Wiki FKKT - User contributions [en]

Sistem za nadzor števila plazmidov v celici (Tulip)

2023-04-24T17:40:04Z

Gregor Strniša:

''Povzeto po članku: [https://www.nature.com/articles/s41467-022-34390-7 S. H. N. Joshi, C. Yong, A. Gyorgy: Inducible plasmid copy number control for synthetic biology in commonly used E. coli strains. Nat. Commun. 2022, 13. ]''

==Uvod==
Ekspresija proteinov obsega več korakov in zahteva poznavanje več sistemov. Da učinkovito izražamo proteine v bakterijskih celicah moramo razumeti potek transkripcije in translacije. Za razliko od različnih možnosti uravnavanja izražanja proteinov na transkripcijskem in translacijskem nivoju, je na regulacijo števila kopij plazmidov v celici težje vplivati. Vsak plazmid ima fiksno število kopij v bakterijski celici, na katerega navadno ne moremo vplivati. Da bi našli pravo število kopij plazmida v celici, ki je potrebno za ekspresijo proteina, moramo za vsak eksperiment naš konstrukt klonirati v vektorje z različnimi števili kopij v celici in te vektorje transformirati v bakterijske celice. Pri tem dolgotrajnem delu pogosto pride do napak, zato so razvili sistem Tulip (TUnable Ligand Inducible Plasmid), ki omogoča enostavno in učinkovito spreminjanje števila kopij plazmida v celici [1, 2].

==Razvoj Tulipa==

===Plazmid pSC101===

Delovanje Tulipa temelji na mehanizmu podvojevanja plazmida pSC101. Ta plazmid v svojem zapisu vsebuje gen za protein repA, ki je dolg 316 aminokislin in se lahko v monomerni obliki veže na vezavno mesto na mestu ori plazmida pSC101. Vezan tvori povezavo z drugimi proteini in spodbudi podvojevanje plazmida. Ob višji koncentraciji v celici protein repA tvori dimere. Kot tak se ne more vezati na vezavno mesto na mestu ori in ne more spodbujati procesa podvojevanje, ampak se veže na lastno regulatorno regijo in inhibira lastno transkripcijo. Zaradi ravnotežja med monomerno in dimerno obliko proteina repA, je število kopij plazmida pSC101 navadno omejeno na 3 kopije na celico [1, 3].

===Mutacije v proteinu repA===

Mutacije v zapisu za protein repA lahko zmanjšajo medsebojno afiniteto monomerov, da bi tvorili dimere, kar vpliva na število kopij plazmida v celici. Z mutacijami ključnih aminokislinskih ostankov, pomembnih za dimerizacijo, so dobili več mutant proteina repA, katerih zapise so vgradili v vključek, ki je imel vključen še zapis za robustno obliko zelenega fluorescenčnega proteina (sfGFP) pod konstitutivnim promotorjem. Merili so fluorescenco sfGFP v odvisnosti od števila kopij plazmida v celici, ki so ga merili s PCR v realnem času. Ugotovili so, da je fluorescenca sfGFP sorazmerna s številom kopij plazmida v celici [1].

V naslednjem eksperimentu so delali z mutiranim repA, ki ni več tvoril dimerov (repAv7), se je bil pa še vedno zmožen vezati na svoje vezavno mesto na mestu ori plazmida pSC101. Zapis za repAv7 so dali na drug plazmid pod inducibilni promotor PCymRC. Na operatorsko regijo pred promotorjem PCymRC se veže represor cymRAM. Ob prisotnosti kuminske kisline (4-izopropil benzojska kislina), ki se veže na cymRAM, se cymRAM ne more več vezati na opreratorsko regijo in transkripcija genov pod promotorjem PCymRC lahko steče. Poleg tega vektorja so v bakterijske celice transformirali še divji tip vektorja pSC101 z zapisom za sfGFP pod konstitutivnim promotorjem. Ob dodatku kuminske kisline v gojišče pride do sinteze repAv7, ki se veže na mesto ori plazmida pSC101 in inducira njegovo podvojevanje. Ob povečanju koncentracije kuminske kisline so zaznali večjo fluorescenco sfGFP in večje število kopij vektorja pSC101 v bakterijskih celicah [1, 4].

==Optimizacija Tulipa==

Za lažjo uporabo so se odločili združiti celoten sistem na en sam konstrukt. Pod promotor PCymRC so vključili zapisa za proteina repAv7 in cymRAM. Ob dodatku kuminske kisline se cymRAM ni več mogel vezati na promotor, torej je potekala transkripcija genov za repAv7 in cymRAM. Zaradi povišanje koncentracije repAv7 je prišlo do višanja števila kopij plazmida v celici. Ko je količina sintetiziranega cymRAM presegla raven kuminske kisline v celici, se je cymRAM zopet vezal na promotor PCymRC, do transkripcije ni prišlo, število kopij plazmida v celici pa se je ustalilo. Spreminjanje koncentracije kuminske kisline v rastnem mediju celic je učinkovito delovalo na spreminjanje števila kopij plazmida v bakterijskih celicah [1].

===Spreminjanje RBS in dodajanje degradacijske oznake===

Sistem Tulip so dodatno izboljšali z optimizacijo ribosom vezavnih mest pred zapisoma za repAv7 in cymRAM. Naredili so plazmidne knjižnice z različnimi RBS, ki so jih transformirali v bakterijske celice, s pretočno citometrijo pa so merili fluorescenco konstitutivno izraženega sfGFP. Pri nizkih koncentracijah kuminske kisline je pogosto prišlo do prevelikega števila kopij plazmida v celici, kar so pripisali prepočasni razgradnji repAv7. Problem so rešili tako, da so zapisu za repAv7 dodali zapis za degradacijsko oznako. Degradacijska oznaka poveča hitrost razgradnje proteina tako, da omogoči lažjo vezavo na proteaze, ki so odgovorne za razgradnjo drugih endogenih proteinov v celici. Preizkušali so delovanje dveh degradacijskih oznak (AAV in AVS), kot boljša se je izkazala oznaka AAV [1, 5].

===Karakterizacija Tulipa===

Sistem Tulip so vključili v vektor in ga transformirali v bakterije seva NEBStable. Sev NEBStable je posebej primeren za transformacijo in pomnoževanje plazmidov. Na njem so okarakterizirali delovanje Tulipa tako, da so merili fluorescenco sfGFP v odvisnosti od koncentracije kuminske kisline. S PCR v realnem času so ugotovili, da lahko spreminjamo vrednost števila kopij plazmida med 2,9 in 50,9. Fluorescenca GFP je bila sorazmerna dodani kuminski kislini in številu kopij plazmida. Preverjali so tudi rast bakterijskih celic in ugotovili, da sistem Tulip ne predstavlja dodatnega bremena celicam, rast celic je bila primerljiva pri različnih koncentracijah kuminske kisline [1].

==Lastnosti Tulipa==

===Obstojnost v drugih bakterijskih sevih===

Učinkovitost Tulipa so preverili tudi v drugih pogosto uporabljenih bakterijskih sevih: DH10B (klonirni sev), NEBExpress (modificiran ekspresijski sev), BW25113 in MG1655 (modelni sev). Vse seve so transformirali s sistemom Tulip s konstitutivno izraženim zapisom za sfGFP. Vsi sevi razen seva NEBExpress so imeli število kopij plazmida sorazmerno s koncentracijo kuminske kisline, dodane gojišču. Sev NEBExpress je imel izmerjeno višjo fluorescenco sfGFP in višje število kopij plazmida že pri nizki koncentraciji kuminske kisline. Sev NEBExpress ima okvarjenih več proteinov, ki so odgovorni za razgradnjo drugih proteinov v celici, zato je v njem prišlo do kopičenja repAv7 in do sorazmernega povečanja števila kopij plazmida in fluorescence [1].

===Regulacija Tulipa===

Lastnosti Tulipa v daljšem časovnem obdobju so opazovali preko gojenja celic z vključkom s Tulipom v turbidostatu. Turbidostat omogoča gojenje celic pri konstantnih pogojih (temperatura, sestava gojišča). Celice so v turbidostatu gojili 48 ur, med katerimi so v dvanajsturnih intervalih spreminjali koncentracijo kuminske kisline v gojišču. Ugotovili so, da do spremembe fluorescence, ki je posledica spremembe koncentracije kuminske kisline, pride v treh do štirih urah. Rast celic je bila skozi celotno časovno obdobje konstantna. Tudi po 50 urah gojenja se je sistem Tulip obdržal v celicah. V kontrolnem poskusu, kjer je gojenje celic potekalo v gojišču brez antibiotika, pa so opazili, da je pri nizkih koncentracijah kuminske kisline prišlo do izgube vključka v bakterijah, zato moramo ob gojenju celic s sistemom Tulip obvezno izvajati selekcijo z antibiotiki [1].

==Uporaba Tulipa==

Sistem Tulip omogoča hitrejšo izbiro pravega števila kopij plazmida v celici. Sistem Tulip so vgradili v dva vektorja, ki sta že imela vključena sistema za zaznavanje homoserin laktona (AHL) ali vanilne kisline. Ob prisotnosti liganda je v vsakem sistemu prišlo do transkripcije gena za škrlaten fluorescenčni protein (mScarI). Vsak vektor je imel vključen še zapis za sfGFP pod konstitutivnem promotorju. Oba vektorja so transformirali v bakterijske celice. Ob različnih koncentracijah kuminske kisline in induktorja (AHL ali vanilna kislina) v gojišču so opazovali fluorescenco sfGFP in mScarI. Pri višjih koncentracijah kuminske kisline je prišlo do višje ekspresije mScarI (sorazmerno z dodatkom AHL ali vanilne kisline). Višje izražanje mScarI je negativno vplivalo na izražanje sfGFP pri isti koncentraciji kuminske kisline, kar so pripisali tekmovanju za aminokisline, potrebne za sintezo obeh fluorescenčnih proteinov. Podobne rezultate dobimo tudi pri plazmidih z velikim številom kopij v celici [1].

==Zaključek==

Za izražanje proteinov je poleg učinkovitega promotorja pomembno tudi število kopij plazmida v celicah, kar omogoča sistem Tulip. Omogoča dinamično regulacijo števila kopij plazmida v celici skozi čas, je obstojen v celicah, uporaben v več bakterijskih sevih in ne povzroča dodatnega bremena celicam. Prava prednost Tulipa leži v krajšem času, ki je potreben za izbiro pravega števila kopij plazmida. Namesto, da vključke kloniramo v vektorje z različnimi števili kopij na celico in vsak vektor posebej transformiramo v celice, lahko v celice vključimo sistem Tulip in s spreminjanjem koncentracije kuminske kisline izberemo pravo število kopij plazmida, s čimer prihranimo na času in denarju.

==Literatura==

[1] S. H. N. Joshi, C. Yong, A. Gyorgy: Inducible plasmid copy number control for synthetic biology in commonly used E. coli strains. Nat. Commun. 2022, 13.

[2] K. Friehs: Plasmid copy number and plasmid stability. Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 2004, 86, 47–82.

[3] D. Manen, L. Caro: The replication of plasmid pSC101. Mol. Microbiol. 1991, 5, 233–237.

[4] A. Mullick, Y. Xu, R. Warren, M. Koutroumanis, C. Guilbault, S. Broussau, F. Malenfant, L. Bourget, L. Lamoureux, R. Lo, et al.: The cumate gene-switch: A system for regulated expression in mammalian cells. BMC Biotechnol. 2006, 6, 1–18.

[5] D. E. Cameron, J. J. Collins: Tunable protein degradation in bacteria. Nat. Biotechnol. 2014, 32, 1276–1281.

Sistem za nadzor števila plazmidov v celici (Tulip)

2023-04-24T17:28:16Z

Gregor Strniša:

''Povzeto po članku: [https://www.nature.com/articles/s41467-022-34390-7 S. H. N. Joshi, C. Yong, A. Gyorgy: Inducible plasmid copy number control for synthetic biology in commonly used E. coli strains. Nat. Commun. 2022, 13. ]''

==Uvod==
Ekspresija proteinov obsega več korakov in zahteva poznavanje več sistemov. Da učinkovito izražamo proteine v bakterijskih celicah moramo razumeti potek transkripcije in translacije. Za razliko od različnih možnosti uravnavanja izražanja proteinov na transkripcijskem in translacijskem nivoju, je na regulacijo števila kopij plazmidov v celici težje vplivati. Vsak plazmid ima fiksno število kopij v bakterijski celici, na katerega navadno ne moremo vplivati. Da bi našli pravo število kopij plazmida v celici, ki je potrebno za ekspresijo proteina, moramo za vsak eksperiment naš konstrukt klonirati v vektorje z različnimi števili kopij v celici in te vektorje transformirati v bakterijske celice. Pri tem dolgotrajnem delu pogosto pride do napak, zato so razvili sistem Tulip (TUnable Ligand Inducible Plasmid), ki omogoča enostavno in učinkovito spreminjanje števila kopij plazmida v celici [1, 2].

==Razvoj Tulipa==

===Plazmid pSC101===

Delovanje Tulipa temelji na mehanizmu podvojevanja plazmida pSC101. Ta plazmid v svojem zapisu vsebuje gen za protein repA, ki je dolg 316 aminokislin in se lahko v monomerni obliki veže na vezavno mesto na mestu ori plazmida pSC101. Vezan tvori povezavo z drugimi proteini in spodbudi podvojevanje plazmida. Ob višji koncentraciji v celici protein repA tvori dimere. Kot tak se ne more vezati na vezavno mesto na mestu ori in ne more spodbujati procesa podvojevanje, ampak se veže na lastno regulatorno regijo in inhibira lastno transkripcijo. Zaradi ravnotežja med monomerno in dimerno obliko proteina repA, je število kopij plazmida pSC101 navadno omejeno na 3 kopije na celico [1, 3].

===Mutacije v proteinu repA===

Mutacije v zapisu za protein repA lahko zmanjšajo medsebojno afiniteto monomerov, da bi tvorili dimere, kar vpliva na število kopij plazmida v celici. Z mutacijami ključnih aminokislinskih ostankov, pomembnih za dimerizacijo, so dobili več mutant proteina repA, katerih zapise so vgradili v vključek, ki je imel vključen še zapis za robustno obliko zelenega fluorescenčnega proteina (sfGFP) pod konstitutivnim promotorjem. Merili so fluorescenco sfGFP v odvisnosti od števila kopij plazmida v celici, ki so ga merili s PCR v realnem času. Ugotovili so, da je fluorescenca sfGFP sorazmerna s številom kopij plazmida v celici [1].

V naslednjem eksperimentu so delali z mutiranim repA, ki ni več tvoril dimerov (repAv7), se je bil pa še vedno zmožen vezati na svoje vezavno mesto na mestu ori plazmida pSC101. Zapis za repAv7 so dali na drug plazmid pod inducibilni promotor PCymRC. Na operatorsko regijo pred promotorjem PCymRC se veže represor cymRAM. Ob prisotnosti kuminske kisline (4-izopropil benzojska kislina), ki se veže na cymRAM, se cymRAM ne more več vezati na opreratorsko regijo in transkripcija genov pod promotorjem PCymRC lahko steče. Poleg tega vektorja so v bakterijske celice transformirali še divji tip vektorja pSC101 z zapisom za sfGFP pod konstitutivnim promotorjem. Ob dodatku kuminske kisline v gojišče pride do sinteze repAv7, ki se veže na mesto ori plazmida pSC101 in inducira njegovo podvojevanje. Ob povečanju koncentracije kuminske kisline so zaznali večjo fluorescenco sfGFP in večje število kopij vektorja pSC101 v bakterijskih celicah [1, 4].

==Optimizacija Tulipa==

Za lažjo uporabo so se odločili združiti celoten sistem na en sam konstrukt. Pod promotor PCymRC so vključili zapisa za proteina repAv7 in cymRAM. Ob dodatku kuminske kisline se cymRAM ni več mogel vezati na promotor, torej je potekala transkripcija genov za repAv7 in cymRAM. Zaradi povišanje koncentracije repAv7 je prišlo do višanja števila kopij plazmida v celici. Ko je količina sintetiziranega cymRAM presegla raven kuminske kisline v celici, se je cymRAM zopet vezal na promotor PCymRC, do transkripcije ni prišlo, število kopij plazmida v celici pa se je ustalilo. Spreminjanje koncentracije kuminske kisline v rastnem mediju celic je učinkovito delovalo na spreminjanje števila kopij plazmida v bakterijskih celicah [1].

===Spreminjanje RBS in dodajanje degradacijske oznake===

Sistem Tulip so dodatno izboljšali z optimizacijo ribosom vezavnih mest pred zapisoma za repAv7 in cymRAM. Naredili so plazmidne knjižnice z različnimi RBS, ki so jih transformirali v bakterijske celice, s pretočno citometrijo pa so merili fluorescenco konstitutivno izraženega sfGFP. Pri nizkih koncentracijah kuminske kisline je pogosto prišlo do prevelikega števila kopij plazmida v celici, kar so pripisali prepočasni razgradnji repAv7. Problem so rešili tako, da so zapisu za repAv7 dodali zapis za degradacijsko oznako. Degradacijska oznaka poveča hitrost razgradnje proteina tako, da omogoči lažjo vezavo na proteaze, ki so odgovorne za razgradnjo drugih endogenih proteinov v celici. Preizkušali so delovanje dveh degradacijskih oznak (AAV in AVS), kot boljša se je izkazala oznaka AAV [1, 5].

===Karakterizacija Tulipa===

Sistem Tulip so vključili v vektor in ga transformirali v bakterije seva NEBStable. Sev NEBStable je posebej primeren za transformacijo in pomnoževanje plazmidov. Na njem so okarakterizirali delovanje Tulipa tako, da so merili fluorescenco sfGFP v odvisnosti od koncentracije kuminske kisline. S PCR v realnem času so ugotovili, da lahko spreminjamo vrednost števila kopij plazmida med 2,9 in 50,9. Fluorescenca GFP je bila sorazmerna dodani kuminski kislini in številu kopij plazmida. Preverjali so tudi rast bakterijskih celic in ugotovili, da sistem Tulip ne predstavlja dodatnega bremena celicam, rast celic je bila primerljiva pri različnih koncentracijah kuminske kisline [1].

==Lastnosti Tulipa==

===Obstojnost v drugih bakterijskih sevih===

Učinkovitost Tulipa so preverili tudi v drugih pogosto uporabljenih bakterijskih sevih: DH10B (klonirni sev), NEBExpress (modificiran ekspresijski sev), BW25113 in MG1655 (modelni sev). Vse seve so transformirali s sistemom Tulip s konstitutivno izraženim zapisom za sfGFP. Vsi sevi razen seva NEBExpress so imeli število kopij plazmida sorazmerno s koncentracijo kuminske kisline, dodane gojišču. Sev NEBExpress je imel izmerjeno višjo fluorescenco sfGFP in višje število kopij plazmida že pri nizki koncentraciji kuminske kisline. Sev NEBExpress ima okvarjenih več proteinov, ki so odgovorni za razgradnjo drugih proteinov v celici, zato je v njem prišlo do kopičenja repAv7 in do sorazmernega povečanja števila kopij plazmida in fluorescence [1].

===Regulacija Tulipa===

Lastnosti Tulipa v daljšem časovnem obdobju so opazovali preko gojenja celic z vključkom s Tulipom v turbidostatu. Turbidostat omogoča gojenje celic pri konstantnih pogojih (temperatura, sestava gojišča). Celice so v turbidostatu gojili 48 ur, med katerimi so v dvanajsturnih intervalih spreminjali koncentracijo kuminske kisline v gojišču. Ugotovili so, da do spremembe fluorescence, ki je posledica spremembe koncentracije kuminske kisline, pride v treh do štirih urah. Rast celic je bila skozi celotno časovno obdobje konstantna. Tudi po 50 urah gojenja se je sistem Tulip obdržal v celicah. V kontrolnem poskusu, kjer je gojenje celic potekalo v gojišču brez antibiotika, pa so opazili, da je pri nizkih koncentracijah kuminske kisline prišlo do izgube vključka v bakterijah, zato moramo ob gojenju celic s sistemom Tulip obvezno izvajati selekcijo z antibiotiki [1].

===Uporaba Tulipa===

Sistem Tulip omogoča hitrejšo izbiro pravega števila kopij plazmida v celici. Sistem Tulip so vgradili v dva vektorja, ki sta že imela vključena sistema za zaznavanje homoserin laktona (AHL) ali vanilne kisline. Ob prisotnosti liganda je v vsakem sistemu prišlo do transkripcije gena za škrlaten fluorescenčni protein (mScarI). Vsak vektor je imel vključen še zapis za sfGFP pod konstitutivnem promotorju. Oba vektorja so transformirali v bakterijske celice. Ob različnih koncentracijah kuminske kisline in induktorja (AHL ali vanilna kislina) v gojišču so opazovali fluorescenco sfGFP in mScarI. Pri višjih koncentracijah kuminske kisline je prišlo do višje ekspresije mScarI (sorazmerno z dodatkom AHL ali vanilne kisline). Višje izražanje mScarI je negativno vplivalo na izražanje sfGFP pri isti koncentraciji kuminske kisline, kar so pripisali tekmovanju za aminokisline, potrebne za sintezo obeh fluorescenčnih proteinov. Podobne rezultate dobimo tudi pri plazmidih z velikim številom kopij v celici [1].

==Zaključek==

Za izražanje proteinov je poleg učinkovitega promotorja pomembno tudi število kopij plazmida v celicah, kar omogoča sistem Tulip. Omogoča dinamično regulacijo števila kopij plazmida v celici skozi čas, je obstojen v celicah, uporaben v več bakterijskih sevih in ne povzroča dodatnega bremena celicam. Prava prednost Tulipa leži v krajšem času, ki je potreben za izbiro pravega števila kopij plazmida. Namesto, da vključke kloniramo v vektorje z različnimi števili kopij na celico in vsak vektor posebej transformiramo v celice, lahko v celice vključimo sistem Tulip in s spreminjanjem koncentracije kuminske kisline izberemo pravo število kopij plazmida, s čimer prihranimo na času in denarju.

==Literatura==

[1] S. H. N. Joshi, C. Yong, A. Gyorgy: Inducible plasmid copy number control for synthetic biology in commonly used E. coli strains. Nat. Commun. 2022, 13.

[2] K. Friehs: Plasmid copy number and plasmid stability. Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 2004, 86, 47–82.

[3] D. Manen, L. Caro: The replication of plasmid pSC101. Mol. Microbiol. 1991, 5, 233–237.

[4] A. Mullick, Y. Xu, R. Warren, M. Koutroumanis, C. Guilbault, S. Broussau, F. Malenfant, L. Bourget, L. Lamoureux, R. Lo, et al.: The cumate gene-switch: A system for regulated expression in mammalian cells. BMC Biotechnol. 2006, 6, 1–18.

[5] D. E. Cameron, J. J. Collins: Tunable protein degradation in bacteria. Nat. Biotechnol. 2014, 32, 1276–1281.

Seminarji SB 2022/23

2023-04-24T17:27:51Z

Gregor Strniša:

V študijskem letu 2022/23 študentje pri Sintezni biologiji predstavljajo naslednje teme:

RAZISKOVALNI ČLANKI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Rudarjenje_in_uporaba_konstitutivnih_promotorjev_iz_Rhodosporidium_toruloides Rudarjenje in uporaba konstitutivnih promotorjev iz ''Rhodosporidium toruloides''] (Ana Babnik)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Biomolekularni_aktuatorji_za_gensko_selektivno_akusti%C4%8Dno_manipulacijo_celic Biomolekularni aktuatorji za gensko selektivno akustično manipulacijo celic] (Greta Junger)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/IN_VIVO_SAMOSESTAVLJENA_siRNA_KOT_NA%C4%8CIN_KOMBINIRANEGA_ZDRAVLJENJA_ULCEROZNEGA_KOLITISA#ZAKLJU.C4.8CEK In vivo samosestavljena siRNA kot način kombiniranega zdravljenja ulceroznega kolitisa] (Tjaša Kos)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Priprava_kompleta_orodij_za_zaznavanje_kvoruma_pri_cianobakterijah:_Razvoj_medceli%C4%8Dne_koordinacije_v_me%C5%A1anih_avtotrofno-heterotrofnih_skupnostih Priprava kompleta orodij za zaznavanje kvoruma pri cianobakterijah: Razvoj medcelične koordinacije v mešanih avtotrofno-heterotrofnih skupnostih] (Nuša Tkalec)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Razvoj_temperaturno_inducibilnega_transkripcijskega_reostata_pri_Neurospori_crassi Razvoj temperaturno inducibilnega transkripcijskega reostata pri ''Neurospori crassi''] (Luka Šegota)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Priprava_tumor_ciljajočih_bakterij_s_stikalnim_sistemom,_ki_se_odziva_na_dušikov(II)_oksid Priprava tumor ciljajočih bakterij s stikalnim sistemom, ki se odziva na dušikov(II) oksid] (Ana Kodra)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Razcepljeni_ribocim%2C_ki_signale_nativnih_RNA_pove%C5%BEe_z_ortogonalnimi_proteinskimi_izhodnimi_signali Razcepljeni ribocim, ki signale nativnih RNA poveže z ortogonalnimi proteinskimi izhodnimi signali] (Ajda Beltram)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sistem_za_nadzor_%C5%A1tevila_plazmidov_v_celici_%28Tulip%29 Sistem za nadzor števila plazmidov v celici (Tulip)] (Gregor Strniša)
NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/MonChassis MonChassis] (Nika Tomsič)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/FIAT_LUX FIAT LUX] (Neža Lanišek)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/NETLANTIS NETLANTIS] (Maša Gabrič)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BINANOX BINANOX] (Vivian Nemanič)
----

Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Povzetek je treba objaviti dva dni pred predstavitvijo do polnoči (za seminarje v sredo torej v ponedeljek). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo približno 5-minutna razprava.

Terminski razpored je razviden iz preglednice na strežniku Google Drive.

Kako je videti seznam seminarjev, lahko preverite pri lanskem letniku: [[Seminarji_SB_2021/22]].

Sistem za nadzor števila plazmidov v celici (Tulip)

2023-04-24T17:25:50Z

Gregor Strniša:

''Povzeto po članku:[https://www.nature.com/articles/s41467-022-34390-7 S. H. N. Joshi, C. Yong, A. Gyorgy: Inducible plasmid copy number control for synthetic biology in commonly used E. coli strains. Nat. Commun. 2022, 13. ]''

==Uvod==
Ekspresija proteinov obsega več korakov in zahteva poznavanje več sistemov. Da učinkovito izražamo proteine v bakterijskih celicah moramo razumeti potek transkripcije in translacije. Za razliko od različnih možnosti uravnavanja izražanja proteinov na transkripcijskem in translacijskem nivoju, je na regulacijo števila kopij plazmidov v celici težje vplivati. Vsak plazmid ima fiksno število kopij v bakterijski celici, na katerega navadno ne moremo vplivati. Da bi našli pravo število kopij plazmida v celici, ki je potrebno za ekspresijo proteina, moramo za vsak eksperiment naš konstrukt klonirati v vektorje z različnimi števili kopij v celici in te vektorje transformirati v bakterijske celice. Pri tem dolgotrajnem delu pogosto pride do napak, zato so razvili sistem Tulip (TUnable Ligand Inducible Plasmid), ki omogoča enostavno in učinkovito spreminjanje števila kopij plazmida v celici [1, 2].

==Razvoj Tulipa==

===Plazmid pSC101===

Delovanje Tulipa temelji na mehanizmu podvojevanja plazmida pSC101. Ta plazmid v svojem zapisu vsebuje gen za protein repA, ki je dolg 316 aminokislin in se lahko v monomerni obliki veže na vezavno mesto na mestu ori plazmida pSC101. Vezan tvori povezavo z drugimi proteini in spodbudi podvojevanje plazmida. Ob višji koncentraciji v celici protein repA tvori dimere. Kot tak se ne more vezati na vezavno mesto na mestu ori in ne more spodbujati procesa podvojevanje, ampak se veže na lastno regulatorno regijo in inhibira lastno transkripcijo. Zaradi ravnotežja med monomerno in dimerno obliko proteina repA, je število kopij plazmida pSC101 navadno omejeno na 3 kopije na celico [1, 3].

===Mutacije v proteinu repA===

Mutacije v zapisu za protein repA lahko zmanjšajo medsebojno afiniteto monomerov, da bi tvorili dimere, kar vpliva na število kopij plazmida v celici. Z mutacijami ključnih aminokislinskih ostankov, pomembnih za dimerizacijo, so dobili več mutant proteina repA, katerih zapise so vgradili v vključek, ki je imel vključen še zapis za robustno obliko zelenega fluorescenčnega proteina (sfGFP) pod konstitutivnim promotorjem. Merili so fluorescenco sfGFP v odvisnosti od števila kopij plazmida v celici, ki so ga merili s PCR v realnem času. Ugotovili so, da je fluorescenca sfGFP sorazmerna s številom kopij plazmida v celici [1].

V naslednjem eksperimentu so delali z mutiranim repA, ki ni več tvoril dimerov (repAv7), se je bil pa še vedno zmožen vezati na svoje vezavno mesto na mestu ori plazmida pSC101. Zapis za repAv7 so dali na drug plazmid pod inducibilni promotor PCymRC. Na operatorsko regijo pred promotorjem PCymRC se veže represor cymRAM. Ob prisotnosti kuminske kisline (4-izopropil benzojska kislina), ki se veže na cymRAM, se cymRAM ne more več vezati na opreratorsko regijo in transkripcija genov pod promotorjem PCymRC lahko steče. Poleg tega vektorja so v bakterijske celice transformirali še divji tip vektorja pSC101 z zapisom za sfGFP pod konstitutivnim promotorjem. Ob dodatku kuminske kisline v gojišče pride do sinteze repAv7, ki se veže na mesto ori plazmida pSC101 in inducira njegovo podvojevanje. Ob povečanju koncentracije kuminske kisline so zaznali večjo fluorescenco sfGFP in večje število kopij vektorja pSC101 v bakterijskih celicah [1, 4].

==Optimizacija Tulipa==

Za lažjo uporabo so se odločili združiti celoten sistem na en sam konstrukt. Pod promotor PCymRC so vključili zapisa za proteina repAv7 in cymRAM. Ob dodatku kuminske kisline se cymRAM ni več mogel vezati na promotor, torej je potekala transkripcija genov za repAv7 in cymRAM. Zaradi povišanje koncentracije repAv7 je prišlo do višanja števila kopij plazmida v celici. Ko je količina sintetiziranega cymRAM presegla raven kuminske kisline v celici, se je cymRAM zopet vezal na promotor PCymRC, do transkripcije ni prišlo, število kopij plazmida v celici pa se je ustalilo. Spreminjanje koncentracije kuminske kisline v rastnem mediju celic je učinkovito delovalo na spreminjanje števila kopij plazmida v bakterijskih celicah [1].

===Spreminjanje RBS in dodajanje degradacijske oznake===

Sistem Tulip so dodatno izboljšali z optimizacijo ribosom vezavnih mest pred zapisoma za repAv7 in cymRAM. Naredili so plazmidne knjižnice z različnimi RBS, ki so jih transformirali v bakterijske celice, s pretočno citometrijo pa so merili fluorescenco konstitutivno izraženega sfGFP. Pri nizkih koncentracijah kuminske kisline je pogosto prišlo do prevelikega števila kopij plazmida v celici, kar so pripisali prepočasni razgradnji repAv7. Problem so rešili tako, da so zapisu za repAv7 dodali zapis za degradacijsko oznako. Degradacijska oznaka poveča hitrost razgradnje proteina tako, da omogoči lažjo vezavo na proteaze, ki so odgovorne za razgradnjo drugih endogenih proteinov v celici. Preizkušali so delovanje dveh degradacijskih oznak (AAV in AVS), kot boljša se je izkazala oznaka AAV [1, 5].

===Karakterizacija Tulipa===

Sistem Tulip so vključili v vektor in ga transformirali v bakterije seva NEBStable. Sev NEBStable je posebej primeren za transformacijo in pomnoževanje plazmidov. Na njem so okarakterizirali delovanje Tulipa tako, da so merili fluorescenco sfGFP v odvisnosti od koncentracije kuminske kisline. S PCR v realnem času so ugotovili, da lahko spreminjamo vrednost števila kopij plazmida med 2,9 in 50,9. Fluorescenca GFP je bila sorazmerna dodani kuminski kislini in številu kopij plazmida. Preverjali so tudi rast bakterijskih celic in ugotovili, da sistem Tulip ne predstavlja dodatnega bremena celicam, rast celic je bila primerljiva pri različnih koncentracijah kuminske kisline [1].

==Lastnosti Tulipa==

===Obstojnost v drugih bakterijskih sevih===

Učinkovitost Tulipa so preverili tudi v drugih pogosto uporabljenih bakterijskih sevih: DH10B (klonirni sev), NEBExpress (modificiran ekspresijski sev), BW25113 in MG1655 (modelni sev). Vse seve so transformirali s sistemom Tulip s konstitutivno izraženim zapisom za sfGFP. Vsi sevi razen seva NEBExpress so imeli število kopij plazmida sorazmerno s koncentracijo kuminske kisline, dodane gojišču. Sev NEBExpress je imel izmerjeno višjo fluorescenco sfGFP in višje število kopij plazmida že pri nizki koncentraciji kuminske kisline. Sev NEBExpress ima okvarjenih več proteinov, ki so odgovorni za razgradnjo drugih proteinov v celici, zato je v njem prišlo do kopičenja repAv7 in do sorazmernega povečanja števila kopij plazmida in fluorescence [1].

===Regulacija Tulipa===

Lastnosti Tulipa v daljšem časovnem obdobju so opazovali preko gojenja celic z vključkom s Tulipom v turbidostatu. Turbidostat omogoča gojenje celic pri konstantnih pogojih (temperatura, sestava gojišča). Celice so v turbidostatu gojili 48 ur, med katerimi so v dvanajsturnih intervalih spreminjali koncentracijo kuminske kisline v gojišču. Ugotovili so, da do spremembe fluorescence, ki je posledica spremembe koncentracije kuminske kisline, pride v treh do štirih urah. Rast celic je bila skozi celotno časovno obdobje konstantna. Tudi po 50 urah gojenja se je sistem Tulip obdržal v celicah. V kontrolnem poskusu, kjer je gojenje celic potekalo v gojišču brez antibiotika, pa so opazili, da je pri nizkih koncentracijah kuminske kisline prišlo do izgube vključka v bakterijah, zato moramo ob gojenju celic s sistemom Tulip obvezno izvajati selekcijo z antibiotiki [1].

===Uporaba Tulipa===

Sistem Tulip omogoča hitrejšo izbiro pravega števila kopij plazmida v celici. Sistem Tulip so vgradili v dva vektorja, ki sta že imela vključena sistema za zaznavanje homoserin laktona (AHL) ali vanilne kisline. Ob prisotnosti liganda je v vsakem sistemu prišlo do transkripcije gena za škrlaten fluorescenčni protein (mScarI). Vsak vektor je imel vključen še zapis za sfGFP pod konstitutivnem promotorju. Oba vektorja so transformirali v bakterijske celice. Ob različnih koncentracijah kuminske kisline in induktorja (AHL ali vanilna kislina) v gojišču so opazovali fluorescenco sfGFP in mScarI. Pri višjih koncentracijah kuminske kisline je prišlo do višje ekspresije mScarI (sorazmerno z dodatkom AHL ali vanilne kisline). Višje izražanje mScarI je negativno vplivalo na izražanje sfGFP pri isti koncentraciji kuminske kisline, kar so pripisali tekmovanju za aminokisline, potrebne za sintezo obeh fluorescenčnih proteinov. Podobne rezultate dobimo tudi pri plazmidih z velikim številom kopij v celici [1].

==Zaključek==

Za izražanje proteinov je poleg učinkovitega promotorja pomembno tudi število kopij plazmida v celicah, kar omogoča sistem Tulip. Omogoča dinamično regulacijo števila kopij plazmida v celici skozi čas, je obstojen v celicah, uporaben v več bakterijskih sevih in ne povzroča dodatnega bremena celicam. Prava prednost Tulipa leži v krajšem času, ki je potreben za izbiro pravega števila kopij plazmida. Namesto, da vključke kloniramo v vektorje z različnimi števili kopij na celico in vsak vektor posebej transformiramo v celice, lahko v celice vključimo sistem Tulip in s spreminjanjem koncentracije kuminske kisline izberemo pravo število kopij plazmida, s čimer prihranimo na času in denarju.

==Literatura==

[1] S. H. N. Joshi, C. Yong, A. Gyorgy: Inducible plasmid copy number control for synthetic biology in commonly used E. coli strains. Nat. Commun. 2022, 13.

[2] K. Friehs: Plasmid copy number and plasmid stability. Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 2004, 86, 47–82.

[3] D. Manen, L. Caro: The replication of plasmid pSC101. Mol. Microbiol. 1991, 5, 233–237.

[4] A. Mullick, Y. Xu, R. Warren, M. Koutroumanis, C. Guilbault, S. Broussau, F. Malenfant, L. Bourget, L. Lamoureux, R. Lo, et al.: The cumate gene-switch: A system for regulated expression in mammalian cells. BMC Biotechnol. 2006, 6, 1–18.

[5] D. E. Cameron, J. J. Collins: Tunable protein degradation in bacteria. Nat. Biotechnol. 2014, 32, 1276–1281.

Sistem za nadzor števila plazmidov v celici (Tulip)

2023-04-24T17:25:01Z

Gregor Strniša:

''Povzeto po članku:[https://www.nature.com/articles/s41467-022-34390-7 S. H. N. Joshi, C. Yong, A. Gyorgy: Inducible plasmid copy number control for synthetic biology in commonly used E. coli strains. Nat. Commun. 2022, 13. ]''

==Uvod==
Ekspresija proteinov obsega več korakov in zahteva poznavanje več sistemov. Da učinkovito izražamo proteine v bakterijskih celicah moramo razumeti potek transkripcije in translacije. Za razliko od različnih možnosti uravnavanja izražanja proteinov na transkripcijskem in translacijskem nivoju, je na regulacijo števila kopij plazmidov v celici težje vplivati. Vsak plazmid ima fiksno število kopij v bakterijski celici, na katerega navadno ne moremo vplivati. Da bi našli pravo število kopij plazmida v celici, ki je potrebno za ekspresijo proteina, moramo za vsak eksperiment naš konstrukt klonirati v vektorje z različnimi števili kopij v celici in te vektorje transformirati v bakterijske celice. Pri tem dolgotrajnem delu pogosto pride do napak, zato so razvili sistem Tulip (TUnable Ligand Inducible Plasmid), ki omogoča enostavno in učinkovito spreminjanje števila kopij plazmida v celici [1, 2].

==Razvoj Tulipa==

===Plazmid pSC101===

Delovanje Tulipa temelji na mehanizmu podvojevanja plazmida pSC101. Ta plazmid v svojem zapisu vsebuje gen za protein repA, ki je dolg 316 aminokislin in se lahko v monomerni obliki veže na vezavno mesto na mestu ori plazmida pSC101. Vezan tvori povezavo z drugimi proteini in spodbudi podvojevanje plazmida. Ob višji koncentraciji v celici protein repA tvori dimere. Kot tak se ne more vezati na vezavno mesto na mestu ori in ne more spodbujati procesa podvojevanje, ampak se veže na lastno regulatorno regijo in inhibira lastno transkripcijo. Zaradi ravnotežja med monomerno in dimerno obliko proteina repA, je število kopij plazmida pSC101 navadno omejeno na 3 kopije na celico [1, 3].

===Mutacije v proteinu repA===

Mutacije v zapisu za protein repA lahko zmanjšajo medsebojno afiniteto monomerov, da bi tvorili dimere, kar vpliva na število kopij plazmida v celici. Z mutacijami ključnih aminokislinskih ostankov, pomembnih za dimerizacijo, so dobili več mutant proteina repA, katerih zapise so vgradili v vključek, ki je imel vključen še zapis za robustno obliko zelenega fluorescenčnega proteina (sfGFP) pod konstitutivnim promotorjem. Merili so fluorescenco sfGFP v odvisnosti od števila kopij plazmida v celici, ki so ga merili s PCR v realnem času. Ugotovili so, da je fluorescenca sfGFP sorazmerna s številom kopij plazmida v celici [1].

V naslednjem eksperimentu so delali z mutiranim repA, ki ni več tvoril dimerov (repAv7), se je bil pa še vedno zmožen vezati na svoje vezavno mesto na mestu ori plazmida pSC101. Zapis za repAv7 so dali na drug plazmid pod inducibilni promotor PCymRC. Na operatorsko regijo pred promotorjem PCymRC se veže represor cymRAM. Ob prisotnosti kuminske kisline (4-izopropil benzojska kislina), ki se veže na cymRAM, se cymRAM ne more več vezati na opreratorsko regijo in transkripcija genov pod promotorjem PCymRC lahko steče. Poleg tega vektorja so v bakterijske celice transformirali še divji tip vektorja pSC101 z zapisom za sfGFP pod konstitutivnim promotorjem. Ob dodatku kuminske kisline v gojišče pride do sinteze repAv7, ki se veže na mesto ori plazmida pSC101 in inducira njegovo podvojevanje. Ob povečanju koncentracije kuminske kisline so zaznali večjo fluorescenco sfGFP in večje število kopij vektorja pSC101 v bakterijskih celicah [1, 4].

==Optimizacija Tulipa==

Za lažjo uporabo so se odločili združiti celoten sistem na en sam konstrukt. Pod promotor PCymRC so vključili zapisa za proteina repAv7 in cymRAM. Ob dodatku kuminske kisline se cymRAM ni več mogel vezati na promotor, torej je potekala transkripcija genov za repAv7 in cymRAM. Zaradi povišanje koncentracije repAv7 je prišlo do višanja števila kopij plazmida v celici. Ko je količina sintetiziranega cymRAM presegla raven kuminske kisline v celici, se je cymRAM zopet vezal na promotor PCymRC, do transkripcije ni prišlo, število kopij plazmida v celici pa se je ustalilo. Spreminjanje koncentracije kuminske kisline v rastnem mediju celic je učinkovito delovalo na spreminjanje števila kopij plazmida v bakterijskih celicah [1].

===Spreminjanje RBS in dodajanje degradacijske oznake===

Sistem Tulip so dodatno izboljšali z optimizacijo ribosom vezavnih mest pred zapisoma za repAv7 in cymRAM. Naredili so plazmidne knjižnice z različnimi RBS, ki so jih transformirali v bakterijske celice, s pretočno citometrijo pa so merili fluorescenco konstitutivno izraženega sfGFP. Pri nizkih koncentracijah kuminske kisline je pogosto prišlo do prevelikega števila kopij plazmida v celici, kar so pripisali prepočasni razgradnji repAv7. Problem so rešili tako, da so zapisu za repAv7 dodali zapis za degradacijsko oznako. Degradacijska oznaka poveča hitrost razgradnje proteina tako, da omogoči lažjo vezavo na proteaze, ki so odgovorne za razgradnjo drugih endogenih proteinov v celici. Preizkušali so delovanje dveh degradacijskih oznak (AAV in AVS), kot boljša se je izkazala oznaka AAV [1, 5].

===Karakterizacija Tulipa===

Sistem Tulip so vključili v vektor in ga transformirali v bakterije seva NEBStable. Sev NEBStable je posebej primeren za transformacijo in pomnoževanje plazmidov. Na njem so okarakterizirali delovanje Tulipa tako, da so merili fluorescenco sfGFP v odvisnosti od koncentracije kuminske kisline. S PCR v realnem času so ugotovili, da lahko spreminjamo vrednost števila kopij plazmida med 2,9 in 50,9. Fluorescenca GFP je bila sorazmerna dodani kuminski kislini in številu kopij plazmida. Preverjali so tudi rast bakterijskih celic in ugotovili, da sistem Tulip ne predstavlja dodatnega bremena celicam, rast celic je bila primerljiva pri različnih koncentracijah kuminske kisline [1].

==Lastnosti Tulipa==

===Obstojnost v drugih bakterijskih sevih===

Učinkovitost Tulipa so preverili tudi v drugih pogosto uporabljenih bakterijskih sevih: DH10B (klonirni sev), NEBExpress (modificiran ekspresijski sev), BW25113 in MG1655 (modelni sev). Vse seve so transformirali s sistemom Tulip s konstitutivno izraženim zapisom za sfGFP. Vsi sevi razen seva NEBExpress so imeli število kopij plazmida sorazmerno s koncentracijo kuminske kisline, dodane gojišču. Sev NEBExpress je imel izmerjeno višjo fluorescenco sfGFP in višje število kopij plazmida že pri nizki koncentraciji kuminske kisline. Sev NEBExpress ima okvarjenih več proteinov, ki so odgovorni za razgradnjo drugih proteinov v celici, zato je v njem prišlo do kopičenja repAv7 in do sorazmernega povečanja števila kopij plazmida in fluorescence [1].

===Regulacija Tulipa===

Lastnosti Tulipa v daljšem časovnem obdobju so opazovali preko gojenja celic z vključkom s Tulipom v turbidostatu. Turbidostat omogoča gojenje celic pri konstantnih pogojih (temperatura, sestava gojišča). Celice so v turbidostatu gojili 48 ur, med katerimi so v dvanajsturnih intervalih spreminjali koncentracijo kuminske kisline v gojišču. Ugotovili so, da do spremembe fluorescence, ki je posledica spremembe koncentracije kuminske kisline, pride v treh do štirih urah. Rast celic je bila skozi celotno časovno obdobje konstantna. Tudi po 50 urah gojenja se je sistem Tulip obdržal v celicah. V kontrolnem poskusu, kjer je gojenje celic potekalo v gojišču brez antibiotika, pa so opazili, da je pri nizkih koncentracijah kuminske kisline prišlo do izgube vključka v bakterijah, zato moramo ob gojenju celic s sistemom Tulip obvezno izvajati selekcijo z antibiotiki [1].

===Uporaba Tulipa===

Sistem Tulip omogoča hitrejšo izbiro pravega števila kopij plazmida v celici. Sistem Tulip so vgradili v dva vektorja, ki sta že imela vključena sistema za zaznavanje homoserin laktona (AHL) ali vanilne kisline. Ob prisotnosti liganda je v vsakem sistemu prišlo do transkripcije gena za škrlaten fluorescenčni protein (mScarI). Vsak vektor je imel vključen še zapis za sfGFP pod konstitutivnem promotorju. Oba vektorja so transformirali v bakterijske celice. Ob različnih koncentracijah kuminske kisline in induktorja (AHL ali vanilna kislina) v gojišču so opazovali fluorescenco sfGFP in mScarI. Pri višjih koncentracijah kuminske kisline je prišlo do višje ekspresije mScarI (sorazmerno z dodatkom AHL ali vanilne kisline). Višje izražanje mScarI je negativno vplivalo na izražanje sfGFP pri isti koncentraciji kuminske kisline, kar so pripisali tekmovanju za aminokisline, potrebne za sintezo obeh fluorescenčnih proteinov. Podobne rezultate dobimo tudi pri plazmidih z velikim številom kopij v celici [1].

==Zaključek==

Za izražanje proteinov je poleg učinkovitega promotorja pomembno tudi število kopij plazmida v celicah, kar omogoča sistem Tulip. Omogoča dinamično regulacijo števila kopij plazmida v celici skozi čas, je obstojen v celicah, uporaben v več bakterijskih sevih in ne povzroča dodatnega bremena celicam. Prava prednost Tulipa leži v krajšem času, ki je potreben za izbiro pravega števila kopij plazmida. Namesto, da vključke kloniramo v vektorje z različnimi števili kopij na celico in vsak vektor posebej transformiramo v celice, lahko v celice vključimo sistem Tulip in s spreminjanjem koncentracije kuminske kisline izberemo pravo število kopij plazmida, s čimer prihranimo na času in denarju.

==Literatura==

[1] S. H. N. Joshi, C. Yong, A. Gyorgy: Inducible plasmid copy number control for synthetic biology in commonly used E. coli strains. Nat. Commun. 2022, 13.
[2] K. Friehs: Plasmid copy number and plasmid stability. Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 2004, 86, 47–82.
[3] D. Manen, L. Caro: The replication of plasmid pSC101. Mol. Microbiol. 1991, 5, 233–237.
[4] A. Mullick, Y. Xu, R. Warren, M. Koutroumanis, C. Guilbault, S. Broussau, F. Malenfant, L. Bourget, L. Lamoureux, R. Lo, et al.: The cumate gene-switch: A system for regulated expression in mammalian cells. BMC Biotechnol. 2006, 6, 1–18.
[5] D. E. Cameron, J. J. Collins: Tunable protein degradation in bacteria. Nat. Biotechnol. 2014, 32, 1276–1281.

Sistem za nadzor števila plazmidov v celici (Tulip)

2023-04-24T17:20:45Z

Gregor Strniša:

Sistem za nadzor števila plazmidov v celici (Tulip)

2023-04-24T17:20:34Z

Gregor Strniša:

Sistem za nadzor števila plazmidov v celici (Tulip)

2023-04-24T17:19:53Z

Gregor Strniša:

Sistem za nadzor števila plazmidov v celici (Tulip)

2023-04-24T17:16:46Z

Gregor Strniša: New page: ''Povzeto po članku:[https://www.nature.com/articles/s41467-022-34390-7 S. H. N. Joshi, C. Yong, A. Gyorgy: Inducible plasmid copy number control for synthetic biology in commonly used E....

Talk:Mehanizmi dodajanja kape in metilacije koronavirusne RNA

2021-05-11T15:50:35Z

Gregor Strniša:

Nika Perko (Uvod, proces dodajanja kape, kape pri mRNA virusih, RNA trifosfataza)

Nika Tomsič (RNA gvanilil transferaza, gvanin-N7 metiltransferaza)

Gregor Strniša (riboza 2'-''O''-metiltransferaza, detekcija tuje RNA v celicah)

Talk:Mehanizmi dodajanja kape in metilacije koronavirusne RNA

2021-05-11T15:50:26Z

Gregor Strniša: New page: Nika Perko (Uvod, proces dodajanja kape, kape pri mRNA virusih, RNA trifosfataza) Nika Tomsič (RNA gvanilil transferaza, gvanin-N7 metiltransferaza) Gregor Strniša (riboza 2'-''O''-metil...

Nika Perko (Uvod, proces dodajanja kape, kape pri mRNA virusih, RNA trifosfataza)
Nika Tomsič (RNA gvanilil transferaza, gvanin-N7 metiltransferaza)
Gregor Strniša (riboza 2'-''O''-metiltransferaza, detekcija tuje RNA v celicah)

Mehanizmi dodajanja kape in metilacije koronavirusne RNA

2021-05-11T15:45:17Z

Gregor Strniša:

==Uvod==
Zorenje mRNA zajema več različnih kemijskih modifikacij in med drugim tudi dodajanje kape na 5’-koncu verige. Ta proces ima pomembno vlogo pri:
*povečevanju stabilnosti verige mRNA, saj jo kapa ščiti pred napadi eksonukleaz
*izvozu verige iz jedra, saj se nanjo lažje vežejo proteini, ki omogočajo transport
*izrezovanju 5’-introna
*pospeševanju translacije, saj spodbuja vezavo iniciacijskega faktorja (eIF4E).
Če molekuli mRNA omenjena struktura manjka, se bo razgradila v citoplazmi.

==Proces dodajanja kape==

Struktura kape na 5’-koncu mRNA nastane kotranskripcijsko in preide več encimskih reakcij. Proces se začne, ko je sintetiziranih že približno 20 nukleotidov. Najprej encim RNA-5’-trifosfataza (TPaza) z iniciacijskega nukleotida odstrani γ-fosfat. Nato se naslednji encim RNA gvanililtransferaza (GTaza) kovalentno poveže z α-fosfatom molekule GTP. Sprosti se molekula pirofosfata (PPi) in nastane intermediatni kompleks Encim-GMP. Ta kompleks omogoči prenos molekule GMP na prej omenjeni iniciacijski nukleotid. Produkt spojitve je struktura kape na 5’-koncu mRNA. Zatem sledi metilacija gvaninskega dela kape na mestu N7, kar omogoči encim (gvanin-N7)-metiltransferaza (N7-MTaza).

Opisani proces velja za tvorbo kape-0, za katerega se predvideva, da poteka tudi pri koronavirusih. Rečemo mu tudi konvencionalni mehanizem dodajanja kape. Pri višjih evkariontih pa se proces navadno na tej stopnji še ne ustavi. Struktura kapa-0 preide še eno ali pa največ dve metilaciji. Če se metilira mesto 2’-O na riboznem delu prvega nukleotida (tj. naslednji nukleotid od iniciacijskega), potem taki strukturi pravimo kapa-1. Če pa se metilirata mesti 2'-O na riboznem delu prvega in drugega nukleotida, taki strukturi pravimo kapa-2. Proces metilacije omogoči encim 2'-''O''-metiltransferaza (2'-''O''-MTaza). Tako encim 2'-''O''-MTaza kot N7-MTaza katalizirata prenos metilne skupine z metilnega donorja S-adenozil-L-metionina (SAM). Stranski produkt teh dveh kataliziranih reakcij je S-adenozil-L-homocistein (SAH).

Kaj je vloga različnih kap? Kapa-0 prepreči, da bi 5'-konec verige mRNA sprožil imunski odziv gostiteljske celice in igra pomembno vlogo pri replikaciji virusnega genoma, saj izboljša translacijo virusnih mRNA. Kapa-1 omogoči, da imunski sistem ne more prepoznati molekule mRNA. Vloga kape-2 trenutno ni znana.

==Kape pri RNA virusih==

Virusi, ki okužijo evkariontske celice, so razvili različne strategije tvorbe kap lastnih molekul mRNA. DNA virusi in retrovirusi se podvajajo v jedru in pri tvorjenju kape-0 izkoristijo molekule gostiteljske celice. Številni virusi, ki se podvajajo v citoplazmi in nimajo dostopa do molekul, potrebnih za dodajanje kape, so v svoj genom vgradili zapise za lastne aparate dodajanja kap. Čeprav sta molekulska organizacija in biokemijski mehanizem tvorjenja kape v virusih različna, so si končne strukture kap podobne.

Negativno usmerjeni RNA virusi iz družin ''Bunyaviridae'' in ''Orthomyxoviridae'' so razvili edinstven ''cap-snatching'' mehanizem. Ta omogoča prevzem kap gostiteljskih molekul mRNA. Mehanizem deluje tako, da virusna od RNA odvisna RNA polimeraza (RdRp) preko podenote PB2 veže 5’-konec gostiteljske mRNA, ki že ima kapo. Polimeraza RdRp pa ima tudi endonukleazno aktivnost, ki ji omogoči, da odcepi kratek del verige mRNA, na katerem je kapa. Odcepljen košček verige, ki na 5'-koncu vsebuje kapo, deluje kot primer (ang. ''primer'') za virusno polimerazo RdRp. Tako lahko poteče transkripcija virusnega zapisa, kjer je matrična veriga negativna virusna RNA. RdRp sintetizira komplementarno negativno verigo.

Razlika med mehanizmom pri alfavirusih in konvencionalnim mehanizmom je ta, da se GTP metilira na mestu N7 še preden se prenese na iniciacijski nukleotid, ki mu je bil γ-fosfat že odstranjen.

Za virus vezikularnega stomatitisa (VSV) predvidevajo, da se monofosforiliran 5’-konec mRNA verige veže na GDP. Proces naj bi deloval tako, da GTPazna aktivnost v RdRp povzroči nastanek GDP iz GTP. Ta GDP ostane vezan v RdRp in bo deloval kot akceptor mRNA. Med transkripcijo nascentni transkript interagira z aktivnim mestom poliribonukleotidiltransferazne domene, ki se nahaja v RdRp. Posledica interakcije je odcep PPi in nastanek 5’-monofosforiliranega konca verige mRNA, ki se še vedno drži RdRp. Aktivnost poliribonukleotidiltransferazne domene omogoči prenos verige mRNA na GDP. Tako nastane kapa na verigi mRNA. Nato se veriga enako metilira kot pri konvencionalnem mehanizmu.

==RNA trifosfataza ==

RNA trifosfataza (TPaza) je encim, ki je odgovoren za začetek postavljanja kape na 5’-konec koronavirusnega RNA. Njegova funkcija je cepiti fosfatno vez med fosfatoma β in γ prvega (iniciacijskega) nukleotida na 5’-koncu. Tako iz 5’-pppN konca nastane difosfatni 5’-ppN konec. Aktivnost encima so preverili s poskusom na kvasovkah seva YBS20 (''cet1''), ki v svojem genomu nimajo kromosomskega lokusa CET1 in so namesto njega vključili virusni gen za rast, ki vsebuje zapis za RNA TPazo. Delitev kvasovk je bila tako odvisna le od delovanja virusne TPaze. Izkazalo se je, da kvasovke ne morejo uporabljati virusnega gena zaradi različne organizacije in mehanizmov postavljanja kape.

Podobno aktivnost so opazili pri nestrukturnem proteinu nsp13. Nsp13 je povezan s helikazno aktivnostjo pri koronavirusih, in sicer deluje kot NTPaza. Ta tako kot TPaza cepi fosfatno skupino. Splošno mnenje je, da naj bi nsp13 imel tudi aktivno funkcijo v postavljanju kape, vendar njegova vloga še čaka na eksperimentalne dokaze.

==RNA gvanilil transferaza==

Odcep fosfata v prejšnji fazi predstavlja nastanek potencialnega mesta za vezavo nove molekule. Gvanilil transferaza (GTaza) je odgovorna za nastanek kovalentne vezi med 5’-koncem mRNA in GMP (pri konvencionalnem nastanku kape) oz. metiliranim GMP (pri vrsti alfavirusov). Tako nastane jedro kape (GpppN oz. m7GpppN). Podobno kot pri merjenju aktivnosti TPaze, so pregledali aktivnost GTaze na sevu kvasovk YBS2 (''ceg1''), ki nimajo kromosomskega lokusa CEG1, ki kodira GTaze kvasovk. Noben encim ni kazal GTazne aktivnosti. Dokazov za obstoj koronavirusne GTaze torej še ni.

==Gvanin-N7 metiltransferaza==

Gvanin-N7 metiltransferaza (N7-MTaza) je tretji encim, ki sodeluje pri sestavljanju kape na virusnih mRNA. Njegova funkcija je metilacija gvanilata, ki ga je GTaza dodala. Nastane tako imenovana struktura kape-0 (m7GpppN). Metilacija stabilizira strukturo kape in prepreči odcep gvanilata. Pri poskusu na kvasovkah YBS40 oz. sevom, ki nima kodiranih encimov MTaze, se je izkazalo, da nsp14 (N7-metiltransferaza in eksoribonukleaza) spodbuja rast celice in lahko prevzame funkcijo N7-MTaze. MTaza in nsp14 torej predstavljata potencialno tarčo za razvitje različnih protivirusnih zdravil.

Nsp14 je edina eksonukleaza, ki jo kodirajo RNA virusi, in lahko sodeluje pri kontrolnem branju pri prepisovanju. Poskusi kažejo, da se nsp14 nespecifično veže na mRNA in deluje kot MTaza. Nadaljnje študije kažejo, da je sposoben metiliranja različnih substratov, med katerimi so tudi GTP, dGTP in drugi analogi začetnih kap. Njegovo delovanje se poveča s prisotnostjo kofaktorja nsp10, s katerim tvori kompleks v stehiometriji 1:1, medtem ko prisotnost nsp16 ne vpliva na njegovo delovanje. Eksonukleazno domeno nsp14 predstavlja prvih 287 aminokislin, ki tvorijo katalitični motiv DEEDh. N7-MTazna domena je sestavljena iz β struktur in motivom cinkovega prsta, ki pa ni potreben za aktivnost encima. Na to domeno se veže molekula SAM, ki omogoči metilacijo.

==Riboza 2’-''O''- metiltransferaza==

Zadnji korak v nastanku kape je metiliranje strukture kape-0 na 2’-O prvega in drugega nukleotida mRNA molekule. Metilacija prvega nukleotida da strukturo kape-1, metilacija obeh pa strukturo kape-2. Metilacija je ključnega pomena pri izogibanju imunskega odziva na tujo virusno RNA. Reakcijo metiliranja opravlja encim riboza 2’-''O''- metiltransferaza. Pri koronavirusih jo sestavljata dva nestrukturna proteina, nsp16 (2’-''O''-metiltransferaza) in nsp10 (kofaktor 2’-''O''-metiltransferaze). Nsp16 vsebuje vezavno mesto za S-adenozil-L-metionin (SAM), ki je donor metilne skupine, nsp10 pa sodeluje pri nastanku aktivnega mesta in stabilizaciji verige mRNA. Za potek reakcije je nujno potrebna tvorba kompleksa teh dveh nestrukturnih proteinov. Substrat kompleksa je s cap-0 zaključena struktura mRNA molekule. Kompleks kaže največjo aktivnost, če je substrat z adeninom zaključena RNA molekula (m7-GpppA-RNA) in nižjo aktivnost ob prisotnosti RNA z gvaninom kot iniciacijskim nukleotidom. Veriga RNA mora biti dovolj dolga, da se lahko ugodno veže na kompleks encima; na kapo-0 vezan le en nukleotid ne sproži reakcije.

==Detekcija tuje RNA v celicah==

Vsak virus v svojem življenjskem ciklu sprosti svoj genetski material v notranjost celice gostitelja, zato so organizmi razvili različne načine za detekcijo tujega dednega materiala v svojih celicah. Tuje RNA molekule zaznavajo receptorji družine RLR (ang. ''RIG-I like receptors''), ki obsega citosolne proteine RIG-I, MDA5 in LGP2. RLR receptorji so zgrajeni iz več domen, helikazne, C-končne in več CARD (ang. ''caspase activation and recruitment''). Vezava ustrezne mRNA na receptor sproži signalno kaskado več kinaz, kar privede v sintezo transkripcijskih faktorjev za transkripcijo genov interferonov tipa ena. Interferoni-I so signalni peptidi, ki se sprostijo iz celice in delujejo avtokrino in parakrino z vezavo na receptorje interferonov-I (IFNAR). Vezava povzroči signalno pot JAK kinaz, ki vodi v izražanje transkripcijskih faktorjev za sintezo genov, ki upočasnijo transkripcijske procese virusov v celici. Molekula RNA, ki jo prepozna RLR receptor, se konča z dvema ali tremi fosfatnimi skupinami na 5'-koncu in ne sme biti metilirana. Pravilna vezava molekule RNA na receptor povzroči premik CARD domen, ki se lahko vežejo na proteine, ki sprožijo signalno pot. Celična mRNA je metilirana in se ne more vezati na RLR. Veliko RNA virusov (z izjemo koronavirusov) nima metilirane kape, zato njihov genetski material prepoznajo RLR receptorji in sprožijo imunski odziv.

==Literatura==

1. Chen, Y., & Guo, D. (2016). Molecular mechanisms of coronavirus RNA capping and methylation. Virologica Sinica, 31(1), 3–11. https://doi.org/10.1007/s12250-016-3726-4

2. Decroly, E., Ferron, F., Lescar, J., & Canard, B. (2012). Pre-mRNA splicing Conventional and unconventional mechanisms for capping viral mRNA. Nature Reviews Microbiology, 10, 51–65. https://doi.org/10.1038/nrmicro2675

3. Ogino, T., & Banerjee, A. K. (2007). Unconventional Mechanism of mRNA Capping by the RNA-Dependent RNA Polymerase of Vesicular Stomatitis Virus. Molecular Cell, 25(1), 85–97. https://doi.org/10.1016/j.molcel.2006.11.013

4. Chen, Y., Su, C., & Ke, M. (2011). Biochemical and Structural Insights into the Mechanisms of SARS Coronavirus RNA Ribose 29-O-Methylation by nsp16/nsp10 Protein Complex. PloS Pathog, 7(10). https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1002294

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Molekularna biologija koronavirusov

2021-05-11T15:40:54Z

Gregor Strniša:

Seminarji pri Molekularni biologiji v študijskem letu 2020/21 obravnavajo sorazmerno ozko področje koronavirusov, vendar je to glede na pandemijo virusa SARS-CoV-2 zelo aktualna tema in zato smiselna, da jo podrobneje obdelamo. Za seminarje sem določil 15 poglavij, ki temeljijo na vsaj enem preglednem članku, objavljenem od leta 2015 naprej. Ti članki naj vam bodo izhodišče za pripravo, dopolnite pa jih z novejšimi podatki, predvsem glede povzročitelja bolezni kovid-19.

Vsako poglavje obdelajo praviloma trije študenti. Vsaka skupina mora pripraviti povzetek seminarja v obsegu 1200-1500 besed in ga objaviti na tem wikiju. Povzetek ne vsebuje slikovnega gradiva, lahko pa vključuje povezave do slik in videov na spletu. Navedite do 5 ključnih virov (ti ne štejejo v vsoto 1200 besed), ki ste jih uporabili.

Vsaka skupina mora objaviti povzetek seminarja najkasneje 24 h pred začetkom seminarjev. Kateri del povzetka je napisal kdo, navedite v zavihku 'discussion'.

Pripravite tudi predstavitev, dolgo pribl. 20 minut (tolerančni okvir je 18-22 min.), temu pa bo sledila razprava, dolga 5-10 min. Vsak član skupine mora predstaviti en del seminarja, pri čemer mora biti delo enakomerno razdeljeno med vse. Osredotočite se na osnovno temo, ki ste si jo izbrali in vključite čim manj splošnega uvoda. Ne opisujte potekov bolezni, če to ni nujno zaradi povezave z biokemijskimi značilnostmi virusov! Glede vsebine predstavitve se posvetujte s kolegi, ki bodo predstavljali sorodna poglavja, tako da bo čim manj prekrivanj.

Seminarji se bodo začeli 4.5.2021 po razporedu, ki bo objavljen v spletni učilnici.

Vsebina seminarjev je izpitna snov. Odgovori na vprašanja iz snovi seminarjev predstavljajo ~10 % končnih točk izpita (2-3 vprašanja od ~30).

Poglavja za seminarje so:
# Patogeni koronavirusi: izvor in evolucija (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/30531947/)
# Molekularni vidiki koronavirusov (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/32661197/)
# Način pakiranja RNA pri koronavirusih (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/31505321/)
# Struktura in funkcija končnih zaporedij koronavirusne genomske RNA (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/25736566/)
# Struktura genoma in replikacija RNA pri koronavirusih (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/31967327/ in https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/32833200/)
# Kontinuirna in diskontinuirna sinteza RNA pri koronavirusih (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/26958916/)
# Vloga gostiteljskih faktorjev pri replikaciji koronavirusne RNA (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/28643204/)
# Natančnost replikacije koronavirusne RNA (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/21593585/)
# Mehanizmi dodajanja kape in metilacije koronavirusne RNA (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/26847650/)
# Translacijski procesi pri sintezi koronavirusnih proteinov (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/22535777/ in https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/27712623/)
# Odgovor na stres in uravnavanje translacije pri koronavirusih (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/27384577/)
# RNA-elementi s cis-regulacijsko aktivnostjo pri koronavirusih (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/27712622/)
# Vloga nestrukturnega proteina 1 pri izražanju genov ob okužbi s koronavirusom (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/25432065/
# Vloga koronavirusne endonukleaze pri izogibanju protivirusnemu odgovoru (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/29307596/)
# Mehanizem fuzije koronavirusne membrane kot tarča za protivirusna zdravila (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/32272173/)
----

Za seminar se prijavite tako, da se vpišete v oklepaj za naslovom seminarja, tako kot je prikazano pri izmišljenem ničtem seminarju.
Seminarje bomo izvedli v enakem vrstnem redu, kot so navedeni zgoraj.

0. Analiza koronavirusov v Gallusovi dvorani Cankarjevega doma (Jasna Briški, Timi Pegan, Sanja Todorović) 

# [[Patogeni koronavirusi: izvor in evolucija]] (Nikola Janakievski, Stefanija Ivanova) 
# [[Molekularni vidiki koronavirusov]] (Neža Leskovar, Iva Matić, Anja Moškrič) 
# [[Način pakiranja RNA pri koronavirusih]] (Timotej Sotosek, Erik Putar, Eva Vene) 
# [[Struktura in funkcija končnih zaporedij koronavirusne genomske RNA]] (Špela Kladnik, Nika Malečkar, Eva Kanalec)
# [[Struktura genoma in replikacija RNA pri koronavirusih]] (Luka Šegota, Maruša Sernc, Luka Stanković)
# [[Kontinuirna in diskontinuirna sinteza RNA pri koronavirusih]] (Jakob Tomšič, Ana Pervanja, Zala Perko)
# [[Vloga gostiteljskih faktorjev pri replikaciji koronavirusne RNA]] (Nika Bedrač, Tinkara Božič, Maja Kobal) 
# Natančnost replikacije koronavirusne RNA (Evgen Kozole, David Verdel, Petra Sintič)
# [[Mehanizmi dodajanja kape in metilacije koronavirusne RNA]] (Nika Perko, Gregor Strniša, Nika Tomsič)
# Translacijski procesi pri sintezi koronavirusnih proteinov (Bor Krajnik, Aljaž Simonič, Luka Hafner)
# Odgovor na stres in uravnavanje translacije pri koronavirusih (Aleksandra Rauter, Nika Banovšek, Laura Unuk, Katharina Carola Pavlin)
# RNA-elementi s cis-regulacijsko aktivnostjo pri koronavirusih (Jan Bregar, Ajda Beltram)
# Vloga nestrukturnega proteina 1 pri izražanju genov ob okužbi s koronavirusom (Srna Anastasovska, Mateja Milosevic)
# Vloga koronavirusne endonukleaze pri izogibanju protivirusnemu odgovoru (Veronika Bračič, Ela Bizjak, Rebeka Jerina)
# Mehanizem fuzije koronavirusne membrane kot tarča za protivirusna zdravila (Manca Pirc, Vid Dobrovoljc, Rahela Repina)

Ko boste pripravljali povzetek, naslov teme na tem, drugem, seznamu povežite z novo wiki stranjo, ki bo vsebovala povzetek. Na koncu besedila povzetka (pod viri) v novo vrstico dodajte oznako: <nowiki>[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]</nowiki> . Zgornji seznam bo po zaključku seminarjev izbrisan. Vire boste navedli na koncu vsakega povzetka, zato za serijo seminarjev ne bodo več pomembni.

Primer, kako so bili urejeni seminarji v prejšnjih letih, si lahko ogledate na strani [[Struktura kromatina]] (2013/14).

#[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Herpesvirusi_in_sorodni_dsDNA_virusi Herpesvirusi in sorodni dsDNA virusi] (Veronika Razpotnik, Ines Medved, Andrej Ivanovski)

Mehanizmi dodajanja kape in metilacije koronavirusne RNA

2021-05-11T15:40:23Z

Gregor Strniša:

==Uvod==
Zorenje mRNA zajema več različnih kemijskih modifikacij in med drugim tudi dodajanje kape na 5’-koncu verige. Ta proces ima pomembno vlogo pri:
*povečevanju stabilnosti verige mRNA, saj jo kapa ščiti pred napadi eksonukleaz
*izvozu verige iz jedra, saj se nanjo lažje vežejo proteini, ki omogočajo transport
*izrezovanju 5’-introna
*pospeševanju translacije, saj spodbuja vezavo iniciacijskega faktorja (eIF4E).
Če molekuli mRNA omenjena struktura manjka, se bo razgradila v citoplazmi.

==Proces dodajanja kape==

Struktura kape na 5’-koncu mRNA nastane kotranskripcijsko in preide več encimskih reakcij. Proces se začne, ko je sintetiziranih že približno 20 nukleotidov. Najprej encim RNA-5’-trifosfataza (TPaza) z iniciacijskega nukleotida odstrani γ-fosfat. Nato se naslednji encim RNA gvanililtransferaza (GTaza) kovalentno poveže z α-fosfatom molekule GTP. Sprosti se molekula pirofosfata (PPi) in nastane intermediatni kompleks Encim-GMP. Ta kompleks omogoči prenos molekule GMP na prej omenjeni iniciacijski nukleotid. Produkt spojitve je struktura kape na 5’-koncu mRNA. Zatem sledi metilacija gvaninskega dela kape na mestu N7, kar omogoči encim (gvanin-N7)-metiltransferaza (N7-MTaza).

Opisani proces velja za tvorbo kape-0, za katerega se predvideva, da poteka tudi pri koronavirusih. Rečemo mu tudi konvencionalni mehanizem dodajanja kape. Pri višjih evkariontih pa se proces navadno na tej stopnji še ne ustavi. Struktura kapa-0 preide še eno ali pa največ dve metilaciji. Če se metilira mesto 2’-O na riboznem delu prvega nukleotida (tj. naslednji nukleotid od iniciacijskega), potem taki strukturi pravimo kapa-1. Če pa se metilirata mesti 2'-O na riboznem delu prvega in drugega nukleotida, taki strukturi pravimo kapa-2. Proces metilacije omogoči encim 2'-''O''-metiltransferaza (2'-''O''-MTaza). Tako encim 2'-''O''-MTaza kot N7-MTaza katalizirata prenos metilne skupine z metilnega donorja S-adenozil-L-metionina (SAM). Stranski produkt teh dveh kataliziranih reakcij je S-adenozil-L-homocistein (SAH).

Kaj je vloga različnih kap? Kapa-0 prepreči, da bi 5'-konec verige mRNA sprožil imunski odziv gostiteljske celice in igra pomembno vlogo pri replikaciji virusnega genoma, saj izboljša translacijo virusnih mRNA. Kapa-1 omogoči, da imunski sistem ne more prepoznati molekule mRNA. Vloga kape-2 trenutno ni znana.

==Kape pri RNA virusih==

Virusi, ki okužijo evkariontske celice, so razvili različne strategije tvorbe kap lastnih molekul mRNA. DNA virusi in retrovirusi se podvajajo v jedru in pri tvorjenju kape-0 izkoristijo molekule gostiteljske celice. Številni virusi, ki se podvajajo v citoplazmi in nimajo dostopa do molekul, potrebnih za dodajanje kape, so v svoj genom vgradili zapise za lastne aparate dodajanja kap. Čeprav sta molekulska organizacija in biokemijski mehanizem tvorjenja kape v virusih različna, so si končne strukture kap podobne.

Negativno usmerjeni RNA virusi iz družin ''Bunyaviridae'' in ''Orthomyxoviridae'' so razvili edinstven ''cap-snatching'' mehanizem. Ta omogoča prevzem kap gostiteljskih molekul mRNA. Mehanizem deluje tako, da virusna od RNA odvisna RNA polimeraza (RdRp) preko podenote PB2 veže 5’-konec gostiteljske mRNA, ki že ima kapo. Polimeraza RdRp pa ima tudi endonukleazno aktivnost, ki ji omogoči, da odcepi kratek del verige mRNA, na katerem je kapa. Odcepljen košček verige, ki na 5'-koncu vsebuje kapo, deluje kot primer (ang. ''primer'') za virusno polimerazo RdRp. Tako lahko poteče transkripcija virusnega zapisa, kjer je matrična veriga negativna virusna RNA. RdRp sintetizira komplementarno negativno verigo.

Razlika med mehanizmom pri alfavirusih in konvencionalnim mehanizmom je ta, da se GTP metilira na mestu N7 še preden se prenese na iniciacijski nukleotid, ki mu je bil γ-fosfat že odstranjen.

Za virus vezikularnega stomatitisa (VSV) predvidevajo, da se monofosforiliran 5’-konec mRNA verige veže na GDP. Proces naj bi deloval tako, da GTPazna aktivnost v RdRp povzroči nastanek GDP iz GTP. Ta GDP ostane vezan v RdRp in bo deloval kot akceptor mRNA. Med transkripcijo nascentni transkript interagira z aktivnim mestom poliribonukleotidiltransferazne domene, ki se nahaja v RdRp. Posledica interakcije je odcep PPi in nastanek 5’-monofosforiliranega konca verige mRNA, ki se še vedno drži RdRp. Aktivnost poliribonukleotidiltransferazne domene omogoči prenos verige mRNA na GDP. Tako nastane kapa na verigi mRNA. Nato se veriga enako metilira kot pri konvencionalnem mehanizmu.

==RNA trifosfataza ==

RNA trifosfataza (TPaza) je encim, ki je odgovoren za začetek postavljanja kape na 5’-konec koronavirusnega RNA. Njegova funkcija je cepiti fosfatno vez med fosfatoma β in γ prvega (iniciacijskega) nukleotida na 5’-koncu. Tako iz 5’-pppN konca nastane difosfatni 5’-ppN konec. Aktivnost encima so preverili s poskusom na kvasovkah seva YBS20 (''cet1''), ki v svojem genomu nimajo kromosomskega lokusa CET1 in so namesto njega vključili virusni gen za rast, ki vsebuje zapis za RNA TPazo. Delitev kvasovk je bila tako odvisna le od delovanja virusne TPaze. Izkazalo se je, da kvasovke ne morejo uporabljati virusnega gena zaradi različne organizacije in mehanizmov postavljanja kape.

Podobno aktivnost so opazili pri nestrukturnem proteinu nsp13. Nsp13 je povezan s helikazno aktivnostjo pri koronavirusih, in sicer deluje kot NTPaza. Ta tako kot TPaza cepi fosfatno skupino. Splošno mnenje je, da naj bi nsp13 imel tudi aktivno funkcijo v postavljanju kape, vendar njegova vloga še čaka na eksperimentalne dokaze.

==RNA gvanilil transferaza==

Odcep fosfata v prejšnji fazi predstavlja nastanek potencialnega mesta za vezavo nove molekule. GTaza je odgovorna za nastanek kovalentne vezi med 5’-koncem mRNA in GMP (pri konvencionalnem nastanku kape) oz. metiliranim GMP (pri vrsti alfavirusov). Tako nastane jedro kape (GpppN oz. m7GpppN). Podobno kot pri merjenju aktivnosti TPaze, so pregledali aktivnost GTaze na sevu kvasovk YBS2 (''ceg1''), ki nimajo kromosomskega lokusa CEG1, ki kodira GTaze kvasovk. Noben encim ni kazal GTazne aktivnosti. Dokazov za obstoj koronavirusne GTaze torej še ni.

==Gvanin-N7 metiltransferaza==

GVANIN-N7 METILTRANSFERAZA (N7-MTaza) je tretji encim, ki sodeluje pri sestavljanju kape na virusnih mRNA. Njegova funkcija je metilacija gvanilata, ki ga je GTaza dodala. Nastane tako imenovana struktura kape-0 (m7GpppN). Metilacija stabilizira strukturo kape in prepreči odcep gvanilata. Pri poskusu na kvasovkah YBS40 oz. sevom, ki nima kodiranih encimov MTaze, se je izkazalo, da nsp14 (N7-metiltransferaza in eksoribonukleaza) spodbuja rast celice in lahko prevzame funkcijo N7-MTaze. MTaza in nsp14 torej predstavljata potencialno tarčo za razvitje različnih protivirusnih zdravil.

Nsp14 je edina eksonukleaza, ki jo kodirajo RNA virusi, in lahko sodeluje pri kontrolnem branju pri prepisovanju. Poskusi kažejo, da se nsp14 nespecifično veže na mRNA in deluje kot MTaza. Nadaljnje študije kažejo, da je sposoben metiliranja različnih substratov, med katerimi so tudi GTP, dGTP in drugi analogi začetnih kap. Njegovo delovanje se poveča s prisotnostjo kofaktorja nsp10, s katerim tvori kompleks v stehiometriji 1:1, medtem ko prisotnost nsp16 ne vpliva na njegovo delovanje. Eksonukleazno domeno nsp14 predstavlja prvih 287 aminokislin, ki tvorijo katalitični motiv DEEDh. N7-MTazna domena je sestavljena iz β struktur in motivom cinkovega prsta, ki pa ni potreben za aktivnost encima. Na to domeno se veže molekula SAM, ki omogoči metilacijo.

==Riboza 2’-''O''- metiltransferaza==

Zadnji korak v nastanku kape je metiliranje strukture kape-0 na 2’-O prvega in drugega nukleotida mRNA molekule. Metilacija prvega nukleotida da strukturo kape-1, metilacija obeh pa strukturo kape-2. Metilacija je ključnega pomena pri izogibanju imunskega odziva na tujo virusno RNA. Reakcijo metiliranja opravlja encim riboza 2’-''O''- metiltransferaza. Pri koronavirusih jo sestavljata dva nestrukturna proteina, nsp16 (2’-''O''-metiltransferaza) in nsp10 (kofaktor 2’-''O''-metiltransferaze). Nsp16 vsebuje vezavno mesto za S-adenozil-L-metionin (SAM), ki je donor metilne skupine, nsp10 pa sodeluje pri nastanku aktivnega mesta in stabilizaciji verige mRNA. Za potek reakcije je nujno potrebna tvorba kompleksa teh dveh nestrukturnih proteinov. Substrat kompleksa je s cap-0 zaključena struktura mRNA molekule. Kompleks kaže največjo aktivnost, če je substrat z adeninom zaključena RNA molekula (m7-GpppA-RNA) in nižjo aktivnost ob prisotnosti RNA z gvaninom kot iniciacijskim nukleotidom. Veriga RNA mora biti dovolj dolga, da se lahko ugodno veže na kompleks encima; na kapo-0 vezan le en nukleotid ne sproži reakcije.

==Detekcija tuje RNA v celicah==

Vsak virus v svojem življenjskem ciklu sprosti svoj genetski material v notranjost celice gostitelja, zato so organizmi razvili različne načine za detekcijo tujega dednega materiala v svojih celicah. Tuje RNA molekule zaznavajo receptorji družine RLR (ang. ''RIG-I like receptors''), ki obsega citosolne proteine RIG-I, MDA5 in LGP2. RLR receptorji so zgrajeni iz več domen, helikazne, C-končne in več CARD (ang. ''caspase activation and recruitment''). Vezava ustrezne mRNA na receptor sproži signalno kaskado več kinaz, kar privede v sintezo transkripcijskih faktorjev za transkripcijo genov interferonov tipa ena. Interferoni-I so signalni peptidi, ki se sprostijo iz celice in delujejo avtokrino in parakrino z vezavo na receptorje interferonov-I (IFNAR). Vezava povzroči signalno pot JAK kinaz, ki vodi v izražanje transkripcijskih faktorjev za sintezo genov, ki upočasnijo transkripcijske procese virusov v celici. Molekula RNA, ki jo prepozna RLR receptor, se konča z dvema ali tremi fosfatnimi skupinami na 5'-koncu in ne sme biti metilirana. Pravilna vezava molekule RNA na receptor povzroči premik CARD domen, ki se lahko vežejo na proteine, ki sprožijo signalno pot. Celična mRNA je metilirana in se ne more vezati na RLR. Veliko RNA virusov (z izjemo koronavirusov) nima metilirane kape, zato njihov genetski material prepoznajo RLR receptorji in sprožijo imunski odziv.

==Literatura==

1. Chen, Y., & Guo, D. (2016). Molecular mechanisms of coronavirus RNA capping and methylation. Virologica Sinica, 31(1), 3–11. https://doi.org/10.1007/s12250-016-3726-4

2. Decroly, E., Ferron, F., Lescar, J., & Canard, B. (2012). Pre-mRNA splicing Conventional and unconventional mechanisms for capping viral mRNA. Nature Reviews Microbiology, 10, 51–65. https://doi.org/10.1038/nrmicro2675

3. Ogino, T., & Banerjee, A. K. (2007). Unconventional Mechanism of mRNA Capping by the RNA-Dependent RNA Polymerase of Vesicular Stomatitis Virus. Molecular Cell, 25(1), 85–97. https://doi.org/10.1016/j.molcel.2006.11.013

4. Chen, Y., Su, C., & Ke, M. (2011). Biochemical and Structural Insights into the Mechanisms of SARS Coronavirus RNA Ribose 29-O-Methylation by nsp16/nsp10 Protein Complex. PloS Pathog, 7(10). https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1002294

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Mehanizmi dodajanja kape in metilacije koronavirusne RNA

2021-05-11T15:31:12Z

Gregor Strniša:

Mehanizmi dodajanja kape in metilacije koronavirusne RNA

2021-05-11T15:24:18Z

Gregor Strniša:

Mehanizmi dodajanja kape in metilacije koronavirusne RNA

2021-05-11T15:22:15Z

Gregor Strniša: New page: ==Uvod== Zorenje mRNA zajema več različnih kemijskih modifikacij in med drugim tudi dodajanje kape na 5’-koncu verige. Ta proces ima pomembno vlogo pri: *povečevanju stabilnosti verig...

Molekularna biologija koronavirusov

2021-03-26T10:02:54Z

Gregor Strniša:

Seminarji pri Molekularni biologiji v študijskem letu 2020/21 obravnavajo sorazmerno ozko področje koronavirusov, vendar je to glede na pandemijo virusa SARS-CoV-2 zelo aktualna tema in zato smiselna, da jo podrobneje obdelamo. Za seminarje sem določil 15 poglavij, ki temeljijo na vsaj enem preglednem članku, objavljenem od leta 2015 naprej. Ti članki naj vam bodo izhodišče za pripravo, dopolnite pa jih z novejšimi podatki, predvsem glede povzročitelja bolezni kovid-19.

Vsako poglavje obdelajo praviloma trije študenti. Vsaka skupina mora pripraviti povzetek seminarja v obsegu 1200-1500 besed in ga objaviti na tem wikiju. Povzetek ne vsebuje slikovnega gradiva, lahko pa vključuje povezave do slik in videov na spletu. Navedite do 5 ključnih virov (ti ne štejejo v vsoto 1200 besed), ki ste jih uporabili.

Vsaka skupina mora objaviti povzetek seminarja najkasneje 24 h pred začetkom seminarjev. Kateri del povzetka je napisal kdo, navedite v zavihku 'discussion'.

Pripravite tudi predstavitev, dolgo pribl. 20 minut (tolerančni okvir je 18-22 min.), temu pa bo sledila razprava, dolga 5-10 min. Vsak član skupine mora predstaviti en del seminarja, pri čemer mora biti delo enakomerno razdeljeno med vse. Osredotočite se na osnovno temo, ki ste si jo izbrali in vključite čim manj splošnega uvoda. Ne opisujte potekov bolezni, če to ni nujno zaradi povezave z biokemijskimi značilnostmi virusov! Glede vsebine predstavitve se posvetujte s kolegi, ki bodo predstavljali sorodna poglavja, tako da bo čim manj prekrivanj.

Seminarji se bodo začeli 4.5.2021 po razporedu, ki bo objavljen v spletni učilnici.

Vsebina seminarjev je izpitna snov. Odgovori na vprašanja iz snovi seminarjev predstavljajo ~10 % končnih točk izpita (2-3 vprašanja od ~30).

Poglavja za seminarje so:
# Patogeni koronavirusi: izvor in evolucija (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/30531947/) (Nikola Janakievski, Stefanija Ivanova, )
# Molekularni vidiki koronavirusov (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/32661197/)
# Način pakiranja RNA pri koronavirusih (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/31505321/)
# Struktura in funkcija končnih zaporedij koronavirusne genomske RNA (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/25736566/)
# Struktura genoma in replikacija RNA pri koronavirusih (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/31967327/ in https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/32833200/)(Luka Šegota, Maruša Sernc, Luka Stanković)

# Kontinuirna in diskontinuirna sinteza RNA pri koronavirusih (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/26958916/)
# Vloga gostiteljskih faktorjev pri replikaciji koronavirusne RNA (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/28643204/)(Nika Bedrač, Tinkara Božič, Maja Kobal)
# Natančnost replikacije koronavirusne RNA (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/21593585/)
# Mehanizmi dodajanja kape in metilacije koronavirusne RNA (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/26847650/)
# Translacijski procesi pri sintezi koronavirusnih proteinov (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/22535777/ in https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/27712623/)
# Odgovor na stres in uravnavanje translacije pri koronavirusih (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/27384577/)
# RNA-elementi s cis-regulacijsko aktivnostjo pri koronavirusih (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/27712622/)
# Vloga nestrukturnega proteina 1 pri izražanju genov ob okužbi s koronavirusom (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/25432065/
# Vloga koronavirusne endonukleaze pri izogibanju protivirusnemu odgovoru (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/29307596/)
# Mehanizem fuzije koronavirusne membrane kot tarča za protivirusna zdravila (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/32272173/)
----

Za seminar se prijavite tako, da se vpišete v oklepaj za naslovom seminarja, tako kot je prikazano pri izmišljenem ničtem seminarju.
Seminarje bomo izvedli v enakem vrstnem redu, kot so navedeni zgoraj.

0. Analiza koronavirusov v Gallusovi dvorani Cankarjevega doma (Jasna Briški, Timi Pegan, Sanja Todorović) 

# Patogeni koronavirusi: izvor in evolucija (Nikola Janakievski, Stefanija Ivanova, )
# Molekularni vidiki koronavirusov
# Način pakiranja RNA pri koronavirusih
# Struktura in funkcija končnih zaporedij koronavirusne genomske RNA
# Struktura genoma in replikacija RNA pri koronavirusih
# Kontinuirna in diskontinuirna sinteza RNA pri koronavirusih (Jakob Tomšič, Ana Pervanja, Zala Perko)
# Vloga gostiteljskih faktorjev pri replikaciji koronavirusne RNA
# Natančnost replikacije koronavirusne RNA
# Mehanizmi dodajanja kape in metilacije koronavirusne RNA (Nika Perko, Gregor Strniša, Nika Tomsič)
# Translacijski procesi pri sintezi koronavirusnih proteinov (Bor Krajnik,)
# Odgovor na stres in uravnavanje translacije pri koronavirusih
# RNA-elementi s cis-regulacijsko aktivnostjo pri koronavirusih (Jan Bregar, Ajda Beltram)
# Vloga nestrukturnega proteina 1 pri izražanju genov ob okužbi s koronavirusom
# Vloga koronavirusne endonukleaze pri izogibanju protivirusnemu odgovoru (Veronika Bračič, Ela Bizjak)
# Mehanizem fuzije koronavirusne membrane kot tarča za protivirusna zdravila (Manca Pirc)

Ko boste pripravljali povzetek, naslov teme na tem, drugem, seznamu povežite z novo wiki stranjo, ki bo vsebovala povzetek. Na koncu besedila povzetka (pod viri) v novo vrstico dodajte oznako: <nowiki>[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]</nowiki> . Zgornji seznam bo po zaključku seminarjev izbrisan. Vire boste navedli na koncu vsakega povzetka, zato za serijo seminarjev ne bodo več pomembni.

Primer, kako so bili urejeni seminarji v prejšnjih letih, si lahko ogledate na strani [[Struktura kromatina]] (2013/14).

#[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Herpesvirusi_in_sorodni_dsDNA_virusi Herpesvirusi in sorodni dsDNA virusi] (Veronika Razpotnik, Ines Medved, Andrej Ivanovski)

BIO2 Povzetki seminarjev 2020

2020-10-23T15:02:48Z

Gregor Strniša: /* POVZETKI SEMINARJEV BIOKEMIJA 2020/21 */

= POVZETKI SEMINARJEV BIOKEMIJA 2020/21 =

==Jan Bregar - Protein retinoblastoma==

Protein retinoblastoma (pRb) je eden ključnih proteinov, ki regulirajo celični cikel in njegova inaktivacija lahko povzroči različna bolezenska stanja. Ta protein regulira ključni prehod iz G1 v S fazo celičnega cikla s pomočjo interakcij z družino E2F, ki je vrsta transkripcijskih faktorjev celičnega cikla. Retinoblastoma protein (pRb) nadzoruje tudi izstop celice iz celičnega cikla. Njeno aktivnost regulira več mehanizmov, ki zaznavajo znotraj- in zunajcelične signale, ki blokirajo ali dovoljujejo fosforilacijo. pRb fosforilirajo od ciklina odvisne kinaze (Cdk-ji) in s tem protein Rb bodisi inaktivirajo ali pa rahlo spremenijo njegove lastnosti, protein pa vseeno ohrani svojo funkcijo. Odkrili so tudi, da pRb regulira apoptozo s pomočjo enakih interakcij s transkripcijskimi faktorji E2F. To, da je pRb vpleten pri apoptozi, popolno dopolnjuje pRb kot pomemben določevalec usode celice. Med trajanjem celičenga cikla je pRb inaktiviran, kar povzroči, da je celica bolj občutljiva na apoptotske stimuluse. Regulacijo apoptoze lahko onesposobijo nekateri virusi, ki s svojimi onkoproteini povzročijo napake v delovanju proteina Rb, kar lahko predstavlja tveganje za organizem. pRb – E2F kompleksi imajo pomembno vlogo pri regulaciji transkripcije genov, ki so vključeni v diferenciaciji in razvoju.

==Ajda Beltram - Struktura in dinamika signalnih komplekov GPCR==

Receptorji sklopljeni z G-proteinom (GPCR) so transmembranski proteini, ki kot odgovor na ligande regulirajo veliko signalnih poti preko heterotrimernih G-proteinov ali pa preko fosforilacije receptorja s kinazo GRK in arestinov. Vendar ti proteini ne obstajajo le v aktivirani ali neaktivirani obliki, pač pa imajo veliko konformacijskih stanj, ki vsaka sproži svojo signalno pot. Mene je zanimala podrobna razlaga konformacijskih sprememb, ki se zgodijo med prenosom signala. Za aktivacijo G-proteinov je potrebna zamenjava GDP z GTP, kjer igra ključno vlogo razcep domen podenote α G-proteina in destabilizacija vezavnega mesta za nukleotid na Ras-domeni podenote α, kar so posledice konformacijskih sprememb, ki jih povzroči vezava na receptor. Različni ligandi, ki se vežejo na receptorje, pa lahko vplivajo tudi na afiniteto G-proteina do GDP. Kompleksi receptor-G-protein, ki nastanejo z vezavo popolnih agonistov, imajo manjšo afiniteto do GDP, kot tisti, ki so nastali z vezavo delnih agonistov. Pri arestinih pa so prav tako prišli do novega spoznanja. Aktivacija arestinov je večinoma prikazana kot proces iz dveh delov in sicer vezave na fosforiliran C-rep receptorja in nato vezave na jedro receptorja, vendar pa so odkrili, da lahko obe vezavi posebej aktivirata arestin. To nakazuje na to, da verjetno obstaja veliko različnih kompleksov arestina in receptorja, ki regulirajo vsak svojo signalno pot.

==Anja Moškrič - Presinaptični kalcijevi kanalčki kot specializiran nadzor za sproščanje nevrotransmitorjev==

Signalizacija živčnih celic med drugim poteka s prenosom nevrotransmitorjev preko sinaps. Pri kemični sinapsi gre za pretvarjanje električnih impulzov v eksocitotsko sprostitev nevrotransmitorja (npr. glutamat, GABA, epinefrin, norepinefrin). Pri pretvarjanju signala imajo ključno vlogo napetostno uravnavani kalcijevi ionski kanalčki (Cav), v presinaptičnem predelu. Ti, kot odgovor na depolarizacijo nevrona, usmerjajo kalcijeve ione v notranjost celice in posledično sprožijo fuzijo mešička (z nevrotransmitorjem) s presinaptično membrano. Zgrajeni so iz več podenot, od teh je glavna α1, ki tvori poro za pretok ionov. Podenoti α2δ in β pa regulirata lastnosti. Kanalčke glede na obliko glavne podenote klasificiramo v 3 večje skupine: Cav1, Cav2 in Cav3. V večini sinaps so prisotni kanalčki iz družine Cav2. Da eksocitoza lahko poteče hitro in učinkovito, morajo biti Cav locirani znotraj aktivne regije presinaptične membrane, v bližini mesta eksocitoze. Slednjo kalcijevi kanalčki regulirajo preko različnih proteinov. Pomembnejši predstavnik je družina proteinov RIM (z rab3 vezavne molekule). Ti se na kanalček vežejo z RIM vezavnimi proteini (RBP). Z njimi asociira tudi protein munc13, ki je v membrani vezikla in nevrona vezani s proteini SNARE. Ti so mediatorji pri fuziji membran. Delovanje kanalčka inaktivirajo procesi, kot sta od napetosti odvisni mehanizem in od kalcija odvisen mehanizem, ki je povezan s kalmodulinom.

==Gregor Strniša - Načini aktivacije GPCR==

GPCR, oziroma z G proteinom sklopljeni receptorji, so transmembranski proteini, ki s svojim delovanjem vplivajo na dogajanje v celici. Zaradi vezave liganda na njihovo zunajcelično stran se jim spremeni konformacija in omogoči prenos signala preko različnih signalnih molekul. Signal se preko različnih G proteinov in β-arrestinov prenaša do drugih proteinov v celici. Kmalu po odkritju GPCR se je izkazalo, da vsi ne delujejo po istem principu. Nove raziskovalne metode so omogočile napredek na področju vizualizacije molekul in njihovega sledenja v celici. Tako so znanstveniki prišli do odkritja petih novih metod aktivacije GPCR, ki lažje razložijo delovanje receptorjev. Med seboj so si različne, a se lahko pogosto prekrivajo in dopolnjujejo. GPCR omogočijo več možnosti odgovora na določen ligand in njegovo koncentracijo. Načini aktivacije, predstavljeni v moji seminarski nalogi, so pristranska aktivacija, znotrajcelična aktivacija, dimerizacijska aktivacija, transaktivacija in dvofazna aktivacija. Posamezen receptor navadno deluje na več načinov. Ob posameznem načinu so podani primeri receptorjev in njihovega delovanja. Z razumevanjem načinov njihove aktivacije se odprejo nove možnosti razvoja zdravil, ki bi delovale preko GPCR, ali vplivale na njihove signalne poti.

BIO2 Seminar 2020

2020-10-15T15:49:21Z

Gregor Strniša: /* Seznam seminarjev */

= Biokemijski seminar =
doc. dr. Gregor Gunčar, K2.022

== Seznam seminarjev ==
{| {{table}}
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''ime in priimek'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''poglavje'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''naslov seminarja'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''recenzent 1'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''recenzent 2'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''datum oddaje'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''datum recenzije'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''datum predstavitve'''
|-
| Ajda Beltram||12||Zgradba in dinamika signalnih kompleksov GPCR||Luka Hafner||Tinkara Božič||16/10/20||19/10/20||21/10/20
|-
| Jan Bregar||12||||Nika Bedrač||Martin Stanonik||16/10/20||19/10/20||21/10/20
|-
| Anja Moškrič||12|| Presinaptični kalcijevi kanalčki kot specializiran nadzor za sproščanje nevrotransmiterjev||Srna Anastasovska||Luka Stanković||16/10/20||19/10/20||21/10/20
|-
| Gregor Strniša||12||Načini aktivacije GPCR||Manca Pirc||Ana Pervanja||23/10/20||26/10/20||28/10/20
|-
| Vid Dobrovoljc||12||||Maruša Sernc||Nika Banovšek||23/10/20||26/10/20||28/10/20
|-
| Nikola Janakievski||12||||Ajda Beltram||Aljaž Simonič||23/10/20||26/10/20||28/10/20
|-
| Rebeka Jerina||12||||Jan Bregar||Luka Hafner||30/10/20||02/11/20||04/11/20
|-
| Eva Vene||12||Povezava vnetne bolečine z vezavo kapsaicina na TRPV1||Anja Moškrič||Nika Bedrač||30/10/20||02/11/20||04/11/20
|-
| Zala Perko||12||||Gregor Strniša||Srna Anastasovska||30/10/20||02/11/20||04/11/20
|-
| Erik Putar||14-15||||Nikola Janakievski||Manca Pirc||06/11/20||09/11/20||11/11/20
|-
| Iva Matić||14-15||||Rebeka Jerina||Maruša Sernc||06/11/20||09/11/20||11/11/20
|-
| Timotej Sotošek||14-15||||Eva Vene||Ajda Beltram||06/11/20||09/11/20||11/11/20
|-
| Nika Tomsič||16||||Zala Perko||Jan Bregar||13/11/20||16/11/20||18/11/20
|-
| Andrej Špenko||16||||Erik Putar||Anja Moškrič||13/11/20||16/11/20||18/11/20
|-
| Aleksandra Rauter||16||||Iva Matić||Gregor Strniša||13/11/20||16/11/20||18/11/20
|-
| Laura Unuk||17||||Timotej Sotošek||Nikola Janakievski||20/11/20||23/11/20||25/11/20
|-
| Stefanija Ivanova||17||||Nika Tomsič||Rebeka Jerina||20/11/20||23/11/20||25/11/20
|-
| Jakob Tomšič||17||||Andrej Špenko||Eva Vene||20/11/20||23/11/20||25/11/20
|-
| Neža Leskovar||18||||Aleksandra Rauter||Zala Perko||27/11/20||30/11/20||02/12/20
|-
| Luka Šegota||18||||Laura Unuk||Erik Putar||27/11/20||30/11/20||02/12/20
|-
| Nika Perko||18||||Stefanija Ivanova||Iva Matić||27/11/20||30/11/20||02/12/20
|-
| Ela Bizjak||19||||Jakob Tomšič||Timotej Sotošek||04/12/20||07/12/20||09/12/20
|-
| Bor Krajnik||19||||Neža Leskovar||Nika Tomsič||04/12/20||07/12/20||09/12/20
|-
| Maja Kobal||19||||Luka Šegota||Vid Dobrovoljc||04/12/20||07/12/20||09/12/20
|-
| Mateja Milošević||20||||Nika Perko||Andrej Špenko||11/12/20||14/12/20||16/12/20
|-
| Tinkara Božič||20||||Ela Bizjak||Aleksandra Rauter||11/12/20||14/12/20||16/12/20
|-
| Martin Stanonik||20||||Bor Krajnik||Laura Unuk||11/12/20||14/12/20||16/12/20
|-
| Luka Stanković||21||||Maja Kobal||Stefanija Ivanova||18/12/20||21/12/20||23/12/20
|-
| Ana Pervanja||21||||Mateja Milošević||Jakob Tomšič||18/12/20||21/12/20||23/12/20
|-
| Nika Banovšek||21||||Tinkara Božič||Neža Leskovar||18/12/20||21/12/20||23/12/20
|-
| Aljaž Simonič||22||||Martin Stanonik||Luka Šegota||23/12/20||28/12/20||30/12/20
|-
| Luka Hafner||22||||Luka Stanković||Ana Žagar||23/12/20||28/12/20||30/12/20
|-
| Ana Žagar||22||||Vid Dobrovoljc||Nika Perko||23/12/20||28/12/20||30/12/20
|-
| Nika Bedrač||23||||Ana Pervanja||Ela Bizjak||30/12/20||04/01/21||06/01/21
|-
| Srna Anastasovska||23||||Nika Banovšek||Bor Krajnik||30/12/20||04/01/21||06/01/21
|-
| Manca Pirc||23||||Aljaž Simonič||Maja Kobal||30/12/20||04/01/21||06/01/21
|-
| Maruša Sernc||23||||Ana Žagar||Mateja Milošević||08/01/21||11/01/21||13/01/21
|}

*številka v okencu za temo pomeni poglavje v Lehningerju, v katerega naj izbrana tema spada
Razporeditev je začasna in se lahko še spremeni, načeloma pa se termini do vključno 18. poglavja ne bodo spreminjali.
Prosim,da mi sporočite morebitne napake ali če vas nisem razporedil.

== Gradivo za predavanja ==
Gradivo za predavanja in seminarje najdete na http://bio.ijs.si/~zajec/bio2/
username: bio2
password: samozame

==Naloga==
'''Vaša naloga za seminar je: '''
Samostojno pripraviti seminar o seminarski temi, ki vam je bila dodeljena. Za osnovo morate vzeti pregledni članek iz revije, ki ima faktor vpliva nad 5 (npr. [http://www.sciencedirect.com/science/journal/09680004/ TIBS]. Poiskati morate še vsaj tri znanstvene članke, ki se nanašajo na opisano temo in jih uporabiti kot podlago za seminarsko nalogo! Članki so dostopni [http://93.174.95.27/scimag/ tukaj].

Za pripravo seminarja velja naslednje: 
* [[BIO2 Povzetki seminarjev 2020|Povzetek seminarja]] opišete na wikiju '''v 200 besedah''' (+- dvajset besed) - najkasneje do dne ko morate oddati seminar recenzentom.
* Povezavo do povzetka vnesete v tabelo seminarjev tekočega letnika.
* Seminar pripravite v obliki seminarske naloge na ~5-12 straneh A4 (pisava 12, enojni razmak, 2,5 cm robovi). Obseg seminarja naj bo 2700 do 3000 besed , a ne več kot 3500 besed. Seminarska naloga mora vsebovati najmanj tri slike, bolje več. Eno sliko morate narisati sami in to pod sliko posebej označiti. Slika mora imeti legendo in v besedilu mora biti na ustreznem mestu sklic na sliko. 
* Seminar oddajte do datuma oddaje, ki je naveden v tabeli v elektronski obliki z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/ tega obrazca].
* Vsi seminarji so v elektronski obliki dostopni [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/bioseminar/ tukaj].
* Recenzenti do dneva določenega v tabeli določijo popravke (v elektronski obliki) in podajo oceno pisnega dela. Popravljen seminar oddajte z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/ tega obrazca].
* Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Za predstavitev je na voljo 20-25 minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni.
* Predstavitvi sledi razprava. Recenzenti podajo oceno predstavitve in postavijo najmanj dve vprašanji.Vsi ostali morajo postaviti še dve dodatni vprašanji v okviru celega seminarskega obdobja. Vprašanja, ki ste jih postavili vpišite na [https://docs.google.com/forms/d/e/1FAIpQLSdV9OFlNzI3XyS8FRGnuIbG89gwH_36uwz29ocigV--2CXSbQ/viewform tukaj].
* Na dan predstavitve morate docentu še pred predstavitvijo oddati končno (popravljeno) in natisnjeno verzijo seminarja v enem izvodu, elektronsko verzijo seminarja in predstavitev pa oddati na strežnik na dan predstavitve do polnoči.
* Seminarska naloga in povzetek morajo biti v slovenskem jeziku, razen za študente, katerih materni jezik ni slovenščina. Ti lahko oddajo seminar v angleškem jeziku.

==Imena datotek==
Prosim vas, da vse datoteke, ki mi jih pošiljate poimenujete po naslednjem receptu:
* 312_BIO_Priimek_Ime.doc(x) za seminar, npr. 312_BIO_Guncar_Gregor.docx
* 312_BIO_Priimek_ime_final.doc(x) za končno verzijo seminarja
* 312_BIO_Priimek_Ime_rec_Priimek2.doc(x) za recenzijo, kjer je Priimek2 priimek recenzenta, npr. 312_BIO_Guncar_Gregor_rec_Scott.docx (če se pišete Scott in odajate recenzijo za seminar, ki ga je napisal Gunčar)
* 312_BIO_Priimek_Ime.ppt(x) za prezentacijo, npr 312_BIO_Guncar_Gregor.pptx
* 312_BIO_Priimek_ime_poprava.doc(x) za popravljeno končno verzijo seminarja, če so popravki manjši

==Ocenjevanje seminarjev==
Recenzenti ocenijo seminar tako, da izpolnijo [https://docs.google.com/forms/d/1EQDYwFO-DEzZ2R7jf8DhLqIeV4FFxRd3-ScceEASpt4/viewform recenzentsko poročilo] na spletu. Recenzentsko poročilo morate oddati najkasneje do 21:00, en dan pred predstavitvijo seminarja.

== Mnenje o predstavitvi ==
Vsak posameznik odda svoje mnenje o predstavitvi takoj po predstavitvi z online glasovanjem.

==Urejanje spletnih strani na wikiju==
Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''

==Citiranje virov==
Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se držite ene same. V seminarskih nalogah in diplomskih nalogah FKKT uprabljajte shemo citiranja, ki je pobarvana zeleno.
Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati.
Za citate v naravoslovju je najpogostejše citiranje po pravilniku ISO 690. [http://www.zveza-zotks.si/gzm/dokumenti/literatura.html Pravila], ki upoštevajo omenjeni standard, so pripravili pri ZTKS. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati. 
'''Citiranje knjig:''' 
Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica. 
Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN. 

Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005. 
Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4. 
Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.).

'''Citiranje člankov:''' 
Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani. 
Lartigue, C., Glass, J. I., Alperovich, N., Pieper, R., Parmar, P. P., Hutchison III, C. A., Smith, H. O. in Venter, J. C.
Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, 317, str. 632-638.

Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole: 
Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani. 
Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.

Revija Science uporablja skrajšani zapis: 
C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007) 

V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne). Navesti morate tudi vse avtorje dela, razen v primeru, ko jih je 10 ali več. Takrat navedite le prvih devet, za ostale pa uporabite okrajšavo in sod. (in sodelavci). Pred zadnjim avtorjem naj bo vedno besedica "in".

'''Citiranje spletnih virov:''' 
Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov 
strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life 
Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.

TBK2020 Povzetki seminarjev

2020-04-05T09:21:23Z

Gregor Strniša:

=== Gregor Strniša: Vpliv genoma okroglega gobija na njegovo invazivnost===

Invazivne vrste predstavljajo velik problem naši družbi, saj s svojim širjenjem spreminjajo ravnotežje v ekosistemih. Razumevanje njihovega genoma je ključnega pomena za prepoznavanje sposobnosti, ki jim omogočajo prilagajanje na življenje v drugačnih krajih. Okrogli gobi je ena najbolj uspešnih invazivnih vrst, ki se je razširila iz svojega nativnega območja ob Črnem morju vse do Velikih jezer v Ameriki. Znanstveniki so ob primerjavi genoma okroglega gobija z drugimi podobnimi vrstami odkrili nenavadne prilagoditve, zaradi katerih lažje preživi v novih okoljih. Razširjena področja genov za imunski sistem mu omogočajo boljšo obrambo pred drugačnimi mikroorganizmi, ki jih lahko sreča v novem okolju. Povečana so vsa območja genov za nastanek inflamosoma - celične strukture, ki inducira nadzorovano celično smrt preko piroptoze ob detekciji tujih mikroorganizmov. Ima razširjeno območje genov družine CYP (citokromi P450), ki sodelujejo pri razgradnji telesu tujih snovi. Odkrili so še nekaj mutacij genov na receptorjih za vid in voh, za katere pa se še ne ve, ali imajo vpliv na preživetje okroglega gobija v novih okoljih. Nadaljnje raziskave drugih invazivnih vrst bodo pokazale, kako lahko omejimo njihovo širjenje in ohranimo naše ekosisteme.

=== Jan Trebušak:Vbod klopa vrste Amblyomma americanum sproži proizvodnjo IgE in preobčutljivost preko celic T CD4+ in od MyD88 odvisnih poti.===
Alergije, ki jih pri ljudeh sproži vbod klopa so bile zaradi zakasnelih simptomov diagnosticirane šele pred kratkim, predstavljajo pa naraščujočo grožnjo javnemu zdravju. Sindrom alfa-gal je alergija, ki se lahko pojavi, ko gostitelj ob vbodu pride v stik z molekulami galaktoze-alfa-1,3-galaktoze iz klopove sline, to je krvni antigen, ki v klopa pride s pitjem krvi svojega gostitelja. V takih primerih postane oseba alergična na vse vrste mesa, ki vsebujejo omenjeni ogljikov hidrat t.j vse rdeče meso, razen meso višjih primatov in ljudi. Alergija na rdeče meso je ena izmed redkih alergij na hrano, ki lahko sproži hude kožne, gastrointestinalne in respiratorne reakcije, oziroma anafilakso, buren odziv telesa najverjetneje sprožijo specifična protitelesa IgE. Ker so mehanizmi po katerih pride do alergij na hrano slabo poznani, je bil cilj študije razviti mišji model alergijske senzitizacija ob dermalni izpostavitvi klopom, ki bi ga potencialno lahko uporabili za identifikacijo mehanizmov, ki nazdorujejo sprožitev IgE protiteles povezanih z boleznimi, ki jih prenašajo klop.

=== Sara Golob: Vpliv virusa Herpesa simpleksa tipa 1 na razvoj Alzheimerjeve bolezni ===

Pri Alzheimerjevi bolezni pride do padca kognitivnih funkcij, kot so spomin, govor, pozornost, učenje, itd. Razvije se zaradi različnih dejavnikov, ki so lahko dedni ali okoljski. Eden od okoljskih dejavnikov je okužba z virusom Herpes simpleks tip 1. Ta povzroči večje izražanje ε4 alela apolipoproteina E, ki povzroča nalaganje Tau proteina in amiloida beta, ki sestavljata senilne plake pri Alzheimerjevi bolezni. To povezavo so odkrili s protitelesi proti virusu Herpes simpleks tipa 1 ter preko lizosomske okvare, zaradi katere pride do nalaganja amiloida beta v možganih. Dokazana je bila tudi povezava med Alzheimerjevo boleznijo in drugimi boleznimi (epilepsija, demenca, shizofrenija, fibromialgija, demenca), pri katerih je opazna kognitivna disfunkcija. Pri bolnikih z epilepsijo so odkrili amiloidne plake, ki so značilni za Alzheimerjevo bolezen, zaradi česar je večja verjetnost, da oboleli za epilepsijo zbolijo še za Alzheimerjevo boleznijo in obratno. Herpes simpleks virus redko povzroča tudi akutni encefalitis, katerega posledica so epileptični napadi, izguba spomina in spremembe v vedenju. Zato znanstveniki menijo, da je povezava med epilepsijo in Alzheimerjevo boleznijo tudi v apolipoproteinu E.

=== Ena Kartal: Kako celično staranje vodi do nevrodegeneracije ===
Čeprav je bila vzpostavljena povezava med kroničnim vnetjem in nevrodegenerativnimi boleznimi, je bilo veliko odprtih vprašanj v zvezi s tem, kako celično staranje, proces, pri katerem celice, ki se nehajo deliti pod stresom, izločijo mešanico vnetnih beljakovin, vplivajo na te patologije. Raziskovalci poročajo, da staranje v astrocitih, ki je najbolj razširjena vrsta celic v možganih, vodi do škodljive '' ekscitotoksičnosti '' na kortikalnih nevronih, ki so vključeni v spomin.In pri tem pride do Alzheimerjeve bolezni,ki je najpogostejši vzrok demence pri starejših, je nepopravljiva, napredujoča možganska motnja, ki ubija možganske celice in postopoma uničuje spomin.

=== Lenka Stanković: Optimizirano antiangiogeno reprogramiranje tumorskega mikrookolja potencira imunoterapijo CD40 ===

Karakteristika raka je njegova sposobnost spodbujanja angiogeneze, oziroma tvorba novih krvnih žil. Angiogeneza prispeva k rasti in napredovanju tumorja z induciranjem in vzdrževanjem kislega / hipoksičnega in imunosupresivnega okolja. Krvne žile v rakih so pogosto nefunkcionalne in omejujejo promet s T-celicami. Odkritje angiogenih zaviralcev naj bi pripomoglo k zmanjšanju umrljivosti zaradi karcinomov. Tukaj prikazujemo, da imunoterapija proti CD40 poveča tumorsko infiltracijo CD8+T, vendar regresijo tumorja dosežemo močneje, če anti-CD40 kombinirano z dvojno blokado Ang2 in VEGFA. Kombinacija anti-VEGFA, anti-Ang2 in agonističkih protiteles proti anti-CD40 omogoča zavrnitev tumorjev pri sintetičnih modelih tumorjev. Proučevali so odzive tumorjev na anti-VEGFA, anti-Ang2 in agonistična protitelesa proti CD40 v različnih modelih mišjega raka. V raziskavi so pokazali, da kombinacija agonističnih protiteles CD40 z dvojno blokado VEGFA/Ang2 povečuje protitumorski odziv v modelnih raka miši s pomočjo sinergistične regulacije genov in indukcije imunskega permisivnega mikrookruženja tumorja, za katero je značilno provnetno (M1 podobno) aktivacijo makrofagov, vaskularno normalizacija ter izboljšanja infiltracije in prostorska lokalizacija efektorskih T-celic. T-celice pošljejo signale drugim vrstam imunskih celic, vključno s citotoksičnimi T celicami CD8+. Citotoksične T-celice, znane tudi kot CD8 + T-celice, izražajo svoje TCR, ki jih spremlja glikoprotein CD8. CD8 + T-celice so povezane z učinkovitim ubijanjem rakavih celic: med antigensko specifično aktivacijo afiniteta med CD8 glikoproteinom, izraženim s celico CD8 + T, in molekulo MHC razreda I, izraženo z rakavo celico, ohranja obe vrsti celic skupaj. Tesna vezava T celic in rakavih celic skozi kompleks CD8 / TCR in kompleks antigen / MHC-I povzroči, da celice CD8 + T izločajo perforin in grancime, kar vodi v lizo rakavih celic.

=== Nika Tomsič: Pomembnost in delovanje sladkornega prenašalca PfHT1 v parazitu malarije ===
Po oceni World Health Organisation- World malaria report 2019 je v letu 2018 bilo 228 milijonov primerov malarije. Sladkor je glavni vir energije parazita, zato je razumevanje presnove sladkorjev pomembna tema, ki bi lahko predstavljala pomoč pri sestavljanju zdravil in izrivanju tega parazita. Glavna razlika v presnovi sladkorjev med parazitom in drugimi organizmi je prenašalec, ki sladkorje prenaša v celico. Za to je odgovoren šeskotni prenašalec PfHT1, ki je sposoben transportirati bodisi glukozo kot fruktozo. Strukturno pa je zelo podoben prenašalcem človeške celice GLUT. Prenašalec obsega 12 transmembranskih vijačnic, ki tvorijo osrednjo pot za vstop glukoze. Ključni del proteina pa predstavljajo izrastki ki delujejo kot receptorji za sladkorje. Sladkorne prenašalce še nadaljnjo stabilizirajo solne medcelične povezave. Druga velika razlika med PfHT1 in drugimi prenašalci je brez dvoma način odpiranja in zapiranja prenašalca, saj ni sestavljenen samo iz treh običajnih stanj (odprto navznoter, zaprto, odprto navznoter), temveč ga zaznamujejo še dve vmesni stanji (zaprto navznoter in zaprto navzven, angl. inward–occluded in outward-occluded). Nadaljnjo raziskovanje bi torej lahko omogočilo razvoja novih antimalaričnih zdravil, ki blokirajo uvoz sladkorja in zastrašujejo parazita do smrti oz. razvoja novih zaviralcev, ki so bolj specifični za blokiranje funkcije PfHT1, ne da bi pri tem vplivali na transport sladkorja v človeških celicah.

=== Maša Mencigar: Vpliv apoptotskih celic na imunski sistem ===
Apoptotske celice v telesu lahko nadzorujejo imunski sistem in preprečijo nezaželene imunske odzive na telesu lastna tkiva oziroma celice. Avtoimune bolezni so kronične, neozdravljive in predstavlajo velik zdravstven problem, saj bolniki trpijo, hkrati pa povzročajo velike stroške. Znanstveniki iz nemškega centra za raziskave rakavih bolezni (DKFZ - Deutsches Krebsforschungszentrum; angl: German Cancer Research Center) so našli receptor na imunskih celicah miši, ki aktivira ta zaščitni mehanizem in prepreči nevarne avtoimunske reakcije. Ta receptor se imenuje dektin-1, ki ima dvojno vlogo, saj veže beta-glukane in aksin proteine. Pomankanje dektina-1 vodi do simptomov avtoimunih bolezni šele proti koncu življenske dobe. Ključna pa je povezava med encimom NAHPH oksidazo-2 in dektinom-1, zato imajo ljudje, ki nimajo tega encima avtoimune bolezni.

=== Ema Kovačič: Izpostavljenost ploda materini mikrobioti ===
Študija o prehodu materine mikrobiote skozi placento pri otrocih, ki so se rodili s carskim rezom prezgodaj in normalno. Mamam so vzeli brise iz različnih delov telesa, otrokom pa takoj po rojstvu vzorce iz ustne votline in mekonija. Imunski sistem pri otrocih se razvije že v prenatalnem obdobju. Našli so DNK nekaterih bakterij v posteljici, plodovnici in mekoniju, kar kaže, da se zarodek spopade z bakterijami že v prenatalnem obdobju. Odkritje bakterijskih zapisov v materničnem okolju nakazuje na koesistenco mehanizmov za kontorolo izpostavljenosti pri plodu in materini mikrobioti.

=== Zala Puklavec: Globoko učenje void do odkritja novih antibiotikov===
Zaradi naglega pojava bakterij, ki so odporne na antibiotike, raste potreba po odkritju novih antibiotikov. Zato so naučili globoko nevronsko mrežo napovedati molekule, ki imajo antibakterijske lastnosti. S tem računalniškim modelom so odkrili, da ima halicin (c-Jun N-terminal kinase inhibitor SU3327) zelo močne antibakterijske lastnosti. Nadaljni eksperimenti so pokazali, da deluje na drugačen način kot večina antibiotikov. Za razliko od ostalih je halicin proti E.coli bakteriociden, ne le bakteriostatski. Testirali so ga tudi na bakterijah, za katere po mnenju Svetovne zdravstvene organizacije najnujneje potrebujemo neko obliko zdravljenja, in proti veliki večini je deloval zelo uspešno. Z daljšo izpostavljenostjo E.coli halicinu so poskušali izolirati mutantske celice, ki so razvile odpornost nanj, vendar jim ni uspelo, kar kaže na to, da te odpornosti ni možno ali pa se vsaj veliko težje razvije. Z še nekaj eksperimenti pa so prišli do zaključka, da halicin disipatira transmembranski pH potencial in najverjetneje veže Fe3+ pred pH disipacijo in povezavo z membrano.

=== Martin Stanonik: De novo pojavitev adapterskih membranskih proteinov iz timinsko bogatih genskih sekvenc===
Odkrivamo vedno več proteinov, ki so nastali iz de novo genov. To pomeni, da so se kodirali iz nekodirajočih delov DNA, kar velja za redek proces. V laboratorijskih poskusih je preveliko izražanje teh nastajajočih genov omogočalo boljše delovanje celice v primerjavi z prevelikim izražanjem že vzpostavljenih genov in motenje tega procesa ni vplivalo na delovanje celice. za osebek so uporabili kvas, saj glive kvasovke vsebujejo najboljše lastnosti za izražanje genov.To prikazuje velik potencial, še posebej za timinsko bogate sekvence za izdelavo transmembranskih proteinov. Iz kombinacij različnih analiz je bil predlagan nov model genskega nastanka. Ta odkritja, bi lahko omogočala nov način izdelave polipeptidov, ki nastanejo iz teh, de novo, delov DNA.

=== Klara Kočman: Koronavirus: SARS-CoV in SARS-CoV-2 ===
Koronavirusi so veliki, pozitivni RNA virusi. Okuženost z virusom lahko opazimo z značilni simptomi kot so vročina, kašelj in pomanjkanje zraka. Najnovejši tip koronavirusa, SARS-CoV-2, tudi 2019-nCoV, se je prvič pojavil 31. decembra 2019 v mestu Wuhan na Kitajskem. Transport virusa s človeka na človeka je pogost pri telesnih stikih z bolnikom. SARS-CoV-2 primerjajo z virusama MERS-CoV in SARS-CoV. Na podlagi celotne analize genoma in proteinov je virus bližje SARS-CoV kot MERS-CoV, saj obstaja več kot 90% genetska podobnost s SARS-CoV, medtem kot je s MERS-CoV-jem neznatna. Genom virusa SARS-CoV-2 je sestavljen iz približno 30 kilobaz, ki jih kodira več strukturnih in nestrukturnih proteinov. S SARS-CoV si je podoben po dolžini genoma ter podobnem mehanizmu vstopa v celico ter uporabi celičnih receptorjev (ACE2). Glikoprotein ACE2 se nahaja na površini membrane in je pomemben za vezavo receptorjev gostiteljskih celic in gostitelja. Transmembranski proteini virusa se vežejo na človeško celico preko receptorjev ACE2 (encim za pretvorbo angiotenzina 2). Med 120 sekvencami virusa SARS-CoV-2 ni bila zanana niti ena mutacija, zato lahko s ciljenjem slednjih nudimo zaščito. Znanstveniki z opazovanjem odziva na protitelesa pri miših raziskujejo cepivo.

===Timotej Sotošek: Protivirusni remdesivir potentno inhibira RNA-odvisno RNA polimerazo od Srednje Vzhodni respiratorni sindrom koronavirusa===
Zdravilo remdesivir (bolj natančno Remdesivir trifosfat) je preiskovalna spojina, ki je bilo sprva ustvarjeno za zdravit Ebolo. Ima širok spektrum protivirusnih aktivnosti proti RNA virusih kot na primer koronavirusi , Filovirusi,… Njegova tarča je multi-podenotni RNA sintezni kompleks znan pod imenom RNA-odvisna RNA polimeraza na katerem s pomočjo drugih proteinov poteka sinteza virusne RNA verige. Remdesivir je nukleotidni analog ATP-ja s katerim tekmuje za vezavo v nastajajočo se virusno RNA verigo po tem, ko je virus že okuži celico. V primeru, da se Remdesivir uspe vezat v virusno RNA verigo bo ta prenehala rast in tako postala ne uporabna. To pomeni, da je Remdesivir le inhibitor, ki upočasnjuje oz. preprečuje nadaljno širjenje virusa. Raziskave so preiskovale mehanizem inhibicije na virusu Srednje Vzhodni respiratorni sindrom(MERS-CoV) in ga primerjali kako je učinkovit v primerjavi inhibicije virusa Ebola, ter na splošno kako zelo je njegov mehanizem učinkovit. Ker sta si MERS-CoV in SARS-CoV-2 sorodna virusa bi lahko zdravilo Remdesivir pomagal ozdravit obolele z SARS-CoV-2 koronavirusom.

===Nika Perko: Enkapsulacija eteričnega olja pomarančevca v celice gliv kvasovk===
Komarji vrste Aedes aegypti so eni glavnih povzročiteljev bolezni kot so denga, rumena mrzlica, zika in čikungunja. Najdemo jih v tropskem in subtropskem pasu ter celo v Evropi. Znanstveniki Univerze Nove Mehike so poiskali način, kako preprečiti širitev omenjenih bolezni. Ustvarili so naraven insekticid, ki prepreči razvoj komarjev, ko so ti še v stopnji ličinke. Larvicid je sestavljen iz enostavnih komponent: eteričnega olja pomarančevca Citrus sinensis in gliv kvasovk vrste Saccharomyces cervevisiae. Sintetiziran je bil s postopkom enkapsulacije eteričnega olja pomarančevca v celice gliv kvasovk. Med korake tega procesa so vpeljali še enega novega. Z njim so odstranili odvečno eterično olje, ki je ostalo na zunanji strani celic. To je bilo izredno pomembno, saj je odvečno olje delovalo kot repelent. Z različnimi analizami in primerjavami so ugotovili, da struktura celične stene, membrane in oljnih kapljic ostane po enkapsulaciji nespremenjena. Pomembna ugotovitev je bila tudi, da se kvasovke po enkapsulaciji niso mogle več razmnoževat. Testi efektivnosti so bili vzpodbudni, saj je bil larvicid učinkovit pri vseh ličinkah. Najbolj pa je bil učinkovit pri začetni razvojni stopnji ličink. Novi larvicid ima kar nekaj dobrih lastnosti: je naraven, ne more se nenadzorovano širit in tako škodit vodnemu okolju, izdelava je relativno poceni, je neškodljiv za ljudi, dolgo učinkuje…

=== Anja Moškrič: Povezava med infekcijo s temperiranimi bakteriofagi in izgubo sistema CRISPR-Cas tipa I ===
Sistem CRISPR-Cas je imunski mehanizem, ki je značilen za veliko prokariontov in arhej. Gre za gruče enakomerno prekinjenih palindromskih ponovitev, ki nosijo zapis za obrambo proti vdoru tujega dednega materiala (virusov in plazmidov). Kratica Cas pa predstavlja s CRISPR povezane gene, ki kodirajo zapis za nekatere encime, ki cepijo DNA. CRISPR lokus je sestavljen iz ponavljajočih CRISPR genov, med katerimi so vmesniki. Na teh pa je shranjena kopija dela zapisa virusa oz. plazmida. S študijo so želeli izvedeti vpliv infekcije bakterije Pseudomonas aeruginosa, s temperiranim oziroma lizogenim bakteriofagom (DMS3), ki se v obliki profaga vključi v dedni material gostiteljske celice. Izbrana bakterijska vrsta vrši sistem CRISPR-Cas tipa I-F. Za primerjavo so za eksperimente uporabljali tudi nekatere mutirane vrste bakterij,ki so imele napako v CRISPR lokusu. Eksperimenti so pokazali, da ob infekciji z nemutiranimi bakteriofagi bakterije niso sposobne uspešno odstranit le-teh. Iz zbranih rezultatov so ugotovili, da je v tem primeru imunski mehanizem slabo prilagojen celicam, saj povzroča imunopatološki efekt (avtoimunost). Do tega pride zaradi nepopolnega ujemanja zapisa na CRISPR vmesnikih s profagi. Če bakteriofagi ne kodirajo zapisa za acr gene (anti-CRISPR geni, ki zatirajo omenjen mehanizem), lahko to privede do izgube sistema CRISPR-Cas skozi evolucijo.

===Maja Deutsch: Globalni kemični učinki mikrobioma vključujejo nove konjugacije žolčne kisline===
Med vsemi mnogoceličarji in njihovimi mikrobiomi se pojavijo številne medsebojne kemične interakcije. Številne molekule, za katere je znano, da jih proizvaja mikrobiom, izrazito vplivajo na ravnovesje med zdravjem in boleznijo. Z uporabo masne spektrometrije in vizualizacije podatkov so bili ocenjeni učinki mikrobioma na celotno kemijo sesalca s primerjavo podatkov metabolomike pri aseptičnih miši in specifičnih-mikroorganizmov-prostih miši. Ugotovljeno je bilo, da mikrobiota vpliva na kemijo vseh organov. To je vključevalo aminokislinske konjugacije žolčnih kislin, ki so bile uporabljene za proizvodnjo fenilalanoholne kisline, tirozoholne kisline in levcoholne kisline, ki prej še niso bile identificirane, kljub obsežnim raziskavam kemije žolčnih kislin. Ti konjugati žolčne kisline so bili najdeni tudi pri ljudeh, vendar so bile bolj pogoste pri bolnikih z vnetnimi črevesnimi boleznmi, cistično fibrozo in pri dojenčkih. Te spojine so agonizirale farnezodini receptor X (FXR) in miši, ki so imele na novo odkrite kisline, so pokazale zmanjšano izražanje genov za sintezo žolčne kisline. Potrebne pa so nadaljnje raziskave, da se ugotovi, ali imajo te spojine fiziološko vlogo v sesalcih in ali prispevajo k črevesnim boleznim, ki so povezane z mikrobiomsko disbiozo.

=== Hana Glavnik: Kako paraziti malarije zaznajo imunske celice in se pred njimi zaščitijo ===
Pri raziskovanju malarije so znanstveniki odkrili pojav, ki so ga poimenovali rozeta. Rozeta je skupek neokuženih rdečih krvnih celic, ki s pomočjo proteinov, ki jih sintetizira parazit obkolijo okuženo rdečo krvno celico. Parazit se tako zaščiti pred gostiteljevim imunskim sistemom, saj ga monocite tako obkoljenega težje zaznajo. Raziskovali so tvorjenje rozet pri različnih pogojih. Izoliranim parazitom so dodali različne vrste monocitov in opazovali njihovo reakcijo. S tem so odkrili tudi protein IGFBP7, ki inducira tvorjenje rozet, vendar le ob prisotnosti dodatnih serumskih faktorjev. Odkritje proteina IGFBP7 je vodilo v odkritje novega načina tvorjenja rozet, tako imenovanega tipa II, saj za razliko od prvotnega tipa I, ta ne poteče spontano. Nato so pod drobnogled vzeli tvorjenje rozet s proteinom IGFBP7. Z namenom, da bi lahko razložili ta pojav, so eritrocite zdravili z encimom Heparinaza in jih nato izpostavili pogojem, ugodnim za nastanek rozet ter opazovali dobljene rezultate. IGFBP7 opozori parazite na prihod monocitov, nato parazit ta protein uporabi kot most, ki se poveže še z dvema človeškima proteinoma na zdravem eritrocitu in tako pomaga pri tvorjenju.

=== Eva Ratajc: Z-DNA vezavni protein 1 kot ključni dejavnik kontrolirane replikacije virusa Zahodnega Nila in virusa zika ===
Virus Zahodnega Nila (WNV) je glavni povzročitelj virusnega encefalitisa v Združenih državah Amerike. Tudi okužbe z virusom zika (ZIKV) povzročajo resne nevrološke bolezni in prirojene napake. Znano je, da ima pri sproženju imunskega odziva pomembno vlogo Z-DNA vezavni protein 1 (ZBP1). Z-DNA vezavni protein (ZBP1) je citoplazmatski DNA-senzor, ki služi kot receptor za prepoznavanje molekularnih vzorcev. Ob okužbi telesa z virusom zika in virusom Zahodnega Nila se poveča izražanje ZBP1 v mišjih možganih. Zaradi tega so raziskovalci želeli raziskati vlogo ZBP1 pri omejitvi patogeneze pri osebkih, okuženih z navedenima virusoma. Pri miših z izbitim genom za ZBP1 −/− so zaznali višjo stopnjo okužb in višjo smrtnost po okužbi tako s smrtonosno kot z nesmrtonosno obliko virusa Zahodnega Nila kot pri miših divjega tipa (WT). Raziskovalci so ugotovili, da ima ZBP1 ključno vlogo pri omejitvi patogeneze pri miših. ZBP1 prepreči širjenje okužbe WNV in ZIKV v primarnih mišjih celicah in je pomemben za preživetje osebkov z boleznimi, ki ju povzročata omenjena virusa. Pomanjkanje ZBP1 je povzročilo večje količine virusa v serumu in možganih pri ZBP1−/− miših v primerjavi z divjim tipom. Pri ZBP1−/− miših so zaznali tudi višje virusne titre, ki so jih povezali z znižanimi leveli protivirusnih citokinov in kemokinov.

=== Lana Kores: Preučevanje ionskega kanalčka TRPA1 in bolečine s toksinom avstralskega škorpijona ===
Ionski kanalček TRPA1 (znan tudi kot wasabi receptor) je receptor za dražilce, ki povzročajo akutno bolečino in nevrogeno vnetje. Toksin za wasabi receptor WaTx je toksin avstralskega škorpijona, ki s pasivno difuzijo preide čez membrano celice in se nato veže na TRPA1. WaTx deluje na podoben način kot elektofilni dražilci receptorja, le da v nasprotju z njimi kanalčka ne odpre direktno, ampak le stabilizira njegovo odprto stanje in tako zmanjša prepustnost za Ca2+ ione. Koncentracija Ca2+ ionov je zato zadostna, da povzroči akutno bolečino, ne pa dovolj velika, da bi prišlo do nevrogenega vnetja, kot npr. pri elektrofilnem dražilcu AITC.

=== Eva Vene: Nevtralizacija denge v komarjih, ki izražajo načrtovano protitelo ===
Neuspešnost cepiva ter dejstvo, da je, zaradi širjenja življenjskega prostora A. aegypti, ogroženih 50% svetovnega prebivalstva, je vodilo v nadaljnje raziskave, ki bi omogočile zaustavitev širjenja virusa z restrikcijo slednjega že v samih prenašalcih. Možnost za uspeh obetajo protitelesa s širokim spektrom nevtralizacije (ang. broadly neutralizing antibodies), saj so slednja uspešna proti antigensko različnim virusom. Zaenkrat tovrstna protitelesa kot možnost zatiranja širjenja bolezni še niso bila uporabljena proti katerikoli vrsti virusa, njihova upešnost pa se je pokazala pri drugi veji mikroorganizmov.
Za raziskave so uporabili človeško protitelo 1C19, katerega uspešnost proti serotipom DENV je bila znana že iz prejšnjih let. V genom transgenih komarjev je bil dodan modificiran gen za scFv 1C19 (človeško protitelo, ki deluje proti DENV) in fluorescenčni označevalec, ki se sintetizira za protitelesom, tipa tdTomato. V komarje je bil določen serotip virusa vnešen z okuženo krvjo. Določili so dva možna izida okužbe: ponekod je DENV prosto prehajal čez srednje črevo – komarji so postali prenašalci virusa; v drugem primeru pa so izražena protitelesa nevtralizirala serotip virusa in s tem preprečila prenos okužbe naprej.

=== Nina Žgajnar: In vitro samostojno podvojevanje in policistronsko izražanje večjih sintetičnih genomov ===
Konvencionalne metode genskega inženirstva za reševanje zapletenih problemov se običajno osredotočajo na prilagajanje enega ali več genov. Sintezna biologija pa k tem težavam pristopa z novega vidika: ukvarja se z večjimi spremembami obstoječih celičnih struktur in z izgradnjo bolj zapletenih sistemov. Sinteza kemičnega sistema, ki je sposoben razmnoževanja in razvoja, je glavni cilj sintezne biologije. To bi lahko dosegli z in vitro rekonstrukcijo minimalno samozadostne centralne dogme. Znanstveniki so ustvarili sistem in vitro translacije, ki omogoča samostojno podvajanje in izražanje večjih genomov. Demonstrirali so samostojno podvojevanje genoma iz več kot 116 kilobaz, ki zajema celoten niz translacijskih faktorjev E. coli, vse tri ribosomske RNA, sistem za obnavljanje energije ter RNA in DNA polimeraze. Vzporedno z replikacijo DNA sistem omogoča sintezo vsaj 30 kodiranih translacijskih faktorjev, od katerih je polovica izražena v enakih ali večjih količinah od njihovih vhodnih nivojev. Vprašanje, kaj vse lahko dosežemo s samosestavljanjem kemijskih spojin, velja za eno izmed pomembnejših vprašanj v znanosti. Sintezna biologija tukaj postavlja nov cilj: sestaviti organizem izključno iz majhnih molekul. Potencialno bi tako lahko ustvarili organizme, ki bi čistili nevarne odpadke na nedostopnih mestih, rastline, ki bi zaznavale določene kemikalije in se nanje ustrezno odzvale, proizvedli čisto gorivo na učinkovit in trajnosten način ali prepoznavali in uničevali tumorje.

=== Jan Kogovšek: Inhibitor plazmepsina zmoti več stanj življenjskega cikla parazita malarije ===
Parazit Plasmodium falciparum je najpogostejši povzročitelj malarije pri ljudeh. S to boleznijo zboli več milijonov ljudi, umre pa jih približno 400 000 vsako leto. Antimalariki, ki so v uporabi, počasi izgubljajo svojo moč, kajti parazit je postal rezistenten na do sedaj najbolj učinkovito terapijo, imenovano artemisinin combination therapy (ATC). Znanstveniki so v ta namen odkrili tri nove zdravilne učinkovine, ki delujejo kot inhibitorji plazmepsina IX in plazmepsina X, ki ju izloča Plasmodium. Odkrili so, da inhibitorji zavrejo izločanje dodatnih proteinov iz celic, ki parazitu omogočajo vstop v eritrocite. S testi so ugotovili, da WM4 in WM5, ki sta prva na novo odkrita inhibitorja, delujeta na isti princip, vendar ne vplivata na dozorevanje in širjenje oocist parazita. WM382, naknadno odkrit inhibitor, pa poleg istih mehanizmov, kot jih imata WM4 in WM5, deluje tudi na dozorevanje oocist v fazi rasti parazita v jetrih. Za vse tri učinkovine so tudi dokazali specifično delovanje na oba plazmepsina. S tem ko WM382 zavira rast in zorenje oocist parazita, se tudi zmanjša prenašanje parazita na komarje in možnost prenosa rezistence na že obstoječe antimalarike.

=== Kostadin Mitkov: Heat shock factor 2 helps the cells to maintain cell adhesion and protect themselves against stress ===
Maintenance of protein homeostasis is essential for the cell viability and growth. The cells in the human body are constantly exposed to environmental stress factors, which tend to disturb that protein homeostasis maintenance. For the first time, research shows that the contacts between cells, known as cell adhesion, are essential for cells to survive stress and maintain protein homeostasis. Cell adhesion is relied on heat shock factors (HSFs). HSFs mediate their protective functions through diverse genetic programs, which are composed of genes encoding molecular chaperones and other genes crucial for cell survival. Scientists have found that HSF2 is critical for cell survival during prolonged proteotoxicity, and their RNA sequencing (RNA-seq) analyses revealed that cells that lack HSF2 have weakened viability which is not caused by inadequate induction of molecular chaperones but is due to marked downregulation of cadherin superfamily genes. They demonstrated that maintenance of cadherin-mediated cell-cell adhesion is dependent on HSF2 and it is also required for protection against stress induced by proteasome inhibition. This study identifies HSF2 as a key regulator of cadherin superfamily genes and defines cell-cell adhesion as a determinant of proteotoxic stress resistance.

=== Ajda Beltram: Identifikacija potencialnih komponent cepiva proti SARS-CoV-2 na podlagi imunoloških raziskav SARS-CoV ===
Cilj te raziskave je pomoč pri izdelavi cepiva proti SARS-CoV-2 na podlagi imunoloških raziskav SARS-CoV, saj sta si virusa genetske zelo podobna. Dokazali so veliko podobnost med posameznimi strukturnimi proteini SARS-CoV-2 in SARS-CoV, ter nekoliko manjšo med SARS-CoV-2 in MERS-CoV. Primerjali so tudi eksperimentalno določene epitope celic T in B strukturnih proteinov (S in N) SARS-CoV s strukturnimi proteini SARS-CoV-2. Epitope celic T so dobili na podlagi pozitivnega odziva celic T na epitope ali pozitivne vezave MHC na epitope, epitope celic B pa s pozitivno vezavo celic B na epitope. Ugotovili so, da se 23 % epitopov celic T in 16 % epitopov celic B SARS-CoV popolnoma ujema s SARS-CoV-2 in so tudi brez mutacij. Velik potencial predstavljajo predvsem epitopi celic T, saj je bilo dokazano pri SARS-CoV, da omogočajo dolgotrajno zaščito. Pri celicah B pa imajo za sprožitev imunskega odziva s protitelesi za SARS-CoV-2 več potenciala linearni epitopi celic B podenote S2 proteina S, saj se jih veliko popolnoma ujema s SARS-CoV-2. Zaradi vsega tega so najverjetneje cepiva, ki spodbudijo odziv celic T, in cepiva, ki poskušajo izzvati protitelesa, ki se vežejo na linearne epitope podenote S2, efektivna in bi morala biti v prihodnje še bolj raziskana.

Konec klepeta
Napiši sporočilo ...

TBK2020-seminar

2020-03-30T15:54:07Z

Gregor Strniša: /* Seznam seminarjev */

= Temelji biokemije- seminar =

Seminarje vodi prof. dr. Brigita Lenarčič. Seminarji so obvezni.

Ocena seminarjev (6-10) predstavlja enako število odstotkov, ki se prišteje h končni pisni oceni izpita.
Stran na strežniku s seminarskimi nalogami je zaščitena.
Uporabniško ime je: tbk, password pa: samozame## "##" sta dve številki, ki ju izveste na predavanjih.
Tudi za urejanje Wiki strani potrebujete geslo, ki se od zgornjega razlikuje. Postopek pridobitve Wiki uporabniškega imena in gesla je opisan [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Main_Page tukaj].

== Seznam seminarjev ==

{| {{table}}
{| border="1" cellspacing="0" style="border:#c9c9c9 1px solid; margin: 1em 1em 1em 0; border-collapse: collapse;"
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Ime in priimek'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Naslov seminarja'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Povezava'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Rok za oddajo'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Rok za recenzijo'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Datum predstavitve'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 1'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 2'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 3'''
|-
| Anna Scott ||[[TBK2020_Povzetki_seminarjev#Anna_Scott:_Notting_Hill|Moj naslov v slovenščini, link pa kaže na povzetek]]||[https://www.sciencedaily.com/releases/2019/02/190214100038.htm povezava] || 28.10. || 05.11. || 07.11. || r1 || r2 || r3
|-
| Lenka Stanković || Optimizirano antiangiogeno reprogramiranje tumorskega mikrookolja potencira imunoterapijo CD40 || https://www.pnas.org/content/117/1/541 || 24.02. || 27.02. || 03.03. || Špela Došler || Zala Perko || Marija Dujaković
|-
| Ena Kartal || Kako celično staranje vodi do nevrodegeneracije || https://www.sciencedaily.com/releases/2020/01/200129174540.htm || 24.02. || 27.02. || 03.03. || Jasmina Bešić || Ana Žagar || Neža Leskovar
|-
| Ema Kovačič ||Izpostavljenost ploda materinski mikrobioti || https://insight.jci.org/articles/view/127806 || 24.02. || 27.02. || 03.03. || Nikola Janakievski || Karin Rak || Luka Hafner
|-
| Nika Tomsič || Pomembnost in delovanje sladkornega prenašalca PfHT1 v parazitu malarije || 24.02. || 27.02. || 03.03. || Maja Deutsch || Jakob Tomšič || Marigona Beqiraj
|-
| Sara Golob ||Vpliv virusa Herpesa simpleksa tipa 1 na razvoj Alzheimerjeve bolezni || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/10/181019100702.htm || 24.02. || 27.02. || 03.03. || Manca Pirc || Maja Kobal || Rebeka Jerina
|-
| Zala Puklavec ||Globoko učenje vodi do odkritja novih antibiotikov || https://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-8674(20)30102-1?_returnURL=https%3A%2F%2Flinkinghub.elsevier.com%2Fretrieve%2Fpii%2FS0092867420301021%3Fshowall%3Dtrue || 04.03. || 07.03. || 10.03. || Nika Bedrač || Špela Došler || Zala Perko
|-
| Martin Stanonik || De novo pojavitev adapterskih membranskih proteinov iz timinsko bogatih genskih sekvenc || https://www.sciencedaily.com/releases/2020/02/200218104740.htm || 04.03. || 07.03. || 10.03. || Ivana Trifunovska || Jasmina Bešić || Ana Žagar
|-
| Klara Kočman || Novi koronavirus SARS-CoV-2 in SARS-CoV || https://www.sciencedaily.com/releases/2020/01/200131114755.htm || 04.03. || 07.03. || 10.03. || Bor Krajnik || Nikola Janakievski || Karin Rak
|-
| Maša Mencigar || Vpliv apoptotskih celic na imunski sistem || https://www.sciencedaily.com/releases/2020/01/200108123137.htm || 04.03. || 07.03. || 10.03. || Erik Putar || Maja Deutsch || Jakob Tomšič
|-
| Nevena Ješić || Nepravilne komunikacije med celicami vodijo v levkemijo || https://www.sciencedaily.com/releases/2020/02/200206144824.htm || 04.03. || 07.03. || 10.03. || Ela Bizjak || Manca Pirc || Maja Kobal
|-
| Nika Perko ||Enkapsulacija eteričnega olja pomarančevca v celice gliv kvasovk ||https://parasitesandvectors.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13071-019-3870-4 || 10.03. || 13.03. || 24.03. || Lenka Stanković || Nika Bedrač || Špela Došler
|-
| Timotej Sotošek || Protivirusni remdesivir potentno inhibira RNA-odvisno RNA polimerazo od Srednje vzhodni respiratorni sindrome koronavirusa|| || 10.03. || 13.03. || 24.03. || Ena Kartal || Ivana Trifunovska || Jasmina Bešić
|-
| Hana Glavnik || Kako paraziti malarije zaznajo imunske celice in se pred njimi zaščitijo || https://www.sciencedaily.com/releases/2020/02/200218124346.htm || 10.03. || 13.03. || 24.03. || Ema Kovačič || Bor Krajnik || Nikola Janakievski
|-
| Maja Deutsch || Globalni kemični učinki mikrobioma vključujejo nove konjugacije žolčne kisline || https://www.nature.com/articles/s41586-020-2047-9 || 17.03. || 20.03. || 24.03. || Martin Stanonik || Ena Kartal || Ivana Trifunovska
|-
| Eva Ratajc || Z-DNA vezavni protein 1 kot ključni dejavnik kontrolirane replikacije virusa Zahodnega Nila in virusa zika || https://www.readcube.com/articles/10.3389/fmicb.2019.02089 || 17.03. || 20.03. || 24.03. || Anja Moškrič || Ema Kovačič || Bor Krajnik
|-
| Lana Kores || Preučevanje ionskega kanalčka TRPA1 in bolečine s toksinom avstralskega škorpijona || https://www.sciencedaily.com/releases/2019/08/190822113400.htm || 17.03. || 20.03. || 24.03. || Maša Mencigar || Nika Tomsič || Erik Putar
|-
| Jan Kogovšek || Inhibitor plazmepsina zmoti več stanj življenjskega cikla parazita malarije || https://www.sciencedaily.com/releases/2020/03/200304141514.htm || 24.03. || 27.03. || 31.03. || Nika Perko || Zala Puklavec || Lenka Stanković
|-
| Nina Žgajnar || In vitro samostojno podvojevanje in policistronsko izražanje večjih sintetičnih genomov || https://www.sciencedaily.com/releases/2020/02/200218130501.htm || 24.03. || 27.03. || 31.03. || Timotej Sotošek || Martin Stanonik || Ena Kartal
|-
| Erika Rihter || Mikrobiomska analiza krvi in tkiv kot pristop k diagnosticiranju rakavih obolenj || https://www.sciencedaily.com/releases/2020/03/200311123302.htm || 24.03. || 27.03. || 31.03. || Hana Glavnik || Anja Moškrič || Ema Kovačič
|-
| Luka Šegota || Sulfolipid-1 je sprožilec kašlja, ki prenaša tuberkulozo ||https://www.sciencedaily.com/releases/2020/03/200306183349.htm || 24.03. || 27.03. || 31.03. || Klara Kočman || Maša Mencigar || Nika Tomsič
|-
| Eva Vene ||Nevtralizacija denge v komarjih, ki izražajo načrtovano protitelo || https://www.sciencedaily.com/releases/2020/01/200116141710.htm || 24.03. || 27.03. || 31.03. || Gaja Osojnik || Nevena Ješić || Sara Golob
|-
| Ajda Beltram || Predhodna identifikacija potencialnih tarč cepiva za COVID-19 koronavirus na podlagi imunoloških raziskav za Sars-CoV || https://www.sciencedaily.com/releases/2020/02/200226091227.htm|| 31.03. || 03.04. || 07.04. || Aleksandra Pajović || Nika Perko || Zala Puklavec
|-
| Jan Trebušak || || || 31.03. || 03.04. || 07.04. || Aljaž Simonič || Timotej Sotošek || Martin Stanonik
|-
| Jan Bregar || || || 31.03. || 03.04. || 07.04. || Eva Ratajc || Hana Glavnik || Anja Moškrič
|-
| Gregor Strniša || Vpliv genoma okroglega gobija na njegovo invazivnost || https://www.sciencedaily.com/releases/2020/02/200211103721.htm || 31.03. || 03.04. || 07.04. || Lana Kores || Klara Kočman || Maša Mencigar
|-
| Petra Pahor || || || 31.03. || 03.04. || 07.04. || Sara Borišek || Gaja Osojnik || Nevena Ješić
|-
| Nadja Dolničar || || || 08.04. || 11.04. || 14.04. || Jan Kogovšek || Aleksandra Pajović || Nika Perko
|-
| Tina Javeršek || || || 08.04. || 11.04. || 14.04. || Nina Žgajnar || Aljaž Simonič || Timotej Sotošek
|-
| Vid Dobrovoljc || || || 08.04. || 11.04. || 14.04. || Erika Rihter || Eva Ratajc || Hana Glavnik
|-
| Tinkara Božič ||Atomske strukture zaprtega in odprtega protonskega kanalčka M2 razkrivajo transportni mehanizem gripe tipa B ||https://www.sciencedaily.com/releases/2020/02/200203141435.htm || 08.04. || 11.04. || 14.04. || Luka Šegota || Lana Kores || Klara Kočman
|-
| Kostadin Mitkov || || || 08.04. || 11.04. || 14.04. || Eva Vene || Sara Borišek || Gaja Osojnik
|-
| Sara Jerič || || || 15.04. || 18.04. || 21.04. || Ajda Beltram || Jan Kogovšek || Aleksandra Pajović
|-
| Polona Leban || || || 15.04. || 18.04. || 21.04. || Jan Trebušak || Nina Žgajnar || Aljaž Simonič
|-
| Stefanija Ivanova || || || 15.04. || 18.04. || 21.04. || Jan Bregar || Erika Rihter || Eva Ratajc
|-
| Luka Stanković || || || 15.04. || 18.04. || 21.04. || Gregor Strniša || Luka Šegota || Lana Kores
|-
| Ana Pervanja || Biomaterial za sintezo umetnih žilnih struktur || https://www.sciencedaily.com/releases/2020/03/200304141557.htm || 15.04. || 18.04. || 21.04. || Petra Pahor || Eva Vene || Sara Borišek
|-
| Marija Dujaković || || || 29.04. || 02.05. || 05.05. || Nadja Dolničar || Ajda Beltram || Jan Kogovšek
|-
| Neža Leskovar || || || 29.04. || 02.05. || 05.05. || Tina Javeršek || Jan Trebušak || Nina Žgajnar
|-
| Luka Hafner || || || 29.04. || 02.05. || 05.05. || Vid Dobrovoljc || Jan Bregar || Erika Rihter
|-
| Anja Moškrič || Povezava med infekcijo s temperiranimi bakteriofagi in izgubo sistema CRISPR - Cas tipa I|| https://www.nature.com/articles/s41586-020-1936-2 || 29.04. || 02.05. || 05.05. || Tinkara Božič || Gregor Strniša || Luka Šegota
|-
| Rebeka Jerina || || || 29.04. || 02.05. || 05.05. || Kostadin Mitkov || Petra Pahor || Eva Vene
|-
| Zala Perko || Regulacija s staranjem povezanih patoloških stanj z acetilacijo proteina NLRP3 || https://www.sciencedaily.com/releases/2020/02/200206144837.htm || 06.05. || 09.05. || 12.05. || Sara Jerič || Nadja Dolničar || Ajda Beltram
|-
| Ana Žagar || || || 06.05. || 09.05. || 12.05. || Polona Leban || Tina Javeršek || Jan Trebušak
|-
| Karin Rak || || || 06.05. || 09.05. || 12.05. || Stefanija Ivanova || Vid Dobrovoljc || Jan Bregar
|-
| Jakob Tomšič || || || 06.05. || 09.05. || 12.05. || Luka Stanković || Tinkara Božič || Gregor Strniša
|-
| Maja Kobal || || || 06.05. || 09.05. || 12.05. || Ana Pervanja || Kostadin Mitkov || Petra Pahor
|-
|Erika Rihter || || || 13.05. || 16.05. || 19.05. || Marija Dujaković || Sara Jerič || Nadja Dolničar
|-
| Jasmina Bešić || Kako matične celice popravijo škodo zaradi srčnih napadov || https://www.sciencedaily.com/releases/2020/03/200313112144.htm || 13.05. || 16.05. || 19.05. || Neža Leskovar || Polona Leban || Tina Javeršek
|-
| Nikola Janakievski || || || 13.05. || 16.05. || 19.05. || Luka Hafner || Stefanija Ivanova || Vid Dobrovoljc
|-
| Aljaž Simonič || || || 13.05. || 16.05. || 19.05. || Marigona Beqiraj || Luka Stanković || Tinkara Božič
|-
| Manca Pirc || || || 13.05. || 16.05. || 19.05. || Rebeka Jerina || Ana Pervanja || Kostadin Mitkov
|-
| Nika Bedrač || Nižji vnos žveplo vsebujočih amino kislin niža tveganje za razvoj kardiometaboličnih bolezni || https://www.sciencedaily.com/releases/2020/02/200203141501.htm || 20.05. || 23.05. || 26.05. || Zala Perko || Marija Dujaković || Sara Jerič
|-
| Ivana Trifunovska || || || 20.05. || 23.05. || 26.05. || Ana Žagar || Neža Leskovar || Polona Leban
|-
| Bor Krajnik || || || 20.05. || 23.05. || 26.05. || Karin Rak || Luka Hafner || Stefanija Ivanova
|-
| Erik Putar || || || 20.05. || 23.05. || 26.05. || Jakob Tomšič || Marigona Beqiraj || Luka Stanković
|-
| Ela Bizjak || || || 20.05. || 23.05. || 26.05. || Maja Kobal || Rebeka Jerina || Ana Pervanja
|}

==Naloga==
* samostojno pripraviti seminar, katerega tema je novica iz področja biokemije na portalu [http://www.sciencedaily.com ScienceDaily], ki je bila objavljena kasneje kot 1. avgusta 2018. Osnova za seminar naj bo znanstveni članek, ki je podlaga za to novico. Poleg tega članka za seminar uporabite še najmanj pet drugih virov, od teh vsaj še dva druga znanstvena članka, ki se navezujeta na to vsebino.
* članke na temo lahko iščete [https://scholar.google.com/ z Google učenjakom].
* naslov izbrane teme in povezavo do novice vpišite v tabelo seminarjev takoj ko ste si izbrali temo, najkasneje pa en teden pred rokom za oddajo
* [[TBK2020 Povzetki seminarjev|Povzetek seminarja]] opišete na wikiju v približno 200 besedah - najkasneje do dne, ko morate oddati seminar recenzentom.
* Povezavo do povzetka vnesete v tabelo seminarjev tekočega letnika.
* Seminar pripravite v obliki seminarske naloge (pisava Cambria, font 11, enojni razmak, 2,5 cm robovi; tekst naj obsega okoli 1000 besed), vsebuje naj 1-2 sliki. Slika mora imeti legendo in v besedilu mora biti na ustreznem mestu sklic na sliko. Vse uporabljene vire citirajte v tekstu, kot npr. (Nobel, 2010), na koncu pa navedite točen seznam literature, kot je opisano spodaj!
*Celotni seminar naj obsega 2 strani A4 formata (po možnosti dvostransko tiskanje).
* Seminar oddajte do datuma oddaje, ki je naveden v tabeli v elektronski obliki z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/tbk/poslji/ tega obrazca].
* vsi seminarji so v elektronski obliki dostopni [http://bio.ijs.si/~zajec/tbk/poslji//bioseminar/ tukaj].
* Recenzenti do dneva določenega v tabeli določijo popravke in podajo oceno pisnega dela, v predpisanem formatu elektronskega obrazca na internetu.
* Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Za predstavitev je na voljo 10 minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni. Prvi recenzent vodi predstavitve in razpravo ter skrbi za to, da vse poteka v zastavljenih časovnih okvirih.
* Predstavitvi sledi razprava do 5 minut. Sledijo vprašanja prisotnih, recenzenti postavijo vsak vsaj dve vprašanji in na koncu podajo oceno predstavitve.
* En dan pred predstavitvijo na strežnik oddajte tudi končno verzijo. Na dan predstavitve morate oddati tudi končno (popravljeno) in natisnjeno verzijo seminarja v enem izvodu.
* Seminarska naloga in povzetek na wikiju morajo biti v slovenskem jeziku!

==Imena datotek==
Prosim vas, da vse datoteke, ki jih pošiljate poimenujete po spodnjih pravilih. Ne uporabljajte ČŽŠčžš!
Poslati morate naslednje datoteke:
* TBK_2020_Priimek_Ime.doc(x) za seminar, npr. TBK_2020_Guncar_Gregor.docx
* TBK_2020_Priimek_ime_final.doc(x) za končno verzijo seminarja
* TBK_2020_Priimek_Ime_rec_Priimek2.doc(x) za recenzijo, kjer je Priimek2 priimek recenzenta, npr. TBK_2020_Guncar_Gregor_rec_Scott.docx (če se pišete Scott in odajate recenzijo za seminar, ki ga je napisal Gunčar)
* TBK_2020_Priimek_Ime.ppt(x) za prezentacijo, npr TBK_2020_Guncar_Gregor.pptx
* TBK_2020_Priimek_Ime_clanek.pdf za datoteko PDF, ki vsebuje izvirni članek, npr. TBK_2020_Guncar_Gregor_clanek.pdf

==Ocenjevanje seminarjev==
Recenzenti ocenijo seminar tako, da izpolnijo [[https://docs.google.com/forms/d/1Hdg2OHCyG24qwLTnFt09yZTng46RIwaIiUqnKOdsJxQ/viewform recenzentsko poročilo]] na spletu.

== Mnenje o predstavitvi ==
Vsak posameznik '''mora''' oceniti seminar tako, da odda svoje [https://docs.google.com/forms/d/1VvE-jaKikfiDO5Gdybqgp9mf_0uJZfBbIK8PLXKDaS0/viewform mnenje] najkasneje v enem tednu po predstavitvi. Kdor na seminarju ni bil prisoten, mnenja '''ne sme''' oddati.

==Urejanje spletnih strani na wikiju==
Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''

==Faktor vpliva==
Faktor vpliva (angl. impact factor) neke revije pove, kolikokrat so bili v poprečju citirani članki v tej reviji v dveh letih skupaj pred objavo tega faktorja. Faktorje vpliva za posamezno revijo lahko najdete v [http://www.cobiss.si/scripts/cobiss?command=CONNECT&base=JCR COBISS-u]. V polje "Naslov revije" vnesite ime revije za katero želite izvedeti faktor vpliva in pritisnite na gumb POIŠČI. V skrajnem desnem stolpcu se bodo izpisali faktorji vpliva za revije, ki ustrezajo vašim iskalnim kriterijem. Zadetkov za posamezno revijo je več zato, ker so navedeni faktorji vpliva za posamezno leto. Za tekoče leto faktorji vpliva še niso objavljeni, zato se orientirajte po faktorjih vpliva zadnjih par let. Če faktorja vpliva za vašo izbrano revijo ne najdete v bazi COBISS, potem izberite članek iz kakšne druge revije.

==Citiranje virov==Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se v seminarju držite ene same. Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati. '''Citiranje knjig:''' Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica. Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN. Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005. Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4. Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.). '''Citiranje člankov:''' Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani. Lartigue C. ''et al''. Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, letn. 317, str. 632-638.Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole: Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani. Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.Revija Science uporablja skrajšani zapis: C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007) V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne). '''Citiranje spletnih virov:''' Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.