Wiki FKKT - User contributions [en]

Avtomatizacija načrtovanja genetskih vezij

2020-05-26T09:15:55Z

Jc0196:

''Povzeto po članku:'' Nielsen AA, Der BS, Shin J, et al. Genetic circuit design automation. Science. 2016;352(6281):aac7341. doi:10.1126/science.aac7341

== Uvod ==
Celice se odzivajo na svoje okolje, sprejemajo odločitve, gradijo strukture in koordinirajo naloge. Osnova vseh teh procesov so logične operacije, ki jih izvajajo omrežja regulatornih proteinov, ki integrirajo signale in nadzorujejo časovno ekspresijo genov. Celice lahko z uporabo genetskih vezij »sprogramiramo« tako, da generirajo želeno operacijo, vendar pa je načrtovanje celo najbolj enostavnih genetskih vezij časovno zahtevno in nezanesljivo.
EDA (»Electronic Design Automation«) je kategorija programske opreme, razvite za pomoč inženirjem za načrtovanje električnih vezij. Načela EDA lahko uporabimo pri načrtovanju genetskih vezij. V izhodiščnem članku so za to uporabili »jezik opisa strojne opreme« Verilog (ang. »Hardware Description Language«), ki omogoča uporabniku opis funkcije vezja. Uporabnik določi tudi senzorje, aktuatorje in »datoteke omejitev uporabnika« (ang. »User Constraints File«, v nadaljevanju »UCF«), ki definirajo organizem, tehnologijo logičnih vrat in veljavne pogoje delovanja.

Programska oprema »Cello« (www.cellocad.org) uporablja te informacije za samodejno oblikovanje zaporedja DNK za kodiranje želenega vezja. Za to uporablja niz algoritmov, ki razčlenjujejo sintakso Verilog-a, ustvarijo diagram vezja, dodelijo logična vrata, upoštevajo podane omejitve za izgradnjo DNK sekvence in simulirajo učinkovitost. Zanesljivo načrtovanje vezja zahteva izolacijo vrat iz genetskega konteksta, tako da delujejo enako, kadar se uporabljajo v različnih vezjih.
V izhodiščnem članku je bila programska oprema »Cello« uporabljena za načrtovanje 60 genetskih vezij za E.coli (880.000 baznih parov DNK), od katerih so bile vse DNK sekvence zgrajene izključno na način, ki je bil predviden s strani programske opreme, brez dodatnih popravkov. Od teh jih je 45 delovalo pravilno v vsakem izhodnem stanju (do 10 regulatorjev in do 55 delov).

== Programska oprema »Cello« ==

Verilog koda ima hierarhično organizacijo, ki bazira na modulih. V izhodiščnem članku so funkcije vezja definirali z »Case, Assign in Stuctural« stavki znotraj modulov, z fokusom na razvoju asinhrone kombinatorne logike brez povratnih informacij, kar je uporabno pri načrtovanju genetskih vezij, ki lahko procesirajo več okoljskih senzorjev in izberejo med različnimi celičnimi funkcijami.
»Cello« je namenjen načrtovanju vezij za visoko specifične fizične sisteme in pogoje delovanja. Deluje po vzorcu UCF, slednji specificira:

i) tehnologijo logičnih vrat, vključujoč DNK sekvence in funkcionalne podatke,

ii) definirane fizične lokacije za vezje (plazmidni ali genomski lokusi),

iii) organizem, vrsto in genotip,

iv) pogoje obratovanja, v katerih je zasnova vezja veljavna,

v) preferirane logične motive, ki jih je treba vključiti v sintezo vezja.

UCF sledi JSON standardu (»JavaScript Object Notation«), ki je konvertibilen tudi z SBOL (»Synthetic Biology Open Language«).
V izhodiščnem članku so razvili Eco1C1G1T1 UCF za E. coli in tehnologijo logičnih vrat, ki bazira na setu 12 prokariontskih represorjev. Z razvojem nadaljnjih UCF-jev bi lahko tak način načrtovanja vezja postal prenosljiv na druge organizme in pogoje.

== Začetno sestavljanje vrat in neuspešni modeli ==

Konstruirali so knjižnico vrat, ki je bazirala na setu šestnajstih Tet represorjev (TetR) homologov, ki so bili ortogonalni. Te so pretvorili v preprosta NOT/NOR vrata, tako da so vhodni promotorji vodili ekspresijo represorjev, za katerim je bil teminator in izhodni promotor. Zaradi pomanjkanja močnih terminatorjev, so bila vsa vrata generirana z istim terminatorjem (BBa_B0015), vsak represor pa je imel drugačen RBS, ki je bil izbran tako da je maksimiziral dinamični razpon.
Vrata so lahko povezali, tako da so tvorila preprosta funkcionalna vezja; vseeno pa je bila v vsakem primeru potrebna dodatna prilagoditev, prav tako je bil dinamični razpon izhoda nizek. Testirali so tudi odzivne funkcije vrat za napovedovanje obnašanja vezja kot celote, brez dodatnih prilagoditev. Načrtovali so set osmih preprostih vezij sestavljenih iz teh vrat, ki so vsebovala od enega do štirih represorjev. Skoraj vsa generirana vezja so dala napačen odziv. Med vsemi vezji je bilo skupaj pravilnih 13 izhodnih stanj od 32.

Tudi vezja, ki so bazirala samo na enem represorju so pogosto generirala nepredvidljiv odziv, ko so bila sklopljena z različnimi promotorji. Promotorji so generirali transkripte z različnimi 5'-netranslatiranimi regijami (5'-UTR), kar lahko ima močan vpliv na ekspresijo genov. Nekateri promotorji v »downstream« poziciji (poziciji 2 NOR vrat) so reducirali transkripcijo »upstream« promotorja, kar se imenuje »roadblocking«. Nadalje, so nekatera vezja imela probleme z rastjo, kar je bilo povzročeno s strani represorjev, ki so postali toksični, ko so bili izraženi preko nekega določenega praga. Številna vezja pa so bila nestabilna tudi zaradi homologne rekombinacije delov, ki so bili ponovno uporabljeni v istem vezju.

== Izolirana vrata ==

Nadalje je bila generirana druga generacija vrat. Dodane so bile naslednje spremembe:

i) Novi deli so bili dodani k vratom za izolacijo iz genetskega konteksta,

ii) V datoteko UCF so bila dodana navodila, ki niso dovoljevala določenih delov, pozicij in kombinacij delov, ki bi lahko vodile do nepredvidljivega obnašanja,

iii) Transkripcijska izolacija je bila dosežena z dodajanjem drugih močnih terminatorjev z dovolj raznolikimi sekvencami za izogib homologni rekombinaciji,

iv) Izhodni promotorji so bili izolirani na obeh straneh,

v) Nazadnje je bila izmerjena nagnjenost promotorjev k »roadblockingu«, in v datoteko UCF so bila dodana pravila, ki takih promotorjev ne dovoljujejo na poziciji 2 v NOR vratih.

Funkcije odziva so bile potem eksperimentano določene za vsa vrata. Številna vrata prve generacije so imele funkcije odziva take, da jih je bilo težko povezati funkcionalno k senzorjem ali drugim vratom. Da bi povečali možnost uspešne vezave so naredili več verzij teh vrat z različnimi RBS-ji, kar je premaknilo prag odziva. Vpliv na rast vsakih vrat je bil potem izmerjen kot funkcija aktivnosti vhodnih promotorjev, z namenom določanja praga toksičnosti. Da so izločili toksične ali »cross-growth« represorje, so originalni set TetR homologov zmanjšali iz 16 na 12. Štirje od teh so povzočili defekt rasti pri visokih vhodnih vrednostih, čemur se je dalo izogniti z asignacijskim algoritmomom. Ostalih osem preprostih vezij je bilo ponovno oblikovanih z novo knjižnico vrat. Vsa vezja so funkcionirala pravilno in dala 32/32 pravilnih izhodnih stanj.

== Avtomatizacija načrtovanja vezij z uporabo programa »Cello« ==

»Cello« je bil uporabljen za načrtovanje velikega seta 52 dodatnih vezij, ki so bazirala na izoliranih vratih. Ta vezja so vsebovala »Priority Detector«, »well-known functions« (npr. multiplexer) in logiko avtomatizirane formacije celularnih vzorcev (»Rule 30«). Dodatno so bila zgrajena tro-vhodna in eno-izhodna logična vezja, ki demonstrirajo sposobnost interakcije vhodov na različne načine. Taka vezja bi lahko bila uporabljena da celično funkcijo vklopijo ali izklopijo (ON/OFF) v odziv na okolje, definirano z multiplimi signali.

Vsako izmed 52 vezij je bilo določeno ali z uporabo »behavioral« Verilog kode (temelji na uporabi modulov) ali z uporabo ločene enumeracije za identifikacijo globalnega minimuma števila vrat in specifikacijo veznih diagramov z uporabo »structural« Verilog kode (temelji na uporabi »blocks«). Dodatno so bila v datoteko UCF vključena tro-vhodna logična vrata z globalnimi minimumi. Za vsako vezje so bili določeni promotorji senzorjev in ON/OFF vrednosti, izbrana je bila Eco1C1G1T1 UCF in DNK sekvenca je bila avtomatsko generirana s strani programske opreme »Cello«. Sekvence generirane DNK so vsebovale do 10 regulatorjev in do 55 delov. Izhodna stanja vsakega vezja so bila izmerjena z uporabo pretočne citometrije in primerjana z stanji, ki jih je napovedal »Cello«. Izvedenega ni bilo nobenega dodatnega prilagajanja DNK sekvence, ki bi se razlikovala od sekvence, ki jo je predvidel »Cello«.

Od 52 dizajniranih vezij jih je 37 funkcioniralo kot je bilo predvideno, tako da so vsi izhodi korelirali z predvidenimi ON/OFF nivoji. Nadalje je napovedana pretočna citometrija sovpadala z eksperimentalno določeno. Od 412 izhodnih stanj v vseh vezjih jih je bilo 92% pravilnih.
Od 52 vezij jih je bilo sedem nepravilnih v enem stanju, dva sta bila nepravilna v dveh stanjih in pet jih je bilo nepravilnih v več kot treh stanjih. Z večanjem števila dodanih vrat se je povečala možnost napake. Analiza je pokazala, da je do nepričakovanega obnašanja večinoma prišlo pri anhidrotetraciklinskem senzorju (aTc senzor) ali pri AmtR vratih.

== Zaključek ==

Načrtovanje sintetičnih regulatornih omrežij je bilo v glavnem dominirano s strani ročnega razmišljanja po sistemu »trial and error« na nivoju nukleotidov. »Cello« avtomatizira selekcijo in povezovanje delov, z upoštevanjem povezanih omejitev. S tem omogoča hitrejše načrtovanje sistemov z večjim številom delov.

== Viri ==

[1] Nielsen AA, Der BS, Shin J, et al. Genetic circuit design automation. Science. 2016;352(6281):aac7341. doi:10.1126/science.aac7341

[2] Brophy JA, Voigt CA. Principles of genetic circuit design. Nat Methods. 2014;11(5):508‐520. doi:10.1038/nmeth.2926

Seminarji SB 2019/20

2020-05-26T09:15:29Z

Jc0196:

V študijskem letu 2019/20 študentje 1. letnika predstavljajo naslednje teme:

RAZISKOVALNI ČLANKI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) 

1 [[Robustno večcelično računanje z uporabo gensko kodiranih vrat NE-ALI in kemičnih 'žic']] (Tanja Zupan) 
2 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Proizvodnja_%C5%A1inorina%2C_naravne_za%C5%A1%C4%8Dite_pred_soncem%2C_z_uporabo_cianobakterije Proizvodnja šinorina, naravne zaščite pred soncem, z uporabo cianobakterije] (Tina Turel) 
3 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Prenos_informacije_med_bakterijami_v_sesalskem_%C4%8Drevesju_z_uporabo_sistema_zaznavanja_gostote_populacije Prenos informacije med bakterijami v sesalskem črevesju z uporabo sistema zaznavanja gostote populacije] (Anže Jenko) 
4 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sinhronizirani_cikli_lize_bakterijskih_celic_za_in_vivo_dostavo_terapevtikov Sinhronizirani cikli lize bakterijskih celic za ''in vivo'' dostavo terapevtikov](Milica Janković) 
5 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sintezna_pot_fiksacije_ogljikovega_dioksida Sintezna pot fiksacije ogljikovega dioksida] (Ana Obaha) 
6 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sistem_za_brezcelično_sintezno_biologijo_na_osnovi_E.coli Sistem za brezcelično sintezno biologijo na osnovi ''E.coli''] (Ajda Lenardič) 
7 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Engineering_Customized_Cell_Sensing_and_Response_Behaviors_Using_Synthetic_Notch_Receptors Engineering Customized Cell Sensing and Response Behaviors Using Synthetic Notch Receptors] (Jelena Štrbac) 
8 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Programabilni_enocelični_sesalski_bioračunalniki Programabilni enocelični sesalski bioračunalniki] (Andreja Habič) 
9 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Priprava_sistema_s_proteinskimi_logi%C4%8Dnimi_vrati_na_povr%C5%A1ini_lipidnih_membran Priprava sistema s proteinskimi logičnimi vrati na površini lipidnih membran] (Uroš Prešern) 
10 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Kompleksno_celi%C4%8Dno_logi%C4%8Dno_ra%C4%8Dunanje_z_RNA-napravami Kompleksno celično logično računanje z RNA-napravami] (Peter Škrinjar) 
11 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Daljinsko_upravljanje_s_sesalskimi_celicami%2C_na_podlagi_temperaturno_reguliranih_genetskih_stikal_s_svetlobno-toplotnimi_utripi Daljinsko upravljanje s sesalskimi celicami, na podlagi temperaturno reguliranih genetskih stikal s svetlobno-toplotnimi utripi] (Luka Gregorič) 
12 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Komunikacija_na_osnovi_DNA_v_populacijah_sinteticnih_protocelic Komunikacija na osnovi DNA v populacijah sintetičnih protocelic] (Urban Hribar) 
13 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Na%C4%8Drtovanje_mikrobnih_konzorcijev_z_dolo%C4%8Denimi_dru%C5%BEbenimi_interakcijami Načrtovanje mikrobnih konzorcijev z določenimi družbenimi interakcijami] (Jerneja Nimac) 
14 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Orodje_za_modularno_sestavljanje_večgenskih_konstruktov_v_kvasovki: Sistem za modularno sestavljanje večgenskih konstruktov v kvasovki] (Katja Doberšek) 
15 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Genetski_programi_zgrajeni_iz_več_plasti_logičnih_vrat_v_posameznih_celicah Genetski programi zgrajeni iz več plasti logičnih vrat v posameznih celicah] (Daria Latysheva) 
16 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Modularni_klonirni_sistem_MoClo_za_biološko_sintezo_v_mikroalgi_C._reinhardtii Modularni klonirni sistem MoClo za biološko sintezo v mikroalgi ''C. reinhardtii''] (Veronika Razpotnik) 
17 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Vpliv_sinteznih_metabolnih_poti_glikolata_na_produktivnost_rastlin Vpliv sinteznih metabolnih poti glikolata na produktivnost rastlin] (Ines Medved) 
18 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/A_synthetic_biology_approach_to_transform_Yarrowia_Lypolytica_into_a_competitive_biotechnological_producer_of_%CE%B2-carotene: A synthetic biology approach to transform Yarrowia Lypolytica into a competitive biotechnological producer of β-carotene] (Željka Erić) 
19 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/In%C5%BEenirsko_pripravljeni_promotorji%2C_ki_omogo%C4%8Dajo_izra%C5%BEanje_ne_glede_na_%C5%A1tevilo_kopij Inženirsko pripravljeni promotorji, ki omogočajo izražanje ne glede na število kopij] (Benjamin Malovrh) 
20 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Shranjevanje_digitalnih_podatkov_v_DNA Shranjevanje digitalnih podatkov v DNA] (Samo Purič) 
21 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Robusten_in_občutljiv_sintetični_senzor_za_spremljanje_transkripcijskega_izhoda_signalne_mreže_citokininov_in_planta Robusten in občutljiv sintetični senzor za spremljanje transkripcijskega izhoda signalne mreže citokininov in planta] (Andrej Race) 
22 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sinteti%C4%8Dna_logi%C4%8Dna_vezja_in_spomin_v_%C5%BEivih_celicah Sintetična logična vezja in spomin v živih celicah] (Nika Zaveršek) 
23 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Avtomatizacija_na%C4%8Drtovanja_genetskih_vezij Avtomatizacija načrtovanja genetskih vezij] (Janina Gea Cvikl) 
24 [[Hachimoji DNA in RNA: genetski kod z osmimi gradniki]] (Katja Malenšek) 
NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.) 

1 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/PETEXE_-_sistem_za_filtracijo_mikroplastike_v_pralnih_strojih PETEXE - sistem za filtracijo mikroplastike v pralnih strojih]
(Lana Vogrinec) 
2 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Magi.Coli:_sinteza_psilocibina_s_pomo%C4%8Djo_E.coli Magi.Coli: sinteza psilocibina s pomočjo ''E.coli''] (Luka Lavrič) 
3 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/SONOBE_-_proteinski_sistem_za_agregacijo_mikroplastike SONOBE - proteinski sistem za agregacijo mikroplastike] (Vesna Podgrajšek) 
4 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/The_real_MVP:_ekspresijski_sistem_za_pripravo_modularnih_virusom_podobnih_delcev The real MVP: ekspresijski sistem za pripravo modularnih virusom podobnih delcev] (Žiga Vičič) 
5 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BI%28OIL%29OGICAL_FACTORY_-_sistem_za_proizvodnjo_sestavin_palmovega_olja_v_mikroalgi BI(OIL)OGICAL FACTORY - sistem za proizvodnjo sestavin palmovega olja v mikroalgi](Dunia Sahir) 
6 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Antihipertenzivni_probiotik_-_nov_pristop_zni%C5%BEevanja_krvnega_tlaka Antihipertenzivni probiotik - nov pristop zniževanja krvnega tlaka] (Nika Testen) 
7 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/ProQuorum:_probiotik_kot_zdravilo_proti_okužbi_s_C._difficile ProQuorum: probiotik kot zdravilo proti okužbi s ''C. difficile''] (Ana Maklin) 
8 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/ALiVE_%E2%80%93_analiza_%C5%BEivih_celic_z_vezikularnim_izvozom ALiVE – analiza živih celic z vezikularnim izvozom] (Sara Korošec) 
9 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/NoTox_%E2%80%93_sistem_za_prepre%C4%8Devanje_botulinskih_izbruhov NoToX-sistem za preprečevanje botulinskih izbruhov] (Patricija Miklavc) 
10 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/To_bee...Hornet_to_bee,_ali_uporaba_bakterij_za_boj_proti_invazivni_vrsti To bee...Hornet to bee, ali uporaba bakterij za boj proti invazivni vrsti] (Primož Bembič) 
11 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BNU-_Kitajska:_in%C5%BEenirski_%C4%8Drevesni_mikrobi_za_zmanj%C5%A1evanje_debelosti BNU- Kitajska: inženirski črevesni mikrobi za zmanjševanje debelosti] (Sara Jereb) 
12 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/HyDRA_%E2%80%93_detekcija_vodika HyDRA – detekcija vodika] (Andrej Ivanovski) 
13 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/MESH_-_Raz%C5%A1irljiv_enkapsulinski_sistem_za_uporabo_v_zdravstvu MESH - Razširljiv enkapsulinski sistem za uporabo v zdravstvu] (Vid Modic) 

Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Povzetek je treba objaviti dva dni pred predstavitvijo do polnoči (za seminarje v sredo torej v ponedeljek). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo razprava, ki praviloma ne bo daljša od 5 minut.

----

Razpored po datumih predstavitev (pri vsakem terminu so možni največ 4 seminarji; vpišite ime in priimek pri dnevu, ko želite predstaviti seminar):

15.4. 
1 Tanja Zupan 
2 Lana Vogrinec 
3 Luka Lavrič 
4 Vesna Podgrajšek 

21.4. 
1 Žiga Vičič 
2 Tina Turel 
3 Anže Jenko 
4 Dunia Sahir 

22.4. 
1 Milica Janković 
2 Nika Testen 
3 Ana Obaha 
4 Ana Maklin 

5.5. 
1 Ajda Lenardič 
2 Jelena Štrbac 
3 Andreja Habič 
4 Uroš Prešern 

6.5. 
1 Sara Korošec 
2 Peter Škrinjar 
3 Luka Gregorič 
4 Urban Hribar 

12.5. 
1 Jerneja Nimac 
2 Katja Doberšek 
3 Daria Latysheva 
4 Veronika Razpotnik 

13.5. 
1 Ines Medved 
2 Željka Erić 
3 Patricija Miklavc 
4 Benjamin Malovrh 

19.5. 
1 Samo Purič 
2 Sara Jereb 
3 Primož Bembič 
4 Andrej Race 

20.5. 
1 Vid Modic 
2 Andrej Ivanovski 

26.5. 
1 Nika Zaveršek 
2 Janina Gea Cvikl 
3 Katja Malenšek 
4 

27.5. Rezervni termin 
1 
2 
3 
4

Avtomatizacija načrtovanja genetskih vezij

2020-05-26T07:43:58Z

Jc0196:

''Povzeto po članku:'' Nielsen AA, Der BS, Shin J, et al. Genetic circuit design automation. Science. 2016;352(6281):aac7341. doi:10.1126/science.aac7341

== Uvod ==
Celice se odzivajo na svoje okolje, sprejemajo odločitve, gradijo strukture in koordinirajo naloge. Osnova vseh teh procesov so logične operacije, ki jih izvajajo omrežja regulatornih proteinov, ki integrirajo signale in nadzorujejo časovno ekspresijo genov. Celice lahko z uporabo genetskih vezij »sprogramiramo« tako, da generirajo želeno operacijo, vendar pa je načrtovanje celo najbolj enostavnih genetskih vezij časovno zahtevno in nezanesljivo.
EDA (»Electronic Design Automation«) je kategorija programske opreme, razvite za pomoč inženirjem za načrtovanje električnih vezij. Načela EDA lahko uporabimo pri načrtovanju genetskih vezij. V izhodiščnem članku so za to uporabili »jezik opisa strojne opreme« Verilog (ang. »Hardware Description Language«), ki omogoča uporabniku opis funkcije vezja. Uporabnik določi tudi senzorje, aktuatorje in »datoteke omejitev uporabnika« (ang. »User Constraints File«, v nadaljevanju »UCF«), ki definirajo organizem, tehnologijo logičnih vrat in veljavne pogoje delovanja.

Programska oprema »Cello« (www.cellocad.org) uporablja te informacije za samodejno oblikovanje zaporedja DNK za kodiranje želenega vezja. Za to uporablja niz algoritmov, ki razčlenjujejo sintakso Verilog-a, ustvarijo diagram vezja, dodelijo logična vrata, upoštevajo podane omejitve za izgradnjo DNK sekvence in simulirajo učinkovitost. Zanesljivo načrtovanje vezja zahteva izolacijo vrat iz genetskega konteksta, tako da delujejo enako, kadar se uporabljajo v različnih vezjih.
V izhodiščnem članku je bila programska oprema »Cello« uporabljena za načrtovanje 60 genetskih vezij za E.coli (880.000 baznih parov DNK), od katerih so bile vse DNK sekvence zgrajene izključno na način, ki je bil predviden s strani programske opreme, brez dodatnih popravkov. Od teh jih je 45 delovalo pravilno v vsakem izhodnem stanju (do 10 regulatorjev in do 55 delov).

== Programska oprema »Cello« ==

Verilog koda ima hierarhično organizacijo, ki bazira na modulih. V izhodiščnem članku so funkcije vezja definirali z »Case, Assign in Stuctural« stavki znotraj modulov, z fokusom na razvoju asinhrone kombinatorne logike brez povratnih informacij, kar je uporabno pri načrtovanju genetskih vezij, ki lahko procesirajo več okoljskih senzorjev in izberejo med različnimi celičnimi funkcijami.
»Cello« je namenjen načrtovanju vezij za visoko specifične fizične sisteme in pogoje delovanja. Deluje po vzorcu UCF, slednji specificira:

i) tehnologijo logičnih vrat, vključujoč DNK sekvence in funkcionalne podatke,

ii) definirane fizične lokacije za vezje (plazmidni ali genomski lokusi),

iii) organizem, vrsto in genotip,

iv) pogoje obratovanja, v katerih je zasnova vezja veljavna,

v) preferirane logične motive, ki jih je treba vključiti v sintezo vezja.

UCF sledi JSON standardu (»JavaScript Object Notation«), ki je konvertibilen tudi z SBOL (»Synthetic Biology Open Language«).
V izhodiščnem članku so razvili Eco1C1G1T1 UCF za E. coli in tehnologijo logičnih vrat, ki bazira na setu 12 prokariontskih represorjev. Z razvojem nadaljnjih UCF-jev bi lahko tak način načrtovanja vezja postal prenosljiv na druge organizme in pogoje.

== Začetno sestavljanje vrat in neuspešni modeli ==

Konstruirali so knjižnico vrat, ki je bazirala na setu šestnajstih Tet represorjev (TetR) homologov, ki so bili ortogonalni. Te so pretvorili v preprosta NOT/NOR vrata, tako da so vhodni promotorji vodili ekspresijo represorjev, za katerim je bil teminator in izhodni promotor. Zaradi pomanjkanja močnih terminatorjev, so bila vsa vrata generirana z istim terminatorjem (BBa_B0015), vsak represor pa je imel drugačen RBS, ki je bil izbran tako da je maksimiziral dinamični razpon.
Vrata so lahko povezali, tako da so tvorila preprosta funkcionalna vezja; vseeno pa je bila v vsakem primeru potrebna dodatna prilagoditev, prav tako je bil dinamični razpon izhoda nizek. Testirali so tudi odzivne funkcije vrat za napovedovanje obnašanja vezja kot celote, brez dodatnih prilagoditev. Načrtovali so set osmih preprostih vezij sestavljenih iz teh vrat, ki so vsebovala od enega do štirih represorjev. Skoraj vsa generirana vezja so dala napačen odziv. Med vsemi vezji je bilo skupaj pravilnih 13 izhodnih stanj od 32.

Tudi vezja, ki so bazirala samo na enem represorju so pogosto generirala nepredvidljiv odziv, ko so bila sklopljena z različnimi promotorji. Promotorji so generirali transkripte z različnimi 5'-netranslatiranimi regijami (5'-UTR), kar lahko ima močan vpliv na ekspresijo genov. Nekateri promotorji v »downstream« poziciji (poziciji 2 NOR vrat) so reducirali transkripcijo »upstream« promotorja, kar se imenuje »roadblocking«. Nadalje, so nekatera vezja imela probleme z rastjo, kar je bilo povzročeno s strani represorjev, ki so postali toksični, ko so bili izraženi preko nekega določenega praga. Številna vezja pa so bila nestabilna tudi zaradi homologne rekombinacije delov, ki so bili ponovno uporabljeni v istem vezju.

== Izolirana vrata ==

Nadalje je bila generirana druga generacija vrat. Dodane so bile naslednje spremembe:

i) Novi deli so bili dodani k vratom za izolacijo iz genetskega konteksta,

ii) V datoteko UCF so bila dodana navodila, ki niso dovoljevala določenih delov, pozicij in kombinacij delov, ki bi lahko vodile do nepredvidljivega obnašanja,

iii) Transkripcijska izolacija je bila dosežena z dodajanjem drugih močnih terminatorjev z dovolj raznolikimi sekvencami za izogib homologni rekombinaciji,

iv) Izhodni promotorji so bili izolirani na obeh straneh,

v) Nazadnje je bila izmerjena nagnjenost promotorjev k »roadblockingu«, in v datoteko UCF so bila dodana pravila, ki takih promotorjev ne dovoljujejo na poziciji 2 v NOR vratih.

Funkcije odziva so bile potem eksperimentano določene za vsa vrata. Številna vrata prve generacije so imele funkcije odziva take, da jih je bilo težko povezati funkcionalno k senzorjem ali drugim vratom. Da bi povečali možnost uspešne vezave so naredili več verzij teh vrat z različnimi RBS-ji, kar je premaknilo prag odziva. Vpliv na rast vsakih vrat je bil potem izmerjen kot funkcija aktivnosti vhodnih promotorjev, z namenom določanja praga toksičnosti. Da so izločili toksične ali »cross-growth« represorje, so originalni set TetR homologov zmanjšali iz 16 na 12. Štirje od teh so povzočili defekt rasti pri visokih vhodnih vrednostih, čemur se je dalo izogniti z asignacijskim algoritmomom. Ostalih osem preprostih vezij je bilo ponovno oblikovanih z novo knjižnico vrat. Vsa vezja so funkcionirala pravilno in dala 32/32 pravilnih izhodnih stanj.

== Avtomatizacija dizajnirana vezij z uporabo programa »Cello« ==

»Cello« je bil uporabljen za načrtovanje velikega seta 52 dodatnih vezij, ki so bazirala na izoliranih vratih. Ta vezja so vsebovala »Priority Detector«, »well-known functions« (npr. multiplexer) in logiko avtomatizirane formacije celularnih vzorcev (»Rule 30«). Dodatno so bila zgrajena tro-vhodna in eno-izhodna logična vezja, ki demonstrirajo sposobnost interakcije vhodov na različne načine. Taka vezja bi lahko bila uporabljena da celično funkcijo vklopijo ali izklopijo (ON/OFF) v odziv na okolje, definirano z multiplimi signali.

Vsako izmed 52 vezij je bilo določeno ali z uporabo »behavioral« Verilog kode (temelji na uporabi modulov) ali z uporabo ločene enumeracije za identifikacijo globalnega minimuma števila vrat in specifikacijo veznih diagramov z uporabo »structural« Verilog kode (temelji na uporabi »blocks«). Dodatno so bila v datoteko UCF vključena tro-vhodna logična vrata z globalnimi minimumi. Za vsako vezje so bili določeni promotorji senzorjev in ON/OFF vrednosti, izbrana je bila Eco1C1G1T1 UCF in DNK sekvenca je bila avtomatsko generirana s strani programske opreme »Cello«. Sekvence generirane DNK so vsebovale do 10 regulatorjev in do 55 delov. Izhodna stanja vsakega vezja so bila izmerjena z uporabo pretočne citometrije in primerjana z stanji, ki jih je napovedal »Cello«. Izvedenega ni bilo nobenega dodatnega prilagajanja DNK sekvence, ki bi se razlikovala od sekvence, ki jo je predvidel »Cello«.

Od 52 dizajniranih vezij jih je 37 funkcioniralo kot je bilo predvideno, tako da so vsi izhodi korelirali z predvidenimi ON/OFF nivoji. Nadalje je napovedana pretočna citometrija sovpadala z eksperimentalno določeno. Od 412 izhodnih stanj v vseh vezjih jih je bilo 92% pravilnih.
Od 52 vezij jih je bilo sedem nepravilnih v enem stanju, dva sta bila nepravilna v dveh stanjih in pet jih je bilo nepravilnih v več kot treh stanjih. Z večanjem števila dodanih vrat se je povečala možnost napake. Analiza je pokazala, da je do nepričakovanega obnašanja večinoma prišlo pri anhidrotetraciklinskem senzorju (aTc senzor) ali pri AmtR vratih.

== Zaključek ==

Načrtovanje sintetičnih regulatornih omrežij je bilo v glavnem dominirano s strani ročnega razmišljanja po sistemu »trial and error« na nivoju nukleotidov. »Cello« avtomatizira selekcijo in povezovanje delov, z upoštevanjem povezanih omejitev. S tem omogoča hitrejše načrtovanje sistemov z večjim številom delov.

== Viri ==

[1] Nielsen AA, Der BS, Shin J, et al. Genetic circuit design automation. Science. 2016;352(6281):aac7341. doi:10.1126/science.aac7341

[2] Brophy JA, Voigt CA. Principles of genetic circuit design. Nat Methods. 2014;11(5):508‐520. doi:10.1038/nmeth.2926

Avtomatizacija načrtovanja genetskih vezij

2020-05-26T07:43:18Z

Jc0196:

''Povzeto po članku:'' Nielsen AA, Der BS, Shin J, et al. Genetic circuit design automation. Science. 2016;352(6281):aac7341. doi:10.1126/science.aac7341

== Uvod ==
Celice se odzivajo na svoje okolje, sprejemajo odločitve, gradijo strukture in koordinirajo naloge. Osnova vseh teh procesov so logične operacije, ki jih izvajajo omrežja regulatornih proteinov, ki integrirajo signale in nadzorujejo časovno ekspresijo genov. Celice lahko z uporabo genetskih vezij »sprogramiramo« tako, da generirajo želeno operacijo, vendar pa je načrtovanje celo najbolj enostavnih genetskih vezij časovno zahtevno in nezanesljivo.
EDA (»Electronic Design Automation«) je kategorija programske opreme, razvite za pomoč inženirjem za načrtovanje električnih vezij. Načela EDA lahko uporabimo pri načrtovanju genetskih vezij. V izhodiščnem članku so za to uporabili »jezik opisa strojne opreme« Verilog (ang. »Hardware Description Language«), ki omogoča uporabniku opis funkcije vezja. Uporabnik določi tudi senzorje, aktuatorje in »datoteke omejitev uporabnika« (ang. »User Constraints File«, v nadaljevanju »UCF«), ki definirajo organizem, tehnologijo logičnih vrat in veljavne pogoje delovanja.

Programska oprema »Cello« (www.cellocad.org) uporablja te informacije za samodejno oblikovanje zaporedja DNK za kodiranje želenega vezja. Za to uporablja niz algoritmov, ki razčlenjujejo sintakso Verilog-a, ustvarijo diagram vezja, dodelijo logična vrata, upoštevajo podane omejitve za izgradnjo DNK sekvence in simulirajo učinkovitost. Zanesljivo načrtovanje vezja zahteva izolacijo vrat iz genetskega konteksta, tako da delujejo enako, kadar se uporabljajo v različnih vezjih.
V izhodiščnem članku je bila programska oprema »Cello« uporabljena za načrtovanje 60 genetskih vezij za E.coli (880.000 baznih parov DNK), od katerih so bile vse DNK sekvence zgrajene izključno na način, ki je bil predviden s strani programske opreme, brez dodatnih popravkov. Od teh jih je 45 delovalo pravilno v vsakem izhodnem stanju (do 10 regulatorjev in do 55 delov).

== Programska oprema »Cello« ==

Verilog koda ima hierarhično organizacijo, ki bazira na modulih. V izhodiščnem članku so funkcije vezja definirali z »Case, Assign in Stuctural« stavki znotraj modulov, z fokusom na razvoju asinhrone kombinatorne logike brez povratnih informacij, kar je uporabno pri načrtovanju genetskih vezij, ki lahko procesirajo več okoljskih senzorjev in izberejo med različnimi celičnimi funkcijami.
»Cello« je namenjen načrtovanju vezij za visoko specifične fizične sisteme in pogoje delovanja. Deluje po vzorcu UCF, slednji specificira:

i) tehnologijo logičnih vrat, vključujoč DNK sekvence in funkcionalne podatke,

ii) definirane fizične lokacije za vezje (plazmidni ali genomski lokusi),

iii) organizem, vrsto in genotip,

iv) pogoje obratovanja, v katerih je zasnova vezja veljavna,

v) preferirane logične motive, ki jih je treba vključiti v sintezo vezja.

UCF sledi JSON standardu (»JavaScript Object Notation«), ki je konvertibilen tudi z SBOL (»Synthetic Biology Open Language«).
V izhodiščnem članku so razvili Eco1C1G1T1 UCF za E. coli in tehnologijo logičnih vrat, ki bazira na setu 12 prokariontskih represorjev. Z razvojem nadaljnjih UCF-jev bi lahko tak način načrtovanja vezja postal prenosljiv na druge organizme in pogoje.
Začetno sestavljanje vrat in neuspešni modeli

Konstruirali so knjižnico vrat, ki je bazirala na setu šestnajstih Tet represorjev (TetR) homologov, ki so bili ortogonalni. Te so pretvorili v preprosta NOT/NOR vrata, tako da so vhodni promotorji vodili ekspresijo represorjev, za katerim je bil teminator in izhodni promotor. Zaradi pomanjkanja močnih terminatorjev, so bila vsa vrata generirana z istim terminatorjem (BBa_B0015), vsak represor pa je imel drugačen RBS, ki je bil izbran tako da je maksimiziral dinamični razpon.
Vrata so lahko povezali, tako da so tvorila preprosta funkcionalna vezja; vseeno pa je bila v vsakem primeru potrebna dodatna prilagoditev, prav tako je bil dinamični razpon izhoda nizek. Testirali so tudi odzivne funkcije vrat za napovedovanje obnašanja vezja kot celote, brez dodatnih prilagoditev. Načrtovali so set osmih preprostih vezij sestavljenih iz teh vrat, ki so vsebovala od enega do štirih represorjev. Skoraj vsa generirana vezja so dala napačen odziv. Med vsemi vezji je bilo skupaj pravilnih 13 izhodnih stanj od 32.

Tudi vezja, ki so bazirala samo na enem represorju so pogosto generirala nepredvidljiv odziv, ko so bila sklopljena z različnimi promotorji. Promotorji so generirali transkripte z različnimi 5'-netranslatiranimi regijami (5'-UTR), kar lahko ima močan vpliv na ekspresijo genov. Nekateri promotorji v »downstream« poziciji (poziciji 2 NOR vrat) so reducirali transkripcijo »upstream« promotorja, kar se imenuje »roadblocking«. Nadalje, so nekatera vezja imela probleme z rastjo, kar je bilo povzročeno s strani represorjev, ki so postali toksični, ko so bili izraženi preko nekega določenega praga. Številna vezja pa so bila nestabilna tudi zaradi homologne rekombinacije delov, ki so bili ponovno uporabljeni v istem vezju.

== Izolirana vrata ==

Nadalje je bila generirana druga generacija vrat. Dodane so bile naslednje spremembe:

i) Novi deli so bili dodani k vratom za izolacijo iz genetskega konteksta,

ii) V datoteko UCF so bila dodana navodila, ki niso dovoljevala določenih delov, pozicij in kombinacij delov, ki bi lahko vodile do nepredvidljivega obnašanja,

iii) Transkripcijska izolacija je bila dosežena z dodajanjem drugih močnih terminatorjev z dovolj raznolikimi sekvencami za izogib homologni rekombinaciji,

iv) Izhodni promotorji so bili izolirani na obeh straneh,

v) Nazadnje je bila izmerjena nagnjenost promotorjev k »roadblockingu«, in v datoteko UCF so bila dodana pravila, ki takih promotorjev ne dovoljujejo na poziciji 2 v NOR vratih.

Funkcije odziva so bile potem eksperimentano določene za vsa vrata. Številna vrata prve generacije so imele funkcije odziva take, da jih je bilo težko povezati funkcionalno k senzorjem ali drugim vratom. Da bi povečali možnost uspešne vezave so naredili več verzij teh vrat z različnimi RBS-ji, kar je premaknilo prag odziva. Vpliv na rast vsakih vrat je bil potem izmerjen kot funkcija aktivnosti vhodnih promotorjev, z namenom določanja praga toksičnosti. Da so izločili toksične ali »cross-growth« represorje, so originalni set TetR homologov zmanjšali iz 16 na 12. Štirje od teh so povzočili defekt rasti pri visokih vhodnih vrednostih, čemur se je dalo izogniti z asignacijskim algoritmomom. Ostalih osem preprostih vezij je bilo ponovno oblikovanih z novo knjižnico vrat. Vsa vezja so funkcionirala pravilno in dala 32/32 pravilnih izhodnih stanj.

== Avtomatizacija dizajnirana vezij z uporabo programa »Cello« ==

»Cello« je bil uporabljen za načrtovanje velikega seta 52 dodatnih vezij, ki so bazirala na izoliranih vratih. Ta vezja so vsebovala »Priority Detector«, »well-known functions« (npr. multiplexer) in logiko avtomatizirane formacije celularnih vzorcev (»Rule 30«). Dodatno so bila zgrajena tro-vhodna in eno-izhodna logična vezja, ki demonstrirajo sposobnost interakcije vhodov na različne načine. Taka vezja bi lahko bila uporabljena da celično funkcijo vklopijo ali izklopijo (ON/OFF) v odziv na okolje, definirano z multiplimi signali.

Vsako izmed 52 vezij je bilo določeno ali z uporabo »behavioral« Verilog kode (temelji na uporabi modulov) ali z uporabo ločene enumeracije za identifikacijo globalnega minimuma števila vrat in specifikacijo veznih diagramov z uporabo »structural« Verilog kode (temelji na uporabi »blocks«). Dodatno so bila v datoteko UCF vključena tro-vhodna logična vrata z globalnimi minimumi. Za vsako vezje so bili določeni promotorji senzorjev in ON/OFF vrednosti, izbrana je bila Eco1C1G1T1 UCF in DNK sekvenca je bila avtomatsko generirana s strani programske opreme »Cello«. Sekvence generirane DNK so vsebovale do 10 regulatorjev in do 55 delov. Izhodna stanja vsakega vezja so bila izmerjena z uporabo pretočne citometrije in primerjana z stanji, ki jih je napovedal »Cello«. Izvedenega ni bilo nobenega dodatnega prilagajanja DNK sekvence, ki bi se razlikovala od sekvence, ki jo je predvidel »Cello«.

Od 52 dizajniranih vezij jih je 37 funkcioniralo kot je bilo predvideno, tako da so vsi izhodi korelirali z predvidenimi ON/OFF nivoji. Nadalje je napovedana pretočna citometrija sovpadala z eksperimentalno določeno. Od 412 izhodnih stanj v vseh vezjih jih je bilo 92% pravilnih.
Od 52 vezij jih je bilo sedem nepravilnih v enem stanju, dva sta bila nepravilna v dveh stanjih in pet jih je bilo nepravilnih v več kot treh stanjih. Z večanjem števila dodanih vrat se je povečala možnost napake. Analiza je pokazala, da je do nepričakovanega obnašanja večinoma prišlo pri anhidrotetraciklinskem senzorju (aTc senzor) ali pri AmtR vratih.

== Zaključek ==

Načrtovanje sintetičnih regulatornih omrežij je bilo v glavnem dominirano s strani ročnega razmišljanja po sistemu »trial and error« na nivoju nukleotidov. »Cello« avtomatizira selekcijo in povezovanje delov, z upoštevanjem povezanih omejitev. S tem omogoča hitrejše načrtovanje sistemov z večjim številom delov.

== Viri ==

[1] Nielsen AA, Der BS, Shin J, et al. Genetic circuit design automation. Science. 2016;352(6281):aac7341. doi:10.1126/science.aac7341

[2] Brophy JA, Voigt CA. Principles of genetic circuit design. Nat Methods. 2014;11(5):508‐520. doi:10.1038/nmeth.2926

Seminarji SB 2019/20

2020-05-26T07:42:02Z

Jc0196:

V študijskem letu 2019/20 študentje 1. letnika predstavljajo naslednje teme:

RAZISKOVALNI ČLANKI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) 

1 [[Robustno večcelično računanje z uporabo gensko kodiranih vrat NE-ALI in kemičnih 'žic']] (Tanja Zupan) 
2 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Proizvodnja_%C5%A1inorina%2C_naravne_za%C5%A1%C4%8Dite_pred_soncem%2C_z_uporabo_cianobakterije Proizvodnja šinorina, naravne zaščite pred soncem, z uporabo cianobakterije] (Tina Turel) 
3 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Prenos_informacije_med_bakterijami_v_sesalskem_%C4%8Drevesju_z_uporabo_sistema_zaznavanja_gostote_populacije Prenos informacije med bakterijami v sesalskem črevesju z uporabo sistema zaznavanja gostote populacije] (Anže Jenko) 
4 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sinhronizirani_cikli_lize_bakterijskih_celic_za_in_vivo_dostavo_terapevtikov Sinhronizirani cikli lize bakterijskih celic za ''in vivo'' dostavo terapevtikov](Milica Janković) 
5 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sintezna_pot_fiksacije_ogljikovega_dioksida Sintezna pot fiksacije ogljikovega dioksida] (Ana Obaha) 
6 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sistem_za_brezcelično_sintezno_biologijo_na_osnovi_E.coli Sistem za brezcelično sintezno biologijo na osnovi ''E.coli''] (Ajda Lenardič) 
7 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Engineering_Customized_Cell_Sensing_and_Response_Behaviors_Using_Synthetic_Notch_Receptors Engineering Customized Cell Sensing and Response Behaviors Using Synthetic Notch Receptors] (Jelena Štrbac) 
8 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Programabilni_enocelični_sesalski_bioračunalniki Programabilni enocelični sesalski bioračunalniki] (Andreja Habič) 
9 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Priprava_sistema_s_proteinskimi_logi%C4%8Dnimi_vrati_na_povr%C5%A1ini_lipidnih_membran Priprava sistema s proteinskimi logičnimi vrati na površini lipidnih membran] (Uroš Prešern) 
10 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Kompleksno_celi%C4%8Dno_logi%C4%8Dno_ra%C4%8Dunanje_z_RNA-napravami Kompleksno celično logično računanje z RNA-napravami] (Peter Škrinjar) 
11 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Daljinsko_upravljanje_s_sesalskimi_celicami%2C_na_podlagi_temperaturno_reguliranih_genetskih_stikal_s_svetlobno-toplotnimi_utripi Daljinsko upravljanje s sesalskimi celicami, na podlagi temperaturno reguliranih genetskih stikal s svetlobno-toplotnimi utripi] (Luka Gregorič) 
12 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Komunikacija_na_osnovi_DNA_v_populacijah_sinteticnih_protocelic Komunikacija na osnovi DNA v populacijah sintetičnih protocelic] (Urban Hribar) 
13 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Na%C4%8Drtovanje_mikrobnih_konzorcijev_z_dolo%C4%8Denimi_dru%C5%BEbenimi_interakcijami Načrtovanje mikrobnih konzorcijev z določenimi družbenimi interakcijami] (Jerneja Nimac) 
14 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Orodje_za_modularno_sestavljanje_večgenskih_konstruktov_v_kvasovki: Sistem za modularno sestavljanje večgenskih konstruktov v kvasovki] (Katja Doberšek) 
15 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Genetski_programi_zgrajeni_iz_več_plasti_logičnih_vrat_v_posameznih_celicah Genetski programi zgrajeni iz več plasti logičnih vrat v posameznih celicah] (Daria Latysheva) 
16 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Modularni_klonirni_sistem_MoClo_za_biološko_sintezo_v_mikroalgi_C._reinhardtii Modularni klonirni sistem MoClo za biološko sintezo v mikroalgi ''C. reinhardtii''] (Veronika Razpotnik) 
17 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Vpliv_sinteznih_metabolnih_poti_glikolata_na_produktivnost_rastlin Vpliv sinteznih metabolnih poti glikolata na produktivnost rastlin] (Ines Medved) 
18 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/A_synthetic_biology_approach_to_transform_Yarrowia_Lypolytica_into_a_competitive_biotechnological_producer_of_%CE%B2-carotene: A synthetic biology approach to transform Yarrowia Lypolytica into a competitive biotechnological producer of β-carotene] (Željka Erić) 
19 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/In%C5%BEenirsko_pripravljeni_promotorji%2C_ki_omogo%C4%8Dajo_izra%C5%BEanje_ne_glede_na_%C5%A1tevilo_kopij Inženirsko pripravljeni promotorji, ki omogočajo izražanje ne glede na število kopij] (Benjamin Malovrh) 
20 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Shranjevanje_digitalnih_podatkov_v_DNA Shranjevanje digitalnih podatkov v DNA] (Samo Purič) 
21 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Robusten_in_občutljiv_sintetični_senzor_za_spremljanje_transkripcijskega_izhoda_signalne_mreže_citokininov_in_planta Robusten in občutljiv sintetični senzor za spremljanje transkripcijskega izhoda signalne mreže citokininov in planta] (Andrej Race) 
22 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sinteti%C4%8Dna_logi%C4%8Dna_vezja_in_spomin_v_%C5%BEivih_celicah Sintetična logična vezja in spomin v živih celicah] (Nika Zaveršek) 
23 [[Hachimoji DNA in RNA: genetski kod z osmimi gradniki]] (Katja Malenšek) 
24 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Avtomatizacija_na%C4%8Drtovanja_genetskih_vezij Avtomatizacija načrtovanja genetskih vezij] (Janina Gea Cvikl) 

NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.) 

1 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/PETEXE_-_sistem_za_filtracijo_mikroplastike_v_pralnih_strojih PETEXE - sistem za filtracijo mikroplastike v pralnih strojih]
(Lana Vogrinec) 
2 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Magi.Coli:_sinteza_psilocibina_s_pomo%C4%8Djo_E.coli Magi.Coli: sinteza psilocibina s pomočjo ''E.coli''] (Luka Lavrič) 
3 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/SONOBE_-_proteinski_sistem_za_agregacijo_mikroplastike SONOBE - proteinski sistem za agregacijo mikroplastike] (Vesna Podgrajšek) 
4 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/The_real_MVP:_ekspresijski_sistem_za_pripravo_modularnih_virusom_podobnih_delcev The real MVP: ekspresijski sistem za pripravo modularnih virusom podobnih delcev] (Žiga Vičič) 
5 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BI%28OIL%29OGICAL_FACTORY_-_sistem_za_proizvodnjo_sestavin_palmovega_olja_v_mikroalgi BI(OIL)OGICAL FACTORY - sistem za proizvodnjo sestavin palmovega olja v mikroalgi](Dunia Sahir) 
6 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Antihipertenzivni_probiotik_-_nov_pristop_zni%C5%BEevanja_krvnega_tlaka Antihipertenzivni probiotik - nov pristop zniževanja krvnega tlaka] (Nika Testen) 
7 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/ProQuorum:_probiotik_kot_zdravilo_proti_okužbi_s_C._difficile ProQuorum: probiotik kot zdravilo proti okužbi s ''C. difficile''] (Ana Maklin) 
8 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/ALiVE_%E2%80%93_analiza_%C5%BEivih_celic_z_vezikularnim_izvozom ALiVE – analiza živih celic z vezikularnim izvozom] (Sara Korošec) 
9 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/NoTox_%E2%80%93_sistem_za_prepre%C4%8Devanje_botulinskih_izbruhov NoToX-sistem za preprečevanje botulinskih izbruhov] (Patricija Miklavc) 
10 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/To_bee...Hornet_to_bee,_ali_uporaba_bakterij_za_boj_proti_invazivni_vrsti To bee...Hornet to bee, ali uporaba bakterij za boj proti invazivni vrsti] (Primož Bembič) 
11 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BNU-_Kitajska:_in%C5%BEenirski_%C4%8Drevesni_mikrobi_za_zmanj%C5%A1evanje_debelosti BNU- Kitajska: inženirski črevesni mikrobi za zmanjševanje debelosti] (Sara Jereb) 
12 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/HyDRA_%E2%80%93_detekcija_vodika HyDRA – detekcija vodika] (Andrej Ivanovski) 
13 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/MESH_-_Raz%C5%A1irljiv_enkapsulinski_sistem_za_uporabo_v_zdravstvu MESH - Razširljiv enkapsulinski sistem za uporabo v zdravstvu] (Vid Modic) 

Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Povzetek je treba objaviti dva dni pred predstavitvijo do polnoči (za seminarje v sredo torej v ponedeljek). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo razprava, ki praviloma ne bo daljša od 5 minut.

----

Razpored po datumih predstavitev (pri vsakem terminu so možni največ 4 seminarji; vpišite ime in priimek pri dnevu, ko želite predstaviti seminar):

15.4. 
1 Tanja Zupan 
2 Lana Vogrinec 
3 Luka Lavrič 
4 Vesna Podgrajšek 

21.4. 
1 Žiga Vičič 
2 Tina Turel 
3 Anže Jenko 
4 Dunia Sahir 

22.4. 
1 Milica Janković 
2 Nika Testen 
3 Ana Obaha 
4 Ana Maklin 

5.5. 
1 Ajda Lenardič 
2 Jelena Štrbac 
3 Andreja Habič 
4 Uroš Prešern 

6.5. 
1 Sara Korošec 
2 Peter Škrinjar 
3 Luka Gregorič 
4 Urban Hribar 

12.5. 
1 Jerneja Nimac 
2 Katja Doberšek 
3 Daria Latysheva 
4 Veronika Razpotnik 

13.5. 
1 Ines Medved 
2 Željka Erić 
3 Patricija Miklavc 
4 Benjamin Malovrh 

19.5. 
1 Samo Purič 
2 Sara Jereb 
3 Primož Bembič 
4 Andrej Race 

20.5. 
1 Vid Modic 
2 Andrej Ivanovski 

26.5. 
1 Nika Zaveršek 
2 Janina Gea Cvikl 
3 Katja Malenšek 
4 

27.5. Rezervni termin 
1 
2 
3 
4

Avtomatizacija načrtovanja genetskih vezij

2020-05-26T07:40:56Z

Jc0196: New page: Privzeto po članku: Nielsen AA, Der BS, Shin J, et al. Genetic circuit design automation. Science. 2016;352(6281):aac7341. doi:10.1126/science.aac7341 == Uvod == Celice se odzivajo na s...

Privzeto po članku: Nielsen AA, Der BS, Shin J, et al. Genetic circuit design automation. Science. 2016;352(6281):aac7341. doi:10.1126/science.aac7341

== Uvod ==
Celice se odzivajo na svoje okolje, sprejemajo odločitve, gradijo strukture in koordinirajo naloge. Osnova vseh teh procesov so logične operacije, ki jih izvajajo omrežja regulatornih proteinov, ki integrirajo signale in nadzorujejo časovno ekspresijo genov. Celice lahko z uporabo genetskih vezij »sprogramiramo« tako, da generirajo želeno operacijo, vendar pa je načrtovanje celo najbolj enostavnih genetskih vezij časovno zahtevno in nezanesljivo.
EDA (»Electronic Design Automation«) je kategorija programske opreme, razvite za pomoč inženirjem za načrtovanje električnih vezij. Načela EDA lahko uporabimo pri načrtovanju genetskih vezij. V izhodiščnem članku so za to uporabili »jezik opisa strojne opreme« Verilog (ang. »Hardware Description Language«), ki omogoča uporabniku opis funkcije vezja. Uporabnik določi tudi senzorje, aktuatorje in »datoteke omejitev uporabnika« (ang. »User Constraints File«, v nadaljevanju »UCF«), ki definirajo organizem, tehnologijo logičnih vrat in veljavne pogoje delovanja.

Programska oprema »Cello« (www.cellocad.org) uporablja te informacije za samodejno oblikovanje zaporedja DNK za kodiranje želenega vezja. Za to uporablja niz algoritmov, ki razčlenjujejo sintakso Verilog-a, ustvarijo diagram vezja, dodelijo logična vrata, upoštevajo podane omejitve za izgradnjo DNK sekvence in simulirajo učinkovitost. Zanesljivo načrtovanje vezja zahteva izolacijo vrat iz genetskega konteksta, tako da delujejo enako, kadar se uporabljajo v različnih vezjih.
V izhodiščnem članku je bila programska oprema »Cello« uporabljena za načrtovanje 60 genetskih vezij za E.coli (880.000 baznih parov DNK), od katerih so bile vse DNK sekvence zgrajene izključno na način, ki je bil predviden s strani programske opreme, brez dodatnih popravkov. Od teh jih je 45 delovalo pravilno v vsakem izhodnem stanju (do 10 regulatorjev in do 55 delov).

== Programska oprema »Cello« ==

Verilog koda ima hierarhično organizacijo, ki bazira na modulih. V izhodiščnem članku so funkcije vezja definirali z »Case, Assign in Stuctural« stavki znotraj modulov, z fokusom na razvoju asinhrone kombinatorne logike brez povratnih informacij, kar je uporabno pri načrtovanju genetskih vezij, ki lahko procesirajo več okoljskih senzorjev in izberejo med različnimi celičnimi funkcijami.
»Cello« je namenjen načrtovanju vezij za visoko specifične fizične sisteme in pogoje delovanja. Deluje po vzorcu UCF, slednji specificira:

i) tehnologijo logičnih vrat, vključujoč DNK sekvence in funkcionalne podatke,

ii) definirane fizične lokacije za vezje (plazmidni ali genomski lokusi),

iii) organizem, vrsto in genotip,

iv) pogoje obratovanja, v katerih je zasnova vezja veljavna,

v) preferirane logične motive, ki jih je treba vključiti v sintezo vezja.

UCF sledi JSON standardu (»JavaScript Object Notation«), ki je konvertibilen tudi z SBOL (»Synthetic Biology Open Language«).
V izhodiščnem članku so razvili Eco1C1G1T1 UCF za E. coli in tehnologijo logičnih vrat, ki bazira na setu 12 prokariontskih represorjev. Z razvojem nadaljnjih UCF-jev bi lahko tak način načrtovanja vezja postal prenosljiv na druge organizme in pogoje.
Začetno sestavljanje vrat in neuspešni modeli

Konstruirali so knjižnico vrat, ki je bazirala na setu šestnajstih Tet represorjev (TetR) homologov, ki so bili ortogonalni. Te so pretvorili v preprosta NOT/NOR vrata, tako da so vhodni promotorji vodili ekspresijo represorjev, za katerim je bil teminator in izhodni promotor. Zaradi pomanjkanja močnih terminatorjev, so bila vsa vrata generirana z istim terminatorjem (BBa_B0015), vsak represor pa je imel drugačen RBS, ki je bil izbran tako da je maksimiziral dinamični razpon.
Vrata so lahko povezali, tako da so tvorila preprosta funkcionalna vezja; vseeno pa je bila v vsakem primeru potrebna dodatna prilagoditev, prav tako je bil dinamični razpon izhoda nizek. Testirali so tudi odzivne funkcije vrat za napovedovanje obnašanja vezja kot celote, brez dodatnih prilagoditev. Načrtovali so set osmih preprostih vezij sestavljenih iz teh vrat, ki so vsebovala od enega do štirih represorjev. Skoraj vsa generirana vezja so dala napačen odziv. Med vsemi vezji je bilo skupaj pravilnih 13 izhodnih stanj od 32.

Tudi vezja, ki so bazirala samo na enem represorju so pogosto generirala nepredvidljiv odziv, ko so bila sklopljena z različnimi promotorji. Promotorji so generirali transkripte z različnimi 5'-netranslatiranimi regijami (5'-UTR), kar lahko ima močan vpliv na ekspresijo genov. Nekateri promotorji v »downstream« poziciji (poziciji 2 NOR vrat) so reducirali transkripcijo »upstream« promotorja, kar se imenuje »roadblocking«. Nadalje, so nekatera vezja imela probleme z rastjo, kar je bilo povzročeno s strani represorjev, ki so postali toksični, ko so bili izraženi preko nekega določenega praga. Številna vezja pa so bila nestabilna tudi zaradi homologne rekombinacije delov, ki so bili ponovno uporabljeni v istem vezju.

== Izolirana vrata ==

Nadalje je bila generirana druga generacija vrat. Dodane so bile naslednje spremembe:

i) Novi deli so bili dodani k vratom za izolacijo iz genetskega konteksta,

ii) V datoteko UCF so bila dodana navodila, ki niso dovoljevala določenih delov, pozicij in kombinacij delov, ki bi lahko vodile do nepredvidljivega obnašanja,

iii) Transkripcijska izolacija je bila dosežena z dodajanjem drugih močnih terminatorjev z dovolj raznolikimi sekvencami za izogib homologni rekombinaciji,

iv) Izhodni promotorji so bili izolirani na obeh straneh,

v) Nazadnje je bila izmerjena nagnjenost promotorjev k »roadblockingu«, in v datoteko UCF so bila dodana pravila, ki takih promotorjev ne dovoljujejo na poziciji 2 v NOR vratih.

Funkcije odziva so bile potem eksperimentano določene za vsa vrata. Številna vrata prve generacije so imele funkcije odziva take, da jih je bilo težko povezati funkcionalno k senzorjem ali drugim vratom. Da bi povečali možnost uspešne vezave so naredili več verzij teh vrat z različnimi RBS-ji, kar je premaknilo prag odziva. Vpliv na rast vsakih vrat je bil potem izmerjen kot funkcija aktivnosti vhodnih promotorjev, z namenom določanja praga toksičnosti. Da so izločili toksične ali »cross-growth« represorje, so originalni set TetR homologov zmanjšali iz 16 na 12. Štirje od teh so povzočili defekt rasti pri visokih vhodnih vrednostih, čemur se je dalo izogniti z asignacijskim algoritmomom. Ostalih osem preprostih vezij je bilo ponovno oblikovanih z novo knjižnico vrat. Vsa vezja so funkcionirala pravilno in dala 32/32 pravilnih izhodnih stanj.

== Avtomatizacija dizajnirana vezij z uporabo programa »Cello« ==

»Cello« je bil uporabljen za načrtovanje velikega seta 52 dodatnih vezij, ki so bazirala na izoliranih vratih. Ta vezja so vsebovala »Priority Detector«, »well-known functions« (npr. multiplexer) in logiko avtomatizirane formacije celularnih vzorcev (»Rule 30«). Dodatno so bila zgrajena tro-vhodna in eno-izhodna logična vezja, ki demonstrirajo sposobnost interakcije vhodov na različne načine. Taka vezja bi lahko bila uporabljena da celično funkcijo vklopijo ali izklopijo (ON/OFF) v odziv na okolje, definirano z multiplimi signali.

Vsako izmed 52 vezij je bilo določeno ali z uporabo »behavioral« Verilog kode (temelji na uporabi modulov) ali z uporabo ločene enumeracije za identifikacijo globalnega minimuma števila vrat in specifikacijo veznih diagramov z uporabo »structural« Verilog kode (temelji na uporabi »blocks«). Dodatno so bila v datoteko UCF vključena tro-vhodna logična vrata z globalnimi minimumi. Za vsako vezje so bili določeni promotorji senzorjev in ON/OFF vrednosti, izbrana je bila Eco1C1G1T1 UCF in DNK sekvenca je bila avtomatsko generirana s strani programske opreme »Cello«. Sekvence generirane DNK so vsebovale do 10 regulatorjev in do 55 delov. Izhodna stanja vsakega vezja so bila izmerjena z uporabo pretočne citometrije in primerjana z stanji, ki jih je napovedal »Cello«. Izvedenega ni bilo nobenega dodatnega prilagajanja DNK sekvence, ki bi se razlikovala od sekvence, ki jo je predvidel »Cello«.

Od 52 dizajniranih vezij jih je 37 funkcioniralo kot je bilo predvideno, tako da so vsi izhodi korelirali z predvidenimi ON/OFF nivoji. Nadalje je napovedana pretočna citometrija sovpadala z eksperimentalno določeno. Od 412 izhodnih stanj v vseh vezjih jih je bilo 92% pravilnih.
Od 52 vezij jih je bilo sedem nepravilnih v enem stanju, dva sta bila nepravilna v dveh stanjih in pet jih je bilo nepravilnih v več kot treh stanjih. Z večanjem števila dodanih vrat se je povečala možnost napake. Analiza je pokazala, da je do nepričakovanega obnašanja večinoma prišlo pri anhidrotetraciklinskem senzorju (aTc senzor) ali pri AmtR vratih.

== Zaključek ==

Dizajniranje sintetičnih regulatornih omrežij je bilo v glavnem dominirano s strani ročnega razmišljanja po sistemu »trial and error« na nivoju nukleotidov. »Cello« avtomatizira selekcijo in povezovanje delov, z upoštevanjem povezanih omejitev. S tem omogoča hitrejše dizajniranje sistemov z večjim številom delov.

== Viri ==

1. Nielsen AA, Der BS, Shin J, et al. Genetic circuit design automation. Science. 2016;352(6281):aac7341. doi:10.1126/science.aac7341

2. Brophy JA, Voigt CA. Principles of genetic circuit design. Nat Methods. 2014;11(5):508‐520. doi:10.1038/nmeth.2926