==Uvod==

Slabost napredka v kmetijstvu in kemični industriji so zagotovo negativni učinki toksičnih in težko razgradljivih spojin. Eden nevarnejših onesnaževalcev okolja, predvsem podtalnih voda, je halogenirana organska spojina 1,2,3 – trikloropropan (1,2,3 – TCP). Letno se ga proizvede okoli 50 000 ton, od tega se večinoma uporablja v kemični industriji kot topilo ali kot prekurzor za sintezo drugih kemikalij, npr. dikloropropena, v kmetijstvu pa kot hlapni pesticid - fumigant. Zaradi masovne proizvodnje je 1,2,3 - TCP pogosto prisoten na zapuščenih industrijskih mestih, od koder prehaja v podtalnico in nato v pitno vodo. V preteklih 10-ih letih so v več državah dokazali prisotnost v pitni vodi, saj zaradi majhnega adhezijskega koeficienta vanjo lažje prehaja in s tem ogroža okolje ter zdravje ljudi.

1,2,3 – TCP se v naravi težko razgradi, saj ni organizma, ki bi ta toksičen odpadni produkt lahko učinkovito odstranjeval. Načini odstranjevanja vključujejo uporabo aktivnega oglja ali reduktivno deklorinacijo z ničvalentnim železom, vendar so te metode za uporabo pri naravnih pogojih precej neučinkovite in drage. Pretekli poskusi razgradnje z bakterijami ''E. coli'' na iGEM 2013 [ http://2013.igem.org/Team:UESTC_Life#/page/1] niso bili uspešni, zato se je ekipa iGEM s Kitajske [http://2017.igem.org/Team:UESTC-China] odločila uporabiti metodo fitodegradacije s pomočjo »Super tobaka«.

Cilj projekta je bilo skonstruirati encimsko pot v rastlini tobaka za petstopenjsko razgradnjo 1,2,3 –TCP v netoksičen glicerol. Iz preteklih študij je bilo znano, da sistem vključuje tri ključne encime: mutanto haloalkan dehalogenaze (DhaA31) iz ''Rhodococcus rhodochrous'' NCIMB 13064 in mutanto halohidrin dehalogenaze (HheC-W249P) ter epiklorohidrin epoksid hidrolazo (EchA), obe izolirani iz ''Agrobacterium radiobacter'' AD1.

==Konstrukt poti za razgradnjo 1,2,3 - TCP==

Vektor, ki bi omogočil razgradnjo 1,2,3 – TCP v glicerol, so postopno pripravili v rastlinskem ekspresijskem vektorju piGEM2017, z zapisom za odpornost na kanamicin (NptII).

===Izražanje genov za DhaA31, HheC-W249P in EchA v tobaku===
Za izražanje tarčnih genov v tobaku so najprej naredili optimizacijo kodonov, potem pa so sintetizirali posamezne gene za encime DhaA31, HheC-W249P in EchA. Z uporabo virusnega peptida 2A in metode Golden Gate so uspešno vnesli posamezni tarčni gen v vektor piGEM2017 (skelet), pod kontrolo konstitutivnega promotorja CaMV35s. V četrti vektor so vnesli vse tri gene, v zadnjega pa le dva; dobili so naslednje vektorje: ''piGEM2017-001'' (DhaA), ''piGEM2017-002'' (HheC-W249P), ''piGEM2017-003'' (EchA), ''piGEM2017-004'' (DhaA, HheC-W249P in EchA) ter ''piGEM2017-005'' (DhaA, HheC-W249P)

===Izražanje tarčnih genov v koreninah tobaka===
1,2,3 – TCP se povečini nahaja v podtalnici in onesnaženih tleh, zato je bil načrt narediti tak konstrukt, ki bi omogočil izražanje tarčnih genov le v koreninah rastline tobaka. Da bi ragradnjo usmerili v korenine in s tem dobili večjo učinkovitost, so konstitutivni promotor CaMV35s zamenjali z rastlinskim koreninsko-specifičnim promotorjem PYK10 iz ''Arabidopsis thaliana''. Hkrati je bil v vektor vključen še gen za citokinin CKX3, ki bi s spodbujanjem citokineze v kalusu omogočil hitrejšo rast korenin.

===Izvencelično izražanje tarčnih genov===
Vsi trije encimi lahko opravljajo svojo vlogo le zunajcelično. To so pri konstruiranju dosegli z dodatkom zapisa za signalni peptid (AO-S) pred tarčni gen, ki poleg transporta encimov v rastlinsko celično steno omogoča stabilnejše izražanje genov. Nazadnje so skonstruirali vektor, ki je namesto gen za CKX3 vseboval še gen za reporter (ß- glukoronidaza - GUS), s čimer so preverili če multigenski rastlinski ekspresijski vektorji lahko opravijo svojo nalogo.

==Transformacija tobaka in izbira ustreznih rastlin==
Za vnos tujih genov v tobak, ki sodi med dvokaličnice, so uporabili transformacijo z ''Agrobacterium''. Plazmide so vnesli v ''Agrobacterium'' EHA105, s pomočjo katere so fragment T-DNA s tarčnimi geni integrirali v kromosom tobaka. Po približno desetih tednih so preko rastlinske tkivne kulture (kalusa) dobili transgeni tobak.
Z ekstrakcijo genomske DNA prve generacije transgenskega tobaka in reakcije PCR, za pomnoževanje tarčnih genov DhaA31, HheC-W249P in EchA, so izbrali transgene rastline z ustreznim vključkom. V primerjavi z divjim tipom je bilo pomnoževanje uspešno, kar kaže na uspešno izražanje genov za multiencimski sistem. Prisotnost in delovanje multiencimskega sistema so dokazali še s histokemijskem obarvanjem z X-gluc. Korenine transgenih rastlin, z vključenim genom GUS, so bile po 24h urah obarvane modro.

==Rezultati==
Za detekcijo aktivnosti multiencimskega sistema in vitro oz. za določitev koncentracij vseh metabolitov razgradne poti 1,2,3 – TCP so uporabili plinsko kromatografijo. Na projektu so se osredotočili le na aktivnost encimov v listih.

===Aktivnost encimov===
Aktivnost DhaA31 (piGEM2017-001), ki pretvori 1,2,3 – TCP v 2,3 – DCP, je bila po dodatku 5 mM 1,2,3 – TCP višja, kot pri divjem tipu tobaka, kjer intermediata 2,3 – DP niso detektirali.
Pri tobaku z vključenim piGEM2017-002 so aktivnost mutante HheC-W249P detektirali pri dodatku obeh substratov (2,3-DCP in CPD), niso pa zaznali razgradnih produktov (ECH in GDL). Encim HheC-W249P je v rastlinah manj stabilen, poleg tega pa se mora nahajati v aktivni obliki, ki je tetramer. Namesto optimizacije sistema so testirali aktivnost nemutiranega encima HheC, ki ga je proizvedla rekombinantna ''E. coli''. Komponente v tobaku na njegovo aktivnost nimajo vpliva, zato so ga vključili v celotno razgradno pot 1,2,3 – TCP.
V sistemu uspešno deluje tudi tretji encim sistema, EchA (piGEM2017-003), ki pretvori intermediat v končni produkt glicerol. Po 7-ih urah je bila opazna razgradnja ECH v CPD tudi pri divjem tipu tobaka, saj je EchA tudi endogeni encim.

Celotno razgradno pot v tobaku so testirali tako v listih tobaka s piGEM2017-004, kot tudi s piGEM2017-005, kjer je prisotna endogena epoksid hidrolaza EchA. V reakcijsko mešanico so dodali HheC, izoliranega iz ''E. coli'', in spremljali uspešnost pretvorbe 1,2,3 – TCP v glicerol. Proizvodnjo glicerola, končnega produkta so spremljali s kombinacijo plinske kromatografije in masne spektrometrije (GC-MS). Glicerol se je pri obeh vzorcih proizvajal sorazmerno z razgradnjo 1,2,3-TCP, in po 30-ih urah je bila razgradnja 80-odstotna.

===Aktivnost encimov v hidroponičnih raztopinah===
Hidroponika je breztalna tehnika vzgoje rastlin, ki temelji na uporabi hranilnih raztopin, bogatih z minerali. S to tehniko so člani ekipe preverili delovanje njihovega »super tobaka« v vodnem okolju. V ta namen so rastline presadili v hranilne raztopine s 5mM substratom in meritve so pokazale uspešno delovanje DhaA31 in EchA ob dodatku HheC v medij, le pri piGEM2017-004 glicerola ni bilo zaznati, saj se je najverjetneje vključil v rastlinski metabolizem.

==Modeliranje==

Super

2018-01-15T14:41:16Z

Inge.Sotlar: /* Izražanje genov za DhaA31, HheC-W249P in EchA v tobaku */

==Uvod==

Slabost napredka v kmetijstvu in kemični industriji so zagotovo negativni učinki toksičnih in težko razgradljivih spojin. Eden nevarnejših onesnaževalcev okolja, predvsem podtalnih voda, je halogenirana organska spojina 1,2,3 – trikloropropan (1,2,3 – TCP). Letno se ga proizvede okoli 50 000 ton, od tega se večinoma uporablja v kemični industriji kot topilo ali kot prekurzor za sintezo drugih kemikalij, npr. dikloropropena, v kmetijstvu pa kot hlapni pesticid - fumigant. Zaradi masovne proizvodnje je 1,2,3 - TCP pogosto prisoten na zapuščenih industrijskih mestih, od koder prehaja v podtalnico in nato v pitno vodo. V preteklih 10-ih letih so v več državah dokazali prisotnost v pitni vodi, saj zaradi majhnega adhezijskega koeficienta vanjo lažje prehaja in s tem ogroža okolje ter zdravje ljudi.

1,2,3 – TCP se v naravi težko razgradi, saj ni organizma, ki bi ta toksičen odpadni produkt lahko učinkovito odstranjeval. Načini odstranjevanja vključujejo uporabo aktivnega oglja ali reduktivno deklorinacijo z ničvalentnim železom, vendar so te metode za uporabo pri naravnih pogojih precej neučinkovite in drage. Pretekli poskusi razgradnje z bakterijami ''E. coli'' na iGEM 2013 [ http://2013.igem.org/Team:UESTC_Life#/page/1] niso bili uspešni, zato se je ekipa iGEM s Kitajske [http://2017.igem.org/Team:UESTC-China] odločila uporabiti metodo fitodegradacije s pomočjo »Super tobaka«.

Cilj projekta je bilo skonstruirati encimsko pot v rastlini tobaka za petstopenjsko razgradnjo 1,2,3 –TCP v netoksičen glicerol. Iz preteklih študij je bilo znano, da sistem vključuje tri ključne encime: mutanto haloalkan dehalogenaze (DhaA31) iz ''Rhodococcus rhodochrous'' NCIMB 13064 in mutanto halohidrin dehalogenaze (HheC-W249P) ter epiklorohidrin epoksid hidrolazo (EchA), obe izolirani iz ''Agrobacterium radiobacter'' AD1.

==Konstrukt poti za razgradnjo 1,2,3 - TCP==

Vektor, ki bi omogočil razgradnjo 1,2,3 – TCP v glicerol, so postopno pripravili v rastlinskem ekspresijskem vektorju piGEM2017, z zapisom za odpornost na kanamicin (NptII).

===Izražanje genov za DhaA31, HheC-W249P in EchA v tobaku===
Za izražanje tarčnih genov v tobaku so najprej naredili optimizacijo kodonov, potem pa so sintetizirali posamezne gene za encime DhaA31, HheC-W249P in EchA. Z uporabo virusnega peptida 2A in metode Golden Gate so uspešno vnesli posamezni tarčni gen v vektor piGEM2017 (skelet), pod kontrolo konstitutivnega promotorja CaMV35s. V zadnji vektor so vnesli vse tri gene hkrati in dobili so naslednje vektorje: ''piGEM2017-001'' (DhaA), ''piGEM2017-002'' (HheC-W249P), ''piGEM2017-003'' (EchA), ''piGEM2017-004'' (DhaA, HheC-W249P in EchA) ter ''piGEM2017-005'' (DhaA, HheC-W249P)

===Izražanje tarčnih genov v koreninah tobaka===
1,2,3 – TCP se povečini nahaja v podtalnici in onesnaženih tleh, zato je bil načrt narediti tak konstrukt, ki bi omogočil izražanje tarčnih genov le v koreninah rastline tobaka. Da bi ragradnjo usmerili v korenine in s tem dobili večjo učinkovitost, so konstitutivni promotor CaMV35s zamenjali z rastlinskim koreninsko-specifičnim promotorjem PYK10 iz ''Arabidopsis thaliana''. Hkrati je bil v vektor vključen še gen za citokinin CKX3, ki bi s spodbujanjem citokineze v kalusu omogočil hitrejšo rast korenin.

===Izvencelično izražanje tarčnih genov===
Vsi trije encimi lahko opravljajo svojo vlogo le zunajcelično. To so pri konstruiranju dosegli z dodatkom zapisa za signalni peptid (AO-S) pred tarčni gen, ki poleg transporta encimov v rastlinsko celično steno omogoča stabilnejše izražanje genov. Nazadnje so skonstruirali vektor, ki je namesto gen za CKX3 vseboval še gen za reporter (ß- glukoronidaza - GUS), s čimer so preverili če multigenski rastlinski ekspresijski vektorji lahko opravijo svojo nalogo.

==Transformacija tobaka in izbira ustreznih rastlin==
Za vnos tujih genov v tobak, ki sodi med dvokaličnice, so uporabili transformacijo z ''Agrobacterium''. Plazmide so vnesli v ''Agrobacterium'' EHA105, s pomočjo katere so fragment T-DNA s tarčnimi geni integrirali v kromosom tobaka. Po približno desetih tednih so preko rastlinske tkivne kulture (kalusa) dobili transgeni tobak.
Z ekstrakcijo genomske DNA prve generacije transgenskega tobaka in reakcije PCR, za pomnoževanje tarčnih genov DhaA31, HheC-W249P in EchA, so izbrali transgene rastline z ustreznim vključkom. V primerjavi z divjim tipom je bilo pomnoževanje uspešno, kar kaže na uspešno izražanje genov za multiencimski sistem. Prisotnost in delovanje multiencimskega sistema so dokazali še s histokemijskem obarvanjem z X-gluc. Korenine transgenih rastlin, z vključenim genom GUS, so bile po 24h urah obarvane modro.

==Rezultati==
Za detekcijo aktivnosti multiencimskega sistema in vitro oz. za določitev koncentracij vseh metabolitov razgradne poti 1,2,3 – TCP so uporabili plinsko kromatografijo. Na projektu so se osredotočili le na aktivnost encimov v listih.

===Aktivnost encimov===
Aktivnost DhaA31 (piGEM2017-001), ki pretvori 1,2,3 – TCP v 2,3 – DCP, je bila po dodatku 5 mM 1,2,3 – TCP višja, kot pri divjem tipu tobaka, kjer intermediata 2,3 – DP niso detektirali.
Pri tobaku z vključenim piGEM2017-002 so aktivnost mutante HheC-W249P detektirali pri dodatku obeh substratov (2,3-DCP in CPD), niso pa zaznali razgradnih produktov (ECH in GDL). Encim HheC-W249P je v rastlinah manj stabilen, poleg tega pa se mora nahajati v aktivni obliki, ki je tetramer. Namesto optimizacije sistema so testirali aktivnost nemutiranega encima HheC, ki ga je proizvedla rekombinantna ''E. coli''. Komponente v tobaku na njegovo aktivnost nimajo vpliva, zato so ga vključili v celotno razgradno pot 1,2,3 – TCP.
V sistemu uspešno deluje tudi tretji encim sistema, EchA (piGEM2017-003), ki pretvori intermediat v končni produkt glicerol. Po 7-ih urah je bila opazna razgradnja ECH v CPD tudi pri divjem tipu tobaka, saj je EchA tudi endogeni encim.

Celotno razgradno pot v tobaku so testirali tako v listih tobaka s piGEM2017-004, kot tudi s piGEM2017-005, kjer je prisotna endogena epoksid hidrolaza EchA. V reakcijsko mešanico so dodali HheC, izoliranega iz ''E. coli'', in spremljali uspešnost pretvorbe 1,2,3 – TCP v glicerol. Proizvodnjo glicerola, končnega produkta so spremljali s kombinacijo plinske kromatografije in masne spektrometrije (GC-MS). Glicerol se je pri obeh vzorcih proizvajal sorazmerno z razgradnjo 1,2,3-TCP, in po 30-ih urah je bila razgradnja 80-odstotna.

===Aktivnost encimov v hidroponičnih raztopinah===
Hidroponika je breztalna tehnika vzgoje rastlin, ki temelji na uporabi hranilnih raztopin, bogatih z minerali. S to tehniko so člani ekipe preverili delovanje njihovega »super tobaka« v vodnem okolju. V ta namen so rastline presadili v hranilne raztopine s 5mM substratom in meritve so pokazale uspešno delovanje DhaA31 in EchA ob dodatku HheC v medij, le pri piGEM2017-004 glicerola ni bilo zaznati, saj se je najverjetneje vključil v rastlinski metabolizem.

==Modeliranje==

Super

2018-01-15T14:35:00Z

Inge.Sotlar: /* Izražanje genov za encime DhaA31, HheC-W249P in EchA v tobaku */

==Uvod==

Slabost napredka v kmetijstvu in kemični industriji so zagotovo negativni učinki toksičnih in težko razgradljivih spojin. Eden nevarnejših onesnaževalcev okolja, predvsem podtalnih voda, je halogenirana organska spojina 1,2,3 – trikloropropan (1,2,3 – TCP). Letno se ga proizvede okoli 50 000 ton, od tega se večinoma uporablja v kemični industriji kot topilo ali kot prekurzor za sintezo drugih kemikalij, npr. dikloropropena, v kmetijstvu pa kot hlapni pesticid - fumigant. Zaradi masovne proizvodnje je 1,2,3 - TCP pogosto prisoten na zapuščenih industrijskih mestih, od koder prehaja v podtalnico in nato v pitno vodo. V preteklih 10-ih letih so v več državah dokazali prisotnost v pitni vodi, saj zaradi majhnega adhezijskega koeficienta vanjo lažje prehaja in s tem ogroža okolje ter zdravje ljudi.

1,2,3 – TCP se v naravi težko razgradi, saj ni organizma, ki bi ta toksičen odpadni produkt lahko učinkovito odstranjeval. Načini odstranjevanja vključujejo uporabo aktivnega oglja ali reduktivno deklorinacijo z ničvalentnim železom, vendar so te metode za uporabo pri naravnih pogojih precej neučinkovite in drage. Pretekli poskusi razgradnje z bakterijami ''E. coli'' na iGEM 2013 [ http://2013.igem.org/Team:UESTC_Life#/page/1] niso bili uspešni, zato se je ekipa iGEM s Kitajske [http://2017.igem.org/Team:UESTC-China] odločila uporabiti metodo fitodegradacije s pomočjo »Super tobaka«.

Cilj projekta je bilo skonstruirati encimsko pot v rastlini tobaka za petstopenjsko razgradnjo 1,2,3 –TCP v netoksičen glicerol. Iz preteklih študij je bilo znano, da sistem vključuje tri ključne encime: mutanto haloalkan dehalogenaze (DhaA31) iz ''Rhodococcus rhodochrous'' NCIMB 13064 in mutanto halohidrin dehalogenaze (HheC-W249P) ter epiklorohidrin epoksid hidrolazo (EchA), obe izolirani iz ''Agrobacterium radiobacter'' AD1.

==Konstrukt poti za razgradnjo 1,2,3 - TCP==

Vektor, ki bi omogočil razgradnjo 1,2,3 – TCP v glicerol, so postopno pripravili v rastlinskem ekspresijskem vektorju piGEM2017, z zapisom za odpornost na kanamicin (NptII).

===Izražanje genov za DhaA31, HheC-W249P in EchA v tobaku===
Za izražanje tarčnih genov v tobaku so najprej naredili optimizacijo kodonov, potem pa so sintetizirali posamezne gene za encime DhaA31, HheC-W249P in EchA. Z uporabo virusnega peptida 2A in metode Golden Gate so uspešno vnesli posamezni tarčni gen v vektor piGEM2017 (skelet), pod kontrolo konstitutivnega promotorja CaMV35s. V zadnji vektor so vnesli vse tri gene hkrati in dobili so vektorje piGEM2017-001 – 005 (LINK)

===Izražanje tarčnih genov v koreninah tobaka===
1,2,3 – TCP se povečini nahaja v podtalnici in onesnaženih tleh, zato je bil načrt narediti tak konstrukt, ki bi omogočil izražanje tarčnih genov le v koreninah rastline tobaka. Da bi ragradnjo usmerili v korenine in s tem dobili večjo učinkovitost, so konstitutivni promotor CaMV35s zamenjali z rastlinskim koreninsko-specifičnim promotorjem PYK10 iz ''Arabidopsis thaliana''. Hkrati je bil v vektor vključen še gen za citokinin CKX3, ki bi s spodbujanjem citokineze v kalusu omogočil hitrejšo rast korenin.

===Izvencelično izražanje tarčnih genov===
Vsi trije encimi lahko opravljajo svojo vlogo le zunajcelično. To so pri konstruiranju dosegli z dodatkom zapisa za signalni peptid (AO-S) pred tarčni gen, ki poleg transporta encimov v rastlinsko celično steno omogoča stabilnejše izražanje genov. Nazadnje so skonstruirali vektor, ki je namesto gen za CKX3 vseboval še gen za reporter (ß- glukoronidaza - GUS), s čimer so preverili če multigenski rastlinski ekspresijski vektorji lahko opravijo svojo nalogo.

==Transformacija tobaka in izbira ustreznih rastlin==
Za vnos tujih genov v tobak, ki sodi med dvokaličnice, so uporabili transformacijo z ''Agrobacterium''. Plazmide so vnesli v ''Agrobacterium'' EHA105, s pomočjo katere so fragment T-DNA s tarčnimi geni integrirali v kromosom tobaka. Po približno desetih tednih so preko rastlinske tkivne kulture (kalusa) dobili transgeni tobak.
Z ekstrakcijo genomske DNA prve generacije transgenskega tobaka in reakcije PCR, za pomnoževanje tarčnih genov DhaA31, HheC-W249P in EchA, so izbrali transgene rastline z ustreznim vključkom. V primerjavi z divjim tipom je bilo pomnoževanje uspešno, kar kaže na uspešno izražanje genov za multiencimski sistem. Prisotnost in delovanje multiencimskega sistema so dokazali še s histokemijskem obarvanjem z X-gluc. Korenine transgenih rastlin, z vključenim genom GUS, so bile po 24h urah obarvane modro.

==Rezultati==
Za detekcijo aktivnosti multiencimskega sistema in vitro oz. za določitev koncentracij vseh metabolitov razgradne poti 1,2,3 – TCP so uporabili plinsko kromatografijo. Na projektu so se osredotočili le na aktivnost encimov v listih.

===Aktivnost encimov===
Aktivnost DhaA31 (piGEM2017-001), ki pretvori 1,2,3 – TCP v 2,3 – DCP, je bila po dodatku 5 mM 1,2,3 – TCP višja, kot pri divjem tipu tobaka, kjer intermediata 2,3 – DP niso detektirali.
Pri tobaku z vključenim piGEM2017-002 so aktivnost mutante HheC-W249P detektirali pri dodatku obeh substratov (2,3-DCP in CPD), niso pa zaznali razgradnih produktov (ECH in GDL). Encim HheC-W249P je v rastlinah manj stabilen, poleg tega pa se mora nahajati v aktivni obliki, ki je tetramer. Namesto optimizacije sistema so testirali aktivnost nemutiranega encima HheC, ki ga je proizvedla rekombinantna ''E. coli''. Komponente v tobaku na njegovo aktivnost nimajo vpliva, zato so ga vključili v celotno razgradno pot 1,2,3 – TCP.
V sistemu uspešno deluje tudi tretji encim sistema, EchA (piGEM2017-003), ki pretvori intermediat v končni produkt glicerol. Po 7-ih urah je bila opazna razgradnja ECH v CPD tudi pri divjem tipu tobaka, saj je EchA tudi endogeni encim.

Celotno razgradno pot v tobaku so testirali tako v listih tobaka s piGEM2017-004, kot tudi s piGEM2017-005, kjer je prisotna endogena epoksid hidrolaza EchA. V reakcijsko mešanico so dodali HheC, izoliranega iz ''E. coli'', in spremljali uspešnost pretvorbe 1,2,3 – TCP v glicerol. Proizvodnjo glicerola, končnega produkta so spremljali s kombinacijo plinske kromatografije in masne spektrometrije (GC-MS). Glicerol se je pri obeh vzorcih proizvajal sorazmerno z razgradnjo 1,2,3-TCP, in po 30-ih urah je bila razgradnja 80-odstotna.

===Aktivnost encimov v hidroponičnih raztopinah===
Hidroponika je breztalna tehnika vzgoje rastlin, ki temelji na uporabi hranilnih raztopin, bogatih z minerali. S to tehniko so člani ekipe preverili delovanje njihovega »super tobaka« v vodnem okolju. V ta namen so rastline presadili v hranilne raztopine s 5mM substratom in meritve so pokazale uspešno delovanje DhaA31 in EchA ob dodatku HheC v medij, le pri piGEM2017-004 glicerola ni bilo zaznati, saj se je najverjetneje vključil v rastlinski metabolizem.

==Modeliranje==