https://wiki.fkkt.uni-lj.si/api.php?action=feedcontributions&feedformat=atom&user=Irma+Zeljkovi%C4%87 2026-04-07T02:27:44Z User contributions MediaWiki 1.39.3 https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Samoreplicirajo%C4%8D_COVID-19_test&diff=18987 2021-05-12T06:49:43Z

<p>Irma Zeljković: /* Detekcijska metoda 2: Homologna rekombinacija */</p> <hr /> <div>SEED-samoreplicirajoč COVID-19-test je iGEM-projekt iz leta 2020. Avtorji projekta so podiplomski študenti Univerze v Stanfordu v Kaliforniji.<br /> <br /> Spletna stran projekta: [https://2020.igem.org/Team:Stanford]<br /> <br /> Avtorica povzetka: Irma Zeljković<br /> <br /> = '''Uvod''' =<br /> Skupina je začela razmišljati o projektu sredi pandemije COVID-19. Ena od glavnih težav je bila takrat pomanjkanje možnosti testiranja, s katero bi lahko lažje spremljali in izolirali primere. Dve glavni pomanjkljivosti takratnih testov, sta bili potreba po izobraženem kadru in dragi reagenti. Skupina je imela idejo, da bi ustvarili test, ki bi lahko repliciral sam in ne bi potreboval usposobljenega kadra in laboratorijske opreme. [1]<br /> <br /> = '''Opis projekta'''=<br /> Sistem, ki so si ga zamislili sestoji iz treh korakov:<br /> * Vnos nukleinske kisline v bakterijsko celico<br /> * Intracelularna detekcija (RNA toehold ali homologna rekombinacija)<br /> * Intracelularno signaliziranje (prek quorum sensing poti)<br /> Rezultati so hitri in kolorimetrični. [1]<br /> == '''Vnos nukleinske kisline iz okolja''' ==<br /> Odločili so se za delo z bakterijo ''Bacillus Subtilis'', saj gre za naravno kompetentno bakterijo, ki je prepoznana kot GRAS. Kompetentna ''B. subtilis'' izraža specializirane proteine, ki so vstavljeni v kompleks za transport DNA prek membrane. ComEA veže nase DNA. Nato na DNA deluje protein ComG, ki pomaga pri prenosu skozi bakterijsko steno. Ob prehodu nanjo delujejo endonukleaze in DNA se cepi na fragmente. Prehod skozi citoplazemsko membrano pa omogoča protein ComEC, ki pa znotraj membrane tvori proteinsko poro in omogoča prehod le enoverižni DNA. Ko je DNA transportirana v celico jo B. subtilis integrira v kromosom. [2]<br /> Naravna kompetenca ''B. subtilis'' je posledica pomanjkanja hranil v okolju. Regulacija kompetence je zelo zapletena, ključna proteina sta ComK in ComX. ComK je transkripcijski faktor, ki se izrazi po končani eksponentni fazi rasti. Njegova ekspresija je stimulirana s feromonom ComX, ki ga izločajo druge celice s pomočjo poti quorum-sensinga zaradi povečane gostote celic. <br /> Skupina se je odločila za uporabo sevov, ki imajo možnost inducibilne superkompetentnosti. [3]<br /> <br /> Za detekciji s t.i. RNA-toehold stikali so uporabili sev SCK6. V tem sevu je gen ComK pod kontrolo ksiloznega inducibilnega promotorja PxylA. Dodatek ksiloze v kulturo B. subtilisa povzroči ekspresijo DNA transportnih proteinov in začne kompetentnost. <br /> Za sistem, ki je temeljil na rekombinaciji so uporabili sev REG19. Pri tem sevu je ComK pod kontrolo manitolnega inducibilnega promotorja PmtIA, skupaj z genom za kompetenco ComS. Dodatek manitola v gojišče začne kompetentnost bakterij. [1]<br /> <br /> == '''Detekcija tarčne sekvence v celici''' ==<br /> Ko je DNA v celici, je naslednji korak intracelularna detekcija. Skupina je poskusila 2 možna pristopa in sicer RNA-toehold stikala in z integracijo okoljske DNA v genom ''B.subtilis'' s homologno rekombinacijo. [1]<br /> <br /> === Detekcijska metoda 1: RNA toehold stikala===<br /> RNA-toehold stikala so preprosti detektorji, ki jih proizvaja celica in jih lahko uporabljamo ''in vivo'' in ''in vitro''. Gre za enoverižno RNA, katere struktura se tako zvije, da tvori zanko. Takšna RNA je sestavljena iz 5 delov: sprožilca, RBS, začetnega kodona, linkerja in reporterja.<br /> V normalnih razmerah, ko RNA veriga tvori zanko, sta RBS in začetni kodon blokirana in ne more priti do translacije RNA. Ko pa tarčna sekvenca pride v bližino verige RNA, se komplementarno veže na sprožilec in povzroči, da se zanka razvije. Zaradi tega pride do izpostavitve RBS-mesta in ribosomi se lahko vežejo na RNA. <br /> Prednosti tega sistema so, da z lahkoto lahko zamenjamo različne sekvence, da je visoko specifičen, lahko zazna več tarč v eni celici ter da ga lahko proizvajamo in vivo. <br /> Skupina je naredila toehold RNA, ki se integrirajo na plazmid pVeg YFP. Sprožilec je komplementaren genu KanR, ki ga je skupina izbrala kot tarčno sekvenco. Za RBS so uporabili sekvenco, ki je v ''B. subtilis'' specifična za vezanje ribosomov. Kot reporter pa so uporabili YFP, saj hitro difuzira in je rumene barve. [4]<br /> <br /> === Detekcijska metoda 2: Homologna rekombinacija===<br /> Drug način detekcije RNA je rekombinacijski sistem ''B. subtilis'', kjer poteče integracija DNA v kromosom s homologno rekombinacijo. Najprej so transformirali plazmid z negativnim selekcijskim markerjem, ki ga obkrožajo homologne regije tarčne sekvence. Ko celica prevzame sekvenco, se začne proces rekombinacije, ki povzroči, da se gen za negativno selekcijo izreže in ga nadomesti tarčna sekvenca. Če ne pride do prevzema DNA, tudi do rekombinacije ne pride in negativen selekcijski marker ostane v celici. Ta pa vodi v smrt celice ob prisotnosti manoze. [1]<br /> <br /> Skupina je izbrala ManP za negativni selekcijski marker. ManP deluje, tako da fosforilira manozo, ko vstopa v celico in tako onemogoča njen izstop iz celice. Sev REG19 ima izbit gen ManA, ki bi manozo spremenila v fruktozo, zato se fosforilirana manoza nabira v celici. <br /> <br /> Prisotnost tarče sekvence povzroči homologno rekombinacijo, saj je skupina svoj sev ''B. subtilis'' načrtovala z dvema regijama homologije tarčnih sekvenc, ki so vključene v genom na obeh straneh kasete ManP. <br /> Prednosti rekombinantnega sistema so, da se ta proces že naravno odvija v ''B. subtilis''. Slabosti pa so specifičnost (lahko pride do več lažno pozitivnih testov), občutljivost (sistem ne zazna tarčnih sekvenc, če jih je premalo) in ima omejeno hitrost. [1]<br /> <br /> == '''Ojačevanje signala za hitreje branje''' ==<br /> Naslednja faza je ojačevanjevidnega signala, ki so ga dobili z enim izmed sistemov. To fazo so le opisali, niso pa je preizkusili v laboratoriju zaradi težav s časom. <br /> Ojačevanje signala je pomembna, saj omogoča merljive rezultate v celi bakterijski koloniji tudi ob prisotnosti zelo malo nukleinske kisline. V ta namen so se odločili, da bojo uporabili quorum sensing. <br /> Ko kultura B. subtilisa doseže kritično gostoto, se aktivirajo quorum sensing molekule. Takšna molekula je na primer ComX, ki aktivira pot za aktivacijo promotorja PsrfA. Posledica tega je, da nastane bakterijski biofilm. <br /> Nova pot, ki jo je skupina naredila, vključuje pozitivno povratno zanko ComX in povzroči, da celice tvorijo fluorescentne proteine (namesto biofilma). To so storili, tako da so prvo izbili endogen ComX, in ga nadomestili s ComX, ki je bil pod kontrolo promotorja srf-A, PsrfA. Pod tem promotorjem bi bili tudi luxABCDE, ki so bioluminiscentni reporterji, ki si jih je skupina izbrala. Želeli so torej doseči, da bi izražanje Comx molekul aktiviralo PsrfA gene, ki bi proizvedli še več ComX in luxABCDE.<br /> Ojačevanje signala so morali združiti z mehanizmoma za zaznavanje DNA. Pri toehold stikalu bi razvitje zanke povzročilo translacijo ComX. Pri homologni rekombinaciji pa bi le-ta omogočila transkripcijo ComX.[1]<br /> <br /> = '''Uporabljeni biološki deli'''=<br /> <br /> Skupina je poskusila razviti 8 bioloških delov, ki jih lahko razdelimo v tri skupine: reporterji, detektorji, ki temeljijo na rekombinaciji in toehold. Nato pa so konstruirali še napravo za ojačitev signala, ki je niso mogli preizkusiti v laboratoriju. <br /> Prispevek skupine je bil torej devet biokock, saj so mnoge biokocke v registru kompatibilne, vendar ne optimizirane za delo z bakterijo ''B. subtilis''. <br /> <br /> <br /> V tabeli 1 so prikazani vsi biološki deli, ki so jih pripravili med projektom.<br /> <br /> <br /> {|<br /> |+ style=&quot;text-align: left;&quot; | ''Tabela 1: Biološki deli, ki jih je skupina pripravila med projektom. <br /> |-<br /> | '''KODA''' || '''IME S BIOLOŠKEGA DELA'''<br /> |-<br /> | [http://parts.igem.org/wiki/index.php?title=Part:BBa_K3697000 BBa_K3697000] || mCherry BSU<br /> |-<br /> | [http://parts.igem.org/wiki/index.php?title=Part:BBa_K3697008 BBa_K3697008] || YFP CDS<br /> |-<br /> | [http://parts.igem.org/wiki/index.php?title=Part:BBa_K3697010 BBa_K3697010]|| mCherry_BSU Plasmid<br /> |-<br /> | [http://parts.igem.org/wiki/index.php?title=Part:BBa_K3697009 BBa_K3697009 ] || pVEG YFP Plasmid for ''B. subtilis''<br /> |-<br /> | [http://parts.igem.org/wiki/index.php?title=Part:BBa_K3697002 BBa_K3697002] || ManP Expression Casette<br /> |-<br /> | [http://parts.igem.org/wiki/index.php?title=Part:BBa_K3697003 BBa_K3697003] || Homology Arms for KanR Integration In ''B. subtilis''<br /> |-<br /> | [http://parts.igem.org/wiki/index.php?title=Part:BBa_K3697004 BBa_K3697004] || Recombination-Based Detection System for B. subtilis (ManP)<br /> |-<br /> | [http://parts.igem.org/wiki/index.php?title=Part:BBa_K3697011 BBa_K3697011]|| Toehold for Detection of KanR in ''B. subtilis''<br /> |-<br /> | [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3697012 BBa_K3697012] || Signal Amplifier Using ''B. subtilis'' Quorum Sensing Molecule comX<br /> |}<br /> <br /> <br /> <br /> = '''Zaključek''' =<br /> Ideja projekta SEED se lahko uporabi za različne aplikacije, vendar pa se je skupina osredotočila na virusno diagnostiko. Gre za ne invaziven test, kjer lahko dobimo rezultate iz sline. Skupina je pokazala predvsem proof of concept, vendar pa bi se pred uporabo takega testa v komercialne namene moralo narediti še klinična testiranja. <br /> Seed pa bi bilo možno uporabljati tudi za druge namene. V zdravstvu bi ga lahko uporabljali tudi za testiranje drugih virusov (predvsem DNA). Možna pa je tudi uporaba v agronomiji in pri testiranju vode in hrane. <br /> <br /> = '''Viri''' =<br /> *[1] Team: “Stanfors - 2020.igem.org.” https://2020.igem.org/Team:Stanford (accessed May 09, 2021)<br /> *[2] Maier, B., Chen, I., Dubnau, D., &amp; Sheetz, M. P. (2004). DNA transport into Bacillus subtilis requires proton motive force to generate large molecular forces. Nature structural &amp; molecular biology, 11(7), 643–649. https://doi.org/10.1038/nsmb783<br /> *[3] Hamoen, L., Venema, G., &amp; Kuipers, O. (2003). Controlling competence in Bacillus subtilis: Shared use of regulators. Microbiology. 149:9-17. Retrieved May 15, 2014, from http://gbb.eldoc.ub.rug.nl/FILES/root/2003/MicrobiolHamoen/2003MicrobiolHamoen.pdf<br /> *[4] Hong, F., Ma, D., Wu, K., Mina, L.A., Luiten, R.C., Liu, Y., Yan, H., Green, A.A. 57214766484;57189763666;57215219536;14037633900;57206179773;57216667908;7403395897;55328809600; Precise and Programmable Detection of Mutations Using Ultraspecific Riboregulators (2020) Cell, 180 (5), pp. 1018-1032.e16.</div>

Irma Zeljković https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Samoreplicirajo%C4%8D_COVID-19_test&diff=18983 2021-05-12T05:56:33Z

<p>Irma Zeljković: </p> <hr /> <div>SEED-samoreplicirajoč COVID-19-test je iGEM-projekt iz leta 2020. Avtorji projekta so podiplomski študenti Univerze v Stanfordu v Kaliforniji.<br /> <br /> Spletna stran projekta: [https://2020.igem.org/Team:Stanford]<br /> <br /> Avtorica povzetka: Irma Zeljković<br /> <br /> = '''Uvod''' =<br /> Skupina je začela razmišljati o projektu sredi pandemije COVID-19. Ena od glavnih težav je bila takrat pomanjkanje možnosti testiranja, s katero bi lahko lažje spremljali in izolirali primere. Dve glavni pomanjkljivosti takratnih testov, sta bili potreba po izobraženem kadru in dragi reagenti. Skupina je imela idejo, da bi ustvarili test, ki bi lahko repliciral sam in ne bi potreboval usposobljenega kadra in laboratorijske opreme. [1]<br /> <br /> = '''Opis projekta'''=<br /> Sistem, ki so si ga zamislili sestoji iz treh korakov:<br /> * Vnos nukleinske kisline v bakterijsko celico<br /> * Intracelularna detekcija (RNA toehold ali homologna rekombinacija)<br /> * Intracelularno signaliziranje (prek quorum sensing poti)<br /> Rezultati so hitri in kolorimetrični. [1]<br /> == '''Vnos nukleinske kisline iz okolja''' ==<br /> Odločili so se za delo z bakterijo ''Bacillus Subtilis'', saj gre za naravno kompetentno bakterijo, ki je prepoznana kot GRAS. Kompetentna ''B. subtilis'' izraža specializirane proteine, ki so vstavljeni v kompleks za transport DNA prek membrane. ComEA veže nase DNA. Nato na DNA deluje protein ComG, ki pomaga pri prenosu skozi bakterijsko steno. Ob prehodu nanjo delujejo endonukleaze in DNA se cepi na fragmente. Prehod skozi citoplazemsko membrano pa omogoča protein ComEC, ki pa znotraj membrane tvori proteinsko poro in omogoča prehod le enoverižni DNA. Ko je DNA transportirana v celico jo B. subtilis integrira v kromosom. [2]<br /> Naravna kompetenca ''B. subtilis'' je posledica pomanjkanja hranil v okolju. Regulacija kompetence je zelo zapletena, ključna proteina sta ComK in ComX. ComK je transkripcijski faktor, ki se izrazi po končani eksponentni fazi rasti. Njegova ekspresija je stimulirana s feromonom ComX, ki ga izločajo druge celice s pomočjo poti quorum-sensinga zaradi povečane gostote celic. <br /> Skupina se je odločila za uporabo sevov, ki imajo možnost inducibilne superkompetentnosti. [3]<br /> <br /> Za detekciji s t.i. RNA-toehold stikali so uporabili sev SCK6. V tem sevu je gen ComK pod kontrolo ksiloznega inducibilnega promotorja PxylA. Dodatek ksiloze v kulturo B. subtilisa povzroči ekspresijo DNA transportnih proteinov in začne kompetentnost. <br /> Za sistem, ki je temeljil na rekombinaciji so uporabili sev REG19. Pri tem sevu je ComK pod kontrolo manitolnega inducibilnega promotorja PmtIA, skupaj z genom za kompetenco ComS. Dodatek manitola v gojišče začne kompetentnost bakterij. [1]<br /> <br /> == '''Detekcija tarčne sekvence v celici''' ==<br /> Ko je DNA v celici, je naslednji korak intracelularna detekcija. Skupina je poskusila 2 možna pristopa in sicer RNA-toehold stikala in z integracijo okoljske DNA v genom ''B.subtilis'' s homologno rekombinacijo. [1]<br /> <br /> === Detekcijska metoda 1: RNA toehold stikala===<br /> RNA-toehold stikala so preprosti detektorji, ki jih proizvaja celica in jih lahko uporabljamo ''in vivo'' in ''in vitro''. Gre za enoverižno RNA, katere struktura se tako zvije, da tvori zanko. Takšna RNA je sestavljena iz 5 delov: sprožilca, RBS, začetnega kodona, linkerja in reporterja.<br /> V normalnih razmerah, ko RNA veriga tvori zanko, sta RBS in začetni kodon blokirana in ne more priti do translacije RNA. Ko pa tarčna sekvenca pride v bližino verige RNA, se komplementarno veže na sprožilec in povzroči, da se zanka razvije. Zaradi tega pride do izpostavitve RBS-mesta in ribosomi se lahko vežejo na RNA. <br /> Prednosti tega sistema so, da z lahkoto lahko zamenjamo različne sekvence, da je visoko specifičen, lahko zazna več tarč v eni celici ter da ga lahko proizvajamo in vivo. <br /> Skupina je naredila toehold RNA, ki se integrirajo na plazmid pVeg YFP. Sprožilec je komplementaren genu KanR, ki ga je skupina izbrala kot tarčno sekvenco. Za RBS so uporabili sekvenco, ki je v ''B. subtilis'' specifična za vezanje ribosomov. Kot reporter pa so uporabili YFP, saj hitro difuzira in je rumene barve. [4]<br /> <br /> === Detekcijska metoda 2: Homologna rekombinacija===<br /> Drug način detekcije RNA je rekombinacijski sistem ''B. subtilis'', kjer poteče integracija DNA v kromosom s homologno rekombinacijo. Najprej so transformirali plazmid z negativnim selekcijskim markerjem, ki ga obkrožajo homologne regije tarčne sekvence. Ko celica prevzame sekvenco, se začne proces rekombinacije, ki povzroči, da se gen za negativno selekcijo izreže in ga nadomesti tarčna sekvenca. Če ne pride do prevzema DNA, tudi do rekombinacije ne pride in negativen selekcijski marker ostane v celici. Ta pa vodi v smrt celice ob prisotnosti manoze. [1]<br /> <br /> Skupina je zbrala ManP za negativni selekcijski marker. ManP deluje, tako da fosforilira manozo, ko vstopa v celico in tako onemogoča njen izstop iz celice. Sev REG19 ima izbit gen ManA, ki bi manozo spremenila v fruktozo, zato se fosforilirana manoza nabira v celici. <br /> <br /> Prisotnost tarče sekvence povzroči homologno rekombinacijo, saj je skupina svoj sev ''B. subtilis'' načrtovala z dvema regijama homologije tarčnih sekvenc, ki so vključene v genom na obeh straneh kasete ManP. <br /> Prednosti rekombinantnega sistema so, da se ta proces že naravno odvija v ''B. subtilis''. Slabosti pa so specifičnost (lahko pride do več lažno pozitivnih testov), občutljivost (sistem ne zazna tarčnih sekvenc, če jih je premalo) in ima omejeno hitrost. [1]<br /> <br /> == '''Ojačevanje signala za hitreje branje''' ==<br /> Naslednja faza je ojačevanjevidnega signala, ki so ga dobili z enim izmed sistemov. To fazo so le opisali, niso pa je preizkusili v laboratoriju zaradi težav s časom. <br /> Ojačevanje signala je pomembna, saj omogoča merljive rezultate v celi bakterijski koloniji tudi ob prisotnosti zelo malo nukleinske kisline. V ta namen so se odločili, da bojo uporabili quorum sensing. <br /> Ko kultura B. subtilisa doseže kritično gostoto, se aktivirajo quorum sensing molekule. Takšna molekula je na primer ComX, ki aktivira pot za aktivacijo promotorja PsrfA. Posledica tega je, da nastane bakterijski biofilm. <br /> Nova pot, ki jo je skupina naredila, vključuje pozitivno povratno zanko ComX in povzroči, da celice tvorijo fluorescentne proteine (namesto biofilma). To so storili, tako da so prvo izbili endogen ComX, in ga nadomestili s ComX, ki je bil pod kontrolo promotorja srf-A, PsrfA. Pod tem promotorjem bi bili tudi luxABCDE, ki so bioluminiscentni reporterji, ki si jih je skupina izbrala. Želeli so torej doseči, da bi izražanje Comx molekul aktiviralo PsrfA gene, ki bi proizvedli še več ComX in luxABCDE.<br /> Ojačevanje signala so morali združiti z mehanizmoma za zaznavanje DNA. Pri toehold stikalu bi razvitje zanke povzročilo translacijo ComX. Pri homologni rekombinaciji pa bi le-ta omogočila transkripcijo ComX.[1]<br /> <br /> = '''Uporabljeni biološki deli'''=<br /> <br /> Skupina je poskusila razviti 8 bioloških delov, ki jih lahko razdelimo v tri skupine: reporterji, detektorji, ki temeljijo na rekombinaciji in toehold. Nato pa so konstruirali še napravo za ojačitev signala, ki je niso mogli preizkusiti v laboratoriju. <br /> Prispevek skupine je bil torej devet biokock, saj so mnoge biokocke v registru kompatibilne, vendar ne optimizirane za delo z bakterijo ''B. subtilis''. <br /> <br /> <br /> V tabeli 1 so prikazani vsi biološki deli, ki so jih pripravili med projektom.<br /> <br /> <br /> {|<br /> |+ style=&quot;text-align: left;&quot; | ''Tabela 1: Biološki deli, ki jih je skupina pripravila med projektom. <br /> |-<br /> | '''KODA''' || '''IME S BIOLOŠKEGA DELA'''<br /> |-<br /> | [http://parts.igem.org/wiki/index.php?title=Part:BBa_K3697000 BBa_K3697000] || mCherry BSU<br /> |-<br /> | [http://parts.igem.org/wiki/index.php?title=Part:BBa_K3697008 BBa_K3697008] || YFP CDS<br /> |-<br /> | [http://parts.igem.org/wiki/index.php?title=Part:BBa_K3697010 BBa_K3697010]|| mCherry_BSU Plasmid<br /> |-<br /> | [http://parts.igem.org/wiki/index.php?title=Part:BBa_K3697009 BBa_K3697009 ] || pVEG YFP Plasmid for ''B. subtilis''<br /> |-<br /> | [http://parts.igem.org/wiki/index.php?title=Part:BBa_K3697002 BBa_K3697002] || ManP Expression Casette<br /> |-<br /> | [http://parts.igem.org/wiki/index.php?title=Part:BBa_K3697003 BBa_K3697003] || Homology Arms for KanR Integration In ''B. subtilis''<br /> |-<br /> | [http://parts.igem.org/wiki/index.php?title=Part:BBa_K3697004 BBa_K3697004] || Recombination-Based Detection System for B. subtilis (ManP)<br /> |-<br /> | [http://parts.igem.org/wiki/index.php?title=Part:BBa_K3697011 BBa_K3697011]|| Toehold for Detection of KanR in ''B. subtilis''<br /> |-<br /> | [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3697012 BBa_K3697012] || Signal Amplifier Using ''B. subtilis'' Quorum Sensing Molecule comX<br /> |}<br /> <br /> <br /> <br /> = '''Zaključek''' =<br /> Ideja projekta SEED se lahko uporabi za različne aplikacije, vendar pa se je skupina osredotočila na virusno diagnostiko. Gre za ne invaziven test, kjer lahko dobimo rezultate iz sline. Skupina je pokazala predvsem proof of concept, vendar pa bi se pred uporabo takega testa v komercialne namene moralo narediti še klinična testiranja. <br /> Seed pa bi bilo možno uporabljati tudi za druge namene. V zdravstvu bi ga lahko uporabljali tudi za testiranje drugih virusov (predvsem DNA). Možna pa je tudi uporaba v agronomiji in pri testiranju vode in hrane. <br /> <br /> = '''Viri''' =<br /> *[1] Team: “Stanfors - 2020.igem.org.” https://2020.igem.org/Team:Stanford (accessed May 09, 2021)<br /> *[2] Maier, B., Chen, I., Dubnau, D., &amp; Sheetz, M. P. (2004). DNA transport into Bacillus subtilis requires proton motive force to generate large molecular forces. Nature structural &amp; molecular biology, 11(7), 643–649. https://doi.org/10.1038/nsmb783<br /> *[3] Hamoen, L., Venema, G., &amp; Kuipers, O. (2003). Controlling competence in Bacillus subtilis: Shared use of regulators. Microbiology. 149:9-17. Retrieved May 15, 2014, from http://gbb.eldoc.ub.rug.nl/FILES/root/2003/MicrobiolHamoen/2003MicrobiolHamoen.pdf<br /> *[4] Hong, F., Ma, D., Wu, K., Mina, L.A., Luiten, R.C., Liu, Y., Yan, H., Green, A.A. 57214766484;57189763666;57215219536;14037633900;57206179773;57216667908;7403395897;55328809600; Precise and Programmable Detection of Mutations Using Ultraspecific Riboregulators (2020) Cell, 180 (5), pp. 1018-1032.e16.</div>

Irma Zeljković https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Samoreplicirajo%C4%8D_COVID-19_test&diff=18982 2021-05-11T20:28:08Z

<p>Irma Zeljković: /* Uvod */</p> <hr /> <div>SEED-samoreplicirajoč COVID-19-test je iGEM-projekt iz leta 2020. Avtorji projekta so podiplomski študenti Univerze v Stanfordu v Kaliforniji.<br /> <br /> Spletna stran projekta: [https://2020.igem.org/Team:Stanford]<br /> <br /> Avtorica povzetka: Irma Zeljković<br /> <br /> = '''Uvod''' =<br /> Skupina je začela razmišljati o projektu sredi pandemije COVID-19. Ena od glavnih težav je bila takrat pomanjkanje možnosti testiranja, s katero bi lahko lažje spremljali in izolirali primere. Dve glavni pomanjkljivosti takratnih testov, sta bili potreba po izobraženem kadru in dragi reagenti. Skupina je imela idejo, da bi ustvarili test, ki bi lahko repliciral sam in ne bi potreboval usposobljenega kadra in laboratorijske opreme. [1]<br /> <br /> = '''Opis projekta'''=<br /> Sistem, ki so si ga zamislili sestoji iz treh korakov:<br /> * Vnos nukleinske kisline v bakterijsko celico<br /> * Intracelularna detekcija (RNA toehold ali homologna rekombinacija)<br /> * Intracelularno signaliziranje (prek quorum sensing poti)<br /> Rezultati so hitri in kolorimetrični. [1]<br /> == '''Vnos nukleinske kisline iz okolja''' ==<br /> Odločili so se za delo z bakterijo ''Bacillus Subtilis'', saj gre za naravno kompetentno bakterijo, ki je prepoznana kot GRAS. Kompetentna ''B. subtilis'' izraža specializirane proteine, ki so vstavljeni v kompleks za transport DNA prek membrane. ComEA veže nase DNA. Nato na DNA deluje protein ComG, ki pomaga pri prenosu skozi bakterijsko steno. Ob prehodu nanjo delujejo endonukleaze in DNA se cepi na fragmente. Prehod skozi citoplazemsko membrano pa omogoča protein ComEC, ki pa znotraj membrane tvori proteinsko poro in omogoča prehod le enoverižni DNA. Ko je DNA transportirana v celico jo B. subtilis integrira v kromosom. [2]<br /> Naravna kompetenca ''B. subtilis'' je posledica pomanjkanja hranil v okolju. Regulacija kompetence je zelo zapletena, ključna proteina sta ComK in ComX. ComK je transkripcijski faktor, ki se izrazi po končani eksponentni fazi rasti. Njegova ekspresija je stimulirana s feromonom ComX, ki ga izločajo druge celice s pomočjo poti quorum-sensinga zaradi povečane gostote celic. <br /> Skupina se je odločila za uporabo sevov, ki imajo možnost inducibilne superkompetentnosti. [3]<br /> <br /> Za detekciji s t.i. RNA-toehold stikali jo so uporabili sev SCK6. V tem sevu je gen ComK pod kontrolo ksiloznega inducibilnega promotorja PxylA. Dodatek ksiloze v kulturo B. subtilisa povzroči ekspresijo DNA transportnih proteinov in začne kompetentnost. <br /> Za sistem, ki je temeljil na rekombinaciji so uporabili sev REG19. Pri tem sevu je ComK pod kontrolo manitolnega inducibilnega promotorja PmtIA, skupaj z genom za kompetenco ComS. Dodatek manitola v gojišče začne kompetentnost bakterij. [1]<br /> <br /> == '''Detekcija tarčne sekvence v celici''' ==<br /> Ko je DNA v celici, je naslednji korak intracelularna detekcija. Skupina je poskusila 2 možna pristopa in sicer RNA-toehold stikala integracijo okoljske DNA v genom ''B.subtilis'' s homologno rekombinacijo. [1]<br /> <br /> === Detekcijska metoda 1: RNA toehold stikala===<br /> RNA-toehold stikala so preprosti detektorji, ki jih proizvaja celica in jih lahko uporabljamo ''in vivo'' in ''in vitro''. Gre za enoverižno RNA, katere struktura se tako zvije, da tvori zanko. Takšna RNA je sestavljena iz 5 delov: sprožilca, RBS, začetnega kodona, linkerja in reporterja.<br /> V normalnih razmerah, ko RNA veriga tvori zanko, sta RBS in začetni kodon blokirana in ne more priti do translacije RNA. Ko pa tarčna sekvenca pride v bližino verige RNA, se komplementarno veže na sprožilec in povzroči, da se zanka razvije. To povzroči, da je RBS-mesto izpostavljeno in ribosomi se lahko vežejo na to RNA. <br /> Prednosti tega sistema so, da z lahkoto lahko zamenjamo različne sekvence, da je visoko specifičen, lahko zazna več tarč v eni celici in ga lahko proizvajamo in vivo. <br /> Skupina je naredila toeholde, ki se integrirajo na plazmid pVeg YFP. Sprožilec je komplementaren genu KanR, ki ga je skupina izbrala kot tarčno sekvenco. Za RBS so uporabili sekvenco, ki je v ''B. subtilis'' specifična za vezanje ribosomov. Kot reporter pa so uporabili YFP, saj hitro difuzira in je rumene barve. [4]<br /> <br /> === Detekcijska metoda 2: Homologna rekombinacija===<br /> Drug način detekcije RNA je rekombinacijski sistem ''B. subtilis'', kjer poteče integracija DNA v kromosom s homologno rekombinacijo. Najprej so transformirali plazmid z negativnim selekcijskim markerjem, ki ga obkrožajo homologne regije tarčne sekvence. Ko celica prevzame sekvenco, se začne proces rekombinacije, ki povzroči, da se gen za negativno selekcijo izreže in ga nadomesti tarčna sekvenca. Če ne pride do prevzema DNA, tudi do rekombinacije ne pride in negativen selekcijski marker ostane v celici. Ta pa vodi v smrt celice ob prisotnosti manoze. [1]<br /> <br /> Skupina je zbrala ManP za negativni selekcijski marker. ManP deluje, tako da fosforilira manozo, ko vstopa v celico in tako onemogoča njen izstop iz celice. Sev REG19 ima izbit gen ManA, ki bi manozo spremenila v fruktozo, zato se fosforilirana manoza nabira v celici. <br /> <br /> Prisotnost tarče sekvence povzroči homologno rekombinacijo, saj je skupina svoj sev ''B. subtilis'' načrtovala z dvema regijama homologije tarčnih sekvenc, ki so vključene v genom na obeh straneh kasete ManP. <br /> Prednosti rekombinantnega sistema so, da se ta proces že naravno odvija v ''B. subtilis''. Slabosti pa so specifičnost (lahko pride do več lažno pozitivnih testov), občutljivost (sistem ne zazna tarčnih sekvenc, če jih je premalo) in ima omejeno hitrost. [1]<br /> <br /> == '''Ojačevanje signala za hitreje branje''' ==<br /> Naslednja faza je ojačevanjevidnega signala, ki so ga dobili z enim izmed sistemov. To fazo so le opisali, niso pa je preizkusili v laboratoriju zaradi težav s časom. <br /> Ojačevanje signala je pomembna, saj omogoča merljive rezultate v celi bakterijski koloniji tudi ob prisotnosti zelo malo nukleinske kisline. V ta namen so se odločili, da bojo uporabili quorum sensing. <br /> Ko kultura B. subtilisa doseže kritično gostoto, se aktivirajo quorum sensing molekule. Takšna molekula je na primer ComX, ki aktivira pot za aktivacijo promotorja PsrfA. Posledica tega je, da nastane bakterijski biofilm. <br /> Nova pot, ki jo je skupina naredila, vključuje pozitivno povratno zanko ComX in povzroči, da celice tvorijo fluorescentne proteine (namesto biofilma). To so storili, tako da so prvo izbili endogen ComX, in ga nadomestili s ComX, ki je bil pod kontrolo promotorja srf-A, PsrfA. Pod tem promotorjem bi bili tudi luxABCDE, ki so bioluminiscentni reporterji, ki si jih je skupina izbrala. Želeli so torej doseči, da bi izražanje Comx molekul aktiviralo PsrfA gene, ki bi proizvedli še več ComX in luxABCDE.<br /> Ojačevanje signala so morali združiti z mehanizmoma za zaznavanje DNA. Pri toehold stikalu bi razvitje zanke povzročilo translacijo ComX. Pri homologni rekombinaciji pa bi le-ta omogočila transkripcijo ComX.[1]<br /> <br /> = '''Uporabljeni biološki deli'''=<br /> <br /> Skupina je poskusila razviti 8 bioloških delov, ki jih lahko razdelimo v tri skupine: reporterji, detektorji, ki temeljijo na rekombinaciji in toehold. Nato pa so konstruirali še napravo za ojačitev signala, ki je niso mogli preizkusiti v laboratoriju. <br /> Prispevek skupine je bil torej devet biokock, saj so mnoge biokocke v registru kompatibilne, vendar ne optimizirane za delo z bakterijo ''B. subtilis''. <br /> <br /> <br /> V tabeli 1 so prikazani vsi biološki deli, ki so jih pripravili med projektom.<br /> <br /> <br /> {|<br /> |+ style=&quot;text-align: left;&quot; | ''Tabela 1: Biološki deli, ki jih je skupina pripravila med projektom. <br /> |-<br /> | '''KODA''' || '''IME S BIOLOŠKEGA DELA'''<br /> |-<br /> | [http://parts.igem.org/wiki/index.php?title=Part:BBa_K3697000 BBa_K3697000] || mCherry BSU<br /> |-<br /> | [http://parts.igem.org/wiki/index.php?title=Part:BBa_K3697008 BBa_K3697008] || YFP CDS<br /> |-<br /> | [http://parts.igem.org/wiki/index.php?title=Part:BBa_K3697010 BBa_K3697010]|| mCherry_BSU Plasmid<br /> |-<br /> | [http://parts.igem.org/wiki/index.php?title=Part:BBa_K3697009 BBa_K3697009 ] || pVEG YFP Plasmid for ''B. subtilis''<br /> |-<br /> | [http://parts.igem.org/wiki/index.php?title=Part:BBa_K3697002 BBa_K3697002] || ManP Expression Casette<br /> |-<br /> | [http://parts.igem.org/wiki/index.php?title=Part:BBa_K3697003 BBa_K3697003] || Homology Arms for KanR Integration In ''B. subtilis''<br /> |-<br /> | [http://parts.igem.org/wiki/index.php?title=Part:BBa_K3697004 BBa_K3697004] || Recombination-Based Detection System for B. subtilis (ManP)<br /> |-<br /> | [http://parts.igem.org/wiki/index.php?title=Part:BBa_K3697011 BBa_K3697011]|| Toehold for Detection of KanR in ''B. subtilis''<br /> |-<br /> | [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3697012 BBa_K3697012] || Signal Amplifier Using ''B. subtilis'' Quorum Sensing Molecule comX<br /> |}<br /> <br /> <br /> <br /> = '''Zaključek''' =<br /> Ideja projekta SEED se lahko uporabi za različne aplikacije, vendar pa se je skupina osredotočila na virusno diagnostiko. Gre za ne invaziven test, kjer lahko dobimo rezultate iz sline. Skupina je pokazala predvsem proof of concept, vendar pa bi se pred uporabo takega testa v komercialne namene moralo narediti še klinična testiranja. <br /> Seed pa bi bilo možno uporabljati tudi za druge namene. V zdravstvu bi ga lahko uporabljali tudi za testiranje drugih virusov (predvsem DNA). Možna pa je tudi uporaba v agronomiji in pri testiranju vode in hrane. <br /> <br /> = '''Viri''' =<br /> *[1] Team: “Stanfors - 2020.igem.org.” https://2020.igem.org/Team:Stanford (accessed May 09, 2021)<br /> *[2] Maier, B., Chen, I., Dubnau, D., &amp; Sheetz, M. P. (2004). DNA transport into Bacillus subtilis requires proton motive force to generate large molecular forces. Nature structural &amp; molecular biology, 11(7), 643–649. https://doi.org/10.1038/nsmb783<br /> *[3] Hamoen, L., Venema, G., &amp; Kuipers, O. (2003). Controlling competence in Bacillus subtilis: Shared use of regulators. Microbiology. 149:9-17. Retrieved May 15, 2014, from http://gbb.eldoc.ub.rug.nl/FILES/root/2003/MicrobiolHamoen/2003MicrobiolHamoen.pdf<br /> *[4] Hong, F., Ma, D., Wu, K., Mina, L.A., Luiten, R.C., Liu, Y., Yan, H., Green, A.A. 57214766484;57189763666;57215219536;14037633900;57206179773;57216667908;7403395897;55328809600; Precise and Programmable Detection of Mutations Using Ultraspecific Riboregulators (2020) Cell, 180 (5), pp. 1018-1032.e16.</div>

Irma Zeljković https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Samoreplicirajo%C4%8D_COVID-19_test&diff=18981 2021-05-11T19:57:02Z

<p>Irma Zeljković: </p> <hr /> <div>SEED-samoreplicirajoč COVID-19-test je iGEM-projekt iz leta 2020. Avtorji projekta so podiplomski študenti Univerze v Stanfordu v Kaliforniji.<br /> <br /> Spletna stran projekta: [https://2020.igem.org/Team:Stanford]<br /> <br /> Avtorica povzetka: Irma Zeljković<br /> <br /> = '''Uvod''' =<br /> Skupina je začela razmišljati o projektu sredi pandemije COVID-19. Ena od glavnih težav je bila takrat pomanjkanje možnosti testiranja, s katero bi lahko lažje spremljali in izolirali primere. Dve glavni pomanjkljivosti takratnih testov, sta bili potreba po izobraženem kadru in dragi reagenti. Skupina je imela idejo, da bi ustvarili test, ki bi lahko repliciral samega sebe in ne bi potreboval usposobljenega kadra in laboratorijske opreme. [1]<br /> <br /> = '''Opis projekta'''=<br /> Sistem, ki so si ga zamislili sestoji iz treh korakov:<br /> * Vnos nukleinske kisline v bakterijsko celico<br /> * Intracelularna detekcija (RNA toehold ali homologna rekombinacija)<br /> * Intracelularno signaliziranje (prek quorum sensing poti)<br /> Rezultati so hitri in kolorimetrični. [1]<br /> == '''Vnos nukleinske kisline iz okolja''' ==<br /> Odločili so se za delo z bakterijo ''Bacillus Subtilis'', saj gre za naravno kompetentno bakterijo, ki je prepoznana kot GRAS. Kompetentna ''B. subtilis'' izraža specializirane proteine, ki so vstavljeni v kompleks za transport DNA prek membrane. ComEA veže nase DNA. Nato na DNA deluje protein ComG, ki pomaga pri prenosu skozi bakterijsko steno. Ob prehodu nanjo delujejo endonukleaze in DNA se cepi na fragmente. Prehod skozi citoplazemsko membrano pa omogoča protein ComEC, ki pa znotraj membrane tvori proteinsko poro in omogoča prehod le enoverižni DNA. Ko je DNA transportirana v celico jo B. subtilis integrira v kromosom. [2]<br /> Naravna kompetenca ''B. subtilis'' je posledica pomanjkanja hranil v okolju. Regulacija kompetence je zelo zapletena, ključna proteina sta ComK in ComX. ComK je transkripcijski faktor, ki se izrazi po končani eksponentni fazi rasti. Njegova ekspresija je stimulirana s feromonom ComX, ki ga izločajo druge celice s pomočjo poti quorum-sensinga zaradi povečane gostote celic. <br /> Skupina se je odločila za uporabo sevov, ki imajo možnost inducibilne superkompetentnosti. [3]<br /> <br /> Za detekciji s t.i. RNA-toehold stikali jo so uporabili sev SCK6. V tem sevu je gen ComK pod kontrolo ksiloznega inducibilnega promotorja PxylA. Dodatek ksiloze v kulturo B. subtilisa povzroči ekspresijo DNA transportnih proteinov in začne kompetentnost. <br /> Za sistem, ki je temeljil na rekombinaciji so uporabili sev REG19. Pri tem sevu je ComK pod kontrolo manitolnega inducibilnega promotorja PmtIA, skupaj z genom za kompetenco ComS. Dodatek manitola v gojišče začne kompetentnost bakterij. [1]<br /> <br /> == '''Detekcija tarčne sekvence v celici''' ==<br /> Ko je DNA v celici, je naslednji korak intracelularna detekcija. Skupina je poskusila 2 možna pristopa in sicer RNA-toehold stikala integracijo okoljske DNA v genom ''B.subtilis'' s homologno rekombinacijo. [1]<br /> <br /> === Detekcijska metoda 1: RNA toehold stikala===<br /> RNA-toehold stikala so preprosti detektorji, ki jih proizvaja celica in jih lahko uporabljamo ''in vivo'' in ''in vitro''. Gre za enoverižno RNA, katere struktura se tako zvije, da tvori zanko. Takšna RNA je sestavljena iz 5 delov: sprožilca, RBS, začetnega kodona, linkerja in reporterja.<br /> V normalnih razmerah, ko RNA veriga tvori zanko, sta RBS in začetni kodon blokirana in ne more priti do translacije RNA. Ko pa tarčna sekvenca pride v bližino verige RNA, se komplementarno veže na sprožilec in povzroči, da se zanka razvije. To povzroči, da je RBS-mesto izpostavljeno in ribosomi se lahko vežejo na to RNA. <br /> Prednosti tega sistema so, da z lahkoto lahko zamenjamo različne sekvence, da je visoko specifičen, lahko zazna več tarč v eni celici in ga lahko proizvajamo in vivo. <br /> Skupina je naredila toeholde, ki se integrirajo na plazmid pVeg YFP. Sprožilec je komplementaren genu KanR, ki ga je skupina izbrala kot tarčno sekvenco. Za RBS so uporabili sekvenco, ki je v ''B. subtilis'' specifična za vezanje ribosomov. Kot reporter pa so uporabili YFP, saj hitro difuzira in je rumene barve. [4]<br /> <br /> === Detekcijska metoda 2: Homologna rekombinacija===<br /> Drug način detekcije RNA je rekombinacijski sistem ''B. subtilis'', kjer poteče integracija DNA v kromosom s homologno rekombinacijo. Najprej so transformirali plazmid z negativnim selekcijskim markerjem, ki ga obkrožajo homologne regije tarčne sekvence. Ko celica prevzame sekvenco, se začne proces rekombinacije, ki povzroči, da se gen za negativno selekcijo izreže in ga nadomesti tarčna sekvenca. Če ne pride do prevzema DNA, tudi do rekombinacije ne pride in negativen selekcijski marker ostane v celici. Ta pa vodi v smrt celice ob prisotnosti manoze. [1]<br /> <br /> Skupina je zbrala ManP za negativni selekcijski marker. ManP deluje, tako da fosforilira manozo, ko vstopa v celico in tako onemogoča njen izstop iz celice. Sev REG19 ima izbit gen ManA, ki bi manozo spremenila v fruktozo, zato se fosforilirana manoza nabira v celici. <br /> <br /> Prisotnost tarče sekvence povzroči homologno rekombinacijo, saj je skupina svoj sev ''B. subtilis'' načrtovala z dvema regijama homologije tarčnih sekvenc, ki so vključene v genom na obeh straneh kasete ManP. <br /> Prednosti rekombinantnega sistema so, da se ta proces že naravno odvija v ''B. subtilis''. Slabosti pa so specifičnost (lahko pride do več lažno pozitivnih testov), občutljivost (sistem ne zazna tarčnih sekvenc, če jih je premalo) in ima omejeno hitrost. [1]<br /> <br /> == '''Ojačevanje signala za hitreje branje''' ==<br /> Naslednja faza je ojačevanjevidnega signala, ki so ga dobili z enim izmed sistemov. To fazo so le opisali, niso pa je preizkusili v laboratoriju zaradi težav s časom. <br /> Ojačevanje signala je pomembna, saj omogoča merljive rezultate v celi bakterijski koloniji tudi ob prisotnosti zelo malo nukleinske kisline. V ta namen so se odločili, da bojo uporabili quorum sensing. <br /> Ko kultura B. subtilisa doseže kritično gostoto, se aktivirajo quorum sensing molekule. Takšna molekula je na primer ComX, ki aktivira pot za aktivacijo promotorja PsrfA. Posledica tega je, da nastane bakterijski biofilm. <br /> Nova pot, ki jo je skupina naredila, vključuje pozitivno povratno zanko ComX in povzroči, da celice tvorijo fluorescentne proteine (namesto biofilma). To so storili, tako da so prvo izbili endogen ComX, in ga nadomestili s ComX, ki je bil pod kontrolo promotorja srf-A, PsrfA. Pod tem promotorjem bi bili tudi luxABCDE, ki so bioluminiscentni reporterji, ki si jih je skupina izbrala. Želeli so torej doseči, da bi izražanje Comx molekul aktiviralo PsrfA gene, ki bi proizvedli še več ComX in luxABCDE.<br /> Ojačevanje signala so morali združiti z mehanizmoma za zaznavanje DNA. Pri toehold stikalu bi razvitje zanke povzročilo translacijo ComX. Pri homologni rekombinaciji pa bi le-ta omogočila transkripcijo ComX.[1]<br /> <br /> = '''Uporabljeni biološki deli'''=<br /> <br /> Skupina je poskusila razviti 8 bioloških delov, ki jih lahko razdelimo v tri skupine: reporterji, detektorji, ki temeljijo na rekombinaciji in toehold. Nato pa so konstruirali še napravo za ojačitev signala, ki je niso mogli preizkusiti v laboratoriju. <br /> Prispevek skupine je bil torej devet biokock, saj so mnoge biokocke v registru kompatibilne, vendar ne optimizirane za delo z bakterijo ''B. subtilis''. <br /> <br /> <br /> V tabeli 1 so prikazani vsi biološki deli, ki so jih pripravili med projektom.<br /> <br /> <br /> {|<br /> |+ style=&quot;text-align: left;&quot; | ''Tabela 1: Biološki deli, ki jih je skupina pripravila med projektom. <br /> |-<br /> | '''KODA''' || '''IME S BIOLOŠKEGA DELA'''<br /> |-<br /> | [http://parts.igem.org/wiki/index.php?title=Part:BBa_K3697000 BBa_K3697000] || mCherry BSU<br /> |-<br /> | [http://parts.igem.org/wiki/index.php?title=Part:BBa_K3697008 BBa_K3697008] || YFP CDS<br /> |-<br /> | [http://parts.igem.org/wiki/index.php?title=Part:BBa_K3697010 BBa_K3697010]|| mCherry_BSU Plasmid<br /> |-<br /> | [http://parts.igem.org/wiki/index.php?title=Part:BBa_K3697009 BBa_K3697009 ] || pVEG YFP Plasmid for ''B. subtilis''<br /> |-<br /> | [http://parts.igem.org/wiki/index.php?title=Part:BBa_K3697002 BBa_K3697002] || ManP Expression Casette<br /> |-<br /> | [http://parts.igem.org/wiki/index.php?title=Part:BBa_K3697003 BBa_K3697003] || Homology Arms for KanR Integration In ''B. subtilis''<br /> |-<br /> | [http://parts.igem.org/wiki/index.php?title=Part:BBa_K3697004 BBa_K3697004] || Recombination-Based Detection System for B. subtilis (ManP)<br /> |-<br /> | [http://parts.igem.org/wiki/index.php?title=Part:BBa_K3697011 BBa_K3697011]|| Toehold for Detection of KanR in ''B. subtilis''<br /> |-<br /> | [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3697012 BBa_K3697012] || Signal Amplifier Using ''B. subtilis'' Quorum Sensing Molecule comX<br /> |}<br /> <br /> <br /> <br /> = '''Zaključek''' =<br /> Ideja projekta SEED se lahko uporabi za različne aplikacije, vendar pa se je skupina osredotočila na virusno diagnostiko. Gre za ne invaziven test, kjer lahko dobimo rezultate iz sline. Skupina je pokazala predvsem proof of concept, vendar pa bi se pred uporabo takega testa v komercialne namene moralo narediti še klinična testiranja. <br /> Seed pa bi bilo možno uporabljati tudi za druge namene. V zdravstvu bi ga lahko uporabljali tudi za testiranje drugih virusov (predvsem DNA). Možna pa je tudi uporaba v agronomiji in pri testiranju vode in hrane. <br /> <br /> = '''Viri''' =<br /> *[1] Team: “Stanfors - 2020.igem.org.” https://2020.igem.org/Team:Stanford (accessed May 09, 2021)<br /> *[2] Maier, B., Chen, I., Dubnau, D., &amp; Sheetz, M. P. (2004). DNA transport into Bacillus subtilis requires proton motive force to generate large molecular forces. Nature structural &amp; molecular biology, 11(7), 643–649. https://doi.org/10.1038/nsmb783<br /> *[3] Hamoen, L., Venema, G., &amp; Kuipers, O. (2003). Controlling competence in Bacillus subtilis: Shared use of regulators. Microbiology. 149:9-17. Retrieved May 15, 2014, from http://gbb.eldoc.ub.rug.nl/FILES/root/2003/MicrobiolHamoen/2003MicrobiolHamoen.pdf<br /> *[4] Hong, F., Ma, D., Wu, K., Mina, L.A., Luiten, R.C., Liu, Y., Yan, H., Green, A.A. 57214766484;57189763666;57215219536;14037633900;57206179773;57216667908;7403395897;55328809600; Precise and Programmable Detection of Mutations Using Ultraspecific Riboregulators (2020) Cell, 180 (5), pp. 1018-1032.e16.</div>

Irma Zeljković https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Samoreplicirajo%C4%8D_COVID-19_test&diff=18980 2021-05-11T19:56:32Z

<p>Irma Zeljković: /* Vnos nukleinske kisline iz okolja */</p> <hr /> <div>SEED-samoreplicirajoč COVID-19-test je iGEM-projekt iz leta 2020. Avtorji projekta so podiplomski študenti univerze v Stanfordu v Kaliforniji<br /> <br /> Spletna stran projekta: [https://2020.igem.org/Team:Stanford]<br /> <br /> Avtorica povzetka: Irma Zeljković<br /> <br /> = '''Uvod''' =<br /> Skupina je začela razmišljati o projektu sredi pandemije COVID-19. Ena od glavnih težav je bila takrat pomanjkanje možnosti testiranja, s katero bi lahko lažje spremljali in izolirali primere. Dve glavni pomanjkljivosti takratnih testov, sta bili potreba po izobraženem kadru in dragi reagenti. Skupina je imela idejo, da bi ustvarili test, ki bi lahko repliciral samega sebe in ne bi potreboval usposobljenega kadra in laboratorijske opreme. [1]<br /> <br /> = '''Opis projekta'''=<br /> Sistem, ki so si ga zamislili sestoji iz treh korakov:<br /> * Vnos nukleinske kisline v bakterijsko celico<br /> * Intracelularna detekcija (RNA toehold ali homologna rekombinacija)<br /> * Intracelularno signaliziranje (prek quorum sensing poti)<br /> Rezultati so hitri in kolorimetrični. [1]<br /> == '''Vnos nukleinske kisline iz okolja''' ==<br /> Odločili so se za delo z bakterijo ''Bacillus Subtilis'', saj gre za naravno kompetentno bakterijo, ki je prepoznana kot GRAS. Kompetentna ''B. subtilis'' izraža specializirane proteine, ki so vstavljeni v kompleks za transport DNA prek membrane. ComEA veže nase DNA. Nato na DNA deluje protein ComG, ki pomaga pri prenosu skozi bakterijsko steno. Ob prehodu nanjo delujejo endonukleaze in DNA se cepi na fragmente. Prehod skozi citoplazemsko membrano pa omogoča protein ComEC, ki pa znotraj membrane tvori proteinsko poro in omogoča prehod le enoverižni DNA. Ko je DNA transportirana v celico jo B. subtilis integrira v kromosom. [2]<br /> Naravna kompetenca ''B. subtilis'' je posledica pomanjkanja hranil v okolju. Regulacija kompetence je zelo zapletena, ključna proteina sta ComK in ComX. ComK je transkripcijski faktor, ki se izrazi po končani eksponentni fazi rasti. Njegova ekspresija je stimulirana s feromonom ComX, ki ga izločajo druge celice s pomočjo poti quorum-sensinga zaradi povečane gostote celic. <br /> Skupina se je odločila za uporabo sevov, ki imajo možnost inducibilne superkompetentnosti. [3]<br /> <br /> Za detekciji s t.i. RNA-toehold stikali jo so uporabili sev SCK6. V tem sevu je gen ComK pod kontrolo ksiloznega inducibilnega promotorja PxylA. Dodatek ksiloze v kulturo B. subtilisa povzroči ekspresijo DNA transportnih proteinov in začne kompetentnost. <br /> Za sistem, ki je temeljil na rekombinaciji so uporabili sev REG19. Pri tem sevu je ComK pod kontrolo manitolnega inducibilnega promotorja PmtIA, skupaj z genom za kompetenco ComS. Dodatek manitola v gojišče začne kompetentnost bakterij. [1]<br /> <br /> == '''Detekcija tarčne sekvence v celici''' ==<br /> Ko je DNA v celici, je naslednji korak intracelularna detekcija. Skupina je poskusila 2 možna pristopa in sicer RNA-toehold stikala integracijo okoljske DNA v genom ''B.subtilis'' s homologno rekombinacijo. [1]<br /> <br /> === Detekcijska metoda 1: RNA toehold stikala===<br /> RNA-toehold stikala so preprosti detektorji, ki jih proizvaja celica in jih lahko uporabljamo ''in vivo'' in ''in vitro''. Gre za enoverižno RNA, katere struktura se tako zvije, da tvori zanko. Takšna RNA je sestavljena iz 5 delov: sprožilca, RBS, začetnega kodona, linkerja in reporterja.<br /> V normalnih razmerah, ko RNA veriga tvori zanko, sta RBS in začetni kodon blokirana in ne more priti do translacije RNA. Ko pa tarčna sekvenca pride v bližino verige RNA, se komplementarno veže na sprožilec in povzroči, da se zanka razvije. To povzroči, da je RBS-mesto izpostavljeno in ribosomi se lahko vežejo na to RNA. <br /> Prednosti tega sistema so, da z lahkoto lahko zamenjamo različne sekvence, da je visoko specifičen, lahko zazna več tarč v eni celici in ga lahko proizvajamo in vivo. <br /> Skupina je naredila toeholde, ki se integrirajo na plazmid pVeg YFP. Sprožilec je komplementaren genu KanR, ki ga je skupina izbrala kot tarčno sekvenco. Za RBS so uporabili sekvenco, ki je v ''B. subtilis'' specifična za vezanje ribosomov. Kot reporter pa so uporabili YFP, saj hitro difuzira in je rumene barve. [4]<br /> <br /> === Detekcijska metoda 2: Homologna rekombinacija===<br /> Drug način detekcije RNA je rekombinacijski sistem ''B. subtilis'', kjer poteče integracija DNA v kromosom s homologno rekombinacijo. Najprej so transformirali plazmid z negativnim selekcijskim markerjem, ki ga obkrožajo homologne regije tarčne sekvence. Ko celica prevzame sekvenco, se začne proces rekombinacije, ki povzroči, da se gen za negativno selekcijo izreže in ga nadomesti tarčna sekvenca. Če ne pride do prevzema DNA, tudi do rekombinacije ne pride in negativen selekcijski marker ostane v celici. Ta pa vodi v smrt celice ob prisotnosti manoze. [1]<br /> <br /> Skupina je zbrala ManP za negativni selekcijski marker. ManP deluje, tako da fosforilira manozo, ko vstopa v celico in tako onemogoča njen izstop iz celice. Sev REG19 ima izbit gen ManA, ki bi manozo spremenila v fruktozo, zato se fosforilirana manoza nabira v celici. <br /> <br /> Prisotnost tarče sekvence povzroči homologno rekombinacijo, saj je skupina svoj sev ''B. subtilis'' načrtovala z dvema regijama homologije tarčnih sekvenc, ki so vključene v genom na obeh straneh kasete ManP. <br /> Prednosti rekombinantnega sistema so, da se ta proces že naravno odvija v ''B. subtilis''. Slabosti pa so specifičnost (lahko pride do več lažno pozitivnih testov), občutljivost (sistem ne zazna tarčnih sekvenc, če jih je premalo) in ima omejeno hitrost. [1]<br /> <br /> == '''Ojačevanje signala za hitreje branje''' ==<br /> Naslednja faza je ojačevanjevidnega signala, ki so ga dobili z enim izmed sistemov. To fazo so le opisali, niso pa je preizkusili v laboratoriju zaradi težav s časom. <br /> Ojačevanje signala je pomembna, saj omogoča merljive rezultate v celi bakterijski koloniji tudi ob prisotnosti zelo malo nukleinske kisline. V ta namen so se odločili, da bojo uporabili quorum sensing. <br /> Ko kultura B. subtilisa doseže kritično gostoto, se aktivirajo quorum sensing molekule. Takšna molekula je na primer ComX, ki aktivira pot za aktivacijo promotorja PsrfA. Posledica tega je, da nastane bakterijski biofilm. <br /> Nova pot, ki jo je skupina naredila, vključuje pozitivno povratno zanko ComX in povzroči, da celice tvorijo fluorescentne proteine (namesto biofilma). To so storili, tako da so prvo izbili endogen ComX, in ga nadomestili s ComX, ki je bil pod kontrolo promotorja srf-A, PsrfA. Pod tem promotorjem bi bili tudi luxABCDE, ki so bioluminiscentni reporterji, ki si jih je skupina izbrala. Želeli so torej doseči, da bi izražanje Comx molekul aktiviralo PsrfA gene, ki bi proizvedli še več ComX in luxABCDE.<br /> Ojačevanje signala so morali združiti z mehanizmoma za zaznavanje DNA. Pri toehold stikalu bi razvitje zanke povzročilo translacijo ComX. Pri homologni rekombinaciji pa bi le-ta omogočila transkripcijo ComX.[1]<br /> <br /> = '''Uporabljeni biološki deli'''=<br /> <br /> Skupina je poskusila razviti 8 bioloških delov, ki jih lahko razdelimo v tri skupine: reporterji, detektorji, ki temeljijo na rekombinaciji in toehold. Nato pa so konstruirali še napravo za ojačitev signala, ki je niso mogli preizkusiti v laboratoriju. <br /> Prispevek skupine je bil torej devet biokock, saj so mnoge biokocke v registru kompatibilne, vendar ne optimizirane za delo z bakterijo ''B. subtilis''. <br /> <br /> <br /> V tabeli 1 so prikazani vsi biološki deli, ki so jih pripravili med projektom.<br /> <br /> <br /> {|<br /> |+ style=&quot;text-align: left;&quot; | ''Tabela 1: Biološki deli, ki jih je skupina pripravila med projektom. <br /> |-<br /> | '''KODA''' || '''IME S BIOLOŠKEGA DELA'''<br /> |-<br /> | [http://parts.igem.org/wiki/index.php?title=Part:BBa_K3697000 BBa_K3697000] || mCherry BSU<br /> |-<br /> | [http://parts.igem.org/wiki/index.php?title=Part:BBa_K3697008 BBa_K3697008] || YFP CDS<br /> |-<br /> | [http://parts.igem.org/wiki/index.php?title=Part:BBa_K3697010 BBa_K3697010]|| mCherry_BSU Plasmid<br /> |-<br /> | [http://parts.igem.org/wiki/index.php?title=Part:BBa_K3697009 BBa_K3697009 ] || pVEG YFP Plasmid for ''B. subtilis''<br /> |-<br /> | [http://parts.igem.org/wiki/index.php?title=Part:BBa_K3697002 BBa_K3697002] || ManP Expression Casette<br /> |-<br /> | [http://parts.igem.org/wiki/index.php?title=Part:BBa_K3697003 BBa_K3697003] || Homology Arms for KanR Integration In ''B. subtilis''<br /> |-<br /> | [http://parts.igem.org/wiki/index.php?title=Part:BBa_K3697004 BBa_K3697004] || Recombination-Based Detection System for B. subtilis (ManP)<br /> |-<br /> | [http://parts.igem.org/wiki/index.php?title=Part:BBa_K3697011 BBa_K3697011]|| Toehold for Detection of KanR in ''B. subtilis''<br /> |-<br /> | [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3697012 BBa_K3697012] || Signal Amplifier Using ''B. subtilis'' Quorum Sensing Molecule comX<br /> |}<br /> <br /> <br /> <br /> = '''Zaključek''' =<br /> Ideja projekta SEED se lahko uporabi za različne aplikacije, vendar pa se je skupina osredotočila na virusno diagnostiko. Gre za ne invaziven test, kjer lahko dobimo rezultate iz sline. Skupina je pokazala predvsem proof of concept, vendar pa bi se pred uporabo takega testa v komercialne namene moralo narediti še klinična testiranja. <br /> Seed pa bi bilo možno uporabljati tudi za druge namene. V zdravstvu bi ga lahko uporabljali tudi za testiranje drugih virusov (predvsem DNA). Možna pa je tudi uporaba v agronomiji in pri testiranju vode in hrane. <br /> <br /> = '''Viri''' =<br /> *[1] Team: “Stanfors - 2020.igem.org.” https://2020.igem.org/Team:Stanford (accessed May 09, 2021)<br /> *[2] Maier, B., Chen, I., Dubnau, D., &amp; Sheetz, M. P. (2004). DNA transport into Bacillus subtilis requires proton motive force to generate large molecular forces. Nature structural &amp; molecular biology, 11(7), 643–649. https://doi.org/10.1038/nsmb783<br /> *[3] Hamoen, L., Venema, G., &amp; Kuipers, O. (2003). Controlling competence in Bacillus subtilis: Shared use of regulators. Microbiology. 149:9-17. Retrieved May 15, 2014, from http://gbb.eldoc.ub.rug.nl/FILES/root/2003/MicrobiolHamoen/2003MicrobiolHamoen.pdf<br /> *[4] Hong, F., Ma, D., Wu, K., Mina, L.A., Luiten, R.C., Liu, Y., Yan, H., Green, A.A. 57214766484;57189763666;57215219536;14037633900;57206179773;57216667908;7403395897;55328809600; Precise and Programmable Detection of Mutations Using Ultraspecific Riboregulators (2020) Cell, 180 (5), pp. 1018-1032.e16.</div>

Irma Zeljković https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Samoreplicirajo%C4%8D_COVID-19_test&diff=18973 2021-05-11T17:59:56Z

<p>Irma Zeljković: /* Uvod */</p> <hr /> <div>SEED-samoreplicirajoč COVID-19-test je iGEM-projekt iz leta 2020. Avtorji projekta so podiplomski študenti univerze v Stanfordu v Kaliforniji<br /> <br /> Spletna stran projekta: [https://2020.igem.org/Team:Stanford]<br /> <br /> Avtorica povzetka: Irma Zeljković<br /> <br /> = '''Uvod''' =<br /> Skupina je začela razmišljati o projektu sredi pandemije COVID-19. Ena od glavnih težav je bila takrat pomanjkanje možnosti testiranja, s katero bi lahko lažje spremljali in izolirali primere. Dve glavni pomanjkljivosti takratnih testov, sta bili potreba po izobraženem kadru in dragi reagenti. Skupina je imela idejo, da bi ustvarili test, ki bi lahko repliciral samega sebe in ne bi potreboval usposobljenega kadra in laboratorijske opreme. [1]<br /> <br /> = '''Opis projekta'''=<br /> Sistem, ki so si ga zamislili sestoji iz treh korakov:<br /> * Vnos nukleinske kisline v bakterijsko celico<br /> * Intracelularna detekcija (RNA toehold ali homologna rekombinacija)<br /> * Intracelularno signaliziranje (prek quorum sensing poti)<br /> Rezultati so hitri in kolorimetrični. [1]<br /> == '''Vnos nukleinske kisline iz okolja''' ==<br /> Odločili so se za delo z bakterijo ''Bacillus Subtilis'', saj gre za naravno kompetentno bakterijo, ki je prepoznana kot GRAS. Kompetentna ''B. subtilis'' izraža specializirane proteine, ki so vstavljeni v kompleks za transport DNA prek membrane. ComEA veže nase DNA. Nato na DNA deluje protein ComG, ki pomaga pri prenosu skozi bakterijsko steno. Ob prehodu nanjo delujejo endonukleaze in DNA se cepi na fragmente. Prehod skozi citoplazemsko membrano pa omogoča protein ComEC, ki pa znotraj membrane tvori proteinsko poro in omogoča prehod le enoverižni DNA. Ko je DNA transportirana v celico jo B. subtilis integrira v kromosom. [2]<br /> Naravna kompetenca ''B. subtilis'' je posledica pomanjkanja hranil v okolju. Regulacija kompetence je zelo zapletena, ključna proteina sta ComK in ComX. ComK je transkripcijski faktor, ki se izrazi po končani eksponentni fazi rasti. Njegova ekspresija je stimulirana s feromonom ComX, ki ga izločajo druge celice s pomočjo poti quorum-sensinga zaradi povečane gostote celic. <br /> Skupina se je odločila za uporabo sevov, ki imajo možnost inducibilne superkompetentnosti. [3]<br /> <br /> Za detekciji s t.i. RNA-toehold stikali jo so uporabili sev SCK6. V tem sevu je gen ComK pod kontrolo ksiloznega inducibilnega promotorja PxylA. Dodatek ksiloze v kulturo B. subtilisa povzroči ekspresijo DNA transportnih proteinov in začne kompetentnost. <br /> Za sistem, ki je temeljil na rekombinaciji so uporabili sev REG19. Pri tem sevu je ComK pod kontrolo manitolnega inducibilnega promotorja PmtIA, skupaj z genom za kompetenco ComS. Dodatek manitola v gojišče ' začne kompetentnost bakterij. [1]<br /> == '''Detekcija tarčne sekvence v celici''' ==<br /> Ko je DNA v celici, je naslednji korak intracelularna detekcija. Skupina je poskusila 2 možna pristopa in sicer RNA-toehold stikala integracijo okoljske DNA v genom ''B.subtilis'' s homologno rekombinacijo. [1]<br /> <br /> === Detekcijska metoda 1: RNA toehold stikala===<br /> RNA-toehold stikala so preprosti detektorji, ki jih proizvaja celica in jih lahko uporabljamo ''in vivo'' in ''in vitro''. Gre za enoverižno RNA, katere struktura se tako zvije, da tvori zanko. Takšna RNA je sestavljena iz 5 delov: sprožilca, RBS, začetnega kodona, linkerja in reporterja.<br /> V normalnih razmerah, ko RNA veriga tvori zanko, sta RBS in začetni kodon blokirana in ne more priti do translacije RNA. Ko pa tarčna sekvenca pride v bližino verige RNA, se komplementarno veže na sprožilec in povzroči, da se zanka razvije. To povzroči, da je RBS-mesto izpostavljeno in ribosomi se lahko vežejo na to RNA. <br /> Prednosti tega sistema so, da z lahkoto lahko zamenjamo različne sekvence, da je visoko specifičen, lahko zazna več tarč v eni celici in ga lahko proizvajamo in vivo. <br /> Skupina je naredila toeholde, ki se integrirajo na plazmid pVeg YFP. Sprožilec je komplementaren genu KanR, ki ga je skupina izbrala kot tarčno sekvenco. Za RBS so uporabili sekvenco, ki je v ''B. subtilis'' specifična za vezanje ribosomov. Kot reporter pa so uporabili YFP, saj hitro difuzira in je rumene barve. [4]<br /> <br /> === Detekcijska metoda 2: Homologna rekombinacija===<br /> Drug način detekcije RNA je rekombinacijski sistem ''B. subtilis'', kjer poteče integracija DNA v kromosom s homologno rekombinacijo. Najprej so transformirali plazmid z negativnim selekcijskim markerjem, ki ga obkrožajo homologne regije tarčne sekvence. Ko celica prevzame sekvenco, se začne proces rekombinacije, ki povzroči, da se gen za negativno selekcijo izreže in ga nadomesti tarčna sekvenca. Če ne pride do prevzema DNA, tudi do rekombinacije ne pride in negativen selekcijski marker ostane v celici. Ta pa vodi v smrt celice ob prisotnosti manoze. [1]<br /> <br /> Skupina je zbrala ManP za negativni selekcijski marker. ManP deluje, tako da fosforilira manozo, ko vstopa v celico in tako onemogoča njen izstop iz celice. Sev REG19 ima izbit gen ManA, ki bi manozo spremenila v fruktozo, zato se fosforilirana manoza nabira v celici. <br /> <br /> Prisotnost tarče sekvence povzroči homologno rekombinacijo, saj je skupina svoj sev ''B. subtilis'' načrtovala z dvema regijama homologije tarčnih sekvenc, ki so vključene v genom na obeh straneh kasete ManP. <br /> Prednosti rekombinantnega sistema so, da se ta proces že naravno odvija v ''B. subtilis''. Slabosti pa so specifičnost (lahko pride do več lažno pozitivnih testov), občutljivost (sistem ne zazna tarčnih sekvenc, če jih je premalo) in ima omejeno hitrost. [1]<br /> <br /> == '''Ojačevanje signala za hitreje branje''' ==<br /> Naslednja faza je ojačevanjevidnega signala, ki so ga dobili z enim izmed sistemov. To fazo so le opisali, niso pa je preizkusili v laboratoriju zaradi težav s časom. <br /> Ojačevanje signala je pomembna, saj omogoča merljive rezultate v celi bakterijski koloniji tudi ob prisotnosti zelo malo nukleinske kisline. V ta namen so se odločili, da bojo uporabili quorum sensing. <br /> Ko kultura B. subtilisa doseže kritično gostoto, se aktivirajo quorum sensing molekule. Takšna molekula je na primer ComX, ki aktivira pot za aktivacijo promotorja PsrfA. Posledica tega je, da nastane bakterijski biofilm. <br /> Nova pot, ki jo je skupina naredila, vključuje pozitivno povratno zanko ComX in povzroči, da celice tvorijo fluorescentne proteine (namesto biofilma). To so storili, tako da so prvo izbili endogen ComX, in ga nadomestili s ComX, ki je bil pod kontrolo promotorja srf-A, PsrfA. Pod tem promotorjem bi bili tudi luxABCDE, ki so bioluminiscentni reporterji, ki si jih je skupina izbrala. Želeli so torej doseči, da bi izražanje Comx molekul aktiviralo PsrfA gene, ki bi proizvedli še več ComX in luxABCDE.<br /> Ojačevanje signala so morali združiti z mehanizmoma za zaznavanje DNA. Pri toehold stikalu bi razvitje zanke povzročilo translacijo ComX. Pri homologni rekombinaciji pa bi le-ta omogočila transkripcijo ComX.[1]<br /> <br /> = '''Uporabljeni biološki deli'''=<br /> <br /> Skupina je poskusila razviti 8 bioloških delov, ki jih lahko razdelimo v tri skupine: reporterji, detektorji, ki temeljijo na rekombinaciji in toehold. Nato pa so konstruirali še napravo za ojačitev signala, ki je niso mogli preizkusiti v laboratoriju. <br /> Prispevek skupine je bil torej devet biokock, saj so mnoge biokocke v registru kompatibilne, vendar ne optimizirane za delo z bakterijo ''B. subtilis''. <br /> <br /> <br /> V tabeli 1 so prikazani vsi biološki deli, ki so jih pripravili med projektom.<br /> <br /> <br /> {|<br /> |+ style=&quot;text-align: left;&quot; | ''Tabela 1: Biološki deli, ki jih je skupina pripravila med projektom. <br /> |-<br /> | '''KODA''' || '''IME S BIOLOŠKEGA DELA'''<br /> |-<br /> | [http://parts.igem.org/wiki/index.php?title=Part:BBa_K3697000 BBa_K3697000] || mCherry BSU<br /> |-<br /> | [http://parts.igem.org/wiki/index.php?title=Part:BBa_K3697008 BBa_K3697008] || YFP CDS<br /> |-<br /> | [http://parts.igem.org/wiki/index.php?title=Part:BBa_K3697010 BBa_K3697010]|| mCherry_BSU Plasmid<br /> |-<br /> | [http://parts.igem.org/wiki/index.php?title=Part:BBa_K3697009 BBa_K3697009 ] || pVEG YFP Plasmid for ''B. subtilis''<br /> |-<br /> | [http://parts.igem.org/wiki/index.php?title=Part:BBa_K3697002 BBa_K3697002] || ManP Expression Casette<br /> |-<br /> | [http://parts.igem.org/wiki/index.php?title=Part:BBa_K3697003 BBa_K3697003] || Homology Arms for KanR Integration In ''B. subtilis''<br /> |-<br /> | [http://parts.igem.org/wiki/index.php?title=Part:BBa_K3697004 BBa_K3697004] || Recombination-Based Detection System for B. subtilis (ManP)<br /> |-<br /> | [http://parts.igem.org/wiki/index.php?title=Part:BBa_K3697011 BBa_K3697011]|| Toehold for Detection of KanR in ''B. subtilis''<br /> |-<br /> | [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3697012 BBa_K3697012] || Signal Amplifier Using ''B. subtilis'' Quorum Sensing Molecule comX<br /> |}<br /> <br /> <br /> <br /> = '''Zaključek''' =<br /> Ideja projekta SEED se lahko uporabi za različne aplikacije, vendar pa se je skupina osredotočila na virusno diagnostiko. Gre za ne invaziven test, kjer lahko dobimo rezultate iz sline. Skupina je pokazala predvsem proof of concept, vendar pa bi se pred uporabo takega testa v komercialne namene moralo narediti še klinična testiranja. <br /> Seed pa bi bilo možno uporabljati tudi za druge namene. V zdravstvu bi ga lahko uporabljali tudi za testiranje drugih virusov (predvsem DNA). Možna pa je tudi uporaba v agronomiji in pri testiranju vode in hrane. <br /> <br /> = '''Viri''' =<br /> *[1] Team: “Stanfors - 2020.igem.org.” https://2020.igem.org/Team:Stanford (accessed May 09, 2021)<br /> *[2] Maier, B., Chen, I., Dubnau, D., &amp; Sheetz, M. P. (2004). DNA transport into Bacillus subtilis requires proton motive force to generate large molecular forces. Nature structural &amp; molecular biology, 11(7), 643–649. https://doi.org/10.1038/nsmb783<br /> *[3] Hamoen, L., Venema, G., &amp; Kuipers, O. (2003). Controlling competence in Bacillus subtilis: Shared use of regulators. Microbiology. 149:9-17. Retrieved May 15, 2014, from http://gbb.eldoc.ub.rug.nl/FILES/root/2003/MicrobiolHamoen/2003MicrobiolHamoen.pdf<br /> *[4] Hong, F., Ma, D., Wu, K., Mina, L.A., Luiten, R.C., Liu, Y., Yan, H., Green, A.A. 57214766484;57189763666;57215219536;14037633900;57206179773;57216667908;7403395897;55328809600; Precise and Programmable Detection of Mutations Using Ultraspecific Riboregulators (2020) Cell, 180 (5), pp. 1018-1032.e16.</div>

Irma Zeljković https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Samoreplicirajo%C4%8D_COVID-19_test&diff=18970 2021-05-11T17:35:11Z

<p>Irma Zeljković: /* Uvod */</p> <hr /> <div>SEED-samoreplicirajoč COVID-19-test je iGEM-projekt iz leta 2020. Avtorji projekta so podiplomski študenti univerze v Stanfordu v Kaliforniji<br /> <br /> Spletna stran projekta: [https://2020.igem.org/Team:Stanford]<br /> <br /> Avtorica povzetka: Irma Zeljković<br /> <br /> = '''Uvod''' =<br /> Skupina je začela razmišljati o projektu sredi pandemije COVID-19. Ena od glavnih težav je bila takrat pomanjkanje možnosti testiranja, s katero bi lahko lažje spremljali in izolirali primere. Dve glavni pomankljivosti takratnih testov, sta bili potreba po izobraženem kadru in dragi reagenti. Skupina je imela idejo, da bi ustvarili test, ki bi lahko repliciral samega sebe in ne bi potreboval usposobljenega kadra in laboratorijske opreme. [1]<br /> <br /> = '''Opis projekta'''=<br /> Sistem, ki so si ga zamislili sestoji iz treh korakov:<br /> * Vnos nukleinske kisline v bakterijsko celico<br /> * Intracelularna detekcija (RNA toehold ali homologna rekombinacija)<br /> * Intracelularno signaliziranje (prek quorum sensing poti)<br /> Rezultati so hitri in kolorimetrični. [1]<br /> == '''Vnos nukleinske kisline iz okolja''' ==<br /> Odločili so se za delo z bakterijo ''Bacillus Subtilis'', saj gre za naravno kompetentno bakterijo, ki je prepoznana kot GRAS. Kompetentna ''B. subtilis'' izraža specializirane proteine, ki so vstavljeni v kompleks za transport DNA prek membrane. ComEA veže nase DNA. Nato na DNA deluje protein ComG, ki pomaga pri prenosu skozi bakterijsko steno. Ob prehodu nanjo delujejo endonukleaze in DNA se cepi na fragmente. Prehod skozi citoplazemsko membrano pa omogoča protein ComEC, ki pa znotraj membrane tvori proteinsko poro in omogoča prehod le enoverižni DNA. Ko je DNA transportirana v celico jo B. subtilis integrira v kromosom. [2]<br /> Naravna kompetenca ''B. subtilis'' je posledica pomanjkanja hranil v okolju. Regulacija kompetence je zelo zapletena, ključna proteina sta ComK in ComX. ComK je transkripcijski faktor, ki se izrazi po končani eksponentni fazi rasti. Njegova ekspresija je stimulirana s feromonom ComX, ki ga izločajo druge celice s pomočjo poti quorum-sensinga zaradi povečane gostote celic. <br /> Skupina se je odločila za uporabo sevov, ki imajo možnost inducibilne superkompetentnosti. [3]<br /> <br /> Za detekciji s t.i. RNA-toehold stikali jo so uporabili sev SCK6. V tem sevu je gen ComK pod kontrolo ksiloznega inducibilnega promotorja PxylA. Dodatek ksiloze v kulturo B. subtilisa povzroči ekspresijo DNA transportnih proteinov in začne kompetentnost. <br /> Za sistem, ki je temeljil na rekombinaciji so uporabili sev REG19. Pri tem sevu je ComK pod kontrolo manitolnega inducibilnega promotorja PmtIA, skupaj z genom za kompetenco ComS. Dodatek manitola v gojišče ' začne kompetentnost bakterij. [1]<br /> == '''Detekcija tarčne sekvence v celici''' ==<br /> Ko je DNA v celici, je naslednji korak intracelularna detekcija. Skupina je poskusila 2 možna pristopa in sicer RNA-toehold stikala integracijo okoljske DNA v genom ''B.subtilis'' s homologno rekombinacijo. [1]<br /> <br /> === Detekcijska metoda 1: RNA toehold stikala===<br /> RNA-toehold stikala so preprosti detektorji, ki jih proizvaja celica in jih lahko uporabljamo ''in vivo'' in ''in vitro''. Gre za enoverižno RNA, katere struktura se tako zvije, da tvori zanko. Takšna RNA je sestavljena iz 5 delov: sprožilca, RBS, začetnega kodona, linkerja in reporterja.<br /> V normalnih razmerah, ko RNA veriga tvori zanko, sta RBS in začetni kodon blokirana in ne more priti do translacije RNA. Ko pa tarčna sekvenca pride v bližino verige RNA, se komplementarno veže na sprožilec in povzroči, da se zanka razvije. To povzroči, da je RBS-mesto izpostavljeno in ribosomi se lahko vežejo na to RNA. <br /> Prednosti tega sistema so, da z lahkoto lahko zamenjamo različne sekvence, da je visoko specifičen, lahko zazna več tarč v eni celici in ga lahko proizvajamo in vivo. <br /> Skupina je naredila toeholde, ki se integrirajo na plazmid pVeg YFP. Sprožilec je komplementaren genu KanR, ki ga je skupina izbrala kot tarčno sekvenco. Za RBS so uporabili sekvenco, ki je v ''B. subtilis'' specifična za vezanje ribosomov. Kot reporter pa so uporabili YFP, saj hitro difuzira in je rumene barve. [4]<br /> <br /> === Detekcijska metoda 2: Homologna rekombinacija===<br /> Drug način detekcije RNA je rekombinacijski sistem ''B. subtilis'', kjer poteče integracija DNA v kromosom s homologno rekombinacijo. Najprej so transformirali plazmid z negativnim selekcijskim markerjem, ki ga obkrožajo homologne regije tarčne sekvence. Ko celica prevzame sekvenco, se začne proces rekombinacije, ki povzroči, da se gen za negativno selekcijo izreže in ga nadomesti tarčna sekvenca. Če ne pride do prevzema DNA, tudi do rekombinacije ne pride in negativen selekcijski marker ostane v celici. Ta pa vodi v smrt celice ob prisotnosti manoze. [1]<br /> <br /> Skupina je zbrala ManP za negativni selekcijski marker. ManP deluje, tako da fosforilira manozo, ko vstopa v celico in tako onemogoča njen izstop iz celice. Sev REG19 ima izbit gen ManA, ki bi manozo spremenila v fruktozo, zato se fosforilirana manoza nabira v celici. <br /> <br /> Prisotnost tarče sekvence povzroči homologno rekombinacijo, saj je skupina svoj sev ''B. subtilis'' načrtovala z dvema regijama homologije tarčnih sekvenc, ki so vključene v genom na obeh straneh kasete ManP. <br /> Prednosti rekombinantnega sistema so, da se ta proces že naravno odvija v ''B. subtilis''. Slabosti pa so specifičnost (lahko pride do več lažno pozitivnih testov), občutljivost (sistem ne zazna tarčnih sekvenc, če jih je premalo) in ima omejeno hitrost. [1]<br /> <br /> == '''Ojačevanje signala za hitreje branje''' ==<br /> Naslednja faza je ojačevanjevidnega signala, ki so ga dobili z enim izmed sistemov. To fazo so le opisali, niso pa je preizkusili v laboratoriju zaradi težav s časom. <br /> Ojačevanje signala je pomembna, saj omogoča merljive rezultate v celi bakterijski koloniji tudi ob prisotnosti zelo malo nukleinske kisline. V ta namen so se odločili, da bojo uporabili quorum sensing. <br /> Ko kultura B. subtilisa doseže kritično gostoto, se aktivirajo quorum sensing molekule. Takšna molekula je na primer ComX, ki aktivira pot za aktivacijo promotorja PsrfA. Posledica tega je, da nastane bakterijski biofilm. <br /> Nova pot, ki jo je skupina naredila, vključuje pozitivno povratno zanko ComX in povzroči, da celice tvorijo fluorescentne proteine (namesto biofilma). To so storili, tako da so prvo izbili endogen ComX, in ga nadomestili s ComX, ki je bil pod kontrolo promotorja srf-A, PsrfA. Pod tem promotorjem bi bili tudi luxABCDE, ki so bioluminiscentni reporterji, ki si jih je skupina izbrala. Želeli so torej doseči, da bi izražanje Comx molekul aktiviralo PsrfA gene, ki bi proizvedli še več ComX in luxABCDE.<br /> Ojačevanje signala so morali združiti z mehanizmoma za zaznavanje DNA. Pri toehold stikalu bi razvitje zanke povzročilo translacijo ComX. Pri homologni rekombinaciji pa bi le-ta omogočila transkripcijo ComX.[1]<br /> <br /> = '''Uporabljeni biološki deli'''=<br /> <br /> Skupina je poskusila razviti 8 bioloških delov, ki jih lahko razdelimo v tri skupine: reporterji, detektorji, ki temeljijo na rekombinaciji in toehold. Nato pa so konstruirali še napravo za ojačitev signala, ki je niso mogli preizkusiti v laboratoriju. <br /> Prispevek skupine je bil torej devet biokock, saj so mnoge biokocke v registru kompatibilne, vendar ne optimizirane za delo z bakterijo ''B. subtilis''. <br /> <br /> <br /> V tabeli 1 so prikazani vsi biološki deli, ki so jih pripravili med projektom.<br /> <br /> <br /> {|<br /> |+ style=&quot;text-align: left;&quot; | ''Tabela 1: Biološki deli, ki jih je skupina pripravila med projektom. <br /> |-<br /> | '''KODA''' || '''IME S BIOLOŠKEGA DELA'''<br /> |-<br /> | [http://parts.igem.org/wiki/index.php?title=Part:BBa_K3697000 BBa_K3697000] || mCherry BSU<br /> |-<br /> | [http://parts.igem.org/wiki/index.php?title=Part:BBa_K3697008 BBa_K3697008] || YFP CDS<br /> |-<br /> | [http://parts.igem.org/wiki/index.php?title=Part:BBa_K3697010 BBa_K3697010]|| mCherry_BSU Plasmid<br /> |-<br /> | [http://parts.igem.org/wiki/index.php?title=Part:BBa_K3697009 BBa_K3697009 ] || pVEG YFP Plasmid for ''B. subtilis''<br /> |-<br /> | [http://parts.igem.org/wiki/index.php?title=Part:BBa_K3697002 BBa_K3697002] || ManP Expression Casette<br /> |-<br /> | [http://parts.igem.org/wiki/index.php?title=Part:BBa_K3697003 BBa_K3697003] || Homology Arms for KanR Integration In ''B. subtilis''<br /> |-<br /> | [http://parts.igem.org/wiki/index.php?title=Part:BBa_K3697004 BBa_K3697004] || Recombination-Based Detection System for B. subtilis (ManP)<br /> |-<br /> | [http://parts.igem.org/wiki/index.php?title=Part:BBa_K3697011 BBa_K3697011]|| Toehold for Detection of KanR in ''B. subtilis''<br /> |-<br /> | [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3697012 BBa_K3697012] || Signal Amplifier Using ''B. subtilis'' Quorum Sensing Molecule comX<br /> |}<br /> <br /> <br /> <br /> = '''Zaključek''' =<br /> Ideja projekta SEED se lahko uporabi za različne aplikacije, vendar pa se je skupina osredotočila na virusno diagnostiko. Gre za ne invaziven test, kjer lahko dobimo rezultate iz sline. Skupina je pokazala predvsem proof of concept, vendar pa bi se pred uporabo takega testa v komercialne namene moralo narediti še klinična testiranja. <br /> Seed pa bi bilo možno uporabljati tudi za druge namene. V zdravstvu bi ga lahko uporabljali tudi za testiranje drugih virusov (predvsem DNA). Možna pa je tudi uporaba v agronomiji in pri testiranju vode in hrane. <br /> <br /> = '''Viri''' =<br /> *[1] Team: “Stanfors - 2020.igem.org.” https://2020.igem.org/Team:Stanford (accessed May 09, 2021)<br /> *[2] Maier, B., Chen, I., Dubnau, D., &amp; Sheetz, M. P. (2004). DNA transport into Bacillus subtilis requires proton motive force to generate large molecular forces. Nature structural &amp; molecular biology, 11(7), 643–649. https://doi.org/10.1038/nsmb783<br /> *[3] Hamoen, L., Venema, G., &amp; Kuipers, O. (2003). Controlling competence in Bacillus subtilis: Shared use of regulators. Microbiology. 149:9-17. Retrieved May 15, 2014, from http://gbb.eldoc.ub.rug.nl/FILES/root/2003/MicrobiolHamoen/2003MicrobiolHamoen.pdf<br /> *[4] Hong, F., Ma, D., Wu, K., Mina, L.A., Luiten, R.C., Liu, Y., Yan, H., Green, A.A. 57214766484;57189763666;57215219536;14037633900;57206179773;57216667908;7403395897;55328809600; Precise and Programmable Detection of Mutations Using Ultraspecific Riboregulators (2020) Cell, 180 (5), pp. 1018-1032.e16.</div>

Irma Zeljković https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Samoreplicirajo%C4%8D_COVID-19_test&diff=18969 2021-05-11T17:34:23Z

<p>Irma Zeljković: </p> <hr /> <div>SEED-samoreplicirajoč COVID-19-test je iGEM-projekt iz leta 2020. Avtorji projekta so podiplomski študenti univerze v Stanfordu v Kaliforniji<br /> <br /> Spletna stran projekta: [https://2020.igem.org/Team:Stanford]<br /> <br /> Avtorica povzetka: Irma Zeljković<br /> <br /> = '''Uvod''' =<br /> Skupina je začela razmišljati o projektu sredi pandemije COVID-19. Ena od glavnih težav je bila takrat pomanjkanje možnosti testiranja, s katero bi lahko lažje spremljali in izolirali primere. Dve glavni takratnih testov, sta bili potreba po izobraženem kadru in dragi reagenti. Skupina je imela idejo, da bi ustvarili test, ki bi lahko repliciral samega sebe in ne bi potreboval usposobljenega kadra in laboratorijske opreme. [1]<br /> <br /> = '''Opis projekta'''=<br /> Sistem, ki so si ga zamislili sestoji iz treh korakov:<br /> * Vnos nukleinske kisline v bakterijsko celico<br /> * Intracelularna detekcija (RNA toehold ali homologna rekombinacija)<br /> * Intracelularno signaliziranje (prek quorum sensing poti)<br /> Rezultati so hitri in kolorimetrični. [1]<br /> == '''Vnos nukleinske kisline iz okolja''' ==<br /> Odločili so se za delo z bakterijo ''Bacillus Subtilis'', saj gre za naravno kompetentno bakterijo, ki je prepoznana kot GRAS. Kompetentna ''B. subtilis'' izraža specializirane proteine, ki so vstavljeni v kompleks za transport DNA prek membrane. ComEA veže nase DNA. Nato na DNA deluje protein ComG, ki pomaga pri prenosu skozi bakterijsko steno. Ob prehodu nanjo delujejo endonukleaze in DNA se cepi na fragmente. Prehod skozi citoplazemsko membrano pa omogoča protein ComEC, ki pa znotraj membrane tvori proteinsko poro in omogoča prehod le enoverižni DNA. Ko je DNA transportirana v celico jo B. subtilis integrira v kromosom. [2]<br /> Naravna kompetenca ''B. subtilis'' je posledica pomanjkanja hranil v okolju. Regulacija kompetence je zelo zapletena, ključna proteina sta ComK in ComX. ComK je transkripcijski faktor, ki se izrazi po končani eksponentni fazi rasti. Njegova ekspresija je stimulirana s feromonom ComX, ki ga izločajo druge celice s pomočjo poti quorum-sensinga zaradi povečane gostote celic. <br /> Skupina se je odločila za uporabo sevov, ki imajo možnost inducibilne superkompetentnosti. [3]<br /> <br /> Za detekciji s t.i. RNA-toehold stikali jo so uporabili sev SCK6. V tem sevu je gen ComK pod kontrolo ksiloznega inducibilnega promotorja PxylA. Dodatek ksiloze v kulturo B. subtilisa povzroči ekspresijo DNA transportnih proteinov in začne kompetentnost. <br /> Za sistem, ki je temeljil na rekombinaciji so uporabili sev REG19. Pri tem sevu je ComK pod kontrolo manitolnega inducibilnega promotorja PmtIA, skupaj z genom za kompetenco ComS. Dodatek manitola v gojišče ' začne kompetentnost bakterij. [1]<br /> == '''Detekcija tarčne sekvence v celici''' ==<br /> Ko je DNA v celici, je naslednji korak intracelularna detekcija. Skupina je poskusila 2 možna pristopa in sicer RNA-toehold stikala integracijo okoljske DNA v genom ''B.subtilis'' s homologno rekombinacijo. [1]<br /> <br /> === Detekcijska metoda 1: RNA toehold stikala===<br /> RNA-toehold stikala so preprosti detektorji, ki jih proizvaja celica in jih lahko uporabljamo ''in vivo'' in ''in vitro''. Gre za enoverižno RNA, katere struktura se tako zvije, da tvori zanko. Takšna RNA je sestavljena iz 5 delov: sprožilca, RBS, začetnega kodona, linkerja in reporterja.<br /> V normalnih razmerah, ko RNA veriga tvori zanko, sta RBS in začetni kodon blokirana in ne more priti do translacije RNA. Ko pa tarčna sekvenca pride v bližino verige RNA, se komplementarno veže na sprožilec in povzroči, da se zanka razvije. To povzroči, da je RBS-mesto izpostavljeno in ribosomi se lahko vežejo na to RNA. <br /> Prednosti tega sistema so, da z lahkoto lahko zamenjamo različne sekvence, da je visoko specifičen, lahko zazna več tarč v eni celici in ga lahko proizvajamo in vivo. <br /> Skupina je naredila toeholde, ki se integrirajo na plazmid pVeg YFP. Sprožilec je komplementaren genu KanR, ki ga je skupina izbrala kot tarčno sekvenco. Za RBS so uporabili sekvenco, ki je v ''B. subtilis'' specifična za vezanje ribosomov. Kot reporter pa so uporabili YFP, saj hitro difuzira in je rumene barve. [4]<br /> <br /> === Detekcijska metoda 2: Homologna rekombinacija===<br /> Drug način detekcije RNA je rekombinacijski sistem ''B. subtilis'', kjer poteče integracija DNA v kromosom s homologno rekombinacijo. Najprej so transformirali plazmid z negativnim selekcijskim markerjem, ki ga obkrožajo homologne regije tarčne sekvence. Ko celica prevzame sekvenco, se začne proces rekombinacije, ki povzroči, da se gen za negativno selekcijo izreže in ga nadomesti tarčna sekvenca. Če ne pride do prevzema DNA, tudi do rekombinacije ne pride in negativen selekcijski marker ostane v celici. Ta pa vodi v smrt celice ob prisotnosti manoze. [1]<br /> <br /> Skupina je zbrala ManP za negativni selekcijski marker. ManP deluje, tako da fosforilira manozo, ko vstopa v celico in tako onemogoča njen izstop iz celice. Sev REG19 ima izbit gen ManA, ki bi manozo spremenila v fruktozo, zato se fosforilirana manoza nabira v celici. <br /> <br /> Prisotnost tarče sekvence povzroči homologno rekombinacijo, saj je skupina svoj sev ''B. subtilis'' načrtovala z dvema regijama homologije tarčnih sekvenc, ki so vključene v genom na obeh straneh kasete ManP. <br /> Prednosti rekombinantnega sistema so, da se ta proces že naravno odvija v ''B. subtilis''. Slabosti pa so specifičnost (lahko pride do več lažno pozitivnih testov), občutljivost (sistem ne zazna tarčnih sekvenc, če jih je premalo) in ima omejeno hitrost. [1]<br /> <br /> == '''Ojačevanje signala za hitreje branje''' ==<br /> Naslednja faza je ojačevanjevidnega signala, ki so ga dobili z enim izmed sistemov. To fazo so le opisali, niso pa je preizkusili v laboratoriju zaradi težav s časom. <br /> Ojačevanje signala je pomembna, saj omogoča merljive rezultate v celi bakterijski koloniji tudi ob prisotnosti zelo malo nukleinske kisline. V ta namen so se odločili, da bojo uporabili quorum sensing. <br /> Ko kultura B. subtilisa doseže kritično gostoto, se aktivirajo quorum sensing molekule. Takšna molekula je na primer ComX, ki aktivira pot za aktivacijo promotorja PsrfA. Posledica tega je, da nastane bakterijski biofilm. <br /> Nova pot, ki jo je skupina naredila, vključuje pozitivno povratno zanko ComX in povzroči, da celice tvorijo fluorescentne proteine (namesto biofilma). To so storili, tako da so prvo izbili endogen ComX, in ga nadomestili s ComX, ki je bil pod kontrolo promotorja srf-A, PsrfA. Pod tem promotorjem bi bili tudi luxABCDE, ki so bioluminiscentni reporterji, ki si jih je skupina izbrala. Želeli so torej doseči, da bi izražanje Comx molekul aktiviralo PsrfA gene, ki bi proizvedli še več ComX in luxABCDE.<br /> Ojačevanje signala so morali združiti z mehanizmoma za zaznavanje DNA. Pri toehold stikalu bi razvitje zanke povzročilo translacijo ComX. Pri homologni rekombinaciji pa bi le-ta omogočila transkripcijo ComX.[1]<br /> <br /> = '''Uporabljeni biološki deli'''=<br /> <br /> Skupina je poskusila razviti 8 bioloških delov, ki jih lahko razdelimo v tri skupine: reporterji, detektorji, ki temeljijo na rekombinaciji in toehold. Nato pa so konstruirali še napravo za ojačitev signala, ki je niso mogli preizkusiti v laboratoriju. <br /> Prispevek skupine je bil torej devet biokock, saj so mnoge biokocke v registru kompatibilne, vendar ne optimizirane za delo z bakterijo ''B. subtilis''. <br /> <br /> <br /> V tabeli 1 so prikazani vsi biološki deli, ki so jih pripravili med projektom.<br /> <br /> <br /> {|<br /> |+ style=&quot;text-align: left;&quot; | ''Tabela 1: Biološki deli, ki jih je skupina pripravila med projektom. <br /> |-<br /> | '''KODA''' || '''IME S BIOLOŠKEGA DELA'''<br /> |-<br /> | [http://parts.igem.org/wiki/index.php?title=Part:BBa_K3697000 BBa_K3697000] || mCherry BSU<br /> |-<br /> | [http://parts.igem.org/wiki/index.php?title=Part:BBa_K3697008 BBa_K3697008] || YFP CDS<br /> |-<br /> | [http://parts.igem.org/wiki/index.php?title=Part:BBa_K3697010 BBa_K3697010]|| mCherry_BSU Plasmid<br /> |-<br /> | [http://parts.igem.org/wiki/index.php?title=Part:BBa_K3697009 BBa_K3697009 ] || pVEG YFP Plasmid for ''B. subtilis''<br /> |-<br /> | [http://parts.igem.org/wiki/index.php?title=Part:BBa_K3697002 BBa_K3697002] || ManP Expression Casette<br /> |-<br /> | [http://parts.igem.org/wiki/index.php?title=Part:BBa_K3697003 BBa_K3697003] || Homology Arms for KanR Integration In ''B. subtilis''<br /> |-<br /> | [http://parts.igem.org/wiki/index.php?title=Part:BBa_K3697004 BBa_K3697004] || Recombination-Based Detection System for B. subtilis (ManP)<br /> |-<br /> | [http://parts.igem.org/wiki/index.php?title=Part:BBa_K3697011 BBa_K3697011]|| Toehold for Detection of KanR in ''B. subtilis''<br /> |-<br /> | [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3697012 BBa_K3697012] || Signal Amplifier Using ''B. subtilis'' Quorum Sensing Molecule comX<br /> |}<br /> <br /> <br /> <br /> = '''Zaključek''' =<br /> Ideja projekta SEED se lahko uporabi za različne aplikacije, vendar pa se je skupina osredotočila na virusno diagnostiko. Gre za ne invaziven test, kjer lahko dobimo rezultate iz sline. Skupina je pokazala predvsem proof of concept, vendar pa bi se pred uporabo takega testa v komercialne namene moralo narediti še klinična testiranja. <br /> Seed pa bi bilo možno uporabljati tudi za druge namene. V zdravstvu bi ga lahko uporabljali tudi za testiranje drugih virusov (predvsem DNA). Možna pa je tudi uporaba v agronomiji in pri testiranju vode in hrane. <br /> <br /> = '''Viri''' =<br /> *[1] Team: “Stanfors - 2020.igem.org.” https://2020.igem.org/Team:Stanford (accessed May 09, 2021)<br /> *[2] Maier, B., Chen, I., Dubnau, D., &amp; Sheetz, M. P. (2004). DNA transport into Bacillus subtilis requires proton motive force to generate large molecular forces. Nature structural &amp; molecular biology, 11(7), 643–649. https://doi.org/10.1038/nsmb783<br /> *[3] Hamoen, L., Venema, G., &amp; Kuipers, O. (2003). Controlling competence in Bacillus subtilis: Shared use of regulators. Microbiology. 149:9-17. Retrieved May 15, 2014, from http://gbb.eldoc.ub.rug.nl/FILES/root/2003/MicrobiolHamoen/2003MicrobiolHamoen.pdf<br /> *[4] Hong, F., Ma, D., Wu, K., Mina, L.A., Luiten, R.C., Liu, Y., Yan, H., Green, A.A. 57214766484;57189763666;57215219536;14037633900;57206179773;57216667908;7403395897;55328809600; Precise and Programmable Detection of Mutations Using Ultraspecific Riboregulators (2020) Cell, 180 (5), pp. 1018-1032.e16.</div>

Irma Zeljković https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Samoreplicirajo%C4%8D_COVID-19_test&diff=18960 2021-05-11T08:38:22Z

<p>Irma Zeljković: New page: SEED-samoreplicirajoč COVID-19-test je iGEM-projekt iz leta 2020. Avtorji projekta so podiplomski študenti univerze v Stanfordu v kaliforniji Spletna stran projekta: [https://2020.igem....</p> <hr /> <div>SEED-samoreplicirajoč COVID-19-test je iGEM-projekt iz leta 2020. Avtorji projekta so podiplomski študenti univerze v Stanfordu v kaliforniji<br /> <br /> Spletna stran projekta: [https://2020.igem.org/Team:Stanford]<br /> <br /> Avtorica povzetka: Irma Zeljković<br /> <br /> = '''Uvod''' =<br /> Skupina je začela razmišljati o projektu sredi pandemije COVID-19. Ena od glavnih težav je bila takrat pomanjkanje možnosti testiranja, s katero bi lahko lažje spremljali in izolirali primere. Dve glavni takratnih testov, sta bili potreba po izobraženem kadru in dragi reagenti. Skupina je imela idejo, da bi ustvarili test, ki bi lahko repliciral samega sebe in ne bi potreboval usposobljenega kadra in laboratorijske opreme. [1]<br /> <br /> = '''Opis projekta'''=<br /> Sistem, ki so si ga zamislili sestoji iz treh korakov:<br /> * Vnos nukleinske kisline v bakterijsko celico<br /> * Intracelularna detekcija (RNA toehold ali homologna rekombinacija)<br /> * Intracelularno signaliziranje (prek quorum sensing poti)<br /> Rezultati so hitri in kolorimetrični. [1]<br /> == '''Vnos nukleinske kisline iz okolja''' ==<br /> Odločili so se za delo z bakterijo ''Bacillus Subtilis'', saj gre za naravno kompetentno bakterijo, ki je prepoznana kot GRAS. Kompetentna ''B. subtilis'' izraža specializirane proteine, ki so vstavljeni v kompleks za transport DNA prek membrane. ComEA veže nase DNA. Nato na DNA deluje protein ComG, ki pomaga pri prenosu skozi bakterijsko steno. Ob prehodu nanjo delujejo endonukleaze in DNA se cepi na fragmente. Prehod skozi citoplazemsko membrano pa omogoča protein ComEC, ki pa znotraj membrane tvori proteinsko poro in omogoča prehod le enoverižni DNA. Ko je DNA transportirana v celico jo B. subtilis integrira v kromosom. [2]<br /> Naravna kompetenca ''B. subtilis'' je posledica pomanjkanja hranil v okolju. Regulacija kompetence je zelo zapletena, ključna proteina sta ComK in ComX. ComK je transkripcijski faktor, ki se izrazi po končani eksponentni fazi rasti. Njegova ekspresija je stimulirana s feromonom ComX, ki ga izločajo druge celice s pomočjo poti quorum-sensinga zaradi povečane gostote celic. <br /> Skupina se je odločila za uporabo sevov, ki imajo možnost inducibilne superkompetentnosti. [3]<br /> <br /> Za detekciji s t.i. RNA-toehold stikali jo so uporabili sev SCK6. V tem sevu je gen ComK pod kontrolo ksiloznega inducibilnega promotorja PxylA. Dodatek ksiloze v kulturo B. subtilisa povzroči ekspresijo DNA transportnih proteinov in začne kompetentnost. <br /> Za sistem, ki je temeljil na rekombinaciji so uporabili sev REG19. Pri tem sevu je ComK pod kontrolo manitolnega inducibilnega promotorja PmtIA, skupaj z genom za kompetenco ComS. Dodatek manitola v gojišče ' začne kompetentnost bakterij. [1]<br /> == '''Detekcija tarčne sekvence v celici''' ==<br /> Ko je DNA v celici, je naslednji korak intracelularna detekcija. Skupina je poskusila 2 možna pristopa in sicer RNA-toehold stikala integracijo okoljske DNA v genom ''B.subtilis'' s homologno rekombinacijo. [1]<br /> <br /> === Detekcijska metoda 1: RNA toehold stikala===<br /> RNA-toehold stikala so preprosti detektorji, ki jih proizvaja celica in jih lahko uporabljamo ''in vivo'' in ''in vitro''. Gre za enoverižno RNA, katere struktura se tako zvije, da tvori zanko. Takšna RNA je sestavljena iz 5 delov: sprožilca, RBS, začetnega kodona, linkerja in reporterja.<br /> V normalnih razmerah, ko RNA veriga tvori zanko, sta RBS in začetni kodon blokirana in ne more priti do translacije RNA. Ko pa tarčna sekvenca pride v bližino verige RNA, se komplementarno veže na sprožilec in povzroči, da se zanka razvije. To povzroči, da je RBS-mesto izpostavljeno in ribosomi se lahko vežejo na to RNA. <br /> Prednosti tega sistema so, da z lahkoto lahko zamenjamo različne sekvence, da je visoko specifičen, lahko zazna več tarč v eni celici in ga lahko proizvajamo in vivo. <br /> Skupina je naredila toeholde, ki se integrirajo na plazmid pVeg YFP. Sprožilec je komplementaren genu KanR, ki ga je skupina izbrala kot tarčno sekvenco. Za RBS so uporabili sekvenco, ki je v ''B. subtilis'' specifična za vezanje ribosomov. Kot reporter pa so uporabili YFP, saj hitro difuzira in je rumene barve. [4]<br /> <br /> === Detekcijska metoda 2: Homologna rekombinacija===<br /> Drug način detekcije RNA je rekombinacijski sistem ''B. subtilis'', kjer poteče integracija DNA v kromosom s homologno rekombinacijo. Najprej so transformirali plazmid z negativnim selekcijskim markerjem, ki ga obkrožajo homologne regije tarčne sekvence. Ko celica prevzame sekvenco, se začne proces rekombinacije, ki povzroči, da se gen za negativno selekcijo izreže in ga nadomesti tarčna sekvenca. Če ne pride do prevzema DNA, tudi do rekombinacije ne pride in negativen selekcijski marker ostane v celici. Ta pa vodi v smrt celice ob prisotnosti manoze. [1]<br /> <br /> Skupina je zbrala ManP za negativni selekcijski marker. ManP deluje, tako da fosforilira manozo, ko vstopa v celico in tako onemogoča njen izstop iz celice. Sev REG19 ima izbit gen ManA, ki bi manozo spremenila v fruktozo, zato se fosforilirana manoza nabira v celici. <br /> <br /> Prisotnost tarče sekvence povzroči homologno rekombinacijo, saj je skupina svoj sev ''B. subtilis'' načrtovala z dvema regijama homologije tarčnih sekvenc, ki so vključene v genom na obeh straneh kasete ManP. <br /> Prednosti rekombinantnega sistema so, da se ta proces že naravno odvija v ''B. subtilis''. Slabosti pa so specifičnost (lahko pride do več lažno pozitivnih testov), občutljivost (sistem ne zazna tarčnih sekvenc, če jih je premalo) in ima omejeno hitrost. [1]<br /> <br /> == '''Ojačevanje signala za hitreje branje''' ==<br /> Naslednja faza je ojačevanjevidnega signala, ki so ga dobili z enim izmed sistemov. To fazo so le opisali, niso pa je preizkusili v laboratoriju zaradi težav s časom. <br /> Ojačevanje signala je pomembna, saj omogoča merljive rezultate v celi bakterijski koloniji tudi ob prisotnosti zelo malo nukleinske kisline. V ta namen so se odločili, da bojo uporabili quorum sensing. <br /> Ko kultura B. subtilisa doseže kritično gostoto, se aktivirajo quorum sensing molekule. Takšna molekula je na primer ComX, ki aktivira pot za aktivacijo promotorja PsrfA. Posledica tega je, da nastane bakterijski biofilm. <br /> Nova pot, ki jo je skupina naredila, vključuje pozitivno povratno zanko ComX in povzroči, da celice tvorijo fluorescentne proteine (namesto biofilma). To so storili, tako da so prvo izbili endogen ComX, in ga nadomestili s ComX, ki je bil pod kontrolo promotorja srf-A, PsrfA. Pod tem promotorjem bi bili tudi luxABCDE, ki so bioluminiscentni reporterji, ki si jih je skupina izbrala. Želeli so torej doseči, da bi izražanje Comx molekul aktiviralo PsrfA gene, ki bi proizvedli še več ComX in luxABCDE.<br /> Ojačevanje signala so morali združiti z mehanizmoma za zaznavanje DNA. Pri toehold stikalu bi razvitje zanke povzročilo translacijo ComX. Pri homologni rekombinaciji pa bi le-ta omogočila transkripcijo ComX.[1]<br /> <br /> = '''Uporabljeni biološki deli'''=<br /> <br /> Skupina je poskusila razviti 8 bioloških delov, ki jih lahko razdelimo v tri skupine: reporterji, detektorji, ki temeljijo na rekombinaciji in toehold. Nato pa so konstruirali še napravo za ojačitev signala, ki je niso mogli preizkusiti v laboratoriju. <br /> Prispevek skupine je bil torej devet biokock, saj so mnoge biokocke v registru kompatibilne, vendar ne optimizirane za delo z bakterijo ''B. subtilis''. <br /> <br /> <br /> V tabeli 1 so prikazani vsi biološki deli, ki so jih pripravili med projektom.<br /> <br /> <br /> {|<br /> |+ style=&quot;text-align: left;&quot; | ''Tabela 1: Biološki deli, ki jih je skupina pripravila med projektom. <br /> |-<br /> | '''KODA''' || '''IME S BIOLOŠKEGA DELA'''<br /> |-<br /> | [http://parts.igem.org/wiki/index.php?title=Part:BBa_K3697000 BBa_K3697000] || mCherry BSU<br /> |-<br /> | [http://parts.igem.org/wiki/index.php?title=Part:BBa_K3697008 BBa_K3697008] || YFP CDS<br /> |-<br /> | [http://parts.igem.org/wiki/index.php?title=Part:BBa_K3697010 BBa_K3697010]|| mCherry_BSU Plasmid<br /> |-<br /> | [http://parts.igem.org/wiki/index.php?title=Part:BBa_K3697009 BBa_K3697009 ] || pVEG YFP Plasmid for ''B. subtilis''<br /> |-<br /> | [http://parts.igem.org/wiki/index.php?title=Part:BBa_K3697002 BBa_K3697002] || ManP Expression Casette<br /> |-<br /> | [http://parts.igem.org/wiki/index.php?title=Part:BBa_K3697003 BBa_K3697003] || Homology Arms for KanR Integration In ''B. subtilis''<br /> |-<br /> | [http://parts.igem.org/wiki/index.php?title=Part:BBa_K3697004 BBa_K3697004] || Recombination-Based Detection System for B. subtilis (ManP)<br /> |-<br /> | [http://parts.igem.org/wiki/index.php?title=Part:BBa_K3697011 BBa_K3697011]|| Toehold for Detection of KanR in ''B. subtilis''<br /> |-<br /> | [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3697012 BBa_K3697012] || Signal Amplifier Using ''B. subtilis'' Quorum Sensing Molecule comX<br /> |}<br /> <br /> <br /> <br /> = '''Zaključek''' =<br /> Ideja projekta SEED se lahko uporabi za različne aplikacije, vendar pa se je skupina osredotočila na virusno diagnostiko. Gre za ne invaziven test, kjer lahko dobimo rezultate iz sline. Skupina je pokazala predvsem proof of concept, vendar pa bi se pred uporabo takega testa v komercialne namene moralo narediti še klinična testiranja. <br /> Seed pa bi bilo možno uporabljati tudi za druge namene. V zdravstvu bi ga lahko uporabljali tudi za testiranje drugih virusov (predvsem DNA). Možna pa je tudi uporaba v agronomiji in pri testiranju vode in hrane. <br /> <br /> = '''Viri''' =<br /> *[1] Team: “Stanfors - 2020.igem.org.” https://2020.igem.org/Team:Stanford (accessed May 09, 2021)<br /> *[2] Maier, B., Chen, I., Dubnau, D., &amp; Sheetz, M. P. (2004). DNA transport into Bacillus subtilis requires proton motive force to generate large molecular forces. Nature structural &amp; molecular biology, 11(7), 643–649. https://doi.org/10.1038/nsmb783<br /> *[3] Hamoen, L., Venema, G., &amp; Kuipers, O. (2003). Controlling competence in Bacillus subtilis: Shared use of regulators. Microbiology. 149:9-17. Retrieved May 15, 2014, from http://gbb.eldoc.ub.rug.nl/FILES/root/2003/MicrobiolHamoen/2003MicrobiolHamoen.pdf<br /> *[4] Hong, F., Ma, D., Wu, K., Mina, L.A., Luiten, R.C., Liu, Y., Yan, H., Green, A.A. 57214766484;57189763666;57215219536;14037633900;57206179773;57216667908;7403395897;55328809600; Precise and Programmable Detection of Mutations Using Ultraspecific Riboregulators (2020) Cell, 180 (5), pp. 1018-1032.e16.</div>

Irma Zeljković https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Seminarji_SB_2020/21&diff=18959 2021-05-11T08:37:05Z

<p>Irma Zeljković: </p> <hr /> <div>V študijskem letu 2020/21 študentje 1. letnika predstavljajo naslednje teme: <br /> <br /> RAZISKOVALNI ČLANKI<br /> <br /> (Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) &lt;br&gt;<br /> <br /> 1 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Proizvodnja_1,3-propandiola_iz_različnih_ogljikovodikov_po_nenaravni_poti_preko_3-hidroksipropanojske_kisline Proizvodnja 1,3-propandiola iz različnih ogljikovodikov po nenaravni poti preko 3-hidroksipropanojske kisline] <br /> (Liza Ulčakar) &lt;br&gt;<br /> 2 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Doseganje_asimetri%C4%8Dnosti_in_asimetri%C4%8Dne_delitve_pri_E._coli Doseganje asimetričnosti in asimetrične delitve pri E. coli] (Aljaž Bratina) &lt;br&gt;<br /> 3 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Zmanj%C5%A1ana_procesivnost_ribosomov_v_sistemu_PURE Zmanjšana procesivnost ribosomov v sistemu PURE] (Tina Kolenc Milavec) &lt;br&gt;<br /> 4 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Na%C4%8Drtovana_pot_zvijanja_proteinskih_origamijev Načrtovana pot zvijanja proteinskih origamijev] (Anamarija Agnič) &lt;br&gt;<br /> 5 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/U%C4%8Dinkovita_svetlobno_inducibilna_Dre_rekombinaza_za_%C4%8Dasovno_in_prostorsko_celi%C4%8Dno_specifi%C4%8Dno_urejanje_genoma_v_mi%C5%A1jih_modelih#VIRI Učinkovita svetlobno inducibilna Dre rekombinaza za časovno in prostorsko celično specifično urejanje genoma v mišjih modelih] (Nika Mikulič Vernik) &lt;br&gt;<br /> 6 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Vzpostavitev_termometra_tRNA_za_dolo%C4%8Danje_temperature_optimalne_rasti_mikroorganizmov Vzpostavitev termometra tRNA za določanje temperature optimalne rasti mikroorganizmov] (Urša Štrancar) &lt;br&gt;<br /> 7 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Racionalna_zasnova_minimalnih_sinteti%C4%8Dnih_promotorjev_za_rastline#Construction_of_plasmids Racionalna zasnova minimalnih sintetičnih promotorjev za rastline] (Almina Tahirović) &lt;br&gt;<br /> 8 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Reverzibilna_toplotna_regulacija_za_bifunkcionalno_dinamično_uravnavanje_izražanja_genov_v_E._coli Reverzibilna toplotna regulacija za bifunkcionalno dinamično uravnavanje izražanja genov v E. coli] (Urška Fajdiga) &lt;br&gt;<br /> 9 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sinteti%C4%8Dna_optogenetska_naprava_na_osnovi_BRET_za_pulzirajo%C4%8Do_ekspresijo_transgena%2C_ki_omogo%C4%8Da_glukozno_homeostazo_pri_mi%C5%A1ih Sintetična optogenetska naprava na osnovi BRET za pulzirajočo ekspresijo transgena, ki omogoča glukozno homeostazo pri miših] (Paula Horvat) &lt;br&gt;<br /> 10 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Hkratna_karakterizacija_več_različnih_racionalno_načrtovanih_promotorskih_arhitektur Vpogled v kombinatorno logiko z IPTG induciranih sistemov] (Urška Zagorc) &lt;br&gt;<br /> 11 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Ponovno_določanje_specifičnosti_izven_citoplazme_aktivnih_sigma_faktorjev Ponovno določanje specifičnosti izven citoplazme aktivnih sigma faktorjev] (Eva Keber) &lt;br&gt;<br /> 12 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Hierarhi%C4%8Dno_sestavljanje_asimetri%C4%8Dnih_ikozaedri%C4%8Dnih_virusnih_kapsid Hierarhično sestavljanje asimetričnih ikozaedričnih virusnih kapsid] (Urška Pečarič Strnad) &lt;br&gt;<br /> 13 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Avtomatizirano_oblikovanje_sintezne_mikrobne_zdru%C5%BEbe Avtomatizirano oblikovanje sintezne mikrobne združbe] (Urša Lovše)<br /> <br /> NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI <br /> <br /> (Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.) &lt;br&gt;<br /> <br /> 1 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/RESHAPE_-_spreminjanje_morfologije_nitastih_gliv RESHAPE - spreminjanje morfologije nitastih gliv] <br /> (Špela Supej) &lt;br&gt;<br /> 2 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/The_Chlamy_Cleaner:_razgradnja_pesticida_z_zeleno_algo The Chlamy Cleaner: razgradnja pesticida z zeleno algo] (Doroteja Armič) &lt;br&gt;<br /> 3 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/TheraPUFA:_nazalni_probiotik_proti_okužbam_in_vnetjem TheraPUFA- nazalni probiotik proti okužbam in vnetjem] (Barbara Slapnik) &lt;br&gt;<br /> 4 [[S-POP: Modularni biosenzor za zaznavanje obstojnih organskih onesnaževal v okoljskih vodah]] (Tadej Medved) &lt;br&gt;<br /> 5 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/MARS-magnetni_sistem_za_recikliranje_ATP MARS-magnetni sistem za recikliranje ATP] (David Miškić) &lt;br&gt;<br /> 6 [[B.O.T.: Bakterijska oscilacijska terapija za zdravljenje kolorektalnega raka]] (Neža Pavko) &lt;br&gt;<br /> 7 [[Rapidemic razvoj novega kompleta za hitro diagnostiko na mestu oskrbe]] (Mirsad Mešić) &lt;br&gt;<br /> 8 [[iGEMINI: Kvasovke kot prehransko dopolnilo v vesolju]] (Klementina Polanec) &lt;br&gt;<br /> 9 [[Antea-Glyphosate: Detekcija in razgradnja glifosata]] (Jernej Imperl) &lt;br&gt;<br /> 10 [[NANOFLEX: Standardiziran, prilagodljiv in priročen celični biosenzor]] (Martin Špendl) &lt;br&gt;<br /> 11 [[FlavoFlow: ribogojniška zaščita pred okužbami rib]] (Mateja Žvipelj) &lt;br&gt;<br /> 12 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/samoreplicirajoč_COVID-19_test Samoreplicirajoč COVID-19-test] (Irma Zeljković) &lt;br&gt;<br /> <br /> ----<br /> <br /> Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Povzetek je treba objaviti dva dni pred predstavitvijo do polnoči (za seminarje v sredo torej v ponedeljek). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo razprava, ki praviloma ne bo daljša od 5 minut.</div>

Irma Zeljković https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Samoreplicirajo%C4%8D_komplet_za_testiranje_na_COVID-19&diff=18958 2021-05-11T08:10:26Z

<p>Irma Zeljković: /* Opis projekta */</p> <hr /> <div>SEED-samoreplicirajoč komplet za testiranje na COVID-19 je iGEM-projekt iz leta 2020. Avtorji projekta so podiplomski študenti univerze v Stanfordu v kaliforniji<br /> <br /> Spletna stran projekta: [https://2020.igem.org/Team:Stanford]<br /> <br /> Avtorica povzetka: Irma Zeljković<br /> <br /> = '''Uvod''' =<br /> Skupina je začela razmišljati o projektu sredi pandemije COVID-19. Ena od glavnih težav je bila takrat pomanjkanje možnosti testiranja, s katero bi lahko lažje spremljali in izolirali primere. Dve glavni takratnih testov, sta bili potreba po izobraženem kadru in dragi reagenti. Skupina je imela idejo, da bi ustvarili test, ki bi lahko repliciral samega sebe in ne bi potreboval usposobljenega kadra in laboratorijske opreme. [1]<br /> <br /> = '''Opis projekta'''=<br /> Sistem, ki so si ga zamislili sestoji iz treh korakov:<br /> * Vnos nukleinske kisline v bakterijsko celico<br /> * Intracelularna detekcija (RNA toehold ali homologna rekombinacija)<br /> * Intracelularno signaliziranje (prek quorum sensing poti)<br /> Rezultati so hitri in kolorimetrični. [1]<br /> == '''Vnos nukleinske kisline iz okolja''' ==<br /> Odločili so se za delo z bakterijo ''Bacillus Subtilis'', saj gre za naravno kompetentno bakterijo, ki je prepoznana kot GRAS. Kompetentna ''B. subtilis'' izraža specializirane proteine, ki so vstavljeni v kompleks za transport DNA prek membrane. ComEA veže nase DNA. Nato na DNA deluje protein ComG, ki pomaga pri prenosu skozi bakterijsko steno. Ob prehodu nanjo delujejo endonukleaze in DNA se cepi na fragmente. Prehod skozi citoplazemsko membrano pa omogoča protein ComEC, ki pa znotraj membrane tvori proteinsko poro in omogoča prehod le enoverižni DNA. Ko je DNA transportirana v celico jo B. subtilis integrira v kromosom. [2]<br /> Naravna kompetenca ''B. subtilis'' je posledica pomanjkanja hranil v okolju. Regulacija kompetence je zelo zapletena, ključna proteina sta ComK in ComX. ComK je transkripcijski faktor, ki se izrazi po končani eksponentni fazi rasti. Njegova ekspresija je stimulirana s feromonom ComX, ki ga izločajo druge celice s pomočjo poti quorum-sensinga zaradi povečane gostote celic. <br /> Skupina se je odločila za uporabo sevov, ki imajo možnost inducibilne superkompetentnosti. [3]<br /> <br /> Za detekciji s t.i. RNA-toehold stikali jo so uporabili sev SCK6. V tem sevu je gen ComK pod kontrolo ksiloznega inducibilnega promotorja PxylA. Dodatek ksiloze v kulturo B. subtilisa povzroči ekspresijo DNA transportnih proteinov in začne kompetentnost. <br /> Za sistem, ki je temeljil na rekombinaciji so uporabili sev REG19. Pri tem sevu je ComK pod kontrolo manitolnega inducibilnega promotorja PmtIA, skupaj z genom za kompetenco ComS. Dodatek manitola v gojišče ' začne kompetentnost bakterij. [1]<br /> == '''Detekcija tarčne sekvence v celici''' ==<br /> Ko je DNA v celici, je naslednji korak intracelularna detekcija. Skupina je poskusila 2 možna pristopa in sicer RNA-toehold stikala integracijo okoljske DNA v genom ''B.subtilis'' s homologno rekombinacijo. [1]<br /> <br /> === Detekcijska metoda 1: RNA toehold stikala===<br /> RNA-toehold stikala so preprosti detektorji, ki jih proizvaja celica in jih lahko uporabljamo ''in vivo'' in ''in vitro''. Gre za enoverižno RNA, katere struktura se tako zvije, da tvori zanko. Takšna RNA je sestavljena iz 5 delov: sprožilca, RBS, začetnega kodona, linkerja in reporterja.<br /> V normalnih razmerah, ko RNA veriga tvori zanko, sta RBS in začetni kodon blokirana in ne more priti do translacije RNA. Ko pa tarčna sekvenca pride v bližino verige RNA, se komplementarno veže na sprožilec in povzroči, da se zanka razvije. To povzroči, da je RBS-mesto izpostavljeno in ribosomi se lahko vežejo na to RNA. <br /> Prednosti tega sistema so, da z lahkoto lahko zamenjamo različne sekvence, da je visoko specifičen, lahko zazna več tarč v eni celici in ga lahko proizvajamo in vivo. <br /> Skupina je naredila toeholde, ki se integrirajo na plazmid pVeg YFP. Sprožilec je komplementaren genu KanR, ki ga je skupina izbrala kot tarčno sekvenco. Za RBS so uporabili sekvenco, ki je v ''B. subtilis'' specifična za vezanje ribosomov. Kot reporter pa so uporabili YFP, saj hitro difuzira in je rumene barve. [4]<br /> <br /> === Detekcijska metoda 2: Homologna rekombinacija===<br /> Drug način detekcije RNA je rekombinacijski sistem ''B. subtilis'', kjer poteče integracija DNA v kromosom s homologno rekombinacijo. Najprej so transformirali plazmid z negativnim selekcijskim markerjem, ki ga obkrožajo homologne regije tarčne sekvence. Ko celica prevzame sekvenco, se začne proces rekombinacije, ki povzroči, da se gen za negativno selekcijo izreže in ga nadomesti tarčna sekvenca. Če ne pride do prevzema DNA, tudi do rekombinacije ne pride in negativen selekcijski marker ostane v celici. Ta pa vodi v smrt celice ob prisotnosti manoze. [1]<br /> <br /> Skupina je zbrala ManP za negativni selekcijski marker. ManP deluje, tako da fosforilira manozo, ko vstopa v celico in tako onemogoča njen izstop iz celice. Sev REG19 ima izbit gen ManA, ki bi manozo spremenila v fruktozo, zato se fosforilirana manoza nabira v celici. <br /> <br /> Prisotnost tarče sekvence povzroči homologno rekombinacijo, saj je skupina svoj sev ''B. subtilis'' načrtovala z dvema regijama homologije tarčnih sekvenc, ki so vključene v genom na obeh straneh kasete ManP. <br /> Prednosti rekombinantnega sistema so, da se ta proces že naravno odvija v ''B. subtilis''. Slabosti pa so specifičnost (lahko pride do več lažno pozitivnih testov), občutljivost (sistem ne zazna tarčnih sekvenc, če jih je premalo) in ima omejeno hitrost. [1]<br /> <br /> == '''Ojačevanje signala za hitreje branje''' ==<br /> Naslednja faza je ojačevanjevidnega signala, ki so ga dobili z enim izmed sistemov. To fazo so le opisali, niso pa je preizkusili v laboratoriju zaradi težav s časom. <br /> Ojačevanje signala je pomembna, saj omogoča merljive rezultate v celi bakterijski koloniji tudi ob prisotnosti zelo malo nukleinske kisline. V ta namen so se odločili, da bojo uporabili quorum sensing. <br /> Ko kultura B. subtilisa doseže kritično gostoto, se aktivirajo quorum sensing molekule. Takšna molekula je na primer ComX, ki aktivira pot za aktivacijo promotorja PsrfA. Posledica tega je, da nastane bakterijski biofilm. <br /> Nova pot, ki jo je skupina naredila, vključuje pozitivno povratno zanko ComX in povzroči, da celice tvorijo fluorescentne proteine (namesto biofilma). To so storili, tako da so prvo izbili endogen ComX, in ga nadomestili s ComX, ki je bil pod kontrolo promotorja srf-A, PsrfA. Pod tem promotorjem bi bili tudi luxABCDE, ki so bioluminiscentni reporterji, ki si jih je skupina izbrala. Želeli so torej doseči, da bi izražanje Comx molekul aktiviralo PsrfA gene, ki bi proizvedli še več ComX in luxABCDE.<br /> Ojačevanje signala so morali združiti z mehanizmoma za zaznavanje DNA. Pri toehold stikalu bi razvitje zanke povzročilo translacijo ComX. Pri homologni rekombinaciji pa bi le-ta omogočila transkripcijo ComX.[1]<br /> <br /> = '''Uporabljeni biološki deli'''=<br /> <br /> Skupina je poskusila razviti 8 bioloških delov, ki jih lahko razdelimo v tri skupine: reporterji, detektorji, ki temeljijo na rekombinaciji in toehold. Nato pa so konstruirali še napravo za ojačitev signala, ki je niso mogli preizkusiti v laboratoriju. <br /> Prispevek skupine je bil torej devet biokock, saj so mnoge biokocke v registru kompatibilne, vendar ne optimizirane za delo z bakterijo ''B. subtilis''. <br /> <br /> <br /> V tabeli 1 so prikazani vsi biološki deli, ki so jih pripravili med projektom.<br /> <br /> <br /> {|<br /> |+ style=&quot;text-align: left;&quot; | ''Tabela 1: Biološki deli, ki jih je skupina pripravila med projektom. <br /> |-<br /> | '''KODA''' || '''IME S BIOLOŠKEGA DELA'''<br /> |-<br /> | [http://parts.igem.org/wiki/index.php?title=Part:BBa_K3697000 BBa_K3697000] || mCherry BSU<br /> |-<br /> | [http://parts.igem.org/wiki/index.php?title=Part:BBa_K3697008 BBa_K3697008] || YFP CDS<br /> |-<br /> | [http://parts.igem.org/wiki/index.php?title=Part:BBa_K3697010 BBa_K3697010]|| mCherry_BSU Plasmid<br /> |-<br /> | [http://parts.igem.org/wiki/index.php?title=Part:BBa_K3697009 BBa_K3697009 ] || pVEG YFP Plasmid for ''B. subtilis''<br /> |-<br /> | [http://parts.igem.org/wiki/index.php?title=Part:BBa_K3697002 BBa_K3697002] || ManP Expression Casette<br /> |-<br /> | [http://parts.igem.org/wiki/index.php?title=Part:BBa_K3697003 BBa_K3697003] || Homology Arms for KanR Integration In ''B. subtilis''<br /> |-<br /> | [http://parts.igem.org/wiki/index.php?title=Part:BBa_K3697004 BBa_K3697004] || Recombination-Based Detection System for B. subtilis (ManP)<br /> |-<br /> | [http://parts.igem.org/wiki/index.php?title=Part:BBa_K3697011 BBa_K3697011]|| Toehold for Detection of KanR in ''B. subtilis''<br /> |-<br /> | [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3697012 BBa_K3697012] || Signal Amplifier Using ''B. subtilis'' Quorum Sensing Molecule comX<br /> |}<br /> <br /> <br /> <br /> = '''Zaključek''' =<br /> Ideja projekta SEED se lahko uporabi za različne aplikacije, vendar pa se je skupina osredotočila na virusno diagnostiko. Gre za ne invaziven test, kjer lahko dobimo rezultate iz sline. Skupina je pokazala predvsem proof of concept, vendar pa bi se pred uporabo takega testa v komercialne namene moralo narediti še klinična testiranja. <br /> Seed pa bi bilo možno uporabljati tudi za druge namene. V zdravstvu bi ga lahko uporabljali tudi za testiranje drugih virusov (predvsem DNA). Možna pa je tudi uporaba v agronomiji in pri testiranju vode in hrane. <br /> <br /> = '''Viri''' =<br /> *[1] Team: “Stanfors - 2020.igem.org.” https://2020.igem.org/Team:Stanford (accessed May 09, 2021)<br /> *[2] Maier, B., Chen, I., Dubnau, D., &amp; Sheetz, M. P. (2004). DNA transport into Bacillus subtilis requires proton motive force to generate large molecular forces. Nature structural &amp; molecular biology, 11(7), 643–649. https://doi.org/10.1038/nsmb783<br /> *[3] Hamoen, L., Venema, G., &amp; Kuipers, O. (2003). Controlling competence in Bacillus subtilis: Shared use of regulators. Microbiology. 149:9-17. Retrieved May 15, 2014, from http://gbb.eldoc.ub.rug.nl/FILES/root/2003/MicrobiolHamoen/2003MicrobiolHamoen.pdf<br /> *[4] Hong, F., Ma, D., Wu, K., Mina, L.A., Luiten, R.C., Liu, Y., Yan, H., Green, A.A. 57214766484;57189763666;57215219536;14037633900;57206179773;57216667908;7403395897;55328809600; Precise and Programmable Detection of Mutations Using Ultraspecific Riboregulators (2020) Cell, 180 (5), pp. 1018-1032.e16. Cited 5 times.</div>

Irma Zeljković https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Samoreplicirajo%C4%8D_komplet_za_testiranje_na_COVID-19&diff=18957 2021-05-11T08:08:49Z

<p>Irma Zeljković: /* Uvod */</p> <hr /> <div>SEED-samoreplicirajoč komplet za testiranje na COVID-19 je iGEM-projekt iz leta 2020. Avtorji projekta so podiplomski študenti univerze v Stanfordu v kaliforniji<br /> <br /> Spletna stran projekta: [https://2020.igem.org/Team:Stanford]<br /> <br /> Avtorica povzetka: Irma Zeljković<br /> <br /> = '''Uvod''' =<br /> Skupina je začela razmišljati o projektu sredi pandemije COVID-19. Ena od glavnih težav je bila takrat pomanjkanje možnosti testiranja, s katero bi lahko lažje spremljali in izolirali primere. Dve glavni takratnih testov, sta bili potreba po izobraženem kadru in dragi reagenti. Skupina je imela idejo, da bi ustvarili test, ki bi lahko repliciral samega sebe in ne bi potreboval usposobljenega kadra in laboratorijske opreme. [1]<br /> <br /> = '''Opis projekta'''=<br /> Sistem, ki so si ga zamislili sestoji iz treh korakov:<br /> * Vnos nukleinske kisline v bakterijsko celico<br /> * Intracelularna detekcija (RNA toehold ali homologna rekombinacija)<br /> * Intracelularno signaliziranje (prek quorum sensing poti)<br /> Rezultati so hitri in kolorimetrični.<br /> == '''Vnos nukleinske kisline iz okolja''' ==<br /> Odločili so se za delo z bakterijo ''Bacillus Subtilis'', saj gre za naravno kompetentno bakterijo, ki je prepoznana kot GRAS. Kompetentna ''B. subtilis'' izraža specializirane proteine, ki so vstavljeni v kompleks za transport DNA prek membrane. ComEA veže nase DNA. Nato na DNA deluje protein ComG, ki pomaga pri prenosu skozi bakterijsko steno. Ob prehodu nanjo delujejo endonukleaze in DNA se cepi na fragmente. Prehod skozi citoplazemsko membrano pa omogoča protein ComEC, ki pa znotraj membrane tvori proteinsko poro in omogoča prehod le enoverižni DNA. Ko je DNA transportirana v celico jo B. subtilis integrira v kromosom. <br /> Naravna kompetenca ''B. subtilis'' je posledica pomanjkanja hranil v okolju. Regulacija kompetence je zelo zapletena, ključna proteina sta ComK in ComX. ComK je transkripcijski faktor, ki se izrazi po končani eksponentni fazi rasti. Njegova ekspresija je stimulirana s feromonom ComX, ki ga izločajo druge celice s pomočjo poti quorum-sensinga zaradi povečane gostote celic. <br /> Skupina se je odločila za uporabo sevov, ki imajo možnost inducibilne superkompetentnosti. <br /> <br /> Za detekciji s t.i. RNA-toehold stikali jo so uporabili sev SCK6. V tem sevu je gen ComK pod kontrolo ksiloznega inducibilnega promotorja PxylA. Dodatek ksiloze v kulturo B. subtilisa povzroči ekspresijo DNA transportnih proteinov in začne kompetentnost. <br /> Za sistem, ki je temeljil na rekombinaciji so uporabili sev REG19. Pri tem sevu je ComK pod kontrolo manitolnega inducibilnega promotorja PmtIA, skupaj z genom za kompetenco ComS. Dodatek manitola v gojišče ' začne kompetentnost bakterij.<br /> == '''Detekcija tarčne sekvence v celici''' ==<br /> Ko je DNA v celici, je naslednji korak intracelularna detekcija. Skupina je poskusila 2 možna pristopa in sicer RNA-toehold stikala integracijo okoljske DNA v genom ''B.subtilis'' s homologno rekombinacijo.<br /> <br /> === Detekcijska metoda 1: RNA toehold stikala===<br /> RNA-toehold stikala so preprosti detektorji, ki jih proizvaja celica in jih lahko uporabljamo ''in vivo'' in ''in vitro''. Gre za enoverižno RNA, katere struktura se tako zvije, da tvori zanko. Takšna RNA je sestavljena iz 5 delov: sprožilca, RBS, začetnega kodona, linkerja in reporterja.<br /> V normalnih razmerah, ko RNA veriga tvori zanko, sta RBS in začetni kodon blokirana in ne more priti do translacije RNA. Ko pa tarčna sekvenca pride v bližino verige RNA, se komplementarno veže na sprožilec in povzroči, da se zanka razvije. To povzroči, da je RBS-mesto izpostavljeno in ribosomi se lahko vežejo na to RNA. <br /> Prednosti tega sistema so, da z lahkoto lahko zamenjamo različne sekvence, da je visoko specifičen, lahko zazna več tarč v eni celici in ga lahko proizvajamo in vivo. <br /> Skupina je naredila toeholde, ki se integrirajo na plazmid pVeg YFP. Sprožilec je komplementaren genu KanR, ki ga je skupina izbrala kot tarčno sekvenco. Za RBS so uporabili sekvenco, ki je v ''B. subtilis'' specifična za vezanje ribosomov. Kot reporter pa so uporabili YFP, saj hitro difuzira in je rumene barve.<br /> <br /> === Detekcijska metoda 2: Homologna rekombinacija===<br /> Drug način detekcije RNA je rekombinacijski sistem ''B. subtilis'', kjer poteče integracija DNA v kromosom s homologno rekombinacijo. Najprej so transformirali plazmid z negativnim selekcijskim markerjem, ki ga obkrožajo homologne regije tarčne sekvence. Ko celica prevzame sekvenco, se začne proces rekombinacije, ki povzroči, da se gen za negativno selekcijo izreže in ga nadomesti tarčna sekvenca. Če ne pride do prevzema DNA, tudi do rekombinacije ne pride in negativen selekcijski marker ostane v celici. Ta pa vodi v smrt celice ob prisotnosti manoze. <br /> <br /> Skupina je zbrala ManP za negativni selekcijski marker. ManP deluje, tako da fosforilira manozo, ko vstopa v celico in tako onemogoča njen izstop iz celice. Sev REG19 ima izbit gen ManA, ki bi manozo spremenila v fruktozo, zato se fosforilirana manoza nabira v celici. <br /> <br /> Prisotnost tarče sekvence povzroči homologno rekombinacijo, saj je skupina svoj sev ''B. subtilis'' načrtovala z dvema regijama homologije tarčnih sekvenc, ki so vključene v genom na obeh straneh kasete ManP. <br /> Prednosti rekombinantnega sistema so, da se ta proces že naravno odvija v ''B. subtilis''. Slabosti pa so specifičnost (lahko pride do več lažno pozitivnih testov), občutljivost (sistem ne zazna tarčnih sekvenc, če jih je premalo) in ima omejeno hitrost. <br /> <br /> == '''Ojačevanje signala za hitreje branje''' ==<br /> Naslednja faza je ojačevanjevidnega signala, ki so ga dobili z enim izmed sistemov. To fazo so le opisali, niso pa je preizkusili v laboratoriju zaradi težav s časom. <br /> Ojačevanje signala je pomembna, saj omogoča merljive rezultate v celi bakterijski koloniji tudi ob prisotnosti zelo malo nukleinske kisline. V ta namen so se odločili, da bojo uporabili quorum sensing. <br /> Ko kultura B. subtilisa doseže kritično gostoto, se aktivirajo quorum sensing molekule. Takšna molekula je na primer ComX, ki aktivira pot za aktivacijo promotorja PsrfA. Posledica tega je, da nastane bakterijski biofilm. <br /> Nova pot, ki jo je skupina naredila, vključuje pozitivno povratno zanko ComX in povzroči, da celice tvorijo fluorescentne proteine (namesto biofilma). To so storili, tako da so prvo izbili endogen ComX, in ga nadomestili s ComX, ki je bil pod kontrolo promotorja srf-A, PsrfA. Pod tem promotorjem bi bili tudi luxABCDE, ki so bioluminiscentni reporterji, ki si jih je skupina izbrala. Želeli so torej doseči, da bi izražanje Comx molekul aktiviralo PsrfA gene, ki bi proizvedli še več ComX in luxABCDE.<br /> Ojačevanje signala so morali združiti z mehanizmoma za zaznavanje DNA. Pri toehold stikalu bi razvitje zanke povzročilo translacijo ComX. Pri homologni rekombinaciji pa bi le-ta omogočila transkripcijo comx. <br /> = '''Uporabljeni biološki deli'''=<br /> <br /> Skupina je poskusila razviti 8 bioloških delov, ki jih lahko razdelimo v tri skupine: reporterji, detektorji, ki temeljijo na rekombinaciji in toehold. Nato pa so konstruirali še napravo za ojačitev signala, ki je niso mogli preizkusiti v laboratoriju. <br /> Prispevek skupine je bil torej devet biokock, saj so mnoge biokocke v registru kompatibilne, vendar ne optimizirane za delo z bakterijo ''B. subtilis''. <br /> <br /> <br /> V tabeli 1 so prikazani vsi biološki deli, ki so jih pripravili med projektom.<br /> <br /> <br /> {|<br /> |+ style=&quot;text-align: left;&quot; | ''Tabela 1: Biološki deli, ki jih je skupina pripravila med projektom. <br /> |-<br /> | '''KODA''' || '''IME S BIOLOŠKEGA DELA'''<br /> |-<br /> | [http://parts.igem.org/wiki/index.php?title=Part:BBa_K3697000 BBa_K3697000] || mCherry BSU<br /> |-<br /> | [http://parts.igem.org/wiki/index.php?title=Part:BBa_K3697008 BBa_K3697008] || YFP CDS<br /> |-<br /> | [http://parts.igem.org/wiki/index.php?title=Part:BBa_K3697010 BBa_K3697010]|| mCherry_BSU Plasmid<br /> |-<br /> | [http://parts.igem.org/wiki/index.php?title=Part:BBa_K3697009 BBa_K3697009 ] || pVEG YFP Plasmid for ''B. subtilis''<br /> |-<br /> | [http://parts.igem.org/wiki/index.php?title=Part:BBa_K3697002 BBa_K3697002] || ManP Expression Casette<br /> |-<br /> | [http://parts.igem.org/wiki/index.php?title=Part:BBa_K3697003 BBa_K3697003] || Homology Arms for KanR Integration In ''B. subtilis''<br /> |-<br /> | [http://parts.igem.org/wiki/index.php?title=Part:BBa_K3697004 BBa_K3697004] || Recombination-Based Detection System for B. subtilis (ManP)<br /> |-<br /> | [http://parts.igem.org/wiki/index.php?title=Part:BBa_K3697011 BBa_K3697011]|| Toehold for Detection of KanR in ''B. subtilis''<br /> |-<br /> | [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3697012 BBa_K3697012] || Signal Amplifier Using ''B. subtilis'' Quorum Sensing Molecule comX<br /> |}<br /> <br /> <br /> <br /> = '''Zaključek''' =<br /> Ideja projekta SEED se lahko uporabi za različne aplikacije, vendar pa se je skupina osredotočila na virusno diagnostiko. Gre za ne invaziven test, kjer lahko dobimo rezultate iz sline. Skupina je pokazala predvsem proof of concept, vendar pa bi se pred uporabo takega testa v komercialne namene moralo narediti še klinična testiranja. <br /> Seed pa bi bilo možno uporabljati tudi za druge namene. V zdravstvu bi ga lahko uporabljali tudi za testiranje drugih virusov (predvsem DNA). Možna pa je tudi uporaba v agronomiji in pri testiranju vode in hrane. <br /> <br /> = '''Viri''' =<br /> *[1] Team: “Stanfors - 2020.igem.org.” https://2020.igem.org/Team:Stanford (accessed May 09, 2021)<br /> *[2] Maier, B., Chen, I., Dubnau, D., &amp; Sheetz, M. P. (2004). DNA transport into Bacillus subtilis requires proton motive force to generate large molecular forces. Nature structural &amp; molecular biology, 11(7), 643–649. https://doi.org/10.1038/nsmb783<br /> *[3] Hamoen, L., Venema, G., &amp; Kuipers, O. (2003). Controlling competence in Bacillus subtilis: Shared use of regulators. Microbiology. 149:9-17. Retrieved May 15, 2014, from http://gbb.eldoc.ub.rug.nl/FILES/root/2003/MicrobiolHamoen/2003MicrobiolHamoen.pdf<br /> *[4] Hong, F., Ma, D., Wu, K., Mina, L.A., Luiten, R.C., Liu, Y., Yan, H., Green, A.A. 57214766484;57189763666;57215219536;14037633900;57206179773;57216667908;7403395897;55328809600; Precise and Programmable Detection of Mutations Using Ultraspecific Riboregulators (2020) Cell, 180 (5), pp. 1018-1032.e16. Cited 5 times.</div>

Irma Zeljković https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Samoreplicirajo%C4%8D_komplet_za_testiranje_na_COVID-19&diff=18956 2021-05-11T08:08:23Z

<p>Irma Zeljković: /* Viri */</p> <hr /> <div>SEED-samoreplicirajoč komplet za testiranje na COVID-19 je iGEM-projekt iz leta 2020. Avtorji projekta so podiplomski študenti univerze v Stanfordu v kaliforniji<br /> <br /> Spletna stran projekta: [https://2020.igem.org/Team:Stanford]<br /> <br /> Avtorica povzetka: Irma Zeljković<br /> <br /> = '''Uvod''' =<br /> Skupina je začela razmišljati o projektu sredi pandemije COVID-19. Ena od glavnih težav je bila takrat pomanjkanje možnosti testiranja, s katero bi lahko lažje spremljali in izolirali primere. Dve glavni takratnih testov, sta bili potreba po izobraženem kadru in dragi reagenti. Skupina je imela idejo, da bi ustvarili test, ki bi lahko repliciral samega sebe in ne bi potreboval usposobljenega kadra in laboratorijske opreme.<br /> <br /> = '''Opis projekta'''=<br /> Sistem, ki so si ga zamislili sestoji iz treh korakov:<br /> * Vnos nukleinske kisline v bakterijsko celico<br /> * Intracelularna detekcija (RNA toehold ali homologna rekombinacija)<br /> * Intracelularno signaliziranje (prek quorum sensing poti)<br /> Rezultati so hitri in kolorimetrični.<br /> == '''Vnos nukleinske kisline iz okolja''' ==<br /> Odločili so se za delo z bakterijo ''Bacillus Subtilis'', saj gre za naravno kompetentno bakterijo, ki je prepoznana kot GRAS. Kompetentna ''B. subtilis'' izraža specializirane proteine, ki so vstavljeni v kompleks za transport DNA prek membrane. ComEA veže nase DNA. Nato na DNA deluje protein ComG, ki pomaga pri prenosu skozi bakterijsko steno. Ob prehodu nanjo delujejo endonukleaze in DNA se cepi na fragmente. Prehod skozi citoplazemsko membrano pa omogoča protein ComEC, ki pa znotraj membrane tvori proteinsko poro in omogoča prehod le enoverižni DNA. Ko je DNA transportirana v celico jo B. subtilis integrira v kromosom. <br /> Naravna kompetenca ''B. subtilis'' je posledica pomanjkanja hranil v okolju. Regulacija kompetence je zelo zapletena, ključna proteina sta ComK in ComX. ComK je transkripcijski faktor, ki se izrazi po končani eksponentni fazi rasti. Njegova ekspresija je stimulirana s feromonom ComX, ki ga izločajo druge celice s pomočjo poti quorum-sensinga zaradi povečane gostote celic. <br /> Skupina se je odločila za uporabo sevov, ki imajo možnost inducibilne superkompetentnosti. <br /> <br /> Za detekciji s t.i. RNA-toehold stikali jo so uporabili sev SCK6. V tem sevu je gen ComK pod kontrolo ksiloznega inducibilnega promotorja PxylA. Dodatek ksiloze v kulturo B. subtilisa povzroči ekspresijo DNA transportnih proteinov in začne kompetentnost. <br /> Za sistem, ki je temeljil na rekombinaciji so uporabili sev REG19. Pri tem sevu je ComK pod kontrolo manitolnega inducibilnega promotorja PmtIA, skupaj z genom za kompetenco ComS. Dodatek manitola v gojišče ' začne kompetentnost bakterij.<br /> == '''Detekcija tarčne sekvence v celici''' ==<br /> Ko je DNA v celici, je naslednji korak intracelularna detekcija. Skupina je poskusila 2 možna pristopa in sicer RNA-toehold stikala integracijo okoljske DNA v genom ''B.subtilis'' s homologno rekombinacijo.<br /> <br /> === Detekcijska metoda 1: RNA toehold stikala===<br /> RNA-toehold stikala so preprosti detektorji, ki jih proizvaja celica in jih lahko uporabljamo ''in vivo'' in ''in vitro''. Gre za enoverižno RNA, katere struktura se tako zvije, da tvori zanko. Takšna RNA je sestavljena iz 5 delov: sprožilca, RBS, začetnega kodona, linkerja in reporterja.<br /> V normalnih razmerah, ko RNA veriga tvori zanko, sta RBS in začetni kodon blokirana in ne more priti do translacije RNA. Ko pa tarčna sekvenca pride v bližino verige RNA, se komplementarno veže na sprožilec in povzroči, da se zanka razvije. To povzroči, da je RBS-mesto izpostavljeno in ribosomi se lahko vežejo na to RNA. <br /> Prednosti tega sistema so, da z lahkoto lahko zamenjamo različne sekvence, da je visoko specifičen, lahko zazna več tarč v eni celici in ga lahko proizvajamo in vivo. <br /> Skupina je naredila toeholde, ki se integrirajo na plazmid pVeg YFP. Sprožilec je komplementaren genu KanR, ki ga je skupina izbrala kot tarčno sekvenco. Za RBS so uporabili sekvenco, ki je v ''B. subtilis'' specifična za vezanje ribosomov. Kot reporter pa so uporabili YFP, saj hitro difuzira in je rumene barve.<br /> <br /> === Detekcijska metoda 2: Homologna rekombinacija===<br /> Drug način detekcije RNA je rekombinacijski sistem ''B. subtilis'', kjer poteče integracija DNA v kromosom s homologno rekombinacijo. Najprej so transformirali plazmid z negativnim selekcijskim markerjem, ki ga obkrožajo homologne regije tarčne sekvence. Ko celica prevzame sekvenco, se začne proces rekombinacije, ki povzroči, da se gen za negativno selekcijo izreže in ga nadomesti tarčna sekvenca. Če ne pride do prevzema DNA, tudi do rekombinacije ne pride in negativen selekcijski marker ostane v celici. Ta pa vodi v smrt celice ob prisotnosti manoze. <br /> <br /> Skupina je zbrala ManP za negativni selekcijski marker. ManP deluje, tako da fosforilira manozo, ko vstopa v celico in tako onemogoča njen izstop iz celice. Sev REG19 ima izbit gen ManA, ki bi manozo spremenila v fruktozo, zato se fosforilirana manoza nabira v celici. <br /> <br /> Prisotnost tarče sekvence povzroči homologno rekombinacijo, saj je skupina svoj sev ''B. subtilis'' načrtovala z dvema regijama homologije tarčnih sekvenc, ki so vključene v genom na obeh straneh kasete ManP. <br /> Prednosti rekombinantnega sistema so, da se ta proces že naravno odvija v ''B. subtilis''. Slabosti pa so specifičnost (lahko pride do več lažno pozitivnih testov), občutljivost (sistem ne zazna tarčnih sekvenc, če jih je premalo) in ima omejeno hitrost. <br /> <br /> == '''Ojačevanje signala za hitreje branje''' ==<br /> Naslednja faza je ojačevanjevidnega signala, ki so ga dobili z enim izmed sistemov. To fazo so le opisali, niso pa je preizkusili v laboratoriju zaradi težav s časom. <br /> Ojačevanje signala je pomembna, saj omogoča merljive rezultate v celi bakterijski koloniji tudi ob prisotnosti zelo malo nukleinske kisline. V ta namen so se odločili, da bojo uporabili quorum sensing. <br /> Ko kultura B. subtilisa doseže kritično gostoto, se aktivirajo quorum sensing molekule. Takšna molekula je na primer ComX, ki aktivira pot za aktivacijo promotorja PsrfA. Posledica tega je, da nastane bakterijski biofilm. <br /> Nova pot, ki jo je skupina naredila, vključuje pozitivno povratno zanko ComX in povzroči, da celice tvorijo fluorescentne proteine (namesto biofilma). To so storili, tako da so prvo izbili endogen ComX, in ga nadomestili s ComX, ki je bil pod kontrolo promotorja srf-A, PsrfA. Pod tem promotorjem bi bili tudi luxABCDE, ki so bioluminiscentni reporterji, ki si jih je skupina izbrala. Želeli so torej doseči, da bi izražanje Comx molekul aktiviralo PsrfA gene, ki bi proizvedli še več ComX in luxABCDE.<br /> Ojačevanje signala so morali združiti z mehanizmoma za zaznavanje DNA. Pri toehold stikalu bi razvitje zanke povzročilo translacijo ComX. Pri homologni rekombinaciji pa bi le-ta omogočila transkripcijo comx. <br /> = '''Uporabljeni biološki deli'''=<br /> <br /> Skupina je poskusila razviti 8 bioloških delov, ki jih lahko razdelimo v tri skupine: reporterji, detektorji, ki temeljijo na rekombinaciji in toehold. Nato pa so konstruirali še napravo za ojačitev signala, ki je niso mogli preizkusiti v laboratoriju. <br /> Prispevek skupine je bil torej devet biokock, saj so mnoge biokocke v registru kompatibilne, vendar ne optimizirane za delo z bakterijo ''B. subtilis''. <br /> <br /> <br /> V tabeli 1 so prikazani vsi biološki deli, ki so jih pripravili med projektom.<br /> <br /> <br /> {|<br /> |+ style=&quot;text-align: left;&quot; | ''Tabela 1: Biološki deli, ki jih je skupina pripravila med projektom. <br /> |-<br /> | '''KODA''' || '''IME S BIOLOŠKEGA DELA'''<br /> |-<br /> | [http://parts.igem.org/wiki/index.php?title=Part:BBa_K3697000 BBa_K3697000] || mCherry BSU<br /> |-<br /> | [http://parts.igem.org/wiki/index.php?title=Part:BBa_K3697008 BBa_K3697008] || YFP CDS<br /> |-<br /> | [http://parts.igem.org/wiki/index.php?title=Part:BBa_K3697010 BBa_K3697010]|| mCherry_BSU Plasmid<br /> |-<br /> | [http://parts.igem.org/wiki/index.php?title=Part:BBa_K3697009 BBa_K3697009 ] || pVEG YFP Plasmid for ''B. subtilis''<br /> |-<br /> | [http://parts.igem.org/wiki/index.php?title=Part:BBa_K3697002 BBa_K3697002] || ManP Expression Casette<br /> |-<br /> | [http://parts.igem.org/wiki/index.php?title=Part:BBa_K3697003 BBa_K3697003] || Homology Arms for KanR Integration In ''B. subtilis''<br /> |-<br /> | [http://parts.igem.org/wiki/index.php?title=Part:BBa_K3697004 BBa_K3697004] || Recombination-Based Detection System for B. subtilis (ManP)<br /> |-<br /> | [http://parts.igem.org/wiki/index.php?title=Part:BBa_K3697011 BBa_K3697011]|| Toehold for Detection of KanR in ''B. subtilis''<br /> |-<br /> | [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3697012 BBa_K3697012] || Signal Amplifier Using ''B. subtilis'' Quorum Sensing Molecule comX<br /> |}<br /> <br /> <br /> <br /> = '''Zaključek''' =<br /> Ideja projekta SEED se lahko uporabi za različne aplikacije, vendar pa se je skupina osredotočila na virusno diagnostiko. Gre za ne invaziven test, kjer lahko dobimo rezultate iz sline. Skupina je pokazala predvsem proof of concept, vendar pa bi se pred uporabo takega testa v komercialne namene moralo narediti še klinična testiranja. <br /> Seed pa bi bilo možno uporabljati tudi za druge namene. V zdravstvu bi ga lahko uporabljali tudi za testiranje drugih virusov (predvsem DNA). Možna pa je tudi uporaba v agronomiji in pri testiranju vode in hrane. <br /> <br /> = '''Viri''' =<br /> *[1] Team: “Stanfors - 2020.igem.org.” https://2020.igem.org/Team:Stanford (accessed May 09, 2021)<br /> *[2] Maier, B., Chen, I., Dubnau, D., &amp; Sheetz, M. P. (2004). DNA transport into Bacillus subtilis requires proton motive force to generate large molecular forces. Nature structural &amp; molecular biology, 11(7), 643–649. https://doi.org/10.1038/nsmb783<br /> *[3] Hamoen, L., Venema, G., &amp; Kuipers, O. (2003). Controlling competence in Bacillus subtilis: Shared use of regulators. Microbiology. 149:9-17. Retrieved May 15, 2014, from http://gbb.eldoc.ub.rug.nl/FILES/root/2003/MicrobiolHamoen/2003MicrobiolHamoen.pdf<br /> *[4] Hong, F., Ma, D., Wu, K., Mina, L.A., Luiten, R.C., Liu, Y., Yan, H., Green, A.A. 57214766484;57189763666;57215219536;14037633900;57206179773;57216667908;7403395897;55328809600; Precise and Programmable Detection of Mutations Using Ultraspecific Riboregulators (2020) Cell, 180 (5), pp. 1018-1032.e16. Cited 5 times.</div>

Irma Zeljković https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Samoreplicirajo%C4%8D_komplet_za_testiranje_na_COVID-19&diff=18937 2021-05-10T20:07:12Z

<p>Irma Zeljković: New page: SEED-samoreplicirajoč komplet za testiranje na COVID-19 je iGEM-projekt iz leta 2020. Avtorji projekta so podiplomski študenti univerze v Stanfordu v kaliforniji Spletna stran projekta:...</p> <hr /> <div>SEED-samoreplicirajoč komplet za testiranje na COVID-19 je iGEM-projekt iz leta 2020. Avtorji projekta so podiplomski študenti univerze v Stanfordu v kaliforniji<br /> <br /> Spletna stran projekta: [https://2020.igem.org/Team:Stanford]<br /> <br /> Avtorica povzetka: Irma Zeljković<br /> <br /> = '''Uvod''' =<br /> Skupina je začela razmišljati o projektu sredi pandemije COVID-19. Ena od glavnih težav je bila takrat pomanjkanje možnosti testiranja, s katero bi lahko lažje spremljali in izolirali primere. Dve glavni takratnih testov, sta bili potreba po izobraženem kadru in dragi reagenti. Skupina je imela idejo, da bi ustvarili test, ki bi lahko repliciral samega sebe in ne bi potreboval usposobljenega kadra in laboratorijske opreme.<br /> <br /> = '''Opis projekta'''=<br /> Sistem, ki so si ga zamislili sestoji iz treh korakov:<br /> * Vnos nukleinske kisline v bakterijsko celico<br /> * Intracelularna detekcija (RNA toehold ali homologna rekombinacija)<br /> * Intracelularno signaliziranje (prek quorum sensing poti)<br /> Rezultati so hitri in kolorimetrični.<br /> == '''Vnos nukleinske kisline iz okolja''' ==<br /> Odločili so se za delo z bakterijo ''Bacillus Subtilis'', saj gre za naravno kompetentno bakterijo, ki je prepoznana kot GRAS. Kompetentna ''B. subtilis'' izraža specializirane proteine, ki so vstavljeni v kompleks za transport DNA prek membrane. ComEA veže nase DNA. Nato na DNA deluje protein ComG, ki pomaga pri prenosu skozi bakterijsko steno. Ob prehodu nanjo delujejo endonukleaze in DNA se cepi na fragmente. Prehod skozi citoplazemsko membrano pa omogoča protein ComEC, ki pa znotraj membrane tvori proteinsko poro in omogoča prehod le enoverižni DNA. Ko je DNA transportirana v celico jo B. subtilis integrira v kromosom. <br /> Naravna kompetenca ''B. subtilis'' je posledica pomanjkanja hranil v okolju. Regulacija kompetence je zelo zapletena, ključna proteina sta ComK in ComX. ComK je transkripcijski faktor, ki se izrazi po končani eksponentni fazi rasti. Njegova ekspresija je stimulirana s feromonom ComX, ki ga izločajo druge celice s pomočjo poti quorum-sensinga zaradi povečane gostote celic. <br /> Skupina se je odločila za uporabo sevov, ki imajo možnost inducibilne superkompetentnosti. <br /> <br /> Za detekciji s t.i. RNA-toehold stikali jo so uporabili sev SCK6. V tem sevu je gen ComK pod kontrolo ksiloznega inducibilnega promotorja PxylA. Dodatek ksiloze v kulturo B. subtilisa povzroči ekspresijo DNA transportnih proteinov in začne kompetentnost. <br /> Za sistem, ki je temeljil na rekombinaciji so uporabili sev REG19. Pri tem sevu je ComK pod kontrolo manitolnega inducibilnega promotorja PmtIA, skupaj z genom za kompetenco ComS. Dodatek manitola v gojišče ' začne kompetentnost bakterij.<br /> == '''Detekcija tarčne sekvence v celici''' ==<br /> Ko je DNA v celici, je naslednji korak intracelularna detekcija. Skupina je poskusila 2 možna pristopa in sicer RNA-toehold stikala integracijo okoljske DNA v genom ''B.subtilis'' s homologno rekombinacijo.<br /> <br /> === Detekcijska metoda 1: RNA toehold stikala===<br /> RNA-toehold stikala so preprosti detektorji, ki jih proizvaja celica in jih lahko uporabljamo ''in vivo'' in ''in vitro''. Gre za enoverižno RNA, katere struktura se tako zvije, da tvori zanko. Takšna RNA je sestavljena iz 5 delov: sprožilca, RBS, začetnega kodona, linkerja in reporterja.<br /> V normalnih razmerah, ko RNA veriga tvori zanko, sta RBS in začetni kodon blokirana in ne more priti do translacije RNA. Ko pa tarčna sekvenca pride v bližino verige RNA, se komplementarno veže na sprožilec in povzroči, da se zanka razvije. To povzroči, da je RBS-mesto izpostavljeno in ribosomi se lahko vežejo na to RNA. <br /> Prednosti tega sistema so, da z lahkoto lahko zamenjamo različne sekvence, da je visoko specifičen, lahko zazna več tarč v eni celici in ga lahko proizvajamo in vivo. <br /> Skupina je naredila toeholde, ki se integrirajo na plazmid pVeg YFP. Sprožilec je komplementaren genu KanR, ki ga je skupina izbrala kot tarčno sekvenco. Za RBS so uporabili sekvenco, ki je v ''B. subtilis'' specifična za vezanje ribosomov. Kot reporter pa so uporabili YFP, saj hitro difuzira in je rumene barve.<br /> <br /> === Detekcijska metoda 2: Homologna rekombinacija===<br /> Drug način detekcije RNA je rekombinacijski sistem ''B. subtilis'', kjer poteče integracija DNA v kromosom s homologno rekombinacijo. Najprej so transformirali plazmid z negativnim selekcijskim markerjem, ki ga obkrožajo homologne regije tarčne sekvence. Ko celica prevzame sekvenco, se začne proces rekombinacije, ki povzroči, da se gen za negativno selekcijo izreže in ga nadomesti tarčna sekvenca. Če ne pride do prevzema DNA, tudi do rekombinacije ne pride in negativen selekcijski marker ostane v celici. Ta pa vodi v smrt celice ob prisotnosti manoze. <br /> <br /> Skupina je zbrala ManP za negativni selekcijski marker. ManP deluje, tako da fosforilira manozo, ko vstopa v celico in tako onemogoča njen izstop iz celice. Sev REG19 ima izbit gen ManA, ki bi manozo spremenila v fruktozo, zato se fosforilirana manoza nabira v celici. <br /> <br /> Prisotnost tarče sekvence povzroči homologno rekombinacijo, saj je skupina svoj sev ''B. subtilis'' načrtovala z dvema regijama homologije tarčnih sekvenc, ki so vključene v genom na obeh straneh kasete ManP. <br /> Prednosti rekombinantnega sistema so, da se ta proces že naravno odvija v ''B. subtilis''. Slabosti pa so specifičnost (lahko pride do več lažno pozitivnih testov), občutljivost (sistem ne zazna tarčnih sekvenc, če jih je premalo) in ima omejeno hitrost. <br /> <br /> == '''Ojačevanje signala za hitreje branje''' ==<br /> Naslednja faza je ojačevanjevidnega signala, ki so ga dobili z enim izmed sistemov. To fazo so le opisali, niso pa je preizkusili v laboratoriju zaradi težav s časom. <br /> Ojačevanje signala je pomembna, saj omogoča merljive rezultate v celi bakterijski koloniji tudi ob prisotnosti zelo malo nukleinske kisline. V ta namen so se odločili, da bojo uporabili quorum sensing. <br /> Ko kultura B. subtilisa doseže kritično gostoto, se aktivirajo quorum sensing molekule. Takšna molekula je na primer ComX, ki aktivira pot za aktivacijo promotorja PsrfA. Posledica tega je, da nastane bakterijski biofilm. <br /> Nova pot, ki jo je skupina naredila, vključuje pozitivno povratno zanko ComX in povzroči, da celice tvorijo fluorescentne proteine (namesto biofilma). To so storili, tako da so prvo izbili endogen ComX, in ga nadomestili s ComX, ki je bil pod kontrolo promotorja srf-A, PsrfA. Pod tem promotorjem bi bili tudi luxABCDE, ki so bioluminiscentni reporterji, ki si jih je skupina izbrala. Želeli so torej doseči, da bi izražanje Comx molekul aktiviralo PsrfA gene, ki bi proizvedli še več ComX in luxABCDE.<br /> Ojačevanje signala so morali združiti z mehanizmoma za zaznavanje DNA. Pri toehold stikalu bi razvitje zanke povzročilo translacijo ComX. Pri homologni rekombinaciji pa bi le-ta omogočila transkripcijo comx. <br /> = '''Uporabljeni biološki deli'''=<br /> <br /> Skupina je poskusila razviti 8 bioloških delov, ki jih lahko razdelimo v tri skupine: reporterji, detektorji, ki temeljijo na rekombinaciji in toehold. Nato pa so konstruirali še napravo za ojačitev signala, ki je niso mogli preizkusiti v laboratoriju. <br /> Prispevek skupine je bil torej devet biokock, saj so mnoge biokocke v registru kompatibilne, vendar ne optimizirane za delo z bakterijo ''B. subtilis''. <br /> <br /> <br /> V tabeli 1 so prikazani vsi biološki deli, ki so jih pripravili med projektom.<br /> <br /> <br /> {|<br /> |+ style=&quot;text-align: left;&quot; | ''Tabela 1: Biološki deli, ki jih je skupina pripravila med projektom. <br /> |-<br /> | '''KODA''' || '''IME S BIOLOŠKEGA DELA'''<br /> |-<br /> | [http://parts.igem.org/wiki/index.php?title=Part:BBa_K3697000 BBa_K3697000] || mCherry BSU<br /> |-<br /> | [http://parts.igem.org/wiki/index.php?title=Part:BBa_K3697008 BBa_K3697008] || YFP CDS<br /> |-<br /> | [http://parts.igem.org/wiki/index.php?title=Part:BBa_K3697010 BBa_K3697010]|| mCherry_BSU Plasmid<br /> |-<br /> | [http://parts.igem.org/wiki/index.php?title=Part:BBa_K3697009 BBa_K3697009 ] || pVEG YFP Plasmid for ''B. subtilis''<br /> |-<br /> | [http://parts.igem.org/wiki/index.php?title=Part:BBa_K3697002 BBa_K3697002] || ManP Expression Casette<br /> |-<br /> | [http://parts.igem.org/wiki/index.php?title=Part:BBa_K3697003 BBa_K3697003] || Homology Arms for KanR Integration In ''B. subtilis''<br /> |-<br /> | [http://parts.igem.org/wiki/index.php?title=Part:BBa_K3697004 BBa_K3697004] || Recombination-Based Detection System for B. subtilis (ManP)<br /> |-<br /> | [http://parts.igem.org/wiki/index.php?title=Part:BBa_K3697011 BBa_K3697011]|| Toehold for Detection of KanR in ''B. subtilis''<br /> |-<br /> | [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3697012 BBa_K3697012] || Signal Amplifier Using ''B. subtilis'' Quorum Sensing Molecule comX<br /> |}<br /> <br /> <br /> <br /> = '''Zaključek''' =<br /> Ideja projekta SEED se lahko uporabi za različne aplikacije, vendar pa se je skupina osredotočila na virusno diagnostiko. Gre za ne invaziven test, kjer lahko dobimo rezultate iz sline. Skupina je pokazala predvsem proof of concept, vendar pa bi se pred uporabo takega testa v komercialne namene moralo narediti še klinična testiranja. <br /> Seed pa bi bilo možno uporabljati tudi za druge namene. V zdravstvu bi ga lahko uporabljali tudi za testiranje drugih virusov (predvsem DNA). Možna pa je tudi uporaba v agronomiji in pri testiranju vode in hrane. <br /> <br /> = '''Viri''' =</div>

Irma Zeljković https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Seminarji_SB_2020/21&diff=18935 2021-05-10T19:59:09Z

<p>Irma Zeljković: </p> <hr /> <div>V študijskem letu 2020/21 študentje 1. letnika predstavljajo naslednje teme: <br /> <br /> RAZISKOVALNI ČLANKI<br /> <br /> (Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) &lt;br&gt;<br /> <br /> 1 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Proizvodnja_1,3-propandiola_iz_različnih_ogljikovodikov_po_nenaravni_poti_preko_3-hidroksipropanojske_kisline Proizvodnja 1,3-propandiola iz različnih ogljikovodikov po nenaravni poti preko 3-hidroksipropanojske kisline] <br /> (Liza Ulčakar) &lt;br&gt;<br /> 2 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Doseganje_asimetri%C4%8Dnosti_in_asimetri%C4%8Dne_delitve_pri_E._coli Doseganje asimetričnosti in asimetrične delitve pri E. coli] (Aljaž Bratina) &lt;br&gt;<br /> 3 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Zmanj%C5%A1ana_procesivnost_ribosomov_v_sistemu_PURE Zmanjšana procesivnost ribosomov v sistemu PURE] (Tina Kolenc Milavec) &lt;br&gt;<br /> 4 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Na%C4%8Drtovana_pot_zvijanja_proteinskih_origamijev Načrtovana pot zvijanja proteinskih origamijev] (Anamarija Agnič) &lt;br&gt;<br /> 5 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/U%C4%8Dinkovita_svetlobno_inducibilna_Dre_rekombinaza_za_%C4%8Dasovno_in_prostorsko_celi%C4%8Dno_specifi%C4%8Dno_urejanje_genoma_v_mi%C5%A1jih_modelih#VIRI Učinkovita svetlobno inducibilna Dre rekombinaza za časovno in prostorsko celično specifično urejanje genoma v mišjih modelih] (Nika Mikulič Vernik) &lt;br&gt;<br /> 6 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Vzpostavitev_termometra_tRNA_za_dolo%C4%8Danje_temperature_optimalne_rasti_mikroorganizmov Vzpostavitev termometra tRNA za določanje temperature optimalne rasti mikroorganizmov] (Urša Štrancar) &lt;br&gt;<br /> 7 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Racionalna_zasnova_minimalnih_sinteti%C4%8Dnih_promotorjev_za_rastline#Construction_of_plasmids Racionalna zasnova minimalnih sintetičnih promotorjev za rastline] (Almina Tahirović) &lt;br&gt;<br /> 8 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Reverzibilna_toplotna_regulacija_za_bifunkcionalno_dinamično_uravnavanje_izražanja_genov_v_E._coli Reverzibilna toplotna regulacija za bifunkcionalno dinamično uravnavanje izražanja genov v E. coli] (Urška Fajdiga) &lt;br&gt;<br /> 9 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sinteti%C4%8Dna_optogenetska_naprava_na_osnovi_BRET_za_pulzirajo%C4%8Do_ekspresijo_transgena%2C_ki_omogo%C4%8Da_glukozno_homeostazo_pri_mi%C5%A1ih Sintetična optogenetska naprava na osnovi BRET za pulzirajočo ekspresijo transgena, ki omogoča glukozno homeostazo pri miših] (Paula Horvat) &lt;br&gt;<br /> 10 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Hkratna_karakterizacija_več_različnih_racionalno_načrtovanih_promotorskih_arhitektur Vpogled v kombinatorno logiko z IPTG induciranih sistemov] (Urška Zagorc) &lt;br&gt;<br /> 11 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Ponovno_določanje_specifičnosti_izven_citoplazme_aktivnih_sigma_faktorjev Ponovno določanje specifičnosti izven citoplazme aktivnih sigma faktorjev] (Eva Keber) &lt;br&gt;<br /> 12 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Hierarhi%C4%8Dno_sestavljanje_asimetri%C4%8Dnih_ikozaedri%C4%8Dnih_virusnih_kapsid Hierarhično sestavljanje asimetričnih ikozaedričnih virusnih kapsid] (Urška Pečarič Strnad)<br /> <br /> NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI <br /> <br /> (Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.) &lt;br&gt;<br /> <br /> 1 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/RESHAPE_-_spreminjanje_morfologije_nitastih_gliv RESHAPE - spreminjanje morfologije nitastih gliv] <br /> (Špela Supej) &lt;br&gt;<br /> 2 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/The_Chlamy_Cleaner:_razgradnja_pesticida_z_zeleno_algo The Chlamy Cleaner: razgradnja pesticida z zeleno algo] (Doroteja Armič) &lt;br&gt;<br /> 3 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/TheraPUFA:_nazalni_probiotik_proti_okužbam_in_vnetjem TheraPUFA- nazalni probiotik proti okužbam in vnetjem] (Barbara Slapnik) &lt;br&gt;<br /> 4 [[S-POP: Modularni biosenzor za zaznavanje obstojnih organskih onesnaževal v okoljskih vodah]] (Tadej Medved) &lt;br&gt;<br /> 5 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/MARS-magnetni_sistem_za_recikliranje_ATP MARS-magnetni sistem za recikliranje ATP] (David Miškić) &lt;br&gt;<br /> 6 [[B.O.T.: Bakterijska oscilacijska terapija za zdravljenje kolorektalnega raka]] (Neža Pavko) &lt;br&gt;<br /> 7 [[Rapidemic razvoj novega kompleta za hitro diagnostiko na mestu oskrbe]] (Mirsad Mešić) &lt;br&gt;<br /> 8 [[iGEMINI: Kvasovke kot prehransko dopolnilo v vesolju]] (Klementina Polanec) &lt;br&gt;<br /> 9 [[Antea-Glyphosate: Detekcija in razgradnja glifosata]] (Jernej Imperl) &lt;br&gt;<br /> 10 [[NANOFLEX: Standardiziran, prilagodljiv in priročen celični biosenzor]] (Martin Špendl) &lt;br&gt;<br /> 11 [[FlavoFlow: ribogojniška zaščita pred okužbami rib]] (Mateja Žvipelj) &lt;br&gt;<br /> 12 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/samoreplicirajoč_komplet_za_testiranje_na_COVID-19 Samoreplicirajoč komplet za testiranje na COVID-19] (Irma Zeljković) &lt;br&gt;<br /> <br /> ----<br /> <br /> Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Povzetek je treba objaviti dva dni pred predstavitvijo do polnoči (za seminarje v sredo torej v ponedeljek). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo razprava, ki praviloma ne bo daljša od 5 minut.</div>

Irma Zeljković https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=BNT-seminar&diff=17968 2021-03-15T17:22:48Z

<p>Irma Zeljković: /* Seznam seminarjev */</p> <hr /> <div>= Bionanotehnologija 2021- seminar =<br /> doc. dr. Gregor Gunčar, K2.022<br /> <br /> == Seznam seminarjev ==<br /> <br /> {| {{table}}<br /> | align=&quot;center&quot; style=&quot;background:#f0f0f0;&quot;|'''Vpisna številka'''<br /> 30170005 &lt;br /&gt;<br /> 30019058 &lt;br /&gt;<br /> 30170022 &lt;br /&gt;<br /> 30200303 &lt;br /&gt;<br /> 30019363 &lt;br /&gt;<br /> 30200310 &lt;br /&gt;<br /> 30019057 &lt;br /&gt;<br /> 30170131 &lt;br /&gt;<br /> 30170078 &lt;br /&gt;<br /> 30019040 &lt;br /&gt;<br /> 30170177 &lt;br /&gt;<br /> 30200324 &lt;br /&gt;<br /> 30200315 &lt;br /&gt;<br /> 30019063 &lt;br /&gt;<br /> 30200312 &lt;br /&gt;<br /> 30170002 &lt;br /&gt;<br /> 30170103 &lt;br /&gt;<br /> 30200319 &lt;br /&gt;<br /> 30200309 &lt;br /&gt;<br /> 30200322 &lt;br /&gt;<br /> 30200320 &lt;br /&gt;<br /> 30019056 &lt;br /&gt;<br /> 30200311 &lt;br /&gt;<br /> 30200306 &lt;br /&gt;<br /> 30170243 &lt;br /&gt;<br /> 30019051 &lt;br /&gt;<br /> 30170141 &lt;br /&gt;<br /> 30170061 &lt;br /&gt;<br /> 30019035 &lt;br /&gt;<br /> 30200316 &lt;br /&gt;<br /> 30170222 &lt;br /&gt;<br /> 30200317 &lt;br /&gt;<br /> 30170193 &lt;br /&gt;<br /> 30200307 &lt;br /&gt;<br /> 30200321 &lt;br /&gt;<br /> | align=&quot;center&quot; style=&quot;background:#f0f0f0;&quot;|'''datum predstavitve'''<br /> 16.3.2021 &lt;br /&gt;<br /> 16.3.2021 &lt;br /&gt;<br /> 16.3.2021 &lt;br /&gt;<br /> 23.3.2021 &lt;br /&gt;<br /> 23.3.2021 &lt;br /&gt;<br /> 23.3.2021 &lt;br /&gt;<br /> 30.3.2021 &lt;br /&gt;<br /> 6.4.2021 &lt;br /&gt;<br /> 6.4.2021 &lt;br /&gt;<br /> 6.4.2021 &lt;br /&gt;<br /> 13.4.2021 &lt;br /&gt;<br /> 13.4.2021 &lt;br /&gt;<br /> 13.4.2021 &lt;br /&gt;<br /> 20.4.2021 &lt;br /&gt;<br /> 20.4.2021 &lt;br /&gt;<br /> 4.5.2021 &lt;br /&gt;<br /> 4.5.2021 &lt;br /&gt;<br /> 23.3.2021 &lt;br /&gt;<br /> 20.4.2020 &lt;br /&gt;<br /> 20.4.2020 &lt;br /&gt;<br /> 6.4.2021 &lt;br /&gt;<br /> 4.5.2021 &lt;br /&gt;<br /> 11.5.2021 &lt;br /&gt;<br /> 18.5.2021 &lt;br /&gt;<br /> 4.5.2021 &lt;br /&gt;<br /> 11.5.2021 &lt;br /&gt;<br /> 11.5.2021 &lt;br /&gt;<br /> 4.5.2021 &lt;br /&gt;<br /> 11.5.2021 &lt;br /&gt;<br /> 18.5.2021 &lt;br /&gt;<br /> 30.3.2021 &lt;br /&gt;<br /> 13.4.2021 &lt;br /&gt;<br /> 11.5.2021 &lt;br /&gt;<br /> 18.5.2021 &lt;br /&gt;<br /> 18.5.2021 &lt;br /&gt;<br /> | align=&quot;center&quot; style=&quot;background:#f0f0f0;&quot;|'''recenzent1'''<br /> Anamarija Agnič &lt;br /&gt;<br /> Aljaž Bratina &lt;br /&gt;<br /> Matija Ruparčič &lt;br /&gt;<br /> Urban Hribar &lt;br /&gt;<br /> Sabina Sladič Oblak &lt;br /&gt;<br /> Irma Zeljković &lt;br /&gt;<br /> Barbara Slapnik &lt;br /&gt;<br /> Tina Kolenc Milavec &lt;br /&gt;<br /> Klementina Polanec &lt;br /&gt;<br /> Ajda Godec &lt;br /&gt;<br /> Martin Špendl &lt;br /&gt;<br /> Tjaša Mlakar &lt;br /&gt;<br /> Urša Lovše &lt;br /&gt;<br /> Sara Laznik &lt;br /&gt;<br /> Neža Pvko &lt;br /&gt;<br /> Doroteja Armič &lt;br /&gt;<br /> Martina Lokar &lt;br /&gt;<br /> Martin Špendl &lt;br /&gt;<br /> Saša Slabe &lt;br /&gt;<br /> Eva Keber &lt;br /&gt;<br /> Mateja Žvipelj &lt;br /&gt;<br /> Špela Supej &lt;br /&gt;<br /> Urška Fajdiga &lt;br /&gt;<br /> Ernestina Lavrih &lt;br /&gt;<br /> Nika Mikulič Vernik &lt;br /&gt;<br /> Liza Ulčakar &lt;br /&gt;<br /> Urša Štrancar &lt;br /&gt;<br /> Tadej Medved &lt;br /&gt;<br /> Urška Zagorc &lt;br /&gt;<br /> Nina Lukančič &lt;br /&gt;<br /> Urška Pečarič Strnad &lt;br /&gt;<br /> Anže Karlek &lt;br /&gt;<br /> Luka Gnidovec &lt;br /&gt;<br /> Almina Tahirović &lt;br /&gt;<br /> Mirsad Mešić &lt;br /&gt;<br /> | align=&quot;center&quot; style=&quot;background:#f0f0f0;&quot;|'''recenzent2'''<br /> Urška Pečarič Strnad &lt;br /&gt;<br /> Urška Zagorc &lt;br /&gt;<br /> Ernestina Lavrih &lt;br /&gt;<br /> Liza Ulčakar &lt;br /&gt;<br /> Urša Štrancar &lt;br /&gt;<br /> Paula Horvat &lt;br /&gt;<br /> Sara Laznik &lt;br /&gt;<br /> Luka Gnidovec &lt;br /&gt;<br /> Irma Zeljković &lt;br /&gt;<br /> Eva Keber &lt;br /&gt;<br /> Jernej Imperl &lt;br /&gt;<br /> Barbara Slapnik &lt;br /&gt;<br /> Mirsad Mešić &lt;br /&gt;<br /> Urša Lovše &lt;br /&gt;<br /> Anamarija Agnič &lt;br /&gt;<br /> Neža Pavko &lt;br /&gt;<br /> Mateja Žvipelj &lt;br /&gt;<br /> Almina Tahirović &lt;br /&gt;<br /> Nika Mikulič Vernik &lt;br /&gt;<br /> Martina Lokar &lt;br /&gt;<br /> Urška Fajdiga &lt;br /&gt;<br /> Saša Slabe &lt;br /&gt;<br /> Klementina Polanec &lt;br /&gt;<br /> Tjaša Mlakar &lt;br /&gt;<br /> Ajda Godec &lt;br /&gt;<br /> Jernej Imperl &lt;br /&gt;<br /> Špela Supej &lt;br /&gt;<br /> Aljaž Bratina &lt;br /&gt;<br /> Nina Lukančič &lt;br /&gt;<br /> Matija Ruparčič &lt;br /&gt;<br /> Anže Karlek &lt;br /&gt;<br /> Sabina S. Oblak &lt;br /&gt;<br /> Urban Hribar &lt;br /&gt;<br /> Tina Kolenc Milavec &lt;br /&gt;<br /> Tadej Medved &lt;br /&gt;<br /> |}<br /> <br /> ==Naloga==<br /> Pripravite projektno nalogo iz področja Bionanotehnologije. Najpomembnejša je originalna ideja za nek izvedljiv projekt, ki pa mora biti takšen, da pritegne investitorje. Ker je pomembno tudi kako boste to naredili, morate predstaviti tudi metodo in ne samo ideje. Natančno morate vedeti, kako boste projekt izvedli.<br /> <br /> Predlagana struktura teksta:<br /> * Uvod<br /> * Predstavitev problema, znanstvena izhodišča, cilji<br /> * Izvedba projekta, metodologija, tehnike, materiali, vprašanja, hipoteze<br /> * Literatura<br /> <br /> Za pripravo seminarja velja naslednje:&lt;br&gt;<br /> * Elektronska verzija seminarja: avtor, naslov projekta, razširjeni povzetek projekta- 350-400 besed (brez literature) in grafični povzetek (čez približno pol strani). Vse naj bo na maksimalno dveh straneh, a ne sme vsebovati manj kot 350 besed (sem se ne šteje literatura). <br /> * Elektronsko verzijo seminarja oddajte en dan pred predstavitvijo, kasneje pa boste vsebino še prekopirali na za to določeno spletno stran, predstavitev pa eno uro pred seminarjem na [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/ strežnik].<br /> * Vsi seminarji so v elektronski obliki dostopni [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/bioseminar/ tukaj].<br /> * Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Za predstavitev je na voljo XY minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni.<br /> * Predstavitvi sledi razprava. Recenzenta morate predlagati vsaj eno izboljšavo predstavljenega projekta.<br /> <br /> ==&lt;font color=green&gt;Imena datotek&lt;/font&gt;==<br /> Prosim vas, da vse datoteke poimenujete po naslednjem modelu:<br /> * 20_nano_Priimek.doc za seminar, npr. 20_nano_Craik_Venter.doc<br /> * 20_nano_Priimek.ppt za prezentacijo, npr. 20_nano_Craik_Venter.ppt<br /> <br /> ==Urejanje spletnih strani na wikiju==<br /> Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''<br /> <br /> ==Citiranje virov==<br /> Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se držite ene same. V seminarskih nalogah in diplomskih nalogah FKKT uprabljajte shemo citiranja, ki je pobarvana &lt;font color=green&gt;zeleno&lt;/font&gt;.<br /> Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati.<br /> Za citate v naravoslovju je najpogostejše citiranje po pravilniku ISO 690. [http://www.zveza-zotks.si/gzm/dokumenti/literatura.html Pravila], ki upoštevajo omenjeni standard, so pripravili pri ZTKS. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati.&lt;br&gt;<br /> '''Citiranje knjig:'''&lt;br&gt;<br /> Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica.&lt;br&gt;<br /> Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN.&lt;br&gt;<br /> <br /> Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005.&lt;br&gt;<br /> Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4.&lt;br&gt;<br /> Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.). <br /> <br /> '''Citiranje člankov:'''&lt;br&gt;<br /> Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani.&lt;br&gt;<br /> &lt;font color=green&gt;Lartigue, C., Glass, J. I., Alperovich, N., Pieper, R., Parmar, P. P., Hutchison III, C. A., Smith, H. O. in Venter, J. C.<br /> Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, 317, str. 632-638.&lt;/font&gt;<br /> <br /> Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole:&lt;br&gt;<br /> Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani.&lt;br&gt;<br /> Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.<br /> <br /> Revija Science uporablja skrajšani zapis:&lt;br&gt;<br /> C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007)&lt;br&gt;<br /> <br /> V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne). Navesti morate tudi vse avtorje dela, razen v primeru, ko jih je 10 ali več. Takrat navedite le prvih devet, za ostale pa uporabite okrajšavo in sod. (in sodelavci). Pred zadnjim avtorjem naj bo vedno besedica &quot;in&quot;. <br /> <br /> <br /> '''Citiranje spletnih virov:'''&lt;br&gt;<br /> Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov&lt;br&gt;<br /> strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life&lt;br&gt;<br /> Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.</div>

Irma Zeljković