spy terminatorja. Vse skupaj je klonirano v plazmidno ogrodje STKA 1A. Posamezne biokocke so skupaj povezali z reakcijo Golden Gate. Pri načrtovanju konstrukta eksonukleaze D15 so za pravilno sestavljanje s proteinom Cas9 namesto terminatorja vanj vstavili spacer 0D. Podobno za pravilno sestavljanje končnega konstrukta Cas9 namesto promoterja vsebuje spacer 0A [1].

= Cilji za prihodnost =

Glavni problem sinteznobioloških izdelkov kot je Sporadicate so omejitve, ki jih prinaša uporaba GSO-jev. Sporadicate sicer naj ne bi vseboval gensko spremenjenih plazmidov v vegetativnih bakterijah, a še vedno lahko pride do nedelovanja mehanizma razgradnje in posledično do razširitve GSO bakterij. Za oceno možnosti takšnega scenarija in potencialne izboljšave produkta bi tako projekt potreboval nadaljnje testiranje na rastlinah in na terenu [1].

= Viri =
[1] SPORADICATE https://2022.igem.wiki/imperial-college-london/

Sporadicate

2023-05-09T09:09:35Z

GasperMozina: /* Problem */

Sporadicate je sinteznobiološki projekt v okviru tekmovanja iGEM 2022, ki ga je pripravila skupina študentov iz londonske univerze Imperal College London. Dostopen je na spletnem naslovu [https://2022.igem.wiki/imperial-college-london https://2022.igem.wiki/imperial-college-london.]

= Problem =
Naraščajoče svetovno prebivalstvo zahteva vedno večjo proizvodnjo hrane, zaradi mednarodnih konfliktov, podnebnih ekstremov in gospodarskih kriz, pa je preskrba s hrano vse bolj otežena. Za spopadanje s problemom lakote je nujno zvišanje kmetijske produktivnosti ter razvoj odpornih in trajnostnih sistemov. Bolezni rastlin povzročajo 10-15 odstotni izpad pridelka, od tega pa glivne bolezni predstavljajo kar 70-80 odstotkov. Trenutna uporaba fungicidov je nezadostna, zato so novi ukrepi ključnega pomena. V okviru projekta Sporadicate so razvili nestrupen biofungicid s širokim spektrom delovanja, sestavljen iz sistema bakterij ''B. subtilis'', ki odpravlja časovni zamik med diagnozo in zdravljenjem. Naravni sevi te bakterije so prisotni v talnem mikrobiomu in delujejo kot odlični bioobvladovalci, hkrati pa so popolnoma netoksični za ljudi, živali ali rastline [1].

= Načrt dela =
Projekt je zasnovan na sistemu »sense and response«. Torej, sistem, ki okužbo z glivo zazna in se nanjo tudi ustrezno odzove. Temelji na modificiranju spor ''B. subtilis'' tako, da te na svojem površju izražajo hitinaze, ki lahko razgrajujejo s hitinom bogato zunanjo membrano gliv. Pri procesu nastajajo monomeri hitina, ki delujejo kot univerzalni biomarkerji za vse glivne patogene in sprožijo imunski odziv rastlin. Spore B. subtilis bi vsebovale tudi mutirani germinantni receptor, ki bi vezal hitinske monomere. Ob vezavi se bi sprožil kaskadni odziv in omogočil reaktivacijo spor in razvoj vegetativnih bakterij. V nekaj minutah se bi bakterije namnožile in začele sproščati protiglivne lipopeptide. Modifikacije na sporah ''B. subtilis'' bi uvedli s tehnologijo CRISPR, katere elemente bi dostavljali s pomočjo samorazgradljivih plazmidov – namnožene bakterije tako ne bi vsebovale nobene tuje DNA [1].

= Teoretično ozadje =

== Hitin ==
Raziskovalci so definirali dve optimalni strategiji za biokontrolo rastlin. Biofungicid mora imeti širok spekter protiglivnega delovanja, ali pa mora promovirati rastlinski imunski sistem. Študenti projekta Sporadicate so želeli zasnovati sistem, ki bi lahko naredil oboje in kot primerno tarčno molekulo so izbrali hitin. Hitin je linearni homopolimer z β-(1,4) vezjo povezanih povezanih N-acetil-D-glukozaminskih (NAG) monomerov. Predstavlja enega izmed glavnih komponent celične stene gliv in s tem idealen biomarker. Medtem ko rastlinski imunski receptorji hitina direktno ne zaznavajo, lahko zaznajo njegove manjše fragmente ali monomere. Te lahko dobimo z delovanjem hitin razgrajujočih encimov hitinaz, ki so vrsta glikozilnih hidrolaz, katere razgrajujejo glikozidne vezi hitinskih polimerov. Večja dostopnost monomerov hitina omogoča induciranje fenomena SAR (systemic acquired resistance) in s tem večjo odpornost rastlin na okužbe [1].

== ''B. subtilis'' ==
Spore ''B. subtilis'' so poceni, vzdržljivi, robustni predstavitveni sistemi, katere lastnosti so idealne za razvoj takšnega sistema. ''B. subtilis'' izkazuje močne protiglivne lastnosti in je s strani FDA-ja označen kot generalno varen, saj ni patogen ali toksikogen do rastlin, živali ali ljudi. Med protiglivnimi defenzivnimi mehanizmi so: produkcija bakteriocinov, produkcija antibiotičnih lipopeptidov, produkcija iturina A, indukcija SAR-a in stimulacija rasti rastlinam simbiotskim glivam. Spore bakterij so zelo odporne na zunanje ekstremne pogoje in kljubujejo visoki temperaturi, UV radiaciji in ekstremnim pH-jem. Ob detekciji primernih nutrientov pa se hitro vrnejo v vegetativno stanje in se lahko delijo [1].

= Potek dela =

== Hitinski predstavitveni sistem ==
Spore se v procesu sporulacije obdajo z več membranami, med katerimi je biotehnološko najbolj zanimiv t.i. plašč, ki vsebuje več kot 70 različnih proteinov in glikoproteinov. Nekateri izmed njih so se že izkazali kot molekulska predstavitvena sidra, za projekt Sporadicate pa so študenti uporabili strukturni protein CotG. Na sidrni protein CotG so z linkerjem povezali hitinazo ChiS. Gre za eksohitinazo pridobljeno iz organizma ''B. pumilus'', ki poleg hitinazne aktivnosti izkazuje še možnost delovanja kot lizocim. Poleg CotG so testirali še vezavo na sidrni protein CotZ, ki se nahaja v zunanji ovojnici, katera objema plašč spore [1].

== Samorazgrajujoči-se plazmid ==
Sistem CotG-linker-ChiS so v bakterijske spore uvedli s plazmidom, ki se s sporulacijo razgradi. Razgradnjo so dosegli s sistemom CRISPR-Cas9 tako, da so pod promotor PsspB, ki se aktivira s sporulacijo, vstavili Cas9. Operon je bil torej sestavljen iz promotorja PsspB, ribosoma optRBS, Cas9 CDS in iz terminatorja B0015. Za dosego večje občutljivosti sistema so gRNA vstavili izven tega operona pod konstitutivni promotor ter s tem zagotovili večjo koncentracijo gRNA ob ekspresiji Cas9. Tarčna gRNA je bila regija ori vstavljenega plazmida. Operon je bil sestavljen iz konstitutivnega promotorja PlepA, ribosoma RBS2 gRNA CDS, D15 eksonukleaze in terminatorja Spy1 [1].

== Receptor za reaktivacijo spor ==

Mirujoče spore se v metabolično aktivne, vegetativne bakterije spremenijo v procesu germinacije/kaljenja. Točen mehanizem, ki zažene germinacijo še ni pojasnjen, znano pa je, da proces sprožijo hranila, kot so L-alanin, asparagin in enostavni sladkorji. V ''B. subtilis'' poznamo tri receptorje, ki uravnavajo proces germinacije: GerA, GerB in GerK. Medtem ko GerK in GerB za indukcijo potrebujeta več signalov (hranil), GerA lahko sproži popolno germinacijo spore le ob prisotnosti L-alanina. Receptor, ki bi sprožil proces germinacije ob prisotnosti monomerov hitina, so torej osnovali na receptorju GerA. GerA delulje kot vodni in ionski kanalček, ki aktivira germinacijo z rehidracijo spore. Pri načrtovanju so upoštevali, da se L-alanin veže le na podenoto GerAB in tako načrtovali proces mutageneze le na to regijo receptorja. Aminokislinske ostanke, ki dajo receptorju specifičnost, so najprej določili z bioinformatskimi orodji (AlphaFold, Multiple Sequence Alignment). Laboratorijsko testiranje so izvedli z 10^8 različnimi kombinacijiami mutiranih proteinov GerA, pri čemer so uporabljali test specifičnosti s pozitivno in negativno selekcijo [1].

== Konstrukcija vektorjev in proces kloniranja ==

Za kloniranje osnovnih konstruktov DNA so v projektu kot ogrodje uporabili plazmid pSTK-0-sfGFP. Plazmid vsebuje MCS regijo, selekcijski marker z odpornostjo na kloramfenikol, sfGFP; s katerim lahko prepoznamo uspešne insercije tarčnih regij, sfGFP RBS in ORI. Za ekspresijo proteinov v B. subtilis so uporabili ogrodje STK-EXP-1-sfGFP. Vektor omogoča selekcijo uspešno transformiranih celic z markerjem kloramfenikolom in selekcijo uspešno ustavljenega zaporedja z sfGFP proteinom [1].
CotG so z linkerjem povezali z reakcijo Phusion PCR. Linker so uvedli na 3' konec CotG CDS regije. V skupini so imeli na razpolago hitinazo v dveh delih oz. dveh linearnih fragmentih ChiS_part1 in ChiS_part2. Pred vezavo na 3' konec linkerja je bilo dva dela potrebno povezati. Za ta namen so uporabili »shranjevalni« vektor YTK001 – vektor YTK Golden Gate toolkita. Za vsak del hitinaze so načrtali olige in jim dodali previske, ki se ujemajo z restriktazo BsmBI (komplementarno z MCS regijo YTK001). Po PCR reakciji so s plazmidi transformirali E. coli celice in potrdili uspešnost. Fragmenta CotG-linker in ChiS so v projektu združili v Golden Gate reakciji z Bpil. CDS fragment so vstavili v plazmid skupaj s promotorjem, RBS-jem, GFP-jem in terminatorjem ter dobili funkcionalen transkript CotG-linker-ChiS. Konstrukt gRNA je sestavljen iz močnega konstitutivnega promotorja PlepA, RBS-ja TM_RBS2, gRNA CDS in Spy terminatorja. Vse skupaj je klonirano v plazmidno ogrodje STKA 1A. Posamezne biokocke so skupaj povezali z reakcijo Golden Gate. Pri načrtovanju konstrukta eksonukleaze D15 so za pravilno sestavljanje s proteinom Cas9 namesto terminatorja vanj vstavili spacer 0D. Podobno za pravilno sestavljanje končnega konstrukta Cas9 namesto promoterja vsebuje spacer 0A [1].

= Cilji za prihodnost =

Glavni problem sinteznobioloških izdelkov kot je Sporadicate so omejitve, ki jih prinaša uporaba GSO-jev. Sporadicate sicer naj ne bi vseboval gensko spremenjenih plazmidov v vegetativnih bakterijah, a še vedno lahko pride do nedelovanja mehanizma razgradnje in posledično do razširitve GSO bakterij. Za oceno možnosti takšnega scenarija in potencialne izboljšave produkta bi tako projekt potreboval nadaljnje testiranje na rastlinah in na terenu [1].

= Viri =
[1] SPORADICATE https://2022.igem.wiki/imperial-college-london/

Sporadicate

2023-05-08T22:10:10Z

GasperMozina: /* Hitinski predstavitveni sistem */

Sporadicate je sinteznobiološki projekt v okviru tekmovanja iGEM 2022, ki ga je pripravila skupina študentov iz londonske univerze Imperal College London. Dostopen je na spletnem naslovu [https://2022.igem.wiki/imperial-college-london https://2022.igem.wiki/imperial-college-london.]

= Problem =
Naraščajoče svetovno prebivalstvo zahteva vedno večjo proizvodnjo hrane, zaradi mednarodnih konfliktov, podnebnih ekstremov in gospodarskih kriz, pa je preskrba s hrano vse bolj otežena. Za spopadanje s problemom lakote je nujno zvišanje kmetijske produktivnosti ter razvoj odpornih in trajnostnih sistemov. Bolezni rastlin povzročajo 10-15 odstotni izpad pridelka, od tega pa glivične bolezni predstavljajo kar 70-80 odstotkov. Trenutna uporaba fungicidov je nezadostna, zato so novi ukrepi ključnega pomena. V okviru projekta Sporadicate so razvili nestrupen biofungicid s širokim spektrom delovanja, sestavljen iz sistema bakterij ''B. subtilis'', ki odpravlja časovni zamik med diagnozo in zdravljenjem. Naravni sevi te bakterije so prisotni v talnem mikrobiomu in delujejo kot odlični bioobvladovalci, hkrati pa so popolnoma netoksični za ljudi, živali ali rastline [1].

= Načrt dela =
Projekt je zasnovan na sistemu »sense and response«. Torej, sistem, ki okužbo z glivo zazna in se nanjo tudi ustrezno odzove. Temelji na modificiranju spor ''B. subtilis'' tako, da te na svojem površju izražajo hitinaze, ki lahko razgrajujejo s hitinom bogato zunanjo membrano gliv. Pri procesu nastajajo monomeri hitina, ki delujejo kot univerzalni biomarkerji za vse glivne patogene in sprožijo imunski odziv rastlin. Spore B. subtilis bi vsebovale tudi mutirani germinantni receptor, ki bi vezal hitinske monomere. Ob vezavi se bi sprožil kaskadni odziv in omogočil reaktivacijo spor in razvoj vegetativnih bakterij. V nekaj minutah se bi bakterije namnožile in začele sproščati protiglivne lipopeptide. Modifikacije na sporah ''B. subtilis'' bi uvedli s tehnologijo CRISPR, katere elemente bi dostavljali s pomočjo samorazgradljivih plazmidov – namnožene bakterije tako ne bi vsebovale nobene tuje DNA [1].

= Teoretično ozadje =

== Hitin ==
Raziskovalci so definirali dve optimalni strategiji za biokontrolo rastlin. Biofungicid mora imeti širok spekter protiglivnega delovanja, ali pa mora promovirati rastlinski imunski sistem. Študenti projekta Sporadicate so želeli zasnovati sistem, ki bi lahko naredil oboje in kot primerno tarčno molekulo so izbrali hitin. Hitin je linearni homopolimer z β-(1,4) vezjo povezanih povezanih N-acetil-D-glukozaminskih (NAG) monomerov. Predstavlja enega izmed glavnih komponent celične stene gliv in s tem idealen biomarker. Medtem ko rastlinski imunski receptorji hitina direktno ne zaznavajo, lahko zaznajo njegove manjše fragmente ali monomere. Te lahko dobimo z delovanjem hitin razgrajujočih encimov hitinaz, ki so vrsta glikozilnih hidrolaz, katere razgrajujejo glikozidne vezi hitinskih polimerov. Večja dostopnost monomerov hitina omogoča induciranje fenomena SAR (systemic acquired resistance) in s tem večjo odpornost rastlin na okužbe [1].

== ''B. subtilis'' ==
Spore ''B. subtilis'' so poceni, vzdržljivi, robustni predstavitveni sistemi, katere lastnosti so idealne za razvoj takšnega sistema. ''B. subtilis'' izkazuje močne protiglivne lastnosti in je s strani FDA-ja označen kot generalno varen, saj ni patogen ali toksikogen do rastlin, živali ali ljudi. Med protiglivnimi defenzivnimi mehanizmi so: produkcija bakteriocinov, produkcija antibiotičnih lipopeptidov, produkcija iturina A, indukcija SAR-a in stimulacija rasti rastlinam simbiotskim glivam. Spore bakterij so zelo odporne na zunanje ekstremne pogoje in kljubujejo visoki temperaturi, UV radiaciji in ekstremnim pH-jem. Ob detekciji primernih nutrientov pa se hitro vrnejo v vegetativno stanje in se lahko delijo [1].

= Potek dela =

== Hitinski predstavitveni sistem ==
Spore se v procesu sporulacije obdajo z več membranami, med katerimi je biotehnološko najbolj zanimiv t.i. plašč, ki vsebuje več kot 70 različnih proteinov in glikoproteinov. Nekateri izmed njih so se že izkazali kot molekulska predstavitvena sidra, za projekt Sporadicate pa so študenti uporabili strukturni protein CotG. Na sidrni protein CotG so z linkerjem povezali hitinazo ChiS. Gre za eksohitinazo pridobljeno iz organizma ''B. pumilus'', ki poleg hitinazne aktivnosti izkazuje še možnost delovanja kot lizocim. Poleg CotG so testirali še vezavo na sidrni protein CotZ, ki se nahaja v zunanji ovojnici, katera objema plašč spore [1].

== Samorazgrajujoči-se plazmid ==
Sistem CotG-linker-ChiS so v bakterijske spore uvedli s plazmidom, ki se s sporulacijo razgradi. Razgradnjo so dosegli s sistemom CRISPR-Cas9 tako, da so pod promotor PsspB, ki se aktivira s sporulacijo, vstavili Cas9. Operon je bil torej sestavljen iz promotorja PsspB, ribosoma optRBS, Cas9 CDS in iz terminatorja B0015. Za dosego večje občutljivosti sistema so gRNA vstavili izven tega operona pod konstitutivni promotor ter s tem zagotovili večjo koncentracijo gRNA ob ekspresiji Cas9. Tarčna gRNA je bila regija ori vstavljenega plazmida. Operon je bil sestavljen iz konstitutivnega promotorja PlepA, ribosoma RBS2 gRNA CDS, D15 eksonukleaze in terminatorja Spy1 [1].

== Receptor za reaktivacijo spor ==

Mirujoče spore se v metabolično aktivne, vegetativne bakterije spremenijo v procesu germinacije/kaljenja. Točen mehanizem, ki zažene germinacijo še ni pojasnjen, znano pa je, da proces sprožijo hranila, kot so L-alanin, asparagin in enostavni sladkorji. V ''B. subtilis'' poznamo tri receptorje, ki uravnavajo proces germinacije: GerA, GerB in GerK. Medtem ko GerK in GerB za indukcijo potrebujeta več signalov (hranil), GerA lahko sproži popolno germinacijo spore le ob prisotnosti L-alanina. Receptor, ki bi sprožil proces germinacije ob prisotnosti monomerov hitina, so torej osnovali na receptorju GerA. GerA delulje kot vodni in ionski kanalček, ki aktivira germinacijo z rehidracijo spore. Pri načrtovanju so upoštevali, da se L-alanin veže le na podenoto GerAB in tako načrtovali proces mutageneze le na to regijo receptorja. Aminokislinske ostanke, ki dajo receptorju specifičnost, so najprej določili z bioinformatskimi orodji (AlphaFold, Multiple Sequence Alignment). Laboratorijsko testiranje so izvedli z 10^8 različnimi kombinacijiami mutiranih proteinov GerA, pri čemer so uporabljali test specifičnosti s pozitivno in negativno selekcijo [1].

== Konstrukcija vektorjev in proces kloniranja ==

Za kloniranje osnovnih konstruktov DNA so v projektu kot ogrodje uporabili plazmid pSTK-0-sfGFP. Plazmid vsebuje MCS regijo, selekcijski marker z odpornostjo na kloramfenikol, sfGFP; s katerim lahko prepoznamo uspešne insercije tarčnih regij, sfGFP RBS in ORI. Za ekspresijo proteinov v B. subtilis so uporabili ogrodje STK-EXP-1-sfGFP. Vektor omogoča selekcijo uspešno transformiranih celic z markerjem kloramfenikolom in selekcijo uspešno ustavljenega zaporedja z sfGFP proteinom [1].
CotG so z linkerjem povezali z reakcijo Phusion PCR. Linker so uvedli na 3' konec CotG CDS regije. V skupini so imeli na razpolago hitinazo v dveh delih oz. dveh linearnih fragmentih ChiS_part1 in ChiS_part2. Pred vezavo na 3' konec linkerja je bilo dva dela potrebno povezati. Za ta namen so uporabili »shranjevalni« vektor YTK001 – vektor YTK Golden Gate toolkita. Za vsak del hitinaze so načrtali olige in jim dodali previske, ki se ujemajo z restriktazo BsmBI (komplementarno z MCS regijo YTK001). Po PCR reakciji so s plazmidi transformirali E. coli celice in potrdili uspešnost. Fragmenta CotG-linker in ChiS so v projektu združili v Golden Gate reakciji z Bpil. CDS fragment so vstavili v plazmid skupaj s promotorjem, RBS-jem, GFP-jem in terminatorjem ter dobili funkcionalen transkript CotG-linker-ChiS. Konstrukt gRNA je sestavljen iz močnega konstitutivnega promotorja PlepA, RBS-ja TM_RBS2, gRNA CDS in Spy terminatorja. Vse skupaj je klonirano v plazmidno ogrodje STKA 1A. Posamezne biokocke so skupaj povezali z reakcijo Golden Gate. Pri načrtovanju konstrukta eksonukleaze D15 so za pravilno sestavljanje s proteinom Cas9 namesto terminatorja vanj vstavili spacer 0D. Podobno za pravilno sestavljanje končnega konstrukta Cas9 namesto promoterja vsebuje spacer 0A [1].

= Cilji za prihodnost =

Glavni problem sinteznobioloških izdelkov kot je Sporadicate so omejitve, ki jih prinaša uporaba GSO-jev. Sporadicate sicer naj ne bi vseboval gensko spremenjenih plazmidov v vegetativnih bakterijah, a še vedno lahko pride do nedelovanja mehanizma razgradnje in posledično do razširitve GSO bakterij. Za oceno možnosti takšnega scenarija in potencialne izboljšave produkta bi tako projekt potreboval nadaljnje testiranje na rastlinah in na terenu [1].

= Viri =
[1] SPORADICATE https://2022.igem.wiki/imperial-college-london/

Sporadicate

2023-05-08T20:01:50Z

GasperMozina: /* Konstrukcija vektorjev in proces kloniranja */

Sporadicate je sinteznobiološki projekt v okviru tekmovanja iGEM 2022, ki ga je pripravila skupina študentov iz londonske univerze Imperal College London. Dostopen je na spletnem naslovu [https://2022.igem.wiki/imperial-college-london https://2022.igem.wiki/imperial-college-london.]

= Problem =
Naraščajoče svetovno prebivalstvo zahteva vedno večjo proizvodnjo hrane, zaradi mednarodnih konfliktov, podnebnih ekstremov in gospodarskih kriz, pa je preskrba s hrano vse bolj otežena. Za spopadanje s problemom lakote je nujno zvišanje kmetijske produktivnosti ter razvoj odpornih in trajnostnih sistemov. Bolezni rastlin povzročajo 10-15 odstotni izpad pridelka, od tega pa glivične bolezni predstavljajo kar 70-80 odstotkov. Trenutna uporaba fungicidov je nezadostna, zato so novi ukrepi ključnega pomena. V okviru projekta Sporadicate so razvili nestrupen biofungicid s širokim spektrom delovanja, sestavljen iz sistema bakterij ''B. subtilis'', ki odpravlja časovni zamik med diagnozo in zdravljenjem. Naravni sevi te bakterije so prisotni v talnem mikrobiomu in delujejo kot odlični bioobvladovalci, hkrati pa so popolnoma netoksični za ljudi, živali ali rastline [1].

= Načrt dela =
Projekt je zasnovan na sistemu »sense and response«. Torej, sistem, ki okužbo z glivo zazna in se nanjo tudi ustrezno odzove. Temelji na modificiranju spor ''B. subtilis'' tako, da te na svojem površju izražajo hitinaze, ki lahko razgrajujejo s hitinom bogato zunanjo membrano gliv. Pri procesu nastajajo monomeri hitina, ki delujejo kot univerzalni biomarkerji za vse glivne patogene in sprožijo imunski odziv rastlin. Spore B. subtilis bi vsebovale tudi mutirani germinantni receptor, ki bi vezal hitinske monomere. Ob vezavi se bi sprožil kaskadni odziv in omogočil reaktivacijo spor in razvoj vegetativnih bakterij. V nekaj minutah se bi bakterije namnožile in začele sproščati protiglivne lipopeptide. Modifikacije na sporah ''B. subtilis'' bi uvedli s tehnologijo CRISPR, katere elemente bi dostavljali s pomočjo samorazgradljivih plazmidov – namnožene bakterije tako ne bi vsebovale nobene tuje DNA [1].

= Teoretično ozadje =

== Hitin ==
Raziskovalci so definirali dve optimalni strategiji za biokontrolo rastlin. Biofungicid mora imeti širok spekter protiglivnega delovanja, ali pa mora promovirati rastlinski imunski sistem. Študenti projekta Sporadicate so želeli zasnovati sistem, ki bi lahko naredil oboje in kot primerno tarčno molekulo so izbrali hitin. Hitin je linearni homopolimer z β-(1,4) vezjo povezanih povezanih N-acetil-D-glukozaminskih (NAG) monomerov. Predstavlja enega izmed glavnih komponent celične stene gliv in s tem idealen biomarker. Medtem ko rastlinski imunski receptorji hitina direktno ne zaznavajo, lahko zaznajo njegove manjše fragmente ali monomere. Te lahko dobimo z delovanjem hitin razgrajujočih encimov hitinaz, ki so vrsta glikozilnih hidrolaz, katere razgrajujejo glikozidne vezi hitinskih polimerov. Večja dostopnost monomerov hitina omogoča induciranje fenomena SAR (systemic acquired resistance) in s tem večjo odpornost rastlin na okužbe [1].

== ''B. subtilis'' ==
Spore ''B. subtilis'' so poceni, vzdržljivi, robustni predstavitveni sistemi, katere lastnosti so idealne za razvoj takšnega sistema. ''B. subtilis'' izkazuje močne protiglivne lastnosti in je s strani FDA-ja označen kot generalno varen, saj ni patogen ali toksikogen do rastlin, živali ali ljudi. Med protiglivnimi defenzivnimi mehanizmi so: produkcija bakteriocinov, produkcija antibiotičnih lipopeptidov, produkcija iturina A, indukcija SAR-a in stimulacija rasti rastlinam simbiotskim glivam. Spore bakterij so zelo odporne na zunanje ekstremne pogoje in kljubujejo visoki temperaturi, UV radiaciji in ekstremnim pH-jem. Ob detekciji primernih nutrientov pa se hitro vrnejo v vegetativno stanje in se lahko delijo [1].

= Potek dela =

== Hitinski predstavitveni sistem ==
Spore se v procesu sporulacije obdajo z več membranami, med katerimi je biotehnološko najbolj zanimiv t.i. plašč, ki vsebuje več kot 70 različnih proteinov in glikoproteinov. Nekateri izmed njih so se že izkazali kot molekulska predstavitvena sidra, za projekt Sporadicate pa so študenti uporabili strukturni protein CotG. Na sidrni protein CotG so z linkerjem povezali hitinazo ChiS. Gre za eksohitinazo pridobljeno iz organizma ''B. pumilus'', ki poleg hitinazne aktivnosti izkazuje še možnost delovanja kot lizocim. Poleg CotG so testirali še vezavo na sidrni protein CotZ, ki se nahaja v zunanji ovojnici, katera objema plašč spore.[1].

== Samorazgrajujoči-se plazmid ==
Sistem CotG-linker-ChiS so v bakterijske spore uvedli s plazmidom, ki se s sporulacijo razgradi. Razgradnjo so dosegli s sistemom CRISPR-Cas9 tako, da so pod promotor PsspB, ki se aktivira s sporulacijo, vstavili Cas9. Operon je bil torej sestavljen iz promotorja PsspB, ribosoma optRBS, Cas9 CDS in iz terminatorja B0015. Za dosego večje občutljivosti sistema so gRNA vstavili izven tega operona pod konstitutivni promotor ter s tem zagotovili večjo koncentracijo gRNA ob ekspresiji Cas9. Tarčna gRNA je bila regija ori vstavljenega plazmida. Operon je bil sestavljen iz konstitutivnega promotorja PlepA, ribosoma RBS2 gRNA CDS, D15 eksonukleaze in terminatorja Spy1 [1].

== Receptor za reaktivacijo spor ==

Mirujoče spore se v metabolično aktivne, vegetativne bakterije spremenijo v procesu germinacije/kaljenja. Točen mehanizem, ki zažene germinacijo še ni pojasnjen, znano pa je, da proces sprožijo hranila, kot so L-alanin, asparagin in enostavni sladkorji. V ''B. subtilis'' poznamo tri receptorje, ki uravnavajo proces germinacije: GerA, GerB in GerK. Medtem ko GerK in GerB za indukcijo potrebujeta več signalov (hranil), GerA lahko sproži popolno germinacijo spore le ob prisotnosti L-alanina. Receptor, ki bi sprožil proces germinacije ob prisotnosti monomerov hitina, so torej osnovali na receptorju GerA. GerA delulje kot vodni in ionski kanalček, ki aktivira germinacijo z rehidracijo spore. Pri načrtovanju so upoštevali, da se L-alanin veže le na podenoto GerAB in tako načrtovali proces mutageneze le na to regijo receptorja. Aminokislinske ostanke, ki dajo receptorju specifičnost, so najprej določili z bioinformatskimi orodji (AlphaFold, Multiple Sequence Alignment). Laboratorijsko testiranje so izvedli z 10^8 različnimi kombinacijiami mutiranih proteinov GerA, pri čemer so uporabljali test specifičnosti s pozitivno in negativno selekcijo [1].

== Konstrukcija vektorjev in proces kloniranja ==

Za kloniranje osnovnih konstruktov DNA so v projektu kot ogrodje uporabili plazmid pSTK-0-sfGFP. Plazmid vsebuje MCS regijo, selekcijski marker z odpornostjo na kloramfenikol, sfGFP; s katerim lahko prepoznamo uspešne insercije tarčnih regij, sfGFP RBS in ORI. Za ekspresijo proteinov v B. subtilis so uporabili ogrodje STK-EXP-1-sfGFP. Vektor omogoča selekcijo uspešno transformiranih celic z markerjem kloramfenikolom in selekcijo uspešno ustavljenega zaporedja z sfGFP proteinom [1].
CotG so z linkerjem povezali z reakcijo Phusion PCR. Linker so uvedli na 3' konec CotG CDS regije. V skupini so imeli na razpolago hitinazo v dveh delih oz. dveh linearnih fragmentih ChiS_part1 in ChiS_part2. Pred vezavo na 3' konec linkerja je bilo dva dela potrebno povezati. Za ta namen so uporabili »shranjevalni« vektor YTK001 – vektor YTK Golden Gate toolkita. Za vsak del hitinaze so načrtali olige in jim dodali previske, ki se ujemajo z restriktazo BsmBI (komplementarno z MCS regijo YTK001). Po PCR reakciji so s plazmidi transformirali E. coli celice in potrdili uspešnost. Fragmenta CotG-linker in ChiS so v projektu združili v Golden Gate reakciji z Bpil. CDS fragment so vstavili v plazmid skupaj s promotorjem, RBS-jem, GFP-jem in terminatorjem ter dobili funkcionalen transkript CotG-linker-ChiS. Konstrukt gRNA je sestavljen iz močnega konstitutivnega promotorja PlepA, RBS-ja TM_RBS2, gRNA CDS in Spy terminatorja. Vse skupaj je klonirano v plazmidno ogrodje STKA 1A. Posamezne biokocke so skupaj povezali z reakcijo Golden Gate. Pri načrtovanju konstrukta eksonukleaze D15 so za pravilno sestavljanje s proteinom Cas9 namesto terminatorja vanj vstavili spacer 0D. Podobno za pravilno sestavljanje končnega konstrukta Cas9 namesto promoterja vsebuje spacer 0A [1].

= Cilji za prihodnost =

Glavni problem sinteznobioloških izdelkov kot je Sporadicate so omejitve, ki jih prinaša uporaba GSO-jev. Sporadicate sicer naj ne bi vseboval gensko spremenjenih plazmidov v vegetativnih bakterijah, a še vedno lahko pride do nedelovanja mehanizma razgradnje in posledično do razširitve GSO bakterij. Za oceno možnosti takšnega scenarija in potencialne izboljšave produkta bi tako projekt potreboval nadaljnje testiranje na rastlinah in na terenu [1].

= Viri =
[1] SPORADICATE https://2022.igem.wiki/imperial-college-london/

Sporadicate

2023-05-08T20:01:26Z

GasperMozina:

Sporadicate je sinteznobiološki projekt v okviru tekmovanja iGEM 2022, ki ga je pripravila skupina študentov iz londonske univerze Imperal College London. Dostopen je na spletnem naslovu [https://2022.igem.wiki/imperial-college-london https://2022.igem.wiki/imperial-college-london.]

= Problem =
Naraščajoče svetovno prebivalstvo zahteva vedno večjo proizvodnjo hrane, zaradi mednarodnih konfliktov, podnebnih ekstremov in gospodarskih kriz, pa je preskrba s hrano vse bolj otežena. Za spopadanje s problemom lakote je nujno zvišanje kmetijske produktivnosti ter razvoj odpornih in trajnostnih sistemov. Bolezni rastlin povzročajo 10-15 odstotni izpad pridelka, od tega pa glivične bolezni predstavljajo kar 70-80 odstotkov. Trenutna uporaba fungicidov je nezadostna, zato so novi ukrepi ključnega pomena. V okviru projekta Sporadicate so razvili nestrupen biofungicid s širokim spektrom delovanja, sestavljen iz sistema bakterij ''B. subtilis'', ki odpravlja časovni zamik med diagnozo in zdravljenjem. Naravni sevi te bakterije so prisotni v talnem mikrobiomu in delujejo kot odlični bioobvladovalci, hkrati pa so popolnoma netoksični za ljudi, živali ali rastline [1].

= Načrt dela =
Projekt je zasnovan na sistemu »sense and response«. Torej, sistem, ki okužbo z glivo zazna in se nanjo tudi ustrezno odzove. Temelji na modificiranju spor ''B. subtilis'' tako, da te na svojem površju izražajo hitinaze, ki lahko razgrajujejo s hitinom bogato zunanjo membrano gliv. Pri procesu nastajajo monomeri hitina, ki delujejo kot univerzalni biomarkerji za vse glivne patogene in sprožijo imunski odziv rastlin. Spore B. subtilis bi vsebovale tudi mutirani germinantni receptor, ki bi vezal hitinske monomere. Ob vezavi se bi sprožil kaskadni odziv in omogočil reaktivacijo spor in razvoj vegetativnih bakterij. V nekaj minutah se bi bakterije namnožile in začele sproščati protiglivne lipopeptide. Modifikacije na sporah ''B. subtilis'' bi uvedli s tehnologijo CRISPR, katere elemente bi dostavljali s pomočjo samorazgradljivih plazmidov – namnožene bakterije tako ne bi vsebovale nobene tuje DNA [1].

= Teoretično ozadje =

== Hitin ==
Raziskovalci so definirali dve optimalni strategiji za biokontrolo rastlin. Biofungicid mora imeti širok spekter protiglivnega delovanja, ali pa mora promovirati rastlinski imunski sistem. Študenti projekta Sporadicate so želeli zasnovati sistem, ki bi lahko naredil oboje in kot primerno tarčno molekulo so izbrali hitin. Hitin je linearni homopolimer z β-(1,4) vezjo povezanih povezanih N-acetil-D-glukozaminskih (NAG) monomerov. Predstavlja enega izmed glavnih komponent celične stene gliv in s tem idealen biomarker. Medtem ko rastlinski imunski receptorji hitina direktno ne zaznavajo, lahko zaznajo njegove manjše fragmente ali monomere. Te lahko dobimo z delovanjem hitin razgrajujočih encimov hitinaz, ki so vrsta glikozilnih hidrolaz, katere razgrajujejo glikozidne vezi hitinskih polimerov. Večja dostopnost monomerov hitina omogoča induciranje fenomena SAR (systemic acquired resistance) in s tem večjo odpornost rastlin na okužbe [1].

== ''B. subtilis'' ==
Spore ''B. subtilis'' so poceni, vzdržljivi, robustni predstavitveni sistemi, katere lastnosti so idealne za razvoj takšnega sistema. ''B. subtilis'' izkazuje močne protiglivne lastnosti in je s strani FDA-ja označen kot generalno varen, saj ni patogen ali toksikogen do rastlin, živali ali ljudi. Med protiglivnimi defenzivnimi mehanizmi so: produkcija bakteriocinov, produkcija antibiotičnih lipopeptidov, produkcija iturina A, indukcija SAR-a in stimulacija rasti rastlinam simbiotskim glivam. Spore bakterij so zelo odporne na zunanje ekstremne pogoje in kljubujejo visoki temperaturi, UV radiaciji in ekstremnim pH-jem. Ob detekciji primernih nutrientov pa se hitro vrnejo v vegetativno stanje in se lahko delijo [1].

= Potek dela =

== Hitinski predstavitveni sistem ==
Spore se v procesu sporulacije obdajo z več membranami, med katerimi je biotehnološko najbolj zanimiv t.i. plašč, ki vsebuje več kot 70 različnih proteinov in glikoproteinov. Nekateri izmed njih so se že izkazali kot molekulska predstavitvena sidra, za projekt Sporadicate pa so študenti uporabili strukturni protein CotG. Na sidrni protein CotG so z linkerjem povezali hitinazo ChiS. Gre za eksohitinazo pridobljeno iz organizma ''B. pumilus'', ki poleg hitinazne aktivnosti izkazuje še možnost delovanja kot lizocim. Poleg CotG so testirali še vezavo na sidrni protein CotZ, ki se nahaja v zunanji ovojnici, katera objema plašč spore.[1].

== Samorazgrajujoči-se plazmid ==
Sistem CotG-linker-ChiS so v bakterijske spore uvedli s plazmidom, ki se s sporulacijo razgradi. Razgradnjo so dosegli s sistemom CRISPR-Cas9 tako, da so pod promotor PsspB, ki se aktivira s sporulacijo, vstavili Cas9. Operon je bil torej sestavljen iz promotorja PsspB, ribosoma optRBS, Cas9 CDS in iz terminatorja B0015. Za dosego večje občutljivosti sistema so gRNA vstavili izven tega operona pod konstitutivni promotor ter s tem zagotovili večjo koncentracijo gRNA ob ekspresiji Cas9. Tarčna gRNA je bila regija ori vstavljenega plazmida. Operon je bil sestavljen iz konstitutivnega promotorja PlepA, ribosoma RBS2 gRNA CDS, D15 eksonukleaze in terminatorja Spy1 [1].

== Receptor za reaktivacijo spor ==

Mirujoče spore se v metabolično aktivne, vegetativne bakterije spremenijo v procesu germinacije/kaljenja. Točen mehanizem, ki zažene germinacijo še ni pojasnjen, znano pa je, da proces sprožijo hranila, kot so L-alanin, asparagin in enostavni sladkorji. V ''B. subtilis'' poznamo tri receptorje, ki uravnavajo proces germinacije: GerA, GerB in GerK. Medtem ko GerK in GerB za indukcijo potrebujeta več signalov (hranil), GerA lahko sproži popolno germinacijo spore le ob prisotnosti L-alanina. Receptor, ki bi sprožil proces germinacije ob prisotnosti monomerov hitina, so torej osnovali na receptorju GerA. GerA delulje kot vodni in ionski kanalček, ki aktivira germinacijo z rehidracijo spore. Pri načrtovanju so upoštevali, da se L-alanin veže le na podenoto GerAB in tako načrtovali proces mutageneze le na to regijo receptorja. Aminokislinske ostanke, ki dajo receptorju specifičnost, so najprej določili z bioinformatskimi orodji (AlphaFold, Multiple Sequence Alignment). Laboratorijsko testiranje so izvedli z 10^8 različnimi kombinacijiami mutiranih proteinov GerA, pri čemer so uporabljali test specifičnosti s pozitivno in negativno selekcijo [1].

== Konstrukcija vektorjev in proces kloniranja ==

Za kloniranje osnovnih konstruktov DNA so v projektu kot ogrodje uporabili plazmid pSTK-0-sfGFP. Plazmid vsebuje MCS regijo, selekcijski marker z odpornostjo na kloramfenikol, sfGFP; s katerim lahko prepoznamo uspešne insercije tarčnih regij, sfGFP RBS in ORI. Za ekspresijo proteinov v B. subtilis so uporabili ogrodje STK-EXP-1-sfGFP. Vektor omogoča selekcijo uspešno transformiranih celic z markerjem kloramfenikolom in selekcijo uspešno ustavljenega zaporedja z sfGFP proteinom [1].
CotG so z linkerjem povezali z reakcijo Phusion PCR. Linker so uvedli na 3' konec CotG CDS regije. V skupini so imeli na razpolago hitinazo v dveh delih oz. dveh linearnih fragmentih ChiS_part1 in ChiS_part2. Pred vezavo na 3' konec linkerja je bilo dva dela potrebno povezati. Za ta namen so uporabili »shranjevalni« vektor YTK001 – vektor YTK Golden Gate toolkita. Za vsak del hitinaze so načrtali olige in jim dodali previske, ki se ujemajo z restriktazo BsmBI (komplementarno z MCS regijo YTK001). Po PCR reakciji so s plazmidi transformirali E. coli celice in potrdili uspešnost. Fragmenta CotG-linker in ChiS so v projektu združili v Golden Gate reakciji z Bpil. CDS fragment so vstavili v plazmid skupaj s promotorjem, RBS-jem, GFP-jem in terminatorjem ter dobili funkcionalen transkript CotG-linker-ChiS. Konstrukt gRNA je sestavljen iz močnega konstitutivnega promotorja PlepA, RBS-ja TM_RBS2, gRNA CDS in Spy terminatorja. Vse skupaj je klonirano v plazmidno ogrodje STKA 1A. Posamezne biokocke so skupaj povezali z reakcijo Golden Gate. Pri načrtovanju konstrukta eksonukleaze D15 so za pravilno sestavljanje s proteinom Cas9 namesto terminatorja vanj vstavili spacer 0D. Podobno za pravilno sestavljanje končnega konstrukta Cas9 namesto promoterja vsebuje spacer 0A.

= Cilji za prihodnost =

Glavni problem sinteznobioloških izdelkov kot je Sporadicate so omejitve, ki jih prinaša uporaba GSO-jev. Sporadicate sicer naj ne bi vseboval gensko spremenjenih plazmidov v vegetativnih bakterijah, a še vedno lahko pride do nedelovanja mehanizma razgradnje in posledično do razširitve GSO bakterij. Za oceno možnosti takšnega scenarija in potencialne izboljšave produkta bi tako projekt potreboval nadaljnje testiranje na rastlinah in na terenu [1].

= Viri =
[1] SPORADICATE https://2022.igem.wiki/imperial-college-london/

Sporadicate

2023-05-08T19:04:12Z

GasperMozina: /* Samorazgrajujočise plazmid */

Sporadicate je sinteznobiološki projekt v okviru tekmovanja iGEM 2022, ki ga je pripravila skupina študentov iz londonske univerze Imperal College London. Dostopen je na spletnem naslovu [https://2022.igem.wiki/imperial-college-london https://2022.igem.wiki/imperial-college-london.]

= Problem =
Naraščajoče svetovno prebivalstvo zahteva vedno večjo proizvodnjo hrane, zaradi mednarodnih konfliktov, podnebnih ekstremov in gospodarskih kriz, pa je preskrba s hrano vse bolj otežena. Za spopadanje s problemom lakote je nujno zvišanje kmetijske produktivnosti ter razvoj odpornih in trajnostnih sistemov. Bolezni rastlin povzročajo 10-15 odstotni izpad pridelka, od tega pa glivične bolezni predstavljajo kar 70-80 odstotkov. Trenutna uporaba fungicidov je nezadostna, zato so novi ukrepi ključnega pomena. V okviru projekta Sporadicate so razvili nestrupen biofungicid s širokim spektrom delovanja, sestavljen iz sistema bakterij ''B. subtilis'', ki odpravlja časovni zamik med diagnozo in zdravljenjem. Naravni sevi te bakterije so prisotni v talnem mikrobiomu in delujejo kot odlični bioobvladovalci, hkrati pa so popolnoma netoksični za ljudi, živali ali rastline [1].

= Načrt dela =
Projekt je zasnovan na sistemu »sense and response«. Torej, sistem, ki okužbo z glivo zazna in se nanjo tudi ustrezno odzove. Temelji na modificiranju spor ''B. subtilis'' tako, da te na svojem površju izražajo hitinaze, ki lahko razgrajujejo s hitinom bogato zunanjo membrano gliv. Pri procesu nastajajo monomeri hitina, ki delujejo kot univerzalni biomarkerji za vse glivne patogene in sprožijo imunski odziv rastlin. Spore B. subtilis bi vsebovale tudi mutirani germinantni receptor, ki bi vezal hitinske monomere. Ob vezavi se bi sprožil kaskadni odziv in omogočil reaktivacijo spor in razvoj vegetativnih bakterij. V nekaj minutah se bi bakterije namnožile in začele sproščati protiglivne lipopeptide. Modifikacije na sporah ''B. subtilis'' bi uvedli s tehnologijo CRISPR, katere elemente bi dostavljali s pomočjo samorazgradljivih plazmidov – namnožene bakterije tako ne bi vsebovale nobene tuje DNA [1].

= Teoretično ozadje =

== Hitin ==
Raziskovalci so definirali dve optimalni strategiji za biokontrolo rastlin. Biofungicid mora imeti širok spekter protiglivnega delovanja, ali pa mora promovirati rastlinski imunski sistem. Študenti projekta Sporadicate so želeli zasnovati sistem, ki bi lahko naredil oboje in kot primerno tarčno molekulo so izbrali hitin. Hitin je linearni homopolimer z β-(1,4) vezjo povezanih povezanih N-acetil-D-glukozaminskih (NAG) monomerov. Predstavlja enega izmed glavnih komponent celične stene gliv in s tem idealen biomarker. Medtem ko rastlinski imunski receptorji hitina direktno ne zaznavajo, lahko zaznajo njegove manjše fragmente ali monomere. Te lahko dobimo z delovanjem hitin razgrajujočih encimov hitinaz, ki so vrsta glikozilnih hidrolaz, katere razgrajujejo glikozidne vezi hitinskih polimerov. Večja dostopnost monomerov hitina omogoča induciranje fenomena SAR (systemic acquired resistance) in s tem večjo odpornost rastlin na okužbe [1].

== ''B. subtilis'' ==
Spore ''B. subtilis'' so poceni, vzdržljivi, robustni predstavitveni sistemi, katere lastnosti so idealne za razvoj takšnega sistema. ''B. subtilis'' izkazuje močne protiglivne lastnosti in je s strani FDA-ja označen kot generalno varen, saj ni patogen ali toksikogen do rastlin, živali ali ljudi. Med protiglivnimi defenzivnimi mehanizmi so: produkcija bakteriocinov, produkcija antibiotičnih lipopeptidov, produkcija iturina A, indukcija SAR-a in stimulacija rasti rastlinam simbiotskim glivam. Spore bakterij so zelo odporne na zunanje ekstremne pogoje in kljubujejo visoki temperaturi, UV radiaciji in ekstremnim pH-jem. Ob detekciji primernih nutrientov pa se hitro vrnejo v vegetativno stanje in se lahko delijo [1].

= Potek dela =

== Hitinski predstavitveni sistem ==
Spore se v procesu sporulacije obdajo z več membranami, med katerimi je biotehnološko najbolj zanimiv t.i. plašč, ki vsebuje več kot 70 različnih proteinov in glikoproteinov. Nekateri izmed njih so se že izkazali kot molekulska predstavitvena sidra, za projekt Sporadicate pa so študenti uporabili strukturni protein CotG. Na sidrni protein CotG so z linkerjem povezali hitinazo ChiS. Gre za eksohitinazo pridobljeno iz organizma ''B. pumilus'', ki poleg hitinazne aktivnosti izkazuje še možnost delovanja kot lizocim. Poleg CotG so testirali še vezavo na sidrni protein CotZ, ki se nahaja v zunanji ovojnici, katera objema plašč spore.[1].

== Samorazgrajujoči-se plazmid ==
Sistem CotG-linker-ChiS so v bakterijske spore uvedli s plazmidom, ki se s sporulacijo razgradi. Razgradnjo so dosegli s sistemom CRISPR-Cas9 tako, da so pod promotor PsspB, ki se aktivira s sporulacijo, vstavili Cas9. Operon je bil torej sestavljen iz promotorja PsspB, ribosoma optRBS, Cas9 CDS in iz terminatorja B0015. Za dosego večje občutljivosti sistema so gRNA vstavili izven tega operona pod konstitutivni promotor ter s tem zagotovili večjo koncentracijo gRNA ob ekspresiji Cas9. Tarčna gRNA je bila regija ori vstavljenega plazmida. Operon je bil sestavljen iz konstitutivnega promotorja PlepA, ribosoma RBS2 gRNA CDS, D15 eksonukleaze in terminatorja Spy1 [1].

== Receptor za reaktivacijo spor ==

Mirujoče spore se v metabolično aktivne, vegetativne bakterije spremenijo v procesu germinacije/kaljenja. Točen mehanizem, ki zažene germinacijo še ni pojasnjen, znano pa je, da proces sprožijo hranila, kot so L-alanin, asparagin in enostavni sladkorji. V ''B. subtilis'' poznamo tri receptorje, ki uravnavajo proces germinacije: GerA, GerB in GerK. Medtem ko GerK in GerB za indukcijo potrebujeta več signalov (hranil), GerA lahko sproži popolno germinacijo spore le ob prisotnosti L-alanina. Receptor, ki bi sprožil proces germinacije ob prisotnosti monomerov hitina, so torej osnovali na receptorju GerA. GerA delulje kot vodni in ionski kanalček, ki aktivira germinacijo z rehidracijo spore. Pri načrtovanju so upoštevali, da se L-alanin veže le na podenoto GerAB in tako načrtovali proces mutageneze le na to regijo receptorja. Aminokislinske ostanke, ki dajo receptorju specifičnost, so najprej določili z bioinformatskimi orodji (AlphaFold, Multiple Sequence Alignment). Laboratorijsko testiranje so izvedli z 10^8 različnimi kombinacijiami mutiranih proteinov GerA, pri čemer so uporabljali test specifičnosti s pozitivno in negativno selekcijo [1].

== Konstrukcija vektorjev ==

Za kloniranje osnovnih konstruktov DNA so v projektu kot ogrodje uporabili plazmid pSTK-0-sfGFP. Plazmid vsebuje MCS regijo, selekcijski marker z odpornostjo na kloramfenikol, sfGFP; s katerim lahko prepoznamo uspešne insercije tarčnih regij, sfGFP RBS in ORI. Za ekspresijo proteinov v B. subtilis so uporabili ogrodje STK-EXP-1-sfGFP. Vektor omogoča selekcijo uspešno transformiranih celic z markerjem kloramfenikolom in selekcijo uspešno ustavljenega zaporedja z sfGFP proteinom [1].

= Cilji za prihodnost =

Glavni problem sinteznobioloških izdelkov kot je Sporadicate so omejitve, ki jih prinaša uporaba GSO-jev. Sporadicate sicer naj ne bi vseboval gensko spremenjenih plazmidov v vegetativnih bakterijah, a še vedno lahko pride do nedelovanja mehanizma razgradnje in posledično do razširitve GSO bakterij. Za oceno možnosti takšnega scenarija in potencialne izboljšave produkta bi tako projekt potreboval nadaljnje testiranje na rastlinah in na terenu [1].

= Viri =
[1] SPORADICATE https://2022.igem.wiki/imperial-college-london/

Sporadicate

2023-05-08T18:36:38Z

GasperMozina:

Sporadicate je sinteznobiološki projekt v okviru tekmovanja iGEM 2022, ki ga je pripravila skupina študentov iz londonske univerze Imperal College London. Dostopen je na spletnem naslovu [https://2022.igem.wiki/imperial-college-london https://2022.igem.wiki/imperial-college-london.]

= Problem =
Naraščajoče svetovno prebivalstvo zahteva vedno večjo proizvodnjo hrane, zaradi mednarodnih konfliktov, podnebnih ekstremov in gospodarskih kriz, pa je preskrba s hrano vse bolj otežena. Za spopadanje s problemom lakote je nujno zvišanje kmetijske produktivnosti ter razvoj odpornih in trajnostnih sistemov. Bolezni rastlin povzročajo 10-15 odstotni izpad pridelka, od tega pa glivične bolezni predstavljajo kar 70-80 odstotkov. Trenutna uporaba fungicidov je nezadostna, zato so novi ukrepi ključnega pomena. V okviru projekta Sporadicate so razvili nestrupen biofungicid s širokim spektrom delovanja, sestavljen iz sistema bakterij ''B. subtilis'', ki odpravlja časovni zamik med diagnozo in zdravljenjem. Naravni sevi te bakterije so prisotni v talnem mikrobiomu in delujejo kot odlični bioobvladovalci, hkrati pa so popolnoma netoksični za ljudi, živali ali rastline [1].

= Načrt dela =
Projekt je zasnovan na sistemu »sense and response«. Torej, sistem, ki okužbo z glivo zazna in se nanjo tudi ustrezno odzove. Temelji na modificiranju spor ''B. subtilis'' tako, da te na svojem površju izražajo hitinaze, ki lahko razgrajujejo s hitinom bogato zunanjo membrano gliv. Pri procesu nastajajo monomeri hitina, ki delujejo kot univerzalni biomarkerji za vse glivne patogene in sprožijo imunski odziv rastlin. Spore B. subtilis bi vsebovale tudi mutirani germinantni receptor, ki bi vezal hitinske monomere. Ob vezavi se bi sprožil kaskadni odziv in omogočil reaktivacijo spor in razvoj vegetativnih bakterij. V nekaj minutah se bi bakterije namnožile in začele sproščati protiglivne lipopeptide. Modifikacije na sporah ''B. subtilis'' bi uvedli s tehnologijo CRISPR, katere elemente bi dostavljali s pomočjo samorazgradljivih plazmidov – namnožene bakterije tako ne bi vsebovale nobene tuje DNA [1].

= Teoretično ozadje =

== Hitin ==
Raziskovalci so definirali dve optimalni strategiji za biokontrolo rastlin. Biofungicid mora imeti širok spekter protiglivnega delovanja, ali pa mora promovirati rastlinski imunski sistem. Študenti projekta Sporadicate so želeli zasnovati sistem, ki bi lahko naredil oboje in kot primerno tarčno molekulo so izbrali hitin. Hitin je linearni homopolimer z β-(1,4) vezjo povezanih povezanih N-acetil-D-glukozaminskih (NAG) monomerov. Predstavlja enega izmed glavnih komponent celične stene gliv in s tem idealen biomarker. Medtem ko rastlinski imunski receptorji hitina direktno ne zaznavajo, lahko zaznajo njegove manjše fragmente ali monomere. Te lahko dobimo z delovanjem hitin razgrajujočih encimov hitinaz, ki so vrsta glikozilnih hidrolaz, katere razgrajujejo glikozidne vezi hitinskih polimerov. Večja dostopnost monomerov hitina omogoča induciranje fenomena SAR (systemic acquired resistance) in s tem večjo odpornost rastlin na okužbe [1].

== ''B. subtilis'' ==
Spore ''B. subtilis'' so poceni, vzdržljivi, robustni predstavitveni sistemi, katere lastnosti so idealne za razvoj takšnega sistema. ''B. subtilis'' izkazuje močne protiglivne lastnosti in je s strani FDA-ja označen kot generalno varen, saj ni patogen ali toksikogen do rastlin, živali ali ljudi. Med protiglivnimi defenzivnimi mehanizmi so: produkcija bakteriocinov, produkcija antibiotičnih lipopeptidov, produkcija iturina A, indukcija SAR-a in stimulacija rasti rastlinam simbiotskim glivam. Spore bakterij so zelo odporne na zunanje ekstremne pogoje in kljubujejo visoki temperaturi, UV radiaciji in ekstremnim pH-jem. Ob detekciji primernih nutrientov pa se hitro vrnejo v vegetativno stanje in se lahko delijo [1].

= Potek dela =

== Hitinski predstavitveni sistem ==
Spore se v procesu sporulacije obdajo z več membranami, med katerimi je biotehnološko najbolj zanimiv t.i. plašč, ki vsebuje več kot 70 različnih proteinov in glikoproteinov. Nekateri izmed njih so se že izkazali kot molekulska predstavitvena sidra, za projekt Sporadicate pa so študenti uporabili strukturni protein CotG. Na sidrni protein CotG so z linkerjem povezali hitinazo ChiS. Gre za eksohitinazo pridobljeno iz organizma ''B. pumilus'', ki poleg hitinazne aktivnosti izkazuje še možnost delovanja kot lizocim. Poleg CotG so testirali še vezavo na sidrni protein CotZ, ki se nahaja v zunanji ovojnici, katera objema plašč spore.[1].

== Samorazgrajujočise plazmid ==
Sistem CotG-linker-ChiS so v bakterijske spore uvedli s plazmidom, ki se s sporulacijo razgradi. Razgradnjo so dosegli s sistemom CRISPR-Cas9 tako, da so pod promotor PsspB, ki se aktivira s sporulacijo, vstavili Cas9. Operon je bil torej sestavljen iz promotorja PsspB, ribosoma optRBS, Cas9 CDS in iz terminatorja B0015. Za dosego večje občutljivosti sistema so gRNA vstavili izven tega operona pod konstitutivni promotor ter s tem zagotovili večjo koncentracijo gRNA ob ekspresiji Cas9. Tarčna gRNA je bila regija ori vstavljenega plazmida. Operon je bil sestavljen iz konstitutivnega promotorja PlepA, ribosoma RBS2 gRNA CDS, D15 eksonukleaze in terminatorja Spy1 [1].

== Receptor za reaktivacijo spor ==

Mirujoče spore se v metabolično aktivne, vegetativne bakterije spremenijo v procesu germinacije/kaljenja. Točen mehanizem, ki zažene germinacijo še ni pojasnjen, znano pa je, da proces sprožijo hranila, kot so L-alanin, asparagin in enostavni sladkorji. V ''B. subtilis'' poznamo tri receptorje, ki uravnavajo proces germinacije: GerA, GerB in GerK. Medtem ko GerK in GerB za indukcijo potrebujeta več signalov (hranil), GerA lahko sproži popolno germinacijo spore le ob prisotnosti L-alanina. Receptor, ki bi sprožil proces germinacije ob prisotnosti monomerov hitina, so torej osnovali na receptorju GerA. GerA delulje kot vodni in ionski kanalček, ki aktivira germinacijo z rehidracijo spore. Pri načrtovanju so upoštevali, da se L-alanin veže le na podenoto GerAB in tako načrtovali proces mutageneze le na to regijo receptorja. Aminokislinske ostanke, ki dajo receptorju specifičnost, so najprej določili z bioinformatskimi orodji (AlphaFold, Multiple Sequence Alignment). Laboratorijsko testiranje so izvedli z 10^8 različnimi kombinacijiami mutiranih proteinov GerA, pri čemer so uporabljali test specifičnosti s pozitivno in negativno selekcijo [1].

== Konstrukcija vektorjev ==

Za kloniranje osnovnih konstruktov DNA so v projektu kot ogrodje uporabili plazmid pSTK-0-sfGFP. Plazmid vsebuje MCS regijo, selekcijski marker z odpornostjo na kloramfenikol, sfGFP; s katerim lahko prepoznamo uspešne insercije tarčnih regij, sfGFP RBS in ORI. Za ekspresijo proteinov v B. subtilis so uporabili ogrodje STK-EXP-1-sfGFP. Vektor omogoča selekcijo uspešno transformiranih celic z markerjem kloramfenikolom in selekcijo uspešno ustavljenega zaporedja z sfGFP proteinom [1].

= Cilji za prihodnost =

Glavni problem sinteznobioloških izdelkov kot je Sporadicate so omejitve, ki jih prinaša uporaba GSO-jev. Sporadicate sicer naj ne bi vseboval gensko spremenjenih plazmidov v vegetativnih bakterijah, a še vedno lahko pride do nedelovanja mehanizma razgradnje in posledično do razširitve GSO bakterij. Za oceno možnosti takšnega scenarija in potencialne izboljšave produkta bi tako projekt potreboval nadaljnje testiranje na rastlinah in na terenu [1].

= Viri =
[1] SPORADICATE https://2022.igem.wiki/imperial-college-london/

Sporadicate

2023-05-08T18:35:24Z

GasperMozina:

Sporadicate je sinteznobiološki projekt v okviru tekmovanja iGEM 2022, ki ga je pripravila skupina študentov iz londonske univerze Imperal College London. Dostopen je na spletnem naslovu [https://2022.igem.wiki/imperial-college-london https://2022.igem.wiki/imperial-college-london.]

= Problem =
Naraščajoče svetovno prebivalstvo zahteva vedno večjo proizvodnjo hrane, zaradi mednarodnih konfliktov, podnebnih ekstremov in gospodarskih kriz, pa je preskrba s hrano vse bolj otežena. Za spopadanje s problemom lakote je nujno zvišanje kmetijske produktivnosti ter razvoj odpornih in trajnostnih sistemov. Bolezni rastlin povzročajo 10-15 odstotni izpad pridelka, od tega pa glivične bolezni predstavljajo kar 70-80 odstotkov. Trenutna uporaba fungicidov je nezadostna, zato so novi ukrepi ključnega pomena. V okviru projekta Sporadicate so razvili nestrupen biofungicid s širokim spektrom delovanja, sestavljen iz sistema bakterij ''B. subtilis'', ki odpravlja časovni zamik med diagnozo in zdravljenjem. Naravni sevi te bakterije so prisotni v talnem mikrobiomu in delujejo kot odlični bioobvladovalci, hkrati pa so popolnoma netoksični za ljudi, živali ali rastline [1].

= Načrt dela =
Projekt je zasnovan na sistemu »sense and response«. Torej, sistem, ki okužbo z glivo zazna in se nanjo tudi ustrezno odzove. Temelji na modificiranju spor ''B. subtilis'' tako, da te na svojem površju izražajo hitinaze, ki lahko razgrajujejo s hitinom bogato zunanjo membrano gliv. Pri procesu nastajajo monomeri hitina, ki delujejo kot univerzalni biomarkerji za vse glivne patogene in sprožijo imunski odziv rastlin. Spore B. subtilis bi vsebovale tudi mutirani germinantni receptor, ki bi vezal hitinske monomere. Ob vezavi se bi sprožil kaskadni odziv in omogočil reaktivacijo spor in razvoj vegetativnih bakterij. V nekaj minutah se bi bakterije namnožile in začele sproščati protiglivne lipopeptide. Modifikacije na sporah ''B. subtilis'' bi uvedli s tehnologijo CRISPR, katere elemente bi dostavljali s pomočjo samorazgradljivih plazmidov – namnožene bakterije tako ne bi vsebovale nobene tuje DNA [1].

= Teoretično ozadje =

== Hitin ==
Raziskovalci so definirali dve optimalni strategiji za biokontrolo rastlin. Biofungicid mora imeti širok spekter protiglivnega delovanja, ali pa mora promovirati rastlinski imunski sistem. Študenti projekta Sporadicate so želeli zasnovati sistem, ki bi lahko naredil oboje in kot primerno tarčno molekulo so izbrali hitin. Hitin je linearni homopolimer z β-(1,4) vezjo povezanih povezanih N-acetil-D-glukozaminskih (NAG) monomerov. Predstavlja enega izmed glavnih komponent celične stene gliv in s tem idealen biomarker. Medtem ko rastlinski imunski receptorji hitina direktno ne zaznavajo, lahko zaznajo njegove manjše fragmente ali monomere. Te lahko dobimo z delovanjem hitin razgrajujočih encimov hitinaz, ki so vrsta glikozilnih hidrolaz, katere razgrajujejo glikozidne vezi hitinskih polimerov. Večja dostopnost monomerov hitina omogoča induciranje fenomena SAR (systemic acquired resistance) in s tem večjo odpornost rastlin na okužbe [1].

== ''B. subtilis'' ==
Spore ''B. subtilis'' so poceni, vzdržljivi, robustni predstavitveni sistemi, katere lastnosti so idealne za razvoj takšnega sistema. ''B. subtilis'' izkazuje močne protiglivne lastnosti in je s strani FDA-ja označen kot generalno varen, saj ni patogen ali toksikogen do rastlin, živali ali ljudi. Med protiglivnimi defenzivnimi mehanizmi so: produkcija bakteriocinov, produkcija antibiotičnih lipopeptidov, produkcija iturina A, indukcija SAR-a in stimulacija rasti rastlinam simbiotskim glivam. Spore bakterij so zelo odporne na zunanje ekstremne pogoje in kljubujejo visoki temperaturi, UV radiaciji in ekstremnim pH-jem. Ob detekciji primernih nutrientov pa se hitro vrnejo v vegetativno stanje in se lahko delijo [1].

= Potek dela =

== Hitinski predstavitveni sistem ==
Spore se v procesu sporulacije obdajo z več membranami, med katerimi je biotehnološko najbolj zanimiv t.i. plašč, ki vsebuje več kot 70 različnih proteinov in glikoproteinov. Nekateri izmed njih so se že izkazali kot molekulska predstavitvena sidra, za projekt Sporadicate pa so študenti uporabili strukturni protein CotG. Na sidrni protein CotG so z linkerjem povezali hitinazo ChiS. Gre za eksohitinazo pridobljeno iz organizma ''B. pumilus'', ki poleg hitinazne aktivnosti izkazuje še možnost delovanja kot lizocim. Poleg CotG so testirali še vezavo na sidrni protein CotZ, ki se nahaja v zunanji ovojnici, katera objema plašč spore.[1].

== Samorazgrajujočise plazmid ==
Sistem CotG-linker-ChiS so v bakterijske spore uvedli s plazmidom, ki se s sporulacijo razgradi. Razgradnjo so dosegli s sistemom CRISPR-Cas9 tako, da so pod promotor PsspB, ki se aktivira s sporulacijo, vstavili Cas9. Operon je bil torej sestavljen iz promotorja PsspB, ribosoma optRBS, Cas9 CDS in iz terminatorja B0015. Za dosego večje občutljivosti sistema so gRNA vstavili izven tega operona pod konstitutivni promotor ter s tem zagotovili večjo koncentracijo gRNA ob ekspresiji Cas9. Tarčna gRNA je bila regija ori vstavljenega plazmida. Operon je bil sestavljen iz konstitutivnega promotorja PlepA, ribosoma RBS2 gRNA CDS, D15 eksonukleaze in terminatorja Spy1 [1].

== Receptor za reaktivacijo spor ==

Mirujoče spore se v metabolično aktivne, vegetativne bakterije spremenijo v procesu germinacije/kaljenja. Točen mehanizem, ki zažene germinacijo še ni pojasnjen, znano pa je, da proces sprožijo hranila, kot so L-alanin, asparagin in enostavni sladkorji. V ''B. subtilis'' poznamo tri receptorje, ki uravnavajo proces germinacije: GerA, GerB in GerK. Medtem ko GerK in GerB za indukcijo potrebujeta več signalov (hranil), GerA lahko sproži popolno germinacijo spore le ob prisotnosti L-alanina. Receptor, ki bi sprožil proces germinacije ob prisotnosti monomerov hitina, so torej osnovali na receptorju GerA. GerA delulje kot vodni in ionski kanalček, ki aktivira germinacijo z rehidracijo spore. Pri načrtovanju so upoštevali, da se L-alanin veže le na podenoto GerAB in tako načrtovali proces mutageneze le na to regijo receptorja. Aminokislinske ostanke, ki dajo receptorju specifičnost, so najprej določili z bioinformatskimi orodji (AlphaFold, Multiple Sequence Alignment). Laboratorijsko testiranje so izvedli z 10^8 različnimi kombinacijiami mutiranih proteinov GerA, pri čemer so uporabljali test specifičnosti s pozitivno in negativno selekcijo. [1].

= Konstrukcija vektorjev =

Za kloniranje osnovnih konstruktov DNA so v projektu kot ogrodje uporabili plazmid pSTK-0-sfGFP. Plazmid vsebuje MCS regijo, selekcijski marker z odpornostjo na kloramfenikol, sfGFP; s katerim lahko prepoznamo uspešne insercije tarčnih regij, sfGFP RBS in ORI. Za ekspresijo proteinov v B. subtilis so uporabili ogrodje STK-EXP-1-sfGFP. Vektor omogoča selekcijo uspešno transformiranih celic z markerjem kloramfenikolom in selekcijo uspešno ustavljenega zaporedja z sfGFP proteinom.

= Cilji za prihodnost =

Glavni problem sinteznobioloških izdelkov kot je Sporadicate so omejitve, ki jih prinaša uporaba GSO-jev. Sporadicate sicer naj ne bi vseboval gensko spremenjenih plazmidov v vegetativnih bakterijah, a še vedno lahko pride do nedelovanja mehanizma razgradnje in posledično do razširitve GSO bakterij. Za oceno možnosti takšnega scenarija in potencialne izboljšave produkta bi tako projekt potreboval nadaljnje testiranje na rastlinah in na terenu.

= Viri =
[1] SPORADICATE https://2022.igem.wiki/imperial-college-london/

Sporadicate

2023-05-08T17:18:42Z

GasperMozina:

Sporadicate je sinteznobiološki projekt v okviru tekmovanja iGEM 2022, ki ga je pripravila skupina študentov iz londonske univerze Imperal College London. Dostopen je na spletnem naslovu [https://2022.igem.wiki/imperial-college-london https://2022.igem.wiki/imperial-college-london.]

= Problem =
Naraščajoče svetovno prebivalstvo zahteva vedno večjo proizvodnjo hrane, zaradi mednarodnih konfliktov, podnebnih ekstremov in gospodarskih kriz, pa je preskrba s hrano vse bolj otežena. Za spopadanje s problemom lakote je nujno zvišanje kmetijske produktivnosti ter razvoj odpornih in trajnostnih sistemov. Bolezni rastlin povzročajo 10-15 odstotni izpad pridelka, od tega pa glivične bolezni predstavljajo kar 70-80 odstotkov. Trenutna uporaba fungicidov je nezadostna, zato so novi ukrepi ključnega pomena. V okviru projekta Sporadicate so razvili nestrupen biofungicid s širokim spektrom delovanja, sestavljen iz sistema bakterij ''B. subtilis'', ki odpravlja časovni zamik med diagnozo in zdravljenjem. Naravni sevi te bakterije so prisotni v talnem mikrobiomu in delujejo kot odlični bioobvladovalci, hkrati pa so popolnoma netoksični za ljudi, živali ali rastline [1].

= Načrt dela =
Projekt je zasnovan na sistemu »sense and response«. Torej, sistem, ki okužbo z glivo zazna in se nanjo tudi ustrezno odzove. Temelji na modificiranju spor ''B. subtilis'' tako, da te na svojem površju izražajo hitinaze, ki lahko razgrajujejo s hitinom bogato zunanjo membrano gliv. Pri procesu nastajajo monomeri hitina, ki delujejo kot univerzalni biomarkerji za vse glivne patogene in sprožijo imunski odziv rastlin. Spore B. subtilis bi vsebovale tudi mutirani germinantni receptor, ki bi vezal hitinske monomere. Ob vezavi se bi sprožil kaskadni odziv in omogočil reaktivacijo spor in razvoj vegetativnih bakterij. V nekaj minutah se bi bakterije namnožile in začele sproščati protiglivne lipopeptide. Modifikacije na sporah ''B. subtilis'' bi uvedli s tehnologijo CRISPR, katere elemente bi dostavljali s pomočjo samorazgradljivih plazmidov – namnožene bakterije tako ne bi vsebovale nobene tuje DNA [1].

= Teoretično ozadje =

== Hitin ==
Raziskovalci so definirali dve optimalni strategiji za biokontrolo rastlin. Biofungicid mora imeti širok spekter protiglivnega delovanja, ali pa mora promovirati rastlinski imunski sistem. Študenti projekta Sporadicate so želeli zasnovati sistem, ki bi lahko naredil oboje in kot primerno tarčno molekulo so izbrali hitin. Hitin je linearni homopolimer z β-(1,4) vezjo povezanih povezanih N-acetil-D-glukozaminskih (NAG) monomerov. Predstavlja enega izmed glavnih komponent celične stene gliv in s tem idealen biomarker. Medtem ko rastlinski imunski receptorji hitina direktno ne zaznavajo, lahko zaznajo njegove manjše fragmente ali monomere. Te lahko dobimo z delovanjem hitin razgrajujočih encimov hitinaz, ki so vrsta glikozilnih hidrolaz, katere razgrajujejo glikozidne vezi hitinskih polimerov. Večja dostopnost monomerov hitina omogoča induciranje fenomena SAR (systemic acquired resistance) in s tem večjo odpornost rastlin na okužbe [1].

== ''B. subtilis'' ==
Spore ''B. subtilis'' so poceni, vzdržljivi, robustni predstavitveni sistemi, katere lastnosti so idealne za razvoj takšnega sistema. ''B. subtilis'' izkazuje močne protiglivne lastnosti in je s strani FDA-ja označen kot generalno varen, saj ni patogen ali toksikogen do rastlin, živali ali ljudi. Med protiglivnimi defenzivnimi mehanizmi so: produkcija bakteriocinov, produkcija antibiotičnih lipopeptidov, produkcija iturina A, indukcija SAR-a in stimulacija rasti rastlinam simbiotskim glivam. Spore bakterij so zelo odporne na zunanje ekstremne pogoje in kljubujejo visoki temperaturi, UV radiaciji in ekstremnim pH-jem. Ob detekciji primernih nutrientov pa se hitro vrnejo v vegetativno stanje in se lahko delijo [1].

= Potek dela =

== Hitinski predstavitveni sistem ==
Spore se v procesu sporulacije obdajo z več membranami, med katerimi je biotehnološko najbolj zanimiv t.i. plašč, ki vsebuje več kot 70 različnih proteinov in glikoproteinov. Nekateri izmed njih so se že izkazali kot molekulska predstavitvena sidra, za projekt Sporadicate pa so študenti uporabili strukturni protein CotG. Na sidrni protein CotG so z linkerjem povezali hitinazo ChiS. Gre za eksohitinazo pridobljeno iz organizma ''B. pumilus'', ki poleg hitinazne aktivnosti izkazuje še možnost delovanja kot lizocim. Poleg CotG so testirali še vezavo na sidrni protein CotZ, ki se nahaja v zunanji ovojnici, katera objema plašč spore.[1].

== Samorazgrajujočise plazmid ==
Sistem CotG-linker-ChiS so v bakterijske spore uvedli s plazmidom, ki se s sporulacijo razgradi. Razgradnjo so dosegli s sistemom CRISPR-Cas9 tako, da so pod promotor PsspB, ki se aktivira s sporulacijo, vstavili Cas9. Operon je bil torej sestavljen iz promotorja PsspB, Cas9 CDS in iz terminatorja. Za dosego večje občutljivosti sistema so gRNA vstavili izven tega operona pod konstitutivni promotor ter s tem zagotovili večjo koncentracijo gRNA ob ekspresiji Cas9. Tarčna gRNA je bila regija ori vstavljenega plazmida. Operon je bil sestavljen iz konstitutivnega promotorja PlepA, gRNA CDS, D15 eksonukleaze in terminatorja [1].

== Receptor za reaktivacijo spor ==

Mirujoče spore se v metabolično aktivne, vegetativne bakterije spremenijo v procesu germinacije/kaljenja. Točen mehanizem, ki zažene germinacijo še ni pojasnjen, znano pa je, da proces sprožijo hranila, kot so L-alanin, asparagin in enostavni sladkorji. V ''B. subtilis'' poznamo tri receptorje, ki uravnavajo proces germinacije: GerA, GerB in GerK. Medtem ko GerK in GerB za indukcijo potrebujeta več signalov (hranil), GerA lahko sproži popolno germinacijo spore le ob prisotnosti L-alanina. Receptor, ki bi sprožil proces germinacije ob prisotnosti monomerov hitina, so torej osnovali na receptorju GerA. GerA delulje kot vodni in ionski kanalček, ki aktivira germinacijo z rehidracijo spore. Pri načrtovanju so upoštevali, da se L-alanin veže le na podenoto GerAB in tako načrtovali proces mutageneze le na to regijo receptorja. Aminokislinske ostanke, ki dajo receptorju specifičnost, so najprej določili z bioinformatskimi orodji (AlphaFold, Multiple Sequence Alignment). Laboratorijsko testiranje so izvedli z 10^8 različnimi kombinacijiami mutiranih proteinov GerA, pri čemer so uporabljali test specifičnosti s pozitivno in negativno selekcijo. [1].

= Cilji za prihodnost =

Glavni problem sinteznobioloških izdelkov kot je Sporadicate so omejitve, ki jih prinaša uporaba GSO-jev. Sporadicate sicer naj ne bi vseboval gensko spremenjenih plazmidov v vegetativnih bakterijah, a še vedno lahko pride do nedelovanja mehanizma razgradnje in posledično do razširitve GSO bakterij. Za oceno možnosti takšnega scenarija in potencialne izboljšave produkta bi tako projekt potreboval nadaljnje testiranje na rastlinah in na terenu.

= Viri =
[1] SPORADICATE https://2022.igem.wiki/imperial-college-london/

Sporadicate

2023-05-08T17:17:35Z

GasperMozina: New page: Sporadicate je sinteznobiološki projekt v okviru tekmovanja iGEM 2022, ki ga je pripravila skupina študentov iz londonske univerze Imperal College London. Dostopen je na spletnem naslovu...

Sporadicate je sinteznobiološki projekt v okviru tekmovanja iGEM 2022, ki ga je pripravila skupina študentov iz londonske univerze Imperal College London. Dostopen je na spletnem naslovu [https://2022.igem.wiki/imperial-college-london https://2022.igem.wiki/imperial-college-london.]

= Problem =
Naraščajoče svetovno prebivalstvo zahteva vedno večjo proizvodnjo hrane, zaradi mednarodnih konfliktov, podnebnih ekstremov in gospodarskih kriz, pa je preskrba s hrano vse bolj otežena. Za spopadanje s problemom lakote je nujno zvišanje kmetijske produktivnosti ter razvoj odpornih in trajnostnih sistemov. Bolezni rastlin povzročajo 10-15 odstotni izpad pridelka, od tega pa glivične bolezni predstavljajo kar 70-80 odstotkov. Trenutna uporaba fungicidov je nezadostna, zato so novi ukrepi ključnega pomena. V okviru projekta Sporadicate so razvili nestrupen biofungicid s širokim spektrom delovanja, sestavljen iz sistema bakterij ''B. subtilis'', ki odpravlja časovni zamik med diagnozo in zdravljenjem. Naravni sevi te bakterije so prisotni v talnem mikrobiomu in delujejo kot odlični bioobvladovalci, hkrati pa so popolnoma netoksični za ljudi, živali ali rastline [1].

= Načrt dela =
Projekt je zasnovan na sistemu »sense and response«. Torej, sistem, ki okužbo z glivo zazna in se nanjo tudi ustrezno odzove. Temelji na modificiranju spor ''B. subtilis'' tako, da te na svojem površju izražajo hitinaze, ki lahko razgrajujejo s hitinom bogato zunanjo membrano gliv. Pri procesu nastajajo monomeri hitina, ki delujejo kot univerzalni biomarkerji za vse glivne patogene in sprožijo imunski odziv rastlin. Spore B. subtilis bi vsebovale tudi mutirani germinantni receptor, ki bi vezal hitinske monomere. Ob vezavi se bi sprožil kaskadni odziv in omogočil reaktivacijo spor in razvoj vegetativnih bakterij. V nekaj minutah se bi bakterije namnožile in začele sproščati protiglivne lipopeptide. Modifikacije na sporah ''B. subtilis'' bi uvedli s tehnologijo CRISPR, katere elemente bi dostavljali s pomočjo samorazgradljivih plazmidov – namnožene bakterije tako ne bi vsebovale nobene tuje DNA [1].

= Teoretično ozadje =

== Hitin ==
Raziskovalci so definirali dve optimalni strategiji za biokontrolo rastlin. Biofungicid mora imeti širok spekter protiglivnega delovanja, ali pa mora promovirati rastlinski imunski sistem. Študenti projekta Sporadicate so želeli zasnovati sistem, ki bi lahko naredil oboje in kot primerno tarčno molekulo so izbrali hitin. Hitin je linearni homopolimer z β-(1,4) vezjo povezanih povezanih N-acetil-D-glukozaminskih (NAG) monomerov. Predstavlja enega izmed glavnih komponent celične stene gliv in s tem idealen biomarker. Medtem ko rastlinski imunski receptorji hitina direktno ne zaznavajo, lahko zaznajo njegove manjše fragmente ali monomere. Te lahko dobimo z delovanjem hitin razgrajujočih encimov hitinaz, ki so vrsta glikozilnih hidrolaz, katere razgrajujejo glikozidne vezi hitinskih polimerov. Večja dostopnost monomerov hitina omogoča induciranje fenomena SAR (systemic acquired resistance) in s tem večjo odpornost rastlin na okužbe [1].

== ''B. subtilis'' ==
Spore ''B. subtilis'' so poceni, vzdržljivi, robustni predstavitveni sistemi, katere lastnosti so idealne za razvoj takšnega sistema. ''B. subtilis'' izkazuje močne protiglivne lastnosti in je s strani FDA-ja označen kot generalno varen, saj ni patogen ali toksikogen do rastlin, živali ali ljudi. Med protiglivnimi defenzivnimi mehanizmi so: produkcija bakteriocinov, produkcija antibiotičnih lipopeptidov, produkcija iturina A, indukcija SAR-a in stimulacija rasti rastlinam simbiotskim glivam. Spore bakterij so zelo odporne na zunanje ekstremne pogoje in kljubujejo visoki temperaturi, UV radiaciji in ekstremnim pH-jem. Ob detekciji primernih nutrientov pa se hitro vrnejo v vegetativno stanje in se lahko delijo [1].

= Potek dela =

== Hitinski predstavitveni sistem ==
Spore se v procesu sporulacije obdajo z več membranami, med katerimi je biotehnološko najbolj zanimiv t.i. plašč, ki vsebuje več kot 70 različnih proteinov in glikoproteinov. Nekateri izmed njih so se že izkazali kot molekulska predstavitvena sidra, za projekt Sporadicate pa so študenti uporabili strukturni protein CotG. Na sidrni protein CotG so z linkerjem povezali hitinazo ChiS. Gre za eksohitinazo pridobljeno iz organizma B. pumilus, ki poleg hitinazne aktivnosti izkazuje še možnost delovanja kot lizocim. Poleg CotG so testirali še vezavo na sidrni protein CotZ, ki se nahaja v zunanji ovojnici, katera objema plašč spore.[1].

== Samorazgrajujočise plazmid ==
Sistem CotG-linker-ChiS so v bakterijske spore uvedli s plazmidom, ki se s sporulacijo razgradi. Razgradnjo so dosegli s sistemom CRISPR-Cas9 tako, da so pod promotor PsspB, ki se aktivira s sporulacijo, vstavili Cas9. Operon je bil torej sestavljen iz promotorja PsspB, Cas9 CDS in iz terminatorja. Za dosego večje občutljivosti sistema so gRNA vstavili izven tega operona pod konstitutivni promotor ter s tem zagotovili večjo koncentracijo gRNA ob ekspresiji Cas9. Tarčna gRNA je bila regija ori vstavljenega plazmida. Operon je bil sestavljen iz konstitutivnega promotorja PlepA, gRNA CDS, D15 eksonukleaze in terminatorja [1].

== Receptor za reaktivacijo spor ==

Mirujoče spore se v metabolično aktivne, vegetativne bakterije spremenijo v procesu germinacije/kaljenja. Točen mehanizem, ki zažene germinacijo še ni pojasnjen, znano pa je, da proces sprožijo hranila, kot so L-alanin, asparagin in enostavni sladkorji. V ''B. subtilis'' poznamo tri receptorje, ki uravnavajo proces germinacije: GerA, GerB in GerK. Medtem ko GerK in GerB za indukcijo potrebujeta več signalov (hranil), GerA lahko sproži popolno germinacijo spore le ob prisotnosti L-alanina. Receptor, ki bi sprožil proces germinacije ob prisotnosti monomerov hitina, so torej osnovali na receptorju GerA. GerA delulje kot vodni in ionski kanalček, ki aktivira germinacijo z rehidracijo spore. Pri načrtovanju so upoštevali, da se L-alanin veže le na podenoto GerAB in tako načrtovali proces mutageneze le na to regijo receptorja. Aminokislinske ostanke, ki dajo receptorju specifičnost, so najprej določili z bioinformatskimi orodji (AlphaFold, Multiple Sequence Alignment). Laboratorijsko testiranje so izvedli z 10^8 različnimi kombinacijiami mutiranih proteinov GerA, pri čemer so uporabljali test specifičnosti s pozitivno in negativno selekcijo. [1].

= Cilji za prihodnost =

Glavni problem sinteznobioloških izdelkov kot je Sporadicate so omejitve, ki jih prinaša uporaba GSO-jev. Sporadicate sicer naj ne bi vseboval gensko spremenjenih plazmidov v vegetativnih bakterijah, a še vedno lahko pride do nedelovanja mehanizma razgradnje in posledično do razširitve GSO bakterij. Za oceno možnosti takšnega scenarija in potencialne izboljšave produkta bi tako projekt potreboval nadaljnje testiranje na rastlinah in na terenu.

= Viri =
[1] SPORADICATE https://2022.igem.wiki/imperial-college-london/

Seminarji SB 2022/23

2023-05-08T16:59:22Z

GasperMozina: /* Image:Headline textImage:Media:Example.jpg */

== [[Image:Headline text]][[Image:[[Media:Example.jpg]]]] ==
[[http://www.example.com link title]]V študijskem letu 2022/23 študentje pri Sintezni biologiji predstavljajo naslednje teme:

RAZISKOVALNI ČLANKI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) <br>
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Rudarjenje_in_uporaba_konstitutivnih_promotorjev_iz_Rhodosporidium_toruloides Rudarjenje in uporaba konstitutivnih promotorjev iz ''Rhodosporidium toruloides''] (Ana Babnik)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Biomolekularni_aktuatorji_za_gensko_selektivno_akusti%C4%8Dno_manipulacijo_celic Biomolekularni aktuatorji za gensko selektivno akustično manipulacijo celic] (Greta Junger)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/IN_VIVO_SAMOSESTAVLJENA_siRNA_KOT_NA%C4%8CIN_KOMBINIRANEGA_ZDRAVLJENJA_ULCEROZNEGA_KOLITISA#ZAKLJU.C4.8CEK In vivo samosestavljena siRNA kot način kombiniranega zdravljenja ulceroznega kolitisa] (Tjaša Kos)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Priprava_kompleta_orodij_za_zaznavanje_kvoruma_pri_cianobakterijah:_Razvoj_medceli%C4%8Dne_koordinacije_v_me%C5%A1anih_avtotrofno-heterotrofnih_skupnostih Priprava kompleta orodij za zaznavanje kvoruma pri cianobakterijah: Razvoj medcelične koordinacije v mešanih avtotrofno-heterotrofnih skupnostih] (Nuša Tkalec)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Razvoj_temperaturno_inducibilnega_transkripcijskega_reostata_pri_Neurospori_crassi Razvoj temperaturno inducibilnega transkripcijskega reostata pri ''Neurospori crassi''] (Luka Šegota)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Priprava_tumor_ciljajočih_bakterij_s_stikalnim_sistemom,_ki_se_odziva_na_dušikov(II)_oksid Priprava tumor ciljajočih bakterij s stikalnim sistemom, ki se odziva na dušikov(II) oksid] (Ana Kodra)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Razcepljeni_ribocim%2C_ki_signale_nativnih_RNA_pove%C5%BEe_z_ortogonalnimi_proteinskimi_izhodnimi_signali Razcepljeni ribocim, ki signale nativnih RNA poveže z ortogonalnimi proteinskimi izhodnimi signali] (Ajda Beltram)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sistem_za_nadzor_%C5%A1tevila_plazmidov_v_celici_%28Tulip%29 Sistem za nadzor števila plazmidov v celici (Tulip)] (Gregor Strniša)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Skupnostna_znanost_je_na%C4%8Drtovala_ribosome_s_koristnimi_fenotipi Skupnostna znanost je načrtovala ribosome s koristnimi fenotipi] (Tanja Gošnjak)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Pristop_sintezne_biologije_za_načrtovanje_kandidata_za_cepivo_proti_delta_različici_SARSCoV2_je_razkril_prekinitev_favoriziranega_para_kodonov_kot_boljšo_strategijo_pred_uporabo_redkih_kodonov Pristop sintezne biologije za načrtovanje kandidata za cepivo proti delta različici SARS-CoV-2 je razkril prekinitev favoriziranega para kodonov kot boljšo strategijo pred uporabo redkih kodonov] (Stefanija Ivanova)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Dvosmerni_hibridni_eritritol_–_inducibilni_promotor_za_sintezno_biologijo_v_Yarrowia_lipolytica Dvosmerni hibridni eritritol – inducibilni promotor za sintezno biologijo v ''Yarrowia lipolytica''] (Maša Andoljšek)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Utišanje_izražanja_genov_s_strukturo_definirano_zankasto_strukturo_male_nekodirajoče_RNA_s_programiranimi_regulatornimi_aktivnostmi Utišanje izražanja genov s strukturo definirano zankasto strukturo male nekodirajoče RNA s programiranimi regulatornimi aktivnostmi] (Nika Bedrač)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Izbolj%C5%A1anje_evolucijske_stabilnosti_obremenjujo%C4%8Dih_in_toksi%C4%8Dnih_funkcij_v_E.coli_z_diferenciacijskim_genetskim_vezjem_posredovanim_z_integrazo Izboljšanje evolucijske stabilnosti obremenjujočih in toksičnih funkcij v E.coli z diferenciacijskim genetskim vezjem posredovanim z integrazo] (Nika Banovšek)

NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/MonChassis MonChassis] (Nika Tomsič)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/FIAT_LUX FIAT LUX] (Neža Lanišek)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/NETLANTIS NETLANTIS] (Maša Gabrič)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BINANOX BINANOX] (Vivian Nemanič)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/CoBiota CoBiota] (Petra Sintič)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sporadicate Sporadicate] (Gašper Možina)
----

Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Povzetek je treba objaviti dva dni pred predstavitvijo do polnoči (za seminarje v sredo torej v ponedeljek). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo približno 5-minutna razprava.

Terminski razpored je razviden iz preglednice na strežniku Google Drive.

Kako je videti seznam seminarjev, lahko preverite pri lanskem letniku: [[Seminarji_SB_2021/22]].

Retrotranspozoni LINE-1 in dejavniki, ki uravnavajo njihovo delovanje

2022-04-24T11:36:17Z

GasperMozina: /* Viri */

==Uvod==
LINE-1 (L1) so retrotranspozoni, ki spadajo v skupino dolgih razpršenih jedrnih elementov (LINE). Pri človeku predstavljajo okoli 17 % genoma, nahajajo pa se predvsem v nekodirajočih regijah.

Celotna kopija L1 je pri človeku dolga okoli 6 kbp. Sestavlja jo dvosmerni promotor na 5' koncu neprevajajoče se regije (UTR), dva odprta bralna okvirja (ORF1 in ORF2) in poli-A rep na 3' koncu UTR. ORF1 kodira protein, ki je ključen za stabilizacijo nove kopije L1, ORF2 pa kodira proteine z endonukleazno in reverznotranskriptazno aktivnostjo, ki sta ključni za retrotranspozicijo.

'''Mehanizem retrotranspozicije LINE-1'''

Retrotranspozicija L1 poteka po mehanizmu "na tarčnem mestu začete reverzne transkripcije" (TPRT). V celičnem jedru RNA-polimeraza II katalizira transkripcijo L1 v novo kopijo L1 RNA, ki poliadenilirana zapusti jedro. V citoplazmi se s translacijo sintetizirajo ORF1 in ORF2 proteini. Na poli-A rep L1 RNA se veže protein, ki omogoči tvorbo L1 ribonukleoproteina (RNP). L1 RNP se transportira nazaj v jedro. Endonukleaza ustvari zarezo v spodnji verigi tarčne DNA, kamor se nadalje preko poli-A repa veže L1 transkript – reverzna transkriptaza L1 RNA uporabi kot matrico za podaljšanje 3' konca spodnje verige tarčne DNA. Po integraciji komplementarne verige nove kopije L1 endonukleaza ustvari zarezo v zgornji verigi tarčne DNA, reverzna transkriptaza pa podaljša 3' konec nove zareze. Sinteza DNA tako nadomesti RNA. Na koncu nastopijo encimi, ki sodelujejo v popravljalnih mehanizmih novonastale DNA.

'''Regulacija aktivnosti LINE-1'''

Aktivnost L1 retrotranspozonov nadzorujejo različni faktorji v somatskih in zarodnih celicah ter na vseh stopnjah razvoja organizma. Regulacija L1 poteka na transkripcijskem in posttranskripcijskem nivoju ter na stopnji integracije v genom.

==Regulacija LINE-1 na predimplantacijski stopnji==
Na predimplantacijski stopnji razvoja organizma je aktivnost L1 regulirana na nivoju transkripcije z metilacijo DNA, modifikacijami histonov in N6-metiladenilacijo ter na posttranskripcijski ravni prav tako z N6-metiladenilacijo in pa s kompleksom, ki usmerja eksosome v jedru (kompleks NEXT). Regulacija aktivnosti L1 na tej stopnji je do sedaj najbolj podrobno preučena na mišjih modelih.

Metilacija DNA je epigenetski mehanizem, pri katerem pride do prenosa metilne skupine na C5 pozicijo citozina, pri čemer nastane 5-metilcitozin. Prenos metilne skupine z donorja metilne skupine S-adenozil metionina (SAM) katalizirajo metiltransferaze. Metilacijo CpG DNA na predimplantacijski stopnji katalizirata metiltransferazi DNMT1 in DNMT3B. Z eksperimenti so pokazali, da izbitje teh encimov privede do smrti mišjega zarodka. V miših je najvišja stopnja metilacije dosežena na stopnji oblikovanja zigote, potem se stopnja metilacije DNA zniža in minimum doseže na stopnji osemceličnega zarodka.

Histoni regulirajo transkripcijo na podlagi modifikacij, ki na različne načine vplivajo na njihovo interakcijo z DNA. Za regulacijo aktivnosti L1 je na predimplantacijski stopnji ključna predvsem metilacija histonov, ki poteka na lizinskem ali argininskem aminokislinskem ostanku N-terminalnega repa histona. Metilacijo histonov katalizirajo metiltransferaze. Metilacijo arginina katalizira protein arginin N-metiltransferaza 5 (PRMT5). Pri metilaciji histona H3 na lizinu 9 (H3K9) sodelujejo tri metiltransferaze: SUV39H, G9a in SETDB1. Z metilacijo histonov nastanejo različni histonski markerji, ki so vključeni v represijo transkripcije L1 (H3K9me2, H3K9me3). Pri metilaciji histonov sodeluje tudi faktor za sestavljanje kromatina (CAF-1). K nastanku histonskega markerja H3K9me3 in nadalje oblikovanju heterokromatina pripomore tudi regulatorni človeški utiševalni kompleks (kompleks HUSH). Sestavljajo ga trije proteini: TASOR, MPP8 in Perifilin.

Poleg metilacije DNA in modifikacij histonov k zmanjšanju izražanja L1 in tvorbi heterokromatina v sesalcih pripomore še N6-metiladenilacija. Z eksperimenti so pokazali, da prisotnost markerja N6-metiladenina v miših vodi do inaktivacije L1.

N6-metiladenilirani pa so lahko tudi L1 RNA transkripti, kar vodi v njihovo utišanje. Pomanjkanje proteina, ki vsebuje YT521-B homologno domeno (YTHDC1), faktorja, ki vodi v utišanje s prepoznavo N6-metiladenozinske modifikacije, lahko vodi do ponovne aktivacije utišanih L1.

Do posttranskripcijske razgradnje L1 vodi tudi kompleks NEXT. Kompleks NEXT deluje kot kofaktor RNA eksosomov v nukleoplazmi in tako pripomore k eksosomski razgradnji novonastale RNA. Sestavljajo ga trije proteini, med katerimi je najpomembnejši protein, ki vsebuje CCHC domeno cinkovega prsta (ZCCHC8).

==Regulacija LINE-1 v zarodnih celicah==
Mehanizmi regulacije L1 se pri moških in ženskih zarodnih celicah razlikujejo.

Za regulacijo aktivnosti L1 v moških zarodnih celicah je ključnega pomena t.i. piRNA/Piwi regulatorna pot. piRNA (s Piwi proteini interagirajoče RNA) so majhne nekodirajoče RNA dolge med 26 in 30 nt. Kot že ime pove piRNA tvorijo komplekse s skupino proteinov imenovano Piwi. Pri ljudeh se izražajo štiri različni Piwi proteini (PIWIL1-PIWIL4), samo tri Piwi proteine pa so identificirali pri miših (Miwi, Mili in Miwi2) in pri ''Drosophila melanogaster'' (Piwi, Aub in Ago3). piRNA lahko v kompleksu s proteinom Piwi direktno interagira z L1 RNA in tvori dvoverižni hibrid, ki ga Piwi protein s svojo ribonukleazno aktivnostjo nato cepi. Poleg tega lahko kompleks piRNA-Piwi reprimira aktivnost L1 tudi preko posredovanja pri de novo metilaciji DNA ter pri modifikaciji histonov, specifično pri modifikaciji H3K9me3. Ni pa še bolj podrobno raziskano, kakšna je točna vloga piRNA-Piwi pri teh dveh procesih.

Mehanizem direktne interakcije piRNA-Piwi z L1 mRNA je bil študiran na vinskih mušicah. Ključni sta bili opažanji, da (i) Piwi in Aub tvorita komplekse s protismerno piRNA glede na L1 RNA, ki ima na 5' koncu preferenčno uracil in (ii) Ago3 tvori komplekse s smerno piRNA, ki nima enake preference na 5' koncu. Po prepisu zaporedij za piRNA vsebuje RNA transkript zapise za več različnih piRNA hkrati. Cepitev transkripta na posamezne piRNA še ni dodobra razložena. Znano je le-da imajo po cepitvi piRNA na 5' mestu preferenčno uracil. Take piRNA se vežejo na Piwi ali Aub. Ko piRNA v kompleksu po komplementarnosti prepozna L1 mRNA in se z njo poveže preko vodikovih vezi, Piwi/Aub cepi fosfodiestersko vez približno 10 nt stran od 5' konca piRNA. Rezana L1 RNA se v celici procesira s cepitvijo 3' konca in tvori smerno piRNA, ki se veže na Ago3. Mehanizem procesiranja 3' konca ni poznan. Smerna piRNA v kompleksu z Ago3 se veže na primarni piRNA transkript, ki ga Ago3 nato cepi in s tem tvori nove protismerne piRNA. S tem se cikel ponovno začne.

Regulacija L1 v ženskih zarodnih celicah se zgodi predvsem na post-transkripcijski ravni. Nekateri proteini Piwi se sicer izražajo, vendar piRNA/Piwi regulatorna pot ne deluje. Namesto tega regulacija poteka predvsem na principu interferenčne RNA in pa razgradnje L1 RNA, pri kateri sodelujejo različne ribonukleaze in pa kompleks NEXT.

==Regulacija LINE-1 med razvojem zarodka==
Med razvojem zarodka regulacija aktivnosti L1 po posameznih tkivih ni dodobra poznana. Aktivnost L1 je reprimirana preko metilacije DNA, ki jo vršijo metiltransferaze DNMT1, DNMT3A in DNMT3B. DNMT1 je odgovorna za ohranjevanje metilacijskega vzorca po celični delitvi, medtem ko DNMT3A in DNMT3B sodelujeta pri de novo metilaciji.

Aktivnost L1 je med razvojem zarodka največja v možganih, kjer je bilo zaznanih tudi največ somatskih mutacij. Znano je, da je piRNA-Piwi pot delujoča med razvojem možganov, vendar domnevno v manjšem obsegu kot pri zarodnih celicah. Aktivnost L1 je selektivno reprimirana s pomočjo MeCP2 (metil-CpG-vezavni protein). Pri regulaciji sodeluje tudi protein YY1 (Yin Yang 1), ki ima lahko vlogo aktivatorja ali represorja. YY1 je namreč nujen za začetek transkripcije L1 (aktivator), a hkrati sodeluje pri metilaciji L1 promotorja (represor). Domneva se, da je dvojna vloga YY1 regulirana bodisi s posttranslacijskimi modifikacijami proteina (acetilacija) bodisi preko interakcij z različnimi kofaktorji. Ko YY1 deluje kot represor L1, se veže na 5' UTR in posreduje pri vezavi metiltransferaz.

==Regulacija LINE-1 v somatskih celicah==
V večini somatskih celicah organizma je L1 repremiran in njegova aktivacija je po navadi povezana z različnimi patologijami (rak, nevropsihiatrične in avtoimune bolezni) ali starostnimi spremembami. Izjema je možgansko tkivo, kjer je L1 aktiven v nevronih in glijah.

L1 je v glavnem repremiran z metilacijo DNA in specifičnimi modifikacijami histona, kar zmanjša dostopnost kromatina v L1 regijah somatskega tkiva. Proteini iz družine sirtuinov so povezani z mnogimi celičnimi procesi (popravljanje DNA, uravnavanje dolžine telomer, anti-vnetni procesi ...) in ena izmed funkcij proteina SIRT6 je tudi zaviranje L1. To se dogaja preko dveh poti. V prvi pride do mono-ADP ribozilacije faktorja KAP1, kar stimulira tvorbo heterokromatina, v drugi pa prihaja do interakcije SIRT6 s transkripcijskim faktorjem MePC2, ki je vključen v proces metilacije L1 promotorske regije.

Posttranskripcijsko se L1 v somatskih celicah specifično inhibira preko RNA interference z miR-128, ki skupaj z Ago proteinom tvori RISC kompleks. Možna mehanizma sta dva; miR-128 se lahko direktno veže na ORF2 regijo L1 mRNA, lahko pa inhibira celične faktorje, ki omogočijo transport L1 RNP iz citoplazme v jedro – transportin-1 (TNPO1) in hnRNPA1. Obstaja tudi alternativen mehanizem, v katerem RISC kompleks neposredno prepozna lasnično zanko pre-miRNA v 5'UTR regiji L1 transkripta in jo prereže, kar prepreči njegovo nadaljnje zorenje. V inhibicijo L1 so vključeni tudi drugi nuklearni ribonukleoproteini (R, Q, L), a njihov mehanizem inhibicije še ni raziskan.

L1 inhibirajo protivirusni faktorji. Ti se aktivirajo ob prisotnosti virusnih nukleinskih kislin in ob prisotnosti retrotranspozonov. Študije so pokazale, da L1 mRNA sproži imunski odziv in poveča nivo interferona β. INFB inducira encim RNazo L, le-ta pa cepi RNA in posledično vodi v pomembno znižanje ORF1 in ORF2 L1 proteinov. Močan inhibitor L1 je tudi MOV10 helikaza RNA. Mehanizem te helikaze ni popolnoma znan, znano pa je, da MOV10 z drugimi protivirusnimi proteini tvori kompleks, ki v interakciji z L1 transkripti tvori stresne granule, ki se potem nadaljnje razgradijo. Protein SAMHD1 (''SAM domain and HD domain-containing protein 1'') inhibira reverzno transkripcijo L1 z vezavo na ORF2 in zmanjša izražanje ORF2 proteinov. Družina proteinov APOBEC3 je ena prvih odkritih celičnih obrambnih sistemov proti nekontroliranem širjenju L1 in je prisotna zgolj pri človeku. Dogaja se na posttranskripcijskem nivoju preko deaminacijsko odvisnega ali neodvisnega mehanizma. Za L1 najbolj aktiven encim hA3A z deaminazno aktivnostjo pretvarja citozin v uracil v prvi verigi L1 cDNA transkripta. hA3C ali hA3DE delujeta po neodvisnem mehanizmu in blokirata reverzno transkripcijo L1 z interakcijo z L1 kompleksom RNP in ORF1 v celični citoplazmi.

V zadnji fazi retrotranspozicije oz. v integraciji v genom, inhibicija poteka preko proteinov, ki s svojim delovanjem popravljajo prekinitve enojne in dvojno zvite molekule DNA. K inhibiciji L1 veliko prispevajo faktorji, ki sodelujejo v postreplikativnih modifikacijah DNA (npr. encim ATM, ki ob poškodovanju DNA aktivira različne faktorje in komplekse, kateri popravljajo DNA – deficit ATM ali njemu podobnih proteinov vodi v povišano aktivnost L1).
V regulacijo L1 so vključeni faktorji celičnega cikla. Na 5'UTR promoter L1 se lahko veže transkripcijski faktor p53. Ta povzroči inhibitorne posttranslacijske modifikacije na N-koncih aminokislinskih ostankov histona. Inhibicijsko delujeta tudi faktorja p21 in p27 (Vezava na ORF2, preprečitev integracije).

Retrotranspozicijo L1 promovira histonska demetilaza KDM4B, ki promovira demetilacijo H3K9me3 histonov, njena aktivnost pa je povečana v različnih tipih raka. Pozitivno regulacijo L1 povzroča transkripcijski faktor RUNX3 (''runt-domain transcription factor''), ki se veže na regijo 5'UTR. Omeniti je potrebno tudi transkripcijski faktor FOXA1, katerega delovanje na L1 so opazili pri celičnem staranju – večje izražanje imunskih faktorjev, ki ga ne spremlja repremija L1 - in aktivacija L1 skupaj s prisotnim vnetjem je dober pokazatelj staranja. Spreminjanje regulacije L1 je torej potencialna tarča zdravljenja s starostjo povezanih bolezni.

==Viri==
[1] Protasova, Maria Sergeevna, Tatiana Vladimirovna Andreeva, and Evgeny Ivanovich Rogaev. “Factors Regulating the Activity of LINE1 Retrotransposons.” Genes 12, no. 10 (2021): 1562. https://doi.org/10.3390/genes12101562.

[2] Wu, You, Wenqiang Liu, Jiayu Chen, Shuaitong Liu, Mingzhu Wang, Lei Yang, Chuan Chen, et al. “Nuclear Exosome Targeting Complex Core Factor ZCCHC8 Regulates the Degradation of line1 RNA in Early Embryos and Embryonic Stem Cells.” Cell Reports 29, no. 8 (2019). https://doi.org/10.1016/j.celrep.2019.10.055.

[3] Brennecke, Julius, Alexei A. Aravin, Alexander Stark, Monica Dus, Manolis Kellis, Ravi Sachidanandam, and Gregory J. Hannon. “Discrete Small RNA-Generating Loci as Master Regulators of Transposon Activity in Drosophila.” Cell 128, no. 6 (2007): 1089–1103. https://doi.org/10.1016/j.cell.2007.01.043.

[4] Verheul, Thijs C., Levi van Hijfte, Elena Perenthaler, and Tahsin Stefan Barakat. “The Why of YY1: Mechanisms of Transcriptional Regulation by Yin Yang 1.” Frontiers in Cell and Developmental Biology 8 (2020). https://doi.org/10.3389/fcell.2020.592164.

[5] Thomas, Charles A et al. “LINE-1 retrotransposition in the nervous system.” Annual review of cell and developmental biology vol. 28 (2012).
https://doi:10.1146/annurev-cellbio-101011-155822

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Retrotranspozoni LINE-1 in dejavniki, ki uravnavajo njihovo delovanje

2022-04-24T11:17:27Z

GasperMozina: /* Regulacija LINE-1 v somatskih celicah */

==Uvod==
LINE-1 (L1) so retrotranspozoni, ki spadajo v skupino dolgih razpršenih jedrnih elementov (LINE). Pri človeku predstavljajo okoli 17 % genoma, nahajajo pa se predvsem v nekodirajočih regijah.

Celotna kopija L1 je pri človeku dolga okoli 6 kbp. Sestavlja jo dvosmerni promotor na 5' koncu neprevajajoče se regije (UTR), dva odprta bralna okvirja (ORF1 in ORF2) in poli-A rep na 3' koncu UTR. ORF1 kodira protein, ki je ključen za stabilizacijo nove kopije L1, ORF2 pa kodira proteine z endonukleazno in reverznotranskriptazno aktivnostjo, ki sta ključni za retrotranspozicijo.

'''Mehanizem retrotranspozicije LINE-1'''

Retrotranspozicija L1 poteka po mehanizmu "na tarčnem mestu začete reverzne transkripcije" (TPRT). V celičnem jedru RNA-polimeraza II katalizira transkripcijo L1 v novo kopijo L1 RNA, ki poliadenilirana zapusti jedro. V citoplazmi se s translacijo sintetizirajo ORF1 in ORF2 proteini. Na poli-A rep L1 RNA se veže protein, ki omogoči tvorbo L1 ribonukleoproteina (RNP). L1 RNP se transportira nazaj v jedro. Endonukleaza ustvari zarezo v spodnji verigi tarčne DNA, kamor se nadalje preko poli-A repa veže L1 transkript – reverzna transkriptaza L1 RNA uporabi kot matrico za podaljšanje 3' konca spodnje verige tarčne DNA. Po integraciji komplementarne verige nove kopije L1 endonukleaza ustvari zarezo v zgornji verigi tarčne DNA, reverzna transkriptaza pa podaljša 3' konec nove zareze. Sinteza DNA tako nadomesti RNA. Na koncu nastopijo encimi, ki sodelujejo v popravljalnih mehanizmih novonastale DNA.

'''Regulacija aktivnosti LINE-1'''

Aktivnost L1 retrotranspozonov nadzorujejo različni faktorji v somatskih in zarodnih celicah ter na vseh stopnjah razvoja organizma. Regulacija L1 poteka na transkripcijskem in posttranskripcijskem nivoju ter na stopnji integracije v genom.

==Regulacija LINE-1 na predimplantacijski stopnji==
Na predimplantacijski stopnji razvoja organizma je aktivnost L1 regulirana na nivoju transkripcije z metilacijo DNA, modifikacijami histonov in N6-metiladenilacijo ter na posttranskripcijski ravni prav tako z N6-metiladenilacijo in pa s kompleksom, ki usmerja eksosome v jedru (kompleks NEXT). Regulacija aktivnosti L1 na tej stopnji je do sedaj najbolj podrobno preučena na mišjih modelih.

Metilacija DNA je epigenetski mehanizem, pri katerem pride do prenosa metilne skupine na C5 pozicijo citozina, pri čemer nastane 5-metilcitozin. Prenos metilne skupine z donorja metilne skupine S-adenozil metionina (SAM) katalizirajo metiltransferaze. Metilacijo CpG DNA na predimplantacijski stopnji katalizirata metiltransferazi DNMT1 in DNMT3B. Z eksperimenti so pokazali, da izbitje teh encimov privede do smrti mišjega zarodka. V miših je najvišja stopnja metilacije dosežena na stopnji oblikovanja zigote, potem se stopnja metilacije DNA zniža in minimum doseže na stopnji osemceličnega zarodka.

Histoni regulirajo transkripcijo na podlagi modifikacij, ki na različne načine vplivajo na njihovo interakcijo z DNA. Za regulacijo aktivnosti L1 je na predimplantacijski stopnji ključna predvsem metilacija histonov, ki poteka na lizinskem ali argininskem aminokislinskem ostanku N-terminalnega repa histona. Metilacijo histonov katalizirajo metiltransferaze. Metilacijo arginina katalizira protein arginin N-metiltransferaza 5 (PRMT5). Pri metilaciji histona H3 na lizinu 9 (H3K9) sodelujejo tri metiltransferaze: SUV39H, G9a in SETDB1. Z metilacijo histonov nastanejo različni histonski markerji, ki so vključeni v represijo transkripcije L1 (H3K9me2, H3K9me3). Pri metilaciji histonov sodeluje tudi faktor za sestavljanje kromatina (CAF-1). K nastanku histonskega markerja H3K9me3 in nadalje oblikovanju heterokromatina pripomore tudi regulatorni človeški utiševalni kompleks (kompleks HUSH). Sestavljajo ga trije proteini: TASOR, MPP8 in Perifilin.

Poleg metilacije DNA in modifikacij histonov k zmanjšanju izražanja L1 in tvorbi heterokromatina v sesalcih pripomore še N6-metiladenilacija. Z eksperimenti so pokazali, da prisotnost markerja N6-metiladenina v miših vodi do inaktivacije L1.

N6-metiladenilirani pa so lahko tudi L1 RNA transkripti, kar vodi v njihovo utišanje. Pomanjkanje proteina, ki vsebuje YT521-B homologno domeno (YTHDC1), faktorja, ki vodi v utišanje s prepoznavo N6-metiladenozinske modifikacije, lahko vodi do ponovne aktivacije utišanih L1.

Do posttranskripcijske razgradnje L1 vodi tudi kompleks NEXT. Kompleks NEXT deluje kot kofaktor RNA eksosomov v nukleoplazmi in tako pripomore k eksosomski razgradnji novonastale RNA. Sestavljajo ga trije proteini, med katerimi je najpomembnejši protein, ki vsebuje CCHC domeno cinkovega prsta (ZCCHC8).

==Regulacija LINE-1 v zarodnih celicah==
Mehanizmi regulacije L1 se pri moških in ženskih zarodnih celicah razlikujejo.

Za regulacijo aktivnosti L1 v moških zarodnih celicah je ključnega pomena t.i. piRNA/Piwi regulatorna pot. piRNA (s Piwi proteini interagirajoče RNA) so majhne nekodirajoče RNA dolge med 26 in 30 nt. Kot že ime pove piRNA tvorijo komplekse s skupino proteinov imenovano Piwi. Pri ljudeh se izražajo štiri različni Piwi proteini (PIWIL1-PIWIL4), samo tri Piwi proteine pa so identificirali pri miših (Miwi, Mili in Miwi2) in pri ''Drosophila melanogaster'' (Piwi, Aub in Ago3). piRNA lahko v kompleksu s proteinom Piwi direktno interagira z L1 RNA in tvori dvoverižni hibrid, ki ga Piwi protein s svojo ribonukleazno aktivnostjo nato cepi. Poleg tega lahko kompleks piRNA-Piwi reprimira aktivnost L1 tudi preko posredovanja pri de novo metilaciji DNA ter pri modifikaciji histonov, specifično pri modifikaciji H3K9me3. Ni pa še bolj podrobno raziskano, kakšna je točna vloga piRNA-Piwi pri teh dveh procesih.

Mehanizem direktne interakcije piRNA-Piwi z L1 mRNA je bil študiran na vinskih mušicah. Ključni sta bili opažanji, da (i) Piwi in Aub tvorita komplekse s protismerno piRNA glede na L1 RNA, ki ima na 5' koncu preferenčno uracil in (ii) Ago3 tvori komplekse s smerno piRNA, ki nima enake preference na 5' koncu. Po prepisu zaporedij za piRNA vsebuje RNA transkript zapise za več različnih piRNA hkrati. Cepitev transkripta na posamezne piRNA še ni dodobra razložena. Znano je le-da imajo po cepitvi piRNA na 5' mestu preferenčno uracil. Take piRNA se vežejo na Piwi ali Aub. Ko piRNA v kompleksu po komplementarnosti prepozna L1 mRNA in se z njo poveže preko vodikovih vezi, Piwi/Aub cepi fosfodiestersko vez približno 10 nt stran od 5' konca piRNA. Rezana L1 RNA se v celici procesira s cepitvijo 3' konca in tvori smerno piRNA, ki se veže na Ago3. Mehanizem procesiranja 3' konca ni poznan. Smerna piRNA v kompleksu z Ago3 se veže na primarni piRNA transkript, ki ga Ago3 nato cepi in s tem tvori nove protismerne piRNA. S tem se cikel ponovno začne.

Regulacija L1 v ženskih zarodnih celicah se zgodi predvsem na post-transkripcijski ravni. Nekateri proteini Piwi se sicer izražajo, vendar piRNA/Piwi regulatorna pot ne deluje. Namesto tega regulacija poteka predvsem na principu interferenčne RNA in pa razgradnje L1 RNA, pri kateri sodelujejo različne ribonukleaze in pa kompleks NEXT.

==Regulacija LINE-1 med razvojem zarodka==
Med razvojem zarodka regulacija aktivnosti L1 po posameznih tkivih ni dodobra poznana. Aktivnost L1 je reprimirana preko metilacije DNA, ki jo vršijo metiltransferaze DNMT1, DNMT3A in DNMT3B. DNMT1 je odgovorna za ohranjevanje metilacijskega vzorca po celični delitvi, medtem ko DNMT3A in DNMT3B sodelujeta pri de novo metilaciji.

Aktivnost L1 je med razvojem zarodka največja v možganih, kjer je bilo zaznanih tudi največ somatskih mutacij. Znano je, da je piRNA-Piwi pot delujoča med razvojem možganov, vendar domnevno v manjšem obsegu kot pri zarodnih celicah. Aktivnost L1 je selektivno reprimirana s pomočjo MeCP2 (metil-CpG-vezavni protein). Pri regulaciji sodeluje tudi protein YY1 (Yin Yang 1), ki ima lahko vlogo aktivatorja ali represorja. YY1 je namreč nujen za začetek transkripcije L1 (aktivator), a hkrati sodeluje pri metilaciji L1 promotorja (represor). Domneva se, da je dvojna vloga YY1 regulirana bodisi s posttranslacijskimi modifikacijami proteina (acetilacija) bodisi preko interakcij z različnimi kofaktorji. Ko YY1 deluje kot represor L1, se veže na 5' UTR in posreduje pri vezavi metiltransferaz.

==Regulacija LINE-1 v somatskih celicah==
V večini somatskih celicah organizma je L1 repremiran in njegova aktivacija je po navadi povezana z različnimi patologijami (rak, nevropsihiatrične in avtoimune bolezni) ali starostnimi spremembami. Izjema je možgansko tkivo, kjer je L1 aktiven v nevronih in glijah.

L1 je v glavnem repremiran z metilacijo DNA in specifičnimi modifikacijami histona, kar zmanjša dostopnost kromatina v L1 regijah somatskega tkiva. Proteini iz družine sirtuinov so povezani z mnogimi celičnimi procesi (popravljanje DNA, uravnavanje dolžine telomer, anti-vnetni procesi ...) in ena izmed funkcij proteina SIRT6 je tudi zaviranje L1. To se dogaja preko dveh poti. V prvi pride do mono-ADP ribozilacije faktorja KAP1, kar stimulira tvorbo heterokromatina, v drugi pa prihaja do interakcije SIRT6 s transkripcijskim faktorjem MePC2, ki je vključen v proces metilacije L1 promotorske regije.

Posttranskripcijsko se L1 v somatskih celicah specifično inhibira preko RNA interference z miR-128, ki skupaj z Ago proteinom tvori RISC kompleks. Možna mehanizma sta dva; miR-128 se lahko direktno veže na ORF2 regijo L1 mRNA, lahko pa inhibira celične faktorje, ki omogočijo transport L1 RNP iz citoplazme v jedro – transportin-1 (TNPO1) in hnRNPA1. Obstaja tudi alternativen mehanizem, v katerem RISC kompleks neposredno prepozna lasnično zanko pre-miRNA v 5'UTR regiji L1 transkripta in jo prereže, kar prepreči njegovo nadaljnje zorenje. V inhibicijo L1 so vključeni tudi drugi nuklearni ribonukleoproteini (R, Q, L), a njihov mehanizem inhibicije še ni raziskan.

L1 inhibirajo protivirusni faktorji. Ti se aktivirajo ob prisotnosti virusnih nukleinskih kislin in ob prisotnosti retrotranspozonov. Študije so pokazale, da L1 mRNA sproži imunski odziv in poveča nivo interferona β. INFB inducira encim RNazo L, le-ta pa cepi RNA in posledično vodi v pomembno znižanje ORF1 in ORF2 L1 proteinov. Močan inhibitor L1 je tudi MOV10 helikaza RNA. Mehanizem te helikaze ni popolnoma znan, znano pa je, da MOV10 z drugimi protivirusnimi proteini tvori kompleks, ki v interakciji z L1 transkripti tvori stresne granule, ki se potem nadaljnje razgradijo. Protein SAMHD1 (''SAM domain and HD domain-containing protein 1'') inhibira reverzno transkripcijo L1 z vezavo na ORF2 in zmanjša izražanje ORF2 proteinov. Družina proteinov APOBEC3 je ena prvih odkritih celičnih obrambnih sistemov proti nekontroliranem širjenju L1 in je prisotna zgolj pri človeku. Dogaja se na posttranskripcijskem nivoju preko deaminacijsko odvisnega ali neodvisnega mehanizma. Za L1 najbolj aktiven encim hA3A z deaminazno aktivnostjo pretvarja citozin v uracil v prvi verigi L1 cDNA transkripta. hA3C ali hA3DE delujeta po neodvisnem mehanizmu in blokirata reverzno transkripcijo L1 z interakcijo z L1 kompleksom RNP in ORF1 v celični citoplazmi.

V zadnji fazi retrotranspozicije oz. v integraciji v genom, inhibicija poteka preko proteinov, ki s svojim delovanjem popravljajo prekinitve enojne in dvojno zvite molekule DNA. K inhibiciji L1 veliko prispevajo faktorji, ki sodelujejo v postreplikativnih modifikacijah DNA (npr. encim ATM, ki ob poškodovanju DNA aktivira različne faktorje in komplekse, kateri popravljajo DNA – deficit ATM ali njemu podobnih proteinov vodi v povišano aktivnost L1).
V regulacijo L1 so vključeni faktorji celičnega cikla. Na 5'UTR promoter L1 se lahko veže transkripcijski faktor p53. Ta povzroči inhibitorne posttranslacijske modifikacije na N-koncih aminokislinskih ostankov histona. Inhibicijsko delujeta tudi faktorja p21 in p27 (Vezava na ORF2, preprečitev integracije).

Retrotranspozicijo L1 promovira histonska demetilaza KDM4B, ki promovira demetilacijo H3K9me3 histonov, njena aktivnost pa je povečana v različnih tipih raka. Pozitivno regulacijo L1 povzroča transkripcijski faktor RUNX3 (''runt-domain transcription factor''), ki se veže na regijo 5'UTR. Omeniti je potrebno tudi transkripcijski faktor FOXA1, katerega delovanje na L1 so opazili pri celičnem staranju – večje izražanje imunskih faktorjev, ki ga ne spremlja repremija L1 - in aktivacija L1 skupaj s prisotnim vnetjem je dober pokazatelj staranja. Spreminjanje regulacije L1 je torej potencialna tarča zdravljenja s starostjo povezanih bolezni.

==Viri==
[1] Protasova, Maria Sergeevna, Tatiana Vladimirovna Andreeva, and Evgeny Ivanovich Rogaev. “Factors Regulating the Activity of LINE1 Retrotransposons.” Genes 12, no. 10 (2021): 1562. https://doi.org/10.3390/genes12101562.

[2] Wu, You, Wenqiang Liu, Jiayu Chen, Shuaitong Liu, Mingzhu Wang, Lei Yang, Chuan Chen, et al. “Nuclear Exosome Targeting Complex Core Factor ZCCHC8 Regulates the Degradation of line1 RNA in Early Embryos and Embryonic Stem Cells.” Cell Reports 29, no. 8 (2019). https://doi.org/10.1016/j.celrep.2019.10.055.

[3] Brennecke, Julius, Alexei A. Aravin, Alexander Stark, Monica Dus, Manolis Kellis, Ravi Sachidanandam, and Gregory J. Hannon. “Discrete Small RNA-Generating Loci as Master Regulators of Transposon Activity in Drosophila.” Cell 128, no. 6 (2007): 1089–1103. https://doi.org/10.1016/j.cell.2007.01.043.

[4] Verheul, Thijs C., Levi van Hijfte, Elena Perenthaler, and Tahsin Stefan Barakat. “The Why of YY1: Mechanisms of Transcriptional Regulation by Yin Yang 1.” Frontiers in Cell and Developmental Biology 8 (2020). https://doi.org/10.3389/fcell.2020.592164.

[5] Gates, Leah A et al. “Histone Marks in the 'Driver's Seat': Functional Roles in Steering the Transcription Cycle.” Trends in biochemical sciences vol. 42,12 (2017): 977-989. doi:10.1016/j.tibs.2017.10.004

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Retrotranspozoni LINE-1 in dejavniki, ki uravnavajo njihovo delovanje

2022-04-24T11:16:05Z

GasperMozina: /* Viri */

==Uvod==
LINE-1 (L1) so retrotranspozoni, ki spadajo v skupino dolgih razpršenih jedrnih elementov (LINE). Pri človeku predstavljajo okoli 17 % genoma, nahajajo pa se predvsem v nekodirajočih regijah.

Celotna kopija L1 je pri človeku dolga okoli 6 kbp. Sestavlja jo dvosmerni promotor na 5' koncu neprevajajoče se regije (UTR), dva odprta bralna okvirja (ORF1 in ORF2) in poli-A rep na 3' koncu UTR. ORF1 kodira protein, ki je ključen za stabilizacijo nove kopije L1, ORF2 pa kodira proteine z endonukleazno in reverznotranskriptazno aktivnostjo, ki sta ključni za retrotranspozicijo.

'''Mehanizem retrotranspozicije LINE-1'''

Retrotranspozicija L1 poteka po mehanizmu "na tarčnem mestu začete reverzne transkripcije" (TPRT). V celičnem jedru RNA-polimeraza II katalizira transkripcijo L1 v novo kopijo L1 RNA, ki poliadenilirana zapusti jedro. V citoplazmi se s translacijo sintetizirajo ORF1 in ORF2 proteini. Na poli-A rep L1 RNA se veže protein, ki omogoči tvorbo L1 ribonukleoproteina (RNP). L1 RNP se transportira nazaj v jedro. Endonukleaza ustvari zarezo v spodnji verigi tarčne DNA, kamor se nadalje preko poli-A repa veže L1 transkript – reverzna transkriptaza L1 RNA uporabi kot matrico za podaljšanje 3' konca spodnje verige tarčne DNA. Po integraciji komplementarne verige nove kopije L1 endonukleaza ustvari zarezo v zgornji verigi tarčne DNA, reverzna transkriptaza pa podaljša 3' konec nove zareze. Sinteza DNA tako nadomesti RNA. Na koncu nastopijo encimi, ki sodelujejo v popravljalnih mehanizmih novonastale DNA.

'''Regulacija aktivnosti LINE-1'''

Aktivnost L1 retrotranspozonov nadzorujejo različni faktorji v somatskih in zarodnih celicah ter na vseh stopnjah razvoja organizma. Regulacija L1 poteka na transkripcijskem in posttranskripcijskem nivoju ter na stopnji integracije v genom.

==Regulacija LINE-1 na predimplantacijski stopnji==
Na predimplantacijski stopnji razvoja organizma je aktivnost L1 regulirana na nivoju transkripcije z metilacijo DNA, modifikacijami histonov in N6-metiladenilacijo ter na posttranskripcijski ravni prav tako z N6-metiladenilacijo in pa s kompleksom, ki usmerja eksosome v jedru (kompleks NEXT). Regulacija aktivnosti L1 na tej stopnji je do sedaj najbolj podrobno preučena na mišjih modelih.

Metilacija DNA je epigenetski mehanizem, pri katerem pride do prenosa metilne skupine na C5 pozicijo citozina, pri čemer nastane 5-metilcitozin. Prenos metilne skupine z donorja metilne skupine S-adenozil metionina (SAM) katalizirajo metiltransferaze. Metilacijo CpG DNA na predimplantacijski stopnji katalizirata metiltransferazi DNMT1 in DNMT3B. Z eksperimenti so pokazali, da izbitje teh encimov privede do smrti mišjega zarodka. V miših je najvišja stopnja metilacije dosežena na stopnji oblikovanja zigote, potem se stopnja metilacije DNA zniža in minimum doseže na stopnji osemceličnega zarodka.

Histoni regulirajo transkripcijo na podlagi modifikacij, ki na različne načine vplivajo na njihovo interakcijo z DNA. Za regulacijo aktivnosti L1 je na predimplantacijski stopnji ključna predvsem metilacija histonov, ki poteka na lizinskem ali argininskem aminokislinskem ostanku N-terminalnega repa histona. Metilacijo histonov katalizirajo metiltransferaze. Metilacijo arginina katalizira protein arginin N-metiltransferaza 5 (PRMT5). Pri metilaciji histona H3 na lizinu 9 (H3K9) sodelujejo tri metiltransferaze: SUV39H, G9a in SETDB1. Z metilacijo histonov nastanejo različni histonski markerji, ki so vključeni v represijo transkripcije L1 (H3K9me2, H3K9me3). Pri metilaciji histonov sodeluje tudi faktor za sestavljanje kromatina (CAF-1). K nastanku histonskega markerja H3K9me3 in nadalje oblikovanju heterokromatina pripomore tudi regulatorni človeški utiševalni kompleks (kompleks HUSH). Sestavljajo ga trije proteini: TASOR, MPP8 in Perifilin.

Poleg metilacije DNA in modifikacij histonov k zmanjšanju izražanja L1 in tvorbi heterokromatina v sesalcih pripomore še N6-metiladenilacija. Z eksperimenti so pokazali, da prisotnost markerja N6-metiladenina v miših vodi do inaktivacije L1.

N6-metiladenilirani pa so lahko tudi L1 RNA transkripti, kar vodi v njihovo utišanje. Pomanjkanje proteina, ki vsebuje YT521-B homologno domeno (YTHDC1), faktorja, ki vodi v utišanje s prepoznavo N6-metiladenozinske modifikacije, lahko vodi do ponovne aktivacije utišanih L1.

Do posttranskripcijske razgradnje L1 vodi tudi kompleks NEXT. Kompleks NEXT deluje kot kofaktor RNA eksosomov v nukleoplazmi in tako pripomore k eksosomski razgradnji novonastale RNA. Sestavljajo ga trije proteini, med katerimi je najpomembnejši protein, ki vsebuje CCHC domeno cinkovega prsta (ZCCHC8).

==Regulacija LINE-1 v zarodnih celicah==
Mehanizmi regulacije L1 se pri moških in ženskih zarodnih celicah razlikujejo.

Za regulacijo aktivnosti L1 v moških zarodnih celicah je ključnega pomena t.i. piRNA/Piwi regulatorna pot. piRNA (s Piwi proteini interagirajoče RNA) so majhne nekodirajoče RNA dolge med 26 in 30 nt. Kot že ime pove piRNA tvorijo komplekse s skupino proteinov imenovano Piwi. Pri ljudeh se izražajo štiri različni Piwi proteini (PIWIL1-PIWIL4), samo tri Piwi proteine pa so identificirali pri miših (Miwi, Mili in Miwi2) in pri ''Drosophila melanogaster'' (Piwi, Aub in Ago3). piRNA lahko v kompleksu s proteinom Piwi direktno interagira z L1 RNA in tvori dvoverižni hibrid, ki ga Piwi protein s svojo ribonukleazno aktivnostjo nato cepi. Poleg tega lahko kompleks piRNA-Piwi reprimira aktivnost L1 tudi preko posredovanja pri de novo metilaciji DNA ter pri modifikaciji histonov, specifično pri modifikaciji H3K9me3. Ni pa še bolj podrobno raziskano, kakšna je točna vloga piRNA-Piwi pri teh dveh procesih.

Mehanizem direktne interakcije piRNA-Piwi z L1 mRNA je bil študiran na vinskih mušicah. Ključni sta bili opažanji, da (i) Piwi in Aub tvorita komplekse s protismerno piRNA glede na L1 RNA, ki ima na 5' koncu preferenčno uracil in (ii) Ago3 tvori komplekse s smerno piRNA, ki nima enake preference na 5' koncu. Po prepisu zaporedij za piRNA vsebuje RNA transkript zapise za več različnih piRNA hkrati. Cepitev transkripta na posamezne piRNA še ni dodobra razložena. Znano je le-da imajo po cepitvi piRNA na 5' mestu preferenčno uracil. Take piRNA se vežejo na Piwi ali Aub. Ko piRNA v kompleksu po komplementarnosti prepozna L1 mRNA in se z njo poveže preko vodikovih vezi, Piwi/Aub cepi fosfodiestersko vez približno 10 nt stran od 5' konca piRNA. Rezana L1 RNA se v celici procesira s cepitvijo 3' konca in tvori smerno piRNA, ki se veže na Ago3. Mehanizem procesiranja 3' konca ni poznan. Smerna piRNA v kompleksu z Ago3 se veže na primarni piRNA transkript, ki ga Ago3 nato cepi in s tem tvori nove protismerne piRNA. S tem se cikel ponovno začne.

Regulacija L1 v ženskih zarodnih celicah se zgodi predvsem na post-transkripcijski ravni. Nekateri proteini Piwi se sicer izražajo, vendar piRNA/Piwi regulatorna pot ne deluje. Namesto tega regulacija poteka predvsem na principu interferenčne RNA in pa razgradnje L1 RNA, pri kateri sodelujejo različne ribonukleaze in pa kompleks NEXT.

==Regulacija LINE-1 med razvojem zarodka==
Med razvojem zarodka regulacija aktivnosti L1 po posameznih tkivih ni dodobra poznana. Aktivnost L1 je reprimirana preko metilacije DNA, ki jo vršijo metiltransferaze DNMT1, DNMT3A in DNMT3B. DNMT1 je odgovorna za ohranjevanje metilacijskega vzorca po celični delitvi, medtem ko DNMT3A in DNMT3B sodelujeta pri de novo metilaciji.

Aktivnost L1 je med razvojem zarodka največja v možganih, kjer je bilo zaznanih tudi največ somatskih mutacij. Znano je, da je piRNA-Piwi pot delujoča med razvojem možganov, vendar domnevno v manjšem obsegu kot pri zarodnih celicah. Aktivnost L1 je selektivno reprimirana s pomočjo MeCP2 (metil-CpG-vezavni protein). Pri regulaciji sodeluje tudi protein YY1 (Yin Yang 1), ki ima lahko vlogo aktivatorja ali represorja. YY1 je namreč nujen za začetek transkripcije L1 (aktivator), a hkrati sodeluje pri metilaciji L1 promotorja (represor). Domneva se, da je dvojna vloga YY1 regulirana bodisi s posttranslacijskimi modifikacijami proteina (acetilacija) bodisi preko interakcij z različnimi kofaktorji. Ko YY1 deluje kot represor L1, se veže na 5' UTR in posreduje pri vezavi metiltransferaz.

==Regulacija LINE-1 v somatskih celicah==
V večini somatskih celicah organizma je L1 repremiran in njegova aktivacija je po navadi povezana z različnimi patologijami (rak, nevropsihiatrične in avtoimune bolezni) ali starostnimi spremembami. Izjema je možgansko tkivo, kjer je L1 aktiven v nevronih in glijah.

L1 je v glavnem repremiran z metilacijo DNA in specifičnimi modifikacijami histona, kar zmanjša dostopnost kromatina v L1 regijah somatskega tkiva. Proteini iz družine sirtuinov so povezani z mnogimi celičnimi procesi (popravljanje DNA, uravnavanje dolžine telomer, anti-vnetni procesi ...) in ena izmed funkcij proteina SIRT6 je tudi zaviranje L1. To se dogaja preko dveh poti. V prvi pride do mono-ADP ribozilacije faktorja KAP1, kar stimulira tvorbo heterokromatina, v drugi pa prihaja do interakcije SIRT6 s transkripcijskim faktorjem MePC2, ki je vključen v proces metilacije L1 promotorske regije.

Posttranskripcijsko se L1 v somatskih celicah specifično inhibira preko RNA interference z miR-128, ki skupaj z Ago proteinom tvori RISC kompleks. Možna mehanizma sta dva; miR-128 se lahko direktno veže na ORF2 regijo L1 mRNA, lahko pa inhibira celične faktorje, ki omogočijo transport L1 RNP iz citoplazme v jedro – transportin-1 (TNPO1) in hnRNPA1. Obstaja tudi alternativen mehanizem, v katerem RISC kompleks neposredno prepozna lasnično zanko pre-miRNA v 5'UTR regiji L1 transkripta in jo prereže, kar prepreči njegovo nadaljnje zorenje. V inhibicijo L1 so vključeni tudi drugi nuklearni ribonukleoproteini (R, Q, L), a njihov mehanizem inhibicije še ni raziskan.

L1 inhibirajo protivirusni faktorji. Ti se aktivirajo ob prisotnosti virusnih nukleinskih kislin in ob prisotnosti retrotranspozonov. Študije so pokazale, da L1 mRNA sproži imunski odziv in poveča nivo interferona β. INFB inducira encim RNazo L, le-ta pa cepi RNA in posledično vodi v pomembno znižanje ORF1 in ORF2 L1 proteinov. Močan inhibitor L1 je tudi MOV10 helikaza RNA. Mehanizem te helikaze ni popolnoma znan, znano pa je, da MOV10 z drugimi protivirusnimi proteini tvori kompleks, ki v interakciji z L1 transkripti tvori stresne granule, ki se potem nadaljnje razgradijo. Protein SAMHD1 (''SAM domain and HD domain-containing protein 1'') inhibira reverzno transkripcijo L1 z vezavo na ORF2 in zmanjša izražanje ORF2 proteinov. Družina proteinov APOBEC3 je ena prvih odkritih celičnih obrambnih sistemov proti nekontroliranem širjenju L1 in je prisotna zgolj pri človeku. Dogaja se na posttranskripcijskem nivoju preko deaminacijsko odvisnega ali neodvisnega mehanizma. Za L1 najbolj aktiven encim hA3A z deaminazno aktivnostjo pretvarja citozin v uracil v prvi verigi L1 cDNA transkripta. hA3C ali hA3DE delujeta po neodvisnem mehanizmu in blokirata reverzno transkripcijo L1 z interakcijo z L1 kompleksom RNP in ORF1 v celični citoplazmi.

V zadnji fazi retrotranspozicije oz. v integraciji v genom, inhibicija poteka preko proteinov, ki s svojim delovanjem popravljajo prekinitve enojne in dvojno zvite molekule DNA. K inhibiciji L1 veliko prispevajo faktorji, ki sodelujejo v postreplikativnih modifikacijah DNA (npr. encim ATM, ki ob poškodovanju DNA aktivira različne faktorje in komplekse, kateri popravljajo DNA – deficit ATM ali njemu podobnih proteinov vodi v povišano aktivnost L1).
V regulacijo L1 so vključeni faktorji celičnega cikla. Na 5'UTR promoter L1 se lahko veže transkripcijski faktor p53. Ta povzroči inhibitorne posttranslacijske modifikacije na N-koncih aminokislinskih ostankov histona. Inhibicijsko delujeta tudi faktorja p21 in p27 (Vezava na ORF2, preprečitev integracije).

Retrotranspozicijo L1 promovira histonska demetilaza KDM4B, ki promovira demetilacijo H3K9me3 histonov, njena aktivnost pa je povečana v različnih tipih raka. Pozitivno regulacijo L1 povzroča transkripcijski faktor RUNX3 (''runt-domain transcription factor''), ki se veže na regijo 5'UTR. Omeniti je potrebno tudi transkripcijski faktor FOXA1, ki je aktiven pri raku. Delovanje FOXA1 na L1 so opazili pri celičnem staranju – večje izražanje imunskih faktorjev, ki ga ne spremlja repremija L1 - in aktivacija L1 skupaj s prisotnim vnetjem je dober pokazatelj staranja. Spreminjanje regulacije L1 je torej potencialna tarča zdravljenja s starostjo povezanih bolezni.

==Viri==
[1] Protasova, Maria Sergeevna, Tatiana Vladimirovna Andreeva, and Evgeny Ivanovich Rogaev. “Factors Regulating the Activity of LINE1 Retrotransposons.” Genes 12, no. 10 (2021): 1562. https://doi.org/10.3390/genes12101562.

[2] Wu, You, Wenqiang Liu, Jiayu Chen, Shuaitong Liu, Mingzhu Wang, Lei Yang, Chuan Chen, et al. “Nuclear Exosome Targeting Complex Core Factor ZCCHC8 Regulates the Degradation of line1 RNA in Early Embryos and Embryonic Stem Cells.” Cell Reports 29, no. 8 (2019). https://doi.org/10.1016/j.celrep.2019.10.055.

[3] Brennecke, Julius, Alexei A. Aravin, Alexander Stark, Monica Dus, Manolis Kellis, Ravi Sachidanandam, and Gregory J. Hannon. “Discrete Small RNA-Generating Loci as Master Regulators of Transposon Activity in Drosophila.” Cell 128, no. 6 (2007): 1089–1103. https://doi.org/10.1016/j.cell.2007.01.043.

[4] Verheul, Thijs C., Levi van Hijfte, Elena Perenthaler, and Tahsin Stefan Barakat. “The Why of YY1: Mechanisms of Transcriptional Regulation by Yin Yang 1.” Frontiers in Cell and Developmental Biology 8 (2020). https://doi.org/10.3389/fcell.2020.592164.

[5] Gates, Leah A et al. “Histone Marks in the 'Driver's Seat': Functional Roles in Steering the Transcription Cycle.” Trends in biochemical sciences vol. 42,12 (2017): 977-989. doi:10.1016/j.tibs.2017.10.004

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Retrotranspozoni LINE-1 in dejavniki, ki uravnavajo njihovo delovanje

2022-04-24T11:15:47Z

GasperMozina: /* Viri */

==Uvod==
LINE-1 (L1) so retrotranspozoni, ki spadajo v skupino dolgih razpršenih jedrnih elementov (LINE). Pri človeku predstavljajo okoli 17 % genoma, nahajajo pa se predvsem v nekodirajočih regijah.

Celotna kopija L1 je pri človeku dolga okoli 6 kbp. Sestavlja jo dvosmerni promotor na 5' koncu neprevajajoče se regije (UTR), dva odprta bralna okvirja (ORF1 in ORF2) in poli-A rep na 3' koncu UTR. ORF1 kodira protein, ki je ključen za stabilizacijo nove kopije L1, ORF2 pa kodira proteine z endonukleazno in reverznotranskriptazno aktivnostjo, ki sta ključni za retrotranspozicijo.

'''Mehanizem retrotranspozicije LINE-1'''

Retrotranspozicija L1 poteka po mehanizmu "na tarčnem mestu začete reverzne transkripcije" (TPRT). V celičnem jedru RNA-polimeraza II katalizira transkripcijo L1 v novo kopijo L1 RNA, ki poliadenilirana zapusti jedro. V citoplazmi se s translacijo sintetizirajo ORF1 in ORF2 proteini. Na poli-A rep L1 RNA se veže protein, ki omogoči tvorbo L1 ribonukleoproteina (RNP). L1 RNP se transportira nazaj v jedro. Endonukleaza ustvari zarezo v spodnji verigi tarčne DNA, kamor se nadalje preko poli-A repa veže L1 transkript – reverzna transkriptaza L1 RNA uporabi kot matrico za podaljšanje 3' konca spodnje verige tarčne DNA. Po integraciji komplementarne verige nove kopije L1 endonukleaza ustvari zarezo v zgornji verigi tarčne DNA, reverzna transkriptaza pa podaljša 3' konec nove zareze. Sinteza DNA tako nadomesti RNA. Na koncu nastopijo encimi, ki sodelujejo v popravljalnih mehanizmih novonastale DNA.

'''Regulacija aktivnosti LINE-1'''

Aktivnost L1 retrotranspozonov nadzorujejo različni faktorji v somatskih in zarodnih celicah ter na vseh stopnjah razvoja organizma. Regulacija L1 poteka na transkripcijskem in posttranskripcijskem nivoju ter na stopnji integracije v genom.

==Regulacija LINE-1 na predimplantacijski stopnji==
Na predimplantacijski stopnji razvoja organizma je aktivnost L1 regulirana na nivoju transkripcije z metilacijo DNA, modifikacijami histonov in N6-metiladenilacijo ter na posttranskripcijski ravni prav tako z N6-metiladenilacijo in pa s kompleksom, ki usmerja eksosome v jedru (kompleks NEXT). Regulacija aktivnosti L1 na tej stopnji je do sedaj najbolj podrobno preučena na mišjih modelih.

Metilacija DNA je epigenetski mehanizem, pri katerem pride do prenosa metilne skupine na C5 pozicijo citozina, pri čemer nastane 5-metilcitozin. Prenos metilne skupine z donorja metilne skupine S-adenozil metionina (SAM) katalizirajo metiltransferaze. Metilacijo CpG DNA na predimplantacijski stopnji katalizirata metiltransferazi DNMT1 in DNMT3B. Z eksperimenti so pokazali, da izbitje teh encimov privede do smrti mišjega zarodka. V miših je najvišja stopnja metilacije dosežena na stopnji oblikovanja zigote, potem se stopnja metilacije DNA zniža in minimum doseže na stopnji osemceličnega zarodka.

Histoni regulirajo transkripcijo na podlagi modifikacij, ki na različne načine vplivajo na njihovo interakcijo z DNA. Za regulacijo aktivnosti L1 je na predimplantacijski stopnji ključna predvsem metilacija histonov, ki poteka na lizinskem ali argininskem aminokislinskem ostanku N-terminalnega repa histona. Metilacijo histonov katalizirajo metiltransferaze. Metilacijo arginina katalizira protein arginin N-metiltransferaza 5 (PRMT5). Pri metilaciji histona H3 na lizinu 9 (H3K9) sodelujejo tri metiltransferaze: SUV39H, G9a in SETDB1. Z metilacijo histonov nastanejo različni histonski markerji, ki so vključeni v represijo transkripcije L1 (H3K9me2, H3K9me3). Pri metilaciji histonov sodeluje tudi faktor za sestavljanje kromatina (CAF-1). K nastanku histonskega markerja H3K9me3 in nadalje oblikovanju heterokromatina pripomore tudi regulatorni človeški utiševalni kompleks (kompleks HUSH). Sestavljajo ga trije proteini: TASOR, MPP8 in Perifilin.

Poleg metilacije DNA in modifikacij histonov k zmanjšanju izražanja L1 in tvorbi heterokromatina v sesalcih pripomore še N6-metiladenilacija. Z eksperimenti so pokazali, da prisotnost markerja N6-metiladenina v miših vodi do inaktivacije L1.

N6-metiladenilirani pa so lahko tudi L1 RNA transkripti, kar vodi v njihovo utišanje. Pomanjkanje proteina, ki vsebuje YT521-B homologno domeno (YTHDC1), faktorja, ki vodi v utišanje s prepoznavo N6-metiladenozinske modifikacije, lahko vodi do ponovne aktivacije utišanih L1.

Do posttranskripcijske razgradnje L1 vodi tudi kompleks NEXT. Kompleks NEXT deluje kot kofaktor RNA eksosomov v nukleoplazmi in tako pripomore k eksosomski razgradnji novonastale RNA. Sestavljajo ga trije proteini, med katerimi je najpomembnejši protein, ki vsebuje CCHC domeno cinkovega prsta (ZCCHC8).

==Regulacija LINE-1 v zarodnih celicah==
Mehanizmi regulacije L1 se pri moških in ženskih zarodnih celicah razlikujejo.

Za regulacijo aktivnosti L1 v moških zarodnih celicah je ključnega pomena t.i. piRNA/Piwi regulatorna pot. piRNA (s Piwi proteini interagirajoče RNA) so majhne nekodirajoče RNA dolge med 26 in 30 nt. Kot že ime pove piRNA tvorijo komplekse s skupino proteinov imenovano Piwi. Pri ljudeh se izražajo štiri različni Piwi proteini (PIWIL1-PIWIL4), samo tri Piwi proteine pa so identificirali pri miših (Miwi, Mili in Miwi2) in pri ''Drosophila melanogaster'' (Piwi, Aub in Ago3). piRNA lahko v kompleksu s proteinom Piwi direktno interagira z L1 RNA in tvori dvoverižni hibrid, ki ga Piwi protein s svojo ribonukleazno aktivnostjo nato cepi. Poleg tega lahko kompleks piRNA-Piwi reprimira aktivnost L1 tudi preko posredovanja pri de novo metilaciji DNA ter pri modifikaciji histonov, specifično pri modifikaciji H3K9me3. Ni pa še bolj podrobno raziskano, kakšna je točna vloga piRNA-Piwi pri teh dveh procesih.

Mehanizem direktne interakcije piRNA-Piwi z L1 mRNA je bil študiran na vinskih mušicah. Ključni sta bili opažanji, da (i) Piwi in Aub tvorita komplekse s protismerno piRNA glede na L1 RNA, ki ima na 5' koncu preferenčno uracil in (ii) Ago3 tvori komplekse s smerno piRNA, ki nima enake preference na 5' koncu. Po prepisu zaporedij za piRNA vsebuje RNA transkript zapise za več različnih piRNA hkrati. Cepitev transkripta na posamezne piRNA še ni dodobra razložena. Znano je le-da imajo po cepitvi piRNA na 5' mestu preferenčno uracil. Take piRNA se vežejo na Piwi ali Aub. Ko piRNA v kompleksu po komplementarnosti prepozna L1 mRNA in se z njo poveže preko vodikovih vezi, Piwi/Aub cepi fosfodiestersko vez približno 10 nt stran od 5' konca piRNA. Rezana L1 RNA se v celici procesira s cepitvijo 3' konca in tvori smerno piRNA, ki se veže na Ago3. Mehanizem procesiranja 3' konca ni poznan. Smerna piRNA v kompleksu z Ago3 se veže na primarni piRNA transkript, ki ga Ago3 nato cepi in s tem tvori nove protismerne piRNA. S tem se cikel ponovno začne.

Regulacija L1 v ženskih zarodnih celicah se zgodi predvsem na post-transkripcijski ravni. Nekateri proteini Piwi se sicer izražajo, vendar piRNA/Piwi regulatorna pot ne deluje. Namesto tega regulacija poteka predvsem na principu interferenčne RNA in pa razgradnje L1 RNA, pri kateri sodelujejo različne ribonukleaze in pa kompleks NEXT.

==Regulacija LINE-1 med razvojem zarodka==
Med razvojem zarodka regulacija aktivnosti L1 po posameznih tkivih ni dodobra poznana. Aktivnost L1 je reprimirana preko metilacije DNA, ki jo vršijo metiltransferaze DNMT1, DNMT3A in DNMT3B. DNMT1 je odgovorna za ohranjevanje metilacijskega vzorca po celični delitvi, medtem ko DNMT3A in DNMT3B sodelujeta pri de novo metilaciji.

Aktivnost L1 je med razvojem zarodka največja v možganih, kjer je bilo zaznanih tudi največ somatskih mutacij. Znano je, da je piRNA-Piwi pot delujoča med razvojem možganov, vendar domnevno v manjšem obsegu kot pri zarodnih celicah. Aktivnost L1 je selektivno reprimirana s pomočjo MeCP2 (metil-CpG-vezavni protein). Pri regulaciji sodeluje tudi protein YY1 (Yin Yang 1), ki ima lahko vlogo aktivatorja ali represorja. YY1 je namreč nujen za začetek transkripcije L1 (aktivator), a hkrati sodeluje pri metilaciji L1 promotorja (represor). Domneva se, da je dvojna vloga YY1 regulirana bodisi s posttranslacijskimi modifikacijami proteina (acetilacija) bodisi preko interakcij z različnimi kofaktorji. Ko YY1 deluje kot represor L1, se veže na 5' UTR in posreduje pri vezavi metiltransferaz.

==Regulacija LINE-1 v somatskih celicah==
V večini somatskih celicah organizma je L1 repremiran in njegova aktivacija je po navadi povezana z različnimi patologijami (rak, nevropsihiatrične in avtoimune bolezni) ali starostnimi spremembami. Izjema je možgansko tkivo, kjer je L1 aktiven v nevronih in glijah.

L1 je v glavnem repremiran z metilacijo DNA in specifičnimi modifikacijami histona, kar zmanjša dostopnost kromatina v L1 regijah somatskega tkiva. Proteini iz družine sirtuinov so povezani z mnogimi celičnimi procesi (popravljanje DNA, uravnavanje dolžine telomer, anti-vnetni procesi ...) in ena izmed funkcij proteina SIRT6 je tudi zaviranje L1. To se dogaja preko dveh poti. V prvi pride do mono-ADP ribozilacije faktorja KAP1, kar stimulira tvorbo heterokromatina, v drugi pa prihaja do interakcije SIRT6 s transkripcijskim faktorjem MePC2, ki je vključen v proces metilacije L1 promotorske regije.

Posttranskripcijsko se L1 v somatskih celicah specifično inhibira preko RNA interference z miR-128, ki skupaj z Ago proteinom tvori RISC kompleks. Možna mehanizma sta dva; miR-128 se lahko direktno veže na ORF2 regijo L1 mRNA, lahko pa inhibira celične faktorje, ki omogočijo transport L1 RNP iz citoplazme v jedro – transportin-1 (TNPO1) in hnRNPA1. Obstaja tudi alternativen mehanizem, v katerem RISC kompleks neposredno prepozna lasnično zanko pre-miRNA v 5'UTR regiji L1 transkripta in jo prereže, kar prepreči njegovo nadaljnje zorenje. V inhibicijo L1 so vključeni tudi drugi nuklearni ribonukleoproteini (R, Q, L), a njihov mehanizem inhibicije še ni raziskan.

L1 inhibirajo protivirusni faktorji. Ti se aktivirajo ob prisotnosti virusnih nukleinskih kislin in ob prisotnosti retrotranspozonov. Študije so pokazale, da L1 mRNA sproži imunski odziv in poveča nivo interferona β. INFB inducira encim RNazo L, le-ta pa cepi RNA in posledično vodi v pomembno znižanje ORF1 in ORF2 L1 proteinov. Močan inhibitor L1 je tudi MOV10 helikaza RNA. Mehanizem te helikaze ni popolnoma znan, znano pa je, da MOV10 z drugimi protivirusnimi proteini tvori kompleks, ki v interakciji z L1 transkripti tvori stresne granule, ki se potem nadaljnje razgradijo. Protein SAMHD1 (''SAM domain and HD domain-containing protein 1'') inhibira reverzno transkripcijo L1 z vezavo na ORF2 in zmanjša izražanje ORF2 proteinov. Družina proteinov APOBEC3 je ena prvih odkritih celičnih obrambnih sistemov proti nekontroliranem širjenju L1 in je prisotna zgolj pri človeku. Dogaja se na posttranskripcijskem nivoju preko deaminacijsko odvisnega ali neodvisnega mehanizma. Za L1 najbolj aktiven encim hA3A z deaminazno aktivnostjo pretvarja citozin v uracil v prvi verigi L1 cDNA transkripta. hA3C ali hA3DE delujeta po neodvisnem mehanizmu in blokirata reverzno transkripcijo L1 z interakcijo z L1 kompleksom RNP in ORF1 v celični citoplazmi.

V zadnji fazi retrotranspozicije oz. v integraciji v genom, inhibicija poteka preko proteinov, ki s svojim delovanjem popravljajo prekinitve enojne in dvojno zvite molekule DNA. K inhibiciji L1 veliko prispevajo faktorji, ki sodelujejo v postreplikativnih modifikacijah DNA (npr. encim ATM, ki ob poškodovanju DNA aktivira različne faktorje in komplekse, kateri popravljajo DNA – deficit ATM ali njemu podobnih proteinov vodi v povišano aktivnost L1).
V regulacijo L1 so vključeni faktorji celičnega cikla. Na 5'UTR promoter L1 se lahko veže transkripcijski faktor p53. Ta povzroči inhibitorne posttranslacijske modifikacije na N-koncih aminokislinskih ostankov histona. Inhibicijsko delujeta tudi faktorja p21 in p27 (Vezava na ORF2, preprečitev integracije).

Retrotranspozicijo L1 promovira histonska demetilaza KDM4B, ki promovira demetilacijo H3K9me3 histonov, njena aktivnost pa je povečana v različnih tipih raka. Pozitivno regulacijo L1 povzroča transkripcijski faktor RUNX3 (''runt-domain transcription factor''), ki se veže na regijo 5'UTR. Omeniti je potrebno tudi transkripcijski faktor FOXA1, ki je aktiven pri raku. Delovanje FOXA1 na L1 so opazili pri celičnem staranju – večje izražanje imunskih faktorjev, ki ga ne spremlja repremija L1 - in aktivacija L1 skupaj s prisotnim vnetjem je dober pokazatelj staranja. Spreminjanje regulacije L1 je torej potencialna tarča zdravljenja s starostjo povezanih bolezni.

==Viri==
[1] Protasova, Maria Sergeevna, Tatiana Vladimirovna Andreeva, and Evgeny Ivanovich Rogaev. “Factors Regulating the Activity of LINE1 Retrotransposons.” Genes 12, no. 10 (2021): 1562. https://doi.org/10.3390/genes12101562.

[2] Wu, You, Wenqiang Liu, Jiayu Chen, Shuaitong Liu, Mingzhu Wang, Lei Yang, Chuan Chen, et al. “Nuclear Exosome Targeting Complex Core Factor ZCCHC8 Regulates the Degradation of line1 RNA in Early Embryos and Embryonic Stem Cells.” Cell Reports 29, no. 8 (2019). https://doi.org/10.1016/j.celrep.2019.10.055.

[3] Brennecke, Julius, Alexei A. Aravin, Alexander Stark, Monica Dus, Manolis Kellis, Ravi Sachidanandam, and Gregory J. Hannon. “Discrete Small RNA-Generating Loci as Master Regulators of Transposon Activity in Drosophila.” Cell 128, no. 6 (2007): 1089–1103. https://doi.org/10.1016/j.cell.2007.01.043.

[4] Verheul, Thijs C., Levi van Hijfte, Elena Perenthaler, and Tahsin Stefan Barakat. “The Why of YY1: Mechanisms of Transcriptional Regulation by Yin Yang 1.” Frontiers in Cell and Developmental Biology 8 (2020). https://doi.org/10.3389/fcell.2020.592164.

[5] Gates, Leah A et al. “Histone Marks in the 'Driver's Seat': Functional Roles in Steering the Transcription Cycle.” Trends in biochemical sciences vol. 42,12 (2017).

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Retrotranspozoni LINE-1 in dejavniki, ki uravnavajo njihovo delovanje

2022-04-24T10:02:41Z

GasperMozina: /* Regulacija LINE-1 v somatskih celicah */

==Uvod==
LINE-1 (L1) so retrotranspozoni, ki spadajo v skupino dolgih razpršenih jedrnih elementov (LINE). Pri človeku predstavljajo okoli 17 % genoma, nahajajo pa se predvsem v nekodirajočih regijah.

Celotna kopija L1 je pri človeku dolga okoli 6 kbp. Sestavlja jo dvosmerni promotor na 5' koncu neprevajajoče se regije (UTR), dva odprta bralna okvirja (ORF1 in ORF2) in poli-A rep na 3' koncu UTR. ORF1 kodira protein, ki je ključen za stabilizacijo nove kopije L1, ORF2 pa kodira proteine z endonukleazno in reverznotranskriptazno aktivnostjo, ki sta ključni za retrotranspozicijo.

'''Mehanizem retrotranspozicije LINE-1'''

Retrotranspozicija L1 poteka po mehanizmu "na tarčnem mestu začete reverzne transkripcije" (TPRT). V celičnem jedru RNA-polimeraza II katalizira transkripcijo L1 v novo kopijo L1 RNA, ki poliadenilirana zapusti jedro. V citoplazmi se s translacijo sintetizirajo ORF1 in ORF2 proteini. Na poli-A rep L1 RNA se veže protein, ki omogoči tvorbo L1 ribonukleoproteina (RNP). L1 RNP se transportira nazaj v jedro. Endonukleaza ustvari zarezo v spodnji verigi tarčne DNA, kamor se nadalje preko poli-A repa veže L1 transkript – reverzna transkriptaza L1 RNA uporabi kot matrico za podaljšanje 3' konca spodnje verige tarčne DNA. Po integraciji komplementarne verige nove kopije L1 endonukleaza ustvari zarezo v zgornji verigi tarčne DNA, reverzna transkriptaza pa podaljša 3' konec nove zareze. Sinteza DNA tako nadomesti RNA. Na koncu nastopijo encimi, ki sodelujejo v popravljalnih mehanizmih novonastale DNA.

'''Regulacija aktivnosti LINE-1'''

Aktivnost L1 retrotranspozonov nadzorujejo različni faktorji v somatskih in zarodnih celicah ter na vseh stopnjah razvoja organizma. Regulacija L1 poteka na transkripcijskem in posttranskripcijskem nivoju ter na stopnji integracije v genom.

==Regulacija LINE-1 na predimplantacijski stopnji==
Na predimplantacijski stopnji razvoja organizma je aktivnost L1 regulirana na nivoju transkripcije z metilacijo DNA, modifikacijami histonov in N6-metiladenilacijo ter na posttranskripcijski ravni prav tako z N6-metiladenilacijo in pa s kompleksom, ki usmerja eksosome v jedru (kompleks NEXT). Regulacija aktivnosti L1 na tej stopnji je do sedaj najbolj podrobno preučena na mišjih modelih.

Metilacija DNA je epigenetski mehanizem, pri katerem pride do prenosa metilne skupine na C5 pozicijo citozina, pri čemer nastane 5-metilcitozin. Prenos metilne skupine z donorja metilne skupine S-adenozil metionina (SAM) katalizirajo metiltransferaze. Metilacijo CpG DNA na predimplantacijski stopnji katalizirata metiltransferazi DNMT1 in DNMT3B. Z eksperimenti so pokazali, da izbitje teh encimov privede do smrti mišjega zarodka. V miših je najvišja stopnja metilacije dosežena na stopnji oblikovanja zigote, potem se stopnja metilacije DNA zniža in minimum doseže na stopnji osemceličnega zarodka.

Histoni regulirajo transkripcijo na podlagi modifikacij, ki na različne načine vplivajo na njihovo interakcijo z DNA. Za regulacijo aktivnosti L1 je na predimplantacijski stopnji ključna predvsem metilacija histonov, ki poteka na lizinskem ali argininskem aminokislinskem ostanku N-terminalnega repa histona. Metilacijo histonov katalizirajo metiltransferaze. Metilacijo arginina katalizira protein arginin N-metiltransferaza 5 (PRMT5). Pri metilaciji histona H3 na lizinu 9 (H3K9) sodelujejo tri metiltransferaze: SUV39H, G9a in SETDB1. Z metilacijo histonov nastanejo različni histonski markerji, ki so vključeni v represijo transkripcije L1 (H3K9me2, H3K9me3). Pri metilaciji histonov sodeluje tudi faktor za sestavljanje kromatina (CAF-1). K nastanku histonskega markerja H3K9me3 in nadalje oblikovanju heterokromatina pripomore tudi regulatorni človeški utiševalni kompleks (kompleks HUSH). Sestavljajo ga trije proteini: TASOR, MPP8 in Perifilin.

Poleg metilacije DNA in modifikacij histonov k zmanjšanju izražanja L1 in tvorbi heterokromatina v sesalcih pripomore še N6-metiladenilacija. Z eksperimenti so pokazali, da prisotnost markerja N6-metiladenina v miših vodi do inaktivacije L1.

N6-metiladenilirani pa so lahko tudi L1 RNA transkripti, kar vodi v njihovo utišanje. Pomanjkanje proteina, ki vsebuje YT521-B homologno domeno (YTHDC1), faktorja, ki vodi v utišanje s prepoznavo N6-metiladenozinske modifikacije, lahko vodi do ponovne aktivacije utišanih L1.

Do posttranskripcijske razgradnje L1 vodi tudi kompleks NEXT. Kompleks NEXT deluje kot kofaktor RNA eksosomov v nukleoplazmi in tako pripomore k eksosomski razgradnji novonastale RNA. Sestavljajo ga trije proteini, med katerimi je najpomembnejši protein, ki vsebuje CCHC domeno cinkovega prsta (ZCCHC8).

==Regulacija LINE-1 v zarodnih celicah==
Mehanizmi regulacije L1 se pri moških in ženskih zarodnih celicah razlikujejo.

Za regulacijo aktivnosti L1 v moških zarodnih celicah je ključnega pomena t.i. piRNA/Piwi regulatorna pot. piRNA (s Piwi proteini interagirajoče RNA) so majhne nekodirajoče RNA dolge med 26 in 30 nt. Kot že ime pove piRNA tvorijo komplekse s skupino proteinov imenovano Piwi. Pri ljudeh se izražajo štiri različni Piwi proteini (PIWIL1-PIWIL4), samo tri Piwi proteine pa so identificirali pri miših (Miwi, Mili in Miwi2) in pri ''Drosophila melanogaster'' (Piwi, Aub in Ago3). piRNA lahko v kompleksu s proteinom Piwi direktno interagira z L1 RNA in tvori dvoverižni hibrid, ki ga Piwi protein s svojo ribonukleazno aktivnostjo nato cepi. Poleg tega lahko kompleks piRNA-Piwi reprimira aktivnost L1 tudi preko posredovanja pri de novo metilaciji DNA ter pri modifikaciji histonov, specifično pri modifikaciji H3K9me3. Ni pa še bolj podrobno raziskano, kakšna je točna vloga piRNA-Piwi pri teh dveh procesih.

Mehanizem direktne interakcije piRNA-Piwi z L1 mRNA je bil študiran na vinskih mušicah. Ključni sta bili opažanji, da (i) Piwi in Aub tvorita komplekse s protismerno piRNA glede na L1 RNA, ki ima na 5' koncu preferenčno uracil in (ii) Ago3 tvori komplekse s smerno piRNA, ki nima enake preference na 5' koncu. Po prepisu zaporedij za piRNA vsebuje RNA transkript zapise za več različnih piRNA hkrati. Cepitev transkripta na posamezne piRNA še ni dodobra razložena. Znano je le-da imajo po cepitvi piRNA na 5' mestu preferenčno uracil. Take piRNA se vežejo na Piwi ali Aub. Ko piRNA v kompleksu po komplementarnosti prepozna L1 mRNA in se z njo poveže preko vodikovih vezi, Piwi/Aub cepi fosfodiestersko vez približno 10 nt stran od 5' konca piRNA. Rezana L1 RNA se v celici procesira s cepitvijo 3' konca in tvori smerno piRNA, ki se veže na Ago3. Mehanizem procesiranja 3' konca ni poznan. Smerna piRNA v kompleksu z Ago3 se veže na primarni piRNA transkript, ki ga Ago3 nato cepi in s tem tvori nove protismerne piRNA. S tem se cikel ponovno začne.

Regulacija L1 v ženskih zarodnih celicah se zgodi predvsem na post-transkripcijski ravni. Nekateri proteini Piwi se sicer izražajo, vendar piRNA/Piwi regulatorna pot ne deluje. Namesto tega regulacija poteka predvsem na principu interferenčne RNA in pa razgradnje L1 RNA, pri kateri sodelujejo različne ribonukleaze in pa kompleks NEXT.

==Regulacija LINE-1 med razvojem zarodka==
Med razvojem zarodka regulacija aktivnosti L1 po posameznih tkivih ni dodobra poznana. Aktivnost L1 je reprimirana preko metilacije DNA, ki jo vršijo metiltransferaze DNMT1, DNMT3A in DNMT3B. DNMT1 je odgovorna za ohranjevanje metilacijskega vzorca po celični delitvi, medtem ko DNMT3A in DNMT3B sodelujeta pri de novo metilaciji.

Aktivnost L1 je med razvojem zarodka največja v možganih, kjer je bilo zaznanih tudi največ somatskih mutacij. Znano je, da je piRNA-Piwi pot delujoča med razvojem možganov, vendar domnevno v manjšem obsegu kot pri zarodnih celicah. Aktivnost L1 je selektivno reprimirana s pomočjo MeCP2 (metil-CpG-vezavni protein). Pri regulaciji sodeluje tudi protein YY1 (Yin Yang 1), ki ima lahko vlogo aktivatorja ali represorja. YY1 je namreč nujen za začetek transkripcije L1 (aktivator), a hkrati sodeluje pri metilaciji L1 promotorja (represor). Domneva se, da je dvojna vloga YY1 regulirana bodisi s posttranslacijskimi modifikacijami proteina (acetilacija) bodisi preko interakcij z različnimi kofaktorji. Ko YY1 deluje kot represor L1, se veže na 5' UTR in posreduje pri vezavi metiltransferaz.

==Regulacija LINE-1 v somatskih celicah==

V večini somatskih celicah organizma je L1 repremiran in njegova aktivacija je po navadi povezana z različnimi patologijami (rak, nevropsihiatrične in avtoimune bolezni) ali starostnimi spremembami. Izjema je možgansko tkivo, kjer je L1 aktiven v nevronih in glijah.

L1 je v glavnem repremiran z metilacijo DNA in specifičnimi modifikacijami histona, kar zmanjša dostopnost kromatina v L1 regijah somatskega tkiva. Proteini iz družine sirtuinov so povezani z mnogimi celičnimi procesi (popravljanje DNA, uravnavanje dolžine telomer, anti-vnetni procesi ...) in ena izmed funkcij proteina SIRT6 je tudi zaviranje L1. To se dogaja preko dveh poti. V prvi pride do mono-ADP ribozilacije faktorja KAP1, kar stimulira tvorbo heterokromatina, v drugi pa prihaja do interakcije SIRT6 s transkripcijskim faktorjem MePC2, ki je vključen v proces metilacije L1 promotorske regije.

Posttranskripcijsko se L1 v somatskih celicah specifično inhibira preko RNA interference z miR-128, ki skupaj z Ago proteinom tvori RISC kompleks. Možna mehanizma sta dva; miR-128 se lahko direktno veže na ORF2 regijo L1 mRNA, lahko pa inhibira celične faktorje, ki omogočijo transport L1 RNP iz citoplazme v jedro – transportin-1 (TNPO1) in hnRNPA1. Obstaja tudi alternativen mehanizem, v katerem RISC kompleks neposredno prepozna lasnično zanko pre-miRNA v 5'UTR regiji L1 transkripta in jo prereže, kar prepreči njegovo nadaljnje zorenje. V inhibicijo L1 so vključeni tudi drugi nuklearni ribonukleoproteini (R, Q, L), a njihov mehanizem inhibicije še ni raziskan.

L1 inhibirajo protivirusni faktorji. Ti se aktivirajo ob prisotnosti virusnih nukleinskih kislin in ob prisotnosti retrotranspozonov. Študije so pokazale, da L1 mRNA sproži imunski odziv in poveča nivo interferona β. INFB inducira encim RNazo L, le-ta pa cepi RNA in posledično vodi v pomembno znižanje ORF1 in ORF2 L1 proteinov. Močan inhibitor L1 je tudi MOV10 helikaza RNA. Mehanizem te helikaze ni popolnoma znan, znano pa je, da MOV10 z drugimi protivirusnimi proteini tvori kompleks, ki v interakciji z L1 transkripti tvori stresne granule, ki se potem nadaljnje razgradijo. Protein SAMHD1 (''SAM domain and HD domain-containing protein 1'') inhibira reverzno transkripcijo L1 z vezavo na ORF2 in zmanjša izražanje ORF2 proteinov. Družina proteinov APOBEC3 je ena prvih odkritih celičnih obrambnih sistemov proti nekontroliranem širjenju L1 in je prisotna zgolj pri človeku. Dogaja se na posttranskripcijskem nivoju preko deaminacijsko odvisnega ali neodvisnega mehanizma. Za L1 najbolj aktiven encim hA3A z deaminazno aktivnostjo pretvarja citozin v uracil v prvi verigi L1 cDNA transkripta. hA3C ali hA3DE delujeta po neodvisnem mehanizmu in blokirata reverzno transkripcijo L1 z interakcijo z L1 kompleksom RNP in ORF1 v celični citoplazmi.

V zadnji fazi retrotranspozicije oz. v integraciji v genom, inhibicija poteka preko proteinov, ki s svojim delovanjem popravljajo prekinitve enojne in dvojno zvite molekule DNA. K inhibiciji L1 veliko prispevajo faktorji, ki sodelujejo v postreplikativnih modifikacijah DNA (npr. encim ATM, ki ob poškodovanju DNA aktivira različne faktorje in komplekse, kateri popravljajo DNA – deficit ATM ali njemu podobnih proteinov vodi v povišano aktivnost L1).
V regulacijo L1 so vključeni faktorji celičnega cikla. Na 5'UTR promoter L1 se lahko veže transkripcijski faktor p53. Ta povzroči inhibitorne posttranslacijske modifikacije na N-koncih aminokislinskih ostankov histona. Inhibicijsko delujeta tudi faktorja p21 in p27 (Vezava na ORF2, preprečitev integracije).

Retrotranspozicijo L1 promovira histonska demetilaza KDM4B, ki promovira demetilacijo H3K9me3 histonov, njena aktivnost pa je povečana v različnih tipih raka. Pozitivno regulacijo L1 povzroča transkripcijski faktor RUNX3 (''runt-domain transcription factor''), ki se veže na regijo 5'UTR. Omeniti je potrebno tudi transkripcijski faktor FOXA1, ki je aktiven pri raku. Delovanje FOXA1 na L1 so opazili pri celičnem staranju – večje izražanje imunskih faktorjev, ki ga ne spremlja repremija L1 - in aktivacija L1 skupaj s prisotnim vnetjem je dober pokazatelj staranja. Spreminjanje regulacije L1 je torej potencialna tarča zdravljenja s starostjo povezanih bolezni.

==Viri==
[1] Protasova, Maria Sergeevna, Tatiana Vladimirovna Andreeva, and Evgeny Ivanovich Rogaev. “Factors Regulating the Activity of LINE1 Retrotransposons.” Genes 12, no. 10 (2021): 1562. https://doi.org/10.3390/genes12101562.

[2] Wu, You, Wenqiang Liu, Jiayu Chen, Shuaitong Liu, Mingzhu Wang, Lei Yang, Chuan Chen, et al. “Nuclear Exosome Targeting Complex Core Factor ZCCHC8 Regulates the Degradation of line1 RNA in Early Embryos and Embryonic Stem Cells.” Cell Reports 29, no. 8 (2019). https://doi.org/10.1016/j.celrep.2019.10.055.

[3] Brennecke, Julius, Alexei A. Aravin, Alexander Stark, Monica Dus, Manolis Kellis, Ravi Sachidanandam, and Gregory J. Hannon. “Discrete Small RNA-Generating Loci as Master Regulators of Transposon Activity in Drosophila.” Cell 128, no. 6 (2007): 1089–1103. https://doi.org/10.1016/j.cell.2007.01.043.

[4] Verheul, Thijs C., Levi van Hijfte, Elena Perenthaler, and Tahsin Stefan Barakat. “The Why of YY1: Mechanisms of Transcriptional Regulation by Yin Yang 1.” Frontiers in Cell and Developmental Biology 8 (2020). https://doi.org/10.3389/fcell.2020.592164.

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Retrotranspozoni LINE-1 in dejavniki, ki uravnavajo njihovo delovanje

2022-04-24T10:01:39Z

GasperMozina: /* Regulacija LINE-1 v somatskih celicah */

==Uvod==
LINE-1 (L1) so retrotranspozoni, ki spadajo v skupino dolgih razpršenih jedrnih elementov (LINE). Pri človeku predstavljajo okoli 17 % genoma, nahajajo pa se predvsem v nekodirajočih regijah.

Celotna kopija L1 je pri človeku dolga okoli 6 kbp. Sestavlja jo dvosmerni promotor na 5' koncu neprevajajoče se regije (UTR), dva odprta bralna okvirja (ORF1 in ORF2) in poli-A rep na 3' koncu UTR. ORF1 kodira protein, ki je ključen za stabilizacijo nove kopije L1, ORF2 pa kodira proteine z endonukleazno in reverznotranskriptazno aktivnostjo, ki sta ključni za retrotranspozicijo.

'''Mehanizem retrotranspozicije LINE-1'''

Retrotranspozicija L1 poteka po mehanizmu "na tarčnem mestu začete reverzne transkripcije" (TPRT). V celičnem jedru RNA-polimeraza II katalizira transkripcijo L1 v novo kopijo L1 RNA, ki poliadenilirana zapusti jedro. V citoplazmi se s translacijo sintetizirajo ORF1 in ORF2 proteini. Na poli-A rep L1 RNA se veže protein, ki omogoči tvorbo L1 ribonukleoproteina (RNP). L1 RNP se transportira nazaj v jedro. Endonukleaza ustvari zarezo v spodnji verigi tarčne DNA, kamor se nadalje preko poli-A repa veže L1 transkript – reverzna transkriptaza L1 RNA uporabi kot matrico za podaljšanje 3' konca spodnje verige tarčne DNA. Po integraciji komplementarne verige nove kopije L1 endonukleaza ustvari zarezo v zgornji verigi tarčne DNA, reverzna transkriptaza pa podaljša 3' konec nove zareze. Sinteza DNA tako nadomesti RNA. Na koncu nastopijo encimi, ki sodelujejo v popravljalnih mehanizmih novonastale DNA.

'''Regulacija aktivnosti LINE-1'''

Aktivnost L1 retrotranspozonov nadzorujejo različni faktorji v somatskih in zarodnih celicah ter na vseh stopnjah razvoja organizma. Regulacija L1 poteka na transkripcijskem in posttranskripcijskem nivoju ter na stopnji integracije v genom.

==Regulacija LINE-1 na predimplantacijski stopnji==
Na predimplantacijski stopnji razvoja organizma je aktivnost L1 regulirana na nivoju transkripcije z metilacijo DNA, modifikacijami histonov in N6-metiladenilacijo ter na posttranskripcijski ravni prav tako z N6-metiladenilacijo in pa s kompleksom, ki usmerja eksosome v jedru (kompleks NEXT). Regulacija aktivnosti L1 na tej stopnji je do sedaj najbolj podrobno preučena na mišjih modelih.

Metilacija DNA je epigenetski mehanizem, pri katerem pride do prenosa metilne skupine na C5 pozicijo citozina, pri čemer nastane 5-metilcitozin. Prenos metilne skupine z donorja metilne skupine S-adenozil metionina (SAM) katalizirajo metiltransferaze. Metilacijo CpG DNA na predimplantacijski stopnji katalizirata metiltransferazi DNMT1 in DNMT3B. Z eksperimenti so pokazali, da izbitje teh encimov privede do smrti mišjega zarodka. V miših je najvišja stopnja metilacije dosežena na stopnji oblikovanja zigote, potem se stopnja metilacije DNA zniža in minimum doseže na stopnji osemceličnega zarodka.

Histoni regulirajo transkripcijo na podlagi modifikacij, ki na različne načine vplivajo na njihovo interakcijo z DNA. Za regulacijo aktivnosti L1 je na predimplantacijski stopnji ključna predvsem metilacija histonov, ki poteka na lizinskem ali argininskem aminokislinskem ostanku N-terminalnega repa histona. Metilacijo histonov katalizirajo metiltransferaze. Metilacijo arginina katalizira protein arginin N-metiltransferaza 5 (PRMT5). Pri metilaciji histona H3 na lizinu 9 (H3K9) sodelujejo tri metiltransferaze: SUV39H, G9a in SETDB1. Z metilacijo histonov nastanejo različni histonski markerji, ki so vključeni v represijo transkripcije L1 (H3K9me2, H3K9me3). Pri metilaciji histonov sodeluje tudi faktor za sestavljanje kromatina (CAF-1). K nastanku histonskega markerja H3K9me3 in nadalje oblikovanju heterokromatina pripomore tudi regulatorni človeški utiševalni kompleks (kompleks HUSH). Sestavljajo ga trije proteini: TASOR, MPP8 in Perifilin.

Poleg metilacije DNA in modifikacij histonov k zmanjšanju izražanja L1 in tvorbi heterokromatina v sesalcih pripomore še N6-metiladenilacija. Z eksperimenti so pokazali, da prisotnost markerja N6-metiladenina v miših vodi do inaktivacije L1.

N6-metiladenilirani pa so lahko tudi L1 RNA transkripti, kar vodi v njihovo utišanje. Pomanjkanje proteina, ki vsebuje YT521-B homologno domeno (YTHDC1), faktorja, ki vodi v utišanje s prepoznavo N6-metiladenozinske modifikacije, lahko vodi do ponovne aktivacije utišanih L1.

Do posttranskripcijske razgradnje L1 vodi tudi kompleks NEXT. Kompleks NEXT deluje kot kofaktor RNA eksosomov v nukleoplazmi in tako pripomore k eksosomski razgradnji novonastale RNA. Sestavljajo ga trije proteini, med katerimi je najpomembnejši protein, ki vsebuje CCHC domeno cinkovega prsta (ZCCHC8).

==Regulacija LINE-1 v zarodnih celicah==
Mehanizmi regulacije L1 se pri moških in ženskih zarodnih celicah razlikujejo.

Za regulacijo aktivnosti L1 v moških zarodnih celicah je ključnega pomena t.i. piRNA/Piwi regulatorna pot. piRNA (s Piwi proteini interagirajoče RNA) so majhne nekodirajoče RNA dolge med 26 in 30 nt. Kot že ime pove piRNA tvorijo komplekse s skupino proteinov imenovano Piwi. Pri ljudeh se izražajo štiri različni Piwi proteini (PIWIL1-PIWIL4), samo tri Piwi proteine pa so identificirali pri miših (Miwi, Mili in Miwi2) in pri ''Drosophila melanogaster'' (Piwi, Aub in Ago3). piRNA lahko v kompleksu s proteinom Piwi direktno interagira z L1 RNA in tvori dvoverižni hibrid, ki ga Piwi protein s svojo ribonukleazno aktivnostjo nato cepi. Poleg tega lahko kompleks piRNA-Piwi reprimira aktivnost L1 tudi preko posredovanja pri de novo metilaciji DNA ter pri modifikaciji histonov, specifično pri modifikaciji H3K9me3. Ni pa še bolj podrobno raziskano, kakšna je točna vloga piRNA-Piwi pri teh dveh procesih.

Mehanizem direktne interakcije piRNA-Piwi z L1 mRNA je bil študiran na vinskih mušicah. Ključni sta bili opažanji, da (i) Piwi in Aub tvorita komplekse s protismerno piRNA glede na L1 RNA, ki ima na 5' koncu preferenčno uracil in (ii) Ago3 tvori komplekse s smerno piRNA, ki nima enake preference na 5' koncu. Po prepisu zaporedij za piRNA vsebuje RNA transkript zapise za več različnih piRNA hkrati. Cepitev transkripta na posamezne piRNA še ni dodobra razložena. Znano je le-da imajo po cepitvi piRNA na 5' mestu preferenčno uracil. Take piRNA se vežejo na Piwi ali Aub. Ko piRNA v kompleksu po komplementarnosti prepozna L1 mRNA in se z njo poveže preko vodikovih vezi, Piwi/Aub cepi fosfodiestersko vez približno 10 nt stran od 5' konca piRNA. Rezana L1 RNA se v celici procesira s cepitvijo 3' konca in tvori smerno piRNA, ki se veže na Ago3. Mehanizem procesiranja 3' konca ni poznan. Smerna piRNA v kompleksu z Ago3 se veže na primarni piRNA transkript, ki ga Ago3 nato cepi in s tem tvori nove protismerne piRNA. S tem se cikel ponovno začne.

Regulacija L1 v ženskih zarodnih celicah se zgodi predvsem na post-transkripcijski ravni. Nekateri proteini Piwi se sicer izražajo, vendar piRNA/Piwi regulatorna pot ne deluje. Namesto tega regulacija poteka predvsem na principu interferenčne RNA in pa razgradnje L1 RNA, pri kateri sodelujejo različne ribonukleaze in pa kompleks NEXT.

==Regulacija LINE-1 med razvojem zarodka==
Med razvojem zarodka regulacija aktivnosti L1 po posameznih tkivih ni dodobra poznana. Aktivnost L1 je reprimirana preko metilacije DNA, ki jo vršijo metiltransferaze DNMT1, DNMT3A in DNMT3B. DNMT1 je odgovorna za ohranjevanje metilacijskega vzorca po celični delitvi, medtem ko DNMT3A in DNMT3B sodelujeta pri de novo metilaciji.

Aktivnost L1 je med razvojem zarodka največja v možganih, kjer je bilo zaznanih tudi največ somatskih mutacij. Znano je, da je piRNA-Piwi pot delujoča med razvojem možganov, vendar domnevno v manjšem obsegu kot pri zarodnih celicah. Aktivnost L1 je selektivno reprimirana s pomočjo MeCP2 (metil-CpG-vezavni protein). Pri regulaciji sodeluje tudi protein YY1 (Yin Yang 1), ki ima lahko vlogo aktivatorja ali represorja. YY1 je namreč nujen za začetek transkripcije L1 (aktivator), a hkrati sodeluje pri metilaciji L1 promotorja (represor). Domneva se, da je dvojna vloga YY1 regulirana bodisi s posttranslacijskimi modifikacijami proteina (acetilacija) bodisi preko interakcij z različnimi kofaktorji. Ko YY1 deluje kot represor L1, se veže na 5' UTR in posreduje pri vezavi metiltransferaz.

==Regulacija LINE-1 v somatskih celicah==

V večini somatskih celicah organizma je L1 repremiran in njegova aktivacija je po navadi povezana z različnimi patologijami (rak, nevropsihiatrične in avtoimune bolezni) ali starostnimi spremembami. Izjema je možgansko tkivo, kjer je L1 aktiven v nevronih in glijah.

L1 je v glavnem repremiran z metilacijo DNA in specifičnimi modifikacijami histona, kar zmanjša dostopnost kromatina v L1 regijah somatskega tkiva. Proteini iz družine sirtuinov so povezani z mnogimi celičnimi procesi (popravljanje DNA, uravnavanje dolžine telomer, anti-vnetni procesi ...) in ena izmed funkcij proteina SIRT6 je tudi zaviranje L1. To se dogaja preko dveh poti. V prvi pride do mono-ADP ribozilacije faktorja KAP1, kar stimulira tvorbo heterokromatina, v drugi pa prihaja do interakcije SIRT6 s transkripcijskim faktorjem MePC2, ki je vključen v proces metilacije L1 promotorske regije.

Posttranskripcijsko se L1 v somatskih celicah specifično inhibira preko RNA interference z miR-128, ki skupaj z Ago proteinom tvori RISC kompleks. Možna mehanizma sta dva; miR-128 se lahko direktno veže na ORF2 regijo L1 mRNA, lahko pa inhibira celične faktorje, ki omogočijo transport L1 RNP iz citoplazme v jedro – transportin-1 (TNPO1) in hnRNPA1. Obstaja tudi alternativen mehanizem, v katerem RISC kompleks neposredno prepozna lasnično zanko pre-miRNA v 5'UTR regiji L1 transkripta in jo prereže, kar prepreči njegovo nadaljnje zorenje. V inhibicijo L1 so vključeni tudi drugi nuklearni ribonukleoproteini (R, Q, L), a njihov mehanizem inhibicije še ni raziskan.

L1 inhibirajo protivirusni faktorji. Ti se aktivirajo ob prisotnosti virusnih nukleinskih kislin in ob prisotnosti retrotranspozonov. Študije so pokazale, da L1 mRNA sproži imunski odziv in poveča nivo interferona β. INFB inducira encim RNazo L, le-ta pa cepi RNA in posledično vodi v pomembno znižanje ORF1 in ORF2 L1 proteinov. Močan inhibitor L1 je tudi MOV10 helikaza RNA. Mehanizem te helikaze ni popolnoma znan, znano pa je, da MOV10 z drugimi protivirusnimi proteini tvori kompleks, ki v interakciji z L1 transkripti tvori stresne granule, ki se potem nadaljnje razgradijo. Protein SAMHD1 (''SAM domain and HD domain-containing protein 1'') inhibira reverzno transkripcijo L1 z vezavo na ORF2 in zmanjša izražanje ORF2 proteinov. Družina proteinov APOBEC3 je ena prvih odkritih celičnih obrambnih sistemov proti nekontroliranem širjenju L1 in je prisotna zgolj pri človeku. Dogaja se na posttranskripcijskem nivoju preko deaminacijsko odvisnega ali neodvisnega mehanizma. Za L1 najbolj aktiven encim hA3A z deaminazno aktivnostjo pretvarja citozin v uracil v prvi verigi L1 cDNA transkripta. hA3C ali hA3DE delujeta po neodvisnem mehanizmu in blokirata reverzno transkripcijo L1 z interakcijo z L1 kompleksom RNP in ORF1 v celični citoplazmi.

V zadnji fazi retrotranspozicije oz. v integraciji v genom, inhibicija poteka preko proteinov, ki s svojim delovanjem popravljajo prekinitve enojne in dvojno zvite molekule DNA. K inhibiciji L1 veliko prispevajo faktorji, ki sodelujejo v postreplikativnih modifikacijah DNA (npr. encim ATM, ki ob poškodovanju DNA aktivira različne faktorje in komplekse, kateri popravljajo DNA – deficit ATM ali njemu podobnih proteinov vodi v povišano aktivnost L1).
V regulacijo L1 so vključeni faktorji celičnega cikla. Na 5'UTR promoter L1 se lahko veže transkripcijski faktor p53. Ta povzroči inhibitorne posttranslacijske modifikacije na N-koncih aminokislinskih ostankov histona. Inhibicijsko delujeta tudi faktorja p21 in p27 (Vezava na ORF2, preprečitev integracije).

Retrotranspozicijo L1 promovira histonska demetilaza KDM4B, ki promovira deametilacijo H3K9me3 histonov, njena aktivnost pa je povečana v različnih tipih raka. Pozitivno regulacijo L1 povzroča transkripcijski faktor RUNX3 (''runt-domain transcription factor''), ki se veže na regijo 5'UTR. Omeniti je potrebno tudi transkripcijski faktor FOXA1, ki je aktiven pri raku. Delovanje FOXA1 na L1 so opazili pri celičnem staranju – večje izražanje imunskih faktorjev, ki ga ne spremlja repremija L1 - in aktivacija L1 skupaj s prisotnim vnetjem je dober pokazatelj staranja. Spreminjanje regulacije L1 je torej potencialna tarča zdravljenja s starostjo povezanih bolezni.

==Viri==
[1] Protasova, Maria Sergeevna, Tatiana Vladimirovna Andreeva, and Evgeny Ivanovich Rogaev. “Factors Regulating the Activity of LINE1 Retrotransposons.” Genes 12, no. 10 (2021): 1562. https://doi.org/10.3390/genes12101562.

[2] Wu, You, Wenqiang Liu, Jiayu Chen, Shuaitong Liu, Mingzhu Wang, Lei Yang, Chuan Chen, et al. “Nuclear Exosome Targeting Complex Core Factor ZCCHC8 Regulates the Degradation of line1 RNA in Early Embryos and Embryonic Stem Cells.” Cell Reports 29, no. 8 (2019). https://doi.org/10.1016/j.celrep.2019.10.055.

[3] Brennecke, Julius, Alexei A. Aravin, Alexander Stark, Monica Dus, Manolis Kellis, Ravi Sachidanandam, and Gregory J. Hannon. “Discrete Small RNA-Generating Loci as Master Regulators of Transposon Activity in Drosophila.” Cell 128, no. 6 (2007): 1089–1103. https://doi.org/10.1016/j.cell.2007.01.043.

[4] Verheul, Thijs C., Levi van Hijfte, Elena Perenthaler, and Tahsin Stefan Barakat. “The Why of YY1: Mechanisms of Transcriptional Regulation by Yin Yang 1.” Frontiers in Cell and Developmental Biology 8 (2020). https://doi.org/10.3389/fcell.2020.592164.

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Retrotranspozoni LINE-1 in dejavniki, ki uravnavajo njihovo delovanje

2022-04-24T09:58:36Z

GasperMozina: /* Regulacija LINE-1 v somatskih celicah */

==Uvod==
LINE-1 (L1) so retrotranspozoni, ki spadajo v skupino dolgih razpršenih jedrnih elementov (LINE). Pri človeku predstavljajo okoli 17 % genoma, nahajajo pa se predvsem v nekodirajočih regijah.

Celotna kopija L1 je pri človeku dolga okoli 6 kbp. Sestavlja jo dvosmerni promotor na 5' koncu neprevajajoče se regije (UTR), dva odprta bralna okvirja (ORF1 in ORF2) in poli-A rep na 3' koncu UTR. ORF1 kodira protein, ki je ključen za stabilizacijo nove kopije L1, ORF2 pa kodira proteine z endonukleazno in reverznotranskriptazno aktivnostjo, ki sta ključni za retrotranspozicijo.

'''Mehanizem retrotranspozicije LINE-1'''

Retrotranspozicija L1 poteka po mehanizmu "na tarčnem mestu začete reverzne transkripcije" (TPRT). V celičnem jedru RNA-polimeraza II katalizira transkripcijo L1 v novo kopijo L1 RNA, ki poliadenilirana zapusti jedro. V citoplazmi se s translacijo sintetizirajo ORF1 in ORF2 proteini. Na poli-A rep L1 RNA se veže protein, ki omogoči tvorbo L1 ribonukleoproteina (RNP). L1 RNP se transportira nazaj v jedro. Endonukleaza ustvari zarezo v spodnji verigi tarčne DNA, kamor se nadalje preko poli-A repa veže L1 transkript – reverzna transkriptaza L1 RNA uporabi kot matrico za podaljšanje 3' konca spodnje verige tarčne DNA. Po integraciji komplementarne verige nove kopije L1 endonukleaza ustvari zarezo v zgornji verigi tarčne DNA, reverzna transkriptaza pa podaljša 3' konec nove zareze. Sinteza DNA tako nadomesti RNA. Na koncu nastopijo encimi, ki sodelujejo v popravljalnih mehanizmih novonastale DNA.

'''Regulacija aktivnosti LINE-1'''

Aktivnost L1 retrotranspozonov nadzorujejo različni faktorji v somatskih in zarodnih celicah ter na vseh stopnjah razvoja organizma. Regulacija L1 poteka na transkripcijskem in posttranskripcijskem nivoju ter na stopnji integracije v genom.

==Regulacija LINE-1 na predimplantacijski stopnji==
Na predimplantacijski stopnji razvoja organizma je aktivnost L1 regulirana na nivoju transkripcije z metilacijo DNA, modifikacijami histonov in N6-metiladenilacijo ter na posttranskripcijski ravni prav tako z N6-metiladenilacijo in pa s kompleksom, ki usmerja eksosome v jedru (kompleks NEXT). Regulacija aktivnosti L1 na tej stopnji je do sedaj najbolj podrobno preučena na mišjih modelih.

Metilacija DNA je epigenetski mehanizem, pri katerem pride do prenosa metilne skupine na C5 pozicijo citozina, pri čemer nastane 5-metilcitozin. Prenos metilne skupine z donorja metilne skupine S-adenozil metionina (SAM) katalizirajo metiltransferaze. Metilacijo CpG DNA na predimplantacijski stopnji katalizirata metiltransferazi DNMT1 in DNMT3B. Z eksperimenti so pokazali, da izbitje teh encimov privede do smrti mišjega zarodka. V miših je najvišja stopnja metilacije dosežena na stopnji oblikovanja zigote, potem se stopnja metilacije DNA zniža in minimum doseže na stopnji osemceličnega zarodka.

Histoni regulirajo transkripcijo na podlagi modifikacij, ki na različne načine vplivajo na njihovo interakcijo z DNA. Za regulacijo aktivnosti L1 je na predimplantacijski stopnji ključna predvsem metilacija histonov, ki poteka na lizinskem ali argininskem aminokislinskem ostanku N-terminalnega repa histona. Metilacijo histonov katalizirajo metiltransferaze. Metilacijo arginina katalizira protein arginin N-metiltransferaza 5 (PRMT5). Pri metilaciji histona H3 na lizinu 9 (H3K9) sodelujejo tri metiltransferaze: SUV39H, G9a in SETDB1. Z metilacijo histonov nastanejo različni histonski markerji, ki so vključeni v represijo transkripcije L1 (H3K9me2, H3K9me3). Pri metilaciji histonov sodeluje tudi faktor za sestavljanje kromatina (CAF-1). K nastanku histonskega markerja H3K9me3 in nadalje oblikovanju heterokromatina pripomore tudi regulatorni človeški utiševalni kompleks (kompleks HUSH). Sestavljajo ga trije proteini: TASOR, MPP8 in Perifilin.

Poleg metilacije DNA in modifikacij histonov k zmanjšanju izražanja L1 in tvorbi heterokromatina v sesalcih pripomore še N6-metiladenilacija. Z eksperimenti so pokazali, da prisotnost markerja N6-metiladenina v miših vodi do inaktivacije L1.

N6-metiladenilirani pa so lahko tudi L1 RNA transkripti, kar vodi v njihovo utišanje. Pomanjkanje proteina, ki vsebuje YT521-B homologno domeno (YTHDC1), faktorja, ki vodi v utišanje s prepoznavo N6-metiladenozinske modifikacije, lahko vodi do ponovne aktivacije utišanih L1.

Do posttranskripcijske razgradnje L1 vodi tudi kompleks NEXT. Kompleks NEXT deluje kot kofaktor RNA eksosomov v nukleoplazmi in tako pripomore k eksosomski razgradnji novonastale RNA. Sestavljajo ga trije proteini, med katerimi je najpomembnejši protein, ki vsebuje CCHC domeno cinkovega prsta (ZCCHC8).

==Regulacija LINE-1 v zarodnih celicah==
Mehanizmi regulacije L1 se pri moških in ženskih zarodnih celicah razlikujejo.

Za regulacijo aktivnosti L1 v moških zarodnih celicah je ključnega pomena t.i. piRNA/Piwi regulatorna pot. piRNA (s Piwi proteini interagirajoče RNA) so majhne nekodirajoče RNA dolge med 26 in 30 nt. Kot že ime pove piRNA tvorijo komplekse s skupino proteinov imenovano Piwi. Pri ljudeh se izražajo štiri različni Piwi proteini (PIWIL1-PIWIL4), samo tri Piwi proteine pa so identificirali pri miših (Miwi, Mili in Miwi2) in pri ''Drosophila melanogaster'' (Piwi, Aub in Ago3). piRNA lahko v kompleksu s proteinom Piwi direktno interagira z L1 RNA in tvori dvoverižni hibrid, ki ga Piwi protein s svojo ribonukleazno aktivnostjo nato cepi. Poleg tega lahko kompleks piRNA-Piwi reprimira aktivnost L1 tudi preko posredovanja pri de novo metilaciji DNA ter pri modifikaciji histonov, specifično pri modifikaciji H3K9me3. Ni pa še bolj podrobno raziskano, kakšna je točna vloga piRNA-Piwi pri teh dveh procesih.

Mehanizem direktne interakcije piRNA-Piwi z L1 mRNA je bil študiran na vinskih mušicah. Ključni sta bili opažanji, da (i) Piwi in Aub tvorita komplekse s protismerno piRNA glede na L1 RNA, ki ima na 5' koncu preferenčno uracil in (ii) Ago3 tvori komplekse s smerno piRNA, ki nima enake preference na 5' koncu. Po prepisu zaporedij za piRNA vsebuje RNA transkript zapise za več različnih piRNA hkrati. Cepitev transkripta na posamezne piRNA še ni dodobra razložena. Znano je le-da imajo po cepitvi piRNA na 5' mestu preferenčno uracil. Take piRNA se vežejo na Piwi ali Aub. Ko piRNA v kompleksu po komplementarnosti prepozna L1 mRNA in se z njo poveže preko vodikovih vezi, Piwi/Aub cepi fosfodiestersko vez približno 10 nt stran od 5' konca piRNA. Rezana L1 RNA se v celici procesira s cepitvijo 3' konca in tvori smerno piRNA, ki se veže na Ago3. Mehanizem procesiranja 3' konca ni poznan. Smerna piRNA v kompleksu z Ago3 se veže na primarni piRNA transkript, ki ga Ago3 nato cepi in s tem tvori nove protismerne piRNA. S tem se cikel ponovno začne.

Regulacija L1 v ženskih zarodnih celicah se zgodi predvsem na post-transkripcijski ravni. Nekateri proteini Piwi se sicer izražajo, vendar piRNA/Piwi regulatorna pot ne deluje. Namesto tega regulacija poteka predvsem na principu interferenčne RNA in pa razgradnje L1 RNA, pri kateri sodelujejo različne ribonukleaze in pa kompleks NEXT.

==Regulacija LINE-1 med razvojem zarodka==
Med razvojem zarodka regulacija aktivnosti L1 po posameznih tkivih ni dodobra poznana. Aktivnost L1 je reprimirana preko metilacije DNA, ki jo vršijo metiltransferaze DNMT1, DNMT3A in DNMT3B. DNMT1 je odgovorna za ohranjevanje metilacijskega vzorca po celični delitvi, medtem ko DNMT3A in DNMT3B sodelujeta pri de novo metilaciji.

Aktivnost L1 je med razvojem zarodka največja v možganih, kjer je bilo zaznanih tudi največ somatskih mutacij. Znano je, da je piRNA-Piwi pot delujoča med razvojem možganov, vendar domnevno v manjšem obsegu kot pri zarodnih celicah. Aktivnost L1 je selektivno reprimirana s pomočjo MeCP2 (metil-CpG-vezavni protein). Pri regulaciji sodeluje tudi protein YY1 (Yin Yang 1), ki ima lahko vlogo aktivatorja ali represorja. YY1 je namreč nujen za začetek transkripcije L1 (aktivator), a hkrati sodeluje pri metilaciji L1 promotorja (represor). Domneva se, da je dvojna vloga YY1 regulirana bodisi s posttranslacijskimi modifikacijami proteina (acetilacija) bodisi preko interakcij z različnimi kofaktorji. Ko YY1 deluje kot represor L1, se veže na 5' UTR in posreduje pri vezavi metiltransferaz.

==Regulacija LINE-1 v somatskih celicah==

V večini somatskih celicah organizma je L1 repremiran in njegova aktivacija je po navadi povezana z različnimi patologijami (rak, nevropsihiatrične in avtoimune bolezni) ali starostnimi spremembami. Izjema je možgansko tkivo, kjer je L1 aktiven v nevronih in glijah.

L1 je v glavnem repremiran z metilacijo DNA in specifičnimi modifikacijami histona, kar zmanjša dostopnost kromatina v L1 regijah somatskega tkiva. Proteini iz družine sirtuinov so povezani z mnogimi celičnimi procesi (popravljanje DNA, uravnavanje dolžine telomer, anti-vnetni procesi ...) in ena izmed funkcij proteina SIRT6 je tudi zaviranje L1. To se dogaja preko dveh poti. V prvi pride do mono-ADP ribozilacije faktorja KAP1, kar stimulira tvorbo heterokromatina, v drugi pa prihaja do interakcije SIRT6 s transkripcijskim faktorjem MePC2, ki je vključen v proces metilacije L1 promotorske regije.

Posttranskripcijsko se L1 v somatskih celicah specifično inhibira preko RNA interference z miR-128, ki skupaj z Ago proteinom tvori RISC kompleks. Možna mehanizma sta dva; miR-128 se lahko direktno veže na ORF2 regijo L1 mRNA, lahko pa inhibira celične faktorje, ki omogočijo transport L1 RNP iz citoplazme v jedro – transportin-1 (TNPO1) in hnRNPA1. Obstaja tudi alternativen mehanizem, v katerem RISC kompleks neposredno prepozna lasnično zanko pre-miRNA v 5'UTR regiji L1 transkripta in jo prereže, kar prepreči njegovo nadaljnje zorenje. V inhibicijo L1 so vključeni tudi drugi nuklearni ribonukleoproteini (R, Q, L), a njihov mehanizem inhibicije še ni raziskan.

L1 inhibirajo protivirusni faktorji. Ti se aktivirajo ob prisotnosti virusnih nukleinskih kislin in ob prisotnosti retrotranspozonov. Študije so pokazale, da L1 mRNA sproži imunski odziv in poveča nivo interferona β. INFB inducira encim RNazo L, le-ta pa cepi RNA in posledično vodi v pomembno znižanje ORF1 in ORF2 L1 proteinov. Močan inhibitor L1 je tudi MOV10 helikaza RNA. Mehanizem te helikaze ni popolnoma znan, znano pa je, da MOV10 z drugimi protivirusnimi proteini tvori kompleks, ki v interakciji z L1 transkripti tvori stresne granule, ki se potem nadaljnje razgradijo. Protein SAMHD1 (SAM domain and HD domain-containing protein 1) inhibira reverzno transkripcijo L1 z vezavo na ORF2 in zmanjša izražanje ORF2 proteinov. Družina proteinov APOBEC3 je ena prvih odkritih celičnih obrambnih sistemov proti nekontroliranem širjenju L1 in je prisotna zgolj pri človeku. Dogaja se na post-transkripcijskem nivoju preko deaminacijsko odvisnega ali neodvisnega mehanizma. Za L1 najbolj aktiven encim hA3A z deaminazno aktivnostjo pretvarja citozin v uracil v prvi verigi L1 cDNA transkripta. hA3C ali hA3DE delujeta po neodvisnem mehanizmu in blokirata reverzno transkripcijo L1 z interakcijo z L1 kompleksom RNP in ORF1 v celični citoplazmi.

V zadnji fazi retrotranspozicije oz. v integraciji v genom, inhibicija poteka preko proteinov, ki s svojim delovanjem popravljajo prekinitve enojne in dvojno zvite molekule DNA. K inhibiciji L1 veliko prispevajo faktorji, ki sodelujejo v postreplikativnih modifikacijah DNA (npr. encim ATM, ki ob poškodovanju DNA aktivira različne faktorje in komplekse, kateri popravljajo DNA – deficit ATM ali njemu podobnih proteinov vodi v povišano aktivnost L1).
V regulacijo L1 so vključeni faktorji celičnega cikla. Na 5'UTR promoter L1 se lahko veže transkripcijski faktor p53. Ta povzroči inhibitorne posttranslacijske modifikacije na N-koncih aminokislinskih ostankov histona. Inhibicijsko delujeta tudi faktorja p21 in p27 (Vezava na ORF2, preprečitev integracije).

Retrotranspozicijo L1 promovira histonska demetilaza KDM4B, ki promovira deametilacijo H3K9me3 histonov, njena aktivnost pa je povečana v različnih tipih raka. Pozitivno regulacijo L1 povzroča transkripcijski faktor RUNX3 (runt-domain transcription factor), ki se veže na regijo 5'UTR. Omeniti je potrebno tudi transkripcijski faktor FOXA1, ki je aktiven pri raku. Delovanje FOXA1 na L1 so opazili pri celičnem staranju – večje izražanje imunskih faktorjev, ki ga ne spremlja repremija L1 - in aktivacija L1 skupaj s prisotnim vnetjem je dober pokazatelj staranja. Spreminjanje regulacije L1 je torej potencialna tarča zdravljenja s starostjo povezanih bolezni.

==Viri==
[1] Protasova, Maria Sergeevna, Tatiana Vladimirovna Andreeva, and Evgeny Ivanovich Rogaev. “Factors Regulating the Activity of LINE1 Retrotransposons.” Genes 12, no. 10 (2021): 1562. https://doi.org/10.3390/genes12101562.

[2] Wu, You, Wenqiang Liu, Jiayu Chen, Shuaitong Liu, Mingzhu Wang, Lei Yang, Chuan Chen, et al. “Nuclear Exosome Targeting Complex Core Factor ZCCHC8 Regulates the Degradation of line1 RNA in Early Embryos and Embryonic Stem Cells.” Cell Reports 29, no. 8 (2019). https://doi.org/10.1016/j.celrep.2019.10.055.

[3] Brennecke, Julius, Alexei A. Aravin, Alexander Stark, Monica Dus, Manolis Kellis, Ravi Sachidanandam, and Gregory J. Hannon. “Discrete Small RNA-Generating Loci as Master Regulators of Transposon Activity in Drosophila.” Cell 128, no. 6 (2007): 1089–1103. https://doi.org/10.1016/j.cell.2007.01.043.

[4] Verheul, Thijs C., Levi van Hijfte, Elena Perenthaler, and Tahsin Stefan Barakat. “The Why of YY1: Mechanisms of Transcriptional Regulation by Yin Yang 1.” Frontiers in Cell and Developmental Biology 8 (2020). https://doi.org/10.3389/fcell.2020.592164.

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Retrotranspozoni LINE-1 in dejavniki, ki uravnavajo njihovo delovanje

2022-04-24T09:56:30Z

GasperMozina: /* Regulacija LINE-1 v somatskih celicah */

==Uvod==
LINE-1 (L1) so retrotranspozoni, ki spadajo v skupino dolgih razpršenih jedrnih elementov (LINE). Pri človeku predstavljajo okoli 17 % genoma, nahajajo pa se predvsem v nekodirajočih regijah.

Celotna kopija L1 je pri človeku dolga okoli 6 kbp. Sestavlja jo dvosmerni promotor na 5' koncu neprevajajoče se regije (UTR), dva odprta bralna okvirja (ORF1 in ORF2) in poli-A rep na 3' koncu UTR. ORF1 kodira protein, ki je ključen za stabilizacijo nove kopije L1, ORF2 pa kodira proteine z endonukleazno in reverznotranskriptazno aktivnostjo, ki sta ključni za retrotranspozicijo.

'''Mehanizem retrotranspozicije LINE-1'''

Retrotranspozicija L1 poteka po mehanizmu "na tarčnem mestu začete reverzne transkripcije" (TPRT). V celičnem jedru RNA-polimeraza II katalizira transkripcijo L1 v novo kopijo L1 RNA, ki poliadenilirana zapusti jedro. V citoplazmi se s translacijo sintetizirajo ORF1 in ORF2 proteini. Na poli-A rep L1 RNA se veže protein, ki omogoči tvorbo L1 ribonukleoproteina (RNP). L1 RNP se transportira nazaj v jedro. Endonukleaza ustvari zarezo v spodnji verigi tarčne DNA, kamor se nadalje preko poli-A repa veže L1 transkript – reverzna transkriptaza L1 RNA uporabi kot matrico za podaljšanje 3' konca spodnje verige tarčne DNA. Po integraciji komplementarne verige nove kopije L1 endonukleaza ustvari zarezo v zgornji verigi tarčne DNA, reverzna transkriptaza pa podaljša 3' konec nove zareze. Sinteza DNA tako nadomesti RNA. Na koncu nastopijo encimi, ki sodelujejo v popravljalnih mehanizmih novonastale DNA.

'''Regulacija aktivnosti LINE-1'''

Aktivnost L1 retrotranspozonov nadzorujejo različni faktorji v somatskih in zarodnih celicah ter na vseh stopnjah razvoja organizma. Regulacija L1 poteka na transkripcijskem in posttranskripcijskem nivoju ter na stopnji integracije v genom.

==Regulacija LINE-1 na predimplantacijski stopnji==
Na predimplantacijski stopnji razvoja organizma je aktivnost L1 regulirana na nivoju transkripcije z metilacijo DNA, modifikacijami histonov in N6-metiladenilacijo ter na posttranskripcijski ravni prav tako z N6-metiladenilacijo in pa s kompleksom, ki usmerja eksosome v jedru (kompleks NEXT). Regulacija aktivnosti L1 na tej stopnji je do sedaj najbolj podrobno preučena na mišjih modelih.

Metilacija DNA je epigenetski mehanizem, pri katerem pride do prenosa metilne skupine na C5 pozicijo citozina, pri čemer nastane 5-metilcitozin. Prenos metilne skupine z donorja metilne skupine S-adenozil metionina (SAM) katalizirajo metiltransferaze. Metilacijo CpG DNA na predimplantacijski stopnji katalizirata metiltransferazi DNMT1 in DNMT3B. Z eksperimenti so pokazali, da izbitje teh encimov privede do smrti mišjega zarodka. V miših je najvišja stopnja metilacije dosežena na stopnji oblikovanja zigote, potem se stopnja metilacije DNA zniža in minimum doseže na stopnji osemceličnega zarodka.

Histoni regulirajo transkripcijo na podlagi modifikacij, ki na različne načine vplivajo na njihovo interakcijo z DNA. Za regulacijo aktivnosti L1 je na predimplantacijski stopnji ključna predvsem metilacija histonov, ki poteka na lizinskem ali argininskem aminokislinskem ostanku N-terminalnega repa histona. Metilacijo histonov katalizirajo metiltransferaze. Metilacijo arginina katalizira protein arginin N-metiltransferaza 5 (PRMT5). Pri metilaciji histona H3 na lizinu 9 (H3K9) sodelujejo tri metiltransferaze: SUV39H, G9a in SETDB1. Z metilacijo histonov nastanejo različni histonski markerji, ki so vključeni v represijo transkripcije L1 (H3K9me2, H3K9me3). Pri metilaciji histonov sodeluje tudi faktor za sestavljanje kromatina (CAF-1). K nastanku histonskega markerja H3K9me3 in nadalje oblikovanju heterokromatina pripomore tudi regulatorni človeški utiševalni kompleks (kompleks HUSH). Sestavljajo ga trije proteini: TASOR, MPP8 in Perifilin.

Poleg metilacije DNA in modifikacij histonov k zmanjšanju izražanja L1 in tvorbi heterokromatina v sesalcih pripomore še N6-metiladenilacija. Z eksperimenti so pokazali, da prisotnost markerja N6-metiladenina v miših vodi do inaktivacije L1.

N6-metiladenilirani pa so lahko tudi L1 RNA transkripti, kar vodi v njihovo utišanje. Pomanjkanje proteina, ki vsebuje YT521-B homologno domeno (YTHDC1), faktorja, ki vodi v utišanje s prepoznavo N6-metiladenozinske modifikacije, lahko vodi do ponovne aktivacije utišanih L1.

Do posttranskripcijske razgradnje L1 vodi tudi kompleks NEXT. Kompleks NEXT deluje kot kofaktor RNA eksosomov v nukleoplazmi in tako pripomore k eksosomski razgradnji novonastale RNA. Sestavljajo ga trije proteini, med katerimi je najpomembnejši protein, ki vsebuje CCHC domeno cinkovega prsta (ZCCHC8).

==Regulacija LINE-1 v zarodnih celicah==
Mehanizmi regulacije L1 se pri moških in ženskih zarodnih celicah razlikujejo.

Za regulacijo aktivnosti L1 v moških zarodnih celicah je ključnega pomena t.i. piRNA/Piwi regulatorna pot. piRNA (s Piwi proteini interagirajoče RNA) so majhne nekodirajoče RNA dolge med 26 in 30 nt. Kot že ime pove piRNA tvorijo komplekse s skupino proteinov imenovano Piwi. Pri ljudeh se izražajo štiri različni Piwi proteini (PIWIL1-PIWIL4), samo tri Piwi proteine pa so identificirali pri miših (Miwi, Mili in Miwi2) in pri ''Drosophila melanogaster'' (Piwi, Aub in Ago3). piRNA lahko v kompleksu s proteinom Piwi direktno interagira z L1 RNA in tvori dvoverižni hibrid, ki ga Piwi protein s svojo ribonukleazno aktivnostjo nato cepi. Poleg tega lahko kompleks piRNA-Piwi reprimira aktivnost L1 tudi preko posredovanja pri de novo metilaciji DNA ter pri modifikaciji histonov, specifično pri modifikaciji H3K9me3. Ni pa še bolj podrobno raziskano, kakšna je točna vloga piRNA-Piwi pri teh dveh procesih.

Mehanizem direktne interakcije piRNA-Piwi z L1 mRNA je bil študiran na vinskih mušicah. Ključni sta bili opažanji, da (i) Piwi in Aub tvorita komplekse s protismerno piRNA glede na L1 RNA, ki ima na 5' koncu preferenčno uracil in (ii) Ago3 tvori komplekse s smerno piRNA, ki nima enake preference na 5' koncu. Po prepisu zaporedij za piRNA vsebuje RNA transkript zapise za več različnih piRNA hkrati. Cepitev transkripta na posamezne piRNA še ni dodobra razložena. Znano je le-da imajo po cepitvi piRNA na 5' mestu preferenčno uracil. Take piRNA se vežejo na Piwi ali Aub. Ko piRNA v kompleksu po komplementarnosti prepozna L1 mRNA in se z njo poveže preko vodikovih vezi, Piwi/Aub cepi fosfodiestersko vez približno 10 nt stran od 5' konca piRNA. Rezana L1 RNA se v celici procesira s cepitvijo 3' konca in tvori smerno piRNA, ki se veže na Ago3. Mehanizem procesiranja 3' konca ni poznan. Smerna piRNA v kompleksu z Ago3 se veže na primarni piRNA transkript, ki ga Ago3 nato cepi in s tem tvori nove protismerne piRNA. S tem se cikel ponovno začne.

Regulacija L1 v ženskih zarodnih celicah se zgodi predvsem na post-transkripcijski ravni. Nekateri proteini Piwi se sicer izražajo, vendar piRNA/Piwi regulatorna pot ne deluje. Namesto tega regulacija poteka predvsem na principu interferenčne RNA in pa razgradnje L1 RNA, pri kateri sodelujejo različne ribonukleaze in pa kompleks NEXT.

==Regulacija LINE-1 med razvojem zarodka==
Med razvojem zarodka regulacija aktivnosti L1 po posameznih tkivih ni dodobra poznana. Aktivnost L1 je reprimirana preko metilacije DNA, ki jo vršijo metiltransferaze DNMT1, DNMT3A in DNMT3B. DNMT1 je odgovorna za ohranjevanje metilacijskega vzorca po celični delitvi, medtem ko DNMT3A in DNMT3B sodelujeta pri de novo metilaciji.

Aktivnost L1 je med razvojem zarodka največja v možganih, kjer je bilo zaznanih tudi največ somatskih mutacij. Znano je, da je piRNA-Piwi pot delujoča med razvojem možganov, vendar domnevno v manjšem obsegu kot pri zarodnih celicah. Aktivnost L1 je selektivno reprimirana s pomočjo MeCP2 (metil-CpG-vezavni protein). Pri regulaciji sodeluje tudi protein YY1 (Yin Yang 1), ki ima lahko vlogo aktivatorja ali represorja. YY1 je namreč nujen za začetek transkripcije L1 (aktivator), a hkrati sodeluje pri metilaciji L1 promotorja (represor). Domneva se, da je dvojna vloga YY1 regulirana bodisi s posttranslacijskimi modifikacijami proteina (acetilacija) bodisi preko interakcij z različnimi kofaktorji. Ko YY1 deluje kot represor L1, se veže na 5' UTR in posreduje pri vezavi metiltransferaz.

==Regulacija LINE-1 v somatskih celicah==

V večini somatskih celicah organizma je L1 repremiran in njegova aktivacija je po navadi povezana z različnimi patologijami (rak, nevropsihiatrične in avtoimune bolezni) ali starostnimi spremembami. Izjema je možgansko tkivo, kjer je L1 aktiven v nevronih in glijah.

L1 je v glavnem repremiran z metilacijo DNA in specifičnimi modifikacijami histona, kar zmanjša dostopnost kromatina v L1 regijah somatskega tkiva. Proteini iz družine sirtuinov so povezani z mnogimi celičnimi procesi (popravljanje DNA, uravnavanje dolžine telomer, anti-vnetni procesi ...) in ena izmed funkcij proteina SIRT6 je tudi zaviranje L1. To se dogaja preko dveh poti. V prvi pride do mono-ADP ribozilacije faktorja KAP1, kar stimulira tvorbo heterokromatina, v drugi pa pride do interakcije SIRT6 s transkripcijskim faktorjem MePC2, ki je vključen v proces metilacije L1 promotorske regije.

Posttranskripcijsko se L1 v somatskih celicah specifično inhibira preko RNA interference z miR-128, ki skupaj z Ago proteinom tvori RISC kompleks. Možna mehanizma sta dva; miR-128 se lahko direktno veže na ORF2 regijo L1 mRNA, lahko pa inhibira celične faktorje, ki omogočijo transport L1 RNP iz citoplazme v jedro – transportin-1 (TNPO1) in hnRNPA1. Obstaja tudi alternativen mehanizem, v katerem RISC kompleks neposredno prepozna lasnično zanko pre-miRNA v 5'UTR regiji L1 transkripta in jo prereže, kar prepreči njegovo nadaljnje zorenje. V inhibicijo L1 so vključeni tudi drugi nuklearni ribonukleoproteini (R, Q, L), a njihov mehanizem inhibicije še ni raziskan.

L1 inhibirajo protivirusni faktorji. Ti se aktivirajo ob prisotnosti virusnih nukleinskih kislin in ob prisotnosti retrotranspozonov. Študije so pokazale, da L1 mRNA sproži imunski odziv in poveča nivo interferona β. INFB inducira encim RNazo L, le-ta pa cepi RNA in posledično vodi v pomembno znižanje ORF1 in ORF2 L1 proteinov. Močan inhibitor L1 je tudi MOV10 helikaza RNA. Mehanizem te helikaze ni popolnoma znan, znano pa je, da MOV10 z drugimi protivirusnimi proteini tvori kompleks, ki v interakciji z L1 transkripti tvori stresne granule, ki se potem nadaljnje razgradijo. Protein SAMHD1 (SAM domain and HD domain-containing protein 1) inhibira reverzno transkripcijo L1 z vezavo na ORF2 in zmanjša izražanje ORF2 proteinov. Družina proteinov APOBEC3 je ena prvih odkritih celičnih obrambnih sistemov proti nekontroliranem širjenju L1 in je prisotna zgolj pri človeku. Dogaja se na post-transkripcijskem nivoju preko deaminacijsko odvisnega ali neodvisnega mehanizma. Za L1 najbolj aktiven encim hA3A z deaminazno aktivnostjo pretvarja citozin v uracil v prvi verigi L1 cDNA transkripta. hA3C ali hA3DE delujeta po neodvisnem mehanizmu in blokirata reverzno transkripcijo L1 z interakcijo z L1 kompleksom RNP in ORF1 v celični citoplazmi.

V zadnji fazi retrotranspozicije oz. v integraciji v genom, inhibicija poteka preko proteinov, ki s svojim delovanjem popravljajo prekinitve enojne in dvojno zvite molekule DNA. K inhibiciji L1 veliko prispevajo faktorji, ki sodelujejo v postreplikativnih modifikacijah DNA (npr. encim ATM, ki ob poškodovanju DNA aktivira različne faktorje in komplekse, kateri popravljajo DNA – deficit ATM ali njemu podobnih proteinov vodi v povišano aktivnost L1).
V regulacijo L1 so vključeni faktorji celičnega cikla. Na 5'UTR promoter L1 se lahko veže transkripcijski faktor p53. Ta povzroči inhibitorne posttranslacijske modifikacije na N-koncih aminokislinskih ostankov histona. Inhibicijsko delujeta tudi faktorja p21 in p27 (Vezava na ORF2, preprečitev integracije).

Retrotranspozicijo L1 promovira histonska demetilaza KDM4B, ki promovira deametilacijo H3K9me3 histonov, njena aktivnost pa je povečana v različnih tipih raka. Pozitivno regulacijo L1 povzroča transkripcijski faktor RUNX3 (runt-domain transcription factor), ki se veže na regijo 5'UTR. Omeniti je potrebno tudi transkripcijski faktor FOXA1, ki je aktiven pri raku. Delovanje FOXA1 na L1 so opazili pri celičnem staranju – večje izražanje imunskih faktorjev, ki ga ne spremlja repremija L1 - in aktivacija L1 skupaj s prisotnim vnetjem je dober pokazatelj staranja. Spreminjanje regulacije L1 je torej potencialna tarča zdravljenja s starostjo povezanih bolezni.

==Viri==
[1] Protasova, Maria Sergeevna, Tatiana Vladimirovna Andreeva, and Evgeny Ivanovich Rogaev. “Factors Regulating the Activity of LINE1 Retrotransposons.” Genes 12, no. 10 (2021): 1562. https://doi.org/10.3390/genes12101562.

[2] Wu, You, Wenqiang Liu, Jiayu Chen, Shuaitong Liu, Mingzhu Wang, Lei Yang, Chuan Chen, et al. “Nuclear Exosome Targeting Complex Core Factor ZCCHC8 Regulates the Degradation of line1 RNA in Early Embryos and Embryonic Stem Cells.” Cell Reports 29, no. 8 (2019). https://doi.org/10.1016/j.celrep.2019.10.055.

[3] Brennecke, Julius, Alexei A. Aravin, Alexander Stark, Monica Dus, Manolis Kellis, Ravi Sachidanandam, and Gregory J. Hannon. “Discrete Small RNA-Generating Loci as Master Regulators of Transposon Activity in Drosophila.” Cell 128, no. 6 (2007): 1089–1103. https://doi.org/10.1016/j.cell.2007.01.043.

[4] Verheul, Thijs C., Levi van Hijfte, Elena Perenthaler, and Tahsin Stefan Barakat. “The Why of YY1: Mechanisms of Transcriptional Regulation by Yin Yang 1.” Frontiers in Cell and Developmental Biology 8 (2020). https://doi.org/10.3389/fcell.2020.592164.

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Retrotranspozoni LINE-1 in dejavniki, ki uravnavajo njihovo delovanje

2022-04-24T09:55:07Z

GasperMozina:

==Uvod==
LINE-1 (L1) so retrotranspozoni, ki spadajo v skupino dolgih razpršenih jedrnih elementov (LINE). Pri človeku predstavljajo okoli 17 % genoma, nahajajo pa se predvsem v nekodirajočih regijah.

Celotna kopija L1 je pri človeku dolga okoli 6 kbp. Sestavlja jo dvosmerni promotor na 5' koncu neprevajajoče se regije (UTR), dva odprta bralna okvirja (ORF1 in ORF2) in poli-A rep na 3' koncu UTR. ORF1 kodira protein, ki je ključen za stabilizacijo nove kopije L1, ORF2 pa kodira proteine z endonukleazno in reverznotranskriptazno aktivnostjo, ki sta ključni za retrotranspozicijo.

'''Mehanizem retrotranspozicije LINE-1'''

Retrotranspozicija L1 poteka po mehanizmu "na tarčnem mestu začete reverzne transkripcije" (TPRT). V celičnem jedru RNA-polimeraza II katalizira transkripcijo L1 v novo kopijo L1 RNA, ki poliadenilirana zapusti jedro. V citoplazmi se s translacijo sintetizirajo ORF1 in ORF2 proteini. Na poli-A rep L1 RNA se veže protein, ki omogoči tvorbo L1 ribonukleoproteina (RNP). L1 RNP se transportira nazaj v jedro. Endonukleaza ustvari zarezo v spodnji verigi tarčne DNA, kamor se nadalje preko poli-A repa veže L1 transkript – reverzna transkriptaza L1 RNA uporabi kot matrico za podaljšanje 3' konca spodnje verige tarčne DNA. Po integraciji komplementarne verige nove kopije L1 endonukleaza ustvari zarezo v zgornji verigi tarčne DNA, reverzna transkriptaza pa podaljša 3' konec nove zareze. Sinteza DNA tako nadomesti RNA. Na koncu nastopijo encimi, ki sodelujejo v popravljalnih mehanizmih novonastale DNA.

'''Regulacija aktivnosti LINE-1'''

Aktivnost L1 retrotranspozonov nadzorujejo različni faktorji v somatskih in zarodnih celicah ter na vseh stopnjah razvoja organizma. Regulacija L1 poteka na transkripcijskem in posttranskripcijskem nivoju ter na stopnji integracije v genom.

==Regulacija LINE-1 na predimplantacijski stopnji==
Na predimplantacijski stopnji razvoja organizma je aktivnost L1 regulirana na nivoju transkripcije z metilacijo DNA, modifikacijami histonov in N6-metiladenilacijo ter na posttranskripcijski ravni prav tako z N6-metiladenilacijo in pa s kompleksom, ki usmerja eksosome v jedru (kompleks NEXT). Regulacija aktivnosti L1 na tej stopnji je do sedaj najbolj podrobno preučena na mišjih modelih.

Metilacija DNA je epigenetski mehanizem, pri katerem pride do prenosa metilne skupine na C5 pozicijo citozina, pri čemer nastane 5-metilcitozin. Prenos metilne skupine z donorja metilne skupine S-adenozil metionina (SAM) katalizirajo metiltransferaze. Metilacijo CpG DNA na predimplantacijski stopnji katalizirata metiltransferazi DNMT1 in DNMT3B. Z eksperimenti so pokazali, da izbitje teh encimov privede do smrti mišjega zarodka. V miših je najvišja stopnja metilacije dosežena na stopnji oblikovanja zigote, potem se stopnja metilacije DNA zniža in minimum doseže na stopnji osemceličnega zarodka.

Histoni regulirajo transkripcijo na podlagi modifikacij, ki na različne načine vplivajo na njihovo interakcijo z DNA. Za regulacijo aktivnosti L1 je na predimplantacijski stopnji ključna predvsem metilacija histonov, ki poteka na lizinskem ali argininskem aminokislinskem ostanku N-terminalnega repa histona. Metilacijo histonov katalizirajo metiltransferaze. Metilacijo arginina katalizira protein arginin N-metiltransferaza 5 (PRMT5). Pri metilaciji histona H3 na lizinu 9 (H3K9) sodelujejo tri metiltransferaze: SUV39H, G9a in SETDB1. Z metilacijo histonov nastanejo različni histonski markerji, ki so vključeni v represijo transkripcije L1 (H3K9me2, H3K9me3). Pri metilaciji histonov sodeluje tudi faktor za sestavljanje kromatina (CAF-1). K nastanku histonskega markerja H3K9me3 in nadalje oblikovanju heterokromatina pripomore tudi regulatorni človeški utiševalni kompleks (kompleks HUSH). Sestavljajo ga trije proteini: TASOR, MPP8 in Perifilin.

Poleg metilacije DNA in modifikacij histonov k zmanjšanju izražanja L1 in tvorbi heterokromatina v sesalcih pripomore še N6-metiladenilacija. Z eksperimenti so pokazali, da prisotnost markerja N6-metiladenina v miših vodi do inaktivacije L1.

N6-metiladenilirani pa so lahko tudi L1 RNA transkripti, kar vodi v njihovo utišanje. Pomanjkanje proteina, ki vsebuje YT521-B homologno domeno (YTHDC1), faktorja, ki vodi v utišanje s prepoznavo N6-metiladenozinske modifikacije, lahko vodi do ponovne aktivacije utišanih L1.

Do posttranskripcijske razgradnje L1 vodi tudi kompleks NEXT. Kompleks NEXT deluje kot kofaktor RNA eksosomov v nukleoplazmi in tako pripomore k eksosomski razgradnji novonastale RNA. Sestavljajo ga trije proteini, med katerimi je najpomembnejši protein, ki vsebuje CCHC domeno cinkovega prsta (ZCCHC8).

==Regulacija LINE-1 v zarodnih celicah==
Mehanizmi regulacije L1 se pri moških in ženskih zarodnih celicah razlikujejo.

Za regulacijo aktivnosti L1 v moških zarodnih celicah je ključnega pomena t.i. piRNA/Piwi regulatorna pot. piRNA (s Piwi proteini interagirajoče RNA) so majhne nekodirajoče RNA dolge med 26 in 30 nt. Kot že ime pove piRNA tvorijo komplekse s skupino proteinov imenovano Piwi. Pri ljudeh se izražajo štiri različni Piwi proteini (PIWIL1-PIWIL4), samo tri Piwi proteine pa so identificirali pri miših (Miwi, Mili in Miwi2) in pri ''Drosophila melanogaster'' (Piwi, Aub in Ago3). piRNA lahko v kompleksu s proteinom Piwi direktno interagira z L1 RNA in tvori dvoverižni hibrid, ki ga Piwi protein s svojo ribonukleazno aktivnostjo nato cepi. Poleg tega lahko kompleks piRNA-Piwi reprimira aktivnost L1 tudi preko posredovanja pri de novo metilaciji DNA ter pri modifikaciji histonov, specifično pri modifikaciji H3K9me3. Ni pa še bolj podrobno raziskano, kakšna je točna vloga piRNA-Piwi pri teh dveh procesih.

Mehanizem direktne interakcije piRNA-Piwi z L1 mRNA je bil študiran na vinskih mušicah. Ključni sta bili opažanji, da (i) Piwi in Aub tvorita komplekse s protismerno piRNA glede na L1 RNA, ki ima na 5' koncu preferenčno uracil in (ii) Ago3 tvori komplekse s smerno piRNA, ki nima enake preference na 5' koncu. Po prepisu zaporedij za piRNA vsebuje RNA transkript zapise za več različnih piRNA hkrati. Cepitev transkripta na posamezne piRNA še ni dodobra razložena. Znano je le-da imajo po cepitvi piRNA na 5' mestu preferenčno uracil. Take piRNA se vežejo na Piwi ali Aub. Ko piRNA v kompleksu po komplementarnosti prepozna L1 mRNA in se z njo poveže preko vodikovih vezi, Piwi/Aub cepi fosfodiestersko vez približno 10 nt stran od 5' konca piRNA. Rezana L1 RNA se v celici procesira s cepitvijo 3' konca in tvori smerno piRNA, ki se veže na Ago3. Mehanizem procesiranja 3' konca ni poznan. Smerna piRNA v kompleksu z Ago3 se veže na primarni piRNA transkript, ki ga Ago3 nato cepi in s tem tvori nove protismerne piRNA. S tem se cikel ponovno začne.

Regulacija L1 v ženskih zarodnih celicah se zgodi predvsem na post-transkripcijski ravni. Nekateri proteini Piwi se sicer izražajo, vendar piRNA/Piwi regulatorna pot ne deluje. Namesto tega regulacija poteka predvsem na principu interferenčne RNA in pa razgradnje L1 RNA, pri kateri sodelujejo različne ribonukleaze in pa kompleks NEXT.

==Regulacija LINE-1 med razvojem zarodka==
Med razvojem zarodka regulacija aktivnosti L1 po posameznih tkivih ni dodobra poznana. Aktivnost L1 je reprimirana preko metilacije DNA, ki jo vršijo metiltransferaze DNMT1, DNMT3A in DNMT3B. DNMT1 je odgovorna za ohranjevanje metilacijskega vzorca po celični delitvi, medtem ko DNMT3A in DNMT3B sodelujeta pri de novo metilaciji.

Aktivnost L1 je med razvojem zarodka največja v možganih, kjer je bilo zaznanih tudi največ somatskih mutacij. Znano je, da je piRNA-Piwi pot delujoča med razvojem možganov, vendar domnevno v manjšem obsegu kot pri zarodnih celicah. Aktivnost L1 je selektivno reprimirana s pomočjo MeCP2 (metil-CpG-vezavni protein). Pri regulaciji sodeluje tudi protein YY1 (Yin Yang 1), ki ima lahko vlogo aktivatorja ali represorja. YY1 je namreč nujen za začetek transkripcije L1 (aktivator), a hkrati sodeluje pri metilaciji L1 promotorja (represor). Domneva se, da je dvojna vloga YY1 regulirana bodisi s posttranslacijskimi modifikacijami proteina (acetilacija) bodisi preko interakcij z različnimi kofaktorji. Ko YY1 deluje kot represor L1, se veže na 5' UTR in posreduje pri vezavi metiltransferaz.

==Regulacija LINE-1 v somatskih celicah==

V večini somatskih celicah organizma je L1 repremiran in njegova aktivacija je po navadi povezana z različnimi patologijami (rak, nevropsihiatrične in avtoimune bolezni) ali starostnimi spremembami. Izjema je možgansko tkivo, kjer je L1 aktiven v nevronih in glijah.

L1 je v glavnem repremiran z metilacijo DNA in specifičnimi modifikacijami histona, kar zmanjša dostopnost kromatina v L1 regijah somatskega tkiva. Proteini iz družine sirtuinov so povezani z mnogimi celičnimi procesi (popravljanje DNA, uravnavanje dolžine telomer, anti-vnetni procesi ..) in ena izmed funkcij proteina SIRT6 je tudi zaviranje L1. To se dogaja preko dveh poti. V prvi pride do mono-ADP ribozilacije faktorja KAP1, kar stimulira tvorbo heterokromatina, v drugi pa pride do interakcije SIRT6 s transkripcijskim faktorjem MePC2, ki je vključen v proces metilacije L1 promotorske regije.

Posttranskripcijsko se L1 v somatskih celicah specifično inhibira preko RNA interference z miR-128, ki skupaj z Ago proteinom tvori RISC kompleks. Možna mehanizma sta dva; miR-128 se lahko direktno veže na ORF2 regijo L1 mRNA, lahko pa inhibira celične faktorje, ki omogočijo transport L1 RNP iz citoplazme v jedro – transportin-1 (TNPO1) in hnRNPA1. Obstaja tudi alternativen mehanizem, v katerem RISC kompleks neposredno prepozna lasnično zanko pre-miRNA v 5'UTR regiji L1 transkripta in jo prereže, kar prepreči njegovo nadaljnje zorenje. V inhibicijo L1 so vključeni tudi drugi nuklearni ribonukleoproteini (R, Q, L), a njihov mehanizem inhibicije še ni raziskan.

L1 inhibirajo protivirusni faktorji. Ti se aktivirajo ob prisotnosti virusnih nukleinskih kislin in ob prisotnosti retrotranspozonov. Študije so pokazale, da L1 mRNA sproži imunski odziv in poveča nivo interferona β. INFB inducira encim RNazo L, le-ta pa cepi RNA in posledično vodi v pomembno znižanje ORF1 in ORF2 L1 proteinov. Močan inhibitor L1 je tudi MOV10 helikaza RNA. Mehanizem te helikaze ni popolnoma znan, znano pa je, da MOV10 z drugimi protivirusnimi proteini tvori kompleks, ki v interakciji z L1 transkripti tvori stresne granule, ki se potem nadaljnje razgradijo. Protein SAMHD1 (SAM domain and HD domain-containing protein 1) inhibira reverzno transkripcijo L1 z vezavo na ORF2 in zmanjša izražanje ORF2 proteinov. Družina proteinov APOBEC3 je ena prvih odkritih celičnih obrambnih sistemov proti nekontroliranem širjenju L1 in je prisotna zgolj pri človeku. Dogaja se na post-transkripcijskem nivoju preko deaminacijsko odvisnega ali neodvisnega mehanizma. Za L1 najbolj aktiven encim hA3A z deaminazno aktivnostjo pretvarja citozin v uracil v prvi verigi L1 cDNA transkripta. hA3C ali hA3DE delujeta po neodvisnem mehanizmu in blokirata reverzno transkripcijo L1 z interakcijo z L1 kompleksom RNP in ORF1 v celični citoplazmi.

V zadnji fazi retrotranspozicije oz. v integraciji v genom, inhibicija poteka preko proteinov, ki s svojim delovanjem popravljajo prekinitve enojne in dvojno zvite molekule DNA. K inhibiciji L1 veliko prispevajo faktorji, ki sodelujejo v postreplikativnih modifikacijah DNA (npr. encim ATM, ki ob poškodovanju DNA aktivira različne faktorje in komplekse, kateri popravljajo DNA – deficit ATM ali njemu podobnih proteinov vodi v povišano aktivnost L1).
V regulacijo L1 so vključeni faktorji celičnega cikla. Na 5'UTR promoter L1 se lahko veže transkripcijski faktor p53. Ta povzroči inhibitorne posttranslacijske modifikacije na N-koncih aminokislinskih ostankov histona. Inhibicijsko delujeta tudi faktorja p21 in p27 (Vezava na ORF2, preprečitev integracije).

Retrotranspozicijo L1 promovira histonska demetilaza KDM4B, ki promovira deametilacijo H3K9me3 histonov, njena aktivnost pa je povečana v različnih tipih raka. Pozitivno regulacijo L1 povzroča transkripcijski faktor RUNX3 (runt-domain transcription factor), ki se veže na regijo 5'UTR. Omeniti je potrebno tudi transkripcijski faktor FOXA1, ki je aktiven pri raku. Delovanje FOXA1 na L1 so opazili pri celičnem staranju – večje izražanje imunskih faktorjev, ki ga ne spremlja repremija L1 - in aktivacija L1 skupaj s prisotnim vnetjem je dober pokazatelj staranja. Spreminjanje regulacije L1 je torej potencialna tarča zdravljenja s starostjo povezanih bolezni.

==Viri==
[1] Protasova, Maria Sergeevna, Tatiana Vladimirovna Andreeva, and Evgeny Ivanovich Rogaev. “Factors Regulating the Activity of LINE1 Retrotransposons.” Genes 12, no. 10 (2021): 1562. https://doi.org/10.3390/genes12101562.

[2] Wu, You, Wenqiang Liu, Jiayu Chen, Shuaitong Liu, Mingzhu Wang, Lei Yang, Chuan Chen, et al. “Nuclear Exosome Targeting Complex Core Factor ZCCHC8 Regulates the Degradation of line1 RNA in Early Embryos and Embryonic Stem Cells.” Cell Reports 29, no. 8 (2019). https://doi.org/10.1016/j.celrep.2019.10.055.

[3] Brennecke, Julius, Alexei A. Aravin, Alexander Stark, Monica Dus, Manolis Kellis, Ravi Sachidanandam, and Gregory J. Hannon. “Discrete Small RNA-Generating Loci as Master Regulators of Transposon Activity in Drosophila.” Cell 128, no. 6 (2007): 1089–1103. https://doi.org/10.1016/j.cell.2007.01.043.

[4] Verheul, Thijs C., Levi van Hijfte, Elena Perenthaler, and Tahsin Stefan Barakat. “The Why of YY1: Mechanisms of Transcriptional Regulation by Yin Yang 1.” Frontiers in Cell and Developmental Biology 8 (2020). https://doi.org/10.3389/fcell.2020.592164.

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]