Wiki FKKT - User contributions [en]

Biomolekularni aktuatorji za gensko selektivno akustično manipulacijo celic

2023-04-09T09:17:58Z

Greta Junger:

Povzeto po članku [https://www.science.org/doi/10.1126/sciadv.add9186#F3 ''D. Wu, D. Baresch, C. Cook, Z. Ma, M. Duan, D. Malounda, D. Maresca, M. P. Abundo, J. Lee, S. Shivaei, et al.: Biomolecular Actuators for Genetically Selective Acoustic Manipulation of Cells. Sci. Adv. 2023, 9.'']

== Uvod ==

Sposobnost manipulacije fizičnega položaja specifičnih celic je ključnega pomena za biomedicino, sintetično biologijo in področje živih materialov. To je mogoče doseči na različne načine, avtorji tega članka pa so se osredotočili na uporabo ultrazvoka. Slednji ima namreč sposobnost manipulacije s celicami z visoko prostorsko natančnostjo in hitro odzivnostjo preko akustične radiacijske sile. Ker pa ima večina celic podobne akustične lastnosti, so avtorji članka kot aktuatorje, tj. premikalnike celic, uporabili plinske vezikle. Z več eksperimenti so pokazali, da slednji omogočajo selektivno akustično manipulacijo celic, ki imajo v svoji citoplazmi prisotne plinske vezikle.

== Sila akustičnega sevanja ==

Na majhen sferični delec v polju ultrazvočnega (UZ) stoječega valovanja deluje sila akustičnega sevanja (ang. ''acoustic radiation force'', ARF). Slednja temelji na ustvarjeni tlačni sili, ki je časovno nespremenljiva in privlači telesa bodisi v območje najnižjega tlaka (na področje vozlišč/oslabitev valovanja), bodisi v območje najvišjega tlaka (na področje ojačitev valovanja). Ta sila je odvisna od razlik v gostoti in stisljivosti delca od okoliškega medija, kar je izraženo z akustičnim kontrastnim faktorjem Φ. Slednji določa smer delovanja ARF na delec v okoliškem mediju. Delci, katerih Φ > 0, se gibljejo v smeri območja oslabitve valovanja, delci, za katere je Φ < 0, pa potujejo v smeri ojačitev [1,2].

Preko ARF lahko z uporabo UZ enostavno manipuliramo z različnimi materiali, vendar pa je zaradi podobnih vrednosti Φ med različnimi celicami izziv povezati aktivacijo, ki temelji na ARF, z izražanjem specifičnega gena in posledično z manipulacijo specifičnih celic. Za to bi bilo potrebno genetsko kodirano sredstvo, ki bi lahko izrazito spremenilo akustične lastnosti celice. S tem v mislih so avtorji članka preverili, če lahko kot gensko selektivne aktuatorje uporabijo plinske vezikle [3].

== Plinski vezikli se neposredno odzivajo na UZ ==

Plinski vezikli (ang. ''gas vesicles'', GV) so votle proteinske nanostrukture, napolnjene s plini. Razvili so se v vodnih fotosintetskih mikrobih, kjer služijo kot sredstvo za doseganje plovnosti za boljši dostop do sončne svetlobe. Ker se GV bistveno razlikujejo v svojih fizikalnih lastnostih (nižja gostota in večja stisljivost) od okoliškega medija (voda), so raziskovalci domnevali, da bodo imeli izrazito drugačen Φ, zaradi česar bodo v polju UZ valovanja potovali drugače. GV so modelirali kot sferične delce z gostoto 120 kg/m3 in stisljivostjo 1,55 × 10^8 Pa^−1, ter tako ocenili akustični kontrastni faktor kot izrazito negativen (−11,7). Svojo domnevo so potrdili tudi z eksperimenti. GV so izolirali iz cianobakterije ''Anabaena flos-aquae'' (Ana) ter jih kemično označili s fluorescenčnim barvilom. Nato so raztopino GV prenesli v mikrofluidni kanal, opremljen s piezoelektričim resonatorjem, ki generira UZ valovanje z ustrezno valovno dolžino. Širina kanala je bila enaka polovični valovni dolžini generiranega UZ. Posledično so bila območja oslabitve v središču, območja ojačitve pa na steni kanala, kamor so tudi potovali GV. Kot kontrolo so uporabili počene GV, za katere so pokazali, da v polju UZ valovanja ne potujejo. Na podlagi obetavnih rezultatov so avtorji domnevali, da imajo GV sposobnost, da s svojo prisotnostjo v celici spremenijo njene akustične lastnosti, zaradi česar bodo celice, ki vsebujejo GV, doživele izrazito drugačno silo akustičnega sevanja kot tiste, ki GV ne vsebujejo. To bi omogočalo selektivno manipuliranje celic z UZ na podlagi njihovega genotipa [3].

== Selektivna akustična manipulacija bakterijskih celic ==

V prvem delu eksperimenta so s plazmidom pET28a, ki vsebuje insert [https://www.addgene.org/106473/ bARG1] (Acoustic Reporter Gene 1, sestavljen iz kombinacije 13 genov iz Ana in ''Bacillus megaterium'', ključnih za nastanek GV), transformirali bakterijske celice ''E. coli''. Tiste, ki so uspešno izražale GV, so označili s fluoresenčnim barvilom. Kot kontrolo so uporabili celice, v katerih so z izpostavitvijo visokemu tlaku predhodno počili GV. Po izpostavitvi celic stoječemu UZ valovanju so premik zaznali le pri celicah, ki so vsebovale GV. Te so se namreč pomaknile v območja ojačitve na steni mikrofluidnega kanala. Celice ter večina bioloških komponent ima v vodni raztopini pozitiven akustični kontrastni faktor Φ, vendar pa je ta zelo majhen (od 0.06 do 0.12). Rezultat zgornjega eksperimenta potrjuje, da prisotnost GV povzroči spremembo celotnega Φ celice, tako da ta postane manjši od nič, obenem pa reši tudi problem neodzivnosti majhnih celic na ARF. Celice, ki GV niso vsebovale, se namreč niso pomaknile nikamor (čeprav bi se zaradi pozitivnega Φ morale pomakniti v smeri območja oslabitve stoječega valovanja) [3].

Glede na obetavne rezultate so avtorji članka želeli preizkusiti, če je z UZ ob prisotnosti GV mogoča natančna in hitra prostorska manipulacija celic. Najprej so v za to posebej zasnovani akustični komori ustvarili vzorec stoječega valovanja ter vanjo dali raztopino fluorescenčno označenih celic, ki vsebujejo GV. Opazili so, da so se celice uredile v določen vzorec stoječega valovanja ter se po spremembi frekvence UZ v času nekaj sekund preoblikovale v novega. Nato so naredili še korak naprej in iz bakterijskih celic, ki vsebujejo GV, ustvarili akustični hologram. To je poimenovanje za tehniko, ki omogoča sestavljanje 3D objektov iz različnih vrst delcev samo z uporabo zvoka. Z uporabo 3D-natisnjene fazne maske so ustvarili profil visokega tlaka v obliki črke "R". Pripravili so 0,25 % raztopino agaroze v gojišču LB, ter vanjo dodali bakterijske celice, ki vsebujejo GV. Pri tem so temperaturo ves čas vzdrževali pri 37 °C, c čimer so preprečili gelacijo agaroze. Nato so raztopino izpostavili UZ ter pustili, da se je agaroza strdila. Kot pričakovano, so se bakterije znotraj strjenega gela imobilizirale v želenem prostorskem vzorcu 'R'. Uspešno so pokazali tudi, da lahko z UZ ustvarijo 'past', v katero se ujamejo celice, in s katero lahko povzročijo translacijo delcev v prostoru (podobno kot to zmore optična pinceta) [3].

== Selektivna akustična manipulacija sesalskih celic ==

V nadaljevanju so raziskovalci preverili še, če enake lastnosti veljajo tudi za sesalske celice, ki vsebujejo GV. Pripravili so gensko spremenjene celice HEK293T, ki so pod inducibilnim tetraciklinskim promotorjem vsebovale zapis za mARG1. Kot kontrolo so uporabili celice HEK293T, ki so imele pod enakim promotorjem zapis za fluorescenčni protein mCherry. Ko so celice izpostavili UZ so ugotovili, da se je večinski del celic, ki vsebujejo GV, pomaknil v območja ojačitev, torej proti stenam kanala. Za razliko od bakterijskih celic, kjer ob odsotnosti GV v polju UZ valovanja niso opazili nobenega premika, so pri kontrolnih sesalskih celicah opazili, da so se te premaknile na območje oslabitev, torej v središče kanala. To je pričakovano, saj imajo celice pozitiven akustičnim kontrastni faktor Φ, poleg tega pa so sesalske celice večje od bakterijskih in posledično čutijo vpliv ARF. Naredili so tudi podoben eksperiment, kot so ga izvedli na bakterijskih celicah. Sesalske celice so transficirali s plazmidom, ki vsebuje zapis mARG1, ter jih izpostavili enakemu akustičnemu hologramu v obliki črke R kot prej bakterije. Tudi tukaj so opazili, da so se transficirane celice uredile v želeno obliko, medtem ko so se kontrolne celice od območja vzorca izrazito odmaknile. Ključno pri tem je dejstvo, da akustična manipulacija celic v vzorec ni vplivala na njihovo viabilnost [3].

V nadaljevanju so fluorescentno označene GV inkubirali z mišjimi makrofagi, ki imajo sposobnost endocitoze. Po izpostavitvi UZ so lahko selektivno manipulirali le celice, ki so uspešno prevzele GV. S tem so pokazali, da lahko GV služijo tudi kot biomakerji za neko določeno biološko funkcijo, v tem primeru endocitoze. Pokazali so tudi, da lahko GV delujejo kot markerji, ki omogočajo razvrščanje celic na podlagi njihovega genotipa v akustično-fluidni napravi. To bi lahko predstavljalo alternativo FACS, trenutno najpogosteje uporabljeni metodi za selekcijo celic na podlagi genotipa, ki zahteva drago in kompleksno opremo [3].

== Zaključek ==

V raziskavi so pokazali, da plinski vezikli doživljajo močno silo akustičnega sevanja in delujejo kot prvi gensko kodirani aktuatorji za ultrazvok, ki imajo sposobnost, da s svojo prisotnostjo v celici povečajo in izrazito spremenijo njen akustični kontrastni faktor ter s tem spremenijo njene akustične lastnosti. Prisotnost plinskih veziklov omogoča neposredno akustično manipulacijo bakterijskih celic z lovljenjem v akustično past in kontroliranim preoblikovanjem v želen vzorec stoječega valovanja ter selektivno manipulacijo bakterijskih in sesalskih celic na podlagi njihovega genotipa v želeno obliko (nastanek akustičnega holograma).

Predstavljeni rezultati dokazujejo sposobnost GV, da služijo kot prvi gensko kodirani aktuatorji za ultrazvok in tako povežejo akustično manipulacijo s področjem molekularne in sintetične biologije. Tehnologija predstavlja velik potencial na področju tkivnega inženiringa, kjer je cilj ustvariti funkcionalna tkiva oziroma organe z uporabo živih celic. Z uporabo biomolekularnih aktuatorjev bi lahko izboljšali učinkovitost in natančnost na področju regenerativne medicine. Tak pristop namreč v primerjavi z optičnimi in magnetnimi tehnikami manipulacije ponuja edinstvene prednosti – deluje v neprozornem mediju, je neinvaziven, ne vpliva na viabilnost celic ter omogoča fino prostorsko regulacijo in hitro odzivnost, poleg tega pa je tudi relativno cenovno ugoden.

== Viri ==

[1] H. Bruus: Acoustofluidics 7: The Acoustic Radiation Force on Small Particles. Lab Chip 2012, 12, 1014–1021.

[2] J. Čemažar: Dielektroforetsko Ločevanje Bioloških Celic v Mikropretočni Komori : Doktorska Disertacija, Univ. v Ljubljani, Fak. za elektrotehniko, 2013.

[3] D. Wu, D. Baresch, C. Cook, Z. Ma, M. Duan, D. Malounda, D. Maresca, M. P. Abundo, J. Lee, S. Shivaei, et al.: Biomolecular Actuators for Genetically Selective Acoustic Manipulation of Cells. Sci. Adv. 2023, 9.

Biomolekularni aktuatorji za gensko selektivno akustično manipulacijo celic

2023-04-02T14:06:23Z

Greta Junger: /* Ekspresija plinskih veziklov omogoča selektivno akustično manipulacijo sesalskih celic */

Povzeto po članku ''D. Wu, D. Baresch, C. Cook, Z. Ma, M. Duan, D. Malounda, D. Maresca, M. P. Abundo, J. Lee, S. Shivaei, et al.: Biomolecular Actuators for Genetically Selective Acoustic Manipulation of Cells. Sci. Adv. 2023, 9.''

== Uvod ==

Sposobnost manipulacije fizičnega položaja specifičnih celic je ključnega pomena za biomedicino, sintetično biologijo in področje živih materialov. To je mogoče doseči na različne načine, avtorji tega članka pa so se osredotočili na uporabo ultrazvoka. Slednji ima namreč sposobnost manipulacije s celicami z visoko prostorsko natančnostjo in hitro odzivnostjo preko akustične radiacijske sile. Ker pa ima večina celic podobne akustične lastnosti, so avtorji članka kot aktuatorje, tj. premikalnike celic, uporabili plinske vezikle. Z več eksperimenti so pokazali, da slednji omogočajo selektivno akustično manipulacijo celic, ki imajo v svoji citoplazmi prisotne plinske vezikle.

== Sila akustičnega sevanja ==

Na majhen sferični delec v polju ultrazvočnega (UZ) stoječega valovanja deluje sila akustičnega sevanja (ang. ''acoustic radiation force'', ARF). Slednja temelji na ustvarjeni tlačni sili, ki je časovno nespremenljiva in privlači telesa bodisi v območje najnižjega tlaka (na področje vozlišč/oslabitev valovanja), bodisi v območje najvišjega tlaka (na področje ojačitev valovanja). Ta sila je odvisna od razlik v gostoti in stisljivosti delca od okoliškega medija, kar je izraženo z akustičnim kontrastnim faktorjem Φ. Slednji določa smer delovanja ARF na delec v okoliškem mediju. Delci, katerih Φ > 0, se gibljejo v smeri območja oslabitve valovanja, delci, za katere je Φ < 0, pa potujejo v smeri ojačitev [1,2].

Preko ARF lahko z uporabo UZ enostavno manipuliramo z različnimi materiali, vendar pa je zaradi podobnih vrednosti Φ med različnimi celicami izziv povezati aktivacijo, ki temelji na ARF, z izražanjem specifičnega gena in posledično z manipulacijo specifičnih celic. Za to bi bilo potrebno genetsko kodirano sredstvo, ki bi lahko izrazito spremenilo akustične lastnosti celice. S tem v mislih so avtorji članka preverili, če lahko kot gensko selektivne aktuatorje uporabijo plinske vezikle [3].

== Plinski vezikli se neposredno odzivajo na UZ ==

Plinski vezikli (ang. ''gas vesicles'', GV) so votle proteinske nanostrukture, napolnjene s plini. Razvili so se v vodnih fotosintetskih mikrobih, kjer služijo kot sredstvo za doseganje plovnosti za boljši dostop do sončne svetlobe. Ker se GV bistveno razlikujejo v svojih fizikalnih lastnostih (nižja gostota in večja stisljivost) od okoliškega medija (voda), so raziskovalci domnevali, da bodo imeli izrazito drugačen Φ, zaradi česar bodo v polju UZ valovanja potovali drugače. GV so modelirali kot sferične delce z gostoto 120 kg/m3 in stisljivostjo 1,55 × 10^8 Pa^−1, ter tako ocenili akustični kontrastni faktor kot izrazito negativen (−11,7). Svojo domnevo so potrdili tudi z eksperimenti. GV so izolirali iz cianobakterije ''Anabaena flos-aquae'' (Ana) ter jih kemično označili s fluorescenčnim barvilom. Nato so raztopino GV prenesli v mikrofluidni kanal, opremljen s piezoelektričim resonatorjem, ki generira UZ valovanje z ustrezno valovno dolžino. Širina kanala je bila enaka polovični valovni dolžini generiranega UZ. Posledično so bila območja oslabitve v središču, območja ojačitve pa na steni kanala, kamor so tudi potovali GV. Kot kontrolo so uporabili počene GV, za katere so pokazali, da v polju UZ valovanja ne potujejo. Na podlagi obetavnih rezultatov so avtorji domnevali, da imajo GV sposobnost, da s svojo prisotnostjo v celici spremenijo njene akustične lastnosti, zaradi česar bodo celice, ki vsebujejo GV, doživele izrazito drugačno silo akustičnega sevanja kot tiste, ki GV ne vsebujejo. To bi omogočalo selektivno manipuliranje celic z UZ na podlagi njihovega genotipa [3].

== Selektivna akustična manipulacija bakterijskih celic ==

V prvem delu eksperimenta so s plazmidom pET28a, ki vsebuje insert [https://www.addgene.org/106473/ bARG1] (Acoustic Reporter Gene 1, sestavljen iz kombinacije 13 genov iz Ana in ''Bacillus megaterium'', ključnih za nastanek GV), transformirali bakterijske celice ''E. coli''. Tiste, ki so uspešno izražale GV, so označili s fluoresenčnim barvilom. Kot kontrolo so uporabili celice, v katerih so z izpostavitvijo visokemu tlaku predhodno počili GV. Po izpostavitvi celic stoječemu UZ valovanju so premik zaznali le pri celicah, ki so vsebovale GV. Te so se namreč pomaknile v območja ojačitve na steni mikrofluidnega kanala. Celice ter večina bioloških komponent ima v vodni raztopini pozitiven akustični kontrastni faktor Φ, vendar pa je ta zelo majhen (od 0.06 do 0.12). Rezultat zgornjega eksperimenta potrjuje, da prisotnost GV povzroči spremembo celotnega Φ celice, tako da ta postane manjši od nič, obenem pa reši tudi problem neodzivnosti majhnih celic na ARF. Celice, ki GV niso vsebovale, se namreč niso pomaknile nikamor (čeprav bi se zaradi pozitivnega Φ morale pomakniti v smeri območja oslabitve stoječega valovanja) [3].

Glede na obetavne rezultate so avtorji članka želeli preizkusiti, če je z UZ ob prisotnosti GV mogoča natančna in hitra prostorska manipulacija celic. Najprej so v za to posebej zasnovani akustični komori ustvarili vzorec stoječega valovanja ter vanjo dali raztopino fluorescenčno označenih celic, ki vsebujejo GV. Opazili so, da so se celice uredile v določen vzorec stoječega valovanja ter se po spremembi frekvence UZ v času nekaj sekund preoblikovale v novega. Nato so naredili še korak naprej in iz bakterijskih celic, ki vsebujejo GV, ustvarili akustični hologram. To je poimenovanje za tehniko, ki omogoča sestavljanje 3D objektov iz različnih vrst delcev samo z uporabo zvoka. Z uporabo 3D-natisnjene fazne maske so ustvarili profil visokega tlaka v obliki črke "R". Pripravili so 0,25 % raztopino agaroze v gojišču LB, ter vanjo dodali bakterijske celice, ki vsebujejo GV. Pri tem so temperaturo ves čas vzdrževali pri 37 °C, c čimer so preprečili gelacijo agaroze. Nato so raztopino izpostavili UZ ter pustili, da se je agaroza strdila. Kot pričakovano, so se bakterije znotraj strjenega gela imobilizirale v želenem prostorskem vzorcu 'R'. Uspešno so pokazali tudi, da lahko z UZ ustvarijo 'past', v katero se ujamejo celice, in s katero lahko povzročijo translacijo delcev v prostoru (podobno kot to zmore optična pinceta) [3].

== Selektivna akustična manipulacija sesalskih celic ==

V nadaljevanju so raziskovalci preverili še, če enake lastnosti veljajo tudi za sesalske celice, ki vsebujejo GV. Pripravili so gensko spremenjene celice HEK293T, ki so pod inducibilnim tetraciklinskim promotorjem vsebovale zapis za mARG1. Kot kontrolo so uporabili celice HEK293T, ki so imele pod enakim promotorjem zapis za fluorescenčni protein mCherry. Ko so celice izpostavili UZ so ugotovili, da se je večinski del celic, ki vsebujejo GV, pomaknil v območja ojačitev, torej proti stenam kanala. Za razliko od bakterijskih celic, kjer ob odsotnosti GV v polju UZ valovanja niso opazili nobenega premika, so pri kontrolnih sesalskih celicah opazili, da so se te premaknile na območje oslabitev, torej v središče kanala. To je pričakovano, saj imajo celice pozitiven akustičnim kontrastni faktor Φ, poleg tega pa so sesalske celice večje od bakterijskih in posledično čutijo vpliv ARF. Naredili so tudi podoben eksperiment, kot so ga izvedli na bakterijskih celicah. Sesalske celice so transficirali s plazmidom, ki vsebuje zapis mARG1, ter jih izpostavili enakemu akustičnemu hologramu v obliki črke R kot prej bakterije. Tudi tukaj so opazili, da so se transficirane celice uredile v želeno obliko, medtem ko so se kontrolne celice od območja vzorca izrazito odmaknile. Ključno pri tem je dejstvo, da akustična manipulacija celic v vzorec ni vplivala na njihovo viabilnost [3].

V nadaljevanju so fluorescentno označene GV inkubirali z mišjimi makrofagi, ki imajo sposobnost endocitoze. Po izpostavitvi UZ so lahko selektivno manipulirali le celice, ki so uspešno prevzele GV. S tem so pokazali, da lahko GV služijo tudi kot biomakerji za neko določeno biološko funkcijo, v tem primeru endocitoze. Pokazali so tudi, da lahko GV delujejo kot markerji, ki omogočajo razvrščanje celic na podlagi njihovega genotipa v akustično-fluidni napravi. To bi lahko predstavljalo alternativo FACS, trenutno najpogosteje uporabljeni metodi za selekcijo celic na podlagi genotipa, ki zahteva drago in kompleksno opremo [3].

== Zaključek ==

V raziskavi so pokazali, da plinski vezikli doživljajo močno silo akustičnega sevanja in delujejo kot prvi gensko kodirani aktuatorji za ultrazvok, ki imajo sposobnost, da s svojo prisotnostjo v celici povečajo in izrazito spremenijo njen akustični kontrastni faktor ter s tem spremenijo njene akustične lastnosti. Prisotnost plinskih veziklov omogoča neposredno akustično manipulacijo bakterijskih celic z lovljenjem v akustično past in kontroliranim preoblikovanjem v želen vzorec stoječega valovanja ter selektivno manipulacijo bakterijskih in sesalskih celic na podlagi njihovega genotipa v želeno obliko (nastanek akustičnega holograma).

Predstavljeni rezultati dokazujejo sposobnost GV, da služijo kot prvi gensko kodirani aktuatorji za ultrazvok in tako povežejo akustično manipulacijo s področjem molekularne in sintetične biologije. Tehnologija predstavlja velik potencial na področju tkivnega inženiringa, kjer je cilj ustvariti funkcionalna tkiva oziroma organe z uporabo živih celic. Z uporabo biomolekularnih aktuatorjev bi lahko izboljšali učinkovitost in natančnost na področju regenerativne medicine. Tak pristop namreč v primerjavi z optičnimi in magnetnimi tehnikami manipulacije ponuja edinstvene prednosti – deluje v neprozornem mediju, je neinvaziven, ne vpliva na viabilnost celic ter omogoča fino prostorsko regulacijo in hitro odzivnost, poleg tega pa je tudi relativno cenovno ugoden.

== Viri ==

[1] H. Bruus: Acoustofluidics 7: The Acoustic Radiation Force on Small Particles. Lab Chip 2012, 12, 1014–1021.

[2] J. Čemažar: Dielektroforetsko Ločevanje Bioloških Celic v Mikropretočni Komori : Doktorska Disertacija, Univ. v Ljubljani, Fak. za elektrotehniko, 2013.

[3] D. Wu, D. Baresch, C. Cook, Z. Ma, M. Duan, D. Malounda, D. Maresca, M. P. Abundo, J. Lee, S. Shivaei, et al.: Biomolecular Actuators for Genetically Selective Acoustic Manipulation of Cells. Sci. Adv. 2023, 9.

Biomolekularni aktuatorji za gensko selektivno akustično manipulacijo celic

2023-04-02T14:06:06Z

Greta Junger: /* Selektivno akustično manipulacijo bakterijskih celic */

Povzeto po članku ''D. Wu, D. Baresch, C. Cook, Z. Ma, M. Duan, D. Malounda, D. Maresca, M. P. Abundo, J. Lee, S. Shivaei, et al.: Biomolecular Actuators for Genetically Selective Acoustic Manipulation of Cells. Sci. Adv. 2023, 9.''

== Uvod ==

Sposobnost manipulacije fizičnega položaja specifičnih celic je ključnega pomena za biomedicino, sintetično biologijo in področje živih materialov. To je mogoče doseči na različne načine, avtorji tega članka pa so se osredotočili na uporabo ultrazvoka. Slednji ima namreč sposobnost manipulacije s celicami z visoko prostorsko natančnostjo in hitro odzivnostjo preko akustične radiacijske sile. Ker pa ima večina celic podobne akustične lastnosti, so avtorji članka kot aktuatorje, tj. premikalnike celic, uporabili plinske vezikle. Z več eksperimenti so pokazali, da slednji omogočajo selektivno akustično manipulacijo celic, ki imajo v svoji citoplazmi prisotne plinske vezikle.

== Sila akustičnega sevanja ==

Na majhen sferični delec v polju ultrazvočnega (UZ) stoječega valovanja deluje sila akustičnega sevanja (ang. ''acoustic radiation force'', ARF). Slednja temelji na ustvarjeni tlačni sili, ki je časovno nespremenljiva in privlači telesa bodisi v območje najnižjega tlaka (na področje vozlišč/oslabitev valovanja), bodisi v območje najvišjega tlaka (na področje ojačitev valovanja). Ta sila je odvisna od razlik v gostoti in stisljivosti delca od okoliškega medija, kar je izraženo z akustičnim kontrastnim faktorjem Φ. Slednji določa smer delovanja ARF na delec v okoliškem mediju. Delci, katerih Φ > 0, se gibljejo v smeri območja oslabitve valovanja, delci, za katere je Φ < 0, pa potujejo v smeri ojačitev [1,2].

Preko ARF lahko z uporabo UZ enostavno manipuliramo z različnimi materiali, vendar pa je zaradi podobnih vrednosti Φ med različnimi celicami izziv povezati aktivacijo, ki temelji na ARF, z izražanjem specifičnega gena in posledično z manipulacijo specifičnih celic. Za to bi bilo potrebno genetsko kodirano sredstvo, ki bi lahko izrazito spremenilo akustične lastnosti celice. S tem v mislih so avtorji članka preverili, če lahko kot gensko selektivne aktuatorje uporabijo plinske vezikle [3].

== Plinski vezikli se neposredno odzivajo na UZ ==

Plinski vezikli (ang. ''gas vesicles'', GV) so votle proteinske nanostrukture, napolnjene s plini. Razvili so se v vodnih fotosintetskih mikrobih, kjer služijo kot sredstvo za doseganje plovnosti za boljši dostop do sončne svetlobe. Ker se GV bistveno razlikujejo v svojih fizikalnih lastnostih (nižja gostota in večja stisljivost) od okoliškega medija (voda), so raziskovalci domnevali, da bodo imeli izrazito drugačen Φ, zaradi česar bodo v polju UZ valovanja potovali drugače. GV so modelirali kot sferične delce z gostoto 120 kg/m3 in stisljivostjo 1,55 × 10^8 Pa^−1, ter tako ocenili akustični kontrastni faktor kot izrazito negativen (−11,7). Svojo domnevo so potrdili tudi z eksperimenti. GV so izolirali iz cianobakterije ''Anabaena flos-aquae'' (Ana) ter jih kemično označili s fluorescenčnim barvilom. Nato so raztopino GV prenesli v mikrofluidni kanal, opremljen s piezoelektričim resonatorjem, ki generira UZ valovanje z ustrezno valovno dolžino. Širina kanala je bila enaka polovični valovni dolžini generiranega UZ. Posledično so bila območja oslabitve v središču, območja ojačitve pa na steni kanala, kamor so tudi potovali GV. Kot kontrolo so uporabili počene GV, za katere so pokazali, da v polju UZ valovanja ne potujejo. Na podlagi obetavnih rezultatov so avtorji domnevali, da imajo GV sposobnost, da s svojo prisotnostjo v celici spremenijo njene akustične lastnosti, zaradi česar bodo celice, ki vsebujejo GV, doživele izrazito drugačno silo akustičnega sevanja kot tiste, ki GV ne vsebujejo. To bi omogočalo selektivno manipuliranje celic z UZ na podlagi njihovega genotipa [3].

== Selektivna akustična manipulacija bakterijskih celic ==

V prvem delu eksperimenta so s plazmidom pET28a, ki vsebuje insert [https://www.addgene.org/106473/ bARG1] (Acoustic Reporter Gene 1, sestavljen iz kombinacije 13 genov iz Ana in ''Bacillus megaterium'', ključnih za nastanek GV), transformirali bakterijske celice ''E. coli''. Tiste, ki so uspešno izražale GV, so označili s fluoresenčnim barvilom. Kot kontrolo so uporabili celice, v katerih so z izpostavitvijo visokemu tlaku predhodno počili GV. Po izpostavitvi celic stoječemu UZ valovanju so premik zaznali le pri celicah, ki so vsebovale GV. Te so se namreč pomaknile v območja ojačitve na steni mikrofluidnega kanala. Celice ter večina bioloških komponent ima v vodni raztopini pozitiven akustični kontrastni faktor Φ, vendar pa je ta zelo majhen (od 0.06 do 0.12). Rezultat zgornjega eksperimenta potrjuje, da prisotnost GV povzroči spremembo celotnega Φ celice, tako da ta postane manjši od nič, obenem pa reši tudi problem neodzivnosti majhnih celic na ARF. Celice, ki GV niso vsebovale, se namreč niso pomaknile nikamor (čeprav bi se zaradi pozitivnega Φ morale pomakniti v smeri območja oslabitve stoječega valovanja) [3].

Glede na obetavne rezultate so avtorji članka želeli preizkusiti, če je z UZ ob prisotnosti GV mogoča natančna in hitra prostorska manipulacija celic. Najprej so v za to posebej zasnovani akustični komori ustvarili vzorec stoječega valovanja ter vanjo dali raztopino fluorescenčno označenih celic, ki vsebujejo GV. Opazili so, da so se celice uredile v določen vzorec stoječega valovanja ter se po spremembi frekvence UZ v času nekaj sekund preoblikovale v novega. Nato so naredili še korak naprej in iz bakterijskih celic, ki vsebujejo GV, ustvarili akustični hologram. To je poimenovanje za tehniko, ki omogoča sestavljanje 3D objektov iz različnih vrst delcev samo z uporabo zvoka. Z uporabo 3D-natisnjene fazne maske so ustvarili profil visokega tlaka v obliki črke "R". Pripravili so 0,25 % raztopino agaroze v gojišču LB, ter vanjo dodali bakterijske celice, ki vsebujejo GV. Pri tem so temperaturo ves čas vzdrževali pri 37 °C, c čimer so preprečili gelacijo agaroze. Nato so raztopino izpostavili UZ ter pustili, da se je agaroza strdila. Kot pričakovano, so se bakterije znotraj strjenega gela imobilizirale v želenem prostorskem vzorcu 'R'. Uspešno so pokazali tudi, da lahko z UZ ustvarijo 'past', v katero se ujamejo celice, in s katero lahko povzročijo translacijo delcev v prostoru (podobno kot to zmore optična pinceta) [3].

== Ekspresija plinskih veziklov omogoča selektivno akustično manipulacijo sesalskih celic ==

V nadaljevanju so raziskovalci preverili še, če enake lastnosti veljajo tudi za sesalske celice, ki vsebujejo GV. Pripravili so gensko spremenjene celice HEK293T, ki so pod inducibilnim tetraciklinskim promotorjem vsebovale zapis za mARG1. Kot kontrolo so uporabili celice HEK293T, ki so imele pod enakim promotorjem zapis za fluorescenčni protein mCherry. Ko so celice izpostavili UZ so ugotovili, da se je večinski del celic, ki vsebujejo GV, pomaknil v območja ojačitev, torej proti stenam kanala. Za razliko od bakterijskih celic, kjer ob odsotnosti GV v polju UZ valovanja niso opazili nobenega premika, so pri kontrolnih sesalskih celicah opazili, da so se te premaknile na območje oslabitev, torej v središče kanala. To je pričakovano, saj imajo celice pozitiven akustičnim kontrastni faktor Φ, poleg tega pa so sesalske celice večje od bakterijskih in posledično čutijo vpliv ARF. Naredili so tudi podoben eksperiment, kot so ga izvedli na bakterijskih celicah. Sesalske celice so transficirali s plazmidom, ki vsebuje zapis mARG1, ter jih izpostavili enakemu akustičnemu hologramu v obliki črke R kot prej bakterije. Tudi tukaj so opazili, da so se transficirane celice uredile v želeno obliko, medtem ko so se kontrolne celice od območja vzorca izrazito odmaknile. Ključno pri tem je dejstvo, da akustična manipulacija celic v vzorec ni vplivala na njihovo viabilnost [3].

V nadaljevanju so fluorescentno označene GV inkubirali z mišjimi makrofagi, ki imajo sposobnost endocitoze. Po izpostavitvi UZ so lahko selektivno manipulirali le celice, ki so uspešno prevzele GV. S tem so pokazali, da lahko GV služijo tudi kot biomakerji za neko določeno biološko funkcijo, v tem primeru endocitoze. Pokazali so tudi, da lahko GV delujejo kot markerji, ki omogočajo razvrščanje celic na podlagi njihovega genotipa v akustično-fluidni napravi. To bi lahko predstavljalo alternativo FACS, trenutno najpogosteje uporabljeni metodi za selekcijo celic na podlagi genotipa, ki zahteva drago in kompleksno opremo [3].

== Zaključek ==

V raziskavi so pokazali, da plinski vezikli doživljajo močno silo akustičnega sevanja in delujejo kot prvi gensko kodirani aktuatorji za ultrazvok, ki imajo sposobnost, da s svojo prisotnostjo v celici povečajo in izrazito spremenijo njen akustični kontrastni faktor ter s tem spremenijo njene akustične lastnosti. Prisotnost plinskih veziklov omogoča neposredno akustično manipulacijo bakterijskih celic z lovljenjem v akustično past in kontroliranim preoblikovanjem v želen vzorec stoječega valovanja ter selektivno manipulacijo bakterijskih in sesalskih celic na podlagi njihovega genotipa v želeno obliko (nastanek akustičnega holograma).

Predstavljeni rezultati dokazujejo sposobnost GV, da služijo kot prvi gensko kodirani aktuatorji za ultrazvok in tako povežejo akustično manipulacijo s področjem molekularne in sintetične biologije. Tehnologija predstavlja velik potencial na področju tkivnega inženiringa, kjer je cilj ustvariti funkcionalna tkiva oziroma organe z uporabo živih celic. Z uporabo biomolekularnih aktuatorjev bi lahko izboljšali učinkovitost in natančnost na področju regenerativne medicine. Tak pristop namreč v primerjavi z optičnimi in magnetnimi tehnikami manipulacije ponuja edinstvene prednosti – deluje v neprozornem mediju, je neinvaziven, ne vpliva na viabilnost celic ter omogoča fino prostorsko regulacijo in hitro odzivnost, poleg tega pa je tudi relativno cenovno ugoden.

== Viri ==

[1] H. Bruus: Acoustofluidics 7: The Acoustic Radiation Force on Small Particles. Lab Chip 2012, 12, 1014–1021.

[2] J. Čemažar: Dielektroforetsko Ločevanje Bioloških Celic v Mikropretočni Komori : Doktorska Disertacija, Univ. v Ljubljani, Fak. za elektrotehniko, 2013.

[3] D. Wu, D. Baresch, C. Cook, Z. Ma, M. Duan, D. Malounda, D. Maresca, M. P. Abundo, J. Lee, S. Shivaei, et al.: Biomolecular Actuators for Genetically Selective Acoustic Manipulation of Cells. Sci. Adv. 2023, 9.

Biomolekularni aktuatorji za gensko selektivno akustično manipulacijo celic

2023-04-02T14:05:39Z

Greta Junger: /* Ekspresija plinskih veziklov omogoča selektivno akustično manipulacijo bakterijskih celic */

Povzeto po članku ''D. Wu, D. Baresch, C. Cook, Z. Ma, M. Duan, D. Malounda, D. Maresca, M. P. Abundo, J. Lee, S. Shivaei, et al.: Biomolecular Actuators for Genetically Selective Acoustic Manipulation of Cells. Sci. Adv. 2023, 9.''

== Uvod ==

Sposobnost manipulacije fizičnega položaja specifičnih celic je ključnega pomena za biomedicino, sintetično biologijo in področje živih materialov. To je mogoče doseči na različne načine, avtorji tega članka pa so se osredotočili na uporabo ultrazvoka. Slednji ima namreč sposobnost manipulacije s celicami z visoko prostorsko natančnostjo in hitro odzivnostjo preko akustične radiacijske sile. Ker pa ima večina celic podobne akustične lastnosti, so avtorji članka kot aktuatorje, tj. premikalnike celic, uporabili plinske vezikle. Z več eksperimenti so pokazali, da slednji omogočajo selektivno akustično manipulacijo celic, ki imajo v svoji citoplazmi prisotne plinske vezikle.

== Sila akustičnega sevanja ==

Na majhen sferični delec v polju ultrazvočnega (UZ) stoječega valovanja deluje sila akustičnega sevanja (ang. ''acoustic radiation force'', ARF). Slednja temelji na ustvarjeni tlačni sili, ki je časovno nespremenljiva in privlači telesa bodisi v območje najnižjega tlaka (na področje vozlišč/oslabitev valovanja), bodisi v območje najvišjega tlaka (na področje ojačitev valovanja). Ta sila je odvisna od razlik v gostoti in stisljivosti delca od okoliškega medija, kar je izraženo z akustičnim kontrastnim faktorjem Φ. Slednji določa smer delovanja ARF na delec v okoliškem mediju. Delci, katerih Φ > 0, se gibljejo v smeri območja oslabitve valovanja, delci, za katere je Φ < 0, pa potujejo v smeri ojačitev [1,2].

Preko ARF lahko z uporabo UZ enostavno manipuliramo z različnimi materiali, vendar pa je zaradi podobnih vrednosti Φ med različnimi celicami izziv povezati aktivacijo, ki temelji na ARF, z izražanjem specifičnega gena in posledično z manipulacijo specifičnih celic. Za to bi bilo potrebno genetsko kodirano sredstvo, ki bi lahko izrazito spremenilo akustične lastnosti celice. S tem v mislih so avtorji članka preverili, če lahko kot gensko selektivne aktuatorje uporabijo plinske vezikle [3].

== Plinski vezikli se neposredno odzivajo na UZ ==

Plinski vezikli (ang. ''gas vesicles'', GV) so votle proteinske nanostrukture, napolnjene s plini. Razvili so se v vodnih fotosintetskih mikrobih, kjer služijo kot sredstvo za doseganje plovnosti za boljši dostop do sončne svetlobe. Ker se GV bistveno razlikujejo v svojih fizikalnih lastnostih (nižja gostota in večja stisljivost) od okoliškega medija (voda), so raziskovalci domnevali, da bodo imeli izrazito drugačen Φ, zaradi česar bodo v polju UZ valovanja potovali drugače. GV so modelirali kot sferične delce z gostoto 120 kg/m3 in stisljivostjo 1,55 × 10^8 Pa^−1, ter tako ocenili akustični kontrastni faktor kot izrazito negativen (−11,7). Svojo domnevo so potrdili tudi z eksperimenti. GV so izolirali iz cianobakterije ''Anabaena flos-aquae'' (Ana) ter jih kemično označili s fluorescenčnim barvilom. Nato so raztopino GV prenesli v mikrofluidni kanal, opremljen s piezoelektričim resonatorjem, ki generira UZ valovanje z ustrezno valovno dolžino. Širina kanala je bila enaka polovični valovni dolžini generiranega UZ. Posledično so bila območja oslabitve v središču, območja ojačitve pa na steni kanala, kamor so tudi potovali GV. Kot kontrolo so uporabili počene GV, za katere so pokazali, da v polju UZ valovanja ne potujejo. Na podlagi obetavnih rezultatov so avtorji domnevali, da imajo GV sposobnost, da s svojo prisotnostjo v celici spremenijo njene akustične lastnosti, zaradi česar bodo celice, ki vsebujejo GV, doživele izrazito drugačno silo akustičnega sevanja kot tiste, ki GV ne vsebujejo. To bi omogočalo selektivno manipuliranje celic z UZ na podlagi njihovega genotipa [3].

== Selektivno akustično manipulacijo bakterijskih celic ==

V prvem delu eksperimenta so s plazmidom pET28a, ki vsebuje insert [https://www.addgene.org/106473/ bARG1] (Acoustic Reporter Gene 1, sestavljen iz kombinacije 13 genov iz Ana in ''Bacillus megaterium'', ključnih za nastanek GV), transformirali bakterijske celice ''E. coli''. Tiste, ki so uspešno izražale GV, so označili s fluoresenčnim barvilom. Kot kontrolo so uporabili celice, v katerih so z izpostavitvijo visokemu tlaku predhodno počili GV. Po izpostavitvi celic stoječemu UZ valovanju so premik zaznali le pri celicah, ki so vsebovale GV. Te so se namreč pomaknile v območja ojačitve na steni mikrofluidnega kanala. Celice ter večina bioloških komponent ima v vodni raztopini pozitiven akustični kontrastni faktor Φ, vendar pa je ta zelo majhen (od 0.06 do 0.12). Rezultat zgornjega eksperimenta potrjuje, da prisotnost GV povzroči spremembo celotnega Φ celice, tako da ta postane manjši od nič, obenem pa reši tudi problem neodzivnosti majhnih celic na ARF. Celice, ki GV niso vsebovale, se namreč niso pomaknile nikamor (čeprav bi se zaradi pozitivnega Φ morale pomakniti v smeri območja oslabitve stoječega valovanja) [3].

Glede na obetavne rezultate so avtorji članka želeli preizkusiti, če je z UZ ob prisotnosti GV mogoča natančna in hitra prostorska manipulacija celic. Najprej so v za to posebej zasnovani akustični komori ustvarili vzorec stoječega valovanja ter vanjo dali raztopino fluorescenčno označenih celic, ki vsebujejo GV. Opazili so, da so se celice uredile v določen vzorec stoječega valovanja ter se po spremembi frekvence UZ v času nekaj sekund preoblikovale v novega. Nato so naredili še korak naprej in iz bakterijskih celic, ki vsebujejo GV, ustvarili akustični hologram. To je poimenovanje za tehniko, ki omogoča sestavljanje 3D objektov iz različnih vrst delcev samo z uporabo zvoka. Z uporabo 3D-natisnjene fazne maske so ustvarili profil visokega tlaka v obliki črke "R". Pripravili so 0,25 % raztopino agaroze v gojišču LB, ter vanjo dodali bakterijske celice, ki vsebujejo GV. Pri tem so temperaturo ves čas vzdrževali pri 37 °C, c čimer so preprečili gelacijo agaroze. Nato so raztopino izpostavili UZ ter pustili, da se je agaroza strdila. Kot pričakovano, so se bakterije znotraj strjenega gela imobilizirale v želenem prostorskem vzorcu 'R'. Uspešno so pokazali tudi, da lahko z UZ ustvarijo 'past', v katero se ujamejo celice, in s katero lahko povzročijo translacijo delcev v prostoru (podobno kot to zmore optična pinceta) [3].

== Ekspresija plinskih veziklov omogoča selektivno akustično manipulacijo sesalskih celic ==

V nadaljevanju so raziskovalci preverili še, če enake lastnosti veljajo tudi za sesalske celice, ki vsebujejo GV. Pripravili so gensko spremenjene celice HEK293T, ki so pod inducibilnim tetraciklinskim promotorjem vsebovale zapis za mARG1. Kot kontrolo so uporabili celice HEK293T, ki so imele pod enakim promotorjem zapis za fluorescenčni protein mCherry. Ko so celice izpostavili UZ so ugotovili, da se je večinski del celic, ki vsebujejo GV, pomaknil v območja ojačitev, torej proti stenam kanala. Za razliko od bakterijskih celic, kjer ob odsotnosti GV v polju UZ valovanja niso opazili nobenega premika, so pri kontrolnih sesalskih celicah opazili, da so se te premaknile na območje oslabitev, torej v središče kanala. To je pričakovano, saj imajo celice pozitiven akustičnim kontrastni faktor Φ, poleg tega pa so sesalske celice večje od bakterijskih in posledično čutijo vpliv ARF. Naredili so tudi podoben eksperiment, kot so ga izvedli na bakterijskih celicah. Sesalske celice so transficirali s plazmidom, ki vsebuje zapis mARG1, ter jih izpostavili enakemu akustičnemu hologramu v obliki črke R kot prej bakterije. Tudi tukaj so opazili, da so se transficirane celice uredile v želeno obliko, medtem ko so se kontrolne celice od območja vzorca izrazito odmaknile. Ključno pri tem je dejstvo, da akustična manipulacija celic v vzorec ni vplivala na njihovo viabilnost [3].

V nadaljevanju so fluorescentno označene GV inkubirali z mišjimi makrofagi, ki imajo sposobnost endocitoze. Po izpostavitvi UZ so lahko selektivno manipulirali le celice, ki so uspešno prevzele GV. S tem so pokazali, da lahko GV služijo tudi kot biomakerji za neko določeno biološko funkcijo, v tem primeru endocitoze. Pokazali so tudi, da lahko GV delujejo kot markerji, ki omogočajo razvrščanje celic na podlagi njihovega genotipa v akustično-fluidni napravi. To bi lahko predstavljalo alternativo FACS, trenutno najpogosteje uporabljeni metodi za selekcijo celic na podlagi genotipa, ki zahteva drago in kompleksno opremo [3].

== Zaključek ==

V raziskavi so pokazali, da plinski vezikli doživljajo močno silo akustičnega sevanja in delujejo kot prvi gensko kodirani aktuatorji za ultrazvok, ki imajo sposobnost, da s svojo prisotnostjo v celici povečajo in izrazito spremenijo njen akustični kontrastni faktor ter s tem spremenijo njene akustične lastnosti. Prisotnost plinskih veziklov omogoča neposredno akustično manipulacijo bakterijskih celic z lovljenjem v akustično past in kontroliranim preoblikovanjem v želen vzorec stoječega valovanja ter selektivno manipulacijo bakterijskih in sesalskih celic na podlagi njihovega genotipa v želeno obliko (nastanek akustičnega holograma).

Predstavljeni rezultati dokazujejo sposobnost GV, da služijo kot prvi gensko kodirani aktuatorji za ultrazvok in tako povežejo akustično manipulacijo s področjem molekularne in sintetične biologije. Tehnologija predstavlja velik potencial na področju tkivnega inženiringa, kjer je cilj ustvariti funkcionalna tkiva oziroma organe z uporabo živih celic. Z uporabo biomolekularnih aktuatorjev bi lahko izboljšali učinkovitost in natančnost na področju regenerativne medicine. Tak pristop namreč v primerjavi z optičnimi in magnetnimi tehnikami manipulacije ponuja edinstvene prednosti – deluje v neprozornem mediju, je neinvaziven, ne vpliva na viabilnost celic ter omogoča fino prostorsko regulacijo in hitro odzivnost, poleg tega pa je tudi relativno cenovno ugoden.

== Viri ==

[1] H. Bruus: Acoustofluidics 7: The Acoustic Radiation Force on Small Particles. Lab Chip 2012, 12, 1014–1021.

[2] J. Čemažar: Dielektroforetsko Ločevanje Bioloških Celic v Mikropretočni Komori : Doktorska Disertacija, Univ. v Ljubljani, Fak. za elektrotehniko, 2013.

[3] D. Wu, D. Baresch, C. Cook, Z. Ma, M. Duan, D. Malounda, D. Maresca, M. P. Abundo, J. Lee, S. Shivaei, et al.: Biomolecular Actuators for Genetically Selective Acoustic Manipulation of Cells. Sci. Adv. 2023, 9.

Biomolekularni aktuatorji za gensko selektivno akustično manipulacijo celic

2023-04-02T14:05:18Z

Greta Junger: /* Ekspresija plinskih veziklov omogoča selektivno akustično manipulacijo sesalskih celic */

Povzeto po članku ''D. Wu, D. Baresch, C. Cook, Z. Ma, M. Duan, D. Malounda, D. Maresca, M. P. Abundo, J. Lee, S. Shivaei, et al.: Biomolecular Actuators for Genetically Selective Acoustic Manipulation of Cells. Sci. Adv. 2023, 9.''

== Uvod ==

Sposobnost manipulacije fizičnega položaja specifičnih celic je ključnega pomena za biomedicino, sintetično biologijo in področje živih materialov. To je mogoče doseči na različne načine, avtorji tega članka pa so se osredotočili na uporabo ultrazvoka. Slednji ima namreč sposobnost manipulacije s celicami z visoko prostorsko natančnostjo in hitro odzivnostjo preko akustične radiacijske sile. Ker pa ima večina celic podobne akustične lastnosti, so avtorji članka kot aktuatorje, tj. premikalnike celic, uporabili plinske vezikle. Z več eksperimenti so pokazali, da slednji omogočajo selektivno akustično manipulacijo celic, ki imajo v svoji citoplazmi prisotne plinske vezikle.

== Sila akustičnega sevanja ==

Na majhen sferični delec v polju ultrazvočnega (UZ) stoječega valovanja deluje sila akustičnega sevanja (ang. ''acoustic radiation force'', ARF). Slednja temelji na ustvarjeni tlačni sili, ki je časovno nespremenljiva in privlači telesa bodisi v območje najnižjega tlaka (na področje vozlišč/oslabitev valovanja), bodisi v območje najvišjega tlaka (na področje ojačitev valovanja). Ta sila je odvisna od razlik v gostoti in stisljivosti delca od okoliškega medija, kar je izraženo z akustičnim kontrastnim faktorjem Φ. Slednji določa smer delovanja ARF na delec v okoliškem mediju. Delci, katerih Φ > 0, se gibljejo v smeri območja oslabitve valovanja, delci, za katere je Φ < 0, pa potujejo v smeri ojačitev [1,2].

Preko ARF lahko z uporabo UZ enostavno manipuliramo z različnimi materiali, vendar pa je zaradi podobnih vrednosti Φ med različnimi celicami izziv povezati aktivacijo, ki temelji na ARF, z izražanjem specifičnega gena in posledično z manipulacijo specifičnih celic. Za to bi bilo potrebno genetsko kodirano sredstvo, ki bi lahko izrazito spremenilo akustične lastnosti celice. S tem v mislih so avtorji članka preverili, če lahko kot gensko selektivne aktuatorje uporabijo plinske vezikle [3].

== Plinski vezikli se neposredno odzivajo na UZ ==

Plinski vezikli (ang. ''gas vesicles'', GV) so votle proteinske nanostrukture, napolnjene s plini. Razvili so se v vodnih fotosintetskih mikrobih, kjer služijo kot sredstvo za doseganje plovnosti za boljši dostop do sončne svetlobe. Ker se GV bistveno razlikujejo v svojih fizikalnih lastnostih (nižja gostota in večja stisljivost) od okoliškega medija (voda), so raziskovalci domnevali, da bodo imeli izrazito drugačen Φ, zaradi česar bodo v polju UZ valovanja potovali drugače. GV so modelirali kot sferične delce z gostoto 120 kg/m3 in stisljivostjo 1,55 × 10^8 Pa^−1, ter tako ocenili akustični kontrastni faktor kot izrazito negativen (−11,7). Svojo domnevo so potrdili tudi z eksperimenti. GV so izolirali iz cianobakterije ''Anabaena flos-aquae'' (Ana) ter jih kemično označili s fluorescenčnim barvilom. Nato so raztopino GV prenesli v mikrofluidni kanal, opremljen s piezoelektričim resonatorjem, ki generira UZ valovanje z ustrezno valovno dolžino. Širina kanala je bila enaka polovični valovni dolžini generiranega UZ. Posledično so bila območja oslabitve v središču, območja ojačitve pa na steni kanala, kamor so tudi potovali GV. Kot kontrolo so uporabili počene GV, za katere so pokazali, da v polju UZ valovanja ne potujejo. Na podlagi obetavnih rezultatov so avtorji domnevali, da imajo GV sposobnost, da s svojo prisotnostjo v celici spremenijo njene akustične lastnosti, zaradi česar bodo celice, ki vsebujejo GV, doživele izrazito drugačno silo akustičnega sevanja kot tiste, ki GV ne vsebujejo. To bi omogočalo selektivno manipuliranje celic z UZ na podlagi njihovega genotipa [3].

== Ekspresija plinskih veziklov omogoča selektivno akustično manipulacijo bakterijskih celic ==

V prvem delu eksperimenta so s plazmidom pET28a, ki vsebuje insert [https://www.addgene.org/106473/ bARG1] (Acoustic Reporter Gene 1, sestavljen iz kombinacije 13 genov iz Ana in ''Bacillus megaterium'', ključnih za nastanek GV), transformirali bakterijske celice ''E. coli''. Tiste, ki so uspešno izražale GV, so označili s fluoresenčnim barvilom. Kot kontrolo so uporabili celice, v katerih so z izpostavitvijo visokemu tlaku predhodno počili GV. Po izpostavitvi celic stoječemu UZ valovanju so premik zaznali le pri celicah, ki so vsebovale GV. Te so se namreč pomaknile v območja ojačitve na steni mikrofluidnega kanala. Celice ter večina bioloških komponent ima v vodni raztopini pozitiven akustični kontrastni faktor Φ, vendar pa je ta zelo majhen (od 0.06 do 0.12). Rezultat zgornjega eksperimenta potrjuje, da prisotnost GV povzroči spremembo celotnega Φ celice, tako da ta postane manjši od nič, obenem pa reši tudi problem neodzivnosti majhnih celic na ARF. Celice, ki GV niso vsebovale, se namreč niso pomaknile nikamor (čeprav bi se zaradi pozitivnega Φ morale pomakniti v smeri območja oslabitve stoječega valovanja) [3].

Glede na obetavne rezultate so avtorji članka želeli preizkusiti, če je z UZ ob prisotnosti GV mogoča natančna in hitra prostorska manipulacija celic. Najprej so v za to posebej zasnovani akustični komori ustvarili vzorec stoječega valovanja ter vanjo dali raztopino fluorescenčno označenih celic, ki vsebujejo GV. Opazili so, da so se celice uredile v določen vzorec stoječega valovanja ter se po spremembi frekvence UZ v času nekaj sekund preoblikovale v novega. Nato so naredili še korak naprej in iz bakterijskih celic, ki vsebujejo GV, ustvarili akustični hologram. To je poimenovanje za tehniko, ki omogoča sestavljanje 3D objektov iz različnih vrst delcev samo z uporabo zvoka. Z uporabo 3D-natisnjene fazne maske so ustvarili profil visokega tlaka v obliki črke "R". Pripravili so 0,25 % raztopino agaroze v gojišču LB, ter vanjo dodali bakterijske celice, ki vsebujejo GV. Pri tem so temperaturo ves čas vzdrževali pri 37 °C, c čimer so preprečili gelacijo agaroze. Nato so raztopino izpostavili UZ ter pustili, da se je agaroza strdila. Kot pričakovano, so se bakterije znotraj strjenega gela imobilizirale v želenem prostorskem vzorcu 'R'. Uspešno so pokazali tudi, da lahko z UZ ustvarijo 'past', v katero se ujamejo celice, in s katero lahko povzročijo translacijo delcev v prostoru (podobno kot to zmore optična pinceta) [3].

== Ekspresija plinskih veziklov omogoča selektivno akustično manipulacijo sesalskih celic ==

V nadaljevanju so raziskovalci preverili še, če enake lastnosti veljajo tudi za sesalske celice, ki vsebujejo GV. Pripravili so gensko spremenjene celice HEK293T, ki so pod inducibilnim tetraciklinskim promotorjem vsebovale zapis za mARG1. Kot kontrolo so uporabili celice HEK293T, ki so imele pod enakim promotorjem zapis za fluorescenčni protein mCherry. Ko so celice izpostavili UZ so ugotovili, da se je večinski del celic, ki vsebujejo GV, pomaknil v območja ojačitev, torej proti stenam kanala. Za razliko od bakterijskih celic, kjer ob odsotnosti GV v polju UZ valovanja niso opazili nobenega premika, so pri kontrolnih sesalskih celicah opazili, da so se te premaknile na območje oslabitev, torej v središče kanala. To je pričakovano, saj imajo celice pozitiven akustičnim kontrastni faktor Φ, poleg tega pa so sesalske celice večje od bakterijskih in posledično čutijo vpliv ARF. Naredili so tudi podoben eksperiment, kot so ga izvedli na bakterijskih celicah. Sesalske celice so transficirali s plazmidom, ki vsebuje zapis mARG1, ter jih izpostavili enakemu akustičnemu hologramu v obliki črke R kot prej bakterije. Tudi tukaj so opazili, da so se transficirane celice uredile v želeno obliko, medtem ko so se kontrolne celice od območja vzorca izrazito odmaknile. Ključno pri tem je dejstvo, da akustična manipulacija celic v vzorec ni vplivala na njihovo viabilnost [3].

V nadaljevanju so fluorescentno označene GV inkubirali z mišjimi makrofagi, ki imajo sposobnost endocitoze. Po izpostavitvi UZ so lahko selektivno manipulirali le celice, ki so uspešno prevzele GV. S tem so pokazali, da lahko GV služijo tudi kot biomakerji za neko določeno biološko funkcijo, v tem primeru endocitoze. Pokazali so tudi, da lahko GV delujejo kot markerji, ki omogočajo razvrščanje celic na podlagi njihovega genotipa v akustično-fluidni napravi. To bi lahko predstavljalo alternativo FACS, trenutno najpogosteje uporabljeni metodi za selekcijo celic na podlagi genotipa, ki zahteva drago in kompleksno opremo [3].

== Zaključek ==

V raziskavi so pokazali, da plinski vezikli doživljajo močno silo akustičnega sevanja in delujejo kot prvi gensko kodirani aktuatorji za ultrazvok, ki imajo sposobnost, da s svojo prisotnostjo v celici povečajo in izrazito spremenijo njen akustični kontrastni faktor ter s tem spremenijo njene akustične lastnosti. Prisotnost plinskih veziklov omogoča neposredno akustično manipulacijo bakterijskih celic z lovljenjem v akustično past in kontroliranim preoblikovanjem v želen vzorec stoječega valovanja ter selektivno manipulacijo bakterijskih in sesalskih celic na podlagi njihovega genotipa v želeno obliko (nastanek akustičnega holograma).

Predstavljeni rezultati dokazujejo sposobnost GV, da služijo kot prvi gensko kodirani aktuatorji za ultrazvok in tako povežejo akustično manipulacijo s področjem molekularne in sintetične biologije. Tehnologija predstavlja velik potencial na področju tkivnega inženiringa, kjer je cilj ustvariti funkcionalna tkiva oziroma organe z uporabo živih celic. Z uporabo biomolekularnih aktuatorjev bi lahko izboljšali učinkovitost in natančnost na področju regenerativne medicine. Tak pristop namreč v primerjavi z optičnimi in magnetnimi tehnikami manipulacije ponuja edinstvene prednosti – deluje v neprozornem mediju, je neinvaziven, ne vpliva na viabilnost celic ter omogoča fino prostorsko regulacijo in hitro odzivnost, poleg tega pa je tudi relativno cenovno ugoden.

== Viri ==

[1] H. Bruus: Acoustofluidics 7: The Acoustic Radiation Force on Small Particles. Lab Chip 2012, 12, 1014–1021.

[2] J. Čemažar: Dielektroforetsko Ločevanje Bioloških Celic v Mikropretočni Komori : Doktorska Disertacija, Univ. v Ljubljani, Fak. za elektrotehniko, 2013.

[3] D. Wu, D. Baresch, C. Cook, Z. Ma, M. Duan, D. Malounda, D. Maresca, M. P. Abundo, J. Lee, S. Shivaei, et al.: Biomolecular Actuators for Genetically Selective Acoustic Manipulation of Cells. Sci. Adv. 2023, 9.

Biomolekularni aktuatorji za gensko selektivno akustično manipulacijo celic

2023-04-02T13:47:34Z

Greta Junger: /* Ekspresija plinskih veziklov omogoča selektivno akustično manipulacijo bakterijskih celic */

Povzeto po članku ''D. Wu, D. Baresch, C. Cook, Z. Ma, M. Duan, D. Malounda, D. Maresca, M. P. Abundo, J. Lee, S. Shivaei, et al.: Biomolecular Actuators for Genetically Selective Acoustic Manipulation of Cells. Sci. Adv. 2023, 9.''

== Uvod ==

Sposobnost manipulacije fizičnega položaja specifičnih celic je ključnega pomena za biomedicino, sintetično biologijo in področje živih materialov. To je mogoče doseči na različne načine, avtorji tega članka pa so se osredotočili na uporabo ultrazvoka. Slednji ima namreč sposobnost manipulacije s celicami z visoko prostorsko natančnostjo in hitro odzivnostjo preko akustične radiacijske sile. Ker pa ima večina celic podobne akustične lastnosti, so avtorji članka kot aktuatorje, tj. premikalnike celic, uporabili plinske vezikle. Z več eksperimenti so pokazali, da slednji omogočajo selektivno akustično manipulacijo celic, ki imajo v svoji citoplazmi prisotne plinske vezikle.

== Sila akustičnega sevanja ==

Na majhen sferični delec v polju ultrazvočnega (UZ) stoječega valovanja deluje sila akustičnega sevanja (ang. ''acoustic radiation force'', ARF). Slednja temelji na ustvarjeni tlačni sili, ki je časovno nespremenljiva in privlači telesa bodisi v območje najnižjega tlaka (na področje vozlišč/oslabitev valovanja), bodisi v območje najvišjega tlaka (na področje ojačitev valovanja). Ta sila je odvisna od razlik v gostoti in stisljivosti delca od okoliškega medija, kar je izraženo z akustičnim kontrastnim faktorjem Φ. Slednji določa smer delovanja ARF na delec v okoliškem mediju. Delci, katerih Φ > 0, se gibljejo v smeri območja oslabitve valovanja, delci, za katere je Φ < 0, pa potujejo v smeri ojačitev [1,2].

Preko ARF lahko z uporabo UZ enostavno manipuliramo z različnimi materiali, vendar pa je zaradi podobnih vrednosti Φ med različnimi celicami izziv povezati aktivacijo, ki temelji na ARF, z izražanjem specifičnega gena in posledično z manipulacijo specifičnih celic. Za to bi bilo potrebno genetsko kodirano sredstvo, ki bi lahko izrazito spremenilo akustične lastnosti celice. S tem v mislih so avtorji članka preverili, če lahko kot gensko selektivne aktuatorje uporabijo plinske vezikle [3].

== Plinski vezikli se neposredno odzivajo na UZ ==

Plinski vezikli (ang. ''gas vesicles'', GV) so votle proteinske nanostrukture, napolnjene s plini. Razvili so se v vodnih fotosintetskih mikrobih, kjer služijo kot sredstvo za doseganje plovnosti za boljši dostop do sončne svetlobe. Ker se GV bistveno razlikujejo v svojih fizikalnih lastnostih (nižja gostota in večja stisljivost) od okoliškega medija (voda), so raziskovalci domnevali, da bodo imeli izrazito drugačen Φ, zaradi česar bodo v polju UZ valovanja potovali drugače. GV so modelirali kot sferične delce z gostoto 120 kg/m3 in stisljivostjo 1,55 × 10^8 Pa^−1, ter tako ocenili akustični kontrastni faktor kot izrazito negativen (−11,7). Svojo domnevo so potrdili tudi z eksperimenti. GV so izolirali iz cianobakterije ''Anabaena flos-aquae'' (Ana) ter jih kemično označili s fluorescenčnim barvilom. Nato so raztopino GV prenesli v mikrofluidni kanal, opremljen s piezoelektričim resonatorjem, ki generira UZ valovanje z ustrezno valovno dolžino. Širina kanala je bila enaka polovični valovni dolžini generiranega UZ. Posledično so bila območja oslabitve v središču, območja ojačitve pa na steni kanala, kamor so tudi potovali GV. Kot kontrolo so uporabili počene GV, za katere so pokazali, da v polju UZ valovanja ne potujejo. Na podlagi obetavnih rezultatov so avtorji domnevali, da imajo GV sposobnost, da s svojo prisotnostjo v celici spremenijo njene akustične lastnosti, zaradi česar bodo celice, ki vsebujejo GV, doživele izrazito drugačno silo akustičnega sevanja kot tiste, ki GV ne vsebujejo. To bi omogočalo selektivno manipuliranje celic z UZ na podlagi njihovega genotipa [3].

== Ekspresija plinskih veziklov omogoča selektivno akustično manipulacijo bakterijskih celic ==

V prvem delu eksperimenta so s plazmidom pET28a, ki vsebuje insert [https://www.addgene.org/106473/ bARG1] (Acoustic Reporter Gene 1, sestavljen iz kombinacije 13 genov iz Ana in ''Bacillus megaterium'', ključnih za nastanek GV), transformirali bakterijske celice ''E. coli''. Tiste, ki so uspešno izražale GV, so označili s fluoresenčnim barvilom. Kot kontrolo so uporabili celice, v katerih so z izpostavitvijo visokemu tlaku predhodno počili GV. Po izpostavitvi celic stoječemu UZ valovanju so premik zaznali le pri celicah, ki so vsebovale GV. Te so se namreč pomaknile v območja ojačitve na steni mikrofluidnega kanala. Celice ter večina bioloških komponent ima v vodni raztopini pozitiven akustični kontrastni faktor Φ, vendar pa je ta zelo majhen (od 0.06 do 0.12). Rezultat zgornjega eksperimenta potrjuje, da prisotnost GV povzroči spremembo celotnega Φ celice, tako da ta postane manjši od nič, obenem pa reši tudi problem neodzivnosti majhnih celic na ARF. Celice, ki GV niso vsebovale, se namreč niso pomaknile nikamor (čeprav bi se zaradi pozitivnega Φ morale pomakniti v smeri območja oslabitve stoječega valovanja) [3].

Glede na obetavne rezultate so avtorji članka želeli preizkusiti, če je z UZ ob prisotnosti GV mogoča natančna in hitra prostorska manipulacija celic. Najprej so v za to posebej zasnovani akustični komori ustvarili vzorec stoječega valovanja ter vanjo dali raztopino fluorescenčno označenih celic, ki vsebujejo GV. Opazili so, da so se celice uredile v določen vzorec stoječega valovanja ter se po spremembi frekvence UZ v času nekaj sekund preoblikovale v novega. Nato so naredili še korak naprej in iz bakterijskih celic, ki vsebujejo GV, ustvarili akustični hologram. To je poimenovanje za tehniko, ki omogoča sestavljanje 3D objektov iz različnih vrst delcev samo z uporabo zvoka. Z uporabo 3D-natisnjene fazne maske so ustvarili profil visokega tlaka v obliki črke "R". Pripravili so 0,25 % raztopino agaroze v gojišču LB, ter vanjo dodali bakterijske celice, ki vsebujejo GV. Pri tem so temperaturo ves čas vzdrževali pri 37 °C, c čimer so preprečili gelacijo agaroze. Nato so raztopino izpostavili UZ ter pustili, da se je agaroza strdila. Kot pričakovano, so se bakterije znotraj strjenega gela imobilizirale v želenem prostorskem vzorcu 'R'. Uspešno so pokazali tudi, da lahko z UZ ustvarijo 'past', v katero se ujamejo celice, in s katero lahko povzročijo translacijo delcev v prostoru (podobno kot to zmore optična pinceta) [3].

== Ekspresija plinskih veziklov omogoča selektivno akustično manipulacijo sesalskih celic ==

V nadaljevanju so raziskovalci preverili še, če enake lastnosti veljajo tudi za sesalske celice, ki vsebujejo GV. Pripravili so gensko spremenjene celice HEK293T, ki so pod inducibilnim tetraciklinskim promotorjem vsebovale zapis za mARG1. Kot kontrolo so uporabili celice HEK293T, ki so imele pod enakim promotorjem zapis za fluorescenčni protein mCherry. Ko so celice izpostavili UZ so ugotovili, da se je večinski del celic, ki vsebujejo GV, pomaknil v območja ojačitev, torej proti stenam kanala. Za razliko od bakterijskih celic, kjer ob odsotnosti GV v polju UZ valovanja niso opazili nobenega premika, so pri kontrolnih sesalskih celicah opazili, da so se te premaknile na območje oslabitev, torej v središče kanala. To je pričakovano, saj imajo celice pozitiven akustičnim kontrastni faktor Φ, poleg tega pa so sesalske celice večje od bakterijskih in posledično čutijo vpliv ARF. Naredili so tudi podoben eksperiment, kot so ga izvedli na bakterijskih celicah. Sesalske celice so transficirali s plazmidom, ki vsebuje zapis mARG1, ter jih izpostavili enakemu akustičnemu hologramu v obliki črke R kot prej bakterije. Tudi tukaj so opazili, da so se transficirane celice uredile v želeno obliko, medtem ko so se kontrolne celice od območja vzorca izrazito odmaknile. Ključno pri tem je dejstvo, da akustična manipulacija celic v vzorec ni vplivala na njihovo viabilnost [3].

V nadaljevanju so fluorescentno označene GV inkubirali z mišjimi makrofagi, ki imajo sposobnost endocitoze. Po izpostavitvi UZ so lahko selektivno manipulirali le celice, ki so uspešno prevzele GV. S tem so pokazali, da lahko GV služijo tudi kot biomakerji za neko določeno biološko funkcijo, v tem primeru endocitoze. Pokazali so tudi, da lahko GV delujejo kot markerji, ki omogočajo razvrščanje celic na podlagi njihovega genotipa v akustično-fluidni napravi. To bi lahko predstavljalo alternativo FACS, trenutno najpogosteje uporabljeni metodi za selekcijo celic na podlagi genotipa, ki zahteva drago in kompleksno opremo.

== Zaključek ==

V raziskavi so pokazali, da plinski vezikli doživljajo močno silo akustičnega sevanja in delujejo kot prvi gensko kodirani aktuatorji za ultrazvok, ki imajo sposobnost, da s svojo prisotnostjo v celici povečajo in izrazito spremenijo njen akustični kontrastni faktor ter s tem spremenijo njene akustične lastnosti. Prisotnost plinskih veziklov omogoča neposredno akustično manipulacijo bakterijskih celic z lovljenjem v akustično past in kontroliranim preoblikovanjem v želen vzorec stoječega valovanja ter selektivno manipulacijo bakterijskih in sesalskih celic na podlagi njihovega genotipa v želeno obliko (nastanek akustičnega holograma).

Predstavljeni rezultati dokazujejo sposobnost GV, da služijo kot prvi gensko kodirani aktuatorji za ultrazvok in tako povežejo akustično manipulacijo s področjem molekularne in sintetične biologije. Tehnologija predstavlja velik potencial na področju tkivnega inženiringa, kjer je cilj ustvariti funkcionalna tkiva oziroma organe z uporabo živih celic. Z uporabo biomolekularnih aktuatorjev bi lahko izboljšali učinkovitost in natančnost na področju regenerativne medicine. Tak pristop namreč v primerjavi z optičnimi in magnetnimi tehnikami manipulacije ponuja edinstvene prednosti – deluje v neprozornem mediju, je neinvaziven, ne vpliva na viabilnost celic ter omogoča fino prostorsko regulacijo in hitro odzivnost, poleg tega pa je tudi relativno cenovno ugoden.

== Viri ==

[1] H. Bruus: Acoustofluidics 7: The Acoustic Radiation Force on Small Particles. Lab Chip 2012, 12, 1014–1021.

[2] J. Čemažar: Dielektroforetsko Ločevanje Bioloških Celic v Mikropretočni Komori : Doktorska Disertacija, Univ. v Ljubljani, Fak. za elektrotehniko, 2013.

[3] D. Wu, D. Baresch, C. Cook, Z. Ma, M. Duan, D. Malounda, D. Maresca, M. P. Abundo, J. Lee, S. Shivaei, et al.: Biomolecular Actuators for Genetically Selective Acoustic Manipulation of Cells. Sci. Adv. 2023, 9.

Biomolekularni aktuatorji za gensko selektivno akustično manipulacijo celic

2023-04-02T13:47:00Z

Greta Junger: /* Ekspresija plinskih veziklov omogoča selektivno akustično manipulacijo bakterijskih celic */

Povzeto po članku ''D. Wu, D. Baresch, C. Cook, Z. Ma, M. Duan, D. Malounda, D. Maresca, M. P. Abundo, J. Lee, S. Shivaei, et al.: Biomolecular Actuators for Genetically Selective Acoustic Manipulation of Cells. Sci. Adv. 2023, 9.''

== Uvod ==

Sposobnost manipulacije fizičnega položaja specifičnih celic je ključnega pomena za biomedicino, sintetično biologijo in področje živih materialov. To je mogoče doseči na različne načine, avtorji tega članka pa so se osredotočili na uporabo ultrazvoka. Slednji ima namreč sposobnost manipulacije s celicami z visoko prostorsko natančnostjo in hitro odzivnostjo preko akustične radiacijske sile. Ker pa ima večina celic podobne akustične lastnosti, so avtorji članka kot aktuatorje, tj. premikalnike celic, uporabili plinske vezikle. Z več eksperimenti so pokazali, da slednji omogočajo selektivno akustično manipulacijo celic, ki imajo v svoji citoplazmi prisotne plinske vezikle.

== Sila akustičnega sevanja ==

Na majhen sferični delec v polju ultrazvočnega (UZ) stoječega valovanja deluje sila akustičnega sevanja (ang. ''acoustic radiation force'', ARF). Slednja temelji na ustvarjeni tlačni sili, ki je časovno nespremenljiva in privlači telesa bodisi v območje najnižjega tlaka (na področje vozlišč/oslabitev valovanja), bodisi v območje najvišjega tlaka (na področje ojačitev valovanja). Ta sila je odvisna od razlik v gostoti in stisljivosti delca od okoliškega medija, kar je izraženo z akustičnim kontrastnim faktorjem Φ. Slednji določa smer delovanja ARF na delec v okoliškem mediju. Delci, katerih Φ > 0, se gibljejo v smeri območja oslabitve valovanja, delci, za katere je Φ < 0, pa potujejo v smeri ojačitev [1,2].

Preko ARF lahko z uporabo UZ enostavno manipuliramo z različnimi materiali, vendar pa je zaradi podobnih vrednosti Φ med različnimi celicami izziv povezati aktivacijo, ki temelji na ARF, z izražanjem specifičnega gena in posledično z manipulacijo specifičnih celic. Za to bi bilo potrebno genetsko kodirano sredstvo, ki bi lahko izrazito spremenilo akustične lastnosti celice. S tem v mislih so avtorji članka preverili, če lahko kot gensko selektivne aktuatorje uporabijo plinske vezikle [3].

== Plinski vezikli se neposredno odzivajo na UZ ==

Plinski vezikli (ang. ''gas vesicles'', GV) so votle proteinske nanostrukture, napolnjene s plini. Razvili so se v vodnih fotosintetskih mikrobih, kjer služijo kot sredstvo za doseganje plovnosti za boljši dostop do sončne svetlobe. Ker se GV bistveno razlikujejo v svojih fizikalnih lastnostih (nižja gostota in večja stisljivost) od okoliškega medija (voda), so raziskovalci domnevali, da bodo imeli izrazito drugačen Φ, zaradi česar bodo v polju UZ valovanja potovali drugače. GV so modelirali kot sferične delce z gostoto 120 kg/m3 in stisljivostjo 1,55 × 10^8 Pa^−1, ter tako ocenili akustični kontrastni faktor kot izrazito negativen (−11,7). Svojo domnevo so potrdili tudi z eksperimenti. GV so izolirali iz cianobakterije ''Anabaena flos-aquae'' (Ana) ter jih kemično označili s fluorescenčnim barvilom. Nato so raztopino GV prenesli v mikrofluidni kanal, opremljen s piezoelektričim resonatorjem, ki generira UZ valovanje z ustrezno valovno dolžino. Širina kanala je bila enaka polovični valovni dolžini generiranega UZ. Posledično so bila območja oslabitve v središču, območja ojačitve pa na steni kanala, kamor so tudi potovali GV. Kot kontrolo so uporabili počene GV, za katere so pokazali, da v polju UZ valovanja ne potujejo. Na podlagi obetavnih rezultatov so avtorji domnevali, da imajo GV sposobnost, da s svojo prisotnostjo v celici spremenijo njene akustične lastnosti, zaradi česar bodo celice, ki vsebujejo GV, doživele izrazito drugačno silo akustičnega sevanja kot tiste, ki GV ne vsebujejo. To bi omogočalo selektivno manipuliranje celic z UZ na podlagi njihovega genotipa [3].

== Ekspresija plinskih veziklov omogoča selektivno akustično manipulacijo bakterijskih celic ==

V prvem delu eksperimenta so s plazmidom pET28a, ki vsebuje insert [https://www.addgene.org/106473/ bARG1] (Acoustic Reporter Gene 1, sestavljen iz kombinacije 13 genov iz Ana in ''Bacillus megaterium'', ključnih za nastanek GV), transformirali bakterijske celice ''E. coli''. Tiste, ki so uspešno izražale GV, so označili s fluoresenčnim barvilom. Kot kontrolo so uporabili celice, v katerih so z izpostavitvijo visokemu tlaku predhodno počili GV. Po izpostavitvi celic stoječemu UZ valovanju so premik zaznali le pri celicah, ki so vsebovale GV. Te so se namreč pomaknile v območja ojačitve na steni mikrofluidnega kanala. Celice ter večina bioloških komponent ima v vodni raztopini pozitiven akustični kontrastni faktor Φ, vendar pa je ta zelo majhen (od 0.06 do 0.12). Rezultat zgornjega eksperimenta potrjuje, da prisotnost GV povzroči spremembo celotnega Φ celice, tako da ta postane manjši od nič, obenem pa reši tudi problem neodzivnosti majhnih celic na ARF. Celice, ki GV niso vsebovale, se namreč niso pomaknile nikamor (čeprav bi se zaradi pozitivnega Φ morale pomakniti v smeri območja oslabitve stoječega valovanja) [3].

Glede na obetavne rezultate so avtorji članka želeli preizkusiti, če je z UZ ob prisotnosti GV mogoča natančna in hitra prostorska manipulacija celic. Najprej so v za to posebej zasnovani akustični komori ustvarili vzorec stoječega valovanja ter vanjo dali raztopino fluorescenčno označenih celic, ki so vsebovale GV. Opazili so, da so se celice uredile v določen vzorec stoječega valovanja ter se po spremembi frekvence UZ v času nekaj sekund preoblikovale v novega. Nato so naredili še korak naprej in iz bakterijskih celic, ki vsebujejo GV, ustvarili akustični hologram. To je poimenovanje za tehniko, ki omogoča sestavljanje 3D objektov iz različnih vrst delcev samo z uporabo zvoka. Z uporabo 3D-natisnjene fazne maske so ustvarili profil visokega tlaka v obliki črke "R". Pripravili so 0,25 % raztopino agaroze v gojišču LB, ter vanjo dodali bakterijske celice, ki vsebujejo GV. Pri tem so temperaturo ves čas vzdrževali pri 37 °C, c čimer so preprečili gelacijo agaroze. Nato so raztopino izpostavili UZ ter pustili, da se je agaroza strdila. Kot pričakovano, so se bakterije znotraj strjenega gela imobilizirale v želenem prostorskem vzorcu 'R'. Uspešno so pokazali tudi, da lahko z UZ ustvarijo 'past', v katero se ujamejo celice, in s katero lahko povzročijo translacijo delcev v prostoru (podobno kot to zmore optična pinceta) [3].

== Ekspresija plinskih veziklov omogoča selektivno akustično manipulacijo sesalskih celic ==

V nadaljevanju so raziskovalci preverili še, če enake lastnosti veljajo tudi za sesalske celice, ki vsebujejo GV. Pripravili so gensko spremenjene celice HEK293T, ki so pod inducibilnim tetraciklinskim promotorjem vsebovale zapis za mARG1. Kot kontrolo so uporabili celice HEK293T, ki so imele pod enakim promotorjem zapis za fluorescenčni protein mCherry. Ko so celice izpostavili UZ so ugotovili, da se je večinski del celic, ki vsebujejo GV, pomaknil v območja ojačitev, torej proti stenam kanala. Za razliko od bakterijskih celic, kjer ob odsotnosti GV v polju UZ valovanja niso opazili nobenega premika, so pri kontrolnih sesalskih celicah opazili, da so se te premaknile na območje oslabitev, torej v središče kanala. To je pričakovano, saj imajo celice pozitiven akustičnim kontrastni faktor Φ, poleg tega pa so sesalske celice večje od bakterijskih in posledično čutijo vpliv ARF. Naredili so tudi podoben eksperiment, kot so ga izvedli na bakterijskih celicah. Sesalske celice so transficirali s plazmidom, ki vsebuje zapis mARG1, ter jih izpostavili enakemu akustičnemu hologramu v obliki črke R kot prej bakterije. Tudi tukaj so opazili, da so se transficirane celice uredile v želeno obliko, medtem ko so se kontrolne celice od območja vzorca izrazito odmaknile. Ključno pri tem je dejstvo, da akustična manipulacija celic v vzorec ni vplivala na njihovo viabilnost [3].

V nadaljevanju so fluorescentno označene GV inkubirali z mišjimi makrofagi, ki imajo sposobnost endocitoze. Po izpostavitvi UZ so lahko selektivno manipulirali le celice, ki so uspešno prevzele GV. S tem so pokazali, da lahko GV služijo tudi kot biomakerji za neko določeno biološko funkcijo, v tem primeru endocitoze. Pokazali so tudi, da lahko GV delujejo kot markerji, ki omogočajo razvrščanje celic na podlagi njihovega genotipa v akustično-fluidni napravi. To bi lahko predstavljalo alternativo FACS, trenutno najpogosteje uporabljeni metodi za selekcijo celic na podlagi genotipa, ki zahteva drago in kompleksno opremo.

== Zaključek ==

V raziskavi so pokazali, da plinski vezikli doživljajo močno silo akustičnega sevanja in delujejo kot prvi gensko kodirani aktuatorji za ultrazvok, ki imajo sposobnost, da s svojo prisotnostjo v celici povečajo in izrazito spremenijo njen akustični kontrastni faktor ter s tem spremenijo njene akustične lastnosti. Prisotnost plinskih veziklov omogoča neposredno akustično manipulacijo bakterijskih celic z lovljenjem v akustično past in kontroliranim preoblikovanjem v želen vzorec stoječega valovanja ter selektivno manipulacijo bakterijskih in sesalskih celic na podlagi njihovega genotipa v želeno obliko (nastanek akustičnega holograma).

Predstavljeni rezultati dokazujejo sposobnost GV, da služijo kot prvi gensko kodirani aktuatorji za ultrazvok in tako povežejo akustično manipulacijo s področjem molekularne in sintetične biologije. Tehnologija predstavlja velik potencial na področju tkivnega inženiringa, kjer je cilj ustvariti funkcionalna tkiva oziroma organe z uporabo živih celic. Z uporabo biomolekularnih aktuatorjev bi lahko izboljšali učinkovitost in natančnost na področju regenerativne medicine. Tak pristop namreč v primerjavi z optičnimi in magnetnimi tehnikami manipulacije ponuja edinstvene prednosti – deluje v neprozornem mediju, je neinvaziven, ne vpliva na viabilnost celic ter omogoča fino prostorsko regulacijo in hitro odzivnost, poleg tega pa je tudi relativno cenovno ugoden.

== Viri ==

[1] H. Bruus: Acoustofluidics 7: The Acoustic Radiation Force on Small Particles. Lab Chip 2012, 12, 1014–1021.

[2] J. Čemažar: Dielektroforetsko Ločevanje Bioloških Celic v Mikropretočni Komori : Doktorska Disertacija, Univ. v Ljubljani, Fak. za elektrotehniko, 2013.

[3] D. Wu, D. Baresch, C. Cook, Z. Ma, M. Duan, D. Malounda, D. Maresca, M. P. Abundo, J. Lee, S. Shivaei, et al.: Biomolecular Actuators for Genetically Selective Acoustic Manipulation of Cells. Sci. Adv. 2023, 9.

Biomolekularni aktuatorji za gensko selektivno akustično manipulacijo celic

2023-04-02T13:42:44Z

Greta Junger: /* Uvod */

Povzeto po članku ''D. Wu, D. Baresch, C. Cook, Z. Ma, M. Duan, D. Malounda, D. Maresca, M. P. Abundo, J. Lee, S. Shivaei, et al.: Biomolecular Actuators for Genetically Selective Acoustic Manipulation of Cells. Sci. Adv. 2023, 9.''

== Uvod ==

Sposobnost manipulacije fizičnega položaja specifičnih celic je ključnega pomena za biomedicino, sintetično biologijo in področje živih materialov. To je mogoče doseči na različne načine, avtorji tega članka pa so se osredotočili na uporabo ultrazvoka. Slednji ima namreč sposobnost manipulacije s celicami z visoko prostorsko natančnostjo in hitro odzivnostjo preko akustične radiacijske sile. Ker pa ima večina celic podobne akustične lastnosti, so avtorji članka kot aktuatorje, tj. premikalnike celic, uporabili plinske vezikle. Z več eksperimenti so pokazali, da slednji omogočajo selektivno akustično manipulacijo celic, ki imajo v svoji citoplazmi prisotne plinske vezikle.

== Sila akustičnega sevanja ==

Na majhen sferični delec v polju ultrazvočnega (UZ) stoječega valovanja deluje sila akustičnega sevanja (ang. ''acoustic radiation force'', ARF). Slednja temelji na ustvarjeni tlačni sili, ki je časovno nespremenljiva in privlači telesa bodisi v območje najnižjega tlaka (na področje vozlišč/oslabitev valovanja), bodisi v območje najvišjega tlaka (na področje ojačitev valovanja). Ta sila je odvisna od razlik v gostoti in stisljivosti delca od okoliškega medija, kar je izraženo z akustičnim kontrastnim faktorjem Φ. Slednji določa smer delovanja ARF na delec v okoliškem mediju. Delci, katerih Φ > 0, se gibljejo v smeri območja oslabitve valovanja, delci, za katere je Φ < 0, pa potujejo v smeri ojačitev [1,2].

Preko ARF lahko z uporabo UZ enostavno manipuliramo z različnimi materiali, vendar pa je zaradi podobnih vrednosti Φ med različnimi celicami izziv povezati aktivacijo, ki temelji na ARF, z izražanjem specifičnega gena in posledično z manipulacijo specifičnih celic. Za to bi bilo potrebno genetsko kodirano sredstvo, ki bi lahko izrazito spremenilo akustične lastnosti celice. S tem v mislih so avtorji članka preverili, če lahko kot gensko selektivne aktuatorje uporabijo plinske vezikle [3].

== Plinski vezikli se neposredno odzivajo na UZ ==

Plinski vezikli (ang. ''gas vesicles'', GV) so votle proteinske nanostrukture, napolnjene s plini. Razvili so se v vodnih fotosintetskih mikrobih, kjer služijo kot sredstvo za doseganje plovnosti za boljši dostop do sončne svetlobe. Ker se GV bistveno razlikujejo v svojih fizikalnih lastnostih (nižja gostota in večja stisljivost) od okoliškega medija (voda), so raziskovalci domnevali, da bodo imeli izrazito drugačen Φ, zaradi česar bodo v polju UZ valovanja potovali drugače. GV so modelirali kot sferične delce z gostoto 120 kg/m3 in stisljivostjo 1,55 × 10^8 Pa^−1, ter tako ocenili akustični kontrastni faktor kot izrazito negativen (−11,7). Svojo domnevo so potrdili tudi z eksperimenti. GV so izolirali iz cianobakterije ''Anabaena flos-aquae'' (Ana) ter jih kemično označili s fluorescenčnim barvilom. Nato so raztopino GV prenesli v mikrofluidni kanal, opremljen s piezoelektričim resonatorjem, ki generira UZ valovanje z ustrezno valovno dolžino. Širina kanala je bila enaka polovični valovni dolžini generiranega UZ. Posledično so bila območja oslabitve v središču, območja ojačitve pa na steni kanala, kamor so tudi potovali GV. Kot kontrolo so uporabili počene GV, za katere so pokazali, da v polju UZ valovanja ne potujejo. Na podlagi obetavnih rezultatov so avtorji domnevali, da imajo GV sposobnost, da s svojo prisotnostjo v celici spremenijo njene akustične lastnosti, zaradi česar bodo celice, ki vsebujejo GV, doživele izrazito drugačno silo akustičnega sevanja kot tiste, ki GV ne vsebujejo. To bi omogočalo selektivno manipuliranje celic z UZ na podlagi njihovega genotipa [3].

== Ekspresija plinskih veziklov omogoča selektivno akustično manipulacijo bakterijskih celic ==

V prvem delu eksperimenta so s plazmidom pET28a, ki vsebuje insert [https://www.addgene.org/106473/ bARG1] (Acoustic Reporter Gene 1, sestavljen iz kombinacije 13 genov iz Ana in ''Bacillus megaterium'', ključnih za nastanek GV), transformirali bakterijske celice ''E. coli''. Tiste, ki so uspešno izražale GV, so označili s fluoresenčnim barvilom. Kot kontrolo so uporabili celice, v katerih so z izpostavitvijo visokemu tlaku predhodno počili GV. Po izpostavitvi celic stoječemu UZ valovanju so premik zaznali le pri celicah, ki so vsebovale GV. Te so se namreč pomaknile v območja ojačitve na steni mikrofluidnega kanala. Celice ter večina bioloških komponent ima v vodni raztopini pozitiven akustični kontrastni faktor Φ, vendar pa je ta zelo majhen (od 0.06 do 0.12). Rezultat zgornjega eksperimenta potrjuje, da prisotnost GV povzroči spremembo celotnega Φ celice, tako da ta postane manjši od nič, obenem pa reši tudi problem neodzivnosti majhnih celic na ARF. Celice, ki GV niso vsebovale, se namreč niso pomaknile nikamor (čeprav bi se zaradi pozitivnega Φ morale pomakniti v smeri območja oslabitve stoječega valovanja) [3].

Glede na obetavne rezultate so avtorji članka želeli preizkusiti, če je z UZ ob prisotnosti GV mogoča natančna in hitra prostorska manipulacija celic. Najprej so v za to posebej zasnovani akustični komori ustvarili vzorec stoječega valovanja ter vanjo dali raztopino fluorescenčno označenih celic, ki vsebujejo GV. Opazili so, da so se celice uredile v določen vzorec stoječega valovanja ter se po spremembi frekvence UZ v času nekaj sekund preoblikovale v novega. Nato so naredili še korak naprej in iz bakterijskih celic, ki vsebujejo GV, ustvarili akustični hologram. To je poimenovanje za tehniko, ki omogoča sestavljanje 3D objektov iz različnih vrst delcev samo z uporabo zvoka. Z uporabo 3D-natisnjene fazne maske so ustvarili profil visokega tlaka v obliki črke "R". Pripravili so 0,25 % raztopino agaroze v gojišču LB, ter vanjo dodali bakterijske celice, ki vsebujejo GV. Pri tem so temperaturo ves čas vzdrževali pri 37 °C, c čimer so preprečili gelacijo agaroze. Nato so raztopino izpostavili UZ ter pustili, da se je agaroza strdila. Kot pričakovano, so se bakterije znotraj strjenega gela imobilizirale v želenem prostorskem vzorcu 'R'. Uspešno so pokazali tudi, da lahko z UZ ustvarijo 'past', v katero se ujamejo celice, in s katero lahko povzročijo translacijo delcev v prostoru (podobno kot to zmore optična pinceta) [3].

== Ekspresija plinskih veziklov omogoča selektivno akustično manipulacijo sesalskih celic ==

V nadaljevanju so raziskovalci preverili še, če enake lastnosti veljajo tudi za sesalske celice, ki vsebujejo GV. Pripravili so gensko spremenjene celice HEK293T, ki so pod inducibilnim tetraciklinskim promotorjem vsebovale zapis za mARG1. Kot kontrolo so uporabili celice HEK293T, ki so imele pod enakim promotorjem zapis za fluorescenčni protein mCherry. Ko so celice izpostavili UZ so ugotovili, da se je večinski del celic, ki vsebujejo GV, pomaknil v območja ojačitev, torej proti stenam kanala. Za razliko od bakterijskih celic, kjer ob odsotnosti GV v polju UZ valovanja niso opazili nobenega premika, so pri kontrolnih sesalskih celicah opazili, da so se te premaknile na območje oslabitev, torej v središče kanala. To je pričakovano, saj imajo celice pozitiven akustičnim kontrastni faktor Φ, poleg tega pa so sesalske celice večje od bakterijskih in posledično čutijo vpliv ARF. Naredili so tudi podoben eksperiment, kot so ga izvedli na bakterijskih celicah. Sesalske celice so transficirali s plazmidom, ki vsebuje zapis mARG1, ter jih izpostavili enakemu akustičnemu hologramu v obliki črke R kot prej bakterije. Tudi tukaj so opazili, da so se transficirane celice uredile v želeno obliko, medtem ko so se kontrolne celice od območja vzorca izrazito odmaknile. Ključno pri tem je dejstvo, da akustična manipulacija celic v vzorec ni vplivala na njihovo viabilnost [3].

V nadaljevanju so fluorescentno označene GV inkubirali z mišjimi makrofagi, ki imajo sposobnost endocitoze. Po izpostavitvi UZ so lahko selektivno manipulirali le celice, ki so uspešno prevzele GV. S tem so pokazali, da lahko GV služijo tudi kot biomakerji za neko določeno biološko funkcijo, v tem primeru endocitoze. Pokazali so tudi, da lahko GV delujejo kot markerji, ki omogočajo razvrščanje celic na podlagi njihovega genotipa v akustično-fluidni napravi. To bi lahko predstavljalo alternativo FACS, trenutno najpogosteje uporabljeni metodi za selekcijo celic na podlagi genotipa, ki zahteva drago in kompleksno opremo.

== Zaključek ==

V raziskavi so pokazali, da plinski vezikli doživljajo močno silo akustičnega sevanja in delujejo kot prvi gensko kodirani aktuatorji za ultrazvok, ki imajo sposobnost, da s svojo prisotnostjo v celici povečajo in izrazito spremenijo njen akustični kontrastni faktor ter s tem spremenijo njene akustične lastnosti. Prisotnost plinskih veziklov omogoča neposredno akustično manipulacijo bakterijskih celic z lovljenjem v akustično past in kontroliranim preoblikovanjem v želen vzorec stoječega valovanja ter selektivno manipulacijo bakterijskih in sesalskih celic na podlagi njihovega genotipa v želeno obliko (nastanek akustičnega holograma).

Predstavljeni rezultati dokazujejo sposobnost GV, da služijo kot prvi gensko kodirani aktuatorji za ultrazvok in tako povežejo akustično manipulacijo s področjem molekularne in sintetične biologije. Tehnologija predstavlja velik potencial na področju tkivnega inženiringa, kjer je cilj ustvariti funkcionalna tkiva oziroma organe z uporabo živih celic. Z uporabo biomolekularnih aktuatorjev bi lahko izboljšali učinkovitost in natančnost na področju regenerativne medicine. Tak pristop namreč v primerjavi z optičnimi in magnetnimi tehnikami manipulacije ponuja edinstvene prednosti – deluje v neprozornem mediju, je neinvaziven, ne vpliva na viabilnost celic ter omogoča fino prostorsko regulacijo in hitro odzivnost, poleg tega pa je tudi relativno cenovno ugoden.

== Viri ==

[1] H. Bruus: Acoustofluidics 7: The Acoustic Radiation Force on Small Particles. Lab Chip 2012, 12, 1014–1021.

[2] J. Čemažar: Dielektroforetsko Ločevanje Bioloških Celic v Mikropretočni Komori : Doktorska Disertacija, Univ. v Ljubljani, Fak. za elektrotehniko, 2013.

[3] D. Wu, D. Baresch, C. Cook, Z. Ma, M. Duan, D. Malounda, D. Maresca, M. P. Abundo, J. Lee, S. Shivaei, et al.: Biomolecular Actuators for Genetically Selective Acoustic Manipulation of Cells. Sci. Adv. 2023, 9.

Biomolekularni aktuatorji za gensko selektivno akustično manipulacijo celic

2023-04-02T13:37:42Z

Greta Junger: /* Zaključek */

Povzeto po članku ''D. Wu, D. Baresch, C. Cook, Z. Ma, M. Duan, D. Malounda, D. Maresca, M. P. Abundo, J. Lee, S. Shivaei, et al.: Biomolecular Actuators for Genetically Selective Acoustic Manipulation of Cells. Sci. Adv. 2023, 9.''

== Uvod ==

Sposobnost manipulacije fizičnega položaja specifičnih celic je ključna za biomedicino, sintetično biologijo in področje živih materialov. To je mogoče doseči na različne načine, avtorji tega članka pa so se osredotočili na uporabo ultrazvoka. Slednji ima namreč sposobnost manipulacije s celicami z visoko prostorsko natančnostjo in hitro odzivnostjo preko akustične radiacijske sile. Ker pa ima večina celic podobne akustične lastnosti, so avtorji članka kot aktuatorje, tj. premikalnike celic, uporabili plinske vezikle. Z več eksperimenti so pokazali, da slednji omogočajo selektivno akustično manipulacijo celic, ki imajo v svoji citoplazmi prisotne plinske vezikle.

== Sila akustičnega sevanja ==

Na majhen sferični delec v polju ultrazvočnega (UZ) stoječega valovanja deluje sila akustičnega sevanja (ang. ''acoustic radiation force'', ARF). Slednja temelji na ustvarjeni tlačni sili, ki je časovno nespremenljiva in privlači telesa bodisi v območje najnižjega tlaka (na področje vozlišč/oslabitev valovanja), bodisi v območje najvišjega tlaka (na področje ojačitev valovanja). Ta sila je odvisna od razlik v gostoti in stisljivosti delca od okoliškega medija, kar je izraženo z akustičnim kontrastnim faktorjem Φ. Slednji določa smer delovanja ARF na delec v okoliškem mediju. Delci, katerih Φ > 0, se gibljejo v smeri območja oslabitve valovanja, delci, za katere je Φ < 0, pa potujejo v smeri ojačitev [1,2].

Preko ARF lahko z uporabo UZ enostavno manipuliramo z različnimi materiali, vendar pa je zaradi podobnih vrednosti Φ med različnimi celicami izziv povezati aktivacijo, ki temelji na ARF, z izražanjem specifičnega gena in posledično z manipulacijo specifičnih celic. Za to bi bilo potrebno genetsko kodirano sredstvo, ki bi lahko izrazito spremenilo akustične lastnosti celice. S tem v mislih so avtorji članka preverili, če lahko kot gensko selektivne aktuatorje uporabijo plinske vezikle [3].

== Plinski vezikli se neposredno odzivajo na UZ ==

Plinski vezikli (ang. ''gas vesicles'', GV) so votle proteinske nanostrukture, napolnjene s plini. Razvili so se v vodnih fotosintetskih mikrobih, kjer služijo kot sredstvo za doseganje plovnosti za boljši dostop do sončne svetlobe. Ker se GV bistveno razlikujejo v svojih fizikalnih lastnostih (nižja gostota in večja stisljivost) od okoliškega medija (voda), so raziskovalci domnevali, da bodo imeli izrazito drugačen Φ, zaradi česar bodo v polju UZ valovanja potovali drugače. GV so modelirali kot sferične delce z gostoto 120 kg/m3 in stisljivostjo 1,55 × 10^8 Pa^−1, ter tako ocenili akustični kontrastni faktor kot izrazito negativen (−11,7). Svojo domnevo so potrdili tudi z eksperimenti. GV so izolirali iz cianobakterije ''Anabaena flos-aquae'' (Ana) ter jih kemično označili s fluorescenčnim barvilom. Nato so raztopino GV prenesli v mikrofluidni kanal, opremljen s piezoelektričim resonatorjem, ki generira UZ valovanje z ustrezno valovno dolžino. Širina kanala je bila enaka polovični valovni dolžini generiranega UZ. Posledično so bila območja oslabitve v središču, območja ojačitve pa na steni kanala, kamor so tudi potovali GV. Kot kontrolo so uporabili počene GV, za katere so pokazali, da v polju UZ valovanja ne potujejo. Na podlagi obetavnih rezultatov so avtorji domnevali, da imajo GV sposobnost, da s svojo prisotnostjo v celici spremenijo njene akustične lastnosti, zaradi česar bodo celice, ki vsebujejo GV, doživele izrazito drugačno silo akustičnega sevanja kot tiste, ki GV ne vsebujejo. To bi omogočalo selektivno manipuliranje celic z UZ na podlagi njihovega genotipa [3].

== Ekspresija plinskih veziklov omogoča selektivno akustično manipulacijo bakterijskih celic ==

V prvem delu eksperimenta so s plazmidom pET28a, ki vsebuje insert [https://www.addgene.org/106473/ bARG1] (Acoustic Reporter Gene 1, sestavljen iz kombinacije 13 genov iz Ana in ''Bacillus megaterium'', ključnih za nastanek GV), transformirali bakterijske celice ''E. coli''. Tiste, ki so uspešno izražale GV, so označili s fluoresenčnim barvilom. Kot kontrolo so uporabili celice, v katerih so z izpostavitvijo visokemu tlaku predhodno počili GV. Po izpostavitvi celic stoječemu UZ valovanju so premik zaznali le pri celicah, ki so vsebovale GV. Te so se namreč pomaknile v območja ojačitve na steni mikrofluidnega kanala. Celice ter večina bioloških komponent ima v vodni raztopini pozitiven akustični kontrastni faktor Φ, vendar pa je ta zelo majhen (od 0.06 do 0.12). Rezultat zgornjega eksperimenta potrjuje, da prisotnost GV povzroči spremembo celotnega Φ celice, tako da ta postane manjši od nič, obenem pa reši tudi problem neodzivnosti majhnih celic na ARF. Celice, ki GV niso vsebovale, se namreč niso pomaknile nikamor (čeprav bi se zaradi pozitivnega Φ morale pomakniti v smeri območja oslabitve stoječega valovanja) [3].

Glede na obetavne rezultate so avtorji članka želeli preizkusiti, če je z UZ ob prisotnosti GV mogoča natančna in hitra prostorska manipulacija celic. Najprej so v za to posebej zasnovani akustični komori ustvarili vzorec stoječega valovanja ter vanjo dali raztopino fluorescenčno označenih celic, ki vsebujejo GV. Opazili so, da so se celice uredile v določen vzorec stoječega valovanja ter se po spremembi frekvence UZ v času nekaj sekund preoblikovale v novega. Nato so naredili še korak naprej in iz bakterijskih celic, ki vsebujejo GV, ustvarili akustični hologram. To je poimenovanje za tehniko, ki omogoča sestavljanje 3D objektov iz različnih vrst delcev samo z uporabo zvoka. Z uporabo 3D-natisnjene fazne maske so ustvarili profil visokega tlaka v obliki črke "R". Pripravili so 0,25 % raztopino agaroze v gojišču LB, ter vanjo dodali bakterijske celice, ki vsebujejo GV. Pri tem so temperaturo ves čas vzdrževali pri 37 °C, c čimer so preprečili gelacijo agaroze. Nato so raztopino izpostavili UZ ter pustili, da se je agaroza strdila. Kot pričakovano, so se bakterije znotraj strjenega gela imobilizirale v želenem prostorskem vzorcu 'R'. Uspešno so pokazali tudi, da lahko z UZ ustvarijo 'past', v katero se ujamejo celice, in s katero lahko povzročijo translacijo delcev v prostoru (podobno kot to zmore optična pinceta) [3].

== Ekspresija plinskih veziklov omogoča selektivno akustično manipulacijo sesalskih celic ==

V nadaljevanju so raziskovalci preverili še, če enake lastnosti veljajo tudi za sesalske celice, ki vsebujejo GV. Pripravili so gensko spremenjene celice HEK293T, ki so pod inducibilnim tetraciklinskim promotorjem vsebovale zapis za mARG1. Kot kontrolo so uporabili celice HEK293T, ki so imele pod enakim promotorjem zapis za fluorescenčni protein mCherry. Ko so celice izpostavili UZ so ugotovili, da se je večinski del celic, ki vsebujejo GV, pomaknil v območja ojačitev, torej proti stenam kanala. Za razliko od bakterijskih celic, kjer ob odsotnosti GV v polju UZ valovanja niso opazili nobenega premika, so pri kontrolnih sesalskih celicah opazili, da so se te premaknile na območje oslabitev, torej v središče kanala. To je pričakovano, saj imajo celice pozitiven akustičnim kontrastni faktor Φ, poleg tega pa so sesalske celice večje od bakterijskih in posledično čutijo vpliv ARF. Naredili so tudi podoben eksperiment, kot so ga izvedli na bakterijskih celicah. Sesalske celice so transficirali s plazmidom, ki vsebuje zapis mARG1, ter jih izpostavili enakemu akustičnemu hologramu v obliki črke R kot prej bakterije. Tudi tukaj so opazili, da so se transficirane celice uredile v želeno obliko, medtem ko so se kontrolne celice od območja vzorca izrazito odmaknile. Ključno pri tem je dejstvo, da akustična manipulacija celic v vzorec ni vplivala na njihovo viabilnost [3].

V nadaljevanju so fluorescentno označene GV inkubirali z mišjimi makrofagi, ki imajo sposobnost endocitoze. Po izpostavitvi UZ so lahko selektivno manipulirali le celice, ki so uspešno prevzele GV. S tem so pokazali, da lahko GV služijo tudi kot biomakerji za neko določeno biološko funkcijo, v tem primeru endocitoze. Pokazali so tudi, da lahko GV delujejo kot markerji, ki omogočajo razvrščanje celic na podlagi njihovega genotipa v akustično-fluidni napravi. To bi lahko predstavljalo alternativo FACS, trenutno najpogosteje uporabljeni metodi za selekcijo celic na podlagi genotipa, ki zahteva drago in kompleksno opremo.

== Zaključek ==

V raziskavi so pokazali, da plinski vezikli doživljajo močno silo akustičnega sevanja in delujejo kot prvi gensko kodirani aktuatorji za ultrazvok, ki imajo sposobnost, da s svojo prisotnostjo v celici povečajo in izrazito spremenijo njen akustični kontrastni faktor ter s tem spremenijo njene akustične lastnosti. Prisotnost plinskih veziklov omogoča neposredno akustično manipulacijo bakterijskih celic z lovljenjem v akustično past in kontroliranim preoblikovanjem v želen vzorec stoječega valovanja ter selektivno manipulacijo bakterijskih in sesalskih celic na podlagi njihovega genotipa v želeno obliko (nastanek akustičnega holograma).

Predstavljeni rezultati dokazujejo sposobnost GV, da služijo kot prvi gensko kodirani aktuatorji za ultrazvok in tako povežejo akustično manipulacijo s področjem molekularne in sintetične biologije. Tehnologija predstavlja velik potencial na področju tkivnega inženiringa, kjer je cilj ustvariti funkcionalna tkiva oziroma organe z uporabo živih celic. Z uporabo biomolekularnih aktuatorjev bi lahko izboljšali učinkovitost in natančnost na področju regenerativne medicine. Tak pristop namreč v primerjavi z optičnimi in magnetnimi tehnikami manipulacije ponuja edinstvene prednosti – deluje v neprozornem mediju, je neinvaziven, ne vpliva na viabilnost celic ter omogoča fino prostorsko regulacijo in hitro odzivnost, poleg tega pa je tudi relativno cenovno ugoden.

== Viri ==

[1] H. Bruus: Acoustofluidics 7: The Acoustic Radiation Force on Small Particles. Lab Chip 2012, 12, 1014–1021.

[2] J. Čemažar: Dielektroforetsko Ločevanje Bioloških Celic v Mikropretočni Komori : Doktorska Disertacija, Univ. v Ljubljani, Fak. za elektrotehniko, 2013.

[3] D. Wu, D. Baresch, C. Cook, Z. Ma, M. Duan, D. Malounda, D. Maresca, M. P. Abundo, J. Lee, S. Shivaei, et al.: Biomolecular Actuators for Genetically Selective Acoustic Manipulation of Cells. Sci. Adv. 2023, 9.

Biomolekularni aktuatorji za gensko selektivno akustično manipulacijo celic

2023-04-02T13:36:49Z

Greta Junger: /* Ekspresija plinskih veziklov omogoča selektivno akustično manipulacijo bakterijskih celic */

Povzeto po članku ''D. Wu, D. Baresch, C. Cook, Z. Ma, M. Duan, D. Malounda, D. Maresca, M. P. Abundo, J. Lee, S. Shivaei, et al.: Biomolecular Actuators for Genetically Selective Acoustic Manipulation of Cells. Sci. Adv. 2023, 9.''

== Uvod ==

Sposobnost manipulacije fizičnega položaja specifičnih celic je ključna za biomedicino, sintetično biologijo in področje živih materialov. To je mogoče doseči na različne načine, avtorji tega članka pa so se osredotočili na uporabo ultrazvoka. Slednji ima namreč sposobnost manipulacije s celicami z visoko prostorsko natančnostjo in hitro odzivnostjo preko akustične radiacijske sile. Ker pa ima večina celic podobne akustične lastnosti, so avtorji članka kot aktuatorje, tj. premikalnike celic, uporabili plinske vezikle. Z več eksperimenti so pokazali, da slednji omogočajo selektivno akustično manipulacijo celic, ki imajo v svoji citoplazmi prisotne plinske vezikle.

== Sila akustičnega sevanja ==

Na majhen sferični delec v polju ultrazvočnega (UZ) stoječega valovanja deluje sila akustičnega sevanja (ang. ''acoustic radiation force'', ARF). Slednja temelji na ustvarjeni tlačni sili, ki je časovno nespremenljiva in privlači telesa bodisi v območje najnižjega tlaka (na področje vozlišč/oslabitev valovanja), bodisi v območje najvišjega tlaka (na področje ojačitev valovanja). Ta sila je odvisna od razlik v gostoti in stisljivosti delca od okoliškega medija, kar je izraženo z akustičnim kontrastnim faktorjem Φ. Slednji določa smer delovanja ARF na delec v okoliškem mediju. Delci, katerih Φ > 0, se gibljejo v smeri območja oslabitve valovanja, delci, za katere je Φ < 0, pa potujejo v smeri ojačitev [1,2].

Preko ARF lahko z uporabo UZ enostavno manipuliramo z različnimi materiali, vendar pa je zaradi podobnih vrednosti Φ med različnimi celicami izziv povezati aktivacijo, ki temelji na ARF, z izražanjem specifičnega gena in posledično z manipulacijo specifičnih celic. Za to bi bilo potrebno genetsko kodirano sredstvo, ki bi lahko izrazito spremenilo akustične lastnosti celice. S tem v mislih so avtorji članka preverili, če lahko kot gensko selektivne aktuatorje uporabijo plinske vezikle [3].

== Plinski vezikli se neposredno odzivajo na UZ ==

Plinski vezikli (ang. ''gas vesicles'', GV) so votle proteinske nanostrukture, napolnjene s plini. Razvili so se v vodnih fotosintetskih mikrobih, kjer služijo kot sredstvo za doseganje plovnosti za boljši dostop do sončne svetlobe. Ker se GV bistveno razlikujejo v svojih fizikalnih lastnostih (nižja gostota in večja stisljivost) od okoliškega medija (voda), so raziskovalci domnevali, da bodo imeli izrazito drugačen Φ, zaradi česar bodo v polju UZ valovanja potovali drugače. GV so modelirali kot sferične delce z gostoto 120 kg/m3 in stisljivostjo 1,55 × 10^8 Pa^−1, ter tako ocenili akustični kontrastni faktor kot izrazito negativen (−11,7). Svojo domnevo so potrdili tudi z eksperimenti. GV so izolirali iz cianobakterije ''Anabaena flos-aquae'' (Ana) ter jih kemično označili s fluorescenčnim barvilom. Nato so raztopino GV prenesli v mikrofluidni kanal, opremljen s piezoelektričim resonatorjem, ki generira UZ valovanje z ustrezno valovno dolžino. Širina kanala je bila enaka polovični valovni dolžini generiranega UZ. Posledično so bila območja oslabitve v središču, območja ojačitve pa na steni kanala, kamor so tudi potovali GV. Kot kontrolo so uporabili počene GV, za katere so pokazali, da v polju UZ valovanja ne potujejo. Na podlagi obetavnih rezultatov so avtorji domnevali, da imajo GV sposobnost, da s svojo prisotnostjo v celici spremenijo njene akustične lastnosti, zaradi česar bodo celice, ki vsebujejo GV, doživele izrazito drugačno silo akustičnega sevanja kot tiste, ki GV ne vsebujejo. To bi omogočalo selektivno manipuliranje celic z UZ na podlagi njihovega genotipa [3].

== Ekspresija plinskih veziklov omogoča selektivno akustično manipulacijo bakterijskih celic ==

V prvem delu eksperimenta so s plazmidom pET28a, ki vsebuje insert [https://www.addgene.org/106473/ bARG1] (Acoustic Reporter Gene 1, sestavljen iz kombinacije 13 genov iz Ana in ''Bacillus megaterium'', ključnih za nastanek GV), transformirali bakterijske celice ''E. coli''. Tiste, ki so uspešno izražale GV, so označili s fluoresenčnim barvilom. Kot kontrolo so uporabili celice, v katerih so z izpostavitvijo visokemu tlaku predhodno počili GV. Po izpostavitvi celic stoječemu UZ valovanju so premik zaznali le pri celicah, ki so vsebovale GV. Te so se namreč pomaknile v območja ojačitve na steni mikrofluidnega kanala. Celice ter večina bioloških komponent ima v vodni raztopini pozitiven akustični kontrastni faktor Φ, vendar pa je ta zelo majhen (od 0.06 do 0.12). Rezultat zgornjega eksperimenta potrjuje, da prisotnost GV povzroči spremembo celotnega Φ celice, tako da ta postane manjši od nič, obenem pa reši tudi problem neodzivnosti majhnih celic na ARF. Celice, ki GV niso vsebovale, se namreč niso pomaknile nikamor (čeprav bi se zaradi pozitivnega Φ morale pomakniti v smeri območja oslabitve stoječega valovanja) [3].

Glede na obetavne rezultate so avtorji članka želeli preizkusiti, če je z UZ ob prisotnosti GV mogoča natančna in hitra prostorska manipulacija celic. Najprej so v za to posebej zasnovani akustični komori ustvarili vzorec stoječega valovanja ter vanjo dali raztopino fluorescenčno označenih celic, ki vsebujejo GV. Opazili so, da so se celice uredile v določen vzorec stoječega valovanja ter se po spremembi frekvence UZ v času nekaj sekund preoblikovale v novega. Nato so naredili še korak naprej in iz bakterijskih celic, ki vsebujejo GV, ustvarili akustični hologram. To je poimenovanje za tehniko, ki omogoča sestavljanje 3D objektov iz različnih vrst delcev samo z uporabo zvoka. Z uporabo 3D-natisnjene fazne maske so ustvarili profil visokega tlaka v obliki črke "R". Pripravili so 0,25 % raztopino agaroze v gojišču LB, ter vanjo dodali bakterijske celice, ki vsebujejo GV. Pri tem so temperaturo ves čas vzdrževali pri 37 °C, c čimer so preprečili gelacijo agaroze. Nato so raztopino izpostavili UZ ter pustili, da se je agaroza strdila. Kot pričakovano, so se bakterije znotraj strjenega gela imobilizirale v želenem prostorskem vzorcu 'R'. Uspešno so pokazali tudi, da lahko z UZ ustvarijo 'past', v katero se ujamejo celice, in s katero lahko povzročijo translacijo delcev v prostoru (podobno kot to zmore optična pinceta) [3].

== Ekspresija plinskih veziklov omogoča selektivno akustično manipulacijo sesalskih celic ==

V nadaljevanju so raziskovalci preverili še, če enake lastnosti veljajo tudi za sesalske celice, ki vsebujejo GV. Pripravili so gensko spremenjene celice HEK293T, ki so pod inducibilnim tetraciklinskim promotorjem vsebovale zapis za mARG1. Kot kontrolo so uporabili celice HEK293T, ki so imele pod enakim promotorjem zapis za fluorescenčni protein mCherry. Ko so celice izpostavili UZ so ugotovili, da se je večinski del celic, ki vsebujejo GV, pomaknil v območja ojačitev, torej proti stenam kanala. Za razliko od bakterijskih celic, kjer ob odsotnosti GV v polju UZ valovanja niso opazili nobenega premika, so pri kontrolnih sesalskih celicah opazili, da so se te premaknile na območje oslabitev, torej v središče kanala. To je pričakovano, saj imajo celice pozitiven akustičnim kontrastni faktor Φ, poleg tega pa so sesalske celice večje od bakterijskih in posledično čutijo vpliv ARF. Naredili so tudi podoben eksperiment, kot so ga izvedli na bakterijskih celicah. Sesalske celice so transficirali s plazmidom, ki vsebuje zapis mARG1, ter jih izpostavili enakemu akustičnemu hologramu v obliki črke R kot prej bakterije. Tudi tukaj so opazili, da so se transficirane celice uredile v želeno obliko, medtem ko so se kontrolne celice od območja vzorca izrazito odmaknile. Ključno pri tem je dejstvo, da akustična manipulacija celic v vzorec ni vplivala na njihovo viabilnost [3].

V nadaljevanju so fluorescentno označene GV inkubirali z mišjimi makrofagi, ki imajo sposobnost endocitoze. Po izpostavitvi UZ so lahko selektivno manipulirali le celice, ki so uspešno prevzele GV. S tem so pokazali, da lahko GV služijo tudi kot biomakerji za neko določeno biološko funkcijo, v tem primeru endocitoze. Pokazali so tudi, da lahko GV delujejo kot markerji, ki omogočajo razvrščanje celic na podlagi njihovega genotipa v akustično-fluidni napravi. To bi lahko predstavljalo alternativo FACS, trenutno najpogosteje uporabljeni metodi za selekcijo celic na podlagi genotipa, ki zahteva drago in kompleksno opremo.

== Zaključek ==

V raziskavi so pokazali, da plinski vezikli delujejo kot prvi gensko kodirani aktuatorji za ultrazvok, ki doživljajo močno silo akustičnega sevanja in imajo sposobnost, da s svojo prisotnostjo v celici povečajo in izrazito spremenijo njen akustični kontrastni faktor ter s tem spremenijo njene akustične lastnosti. Prisotnost plinskih veziklov omogoča neposredno akustično manipulacijo bakterijskih celic z lovljenjem v akustično past in kontroliranim preoblikovanjem v želen vzorec stoječega valovanja ter selektivno manipulacijo bakterijskih in sesalskih celic na podlagi njihovega genotipa v želeno obliko (nastanek akustičnega holograma).

Predstavljeni rezultati dokazujejo sposobnost GV, da služijo kot prvi gensko kodirani aktuatorji za ultrazvok in tako povežejo akustično manipulacijo s področjem molekularne in sintetične biologije. Tehnologija predstavlja velik potencial na področju tkivnega inženiringa, kjer je cilj ustvariti funkcionalna tkiva oziroma organe z uporabo živih celic. Z uporabo biomolekularnih aktuatorjev bi lahko izboljšali učinkovitost in natančnost na področju regenerativne medicine. Tak pristop namreč v primerjavi z optičnimi in magnetnimi tehnikami manipulacije ponuja edinstvene prednosti – deluje v neprozornem mediju, je neinvaziven, ne vpliva na viabilnost celic ter omogoča fino prostorsko regulacijo in hitro odzivnost, poleg tega pa je tudi relativno cenovno ugoden.

== Viri ==

[1] H. Bruus: Acoustofluidics 7: The Acoustic Radiation Force on Small Particles. Lab Chip 2012, 12, 1014–1021.

[2] J. Čemažar: Dielektroforetsko Ločevanje Bioloških Celic v Mikropretočni Komori : Doktorska Disertacija, Univ. v Ljubljani, Fak. za elektrotehniko, 2013.

[3] D. Wu, D. Baresch, C. Cook, Z. Ma, M. Duan, D. Malounda, D. Maresca, M. P. Abundo, J. Lee, S. Shivaei, et al.: Biomolecular Actuators for Genetically Selective Acoustic Manipulation of Cells. Sci. Adv. 2023, 9.

Biomolekularni aktuatorji za gensko selektivno akustično manipulacijo celic

2023-04-02T13:32:29Z

Greta Junger:

Povzeto po članku ''D. Wu, D. Baresch, C. Cook, Z. Ma, M. Duan, D. Malounda, D. Maresca, M. P. Abundo, J. Lee, S. Shivaei, et al.: Biomolecular Actuators for Genetically Selective Acoustic Manipulation of Cells. Sci. Adv. 2023, 9.''

== Uvod ==

Sposobnost manipulacije fizičnega položaja specifičnih celic je ključna za biomedicino, sintetično biologijo in področje živih materialov. To je mogoče doseči na različne načine, avtorji tega članka pa so se osredotočili na uporabo ultrazvoka. Slednji ima namreč sposobnost manipulacije s celicami z visoko prostorsko natančnostjo in hitro odzivnostjo preko akustične radiacijske sile. Ker pa ima večina celic podobne akustične lastnosti, so avtorji članka kot aktuatorje, tj. premikalnike celic, uporabili plinske vezikle. Z več eksperimenti so pokazali, da slednji omogočajo selektivno akustično manipulacijo celic, ki imajo v svoji citoplazmi prisotne plinske vezikle.

== Sila akustičnega sevanja ==

Na majhen sferični delec v polju ultrazvočnega (UZ) stoječega valovanja deluje sila akustičnega sevanja (ang. ''acoustic radiation force'', ARF). Slednja temelji na ustvarjeni tlačni sili, ki je časovno nespremenljiva in privlači telesa bodisi v območje najnižjega tlaka (na področje vozlišč/oslabitev valovanja), bodisi v območje najvišjega tlaka (na področje ojačitev valovanja). Ta sila je odvisna od razlik v gostoti in stisljivosti delca od okoliškega medija, kar je izraženo z akustičnim kontrastnim faktorjem Φ. Slednji določa smer delovanja ARF na delec v okoliškem mediju. Delci, katerih Φ > 0, se gibljejo v smeri območja oslabitve valovanja, delci, za katere je Φ < 0, pa potujejo v smeri ojačitev [1,2].

Preko ARF lahko z uporabo UZ enostavno manipuliramo z različnimi materiali, vendar pa je zaradi podobnih vrednosti Φ med različnimi celicami izziv povezati aktivacijo, ki temelji na ARF, z izražanjem specifičnega gena in posledično z manipulacijo specifičnih celic. Za to bi bilo potrebno genetsko kodirano sredstvo, ki bi lahko izrazito spremenilo akustične lastnosti celice. S tem v mislih so avtorji članka preverili, če lahko kot gensko selektivne aktuatorje uporabijo plinske vezikle [3].

== Plinski vezikli se neposredno odzivajo na UZ ==

Plinski vezikli (ang. ''gas vesicles'', GV) so votle proteinske nanostrukture, napolnjene s plini. Razvili so se v vodnih fotosintetskih mikrobih, kjer služijo kot sredstvo za doseganje plovnosti za boljši dostop do sončne svetlobe. Ker se GV bistveno razlikujejo v svojih fizikalnih lastnostih (nižja gostota in večja stisljivost) od okoliškega medija (voda), so raziskovalci domnevali, da bodo imeli izrazito drugačen Φ, zaradi česar bodo v polju UZ valovanja potovali drugače. GV so modelirali kot sferične delce z gostoto 120 kg/m3 in stisljivostjo 1,55 × 10^8 Pa^−1, ter tako ocenili akustični kontrastni faktor kot izrazito negativen (−11,7). Svojo domnevo so potrdili tudi z eksperimenti. GV so izolirali iz cianobakterije ''Anabaena flos-aquae'' (Ana) ter jih kemično označili s fluorescenčnim barvilom. Nato so raztopino GV prenesli v mikrofluidni kanal, opremljen s piezoelektričim resonatorjem, ki generira UZ valovanje z ustrezno valovno dolžino. Širina kanala je bila enaka polovični valovni dolžini generiranega UZ. Posledično so bila območja oslabitve v središču, območja ojačitve pa na steni kanala, kamor so tudi potovali GV. Kot kontrolo so uporabili počene GV, za katere so pokazali, da v polju UZ valovanja ne potujejo. Na podlagi obetavnih rezultatov so avtorji domnevali, da imajo GV sposobnost, da s svojo prisotnostjo v celici spremenijo njene akustične lastnosti, zaradi česar bodo celice, ki vsebujejo GV, doživele izrazito drugačno silo akustičnega sevanja kot tiste, ki GV ne vsebujejo. To bi omogočalo selektivno manipuliranje celic z UZ na podlagi njihovega genotipa [3].

== Ekspresija plinskih veziklov omogoča selektivno akustično manipulacijo bakterijskih celic ==

V prvem delu eksperimenta so s plazmidom pET28a, ki vsebuje insert bARG1 (Acoustic Reporter Gene 1, sestavljen iz kombinacije 13 genov iz Ana in ''Bacillus megaterium'', ključnih za nastanek GV), transformirali bakterijske celice ''E. coli''. Tiste, ki so uspešno izražale GV, so označili s fluoresenčnim barvilom. Kot kontrolo so uporabili celice, v katerih so z izpostavitvijo visokemu tlaku predhodno počili GV. Po izpostavitvi celic stoječemu UZ valovanju so premik zaznali le pri celicah, ki so vsebovale GV. Te so se namreč pomaknile v območja ojačitve na steni mikrofluidnega kanala. Celice ter večina bioloških komponent ima v vodni raztopini pozitiven akustični kontrastni faktor Φ, vendar pa je ta zelo majhen (od 0.06 do 0.12). Rezultat zgornjega eksperimenta potrjuje, da prisotnost GV povzroči spremembo celotnega Φ celice, tako da ta postane manjši od nič, obenem pa reši tudi problem neodzivnosti majhnih celic na ARF. Celice, ki GV niso vsebovale, se namreč niso pomaknile nikamor (čeprav bi se zaradi pozitivnega Φ morale pomakniti v smeri območja oslabitve stoječega valovanja) [3].

Glede na obetavne rezultate so avtorji članka želeli preizkusiti, če je z UZ ob prisotnosti GV mogoča natančna in hitra prostorska manipulacija celic. Najprej so v za to posebej zasnovani akustični komori ustvarili vzorec stoječega valovanja ter vanjo dali raztopino fluorescenčno označenih celic, ki vsebujejo GV. Opazili so, da so se celice uredile v določen vzorec stoječega valovanja ter se po spremembi frekvence UZ v času nekaj sekund preoblikovale v novega. Nato so naredili še korak naprej in iz bakterijskih celic, ki vsebujejo GV, ustvarili akustični hologram. To je poimenovanje za tehniko, ki omogoča sestavljanje 3D objektov iz različnih vrst delcev samo z uporabo zvoka. Z uporabo 3D-natisnjene fazne maske so ustvarili profil visokega tlaka v obliki črke "R". Pripravili so 0,25 % raztopino agaroze v gojišču LB, ter vanjo dodali bakterijske celice, ki vsebujejo GV. Pri tem so temperaturo ves čas vzdrževali pri 37 °C, c čimer so preprečili gelacijo agaroze. Nato so raztopino izpostavili UZ ter pustili, da se je agaroza strdila. Kot pričakovano, so se bakterije znotraj strjenega gela imobilizirale v želenem prostorskem vzorcu 'R'. Uspešno so pokazali tudi, da lahko z UZ ustvarijo 'past', v katero se ujamejo celice, in s katero lahko povzročijo translacijo delcev v prostoru (podobno kot to zmore optična pinceta) [3].

== Ekspresija plinskih veziklov omogoča selektivno akustično manipulacijo sesalskih celic ==

V nadaljevanju so raziskovalci preverili še, če enake lastnosti veljajo tudi za sesalske celice, ki vsebujejo GV. Pripravili so gensko spremenjene celice HEK293T, ki so pod inducibilnim tetraciklinskim promotorjem vsebovale zapis za mARG1. Kot kontrolo so uporabili celice HEK293T, ki so imele pod enakim promotorjem zapis za fluorescenčni protein mCherry. Ko so celice izpostavili UZ so ugotovili, da se je večinski del celic, ki vsebujejo GV, pomaknil v območja ojačitev, torej proti stenam kanala. Za razliko od bakterijskih celic, kjer ob odsotnosti GV v polju UZ valovanja niso opazili nobenega premika, so pri kontrolnih sesalskih celicah opazili, da so se te premaknile na območje oslabitev, torej v središče kanala. To je pričakovano, saj imajo celice pozitiven akustičnim kontrastni faktor Φ, poleg tega pa so sesalske celice večje od bakterijskih in posledično čutijo vpliv ARF. Naredili so tudi podoben eksperiment, kot so ga izvedli na bakterijskih celicah. Sesalske celice so transficirali s plazmidom, ki vsebuje zapis mARG1, ter jih izpostavili enakemu akustičnemu hologramu v obliki črke R kot prej bakterije. Tudi tukaj so opazili, da so se transficirane celice uredile v želeno obliko, medtem ko so se kontrolne celice od območja vzorca izrazito odmaknile. Ključno pri tem je dejstvo, da akustična manipulacija celic v vzorec ni vplivala na njihovo viabilnost [3].

V nadaljevanju so fluorescentno označene GV inkubirali z mišjimi makrofagi, ki imajo sposobnost endocitoze. Po izpostavitvi UZ so lahko selektivno manipulirali le celice, ki so uspešno prevzele GV. S tem so pokazali, da lahko GV služijo tudi kot biomakerji za neko določeno biološko funkcijo, v tem primeru endocitoze. Pokazali so tudi, da lahko GV delujejo kot markerji, ki omogočajo razvrščanje celic na podlagi njihovega genotipa v akustično-fluidni napravi. To bi lahko predstavljalo alternativo FACS, trenutno najpogosteje uporabljeni metodi za selekcijo celic na podlagi genotipa, ki zahteva drago in kompleksno opremo.

== Zaključek ==

V raziskavi so pokazali, da plinski vezikli delujejo kot prvi gensko kodirani aktuatorji za ultrazvok, ki doživljajo močno silo akustičnega sevanja in imajo sposobnost, da s svojo prisotnostjo v celici povečajo in izrazito spremenijo njen akustični kontrastni faktor ter s tem spremenijo njene akustične lastnosti. Prisotnost plinskih veziklov omogoča neposredno akustično manipulacijo bakterijskih celic z lovljenjem v akustično past in kontroliranim preoblikovanjem v želen vzorec stoječega valovanja ter selektivno manipulacijo bakterijskih in sesalskih celic na podlagi njihovega genotipa v želeno obliko (nastanek akustičnega holograma).

Predstavljeni rezultati dokazujejo sposobnost GV, da služijo kot prvi gensko kodirani aktuatorji za ultrazvok in tako povežejo akustično manipulacijo s področjem molekularne in sintetične biologije. Tehnologija predstavlja velik potencial na področju tkivnega inženiringa, kjer je cilj ustvariti funkcionalna tkiva oziroma organe z uporabo živih celic. Z uporabo biomolekularnih aktuatorjev bi lahko izboljšali učinkovitost in natančnost na področju regenerativne medicine. Tak pristop namreč v primerjavi z optičnimi in magnetnimi tehnikami manipulacije ponuja edinstvene prednosti – deluje v neprozornem mediju, je neinvaziven, ne vpliva na viabilnost celic ter omogoča fino prostorsko regulacijo in hitro odzivnost, poleg tega pa je tudi relativno cenovno ugoden.

== Viri ==

[1] H. Bruus: Acoustofluidics 7: The Acoustic Radiation Force on Small Particles. Lab Chip 2012, 12, 1014–1021.

[2] J. Čemažar: Dielektroforetsko Ločevanje Bioloških Celic v Mikropretočni Komori : Doktorska Disertacija, Univ. v Ljubljani, Fak. za elektrotehniko, 2013.

[3] D. Wu, D. Baresch, C. Cook, Z. Ma, M. Duan, D. Malounda, D. Maresca, M. P. Abundo, J. Lee, S. Shivaei, et al.: Biomolecular Actuators for Genetically Selective Acoustic Manipulation of Cells. Sci. Adv. 2023, 9.

Biomolekularni aktuatorji za gensko selektivno akustično manipulacijo celic

2023-04-02T13:29:38Z

Greta Junger:

Povzeto po članku ''D. Wu, D. Baresch, C. Cook, Z. Ma, M. Duan, D. Malounda, D. Maresca, M. P. Abundo, J. Lee, S. Shivaei, et al.: Biomolecular Actuators for Genetically Selective Acoustic Manipulation of Cells. Sci. Adv. 2023, 9.''

== Uvod ==

Sposobnost manipulacije fizičnega položaja specifičnih celic je ključna za biomedicino, sintetično biologijo in področje živih materialov. To je mogoče doseči na različne načine, avtorji tega članka pa so se osredotočili na uporabo ultrazvoka. Slednji ima namreč sposobnost manipulacije s celicami z visoko prostorsko natančnostjo in hitro odzivnostjo preko akustične radiacijske sile. Ker pa ima večina celic podobne akustične lastnosti, so avtorji članka kot aktuatorje, tj. premikalnike celic, uporabili plinske vezikle. Z več eksperimenti so pokazali, da slednji omogočajo selektivno akustično manipulacijo celic, ki imajo v svoji citoplazmi prisotne plinske vezikle.

== Sila akustičnega sevanja ==

Na majhen sferični delec v polju ultrazvočnega (UZ) stoječega valovanja deluje sila akustičnega sevanja (ang. ''acoustic radiation force'', ARF). Slednja temelji na ustvarjeni tlačni sili, ki je časovno nespremenljiva in privlači telesa bodisi v območje najnižjega tlaka (na področje vozlišč/oslabitev valovanja), bodisi v območje najvišjega tlaka (na področje ojačitev valovanja). Ta sila je odvisna od razlik v gostoti in stisljivosti delca od okoliškega medija, kar je izraženo z akustičnim kontrastnim faktorjem Φ. Slednji določa smer delovanja ARF na delec v okoliškem mediju. Delci, katerih Φ > 0, se gibljejo v smeri območja oslabitve valovanja, delci, za katere je Φ < 0, pa potujejo v smeri ojačitev [1,2].

Preko ARF lahko z uporabo UZ enostavno manipuliramo z različnimi materiali, vendar pa je zaradi podobnih vrednosti Φ med različnimi celicami izziv povezati aktivacijo, ki temelji na ARF, z izražanjem specifičnega gena in posledično z manipulacijo specifičnih celic. Za to bi bilo potrebno genetsko kodirano sredstvo, ki bi lahko izrazito spremenilo akustične lastnosti celice. S tem v mislih so avtorji članka preverili, če lahko kot gensko selektivne aktuatorje uporabijo plinske vezikle [3].

== Plinski vezikli se neposredno odzivajo na UZ ==

Plinski vezikli (ang. ''gas vesicles'', GV) so votle proteinske nanostrukture, napolnjene s plini. Razvili so se v vodnih fotosintetskih mikrobih, kjer služijo kot sredstvo za doseganje plovnosti za boljši dostop do sončne svetlobe. Ker se GV bistveno razlikujejo v svojih fizikalnih lastnostih (nižja gostota in večja stisljivost) od okoliškega medija (voda), so raziskovalci domnevali, da bodo imeli izrazito drugačen Φ, zaradi česar bodo v polju UZ valovanja potovali drugače. GV so modelirali kot sferične delce z gostoto 120 kg/m3 in stisljivostjo 1,55 × 10^8 Pa^−1, ter tako ocenili akustični kontrastni faktor kot izrazito negativen (−11,7). Svojo domnevo so potrdili tudi z eksperimenti. GV so izolirali iz cianobakterije ''Anabaena flos-aquae'' (Ana) ter jih kemično označili s fluorescenčnim barvilom. Nato so raztopino GV prenesli v mikrofluidni kanal, opremljen s piezoelektričim resonatorjem, ki generira UZ valovanje z ustrezno valovno dolžino. Širina kanala je bila enaka polovični valovni dolžini generiranega UZ. Posledično so bila območja oslabitve v središču, območja ojačitve pa na steni kanala, kamor so tudi potovali GV. Kot kontrolo so uporabili počene GV, za katere so pokazali, da v polju UZ valovanja ne potujejo. Na podlagi obetavnih rezultatov so avtorji domnevali, da imajo GV sposobnost, da s svojo prisotnostjo v celici spremenijo njene akustične lastnosti, zaradi česar bodo celice, ki vsebujejo GV, doživele izrazito drugačno silo akustičnega sevanja kot tiste, ki GV ne vsebujejo. To bi omogočalo selektivno manipuliranje celic z UZ na podlagi njihovega genotipa [3].

== Ekspresija plinskih veziklov omogoča selektivno akustično manipulacijo bakterijskih celic ==

V prvem delu eksperimenta so s plazmidom pET28a, ki vsebuje insert bARG1 (Acoustic Reporter Gene 1, sestavljen iz kombinacije 13 genov iz Ana in ''Bacillus megaterium'', ključnih za nastanek GV), transformirali bakterijske celice ''E. coli''. Tiste, ki so uspešno izražale GV, so označili s fluoresenčnim barvilom. Kot kontrolo so uporabili celice, v katerih so z izpostavitvijo visokemu tlaku predhodno počili GV. Po izpostavitvi celic stoječemu UZ valovanju so premik zaznali le pri celicah, ki so vsebovale GV. Te so se namreč pomaknile v območja ojačitve na steni mikrofluidnega kanala. Celice ter večina bioloških komponent ima v vodni raztopini pozitiven akustični kontrastni faktor Φ, vendar pa je ta zelo majhen (od 0.06 do 0.12). Rezultat zgornjega eksperimenta potrjuje, da prisotnost GV povzroči spremembo celotnega Φ celice, tako da ta postane manjši od nič, obenem pa reši tudi problem neodzivnosti majhnih celic na ARF. Celice, ki GV niso vsebovale, se namreč niso pomaknile nikamor (čeprav bi se zaradi pozitivnega Φ morale pomakniti v smeri območja oslabitve stoječega valovanja) [3].

Glede na obetavne rezultate so avtorji članka želeli preizkusiti, če je z UZ ob prisotnosti GV mogoča natančna in hitra prostorska manipulacija celic. Najprej so v za to posebej zasnovani akustični komori ustvarili vzorec stoječega valovanja ter vanjo dali raztopino fluorescenčno označenih celic, ki vsebujejo GV. Opazili so, da so se celice uredile v določen vzorec stoječega valovanja ter se po spremembi frekvence UZ v času nekaj sekund preoblikovale v novega. Nato so naredili še korak naprej in iz bakterijskih celic, ki vsebujejo GV, ustvarili akustični hologram. To je poimenovanje za tehniko, ki omogoča sestavljanje 3D objektov iz različnih vrst delcev samo z uporabo zvoka. Z uporabo 3D-natisnjene fazne maske so ustvarili profil visokega tlaka v obliki črke "R". Pripravili so 0,25 % raztopino agaroze v gojišču LB, ter vanjo dodali bakterijske celice, ki vsebujejo GV. Pri tem so temperaturo ves čas vzdrževali pri 37 °C, c čimer so preprečili gelacijo agaroze. Nato so raztopino izpostavili UZ ter pustili, da se je agaroza strdila. Kot pričakovano, so se bakterije znotraj strjenega gela imobilizirale v želenem prostorskem vzorcu 'R'. Uspešno so pokazali tudi, da lahko z UZ ustvarijo 'past', v katero se ujamejo celice, in s katero lahko povzročijo translacijo delcev v prostoru (podobno kot to zmore optična pinceta) [3].

== Ekspresija plinskih veziklov omogoča selektivno akustično manipulacijo sesalskih celic ==

V nadaljevanju so raziskovalci preverili še, če enake lastnosti veljajo tudi za sesalske celice, ki vsebujejo GV. Pripravili so gensko spremenjene celice HEK293T, ki so pod inducibilnim tetraciklinskim promotorjem vsebovale zapis za mARG1. Kot kontrolo so uporabili celice HEK293T, ki so imele pod enakim promotorjem zapis za fluorescenčni protein mCherry. Ko so celice izpostavili UZ so ugotovili, da se je večinski del celic, ki vsebujejo GV, pomaknil v območja ojačitev, torej proti stenam kanala. Za razliko od bakterijskih celic, kjer ob odsotnosti GV v polju UZ valovanja niso opazili nobenega premika, so pri kontrolnih sesalskih celicah opazili, da so se te premaknile na območje oslabitev, torej v središče kanala. To je pričakovano, saj imajo celice pozitiven akustičnim kontrastni faktor Φ, poleg tega pa so sesalske celice večje od bakterijskih in posledično čutijo vpliv ARF. Naredili so tudi podoben eksperiment, kot so ga izvedli na bakterijskih celicah. Sesalske celice so transficirali s plazmidom, ki vsebuje zapis mARG1, ter jih izpostavili enakemu akustičnemu hologramu v obliki črke R kot prej bakterije. Tudi tukaj so opazili, da so se transficirane celice uredile v želeno obliko, medtem ko so se kontrolne celice od območja vzorca izrazito odmaknile. Ključno pri tem je dejstvo, da akustična manipulacija celic v vzorec ni vplivala na njihovo viabilnost [3].

V nadaljevanju so fluorescentno označene GV inkubirali z mišjimi makrofagi, ki imajo sposobnost endocitoze. Po izpostavitvi UZ so lahko selektivno manipulirali le celice, ki so uspešno prevzele GV. S tem so pokazali, da lahko GV služijo tudi kot biomakerji za neko določeno biološko funkcijo, v tem primeru endocitoze. Pokazali so tudi, da lahko GV delujejo kot markerji, ki omogočajo razvrščanje celic na podlagi njihovega genotipa v akustično-fluidni napravi. To bi lahko predstavljalo alternativo FACS, trenutno najpogosteje uporabljeni metodi za selekcijo celic na podlagi genotipa, ki zahteva drago in kompleksno opremo.

== Zaključek ==

V raziskavi so pokazali, da plinski vezikli delujejo kot prvi gensko kodirani aktuatorji za ultrazvok, ki doživljajo močno silo akustičnega sevanja in imajo sposobnost, da s svojo prisotnostjo v celici povečajo in izrazito spremenijo njen akustični kontrastni faktor ter s tem spremenijo njene akustične lastnosti. Prisotnost plinskih veziklov omogoča neposredno akustično manipulacijo bakterijskih celic z lovljenjem v akustično past in kontroliranim preoblikovanjem v želen vzorec stoječega valovanja ter selektivno manipulacijo bakterijskih in sesalskih celic na podlagi njihovega genotipa v želeno obliko (nastanek akustičnega holograma).

Predstavljeni rezultati dokazujejo sposobnost GV, da služijo kot prvi gensko kodirani aktuatorji za ultrazvok in tako povežejo akustično manipulacijo s področjem molekularne in sintetične biologije. Tehnologija predstavlja velik potencial na področju tkivnega inženiringa, kjer je cilj ustvariti funkcionalna tkiva oziroma organe z uporabo živih celic. Z uporabo biomolekularnih aktuatorjev bi lahko izboljšali učinkovitost in natančnost na področju regenerativne medicine. Tak pristop namreč v primerjavi z optičnimi in magnetnimi tehnikami manipulacije ponuja edinstvene prednosti – deluje v neprozornem mediju, je neinvaziven, ne vpliva na viabilnost celic ter omogoča fino prostorsko regulacijo in hitro odzivnost, poleg tega pa je tudi relativno cenovno ugoden.

== Viri ==

[1] H. Bruus: Acoustofluidics 7: The Acoustic Radiation Force on Small Particles. Lab Chip 2012, 12, 1014–1021.

[2] J. Čemažar: Dielektroforetsko Ločevanje Bioloških Celic v Mikropretočni Komori : Doktorska Disertacija, Univ. v Ljubljani, Fak. za elektrotehniko, 2013.

[3] D. Wu, D. Baresch, C. Cook, Z. Ma, M. Duan, D. Malounda, D. Maresca, M. P. Abundo, J. Lee, S. Shivaei, et al.: Biomolecular Actuators for Genetically Selective Acoustic Manipulation of Cells. Sci. Adv. 2023, 9.

Biomolekularni aktuatorji za gensko selektivno akustično manipulacijo celic

2023-04-02T13:29:10Z

Greta Junger:

Povzeto po članku ''D. Wu, D. Baresch, C. Cook, Z. Ma, M. Duan, D. Malounda, D. Maresca, M. P. Abundo, J. Lee, S. Shivaei, et al.: Biomolecular Actuators for Genetically Selective Acoustic Manipulation of Cells. Sci. Adv. 2023, 9.''

== Uvod ==

Sposobnost manipulacije fizičnega položaja specifičnih celic je ključna za biomedicino, sintetično biologijo in področje živih materialov. To je mogoče doseči na različne načine, avtorji tega članka pa so se osredotočili na uporabo ultrazvoka. Slednji ima namreč sposobnost manipulacije s celicami z visoko prostorsko natančnostjo in hitro odzivnostjo preko akustične radiacijske sile. Ker pa ima večina celic podobne akustične lastnosti, so avtorji članka kot aktuatorje, tj. premikalnike celic, uporabili plinske vezikle. Z več eksperimenti so pokazali, da slednji omogočajo selektivno akustično manipulacijo celic, ki imajo v svoji citoplazmi prisotne plinske vezikle.

== Sila akustičnega sevanja ==

Na majhen sferični delec v polju ultrazvočnega (UZ) stoječega valovanja deluje sila akustičnega sevanja (ang. ''acoustic radiation force'', ARF). Slednja temelji na ustvarjeni tlačni sili, ki je časovno nespremenljiva in privlači telesa bodisi v območje najnižjega tlaka (na področje vozlišč/oslabitev valovanja), bodisi v območje najvišjega tlaka (na področje ojačitev valovanja). Ta sila je odvisna od razlik v gostoti in stisljivosti delca od okoliškega medija, kar je izraženo z akustičnim kontrastnim faktorjem Φ. Slednji določa smer delovanja ARF na delec v okoliškem mediju. Delci, katerih Φ > 0, se gibljejo v smeri območja oslabitve valovanja, delci, za katere je Φ < 0, pa potujejo v smeri ojačitev [1,2].

Preko ARF lahko z uporabo UZ enostavno manipuliramo z različnimi materiali, vendar pa je zaradi podobnih vrednosti Φ med različnimi celicami izziv povezati aktivacijo, ki temelji na ARF, z izražanjem specifičnega gena in posledično z manipulacijo specifičnih celic. Za to bi bilo potrebno genetsko kodirano sredstvo, ki bi lahko izrazito spremenilo akustične lastnosti celice. S tem v mislih so avtorji članka preverili, če lahko kot gensko selektivne aktuatorje uporabijo plinske vezikle [3].

== Plinski vezikli se neposredno odzivajo na UZ ==

Plinski vezikli (ang. ''gas vesicles'', GV) so votle proteinske nanostrukture, napolnjene s plini. Razvili so se v vodnih fotosintetskih mikrobih, kjer služijo kot sredstvo za doseganje plovnosti za boljši dostop do sončne svetlobe. Ker se GV bistveno razlikujejo v svojih fizikalnih lastnostih (nižja gostota in večja stisljivost) od okoliškega medija (voda), so raziskovalci domnevali, da bodo imeli izrazito drugačen Φ, zaradi česar bodo v polju UZ valovanja potovali drugače. GV so modelirali kot sferične delce z gostoto 120 kg/m3 in stisljivostjo 1,55 × 10^8 Pa^−1, ter tako ocenili akustični kontrastni faktor kot izrazito negativen (−11,7). Svojo domnevo so potrdili tudi z eksperimenti. GV so izolirali iz cianobakterije ''Anabaena flos-aquae'' (Ana) ter jih kemično označili s fluorescenčnim barvilom. Nato so raztopino GV prenesli v mikrofluidni kanal, opremljen s piezoelektričim resonatorjem, ki generira UZ valovanje z ustrezno valovno dolžino. Širina kanala je bila enaka polovični valovni dolžini generiranega UZ. Posledično so bila območja oslabitve v središču, območja ojačitve pa na steni kanala, kamor so tudi potovali GV. Kot kontrolo so uporabili počene GV, za katere so pokazali, da v polju UZ valovanja ne potujejo. Na podlagi obetavnih rezultatov so avtorji domnevali, da imajo GV sposobnost, da s svojo prisotnostjo v celici spremenijo njene akustične lastnosti, zaradi česar bodo celice, ki vsebujejo GV, doživele izrazito drugačno silo akustičnega sevanja kot tiste, ki GV ne vsebujejo. To bi omogočalo selektivno manipuliranje celic z UZ na podlagi njihovega genotipa [3].

== Ekspresija plinskih veziklov omogoča selektivno akustično manipulacijo bakterijskih celic ==

V prvem delu eksperimenta so s plazmidom pET28a, ki vsebuje insert bARG1 (Acoustic Reporter Gene 1, sestavljen iz kombinacije 13 genov iz Ana in ''Bacillus megaterium'', ključnih za nastanek GV), transformirali bakterijske celice ''E. coli''. Tiste, ki so uspešno izražale GV, so označili s fluoresenčnim barvilom. Kot kontrolo so uporabili celice, v katerih so z izpostavitvijo visokemu tlaku predhodno počili GV. Po izpostavitvi celic stoječemu UZ valovanju so premik zaznali le pri celicah, ki so vsebovale GV. Te so se namreč pomaknile v območja ojačitve na steni mikrofluidnega kanala. Celice ter večina bioloških komponent ima v vodni raztopini pozitiven akustični kontrastni faktor Φ, vendar pa je ta zelo majhen (od 0.06 do 0.12). Rezultat zgornjega eksperimenta potrjuje, da prisotnost GV povzroči spremembo celotnega Φ celice, tako da ta postane manjši od nič, obenem pa reši tudi problem neodzivnosti majhnih celic na ARF. Celice, ki GV niso vsebovale, se namreč niso pomaknile nikamor (čeprav bi se zaradi pozitivnega Φ morale pomakniti v smeri območja oslabitve stoječega valovanja) [3].

Glede na obetavne rezultate so avtorji članka želeli preizkusiti, če je z UZ ob prisotnosti GV mogoča natančna in hitra prostorska manipulacija celic. Najprej so v za to posebej zasnovani akustični komori ustvarili vzorec stoječega valovanja ter vanjo dali raztopino fluorescenčno označenih celic, ki vsebujejo GV. Opazili so, da so se celice uredile v določen vzorec stoječega valovanja ter se po spremembi frekvence UZ v času nekaj sekund preoblikovale v novega. Nato so naredili še korak naprej in iz bakterijskih celic, ki vsebujejo GV, ustvarili akustični hologram. To je poimenovanje za tehniko, ki omogoča sestavljanje 3D objektov iz različnih vrst delcev samo z uporabo zvoka. Z uporabo 3D-natisnjene fazne maske so ustvarili profil visokega tlaka v obliki črke "R". Pripravili so 0,25 % raztopino agaroze v gojišču LB, ter vanjo dodali bakterijske celice, ki vsebujejo GV. Pri tem so temperaturo ves čas vzdrževali pri 37 °C, c čimer so preprečili gelacijo agaroze. Nato so raztopino izpostavili UZ ter pustili, da se je agaroza strdila. Kot pričakovano, so se bakterije znotraj strjenega gela imobilizirale v želenem prostorskem vzorcu 'R'. Uspešno so pokazali tudi, da lahko z UZ ustvarijo 'past', v katero se ujamejo celice, in s katero lahko povzročijo translacijo delcev v prostoru (podobno kot to zmore optična pinceta) [3].

== Ekspresija plinskih veziklov omogoča selektivno akustično manipulacijo sesalskih celic ==

V nadaljevanju so raziskovalci preverili še, če enake lastnosti veljajo tudi za sesalske celice, ki vsebujejo GV. Pripravili so gensko spremenjene celice HEK293T, ki so pod inducibilnim tetraciklinskim promotorjem vsebovale zapis za mARG1. Kot kontrolo so uporabili celice HEK293T, ki so imele pod enakim promotorjem zapis za fluorescenčni protein mCherry. Ko so celice izpostavili UZ so ugotovili, da se je večinski del celic, ki vsebujejo GV, pomaknil v območja ojačitev, torej proti stenam kanala. Za razliko od bakterijskih celic, kjer ob odsotnosti GV v polju UZ valovanja niso opazili nobenega premika, so pri kontrolnih sesalskih celicah opazili, da so se te premaknile na območje oslabitev, torej v središče kanala. To je pričakovano, saj imajo celice pozitiven akustičnim kontrastni faktor Φ, poleg tega pa so sesalske celice večje od bakterijskih in posledično čutijo vpliv ARF. Naredili so tudi podoben eksperiment, kot so ga izvedli na bakterijskih celicah. Sesalske celice so transficirali s plazmidom, ki vsebuje zapis mARG1, ter jih izpostavili enakemu akustičnemu hologramu v obliki črke R kot prej bakterije. Tudi tukaj so opazili, da so se transficirane celice uredile v želeno obliko, medtem ko so se kontrolne celice od območja vzorca izrazito odmaknile. Ključno pri tem je dejstvo, da akustična manipulacija celic v vzorec ni vplivala na njihovo viabilnost [3].

V nadaljevanju so fluorescentno označene GV inkubirali z mišjimi makrofagi, ki imajo sposobnost endocitoze. Po izpostavitvi UZ so lahko selektivno manipulirali le celice, ki so uspešno prevzele GV. S tem so pokazali, da lahko GV služijo tudi kot biomakerji za neko določeno biološko funkcijo, v tem primeru endocitoze. Pokazali so tudi, da lahko GV delujejo kot markerji, ki omogočajo razvrščanje celic na podlagi njihovega genotipa v akustično-fluidni napravi. To bi lahko predstavljalo alternativo FACS, trenutno najpogosteje uporabljeni metodi za selekcijo celic na podlagi genotipa, ki zahteva drago in kompleksno opremo.

== Zaključek ==

V raziskavi so pokazali, da plinski vezikli delujejo kot prvi gensko kodirani aktuatorji za ultrazvok, ki doživljajo močno silo akustičnega sevanja in imajo sposobnost, da s svojo prisotnostjo v celici povečajo in izrazito spremenijo njen akustični kontrastni faktor ter s tem spremenijo njene akustične lastnosti. Prisotnost plinskih veziklov omogoča neposredno akustično manipulacijo bakterijskih celic z lovljenjem v akustično past in kontroliranim preoblikovanjem v želen vzorec stoječega valovanja ter selektivno manipulacijo bakterijskih in sesalskih celic na podlagi njihovega genotipa v želeno obliko (nastanek akustičnega holograma).

Predstavljeni rezultati dokazujejo sposobnost GV, da služijo kot prvi gensko kodirani aktuatorji za ultrazvok in tako povežejo akustično manipulacijo s področjem molekularne in sintetične biologije. Tehnologija predstavlja velik potencial na področju tkivnega inženiringa, kjer je cilj ustvariti funkcionalna tkiva oziroma organe z uporabo živih celic. Z uporabo biomolekularnih aktuatorjev bi lahko izboljšali učinkovitost in natančnost na področju regenerativne medicine. Tak pristop namreč v primerjavi z optičnimi in magnetnimi tehnikami manipulacije ponuja edinstvene prednosti – deluje v neprozornem mediju, je neinvaziven, ne vpliva na viabilnost celic ter omogoča fino prostorsko regulacijo in hitro odzivnost, poleg tega pa je tudi relativno cenovno ugoden.

== Viri ==

[1] H. Bruus: Acoustofluidics 7: The Acoustic Radiation Force on Small Particles. Lab Chip 2012, 12, 1014–1021.

[2] J. Čemažar: Dielektroforetsko Ločevanje Bioloških Celic v Mikropretočni Komori : Doktorska Disertacija, Univ. v Ljubljani, Fak. za elektrotehniko, 2013.

[3] D. Wu, D. Baresch, C. Cook, Z. Ma, M. Duan, D. Malounda, D. Maresca, M. P. Abundo, J. Lee, S. Shivaei, et al.: Biomolecular Actuators for Genetically Selective Acoustic Manipulation of Cells. Sci. Adv. 2023, 9.

Biomolekularni aktuatorji za gensko selektivno akustično manipulacijo celic

2023-04-02T13:20:35Z

Greta Junger:

Biomolekularni aktuatorji za gensko selektivno akustično manipulacijo celic

2023-04-02T13:17:51Z

Greta Junger:

Sposobnost manipulacije fizičnega položaja specifičnih celic je ključna za biomedicino, sintetično biologijo in področje živih materialov. To je mogoče doseči na različne načine, avtorji tega članka pa so se osredotočili na uporabo ultrazvoka. Slednji ima namreč sposobnost manipulacije s celicami z visoko prostorsko natančnostjo in hitro odzivnostjo preko akustične radiacijske sile. Ker pa ima večina celic podobne akustične lastnosti, so avtorji članka kot aktuatorje, tj. premikalnike celic, uporabili plinske vezikle. Z več eksperimenti so pokazali, da slednji omogočajo selektivno akustično manipulacijo celic, ki imajo v svoji citoplazmi prisotne plinske vezikle.

== Sila akustičnega sevanja
==

Seminarji SB 2022/23

2023-04-02T13:16:36Z

Greta Junger:

V študijskem letu 2022/23 študentje pri Sintezni biologiji predstavljajo naslednje teme:

RAZISKOVALNI ČLANKI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Rudarjenje_in_uporaba_konstitutivnih_promotorjev_iz_Rhodosporidium_toruloides Rudarjenje in uporaba konstitutivnih promotorjev iz ''Rhodosporidium toruloides''] (Ana Babnik)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Biomolekularni_aktuatorji_za_gensko_selektivno_akusti%C4%8Dno_manipulacijo_celic Biomolekularni aktuatorji za gensko selektivno akustično manipulacijo celic] (Greta Junger)

NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.)
#
#

----

Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Povzetek je treba objaviti dva dni pred predstavitvijo do polnoči (za seminarje v sredo torej v ponedeljek). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo približno 5-minutna razprava.

Terminski razpored je razviden iz preglednice na strežniku Google Drive.

Kako je videti seznam seminarjev, lahko preverite pri lanskem letniku: [[Seminarji_SB_2021/22]].

Seminarji SB 2022/23

2023-04-02T13:14:56Z

Greta Junger:

V študijskem letu 2022/23 študentje pri Sintezni biologiji predstavljajo naslednje teme:

RAZISKOVALNI ČLANKI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Rudarjenje_in_uporaba_konstitutivnih_promotorjev_iz_Rhodosporidium_toruloides Rudarjenje in uporaba konstitutivnih promotorjev iz ''Rhodosporidium toruloides''] (Ana Babnik)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Biomolekularni_aktuatorji_za_gensko_selektivno_akusti%C4%8Dno_manipulacijo_celic] (Greta Junger)

NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.)
#
#

----

Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Povzetek je treba objaviti dva dni pred predstavitvijo do polnoči (za seminarje v sredo torej v ponedeljek). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo približno 5-minutna razprava.

Terminski razpored je razviden iz preglednice na strežniku Google Drive.

Kako je videti seznam seminarjev, lahko preverite pri lanskem letniku: [[Seminarji_SB_2021/22]].

Biomolekularni aktuatorji za gensko selektivno akustično manipulacijo celic

2023-04-02T13:14:08Z

Greta Junger: New page: Sposobnost manipulacije fizičnega položaja specifičnih celic je ključna za biomedicino, sintetično biologijo in področje živih materialov. To je mogoče doseči na različne načine...

Fagni endolizini: mehanizem delovanja in možnosti za izboljšave

2020-05-04T18:56:59Z

Greta Junger:

Endolizini so pestra družina encimov, zapisanih v bakteriofagnem genomu. Izrazijo se znotraj gostiteljske celice na koncu bakteriofagnega litičnega cikla, ko razgradijo bakterijsko peptidoglikansko steno (PG). To povzroči lizo celice in sprostitev na novo ustvarjenih bakteriofagov v okolico.

Naravno antibiotično funkcijo endolizinov lahko s pridom uporabimo pri sintezi encimskih antibiotikov, ki so zaradi svojega načina delovanja hitrejši in bolj specifični od standardnih antibiotikov. Poleg tega je možnost nastanka rezistence na njih majhna, saj cepijo konservativne peptidoglikanske vezi, ki jih bakterija težje spremeni, ob tem pa jim ni potrebno niti vstopiti v celico. Čeprav so endolizini perspektivni, pa je prostora za izboljšave še veliko. S pomočjo različnih bioinženirskih modifikacij se znanstveniki trudijo optimizirati njihovo delovanje v fizioloških pogojih (npr. topnost, obstojnost v krvni plazmi, aktivnost pri fiziološkem pH, specifičnost…) Na začetku je bila eksogena uporaba endolizinov možna le na Grampozitivnih bakterijah, z leti raziskav in modifikacij pa so delovanje nekaterih uspeli razširiti tudi na Gramnegativne.

==Delitev endolizinov==

===Struktura===

Po strukturi jih delimo na enodomenske globularne, ki so bolj značilni za Gramnegativne bakterije, in dvodomenske modularne, ki se pojavijo pri obeh tipih. V modularnih je N-končna encimsko aktivna domena (EAD) s kratko, fleksibilno verigo povezana s C-končno, ki je specifična za vezavo na celično steno (CBD). Zaradi take strukture modularni endolizini predstavljajo večji potencial za bioinženirske izboljšave, saj se posamezni domeni lahko obravnava ločeno ter se ju lahko neodvisno spreminja (npr. točkovna mutacija), doda ali odstrani, s čimer nastane protein z novo ali izboljšano funkcijo. V modularnih endolizinih, ki delujejo na Gramnegativne bakterije (slednji so sicer redki), pa sta domeni zamenjani. Čeprav je CBD specifična za vezavo na PG, pa njena prisotnost za delovanje endolizina ni vedno ključna. V nekaterih primerih njihova aktivnost ob odstranitvi CBD ni nič slabša ali je celo povečana.

===Katalitska zmožnost===

Endolizini se delijo tudi glede na katalitske zmožnosti. Peptidoglikanska stena je sestavljena iz ponavljajočih se enot N-acetilglukozamina in N-acetilmuraminske kisline, ki so med sabo povezane z β-(1,4)-glikozidno vezjo. To vez cepijo N-acetilglikozidaze. Na N-acetilmuraminsko kislino je z amidno vezjo pripeta peptidna veriga iz 3-5 aminokislin, posamezne verige pa so med seboj tudi navzkrižno povezane. Amidno vez cepijo N-acetilmuramoil-L-alanin amidaze, peptidno vez med aminokislinami in posameznimi peptidnimi verigami pa endopeptidaze.

==N-acetilglikozidaze==

===N-acetilmuramidaze===

N-acetilmuramidaze, ki delujejo na Grampozitivne bakterije, spadajo v družino glikozidnih hidrolaz 25. Vez cepijo na reducirajočem koncu N-acetilmuraminske kisline po enem izmed dveh predlaganih mehanizmov. Pri prvem so za katalizo ključni trije aspartati in en glutamat. Najprej Asp deprotonira molekulo vode, ki nato kot nukleofil napade β-1,4 vez. Istočasno Glu donira svoj proton, tako da pride do inverzije anomernega centra. Preko preostalih dveh Asp se katalitsko mesto regenerira. Pri drugem mehanizmu sta ključna aminokislinska ostanka le Asp in Glu. Asp veže substrat, v katerem pride do intramolekularnega nukleofilnega napada N-acetoamidne stranske skupine na β-1,4 vez. Nato Glu deprotonira molekulo vode, ki nukleofilno napade anomerni C atom, vendar tako, da se anomerni center ohrani.

Do zdaj sta poznani le dve modularni N-acetilmuramidazi, ki delujeta v Gram negativnih bakterijah, vendar pa njun mehanizem delovanja še ni dobro pojasnjen.

====Izboljšave====
N-acetilmuramidaze imajo velik potencial za bioinženirsko izboljšavo. Dober primer sta za pnevmokoke specifična Cpl-1 in Cpl-7. Cpl-7 ima zelo aktivno EAD, vendar ima kljub temu nižjo bakteriolitično zmožnost kot Cpl-1. Razlog za to je bolj negativen neto naboj Cpl-7 pri fiziološkem pH kot pri Cpl-1. Z zamenjavo 5 aminokislin so neto naboj spremenili na pozitiven ter ustvarili spremenjen encim Cpl-7S, ki je kazal izboljšano bakteriolitično zmožnost proti pnevmokokom in nekaterim drugim bakterijam. S kombinacijo CBD iz Cpl-1 in EAD iz Cpl-7 so ustvarili himerolizin Cpl-711 z izboljšanimi bakteriolitičnimi značilnosti v primerjavi s starševskima endolizinoma. Z bioinženirsko metodo pa se ne trudijo le povečati bakteriolitične funkcije, pač pa tudi podaljšati njihovo življenjsko dobo v krvni plazmi. V ta namen so v posamezni monomer Cpl-1 vpeljali cisteine, ki so nato med seboj tvorili intermolekularne disulfidne vezi. Nastali Cpl-1 dimer je poleg podaljšane življenjske dobe v krvni plazmi kazal tudi dvakrat večjo aktivnost.

===Litične transglikozilaze===

Litične transglikozilaze tako kot N-acetilmuramidaze cepijo β-1,4 vez med N-acetilglukozaminom in N-acetilmuraminsko kislino, pri čemer nastane 1,6-anhidromuramoil, vendar z razliko, da za delovanje ne potrebujejo vode. Edini endolizin iz tega razreda, ki so ga uspeli kristalizirati in potrditi njegovo katalitično funkcijo je Gp144 (deluje na Pseudomonas aeruginoso). Prav tako je eden izmed redkih, ki deluje na Gramnegativne bakterije. Endolizin v raztopini obstaja v različnih oligomernih oblikah, in sicer kot mono-, di- in trimer. V cepitev vezi je vpleten Glu115, vendar rezultati več raziskav kažejo, da je vpleten tudi Glu178.

====Izboljšave====

Pri Grampozitivnih bakterijah se je izkazalo, da se ta aktivnost izgubi, saj te O-acetilirajo peptidoglikan na tisti stranski skupini, ki je vključena v nastanek 1,6-anhidromuramoila. Prav tako je bilo dokazano, da je pri tej vrsti bakterij interakcija encima s peptidoglikanom oslabljena. Delovanje na Grampozitivne bakterije, ki nimajo zaestrenih skupin, in Gramnegativne bi lahko izboljšali, če bi poznali natančne mehanizme vezave, da bi te lahko izboljšali. Pri modificiranju encima bi bilo potrebno paziti, da modifikacije ne bi vplivale na procese, ki so povezane z oligomerizacijo.

===N-acetilglukozaminidaze===

Edini strukturno znan endolizin z aktivnostjo N-acetilglukozaminidaze, ki cepi vez za N-acetilglukozaminom, je PlyC. Encim je kompleks, sestavljen iz ene velike podenote in homooktamernega obroča. Na veliki podenoti se nahajata obe do sedaj identificirani encimsko aktivni domeni: od cisteina in histidina odvisna amidohidrolazna/peptidazna domena (PlyCCHAP) in N-acetilglukozaminidazna domena (PlyCGyH). Jedro PlyCGyH sestavlja struktura iz šestih α-heliksov, podobno kot pri nekaterih proteinih družine glikozidnih hidrolaz 73 (GH73). Znotraj omenjene regije je ohranjen aminokislinski ostanek Glu78, ki pri reakciji deluje kot kislina. Pri nekaterih encimih iz družine GH73, so bili opaženi možni katalitični aminokislinski ostanki na β-traku nasproti aktivnega mesta, ki pa v primeru PlyC ne obstaja. Zaradi odsotnosti kislih ostankov je verjetno v mehanizmu pozicioniranja in cepitve vezi vključen Tyr74.

====Izboljšave====

Endolizin se je izkazal za učinkovitega, vendar izgubi svojo aktivnost že pri 45˚C, za kar je odgovorna velika podenota, vendar se da z uvedbo mutacij termično stabilnost močno povečati. Za razvoj modificiranih encimov, ki bi delovali na več vrst bakterij, bi rabili več znanih encimov, da bi lahko preučili mehanizme delovanja.

==N-acetilmuramoil-L-alanin amidaze==

N-acetilmuramoil-L-alanin amidaze cepijo amidno vez med N-acetilmuraminsko kislino in L-alaninom. V družino od cinka odvisnih amidaz 2 sodijo PlyL, PlyG, XlyA in LysGH15, ki imajo podobno strukturo in ohranjenost katalitičih ostankov. Zn-ion je koordiniran med molekulo vode, dvema histidinskima in enim cisteinskim ostankom. Pomembna ostanka sta glutamat, ki aktivira vodo za nukleofilni napad, in lizin, ki stabilizira intermediat. Znani sta dve amidazi PlyPSA in CD27L, ki spadata v skupino od cinka odvisnih amidaz 3. Endolizine te skupine sestavlja β-ploskev iz šest trakov, ki jih obdaja pet α-vijačnic. Zn-ion je koordiniran v vezavnem žepu z dvema histidinskima in enim glutamatskim ostankom. Ohranjena glutamatska ostanka med reakcijo delujeta kot akceptorja protona.

===Izboljšave===

Za namen reguliranja litične aktivnosti je možno skrajšati encim na le encimsko domeno z odstranitvijo vezavne domene, kar vodi do povečanja ali zmanjšanja aktivnosti. Učinki krajšanja endolizinov pri skupini amidaz 2 se razlikujejo, in sicer se lahko litična aktivnost ohrani ali izgubi. Z uvajanjem pozitivno nabitih aminokislin, se da aktivnost povrniti, vendar je ključno, da se te uvedejo okoli aktivnega mesta. Domnevno naj bi skupen pozitiven naboj endolizina ugodno vplival na interakcije s peptidoglikanom. Krajšanje endolizina pri amidazah 3 je imelo ponovno učinke na zmanjšanje in zvečanje aktivnosti. To kaže na nepoznavanje interakcij med encimsko in aktivno domeno pri različnih endolizinih. Boljše razumevanje strukture in delovanja endolizinov iz skupine amidaz 3 bi olajšalo modifikacije le-teh.

==Endopeptidaze==

Endopeptidaze cepijo peptidne vezi med aminokislinami, ki tvorijo polipeptidne verige in interpeptidni most. Raznolikost ostankov, ki tvorijo peptidoglikanske polipeptidne verige in interpeptidni most, kažejo na to, da gre verjetno za raznoliko skupino endolizinov z različnimi mehanizmi, ki ustrezajo različnim vezem. Ta razred endolizinov je zelo slabo razumljen - obstaja samo ena rešena struktura endolizina z endopeptidazno aktivnostjo, Ply500. Encimsko aktivna domena Ply500 za katalizo potrebuje cinkov ion, njena struktura pa spominja na kavč: ena α-vijačnica in tri antiparalelni β-trakovi tvorijo sedež, ki ga podpirata dve α-vijačnici, še ena α-vijačnica skupaj z zanko pa tvori naslonjalo.

Kot večina drugih endolizinov ima tudi Ply500 modularno strukturo, sestavljeno iz domene, ki veže celično steno in encimsko aktivno domeno. Opažena je bila jasna strukturna podobnost s peptidazami, ki spadajo v družino LAS. Njihovo skupno funkcionalno podobnost podpirata skupen vezani Zn2+ ion in aminokislinski ostanki His80, Asp87 in His133 na aktivnem mestu. Dejstvo, da je CBD Ply500 homologen CBD faga Listerie N-acetilmuramoil-1-alanin amidaze PlyPSA, ki ima popolnoma drugačen EAD, ponazarja funkcionalno spremenljivost tega razreda encimov in odpira zanimive možnosti za proteinski inženiring. Na žalost poskusi pridobivanja kristalov celotnega rekombinantnega encima Ply500 niso uspeli, verjetno zaradi prirojene prožnosti njegove arhitekture z dvema domenoma. Najdemo pa tudi variacije znotraj predlaganih katalitičnih ostankov. Cinkov ion je koordiniran z ohranjenimi ostanki His80, Asp87 in His132 in molekulo vode, pri čemer je Asp130 aktivira molekulo vode za nukleofilni napad. Drugi ključni ostanki bi lahko bili Arg50 in Gln55 za stabilizacijo oksianionskega intermediata. Poleg Ply500 pa imamo zelo omejeno mehanično razumevanje te potencialno obsežne skupine endolizinov.

===Izboljšave===

Da bi izboljšali delovanje Ply500, so v eni izmed študij kombinirali njegov CBD s PlyP35, kar je povzročilo 50-kratno povečanje afinitete vezave na celično steno (KA = 2,93 × 1010 M-1), kar omogoča visoko učinkovito imobilizacijo tarčnih celic. Pokazali so tudi, da se lahko afiniteto vezave še poveča s povečanjem kopij istega CBD-ja v enem fuzijskem konstruktu. Poleg tega povečana afiniteta do celične stene verjetno povzroči močnejšo vezavo pri visoki ionski jakosti, kar pojasnjuje opažanje, da je Ply500 endolizin z podvojenim CBD pokazal povečano aktivnost pri povišanih koncentracijah soli. V določenih primerih lahko modularni inženiring endolizinov rešuje tudi težave z topnostjo, kar zagotavlja učinkovito proizvodnjo in čiščenje sicer netopnih litičnih proteinov.

==CHAP==

Struktura encimsko aktivnih domen endolizina je odvisna od cepljene peptidoglikanske vezi. Vendar pa ima en razred encimsko aktivnih domen, cistein histidinsko odvisna domena amidohidrolaze/peptidaze (CHAP - cysteine histidine-dependent amidohydrolase/peptidase), lahko amidazno ali endopeptidazno aktivnost. CHAP domena ima lahko tudi obe aktivnosti v enem polipeptidu, kar lahko opazimo v PlyGRCS. Žal struktura tega endolizina še ni bila rešena, zato molekularni mehanizem dvojne aktivnosti ostaja neznan.
Značilnost CHAP endolizinov sta ostanka cistein in histidin, kjer stranska veriga cisteina verjetno deluje kot nukleofil, ki ga aktivira histidin. Kako so podobna endolizinska zvitja sposobna cepiti različne vezi, ni povsem jasno, vendar ima možnost vključitve dvojne aktivnosti, kot je razvidno iz PlyGRCS, v eno aktivno domeno CHAP zanimiv potencial za antibakterijsko uporabo.

==Viri==

Love, M. J., Abeysekera, G. S., Muscroft-Taylor, A. C., Billington, C. & Dobson, R. C. J. On the catalytic mechanism of bacteriophage endolysins: Opportunities for engineering. Biochimica et Biophysica Acta - Proteins and Proteomics vol. 1868 140302 (2020).

São-José, C. Engineering of phage-derived lytic enzymes: Improving their potential as antimicrobials. Antibiotics vol. 7 (2018).

Korndörfer, I. P., Kanitz, A., Danzer, J., Zimmer, M., Loessner, M. J., & Skerra, A. (2008). Structural analysis of the L-alanoyl-D-glutamate endopeptidase domain of Listeria bacteriophage endolysin Ply500 reveals a new member of the LAS peptidase family. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography, 64(6), 644–650. doi: 10.1107/s0907444908007890

Gerstmans, H., Criel, B. & Briers, Y. Synthetic biology of modular endolysins. Biotechnol. Adv. 36, 624–640 (2018).

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Fagni endolizini: mehanizem delovanja in možnosti za izboljšave

2020-05-04T18:53:12Z

Greta Junger: /* N-acetilmuramidaze */

Endolizini so pestra družina encimov, zapisanih v bakteriofagnem genomu. Izrazijo se znotraj gostiteljske celice na koncu bakteriofagnega litičnega cikla, ko razgradijo bakterijsko peptidoglikansko steno (PG). To povzroči lizo celice in sprostitev na novo ustvarjenih bakteriofagov v okolico.

Naravno antibiotično funkcijo endolizinov lahko s pridom uporabimo pri sintezi encimskih antibiotikov, ki so zaradi svojega načina delovanja hitrejši in bolj specifični od standardnih antibiotikov. Poleg tega je možnost nastanka rezistence na njih majhna, saj cepijo konservativne peptidoglikanske vezi, ki jih bakterija težje spremeni, ob tem pa jim ni potrebno niti vstopiti v celico. Čeprav so endolizini perspektivni, pa je prostora za izboljšave še veliko. S pomočjo različnih bioinženirskih modifikacij se znanstveniki trudijo optimizirati njihovo delovanje v fizioloških pogojih (npr. topnost, obstojnost v krvni plazmi, aktivnost pri fiziološkem pH, specifičnost…) Na začetku je bila eksogena uporaba endolizinov možna le na Grampozitivnih bakterijah, z leti raziskav in modifikacij pa so delovanje nekaterih uspeli razširiti tudi na Gramnegativne.

==Delitev endolizinov==

===Struktura===

Po strukturi jih delimo na enodomenske globularne, ki so bolj značilni za Gramnegativne bakterije, in dvodomenske modularne, ki se pojavijo pri obeh tipih. V modularnih je N-končna encimsko aktivna domena (EAD) s kratko, fleksibilno verigo povezana s C-končno, ki je specifična za vezavo na celično steno (CBD). Zaradi take strukture modularni endolizini predstavljajo večji potencial za bioinženirske izboljšave, saj se posamezni domeni lahko obravnava ločeno ter se ju lahko neodvisno spreminja (npr. točkovna mutacija), doda ali odstrani, s čimer nastane protein z novo ali izboljšano funkcijo. V modularnih endolizinih, ki delujejo na Gramnegativne bakterije (slednji so sicer redki), pa sta domeni zamenjani. Čeprav je CBD specifična za vezavo na PG, pa njena prisotnost za delovanje endolizina ni vedno ključna. V nekaterih primerih njihova aktivnost ob odstranitvi CBD ni nič slabša ali je celo povečana.

===Katalitska zmožnost===

Endolizini se delijo tudi glede na katalitske zmožnosti. Peptidoglikanska stena je sestavljena iz ponavljajočih se enot N-acetilglukozamina in N-acetilmuraminske kisline, ki so med sabo povezane z β-(1,4)-glikozidno vezjo. To vez cepijo N-acetilglikozidaze. Na N-acetilmuraminsko kislino je z amidno vezjo pripeta peptidna veriga iz 3-5 aminokislin, posamezne verige pa so med seboj tudi navzkrižno povezane. Amidno vez cepijo N-acetilmuramoil-L-alanin amidaze, peptidno vez med aminokislinami in posameznimi peptidnimi verigami pa endopeptidaze.

==N-acetilglikozidaze==

===N-acetilmuramidaze===

N-acetilmuramidaze, ki delujejo na Grampozitivne bakterije, spadajo v družino glikozidnih hidrolaz 25. Vez cepijo na reducirajočem koncu N-acetilmuraminske kisline po enem izmed dveh predlaganih mehanizmov. Pri prvem so za katalizo ključni trije aspartati in en glutamat. Najprej Asp deprotonira molekulo vode, ki nato kot nukleofil napade β-1,4 vez. Istočasno Glu donira svoj proton, tako da pride do inverzije anomernega centra. Preko preostalih dveh Asp se katalitsko mesto regenerira. Pri drugem mehanizmu sta ključna aminokislinska ostanka le Asp in Glu. Asp veže substrat, v katerem pride do intramolekularnega nukleofilnega napada N-acetoamidne stranske skupine na β-1,4 vez. Nato Glu deprotonira molekulo vode, ki nukleofilno napade anomerni C atom, vendar tako, da se anomerni center ohrani.

Do zdaj sta poznani le dve modularni N-acetilmuramidazi, ki delujeta v Gram negativnih bakterijah, vendar pa njun mehanizem delovanja še ni dobro pojasnjen.

====Izboljšave====
N-acetilmuramidaze imajo velik potencial za bioinženirsko izboljšavo. Dober primer sta za pnevmokoke specifična Cpl-1 in Cpl-7. Cpl-7 ima zelo aktivno EAD, vendar ima kljub temu nižjo bakteriolitično zmožnost kot Cpl-1. Razlog za to je bolj negativen neto naboj Cpl-7 pri fiziološkem pH kot pri Cpl-1. Z zamenjavo 5 aminokislin so neto naboj spremenili na pozitiven ter ustvarili spremenjen encim Cpl-7S, ki je kazal izboljšano bakteriolitično zmožnost proti pnevmokokom in nekaterim drugim bakterijam. S kombinacijo CBD iz Cpl-1 in EAD iz Cpl-7 so ustvarili himerolizin Cpl-711 z izboljšanimi bakteriolitičnimi značilnosti v primerjavi s starševskima endolizinoma. Z bioinženirsko metodo pa se ne trudijo le povečati bakteriolitične funkcije enzobiotikov, pač pa tudi podaljšati njihovo življenjsko dobo v krvni plazmi. Iz tam so namreč majhni proteini zaradi delovanja ledvic hitro izločeni. V ta namen so v posamezni monomer Cpl-1 vpeljali cisteine, ki so nato med seboj tvorili intermolekularne disulfidne vezi. Nastali Cpl-1 dimer je poleg podaljšane življenjske dobe v krvni plazmi kazal tudi dvakrat večjo specifičnost.

===Litične transglikozilaze===

Litične transglikozilaze tako kot N-acetilmuramidaze cepijo β-1,4 vez med N-acetilglukozaminom in N-acetilmuraminsko kislino, pri čemer nastane 1,6-anhidromuramoil, vendar z razliko, da za delovanje ne potrebujejo vode. Edini endolizin iz tega razreda, ki so ga uspeli kristalizirati in potrditi njegovo katalitično funkcijo je Gp144 (deluje na Pseudomonas aeruginoso). Prav tako je eden izmed redkih, ki deluje na Gramnegativne bakterije. Endolizin v raztopini obstaja v različnih oligomernih oblikah, in sicer kot mono-, di- in trimer. V cepitev vezi je vpleten Glu115, vendar rezultati več raziskav kažejo, da je vpleten tudi Glu178.

====Izboljšave====

Pri Grampozitivnih bakterijah se je izkazalo, da se ta aktivnost izgubi, saj te O-acetilirajo peptidoglikan na tisti stranski skupini, ki je vključena v nastanek 1,6-anhidromuramoila. Prav tako je bilo dokazano, da je pri tej vrsti bakterij interakcija encima s peptidoglikanom oslabljena. Delovanje na Grampozitivne bakterije, ki nimajo zaestrenih skupin, in Gramnegativne bi lahko izboljšali, če bi poznali natančne mehanizme vezave, da bi te lahko izboljšali. Pri modificiranju encima bi bilo potrebno paziti, da modifikacije ne bi vplivale na procese, ki so povezane z oligomerizacijo.

===N-acetilglukozaminidaze===

Edini strukturno znan endolizin z aktivnostjo N-acetilglukozaminidaze, ki cepi vez za N-acetilglukozaminom, je PlyC. Encim je kompleks, sestavljen iz ene velike podenote in homooktamernega obroča. Na veliki podenoti se nahajata obe do sedaj identificirani encimsko aktivni domeni: od cisteina in histidina odvisna amidohidrolazna/peptidazna domena (PlyCCHAP) in N-acetilglukozaminidazna domena (PlyCGyH). Jedro PlyCGyH sestavlja struktura iz šestih α-heliksov, podobno kot pri nekaterih proteinih družine glikozidnih hidrolaz 73 (GH73). Znotraj omenjene regije je ohranjen aminokislinski ostanek Glu78, ki pri reakciji deluje kot kislina. Pri nekaterih encimih iz družine GH73, so bili opaženi možni katalitični aminokislinski ostanki na β-traku nasproti aktivnega mesta, ki pa v primeru PlyC ne obstaja. Zaradi odsotnosti kislih ostankov je verjetno v mehanizmu pozicioniranja in cepitve vezi vključen Tyr74.

====Izboljšave====

Endolizin se je izkazal za učinkovitega, vendar izgubi svojo aktivnost že pri 45˚C, za kar je odgovorna velika podenota, vendar se da z uvedbo mutacij termično stabilnost močno povečati. Za razvoj modificiranih encimov, ki bi delovali na več vrst bakterij, bi rabili več znanih encimov, da bi lahko preučili mehanizme delovanja.

==N-acetilmuramoil-L-alanin amidaze==

N-acetilmuramoil-L-alanin amidaze cepijo amidno vez med N-acetilmuraminsko kislino in L-alaninom. V družino od cinka odvisnih amidaz 2 sodijo PlyL, PlyG, XlyA in LysGH15, ki imajo podobno strukturo in ohranjenost katalitičih ostankov. Zn-ion je koordiniran med molekulo vode, dvema histidinskima in enim cisteinskim ostankom. Pomembna ostanka sta glutamat, ki aktivira vodo za nukleofilni napad, in lizin, ki stabilizira intermediat. Znani sta dve amidazi PlyPSA in CD27L, ki spadata v skupino od cinka odvisnih amidaz 3. Endolizine te skupine sestavlja β-ploskev iz šest trakov, ki jih obdaja pet α-vijačnic. Zn-ion je koordiniran v vezavnem žepu z dvema histidinskima in enim glutamatskim ostankom. Ohranjena glutamatska ostanka med reakcijo delujeta kot akceptorja protona.

===Izboljšave===

Za namen reguliranja litične aktivnosti je možno skrajšati encim na le encimsko domeno z odstranitvijo vezavne domene, kar vodi do povečanja ali zmanjšanja aktivnosti. Učinki krajšanja endolizinov pri skupini amidaz 2 se razlikujejo, in sicer se lahko litična aktivnost ohrani ali izgubi. Z uvajanjem pozitivno nabitih aminokislin, se da aktivnost povrniti, vendar je ključno, da se te uvedejo okoli aktivnega mesta. Domnevno naj bi skupen pozitiven naboj endolizina ugodno vplival na interakcije s peptidoglikanom. Krajšanje endolizina pri amidazah 3 je imelo ponovno učinke na zmanjšanje in zvečanje aktivnosti. To kaže na nepoznavanje interakcij med encimsko in aktivno domeno pri različnih endolizinih. Boljše razumevanje strukture in delovanja endolizinov iz skupine amidaz 3 bi olajšalo modifikacije le-teh.

==Endopeptidaze==

Endopeptidaze cepijo peptidne vezi med aminokislinami, ki tvorijo polipeptidne verige in interpeptidni most. Raznolikost ostankov, ki tvorijo peptidoglikanske polipeptidne verige in interpeptidni most, kažejo na to, da gre verjetno za raznoliko skupino endolizinov z različnimi mehanizmi, ki ustrezajo različnim vezem. Ta razred endolizinov je zelo slabo razumljen - obstaja samo ena rešena struktura endolizina z endopeptidazno aktivnostjo, Ply500. Encimsko aktivna domena Ply500 za katalizo potrebuje cinkov ion, njena struktura pa spominja na kavč: ena α-vijačnica in tri antiparalelni β-trakovi tvorijo sedež, ki ga podpirata dve α-vijačnici, še ena α-vijačnica skupaj z zanko pa tvori naslonjalo.

Kot večina drugih endolizinov ima tudi Ply500 modularno strukturo, sestavljeno iz domene, ki veže celično steno in encimsko aktivno domeno. Opažena je bila jasna strukturna podobnost s peptidazami, ki spadajo v družino LAS. Njihovo skupno funkcionalno podobnost podpirata skupen vezani Zn2+ ion in aminokislinski ostanki His80, Asp87 in His133 na aktivnem mestu. Dejstvo, da je CBD Ply500 homologen CBD faga Listerie N-acetilmuramoil-1-alanin amidaze PlyPSA, ki ima popolnoma drugačen EAD, ponazarja funkcionalno spremenljivost tega razreda encimov in odpira zanimive možnosti za proteinski inženiring. Na žalost poskusi pridobivanja kristalov celotnega rekombinantnega encima Ply500 niso uspeli, verjetno zaradi prirojene prožnosti njegove arhitekture z dvema domenoma. Najdemo pa tudi variacije znotraj predlaganih katalitičnih ostankov. Cinkov ion je koordiniran z ohranjenimi ostanki His80, Asp87 in His132 in molekulo vode, pri čemer je Asp130 aktivira molekulo vode za nukleofilni napad. Drugi ključni ostanki bi lahko bili Arg50 in Gln55 za stabilizacijo oksianionskega intermediata. Poleg Ply500 pa imamo zelo omejeno mehanično razumevanje te potencialno obsežne skupine endolizinov.

===Izboljšave===

Da bi izboljšali delovanje Ply500, so v eni izmed študij kombinirali njegov CBD s PlyP35, kar je povzročilo 50-kratno povečanje afinitete vezave na celično steno (KA = 2,93 × 1010 M-1), kar omogoča visoko učinkovito imobilizacijo tarčnih celic. Pokazali so tudi, da se lahko afiniteto vezave še poveča s povečanjem kopij istega CBD-ja v enem fuzijskem konstruktu. Poleg tega povečana afiniteta do celične stene verjetno povzroči močnejšo vezavo pri visoki ionski jakosti, kar pojasnjuje opažanje, da je Ply500 endolizin z podvojenim CBD pokazal povečano aktivnost pri povišanih koncentracijah soli. V določenih primerih lahko modularni inženiring endolizinov rešuje tudi težave z topnostjo, kar zagotavlja učinkovito proizvodnjo in čiščenje sicer netopnih litičnih proteinov.

==CHAP==

Struktura encimsko aktivnih domen endolizina je odvisna od cepljene peptidoglikanske vezi. Vendar pa ima en razred encimsko aktivnih domen, cistein histidinsko odvisna domena amidohidrolaze/peptidaze (CHAP - cysteine histidine-dependent amidohydrolase/peptidase), lahko amidazno ali endopeptidazno aktivnost. CHAP domena ima lahko tudi obe aktivnosti v enem polipeptidu, kar lahko opazimo v PlyGRCS. Žal struktura tega endolizina še ni bila rešena, zato molekularni mehanizem dvojne aktivnosti ostaja neznan.
Značilnost CHAP endolizinov sta ostanka cistein in histidin, kjer stranska veriga cisteina verjetno deluje kot nukleofil, ki ga aktivira histidin. Kako so podobna endolizinska zvitja sposobna cepiti različne vezi, ni povsem jasno, vendar ima možnost vključitve dvojne aktivnosti, kot je razvidno iz PlyGRCS, v eno aktivno domeno CHAP zanimiv potencial za antibakterijsko uporabo.

==Viri==

Love, M. J., Abeysekera, G. S., Muscroft-Taylor, A. C., Billington, C. & Dobson, R. C. J. On the catalytic mechanism of bacteriophage endolysins: Opportunities for engineering. Biochimica et Biophysica Acta - Proteins and Proteomics vol. 1868 140302 (2020).

São-José, C. Engineering of phage-derived lytic enzymes: Improving their potential as antimicrobials. Antibiotics vol. 7 (2018).

Korndörfer, I. P., Kanitz, A., Danzer, J., Zimmer, M., Loessner, M. J., & Skerra, A. (2008). Structural analysis of the L-alanoyl-D-glutamate endopeptidase domain of Listeria bacteriophage endolysin Ply500 reveals a new member of the LAS peptidase family. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography, 64(6), 644–650. doi: 10.1107/s0907444908007890

Gerstmans, H., Criel, B. & Briers, Y. Synthetic biology of modular endolysins. Biotechnol. Adv. 36, 624–640 (2018).

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Fagni endolizini: mehanizem delovanja in možnosti za izboljšave

2020-05-04T18:52:52Z

Greta Junger: /* N-acetilmuramidaze */

Endolizini so pestra družina encimov, zapisanih v bakteriofagnem genomu. Izrazijo se znotraj gostiteljske celice na koncu bakteriofagnega litičnega cikla, ko razgradijo bakterijsko peptidoglikansko steno (PG). To povzroči lizo celice in sprostitev na novo ustvarjenih bakteriofagov v okolico.

Naravno antibiotično funkcijo endolizinov lahko s pridom uporabimo pri sintezi encimskih antibiotikov, ki so zaradi svojega načina delovanja hitrejši in bolj specifični od standardnih antibiotikov. Poleg tega je možnost nastanka rezistence na njih majhna, saj cepijo konservativne peptidoglikanske vezi, ki jih bakterija težje spremeni, ob tem pa jim ni potrebno niti vstopiti v celico. Čeprav so endolizini perspektivni, pa je prostora za izboljšave še veliko. S pomočjo različnih bioinženirskih modifikacij se znanstveniki trudijo optimizirati njihovo delovanje v fizioloških pogojih (npr. topnost, obstojnost v krvni plazmi, aktivnost pri fiziološkem pH, specifičnost…) Na začetku je bila eksogena uporaba endolizinov možna le na Grampozitivnih bakterijah, z leti raziskav in modifikacij pa so delovanje nekaterih uspeli razširiti tudi na Gramnegativne.

==Delitev endolizinov==

===Struktura===

Po strukturi jih delimo na enodomenske globularne, ki so bolj značilni za Gramnegativne bakterije, in dvodomenske modularne, ki se pojavijo pri obeh tipih. V modularnih je N-končna encimsko aktivna domena (EAD) s kratko, fleksibilno verigo povezana s C-končno, ki je specifična za vezavo na celično steno (CBD). Zaradi take strukture modularni endolizini predstavljajo večji potencial za bioinženirske izboljšave, saj se posamezni domeni lahko obravnava ločeno ter se ju lahko neodvisno spreminja (npr. točkovna mutacija), doda ali odstrani, s čimer nastane protein z novo ali izboljšano funkcijo. V modularnih endolizinih, ki delujejo na Gramnegativne bakterije (slednji so sicer redki), pa sta domeni zamenjani. Čeprav je CBD specifična za vezavo na PG, pa njena prisotnost za delovanje endolizina ni vedno ključna. V nekaterih primerih njihova aktivnost ob odstranitvi CBD ni nič slabša ali je celo povečana.

===Katalitska zmožnost===

Endolizini se delijo tudi glede na katalitske zmožnosti. Peptidoglikanska stena je sestavljena iz ponavljajočih se enot N-acetilglukozamina in N-acetilmuraminske kisline, ki so med sabo povezane z β-(1,4)-glikozidno vezjo. To vez cepijo N-acetilglikozidaze. Na N-acetilmuraminsko kislino je z amidno vezjo pripeta peptidna veriga iz 3-5 aminokislin, posamezne verige pa so med seboj tudi navzkrižno povezane. Amidno vez cepijo N-acetilmuramoil-L-alanin amidaze, peptidno vez med aminokislinami in posameznimi peptidnimi verigami pa endopeptidaze.

==N-acetilglikozidaze==

===N-acetilmuramidaze===

N-acetilmuramidaze, ki delujejo na Grampozitivne bakterije, spadajo v družino glikozidnih hidrolaz 25. Vez cepijo na reducirajočem koncu N-acetilmuraminske kisline po enem izmed dveh predlaganih mehanizmov. Pri prvem so za katalizo ključni trije aspartati in en glutamat. Najprej Asp deprotonira molekulo vode, ki nato kot nukleofil napade β-1,4 vez. Istočasno Glu donira svoj proton, tako da pride do inverzije anomernega centra. Preko preostalih dveh Asp se katalitsko mesto regenerira. Pri drugem mehanizmu sta ključna aminokislinska ostanka le Asp in Glu. Asp veže substrat, v katerem pride do intramolekularnega nukleofilnega napada N-acetoamidne stranske skupine na β-1,4 vez. Nato Glu deprotonira molekulo vode, ki nukleofilno napade anomerni C atom, vendar tako, da se anomerni center ohrani.
Do zdaj sta poznani le dve modularni N-acetilmuramidazi, ki delujeta v Gram negativnih bakterijah, vendar pa njun mehanizem delovanja še ni dobro pojasnjen.

====Izboljšave====
N-acetilmuramidaze imajo velik potencial za bioinženirsko izboljšavo. Dober primer sta za pnevmokoke specifična Cpl-1 in Cpl-7. Cpl-7 ima zelo aktivno EAD, vendar ima kljub temu nižjo bakteriolitično zmožnost kot Cpl-1. Razlog za to je bolj negativen neto naboj Cpl-7 pri fiziološkem pH kot pri Cpl-1. Z zamenjavo 5 aminokislin so neto naboj spremenili na pozitiven ter ustvarili spremenjen encim Cpl-7S, ki je kazal izboljšano bakteriolitično zmožnost proti pnevmokokom in nekaterim drugim bakterijam. S kombinacijo CBD iz Cpl-1 in EAD iz Cpl-7 so ustvarili himerolizin Cpl-711 z izboljšanimi bakteriolitičnimi značilnosti v primerjavi s starševskima endolizinoma. Z bioinženirsko metodo pa se ne trudijo le povečati bakteriolitične funkcije enzobiotikov, pač pa tudi podaljšati njihovo življenjsko dobo v krvni plazmi. Iz tam so namreč majhni proteini zaradi delovanja ledvic hitro izločeni. V ta namen so v posamezni monomer Cpl-1 vpeljali cisteine, ki so nato med seboj tvorili intermolekularne disulfidne vezi. Nastali Cpl-1 dimer je poleg podaljšane življenjske dobe v krvni plazmi kazal tudi dvakrat večjo specifičnost.

===Litične transglikozilaze===

Litične transglikozilaze tako kot N-acetilmuramidaze cepijo β-1,4 vez med N-acetilglukozaminom in N-acetilmuraminsko kislino, pri čemer nastane 1,6-anhidromuramoil, vendar z razliko, da za delovanje ne potrebujejo vode. Edini endolizin iz tega razreda, ki so ga uspeli kristalizirati in potrditi njegovo katalitično funkcijo je Gp144 (deluje na Pseudomonas aeruginoso). Prav tako je eden izmed redkih, ki deluje na Gramnegativne bakterije. Endolizin v raztopini obstaja v različnih oligomernih oblikah, in sicer kot mono-, di- in trimer. V cepitev vezi je vpleten Glu115, vendar rezultati več raziskav kažejo, da je vpleten tudi Glu178.

====Izboljšave====

Pri Grampozitivnih bakterijah se je izkazalo, da se ta aktivnost izgubi, saj te O-acetilirajo peptidoglikan na tisti stranski skupini, ki je vključena v nastanek 1,6-anhidromuramoila. Prav tako je bilo dokazano, da je pri tej vrsti bakterij interakcija encima s peptidoglikanom oslabljena. Delovanje na Grampozitivne bakterije, ki nimajo zaestrenih skupin, in Gramnegativne bi lahko izboljšali, če bi poznali natančne mehanizme vezave, da bi te lahko izboljšali. Pri modificiranju encima bi bilo potrebno paziti, da modifikacije ne bi vplivale na procese, ki so povezane z oligomerizacijo.

===N-acetilglukozaminidaze===

Edini strukturno znan endolizin z aktivnostjo N-acetilglukozaminidaze, ki cepi vez za N-acetilglukozaminom, je PlyC. Encim je kompleks, sestavljen iz ene velike podenote in homooktamernega obroča. Na veliki podenoti se nahajata obe do sedaj identificirani encimsko aktivni domeni: od cisteina in histidina odvisna amidohidrolazna/peptidazna domena (PlyCCHAP) in N-acetilglukozaminidazna domena (PlyCGyH). Jedro PlyCGyH sestavlja struktura iz šestih α-heliksov, podobno kot pri nekaterih proteinih družine glikozidnih hidrolaz 73 (GH73). Znotraj omenjene regije je ohranjen aminokislinski ostanek Glu78, ki pri reakciji deluje kot kislina. Pri nekaterih encimih iz družine GH73, so bili opaženi možni katalitični aminokislinski ostanki na β-traku nasproti aktivnega mesta, ki pa v primeru PlyC ne obstaja. Zaradi odsotnosti kislih ostankov je verjetno v mehanizmu pozicioniranja in cepitve vezi vključen Tyr74.

====Izboljšave====

Endolizin se je izkazal za učinkovitega, vendar izgubi svojo aktivnost že pri 45˚C, za kar je odgovorna velika podenota, vendar se da z uvedbo mutacij termično stabilnost močno povečati. Za razvoj modificiranih encimov, ki bi delovali na več vrst bakterij, bi rabili več znanih encimov, da bi lahko preučili mehanizme delovanja.

==N-acetilmuramoil-L-alanin amidaze==

N-acetilmuramoil-L-alanin amidaze cepijo amidno vez med N-acetilmuraminsko kislino in L-alaninom. V družino od cinka odvisnih amidaz 2 sodijo PlyL, PlyG, XlyA in LysGH15, ki imajo podobno strukturo in ohranjenost katalitičih ostankov. Zn-ion je koordiniran med molekulo vode, dvema histidinskima in enim cisteinskim ostankom. Pomembna ostanka sta glutamat, ki aktivira vodo za nukleofilni napad, in lizin, ki stabilizira intermediat. Znani sta dve amidazi PlyPSA in CD27L, ki spadata v skupino od cinka odvisnih amidaz 3. Endolizine te skupine sestavlja β-ploskev iz šest trakov, ki jih obdaja pet α-vijačnic. Zn-ion je koordiniran v vezavnem žepu z dvema histidinskima in enim glutamatskim ostankom. Ohranjena glutamatska ostanka med reakcijo delujeta kot akceptorja protona.

===Izboljšave===

Za namen reguliranja litične aktivnosti je možno skrajšati encim na le encimsko domeno z odstranitvijo vezavne domene, kar vodi do povečanja ali zmanjšanja aktivnosti. Učinki krajšanja endolizinov pri skupini amidaz 2 se razlikujejo, in sicer se lahko litična aktivnost ohrani ali izgubi. Z uvajanjem pozitivno nabitih aminokislin, se da aktivnost povrniti, vendar je ključno, da se te uvedejo okoli aktivnega mesta. Domnevno naj bi skupen pozitiven naboj endolizina ugodno vplival na interakcije s peptidoglikanom. Krajšanje endolizina pri amidazah 3 je imelo ponovno učinke na zmanjšanje in zvečanje aktivnosti. To kaže na nepoznavanje interakcij med encimsko in aktivno domeno pri različnih endolizinih. Boljše razumevanje strukture in delovanja endolizinov iz skupine amidaz 3 bi olajšalo modifikacije le-teh.

==Endopeptidaze==

Endopeptidaze cepijo peptidne vezi med aminokislinami, ki tvorijo polipeptidne verige in interpeptidni most. Raznolikost ostankov, ki tvorijo peptidoglikanske polipeptidne verige in interpeptidni most, kažejo na to, da gre verjetno za raznoliko skupino endolizinov z različnimi mehanizmi, ki ustrezajo različnim vezem. Ta razred endolizinov je zelo slabo razumljen - obstaja samo ena rešena struktura endolizina z endopeptidazno aktivnostjo, Ply500. Encimsko aktivna domena Ply500 za katalizo potrebuje cinkov ion, njena struktura pa spominja na kavč: ena α-vijačnica in tri antiparalelni β-trakovi tvorijo sedež, ki ga podpirata dve α-vijačnici, še ena α-vijačnica skupaj z zanko pa tvori naslonjalo.

Kot večina drugih endolizinov ima tudi Ply500 modularno strukturo, sestavljeno iz domene, ki veže celično steno in encimsko aktivno domeno. Opažena je bila jasna strukturna podobnost s peptidazami, ki spadajo v družino LAS. Njihovo skupno funkcionalno podobnost podpirata skupen vezani Zn2+ ion in aminokislinski ostanki His80, Asp87 in His133 na aktivnem mestu. Dejstvo, da je CBD Ply500 homologen CBD faga Listerie N-acetilmuramoil-1-alanin amidaze PlyPSA, ki ima popolnoma drugačen EAD, ponazarja funkcionalno spremenljivost tega razreda encimov in odpira zanimive možnosti za proteinski inženiring. Na žalost poskusi pridobivanja kristalov celotnega rekombinantnega encima Ply500 niso uspeli, verjetno zaradi prirojene prožnosti njegove arhitekture z dvema domenoma. Najdemo pa tudi variacije znotraj predlaganih katalitičnih ostankov. Cinkov ion je koordiniran z ohranjenimi ostanki His80, Asp87 in His132 in molekulo vode, pri čemer je Asp130 aktivira molekulo vode za nukleofilni napad. Drugi ključni ostanki bi lahko bili Arg50 in Gln55 za stabilizacijo oksianionskega intermediata. Poleg Ply500 pa imamo zelo omejeno mehanično razumevanje te potencialno obsežne skupine endolizinov.

===Izboljšave===

Da bi izboljšali delovanje Ply500, so v eni izmed študij kombinirali njegov CBD s PlyP35, kar je povzročilo 50-kratno povečanje afinitete vezave na celično steno (KA = 2,93 × 1010 M-1), kar omogoča visoko učinkovito imobilizacijo tarčnih celic. Pokazali so tudi, da se lahko afiniteto vezave še poveča s povečanjem kopij istega CBD-ja v enem fuzijskem konstruktu. Poleg tega povečana afiniteta do celične stene verjetno povzroči močnejšo vezavo pri visoki ionski jakosti, kar pojasnjuje opažanje, da je Ply500 endolizin z podvojenim CBD pokazal povečano aktivnost pri povišanih koncentracijah soli. V določenih primerih lahko modularni inženiring endolizinov rešuje tudi težave z topnostjo, kar zagotavlja učinkovito proizvodnjo in čiščenje sicer netopnih litičnih proteinov.

==CHAP==

Struktura encimsko aktivnih domen endolizina je odvisna od cepljene peptidoglikanske vezi. Vendar pa ima en razred encimsko aktivnih domen, cistein histidinsko odvisna domena amidohidrolaze/peptidaze (CHAP - cysteine histidine-dependent amidohydrolase/peptidase), lahko amidazno ali endopeptidazno aktivnost. CHAP domena ima lahko tudi obe aktivnosti v enem polipeptidu, kar lahko opazimo v PlyGRCS. Žal struktura tega endolizina še ni bila rešena, zato molekularni mehanizem dvojne aktivnosti ostaja neznan.
Značilnost CHAP endolizinov sta ostanka cistein in histidin, kjer stranska veriga cisteina verjetno deluje kot nukleofil, ki ga aktivira histidin. Kako so podobna endolizinska zvitja sposobna cepiti različne vezi, ni povsem jasno, vendar ima možnost vključitve dvojne aktivnosti, kot je razvidno iz PlyGRCS, v eno aktivno domeno CHAP zanimiv potencial za antibakterijsko uporabo.

==Viri==

Love, M. J., Abeysekera, G. S., Muscroft-Taylor, A. C., Billington, C. & Dobson, R. C. J. On the catalytic mechanism of bacteriophage endolysins: Opportunities for engineering. Biochimica et Biophysica Acta - Proteins and Proteomics vol. 1868 140302 (2020).

São-José, C. Engineering of phage-derived lytic enzymes: Improving their potential as antimicrobials. Antibiotics vol. 7 (2018).

Korndörfer, I. P., Kanitz, A., Danzer, J., Zimmer, M., Loessner, M. J., & Skerra, A. (2008). Structural analysis of the L-alanoyl-D-glutamate endopeptidase domain of Listeria bacteriophage endolysin Ply500 reveals a new member of the LAS peptidase family. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography, 64(6), 644–650. doi: 10.1107/s0907444908007890

Gerstmans, H., Criel, B. & Briers, Y. Synthetic biology of modular endolysins. Biotechnol. Adv. 36, 624–640 (2018).

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Fagni endolizini: mehanizem delovanja in možnosti za izboljšave

2020-05-04T18:37:40Z

Greta Junger: /* N-acetilglukozaminidaze */

Endolizini so pestra družina encimov, zapisanih v bakteriofagnem genomu. Izrazijo se znotraj gostiteljske celice na koncu bakteriofagnega litičnega cikla, ko razgradijo bakterijsko peptidoglikansko steno (PG). To povzroči lizo celice in sprostitev na novo ustvarjenih bakteriofagov v okolico.

Naravno antibiotično funkcijo endolizinov lahko s pridom uporabimo pri sintezi encimskih antibiotikov, ki so zaradi svojega načina delovanja hitrejši in bolj specifični od standardnih antibiotikov. Poleg tega je možnost nastanka rezistence na njih majhna, saj cepijo konservativne peptidoglikanske vezi, ki jih bakterija težje spremeni, ob tem pa jim ni potrebno niti vstopiti v celico. Čeprav so endolizini perspektivni, pa je prostora za izboljšave še veliko. S pomočjo različnih bioinženirskih modifikacij se znanstveniki trudijo optimizirati njihovo delovanje v fizioloških pogojih (npr. topnost, obstojnost v krvni plazmi, aktivnost pri fiziološkem pH, specifičnost…) Na začetku je bila eksogena uporaba endolizinov možna le na Grampozitivnih bakterijah, z leti raziskav in modifikacij pa so delovanje nekaterih uspeli razširiti tudi na Gramnegativne.

==Delitev endolizinov==

===Struktura===

Po strukturi jih delimo na enodomenske globularne, ki so bolj značilni za Gramnegativne bakterije, in dvodomenske modularne, ki se pojavijo pri obeh tipih. V modularnih je N-končna encimsko aktivna domena (EAD) s kratko, fleksibilno verigo povezana s C-končno, ki je specifična za vezavo na celično steno (CBD). Zaradi take strukture modularni endolizini predstavljajo večji potencial za bioinženirske izboljšave, saj se posamezni domeni lahko obravnava ločeno ter se ju lahko neodvisno spreminja (npr. točkovna mutacija), doda ali odstrani, s čimer nastane protein z novo ali izboljšano funkcijo. V modularnih endolizinih, ki delujejo na Gramnegativne bakterije (slednji so sicer redki), pa sta domeni zamenjani. Čeprav je CBD specifična za vezavo na PG, pa njena prisotnost za delovanje endolizina ni vedno ključna. V nekaterih primerih njihova aktivnost ob odstranitvi CBD ni nič slabša ali je celo povečana.

===Katalitska zmožnost===

Endolizini se delijo tudi glede na katalitske zmožnosti. Peptidoglikanska stena je sestavljena iz ponavljajočih se enot N-acetilglukozamina in N-acetilmuraminske kisline, ki so med sabo povezane z β-(1,4)-glikozidno vezjo. To vez cepijo N-acetilglikozidaze. Na N-acetilmuraminsko kislino je z amidno vezjo pripeta peptidna veriga iz 3-5 aminokislin, posamezne verige pa so med seboj tudi navzkrižno povezane. Amidno vez cepijo N-acetilmuramoil-L-alanin amidaze, peptidno vez med aminokislinami in posameznimi peptidnimi verigami pa endopeptidaze.

==N-acetilglikozidaze==

===N-acetilmuramidaze===

N-acetilmuramidaze, ki delujejo na Grampozitivne bakterije, spadajo v družino glikozidnih hidrolaz 25. Vez cepijo na reducirajočem koncu N-acetilmuraminske kisline po enem izmed dveh predlaganih mehanizmov. Pri prvem so za katalizo ključni trije aspartati in en glutamat. Najprej Asp deprotonira molekulo vode, ki nato kot nukleofil napade β-1,4 vez. Istočasno Glu donira svoj proton, tako da pride do inverzije anomernega centra. Preko preostalih dveh Asp se katalitsko mesto regenerira. Pri drugem mehanizmu sta ključna aminokislinska ostanka le Asp in Glu. Asp veže substrat, v katerem pride do intramolekularnega nukleofilnega napada N-acetoamidne stranske skupine na β-1,4 vez. Nato Glu deprotonira molekulo vode, ki nukleofilno napade anomerni C atom, vendar tako, da se anomerni center ohrani.

====Izboljšave====
N-acetilmuramidaze imajo velik potencial za bioinženirsko izboljšavo. Dober primer sta za pnevmokoke specifična Cpl-1 in Cpl-7. Cpl-7 ima zelo aktivno EAD, vendar ima kljub temu nižjo bakteriolitično zmožnost kot Cpl-1. Razlog za to je bolj negativen neto naboj Cpl-7 pri fiziološkem pH kot pri Cpl-1. Z zamenjavo 5 aminokislin so neto naboj spremenili na pozitiven ter ustvarili spremenjen encim Cpl-7S, ki je kazal izboljšano bakteriolitično zmožnost proti pnevmokokom in nekaterim drugim bakterijam. S kombinacijo CBD iz Cpl-1 in EAD iz Cpl-7 so ustvarili himerolizin Cpl-711 z izboljšanimi bakteriolitičnimi značilnosti v primerjavi s starševskima endolizinoma. Z bioinženirsko metodo pa se ne trudijo le povečati bakteriolitične funkcije enzobiotikov, pač pa tudi podaljšati njihovo življenjsko dobo v krvni plazmi. Iz tam so namreč majhni proteini zaradi delovanja ledvic hitro izločeni. V ta namen so v posamezni monomer Cpl-1 vpeljali cisteine, ki so nato med seboj tvorili intermolekularne disulfidne vezi. Nastali Cpl-1 dimer je poleg podaljšane življenjske dobe v krvni plazmi kazal tudi dvakrat večjo specifičnost.

===Litične transglikozilaze===

Litične transglikozilaze tako kot N-acetilmuramidaze cepijo β-1,4 vez med N-acetilglukozaminom in N-acetilmuraminsko kislino, pri čemer nastane 1,6-anhidromuramoil, vendar z razliko, da za delovanje ne potrebujejo vode. Edini endolizin iz tega razreda, ki so ga uspeli kristalizirati in potrditi njegovo katalitično funkcijo je Gp144 (deluje na Pseudomonas aeruginoso). Prav tako je eden izmed redkih, ki deluje na Gramnegativne bakterije. Endolizin v raztopini obstaja v različnih oligomernih oblikah, in sicer kot mono-, di- in trimer. V cepitev vezi je vpleten Glu115, vendar rezultati več raziskav kažejo, da je vpleten tudi Glu178.

====Izboljšave====

Pri Grampozitivnih bakterijah se je izkazalo, da se ta aktivnost izgubi, saj te O-acetilirajo peptidoglikan na tisti stranski skupini, ki je vključena v nastanek 1,6-anhidromuramoila. Prav tako je bilo dokazano, da je pri tej vrsti bakterij interakcija encima s peptidoglikanom oslabljena. Delovanje na Grampozitivne bakterije, ki nimajo zaestrenih skupin, in Gramnegativne bi lahko izboljšali, če bi poznali natančne mehanizme vezave, da bi te lahko izboljšali. Pri modificiranju encima bi bilo potrebno paziti, da modifikacije ne bi vplivale na procese, ki so povezane z oligomerizacijo.

===N-acetilglukozaminidaze===

Edini strukturno znan endolizin z aktivnostjo N-acetilglukozaminidaze, ki cepi vez za N-acetilglukozaminom, je PlyC. Encim je kompleks, sestavljen iz ene velike podenote in homooktamernega obroča. Na veliki podenoti se nahajata obe do sedaj identificirani encimsko aktivni domeni: od cisteina in histidina odvisna amidohidrolazna/peptidazna domena (PlyCCHAP) in N-acetilglukozaminidazna domena (PlyCGyH). Jedro PlyCGyH sestavlja struktura iz šestih α-heliksov, podobno kot pri nekaterih proteinih družine glikozidnih hidrolaz 73 (GH73). Znotraj omenjene regije je ohranjen aminokislinski ostanek Glu78, ki pri reakciji deluje kot kislina. Pri nekaterih encimih iz družine GH73, so bili opaženi možni katalitični aminokislinski ostanki na β-traku nasproti aktivnega mesta, ki pa v primeru PlyC ne obstaja. Zaradi odsotnosti kislih ostankov je verjetno v mehanizmu pozicioniranja in cepitve vezi vključen Tyr74.

====Izboljšave====

Endolizin se je izkazal za učinkovitega, vendar izgubi svojo aktivnost že pri 45˚C, za kar je odgovorna velika podenota, vendar se da z uvedbo mutacij termično stabilnost močno povečati. Za razvoj modificiranih encimov, ki bi delovali na več vrst bakterij, bi rabili več znanih encimov, da bi lahko preučili mehanizme delovanja.

==N-acetilmuramoil-L-alanin amidaze==

N-acetilmuramoil-L-alanin amidaze cepijo amidno vez med N-acetilmuraminsko kislino in L-alaninom. V družino od cinka odvisnih amidaz 2 sodijo PlyL, PlyG, XlyA in LysGH15, ki imajo podobno strukturo in ohranjenost katalitičih ostankov. Zn-ion je koordiniran med molekulo vode, dvema histidinskima in enim cisteinskim ostankom. Pomembna ostanka sta glutamat, ki aktivira vodo za nukleofilni napad, in lizin, ki stabilizira intermediat. Znani sta dve amidazi PlyPSA in CD27L, ki spadata v skupino od cinka odvisnih amidaz 3. Endolizine te skupine sestavlja β-ploskev iz šest trakov, ki jih obdaja pet α-vijačnic. Zn-ion je koordiniran v vezavnem žepu z dvema histidinskima in enim glutamatskim ostankom. Ohranjena glutamatska ostanka med reakcijo delujeta kot akceptorja protona.

===Izboljšave===

Za namen reguliranja litične aktivnosti je možno skrajšati encim na le encimsko domeno z odstranitvijo vezavne domene, kar vodi do povečanja ali zmanjšanja aktivnosti. Učinki krajšanja endolizinov pri skupini amidaz 2 se razlikujejo, in sicer se lahko litična aktivnost ohrani ali izgubi. Z uvajanjem pozitivno nabitih aminokislin, se da aktivnost povrniti, vendar je ključno, da se te uvedejo okoli aktivnega mesta. Domnevno naj bi skupen pozitiven naboj endolizina ugodno vplival na interakcije s peptidoglikanom. Krajšanje endolizina pri amidazah 3 je imelo ponovno učinke na zmanjšanje in zvečanje aktivnosti. To kaže na nepoznavanje interakcij med encimsko in aktivno domeno pri različnih endolizinih. Boljše razumevanje strukture in delovanja endolizinov iz skupine amidaz 3 bi olajšalo modifikacije le-teh.

==Endopeptidaze==

Endopeptidaze cepijo peptidne vezi med aminokislinami, ki tvorijo polipeptidne verige in interpeptidni most. Raznolikost ostankov, ki tvorijo peptidoglikanske polipeptidne verige in interpeptidni most, kažejo na to, da gre verjetno za raznoliko skupino endolizinov z različnimi mehanizmi, ki ustrezajo različnim vezem. Ta razred endolizinov je zelo slabo razumljen - obstaja samo ena rešena struktura endolizina z endopeptidazno aktivnostjo, Ply500. Encimsko aktivna domena Ply500 za katalizo potrebuje cinkov ion, njena struktura pa spominja na kavč: ena α-vijačnica in tri antiparalelni β-trakovi tvorijo sedež, ki ga podpirata dve α-vijačnici, še ena α-vijačnica skupaj z zanko pa tvori naslonjalo.

Kot večina drugih endolizinov ima tudi Ply500 modularno strukturo, sestavljeno iz domene, ki veže celično steno in encimsko aktivno domeno. Opažena je bila jasna strukturna podobnost s peptidazami, ki spadajo v družino LAS. Njihovo skupno funkcionalno podobnost podpirata skupen vezani Zn2+ ion in aminokislinski ostanki His80, Asp87 in His133 na aktivnem mestu. Dejstvo, da je CBD Ply500 homologen CBD faga Listerie N-acetilmuramoil-1-alanin amidaze PlyPSA, ki ima popolnoma drugačen EAD, ponazarja funkcionalno spremenljivost tega razreda encimov in odpira zanimive možnosti za proteinski inženiring. Na žalost poskusi pridobivanja kristalov celotnega rekombinantnega encima Ply500 niso uspeli, verjetno zaradi prirojene prožnosti njegove arhitekture z dvema domenoma. Najdemo pa tudi variacije znotraj predlaganih katalitičnih ostankov. Cinkov ion je koordiniran z ohranjenimi ostanki His80, Asp87 in His132 in molekulo vode, pri čemer je Asp130 aktivira molekulo vode za nukleofilni napad. Drugi ključni ostanki bi lahko bili Arg50 in Gln55 za stabilizacijo oksianionskega intermediata. Poleg Ply500 pa imamo zelo omejeno mehanično razumevanje te potencialno obsežne skupine endolizinov.

===Izboljšave===

Da bi izboljšali delovanje Ply500, so v eni izmed študij kombinirali njegov CBD s PlyP35, kar je povzročilo 50-kratno povečanje afinitete vezave na celično steno (KA = 2,93 × 1010 M-1), kar omogoča visoko učinkovito imobilizacijo tarčnih celic. Pokazali so tudi, da se lahko afiniteto vezave še poveča s povečanjem kopij istega CBD-ja v enem fuzijskem konstruktu. Poleg tega povečana afiniteta do celične stene verjetno povzroči močnejšo vezavo pri visoki ionski jakosti, kar pojasnjuje opažanje, da je Ply500 endolizin z podvojenim CBD pokazal povečano aktivnost pri povišanih koncentracijah soli. V določenih primerih lahko modularni inženiring endolizinov rešuje tudi težave z topnostjo, kar zagotavlja učinkovito proizvodnjo in čiščenje sicer netopnih litičnih proteinov.

==CHAP==

Struktura encimsko aktivnih domen endolizina je odvisna od cepljene peptidoglikanske vezi. Vendar pa ima en razred encimsko aktivnih domen, cistein histidinsko odvisna domena amidohidrolaze/peptidaze (CHAP - cysteine histidine-dependent amidohydrolase/peptidase), lahko amidazno ali endopeptidazno aktivnost. CHAP domena ima lahko tudi obe aktivnosti v enem polipeptidu, kar lahko opazimo v PlyGRCS. Žal struktura tega endolizina še ni bila rešena, zato molekularni mehanizem dvojne aktivnosti ostaja neznan.
Značilnost CHAP endolizinov sta ostanka cistein in histidin, kjer stranska veriga cisteina verjetno deluje kot nukleofil, ki ga aktivira histidin. Kako so podobna endolizinska zvitja sposobna cepiti različne vezi, ni povsem jasno, vendar ima možnost vključitve dvojne aktivnosti, kot je razvidno iz PlyGRCS, v eno aktivno domeno CHAP zanimiv potencial za antibakterijsko uporabo.

==Viri==

Love, M. J., Abeysekera, G. S., Muscroft-Taylor, A. C., Billington, C. & Dobson, R. C. J. On the catalytic mechanism of bacteriophage endolysins: Opportunities for engineering. Biochimica et Biophysica Acta - Proteins and Proteomics vol. 1868 140302 (2020).

São-José, C. Engineering of phage-derived lytic enzymes: Improving their potential as antimicrobials. Antibiotics vol. 7 (2018).

Korndörfer, I. P., Kanitz, A., Danzer, J., Zimmer, M., Loessner, M. J., & Skerra, A. (2008). Structural analysis of the L-alanoyl-D-glutamate endopeptidase domain of Listeria bacteriophage endolysin Ply500 reveals a new member of the LAS peptidase family. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography, 64(6), 644–650. doi: 10.1107/s0907444908007890

Gerstmans, H., Criel, B. & Briers, Y. Synthetic biology of modular endolysins. Biotechnol. Adv. 36, 624–640 (2018).

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Fagni endolizini: mehanizem delovanja in možnosti za izboljšave

2020-05-04T18:33:58Z

Greta Junger: /* Litične transglikozilaze */

Endolizini so pestra družina encimov, zapisanih v bakteriofagnem genomu. Izrazijo se znotraj gostiteljske celice na koncu bakteriofagnega litičnega cikla, ko razgradijo bakterijsko peptidoglikansko steno (PG). To povzroči lizo celice in sprostitev na novo ustvarjenih bakteriofagov v okolico.

Naravno antibiotično funkcijo endolizinov lahko s pridom uporabimo pri sintezi encimskih antibiotikov, ki so zaradi svojega načina delovanja hitrejši in bolj specifični od standardnih antibiotikov. Poleg tega je možnost nastanka rezistence na njih majhna, saj cepijo konservativne peptidoglikanske vezi, ki jih bakterija težje spremeni, ob tem pa jim ni potrebno niti vstopiti v celico. Čeprav so endolizini perspektivni, pa je prostora za izboljšave še veliko. S pomočjo različnih bioinženirskih modifikacij se znanstveniki trudijo optimizirati njihovo delovanje v fizioloških pogojih (npr. topnost, obstojnost v krvni plazmi, aktivnost pri fiziološkem pH, specifičnost…) Na začetku je bila eksogena uporaba endolizinov možna le na Grampozitivnih bakterijah, z leti raziskav in modifikacij pa so delovanje nekaterih uspeli razširiti tudi na Gramnegativne.

==Delitev endolizinov==

===Struktura===

Po strukturi jih delimo na enodomenske globularne, ki so bolj značilni za Gramnegativne bakterije, in dvodomenske modularne, ki se pojavijo pri obeh tipih. V modularnih je N-končna encimsko aktivna domena (EAD) s kratko, fleksibilno verigo povezana s C-končno, ki je specifična za vezavo na celično steno (CBD). Zaradi take strukture modularni endolizini predstavljajo večji potencial za bioinženirske izboljšave, saj se posamezni domeni lahko obravnava ločeno ter se ju lahko neodvisno spreminja (npr. točkovna mutacija), doda ali odstrani, s čimer nastane protein z novo ali izboljšano funkcijo. V modularnih endolizinih, ki delujejo na Gramnegativne bakterije (slednji so sicer redki), pa sta domeni zamenjani. Čeprav je CBD specifična za vezavo na PG, pa njena prisotnost za delovanje endolizina ni vedno ključna. V nekaterih primerih njihova aktivnost ob odstranitvi CBD ni nič slabša ali je celo povečana.

===Katalitska zmožnost===

Endolizini se delijo tudi glede na katalitske zmožnosti. Peptidoglikanska stena je sestavljena iz ponavljajočih se enot N-acetilglukozamina in N-acetilmuraminske kisline, ki so med sabo povezane z β-(1,4)-glikozidno vezjo. To vez cepijo N-acetilglikozidaze. Na N-acetilmuraminsko kislino je z amidno vezjo pripeta peptidna veriga iz 3-5 aminokislin, posamezne verige pa so med seboj tudi navzkrižno povezane. Amidno vez cepijo N-acetilmuramoil-L-alanin amidaze, peptidno vez med aminokislinami in posameznimi peptidnimi verigami pa endopeptidaze.

==N-acetilglikozidaze==

===N-acetilmuramidaze===

N-acetilmuramidaze, ki delujejo na Grampozitivne bakterije, spadajo v družino glikozidnih hidrolaz 25. Vez cepijo na reducirajočem koncu N-acetilmuraminske kisline po enem izmed dveh predlaganih mehanizmov. Pri prvem so za katalizo ključni trije aspartati in en glutamat. Najprej Asp deprotonira molekulo vode, ki nato kot nukleofil napade β-1,4 vez. Istočasno Glu donira svoj proton, tako da pride do inverzije anomernega centra. Preko preostalih dveh Asp se katalitsko mesto regenerira. Pri drugem mehanizmu sta ključna aminokislinska ostanka le Asp in Glu. Asp veže substrat, v katerem pride do intramolekularnega nukleofilnega napada N-acetoamidne stranske skupine na β-1,4 vez. Nato Glu deprotonira molekulo vode, ki nukleofilno napade anomerni C atom, vendar tako, da se anomerni center ohrani.

====Izboljšave====
N-acetilmuramidaze imajo velik potencial za bioinženirsko izboljšavo. Dober primer sta za pnevmokoke specifična Cpl-1 in Cpl-7. Cpl-7 ima zelo aktivno EAD, vendar ima kljub temu nižjo bakteriolitično zmožnost kot Cpl-1. Razlog za to je bolj negativen neto naboj Cpl-7 pri fiziološkem pH kot pri Cpl-1. Z zamenjavo 5 aminokislin so neto naboj spremenili na pozitiven ter ustvarili spremenjen encim Cpl-7S, ki je kazal izboljšano bakteriolitično zmožnost proti pnevmokokom in nekaterim drugim bakterijam. S kombinacijo CBD iz Cpl-1 in EAD iz Cpl-7 so ustvarili himerolizin Cpl-711 z izboljšanimi bakteriolitičnimi značilnosti v primerjavi s starševskima endolizinoma. Z bioinženirsko metodo pa se ne trudijo le povečati bakteriolitične funkcije enzobiotikov, pač pa tudi podaljšati njihovo življenjsko dobo v krvni plazmi. Iz tam so namreč majhni proteini zaradi delovanja ledvic hitro izločeni. V ta namen so v posamezni monomer Cpl-1 vpeljali cisteine, ki so nato med seboj tvorili intermolekularne disulfidne vezi. Nastali Cpl-1 dimer je poleg podaljšane življenjske dobe v krvni plazmi kazal tudi dvakrat večjo specifičnost.

===Litične transglikozilaze===

Litične transglikozilaze tako kot N-acetilmuramidaze cepijo β-1,4 vez med N-acetilglukozaminom in N-acetilmuraminsko kislino, pri čemer nastane 1,6-anhidromuramoil, vendar z razliko, da za delovanje ne potrebujejo vode. Edini endolizin iz tega razreda, ki so ga uspeli kristalizirati in potrditi njegovo katalitično funkcijo je Gp144 (deluje na Pseudomonas aeruginoso). Prav tako je eden izmed redkih, ki deluje na Gramnegativne bakterije. Endolizin v raztopini obstaja v različnih oligomernih oblikah, in sicer kot mono-, di- in trimer. V cepitev vezi je vpleten Glu115, vendar rezultati več raziskav kažejo, da je vpleten tudi Glu178.

====Izboljšave====

Pri Grampozitivnih bakterijah se je izkazalo, da se ta aktivnost izgubi, saj te O-acetilirajo peptidoglikan na tisti stranski skupini, ki je vključena v nastanek 1,6-anhidromuramoila. Prav tako je bilo dokazano, da je pri tej vrsti bakterij interakcija encima s peptidoglikanom oslabljena. Delovanje na Grampozitivne bakterije, ki nimajo zaestrenih skupin, in Gramnegativne bi lahko izboljšali, če bi poznali natančne mehanizme vezave, da bi te lahko izboljšali. Pri modificiranju encima bi bilo potrebno paziti, da modifikacije ne bi vplivale na procese, ki so povezane z oligomerizacijo.

===N-acetilglukozaminidaze===

Edini strukturno znan endolizin z aktivnostjo N-acetilglukozaminidaze, ki cepi vez za N-acetilglukozaminom je PlyC. Encim je kompleks, sestavljen iz ene velike podenote in homooktamernega obroča. Na veliki podenoti se nahajata obe do sedaj identificirani encimsko aktivni domeni: od cisteina in histidina odvisna amidohidrolazna/peptidazna domena (PlyCCHAP) in N-acetilglukozaminidazna domena (PlyCGyH). Jedro PlyCGyH sestavlja struktura iz šestih α-heliksov, podobno kot pri nekaterih proteinih družine glikozidnih hidrolaz 73 (GH73). Znotraj omenjene regije je ohranjen aminokislinski ostanek Glu78, ki pri reakciji deluje kot kislina. Pri nekaterih encimih iz družine GH73, so bili opaženi možni katalitični aminokislinski ostanki na β-traku nasproti aktivnega mesta, ki pa v primeru PlyC ne obstaja. Zaradi odsotnosti kislih ostankov je verjetno v mehanizmu pozicioniranja in cepitve vezi vključen Tyr74.

====Izboljšave====

Endolizin se je izkazal za učinkovitega, vendar izgubi svojo aktivnost že pri 45˚C, za kar je odgovorna velika podenota, vendar se da z uvedbo mutacij termično stabilnost močno povečati. Za razvoj modificiranih encimov, ki bi delovali na več vrst bakterij, bi rabili več znanih encimov, da bi lahko preučili mehanizme delovanja.

==N-acetilmuramoil-L-alanin amidaze==

N-acetilmuramoil-L-alanin amidaze cepijo amidno vez med N-acetilmuraminsko kislino in L-alaninom. V družino od cinka odvisnih amidaz 2 sodijo PlyL, PlyG, XlyA in LysGH15, ki imajo podobno strukturo in ohranjenost katalitičih ostankov. Zn-ion je koordiniran med molekulo vode, dvema histidinskima in enim cisteinskim ostankom. Pomembna ostanka sta glutamat, ki aktivira vodo za nukleofilni napad, in lizin, ki stabilizira intermediat. Znani sta dve amidazi PlyPSA in CD27L, ki spadata v skupino od cinka odvisnih amidaz 3. Endolizine te skupine sestavlja β-ploskev iz šest trakov, ki jih obdaja pet α-vijačnic. Zn-ion je koordiniran v vezavnem žepu z dvema histidinskima in enim glutamatskim ostankom. Ohranjena glutamatska ostanka med reakcijo delujeta kot akceptorja protona.

===Izboljšave===

Za namen reguliranja litične aktivnosti je možno skrajšati encim na le encimsko domeno z odstranitvijo vezavne domene, kar vodi do povečanja ali zmanjšanja aktivnosti. Učinki krajšanja endolizinov pri skupini amidaz 2 se razlikujejo, in sicer se lahko litična aktivnost ohrani ali izgubi. Z uvajanjem pozitivno nabitih aminokislin, se da aktivnost povrniti, vendar je ključno, da se te uvedejo okoli aktivnega mesta. Domnevno naj bi skupen pozitiven naboj endolizina ugodno vplival na interakcije s peptidoglikanom. Krajšanje endolizina pri amidazah 3 je imelo ponovno učinke na zmanjšanje in zvečanje aktivnosti. To kaže na nepoznavanje interakcij med encimsko in aktivno domeno pri različnih endolizinih. Boljše razumevanje strukture in delovanja endolizinov iz skupine amidaz 3 bi olajšalo modifikacije le-teh.

==Endopeptidaze==

Endopeptidaze cepijo peptidne vezi med aminokislinami, ki tvorijo polipeptidne verige in interpeptidni most. Raznolikost ostankov, ki tvorijo peptidoglikanske polipeptidne verige in interpeptidni most, kažejo na to, da gre verjetno za raznoliko skupino endolizinov z različnimi mehanizmi, ki ustrezajo različnim vezem. Ta razred endolizinov je zelo slabo razumljen - obstaja samo ena rešena struktura endolizina z endopeptidazno aktivnostjo, Ply500. Encimsko aktivna domena Ply500 za katalizo potrebuje cinkov ion, njena struktura pa spominja na kavč: ena α-vijačnica in tri antiparalelni β-trakovi tvorijo sedež, ki ga podpirata dve α-vijačnici, še ena α-vijačnica skupaj z zanko pa tvori naslonjalo.

Kot večina drugih endolizinov ima tudi Ply500 modularno strukturo, sestavljeno iz domene, ki veže celično steno in encimsko aktivno domeno. Opažena je bila jasna strukturna podobnost s peptidazami, ki spadajo v družino LAS. Njihovo skupno funkcionalno podobnost podpirata skupen vezani Zn2+ ion in aminokislinski ostanki His80, Asp87 in His133 na aktivnem mestu. Dejstvo, da je CBD Ply500 homologen CBD faga Listerie N-acetilmuramoil-1-alanin amidaze PlyPSA, ki ima popolnoma drugačen EAD, ponazarja funkcionalno spremenljivost tega razreda encimov in odpira zanimive možnosti za proteinski inženiring. Na žalost poskusi pridobivanja kristalov celotnega rekombinantnega encima Ply500 niso uspeli, verjetno zaradi prirojene prožnosti njegove arhitekture z dvema domenoma. Najdemo pa tudi variacije znotraj predlaganih katalitičnih ostankov. Cinkov ion je koordiniran z ohranjenimi ostanki His80, Asp87 in His132 in molekulo vode, pri čemer je Asp130 aktivira molekulo vode za nukleofilni napad. Drugi ključni ostanki bi lahko bili Arg50 in Gln55 za stabilizacijo oksianionskega intermediata. Poleg Ply500 pa imamo zelo omejeno mehanično razumevanje te potencialno obsežne skupine endolizinov.

===Izboljšave===

Da bi izboljšali delovanje Ply500, so v eni izmed študij kombinirali njegov CBD s PlyP35, kar je povzročilo 50-kratno povečanje afinitete vezave na celično steno (KA = 2,93 × 1010 M-1), kar omogoča visoko učinkovito imobilizacijo tarčnih celic. Pokazali so tudi, da se lahko afiniteto vezave še poveča s povečanjem kopij istega CBD-ja v enem fuzijskem konstruktu. Poleg tega povečana afiniteta do celične stene verjetno povzroči močnejšo vezavo pri visoki ionski jakosti, kar pojasnjuje opažanje, da je Ply500 endolizin z podvojenim CBD pokazal povečano aktivnost pri povišanih koncentracijah soli. V določenih primerih lahko modularni inženiring endolizinov rešuje tudi težave z topnostjo, kar zagotavlja učinkovito proizvodnjo in čiščenje sicer netopnih litičnih proteinov.

==CHAP==

Struktura encimsko aktivnih domen endolizina je odvisna od cepljene peptidoglikanske vezi. Vendar pa ima en razred encimsko aktivnih domen, cistein histidinsko odvisna domena amidohidrolaze/peptidaze (CHAP - cysteine histidine-dependent amidohydrolase/peptidase), lahko amidazno ali endopeptidazno aktivnost. CHAP domena ima lahko tudi obe aktivnosti v enem polipeptidu, kar lahko opazimo v PlyGRCS. Žal struktura tega endolizina še ni bila rešena, zato molekularni mehanizem dvojne aktivnosti ostaja neznan.
Značilnost CHAP endolizinov sta ostanka cistein in histidin, kjer stranska veriga cisteina verjetno deluje kot nukleofil, ki ga aktivira histidin. Kako so podobna endolizinska zvitja sposobna cepiti različne vezi, ni povsem jasno, vendar ima možnost vključitve dvojne aktivnosti, kot je razvidno iz PlyGRCS, v eno aktivno domeno CHAP zanimiv potencial za antibakterijsko uporabo.

==Viri==

Love, M. J., Abeysekera, G. S., Muscroft-Taylor, A. C., Billington, C. & Dobson, R. C. J. On the catalytic mechanism of bacteriophage endolysins: Opportunities for engineering. Biochimica et Biophysica Acta - Proteins and Proteomics vol. 1868 140302 (2020).

São-José, C. Engineering of phage-derived lytic enzymes: Improving their potential as antimicrobials. Antibiotics vol. 7 (2018).

Korndörfer, I. P., Kanitz, A., Danzer, J., Zimmer, M., Loessner, M. J., & Skerra, A. (2008). Structural analysis of the L-alanoyl-D-glutamate endopeptidase domain of Listeria bacteriophage endolysin Ply500 reveals a new member of the LAS peptidase family. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography, 64(6), 644–650. doi: 10.1107/s0907444908007890

Gerstmans, H., Criel, B. & Briers, Y. Synthetic biology of modular endolysins. Biotechnol. Adv. 36, 624–640 (2018).

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Fagni endolizini: mehanizem delovanja in možnosti za izboljšave

2020-05-04T18:33:32Z

Greta Junger: /* Izboljšave */

Endolizini so pestra družina encimov, zapisanih v bakteriofagnem genomu. Izrazijo se znotraj gostiteljske celice na koncu bakteriofagnega litičnega cikla, ko razgradijo bakterijsko peptidoglikansko steno (PG). To povzroči lizo celice in sprostitev na novo ustvarjenih bakteriofagov v okolico.

Naravno antibiotično funkcijo endolizinov lahko s pridom uporabimo pri sintezi encimskih antibiotikov, ki so zaradi svojega načina delovanja hitrejši in bolj specifični od standardnih antibiotikov. Poleg tega je možnost nastanka rezistence na njih majhna, saj cepijo konservativne peptidoglikanske vezi, ki jih bakterija težje spremeni, ob tem pa jim ni potrebno niti vstopiti v celico. Čeprav so endolizini perspektivni, pa je prostora za izboljšave še veliko. S pomočjo različnih bioinženirskih modifikacij se znanstveniki trudijo optimizirati njihovo delovanje v fizioloških pogojih (npr. topnost, obstojnost v krvni plazmi, aktivnost pri fiziološkem pH, specifičnost…) Na začetku je bila eksogena uporaba endolizinov možna le na Grampozitivnih bakterijah, z leti raziskav in modifikacij pa so delovanje nekaterih uspeli razširiti tudi na Gramnegativne.

==Delitev endolizinov==

===Struktura===

Po strukturi jih delimo na enodomenske globularne, ki so bolj značilni za Gramnegativne bakterije, in dvodomenske modularne, ki se pojavijo pri obeh tipih. V modularnih je N-končna encimsko aktivna domena (EAD) s kratko, fleksibilno verigo povezana s C-končno, ki je specifična za vezavo na celično steno (CBD). Zaradi take strukture modularni endolizini predstavljajo večji potencial za bioinženirske izboljšave, saj se posamezni domeni lahko obravnava ločeno ter se ju lahko neodvisno spreminja (npr. točkovna mutacija), doda ali odstrani, s čimer nastane protein z novo ali izboljšano funkcijo. V modularnih endolizinih, ki delujejo na Gramnegativne bakterije (slednji so sicer redki), pa sta domeni zamenjani. Čeprav je CBD specifična za vezavo na PG, pa njena prisotnost za delovanje endolizina ni vedno ključna. V nekaterih primerih njihova aktivnost ob odstranitvi CBD ni nič slabša ali je celo povečana.

===Katalitska zmožnost===

Endolizini se delijo tudi glede na katalitske zmožnosti. Peptidoglikanska stena je sestavljena iz ponavljajočih se enot N-acetilglukozamina in N-acetilmuraminske kisline, ki so med sabo povezane z β-(1,4)-glikozidno vezjo. To vez cepijo N-acetilglikozidaze. Na N-acetilmuraminsko kislino je z amidno vezjo pripeta peptidna veriga iz 3-5 aminokislin, posamezne verige pa so med seboj tudi navzkrižno povezane. Amidno vez cepijo N-acetilmuramoil-L-alanin amidaze, peptidno vez med aminokislinami in posameznimi peptidnimi verigami pa endopeptidaze.

==N-acetilglikozidaze==

===N-acetilmuramidaze===

N-acetilmuramidaze, ki delujejo na Grampozitivne bakterije, spadajo v družino glikozidnih hidrolaz 25. Vez cepijo na reducirajočem koncu N-acetilmuraminske kisline po enem izmed dveh predlaganih mehanizmov. Pri prvem so za katalizo ključni trije aspartati in en glutamat. Najprej Asp deprotonira molekulo vode, ki nato kot nukleofil napade β-1,4 vez. Istočasno Glu donira svoj proton, tako da pride do inverzije anomernega centra. Preko preostalih dveh Asp se katalitsko mesto regenerira. Pri drugem mehanizmu sta ključna aminokislinska ostanka le Asp in Glu. Asp veže substrat, v katerem pride do intramolekularnega nukleofilnega napada N-acetoamidne stranske skupine na β-1,4 vez. Nato Glu deprotonira molekulo vode, ki nukleofilno napade anomerni C atom, vendar tako, da se anomerni center ohrani.

====Izboljšave====
N-acetilmuramidaze imajo velik potencial za bioinženirsko izboljšavo. Dober primer sta za pnevmokoke specifična Cpl-1 in Cpl-7. Cpl-7 ima zelo aktivno EAD, vendar ima kljub temu nižjo bakteriolitično zmožnost kot Cpl-1. Razlog za to je bolj negativen neto naboj Cpl-7 pri fiziološkem pH kot pri Cpl-1. Z zamenjavo 5 aminokislin so neto naboj spremenili na pozitiven ter ustvarili spremenjen encim Cpl-7S, ki je kazal izboljšano bakteriolitično zmožnost proti pnevmokokom in nekaterim drugim bakterijam. S kombinacijo CBD iz Cpl-1 in EAD iz Cpl-7 so ustvarili himerolizin Cpl-711 z izboljšanimi bakteriolitičnimi značilnosti v primerjavi s starševskima endolizinoma. Z bioinženirsko metodo pa se ne trudijo le povečati bakteriolitične funkcije enzobiotikov, pač pa tudi podaljšati njihovo življenjsko dobo v krvni plazmi. Iz tam so namreč majhni proteini zaradi delovanja ledvic hitro izločeni. V ta namen so v posamezni monomer Cpl-1 vpeljali cisteine, ki so nato med seboj tvorili intermolekularne disulfidne vezi. Nastali Cpl-1 dimer je poleg podaljšane življenjske dobe v krvni plazmi kazal tudi dvakrat večjo specifičnost.

===Litične transglikozilaze===

Litične transglikozilaze tako kot N-acetilmuramidaze cepijo β-1,4 vez med N-acetilglukozaminom in N-acetilmuraminsko kislino, pri čemer nastane 1,6-anhidromuramoil, vendar z razliko, da za delovanje ne potrebujejo vode. Edini endolizin iz tega razreda, ki so ga uspeli kristalizirati in potrditi njegovo katalitično funkcijo je Gp144 (deluje na Pseudomonas aeruginoso). Prav tako je eden izmed redkih, ki deluje na Gram negativne bakterije. Endolizin v raztopini obstaja v različnih oligomernih oblikah, in sicer kot mono-, di- in trimer. V cepitev vezi je vpleten Glu115, vendar rezultati več raziskav kažejo, da je vpleten tudi Glu178.

====Izboljšave====

Pri Grampozitivnih bakterijah se je izkazalo, da se ta aktivnost izgubi, saj te O-acetilirajo peptidoglikan na tisti stranski skupini, ki je vključena v nastanek 1,6-anhidromuramoila. Prav tako je bilo dokazano, da je pri tej vrsti bakterij interakcija encima s peptidoglikanom oslabljena. Delovanje na Grampozitivne bakterije, ki nimajo zaestrenih skupin, in Gramnegativne bi lahko izboljšali, če bi poznali natančne mehanizme vezave, da bi te lahko izboljšali. Pri modificiranju encima bi bilo potrebno paziti, da modifikacije ne bi vplivale na procese, ki so povezane z oligomerizacijo.

===N-acetilglukozaminidaze===

Edini strukturno znan endolizin z aktivnostjo N-acetilglukozaminidaze, ki cepi vez za N-acetilglukozaminom je PlyC. Encim je kompleks, sestavljen iz ene velike podenote in homooktamernega obroča. Na veliki podenoti se nahajata obe do sedaj identificirani encimsko aktivni domeni: od cisteina in histidina odvisna amidohidrolazna/peptidazna domena (PlyCCHAP) in N-acetilglukozaminidazna domena (PlyCGyH). Jedro PlyCGyH sestavlja struktura iz šestih α-heliksov, podobno kot pri nekaterih proteinih družine glikozidnih hidrolaz 73 (GH73). Znotraj omenjene regije je ohranjen aminokislinski ostanek Glu78, ki pri reakciji deluje kot kislina. Pri nekaterih encimih iz družine GH73, so bili opaženi možni katalitični aminokislinski ostanki na β-traku nasproti aktivnega mesta, ki pa v primeru PlyC ne obstaja. Zaradi odsotnosti kislih ostankov je verjetno v mehanizmu pozicioniranja in cepitve vezi vključen Tyr74.

====Izboljšave====

Endolizin se je izkazal za učinkovitega, vendar izgubi svojo aktivnost že pri 45˚C, za kar je odgovorna velika podenota, vendar se da z uvedbo mutacij termično stabilnost močno povečati. Za razvoj modificiranih encimov, ki bi delovali na več vrst bakterij, bi rabili več znanih encimov, da bi lahko preučili mehanizme delovanja.

==N-acetilmuramoil-L-alanin amidaze==

N-acetilmuramoil-L-alanin amidaze cepijo amidno vez med N-acetilmuraminsko kislino in L-alaninom. V družino od cinka odvisnih amidaz 2 sodijo PlyL, PlyG, XlyA in LysGH15, ki imajo podobno strukturo in ohranjenost katalitičih ostankov. Zn-ion je koordiniran med molekulo vode, dvema histidinskima in enim cisteinskim ostankom. Pomembna ostanka sta glutamat, ki aktivira vodo za nukleofilni napad, in lizin, ki stabilizira intermediat. Znani sta dve amidazi PlyPSA in CD27L, ki spadata v skupino od cinka odvisnih amidaz 3. Endolizine te skupine sestavlja β-ploskev iz šest trakov, ki jih obdaja pet α-vijačnic. Zn-ion je koordiniran v vezavnem žepu z dvema histidinskima in enim glutamatskim ostankom. Ohranjena glutamatska ostanka med reakcijo delujeta kot akceptorja protona.

===Izboljšave===

Za namen reguliranja litične aktivnosti je možno skrajšati encim na le encimsko domeno z odstranitvijo vezavne domene, kar vodi do povečanja ali zmanjšanja aktivnosti. Učinki krajšanja endolizinov pri skupini amidaz 2 se razlikujejo, in sicer se lahko litična aktivnost ohrani ali izgubi. Z uvajanjem pozitivno nabitih aminokislin, se da aktivnost povrniti, vendar je ključno, da se te uvedejo okoli aktivnega mesta. Domnevno naj bi skupen pozitiven naboj endolizina ugodno vplival na interakcije s peptidoglikanom. Krajšanje endolizina pri amidazah 3 je imelo ponovno učinke na zmanjšanje in zvečanje aktivnosti. To kaže na nepoznavanje interakcij med encimsko in aktivno domeno pri različnih endolizinih. Boljše razumevanje strukture in delovanja endolizinov iz skupine amidaz 3 bi olajšalo modifikacije le-teh.

==Endopeptidaze==

Endopeptidaze cepijo peptidne vezi med aminokislinami, ki tvorijo polipeptidne verige in interpeptidni most. Raznolikost ostankov, ki tvorijo peptidoglikanske polipeptidne verige in interpeptidni most, kažejo na to, da gre verjetno za raznoliko skupino endolizinov z različnimi mehanizmi, ki ustrezajo različnim vezem. Ta razred endolizinov je zelo slabo razumljen - obstaja samo ena rešena struktura endolizina z endopeptidazno aktivnostjo, Ply500. Encimsko aktivna domena Ply500 za katalizo potrebuje cinkov ion, njena struktura pa spominja na kavč: ena α-vijačnica in tri antiparalelni β-trakovi tvorijo sedež, ki ga podpirata dve α-vijačnici, še ena α-vijačnica skupaj z zanko pa tvori naslonjalo.

Kot večina drugih endolizinov ima tudi Ply500 modularno strukturo, sestavljeno iz domene, ki veže celično steno in encimsko aktivno domeno. Opažena je bila jasna strukturna podobnost s peptidazami, ki spadajo v družino LAS. Njihovo skupno funkcionalno podobnost podpirata skupen vezani Zn2+ ion in aminokislinski ostanki His80, Asp87 in His133 na aktivnem mestu. Dejstvo, da je CBD Ply500 homologen CBD faga Listerie N-acetilmuramoil-1-alanin amidaze PlyPSA, ki ima popolnoma drugačen EAD, ponazarja funkcionalno spremenljivost tega razreda encimov in odpira zanimive možnosti za proteinski inženiring. Na žalost poskusi pridobivanja kristalov celotnega rekombinantnega encima Ply500 niso uspeli, verjetno zaradi prirojene prožnosti njegove arhitekture z dvema domenoma. Najdemo pa tudi variacije znotraj predlaganih katalitičnih ostankov. Cinkov ion je koordiniran z ohranjenimi ostanki His80, Asp87 in His132 in molekulo vode, pri čemer je Asp130 aktivira molekulo vode za nukleofilni napad. Drugi ključni ostanki bi lahko bili Arg50 in Gln55 za stabilizacijo oksianionskega intermediata. Poleg Ply500 pa imamo zelo omejeno mehanično razumevanje te potencialno obsežne skupine endolizinov.

===Izboljšave===

Da bi izboljšali delovanje Ply500, so v eni izmed študij kombinirali njegov CBD s PlyP35, kar je povzročilo 50-kratno povečanje afinitete vezave na celično steno (KA = 2,93 × 1010 M-1), kar omogoča visoko učinkovito imobilizacijo tarčnih celic. Pokazali so tudi, da se lahko afiniteto vezave še poveča s povečanjem kopij istega CBD-ja v enem fuzijskem konstruktu. Poleg tega povečana afiniteta do celične stene verjetno povzroči močnejšo vezavo pri visoki ionski jakosti, kar pojasnjuje opažanje, da je Ply500 endolizin z podvojenim CBD pokazal povečano aktivnost pri povišanih koncentracijah soli. V določenih primerih lahko modularni inženiring endolizinov rešuje tudi težave z topnostjo, kar zagotavlja učinkovito proizvodnjo in čiščenje sicer netopnih litičnih proteinov.

==CHAP==

Struktura encimsko aktivnih domen endolizina je odvisna od cepljene peptidoglikanske vezi. Vendar pa ima en razred encimsko aktivnih domen, cistein histidinsko odvisna domena amidohidrolaze/peptidaze (CHAP - cysteine histidine-dependent amidohydrolase/peptidase), lahko amidazno ali endopeptidazno aktivnost. CHAP domena ima lahko tudi obe aktivnosti v enem polipeptidu, kar lahko opazimo v PlyGRCS. Žal struktura tega endolizina še ni bila rešena, zato molekularni mehanizem dvojne aktivnosti ostaja neznan.
Značilnost CHAP endolizinov sta ostanka cistein in histidin, kjer stranska veriga cisteina verjetno deluje kot nukleofil, ki ga aktivira histidin. Kako so podobna endolizinska zvitja sposobna cepiti različne vezi, ni povsem jasno, vendar ima možnost vključitve dvojne aktivnosti, kot je razvidno iz PlyGRCS, v eno aktivno domeno CHAP zanimiv potencial za antibakterijsko uporabo.

==Viri==

Love, M. J., Abeysekera, G. S., Muscroft-Taylor, A. C., Billington, C. & Dobson, R. C. J. On the catalytic mechanism of bacteriophage endolysins: Opportunities for engineering. Biochimica et Biophysica Acta - Proteins and Proteomics vol. 1868 140302 (2020).

São-José, C. Engineering of phage-derived lytic enzymes: Improving their potential as antimicrobials. Antibiotics vol. 7 (2018).

Korndörfer, I. P., Kanitz, A., Danzer, J., Zimmer, M., Loessner, M. J., & Skerra, A. (2008). Structural analysis of the L-alanoyl-D-glutamate endopeptidase domain of Listeria bacteriophage endolysin Ply500 reveals a new member of the LAS peptidase family. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography, 64(6), 644–650. doi: 10.1107/s0907444908007890

Gerstmans, H., Criel, B. & Briers, Y. Synthetic biology of modular endolysins. Biotechnol. Adv. 36, 624–640 (2018).

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Fagni endolizini: mehanizem delovanja in možnosti za izboljšave

2020-05-04T18:31:28Z

Greta Junger: /* Katalitska zmožnost */

Endolizini so pestra družina encimov, zapisanih v bakteriofagnem genomu. Izrazijo se znotraj gostiteljske celice na koncu bakteriofagnega litičnega cikla, ko razgradijo bakterijsko peptidoglikansko steno (PG). To povzroči lizo celice in sprostitev na novo ustvarjenih bakteriofagov v okolico.

Naravno antibiotično funkcijo endolizinov lahko s pridom uporabimo pri sintezi encimskih antibiotikov, ki so zaradi svojega načina delovanja hitrejši in bolj specifični od standardnih antibiotikov. Poleg tega je možnost nastanka rezistence na njih majhna, saj cepijo konservativne peptidoglikanske vezi, ki jih bakterija težje spremeni, ob tem pa jim ni potrebno niti vstopiti v celico. Čeprav so endolizini perspektivni, pa je prostora za izboljšave še veliko. S pomočjo različnih bioinženirskih modifikacij se znanstveniki trudijo optimizirati njihovo delovanje v fizioloških pogojih (npr. topnost, obstojnost v krvni plazmi, aktivnost pri fiziološkem pH, specifičnost…) Na začetku je bila eksogena uporaba endolizinov možna le na Grampozitivnih bakterijah, z leti raziskav in modifikacij pa so delovanje nekaterih uspeli razširiti tudi na Gramnegativne.

==Delitev endolizinov==

===Struktura===

Po strukturi jih delimo na enodomenske globularne, ki so bolj značilni za Gramnegativne bakterije, in dvodomenske modularne, ki se pojavijo pri obeh tipih. V modularnih je N-končna encimsko aktivna domena (EAD) s kratko, fleksibilno verigo povezana s C-končno, ki je specifična za vezavo na celično steno (CBD). Zaradi take strukture modularni endolizini predstavljajo večji potencial za bioinženirske izboljšave, saj se posamezni domeni lahko obravnava ločeno ter se ju lahko neodvisno spreminja (npr. točkovna mutacija), doda ali odstrani, s čimer nastane protein z novo ali izboljšano funkcijo. V modularnih endolizinih, ki delujejo na Gramnegativne bakterije (slednji so sicer redki), pa sta domeni zamenjani. Čeprav je CBD specifična za vezavo na PG, pa njena prisotnost za delovanje endolizina ni vedno ključna. V nekaterih primerih njihova aktivnost ob odstranitvi CBD ni nič slabša ali je celo povečana.

===Katalitska zmožnost===

Endolizini se delijo tudi glede na katalitske zmožnosti. Peptidoglikanska stena je sestavljena iz ponavljajočih se enot N-acetilglukozamina in N-acetilmuraminske kisline, ki so med sabo povezane z β-(1,4)-glikozidno vezjo. To vez cepijo N-acetilglikozidaze. Na N-acetilmuraminsko kislino je z amidno vezjo pripeta peptidna veriga iz 3-5 aminokislin, posamezne verige pa so med seboj tudi navzkrižno povezane. Amidno vez cepijo N-acetilmuramoil-L-alanin amidaze, peptidno vez med aminokislinami in posameznimi peptidnimi verigami pa endopeptidaze.

==N-acetilglikozidaze==

===N-acetilmuramidaze===

N-acetilmuramidaze, ki delujejo na Grampozitivne bakterije, spadajo v družino glikozidnih hidrolaz 25. Vez cepijo na reducirajočem koncu N-acetilmuraminske kisline po enem izmed dveh predlaganih mehanizmov. Pri prvem so za katalizo ključni trije aspartati in en glutamat. Najprej Asp deprotonira molekulo vode, ki nato kot nukleofil napade β-1,4 vez. Istočasno Glu donira svoj proton, tako da pride do inverzije anomernega centra. Preko preostalih dveh Asp se katalitsko mesto regenerira. Pri drugem mehanizmu sta ključna aminokislinska ostanka le Asp in Glu. Asp veže substrat, v katerem pride do intramolekularnega nukleofilnega napada N-acetoamidne stranske skupine na β-1,4 vez. Nato Glu deprotonira molekulo vode, ki nukleofilno napade anomerni C atom, vendar tako, da se anomerni center ohrani.

====Izboljšave====
N-acetilmuramidaze imajo velik potencial za bioinženirsko izboljšavo. Dober primer sta za pnevmokoke specifična Cpl-1 in Cpl-7. Cpl-7 ima zelo aktivno EAD, vendar ima kljub temu nižjo bakteriolitično zmožnost kot Cpl-1. Razlog za to je bolj negativen neto naboj Cpl-7 pri fiziološkem pH kot pri Cpl-1. Z zamenjavo 5 aminokislin so neto naboj spremenili na pozitiven ter ustvarili spremenjen encim Cpl-7S, ki je kazal izboljšano bakteriolitično zmožnost proti pnevmokokom in nekaterim drugim bakterijam. S kombinacijo CBD iz Cpl-1 in EAD iz Cpl-7 so ustvarili himerolizin Cpl-711 z izboljšanimi bakteriolitičnimi značilnosti v primerjavi s starševskima endolizinoma. Z bioinženirsko metodo pa se ne trudijo le povečati bakteriolitične funkcije enzobiotikov, pač pa tudi podaljšati njihovo življenjsko dobo v krvni plazmi. Iz tam so namreč majhni proteini zaradi delovanja ledvic hitro izločeni. V ta namen so v posamezni monomer Cpl-1 vpeljali cisteine, ki so nato med seboj tvorili intermolekularne disulfidne vezi. Nastali Cpl-1 dimer je poleg podaljšane življenjske dobe v krvni plazmi kazal tudi dvakrat večjo specifičnost.

===Litične transglikozilaze===

Litične transglikozilaze tako kot N-acetilmuramidaze cepijo β-1,4 vez med N-acetilglukozaminom in N-acetilmuraminsko kislino, pri čemer nastane 1,6-anhidromuramoil, vendar z razliko, da za delovanje ne potrebujejo vode. Edini endolizin iz tega razreda, ki so ga uspeli kristalizirati in potrditi njegovo katalitično funkcijo je Gp144 (deluje na Pseudomonas aeruginoso). Prav tako je eden izmed redkih, ki deluje na Gram negativne bakterije. Endolizin v raztopini obstaja v različnih oligomernih oblikah, in sicer kot mono-, di- in trimer. V cepitev vezi je vpleten Glu115, vendar rezultati več raziskav kažejo, da je vpleten tudi Glu178.

====Izboljšave====

Pri Gram pozitivnih bakterijah se je izkazalo, da se ta aktivnost izgubi, saj te O-acetilirajo peptidoglikan na tisti stranski skupini, ki je vključena v nastanek 1,6-anhidromuramoila. Prav tako je bilo dokazano, da je pri tej vrsti bakterij interakcija encima s peptidoglikanom oslabljena. Delovanje na Gram pozitivne bakterije, ki nimajo zaestrenih skupin, in Gram negativne bi lahko izboljšali, če bi poznali natančne mehanizme vezave, da bi te lahko izboljšali. Pri modificiranju encima bi bilo potrebno paziti, da modifikacije ne bi vplivale na procese, ki so povezane z oligomerizacijo.

===N-acetilglukozaminidaze===

Edini strukturno znan endolizin z aktivnostjo N-acetilglukozaminidaze, ki cepi vez za N-acetilglukozaminom je PlyC. Encim je kompleks, sestavljen iz ene velike podenote in homooktamernega obroča. Na veliki podenoti se nahajata obe do sedaj identificirani encimsko aktivni domeni: od cisteina in histidina odvisna amidohidrolazna/peptidazna domena (PlyCCHAP) in N-acetilglukozaminidazna domena (PlyCGyH). Jedro PlyCGyH sestavlja struktura iz šestih α-heliksov, podobno kot pri nekaterih proteinih družine glikozidnih hidrolaz 73 (GH73). Znotraj omenjene regije je ohranjen aminokislinski ostanek Glu78, ki pri reakciji deluje kot kislina. Pri nekaterih encimih iz družine GH73, so bili opaženi možni katalitični aminokislinski ostanki na β-traku nasproti aktivnega mesta, ki pa v primeru PlyC ne obstaja. Zaradi odsotnosti kislih ostankov je verjetno v mehanizmu pozicioniranja in cepitve vezi vključen Tyr74.

====Izboljšave====

Endolizin se je izkazal za učinkovitega, vendar izgubi svojo aktivnost že pri 45˚C, za kar je odgovorna velika podenota, vendar se da z uvedbo mutacij termično stabilnost močno povečati. Za razvoj modificiranih encimov, ki bi delovali na več vrst bakterij, bi rabili več znanih encimov, da bi lahko preučili mehanizme delovanja.

==N-acetilmuramoil-L-alanin amidaze==

N-acetilmuramoil-L-alanin amidaze cepijo amidno vez med N-acetilmuraminsko kislino in L-alaninom. V družino od cinka odvisnih amidaz 2 sodijo PlyL, PlyG, XlyA in LysGH15, ki imajo podobno strukturo in ohranjenost katalitičih ostankov. Zn-ion je koordiniran med molekulo vode, dvema histidinskima in enim cisteinskim ostankom. Pomembna ostanka sta glutamat, ki aktivira vodo za nukleofilni napad, in lizin, ki stabilizira intermediat. Poznani sta dve amidazi PlyPSA in CD27L, ki spadata v skupino od cinka odvisnih amidaz 3. Endolizine te skupine sestavlja β-ploskev iz šest trakov, ki jih obdaja pet α-vijačnic. Zn-ion je koordiniran v vezavnem žepu z dvema histidinskima in enim glutamatskim ostankom. Ohranjena glutamatska ostanka med reakcijo delujeta kot akceptorja protona.

===Izboljšave===

Za namen reguliranja litične aktivnosti je možno skrajšati encim na le encimsko domeno z odstranitvijo vezavne domene, kar vodi do povečanja ali zmanjšanja aktivnosti. Učinki krajšanja endolizinov pri skupini amidaz 2 se razlikujejo, in sicer se lahko litična aktivnost ohrani ali izgubi. Z uvajanjem pozitivno nabitih aminokislin, se da aktivnost povrniti, vendar je ključno, da se te uvedejo okoli aktivnega mesta. Domnevno naj bi skupen pozitiven naboj endolizina ugodno vplival na interakcije s peptidoglikanom. Krajšanje endolizina pri amidazah 3 je imelo ponovno učinke na zmanjšanje in zvečanje aktivnosti. To kaže na nepoznavanje interakcij med encimsko in aktivno domeno pri različnih endolizinih. Boljše razumevanje strukture in delovanja endolizinov iz skupine amidaz 3 bi olajšalo modifikacije le-teh.

==Endopeptidaze==

Endopeptidaze cepijo peptidne vezi med aminokislinami, ki tvorijo polipeptidne verige in interpeptidni most. Raznolikost ostankov, ki tvorijo peptidoglikanske polipeptidne verige in interpeptidni most, kažejo na to, da gre verjetno za raznoliko skupino endolizinov z različnimi mehanizmi, ki ustrezajo različnim vezem. Ta razred endolizinov je zelo slabo razumljen - obstaja samo ena rešena struktura endolizina z endopeptidazno aktivnostjo, Ply500. Encimsko aktivna domena Ply500 za katalizo potrebuje cinkov ion, njena struktura pa spominja na kavč: ena α-vijačnica in tri antiparalelni β-trakovi tvorijo sedež, ki ga podpirata dve α-vijačnici, še ena α-vijačnica skupaj z zanko pa tvori naslonjalo.

Kot večina drugih endolizinov ima tudi Ply500 modularno strukturo, sestavljeno iz domene, ki veže celično steno in encimsko aktivno domeno. Opažena je bila jasna strukturna podobnost s peptidazami, ki spadajo v družino LAS. Njihovo skupno funkcionalno podobnost podpirata skupen vezani Zn2+ ion in aminokislinski ostanki His80, Asp87 in His133 na aktivnem mestu. Dejstvo, da je CBD Ply500 homologen CBD faga Listerie N-acetilmuramoil-1-alanin amidaze PlyPSA, ki ima popolnoma drugačen EAD, ponazarja funkcionalno spremenljivost tega razreda encimov in odpira zanimive možnosti za proteinski inženiring. Na žalost poskusi pridobivanja kristalov celotnega rekombinantnega encima Ply500 niso uspeli, verjetno zaradi prirojene prožnosti njegove arhitekture z dvema domenoma. Najdemo pa tudi variacije znotraj predlaganih katalitičnih ostankov. Cinkov ion je koordiniran z ohranjenimi ostanki His80, Asp87 in His132 in molekulo vode, pri čemer je Asp130 aktivira molekulo vode za nukleofilni napad. Drugi ključni ostanki bi lahko bili Arg50 in Gln55 za stabilizacijo oksianionskega intermediata. Poleg Ply500 pa imamo zelo omejeno mehanično razumevanje te potencialno obsežne skupine endolizinov.

===Izboljšave===

Da bi izboljšali delovanje Ply500, so v eni izmed študij kombinirali njegov CBD s PlyP35, kar je povzročilo 50-kratno povečanje afinitete vezave na celično steno (KA = 2,93 × 1010 M-1), kar omogoča visoko učinkovito imobilizacijo tarčnih celic. Pokazali so tudi, da se lahko afiniteto vezave še poveča s povečanjem kopij istega CBD-ja v enem fuzijskem konstruktu. Poleg tega povečana afiniteta do celične stene verjetno povzroči močnejšo vezavo pri visoki ionski jakosti, kar pojasnjuje opažanje, da je Ply500 endolizin z podvojenim CBD pokazal povečano aktivnost pri povišanih koncentracijah soli. V določenih primerih lahko modularni inženiring endolizinov rešuje tudi težave z topnostjo, kar zagotavlja učinkovito proizvodnjo in čiščenje sicer netopnih litičnih proteinov.

==CHAP==

Struktura encimsko aktivnih domen endolizina je odvisna od cepljene peptidoglikanske vezi. Vendar pa ima en razred encimsko aktivnih domen, cistein histidinsko odvisna domena amidohidrolaze/peptidaze (CHAP - cysteine histidine-dependent amidohydrolase/peptidase), lahko amidazno ali endopeptidazno aktivnost. CHAP domena ima lahko tudi obe aktivnosti v enem polipeptidu, kar lahko opazimo v PlyGRCS. Žal struktura tega endolizina še ni bila rešena, zato molekularni mehanizem dvojne aktivnosti ostaja neznan.
Značilnost CHAP endolizinov sta ostanka cistein in histidin, kjer stranska veriga cisteina verjetno deluje kot nukleofil, ki ga aktivira histidin. Kako so podobna endolizinska zvitja sposobna cepiti različne vezi, ni povsem jasno, vendar ima možnost vključitve dvojne aktivnosti, kot je razvidno iz PlyGRCS, v eno aktivno domeno CHAP zanimiv potencial za antibakterijsko uporabo.

==Viri==

Love, M. J., Abeysekera, G. S., Muscroft-Taylor, A. C., Billington, C. & Dobson, R. C. J. On the catalytic mechanism of bacteriophage endolysins: Opportunities for engineering. Biochimica et Biophysica Acta - Proteins and Proteomics vol. 1868 140302 (2020).

São-José, C. Engineering of phage-derived lytic enzymes: Improving their potential as antimicrobials. Antibiotics vol. 7 (2018).

Korndörfer, I. P., Kanitz, A., Danzer, J., Zimmer, M., Loessner, M. J., & Skerra, A. (2008). Structural analysis of the L-alanoyl-D-glutamate endopeptidase domain of Listeria bacteriophage endolysin Ply500 reveals a new member of the LAS peptidase family. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography, 64(6), 644–650. doi: 10.1107/s0907444908007890

Gerstmans, H., Criel, B. & Briers, Y. Synthetic biology of modular endolysins. Biotechnol. Adv. 36, 624–640 (2018).

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Fagni endolizini: mehanizem delovanja in možnosti za izboljšave

2020-05-04T18:20:35Z

Greta Junger: /* Struktura */

Endolizini so pestra družina encimov, zapisanih v bakteriofagnem genomu. Izrazijo se znotraj gostiteljske celice na koncu bakteriofagnega litičnega cikla, ko razgradijo bakterijsko peptidoglikansko steno (PG). To povzroči lizo celice in sprostitev na novo ustvarjenih bakteriofagov v okolico.

Naravno antibiotično funkcijo endolizinov lahko s pridom uporabimo pri sintezi encimskih antibiotikov, ki so zaradi svojega načina delovanja hitrejši in bolj specifični od standardnih antibiotikov. Poleg tega je možnost nastanka rezistence na njih majhna, saj cepijo konservativne peptidoglikanske vezi, ki jih bakterija težje spremeni, ob tem pa jim ni potrebno niti vstopiti v celico. Čeprav so endolizini perspektivni, pa je prostora za izboljšave še veliko. S pomočjo različnih bioinženirskih modifikacij se znanstveniki trudijo optimizirati njihovo delovanje v fizioloških pogojih (npr. topnost, obstojnost v krvni plazmi, aktivnost pri fiziološkem pH, specifičnost…) Na začetku je bila eksogena uporaba endolizinov možna le na Grampozitivnih bakterijah, z leti raziskav in modifikacij pa so delovanje nekaterih uspeli razširiti tudi na Gramnegativne.

==Delitev endolizinov==

===Struktura===

Po strukturi jih delimo na enodomenske globularne, ki so bolj značilni za Gramnegativne bakterije, in dvodomenske modularne, ki se pojavijo pri obeh tipih. V modularnih je N-končna encimsko aktivna domena (EAD) s kratko, fleksibilno verigo povezana s C-končno, ki je specifična za vezavo na celično steno (CBD). Zaradi take strukture modularni endolizini predstavljajo večji potencial za bioinženirske izboljšave, saj se posamezni domeni lahko obravnava ločeno ter se ju lahko neodvisno spreminja (npr. točkovna mutacija), doda ali odstrani, s čimer nastane protein z novo ali izboljšano funkcijo. V modularnih endolizinih, ki delujejo na Gramnegativne bakterije (slednji so sicer redki), pa sta domeni zamenjani. Čeprav je CBD specifična za vezavo na PG, pa njena prisotnost za delovanje endolizina ni vedno ključna. V nekaterih primerih njihova aktivnost ob odstranitvi CBD ni nič slabša ali je celo povečana.

===Katalitska zmožnost===

Endolizini se delijo tudi glede na katalitske zmožnosti. Peptidoglikanska stena je sestavljena iz ponavljajočih se enot N-acetilglukozamina in N-acetilmuraminske kisline, ki so med sabo povezane z β-(1,4)-glikozidno vezjo. To vez cepijo N-acetilglikozidaze. Na N-acetilmuraminsko kislino je z amidno vezjo pripeta peptidna veriga iz 3-5 aminokislin. Posamezne verige so med sabo navzkrižno povezane. Amidno vez cepijo N-acetilmuramoil-L-alanin amidaze, peptidno vez med aminokislinami in posameznimi peptidnimi verigami pa endopeptidaze.

==N-acetilglikozidaze==

===N-acetilmuramidaze===

N-acetilmuramidaze, ki delujejo na Grampozitivne bakterije, spadajo v družino glikozidnih hidrolaz 25. Vez cepijo na reducirajočem koncu N-acetilmuraminske kisline po enem izmed dveh predlaganih mehanizmov. Pri prvem so za katalizo ključni trije aspartati in en glutamat. Najprej Asp deprotonira molekulo vode, ki nato kot nukleofil napade β-1,4 vez. Istočasno Glu donira svoj proton, tako da pride do inverzije anomernega centra. Preko preostalih dveh Asp se katalitsko mesto regenerira. Pri drugem mehanizmu sta ključna aminokislinska ostanka le Asp in Glu. Asp veže substrat, v katerem pride do intramolekularnega nukleofilnega napada N-acetoamidne stranske skupine na β-1,4 vez. Nato Glu deprotonira molekulo vode, ki nukleofilno napade anomerni C atom, vendar tako, da se anomerni center ohrani.

====Izboljšave====
N-acetilmuramidaze imajo velik potencial za bioinženirsko izboljšavo. Dober primer sta za pnevmokoke specifična Cpl-1 in Cpl-7. Cpl-7 ima zelo aktivno EAD, vendar ima kljub temu nižjo bakteriolitično zmožnost kot Cpl-1. Razlog za to je bolj negativen neto naboj Cpl-7 pri fiziološkem pH kot pri Cpl-1. Z zamenjavo 5 aminokislin so neto naboj spremenili na pozitiven ter ustvarili spremenjen encim Cpl-7S, ki je kazal izboljšano bakteriolitično zmožnost proti pnevmokokom in nekaterim drugim bakterijam. S kombinacijo CBD iz Cpl-1 in EAD iz Cpl-7 so ustvarili himerolizin Cpl-711 z izboljšanimi bakteriolitičnimi značilnosti v primerjavi s starševskima endolizinoma. Z bioinženirsko metodo pa se ne trudijo le povečati bakteriolitične funkcije enzobiotikov, pač pa tudi podaljšati njihovo življenjsko dobo v krvni plazmi. Iz tam so namreč majhni proteini zaradi delovanja ledvic hitro izločeni. V ta namen so v posamezni monomer Cpl-1 vpeljali cisteine, ki so nato med seboj tvorili intermolekularne disulfidne vezi. Nastali Cpl-1 dimer je poleg podaljšane življenjske dobe v krvni plazmi kazal tudi dvakrat večjo specifičnost.

===Litične transglikozilaze===

Litične transglikozilaze tako kot N-acetilmuramidaze cepijo β-1,4 vez med N-acetilglukozaminom in N-acetilmuraminsko kislino, pri čemer nastane 1,6-anhidromuramoil, vendar z razliko, da za delovanje ne potrebujejo vode. Edini endolizin iz tega razreda, ki so ga uspeli kristalizirati in potrditi njegovo katalitično funkcijo je Gp144 (deluje na Pseudomonas aeruginoso). Prav tako je eden izmed redkih, ki deluje na Gram negativne bakterije. Endolizin v raztopini obstaja v različnih oligomernih oblikah, in sicer kot mono-, di- in trimer. V cepitev vezi je vpleten Glu115, vendar rezultati več raziskav kažejo, da je vpleten tudi Glu178.

====Izboljšave====

Pri Gram pozitivnih bakterijah se je izkazalo, da se ta aktivnost izgubi, saj te O-acetilirajo peptidoglikan na tisti stranski skupini, ki je vključena v nastanek 1,6-anhidromuramoila. Prav tako je bilo dokazano, da je pri tej vrsti bakterij interakcija encima s peptidoglikanom oslabljena. Delovanje na Gram pozitivne bakterije, ki nimajo zaestrenih skupin, in Gram negativne bi lahko izboljšali, če bi poznali natančne mehanizme vezave, da bi te lahko izboljšali. Pri modificiranju encima bi bilo potrebno paziti, da modifikacije ne bi vplivale na procese, ki so povezane z oligomerizacijo.

===N-acetilglukozaminidaze===

Edini strukturno znan endolizin z aktivnostjo N-acetilglukozaminidaze, ki cepi vez za N-acetilglukozaminom je PlyC. Encim je kompleks, sestavljen iz ene velike podenote in homooktamernega obroča. Na veliki podenoti se nahajata obe do sedaj identificirani encimsko aktivni domeni: od cisteina in histidina odvisna amidohidrolazna/peptidazna domena (PlyCCHAP) in N-acetilglukozaminidazna domena (PlyCGyH). Jedro PlyCGyH sestavlja struktura iz šestih α-heliksov, podobno kot pri nekaterih proteinih družine glikozidnih hidrolaz 73 (GH73). Znotraj omenjene regije je ohranjen aminokislinski ostanek Glu78, ki pri reakciji deluje kot kislina. Pri nekaterih encimih iz družine GH73, so bili opaženi možni katalitični aminokislinski ostanki na β-traku nasproti aktivnega mesta, ki pa v primeru PlyC ne obstaja. Zaradi odsotnosti kislih ostankov je verjetno v mehanizmu pozicioniranja in cepitve vezi vključen Tyr74.

====Izboljšave====

Endolizin se je izkazal za učinkovitega, vendar izgubi svojo aktivnost že pri 45˚C, za kar je odgovorna velika podenota, vendar se da z uvedbo mutacij termično stabilnost močno povečati. Za razvoj modificiranih encimov, ki bi delovali na več vrst bakterij, bi rabili več znanih encimov, da bi lahko preučili mehanizme delovanja.

==N-acetilmuramoil-L-alanin amidaze==

N-acetilmuramoil-L-alanin amidaze cepijo amidno vez med N-acetilmuraminsko kislino in L-alaninom. V družino od cinka odvisnih amidaz 2 sodijo PlyL, PlyG, XlyA in LysGH15, ki imajo podobno strukturo in ohranjenost katalitičih ostankov. Zn-ion je koordiniran med molekulo vode, dvema histidinskima in enim cisteinskim ostankom. Pomembna ostanka sta glutamat, ki aktivira vodo za nukleofilni napad, in lizin, ki stabilizira intermediat. Poznani sta dve amidazi PlyPSA in CD27L, ki spadata v skupino od cinka odvisnih amidaz 3. Endolizine te skupine sestavlja β-ploskev iz šest trakov, ki jih obdaja pet α-vijačnic. Zn-ion je koordiniran v vezavnem žepu z dvema histidinskima in enim glutamatskim ostankom. Ohranjena glutamatska ostanka med reakcijo delujeta kot akceptorja protona.

===Izboljšave===

Za namen reguliranja litične aktivnosti je možno skrajšati encim na le encimsko domeno z odstranitvijo vezavne domene, kar vodi do povečanja ali zmanjšanja aktivnosti. Učinki krajšanja endolizinov pri skupini amidaz 2 se razlikujejo, in sicer se lahko litična aktivnost ohrani ali izgubi. Z uvajanjem pozitivno nabitih aminokislin, se da aktivnost povrniti, vendar je ključno, da se te uvedejo okoli aktivnega mesta. Domnevno naj bi skupen pozitiven naboj endolizina ugodno vplival na interakcije s peptidoglikanom. Krajšanje endolizina pri amidazah 3 je imelo ponovno učinke na zmanjšanje in zvečanje aktivnosti. To kaže na nepoznavanje interakcij med encimsko in aktivno domeno pri različnih endolizinih. Boljše razumevanje strukture in delovanja endolizinov iz skupine amidaz 3 bi olajšalo modifikacije le-teh.

==Endopeptidaze==

Endopeptidaze cepijo peptidne vezi med aminokislinami, ki tvorijo polipeptidne verige in interpeptidni most. Raznolikost ostankov, ki tvorijo peptidoglikanske polipeptidne verige in interpeptidni most, kažejo na to, da gre verjetno za raznoliko skupino endolizinov z različnimi mehanizmi, ki ustrezajo različnim vezem. Ta razred endolizinov je zelo slabo razumljen - obstaja samo ena rešena struktura endolizina z endopeptidazno aktivnostjo, Ply500. Encimsko aktivna domena Ply500 za katalizo potrebuje cinkov ion, njena struktura pa spominja na kavč: ena α-vijačnica in tri antiparalelni β-trakovi tvorijo sedež, ki ga podpirata dve α-vijačnici, še ena α-vijačnica skupaj z zanko pa tvori naslonjalo.

Kot večina drugih endolizinov ima tudi Ply500 modularno strukturo, sestavljeno iz domene, ki veže celično steno in encimsko aktivno domeno. Opažena je bila jasna strukturna podobnost s peptidazami, ki spadajo v družino LAS. Njihovo skupno funkcionalno podobnost podpirata skupen vezani Zn2+ ion in aminokislinski ostanki His80, Asp87 in His133 na aktivnem mestu. Dejstvo, da je CBD Ply500 homologen CBD faga Listerie N-acetilmuramoil-1-alanin amidaze PlyPSA, ki ima popolnoma drugačen EAD, ponazarja funkcionalno spremenljivost tega razreda encimov in odpira zanimive možnosti za proteinski inženiring. Na žalost poskusi pridobivanja kristalov celotnega rekombinantnega encima Ply500 niso uspeli, verjetno zaradi prirojene prožnosti njegove arhitekture z dvema domenoma. Najdemo pa tudi variacije znotraj predlaganih katalitičnih ostankov. Cinkov ion je koordiniran z ohranjenimi ostanki His80, Asp87 in His132 in molekulo vode, pri čemer je Asp130 aktivira molekulo vode za nukleofilni napad. Drugi ključni ostanki bi lahko bili Arg50 in Gln55 za stabilizacijo oksianionskega intermediata. Poleg Ply500 pa imamo zelo omejeno mehanično razumevanje te potencialno obsežne skupine endolizinov.

===Izboljšave===

Da bi izboljšali delovanje Ply500, so v eni izmed študij kombinirali njegov CBD s PlyP35, kar je povzročilo 50-kratno povečanje afinitete vezave na celično steno (KA = 2,93 × 1010 M-1), kar omogoča visoko učinkovito imobilizacijo tarčnih celic. Pokazali so tudi, da se lahko afiniteto vezave še poveča s povečanjem kopij istega CBD-ja v enem fuzijskem konstruktu. Poleg tega povečana afiniteta do celične stene verjetno povzroči močnejšo vezavo pri visoki ionski jakosti, kar pojasnjuje opažanje, da je Ply500 endolizin z podvojenim CBD pokazal povečano aktivnost pri povišanih koncentracijah soli. V določenih primerih lahko modularni inženiring endolizinov rešuje tudi težave z topnostjo, kar zagotavlja učinkovito proizvodnjo in čiščenje sicer netopnih litičnih proteinov.

==CHAP==

Struktura encimsko aktivnih domen endolizina je odvisna od cepljene peptidoglikanske vezi. Vendar pa ima en razred encimsko aktivnih domen, cistein histidinsko odvisna domena amidohidrolaze/peptidaze (CHAP - cysteine histidine-dependent amidohydrolase/peptidase), lahko amidazno ali endopeptidazno aktivnost. CHAP domena ima lahko tudi obe aktivnosti v enem polipeptidu, kar lahko opazimo v PlyGRCS. Žal struktura tega endolizina še ni bila rešena, zato molekularni mehanizem dvojne aktivnosti ostaja neznan.
Značilnost CHAP endolizinov sta ostanka cistein in histidin, kjer stranska veriga cisteina verjetno deluje kot nukleofil, ki ga aktivira histidin. Kako so podobna endolizinska zvitja sposobna cepiti različne vezi, ni povsem jasno, vendar ima možnost vključitve dvojne aktivnosti, kot je razvidno iz PlyGRCS, v eno aktivno domeno CHAP zanimiv potencial za antibakterijsko uporabo.

==Viri==

Love, M. J., Abeysekera, G. S., Muscroft-Taylor, A. C., Billington, C. & Dobson, R. C. J. On the catalytic mechanism of bacteriophage endolysins: Opportunities for engineering. Biochimica et Biophysica Acta - Proteins and Proteomics vol. 1868 140302 (2020).

São-José, C. Engineering of phage-derived lytic enzymes: Improving their potential as antimicrobials. Antibiotics vol. 7 (2018).

Korndörfer, I. P., Kanitz, A., Danzer, J., Zimmer, M., Loessner, M. J., & Skerra, A. (2008). Structural analysis of the L-alanoyl-D-glutamate endopeptidase domain of Listeria bacteriophage endolysin Ply500 reveals a new member of the LAS peptidase family. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography, 64(6), 644–650. doi: 10.1107/s0907444908007890

Gerstmans, H., Criel, B. & Briers, Y. Synthetic biology of modular endolysins. Biotechnol. Adv. 36, 624–640 (2018).

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Fagni endolizini: mehanizem delovanja in možnosti za izboljšave

2020-05-04T18:20:00Z

Greta Junger: /* Struktura */

Endolizini so pestra družina encimov, zapisanih v bakteriofagnem genomu. Izrazijo se znotraj gostiteljske celice na koncu bakteriofagnega litičnega cikla, ko razgradijo bakterijsko peptidoglikansko steno (PG). To povzroči lizo celice in sprostitev na novo ustvarjenih bakteriofagov v okolico.

Naravno antibiotično funkcijo endolizinov lahko s pridom uporabimo pri sintezi encimskih antibiotikov, ki so zaradi svojega načina delovanja hitrejši in bolj specifični od standardnih antibiotikov. Poleg tega je možnost nastanka rezistence na njih majhna, saj cepijo konservativne peptidoglikanske vezi, ki jih bakterija težje spremeni, ob tem pa jim ni potrebno niti vstopiti v celico. Čeprav so endolizini perspektivni, pa je prostora za izboljšave še veliko. S pomočjo različnih bioinženirskih modifikacij se znanstveniki trudijo optimizirati njihovo delovanje v fizioloških pogojih (npr. topnost, obstojnost v krvni plazmi, aktivnost pri fiziološkem pH, specifičnost…) Na začetku je bila eksogena uporaba endolizinov možna le na Grampozitivnih bakterijah, z leti raziskav in modifikacij pa so delovanje nekaterih uspeli razširiti tudi na Gramnegativne.

==Delitev endolizinov==

===Struktura===

Po strukturi jih delimo na enodomenske globularne, ki so bolj značilni za Gramnegativne bakterije, in dvodomenske modularne, ki se pojavijo pri obeh tipih. V modularnih je N-končna encimsko aktivna domena (EAD) s kratko, fleksibilno verigo povezana s C-končno, ki je specifična za vezavo na celično steno (CBD). Zaradi take strukture modularni endolizini predstavljajo večji potencial za bioinženirske izboljšave, saj se posamezni domeni lahko obravnava ločeno ter se ju lahko neodvisno spreminja (npr. točkovna mutacija), doda ali odstrani, tako da nastane protein z novo ali izboljšano funkcijo. V modularnih endolizinih, ki delujejo na Gramnegativne bakterije (slednji so sicer redki), pa sta domeni zamenjani. Čeprav je CBD specifična za vezavo na PG, pa njena prisotnost za delovanje endolizina ni vedno ključna. V nekaterih primerih njihova aktivnost ob odstranitvi CBD ni nič slabša ali je celo povečana.

===Katalitska zmožnost===

Endolizini se delijo tudi glede na katalitske zmožnosti. Peptidoglikanska stena je sestavljena iz ponavljajočih se enot N-acetilglukozamina in N-acetilmuraminske kisline, ki so med sabo povezane z β-(1,4)-glikozidno vezjo. To vez cepijo N-acetilglikozidaze. Na N-acetilmuraminsko kislino je z amidno vezjo pripeta peptidna veriga iz 3-5 aminokislin. Posamezne verige so med sabo navzkrižno povezane. Amidno vez cepijo N-acetilmuramoil-L-alanin amidaze, peptidno vez med aminokislinami in posameznimi peptidnimi verigami pa endopeptidaze.

==N-acetilglikozidaze==

===N-acetilmuramidaze===

N-acetilmuramidaze, ki delujejo na Grampozitivne bakterije, spadajo v družino glikozidnih hidrolaz 25. Vez cepijo na reducirajočem koncu N-acetilmuraminske kisline po enem izmed dveh predlaganih mehanizmov. Pri prvem so za katalizo ključni trije aspartati in en glutamat. Najprej Asp deprotonira molekulo vode, ki nato kot nukleofil napade β-1,4 vez. Istočasno Glu donira svoj proton, tako da pride do inverzije anomernega centra. Preko preostalih dveh Asp se katalitsko mesto regenerira. Pri drugem mehanizmu sta ključna aminokislinska ostanka le Asp in Glu. Asp veže substrat, v katerem pride do intramolekularnega nukleofilnega napada N-acetoamidne stranske skupine na β-1,4 vez. Nato Glu deprotonira molekulo vode, ki nukleofilno napade anomerni C atom, vendar tako, da se anomerni center ohrani.

====Izboljšave====
N-acetilmuramidaze imajo velik potencial za bioinženirsko izboljšavo. Dober primer sta za pnevmokoke specifična Cpl-1 in Cpl-7. Cpl-7 ima zelo aktivno EAD, vendar ima kljub temu nižjo bakteriolitično zmožnost kot Cpl-1. Razlog za to je bolj negativen neto naboj Cpl-7 pri fiziološkem pH kot pri Cpl-1. Z zamenjavo 5 aminokislin so neto naboj spremenili na pozitiven ter ustvarili spremenjen encim Cpl-7S, ki je kazal izboljšano bakteriolitično zmožnost proti pnevmokokom in nekaterim drugim bakterijam. S kombinacijo CBD iz Cpl-1 in EAD iz Cpl-7 so ustvarili himerolizin Cpl-711 z izboljšanimi bakteriolitičnimi značilnosti v primerjavi s starševskima endolizinoma. Z bioinženirsko metodo pa se ne trudijo le povečati bakteriolitične funkcije enzobiotikov, pač pa tudi podaljšati njihovo življenjsko dobo v krvni plazmi. Iz tam so namreč majhni proteini zaradi delovanja ledvic hitro izločeni. V ta namen so v posamezni monomer Cpl-1 vpeljali cisteine, ki so nato med seboj tvorili intermolekularne disulfidne vezi. Nastali Cpl-1 dimer je poleg podaljšane življenjske dobe v krvni plazmi kazal tudi dvakrat večjo specifičnost.

===Litične transglikozilaze===

Litične transglikozilaze tako kot N-acetilmuramidaze cepijo β-1,4 vez med N-acetilglukozaminom in N-acetilmuraminsko kislino, pri čemer nastane 1,6-anhidromuramoil, vendar z razliko, da za delovanje ne potrebujejo vode. Edini endolizin iz tega razreda, ki so ga uspeli kristalizirati in potrditi njegovo katalitično funkcijo je Gp144 (deluje na Pseudomonas aeruginoso). Prav tako je eden izmed redkih, ki deluje na Gram negativne bakterije. Endolizin v raztopini obstaja v različnih oligomernih oblikah, in sicer kot mono-, di- in trimer. V cepitev vezi je vpleten Glu115, vendar rezultati več raziskav kažejo, da je vpleten tudi Glu178.

====Izboljšave====

Pri Gram pozitivnih bakterijah se je izkazalo, da se ta aktivnost izgubi, saj te O-acetilirajo peptidoglikan na tisti stranski skupini, ki je vključena v nastanek 1,6-anhidromuramoila. Prav tako je bilo dokazano, da je pri tej vrsti bakterij interakcija encima s peptidoglikanom oslabljena. Delovanje na Gram pozitivne bakterije, ki nimajo zaestrenih skupin, in Gram negativne bi lahko izboljšali, če bi poznali natančne mehanizme vezave, da bi te lahko izboljšali. Pri modificiranju encima bi bilo potrebno paziti, da modifikacije ne bi vplivale na procese, ki so povezane z oligomerizacijo.

===N-acetilglukozaminidaze===

Edini strukturno znan endolizin z aktivnostjo N-acetilglukozaminidaze, ki cepi vez za N-acetilglukozaminom je PlyC. Encim je kompleks, sestavljen iz ene velike podenote in homooktamernega obroča. Na veliki podenoti se nahajata obe do sedaj identificirani encimsko aktivni domeni: od cisteina in histidina odvisna amidohidrolazna/peptidazna domena (PlyCCHAP) in N-acetilglukozaminidazna domena (PlyCGyH). Jedro PlyCGyH sestavlja struktura iz šestih α-heliksov, podobno kot pri nekaterih proteinih družine glikozidnih hidrolaz 73 (GH73). Znotraj omenjene regije je ohranjen aminokislinski ostanek Glu78, ki pri reakciji deluje kot kislina. Pri nekaterih encimih iz družine GH73, so bili opaženi možni katalitični aminokislinski ostanki na β-traku nasproti aktivnega mesta, ki pa v primeru PlyC ne obstaja. Zaradi odsotnosti kislih ostankov je verjetno v mehanizmu pozicioniranja in cepitve vezi vključen Tyr74.

====Izboljšave====

Endolizin se je izkazal za učinkovitega, vendar izgubi svojo aktivnost že pri 45˚C, za kar je odgovorna velika podenota, vendar se da z uvedbo mutacij termično stabilnost močno povečati. Za razvoj modificiranih encimov, ki bi delovali na več vrst bakterij, bi rabili več znanih encimov, da bi lahko preučili mehanizme delovanja.

==N-acetilmuramoil-L-alanin amidaze==

N-acetilmuramoil-L-alanin amidaze cepijo amidno vez med N-acetilmuraminsko kislino in L-alaninom. V družino od cinka odvisnih amidaz 2 sodijo PlyL, PlyG, XlyA in LysGH15, ki imajo podobno strukturo in ohranjenost katalitičih ostankov. Zn-ion je koordiniran med molekulo vode, dvema histidinskima in enim cisteinskim ostankom. Pomembna ostanka sta glutamat, ki aktivira vodo za nukleofilni napad, in lizin, ki stabilizira intermediat. Poznani sta dve amidazi PlyPSA in CD27L, ki spadata v skupino od cinka odvisnih amidaz 3. Endolizine te skupine sestavlja β-ploskev iz šest trakov, ki jih obdaja pet α-vijačnic. Zn-ion je koordiniran v vezavnem žepu z dvema histidinskima in enim glutamatskim ostankom. Ohranjena glutamatska ostanka med reakcijo delujeta kot akceptorja protona.

===Izboljšave===

Za namen reguliranja litične aktivnosti je možno skrajšati encim na le encimsko domeno z odstranitvijo vezavne domene, kar vodi do povečanja ali zmanjšanja aktivnosti. Učinki krajšanja endolizinov pri skupini amidaz 2 se razlikujejo, in sicer se lahko litična aktivnost ohrani ali izgubi. Z uvajanjem pozitivno nabitih aminokislin, se da aktivnost povrniti, vendar je ključno, da se te uvedejo okoli aktivnega mesta. Domnevno naj bi skupen pozitiven naboj endolizina ugodno vplival na interakcije s peptidoglikanom. Krajšanje endolizina pri amidazah 3 je imelo ponovno učinke na zmanjšanje in zvečanje aktivnosti. To kaže na nepoznavanje interakcij med encimsko in aktivno domeno pri različnih endolizinih. Boljše razumevanje strukture in delovanja endolizinov iz skupine amidaz 3 bi olajšalo modifikacije le-teh.

==Endopeptidaze==

Endopeptidaze cepijo peptidne vezi med aminokislinami, ki tvorijo polipeptidne verige in interpeptidni most. Raznolikost ostankov, ki tvorijo peptidoglikanske polipeptidne verige in interpeptidni most, kažejo na to, da gre verjetno za raznoliko skupino endolizinov z različnimi mehanizmi, ki ustrezajo različnim vezem. Ta razred endolizinov je zelo slabo razumljen - obstaja samo ena rešena struktura endolizina z endopeptidazno aktivnostjo, Ply500. Encimsko aktivna domena Ply500 za katalizo potrebuje cinkov ion, njena struktura pa spominja na kavč: ena α-vijačnica in tri antiparalelni β-trakovi tvorijo sedež, ki ga podpirata dve α-vijačnici, še ena α-vijačnica skupaj z zanko pa tvori naslonjalo.

Kot večina drugih endolizinov ima tudi Ply500 modularno strukturo, sestavljeno iz domene, ki veže celično steno in encimsko aktivno domeno. Opažena je bila jasna strukturna podobnost s peptidazami, ki spadajo v družino LAS. Njihovo skupno funkcionalno podobnost podpirata skupen vezani Zn2+ ion in aminokislinski ostanki His80, Asp87 in His133 na aktivnem mestu. Dejstvo, da je CBD Ply500 homologen CBD faga Listerie N-acetilmuramoil-1-alanin amidaze PlyPSA, ki ima popolnoma drugačen EAD, ponazarja funkcionalno spremenljivost tega razreda encimov in odpira zanimive možnosti za proteinski inženiring. Na žalost poskusi pridobivanja kristalov celotnega rekombinantnega encima Ply500 niso uspeli, verjetno zaradi prirojene prožnosti njegove arhitekture z dvema domenoma. Najdemo pa tudi variacije znotraj predlaganih katalitičnih ostankov. Cinkov ion je koordiniran z ohranjenimi ostanki His80, Asp87 in His132 in molekulo vode, pri čemer je Asp130 aktivira molekulo vode za nukleofilni napad. Drugi ključni ostanki bi lahko bili Arg50 in Gln55 za stabilizacijo oksianionskega intermediata. Poleg Ply500 pa imamo zelo omejeno mehanično razumevanje te potencialno obsežne skupine endolizinov.

===Izboljšave===

Da bi izboljšali delovanje Ply500, so v eni izmed študij kombinirali njegov CBD s PlyP35, kar je povzročilo 50-kratno povečanje afinitete vezave na celično steno (KA = 2,93 × 1010 M-1), kar omogoča visoko učinkovito imobilizacijo tarčnih celic. Pokazali so tudi, da se lahko afiniteto vezave še poveča s povečanjem kopij istega CBD-ja v enem fuzijskem konstruktu. Poleg tega povečana afiniteta do celične stene verjetno povzroči močnejšo vezavo pri visoki ionski jakosti, kar pojasnjuje opažanje, da je Ply500 endolizin z podvojenim CBD pokazal povečano aktivnost pri povišanih koncentracijah soli. V določenih primerih lahko modularni inženiring endolizinov rešuje tudi težave z topnostjo, kar zagotavlja učinkovito proizvodnjo in čiščenje sicer netopnih litičnih proteinov.

==CHAP==

Struktura encimsko aktivnih domen endolizina je odvisna od cepljene peptidoglikanske vezi. Vendar pa ima en razred encimsko aktivnih domen, cistein histidinsko odvisna domena amidohidrolaze/peptidaze (CHAP - cysteine histidine-dependent amidohydrolase/peptidase), lahko amidazno ali endopeptidazno aktivnost. CHAP domena ima lahko tudi obe aktivnosti v enem polipeptidu, kar lahko opazimo v PlyGRCS. Žal struktura tega endolizina še ni bila rešena, zato molekularni mehanizem dvojne aktivnosti ostaja neznan.
Značilnost CHAP endolizinov sta ostanka cistein in histidin, kjer stranska veriga cisteina verjetno deluje kot nukleofil, ki ga aktivira histidin. Kako so podobna endolizinska zvitja sposobna cepiti različne vezi, ni povsem jasno, vendar ima možnost vključitve dvojne aktivnosti, kot je razvidno iz PlyGRCS, v eno aktivno domeno CHAP zanimiv potencial za antibakterijsko uporabo.

==Viri==

Love, M. J., Abeysekera, G. S., Muscroft-Taylor, A. C., Billington, C. & Dobson, R. C. J. On the catalytic mechanism of bacteriophage endolysins: Opportunities for engineering. Biochimica et Biophysica Acta - Proteins and Proteomics vol. 1868 140302 (2020).

São-José, C. Engineering of phage-derived lytic enzymes: Improving their potential as antimicrobials. Antibiotics vol. 7 (2018).

Korndörfer, I. P., Kanitz, A., Danzer, J., Zimmer, M., Loessner, M. J., & Skerra, A. (2008). Structural analysis of the L-alanoyl-D-glutamate endopeptidase domain of Listeria bacteriophage endolysin Ply500 reveals a new member of the LAS peptidase family. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography, 64(6), 644–650. doi: 10.1107/s0907444908007890

Gerstmans, H., Criel, B. & Briers, Y. Synthetic biology of modular endolysins. Biotechnol. Adv. 36, 624–640 (2018).

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Fagni endolizini: mehanizem delovanja in možnosti za izboljšave

2020-05-04T18:19:06Z

Greta Junger:

Endolizini so pestra družina encimov, zapisanih v bakteriofagnem genomu. Izrazijo se znotraj gostiteljske celice na koncu bakteriofagnega litičnega cikla, ko razgradijo bakterijsko peptidoglikansko steno (PG). To povzroči lizo celice in sprostitev na novo ustvarjenih bakteriofagov v okolico.

Naravno antibiotično funkcijo endolizinov lahko s pridom uporabimo pri sintezi encimskih antibiotikov, ki so zaradi svojega načina delovanja hitrejši in bolj specifični od standardnih antibiotikov. Poleg tega je možnost nastanka rezistence na njih majhna, saj cepijo konservativne peptidoglikanske vezi, ki jih bakterija težje spremeni, ob tem pa jim ni potrebno niti vstopiti v celico. Čeprav so endolizini perspektivni, pa je prostora za izboljšave še veliko. S pomočjo različnih bioinženirskih modifikacij se znanstveniki trudijo optimizirati njihovo delovanje v fizioloških pogojih (npr. topnost, obstojnost v krvni plazmi, aktivnost pri fiziološkem pH, specifičnost…) Na začetku je bila eksogena uporaba endolizinov možna le na Grampozitivnih bakterijah, z leti raziskav in modifikacij pa so delovanje nekaterih uspeli razširiti tudi na Gramnegativne.

==Delitev endolizinov==

===Struktura===

Po strukturi jih delimo na enodomenske globularne, ki so bolj značilni za Gramnegativne bakterije, in dvodomenske modularne, ki se pojavijo pri obeh tipih. V modularnih je N-končna encimsko aktivna domena (EAD) s kratko, fleksibilno verigo povezana s C-končno, ki je specifična za vezavo na celično steno (CBD). Zaradi take strukture modularni endolizini predstavljajo večji potencial za bioinženirske izboljšave, saj se posamezni domeni lahko obravnava ločeno ter se ju lahko neodvisno spreminja (npr. točkovna mutacija), doda ali odstrani. S tem nastane protein z novo ali izboljšano funkcijo. V modularnih endolizinih, ki delujejo na Gramnegativne bakterije (slednji so sicer redki), pa sta domeni zamenjani. Čeprav je CBD specifična za vezavo na PG, pa njena prisotnost za delovanje endolizina ni vedno ključna. V nekaterih primerih njihova aktivnost ob odstranitvi CBD ni nič slabša ali je celo povečana.

===Katalitska zmožnost===

Endolizini se delijo tudi glede na katalitske zmožnosti. Peptidoglikanska stena je sestavljena iz ponavljajočih se enot N-acetilglukozamina in N-acetilmuraminske kisline, ki so med sabo povezane z β-(1,4)-glikozidno vezjo. To vez cepijo N-acetilglikozidaze. Na N-acetilmuraminsko kislino je z amidno vezjo pripeta peptidna veriga iz 3-5 aminokislin. Posamezne verige so med sabo navzkrižno povezane. Amidno vez cepijo N-acetilmuramoil-L-alanin amidaze, peptidno vez med aminokislinami in posameznimi peptidnimi verigami pa endopeptidaze.

==N-acetilglikozidaze==

===N-acetilmuramidaze===

N-acetilmuramidaze, ki delujejo na Grampozitivne bakterije, spadajo v družino glikozidnih hidrolaz 25. Vez cepijo na reducirajočem koncu N-acetilmuraminske kisline po enem izmed dveh predlaganih mehanizmov. Pri prvem so za katalizo ključni trije aspartati in en glutamat. Najprej Asp deprotonira molekulo vode, ki nato kot nukleofil napade β-1,4 vez. Istočasno Glu donira svoj proton, tako da pride do inverzije anomernega centra. Preko preostalih dveh Asp se katalitsko mesto regenerira. Pri drugem mehanizmu sta ključna aminokislinska ostanka le Asp in Glu. Asp veže substrat, v katerem pride do intramolekularnega nukleofilnega napada N-acetoamidne stranske skupine na β-1,4 vez. Nato Glu deprotonira molekulo vode, ki nukleofilno napade anomerni C atom, vendar tako, da se anomerni center ohrani.

====Izboljšave====
N-acetilmuramidaze imajo velik potencial za bioinženirsko izboljšavo. Dober primer sta za pnevmokoke specifična Cpl-1 in Cpl-7. Cpl-7 ima zelo aktivno EAD, vendar ima kljub temu nižjo bakteriolitično zmožnost kot Cpl-1. Razlog za to je bolj negativen neto naboj Cpl-7 pri fiziološkem pH kot pri Cpl-1. Z zamenjavo 5 aminokislin so neto naboj spremenili na pozitiven ter ustvarili spremenjen encim Cpl-7S, ki je kazal izboljšano bakteriolitično zmožnost proti pnevmokokom in nekaterim drugim bakterijam. S kombinacijo CBD iz Cpl-1 in EAD iz Cpl-7 so ustvarili himerolizin Cpl-711 z izboljšanimi bakteriolitičnimi značilnosti v primerjavi s starševskima endolizinoma. Z bioinženirsko metodo pa se ne trudijo le povečati bakteriolitične funkcije enzobiotikov, pač pa tudi podaljšati njihovo življenjsko dobo v krvni plazmi. Iz tam so namreč majhni proteini zaradi delovanja ledvic hitro izločeni. V ta namen so v posamezni monomer Cpl-1 vpeljali cisteine, ki so nato med seboj tvorili intermolekularne disulfidne vezi. Nastali Cpl-1 dimer je poleg podaljšane življenjske dobe v krvni plazmi kazal tudi dvakrat večjo specifičnost.

===Litične transglikozilaze===

Litične transglikozilaze tako kot N-acetilmuramidaze cepijo β-1,4 vez med N-acetilglukozaminom in N-acetilmuraminsko kislino, pri čemer nastane 1,6-anhidromuramoil, vendar z razliko, da za delovanje ne potrebujejo vode. Edini endolizin iz tega razreda, ki so ga uspeli kristalizirati in potrditi njegovo katalitično funkcijo je Gp144 (deluje na Pseudomonas aeruginoso). Prav tako je eden izmed redkih, ki deluje na Gram negativne bakterije. Endolizin v raztopini obstaja v različnih oligomernih oblikah, in sicer kot mono-, di- in trimer. V cepitev vezi je vpleten Glu115, vendar rezultati več raziskav kažejo, da je vpleten tudi Glu178.

====Izboljšave====

Pri Gram pozitivnih bakterijah se je izkazalo, da se ta aktivnost izgubi, saj te O-acetilirajo peptidoglikan na tisti stranski skupini, ki je vključena v nastanek 1,6-anhidromuramoila. Prav tako je bilo dokazano, da je pri tej vrsti bakterij interakcija encima s peptidoglikanom oslabljena. Delovanje na Gram pozitivne bakterije, ki nimajo zaestrenih skupin, in Gram negativne bi lahko izboljšali, če bi poznali natančne mehanizme vezave, da bi te lahko izboljšali. Pri modificiranju encima bi bilo potrebno paziti, da modifikacije ne bi vplivale na procese, ki so povezane z oligomerizacijo.

===N-acetilglukozaminidaze===

Edini strukturno znan endolizin z aktivnostjo N-acetilglukozaminidaze, ki cepi vez za N-acetilglukozaminom je PlyC. Encim je kompleks, sestavljen iz ene velike podenote in homooktamernega obroča. Na veliki podenoti se nahajata obe do sedaj identificirani encimsko aktivni domeni: od cisteina in histidina odvisna amidohidrolazna/peptidazna domena (PlyCCHAP) in N-acetilglukozaminidazna domena (PlyCGyH). Jedro PlyCGyH sestavlja struktura iz šestih α-heliksov, podobno kot pri nekaterih proteinih družine glikozidnih hidrolaz 73 (GH73). Znotraj omenjene regije je ohranjen aminokislinski ostanek Glu78, ki pri reakciji deluje kot kislina. Pri nekaterih encimih iz družine GH73, so bili opaženi možni katalitični aminokislinski ostanki na β-traku nasproti aktivnega mesta, ki pa v primeru PlyC ne obstaja. Zaradi odsotnosti kislih ostankov je verjetno v mehanizmu pozicioniranja in cepitve vezi vključen Tyr74.

====Izboljšave====

Endolizin se je izkazal za učinkovitega, vendar izgubi svojo aktivnost že pri 45˚C, za kar je odgovorna velika podenota, vendar se da z uvedbo mutacij termično stabilnost močno povečati. Za razvoj modificiranih encimov, ki bi delovali na več vrst bakterij, bi rabili več znanih encimov, da bi lahko preučili mehanizme delovanja.

==N-acetilmuramoil-L-alanin amidaze==

N-acetilmuramoil-L-alanin amidaze cepijo amidno vez med N-acetilmuraminsko kislino in L-alaninom. V družino od cinka odvisnih amidaz 2 sodijo PlyL, PlyG, XlyA in LysGH15, ki imajo podobno strukturo in ohranjenost katalitičih ostankov. Zn-ion je koordiniran med molekulo vode, dvema histidinskima in enim cisteinskim ostankom. Pomembna ostanka sta glutamat, ki aktivira vodo za nukleofilni napad, in lizin, ki stabilizira intermediat. Poznani sta dve amidazi PlyPSA in CD27L, ki spadata v skupino od cinka odvisnih amidaz 3. Endolizine te skupine sestavlja β-ploskev iz šest trakov, ki jih obdaja pet α-vijačnic. Zn-ion je koordiniran v vezavnem žepu z dvema histidinskima in enim glutamatskim ostankom. Ohranjena glutamatska ostanka med reakcijo delujeta kot akceptorja protona.

===Izboljšave===

Za namen reguliranja litične aktivnosti je možno skrajšati encim na le encimsko domeno z odstranitvijo vezavne domene, kar vodi do povečanja ali zmanjšanja aktivnosti. Učinki krajšanja endolizinov pri skupini amidaz 2 se razlikujejo, in sicer se lahko litična aktivnost ohrani ali izgubi. Z uvajanjem pozitivno nabitih aminokislin, se da aktivnost povrniti, vendar je ključno, da se te uvedejo okoli aktivnega mesta. Domnevno naj bi skupen pozitiven naboj endolizina ugodno vplival na interakcije s peptidoglikanom. Krajšanje endolizina pri amidazah 3 je imelo ponovno učinke na zmanjšanje in zvečanje aktivnosti. To kaže na nepoznavanje interakcij med encimsko in aktivno domeno pri različnih endolizinih. Boljše razumevanje strukture in delovanja endolizinov iz skupine amidaz 3 bi olajšalo modifikacije le-teh.

==Endopeptidaze==

Endopeptidaze cepijo peptidne vezi med aminokislinami, ki tvorijo polipeptidne verige in interpeptidni most. Raznolikost ostankov, ki tvorijo peptidoglikanske polipeptidne verige in interpeptidni most, kažejo na to, da gre verjetno za raznoliko skupino endolizinov z različnimi mehanizmi, ki ustrezajo različnim vezem. Ta razred endolizinov je zelo slabo razumljen - obstaja samo ena rešena struktura endolizina z endopeptidazno aktivnostjo, Ply500. Encimsko aktivna domena Ply500 za katalizo potrebuje cinkov ion, njena struktura pa spominja na kavč: ena α-vijačnica in tri antiparalelni β-trakovi tvorijo sedež, ki ga podpirata dve α-vijačnici, še ena α-vijačnica skupaj z zanko pa tvori naslonjalo.

Kot večina drugih endolizinov ima tudi Ply500 modularno strukturo, sestavljeno iz domene, ki veže celično steno in encimsko aktivno domeno. Opažena je bila jasna strukturna podobnost s peptidazami, ki spadajo v družino LAS. Njihovo skupno funkcionalno podobnost podpirata skupen vezani Zn2+ ion in aminokislinski ostanki His80, Asp87 in His133 na aktivnem mestu. Dejstvo, da je CBD Ply500 homologen CBD faga Listerie N-acetilmuramoil-1-alanin amidaze PlyPSA, ki ima popolnoma drugačen EAD, ponazarja funkcionalno spremenljivost tega razreda encimov in odpira zanimive možnosti za proteinski inženiring. Na žalost poskusi pridobivanja kristalov celotnega rekombinantnega encima Ply500 niso uspeli, verjetno zaradi prirojene prožnosti njegove arhitekture z dvema domenoma. Najdemo pa tudi variacije znotraj predlaganih katalitičnih ostankov. Cinkov ion je koordiniran z ohranjenimi ostanki His80, Asp87 in His132 in molekulo vode, pri čemer je Asp130 aktivira molekulo vode za nukleofilni napad. Drugi ključni ostanki bi lahko bili Arg50 in Gln55 za stabilizacijo oksianionskega intermediata. Poleg Ply500 pa imamo zelo omejeno mehanično razumevanje te potencialno obsežne skupine endolizinov.

===Izboljšave===

Da bi izboljšali delovanje Ply500, so v eni izmed študij kombinirali njegov CBD s PlyP35, kar je povzročilo 50-kratno povečanje afinitete vezave na celično steno (KA = 2,93 × 1010 M-1), kar omogoča visoko učinkovito imobilizacijo tarčnih celic. Pokazali so tudi, da se lahko afiniteto vezave še poveča s povečanjem kopij istega CBD-ja v enem fuzijskem konstruktu. Poleg tega povečana afiniteta do celične stene verjetno povzroči močnejšo vezavo pri visoki ionski jakosti, kar pojasnjuje opažanje, da je Ply500 endolizin z podvojenim CBD pokazal povečano aktivnost pri povišanih koncentracijah soli. V določenih primerih lahko modularni inženiring endolizinov rešuje tudi težave z topnostjo, kar zagotavlja učinkovito proizvodnjo in čiščenje sicer netopnih litičnih proteinov.

==CHAP==

Struktura encimsko aktivnih domen endolizina je odvisna od cepljene peptidoglikanske vezi. Vendar pa ima en razred encimsko aktivnih domen, cistein histidinsko odvisna domena amidohidrolaze/peptidaze (CHAP - cysteine histidine-dependent amidohydrolase/peptidase), lahko amidazno ali endopeptidazno aktivnost. CHAP domena ima lahko tudi obe aktivnosti v enem polipeptidu, kar lahko opazimo v PlyGRCS. Žal struktura tega endolizina še ni bila rešena, zato molekularni mehanizem dvojne aktivnosti ostaja neznan.
Značilnost CHAP endolizinov sta ostanka cistein in histidin, kjer stranska veriga cisteina verjetno deluje kot nukleofil, ki ga aktivira histidin. Kako so podobna endolizinska zvitja sposobna cepiti različne vezi, ni povsem jasno, vendar ima možnost vključitve dvojne aktivnosti, kot je razvidno iz PlyGRCS, v eno aktivno domeno CHAP zanimiv potencial za antibakterijsko uporabo.

==Viri==

Love, M. J., Abeysekera, G. S., Muscroft-Taylor, A. C., Billington, C. & Dobson, R. C. J. On the catalytic mechanism of bacteriophage endolysins: Opportunities for engineering. Biochimica et Biophysica Acta - Proteins and Proteomics vol. 1868 140302 (2020).

São-José, C. Engineering of phage-derived lytic enzymes: Improving their potential as antimicrobials. Antibiotics vol. 7 (2018).

Korndörfer, I. P., Kanitz, A., Danzer, J., Zimmer, M., Loessner, M. J., & Skerra, A. (2008). Structural analysis of the L-alanoyl-D-glutamate endopeptidase domain of Listeria bacteriophage endolysin Ply500 reveals a new member of the LAS peptidase family. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography, 64(6), 644–650. doi: 10.1107/s0907444908007890

Gerstmans, H., Criel, B. & Briers, Y. Synthetic biology of modular endolysins. Biotechnol. Adv. 36, 624–640 (2018).

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Fagni endolizini: mehanizem delovanja in možnosti za izboljšave

2020-05-04T18:18:55Z

Greta Junger:

Endolizini so pestra družina encimov, zapisanih v bakteriofagnem genomu. Izrazijo se znotraj gostiteljske celice na koncu bakteriofagnega litičnega cikla, ko razgradijo bakterijsko peptidoglikansko steno (PG). To povzroči lizo celice in sprostitev na novo ustvarjenih bakteriofagov v okolico.
Naravno antibiotično funkcijo endolizinov lahko s pridom uporabimo pri sintezi encimskih antibiotikov, ki so zaradi svojega načina delovanja hitrejši in bolj specifični od standardnih antibiotikov. Poleg tega je možnost nastanka rezistence na njih majhna, saj cepijo konservativne peptidoglikanske vezi, ki jih bakterija težje spremeni, ob tem pa jim ni potrebno niti vstopiti v celico. Čeprav so endolizini perspektivni, pa je prostora za izboljšave še veliko. S pomočjo različnih bioinženirskih modifikacij se znanstveniki trudijo optimizirati njihovo delovanje v fizioloških pogojih (npr. topnost, obstojnost v krvni plazmi, aktivnost pri fiziološkem pH, specifičnost…) Na začetku je bila eksogena uporaba endolizinov možna le na Grampozitivnih bakterijah, z leti raziskav in modifikacij pa so delovanje nekaterih uspeli razširiti tudi na Gramnegativne.

==Delitev endolizinov==

===Struktura===

Po strukturi jih delimo na enodomenske globularne, ki so bolj značilni za Gramnegativne bakterije, in dvodomenske modularne, ki se pojavijo pri obeh tipih. V modularnih je N-končna encimsko aktivna domena (EAD) s kratko, fleksibilno verigo povezana s C-končno, ki je specifična za vezavo na celično steno (CBD). Zaradi take strukture modularni endolizini predstavljajo večji potencial za bioinženirske izboljšave, saj se posamezni domeni lahko obravnava ločeno ter se ju lahko neodvisno spreminja (npr. točkovna mutacija), doda ali odstrani. S tem nastane protein z novo ali izboljšano funkcijo. V modularnih endolizinih, ki delujejo na Gramnegativne bakterije (slednji so sicer redki), pa sta domeni zamenjani. Čeprav je CBD specifična za vezavo na PG, pa njena prisotnost za delovanje endolizina ni vedno ključna. V nekaterih primerih njihova aktivnost ob odstranitvi CBD ni nič slabša ali je celo povečana.

===Katalitska zmožnost===

Endolizini se delijo tudi glede na katalitske zmožnosti. Peptidoglikanska stena je sestavljena iz ponavljajočih se enot N-acetilglukozamina in N-acetilmuraminske kisline, ki so med sabo povezane z β-(1,4)-glikozidno vezjo. To vez cepijo N-acetilglikozidaze. Na N-acetilmuraminsko kislino je z amidno vezjo pripeta peptidna veriga iz 3-5 aminokislin. Posamezne verige so med sabo navzkrižno povezane. Amidno vez cepijo N-acetilmuramoil-L-alanin amidaze, peptidno vez med aminokislinami in posameznimi peptidnimi verigami pa endopeptidaze.

==N-acetilglikozidaze==

===N-acetilmuramidaze===

N-acetilmuramidaze, ki delujejo na Grampozitivne bakterije, spadajo v družino glikozidnih hidrolaz 25. Vez cepijo na reducirajočem koncu N-acetilmuraminske kisline po enem izmed dveh predlaganih mehanizmov. Pri prvem so za katalizo ključni trije aspartati in en glutamat. Najprej Asp deprotonira molekulo vode, ki nato kot nukleofil napade β-1,4 vez. Istočasno Glu donira svoj proton, tako da pride do inverzije anomernega centra. Preko preostalih dveh Asp se katalitsko mesto regenerira. Pri drugem mehanizmu sta ključna aminokislinska ostanka le Asp in Glu. Asp veže substrat, v katerem pride do intramolekularnega nukleofilnega napada N-acetoamidne stranske skupine na β-1,4 vez. Nato Glu deprotonira molekulo vode, ki nukleofilno napade anomerni C atom, vendar tako, da se anomerni center ohrani.

====Izboljšave====
N-acetilmuramidaze imajo velik potencial za bioinženirsko izboljšavo. Dober primer sta za pnevmokoke specifična Cpl-1 in Cpl-7. Cpl-7 ima zelo aktivno EAD, vendar ima kljub temu nižjo bakteriolitično zmožnost kot Cpl-1. Razlog za to je bolj negativen neto naboj Cpl-7 pri fiziološkem pH kot pri Cpl-1. Z zamenjavo 5 aminokislin so neto naboj spremenili na pozitiven ter ustvarili spremenjen encim Cpl-7S, ki je kazal izboljšano bakteriolitično zmožnost proti pnevmokokom in nekaterim drugim bakterijam. S kombinacijo CBD iz Cpl-1 in EAD iz Cpl-7 so ustvarili himerolizin Cpl-711 z izboljšanimi bakteriolitičnimi značilnosti v primerjavi s starševskima endolizinoma. Z bioinženirsko metodo pa se ne trudijo le povečati bakteriolitične funkcije enzobiotikov, pač pa tudi podaljšati njihovo življenjsko dobo v krvni plazmi. Iz tam so namreč majhni proteini zaradi delovanja ledvic hitro izločeni. V ta namen so v posamezni monomer Cpl-1 vpeljali cisteine, ki so nato med seboj tvorili intermolekularne disulfidne vezi. Nastali Cpl-1 dimer je poleg podaljšane življenjske dobe v krvni plazmi kazal tudi dvakrat večjo specifičnost.

===Litične transglikozilaze===

Litične transglikozilaze tako kot N-acetilmuramidaze cepijo β-1,4 vez med N-acetilglukozaminom in N-acetilmuraminsko kislino, pri čemer nastane 1,6-anhidromuramoil, vendar z razliko, da za delovanje ne potrebujejo vode. Edini endolizin iz tega razreda, ki so ga uspeli kristalizirati in potrditi njegovo katalitično funkcijo je Gp144 (deluje na Pseudomonas aeruginoso). Prav tako je eden izmed redkih, ki deluje na Gram negativne bakterije. Endolizin v raztopini obstaja v različnih oligomernih oblikah, in sicer kot mono-, di- in trimer. V cepitev vezi je vpleten Glu115, vendar rezultati več raziskav kažejo, da je vpleten tudi Glu178.

====Izboljšave====

Pri Gram pozitivnih bakterijah se je izkazalo, da se ta aktivnost izgubi, saj te O-acetilirajo peptidoglikan na tisti stranski skupini, ki je vključena v nastanek 1,6-anhidromuramoila. Prav tako je bilo dokazano, da je pri tej vrsti bakterij interakcija encima s peptidoglikanom oslabljena. Delovanje na Gram pozitivne bakterije, ki nimajo zaestrenih skupin, in Gram negativne bi lahko izboljšali, če bi poznali natančne mehanizme vezave, da bi te lahko izboljšali. Pri modificiranju encima bi bilo potrebno paziti, da modifikacije ne bi vplivale na procese, ki so povezane z oligomerizacijo.

===N-acetilglukozaminidaze===

Edini strukturno znan endolizin z aktivnostjo N-acetilglukozaminidaze, ki cepi vez za N-acetilglukozaminom je PlyC. Encim je kompleks, sestavljen iz ene velike podenote in homooktamernega obroča. Na veliki podenoti se nahajata obe do sedaj identificirani encimsko aktivni domeni: od cisteina in histidina odvisna amidohidrolazna/peptidazna domena (PlyCCHAP) in N-acetilglukozaminidazna domena (PlyCGyH). Jedro PlyCGyH sestavlja struktura iz šestih α-heliksov, podobno kot pri nekaterih proteinih družine glikozidnih hidrolaz 73 (GH73). Znotraj omenjene regije je ohranjen aminokislinski ostanek Glu78, ki pri reakciji deluje kot kislina. Pri nekaterih encimih iz družine GH73, so bili opaženi možni katalitični aminokislinski ostanki na β-traku nasproti aktivnega mesta, ki pa v primeru PlyC ne obstaja. Zaradi odsotnosti kislih ostankov je verjetno v mehanizmu pozicioniranja in cepitve vezi vključen Tyr74.

====Izboljšave====

Endolizin se je izkazal za učinkovitega, vendar izgubi svojo aktivnost že pri 45˚C, za kar je odgovorna velika podenota, vendar se da z uvedbo mutacij termično stabilnost močno povečati. Za razvoj modificiranih encimov, ki bi delovali na več vrst bakterij, bi rabili več znanih encimov, da bi lahko preučili mehanizme delovanja.

==N-acetilmuramoil-L-alanin amidaze==

N-acetilmuramoil-L-alanin amidaze cepijo amidno vez med N-acetilmuraminsko kislino in L-alaninom. V družino od cinka odvisnih amidaz 2 sodijo PlyL, PlyG, XlyA in LysGH15, ki imajo podobno strukturo in ohranjenost katalitičih ostankov. Zn-ion je koordiniran med molekulo vode, dvema histidinskima in enim cisteinskim ostankom. Pomembna ostanka sta glutamat, ki aktivira vodo za nukleofilni napad, in lizin, ki stabilizira intermediat. Poznani sta dve amidazi PlyPSA in CD27L, ki spadata v skupino od cinka odvisnih amidaz 3. Endolizine te skupine sestavlja β-ploskev iz šest trakov, ki jih obdaja pet α-vijačnic. Zn-ion je koordiniran v vezavnem žepu z dvema histidinskima in enim glutamatskim ostankom. Ohranjena glutamatska ostanka med reakcijo delujeta kot akceptorja protona.

===Izboljšave===

Za namen reguliranja litične aktivnosti je možno skrajšati encim na le encimsko domeno z odstranitvijo vezavne domene, kar vodi do povečanja ali zmanjšanja aktivnosti. Učinki krajšanja endolizinov pri skupini amidaz 2 se razlikujejo, in sicer se lahko litična aktivnost ohrani ali izgubi. Z uvajanjem pozitivno nabitih aminokislin, se da aktivnost povrniti, vendar je ključno, da se te uvedejo okoli aktivnega mesta. Domnevno naj bi skupen pozitiven naboj endolizina ugodno vplival na interakcije s peptidoglikanom. Krajšanje endolizina pri amidazah 3 je imelo ponovno učinke na zmanjšanje in zvečanje aktivnosti. To kaže na nepoznavanje interakcij med encimsko in aktivno domeno pri različnih endolizinih. Boljše razumevanje strukture in delovanja endolizinov iz skupine amidaz 3 bi olajšalo modifikacije le-teh.

==Endopeptidaze==

Endopeptidaze cepijo peptidne vezi med aminokislinami, ki tvorijo polipeptidne verige in interpeptidni most. Raznolikost ostankov, ki tvorijo peptidoglikanske polipeptidne verige in interpeptidni most, kažejo na to, da gre verjetno za raznoliko skupino endolizinov z različnimi mehanizmi, ki ustrezajo različnim vezem. Ta razred endolizinov je zelo slabo razumljen - obstaja samo ena rešena struktura endolizina z endopeptidazno aktivnostjo, Ply500. Encimsko aktivna domena Ply500 za katalizo potrebuje cinkov ion, njena struktura pa spominja na kavč: ena α-vijačnica in tri antiparalelni β-trakovi tvorijo sedež, ki ga podpirata dve α-vijačnici, še ena α-vijačnica skupaj z zanko pa tvori naslonjalo.

Kot večina drugih endolizinov ima tudi Ply500 modularno strukturo, sestavljeno iz domene, ki veže celično steno in encimsko aktivno domeno. Opažena je bila jasna strukturna podobnost s peptidazami, ki spadajo v družino LAS. Njihovo skupno funkcionalno podobnost podpirata skupen vezani Zn2+ ion in aminokislinski ostanki His80, Asp87 in His133 na aktivnem mestu. Dejstvo, da je CBD Ply500 homologen CBD faga Listerie N-acetilmuramoil-1-alanin amidaze PlyPSA, ki ima popolnoma drugačen EAD, ponazarja funkcionalno spremenljivost tega razreda encimov in odpira zanimive možnosti za proteinski inženiring. Na žalost poskusi pridobivanja kristalov celotnega rekombinantnega encima Ply500 niso uspeli, verjetno zaradi prirojene prožnosti njegove arhitekture z dvema domenoma. Najdemo pa tudi variacije znotraj predlaganih katalitičnih ostankov. Cinkov ion je koordiniran z ohranjenimi ostanki His80, Asp87 in His132 in molekulo vode, pri čemer je Asp130 aktivira molekulo vode za nukleofilni napad. Drugi ključni ostanki bi lahko bili Arg50 in Gln55 za stabilizacijo oksianionskega intermediata. Poleg Ply500 pa imamo zelo omejeno mehanično razumevanje te potencialno obsežne skupine endolizinov.

===Izboljšave===

Da bi izboljšali delovanje Ply500, so v eni izmed študij kombinirali njegov CBD s PlyP35, kar je povzročilo 50-kratno povečanje afinitete vezave na celično steno (KA = 2,93 × 1010 M-1), kar omogoča visoko učinkovito imobilizacijo tarčnih celic. Pokazali so tudi, da se lahko afiniteto vezave še poveča s povečanjem kopij istega CBD-ja v enem fuzijskem konstruktu. Poleg tega povečana afiniteta do celične stene verjetno povzroči močnejšo vezavo pri visoki ionski jakosti, kar pojasnjuje opažanje, da je Ply500 endolizin z podvojenim CBD pokazal povečano aktivnost pri povišanih koncentracijah soli. V določenih primerih lahko modularni inženiring endolizinov rešuje tudi težave z topnostjo, kar zagotavlja učinkovito proizvodnjo in čiščenje sicer netopnih litičnih proteinov.

==CHAP==

Struktura encimsko aktivnih domen endolizina je odvisna od cepljene peptidoglikanske vezi. Vendar pa ima en razred encimsko aktivnih domen, cistein histidinsko odvisna domena amidohidrolaze/peptidaze (CHAP - cysteine histidine-dependent amidohydrolase/peptidase), lahko amidazno ali endopeptidazno aktivnost. CHAP domena ima lahko tudi obe aktivnosti v enem polipeptidu, kar lahko opazimo v PlyGRCS. Žal struktura tega endolizina še ni bila rešena, zato molekularni mehanizem dvojne aktivnosti ostaja neznan.
Značilnost CHAP endolizinov sta ostanka cistein in histidin, kjer stranska veriga cisteina verjetno deluje kot nukleofil, ki ga aktivira histidin. Kako so podobna endolizinska zvitja sposobna cepiti različne vezi, ni povsem jasno, vendar ima možnost vključitve dvojne aktivnosti, kot je razvidno iz PlyGRCS, v eno aktivno domeno CHAP zanimiv potencial za antibakterijsko uporabo.

==Viri==

Love, M. J., Abeysekera, G. S., Muscroft-Taylor, A. C., Billington, C. & Dobson, R. C. J. On the catalytic mechanism of bacteriophage endolysins: Opportunities for engineering. Biochimica et Biophysica Acta - Proteins and Proteomics vol. 1868 140302 (2020).

São-José, C. Engineering of phage-derived lytic enzymes: Improving their potential as antimicrobials. Antibiotics vol. 7 (2018).

Korndörfer, I. P., Kanitz, A., Danzer, J., Zimmer, M., Loessner, M. J., & Skerra, A. (2008). Structural analysis of the L-alanoyl-D-glutamate endopeptidase domain of Listeria bacteriophage endolysin Ply500 reveals a new member of the LAS peptidase family. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography, 64(6), 644–650. doi: 10.1107/s0907444908007890

Gerstmans, H., Criel, B. & Briers, Y. Synthetic biology of modular endolysins. Biotechnol. Adv. 36, 624–640 (2018).

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Fagni endolizini: mehanizem delovanja in možnosti za izboljšave

2020-05-04T18:18:39Z

Greta Junger:

Endolizini so pestra družina encimov, zapisanih v bakteriofagnem genomu. Izrazijo se znotraj gostiteljske celice na koncu bakteriofagnega litičnega cikla, ko razgradijo bakterijsko peptidoglikansko steno (PG). To povzroči lizo celice in sprostitev na novo ustvarjenih bakteriofagov v okolico.

Naravno antibiotično funkcijo endolizinov lahko s pridom uporabimo pri sintezi encimskih antibiotikov, ki so zaradi svojega načina delovanja hitrejši in bolj specifični od standardnih antibiotikov. Poleg tega je možnost nastanka rezistence na njih majhna, saj cepijo konservativne peptidoglikanske vezi, ki jih bakterija težje spremeni, ob tem pa jim ni potrebno niti vstopiti v celico. Čeprav so endolizini perspektivni, pa je prostora za izboljšave še veliko. S pomočjo različnih bioinženirskih modifikacij se znanstveniki trudijo optimizirati njihovo delovanje v fizioloških pogojih (npr. topnost, obstojnost v krvni plazmi, aktivnost pri fiziološkem pH, specifičnost…) Na začetku je bila eksogena uporaba endolizinov možna le na Grampozitivnih bakterijah, z leti raziskav in modifikacij pa so delovanje nekaterih uspeli razširiti tudi na Gramnegativne.

==Delitev endolizinov==

===Struktura===

Po strukturi jih delimo na enodomenske globularne, ki so bolj značilni za Gramnegativne bakterije, in dvodomenske modularne, ki se pojavijo pri obeh tipih. V modularnih je N-končna encimsko aktivna domena (EAD) s kratko, fleksibilno verigo povezana s C-končno, ki je specifična za vezavo na celično steno (CBD). Zaradi take strukture modularni endolizini predstavljajo večji potencial za bioinženirske izboljšave, saj se posamezni domeni lahko obravnava ločeno ter se ju lahko neodvisno spreminja (npr. točkovna mutacija), doda ali odstrani. S tem nastane protein z novo ali izboljšano funkcijo. V modularnih endolizinih, ki delujejo na Gramnegativne bakterije (slednji so sicer redki), pa sta domeni zamenjani. Čeprav je CBD specifična za vezavo na PG, pa njena prisotnost za delovanje endolizina ni vedno ključna. V nekaterih primerih njihova aktivnost ob odstranitvi CBD ni nič slabša ali je celo povečana.

===Katalitska zmožnost===

Endolizini se delijo tudi glede na katalitske zmožnosti. Peptidoglikanska stena je sestavljena iz ponavljajočih se enot N-acetilglukozamina in N-acetilmuraminske kisline, ki so med sabo povezane z β-(1,4)-glikozidno vezjo. To vez cepijo N-acetilglikozidaze. Na N-acetilmuraminsko kislino je z amidno vezjo pripeta peptidna veriga iz 3-5 aminokislin. Posamezne verige so med sabo navzkrižno povezane. Amidno vez cepijo N-acetilmuramoil-L-alanin amidaze, peptidno vez med aminokislinami in posameznimi peptidnimi verigami pa endopeptidaze.

==N-acetilglikozidaze==

===N-acetilmuramidaze===

N-acetilmuramidaze, ki delujejo na Grampozitivne bakterije, spadajo v družino glikozidnih hidrolaz 25. Vez cepijo na reducirajočem koncu N-acetilmuraminske kisline po enem izmed dveh predlaganih mehanizmov. Pri prvem so za katalizo ključni trije aspartati in en glutamat. Najprej Asp deprotonira molekulo vode, ki nato kot nukleofil napade β-1,4 vez. Istočasno Glu donira svoj proton, tako da pride do inverzije anomernega centra. Preko preostalih dveh Asp se katalitsko mesto regenerira. Pri drugem mehanizmu sta ključna aminokislinska ostanka le Asp in Glu. Asp veže substrat, v katerem pride do intramolekularnega nukleofilnega napada N-acetoamidne stranske skupine na β-1,4 vez. Nato Glu deprotonira molekulo vode, ki nukleofilno napade anomerni C atom, vendar tako, da se anomerni center ohrani.

====Izboljšave====
N-acetilmuramidaze imajo velik potencial za bioinženirsko izboljšavo. Dober primer sta za pnevmokoke specifična Cpl-1 in Cpl-7. Cpl-7 ima zelo aktivno EAD, vendar ima kljub temu nižjo bakteriolitično zmožnost kot Cpl-1. Razlog za to je bolj negativen neto naboj Cpl-7 pri fiziološkem pH kot pri Cpl-1. Z zamenjavo 5 aminokislin so neto naboj spremenili na pozitiven ter ustvarili spremenjen encim Cpl-7S, ki je kazal izboljšano bakteriolitično zmožnost proti pnevmokokom in nekaterim drugim bakterijam. S kombinacijo CBD iz Cpl-1 in EAD iz Cpl-7 so ustvarili himerolizin Cpl-711 z izboljšanimi bakteriolitičnimi značilnosti v primerjavi s starševskima endolizinoma. Z bioinženirsko metodo pa se ne trudijo le povečati bakteriolitične funkcije enzobiotikov, pač pa tudi podaljšati njihovo življenjsko dobo v krvni plazmi. Iz tam so namreč majhni proteini zaradi delovanja ledvic hitro izločeni. V ta namen so v posamezni monomer Cpl-1 vpeljali cisteine, ki so nato med seboj tvorili intermolekularne disulfidne vezi. Nastali Cpl-1 dimer je poleg podaljšane življenjske dobe v krvni plazmi kazal tudi dvakrat večjo specifičnost.

===Litične transglikozilaze===

Litične transglikozilaze tako kot N-acetilmuramidaze cepijo β-1,4 vez med N-acetilglukozaminom in N-acetilmuraminsko kislino, pri čemer nastane 1,6-anhidromuramoil, vendar z razliko, da za delovanje ne potrebujejo vode. Edini endolizin iz tega razreda, ki so ga uspeli kristalizirati in potrditi njegovo katalitično funkcijo je Gp144 (deluje na Pseudomonas aeruginoso). Prav tako je eden izmed redkih, ki deluje na Gram negativne bakterije. Endolizin v raztopini obstaja v različnih oligomernih oblikah, in sicer kot mono-, di- in trimer. V cepitev vezi je vpleten Glu115, vendar rezultati več raziskav kažejo, da je vpleten tudi Glu178.

====Izboljšave====

Pri Gram pozitivnih bakterijah se je izkazalo, da se ta aktivnost izgubi, saj te O-acetilirajo peptidoglikan na tisti stranski skupini, ki je vključena v nastanek 1,6-anhidromuramoila. Prav tako je bilo dokazano, da je pri tej vrsti bakterij interakcija encima s peptidoglikanom oslabljena. Delovanje na Gram pozitivne bakterije, ki nimajo zaestrenih skupin, in Gram negativne bi lahko izboljšali, če bi poznali natančne mehanizme vezave, da bi te lahko izboljšali. Pri modificiranju encima bi bilo potrebno paziti, da modifikacije ne bi vplivale na procese, ki so povezane z oligomerizacijo.

===N-acetilglukozaminidaze===

Edini strukturno znan endolizin z aktivnostjo N-acetilglukozaminidaze, ki cepi vez za N-acetilglukozaminom je PlyC. Encim je kompleks, sestavljen iz ene velike podenote in homooktamernega obroča. Na veliki podenoti se nahajata obe do sedaj identificirani encimsko aktivni domeni: od cisteina in histidina odvisna amidohidrolazna/peptidazna domena (PlyCCHAP) in N-acetilglukozaminidazna domena (PlyCGyH). Jedro PlyCGyH sestavlja struktura iz šestih α-heliksov, podobno kot pri nekaterih proteinih družine glikozidnih hidrolaz 73 (GH73). Znotraj omenjene regije je ohranjen aminokislinski ostanek Glu78, ki pri reakciji deluje kot kislina. Pri nekaterih encimih iz družine GH73, so bili opaženi možni katalitični aminokislinski ostanki na β-traku nasproti aktivnega mesta, ki pa v primeru PlyC ne obstaja. Zaradi odsotnosti kislih ostankov je verjetno v mehanizmu pozicioniranja in cepitve vezi vključen Tyr74.

====Izboljšave====

Endolizin se je izkazal za učinkovitega, vendar izgubi svojo aktivnost že pri 45˚C, za kar je odgovorna velika podenota, vendar se da z uvedbo mutacij termično stabilnost močno povečati. Za razvoj modificiranih encimov, ki bi delovali na več vrst bakterij, bi rabili več znanih encimov, da bi lahko preučili mehanizme delovanja.

==N-acetilmuramoil-L-alanin amidaze==

N-acetilmuramoil-L-alanin amidaze cepijo amidno vez med N-acetilmuraminsko kislino in L-alaninom. V družino od cinka odvisnih amidaz 2 sodijo PlyL, PlyG, XlyA in LysGH15, ki imajo podobno strukturo in ohranjenost katalitičih ostankov. Zn-ion je koordiniran med molekulo vode, dvema histidinskima in enim cisteinskim ostankom. Pomembna ostanka sta glutamat, ki aktivira vodo za nukleofilni napad, in lizin, ki stabilizira intermediat. Poznani sta dve amidazi PlyPSA in CD27L, ki spadata v skupino od cinka odvisnih amidaz 3. Endolizine te skupine sestavlja β-ploskev iz šest trakov, ki jih obdaja pet α-vijačnic. Zn-ion je koordiniran v vezavnem žepu z dvema histidinskima in enim glutamatskim ostankom. Ohranjena glutamatska ostanka med reakcijo delujeta kot akceptorja protona.

===Izboljšave===

Za namen reguliranja litične aktivnosti je možno skrajšati encim na le encimsko domeno z odstranitvijo vezavne domene, kar vodi do povečanja ali zmanjšanja aktivnosti. Učinki krajšanja endolizinov pri skupini amidaz 2 se razlikujejo, in sicer se lahko litična aktivnost ohrani ali izgubi. Z uvajanjem pozitivno nabitih aminokislin, se da aktivnost povrniti, vendar je ključno, da se te uvedejo okoli aktivnega mesta. Domnevno naj bi skupen pozitiven naboj endolizina ugodno vplival na interakcije s peptidoglikanom. Krajšanje endolizina pri amidazah 3 je imelo ponovno učinke na zmanjšanje in zvečanje aktivnosti. To kaže na nepoznavanje interakcij med encimsko in aktivno domeno pri različnih endolizinih. Boljše razumevanje strukture in delovanja endolizinov iz skupine amidaz 3 bi olajšalo modifikacije le-teh.

==Endopeptidaze==

Endopeptidaze cepijo peptidne vezi med aminokislinami, ki tvorijo polipeptidne verige in interpeptidni most. Raznolikost ostankov, ki tvorijo peptidoglikanske polipeptidne verige in interpeptidni most, kažejo na to, da gre verjetno za raznoliko skupino endolizinov z različnimi mehanizmi, ki ustrezajo različnim vezem. Ta razred endolizinov je zelo slabo razumljen - obstaja samo ena rešena struktura endolizina z endopeptidazno aktivnostjo, Ply500. Encimsko aktivna domena Ply500 za katalizo potrebuje cinkov ion, njena struktura pa spominja na kavč: ena α-vijačnica in tri antiparalelni β-trakovi tvorijo sedež, ki ga podpirata dve α-vijačnici, še ena α-vijačnica skupaj z zanko pa tvori naslonjalo.

Kot večina drugih endolizinov ima tudi Ply500 modularno strukturo, sestavljeno iz domene, ki veže celično steno in encimsko aktivno domeno. Opažena je bila jasna strukturna podobnost s peptidazami, ki spadajo v družino LAS. Njihovo skupno funkcionalno podobnost podpirata skupen vezani Zn2+ ion in aminokislinski ostanki His80, Asp87 in His133 na aktivnem mestu. Dejstvo, da je CBD Ply500 homologen CBD faga Listerie N-acetilmuramoil-1-alanin amidaze PlyPSA, ki ima popolnoma drugačen EAD, ponazarja funkcionalno spremenljivost tega razreda encimov in odpira zanimive možnosti za proteinski inženiring. Na žalost poskusi pridobivanja kristalov celotnega rekombinantnega encima Ply500 niso uspeli, verjetno zaradi prirojene prožnosti njegove arhitekture z dvema domenoma. Najdemo pa tudi variacije znotraj predlaganih katalitičnih ostankov. Cinkov ion je koordiniran z ohranjenimi ostanki His80, Asp87 in His132 in molekulo vode, pri čemer je Asp130 aktivira molekulo vode za nukleofilni napad. Drugi ključni ostanki bi lahko bili Arg50 in Gln55 za stabilizacijo oksianionskega intermediata. Poleg Ply500 pa imamo zelo omejeno mehanično razumevanje te potencialno obsežne skupine endolizinov.

===Izboljšave===

Da bi izboljšali delovanje Ply500, so v eni izmed študij kombinirali njegov CBD s PlyP35, kar je povzročilo 50-kratno povečanje afinitete vezave na celično steno (KA = 2,93 × 1010 M-1), kar omogoča visoko učinkovito imobilizacijo tarčnih celic. Pokazali so tudi, da se lahko afiniteto vezave še poveča s povečanjem kopij istega CBD-ja v enem fuzijskem konstruktu. Poleg tega povečana afiniteta do celične stene verjetno povzroči močnejšo vezavo pri visoki ionski jakosti, kar pojasnjuje opažanje, da je Ply500 endolizin z podvojenim CBD pokazal povečano aktivnost pri povišanih koncentracijah soli. V določenih primerih lahko modularni inženiring endolizinov rešuje tudi težave z topnostjo, kar zagotavlja učinkovito proizvodnjo in čiščenje sicer netopnih litičnih proteinov.

==CHAP==

Struktura encimsko aktivnih domen endolizina je odvisna od cepljene peptidoglikanske vezi. Vendar pa ima en razred encimsko aktivnih domen, cistein histidinsko odvisna domena amidohidrolaze/peptidaze (CHAP - cysteine histidine-dependent amidohydrolase/peptidase), lahko amidazno ali endopeptidazno aktivnost. CHAP domena ima lahko tudi obe aktivnosti v enem polipeptidu, kar lahko opazimo v PlyGRCS. Žal struktura tega endolizina še ni bila rešena, zato molekularni mehanizem dvojne aktivnosti ostaja neznan.
Značilnost CHAP endolizinov sta ostanka cistein in histidin, kjer stranska veriga cisteina verjetno deluje kot nukleofil, ki ga aktivira histidin. Kako so podobna endolizinska zvitja sposobna cepiti različne vezi, ni povsem jasno, vendar ima možnost vključitve dvojne aktivnosti, kot je razvidno iz PlyGRCS, v eno aktivno domeno CHAP zanimiv potencial za antibakterijsko uporabo.

==Viri==

Love, M. J., Abeysekera, G. S., Muscroft-Taylor, A. C., Billington, C. & Dobson, R. C. J. On the catalytic mechanism of bacteriophage endolysins: Opportunities for engineering. Biochimica et Biophysica Acta - Proteins and Proteomics vol. 1868 140302 (2020).

São-José, C. Engineering of phage-derived lytic enzymes: Improving their potential as antimicrobials. Antibiotics vol. 7 (2018).

Korndörfer, I. P., Kanitz, A., Danzer, J., Zimmer, M., Loessner, M. J., & Skerra, A. (2008). Structural analysis of the L-alanoyl-D-glutamate endopeptidase domain of Listeria bacteriophage endolysin Ply500 reveals a new member of the LAS peptidase family. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography, 64(6), 644–650. doi: 10.1107/s0907444908007890

Gerstmans, H., Criel, B. & Briers, Y. Synthetic biology of modular endolysins. Biotechnol. Adv. 36, 624–640 (2018).

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Fagni endolizini: mehanizem delovanja in možnosti za izboljšave

2020-05-04T18:03:38Z

Greta Junger: /* Viri */

Endolizini so pestra družina encimov, zapisanih v bakteriofagnem genomu. Izrazijo se znotraj gostiteljske celice na koncu bakteriofagnega litičnega cikla, ko razgradijo bakterijsko peptidoglikansko steno (PG). To povzroči lizo celice in sprostitev na novo ustvarjenih bakteriofagov v okolico.

Naravno antibiotično funkcijo endolizinov lahko s pridom uporabimo pri sintezi encimskih antibiotikov. Ker njihovo delovanje temelji na encimski aktivnosti, so hitrejši in bolj specifični od standardnih antibiotikov, obenem pa je možnost nastanka rezistence na njih majhna, saj cepijo konservativne peptidoglikanske vezi, ki jih bakterija težje spremeni. Poleg tega terapevtsko uporabljeni endolizini delujejo na PG od zunaj, torej jim za delovanje ni potrebno dejansko vstopiti v celico. Čeprav je bila na začetku eksogena uporaba endolizinov možna le na Grampozitivnih bakterijah, ki nimajo zunanje membrane, pa so s pomočjo bioinženirskih izboljšav razširili delovanje nekaterih endolizinov tudi na Gramnegativne.

==Delitev endolizinov==

===Struktura===

Po strukturi jih delimo na enodomenske globularne, ki so bolj značilni za Gramnegativne bakterije, in dvodomenske modularne, ki se pojavijo pri obeh tipih. V modularnih je N-končna encimsko aktivna domena (EAD) s kratko, fleksibilno verigo povezana s C-končno, ki je specifična za vezavo na celično steno (CBD). Zaradi take strukture modularni endolizini predstavljajo večji potencial za bioinženirske izboljšave, saj se posamezni domeni lahko obravnava ločeno ter se ju lahko neodvisno spreminja (npr. točkovna mutacija), doda ali odstrani. S tem nastane protein z novo ali izboljšano funkcijo. V modularnih endolizinih, ki delujejo na Gramnegativne bakterije (slednji so sicer redki), pa sta domeni zamenjani. Čeprav je CBD specifična za vezavo na PG, pa njena prisotnost za delovanje endolizina ni vedno ključna. V nekaterih primerih njihova aktivnost ob odstranitvi CBD ni nič slabša ali je celo povečana.

===Katalitska zmožnost===

Endolizini se delijo tudi glede na katalitske zmožnosti. Peptidoglikanska stena je sestavljena iz ponavljajočih se enot N-acetilglukozamina in N-acetilmuraminske kisline, ki so med sabo povezane z β-(1,4)-glikozidno vezjo. To vez cepijo N-acetilglikozidaze. Na N-acetilmuraminsko kislino je z amidno vezjo pripeta peptidna veriga iz 3-5 aminokislin. Posamezne verige so med sabo navzkrižno povezane. Amidno vez cepijo N-acetilmuramoil-L-alanin amidaze, peptidno vez med aminokislinami in posameznimi peptidnimi verigami pa endopeptidaze.

==N-acetilglikozidaze==

===N-acetilmuramidaze===

N-acetilmuramidaze, ki delujejo na Grampozitivne bakterije, spadajo v družino glikozidnih hidrolaz 25. Vez cepijo na reducirajočem koncu N-acetilmuraminske kisline po enem izmed dveh predlaganih mehanizmov. Pri prvem so za katalizo ključni trije aspartati in en glutamat. Najprej Asp deprotonira molekulo vode, ki nato kot nukleofil napade β-1,4 vez. Istočasno Glu donira svoj proton, tako da pride do inverzije anomernega centra. Preko preostalih dveh Asp se katalitsko mesto regenerira. Pri drugem mehanizmu sta ključna aminokislinska ostanka le Asp in Glu. Asp veže substrat, v katerem pride do intramolekularnega nukleofilnega napada N-acetoamidne stranske skupine na β-1,4 vez. Nato Glu deprotonira molekulo vode, ki nukleofilno napade anomerni C atom, vendar tako, da se anomerni center ohrani.

====Izboljšave====
N-acetilmuramidaze imajo velik potencial za bioinženirsko izboljšavo. Dober primer sta za pnevmokoke specifična Cpl-1 in Cpl-7. Cpl-7 ima zelo aktivno EAD, vendar ima kljub temu nižjo bakteriolitično zmožnost kot Cpl-1. Razlog za to je bolj negativen neto naboj Cpl-7 pri fiziološkem pH kot pri Cpl-1. Z zamenjavo 5 aminokislin so neto naboj spremenili na pozitiven ter ustvarili spremenjen encim Cpl-7S, ki je kazal izboljšano bakteriolitično zmožnost proti pnevmokokom in nekaterim drugim bakterijam. S kombinacijo CBD iz Cpl-1 in EAD iz Cpl-7 so ustvarili himerolizin Cpl-711 z izboljšanimi bakteriolitičnimi značilnosti v primerjavi s starševskima endolizinoma. Z bioinženirsko metodo pa se ne trudijo le povečati bakteriolitične funkcije enzobiotikov, pač pa tudi podaljšati njihovo življenjsko dobo v krvni plazmi. Iz tam so namreč majhni proteini zaradi delovanja ledvic hitro izločeni. V ta namen so v posamezni monomer Cpl-1 vpeljali cisteine, ki so nato med seboj tvorili intermolekularne disulfidne vezi. Nastali Cpl-1 dimer je poleg podaljšane življenjske dobe v krvni plazmi kazal tudi dvakrat večjo specifičnost.

===Litične transglikozilaze===

Litične transglikozilaze tako kot N-acetilmuramidaze cepijo β-1,4 vez med N-acetilglukozaminom in N-acetilmuraminsko kislino, pri čemer nastane 1,6-anhidromuramoil, vendar z razliko, da za delovanje ne potrebujejo vode. Edini endolizin iz tega razreda, ki so ga uspeli kristalizirati in potrditi njegovo katalitično funkcijo je Gp144 (deluje na Pseudomonas aeruginoso). Prav tako je eden izmed redkih, ki deluje na Gram negativne bakterije. Endolizin v raztopini obstaja v različnih oligomernih oblikah, in sicer kot mono-, di- in trimer. V cepitev vezi je vpleten Glu115, vendar rezultati več raziskav kažejo, da je vpleten tudi Glu178.

====Izboljšave====

Pri Gram pozitivnih bakterijah se je izkazalo, da se ta aktivnost izgubi, saj te O-acetilirajo peptidoglikan na tisti stranski skupini, ki je vključena v nastanek 1,6-anhidromuramoila. Prav tako je bilo dokazano, da je pri tej vrsti bakterij interakcija encima s peptidoglikanom oslabljena. Delovanje na Gram pozitivne bakterije, ki nimajo zaestrenih skupin, in Gram negativne bi lahko izboljšali, če bi poznali natančne mehanizme vezave, da bi te lahko izboljšali. Pri modificiranju encima bi bilo potrebno paziti, da modifikacije ne bi vplivale na procese, ki so povezane z oligomerizacijo.

===N-acetilglukozaminidaze===

Edini strukturno znan endolizin z aktivnostjo N-acetilglukozaminidaze, ki cepi vez za N-acetilglukozaminom je PlyC. Encim je kompleks, sestavljen iz ene velike podenote in homooktamernega obroča. Na veliki podenoti se nahajata obe do sedaj identificirani encimsko aktivni domeni: od cisteina in histidina odvisna amidohidrolazna/peptidazna domena (PlyCCHAP) in N-acetilglukozaminidazna domena (PlyCGyH). Jedro PlyCGyH sestavlja struktura iz šestih α-heliksov, podobno kot pri nekaterih proteinih družine glikozidnih hidrolaz 73 (GH73). Znotraj omenjene regije je ohranjen aminokislinski ostanek Glu78, ki pri reakciji deluje kot kislina. Pri nekaterih encimih iz družine GH73, so bili opaženi možni katalitični aminokislinski ostanki na β-traku nasproti aktivnega mesta, ki pa v primeru PlyC ne obstaja. Zaradi odsotnosti kislih ostankov je verjetno v mehanizmu pozicioniranja in cepitve vezi vključen Tyr74.

====Izboljšave====

Endolizin se je izkazal za učinkovitega, vendar izgubi svojo aktivnost že pri 45˚C, za kar je odgovorna velika podenota, vendar se da z uvedbo mutacij termično stabilnost močno povečati. Za razvoj modificiranih encimov, ki bi delovali na več vrst bakterij, bi rabili več znanih encimov, da bi lahko preučili mehanizme delovanja.

==N-acetilmuramoil-L-alanin amidaze==

N-acetilmuramoil-L-alanin amidaze cepijo amidno vez med N-acetilmuraminsko kislino in L-alaninom. V družino od cinka odvisnih amidaz 2 sodijo PlyL, PlyG, XlyA in LysGH15, ki imajo podobno strukturo in ohranjenost katalitičih ostankov. Zn-ion je koordiniran med molekulo vode, dvema histidinskima in enim cisteinskim ostankom. Pomembna ostanka sta glutamat, ki aktivira vodo za nukleofilni napad, in lizin, ki stabilizira intermediat. Poznani sta dve amidazi PlyPSA in CD27L, ki spadata v skupino od cinka odvisnih amidaz 3. Endolizine te skupine sestavlja β-ploskev iz šest trakov, ki jih obdaja pet α-vijačnic. Zn-ion je koordiniran v vezavnem žepu z dvema histidinskima in enim glutamatskim ostankom. Ohranjena glutamatska ostanka med reakcijo delujeta kot akceptorja protona.

===Izboljšave===

Za namen reguliranja litične aktivnosti je možno skrajšati encim na le encimsko domeno z odstranitvijo vezavne domene, kar vodi do povečanja ali zmanjšanja aktivnosti. Učinki krajšanja endolizinov pri skupini amidaz 2 se razlikujejo, in sicer se lahko litična aktivnost ohrani ali izgubi. Z uvajanjem pozitivno nabitih aminokislin, se da aktivnost povrniti, vendar je ključno, da se te uvedejo okoli aktivnega mesta. Domnevno naj bi skupen pozitiven naboj endolizina ugodno vplival na interakcije s peptidoglikanom. Krajšanje endolizina pri amidazah 3 je imelo ponovno učinke na zmanjšanje in zvečanje aktivnosti. To kaže na nepoznavanje interakcij med encimsko in aktivno domeno pri različnih endolizinih. Boljše razumevanje strukture in delovanja endolizinov iz skupine amidaz 3 bi olajšalo modifikacije le-teh.

==Endopeptidaze==

Endopeptidaze cepijo peptidne vezi med aminokislinami, ki tvorijo polipeptidne verige in interpeptidni most. Raznolikost ostankov, ki tvorijo peptidoglikanske polipeptidne verige in interpeptidni most, kažejo na to, da gre verjetno za raznoliko skupino endolizinov z različnimi mehanizmi, ki ustrezajo različnim vezem. Ta razred endolizinov je zelo slabo razumljen - obstaja samo ena rešena struktura endolizina z endopeptidazno aktivnostjo, Ply500. Encimsko aktivna domena Ply500 za katalizo potrebuje cinkov ion, njena struktura pa spominja na kavč: ena α-vijačnica in tri antiparalelni β-trakovi tvorijo sedež, ki ga podpirata dve α-vijačnici, še ena α-vijačnica skupaj z zanko pa tvori naslonjalo.

Kot večina drugih endolizinov ima tudi Ply500 modularno strukturo, sestavljeno iz domene, ki veže celično steno in encimsko aktivno domeno. Opažena je bila jasna strukturna podobnost s peptidazami, ki spadajo v družino LAS. Njihovo skupno funkcionalno podobnost podpirata skupen vezani Zn2+ ion in aminokislinski ostanki His80, Asp87 in His133 na aktivnem mestu. Dejstvo, da je CBD Ply500 homologen CBD faga Listerie N-acetilmuramoil-1-alanin amidaze PlyPSA, ki ima popolnoma drugačen EAD, ponazarja funkcionalno spremenljivost tega razreda encimov in odpira zanimive možnosti za proteinski inženiring. Na žalost poskusi pridobivanja kristalov celotnega rekombinantnega encima Ply500 niso uspeli, verjetno zaradi prirojene prožnosti njegove arhitekture z dvema domenoma. Najdemo pa tudi variacije znotraj predlaganih katalitičnih ostankov. Cinkov ion je koordiniran z ohranjenimi ostanki His80, Asp87 in His132 in molekulo vode, pri čemer je Asp130 aktivira molekulo vode za nukleofilni napad. Drugi ključni ostanki bi lahko bili Arg50 in Gln55 za stabilizacijo oksianionskega intermediata. Poleg Ply500 pa imamo zelo omejeno mehanično razumevanje te potencialno obsežne skupine endolizinov.

===Izboljšave===

Da bi izboljšali delovanje Ply500, so v eni izmed študij kombinirali njegov CBD s PlyP35, kar je povzročilo 50-kratno povečanje afinitete vezave na celično steno (KA = 2,93 × 1010 M-1), kar omogoča visoko učinkovito imobilizacijo tarčnih celic. Pokazali so tudi, da se lahko afiniteto vezave še poveča s povečanjem kopij istega CBD-ja v enem fuzijskem konstruktu. Poleg tega povečana afiniteta do celične stene verjetno povzroči močnejšo vezavo pri visoki ionski jakosti, kar pojasnjuje opažanje, da je Ply500 endolizin z podvojenim CBD pokazal povečano aktivnost pri povišanih koncentracijah soli. V določenih primerih lahko modularni inženiring endolizinov rešuje tudi težave z topnostjo, kar zagotavlja učinkovito proizvodnjo in čiščenje sicer netopnih litičnih proteinov.

==CHAP==

Struktura encimsko aktivnih domen endolizina je odvisna od cepljene peptidoglikanske vezi. Vendar pa ima en razred encimsko aktivnih domen, cistein histidinsko odvisna domena amidohidrolaze/peptidaze (CHAP - cysteine histidine-dependent amidohydrolase/peptidase), lahko amidazno ali endopeptidazno aktivnost. CHAP domena ima lahko tudi obe aktivnosti v enem polipeptidu, kar lahko opazimo v PlyGRCS. Žal struktura tega endolizina še ni bila rešena, zato molekularni mehanizem dvojne aktivnosti ostaja neznan.
Značilnost CHAP endolizinov sta ostanka cistein in histidin, kjer stranska veriga cisteina verjetno deluje kot nukleofil, ki ga aktivira histidin. Kako so podobna endolizinska zvitja sposobna cepiti različne vezi, ni povsem jasno, vendar ima možnost vključitve dvojne aktivnosti, kot je razvidno iz PlyGRCS, v eno aktivno domeno CHAP zanimiv potencial za antibakterijsko uporabo.

==Viri==

Love, M. J., Abeysekera, G. S., Muscroft-Taylor, A. C., Billington, C. & Dobson, R. C. J. On the catalytic mechanism of bacteriophage endolysins: Opportunities for engineering. Biochimica et Biophysica Acta - Proteins and Proteomics vol. 1868 140302 (2020).

São-José, C. Engineering of phage-derived lytic enzymes: Improving their potential as antimicrobials. Antibiotics vol. 7 (2018).

Korndörfer, I. P., Kanitz, A., Danzer, J., Zimmer, M., Loessner, M. J., & Skerra, A. (2008). Structural analysis of the L-alanoyl-D-glutamate endopeptidase domain of Listeria bacteriophage endolysin Ply500 reveals a new member of the LAS peptidase family. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography, 64(6), 644–650. doi: 10.1107/s0907444908007890

Gerstmans, H., Criel, B. & Briers, Y. Synthetic biology of modular endolysins. Biotechnol. Adv. 36, 624–640 (2018).

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Fagni endolizini: mehanizem delovanja in možnosti za izboljšave

2020-05-04T16:52:31Z

Greta Junger: New page: Endolizini so pestra družina encimov, zapisanih v bakteriofagnem genomu. Izrazijo se znotraj gostiteljske celice na koncu bakteriofagnega litičnega cikla, ko razgradijo bakterijsko pepti...

BIO2 Povzetki seminarjev 2019

2019-11-08T18:08:20Z

Greta Junger: /* Greta Junger: INTERMEDIATI CIKLA CITRONSKE KISLINE: SIGNALNE MOLEKULE POD KRINKO */

== Kim Glavič: ATP KOT SIGNALNA MOLEKULA ŽIVALI IN RASTLIN ==

Molekula ATP ni le temeljni vir energije za mnoge procese v celici, temveč tudi signalna molekula v zunajceličnem matriksu živali in rastlin. ATP, kot velika polarna molekula, se iz celic rastlin izloči s pomočjo eksocitotskih veziklov ali ATP prenašalcev. Iz živalskih celic pa s pomočjo eksocitotskih veziklov, ATP prenašalcev ali koneksonskih hemikanalčkov. Ob povečanih koncentracijah molekul ATP v zunajceličnem matriksu se te vežejo na ustrezne P2- receptorje. Po sprostitvi nazaj v matriks pa njihovo koncentracijo uravnavajo ekto-nukleotidaze. Na splošno aktivacija P2- receptorjev povzroči povišanje koncentracije kalcijevih ionov in dušikovega monoksida v citosolu celice ter nastanek reaktivnih kisikovih zvrsti v zunajceličnem matriksu. Kalcijevi ioni, dušikov monoksid in reaktivne kisikove zvrsti so sekundarni obveščevalci, ki so ključni za fiziološki odziv celice. Rastlinska ATP-signalizacija ima pomembno vlogo pri časovni regulaciji kalitve cvetnega prahu, rasti pelodne cevke, nastanku koreninskih gomoljev in zaznavanju ter posledično izogibanju oviram pri rasti korenin. Živalska ATP-signalizacija sodeluje pri nastanku imunskega odziva, prenosu živčnih signalov, celični smrti in regulaciji mnogih drugih procesov.

== Tevž Levstek: GLICINSKI TRANSPORTERJI KOT TERAPEVTSKE TARČE ==

Glicin je proteinogena aminokislina, ki opravlja tudi funkcijo signalne molekule, natančneje nevrotransmiterja. Najdemo ga v dveh vrstah sinaps: glicinergičnih, kjer je glavni nevrotransmiter in glutamatergičnih, kjer ima pomožno vlogo, saj pomaga glutamatu pri signaliziranju. Koncentracije glicina v medceličnini regulirajo glicinski transporterji, ki jih delimo na GlyT1 in GlyT2. Glicinergična sinapsa je inhibitorna, kar pomeni, da če glicin aktivira svoj receptor, posinaptično celico hiperpolarizira (še poveča raven kloridnih ionov v njej). V tej sinapsi GlyT1 zmanjšuje koncentracijo glicina, saj ga transportira v okoliške glia celice. GlyT2 po drugi strani pa zvišuje koncentracijo glicina, saj zbira razpršen glicin, ga reciklira in omogoči ponovno usmerjeno pošiljanje proti receptorjem. V glutamatergičnih sinapsah pa je glicin skupaj z glutamatom ekscitatorna signalna molekula. Če se glicin veže na protein NMDA, ki je na posinaptični membrani, mu s pozitivno alosterično modifikacijo olajša vezavo z glutamatom, ki odpre kationski kanalček in depolarizira celico. Tu regulira koncentracijo glicina le GlyT1, ki jo zmanjšuje, GlyT2 pa tu ne nastopa. Razumevanje delovanja obeh sinaps nam lahko omogoči sintezo novih zdravil, ki bi bolj učinkovito delovala proti nekaterim duševnim boleznim kot so shizofrenija, alkoholizem, obsesivno-kompulzivna motnja in še precej drugim. Ta zdravila najpogosteje inhibirajo delovanje GlyT1 in imajo veliko uspešnost pri glodalcih. Pri ljudeh pa na žalost še ni bilo dobrih rezultatov in na razvoj tovrstnega zdravila še čakamo.

== Ana Potočnik: FOSFATIDILSERIN KOT SIGNALNA MOLEKULA ==

Fosfatidilserin je glicerofosfolipid in pomemben gradnik celičnih membran. V zdravih in živečih celicah se nahaja izključno na notranji, citosolni strani fosfolipidnega dvosloja. To asimetrično razporeditev s pomočjo ATP vzpostavlja aminofosfolipidna translokaza. Poleg svoje strukturne vloge ima fosfatidilserin tudi pomembno funkcijo v mnogih signalizacijskih poteh. Kot signalna molekula sodeluje pri koagulaciji krvi, fagocitozi apoptoznih celic, celični fuziji in odlaganju mineralov v osteoblaste. Ključna lastnost fosfatidilserina kot signalne molekule je njegova negativno nabita polarna glava. Preko nje fosfatidilserin z drugimi signalnimi molekulami ali receptorji tvori elektrostatske ali stereospecifične interakcije. Sodeluje pri signalizaciji znotraj celice in tudi pri ekstracelularni signalizaciji. Ko sodeluje pri ekstracelularni signalizaciji, se nahaja tudi na ekstracelularni strani fosfolipidnega dvosloja. Prehod fosfatidilserina iz notranje na zunanjo stran uravnavajo skramblaze. Te so lahko aktivirane s pomočjo kaspaz, ki so encimi, prisotni v apoptozni celici. Med molekulami, ki se vežejo na fosfatidilserin, so najbolj preučevane tiste, ki za vezavo nanj uporabijo Gla domeno. Laktahedrin, ki je na fagocit vezan preko integrinov αvβ3, z vezavo na fosfatidilserin apoptozno celico pritrdi k makrofagu. Gas6 in protein S, ki se prav tako vežeta na fosfatidilserin, pa preko TAM receptorjev sprožita tirozinkinazno aktivnost. Aktivira se Rac1 in polimerizacija aktina sproži fagocitozo apoptozne celice. Izpostavljenost fosfatidilserina na ekstracelularni strani celice je zadosten signal makrofagu, da fagocitira celico. To nakazuje na pomembno vlogo fosfatidilserina kot signalne molekule.

== Tadej Uršič: TLR SIGNALIZACIJA IN NJENA VLOGA PRI REVMATIČNIH BOLEZNIH ==

Prirojeni imunski sistem predstavlja prvi obrambni mehanizem organizma. Celice prirojenega imunskega sistema izražajo receptorje, ki zaznavajo določene gradnike bakterij in virusov in pa molekule, ki nastanejo pri poškodbah samega organizma. Ti receptorji sprožijo signalne poti ki privedejo do odgovora organizma na vdor patogena. Ena od skupin teh receptorjev so TLR (Toll-Like Receptors). So integralni proteini za katere je značilna z levcini bogata ektodomena za prepoznavanje ligandov in pa TIR domena za navzdoljno signalizacijo. TLR-ji prepoznavajo komponente membran (lipide, lipopolisaharide, lipoproteini, …) in nukleinske kisline bakterij in virusov in kot odgovor sprožijo vnetno reakcijo. Če je le ta normalno regulirana le ta pripomore pri odpravi vdirajočih patogenov v organizem. Če pa pride do napak v regulaciji to lahko privede do kroničnega vnetja tkiva. Pri revmatičnih obolenjih, kot so na primer revmatoidni artritis, putiki, lymski artritis, lupus… , so odkrili večjo izraženost TLR-jev, kar je lahko glavni razlog za njihov nastanek. Znanstveniki sedaj testirajo razne inhibitorje TLR-jev ali pa njihovih adaptornih proteinov, kot potencialna zdravila za te bolezni.

== Nika Vegelj : FORMACIJA BIOFILMA V POVEZAVI S C-DI-GMP MOLEKULO ==

Za bakterijo, kot tudi za vsa ostala živa bitja je nujno, da se prilagajajo na spreminjanje življenjskih pogojev, saj jim to omogoča preživetje. Molekula c-di-GMP je sekundarni sporočevalev pri baktrerijah, ki regulira različne celične procese. C-di-GMP so prvič odkrili kot alosterični aktivator celulozne sintetaze v bakteriji Gluconacetobacter xylinum. Pri patogenih organizmih molekula c-di-GMP kontrolira virulentni odgovor, ki je povezan s quorum sensingom, procesom s katerim bakterije med seboj komunicirajo. Koncentracija molekule c-di-GMP je v celici regulirana s pomočjo encimov fosfodiesteraz in gvanilat ciklaz. C-di-GMP je sintetizirana znotraj celice iz dveh molekul GTP s pomočjo encima digvanilat ciklaze, ki na aktivni strani nosi domeno GGDEF. Razpad molekule pa omogoča encim fosfodiesteraza, ki nosi domeno EAL, ta omogoča, da molekula razpade na linearni nukleotid pGpG. Glavni namen raziskovanja molekule c-di-GMP ter njene vloge pri tvorbi biofilma, je bil, da bi ugotovili nove metode, ki bi preprečile nastanek biofilma in tako pozdravile z njim povezane bolezni. Cistična fibroza je ena izmed najpogostejših bolezni v evropi, za njo pa je odgovorna bakterija pseudomonas aeruginosa, ki s tvorbo biofilma povzroča kronično obolenje, saj antibiotiki ne delujejo direktno na biofilm. C-di-GMP je sekundarni sporočevalec pri bakterijah, ne pa tudi pri evkariontih in arhejah. Prav zato je tako zanimiv za znanstvenike, saj lahko z razvojem zdravil, ki bi vplivale na molekulo, razvili potencialna zdravila za kronične bolezni.

== Maja Kolar: BIOKEMIJSKA LOGIKA GLIKOLIZE ==
Čeprav glikoliza sprva zgleda zapletena in naključna, je v smislu zadovoljevanja vsem biokemijskim zahtevam ena najenostavnejših metabolnih poti. Pri načrtovanju poti se je treba zavedati kompromisov za zadovoljevanje različnim omejitvam, zato lahko skozi analizo vseh teoretično možnih poti ugotovimo katera je celici najugodnejša. Termodinamske omejitve vključujejo Gibbsovo prosto entalpijo reakcij, ki jo lahko izračunamo iz redoks potencialov in ugotovimo katere poti v metabolizmu so ender-/eksergonske. Pri encimskih mehanizmih moramo upoštevati aktivacijske skupine, ki pa lahko povečajo reaktivnost intermediatov, kar spada pod fizikalno-kemijske lastnosti intermediatov. Med njih štejemo tudi prepustnost skozi membrano, afiniteto do encimov in toksičnost. Slednjo celica izniči z izogibanjem reakcijskim potem ali sistemi endogene detoksifikacije kot je sistem glioksalaz za intermediat metilglioksal. Pri glikolizi se jim celica izogne z delitvijo elektronske prerazporeditve, kjer po podobnih poteh ne nastopajo toksične spojine. Preko energij vezi in elektronskih prerazporeditev lahko določimo kje na glikolizni poti bo nastajal ATP. Najobsežnejše zastopana je glikoliza Embden-Meyerhof-Parnas, vendar njene naravne alternative dokazujejo, da so skozi evolucijo različni organizmi kot so anaerobne/aerobne bakterije, termofili obravnavali določene zahteve kot bolj ali manj pomembne. Znanje različnih bioloških zahtev pa lahko prenesemo na metabolni inženiring, kjer iščemo učinkovite rešitve za proizvodnjo industrijsko iskanih metabolitov.

== Jure Povšin: VPLIV DIMETIL FUMARATA NA GAPDH IN AEROBNO GLIKOLIZO PRI MODULACIJI IMUNOSTI ==
Aktivirane imunske celice se po Warburgovi hipotezi osredotočijo na izvajanje aerobne glikolize namesto na izvajanje oksidativne fosforilacije, s čimer predstavljajo potencialno terapevtsko tarčo pri avtoimunski boleznih. Dimetil fumarat (DMF), je derivat od intermediarnega fumarata iz Krebsovega cikla. DMF je ester fumarne kisline ter imunomodulacijsko zdravilo, ki se uporablja za zdravljenje multiple skleroze in luskavice. Čeprav njegov terapevtski mehanizem zaenkrat ostaja še negotov, je znano, da DMF kovalentno spreminja ostanke cisteina v procesu, imenovanem succination. Preiskovanje aktivnost DMF-ja dodatno zapleta njegova hidroliza in vivo do monometil fumarata (MMF), ki lahko tudi sam modulira imunski odziv in vnetje tkiv. Kornberg in sodelavci so ugotovili , da DMF pri procesu, imenovanem succination, inaktivira katalitični cistein glikolitičnega encima gliceraldehid 3-fosfat dehidrogenaze (GAPDH) pri miših in ljudeh, tako in vitro kot in vivo. S tem navzdol uravnava aerobno glikolizo v aktiviranih mieloidnih in limfoidnih celicah, kar povrzoča njene protivnetne učinke. Rezultati znanstvenikov zagotavljajo mehanski vpogled v imunsko modulacijo z DMF in predstavljajo dokaz koncepta, da je aerobna glikoliza lahko zelo pomembna terapevtska tarča v avtoimunosti in da nas lahko nadaljnje raziskovanje pripelje do dolgo iskanih zdravil proti hudim avtoimunim boleznim.

== Manca Osolin: REGULACIJA METABOLIZMA GLUKOZE IN LAKTATA V MOŽGANIH ==
Aerobna glikoliza je proces razgradnje glukoze do laktata v prisotnosti kisika. Proces aerobne glikolize je med drugim značilen tudi za astrocite, posebne celice v možganih. Ker imajo nevroni večjo potrebo po energiji kot astrociti, vzdržujejo visok nivo oksidativnega metabolizma, medtem ko astrociti favorizirajo aerobno glikolizo in omejujejo oksidativno aktivnost. Številne raziskave so pokazale, da astrociti laktat, ki nastane v procesu aerobne glikolize, posredujejo nevronom. Ta koncept se imenuje ANLS hipoteza. Nevroni morajo vzdrževati ravnotežje med pentoza fosfatno potjo in glikolitično potjo, da dosežejo potrebe po energiji in da vzdržujejo antioksidativni potencial. Zato uporaba laktata kot oksidativnega substrata lahko zagotavlja ugoden način za nevrone, da proizvedejo visoke količine ATP med zaobidenjem glikolitične poti, saj tako varčujejo glukozo za pentoza fosfatno pot. Aerobna glikoliza, ki poteka v astrocitih in katere končni produkt je laktat, ima pomembno vlogo pri vzdrževanju nevronske aktivnosti. Laktat se prenese iz astrocitov v nevrone, da zadosti energijskim potrebam nevronov, prav tako pa laktat deluje tudi kot signalna molekula, ki regulira nevronske funkcije, kot so vzdražnost in plastičnost nevronov ter okrepitev spomina. V možganih se nahaja tudi posebna vrsta nevronov, ki na različne mehanizme zaznavajo spremembe koncentracije glukoze, kar jim omogoča prilagajanje na zunanje spremembe preko depolarizacije.

== Greta Junger: INTERMEDIATI CIKLA CITRONSKE KISLINE: SIGNALNE MOLEKULE POD KRINKO ==
Cikel citronske kisline je centralna metabolna pot, pri kateri se energetsko bogata molekula acetil-CoA oksidira ter svoje elektrone odda prenašalcem. Oksidacija je postopna in poteka preko več intermediatov. Za njih je dolgo časa veljalo, da je to njihova edina vloga, vendar pa se je ta domneva izkazala za napačno. Večina intermediatov cikla citronske kisline ima namreč večstransko vlogo, saj sodelujejo tako pri signalizaciji kot tudi regulaciji različnih procesov. Za delovanje α ketoglutarat-odvisnih dioksigenaz (2-OGDO) je nujno potreben α ketoglutarat. Zaradi podobne kemijske zgradbe se na 2-OGDO lahko vežeta tudi sukcinat in fumarat, ki pa encima ne aktivirata, pač pa delujeta kot kompetitivna inhibitorja. Kot taka lahko v celici ustvarita pseudo-hipoksično stanje ali pa posredno vplivata na spremembo demetilacije DNA in histonov. Poleg omenjenega imajo nekateri intermediati ključno vlogo tudi pri post-translacijski modifikaciji proteinov, natančneje acetilaciji, sukcinaciji in sukcinilaciji Lys in Cys ostankov. Za sukcinat in α ketoglutarat obstajata specifična GPC-receptorja - SUCNR1 in OXGR1. Fiziološki pomen SUCNR1, ki se med drugim nahaja v ledvicah, srčnem tkivu in očeh, je bolje raziskan od OXGR1O. Nedolgo nazaj so pojasnili tudi vlogo sukcinata pri nastanku reaktivnih kisikovih zvrsti in obratnega toka elektronov.

BIO2 Povzetki seminarjev 2019

2019-11-08T18:08:09Z

Greta Junger:

BIO2 Seminar 2019

2019-11-08T18:05:22Z

Greta Junger: /* Seznam seminarjev */

= Biokemijski seminar =
doc. dr. Gregor Gunčar, K2.022

== Seznam seminarjev ==
{| {{table}}
! ime in priimek !! poglavje !! naslov seminarja !! recenzent 1 !! recenzent 2 !! datum oddaje !! datum recenzije !! datum predstavitve
|-
! Tevž Levstek
| 12 || [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2019 Glicinski transporterji kot terapevtske tarče] || Sašo Jakob || Andrej Špenko || 18/10/2019 || 21/10/2019 || 23/10/2019
|-
! Ana Potočnik
| 12 || Fosfatidilserin kot signalna molekula || Marjeta Milostnik || Maja Mahorič || 18/10/2019 || 21/10/2019 || 23/10/2019
|-
! Kim Glavič
| 12 || ATP kot signalna molekula živali in rastlin || Tina Logonder || Tim Nograšek || 18/10/2019 || 21/10/2019 || 23/10/2019
|-
! Nika Vegelj
| 12 || Formacija biofilma v povezavi s c-di-GMP signalizacijo. || Žan Fortuna || Nina Varda || 25/10/2019 || 28/10/2019 || 30/10/2019
|-
! Tadej Uršič
| 12 || TLR signalizacija in njena vloga pri revmatičnih boleznih || Michelle Oletič || Tina Arnšek || 25/10/2019 || 28/10/2019 || 30/10/2019
|-
! Natalija Razpotnik
| 12 || || Maša Gabrič || Timotej Zgonik || 25/10/2019 || 28/10/2019 || 30/10/2019
|-
! Maja Kolar
| 14-15 || [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2019 Biokemijska logika glikolize] || Tevž Levstek || Sašo Jakob || 01/11/2019 || 04/11/2019 || 06/11/2019
|-
! Jure Povšin
| 14-15 || Vpliv dimetil fumarata na GAPDH in aerobno glikolizo pri modulaciji imunosti || Ana Potočnik || Marjeta Milostnik || 01/11/2019 || 04/11/2019 || 06/11/2019
|-
! Manca Osolin
| 14-15 || Regulacija metabolizma glukoze in laktata v možganih || Kim Glavič || Tina Logonder || 01/11/2019 || 04/11/2019 || 06/11/2019
|-
! Greta Junger
| 16 || Intermediati cikla citronske kisline: signalne molekule pod krinko || Nika Vegelj || Žan Fortuna || 08/11/2019 || 11/11/2019 || 13/11/2019
|-
! Oskar Nemec
| 16 || Uravnavanje delovanja levkocitov z intermediati cikla citronske kisline || Tadej Uršič || Michelle Oletič || 08/11/2019 || 11/11/2019 || 13/11/2019
|-
! Teo Nograšek
| 16 ||GPR91: Premikanje meja intermediatov Krebsovega cikla || Natalija Razpotnik || Maša Gabrič || 08/11/2019 || 11/11/2019 || 13/11/2019
|-
! Ana Babnik
| 17 || Regulacija oksidacije maščobnih kislin v skeletnih mišicah pri aerobni vadbi || Maja Kolar || Tevž Levstek || 15/11/2019 || 18/11/2019 || 20/11/2019
|-
! Maša Andoljšek
| 17 || || Jure Povšin || Ana Potočnik || 15/11/2019 || 18/11/2019 || 20/11/2019
|-
! Nastja Feguš
| 17 || Večdimenzionalna vloga ketonskih teles || Manca Osolin || Kim Glavič || 15/11/2019 || 18/11/2019 || 20/11/2019
|-
! Vivian Nemanič
| 18 || || Greta Junger || Nika Vegelj || 22/11/2019 || 25/11/2019 || 27/11/2019
|-
! Lena Trnovec
| 18 || || Oskar Nemec || Tadej Uršič || 22/11/2019 || 25/11/2019 || 27/11/2019
|-
! Sonja Gabrijelčič
| 18 || || Teo Nograšek || Natalija Razpotnik || 22/11/2019 || 25/11/2019 || 27/11/2019
|-
| Maja Trifkovič || 19 || || Ana Babnik || Maja Kolar || 29/11/2019 || 02/12/2019 || 04/12/2019
|-
| Anja Konjc || 19 || || Maša Andoljšek || Jure Povšin || 29/11/2019 || 02/12/2019 || 04/12/2019
|-
| Ana Vičič || 19 || || Nastja Feguš || Manca Osolin || 29/11/2019 || 02/12/2019 || 04/12/2019
|-
| Andrej Špenko || 20 || || Vivian Nemanič || Greta Junger || 06/12/2019 || 09/12/2019 || 11/12/2019
|-
| Maja Mahorič || 20 || || Lena Trnovec || Oskar Nemec || 06/12/2019 || 09/12/2019 || 11/12/2019
|-
| Tim Nograšek || 20 || || Sonja Gabrijelčič || Teo Nograšek || 06/12/2019 || 09/12/2019 || 11/12/2019
|-
| Nina Varda || 21 || || Maja Trifkovič || Ana Babnik || 13/12/2019 || 16/12/2019 || 18/12/2019
|-
| Tina Arnšek || 21 || || Anja Konjc || Maša Andoljšek || 13/12/2019 || 16/12/2019 || 18/12/2019
|-
| Timotej Zgonik || 21 || || Ana Vičič || Nastja Feguš || 13/12/2019 || 16/12/2019 || 18/12/2019
|-
| Sašo Jakob || 22 || || Andrej Špenko || Vivian Nemanič || 03/01/2020 || 06/01/2020 || 08/01/2020
|-
| Marjeta Milostnik || 22 || || Maja Mahorič || Lena Trnovec || 03/01/2020 || 06/01/2020 || 08/01/2020
|-
| Tina Logonder || 22 || || Tim Nograšek || Sonja Gabrijelčič || 03/01/2020 || 06/01/2020 || 08/01/2020
|-
| Žan Fortuna || 23 || || Nina Varda || Maja Trifkovič || 10/01/2020 || 13/01/2020 || 15/01/2020
|-
| Michelle Oletič || 23 || || Tina Arnšek || Anja Konjc || 10/01/2020 || 13/01/2020 || 15/01/2020
|-
| Maša Gabrič || 23 || || Timotej Zgonik || Ana Vičič || 10/01/2020 || 13/01/2020 || 15/01/2020
|}

Dokončno razporeditev bom objavil naknadno.
*številka v okencu za temo pomeni poglavje v Lehningerju, v katerega naj izbrana tema spada
Sporočite mi morebitne napake ali če vas nisem razporedil.

== Gradivo za predavanja ==
Gradivo za predavanja in seminarje najdete na http://bio.ijs.si/~zajec/bio2/
username: bio2
password: samozame

==Naloga==
'''Vaša naloga za seminar je: '''
Samostojno pripraviti seminar o seminarski temi, ki vam je bila dodeljena. Za osnovo morate vzeti pregledni članek iz revije, ki ima faktor vpliva nad 5 (npr. [http://www.sciencedirect.com/science/journal/09680004/ TIBS]. Poiskati morate še vsaj tri znanstvene članke, ki se nanašajo na opisano temo in jih uporabiti kot podlago za seminarsko nalogo! Članki so dostopni [http://93.174.95.27/scimag/ tukaj].

Za pripravo seminarja velja naslednje: 
* [[BIO2 Povzetki seminarjev 2019|Povzetek seminarja]] opišete na wikiju '''v 200 besedah''' (+- dvajset besed) - najkasneje do dne ko morate oddati seminar recenzentom.
* Povezavo do povzetka vnesete v tabelo seminarjev tekočega letnika.
* Seminar pripravite v obliki seminarske naloge na ~5-12 straneh A4 (pisava 12, enojni razmak, 2,5 cm robovi). Zelo pomembno je, da je obseg od 2700 do 3000 besed , a ne več kot 3500 besed. Seminarska naloga mora vsebovati najmanj tri slike. Eno sliko morate narisati sami in to pod sliko posebej označiti. Slika mora imeti legendo in v besedilu mora biti na ustreznem mestu sklic na sliko. 
* Seminar oddajte do datuma oddaje, ki je naveden v tabeli v elektronski obliki z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/ tega obrazca].
* Vsi seminarji so v elektronski obliki dostopni [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/bioseminar/ tukaj].
* Recenzenti do dneva določenega v tabeli določijo popravke (v elektronski obliki) in podajo oceno pisnega dela. Popravljen seminar oddajte z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/ tega obrazca].
* Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Za predstavitev je na voljo 20 minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni.
* Predstavitvi sledi razprava. Recenzenti podajo oceno predstavitve in postavijo najmanj dve vprašanji.Vsi ostali morajo postaviti še dve dodatni vprašanji v toku celega seminarskega obdobja. Vprašanja, ki ste jih postavili vpišite na [https://docs.google.com/forms/d/e/1FAIpQLSdV9OFlNzI3XyS8FRGnuIbG89gwH_36uwz29ocigV--2CXSbQ/viewform tukaj].
* Na dan predstavitve morate docentu še pred predstavitvijo oddati končno (popravljeno) in natisnjeno verzijo seminarja v enem izvodu, elektronsko verzijo seminarja in predstavitev pa oddati na strežnik na dan predstavitve do polnoči.
* Seminarska naloga in povzetek morajo biti v slovenskem jeziku, razen za študente, katerih materni jezik ni slovenščina. Ti lahko oddajo seminar v angleškem jeziku.

==Imena datotek==
Prosim vas, da vse datoteke, ki mi jih pošiljate poimenujete po naslednjem receptu:
* 312_BIO_Priimek_Ime.doc(x) za seminar, npr. 312_BIO_Guncar_Gregor.docx
* 312_BIO_Priimek_ime_final.doc(x) za končno verzijo seminarja
* 312_BIO_Priimek_Ime_rec_Priimek2.doc(x) za recenzijo, kjer je Priimek2 priimek recenzenta, npr. 312_BIO_Guncar_Gregor_rec_Scott.docx (če se pišete Scott in odajate recenzijo za seminar, ki ga je napisal Gunčar)
* 312_BIO_Priimek_Ime.ppt(x) za prezentacijo, npr 312_BIO_Guncar_Gregor.pptx
* 312_BIO_Priimek_ime_poprava.doc(x) za popravljeno končno verzijo seminarja, če so popravki manjši

==Ocenjevanje seminarjev==
Recenzenti ocenijo seminar tako, da izpolnijo [https://docs.google.com/forms/d/1EQDYwFO-DEzZ2R7jf8DhLqIeV4FFxRd3-ScceEASpt4/viewform recenzentsko poročilo] na spletu. Recenzentsko poročilo morate oddati najkasneje do 21:00, en dan pred predstavitvijo seminarja.

== Mnenje o predstavitvi ==
Vsak posameznik odda svoje mnenje o predstavitvi takoj po predstavitvi z online glasovanjem.

==Urejanje spletnih strani na wikiju==
Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''

==Citiranje virov==
Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se držite ene same. V seminarskih nalogah in diplomskih nalogah FKKT uprabljajte shemo citiranja, ki je pobarvana zeleno.
Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati.
Za citate v naravoslovju je najpogostejše citiranje po pravilniku ISO 690. [http://www.zveza-zotks.si/gzm/dokumenti/literatura.html Pravila], ki upoštevajo omenjeni standard, so pripravili pri ZTKS. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati. 
'''Citiranje knjig:''' 
Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica. 
Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN. 

Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005. 
Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4. 
Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.).

'''Citiranje člankov:''' 
Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani. 
Lartigue, C., Glass, J. I., Alperovich, N., Pieper, R., Parmar, P. P., Hutchison III, C. A., Smith, H. O. in Venter, J. C.
Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, 317, str. 632-638.

Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole: 
Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani. 
Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.

Revija Science uporablja skrajšani zapis: 
C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007) 

V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne). Navesti morate tudi vse avtorje dela, razen v primeru, ko jih je 10 ali več. Takrat navedite le prvih devet, za ostale pa uporabite okrajšavo in sod. (in sodelavci). Pred zadnjim avtorjem naj bo vedno besedica "in".

'''Citiranje spletnih virov:''' 
Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov 
strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life 
Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.

BIO2 Seminar 2019

2019-11-03T15:39:45Z

Greta Junger: /* Seznam seminarjev */

= Biokemijski seminar =
doc. dr. Gregor Gunčar, K2.022

== Seznam seminarjev ==
{| {{table}}
! ime in priimek !! poglavje !! naslov seminarja !! recenzent 1 !! recenzent 2 !! datum oddaje !! datum recenzije !! datum predstavitve
|-
! Tevž Levstek
| 12 || [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2019 Glicinski transporterji kot terapevtske tarče] || Sašo Jakob || Andrej Špenko || 18/10/2019 || 21/10/2019 || 23/10/2019
|-
! Ana Potočnik
| 12 || Fosfatidilserin kot signalna molekula || Marjeta Milostnik || Maja Mahorič || 18/10/2019 || 21/10/2019 || 23/10/2019
|-
! Kim Glavič
| 12 || ATP kot signalna molekula živali in rastlin || Tina Logonder || Tim Nograšek || 18/10/2019 || 21/10/2019 || 23/10/2019
|-
! Nika Vegelj
| 12 || Formacija biofilma v povezavi s c-di-GMP signalizacijo. || Žan Fortuna || Nina Varda || 25/10/2019 || 28/10/2019 || 30/10/2019
|-
! Tadej Uršič
| 12 || TLR signalizacija in njena vloga pri revmatičnih boleznih || Michelle Oletič || Tina Arnšek || 25/10/2019 || 28/10/2019 || 30/10/2019
|-
! Natalija Razpotnik
| 12 || || Maša Gabrič || Timotej Zgonik || 25/10/2019 || 28/10/2019 || 30/10/2019
|-
! Maja Kolar
| 14-15 || [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2019 Biokemijska logika glikolize] || Tevž Levstek || Sašo Jakob || 01/11/2019 || 04/11/2019 || 06/11/2019
|-
! Jure Povšin
| 14-15 || Vpliv dimetil fumarata na GAPDH in aerobno glikolizo pri modulaciji imunosti || Ana Potočnik || Marjeta Milostnik || 01/11/2019 || 04/11/2019 || 06/11/2019
|-
! Manca Osolin
| 14-15 || Regulacija metabolizma glukoze in laktata v možganih || Kim Glavič || Tina Logonder || 01/11/2019 || 04/11/2019 || 06/11/2019
|-
! Greta Junger
| 16 || Intermediates of Metabolism: From Bystanders to Signalling Molecules || Nika Vegelj || Žan Fortuna || 08/11/2019 || 11/11/2019 || 13/11/2019
|-
! Oskar Nemec
| 16 || Uravnavanje delovanja levkocitov z intermediati cikla citronske kisline || Tadej Uršič || Michelle Oletič || 08/11/2019 || 11/11/2019 || 13/11/2019
|-
! Teo Nograšek
| 16 ||GPR91: Premikanje meja intermediatov Krebsovega cikla || Natalija Razpotnik || Maša Gabrič || 08/11/2019 || 11/11/2019 || 13/11/2019
|-
! Ana Babnik
| 17 || || Maja Kolar || Tevž Levstek || 15/11/2019 || 18/11/2019 || 20/11/2019
|-
! Maša Andoljšek
| 17 || || Jure Povšin || Ana Potočnik || 15/11/2019 || 18/11/2019 || 20/11/2019
|-
! Nastja Feguš
| 17 || || Manca Osolin || Kim Glavič || 15/11/2019 || 18/11/2019 || 20/11/2019
|-
! Vivian Nemanič
| 18 || || Greta Junger || Nika Vegelj || 22/11/2019 || 25/11/2019 || 27/11/2019
|-
! Lena Trnovec
| 18 || || Oskar Nemec || Tadej Uršič || 22/11/2019 || 25/11/2019 || 27/11/2019
|-
! Sonja Gabrijelčič
| 18 || || Teo Nograšek || Natalija Razpotnik || 22/11/2019 || 25/11/2019 || 27/11/2019
|-
| Maja Trifkovič || 19 || || Ana Babnik || Maja Kolar || 29/11/2019 || 02/12/2019 || 04/12/2019
|-
| Anja Konjc || 19 || || Maša Andoljšek || Jure Povšin || 29/11/2019 || 02/12/2019 || 04/12/2019
|-
| Ana Vičič || 19 || || Nastja Feguš || Manca Osolin || 29/11/2019 || 02/12/2019 || 04/12/2019
|-
| Andrej Špenko || 20 || || Vivian Nemanič || Greta Junger || 06/12/2019 || 09/12/2019 || 11/12/2019
|-
| Maja Mahorič || 20 || || Lena Trnovec || Oskar Nemec || 06/12/2019 || 09/12/2019 || 11/12/2019
|-
| Tim Nograšek || 20 || || Sonja Gabrijelčič || Teo Nograšek || 06/12/2019 || 09/12/2019 || 11/12/2019
|-
| Nina Varda || 21 || || Maja Trifkovič || Ana Babnik || 13/12/2019 || 16/12/2019 || 18/12/2019
|-
| Tina Arnšek || 21 || || Anja Konjc || Maša Andoljšek || 13/12/2019 || 16/12/2019 || 18/12/2019
|-
| Timotej Zgonik || 21 || || Ana Vičič || Nastja Feguš || 13/12/2019 || 16/12/2019 || 18/12/2019
|-
| Sašo Jakob || 22 || || Andrej Špenko || Vivian Nemanič || 03/01/2020 || 06/01/2020 || 08/01/2020
|-
| Marjeta Milostnik || 22 || || Maja Mahorič || Lena Trnovec || 03/01/2020 || 06/01/2020 || 08/01/2020
|-
| Tina Logonder || 22 || || Tim Nograšek || Sonja Gabrijelčič || 03/01/2020 || 06/01/2020 || 08/01/2020
|-
| Žan Fortuna || 23 || || Nina Varda || Maja Trifkovič || 10/01/2020 || 13/01/2020 || 15/01/2020
|-
| Michelle Oletič || 23 || || Tina Arnšek || Anja Konjc || 10/01/2020 || 13/01/2020 || 15/01/2020
|-
| Maša Gabrič || 23 || || Timotej Zgonik || Ana Vičič || 10/01/2020 || 13/01/2020 || 15/01/2020
|}

Dokončno razporeditev bom objavil naknadno.
*številka v okencu za temo pomeni poglavje v Lehningerju, v katerega naj izbrana tema spada
Sporočite mi morebitne napake ali če vas nisem razporedil.

== Gradivo za predavanja ==
Gradivo za predavanja in seminarje najdete na http://bio.ijs.si/~zajec/bio2/
username: bio2
password: samozame

==Naloga==
'''Vaša naloga za seminar je: '''
Samostojno pripraviti seminar o seminarski temi, ki vam je bila dodeljena. Za osnovo morate vzeti pregledni članek iz revije, ki ima faktor vpliva nad 5 (npr. [http://www.sciencedirect.com/science/journal/09680004/ TIBS]. Poiskati morate še vsaj tri znanstvene članke, ki se nanašajo na opisano temo in jih uporabiti kot podlago za seminarsko nalogo! Članki so dostopni [http://93.174.95.27/scimag/ tukaj].

Za pripravo seminarja velja naslednje: 
* [[BIO2 Povzetki seminarjev 2019|Povzetek seminarja]] opišete na wikiju '''v 200 besedah''' (+- dvajset besed) - najkasneje do dne ko morate oddati seminar recenzentom.
* Povezavo do povzetka vnesete v tabelo seminarjev tekočega letnika.
* Seminar pripravite v obliki seminarske naloge na ~5-12 straneh A4 (pisava 12, enojni razmak, 2,5 cm robovi). Zelo pomembno je, da je obseg od 2700 do 3000 besed , a ne več kot 3500 besed. Seminarska naloga mora vsebovati najmanj tri slike. Eno sliko morate narisati sami in to pod sliko posebej označiti. Slika mora imeti legendo in v besedilu mora biti na ustreznem mestu sklic na sliko. 
* Seminar oddajte do datuma oddaje, ki je naveden v tabeli v elektronski obliki z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/ tega obrazca].
* Vsi seminarji so v elektronski obliki dostopni [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/bioseminar/ tukaj].
* Recenzenti do dneva določenega v tabeli določijo popravke (v elektronski obliki) in podajo oceno pisnega dela. Popravljen seminar oddajte z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/ tega obrazca].
* Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Za predstavitev je na voljo 20 minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni.
* Predstavitvi sledi razprava. Recenzenti podajo oceno predstavitve in postavijo najmanj dve vprašanji.Vsi ostali morajo postaviti še dve dodatni vprašanji v toku celega seminarskega obdobja. Vprašanja, ki ste jih postavili vpišite na [https://docs.google.com/forms/d/e/1FAIpQLSdV9OFlNzI3XyS8FRGnuIbG89gwH_36uwz29ocigV--2CXSbQ/viewform tukaj].
* Na dan predstavitve morate docentu še pred predstavitvijo oddati končno (popravljeno) in natisnjeno verzijo seminarja v enem izvodu, elektronsko verzijo seminarja in predstavitev pa oddati na strežnik na dan predstavitve do polnoči.
* Seminarska naloga in povzetek morajo biti v slovenskem jeziku, razen za študente, katerih materni jezik ni slovenščina. Ti lahko oddajo seminar v angleškem jeziku.

==Imena datotek==
Prosim vas, da vse datoteke, ki mi jih pošiljate poimenujete po naslednjem receptu:
* 312_BIO_Priimek_Ime.doc(x) za seminar, npr. 312_BIO_Guncar_Gregor.docx
* 312_BIO_Priimek_ime_final.doc(x) za končno verzijo seminarja
* 312_BIO_Priimek_Ime_rec_Priimek2.doc(x) za recenzijo, kjer je Priimek2 priimek recenzenta, npr. 312_BIO_Guncar_Gregor_rec_Scott.docx (če se pišete Scott in odajate recenzijo za seminar, ki ga je napisal Gunčar)
* 312_BIO_Priimek_Ime.ppt(x) za prezentacijo, npr 312_BIO_Guncar_Gregor.pptx
* 312_BIO_Priimek_ime_poprava.doc(x) za popravljeno končno verzijo seminarja, če so popravki manjši

==Ocenjevanje seminarjev==
Recenzenti ocenijo seminar tako, da izpolnijo [https://docs.google.com/forms/d/1EQDYwFO-DEzZ2R7jf8DhLqIeV4FFxRd3-ScceEASpt4/viewform recenzentsko poročilo] na spletu. Recenzentsko poročilo morate oddati najkasneje do 21:00, en dan pred predstavitvijo seminarja.

== Mnenje o predstavitvi ==
Vsak posameznik odda svoje mnenje o predstavitvi takoj po predstavitvi z online glasovanjem.

==Urejanje spletnih strani na wikiju==
Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''

==Citiranje virov==
Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se držite ene same. V seminarskih nalogah in diplomskih nalogah FKKT uprabljajte shemo citiranja, ki je pobarvana zeleno.
Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati.
Za citate v naravoslovju je najpogostejše citiranje po pravilniku ISO 690. [http://www.zveza-zotks.si/gzm/dokumenti/literatura.html Pravila], ki upoštevajo omenjeni standard, so pripravili pri ZTKS. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati. 
'''Citiranje knjig:''' 
Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica. 
Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN. 

Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005. 
Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4. 
Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.).

'''Citiranje člankov:''' 
Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani. 
Lartigue, C., Glass, J. I., Alperovich, N., Pieper, R., Parmar, P. P., Hutchison III, C. A., Smith, H. O. in Venter, J. C.
Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, 317, str. 632-638.

Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole: 
Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani. 
Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.

Revija Science uporablja skrajšani zapis: 
C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007) 

V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne). Navesti morate tudi vse avtorje dela, razen v primeru, ko jih je 10 ali več. Takrat navedite le prvih devet, za ostale pa uporabite okrajšavo in sod. (in sodelavci). Pred zadnjim avtorjem naj bo vedno besedica "in".

'''Citiranje spletnih virov:''' 
Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov 
strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life 
Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.

BIO2 Seminar 2019

2019-11-01T14:17:28Z

Greta Junger: /* Seznam seminarjev */

= Biokemijski seminar =
doc. dr. Gregor Gunčar, K2.022

== Seznam seminarjev ==
{| {{table}}
! ime in priimek !! poglavje !! naslov seminarja !! recenzent 1 !! recenzent 2 !! datum oddaje !! datum recenzije !! datum predstavitve
|-
! Tevž Levstek
| 12 || [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2019 Glicinski transporterji kot terapevtske tarče] || Sašo Jakob || Andrej Špenko || 18/10/2019 || 21/10/2019 || 23/10/2019
|-
! Ana Potočnik
| 12 || Fosfatidilserin kot signalna molekula || Marjeta Milostnik || Maja Mahorič || 18/10/2019 || 21/10/2019 || 23/10/2019
|-
! Kim Glavič
| 12 || ATP kot signalna molekula živali in rastlin || Tina Logonder || Tim Nograšek || 18/10/2019 || 21/10/2019 || 23/10/2019
|-
! Nika Vegelj
| 12 || Formacija biofilma v povezavi s c-di-GMP signalizacijo. || Žan Fortuna || Nina Varda || 25/10/2019 || 28/10/2019 || 30/10/2019
|-
! Tadej Uršič
| 12 || TLR signalizacija in njena vloga pri revmatičnih boleznih || Michelle Oletič || Tina Arnšek || 25/10/2019 || 28/10/2019 || 30/10/2019
|-
! Natalija Razpotnik
| 12 || || Maša Gabrič || Timotej Zgonik || 25/10/2019 || 28/10/2019 || 30/10/2019
|-
! Maja Kolar
| 14-15 || || Tevž Levstek || Sašo Jakob || 01/11/2019 || 04/11/2019 || 06/11/2019
|-
! Jure Povšin
| 14-15 || Vpliv dimetil fumarata na GAPDH in aerobno glikolizo pri modulaciji imunosti || Ana Potočnik || Marjeta Milostnik || 01/11/2019 || 04/11/2019 || 06/11/2019
|-
! Manca Osolin
| 14-15 || Regulacija metabolizma med astrociti in nevroni || Kim Glavič || Tina Logonder || 01/11/2019 || 04/11/2019 || 06/11/2019
|-
! Greta Junger
| 16 || The emerging role and targetability of the TCA cycle in cancer metabolism || Nika Vegelj || Žan Fortuna || 08/11/2019 || 11/11/2019 || 13/11/2019
|-
! Oskar Nemec
| 16 || Uravnavanje delovanja levkocitov z intermediati cikla citronske kisline || Tadej Uršič || Michelle Oletič || 08/11/2019 || 11/11/2019 || 13/11/2019
|-
! Teo Nograšek
| 16 ||GPR91: Premikanje meja intermediatov Krebsovega cikla || Natalija Razpotnik || Maša Gabrič || 08/11/2019 || 11/11/2019 || 13/11/2019
|-
! Ana Babnik
| 17 || || Maja Kolar || Tevž Levstek || 15/11/2019 || 18/11/2019 || 20/11/2019
|-
! Maša Andoljšek
| 17 || || Jure Povšin || Ana Potočnik || 15/11/2019 || 18/11/2019 || 20/11/2019
|-
! Nastja Feguš
| 17 || || Manca Osolin || Kim Glavič || 15/11/2019 || 18/11/2019 || 20/11/2019
|-
! Vivian Nemanič
| 18 || || Greta Junger || Nika Vegelj || 22/11/2019 || 25/11/2019 || 27/11/2019
|-
! Lena Trnovec
| 18 || || Oskar Nemec || Tadej Uršič || 22/11/2019 || 25/11/2019 || 27/11/2019
|-
! Sonja Gabrijelčič
| 18 || || Teo Nograšek || Natalija Razpotnik || 22/11/2019 || 25/11/2019 || 27/11/2019
|-
| Maja Trifkovič || 19 || || Ana Babnik || Maja Kolar || 29/11/2019 || 02/12/2019 || 04/12/2019
|-
| Anja Konjc || 19 || || Maša Andoljšek || Jure Povšin || 29/11/2019 || 02/12/2019 || 04/12/2019
|-
| Ana Vičič || 19 || || Nastja Feguš || Manca Osolin || 29/11/2019 || 02/12/2019 || 04/12/2019
|-
| Andrej Špenko || 20 || || Vivian Nemanič || Greta Junger || 06/12/2019 || 09/12/2019 || 11/12/2019
|-
| Maja Mahorič || 20 || || Lena Trnovec || Oskar Nemec || 06/12/2019 || 09/12/2019 || 11/12/2019
|-
| Tim Nograšek || 20 || || Sonja Gabrijelčič || Teo Nograšek || 06/12/2019 || 09/12/2019 || 11/12/2019
|-
| Nina Varda || 21 || || Maja Trifkovič || Ana Babnik || 13/12/2019 || 16/12/2019 || 18/12/2019
|-
| Tina Arnšek || 21 || || Anja Konjc || Maša Andoljšek || 13/12/2019 || 16/12/2019 || 18/12/2019
|-
| Timotej Zgonik || 21 || || Ana Vičič || Nastja Feguš || 13/12/2019 || 16/12/2019 || 18/12/2019
|-
| Sašo Jakob || 22 || || Andrej Špenko || Vivian Nemanič || 03/01/2020 || 06/01/2020 || 08/01/2020
|-
| Marjeta Milostnik || 22 || || Maja Mahorič || Lena Trnovec || 03/01/2020 || 06/01/2020 || 08/01/2020
|-
| Tina Logonder || 22 || || Tim Nograšek || Sonja Gabrijelčič || 03/01/2020 || 06/01/2020 || 08/01/2020
|-
| Žan Fortuna || 23 || || Nina Varda || Maja Trifkovič || 10/01/2020 || 13/01/2020 || 15/01/2020
|-
| Michelle Oletič || 23 || || Tina Arnšek || Anja Konjc || 10/01/2020 || 13/01/2020 || 15/01/2020
|-
| Maša Gabrič || 23 || || Timotej Zgonik || Ana Vičič || 10/01/2020 || 13/01/2020 || 15/01/2020
|}

Dokončno razporeditev bom objavil naknadno.
*številka v okencu za temo pomeni poglavje v Lehningerju, v katerega naj izbrana tema spada
Sporočite mi morebitne napake ali če vas nisem razporedil.

== Gradivo za predavanja ==
Gradivo za predavanja in seminarje najdete na http://bio.ijs.si/~zajec/bio2/
username: bio2
password: samozame

==Naloga==
'''Vaša naloga za seminar je: '''
Samostojno pripraviti seminar o seminarski temi, ki vam je bila dodeljena. Za osnovo morate vzeti pregledni članek iz revije, ki ima faktor vpliva nad 5 (npr. [http://www.sciencedirect.com/science/journal/09680004/ TIBS]. Poiskati morate še vsaj tri znanstvene članke, ki se nanašajo na opisano temo in jih uporabiti kot podlago za seminarsko nalogo! Članki so dostopni [http://93.174.95.27/scimag/ tukaj].

Za pripravo seminarja velja naslednje: 
* [[BIO2 Povzetki seminarjev 2019|Povzetek seminarja]] opišete na wikiju '''v 200 besedah''' (+- dvajset besed) - najkasneje do dne ko morate oddati seminar recenzentom.
* Povezavo do povzetka vnesete v tabelo seminarjev tekočega letnika.
* Seminar pripravite v obliki seminarske naloge na ~5-12 straneh A4 (pisava 12, enojni razmak, 2,5 cm robovi). Zelo pomembno je, da je obseg od 2700 do 3000 besed , a ne več kot 3500 besed. Seminarska naloga mora vsebovati najmanj tri slike. Eno sliko morate narisati sami in to pod sliko posebej označiti. Slika mora imeti legendo in v besedilu mora biti na ustreznem mestu sklic na sliko. 
* Seminar oddajte do datuma oddaje, ki je naveden v tabeli v elektronski obliki z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/ tega obrazca].
* Vsi seminarji so v elektronski obliki dostopni [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/bioseminar/ tukaj].
* Recenzenti do dneva določenega v tabeli določijo popravke (v elektronski obliki) in podajo oceno pisnega dela. Popravljen seminar oddajte z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/ tega obrazca].
* Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Za predstavitev je na voljo 20 minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni.
* Predstavitvi sledi razprava. Recenzenti podajo oceno predstavitve in postavijo najmanj dve vprašanji.Vsi ostali morajo postaviti še dve dodatni vprašanji v toku celega seminarskega obdobja. Vprašanja, ki ste jih postavili vpišite na [https://docs.google.com/forms/d/e/1FAIpQLSdV9OFlNzI3XyS8FRGnuIbG89gwH_36uwz29ocigV--2CXSbQ/viewform tukaj].
* Na dan predstavitve morate docentu še pred predstavitvijo oddati končno (popravljeno) in natisnjeno verzijo seminarja v enem izvodu, elektronsko verzijo seminarja in predstavitev pa oddati na strežnik na dan predstavitve do polnoči.
* Seminarska naloga in povzetek morajo biti v slovenskem jeziku, razen za študente, katerih materni jezik ni slovenščina. Ti lahko oddajo seminar v angleškem jeziku.

==Imena datotek==
Prosim vas, da vse datoteke, ki mi jih pošiljate poimenujete po naslednjem receptu:
* 312_BIO_Priimek_Ime.doc(x) za seminar, npr. 312_BIO_Guncar_Gregor.docx
* 312_BIO_Priimek_ime_final.doc(x) za končno verzijo seminarja
* 312_BIO_Priimek_Ime_rec_Priimek2.doc(x) za recenzijo, kjer je Priimek2 priimek recenzenta, npr. 312_BIO_Guncar_Gregor_rec_Scott.docx (če se pišete Scott in odajate recenzijo za seminar, ki ga je napisal Gunčar)
* 312_BIO_Priimek_Ime.ppt(x) za prezentacijo, npr 312_BIO_Guncar_Gregor.pptx
* 312_BIO_Priimek_ime_poprava.doc(x) za popravljeno končno verzijo seminarja, če so popravki manjši

==Ocenjevanje seminarjev==
Recenzenti ocenijo seminar tako, da izpolnijo [https://docs.google.com/forms/d/1EQDYwFO-DEzZ2R7jf8DhLqIeV4FFxRd3-ScceEASpt4/viewform recenzentsko poročilo] na spletu. Recenzentsko poročilo morate oddati najkasneje do 21:00, en dan pred predstavitvijo seminarja.

== Mnenje o predstavitvi ==
Vsak posameznik odda svoje mnenje o predstavitvi takoj po predstavitvi z online glasovanjem.

==Urejanje spletnih strani na wikiju==
Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''

==Citiranje virov==
Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se držite ene same. V seminarskih nalogah in diplomskih nalogah FKKT uprabljajte shemo citiranja, ki je pobarvana zeleno.
Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati.
Za citate v naravoslovju je najpogostejše citiranje po pravilniku ISO 690. [http://www.zveza-zotks.si/gzm/dokumenti/literatura.html Pravila], ki upoštevajo omenjeni standard, so pripravili pri ZTKS. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati. 
'''Citiranje knjig:''' 
Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica. 
Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN. 

Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005. 
Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4. 
Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.).

'''Citiranje člankov:''' 
Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani. 
Lartigue, C., Glass, J. I., Alperovich, N., Pieper, R., Parmar, P. P., Hutchison III, C. A., Smith, H. O. in Venter, J. C.
Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, 317, str. 632-638.

Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole: 
Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani. 
Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.

Revija Science uporablja skrajšani zapis: 
C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007) 

V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne). Navesti morate tudi vse avtorje dela, razen v primeru, ko jih je 10 ali več. Takrat navedite le prvih devet, za ostale pa uporabite okrajšavo in sod. (in sodelavci). Pred zadnjim avtorjem naj bo vedno besedica "in".

'''Citiranje spletnih virov:''' 
Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov 
strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life 
Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.

BIO2 Seminar 2019

2019-10-31T21:13:55Z

Greta Junger: /* Seznam seminarjev */

= Biokemijski seminar =
doc. dr. Gregor Gunčar, K2.022

== Seznam seminarjev ==
{| {{table}}
! ime in priimek !! poglavje !! naslov seminarja !! recenzent 1 !! recenzent 2 !! datum oddaje !! datum recenzije !! datum predstavitve
|-
! Tevž Levstek
| 12 || [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2019 Glicinski transporterji kot terapevtske tarče] || Sašo Jakob || Andrej Špenko || 18/10/2019 || 21/10/2019 || 23/10/2019
|-
! Ana Potočnik
| 12 || Fosfatidilserin kot signalna molekula || Marjeta Milostnik || Maja Mahorič || 18/10/2019 || 21/10/2019 || 23/10/2019
|-
! Kim Glavič
| 12 || ATP kot signalna molekula živali in rastlin || Tina Logonder || Tim Nograšek || 18/10/2019 || 21/10/2019 || 23/10/2019
|-
! Nika Vegelj
| 12 || Formacija biofilma v povezavi s c-di-GMP signalizacijo. || Žan Fortuna || Nina Varda || 25/10/2019 || 28/10/2019 || 30/10/2019
|-
! Tadej Uršič
| 12 || TLR signalizacija in njena vloga pri revmatičnih boleznih || Michelle Oletič || Tina Arnšek || 25/10/2019 || 28/10/2019 || 30/10/2019
|-
! Natalija Razpotnik
| 12 || || Maša Gabrič || Timotej Zgonik || 25/10/2019 || 28/10/2019 || 30/10/2019
|-
! Maja Kolar
| 14-15 || || Tevž Levstek || Sašo Jakob || 01/11/2019 || 04/11/2019 || 06/11/2019
|-
! Jure Povšin
| 14-15 || Vpliv dimetil fumarata na GAPDH in aerobno glikolizo pri modulaciji imunosti || Ana Potočnik || Marjeta Milostnik || 01/11/2019 || 04/11/2019 || 06/11/2019
|-
! Manca Osolin
| 14-15 || Regulacija metabolizma med astrociti in nevroni || Kim Glavič || Tina Logonder || 01/11/2019 || 04/11/2019 || 06/11/2019
|-
! Greta Junger
| 16 || Krebs Cycle Reimagined: The Emerging Roles of Succinate and Itaconate as Signal Transducers || Nika Vegelj || Žan Fortuna || 08/11/2019 || 11/11/2019 || 13/11/2019
|-
! Oskar Nemec
| 16 || Uravnavanje delovanja levkocitov z intermediati cikla citronske kisline || Tadej Uršič || Michelle Oletič || 08/11/2019 || 11/11/2019 || 13/11/2019
|-
! Teo Nograšek
| 16 ||GPR91: || Natalija Razpotnik || Maša Gabrič || 08/11/2019 || 11/11/2019 || 13/11/2019
|-
! Ana Babnik
| 17 || || Maja Kolar || Tevž Levstek || 15/11/2019 || 18/11/2019 || 20/11/2019
|-
! Maša Andoljšek
| 17 || || Jure Povšin || Ana Potočnik || 15/11/2019 || 18/11/2019 || 20/11/2019
|-
! Nastja Feguš
| 17 || || Manca Osolin || Kim Glavič || 15/11/2019 || 18/11/2019 || 20/11/2019
|-
! Vivian Nemanič
| 18 || || Greta Junger || Nika Vegelj || 22/11/2019 || 25/11/2019 || 27/11/2019
|-
! Lena Trnovec
| 18 || || Oskar Nemec || Tadej Uršič || 22/11/2019 || 25/11/2019 || 27/11/2019
|-
! Sonja Gabrijelčič
| 18 || || Teo Nograšek || Natalija Razpotnik || 22/11/2019 || 25/11/2019 || 27/11/2019
|-
| Maja Trifkovič || 19 || || Ana Babnik || Maja Kolar || 29/11/2019 || 02/12/2019 || 04/12/2019
|-
| Anja Konjc || 19 || || Maša Andoljšek || Jure Povšin || 29/11/2019 || 02/12/2019 || 04/12/2019
|-
| Ana Vičič || 19 || || Nastja Feguš || Manca Osolin || 29/11/2019 || 02/12/2019 || 04/12/2019
|-
| Andrej Špenko || 20 || || Vivian Nemanič || Greta Junger || 06/12/2019 || 09/12/2019 || 11/12/2019
|-
| Maja Mahorič || 20 || || Lena Trnovec || Oskar Nemec || 06/12/2019 || 09/12/2019 || 11/12/2019
|-
| Tim Nograšek || 20 || || Sonja Gabrijelčič || Teo Nograšek || 06/12/2019 || 09/12/2019 || 11/12/2019
|-
| Nina Varda || 21 || || Maja Trifkovič || Ana Babnik || 13/12/2019 || 16/12/2019 || 18/12/2019
|-
| Tina Arnšek || 21 || || Anja Konjc || Maša Andoljšek || 13/12/2019 || 16/12/2019 || 18/12/2019
|-
| Timotej Zgonik || 21 || || Ana Vičič || Nastja Feguš || 13/12/2019 || 16/12/2019 || 18/12/2019
|-
| Sašo Jakob || 22 || || Andrej Špenko || Vivian Nemanič || 03/01/2020 || 06/01/2020 || 08/01/2020
|-
| Marjeta Milostnik || 22 || || Maja Mahorič || Lena Trnovec || 03/01/2020 || 06/01/2020 || 08/01/2020
|-
| Tina Logonder || 22 || || Tim Nograšek || Sonja Gabrijelčič || 03/01/2020 || 06/01/2020 || 08/01/2020
|-
| Žan Fortuna || 23 || || Nina Varda || Maja Trifkovič || 10/01/2020 || 13/01/2020 || 15/01/2020
|-
| Michelle Oletič || 23 || || Tina Arnšek || Anja Konjc || 10/01/2020 || 13/01/2020 || 15/01/2020
|-
| Maša Gabrič || 23 || || Timotej Zgonik || Ana Vičič || 10/01/2020 || 13/01/2020 || 15/01/2020
|}

Dokončno razporeditev bom objavil naknadno.
*številka v okencu za temo pomeni poglavje v Lehningerju, v katerega naj izbrana tema spada
Sporočite mi morebitne napake ali če vas nisem razporedil.

== Gradivo za predavanja ==
Gradivo za predavanja in seminarje najdete na http://bio.ijs.si/~zajec/bio2/
username: bio2
password: samozame

==Naloga==
'''Vaša naloga za seminar je: '''
Samostojno pripraviti seminar o seminarski temi, ki vam je bila dodeljena. Za osnovo morate vzeti pregledni članek iz revije, ki ima faktor vpliva nad 5 (npr. [http://www.sciencedirect.com/science/journal/09680004/ TIBS]. Poiskati morate še vsaj tri znanstvene članke, ki se nanašajo na opisano temo in jih uporabiti kot podlago za seminarsko nalogo! Članki so dostopni [http://93.174.95.27/scimag/ tukaj].

Za pripravo seminarja velja naslednje: 
* [[BIO2 Povzetki seminarjev 2019|Povzetek seminarja]] opišete na wikiju '''v 200 besedah''' (+- dvajset besed) - najkasneje do dne ko morate oddati seminar recenzentom.
* Povezavo do povzetka vnesete v tabelo seminarjev tekočega letnika.
* Seminar pripravite v obliki seminarske naloge na ~5-12 straneh A4 (pisava 12, enojni razmak, 2,5 cm robovi). Zelo pomembno je, da je obseg od 2700 do 3000 besed , a ne več kot 3500 besed. Seminarska naloga mora vsebovati najmanj tri slike. Eno sliko morate narisati sami in to pod sliko posebej označiti. Slika mora imeti legendo in v besedilu mora biti na ustreznem mestu sklic na sliko. 
* Seminar oddajte do datuma oddaje, ki je naveden v tabeli v elektronski obliki z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/ tega obrazca].
* Vsi seminarji so v elektronski obliki dostopni [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/bioseminar/ tukaj].
* Recenzenti do dneva določenega v tabeli določijo popravke (v elektronski obliki) in podajo oceno pisnega dela. Popravljen seminar oddajte z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/ tega obrazca].
* Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Za predstavitev je na voljo 20 minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni.
* Predstavitvi sledi razprava. Recenzenti podajo oceno predstavitve in postavijo najmanj dve vprašanji.Vsi ostali morajo postaviti še dve dodatni vprašanji v toku celega seminarskega obdobja. Vprašanja, ki ste jih postavili vpišite na [https://docs.google.com/forms/d/e/1FAIpQLSdV9OFlNzI3XyS8FRGnuIbG89gwH_36uwz29ocigV--2CXSbQ/viewform tukaj].
* Na dan predstavitve morate docentu še pred predstavitvijo oddati končno (popravljeno) in natisnjeno verzijo seminarja v enem izvodu, elektronsko verzijo seminarja in predstavitev pa oddati na strežnik na dan predstavitve do polnoči.
* Seminarska naloga in povzetek morajo biti v slovenskem jeziku, razen za študente, katerih materni jezik ni slovenščina. Ti lahko oddajo seminar v angleškem jeziku.

==Imena datotek==
Prosim vas, da vse datoteke, ki mi jih pošiljate poimenujete po naslednjem receptu:
* 312_BIO_Priimek_Ime.doc(x) za seminar, npr. 312_BIO_Guncar_Gregor.docx
* 312_BIO_Priimek_ime_final.doc(x) za končno verzijo seminarja
* 312_BIO_Priimek_Ime_rec_Priimek2.doc(x) za recenzijo, kjer je Priimek2 priimek recenzenta, npr. 312_BIO_Guncar_Gregor_rec_Scott.docx (če se pišete Scott in odajate recenzijo za seminar, ki ga je napisal Gunčar)
* 312_BIO_Priimek_Ime.ppt(x) za prezentacijo, npr 312_BIO_Guncar_Gregor.pptx
* 312_BIO_Priimek_ime_poprava.doc(x) za popravljeno končno verzijo seminarja, če so popravki manjši

==Ocenjevanje seminarjev==
Recenzenti ocenijo seminar tako, da izpolnijo [https://docs.google.com/forms/d/1EQDYwFO-DEzZ2R7jf8DhLqIeV4FFxRd3-ScceEASpt4/viewform recenzentsko poročilo] na spletu. Recenzentsko poročilo morate oddati najkasneje do 21:00, en dan pred predstavitvijo seminarja.

== Mnenje o predstavitvi ==
Vsak posameznik odda svoje mnenje o predstavitvi takoj po predstavitvi z online glasovanjem.

==Urejanje spletnih strani na wikiju==
Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''

==Citiranje virov==
Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se držite ene same. V seminarskih nalogah in diplomskih nalogah FKKT uprabljajte shemo citiranja, ki je pobarvana zeleno.
Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati.
Za citate v naravoslovju je najpogostejše citiranje po pravilniku ISO 690. [http://www.zveza-zotks.si/gzm/dokumenti/literatura.html Pravila], ki upoštevajo omenjeni standard, so pripravili pri ZTKS. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati. 
'''Citiranje knjig:''' 
Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica. 
Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN. 

Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005. 
Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4. 
Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.).

'''Citiranje člankov:''' 
Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani. 
Lartigue, C., Glass, J. I., Alperovich, N., Pieper, R., Parmar, P. P., Hutchison III, C. A., Smith, H. O. in Venter, J. C.
Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, 317, str. 632-638.

Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole: 
Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani. 
Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.

Revija Science uporablja skrajšani zapis: 
C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007) 

V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne). Navesti morate tudi vse avtorje dela, razen v primeru, ko jih je 10 ali več. Takrat navedite le prvih devet, za ostale pa uporabite okrajšavo in sod. (in sodelavci). Pred zadnjim avtorjem naj bo vedno besedica "in".

'''Citiranje spletnih virov:''' 
Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov 
strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life 
Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.

TBK2019 Povzetki seminarjev

2019-05-05T15:25:24Z

Greta Junger: /* Greta Junger: Blokiranje proteina CD22 obnovi kognitivne sposobnosti pri starih miših */

=== Sašo Jakob: Terapija pljučnih bolezni z vdihavanjem mRNA ===
Messenger RNA (mRNA) lahko v znanosti uporabimo tako, da jo vstavimo v žive celice, ki lahko sintetizirajo proteine glede na kodiran zapis v njej. Na ta način lahko sintetiziramo proteine za različne namene, eden pomembnejših je zdravljenje bolezni. V primeru respiratornih bolezni, je administracija zdravil (proteinov) lokalno na pljučno tkivo omejena na zgornje dele dihal (sapnik in bronhiji). Zato so že dolgo v uporabi neinvazivna aerosolna zdravila, ki zdravilo enakomerno razdelijo po celotnem bronhijskem in alveolarnem epitelu. Možnosti uporabe aerosolne mRNA za indukcijo sinteze proteinov v pljučnem epitelu so raziskovali Patel in sodelavci. Na podlagi preteklih raziskav so izbrali nekaj molekul, ki bi lahko sodelovale pri dostavi mRNA do pljučnih celic. Teste so izvajali na različnih vrstah laboratorijskih miši. Po smrti so pregledali vse njihove organe in pri njih ugotavljali prisotnost molekul, ki so jih v tkivu pričakovali. Ugotovili so, da je hiperrazvejen PBAE v kompleksu z želeno mRNA najprimernejši način njene dostave do celic pljučnega epitela. Na koncu so s postopkom liofilizacije, kar je sušenje in zmrzovanje pri zelo nizkih temperaturah, dosegli tudi uporabno življenjsko dobo takšnih zmesi.

=== Maja Kolar: Pomen velikosti aksonskih mitohondrijev v možganih ===
Nevroni spadajo med najbolj polarizirane celice v naravi. To jim omogoča oblikovanje različnih lokaliziranih struktur, kot so akson in dendriti. Možgansko skorjo sestavljajo kortikalni nevroni, v katerih se oblike mitohondrijev razlikujejo glede na lokacijo; v dendritih in somi so dolge, cevaste oblike, medtem ko so v izrastkih aksona veliko krajši in kroglasti. Majhnost aksonskih mitohondrijev je povezana predvsem s fizijo oz. binarno cepitvijo, ki poteka prek oligomerizacije Drp1 proteina iz skupine dinaminov zunanji membrani. Ker je Drp1 citoplazemski protein, se z mitohondrijsko zunanjo membrano veže prek 4 različnih receptorjev, nevroznanstveniki Univerze v Columbiji, Lewis in sodelavci, pa so raziskovali predvsem receptor MFF (ang. mitochondrial fission factor), saj je v kortikalnih nevronih najpogostejši. Ekspresijo MFF gena so Lewis in sodelavci zavirali prek uporabe shRNA (ang. short hairpin RNA) ki je umetno izdelan RNA in se uporablja za RNA posege pri zaviranju ekspresije tarčnih genov. Z raziskavo so dokazali, da MFF nima znatnega vpliva na membranski potencial mitohondrijev in na njihovo skupno sposobnost pridelave ATP, je pa z zmanjšanim delovanjem izrazito vplival na povečanje presinaptičnih mitohondrijev. To je povečalo mitohondrijsko sposobnost absorpcije Ca2+ ionov med nevrotransmisijo, kar je vodilo do zmanjšanega presinaptičnega citoplazemskega kopičenja Ca2+. Posledično se je zmanjšalo sproščanje nevrotransmitorjev v sinaptično špranjo, zmanjšala aksonska razvejanost v možganih in oslabila medsebojna povezanost nevronov.

=== Timotej Zgonik: Vijačna struktura v biomolekulah se lahko razvije na dokaj preprost način ===
Že dolgo časa v biokemiji obstaja problem, kako so iz akiralnih molekul nastali kiralni komplesksi, saj je pri eksperimentih vedno bilo treba dodati kiralni center, da so se ostale molekule pravilno zvile. Raziskovalci Tehnološkega inštituta v Georgiji so izvedli tri eksperimente, ki so demonstrirali tvorbo homokiralnih struktur iz akiralnih komponent. V prvem eksperimentu so pripravili raztopino triaminopirimidina (TAP) in 6-(2,4,6-triokso-1,3,5-triazinan-1-il)heksanojske kisline (CyCo6). Spojini sta se povezali v heksamerne rozete, te pa so se nalagale v stolpiče tako leve in desne kiralnosti. Ko so v drugem eksperimentu v raztopini zamenjali CyCo6 z analogno, a kiralno spojino, je bila kiralnost vseh posledično nastalih struktur enaka. Tudi če je bila le vsaka tisoča molekula CyCo6 zamenjana s kiralnim analogom, so bile strukture še vedno homokiralne. Enako je veljalo tudi, če sta bila v raztopini prisotna enantiomera obeh kiralnosti, a je bil eden v rahlem presežku. Pri tretjem poskusu so rezultate uspeli ponoviti tudi za organske spojine, ki bi na Zemlji lahko bile prisotne pred nastankom življenja, čeprav je bil pri tem bil učinek ojačitve kiralnosti šibkejši, enantiomerski presežek, potreben za homokiralnost, pa večji. Vendarle gre pri tem za prvi primer, ko so spontano nastali analogi nukleotidov povzročili tvorbo homokiralnih struktur.

=== Nina Varda: Kompleksne molekule, ki se zvijajo kot proteini, lahko nastanejo spontano ===
Proteini in nukleinske kisline so ključne za delovanje živih organizmov. Zanje je značilno, da se zvijejo v posebne konformacije, ki določajo njihove funkcije. A načrt po katerem bi se makromolekule zvijale še ni bil odkrit. Tako se je razvilo področje raziskovanja foldamerov (sintetičnih oligomerov, ki se zvijajo v sekundarne in terciarne strukture npr. v vijačnice in plošče). Otto in sodelavci so v svoji raziskavi predstavili kompleksno molekulo, ki lahko nastane spontano. Iz gradnika, ki ga sestavljata aminokislinska in adeninska podenota, so pridobili makrocikel iz 15 gradnikov. 15mer se je tako v kristalni obliki, kot tudi v raztopini zvil, zaradi nekovalentnih interakcij med gradniki. Najbolj opazen strukturni motiv je nalaganje aromatskih obročev v kupe (sekundarne strukture). Ena molekula se zvije v 5 kupov, pri čemer je vsak sestavljen iz treh fenilnih obročev in dveh adeninskih obročev. Ker so kupi med sabo orientirani, je prisotna tudi terciarna struktura. Pri nekaterih foldamerih so že bile odkrite katalitske in inhibitorne lastnosti. Ker so foldameri, ki so zaradi svoje terciarne zgradbe relativno kompleksni, sposobni spontanega nastanka, je možno, da so se pojavili in imeli pomembno vlogo že v zgodnjih fazah nastanka življenja.

===Anja Konjc: Nanodelci v boju proti raku===

Nanodelci postajajo čedalje pomembnejši pri razvoju zdravil, saj imajo določene posebnosti, ki omogočajo tarčno usmerjanje zdravil in zmanjševanje njihovih stranskih učinkov (npr. pri kemoterapiji). Vendar so predhodne raziskave pokazale določene pomanjkljivosti. S sintezo posebnega ščita, imenovanega proteinski koronski ščit (PCS), so raziskovalci rešili te omejitve. Ugotovili so namreč, da PCS zmanjša interakcije nanodelcev s serumskimi proteini in omogoči, da makrofagi teh delcev ne fagocitirajo. Tako nanodelci ostanejo več časa v krvi in prenesejo zdravila na ciljno mesto (npr. v tumorje). Nanodelci so namreč sposobni prenašati sorazmerno velike količine molekul (npr. zdravil), ki jih vstavimo v njihove pore. Znanstveniki so PCS sintetizirali tako, da so nanodelce prevlekli s posebnimi proteini. Obnašanje tako prevlečenih nanodelcev so opazovali z različnimi poskusi. Ko so mišim vbrizgali različne nanodelce, so ugotovili, da so se v tumorjih najbolj nakopičili tisti s PCS. To je dokazalo hipotezo, da lahko ti nanodelci uspešno prinesejo zdravila v tumorje, ne da bi pri tem prišlo do imunskega odziva, torej fagocitoze delcev. Zato bodo tudi v prihodnje nanodelci s PCS imeli pomembno vlogo pri zdravljenju različnih obolenj, ne le rakavih, saj povečujejo učinkovitost zdravljenja.

=== Oskar Nemec: Shizofrenija je povezana z nenavadnim imunskim odzivom na virus Epstein-Barr ===
Ustanovi Johns Hopkins Medicine in Sheppard Pratt Health System sta izvedli raziskavo, ki je pokazala, da imajo ljudje s shizofrenijo povečano količino protiteles proti virusu Epstein-Barr (VEB). Gre za herpesvirus, ki lahko povzroči infekcijsko mononukleozo. Za povečan imunski odziv je morda krivo dejstvo, da shizofrenija spremeni imunski sistem pacientov in jih naredi bolj občutljive na virus ali pa okužba poveča tveganje za izoblikovanje shizofrenije. Študijo so izvedli na 743 osebah - 432 je bilo obolelih za shizofrenijo, 311 pa jih je bilo zdravih. Najprej so izmerili količino protiteles proti komponentam virusa in primerjali količino protiteles med zdravo skupino in shizofreniki. Ugotovili so, da imajo shizofreniki od 1.7 do 2.3-krat večjo verjetnost, da imajo povečano količino protiteles proti VEB. Merili so tudi količino protiteles proti ostalim podobnim virusom, ampak pri shizofrenikih niso ugotovili odstopanja od zdrave skupine. Nato so proučevali DNA udeležencev ter ugotovili, da če ima dana oseba povečano količino protiteles proti VEB in tudi genetsko dovzetnost za shizofrenijo, je verjetnost da je ta oseba v skupini shizofrenikov osemkrat večja kot pa verjetnost, da je oseba zdrava. Ker ni pravih zdravil proti virusu, je pomembno, da odkrijejo, kako preprečiti delitev virusa. Povečano razumevanje delovanja infekcije z virusom VEB nam lahko morda pomaga pri zdravljenju shizofrenije.

=== Vivian Nemanič: Zmanjšanje stranskih učinkov kemoterapije z absorpcijsko napravo ===
Zdravila, ki jih uporabljamo za kemoterapijo, imajo veliko stranskih učinkov na naše telo. Da pa da zdravila delovala, so potrebne zelo velike količine, ki pa ne morejo ostati samo na tumorju oz. na prizadetem organu. V tej študiji so skušali ugotoviti kako bi preprečili, da zdravila zakrožijo po celem telesu in rešitev bi lahko bila absorpcijska naprava, ki bi nase vezala zdravilo iz krvi in tako pravzaprav absorbirala do 70% zdravila, ki ni ostalo v tumorju. To napravo bi izdelali s 3D tiskalnikom, zato da bi bila optimalne oblike in velikosti in bi se popolnoma prilegala žili. Eksperiment so izvedli na prašičih za primer jetrnega raka in bil je zelo uspešen. Verjetno bi absorpcijska naprava delovala tudi pri drugih vrstah raka in pri različnih zdravilih za kemoterapijo, poleg tega pa je pomembno da naprava ne ovira krvnega obtoka ali povzroče tromboze. Torej je varna za naše telo, saj naj ne bi imela nobenih negativnih učinkov na delovanje našega telesa, saj jo po približno eni uri po začetku kemoterapije vzamemo iz telesa, saj hitro opravi svojo nalogo. Naprava bi lahko postala zelo pomembna tudi pri odstranjevanju toksinov pri bakterijskih okužbah, okoljskih toksinov, ali pa tudi samih celic, ki bi jih ujeli na podlagi specifičnih kemijskih, fizikalnih ali bioloških značilnosti.

=== Kim Glavič: Preveč popravljanja DNA lahko poškoduje tkiva ===
Zaradi nenehnega nastajanja poškodb DNA, ki jih povzročajo okoljski dejavniki, stranski produkti celičnega metabolizma ali pa kemoterapevtiki (npr. alkilirajoče snovi), so se razvili različni popravljalni mehanizmi, ki te napake popravljajo in skrbijo za zaščito zdravih tkiv. Eden takih mehanizmov je tudi popravljanje z izcepom baze (BER), ki v večini celic učinkovito odstrani napake. V nekaterih celicah, ki vsebujejo večje količine DNA-glikozilaze (AAG) pa njegova prevelika aktivnost povzroči kaskado dogodkov, kateri vodijo do celične smrti. Raziskovalci so ugotovili, da je povzročena degeneracija celic odvisna tako od količine AAG kot tudi od spola organizma ter, da sta pri propadanju teh celic prisotni dve vrsti celičnih smrti in sicer apoptoza (genetsko kontrolirana programirana celična smrt) ter nekroza (poteče kadar celica propade zaradi poškodbe). Pri slednji se med procesom propadanja izloča protein, ki posredno vpliva na nastanek vnetne reakcije torej prodiranja makrofagov na mesto propadajočih celic. TI makrofagi pa vplivajo na nastanek zelo reaktivnih kisikovih spojin, katere povzročijo še več poškodb DNA. Zaradi tega se aktivnost AAG še poveča, kar pa povzroči še večjo količino propadlih celic.

=== Ela Sabadin: Genska terapija lahko ozdravi prirojeno gluhost pri miših ===
Znanstveniki so uspeli obnoviti sluh v odrasli miši modela DFNB9 gluhosti – motnja sluha, ki predstavlja enega najbolj pogostih primerov genetsko prirojene gluhosti. Posamezniki z DFNB9 so popolnoma gluhi in imajo pomanjkanje gena za kodiranje otoferlina (pri ljudeh je kodiran z otof genom), proteina, ki je bistven za prenašanje zvočnih informacij v slušno-senzoričnih sinapsah. Z injeciranjem tega gena v bolne miši, so znanstveniki uspešno obnovili funkcijo slušne sinapse in povrnili sluh na skoraj normalno stopnjo. Genska terapija na podlagi AAV (adeno-associated virus) je obetajoča terapevtska možnost za zdravljenje gluhosti, vendar je njena vloga omejena s potencialno ozkim terapevtskim oknom. Kakorkoli, ker je AAV omejil kapaciteto paketa DNA (približno 4,7 kilobaz), je zahtevno uporabiti to tehniko za gene, katerih regija kodiranja (cDNA) presega 5 kb, kot je na primer gen za kodiranje otoferlina, ki ima regijo kodiranja dolgo 6 kb. Znanstveniki so premagali to oviro s prilagajanjem AAV pristopa, znanega kot dvojna AAV strategija. Rezultati, doseženi s strani znanstvenikov, kažejo na to, da ja terapevtsko okno za prenos lokalnih genov pri pacientih z DFNB9 prirojeno gluhostjo lahko širše kot zgolj ideja in ponuja upe za razširitev teh ugotovitev na ostale tipe gluhosti.

=== Aleksandra Rauter: Izolirana bakterija črevesne flore in njena možna povezava z depresijo ===
Črevesna flora je kompleksni mikrobni ekosistem v gastrointestinalnem traktu sesalcev. Vpliva na mnoge pomembne funkcije gostitelja, vpliva pa tudi na živčni sistem. V sami raziskavi so se osredotočili na rastne faktorje, ki vplivajo na celično delitev, proliferacijo. Zaradi odsotnosti rastnih faktorjev v umetnih medijih, je večina bakterij še negojenih, kar ovira naše razumevanje njihovih bioloških vlog. V študiji so z uporabo kokulture izolirali bakterijo KLE1738, ki je za svojo rast potrebovala prisotnost bakterije Bacteroides fragilis. Analiza supernatanta B. fragilis je vodila v izolacijo rastnega faktorja. To je bila GABA (Gamma AminoButyric Acid), ki je glavni nevrotransmiterski inhibitor v centralnem živčnem sistemu. Na podlagi spremenjenih vrednosti GABA v odvisnosti od antibiotikov in prisotnosti mikroorganizmov, so prišli do zaključka, da je črevesna flora posredno povezana tudi z različnimi boleznimi. Raziskali so, kako ševilčnost B. fragilis vpliva na nevronsko mrežo in povezavo med posameznimi regijami v možganih. Rezultati so pokazali, da zmanjšano število bakterij obratno korelira s funkcionalno povezavo med posameznimi možganskimi regijami. Prekrivanje teh z regijami limbičnega sistema je vplivalo na čustvene odizve. Z izolirano bakterijo KLE1738 niso našli nobene povezave. Dejstvo, da številčnost bakterij Bacteroides (in posledično vrednosti GABA) vpliva na fiziologijo možganskih regij, so potrdile tudi ostale študije. Raziskovalci so mnenja, da je to prvi korak k razumevanju te povezave.

=== Ana Babnik: Kako nas okuži določena vrsta bakterij? ===
Znano je, da Gram negativne bakterije v veziklih zunanje membrane transportirajo toksine, zaradi katerih zbolimo. O mehanizmu nastanku veziklov zunanje membrane se do sedaj ni vedelo veliko, predlaganih pa je bilo nekaj teorij biogeneze teh veziklov. Raziskovalcem iz Binghamton University v New Yorku je uspelo odkriti mehanizem, kako bakterije ''Pseudomonas aeruginosa'' komunicirajo med sabo preko majhnih molekul ''Pseudomonas quinolone signal'' (PQS). Ta bakterija je pomembna, saj je predmet mnogih raziskav in pri živalih, rastlinah in ljudeh povzroča hude okužbe. Molekula PQS se preko več korakov vgradi v vrhnji sloj zunanje membrane, s tem asimetrično poveča membrano in povzroči uvihanje. Li in sodelavci so s simulacijami, pri katerih so približali molekulo na 1 nm (trajanje 300 ns ali 500 ns), dokazali, da pri tem delujejo močne vodikove vezi med fosfatno skupino membrane in funkcionalnimi skupinami PQS, ki pomagajo pri spontani umestitvi v membrano. Z meritvami minimalne razdalje med vrhnjim slojem in PQS, ki je znašal 1,35 nm, so potrdili izjemno stabilnost faze vezave molekule na površino. Odkrili pa so tudi spremembo iz odprte v zaprto konformacijo PQS, ki zmanjša odbojne sile pri penetraciji vrhnjega dela membrane. Sklepajo, da bi tak model komunikacije bakterij lahko obstajal še pri drugih vrstah Gram negativnih bakterij. Spoznanja raziskave pa prinašajo boljše razumevanje mehanizmov biogeneze membranskih veziklov, ki raziskovalcem pomagajo razumeti interakcije med več vrstami ter tako posledično iskati rešitve za preprečitev potencialnih okužb.

=== Karmen Ferjan: Sestavina zelenega čaja, ki pomaga siRNA zdrsniti v celico ===
Glavni problem pri kliničnem prenosu siRNA v zdravilih je dostava v citosol. Mnogi polimeri so bili razviti za ta prenos siRNA, ampak noben hkrati ni ustrezal, bili so premalo učinkoviti ali pa preveč toksični. Članek objavljen v reviji ACS central Science poroča o preprosti strategiji za izgradnjo nanodelcev v obliki jedra z lupino, ki je zelo učinkovita za dostavo siRNA. Nanodelec je pripravljen z entropijsko-gnanim kompleksom siRNA in sestavine zelenega čaja EGCG, ter je obložen z polimeri nizke molekulske mase. Poskusi so bili izvedeni z šestimi različno razvejanimi naravnimi in sintetičnimi polimeri. Izdelan nanodelec je imenovan GNP (Green Nanoparticle). Ta strategija lajša polimerom zgoščevanje siRNA v enoten nanodelec, ki lažje dostopa v celico kot siRNA brez catechina. Zgoščevanje dokažemo z drugačno barvo fluresciranj v prisotnosti EtBr. Namen uporabe GNP je lajšanje bolezenskih stanj kot je na primer kronično črevesno vnetje. Poskusi uporabe so bili izvedeni na HeLa celicah ter na miših. EGCG je z antioksidantskimi, proti-vnetnimi, antibakterijskimi in proti-rakotvornimi učinki navdihujoč za lokalno zdravljenje različnih bolezni.

=== Maša Andoljšek: Zrele človeške celice lahko spremenijo svojo funkcijo ===
Poznamo diferenciacijo zrelih celic pri rastlinah, nekaterih živalih, manj pa pri sesalcih. Splošno velja, da človeške odrasle matične celice ne morejo spremeniti svoje funkcije. Raziskava je bila na temo plastičnosti, to pomeni spreminjanje naloge zrele celice. Raziskovali so, ali lahko celice alfa (proizvajalke glukagona) ali celice gama (proizvajalke pankreatičnega polipeptida), ki se nahajajo v Langerhansovih otočkih trebušne slinavke, spremenijo svojo funkcijo in začnejo proizvajati inzulin, kot celice beta. Raziskava je potekala in vitro, nato pa še in vivo, saj so psevdootočke, spremenjenih celic z transkripcijskimi faktorji(Pdx1, Mafa in Nkx6-1), transplantirali v miši. Sprva so celicam alfa dodali zeleni fluorescenčni protein in zgodilo se ni nič, nato so ob dodatku Pdx1 in Mafa začele proizvajati največ inzulina, ter tudi nekatere gene celic beta. Čez nekaj tednov so proizvajale le še inzulin. Potrdili so diferenciacijo celic alfa in gama in vitro. Prilagajanje je bilo s časom čedalje bolj uspešno. Celice alfa in vivo so postale uspešne proizvajalke inzulina in ob transplantaciji psevdodotočkov celic alfa zdravih donorjev so ozdravili diabetes pri miši. Ugotovili so, da so se celice hitreje spremenile in vivo, kot in vitro. Da bi ugotovitve te raziskave postale del zdravljenja je potrebno še veliko, bi pa lahko bilo to zdravljenje uspešnejše od zdravljenja diabetesa danes.

=== Nika Vegelj: Nove poti iskanja funkcionalnega zdravila za virus HIV ===
Virus HIV spada v družino retrovirusov, njegov genom pa je sestavljen iz dveh enojnih vijačnic RNA. Virus HIV primarno okuži celice, ki so pomembne pri imunskem odzivu, to so CD4+ T celice. Problem virusa HIV je ta, da se ga telo ne more znebiti zgolj s tvorbo protiteles, saj ostane integriran v genomu obolelega. Okužba z virusom HIV nato sproži odmiranje celic, ter apoptozo neokuženih celic, ki pridejo v stik z okuženimi. Zmanjšanje števila CD4+ T limfocitov pa vodi do nezadostnega celično posredovanega imunskega odziva. Funkcionalno zdravilo za virus HIV zahteva, da si organizem ponovno zgradi imunski sistem. Virus HIV primarno okuži celice, ki so pomembne pri imunskem odzivu, to pa so CD4+ T limfociti. Ko virus okuži CD4+ T limfocite, se lahko aktivno deli, da proizvede čim več novih virusov ali pa gre v stanje mirovanja. Znanstveniki so z raziskavo prikazali, da stimulacija CD4 T limfocitov z anti - α4 β7 antitelesi lahko modulirajo količino cofilina in popravijo defekt migracije T limfocitov, ki ga je povzročila hiperaktivacija cofilina. Znanstveniki so torej s to raziskavo odkrili nove možnosti za testiranje novih terapevtikov, ki bi obnovili sistem za migracijo T celic ter repopulacijo tkiv za rekonstrukcijo imunskega sistema in posledično nadzora nad virusom.

=== Tevž Levstek: Odkritje, ki izboljša razumevanje, kako se nekateri virusi množijo ===
Osnovno razumevanje razmnoževanja virusov domneva, da določen virus okuži eno celico, ki pa naprej proizvede nove viruse in tako nadaljuje z okužbo sosednjih celic. Obstajajo pa tudi drugačni, večdelni virusi. Tovrstni virusi ne vsebujejo vsega dednega zapisa v le eni kapsidi, ampak so segmenti dednega materiala razporejeni po virusni populaciji. Omenjeni segmenti navadno zapisujejo različne, zaključene enote genskega zapisa, raziskovalci pa so v tem primeru uporabili virus, ki je imel 8 genskih segmentov. Ker je zelo majhna možnost, da bi vseh osem segmentov okužilo isto celico, so raziskovalci preverili, ali ti med sabo pri vstopanju v celice kakor koli vplivajo, da bi se ta možnost povečala. Ugotovili so, da se to ne dogaja in da dejansko skoraj nobena celica ne dobi vseh virusovih segmentov. Nadalje so raziskali, ali se sploh lahko razmnožujejo virusi iz celice, ki nima vseh genskih segmentov. Pokazali so, da v celicah, ki imajo določen virusni segment, nimajo pa segmenta z geni za replikacijo, ta vseeno poteka. Pojavijo se tudi proteini, ki jih ne zapisuje segment v celici, ampak segment v sosednji celici. Čeprav direktno niso dokazali, da bi virusovi proteini potovali iz ene celice v drugo, je dokazano, da se nekako pojavijo v celicah, ki zanje ne vsebujejo genskega zapisa, če katera od celic poleg ta zapis vsebuje. To pomeni, da najverjetneje med okuženimi celicami poteka transport ali dovršenih proteinov ali pa molekul mRNA, ki te beljakovine zapisujejo.

=== Michelle Oletič: Naivni makrofagi ===
Plazminogen aktivator zaviralec-1 (PAI-1) ima pro-tumorigenično funkcijo preko pro-angiogene in anti-apoptotične aktivnosti. V novi študiji je DeClerckova ekipa pokazala, da rakaste celice uporabljajo PAI-1, da prelisičijo imunski sistem telesa v podporo raku. Raziskava Los Angelske otroške bolnišnice z Yves DeClerck načelu je bila namenjena dokazovanju, da PAI-1 spodbuja rekrutiranje in M2 polarizacijo monocitov oz. makrofagov prek različnih strukturnih domen. Eni od teh dveh sta njegova LRP1 interakcijska domena in uPA interakcijska domena, ki pospešuje polarizacijo makrofagov M2 in indukcijo aktivacijske poti avtokrinega interlevkina (IL) -6 / STAT3. Raziskava, ki je potekala in vivo na miših je pokazala zadovoljive rezultate, da je izražanje PAI-1 povezano s povečano tumorigenostjo, povečano prisotnostjo M2 makrofagov, višjimi nivoji IL-6 in povečano fosforilacijo STAT3 v makrofagih. Močne pozitivne povezave med ekspresijo PAI-1, IL-6 in CD163 (M2 marker) so bile ugotovljene tudi z analizo podatkov več kot 11.000 vzorcev bolnikov z različnimi vrstami rakov pri ljudeh. Ti podatki skupaj zagotavljajo dokaze za mehanizem, ki pojasnjuje pro-tumogerično dejavnost pri raku. Tako odkritje je izrednega pomena pri zdravljenju raka in velik prvi korak k načinu odkrivanja novih možnosti.

=== Ana Vičič: Zdravila naslednje generacije, ki bi ovirala prenos malarijskega parazita v komarje ===
Za razumevanje pristopa znanstvenikov k problemu malarije moramo vedeti, da se infekcijske celice malarijskega parazita P. falciparum, ki jih med ljudmi prenašajo Anopheles komarji, v komarje prvotno v neaktivni obliki prenesejo iz človeka. Če bi torej z določenimi substancami preprečili prenos parazita v komarje, bi s tem onemogočili raznašanje aktiviranega parazita v človeški populaciji. Delves, M. J. in sodelavci so v omenjeni raziskavi za izhodišče vzeli 'Global Health Chemical Diversity Library' (GHCDL), knjižnico 68 689 različnih spojin s proti-malarijskim potencialom. Za postopno oženje nabora spojin in končno identifikacijo najobetavnejših so uporabili številne kriterije in analize v vrstnem redu kot sledi; učinkovitost v majhnih koncentracijah, majhna citotoksičnost za človeške celice, biološka, kemijska in fenotipska analiza, ter dva in vivo testa. S temeljitim pregledom GHCDL so identificirali in analizirali številne obetavne spojine za blokiranje prenosa malarijskih parazitov v komarje. V ožjo selekcijo so sprejeli tri spojine, BPCA, DDD01245291 in DDD01035881. Nato so na podlagi rezultatov in vivo testov za najobetavnejšo spojino določili DDD01035881 in njene analoge, ki prav tako vsebujejo N-4HCS ogrodje.

=== Lena Trnovec: Serotonin lahko regulira izražanje genov v nevronih. ===
Ko govorimo o dednosti in izražanju genov, imamo največkrat v mislih zaporedje nukleotidov v molekuli DNK in spremembe v njem. Vzroki za te spremembe so kompleksni molekularni mehanizmi, med katere spadajo tako kemične modifikacije molekul DNK in RNK kot tudi post-translacijske modifikacije histonov – proteinov, okoli katerih se ovija kromatin. V članku v reviji Nature znanstveniki iz Mount Sinai School of Medicine poročajo, da so histoni lahko modificirani s pomočjo serotonina – proteina, ki je znan predvsem po svoji ključni vlogi v uravnavanju aktivnosti nevronov.Serotonin (tudi 5-hidroksitriptamin ali 5-HT) je biogeni monoamin, ki ima v človeškem organizmu vlogo tkivnega hormona in živčnega prenašalca. Raziskava je razkrila, da serotonin lahko neposredno (brez receptorja) cilja na kromatin preko post-translacijske modifikacije, ki ji pravimo serotonilacija. Prišli so do ugotovitev, da transglutaminaza 2 serotonilira histon H3 na položaju Q5 takrat, ko je položaj K4 trimetiliran. Kombinacija teh dveh post-translacijskih modifikacij se imenuje H3K4me3Q5ser. Ker sta modificirani lizinski in glutaminski ostanek drug ob drugem, je možno, da je stabilnost teh dveh modifikacij soodvisna. Njuna bližina bi lahko tudi pomagala pri funkciji transkripcijskih faktorjev TFIID in posledično vplivala na gensko izražanje.

=== Marjeta Milostnik: Ključ do podaljšane življenjske dobe? Rubicon spremeni delovanje avtofagije med staranjem ===
Avtofagija je proces celične razgradnje, s katerim celica reciklira snovi, ki so odvečne ali poškodovane. Pri tem uporablja lizosomske encime in strukture imenovane avtofagosomi, ki v citoplazmi zajamejo material za razgradnjo in ga dostavijo lizosomom, s katerimi skupaj tvojijo avtofagosome. V predstavljeni raziskavi so prišli do spoznanja, da je delovanje avtofagije s starostjo vpada in s tem povezali povečanje količine proteina Rubicon v celici. Raziskava je pokazala novo vlogo Rubicona, ki je bil doslej znan le kot protein ki interagira z Beclin-1. Ugotovili so, da ima Rubicon ključno vlogo pri regulianju staranja. Z raziskovanjem na organizmih C. elegans, samicah sadne muhe in miših so odkrili, da znižanje Rubicona aktivira avtofagijo, čeprav še vedno ni jasno kako. Skladno s pričakovanji je aktiviranje avtofagije podaljšalo življenjsko dobo, nekje bolj, nekje manj učinkovito. Znižanje nivoja Rubicona je bilo najbolj učinkovito v nevronih (živčnih celicah), saj se je takrat najbolj povečala življenjska doba organizma. Rezultati na miših, skupaj z rezultati na črvih in muhah kažejo, da je znižanje Rubicona v nevronih dovolj, da izboljša starostne fenotipe v organizmih, v primeru C. elegans je znižanje Rubicona zmanjšalo kopičenje proteina v steni telesne mišice, kar je eden od znakov staranja.

===Matevž Drnovšek: Koruzni sirup z visoko vsebnostjo fruktoze pospeši proliferacijo raka pri miših ===
Povečana poraba sladkih pijač je povezana z razširjanjem prekomerne debelosti po svetu, ki je izbruhnila v 80. letih prejšnjega stoletja . V povsem istem časovnem obdobju so znanstveniki zasledili povečanje pojavnosti kolorektalnega raka predvsem med mladimi in odraslimi srednjih let. Ti podatki kažejo na možno povezavo med debelostjo, razvojem kolorektalnega raka in pogostim uživanjem sladkih pijač. Dokazano je, da prekomerno uživanje sladkih pijač povzroča debelost. Debelost pa posledično povečuje tveganje za kolorektalnega raka, za katerim najbolj pogosto zbolevajo moški. Dva dejavnika, ki dokazano vplivata na pospešeno proliferacijo tumorjev sta debelost in presnovni sindrom. Do sedaj pa še ni bilo dokazano, da bi prekomerno uživanje sladkih pijač neposredno vplivalo na proliferacijo tumorjev v črevesju. To povezavo so poskušali znanstveniki odkriti in dokazati z raziskavo na miših, ki so jih hranili z mešanico glukoznega in fruktoznega sirupa.

===Maša Gabrič: Cepivo, s katerim bi lahko izkoreninili otroško paralizo===
Cepiva so najbolj učinkovita metoda kontroliranja virusnih okužb. Dokaz za to je izkoreninjenje črnih koz, močno zmanjšanje okužb s poliovirusom, HPV (Human Papillomavirus), gripo… Poliomielitis ali otroška paraliza je močno nalezljiva bolezen, ki jo povzroča poliovirus in se danes pojavlja le še v redkih državah v razvoju. Trenutno sta v uporabi dve cepivi proti poliomielitisu, OPV (Oral Poliovirus Vaccine), ki je oralno cepivo in vsebuje oslabljen virus ter IPV (Inactivated Poiliovirus Vaccine), ki ga injiciramo v mišico in vsebuje deaktiviran virus. OPV je bil zelo priljubljen, ker omogoča lažji potek masovnih cepilnih akcij, ki jih izvajajo v državah v razvoj, saj ni potrebe po sterilnih iglah. Da bi izkoreninili otroško paralizo pa bomo morali OPV nadomestiti z IPV, saj ima ta v redkih primerih škodljiv, nasprotni učinek, paralizo, povezano s cepivom. IPV je lahko pri optimalni temperaturi (2 – 8°C) hranjeno do 4 leta, vendar pa formula ni stabilna pri temperaturah višjih od 8°C, kar močno otežuje njegovo prenašanje in shranjevanje. Znanstveniki so razvili cepivo, ki je ostalo stabilno po 4 tedenski inkubaciji pri 4, 25 in 40°C ter je induciralo močna nevtralizacijska protitelesa in polno zaščito prodi poliovirusu divjega tipa pri miši.

===Alliana Kolar: Hiperaktivnost možganskih celic bi lahko bila razlog za neučinkovitost antidepresivov===
Klinična depresija je najbolj prevladujoča psihiatrična motnja, za katero trpi vedno več ljudi. Zdravi se jo z različnimi antidepresivi, najpogosteje s selektivnim zaviralcem ponovnega privzema serotonina (SSRI - Selective Serotonin Reuptake Inhibitors), ki deluje tako, da uravnoteži nepravilno presnovo serotonina (5-HT), namreč to je vzrok ali posledica (to nam je zaenkrat še neznano) depresije. Ker se približno 30% pacientov ne odzove na te antidepresive, so znanstveniki hoteli ugotoviti, kaj je razlog za neučinkovitost zdravila. Po osmih tednih zdravljenja pacientov s SSRI, so s tehnologijo induciranih pluripotentnih matičnih celic generirali nevrone pacientov, ki se odzovejo na zdravila, pacientov ki se ne odzovejo na zdravila in popolnoma zdravih posameznikov. Rezultati so pokazali, da je v nevronih pacientov, ki se ne odzovejo na SSRI, v primerjavi z drugima dvema skupinama višja aktivnost delovanja, kar pomeni, da se serotonin hitreje presnavlja, to pa povzroča nižjo koncentracijo serotonina v nevronih. Razlog za hiperaktivnost nevronov je v večjem številu serotonergičnih receptorjev 5-HT7 in 5-HT2A, ki igrajo vlogo pri prenosu serotonina do encima, kjer se razgradi. Ta problem bi lahko rešili z vezavo antagonistov na receptorje, ki zasedejo njihovo mesto in posledično se serotonin ne more vezati nanje, kar ohranja višjo koncentracijo serotonina v nevronih.

===Laura Unuk: Kako HIV-1 protein zavira odgovore imunskega sistema===
HIV ali virus humane imunske pomanjkljivosti povzroča počasi napredujoče kronične bolezni z dolgo dobo inkubacije. Za uspeh zasluženi proteini Vif, Nef, Vpr in Vpu, saj vznemirijo nekatere prirojene imunske senzorje. Znanstveniki so v raziskavah ugotovili novo vlogo Vpu-ja in sicer sposobnost, da prepreči aktivacijo NF-κB. V tej študiji so tako pojasnili (1) globalni vpliv Vpu na izražanje gostiteljskega gena, (2) transkripcijske faktorje, ki jih je usmerila Vpu, in (3) vlogo protiukrepanja tetherina pri imunosupresivni aktivnosti Vpu. Imuno-fluorescenčna mikroskopija je pokazala, da je Vpu-posredovano zaviranje aktivnosti NF-κB povezana z zmanjšano jedrsko translokacijo p65. Z različnimi tehnikami in metodami so pokazali, da Vpu zavira transkripcijo množice NF-κB-inducibilnih gostiteljskih genov s ključnimi vlogami imunskih odgovorih in da Vpu zmanjša izražanje IFN-jev tipa I in drugih pro-vnetnih citokinov. Analiza posameznih genov je pokazala, da Vpu bistveno zmanjša ravni mRNA gostiteljskih restrikcijskih faktorjev. Te ugotovitve kažejo, da Vpu virusa HIV-1 izvaja široko imunsko-zaviralno aktivnost pri okuženih primarnih CD4 + T celicah.

===Jure Povšin: Vpliv položaja celice na njeno obnovo===
Iz preprostega vzorca tkiva rastline, kot je veja ali list, lahko zraste popolnoma nova rastlina. Nove tehnologije sekvenciranja so omogočile izvedbo analize transkriptoma na ravni ene celice, a večina teh metod izgubi informacijo o položaju celice, ki je ključna pri razumevanju regeneracije celic, saj si celice, ki se dotikajo, pošiljajo signale med seboj. Raziskovalci iz Nara Institute of Science and Technology (NAIST) so oblikovali metodo, s katero so lahko iz individualnih živih celic iz nepoškodovanega tkiva izvlekli jedro, ki je vsebovalo RNA, brez da bi ogrožali celične informacije o položaju.To metodo so poimenovali single cell-digital gene expression (1cell-DGE). To je neka vrsta enoceličnega RNA-sekvenciranja , ki uporablja mikromanipulacijo za ekstrahiranje vsebine posamezne žive celice v nepoškodovanem tkivu, medtem ko se zabeleži tudi informacija o njenem položaju. To metodo so uporabili na rastlini Physcomitrella patens. Raziskovalci so izrezali distalno polovico listov te rastline ter takoj po rezu in še enkrat po 24 urah izsesali jedro in okoliško citoplazmo iz posameznih celic listov, ki so se bile na mestu reza ter sintetizirali cDNA iz RNA . Analizirali so RNA iz 31 celic takoj po izrezu in 34 celic 24 ur kasneje. Skupaj je bilo ugotovljenih 6382 diferencialno izraženih genov, od katerih je bilo izraženih 2382 genov v vzorcih odvzetih po 0 urah in 4000 genov v vzorcih odvzetih po 24 urah.

===Žan Fortuna: Molekula, ki bi lahko odstranila virus hepatitisa C===
V zadnjih letih so bili sintetični peptidi obetavni cilji za razvoj zdravil, ki imajo nizke stranske učinke, so stroškovno učinkoviti in dovzetni za racionalno načrtovanje. Peptid Hecate je bil prvotno opisan kot močan bakterijski zaviralec in kasneje kot zdravilo proti raku s funkcijami, povezanimi z lastnostmi lipidne interakcije. Hepatitis C je bolezen, ki napada predvsem jetra in jo povzroča virus hepatitisa C. Virusi, kot je virus hepatitisa C (VHC), imajo življenjski cikel, ki je odvisen od lipidov in bi jih lahko Hecate prizadel na več načinov. Znanstveniki so spremenili strukturo peptida in so na njegovem N-koncu dodali različne radikale in tako spremljali njihove učinke na virus hepatitisa C in citotoksičnost. Hecate, konjugiran z galno kislino, je bil najučinkovitejši derivat peptida Hecate, ki je bil uspešen zaviralec v infekcijskem ciklu HCV. Najobetavnejši vidik pa je bil mehanizem delovanja GA-Hecate, ki je bil povezan z uravnoteženo medsebojno interakcijo lipidov z virusnimi ovojnicami in lipidnimi kapljicami. Ta peptid zavira tako prehod virusa v celico in njegov izhod iz nje, kot tudi zavira podvajanje virusne RNA v celici in izgradnjo snovi, potrebnih za njegovo pravilno delovanje.

===Tim Nograšek: Molekulska proteza za bolnike s cistično fibrozo===
Cistična fibroza je med ljudmi pogosta bolezen, pri kateri pride do okvare proteina CFTR(Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator). Omenjeni protein skrbi v epitelnih celicah dihal za pravilen prehod klorovih in hidrogenkarbonatnih ionov. Prehod je lahko onemogočen, če pride da mutacije na 7. kromosomu in posledično prenos anionov ni več omogočen. Da bi preprečili posledice kot so padec pH-ja, višja viskoznost mukusa na apikalni strani epitelnih celic in padec odpornosti proti bakterijam, so raziskovalci z University of Illinois, pod vodstvom Dr. Martin D. Burke odkrili ustrezno molekulsko protezo in sicer Amphotericin B (AmB). AmB je majhna molekula naravnega izvora, ki je zmožna tvorbe ionskih kanalčkov. Do sedaj je bila v zdravstvu znana kot droga za glivične okužbe, raziskave pa so pokazale, da je zmožna nadomestiti protein CFTR in opravljati naloge namesto njega. Raziskovalci so s poskusi na in-vitro tkivih pljuč in in-vivo okuženih pujsih z cistično fibrozo pokazali, da se je raven 〖HCO〗_3 – po dodatku AmB ponovno dvignila na apikalnem delu celic. Posledično se je pH vrednost ponovno vrnila na normalno raven. Uravnovešenost kationov in anionov je omogočila ponoven prehod vode skozi celice in mukus na površini ni bil več tako gost. Tako se je viskoznost zmanjšala in odpornost proti bakterijam dvignila, saj se niso več morale zadrževati v mukusu. AmB je dokazano nadomestila različne tipe mutacij CFTR-ja in je potencialno zdravilo za bolnike z cistično fibrozo.

===Ana Potočnik: Bakteriofagi sprožijo protivirusno imunost in preprečijo odstranitev bakterijske okužbe===
Na mestih bakterijskih okužb so velikokrat prisotni bakteriofagi, a je njihov vpliv na celice sesalcev še dokaj nejasen. V raziskavi so določili patogene vloge nitastega bakteriofaga Pf, ki ga producira bakterija Pseudomonas aeruginosa (Pa), da bi zatrla protibakterijski imunski odziv organizma. Pa je Gram negativna bakterija, ki pogosto okuži dihalne poti, sečila, kri, opekline in rane. Je eden nevarnejših patogenov, saj je že zelo odporna proti antibiotikom, okužba pa je velikokrat smrtonosna. Pf v mišjih in človeških ranah spodbujajo okužbo s Pa, na kar kaže korelacija med starostjo kronične rane, okužene s Pa, in prisotnostjo Pf. Predlagajo model, kjer mišji ali človeški levkocit endocitira bakteriofag Pf, nato pa deli Pf povzročijo, da tolični receptorji, kot je TLR3, preko adapterjev TRIF, ki spodbudijo sintezo interferona tipa 1, posledično inhibirajo sintezo citokinov TNF, in zato omejujejo fagocitozo bakterij Pa ter tako pospešijo in poslabšajo bakterijsko okužbo. Imunski sistem tako deluje protivirusno namesto protibakterijsko. Cepljenje proti Pf zmanjša bakterijsko okužbo s Pa v človeških ali mišjih ranah. Cepljenje proti bakteriofagom predstavlja potencialno strategijo za preprečevanje bakterijskih okužb.

===Tadej Uršič: Proteina, ki navadno ubijeta celico, zatreta listerijo in ne poškodujejo gostiteljske celice===
Protein RIPK3 in njegov navzdoljni efektor MLKL ponavadi regulrat nekroptozo pri virusni okužbi celice. Do nekroptoze pride zaradi fosforilaciije RIPK3, ki posledično fosforilira MLKL, ki se zaradi tega oligomerizira. Ta oligomer se vgradi v celično membrano gostiteljskaktivav+ciji poti RIPK#e celice, kar povzroči nastanek por v tej membrani in rezultira v litični smrti celie. V raziskavi so raziskovalci univerze North Carolina State University raziskovali primer ko delovanje teh dveh proteinov prepreči nadljno razmnoževanje bakterije Listeria monocytogenes (listerija) in zraven ne uniči gostiteljske celice. Bakterija listerija je zelo razširjena v naravnem okolju in povzroča listeriozo. Listerioza je bakterijska okužba pri kateri celice listerije prodrejo v celice gastrointestinalnega trakta in se v citoplazmi teh celic namnožijo in sistemsko okužijo organizem. V raziskavi so odkrivali kako vdor bakterije listerija v epitelne celice črevesja miši aktivira pot RIPK3-MLKL, ki uspešno zaustavi nadaljno razmnoževanje listerije in zakaj pri tem ne pride do nekroptične smrti gostiteljske celice. Dokazali so da pri aktivaciji poti RIPK3-MLKL pride do foforilacije MLKL, ki pa se ne oligomerizira ampak se veže nacelično membrano listerije, kar prepreči njeno nadaljno razmnoževanje.

===Tina Arnšek: Prvi funkcionalni tarčni inhibitorji arašidovih alergenov===
Alergija je pretirana imunska reakcija na nekatere snovi v okolju, ki običajno nimajo učinka na ljudi. Te snovi imenujemo alergeni. Vezava IgE (imunoglobin E) na specifične molekule, prisotne v hrani, sproži imunski odziv. Kritični korak pri alergijskem odzivu na arašide je vezava arašidovih alergenov na alergen-specifična IgE protitelesa (sIgE), ki so pritrjena na receptorje na površini mastocitov, kar povzroči njihovo zamreženje. To povzroči celično degranulacijo. Znanstveniki so raziskovali specifične sIgE inhibitorje, imenovane kovalentni heterobivalentni inhibitorji (cHBIs), ki selektivno tvorijo kovalentne vezi le z sIgE in tako trajno inhibirajo alergenske epitope. Velik izziv pri razvoju takih inhibitorjev je identifikacija kritičnih imunogenih epitopov izmed velikega števila potencialnih epitopov. V ta namen so razvili testni sistem, ki so ga poimenovali nanoalergeni, ki temelji na nanodelcih in tako identificirali najbolj kritične epitope Ara h 2 in Ara h 6 (imunogena proteina, ki sta najbolj povezana s hudimi alergijskimi reakcijami). S poskusi so znanstveniki ugotovili, da kombinacija le dveh razvitih inhibitorjev epitopov povzroči močno inhibicijo imunskih celic in interakcij arašidovih alergenov. S pridobljenimi informacijami so lahko razvili cHBI in ireverzibilno in selektivno inhibirali arašidove alergene ter preprečili alergijski odziv.

===Maja Mahorič: Spreminjanje odprtih ran v kožo===
Koža je kompleksno zgrajen organ, ki pomaga vzdrževati homeostazo telesa. V primeru poškodb in ran je sposobna obnove in celjenja. Pomembno vlogo imajo celice imenovane keratinocite, ki se v času poškodb odzovejo na stimulatorje iz rane, kar sproži njihovo migracijo in re-epitalizacijo poškodovanega tkiva. Vendar ta proces ni zadosten pri večjih ranah. Zato so M. Kurita in sodelavci z metodo analize s pomočjo mikro mrež primerjali izražanje genov pri človeških keratinocitah in hDFs (human Dermal Fibroblasts) ter hDASCs (Adipose – Derived Stromal Cells) in odkrili 55 transkripcijskih faktorjev in 31 mikroRNA, ki potencialno sodelujejo pri reprogramiranju celic. Te faktorje so v različnih kombinacijah prenesli v celice in opazovali rodove celic in vitro. Najboljše rezultate je predstavljala kombinacija štirih transkripcijskih faktorjev in sicer; DNP63A in GRHL2, ki celice reprogramirata, MYC, ki izboljša učinkovitost reprogramiranja, celične delitve in stratificiranje epitela ter faktor TFAP2A, ki je pospešil rast kolonij. V poskusih in vivo so mišim kirurško odstranili del epidermisa na hrbtu in rano z izolacijskimi komorami izolirali od okoliškega epidermisa, s čimer so simulirali središče večje rane. Transkripcijske faktorje so prenesli v celice in po 28. dneh opazovanja tkivo testirali. Vzgojeno tkivo je bilo zelo podobno epidermisu na robu rane, po daljšem času opazovanja pa se je uspešno zacelilo z robom rane in izražalo histološke karakteristike normalne kože.

===Nastja Feguš: Specifično narejeni proteini lahko pomagajo ustvariti protitelesa proti virusu HIV===
Iskanje cepiva za virus HIV je izjemno težko, saj se genom virusa ves čas spreminja. Da bi lahko ustvarili protitelesa, ki bi vezala virus, morajo znanstveniki najprej prepoznati regije virusa, ki se ne spreminjajo. Virusna ovojnica HIV-a je na določenih mestih glikozilirana. Mesta glikozilacije se združujejo v regije CONEs. Te regije zakrivajo spodaj ležečo virusno ovojnico, ki je glavna tarča protiteles. Ta se zaradi zgoščenih oligosaharidov na teh regijah ne morejo vezati nanjo. Zhu in sodelavci so ugotovili, da se zaradi naravne variacije genov včasih zgodi, da pride do izpada oligosaharidov v regijah CONE in prav te regije, bi lahko bile cilj specifičnih protiteles. Raziskovalci so s pomočjo računalniškega modeliranja oblikovali proteine, ki posnemajo obliko virusne ovojnice. Oblikovali so več različic in presojali primernost le teh s pomočjo različnih simulacij. Najboljše različice so nato izrazili v ''E. coli'' in izvedli podrobne strukturne analize in imunizacijske poskuse. Manjše skupine zajcev so imunizirali z različicami proteinov. Nato so preizkusili ali so v krvi specifična protitelesa, ki bi lahko vezala virus HIV. Dobili so solidne rezultate, saj so določene različice proteinov spodbudile nastanek protiteles, ki lahko vežejo HIV. To je spodbuden začetek nadaljnjih raziskav za iskanje funkcionalnega cepiva za virus HIV.

===Mateja Milošević: Kanabinoidne spojine lahko zavirajo rast celic raka debelega črevesa===
Zaradi nedavnih raziskav marihuane za medicinske namene in povezave z depresijo in tesnobo, znanstveniki vse bolj raziskujejo njenega potenciala. Znanstveniki na Pen State Collegeu so raziskali vpliv kanabinoidnih spojin na kolorektalni rak. Kolorektalni rak je eden od najpogostejših in je bilo ugotovljeno, da je povezan z Wnt/β-katenin poti in da je bilo delovanje endokanabinoidnih receptorjev CB1, CB2 in CB3 ojačeno pri bolezni. Cilj je bil ugotoviti od 370 testiranih sintetičnih kanabinoidnih spojin, katere bi zmanjšale sposobnost preživetja 7 različnih vrst rakavih celic in so z analizo celičnih kultur z mutiranimi Wnt-signali ugotovile, koliko in kako je celica občutljiva na kanabinoide. Med temi 370 testiranimi sintetičnimi kanabinoidnimi spojinami so odkrili 10 spojin, ki zmanjšujejo življenjsko dobo testiranih celic raka debelega črevesa. Študije so tudi pokazale da fitokanabinoida skupina, v kateri sta THC in CBD, imajo omejen učinek na rast rakavih celic. Oba sta bila posebej testirana in sta pokazala da THC in CBD imata zelo slab ali skoraj noben vpliv (pri določeni koncentraciji) na stabilnost in živost rakastih celic, uporabljenih v raziskavi.

===Greta Junger: Blokiranje proteina CD22 obnovi kognitivne sposobnosti pri starih miših===
V naših možganih so poleg nevronov prisotne tudi celice mikroglija, katerih najpomembnejša funkcija je fagocitoza patogenov oziroma odpadnega celičnega materiala, npr. mielinskih fragmentov. Mielinski fragmenti so ostanki mielinskih ovojnic, ki so propadle bodisi zaradi starosti, bodisi zaradi različnih neurodegenerativnih bolezni. Ker naj bi se fagocitotske sposobnosti mikroglij s starostjo poslabšale, je raziskovalce z univerze Stanford University School of Medicine zanimalo, ali obstaja povezava med slabšo fagocitotsko zmožnostjo mikroglij in zmanjšanjem kognitivnih sposobnosti pri starih miših. Najprej so z metodo CRISPR-Cas9 določili gen, katerega izraženost se s starostjo povečuje in ima negativen vpliv na zmožnost fagocitoze mikroglij. Edini, ki je ustrezal temu kriteriju je bil gen CD22, ki kodira istoimenski protein. Ko so v mikroglijah starih miši blokirali protein CD22, so se fagocitotske sposobnosti mikroglij povečale. Enak učinek so dosegli tudi v mikroglijah miši z izbitim genom CD22. Za konec so testirali še vpliv dolgotrajne blokade proteina CD22 na stare miši. Ugotovili so, da se v mikroglijah izrazijo enaki geni, kot so običajno izraženi v mikroglijah mladih miši. Iz rezultatov sklepajo, da dolgotrajno blokiranje proteina CD22 deloma povrne 'mladostne' lastnosti starim mikroglijam. To so potrdili tudi s testi obnašanja, saj so imele starejše miši z izbitim genom CD22 podobne kognitivne sposobnosti kot mlajše z izraženim genom.

TBK2019-seminar

2019-05-05T09:38:23Z

Greta Junger: /* Seznam seminarjev */

= Temelji biokemije- seminar =

Seminarje vodi prof. dr. Brigita Lenarčič. Seminarji so obvezni.

Ocena seminarjev (6-10) predstavlja enako število odstotkov, ki se prišteje h končni pisni oceni izpita.
Stran na strežniku s seminarskimi nalogami je zaščitena.
Uporabniško ime je: tbk, password pa: samozame## "##" sta dve številki, ki ju izveste na predavanjih.
Tudi za urejanje Wiki strani potrebujete geslo, ki se od zgornjega razlikuje. Postopek pridobitve Wiki uporabniškega imena in gesla je opisan [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Main_Page tukaj].

== Seznam seminarjev ==

{| border="1" cellpadding="4" cellspacing="0" style="border:#c9c9c9 1px solid; margin: 1em 1em 1em 0; border-collapse: collapse;"
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Ime in priimek'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Naslov seminarja'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Povezava'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Rok za oddajo'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Rok za recenzijo'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Datum predstavitve'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 1'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 2'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 3'''
|-
| Anna Scott||Moj naslov v slovenščini||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/02/190214100038.htm||28.10.||05.11.||07.11.||r1||r2||r3
|-
| Maša Andoljšek||Zrele človeške celice lahko spremenijo svojo funkcijo||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/02/190213132309.htm||21.02.||22.02.||25.02.|| Isidora Stevanoska|| Tina Arnšek|| Lena Trnovec
|-
| Maja Trifkovič||naslov||povezava do novice||21.02.||22.02.||25.02.|| Manca Osolin|| Tadej Uršič|| Ana Vičič
|-
| Teo Nograšek||Kako se proteini vgradijo v celično membrano||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/02/190214100038.htm||21.02.||22.02.||25.02.|| Ajda Košorok|| Ana Potočnik|| Maša Gabrič
|-
| Maja Kolar||Pomen velikosti aksonskih mitohondrijev v možganih||https://www.sciencedaily.com/releases/2018/11/181127110959.htm||28.02.||01.03.||04.03.|| Hana Zajc|| Mateja Milošević||
Laura Unuk
|-
| Nina Varda||Kompleksne molekule, ki se zvijajo kot proteini, lahko nastanejo spontano||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/01/190117110824.htm||28.02.||01.03.||04.03.|| Katja Benčuk|| Nastja Feguš|| Sašo Jakob
|-
| Anja Konjc||Nanodelci v boju proti raku||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/01/190117092550.htm||28.02.||01.03.||04.03.|| Tina Logonder|| Maja Mahorič|| Alliana Kolar
|-
| Timotej Zgonik||Vijačna struktura v biomolekulah se lahko razvije na dokaj preprost način||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/01/190124095112.htm||28.02.||01.03.||04.03.|| Špela Sotlar|| Nika Banovšek|| Nika Ramšak
|-
| Ela Sabadin||Genska terapija lahko ozdravi prirojeno gluhost pri miši ||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/02/190219111643.htm||05.03.||08.03.||11.03.|| Maša Andoljšek|| Greta Junger|| Tim Nograšek
|-
| Kim Glavič||Preveč popravljanja DNA lahko poškoduje tkiva||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/02/190212141409.htm||05.03||08.03.||11.03.|| Maja Trifkovič|| Isidora Stevanoska|| Žan Fortuna
|-
| Oskar Nemec||Shizofrenija je povezana z nenavadnim imunskim odzivom na virus Epstein-Barr||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/01/190109090911.htm||05.03.||08.03.||11.03.|| Teo Nograšek|| Manca Osolin|| Jure Povšin
|-
| Vivian Nemanič||Zmanjšanje stranskih učinkov kemoterapije z absorpcijsko napravo||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/01/190109090930.htm||05.03.||08.03.||11.03.|| Maja Kolar|| Ajda Košorok|| Jernej Kastelic
|-
| Srna Anastasovska||Bakterijski genotoksin kolibaktin človeškega črevesa alkilira DNA.||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/02/190214153159.htm||12.03.||15.03.||18.03.|| Nina Varda|| Hana Zajc|| Tina Arnšek
|-
| Karmen Ferjan||Sestavina zelenega čaja, ki pomaga siRNA zdrsniti v celico||https://www.sciencedaily.com/releases/2018/09/180919083446.htm||12.03.||15.03.||18.03.|| Anja Konjc|| Katja Benčuk|| Tadej Uršič
|-
| Ana Babnik||Kako nas okuži določena vrsta bakterij?||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/02/190225075613.htm||12.03.||15.03.||18.03.|| Timotej Zgonik|| Tina Logonder|| Ana Potočnik
|-
| Aleksandra Rauter||Izolirana bakterija črevesne flore in njena možna povezava z depresijo||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/02/190213124350.htm||12.03.||15.03.||18.03.|| Ela Sabadin|| Špela Sotlar|| Mateja Milošević
|-
| Nika Vegelj||Nove poti iskanja funkcionalnega zdravila za virus HIV||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/02/190207173229.htm||19.03.||22.03.||25.03.|| Kim Glavič|| Maša Andoljšek|| Nastja Feguš
|-
| Adela Šajn||||||19.03.||22.03.||25.03.|| Oskar Nemec|| Maja Trifkovič|| Maja Mahorič
|-
| Michelle Oletič||Naivni makrofagi||https://www.sciencedaily.com/releases/2018/11/181129142441.htm?fbclid=IwAR2x562KFLljGOmHD5T40KXBf6I2L72TpMpvVM0I3lNBckrVxXW3cXQG-vM||19.03.||22.03.||25.03.|| Vivian Nemanič|| Teo Nograšek|| Nika Banovšek
|-
| Tevž Levstek||Odkritje, ki izboljša razumevanje, kako se nekateri virusi množijo ||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/03/190312123658.htm||19.03.||22.03.||25.03.|| Srna Anastasovska|| Maja Kolar|| Greta Junger
|-
| Matevž Drnovšek||Koruzni sirup z visoko vsebnostjo fruktoze pospeši proliferacijo raka pri miših||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/03/190321141924.htm||26.03.||29.03.||01.04.|| Karmen Ferjan|| Nina Varda|| Isidora Stevanoska
|-
| Marjeta Milostnik||Ključ do podaljšane življenjske dobe? Rubicon spremeni delovanje avtofagije med staranjem||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/02/190219111744.htm
||26.03.||29.03.||01.04.|| Ana Babnik|| Anja Konjc|| Manca Osolin
|-
| Lena Trnovec||Serotonin lahko regulira izražanje genov v nevronih.|| https://www.sciencedaily.com/releases/2019/03/190313143312.htm ||26.03.||29.03.||01.04.|| Aleksandra Rauter|| Timotej Zgonik|| Ajda Košorok
|-
| Ana Vičič||Snov, ki preprečuje malarijo pri komarjih.|| https://www.sciencedaily.com/releases/2018/09/180918082059.htm ||26.03.||29.03.||01.04.|| Nika Vegelj|| Ela Sabadin|| Hana Zajc
|-
| Maša Gabrič||Cepivo, s katerim bi lahko izkoreninili otroško paralizo||https://www.sciencedaily.com/releases/2018/11/181127092558.htm||02.04.||05.04.||08.04.|| Adela Šajn|| Kim Glavič|| Katja Benčuk
|-
| Laura Unuk||Kako HIV-1 protein zatira odgovore imunskega sistema||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/02/190205102525.htm||02.04.||05.04.||08.04.|| Michelle Oletič|| Oskar Nemec|| Tina Logonder
|-
| Sašo Jakob||Terapija pljučnih bolezni z vdihavanjem mRNA ||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/01/190104104032.htm||02.04.||05.04.||08.04.|| Tevž Levstek|| Vivian Nemanič|| Špela Sotlar
|-
| Alliana Kolar||Hiperaktivnost možganskih celic bi lahko bila razlog za neučinkovitost antidepresivov||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/01/190131162500.htm||02.04.||05.04.||08.04.|| Matevž Drnovšek|| Srna Anastasovska|| Maša Andoljšek
|-
| Nika Ramšak|| ||||09.04.||12.04.||15.04.|| Marjeta Milostnik|| Karmen Ferjan|| Maja Trifkovič
|-
| Tim Nograšek||Molekulska proteza za bolnike s cistično fibrozo||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/03/190313143248.htm||09.04.||12.04.||15.04.|| Lena Trnovec|| Ana Babnik|| Teo Nograšek
|-
| Žan Fortuna||Molekula, ki lahko odstrani virus hepatitisa C||https://www.sciencedaily.com/releases/2018/12/181219142543.htm||09.04.||12.04.||15.04.|| Ana Vičič|| Aleksandra Rauter|| Maja Kolar
|-
| Jure Povšin||Vpliv položaja celice na njeno obnovo||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/03/190327112716.htm||09.04.||12.04.||15.04.|| Maša Gabrič|| Nika Vegelj|| Nina Varda
|-
| Jernej Kastelic||||||23.04.||26.04.||29.04.|| Laura Unuk|| Adela Šajn|| Anja Konjc
|-
| Tina Arnšek||Razvitje prvih funkcionalnih ciljnih inhibitorjev arašidovih alergenov||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/04/190408161718.htm||23.04.||26.04.||29.04.|| Sašo Jakob|| Michelle Oletič|| Timotej Zgonik
|-
| Tadej Uršič||Proteina, ki navadno ubijeta celico, zatreta listerijo in ne poškodujeta gostiteljske celice||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/04/190418131251.htm||23.04.||26.04.||29.04.|| Alliana Kolar|| Tevž Levstek|| Ela Sabadin
|-
| Ana Potočnik||Bakterija sodeluje z virusom, da poveča možnosti za okužbo||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/03/190328150753.htm||23.04.||26.04.||29.04.|| Nika Ramšak|| Matevž Drnovšek|| Kim Glavič
|-
| Mateja Milošević||Kanabinoidne spojine lahko zavirajo rast celic raka debelega črevesa||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/02/190206091420.htm||30.04.||03.05.||06.05.|| Tim Nograšek|| Marjeta Milostnik|| Oskar Nemec
|-
| Nastja Feguš||Specifično narejeni proteini, lahko pomagajo ustvariti protitelesa proti virusu HIV||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/02/190227081526.htm||30.04.||03.05.||06.05.|| Žan Fortuna|| Lena Trnovec|| Vivian Nemanič
|-
| Maja Mahorič||Spreminjanje odprtih ran v kožo||https://www.sciencedaily.com/releases/2018/09/180905131831.htm||30.04.||03.05.||06.05.|| Jure Povšin|| Ana Vičič|| Srna Anastasovska
|-
| Nika Banovšek||Kako nevroni nadzorujejo napačno zvite proteine||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/03/190327112652.htm||30.04.||03.05.||06.05.|| Jernej Kastelic|| Maša Gabrič|| Karmen Ferjan
|-
| Greta Junger||Blokiranje proteina CD22 obnovi kognitivne sposobnosti pri starih miših||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/04/190403135103.htm ||07.05.||10.05.||13.05.|| Tina Arnšek|| Laura Unuk|| Ana Babnik
|-
| Isidora Stevanoska||Črni nanodelci upočasnjujejo rast tumorjev||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/04/190404104404.htm||07.05.||10.05.||13.05.|| Tadej Uršič|| Sašo Jakob|| Aleksandra Rauter
|-
| Manca Osolin||Kako lahko mitohondrijski encim sproži celično smrt||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/03/190314151623.htm||07.05.||10.05.||13.05.|| Ana Potočnik|| Alliana Kolar|| Nika Vegelj
|-
| Ajda Košorok||New pill can deliver insulin through the stomach||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/02/190207142206.htm||07.05.||10.05.||13.05.|| Mateja Milošević|| Nika Ramšak|| Adela Šajn
|-
| Hana Zajc||||||14.05.||17.05.||20.05.|| Nastja Feguš|| Tim Nograšek|| Michelle Oletič
|-
| Katja Benčuk||||||14.05.||17.05.||20.05.|| Maja Mahorič|| Žan Fortuna|| Tevž Levstek
|-
| Tina Logonder||RNA-vezavni protein Pum2 je tarča v boju proti staranju||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/01/190110141826.htm||14.05.||17.05.||20.05.|| Nika Banovšek|| Jure Povšin|| Matevž Drnovšek
|-
| Špela Sotlar||Vpogled v mehanizem, ki nadzira poškodbe DNA||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/02/190226112344.htm||14.05.||17.05.||20.05.|| Greta Junger|| Jernej Kastelic|| Marjeta Milostnik

|}

==Naloga==
* samostojno pripraviti seminar, katerega tema je novica iz področja biokemije na portalu [http://www.sciencedaily.com ScienceDaily], ki je bila objavljena kasneje kot 1. avgusta 2018. Osnova za seminar naj bo znanstveni članek, ki je podlaga za to novico. Poleg tega članka za seminar uporabite še najmanj pet drugih virov, od teh vsaj še dva druga znanstvena članka, ki se navezujeta na to vsebino.
* članke na temo lahko iščete [https://scholar.google.com/ z Google učenjakom].
* naslov izbrane teme in povezavo do novice vpišite v tabelo seminarjev takoj ko ste si izbrali temo, najkasneje pa en teden pred rokom za oddajo
* [[TBK2019 Povzetki seminarjev|Povzetek seminarja]] opišete na wikiju v približno 200 besedah - najkasneje do dne, ko morate oddati seminar recenzentom.
* Povezavo do povzetka vnesete v tabelo seminarjev tekočega letnika.
* Seminar pripravite v obliki seminarske naloge (pisava Cambria, font 11, enojni razmak, 2,5 cm robovi; tekst naj obsega okoli 1000 besed), vsebuje naj 1-2 sliki. Slika mora imeti legendo in v besedilu mora biti na ustreznem mestu sklic na sliko. Vse uporabljene vire citirajte v tekstu, kot npr. (Nobel, 2010), na koncu pa navedite točen seznam literature, kot je opisano spodaj!
*Celotni seminar naj obsega 2 strani A4 formata (po možnosti dvostransko tiskanje).
* Seminar oddajte do datuma oddaje, ki je naveden v tabeli v elektronski obliki z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/tbk/poslji/ tega obrazca].
* vsi seminarji so v elektronski obliki dostopni [http://bio.ijs.si/~zajec/tbk/poslji//bioseminar/ tukaj].
* Recenzenti do dneva določenega v tabeli določijo popravke in podajo oceno pisnega dela, v predpisanem formatu elektronskega obrazca na internetu.
* Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Za predstavitev je na voljo 12 minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni. Prvi recenzent vodi predstavitve in razpravo ter skrbi za to, da vse poteka v zastavljenih časovnih okvirih.
* Predstavitvi sledi razprava do 8 minut. Sledijo vprašanja prisotnih, recenzenti postavijo vsak vsaj dve vprašanji in na koncu podajo oceno predstavitve.
* En dan pred predstavitvijo na strežnik oddajte tudi končno verzijo. Na dan predstavitve morate oddati tudi končno (popravljeno) in natisnjeno verzijo seminarja v enem izvodu.
* Seminarska naloga in povzetek na wikiju morajo biti v slovenskem jeziku!

==Imena datotek==
Prosim vas, da vse datoteke, ki jih pošiljate poimenujete po spodnjih pravilih. Ne uporabljajte ČŽŠčžš!
Poslati morate naslednje datoteke:
* TBK_2019_Priimek_Ime.doc(x) za seminar, npr. TBK_2017_Guncar_Gregor.docx
* TBK_2019_Priimek_ime_final.doc(x) za končno verzijo seminarja
* TBK_2019_Priimek_Ime_rec_Priimek2.doc(x) za recenzijo, kjer je Priimek2 priimek recenzenta, npr. TBK_2019_Guncar_Gregor_rec_Scott.docx (če se pišete Scott in odajate recenzijo za seminar, ki ga je napisal Gunčar)
* TBK_2019_Priimek_Ime.ppt(x) za prezentacijo, npr TBK_2017_Guncar_Gregor.pptx
* TBK_2019_Priimek_Ime_clanek.pdf za datoteko PDF, ki vsebuje izvirni članek, npr. TBK_2017_Guncar_Gregor_clanek.pdf

==Ocenjevanje seminarjev==
Recenzenti ocenijo seminar tako, da izpolnijo [[https://docs.google.com/forms/d/1Hdg2OHCyG24qwLTnFt09yZTng46RIwaIiUqnKOdsJxQ/viewform recenzentsko poročilo]] na spletu.

== Mnenje o predstavitvi ==
Vsak posameznik '''mora''' oceniti seminar tako, da odda svoje [https://docs.google.com/forms/d/1VvE-jaKikfiDO5Gdybqgp9mf_0uJZfBbIK8PLXKDaS0/viewform mnenje] najkasneje v enem tednu po predstavitvi. Kdor na seminarju ni bil prisoten, mnenja '''ne sme''' oddati.

==Urejanje spletnih strani na wikiju==
Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''

==Faktor vpliva==
Faktor vpliva (angl. impact factor) neke revije pove, kolikokrat so bili v poprečju citirani članki v tej reviji v dveh letih skupaj pred objavo tega faktorja. Faktorje vpliva za posamezno revijo lahko najdete v [http://www.cobiss.si/scripts/cobiss?command=CONNECT&base=JCR COBISS-u]. V polje "Naslov revije" vnesite ime revije za katero želite izvedeti faktor vpliva in pritisnite na gumb POIŠČI. V skrajnem desnem stolpcu se bodo izpisali faktorji vpliva za revije, ki ustrezajo vašim iskalnim kriterijem. Zadetkov za posamezno revijo je več zato, ker so navedeni faktorji vpliva za posamezno leto. Za tekoče leto faktorji vpliva še niso objavljeni, zato se orientirajte po faktorjih vpliva zadnjih par let. Če faktorja vpliva za vašo izbrano revijo ne najdete v bazi COBISS, potem izberite članek iz kakšne druge revije.

==Citiranje virov==Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se v seminarju držite ene same. Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati. '''Citiranje knjig:''' Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica. Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN. Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005. Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4. Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.). '''Citiranje člankov:''' Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani. Lartigue C. ''et al''. Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, letn. 317, str. 632-638.Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole: Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani. Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.Revija Science uporablja skrajšani zapis: C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007) V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne). '''Citiranje spletnih virov:''' Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.

TBK2019 Povzetki seminarjev

2019-05-05T09:36:29Z

Greta Junger:

=== Sašo Jakob: Terapija pljučnih bolezni z vdihavanjem mRNA ===
Messenger RNA (mRNA) lahko v znanosti uporabimo tako, da jo vstavimo v žive celice, ki lahko sintetizirajo proteine glede na kodiran zapis v njej. Na ta način lahko sintetiziramo proteine za različne namene, eden pomembnejših je zdravljenje bolezni. V primeru respiratornih bolezni, je administracija zdravil (proteinov) lokalno na pljučno tkivo omejena na zgornje dele dihal (sapnik in bronhiji). Zato so že dolgo v uporabi neinvazivna aerosolna zdravila, ki zdravilo enakomerno razdelijo po celotnem bronhijskem in alveolarnem epitelu. Možnosti uporabe aerosolne mRNA za indukcijo sinteze proteinov v pljučnem epitelu so raziskovali Patel in sodelavci. Na podlagi preteklih raziskav so izbrali nekaj molekul, ki bi lahko sodelovale pri dostavi mRNA do pljučnih celic. Teste so izvajali na različnih vrstah laboratorijskih miši. Po smrti so pregledali vse njihove organe in pri njih ugotavljali prisotnost molekul, ki so jih v tkivu pričakovali. Ugotovili so, da je hiperrazvejen PBAE v kompleksu z želeno mRNA najprimernejši način njene dostave do celic pljučnega epitela. Na koncu so s postopkom liofilizacije, kar je sušenje in zmrzovanje pri zelo nizkih temperaturah, dosegli tudi uporabno življenjsko dobo takšnih zmesi.

=== Maja Kolar: Pomen velikosti aksonskih mitohondrijev v možganih ===
Nevroni spadajo med najbolj polarizirane celice v naravi. To jim omogoča oblikovanje različnih lokaliziranih struktur, kot so akson in dendriti. Možgansko skorjo sestavljajo kortikalni nevroni, v katerih se oblike mitohondrijev razlikujejo glede na lokacijo; v dendritih in somi so dolge, cevaste oblike, medtem ko so v izrastkih aksona veliko krajši in kroglasti. Majhnost aksonskih mitohondrijev je povezana predvsem s fizijo oz. binarno cepitvijo, ki poteka prek oligomerizacije Drp1 proteina iz skupine dinaminov zunanji membrani. Ker je Drp1 citoplazemski protein, se z mitohondrijsko zunanjo membrano veže prek 4 različnih receptorjev, nevroznanstveniki Univerze v Columbiji, Lewis in sodelavci, pa so raziskovali predvsem receptor MFF (ang. mitochondrial fission factor), saj je v kortikalnih nevronih najpogostejši. Ekspresijo MFF gena so Lewis in sodelavci zavirali prek uporabe shRNA (ang. short hairpin RNA) ki je umetno izdelan RNA in se uporablja za RNA posege pri zaviranju ekspresije tarčnih genov. Z raziskavo so dokazali, da MFF nima znatnega vpliva na membranski potencial mitohondrijev in na njihovo skupno sposobnost pridelave ATP, je pa z zmanjšanim delovanjem izrazito vplival na povečanje presinaptičnih mitohondrijev. To je povečalo mitohondrijsko sposobnost absorpcije Ca2+ ionov med nevrotransmisijo, kar je vodilo do zmanjšanega presinaptičnega citoplazemskega kopičenja Ca2+. Posledično se je zmanjšalo sproščanje nevrotransmitorjev v sinaptično špranjo, zmanjšala aksonska razvejanost v možganih in oslabila medsebojna povezanost nevronov.

=== Timotej Zgonik: Vijačna struktura v biomolekulah se lahko razvije na dokaj preprost način ===
Že dolgo časa v biokemiji obstaja problem, kako so iz akiralnih molekul nastali kiralni komplesksi, saj je pri eksperimentih vedno bilo treba dodati kiralni center, da so se ostale molekule pravilno zvile. Raziskovalci Tehnološkega inštituta v Georgiji so izvedli tri eksperimente, ki so demonstrirali tvorbo homokiralnih struktur iz akiralnih komponent. V prvem eksperimentu so pripravili raztopino triaminopirimidina (TAP) in 6-(2,4,6-triokso-1,3,5-triazinan-1-il)heksanojske kisline (CyCo6). Spojini sta se povezali v heksamerne rozete, te pa so se nalagale v stolpiče tako leve in desne kiralnosti. Ko so v drugem eksperimentu v raztopini zamenjali CyCo6 z analogno, a kiralno spojino, je bila kiralnost vseh posledično nastalih struktur enaka. Tudi če je bila le vsaka tisoča molekula CyCo6 zamenjana s kiralnim analogom, so bile strukture še vedno homokiralne. Enako je veljalo tudi, če sta bila v raztopini prisotna enantiomera obeh kiralnosti, a je bil eden v rahlem presežku. Pri tretjem poskusu so rezultate uspeli ponoviti tudi za organske spojine, ki bi na Zemlji lahko bile prisotne pred nastankom življenja, čeprav je bil pri tem bil učinek ojačitve kiralnosti šibkejši, enantiomerski presežek, potreben za homokiralnost, pa večji. Vendarle gre pri tem za prvi primer, ko so spontano nastali analogi nukleotidov povzročili tvorbo homokiralnih struktur.

=== Nina Varda: Kompleksne molekule, ki se zvijajo kot proteini, lahko nastanejo spontano ===
Proteini in nukleinske kisline so ključne za delovanje živih organizmov. Zanje je značilno, da se zvijejo v posebne konformacije, ki določajo njihove funkcije. A načrt po katerem bi se makromolekule zvijale še ni bil odkrit. Tako se je razvilo področje raziskovanja foldamerov (sintetičnih oligomerov, ki se zvijajo v sekundarne in terciarne strukture npr. v vijačnice in plošče). Otto in sodelavci so v svoji raziskavi predstavili kompleksno molekulo, ki lahko nastane spontano. Iz gradnika, ki ga sestavljata aminokislinska in adeninska podenota, so pridobili makrocikel iz 15 gradnikov. 15mer se je tako v kristalni obliki, kot tudi v raztopini zvil, zaradi nekovalentnih interakcij med gradniki. Najbolj opazen strukturni motiv je nalaganje aromatskih obročev v kupe (sekundarne strukture). Ena molekula se zvije v 5 kupov, pri čemer je vsak sestavljen iz treh fenilnih obročev in dveh adeninskih obročev. Ker so kupi med sabo orientirani, je prisotna tudi terciarna struktura. Pri nekaterih foldamerih so že bile odkrite katalitske in inhibitorne lastnosti. Ker so foldameri, ki so zaradi svoje terciarne zgradbe relativno kompleksni, sposobni spontanega nastanka, je možno, da so se pojavili in imeli pomembno vlogo že v zgodnjih fazah nastanka življenja.

===Anja Konjc: Nanodelci v boju proti raku===

Nanodelci postajajo čedalje pomembnejši pri razvoju zdravil, saj imajo določene posebnosti, ki omogočajo tarčno usmerjanje zdravil in zmanjševanje njihovih stranskih učinkov (npr. pri kemoterapiji). Vendar so predhodne raziskave pokazale določene pomanjkljivosti. S sintezo posebnega ščita, imenovanega proteinski koronski ščit (PCS), so raziskovalci rešili te omejitve. Ugotovili so namreč, da PCS zmanjša interakcije nanodelcev s serumskimi proteini in omogoči, da makrofagi teh delcev ne fagocitirajo. Tako nanodelci ostanejo več časa v krvi in prenesejo zdravila na ciljno mesto (npr. v tumorje). Nanodelci so namreč sposobni prenašati sorazmerno velike količine molekul (npr. zdravil), ki jih vstavimo v njihove pore. Znanstveniki so PCS sintetizirali tako, da so nanodelce prevlekli s posebnimi proteini. Obnašanje tako prevlečenih nanodelcev so opazovali z različnimi poskusi. Ko so mišim vbrizgali različne nanodelce, so ugotovili, da so se v tumorjih najbolj nakopičili tisti s PCS. To je dokazalo hipotezo, da lahko ti nanodelci uspešno prinesejo zdravila v tumorje, ne da bi pri tem prišlo do imunskega odziva, torej fagocitoze delcev. Zato bodo tudi v prihodnje nanodelci s PCS imeli pomembno vlogo pri zdravljenju različnih obolenj, ne le rakavih, saj povečujejo učinkovitost zdravljenja.

=== Oskar Nemec: Shizofrenija je povezana z nenavadnim imunskim odzivom na virus Epstein-Barr ===
Ustanovi Johns Hopkins Medicine in Sheppard Pratt Health System sta izvedli raziskavo, ki je pokazala, da imajo ljudje s shizofrenijo povečano količino protiteles proti virusu Epstein-Barr (VEB). Gre za herpesvirus, ki lahko povzroči infekcijsko mononukleozo. Za povečan imunski odziv je morda krivo dejstvo, da shizofrenija spremeni imunski sistem pacientov in jih naredi bolj občutljive na virus ali pa okužba poveča tveganje za izoblikovanje shizofrenije. Študijo so izvedli na 743 osebah - 432 je bilo obolelih za shizofrenijo, 311 pa jih je bilo zdravih. Najprej so izmerili količino protiteles proti komponentam virusa in primerjali količino protiteles med zdravo skupino in shizofreniki. Ugotovili so, da imajo shizofreniki od 1.7 do 2.3-krat večjo verjetnost, da imajo povečano količino protiteles proti VEB. Merili so tudi količino protiteles proti ostalim podobnim virusom, ampak pri shizofrenikih niso ugotovili odstopanja od zdrave skupine. Nato so proučevali DNA udeležencev ter ugotovili, da če ima dana oseba povečano količino protiteles proti VEB in tudi genetsko dovzetnost za shizofrenijo, je verjetnost da je ta oseba v skupini shizofrenikov osemkrat večja kot pa verjetnost, da je oseba zdrava. Ker ni pravih zdravil proti virusu, je pomembno, da odkrijejo, kako preprečiti delitev virusa. Povečano razumevanje delovanja infekcije z virusom VEB nam lahko morda pomaga pri zdravljenju shizofrenije.

=== Vivian Nemanič: Zmanjšanje stranskih učinkov kemoterapije z absorpcijsko napravo ===
Zdravila, ki jih uporabljamo za kemoterapijo, imajo veliko stranskih učinkov na naše telo. Da pa da zdravila delovala, so potrebne zelo velike količine, ki pa ne morejo ostati samo na tumorju oz. na prizadetem organu. V tej študiji so skušali ugotoviti kako bi preprečili, da zdravila zakrožijo po celem telesu in rešitev bi lahko bila absorpcijska naprava, ki bi nase vezala zdravilo iz krvi in tako pravzaprav absorbirala do 70% zdravila, ki ni ostalo v tumorju. To napravo bi izdelali s 3D tiskalnikom, zato da bi bila optimalne oblike in velikosti in bi se popolnoma prilegala žili. Eksperiment so izvedli na prašičih za primer jetrnega raka in bil je zelo uspešen. Verjetno bi absorpcijska naprava delovala tudi pri drugih vrstah raka in pri različnih zdravilih za kemoterapijo, poleg tega pa je pomembno da naprava ne ovira krvnega obtoka ali povzroče tromboze. Torej je varna za naše telo, saj naj ne bi imela nobenih negativnih učinkov na delovanje našega telesa, saj jo po približno eni uri po začetku kemoterapije vzamemo iz telesa, saj hitro opravi svojo nalogo. Naprava bi lahko postala zelo pomembna tudi pri odstranjevanju toksinov pri bakterijskih okužbah, okoljskih toksinov, ali pa tudi samih celic, ki bi jih ujeli na podlagi specifičnih kemijskih, fizikalnih ali bioloških značilnosti.

=== Kim Glavič: Preveč popravljanja DNA lahko poškoduje tkiva ===
Zaradi nenehnega nastajanja poškodb DNA, ki jih povzročajo okoljski dejavniki, stranski produkti celičnega metabolizma ali pa kemoterapevtiki (npr. alkilirajoče snovi), so se razvili različni popravljalni mehanizmi, ki te napake popravljajo in skrbijo za zaščito zdravih tkiv. Eden takih mehanizmov je tudi popravljanje z izcepom baze (BER), ki v večini celic učinkovito odstrani napake. V nekaterih celicah, ki vsebujejo večje količine DNA-glikozilaze (AAG) pa njegova prevelika aktivnost povzroči kaskado dogodkov, kateri vodijo do celične smrti. Raziskovalci so ugotovili, da je povzročena degeneracija celic odvisna tako od količine AAG kot tudi od spola organizma ter, da sta pri propadanju teh celic prisotni dve vrsti celičnih smrti in sicer apoptoza (genetsko kontrolirana programirana celična smrt) ter nekroza (poteče kadar celica propade zaradi poškodbe). Pri slednji se med procesom propadanja izloča protein, ki posredno vpliva na nastanek vnetne reakcije torej prodiranja makrofagov na mesto propadajočih celic. TI makrofagi pa vplivajo na nastanek zelo reaktivnih kisikovih spojin, katere povzročijo še več poškodb DNA. Zaradi tega se aktivnost AAG še poveča, kar pa povzroči še večjo količino propadlih celic.

=== Ela Sabadin: Genska terapija lahko ozdravi prirojeno gluhost pri miših ===
Znanstveniki so uspeli obnoviti sluh v odrasli miši modela DFNB9 gluhosti – motnja sluha, ki predstavlja enega najbolj pogostih primerov genetsko prirojene gluhosti. Posamezniki z DFNB9 so popolnoma gluhi in imajo pomanjkanje gena za kodiranje otoferlina (pri ljudeh je kodiran z otof genom), proteina, ki je bistven za prenašanje zvočnih informacij v slušno-senzoričnih sinapsah. Z injeciranjem tega gena v bolne miši, so znanstveniki uspešno obnovili funkcijo slušne sinapse in povrnili sluh na skoraj normalno stopnjo. Genska terapija na podlagi AAV (adeno-associated virus) je obetajoča terapevtska možnost za zdravljenje gluhosti, vendar je njena vloga omejena s potencialno ozkim terapevtskim oknom. Kakorkoli, ker je AAV omejil kapaciteto paketa DNA (približno 4,7 kilobaz), je zahtevno uporabiti to tehniko za gene, katerih regija kodiranja (cDNA) presega 5 kb, kot je na primer gen za kodiranje otoferlina, ki ima regijo kodiranja dolgo 6 kb. Znanstveniki so premagali to oviro s prilagajanjem AAV pristopa, znanega kot dvojna AAV strategija. Rezultati, doseženi s strani znanstvenikov, kažejo na to, da ja terapevtsko okno za prenos lokalnih genov pri pacientih z DFNB9 prirojeno gluhostjo lahko širše kot zgolj ideja in ponuja upe za razširitev teh ugotovitev na ostale tipe gluhosti.

=== Aleksandra Rauter: Izolirana bakterija črevesne flore in njena možna povezava z depresijo ===
Črevesna flora je kompleksni mikrobni ekosistem v gastrointestinalnem traktu sesalcev. Vpliva na mnoge pomembne funkcije gostitelja, vpliva pa tudi na živčni sistem. V sami raziskavi so se osredotočili na rastne faktorje, ki vplivajo na celično delitev, proliferacijo. Zaradi odsotnosti rastnih faktorjev v umetnih medijih, je večina bakterij še negojenih, kar ovira naše razumevanje njihovih bioloških vlog. V študiji so z uporabo kokulture izolirali bakterijo KLE1738, ki je za svojo rast potrebovala prisotnost bakterije Bacteroides fragilis. Analiza supernatanta B. fragilis je vodila v izolacijo rastnega faktorja. To je bila GABA (Gamma AminoButyric Acid), ki je glavni nevrotransmiterski inhibitor v centralnem živčnem sistemu. Na podlagi spremenjenih vrednosti GABA v odvisnosti od antibiotikov in prisotnosti mikroorganizmov, so prišli do zaključka, da je črevesna flora posredno povezana tudi z različnimi boleznimi. Raziskali so, kako ševilčnost B. fragilis vpliva na nevronsko mrežo in povezavo med posameznimi regijami v možganih. Rezultati so pokazali, da zmanjšano število bakterij obratno korelira s funkcionalno povezavo med posameznimi možganskimi regijami. Prekrivanje teh z regijami limbičnega sistema je vplivalo na čustvene odizve. Z izolirano bakterijo KLE1738 niso našli nobene povezave. Dejstvo, da številčnost bakterij Bacteroides (in posledično vrednosti GABA) vpliva na fiziologijo možganskih regij, so potrdile tudi ostale študije. Raziskovalci so mnenja, da je to prvi korak k razumevanju te povezave.

=== Ana Babnik: Kako nas okuži določena vrsta bakterij? ===
Znano je, da Gram negativne bakterije v veziklih zunanje membrane transportirajo toksine, zaradi katerih zbolimo. O mehanizmu nastanku veziklov zunanje membrane se do sedaj ni vedelo veliko, predlaganih pa je bilo nekaj teorij biogeneze teh veziklov. Raziskovalcem iz Binghamton University v New Yorku je uspelo odkriti mehanizem, kako bakterije ''Pseudomonas aeruginosa'' komunicirajo med sabo preko majhnih molekul ''Pseudomonas quinolone signal'' (PQS). Ta bakterija je pomembna, saj je predmet mnogih raziskav in pri živalih, rastlinah in ljudeh povzroča hude okužbe. Molekula PQS se preko več korakov vgradi v vrhnji sloj zunanje membrane, s tem asimetrično poveča membrano in povzroči uvihanje. Li in sodelavci so s simulacijami, pri katerih so približali molekulo na 1 nm (trajanje 300 ns ali 500 ns), dokazali, da pri tem delujejo močne vodikove vezi med fosfatno skupino membrane in funkcionalnimi skupinami PQS, ki pomagajo pri spontani umestitvi v membrano. Z meritvami minimalne razdalje med vrhnjim slojem in PQS, ki je znašal 1,35 nm, so potrdili izjemno stabilnost faze vezave molekule na površino. Odkrili pa so tudi spremembo iz odprte v zaprto konformacijo PQS, ki zmanjša odbojne sile pri penetraciji vrhnjega dela membrane. Sklepajo, da bi tak model komunikacije bakterij lahko obstajal še pri drugih vrstah Gram negativnih bakterij. Spoznanja raziskave pa prinašajo boljše razumevanje mehanizmov biogeneze membranskih veziklov, ki raziskovalcem pomagajo razumeti interakcije med več vrstami ter tako posledično iskati rešitve za preprečitev potencialnih okužb.

=== Karmen Ferjan: Sestavina zelenega čaja, ki pomaga siRNA zdrsniti v celico ===
Glavni problem pri kliničnem prenosu siRNA v zdravilih je dostava v citosol. Mnogi polimeri so bili razviti za ta prenos siRNA, ampak noben hkrati ni ustrezal, bili so premalo učinkoviti ali pa preveč toksični. Članek objavljen v reviji ACS central Science poroča o preprosti strategiji za izgradnjo nanodelcev v obliki jedra z lupino, ki je zelo učinkovita za dostavo siRNA. Nanodelec je pripravljen z entropijsko-gnanim kompleksom siRNA in sestavine zelenega čaja EGCG, ter je obložen z polimeri nizke molekulske mase. Poskusi so bili izvedeni z šestimi različno razvejanimi naravnimi in sintetičnimi polimeri. Izdelan nanodelec je imenovan GNP (Green Nanoparticle). Ta strategija lajša polimerom zgoščevanje siRNA v enoten nanodelec, ki lažje dostopa v celico kot siRNA brez catechina. Zgoščevanje dokažemo z drugačno barvo fluresciranj v prisotnosti EtBr. Namen uporabe GNP je lajšanje bolezenskih stanj kot je na primer kronično črevesno vnetje. Poskusi uporabe so bili izvedeni na HeLa celicah ter na miših. EGCG je z antioksidantskimi, proti-vnetnimi, antibakterijskimi in proti-rakotvornimi učinki navdihujoč za lokalno zdravljenje različnih bolezni.

=== Maša Andoljšek: Zrele človeške celice lahko spremenijo svojo funkcijo ===
Poznamo diferenciacijo zrelih celic pri rastlinah, nekaterih živalih, manj pa pri sesalcih. Splošno velja, da človeške odrasle matične celice ne morejo spremeniti svoje funkcije. Raziskava je bila na temo plastičnosti, to pomeni spreminjanje naloge zrele celice. Raziskovali so, ali lahko celice alfa (proizvajalke glukagona) ali celice gama (proizvajalke pankreatičnega polipeptida), ki se nahajajo v Langerhansovih otočkih trebušne slinavke, spremenijo svojo funkcijo in začnejo proizvajati inzulin, kot celice beta. Raziskava je potekala in vitro, nato pa še in vivo, saj so psevdootočke, spremenjenih celic z transkripcijskimi faktorji(Pdx1, Mafa in Nkx6-1), transplantirali v miši. Sprva so celicam alfa dodali zeleni fluorescenčni protein in zgodilo se ni nič, nato so ob dodatku Pdx1 in Mafa začele proizvajati največ inzulina, ter tudi nekatere gene celic beta. Čez nekaj tednov so proizvajale le še inzulin. Potrdili so diferenciacijo celic alfa in gama in vitro. Prilagajanje je bilo s časom čedalje bolj uspešno. Celice alfa in vivo so postale uspešne proizvajalke inzulina in ob transplantaciji psevdodotočkov celic alfa zdravih donorjev so ozdravili diabetes pri miši. Ugotovili so, da so se celice hitreje spremenile in vivo, kot in vitro. Da bi ugotovitve te raziskave postale del zdravljenja je potrebno še veliko, bi pa lahko bilo to zdravljenje uspešnejše od zdravljenja diabetesa danes.

=== Nika Vegelj: Nove poti iskanja funkcionalnega zdravila za virus HIV ===
Virus HIV spada v družino retrovirusov, njegov genom pa je sestavljen iz dveh enojnih vijačnic RNA. Virus HIV primarno okuži celice, ki so pomembne pri imunskem odzivu, to so CD4+ T celice. Problem virusa HIV je ta, da se ga telo ne more znebiti zgolj s tvorbo protiteles, saj ostane integriran v genomu obolelega. Okužba z virusom HIV nato sproži odmiranje celic, ter apoptozo neokuženih celic, ki pridejo v stik z okuženimi. Zmanjšanje števila CD4+ T limfocitov pa vodi do nezadostnega celično posredovanega imunskega odziva. Funkcionalno zdravilo za virus HIV zahteva, da si organizem ponovno zgradi imunski sistem. Virus HIV primarno okuži celice, ki so pomembne pri imunskem odzivu, to pa so CD4+ T limfociti. Ko virus okuži CD4+ T limfocite, se lahko aktivno deli, da proizvede čim več novih virusov ali pa gre v stanje mirovanja. Znanstveniki so z raziskavo prikazali, da stimulacija CD4 T limfocitov z anti - α4 β7 antitelesi lahko modulirajo količino cofilina in popravijo defekt migracije T limfocitov, ki ga je povzročila hiperaktivacija cofilina. Znanstveniki so torej s to raziskavo odkrili nove možnosti za testiranje novih terapevtikov, ki bi obnovili sistem za migracijo T celic ter repopulacijo tkiv za rekonstrukcijo imunskega sistema in posledično nadzora nad virusom.

=== Tevž Levstek: Odkritje, ki izboljša razumevanje, kako se nekateri virusi množijo ===
Osnovno razumevanje razmnoževanja virusov domneva, da določen virus okuži eno celico, ki pa naprej proizvede nove viruse in tako nadaljuje z okužbo sosednjih celic. Obstajajo pa tudi drugačni, večdelni virusi. Tovrstni virusi ne vsebujejo vsega dednega zapisa v le eni kapsidi, ampak so segmenti dednega materiala razporejeni po virusni populaciji. Omenjeni segmenti navadno zapisujejo različne, zaključene enote genskega zapisa, raziskovalci pa so v tem primeru uporabili virus, ki je imel 8 genskih segmentov. Ker je zelo majhna možnost, da bi vseh osem segmentov okužilo isto celico, so raziskovalci preverili, ali ti med sabo pri vstopanju v celice kakor koli vplivajo, da bi se ta možnost povečala. Ugotovili so, da se to ne dogaja in da dejansko skoraj nobena celica ne dobi vseh virusovih segmentov. Nadalje so raziskali, ali se sploh lahko razmnožujejo virusi iz celice, ki nima vseh genskih segmentov. Pokazali so, da v celicah, ki imajo določen virusni segment, nimajo pa segmenta z geni za replikacijo, ta vseeno poteka. Pojavijo se tudi proteini, ki jih ne zapisuje segment v celici, ampak segment v sosednji celici. Čeprav direktno niso dokazali, da bi virusovi proteini potovali iz ene celice v drugo, je dokazano, da se nekako pojavijo v celicah, ki zanje ne vsebujejo genskega zapisa, če katera od celic poleg ta zapis vsebuje. To pomeni, da najverjetneje med okuženimi celicami poteka transport ali dovršenih proteinov ali pa molekul mRNA, ki te beljakovine zapisujejo.

=== Michelle Oletič: Naivni makrofagi ===
Plazminogen aktivator zaviralec-1 (PAI-1) ima pro-tumorigenično funkcijo preko pro-angiogene in anti-apoptotične aktivnosti. V novi študiji je DeClerckova ekipa pokazala, da rakaste celice uporabljajo PAI-1, da prelisičijo imunski sistem telesa v podporo raku. Raziskava Los Angelske otroške bolnišnice z Yves DeClerck načelu je bila namenjena dokazovanju, da PAI-1 spodbuja rekrutiranje in M2 polarizacijo monocitov oz. makrofagov prek različnih strukturnih domen. Eni od teh dveh sta njegova LRP1 interakcijska domena in uPA interakcijska domena, ki pospešuje polarizacijo makrofagov M2 in indukcijo aktivacijske poti avtokrinega interlevkina (IL) -6 / STAT3. Raziskava, ki je potekala in vivo na miših je pokazala zadovoljive rezultate, da je izražanje PAI-1 povezano s povečano tumorigenostjo, povečano prisotnostjo M2 makrofagov, višjimi nivoji IL-6 in povečano fosforilacijo STAT3 v makrofagih. Močne pozitivne povezave med ekspresijo PAI-1, IL-6 in CD163 (M2 marker) so bile ugotovljene tudi z analizo podatkov več kot 11.000 vzorcev bolnikov z različnimi vrstami rakov pri ljudeh. Ti podatki skupaj zagotavljajo dokaze za mehanizem, ki pojasnjuje pro-tumogerično dejavnost pri raku. Tako odkritje je izrednega pomena pri zdravljenju raka in velik prvi korak k načinu odkrivanja novih možnosti.

=== Ana Vičič: Zdravila naslednje generacije, ki bi ovirala prenos malarijskega parazita v komarje ===
Za razumevanje pristopa znanstvenikov k problemu malarije moramo vedeti, da se infekcijske celice malarijskega parazita P. falciparum, ki jih med ljudmi prenašajo Anopheles komarji, v komarje prvotno v neaktivni obliki prenesejo iz človeka. Če bi torej z določenimi substancami preprečili prenos parazita v komarje, bi s tem onemogočili raznašanje aktiviranega parazita v človeški populaciji. Delves, M. J. in sodelavci so v omenjeni raziskavi za izhodišče vzeli 'Global Health Chemical Diversity Library' (GHCDL), knjižnico 68 689 različnih spojin s proti-malarijskim potencialom. Za postopno oženje nabora spojin in končno identifikacijo najobetavnejših so uporabili številne kriterije in analize v vrstnem redu kot sledi; učinkovitost v majhnih koncentracijah, majhna citotoksičnost za človeške celice, biološka, kemijska in fenotipska analiza, ter dva in vivo testa. S temeljitim pregledom GHCDL so identificirali in analizirali številne obetavne spojine za blokiranje prenosa malarijskih parazitov v komarje. V ožjo selekcijo so sprejeli tri spojine, BPCA, DDD01245291 in DDD01035881. Nato so na podlagi rezultatov in vivo testov za najobetavnejšo spojino določili DDD01035881 in njene analoge, ki prav tako vsebujejo N-4HCS ogrodje.

=== Lena Trnovec: Serotonin lahko regulira izražanje genov v nevronih. ===
Ko govorimo o dednosti in izražanju genov, imamo največkrat v mislih zaporedje nukleotidov v molekuli DNK in spremembe v njem. Vzroki za te spremembe so kompleksni molekularni mehanizmi, med katere spadajo tako kemične modifikacije molekul DNK in RNK kot tudi post-translacijske modifikacije histonov – proteinov, okoli katerih se ovija kromatin. V članku v reviji Nature znanstveniki iz Mount Sinai School of Medicine poročajo, da so histoni lahko modificirani s pomočjo serotonina – proteina, ki je znan predvsem po svoji ključni vlogi v uravnavanju aktivnosti nevronov.Serotonin (tudi 5-hidroksitriptamin ali 5-HT) je biogeni monoamin, ki ima v človeškem organizmu vlogo tkivnega hormona in živčnega prenašalca. Raziskava je razkrila, da serotonin lahko neposredno (brez receptorja) cilja na kromatin preko post-translacijske modifikacije, ki ji pravimo serotonilacija. Prišli so do ugotovitev, da transglutaminaza 2 serotonilira histon H3 na položaju Q5 takrat, ko je položaj K4 trimetiliran. Kombinacija teh dveh post-translacijskih modifikacij se imenuje H3K4me3Q5ser. Ker sta modificirani lizinski in glutaminski ostanek drug ob drugem, je možno, da je stabilnost teh dveh modifikacij soodvisna. Njuna bližina bi lahko tudi pomagala pri funkciji transkripcijskih faktorjev TFIID in posledično vplivala na gensko izražanje.

=== Marjeta Milostnik: Ključ do podaljšane življenjske dobe? Rubicon spremeni delovanje avtofagije med staranjem ===
Avtofagija je proces celične razgradnje, s katerim celica reciklira snovi, ki so odvečne ali poškodovane. Pri tem uporablja lizosomske encime in strukture imenovane avtofagosomi, ki v citoplazmi zajamejo material za razgradnjo in ga dostavijo lizosomom, s katerimi skupaj tvojijo avtofagosome. V predstavljeni raziskavi so prišli do spoznanja, da je delovanje avtofagije s starostjo vpada in s tem povezali povečanje količine proteina Rubicon v celici. Raziskava je pokazala novo vlogo Rubicona, ki je bil doslej znan le kot protein ki interagira z Beclin-1. Ugotovili so, da ima Rubicon ključno vlogo pri regulianju staranja. Z raziskovanjem na organizmih C. elegans, samicah sadne muhe in miših so odkrili, da znižanje Rubicona aktivira avtofagijo, čeprav še vedno ni jasno kako. Skladno s pričakovanji je aktiviranje avtofagije podaljšalo življenjsko dobo, nekje bolj, nekje manj učinkovito. Znižanje nivoja Rubicona je bilo najbolj učinkovito v nevronih (živčnih celicah), saj se je takrat najbolj povečala življenjska doba organizma. Rezultati na miših, skupaj z rezultati na črvih in muhah kažejo, da je znižanje Rubicona v nevronih dovolj, da izboljša starostne fenotipe v organizmih, v primeru C. elegans je znižanje Rubicona zmanjšalo kopičenje proteina v steni telesne mišice, kar je eden od znakov staranja.

===Matevž Drnovšek: Koruzni sirup z visoko vsebnostjo fruktoze pospeši proliferacijo raka pri miših ===
Povečana poraba sladkih pijač je povezana z razširjanjem prekomerne debelosti po svetu, ki je izbruhnila v 80. letih prejšnjega stoletja . V povsem istem časovnem obdobju so znanstveniki zasledili povečanje pojavnosti kolorektalnega raka predvsem med mladimi in odraslimi srednjih let. Ti podatki kažejo na možno povezavo med debelostjo, razvojem kolorektalnega raka in pogostim uživanjem sladkih pijač. Dokazano je, da prekomerno uživanje sladkih pijač povzroča debelost. Debelost pa posledično povečuje tveganje za kolorektalnega raka, za katerim najbolj pogosto zbolevajo moški. Dva dejavnika, ki dokazano vplivata na pospešeno proliferacijo tumorjev sta debelost in presnovni sindrom. Do sedaj pa še ni bilo dokazano, da bi prekomerno uživanje sladkih pijač neposredno vplivalo na proliferacijo tumorjev v črevesju. To povezavo so poskušali znanstveniki odkriti in dokazati z raziskavo na miših, ki so jih hranili z mešanico glukoznega in fruktoznega sirupa.

===Maša Gabrič: Cepivo, s katerim bi lahko izkoreninili otroško paralizo===
Cepiva so najbolj učinkovita metoda kontroliranja virusnih okužb. Dokaz za to je izkoreninjenje črnih koz, močno zmanjšanje okužb s poliovirusom, HPV (Human Papillomavirus), gripo… Poliomielitis ali otroška paraliza je močno nalezljiva bolezen, ki jo povzroča poliovirus in se danes pojavlja le še v redkih državah v razvoju. Trenutno sta v uporabi dve cepivi proti poliomielitisu, OPV (Oral Poliovirus Vaccine), ki je oralno cepivo in vsebuje oslabljen virus ter IPV (Inactivated Poiliovirus Vaccine), ki ga injiciramo v mišico in vsebuje deaktiviran virus. OPV je bil zelo priljubljen, ker omogoča lažji potek masovnih cepilnih akcij, ki jih izvajajo v državah v razvoj, saj ni potrebe po sterilnih iglah. Da bi izkoreninili otroško paralizo pa bomo morali OPV nadomestiti z IPV, saj ima ta v redkih primerih škodljiv, nasprotni učinek, paralizo, povezano s cepivom. IPV je lahko pri optimalni temperaturi (2 – 8°C) hranjeno do 4 leta, vendar pa formula ni stabilna pri temperaturah višjih od 8°C, kar močno otežuje njegovo prenašanje in shranjevanje. Znanstveniki so razvili cepivo, ki je ostalo stabilno po 4 tedenski inkubaciji pri 4, 25 in 40°C ter je induciralo močna nevtralizacijska protitelesa in polno zaščito prodi poliovirusu divjega tipa pri miši.

===Alliana Kolar: Hiperaktivnost možganskih celic bi lahko bila razlog za neučinkovitost antidepresivov===
Klinična depresija je najbolj prevladujoča psihiatrična motnja, za katero trpi vedno več ljudi. Zdravi se jo z različnimi antidepresivi, najpogosteje s selektivnim zaviralcem ponovnega privzema serotonina (SSRI - Selective Serotonin Reuptake Inhibitors), ki deluje tako, da uravnoteži nepravilno presnovo serotonina (5-HT), namreč to je vzrok ali posledica (to nam je zaenkrat še neznano) depresije. Ker se približno 30% pacientov ne odzove na te antidepresive, so znanstveniki hoteli ugotoviti, kaj je razlog za neučinkovitost zdravila. Po osmih tednih zdravljenja pacientov s SSRI, so s tehnologijo induciranih pluripotentnih matičnih celic generirali nevrone pacientov, ki se odzovejo na zdravila, pacientov ki se ne odzovejo na zdravila in popolnoma zdravih posameznikov. Rezultati so pokazali, da je v nevronih pacientov, ki se ne odzovejo na SSRI, v primerjavi z drugima dvema skupinama višja aktivnost delovanja, kar pomeni, da se serotonin hitreje presnavlja, to pa povzroča nižjo koncentracijo serotonina v nevronih. Razlog za hiperaktivnost nevronov je v večjem številu serotonergičnih receptorjev 5-HT7 in 5-HT2A, ki igrajo vlogo pri prenosu serotonina do encima, kjer se razgradi. Ta problem bi lahko rešili z vezavo antagonistov na receptorje, ki zasedejo njihovo mesto in posledično se serotonin ne more vezati nanje, kar ohranja višjo koncentracijo serotonina v nevronih.

===Laura Unuk: Kako HIV-1 protein zavira odgovore imunskega sistema===
HIV ali virus humane imunske pomanjkljivosti povzroča počasi napredujoče kronične bolezni z dolgo dobo inkubacije. Za uspeh zasluženi proteini Vif, Nef, Vpr in Vpu, saj vznemirijo nekatere prirojene imunske senzorje. Znanstveniki so v raziskavah ugotovili novo vlogo Vpu-ja in sicer sposobnost, da prepreči aktivacijo NF-κB. V tej študiji so tako pojasnili (1) globalni vpliv Vpu na izražanje gostiteljskega gena, (2) transkripcijske faktorje, ki jih je usmerila Vpu, in (3) vlogo protiukrepanja tetherina pri imunosupresivni aktivnosti Vpu. Imuno-fluorescenčna mikroskopija je pokazala, da je Vpu-posredovano zaviranje aktivnosti NF-κB povezana z zmanjšano jedrsko translokacijo p65. Z različnimi tehnikami in metodami so pokazali, da Vpu zavira transkripcijo množice NF-κB-inducibilnih gostiteljskih genov s ključnimi vlogami imunskih odgovorih in da Vpu zmanjša izražanje IFN-jev tipa I in drugih pro-vnetnih citokinov. Analiza posameznih genov je pokazala, da Vpu bistveno zmanjša ravni mRNA gostiteljskih restrikcijskih faktorjev. Te ugotovitve kažejo, da Vpu virusa HIV-1 izvaja široko imunsko-zaviralno aktivnost pri okuženih primarnih CD4 + T celicah.

===Jure Povšin: Vpliv položaja celice na njeno obnovo===
Iz preprostega vzorca tkiva rastline, kot je veja ali list, lahko zraste popolnoma nova rastlina. Nove tehnologije sekvenciranja so omogočile izvedbo analize transkriptoma na ravni ene celice, a večina teh metod izgubi informacijo o položaju celice, ki je ključna pri razumevanju regeneracije celic, saj si celice, ki se dotikajo, pošiljajo signale med seboj. Raziskovalci iz Nara Institute of Science and Technology (NAIST) so oblikovali metodo, s katero so lahko iz individualnih živih celic iz nepoškodovanega tkiva izvlekli jedro, ki je vsebovalo RNA, brez da bi ogrožali celične informacije o položaju.To metodo so poimenovali single cell-digital gene expression (1cell-DGE). To je neka vrsta enoceličnega RNA-sekvenciranja , ki uporablja mikromanipulacijo za ekstrahiranje vsebine posamezne žive celice v nepoškodovanem tkivu, medtem ko se zabeleži tudi informacija o njenem položaju. To metodo so uporabili na rastlini Physcomitrella patens. Raziskovalci so izrezali distalno polovico listov te rastline ter takoj po rezu in še enkrat po 24 urah izsesali jedro in okoliško citoplazmo iz posameznih celic listov, ki so se bile na mestu reza ter sintetizirali cDNA iz RNA . Analizirali so RNA iz 31 celic takoj po izrezu in 34 celic 24 ur kasneje. Skupaj je bilo ugotovljenih 6382 diferencialno izraženih genov, od katerih je bilo izraženih 2382 genov v vzorcih odvzetih po 0 urah in 4000 genov v vzorcih odvzetih po 24 urah.

===Žan Fortuna: Molekula, ki bi lahko odstranila virus hepatitisa C===
V zadnjih letih so bili sintetični peptidi obetavni cilji za razvoj zdravil, ki imajo nizke stranske učinke, so stroškovno učinkoviti in dovzetni za racionalno načrtovanje. Peptid Hecate je bil prvotno opisan kot močan bakterijski zaviralec in kasneje kot zdravilo proti raku s funkcijami, povezanimi z lastnostmi lipidne interakcije. Hepatitis C je bolezen, ki napada predvsem jetra in jo povzroča virus hepatitisa C. Virusi, kot je virus hepatitisa C (VHC), imajo življenjski cikel, ki je odvisen od lipidov in bi jih lahko Hecate prizadel na več načinov. Znanstveniki so spremenili strukturo peptida in so na njegovem N-koncu dodali različne radikale in tako spremljali njihove učinke na virus hepatitisa C in citotoksičnost. Hecate, konjugiran z galno kislino, je bil najučinkovitejši derivat peptida Hecate, ki je bil uspešen zaviralec v infekcijskem ciklu HCV. Najobetavnejši vidik pa je bil mehanizem delovanja GA-Hecate, ki je bil povezan z uravnoteženo medsebojno interakcijo lipidov z virusnimi ovojnicami in lipidnimi kapljicami. Ta peptid zavira tako prehod virusa v celico in njegov izhod iz nje, kot tudi zavira podvajanje virusne RNA v celici in izgradnjo snovi, potrebnih za njegovo pravilno delovanje.

===Tim Nograšek: Molekulska proteza za bolnike s cistično fibrozo===
Cistična fibroza je med ljudmi pogosta bolezen, pri kateri pride do okvare proteina CFTR(Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator). Omenjeni protein skrbi v epitelnih celicah dihal za pravilen prehod klorovih in hidrogenkarbonatnih ionov. Prehod je lahko onemogočen, če pride da mutacije na 7. kromosomu in posledično prenos anionov ni več omogočen. Da bi preprečili posledice kot so padec pH-ja, višja viskoznost mukusa na apikalni strani epitelnih celic in padec odpornosti proti bakterijam, so raziskovalci z University of Illinois, pod vodstvom Dr. Martin D. Burke odkrili ustrezno molekulsko protezo in sicer Amphotericin B (AmB). AmB je majhna molekula naravnega izvora, ki je zmožna tvorbe ionskih kanalčkov. Do sedaj je bila v zdravstvu znana kot droga za glivične okužbe, raziskave pa so pokazale, da je zmožna nadomestiti protein CFTR in opravljati naloge namesto njega. Raziskovalci so s poskusi na in-vitro tkivih pljuč in in-vivo okuženih pujsih z cistično fibrozo pokazali, da se je raven 〖HCO〗_3 – po dodatku AmB ponovno dvignila na apikalnem delu celic. Posledično se je pH vrednost ponovno vrnila na normalno raven. Uravnovešenost kationov in anionov je omogočila ponoven prehod vode skozi celice in mukus na površini ni bil več tako gost. Tako se je viskoznost zmanjšala in odpornost proti bakterijam dvignila, saj se niso več morale zadrževati v mukusu. AmB je dokazano nadomestila različne tipe mutacij CFTR-ja in je potencialno zdravilo za bolnike z cistično fibrozo.

===Ana Potočnik: Bakteriofagi sprožijo protivirusno imunost in preprečijo odstranitev bakterijske okužbe===
Na mestih bakterijskih okužb so velikokrat prisotni bakteriofagi, a je njihov vpliv na celice sesalcev še dokaj nejasen. V raziskavi so določili patogene vloge nitastega bakteriofaga Pf, ki ga producira bakterija Pseudomonas aeruginosa (Pa), da bi zatrla protibakterijski imunski odziv organizma. Pa je Gram negativna bakterija, ki pogosto okuži dihalne poti, sečila, kri, opekline in rane. Je eden nevarnejših patogenov, saj je že zelo odporna proti antibiotikom, okužba pa je velikokrat smrtonosna. Pf v mišjih in človeških ranah spodbujajo okužbo s Pa, na kar kaže korelacija med starostjo kronične rane, okužene s Pa, in prisotnostjo Pf. Predlagajo model, kjer mišji ali človeški levkocit endocitira bakteriofag Pf, nato pa deli Pf povzročijo, da tolični receptorji, kot je TLR3, preko adapterjev TRIF, ki spodbudijo sintezo interferona tipa 1, posledično inhibirajo sintezo citokinov TNF, in zato omejujejo fagocitozo bakterij Pa ter tako pospešijo in poslabšajo bakterijsko okužbo. Imunski sistem tako deluje protivirusno namesto protibakterijsko. Cepljenje proti Pf zmanjša bakterijsko okužbo s Pa v človeških ali mišjih ranah. Cepljenje proti bakteriofagom predstavlja potencialno strategijo za preprečevanje bakterijskih okužb.

===Tadej Uršič: Proteina, ki navadno ubijeta celico, zatreta listerijo in ne poškodujejo gostiteljske celice===
Protein RIPK3 in njegov navzdoljni efektor MLKL ponavadi regulrat nekroptozo pri virusni okužbi celice. Do nekroptoze pride zaradi fosforilaciije RIPK3, ki posledično fosforilira MLKL, ki se zaradi tega oligomerizira. Ta oligomer se vgradi v celično membrano gostiteljskaktivav+ciji poti RIPK#e celice, kar povzroči nastanek por v tej membrani in rezultira v litični smrti celie. V raziskavi so raziskovalci univerze North Carolina State University raziskovali primer ko delovanje teh dveh proteinov prepreči nadljno razmnoževanje bakterije Listeria monocytogenes (listerija) in zraven ne uniči gostiteljske celice. Bakterija listerija je zelo razširjena v naravnem okolju in povzroča listeriozo. Listerioza je bakterijska okužba pri kateri celice listerije prodrejo v celice gastrointestinalnega trakta in se v citoplazmi teh celic namnožijo in sistemsko okužijo organizem. V raziskavi so odkrivali kako vdor bakterije listerija v epitelne celice črevesja miši aktivira pot RIPK3-MLKL, ki uspešno zaustavi nadaljno razmnoževanje listerije in zakaj pri tem ne pride do nekroptične smrti gostiteljske celice. Dokazali so da pri aktivaciji poti RIPK3-MLKL pride do foforilacije MLKL, ki pa se ne oligomerizira ampak se veže nacelično membrano listerije, kar prepreči njeno nadaljno razmnoževanje.

===Tina Arnšek: Prvi funkcionalni tarčni inhibitorji arašidovih alergenov===
Alergija je pretirana imunska reakcija na nekatere snovi v okolju, ki običajno nimajo učinka na ljudi. Te snovi imenujemo alergeni. Vezava IgE (imunoglobin E) na specifične molekule, prisotne v hrani, sproži imunski odziv. Kritični korak pri alergijskem odzivu na arašide je vezava arašidovih alergenov na alergen-specifična IgE protitelesa (sIgE), ki so pritrjena na receptorje na površini mastocitov, kar povzroči njihovo zamreženje. To povzroči celično degranulacijo. Znanstveniki so raziskovali specifične sIgE inhibitorje, imenovane kovalentni heterobivalentni inhibitorji (cHBIs), ki selektivno tvorijo kovalentne vezi le z sIgE in tako trajno inhibirajo alergenske epitope. Velik izziv pri razvoju takih inhibitorjev je identifikacija kritičnih imunogenih epitopov izmed velikega števila potencialnih epitopov. V ta namen so razvili testni sistem, ki so ga poimenovali nanoalergeni, ki temelji na nanodelcih in tako identificirali najbolj kritične epitope Ara h 2 in Ara h 6 (imunogena proteina, ki sta najbolj povezana s hudimi alergijskimi reakcijami). S poskusi so znanstveniki ugotovili, da kombinacija le dveh razvitih inhibitorjev epitopov povzroči močno inhibicijo imunskih celic in interakcij arašidovih alergenov. S pridobljenimi informacijami so lahko razvili cHBI in ireverzibilno in selektivno inhibirali arašidove alergene ter preprečili alergijski odziv.

===Maja Mahorič: Spreminjanje odprtih ran v kožo===
Koža je kompleksno zgrajen organ, ki pomaga vzdrževati homeostazo telesa. V primeru poškodb in ran je sposobna obnove in celjenja. Pomembno vlogo imajo celice imenovane keratinocite, ki se v času poškodb odzovejo na stimulatorje iz rane, kar sproži njihovo migracijo in re-epitalizacijo poškodovanega tkiva. Vendar ta proces ni zadosten pri večjih ranah. Zato so M. Kurita in sodelavci z metodo analize s pomočjo mikro mrež primerjali izražanje genov pri človeških keratinocitah in hDFs (human Dermal Fibroblasts) ter hDASCs (Adipose – Derived Stromal Cells) in odkrili 55 transkripcijskih faktorjev in 31 mikroRNA, ki potencialno sodelujejo pri reprogramiranju celic. Te faktorje so v različnih kombinacijah prenesli v celice in opazovali rodove celic in vitro. Najboljše rezultate je predstavljala kombinacija štirih transkripcijskih faktorjev in sicer; DNP63A in GRHL2, ki celice reprogramirata, MYC, ki izboljša učinkovitost reprogramiranja, celične delitve in stratificiranje epitela ter faktor TFAP2A, ki je pospešil rast kolonij. V poskusih in vivo so mišim kirurško odstranili del epidermisa na hrbtu in rano z izolacijskimi komorami izolirali od okoliškega epidermisa, s čimer so simulirali središče večje rane. Transkripcijske faktorje so prenesli v celice in po 28. dneh opazovanja tkivo testirali. Vzgojeno tkivo je bilo zelo podobno epidermisu na robu rane, po daljšem času opazovanja pa se je uspešno zacelilo z robom rane in izražalo histološke karakteristike normalne kože.

===Nastja Feguš: Specifično narejeni proteini lahko pomagajo ustvariti protitelesa proti virusu HIV===
Iskanje cepiva za virus HIV je izjemno težko, saj se genom virusa ves čas spreminja. Da bi lahko ustvarili protitelesa, ki bi vezala virus, morajo znanstveniki najprej prepoznati regije virusa, ki se ne spreminjajo. Virusna ovojnica HIV-a je na določenih mestih glikozilirana. Mesta glikozilacije se združujejo v regije CONEs. Te regije zakrivajo spodaj ležečo virusno ovojnico, ki je glavna tarča protiteles. Ta se zaradi zgoščenih oligosaharidov na teh regijah ne morejo vezati nanjo. Zhu in sodelavci so ugotovili, da se zaradi naravne variacije genov včasih zgodi, da pride do izpada oligosaharidov v regijah CONE in prav te regije, bi lahko bile cilj specifičnih protiteles. Raziskovalci so s pomočjo računalniškega modeliranja oblikovali proteine, ki posnemajo obliko virusne ovojnice. Oblikovali so več različic in presojali primernost le teh s pomočjo različnih simulacij. Najboljše različice so nato izrazili v ''E. coli'' in izvedli podrobne strukturne analize in imunizacijske poskuse. Manjše skupine zajcev so imunizirali z različicami proteinov. Nato so preizkusili ali so v krvi specifična protitelesa, ki bi lahko vezala virus HIV. Dobili so solidne rezultate, saj so določene različice proteinov spodbudile nastanek protiteles, ki lahko vežejo HIV. To je spodbuden začetek nadaljnjih raziskav za iskanje funkcionalnega cepiva za virus HIV.

===Mateja Milošević: Kanabinoidne spojine lahko zavirajo rast celic raka debelega črevesa===
Zaradi nedavnih raziskav marihuane za medicinske namene in povezave z depresijo in tesnobo, znanstveniki vse bolj raziskujejo njenega potenciala. Znanstveniki na Pen State Collegeu so raziskali vpliv kanabinoidnih spojin na kolorektalni rak. Kolorektalni rak je eden od najpogostejših in je bilo ugotovljeno, da je povezan z Wnt/β-katenin poti in da je bilo delovanje endokanabinoidnih receptorjev CB1, CB2 in CB3 ojačeno pri bolezni. Cilj je bil ugotoviti od 370 testiranih sintetičnih kanabinoidnih spojin, katere bi zmanjšale sposobnost preživetja 7 različnih vrst rakavih celic in so z analizo celičnih kultur z mutiranimi Wnt-signali ugotovile, koliko in kako je celica občutljiva na kanabinoide. Med temi 370 testiranimi sintetičnimi kanabinoidnimi spojinami so odkrili 10 spojin, ki zmanjšujejo življenjsko dobo testiranih celic raka debelega črevesa. Študije so tudi pokazale da fitokanabinoida skupina, v kateri sta THC in CBD, imajo omejen učinek na rast rakavih celic. Oba sta bila posebej testirana in sta pokazala da THC in CBD imata zelo slab ali skoraj noben vpliv (pri določeni koncentraciji) na stabilnost in živost rakastih celic, uporabljenih v raziskavi.

===Greta Junger: Blokiranje proteina CD22 obnovi kognitivne sposobnosti pri starih miših===
V naših možganih so poleg nevronov prisotne tudi celice mikroglija, katerih najpomembnejša funkcija je fagocitoza patogenov oziroma odpadnega celičnega materiala, npr. mielinskih fragmentov. Mielinski fragmenti so ostanki mielinskih ovojnic, ki so propadle bodisi zaradi starosti, bodisi zaradi različnih neurodegenerativnih bolezni. Ker naj bi se fagocitotske sposobnosti mikroglij s starostjo poslabšale, je raziskovalce z univerze Stanford University School of Medicine zanimalo, ali obstaja povezava med slabšo fagocitotsko zmožnostjo mikroglij in zmanjšanjem kognitivnih sposobnosti pri starih miših. Najprej so z metodo CRISPR-Cas9 določili gen, katerega izraženost se s starostjo povečuje in ima negativen vpliv na zmožnost fagocitoze mikroglij. Edini, ki je ustrezal temu kriteriju je bil gen CD22, ki kodira istoimenski protein. Ko so v mikroglijah starih miši blokirali protein CD22, so se fagocitotske sposobnosti mikroglij povečale. Enak učinek so dosegli tudi v mikroglijah miši z izbitim genom CD22. Za konec so testirali še vpliv dolgotrajne blokade proteina CD22 na stare miši. Ugotovili so, da se v mikroglijah izrazijo enaki geni, kot so običajno izraženi v mikroglijah mladih miši. Iz rezultatov sklepajo, da dolgotrajno blokiranje proteina CD22 deloma povrne ''mladostne'' lastnosti starim mikroglijam. To so potrdili tudi s testi obnašanja, saj so imele starejše miši z izbitim genom CD22 podobne kognitivne sposobnosti kot mlajše z izraženim genom.

TBK2019-seminar

2019-04-22T20:13:25Z

Greta Junger: /* Seznam seminarjev */

= Temelji biokemije- seminar =

Seminarje vodi prof. dr. Brigita Lenarčič. Seminarji so obvezni.

Ocena seminarjev (6-10) predstavlja enako število odstotkov, ki se prišteje h končni pisni oceni izpita.
Stran na strežniku s seminarskimi nalogami je zaščitena.
Uporabniško ime je: tbk, password pa: samozame## "##" sta dve številki, ki ju izveste na predavanjih.
Tudi za urejanje Wiki strani potrebujete geslo, ki se od zgornjega razlikuje. Postopek pridobitve Wiki uporabniškega imena in gesla je opisan [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Main_Page tukaj].

== Seznam seminarjev ==

{| border="1" cellpadding="4" cellspacing="0" style="border:#c9c9c9 1px solid; margin: 1em 1em 1em 0; border-collapse: collapse;"
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Ime in priimek'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Naslov seminarja'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Povezava'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Rok za oddajo'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Rok za recenzijo'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Datum predstavitve'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 1'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 2'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 3'''
|-
| Anna Scott||Moj naslov v slovenščini||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/02/190214100038.htm||28.10.||05.11.||07.11.||r1||r2||r3
|-
| Maša Andoljšek||Zrele človeške celice lahko spremenijo svojo funkcijo||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/02/190213132309.htm||21.02.||22.02.||25.02.|| Isidora Stevanoska|| Tina Arnšek|| Lena Trnovec
|-
| Maja Trifkovič||naslov||povezava do novice||21.02.||22.02.||25.02.|| Manca Osolin|| Tadej Uršič|| Ana Vičič
|-
| Teo Nograšek||Kako se proteini vgradijo v celično membrano||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/02/190214100038.htm||21.02.||22.02.||25.02.|| Ajda Košorok|| Ana Potočnik|| Maša Gabrič
|-
| Maja Kolar||Pomen velikosti aksonskih mitohondrijev v možganih||https://www.sciencedaily.com/releases/2018/11/181127110959.htm||28.02.||01.03.||04.03.|| Hana Zajc|| Mateja Milošević||
Laura Unuk
|-
| Nina Varda||Kompleksne molekule, ki se zvijajo kot proteini, lahko nastanejo spontano||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/01/190117110824.htm||28.02.||01.03.||04.03.|| Katja Benčuk|| Nastja Feguš|| Sašo Jakob
|-
| Anja Konjc||Nanodelci v boju proti raku||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/01/190117092550.htm||28.02.||01.03.||04.03.|| Tina Logonder|| Maja Mahorič|| Alliana Kolar
|-
| Timotej Zgonik||Vijačna struktura v biomolekulah se lahko razvije na dokaj preprost način||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/01/190124095112.htm||28.02.||01.03.||04.03.|| Špela Sotlar|| Nika Banovšek|| Nika Ramšak
|-
| Ela Sabadin||Genska terapija lahko ozdravi prirojeno gluhost pri miši ||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/02/190219111643.htm||05.03.||08.03.||11.03.|| Maša Andoljšek|| Greta Junger|| Tim Nograšek
|-
| Kim Glavič||Preveč popravljanja DNA lahko poškoduje tkiva||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/02/190212141409.htm||05.03||08.03.||11.03.|| Maja Trifkovič|| Isidora Stevanoska|| Žan Fortuna
|-
| Oskar Nemec||Shizofrenija je povezana z nenavadnim imunskim odzivom na virus Epstein-Barr||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/01/190109090911.htm||05.03.||08.03.||11.03.|| Teo Nograšek|| Manca Osolin|| Jure Povšin
|-
| Vivian Nemanič||Zmanjšanje stranskih učinkov kemoterapije z absorpcijsko napravo||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/01/190109090930.htm||05.03.||08.03.||11.03.|| Maja Kolar|| Ajda Košorok|| Jernej Kastelic
|-
| Srna Anastasovska||Bakterijski genotoksin kolibaktin človeškega črevesa alkilira DNA.||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/02/190214153159.htm||12.03.||15.03.||18.03.|| Nina Varda|| Hana Zajc|| Tina Arnšek
|-
| Karmen Ferjan||Sestavina zelenega čaja, ki pomaga siRNA zdrsniti v celico||https://www.sciencedaily.com/releases/2018/09/180919083446.htm||12.03.||15.03.||18.03.|| Anja Konjc|| Katja Benčuk|| Tadej Uršič
|-
| Ana Babnik||Kako nas okuži določena vrsta bakterij?||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/02/190225075613.htm||12.03.||15.03.||18.03.|| Timotej Zgonik|| Tina Logonder|| Ana Potočnik
|-
| Aleksandra Rauter||Izolirana bakterija črevesne flore in njena možna povezava z depresijo||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/02/190213124350.htm||12.03.||15.03.||18.03.|| Ela Sabadin|| Špela Sotlar|| Mateja Milošević
|-
| Nika Vegelj||Nove poti iskanja funkcionalnega zdravila za virus HIV||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/02/190207173229.htm||19.03.||22.03.||25.03.|| Kim Glavič|| Maša Andoljšek|| Nastja Feguš
|-
| Adela Šajn||||||19.03.||22.03.||25.03.|| Oskar Nemec|| Maja Trifkovič|| Maja Mahorič
|-
| Michelle Oletič||Naivni makrofagi||https://www.sciencedaily.com/releases/2018/11/181129142441.htm?fbclid=IwAR2x562KFLljGOmHD5T40KXBf6I2L72TpMpvVM0I3lNBckrVxXW3cXQG-vM||19.03.||22.03.||25.03.|| Vivian Nemanič|| Teo Nograšek|| Nika Banovšek
|-
| Tevž Levstek||Odkritje, ki izboljša razumevanje, kako se nekateri virusi množijo ||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/03/190312123658.htm||19.03.||22.03.||25.03.|| Srna Anastasovska|| Maja Kolar|| Greta Junger
|-
| Matevž Drnovšek||Koruzni sirup z visoko vsebnostjo fruktoze pospeši proliferacijo raka pri miših||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/03/190321141924.htm||26.03.||29.03.||01.04.|| Karmen Ferjan|| Nina Varda|| Isidora Stevanoska
|-
| Marjeta Milostnik||Ključ do podaljšane življenjske dobe? Rubicon spremeni delovanje avtofagije med staranjem||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/02/190219111744.htm
||26.03.||29.03.||01.04.|| Ana Babnik|| Anja Konjc|| Manca Osolin
|-
| Lena Trnovec||Serotonin lahko regulira izražanje genov v nevronih.|| https://www.sciencedaily.com/releases/2019/03/190313143312.htm ||26.03.||29.03.||01.04.|| Aleksandra Rauter|| Timotej Zgonik|| Ajda Košorok
|-
| Ana Vičič||Snov, ki preprečuje malarijo pri komarjih.|| https://www.sciencedaily.com/releases/2018/09/180918082059.htm ||26.03.||29.03.||01.04.|| Nika Vegelj|| Ela Sabadin|| Hana Zajc
|-
| Maša Gabrič||Cepivo, s katerim bi lahko izkoreninili otroško paralizo||https://www.sciencedaily.com/releases/2018/11/181127092558.htm||02.04.||05.04.||08.04.|| Adela Šajn|| Kim Glavič|| Katja Benčuk
|-
| Laura Unuk||Kako HIV-1 protein zatira odgovore imunskega sistema||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/02/190205102525.htm||02.04.||05.04.||08.04.|| Michelle Oletič|| Oskar Nemec|| Tina Logonder
|-
| Sašo Jakob||Terapija pljučnih bolezni z vdihavanjem mRNA ||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/01/190104104032.htm||02.04.||05.04.||08.04.|| Tevž Levstek|| Vivian Nemanič|| Špela Sotlar
|-
| Alliana Kolar||Hiperaktivnost možganskih celic bi lahko bila razlog za neučinkovitost antidepresivov||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/01/190131162500.htm||02.04.||05.04.||08.04.|| Matevž Drnovšek|| Srna Anastasovska|| Maša Andoljšek
|-
| Nika Ramšak|| ||||09.04.||12.04.||15.04.|| Marjeta Milostnik|| Karmen Ferjan|| Maja Trifkovič
|-
| Tim Nograšek||Molekulska proteza za bolnike s cistično fibrozo||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/03/190313143248.htm||09.04.||12.04.||15.04.|| Lena Trnovec|| Ana Babnik|| Teo Nograšek
|-
| Žan Fortuna||Molekula, ki lahko odstrani virus hepatitisa C||https://www.sciencedaily.com/releases/2018/12/181219142543.htm||09.04.||12.04.||15.04.|| Ana Vičič|| Aleksandra Rauter|| Maja Kolar
|-
| Jure Povšin||Vpliv položaja celice na njeno obnovo||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/03/190327112716.htm||09.04.||12.04.||15.04.|| Maša Gabrič|| Nika Vegelj|| Nina Varda
|-
| Jernej Kastelic||||||23.04.||26.04.||29.04.|| Laura Unuk|| Adela Šajn|| Anja Konjc
|-
| Tina Arnšek||Razvitje prvih funkcionalnih ciljnih inhibitorjev arašidovih alergenov||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/04/190408161718.htm||23.04.||26.04.||29.04.|| Sašo Jakob|| Michelle Oletič|| Timotej Zgonik
|-
| Tadej Uršič||Proteina, ki navadno ubijejo celico, zatrejo listerijo in ne poškodujejo gostiteljske celice||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/04/190418131251.htm||23.04.||26.04.||29.04.|| Alliana Kolar|| Tevž Levstek|| Ela Sabadin
|-
| Ana Potočnik||Bakterija sodeluje z virusom, da poveča možnosti za okužbo||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/03/190328150753.htm||23.04.||26.04.||29.04.|| Nika Ramšak|| Matevž Drnovšek|| Kim Glavič
|-
| Mateja Milošević||||||30.04.||03.05.||06.05.|| Tim Nograšek|| Marjeta Milostnik|| Oskar Nemec
|-
| Nastja Feguš||||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/02/190227081526.htm||30.04.||03.05.||06.05.|| Žan Fortuna|| Lena Trnovec|| Vivian Nemanič
|-
| Maja Mahorič||Spreminjanje odprtih ran v kožo||https://www.sciencedaily.com/releases/2018/09/180905131831.htm||30.04.||03.05.||06.05.|| Jure Povšin|| Ana Vičič|| Srna Anastasovska
|-
| Nika Banovšek||Kako nevroni nadzorujejo napačno zvite proteine||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/03/190327112652.htm||30.04.||03.05.||06.05.|| Jernej Kastelic|| Maša Gabrič|| Karmen Ferjan
|-
| Greta Junger||Blocking protein's activity restores cognition in old mice||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/04/190403135103.htm?utm_source=dlvr.it&utm_medium=facebook||07.05.||10.05.||13.05.|| Tina Arnšek|| Laura Unuk|| Ana Babnik
|-
| Isidora Stevanoska||Črni nanodelci upočasnjujejo rast tumorjev||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/04/190404104404.htm||07.05.||10.05.||13.05.|| Tadej Uršič|| Sašo Jakob|| Aleksandra Rauter
|-
| Manca Osolin||Kako lahko mitohondrijski encim sproži celično smrt||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/03/190314151623.htm||07.05.||10.05.||13.05.|| Ana Potočnik|| Alliana Kolar|| Nika Vegelj
|-
| Ajda Košorok||New pill can deliver insulin through the stomach||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/02/190207142206.htm||07.05.||10.05.||13.05.|| Mateja Milošević|| Nika Ramšak|| Adela Šajn
|-
| Hana Zajc||||||14.05.||17.05.||20.05.|| Nastja Feguš|| Tim Nograšek|| Michelle Oletič
|-
| Katja Benčuk||||||14.05.||17.05.||20.05.|| Maja Mahorič|| Žan Fortuna|| Tevž Levstek
|-
| Tina Logonder||RNA-vezavni protein Pum2 je tarča v boju proti staranju||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/01/190110141826.htm||14.05.||17.05.||20.05.|| Nika Banovšek|| Jure Povšin|| Matevž Drnovšek
|-
| Špela Sotlar||Vpogled v mehanizem, ki nadzira poškodbe DNA||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/02/190226112344.htm||14.05.||17.05.||20.05.|| Greta Junger|| Jernej Kastelic|| Marjeta Milostnik

|}

==Naloga==
* samostojno pripraviti seminar, katerega tema je novica iz področja biokemije na portalu [http://www.sciencedaily.com ScienceDaily], ki je bila objavljena kasneje kot 1. avgusta 2018. Osnova za seminar naj bo znanstveni članek, ki je podlaga za to novico. Poleg tega članka za seminar uporabite še najmanj pet drugih virov, od teh vsaj še dva druga znanstvena članka, ki se navezujeta na to vsebino.
* članke na temo lahko iščete [https://scholar.google.com/ z Google učenjakom].
* naslov izbrane teme in povezavo do novice vpišite v tabelo seminarjev takoj ko ste si izbrali temo, najkasneje pa en teden pred rokom za oddajo
* [[TBK2019 Povzetki seminarjev|Povzetek seminarja]] opišete na wikiju v približno 200 besedah - najkasneje do dne, ko morate oddati seminar recenzentom.
* Povezavo do povzetka vnesete v tabelo seminarjev tekočega letnika.
* Seminar pripravite v obliki seminarske naloge (pisava Cambria, font 11, enojni razmak, 2,5 cm robovi; tekst naj obsega okoli 1000 besed), vsebuje naj 1-2 sliki. Slika mora imeti legendo in v besedilu mora biti na ustreznem mestu sklic na sliko. Vse uporabljene vire citirajte v tekstu, kot npr. (Nobel, 2010), na koncu pa navedite točen seznam literature, kot je opisano spodaj!
*Celotni seminar naj obsega 2 strani A4 formata (po možnosti dvostransko tiskanje).
* Seminar oddajte do datuma oddaje, ki je naveden v tabeli v elektronski obliki z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/tbk/poslji/ tega obrazca].
* vsi seminarji so v elektronski obliki dostopni [http://bio.ijs.si/~zajec/tbk/poslji//bioseminar/ tukaj].
* Recenzenti do dneva določenega v tabeli določijo popravke in podajo oceno pisnega dela, v predpisanem formatu elektronskega obrazca na internetu.
* Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Za predstavitev je na voljo 12 minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni. Prvi recenzent vodi predstavitve in razpravo ter skrbi za to, da vse poteka v zastavljenih časovnih okvirih.
* Predstavitvi sledi razprava do 8 minut. Sledijo vprašanja prisotnih, recenzenti postavijo vsak vsaj dve vprašanji in na koncu podajo oceno predstavitve.
* En dan pred predstavitvijo na strežnik oddajte tudi končno verzijo. Na dan predstavitve morate oddati tudi končno (popravljeno) in natisnjeno verzijo seminarja v enem izvodu.
* Seminarska naloga in povzetek na wikiju morajo biti v slovenskem jeziku!

==Imena datotek==
Prosim vas, da vse datoteke, ki jih pošiljate poimenujete po spodnjih pravilih. Ne uporabljajte ČŽŠčžš!
Poslati morate naslednje datoteke:
* TBK_2019_Priimek_Ime.doc(x) za seminar, npr. TBK_2017_Guncar_Gregor.docx
* TBK_2019_Priimek_ime_final.doc(x) za končno verzijo seminarja
* TBK_2019_Priimek_Ime_rec_Priimek2.doc(x) za recenzijo, kjer je Priimek2 priimek recenzenta, npr. TBK_2019_Guncar_Gregor_rec_Scott.docx (če se pišete Scott in odajate recenzijo za seminar, ki ga je napisal Gunčar)
* TBK_2019_Priimek_Ime.ppt(x) za prezentacijo, npr TBK_2017_Guncar_Gregor.pptx
* TBK_2019_Priimek_Ime_clanek.pdf za datoteko PDF, ki vsebuje izvirni članek, npr. TBK_2017_Guncar_Gregor_clanek.pdf

==Ocenjevanje seminarjev==
Recenzenti ocenijo seminar tako, da izpolnijo [[https://docs.google.com/forms/d/1Hdg2OHCyG24qwLTnFt09yZTng46RIwaIiUqnKOdsJxQ/viewform recenzentsko poročilo]] na spletu.

== Mnenje o predstavitvi ==
Vsak posameznik '''mora''' oceniti seminar tako, da odda svoje [https://docs.google.com/forms/d/1VvE-jaKikfiDO5Gdybqgp9mf_0uJZfBbIK8PLXKDaS0/viewform mnenje] najkasneje v enem tednu po predstavitvi. Kdor na seminarju ni bil prisoten, mnenja '''ne sme''' oddati.

==Urejanje spletnih strani na wikiju==
Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''

==Faktor vpliva==
Faktor vpliva (angl. impact factor) neke revije pove, kolikokrat so bili v poprečju citirani članki v tej reviji v dveh letih skupaj pred objavo tega faktorja. Faktorje vpliva za posamezno revijo lahko najdete v [http://www.cobiss.si/scripts/cobiss?command=CONNECT&base=JCR COBISS-u]. V polje "Naslov revije" vnesite ime revije za katero želite izvedeti faktor vpliva in pritisnite na gumb POIŠČI. V skrajnem desnem stolpcu se bodo izpisali faktorji vpliva za revije, ki ustrezajo vašim iskalnim kriterijem. Zadetkov za posamezno revijo je več zato, ker so navedeni faktorji vpliva za posamezno leto. Za tekoče leto faktorji vpliva še niso objavljeni, zato se orientirajte po faktorjih vpliva zadnjih par let. Če faktorja vpliva za vašo izbrano revijo ne najdete v bazi COBISS, potem izberite članek iz kakšne druge revije.

==Citiranje virov==Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se v seminarju držite ene same. Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati. '''Citiranje knjig:''' Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica. Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN. Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005. Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4. Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.). '''Citiranje člankov:''' Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani. Lartigue C. ''et al''. Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, letn. 317, str. 632-638.Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole: Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani. Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.Revija Science uporablja skrajšani zapis: C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007) V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne). '''Citiranje spletnih virov:''' Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.