Wiki FKKT - User contributions [en]

Preoblikovanje genskega skupka za fiksacijo dušika bakterije Klebsiella oxytoca

2018-12-10T19:12:10Z

GasperVirant: /* Popolnoma preoblikovan genski skupek */

Povzeto po raziskovalnem članku: Refactoring the nitrogen fixation gene cluster from ''Klebsiella oxytoca'' [1]

== Težave pri uporabi naravnih genskih zapisov ==

Veliko funkcij, zanimivih za biotehnološko uporabo, je pogosto zapisanih v genskih skupkih. Velikost genskih skupkov je zelo različna, nekateri vsebujejo le nekaj genov, spet drugi nekaj sto genov. Pri prokariontih so lahko geni organizirani v obliki operonov, kar pomeni, da je več genov skupaj pod kontrolo enega promotorja. V primeru bakterije Klebsiella oxytoca je genski skupek za fiksacijo dušika sestavljen iz 20 genov, organiziranih v 7 operonov, s skupno dolžino 23,5 kb DNA. Pogosto želimo DNA zapis za določeno lastnost prenesti iz organizma, ki ga je težko gojiti pod laboratorijskimi pogoji, v drugega, vendar je lahko že sama dolžina zapisa omejujoč dejavnik. Precejšnjo težavo predstavlja tudi gostiteljeva regulacija, ki nadzoruje transkripcijsko aktivnost genov preko različnih povratnih zank, pogosto zelo zapletenih in vpetih v širšo mrežo interakcij. Lokusi ostanejo transkripcijsko neodzivni dokler določen kemijski ali fizični signal ne inducira njihovega prepisovanja. Pogosto je opazna presežnost, kar pomeni, da en regulatorni signal lahko kontrolira transkripcijo več operonov, in obratno, en operon je lahko posredno odziven na več različnih signalov. Dodatno se geni lahko med seboj prekrivajo, DNA zapisi imajo lahko več funkcij, pa tudi translacija je lahko regulirana preko malih RNA. Omenjene ovire imajo za posledico, da veliko genskih skupkov ostane kriptičnih, kar pomeni, da laboratorijski pogoji za njihovo aktivnost ostanejo neznanka [1], [2], [3].

== Spreminjanje nativnega zapisa genskih skupkov ==

=== Pristop od zgoraj navzdol ===

Pri spreminjanju genskih skupkov od zgoraj navzdol je pogost pristop manipulacija naravno prisotne regulacije ali dodajanje sintetičnih regulacij v sicer naravni genski zapis. Izbijanje represorja ali povišana ekspresija aktivatorja privede do povečane količine produkta določene biosintetične poti. V kolikor genski skupek sestoji le iz enega operona, vstavitev sintetičnega promotorja pred skupek poveča ekspresijo. Analogno se poveča ekspresija, če vsak gen posebej postavimo pod kontrolo sintetičnega promotorja [1], [4].

=== Pristop od spodaj navzgor ===

Pri pristopu od spodaj navzgor gre za grajenje genskega skupka izključno z uporabo sintetičnih DNA regij, ki so načrtane tako, da eliminirajo vso naravno prisotno regulacijo.

V prvem koraku se s pomočjo računalniških programov pregleda celoten naravni zapis genskega skupka. Sledi odstranitev vse nekodirajoče DNA, neesencialnih genov in zapisov za regulatorje. V naslednjem koraku se gene, ki jim je bila določena pomembna vloga pri končni lastnosti skupka, ponovno prepiše, in sicer uporabi se kodone, ki so čim bolj različni tistim v naravnem zapisu. S tem se ohrani aminokislinsko zaporedje, spremeni pa se zaporedje nukleotidov. Namen tega koraka je uvedba mutacij, ki odstranijo ves morebiten notranji nadzor, kot so spregledani oz. še ne okarakterizirani operatorji, promotorji, sekundarne mRNA strukture, metilacijska mesta, regulacije kodonov in pavzirajoča mesta. Pavzirajoča mesta ležijo za poli(A) repom in so terminatorski signal za RNA polimerazo (II), ki je sicer prisotna v sesalskih celicah, vendar je sorodna RNA polimerazi pri bakterijah [1], [5]. Rekodirana zaporedja se ponovno pregleda z računalniškim programom in v kolikor obstaja še kakšna regija, ki bi imelo regulatorno funkcijo, je le-ta odstranjena. Rekodirane gene se organizira v umetne operone. Posamezni geni v operonu so med seboj ločeni z vmesniki, vsakemu izmed njih pa je dodano tudi sintetično vezavno mesto za ribosom (RBS). Na začetek vsakega operona pa je postavljen sintetični promotor, ki regulira njegovo prepisovanje. Končni rezultat je preoblikovan genski skupek, organiziran v serijo diskretnih, dobro okarakteriziranih genetskih delov z odstranjeno naravno prisotno regulacijo. Sintetična regulacija omogoča kontrolo nad dinamiko in pogoji pod katerimi se skupek izraža [1].

== Genski skupek za fiksacijo dušika ==

Fiksacija dušika je pretvorba dvoatomarnega dušika (N2) iz atmosfere v amonijak (NH3). Mikroorganizmi fiksirajo dušik s pomočjo encima nitrogenaza. Slednji sestoji iz dveh podenot: iz heterotetramernega MoFe proteina (katalizira redukcijo dušika) in homodimernega Fe proteina (donor elektronov za redukcijo dušika). Naravno prisoten zapis za nitrogenazo v K. oxytoca zajema 23,5 kb DNA in kodira 20 proteinov (gradnike obeh podenot nitrogenaze, encime za biosintezo metaloskupkov, šaperone, elektronske transporterje in regulatorje) [6].

== Toleranca nativnega genskega skupka na spremebe v izražanju posameznih genov ==

Pred preoblikovanjem skupka je potrebno preveriti kako povečano izražanje posameznega gena ali več genov skupaj vpliva na končno funkcijo nitrogenaze. Vsak gen ima namreč svoj optimum izražanja, kar pomeni, da preveliko oz. premajhno izražanje negativno vpliva na biološko funkcijo celotnega genskega skupka. V ta namen se iz naravnega zapisa sistematično izbija posamezne gene, katere je nato potrebno zapisati na ločen plazmid, postaviti pod nadzor inducibilnega promotorja (npr. Ptac) in izvesti komplementacijo. Optimum se določi z merjenjem nitrogenazne aktivnosti glede na aktivnost inducibilnega promotorja. Na primer, izmerjeno je bilo, da morajo biti geni, ki kontrolirajo transport elektronov (nifJ in nifF), dokaj nizko izraženi, saj povečano izražanje negativno vpliva na funkcijo nitrogenze. V nasprotju mora biti operon (nifBQ), ki zapisuje za proteine pomembne pri sintezi FeMo jedra in integraciji molibdena, izražen 10-krat močneje kot pa operon (nifUSVWZM), ki zapisuje za proteine pomembne pri tvorbi Fe-S jedra. Gene s podobno stopnjo izražanja se poveže v operon in postavi pod nadzor sintetičnega regulatorja. Pri procesu komplementacije se odkrije tudi negativne regulatorje izražanja in se jih nato izbriše (v dotičnem primeru: nifLA, nifX in nifT) [1], [7].

== Popolnoma preoblikovan genski skupek ==

Posamezen preoblikovan operon so postavili pod nadzor IPTG-inducibilnega promotorja Ptac in izmerili stopnjo izražanja glede na nitrogenazno aktivnost. Preden so operone združili v genski skupek, so jim zamenjali Ptac s T7 promotorji. Moč promotorja vsakega operona so prilagodili glede na prej izmerjeno optimalno stopnjo izražanja pod kontrolo Ptac. Kot referenco so vzeli nfiHDK operon, ki je v K. oxytoca močno izražen (produkt gena nifHDK predstavlja 10% vseh celičnih proteinov). Postavili so ga pod močan T7 promotor divjega tipa. Ostale operone so postavili pod oslabljene T7 promotorje, glede na relativno izražanje proti nifHDK operonu. Manjši kot je optimum izražanja določenega operona, pod bolj oslabljen T7 promotor so ga postavili. Vsak posamezen operon pod kontrolo T7* RNAP je dosegel podobno vrednost izražanja kot pod kontrolo Ptac [1].

Preoblikovan genski skupek za fiksacijo dušika so vgradili na en plazmid, na drug plazmid pa so vgradili krmilnik, ki nadzoruje transkripcijsko aktivnost opisanega genskega skupka.
Krmilnik sestoji iz senzorja in vezja. Senzor je v dotičnem primeru promotor Ptac, ki se inducibilno izraža glede na prisotnost IPTG-ja. Vezje pa predstavlja zapis za mutirano T7 RNA polimerazo (T7* RNAP). Torej ob prisotnosti IPTG-ja, promotor Ptac sproži prepisovanje gena za T7* RNAP, T7 RNAP pa nato začne s prepisovanjem celotnega genskega skupka za fiksacijo dušika [1].

S plazmidom, ki je nosil zapis za preoblikovan genski skupek in plazmidom z zapisom za krmilnik so transformirali sev K. oxytoca, kateremu je bil predhodno izbit naravni zapis za fiksacijo dušika (K. oxytoca nif KO). Sintetični genski skupek za fiksacijo dušika je dosegel 7,4% +/- 2,4% aktivnosti nitrogenaze v primerjavi z divjim tipom. Transformirani sevi so izrabljali N2 iz ozračja kot vir dušika, vendar so rastli 3,5-krat počasneje kot divji tip sevov [1].

Končni preoblikovan genski skupek za fiksacijo dušika, vključno s krmilnikom, je vseboval 89 genetskih delov. Funkcija vsakega dela je natančno definirana in okarakterizirana. Kot pričakovano je nitrogenazna aktivnost sintetičnega skupka nižja od naravno prisotnega, saj gre za spreminjanje evolucijsko zelo ohranjenega sistema [1].

== Menjava krmilnikov za spremembo regulacije ==

Ločba krmilnika in preoblikovanega genskega skupka omogoča enostavno spremembo reguliranja sistema. V kolikor zamenjamo senzor na krmilniku, je le ta odziven na drug signal. Senzor odziven na IPTG (v dotičnem primeru je to promotor Ptac) so zamenjali s Tc-inducibilnim promotorjem Ptet. Ob prisotnosti ustreznega signala je ne glede na izbiro senzorja nastala enka količina NH3 relativno glede na WT sistem (7,2 % +/- 1,7 %). Ustvarili so tudi senzor, ki je bil občutljiv na IPTG in Tc hkrati, kar v praksi pomeni, da so pred zapis za T7* RNAP vstavili tako Ptac kot tudi Ptet. V tem primeru je bila ob prisotnosti le IPTG-ja količina proizvedenega NH3 nekoliko nižja glede na naravno prisoten zapis, in sicer 6,6 % +/- 1,7 %. Načrtovanje krmilnikov tako predstavlja enostaven način regulacije celotnega sistema [1].

Pri naravnem zapisu za fiksacijo dušika v K. oxytoca je amonijak negativni regulator delovaja nitrogenaze. V prisotnosti 17,5 mM amoniaka v gojišču, je aktivnost fiksacije dušika inhibirana. V nasprotju je bila pri preoblikovanem genskem skupku aktivnost nitrogenaze 1,1 % +/- 0,5 %. Aktivnost je nekoliko nižja, vendar ne zaradi inhibicije encima, temveč zaradi znižanja aktivnosti krmilnika za 4,5-krat. V kolikor bi bil krmilnik bolj robusten, naj bi bila aktivnost nitrogenaze nespremenjena [1].

== Prednosti preoblikovanja genskih skupkov ==

Namen preoblikovanja naravnega zapisa je olajšati nadaljnje delo z večgenskimi sistemi, ki imajo po navadi zelo kompleksno genetiko. Ti sistemi so se razvili skozi evolucijo in so pogosto močno regulirani. Regulacija je presežna in vpeta v širšo mrežo interakcij, kar pomeni, da en signal lahko regulira več biokemijskih mehanizmov. Z modeliranjem genskih skupkov, fizičnim ločevanjem in izolacijo posameznih regij poenostavimo sistem. Takšni sistemi lahko služijo kot platforma za raziskave v bazični biologiji. Izolirane regije okarakteriziramo in jim pripišemo funkcijo. Prav tako poenostavljeni genski skupki omogočajo kvantifikacijo vpliva regulatornih interakcij v izolaciji. Izoliranemu sistemu sistematično in po korakih dodajamo nazaj regulacije in spremljamo njihov vpliv, kar privede do odkrivanja novih genetskih in regulatornih modelov [1].

== Viri ==

[1] K. Temme, D. Zhao, and C. A. Voigt, “Refactoring the nitrogen fi xation gene cluster from Klebsiella oxytoca,” vol. 109, no. 18, pp. 2–7, 2012.

[2] E. Zazopoulos et al., “A genomics-guided approach for discovering and expressing cryptic metabolic pathways,” Nat. Biotechnol., vol. 21, no. 2, pp. 187–190, 2003.

[3] A. Ishihama, “Prokaryotic genome regulation: Multifactor promoters, multitarget regulators and hierarchic networks,” FEMS Microbiol. Rev., vol. 34, no. 5, pp. 628–645, 2010.

[4] L. B. Pickens, Y. Tang, and Y.-H. Chooi, “Metabolic Engineering for the Production of Natural Products,” Annu. Rev. Chem. Biomol. Eng., vol. 2, no. 1, pp. 211–236, 2011.

[5] N. Gorkman, S. West, N. J. Proudfoot, "Pouse sites promote transcriptional termination of mammalian RNA polymerase II," Mol Cell Biol., vol. 26, no. 20, pp. 3986-3996, 2006

[6] L. M. Rubio, P. W. Ludden, "Maturation of Nitrogenase: a Biochemical Puzzle," J Bacteriol., vol. 187, no. 2, pp. 405-414, 2005

[7] R. Dixon and D. Kahn, “Genetic regulation of biological nitrogen fixation,” Nat. Rev. Microbiol., vol. 2, no. 8, pp. 621–631, 2004.

Preoblikovanje genskega skupka za fiksacijo dušika bakterije Klebsiella oxytoca

2018-12-10T19:11:46Z

GasperVirant: /* Menjava krmilnikov za spremembo regulacije */

Povzeto po raziskovalnem članku: Refactoring the nitrogen fixation gene cluster from ''Klebsiella oxytoca'' [1]

== Težave pri uporabi naravnih genskih zapisov ==

Veliko funkcij, zanimivih za biotehnološko uporabo, je pogosto zapisanih v genskih skupkih. Velikost genskih skupkov je zelo različna, nekateri vsebujejo le nekaj genov, spet drugi nekaj sto genov. Pri prokariontih so lahko geni organizirani v obliki operonov, kar pomeni, da je več genov skupaj pod kontrolo enega promotorja. V primeru bakterije Klebsiella oxytoca je genski skupek za fiksacijo dušika sestavljen iz 20 genov, organiziranih v 7 operonov, s skupno dolžino 23,5 kb DNA. Pogosto želimo DNA zapis za določeno lastnost prenesti iz organizma, ki ga je težko gojiti pod laboratorijskimi pogoji, v drugega, vendar je lahko že sama dolžina zapisa omejujoč dejavnik. Precejšnjo težavo predstavlja tudi gostiteljeva regulacija, ki nadzoruje transkripcijsko aktivnost genov preko različnih povratnih zank, pogosto zelo zapletenih in vpetih v širšo mrežo interakcij. Lokusi ostanejo transkripcijsko neodzivni dokler določen kemijski ali fizični signal ne inducira njihovega prepisovanja. Pogosto je opazna presežnost, kar pomeni, da en regulatorni signal lahko kontrolira transkripcijo več operonov, in obratno, en operon je lahko posredno odziven na več različnih signalov. Dodatno se geni lahko med seboj prekrivajo, DNA zapisi imajo lahko več funkcij, pa tudi translacija je lahko regulirana preko malih RNA. Omenjene ovire imajo za posledico, da veliko genskih skupkov ostane kriptičnih, kar pomeni, da laboratorijski pogoji za njihovo aktivnost ostanejo neznanka [1], [2], [3].

== Spreminjanje nativnega zapisa genskih skupkov ==

=== Pristop od zgoraj navzdol ===

Pri spreminjanju genskih skupkov od zgoraj navzdol je pogost pristop manipulacija naravno prisotne regulacije ali dodajanje sintetičnih regulacij v sicer naravni genski zapis. Izbijanje represorja ali povišana ekspresija aktivatorja privede do povečane količine produkta določene biosintetične poti. V kolikor genski skupek sestoji le iz enega operona, vstavitev sintetičnega promotorja pred skupek poveča ekspresijo. Analogno se poveča ekspresija, če vsak gen posebej postavimo pod kontrolo sintetičnega promotorja [1], [4].

=== Pristop od spodaj navzgor ===

Pri pristopu od spodaj navzgor gre za grajenje genskega skupka izključno z uporabo sintetičnih DNA regij, ki so načrtane tako, da eliminirajo vso naravno prisotno regulacijo.

V prvem koraku se s pomočjo računalniških programov pregleda celoten naravni zapis genskega skupka. Sledi odstranitev vse nekodirajoče DNA, neesencialnih genov in zapisov za regulatorje. V naslednjem koraku se gene, ki jim je bila določena pomembna vloga pri končni lastnosti skupka, ponovno prepiše, in sicer uporabi se kodone, ki so čim bolj različni tistim v naravnem zapisu. S tem se ohrani aminokislinsko zaporedje, spremeni pa se zaporedje nukleotidov. Namen tega koraka je uvedba mutacij, ki odstranijo ves morebiten notranji nadzor, kot so spregledani oz. še ne okarakterizirani operatorji, promotorji, sekundarne mRNA strukture, metilacijska mesta, regulacije kodonov in pavzirajoča mesta. Pavzirajoča mesta ležijo za poli(A) repom in so terminatorski signal za RNA polimerazo (II), ki je sicer prisotna v sesalskih celicah, vendar je sorodna RNA polimerazi pri bakterijah [1], [5]. Rekodirana zaporedja se ponovno pregleda z računalniškim programom in v kolikor obstaja še kakšna regija, ki bi imelo regulatorno funkcijo, je le-ta odstranjena. Rekodirane gene se organizira v umetne operone. Posamezni geni v operonu so med seboj ločeni z vmesniki, vsakemu izmed njih pa je dodano tudi sintetično vezavno mesto za ribosom (RBS). Na začetek vsakega operona pa je postavljen sintetični promotor, ki regulira njegovo prepisovanje. Končni rezultat je preoblikovan genski skupek, organiziran v serijo diskretnih, dobro okarakteriziranih genetskih delov z odstranjeno naravno prisotno regulacijo. Sintetična regulacija omogoča kontrolo nad dinamiko in pogoji pod katerimi se skupek izraža [1].

== Genski skupek za fiksacijo dušika ==

Fiksacija dušika je pretvorba dvoatomarnega dušika (N2) iz atmosfere v amonijak (NH3). Mikroorganizmi fiksirajo dušik s pomočjo encima nitrogenaza. Slednji sestoji iz dveh podenot: iz heterotetramernega MoFe proteina (katalizira redukcijo dušika) in homodimernega Fe proteina (donor elektronov za redukcijo dušika). Naravno prisoten zapis za nitrogenazo v K. oxytoca zajema 23,5 kb DNA in kodira 20 proteinov (gradnike obeh podenot nitrogenaze, encime za biosintezo metaloskupkov, šaperone, elektronske transporterje in regulatorje) [6].

== Toleranca nativnega genskega skupka na spremebe v izražanju posameznih genov ==

Pred preoblikovanjem skupka je potrebno preveriti kako povečano izražanje posameznega gena ali več genov skupaj vpliva na končno funkcijo nitrogenaze. Vsak gen ima namreč svoj optimum izražanja, kar pomeni, da preveliko oz. premajhno izražanje negativno vpliva na biološko funkcijo celotnega genskega skupka. V ta namen se iz naravnega zapisa sistematično izbija posamezne gene, katere je nato potrebno zapisati na ločen plazmid, postaviti pod nadzor inducibilnega promotorja (npr. Ptac) in izvesti komplementacijo. Optimum se določi z merjenjem nitrogenazne aktivnosti glede na aktivnost inducibilnega promotorja. Na primer, izmerjeno je bilo, da morajo biti geni, ki kontrolirajo transport elektronov (nifJ in nifF), dokaj nizko izraženi, saj povečano izražanje negativno vpliva na funkcijo nitrogenze. V nasprotju mora biti operon (nifBQ), ki zapisuje za proteine pomembne pri sintezi FeMo jedra in integraciji molibdena, izražen 10-krat močneje kot pa operon (nifUSVWZM), ki zapisuje za proteine pomembne pri tvorbi Fe-S jedra. Gene s podobno stopnjo izražanja se poveže v operon in postavi pod nadzor sintetičnega regulatorja. Pri procesu komplementacije se odkrije tudi negativne regulatorje izražanja in se jih nato izbriše (v dotičnem primeru: nifLA, nifX in nifT) [1], [7].

== Popolnoma preoblikovan genski skupek ==

Posamezen preoblikovan operon so postavili pod nadzor IPTG-inducibilnega promotorja Ptac in izmerili stopnjo izražanja glede na nitrogenazno aktivnost. Preden so operone združili v genski skupek, so jim zamenjali Ptac s T7 promotorji. Moč promotorja vsakega operona so prilagodili glede na prej izmerjeno optimalno stopnjo izražanja pod kontrolo Ptac. Kot referenco so vzeli nfiHDK operon, ki je v K. oxytoca močno izražen (produkt gena nifHDK predstavlja 10% vseh celičnih proteinov). Postavili so ga pod močan T7 promotor divjega tipa. Ostale operone so postavili pod oslabljene T7 promotorje, glede na relativno izražanje proti nifHDK operonu. Manjši kot je optimum izražanja določenega operona, pod bolj oslabljen T7 promotor so ga postavili. Vsak posamezen operon pod kontrolo T7* RNAP je dosegel podobno vrednost izražanja kot pod kontrolo Ptac [1].

Preoblikovan genski skupek za fiksacijo dušika so vgradili na en plazmid, na drug plazmid pa so vgradili krmilnik, ki nadzoruje transkripcijsko aktivnost opisanega genskega skupka.
Krmilnik sestoji iz senzorja in vezja. Senzor je v dotičnem primeru promotor Ptac, ki se inducibilno izraža glede na prisotnost IPTG-ja. Vezje pa predstavlja zapis za mutirano T7 RNA polimerazo (T7* RNAP). Torej ob prisotnosti IPTG-ja, promotor Ptac sproži prepisovanje gena za T7* RNAP, T7 RNAP pa nato začne s prepisovanjem celotnega genskega skupka za fiksacijo dušika [1].

S plazmidom, ki je nosil zapis za preoblikovan genski skupek in plazmidom z zapisom za krmilnik so transformirali sev K. oxytoca, kateremu je bil predhodno izbit naravni zapis za fiksacijo dušika (K. oxytoca nif KO). Sintetični genski skupek za fiksacijo dušika je dosegel 7,4% +/- 2,4% aktivnosti nitrogenaze v primerjavi z divjim tipom. Transformirani sevi so izrabljali N2 iz ozračja kot vir dušika, vendar so rastli 3,5-krat počasneje kot divji tip sevov [1].

Končni preoblikovan genski skupek za fiksacijo dušika, vključno s krmilnikom, je vseboval 89 genetskih delov. Funkcija vsakega dela je natančno definirana in okarakterizirana. Kot pričakovano je nitrogenazna aktivnost sintetičnega skupka nižja od naravno prisotnega, saj gre za spreminjanje evolucijsko zelo ohranjenega sistema [1].

== Menjava krmilnikov za spremembo regulacije ==

Ločba krmilnika in preoblikovanega genskega skupka omogoča enostavno spremembo reguliranja sistema. V kolikor zamenjamo senzor na krmilniku, je le ta odziven na drug signal. Senzor odziven na IPTG (v dotičnem primeru je to promotor Ptac) so zamenjali s Tc-inducibilnim promotorjem Ptet. Ob prisotnosti ustreznega signala je ne glede na izbiro senzorja nastala enka količina NH3 relativno glede na WT sistem (7,2 % +/- 1,7 %). Ustvarili so tudi senzor, ki je bil občutljiv na IPTG in Tc hkrati, kar v praksi pomeni, da so pred zapis za T7* RNAP vstavili tako Ptac kot tudi Ptet. V tem primeru je bila ob prisotnosti le IPTG-ja količina proizvedenega NH3 nekoliko nižja glede na naravno prisoten zapis, in sicer 6,6 % +/- 1,7 %. Načrtovanje krmilnikov tako predstavlja enostaven način regulacije celotnega sistema [1].

Pri naravnem zapisu za fiksacijo dušika v K. oxytoca je amonijak negativni regulator delovaja nitrogenaze. V prisotnosti 17,5 mM amoniaka v gojišču, je aktivnost fiksacije dušika inhibirana. V nasprotju je bila pri preoblikovanem genskem skupku aktivnost nitrogenaze 1,1 % +/- 0,5 %. Aktivnost je nekoliko nižja, vendar ne zaradi inhibicije encima, temveč zaradi znižanja aktivnosti krmilnika za 4,5-krat. V kolikor bi bil krmilnik bolj robusten, naj bi bila aktivnost nitrogenaze nespremenjena [1].

== Prednosti preoblikovanja genskih skupkov ==

Namen preoblikovanja naravnega zapisa je olajšati nadaljnje delo z večgenskimi sistemi, ki imajo po navadi zelo kompleksno genetiko. Ti sistemi so se razvili skozi evolucijo in so pogosto močno regulirani. Regulacija je presežna in vpeta v širšo mrežo interakcij, kar pomeni, da en signal lahko regulira več biokemijskih mehanizmov. Z modeliranjem genskih skupkov, fizičnim ločevanjem in izolacijo posameznih regij poenostavimo sistem. Takšni sistemi lahko služijo kot platforma za raziskave v bazični biologiji. Izolirane regije okarakteriziramo in jim pripišemo funkcijo. Prav tako poenostavljeni genski skupki omogočajo kvantifikacijo vpliva regulatornih interakcij v izolaciji. Izoliranemu sistemu sistematično in po korakih dodajamo nazaj regulacije in spremljamo njihov vpliv, kar privede do odkrivanja novih genetskih in regulatornih modelov [1].

== Viri ==

[1] K. Temme, D. Zhao, and C. A. Voigt, “Refactoring the nitrogen fi xation gene cluster from Klebsiella oxytoca,” vol. 109, no. 18, pp. 2–7, 2012.

[2] E. Zazopoulos et al., “A genomics-guided approach for discovering and expressing cryptic metabolic pathways,” Nat. Biotechnol., vol. 21, no. 2, pp. 187–190, 2003.

[3] A. Ishihama, “Prokaryotic genome regulation: Multifactor promoters, multitarget regulators and hierarchic networks,” FEMS Microbiol. Rev., vol. 34, no. 5, pp. 628–645, 2010.

[4] L. B. Pickens, Y. Tang, and Y.-H. Chooi, “Metabolic Engineering for the Production of Natural Products,” Annu. Rev. Chem. Biomol. Eng., vol. 2, no. 1, pp. 211–236, 2011.

[5] N. Gorkman, S. West, N. J. Proudfoot, "Pouse sites promote transcriptional termination of mammalian RNA polymerase II," Mol Cell Biol., vol. 26, no. 20, pp. 3986-3996, 2006

[6] L. M. Rubio, P. W. Ludden, "Maturation of Nitrogenase: a Biochemical Puzzle," J Bacteriol., vol. 187, no. 2, pp. 405-414, 2005

[7] R. Dixon and D. Kahn, “Genetic regulation of biological nitrogen fixation,” Nat. Rev. Microbiol., vol. 2, no. 8, pp. 621–631, 2004.

Preoblikovanje genskega skupka za fiksacijo dušika bakterije Klebsiella oxytoca

2018-12-10T19:10:46Z

GasperVirant: /* Genski skupek za fiksacijo dušika */

Povzeto po raziskovalnem članku: Refactoring the nitrogen fixation gene cluster from ''Klebsiella oxytoca'' [1]

== Težave pri uporabi naravnih genskih zapisov ==

Veliko funkcij, zanimivih za biotehnološko uporabo, je pogosto zapisanih v genskih skupkih. Velikost genskih skupkov je zelo različna, nekateri vsebujejo le nekaj genov, spet drugi nekaj sto genov. Pri prokariontih so lahko geni organizirani v obliki operonov, kar pomeni, da je več genov skupaj pod kontrolo enega promotorja. V primeru bakterije Klebsiella oxytoca je genski skupek za fiksacijo dušika sestavljen iz 20 genov, organiziranih v 7 operonov, s skupno dolžino 23,5 kb DNA. Pogosto želimo DNA zapis za določeno lastnost prenesti iz organizma, ki ga je težko gojiti pod laboratorijskimi pogoji, v drugega, vendar je lahko že sama dolžina zapisa omejujoč dejavnik. Precejšnjo težavo predstavlja tudi gostiteljeva regulacija, ki nadzoruje transkripcijsko aktivnost genov preko različnih povratnih zank, pogosto zelo zapletenih in vpetih v širšo mrežo interakcij. Lokusi ostanejo transkripcijsko neodzivni dokler določen kemijski ali fizični signal ne inducira njihovega prepisovanja. Pogosto je opazna presežnost, kar pomeni, da en regulatorni signal lahko kontrolira transkripcijo več operonov, in obratno, en operon je lahko posredno odziven na več različnih signalov. Dodatno se geni lahko med seboj prekrivajo, DNA zapisi imajo lahko več funkcij, pa tudi translacija je lahko regulirana preko malih RNA. Omenjene ovire imajo za posledico, da veliko genskih skupkov ostane kriptičnih, kar pomeni, da laboratorijski pogoji za njihovo aktivnost ostanejo neznanka [1], [2], [3].

== Spreminjanje nativnega zapisa genskih skupkov ==

=== Pristop od zgoraj navzdol ===

Pri spreminjanju genskih skupkov od zgoraj navzdol je pogost pristop manipulacija naravno prisotne regulacije ali dodajanje sintetičnih regulacij v sicer naravni genski zapis. Izbijanje represorja ali povišana ekspresija aktivatorja privede do povečane količine produkta določene biosintetične poti. V kolikor genski skupek sestoji le iz enega operona, vstavitev sintetičnega promotorja pred skupek poveča ekspresijo. Analogno se poveča ekspresija, če vsak gen posebej postavimo pod kontrolo sintetičnega promotorja [1], [4].

=== Pristop od spodaj navzgor ===

Pri pristopu od spodaj navzgor gre za grajenje genskega skupka izključno z uporabo sintetičnih DNA regij, ki so načrtane tako, da eliminirajo vso naravno prisotno regulacijo.

V prvem koraku se s pomočjo računalniških programov pregleda celoten naravni zapis genskega skupka. Sledi odstranitev vse nekodirajoče DNA, neesencialnih genov in zapisov za regulatorje. V naslednjem koraku se gene, ki jim je bila določena pomembna vloga pri končni lastnosti skupka, ponovno prepiše, in sicer uporabi se kodone, ki so čim bolj različni tistim v naravnem zapisu. S tem se ohrani aminokislinsko zaporedje, spremeni pa se zaporedje nukleotidov. Namen tega koraka je uvedba mutacij, ki odstranijo ves morebiten notranji nadzor, kot so spregledani oz. še ne okarakterizirani operatorji, promotorji, sekundarne mRNA strukture, metilacijska mesta, regulacije kodonov in pavzirajoča mesta. Pavzirajoča mesta ležijo za poli(A) repom in so terminatorski signal za RNA polimerazo (II), ki je sicer prisotna v sesalskih celicah, vendar je sorodna RNA polimerazi pri bakterijah [1], [5]. Rekodirana zaporedja se ponovno pregleda z računalniškim programom in v kolikor obstaja še kakšna regija, ki bi imelo regulatorno funkcijo, je le-ta odstranjena. Rekodirane gene se organizira v umetne operone. Posamezni geni v operonu so med seboj ločeni z vmesniki, vsakemu izmed njih pa je dodano tudi sintetično vezavno mesto za ribosom (RBS). Na začetek vsakega operona pa je postavljen sintetični promotor, ki regulira njegovo prepisovanje. Končni rezultat je preoblikovan genski skupek, organiziran v serijo diskretnih, dobro okarakteriziranih genetskih delov z odstranjeno naravno prisotno regulacijo. Sintetična regulacija omogoča kontrolo nad dinamiko in pogoji pod katerimi se skupek izraža [1].

== Genski skupek za fiksacijo dušika ==

Fiksacija dušika je pretvorba dvoatomarnega dušika (N2) iz atmosfere v amonijak (NH3). Mikroorganizmi fiksirajo dušik s pomočjo encima nitrogenaza. Slednji sestoji iz dveh podenot: iz heterotetramernega MoFe proteina (katalizira redukcijo dušika) in homodimernega Fe proteina (donor elektronov za redukcijo dušika). Naravno prisoten zapis za nitrogenazo v K. oxytoca zajema 23,5 kb DNA in kodira 20 proteinov (gradnike obeh podenot nitrogenaze, encime za biosintezo metaloskupkov, šaperone, elektronske transporterje in regulatorje) [6].

== Toleranca nativnega genskega skupka na spremebe v izražanju posameznih genov ==

Pred preoblikovanjem skupka je potrebno preveriti kako povečano izražanje posameznega gena ali več genov skupaj vpliva na končno funkcijo nitrogenaze. Vsak gen ima namreč svoj optimum izražanja, kar pomeni, da preveliko oz. premajhno izražanje negativno vpliva na biološko funkcijo celotnega genskega skupka. V ta namen se iz naravnega zapisa sistematično izbija posamezne gene, katere je nato potrebno zapisati na ločen plazmid, postaviti pod nadzor inducibilnega promotorja (npr. Ptac) in izvesti komplementacijo. Optimum se določi z merjenjem nitrogenazne aktivnosti glede na aktivnost inducibilnega promotorja. Na primer, izmerjeno je bilo, da morajo biti geni, ki kontrolirajo transport elektronov (nifJ in nifF), dokaj nizko izraženi, saj povečano izražanje negativno vpliva na funkcijo nitrogenze. V nasprotju mora biti operon (nifBQ), ki zapisuje za proteine pomembne pri sintezi FeMo jedra in integraciji molibdena, izražen 10-krat močneje kot pa operon (nifUSVWZM), ki zapisuje za proteine pomembne pri tvorbi Fe-S jedra. Gene s podobno stopnjo izražanja se poveže v operon in postavi pod nadzor sintetičnega regulatorja. Pri procesu komplementacije se odkrije tudi negativne regulatorje izražanja in se jih nato izbriše (v dotičnem primeru: nifLA, nifX in nifT) [1], [7].

== Popolnoma preoblikovan genski skupek ==

Posamezen preoblikovan operon so postavili pod nadzor IPTG-inducibilnega promotorja Ptac in izmerili stopnjo izražanja glede na nitrogenazno aktivnost. Preden so operone združili v genski skupek, so jim zamenjali Ptac s T7 promotorji. Moč promotorja vsakega operona so prilagodili glede na prej izmerjeno optimalno stopnjo izražanja pod kontrolo Ptac. Kot referenco so vzeli nfiHDK operon, ki je v K. oxytoca močno izražen (produkt gena nifHDK predstavlja 10% vseh celičnih proteinov). Postavili so ga pod močan T7 promotor divjega tipa. Ostale operone so postavili pod oslabljene T7 promotorje, glede na relativno izražanje proti nifHDK operonu. Manjši kot je optimum izražanja določenega operona, pod bolj oslabljen T7 promotor so ga postavili. Vsak posamezen operon pod kontrolo T7* RNAP je dosegel podobno vrednost izražanja kot pod kontrolo Ptac [1].

Preoblikovan genski skupek za fiksacijo dušika so vgradili na en plazmid, na drug plazmid pa so vgradili krmilnik, ki nadzoruje transkripcijsko aktivnost opisanega genskega skupka.
Krmilnik sestoji iz senzorja in vezja. Senzor je v dotičnem primeru promotor Ptac, ki se inducibilno izraža glede na prisotnost IPTG-ja. Vezje pa predstavlja zapis za mutirano T7 RNA polimerazo (T7* RNAP). Torej ob prisotnosti IPTG-ja, promotor Ptac sproži prepisovanje gena za T7* RNAP, T7 RNAP pa nato začne s prepisovanjem celotnega genskega skupka za fiksacijo dušika [1].

S plazmidom, ki je nosil zapis za preoblikovan genski skupek in plazmidom z zapisom za krmilnik so transformirali sev K. oxytoca, kateremu je bil predhodno izbit naravni zapis za fiksacijo dušika (K. oxytoca nif KO). Sintetični genski skupek za fiksacijo dušika je dosegel 7,4% +/- 2,4% aktivnosti nitrogenaze v primerjavi z divjim tipom. Transformirani sevi so izrabljali N2 iz ozračja kot vir dušika, vendar so rastli 3,5-krat počasneje kot divji tip sevov [1].

Končni preoblikovan genski skupek za fiksacijo dušika, vključno s krmilnikom, je vseboval 89 genetskih delov. Funkcija vsakega dela je natančno definirana in okarakterizirana. Kot pričakovano je nitrogenazna aktivnost sintetičnega skupka nižja od naravno prisotnega, saj gre za spreminjanje evolucijsko zelo ohranjenega sistema [1].

== Menjava krmilnikov za spremembo regulacije ==

Ločba krmilnika in preoblikovanega genskega skupka omogoča enostavno spremembo reguliranja sistema. V kolikor zamenjamo senzor na krmilniku, je le ta odziven na drug signal. Senzor odziven na IPTG (v dotičnem primeru je to promotor Ptac) so zamenjali s Tc-inducibilnim promotorjem Ptet. Ob prisotnosti ustreznega signala je ne glede na izbiro senzorja nastala enka količina NH3 relativno glede na WT sistem (7,2 % +/- 1,7 %). Ustvarili so tudi senzor, ki je bil občutljiv na IPTG in Tc hkrati, kar v praksi pomeni, da so pred zapis za T7* RNAP vstavili tako Ptac kot tudi Ptet. V tem primeru je bila ob prisotnosti le IPTG-ja količina proizvedenega NH3 nekoliko nižja glede na naravno prisoten zapis, in sicer 6,6 % +/- 1,7 %. Načrtovanje krmilnikov tako predstavlja enostaven način regulacije celotnega sistema [1].

Pri naravnem zapisu za fiksacijo dušika v K. oxytoca je amonijak negativni regulator delovaja nitrogenaze. V prisotnosti 17,5 mM amoniaka v gojišču, je aktivnost fiksacije dušika inhibirana. V nasprotju je bila pri preoblikovanem genskem skupku aktivnost nitrogenaze 1,1 % +/- 0,5 %. Aktivnost je nekoliko nižja, vendar ne zaradi inhibicije encima, temveč zaradi znižanja aktivnosti krmilnika za 4,5-krat. V kolikor bi bil krmilnik bolj robusten, naj bi bila aktivnost nitrogenaze nespremenjena [1].

== Prednosti preoblikovanja genskih skupkov ==

Namen preoblikovanja naravnega zapisa je olajšati nadaljnje delo z večgenskimi sistemi, ki imajo po navadi zelo kompleksno genetiko. Ti sistemi so se razvili skozi evolucijo in so pogosto močno regulirani. Regulacija je presežna in vpeta v širšo mrežo interakcij, kar pomeni, da en signal lahko regulira več biokemijskih mehanizmov. Z modeliranjem genskih skupkov, fizičnim ločevanjem in izolacijo posameznih regij poenostavimo sistem. Takšni sistemi lahko služijo kot platforma za raziskave v bazični biologiji. Izolirane regije okarakteriziramo in jim pripišemo funkcijo. Prav tako poenostavljeni genski skupki omogočajo kvantifikacijo vpliva regulatornih interakcij v izolaciji. Izoliranemu sistemu sistematično in po korakih dodajamo nazaj regulacije in spremljamo njihov vpliv, kar privede do odkrivanja novih genetskih in regulatornih modelov [1].

== Viri ==

[1] K. Temme, D. Zhao, and C. A. Voigt, “Refactoring the nitrogen fi xation gene cluster from Klebsiella oxytoca,” vol. 109, no. 18, pp. 2–7, 2012.

[2] E. Zazopoulos et al., “A genomics-guided approach for discovering and expressing cryptic metabolic pathways,” Nat. Biotechnol., vol. 21, no. 2, pp. 187–190, 2003.

[3] A. Ishihama, “Prokaryotic genome regulation: Multifactor promoters, multitarget regulators and hierarchic networks,” FEMS Microbiol. Rev., vol. 34, no. 5, pp. 628–645, 2010.

[4] L. B. Pickens, Y. Tang, and Y.-H. Chooi, “Metabolic Engineering for the Production of Natural Products,” Annu. Rev. Chem. Biomol. Eng., vol. 2, no. 1, pp. 211–236, 2011.

[5] N. Gorkman, S. West, N. J. Proudfoot, "Pouse sites promote transcriptional termination of mammalian RNA polymerase II," Mol Cell Biol., vol. 26, no. 20, pp. 3986-3996, 2006

[6] L. M. Rubio, P. W. Ludden, "Maturation of Nitrogenase: a Biochemical Puzzle," J Bacteriol., vol. 187, no. 2, pp. 405-414, 2005

[7] R. Dixon and D. Kahn, “Genetic regulation of biological nitrogen fixation,” Nat. Rev. Microbiol., vol. 2, no. 8, pp. 621–631, 2004.

Seminarji SB 2018/19

2018-12-10T18:38:29Z

GasperVirant:

V študijskem letu 2018/19 študentje predstavljajo naslednje teme:

RAZISKOVALNI ČLANKI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) 

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/MoClo:_modularni_klonirni_sistem_za_standardizirano_sestavljanje_ve%C4%8Dgenskih_konstruktov MoClo: modularni klonirni sistem za standardizirano sestavljanje večgenskih konstruktov] (Valentina Levak)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/RNA-stikala_tipa_%C2%BBToehold%C2%AB:_de_novo_oblikovani_regulatorji_izra%C5%BEanja_genov RNA-stikala tipa Toehold: de novo oblikovani regulatorji izražanja genov] (Špela Malenšek)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Raznoliko_in_modelno_zasnovana_priprava_sinteti%C4%8Dnih_genskih_vezij_s_predvidenimi_lastnostmi Raznoliko in modelno zasnovana priprava sintetičnih genskih vezij s predvidenimi lastnostmi] (Matej Kolarič)

[[Dispersing biofilms with engineered enzymatic bacteriophage]] (Fran Krstanović)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Nekaj_pogledov_na_sistemsko_biologijo_kvasovke Nekaj pogledov na sistemsko biologijo kvasovke] (Gašper Žun)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Organizacija_znotrajceli%C4%8Dnih_reakcij_z_razumsko_na%C4%8Drtovanimi_RNA_sestavi#Na.C4.8Drtovanje_in_sestavljanje_RNA_sestavov Organizacija znotrajceličnih reakcij z razumsko načrtovanimi RNA sestavi] (Urška Jelenovec)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Biolo%C5%A1ko_vezje_na_osnovi_RNA-interference_za_identifikacijo_specifi%C4%8Dnih_rakavih_celic Biološko vezje na osnovi RNA-interference za identifikacijo specifičnih rakavih celic] (Gašper Marinšek)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Kontrola_hitrosti_translacije_preko_pomožnega_mesta_5’-UTR:_energijski_kompromis_med_dostopnostjo%2C_selektivnim_razvijanjem_RNA-struktur_in_drsenjem_30S_ribosomske_podenote_po_RNA-strukturah Kontrola hitrosti translacije preko pomožnega mesta 5’-UTR: energijski kompromis med dostopnostjo, selektivnim razvijanjem RNA-struktur in drsenjem 30S ribosomske podenote po RNA-strukturah] (Neža Koritnik)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Preoblikovanje_genskega_skupka_za_fiksacijo_dušika_bakterije_Klebsiella_oxytoca Preoblikovanje genskega skupka za fiksacijo dušika bakterije ''Klebsiella oxytoca''] (Gašper Virant)

NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.) 
[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Phactory:_proizvodnja_bakteriofagov_za_precizno_zdravljenje Phactory: proizvodnja bakteriofagov za precizno zdravljenje] (Rok Miklavčič)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Canditect:_hitra_detekcija_vaginalne_infekcije_s_Candido_albicans_z_uporabo_sistema_CRISPR/dCas9 Canditect – hitra detekcija vaginalne infekcije s Candido albicans z uporabo sistema CRISPR/dCas9] (Jerneja Ovčar)

Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo razprava, ki praviloma ne bo daljša od 5 minut.

----

Razpored po datumih predstavitev (pri vsakem terminu je navedeno število možnih seminarjev; vpišite ime in priimek pri dnevu, ko želite predstaviti seminar ter dopišite naslov seminarja, ki naj bo povezan s povzetkom):

22.11. 
1 
2 Valentina Levak 

27.11. 
1 
2 
3 
4 

29.11. 
1 Matej Kolarič 
2 Špela Malenšek 
3 
4 

4.12. 
1 Gašper Žun 
2 Fran Krstanovic 
3 
4 

6.12. 
1 Urška Jelenovec 
2 Rok Miklavčič 
3 
4 

11.12. 
1 Jerneja Ovčar 
2 Neža Koritnik 
3 Gašper Virant 
4 Gašper Marinšek 

18.12. 
1 Tina Požun 
2 Anamarija Habič 
3 Roberta Mulac 
4 Kity Požek 

3.1. 
1 Urška Kašnik 
2 Nina Mavec 
3 Primož Tič 
4 Ernest Šprager 

8.1. 
1 Marija Atanasova 
2 Bine Tršavec 
3 Peter Pečan 
4 Tjaša Sorčan 

10.1. 
1 Špela Koren 
2 Natalija Pucihar 
3 Karmen Žbogar 
4 Uroš Zavrtanik 

15.1. 
1 Jerneja Kocutar 
2 Blaž Lebar 
3 Tadej Satler 
4 Miha Koprivnikar Krajnc 

17.1. 
1 Milena Stojkovska 
2

Preoblikovanje genskega skupka za fiksacijo dušika bakterije Klebsiella oxytoca

2018-12-10T18:36:50Z

GasperVirant: /* Menjava krmilnikov za spremembo regulacije */

Povzeto po raziskovalnem članku: Refactoring the nitrogen fixation gene cluster from ''Klebsiella oxytoca'' [1]

== Težave pri uporabi naravnih genskih zapisov ==

Veliko funkcij, zanimivih za biotehnološko uporabo, je pogosto zapisanih v genskih skupkih. Velikost genskih skupkov je zelo različna, nekateri vsebujejo le nekaj genov, spet drugi nekaj sto genov. Pri prokariontih so lahko geni organizirani v obliki operonov, kar pomeni, da je več genov skupaj pod kontrolo enega promotorja. V primeru bakterije Klebsiella oxytoca je genski skupek za fiksacijo dušika sestavljen iz 20 genov, organiziranih v 7 operonov, s skupno dolžino 23,5 kb DNA. Pogosto želimo DNA zapis za določeno lastnost prenesti iz organizma, ki ga je težko gojiti pod laboratorijskimi pogoji, v drugega, vendar je lahko že sama dolžina zapisa omejujoč dejavnik. Precejšnjo težavo predstavlja tudi gostiteljeva regulacija, ki nadzoruje transkripcijsko aktivnost genov preko različnih povratnih zank, pogosto zelo zapletenih in vpetih v širšo mrežo interakcij. Lokusi ostanejo transkripcijsko neodzivni dokler določen kemijski ali fizični signal ne inducira njihovega prepisovanja. Pogosto je opazna presežnost, kar pomeni, da en regulatorni signal lahko kontrolira transkripcijo več operonov, in obratno, en operon je lahko posredno odziven na več različnih signalov. Dodatno se geni lahko med seboj prekrivajo, DNA zapisi imajo lahko več funkcij, pa tudi translacija je lahko regulirana preko malih RNA. Omenjene ovire imajo za posledico, da veliko genskih skupkov ostane kriptičnih, kar pomeni, da laboratorijski pogoji za njihovo aktivnost ostanejo neznanka [1], [2], [3].

== Spreminjanje nativnega zapisa genskih skupkov ==

=== Pristop od zgoraj navzdol ===

Pri spreminjanju genskih skupkov od zgoraj navzdol je pogost pristop manipulacija naravno prisotne regulacije ali dodajanje sintetičnih regulacij v sicer naravni genski zapis. Izbijanje represorja ali povišana ekspresija aktivatorja privede do povečane količine produkta določene biosintetične poti. V kolikor genski skupek sestoji le iz enega operona, vstavitev sintetičnega promotorja pred skupek poveča ekspresijo. Analogno se poveča ekspresija, če vsak gen posebej postavimo pod kontrolo sintetičnega promotorja [1], [4].

=== Pristop od spodaj navzgor ===

Pri pristopu od spodaj navzgor gre za grajenje genskega skupka izključno z uporabo sintetičnih DNA regij, ki so načrtane tako, da eliminirajo vso naravno prisotno regulacijo.

V prvem koraku se s pomočjo računalniških programov pregleda celoten naravni zapis genskega skupka. Sledi odstranitev vse nekodirajoče DNA, neesencialnih genov in zapisov za regulatorje. V naslednjem koraku se gene, ki jim je bila določena pomembna vloga pri končni lastnosti skupka, ponovno prepiše, in sicer uporabi se kodone, ki so čim bolj različni tistim v naravnem zapisu. S tem se ohrani aminokislinsko zaporedje, spremeni pa se zaporedje nukleotidov. Namen tega koraka je uvedba mutacij, ki odstranijo ves morebiten notranji nadzor, kot so spregledani oz. še ne okarakterizirani operatorji, promotorji, sekundarne mRNA strukture, metilacijska mesta, regulacije kodonov in pavzirajoča mesta. Pavzirajoča mesta ležijo za poli(A) repom in so terminatorski signal za RNA polimerazo (II), ki je sicer prisotna v sesalskih celicah, vendar je sorodna RNA polimerazi pri bakterijah [1], [5]. Rekodirana zaporedja se ponovno pregleda z računalniškim programom in v kolikor obstaja še kakšna regija, ki bi imelo regulatorno funkcijo, je le-ta odstranjena. Rekodirane gene se organizira v umetne operone. Posamezni geni v operonu so med seboj ločeni z vmesniki, vsakemu izmed njih pa je dodano tudi sintetično vezavno mesto za ribosom (RBS). Na začetek vsakega operona pa je postavljen sintetični promotor, ki regulira njegovo prepisovanje. Končni rezultat je preoblikovan genski skupek, organiziran v serijo diskretnih, dobro okarakteriziranih genetskih delov z odstranjeno naravno prisotno regulacijo. Sintetična regulacija omogoča kontrolo nad dinamiko in pogoji pod katerimi se skupek izraža [1].

== Genski skupek za fiksacijo dušika ==

Fiksacija dušika je pretvorba dvoatomarnega dušika (N2) iz atmosfere v amonijak (NH3). Mikroorganizmi fiksirajo dušik s pomočjo encima nitrogenaza. Slednji sestoji iz dveh podenot: iz heterotetramernega MoFe proteina (katalizira redukcijo dušika) in homodimernega Fe proteina (donor elektronov za redukcijo dušika). Naravno prisoten zapis za nitrogenazo v K. oxytoca zajema 23,5 kb DNA in kodira 20 proteinov (gradnike obeh podenot nitrogenaze, encime za biosintezo metaloskupkov, šaperone, elektronske transporterje in regulatorje) [6].

== Toleranca nativnega genskega skupka na spremebe v izražanju posameznih genov ==

Pred preoblikovanjem skupka je potrebno preveriti kako povečano izražanje posameznega gena ali več genov skupaj vpliva na končno funkcijo nitrogenaze. Vsak gen ima namreč svoj optimum izražanja, kar pomeni, da preveliko oz. premajhno izražanje negativno vpliva na biološko funkcijo celotnega genskega skupka. V ta namen se iz naravnega zapisa sistematično izbija posamezne gene, katere je nato potrebno zapisati na ločen plazmid, postaviti pod nadzor inducibilnega promotorja (npr. Ptac) in izvesti komplementacijo. Optimum se določi z merjenjem nitrogenazne aktivnosti glede na aktivnost inducibilnega promotorja. Na primer, izmerjeno je bilo, da morajo biti geni, ki kontrolirajo transport elektronov (nifJ in nifF), dokaj nizko izraženi, saj povečano izražanje negativno vpliva na funkcijo nitrogenze. V nasprotju mora biti operon (nifBQ), ki zapisuje za proteine pomembne pri sintezi FeMo jedra in integraciji molibdena, izražen 10-krat močneje kot pa operon (nifUSVWZM), ki zapisuje za proteine pomembne pri tvorbi Fe-S jedra. Gene s podobno stopnjo izražanja se poveže v operon in postavi pod nadzor sintetičnega regulatorja. Pri procesu komplementacije se odkrije tudi negativne regulatorje izražanja in se jih nato izbriše (v dotičnem primeru: nifLA, nifX in nifT) [1], [7].

== Popolnoma preoblikovan genski skupek ==

Posamezen preoblikovan operon so postavili pod nadzor IPTG-inducibilnega promotorja Ptac in izmerili stopnjo izražanja glede na nitrogenazno aktivnost. Preden so operone združili v genski skupek, so jim zamenjali Ptac s T7 promotorji. Moč promotorja vsakega operona so prilagodili glede na prej izmerjeno optimalno stopnjo izražanja pod kontrolo Ptac. Kot referenco so vzeli nfiHDK operon, ki je v K. oxytoca močno izražen (produkt gena nifHDK predstavlja 10% vseh celičnih proteinov). Postavili so ga pod močan T7 promotor divjega tipa. Ostale operone so postavili pod oslabljene T7 promotorje, glede na relativno izražanje proti nifHDK operonu. Manjši kot je optimum izražanja določenega operona, pod bolj oslabljen T7 promotor so ga postavili. Vsak posamezen operon pod kontrolo T7* RNAP je dosegel podobno vrednost izražanja kot pod kontrolo Ptac [1].

Preoblikovan genski skupek za fiksacijo dušika so vgradili na en plazmid, na drug plazmid pa so vgradili krmilnik, ki nadzoruje transkripcijsko aktivnost opisanega genskega skupka.
Krmilnik sestoji iz senzorja in vezja. Senzor je v dotičnem primeru promotor Ptac, ki se inducibilno izraža glede na prisotnost IPTG-ja. Vezje pa predstavlja zapis za mutirano T7 RNA polimerazo (T7* RNAP). Torej ob prisotnosti IPTG-ja, promotor Ptac sproži prepisovanje gena za T7* RNAP, T7 RNAP pa nato začne s prepisovanjem celotnega genskega skupka za fiksacijo dušika [1].

S plazmidom, ki je nosil zapis za preoblikovan genski skupek in plazmidom z zapisom za krmilnik so transformirali sev K. oxytoca, kateremu je bil predhodno izbit naravni zapis za fiksacijo dušika (K. oxytoca nif KO). Sintetični genski skupek za fiksacijo dušika je dosegel 7,4% +/- 2,4% aktivnosti nitrogenaze v primerjavi z divjim tipom. Transformirani sevi so izrabljali N2 iz ozračja kot vir dušika, vendar so rastli 3,5-krat počasneje kot divji tip sevov [1].

Končni preoblikovan genski skupek za fiksacijo dušika, vključno s krmilnikom, je vseboval 89 genetskih delov. Funkcija vsakega dela je natančno definirana in okarakterizirana. Kot pričakovano je nitrogenazna aktivnost sintetičnega skupka nižja od naravno prisotnega, saj gre za spreminjanje evolucijsko zelo ohranjenega sistema [1].

== Menjava krmilnikov za spremembo regulacije ==

Ločba krmilnika in preoblikovanega genskega skupka omogoča enostavno spremembo reguliranja sistema. V kolikor zamenjamo senzor na krmilniku, je le ta odziven na drug signal. Senzor odziven na IPTG (v dotičnem primeru je to promotor Ptac) so zamenjali s Tc-inducibilnim promotorjem Ptet. Ob prisotnosti ustreznega signala je ne glede na izbiro senzorja nastala enka količina NH3 relativno glede na WT sistem (7,2 % +/- 1,7 %). Ustvarili so tudi senzor, ki je bil občutljiv na IPTG in Tc hkrati, kar v praksi pomeni, da so pred zapis za T7* RNAP vstavili tako Ptac kot tudi Ptet. V tem primeru je bila ob prisotnosti le IPTG-ja količina proizvedenega NH3 nekoliko nižja glede na naravno prisoten zapis, in sicer 6,6 % +/- 1,7 %. Načrtovanje krmilnikov tako predstavlja enostaven način regulacije celotnega sistema [1].

Pri naravnem zapisu za fiksacijo dušika v K. oxytoca je amonijak negativni regulator delovaja nitrogenaze. V prisotnosti 17,5 mM amoniaka v gojišču, je aktivnost fiksacije dušika inhibirana. V nasprotju je bila pri preoblikovanem genskem skupku aktivnost nitrogenaze 1,1 % +/- 0,5 %. Aktivnost je nekoliko nižja, vendar ne zaradi inhibicije encima, temveč zaradi znižanja aktivnosti krmilnika za 4,5-krat. V kolikor bi bil krmilnik bolj robusten, naj bi bila aktivnost nitrogenaze nespremenjena [1].

== Prednosti preoblikovanja genskih skupkov ==

Namen preoblikovanja naravnega zapisa je olajšati nadaljnje delo z večgenskimi sistemi, ki imajo po navadi zelo kompleksno genetiko. Ti sistemi so se razvili skozi evolucijo in so pogosto močno regulirani. Regulacija je presežna in vpeta v širšo mrežo interakcij, kar pomeni, da en signal lahko regulira več biokemijskih mehanizmov. Z modeliranjem genskih skupkov, fizičnim ločevanjem in izolacijo posameznih regij poenostavimo sistem. Takšni sistemi lahko služijo kot platforma za raziskave v bazični biologiji. Izolirane regije okarakteriziramo in jim pripišemo funkcijo. Prav tako poenostavljeni genski skupki omogočajo kvantifikacijo vpliva regulatornih interakcij v izolaciji. Izoliranemu sistemu sistematično in po korakih dodajamo nazaj regulacije in spremljamo njihov vpliv, kar privede do odkrivanja novih genetskih in regulatornih modelov [1].

== Viri ==

[1] K. Temme, D. Zhao, and C. A. Voigt, “Refactoring the nitrogen fi xation gene cluster from Klebsiella oxytoca,” vol. 109, no. 18, pp. 2–7, 2012.

[2] E. Zazopoulos et al., “A genomics-guided approach for discovering and expressing cryptic metabolic pathways,” Nat. Biotechnol., vol. 21, no. 2, pp. 187–190, 2003.

[3] A. Ishihama, “Prokaryotic genome regulation: Multifactor promoters, multitarget regulators and hierarchic networks,” FEMS Microbiol. Rev., vol. 34, no. 5, pp. 628–645, 2010.

[4] L. B. Pickens, Y. Tang, and Y.-H. Chooi, “Metabolic Engineering for the Production of Natural Products,” Annu. Rev. Chem. Biomol. Eng., vol. 2, no. 1, pp. 211–236, 2011.

[5] N. Gorkman, S. West, N. J. Proudfoot, "Pouse sites promote transcriptional termination of mammalian RNA polymerase II," Mol Cell Biol., vol. 26, no. 20, pp. 3986-3996, 2006

[6] L. M. Rubio, P. W. Ludden, "Maturation of Nitrogenase: a Biochemical Puzzle," J Bacteriol., vol. 187, no. 2, pp. 405-414, 2005

[7] R. Dixon and D. Kahn, “Genetic regulation of biological nitrogen fixation,” Nat. Rev. Microbiol., vol. 2, no. 8, pp. 621–631, 2004.

Preoblikovanje genskega skupka za fiksacijo dušika bakterije Klebsiella oxytoca

2018-12-10T18:35:33Z

GasperVirant: /* Popolnoma preoblikovan genski skupek */

Povzeto po raziskovalnem članku: Refactoring the nitrogen fixation gene cluster from ''Klebsiella oxytoca'' [1]

== Težave pri uporabi naravnih genskih zapisov ==

Veliko funkcij, zanimivih za biotehnološko uporabo, je pogosto zapisanih v genskih skupkih. Velikost genskih skupkov je zelo različna, nekateri vsebujejo le nekaj genov, spet drugi nekaj sto genov. Pri prokariontih so lahko geni organizirani v obliki operonov, kar pomeni, da je več genov skupaj pod kontrolo enega promotorja. V primeru bakterije Klebsiella oxytoca je genski skupek za fiksacijo dušika sestavljen iz 20 genov, organiziranih v 7 operonov, s skupno dolžino 23,5 kb DNA. Pogosto želimo DNA zapis za določeno lastnost prenesti iz organizma, ki ga je težko gojiti pod laboratorijskimi pogoji, v drugega, vendar je lahko že sama dolžina zapisa omejujoč dejavnik. Precejšnjo težavo predstavlja tudi gostiteljeva regulacija, ki nadzoruje transkripcijsko aktivnost genov preko različnih povratnih zank, pogosto zelo zapletenih in vpetih v širšo mrežo interakcij. Lokusi ostanejo transkripcijsko neodzivni dokler določen kemijski ali fizični signal ne inducira njihovega prepisovanja. Pogosto je opazna presežnost, kar pomeni, da en regulatorni signal lahko kontrolira transkripcijo več operonov, in obratno, en operon je lahko posredno odziven na več različnih signalov. Dodatno se geni lahko med seboj prekrivajo, DNA zapisi imajo lahko več funkcij, pa tudi translacija je lahko regulirana preko malih RNA. Omenjene ovire imajo za posledico, da veliko genskih skupkov ostane kriptičnih, kar pomeni, da laboratorijski pogoji za njihovo aktivnost ostanejo neznanka [1], [2], [3].

== Spreminjanje nativnega zapisa genskih skupkov ==

=== Pristop od zgoraj navzdol ===

Pri spreminjanju genskih skupkov od zgoraj navzdol je pogost pristop manipulacija naravno prisotne regulacije ali dodajanje sintetičnih regulacij v sicer naravni genski zapis. Izbijanje represorja ali povišana ekspresija aktivatorja privede do povečane količine produkta določene biosintetične poti. V kolikor genski skupek sestoji le iz enega operona, vstavitev sintetičnega promotorja pred skupek poveča ekspresijo. Analogno se poveča ekspresija, če vsak gen posebej postavimo pod kontrolo sintetičnega promotorja [1], [4].

=== Pristop od spodaj navzgor ===

Pri pristopu od spodaj navzgor gre za grajenje genskega skupka izključno z uporabo sintetičnih DNA regij, ki so načrtane tako, da eliminirajo vso naravno prisotno regulacijo.

V prvem koraku se s pomočjo računalniških programov pregleda celoten naravni zapis genskega skupka. Sledi odstranitev vse nekodirajoče DNA, neesencialnih genov in zapisov za regulatorje. V naslednjem koraku se gene, ki jim je bila določena pomembna vloga pri končni lastnosti skupka, ponovno prepiše, in sicer uporabi se kodone, ki so čim bolj različni tistim v naravnem zapisu. S tem se ohrani aminokislinsko zaporedje, spremeni pa se zaporedje nukleotidov. Namen tega koraka je uvedba mutacij, ki odstranijo ves morebiten notranji nadzor, kot so spregledani oz. še ne okarakterizirani operatorji, promotorji, sekundarne mRNA strukture, metilacijska mesta, regulacije kodonov in pavzirajoča mesta. Pavzirajoča mesta ležijo za poli(A) repom in so terminatorski signal za RNA polimerazo (II), ki je sicer prisotna v sesalskih celicah, vendar je sorodna RNA polimerazi pri bakterijah [1], [5]. Rekodirana zaporedja se ponovno pregleda z računalniškim programom in v kolikor obstaja še kakšna regija, ki bi imelo regulatorno funkcijo, je le-ta odstranjena. Rekodirane gene se organizira v umetne operone. Posamezni geni v operonu so med seboj ločeni z vmesniki, vsakemu izmed njih pa je dodano tudi sintetično vezavno mesto za ribosom (RBS). Na začetek vsakega operona pa je postavljen sintetični promotor, ki regulira njegovo prepisovanje. Končni rezultat je preoblikovan genski skupek, organiziran v serijo diskretnih, dobro okarakteriziranih genetskih delov z odstranjeno naravno prisotno regulacijo. Sintetična regulacija omogoča kontrolo nad dinamiko in pogoji pod katerimi se skupek izraža [1].

== Genski skupek za fiksacijo dušika ==

Fiksacija dušika je pretvorba dvoatomarnega dušika (N2) iz atmosfere v amonijak (NH3). Mikroorganizmi fiksirajo dušik s pomočjo encima nitrogenaza. Slednji sestoji iz dveh podenot: iz heterotetramernega MoFe proteina (katalizira redukcijo dušika) in homodimernega Fe proteina (donor elektronov za redukcijo dušika). Naravno prisoten zapis za nitrogenazo v K. oxytoca zajema 23,5 kb DNA in kodira 20 proteinov (gradnike obeh podenot nitrogenaze, encime za biosintezo metaloskupkov, šaperone, elektronske transporterje in regulatorje) [6].

== Toleranca nativnega genskega skupka na spremebe v izražanju posameznih genov ==

Pred preoblikovanjem skupka je potrebno preveriti kako povečano izražanje posameznega gena ali več genov skupaj vpliva na končno funkcijo nitrogenaze. Vsak gen ima namreč svoj optimum izražanja, kar pomeni, da preveliko oz. premajhno izražanje negativno vpliva na biološko funkcijo celotnega genskega skupka. V ta namen se iz naravnega zapisa sistematično izbija posamezne gene, katere je nato potrebno zapisati na ločen plazmid, postaviti pod nadzor inducibilnega promotorja (npr. Ptac) in izvesti komplementacijo. Optimum se določi z merjenjem nitrogenazne aktivnosti glede na aktivnost inducibilnega promotorja. Na primer, izmerjeno je bilo, da morajo biti geni, ki kontrolirajo transport elektronov (nifJ in nifF), dokaj nizko izraženi, saj povečano izražanje negativno vpliva na funkcijo nitrogenze. V nasprotju mora biti operon (nifBQ), ki zapisuje za proteine pomembne pri sintezi FeMo jedra in integraciji molibdena, izražen 10-krat močneje kot pa operon (nifUSVWZM), ki zapisuje za proteine pomembne pri tvorbi Fe-S jedra. Gene s podobno stopnjo izražanja se poveže v operon in postavi pod nadzor sintetičnega regulatorja. Pri procesu komplementacije se odkrije tudi negativne regulatorje izražanja in se jih nato izbriše (v dotičnem primeru: nifLA, nifX in nifT) [1], [7].

== Popolnoma preoblikovan genski skupek ==

Posamezen preoblikovan operon so postavili pod nadzor IPTG-inducibilnega promotorja Ptac in izmerili stopnjo izražanja glede na nitrogenazno aktivnost. Preden so operone združili v genski skupek, so jim zamenjali Ptac s T7 promotorji. Moč promotorja vsakega operona so prilagodili glede na prej izmerjeno optimalno stopnjo izražanja pod kontrolo Ptac. Kot referenco so vzeli nfiHDK operon, ki je v K. oxytoca močno izražen (produkt gena nifHDK predstavlja 10% vseh celičnih proteinov). Postavili so ga pod močan T7 promotor divjega tipa. Ostale operone so postavili pod oslabljene T7 promotorje, glede na relativno izražanje proti nifHDK operonu. Manjši kot je optimum izražanja določenega operona, pod bolj oslabljen T7 promotor so ga postavili. Vsak posamezen operon pod kontrolo T7* RNAP je dosegel podobno vrednost izražanja kot pod kontrolo Ptac [1].

Preoblikovan genski skupek za fiksacijo dušika so vgradili na en plazmid, na drug plazmid pa so vgradili krmilnik, ki nadzoruje transkripcijsko aktivnost opisanega genskega skupka.
Krmilnik sestoji iz senzorja in vezja. Senzor je v dotičnem primeru promotor Ptac, ki se inducibilno izraža glede na prisotnost IPTG-ja. Vezje pa predstavlja zapis za mutirano T7 RNA polimerazo (T7* RNAP). Torej ob prisotnosti IPTG-ja, promotor Ptac sproži prepisovanje gena za T7* RNAP, T7 RNAP pa nato začne s prepisovanjem celotnega genskega skupka za fiksacijo dušika [1].

S plazmidom, ki je nosil zapis za preoblikovan genski skupek in plazmidom z zapisom za krmilnik so transformirali sev K. oxytoca, kateremu je bil predhodno izbit naravni zapis za fiksacijo dušika (K. oxytoca nif KO). Sintetični genski skupek za fiksacijo dušika je dosegel 7,4% +/- 2,4% aktivnosti nitrogenaze v primerjavi z divjim tipom. Transformirani sevi so izrabljali N2 iz ozračja kot vir dušika, vendar so rastli 3,5-krat počasneje kot divji tip sevov [1].

Končni preoblikovan genski skupek za fiksacijo dušika, vključno s krmilnikom, je vseboval 89 genetskih delov. Funkcija vsakega dela je natančno definirana in okarakterizirana. Kot pričakovano je nitrogenazna aktivnost sintetičnega skupka nižja od naravno prisotnega, saj gre za spreminjanje evolucijsko zelo ohranjenega sistema [1].

== Menjava krmilnikov za spremembo regulacije ==

Ločba krmilnika in preoblikovanega genskega skupka omogoča enostavno spremembo reguliranja sistema. V kolikor zamenjamo senzor na krmilniku, je le ta odziven na drug signal. Senzor odziven na IPTG (v dotičnem primeru je to promotor Ptac) so zamenjali s Tc-inducibilnim promotorjem Ptet. Ob prisotnosti ustreznega signala je ne glede na izbiro senzorja nastala enka količina NH3 relativno glede na WT sistem (7,2 % +/- 1,7 %). Ustvarili so tudi senzor, ki je bil občutljiv na IPTG in Tc hkrati, kar v praksi pomeni, da so pred zapis za T7* RNAP vstavili tako Ptac kot tudi Ptet. V tem primeru je bila ob prisotnosti le IPTG-ja količina proizvedenega NH3 nekoliko nižja glede na naravno prisoten zapis, in sicer 6,6 % +/- 1,7 %. Načrtovanje krmilnikov tako predstavlja enostaven način regulacije celotnega sistema [1].

Pri naravnem zapisu za fiksacijo dušika v K. oxytoca je amonijak negativni regulator delovaja nitrogenaze. V prisotnosti 17,5 mM amoniaka v gojišču, je aktivnost fiksacije dušika inhibirana. V nasprotju je bila pri preoblikovanem genskem skupku aktivnost nitrogenaze 1,1 % +/- 0,5 %. Aktivnost je nekoliko nižja, vendar ne zaradi inhibicije encima, temveč zaradi znižanja aktivnosti krmilnika za 4,5-krat. V kolikor bi bil krmilnik bolj robusten, naj bi bila aktivnost nitrogenaze nespremenjena [1].

== Prednosti preoblikovanja genskih skupkov ==

Namen preoblikovanja naravnega zapisa je olajšati nadaljnje delo z večgenskimi sistemi, ki imajo po navadi zelo kompleksno genetiko. Ti sistemi so se razvili skozi evolucijo in so pogosto močno regulirani. Regulacija je presežna in vpeta v širšo mrežo interakcij, kar pomeni, da en signal lahko regulira več biokemijskih mehanizmov. Z modeliranjem genskih skupkov, fizičnim ločevanjem in izolacijo posameznih regij poenostavimo sistem. Takšni sistemi lahko služijo kot platforma za raziskave v bazični biologiji. Izolirane regije okarakteriziramo in jim pripišemo funkcijo. Prav tako poenostavljeni genski skupki omogočajo kvantifikacijo vpliva regulatornih interakcij v izolaciji. Izoliranemu sistemu sistematično in po korakih dodajamo nazaj regulacije in spremljamo njihov vpliv, kar privede do odkrivanja novih genetskih in regulatornih modelov [1].

== Viri ==

[1] K. Temme, D. Zhao, and C. A. Voigt, “Refactoring the nitrogen fi xation gene cluster from Klebsiella oxytoca,” vol. 109, no. 18, pp. 2–7, 2012.

[2] E. Zazopoulos et al., “A genomics-guided approach for discovering and expressing cryptic metabolic pathways,” Nat. Biotechnol., vol. 21, no. 2, pp. 187–190, 2003.

[3] A. Ishihama, “Prokaryotic genome regulation: Multifactor promoters, multitarget regulators and hierarchic networks,” FEMS Microbiol. Rev., vol. 34, no. 5, pp. 628–645, 2010.

[4] L. B. Pickens, Y. Tang, and Y.-H. Chooi, “Metabolic Engineering for the Production of Natural Products,” Annu. Rev. Chem. Biomol. Eng., vol. 2, no. 1, pp. 211–236, 2011.

[5] N. Gorkman, S. West, N. J. Proudfoot, "Pouse sites promote transcriptional termination of mammalian RNA polymerase II," Mol Cell Biol., vol. 26, no. 20, pp. 3986-3996, 2006

[6] L. M. Rubio, P. W. Ludden, "Maturation of Nitrogenase: a Biochemical Puzzle," J Bacteriol., vol. 187, no. 2, pp. 405-414, 2005

[7] R. Dixon and D. Kahn, “Genetic regulation of biological nitrogen fixation,” Nat. Rev. Microbiol., vol. 2, no. 8, pp. 621–631, 2004.

Preoblikovanje genskega skupka za fiksacijo dušika bakterije Klebsiella oxytoca

2018-12-10T18:34:19Z

GasperVirant: /* Toleranca nativnega genskega skupka na spremebe v izražanju posameznih genov */

Povzeto po raziskovalnem članku: Refactoring the nitrogen fixation gene cluster from ''Klebsiella oxytoca'' [1]

== Težave pri uporabi naravnih genskih zapisov ==

Veliko funkcij, zanimivih za biotehnološko uporabo, je pogosto zapisanih v genskih skupkih. Velikost genskih skupkov je zelo različna, nekateri vsebujejo le nekaj genov, spet drugi nekaj sto genov. Pri prokariontih so lahko geni organizirani v obliki operonov, kar pomeni, da je več genov skupaj pod kontrolo enega promotorja. V primeru bakterije Klebsiella oxytoca je genski skupek za fiksacijo dušika sestavljen iz 20 genov, organiziranih v 7 operonov, s skupno dolžino 23,5 kb DNA. Pogosto želimo DNA zapis za določeno lastnost prenesti iz organizma, ki ga je težko gojiti pod laboratorijskimi pogoji, v drugega, vendar je lahko že sama dolžina zapisa omejujoč dejavnik. Precejšnjo težavo predstavlja tudi gostiteljeva regulacija, ki nadzoruje transkripcijsko aktivnost genov preko različnih povratnih zank, pogosto zelo zapletenih in vpetih v širšo mrežo interakcij. Lokusi ostanejo transkripcijsko neodzivni dokler določen kemijski ali fizični signal ne inducira njihovega prepisovanja. Pogosto je opazna presežnost, kar pomeni, da en regulatorni signal lahko kontrolira transkripcijo več operonov, in obratno, en operon je lahko posredno odziven na več različnih signalov. Dodatno se geni lahko med seboj prekrivajo, DNA zapisi imajo lahko več funkcij, pa tudi translacija je lahko regulirana preko malih RNA. Omenjene ovire imajo za posledico, da veliko genskih skupkov ostane kriptičnih, kar pomeni, da laboratorijski pogoji za njihovo aktivnost ostanejo neznanka [1], [2], [3].

== Spreminjanje nativnega zapisa genskih skupkov ==

=== Pristop od zgoraj navzdol ===

Pri spreminjanju genskih skupkov od zgoraj navzdol je pogost pristop manipulacija naravno prisotne regulacije ali dodajanje sintetičnih regulacij v sicer naravni genski zapis. Izbijanje represorja ali povišana ekspresija aktivatorja privede do povečane količine produkta določene biosintetične poti. V kolikor genski skupek sestoji le iz enega operona, vstavitev sintetičnega promotorja pred skupek poveča ekspresijo. Analogno se poveča ekspresija, če vsak gen posebej postavimo pod kontrolo sintetičnega promotorja [1], [4].

=== Pristop od spodaj navzgor ===

Pri pristopu od spodaj navzgor gre za grajenje genskega skupka izključno z uporabo sintetičnih DNA regij, ki so načrtane tako, da eliminirajo vso naravno prisotno regulacijo.

V prvem koraku se s pomočjo računalniških programov pregleda celoten naravni zapis genskega skupka. Sledi odstranitev vse nekodirajoče DNA, neesencialnih genov in zapisov za regulatorje. V naslednjem koraku se gene, ki jim je bila določena pomembna vloga pri končni lastnosti skupka, ponovno prepiše, in sicer uporabi se kodone, ki so čim bolj različni tistim v naravnem zapisu. S tem se ohrani aminokislinsko zaporedje, spremeni pa se zaporedje nukleotidov. Namen tega koraka je uvedba mutacij, ki odstranijo ves morebiten notranji nadzor, kot so spregledani oz. še ne okarakterizirani operatorji, promotorji, sekundarne mRNA strukture, metilacijska mesta, regulacije kodonov in pavzirajoča mesta. Pavzirajoča mesta ležijo za poli(A) repom in so terminatorski signal za RNA polimerazo (II), ki je sicer prisotna v sesalskih celicah, vendar je sorodna RNA polimerazi pri bakterijah [1], [5]. Rekodirana zaporedja se ponovno pregleda z računalniškim programom in v kolikor obstaja še kakšna regija, ki bi imelo regulatorno funkcijo, je le-ta odstranjena. Rekodirane gene se organizira v umetne operone. Posamezni geni v operonu so med seboj ločeni z vmesniki, vsakemu izmed njih pa je dodano tudi sintetično vezavno mesto za ribosom (RBS). Na začetek vsakega operona pa je postavljen sintetični promotor, ki regulira njegovo prepisovanje. Končni rezultat je preoblikovan genski skupek, organiziran v serijo diskretnih, dobro okarakteriziranih genetskih delov z odstranjeno naravno prisotno regulacijo. Sintetična regulacija omogoča kontrolo nad dinamiko in pogoji pod katerimi se skupek izraža [1].

== Genski skupek za fiksacijo dušika ==

Fiksacija dušika je pretvorba dvoatomarnega dušika (N2) iz atmosfere v amonijak (NH3). Mikroorganizmi fiksirajo dušik s pomočjo encima nitrogenaza. Slednji sestoji iz dveh podenot: iz heterotetramernega MoFe proteina (katalizira redukcijo dušika) in homodimernega Fe proteina (donor elektronov za redukcijo dušika). Naravno prisoten zapis za nitrogenazo v K. oxytoca zajema 23,5 kb DNA in kodira 20 proteinov (gradnike obeh podenot nitrogenaze, encime za biosintezo metaloskupkov, šaperone, elektronske transporterje in regulatorje) [6].

== Toleranca nativnega genskega skupka na spremebe v izražanju posameznih genov ==

Pred preoblikovanjem skupka je potrebno preveriti kako povečano izražanje posameznega gena ali več genov skupaj vpliva na končno funkcijo nitrogenaze. Vsak gen ima namreč svoj optimum izražanja, kar pomeni, da preveliko oz. premajhno izražanje negativno vpliva na biološko funkcijo celotnega genskega skupka. V ta namen se iz naravnega zapisa sistematično izbija posamezne gene, katere je nato potrebno zapisati na ločen plazmid, postaviti pod nadzor inducibilnega promotorja (npr. Ptac) in izvesti komplementacijo. Optimum se določi z merjenjem nitrogenazne aktivnosti glede na aktivnost inducibilnega promotorja. Na primer, izmerjeno je bilo, da morajo biti geni, ki kontrolirajo transport elektronov (nifJ in nifF), dokaj nizko izraženi, saj povečano izražanje negativno vpliva na funkcijo nitrogenze. V nasprotju mora biti operon (nifBQ), ki zapisuje za proteine pomembne pri sintezi FeMo jedra in integraciji molibdena, izražen 10-krat močneje kot pa operon (nifUSVWZM), ki zapisuje za proteine pomembne pri tvorbi Fe-S jedra. Gene s podobno stopnjo izražanja se poveže v operon in postavi pod nadzor sintetičnega regulatorja. Pri procesu komplementacije se odkrije tudi negativne regulatorje izražanja in se jih nato izbriše (v dotičnem primeru: nifLA, nifX in nifT) [1], [7].

== Popolnoma preoblikovan genski skupek ==

Posamezen preoblikovan operon so postavili pod nadzor IPTG-inducibilnega promotorja Ptac in izmerili stopnjo izražanja glede na nitrogenazno aktivnost. Preden so operone združili v genski skupek, so jim zamenjali Ptac s T7 promotorji. Moč promotorja vsakega operona so prilagodili glede na prej izmerjeno optimalno stopnjo izražanja pod kontrolo Ptac. Kot referenco so vzeli nfiHDK operon, ki je v K. oxytoca močno izražen (produkt gena nifHDK predstavlja 10% vseh celičnih proteinov). Postavili so ga pod močan T7 promotor divjega tipa. Ostale operone so postavili pod oslabljene T7 promotorje, glede na relativno izražanje proti nifHDK operonu. Manjši kot je optimum izražanja določenega operona, pod bolj oslabljen T7 promotor so ga postavili. Vsak posamezen operon pod kontrolo T7* RNAP je dosegel podobno vrednost izražanja kot pod kontrolo Ptac [1].

Preoblikovan genski skupek za fiksacijo dušika so vgradili na en plazmid, na drug plazmid pa so vgradili krmilnik, ki nadzoruje transkripcijsko aktivnost opisanega genskega skupka.
Krmilnik sestoji iz senzorja in vezja. Senzor je v dotičnem primeru promotor Ptac, ki se inducibilno izraža glede na prisotnost IPTG-ja. Vezje pa predstavlja zapis za mutirano T7 RNA polimerazo (T7* RNAP). Torej ob prisotnosti IPTG-ja, promotor Ptac sproži prepisovanje gena za T7* RNAP, T7 RNAP pa nato začne s prepisovanjem celotnega genskega skupka za fiksacijo dušika [1].

S plazmidom, ki je nosil zapis za preoblikovan genski skupek in plazmidom z zapisom za krmilnik so transformirali sev K. oxytoca, kateremu je bil predhodno izbit naravni zapis za fiksacijo dušika (K. oxytoca nif KO). Sintetični genski skupek za fiksacijo dušika je dosegel 7,4% +/- 2,4% aktivnosti nitrogenaze v primerjavi z divjim tipom. Transformirani sevi so izrabljali N2 iz ozračja kot vir dušika, vendar so rastli 3,5-krat počasneje kot divji tip sevov [1].

Končni preoblikovan genski skupek za fiksacijo dušika, vključno s krmilnikom, je vseboval 89 genetskih delov. Funkcija vsakega dela je natančno definirana in okarakterizirana. Kot pričakovano je nitrogenazna aktivnost sintetičnega skupka nižja od naravno prisotnega, saj gre za spreminjanje evolucijsko zelo ohranjenega sistema [1].

== Menjava krmilnikov za spremembo regulacije ==

Ločba krmilnika in preoblikovanega genskega skupka omogoča enostavno spremembo reguliranja sistema. V kolikor zamenjamo senzor na krmilniku, je le ta odziven na drug signal. Senzor odziven na IPTG (v dotičnem primeru je to promotor Ptac) so zamenjali s Tc-inducibilnim promotorjem Ptet. Ob prisotnosti ustreznega signala je ne glede na izbiro senzorja nastala enka količina NH3 relativno glede na WT sistem (7,2 % +/- 1,7 %). Ustvarili so tudi senzor, ki je bil občutljiv na IPTG in Tc hkrati, kar v praksi pomeni, da so pred zapis za T7* RNAP vstavili tako Ptac kot tudi Ptet. V tem primeru je bila ob prisotnosti le IPTG-ja količina proizvedenega NH3 nekoliko nižja glede na naravno prisoten zapis, in sicer 6,6 % +/- 1,7 %. Načrtovanje krmilnikov tako predstavlja enostaven način regulacije celotnega sistema [1].

Pri naravnem zapisu za fiksacijo dušika v K. oxytoca je amonijak negativni regulator delovaja nitrogenaze. V prisotnosti 17,5 mM amoniaka v gojišču, je aktivnost fiksacije dušika inhibirana. V nasprotju je bila pri preoblikovanem genskem skupku aktivnost nitrogenaze 1,1 % +/- 0,5 %. Aktivnost je nekoliko nižja, vendar ne zaradi inhibicije encima, temveč zaradi znižanja aktivnosti krmilnika za 4,5-krat. V kolikor bi bil krmilnik bolj robusten, naj bi bila aktivnost nitrogenaze nespremenjena [1].

== Prednosti preoblikovanja genskih skupkov ==

Namen preoblikovanja naravnega zapisa je olajšati nadaljnje delo z večgenskimi sistemi, ki imajo po navadi zelo kompleksno genetiko. Ti sistemi so se razvili skozi evolucijo in so pogosto močno regulirani. Regulacija je presežna in vpeta v širšo mrežo interakcij, kar pomeni, da en signal lahko regulira več biokemijskih mehanizmov. Z modeliranjem genskih skupkov, fizičnim ločevanjem in izolacijo posameznih regij poenostavimo sistem. Takšni sistemi lahko služijo kot platforma za raziskave v bazični biologiji. Izolirane regije okarakteriziramo in jim pripišemo funkcijo. Prav tako poenostavljeni genski skupki omogočajo kvantifikacijo vpliva regulatornih interakcij v izolaciji. Izoliranemu sistemu sistematično in po korakih dodajamo nazaj regulacije in spremljamo njihov vpliv, kar privede do odkrivanja novih genetskih in regulatornih modelov [1].

== Viri ==

[1] K. Temme, D. Zhao, and C. A. Voigt, “Refactoring the nitrogen fi xation gene cluster from Klebsiella oxytoca,” vol. 109, no. 18, pp. 2–7, 2012.

[2] E. Zazopoulos et al., “A genomics-guided approach for discovering and expressing cryptic metabolic pathways,” Nat. Biotechnol., vol. 21, no. 2, pp. 187–190, 2003.

[3] A. Ishihama, “Prokaryotic genome regulation: Multifactor promoters, multitarget regulators and hierarchic networks,” FEMS Microbiol. Rev., vol. 34, no. 5, pp. 628–645, 2010.

[4] L. B. Pickens, Y. Tang, and Y.-H. Chooi, “Metabolic Engineering for the Production of Natural Products,” Annu. Rev. Chem. Biomol. Eng., vol. 2, no. 1, pp. 211–236, 2011.

[5] N. Gorkman, S. West, N. J. Proudfoot, "Pouse sites promote transcriptional termination of mammalian RNA polymerase II," Mol Cell Biol., vol. 26, no. 20, pp. 3986-3996, 2006

[6] L. M. Rubio, P. W. Ludden, "Maturation of Nitrogenase: a Biochemical Puzzle," J Bacteriol., vol. 187, no. 2, pp. 405-414, 2005

[7] R. Dixon and D. Kahn, “Genetic regulation of biological nitrogen fixation,” Nat. Rev. Microbiol., vol. 2, no. 8, pp. 621–631, 2004.

Preoblikovanje genskega skupka za fiksacijo dušika bakterije Klebsiella oxytoca

2018-12-10T18:33:09Z

GasperVirant: /* Popolnoma preoblikovan genski skupek */

Povzeto po raziskovalnem članku: Refactoring the nitrogen fixation gene cluster from ''Klebsiella oxytoca'' [1]

== Težave pri uporabi naravnih genskih zapisov ==

Veliko funkcij, zanimivih za biotehnološko uporabo, je pogosto zapisanih v genskih skupkih. Velikost genskih skupkov je zelo različna, nekateri vsebujejo le nekaj genov, spet drugi nekaj sto genov. Pri prokariontih so lahko geni organizirani v obliki operonov, kar pomeni, da je več genov skupaj pod kontrolo enega promotorja. V primeru bakterije Klebsiella oxytoca je genski skupek za fiksacijo dušika sestavljen iz 20 genov, organiziranih v 7 operonov, s skupno dolžino 23,5 kb DNA. Pogosto želimo DNA zapis za določeno lastnost prenesti iz organizma, ki ga je težko gojiti pod laboratorijskimi pogoji, v drugega, vendar je lahko že sama dolžina zapisa omejujoč dejavnik. Precejšnjo težavo predstavlja tudi gostiteljeva regulacija, ki nadzoruje transkripcijsko aktivnost genov preko različnih povratnih zank, pogosto zelo zapletenih in vpetih v širšo mrežo interakcij. Lokusi ostanejo transkripcijsko neodzivni dokler določen kemijski ali fizični signal ne inducira njihovega prepisovanja. Pogosto je opazna presežnost, kar pomeni, da en regulatorni signal lahko kontrolira transkripcijo več operonov, in obratno, en operon je lahko posredno odziven na več različnih signalov. Dodatno se geni lahko med seboj prekrivajo, DNA zapisi imajo lahko več funkcij, pa tudi translacija je lahko regulirana preko malih RNA. Omenjene ovire imajo za posledico, da veliko genskih skupkov ostane kriptičnih, kar pomeni, da laboratorijski pogoji za njihovo aktivnost ostanejo neznanka [1], [2], [3].

== Spreminjanje nativnega zapisa genskih skupkov ==

=== Pristop od zgoraj navzdol ===

Pri spreminjanju genskih skupkov od zgoraj navzdol je pogost pristop manipulacija naravno prisotne regulacije ali dodajanje sintetičnih regulacij v sicer naravni genski zapis. Izbijanje represorja ali povišana ekspresija aktivatorja privede do povečane količine produkta določene biosintetične poti. V kolikor genski skupek sestoji le iz enega operona, vstavitev sintetičnega promotorja pred skupek poveča ekspresijo. Analogno se poveča ekspresija, če vsak gen posebej postavimo pod kontrolo sintetičnega promotorja [1], [4].

=== Pristop od spodaj navzgor ===

Pri pristopu od spodaj navzgor gre za grajenje genskega skupka izključno z uporabo sintetičnih DNA regij, ki so načrtane tako, da eliminirajo vso naravno prisotno regulacijo.

V prvem koraku se s pomočjo računalniških programov pregleda celoten naravni zapis genskega skupka. Sledi odstranitev vse nekodirajoče DNA, neesencialnih genov in zapisov za regulatorje. V naslednjem koraku se gene, ki jim je bila določena pomembna vloga pri končni lastnosti skupka, ponovno prepiše, in sicer uporabi se kodone, ki so čim bolj različni tistim v naravnem zapisu. S tem se ohrani aminokislinsko zaporedje, spremeni pa se zaporedje nukleotidov. Namen tega koraka je uvedba mutacij, ki odstranijo ves morebiten notranji nadzor, kot so spregledani oz. še ne okarakterizirani operatorji, promotorji, sekundarne mRNA strukture, metilacijska mesta, regulacije kodonov in pavzirajoča mesta. Pavzirajoča mesta ležijo za poli(A) repom in so terminatorski signal za RNA polimerazo (II), ki je sicer prisotna v sesalskih celicah, vendar je sorodna RNA polimerazi pri bakterijah [1], [5]. Rekodirana zaporedja se ponovno pregleda z računalniškim programom in v kolikor obstaja še kakšna regija, ki bi imelo regulatorno funkcijo, je le-ta odstranjena. Rekodirane gene se organizira v umetne operone. Posamezni geni v operonu so med seboj ločeni z vmesniki, vsakemu izmed njih pa je dodano tudi sintetično vezavno mesto za ribosom (RBS). Na začetek vsakega operona pa je postavljen sintetični promotor, ki regulira njegovo prepisovanje. Končni rezultat je preoblikovan genski skupek, organiziran v serijo diskretnih, dobro okarakteriziranih genetskih delov z odstranjeno naravno prisotno regulacijo. Sintetična regulacija omogoča kontrolo nad dinamiko in pogoji pod katerimi se skupek izraža [1].

== Genski skupek za fiksacijo dušika ==

Fiksacija dušika je pretvorba dvoatomarnega dušika (N2) iz atmosfere v amonijak (NH3). Mikroorganizmi fiksirajo dušik s pomočjo encima nitrogenaza. Slednji sestoji iz dveh podenot: iz heterotetramernega MoFe proteina (katalizira redukcijo dušika) in homodimernega Fe proteina (donor elektronov za redukcijo dušika). Naravno prisoten zapis za nitrogenazo v K. oxytoca zajema 23,5 kb DNA in kodira 20 proteinov (gradnike obeh podenot nitrogenaze, encime za biosintezo metaloskupkov, šaperone, elektronske transporterje in regulatorje) [6].

== Toleranca nativnega genskega skupka na spremebe v izražanju posameznih genov ==

Pred preoblikovanjem skupka je potrebno preveriti kako povečano izražanje posameznega gena ali več genov skupaj vpliva na končno funkcijo nitrogenaze. Vsak gen ima namreč svoj optimum izražanja, kar pomeni, da preveliko oz. premajhno izražanje negativno vpliva na biološko funkcijo celotnega genskega skupka. V ta namen se iz naravnega zapisa sistematično izbija posamezne gene, katere je nato potrebno zapisati na ločen plazmid, postaviti pod nadzor inducibilnega promotorja (npr. Ptac) in izvesti komplementacijo. Optimum se določi z merjenjem nitrogenazne aktivnosti glede na aktivnost inducibilnega promotorja. Na primer, izmerjeno je bilo, da morajo biti geni, ki kontrolirajo transport elektronov (nifJ in nifF), dokaj nizko izraženi, saj povečano izražanje negativno vpliva na funkcijo nitrogenze. V nasprotju mora biti operon (nifBQ), ki zapisuje za proteine pomembne pri sintezi FeMo jedra in integraciji molibdena, izražen 10-krat močneje kot pa operon (nifUSVWZM), ki zapisuje za proteine pomembne pri tvorbi Fe-S jedra. Gene s podobno stopnjo izražanja se poveže v operon in postavi pod nadzor sintetičnega regulatorja. Pri procesu komplementacije se odkrije tudi negativne regulatorje izražanja in se jih nato izbriše (v dotičnem primeru: nifLA, nifX in nifT) [1], [7].

== Popolnoma preoblikovan genski skupek ==

Posamezen preoblikovan operon so postavili pod nadzor IPTG-inducibilnega promotorja Ptac in izmerili stopnjo izražanja glede na nitrogenazno aktivnost. Preden so operone združili v genski skupek, so jim zamenjali Ptac s T7 promotorji. Moč promotorja vsakega operona so prilagodili glede na prej izmerjeno optimalno stopnjo izražanja pod kontrolo Ptac. Kot referenco so vzeli nfiHDK operon, ki je v K. oxytoca močno izražen (produkt gena nifHDK predstavlja 10% vseh celičnih proteinov). Postavili so ga pod močan T7 promotor divjega tipa. Ostale operone so postavili pod oslabljene T7 promotorje, glede na relativno izražanje proti nifHDK operonu. Manjši kot je optimum izražanja določenega operona, pod bolj oslabljen T7 promotor so ga postavili. Vsak posamezen operon pod kontrolo T7* RNAP je dosegel podobno vrednost izražanja kot pod kontrolo Ptac [1].

Preoblikovan genski skupek za fiksacijo dušika so vgradili na en plazmid, na drug plazmid pa so vgradili krmilnik, ki nadzoruje transkripcijsko aktivnost opisanega genskega skupka.
Krmilnik sestoji iz senzorja in vezja. Senzor je v dotičnem primeru promotor Ptac, ki se inducibilno izraža glede na prisotnost IPTG-ja. Vezje pa predstavlja zapis za mutirano T7 RNA polimerazo (T7* RNAP). Torej ob prisotnosti IPTG-ja, promotor Ptac sproži prepisovanje gena za T7* RNAP, T7 RNAP pa nato začne s prepisovanjem celotnega genskega skupka za fiksacijo dušika [1].

S plazmidom, ki je nosil zapis za preoblikovan genski skupek in plazmidom z zapisom za krmilnik so transformirali sev K. oxytoca, kateremu je bil predhodno izbit naravni zapis za fiksacijo dušika (K. oxytoca nif KO). Sintetični genski skupek za fiksacijo dušika je dosegel 7,4% +/- 2,4% aktivnosti nitrogenaze v primerjavi z divjim tipom. Transformirani sevi so izrabljali N2 iz ozračja kot vir dušika, vendar so rastli 3,5-krat počasneje kot divji tip sevov [1].

Končni preoblikovan genski skupek za fiksacijo dušika, vključno s krmilnikom, je vseboval 89 genetskih delov. Funkcija vsakega dela je natančno definirana in okarakterizirana. Kot pričakovano je nitrogenazna aktivnost sintetičnega skupka nižja od naravno prisotnega, saj gre za spreminjanje evolucijsko zelo ohranjenega sistema [1].

== Menjava krmilnikov za spremembo regulacije ==

Ločba krmilnika in preoblikovanega genskega skupka omogoča enostavno spremembo reguliranja sistema. V kolikor zamenjamo senzor na krmilniku, je le ta odziven na drug signal. Senzor odziven na IPTG (v dotičnem primeru je to promotor Ptac) so zamenjali s Tc-inducibilnim promotorjem Ptet. Ob prisotnosti ustreznega signala je ne glede na izbiro senzorja nastala enka količina NH3 relativno glede na WT sistem (7,2 % +/- 1,7 %). Ustvarili so tudi senzor, ki je bil občutljiv na IPTG in Tc hkrati, kar v praksi pomeni, da so pred zapis za T7* RNAP vstavili tako Ptac kot tudi Ptet. V tem primeru je bila ob prisotnosti le IPTG-ja količina proizvedenega NH3 nekoliko nižja glede na naravno prisoten zapis, in sicer 6,6 % +/- 1,7 %. Načrtovanje krmilnikov tako predstavlja enostaven način regulacije celotnega sistema [1].

Pri naravnem zapisu za fiksacijo dušika v K. oxytoca je amonijak negativni regulator delovaja nitrogenaze. V prisotnosti 17,5 mM amoniaka v gojišču, je aktivnost fiksacije dušika inhibirana. V nasprotju je bila pri preoblikovanem genskem skupku aktivnost nitrogenaze 1,1 % +/- 0,5 %. Aktivnost je nekoliko nižja, vendar ne zaradi inhibicije encima, temveč zaradi znižanja aktivnosti krmilnika za 4,5-krat. V kolikor bi bil krmilnik bolj robusten, naj bi bila aktivnost nitrogenaze nespremenjena [1].

== Prednosti preoblikovanja genskih skupkov ==

Namen preoblikovanja naravnega zapisa je olajšati nadaljnje delo z večgenskimi sistemi, ki imajo po navadi zelo kompleksno genetiko. Ti sistemi so se razvili skozi evolucijo in so pogosto močno regulirani. Regulacija je presežna in vpeta v širšo mrežo interakcij, kar pomeni, da en signal lahko regulira več biokemijskih mehanizmov. Z modeliranjem genskih skupkov, fizičnim ločevanjem in izolacijo posameznih regij poenostavimo sistem. Takšni sistemi lahko služijo kot platforma za raziskave v bazični biologiji. Izolirane regije okarakteriziramo in jim pripišemo funkcijo. Prav tako poenostavljeni genski skupki omogočajo kvantifikacijo vpliva regulatornih interakcij v izolaciji. Izoliranemu sistemu sistematično in po korakih dodajamo nazaj regulacije in spremljamo njihov vpliv, kar privede do odkrivanja novih genetskih in regulatornih modelov [1].

== Viri ==

[1] K. Temme, D. Zhao, and C. A. Voigt, “Refactoring the nitrogen fi xation gene cluster from Klebsiella oxytoca,” vol. 109, no. 18, pp. 2–7, 2012.

[2] E. Zazopoulos et al., “A genomics-guided approach for discovering and expressing cryptic metabolic pathways,” Nat. Biotechnol., vol. 21, no. 2, pp. 187–190, 2003.

[3] A. Ishihama, “Prokaryotic genome regulation: Multifactor promoters, multitarget regulators and hierarchic networks,” FEMS Microbiol. Rev., vol. 34, no. 5, pp. 628–645, 2010.

[4] L. B. Pickens, Y. Tang, and Y.-H. Chooi, “Metabolic Engineering for the Production of Natural Products,” Annu. Rev. Chem. Biomol. Eng., vol. 2, no. 1, pp. 211–236, 2011.

[5] N. Gorkman, S. West, N. J. Proudfoot, "Pouse sites promote transcriptional termination of mammalian RNA polymerase II," Mol Cell Biol., vol. 26, no. 20, pp. 3986-3996, 2006

[6] L. M. Rubio, P. W. Ludden, "Maturation of Nitrogenase: a Biochemical Puzzle," J Bacteriol., vol. 187, no. 2, pp. 405-414, 2005

[7] R. Dixon and D. Kahn, “Genetic regulation of biological nitrogen fixation,” Nat. Rev. Microbiol., vol. 2, no. 8, pp. 621–631, 2004.

Seminarji SB 2018/19

2018-12-10T18:26:56Z

GasperVirant:

Preoblikovanje genskega skupka za fiksacijo dušika bakterije Klebsiella oxytoca

2018-12-10T18:23:48Z

GasperVirant: New page: Povzeto po raziskovalnem članku: Refactoring the nitrogen fixation gene cluster from ''Klebsiella oxytoca'' [1] == Težave pri uporabi naravnih genskih zapisov == Veliko funkcij, zanim...

Povzeto po raziskovalnem članku: Refactoring the nitrogen fixation gene cluster from ''Klebsiella oxytoca'' [1]

== Težave pri uporabi naravnih genskih zapisov ==

Veliko funkcij, zanimivih za biotehnološko uporabo, je pogosto zapisanih v genskih skupkih. Velikost genskih skupkov je zelo različna, nekateri vsebujejo le nekaj genov, spet drugi nekaj sto genov. Pri prokariontih so lahko geni organizirani v obliki operonov, kar pomeni, da je več genov skupaj pod kontrolo enega promotorja. V primeru bakterije Klebsiella oxytoca je genski skupek za fiksacijo dušika sestavljen iz 20 genov, organiziranih v 7 operonov, s skupno dolžino 23,5 kb DNA. Pogosto želimo DNA zapis za določeno lastnost prenesti iz organizma, ki ga je težko gojiti pod laboratorijskimi pogoji, v drugega, vendar je lahko že sama dolžina zapisa omejujoč dejavnik. Precejšnjo težavo predstavlja tudi gostiteljeva regulacija, ki nadzoruje transkripcijsko aktivnost genov preko različnih povratnih zank, pogosto zelo zapletenih in vpetih v širšo mrežo interakcij. Lokusi ostanejo transkripcijsko neodzivni dokler določen kemijski ali fizični signal ne inducira njihovega prepisovanja. Pogosto je opazna presežnost, kar pomeni, da en regulatorni signal lahko kontrolira transkripcijo več operonov, in obratno, en operon je lahko posredno odziven na več različnih signalov. Dodatno se geni lahko med seboj prekrivajo, DNA zapisi imajo lahko več funkcij, pa tudi translacija je lahko regulirana preko malih RNA. Omenjene ovire imajo za posledico, da veliko genskih skupkov ostane kriptičnih, kar pomeni, da laboratorijski pogoji za njihovo aktivnost ostanejo neznanka [1], [2], [3].

== Spreminjanje nativnega zapisa genskih skupkov ==

=== Pristop od zgoraj navzdol ===

Pri spreminjanju genskih skupkov od zgoraj navzdol je pogost pristop manipulacija naravno prisotne regulacije ali dodajanje sintetičnih regulacij v sicer naravni genski zapis. Izbijanje represorja ali povišana ekspresija aktivatorja privede do povečane količine produkta določene biosintetične poti. V kolikor genski skupek sestoji le iz enega operona, vstavitev sintetičnega promotorja pred skupek poveča ekspresijo. Analogno se poveča ekspresija, če vsak gen posebej postavimo pod kontrolo sintetičnega promotorja [1], [4].

=== Pristop od spodaj navzgor ===

Pri pristopu od spodaj navzgor gre za grajenje genskega skupka izključno z uporabo sintetičnih DNA regij, ki so načrtane tako, da eliminirajo vso naravno prisotno regulacijo.

V prvem koraku se s pomočjo računalniških programov pregleda celoten naravni zapis genskega skupka. Sledi odstranitev vse nekodirajoče DNA, neesencialnih genov in zapisov za regulatorje. V naslednjem koraku se gene, ki jim je bila določena pomembna vloga pri končni lastnosti skupka, ponovno prepiše, in sicer uporabi se kodone, ki so čim bolj različni tistim v naravnem zapisu. S tem se ohrani aminokislinsko zaporedje, spremeni pa se zaporedje nukleotidov. Namen tega koraka je uvedba mutacij, ki odstranijo ves morebiten notranji nadzor, kot so spregledani oz. še ne okarakterizirani operatorji, promotorji, sekundarne mRNA strukture, metilacijska mesta, regulacije kodonov in pavzirajoča mesta. Pavzirajoča mesta ležijo za poli(A) repom in so terminatorski signal za RNA polimerazo (II), ki je sicer prisotna v sesalskih celicah, vendar je sorodna RNA polimerazi pri bakterijah [1], [5]. Rekodirana zaporedja se ponovno pregleda z računalniškim programom in v kolikor obstaja še kakšna regija, ki bi imelo regulatorno funkcijo, je le-ta odstranjena. Rekodirane gene se organizira v umetne operone. Posamezni geni v operonu so med seboj ločeni z vmesniki, vsakemu izmed njih pa je dodano tudi sintetično vezavno mesto za ribosom (RBS). Na začetek vsakega operona pa je postavljen sintetični promotor, ki regulira njegovo prepisovanje. Končni rezultat je preoblikovan genski skupek, organiziran v serijo diskretnih, dobro okarakteriziranih genetskih delov z odstranjeno naravno prisotno regulacijo. Sintetična regulacija omogoča kontrolo nad dinamiko in pogoji pod katerimi se skupek izraža [1].

== Genski skupek za fiksacijo dušika ==

Fiksacija dušika je pretvorba dvoatomarnega dušika (N2) iz atmosfere v amonijak (NH3). Mikroorganizmi fiksirajo dušik s pomočjo encima nitrogenaza. Slednji sestoji iz dveh podenot: iz heterotetramernega MoFe proteina (katalizira redukcijo dušika) in homodimernega Fe proteina (donor elektronov za redukcijo dušika). Naravno prisoten zapis za nitrogenazo v K. oxytoca zajema 23,5 kb DNA in kodira 20 proteinov (gradnike obeh podenot nitrogenaze, encime za biosintezo metaloskupkov, šaperone, elektronske transporterje in regulatorje) [6].

== Toleranca nativnega genskega skupka na spremebe v izražanju posameznih genov ==

Pred preoblikovanjem skupka je potrebno preveriti kako povečano izražanje posameznega gena ali več genov skupaj vpliva na končno funkcijo nitrogenaze. Vsak gen ima namreč svoj optimum izražanja, kar pomeni, da preveliko oz. premajhno izražanje negativno vpliva na biološko funkcijo celotnega genskega skupka. V ta namen se iz naravnega zapisa sistematično izbija posamezne gene, katere je nato potrebno zapisati na ločen plazmid, postaviti pod nadzor inducibilnega promotorja (npr. Ptac) in izvesti komplementacijo. Optimum se določi z merjenjem nitrogenazne aktivnosti glede na aktivnost inducibilnega promotorja. Na primer, izmerjeno je bilo, da morajo biti geni, ki kontrolirajo transport elektronov (nifJ in nifF), dokaj nizko izraženi, saj povečano izražanje negativno vpliva na funkcijo nitrogenze. V nasprotju mora biti operon (nifBQ), ki zapisuje za proteine pomembne pri sintezi FeMo jedra in integraciji molibdena, izražen 10-krat močneje kot pa operon (nifUSVWZM), ki zapisuje za proteine pomembne pri tvorbi Fe-S jedra. Gene s podobno stopnjo izražanja se poveže v operon in postavi pod nadzor sintetičnega regulatorja. Pri procesu komplementacije se odkrije tudi negativne regulatorje izražanja in se jih nato izbriše (v dotičnem primeru: nifLA, nifX in nifT) [1], [7].

== Popolnoma preoblikovan genski skupek ==

Posamezen preoblikovan operon so postavili pod nadzor IPTG-inducibilnega promotorja Ptac in izmerili stopnjo izražanja glede na nitrogenazno aktivnost. Preden so operone združili v genski skupek, so jim zamenjali Ptac s T7 promotorji. Moč promotorja vsakega operona so prilagodili glede na prej izmerjeno optimalno stopnjo izražanja pod kontrolo Ptac. Kot referenco so vzeli nfiHDK operon, ki je v K. oxytoca močno izražen (produkt gena nifHDK predstavlja 10% vseh celičnih proteinov). Postavili so ga pod močan T7 promotor divjega tipa. Ostale operone so postavili pod oslabljene T7 promotorje, glede na relativno izražanje proti nifHDK operonu. Manjši kot je optimum izražanja določenega operona, pod bolj oslabljen T7 promotor so ga postavili. Vsak posamezen operon pod kontrolo T7* RNAP je dosegel podobno vrednost izražanja kot pod kontrolo Ptac [1].

Preoblikovan genski skupek za fiksacijo dušika so vgradili na en plazmid, na drug plazmid pa so vgradili krmilnik, ki nadzoruje transkripcijsko aktivnost opisanega genskega skupka.
Krmilnik sestoji iz senzorja in vezja. Senzor je v dotičnem primeru promotor Ptac, ki se inducibilno izraža glede na prisotnost IPTG-ja. Vezje pa predstavlja zapis za mutirano T7 RNA polimerazo (T7* RNAP). Torej ob prisotnosti IPTG-ja, promotor Ptac sproži prepisovanje gena za T7* RNAP, T7 RNAP pa nato začne s prepisovanjem celotnega genskega skupka za fiksacijo dušika [1].

S plazmidom, ki je nosil zapis za preoblikovan genski skupek in plazmidom z zapisom za krmilnik so transformirali sev K. oxytoca, kateremu je bil predhodno izbit naravni zapis za fiksacijo dušika (K. oxytoca nif KO). Sintetični genski skupek za fiksacijo dušika je dosegel 7,4% +/- 2,4% aktivnosti nitrogenaze v primerjavi z divjim tipom. Transformirani sevi so izrabljali N2 iz ozračja kot vir dušika, vendar so rastli 3,5-krat počasneje kot divji tip sevov [1].

Končni preoblikovan genski skupek za fiksacijo dušika, vključno s krmilnikom, je vseboval 89 genetskih delov. Funkcija vsakega dela je natančno definirana in okarakterizirana. Kot pričakovano je nitrogenazna aktivnost sintetičnega skupka nižja od naravno prisotnega, saj gre za spreminjanje evolucijsko zelo ohranjenega sistema [1].

== Menjava krmilnikov za spremembo regulacije ==

Ločba krmilnika in preoblikovanega genskega skupka omogoča enostavno spremembo reguliranja sistema. V kolikor zamenjamo senzor na krmilniku, je le ta odziven na drug signal. Senzor odziven na IPTG (v dotičnem primeru je to promotor Ptac) so zamenjali s Tc-inducibilnim promotorjem Ptet. Ob prisotnosti ustreznega signala je ne glede na izbiro senzorja nastala enka količina NH3 relativno glede na WT sistem (7,2 % +/- 1,7 %). Ustvarili so tudi senzor, ki je bil občutljiv na IPTG in Tc hkrati, kar v praksi pomeni, da so pred zapis za T7* RNAP vstavili tako Ptac kot tudi Ptet. V tem primeru je bila ob prisotnosti le IPTG-ja količina proizvedenega NH3 nekoliko nižja glede na naravno prisoten zapis, in sicer 6,6 % +/- 1,7 %. Načrtovanje krmilnikov tako predstavlja enostaven način regulacije celotnega sistema [1].

Pri naravnem zapisu za fiksacijo dušika v K. oxytoca je amonijak negativni regulator delovaja nitrogenaze. V prisotnosti 17,5 mM amoniaka v gojišču, je aktivnost fiksacije dušika inhibirana. V nasprotju je bila pri preoblikovanem genskem skupku aktivnost nitrogenaze 1,1 % +/- 0,5 %. Aktivnost je nekoliko nižja, vendar ne zaradi inhibicije encima, temveč zaradi znižanja aktivnosti krmilnika za 4,5-krat. V kolikor bi bil krmilnik bolj robusten, naj bi bila aktivnost nitrogenaze nespremenjena [1].

== Prednosti preoblikovanja genskih skupkov ==

Namen preoblikovanja naravnega zapisa je olajšati nadaljnje delo z večgenskimi sistemi, ki imajo po navadi zelo kompleksno genetiko. Ti sistemi so se razvili skozi evolucijo in so pogosto močno regulirani. Regulacija je presežna in vpeta v širšo mrežo interakcij, kar pomeni, da en signal lahko regulira več biokemijskih mehanizmov. Z modeliranjem genskih skupkov, fizičnim ločevanjem in izolacijo posameznih regij poenostavimo sistem. Takšni sistemi lahko služijo kot platforma za raziskave v bazični biologiji. Izolirane regije okarakteriziramo in jim pripišemo funkcijo. Prav tako poenostavljeni genski skupki omogočajo kvantifikacijo vpliva regulatornih interakcij v izolaciji. Izoliranemu sistemu sistematično in po korakih dodajamo nazaj regulacije in spremljamo njihov vpliv, kar privede do odkrivanja novih genetskih in regulatornih modelov [1].

== Viri ==

[1] K. Temme, D. Zhao, and C. A. Voigt, “Refactoring the nitrogen fi xation gene cluster from Klebsiella oxytoca,” vol. 109, no. 18, pp. 2–7, 2012.

[2] E. Zazopoulos et al., “A genomics-guided approach for discovering and expressing cryptic metabolic pathways,” Nat. Biotechnol., vol. 21, no. 2, pp. 187–190, 2003.

[3] A. Ishihama, “Prokaryotic genome regulation: Multifactor promoters, multitarget regulators and hierarchic networks,” FEMS Microbiol. Rev., vol. 34, no. 5, pp. 628–645, 2010.

[4] L. B. Pickens, Y. Tang, and Y.-H. Chooi, “Metabolic Engineering for the Production of Natural Products,” Annu. Rev. Chem. Biomol. Eng., vol. 2, no. 1, pp. 211–236, 2011.

[5] N. Gorkman, S. West, N. J. Proudfoot, "Pouse sites promote transcriptional termination of mammalian RNA polymerase II," Mol Cell Biol., vol. 26, no. 20, pp. 3986-3996, 2006

[6] L. M. Rubio, P. W. Ludden, "Maturation of Nitrogenase: a Biochemical Puzzle," J Bacteriol., vol. 187, no. 2, pp. 405-414, 2005

[7] R. Dixon and D. Kahn, “Genetic regulation of biological nitrogen fixation,” Nat. Rev. Microbiol., vol. 2, no. 8, pp. 621–631, 2004.

BIO2 Povzetki seminarjev 2015

2015-12-10T20:33:28Z

GasperVirant: /* Gašper Virant: Vpliv reaktivnih kisikovih spojin na dolžino življenjske dobe */

== Biokemija- Povzetki seminarjev 2015/2016 ==
Nazaj na osnovno [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Seminar_2015 stran]

=== Kristjan Stibilj: PI3K kaskada in njihova vloga pri rakavih obolenjih ===
Dandanes je zdravljenje rakavih obolenj poglavitna točka v razvoju farmacevtskih zdravil. Velike multinacionalke vlagajo ogromno denarja v razvoj zdravila, ki bi ozdravil tumorje oz. omilil njihovo delovanje. Za nastanek rakavih obolenj so v veliki meri krivi receptorji tirozin kinaze (RTK) in njihova PI3K/AKT/mTOR signalna pot. Ta namreč nadzoruje celično proliferacijo, metabolizem, premikanje in preživetje. Mutacije ključnih proteinov v PI3K kaskadi vodijo do nenadzorovane rasti in delitve celic, kar privede do nastanka tumorjev. Glavni princip zdravljenja oz. iskanje zdravila za rakava obolenja je torej poiskati takšno molekulo, ki bi uspešno inhibirala mutiran protein in s tem ustavila njegovo hiperaktivacjo. Znanstveniki so v zadnjih letih odkrili precej inhibitorjev, ki so bolj ali majn specifični in so sedaj v preiskavah kot morebitno zdravilo. Za inhibiranje PI3K molekule sta se v predkličninih študijah pokazala kot uspešna pictilisib in buparlisib, ki se vežeta na ATP-vezavno mesto. Na enak način deluje tudi večina AKT inhibitorjev, kamor spada tudi dobro raziskan Inhibitor VIII. mTOR, zadnja molekula v PI3K kaskadi, pa ima prav tako kar nekaj sintetičnih inhibitorjev, ki so analogni naravni molekuli rapamcin. Vsi našteti inhibitorji pa žal še niso zdravila za raka, saj so interakcije z ostalimi encimi v celici še vedno nepoznane.

=== Klara Kuret: Vpliv bakterijskih efektorjev na celični ubikvitinacijski sistem in rastlinski imunski odziv ===
Patogene bakterije uporabljajo efektorje za zatiranje imunskega odziva gostitelja. Tarča mnogih efektorskih proteinov je celični ubikvitinacijski sistem (UBS), ki je pomemben regulator imunskega odgovora. Ubikvitinska signalizacija poteka preko treh encimskih kompleksov, ki na proteinske substrate vežejo molekule ubikvitina. Dolžina in oblika ubikvitinske verige narekujeta, kakšen bo biološki odgovor celice na ubikvitinacijo oz. kaj se bo s substratom zgodilo. Ker prokarionti nimajo lastnega ubikvitinacijskega sistema, so morali razviti drugačne mehanizme, ki jim omogočajo interakcijo z evkariontskimi proteini, kateri nastopajo pri ubikvitinaciji. Efektorji lahko gostiteljski UBS izkoriščajo tako, da strukturno ali funkcijsko posnemajo evkariontske komponente UBS, ali pa so homologi evkariontskih proteinov. Lahko tudi pospešujejo ali inhibirajo delovanje 26S proteasoma. Efektorski proteini torej izkoriščajo evkariontske strategije za nadzor in manipulacijo gostiteljevih celičnih procesov, v smeri, ki patogenu omogoča čim boljšo možnost razvoja in množitve. Efektorji AvrPtoB, HopM1 ter VirF so nastali z različnim evolucijskim razvojem, zato se tudi mehanizmi njihovega delovanja na UBS razlikujejo. Patogeni efektorji lahko preko ubikvitinacije pomembnih signalnih proteinov v imunskih kaskadah povzročijo nezmožnost celice, da aktivira PAMP ter ETI imunost. Razgradnja gostiteljevih proteinov vodi lahko do motenj v izražanju genov, motenj v vezikularnem transportu in številnih drugih nepravilnosti v celičnih procesih, ki pripeljejo do večje dovzetnosti celice za okužbo.

=== Tjaša Lukšič: Alternativno izrezovanje GPCR-jev s poudarkom na sekretinski družini ===
Alternativno izrezovanje GPCR-jev je pogost pojav, še posebej pri sekretinski in nekaterih sorodnih družinah. Receptorji sekretinske družine se pojavljajo v zanimivih izooblikah, ki odstirajo nove poglede na regulacijo celične signalizacije. V sedmi transmembranski vijačnici sekretinskih GPCR-jev je dobro ohranjen ekson 12 oz. zaporedje 14 aminokislin, ki je tarča izrezovalno-povezovalnega kompleksa pri nekaterih receptorjih. Delecija eksona 12 nima izrazitega vpliva na vezavo primarnih sporočevalcev, ima pa zato toliko večje posledice pri prenosu signalov. Povezovanje z G-proteini je onemogočeno, ker skrajšana TMD7 ne omogoča normalne konformacijske spremembe. Le-ta se v običajnih izooblikah zgodi zaradi premika TMD6 in TMD7 proti statični TMD3, kar razkrije intracelularno vezavno domeno za navzdolnje efektorje. Poleg omenjene funkcije lažnega receptorja, se oslabi tudi membranska ekspresija kratkih-TMD7 receptorjev, saj je izbrisan transportni motiv v eksonu 12 in zmanjšana hidrofobnost C konca. Najbolj fascinantna posledica je zagotovo dominantno negativna regulacija membranske ekspresije ostalih izooblik. Za transport GPCR-jev iz kontrolnega sistema endoplazmatskega retikuluma je potrebna oligomerizacija. Hetero-oligomeri določenih kombinacij s kratkim-TMD7 receptorjem ne uspejo zapustiti ER, število delujočih receptorjev v membrani se zmanjšuje in celica je slabše odzivna na njihove primarne sporočevalce. Med tem pa nekateri receptorji nimajo težav pri transportu skupaj s skrajšanimi izooblikami. Številna bolezenska stanja so povezana s patološkimi izooblikami ali z neuspešnim transportom proteinov iz ER, za kar obstaja potencialna rešitev v farmakoloških šaperonih.

=== Rok Miklavčič: Preusmeritve signalnih poti preko TNFR1 v boju s patogeni ===
Celice so se skozi čas prilagodile na življenje v okolju, polnem potencialno škodljivih patogenov. Razvilo se je mnogo mehanizmov celičnega odgovora, ki so prilagojeni tako, da lahko ustrezen odgovor na patogene pripravijo v različnih situacijah. En takih mehanizmov predstavlja tudi signalna kaskada preko TNFR1, receptorja za citokin TNFα. TNFα sprostijo celice imunskega sistema, ko zaznajo prisotnost patogena. Osnovni celični odgovor pri stimulaciji TNFR1 je kaskada, ki preko zaporedja ubikvitinacij sodelujočih proteinov, privede do translokacije transkripcijskega faktorja NF-κB v jedro. NF-κB tam sproži prepisovanje genov za vnetne citokine, ki ob kasnejšem sproščanju v okolico celice povzročijo vnetni odziv sosednjih celic ter s tem omejitev okužbe. Nekateri patogeni pa so na ta odziv prilagojeni tako, da inhibirajo ključne proteine v začetni kaskadi in s tem zmanjšajo vnetje, vendar pa imajo na to prilagoditev odgovor tudi gostiteljske celice. Pri taki inhibiciji pride do prenosa signala po drugi poti, ki privede do apoptoze napadene celice, kar ubije tudi patogene v njej, in tako omeji okužbo. Patogeni lahko inhibirajo tudi samo apoptozo, zaradi česar obstaja tudi zasilni celični mehanizem odgovora nanje. V primeru inhibicije apoptoze se kaskada konča z aktivacijo psevdokinaze MLKL, ki je glavni efektor za mehanizem programirane nekroze z imenom nekroptoza. Pri nekroptozi pride kot pri nekrozi do celične lize, pri čemer se v okolico sprostijo DAMP-i, ki sprožijo vnetni odziv okoliškega tkiva.

=== Ema Gašperšič: PKC in njihov vpliv na raka ter Alzheimerjevo bolezen ===
Protein kinaze C (PKC) so družina encimov, ki sodelujejo v številnih signalnih poteh v celici. S fosforilacijo serina ali treonina nekega drugega proteina regulira njegovo aktivnost. Vplivajo na proliferacijo in diferenciacijo celice, apoptozo, oblikovanje sinaps, učenje ter shranjevanje spominov, nevrološke motnje in mnogo drugih procesov v celici. Za aktivacijo PKC sta ključni povečani koncentraciji diacilglicerola (DAG) in kalcijevih ionov Ca2+, ki z vezavo na PKC povzročita prehod iz neaktivne v aktivno obliko. Aktivacija PKC vpliva na spodbujanje oziroma inhibiranje razvoja raznih bolezni, kot so rak, ishemična možganska kap ali Alzheimerjeva bolezen in druge nevrodegenerativne bolezni. Problem je v tem, da je pri zdravljenju raka potrebno rast celic čim prej zaustaviti, med tem ko morajo pri nevrodegenerativnih boleznih nevroni ostajati živi. Poleg tega je zanimivo, da naj bi nekateri aktivatorji protein kinaz C rast rakavih celic spodbujali, drugi pa zavirali. Običajen mehanizem delovanja PKC je težko opisati, saj obstaja več oblik PKC izoencimov, ki so po različnih tkivih različno razporejeni, v celici imajo različne funkcije, poleg tega pa obstaja več signalnih poti, ki vodijo do aktivacije PKC. Vse to so razlogi za oteženo delo raziskovalcev, ki želijo odkriti načine zdravljenja prej omenjenih boleznih, zato torej to področje zahteva še precej raziskav, ki bi posledično lahko olajšale njihovo zdravljenje.

=== Tadej Satler: PD-1 limfocitov in melanomskih celic ===
Melanom je najnevarnejša oblika kožnega raka in znanstveniki že desetletja borijo izboljšali rezultate zdravljenja. Vzpodbuditi želijo proti-tumorski odziv imunskega sistema, vendar so zaradi kontrolnih točk neuspešni. Kontrolne točke so ključne za ohranjanje imunske homeostaze, saj bi brez njih bili žrtev številnim avtoimunskim boleznim in poškodbam tkiva ob prevelikem odzivu sistema na patogene vnetje. Med imunske kontrolne točke spada tudi receptor PD-1. Je monomer sestavljen iz imunoglobulinske in citoplazemske domene. Zanj sta značilna tudi dva liganda (PD-L1 in PD-L2), ki sta potrebna za njegovo aktivacijo. Najdemo ga predvsem pri limfocitih T in nekaterih melanomskih celicah. Izražanje PD-1 je raziskano predvsem pri limfocitih T, kjer ob interakciji z ligandoma inhibira delovanje in funkcije limfocitov ter povzroča njihovo apoptozo. To doseže s pomočjo zaviranja številnih ključnih procesov znotraj celice, ki so potrebni za njeno normalno delovanje. Pri melanomskih celicah je pa delovanje PD-1 še dokaj neraziskano. Do zdaj njegova prisotnost ni bila znana, vendar so nedavne raziskave pokazale njegovo izražanje na nekaterih celicah limfocitov. Obnašanje PD-1 melanomskih celic je drugačno kot pa pri limfocitih, saj njegovo izražanje spodbuja rast tumorja. S pomočjo boljšega poznavanja delovanja PD-1 v limfocitih T in melanomskih celicah, bo lažje razviti učinkovitejše metode boja proti raku.

=== Tilen Tršelič: PKM2 in njegova vloga pri razvoju rakavih celic ===
Piruvat kinaza (PK) je pomemben glikolitski encim, ki se pojavlja v štirih različnih oblikah. Oblika M2 je posebno zanimiva, saj poleg svoje glikolitske funkcije opravlja še mnoge druge, nemetabolične funkcije. Poleg tega je PKM2 prevladujoča oblika encima v rakavih celicah. Razlog za povečano izražanje le-tega verjeno izhaja iz dejstva, da lahko PKM2 zavzema aktivno tetramerno obliko ali skoraj neaktivno dimerno obliko. Možnost menjavanja svojih oblik celicam, bodisi zdravim ali rakavim, omogoča prilagajanje delovanja njihovim potrebam. Če celici primanjkuje energije, lahko encim zavzema pretežno aktivno tetramerno obliko in tako spodbuja proizvodnjo ATP. Če celica potrebuje nove makromolekule za proliferacijo, tu encim lahko zavzame pretežno neaktivno dimerno obliko in spodbuja kopičenje intermediatov glikolize. Te so ključni za sintezo novih snovi, saj služijo kot njihovi prekurzorji.
Aktivnost encima PKM2 se regulira na več načinov. Vlogo regulatorjev po navadi opravljajo post-translacijske modifikacije encima, lahko pa tudi nekatere druge spremembe v celičnem okolju.
PKM2 v svoji manj aktivni dimerni obliki prav tako lahko regulira druge procese. Predvsem pospešuje celično rast in razvoj prek reakcij z pomembnimi transkripcijskimi faktorji v jedru. Izkazalo se je, da delovanje encima PKM2 močno koristi rakavim celicam.
Ker je encim PKM2 zelo pomemben za razvoj takšnih celic, predstavlja dobro potencialno tarčo za zdravljenje. Raziskave potrjujejo, da bi bilo slednje možno, ne ponujajo pa konkretnega odgovora na vprašanje, kako bi takšno zdravljenje potekalo.

=== Tina Šimunović: Pentoza-fosfatna pot, njena regulacija in povezava z rakom ===
Pod imenom rak razumemo bolezen, za katero je značilna nenadzorovana rast in celična delitev. Rakave celice imajo tako večjo potrebo po biosintezi pomembnih makromolekul, ki jo zadostijo s prilagoditvijo in spremembo svojih metaboličnih poti. Ena izmed prilagoditev je lahko sprememba pentoza-fosfatne poti (PPP). To je ena izmed metaboličnih poti glukoze, katere glavna produkta sta riboza-5-fosfat in NADPH. Prva se naprej uporablja pri sintezi nukleinskih kislin, NADPH pa je pomemben za sintezo makromolekul in za detoksikacijo. Regulacija PPP poteka preko njenih metabolnih encimov. V rakavih celicah je predvsem izražena povišana aktivnost glukoza-6-fosfat dehidrogenaze in s tem aktivnost PPP. Pri tem encimu sta, poleg mnogih drugih, najpomembnejša regulatorja NADPH in tumorski supresor p53. Aktivnost PPP lahko poveča tudi acetilacija 6-fosfoglukonat dehidrogenaze ali pa povečano izražanje transketolaze. Na pospešeno proliferacijo rakavih celic vplivajo tudi inaktivirani tumorski supresorji in aktivirani onkoproteini, npr. p53, TIGAR, ATM, Ras, mTORC1 in Nrf2. Največji pomen PPP pri rakavih celicah, je v zaščiti pred celično smrtjo, saj se s povečano aktivnostjo PPP pospeši tvorba njenih produktov, ki so ključni pri preživetju celice. Z inhibicijo te poti, bi lahko tudi inhibirali rast tumorjev. PPP je tako postala potenciala tarča za zdravljenje raka, vendar je za to potrebnih še veliko raziskav in boljše razumevanje metabolizma rakavih celic.

=== Maja Zupanc: Kako dolge nekodirajoče RNA vplivajo na regulacijo metabolizma ===
Ena najbolj fascinantnih lastnosti metabolizma je njegova regulacija. Za homeostazo metabolizma hranil in energije v telesu je nujna specializirana regulacija centralnega živčnega sistema, Langerhansovih otočkov trebušne slinavke in glavnih metabolnih tkiv (maščobno tkivo, skeletne mišice in jetra). Dolge nekodirajoče molekule RNA (lncRNA) so RNA molekule dolge več kot 200 nukleotidov, ki ne kodirajo proteinov. Njihov spekter delovanja je izredno širok, na metabolizem vplivajo prek regulacije procesov adipogeneze in hepatičnega metabolizma, nadzora funkcionalnosti Langerhansovih otočkastih celic, regulacije razvoja skeletnih mišic, in energijske homeostaze. Do sedaj je bilo odkritih že več kot 60000 dolgih nekodirajočih RNA molekul in repetuar njihovih funkcij se z vsako novo raziskavo širi. Vloga lncRNA je še pred desetimi leti bila neznanka, od takrat pa nam je že postalo jasno, da so pomembni regulatorji izražanja DNA, diferenciacije in razvoja celic, razvoja tkiva in tumorogeneze. V resnici pa vemo zelo malo, oziroma smo šele na začetku razumevanja lncRNA. Ker se zaradi tega z vsakim novim odkritjem pojavlja še več vprašanj (o podrobnih principih delovanja lncRNA in njihovega sodelovanja z drugimi molekulami, o še nepoznanih funkcijah, vpletenosti v bolezni in možnosti razvoja novih tehnik zdravljenja…), so raziskave na tem področju zelo aktualne.

=== Lara Jerman: Warburgov učinek: od raka do avtoimunosti ===
V dvajsetih letih prejšnjega stoletja je Otto Warburg s svojimi sodelavci meril porabo kisika in sintezo laktata v rakastem tkivu. Pri tem je prišel do zelo pomembnega opažanja, ki ostaja zelo aktualno – da celice rakastega tkiva tudi ob normoksičnih pogojih vztrajajo pri močno povečani glikolizi. Danes vemo, da se Warburgov učinek v rakastih tkivi pojavlja skoraj univerzalno. Večina Warburgovih opažanj in meritev je bila kvantitativno pravilna. Njegova razlaga vzroka pojava pa se je izkazala za napačno, saj povečano stopnjo glikolize zasledimo v mnogih rakastih tkivih brez določljivih mitohondrijskih mutacij ali motenj oksidativno-fosforilacijske metabolne poti. V takih tkivih sinteza ATP v mitohondrijih poteka nemoteno in enako učinkovito kot pri normalnih tkivih z enako koncentracijo kisika. Raziskave zadnjih let kažejo na to, da je povečana glikoliza strateška poteza rakastih celic, ki zadovoljuje predvsem njihove potrebe po sintezi biomase. V skoraj stoletju od Warburgovega prvotnega odkritja je postalo jasno, da metabolična stikala omogočajo celici, da se prilagaja svojim bioenergetskim in biosintetskim potrebam. Zmožnost hitrega prilagajanje potrebam je še posebej pomembna pri imunskih celicah, ki morajo ob imunskem odzivu hitro preiti iz mirujočega stanja. Zato ni presenetljivo, da so si rakaste in imunske celice glede zagotavljanja metabolnih tokov in bionenergetike za rast in širjenje v marsičem podobne.

=== Sara Tekavec: Mutacije encimov Krebsovega cikla in vpliv na razvoj ter rast tumorjev ===
Encimi izocitrat dehidrogenaza (IDH), sukcinat dehidrogenaza (SDH) in fumarat hidrataza (FH) sodelujejo v Krebsovem ciklu. Prvi omogoča pretvorbo izocitrata v α-ketoglutarat (α-KG), drugi pretvorbo sukcinata v fumarat, tretji pa pretvorbo fumarata v malat. Za gene, ki kodirajo te encime, so značilne mutacije, ki vodijo v nastanek in rast tumorjev. Mutacije so lahko onkogen-aktivirajoče (mutacija IDH) ali tumor-supresor deaktivirajoče (mutacije SDH in FH). Mutacija IDH tako v encimu vzpodbudi novo funkcijo, in sicer pretvorbo α-ketoglutarata ob prisotnosti NADPH v onkometabolit 2-hidroksiglutarat (2-HG). Pri drugih dveh mutacijah pa gre za to, da je aktivnost encima zmanjšana oz. je sploh ni, kar ima za posledico kopičenje sukcinata ali fumarata. To ugodno vpliva na rast tumorja, saj lahko te tri omenjene molekule na različne načine inducirajo izražanje genov, pomembnih za celično rast in preživetje. Vse tri na primer stabilizirajo hipoksični inducibilni faktor (HIF), ki nato sproži transkripcijo in angiogenezo (rast krvnih žil). Z zmanjšano koncentracijo dveh antioksidantov NADPH in α-ketoglutarata se poveča tudi tveganje za nove mutacije, povzročene s strani reaktivnih kisikovih zvrsti. Poleg tega lahko α-KG sam deluje kot mutagen ali pa tudi inhibira metilacijo DNA in histonov, zaradi česar je izražanje onkogenov povečano. Kljub temu, da je ta metabolična pot pri tumorjih precej kompleksna, nam bodo nove metode detekcije tumorjev kmalu omogočile tudi boljše razumevanje samih mutacij in mehanizma nastanka tumorjev, ki tiči v ozadju.

=== Fran Krstanović: L-Carnitine enhances exercise endurance capacity ===
Our energy metabolism is working constantly to cover energy need of our body. ATP represents the first line of action. With cellular ATP concentration low, our body needs other sources of energy as fuel. Fats carbs and proteins play that part. To get energy from fats they need to be oxidase. The process of fat oxidation is situated in the mitochondria. Fats need a special transporter to get into the cell, l-carnitine.
Apart from fat transportation l-carnitine has many other roles; enhancing exercise endurance capacity is believed to be one of them. Mice fed with L-carnitine showed great promise to confirm this theory. Glycogen concentrations were higher, all important parameters for fatty acid intake and mitochondria biogenesis were higher and do additional AMPK was activated. The most important parameter was higher endurance capacity was reached. The problem lies in implicating the theory on humans; consuming concentrations are unknown (high can lead to problems, low won’t have affect). Further experiments will surely be held as carnitine provides great attention from sports industries as a supplement for fat burning or maybe for greater athletes’ fatigue.

=== Janja Krapež: Vpliv metabolizma maščobnih kislin na povišan krvni tlak v plučnih arterijah ===
Povišan krvni tlak v pljučnih arterijah (PAH) je huda bolezen, ki posledično zelo vpliva tudi na srce, predvsem na desni prekat, ki se zaradi prevelike obremenjenosti poveča. To lahko privede tudi do odpovedi srca. Zakaj pride do nepravilnega delovanja desnega prekata, je še neznano, prav tako kako do tega pride. Zadnje raziskave sklepajo, da je z nedelovanje povezan tudi metabolizem maščobnih kislin in glukoze. Problem predstavlja kopičenje maščobnih kislin znotraj mišičnih celic srca. Za transport maščobnih kislin z dolgimi verigami poskrbi protein CD36 skupaj s FATP (v miocitih FATP6). Kopičenje maščobnih kislin v celici je povezano tudi s favoriziranjem oksidacije glukoze. Preklop med ß-oksidacijo maščobnih kislin in oksidacijo glukoze poteka v Randlovem ciklu, kjer intermediati ene oksidacije inhibirajo drugo. Ključni pri inhibiciji ß-oksidacije je malonil-CoA, ki inhibira CAP encim na mitohondrjski membrani in je ključni prenašalec maščobnih kislin v mitohondrij, kjer se nadalje oksidirajo. Trenutne raziskave želijo izboljšati delovanje desnega prekata prav preko oksidacije maščobnih kislin. Šele razumevanje zapletenih mehanizmov metabolizma bo omogočilo nadaljnji razvoj potencialnih zdravil za zdravljenje PAH in posledično tudi izboljšalo delovanje desnega prekata.

=== Elvira Boršić: Posledice spremenjenega metabolizma maščobnih kislin v kardiomiocitih ===
V fetusu kardiomiociti pridobivajo energijo z oksidacijo glukoze in laktata zaradi pomanjkanja kisika. Ko se rodimo pa postanejo maščobne kisline preferenčni substrat pridobivanja ATP-ja. Do sprememb glavnega substrata pride zaradi večjih telesnih obremenitev, bolezni in okoliščin zunaj celice. Pri tem imajo osrednjo vlogo razni transkripcijski faktorji, npr. receptor, aktiviran s peroksisomskim proliferatorjem α (PPARα), in transkripcijski koaktivatorji, npr. PPARγ koaktivator 1α (PGC1α). Dokazali so, da lahko nedelovanje vsaj 22 encimov in transporterjev udeleženih pri metabolizmu maščobnih kislin povzroči razne bolezni, ki zmanjšajo delovanje srca. Vsaka od teh pa lahko povzroči srčno popuščanje. Do tega pride, ko srce ni več zmožno črpati krvi iz pljuč po telesu. Najpogostejša vzroka sta zvišan krvni tlak in ishemija. Slednjo povzroči hipoksija, zaradi česar se ustavi tok elektronov v dihalni verigi. V anaerobnih pogojih je tako glikoliza edini vir energije in proizvede le 5 % celotnega ATP-ja, ki ga imajo kardiomiociti v normalnih pogojih. Produkti glikolize porušijo homeostazo in za ohranjanje le-te celice porabijo veliko energije, ki bi se sicer porabila pri kontrakciji. Raven kisika se obnovi pri reperfuziji, ki pa naredi še več škode kot ishemija. Zaradi srčnega popuščanja umre vsako leto več tisoč ljudi, saj še ne poznamo zdravila, ki bi to bolezen preprečilo. Ker še ne razumemo vseh mehanizmov, poteka na tem področju veliko raziskav.

=== Miha Koprivnikar Krajnc: Pomanjkanje karbamoil-fosfat sintetaze ===
Pomanjkanje karbamoil fosfat sintetaze (CPS1) je ena izmed motenj cikla sečnine, torej poslabša zmožnost proizvodnje sečnine, ki ima pomembno vlogo pri regulaciji pH. CPS1 katalizira nastanek vstopne spojine cikla sečnine, karbamoil fosfat, in jo regulirajo Mg2+, Ca2+, NAG, ter tudi druge snovi posredno, preko NAG sintetaze. Mutacij, ki povzročajo spremembo strukture CPS1 je kar nekaj in povzročajo spremembe v aktivnosti encima različnih jakosti (od milih sprememb do popolne inaktivacije). To je razlog, da nekateri oboleli velikokrat sploh ne dočakajo otroštva, medtem ko pri ostalih bolezen pride na dan kasneje v življenju ob nekem stresu za organizem. Simptomi pomanjkanja CPS1 so predvsem nevropatološke narave in vključujejo poslabšanje kognitivnih sposobnosti, epizode delirija, utrujenost in druge simptome. Pri pacientih s hujšimi motnjami lahko bolezen tudi po zdravljenju pusti trajne posledice, saj pride do poškodb možganov v procesu razvoja. Razlog za nevrotoksičnost je osmotska aktivnost glutamina, ki se v velikih količinah nabira v astrocitah možganov. To povzroča hipertonično okolje v celicah in otekanje možganov. Brez ukrepov to privede do kome in smrti. Zdravljenje akutnih primerov motnje se začne z uporabo lovilcev amonijaka in dializo krvi, nadaljnji ukrepi pa so za enkrat omejeni na dieto z malo proteinov in citrulin. Za prihodnost je obetavno zdravljenje s stimulacijo encima z aktivatorjem oziroma njegovim analogom ali pa kar s stimulacijo sintetaze aktivatorja.

=== Špela Malenšek: Leucinska in glutaminska regulacija mTORC1 ===
Kompleks mTORC1 je ohranjena Ser/Thr kinaza, ki z združevanjem signalov regulira celično ravnovesje med anabolizmom in katabolizmom. Nadzoruje celično rast, sintezo proteinov ter ribosomov in blokira avtofagijo. Nepravilno delovanje mTORC1 je vzrok različnim vrstam raka, diabetesu tipa 2 in nevrodegenerativnim boleznim. Verjetno najpomembnejši, a hkrati najmanj razumljeni regulatorji mTORC1 so aminokisline, med katerimi izstopata leucin in glutamin. Koncentraciji slednjih v citosolu sta odvisni druga od druge, saj je t.i. terciarni aktivni transport leucina v celico sklopljen s prenosom glutamina iz celice. Eden izmed modelov regulacije mTORC1 predpostavlja, da so pri prenosu aminokislinskega signala do mTORC1 glavni trije multiproteinski kompleksi, ki vključujejo majhne RagGTPaze, Ragulator in v-ATPazo. Združitev slednjih poteka na lizosomih, kjer je mTORC1 posledično tudi aktiviran s proteinom Rheb. Aminokislinska signalna kaskada mTORC1 predstavlja tudi tipalo, s katerim celica zaznava prisotnost in koncentracijo aminokislin v lizosomskem lumnu, citoplazmi in v zunaj-celičnem prostoru. Delovanje v-ATPaze je namreč močno odvisno od koncentracije leucina v notranjosti lizosomov in predstavlja t.i. »notranjo« regulacijo mTORC1. Hkrati naj bi leucin neposredno vplival na spremembno konformacije RagGTPaz z vezavo na protein Sestrin2, vendar so je popoln mehanizem posledice vezave leucina še nepojasnjen. Glutamin naj bi na mTORC1 deloval drugače kot leucin (brez posredovanja RagGTPaz in Ragulatorja), hkrati pa naj bi regulacijsko vlogo aktivacije mTORC1 imel tudi eden izmed produktov dvojne deaminacije glumatina, α-ketoglutarat.

=== Neža Koritnik: Uravnavanje koncentracije ROS in glutationilacija v mitohondriju ===
V mitohondriju zaradi razlik v redoks okolju nastajajo reaktivne kisikove spojine (ROS), ki lahko povzročajo oksidativno škodo, v manjših koncentracijah pa so pomembne signalne molekule. Njihov glavni vir so predvsem flavoproteini, jih najdemo tudi v kompleksih dihalne verige in nekaterih encimih Krebsovega cikla. Ti lahko v času oksidativnega stresa zaradi različnih razlogov prenesejo elektrone namesto na njihov naravni akceptor direktno na kisik, pri čemer se tvorijo reaktivni superoksidni radikali (in druge ROS). H2O2 ima sposobnost oksidacije tiolnih cisteinskih ostankov proteinov (-SH do -SOH), kar ponavadi povzroči reverzibilno deaktivacijo proteinov in s tem regulacijo različnih procesov v mitohondriju. V skrajnem primeru pa pride do hiperoksidacije (do -SO2H ali - SO3H), ki pa je ireverzibilna in lahko trajo poškoduje proteine in druge molekule. Za preprečevanje oksidativne škode in uravnavanjem redoks signalizacije so se razvili sistemi GSH/Gpx/GR in Prx/Trx/TrxR. Glutation (GSH) je pomembna molekula, ki v razmerju s svojo oksidirano obliko (dimerom GSSG) določa redoks stanje v mitohondriju. V oksidirani obliki ima sposobnost vezave na tiole cisteinskih ostankov proteinov. To je proces glutationilacije, pri kateri se tvori disulfidna povezava protein-SSG, kar pa ima regulatorno vlogo (začasna aktivacija/deaktivacija proteina) ali pa zaščitno vlogo pred hiperoksidacijo. Pomemben encim, ki regulira glutationilacijo je glutaredoksin (Grx). S temi mehanizmi se v mitohondriju uravnavajo številni metabolni procesi in redoks stanje matriksa.

=== Urša Kopač: Vpliv mutacij na delovanje ATP-sintaze s poudarkom na TMEM70 ===
Mutacije genov, ki vplivajo na encim ATP-sintaza, v grobem razdelimo v dve skupini. Tiste, ki nastanejo na mitohondrijski mtDNA, in tiste, ki vplivajo na genski material v jedru (nDNA). Različne mutacije vplivajo na različne podenote ATP-sintaze, ali pa mutirajo gene za proteinske faktorje, ki sodelujejo pri biosintezi ATP-sintaze. Med slednje prištevamo tudi mutacije TMEM70 na nDNA. Proteinski faktor TMEM70 vpliva sintezo domene F1. Ugotovili so, da mutacije na genu TMEM70 povzročijo, da se sinteza ATP-sintaze ustavi že v začetni fazi. Ker se encimski kompleks ne more sintetizirati do konca, nastanejo motnje v metabolizmu zaradi pomanjkanja ATP. Z elektronsko mikroskopijo so dokazali, da se v takšnih bolezenskih stanjih morfologija mitohondrija korenito spremeni. S proučevanjem mutacij genov, ki vplivajo na delovanje ATP-sintaze, pridobivamo tudi nove podatke o biosintezi ATP-sintaze. To je več kot dobrodošlo, saj v nasprotju s samo strukturo ATPaze o poteku izgradnje encima ne vemo veliko. Predvsem se na ta način zbira podatke o pomožnih faktorjih, ki imajo ključno vlogo pri tvorbi tega pomembnega encima. Za primer lahko vzamemo TMEM70. Šele s proučevanjem mutacije TMEM70 pri bolnikih z mitohondrijskimi boleznimi so odkrili, da je sama sinteza ATP-sintaze povezana s pomožnim proteinskim faktorjem TMEM70. Obširnejše znanje o biogenezi ATP-sintaze ter o mutacijah, ki vplivajo na delovanje ATP-sintaze, pomeni tudi več možnosti za razvijanje novih potencialnih zdravil in oblik zdravljenja.

=== Gašper Virant: Vpliv reaktivnih kisikovih spojin na dolžino življenjske dobe ===
Reaktivne kisikove spojine oz. kratko ROS nastajajo v 90% v mitohondrijih v glavnem na dihalni verigi, natančneje na kompleksih I in III. V preteklosti so veljale kot nujno zlo prisotno v celici, saj lahko zaradi svojih oksidacijskih lastnosti poškodujejo proteine, DNA in ostale makromolekule, kar vodi v celično disfunkcijo in kasneje smrt. V poznejših raziskavah so ROS-e začeli osvetljevati z druge strani in jim pripisovati ter poudarjati njihov pomen za celično sporočanje. Seveda je transdukcija z ROS-i zelo reguliran proces na več stopnjah. V glavnem se ROSi pojavijo v povečani količini kot odgovor na stres in v vlogi signalnih intermediatov aktivirajo različne celične odzive, ki vodijo k adaptaciji na le-tega . Prekomerna količina ROS-ov je lahko zmanjšana s transkripcijo genov, ki kodirajo sirtuine. Ti veljajo za proteine, ki skrbijo za vitalnost in zdravje celic ter tako podaljšujejo življenjsko dobo organizma. Sirtuini z deacetilacijo aktivirajo superoksid dizmutaze (SOD) in s tem posledično pomembno znižajo nivo ROS-ov v celici. SOD so encimi, ki pretvarjajo superoksidni anion v vodikov peroksid, kateri v nadaljnjih reakcijah razpade na kisik in vodo. Skratka, rekativne kisikove spojine so v višjih koncentracijah za celico škodljive in krajšajo življenjsko dobo, v malih količinah pa so nujno potrebne za celično sporočanje.

=== Simon Aleksič: Sinteza eksopolisaharidov v bakterijah in njihov vpliv na povečanje populacije celic imunskega odziva ===
V človeškem telesu je bakterij desetkrat več kot človeških celic, zato kljub njihovi mikroskopski velikosti njihovega vpliva na telo ne smemo zanemarjati. Pomembne sekrecijske molekule bakterij so eksopolisaharidi, ki se nahajajo na zunanji strani bakterijske membrane in pomagajo pri tvorbi kapsule. Sinteza eksopolisaharidov vključuje zanimive encimske komplekse in procese, med drugim tudi fosfotransferazno pot. Čeprav imajo eksopolisaharidi za bakterijo mnogo efektov, kot so zaščita pred izsušitvijo, spremembami pH in vdiranju antibiotikov so za nas še posebej zanimivi pozitivni učinki eksopolisaharidov na človeške celice imunskega sistema. Bakterija Bacteroides fragilis, ki simbiontsko živi v človeškem črevesju, je ena izmed bakterij, ki izloča zwitterionski polisaharid. Ta vsebuje tako pozitivno kot negativno nabite skupine, te pa mu omogočajo, da ga prepoznajo antigen predstavljajoče celice in ga predstavijo celicam CD4+T, ki imajo regulatorsko vlogo v imunskem sistemu, imunski odziv aktivirajo in tudi inhibirajo. S predstavljanjem antigena se poveča število celic CD4+T, kar tudi posledično privede do boljšega imunskega odziva pri potencialnemu vdoru nevarnih antigenov v telo. Dandanes je mnogo govora o boleznih, povezanih s prekomernim imunskim odzivom telesa na nenevarne antigene - alergijah. Prav zgodnja izpostavitev bakterijam kot je Bacteroides fragilis lahko pripomore k preprečitvi takšnih obolenj pri ljudeh, nadaljnje raziskave pa bodo razkrile več ugodnih učinkov simbiontskih bakterij na imunski sistem.

=== Uroš Zavrtanik: RuBisCO aktivaza ===
Rubisco aktivaze (Rca) so posebni proteini, ki so se specializirali za aktivacijo inhibiranega Rubisca (ribuloza-bisfosfat dekarboksilaza/oksigenaza). Ta korak je ključen za dovoljšen izkoristek fotosinteze. Rca je motorni protein, ki spada v družino AAA+ proteinov (ATPases associated with various cellular activities). ATPazna aktivnost proteina omogoča spremembe med konformacijama z vezanim ATP ter po hidrolizi vezanim ADP. Rca tvorijo heksamerne komplekse, ki so v interakciji z inhibiranim Rubiscom zmožne le tega preoblikovati tako, da inhibitor zapusti aktivno mesto encima in Rubisco postane znova aktiven. Model mehanizma aktivacije, ki je bil postavljen glede na strukture udeleženih kompleksov in se ujema z eksperimentalnimi ugotovitvami, vključuje interakcijo centralne pore heksamernega kompleksa Cbbx (Rca za Rubisco rdečega tipa) z na-površini-Rubisca (rdeči tip) izpostavljenim aminokislinskim repom. Z vezavo aminokislinskega repa v poro in njeno kasnejšo transformacijo ob hidrolizi ATP, se lahko sila preko aminokislinskega repa prenese v notranjost Rubisca, kar destabilizira vezavo inhibitorja in ga odstrani z aktivnega mesta. Ker Rca katalizira hidrolizo visokoenergetskega celičnega vira (ATP), je njena regulacija smiselno uravnana. Eden izmed zanimivejših aspektov te regulacije je regulacija glede na svetlobne pogoje, ki vključuje redukcijo in oksidacijo cisteinskih ostankov v α podenotah heksamera Rca zelenega tipa pod vplivom delovanja tioredoksina ''f''. Prikazana modela nam jasno kažejo, kako tesno sta povezana struktura in funkcija in kako pomembne so strukturnobiološke študije za razumevanje bioloških procesov in njihovo manipulacijo.

BIO2 Povzetki seminarjev 2015

2015-12-02T23:15:52Z

GasperVirant: /* Biokemija- Povzetki seminarjev 2015/2016 */

== Biokemija- Povzetki seminarjev 2015/2016 ==
Nazaj na osnovno [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Seminar_2015 stran]

=== Kristjan Stibilj: PI3K kaskada in njihova vloga pri rakavih obolenjih ===
Dandanes je zdravljenje rakavih obolenj poglavitna točka v razvoju farmacevtskih zdravil. Velike multinacionalke vlagajo ogromno denarja v razvoj zdravila, ki bi ozdravil tumorje oz. omilil njihovo delovanje. Za nastanek rakavih obolenj so v veliki meri krivi receptorji tirozin kinaze (RTK) in njihova PI3K/AKT/mTOR signalna pot. Ta namreč nadzoruje celično proliferacijo, metabolizem, premikanje in preživetje. Mutacije ključnih proteinov v PI3K kaskadi vodijo do nenadzorovane rasti in delitve celic, kar privede do nastanka tumorjev. Glavni princip zdravljenja oz. iskanje zdravila za rakava obolenja je torej poiskati takšno molekulo, ki bi uspešno inhibirala mutiran protein in s tem ustavila njegovo hiperaktivacjo. Znanstveniki so v zadnjih letih odkrili precej inhibitorjev, ki so bolj ali majn specifični in so sedaj v preiskavah kot morebitno zdravilo. Za inhibiranje PI3K molekule sta se v predkličninih študijah pokazala kot uspešna pictilisib in buparlisib, ki se vežeta na ATP-vezavno mesto. Na enak način deluje tudi večina AKT inhibitorjev, kamor spada tudi dobro raziskan Inhibitor VIII. mTOR, zadnja molekula v PI3K kaskadi, pa ima prav tako kar nekaj sintetičnih inhibitorjev, ki so analogni naravni molekuli rapamcin. Vsi našteti inhibitorji pa žal še niso zdravila za raka, saj so interakcije z ostalimi encimi v celici še vedno nepoznane.

=== Klara Kuret: Vpliv bakterijskih efektorjev na celični ubikvitinacijski sistem in rastlinski imunski odziv ===
Patogene bakterije uporabljajo efektorje za zatiranje imunskega odziva gostitelja. Tarča mnogih efektorskih proteinov je celični ubikvitinacijski sistem (UBS), ki je pomemben regulator imunskega odgovora. Ubikvitinska signalizacija poteka preko treh encimskih kompleksov, ki na proteinske substrate vežejo molekule ubikvitina. Dolžina in oblika ubikvitinske verige narekujeta, kakšen bo biološki odgovor celice na ubikvitinacijo oz. kaj se bo s substratom zgodilo. Ker prokarionti nimajo lastnega ubikvitinacijskega sistema, so morali razviti drugačne mehanizme, ki jim omogočajo interakcijo z evkariontskimi proteini, kateri nastopajo pri ubikvitinaciji. Efektorji lahko gostiteljski UBS izkoriščajo tako, da strukturno ali funkcijsko posnemajo evkariontske komponente UBS, ali pa so homologi evkariontskih proteinov. Lahko tudi pospešujejo ali inhibirajo delovanje 26S proteasoma. Efektorski proteini torej izkoriščajo evkariontske strategije za nadzor in manipulacijo gostiteljevih celičnih procesov, v smeri, ki patogenu omogoča čim boljšo možnost razvoja in množitve. Efektorji AvrPtoB, HopM1 ter VirF so nastali z različnim evolucijskim razvojem, zato se tudi mehanizmi njihovega delovanja na UBS razlikujejo. Patogeni efektorji lahko preko ubikvitinacije pomembnih signalnih proteinov v imunskih kaskadah povzročijo nezmožnost celice, da aktivira PAMP ter ETI imunost. Razgradnja gostiteljevih proteinov vodi lahko do motenj v izražanju genov, motenj v vezikularnem transportu in številnih drugih nepravilnosti v celičnih procesih, ki pripeljejo do večje dovzetnosti celice za okužbo.

=== Tjaša Lukšič: Alternativno izrezovanje GPCR-jev s poudarkom na sekretinski družini ===
Alternativno izrezovanje GPCR-jev je pogost pojav, še posebej pri sekretinski in nekaterih sorodnih družinah. Receptorji sekretinske družine se pojavljajo v zanimivih izooblikah, ki odstirajo nove poglede na regulacijo celične signalizacije. V sedmi transmembranski vijačnici sekretinskih GPCR-jev je dobro ohranjen ekson 12 oz. zaporedje 14 aminokislin, ki je tarča izrezovalno-povezovalnega kompleksa pri nekaterih receptorjih. Delecija eksona 12 nima izrazitega vpliva na vezavo primarnih sporočevalcev, ima pa zato toliko večje posledice pri prenosu signalov. Povezovanje z G-proteini je onemogočeno, ker skrajšana TMD7 ne omogoča normalne konformacijske spremembe. Le-ta se v običajnih izooblikah zgodi zaradi premika TMD6 in TMD7 proti statični TMD3, kar razkrije intracelularno vezavno domeno za navzdolnje efektorje. Poleg omenjene funkcije lažnega receptorja, se oslabi tudi membranska ekspresija kratkih-TMD7 receptorjev, saj je izbrisan transportni motiv v eksonu 12 in zmanjšana hidrofobnost C konca. Najbolj fascinantna posledica je zagotovo dominantno negativna regulacija membranske ekspresije ostalih izooblik. Za transport GPCR-jev iz kontrolnega sistema endoplazmatskega retikuluma je potrebna oligomerizacija. Hetero-oligomeri določenih kombinacij s kratkim-TMD7 receptorjem ne uspejo zapustiti ER, število delujočih receptorjev v membrani se zmanjšuje in celica je slabše odzivna na njihove primarne sporočevalce. Med tem pa nekateri receptorji nimajo težav pri transportu skupaj s skrajšanimi izooblikami. Številna bolezenska stanja so povezana s patološkimi izooblikami ali z neuspešnim transportom proteinov iz ER, za kar obstaja potencialna rešitev v farmakoloških šaperonih.

=== Rok Miklavčič: Preusmeritve signalnih poti preko TNFR1 v boju s patogeni ===
Celice so se skozi čas prilagodile na življenje v okolju, polnem potencialno škodljivih patogenov. Razvilo se je mnogo mehanizmov celičnega odgovora, ki so prilagojeni tako, da lahko ustrezen odgovor na patogene pripravijo v različnih situacijah. En takih mehanizmov predstavlja tudi signalna kaskada preko TNFR1, receptorja za citokin TNFα. TNFα sprostijo celice imunskega sistema, ko zaznajo prisotnost patogena. Osnovni celični odgovor pri stimulaciji TNFR1 je kaskada, ki preko zaporedja ubikvitinacij sodelujočih proteinov, privede do translokacije transkripcijskega faktorja NF-κB v jedro. NF-κB tam sproži prepisovanje genov za vnetne citokine, ki ob kasnejšem sproščanju v okolico celice povzročijo vnetni odziv sosednjih celic ter s tem omejitev okužbe. Nekateri patogeni pa so na ta odziv prilagojeni tako, da inhibirajo ključne proteine v začetni kaskadi in s tem zmanjšajo vnetje, vendar pa imajo na to prilagoditev odgovor tudi gostiteljske celice. Pri taki inhibiciji pride do prenosa signala po drugi poti, ki privede do apoptoze napadene celice, kar ubije tudi patogene v njej, in tako omeji okužbo. Patogeni lahko inhibirajo tudi samo apoptozo, zaradi česar obstaja tudi zasilni celični mehanizem odgovora nanje. V primeru inhibicije apoptoze se kaskada konča z aktivacijo psevdokinaze MLKL, ki je glavni efektor za mehanizem programirane nekroze z imenom nekroptoza. Pri nekroptozi pride kot pri nekrozi do celične lize, pri čemer se v okolico sprostijo DAMP-i, ki sprožijo vnetni odziv okoliškega tkiva.

=== Ema Gašperšič: PKC in njihov vpliv na raka ter Alzheimerjevo bolezen ===
Protein kinaze C (PKC) so družina encimov, ki sodelujejo v številnih signalnih poteh v celici. S fosforilacijo serina ali treonina nekega drugega proteina regulira njegovo aktivnost. Vplivajo na proliferacijo in diferenciacijo celice, apoptozo, oblikovanje sinaps, učenje ter shranjevanje spominov, nevrološke motnje in mnogo drugih procesov v celici. Za aktivacijo PKC sta ključni povečani koncentraciji diacilglicerola (DAG) in kalcijevih ionov Ca2+, ki z vezavo na PKC povzročita prehod iz neaktivne v aktivno obliko. Aktivacija PKC vpliva na spodbujanje oziroma inhibiranje razvoja raznih bolezni, kot so rak, ishemična možganska kap ali Alzheimerjeva bolezen in druge nevrodegenerativne bolezni. Problem je v tem, da je pri zdravljenju raka potrebno rast celic čim prej zaustaviti, med tem ko morajo pri nevrodegenerativnih boleznih nevroni ostajati živi. Poleg tega je zanimivo, da naj bi nekateri aktivatorji protein kinaz C rast rakavih celic spodbujali, drugi pa zavirali. Običajen mehanizem delovanja PKC je težko opisati, saj obstaja več oblik PKC izoencimov, ki so po različnih tkivih različno razporejeni, v celici imajo različne funkcije, poleg tega pa obstaja več signalnih poti, ki vodijo do aktivacije PKC. Vse to so razlogi za oteženo delo raziskovalcev, ki želijo odkriti načine zdravljenja prej omenjenih boleznih, zato torej to področje zahteva še precej raziskav, ki bi posledično lahko olajšale njihovo zdravljenje.

=== Tadej Satler: PD-1 limfocitov in melanomskih celic ===
Melanom je najnevarnejša oblika kožnega raka in znanstveniki že desetletja borijo izboljšali rezultate zdravljenja. Vzpodbuditi želijo proti-tumorski odziv imunskega sistema, vendar so zaradi kontrolnih točk neuspešni. Kontrolne točke so ključne za ohranjanje imunske homeostaze, saj bi brez njih bili žrtev številnim avtoimunskim boleznim in poškodbam tkiva ob prevelikem odzivu sistema na patogene vnetje. Med imunske kontrolne točke spada tudi receptor PD-1. Je monomer sestavljen iz imunoglobulinske in citoplazemske domene. Zanj sta značilna tudi dva liganda (PD-L1 in PD-L2), ki sta potrebna za njegovo aktivacijo. Najdemo ga predvsem pri limfocitih T in nekaterih melanomskih celicah. Izražanje PD-1 je raziskano predvsem pri limfocitih T, kjer ob interakciji z ligandoma inhibira delovanje in funkcije limfocitov ter povzroča njihovo apoptozo. To doseže s pomočjo zaviranja številnih ključnih procesov znotraj celice, ki so potrebni za njeno normalno delovanje. Pri melanomskih celicah je pa delovanje PD-1 še dokaj neraziskano. Do zdaj njegova prisotnost ni bila znana, vendar so nedavne raziskave pokazale njegovo izražanje na nekaterih celicah limfocitov. Obnašanje PD-1 melanomskih celic je drugačno kot pa pri limfocitih, saj njegovo izražanje spodbuja rast tumorja. S pomočjo boljšega poznavanja delovanja PD-1 v limfocitih T in melanomskih celicah, bo lažje razviti učinkovitejše metode boja proti raku.

=== Tilen Tršelič: PKM2 in njegova vloga pri razvoju rakavih celic ===
Piruvat kinaza (PK) je pomemben glikolitski encim, ki se pojavlja v štirih različnih oblikah. Oblika M2 je posebno zanimiva, saj poleg svoje glikolitske funkcije opravlja še mnoge druge, nemetabolične funkcije. Poleg tega je PKM2 prevladujoča oblika encima v rakavih celicah. Razlog za povečano izražanje le-tega verjeno izhaja iz dejstva, da lahko PKM2 zavzema aktivno tetramerno obliko ali skoraj neaktivno dimerno obliko. Možnost menjavanja svojih oblik celicam, bodisi zdravim ali rakavim, omogoča prilagajanje delovanja njihovim potrebam. Če celici primanjkuje energije, lahko encim zavzema pretežno aktivno tetramerno obliko in tako spodbuja proizvodnjo ATP. Če celica potrebuje nove makromolekule za proliferacijo, tu encim lahko zavzame pretežno neaktivno dimerno obliko in spodbuja kopičenje intermediatov glikolize. Te so ključni za sintezo novih snovi, saj služijo kot njihovi prekurzorji.
Aktivnost encima PKM2 se regulira na več načinov. Vlogo regulatorjev po navadi opravljajo post-translacijske modifikacije encima, lahko pa tudi nekatere druge spremembe v celičnem okolju.
PKM2 v svoji manj aktivni dimerni obliki prav tako lahko regulira druge procese. Predvsem pospešuje celično rast in razvoj prek reakcij z pomembnimi transkripcijskimi faktorji v jedru. Izkazalo se je, da delovanje encima PKM2 močno koristi rakavim celicam.
Ker je encim PKM2 zelo pomemben za razvoj takšnih celic, predstavlja dobro potencialno tarčo za zdravljenje. Raziskave potrjujejo, da bi bilo slednje možno, ne ponujajo pa konkretnega odgovora na vprašanje, kako bi takšno zdravljenje potekalo.

=== Tina Šimunović: Pentoza-fosfatna pot, njena regulacija in povezava z rakom ===
Pod imenom rak razumemo bolezen, za katero je značilna nenadzorovana rast in celična delitev. Rakave celice imajo tako večjo potrebo po biosintezi pomembnih makromolekul, ki jo zadostijo s prilagoditvijo in spremembo svojih metaboličnih poti. Ena izmed prilagoditev je lahko sprememba pentoza-fosfatne poti (PPP). To je ena izmed metaboličnih poti glukoze, katere glavna produkta sta riboza-5-fosfat in NADPH. Prva se naprej uporablja pri sintezi nukleinskih kislin, NADPH pa je pomemben za sintezo makromolekul in za detoksikacijo. Regulacija PPP poteka preko njenih metabolnih encimov. V rakavih celicah je predvsem izražena povišana aktivnost glukoza-6-fosfat dehidrogenaze in s tem aktivnost PPP. Pri tem encimu sta, poleg mnogih drugih, najpomembnejša regulatorja NADPH in tumorski supresor p53. Aktivnost PPP lahko poveča tudi acetilacija 6-fosfoglukonat dehidrogenaze ali pa povečano izražanje transketolaze. Na pospešeno proliferacijo rakavih celic vplivajo tudi inaktivirani tumorski supresorji in aktivirani onkoproteini, npr. p53, TIGAR, ATM, Ras, mTORC1 in Nrf2. Največji pomen PPP pri rakavih celicah, je v zaščiti pred celično smrtjo, saj se s povečano aktivnostjo PPP pospeši tvorba njenih produktov, ki so ključni pri preživetju celice. Z inhibicijo te poti, bi lahko tudi inhibirali rast tumorjev. PPP je tako postala potenciala tarča za zdravljenje raka, vendar je za to potrebnih še veliko raziskav in boljše razumevanje metabolizma rakavih celic.

=== Maja Zupanc: Kako dolge nekodirajoče RNA vplivajo na regulacijo metabolizma ===
Ena najbolj fascinantnih lastnosti metabolizma je njegova regulacija. Za homeostazo metabolizma hranil in energije v telesu je nujna specializirana regulacija centralnega živčnega sistema, Langerhansovih otočkov trebušne slinavke in glavnih metabolnih tkiv (maščobno tkivo, skeletne mišice in jetra). Dolge nekodirajoče molekule RNA (lncRNA) so RNA molekule dolge več kot 200 nukleotidov, ki ne kodirajo proteinov. Njihov spekter delovanja je izredno širok, na metabolizem vplivajo prek regulacije procesov adipogeneze in hepatičnega metabolizma, nadzora funkcionalnosti Langerhansovih otočkastih celic, regulacije razvoja skeletnih mišic, in energijske homeostaze. Do sedaj je bilo odkritih že več kot 60000 dolgih nekodirajočih RNA molekul in repetuar njihovih funkcij se z vsako novo raziskavo širi. Vloga lncRNA je še pred desetimi leti bila neznanka, od takrat pa nam je že postalo jasno, da so pomembni regulatorji izražanja DNA, diferenciacije in razvoja celic, razvoja tkiva in tumorogeneze. V resnici pa vemo zelo malo, oziroma smo šele na začetku razumevanja lncRNA. Ker se zaradi tega z vsakim novim odkritjem pojavlja še več vprašanj (o podrobnih principih delovanja lncRNA in njihovega sodelovanja z drugimi molekulami, o še nepoznanih funkcijah, vpletenosti v bolezni in možnosti razvoja novih tehnik zdravljenja…), so raziskave na tem področju zelo aktualne.

=== Lara Jerman: Warburgov učinek: od raka do avtoimunosti ===
V dvajsetih letih prejšnjega stoletja je Otto Warburg s svojimi sodelavci meril porabo kisika in sintezo laktata v rakastem tkivu. Pri tem je prišel do zelo pomembnega opažanja, ki ostaja zelo aktualno – da celice rakastega tkiva tudi ob normoksičnih pogojih vztrajajo pri močno povečani glikolizi. Danes vemo, da se Warburgov učinek v rakastih tkivi pojavlja skoraj univerzalno. Večina Warburgovih opažanj in meritev je bila kvantitativno pravilna. Njegova razlaga vzroka pojava pa se je izkazala za napačno, saj povečano stopnjo glikolize zasledimo v mnogih rakastih tkivih brez določljivih mitohondrijskih mutacij ali motenj oksidativno-fosforilacijske metabolne poti. V takih tkivih sinteza ATP v mitohondrijih poteka nemoteno in enako učinkovito kot pri normalnih tkivih z enako koncentracijo kisika. Raziskave zadnjih let kažejo na to, da je povečana glikoliza strateška poteza rakastih celic, ki zadovoljuje predvsem njihove potrebe po sintezi biomase. V skoraj stoletju od Warburgovega prvotnega odkritja je postalo jasno, da metabolična stikala omogočajo celici, da se prilagaja svojim bioenergetskim in biosintetskim potrebam. Zmožnost hitrega prilagajanje potrebam je še posebej pomembna pri imunskih celicah, ki morajo ob imunskem odzivu hitro preiti iz mirujočega stanja. Zato ni presenetljivo, da so si rakaste in imunske celice glede zagotavljanja metabolnih tokov in bionenergetike za rast in širjenje v marsičem podobne.

=== Sara Tekavec: Mutacije encimov Krebsovega cikla in vpliv na razvoj ter rast tumorjev ===
Encimi izocitrat dehidrogenaza (IDH), sukcinat dehidrogenaza (SDH) in fumarat hidrataza (FH) sodelujejo v Krebsovem ciklu. Prvi omogoča pretvorbo izocitrata v α-ketoglutarat (α-KG), drugi pretvorbo sukcinata v fumarat, tretji pa pretvorbo fumarata v malat. Za gene, ki kodirajo te encime, so značilne mutacije, ki vodijo v nastanek in rast tumorjev. Mutacije so lahko onkogen-aktivirajoče (mutacija IDH) ali tumor-supresor deaktivirajoče (mutacije SDH in FH). Mutacija IDH tako v encimu vzpodbudi novo funkcijo, in sicer pretvorbo α-ketoglutarata ob prisotnosti NADPH v onkometabolit 2-hidroksiglutarat (2-HG). Pri drugih dveh mutacijah pa gre za to, da je aktivnost encima zmanjšana oz. je sploh ni, kar ima za posledico kopičenje sukcinata ali fumarata. To ugodno vpliva na rast tumorja, saj lahko te tri omenjene molekule na različne načine inducirajo izražanje genov, pomembnih za celično rast in preživetje. Vse tri na primer stabilizirajo hipoksični inducibilni faktor (HIF), ki nato sproži transkripcijo in angiogenezo (rast krvnih žil). Z zmanjšano koncentracijo dveh antioksidantov NADPH in α-ketoglutarata se poveča tudi tveganje za nove mutacije, povzročene s strani reaktivnih kisikovih zvrsti. Poleg tega lahko α-KG sam deluje kot mutagen ali pa tudi inhibira metilacijo DNA in histonov, zaradi česar je izražanje onkogenov povečano. Kljub temu, da je ta metabolična pot pri tumorjih precej kompleksna, nam bodo nove metode detekcije tumorjev kmalu omogočile tudi boljše razumevanje samih mutacij in mehanizma nastanka tumorjev, ki tiči v ozadju.

=== Fran Krstanović: L-Carnitine enhances exercise endurance capacity ===
Our energy metabolism is working constantly to cover energy need of our body. ATP represents the first line of action. With cellular ATP concentration low, our body needs other sources of energy as fuel. Fats carbs and proteins play that part. To get energy from fats they need to be oxidase. The process of fat oxidation is situated in the mitochondria. Fats need a special transporter to get into the cell, l-carnitine.
Apart from fat transportation l-carnitine has many other roles; enhancing exercise endurance capacity is believed to be one of them. Mice fed with L-carnitine showed great promise to confirm this theory. Glycogen concentrations were higher, all important parameters for fatty acid intake and mitochondria biogenesis were higher and do additional AMPK was activated. The most important parameter was higher endurance capacity was reached. The problem lies in implicating the theory on humans; consuming concentrations are unknown (high can lead to problems, low won’t have affect). Further experiments will surely be held as carnitine provides great attention from sports industries as a supplement for fat burning or maybe for greater athletes’ fatigue.

=== Janja Krapež: Vpliv metabolizma maščobnih kislin na povišan krvni tlak v plučnih arterijah ===
Povišan krvni tlak v pljučnih arterijah (PAH) je huda bolezen, ki posledično zelo vpliva tudi na srce, predvsem na desni prekat, ki se zaradi prevelike obremenjenosti poveča. To lahko privede tudi do odpovedi srca. Zakaj pride do nepravilnega delovanja desnega prekata, je še neznano, prav tako kako do tega pride. Zadnje raziskave sklepajo, da je z nedelovanje povezan tudi metabolizem maščobnih kislin in glukoze. Problem predstavlja kopičenje maščobnih kislin znotraj mišičnih celic srca. Za transport maščobnih kislin z dolgimi verigami poskrbi protein CD36 skupaj s FATP (v miocitih FATP6). Kopičenje maščobnih kislin v celici je povezano tudi s favoriziranjem oksidacije glukoze. Preklop med ß-oksidacijo maščobnih kislin in oksidacijo glukoze poteka v Randlovem ciklu, kjer intermediati ene oksidacije inhibirajo drugo. Ključni pri inhibiciji ß-oksidacije je malonil-CoA, ki inhibira CAP encim na mitohondrjski membrani in je ključni prenašalec maščobnih kislin v mitohondrij, kjer se nadalje oksidirajo. Trenutne raziskave želijo izboljšati delovanje desnega prekata prav preko oksidacije maščobnih kislin. Šele razumevanje zapletenih mehanizmov metabolizma bo omogočilo nadaljnji razvoj potencialnih zdravil za zdravljenje PAH in posledično tudi izboljšalo delovanje desnega prekata.

=== Elvira Boršić: Posledice spremenjenega metabolizma maščobnih kislin v kardiomiocitih ===
V fetusu kardiomiociti pridobivajo energijo z oksidacijo glukoze in laktata zaradi pomanjkanja kisika. Ko se rodimo pa postanejo maščobne kisline preferenčni substrat pridobivanja ATP-ja. Do sprememb glavnega substrata pride zaradi večjih telesnih obremenitev, bolezni in okoliščin zunaj celice. Pri tem imajo osrednjo vlogo razni transkripcijski faktorji, npr. receptor, aktiviran s peroksisomskim proliferatorjem α (PPARα), in transkripcijski koaktivatorji, npr. PPARγ koaktivator 1α (PGC1α). Dokazali so, da lahko nedelovanje vsaj 22 encimov in transporterjev udeleženih pri metabolizmu maščobnih kislin povzroči razne bolezni, ki zmanjšajo delovanje srca. Vsaka od teh pa lahko povzroči srčno popuščanje. Do tega pride, ko srce ni več zmožno črpati krvi iz pljuč po telesu. Najpogostejša vzroka sta zvišan krvni tlak in ishemija. Slednjo povzroči hipoksija, zaradi česar se ustavi tok elektronov v dihalni verigi. V anaerobnih pogojih je tako glikoliza edini vir energije in proizvede le 5 % celotnega ATP-ja, ki ga imajo kardiomiociti v normalnih pogojih. Produkti glikolize porušijo homeostazo in za ohranjanje le-te celice porabijo veliko energije, ki bi se sicer porabila pri kontrakciji. Raven kisika se obnovi pri reperfuziji, ki pa naredi še več škode kot ishemija. Zaradi srčnega popuščanja umre vsako leto več tisoč ljudi, saj še ne poznamo zdravila, ki bi to bolezen preprečilo. Ker še ne razumemo vseh mehanizmov, poteka na tem področju veliko raziskav.

=== Miha Koprivnikar Krajnc: Pomanjkanje karbamoil-fosfat sintetaze ===
Pomanjkanje karbamoil fosfat sintetaze (CPS1) je ena izmed motenj cikla sečnine, torej poslabša zmožnost proizvodnje sečnine, ki ima pomembno vlogo pri regulaciji pH. CPS1 katalizira nastanek vstopne spojine cikla sečnine, karbamoil fosfat, in jo regulirajo Mg2+, Ca2+, NAG, ter tudi druge snovi posredno, preko NAG sintetaze. Mutacij, ki povzročajo spremembo strukture CPS1 je kar nekaj in povzročajo spremembe v aktivnosti encima različnih jakosti (od milih sprememb do popolne inaktivacije). To je razlog, da nekateri oboleli velikokrat sploh ne dočakajo otroštva, medtem ko pri ostalih bolezen pride na dan kasneje v življenju ob nekem stresu za organizem. Simptomi pomanjkanja CPS1 so predvsem nevropatološke narave in vključujejo poslabšanje kognitivnih sposobnosti, epizode delirija, utrujenost in druge simptome. Pri pacientih s hujšimi motnjami lahko bolezen tudi po zdravljenju pusti trajne posledice, saj pride do poškodb možganov v procesu razvoja. Razlog za nevrotoksičnost je osmotska aktivnost glutamina, ki se v velikih količinah nabira v astrocitah možganov. To povzroča hipertonično okolje v celicah in otekanje možganov. Brez ukrepov to privede do kome in smrti. Zdravljenje akutnih primerov motnje se začne z uporabo lovilcev amonijaka in dializo krvi, nadaljnji ukrepi pa so za enkrat omejeni na dieto z malo proteinov in citrulin. Za prihodnost je obetavno zdravljenje s stimulacijo encima z aktivatorjem oziroma njegovim analogom ali pa kar s stimulacijo sintetaze aktivatorja.

=== Špela Malenšek: Leucinska in glutaminska regulacija mTORC1 ===
Kompleks mTORC1 je ohranjena Ser/Thr kinaza, ki z združevanjem signalov regulira celično ravnovesje med anabolizmom in katabolizmom. Nadzoruje celično rast, sintezo proteinov ter ribosomov in blokira avtofagijo. Nepravilno delovanje mTORC1 je vzrok različnim vrstam raka, diabetesu tipa 2 in nevrodegenerativnim boleznim. Verjetno najpomembnejši, a hkrati najmanj razumljeni regulatorji mTORC1 so aminokisline, med katerimi izstopata leucin in glutamin. Koncentraciji slednjih v citosolu sta odvisni druga od druge, saj je t.i. terciarni aktivni transport leucina v celico sklopljen s prenosom glutamina iz celice. Eden izmed modelov regulacije mTORC1 predpostavlja, da so pri prenosu aminokislinskega signala do mTORC1 glavni trije multiproteinski kompleksi, ki vključujejo majhne RagGTPaze, Ragulator in v-ATPazo. Združitev slednjih poteka na lizosomih, kjer je mTORC1 posledično tudi aktiviran s proteinom Rheb. Aminokislinska signalna kaskada mTORC1 predstavlja tudi tipalo, s katerim celica zaznava prisotnost in koncentracijo aminokislin v lizosomskem lumnu, citoplazmi in v zunaj-celičnem prostoru. Delovanje v-ATPaze je namreč močno odvisno od koncentracije leucina v notranjosti lizosomov in predstavlja t.i. »notranjo« regulacijo mTORC1. Hkrati naj bi leucin neposredno vplival na spremembno konformacije RagGTPaz z vezavo na protein Sestrin2, vendar so je popoln mehanizem posledice vezave leucina še nepojasnjen. Glutamin naj bi na mTORC1 deloval drugače kot leucin (brez posredovanja RagGTPaz in Ragulatorja), hkrati pa naj bi regulacijsko vlogo aktivacije mTORC1 imel tudi eden izmed produktov dvojne deaminacije glumatina, α-ketoglutarat.

=== Neža Koritnik: Uravnavanje koncentracije ROS in glutationilacija v mitohondriju ===
V mitohondriju zaradi razlik v redoks okolju nastajajo reaktivne kisikove spojine (ROS), ki lahko povzročajo oksidativno škodo, v manjših koncentracijah pa so pomembne signalne molekule. Njihov glavni vir so predvsem flavoproteini, jih najdemo tudi v kompleksih dihalne verige in nekaterih encimih Krebsovega cikla. Ti lahko v času oksidativnega stresa zaradi različnih razlogov prenesejo elektrone namesto na njihov naravni akceptor direktno na kisik, pri čemer se tvorijo reaktivni superoksidni radikali (in druge ROS). H2O2 ima sposobnost oksidacije tiolnih cisteinskih ostankov proteinov (-SH do -SOH), kar ponavadi povzroči reverzibilno deaktivacijo proteinov in s tem regulacijo različnih procesov v mitohondriju. V skrajnem primeru pa pride do hiperoksidacije (do -SO2H ali - SO3H), ki pa je ireverzibilna in lahko trajo poškoduje proteine in druge molekule. Za preprečevanje oksidativne škode in uravnavanjem redoks signalizacije so se razvili sistemi GSH/Gpx/GR in Prx/Trx/TrxR. Glutation (GSH) je pomembna molekula, ki v razmerju s svojo oksidirano obliko (dimerom GSSG) določa redoks stanje v mitohondriju. V oksidirani obliki ima sposobnost vezave na tiole cisteinskih ostankov proteinov. To je proces glutationilacije, pri kateri se tvori disulfidna povezava protein-SSG, kar pa ima regulatorno vlogo (začasna aktivacija/deaktivacija proteina) ali pa zaščitno vlogo pred hiperoksidacijo. Pomemben encim, ki regulira glutationilacijo je glutaredoksin (Grx). S temi mehanizmi se v mitohondriju uravnavajo številni metabolni procesi in redoks stanje matriksa.

=== Urša Kopač: Vpliv mutacij na delovanje ATP-sintaze s poudarkom na TMEM70 ===
Mutacije genov, ki vplivajo na encim ATP-sintaza, v grobem razdelimo v dve skupini. Tiste, ki nastanejo na mitohondrijski mtDNA, in tiste, ki vplivajo na genski material v jedru (nDNA). Različne mutacije vplivajo na različne podenote ATP-sintaze, ali pa mutirajo gene za proteinske faktorje, ki sodelujejo pri biosintezi ATP-sintaze. Med slednje prištevamo tudi mutacije TMEM70 na nDNA. Proteinski faktor TMEM70 vpliva sintezo domene F1. Ugotovili so, da mutacije na genu TMEM70 povzročijo, da se sinteza ATP-sintaze ustavi že v začetni fazi. Ker se encimski kompleks ne more sintetizirati do konca, nastanejo motnje v metabolizmu zaradi pomanjkanja ATP. Z elektronsko mikroskopijo so dokazali, da se v takšnih bolezenskih stanjih morfologija mitohondrija korenito spremeni. S proučevanjem mutacij genov, ki vplivajo na delovanje ATP-sintaze, pridobivamo tudi nove podatke o biosintezi ATP-sintaze. To je več kot dobrodošlo, saj v nasprotju s samo strukturo ATPaze o poteku izgradnje encima ne vemo veliko. Predvsem se na ta način zbira podatke o pomožnih faktorjih, ki imajo ključno vlogo pri tvorbi tega pomembnega encima. Za primer lahko vzamemo TMEM70. Šele s proučevanjem mutacije TMEM70 pri bolnikih z mitohondrijskimi boleznimi so odkrili, da je sama sinteza ATP-sintaze povezana s pomožnim proteinskim faktorjem TMEM70. Obširnejše znanje o biogenezi ATP-sintaze ter o mutacijah, ki vplivajo na delovanje ATP-sintaze, pomeni tudi več možnosti za razvijanje novih potencialnih zdravil in oblik zdravljenja.

=== Gašper Virant: Vpliv reaktivnih kisikovih spojin na dolžino življenjske dobe ===
Reaktivne kisikove spojine oz. kratko ROS nastajajo v 90% v mitohondrijih v glavnem na dihalni verigi, natančneje na kompleksih I in III. V preteklosti so veljale kot nujno zlo prisotno v celici, saj lahko zaradi svojih oksidacijskih lastnosti poškodujejo proteine, DNA in ostale makromolekule, kar vodi v celično disfunkcijo in kasneje smrt. V poznejših raziskavah so ROS-e začeli osvetljevati z druge strani in jim pripisovati ter poudarjati njihov pomen za celično sporočanje. Seveda je transdukcija z ROS-i zelo reguliran proces na več stopnjah. V glavnem se ROSi pojavijo v povečani količini kot odgovor na stres in v vlogi signalnih intermediatov aktivirajo različne celične odzive, ki vodijo k adaptaciji na le-tega . Med drugim izzovejo transkripcijo genov, ki kodirajo sirtuine. Ti veljajo za proteine, ki skrbijo za vitalnost in zdravje celic ter tako podaljšujejo življenjsko dobo organizma. Sirtuini z deacetilacijo aktivirajo superoksid dizmutaze (SOD) in s tem posledično pomembno znižajo nivo ROS-ov v celici. SOD so encimi, ki pretvarjajo superoksidni anion v vodikov peroksid, kateri v nadaljnjih reakcijah razpade na kisik in vodo. Skratka, rekativne kisikove spojine so v višjih koncentracijah za celico škodljive in krajšajo življenjsko dobo, v malih količinah pa so nujno potrebne za celično sporočanje.

BIO2 Seminar 2015

2015-12-02T22:19:40Z

GasperVirant: /* Seznam seminarjev */

= Biokemijski seminar =
doc. dr. Gregor Gunčar, K2.022

== Seznam seminarjev ==
{| {{table}}
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Ime Priimek'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''poglavje'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Naslov seminarja'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 1'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 2'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Datum oddaje'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Datum recenzije'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Datum predstavitve'''
|-
| Kristjan Stibilj||12||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2015#Kristjan_Stibilj:_Inhibicija PI3k/AKT/mTOR signalne poti kot orožje proti raku||Lovro Kotnik||Blaž Lebar]||21/10/15||23/10/15||28/10/15
|-
| Tjaša Lukšič||12||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2015#Tjasa_Luksic: Alternativno izrezovanje GPCR-jev s poudarkom na sekretinski družini]||Karmen Žbogar||Aleksandra Uzar||21/10/15||23/10/15||28/10/15
|-
| Klara Kuret||12||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2015#Klara_Kuret: Vpliv bakterijskih efektorjev na celični ubikvitinacijski sistem in rastlinski imunski odziv]||Klara Lenart||Petra Hruševar||21/10/15||23/10/15||28/10/15
|-
| Rok Miklavčič||12||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2015#Rok_Miklavčič: Preusmeritve signalnih poti preko TNFR1 v boju s patogeni]||Katja Čop||Lovro Kotnik||28/10/15||30/10/15||04/11/15
|-
| Ema Gašperšič||12||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2015#Ema_Gaspersic: PKC in njihov vpliv na raka ter Alzheimerjevo bolezen]||Nejc Kejžar||Karmen Žbogar||28/10/15||30/10/15||04/11/15
|-
| Tadej Satler||12||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2015#Tadej_Satler: PD-1 limfocitov in melanomskih celic]||Neža Brezovar||Klara Lenart||28/10/15||30/10/15||04/11/15
|-
| Tina Šimunović||14-15||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2015#Tina_Simunovic: Pentoza-fosfatna pot, njena regulacija in povezava z rakom]||Kristjan Stibilj||Katja Čop||04/11/15||06/11/15||11/11/15
|-
| Maja Zupanc||14-15||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2015#Maja_Zupanc: Kako dolge nekodirajoče RNA vplivajo na metabolizem]||Tjaša Lukšič||Nejc Kejžar||04/11/15||06/11/15||11/11/15
|-
| Tilen Tršelič||14-15||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2015#Tilen_Trselic: PKM2 in njegova vloga pri razvoju rakavih celic]||Klara Kuret||Dorotea Borković||04/11/15||06/11/15||11/11/15
|-
| Lara Jerman||16||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2015#Lara_Jerman: Warburgov učinek: od raka do avtoimunosti]||Rok Miklavčič||Neža Brezovar||11/11/15||13/11/15||18/11/15
|-
| Eva Rajh||16||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2015#Eva_Rajh: Vpliv intermediatov Krebsovega cikla na modifikacije DNK in histonov ter vpliv na staranje]||Ema Gašperšič||Kristjan Stibilj||11/11/15||13/11/15||18/11/15
|-
| Sara Tekavec||16||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2015#Sara_Tekavec: Mutacije encimov Krebsovega cikla in vpliv na razvoj ter rast tumorjev]||Tadej Satler||Tjaša Lukšič||11/11/15||13/11/15||18/11/15
|-
| Fran Krstanović||17||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2015#Fran_Krstanovic: L-Carnitine enhances exercise endurance capacity]||Tina Šimunović||Klara Kuret||18/11/15||20/11/15||25/11/15
|-
| Elvira Boršić||17||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2015#Elvira_Boršić: Posledice spremenjenega metabolizma maščobnih kislin v kardiomiocitih]||Maja Zupanc||Rok Miklavčič||18/11/15||20/11/15||25/11/15
|-
| Janja Krapež||17||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2015#Janja_Krapež: Vpliv metabolizma maščobnih kisln na povišan krvni tlak v pljučnih arterijah]||Tilen Tršelič||Ema Gašperšič||18/11/15||20/11/15||25/11/15
|-
| Janez Javornik||18||||Lara Jerman||Tadej Satler||25/11/15||27/11/15||02/12/15
|-
| Miha Koprivnikar Krajnc||18||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2015#Miha_Koprivnikar_Krajnc: Pomanjkanje karbamoil-fosfat sintetaze]||Eva Rajh||Tina Šimunović||25/11/15||27/11/15||02/12/15
|-
| Špela Malenšek||18||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2015#Špela_Malenšek: Leucinska in glutaminska regulacija mTORC1]||Sara Tekavec||Maja Zupanc||25/11/15||27/11/15||02/12/15
|-
| Urša Kopač||19||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2015#Urša_Kopač: Vpliv mutacij na delovanje ATP-sintaze s poudarkom na TMEM70]||Fran Krstanović||Tilen Tršelič||02/12/15||04/12/15||09/12/15
|-
| Neža Koritnik||19||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2015#Ne.C5.BEa_Koritnik: Uravnavanje koncentracije ROS in glutationilacija v mitohondriju]||Dorotea Borković||Lara Jerman||02/12/15||04/12/15||09/12/15
|-
| Gašper Virant||19||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2015#Gašper_Virant: Vpliv reaktivnih kisikovih spojin na dolžino življenske dobe]||Elvira Boršić||Eva Rajh||02/12/15||04/12/15||09/12/15
|-
| Uroš Zavrtanik||20||||Janja Krapež||Sara Tekavec||09/12/15||11/12/15||16/12/15
|-
| Simon Aleksič||20||||Janez Javornik||Fran Krstanović||09/12/15||11/12/15||16/12/15
|-
| Matej Hvalec||20||||Miha Koprivnikar Krajnc||Elvira Boršić||09/12/15||11/12/15||16/12/15
|-
| Urša Čerček||21||PCSK9: Nov način uravnavanja koncentracije LDL v krvi||Špela Malenšek||Janja Krapež||16/12/15||18/12/15||23/12/15
|-
| Katja Brezovar||21||Vloga sfingolipidov pri fagocitozi ''Candide albicans''||Urša Kopač||Janez Javornik||16/12/15||18/12/15||23/12/15
|-
| Gašper Žun||21||||Neža Koritnik||Miha Koprivnikar Krajnc||16/12/15||18/12/15||23/12/15
|-
| Blaž Lebar||22||||Gašper Virant||Špela Malenšek||23/12/15||03/01/16||06/01/16
|-
| Aleksandra Uzar||22||Nucleoside antibiotics||Uroš Zavrtanik||Urša Kopač||23/12/15||03/01/16||06/01/16
|-
| Petra Hruševar||22||Vloga metabolizma serina in glicina pri raku||Simon Aleksič||Neža Koritnik||23/12/15||03/01/16||06/01/16
|-
| Dorotea Borković||23||||Matej Hvalec||Gašper Virant||06/01/16||08/01/16||12/01/16
|-
| Karmen Žbogar||23||||Katja Brezovar||Simon Aleksič||06/01/16||08/01/16||13/01/16
|-
| Klara Lenart||23||||Gašper Žun||Matej Hvalec||06/01/16||08/01/16||13/01/16
|-
| Lovro Kotnik||23||||Urša Čerček||Uroš Zavrtanik||06/01/16||08/01/16||13/01/16
|-
| Katja Čop||23||||Blaž Lebar||Urša Čerček||13/01/16||15/01/16||20/01/16
|-
| Nejc Kejžar||23||Hormonska regulacija razvoja T-celic||Aleksandra Uzar||Katja Brezovar||13/01/16||15/01/16||20/01/16
|-
| Neža Brezovar||23||||Petra Hruševar||Gašper Žun||13/01/16||15/01/16||20/01/16
|}

*številka v okencu za temo pomeni poglavje v Lehningerju, v katerega naj izbrana tema spada

== Gradivo za predavanja ==
Gradivo za predavanja in seminarje najdete na http://bio.ijs.si/~zajec/bio2/
username: bio2
password: samozame

==Naloga==
'''Vaša naloga za seminar je: '''
Samostojno pripraviti seminar o seminarski temi, ki vam je bila dodeljena. Za osnovo morate vzeti pregledni članek iz revije, ki ima faktor vpliva nad 5 (npr. [http://www.sciencedirect.com/science/journal/09680004/ TIBS]. Poiskati morate še vsaj tri znanstvene članke, ki se nanašajo na opisano temo in jih uporabiti kot podlago za seminarsko nalogo! Članki so dostopni [http://93.174.95.27/scimag/ tukaj].

Za pripravo seminarja velja naslednje: 
* [[BIO2 Povzetki seminarjev 2015|Povzetek seminarja]] opišete na wikiju '''v 200 besedah''' (+- dvajset besed) - najkasneje do dne ko morate oddati seminar recenzentom.
* Povezavo do povzetka vnesete v tabelo seminarjev tekočega letnika.
* Seminar pripravite v obliki seminarske naloge na ~5-12 straneh A4 (pisava 12, enojni razmak, 2,5 cm robovi). Zelo pomembno je, da je obseg od 2700 do 3000 besed , a ne več kot 3500 besed. Seminarska naloga mora vsebovati najmanj tri slike. Slika mora imeti legendo in v besedilu mora biti na ustreznem mestu sklic na sliko. 
* Seminar oddajte do datuma oddaje, ki je naveden v tabeli v elektronski obliki z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/ tega obrazca].
* Vsi seminarji so v elektronski obliki dostopni [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/bioseminar/ tukaj].
* Recenzenti do dneva določenega v tabeli določijo popravke (v elektronski obliki) in podajo oceno pisnega dela. Popravljen seminar oddajte z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/ tega obrazca].
* Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Za predstavitev je na voljo 20 minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni.
* Predstavitvi sledi razprava. Recenzenti podajo oceno predstavitve in postavijo najmanj dve vprašanji.Vsi ostali morajo postaviti še dve dodatni vprašanji v toku celega seminarskega obdobja.
* Na dan predstavitve morate docentu še pred predstavitvijo oddati končno (popravljeno) in natisnjeno verzijo seminarja v enem izvodu, elektronsko verzijo seminarja in predstavitev pa oddati na strežnik na dan predstavitve do polnoči.
* Seminarska naloga in povzetek morajo biti v slovenskem jeziku, razen za študente, katerih materni jezik ni slovenščina. Ti lahko oddajo seminar v angleškem jeziku.

==Imena datotek==
Prosim vas, da vse datoteke, ki mi jih pošiljate poimenujete po naslednjem receptu:
* 312_BIO_Priimek_Ime.doc(x) za seminar, npr. 312_BIO_Guncar_Gregor.docx
* 312_BIO_Priimek_ime_final.doc(x) za končno verzijo seminarja
* 312_BIO_Priimek_Ime_rec_Priimek2.doc(x) za recenzijo, kjer je Priimek2 priimek recenzenta, npr. 312_BIO_Guncar_Gregor_rec_Scott.docx (če se pišete Scott in odajate recenzijo za seminar, ki ga je napisal Gunčar)
* 312_BIO_Priimek_Ime.ppt(x) za prezentacijo, npr 312_BIO_Guncar_Gregor.pptx
* 312_BIO_Priimek_ime_poprava.doc(x) za popravljeno končno verzijo seminarja, če so popravki manjši
* 116_BIO_Priimek_Ime.doc(x) za seminar, ki je napisan na novo in je bil prijavljen v shemo 50%

==Ocenjevanje seminarjev==
Recenzenti ocenijo seminar tako, da izpolnijo [https://docs.google.com/forms/d/1EQDYwFO-DEzZ2R7jf8DhLqIeV4FFxRd3-ScceEASpt4/viewform recenzentsko poročilo] na spletu. Recenzentsko poročilo morate oddati najkasneje do 21:00, en dan pred predstavitvijo seminarja.

== Mnenje o predstavitvi ==
Vsak posameznik odda svoje mnenje o predstavitvi takoj po predstavitvi z online glasovanjem.

==Urejanje spletnih strani na wikiju==
Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''

==Citiranje virov==
Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se držite ene same. V seminarskih nalogah in diplomskih nalogah FKKT uprabljajte shemo citiranja, ki je pobarvana zeleno.
Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati.
Za citate v naravoslovju je najpogostejše citiranje po pravilniku ISO 690. [http://www.zveza-zotks.si/gzm/dokumenti/literatura.html Pravila], ki upoštevajo omenjeni standard, so pripravili pri ZTKS. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati. 
'''Citiranje knjig:''' 
Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica. 
Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN. 

Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005. 
Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4. 
Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.).

'''Citiranje člankov:''' 
Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani. 
Lartigue, C., Glass, J. I., Alperovich, N., Pieper, R., Parmar, P. P., Hutchison III, C. A., Smith, H. O. in Venter, J. C.
Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, 317, str. 632-638.

Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole: 
Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani. 
Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.

Revija Science uporablja skrajšani zapis: 
C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007) 

V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne). Navesti morate tudi vse avtorje dela, razen v primeru, ko jih je 10 ali več. Takrat navedite le prvih devet, za ostale pa uporabite okrajšavo in sod. (in sodelavci). Pred zadnjim avtorjem naj bo vedno besedica "in".

'''Citiranje spletnih virov:''' 
Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov 
strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life 
Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.

BIO2 Seminar 2015

2015-12-02T22:11:06Z

GasperVirant: /* Seznam seminarjev */

= Biokemijski seminar =
doc. dr. Gregor Gunčar, K2.022

== Seznam seminarjev ==
{| {{table}}
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Ime Priimek'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''poglavje'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Naslov seminarja'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 1'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 2'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Datum oddaje'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Datum recenzije'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Datum predstavitve'''
|-
| Kristjan Stibilj||12||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2015#Kristjan_Stibilj:_Inhibicija PI3k/AKT/mTOR signalne poti kot orožje proti raku||Lovro Kotnik||Blaž Lebar]||21/10/15||23/10/15||28/10/15
|-
| Tjaša Lukšič||12||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2015#Tjasa_Luksic: Alternativno izrezovanje GPCR-jev s poudarkom na sekretinski družini]||Karmen Žbogar||Aleksandra Uzar||21/10/15||23/10/15||28/10/15
|-
| Klara Kuret||12||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2015#Klara_Kuret: Vpliv bakterijskih efektorjev na celični ubikvitinacijski sistem in rastlinski imunski odziv]||Klara Lenart||Petra Hruševar||21/10/15||23/10/15||28/10/15
|-
| Rok Miklavčič||12||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2015#Rok_Miklavčič: Preusmeritve signalnih poti preko TNFR1 v boju s patogeni]||Katja Čop||Lovro Kotnik||28/10/15||30/10/15||04/11/15
|-
| Ema Gašperšič||12||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2015#Ema_Gaspersic: PKC in njihov vpliv na raka ter Alzheimerjevo bolezen]||Nejc Kejžar||Karmen Žbogar||28/10/15||30/10/15||04/11/15
|-
| Tadej Satler||12||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2015#Tadej_Satler: PD-1 limfocitov in melanomskih celic]||Neža Brezovar||Klara Lenart||28/10/15||30/10/15||04/11/15
|-
| Tina Šimunović||14-15||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2015#Tina_Simunovic: Pentoza-fosfatna pot, njena regulacija in povezava z rakom]||Kristjan Stibilj||Katja Čop||04/11/15||06/11/15||11/11/15
|-
| Maja Zupanc||14-15||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2015#Maja_Zupanc: Kako dolge nekodirajoče RNA vplivajo na metabolizem]||Tjaša Lukšič||Nejc Kejžar||04/11/15||06/11/15||11/11/15
|-
| Tilen Tršelič||14-15||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2015#Tilen_Trselic: PKM2 in njegova vloga pri razvoju rakavih celic]||Klara Kuret||Dorotea Borković||04/11/15||06/11/15||11/11/15
|-
| Lara Jerman||16||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2015#Lara_Jerman: Warburgov učinek: od raka do avtoimunosti]||Rok Miklavčič||Neža Brezovar||11/11/15||13/11/15||18/11/15
|-
| Eva Rajh||16||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2015#Eva_Rajh: Vpliv intermediatov Krebsovega cikla na modifikacije DNK in histonov ter vpliv na staranje]||Ema Gašperšič||Kristjan Stibilj||11/11/15||13/11/15||18/11/15
|-
| Sara Tekavec||16||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2015#Sara_Tekavec: Mutacije encimov Krebsovega cikla in vpliv na razvoj ter rast tumorjev]||Tadej Satler||Tjaša Lukšič||11/11/15||13/11/15||18/11/15
|-
| Fran Krstanović||17||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2015#Fran_Krstanovic: L-Carnitine enhances exercise endurance capacity]||Tina Šimunović||Klara Kuret||18/11/15||20/11/15||25/11/15
|-
| Elvira Boršić||17||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2015#Elvira_Boršić: Posledice spremenjenega metabolizma maščobnih kislin v kardiomiocitih]||Maja Zupanc||Rok Miklavčič||18/11/15||20/11/15||25/11/15
|-
| Janja Krapež||17||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2015#Janja_Krapež: Vpliv metabolizma maščobnih kisln na povišan krvni tlak v pljučnih arterijah]||Tilen Tršelič||Ema Gašperšič||18/11/15||20/11/15||25/11/15
|-
| Janez Javornik||18||||Lara Jerman||Tadej Satler||25/11/15||27/11/15||02/12/15
|-
| Miha Koprivnikar Krajnc||18||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2015#Miha_Koprivnikar_Krajnc: Pomanjkanje karbamoil-fosfat sintetaze]||Eva Rajh||Tina Šimunović||25/11/15||27/11/15||02/12/15
|-
| Špela Malenšek||18||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2015#Špela_Malenšek: Leucinska in glutaminska regulacija mTORC1]||Sara Tekavec||Maja Zupanc||25/11/15||27/11/15||02/12/15
|-
| Urša Kopač||19||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2015#Urša_Kopač: Vpliv mutacij na delovanje ATP-sintaze s poudarkom na TMEM70]||Fran Krstanović||Tilen Tršelič||02/12/15||04/12/15||09/12/15
|-
| Neža Koritnik||19||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2015#Ne.C5.BEa_Koritnik: Uravnavanje koncentracije ROS in glutationilacija v mitohondriju]||Dorotea Borković||Lara Jerman||02/12/15||04/12/15||09/12/15
|-
| Gašper Virant||19||Vpliv reaktivnih kisikovih spojin na dolžino življenske dobe||Elvira Boršić||Eva Rajh||02/12/15||04/12/15||09/12/15
|-
| Uroš Zavrtanik||20||||Janja Krapež||Sara Tekavec||09/12/15||11/12/15||16/12/15
|-
| Simon Aleksič||20||||Janez Javornik||Fran Krstanović||09/12/15||11/12/15||16/12/15
|-
| Matej Hvalec||20||||Miha Koprivnikar Krajnc||Elvira Boršić||09/12/15||11/12/15||16/12/15
|-
| Urša Čerček||21||PCSK9: Nov način uravnavanja koncentracije LDL v krvi||Špela Malenšek||Janja Krapež||16/12/15||18/12/15||23/12/15
|-
| Katja Brezovar||21||Vloga sfingolipidov pri fagocitozi ''Candide albicans''||Urša Kopač||Janez Javornik||16/12/15||18/12/15||23/12/15
|-
| Gašper Žun||21||||Neža Koritnik||Miha Koprivnikar Krajnc||16/12/15||18/12/15||23/12/15
|-
| Blaž Lebar||22||||Gašper Virant||Špela Malenšek||23/12/15||03/01/16||06/01/16
|-
| Aleksandra Uzar||22||Nucleoside antibiotics||Uroš Zavrtanik||Urša Kopač||23/12/15||03/01/16||06/01/16
|-
| Petra Hruševar||22||Vloga metabolizma serina in glicina pri raku||Simon Aleksič||Neža Koritnik||23/12/15||03/01/16||06/01/16
|-
| Dorotea Borković||23||||Matej Hvalec||Gašper Virant||06/01/16||08/01/16||12/01/16
|-
| Karmen Žbogar||23||||Katja Brezovar||Simon Aleksič||06/01/16||08/01/16||13/01/16
|-
| Klara Lenart||23||||Gašper Žun||Matej Hvalec||06/01/16||08/01/16||13/01/16
|-
| Lovro Kotnik||23||||Urša Čerček||Uroš Zavrtanik||06/01/16||08/01/16||13/01/16
|-
| Katja Čop||23||||Blaž Lebar||Urša Čerček||13/01/16||15/01/16||20/01/16
|-
| Nejc Kejžar||23||Hormonska regulacija razvoja T-celic||Aleksandra Uzar||Katja Brezovar||13/01/16||15/01/16||20/01/16
|-
| Neža Brezovar||23||||Petra Hruševar||Gašper Žun||13/01/16||15/01/16||20/01/16
|}

*številka v okencu za temo pomeni poglavje v Lehningerju, v katerega naj izbrana tema spada

== Gradivo za predavanja ==
Gradivo za predavanja in seminarje najdete na http://bio.ijs.si/~zajec/bio2/
username: bio2
password: samozame

==Naloga==
'''Vaša naloga za seminar je: '''
Samostojno pripraviti seminar o seminarski temi, ki vam je bila dodeljena. Za osnovo morate vzeti pregledni članek iz revije, ki ima faktor vpliva nad 5 (npr. [http://www.sciencedirect.com/science/journal/09680004/ TIBS]. Poiskati morate še vsaj tri znanstvene članke, ki se nanašajo na opisano temo in jih uporabiti kot podlago za seminarsko nalogo! Članki so dostopni [http://93.174.95.27/scimag/ tukaj].

Za pripravo seminarja velja naslednje: 
* [[BIO2 Povzetki seminarjev 2015|Povzetek seminarja]] opišete na wikiju '''v 200 besedah''' (+- dvajset besed) - najkasneje do dne ko morate oddati seminar recenzentom.
* Povezavo do povzetka vnesete v tabelo seminarjev tekočega letnika.
* Seminar pripravite v obliki seminarske naloge na ~5-12 straneh A4 (pisava 12, enojni razmak, 2,5 cm robovi). Zelo pomembno je, da je obseg od 2700 do 3000 besed , a ne več kot 3500 besed. Seminarska naloga mora vsebovati najmanj tri slike. Slika mora imeti legendo in v besedilu mora biti na ustreznem mestu sklic na sliko. 
* Seminar oddajte do datuma oddaje, ki je naveden v tabeli v elektronski obliki z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/ tega obrazca].
* Vsi seminarji so v elektronski obliki dostopni [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/bioseminar/ tukaj].
* Recenzenti do dneva določenega v tabeli določijo popravke (v elektronski obliki) in podajo oceno pisnega dela. Popravljen seminar oddajte z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/ tega obrazca].
* Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Za predstavitev je na voljo 20 minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni.
* Predstavitvi sledi razprava. Recenzenti podajo oceno predstavitve in postavijo najmanj dve vprašanji.Vsi ostali morajo postaviti še dve dodatni vprašanji v toku celega seminarskega obdobja.
* Na dan predstavitve morate docentu še pred predstavitvijo oddati končno (popravljeno) in natisnjeno verzijo seminarja v enem izvodu, elektronsko verzijo seminarja in predstavitev pa oddati na strežnik na dan predstavitve do polnoči.
* Seminarska naloga in povzetek morajo biti v slovenskem jeziku, razen za študente, katerih materni jezik ni slovenščina. Ti lahko oddajo seminar v angleškem jeziku.

==Imena datotek==
Prosim vas, da vse datoteke, ki mi jih pošiljate poimenujete po naslednjem receptu:
* 312_BIO_Priimek_Ime.doc(x) za seminar, npr. 312_BIO_Guncar_Gregor.docx
* 312_BIO_Priimek_ime_final.doc(x) za končno verzijo seminarja
* 312_BIO_Priimek_Ime_rec_Priimek2.doc(x) za recenzijo, kjer je Priimek2 priimek recenzenta, npr. 312_BIO_Guncar_Gregor_rec_Scott.docx (če se pišete Scott in odajate recenzijo za seminar, ki ga je napisal Gunčar)
* 312_BIO_Priimek_Ime.ppt(x) za prezentacijo, npr 312_BIO_Guncar_Gregor.pptx
* 312_BIO_Priimek_ime_poprava.doc(x) za popravljeno končno verzijo seminarja, če so popravki manjši
* 116_BIO_Priimek_Ime.doc(x) za seminar, ki je napisan na novo in je bil prijavljen v shemo 50%

==Ocenjevanje seminarjev==
Recenzenti ocenijo seminar tako, da izpolnijo [https://docs.google.com/forms/d/1EQDYwFO-DEzZ2R7jf8DhLqIeV4FFxRd3-ScceEASpt4/viewform recenzentsko poročilo] na spletu. Recenzentsko poročilo morate oddati najkasneje do 21:00, en dan pred predstavitvijo seminarja.

== Mnenje o predstavitvi ==
Vsak posameznik odda svoje mnenje o predstavitvi takoj po predstavitvi z online glasovanjem.

==Urejanje spletnih strani na wikiju==
Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''

==Citiranje virov==
Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se držite ene same. V seminarskih nalogah in diplomskih nalogah FKKT uprabljajte shemo citiranja, ki je pobarvana zeleno.
Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati.
Za citate v naravoslovju je najpogostejše citiranje po pravilniku ISO 690. [http://www.zveza-zotks.si/gzm/dokumenti/literatura.html Pravila], ki upoštevajo omenjeni standard, so pripravili pri ZTKS. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati. 
'''Citiranje knjig:''' 
Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica. 
Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN. 

Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005. 
Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4. 
Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.).

'''Citiranje člankov:''' 
Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani. 
Lartigue, C., Glass, J. I., Alperovich, N., Pieper, R., Parmar, P. P., Hutchison III, C. A., Smith, H. O. in Venter, J. C.
Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, 317, str. 632-638.

Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole: 
Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani. 
Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.

Revija Science uporablja skrajšani zapis: 
C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007) 

V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne). Navesti morate tudi vse avtorje dela, razen v primeru, ko jih je 10 ali več. Takrat navedite le prvih devet, za ostale pa uporabite okrajšavo in sod. (in sodelavci). Pred zadnjim avtorjem naj bo vedno besedica "in".

'''Citiranje spletnih virov:''' 
Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov 
strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life 
Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.

TBK2015 Povzetki seminarjev

2015-03-28T21:30:07Z

GasperVirant: /* Gašper Virant: Vezava agonista na adenozinske receptorje lajša kronično bolečino */

[[TBK2015-seminar|Nazaj na osnovno stran]]

=== Uroš Zavrtanik: Mehanizem popravljanja DNA: NER (faktor XPC) ===

Od samega nastanka naprej se življenje spopada s fundamentalnim problemom kemijske nestabilnosti genetske informacije, shranjene v DNA. Molekula DNA je izpostavljena številnim fizikalnim ter kemijskim dejavnikom, ki lahko vplivajo na njeno strukturo in posredno ali neposredno tudi na samo informacijo. Ker pa predstavlja ohranjanje informacije eden izmed ključnih in pomembnejših aspektov življenja samega, so se tekom evolucije razvili številni mehanizmi popravljanja DNA. Eden izmed teh mehanizmov je popravljanje DNA z izrezom nukleotidov (ang. Nucleotide Excision Repair-NER). NER je popravljalni proces za odstranjevanje in popravo večjih strukturnih nepravilnosti v strukturi DNA, ki so v glavnem posledica radiacije (UV, gama) ter okolijskih dejavnikov (specifične molekule, ki lahko strukturno poškodujejo DNA). NER predstavlja pri človeku edini mehanizem za popravljanje poškodb povzročenih zaradi UV radiacije. Največji izziv NER je, kako najti vse poškodovane dele DNA v celotnem genomu. Na podlagi eksperimentalnih ugotovitev raziskovalci ugotavljajo, da bi lahko bil ''ključ do uspeha'' naključna vezava proteina XPC (začetni faktor NER) na nespecifično mesto v DNA ter nato vzdolžna difuzija XPC do poškodovanega (specifičnega) mesta, kjer XPC za trenutek obstane, kar je signal za sprožitev popravljalnega procesa. Odkritje bi lahko predstavljalo generalni koncept mehanizma še vedno malo raziskane interakcije protein-DNA.

=== Gašper Virant: Vezava agonista na adenozinske receptorje lajša kronično bolečino ===
Kronična bolečina je posledica okvare živčevja. Ločimo nociceptivno kronično bolečino, ki jo povzroča draženje bolečinskih receptorjev (nociceptorjev) v tkivih notranjih organov ter mišičnoskeletnega sistema, in nevropatsko kronično bolečino, ki nastane kot posledica okvare, poškodbe ali motenega delovanja perifernega ali osrednjega živčevja . Najbolj uspešni pristopi lajšanja tovrstne bolečine temeljijo na uporabi mehanizma kalcijevih kanalčkov, opioidov, in adrenergikov. Pogosto pa imajo ta zdravila stranske učinke, ki nastopijo ob neprestani uporabi. Prav tako telo razvije toleranco do njih, kar pomeni, da je za enak učinek potreben vedno večji odmerek, kar vodi v zmanjšano učinkovanje zdravila. Kot močno ne-narkotično in ne-opoidno sredstvo za lajšanje tovrstne bolečine se je izkazal adenozin. Adenozin oz. nekateri še bolj selektivni agonisti se vežejo na zunajcelične adenozinske receptorje in s tem zmanjšajo zaznavanje bolečine. Adenozin v zunajceličem prostoru ni obstojen, vendar lahko njegovo življensko dobo podaljšamo z inhibicijo andenozin kinaz in deaminaz ter tako posledično podaljšamo tudi protibolečinsko delovanje. Visoko selektiven agonist z veliko afiniteto do A3 podskupine adenozinskih receptorjev bi tudi pomembno odpravil neželene stranske učinke.

=== Klara Lenart: Permanentno označevanje nevronskih povezav ===

Preučevanje nevronskih povezav je precej neraziskano področje. Za raziskave teh povezav uporabljajo proteine, najpogosteje skupino proteinov imenovano GCaMP, ki oddajajo fluorescenčno svetlobo kratek čas po zaznavi spremembe v koncentraciji kalcijevih ionov v celici. Skupina znanstvenikov z medicinskega inštituta Howard Hughes je razvila nov protein, imenovan CaMPARI(podoben je skupini GCaMP-jev), ki označuje aktivne nevrone glede na spremembo koncentracije Ca2+ v njih. Proteini, podobni CaMPARI-ju obstajajo že zadnjih 20 let, a posebnost novega proteina je permanentna fluorescenca, ki jo oddaja ob povečanju koncentracije kalcija v celici ter sočasnem obsevanju z vijolično svetlobo. Glavni del CaMPARI-ja je fluorescenten protein EosFP, ki spremeni barvo iz zelene v rdečo ob obsvetljevanju z vijolično svetlobo. Ko so EosFP spojili z kalmodulinom in peptidom M13, katera sta potrebna za vezavo kalcijevih ionov, je nastal CaMPARI. Ponuja možnost raziskav nevronskih povezav med kompleksnejšim vedenjem, na primer med učenjem. Prav tako je uporaben, ker lahko z reguliranim obsvetljevanjem vplivamo, kdaj bo potekala pretvorba iz zelene v rdečo in kdaj ne. Preizkusili so ga v štirih poskusih; na ličinkah in odraslih osebkih vinske mušice, na ličinkah cebrice in na odraslih miših. Vsi poskusi so potrdili že znana dejstva, kar dokazuje njegovo zanesljivost, ter ponuja mnogo možnosti za nadaljnje raziskave.

=== Blaž Lebar: Preučitev imunskega odziva komarja po piku ===

Malarija je bolezen, ki jo prenaša komar mrzličar ali Anopheles. Na leto se okuži na stotine milijonov ljudi, nekaj milijonov jih tudi umre. Povzročitelj te bolezni so različne vrste plazmodijev, ki se uspešno množijo v komarju, ki nato po piku okuži svojo žrtev. Vendar kako uspe tako inferiorno bitje kot je komar okužiti tako kompleksno bitje kot je človek, morda celo smrtno, sam komar pa normalno funkcionira navkljub patogenom v lastnem v organizmu?
Za komarjev imunski sistem so odgovorni LRIMi, bilo naj bi jih nekaj več kot 24, vendar delovanja večine še ne poznajo. Najpomembnejša za imunski sistem komarja naj bi bila člena sistema komplementa: LRIM1 in APL1C v hemolimfi, ki se z LRRji povežeta z TEP1cut in tako izvedeta uspešno lizo in melanizacijo patogenov, vendar sta se izkazala kot popolnoma neučinkovita pri eliminaciji P. berghei. V tej študiji pa so se osredotočili na LRIM9, protein v imunskem sistemu, ki naj bi imel najpomembnejšo vlogo pri borbi z plazmodiji. Najpogostejša tehnika je bila qRT-PCR, preverjali pa so namnožitev, reprodukcijo in melanizacijo P. berghei pri komarjih vrste A. gambiae ob prehranjevanju s krvjo miši, ter različne vplive na izražanje LRIM9 (prehranjevanje, bakterije, imunost…). Ugotovili so tudi povezavo izražanja LRIM9 in hormona »ecdysone«, ki se izloča iz jajčnikov samic.
Danih je bilo veliko odgovorov, ki pa so odprli nova vprašanja, katera bodo zahtevala še veliko raziskav.

=== Ema Gašperšič: Dvojedrni bakrov kompleks naj bi preprečil širjenje raka ===
Čeprav je v zadnjem času opazen napredek na področju zdravljenja raka, še vedno obstajajo določene pomanjkljivosti. Eno izmed najbolj pogosto uporabljenih zdravil za različne vrste raka je cisplatin, ki se veže na dušikove baze DNA in s tem povzroči celično smrt oz. apoptozo. Cisplatin pa kljub vsemu ni vedno učinkovit in ima precej stranskih učinkov, zato so raziskovalci želeli razviti alternativno zdravilo. Razvili so citotoksični dvojedrni kompleks z bakrom, ki se s pomočjo molekularne prepoznave veže na dve sosednji fosfatni skupini na vijačnici DNA, kar prepreči celične delitve in uniči patološko celico. Z različnimi anorganskimi in biokemijskimi metodami, spektroskopijo in metodami na posameznih molekulah so dokazali, da dvojedrni Cu2 kompleks zavira sintezo DNA in je citotoksična za človeške rakave celice. V članku je predstavljena sinteza prvega kompleksa iz te družine molekul, bakrovega Cu2 kompleksa ter različne metode, s katerimi so dokazali sposobnost ustrezne koordinacije Cu2(2+), sposobnost močne vezave Cu2(2+) na DNA, sposobnost inhibicije sinteze DNA ter citotoksičnost kompleksa. Iz dobljenih rezultatov znanstveniki predpostavljajo učinkovito interakcijo med Cu2(2+) in DNA in vitro ter v živih celicah. Nadaljnje klinične in medicinske raziskave pa bodo še odločale o tem, kako, in če sploh, bo bakrov kompleks resnično preizkušen na pacientih z rakom.

=== Tjaša Lukšič: Ključne biološke funkcije skakajočih genov ===

Dobro polovico človeškega genoma sestavljajo ponavljajoči se genetski elementi, katerim v preteklosti niso pripisovali posebne vloge, danes pa vse bolj postaja jasno, da njihova prisotnost v genomu prinaša svojevrstne biološke funkcije. Alu sekvence so primer takšnih transpozicijskih elementov, katerih prepisovanje je običajno minimalizirano, vendar se ob virusnih infekcijah ali stresu močno poveča. Po klasifikaciji so podvrsta kratkih razpršenih jedrnih elementov (SINE), ki se lahko transponirajo po genomu prek RNA intermediata, vendar ne kodirajo proteinov. Alu sekvence prepisuje RNA polimeraza III, Alu RNA pa ima značilno sekundarno strukturo dveh rok, ki omogoča tvorbo kompleksov s proteinskimi dimeri SRP9/14. Nastanek takšnih Alu ribonukleoproteinov (RNP) v običajnih celičnih razmerah ni pogost, saj je kljub veliki količini monomerov SRP9 in SRP14 stopnja pojavljanja Alu RNA-jev veliko manjša. Tvorba Alu RNP-jev prepreči iniciacijo prevajanja mRNA v aminokislinsko zaporedje in tvorbo polisomov. Po vezavi Alu RNP-ja na ribosomsko podenoto 40S, Alu RNA lahko zapusti kompleks in sodeluje v nadaljnjih prenosih novih SRP9/14. Mehanizem delovanja takšnih kompleksov je relativno nepoznan in odpira nove poglede na smisel ohranitve transpozicijskih elementov skozi evolucijo. Alu sekvence je predstavljajo perspektivno področje za preučevanje ravno zaradi njihovega prispevka k zaščiti translacijskih procesov celice v neugodnih razmerah in zaradi drugih še neodkritih, potencialnih bioloških funkcij.

=== Špela Malenšek: Smo zaradi endogenih retrovirusov pametnejši? ===

Človeški endogeni retrovirusi (ERV), genetsko podedovani ostanki preteklih virusnih infekcij, so klasično obravnavani kot človeku oziroma gostitelju neuporabni del genoma, tako imenovani "junk DNA". Njihovo delovanje je v običajnih somatskih celicah (fibroblasti, hepatocite, bele krvne celice …) nadzorovano z epigenetskim mehanizmom metilacije DNA, kjer se metilna skupina doda citozinu ali adeninu in tako prepreči izražanje virusnih delov genoma. V nevronskih izvornih celicah naj bi med drugim izražanje endogenih retrovirusnih elementov nadzoroval tudi protein TRIM28. Deluje namreč kot korepresor, ki z modifikacijo histonov zatre prepisovanje genetskega materiala. Raziskave na univerzah Lund in EPLF so pokazale, da se ob izbrisu TRIM28 v celicah nakopičita dve večji skupini ERV, ki pri miših vplivata na izražanje gena BC048671 in služita kot startni točki za IncRNA (dolga nekodirajoča RNA). Hkrati izbris proteina TRIM28 povzroči tako kompleksne vedenjske spremembe kot tudi abnormalne vedenjske fenotipe modelnih organizmov (miši), ki se izkažejo podobne nekaterim človeškim psihološkim motnjam. Klasični hipotezi o nefunkcionalnosti ERV se tako zoperstavlja nova ideja, ki trdi, da aktivnost ERV vpliva na izražanje genov v nevronskih izvornih celicah in na kompleksnost nevronske mreže v možganih. S tem se odpira popolnoma nova molekularna perspektiva na analizo kompleksnih vedenjskih vzorcev, možganskih motenj in samega delovanja nevronske mreže.

=== Nejc Kejžar: Novi 'pametni' inzulin ===

Z odkritjem biotehnoloških metod za umetno sintezo inzulina s pomočjo bakterije E. coli ali kvasovk je življenje s sladkorno boleznijo postalo mogoče, še vedno pa so prisotni zapleti, ki jih povzročata hipoglikemija in hiperglikemija. Današnje inzulinske terapije se osredotočajo na konstanto merjenje koncentracij glukoze v krvi in intravenozni vnos inzulina glede na izmerjeno koncentracijo, kar pa je kljub nujnosti (še posebej za paciente diabetesa tipa 1) zelo nadležno. Do težav lahko pride zaradi neupoštevanja terapije ali slabe glikemične kontrole, kar lahko v resnih stanjih hipoglikemije privede do kome ali smrti, hiperglikemija pa lahko vodi do kardiovaskularnih obolenj, težav s celjenjem ran ali celo do raka. Za učinkovitejše nadziranje krvne koncentracije glukoze in olajšano življenje pacientov je skupina znanstvenikov iz MIT razvila ‘pametni’ inzulin, ki ima nase pritrjen konjugat sestavljen iz alifatske verige 11 ogljikovih atomov in fenilborove kisline. Alifatska veriga povzroča podaljšano delovanje inzulina, fenilborova kislina pa služi kot ‘stikalo’, ki aktivira delovanje inzulina samo ob povečani koncentracije glukoze v krvi. Ta sintetični derivat je zmožen hitrejšega obnavljanja normalnih koncentracij krvne glukoze kot naravni in klinični inzulin, večkratnega zaporednega odziva na porast glukoze, prav tako pa ima nižji hipoglikemični indeks ob administraciji v času normalnih koncentracij glukoze, kar pomeni, da je tveganje za hipoglikemijo manjše. V najbolj zgovornem testu je bilo pokazano, da je učinkovitost pametnega inzulina primerljiva z delovanjem zdravega pankreasa.

=== Simon Aleksič: Zorenje mRNA pri lignjih zaznamujejo A-I deaminacije ===

Informacijska RNA je po prepisu iz DNA podvržena dodatnim procesom, tako v jedru kot tudi v citoplazmi. Izrezovanje intronov je le en izmed procesov, ki zagotavlja strukturno variabilnost proteinov. Za variabilnost strukture poskrbijo tudi malo raziskane deaminacije nukleotidov . Deaminacije nukleotidov so katalitski kemijski procesi, ki omogočajo spreminjanje tripletov kodonov v zapisih mRNA s pomočjo proteinov ADAR. Za takšne procese so predvidevali, da so v organizmih redki in nimajo posebnega vpliva na delovanje proteinov v telesu. A študija univerze v Tel Avivu je pokazala, da so deaminacije adenozina v inozin v živčnih tkivih lignjev eden poglavitnih procesov, ki se zgodijo pred translacijo mRNA v proteine. Deaminacije s spremembami tripletov povzročijo zamenjave aminokislin v proteinih, raziskava pa dokaže, da se stabilnejše aminokisline zamenjajo z manj stabilnimi. Manj stabilne aminokisline v območju aktivnega mesta in hidrofobnega jedra povzročijo, da je protein sam manj občutljiv na nižje temperature okolja in lahko ostane delujoč pri spremenjenih razmerah okolja. Deaminacije so posebno pogoste v mRNA prepisih genov, ki zapisujejo proteine vključene v živčni sistem in citoskelet. Novejše raziskave mutacije genov za protein ADAR pri človeku povezujejo z različnimi imunskimi boleznimi, kot so ADA-SCID in sindrom Aicardi–Goutières.

=== Gašper Žun: Antibiotiki betalaktami uničujejo bakterije z okvaro mehanizma za izgradnjo celične stene ===
Antibiotiki β-laktami, med katere spada tudi penicilin, predstavljajo eno izmed najdlje in najsplošneje uporabnih terapij pri bakterijskih okužbah. Učinkujejo tako, da z vezavo na penicilin-vezavne proteine (PBP) okvarijo mehanizem za sintezo celične stene. S tem onemogočijo zamreženje nastajajočih verig peptidoglikanov (PG) v matriks, v manjši meri pa se nove verige še vedno lahko sintetizirajo. Celična stena takih bakterij je zato neobičajnih oblik, med delitvijo pa se lahko na določenih mestih pretrga in celica propade. Zaradi nastajanja enoverižnih PG se vključijo v proces encimi (Slt), ki take neobičajne verige razgrajujejo. Lastnosti celične stene na tak način ostajajo funkcionalne, vendar pa zaradi vključenega brezuspešnega cikla sinteze in razgradnje celične stene pride do prekomerne porabe za celico pomembnih snovi, kar le še prispeva k toksičnemu delovanja antibiotikov. Obrambni mehanizmi proti antibiotični aktivnosti vključujejo encime (β-laktamaze), ki razgrajujejo β-laktame. Vse večja odpornost bakterij na antibiotike je posledica povečane frekvence genskega zapisa za β-laktamaze, ki se med bakterijami prenaša s plazmidi. Ker je za uspešen boj proti bakterijam potreben nenehen razvoj novih zdravil in terapij, je potrebno dodobra spoznati tako način učinkovanja antibiotikov kot način delovanja bakterij. Članek prispeva nov vpogled v delovanje encima Slt za razgradnjo nezamreženega novo nastalega PG, saj mu pripisuje vlogo kontrole nad kvaliteto izgradnje celične stene, kar pa v resnici potencira uničujoče posledice antibiotikov.

=== Rok Miklavčič: Kontrola prenašalnih RNA na CCA-dodajajočem encimu ===
tRNA je ena od biološko najpomembnejših molekul v živih organizmih in ima ključno vlogo pri sintezi proteinov, zato je pomembno, da so vse tRNA, ki na ribosome prinašajo aminokisline, funkcionalne. Od prepisa dalje grejo zato tRNA prepisi skozi serijo procesov in modifikacij, ki na koncu privedejo do popolnoma funkcionalnih tRNA. V predzadnji fazi urejanja tRNA sodeluje CCA-dodajajoči encim, ki na 3'-konec prepisov tRNA pripne končno nukleotidno zaporedje CCA, v zadnji fazi pa se na zadnji adenin nukleotid veže še ustrezna aminokislina. CCA-dodajajoči encim pa ima v sintezi tRNA še eno nedavno odkrito funkcijo: nestabilnim prepisom tRNA pripne nukleotidno zaporedje CCACCA, ki je signal za razgradnjo. Na ta način encim kontrolira kvaliteto tRNA in pripomore k optimizaciji same sinteze proteinov. Na CCA-dodajajočem encimu se razlike med stabilnimi in nestabilnimi tRNA prepisi pokažejo po vezavi prvega zaporedja CCA, in sicer pri premiku encima. Stabilne tRNA se ob premiku odcepijo z encima, medtem ko pri nestabilnih tRNA premik povzroči transformacijo njihove sekundarne strukture, ob tem pa nastane na tRNA izboklina. Za transformirane nestabilne tRNA se cikel dodajanja zaporedja CCA nato izvede še enkrat, kar privede do končnega zaporedja CCACCA. Po končanem drugem ciklu se ob nadaljnjem premiku encima z njega odcepijo tudi nestabilne tRNA.

=== Tilen Tršelič: Transport proteinov v celico s pomočjo nanodelcev ===
Nanotehnologija v moderni znanosti že dolgo igra pomembno vlogo. Raziskovalci so ugotovili, da lahko s pomočjo nanodelcev v celice dostavljajo nukleotide in nekatere druge manjše molekule. Medicina je zato kmalu izrazila željo, da bi v celico lahko dostavljali tudi delujoče, zaključene proteine, ki bi pomagali pri zdravljenju različnih bolezni.
Na Univerzi v Kaliforniji so nedavno odkrili način, kako bi nanotehnologijo res lahko uporabljali za transport proteinov v celice. Ugotovili so, da obstajajo delci, ki so zmožni vezati protein, ga prenašati in ob laserskem obsevanju sprostiti v celico. Podobne metode so že bile testirane, a je njihova uporabna vrednost majhna, saj je lasersko obsevanje zaradi visoke energije pogosto poškodovalo tkiva in organizme.
Raziskava, predstavljena v seminarju, je z uporabo zlatih nanodelcev in posebnega fluorescentnega proteina GFP dokazala, da je neškodljiv, natančen transport proteinov v celice le mogoč. Izbrana metoda transporta prav tako omogoča velik nadzor nad lokacijo in časom sprostitve izbranega proteina v okolje. Znanstveniki so na zlat nanodelec vezali poseben prenašalec, ki je sposoben vezati histidinizirane proteine, jih dostaviti v celico in jih nato ob laserskem obsevanju z nizko energijo sprostiti v okolje.
Raziskava in njeni izsledki imajo velik pomen, saj bi predstavljena metoda lahko omogočila vodeno diferenciacijo matičnih celic ali vodeno celično smrt in s tem zdravljenje nekaterih težjih bolezni.

TBK2015 Povzetki seminarjev

2015-03-25T21:11:56Z

GasperVirant: /* Gašper Virant: Vezava agonista na adenozinske receptorje */

[[TBK2015-seminar|Nazaj na osnovno stran]]

=== Uroš Zavrtanik: Mehanizem popravljanja DNA: NER (faktor XPC) ===

Od samega nastanka naprej se življenje spopada s fundamentalnim problemom kemijske nestabilnosti genetske informacije, shranjene v DNA. Molekula DNA je izpostavljena številnim fizikalnim ter kemijskim dejavnikom, ki lahko vplivajo na njeno strukturo in posredno ali neposredno tudi na samo informacijo. Ker pa predstavlja ohranjanje informacije eden izmed ključnih in pomembnejših aspektov življenja samega, so se tekom evolucije razvili številni mehanizmi popravljanja DNA. Eden izmed teh mehanizmov je popravljanje DNA z izrezom nukleotidov (ang. Nucleotide Excision Repair-NER). NER je popravljalni proces za odstranjevanje in popravo večjih strukturnih nepravilnosti v strukturi DNA, ki so v glavnem posledica radiacije (UV, gama) ter okolijskih dejavnikov (specifične molekule, ki lahko strukturno poškodujejo DNA). NER predstavlja pri človeku edini mehanizem za popravljanje poškodb povzročenih zaradi UV radiacije. Največji izziv NER je, kako najti vse poškodovane dele DNA v celotnem genomu. Na podlagi eksperimentalnih ugotovitev raziskovalci ugotavljajo, da bi lahko bil ''ključ do uspeha'' naključna vezava proteina XPC (začetni faktor NER) na nespecifično mesto v DNA ter nato vzdolžna difuzija XPC do poškodovanega (specifičnega) mesta, kjer XPC za trenutek obstane, kar je signal za sprožitev popravljalnega procesa. Odkritje bi lahko predstavljalo generalni koncept mehanizma še vedno malo raziskane interakcije protein-DNA.

=== Gašper Virant: Vezava agonista na adenozinske receptorje lajša kronično bolečino ===
Kronična bolečina je posledica okvare živčevja. Ločimo nociceptivno kronično bolečino, ki jo povzroča draženje bolečinskih receptorjev (nociceptorjev) v tkivih notranjih organov ter mišičnoskeletnega sistema, in nevropatsko kronično bolečino, ki nastane kot posledica okvare, poškodbe ali motenega delovanja perifernega ali osrednjega živčevja . Najbolj uspešni pristopi lajšanja tovrstne bolečine temeljijo na uporabi mehanizma kalcijevih kanalčkov, opioidov, in adrenergikov. Pogosto pa imajo ta zdravila stranske učinke, ki nastopijo ob neprestani uporabi. Prav tako telo razvije toleranco do njih, kar pomeni, da je za enak učinek potreben vedno večji odmerek, kar vodi v zmanjšano učinkovanje zdravila. Kot močno ne-narkotično in ne-opoidno sredstvo za lajšanje tovrstne bolečine se je izkazal adenozin. Adenozin oz. nekateri še bolj selektivni agonisti se vežejo na zunajcelične adenozinske receptorje in s tem zmanjšajo nocicepcijo. Adenozin v zunajceličem prostoru ni obstojen, vendar lahko njegovo življensko dobo podaljšamo z inhibicijo andenozin kinaz in deaminaz ter tako posledično podaljšamo tudi protibolečinsko delovanje. Visoko selektiven agonist z veliko afiniteto do A3 podskupine adenozinskih receptorjev bi tudi pomembno odpravil neželene stranske učinke.

=== Klara Lenart: Permanentno označevanje nevronskih povezav ===

Preučevanje nevronskih povezav je precej neraziskano področje. Za raziskave teh povezav uporabljajo proteine, najpogosteje skupino proteinov imenovano GCaMP, ki oddajajo fluorescenčno svetlobo kratek čas po zaznavi spremembe v koncentraciji kalcijevih ionov v celici. Skupina znanstvenikov z medicinskega inštituta Howard Hughes je razvila nov protein, imenovan CaMPARI(podoben je skupini GCaMP-jev), ki označuje aktivne nevrone glede na spremembo koncentracije Ca2+ v njih. Proteini, podobni CaMPARI-ju obstajajo že zadnjih 20 let, a posebnost novega proteina je permanentna fluorescenca, ki jo oddaja ob povečanju koncentracije kalcija v celici ter sočasnem obsevanju z vijolično svetlobo. Glavni del CaMPARI-ja je fluorescenten protein EosFP, ki spremeni barvo iz zelene v rdečo ob obsvetljevanju z vijolično svetlobo. Ko so EosFP spojili z kalmodulinom in peptidom M13, katera sta potrebna za vezavo kalcijevih ionov, je nastal CaMPARI. Ponuja možnost raziskav nevronskih povezav med kompleksnejšim vedenjem, na primer med učenjem. Prav tako je uporaben, ker lahko z reguliranim obsvetljevanjem vplivamo, kdaj bo potekala pretvorba iz zelene v rdečo in kdaj ne. Preizkusili so ga v štirih poskusih; na ličinkah in odraslih osebkih vinske mušice, na ličinkah cebrice in na odraslih miših. Vsi poskusi so potrdili že znana dejstva, kar dokazuje njegovo zanesljivost, ter ponuja mnogo možnosti za nadaljnje raziskave.

=== Blaž Lebar: Preučitev imunskega odziva komarja po piku ===

Malarija je bolezen, ki jo prenaša komar mrzličar ali Anopheles. Na leto se okuži na stotine milijonov ljudi, nekaj milijonov jih tudi umre. Povzročitelj te bolezni so različne vrste plazmodijev, ki se uspešno množijo v komarju, ki nato po piku okuži svojo žrtev. Vendar kako uspe tako inferiorno bitje kot je komar okužiti tako kompleksno bitje kot je človek, morda celo smrtno, sam komar pa normalno funkcionira navkljub patogenom v lastnem v organizmu?
Za komarjev imunski sistem so odgovorni LRIMi, bilo naj bi jih nekaj več kot 24, vendar delovanja večine še ne poznajo. Najpomembnejša za imunski sistem komarja naj bi bila člena sistema komplementa: LRIM1 in APL1C v hemolimfi, ki se z LRRji povežeta z TEP1cut in tako izvedeta uspešno lizo in melanizacijo patogenov, vendar sta se izkazala kot popolnoma neučinkovita pri eliminaciji P. berghei. V tej študiji pa so se osredotočili na LRIM9, protein v imunskem sistemu, ki naj bi imel najpomembnejšo vlogo pri borbi z plazmodiji. Najpogostejša tehnika je bila qRT-PCR, preverjali pa so namnožitev, reprodukcijo in melanizacijo P. berghei pri komarjih vrste A. gambiae ob prehranjevanju s krvjo miši, ter različne vplive na izražanje LRIM9 (prehranjevanje, bakterije, imunost…). Ugotovili so tudi povezavo izražanja LRIM9 in hormona »ecdysone«, ki se izloča iz jajčnikov samic.
Danih je bilo veliko odgovorov, ki pa so odprli nova vprašanja, katera bodo zahtevala še veliko raziskav.

=== Ema Gašperšič: Dvojedrni bakrov kompleks naj bi preprečil širjenje raka ===
Čeprav je v zadnjem času opazen napredek na področju zdravljenja raka, še vedno obstajajo določene pomanjkljivosti. Eno izmed najbolj pogosto uporabljenih zdravil za različne vrste raka je cisplatin, ki se veže na dušikove baze DNA in s tem povzroči celično smrt oz. apoptozo. Cisplatin pa kljub vsemu ni vedno učinkovit in ima precej stranskih učinkov, zato so raziskovalci želeli razviti alternativno zdravilo. Razvili so citotoksični dvojedrni kompleks z bakrom, ki se s pomočjo molekularne prepoznave veže na dve sosednji fosfatni skupini na vijačnici DNA, kar prepreči celične delitve in uniči patološko celico. Z različnimi anorganskimi in biokemijskimi metodami, spektroskopijo in metodami na posameznih molekulah so dokazali, da dvojedrni Cu2 kompleks zavira sintezo DNA in je citotoksična za človeške rakave celice. V članku je predstavljena sinteza prvega kompleksa iz te družine molekul, bakrovega Cu2 kompleksa ter različne metode, s katerimi so dokazali sposobnost ustrezne koordinacije Cu2(2+), sposobnost močne vezave Cu2(2+) na DNA, sposobnost inhibicije sinteze DNA ter citotoksičnost kompleksa. Iz dobljenih rezultatov znanstveniki predpostavljajo učinkovito interakcijo med Cu2(2+) in DNA in vitro ter v živih celicah. Nadaljnje klinične in medicinske raziskave pa bodo še odločale o tem, kako, in če sploh, bo bakrov kompleks resnično preizkušen na pacientih z rakom.

=== Tjaša Lukšič: Ključne biološke funkcije skakajočih genov ===

Dobro polovico človeškega genoma sestavljajo ponavljajoči se genetski elementi, katerim v preteklosti niso pripisovali posebne vloge, danes pa vse bolj postaja jasno, da njihova prisotnost v genomu prinaša svojevrstne biološke funkcije. Alu sekvence so primer takšnih transpozicijskih elementov, katerih prepisovanje je običajno minimalizirano, vendar se ob virusnih infekcijah ali stresu močno poveča. Po klasifikaciji so podvrsta kratkih razpršenih jedrnih elementov (SINE), ki se lahko transponirajo po genomu prek RNA intermediata, vendar ne kodirajo proteinov. Alu sekvence prepisuje RNA polimeraza III, Alu RNA pa ima značilno sekundarno strukturo dveh rok, ki omogoča tvorbo kompleksov s proteinskimi dimeri SRP9/14. Nastanek takšnih Alu ribonukleoproteinov (RNP) v običajnih celičnih razmerah ni pogost, saj je kljub veliki količini monomerov SRP9 in SRP14 stopnja pojavljanja Alu RNA-jev veliko manjša. Tvorba Alu RNP-jev prepreči iniciacijo prevajanja mRNA v aminokislinsko zaporedje in tvorbo polisomov. Po vezavi Alu RNP-ja na ribosomsko podenoto 40S, Alu RNA lahko zapusti kompleks in sodeluje v nadaljnjih prenosih novih SRP9/14. Mehanizem delovanja takšnih kompleksov je relativno nepoznan in odpira nove poglede na smisel ohranitve transpozicijskih elementov skozi evolucijo. Alu sekvence je predstavljajo perspektivno področje za preučevanje ravno zaradi njihovega prispevka k zaščiti translacijskih procesov celice v neugodnih razmerah in zaradi drugih še neodkritih, potencialnih bioloških funkcij.

=== Špela Malenšek: Smo zaradi endogenih retrovirusov pametnejši? ===

Človeški endogeni retrovirusi (ERV), genetsko podedovani ostanki preteklih virusnih infekcij, so klasično obravnavani kot človeku oziroma gostitelju neuporabni del genoma, tako imenovani "junk DNA". Njihovo delovanje je v običajnih somatskih celicah (fibroblasti, hepatocite, bele krvne celice …) nadzorovano z epigenetskim mehanizmom metilacije DNA, kjer se metilna skupina doda citozinu ali adeninu in tako prepreči izražanje virusnih delov genoma. V nevronskih izvornih celicah naj bi med drugim izražanje endogenih retrovirusnih elementov nadzoroval tudi protein TRIM28. Deluje namreč kot korepresor, ki z modifikacijo histonov zatre prepisovanje genetskega materiala. Raziskave na univerzah Lund in EPLF so pokazale, da se ob izbrisu TRIM28 v celicah nakopičita dve večji skupini ERV, ki pri miših vplivata na izražanje gena BC048671 in služita kot startni točki za IncRNA (dolga nekodirajoča RNA). Hkrati izbris proteina TRIM28 povzroči tako kompleksne vedenjske spremembe kot tudi abnormalne vedenjske fenotipe modelnih organizmov (miši), ki se izkažejo podobne nekaterim človeškim psihološkim motnjam. Klasični hipotezi o nefunkcionalnosti ERV se tako zoperstavlja nova ideja, ki trdi, da aktivnost ERV vpliva na izražanje genov v nevronskih izvornih celicah in na kompleksnost nevronske mreže v možganih. S tem se odpira popolnoma nova molekularna perspektiva na analizo kompleksnih vedenjskih vzorcev, možganskih motenj in samega delovanja nevronske mreže.

=== Nejc Kejžar: Novi 'pametni' inzulin ===

Z odkritjem biotehnoloških metod za umetno sintezo inzulina s pomočjo bakterije E. coli ali kvasovk je življenje s sladkorno boleznijo postalo mogoče, še vedno pa so prisotni zapleti, ki jih povzročata hipoglikemija in hiperglikemija. Današnje inzulinske terapije se osredotočajo na konstanto merjenje koncentracij glukoze v krvi in intravenozni vnos inzulina glede na izmerjeno koncentracijo, kar pa je kljub nujnosti (še posebej za paciente diabetesa tipa 1) zelo nadležno. Do težav lahko pride zaradi neupoštevanja terapije ali slabe glikemične kontrole, kar lahko v resnih stanjih hipoglikemije privede do kome ali smrti, hiperglikemija pa lahko vodi do kardiovaskularnih obolenj, težav s celjenjem ran ali celo do raka. Za učinkovitejše nadziranje krvne koncentracije glukoze in olajšano življenje pacientov je skupina znanstvenikov iz MIT razvila ‘pametni’ inzulin, ki ima nase pritrjen konjugat sestavljen iz alifatske verige 11 ogljikovih atomov in fenilborove kisline. Alifatska veriga povzroča podaljšano delovanje inzulina, fenilborova kislina pa služi kot ‘stikalo’, ki aktivira delovanje inzulina samo ob povečani koncentracije glukoze v krvi. Ta sintetični derivat je zmožen hitrejšega obnavljanja normalnih koncentracij krvne glukoze kot naravni in klinični inzulin, večkratnega zaporednega odziva na porast glukoze, prav tako pa ima nižji hipoglikemični indeks ob administraciji v času normalnih koncentracij glukoze, kar pomeni, da je tveganje za hipoglikemijo manjše. V najbolj zgovornem testu je bilo pokazano, da je učinkovitost pametnega inzulina primerljiva z delovanjem zdravega pankreasa.

=== Simon Aleksič: Zorenje mRNA pri lignjih zaznamujejo A-I deaminacije ===

Informacijska RNA je po prepisu iz DNA podvržena dodatnim procesom, tako v jedru kot tudi v citoplazmi. Izrezovanje intronov je le en izmed procesov, ki zagotavlja strukturno variabilnost proteinov. Za variabilnost strukture poskrbijo tudi malo raziskane deaminacije nukleotidov . Deaminacije nukleotidov so katalitski kemijski procesi, ki omogočajo spreminjanje tripletov kodonov v zapisih mRNA s pomočjo proteinov ADAR. Za takšne procese so predvidevali, da so v organizmih redki in nimajo posebnega vpliva na delovanje proteinov v telesu. A študija univerze v Tel Avivu je pokazala, da so deaminacije adenozina v inozin v živčnih tkivih lignjev eden poglavitnih procesov, ki se zgodijo pred translacijo mRNA v proteine. Deaminacije s spremembami tripletov povzročijo zamenjave aminokislin v proteinih, raziskava pa dokaže, da se stabilnejše aminokisline zamenjajo z manj stabilnimi. Manj stabilne aminokisline v območju aktivnega mesta in hidrofobnega jedra povzročijo, da je protein sam manj občutljiv na nižje temperature okolja in lahko ostane delujoč pri spremenjenih razmerah okolja. Deaminacije so posebno pogoste v mRNA prepisih genov, ki zapisujejo proteine vključene v živčni sistem in citoskelet. Novejše raziskave mutacije genov za protein ADAR pri človeku povezujejo z različnimi imunskimi boleznimi, kot so ADA-SCID in sindrom Aicardi–Goutières.

=== Gašper Žun: Antibiotiki betalaktami uničujejo bakterije z okvaro mehanizma za izgradnjo celične stene ===
Antibiotiki β-laktami, med katere spada tudi penicilin, predstavljajo eno izmed najdlje in najsplošneje uporabnih terapij pri bakterijskih okužbah. Učinkujejo tako, da z vezavo na penicilin-vezavne proteine (PBP) okvarijo mehanizem za sintezo celične stene. S tem onemogočijo zamreženje nastajajočih verig peptidoglikanov (PG) v matriks, v manjši meri pa se nove verige še vedno lahko sintetizirajo. Celična stena takih bakterij je zato neobičajnih oblik, med delitvijo pa se lahko na določenih mestih pretrga in celica propade. Zaradi nastajanja enoverižnih PG se vključijo v proces encimi (Slt), ki take neobičajne verige razgrajujejo. Lastnosti celične stene na tak način ostajajo funkcionalne, vendar pa zaradi vključenega brezuspešnega cikla sinteze in razgradnje celične stene pride do prekomerne porabe za celico pomembnih snovi, kar le še prispeva k toksičnemu delovanja antibiotikov. Obrambni mehanizmi proti antibiotični aktivnosti vključujejo encime (β-laktamaze), ki razgrajujejo β-laktame. Vse večja odpornost bakterij na antibiotike je posledica povečane frekvence genskega zapisa za β-laktamaze, ki se med bakterijami prenaša s plazmidi. Ker je za uspešen boj proti bakterijam potreben nenehen razvoj novih zdravil in terapij, je potrebno dodobra spoznati tako način učinkovanja antibiotikov kot način delovanja bakterij. Članek prispeva nov vpogled v delovanje encima Slt za razgradnjo nezamreženega novo nastalega PG, saj mu pripisuje vlogo kontrole nad kvaliteto izgradnje celične stene, kar pa v resnici potencira uničujoče posledice antibiotikov.

=== Rok Miklavčič: Kontrola prenašalnih RNA na CCA-dodajajočem encimu ===
tRNA je ena od biološko najpomembnejših molekul v živih organizmih in ima ključno vlogo pri sintezi proteinov, zato je pomembno, da so vse tRNA, ki na ribosome prinašajo aminokisline, funkcionalne. Od prepisa dalje grejo zato tRNA prepisi skozi serijo procesov in modifikacij, ki na koncu privedejo do popolnoma funkcionalnih tRNA. V predzadnji fazi urejanja tRNA sodeluje CCA-dodajajoči encim, ki na 3'-konec prepisov tRNA pripne končno nukleotidno zaporedje CCA, v zadnji fazi pa se na zadnji adenin nukleotid veže še ustrezna aminokislina. CCA-dodajajoči encim pa ima v sintezi tRNA še eno nedavno odkrito funkcijo: nestabilnim prepisom tRNA pripne nukleotidno zaporedje CCACCA, ki je signal za razgradnjo. Na ta način encim kontrolira kvaliteto tRNA in pripomore k optimizaciji same sinteze proteinov. Na CCA-dodajajočem encimu se razlike med stabilnimi in nestabilnimi tRNA prepisi pokažejo po vezavi prvega zaporedja CCA, in sicer pri premiku encima. Stabilne tRNA se ob premiku odcepijo z encima, medtem ko pri nestabilnih tRNA premik povzroči transformacijo njihove sekundarne strukture, ob tem pa nastane na tRNA izboklina. Za transformirane nestabilne tRNA se cikel dodajanja zaporedja CCA nato izvede še enkrat, kar privede do končnega zaporedja CCACCA. Po končanem drugem ciklu se ob nadaljnjem premiku encima z njega odcepijo tudi nestabilne tRNA.

=== Tilen Tršelič: Transport proteinov v celico s pomočjo nanodelcev ===
Nanotehnologija v moderni znanosti že dolgo igra pomembno vlogo. Raziskovalci so ugotovili, da lahko s pomočjo nanodelcev v celice dostavljajo nukleotide in nekatere druge manjše molekule. Medicina je zato kmalu izrazila željo, da bi v celico lahko dostavljali tudi delujoče, zaključene proteine, ki bi pomagali pri zdravljenju različnih bolezni.
Na Univerzi v Kaliforniji so nedavno odkrili način, kako bi nanotehnologijo res lahko uporabljali za transport proteinov v celice. Ugotovili so, da obstajajo delci, ki so zmožni vezati protein, ga prenašati in ob laserskem obsevanju sprostiti v celico. Podobne metode so že bile testirane, a je njihova uporabna vrednost majhna, saj je lasersko obsevanje zaradi visoke energije pogosto poškodovalo tkiva in organizme.
Raziskava, predstavljena v seminarju, je z uporabo zlatih nanodelcev in posebnega fluorescentnega proteina GFP dokazala, da je neškodljiv, natančen transport proteinov v celice le mogoč. Izbrana metoda transporta prav tako omogoča velik nadzor nad lokacijo in časom sprostitve izbranega proteina v okolje. Znanstveniki so na zlat nanodelec vezali poseben prenašalec, ki je sposoben vezati histidinizirane proteine, jih dostaviti v celico in jih nato ob laserskem obsevanju z nizko energijo sprostiti v okolje.
Raziskava in njeni izsledki imajo velik pomen, saj bi predstavljena metoda lahko omogočila vodeno diferenciacijo matičnih celic ali vodeno celično smrt in s tem zdravljenje nekaterih težjih bolezni.

TBK2015-seminar

2015-03-25T21:10:43Z

GasperVirant: /* Seznam seminarjev */

= Temelji biokemije- seminar =

Seminarje vodi prof. dr. Brigita Lenarčič. Seminarji so obvezni.

Ocena seminarjev (6-10) predstavlja enako število odstotkov, ki se prištejeh končnipisni oceni izpita.
Stran na strežniku s seminarskimi nalogami je zaščitena.
Uporabniško ime je: tbk, password pa: samozame## "##" sta dve številki, ki ju izveste na predavanjih.

== Seznam seminarjev ==
{| border="1" cellpadding="4" cellspacing="0" style="border:#c9c9c9 1px solid; margin: 1em 1em 1em 0; border-collapse: collapse;"
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Ime in priimek'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Naslov seminarja'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Povezava'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Rok za oddajo'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Rok za recenzijo'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Datum predstavitve'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 1'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 2'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 3'''
|-
| Klara Lenart||Permanentno označevanje nevronskih povezav||http://www.sciencedaily.com/releases/2015/02/150212141453.htm||10.03.||13.03.||16.03.||Maja Zupanc||Matej Hvalec||Urša Kopač
|-
| Uroš Zavrtanik||Popravljalni mehanizem DNA (NER)||http://www.sciencedaily.com/releases/2015/01/150128141423.htm||10.03.||13.03.||16.03.||Eva Rajh||Lara Jerman||Neža Koritnik
|-
| Blaž Lebar||Preučitev imunskega odziva komarja po piku||http://www.sciencedaily.com/releases/2015/02/150206174850.htm||10.03.||13.03.||16.03.||Elvira Boršić||Kristjan Stibilj||Katja Čop
|-
| Gašper Žun||Antibiotiki uničujejo bakterije z okvaro izgradnje celične stene||http://www.sciencedaily.com/releases/2014/12/141205114011.htm||17.03.||20.03.||23.03.||Nejc Kejžar||Samo Smole||Klara Kuret
|-
| Rok Miklavčič||Kontrola prenašalnih RNA na CCA-dodajajočem encimu||http://www.sciencedaily.com/releases/2015/01/150129151612.htm||17.03.||20.03.||23.03.||Tilen Tršelič||Miha Koprivnikar Krajnc||Matej Hvalec
|-
| Simon Aleksič||Zorenje mRNA pri lignjih zaznamujejo A-I deaminacije ||http://www.sciencedaily.com/releases/2015/02/150212114327.htm||17.03.||20.03.||23.03.||Klara Lenart||Maja Zupanc||Lara Jerman
|-
| Tjaša Lukšič||Ključne biološke funkcije skakajočih genov||http://www.sciencedaily.com/releases/2015/02/150219133102.htm||17.03.||20.03.||23.03.||Uroš Zavrtanik||Eva Rajh||Kristjan Stibilj
|-
| Špela Malenšek||Smo zaradi endogenih retrovirusov pametnejši?||http://www.sciencedaily.com/releases/2015/01/150112093129.htm||24.03.||27.03.||30.03.||Blaž Lebar||Elvira Boršić||Samo Smole
|-
| Ema Gašperšič||Dvojedrni bakrov kompleks naj bi preprečil širjenje raka||http://www.sciencedaily.com/releases/2015/03/150302071134.htm||24.03.||27.03.||30.03.||Gašper Žun||Nejc Kejžar||Miha Koprivnikar Krajnc
|-
| Tilen Tršelič||Transport proteinov v celico s pomočjo nanodelcev||http://www.sciencedaily.com/releases/2015/01/150108141444.htm||24.03.||27.03.||30.03.||Miha Koprivnikar Krajnc||Klara Kuret||Samo Purič
|-
| Gašper Virant||Vezava agonista na adenozinske receptorje lajša kronično bolečino||http://www.sciencedaily.com/releases/2014/11/141126132639.htm||24.03.||27.03.||30.03.||Simon Aleksič||Klara Lenart||Eva Rajh
|-
| Manca Zupan||||||07.04.||10.04.||13.04.||Tjaša Lukšič||Uroš Zavrtanik||Elvira Boršić
|-
| Urša Čerček||||http://www.sciencedaily.com/releases/2014/09/140911094721.htm||07.04.||10.04.||13.04.||Špela Malenšek||Blaž Lebar||Nejc Kejžar
|-
| Katja Brezovar||HIV nadzoruje svojo aktivnost neodvisno od gostiteljske celice||http://www.sciencedaily.com/releases/2015/02/150227112749.htm||07.04.||10.04.||13.04.||Ema Gašperšič||Gašper Žun||Tilen Tršelič
|-
| Lovro Kotnik||Acetilacija lizina in spremembe v proteomu astrocitov možganske skorje pri okužbi s Toxoplasma gondii||http://www.sciencedaily.com/releases/2015/03/150318153918.htm||07.04.||10.04.||13.04.||Petra Hruševar||Rok Miklavčič||Klara Lenart
|-
| Maruša Grošelj||||||14.04.||17.04.||20.04.||Gašper Virant||Simon Aleksič||Uroš Zavrtanik
|-
| Tadej Satler||||||14.04.||17.04.||20.04.||Manca Zupan||Tjaša Lukšič||Blaž Lebar
|-
| Aleksandra Uzar||||||14.04.||17.04.||20.04.||Urša Čerček||Špela Malenšek||Gašper Žun
|-
| Niko Šetar||||||14.04.||17.04.||20.04.||Katja Brezovar||Ema Gašperšič||Rok Miklavčič
|-
| Lija Srnovršnik||||||24.04.||30.04.||04.05.||Lovro Kotnik||Petra Hruševar||Simon Aleksič
|-
| Sara Tekavec||||http://www.sciencedaily.com/releases/2015/03/150302123345.htm||24.04.||30.04.||04.05.||Maruša Grošelj||Gašper Virant||Tjaša Lukšič
|-
| Jaka Kos||||||24.04.||30.04.||04.05.||Tadej Satler||Manca Zupan||Špela Malenšek
|-
| Samo Purič||Desifrirana enigma: virusne infekcije||http://www.sciencedaily.com/releases/2015/02/150204075224.htm||24.04.||30.04.||04.05.||Aleksandra Uzar||Urša Čerček||Ema Gašperšič
|-
| Urša Kopač||||||05.05.||08.05.||11.05.||Niko Šetar||Katja Brezovar||Petra Hruševar
|-
| Neža Koritnik||Vpliv nekodirajoče DNA na tvorbo raka: interakcije na dolge razdalje||http://www.sciencedaily.com/releases/2015/02/150219090349.htm||05.05.||08.05.||11.05.||Lija Srnovršnik||Lovro Kotnik||Gašper Virant
|-
| Katja Čop||Osredja vloga proteina pri odpovedi srca||http://www.sciencedaily.com/releases/2015/03/150305125144.htm||05.05.||08.05.||11.05.||Sara Tekavec||Maruša Grošelj||Manca Zupan
|-
| Klara Kuret||||||05.05.||08.05.||11.05.||Jaka Kos||Tadej Satler||Urša Čerček
|-
| Matej Hvalec||||||12.05.||15.05.||18.05.||Samo Purič||Aleksandra Uzar||Katja Brezovar
|-
| Lara Jerman||||||12.05.||15.05.||18.05.||Urša Kopač||Niko Šetar||Lovro Kotnik
|-
| Kristjan Stibilj|||||http://www.sciencedaily.com/releases/2015/02/150203112022.htm||12.05.||15.05.||18.05.||Neža Koritnik||Lija Srnovršnik||Maruša Grošelj
|-
| Samo Smole||||||12.05.||15.05.||18.05.||Katja Čop||Sara Tekavec||Tadej Satler
|-
| Miha Koprivnikar Krajnc||||||19.05.||22.05.||25.05.||Klara Kuret||Jaka Kos||Aleksandra Uzar
|-
| Maja Zupanc||||||19.05.||22.05.||25.05.||Matej Hvalec||Samo Purič||Niko Šetar
|-
| Eva Rajh||||||19.05.||22.05.||25.05.||Lara Jerman||Urša Kopač||Lija Srnovršnik
|-
| Elvira Boršić||||||19.05.||22.05.||25.05.||Kristjan Stibilj||Neža Koritnik||Sara Tekavec
|-
| Nejc Kejžar||Novi 'pametni' inzulin||http://www.sciencedaily.com/releases/2015/02/150209161141.htm||26.05.||29.05.||01.06.||Samo Smole||Katja Čop||Jaka Kos
|-
| Petra Hruševar||||||26.05.||29.05.||01.06.||Rok Miklavčič||Tilen Tršelič||Maja Zupanc
|}

==Naloga==
* samostojno pripraviti seminar, katerega tema je novica iz področja biokemije na portalu [http://www.sciencedaily.com ScienceDaily], ki je bila objavljena kasneje kot 1. avgusta 2014. Osnova za seminar naj bo znanstveni članek, ki je podlaga za to novico. Poleg tega članka za seminar uporabite še najmanj pet drugih virov, od teh vsaj še dva druga znanstvena članka, ki se navezujeta na to vsebino.
* članke na temo lahko iščete v PubMed povezavi [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/ tukaj]
* naslov izbrane teme in povezavo do novice vpišite v tabelo seminarjev takoj ko ste si izbrali temo, najkasneje pa en teden pred rokom za oddajo
* [[TBK2015 Povzetki seminarjev|Povzetek seminarja]] opišete na wikiju v približno 200 besedah - najkasneje do dne ko morate oddati seminar recenzentom.
* Povezavo do povzetka vnesete v tabelo seminarjev tekočega letnika.
* Seminar pripravite v obliki seminarske naloge (pisava Cambria, font 11, enojni razmak, 2,5 cm robovi; tekst naj obsega okoli 1000 besed), vsebuje naj 1-2 sliki. Slika mora imeti legendo in v besedilu mora biti na ustreznem mestu sklic na sliko. Vse uporabljene vire citirajte v tekstu, kot npr. (Nobel, 2010), na koncu pa navedite točen seznam literature, kot je opisano spodaj!
*Celotni seminar naj obsega 2 strani A4 formata (po možnosti dvostransko tiskanje).
* Seminar oddajte do datuma oddaje, ki je naveden v tabeli v elektronski obliki z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/tbk/poslji/ tega obrazca].
* vsi seminarji so v elektronski obliki dostopni [http://bio.ijs.si/~zajec/tbk/poslji//bioseminar/ tukaj].
* Recenzenti do dneva določenega v tabeli določijo popravke in podajo oceno pisnega dela, v predpisanem formatu elektronskega obrazca na internetu.
* Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Za predstavitev je na voljo 12 minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni. Prvi recenzent vodi predstavitve in razpravo ter skrbi za to, da vse poteka v zastavljenih časovnih okvirih.
* Predstavitvi sledi razprava do 8 minut. Sledijo vprašanja prisotnih, recenzenti postavijo vsak vsaj dve vprašanji in na koncu podajo oceno predstavitve.
* En dan pred predstavitvijo na strežnik oddajte tudi končno verzijo. Na dan predstavitve morate oddati tudi končno (popravljeno) in natisnjeno verzijo seminarja v enem izvodu.
* Seminarska naloga in povzetek na wikiju morajo biti v slovenskem jeziku!

==Imena datotek==
Prosim vas, da vse datoteke, ki jih pošiljate poimenujete po spodnjih pravilih. Ne uporabljajte ČŽŠčžš!
* TBK_2015_Priimek_Ime.doc(x) za seminar, npr. TBK_2015_Guncar_Gregor.docx
* TBK_2015_Priimek_ime_final.doc(x) za končno verzijo seminarja
* TBK_2015_Priimek_Ime_rec_Priimek2.doc(x) za recenzijo, kjer je Priimek2 priimek recenzenta, npr. TBK_2015_Guncar_Gregor_rec_Scott.docx (če se pišete Scott in odajate recenzijo za seminar, ki ga je napisal Gunčar)
* TBK_2015_Priimek_Ime.ppt(x) za prezentacijo, npr TBK_2015_Guncar_Gregor.pptx

==Ocenjevanje seminarjev==
Recenzenti ocenijo seminar tako, da izpolnijo [[https://docs.google.com/forms/d/1Hdg2OHCyG24qwLTnFt09yZTng46RIwaIiUqnKOdsJxQ/viewform recenzentsko poročilo]] na spletu.

== Mnenje o predstavitvi ==
Vsak posameznik '''mora''' oceniti seminar tako, da odda svoje [https://docs.google.com/forms/d/1VvE-jaKikfiDO5Gdybqgp9mf_0uJZfBbIK8PLXKDaS0/viewform mnenje] najkasneje v enem tednu po predstavitvi. Kdor na seminarju ni bil prisoten, mnenja '''ne sme''' oddati.

==Urejanje spletnih strani na wikiju==
Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''

==Faktor vpliva==
Faktor vpliva (angl. impact factor) neke revije pove, kolikokrat so bili v poprečju citirani članki v tej reviji v dveh letih skupaj pred objavo tega faktorja. Faktorje vpliva za posamezno revijo lahko najdete v [http://www.cobiss.si/scripts/cobiss?command=CONNECT&base=JCR COBISS-u]. V polje "Naslov revije" vnesite ime revije za katero želite izvedeti faktor vpliva in pritisnite na gumb POIŠČI. V skrajnem desnem stolpcu se bodo izpisali faktorji vpliva za revije, ki ustrezajo vašim iskalnim kriterijem. Zadetkov za posamezno revijo je več zato, ker so navedeni faktorji vpliva za posamezno leto. Za leto 2011 faktorji vpliva še niso objavljeni, zato se orientirajte po faktorjih vpliva zadnjih par let. Če faktorja vpliva za vašo izbrano revijo ne najdete v bazi COBISS, potem izberite članek iz kakšne druge revije.

==Citiranje virov==Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se v seminarju držite ene same.Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati.Za citate v naravoslovju je najpogostejše citiranje po pravilniku ISO 690. [http://www.google.com/url?sa=t&source=web&cd=6&sqi=2&ved=0CEUQFjAF&url=http%3A%2F%2Fwww.tre.sik.si%2Fmain%2Fpomoc%2Ffiles%2Fcitiranje_in_navajanje_virov.pdf&rct=j&q=citiranje%20po%20pravilniku%20ISO%20690&ei=jPBqTe6FC9DKswaWk-TmDA&usg=AFQjCNF8r6X9Y781sanDObaXNdCew4suUg&sig2=cTqKObSJsTicekWGRGa72g&cad=rja Pravila], ki upoštevajo omenjeni standard, so pripravili pri ZTKS. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati. '''Citiranje knjig:''' Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica. Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN. Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005. Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4. Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.). '''Citiranje člankov:''' Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani. Lartigue C. ''et al''. Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, letn. 317, str. 632-638.Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole: Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani. Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.Revija Science uporablja skrajšani zapis: C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007) V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne).'''Citiranje spletnih virov:''' Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.

TBK2015-seminar

2015-03-25T16:59:34Z

GasperVirant: /* Seznam seminarjev */

= Temelji biokemije- seminar =

Seminarje vodi prof. dr. Brigita Lenarčič. Seminarji so obvezni.

Ocena seminarjev (6-10) predstavlja enako število odstotkov, ki se prištejeh končnipisni oceni izpita.
Stran na strežniku s seminarskimi nalogami je zaščitena.
Uporabniško ime je: tbk, password pa: samozame## "##" sta dve številki, ki ju izveste na predavanjih.

== Seznam seminarjev ==
{| border="1" cellpadding="4" cellspacing="0" style="border:#c9c9c9 1px solid; margin: 1em 1em 1em 0; border-collapse: collapse;"
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Ime in priimek'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Naslov seminarja'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Povezava'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Rok za oddajo'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Rok za recenzijo'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Datum predstavitve'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 1'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 2'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 3'''
|-
| Klara Lenart||Permanentno označevanje nevronskih povezav||http://www.sciencedaily.com/releases/2015/02/150212141453.htm||10.03.||13.03.||16.03.||Maja Zupanc||Matej Hvalec||Urša Kopač
|-
| Uroš Zavrtanik||Popravljalni mehanizem DNA (NER)||http://www.sciencedaily.com/releases/2015/01/150128141423.htm||10.03.||13.03.||16.03.||Eva Rajh||Lara Jerman||Neža Koritnik
|-
| Blaž Lebar||Preučitev imunskega odziva komarja po piku||http://www.sciencedaily.com/releases/2015/02/150206174850.htm||10.03.||13.03.||16.03.||Elvira Boršić||Kristjan Stibilj||Katja Čop
|-
| Gašper Žun||Antibiotiki uničujejo bakterije z okvaro izgradnje celične stene||http://www.sciencedaily.com/releases/2014/12/141205114011.htm||17.03.||20.03.||23.03.||Nejc Kejžar||Samo Smole||Klara Kuret
|-
| Rok Miklavčič||Kontrola prenašalnih RNA na CCA-dodajajočem encimu||http://www.sciencedaily.com/releases/2015/01/150129151612.htm||17.03.||20.03.||23.03.||Tilen Tršelič||Miha Koprivnikar Krajnc||Matej Hvalec
|-
| Simon Aleksič||Zorenje mRNA pri lignjih zaznamujejo A-I deaminacije ||http://www.sciencedaily.com/releases/2015/02/150212114327.htm||17.03.||20.03.||23.03.||Klara Lenart||Maja Zupanc||Lara Jerman
|-
| Tjaša Lukšič||Ključne biološke funkcije skakajočih genov||http://www.sciencedaily.com/releases/2015/02/150219133102.htm||17.03.||20.03.||23.03.||Uroš Zavrtanik||Eva Rajh||Kristjan Stibilj
|-
| Špela Malenšek||Smo zaradi endogenih retrovirusov pametnejši?||http://www.sciencedaily.com/releases/2015/01/150112093129.htm||24.03.||27.03.||30.03.||Blaž Lebar||Elvira Boršić||Samo Smole
|-
| Ema Gašperšič||Dvojedrni bakrov kompleks naj bi preprečil širjenje raka||http://www.sciencedaily.com/releases/2015/03/150302071134.htm||24.03.||27.03.||30.03.||Gašper Žun||Nejc Kejžar||Miha Koprivnikar Krajnc
|-
| Tilen Tršelič||Transport proteinov v celico s pomočjo nanodelcev||http://www.sciencedaily.com/releases/2015/01/150108141444.htm||24.03.||27.03.||30.03.||Miha Koprivnikar Krajnc||Klara Kuret||Samo Purič
|-
| Gašper Virant||Vezava agonista na adenozinske receptorje||http://www.sciencedaily.com/releases/2014/11/141126132639.htm||24.03.||27.03.||30.03.||Simon Aleksič||Klara Lenart||Eva Rajh
|-
| Manca Zupan||||||07.04.||10.04.||13.04.||Tjaša Lukšič||Uroš Zavrtanik||Elvira Boršić
|-
| Urša Čerček||||http://www.sciencedaily.com/releases/2014/09/140911094721.htm||07.04.||10.04.||13.04.||Špela Malenšek||Blaž Lebar||Nejc Kejžar
|-
| Katja Brezovar||HIV nadzoruje svojo aktivnost neodvisno od gostiteljske celice||http://www.sciencedaily.com/releases/2015/02/150227112749.htm||07.04.||10.04.||13.04.||Ema Gašperšič||Gašper Žun||Tilen Tršelič
|-
| Lovro Kotnik||Acetilacija lizina in spremembe v proteomu astrocitov možganske skorje pri okužbi s Toxoplasma gondii||http://www.sciencedaily.com/releases/2015/03/150318153918.htm||07.04.||10.04.||13.04.||Petra Hruševar||Rok Miklavčič||Klara Lenart
|-
| Maruša Grošelj||||||14.04.||17.04.||20.04.||Gašper Virant||Simon Aleksič||Uroš Zavrtanik
|-
| Tadej Satler||||||14.04.||17.04.||20.04.||Manca Zupan||Tjaša Lukšič||Blaž Lebar
|-
| Aleksandra Uzar||||||14.04.||17.04.||20.04.||Urša Čerček||Špela Malenšek||Gašper Žun
|-
| Niko Šetar||||||14.04.||17.04.||20.04.||Katja Brezovar||Ema Gašperšič||Rok Miklavčič
|-
| Lija Srnovršnik||||||24.04.||30.04.||04.05.||Lovro Kotnik||Petra Hruševar||Simon Aleksič
|-
| Sara Tekavec||||http://www.sciencedaily.com/releases/2015/03/150302123345.htm||24.04.||30.04.||04.05.||Maruša Grošelj||Gašper Virant||Tjaša Lukšič
|-
| Jaka Kos||||||24.04.||30.04.||04.05.||Tadej Satler||Manca Zupan||Špela Malenšek
|-
| Samo Purič||Desifrirana enigma: virusne infekcije||http://www.sciencedaily.com/releases/2015/02/150204075224.htm||24.04.||30.04.||04.05.||Aleksandra Uzar||Urša Čerček||Ema Gašperšič
|-
| Urša Kopač||||||05.05.||08.05.||11.05.||Niko Šetar||Katja Brezovar||Petra Hruševar
|-
| Neža Koritnik||Vpliv nekodirajoče DNA na tvorbo raka: interakcije na dolge razdalje||http://www.sciencedaily.com/releases/2015/02/150219090349.htm||05.05.||08.05.||11.05.||Lija Srnovršnik||Lovro Kotnik||Gašper Virant
|-
| Katja Čop||Osredja vloga proteina pri odpovedi srca||http://www.sciencedaily.com/releases/2015/03/150305125144.htm||05.05.||08.05.||11.05.||Sara Tekavec||Maruša Grošelj||Manca Zupan
|-
| Klara Kuret||||||05.05.||08.05.||11.05.||Jaka Kos||Tadej Satler||Urša Čerček
|-
| Matej Hvalec||||||12.05.||15.05.||18.05.||Samo Purič||Aleksandra Uzar||Katja Brezovar
|-
| Lara Jerman||||||12.05.||15.05.||18.05.||Urša Kopač||Niko Šetar||Lovro Kotnik
|-
| Kristjan Stibilj|||||http://www.sciencedaily.com/releases/2015/02/150203112022.htm||12.05.||15.05.||18.05.||Neža Koritnik||Lija Srnovršnik||Maruša Grošelj
|-
| Samo Smole||||||12.05.||15.05.||18.05.||Katja Čop||Sara Tekavec||Tadej Satler
|-
| Miha Koprivnikar Krajnc||||||19.05.||22.05.||25.05.||Klara Kuret||Jaka Kos||Aleksandra Uzar
|-
| Maja Zupanc||||||19.05.||22.05.||25.05.||Matej Hvalec||Samo Purič||Niko Šetar
|-
| Eva Rajh||||||19.05.||22.05.||25.05.||Lara Jerman||Urša Kopač||Lija Srnovršnik
|-
| Elvira Boršić||||||19.05.||22.05.||25.05.||Kristjan Stibilj||Neža Koritnik||Sara Tekavec
|-
| Nejc Kejžar||Novi 'pametni' inzulin||http://www.sciencedaily.com/releases/2015/02/150209161141.htm||26.05.||29.05.||01.06.||Samo Smole||Katja Čop||Jaka Kos
|-
| Petra Hruševar||||||26.05.||29.05.||01.06.||Rok Miklavčič||Tilen Tršelič||Maja Zupanc
|}

==Naloga==
* samostojno pripraviti seminar, katerega tema je novica iz področja biokemije na portalu [http://www.sciencedaily.com ScienceDaily], ki je bila objavljena kasneje kot 1. avgusta 2014. Osnova za seminar naj bo znanstveni članek, ki je podlaga za to novico. Poleg tega članka za seminar uporabite še najmanj pet drugih virov, od teh vsaj še dva druga znanstvena članka, ki se navezujeta na to vsebino.
* članke na temo lahko iščete v PubMed povezavi [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/ tukaj]
* naslov izbrane teme in povezavo do novice vpišite v tabelo seminarjev takoj ko ste si izbrali temo, najkasneje pa en teden pred rokom za oddajo
* [[TBK2015 Povzetki seminarjev|Povzetek seminarja]] opišete na wikiju v približno 200 besedah - najkasneje do dne ko morate oddati seminar recenzentom.
* Povezavo do povzetka vnesete v tabelo seminarjev tekočega letnika.
* Seminar pripravite v obliki seminarske naloge (pisava Cambria, font 11, enojni razmak, 2,5 cm robovi; tekst naj obsega okoli 1000 besed), vsebuje naj 1-2 sliki. Slika mora imeti legendo in v besedilu mora biti na ustreznem mestu sklic na sliko. Vse uporabljene vire citirajte v tekstu, kot npr. (Nobel, 2010), na koncu pa navedite točen seznam literature, kot je opisano spodaj!
*Celotni seminar naj obsega 2 strani A4 formata (po možnosti dvostransko tiskanje).
* Seminar oddajte do datuma oddaje, ki je naveden v tabeli v elektronski obliki z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/tbk/poslji/ tega obrazca].
* vsi seminarji so v elektronski obliki dostopni [http://bio.ijs.si/~zajec/tbk/poslji//bioseminar/ tukaj].
* Recenzenti do dneva določenega v tabeli določijo popravke in podajo oceno pisnega dela, v predpisanem formatu elektronskega obrazca na internetu.
* Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Za predstavitev je na voljo 12 minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni. Prvi recenzent vodi predstavitve in razpravo ter skrbi za to, da vse poteka v zastavljenih časovnih okvirih.
* Predstavitvi sledi razprava do 8 minut. Sledijo vprašanja prisotnih, recenzenti postavijo vsak vsaj dve vprašanji in na koncu podajo oceno predstavitve.
* En dan pred predstavitvijo na strežnik oddajte tudi končno verzijo. Na dan predstavitve morate oddati tudi končno (popravljeno) in natisnjeno verzijo seminarja v enem izvodu.
* Seminarska naloga in povzetek na wikiju morajo biti v slovenskem jeziku!

==Imena datotek==
Prosim vas, da vse datoteke, ki jih pošiljate poimenujete po spodnjih pravilih. Ne uporabljajte ČŽŠčžš!
* TBK_2015_Priimek_Ime.doc(x) za seminar, npr. TBK_2015_Guncar_Gregor.docx
* TBK_2015_Priimek_ime_final.doc(x) za končno verzijo seminarja
* TBK_2015_Priimek_Ime_rec_Priimek2.doc(x) za recenzijo, kjer je Priimek2 priimek recenzenta, npr. TBK_2015_Guncar_Gregor_rec_Scott.docx (če se pišete Scott in odajate recenzijo za seminar, ki ga je napisal Gunčar)
* TBK_2015_Priimek_Ime.ppt(x) za prezentacijo, npr TBK_2015_Guncar_Gregor.pptx

==Ocenjevanje seminarjev==
Recenzenti ocenijo seminar tako, da izpolnijo [[https://docs.google.com/forms/d/1Hdg2OHCyG24qwLTnFt09yZTng46RIwaIiUqnKOdsJxQ/viewform recenzentsko poročilo]] na spletu.

== Mnenje o predstavitvi ==
Vsak posameznik '''mora''' oceniti seminar tako, da odda svoje [https://docs.google.com/forms/d/1VvE-jaKikfiDO5Gdybqgp9mf_0uJZfBbIK8PLXKDaS0/viewform mnenje] najkasneje v enem tednu po predstavitvi. Kdor na seminarju ni bil prisoten, mnenja '''ne sme''' oddati.

==Urejanje spletnih strani na wikiju==
Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''

==Faktor vpliva==
Faktor vpliva (angl. impact factor) neke revije pove, kolikokrat so bili v poprečju citirani članki v tej reviji v dveh letih skupaj pred objavo tega faktorja. Faktorje vpliva za posamezno revijo lahko najdete v [http://www.cobiss.si/scripts/cobiss?command=CONNECT&base=JCR COBISS-u]. V polje "Naslov revije" vnesite ime revije za katero želite izvedeti faktor vpliva in pritisnite na gumb POIŠČI. V skrajnem desnem stolpcu se bodo izpisali faktorji vpliva za revije, ki ustrezajo vašim iskalnim kriterijem. Zadetkov za posamezno revijo je več zato, ker so navedeni faktorji vpliva za posamezno leto. Za leto 2011 faktorji vpliva še niso objavljeni, zato se orientirajte po faktorjih vpliva zadnjih par let. Če faktorja vpliva za vašo izbrano revijo ne najdete v bazi COBISS, potem izberite članek iz kakšne druge revije.

==Citiranje virov==Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se v seminarju držite ene same.Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati.Za citate v naravoslovju je najpogostejše citiranje po pravilniku ISO 690. [http://www.google.com/url?sa=t&source=web&cd=6&sqi=2&ved=0CEUQFjAF&url=http%3A%2F%2Fwww.tre.sik.si%2Fmain%2Fpomoc%2Ffiles%2Fcitiranje_in_navajanje_virov.pdf&rct=j&q=citiranje%20po%20pravilniku%20ISO%20690&ei=jPBqTe6FC9DKswaWk-TmDA&usg=AFQjCNF8r6X9Y781sanDObaXNdCew4suUg&sig2=cTqKObSJsTicekWGRGa72g&cad=rja Pravila], ki upoštevajo omenjeni standard, so pripravili pri ZTKS. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati. '''Citiranje knjig:''' Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica. Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN. Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005. Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4. Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.). '''Citiranje člankov:''' Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani. Lartigue C. ''et al''. Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, letn. 317, str. 632-638.Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole: Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani. Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.Revija Science uporablja skrajšani zapis: C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007) V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne).'''Citiranje spletnih virov:''' Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.

TBK2015 Povzetki seminarjev

2015-03-25T16:01:58Z

GasperVirant: /* Gašper Virant: Vezava agonista na adenozinske receptorje */

[[TBK2015-seminar|Nazaj na osnovno stran]]

=== Uroš Zavrtanik: Mehanizem popravljanja DNA: NER (faktor XPC) ===

Od samega nastanka naprej se življenje spopada s fundamentalnim problemom kemijske nestabilnosti genetske informacije, shranjene v DNA. Molekula DNA je izpostavljena številnim fizikalnim ter kemijskim dejavnikom, ki lahko vplivajo na njeno strukturo in posredno ali neposredno tudi na samo informacijo. Ker pa predstavlja ohranjanje informacije eden izmed ključnih in pomembnejših aspektov življenja samega, so se tekom evolucije razvili številni mehanizmi popravljanja DNA. Eden izmed teh mehanizmov je popravljanje DNA z izrezom nukleotidov (ang. Nucleotide Excision Repair-NER). NER je popravljalni proces za odstranjevanje in popravo večjih strukturnih nepravilnosti v strukturi DNA, ki so v glavnem posledica radiacije (UV, gama) ter okolijskih dejavnikov (specifične molekule, ki lahko strukturno poškodujejo DNA). NER predstavlja pri človeku edini mehanizem za popravljanje poškodb povzročenih zaradi UV radiacije. Največji izziv NER je, kako najti vse poškodovane dele DNA v celotnem genomu. Na podlagi eksperimentalnih ugotovitev raziskovalci ugotavljajo, da bi lahko bil ''ključ do uspeha'' naključna vezava proteina XPC (začetni faktor NER) na nespecifično mesto v DNA ter nato vzdolžna difuzija XPC do poškodovanega (specifičnega) mesta, kjer XPC za trenutek obstane, kar je signal za sprožitev popravljalnega procesa. Odkritje bi lahko predstavljalo generalni koncept mehanizma še vedno malo raziskane interakcije protein-DNA.

=== Gašper Virant: Vezava agonista na adenozinske receptorje ===
Kronična bolečina je posledica okvare živčevja. Ločimo nociceptivno kronično bolečino, ki jo povzroča draženje bolečinskih receptorjev (nociceptorjev) v tkivih notranjih organov ter mišičnoskeletnega sistema, in nevropatsko kronično bolečino, ki nastane kot posledica okvare, poškodbe ali motenega delovanja perifernega ali osrednjega živčevja . Najbolj uspešni pristopi lajšanja tovrstne bolečine temeljijo na uporabi mehanizma kalcijevih kanalčkov, opioidov, in adrenergikov. Pogosto pa imajo ta zdravila stranske učinke, ki nastopijo ob neprestani uporabi. Prav tako telo razvije toleranco do njih, kar pomeni, da je za enak učinek potreben vedno večji odmerek, kar vodi v zmanjšano učinkovanje zdravila. Kot močno ne-narkotično in ne-opoidno sredstvo za lajšanje tovrstne bolečine se je izkazal adenozin. Adenozin oz. nekateri še bolj selektivni agonisti se vežejo na zunajcelične adenozinske receptorje in s tem zmanjšajo nocicepcijo. Adenozin v zunajceličem prostoru ni obstojen, vendar lahko njegovo življensko dobo podaljšamo z inhibicijo andenozin kinaz in deaminaz ter tako posledično podaljšamo tudi protibolečinsko delovanje. Visoko selektiven agonist z veliko afiniteto do A3 podskupine adenozinskih receptorjev bi tudi pomembno odpravil neželene stranske učinke.

=== Klara Lenart: Permanentno označevanje nevronskih povezav ===

Preučevanje nevronskih povezav je precej neraziskano področje. Za raziskave teh povezav uporabljajo proteine, najpogosteje skupino proteinov imenovano GCaMP, ki oddajajo fluorescenčno svetlobo kratek čas po zaznavi spremembe v koncentraciji kalcijevih ionov v celici. Skupina znanstvenikov z medicinskega inštituta Howard Hughes je razvila nov protein, imenovan CaMPARI(podoben je skupini GCaMP-jev), ki označuje aktivne nevrone glede na spremembo koncentracije Ca2+ v njih. Proteini, podobni CaMPARI-ju obstajajo že zadnjih 20 let, a posebnost novega proteina je permanentna fluorescenca, ki jo oddaja ob povečanju koncentracije kalcija v celici ter sočasnem obsevanju z vijolično svetlobo. Glavni del CaMPARI-ja je fluorescenten protein EosFP, ki spremeni barvo iz zelene v rdečo ob obsvetljevanju z vijolično svetlobo. Ko so EosFP spojili z kalmodulinom in peptidom M13, katera sta potrebna za vezavo kalcijevih ionov, je nastal CaMPARI. Ponuja možnost raziskav nevronskih povezav med kompleksnejšim vedenjem, na primer med učenjem. Prav tako je uporaben, ker lahko z reguliranim obsvetljevanjem vplivamo, kdaj bo potekala pretvorba iz zelene v rdečo in kdaj ne. Preizkusili so ga v štirih poskusih; na ličinkah in odraslih osebkih vinske mušice, na ličinkah cebrice in na odraslih miših. Vsi poskusi so potrdili že znana dejstva, kar dokazuje njegovo zanesljivost, ter ponuja mnogo možnosti za nadaljnje raziskave.

=== Blaž Lebar: Preučitev imunskega odziva komarja po piku ===

Malarija je bolezen, ki jo prenaša komar mrzličar ali Anopheles. Na leto se okuži na stotine milijonov ljudi, nekaj milijonov jih tudi umre. Povzročitelj te bolezni so različne vrste plazmodijev, ki se uspešno množijo v komarju, ki nato po piku okuži svojo žrtev. Vendar kako uspe tako inferiorno bitje kot je komar okužiti tako kompleksno bitje kot je človek, morda celo smrtno, sam komar pa normalno funkcionira navkljub patogenom v lastnem v organizmu?
Za komarjev imunski sistem so odgovorni LRIMi, bilo naj bi jih nekaj več kot 24, vendar delovanja večine še ne poznajo. Najpomembnejša za imunski sistem komarja naj bi bila člena sistema komplementa: LRIM1 in APL1C v hemolimfi, ki se z LRRji povežeta z TEP1cut in tako izvedeta uspešno lizo in melanizacijo patogenov, vendar sta se izkazala kot popolnoma neučinkovita pri eliminaciji P. berghei. V tej študiji pa so se osredotočili na LRIM9, protein v imunskem sistemu, ki naj bi imel najpomembnejšo vlogo pri borbi z plazmodiji. Najpogostejša tehnika je bila qRT-PCR, preverjali pa so namnožitev, reprodukcijo in melanizacijo P. berghei pri komarjih vrste A. gambiae ob prehranjevanju s krvjo miši, ter različne vplive na izražanje LRIM9 (prehranjevanje, bakterije, imunost…). Ugotovili so tudi povezavo izražanja LRIM9 in hormona »ecdysone«, ki se izloča iz jajčnikov samic.
Danih je bilo veliko odgovorov, ki pa so odprli nova vprašanja, katera bodo zahtevala še veliko raziskav.

=== Ema Gašperšič: Dvojedrni bakrov kompleks naj bi preprečil širjenje raka ===
Čeprav je v zadnjem času opazen napredek na področju zdravljenja raka, še vedno obstajajo določene pomanjkljivosti. Eno izmed najbolj pogosto uporabljenih zdravil za različne vrste raka je cisplatin, ki se veže na dušikove baze DNA in s tem povzroči celično smrt oz. apoptozo. Cisplatin pa kljub vsemu ni vedno učinkovit in ima precej stranskih učinkov, zato so raziskovalci želeli razviti alternativno zdravilo. Razvili so citotoksični dvojedrni kompleks z bakrom, ki se s pomočjo molekularne prepoznave veže na dve sosednji fosfatni skupini na vijačnici DNA, kar prepreči celične delitve in uniči patološko celico. Z različnimi anorganskimi in biokemijskimi metodami, spektroskopijo in metodami na posameznih molekulah so dokazali, da dvojedrni Cu2 kompleks zavira sintezo DNA in je citotoksična za človeške rakave celice. V članku je predstavljena sinteza prvega kompleksa iz te družine molekul, bakrovega Cu2 kompleksa ter različne metode, s katerimi so dokazali sposobnost ustrezne koordinacije Cu2(2+), sposobnost močne vezave Cu2(2+) na DNA, sposobnost inhibicije sinteze DNA ter citotoksičnost kompleksa. Iz dobljenih rezultatov znanstveniki predpostavljajo učinkovito interakcijo med Cu2(2+) in DNA in vitro ter v živih celicah. Nadaljnje klinične in medicinske raziskave pa bodo še odločale o tem, kako, in če sploh, bo bakrov kompleks resnično preizkušen na pacientih z rakom.

=== Tjaša Lukšič: Ključne biološke funkcije skakajočih genov ===

Dobro polovico človeškega genoma sestavljajo ponavljajoči se genetski elementi, katerim v preteklosti niso pripisovali posebne vloge, danes pa vse bolj postaja jasno, da njihova prisotnost v genomu prinaša svojevrstne biološke funkcije. Alu sekvence so primer takšnih transpozicijskih elementov, katerih prepisovanje je običajno minimalizirano, vendar se ob virusnih infekcijah ali stresu močno poveča. Po klasifikaciji so podvrsta kratkih razpršenih jedrnih elementov (SINE), ki se lahko transponirajo po genomu prek RNA intermediata, vendar ne kodirajo proteinov. Alu sekvence prepisuje RNA polimeraza III, Alu RNA pa ima značilno sekundarno strukturo dveh rok, ki omogoča tvorbo kompleksov s proteinskimi dimeri SRP9/14. Nastanek takšnih Alu ribonukleoproteinov (RNP) v običajnih celičnih razmerah ni pogost, saj je kljub veliki količini monomerov SRP9 in SRP14 stopnja pojavljanja Alu RNA-jev veliko manjša. Tvorba Alu RNP-jev prepreči iniciacijo prevajanja mRNA v aminokislinsko zaporedje in tvorbo polisomov. Po vezavi Alu RNP-ja na ribosomsko podenoto 40S, Alu RNA lahko zapusti kompleks in sodeluje v nadaljnjih prenosih novih SRP9/14. Mehanizem delovanja takšnih kompleksov je relativno nepoznan in odpira nove poglede na smisel ohranitve transpozicijskih elementov skozi evolucijo. Alu sekvence je predstavljajo perspektivno področje za preučevanje ravno zaradi njihovega prispevka k zaščiti translacijskih procesov celice v neugodnih razmerah in zaradi drugih še neodkritih, potencialnih bioloških funkcij.

=== Špela Malenšek: Smo zaradi endogenih retrovirusov pametnejši? ===

Človeški endogeni retrovirusi (ERV), genetsko podedovani ostanki preteklih virusnih infekcij, so klasično obravnavani kot človeku oziroma gostitelju neuporabni del genoma, tako imenovani "junk DNA". Njihovo delovanje je v običajnih somatskih celicah (fibroblasti, hepatocite, bele krvne celice …) nadzorovano z epigenetskim mehanizmom metilacije DNA, kjer se metilna skupina doda citozinu ali adeninu in tako prepreči izražanje virusnih delov genoma. V nevronskih izvornih celicah naj bi med drugim izražanje endogenih retrovirusnih elementov nadzoroval tudi protein TRIM28. Deluje namreč kot korepresor, ki z modifikacijo histonov zatre prepisovanje genetskega materiala. Raziskave na univerzah Lund in EPLF so pokazale, da se ob izbrisu TRIM28 v celicah nakopičita dve večji skupini ERV, ki pri miših vplivata na izražanje gena BC048671 in služita kot startni točki za IncRNA (dolga nekodirajoča RNA). Hkrati izbris proteina TRIM28 povzroči tako kompleksne vedenjske spremembe kot tudi abnormalne vedenjske fenotipe modelnih organizmov (miši), ki se izkažejo podobne nekaterim človeškim psihološkim motnjam. Klasični hipotezi o nefunkcionalnosti ERV se tako zoperstavlja nova ideja, ki trdi, da aktivnost ERV vpliva na izražanje genov v nevronskih izvornih celicah in na kompleksnost nevronske mreže v možganih. S tem se odpira popolnoma nova molekularna perspektiva na analizo kompleksnih vedenjskih vzorcev, možganskih motenj in samega delovanja nevronske mreže.

=== Nejc Kejžar: Novi 'pametni' inzulin ===

Z odkritjem biotehnoloških metod za umetno sintezo inzulina s pomočjo bakterije E. coli ali kvasovk je življenje s sladkorno boleznijo postalo mogoče, še vedno pa so prisotni zapleti, ki jih povzročata hipoglikemija in hiperglikemija. Današnje inzulinske terapije se osredotočajo na konstanto merjenje koncentracij glukoze v krvi in intravenozni vnos inzulina glede na izmerjeno koncentracijo, kar pa je kljub nujnosti (še posebej za paciente diabetesa tipa 1) zelo nadležno. Do težav lahko pride zaradi neupoštevanja terapije ali slabe glikemične kontrole, kar lahko v resnih stanjih hipoglikemije privede do kome ali smrti, hiperglikemija pa lahko vodi do kardiovaskularnih obolenj, težav s celjenjem ran ali celo do raka. Za učinkovitejše nadziranje krvne koncentracije glukoze in olajšano življenje pacientov je skupina znanstvenikov iz MIT razvila ‘pametni’ inzulin, ki ima nase pritrjen konjugat sestavljen iz alifatske verige 11 ogljikovih atomov in fenilborove kisline. Alifatska veriga povzroča podaljšano delovanje inzulina, fenilborova kislina pa služi kot ‘stikalo’, ki aktivira delovanje inzulina samo ob povečani koncentracije glukoze v krvi. Ta sintetični derivat je zmožen hitrejšega obnavljanja normalnih koncentracij krvne glukoze kot naravni in klinični inzulin, večkratnega zaporednega odziva na porast glukoze, prav tako pa ima nižji hipoglikemični indeks ob administraciji v času normalnih koncentracij glukoze, kar pomeni, da je tveganje za hipoglikemijo manjše. V najbolj zgovornem testu je bilo pokazano, da je učinkovitost pametnega inzulina primerljiva z delovanjem zdravega pankreasa.

=== Simon Aleksič: Zorenje mRNA pri lignjih zaznamujejo A-I deaminacije ===

Informacijska RNA je po prepisu iz DNA podvržena dodatnim procesom, tako v jedru kot tudi v citoplazmi. Izrezovanje intronov je le en izmed procesov, ki zagotavlja strukturno variabilnost proteinov. Za variabilnost strukture poskrbijo tudi malo raziskane deaminacije nukleotidov . Deaminacije nukleotidov so katalitski kemijski procesi, ki omogočajo spreminjanje tripletov kodonov v zapisih mRNA s pomočjo proteinov ADAR. Za takšne procese so predvidevali, da so v organizmih redki in nimajo posebnega vpliva na delovanje proteinov v telesu. A študija univerze v Tel Avivu je pokazala, da so deaminacije adenozina v inozin v živčnih tkivih lignjev eden poglavitnih procesov, ki se zgodijo pred translacijo mRNA v proteine. Deaminacije s spremembami tripletov povzročijo zamenjave aminokislin v proteinih, raziskava pa dokaže, da se stabilnejše aminokisline zamenjajo z manj stabilnimi. Manj stabilne aminokisline v območju aktivnega mesta in hidrofobnega jedra povzročijo, da je protein sam manj občutljiv na nižje temperature okolja in lahko ostane delujoč pri spremenjenih razmerah okolja. Deaminacije so posebno pogoste v mRNA prepisih genov, ki zapisujejo proteine vključene v živčni sistem in citoskelet. Novejše raziskave mutacije genov za protein ADAR pri človeku povezujejo z različnimi imunskimi boleznimi, kot so ADA-SCID in sindrom Aicardi–Goutières.

=== Gašper Žun: Antibiotiki betalaktami uničujejo bakterije z okvaro mehanizma za izgradnjo celične stene ===
Antibiotiki β-laktami, med katere spada tudi penicilin, predstavljajo eno izmed najdlje in najsplošneje uporabnih terapij pri bakterijskih okužbah. Učinkujejo tako, da z vezavo na penicilin-vezavne proteine (PBP) okvarijo mehanizem za sintezo celične stene. S tem onemogočijo zamreženje nastajajočih verig peptidoglikanov (PG) v matriks, v manjši meri pa se nove verige še vedno lahko sintetizirajo. Celična stena takih bakterij je zato neobičajnih oblik, med delitvijo pa se lahko na določenih mestih pretrga in celica propade. Zaradi nastajanja enoverižnih PG se vključijo v proces encimi (Slt), ki take neobičajne verige razgrajujejo. Lastnosti celične stene na tak način ostajajo funkcionalne, vendar pa zaradi vključenega brezuspešnega cikla sinteze in razgradnje celične stene pride do prekomerne porabe za celico pomembnih snovi, kar le še prispeva k toksičnemu delovanja antibiotikov. Obrambni mehanizmi proti antibiotični aktivnosti vključujejo encime (β-laktamaze), ki razgrajujejo β-laktame. Vse večja odpornost bakterij na antibiotike je posledica povečane frekvence genskega zapisa za β-laktamaze, ki se med bakterijami prenaša s plazmidi. Ker je za uspešen boj proti bakterijam potreben nenehen razvoj novih zdravil in terapij, je potrebno dodobra spoznati tako način učinkovanja antibiotikov kot način delovanja bakterij. Članek prispeva nov vpogled v delovanje encima Slt za razgradnjo nezamreženega novo nastalega PG, saj mu pripisuje vlogo kontrole nad kvaliteto izgradnje celične stene, kar pa v resnici potencira uničujoče posledice antibiotikov.

=== Rok Miklavčič: Kontrola prenašalnih RNA na CCA-dodajajočem encimu ===
tRNA je ena od biološko najpomembnejših molekul v živih organizmih in ima ključno vlogo pri sintezi proteinov, zato je pomembno, da so vse tRNA, ki na ribosome prinašajo aminokisline, funkcionalne. Od prepisa dalje grejo zato tRNA prepisi skozi serijo procesov in modifikacij, ki na koncu privedejo do popolnoma funkcionalnih tRNA. V predzadnji fazi urejanja tRNA sodeluje CCA-dodajajoči encim, ki na 3'-konec prepisov tRNA pripne končno nukleotidno zaporedje CCA, v zadnji fazi pa se na zadnji adenin nukleotid veže še ustrezna aminokislina. CCA-dodajajoči encim pa ima v sintezi tRNA še eno nedavno odkrito funkcijo: nestabilnim prepisom tRNA pripne nukleotidno zaporedje CCACCA, ki je signal za razgradnjo. Na ta način encim kontrolira kvaliteto tRNA in pripomore k optimizaciji same sinteze proteinov. Na CCA-dodajajočem encimu se razlike med stabilnimi in nestabilnimi tRNA prepisi pokažejo po vezavi prvega zaporedja CCA, in sicer pri premiku encima. Stabilne tRNA se ob premiku odcepijo z encima, medtem ko pri nestabilnih tRNA premik povzroči transformacijo njihove sekundarne strukture, ob tem pa nastane na tRNA izboklina. Za transformirane nestabilne tRNA se cikel dodajanja zaporedja CCA nato izvede še enkrat, kar privede do končnega zaporedja CCACCA. Po končanem drugem ciklu se ob nadaljnjem premiku encima z njega odcepijo tudi nestabilne tRNA.

=== Tilen Tršelič: Transport proteinov v celico s pomočjo nanodelcev ===
Nanotehnologija v moderni znanosti že dolgo igra pomembno vlogo. Raziskovalci so ugotovili, da lahko s pomočjo nanodelcev v celice dostavljajo nukleotide in nekatere druge manjše molekule. Medicina je zato kmalu izrazila željo, da bi v celico lahko dostavljali tudi delujoče, zaključene proteine, ki bi pomagali pri zdravljenju različnih bolezni.
Na Univerzi v Kaliforniji so nedavno odkrili način, kako bi nanotehnologijo res lahko uporabljali za transport proteinov v celice. Ugotovili so, da obstajajo delci, ki so zmožni vezati protein, ga prenašati in ob laserskem obsevanju sprostiti v celico. Podobne metode so že bile testirane, a je njihova uporabna vrednost majhna, saj je lasersko obsevanje zaradi visoke energije pogosto poškodovalo tkiva in organizme.
Raziskava, predstavljena v seminarju, je z uporabo zlatih nanodelcev in posebnega fluorescentnega proteina GFP dokazala, da je neškodljiv, natančen transport proteinov v celice le mogoč. Izbrana metoda transporta prav tako omogoča velik nadzor nad lokacijo in časom sprostitve izbranega proteina v okolje. Znanstveniki so na zlat nanodelec vezali poseben prenašalec, ki je sposoben vezati histidinizirane proteine, jih dostaviti v celico in jih nato ob laserskem obsevanju z nizko energijo sprostiti v okolje.
Raziskava in njeni izsledki imajo velik pomen, saj bi predstavljena metoda lahko omogočila vodeno diferenciacijo matičnih celic ali vodeno celično smrt in s tem zdravljenje nekaterih težjih bolezni.

TBK2015 Povzetki seminarjev

2015-03-25T15:29:52Z

GasperVirant: /* Gašper Virant: Vezava agonista na adenozinske receptorje */

[[TBK2015-seminar|Nazaj na osnovno stran]]

=== Uroš Zavrtanik: Mehanizem popravljanja DNA: NER (faktor XPC) ===

Od samega nastanka naprej se življenje spopada s fundamentalnim problemom kemijske nestabilnosti genetske informacije, shranjene v DNA. Molekula DNA je izpostavljena številnim fizikalnim ter kemijskim dejavnikom, ki lahko vplivajo na njeno strukturo in posredno ali neposredno tudi na samo informacijo. Ker pa predstavlja ohranjanje informacije eden izmed ključnih in pomembnejših aspektov življenja samega, so se tekom evolucije razvili številni mehanizmi popravljanja DNA. Eden izmed teh mehanizmov je popravljanje DNA z izrezom nukleotidov (ang. Nucleotide Excision Repair-NER). NER je popravljalni proces za odstranjevanje in popravo večjih strukturnih nepravilnosti v strukturi DNA, ki so v glavnem posledica radiacije (UV, gama) ter okolijskih dejavnikov (specifične molekule, ki lahko strukturno poškodujejo DNA). NER predstavlja pri človeku edini mehanizem za popravljanje poškodb povzročenih zaradi UV radiacije. Največji izziv NER je, kako najti vse poškodovane dele DNA v celotnem genomu. Na podlagi eksperimentalnih ugotovitev raziskovalci ugotavljajo, da bi lahko bil ''ključ do uspeha'' naključna vezava proteina XPC (začetni faktor NER) na nespecifično mesto v DNA ter nato vzdolžna difuzija XPC do poškodovanega (specifičnega) mesta, kjer XPC za trenutek obstane, kar je signal za sprožitev popravljalnega procesa. Odkritje bi lahko predstavljalo generalni koncept mehanizma še vedno malo raziskane interakcije protein-DNA.

=== Gašper Virant: Vezava agonista na adenozinske receptorje ===
Kronična bolečina je posledica okvare živčevja. Ločimo nociceptivno kronično bolečino, ki jo povzroča draženje bolečinskih receptorjev (nociceptorjev) v tkivih notranjih organov ter mišičnoskeletnega sistema, in nevropatsko kronično bolečino, ki nastane kot posledica okvare, poškodbe ali motenega delovanja perifernega ali osrednjega živčevja . Najbolj uspešni pristopi lajšanja tovrstne bolečine temeljijo na uporabi mehanizma kalcijevih kanalčkov, opioidov, in adrenergikov. Pogosto pa imajo ta zdravila stranske učinke, ki nastopijo ob neprestani uporabi. Prav tako telo razvije toleranco do njih, kar pomeni, da je za enak učinek potreben vedno večji odmerek, kar vodi v zmanjšano učinkovanje zdravila. Kot močno ne-narkotično in ne-opoidno sredstvo za lajšanje tovrstne bolečine se je izkazal adenozin. Adenozin oz. nekateri še bolj selektivni agonisti se vežejo na adenozinske receptorje in s tem zmanjšajo nocicepcijo. Takšen visoko selektiven agonist z veliko afiniteto do A3 podskupine adenozinskih receptorjev bi tudi pomembno odpravil neželene stranske učinke.

=== Klara Lenart: Permanentno označevanje nevronskih povezav ===

Preučevanje nevronskih povezav je precej neraziskano področje. Za raziskave teh povezav uporabljajo proteine, najpogosteje skupino proteinov imenovano GCaMP, ki oddajajo fluorescenčno svetlobo kratek čas po zaznavi spremembe v koncentraciji kalcijevih ionov v celici. Skupina znanstvenikov z medicinskega inštituta Howard Hughes je razvila nov protein, imenovan CaMPARI(podoben je skupini GCaMP-jev), ki označuje aktivne nevrone glede na spremembo koncentracije Ca2+ v njih. Proteini, podobni CaMPARI-ju obstajajo že zadnjih 20 let, a posebnost novega proteina je permanentna fluorescenca, ki jo oddaja ob povečanju koncentracije kalcija v celici ter sočasnem obsevanju z vijolično svetlobo. Glavni del CaMPARI-ja je fluorescenten protein EosFP, ki spremeni barvo iz zelene v rdečo ob obsvetljevanju z vijolično svetlobo. Ko so EosFP spojili z kalmodulinom in peptidom M13, katera sta potrebna za vezavo kalcijevih ionov, je nastal CaMPARI. Ponuja možnost raziskav nevronskih povezav med kompleksnejšim vedenjem, na primer med učenjem. Prav tako je uporaben, ker lahko z reguliranim obsvetljevanjem vplivamo, kdaj bo potekala pretvorba iz zelene v rdečo in kdaj ne. Preizkusili so ga v štirih poskusih; na ličinkah in odraslih osebkih vinske mušice, na ličinkah cebrice in na odraslih miših. Vsi poskusi so potrdili že znana dejstva, kar dokazuje njegovo zanesljivost, ter ponuja mnogo možnosti za nadaljnje raziskave.

=== Blaž Lebar: Preučitev imunskega odziva komarja po piku ===

Malarija je bolezen, ki jo prenaša komar mrzličar ali Anopheles. Na leto se okuži na stotine milijonov ljudi, nekaj milijonov jih tudi umre. Povzročitelj te bolezni so različne vrste plazmodijev, ki se uspešno množijo v komarju, ki nato po piku okuži svojo žrtev. Vendar kako uspe tako inferiorno bitje kot je komar okužiti tako kompleksno bitje kot je človek, morda celo smrtno, sam komar pa normalno funkcionira navkljub patogenom v lastnem v organizmu?
Za komarjev imunski sistem so odgovorni LRIMi, bilo naj bi jih nekaj več kot 24, vendar delovanja večine še ne poznajo. Najpomembnejša za imunski sistem komarja naj bi bila člena sistema komplementa: LRIM1 in APL1C v hemolimfi, ki se z LRRji povežeta z TEP1cut in tako izvedeta uspešno lizo in melanizacijo patogenov, vendar sta se izkazala kot popolnoma neučinkovita pri eliminaciji P. berghei. V tej študiji pa so se osredotočili na LRIM9, protein v imunskem sistemu, ki naj bi imel najpomembnejšo vlogo pri borbi z plazmodiji. Najpogostejša tehnika je bila qRT-PCR, preverjali pa so namnožitev, reprodukcijo in melanizacijo P. berghei pri komarjih vrste A. gambiae ob prehranjevanju s krvjo miši, ter različne vplive na izražanje LRIM9 (prehranjevanje, bakterije, imunost…). Ugotovili so tudi povezavo izražanja LRIM9 in hormona »ecdysone«, ki se izloča iz jajčnikov samic.
Danih je bilo veliko odgovorov, ki pa so odprli nova vprašanja, katera bodo zahtevala še veliko raziskav.

=== Ema Gašperšič: Dvojedrni bakrov kompleks naj bi preprečil širjenje raka ===
Čeprav je v zadnjem času opazen napredek na področju zdravljenja raka, še vedno obstajajo določene pomanjkljivosti. Eno izmed najbolj pogosto uporabljenih zdravil za različne vrste raka je cisplatin, ki se veže na dušikove baze DNA in s tem povzroči celično smrt oz. apoptozo. Cisplatin pa kljub vsemu ni vedno učinkovit in ima precej stranskih učinkov, zato so raziskovalci želeli razviti alternativno zdravilo. Razvili so citotoksični dvojedrni kompleks z bakrom, ki se s pomočjo molekularne prepoznave veže na dve sosednji fosfatni skupini na vijačnici DNA, kar prepreči celične delitve in uniči patološko celico. Z različnimi anorganskimi in biokemijskimi metodami, spektroskopijo in metodami na posameznih molekulah so dokazali, da dvojedrni Cu2 kompleks zavira sintezo DNA in je citotoksična za človeške rakave celice. V članku je predstavljena sinteza prvega kompleksa iz te družine molekul, bakrovega Cu2 kompleksa ter različne metode, s katerimi so dokazali sposobnost ustrezne koordinacije Cu2(2+), sposobnost močne vezave Cu2(2+) na DNA, sposobnost inhibicije sinteze DNA ter citotoksičnost kompleksa. Iz dobljenih rezultatov znanstveniki predpostavljajo učinkovito interakcijo med Cu2(2+) in DNA in vitro ter v živih celicah. Nadaljnje klinične in medicinske raziskave pa bodo še odločale o tem, kako, in če sploh, bo bakrov kompleks resnično preizkušen na pacientih z rakom.

=== Tjaša Lukšič: Ključne biološke funkcije skakajočih genov ===

Dobro polovico človeškega genoma sestavljajo ponavljajoči se genetski elementi, katerim v preteklosti niso pripisovali posebne vloge, danes pa vse bolj postaja jasno, da njihova prisotnost v genomu prinaša svojevrstne biološke funkcije. Alu sekvence so primer takšnih transpozicijskih elementov, katerih prepisovanje je običajno minimalizirano, vendar se ob virusnih infekcijah ali stresu močno poveča. Po klasifikaciji so podvrsta kratkih razpršenih jedrnih elementov (SINE), ki se lahko transponirajo po genomu prek RNA intermediata, vendar ne kodirajo proteinov. Alu sekvence prepisuje RNA polimeraza III, Alu RNA pa ima značilno sekundarno strukturo dveh rok, ki omogoča tvorbo kompleksov s proteinskimi dimeri SRP9/14. Nastanek takšnih Alu ribonukleoproteinov (RNP) v običajnih celičnih razmerah ni pogost, saj je kljub veliki količini monomerov SRP9 in SRP14 stopnja pojavljanja Alu RNA-jev veliko manjša. Tvorba Alu RNP-jev prepreči iniciacijo prevajanja mRNA v aminokislinsko zaporedje in tvorbo polisomov. Po vezavi Alu RNP-ja na ribosomsko podenoto 40S, Alu RNA lahko zapusti kompleks in sodeluje v nadaljnjih prenosih novih SRP9/14. Mehanizem delovanja takšnih kompleksov je relativno nepoznan in odpira nove poglede na smisel ohranitve transpozicijskih elementov skozi evolucijo. Alu sekvence je predstavljajo perspektivno področje za preučevanje ravno zaradi njihovega prispevka k zaščiti translacijskih procesov celice v neugodnih razmerah in zaradi drugih še neodkritih, potencialnih bioloških funkcij.

=== Špela Malenšek: Smo zaradi endogenih retrovirusov pametnejši? ===

Človeški endogeni retrovirusi (ERV), genetsko podedovani ostanki preteklih virusnih infekcij, so klasično obravnavani kot človeku oziroma gostitelju neuporabni del genoma, tako imenovani "junk DNA". Njihovo delovanje je v običajnih somatskih celicah (fibroblasti, hepatocite, bele krvne celice …) nadzorovano z epigenetskim mehanizmom metilacije DNA, kjer se metilna skupina doda citozinu ali adeninu in tako prepreči izražanje virusnih delov genoma. V nevronskih izvornih celicah naj bi med drugim izražanje endogenih retrovirusnih elementov nadzoroval tudi protein TRIM28. Deluje namreč kot korepresor, ki z modifikacijo histonov zatre prepisovanje genetskega materiala. Raziskave na univerzah Lund in EPLF so pokazale, da se ob izbrisu TRIM28 v celicah nakopičita dve večji skupini ERV, ki pri miših vplivata na izražanje gena BC048671 in služita kot startni točki za IncRNA (dolga nekodirajoča RNA). Hkrati izbris proteina TRIM28 povzroči tako kompleksne vedenjske spremembe kot tudi abnormalne vedenjske fenotipe modelnih organizmov (miši), ki se izkažejo podobne nekaterim človeškim psihološkim motnjam. Klasični hipotezi o nefunkcionalnosti ERV se tako zoperstavlja nova ideja, ki trdi, da aktivnost ERV vpliva na izražanje genov v nevronskih izvornih celicah in na kompleksnost nevronske mreže v možganih. S tem se odpira popolnoma nova molekularna perspektiva na analizo kompleksnih vedenjskih vzorcev, možganskih motenj in samega delovanja nevronske mreže.

=== Nejc Kejžar: Novi 'pametni' inzulin ===

Z odkritjem biotehnoloških metod za umetno sintezo inzulina s pomočjo bakterije E. coli ali kvasovk je življenje s sladkorno boleznijo postalo mogoče, še vedno pa so prisotni zapleti, ki jih povzročata hipoglikemija in hiperglikemija. Današnje inzulinske terapije se osredotočajo na konstanto merjenje koncentracij glukoze v krvi in intravenozni vnos inzulina glede na izmerjeno koncentracijo, kar pa je kljub nujnosti (še posebej za paciente diabetesa tipa 1) zelo nadležno. Do težav lahko pride zaradi neupoštevanja terapije ali slabe glikemične kontrole, kar lahko v resnih stanjih hipoglikemije privede do kome ali smrti, hiperglikemija pa lahko vodi do kardiovaskularnih obolenj, težav s celjenjem ran ali celo do raka. Za učinkovitejše nadziranje krvne koncentracije glukoze in olajšano življenje pacientov je skupina znanstvenikov iz MIT razvila ‘pametni’ inzulin, ki ima nase pritrjen konjugat sestavljen iz alifatske verige 11 ogljikovih atomov in fenilborove kisline. Alifatska veriga povzroča podaljšano delovanje inzulina, fenilborova kislina pa služi kot ‘stikalo’, ki aktivira delovanje inzulina samo ob povečani koncentracije glukoze v krvi. Ta sintetični derivat je zmožen hitrejšega obnavljanja normalnih koncentracij krvne glukoze kot naravni in klinični inzulin, večkratnega zaporednega odziva na porast glukoze, prav tako pa ima nižji hipoglikemični indeks ob administraciji v času normalnih koncentracij glukoze, kar pomeni, da je tveganje za hipoglikemijo manjše. V najbolj zgovornem testu je bilo pokazano, da je učinkovitost pametnega inzulina primerljiva z delovanjem zdravega pankreasa.

=== Simon Aleksič: Zorenje mRNA pri lignjih zaznamujejo A-I deaminacije ===

Informacijska RNA je po prepisu iz DNA podvržena dodatnim procesom, tako v jedru kot tudi v citoplazmi. Izrezovanje intronov je le en izmed procesov, ki zagotavlja strukturno variabilnost proteinov. Za variabilnost strukture poskrbijo tudi malo raziskane deaminacije nukleotidov . Deaminacije nukleotidov so katalitski kemijski procesi, ki omogočajo spreminjanje tripletov kodonov v zapisih mRNA s pomočjo proteinov ADAR. Za takšne procese so predvidevali, da so v organizmih redki in nimajo posebnega vpliva na delovanje proteinov v telesu. A študija univerze v Tel Avivu je pokazala, da so deaminacije adenozina v inozin v živčnih tkivih lignjev eden poglavitnih procesov, ki se zgodijo pred translacijo mRNA v proteine. Deaminacije s spremembami tripletov povzročijo zamenjave aminokislin v proteinih, raziskava pa dokaže, da se stabilnejše aminokisline zamenjajo z manj stabilnimi. Manj stabilne aminokisline v območju aktivnega mesta in hidrofobnega jedra povzročijo, da je protein sam manj občutljiv na nižje temperature okolja in lahko ostane delujoč pri spremenjenih razmerah okolja. Deaminacije so posebno pogoste v mRNA prepisih genov, ki zapisujejo proteine vključene v živčni sistem in citoskelet. Novejše raziskave mutacije genov za protein ADAR pri človeku povezujejo z različnimi imunskimi boleznimi, kot so ADA-SCID in sindrom Aicardi–Goutières.

=== Gašper Žun: Antibiotiki betalaktami uničujejo bakterije z okvaro mehanizma za izgradnjo celične stene ===
Antibiotiki β-laktami, med katere spada tudi penicilin, predstavljajo eno izmed najdlje in najsplošneje uporabnih terapij pri bakterijskih okužbah. Učinkujejo tako, da z vezavo na penicilin-vezavne proteine (PBP) okvarijo mehanizem za sintezo celične stene. S tem onemogočijo zamreženje nastajajočih verig peptidoglikanov (PG) v matriks, v manjši meri pa se nove verige še vedno lahko sintetizirajo. Celična stena takih bakterij je zato neobičajnih oblik, med delitvijo pa se lahko na določenih mestih pretrga in celica propade. Zaradi nastajanja enoverižnih PG se vključijo v proces encimi (Slt), ki take neobičajne verige razgrajujejo. Lastnosti celične stene na tak način ostajajo funkcionalne, vendar pa zaradi vključenega brezuspešnega cikla sinteze in razgradnje celične stene pride do prekomerne porabe za celico pomembnih snovi, kar le še prispeva k toksičnemu delovanja antibiotikov. Obrambni mehanizmi proti antibiotični aktivnosti vključujejo encime (β-laktamaze), ki razgrajujejo β-laktame. Vse večja odpornost bakterij na antibiotike je posledica povečane frekvence genskega zapisa za β-laktamaze, ki se med bakterijami prenaša s plazmidi. Ker je za uspešen boj proti bakterijam potreben nenehen razvoj novih zdravil in terapij, je potrebno dodobra spoznati tako način učinkovanja antibiotikov kot način delovanja bakterij. Članek prispeva nov vpogled v delovanje encima Slt za razgradnjo nezamreženega novo nastalega PG, saj mu pripisuje vlogo kontrole nad kvaliteto izgradnje celične stene, kar pa v resnici potencira uničujoče posledice antibiotikov.

=== Rok Miklavčič: Kontrola prenašalnih RNA na CCA-dodajajočem encimu ===
tRNA je ena od biološko najpomembnejših molekul v živih organizmih in ima ključno vlogo pri sintezi proteinov, zato je pomembno, da so vse tRNA, ki na ribosome prinašajo aminokisline, funkcionalne. Od prepisa dalje grejo zato tRNA prepisi skozi serijo procesov in modifikacij, ki na koncu privedejo do popolnoma funkcionalnih tRNA. V predzadnji fazi urejanja tRNA sodeluje CCA-dodajajoči encim, ki na 3'-konec prepisov tRNA pripne končno nukleotidno zaporedje CCA, v zadnji fazi pa se na zadnji adenin nukleotid veže še ustrezna aminokislina. CCA-dodajajoči encim pa ima v sintezi tRNA še eno nedavno odkrito funkcijo: nestabilnim prepisom tRNA pripne nukleotidno zaporedje CCACCA, ki je signal za razgradnjo. Na ta način encim kontrolira kvaliteto tRNA in pripomore k optimizaciji same sinteze proteinov. Na CCA-dodajajočem encimu se razlike med stabilnimi in nestabilnimi tRNA prepisi pokažejo po vezavi prvega zaporedja CCA, in sicer pri premiku encima. Stabilne tRNA se ob premiku odcepijo z encima, medtem ko pri nestabilnih tRNA premik povzroči transformacijo njihove sekundarne strukture, ob tem pa nastane na tRNA izboklina. Za transformirane nestabilne tRNA se cikel dodajanja zaporedja CCA nato izvede še enkrat, kar privede do končnega zaporedja CCACCA. Po končanem drugem ciklu se ob nadaljnjem premiku encima z njega odcepijo tudi nestabilne tRNA.

=== Tilen Tršelič: Transport proteinov v celico s pomočjo nanodelcev ===
Nanotehnologija v moderni znanosti že dolgo igra pomembno vlogo. Raziskovalci so ugotovili, da lahko s pomočjo nanodelcev v celice dostavljajo nukleotide in nekatere druge manjše molekule. Medicina je zato kmalu izrazila željo, da bi v celico lahko dostavljali tudi delujoče, zaključene proteine, ki bi pomagali pri zdravljenju različnih bolezni.
Na Univerzi v Kaliforniji so nedavno odkrili način, kako bi nanotehnologijo res lahko uporabljali za transport proteinov v celice. Ugotovili so, da obstajajo delci, ki so zmožni vezati protein, ga prenašati in ob laserskem obsevanju sprostiti v celico. Podobne metode so že bile testirane, a je njihova uporabna vrednost majhna, saj je lasersko obsevanje zaradi visoke energije pogosto poškodovalo tkiva in organizme.
Raziskava, predstavljena v seminarju, je z uporabo zlatih nanodelcev in posebnega fluorescentnega proteina GFP dokazala, da je neškodljiv, natančen transport proteinov v celice le mogoč. Izbrana metoda transporta prav tako omogoča velik nadzor nad lokacijo in časom sprostitve izbranega proteina v okolje. Znanstveniki so na zlat nanodelec vezali poseben prenašalec, ki je sposoben vezati histidinizirane proteine, jih dostaviti v celico in jih nato ob laserskem obsevanju z nizko energijo sprostiti v okolje.
Raziskava in njeni izsledki imajo velik pomen, saj bi predstavljena metoda lahko omogočila vodeno diferenciacijo matičnih celic ali vodeno celično smrt in s tem zdravljenje nekaterih težjih bolezni.

TBK2015-seminar

2015-03-03T15:21:04Z

GasperVirant: /* Seznam seminarjev */

= Temelji biokemije- seminar =

Seminarje vodi prof. dr. Brigita Lenarčič. Seminarji so obvezni.

Ocena seminarjev (6-10) predstavlja enako število odstotkov, ki se prištejeh končnipisni oceni izpita.
Stran na strežniku s seminarskimi nalogami je zaščitena.
Uporabniško ime je: tbk, password pa: samozame## "##" sta dve številki, ki ju izveste na predavanjih.

== Seznam seminarjev ==
{| border="1" cellpadding="4" cellspacing="0" style="border:#c9c9c9 1px solid; margin: 1em 1em 1em 0; border-collapse: collapse;"
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Ime in priimek'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Naslov seminarja'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Povezava'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Rok za oddajo'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Rok za recenzijo'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Datum predstavitve'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 1'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 2'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 3'''
|-
| Klara Lenart||Permanentno označevanje nevronskih krogov||http://www.sciencedaily.com/releases/2015/02/150212141453.htm||10.03.||13.03.||16.03.||Maja Zupanc||Matej Hvalec||Urša Kopač
|-
| Uroš Zavrtanik||Popravljalni mehanizem DNA (XPC)||http://www.sciencedaily.com/releases/2015/01/150128141423.htm||10.03.||13.03.||16.03.||Eva Rajh||Lara Jerman||Neža Koritnik
|-
| Blaž Lebar||Preučitev imunskega odziva komarja po piku||http://www.sciencedaily.com/releases/2015/02/150206174850.htm||10.03.||13.03.||16.03.||Elvira Boršić||Kristjan Stibilj||Katja Čop
|-
| Gašper Žun||||||17.03.||20.03.||23.03.||Nejc Kejžar||Samo Smole||Klara Kuret
|-
| Rok Miklavčič||||||17.03.||20.03.||23.03.||Tilen Tršelič||Miha Koprivnikar Krajnc||Matej Hvalec
|-
| Simon Aleksič||Zorenje mRNA pri lignjih zaznamujejo A-I deaminacije ||http://www.sciencedaily.com/releases/2015/02/150212114327.htm||17.03.||20.03.||23.03.||Klara Lenart||Maja Zupanc||Lara Jerman
|-
| Tjaša Lukšič||||||17.03.||20.03.||23.03.||Uroš Zavrtanik||Eva Rajh||Kristjan Stibilj
|-
| Špela Malenšek||Smo zaradi endogenih retrovirusov pametnejši?||http://www.sciencedaily.com/releases/2015/01/150112093129.htm||24.03.||27.03.||30.03.||Blaž Lebar||Elvira Boršić||Samo Smole
|-
| Ema Gašperšič||||||24.03.||27.03.||30.03.||Gašper Žun||Nejc Kejžar||Miha Koprivnikar Krajnc
|-
| Tilen Tršelič||||||24.03.||27.03.||30.03.||Miha Koprivnikar Krajnc||Klara Kuret||Samo Purič
|-
| Gašper Virant||Stikalo za bolečino||http://www.sciencedaily.com/releases/2014/11/141126132639.htm||24.03.||27.03.||30.03.||Simon Aleksič||Klara Lenart||Eva Rajh
|-
| Manca Zupan||||||07.04.||10.04.||13.04.||Tjaša Lukšič||Uroš Zavrtanik||Elvira Boršić
|-
| Urša Čerček||||||07.04.||10.04.||13.04.||Špela Malenšek||Blaž Lebar||Nejc Kejžar
|-
| Katja Brezovar||HIV nadzoruje svojo aktivnost neodvisno od gostiteljske celice||http://www.sciencedaily.com/releases/2015/02/150227112749.htm||07.04.||10.04.||13.04.||Ema Gašperšič||Gašper Žun||Tilen Tršelič
|-
| Lovro Kotnik||||||07.04.||10.04.||13.04.||Petra Hruševar||Rok Miklavčič||Klara Lenart
|-
| Maruša Grošelj||||||14.04.||17.04.||20.04.||Gašper Virant||Simon Aleksič||Uroš Zavrtanik
|-
| Tadej Satler||||||14.04.||17.04.||20.04.||Manca Zupan||Tjaša Lukšič||Blaž Lebar
|-
| Aleksandra Uzar||||||14.04.||17.04.||20.04.||Urša Čerček||Špela Malenšek||Gašper Žun
|-
| Niko Šetar||||||14.04.||17.04.||20.04.||Katja Brezovar||Ema Gašperšič||Rok Miklavčič
|-
| Lija Srnovršnik||||||24.04.||30.04.||04.05.||Lovro Kotnik||Petra Hruševar||Simon Aleksič
|-
| Sara Tekavec||||||24.04.||30.04.||04.05.||Maruša Grošelj||Gašper Virant||Tjaša Lukšič
|-
| Jaka Kos||||||24.04.||30.04.||04.05.||Tadej Satler||Manca Zupan||Špela Malenšek
|-
| Samo Purič||Desifrirana enigma: virusne infekcije||http://www.sciencedaily.com/releases/2015/02/150204075224.htm||24.04.||30.04.||04.05.||Aleksandra Uzar||Urša Čerček||Ema Gašperšič
|-
| Urša Kopač||||||05.05.||08.05.||11.05.||Niko Šetar||Katja Brezovar||Petra Hruševar
|-
| Neža Koritnik||Vpliv nekodirajoče DNA na tvorbo raka: interakcije na dolge razdalje||http://www.sciencedaily.com/releases/2015/02/150219090349.htm||05.05.||08.05.||11.05.||Lija Srnovršnik||Lovro Kotnik||Gašper Virant
|-
| Katja Čop||||||05.05.||08.05.||11.05.||Sara Tekavec||Maruša Grošelj||Manca Zupan
|-
| Klara Kuret||||||05.05.||08.05.||11.05.||Jaka Kos||Tadej Satler||Urša Čerček
|-
| Matej Hvalec||||||12.05.||15.05.||18.05.||Samo Purič||Aleksandra Uzar||Katja Brezovar
|-
| Lara Jerman||||||12.05.||15.05.||18.05.||Urša Kopač||Niko Šetar||Lovro Kotnik
|-
| Kristjan Stibilj||||||12.05.||15.05.||18.05.||Neža Koritnik||Lija Srnovršnik||Maruša Grošelj
|-
| Samo Smole||||||12.05.||15.05.||18.05.||Katja Čop||Sara Tekavec||Tadej Satler
|-
| Miha Koprivnikar Krajnc||||||19.05.||22.05.||25.05.||Klara Kuret||Jaka Kos||Aleksandra Uzar
|-
| Maja Zupanc||||||19.05.||22.05.||25.05.||Matej Hvalec||Samo Purič||Niko Šetar
|-
| Eva Rajh||||||19.05.||22.05.||25.05.||Lara Jerman||Urša Kopač||Lija Srnovršnik
|-
| Elvira Boršić||||||19.05.||22.05.||25.05.||Kristjan Stibilj||Neža Koritnik||Sara Tekavec
|-
| Nejc Kejžar||Novi 'pametni' inzulin||http://www.sciencedaily.com/releases/2015/02/150209161141.htm||26.05.||29.05.||01.06.||Samo Smole||Katja Čop||Jaka Kos
|-
| Petra Hruševar||||||26.05.||29.05.||01.06.||Rok Miklavčič||Tilen Tršelič||Maja Zupanc
|}

==Naloga==
* samostojno pripraviti seminar, katerega tema je novica iz področja biokemije na portalu [http://www.sciencedaily.com ScienceDaily], ki je bila objavljena kasneje kot 1. avgusta 2014. Osnova za seminar naj bo znanstveni članek, ki je podlaga za to novico. Poleg tega članka za seminar uporabite še najmanj pet drugih virov, od teh vsaj še dva druga znanstvena članka, ki se navezujeta na to vsebino.
* članke na temo lahko iščete v PubMed povezavi [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/ tukaj]
* naslov izbrane teme in povezavo do novice vpišite v tabelo seminarjev takoj ko ste si izbrali temo, najkasneje pa en teden pred rokom za oddajo
* [[TBK2015 Povzetki seminarjev|Povzetek seminarja]] opišete na wikiju v približno 200 besedah - najkasneje do dne ko morate oddati seminar recenzentom.
* Povezavo do povzetka vnesete v tabelo seminarjev tekočega letnika.
* Seminar pripravite v obliki seminarske naloge (pisava Cambria, font 11, enojni razmak, 2,5 cm robovi; tekst naj obsega okoli 1000 besed), vsebuje naj 1-2 sliki. Slika mora imeti legendo in v besedilu mora biti na ustreznem mestu sklic na sliko. Vse uporabljene vire citirajte v tekstu, kot npr. (Nobel, 2010), na koncu pa navedite točen seznam literature, kot je opisano spodaj!
*Celotni seminar naj obsega 2 strani A4 formata (po možnosti dvostransko tiskanje).
* Seminar oddajte do datuma oddaje, ki je naveden v tabeli v elektronski obliki z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/tbk/poslji/ tega obrazca].
* vsi seminarji so v elektronski obliki dostopni [http://bio.ijs.si/~zajec/tbk/poslji//bioseminar/ tukaj].
* Recenzenti do dneva določenega v tabeli določijo popravke in podajo oceno pisnega dela, v predpisanem formatu elektronskega obrazca na internetu.
* Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Za predstavitev je na voljo 12 minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni. Prvi recenzent vodi predstavitve in razpravo ter skrbi za to, da vse poteka v zastavljenih časovnih okvirih.
* Predstavitvi sledi razprava do 8 minut. Sledijo vprašanja prisotnih, recenzenti postavijo vsak vsaj dve vprašanji in na koncu podajo oceno predstavitve.
* En dan pred predstavitvijo na strežnik oddajte tudi končno verzijo. Na dan predstavitve morate oddati tudi končno (popravljeno) in natisnjeno verzijo seminarja v enem izvodu.
* Seminarska naloga in povzetek na wikiju morajo biti v slovenskem jeziku!

==Imena datotek==
Prosim vas, da vse datoteke, ki jih pošiljate poimenujete po spodnjih pravilih. Ne uporabljajte ČŽŠčžš!
* TBK_2015_Priimek_Ime.doc(x) za seminar, npr. TBK_2015_Guncar_Gregor.docx
* TBK_2015_Priimek_ime_final.doc(x) za končno verzijo seminarja
* TBK_2015_Priimek_Ime_rec_Priimek2.doc(x) za recenzijo, kjer je Priimek2 priimek recenzenta, npr. TBK_2015_Guncar_Gregor_rec_Scott.docx (če se pišete Scott in odajate recenzijo za seminar, ki ga je napisal Gunčar)
* TBK_2015_Priimek_Ime.ppt(x) za prezentacijo, npr TBK_2015_Guncar_Gregor.pptx

==Ocenjevanje seminarjev==
Recenzenti ocenijo seminar tako, da izpolnijo [[https://docs.google.com/forms/d/1Hdg2OHCyG24qwLTnFt09yZTng46RIwaIiUqnKOdsJxQ/viewform recenzentsko poročilo]] na spletu.

== Mnenje o predstavitvi ==
Vsak posameznik '''mora''' oceniti seminar tako, da odda svoje [https://docs.google.com/forms/d/1VvE-jaKikfiDO5Gdybqgp9mf_0uJZfBbIK8PLXKDaS0/viewform mnenje] najkasneje v enem tednu po predstavitvi. Kdor na seminarju ni bil prisoten, mnenja '''ne sme''' oddati.

==Urejanje spletnih strani na wikiju==
Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''

==Faktor vpliva==
Faktor vpliva (angl. impact factor) neke revije pove, kolikokrat so bili v poprečju citirani članki v tej reviji v dveh letih skupaj pred objavo tega faktorja. Faktorje vpliva za posamezno revijo lahko najdete v [http://www.cobiss.si/scripts/cobiss?command=CONNECT&base=JCR COBISS-u]. V polje "Naslov revije" vnesite ime revije za katero želite izvedeti faktor vpliva in pritisnite na gumb POIŠČI. V skrajnem desnem stolpcu se bodo izpisali faktorji vpliva za revije, ki ustrezajo vašim iskalnim kriterijem. Zadetkov za posamezno revijo je več zato, ker so navedeni faktorji vpliva za posamezno leto. Za leto 2011 faktorji vpliva še niso objavljeni, zato se orientirajte po faktorjih vpliva zadnjih par let. Če faktorja vpliva za vašo izbrano revijo ne najdete v bazi COBISS, potem izberite članek iz kakšne druge revije.

==Citiranje virov==Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se v seminarju držite ene same.Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati.Za citate v naravoslovju je najpogostejše citiranje po pravilniku ISO 690. [http://www.google.com/url?sa=t&source=web&cd=6&sqi=2&ved=0CEUQFjAF&url=http%3A%2F%2Fwww.tre.sik.si%2Fmain%2Fpomoc%2Ffiles%2Fcitiranje_in_navajanje_virov.pdf&rct=j&q=citiranje%20po%20pravilniku%20ISO%20690&ei=jPBqTe6FC9DKswaWk-TmDA&usg=AFQjCNF8r6X9Y781sanDObaXNdCew4suUg&sig2=cTqKObSJsTicekWGRGa72g&cad=rja Pravila], ki upoštevajo omenjeni standard, so pripravili pri ZTKS. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati. '''Citiranje knjig:''' Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica. Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN. Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005. Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4. Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.). '''Citiranje člankov:''' Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani. Lartigue C. ''et al''. Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, letn. 317, str. 632-638.Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole: Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani. Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.Revija Science uporablja skrajšani zapis: C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007) V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne).'''Citiranje spletnih virov:''' Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.