Wiki FKKT - User contributions [en]

Značilnosti cepiva Novavax (proteinsko)

2021-05-05T19:26:06Z

JernejI:

Cepivo NVX-CoV2373 (v nadaljevanju: cepivo Novavax) je cepivo ameriškega podjetja Novavax proti COVID-19. Cepivo temelji na nanodelcih z rekombinantnim proteinom bodice virusa SARS-CoV-2. V času pisanja cepivo še ni odobreno v Evropi.

=Osnovne značilnosti cepiva=
Cepivo Novavax je sestavljeno iz treh ključnih sestavin: rekombinantni protein bodice, polisorbat 80 in adjuvant Matrix-M. Cepivo se lahko hrani na temperaturi 2-8 °C tudi do 6 mesecev [1,2].
==Rekombinantni protein bodice==

Protein bodice je antigen, ki ga s cepivom želimo predstaviti imunskemu sistemu. S tega vidika je to cepivo podobno konkurenčnim cepivom, vendar pa je cepivo Novavax eno redkih, ki uporablja očiščen protein neposredno v cepivu (namesto mRNA ali virusnega vektorja). V zaporedje proteina so uvedli dva seta mutacij. Najprej so spremenili tarčno zaporedje za cepitev (682-QQAQ-685), kar onemogoči aktivacijo proteina v našem telesu, z naslednjo spremembo (K986P in V987P) pa so povečali stabilnost strukture. Prilagojen protein je stabilen pri različnih pogojih in je primeren za vzpostavitev imunosti na SARS-CoV-2 [2].

Za pridobivanje proteina so izbrali kulture celic vešče ''Spodoptera frugiperda'' (Sf9), saj omogočajo pridobivanje proteina bodice v velikih količinah in s pravilno strukturo. S pomočjo insektnega virusa so v celice vnesli gen za mutiran protein bodice, ki se je nato izražal na površini celic. Celice so razgradili, očistili pridobljen protein bodice in ga uporabili za pripravo cepiva [2, 3].

==Polisorbat 80==

Polisorbat 80 je neionski detergent, ki se uporablja v živilski industriji, kozmetiki in medicini [4]. V vodnih raztopinah lahko polisorbat 80 spontano tvori micele – 10 nm velike lipidne strukture v obliki valja [5]. V cepivu Novavax te micele služijo kot ogrodje, v katerega se lahko zasidrajo proteini bodice. Tako nastanejo nanodelci veliki okoli 30 nm, ki lahko vsebujejo hkrati tudi do 14 proteinov bodice. Ker nanodelec predstavlja večjo strukturo kot pa sam protein bodice in navzven celo spominja na virus, sproži močnejši imunski odziv in poveča učinkovitost cepiva [5, 6].

==Matrix-M==

Adjuvanti so sestavine cepiva, ki spodbudijo imunski sistem in povečajo učinkovitost cepiva. Cepivu Novavax je dodan adjuvant Matrix-M, ki je sestavljen iz saponina rastline ''Quillaja saponaria'', holesterola in fosfolipidov. Tvori okrogle kletke podobne velikosti kot nanodelci s proteinom bodice [6, 7].

=Klinična preskušanja cepiva=

Prva preskušanja varnosti in imunogenosti cepiva Novavax so potekala na miših in pavijanih. Po prejemu 2 odmerkov cepiva so živali proizvedle protitelesa proti proteinu bodice, ki so bila sposobna nevtralizirati divji tip SARS-CoV-2. Tako se virus ni mogel vezati na receptorje na površini celic in jih okužiti. S tem so raziskovalci potrdili delovanje in varnost cepiva, s čimer so prešli na klinična preskušanja na ljudeh [8,9].

'''1. faza''' kliničnega preskušanja se je začela maja 2020 v Avstraliji. Sodelovalo je 131 zdravih prostovoljcev, starih od 18 do 59 let. Prvi in drugi odmerek so prejeli 21 dni narazen, pri čemer jih je 83 prejelo cepivo z adjuvantom, 25 brez adjuvanta in 23 placebo. Najbolj pogosta lokalna stranska učinka sta bila bolečina in oteklina na mestu vboda, sistemski stranski učinki pa utrujenost, glavobol in bolečine v mišicah. Stranski učinki so bili v glavnem kratkotrajni in blagi. Cepivo z adjuvantom je sprožilo močnejši imunski odziv in spodbudilo nastanek večje količine protiteles, kot so jih zaznali v krvi posameznikov, ki so preboleli COVID-19. Zaznali so tudi močan odziv T-celic pomagalk tipa 1 [9].

'''2. fazo''' kliničnega preskušanja so začeli avgusta 2020 v ZDA in Avstraliji. Sodelovalo je 1256 prostovoljcev, starih od 18 do 84 let, pri čemer jih je 45 % predstavljajo skupino starejših (60-84 let). Sodelujoče so razdelili v 5 skupin, od tega so 4 prejele različne doze cepiva z adjuvantom, 1 pa placebo. Rezultati 2. faze so bili v glavnem enaki kot rezultati 1. faze. Ugotovili so, da je cepivo varno tudi za starejšo populacijo. Stranski učinki so bili pri starejših redkejši in blažji, imunski odziv na cepivo pa je bil nekoliko slabši zaradi staranja imunskega sistema. Ugotovili so, da je nižja doza cepiva (5 µg) bolj primerna kot višja (25 µg), saj pri cepljenih povzroči manj stranskih učinkov, razvije pa se približno enaka količina protiteles [10,11].

'''3. faza''' kliničnega preskušanja se je začela septembra 2020 v Združenem kraljestvu. Sodelovalo je več kot 15.000 prostovoljcev, od tega 27 % starih nad 65 let. Polovica sodelujočih je prejela 2 odmerka cepiva, druga polovica dva odmerka placeba. Rezultati preskušanja še niso objavljeni v obliki znanstvenega članka, je pa podjetje Novavax sporočilo, da učinkovitost cepiva proti originalnemu sevu virusa znaša 96,4 %, proti britanski različici pa 86,3 %. Cepivo nudi 100 % zaščito pred hudim potekom COVID-19 [12].

==Ostala klinična preskušanja==

*Rezultati faze 2b iz Republike Južne Afrike so pokazali, da je učinkovitost cepiva proti južnoafriški različici 55,4 % (za HIV-negativno populacijo) [12].
*V ZDA in Mehiki trenutno še poteka 3. faza kliničnega preskušanja, v kateri sodeluje okoli 30.000 prostovoljcev starejših od 18 let [8].
*Od februarja 2021 v Združenem kraljestvu poteka raziskava, v kateri so prostovoljce cepili s kombinacijo različnih cepiv (Astrazeneca, Pfizer, Moderna in Novavax). Prvi in drugi odmerek sta predstavljali enako ali pa različni cepivi [13].

=Viri=
# The Cold Truth about COVID-19 Vaccines https://www.genengnews.com/news/the-cold-truth-about-covid-19-vaccines/ (pridobljeno 4. 5. 2021).
# J. H. Tian, N. Patel, R. Haupt, H. Zhou, S. Weston, H. Hammond, J. Logue, A. D. Portnoff, J. Norton, … G. Smith: SARS-CoV-2 spike glycoprotein vaccine candidate NVX-CoV2373 immunogenicity in baboons and protection in mice. ''Nat. Commun.'' '''2021''', ''12(1)'', str. 1–14.
# Urgent global health needs addressed by Novavax https://www.novavax.com/our-unique-technology (pridobljeno 3. 5. 2021).
#Polysorbate 80 - Wikipedia https://en.wikipedia.org/wiki/Polysorbate_80 (pridobljeno 3. 5. 2021).
# C. Boutin: NIST Clarifies Structure of Prospective Vaccine for Respiratory Virus | NIST https://www.nist.gov/news-events/news/2020/12/nist-clarifies-structure-prospective-vaccine-respiratory-virus (pridobljeno 3. 5. 2021).
# S. Bangaru, G. Ozorowski, H. L. Turner, A. Antanasijevic, D. Huang, X. Wang, J. L. Torres, J. K. Diedrich, J. H. Tian, … A. B. Ward: Structural analysis of full-length SARS-CoV-2 spike protein from an advanced vaccine candidate. ''Science''. '''2020''', ''370(6520)'', str. 1089–1094.
#J. M. Reimer, K. H. Karlsson, K. Lövgren-Bengtsson, S. E. Magnusson, A. Fuentes, L. Stertman: Matrix-MTM Adjuvant Induces Local Recruitment, Activation and Maturation of Central Immune Cells in Absence of Antigen. ''PLoS One.'' '''2012''', ''7(7)'', str. e41451.
#Phase 3 trial of Novavax investigational COVID-19 vaccine opens | National Institutes of Health (NIH) https://www.nih.gov/news-events/news-releases/phase-3-trial-novavax-investigational-covid-19-vaccine-opens (pridobljeno 4. 5. 2021).
#C. Keech, G. Albert, I. Cho, A. Robertson, P. Reed, S. Neal, J. S. Plested, M. Zhu, S. Cloney-Clark, … G. M. Glenn: Phase 1–2 Trial of a SARS-CoV-2 Recombinant Spike Protein Nanoparticle Vaccine. ''N. Engl. J. Med.'' '''2020''', ''383(24)'', str. 2320–2332.
#Novavax Initiates Phase 2 Portion of Phase 1/2 Clinical Trial of COVID-19 Vaccine | Novavax Inc. - IR Site https://ir.novavax.com/news-releases/news-release-details/novavax-initiates-phase-2-portion-phase-12-clinical-trial-covid (pridobljeno 4. 5. 2021).
#N. Formica, R. Mallory, G. Albert, M. Robinson, J. S. Plested, I. Cho, A. Robertson, F. Dubovsky, G. M. Glenn: Evaluation of a SARS-CoV-2 Vaccine NVX-CoV2373 in Younger and Older Adults. ''medRxiv'' '''2021''', str. 2021.02.26.21252482.
#Novavax Confirms High Levels of Efficacy Against Original and Variant COVID-19 Strains in United Kingdom and South Africa Trials | Novavax Inc. - IR Site https://ir.novavax.com/news-releases/news-release-details/novavax-confirms-high-levels-efficacy-against-original-and-0 (pridobljeno 4. 5. 2021).
#E. Mahase: Covid-19: Moderna and Novavax vaccines to be tested in mixing vaccines trial. ''BMJ'' '''2021''', ''372'', str. n971.

Značilnosti cepiva Novavax (proteinsko)

2021-05-04T14:14:06Z

JernejI: /* Rekombinantni protein bodice */

Značilnosti cepiva Novavax (proteinsko)

2021-05-04T14:13:56Z

JernejI: /* Matrix-M */

Značilnosti cepiva Novavax (proteinsko)

2021-05-04T14:13:35Z

JernejI: New page: Cepivo NVX-CoV2373 (v nadaljevanju: cepivo Novavax) je cepivo ameriškega podjetja Novavax proti COVID-19. Cepivo temelji na nanodelcih z rekombinantnim proteinom bodice virusa SARS-CoV-2....

Protikovidna cepiva

2021-05-04T14:01:44Z

JernejI:

Študentski seminar pri predmetu Molekularna biotehnologija 2020/21 
Univerza v Ljubljani, Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo 
Magistrski študij Biokemija 

Seminar pripravljajo študentje 1. in 2. letnika magistrskega študija. Kratki povzetki morajo biti napisani na taki ravni zahtevnosti, da so razumljivi širši javnosti. Predstavitve seminarjev (6 oz. 12 minut) imajo splošen uvod in strokovno nadaljevanje. Vsebina temelji na javno dostopnih podatkih v času priprave seminarja. Po zadnji seminarski predstavitvi bomo predvidoma izdali zbornih povzetkov, ki bo vključeval tudi slikovne razlage. Poleg tega seminarja morajo študentje pripraviti tudi daljšo predstavitev teme iz znanstvene literature.

Razpored predstavitev:

# [[Molekularnobiološke značilnosti SARS-CoV-2 in aktualni mutanti (južnoafriški, britanski, nigerijski,...)]] - 11.3. (12 min) 
# [[Interakcija SARS-CoV-2 s tarčno celico]] - 11.3. (6 min) 
# [[Značilnosti cepiva proizvajalca Moderna (mRNA)]] - 18.3. (12 min) 
# [[Rezultati kliničnih testiranj cepiva proizvajalca Moderna (mRNA) ]] - 18.3.(6 min) 
# [[Značilnosti cepiva proizvajalca AstraZeneca / Oxford University (ChAdOx1)]] - 25.3. (12 min) 
# [[Rezultati kliničnih testiranj proizvajalca AstraZeneca / Oxford University (ChAdOx1)]] - 25.3. (6 min) 
# [[Značilnosti cepiva proizvajalca Pfizer / BioNTech (mRNA)]] - 1.4. (12 min) 
# [[Rezultati kliničnih testiranj cepiva proizvajalca Pfizer / BioNTech (mRNA)]] - 1.4. (12 min) 
# [[Značilnosti cepiva proizvajalca Johnson&Johnson / Jennsen (Ad26)]] - 8.4. (6 min) 
# [[Opuščena cepiva: Merck (IAVI, Themix), Imperial College London, Univ. of Queensland]] - 8.4. (12 min) 
# [[Značilnosti cepiva Sputnik V (Gamaleya) (Ad26, Ad5)]] - 15.4. (12 min) 
# [[Značilnosti cepiva CanSino (Ad5)]] - 15.4. (12 min) 
# [[Značilnosti cepiv Sinopharm in Sinovac (inaktivirano)]] - 22.4. (12 min) 
# [[Značilnosti cepiva Bharat Biotech (inaktivirano)]] - 22.4. (12 min) 
# [[Značilnosti cepiva Novavax (proteinsko)]] - 6.5. (12 min) 
# Značilnosti cepiva EpiVacCorona (peptidno) - 6.5. (6 min) 
# Značilnosti cepiva VBI-2902a (virusom podobni delci) - 13.5. (6 min) 
nerazporejeno:
# Značilnosti cepiva Zydus Cadila (DNA) 
# Značilnosti cepiva COVAXX / UBI (peptidno) 
 
----
Povezava do [https://www.youtube.com/watch?v=K3odScka55A videa z razlago] o načinu določanja učinkovitosti cepiv in o (ne)smislu primerjanja teh vrednosti (Vox).

Antea-Glyphosate: Detekcija in razgradnja glifosata

2021-04-19T18:46:14Z

JernejI:

Antea-Glyphosate je projekt v okviru tekmovanja leta iGEM 2020, ki so ga pripravili študentje z univerze Xiamen na Kitajskem.

Povezava do projekta: [https://2020.igem.org/Team:XMU-China https://2020.igem.org/Team:XMU-China]

Avtor povzetka: Jernej Imperl

=Uvod=

Glifosat je eden od najširše uporabljanih herbicidov in mnoge raziskave nakazujejo na možne škodljive učinke za netarčne rastline, mikroorganizme in živali [1]. Kljub temu da človek v vsakdanjem življenju ni izpostavljen nevarnim količinam glifosata [1, 2], je njegova prisotnost v prsti in vodi zaskrbljujoča.

Ker glifosat v strukturi ne vsebuje nobenih kromofornih ali fluorofornih skupin, je njegova detekcija zapletena in zamudna. Prav tako bi bilo za učinkovito odstranjevanje glifosata iz okolja potrebno razviti hitro metodo, ki bi delovala pod različnimi okolijskimi pogoji [1].

Skupina iGEM iz univerze Xiamen na Kitajskem si je za cilj zadala rešiti ta dva problema in vzpostaviti sinteznobiološko rešitev za detekcijo in razgradnjo glifosata v prsti. Projekt so poimenovali Antea-Glyphosate, saj jim je idejo za projekt dal razmislek o intenzivni uporabi herbicidov pri pridelavi čaja. Pripravili so sistem za detekcijo glifosata in sistem za razgradnjo glifosata v prsti v vzorcu ter vsakega opremili s svojim stikalom smrti.

Poleg gensko spremenjenih bakterij so pripravili tudi merilni aparat, ki temelji na uporabi njihovega sistema za detekcijo glifosata in rezultate posreduje mobilni aplikaciji. V nadaljevanju je predstavljena predvsem sinteznobiološka plat njihovega projekta. Zaradi pandemije COVID-19 in omejenega časa za eksperimente so predstavljeni eksperimenti pretežno preliminarne narave (»proof of concept«).

=Detekcija=

==Osnovni princip==
Sistem za detekcijo glifosata z rekombinantno ''Escherichia coli'' temelji na njegovi delni razgradnji in posrednem merjenju koncentracije NADPH, ki se ob reakciji porablja. Encim glifosat oksidoreduktaza (GOX) katalizira cepitev vezi C-N, kar vodi do nastanka glioksilata in aminometilfosfonske kisline (AMPA) [3]. Glioksilat reduktaza (GRHPR) nato katalizira redukcijo glioksilata v glikolno kislino, ob čemer se NADPH oksidira v NADP+ [4]. Protein iNap na koncu deluje kot senzor za NADPH, saj se ob vezavi tega kofaktorja konformacijsko spremeni in odda fluorescenčni signal [5]. Kadar je v raztopini torej prisoten glifosat, se bo ob njegovi encimski razgradnji NADPH pretvarjal v NADP+, kar pa bi lahko zaznali z merjenjem upada fluorescence iNap in tako določili koncentracijo glifosata.

Da bi se izognili alternativnim metabolnim potem in lažnim rezultatom zaradi citosolnega NADPH, so encime želeli pritrditi na zunanjo površino bakterijske celice, tako da bi jih fuzirali z membranskimi proteini. Kot fuzijske partnerje so preizkusili proteine INPNC, BrkA in AIDA.

==Eksperiment==

Tabela 1: Biokocke za sistem detekcije.
{| border=1 style="border-collapse: collapse;"
|-
| Protein || Opis || '''INPNC''' || '''BrkA''' || '''AIDA'''
|-
|''' GOX ''' || Glifosat oksidoreduktaza iz rastline ''Echinochloa colona''. || [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3332052 BBa_K3332052] || [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3332055 BBa_K3332055] || [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3332054 BBa_K3332054]
|-
| ''' GRHPR '''|| Glioksilat reduktaza iz človeških jeter. || [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3332057 BBa_K3332057] || [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3332060 BBa_K3332060] || [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3332059 BBa_K3332059]
|-
| ''' iNAP '''|| Fuzija proteinov cpYFP in NADPH vezavne domene proteina REX iz ''Thermus aquaticus''.|| [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3332047 BBa_K3332047] || [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3332050 BBa_K3332050] || [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3332049 BBa_K3332049]
|-
|}

V eksperimentu so želeli preizkusiti delovanje proteinov, ko so bili ti pritrjeni na površino celic. V predhodnih eksperimentih so potrdili uspešno izražanje izbranih proteinov na površini celice. Pripravili so biokocke, kjer je bil vsak izmed treh proteinov fuziran na tri različne membranske proteine: INPNC, BrkA ali AIDA (tabela 1). Biokocke so vsebovale konstitutivni promotor [http://parts.igem.org/Part:BBa_J23100 J23100], RBS [http://parts.igem.org/Part:BBa_B0034 BBa_B0034] in terminator [http://parts.igem.org/Part:BBa_B0015 BBa_B0015]. Proteine so predstavili na površini ''E. coli'' DH5α in jih preizkusili v seriji eksperimentov.

*Suspenziji celic z izraženim GRHPR so dodali glioksilat in NADPH. Koncentracijo NADPH so spremljali z merjenjem OD340. Opazili so, da je koncentracija NADPH skozi čas padala, na podlagi česar so sklepali, da encim uspešno katalizira reakcijo. Primerjali so učinkovitost encima z različnimi fuzijskimi partnerji in sklenili, da je bila izmed vseh najučinkovitejša kombinacija INPNC-GRHPR.

*V naslednjem eksperimentu so suspenziji celic z izraženim GOX dodali glifosat, NADPH in topno obliko encima GRHPR. Na podlagi upada OD340 so določili, da je GOX uspešno kataliziral reakcijo in vsi fuzijski proteini so bili podobno učinkoviti.

*Zaradi omejenega časa za eksperimente so uspeli preizkusiti le kombinaciji INPNC-iNap in iNap-AIDA. Merili so časovno odvisnost fluorescence (ekscitacija pri 420 nm, emisija pri 528 nm) pri različnih koncentracijah NADPH pokazali odvisnost fluorescence od koncentracije pri obeh fuzijskih proteinih.

*Pripravili so suspenzijo, kjer so hkrati dodali celice z vsakim od treh proteinov (pritrjenih preko INPNC). Suspenziji so dodali glifosat in NADPH ter spremljali fluorescenco skozi čas. V primerjavi s kontrolo brez izraženih proteinov je v suspenziji prišlo do znatnega upada fluorescence, s čimer so potrdili delovanje njihovega sistema.

=Razgradnja=

==Osnovni princip==
Poleg sistema za detekcijo glifosata v vzorcu so želeli pripraviti tudi gensko spremenjeno bakterijo ''E. coli'', ki bi lahko glifosat in njegov derivat AMPA v okolju razgradila v neškodljive produkte. Za razliko od pristopa za detekcijo glifosata, bi tokrat njegova razgradnja potekala po alternativni poti, ki temelji na cepitvi vezi C-P. Za tak mehanizem razgradnje so odgovorni encimi, ki so zapisani na operonu ''phn'', ki ga najdemo pri številnih bakterijah, tudi ''E. coli''. Proteini PhnC, D in E predstavljajo sistem za aktivni transport fosfonskih kislin v celico, medtem ko kompleks PhnGHIJK, katerega glavna katalitična komponenta je PhnJ, katalizira cepitev vezi C-P s hkratno hidrolizo ATP. Po odstranitvi fosfitne skupine z glifosata, se sprosti N-metilglicin, ki pa se lahko v celici naprej oksidira do formaldehida in glicina.

Encim PhnO katalizira prenos acetilne skupine iz acetil koencima A na AMPA. Acetiliran AMPA lahko deluje kot substrat za PhnGHIJK, ki ga razgradi do N-metilacetamida. PhnO in PhnGHIJK lahko torej razgrajujejo tako glifosat kot tudi AMPA [6].

==Eksperimenti==

Tabela 2: Sestavni deli biokocke za degradacijo.
{| border=1 style="border-collapse: collapse;"
|-
| Zapis || Opis
|-
|'''PhnJ'''|| Katalitična podenota C-P liaze iz ''Enterobacter cloacae'' K7.
|-
|'''PhnO''' || Encim za acetilacijo AMPA iz ''Salmonella enterica''.
|-
|'''PhnE1 in PhnE2''' || Del transportnega sistema za glifosat iz iz ''Sinorhizobium meliloti'' 1021.
|-
|'''anti-PhnJ''' || siRNA za endogen ''phnJ''.
|-
|'''anti-PhnF''' || siRNA za endogen ''phnF''.
|-
|}

Da bi izboljšali razgradnjo glifosata in AMPA v ''E. coli'' so želeli nekatere gene ''phn'' nadomestiti s homologi iz drugih organizmov, kjer ta razgradnja poteka učinkoviteje (tabela 2). Vstaviti so želeli gene ''phnJ'' iz ''Enterobacter cloacae'' K7 [7], ''phnO'' iz ''Salmonella enterica'' [8] in ''phnE1/E2'' iz ''Sinorhizobium meliloti'' 1021 [9]. Hkrati so želeli inhibirati izražanje endognih zapisov za PhnF, ki deluje kot represor za nekatere gene ''phn'' [6], in PhnJ, ki bi lahko z rekombninantnim PhnJ tekmoval za podenote kompleksa PhnGHJIK. Kot metodo inhibicije izražanja so izbrali siRNA.

Pripravili so biokocko [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3332099 BBa_K3332099], ki je vsebovala vse potrebne zapise. Izražanje genov za proteine so nadzorovali promotorji [http://parts.igem.org/Part:BBa_J23100 J23100] in RBS [http://parts.igem.org/Part:BBa_B0034 BBa_B0034], tako da sta imela ''phnJ'' in ''phnO'' vsak svoj promotor in RBS, ''phnE1'' in ''phnE2'' pa sta bila povezana policistronsko. Uporabili so terminator [http://parts.igem.org/Part:BBa_B0015 BBa_B0015]. Za siRNA so uporabili promotor [http://parts.igem.org/Part:BBa_J23101 J23101] in terminator [http://parts.igem.org/Part:BBa_J61048 BBa_J61048], zaporedjem pa so za boljšo stabilnost in učinkovitost dodali še zaporedje OmpA 5' UTR [10] in vezavno mesto za Hfq [11].

S konstruktom, ki je vseboval pripravljeno biokocko, so transformirali ''E. coli'' BL21(DE3). Bakterije so gojili v gojišču z glifosatom in po 5 h določili koncentracijo preostalega glifosata v gojišču tako, da so uporabili svoj sistem za detekcijo. Primerjali so konstrukte z različnimi kombinacijami zapisov, vendar je bila najuspešnejša biokocka opisana zgoraj, ki je vsebovala vse zapise hkrati. Medtem ko so bakterije v negativni kontroli po 5 h privzele 8,6 % glifosata iz gojišča, so ''E. coli'' z biokocko privzele 43,1 %.

=Stikala smrti=

==Stikalo za sistem detekcije==
Stikalo smrti pri sistemu detekcije glifosata bi zagotovilo, da bi gensko spremenjene ''E. coli'' odmrle, če bi se sprostile v okolje. Gojišče, v katerem bi potekala detekcija glifosata v vzorcu, bi vsebovalo arabinozo, ki bi inhibirala sintezo citotoksične nukleaze MazF [12]. V primeru, da bi bakterije zapustile to goijšče, bi se mazF lahko izražal in privedel do celične smrti.

Pripravili so preprosto napravo [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3332081 BBa_K3332081], ki deluje kot inverter. Promotor PBAD nadzoruje izražanje zapisa za cI, promotor PR pa nadzoruje izražanje ''mazF''. Arabinoza povzroči preklop araC iz represorske v aktivatorsko obliko, kar spodbudi izražanje zapisa za cI, cI pa inhibira transkripcijo ''mazF''. V odsotnosti arabinoze bo araC inhibiral izražanje ''cI'', torej bo transkripcija ''mazF'' lahko potekala.

Pripravili so eksperiment, kjer so celice z inverterjem gojili v prisotnosti ali odsotnosti arabinoze. Rast bakterij so določili s štetjem CFU po različnih časih inkubacije. Ob prisotnosti arabinoze niso opazili znatnih sprememb v številu kolonij, medtem ko je pri odsotnosti arabinoze število kolonij izrazito upadlo v roku 8 h.

==Stikalo za sistem degradacije==
Sistem za degradacijo glifosata bi predvidoma deloval tako, da bi suspenzijo bakterij vnesli neposredno v prst, v kateri želimo odstraniti glifosat. Da bi preprečili nenadzorovano širjenje gensko spremenjenih bakterij, bi stikalo za smrt poskrbelo, da bakterije uspešno razgradijo glifosat, nato pa po opravljeni nalogi odmrejo.
Zamislili so si napravo, ki bi ob prisotnosti glifosata zavirala izražanje ''mazF'', v njegovi odsotnosti pa se bi ''mazF'' izražal in vodil v smrt.

Biokocka [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3332078 BBa_K3332078] deluje kot inverter. Namesto neposredne detekcije glifosata, so kot merilo njegove prisotnosti uporabili formaldehid, ki je eden od produktov ob razgradnji glifosata. HxlR je transkripcijski faktor, ki ob vezavi formaldehida deluje kot aktivator promotorja PHCHO [13]. PHCHO nadzoruje izražanje ''cI'', promotor PR pa izražanje ''mazF''. Ob prisotnosti formaldehida, bo HxlR aktiviral transkripcijo zapisa za cI, cI pa bo onemogočil izražanje ''mazF''. Kadar pa je formaldehid odsoten, transkripcija ''cI'' ne bo potekala in posledično se ''mazF'' lahko izraža.

Zaradi omejenega časa za eksperimentalno delo, so utegnili preizkusiti le delovanje posameznih sestavnih delov tega stikala, niso pa uspeli izvesti eksperimenta s celotno biokocko.

=Viri=

# S. Singh, V. Kumar, S. Datta, A. B. Wani, D. S. Dhanjal, R. Romero, J. Singh: Glyphosate Uptake, Translocation, Resistance Emergence in Crops, Analytical Monitoring, Toxicity and Degradation: A Review. Environmental Chemistry Letters. Springer May 1, 2020, pp. 663–702.
# World Health Organization: Glyphosate and AMPA in Drinking-water http://www.who.int/water_sanitation_health/ (pridobljeno 18. 4. 2021).
# L. Pan, Q. Yu, H. Han, L. Mao, A. Nyporko, L. J. Fan, L. Bai, S. Powles: Aldo-keto reductase metabolizes glyphosate and confers glyphosate resistance in Echinochloa colona. Plant Physiol. 2019, 181(4), str. 1519–1534.
# G. Rumsby, D. P. Cregeen: Identification and expression of a cDNA for human hydroxypyruvate/glyoxylate reductase. Biochim. Biophys. Acta - Gene Struct. Expr. 1999, 1446(3), str. 383–388.
# R. Tao, Y. Zhao, H. Chu, A. Wang, J. Zhu, X. Chen, Y. Zou, M. Shi, R. Liu, … Y. Yang: Genetically encoded fluorescent sensors reveal dynamic regulation of NADPH metabolism. Nat. Methods 2017, 14(7), str. 720–728.
# B. Hove-Jensen, D. L. Zechel, B. Jochimsen: Utilization of Glyphosate as Phosphate Source: Biochemistry and Genetics of Bacterial Carbon-Phosphorus Lyase. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2014, 78(1), str. 176–197.
# Y. V. Kryuchkova, G. L. Burygin, N. E. Gogoleva, Y. V. Gogolev, M. P. Chernyshova, O. E. Makarov, E. E. Fedorov, O. V. Turkovskaya: Isolation and characterization of a glyphosate-degrading rhizosphere strain, Enterobacter cloacae K7. Microbiol. Res. 2014, 169(1), str. 99–105.
# J. C. Errey, J. S. Blanchard: Functional annotation and kinetic characterization of PhnO from Salmonella enterica. Biochemistry 2006, 45(9), str. 3033–3039.
# C. M. Liu, P. A. McLean, C. C. Sookdeo, F. C. Cannon: Degradation of the herbicide glyphosate by members of the family Rhizobiaceae. Appl. Environ. Microbiol. 1991, 57(6), str. 1799–1804.
# M. J. Hansen, L. ‐H Chen, M. L. S. Fejzo, J. G. Beiasco: The ompA 5′ untranslated region impedes a major pathway for mRNA degradation in Escherichia coli. Mol. Microbiol. 1994, 12(5), str. 707–716.
# G. M. Cech, A. Szalewska-Palasz, K. Kubiak, A. Malabirade, W. Grange, V. Arluison, G. Wegrzyn: The Escherichia Coli Hfq Protein: An Unattended DNA-Transactions Regulator. Frontiers in Molecular Biosciences. Frontiers Media S.A. July 28, 2016, p. 36.
# Y. Zhang, J. Zhang, K. P. Hoeflich, M. Ikura, G. Qing, M. Inouye: MazF cleaves cellular mRNAs specifically at ACA to block protein synthesis in Escherichia coli. Mol. Cell 2003, 12(4), str. 913–923.
# R. Zhu, G. Zhang, M. Jing, Y. Han, J. Li, J. Zhao, Y. Li, P. R. Chen: Genetically encoded formaldehyde sensors inspired by a protein intra-helical crosslinking reaction. Nat. Commun. 2021, 12(1), str. 1–13.

Antea-Glyphosate: Detekcija in razgradnja glifosata

2021-04-19T18:43:25Z

JernejI: /* Eksperimenti */

Antea-Glyphosate: Detekcija in razgradnja glifosata

2021-04-19T18:42:54Z

JernejI:

Antea-Glyphosate je projekt v okviru tekmovanja leta iGEM 2020, ki so ga pripravili študentje z univerze Xiamen na Kitajskem.

Povezava do projekta: [https://2020.igem.org/Team:XMU-China https://2020.igem.org/Team:XMU-China]

Avtor povzetka: Jernej Imperl

=Uvod=

Glifosat je eden od najširše uporabljanih herbicidov in mnoge raziskave nakazujejo na možne škodljive učinke za netarčne rastline, mikroorganizme in živali [1]. Kljub temu da človek v vsakdanjem življenju ni izpostavljen nevarnim količinam glifosata [1, 2], je njegova prisotnost v prsti in vodi zaskrbljujoča.

Ker glifosat v strukturi ne vsebuje nobenih kromofornih ali fluorofornih skupin, je njegova detekcija zapletena in zamudna. Prav tako bi bilo za učinkovito odstranjevanje glifosata iz okolja potrebno razviti hitro metodo, ki bi delovala pod različnimi okolijskimi pogoji [1].

Skupina iGEM iz univerze Xiamen na Kitajskem si je za cilj zadala rešiti ta dva problema in vzpostaviti sinteznobiološko rešitev za detekcijo in razgradnjo glifosata v prsti. Projekt so poimenovali Antea-Glyphosate, saj jim je idejo za projekt dal razmislek o intenzivni uporabi herbicidov pri pridelavi čaja. Pripravili so sistem za detekcijo glifosata in sistem za razgradnjo glifosata v prsti v vzorcu ter vsakega opremili s svojim stikalom smrti.

Poleg gensko spremenjenih bakterij so pripravili tudi merilni aparat, ki temelji na uporabi njihovega sistema za detekcijo glifosata in rezultate posreduje mobilni aplikaciji. V nadaljevanju je predstavljena predvsem sinteznobiološka plat njihovega projekta. Zaradi pandemije COVID-19 in omejenega časa za eksperimente so predstavljeni eksperimenti pretežno preliminarne narave (»proof of concept«).

=Detekcija=

==Osnovni princip==
Sistem za detekcijo glifosata z rekombinantno ''Escherichia coli'' temelji na njegovi delni razgradnji in posrednem merjenju koncentracije NADPH, ki se ob reakciji porablja. Encim glifosat oksidoreduktaza (GOX) katalizira cepitev vezi C-N, kar vodi do nastanka glioksilata in aminometilfosfonske kisline (AMPA) [3]. Glioksilat reduktaza (GRHPR) nato katalizira redukcijo glioksilata v glikolno kislino, ob čemer se NADPH oksidira v NADP+ [4]. Protein iNap na koncu deluje kot senzor za NADPH, saj se ob vezavi tega kofaktorja konformacijsko spremeni in odda fluorescenčni signal [5]. Kadar je v raztopini torej prisoten glifosat, se bo ob njegovi encimski razgradnji NADPH pretvarjal v NADP+, kar pa bi lahko zaznali z merjenjem upada fluorescence iNap in tako določili koncentracijo glifosata.

Da bi se izognili alternativnim metabolnim potem in lažnim rezultatom zaradi citosolnega NADPH, so encime želeli pritrditi na zunanjo površino bakterijske celice, tako da bi jih fuzirali z membranskimi proteini. Kot fuzijske partnerje so preizkusili proteine INPNC, BrkA in AIDA.

==Eksperiment==

Tabela 1: Biokocke za sistem detekcije.
{| border=1 style="border-collapse: collapse;"
|-
| Protein || Opis || '''INPNC''' || '''BrkA''' || '''AIDA'''
|-
|''' GOX ''' || Glifosat oksidoreduktaza iz rastline ''Echinochloa colona''. || [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3332052 BBa_K3332052] || [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3332055 BBa_K3332055] || [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3332054 BBa_K3332054]
|-
| ''' GRHPR '''|| Glioksilat reduktaza iz človeških jeter. || [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3332057 BBa_K3332057] || [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3332060 BBa_K3332060] || [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3332059 BBa_K3332059]
|-
| ''' iNAP '''|| Fuzija proteinov cpYFP in NADPH vezavne domene proteina REX iz ''Thermus aquaticus''.|| [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3332047 BBa_K3332047] || [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3332050 BBa_K3332050] || [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3332049 BBa_K3332049]
|-
|}

V eksperimentu so želeli preizkusiti delovanje proteinov, ko so bili ti pritrjeni na površino celic. V predhodnih eksperimentih so potrdili uspešno izražanje izbranih proteinov na površini celice. Pripravili so biokocke, kjer je bil vsak izmed treh proteinov fuziran na tri različne membranske proteine: INPNC, BrkA ali AIDA (tabela 1). Biokocke so vsebovale konstitutivni promotor [http://parts.igem.org/Part:BBa_J23100 J23100], RBS [http://parts.igem.org/Part:BBa_B0034 BBa_B0034] in terminator [http://parts.igem.org/Part:BBa_B0015 BBa_B0015]. Proteine so predstavili na površini ''E. coli'' DH5α in jih preizkusili v seriji eksperimentov.

*Suspenziji celic z izraženim GRHPR so dodali glioksilat in NADPH. Koncentracijo NADPH so spremljali z merjenjem OD340. Opazili so, da je koncentracija NADPH skozi čas padala, na podlagi česar so sklepali, da encim uspešno katalizira reakcijo. Primerjali so učinkovitost encima z različnimi fuzijskimi partnerji in sklenili, da je bila izmed vseh najučinkovitejša kombinacija INPNC-GRHPR.

*V naslednjem eksperimentu so suspenziji celic z izraženim GOX dodali glifosat, NADPH in topno obliko encima GRHPR. Na podlagi upada OD340 so določili, da je GOX uspešno kataliziral reakcijo in vsi fuzijski proteini so bili podobno učinkoviti.

*Zaradi omejenega časa za eksperimente so uspeli preizkusiti le kombinaciji INPNC-iNap in iNap-AIDA. Merili so časovno odvisnost fluorescence (ekscitacija pri 420 nm, emisija pri 528 nm) pri različnih koncentracijah NADPH pokazali odvisnost fluorescence od koncentracije pri obeh fuzijskih proteinih.

*Pripravili so suspenzijo, kjer so hkrati dodali celice z vsakim od treh proteinov (pritrjenih preko INPNC). Suspenziji so dodali glifosat in NADPH ter spremljali fluorescenco skozi čas. V primerjavi s kontrolo brez izraženih proteinov je v suspenziji prišlo do znatnega upada fluorescence, s čimer so potrdili delovanje njihovega sistema.

=Razgradnja=

==Osnovni princip==
Poleg sistema za detekcijo glifosata v vzorcu so želeli pripraviti tudi gensko spremenjeno bakterijo ''E. coli'', ki bi lahko glifosat in njegov derivat AMPA v okolju razgradila v neškodljive produkte. Za razliko od pristopa za detekcijo glifosata, bi tokrat njegova razgradnja potekala po alternativni poti, ki temelji na cepitvi vezi C-P. Za tak mehanizem razgradnje so odgovorni encimi, ki so zapisani na operonu ''phn'', ki ga najdemo pri številnih bakterijah, tudi ''E. coli''. Proteini PhnC, D in E predstavljajo sistem za aktivni transport fosfonskih kislin v celico, medtem ko kompleks PhnGHIJK, katerega glavna katalitična komponenta je PhnJ, katalizira cepitev vezi C-P s hkratno hidrolizo ATP. Po odstranitvi fosfitne skupine z glifosata, se sprosti N-metilglicin, ki pa se lahko v celici naprej oksidira do formaldehida in glicina.

Encim PhnO katalizira prenos acetilne skupine iz acetil koencima A na AMPA. Acetiliran AMPA lahko deluje kot substrat za PhnGHIJK, ki ga razgradi do N-metilacetamida. PhnO in PhnGHIJK lahko torej razgrajujejo tako glifosat kot tudi AMPA [6].

==Eksperimenti==

Tabela 2: Sestavni deli biokocke za degradacijo.
{| border=1 style="border-collapse: collapse;"
|-
| Zapis || Opis
|-
|'''PhnJ'''|| Katalitična podenota C-P liaze iz ''Enterobacter cloacae'' K7.
|-
|'''PhnO''' || Encim za acetilacijo AMPA iz ''Salmonella enterica''.
|-
|'''PhnE1 in PhnE2''' || Del transportnega sistema za glifosat iz iz ''Sinorhizobium meliloti'' 1021.
|-
|'''anti-PhnJ''' || siRNA za endogen ''phnJ''.
|-
|'''anti-PhnF''' || siRNA za endogen ''phnF''.
|-
|}

Da bi izboljšali razgradnjo glifosata in AMPA v ''E. coli'' so želeli nekatere gene ''phn'' nadomestiti s homologi iz drugih organizmov, kjer ta razgradnja poteka učinkoviteje. Vstaviti so želeli gene ''phnJ'' iz ''Enterobacter cloacae'' K7 [7], ''phnO'' iz ''Salmonella enterica'' [8] in ''phnE1/E2'' iz ''Sinorhizobium meliloti'' 1021 [9]. Hkrati so želeli inhibirati izražanje endognih zapisov za PhnF, ki deluje kot represor za nekatere gene ''phn'' [6], in PhnJ, ki bi lahko z rekombninantnim PhnJ tekmoval za podenote kompleksa PhnGHJIK. Kot metodo inhibicije izražanja so izbrali siRNA.

Pripravili so biokocko [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3332099 BBa_K3332099], ki je vsebovala vse potrebne zapise. Izražanje genov za proteine so nadzorovali promotorji [http://parts.igem.org/Part:BBa_J23100 J23100] in RBS [http://parts.igem.org/Part:BBa_B0034 BBa_B0034], tako da sta imela ''phnJ'' in ''phnO'' vsak svoj promotor in RBS, ''phnE1'' in ''phnE2'' pa sta bila povezana policistronsko. Uporabili so terminator [http://parts.igem.org/Part:BBa_B0015 BBa_B0015]. Za siRNA so uporabili promotor [http://parts.igem.org/Part:BBa_J23101 J23101] in terminator [http://parts.igem.org/Part:BBa_J61048 BBa_J61048], zaporedjem pa so za boljšo stabilnost in učinkovitost dodali še zaporedje OmpA 5' UTR [10] in vezavno mesto za Hfq [11].

S konstruktom, ki je vseboval pripravljeno biokocko, so transformirali ''E. coli'' BL21(DE3). Bakterije so gojili v gojišču z glifosatom in po 5 h določili koncentracijo preostalega glifosata v gojišču tako, da so uporabili svoj sistem za detekcijo. Primerjali so konstrukte z različnimi kombinacijami zapisov, vendar je bila najuspešnejša biokocka opisana zgoraj, ki je vsebovala vse zapise hkrati. Medtem ko so bakterije v negativni kontroli po 5 h privzele 8,6 % glifosata iz gojišča, so ''E. coli'' z biokocko privzele 43,1 %.

=Stikala smrti=

==Stikalo za sistem detekcije==
Stikalo smrti pri sistemu detekcije glifosata bi zagotovilo, da bi gensko spremenjene ''E. coli'' odmrle, če bi se sprostile v okolje. Gojišče, v katerem bi potekala detekcija glifosata v vzorcu, bi vsebovalo arabinozo, ki bi inhibirala sintezo citotoksične nukleaze MazF [12]. V primeru, da bi bakterije zapustile to goijšče, bi se mazF lahko izražal in privedel do celične smrti.

Pripravili so preprosto napravo [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3332081 BBa_K3332081], ki deluje kot inverter. Promotor PBAD nadzoruje izražanje zapisa za cI, promotor PR pa nadzoruje izražanje ''mazF''. Arabinoza povzroči preklop araC iz represorske v aktivatorsko obliko, kar spodbudi izražanje zapisa za cI, cI pa inhibira transkripcijo ''mazF''. V odsotnosti arabinoze bo araC inhibiral izražanje ''cI'', torej bo transkripcija ''mazF'' lahko potekala.

Pripravili so eksperiment, kjer so celice z inverterjem gojili v prisotnosti ali odsotnosti arabinoze. Rast bakterij so določili s štetjem CFU po različnih časih inkubacije. Ob prisotnosti arabinoze niso opazili znatnih sprememb v številu kolonij, medtem ko je pri odsotnosti arabinoze število kolonij izrazito upadlo v roku 8 h.

==Stikalo za sistem degradacije==
Sistem za degradacijo glifosata bi predvidoma deloval tako, da bi suspenzijo bakterij vnesli neposredno v prst, v kateri želimo odstraniti glifosat. Da bi preprečili nenadzorovano širjenje gensko spremenjenih bakterij, bi stikalo za smrt poskrbelo, da bakterije uspešno razgradijo glifosat, nato pa po opravljeni nalogi odmrejo.
Zamislili so si napravo, ki bi ob prisotnosti glifosata zavirala izražanje ''mazF'', v njegovi odsotnosti pa se bi ''mazF'' izražal in vodil v smrt.

Biokocka [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3332078 BBa_K3332078] deluje kot inverter. Namesto neposredne detekcije glifosata, so kot merilo njegove prisotnosti uporabili formaldehid, ki je eden od produktov ob razgradnji glifosata. HxlR je transkripcijski faktor, ki ob vezavi formaldehida deluje kot aktivator promotorja PHCHO [13]. PHCHO nadzoruje izražanje ''cI'', promotor PR pa izražanje ''mazF''. Ob prisotnosti formaldehida, bo HxlR aktiviral transkripcijo zapisa za cI, cI pa bo onemogočil izražanje ''mazF''. Kadar pa je formaldehid odsoten, transkripcija ''cI'' ne bo potekala in posledično se ''mazF'' lahko izraža.

Zaradi omejenega časa za eksperimentalno delo, so utegnili preizkusiti le delovanje posameznih sestavnih delov tega stikala, niso pa uspeli izvesti eksperimenta s celotno biokocko.

=Viri=

# S. Singh, V. Kumar, S. Datta, A. B. Wani, D. S. Dhanjal, R. Romero, J. Singh: Glyphosate Uptake, Translocation, Resistance Emergence in Crops, Analytical Monitoring, Toxicity and Degradation: A Review. Environmental Chemistry Letters. Springer May 1, 2020, pp. 663–702.
# World Health Organization: Glyphosate and AMPA in Drinking-water http://www.who.int/water_sanitation_health/ (pridobljeno 18. 4. 2021).
# L. Pan, Q. Yu, H. Han, L. Mao, A. Nyporko, L. J. Fan, L. Bai, S. Powles: Aldo-keto reductase metabolizes glyphosate and confers glyphosate resistance in Echinochloa colona. Plant Physiol. 2019, 181(4), str. 1519–1534.
# G. Rumsby, D. P. Cregeen: Identification and expression of a cDNA for human hydroxypyruvate/glyoxylate reductase. Biochim. Biophys. Acta - Gene Struct. Expr. 1999, 1446(3), str. 383–388.
# R. Tao, Y. Zhao, H. Chu, A. Wang, J. Zhu, X. Chen, Y. Zou, M. Shi, R. Liu, … Y. Yang: Genetically encoded fluorescent sensors reveal dynamic regulation of NADPH metabolism. Nat. Methods 2017, 14(7), str. 720–728.
# B. Hove-Jensen, D. L. Zechel, B. Jochimsen: Utilization of Glyphosate as Phosphate Source: Biochemistry and Genetics of Bacterial Carbon-Phosphorus Lyase. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2014, 78(1), str. 176–197.
# Y. V. Kryuchkova, G. L. Burygin, N. E. Gogoleva, Y. V. Gogolev, M. P. Chernyshova, O. E. Makarov, E. E. Fedorov, O. V. Turkovskaya: Isolation and characterization of a glyphosate-degrading rhizosphere strain, Enterobacter cloacae K7. Microbiol. Res. 2014, 169(1), str. 99–105.
# J. C. Errey, J. S. Blanchard: Functional annotation and kinetic characterization of PhnO from Salmonella enterica. Biochemistry 2006, 45(9), str. 3033–3039.
# C. M. Liu, P. A. McLean, C. C. Sookdeo, F. C. Cannon: Degradation of the herbicide glyphosate by members of the family Rhizobiaceae. Appl. Environ. Microbiol. 1991, 57(6), str. 1799–1804.
# M. J. Hansen, L. ‐H Chen, M. L. S. Fejzo, J. G. Beiasco: The ompA 5′ untranslated region impedes a major pathway for mRNA degradation in Escherichia coli. Mol. Microbiol. 1994, 12(5), str. 707–716.
# G. M. Cech, A. Szalewska-Palasz, K. Kubiak, A. Malabirade, W. Grange, V. Arluison, G. Wegrzyn: The Escherichia Coli Hfq Protein: An Unattended DNA-Transactions Regulator. Frontiers in Molecular Biosciences. Frontiers Media S.A. July 28, 2016, p. 36.
# Y. Zhang, J. Zhang, K. P. Hoeflich, M. Ikura, G. Qing, M. Inouye: MazF cleaves cellular mRNAs specifically at ACA to block protein synthesis in Escherichia coli. Mol. Cell 2003, 12(4), str. 913–923.
# R. Zhu, G. Zhang, M. Jing, Y. Han, J. Li, J. Zhao, Y. Li, P. R. Chen: Genetically encoded formaldehyde sensors inspired by a protein intra-helical crosslinking reaction. Nat. Commun. 2021, 12(1), str. 1–13.

Antea-Glyphosate: Detekcija in razgradnja glifosata

2021-04-19T18:29:24Z

JernejI: /* Stikalo za sistem detekcije */

Antea-Glyphosate je projekt v okviru tekmovanja leta iGEM 2020, ki so ga pripravili študentje z univerze Xiamen na Kitajskem.

Povezava do projekta: [https://2020.igem.org/Team:XMU-China https://2020.igem.org/Team:XMU-China]

Avtor povzetka: Jernej Imperl

=Uvod=

Glifosat je eden od najširše uporabljanih herbicidov in mnoge raziskave nakazujejo na možne škodljive učinke za netarčne rastline, mikroorganizme in živali [1]. Kljub temu da človek v vsakdanjem življenju ni izpostavljen nevarnim količinam glifosata [1, 2], je njegova prisotnost v prsti in vodi zaskrbljujoča.

Ker glifosat v strukturi ne vsebuje nobenih kromofornih ali fluorofornih skupin, je njegova detekcija zapletena in zamudna. Prav tako bi bilo za učinkovito odstranjevanje glifosata iz okolja potrebno razviti hitro metodo, ki bi delovala pod različnimi okolijskimi pogoji [1].

Skupina iGEM iz univerze Xiamen na Kitajskem si je za cilj zadala rešiti ta dva problema in vzpostaviti sinteznobiološko rešitev za detekcijo in razgradnjo glifosata v prsti. Projekt so poimenovali Antea-Glyphosate, saj jim je idejo za projekt dal razmislek o intenzivni uporabi herbicidov pri pridelavi čaja. Pripravili so sistem za detekcijo glifosata in sistem za razgradnjo glifosata v prsti v vzorcu ter vsakega opremili s svojim stikalom smrti.

Poleg gensko spremenjenih bakterij so pripravili tudi merilni aparat, ki temelji na uporabi njihovega sistema za detekcijo glifosata in rezultate posreduje mobilni aplikaciji. V nadaljevanju je predstavljena predvsem sinteznobiološka plat njihovega projekta. Zaradi pandemije COVID-19 in omejenega časa za eksperimente so predstavljeni eksperimenti pretežno preliminarne narave (»proof of concept«).

=Detekcija=

==Osnovni princip==
Sistem za detekcijo glifosata z rekombinantno ''Escherichia coli'' temelji na njegovi delni razgradnji in posrednem merjenju koncentracije NADPH, ki se ob reakciji porablja. Encim glifosat oksidoreduktaza (GOX) katalizira cepitev vezi C-N, kar vodi do nastanka glioksilata in aminometilfosfonske kisline (AMPA) [3]. Glioksilat reduktaza (GRHPR) nato katalizira redukcijo glioksilata v glikolno kislino, ob čemer se NADPH oksidira v NADP+ [4]. Protein iNap na koncu deluje kot senzor za NADPH, saj se ob vezavi tega kofaktorja konformacijsko spremeni in odda fluorescenčni signal [5]. Kadar je v raztopini torej prisoten glifosat, se bo ob njegovi encimski razgradnji NADPH pretvarjal v NADP+, kar pa bi lahko zaznali z merjenjem upada fluorescence iNap in tako določili koncentracijo glifosata.

Da bi se izognili alternativnim metabolnim potem in lažnim rezultatom zaradi citosolnega NADPH, so encime želeli pritrditi na zunanjo površino bakterijske celice, tako da bi jih fuzirali z membranskimi proteini. Kot fuzijske partnerje so preizkusili proteine INPNC, BrkA in AIDA.

==Eksperiment==

Tabela 1: Biokocke za sistem detekcije.
{| border=1 style="border-collapse: collapse;"
|-
| Protein || Opis || '''INPNC''' || '''BrkA''' || '''AIDA'''
|-
|''' GOX ''' || Glifosat oksidoreduktaza iz rastline ''Echinochloa colona''. || [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3332052 BBa_K3332052] || [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3332055 BBa_K3332055] || [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3332054 BBa_K3332054]
|-
| ''' GRHPR '''|| Glioksilat reduktaza iz človeških jeter. || [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3332057 BBa_K3332057] || [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3332060 BBa_K3332060] || [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3332059 BBa_K3332059]
|-
| ''' iNAP '''|| Fuzija proteinov cpYFP in NADPH vezavne domene proteina REX iz ''Thermus aquaticus''.|| [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3332047 BBa_K3332047] || [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3332050 BBa_K3332050] || [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3332049 BBa_K3332049]
|-
|}

V eksperimentu so želeli preizkusiti delovanje proteinov, ko so bili ti pritrjeni na površino celic. V predhodnih eksperimentih so potrdili uspešno izražanje izbranih proteinov na površini celice. Pripravili so biokocke, kjer je bil vsak izmed treh proteinov fuziran na tri različne membranske proteine: INPNC, BrkA ali AIDA (tabela 1). Biokocke so vsebovale konstitutivni promotor [http://parts.igem.org/Part:BBa_J23100 J23100], RBS [http://parts.igem.org/Part:BBa_B0034 BBa_B0034] in terminator [http://parts.igem.org/Part:BBa_B0015 BBa_B0015]. Proteine so predstavili na površini ''E. coli'' DH5α in jih preizkusili v seriji eksperimentov.

*Suspenziji celic z izraženim GRHPR so dodali glioksilat in NADPH. Koncentracijo NADPH so spremljali z merjenjem OD340. Opazili so, da je koncentracija NADPH skozi čas padala, na podlagi česar so sklepali, da encim uspešno katalizira reakcijo. Primerjali so učinkovitost encima z različnimi fuzijskimi partnerji in sklenili, da je bila izmed vseh najučinkovitejša kombinacija INPNC-GRHPR.

*V naslednjem eksperimentu so suspenziji celic z izraženim GOX dodali glifosat, NADPH in topno obliko encima GRHPR. Na podlagi upada OD340 so določili, da je GOX uspešno kataliziral reakcijo in vsi fuzijski proteini so bili podobno učinkoviti.

*Zaradi omejenega časa za eksperimente so uspeli preizkusiti le kombinaciji INPNC-iNap in iNap-AIDA. Merili so časovno odvisnost fluorescence (ekscitacija pri 420 nm, emisija pri 528 nm) pri različnih koncentracijah NADPH pokazali odvisnost fluorescence od koncentracije pri obeh fuzijskih proteinih.

*Pripravili so suspenzijo, kjer so hkrati dodali celice z vsakim od treh proteinov (pritrjenih preko INPNC). Suspenziji so dodali glifosat in NADPH ter spremljali fluorescenco skozi čas. V primerjavi s kontrolo brez izraženih proteinov je v suspenziji prišlo do znatnega upada fluorescence, s čimer so potrdili delovanje njihovega sistema.

=Razgradnja=

==Osnovni princip==
Poleg sistema za detekcijo glifosata v vzorcu so želeli pripraviti tudi gensko spremenjeno bakterijo ''E. coli'', ki bi lahko glifosat in njegov derivat AMPA v okolju razgradila v neškodljive produkte. Za razliko od pristopa za detekcijo glifosata, bi tokrat njegova razgradnja potekala po alternativni poti, ki temelji na cepitvi vezi C-P. Za tak mehanizem razgradnje so odgovorni encimi, ki so zapisani na operonu ''phn'', ki ga najdemo pri številnih bakterijah, tudi ''E. coli''. Proteini PhnC, D in E predstavljajo sistem za aktivni transport fosfonskih kislin v celico, medtem ko kompleks PhnGHIJK, katerega glavna katalitična komponenta je PhnJ, katalizira cepitev vezi C-P s hkratno hidrolizo ATP. Po odstranitvi fosfitne skupine z glifosata, se sprosti N-metilglicin, ki pa se lahko v celici naprej oksidira do formaldehida in glicina.

Encim PhnO katalizira prenos acetilne skupine iz acetil koencima A na AMPA. Acetiliran AMPA lahko deluje kot substrat za PhnGHIJK, ki ga razgradi do N-metilacetamida. PhnO in PhnGHIJK lahko torej razgrajujejo tako glifosat kot tudi AMPA [6].

==Eksperimenti==
Da bi izboljšali razgradnjo glifosata in AMPA v ''E. coli'' so želeli nekatere gene ''phn'' nadomestiti s homologi iz drugih organizmov, kjer ta razgradnja poteka učinkoviteje. Vstaviti so želeli gene ''phnJ'' iz ''Enterobacter cloacae'' K7 [7], ''phnO'' iz ''Salmonella enterica'' [8] in ''phnE1/E2'' iz ''Sinorhizobium meliloti'' 1021 [9]. Hkrati so želeli inhibirati izražanje endognih zapisov za PhnF, ki deluje kot represor za nekatere gene ''phn'' [6], in PhnJ, ki bi lahko z rekombninantnim PhnJ tekmoval za podenote kompleksa PhnGHJIK. Kot metodo inhibicije izražanja so izbrali siRNA.

Pripravili so biokocko BBa_K3332099, ki je vsebovala vse potrebne zapise. Izražanje genov za proteine so nadzorovali promotorji J23100 in RBS BBa_B0034, tako da sta imela ''phnJ'' in ''phnO'' vsak svoj promotor in RBS, ''phnE1'' in ''phnE2'' pa sta bila povezana policistronsko. Uporabili so terminator BBa_B0015. Za siRNA so uporabili promotor BBa_J23101 in terminator BBa_J61048, zaporedjem pa so za boljšo stabilnost in učinkovitost dodali še zaporedje OmpA 5' UTR [10] in vezavno mesto za Hfq [11].

S konstruktom, ki je vseboval pripravljeno biokocko, so transformirali ''E. coli'' BL21(DE3). Bakterije so gojili v gojišču z glifosatom in po 5 h določili koncentracijo preostalega glifosata v gojišču tako, da so uporabili svoj sistem za detekcijo. Primerjali so konstrukte z različnimi kombinacijami zapisov, vendar je bila najuspešnejša biokocka opisana zgoraj, ki je vsebovala vse zapise hkrati. Medtem ko so bakterije v negativni kontroli po 5 h privzele 8,6 % glifosata iz gojišča, so ''E. coli'' z biokocko privzele 43,1 %.

=Stikala smrti=

==Stikalo za sistem detekcije==
Stikalo smrti pri sistemu detekcije glifosata bi zagotovilo, da bi gensko spremenjene ''E. coli'' odmrle, če bi se sprostile v okolje. Gojišče, v katerem bi potekala detekcija glifosata v vzorcu, bi vsebovalo arabinozo, ki bi inhibirala sintezo citotoksične nukleaze MazF [12]. V primeru, da bi bakterije zapustile to goijšče, bi se mazF lahko izražal in privedel do celične smrti.

Pripravili so preprosto napravo [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3332081 BBa_K3332081], ki deluje kot inverter. Promotor PBAD nadzoruje izražanje zapisa za cI, promotor PR pa nadzoruje izražanje ''mazF''. Arabinoza povzroči preklop araC iz represorske v aktivatorsko obliko, kar spodbudi izražanje zapisa za cI, cI pa inhibira transkripcijo ''mazF''. V odsotnosti arabinoze bo araC inhibiral izražanje ''cI'', torej bo transkripcija ''mazF'' lahko potekala.

Pripravili so eksperiment, kjer so celice z inverterjem gojili v prisotnosti ali odsotnosti arabinoze. Rast bakterij so določili s štetjem CFU po različnih časih inkubacije. Ob prisotnosti arabinoze niso opazili znatnih sprememb v številu kolonij, medtem ko je pri odsotnosti arabinoze število kolonij izrazito upadlo v roku 8 h.

==Stikalo za sistem degradacije==
Sistem za degradacijo glifosata bi predvidoma deloval tako, da bi suspenzijo bakterij vnesli neposredno v prst, v kateri želimo odstraniti glifosat. Da bi preprečili nenadzorovano širjenje gensko spremenjenih bakterij, bi stikalo za smrt poskrbelo, da bakterije uspešno razgradijo glifosat, nato pa po opravljeni nalogi odmrejo.
Zamislili so si napravo, ki bi ob prisotnosti glifosata zavirala izražanje ''mazF'', v njegovi odsotnosti pa se bi ''mazF'' izražal in vodil v smrt.

Biokocka [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3332078 BBa_K3332078] deluje kot inverter. Namesto neposredne detekcije glifosata, so kot merilo njegove prisotnosti uporabili formaldehid, ki je eden od produktov ob razgradnji glifosata. HxlR je transkripcijski faktor, ki ob vezavi formaldehida deluje kot aktivator promotorja PHCHO [13]. PHCHO nadzoruje izražanje ''cI'', promotor PR pa izražanje ''mazF''. Ob prisotnosti formaldehida, bo HxlR aktiviral transkripcijo zapisa za cI, cI pa bo onemogočil izražanje ''mazF''. Kadar pa je formaldehid odsoten, transkripcija ''cI'' ne bo potekala in posledično se ''mazF'' lahko izraža.

Zaradi omejenega časa za eksperimentalno delo, so utegnili preizkusiti le delovanje posameznih sestavnih delov tega stikala, niso pa uspeli izvesti eksperimenta s celotno biokocko.

=Viri=

# S. Singh, V. Kumar, S. Datta, A. B. Wani, D. S. Dhanjal, R. Romero, J. Singh: Glyphosate Uptake, Translocation, Resistance Emergence in Crops, Analytical Monitoring, Toxicity and Degradation: A Review. Environmental Chemistry Letters. Springer May 1, 2020, pp. 663–702.
# World Health Organization: Glyphosate and AMPA in Drinking-water http://www.who.int/water_sanitation_health/ (pridobljeno 18. 4. 2021).
# L. Pan, Q. Yu, H. Han, L. Mao, A. Nyporko, L. J. Fan, L. Bai, S. Powles: Aldo-keto reductase metabolizes glyphosate and confers glyphosate resistance in Echinochloa colona. Plant Physiol. 2019, 181(4), str. 1519–1534.
# G. Rumsby, D. P. Cregeen: Identification and expression of a cDNA for human hydroxypyruvate/glyoxylate reductase. Biochim. Biophys. Acta - Gene Struct. Expr. 1999, 1446(3), str. 383–388.
# R. Tao, Y. Zhao, H. Chu, A. Wang, J. Zhu, X. Chen, Y. Zou, M. Shi, R. Liu, … Y. Yang: Genetically encoded fluorescent sensors reveal dynamic regulation of NADPH metabolism. Nat. Methods 2017, 14(7), str. 720–728.
# B. Hove-Jensen, D. L. Zechel, B. Jochimsen: Utilization of Glyphosate as Phosphate Source: Biochemistry and Genetics of Bacterial Carbon-Phosphorus Lyase. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2014, 78(1), str. 176–197.
# Y. V. Kryuchkova, G. L. Burygin, N. E. Gogoleva, Y. V. Gogolev, M. P. Chernyshova, O. E. Makarov, E. E. Fedorov, O. V. Turkovskaya: Isolation and characterization of a glyphosate-degrading rhizosphere strain, Enterobacter cloacae K7. Microbiol. Res. 2014, 169(1), str. 99–105.
# J. C. Errey, J. S. Blanchard: Functional annotation and kinetic characterization of PhnO from Salmonella enterica. Biochemistry 2006, 45(9), str. 3033–3039.
# C. M. Liu, P. A. McLean, C. C. Sookdeo, F. C. Cannon: Degradation of the herbicide glyphosate by members of the family Rhizobiaceae. Appl. Environ. Microbiol. 1991, 57(6), str. 1799–1804.
# M. J. Hansen, L. ‐H Chen, M. L. S. Fejzo, J. G. Beiasco: The ompA 5′ untranslated region impedes a major pathway for mRNA degradation in Escherichia coli. Mol. Microbiol. 1994, 12(5), str. 707–716.
# G. M. Cech, A. Szalewska-Palasz, K. Kubiak, A. Malabirade, W. Grange, V. Arluison, G. Wegrzyn: The Escherichia Coli Hfq Protein: An Unattended DNA-Transactions Regulator. Frontiers in Molecular Biosciences. Frontiers Media S.A. July 28, 2016, p. 36.
# Y. Zhang, J. Zhang, K. P. Hoeflich, M. Ikura, G. Qing, M. Inouye: MazF cleaves cellular mRNAs specifically at ACA to block protein synthesis in Escherichia coli. Mol. Cell 2003, 12(4), str. 913–923.
# R. Zhu, G. Zhang, M. Jing, Y. Han, J. Li, J. Zhao, Y. Li, P. R. Chen: Genetically encoded formaldehyde sensors inspired by a protein intra-helical crosslinking reaction. Nat. Commun. 2021, 12(1), str. 1–13.

Antea-Glyphosate: Detekcija in razgradnja glifosata

2021-04-19T18:28:24Z

JernejI: /* Stikalo za sistem degradacije */

Antea-Glyphosate je projekt v okviru tekmovanja leta iGEM 2020, ki so ga pripravili študentje z univerze Xiamen na Kitajskem.

Povezava do projekta: [https://2020.igem.org/Team:XMU-China https://2020.igem.org/Team:XMU-China]

Avtor povzetka: Jernej Imperl

=Uvod=

Glifosat je eden od najširše uporabljanih herbicidov in mnoge raziskave nakazujejo na možne škodljive učinke za netarčne rastline, mikroorganizme in živali [1]. Kljub temu da človek v vsakdanjem življenju ni izpostavljen nevarnim količinam glifosata [1, 2], je njegova prisotnost v prsti in vodi zaskrbljujoča.

Ker glifosat v strukturi ne vsebuje nobenih kromofornih ali fluorofornih skupin, je njegova detekcija zapletena in zamudna. Prav tako bi bilo za učinkovito odstranjevanje glifosata iz okolja potrebno razviti hitro metodo, ki bi delovala pod različnimi okolijskimi pogoji [1].

Skupina iGEM iz univerze Xiamen na Kitajskem si je za cilj zadala rešiti ta dva problema in vzpostaviti sinteznobiološko rešitev za detekcijo in razgradnjo glifosata v prsti. Projekt so poimenovali Antea-Glyphosate, saj jim je idejo za projekt dal razmislek o intenzivni uporabi herbicidov pri pridelavi čaja. Pripravili so sistem za detekcijo glifosata in sistem za razgradnjo glifosata v prsti v vzorcu ter vsakega opremili s svojim stikalom smrti.

Poleg gensko spremenjenih bakterij so pripravili tudi merilni aparat, ki temelji na uporabi njihovega sistema za detekcijo glifosata in rezultate posreduje mobilni aplikaciji. V nadaljevanju je predstavljena predvsem sinteznobiološka plat njihovega projekta. Zaradi pandemije COVID-19 in omejenega časa za eksperimente so predstavljeni eksperimenti pretežno preliminarne narave (»proof of concept«).

=Detekcija=

==Osnovni princip==
Sistem za detekcijo glifosata z rekombinantno ''Escherichia coli'' temelji na njegovi delni razgradnji in posrednem merjenju koncentracije NADPH, ki se ob reakciji porablja. Encim glifosat oksidoreduktaza (GOX) katalizira cepitev vezi C-N, kar vodi do nastanka glioksilata in aminometilfosfonske kisline (AMPA) [3]. Glioksilat reduktaza (GRHPR) nato katalizira redukcijo glioksilata v glikolno kislino, ob čemer se NADPH oksidira v NADP+ [4]. Protein iNap na koncu deluje kot senzor za NADPH, saj se ob vezavi tega kofaktorja konformacijsko spremeni in odda fluorescenčni signal [5]. Kadar je v raztopini torej prisoten glifosat, se bo ob njegovi encimski razgradnji NADPH pretvarjal v NADP+, kar pa bi lahko zaznali z merjenjem upada fluorescence iNap in tako določili koncentracijo glifosata.

Da bi se izognili alternativnim metabolnim potem in lažnim rezultatom zaradi citosolnega NADPH, so encime želeli pritrditi na zunanjo površino bakterijske celice, tako da bi jih fuzirali z membranskimi proteini. Kot fuzijske partnerje so preizkusili proteine INPNC, BrkA in AIDA.

==Eksperiment==

Tabela 1: Biokocke za sistem detekcije.
{| border=1 style="border-collapse: collapse;"
|-
| Protein || Opis || '''INPNC''' || '''BrkA''' || '''AIDA'''
|-
|''' GOX ''' || Glifosat oksidoreduktaza iz rastline ''Echinochloa colona''. || [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3332052 BBa_K3332052] || [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3332055 BBa_K3332055] || [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3332054 BBa_K3332054]
|-
| ''' GRHPR '''|| Glioksilat reduktaza iz človeških jeter. || [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3332057 BBa_K3332057] || [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3332060 BBa_K3332060] || [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3332059 BBa_K3332059]
|-
| ''' iNAP '''|| Fuzija proteinov cpYFP in NADPH vezavne domene proteina REX iz ''Thermus aquaticus''.|| [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3332047 BBa_K3332047] || [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3332050 BBa_K3332050] || [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3332049 BBa_K3332049]
|-
|}

V eksperimentu so želeli preizkusiti delovanje proteinov, ko so bili ti pritrjeni na površino celic. V predhodnih eksperimentih so potrdili uspešno izražanje izbranih proteinov na površini celice. Pripravili so biokocke, kjer je bil vsak izmed treh proteinov fuziran na tri različne membranske proteine: INPNC, BrkA ali AIDA (tabela 1). Biokocke so vsebovale konstitutivni promotor [http://parts.igem.org/Part:BBa_J23100 J23100], RBS [http://parts.igem.org/Part:BBa_B0034 BBa_B0034] in terminator [http://parts.igem.org/Part:BBa_B0015 BBa_B0015]. Proteine so predstavili na površini ''E. coli'' DH5α in jih preizkusili v seriji eksperimentov.

*Suspenziji celic z izraženim GRHPR so dodali glioksilat in NADPH. Koncentracijo NADPH so spremljali z merjenjem OD340. Opazili so, da je koncentracija NADPH skozi čas padala, na podlagi česar so sklepali, da encim uspešno katalizira reakcijo. Primerjali so učinkovitost encima z različnimi fuzijskimi partnerji in sklenili, da je bila izmed vseh najučinkovitejša kombinacija INPNC-GRHPR.

*V naslednjem eksperimentu so suspenziji celic z izraženim GOX dodali glifosat, NADPH in topno obliko encima GRHPR. Na podlagi upada OD340 so določili, da je GOX uspešno kataliziral reakcijo in vsi fuzijski proteini so bili podobno učinkoviti.

*Zaradi omejenega časa za eksperimente so uspeli preizkusiti le kombinaciji INPNC-iNap in iNap-AIDA. Merili so časovno odvisnost fluorescence (ekscitacija pri 420 nm, emisija pri 528 nm) pri različnih koncentracijah NADPH pokazali odvisnost fluorescence od koncentracije pri obeh fuzijskih proteinih.

*Pripravili so suspenzijo, kjer so hkrati dodali celice z vsakim od treh proteinov (pritrjenih preko INPNC). Suspenziji so dodali glifosat in NADPH ter spremljali fluorescenco skozi čas. V primerjavi s kontrolo brez izraženih proteinov je v suspenziji prišlo do znatnega upada fluorescence, s čimer so potrdili delovanje njihovega sistema.

=Razgradnja=

==Osnovni princip==
Poleg sistema za detekcijo glifosata v vzorcu so želeli pripraviti tudi gensko spremenjeno bakterijo ''E. coli'', ki bi lahko glifosat in njegov derivat AMPA v okolju razgradila v neškodljive produkte. Za razliko od pristopa za detekcijo glifosata, bi tokrat njegova razgradnja potekala po alternativni poti, ki temelji na cepitvi vezi C-P. Za tak mehanizem razgradnje so odgovorni encimi, ki so zapisani na operonu ''phn'', ki ga najdemo pri številnih bakterijah, tudi ''E. coli''. Proteini PhnC, D in E predstavljajo sistem za aktivni transport fosfonskih kislin v celico, medtem ko kompleks PhnGHIJK, katerega glavna katalitična komponenta je PhnJ, katalizira cepitev vezi C-P s hkratno hidrolizo ATP. Po odstranitvi fosfitne skupine z glifosata, se sprosti N-metilglicin, ki pa se lahko v celici naprej oksidira do formaldehida in glicina.

Encim PhnO katalizira prenos acetilne skupine iz acetil koencima A na AMPA. Acetiliran AMPA lahko deluje kot substrat za PhnGHIJK, ki ga razgradi do N-metilacetamida. PhnO in PhnGHIJK lahko torej razgrajujejo tako glifosat kot tudi AMPA [6].

==Eksperimenti==
Da bi izboljšali razgradnjo glifosata in AMPA v ''E. coli'' so želeli nekatere gene ''phn'' nadomestiti s homologi iz drugih organizmov, kjer ta razgradnja poteka učinkoviteje. Vstaviti so želeli gene ''phnJ'' iz ''Enterobacter cloacae'' K7 [7], ''phnO'' iz ''Salmonella enterica'' [8] in ''phnE1/E2'' iz ''Sinorhizobium meliloti'' 1021 [9]. Hkrati so želeli inhibirati izražanje endognih zapisov za PhnF, ki deluje kot represor za nekatere gene ''phn'' [6], in PhnJ, ki bi lahko z rekombninantnim PhnJ tekmoval za podenote kompleksa PhnGHJIK. Kot metodo inhibicije izražanja so izbrali siRNA.

Pripravili so biokocko BBa_K3332099, ki je vsebovala vse potrebne zapise. Izražanje genov za proteine so nadzorovali promotorji J23100 in RBS BBa_B0034, tako da sta imela ''phnJ'' in ''phnO'' vsak svoj promotor in RBS, ''phnE1'' in ''phnE2'' pa sta bila povezana policistronsko. Uporabili so terminator BBa_B0015. Za siRNA so uporabili promotor BBa_J23101 in terminator BBa_J61048, zaporedjem pa so za boljšo stabilnost in učinkovitost dodali še zaporedje OmpA 5' UTR [10] in vezavno mesto za Hfq [11].

S konstruktom, ki je vseboval pripravljeno biokocko, so transformirali ''E. coli'' BL21(DE3). Bakterije so gojili v gojišču z glifosatom in po 5 h določili koncentracijo preostalega glifosata v gojišču tako, da so uporabili svoj sistem za detekcijo. Primerjali so konstrukte z različnimi kombinacijami zapisov, vendar je bila najuspešnejša biokocka opisana zgoraj, ki je vsebovala vse zapise hkrati. Medtem ko so bakterije v negativni kontroli po 5 h privzele 8,6 % glifosata iz gojišča, so ''E. coli'' z biokocko privzele 43,1 %.

=Stikala smrti=

==Stikalo za sistem detekcije==
Stikalo smrti pri sistemu detekcije glifosata bi zagotovilo, da bi gensko spremenjene ''E. coli'' odmrle, če bi se sprostile v okolje. Gojišče, v katerem bi potekala detekcija glifosata v vzorcu, bi vsebovalo arabinozo, ki bi inhibirala sintezo citotoksične nukleaze MazF [12]. V primeru, da bi bakterije zapustile to goijšče, bi se mazF lahko izražal in privedel do celične smrti.

Pripravili so preprosto napravo [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3332078 BBa_K3332078], ki deluje kot inverter. Promotor PBAD nadzoruje izražanje zapisa za cI, promotor PR pa nadzoruje izražanje ''mazF''. Arabinoza povzroči preklop araC iz represorske v aktivatorsko obliko, kar spodbudi izražanje zapisa za cI, cI pa inhibira transkripcijo ''mazF''. V odsotnosti arabinoze bo araC inhibiral izražanje ''cI'', torej bo transkripcija ''mazF'' lahko potekala.

Pripravili so eksperiment, kjer so celice z inverterjem gojili v prisotnosti ali odsotnosti arabinoze. Rast bakterij so določili s štetjem CFU po različnih časih inkubacije. Ob prisotnosti arabinoze niso opazili znatnih sprememb v številu kolonij, medtem ko je pri odsotnosti arabinoze število kolonij izrazito upadlo v roku 8 h.

==Stikalo za sistem degradacije==
Sistem za degradacijo glifosata bi predvidoma deloval tako, da bi suspenzijo bakterij vnesli neposredno v prst, v kateri želimo odstraniti glifosat. Da bi preprečili nenadzorovano širjenje gensko spremenjenih bakterij, bi stikalo za smrt poskrbelo, da bakterije uspešno razgradijo glifosat, nato pa po opravljeni nalogi odmrejo.
Zamislili so si napravo, ki bi ob prisotnosti glifosata zavirala izražanje ''mazF'', v njegovi odsotnosti pa se bi ''mazF'' izražal in vodil v smrt.

Biokocka [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3332078 BBa_K3332078] deluje kot inverter. Namesto neposredne detekcije glifosata, so kot merilo njegove prisotnosti uporabili formaldehid, ki je eden od produktov ob razgradnji glifosata. HxlR je transkripcijski faktor, ki ob vezavi formaldehida deluje kot aktivator promotorja PHCHO [13]. PHCHO nadzoruje izražanje ''cI'', promotor PR pa izražanje ''mazF''. Ob prisotnosti formaldehida, bo HxlR aktiviral transkripcijo zapisa za cI, cI pa bo onemogočil izražanje ''mazF''. Kadar pa je formaldehid odsoten, transkripcija ''cI'' ne bo potekala in posledično se ''mazF'' lahko izraža.

Zaradi omejenega časa za eksperimentalno delo, so utegnili preizkusiti le delovanje posameznih sestavnih delov tega stikala, niso pa uspeli izvesti eksperimenta s celotno biokocko.

=Viri=

# S. Singh, V. Kumar, S. Datta, A. B. Wani, D. S. Dhanjal, R. Romero, J. Singh: Glyphosate Uptake, Translocation, Resistance Emergence in Crops, Analytical Monitoring, Toxicity and Degradation: A Review. Environmental Chemistry Letters. Springer May 1, 2020, pp. 663–702.
# World Health Organization: Glyphosate and AMPA in Drinking-water http://www.who.int/water_sanitation_health/ (pridobljeno 18. 4. 2021).
# L. Pan, Q. Yu, H. Han, L. Mao, A. Nyporko, L. J. Fan, L. Bai, S. Powles: Aldo-keto reductase metabolizes glyphosate and confers glyphosate resistance in Echinochloa colona. Plant Physiol. 2019, 181(4), str. 1519–1534.
# G. Rumsby, D. P. Cregeen: Identification and expression of a cDNA for human hydroxypyruvate/glyoxylate reductase. Biochim. Biophys. Acta - Gene Struct. Expr. 1999, 1446(3), str. 383–388.
# R. Tao, Y. Zhao, H. Chu, A. Wang, J. Zhu, X. Chen, Y. Zou, M. Shi, R. Liu, … Y. Yang: Genetically encoded fluorescent sensors reveal dynamic regulation of NADPH metabolism. Nat. Methods 2017, 14(7), str. 720–728.
# B. Hove-Jensen, D. L. Zechel, B. Jochimsen: Utilization of Glyphosate as Phosphate Source: Biochemistry and Genetics of Bacterial Carbon-Phosphorus Lyase. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2014, 78(1), str. 176–197.
# Y. V. Kryuchkova, G. L. Burygin, N. E. Gogoleva, Y. V. Gogolev, M. P. Chernyshova, O. E. Makarov, E. E. Fedorov, O. V. Turkovskaya: Isolation and characterization of a glyphosate-degrading rhizosphere strain, Enterobacter cloacae K7. Microbiol. Res. 2014, 169(1), str. 99–105.
# J. C. Errey, J. S. Blanchard: Functional annotation and kinetic characterization of PhnO from Salmonella enterica. Biochemistry 2006, 45(9), str. 3033–3039.
# C. M. Liu, P. A. McLean, C. C. Sookdeo, F. C. Cannon: Degradation of the herbicide glyphosate by members of the family Rhizobiaceae. Appl. Environ. Microbiol. 1991, 57(6), str. 1799–1804.
# M. J. Hansen, L. ‐H Chen, M. L. S. Fejzo, J. G. Beiasco: The ompA 5′ untranslated region impedes a major pathway for mRNA degradation in Escherichia coli. Mol. Microbiol. 1994, 12(5), str. 707–716.
# G. M. Cech, A. Szalewska-Palasz, K. Kubiak, A. Malabirade, W. Grange, V. Arluison, G. Wegrzyn: The Escherichia Coli Hfq Protein: An Unattended DNA-Transactions Regulator. Frontiers in Molecular Biosciences. Frontiers Media S.A. July 28, 2016, p. 36.
# Y. Zhang, J. Zhang, K. P. Hoeflich, M. Ikura, G. Qing, M. Inouye: MazF cleaves cellular mRNAs specifically at ACA to block protein synthesis in Escherichia coli. Mol. Cell 2003, 12(4), str. 913–923.
# R. Zhu, G. Zhang, M. Jing, Y. Han, J. Li, J. Zhao, Y. Li, P. R. Chen: Genetically encoded formaldehyde sensors inspired by a protein intra-helical crosslinking reaction. Nat. Commun. 2021, 12(1), str. 1–13.

Antea-Glyphosate: Detekcija in razgradnja glifosata

2021-04-19T18:28:00Z

JernejI: /* Stikalo za sistem detekcije */

Antea-Glyphosate je projekt v okviru tekmovanja leta iGEM 2020, ki so ga pripravili študentje z univerze Xiamen na Kitajskem.

Povezava do projekta: [https://2020.igem.org/Team:XMU-China https://2020.igem.org/Team:XMU-China]

Avtor povzetka: Jernej Imperl

=Uvod=

Glifosat je eden od najširše uporabljanih herbicidov in mnoge raziskave nakazujejo na možne škodljive učinke za netarčne rastline, mikroorganizme in živali [1]. Kljub temu da človek v vsakdanjem življenju ni izpostavljen nevarnim količinam glifosata [1, 2], je njegova prisotnost v prsti in vodi zaskrbljujoča.

Ker glifosat v strukturi ne vsebuje nobenih kromofornih ali fluorofornih skupin, je njegova detekcija zapletena in zamudna. Prav tako bi bilo za učinkovito odstranjevanje glifosata iz okolja potrebno razviti hitro metodo, ki bi delovala pod različnimi okolijskimi pogoji [1].

Skupina iGEM iz univerze Xiamen na Kitajskem si je za cilj zadala rešiti ta dva problema in vzpostaviti sinteznobiološko rešitev za detekcijo in razgradnjo glifosata v prsti. Projekt so poimenovali Antea-Glyphosate, saj jim je idejo za projekt dal razmislek o intenzivni uporabi herbicidov pri pridelavi čaja. Pripravili so sistem za detekcijo glifosata in sistem za razgradnjo glifosata v prsti v vzorcu ter vsakega opremili s svojim stikalom smrti.

Poleg gensko spremenjenih bakterij so pripravili tudi merilni aparat, ki temelji na uporabi njihovega sistema za detekcijo glifosata in rezultate posreduje mobilni aplikaciji. V nadaljevanju je predstavljena predvsem sinteznobiološka plat njihovega projekta. Zaradi pandemije COVID-19 in omejenega časa za eksperimente so predstavljeni eksperimenti pretežno preliminarne narave (»proof of concept«).

=Detekcija=

==Osnovni princip==
Sistem za detekcijo glifosata z rekombinantno ''Escherichia coli'' temelji na njegovi delni razgradnji in posrednem merjenju koncentracije NADPH, ki se ob reakciji porablja. Encim glifosat oksidoreduktaza (GOX) katalizira cepitev vezi C-N, kar vodi do nastanka glioksilata in aminometilfosfonske kisline (AMPA) [3]. Glioksilat reduktaza (GRHPR) nato katalizira redukcijo glioksilata v glikolno kislino, ob čemer se NADPH oksidira v NADP+ [4]. Protein iNap na koncu deluje kot senzor za NADPH, saj se ob vezavi tega kofaktorja konformacijsko spremeni in odda fluorescenčni signal [5]. Kadar je v raztopini torej prisoten glifosat, se bo ob njegovi encimski razgradnji NADPH pretvarjal v NADP+, kar pa bi lahko zaznali z merjenjem upada fluorescence iNap in tako določili koncentracijo glifosata.

Da bi se izognili alternativnim metabolnim potem in lažnim rezultatom zaradi citosolnega NADPH, so encime želeli pritrditi na zunanjo površino bakterijske celice, tako da bi jih fuzirali z membranskimi proteini. Kot fuzijske partnerje so preizkusili proteine INPNC, BrkA in AIDA.

==Eksperiment==

Tabela 1: Biokocke za sistem detekcije.
{| border=1 style="border-collapse: collapse;"
|-
| Protein || Opis || '''INPNC''' || '''BrkA''' || '''AIDA'''
|-
|''' GOX ''' || Glifosat oksidoreduktaza iz rastline ''Echinochloa colona''. || [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3332052 BBa_K3332052] || [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3332055 BBa_K3332055] || [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3332054 BBa_K3332054]
|-
| ''' GRHPR '''|| Glioksilat reduktaza iz človeških jeter. || [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3332057 BBa_K3332057] || [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3332060 BBa_K3332060] || [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3332059 BBa_K3332059]
|-
| ''' iNAP '''|| Fuzija proteinov cpYFP in NADPH vezavne domene proteina REX iz ''Thermus aquaticus''.|| [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3332047 BBa_K3332047] || [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3332050 BBa_K3332050] || [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3332049 BBa_K3332049]
|-
|}

V eksperimentu so želeli preizkusiti delovanje proteinov, ko so bili ti pritrjeni na površino celic. V predhodnih eksperimentih so potrdili uspešno izražanje izbranih proteinov na površini celice. Pripravili so biokocke, kjer je bil vsak izmed treh proteinov fuziran na tri različne membranske proteine: INPNC, BrkA ali AIDA (tabela 1). Biokocke so vsebovale konstitutivni promotor [http://parts.igem.org/Part:BBa_J23100 J23100], RBS [http://parts.igem.org/Part:BBa_B0034 BBa_B0034] in terminator [http://parts.igem.org/Part:BBa_B0015 BBa_B0015]. Proteine so predstavili na površini ''E. coli'' DH5α in jih preizkusili v seriji eksperimentov.

*Suspenziji celic z izraženim GRHPR so dodali glioksilat in NADPH. Koncentracijo NADPH so spremljali z merjenjem OD340. Opazili so, da je koncentracija NADPH skozi čas padala, na podlagi česar so sklepali, da encim uspešno katalizira reakcijo. Primerjali so učinkovitost encima z različnimi fuzijskimi partnerji in sklenili, da je bila izmed vseh najučinkovitejša kombinacija INPNC-GRHPR.

*V naslednjem eksperimentu so suspenziji celic z izraženim GOX dodali glifosat, NADPH in topno obliko encima GRHPR. Na podlagi upada OD340 so določili, da je GOX uspešno kataliziral reakcijo in vsi fuzijski proteini so bili podobno učinkoviti.

*Zaradi omejenega časa za eksperimente so uspeli preizkusiti le kombinaciji INPNC-iNap in iNap-AIDA. Merili so časovno odvisnost fluorescence (ekscitacija pri 420 nm, emisija pri 528 nm) pri različnih koncentracijah NADPH pokazali odvisnost fluorescence od koncentracije pri obeh fuzijskih proteinih.

*Pripravili so suspenzijo, kjer so hkrati dodali celice z vsakim od treh proteinov (pritrjenih preko INPNC). Suspenziji so dodali glifosat in NADPH ter spremljali fluorescenco skozi čas. V primerjavi s kontrolo brez izraženih proteinov je v suspenziji prišlo do znatnega upada fluorescence, s čimer so potrdili delovanje njihovega sistema.

=Razgradnja=

==Osnovni princip==
Poleg sistema za detekcijo glifosata v vzorcu so želeli pripraviti tudi gensko spremenjeno bakterijo ''E. coli'', ki bi lahko glifosat in njegov derivat AMPA v okolju razgradila v neškodljive produkte. Za razliko od pristopa za detekcijo glifosata, bi tokrat njegova razgradnja potekala po alternativni poti, ki temelji na cepitvi vezi C-P. Za tak mehanizem razgradnje so odgovorni encimi, ki so zapisani na operonu ''phn'', ki ga najdemo pri številnih bakterijah, tudi ''E. coli''. Proteini PhnC, D in E predstavljajo sistem za aktivni transport fosfonskih kislin v celico, medtem ko kompleks PhnGHIJK, katerega glavna katalitična komponenta je PhnJ, katalizira cepitev vezi C-P s hkratno hidrolizo ATP. Po odstranitvi fosfitne skupine z glifosata, se sprosti N-metilglicin, ki pa se lahko v celici naprej oksidira do formaldehida in glicina.

Encim PhnO katalizira prenos acetilne skupine iz acetil koencima A na AMPA. Acetiliran AMPA lahko deluje kot substrat za PhnGHIJK, ki ga razgradi do N-metilacetamida. PhnO in PhnGHIJK lahko torej razgrajujejo tako glifosat kot tudi AMPA [6].

==Eksperimenti==
Da bi izboljšali razgradnjo glifosata in AMPA v ''E. coli'' so želeli nekatere gene ''phn'' nadomestiti s homologi iz drugih organizmov, kjer ta razgradnja poteka učinkoviteje. Vstaviti so želeli gene ''phnJ'' iz ''Enterobacter cloacae'' K7 [7], ''phnO'' iz ''Salmonella enterica'' [8] in ''phnE1/E2'' iz ''Sinorhizobium meliloti'' 1021 [9]. Hkrati so želeli inhibirati izražanje endognih zapisov za PhnF, ki deluje kot represor za nekatere gene ''phn'' [6], in PhnJ, ki bi lahko z rekombninantnim PhnJ tekmoval za podenote kompleksa PhnGHJIK. Kot metodo inhibicije izražanja so izbrali siRNA.

Pripravili so biokocko BBa_K3332099, ki je vsebovala vse potrebne zapise. Izražanje genov za proteine so nadzorovali promotorji J23100 in RBS BBa_B0034, tako da sta imela ''phnJ'' in ''phnO'' vsak svoj promotor in RBS, ''phnE1'' in ''phnE2'' pa sta bila povezana policistronsko. Uporabili so terminator BBa_B0015. Za siRNA so uporabili promotor BBa_J23101 in terminator BBa_J61048, zaporedjem pa so za boljšo stabilnost in učinkovitost dodali še zaporedje OmpA 5' UTR [10] in vezavno mesto za Hfq [11].

S konstruktom, ki je vseboval pripravljeno biokocko, so transformirali ''E. coli'' BL21(DE3). Bakterije so gojili v gojišču z glifosatom in po 5 h določili koncentracijo preostalega glifosata v gojišču tako, da so uporabili svoj sistem za detekcijo. Primerjali so konstrukte z različnimi kombinacijami zapisov, vendar je bila najuspešnejša biokocka opisana zgoraj, ki je vsebovala vse zapise hkrati. Medtem ko so bakterije v negativni kontroli po 5 h privzele 8,6 % glifosata iz gojišča, so ''E. coli'' z biokocko privzele 43,1 %.

=Stikala smrti=

==Stikalo za sistem detekcije==
Stikalo smrti pri sistemu detekcije glifosata bi zagotovilo, da bi gensko spremenjene ''E. coli'' odmrle, če bi se sprostile v okolje. Gojišče, v katerem bi potekala detekcija glifosata v vzorcu, bi vsebovalo arabinozo, ki bi inhibirala sintezo citotoksične nukleaze MazF [12]. V primeru, da bi bakterije zapustile to goijšče, bi se mazF lahko izražal in privedel do celične smrti.

Pripravili so preprosto napravo [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3332078 BBa_K3332078], ki deluje kot inverter. Promotor PBAD nadzoruje izražanje zapisa za cI, promotor PR pa nadzoruje izražanje ''mazF''. Arabinoza povzroči preklop araC iz represorske v aktivatorsko obliko, kar spodbudi izražanje zapisa za cI, cI pa inhibira transkripcijo ''mazF''. V odsotnosti arabinoze bo araC inhibiral izražanje ''cI'', torej bo transkripcija ''mazF'' lahko potekala.

Pripravili so eksperiment, kjer so celice z inverterjem gojili v prisotnosti ali odsotnosti arabinoze. Rast bakterij so določili s štetjem CFU po različnih časih inkubacije. Ob prisotnosti arabinoze niso opazili znatnih sprememb v številu kolonij, medtem ko je pri odsotnosti arabinoze število kolonij izrazito upadlo v roku 8 h.

==Stikalo za sistem degradacije==
Sistem za degradacijo glifosata bi predvidoma deloval tako, da bi suspenzijo bakterij vnesli neposredno v prst, v kateri želimo odstraniti glifosat. Da bi preprečili nenadzorovano širjenje gensko spremenjenih bakterij, bi stikalo za smrt poskrbelo, da bakterije uspešno razgradijo glifosat, nato pa po opravljeni nalogi odmrejo.
Zamislili so si napravo, ki bi ob prisotnosti glifosata zavirala izražanje ''mazF'', v njegovi odsotnosti pa se bi ''mazF'' izražal in vodil v smrt.

Biokocka BBa_K3332078 deluje kot inverter. Namesto neposredne detekcije glifosata, so kot merilo njegove prisotnosti uporabili formaldehid, ki je eden od produktov ob razgradnji glifosata. HxlR je transkripcijski faktor, ki ob vezavi formaldehida deluje kot aktivator promotorja PHCHO [13]. PHCHO nadzoruje izražanje ''cI'', promotor PR pa izražanje ''mazF''. Ob prisotnosti formaldehida, bo HxlR aktiviral transkripcijo zapisa za cI, cI pa bo onemogočil izražanje ''mazF''. Kadar pa je formaldehid odsoten, transkripcija ''cI'' ne bo potekala in posledično se ''mazF'' lahko izraža.

Zaradi omejenega časa za eksperimentalno delo, so utegnili preizkusiti le delovanje posameznih sestavnih delov tega stikala, niso pa uspeli izvesti eksperimenta s celotno biokocko.

=Viri=

# S. Singh, V. Kumar, S. Datta, A. B. Wani, D. S. Dhanjal, R. Romero, J. Singh: Glyphosate Uptake, Translocation, Resistance Emergence in Crops, Analytical Monitoring, Toxicity and Degradation: A Review. Environmental Chemistry Letters. Springer May 1, 2020, pp. 663–702.
# World Health Organization: Glyphosate and AMPA in Drinking-water http://www.who.int/water_sanitation_health/ (pridobljeno 18. 4. 2021).
# L. Pan, Q. Yu, H. Han, L. Mao, A. Nyporko, L. J. Fan, L. Bai, S. Powles: Aldo-keto reductase metabolizes glyphosate and confers glyphosate resistance in Echinochloa colona. Plant Physiol. 2019, 181(4), str. 1519–1534.
# G. Rumsby, D. P. Cregeen: Identification and expression of a cDNA for human hydroxypyruvate/glyoxylate reductase. Biochim. Biophys. Acta - Gene Struct. Expr. 1999, 1446(3), str. 383–388.
# R. Tao, Y. Zhao, H. Chu, A. Wang, J. Zhu, X. Chen, Y. Zou, M. Shi, R. Liu, … Y. Yang: Genetically encoded fluorescent sensors reveal dynamic regulation of NADPH metabolism. Nat. Methods 2017, 14(7), str. 720–728.
# B. Hove-Jensen, D. L. Zechel, B. Jochimsen: Utilization of Glyphosate as Phosphate Source: Biochemistry and Genetics of Bacterial Carbon-Phosphorus Lyase. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2014, 78(1), str. 176–197.
# Y. V. Kryuchkova, G. L. Burygin, N. E. Gogoleva, Y. V. Gogolev, M. P. Chernyshova, O. E. Makarov, E. E. Fedorov, O. V. Turkovskaya: Isolation and characterization of a glyphosate-degrading rhizosphere strain, Enterobacter cloacae K7. Microbiol. Res. 2014, 169(1), str. 99–105.
# J. C. Errey, J. S. Blanchard: Functional annotation and kinetic characterization of PhnO from Salmonella enterica. Biochemistry 2006, 45(9), str. 3033–3039.
# C. M. Liu, P. A. McLean, C. C. Sookdeo, F. C. Cannon: Degradation of the herbicide glyphosate by members of the family Rhizobiaceae. Appl. Environ. Microbiol. 1991, 57(6), str. 1799–1804.
# M. J. Hansen, L. ‐H Chen, M. L. S. Fejzo, J. G. Beiasco: The ompA 5′ untranslated region impedes a major pathway for mRNA degradation in Escherichia coli. Mol. Microbiol. 1994, 12(5), str. 707–716.
# G. M. Cech, A. Szalewska-Palasz, K. Kubiak, A. Malabirade, W. Grange, V. Arluison, G. Wegrzyn: The Escherichia Coli Hfq Protein: An Unattended DNA-Transactions Regulator. Frontiers in Molecular Biosciences. Frontiers Media S.A. July 28, 2016, p. 36.
# Y. Zhang, J. Zhang, K. P. Hoeflich, M. Ikura, G. Qing, M. Inouye: MazF cleaves cellular mRNAs specifically at ACA to block protein synthesis in Escherichia coli. Mol. Cell 2003, 12(4), str. 913–923.
# R. Zhu, G. Zhang, M. Jing, Y. Han, J. Li, J. Zhao, Y. Li, P. R. Chen: Genetically encoded formaldehyde sensors inspired by a protein intra-helical crosslinking reaction. Nat. Commun. 2021, 12(1), str. 1–13.

Antea-Glyphosate: Detekcija in razgradnja glifosata

2021-04-19T18:25:32Z

JernejI: /* Eksperiment */

Antea-Glyphosate je projekt v okviru tekmovanja leta iGEM 2020, ki so ga pripravili študentje z univerze Xiamen na Kitajskem.

Povezava do projekta: [https://2020.igem.org/Team:XMU-China https://2020.igem.org/Team:XMU-China]

Avtor povzetka: Jernej Imperl

=Uvod=

Glifosat je eden od najširše uporabljanih herbicidov in mnoge raziskave nakazujejo na možne škodljive učinke za netarčne rastline, mikroorganizme in živali [1]. Kljub temu da človek v vsakdanjem življenju ni izpostavljen nevarnim količinam glifosata [1, 2], je njegova prisotnost v prsti in vodi zaskrbljujoča.

Ker glifosat v strukturi ne vsebuje nobenih kromofornih ali fluorofornih skupin, je njegova detekcija zapletena in zamudna. Prav tako bi bilo za učinkovito odstranjevanje glifosata iz okolja potrebno razviti hitro metodo, ki bi delovala pod različnimi okolijskimi pogoji [1].

Skupina iGEM iz univerze Xiamen na Kitajskem si je za cilj zadala rešiti ta dva problema in vzpostaviti sinteznobiološko rešitev za detekcijo in razgradnjo glifosata v prsti. Projekt so poimenovali Antea-Glyphosate, saj jim je idejo za projekt dal razmislek o intenzivni uporabi herbicidov pri pridelavi čaja. Pripravili so sistem za detekcijo glifosata in sistem za razgradnjo glifosata v prsti v vzorcu ter vsakega opremili s svojim stikalom smrti.

Poleg gensko spremenjenih bakterij so pripravili tudi merilni aparat, ki temelji na uporabi njihovega sistema za detekcijo glifosata in rezultate posreduje mobilni aplikaciji. V nadaljevanju je predstavljena predvsem sinteznobiološka plat njihovega projekta. Zaradi pandemije COVID-19 in omejenega časa za eksperimente so predstavljeni eksperimenti pretežno preliminarne narave (»proof of concept«).

=Detekcija=

==Osnovni princip==
Sistem za detekcijo glifosata z rekombinantno ''Escherichia coli'' temelji na njegovi delni razgradnji in posrednem merjenju koncentracije NADPH, ki se ob reakciji porablja. Encim glifosat oksidoreduktaza (GOX) katalizira cepitev vezi C-N, kar vodi do nastanka glioksilata in aminometilfosfonske kisline (AMPA) [3]. Glioksilat reduktaza (GRHPR) nato katalizira redukcijo glioksilata v glikolno kislino, ob čemer se NADPH oksidira v NADP+ [4]. Protein iNap na koncu deluje kot senzor za NADPH, saj se ob vezavi tega kofaktorja konformacijsko spremeni in odda fluorescenčni signal [5]. Kadar je v raztopini torej prisoten glifosat, se bo ob njegovi encimski razgradnji NADPH pretvarjal v NADP+, kar pa bi lahko zaznali z merjenjem upada fluorescence iNap in tako določili koncentracijo glifosata.

Da bi se izognili alternativnim metabolnim potem in lažnim rezultatom zaradi citosolnega NADPH, so encime želeli pritrditi na zunanjo površino bakterijske celice, tako da bi jih fuzirali z membranskimi proteini. Kot fuzijske partnerje so preizkusili proteine INPNC, BrkA in AIDA.

==Eksperiment==

Tabela 1: Biokocke za sistem detekcije.
{| border=1 style="border-collapse: collapse;"
|-
| Protein || Opis || '''INPNC''' || '''BrkA''' || '''AIDA'''
|-
|''' GOX ''' || Glifosat oksidoreduktaza iz rastline ''Echinochloa colona''. || [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3332052 BBa_K3332052] || [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3332055 BBa_K3332055] || [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3332054 BBa_K3332054]
|-
| ''' GRHPR '''|| Glioksilat reduktaza iz človeških jeter. || [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3332057 BBa_K3332057] || [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3332060 BBa_K3332060] || [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3332059 BBa_K3332059]
|-
| ''' iNAP '''|| Fuzija proteinov cpYFP in NADPH vezavne domene proteina REX iz ''Thermus aquaticus''.|| [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3332047 BBa_K3332047] || [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3332050 BBa_K3332050] || [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3332049 BBa_K3332049]
|-
|}

V eksperimentu so želeli preizkusiti delovanje proteinov, ko so bili ti pritrjeni na površino celic. V predhodnih eksperimentih so potrdili uspešno izražanje izbranih proteinov na površini celice. Pripravili so biokocke, kjer je bil vsak izmed treh proteinov fuziran na tri različne membranske proteine: INPNC, BrkA ali AIDA (tabela 1). Biokocke so vsebovale konstitutivni promotor [http://parts.igem.org/Part:BBa_J23100 J23100], RBS [http://parts.igem.org/Part:BBa_B0034 BBa_B0034] in terminator [http://parts.igem.org/Part:BBa_B0015 BBa_B0015]. Proteine so predstavili na površini ''E. coli'' DH5α in jih preizkusili v seriji eksperimentov.

*Suspenziji celic z izraženim GRHPR so dodali glioksilat in NADPH. Koncentracijo NADPH so spremljali z merjenjem OD340. Opazili so, da je koncentracija NADPH skozi čas padala, na podlagi česar so sklepali, da encim uspešno katalizira reakcijo. Primerjali so učinkovitost encima z različnimi fuzijskimi partnerji in sklenili, da je bila izmed vseh najučinkovitejša kombinacija INPNC-GRHPR.

*V naslednjem eksperimentu so suspenziji celic z izraženim GOX dodali glifosat, NADPH in topno obliko encima GRHPR. Na podlagi upada OD340 so določili, da je GOX uspešno kataliziral reakcijo in vsi fuzijski proteini so bili podobno učinkoviti.

*Zaradi omejenega časa za eksperimente so uspeli preizkusiti le kombinaciji INPNC-iNap in iNap-AIDA. Merili so časovno odvisnost fluorescence (ekscitacija pri 420 nm, emisija pri 528 nm) pri različnih koncentracijah NADPH pokazali odvisnost fluorescence od koncentracije pri obeh fuzijskih proteinih.

*Pripravili so suspenzijo, kjer so hkrati dodali celice z vsakim od treh proteinov (pritrjenih preko INPNC). Suspenziji so dodali glifosat in NADPH ter spremljali fluorescenco skozi čas. V primerjavi s kontrolo brez izraženih proteinov je v suspenziji prišlo do znatnega upada fluorescence, s čimer so potrdili delovanje njihovega sistema.

=Razgradnja=

==Osnovni princip==
Poleg sistema za detekcijo glifosata v vzorcu so želeli pripraviti tudi gensko spremenjeno bakterijo ''E. coli'', ki bi lahko glifosat in njegov derivat AMPA v okolju razgradila v neškodljive produkte. Za razliko od pristopa za detekcijo glifosata, bi tokrat njegova razgradnja potekala po alternativni poti, ki temelji na cepitvi vezi C-P. Za tak mehanizem razgradnje so odgovorni encimi, ki so zapisani na operonu ''phn'', ki ga najdemo pri številnih bakterijah, tudi ''E. coli''. Proteini PhnC, D in E predstavljajo sistem za aktivni transport fosfonskih kislin v celico, medtem ko kompleks PhnGHIJK, katerega glavna katalitična komponenta je PhnJ, katalizira cepitev vezi C-P s hkratno hidrolizo ATP. Po odstranitvi fosfitne skupine z glifosata, se sprosti N-metilglicin, ki pa se lahko v celici naprej oksidira do formaldehida in glicina.

Encim PhnO katalizira prenos acetilne skupine iz acetil koencima A na AMPA. Acetiliran AMPA lahko deluje kot substrat za PhnGHIJK, ki ga razgradi do N-metilacetamida. PhnO in PhnGHIJK lahko torej razgrajujejo tako glifosat kot tudi AMPA [6].

==Eksperimenti==
Da bi izboljšali razgradnjo glifosata in AMPA v ''E. coli'' so želeli nekatere gene ''phn'' nadomestiti s homologi iz drugih organizmov, kjer ta razgradnja poteka učinkoviteje. Vstaviti so želeli gene ''phnJ'' iz ''Enterobacter cloacae'' K7 [7], ''phnO'' iz ''Salmonella enterica'' [8] in ''phnE1/E2'' iz ''Sinorhizobium meliloti'' 1021 [9]. Hkrati so želeli inhibirati izražanje endognih zapisov za PhnF, ki deluje kot represor za nekatere gene ''phn'' [6], in PhnJ, ki bi lahko z rekombninantnim PhnJ tekmoval za podenote kompleksa PhnGHJIK. Kot metodo inhibicije izražanja so izbrali siRNA.

Pripravili so biokocko BBa_K3332099, ki je vsebovala vse potrebne zapise. Izražanje genov za proteine so nadzorovali promotorji J23100 in RBS BBa_B0034, tako da sta imela ''phnJ'' in ''phnO'' vsak svoj promotor in RBS, ''phnE1'' in ''phnE2'' pa sta bila povezana policistronsko. Uporabili so terminator BBa_B0015. Za siRNA so uporabili promotor BBa_J23101 in terminator BBa_J61048, zaporedjem pa so za boljšo stabilnost in učinkovitost dodali še zaporedje OmpA 5' UTR [10] in vezavno mesto za Hfq [11].

S konstruktom, ki je vseboval pripravljeno biokocko, so transformirali ''E. coli'' BL21(DE3). Bakterije so gojili v gojišču z glifosatom in po 5 h določili koncentracijo preostalega glifosata v gojišču tako, da so uporabili svoj sistem za detekcijo. Primerjali so konstrukte z različnimi kombinacijami zapisov, vendar je bila najuspešnejša biokocka opisana zgoraj, ki je vsebovala vse zapise hkrati. Medtem ko so bakterije v negativni kontroli po 5 h privzele 8,6 % glifosata iz gojišča, so ''E. coli'' z biokocko privzele 43,1 %.

=Stikala smrti=

==Stikalo za sistem detekcije==
Stikalo smrti pri sistemu detekcije glifosata bi zagotovilo, da bi gensko spremenjene ''E. coli'' odmrle, če bi se sprostile v okolje. Gojišče, v katerem bi potekala detekcija glifosata v vzorcu, bi vsebovalo arabinozo, ki bi inhibirala sintezo citotoksične nukleaze MazF [12]. V primeru, da bi bakterije zapustile to goijšče, bi se mazF lahko izražal in privedel do celične smrti.

Pripravili so preprosto napravo BBa_K3332078, ki deluje kot inverter. Promotor PBAD nadzoruje izražanje zapisa za cI, promotor PR pa nadzoruje izražanje ''mazF''. Arabinoza povzroči preklop araC iz represorske v aktivatorsko obliko, kar spodbudi izražanje zapisa za cI, cI pa inhibira transkripcijo ''mazF''. V odsotnosti arabinoze bo araC inhibiral izražanje ''cI'', torej bo transkripcija ''mazF'' lahko potekala.

Pripravili so eksperiment, kjer so celice z inverterjem gojili v prisotnosti ali odsotnosti arabinoze. Rast bakterij so določili s štetjem CFU po različnih časih inkubacije. Ob prisotnosti arabinoze niso opazili znatnih sprememb v številu kolonij, medtem ko je pri odsotnosti arabinoze število kolonij izrazito upadlo v roku 8 h.

==Stikalo za sistem degradacije==
Sistem za degradacijo glifosata bi predvidoma deloval tako, da bi suspenzijo bakterij vnesli neposredno v prst, v kateri želimo odstraniti glifosat. Da bi preprečili nenadzorovano širjenje gensko spremenjenih bakterij, bi stikalo za smrt poskrbelo, da bakterije uspešno razgradijo glifosat, nato pa po opravljeni nalogi odmrejo.
Zamislili so si napravo, ki bi ob prisotnosti glifosata zavirala izražanje ''mazF'', v njegovi odsotnosti pa se bi ''mazF'' izražal in vodil v smrt.

Biokocka BBa_K3332078 deluje kot inverter. Namesto neposredne detekcije glifosata, so kot merilo njegove prisotnosti uporabili formaldehid, ki je eden od produktov ob razgradnji glifosata. HxlR je transkripcijski faktor, ki ob vezavi formaldehida deluje kot aktivator promotorja PHCHO [13]. PHCHO nadzoruje izražanje ''cI'', promotor PR pa izražanje ''mazF''. Ob prisotnosti formaldehida, bo HxlR aktiviral transkripcijo zapisa za cI, cI pa bo onemogočil izražanje ''mazF''. Kadar pa je formaldehid odsoten, transkripcija ''cI'' ne bo potekala in posledično se ''mazF'' lahko izraža.

Zaradi omejenega časa za eksperimentalno delo, so utegnili preizkusiti le delovanje posameznih sestavnih delov tega stikala, niso pa uspeli izvesti eksperimenta s celotno biokocko.

=Viri=

# S. Singh, V. Kumar, S. Datta, A. B. Wani, D. S. Dhanjal, R. Romero, J. Singh: Glyphosate Uptake, Translocation, Resistance Emergence in Crops, Analytical Monitoring, Toxicity and Degradation: A Review. Environmental Chemistry Letters. Springer May 1, 2020, pp. 663–702.
# World Health Organization: Glyphosate and AMPA in Drinking-water http://www.who.int/water_sanitation_health/ (pridobljeno 18. 4. 2021).
# L. Pan, Q. Yu, H. Han, L. Mao, A. Nyporko, L. J. Fan, L. Bai, S. Powles: Aldo-keto reductase metabolizes glyphosate and confers glyphosate resistance in Echinochloa colona. Plant Physiol. 2019, 181(4), str. 1519–1534.
# G. Rumsby, D. P. Cregeen: Identification and expression of a cDNA for human hydroxypyruvate/glyoxylate reductase. Biochim. Biophys. Acta - Gene Struct. Expr. 1999, 1446(3), str. 383–388.
# R. Tao, Y. Zhao, H. Chu, A. Wang, J. Zhu, X. Chen, Y. Zou, M. Shi, R. Liu, … Y. Yang: Genetically encoded fluorescent sensors reveal dynamic regulation of NADPH metabolism. Nat. Methods 2017, 14(7), str. 720–728.
# B. Hove-Jensen, D. L. Zechel, B. Jochimsen: Utilization of Glyphosate as Phosphate Source: Biochemistry and Genetics of Bacterial Carbon-Phosphorus Lyase. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2014, 78(1), str. 176–197.
# Y. V. Kryuchkova, G. L. Burygin, N. E. Gogoleva, Y. V. Gogolev, M. P. Chernyshova, O. E. Makarov, E. E. Fedorov, O. V. Turkovskaya: Isolation and characterization of a glyphosate-degrading rhizosphere strain, Enterobacter cloacae K7. Microbiol. Res. 2014, 169(1), str. 99–105.
# J. C. Errey, J. S. Blanchard: Functional annotation and kinetic characterization of PhnO from Salmonella enterica. Biochemistry 2006, 45(9), str. 3033–3039.
# C. M. Liu, P. A. McLean, C. C. Sookdeo, F. C. Cannon: Degradation of the herbicide glyphosate by members of the family Rhizobiaceae. Appl. Environ. Microbiol. 1991, 57(6), str. 1799–1804.
# M. J. Hansen, L. ‐H Chen, M. L. S. Fejzo, J. G. Beiasco: The ompA 5′ untranslated region impedes a major pathway for mRNA degradation in Escherichia coli. Mol. Microbiol. 1994, 12(5), str. 707–716.
# G. M. Cech, A. Szalewska-Palasz, K. Kubiak, A. Malabirade, W. Grange, V. Arluison, G. Wegrzyn: The Escherichia Coli Hfq Protein: An Unattended DNA-Transactions Regulator. Frontiers in Molecular Biosciences. Frontiers Media S.A. July 28, 2016, p. 36.
# Y. Zhang, J. Zhang, K. P. Hoeflich, M. Ikura, G. Qing, M. Inouye: MazF cleaves cellular mRNAs specifically at ACA to block protein synthesis in Escherichia coli. Mol. Cell 2003, 12(4), str. 913–923.
# R. Zhu, G. Zhang, M. Jing, Y. Han, J. Li, J. Zhao, Y. Li, P. R. Chen: Genetically encoded formaldehyde sensors inspired by a protein intra-helical crosslinking reaction. Nat. Commun. 2021, 12(1), str. 1–13.

Antea-Glyphosate: Detekcija in razgradnja glifosata

2021-04-19T18:24:07Z

JernejI: /* Eksperiment */

Antea-Glyphosate je projekt v okviru tekmovanja leta iGEM 2020, ki so ga pripravili študentje z univerze Xiamen na Kitajskem.

Povezava do projekta: [https://2020.igem.org/Team:XMU-China https://2020.igem.org/Team:XMU-China]

Avtor povzetka: Jernej Imperl

=Uvod=

Glifosat je eden od najširše uporabljanih herbicidov in mnoge raziskave nakazujejo na možne škodljive učinke za netarčne rastline, mikroorganizme in živali [1]. Kljub temu da človek v vsakdanjem življenju ni izpostavljen nevarnim količinam glifosata [1, 2], je njegova prisotnost v prsti in vodi zaskrbljujoča.

Ker glifosat v strukturi ne vsebuje nobenih kromofornih ali fluorofornih skupin, je njegova detekcija zapletena in zamudna. Prav tako bi bilo za učinkovito odstranjevanje glifosata iz okolja potrebno razviti hitro metodo, ki bi delovala pod različnimi okolijskimi pogoji [1].

Skupina iGEM iz univerze Xiamen na Kitajskem si je za cilj zadala rešiti ta dva problema in vzpostaviti sinteznobiološko rešitev za detekcijo in razgradnjo glifosata v prsti. Projekt so poimenovali Antea-Glyphosate, saj jim je idejo za projekt dal razmislek o intenzivni uporabi herbicidov pri pridelavi čaja. Pripravili so sistem za detekcijo glifosata in sistem za razgradnjo glifosata v prsti v vzorcu ter vsakega opremili s svojim stikalom smrti.

Poleg gensko spremenjenih bakterij so pripravili tudi merilni aparat, ki temelji na uporabi njihovega sistema za detekcijo glifosata in rezultate posreduje mobilni aplikaciji. V nadaljevanju je predstavljena predvsem sinteznobiološka plat njihovega projekta. Zaradi pandemije COVID-19 in omejenega časa za eksperimente so predstavljeni eksperimenti pretežno preliminarne narave (»proof of concept«).

=Detekcija=

==Osnovni princip==
Sistem za detekcijo glifosata z rekombinantno ''Escherichia coli'' temelji na njegovi delni razgradnji in posrednem merjenju koncentracije NADPH, ki se ob reakciji porablja. Encim glifosat oksidoreduktaza (GOX) katalizira cepitev vezi C-N, kar vodi do nastanka glioksilata in aminometilfosfonske kisline (AMPA) [3]. Glioksilat reduktaza (GRHPR) nato katalizira redukcijo glioksilata v glikolno kislino, ob čemer se NADPH oksidira v NADP+ [4]. Protein iNap na koncu deluje kot senzor za NADPH, saj se ob vezavi tega kofaktorja konformacijsko spremeni in odda fluorescenčni signal [5]. Kadar je v raztopini torej prisoten glifosat, se bo ob njegovi encimski razgradnji NADPH pretvarjal v NADP+, kar pa bi lahko zaznali z merjenjem upada fluorescence iNap in tako določili koncentracijo glifosata.

Da bi se izognili alternativnim metabolnim potem in lažnim rezultatom zaradi citosolnega NADPH, so encime želeli pritrditi na zunanjo površino bakterijske celice, tako da bi jih fuzirali z membranskimi proteini. Kot fuzijske partnerje so preizkusili proteine INPNC, BrkA in AIDA.

==Eksperiment==

Tabela 1: Povzetek pripravljenih biokock za razgradnjo
{| border=1 style="border-collapse: collapse;"
|-
| Protein || Opis || '''INPNC''' || '''BrkA''' || '''AIDA'''
|-
|''' GOX ''' || Glifosat oksidoreduktaza iz rastline ''Echinochloa colona''. || [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3332052 BBa_K3332052] || [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3332055 BBa_K3332055] || [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3332054 BBa_K3332054]
|-
| ''' GRHPR '''|| Glioksilat reduktaza iz človeških jeter. || [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3332057 BBa_K3332057] || [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3332060 BBa_K3332060] || [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3332059 BBa_K3332059]
|-
| ''' iNAP '''|| Fuzija proteinov cpYFP in NADPH vezavne domene proteina REX iz ''Thermus aquaticus''.|| [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3332047 BBa_K3332047] || [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3332050 BBa_K3332050] || [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3332049 BBa_K3332049]
|-
|}

V eksperimentu so želeli preizkusiti delovanje proteinov, ko so bili ti pritrjeni na površino celic. V predhodnih eksperimentih so potrdili uspešno izražanje izbranih proteinov na površini celice. Pripravili so biokocke, kjer je bil vsak izmed treh proteinov fuziran na tri različne membranske proteine: INPNC, BrkA ali AIDA (tabela 1). Biokocke so vsebovale konstitutivni promotor [http://parts.igem.org/Part:BBa_J23100 J23100], RBS [http://parts.igem.org/Part:BBa_B0034 BBa_B0034] in terminator [http://parts.igem.org/Part:BBa_B0015 BBa_B0015]. Proteine so predstavili na površini ''E. coli'' DH5α in jih preizkusili v seriji eksperimentov.

*Suspenziji celic z izraženim GRHPR so dodali glioksilat in NADPH. Koncentracijo NADPH so spremljali z merjenjem OD340. Opazili so, da je koncentracija NADPH skozi čas padala, na podlagi česar so sklepali, da encim uspešno katalizira reakcijo. Primerjali so učinkovitost encima z različnimi fuzijskimi partnerji in sklenili, da je bila izmed vseh najučinkovitejša kombinacija INPNC-GRHPR.

*V naslednjem eksperimentu so suspenziji celic z izraženim GOX dodali glifosat, NADPH in topno obliko encima GRHPR. Na podlagi upada OD340 so določili, da je GOX uspešno kataliziral reakcijo in vsi fuzijski proteini so bili podobno učinkoviti.

*Zaradi omejenega časa za eksperimente so uspeli preizkusiti le kombinaciji INPNC-iNap in iNap-AIDA. Merili so časovno odvisnost fluorescence (ekscitacija pri 420 nm, emisija pri 528 nm) pri različnih koncentracijah NADPH pokazali odvisnost fluorescence od koncentracije pri obeh fuzijskih proteinih.

*Pripravili so suspenzijo, kjer so hkrati dodali celice z vsakim od treh proteinov (pritrjenih preko INPNC). Suspenziji so dodali glifosat in NADPH ter spremljali fluorescenco skozi čas. V primerjavi s kontrolo brez izraženih proteinov je v suspenziji prišlo do znatnega upada fluorescence, s čimer so potrdili delovanje njihovega sistema.

=Razgradnja=

==Osnovni princip==
Poleg sistema za detekcijo glifosata v vzorcu so želeli pripraviti tudi gensko spremenjeno bakterijo ''E. coli'', ki bi lahko glifosat in njegov derivat AMPA v okolju razgradila v neškodljive produkte. Za razliko od pristopa za detekcijo glifosata, bi tokrat njegova razgradnja potekala po alternativni poti, ki temelji na cepitvi vezi C-P. Za tak mehanizem razgradnje so odgovorni encimi, ki so zapisani na operonu ''phn'', ki ga najdemo pri številnih bakterijah, tudi ''E. coli''. Proteini PhnC, D in E predstavljajo sistem za aktivni transport fosfonskih kislin v celico, medtem ko kompleks PhnGHIJK, katerega glavna katalitična komponenta je PhnJ, katalizira cepitev vezi C-P s hkratno hidrolizo ATP. Po odstranitvi fosfitne skupine z glifosata, se sprosti N-metilglicin, ki pa se lahko v celici naprej oksidira do formaldehida in glicina.

Encim PhnO katalizira prenos acetilne skupine iz acetil koencima A na AMPA. Acetiliran AMPA lahko deluje kot substrat za PhnGHIJK, ki ga razgradi do N-metilacetamida. PhnO in PhnGHIJK lahko torej razgrajujejo tako glifosat kot tudi AMPA [6].

==Eksperimenti==
Da bi izboljšali razgradnjo glifosata in AMPA v ''E. coli'' so želeli nekatere gene ''phn'' nadomestiti s homologi iz drugih organizmov, kjer ta razgradnja poteka učinkoviteje. Vstaviti so želeli gene ''phnJ'' iz ''Enterobacter cloacae'' K7 [7], ''phnO'' iz ''Salmonella enterica'' [8] in ''phnE1/E2'' iz ''Sinorhizobium meliloti'' 1021 [9]. Hkrati so želeli inhibirati izražanje endognih zapisov za PhnF, ki deluje kot represor za nekatere gene ''phn'' [6], in PhnJ, ki bi lahko z rekombninantnim PhnJ tekmoval za podenote kompleksa PhnGHJIK. Kot metodo inhibicije izražanja so izbrali siRNA.

Pripravili so biokocko BBa_K3332099, ki je vsebovala vse potrebne zapise. Izražanje genov za proteine so nadzorovali promotorji J23100 in RBS BBa_B0034, tako da sta imela ''phnJ'' in ''phnO'' vsak svoj promotor in RBS, ''phnE1'' in ''phnE2'' pa sta bila povezana policistronsko. Uporabili so terminator BBa_B0015. Za siRNA so uporabili promotor BBa_J23101 in terminator BBa_J61048, zaporedjem pa so za boljšo stabilnost in učinkovitost dodali še zaporedje OmpA 5' UTR [10] in vezavno mesto za Hfq [11].

S konstruktom, ki je vseboval pripravljeno biokocko, so transformirali ''E. coli'' BL21(DE3). Bakterije so gojili v gojišču z glifosatom in po 5 h določili koncentracijo preostalega glifosata v gojišču tako, da so uporabili svoj sistem za detekcijo. Primerjali so konstrukte z različnimi kombinacijami zapisov, vendar je bila najuspešnejša biokocka opisana zgoraj, ki je vsebovala vse zapise hkrati. Medtem ko so bakterije v negativni kontroli po 5 h privzele 8,6 % glifosata iz gojišča, so ''E. coli'' z biokocko privzele 43,1 %.

=Stikala smrti=

==Stikalo za sistem detekcije==
Stikalo smrti pri sistemu detekcije glifosata bi zagotovilo, da bi gensko spremenjene ''E. coli'' odmrle, če bi se sprostile v okolje. Gojišče, v katerem bi potekala detekcija glifosata v vzorcu, bi vsebovalo arabinozo, ki bi inhibirala sintezo citotoksične nukleaze MazF [12]. V primeru, da bi bakterije zapustile to goijšče, bi se mazF lahko izražal in privedel do celične smrti.

Pripravili so preprosto napravo BBa_K3332078, ki deluje kot inverter. Promotor PBAD nadzoruje izražanje zapisa za cI, promotor PR pa nadzoruje izražanje ''mazF''. Arabinoza povzroči preklop araC iz represorske v aktivatorsko obliko, kar spodbudi izražanje zapisa za cI, cI pa inhibira transkripcijo ''mazF''. V odsotnosti arabinoze bo araC inhibiral izražanje ''cI'', torej bo transkripcija ''mazF'' lahko potekala.

Pripravili so eksperiment, kjer so celice z inverterjem gojili v prisotnosti ali odsotnosti arabinoze. Rast bakterij so določili s štetjem CFU po različnih časih inkubacije. Ob prisotnosti arabinoze niso opazili znatnih sprememb v številu kolonij, medtem ko je pri odsotnosti arabinoze število kolonij izrazito upadlo v roku 8 h.

==Stikalo za sistem degradacije==
Sistem za degradacijo glifosata bi predvidoma deloval tako, da bi suspenzijo bakterij vnesli neposredno v prst, v kateri želimo odstraniti glifosat. Da bi preprečili nenadzorovano širjenje gensko spremenjenih bakterij, bi stikalo za smrt poskrbelo, da bakterije uspešno razgradijo glifosat, nato pa po opravljeni nalogi odmrejo.
Zamislili so si napravo, ki bi ob prisotnosti glifosata zavirala izražanje ''mazF'', v njegovi odsotnosti pa se bi ''mazF'' izražal in vodil v smrt.

Biokocka BBa_K3332078 deluje kot inverter. Namesto neposredne detekcije glifosata, so kot merilo njegove prisotnosti uporabili formaldehid, ki je eden od produktov ob razgradnji glifosata. HxlR je transkripcijski faktor, ki ob vezavi formaldehida deluje kot aktivator promotorja PHCHO [13]. PHCHO nadzoruje izražanje ''cI'', promotor PR pa izražanje ''mazF''. Ob prisotnosti formaldehida, bo HxlR aktiviral transkripcijo zapisa za cI, cI pa bo onemogočil izražanje ''mazF''. Kadar pa je formaldehid odsoten, transkripcija ''cI'' ne bo potekala in posledično se ''mazF'' lahko izraža.

Zaradi omejenega časa za eksperimentalno delo, so utegnili preizkusiti le delovanje posameznih sestavnih delov tega stikala, niso pa uspeli izvesti eksperimenta s celotno biokocko.

=Viri=

# S. Singh, V. Kumar, S. Datta, A. B. Wani, D. S. Dhanjal, R. Romero, J. Singh: Glyphosate Uptake, Translocation, Resistance Emergence in Crops, Analytical Monitoring, Toxicity and Degradation: A Review. Environmental Chemistry Letters. Springer May 1, 2020, pp. 663–702.
# World Health Organization: Glyphosate and AMPA in Drinking-water http://www.who.int/water_sanitation_health/ (pridobljeno 18. 4. 2021).
# L. Pan, Q. Yu, H. Han, L. Mao, A. Nyporko, L. J. Fan, L. Bai, S. Powles: Aldo-keto reductase metabolizes glyphosate and confers glyphosate resistance in Echinochloa colona. Plant Physiol. 2019, 181(4), str. 1519–1534.
# G. Rumsby, D. P. Cregeen: Identification and expression of a cDNA for human hydroxypyruvate/glyoxylate reductase. Biochim. Biophys. Acta - Gene Struct. Expr. 1999, 1446(3), str. 383–388.
# R. Tao, Y. Zhao, H. Chu, A. Wang, J. Zhu, X. Chen, Y. Zou, M. Shi, R. Liu, … Y. Yang: Genetically encoded fluorescent sensors reveal dynamic regulation of NADPH metabolism. Nat. Methods 2017, 14(7), str. 720–728.
# B. Hove-Jensen, D. L. Zechel, B. Jochimsen: Utilization of Glyphosate as Phosphate Source: Biochemistry and Genetics of Bacterial Carbon-Phosphorus Lyase. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2014, 78(1), str. 176–197.
# Y. V. Kryuchkova, G. L. Burygin, N. E. Gogoleva, Y. V. Gogolev, M. P. Chernyshova, O. E. Makarov, E. E. Fedorov, O. V. Turkovskaya: Isolation and characterization of a glyphosate-degrading rhizosphere strain, Enterobacter cloacae K7. Microbiol. Res. 2014, 169(1), str. 99–105.
# J. C. Errey, J. S. Blanchard: Functional annotation and kinetic characterization of PhnO from Salmonella enterica. Biochemistry 2006, 45(9), str. 3033–3039.
# C. M. Liu, P. A. McLean, C. C. Sookdeo, F. C. Cannon: Degradation of the herbicide glyphosate by members of the family Rhizobiaceae. Appl. Environ. Microbiol. 1991, 57(6), str. 1799–1804.
# M. J. Hansen, L. ‐H Chen, M. L. S. Fejzo, J. G. Beiasco: The ompA 5′ untranslated region impedes a major pathway for mRNA degradation in Escherichia coli. Mol. Microbiol. 1994, 12(5), str. 707–716.
# G. M. Cech, A. Szalewska-Palasz, K. Kubiak, A. Malabirade, W. Grange, V. Arluison, G. Wegrzyn: The Escherichia Coli Hfq Protein: An Unattended DNA-Transactions Regulator. Frontiers in Molecular Biosciences. Frontiers Media S.A. July 28, 2016, p. 36.
# Y. Zhang, J. Zhang, K. P. Hoeflich, M. Ikura, G. Qing, M. Inouye: MazF cleaves cellular mRNAs specifically at ACA to block protein synthesis in Escherichia coli. Mol. Cell 2003, 12(4), str. 913–923.
# R. Zhu, G. Zhang, M. Jing, Y. Han, J. Li, J. Zhao, Y. Li, P. R. Chen: Genetically encoded formaldehyde sensors inspired by a protein intra-helical crosslinking reaction. Nat. Commun. 2021, 12(1), str. 1–13.

Antea-Glyphosate: Detekcija in razgradnja glifosata

2021-04-19T18:14:32Z

JernejI:

Antea-Glyphosate je projekt v okviru tekmovanja leta iGEM 2020, ki so ga pripravili študentje z univerze Xiamen na Kitajskem.

Povezava do projekta: [https://2020.igem.org/Team:XMU-China https://2020.igem.org/Team:XMU-China]

Avtor povzetka: Jernej Imperl

=Uvod=

Glifosat je eden od najširše uporabljanih herbicidov in mnoge raziskave nakazujejo na možne škodljive učinke za netarčne rastline, mikroorganizme in živali [1]. Kljub temu da človek v vsakdanjem življenju ni izpostavljen nevarnim količinam glifosata [1, 2], je njegova prisotnost v prsti in vodi zaskrbljujoča.

Ker glifosat v strukturi ne vsebuje nobenih kromofornih ali fluorofornih skupin, je njegova detekcija zapletena in zamudna. Prav tako bi bilo za učinkovito odstranjevanje glifosata iz okolja potrebno razviti hitro metodo, ki bi delovala pod različnimi okolijskimi pogoji [1].

Skupina iGEM iz univerze Xiamen na Kitajskem si je za cilj zadala rešiti ta dva problema in vzpostaviti sinteznobiološko rešitev za detekcijo in razgradnjo glifosata v prsti. Projekt so poimenovali Antea-Glyphosate, saj jim je idejo za projekt dal razmislek o intenzivni uporabi herbicidov pri pridelavi čaja. Pripravili so sistem za detekcijo glifosata in sistem za razgradnjo glifosata v prsti v vzorcu ter vsakega opremili s svojim stikalom smrti.

Poleg gensko spremenjenih bakterij so pripravili tudi merilni aparat, ki temelji na uporabi njihovega sistema za detekcijo glifosata in rezultate posreduje mobilni aplikaciji. V nadaljevanju je predstavljena predvsem sinteznobiološka plat njihovega projekta. Zaradi pandemije COVID-19 in omejenega časa za eksperimente so predstavljeni eksperimenti pretežno preliminarne narave (»proof of concept«).

=Detekcija=

==Osnovni princip==
Sistem za detekcijo glifosata z rekombinantno ''Escherichia coli'' temelji na njegovi delni razgradnji in posrednem merjenju koncentracije NADPH, ki se ob reakciji porablja. Encim glifosat oksidoreduktaza (GOX) katalizira cepitev vezi C-N, kar vodi do nastanka glioksilata in aminometilfosfonske kisline (AMPA) [3]. Glioksilat reduktaza (GRHPR) nato katalizira redukcijo glioksilata v glikolno kislino, ob čemer se NADPH oksidira v NADP+ [4]. Protein iNap na koncu deluje kot senzor za NADPH, saj se ob vezavi tega kofaktorja konformacijsko spremeni in odda fluorescenčni signal [5]. Kadar je v raztopini torej prisoten glifosat, se bo ob njegovi encimski razgradnji NADPH pretvarjal v NADP+, kar pa bi lahko zaznali z merjenjem upada fluorescence iNap in tako določili koncentracijo glifosata.

Da bi se izognili alternativnim metabolnim potem in lažnim rezultatom zaradi citosolnega NADPH, so encime želeli pritrditi na zunanjo površino bakterijske celice, tako da bi jih fuzirali z membranskimi proteini. Kot fuzijske partnerje so preizkusili proteine INPNC, BrkA in AIDA.

==Eksperiment==

Tabela 1: Povzetek pripravljenih biokock za razgradnjo
{| border=1 style="border-collapse: collapse;"
|-
| Protein || Opis || '''INPNC''' || '''BrkA''' || '''AIDA'''
|-
| ''' GOX ''' || Glifosat oksidoreduktaza iz rastline ''Echinochloa colona''. || [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3332052 BBa_K3332052] || [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3332055 BBa_K3332055] || [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3332054 BBa_K3332054]
|-
| ''' GRHPR '''|| Glioksilat reduktaza iz človeških jeter. || [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3332057 BBa_K3332057] || [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3332060 BBa_K3332060] || [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3332059 BBa_K3332059]
|-
| ''' iNAP '''|| Fuzija proteinov cpYFP in NADPH vezavne domene proteina REX iz ''Thermus aquaticus''.|| [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3332047 BBa_K3332047] || [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3332050 BBa_K3332050] || [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3332049 BBa_K3332049]
|-
|}

V eksperimentu so želeli preizkusiti delovanje proteinov, ko so bili ti pritrjeni na površino celic. V predhodnih eksperimentih so potrdili uspešno izražanje izbranih proteinov na površini celice. Pripravili so biokocke, kjer je bil vsak izmed treh proteinov fuziran na tri različne membranske proteine: INPNC, BrkA ali AIDA (tabela 1). Biokocke so vsebovale konstitutivni promotor [http://parts.igem.org/Part:BBa_J23100 J23100], RBS [http://parts.igem.org/Part:BBa_B0034 BBa_B0034] in terminator [http://parts.igem.org/Part:BBa_B0015 BBa_B0015]. Proteine so predstavili na površini ''E. coli'' DH5α in jih preizkusili v seriji eksperimentov.

*Suspenziji celic z izraženim GRHPR so dodali glioksilat in NADPH. Koncentracijo NADPH so spremljali z merjenjem OD340. Opazili so, da je koncentracija NADPH skozi čas padala, na podlagi česar so sklepali, da encim uspešno katalizira reakcijo. Primerjali so učinkovitost encima z različnimi fuzijskimi partnerji in sklenili, da je bila izmed vseh najučinkovitejša kombinacija INPNC-GRHPR.

*V naslednjem eksperimentu so suspenziji celic z izraženim GOX dodali glifosat, NADPH in topno obliko encima GRHPR. Na podlagi upada OD340 so določili, da je GOX uspešno kataliziral reakcijo in vsi fuzijski proteini so bili podobno učinkoviti.

*Zaradi omejenega časa za eksperimente so uspeli preizkusiti le kombinaciji INPNC-iNap in iNap-AIDA. Merili so časovno odvisnost fluorescence (ekscitacija pri 420 nm, emisija pri 528 nm) pri različnih koncentracijah NADPH pokazali odvisnost fluorescence od koncentracije pri obeh fuzijskih proteinih.

*Pripravili so suspenzijo, kjer so hkrati dodali celice z vsakim od treh proteinov (pritrjenih preko INPNC). Suspenziji so dodali glifosat in NADPH ter spremljali fluorescenco skozi čas. V primerjavi s kontrolo brez izraženih proteinov je v suspenziji prišlo do znatnega upada fluorescence, s čimer so potrdili delovanje njihovega sistema.

=Razgradnja=

==Osnovni princip==
Poleg sistema za detekcijo glifosata v vzorcu so želeli pripraviti tudi gensko spremenjeno bakterijo ''E. coli'', ki bi lahko glifosat in njegov derivat AMPA v okolju razgradila v neškodljive produkte. Za razliko od pristopa za detekcijo glifosata, bi tokrat njegova razgradnja potekala po alternativni poti, ki temelji na cepitvi vezi C-P. Za tak mehanizem razgradnje so odgovorni encimi, ki so zapisani na operonu ''phn'', ki ga najdemo pri številnih bakterijah, tudi ''E. coli''. Proteini PhnC, D in E predstavljajo sistem za aktivni transport fosfonskih kislin v celico, medtem ko kompleks PhnGHIJK, katerega glavna katalitična komponenta je PhnJ, katalizira cepitev vezi C-P s hkratno hidrolizo ATP. Po odstranitvi fosfitne skupine z glifosata, se sprosti N-metilglicin, ki pa se lahko v celici naprej oksidira do formaldehida in glicina.

Encim PhnO katalizira prenos acetilne skupine iz acetil koencima A na AMPA. Acetiliran AMPA lahko deluje kot substrat za PhnGHIJK, ki ga razgradi do N-metilacetamida. PhnO in PhnGHIJK lahko torej razgrajujejo tako glifosat kot tudi AMPA [6].

==Eksperimenti==
Da bi izboljšali razgradnjo glifosata in AMPA v ''E. coli'' so želeli nekatere gene ''phn'' nadomestiti s homologi iz drugih organizmov, kjer ta razgradnja poteka učinkoviteje. Vstaviti so želeli gene ''phnJ'' iz ''Enterobacter cloacae'' K7 [7], ''phnO'' iz ''Salmonella enterica'' [8] in ''phnE1/E2'' iz ''Sinorhizobium meliloti'' 1021 [9]. Hkrati so želeli inhibirati izražanje endognih zapisov za PhnF, ki deluje kot represor za nekatere gene ''phn'' [6], in PhnJ, ki bi lahko z rekombninantnim PhnJ tekmoval za podenote kompleksa PhnGHJIK. Kot metodo inhibicije izražanja so izbrali siRNA.

Pripravili so biokocko BBa_K3332099, ki je vsebovala vse potrebne zapise. Izražanje genov za proteine so nadzorovali promotorji J23100 in RBS BBa_B0034, tako da sta imela ''phnJ'' in ''phnO'' vsak svoj promotor in RBS, ''phnE1'' in ''phnE2'' pa sta bila povezana policistronsko. Uporabili so terminator BBa_B0015. Za siRNA so uporabili promotor BBa_J23101 in terminator BBa_J61048, zaporedjem pa so za boljšo stabilnost in učinkovitost dodali še zaporedje OmpA 5' UTR [10] in vezavno mesto za Hfq [11].

S konstruktom, ki je vseboval pripravljeno biokocko, so transformirali ''E. coli'' BL21(DE3). Bakterije so gojili v gojišču z glifosatom in po 5 h določili koncentracijo preostalega glifosata v gojišču tako, da so uporabili svoj sistem za detekcijo. Primerjali so konstrukte z različnimi kombinacijami zapisov, vendar je bila najuspešnejša biokocka opisana zgoraj, ki je vsebovala vse zapise hkrati. Medtem ko so bakterije v negativni kontroli po 5 h privzele 8,6 % glifosata iz gojišča, so ''E. coli'' z biokocko privzele 43,1 %.

=Stikala smrti=

==Stikalo za sistem detekcije==
Stikalo smrti pri sistemu detekcije glifosata bi zagotovilo, da bi gensko spremenjene ''E. coli'' odmrle, če bi se sprostile v okolje. Gojišče, v katerem bi potekala detekcija glifosata v vzorcu, bi vsebovalo arabinozo, ki bi inhibirala sintezo citotoksične nukleaze MazF [12]. V primeru, da bi bakterije zapustile to goijšče, bi se mazF lahko izražal in privedel do celične smrti.

Pripravili so preprosto napravo BBa_K3332078, ki deluje kot inverter. Promotor PBAD nadzoruje izražanje zapisa za cI, promotor PR pa nadzoruje izražanje ''mazF''. Arabinoza povzroči preklop araC iz represorske v aktivatorsko obliko, kar spodbudi izražanje zapisa za cI, cI pa inhibira transkripcijo ''mazF''. V odsotnosti arabinoze bo araC inhibiral izražanje ''cI'', torej bo transkripcija ''mazF'' lahko potekala.

Pripravili so eksperiment, kjer so celice z inverterjem gojili v prisotnosti ali odsotnosti arabinoze. Rast bakterij so določili s štetjem CFU po različnih časih inkubacije. Ob prisotnosti arabinoze niso opazili znatnih sprememb v številu kolonij, medtem ko je pri odsotnosti arabinoze število kolonij izrazito upadlo v roku 8 h.

==Stikalo za sistem degradacije==
Sistem za degradacijo glifosata bi predvidoma deloval tako, da bi suspenzijo bakterij vnesli neposredno v prst, v kateri želimo odstraniti glifosat. Da bi preprečili nenadzorovano širjenje gensko spremenjenih bakterij, bi stikalo za smrt poskrbelo, da bakterije uspešno razgradijo glifosat, nato pa po opravljeni nalogi odmrejo.
Zamislili so si napravo, ki bi ob prisotnosti glifosata zavirala izražanje ''mazF'', v njegovi odsotnosti pa se bi ''mazF'' izražal in vodil v smrt.

Biokocka BBa_K3332078 deluje kot inverter. Namesto neposredne detekcije glifosata, so kot merilo njegove prisotnosti uporabili formaldehid, ki je eden od produktov ob razgradnji glifosata. HxlR je transkripcijski faktor, ki ob vezavi formaldehida deluje kot aktivator promotorja PHCHO [13]. PHCHO nadzoruje izražanje ''cI'', promotor PR pa izražanje ''mazF''. Ob prisotnosti formaldehida, bo HxlR aktiviral transkripcijo zapisa za cI, cI pa bo onemogočil izražanje ''mazF''. Kadar pa je formaldehid odsoten, transkripcija ''cI'' ne bo potekala in posledično se ''mazF'' lahko izraža.

Zaradi omejenega časa za eksperimentalno delo, so utegnili preizkusiti le delovanje posameznih sestavnih delov tega stikala, niso pa uspeli izvesti eksperimenta s celotno biokocko.

=Viri=

# S. Singh, V. Kumar, S. Datta, A. B. Wani, D. S. Dhanjal, R. Romero, J. Singh: Glyphosate Uptake, Translocation, Resistance Emergence in Crops, Analytical Monitoring, Toxicity and Degradation: A Review. Environmental Chemistry Letters. Springer May 1, 2020, pp. 663–702.
# World Health Organization: Glyphosate and AMPA in Drinking-water http://www.who.int/water_sanitation_health/ (pridobljeno 18. 4. 2021).
# L. Pan, Q. Yu, H. Han, L. Mao, A. Nyporko, L. J. Fan, L. Bai, S. Powles: Aldo-keto reductase metabolizes glyphosate and confers glyphosate resistance in Echinochloa colona. Plant Physiol. 2019, 181(4), str. 1519–1534.
# G. Rumsby, D. P. Cregeen: Identification and expression of a cDNA for human hydroxypyruvate/glyoxylate reductase. Biochim. Biophys. Acta - Gene Struct. Expr. 1999, 1446(3), str. 383–388.
# R. Tao, Y. Zhao, H. Chu, A. Wang, J. Zhu, X. Chen, Y. Zou, M. Shi, R. Liu, … Y. Yang: Genetically encoded fluorescent sensors reveal dynamic regulation of NADPH metabolism. Nat. Methods 2017, 14(7), str. 720–728.
# B. Hove-Jensen, D. L. Zechel, B. Jochimsen: Utilization of Glyphosate as Phosphate Source: Biochemistry and Genetics of Bacterial Carbon-Phosphorus Lyase. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2014, 78(1), str. 176–197.
# Y. V. Kryuchkova, G. L. Burygin, N. E. Gogoleva, Y. V. Gogolev, M. P. Chernyshova, O. E. Makarov, E. E. Fedorov, O. V. Turkovskaya: Isolation and characterization of a glyphosate-degrading rhizosphere strain, Enterobacter cloacae K7. Microbiol. Res. 2014, 169(1), str. 99–105.
# J. C. Errey, J. S. Blanchard: Functional annotation and kinetic characterization of PhnO from Salmonella enterica. Biochemistry 2006, 45(9), str. 3033–3039.
# C. M. Liu, P. A. McLean, C. C. Sookdeo, F. C. Cannon: Degradation of the herbicide glyphosate by members of the family Rhizobiaceae. Appl. Environ. Microbiol. 1991, 57(6), str. 1799–1804.
# M. J. Hansen, L. ‐H Chen, M. L. S. Fejzo, J. G. Beiasco: The ompA 5′ untranslated region impedes a major pathway for mRNA degradation in Escherichia coli. Mol. Microbiol. 1994, 12(5), str. 707–716.
# G. M. Cech, A. Szalewska-Palasz, K. Kubiak, A. Malabirade, W. Grange, V. Arluison, G. Wegrzyn: The Escherichia Coli Hfq Protein: An Unattended DNA-Transactions Regulator. Frontiers in Molecular Biosciences. Frontiers Media S.A. July 28, 2016, p. 36.
# Y. Zhang, J. Zhang, K. P. Hoeflich, M. Ikura, G. Qing, M. Inouye: MazF cleaves cellular mRNAs specifically at ACA to block protein synthesis in Escherichia coli. Mol. Cell 2003, 12(4), str. 913–923.
# R. Zhu, G. Zhang, M. Jing, Y. Han, J. Li, J. Zhao, Y. Li, P. R. Chen: Genetically encoded formaldehyde sensors inspired by a protein intra-helical crosslinking reaction. Nat. Commun. 2021, 12(1), str. 1–13.

Antea-Glyphosate: Detekcija in razgradnja glifosata

2021-04-19T18:05:48Z

JernejI: /* Eksperiment */

Antea-Glyphosate je projekt v okviru tekmovanja leta iGEM 2020, ki so ga pripravili študentje z univerze Xiamen na Kitajskem.

Povezava do projekta: [https://2020.igem.org/Team:XMU-China https://2020.igem.org/Team:XMU-China]

Avtor povzetka: Jernej Imperl

=Uvod=

Glifosat je eden od najširše uporabljanih herbicidov in mnoge raziskave nakazujejo na možne škodljive učinke za netarčne rastline, mikroorganizme in živali [1]. Kljub temu da človek v vsakdanjem življenju ni izpostavljen nevarnim količinam glifosata [1, 2], je njegova prisotnost v prsti in vodi zaskrbljujoča.

Ker glifosat v strukturi ne vsebuje nobenih kromofornih ali fluorofornih skupin, je njegova detekcija zapletena in zamudna. Prav tako bi bilo za učinkovito odstranjevanje glifosata iz okolja potrebno razviti hitro metodo, ki bi delovala pod različnimi okolijskimi pogoji [1].

Skupina iGEM iz univerze Xiamen na Kitajskem si je za cilj zadala rešiti ta dva problema in vzpostaviti sinteznobiološko rešitev za detekcijo in razgradnjo glifosata v prsti. Projekt so poimenovali Antea-Glyphosate, saj jim je idejo za projekt dal razmislek o intenzivni uporabi herbicidov pri pridelavi čaja. Pripravili so sistem za detekcijo glifosata in sistem za razgradnjo glifosata v prsti v vzorcu ter vsakega opremili s svojim stikalom smrti.

Poleg gensko spremenjenih bakterij so pripravili tudi merilni aparat, ki temelji na uporabi njihovega sistema za detekcijo glifosata in rezultate posreduje mobilni aplikaciji. V nadaljevanju je predstavljena predvsem sinteznobiološka plat njihovega projekta. Zaradi pandemije COVID-19 in omejenega časa za eksperimente so predstavljeni eksperimenti pretežno preliminarne narave (»proof of concept«).

=Detekcija=

==Osnovni princip==
Sistem za detekcijo glifosata z rekombinantno ''Escherichia coli'' temelji na njegovi delni razgradnji in posrednem merjenju koncentracije NADPH, ki se ob reakciji porablja. Encim glifosat oksidoreduktaza (GOX) katalizira cepitev vezi C-N, kar vodi do nastanka glioksilata in aminometilfosfonske kisline (AMPA) [3]. Glioksilat reduktaza (GRHPR) nato katalizira redukcijo glioksilata v glikolno kislino, ob čemer se NADPH oksidira v NADP+ [4]. Protein iNap na koncu deluje kot senzor za NADPH, saj se ob vezavi tega kofaktorja konformacijsko spremeni in odda fluorescenčni signal [5]. Kadar je v raztopini torej prisoten glifosat, se bo ob njegovi encimski razgradnji NADPH pretvarjal v NADP+, kar pa bi lahko zaznali z merjenjem upada fluorescence iNap in tako določili koncentracijo glifosata.

Da bi se izognili alternativnim metabolnim potem in lažnim rezultatom zaradi citosolnega NADPH, so encime želeli pritrditi na zunanjo površino bakterijske celice, tako da bi jih fuzirali z membranskimi proteini. Kot fuzijske partnerje so preizkusili proteine INPNC, BrkA in AIDA.

==Eksperiment==

Tabela 1: Povzetek pripravljenih biokock za razgradnjo
{| border=1 style="border-collapse: collapse;"
|-
| Protein || Opis || INPNC || BrkA || AIDA
|-
| GOX || opls || [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3332052 BBa_K3332052] || [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3332055 BBa_K3332055] || [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3332054 BBa_K3332054]
|-
| GRHPR || opls || [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3332057 BBa_K3332057] || [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3332060 BBa_K3332060] || [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3332059 BBa_K3332059]
|-
| iNAP || opis || [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3332047 BBa_K3332047] || [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3332050 BBa_K3332050] || [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3332049 BBa_K3332049]
|-
|}

V eksperimentu so želeli preizkusiti delovanje proteinov, ko so bili ti pritrjeni na površino celic. V predhodnih eksperimentih so potrdili uspešno izražanje izbranih proteinov na površini celice. Pripravili so biokocke, kjer je bil vsak izmed treh proteinov fuziran na tri različne membranske proteine: INPNC, BrkA ali AIDA (tabela 1). Biokocke so vsebovale konstitutivni promotor [http://parts.igem.org/Part:BBa_J23100 J23100], RBS [http://parts.igem.org/Part:BBa_B0034 BBa_B0034] in terminator [http://parts.igem.org/Part:BBa_B0015 BBa_B0015]. Proteine so predstavili na površini ''E. coli'' DH5α in jih preizkusili v seriji eksperimentov.

*Suspenziji celic z izraženim GRHPR so dodali glioksilat in NADPH. Koncentracijo NADPH so spremljali z merjenjem OD340. Opazili so, da je koncentracija NADPH skozi čas padala, na podlagi česar so sklepali, da encim uspešno katalizira reakcijo. Primerjali so učinkovitost encima z različnimi fuzijskimi partnerji in sklenili, da je bila izmed vseh najučinkovitejša kombinacija INPNC-GRHPR.

*V naslednjem eksperimentu so suspenziji celic z izraženim GOX dodali glifosat, NADPH in topno obliko encima GRHPR. Na podlagi upada OD340 so določili, da je GOX uspešno kataliziral reakcijo in vsi fuzijski proteini so bili podobno učinkoviti.

*Zaradi omejenega časa za eksperimente so uspeli preizkusiti le kombinaciji INPNC-iNap in iNap-AIDA. Merili so časovno odvisnost fluorescence (ekscitacija pri 420 nm, emisija pri 528 nm) pri različnih koncentracijah NADPH pokazali odvisnost fluorescence od koncentracije pri obeh fuzijskih proteinih.

*Pripravili so suspenzijo, kjer so hkrati dodali celice z vsakim od treh proteinov (pritrjenih preko INPNC). Suspenziji so dodali glifosat in NADPH ter spremljali fluorescenco skozi čas. V primerjavi s kontrolo brez izraženih proteinov je v suspenziji prišlo do znatnega upada fluorescence, s čimer so potrdili delovanje njihovega sistema.

=Razgradnja=

==Osnovni princip==
Poleg sistema za detekcijo glifosata v vzorcu so želeli pripraviti tudi gensko spremenjeno bakterijo ''E. coli'', ki bi lahko glifosat in njegov derivat AMPA v okolju razgradila v neškodljive produkte. Za razliko od pristopa za detekcijo glifosata, bi tokrat njegova razgradnja potekala po alternativni poti, ki temelji na cepitvi vezi C-P. Za tak mehanizem razgradnje so odgovorni encimi, ki so zapisani na operonu ''phn'', ki ga najdemo pri številnih bakterijah, tudi ''E. coli''. Proteini PhnC, D in E predstavljajo sistem za aktivni transport fosfonskih kislin v celico, medtem ko kompleks PhnGHIJK, katerega glavna katalitična komponenta je PhnJ, katalizira cepitev vezi C-P s hkratno hidrolizo ATP. Po odstranitvi fosfitne skupine z glifosata, se sprosti N-metilglicin, ki pa se lahko v celici naprej oksidira do formaldehida in glicina.

Encim PhnO katalizira prenos acetilne skupine iz acetil koencima A na AMPA. Acetiliran AMPA lahko deluje kot substrat za PhnGHIJK, ki ga razgradi do N-metilacetamida. PhnO in PhnGHIJK lahko torej razgrajujejo tako glifosat kot tudi AMPA [6].

==Eksperimenti==
Da bi izboljšali razgradnjo glifosata in AMPA v ''E. coli'' so želeli nekatere gene ''phn'' nadomestiti s homologi iz drugih organizmov, kjer ta razgradnja poteka učinkoviteje. Vstaviti so želeli gene ''phnJ'' iz ''Enterobacter cloacae'' K7 [7], ''phnO'' iz ''Salmonella enterica'' [8] in ''phnE1/E2'' iz ''Sinorhizobium meliloti'' 1021 [9]. Hkrati so želeli inhibirati izražanje endognih zapisov za PhnF, ki deluje kot represor za nekatere gene ''phn'' [6], in PhnJ, ki bi lahko z rekombninantnim PhnJ tekmoval za podenote kompleksa PhnGHJIK. Kot metodo inhibicije izražanja so izbrali siRNA.

Pripravili so biokocko BBa_K3332099, ki je vsebovala vse potrebne zapise. Izražanje genov za proteine so nadzorovali promotorji J23100 in RBS BBa_B0034, tako da sta imela ''phnJ'' in ''phnO'' vsak svoj promotor in RBS, ''phnE1'' in ''phnE2'' pa sta bila povezana policistronsko. Uporabili so terminator BBa_B0015. Za siRNA so uporabili promotor BBa_J23101 in terminator BBa_J61048, zaporedjem pa so za boljšo stabilnost in učinkovitost dodali še zaporedje OmpA 5' UTR [10] in vezavno mesto za Hfq [11].

S konstruktom, ki je vseboval pripravljeno biokocko, so transformirali ''E. coli'' BL21(DE3). Bakterije so gojili v gojišču z glifosatom in po 5 h določili koncentracijo preostalega glifosata v gojišču tako, da so uporabili svoj sistem za detekcijo. Primerjali so konstrukte z različnimi kombinacijami zapisov, vendar je bila najuspešnejša biokocka opisana zgoraj, ki je vsebovala vse zapise hkrati. Medtem ko so bakterije v negativni kontroli po 5 h privzele 8,6 % glifosata iz gojišča, so ''E. coli'' z biokocko privzele 43,1 %.

=Stikala smrti=

==Stikalo za sistem detekcije==
Stikalo smrti pri sistemu detekcije glifosata bi zagotovilo, da bi gensko spremenjene ''E. coli'' odmrle, če bi se sprostile v okolje. Gojišče, v katerem bi potekala detekcija glifosata v vzorcu, bi vsebovalo arabinozo, ki bi inhibirala sintezo citotoksične nukleaze MazF [12]. V primeru, da bi bakterije zapustile to goijšče, bi se mazF lahko izražal in privedel do celične smrti.

Pripravili so preprosto napravo BBa_K3332078, ki deluje kot inverter. Promotor PBAD nadzoruje izražanje zapisa za cI, promotor PR pa nadzoruje izražanje ''mazF''. Arabinoza povzroči preklop araC iz represorske v aktivatorsko obliko, kar spodbudi izražanje zapisa za cI, cI pa inhibira transkripcijo ''mazF''. V odsotnosti arabinoze bo araC inhibiral izražanje ''cI'', torej bo transkripcija ''mazF'' lahko potekala.

Pripravili so eksperiment, kjer so celice z inverterjem gojili v prisotnosti ali odsotnosti arabinoze. Rast bakterij so določili s štetjem CFU po različnih časih inkubacije. Ob prisotnosti arabinoze niso opazili znatnih sprememb v številu kolonij, medtem ko je pri odsotnosti arabinoze število kolonij izrazito upadlo v roku 8 h.

==Stikalo za sistem degradacije==
Sistem za degradacijo glifosata bi predvidoma deloval tako, da bi suspenzijo bakterij vnesli neposredno v prst, v kateri želimo odstraniti glifosat. Da bi preprečili nenadzorovano širjenje gensko spremenjenih bakterij, bi stikalo za smrt poskrbelo, da bakterije uspešno razgradijo glifosat, nato pa po opravljeni nalogi odmrejo.
Zamislili so si napravo, ki bi ob prisotnosti glifosata zavirala izražanje ''mazF'', v njegovi odsotnosti pa se bi ''mazF'' izražal in vodil v smrt.

Biokocka BBa_K3332078 deluje kot inverter. Namesto neposredne detekcije glifosata, so kot merilo njegove prisotnosti uporabili formaldehid, ki je eden od produktov ob razgradnji glifosata. HxlR je transkripcijski faktor, ki ob vezavi formaldehida deluje kot aktivator promotorja PHCHO [13]. PHCHO nadzoruje izražanje ''cI'', promotor PR pa izražanje ''mazF''. Ob prisotnosti formaldehida, bo HxlR aktiviral transkripcijo zapisa za cI, cI pa bo onemogočil izražanje ''mazF''. Kadar pa je formaldehid odsoten, transkripcija ''cI'' ne bo potekala in posledično se ''mazF'' lahko izraža.

Zaradi omejenega časa za eksperimentalno delo, so utegnili preizkusiti le delovanje posameznih sestavnih delov tega stikala, niso pa uspeli izvesti eksperimenta s celotno biokocko.

=Viri=

# S. Singh, V. Kumar, S. Datta, A. B. Wani, D. S. Dhanjal, R. Romero, J. Singh: Glyphosate Uptake, Translocation, Resistance Emergence in Crops, Analytical Monitoring, Toxicity and Degradation: A Review. Environmental Chemistry Letters. Springer May 1, 2020, pp. 663–702.
# World Health Organization: Glyphosate and AMPA in Drinking-water http://www.who.int/water_sanitation_health/ (pridobljeno 18. 4. 2021).
# L. Pan, Q. Yu, H. Han, L. Mao, A. Nyporko, L. J. Fan, L. Bai, S. Powles: Aldo-keto reductase metabolizes glyphosate and confers glyphosate resistance in Echinochloa colona. Plant Physiol. 2019, 181(4), str. 1519–1534.
# G. Rumsby, D. P. Cregeen: Identification and expression of a cDNA for human hydroxypyruvate/glyoxylate reductase. Biochim. Biophys. Acta - Gene Struct. Expr. 1999, 1446(3), str. 383–388.
# R. Tao, Y. Zhao, H. Chu, A. Wang, J. Zhu, X. Chen, Y. Zou, M. Shi, R. Liu, … Y. Yang: Genetically encoded fluorescent sensors reveal dynamic regulation of NADPH metabolism. Nat. Methods 2017, 14(7), str. 720–728.
# B. Hove-Jensen, D. L. Zechel, B. Jochimsen: Utilization of Glyphosate as Phosphate Source: Biochemistry and Genetics of Bacterial Carbon-Phosphorus Lyase. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2014, 78(1), str. 176–197.
# Y. V. Kryuchkova, G. L. Burygin, N. E. Gogoleva, Y. V. Gogolev, M. P. Chernyshova, O. E. Makarov, E. E. Fedorov, O. V. Turkovskaya: Isolation and characterization of a glyphosate-degrading rhizosphere strain, Enterobacter cloacae K7. Microbiol. Res. 2014, 169(1), str. 99–105.
# J. C. Errey, J. S. Blanchard: Functional annotation and kinetic characterization of PhnO from Salmonella enterica. Biochemistry 2006, 45(9), str. 3033–3039.
# C. M. Liu, P. A. McLean, C. C. Sookdeo, F. C. Cannon: Degradation of the herbicide glyphosate by members of the family Rhizobiaceae. Appl. Environ. Microbiol. 1991, 57(6), str. 1799–1804.
# M. J. Hansen, L. ‐H Chen, M. L. S. Fejzo, J. G. Beiasco: The ompA 5′ untranslated region impedes a major pathway for mRNA degradation in Escherichia coli. Mol. Microbiol. 1994, 12(5), str. 707–716.
# G. M. Cech, A. Szalewska-Palasz, K. Kubiak, A. Malabirade, W. Grange, V. Arluison, G. Wegrzyn: The Escherichia Coli Hfq Protein: An Unattended DNA-Transactions Regulator. Frontiers in Molecular Biosciences. Frontiers Media S.A. July 28, 2016, p. 36.
# Y. Zhang, J. Zhang, K. P. Hoeflich, M. Ikura, G. Qing, M. Inouye: MazF cleaves cellular mRNAs specifically at ACA to block protein synthesis in Escherichia coli. Mol. Cell 2003, 12(4), str. 913–923.
# R. Zhu, G. Zhang, M. Jing, Y. Han, J. Li, J. Zhao, Y. Li, P. R. Chen: Genetically encoded formaldehyde sensors inspired by a protein intra-helical crosslinking reaction. Nat. Commun. 2021, 12(1), str. 1–13.

Antea-Glyphosate: Detekcija in razgradnja glifosata

2021-04-19T17:44:42Z

JernejI: /* Viri */

Antea-Glyphosate je projekt v okviru tekmovanja leta iGEM 2020, ki so ga pripravili študentje z univerze Xiamen na Kitajskem.

Povezava do projekta: [https://2020.igem.org/Team:XMU-China https://2020.igem.org/Team:XMU-China]

Avtor povzetka: Jernej Imperl

=Uvod=

Glifosat je eden od najširše uporabljanih herbicidov in mnoge raziskave nakazujejo na možne škodljive učinke za netarčne rastline, mikroorganizme in živali [1]. Kljub temu da človek v vsakdanjem življenju ni izpostavljen nevarnim količinam glifosata [1, 2], je njegova prisotnost v prsti in vodi zaskrbljujoča.

Ker glifosat v strukturi ne vsebuje nobenih kromofornih ali fluorofornih skupin, je njegova detekcija zapletena in zamudna. Prav tako bi bilo za učinkovito odstranjevanje glifosata iz okolja potrebno razviti hitro metodo, ki bi delovala pod različnimi okolijskimi pogoji [1].

Skupina iGEM iz univerze Xiamen na Kitajskem si je za cilj zadala rešiti ta dva problema in vzpostaviti sinteznobiološko rešitev za detekcijo in razgradnjo glifosata v prsti. Projekt so poimenovali Antea-Glyphosate, saj jim je idejo za projekt dal razmislek o intenzivni uporabi herbicidov pri pridelavi čaja. Pripravili so sistem za detekcijo glifosata in sistem za razgradnjo glifosata v prsti v vzorcu ter vsakega opremili s svojim stikalom smrti.

Poleg gensko spremenjenih bakterij so pripravili tudi merilni aparat, ki temelji na uporabi njihovega sistema za detekcijo glifosata in rezultate posreduje mobilni aplikaciji. V nadaljevanju je predstavljena predvsem sinteznobiološka plat njihovega projekta. Zaradi pandemije COVID-19 in omejenega časa za eksperimente so predstavljeni eksperimenti pretežno preliminarne narave (»proof of concept«).

=Detekcija=

==Osnovni princip==
Sistem za detekcijo glifosata z rekombinantno ''Escherichia coli'' temelji na njegovi delni razgradnji in posrednem merjenju koncentracije NADPH, ki se ob reakciji porablja. Encim glifosat oksidoreduktaza (GOX) katalizira cepitev vezi C-N, kar vodi do nastanka glioksilata in aminometilfosfonske kisline (AMPA) [3]. Glioksilat reduktaza (GRHPR) nato katalizira redukcijo glioksilata v glikolno kislino, ob čemer se NADPH oksidira v NADP+ [4]. Protein iNap na koncu deluje kot senzor za NADPH, saj se ob vezavi tega kofaktorja konformacijsko spremeni in odda fluorescenčni signal [5]. Kadar je v raztopini torej prisoten glifosat, se bo ob njegovi encimski razgradnji NADPH pretvarjal v NADP+, kar pa bi lahko zaznali z merjenjem upada fluorescence iNap in tako določili koncentracijo glifosata.

Da bi se izognili alternativnim metabolnim potem in lažnim rezultatom zaradi citosolnega NADPH, so encime želeli pritrditi na zunanjo površino bakterijske celice, tako da bi jih fuzirali z membranskimi proteini. Kot fuzijske partnerje so preizkusili proteine INPNC, BrkA in AIDA.

==Eksperiment==
V eksperimentu so želeli preizkusiti delovanje proteinov, ko so bili ti pritrjeni na površino celic. V predhodnih eksperimentih so potrdili uspešno izražanje izbranih proteinov na površini celice. Pripravili so biokocke BBa_K2922060, BBa_K3332057, BBa_K3332059 (za GRHPR), BBa_K3332052, BBa_K3332054, BBa_K3332055 (za GOX), BBa_K3332047, BBa_K3332049, BBa_K3332050 (za iNap), kjer je bil vsak izmed treh proteinov fuziran na tri različne membranske proteine: INPNC, BrkA ali AIDA. Biokocke so vsebovale promotor J23100, RBS BBa_B0034 in terminator BBa_B0015. Proteine so predstavili na površini ''E. coli'' DH5α in jih preizkusili v seriji eksperimentov.

*Suspenziji celic z izraženim GRHPR so dodali glioksilat in NADPH. Koncentracijo NADPH so spremljali z merjenjem OD340. Opazili so, da je koncentracija NADPH skozi čas padala, na podlagi česar so sklepali, da encim uspešno katalizira reakcijo. Primerjali so učinkovitost encima z različnimi fuzijskimi partnerji in sklenili, da je bila izmed vseh najučinkovitejša kombinacija INPNC-GRHPR.

*V naslednjem eksperimentu so suspenziji celic z izraženim GOX dodali glifosat, NADPH in topno obliko encima GRHPR. Na podlagi upada OD340 so določili, da je GOX uspešno kataliziral reakcijo in vsi fuzijski proteini so bili podobno učinkoviti.

*Zaradi omejenega časa za eksperimente so uspeli preizkusiti le kombinaciji INPNC-iNap in iNap-AIDA. Merili so časovno odvisnost fluorescence (ekscitacija pri 420 nm, emisija pri 528 nm) pri različnih koncentracijah NADPH pokazali odvisnost fluorescence od koncentracije pri obeh fuzijskih proteinih.

*Pripravili so suspenzijo, kjer so hkrati dodali celice z vsakim od treh proteinov (pritrjenih preko INPNC). Suspenziji so dodali glifosat in NADPH ter spremljali fluorescenco skozi čas. V primerjavi s kontrolo brez izraženih proteinov je v suspenziji prišlo do znatnega upada fluorescence, s čimer so potrdili delovanje njihovega sistema.

=Razgradnja=

==Osnovni princip==
Poleg sistema za detekcijo glifosata v vzorcu so želeli pripraviti tudi gensko spremenjeno bakterijo ''E. coli'', ki bi lahko glifosat in njegov derivat AMPA v okolju razgradila v neškodljive produkte. Za razliko od pristopa za detekcijo glifosata, bi tokrat njegova razgradnja potekala po alternativni poti, ki temelji na cepitvi vezi C-P. Za tak mehanizem razgradnje so odgovorni encimi, ki so zapisani na operonu ''phn'', ki ga najdemo pri številnih bakterijah, tudi ''E. coli''. Proteini PhnC, D in E predstavljajo sistem za aktivni transport fosfonskih kislin v celico, medtem ko kompleks PhnGHIJK, katerega glavna katalitična komponenta je PhnJ, katalizira cepitev vezi C-P s hkratno hidrolizo ATP. Po odstranitvi fosfitne skupine z glifosata, se sprosti N-metilglicin, ki pa se lahko v celici naprej oksidira do formaldehida in glicina.

Encim PhnO katalizira prenos acetilne skupine iz acetil koencima A na AMPA. Acetiliran AMPA lahko deluje kot substrat za PhnGHIJK, ki ga razgradi do N-metilacetamida. PhnO in PhnGHIJK lahko torej razgrajujejo tako glifosat kot tudi AMPA [6].

==Eksperimenti==
Da bi izboljšali razgradnjo glifosata in AMPA v ''E. coli'' so želeli nekatere gene ''phn'' nadomestiti s homologi iz drugih organizmov, kjer ta razgradnja poteka učinkoviteje. Vstaviti so želeli gene ''phnJ'' iz ''Enterobacter cloacae'' K7 [7], ''phnO'' iz ''Salmonella enterica'' [8] in ''phnE1/E2'' iz ''Sinorhizobium meliloti'' 1021 [9]. Hkrati so želeli inhibirati izražanje endognih zapisov za PhnF, ki deluje kot represor za nekatere gene ''phn'' [6], in PhnJ, ki bi lahko z rekombninantnim PhnJ tekmoval za podenote kompleksa PhnGHJIK. Kot metodo inhibicije izražanja so izbrali siRNA.

Pripravili so biokocko BBa_K3332099, ki je vsebovala vse potrebne zapise. Izražanje genov za proteine so nadzorovali promotorji J23100 in RBS BBa_B0034, tako da sta imela ''phnJ'' in ''phnO'' vsak svoj promotor in RBS, ''phnE1'' in ''phnE2'' pa sta bila povezana policistronsko. Uporabili so terminator BBa_B0015. Za siRNA so uporabili promotor BBa_J23101 in terminator BBa_J61048, zaporedjem pa so za boljšo stabilnost in učinkovitost dodali še zaporedje OmpA 5' UTR [10] in vezavno mesto za Hfq [11].

S konstruktom, ki je vseboval pripravljeno biokocko, so transformirali ''E. coli'' BL21(DE3). Bakterije so gojili v gojišču z glifosatom in po 5 h določili koncentracijo preostalega glifosata v gojišču tako, da so uporabili svoj sistem za detekcijo. Primerjali so konstrukte z različnimi kombinacijami zapisov, vendar je bila najuspešnejša biokocka opisana zgoraj, ki je vsebovala vse zapise hkrati. Medtem ko so bakterije v negativni kontroli po 5 h privzele 8,6 % glifosata iz gojišča, so ''E. coli'' z biokocko privzele 43,1 %.

=Stikala smrti=

==Stikalo za sistem detekcije==
Stikalo smrti pri sistemu detekcije glifosata bi zagotovilo, da bi gensko spremenjene ''E. coli'' odmrle, če bi se sprostile v okolje. Gojišče, v katerem bi potekala detekcija glifosata v vzorcu, bi vsebovalo arabinozo, ki bi inhibirala sintezo citotoksične nukleaze MazF [12]. V primeru, da bi bakterije zapustile to goijšče, bi se mazF lahko izražal in privedel do celične smrti.

Pripravili so preprosto napravo BBa_K3332078, ki deluje kot inverter. Promotor PBAD nadzoruje izražanje zapisa za cI, promotor PR pa nadzoruje izražanje ''mazF''. Arabinoza povzroči preklop araC iz represorske v aktivatorsko obliko, kar spodbudi izražanje zapisa za cI, cI pa inhibira transkripcijo ''mazF''. V odsotnosti arabinoze bo araC inhibiral izražanje ''cI'', torej bo transkripcija ''mazF'' lahko potekala.

Pripravili so eksperiment, kjer so celice z inverterjem gojili v prisotnosti ali odsotnosti arabinoze. Rast bakterij so določili s štetjem CFU po različnih časih inkubacije. Ob prisotnosti arabinoze niso opazili znatnih sprememb v številu kolonij, medtem ko je pri odsotnosti arabinoze število kolonij izrazito upadlo v roku 8 h.

==Stikalo za sistem degradacije==
Sistem za degradacijo glifosata bi predvidoma deloval tako, da bi suspenzijo bakterij vnesli neposredno v prst, v kateri želimo odstraniti glifosat. Da bi preprečili nenadzorovano širjenje gensko spremenjenih bakterij, bi stikalo za smrt poskrbelo, da bakterije uspešno razgradijo glifosat, nato pa po opravljeni nalogi odmrejo.
Zamislili so si napravo, ki bi ob prisotnosti glifosata zavirala izražanje ''mazF'', v njegovi odsotnosti pa se bi ''mazF'' izražal in vodil v smrt.

Biokocka BBa_K3332078 deluje kot inverter. Namesto neposredne detekcije glifosata, so kot merilo njegove prisotnosti uporabili formaldehid, ki je eden od produktov ob razgradnji glifosata. HxlR je transkripcijski faktor, ki ob vezavi formaldehida deluje kot aktivator promotorja PHCHO [13]. PHCHO nadzoruje izražanje ''cI'', promotor PR pa izražanje ''mazF''. Ob prisotnosti formaldehida, bo HxlR aktiviral transkripcijo zapisa za cI, cI pa bo onemogočil izražanje ''mazF''. Kadar pa je formaldehid odsoten, transkripcija ''cI'' ne bo potekala in posledično se ''mazF'' lahko izraža.

Zaradi omejenega časa za eksperimentalno delo, so utegnili preizkusiti le delovanje posameznih sestavnih delov tega stikala, niso pa uspeli izvesti eksperimenta s celotno biokocko.

=Viri=

# S. Singh, V. Kumar, S. Datta, A. B. Wani, D. S. Dhanjal, R. Romero, J. Singh: Glyphosate Uptake, Translocation, Resistance Emergence in Crops, Analytical Monitoring, Toxicity and Degradation: A Review. Environmental Chemistry Letters. Springer May 1, 2020, pp. 663–702.
# World Health Organization: Glyphosate and AMPA in Drinking-water http://www.who.int/water_sanitation_health/ (pridobljeno 18. 4. 2021).
# L. Pan, Q. Yu, H. Han, L. Mao, A. Nyporko, L. J. Fan, L. Bai, S. Powles: Aldo-keto reductase metabolizes glyphosate and confers glyphosate resistance in Echinochloa colona. Plant Physiol. 2019, 181(4), str. 1519–1534.
# G. Rumsby, D. P. Cregeen: Identification and expression of a cDNA for human hydroxypyruvate/glyoxylate reductase. Biochim. Biophys. Acta - Gene Struct. Expr. 1999, 1446(3), str. 383–388.
# R. Tao, Y. Zhao, H. Chu, A. Wang, J. Zhu, X. Chen, Y. Zou, M. Shi, R. Liu, … Y. Yang: Genetically encoded fluorescent sensors reveal dynamic regulation of NADPH metabolism. Nat. Methods 2017, 14(7), str. 720–728.
# B. Hove-Jensen, D. L. Zechel, B. Jochimsen: Utilization of Glyphosate as Phosphate Source: Biochemistry and Genetics of Bacterial Carbon-Phosphorus Lyase. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2014, 78(1), str. 176–197.
# Y. V. Kryuchkova, G. L. Burygin, N. E. Gogoleva, Y. V. Gogolev, M. P. Chernyshova, O. E. Makarov, E. E. Fedorov, O. V. Turkovskaya: Isolation and characterization of a glyphosate-degrading rhizosphere strain, Enterobacter cloacae K7. Microbiol. Res. 2014, 169(1), str. 99–105.
# J. C. Errey, J. S. Blanchard: Functional annotation and kinetic characterization of PhnO from Salmonella enterica. Biochemistry 2006, 45(9), str. 3033–3039.
# C. M. Liu, P. A. McLean, C. C. Sookdeo, F. C. Cannon: Degradation of the herbicide glyphosate by members of the family Rhizobiaceae. Appl. Environ. Microbiol. 1991, 57(6), str. 1799–1804.
# M. J. Hansen, L. ‐H Chen, M. L. S. Fejzo, J. G. Beiasco: The ompA 5′ untranslated region impedes a major pathway for mRNA degradation in Escherichia coli. Mol. Microbiol. 1994, 12(5), str. 707–716.
# G. M. Cech, A. Szalewska-Palasz, K. Kubiak, A. Malabirade, W. Grange, V. Arluison, G. Wegrzyn: The Escherichia Coli Hfq Protein: An Unattended DNA-Transactions Regulator. Frontiers in Molecular Biosciences. Frontiers Media S.A. July 28, 2016, p. 36.
# Y. Zhang, J. Zhang, K. P. Hoeflich, M. Ikura, G. Qing, M. Inouye: MazF cleaves cellular mRNAs specifically at ACA to block protein synthesis in Escherichia coli. Mol. Cell 2003, 12(4), str. 913–923.
# R. Zhu, G. Zhang, M. Jing, Y. Han, J. Li, J. Zhao, Y. Li, P. R. Chen: Genetically encoded formaldehyde sensors inspired by a protein intra-helical crosslinking reaction. Nat. Commun. 2021, 12(1), str. 1–13.

Antea-Glyphosate: Detekcija in razgradnja glifosata

2021-04-19T17:38:35Z

JernejI: /* Stikalo za sistem degradacije */

Antea-Glyphosate je projekt v okviru tekmovanja leta iGEM 2020, ki so ga pripravili študentje z univerze Xiamen na Kitajskem.

Povezava do projekta: [https://2020.igem.org/Team:XMU-China https://2020.igem.org/Team:XMU-China]

Avtor povzetka: Jernej Imperl

=Uvod=

Glifosat je eden od najširše uporabljanih herbicidov in mnoge raziskave nakazujejo na možne škodljive učinke za netarčne rastline, mikroorganizme in živali [1]. Kljub temu da človek v vsakdanjem življenju ni izpostavljen nevarnim količinam glifosata [1, 2], je njegova prisotnost v prsti in vodi zaskrbljujoča.

Ker glifosat v strukturi ne vsebuje nobenih kromofornih ali fluorofornih skupin, je njegova detekcija zapletena in zamudna. Prav tako bi bilo za učinkovito odstranjevanje glifosata iz okolja potrebno razviti hitro metodo, ki bi delovala pod različnimi okolijskimi pogoji [1].

Skupina iGEM iz univerze Xiamen na Kitajskem si je za cilj zadala rešiti ta dva problema in vzpostaviti sinteznobiološko rešitev za detekcijo in razgradnjo glifosata v prsti. Projekt so poimenovali Antea-Glyphosate, saj jim je idejo za projekt dal razmislek o intenzivni uporabi herbicidov pri pridelavi čaja. Pripravili so sistem za detekcijo glifosata in sistem za razgradnjo glifosata v prsti v vzorcu ter vsakega opremili s svojim stikalom smrti.

Poleg gensko spremenjenih bakterij so pripravili tudi merilni aparat, ki temelji na uporabi njihovega sistema za detekcijo glifosata in rezultate posreduje mobilni aplikaciji. V nadaljevanju je predstavljena predvsem sinteznobiološka plat njihovega projekta. Zaradi pandemije COVID-19 in omejenega časa za eksperimente so predstavljeni eksperimenti pretežno preliminarne narave (»proof of concept«).

=Detekcija=

==Osnovni princip==
Sistem za detekcijo glifosata z rekombinantno ''Escherichia coli'' temelji na njegovi delni razgradnji in posrednem merjenju koncentracije NADPH, ki se ob reakciji porablja. Encim glifosat oksidoreduktaza (GOX) katalizira cepitev vezi C-N, kar vodi do nastanka glioksilata in aminometilfosfonske kisline (AMPA) [3]. Glioksilat reduktaza (GRHPR) nato katalizira redukcijo glioksilata v glikolno kislino, ob čemer se NADPH oksidira v NADP+ [4]. Protein iNap na koncu deluje kot senzor za NADPH, saj se ob vezavi tega kofaktorja konformacijsko spremeni in odda fluorescenčni signal [5]. Kadar je v raztopini torej prisoten glifosat, se bo ob njegovi encimski razgradnji NADPH pretvarjal v NADP+, kar pa bi lahko zaznali z merjenjem upada fluorescence iNap in tako določili koncentracijo glifosata.

Da bi se izognili alternativnim metabolnim potem in lažnim rezultatom zaradi citosolnega NADPH, so encime želeli pritrditi na zunanjo površino bakterijske celice, tako da bi jih fuzirali z membranskimi proteini. Kot fuzijske partnerje so preizkusili proteine INPNC, BrkA in AIDA.

==Eksperiment==
V eksperimentu so želeli preizkusiti delovanje proteinov, ko so bili ti pritrjeni na površino celic. V predhodnih eksperimentih so potrdili uspešno izražanje izbranih proteinov na površini celice. Pripravili so biokocke BBa_K2922060, BBa_K3332057, BBa_K3332059 (za GRHPR), BBa_K3332052, BBa_K3332054, BBa_K3332055 (za GOX), BBa_K3332047, BBa_K3332049, BBa_K3332050 (za iNap), kjer je bil vsak izmed treh proteinov fuziran na tri različne membranske proteine: INPNC, BrkA ali AIDA. Biokocke so vsebovale promotor J23100, RBS BBa_B0034 in terminator BBa_B0015. Proteine so predstavili na površini ''E. coli'' DH5α in jih preizkusili v seriji eksperimentov.

*Suspenziji celic z izraženim GRHPR so dodali glioksilat in NADPH. Koncentracijo NADPH so spremljali z merjenjem OD340. Opazili so, da je koncentracija NADPH skozi čas padala, na podlagi česar so sklepali, da encim uspešno katalizira reakcijo. Primerjali so učinkovitost encima z različnimi fuzijskimi partnerji in sklenili, da je bila izmed vseh najučinkovitejša kombinacija INPNC-GRHPR.

*V naslednjem eksperimentu so suspenziji celic z izraženim GOX dodali glifosat, NADPH in topno obliko encima GRHPR. Na podlagi upada OD340 so določili, da je GOX uspešno kataliziral reakcijo in vsi fuzijski proteini so bili podobno učinkoviti.

*Zaradi omejenega časa za eksperimente so uspeli preizkusiti le kombinaciji INPNC-iNap in iNap-AIDA. Merili so časovno odvisnost fluorescence (ekscitacija pri 420 nm, emisija pri 528 nm) pri različnih koncentracijah NADPH pokazali odvisnost fluorescence od koncentracije pri obeh fuzijskih proteinih.

*Pripravili so suspenzijo, kjer so hkrati dodali celice z vsakim od treh proteinov (pritrjenih preko INPNC). Suspenziji so dodali glifosat in NADPH ter spremljali fluorescenco skozi čas. V primerjavi s kontrolo brez izraženih proteinov je v suspenziji prišlo do znatnega upada fluorescence, s čimer so potrdili delovanje njihovega sistema.

=Razgradnja=

==Osnovni princip==
Poleg sistema za detekcijo glifosata v vzorcu so želeli pripraviti tudi gensko spremenjeno bakterijo ''E. coli'', ki bi lahko glifosat in njegov derivat AMPA v okolju razgradila v neškodljive produkte. Za razliko od pristopa za detekcijo glifosata, bi tokrat njegova razgradnja potekala po alternativni poti, ki temelji na cepitvi vezi C-P. Za tak mehanizem razgradnje so odgovorni encimi, ki so zapisani na operonu ''phn'', ki ga najdemo pri številnih bakterijah, tudi ''E. coli''. Proteini PhnC, D in E predstavljajo sistem za aktivni transport fosfonskih kislin v celico, medtem ko kompleks PhnGHIJK, katerega glavna katalitična komponenta je PhnJ, katalizira cepitev vezi C-P s hkratno hidrolizo ATP. Po odstranitvi fosfitne skupine z glifosata, se sprosti N-metilglicin, ki pa se lahko v celici naprej oksidira do formaldehida in glicina.

Encim PhnO katalizira prenos acetilne skupine iz acetil koencima A na AMPA. Acetiliran AMPA lahko deluje kot substrat za PhnGHIJK, ki ga razgradi do N-metilacetamida. PhnO in PhnGHIJK lahko torej razgrajujejo tako glifosat kot tudi AMPA [6].

==Eksperimenti==
Da bi izboljšali razgradnjo glifosata in AMPA v ''E. coli'' so želeli nekatere gene ''phn'' nadomestiti s homologi iz drugih organizmov, kjer ta razgradnja poteka učinkoviteje. Vstaviti so želeli gene ''phnJ'' iz ''Enterobacter cloacae'' K7 [7], ''phnO'' iz ''Salmonella enterica'' [8] in ''phnE1/E2'' iz ''Sinorhizobium meliloti'' 1021 [9]. Hkrati so želeli inhibirati izražanje endognih zapisov za PhnF, ki deluje kot represor za nekatere gene ''phn'' [6], in PhnJ, ki bi lahko z rekombninantnim PhnJ tekmoval za podenote kompleksa PhnGHJIK. Kot metodo inhibicije izražanja so izbrali siRNA.

Pripravili so biokocko BBa_K3332099, ki je vsebovala vse potrebne zapise. Izražanje genov za proteine so nadzorovali promotorji J23100 in RBS BBa_B0034, tako da sta imela ''phnJ'' in ''phnO'' vsak svoj promotor in RBS, ''phnE1'' in ''phnE2'' pa sta bila povezana policistronsko. Uporabili so terminator BBa_B0015. Za siRNA so uporabili promotor BBa_J23101 in terminator BBa_J61048, zaporedjem pa so za boljšo stabilnost in učinkovitost dodali še zaporedje OmpA 5' UTR [10] in vezavno mesto za Hfq [11].

S konstruktom, ki je vseboval pripravljeno biokocko, so transformirali ''E. coli'' BL21(DE3). Bakterije so gojili v gojišču z glifosatom in po 5 h določili koncentracijo preostalega glifosata v gojišču tako, da so uporabili svoj sistem za detekcijo. Primerjali so konstrukte z različnimi kombinacijami zapisov, vendar je bila najuspešnejša biokocka opisana zgoraj, ki je vsebovala vse zapise hkrati. Medtem ko so bakterije v negativni kontroli po 5 h privzele 8,6 % glifosata iz gojišča, so ''E. coli'' z biokocko privzele 43,1 %.

=Stikala smrti=

==Stikalo za sistem detekcije==
Stikalo smrti pri sistemu detekcije glifosata bi zagotovilo, da bi gensko spremenjene ''E. coli'' odmrle, če bi se sprostile v okolje. Gojišče, v katerem bi potekala detekcija glifosata v vzorcu, bi vsebovalo arabinozo, ki bi inhibirala sintezo citotoksične nukleaze MazF [12]. V primeru, da bi bakterije zapustile to goijšče, bi se mazF lahko izražal in privedel do celične smrti.

Pripravili so preprosto napravo BBa_K3332078, ki deluje kot inverter. Promotor PBAD nadzoruje izražanje zapisa za cI, promotor PR pa nadzoruje izražanje ''mazF''. Arabinoza povzroči preklop araC iz represorske v aktivatorsko obliko, kar spodbudi izražanje zapisa za cI, cI pa inhibira transkripcijo ''mazF''. V odsotnosti arabinoze bo araC inhibiral izražanje ''cI'', torej bo transkripcija ''mazF'' lahko potekala.

Pripravili so eksperiment, kjer so celice z inverterjem gojili v prisotnosti ali odsotnosti arabinoze. Rast bakterij so določili s štetjem CFU po različnih časih inkubacije. Ob prisotnosti arabinoze niso opazili znatnih sprememb v številu kolonij, medtem ko je pri odsotnosti arabinoze število kolonij izrazito upadlo v roku 8 h.

==Stikalo za sistem degradacije==
Sistem za degradacijo glifosata bi predvidoma deloval tako, da bi suspenzijo bakterij vnesli neposredno v prst, v kateri želimo odstraniti glifosat. Da bi preprečili nenadzorovano širjenje gensko spremenjenih bakterij, bi stikalo za smrt poskrbelo, da bakterije uspešno razgradijo glifosat, nato pa po opravljeni nalogi odmrejo.
Zamislili so si napravo, ki bi ob prisotnosti glifosata zavirala izražanje ''mazF'', v njegovi odsotnosti pa se bi ''mazF'' izražal in vodil v smrt.

Biokocka BBa_K3332078 deluje kot inverter. Namesto neposredne detekcije glifosata, so kot merilo njegove prisotnosti uporabili formaldehid, ki je eden od produktov ob razgradnji glifosata. HxlR je transkripcijski faktor, ki ob vezavi formaldehida deluje kot aktivator promotorja PHCHO [13]. PHCHO nadzoruje izražanje ''cI'', promotor PR pa izražanje ''mazF''. Ob prisotnosti formaldehida, bo HxlR aktiviral transkripcijo zapisa za cI, cI pa bo onemogočil izražanje ''mazF''. Kadar pa je formaldehid odsoten, transkripcija ''cI'' ne bo potekala in posledično se ''mazF'' lahko izraža.

Zaradi omejenega časa za eksperimentalno delo, so utegnili preizkusiti le delovanje posameznih sestavnih delov tega stikala, niso pa uspeli izvesti eksperimenta s celotno biokocko.

=Viri=

1. S. Singh, V. Kumar, S. Datta, A. B. Wani, D. S. Dhanjal, R. Romero, J. Singh: Glyphosate Uptake, Translocation, Resistance Emergence in Crops, Analytical Monitoring, Toxicity and Degradation: A Review. Environmental Chemistry Letters. Springer May 1, 2020, pp. 663–702.
2. World Health Organization: Glyphosate and AMPA in Drinking-water http://www.who.int/water_sanitation_health/ (pridobljeno 18. 4. 2021).
3. L. Pan, Q. Yu, H. Han, L. Mao, A. Nyporko, L. J. Fan, L. Bai, S. Powles: Aldo-keto reductase metabolizes glyphosate and confers glyphosate resistance in Echinochloa colona. Plant Physiol. 2019, 181(4), str. 1519–1534.
4. G. Rumsby, D. P. Cregeen: Identification and expression of a cDNA for human hydroxypyruvate/glyoxylate reductase. Biochim. Biophys. Acta - Gene Struct. Expr. 1999, 1446(3), str. 383–388.
5. R. Tao, Y. Zhao, H. Chu, A. Wang, J. Zhu, X. Chen, Y. Zou, M. Shi, R. Liu, … Y. Yang: Genetically encoded fluorescent sensors reveal dynamic regulation of NADPH metabolism. Nat. Methods 2017, 14(7), str. 720–728.
6. B. Hove-Jensen, D. L. Zechel, B. Jochimsen: Utilization of Glyphosate as Phosphate Source: Biochemistry and Genetics of Bacterial Carbon-Phosphorus Lyase. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2014, 78(1), str. 176–197.
7. Y. V. Kryuchkova, G. L. Burygin, N. E. Gogoleva, Y. V. Gogolev, M. P. Chernyshova, O. E. Makarov, E. E. Fedorov, O. V. Turkovskaya: Isolation and characterization of a glyphosate-degrading rhizosphere strain, Enterobacter cloacae K7. Microbiol. Res. 2014, 169(1), str. 99–105.
8. J. C. Errey, J. S. Blanchard: Functional annotation and kinetic characterization of PhnO from Salmonella enterica. Biochemistry 2006, 45(9), str. 3033–3039.
9. C. M. Liu, P. A. McLean, C. C. Sookdeo, F. C. Cannon: Degradation of the herbicide glyphosate by members of the family Rhizobiaceae. Appl. Environ. Microbiol. 1991, 57(6), str. 1799–1804.
10. M. J. Hansen, L. ‐H Chen, M. L. S. Fejzo, J. G. Beiasco: The ompA 5′ untranslated region impedes a major pathway for mRNA degradation in Escherichia coli. Mol. Microbiol. 1994, 12(5), str. 707–716.
11. G. M. Cech, A. Szalewska-Palasz, K. Kubiak, A. Malabirade, W. Grange, V. Arluison, G. Wegrzyn: The Escherichia Coli Hfq Protein: An Unattended DNA-Transactions Regulator. Frontiers in Molecular Biosciences. Frontiers Media S.A. July 28, 2016, p. 36.
12. Y. Zhang, J. Zhang, K. P. Hoeflich, M. Ikura, G. Qing, M. Inouye: MazF cleaves cellular mRNAs specifically at ACA to block protein synthesis in Escherichia coli. Mol. Cell 2003, 12(4), str. 913–923.
13. R. Zhu, G. Zhang, M. Jing, Y. Han, J. Li, J. Zhao, Y. Li, P. R. Chen: Genetically encoded formaldehyde sensors inspired by a protein intra-helical crosslinking reaction. Nat. Commun. 2021, 12(1), str. 1–13.

Antea-Glyphosate: Detekcija in razgradnja glifosata

2021-04-19T17:36:46Z

JernejI: /* Stikalo za sistem detekcije */

Antea-Glyphosate je projekt v okviru tekmovanja leta iGEM 2020, ki so ga pripravili študentje z univerze Xiamen na Kitajskem.

Povezava do projekta: [https://2020.igem.org/Team:XMU-China https://2020.igem.org/Team:XMU-China]

Avtor povzetka: Jernej Imperl

=Uvod=

Glifosat je eden od najširše uporabljanih herbicidov in mnoge raziskave nakazujejo na možne škodljive učinke za netarčne rastline, mikroorganizme in živali [1]. Kljub temu da človek v vsakdanjem življenju ni izpostavljen nevarnim količinam glifosata [1, 2], je njegova prisotnost v prsti in vodi zaskrbljujoča.

Ker glifosat v strukturi ne vsebuje nobenih kromofornih ali fluorofornih skupin, je njegova detekcija zapletena in zamudna. Prav tako bi bilo za učinkovito odstranjevanje glifosata iz okolja potrebno razviti hitro metodo, ki bi delovala pod različnimi okolijskimi pogoji [1].

Skupina iGEM iz univerze Xiamen na Kitajskem si je za cilj zadala rešiti ta dva problema in vzpostaviti sinteznobiološko rešitev za detekcijo in razgradnjo glifosata v prsti. Projekt so poimenovali Antea-Glyphosate, saj jim je idejo za projekt dal razmislek o intenzivni uporabi herbicidov pri pridelavi čaja. Pripravili so sistem za detekcijo glifosata in sistem za razgradnjo glifosata v prsti v vzorcu ter vsakega opremili s svojim stikalom smrti.

Poleg gensko spremenjenih bakterij so pripravili tudi merilni aparat, ki temelji na uporabi njihovega sistema za detekcijo glifosata in rezultate posreduje mobilni aplikaciji. V nadaljevanju je predstavljena predvsem sinteznobiološka plat njihovega projekta. Zaradi pandemije COVID-19 in omejenega časa za eksperimente so predstavljeni eksperimenti pretežno preliminarne narave (»proof of concept«).

=Detekcija=

==Osnovni princip==
Sistem za detekcijo glifosata z rekombinantno ''Escherichia coli'' temelji na njegovi delni razgradnji in posrednem merjenju koncentracije NADPH, ki se ob reakciji porablja. Encim glifosat oksidoreduktaza (GOX) katalizira cepitev vezi C-N, kar vodi do nastanka glioksilata in aminometilfosfonske kisline (AMPA) [3]. Glioksilat reduktaza (GRHPR) nato katalizira redukcijo glioksilata v glikolno kislino, ob čemer se NADPH oksidira v NADP+ [4]. Protein iNap na koncu deluje kot senzor za NADPH, saj se ob vezavi tega kofaktorja konformacijsko spremeni in odda fluorescenčni signal [5]. Kadar je v raztopini torej prisoten glifosat, se bo ob njegovi encimski razgradnji NADPH pretvarjal v NADP+, kar pa bi lahko zaznali z merjenjem upada fluorescence iNap in tako določili koncentracijo glifosata.

Da bi se izognili alternativnim metabolnim potem in lažnim rezultatom zaradi citosolnega NADPH, so encime želeli pritrditi na zunanjo površino bakterijske celice, tako da bi jih fuzirali z membranskimi proteini. Kot fuzijske partnerje so preizkusili proteine INPNC, BrkA in AIDA.

==Eksperiment==
V eksperimentu so želeli preizkusiti delovanje proteinov, ko so bili ti pritrjeni na površino celic. V predhodnih eksperimentih so potrdili uspešno izražanje izbranih proteinov na površini celice. Pripravili so biokocke BBa_K2922060, BBa_K3332057, BBa_K3332059 (za GRHPR), BBa_K3332052, BBa_K3332054, BBa_K3332055 (za GOX), BBa_K3332047, BBa_K3332049, BBa_K3332050 (za iNap), kjer je bil vsak izmed treh proteinov fuziran na tri različne membranske proteine: INPNC, BrkA ali AIDA. Biokocke so vsebovale promotor J23100, RBS BBa_B0034 in terminator BBa_B0015. Proteine so predstavili na površini ''E. coli'' DH5α in jih preizkusili v seriji eksperimentov.

*Suspenziji celic z izraženim GRHPR so dodali glioksilat in NADPH. Koncentracijo NADPH so spremljali z merjenjem OD340. Opazili so, da je koncentracija NADPH skozi čas padala, na podlagi česar so sklepali, da encim uspešno katalizira reakcijo. Primerjali so učinkovitost encima z različnimi fuzijskimi partnerji in sklenili, da je bila izmed vseh najučinkovitejša kombinacija INPNC-GRHPR.

*V naslednjem eksperimentu so suspenziji celic z izraženim GOX dodali glifosat, NADPH in topno obliko encima GRHPR. Na podlagi upada OD340 so določili, da je GOX uspešno kataliziral reakcijo in vsi fuzijski proteini so bili podobno učinkoviti.

*Zaradi omejenega časa za eksperimente so uspeli preizkusiti le kombinaciji INPNC-iNap in iNap-AIDA. Merili so časovno odvisnost fluorescence (ekscitacija pri 420 nm, emisija pri 528 nm) pri različnih koncentracijah NADPH pokazali odvisnost fluorescence od koncentracije pri obeh fuzijskih proteinih.

*Pripravili so suspenzijo, kjer so hkrati dodali celice z vsakim od treh proteinov (pritrjenih preko INPNC). Suspenziji so dodali glifosat in NADPH ter spremljali fluorescenco skozi čas. V primerjavi s kontrolo brez izraženih proteinov je v suspenziji prišlo do znatnega upada fluorescence, s čimer so potrdili delovanje njihovega sistema.

=Razgradnja=

==Osnovni princip==
Poleg sistema za detekcijo glifosata v vzorcu so želeli pripraviti tudi gensko spremenjeno bakterijo ''E. coli'', ki bi lahko glifosat in njegov derivat AMPA v okolju razgradila v neškodljive produkte. Za razliko od pristopa za detekcijo glifosata, bi tokrat njegova razgradnja potekala po alternativni poti, ki temelji na cepitvi vezi C-P. Za tak mehanizem razgradnje so odgovorni encimi, ki so zapisani na operonu ''phn'', ki ga najdemo pri številnih bakterijah, tudi ''E. coli''. Proteini PhnC, D in E predstavljajo sistem za aktivni transport fosfonskih kislin v celico, medtem ko kompleks PhnGHIJK, katerega glavna katalitična komponenta je PhnJ, katalizira cepitev vezi C-P s hkratno hidrolizo ATP. Po odstranitvi fosfitne skupine z glifosata, se sprosti N-metilglicin, ki pa se lahko v celici naprej oksidira do formaldehida in glicina.

Encim PhnO katalizira prenos acetilne skupine iz acetil koencima A na AMPA. Acetiliran AMPA lahko deluje kot substrat za PhnGHIJK, ki ga razgradi do N-metilacetamida. PhnO in PhnGHIJK lahko torej razgrajujejo tako glifosat kot tudi AMPA [6].

==Eksperimenti==
Da bi izboljšali razgradnjo glifosata in AMPA v ''E. coli'' so želeli nekatere gene ''phn'' nadomestiti s homologi iz drugih organizmov, kjer ta razgradnja poteka učinkoviteje. Vstaviti so želeli gene ''phnJ'' iz ''Enterobacter cloacae'' K7 [7], ''phnO'' iz ''Salmonella enterica'' [8] in ''phnE1/E2'' iz ''Sinorhizobium meliloti'' 1021 [9]. Hkrati so želeli inhibirati izražanje endognih zapisov za PhnF, ki deluje kot represor za nekatere gene ''phn'' [6], in PhnJ, ki bi lahko z rekombninantnim PhnJ tekmoval za podenote kompleksa PhnGHJIK. Kot metodo inhibicije izražanja so izbrali siRNA.

Pripravili so biokocko BBa_K3332099, ki je vsebovala vse potrebne zapise. Izražanje genov za proteine so nadzorovali promotorji J23100 in RBS BBa_B0034, tako da sta imela ''phnJ'' in ''phnO'' vsak svoj promotor in RBS, ''phnE1'' in ''phnE2'' pa sta bila povezana policistronsko. Uporabili so terminator BBa_B0015. Za siRNA so uporabili promotor BBa_J23101 in terminator BBa_J61048, zaporedjem pa so za boljšo stabilnost in učinkovitost dodali še zaporedje OmpA 5' UTR [10] in vezavno mesto za Hfq [11].

S konstruktom, ki je vseboval pripravljeno biokocko, so transformirali ''E. coli'' BL21(DE3). Bakterije so gojili v gojišču z glifosatom in po 5 h določili koncentracijo preostalega glifosata v gojišču tako, da so uporabili svoj sistem za detekcijo. Primerjali so konstrukte z različnimi kombinacijami zapisov, vendar je bila najuspešnejša biokocka opisana zgoraj, ki je vsebovala vse zapise hkrati. Medtem ko so bakterije v negativni kontroli po 5 h privzele 8,6 % glifosata iz gojišča, so ''E. coli'' z biokocko privzele 43,1 %.

=Stikala smrti=

==Stikalo za sistem detekcije==
Stikalo smrti pri sistemu detekcije glifosata bi zagotovilo, da bi gensko spremenjene ''E. coli'' odmrle, če bi se sprostile v okolje. Gojišče, v katerem bi potekala detekcija glifosata v vzorcu, bi vsebovalo arabinozo, ki bi inhibirala sintezo citotoksične nukleaze MazF [12]. V primeru, da bi bakterije zapustile to goijšče, bi se mazF lahko izražal in privedel do celične smrti.

Pripravili so preprosto napravo BBa_K3332078, ki deluje kot inverter. Promotor PBAD nadzoruje izražanje zapisa za cI, promotor PR pa nadzoruje izražanje ''mazF''. Arabinoza povzroči preklop araC iz represorske v aktivatorsko obliko, kar spodbudi izražanje zapisa za cI, cI pa inhibira transkripcijo ''mazF''. V odsotnosti arabinoze bo araC inhibiral izražanje ''cI'', torej bo transkripcija ''mazF'' lahko potekala.

Pripravili so eksperiment, kjer so celice z inverterjem gojili v prisotnosti ali odsotnosti arabinoze. Rast bakterij so določili s štetjem CFU po različnih časih inkubacije. Ob prisotnosti arabinoze niso opazili znatnih sprememb v številu kolonij, medtem ko je pri odsotnosti arabinoze število kolonij izrazito upadlo v roku 8 h.

==Stikalo za sistem degradacije==
Sistem za degradacijo glifosata bi predvidoma deloval tako, da bi suspenzijo bakterij vnesli neposredno v prst, v kateri želimo odstraniti glifosat. Da bi preprečili nenadzorovano širjenje gensko spremenjenih bakterij, bi stikalo za smrt poskrbelo, da bakterije uspešno razgradijo glifosat, nato pa po opravljeni nalogi odmrejo. Zamislili so si napravo, ki bi ob prisotnosti glifosata zavirala izražanje mazF, v njegovi odsotnosti pa se bi mazF izražal in vodil v smrt.
Biokocka BBa_K3332078 deluje kot inverter. Namesto neposredne detekcije glifosata, so kot merilo njegove prisotnosti uporabili formaldehid, ki je eden od produktov ob razgradnji glifosata. HxlR je transkripcijski faktor, ki ob vezavi formaldehida deluje kot aktivator promotorja pHCHO [13]. pHCHO nadzoruje izražanje cI, promotor pR pa izražanje mazF. Ob prisotnosti formaldehida, bo HxlR aktiviral transkripcijo cI, cI pa bo onemogočil izražanje mazF. Kadar pa je formaldehid odsoten, transkripcija cI ne bo potekala in posledično se mazF lahko izraža.
Zaradi omejenega časa za eksperimentalno delo, so utegnili preizkusiti le delovanje posameznih sestavnih delov tega stikala, niso pa uspeli izvesti eksperimenta s celotno biokocko.

=Viri=

1. S. Singh, V. Kumar, S. Datta, A. B. Wani, D. S. Dhanjal, R. Romero, J. Singh: Glyphosate Uptake, Translocation, Resistance Emergence in Crops, Analytical Monitoring, Toxicity and Degradation: A Review. Environmental Chemistry Letters. Springer May 1, 2020, pp. 663–702.
2. World Health Organization: Glyphosate and AMPA in Drinking-water http://www.who.int/water_sanitation_health/ (pridobljeno 18. 4. 2021).
3. L. Pan, Q. Yu, H. Han, L. Mao, A. Nyporko, L. J. Fan, L. Bai, S. Powles: Aldo-keto reductase metabolizes glyphosate and confers glyphosate resistance in Echinochloa colona. Plant Physiol. 2019, 181(4), str. 1519–1534.
4. G. Rumsby, D. P. Cregeen: Identification and expression of a cDNA for human hydroxypyruvate/glyoxylate reductase. Biochim. Biophys. Acta - Gene Struct. Expr. 1999, 1446(3), str. 383–388.
5. R. Tao, Y. Zhao, H. Chu, A. Wang, J. Zhu, X. Chen, Y. Zou, M. Shi, R. Liu, … Y. Yang: Genetically encoded fluorescent sensors reveal dynamic regulation of NADPH metabolism. Nat. Methods 2017, 14(7), str. 720–728.
6. B. Hove-Jensen, D. L. Zechel, B. Jochimsen: Utilization of Glyphosate as Phosphate Source: Biochemistry and Genetics of Bacterial Carbon-Phosphorus Lyase. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2014, 78(1), str. 176–197.
7. Y. V. Kryuchkova, G. L. Burygin, N. E. Gogoleva, Y. V. Gogolev, M. P. Chernyshova, O. E. Makarov, E. E. Fedorov, O. V. Turkovskaya: Isolation and characterization of a glyphosate-degrading rhizosphere strain, Enterobacter cloacae K7. Microbiol. Res. 2014, 169(1), str. 99–105.
8. J. C. Errey, J. S. Blanchard: Functional annotation and kinetic characterization of PhnO from Salmonella enterica. Biochemistry 2006, 45(9), str. 3033–3039.
9. C. M. Liu, P. A. McLean, C. C. Sookdeo, F. C. Cannon: Degradation of the herbicide glyphosate by members of the family Rhizobiaceae. Appl. Environ. Microbiol. 1991, 57(6), str. 1799–1804.
10. M. J. Hansen, L. ‐H Chen, M. L. S. Fejzo, J. G. Beiasco: The ompA 5′ untranslated region impedes a major pathway for mRNA degradation in Escherichia coli. Mol. Microbiol. 1994, 12(5), str. 707–716.
11. G. M. Cech, A. Szalewska-Palasz, K. Kubiak, A. Malabirade, W. Grange, V. Arluison, G. Wegrzyn: The Escherichia Coli Hfq Protein: An Unattended DNA-Transactions Regulator. Frontiers in Molecular Biosciences. Frontiers Media S.A. July 28, 2016, p. 36.
12. Y. Zhang, J. Zhang, K. P. Hoeflich, M. Ikura, G. Qing, M. Inouye: MazF cleaves cellular mRNAs specifically at ACA to block protein synthesis in Escherichia coli. Mol. Cell 2003, 12(4), str. 913–923.
13. R. Zhu, G. Zhang, M. Jing, Y. Han, J. Li, J. Zhao, Y. Li, P. R. Chen: Genetically encoded formaldehyde sensors inspired by a protein intra-helical crosslinking reaction. Nat. Commun. 2021, 12(1), str. 1–13.

Antea-Glyphosate: Detekcija in razgradnja glifosata

2021-04-19T17:34:54Z

JernejI:

Antea-Glyphosate je projekt v okviru tekmovanja leta iGEM 2020, ki so ga pripravili študentje z univerze Xiamen na Kitajskem.

Povezava do projekta: [https://2020.igem.org/Team:XMU-China https://2020.igem.org/Team:XMU-China]

Avtor povzetka: Jernej Imperl

=Uvod=

Glifosat je eden od najširše uporabljanih herbicidov in mnoge raziskave nakazujejo na možne škodljive učinke za netarčne rastline, mikroorganizme in živali [1]. Kljub temu da človek v vsakdanjem življenju ni izpostavljen nevarnim količinam glifosata [1, 2], je njegova prisotnost v prsti in vodi zaskrbljujoča.

Ker glifosat v strukturi ne vsebuje nobenih kromofornih ali fluorofornih skupin, je njegova detekcija zapletena in zamudna. Prav tako bi bilo za učinkovito odstranjevanje glifosata iz okolja potrebno razviti hitro metodo, ki bi delovala pod različnimi okolijskimi pogoji [1].

Skupina iGEM iz univerze Xiamen na Kitajskem si je za cilj zadala rešiti ta dva problema in vzpostaviti sinteznobiološko rešitev za detekcijo in razgradnjo glifosata v prsti. Projekt so poimenovali Antea-Glyphosate, saj jim je idejo za projekt dal razmislek o intenzivni uporabi herbicidov pri pridelavi čaja. Pripravili so sistem za detekcijo glifosata in sistem za razgradnjo glifosata v prsti v vzorcu ter vsakega opremili s svojim stikalom smrti.

Poleg gensko spremenjenih bakterij so pripravili tudi merilni aparat, ki temelji na uporabi njihovega sistema za detekcijo glifosata in rezultate posreduje mobilni aplikaciji. V nadaljevanju je predstavljena predvsem sinteznobiološka plat njihovega projekta. Zaradi pandemije COVID-19 in omejenega časa za eksperimente so predstavljeni eksperimenti pretežno preliminarne narave (»proof of concept«).

=Detekcija=

==Osnovni princip==
Sistem za detekcijo glifosata z rekombinantno ''Escherichia coli'' temelji na njegovi delni razgradnji in posrednem merjenju koncentracije NADPH, ki se ob reakciji porablja. Encim glifosat oksidoreduktaza (GOX) katalizira cepitev vezi C-N, kar vodi do nastanka glioksilata in aminometilfosfonske kisline (AMPA) [3]. Glioksilat reduktaza (GRHPR) nato katalizira redukcijo glioksilata v glikolno kislino, ob čemer se NADPH oksidira v NADP+ [4]. Protein iNap na koncu deluje kot senzor za NADPH, saj se ob vezavi tega kofaktorja konformacijsko spremeni in odda fluorescenčni signal [5]. Kadar je v raztopini torej prisoten glifosat, se bo ob njegovi encimski razgradnji NADPH pretvarjal v NADP+, kar pa bi lahko zaznali z merjenjem upada fluorescence iNap in tako določili koncentracijo glifosata.

Da bi se izognili alternativnim metabolnim potem in lažnim rezultatom zaradi citosolnega NADPH, so encime želeli pritrditi na zunanjo površino bakterijske celice, tako da bi jih fuzirali z membranskimi proteini. Kot fuzijske partnerje so preizkusili proteine INPNC, BrkA in AIDA.

==Eksperiment==
V eksperimentu so želeli preizkusiti delovanje proteinov, ko so bili ti pritrjeni na površino celic. V predhodnih eksperimentih so potrdili uspešno izražanje izbranih proteinov na površini celice. Pripravili so biokocke BBa_K2922060, BBa_K3332057, BBa_K3332059 (za GRHPR), BBa_K3332052, BBa_K3332054, BBa_K3332055 (za GOX), BBa_K3332047, BBa_K3332049, BBa_K3332050 (za iNap), kjer je bil vsak izmed treh proteinov fuziran na tri različne membranske proteine: INPNC, BrkA ali AIDA. Biokocke so vsebovale promotor J23100, RBS BBa_B0034 in terminator BBa_B0015. Proteine so predstavili na površini ''E. coli'' DH5α in jih preizkusili v seriji eksperimentov.

*Suspenziji celic z izraženim GRHPR so dodali glioksilat in NADPH. Koncentracijo NADPH so spremljali z merjenjem OD340. Opazili so, da je koncentracija NADPH skozi čas padala, na podlagi česar so sklepali, da encim uspešno katalizira reakcijo. Primerjali so učinkovitost encima z različnimi fuzijskimi partnerji in sklenili, da je bila izmed vseh najučinkovitejša kombinacija INPNC-GRHPR.

*V naslednjem eksperimentu so suspenziji celic z izraženim GOX dodali glifosat, NADPH in topno obliko encima GRHPR. Na podlagi upada OD340 so določili, da je GOX uspešno kataliziral reakcijo in vsi fuzijski proteini so bili podobno učinkoviti.

*Zaradi omejenega časa za eksperimente so uspeli preizkusiti le kombinaciji INPNC-iNap in iNap-AIDA. Merili so časovno odvisnost fluorescence (ekscitacija pri 420 nm, emisija pri 528 nm) pri različnih koncentracijah NADPH pokazali odvisnost fluorescence od koncentracije pri obeh fuzijskih proteinih.

*Pripravili so suspenzijo, kjer so hkrati dodali celice z vsakim od treh proteinov (pritrjenih preko INPNC). Suspenziji so dodali glifosat in NADPH ter spremljali fluorescenco skozi čas. V primerjavi s kontrolo brez izraženih proteinov je v suspenziji prišlo do znatnega upada fluorescence, s čimer so potrdili delovanje njihovega sistema.

=Razgradnja=

==Osnovni princip==
Poleg sistema za detekcijo glifosata v vzorcu so želeli pripraviti tudi gensko spremenjeno bakterijo ''E. coli'', ki bi lahko glifosat in njegov derivat AMPA v okolju razgradila v neškodljive produkte. Za razliko od pristopa za detekcijo glifosata, bi tokrat njegova razgradnja potekala po alternativni poti, ki temelji na cepitvi vezi C-P. Za tak mehanizem razgradnje so odgovorni encimi, ki so zapisani na operonu ''phn'', ki ga najdemo pri številnih bakterijah, tudi ''E. coli''. Proteini PhnC, D in E predstavljajo sistem za aktivni transport fosfonskih kislin v celico, medtem ko kompleks PhnGHIJK, katerega glavna katalitična komponenta je PhnJ, katalizira cepitev vezi C-P s hkratno hidrolizo ATP. Po odstranitvi fosfitne skupine z glifosata, se sprosti N-metilglicin, ki pa se lahko v celici naprej oksidira do formaldehida in glicina.

Encim PhnO katalizira prenos acetilne skupine iz acetil koencima A na AMPA. Acetiliran AMPA lahko deluje kot substrat za PhnGHIJK, ki ga razgradi do N-metilacetamida. PhnO in PhnGHIJK lahko torej razgrajujejo tako glifosat kot tudi AMPA [6].

==Eksperimenti==
Da bi izboljšali razgradnjo glifosata in AMPA v ''E. coli'' so želeli nekatere gene ''phn'' nadomestiti s homologi iz drugih organizmov, kjer ta razgradnja poteka učinkoviteje. Vstaviti so želeli gene ''phnJ'' iz ''Enterobacter cloacae'' K7 [7], ''phnO'' iz ''Salmonella enterica'' [8] in ''phnE1/E2'' iz ''Sinorhizobium meliloti'' 1021 [9]. Hkrati so želeli inhibirati izražanje endognih zapisov za PhnF, ki deluje kot represor za nekatere gene ''phn'' [6], in PhnJ, ki bi lahko z rekombninantnim PhnJ tekmoval za podenote kompleksa PhnGHJIK. Kot metodo inhibicije izražanja so izbrali siRNA.

Pripravili so biokocko BBa_K3332099, ki je vsebovala vse potrebne zapise. Izražanje genov za proteine so nadzorovali promotorji J23100 in RBS BBa_B0034, tako da sta imela ''phnJ'' in ''phnO'' vsak svoj promotor in RBS, ''phnE1'' in ''phnE2'' pa sta bila povezana policistronsko. Uporabili so terminator BBa_B0015. Za siRNA so uporabili promotor BBa_J23101 in terminator BBa_J61048, zaporedjem pa so za boljšo stabilnost in učinkovitost dodali še zaporedje OmpA 5' UTR [10] in vezavno mesto za Hfq [11].

S konstruktom, ki je vseboval pripravljeno biokocko, so transformirali ''E. coli'' BL21(DE3). Bakterije so gojili v gojišču z glifosatom in po 5 h določili koncentracijo preostalega glifosata v gojišču tako, da so uporabili svoj sistem za detekcijo. Primerjali so konstrukte z različnimi kombinacijami zapisov, vendar je bila najuspešnejša biokocka opisana zgoraj, ki je vsebovala vse zapise hkrati. Medtem ko so bakterije v negativni kontroli po 5 h privzele 8,6 % glifosata iz gojišča, so ''E. coli'' z biokocko privzele 43,1 %.

=Stikala smrti=

==Stikalo za sistem detekcije==
Stikalo smrti pri sistemu detekcije glifosata bi zagotovilo, da bi gensko spremenjene E. coli odmrle, če bi se sprostile v okolje. Gojišče, v katerem bi potekala detekcija glifosata v vzorcu, bi vsebovalo arabinozo, ki bi inhibirala sintezo citotoksične nukleaze MazF [12]. V primeru, da bi bakterije zapustile to goijšče, bi se mazF lahko izražal in privedel do celične smrti.
Pripravili so preprosto napravo BBa_K3332078, ki deluje kot inverter. Promotor pBAD nadzoruje izražanje zapisa za cI, promotor pR pa nadzoruje izražanje mazF. Arabinoza povzroči preklop araC iz represorske v aktivatorsko obliko, kar spodbudi izražanje cI, cI pa inhibira transkripcijo mazF. V odsotnosti arabinoze bo araC inhibiral izražanje cI, torej bo transkripcija mazF lahko potekala.
Pripravili so eksperiment, kjer so celice z inverterjem gojili v prisotnosti ali odsotnosti arabinoze. Rast bakterij so določili s štetjem CFU po različnih časih inkubacije. Ob prisotnosti arabinoze niso opazili znatnih sprememb v številu kolonij, medtem ko je pri odsotnosti arabinoze število kolonij izrazito upadlo v roku 8 h.

==Stikalo za sistem degradacije==
Sistem za degradacijo glifosata bi predvidoma deloval tako, da bi suspenzijo bakterij vnesli neposredno v prst, v kateri želimo odstraniti glifosat. Da bi preprečili nenadzorovano širjenje gensko spremenjenih bakterij, bi stikalo za smrt poskrbelo, da bakterije uspešno razgradijo glifosat, nato pa po opravljeni nalogi odmrejo. Zamislili so si napravo, ki bi ob prisotnosti glifosata zavirala izražanje mazF, v njegovi odsotnosti pa se bi mazF izražal in vodil v smrt.
Biokocka BBa_K3332078 deluje kot inverter. Namesto neposredne detekcije glifosata, so kot merilo njegove prisotnosti uporabili formaldehid, ki je eden od produktov ob razgradnji glifosata. HxlR je transkripcijski faktor, ki ob vezavi formaldehida deluje kot aktivator promotorja pHCHO [13]. pHCHO nadzoruje izražanje cI, promotor pR pa izražanje mazF. Ob prisotnosti formaldehida, bo HxlR aktiviral transkripcijo cI, cI pa bo onemogočil izražanje mazF. Kadar pa je formaldehid odsoten, transkripcija cI ne bo potekala in posledično se mazF lahko izraža.
Zaradi omejenega časa za eksperimentalno delo, so utegnili preizkusiti le delovanje posameznih sestavnih delov tega stikala, niso pa uspeli izvesti eksperimenta s celotno biokocko.

=Viri=

1. S. Singh, V. Kumar, S. Datta, A. B. Wani, D. S. Dhanjal, R. Romero, J. Singh: Glyphosate Uptake, Translocation, Resistance Emergence in Crops, Analytical Monitoring, Toxicity and Degradation: A Review. Environmental Chemistry Letters. Springer May 1, 2020, pp. 663–702.
2. World Health Organization: Glyphosate and AMPA in Drinking-water http://www.who.int/water_sanitation_health/ (pridobljeno 18. 4. 2021).
3. L. Pan, Q. Yu, H. Han, L. Mao, A. Nyporko, L. J. Fan, L. Bai, S. Powles: Aldo-keto reductase metabolizes glyphosate and confers glyphosate resistance in Echinochloa colona. Plant Physiol. 2019, 181(4), str. 1519–1534.
4. G. Rumsby, D. P. Cregeen: Identification and expression of a cDNA for human hydroxypyruvate/glyoxylate reductase. Biochim. Biophys. Acta - Gene Struct. Expr. 1999, 1446(3), str. 383–388.
5. R. Tao, Y. Zhao, H. Chu, A. Wang, J. Zhu, X. Chen, Y. Zou, M. Shi, R. Liu, … Y. Yang: Genetically encoded fluorescent sensors reveal dynamic regulation of NADPH metabolism. Nat. Methods 2017, 14(7), str. 720–728.
6. B. Hove-Jensen, D. L. Zechel, B. Jochimsen: Utilization of Glyphosate as Phosphate Source: Biochemistry and Genetics of Bacterial Carbon-Phosphorus Lyase. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2014, 78(1), str. 176–197.
7. Y. V. Kryuchkova, G. L. Burygin, N. E. Gogoleva, Y. V. Gogolev, M. P. Chernyshova, O. E. Makarov, E. E. Fedorov, O. V. Turkovskaya: Isolation and characterization of a glyphosate-degrading rhizosphere strain, Enterobacter cloacae K7. Microbiol. Res. 2014, 169(1), str. 99–105.
8. J. C. Errey, J. S. Blanchard: Functional annotation and kinetic characterization of PhnO from Salmonella enterica. Biochemistry 2006, 45(9), str. 3033–3039.
9. C. M. Liu, P. A. McLean, C. C. Sookdeo, F. C. Cannon: Degradation of the herbicide glyphosate by members of the family Rhizobiaceae. Appl. Environ. Microbiol. 1991, 57(6), str. 1799–1804.
10. M. J. Hansen, L. ‐H Chen, M. L. S. Fejzo, J. G. Beiasco: The ompA 5′ untranslated region impedes a major pathway for mRNA degradation in Escherichia coli. Mol. Microbiol. 1994, 12(5), str. 707–716.
11. G. M. Cech, A. Szalewska-Palasz, K. Kubiak, A. Malabirade, W. Grange, V. Arluison, G. Wegrzyn: The Escherichia Coli Hfq Protein: An Unattended DNA-Transactions Regulator. Frontiers in Molecular Biosciences. Frontiers Media S.A. July 28, 2016, p. 36.
12. Y. Zhang, J. Zhang, K. P. Hoeflich, M. Ikura, G. Qing, M. Inouye: MazF cleaves cellular mRNAs specifically at ACA to block protein synthesis in Escherichia coli. Mol. Cell 2003, 12(4), str. 913–923.
13. R. Zhu, G. Zhang, M. Jing, Y. Han, J. Li, J. Zhao, Y. Li, P. R. Chen: Genetically encoded formaldehyde sensors inspired by a protein intra-helical crosslinking reaction. Nat. Commun. 2021, 12(1), str. 1–13.

Antea-Glyphosate: Detekcija in razgradnja glifosata

2021-04-19T17:34:23Z

JernejI: /* Eksperimenti */

Antea-Glyphosate je projekt v okviru tekmovanja leta iGEM 2020, ki so ga pripravili študentje z univerze Xiamen na Kitajskem.

Povezava do projekta: [https://2020.igem.org/Team:XMU-China https://2020.igem.org/Team:XMU-China]

Avtor povzetka: Jernej Imperl

=Uvod=

Glifosat je eden od najširše uporabljanih herbicidov in mnoge raziskave nakazujejo na možne škodljive učinke za netarčne rastline, mikroorganizme in živali [1]. Kljub temu da človek v vsakdanjem življenju ni izpostavljen nevarnim količinam glifosata [1, 2], je njegova prisotnost v prsti in vodi zaskrbljujoča.

Ker glifosat v strukturi ne vsebuje nobenih kromofornih ali fluorofornih skupin, je njegova detekcija zapletena in zamudna. Prav tako bi bilo za učinkovito odstranjevanje glifosata iz okolja potrebno razviti hitro metodo, ki bi delovala pod različnimi okolijskimi pogoji [1].

Skupina iGEM iz univerze Xiamen na Kitajskem si je za cilj zadala rešiti ta dva problema in vzpostaviti sinteznobiološko rešitev za detekcijo in razgradnjo glifosata v prsti. Projekt so poimenovali Antea-Glyphosate, saj jim je idejo za projekt dal razmislek o intenzivni uporabi herbicidov pri pridelavi čaja. Pripravili so sistem za detekcijo glifosata in sistem za razgradnjo glifosata v prsti v vzorcu ter vsakega opremili s svojim stikalom smrti.

Poleg gensko spremenjenih bakterij so pripravili tudi merilni aparat, ki temelji na uporabi njihovega sistema za detekcijo glifosata in rezultate posreduje mobilni aplikaciji. V nadaljevanju je predstavljena predvsem sinteznobiološka plat njihovega projekta. Zaradi pandemije COVID-19 in omejenega časa za eksperimente so predstavljeni eksperimenti pretežno preliminarne narave (»proof of concept«).

=Detekcija=

==Osnovni princip==
Sistem za detekcijo glifosata z rekombinantno ''Escherichia coli'' temelji na njegovi delni razgradnji in posrednem merjenju koncentracije NADPH, ki se ob reakciji porablja. Encim glifosat oksidoreduktaza (GOX) katalizira cepitev vezi C-N, kar vodi do nastanka glioksilata in aminometilfosfonske kisline (AMPA) [3]. Glioksilat reduktaza (GRHPR) nato katalizira redukcijo glioksilata v glikolno kislino, ob čemer se NADPH oksidira v NADP+ [4]. Protein iNap na koncu deluje kot senzor za NADPH, saj se ob vezavi tega kofaktorja konformacijsko spremeni in odda fluorescenčni signal [5]. Kadar je v raztopini torej prisoten glifosat, se bo ob njegovi encimski razgradnji NADPH pretvarjal v NADP+, kar pa bi lahko zaznali z merjenjem upada fluorescence iNap in tako določili koncentracijo glifosata.

Da bi se izognili alternativnim metabolnim potem in lažnim rezultatom zaradi citosolnega NADPH, so encime želeli pritrditi na zunanjo površino bakterijske celice, tako da bi jih fuzirali z membranskimi proteini. Kot fuzijske partnerje so preizkusili proteine INPNC, BrkA in AIDA.

==Eksperiment==
V eksperimentu so želeli preizkusiti delovanje proteinov, ko so bili ti pritrjeni na površino celic. V predhodnih eksperimentih so potrdili uspešno izražanje izbranih proteinov na površini celice. Pripravili so biokocke BBa_K2922060, BBa_K3332057, BBa_K3332059 (za GRHPR), BBa_K3332052, BBa_K3332054, BBa_K3332055 (za GOX), BBa_K3332047, BBa_K3332049, BBa_K3332050 (za iNap), kjer je bil vsak izmed treh proteinov fuziran na tri različne membranske proteine: INPNC, BrkA ali AIDA. Biokocke so vsebovale promotor J23100, RBS BBa_B0034 in terminator BBa_B0015. Proteine so predstavili na površini ''E. coli'' DH5α in jih preizkusili v seriji eksperimentov.

*Suspenziji celic z izraženim GRHPR so dodali glioksilat in NADPH. Koncentracijo NADPH so spremljali z merjenjem OD340. Opazili so, da je koncentracija NADPH skozi čas padala, na podlagi česar so sklepali, da encim uspešno katalizira reakcijo. Primerjali so učinkovitost encima z različnimi fuzijskimi partnerji in sklenili, da je bila izmed vseh najučinkovitejša kombinacija INPNC-GRHPR.

*V naslednjem eksperimentu so suspenziji celic z izraženim GOX dodali glifosat, NADPH in topno obliko encima GRHPR. Na podlagi upada OD340 so določili, da je GOX uspešno kataliziral reakcijo in vsi fuzijski proteini so bili podobno učinkoviti.

*Zaradi omejenega časa za eksperimente so uspeli preizkusiti le kombinaciji INPNC-iNap in iNap-AIDA. Merili so časovno odvisnost fluorescence (ekscitacija pri 420 nm, emisija pri 528 nm) pri različnih koncentracijah NADPH pokazali odvisnost fluorescence od koncentracije pri obeh fuzijskih proteinih.

*Pripravili so suspenzijo, kjer so hkrati dodali celice z vsakim od treh proteinov (pritrjenih preko INPNC). Suspenziji so dodali glifosat in NADPH ter spremljali fluorescenco skozi čas. V primerjavi s kontrolo brez izraženih proteinov je v suspenziji prišlo do znatnega upada fluorescence, s čimer so potrdili delovanje njihovega sistema.

=Razgradnja=

==Osnovni princip==
Poleg sistema za detekcijo glifosata v vzorcu so želeli pripraviti tudi gensko spremenjeno bakterijo ''E. coli'', ki bi lahko glifosat in njegov derivat AMPA v okolju razgradila v neškodljive produkte. Za razliko od pristopa za detekcijo glifosata, bi tokrat njegova razgradnja potekala po alternativni poti, ki temelji na cepitvi vezi C-P. Za tak mehanizem razgradnje so odgovorni encimi, ki so zapisani na operonu ''phn'', ki ga najdemo pri številnih bakterijah, tudi ''E. coli''. Proteini PhnC, D in E predstavljajo sistem za aktivni transport fosfonskih kislin v celico, medtem ko kompleks PhnGHIJK, katerega glavna katalitična komponenta je PhnJ, katalizira cepitev vezi C-P s hkratno hidrolizo ATP. Po odstranitvi fosfitne skupine z glifosata, se sprosti N-metilglicin, ki pa se lahko v celici naprej oksidira do formaldehida in glicina.

Encim PhnO katalizira prenos acetilne skupine iz acetil koencima A na AMPA. Acetiliran AMPA lahko deluje kot substrat za PhnGHIJK, ki ga razgradi do N-metilacetamida. PhnO in PhnGHIJK lahko torej razgrajujejo tako glifosat kot tudi AMPA [6].

==Eksperimenti==
Da bi izboljšali razgradnjo glifosata in AMPA v ''E. coli'' so želeli nekatere gene ''phn'' nadomestiti s homologi iz drugih organizmov, kjer ta razgradnja poteka učinkoviteje. Vstaviti so želeli gene ''phnJ'' iz ''Enterobacter cloacae'' K7 [7], ''phnO'' iz ''Salmonella enterica'' [8] in ''phnE1/E2'' iz ''Sinorhizobium meliloti'' 1021 [9]. Hkrati so želeli inhibirati izražanje endognih zapisov za PhnF, ki deluje kot represor za nekatere gene ''phn'' [6], in PhnJ, ki bi lahko z rekombninantnim PhnJ tekmoval za podenote kompleksa PhnGHJIK. Kot metodo inhibicije izražanja so izbrali siRNA.

Pripravili so biokocko BBa_K3332099, ki je vsebovala vse potrebne zapise. Izražanje genov za proteine so nadzorovali promotorji J23100 in RBS BBa_B0034, tako da sta imela ''phnJ'' in ''phnO'' vsak svoj promotor in RBS, ''phnE1'' in ''phnE2'' pa sta bila povezana policistronsko. Uporabili so terminator BBa_B0015. Za siRNA so uporabili promotor BBa_J23101 in terminator BBa_J61048, zaporedjem pa so za boljšo stabilnost in učinkovitost dodali še zaporedje OmpA 5' UTR [10] in vezavno mesto za Hfq [11].

S konstruktom, ki je vseboval pripravljeno biokocko, so transformirali ''E. coli'' BL21(DE3). Bakterije so gojili v gojišču z glifosatom in po 5 h določili koncentracijo preostalega glifosata v gojišču tako, da so uporabili svoj sistem za detekcijo. Primerjali so konstrukte z različnimi kombinacijami zapisov, vendar je bila najuspešnejša biokocka opisana zgoraj, ki je vsebovala vse zapise hkrati. Medtem ko so bakterije v negativni kontroli po 5 h privzele 8,6 % glifosata iz gojišča, so ''E. coli'' z biokocko privzele 43,1 %.

=Stikala smrti=

=Stikalo za sistem detekcije=
Stikalo smrti pri sistemu detekcije glifosata bi zagotovilo, da bi gensko spremenjene E. coli odmrle, če bi se sprostile v okolje. Gojišče, v katerem bi potekala detekcija glifosata v vzorcu, bi vsebovalo arabinozo, ki bi inhibirala sintezo citotoksične nukleaze MazF [12]. V primeru, da bi bakterije zapustile to goijšče, bi se mazF lahko izražal in privedel do celične smrti.
Pripravili so preprosto napravo BBa_K3332078, ki deluje kot inverter. Promotor pBAD nadzoruje izražanje zapisa za cI, promotor pR pa nadzoruje izražanje mazF. Arabinoza povzroči preklop araC iz represorske v aktivatorsko obliko, kar spodbudi izražanje cI, cI pa inhibira transkripcijo mazF. V odsotnosti arabinoze bo araC inhibiral izražanje cI, torej bo transkripcija mazF lahko potekala.
Pripravili so eksperiment, kjer so celice z inverterjem gojili v prisotnosti ali odsotnosti arabinoze. Rast bakterij so določili s štetjem CFU po različnih časih inkubacije. Ob prisotnosti arabinoze niso opazili znatnih sprememb v številu kolonij, medtem ko je pri odsotnosti arabinoze število kolonij izrazito upadlo v roku 8 h.

=Stikalo za sistem degradacije=
Sistem za degradacijo glifosata bi predvidoma deloval tako, da bi suspenzijo bakterij vnesli neposredno v prst, v kateri želimo odstraniti glifosat. Da bi preprečili nenadzorovano širjenje gensko spremenjenih bakterij, bi stikalo za smrt poskrbelo, da bakterije uspešno razgradijo glifosat, nato pa po opravljeni nalogi odmrejo. Zamislili so si napravo, ki bi ob prisotnosti glifosata zavirala izražanje mazF, v njegovi odsotnosti pa se bi mazF izražal in vodil v smrt.
Biokocka BBa_K3332078 deluje kot inverter. Namesto neposredne detekcije glifosata, so kot merilo njegove prisotnosti uporabili formaldehid, ki je eden od produktov ob razgradnji glifosata. HxlR je transkripcijski faktor, ki ob vezavi formaldehida deluje kot aktivator promotorja pHCHO [13]. pHCHO nadzoruje izražanje cI, promotor pR pa izražanje mazF. Ob prisotnosti formaldehida, bo HxlR aktiviral transkripcijo cI, cI pa bo onemogočil izražanje mazF. Kadar pa je formaldehid odsoten, transkripcija cI ne bo potekala in posledično se mazF lahko izraža.
Zaradi omejenega časa za eksperimentalno delo, so utegnili preizkusiti le delovanje posameznih sestavnih delov tega stikala, niso pa uspeli izvesti eksperimenta s celotno biokocko.

=Viri=

1. S. Singh, V. Kumar, S. Datta, A. B. Wani, D. S. Dhanjal, R. Romero, J. Singh: Glyphosate Uptake, Translocation, Resistance Emergence in Crops, Analytical Monitoring, Toxicity and Degradation: A Review. Environmental Chemistry Letters. Springer May 1, 2020, pp. 663–702.
2. World Health Organization: Glyphosate and AMPA in Drinking-water http://www.who.int/water_sanitation_health/ (pridobljeno 18. 4. 2021).
3. L. Pan, Q. Yu, H. Han, L. Mao, A. Nyporko, L. J. Fan, L. Bai, S. Powles: Aldo-keto reductase metabolizes glyphosate and confers glyphosate resistance in Echinochloa colona. Plant Physiol. 2019, 181(4), str. 1519–1534.
4. G. Rumsby, D. P. Cregeen: Identification and expression of a cDNA for human hydroxypyruvate/glyoxylate reductase. Biochim. Biophys. Acta - Gene Struct. Expr. 1999, 1446(3), str. 383–388.
5. R. Tao, Y. Zhao, H. Chu, A. Wang, J. Zhu, X. Chen, Y. Zou, M. Shi, R. Liu, … Y. Yang: Genetically encoded fluorescent sensors reveal dynamic regulation of NADPH metabolism. Nat. Methods 2017, 14(7), str. 720–728.
6. B. Hove-Jensen, D. L. Zechel, B. Jochimsen: Utilization of Glyphosate as Phosphate Source: Biochemistry and Genetics of Bacterial Carbon-Phosphorus Lyase. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2014, 78(1), str. 176–197.
7. Y. V. Kryuchkova, G. L. Burygin, N. E. Gogoleva, Y. V. Gogolev, M. P. Chernyshova, O. E. Makarov, E. E. Fedorov, O. V. Turkovskaya: Isolation and characterization of a glyphosate-degrading rhizosphere strain, Enterobacter cloacae K7. Microbiol. Res. 2014, 169(1), str. 99–105.
8. J. C. Errey, J. S. Blanchard: Functional annotation and kinetic characterization of PhnO from Salmonella enterica. Biochemistry 2006, 45(9), str. 3033–3039.
9. C. M. Liu, P. A. McLean, C. C. Sookdeo, F. C. Cannon: Degradation of the herbicide glyphosate by members of the family Rhizobiaceae. Appl. Environ. Microbiol. 1991, 57(6), str. 1799–1804.
10. M. J. Hansen, L. ‐H Chen, M. L. S. Fejzo, J. G. Beiasco: The ompA 5′ untranslated region impedes a major pathway for mRNA degradation in Escherichia coli. Mol. Microbiol. 1994, 12(5), str. 707–716.
11. G. M. Cech, A. Szalewska-Palasz, K. Kubiak, A. Malabirade, W. Grange, V. Arluison, G. Wegrzyn: The Escherichia Coli Hfq Protein: An Unattended DNA-Transactions Regulator. Frontiers in Molecular Biosciences. Frontiers Media S.A. July 28, 2016, p. 36.
12. Y. Zhang, J. Zhang, K. P. Hoeflich, M. Ikura, G. Qing, M. Inouye: MazF cleaves cellular mRNAs specifically at ACA to block protein synthesis in Escherichia coli. Mol. Cell 2003, 12(4), str. 913–923.
13. R. Zhu, G. Zhang, M. Jing, Y. Han, J. Li, J. Zhao, Y. Li, P. R. Chen: Genetically encoded formaldehyde sensors inspired by a protein intra-helical crosslinking reaction. Nat. Commun. 2021, 12(1), str. 1–13.

Antea-Glyphosate: Detekcija in razgradnja glifosata

2021-04-19T17:31:38Z

JernejI: /* Eksperiment */

Antea-Glyphosate je projekt v okviru tekmovanja leta iGEM 2020, ki so ga pripravili študentje z univerze Xiamen na Kitajskem.

Povezava do projekta: [https://2020.igem.org/Team:XMU-China https://2020.igem.org/Team:XMU-China]

Avtor povzetka: Jernej Imperl

=Uvod=

Glifosat je eden od najširše uporabljanih herbicidov in mnoge raziskave nakazujejo na možne škodljive učinke za netarčne rastline, mikroorganizme in živali [1]. Kljub temu da človek v vsakdanjem življenju ni izpostavljen nevarnim količinam glifosata [1, 2], je njegova prisotnost v prsti in vodi zaskrbljujoča.

Ker glifosat v strukturi ne vsebuje nobenih kromofornih ali fluorofornih skupin, je njegova detekcija zapletena in zamudna. Prav tako bi bilo za učinkovito odstranjevanje glifosata iz okolja potrebno razviti hitro metodo, ki bi delovala pod različnimi okolijskimi pogoji [1].

Skupina iGEM iz univerze Xiamen na Kitajskem si je za cilj zadala rešiti ta dva problema in vzpostaviti sinteznobiološko rešitev za detekcijo in razgradnjo glifosata v prsti. Projekt so poimenovali Antea-Glyphosate, saj jim je idejo za projekt dal razmislek o intenzivni uporabi herbicidov pri pridelavi čaja. Pripravili so sistem za detekcijo glifosata in sistem za razgradnjo glifosata v prsti v vzorcu ter vsakega opremili s svojim stikalom smrti.

Poleg gensko spremenjenih bakterij so pripravili tudi merilni aparat, ki temelji na uporabi njihovega sistema za detekcijo glifosata in rezultate posreduje mobilni aplikaciji. V nadaljevanju je predstavljena predvsem sinteznobiološka plat njihovega projekta. Zaradi pandemije COVID-19 in omejenega časa za eksperimente so predstavljeni eksperimenti pretežno preliminarne narave (»proof of concept«).

=Detekcija=

==Osnovni princip==
Sistem za detekcijo glifosata z rekombinantno ''Escherichia coli'' temelji na njegovi delni razgradnji in posrednem merjenju koncentracije NADPH, ki se ob reakciji porablja. Encim glifosat oksidoreduktaza (GOX) katalizira cepitev vezi C-N, kar vodi do nastanka glioksilata in aminometilfosfonske kisline (AMPA) [3]. Glioksilat reduktaza (GRHPR) nato katalizira redukcijo glioksilata v glikolno kislino, ob čemer se NADPH oksidira v NADP+ [4]. Protein iNap na koncu deluje kot senzor za NADPH, saj se ob vezavi tega kofaktorja konformacijsko spremeni in odda fluorescenčni signal [5]. Kadar je v raztopini torej prisoten glifosat, se bo ob njegovi encimski razgradnji NADPH pretvarjal v NADP+, kar pa bi lahko zaznali z merjenjem upada fluorescence iNap in tako določili koncentracijo glifosata.

Da bi se izognili alternativnim metabolnim potem in lažnim rezultatom zaradi citosolnega NADPH, so encime želeli pritrditi na zunanjo površino bakterijske celice, tako da bi jih fuzirali z membranskimi proteini. Kot fuzijske partnerje so preizkusili proteine INPNC, BrkA in AIDA.

==Eksperiment==
V eksperimentu so želeli preizkusiti delovanje proteinov, ko so bili ti pritrjeni na površino celic. V predhodnih eksperimentih so potrdili uspešno izražanje izbranih proteinov na površini celice. Pripravili so biokocke BBa_K2922060, BBa_K3332057, BBa_K3332059 (za GRHPR), BBa_K3332052, BBa_K3332054, BBa_K3332055 (za GOX), BBa_K3332047, BBa_K3332049, BBa_K3332050 (za iNap), kjer je bil vsak izmed treh proteinov fuziran na tri različne membranske proteine: INPNC, BrkA ali AIDA. Biokocke so vsebovale promotor J23100, RBS BBa_B0034 in terminator BBa_B0015. Proteine so predstavili na površini ''E. coli'' DH5α in jih preizkusili v seriji eksperimentov.

*Suspenziji celic z izraženim GRHPR so dodali glioksilat in NADPH. Koncentracijo NADPH so spremljali z merjenjem OD340. Opazili so, da je koncentracija NADPH skozi čas padala, na podlagi česar so sklepali, da encim uspešno katalizira reakcijo. Primerjali so učinkovitost encima z različnimi fuzijskimi partnerji in sklenili, da je bila izmed vseh najučinkovitejša kombinacija INPNC-GRHPR.

*V naslednjem eksperimentu so suspenziji celic z izraženim GOX dodali glifosat, NADPH in topno obliko encima GRHPR. Na podlagi upada OD340 so določili, da je GOX uspešno kataliziral reakcijo in vsi fuzijski proteini so bili podobno učinkoviti.

*Zaradi omejenega časa za eksperimente so uspeli preizkusiti le kombinaciji INPNC-iNap in iNap-AIDA. Merili so časovno odvisnost fluorescence (ekscitacija pri 420 nm, emisija pri 528 nm) pri različnih koncentracijah NADPH pokazali odvisnost fluorescence od koncentracije pri obeh fuzijskih proteinih.

*Pripravili so suspenzijo, kjer so hkrati dodali celice z vsakim od treh proteinov (pritrjenih preko INPNC). Suspenziji so dodali glifosat in NADPH ter spremljali fluorescenco skozi čas. V primerjavi s kontrolo brez izraženih proteinov je v suspenziji prišlo do znatnega upada fluorescence, s čimer so potrdili delovanje njihovega sistema.

=Razgradnja=

==Osnovni princip==
Poleg sistema za detekcijo glifosata v vzorcu so želeli pripraviti tudi gensko spremenjeno bakterijo ''E. coli'', ki bi lahko glifosat in njegov derivat AMPA v okolju razgradila v neškodljive produkte. Za razliko od pristopa za detekcijo glifosata, bi tokrat njegova razgradnja potekala po alternativni poti, ki temelji na cepitvi vezi C-P. Za tak mehanizem razgradnje so odgovorni encimi, ki so zapisani na operonu ''phn'', ki ga najdemo pri številnih bakterijah, tudi ''E. coli''. Proteini PhnC, D in E predstavljajo sistem za aktivni transport fosfonskih kislin v celico, medtem ko kompleks PhnGHIJK, katerega glavna katalitična komponenta je PhnJ, katalizira cepitev vezi C-P s hkratno hidrolizo ATP. Po odstranitvi fosfitne skupine z glifosata, se sprosti N-metilglicin, ki pa se lahko v celici naprej oksidira do formaldehida in glicina.

Encim PhnO katalizira prenos acetilne skupine iz acetil koencima A na AMPA. Acetiliran AMPA lahko deluje kot substrat za PhnGHIJK, ki ga razgradi do N-metilacetamida. PhnO in PhnGHIJK lahko torej razgrajujejo tako glifosat kot tudi AMPA [6].

==Eksperimenti==
Da bi izboljšali razgradnjo glifosata in AMPA v ''E. coli'' so želeli nekatere gene phn nadomestiti s homologi iz drugih organizmov, kjer ta razgradnja poteka učinkoviteje. Vstaviti so želeli gene phnJ iz Enterobacter cloacae K7 [7], phnO iz Salmonella enterica [8] in phnE1/E2 iz Sinorhizobium meliloti 1021 [9]. Hkrati so želeli inhibirati izražanje endognih zapisov za PhnF, ki deluje kot represor za nekatere gene phn [6], in PhnJ, ki bi lahko z rekombninantnim PhnJ tekmoval za podenote kompleksa PhnGHJIK. Kot metodo inhibicije izražanja so izbrali siRNA.
Pripravili so biokocko BBa_K3332099, ki je vsebovala vse potrebne zapise. Izražanje genov za proteine so nadzorovali promotorji J23100 in RBS BBa_B0034, tako da sta imela phnJ in phnO vsak svoj promotor in RBS, phnE1 in phnE2 pa sta bila povezana policistronsko. Uporabili so terminator BBa_B0015. Za siRNA so uporabili promotor BBa_J23101 in terminator BBa_J61048, zaporedjem pa so za boljšo stabilnost in učinkovitost dodali še zaporedje OmpA 5' UTR [10] in vezavno mesto za Hfq [11].
S konstruktom, ki je vseboval pripravljeno biokocko, so transformirali ''E. coli'' BL21(DE3). Bakterije so gojili v gojišču z glifosatom in po 5 h določili koncentracijo preostalega glifosata v gojišču tako, da so uporabili svoj sistem za detekcijo. Primerjali so konstrukte z različnimi kombinacijami zapisov, vendar je bila najuspešnejša biokocka opisana zgoraj, ki je vsebovala vse zapise hkrati. Medtem ko so bakterije v negativni kontroli po 5 h privzele 8,6 % glifosata iz gojišča, so E. coli z biokocko privzele 43,1 %.

=Stikala smrti=

=Stikalo za sistem detekcije=
Stikalo smrti pri sistemu detekcije glifosata bi zagotovilo, da bi gensko spremenjene E. coli odmrle, če bi se sprostile v okolje. Gojišče, v katerem bi potekala detekcija glifosata v vzorcu, bi vsebovalo arabinozo, ki bi inhibirala sintezo citotoksične nukleaze MazF [12]. V primeru, da bi bakterije zapustile to goijšče, bi se mazF lahko izražal in privedel do celične smrti.
Pripravili so preprosto napravo BBa_K3332078, ki deluje kot inverter. Promotor pBAD nadzoruje izražanje zapisa za cI, promotor pR pa nadzoruje izražanje mazF. Arabinoza povzroči preklop araC iz represorske v aktivatorsko obliko, kar spodbudi izražanje cI, cI pa inhibira transkripcijo mazF. V odsotnosti arabinoze bo araC inhibiral izražanje cI, torej bo transkripcija mazF lahko potekala.
Pripravili so eksperiment, kjer so celice z inverterjem gojili v prisotnosti ali odsotnosti arabinoze. Rast bakterij so določili s štetjem CFU po različnih časih inkubacije. Ob prisotnosti arabinoze niso opazili znatnih sprememb v številu kolonij, medtem ko je pri odsotnosti arabinoze število kolonij izrazito upadlo v roku 8 h.

=Stikalo za sistem degradacije=
Sistem za degradacijo glifosata bi predvidoma deloval tako, da bi suspenzijo bakterij vnesli neposredno v prst, v kateri želimo odstraniti glifosat. Da bi preprečili nenadzorovano širjenje gensko spremenjenih bakterij, bi stikalo za smrt poskrbelo, da bakterije uspešno razgradijo glifosat, nato pa po opravljeni nalogi odmrejo. Zamislili so si napravo, ki bi ob prisotnosti glifosata zavirala izražanje mazF, v njegovi odsotnosti pa se bi mazF izražal in vodil v smrt.
Biokocka BBa_K3332078 deluje kot inverter. Namesto neposredne detekcije glifosata, so kot merilo njegove prisotnosti uporabili formaldehid, ki je eden od produktov ob razgradnji glifosata. HxlR je transkripcijski faktor, ki ob vezavi formaldehida deluje kot aktivator promotorja pHCHO [13]. pHCHO nadzoruje izražanje cI, promotor pR pa izražanje mazF. Ob prisotnosti formaldehida, bo HxlR aktiviral transkripcijo cI, cI pa bo onemogočil izražanje mazF. Kadar pa je formaldehid odsoten, transkripcija cI ne bo potekala in posledično se mazF lahko izraža.
Zaradi omejenega časa za eksperimentalno delo, so utegnili preizkusiti le delovanje posameznih sestavnih delov tega stikala, niso pa uspeli izvesti eksperimenta s celotno biokocko.

=Viri=

1. S. Singh, V. Kumar, S. Datta, A. B. Wani, D. S. Dhanjal, R. Romero, J. Singh: Glyphosate Uptake, Translocation, Resistance Emergence in Crops, Analytical Monitoring, Toxicity and Degradation: A Review. Environmental Chemistry Letters. Springer May 1, 2020, pp. 663–702.
2. World Health Organization: Glyphosate and AMPA in Drinking-water http://www.who.int/water_sanitation_health/ (pridobljeno 18. 4. 2021).
3. L. Pan, Q. Yu, H. Han, L. Mao, A. Nyporko, L. J. Fan, L. Bai, S. Powles: Aldo-keto reductase metabolizes glyphosate and confers glyphosate resistance in Echinochloa colona. Plant Physiol. 2019, 181(4), str. 1519–1534.
4. G. Rumsby, D. P. Cregeen: Identification and expression of a cDNA for human hydroxypyruvate/glyoxylate reductase. Biochim. Biophys. Acta - Gene Struct. Expr. 1999, 1446(3), str. 383–388.
5. R. Tao, Y. Zhao, H. Chu, A. Wang, J. Zhu, X. Chen, Y. Zou, M. Shi, R. Liu, … Y. Yang: Genetically encoded fluorescent sensors reveal dynamic regulation of NADPH metabolism. Nat. Methods 2017, 14(7), str. 720–728.
6. B. Hove-Jensen, D. L. Zechel, B. Jochimsen: Utilization of Glyphosate as Phosphate Source: Biochemistry and Genetics of Bacterial Carbon-Phosphorus Lyase. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2014, 78(1), str. 176–197.
7. Y. V. Kryuchkova, G. L. Burygin, N. E. Gogoleva, Y. V. Gogolev, M. P. Chernyshova, O. E. Makarov, E. E. Fedorov, O. V. Turkovskaya: Isolation and characterization of a glyphosate-degrading rhizosphere strain, Enterobacter cloacae K7. Microbiol. Res. 2014, 169(1), str. 99–105.
8. J. C. Errey, J. S. Blanchard: Functional annotation and kinetic characterization of PhnO from Salmonella enterica. Biochemistry 2006, 45(9), str. 3033–3039.
9. C. M. Liu, P. A. McLean, C. C. Sookdeo, F. C. Cannon: Degradation of the herbicide glyphosate by members of the family Rhizobiaceae. Appl. Environ. Microbiol. 1991, 57(6), str. 1799–1804.
10. M. J. Hansen, L. ‐H Chen, M. L. S. Fejzo, J. G. Beiasco: The ompA 5′ untranslated region impedes a major pathway for mRNA degradation in Escherichia coli. Mol. Microbiol. 1994, 12(5), str. 707–716.
11. G. M. Cech, A. Szalewska-Palasz, K. Kubiak, A. Malabirade, W. Grange, V. Arluison, G. Wegrzyn: The Escherichia Coli Hfq Protein: An Unattended DNA-Transactions Regulator. Frontiers in Molecular Biosciences. Frontiers Media S.A. July 28, 2016, p. 36.
12. Y. Zhang, J. Zhang, K. P. Hoeflich, M. Ikura, G. Qing, M. Inouye: MazF cleaves cellular mRNAs specifically at ACA to block protein synthesis in Escherichia coli. Mol. Cell 2003, 12(4), str. 913–923.
13. R. Zhu, G. Zhang, M. Jing, Y. Han, J. Li, J. Zhao, Y. Li, P. R. Chen: Genetically encoded formaldehyde sensors inspired by a protein intra-helical crosslinking reaction. Nat. Commun. 2021, 12(1), str. 1–13.

Antea-Glyphosate: Detekcija in razgradnja glifosata

2021-04-19T17:23:44Z

JernejI: /* Eksperiment */

Antea-Glyphosate je projekt v okviru tekmovanja leta iGEM 2020, ki so ga pripravili študentje z univerze Xiamen na Kitajskem.

Povezava do projekta: [https://2020.igem.org/Team:XMU-China https://2020.igem.org/Team:XMU-China]

Avtor povzetka: Jernej Imperl

=Uvod=

Glifosat je eden od najširše uporabljanih herbicidov in mnoge raziskave nakazujejo na možne škodljive učinke za netarčne rastline, mikroorganizme in živali [1]. Kljub temu da človek v vsakdanjem življenju ni izpostavljen nevarnim količinam glifosata [1, 2], je njegova prisotnost v prsti in vodi zaskrbljujoča.

Ker glifosat v strukturi ne vsebuje nobenih kromofornih ali fluorofornih skupin, je njegova detekcija zapletena in zamudna. Prav tako bi bilo za učinkovito odstranjevanje glifosata iz okolja potrebno razviti hitro metodo, ki bi delovala pod različnimi okolijskimi pogoji [1].

Skupina iGEM iz univerze Xiamen na Kitajskem si je za cilj zadala rešiti ta dva problema in vzpostaviti sinteznobiološko rešitev za detekcijo in razgradnjo glifosata v prsti. Projekt so poimenovali Antea-Glyphosate, saj jim je idejo za projekt dal razmislek o intenzivni uporabi herbicidov pri pridelavi čaja. Pripravili so sistem za detekcijo glifosata in sistem za razgradnjo glifosata v prsti v vzorcu ter vsakega opremili s svojim stikalom smrti.

Poleg gensko spremenjenih bakterij so pripravili tudi merilni aparat, ki temelji na uporabi njihovega sistema za detekcijo glifosata in rezultate posreduje mobilni aplikaciji. V nadaljevanju je predstavljena predvsem sinteznobiološka plat njihovega projekta. Zaradi pandemije COVID-19 in omejenega časa za eksperimente so predstavljeni eksperimenti pretežno preliminarne narave (»proof of concept«).

=Detekcija=

==Osnovni princip==
Sistem za detekcijo glifosata z rekombinantno ''Escherichia coli'' temelji na njegovi delni razgradnji in posrednem merjenju koncentracije NADPH, ki se ob reakciji porablja. Encim glifosat oksidoreduktaza (GOX) katalizira cepitev vezi C-N, kar vodi do nastanka glioksilata in aminometilfosfonske kisline (AMPA) [3]. Glioksilat reduktaza (GRHPR) nato katalizira redukcijo glioksilata v glikolno kislino, ob čemer se NADPH oksidira v NADP+ [4]. Protein iNap na koncu deluje kot senzor za NADPH, saj se ob vezavi tega kofaktorja konformacijsko spremeni in odda fluorescenčni signal [5]. Kadar je v raztopini torej prisoten glifosat, se bo ob njegovi encimski razgradnji NADPH pretvarjal v NADP+, kar pa bi lahko zaznali z merjenjem upada fluorescence iNap in tako določili koncentracijo glifosata.

Da bi se izognili alternativnim metabolnim potem in lažnim rezultatom zaradi citosolnega NADPH, so encime želeli pritrditi na zunanjo površino bakterijske celice, tako da bi jih fuzirali z membranskimi proteini. Kot fuzijske partnerje so preizkusili proteine INPNC, BrkA in AIDA.

==Eksperiment==
V eksperimentu so želeli preizkusiti delovanje proteinov, ko so bili ti pritrjeni na površino celic. V predhodnih eksperimentih so potrdili uspešno izražanje izbranih proteinov na površini celice. Pripravili so biokocke BBa_K2922060, BBa_K3332057, BBa_K3332059 (za GRHPR), BBa_K3332052, BBa_K3332054, BBa_K3332055 (za GOX), BBa_K3332047, BBa_K3332049, BBa_K3332050 (za iNap), kjer je bil vsak izmed treh proteinov fuziran na tri različne membranske proteine: INPNC, BrkA ali AIDA. Biokocke so vsebovale promotor J23100, RBS BBa_B0034 in terminator BBa_B0015. Proteine so predstavili na površini ''E. coli'' DH5α in jih preizkusili v seriji eksperimentov.

*Suspenziji celic z izraženim GRHPR so dodali glioksilat in NADPH ter merili upadanje A340 zaradi porabe NADPH. Primerjali so učinkovitost encima z različnimi fuzijskimi partnerji in sklenili, da je bila izmed vseh najučinkovitejša kombinacija INPNC-GRHPR.

*V naslednjem eksperimentu so suspenziji celic z izraženim GOX dodali glifosat, NADPH in topno obliko encima GRHPR. Na podlagi upada A340 so določili, da je GOX uspešno kataliziral reakcijo in vsi fuzijski proteini so bili podobno učinkoviti.

*Zaradi omejenega časa za eksperimente so uspeli preizkusiti le kombinaciji INPNC-iNap in iNap-AIDA. Merili so časovno odvisnost fluorescence pri različnih koncentracijah NADPH in tudi tokrat pokazali uspešno delovanje obeh fuzijskih proteinov.

*Pripravili so suspenzijo, kjer so hkrati dodali celice z vsakim od treh proteinov (pritrjenih preko INPNC). Suspenziji so dodali glifosat in NADPH ter spremljali fluorescenco skozi čas. V primerjavi s kontrolo brez izraženih proteinov je v suspenziji prišlo do znatnega upada fluorescence, s čimer so potrdili delovanje njihovega sistema.

=Razgradnja=

==Osnovni princip==
Poleg sistema za detekcijo glifosata v vzorcu so želeli pripraviti tudi gensko spremenjeno bakterijo ''E. coli'', ki bi lahko glifosat in njegov derivat AMPA v okolju razgradila v neškodljive produkte. Za razliko od pristopa za detekcijo glifosata, bi tokrat njegova razgradnja potekala po alternativni poti, ki temelji na cepitvi vezi C-P. Za tak mehanizem razgradnje so odgovorni encimi, ki so zapisani na operonu ''phn'', ki ga najdemo pri številnih bakterijah, tudi ''E. coli''. Proteini PhnC, D in E predstavljajo sistem za aktivni transport fosfonskih kislin v celico, medtem ko kompleks PhnGHIJK, katerega glavna katalitična komponenta je PhnJ, katalizira cepitev vezi C-P s hkratno hidrolizo ATP. Po odstranitvi fosfitne skupine z glifosata, se sprosti N-metilglicin, ki pa se lahko v celici naprej oksidira do formaldehida in glicina.

Encim PhnO katalizira prenos acetilne skupine iz acetil koencima A na AMPA. Acetiliran AMPA lahko deluje kot substrat za PhnGHIJK, ki ga razgradi do N-metilacetamida. PhnO in PhnGHIJK lahko torej razgrajujejo tako glifosat kot tudi AMPA [6].

==Eksperimenti==
Da bi izboljšali razgradnjo glifosata in AMPA v ''E. coli'' so želeli nekatere gene phn nadomestiti s homologi iz drugih organizmov, kjer ta razgradnja poteka učinkoviteje. Vstaviti so želeli gene phnJ iz Enterobacter cloacae K7 [7], phnO iz Salmonella enterica [8] in phnE1/E2 iz Sinorhizobium meliloti 1021 [9]. Hkrati so želeli inhibirati izražanje endognih zapisov za PhnF, ki deluje kot represor za nekatere gene phn [6], in PhnJ, ki bi lahko z rekombninantnim PhnJ tekmoval za podenote kompleksa PhnGHJIK. Kot metodo inhibicije izražanja so izbrali siRNA.
Pripravili so biokocko BBa_K3332099, ki je vsebovala vse potrebne zapise. Izražanje genov za proteine so nadzorovali promotorji J23100 in RBS BBa_B0034, tako da sta imela phnJ in phnO vsak svoj promotor in RBS, phnE1 in phnE2 pa sta bila povezana policistronsko. Uporabili so terminator BBa_B0015. Za siRNA so uporabili promotor BBa_J23101 in terminator BBa_J61048, zaporedjem pa so za boljšo stabilnost in učinkovitost dodali še zaporedje OmpA 5' UTR [10] in vezavno mesto za Hfq [11].
S konstruktom, ki je vseboval pripravljeno biokocko, so transformirali ''E. coli'' BL21(DE3). Bakterije so gojili v gojišču z glifosatom in po 5 h določili koncentracijo preostalega glifosata v gojišču tako, da so uporabili svoj sistem za detekcijo. Primerjali so konstrukte z različnimi kombinacijami zapisov, vendar je bila najuspešnejša biokocka opisana zgoraj, ki je vsebovala vse zapise hkrati. Medtem ko so bakterije v negativni kontroli po 5 h privzele 8,6 % glifosata iz gojišča, so E. coli z biokocko privzele 43,1 %.

=Stikala smrti=

=Stikalo za sistem detekcije=
Stikalo smrti pri sistemu detekcije glifosata bi zagotovilo, da bi gensko spremenjene E. coli odmrle, če bi se sprostile v okolje. Gojišče, v katerem bi potekala detekcija glifosata v vzorcu, bi vsebovalo arabinozo, ki bi inhibirala sintezo citotoksične nukleaze MazF [12]. V primeru, da bi bakterije zapustile to goijšče, bi se mazF lahko izražal in privedel do celične smrti.
Pripravili so preprosto napravo BBa_K3332078, ki deluje kot inverter. Promotor pBAD nadzoruje izražanje zapisa za cI, promotor pR pa nadzoruje izražanje mazF. Arabinoza povzroči preklop araC iz represorske v aktivatorsko obliko, kar spodbudi izražanje cI, cI pa inhibira transkripcijo mazF. V odsotnosti arabinoze bo araC inhibiral izražanje cI, torej bo transkripcija mazF lahko potekala.
Pripravili so eksperiment, kjer so celice z inverterjem gojili v prisotnosti ali odsotnosti arabinoze. Rast bakterij so določili s štetjem CFU po različnih časih inkubacije. Ob prisotnosti arabinoze niso opazili znatnih sprememb v številu kolonij, medtem ko je pri odsotnosti arabinoze število kolonij izrazito upadlo v roku 8 h.

=Stikalo za sistem degradacije=
Sistem za degradacijo glifosata bi predvidoma deloval tako, da bi suspenzijo bakterij vnesli neposredno v prst, v kateri želimo odstraniti glifosat. Da bi preprečili nenadzorovano širjenje gensko spremenjenih bakterij, bi stikalo za smrt poskrbelo, da bakterije uspešno razgradijo glifosat, nato pa po opravljeni nalogi odmrejo. Zamislili so si napravo, ki bi ob prisotnosti glifosata zavirala izražanje mazF, v njegovi odsotnosti pa se bi mazF izražal in vodil v smrt.
Biokocka BBa_K3332078 deluje kot inverter. Namesto neposredne detekcije glifosata, so kot merilo njegove prisotnosti uporabili formaldehid, ki je eden od produktov ob razgradnji glifosata. HxlR je transkripcijski faktor, ki ob vezavi formaldehida deluje kot aktivator promotorja pHCHO [13]. pHCHO nadzoruje izražanje cI, promotor pR pa izražanje mazF. Ob prisotnosti formaldehida, bo HxlR aktiviral transkripcijo cI, cI pa bo onemogočil izražanje mazF. Kadar pa je formaldehid odsoten, transkripcija cI ne bo potekala in posledično se mazF lahko izraža.
Zaradi omejenega časa za eksperimentalno delo, so utegnili preizkusiti le delovanje posameznih sestavnih delov tega stikala, niso pa uspeli izvesti eksperimenta s celotno biokocko.

=Viri=

1. S. Singh, V. Kumar, S. Datta, A. B. Wani, D. S. Dhanjal, R. Romero, J. Singh: Glyphosate Uptake, Translocation, Resistance Emergence in Crops, Analytical Monitoring, Toxicity and Degradation: A Review. Environmental Chemistry Letters. Springer May 1, 2020, pp. 663–702.
2. World Health Organization: Glyphosate and AMPA in Drinking-water http://www.who.int/water_sanitation_health/ (pridobljeno 18. 4. 2021).
3. L. Pan, Q. Yu, H. Han, L. Mao, A. Nyporko, L. J. Fan, L. Bai, S. Powles: Aldo-keto reductase metabolizes glyphosate and confers glyphosate resistance in Echinochloa colona. Plant Physiol. 2019, 181(4), str. 1519–1534.
4. G. Rumsby, D. P. Cregeen: Identification and expression of a cDNA for human hydroxypyruvate/glyoxylate reductase. Biochim. Biophys. Acta - Gene Struct. Expr. 1999, 1446(3), str. 383–388.
5. R. Tao, Y. Zhao, H. Chu, A. Wang, J. Zhu, X. Chen, Y. Zou, M. Shi, R. Liu, … Y. Yang: Genetically encoded fluorescent sensors reveal dynamic regulation of NADPH metabolism. Nat. Methods 2017, 14(7), str. 720–728.
6. B. Hove-Jensen, D. L. Zechel, B. Jochimsen: Utilization of Glyphosate as Phosphate Source: Biochemistry and Genetics of Bacterial Carbon-Phosphorus Lyase. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2014, 78(1), str. 176–197.
7. Y. V. Kryuchkova, G. L. Burygin, N. E. Gogoleva, Y. V. Gogolev, M. P. Chernyshova, O. E. Makarov, E. E. Fedorov, O. V. Turkovskaya: Isolation and characterization of a glyphosate-degrading rhizosphere strain, Enterobacter cloacae K7. Microbiol. Res. 2014, 169(1), str. 99–105.
8. J. C. Errey, J. S. Blanchard: Functional annotation and kinetic characterization of PhnO from Salmonella enterica. Biochemistry 2006, 45(9), str. 3033–3039.
9. C. M. Liu, P. A. McLean, C. C. Sookdeo, F. C. Cannon: Degradation of the herbicide glyphosate by members of the family Rhizobiaceae. Appl. Environ. Microbiol. 1991, 57(6), str. 1799–1804.
10. M. J. Hansen, L. ‐H Chen, M. L. S. Fejzo, J. G. Beiasco: The ompA 5′ untranslated region impedes a major pathway for mRNA degradation in Escherichia coli. Mol. Microbiol. 1994, 12(5), str. 707–716.
11. G. M. Cech, A. Szalewska-Palasz, K. Kubiak, A. Malabirade, W. Grange, V. Arluison, G. Wegrzyn: The Escherichia Coli Hfq Protein: An Unattended DNA-Transactions Regulator. Frontiers in Molecular Biosciences. Frontiers Media S.A. July 28, 2016, p. 36.
12. Y. Zhang, J. Zhang, K. P. Hoeflich, M. Ikura, G. Qing, M. Inouye: MazF cleaves cellular mRNAs specifically at ACA to block protein synthesis in Escherichia coli. Mol. Cell 2003, 12(4), str. 913–923.
13. R. Zhu, G. Zhang, M. Jing, Y. Han, J. Li, J. Zhao, Y. Li, P. R. Chen: Genetically encoded formaldehyde sensors inspired by a protein intra-helical crosslinking reaction. Nat. Commun. 2021, 12(1), str. 1–13.

Antea-Glyphosate: Detekcija in razgradnja glifosata

2021-04-19T17:21:34Z

JernejI: /* Osnovni princip */

Antea-Glyphosate je projekt v okviru tekmovanja leta iGEM 2020, ki so ga pripravili študentje z univerze Xiamen na Kitajskem.

Povezava do projekta: [https://2020.igem.org/Team:XMU-China https://2020.igem.org/Team:XMU-China]

Avtor povzetka: Jernej Imperl

=Uvod=

Glifosat je eden od najširše uporabljanih herbicidov in mnoge raziskave nakazujejo na možne škodljive učinke za netarčne rastline, mikroorganizme in živali [1]. Kljub temu da človek v vsakdanjem življenju ni izpostavljen nevarnim količinam glifosata [1, 2], je njegova prisotnost v prsti in vodi zaskrbljujoča.

Ker glifosat v strukturi ne vsebuje nobenih kromofornih ali fluorofornih skupin, je njegova detekcija zapletena in zamudna. Prav tako bi bilo za učinkovito odstranjevanje glifosata iz okolja potrebno razviti hitro metodo, ki bi delovala pod različnimi okolijskimi pogoji [1].

Skupina iGEM iz univerze Xiamen na Kitajskem si je za cilj zadala rešiti ta dva problema in vzpostaviti sinteznobiološko rešitev za detekcijo in razgradnjo glifosata v prsti. Projekt so poimenovali Antea-Glyphosate, saj jim je idejo za projekt dal razmislek o intenzivni uporabi herbicidov pri pridelavi čaja. Pripravili so sistem za detekcijo glifosata in sistem za razgradnjo glifosata v prsti v vzorcu ter vsakega opremili s svojim stikalom smrti.

Poleg gensko spremenjenih bakterij so pripravili tudi merilni aparat, ki temelji na uporabi njihovega sistema za detekcijo glifosata in rezultate posreduje mobilni aplikaciji. V nadaljevanju je predstavljena predvsem sinteznobiološka plat njihovega projekta. Zaradi pandemije COVID-19 in omejenega časa za eksperimente so predstavljeni eksperimenti pretežno preliminarne narave (»proof of concept«).

=Detekcija=

==Osnovni princip==
Sistem za detekcijo glifosata z rekombinantno ''Escherichia coli'' temelji na njegovi delni razgradnji in posrednem merjenju koncentracije NADPH, ki se ob reakciji porablja. Encim glifosat oksidoreduktaza (GOX) katalizira cepitev vezi C-N, kar vodi do nastanka glioksilata in aminometilfosfonske kisline (AMPA) [3]. Glioksilat reduktaza (GRHPR) nato katalizira redukcijo glioksilata v glikolno kislino, ob čemer se NADPH oksidira v NADP+ [4]. Protein iNap na koncu deluje kot senzor za NADPH, saj se ob vezavi tega kofaktorja konformacijsko spremeni in odda fluorescenčni signal [5]. Kadar je v raztopini torej prisoten glifosat, se bo ob njegovi encimski razgradnji NADPH pretvarjal v NADP+, kar pa bi lahko zaznali z merjenjem upada fluorescence iNap in tako določili koncentracijo glifosata.

Da bi se izognili alternativnim metabolnim potem in lažnim rezultatom zaradi citosolnega NADPH, so encime želeli pritrditi na zunanjo površino bakterijske celice, tako da bi jih fuzirali z membranskimi proteini. Kot fuzijske partnerje so preizkusili proteine INPNC, BrkA in AIDA.

==Eksperiment==
V eksperimentu so želeli preizkusiti delovanje proteinov, ko so bili ti pritrjeni na površino celic. V predhodnih eksperimentih so potrdili uspešno izražanje izbranih proteinov na površini celice. Pripravili so biokocke BBa_K2922060, BBa_K3332057, BBa_K3332059 (za GRHPR), BBa_K3332052, BBa_K3332054, BBa_K3332055 (za GOX), BBa_K3332047, BBa_K3332049, BBa_K3332050 (za iNap), kjer je bil vsak izmed treh proteinov fuziran na tri različne membranske proteine: INPNC, BrkA ali AIDA. Biokocke so vsebovale promotor J23100, RBS BBa_B0034 in terminator BBa_B0015. Proteine so predstavili na površini ''E. coli'' DH5α in jih preizkusili v seriji eksperimentov.
- Suspenziji celic z izraženim GRHPR so dodali glioksilat in NADPH ter merili upadanje A340 zaradi porabe NADPH. Primerjali so učinkovitost encima z različnimi fuzijskimi partnerji in sklenili, da je bila izmed vseh najučinkovitejša kombinacija INPNC-GRHPR.
- V naslednjem eksperimentu so suspenziji celic z izraženim GOX dodali glifosat, NADPH in topno obliko encima GRHPR. Na podlagi upada A340 so določili, da je GOX uspešno kataliziral reakcijo in vsi fuzijski proteini so bili podobno učinkoviti.
- Zaradi omejenega časa za eksperimente so uspeli preizkusiti le kombinaciji INPNC-iNap in iNap-AIDA. Merili so časovno odvisnost fluorescence pri različnih koncentracijah NADPH in tudi tokrat pokazali uspešno delovanje obeh fuzijskih proteinov.
- Pripravili so suspenzijo, kjer so hkrati dodali celice z vsakim od treh proteinov (pritrjenih preko INPNC). Suspenziji so dodali glifosat in NADPH ter spremljali fluorescenco skozi čas. V primerjavi s kontrolo brez izraženih proteinov je v suspenziji prišlo do znatnega upada fluorescence, s čimer so potrdili delovanje njihovega sistema.

=Razgradnja=

==Osnovni princip==
Poleg sistema za detekcijo glifosata v vzorcu so želeli pripraviti tudi gensko spremenjeno bakterijo ''E. coli'', ki bi lahko glifosat in njegov derivat AMPA v okolju razgradila v neškodljive produkte. Za razliko od pristopa za detekcijo glifosata, bi tokrat njegova razgradnja potekala po alternativni poti, ki temelji na cepitvi vezi C-P. Za tak mehanizem razgradnje so odgovorni encimi, ki so zapisani na operonu ''phn'', ki ga najdemo pri številnih bakterijah, tudi ''E. coli''. Proteini PhnC, D in E predstavljajo sistem za aktivni transport fosfonskih kislin v celico, medtem ko kompleks PhnGHIJK, katerega glavna katalitična komponenta je PhnJ, katalizira cepitev vezi C-P s hkratno hidrolizo ATP. Po odstranitvi fosfitne skupine z glifosata, se sprosti N-metilglicin, ki pa se lahko v celici naprej oksidira do formaldehida in glicina.

Encim PhnO katalizira prenos acetilne skupine iz acetil koencima A na AMPA. Acetiliran AMPA lahko deluje kot substrat za PhnGHIJK, ki ga razgradi do N-metilacetamida. PhnO in PhnGHIJK lahko torej razgrajujejo tako glifosat kot tudi AMPA [6].

==Eksperimenti==
Da bi izboljšali razgradnjo glifosata in AMPA v ''E. coli'' so želeli nekatere gene phn nadomestiti s homologi iz drugih organizmov, kjer ta razgradnja poteka učinkoviteje. Vstaviti so želeli gene phnJ iz Enterobacter cloacae K7 [7], phnO iz Salmonella enterica [8] in phnE1/E2 iz Sinorhizobium meliloti 1021 [9]. Hkrati so želeli inhibirati izražanje endognih zapisov za PhnF, ki deluje kot represor za nekatere gene phn [6], in PhnJ, ki bi lahko z rekombninantnim PhnJ tekmoval za podenote kompleksa PhnGHJIK. Kot metodo inhibicije izražanja so izbrali siRNA.
Pripravili so biokocko BBa_K3332099, ki je vsebovala vse potrebne zapise. Izražanje genov za proteine so nadzorovali promotorji J23100 in RBS BBa_B0034, tako da sta imela phnJ in phnO vsak svoj promotor in RBS, phnE1 in phnE2 pa sta bila povezana policistronsko. Uporabili so terminator BBa_B0015. Za siRNA so uporabili promotor BBa_J23101 in terminator BBa_J61048, zaporedjem pa so za boljšo stabilnost in učinkovitost dodali še zaporedje OmpA 5' UTR [10] in vezavno mesto za Hfq [11].
S konstruktom, ki je vseboval pripravljeno biokocko, so transformirali ''E. coli'' BL21(DE3). Bakterije so gojili v gojišču z glifosatom in po 5 h določili koncentracijo preostalega glifosata v gojišču tako, da so uporabili svoj sistem za detekcijo. Primerjali so konstrukte z različnimi kombinacijami zapisov, vendar je bila najuspešnejša biokocka opisana zgoraj, ki je vsebovala vse zapise hkrati. Medtem ko so bakterije v negativni kontroli po 5 h privzele 8,6 % glifosata iz gojišča, so E. coli z biokocko privzele 43,1 %.

=Stikala smrti=

=Stikalo za sistem detekcije=
Stikalo smrti pri sistemu detekcije glifosata bi zagotovilo, da bi gensko spremenjene E. coli odmrle, če bi se sprostile v okolje. Gojišče, v katerem bi potekala detekcija glifosata v vzorcu, bi vsebovalo arabinozo, ki bi inhibirala sintezo citotoksične nukleaze MazF [12]. V primeru, da bi bakterije zapustile to goijšče, bi se mazF lahko izražal in privedel do celične smrti.
Pripravili so preprosto napravo BBa_K3332078, ki deluje kot inverter. Promotor pBAD nadzoruje izražanje zapisa za cI, promotor pR pa nadzoruje izražanje mazF. Arabinoza povzroči preklop araC iz represorske v aktivatorsko obliko, kar spodbudi izražanje cI, cI pa inhibira transkripcijo mazF. V odsotnosti arabinoze bo araC inhibiral izražanje cI, torej bo transkripcija mazF lahko potekala.
Pripravili so eksperiment, kjer so celice z inverterjem gojili v prisotnosti ali odsotnosti arabinoze. Rast bakterij so določili s štetjem CFU po različnih časih inkubacije. Ob prisotnosti arabinoze niso opazili znatnih sprememb v številu kolonij, medtem ko je pri odsotnosti arabinoze število kolonij izrazito upadlo v roku 8 h.

=Stikalo za sistem degradacije=
Sistem za degradacijo glifosata bi predvidoma deloval tako, da bi suspenzijo bakterij vnesli neposredno v prst, v kateri želimo odstraniti glifosat. Da bi preprečili nenadzorovano širjenje gensko spremenjenih bakterij, bi stikalo za smrt poskrbelo, da bakterije uspešno razgradijo glifosat, nato pa po opravljeni nalogi odmrejo. Zamislili so si napravo, ki bi ob prisotnosti glifosata zavirala izražanje mazF, v njegovi odsotnosti pa se bi mazF izražal in vodil v smrt.
Biokocka BBa_K3332078 deluje kot inverter. Namesto neposredne detekcije glifosata, so kot merilo njegove prisotnosti uporabili formaldehid, ki je eden od produktov ob razgradnji glifosata. HxlR je transkripcijski faktor, ki ob vezavi formaldehida deluje kot aktivator promotorja pHCHO [13]. pHCHO nadzoruje izražanje cI, promotor pR pa izražanje mazF. Ob prisotnosti formaldehida, bo HxlR aktiviral transkripcijo cI, cI pa bo onemogočil izražanje mazF. Kadar pa je formaldehid odsoten, transkripcija cI ne bo potekala in posledično se mazF lahko izraža.
Zaradi omejenega časa za eksperimentalno delo, so utegnili preizkusiti le delovanje posameznih sestavnih delov tega stikala, niso pa uspeli izvesti eksperimenta s celotno biokocko.

=Viri=

1. S. Singh, V. Kumar, S. Datta, A. B. Wani, D. S. Dhanjal, R. Romero, J. Singh: Glyphosate Uptake, Translocation, Resistance Emergence in Crops, Analytical Monitoring, Toxicity and Degradation: A Review. Environmental Chemistry Letters. Springer May 1, 2020, pp. 663–702.
2. World Health Organization: Glyphosate and AMPA in Drinking-water http://www.who.int/water_sanitation_health/ (pridobljeno 18. 4. 2021).
3. L. Pan, Q. Yu, H. Han, L. Mao, A. Nyporko, L. J. Fan, L. Bai, S. Powles: Aldo-keto reductase metabolizes glyphosate and confers glyphosate resistance in Echinochloa colona. Plant Physiol. 2019, 181(4), str. 1519–1534.
4. G. Rumsby, D. P. Cregeen: Identification and expression of a cDNA for human hydroxypyruvate/glyoxylate reductase. Biochim. Biophys. Acta - Gene Struct. Expr. 1999, 1446(3), str. 383–388.
5. R. Tao, Y. Zhao, H. Chu, A. Wang, J. Zhu, X. Chen, Y. Zou, M. Shi, R. Liu, … Y. Yang: Genetically encoded fluorescent sensors reveal dynamic regulation of NADPH metabolism. Nat. Methods 2017, 14(7), str. 720–728.
6. B. Hove-Jensen, D. L. Zechel, B. Jochimsen: Utilization of Glyphosate as Phosphate Source: Biochemistry and Genetics of Bacterial Carbon-Phosphorus Lyase. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2014, 78(1), str. 176–197.
7. Y. V. Kryuchkova, G. L. Burygin, N. E. Gogoleva, Y. V. Gogolev, M. P. Chernyshova, O. E. Makarov, E. E. Fedorov, O. V. Turkovskaya: Isolation and characterization of a glyphosate-degrading rhizosphere strain, Enterobacter cloacae K7. Microbiol. Res. 2014, 169(1), str. 99–105.
8. J. C. Errey, J. S. Blanchard: Functional annotation and kinetic characterization of PhnO from Salmonella enterica. Biochemistry 2006, 45(9), str. 3033–3039.
9. C. M. Liu, P. A. McLean, C. C. Sookdeo, F. C. Cannon: Degradation of the herbicide glyphosate by members of the family Rhizobiaceae. Appl. Environ. Microbiol. 1991, 57(6), str. 1799–1804.
10. M. J. Hansen, L. ‐H Chen, M. L. S. Fejzo, J. G. Beiasco: The ompA 5′ untranslated region impedes a major pathway for mRNA degradation in Escherichia coli. Mol. Microbiol. 1994, 12(5), str. 707–716.
11. G. M. Cech, A. Szalewska-Palasz, K. Kubiak, A. Malabirade, W. Grange, V. Arluison, G. Wegrzyn: The Escherichia Coli Hfq Protein: An Unattended DNA-Transactions Regulator. Frontiers in Molecular Biosciences. Frontiers Media S.A. July 28, 2016, p. 36.
12. Y. Zhang, J. Zhang, K. P. Hoeflich, M. Ikura, G. Qing, M. Inouye: MazF cleaves cellular mRNAs specifically at ACA to block protein synthesis in Escherichia coli. Mol. Cell 2003, 12(4), str. 913–923.
13. R. Zhu, G. Zhang, M. Jing, Y. Han, J. Li, J. Zhao, Y. Li, P. R. Chen: Genetically encoded formaldehyde sensors inspired by a protein intra-helical crosslinking reaction. Nat. Commun. 2021, 12(1), str. 1–13.

Antea-Glyphosate: Detekcija in razgradnja glifosata

2021-04-19T17:21:19Z

JernejI: /* Osnovni princip */

Antea-Glyphosate je projekt v okviru tekmovanja leta iGEM 2020, ki so ga pripravili študentje z univerze Xiamen na Kitajskem.

Povezava do projekta: [https://2020.igem.org/Team:XMU-China https://2020.igem.org/Team:XMU-China]

Avtor povzetka: Jernej Imperl

=Uvod=

Glifosat je eden od najširše uporabljanih herbicidov in mnoge raziskave nakazujejo na možne škodljive učinke za netarčne rastline, mikroorganizme in živali [1]. Kljub temu da človek v vsakdanjem življenju ni izpostavljen nevarnim količinam glifosata [1, 2], je njegova prisotnost v prsti in vodi zaskrbljujoča.

Ker glifosat v strukturi ne vsebuje nobenih kromofornih ali fluorofornih skupin, je njegova detekcija zapletena in zamudna. Prav tako bi bilo za učinkovito odstranjevanje glifosata iz okolja potrebno razviti hitro metodo, ki bi delovala pod različnimi okolijskimi pogoji [1].

Skupina iGEM iz univerze Xiamen na Kitajskem si je za cilj zadala rešiti ta dva problema in vzpostaviti sinteznobiološko rešitev za detekcijo in razgradnjo glifosata v prsti. Projekt so poimenovali Antea-Glyphosate, saj jim je idejo za projekt dal razmislek o intenzivni uporabi herbicidov pri pridelavi čaja. Pripravili so sistem za detekcijo glifosata in sistem za razgradnjo glifosata v prsti v vzorcu ter vsakega opremili s svojim stikalom smrti.

Poleg gensko spremenjenih bakterij so pripravili tudi merilni aparat, ki temelji na uporabi njihovega sistema za detekcijo glifosata in rezultate posreduje mobilni aplikaciji. V nadaljevanju je predstavljena predvsem sinteznobiološka plat njihovega projekta. Zaradi pandemije COVID-19 in omejenega časa za eksperimente so predstavljeni eksperimenti pretežno preliminarne narave (»proof of concept«).

=Detekcija=

==Osnovni princip==
Sistem za detekcijo glifosata z rekombinantno ''Escherichia coli'' temelji na njegovi delni razgradnji in posrednem merjenju koncentracije NADPH, ki se ob reakciji porablja. Encim glifosat oksidoreduktaza (GOX) katalizira cepitev vezi C-N, kar vodi do nastanka glioksilata in aminometilfosfonske kisline (AMPA) [3]. Glioksilat reduktaza (GRHPR) nato katalizira redukcijo glioksilata v glikolno kislino, ob čemer se NADPH oksidira v NADP+ [4]. Protein iNap na koncu deluje kot senzor za NADPH, saj se ob vezavi tega kofaktorja konformacijsko spremeni in odda fluorescenčni signal [5]. Kadar je v raztopini torej prisoten glifosat, se bo ob njegovi encimski razgradnji NADPH pretvarjal v NADP+, kar pa bi lahko zaznali z merjenjem upada fluorescence iNap in tako določili koncentracijo glifosata.

Da bi se izognili alternativnim metabolnim potem in lažnim rezultatom zaradi citosolnega NADPH, so encime želeli pritrditi na zunanjo površino bakterijske celice, tako da bi jih fuzirali z membranskimi proteini. Kot fuzijske partnerje so preizkusili proteine INPNC, BrkA in AIDA.

==Eksperiment==
V eksperimentu so želeli preizkusiti delovanje proteinov, ko so bili ti pritrjeni na površino celic. V predhodnih eksperimentih so potrdili uspešno izražanje izbranih proteinov na površini celice. Pripravili so biokocke BBa_K2922060, BBa_K3332057, BBa_K3332059 (za GRHPR), BBa_K3332052, BBa_K3332054, BBa_K3332055 (za GOX), BBa_K3332047, BBa_K3332049, BBa_K3332050 (za iNap), kjer je bil vsak izmed treh proteinov fuziran na tri različne membranske proteine: INPNC, BrkA ali AIDA. Biokocke so vsebovale promotor J23100, RBS BBa_B0034 in terminator BBa_B0015. Proteine so predstavili na površini ''E. coli'' DH5α in jih preizkusili v seriji eksperimentov.
- Suspenziji celic z izraženim GRHPR so dodali glioksilat in NADPH ter merili upadanje A340 zaradi porabe NADPH. Primerjali so učinkovitost encima z različnimi fuzijskimi partnerji in sklenili, da je bila izmed vseh najučinkovitejša kombinacija INPNC-GRHPR.
- V naslednjem eksperimentu so suspenziji celic z izraženim GOX dodali glifosat, NADPH in topno obliko encima GRHPR. Na podlagi upada A340 so določili, da je GOX uspešno kataliziral reakcijo in vsi fuzijski proteini so bili podobno učinkoviti.
- Zaradi omejenega časa za eksperimente so uspeli preizkusiti le kombinaciji INPNC-iNap in iNap-AIDA. Merili so časovno odvisnost fluorescence pri različnih koncentracijah NADPH in tudi tokrat pokazali uspešno delovanje obeh fuzijskih proteinov.
- Pripravili so suspenzijo, kjer so hkrati dodali celice z vsakim od treh proteinov (pritrjenih preko INPNC). Suspenziji so dodali glifosat in NADPH ter spremljali fluorescenco skozi čas. V primerjavi s kontrolo brez izraženih proteinov je v suspenziji prišlo do znatnega upada fluorescence, s čimer so potrdili delovanje njihovega sistema.

=Razgradnja=

==Osnovni princip==
Poleg sistema za detekcijo glifosata v vzorcu so želeli pripraviti tudi gensko spremenjeno bakterijo ''E. coli'', ki bi lahko glifosat in njegov derivat AMPA v okolju razgradila v neškodljive produkte. Za razliko od pristopa za detekcijo glifosata, bi tokrat njegova razgradnja potekala po alternativni poti, ki temelji na cepitvi vezi C-P. Za tak mehanizem razgradnje so odgovorni encimi, ki so zapisani na operonu ''phn'', ki ga najdemo pri številnih bakterijah, tudi ''E. coli''. Proteini PhnC, D in E predstavljajo sistem za aktivni transport fosfonskih kislin v celico, medtem ko kompleks PhnGHIJK, katerega glavna katalitična komponenta je PhnJ, katalizira cepitev vezi C-P s hkratno hidrolizo ATP. Po odstranitvi fosfitne skupine z glifosata, se sprosti N-metilglicin, ki pa se lahko v celici naprej oksidira do formaldehida in glicina.
Encim PhnO katalizira prenos acetilne skupine iz acetil koencima A na AMPA. Acetiliran AMPA lahko deluje kot substrat za PhnGHIJK, ki ga razgradi do N-metilacetamida. PhnO in PhnGHIJK lahko torej razgrajujejo tako glifosat kot tudi AMPA [6].

==Eksperimenti==
Da bi izboljšali razgradnjo glifosata in AMPA v ''E. coli'' so želeli nekatere gene phn nadomestiti s homologi iz drugih organizmov, kjer ta razgradnja poteka učinkoviteje. Vstaviti so želeli gene phnJ iz Enterobacter cloacae K7 [7], phnO iz Salmonella enterica [8] in phnE1/E2 iz Sinorhizobium meliloti 1021 [9]. Hkrati so želeli inhibirati izražanje endognih zapisov za PhnF, ki deluje kot represor za nekatere gene phn [6], in PhnJ, ki bi lahko z rekombninantnim PhnJ tekmoval za podenote kompleksa PhnGHJIK. Kot metodo inhibicije izražanja so izbrali siRNA.
Pripravili so biokocko BBa_K3332099, ki je vsebovala vse potrebne zapise. Izražanje genov za proteine so nadzorovali promotorji J23100 in RBS BBa_B0034, tako da sta imela phnJ in phnO vsak svoj promotor in RBS, phnE1 in phnE2 pa sta bila povezana policistronsko. Uporabili so terminator BBa_B0015. Za siRNA so uporabili promotor BBa_J23101 in terminator BBa_J61048, zaporedjem pa so za boljšo stabilnost in učinkovitost dodali še zaporedje OmpA 5' UTR [10] in vezavno mesto za Hfq [11].
S konstruktom, ki je vseboval pripravljeno biokocko, so transformirali ''E. coli'' BL21(DE3). Bakterije so gojili v gojišču z glifosatom in po 5 h določili koncentracijo preostalega glifosata v gojišču tako, da so uporabili svoj sistem za detekcijo. Primerjali so konstrukte z različnimi kombinacijami zapisov, vendar je bila najuspešnejša biokocka opisana zgoraj, ki je vsebovala vse zapise hkrati. Medtem ko so bakterije v negativni kontroli po 5 h privzele 8,6 % glifosata iz gojišča, so E. coli z biokocko privzele 43,1 %.

=Stikala smrti=

=Stikalo za sistem detekcije=
Stikalo smrti pri sistemu detekcije glifosata bi zagotovilo, da bi gensko spremenjene E. coli odmrle, če bi se sprostile v okolje. Gojišče, v katerem bi potekala detekcija glifosata v vzorcu, bi vsebovalo arabinozo, ki bi inhibirala sintezo citotoksične nukleaze MazF [12]. V primeru, da bi bakterije zapustile to goijšče, bi se mazF lahko izražal in privedel do celične smrti.
Pripravili so preprosto napravo BBa_K3332078, ki deluje kot inverter. Promotor pBAD nadzoruje izražanje zapisa za cI, promotor pR pa nadzoruje izražanje mazF. Arabinoza povzroči preklop araC iz represorske v aktivatorsko obliko, kar spodbudi izražanje cI, cI pa inhibira transkripcijo mazF. V odsotnosti arabinoze bo araC inhibiral izražanje cI, torej bo transkripcija mazF lahko potekala.
Pripravili so eksperiment, kjer so celice z inverterjem gojili v prisotnosti ali odsotnosti arabinoze. Rast bakterij so določili s štetjem CFU po različnih časih inkubacije. Ob prisotnosti arabinoze niso opazili znatnih sprememb v številu kolonij, medtem ko je pri odsotnosti arabinoze število kolonij izrazito upadlo v roku 8 h.

=Stikalo za sistem degradacije=
Sistem za degradacijo glifosata bi predvidoma deloval tako, da bi suspenzijo bakterij vnesli neposredno v prst, v kateri želimo odstraniti glifosat. Da bi preprečili nenadzorovano širjenje gensko spremenjenih bakterij, bi stikalo za smrt poskrbelo, da bakterije uspešno razgradijo glifosat, nato pa po opravljeni nalogi odmrejo. Zamislili so si napravo, ki bi ob prisotnosti glifosata zavirala izražanje mazF, v njegovi odsotnosti pa se bi mazF izražal in vodil v smrt.
Biokocka BBa_K3332078 deluje kot inverter. Namesto neposredne detekcije glifosata, so kot merilo njegove prisotnosti uporabili formaldehid, ki je eden od produktov ob razgradnji glifosata. HxlR je transkripcijski faktor, ki ob vezavi formaldehida deluje kot aktivator promotorja pHCHO [13]. pHCHO nadzoruje izražanje cI, promotor pR pa izražanje mazF. Ob prisotnosti formaldehida, bo HxlR aktiviral transkripcijo cI, cI pa bo onemogočil izražanje mazF. Kadar pa je formaldehid odsoten, transkripcija cI ne bo potekala in posledično se mazF lahko izraža.
Zaradi omejenega časa za eksperimentalno delo, so utegnili preizkusiti le delovanje posameznih sestavnih delov tega stikala, niso pa uspeli izvesti eksperimenta s celotno biokocko.

=Viri=

1. S. Singh, V. Kumar, S. Datta, A. B. Wani, D. S. Dhanjal, R. Romero, J. Singh: Glyphosate Uptake, Translocation, Resistance Emergence in Crops, Analytical Monitoring, Toxicity and Degradation: A Review. Environmental Chemistry Letters. Springer May 1, 2020, pp. 663–702.
2. World Health Organization: Glyphosate and AMPA in Drinking-water http://www.who.int/water_sanitation_health/ (pridobljeno 18. 4. 2021).
3. L. Pan, Q. Yu, H. Han, L. Mao, A. Nyporko, L. J. Fan, L. Bai, S. Powles: Aldo-keto reductase metabolizes glyphosate and confers glyphosate resistance in Echinochloa colona. Plant Physiol. 2019, 181(4), str. 1519–1534.
4. G. Rumsby, D. P. Cregeen: Identification and expression of a cDNA for human hydroxypyruvate/glyoxylate reductase. Biochim. Biophys. Acta - Gene Struct. Expr. 1999, 1446(3), str. 383–388.
5. R. Tao, Y. Zhao, H. Chu, A. Wang, J. Zhu, X. Chen, Y. Zou, M. Shi, R. Liu, … Y. Yang: Genetically encoded fluorescent sensors reveal dynamic regulation of NADPH metabolism. Nat. Methods 2017, 14(7), str. 720–728.
6. B. Hove-Jensen, D. L. Zechel, B. Jochimsen: Utilization of Glyphosate as Phosphate Source: Biochemistry and Genetics of Bacterial Carbon-Phosphorus Lyase. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2014, 78(1), str. 176–197.
7. Y. V. Kryuchkova, G. L. Burygin, N. E. Gogoleva, Y. V. Gogolev, M. P. Chernyshova, O. E. Makarov, E. E. Fedorov, O. V. Turkovskaya: Isolation and characterization of a glyphosate-degrading rhizosphere strain, Enterobacter cloacae K7. Microbiol. Res. 2014, 169(1), str. 99–105.
8. J. C. Errey, J. S. Blanchard: Functional annotation and kinetic characterization of PhnO from Salmonella enterica. Biochemistry 2006, 45(9), str. 3033–3039.
9. C. M. Liu, P. A. McLean, C. C. Sookdeo, F. C. Cannon: Degradation of the herbicide glyphosate by members of the family Rhizobiaceae. Appl. Environ. Microbiol. 1991, 57(6), str. 1799–1804.
10. M. J. Hansen, L. ‐H Chen, M. L. S. Fejzo, J. G. Beiasco: The ompA 5′ untranslated region impedes a major pathway for mRNA degradation in Escherichia coli. Mol. Microbiol. 1994, 12(5), str. 707–716.
11. G. M. Cech, A. Szalewska-Palasz, K. Kubiak, A. Malabirade, W. Grange, V. Arluison, G. Wegrzyn: The Escherichia Coli Hfq Protein: An Unattended DNA-Transactions Regulator. Frontiers in Molecular Biosciences. Frontiers Media S.A. July 28, 2016, p. 36.
12. Y. Zhang, J. Zhang, K. P. Hoeflich, M. Ikura, G. Qing, M. Inouye: MazF cleaves cellular mRNAs specifically at ACA to block protein synthesis in Escherichia coli. Mol. Cell 2003, 12(4), str. 913–923.
13. R. Zhu, G. Zhang, M. Jing, Y. Han, J. Li, J. Zhao, Y. Li, P. R. Chen: Genetically encoded formaldehyde sensors inspired by a protein intra-helical crosslinking reaction. Nat. Commun. 2021, 12(1), str. 1–13.

Antea-Glyphosate: Detekcija in razgradnja glifosata

2021-04-19T17:20:49Z

JernejI: /* Osnovni princip */

Antea-Glyphosate je projekt v okviru tekmovanja leta iGEM 2020, ki so ga pripravili študentje z univerze Xiamen na Kitajskem.

Povezava do projekta: [https://2020.igem.org/Team:XMU-China https://2020.igem.org/Team:XMU-China]

Avtor povzetka: Jernej Imperl

=Uvod=

Glifosat je eden od najširše uporabljanih herbicidov in mnoge raziskave nakazujejo na možne škodljive učinke za netarčne rastline, mikroorganizme in živali [1]. Kljub temu da človek v vsakdanjem življenju ni izpostavljen nevarnim količinam glifosata [1, 2], je njegova prisotnost v prsti in vodi zaskrbljujoča.

Ker glifosat v strukturi ne vsebuje nobenih kromofornih ali fluorofornih skupin, je njegova detekcija zapletena in zamudna. Prav tako bi bilo za učinkovito odstranjevanje glifosata iz okolja potrebno razviti hitro metodo, ki bi delovala pod različnimi okolijskimi pogoji [1].

Skupina iGEM iz univerze Xiamen na Kitajskem si je za cilj zadala rešiti ta dva problema in vzpostaviti sinteznobiološko rešitev za detekcijo in razgradnjo glifosata v prsti. Projekt so poimenovali Antea-Glyphosate, saj jim je idejo za projekt dal razmislek o intenzivni uporabi herbicidov pri pridelavi čaja. Pripravili so sistem za detekcijo glifosata in sistem za razgradnjo glifosata v prsti v vzorcu ter vsakega opremili s svojim stikalom smrti.

Poleg gensko spremenjenih bakterij so pripravili tudi merilni aparat, ki temelji na uporabi njihovega sistema za detekcijo glifosata in rezultate posreduje mobilni aplikaciji. V nadaljevanju je predstavljena predvsem sinteznobiološka plat njihovega projekta. Zaradi pandemije COVID-19 in omejenega časa za eksperimente so predstavljeni eksperimenti pretežno preliminarne narave (»proof of concept«).

=Detekcija=

==Osnovni princip==
Sistem za detekcijo glifosata z rekombinantno ''Escherichia coli'' temelji na njegovi delni razgradnji in posrednem merjenju koncentracije NADPH, ki se ob reakciji porablja. Encim glifosat oksidoreduktaza (GOX) katalizira cepitev vezi C-N, kar vodi do nastanka glioksilata in aminometilfosfonske kisline (AMPA) [3]. Glioksilat reduktaza (GRHPR) nato katalizira redukcijo glioksilata v glikolno kislino, ob čemer se NADPH oksidira v NADP+ [4]. Protein iNap na koncu deluje kot senzor za NADPH, saj se ob vezavi tega kofaktorja konformacijsko spremeni in odda fluorescenčni signal [5]. Kadar je v raztopini torej prisoten glifosat, se bo ob njegovi encimski razgradnji NADPH pretvarjal v NADP+, kar pa bi lahko zaznali z merjenjem upada fluorescence iNap in tako določili koncentracijo glifosata.
Da bi se izognili alternativnim metabolnim potem in lažnim rezultatom zaradi citosolnega NADPH, so encime želeli pritrditi na zunanjo površino bakterijske celice, tako da bi jih fuzirali z membranskimi proteini. Kot fuzijske partnerje so preizkusili proteine INPNC, BrkA in AIDA.

==Eksperiment==
V eksperimentu so želeli preizkusiti delovanje proteinov, ko so bili ti pritrjeni na površino celic. V predhodnih eksperimentih so potrdili uspešno izražanje izbranih proteinov na površini celice. Pripravili so biokocke BBa_K2922060, BBa_K3332057, BBa_K3332059 (za GRHPR), BBa_K3332052, BBa_K3332054, BBa_K3332055 (za GOX), BBa_K3332047, BBa_K3332049, BBa_K3332050 (za iNap), kjer je bil vsak izmed treh proteinov fuziran na tri različne membranske proteine: INPNC, BrkA ali AIDA. Biokocke so vsebovale promotor J23100, RBS BBa_B0034 in terminator BBa_B0015. Proteine so predstavili na površini ''E. coli'' DH5α in jih preizkusili v seriji eksperimentov.
- Suspenziji celic z izraženim GRHPR so dodali glioksilat in NADPH ter merili upadanje A340 zaradi porabe NADPH. Primerjali so učinkovitost encima z različnimi fuzijskimi partnerji in sklenili, da je bila izmed vseh najučinkovitejša kombinacija INPNC-GRHPR.
- V naslednjem eksperimentu so suspenziji celic z izraženim GOX dodali glifosat, NADPH in topno obliko encima GRHPR. Na podlagi upada A340 so določili, da je GOX uspešno kataliziral reakcijo in vsi fuzijski proteini so bili podobno učinkoviti.
- Zaradi omejenega časa za eksperimente so uspeli preizkusiti le kombinaciji INPNC-iNap in iNap-AIDA. Merili so časovno odvisnost fluorescence pri različnih koncentracijah NADPH in tudi tokrat pokazali uspešno delovanje obeh fuzijskih proteinov.
- Pripravili so suspenzijo, kjer so hkrati dodali celice z vsakim od treh proteinov (pritrjenih preko INPNC). Suspenziji so dodali glifosat in NADPH ter spremljali fluorescenco skozi čas. V primerjavi s kontrolo brez izraženih proteinov je v suspenziji prišlo do znatnega upada fluorescence, s čimer so potrdili delovanje njihovega sistema.

=Razgradnja=

==Osnovni princip==
Poleg sistema za detekcijo glifosata v vzorcu so želeli pripraviti tudi gensko spremenjeno bakterijo ''E. coli'', ki bi lahko glifosat in njegov derivat AMPA v okolju razgradila v neškodljive produkte. Za razliko od pristopa za detekcijo glifosata, bi tokrat njegova razgradnja potekala po alternativni poti, ki temelji na cepitvi vezi C-P. Za tak mehanizem razgradnje so odgovorni encimi, ki so zapisani na operonu ''phn'', ki ga najdemo pri številnih bakterijah, tudi ''E. coli''. Proteini PhnC, D in E predstavljajo sistem za aktivni transport fosfonskih kislin v celico, medtem ko kompleks PhnGHIJK, katerega glavna katalitična komponenta je PhnJ, katalizira cepitev vezi C-P s hkratno hidrolizo ATP. Po odstranitvi fosfitne skupine z glifosata, se sprosti N-metilglicin, ki pa se lahko v celici naprej oksidira do formaldehida in glicina.
Encim PhnO katalizira prenos acetilne skupine iz acetil koencima A na AMPA. Acetiliran AMPA lahko deluje kot substrat za PhnGHIJK, ki ga razgradi do N-metilacetamida. PhnO in PhnGHIJK lahko torej razgrajujejo tako glifosat kot tudi AMPA [6].

==Eksperimenti==
Da bi izboljšali razgradnjo glifosata in AMPA v ''E. coli'' so želeli nekatere gene phn nadomestiti s homologi iz drugih organizmov, kjer ta razgradnja poteka učinkoviteje. Vstaviti so želeli gene phnJ iz Enterobacter cloacae K7 [7], phnO iz Salmonella enterica [8] in phnE1/E2 iz Sinorhizobium meliloti 1021 [9]. Hkrati so želeli inhibirati izražanje endognih zapisov za PhnF, ki deluje kot represor za nekatere gene phn [6], in PhnJ, ki bi lahko z rekombninantnim PhnJ tekmoval za podenote kompleksa PhnGHJIK. Kot metodo inhibicije izražanja so izbrali siRNA.
Pripravili so biokocko BBa_K3332099, ki je vsebovala vse potrebne zapise. Izražanje genov za proteine so nadzorovali promotorji J23100 in RBS BBa_B0034, tako da sta imela phnJ in phnO vsak svoj promotor in RBS, phnE1 in phnE2 pa sta bila povezana policistronsko. Uporabili so terminator BBa_B0015. Za siRNA so uporabili promotor BBa_J23101 in terminator BBa_J61048, zaporedjem pa so za boljšo stabilnost in učinkovitost dodali še zaporedje OmpA 5' UTR [10] in vezavno mesto za Hfq [11].
S konstruktom, ki je vseboval pripravljeno biokocko, so transformirali ''E. coli'' BL21(DE3). Bakterije so gojili v gojišču z glifosatom in po 5 h določili koncentracijo preostalega glifosata v gojišču tako, da so uporabili svoj sistem za detekcijo. Primerjali so konstrukte z različnimi kombinacijami zapisov, vendar je bila najuspešnejša biokocka opisana zgoraj, ki je vsebovala vse zapise hkrati. Medtem ko so bakterije v negativni kontroli po 5 h privzele 8,6 % glifosata iz gojišča, so E. coli z biokocko privzele 43,1 %.

=Stikala smrti=

=Stikalo za sistem detekcije=
Stikalo smrti pri sistemu detekcije glifosata bi zagotovilo, da bi gensko spremenjene E. coli odmrle, če bi se sprostile v okolje. Gojišče, v katerem bi potekala detekcija glifosata v vzorcu, bi vsebovalo arabinozo, ki bi inhibirala sintezo citotoksične nukleaze MazF [12]. V primeru, da bi bakterije zapustile to goijšče, bi se mazF lahko izražal in privedel do celične smrti.
Pripravili so preprosto napravo BBa_K3332078, ki deluje kot inverter. Promotor pBAD nadzoruje izražanje zapisa za cI, promotor pR pa nadzoruje izražanje mazF. Arabinoza povzroči preklop araC iz represorske v aktivatorsko obliko, kar spodbudi izražanje cI, cI pa inhibira transkripcijo mazF. V odsotnosti arabinoze bo araC inhibiral izražanje cI, torej bo transkripcija mazF lahko potekala.
Pripravili so eksperiment, kjer so celice z inverterjem gojili v prisotnosti ali odsotnosti arabinoze. Rast bakterij so določili s štetjem CFU po različnih časih inkubacije. Ob prisotnosti arabinoze niso opazili znatnih sprememb v številu kolonij, medtem ko je pri odsotnosti arabinoze število kolonij izrazito upadlo v roku 8 h.

=Stikalo za sistem degradacije=
Sistem za degradacijo glifosata bi predvidoma deloval tako, da bi suspenzijo bakterij vnesli neposredno v prst, v kateri želimo odstraniti glifosat. Da bi preprečili nenadzorovano širjenje gensko spremenjenih bakterij, bi stikalo za smrt poskrbelo, da bakterije uspešno razgradijo glifosat, nato pa po opravljeni nalogi odmrejo. Zamislili so si napravo, ki bi ob prisotnosti glifosata zavirala izražanje mazF, v njegovi odsotnosti pa se bi mazF izražal in vodil v smrt.
Biokocka BBa_K3332078 deluje kot inverter. Namesto neposredne detekcije glifosata, so kot merilo njegove prisotnosti uporabili formaldehid, ki je eden od produktov ob razgradnji glifosata. HxlR je transkripcijski faktor, ki ob vezavi formaldehida deluje kot aktivator promotorja pHCHO [13]. pHCHO nadzoruje izražanje cI, promotor pR pa izražanje mazF. Ob prisotnosti formaldehida, bo HxlR aktiviral transkripcijo cI, cI pa bo onemogočil izražanje mazF. Kadar pa je formaldehid odsoten, transkripcija cI ne bo potekala in posledično se mazF lahko izraža.
Zaradi omejenega časa za eksperimentalno delo, so utegnili preizkusiti le delovanje posameznih sestavnih delov tega stikala, niso pa uspeli izvesti eksperimenta s celotno biokocko.

=Viri=

1. S. Singh, V. Kumar, S. Datta, A. B. Wani, D. S. Dhanjal, R. Romero, J. Singh: Glyphosate Uptake, Translocation, Resistance Emergence in Crops, Analytical Monitoring, Toxicity and Degradation: A Review. Environmental Chemistry Letters. Springer May 1, 2020, pp. 663–702.
2. World Health Organization: Glyphosate and AMPA in Drinking-water http://www.who.int/water_sanitation_health/ (pridobljeno 18. 4. 2021).
3. L. Pan, Q. Yu, H. Han, L. Mao, A. Nyporko, L. J. Fan, L. Bai, S. Powles: Aldo-keto reductase metabolizes glyphosate and confers glyphosate resistance in Echinochloa colona. Plant Physiol. 2019, 181(4), str. 1519–1534.
4. G. Rumsby, D. P. Cregeen: Identification and expression of a cDNA for human hydroxypyruvate/glyoxylate reductase. Biochim. Biophys. Acta - Gene Struct. Expr. 1999, 1446(3), str. 383–388.
5. R. Tao, Y. Zhao, H. Chu, A. Wang, J. Zhu, X. Chen, Y. Zou, M. Shi, R. Liu, … Y. Yang: Genetically encoded fluorescent sensors reveal dynamic regulation of NADPH metabolism. Nat. Methods 2017, 14(7), str. 720–728.
6. B. Hove-Jensen, D. L. Zechel, B. Jochimsen: Utilization of Glyphosate as Phosphate Source: Biochemistry and Genetics of Bacterial Carbon-Phosphorus Lyase. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2014, 78(1), str. 176–197.
7. Y. V. Kryuchkova, G. L. Burygin, N. E. Gogoleva, Y. V. Gogolev, M. P. Chernyshova, O. E. Makarov, E. E. Fedorov, O. V. Turkovskaya: Isolation and characterization of a glyphosate-degrading rhizosphere strain, Enterobacter cloacae K7. Microbiol. Res. 2014, 169(1), str. 99–105.
8. J. C. Errey, J. S. Blanchard: Functional annotation and kinetic characterization of PhnO from Salmonella enterica. Biochemistry 2006, 45(9), str. 3033–3039.
9. C. M. Liu, P. A. McLean, C. C. Sookdeo, F. C. Cannon: Degradation of the herbicide glyphosate by members of the family Rhizobiaceae. Appl. Environ. Microbiol. 1991, 57(6), str. 1799–1804.
10. M. J. Hansen, L. ‐H Chen, M. L. S. Fejzo, J. G. Beiasco: The ompA 5′ untranslated region impedes a major pathway for mRNA degradation in Escherichia coli. Mol. Microbiol. 1994, 12(5), str. 707–716.
11. G. M. Cech, A. Szalewska-Palasz, K. Kubiak, A. Malabirade, W. Grange, V. Arluison, G. Wegrzyn: The Escherichia Coli Hfq Protein: An Unattended DNA-Transactions Regulator. Frontiers in Molecular Biosciences. Frontiers Media S.A. July 28, 2016, p. 36.
12. Y. Zhang, J. Zhang, K. P. Hoeflich, M. Ikura, G. Qing, M. Inouye: MazF cleaves cellular mRNAs specifically at ACA to block protein synthesis in Escherichia coli. Mol. Cell 2003, 12(4), str. 913–923.
13. R. Zhu, G. Zhang, M. Jing, Y. Han, J. Li, J. Zhao, Y. Li, P. R. Chen: Genetically encoded formaldehyde sensors inspired by a protein intra-helical crosslinking reaction. Nat. Commun. 2021, 12(1), str. 1–13.

Antea-Glyphosate: Detekcija in razgradnja glifosata

2021-04-19T17:19:10Z

JernejI:

Antea-Glyphosate je projekt v okviru tekmovanja leta iGEM 2020, ki so ga pripravili študentje z univerze Xiamen na Kitajskem.

Povezava do projekta: [https://2020.igem.org/Team:XMU-China https://2020.igem.org/Team:XMU-China]

Avtor povzetka: Jernej Imperl

=Uvod=

Glifosat je eden od najširše uporabljanih herbicidov in mnoge raziskave nakazujejo na možne škodljive učinke za netarčne rastline, mikroorganizme in živali [1]. Kljub temu da človek v vsakdanjem življenju ni izpostavljen nevarnim količinam glifosata [1, 2], je njegova prisotnost v prsti in vodi zaskrbljujoča.

Ker glifosat v strukturi ne vsebuje nobenih kromofornih ali fluorofornih skupin, je njegova detekcija zapletena in zamudna. Prav tako bi bilo za učinkovito odstranjevanje glifosata iz okolja potrebno razviti hitro metodo, ki bi delovala pod različnimi okolijskimi pogoji [1].

Skupina iGEM iz univerze Xiamen na Kitajskem si je za cilj zadala rešiti ta dva problema in vzpostaviti sinteznobiološko rešitev za detekcijo in razgradnjo glifosata v prsti. Projekt so poimenovali Antea-Glyphosate, saj jim je idejo za projekt dal razmislek o intenzivni uporabi herbicidov pri pridelavi čaja. Pripravili so sistem za detekcijo glifosata in sistem za razgradnjo glifosata v prsti v vzorcu ter vsakega opremili s svojim stikalom smrti.

Poleg gensko spremenjenih bakterij so pripravili tudi merilni aparat, ki temelji na uporabi njihovega sistema za detekcijo glifosata in rezultate posreduje mobilni aplikaciji. V nadaljevanju je predstavljena predvsem sinteznobiološka plat njihovega projekta. Zaradi pandemije COVID-19 in omejenega časa za eksperimente so predstavljeni eksperimenti pretežno preliminarne narave (»proof of concept«).

=Detekcija=

==Osnovni princip==
Sistem za detekcijo glifosata z rekombinantno ''Escherichia coli'' temelji na njegovi delni razgradnji in posrednem merjenju koncentracije NADPH, ki se ob reakciji porablja. Encim glifosat oksidoreduktaza (GOX) katalizira cepitev vezi C-N, kar vodi do nastanka glioksilata in aminometilfosfonske kisline (AMPA) [3]. Glioksilat reduktaza (GRHPR) nato katalizira redukcijo glioksilata v glikolno kislino, ob čemer se NADPH oksidira v NADP+ [4]. Protein iNap na koncu deluje kot senzor za NADPH, saj se ob vezavi tega kofaktorja konformacijsko spremeni in odda fluorescenčni signal [5]. Kadar je v raztopini torej prisoten glifosat, se bo ob njegovi encimski razgradnji NADPH pretvarjal v NADP+, kar pa bi lahko zaznali z merjenjem upada fluorescence iNap in tako določili koncentracijo glifosata.
Da bi se izognili alternativnim metabolnim potem in lažnim rezultatom zaradi citosolnega NADPH, so encime želeli pritrditi na zunanjo površino bakterijske celice, tako da bi jih fuzirali z membranskimi proteini. Kot fuzijske partnerje so preizkusili proteine INPNC, BrkA in AIDA.

==Eksperiment==
V eksperimentu so želeli preizkusiti delovanje proteinov, ko so bili ti pritrjeni na površino celic. V predhodnih eksperimentih so potrdili uspešno izražanje izbranih proteinov na površini celice. Pripravili so biokocke BBa_K2922060, BBa_K3332057, BBa_K3332059 (za GRHPR), BBa_K3332052, BBa_K3332054, BBa_K3332055 (za GOX), BBa_K3332047, BBa_K3332049, BBa_K3332050 (za iNap), kjer je bil vsak izmed treh proteinov fuziran na tri različne membranske proteine: INPNC, BrkA ali AIDA. Biokocke so vsebovale promotor J23100, RBS BBa_B0034 in terminator BBa_B0015. Proteine so predstavili na površini ''E. coli'' DH5α in jih preizkusili v seriji eksperimentov.
- Suspenziji celic z izraženim GRHPR so dodali glioksilat in NADPH ter merili upadanje A340 zaradi porabe NADPH. Primerjali so učinkovitost encima z različnimi fuzijskimi partnerji in sklenili, da je bila izmed vseh najučinkovitejša kombinacija INPNC-GRHPR.
- V naslednjem eksperimentu so suspenziji celic z izraženim GOX dodali glifosat, NADPH in topno obliko encima GRHPR. Na podlagi upada A340 so določili, da je GOX uspešno kataliziral reakcijo in vsi fuzijski proteini so bili podobno učinkoviti.
- Zaradi omejenega časa za eksperimente so uspeli preizkusiti le kombinaciji INPNC-iNap in iNap-AIDA. Merili so časovno odvisnost fluorescence pri različnih koncentracijah NADPH in tudi tokrat pokazali uspešno delovanje obeh fuzijskih proteinov.
- Pripravili so suspenzijo, kjer so hkrati dodali celice z vsakim od treh proteinov (pritrjenih preko INPNC). Suspenziji so dodali glifosat in NADPH ter spremljali fluorescenco skozi čas. V primerjavi s kontrolo brez izraženih proteinov je v suspenziji prišlo do znatnega upada fluorescence, s čimer so potrdili delovanje njihovega sistema.

=Razgradnja=

==Osnovni princip==
Poleg sistema za detekcijo glifosata v vzorcu so želeli pripraviti tudi gensko spremenjeno bakterijo ''E. coli'', ki bi lahko glifosat in njegov derivat AMPA v okolju razgradila v neškodljive produkte. Za razliko od pristopa za detekcijo glifosata, bi tokrat njegova razgradnja potekala po alternativni poti, ki temelji na cepitvi vezi C-P. Za tak mehanizem razgradnje so odgovorni encimi, ki so zapisani na operonu ''phn'', ki ga najdemo pri številnih bakterijah, tudi ''E. coli''. Proteini PhnC, D in E predstavljajo sistem za aktivni transport fosfonskih kislin v celico, medtem ko kompleks PhnGHIJK, katerega glavna katalitična komponenta je PhnJ, katalizira cepitev vezi C-P s hkratno hidrolizo ATP. Po odstranitvi fosfitne skupine z glifosata, se sprosti N-metilglicin, ki pa se lahko v celici naprej oksidira do formaldehida in glicina.
Encim PhnO katalizira prenos acetilne skupine iz acetil koencima A na AMPA. Acetiliran AMPA lahko deluje kot substrat za PhnGHIJK, ki ga razgradi do N-metilacetamida. PhnO in PhnGHIJK lahko torej razgrajujejo tako glifosat kot tudi AMPA [6].

==Eksperimenti==
Da bi izboljšali razgradnjo glifosata in AMPA v ''E. coli'' so želeli nekatere gene phn nadomestiti s homologi iz drugih organizmov, kjer ta razgradnja poteka učinkoviteje. Vstaviti so želeli gene phnJ iz Enterobacter cloacae K7 [7], phnO iz Salmonella enterica [8] in phnE1/E2 iz Sinorhizobium meliloti 1021 [9]. Hkrati so želeli inhibirati izražanje endognih zapisov za PhnF, ki deluje kot represor za nekatere gene phn [6], in PhnJ, ki bi lahko z rekombninantnim PhnJ tekmoval za podenote kompleksa PhnGHJIK. Kot metodo inhibicije izražanja so izbrali siRNA.
Pripravili so biokocko BBa_K3332099, ki je vsebovala vse potrebne zapise. Izražanje genov za proteine so nadzorovali promotorji J23100 in RBS BBa_B0034, tako da sta imela phnJ in phnO vsak svoj promotor in RBS, phnE1 in phnE2 pa sta bila povezana policistronsko. Uporabili so terminator BBa_B0015. Za siRNA so uporabili promotor BBa_J23101 in terminator BBa_J61048, zaporedjem pa so za boljšo stabilnost in učinkovitost dodali še zaporedje OmpA 5' UTR [10] in vezavno mesto za Hfq [11].
S konstruktom, ki je vseboval pripravljeno biokocko, so transformirali ''E. coli'' BL21(DE3). Bakterije so gojili v gojišču z glifosatom in po 5 h določili koncentracijo preostalega glifosata v gojišču tako, da so uporabili svoj sistem za detekcijo. Primerjali so konstrukte z različnimi kombinacijami zapisov, vendar je bila najuspešnejša biokocka opisana zgoraj, ki je vsebovala vse zapise hkrati. Medtem ko so bakterije v negativni kontroli po 5 h privzele 8,6 % glifosata iz gojišča, so E. coli z biokocko privzele 43,1 %.

=Stikala smrti=

=Stikalo za sistem detekcije=
Stikalo smrti pri sistemu detekcije glifosata bi zagotovilo, da bi gensko spremenjene E. coli odmrle, če bi se sprostile v okolje. Gojišče, v katerem bi potekala detekcija glifosata v vzorcu, bi vsebovalo arabinozo, ki bi inhibirala sintezo citotoksične nukleaze MazF [12]. V primeru, da bi bakterije zapustile to goijšče, bi se mazF lahko izražal in privedel do celične smrti.
Pripravili so preprosto napravo BBa_K3332078, ki deluje kot inverter. Promotor pBAD nadzoruje izražanje zapisa za cI, promotor pR pa nadzoruje izražanje mazF. Arabinoza povzroči preklop araC iz represorske v aktivatorsko obliko, kar spodbudi izražanje cI, cI pa inhibira transkripcijo mazF. V odsotnosti arabinoze bo araC inhibiral izražanje cI, torej bo transkripcija mazF lahko potekala.
Pripravili so eksperiment, kjer so celice z inverterjem gojili v prisotnosti ali odsotnosti arabinoze. Rast bakterij so določili s štetjem CFU po različnih časih inkubacije. Ob prisotnosti arabinoze niso opazili znatnih sprememb v številu kolonij, medtem ko je pri odsotnosti arabinoze število kolonij izrazito upadlo v roku 8 h.

=Stikalo za sistem degradacije=
Sistem za degradacijo glifosata bi predvidoma deloval tako, da bi suspenzijo bakterij vnesli neposredno v prst, v kateri želimo odstraniti glifosat. Da bi preprečili nenadzorovano širjenje gensko spremenjenih bakterij, bi stikalo za smrt poskrbelo, da bakterije uspešno razgradijo glifosat, nato pa po opravljeni nalogi odmrejo. Zamislili so si napravo, ki bi ob prisotnosti glifosata zavirala izražanje mazF, v njegovi odsotnosti pa se bi mazF izražal in vodil v smrt.
Biokocka BBa_K3332078 deluje kot inverter. Namesto neposredne detekcije glifosata, so kot merilo njegove prisotnosti uporabili formaldehid, ki je eden od produktov ob razgradnji glifosata. HxlR je transkripcijski faktor, ki ob vezavi formaldehida deluje kot aktivator promotorja pHCHO [13]. pHCHO nadzoruje izražanje cI, promotor pR pa izražanje mazF. Ob prisotnosti formaldehida, bo HxlR aktiviral transkripcijo cI, cI pa bo onemogočil izražanje mazF. Kadar pa je formaldehid odsoten, transkripcija cI ne bo potekala in posledično se mazF lahko izraža.
Zaradi omejenega časa za eksperimentalno delo, so utegnili preizkusiti le delovanje posameznih sestavnih delov tega stikala, niso pa uspeli izvesti eksperimenta s celotno biokocko.

=Viri=

1. S. Singh, V. Kumar, S. Datta, A. B. Wani, D. S. Dhanjal, R. Romero, J. Singh: Glyphosate Uptake, Translocation, Resistance Emergence in Crops, Analytical Monitoring, Toxicity and Degradation: A Review. Environmental Chemistry Letters. Springer May 1, 2020, pp. 663–702.
2. World Health Organization: Glyphosate and AMPA in Drinking-water http://www.who.int/water_sanitation_health/ (pridobljeno 18. 4. 2021).
3. L. Pan, Q. Yu, H. Han, L. Mao, A. Nyporko, L. J. Fan, L. Bai, S. Powles: Aldo-keto reductase metabolizes glyphosate and confers glyphosate resistance in Echinochloa colona. Plant Physiol. 2019, 181(4), str. 1519–1534.
4. G. Rumsby, D. P. Cregeen: Identification and expression of a cDNA for human hydroxypyruvate/glyoxylate reductase. Biochim. Biophys. Acta - Gene Struct. Expr. 1999, 1446(3), str. 383–388.
5. R. Tao, Y. Zhao, H. Chu, A. Wang, J. Zhu, X. Chen, Y. Zou, M. Shi, R. Liu, … Y. Yang: Genetically encoded fluorescent sensors reveal dynamic regulation of NADPH metabolism. Nat. Methods 2017, 14(7), str. 720–728.
6. B. Hove-Jensen, D. L. Zechel, B. Jochimsen: Utilization of Glyphosate as Phosphate Source: Biochemistry and Genetics of Bacterial Carbon-Phosphorus Lyase. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2014, 78(1), str. 176–197.
7. Y. V. Kryuchkova, G. L. Burygin, N. E. Gogoleva, Y. V. Gogolev, M. P. Chernyshova, O. E. Makarov, E. E. Fedorov, O. V. Turkovskaya: Isolation and characterization of a glyphosate-degrading rhizosphere strain, Enterobacter cloacae K7. Microbiol. Res. 2014, 169(1), str. 99–105.
8. J. C. Errey, J. S. Blanchard: Functional annotation and kinetic characterization of PhnO from Salmonella enterica. Biochemistry 2006, 45(9), str. 3033–3039.
9. C. M. Liu, P. A. McLean, C. C. Sookdeo, F. C. Cannon: Degradation of the herbicide glyphosate by members of the family Rhizobiaceae. Appl. Environ. Microbiol. 1991, 57(6), str. 1799–1804.
10. M. J. Hansen, L. ‐H Chen, M. L. S. Fejzo, J. G. Beiasco: The ompA 5′ untranslated region impedes a major pathway for mRNA degradation in Escherichia coli. Mol. Microbiol. 1994, 12(5), str. 707–716.
11. G. M. Cech, A. Szalewska-Palasz, K. Kubiak, A. Malabirade, W. Grange, V. Arluison, G. Wegrzyn: The Escherichia Coli Hfq Protein: An Unattended DNA-Transactions Regulator. Frontiers in Molecular Biosciences. Frontiers Media S.A. July 28, 2016, p. 36.
12. Y. Zhang, J. Zhang, K. P. Hoeflich, M. Ikura, G. Qing, M. Inouye: MazF cleaves cellular mRNAs specifically at ACA to block protein synthesis in Escherichia coli. Mol. Cell 2003, 12(4), str. 913–923.
13. R. Zhu, G. Zhang, M. Jing, Y. Han, J. Li, J. Zhao, Y. Li, P. R. Chen: Genetically encoded formaldehyde sensors inspired by a protein intra-helical crosslinking reaction. Nat. Commun. 2021, 12(1), str. 1–13.

Antea-Glyphosate: Detekcija in razgradnja glifosata

2021-04-19T17:15:15Z

JernejI:

Antea-Glyphosate je projekt v okviru tekmovanja leta iGEM 2020, ki so ga pripravili študentje z univerze Xiamen na Kitajskem.
Povezava do projekta: [https://2020.igem.org/Team:XMU-China https://2020.igem.org/Team:XMU-China]

Avtor povzetka: Jernej Imperl

=Uvod=

Glifosat je eden od najširše uporabljanih herbicidov in mnoge raziskave nakazujejo na možne škodljive učinke za netarčne rastline, mikroorganizme in živali [1]. Kljub temu da človek v vsakdanjem življenju ni izpostavljen nevarnim količinam glifosata [1, 2], je njegova prisotnost v prsti in vodi zaskrbljujoča.
Ker glifosat v strukturi ne vsebuje nobenih kromofornih ali fluorofornih skupin, je njegova detekcija zapletena in zamudna. Prav tako bi bilo za učinkovito odstranjevanje glifosata iz okolja potrebno razviti hitro metodo, ki bi delovala pod različnimi okolijskimi pogoji [1].
Skupina iGEM iz univerze Xiamen na Kitajskem si je za cilj zadala rešiti ta dva problema in vzpostaviti sinteznobiološko rešitev za detekcijo in razgradnjo glifosata v prsti. Projekt so poimenovali Antea-Glyphosate, saj jim je idejo za projekt dal razmislek o intenzivni uporabi herbicidov pri pridelavi čaja. Pripravili so sistem za detekcijo glifosata in sistem za razgradnjo glifosata v prsti v vzorcu ter vsakega opremili s svojim stikalom smrti.
Poleg gensko spremenjenih bakterij so pripravili tudi merilni aparat, ki temelji na uporabi njihovega sistema za detekcijo glifosata in rezultate posreduje mobilni aplikaciji. V nadaljevanju je predstavljena predvsem sinteznobiološka plat njihovega projekta. Zaradi pandemije COVID-19 in omejenega časa za eksperimente so predstavljeni eksperimenti pretežno preliminarne narave (»proof of concept«).

=Detekcija=

==Osnovni princip==
Sistem za detekcijo glifosata z rekombinantno E. coli temelji na njegovi delni razgradnji in posrednem merjenju koncentracije NADPH, ki se ob reakciji porablja. Encim glifosat oksidoreduktaza (GOX) katalizira cepitev vezi C-N, kar vodi do nastanka glioksilata in aminometilfosfonske kisline (AMPA) [3]. Glioksilat reduktaza (GRHPR) nato katalizira redukcijo glioksilata v glikolno kislino, ob čemer se NADPH oksidira v NADP+ [4]. Protein iNap na koncu deluje kot senzor za NADPH, saj se ob vezavi tega kofaktorja konformacijsko spremeni in odda fluorescenčni signal [5]. Kadar je v raztopini torej prisoten glifosat, se bo ob njegovi encimski razgradnji NADPH pretvarjal v NADP+, kar pa bi lahko zaznali z merjenjem upada fluorescence iNap in tako določili koncentracijo glifosata.
Da bi se izognili alternativnim metabolnim potem in lažnim rezultatom zaradi citosolnega NADPH, so encime želeli pritrditi na zunanjo površino bakterijske celice, tako da bi jih fuzirali z membranskimi proteini. Kot fuzijske partnerje so preizkusili proteine INPNC, BrkA in AIDA.

==Eksperiment==
V eksperimentu so želeli preizkusiti delovanje proteinov, ko so bili ti pritrjeni na površino celic. V predhodnih eksperimentih so potrdili uspešno izražanje izbranih proteinov na površini celice. Pripravili so biokocke BBa_K2922060, BBa_K3332057, BBa_K3332059 (za GRHPR), BBa_K3332052, BBa_K3332054, BBa_K3332055 (za GOX), BBa_K3332047, BBa_K3332049, BBa_K3332050 (za iNap), kjer je bil vsak izmed treh proteinov fuziran na tri različne membranske proteine: INPNC, BrkA ali AIDA. Biokocke so vsebovale promotor J23100, RBS BBa_B0034 in terminator BBa_B0015. Proteine so predstavili na površini E. coli DH5α in jih preizkusili v seriji eksperimentov.
- Suspenziji celic z izraženim GRHPR so dodali glioksilat in NADPH ter merili upadanje A340 zaradi porabe NADPH. Primerjali so učinkovitost encima z različnimi fuzijskimi partnerji in sklenili, da je bila izmed vseh najučinkovitejša kombinacija INPNC-GRHPR.
- V naslednjem eksperimentu so suspenziji celic z izraženim GOX dodali glifosat, NADPH in topno obliko encima GRHPR. Na podlagi upada A340 so določili, da je GOX uspešno kataliziral reakcijo in vsi fuzijski proteini so bili podobno učinkoviti.
- Zaradi omejenega časa za eksperimente so uspeli preizkusiti le kombinaciji INPNC-iNap in iNap-AIDA. Merili so časovno odvisnost fluorescence pri različnih koncentracijah NADPH in tudi tokrat pokazali uspešno delovanje obeh fuzijskih proteinov.
- Pripravili so suspenzijo, kjer so hkrati dodali celice z vsakim od treh proteinov (pritrjenih preko INPNC). Suspenziji so dodali glifosat in NADPH ter spremljali fluorescenco skozi čas. V primerjavi s kontrolo brez izraženih proteinov je v suspenziji prišlo do znatnega upada fluorescence, s čimer so potrdili delovanje njihovega sistema.

=Razgradnja=

==Osnovni princip==
Poleg sistema za detekcijo glifosata v vzorcu so želeli pripraviti tudi gensko spremenjeno bakterijo E. coli, ki bi lahko glifosat in njegov derivat AMPA v okolju razgradila v neškodljive produkte. Za razliko od pristopa za detekcijo glifosata, bi tokrat njegova razgradnja potekala po alternativni poti, ki temelji na cepitvi vezi C-P. Za tak mehanizem razgradnje so odgovorni encimi, ki so zapisani na operonu phn, ki ga najdemo pri številnih bakterijah, tudi E. coli. Proteini PhnC, D in E predstavljajo sistem za aktivni transport fosfonskih kislin v celico, medtem ko kompleks PhnGHIJK, katerega glavna katalitična komponenta je PhnJ, katalizira cepitev vezi C-P s hkratno hidrolizo ATP. Po odstranitvi fosfitne skupine z glifosata, se sprosti N-metilglicin, ki pa se lahko v celici naprej oksidira do formaldehida in glicina.
Encim PhnO katalizira prenos acetilne skupine iz acetil koencima A na AMPA. Acetiliran AMPA lahko deluje kot substrat za PhnGHIJK, ki ga razgradi do N-metilacetamida. PhnO in PhnGHIJK lahko torej razgrajujejo tako glifosat kot tudi AMPA [6].

==Eksperimenti==
Da bi izboljšali razgradnjo glifosata in AMPA v E. coli so želeli nekatere gene phn nadomestiti s homologi iz drugih organizmov, kjer ta razgradnja poteka učinkoviteje. Vstaviti so želeli gene phnJ iz Enterobacter cloacae K7 [7], phnO iz Salmonella enterica [8] in phnE1/E2 iz Sinorhizobium meliloti 1021 [9]. Hkrati so želeli inhibirati izražanje endognih zapisov za PhnF, ki deluje kot represor za nekatere gene phn [6], in PhnJ, ki bi lahko z rekombninantnim PhnJ tekmoval za podenote kompleksa PhnGHJIK. Kot metodo inhibicije izražanja so izbrali siRNA.
Pripravili so biokocko BBa_K3332099, ki je vsebovala vse potrebne zapise. Izražanje genov za proteine so nadzorovali promotorji J23100 in RBS BBa_B0034, tako da sta imela phnJ in phnO vsak svoj promotor in RBS, phnE1 in phnE2 pa sta bila povezana policistronsko. Uporabili so terminator BBa_B0015. Za siRNA so uporabili promotor BBa_J23101 in terminator BBa_J61048, zaporedjem pa so za boljšo stabilnost in učinkovitost dodali še zaporedje OmpA 5' UTR [10] in vezavno mesto za Hfq [11].
S konstruktom, ki je vseboval pripravljeno biokocko, so transformirali E. coli BL21(DE3). Bakterije so gojili v gojišču z glifosatom in po 5 h določili koncentracijo preostalega glifosata v gojišču tako, da so uporabili svoj sistem za detekcijo. Primerjali so konstrukte z različnimi kombinacijami zapisov, vendar je bila najuspešnejša biokocka opisana zgoraj, ki je vsebovala vse zapise hkrati. Medtem ko so bakterije v negativni kontroli po 5 h privzele 8,6 % glifosata iz gojišča, so E. coli z biokocko privzele 43,1 %.

=Stikala smrti=

=Stikalo za sistem detekcije=
Stikalo smrti pri sistemu detekcije glifosata bi zagotovilo, da bi gensko spremenjene E. coli odmrle, če bi se sprostile v okolje. Gojišče, v katerem bi potekala detekcija glifosata v vzorcu, bi vsebovalo arabinozo, ki bi inhibirala sintezo citotoksične nukleaze MazF [12]. V primeru, da bi bakterije zapustile to goijšče, bi se mazF lahko izražal in privedel do celične smrti.
Pripravili so preprosto napravo BBa_K3332078, ki deluje kot inverter. Promotor pBAD nadzoruje izražanje zapisa za cI, promotor pR pa nadzoruje izražanje mazF. Arabinoza povzroči preklop araC iz represorske v aktivatorsko obliko, kar spodbudi izražanje cI, cI pa inhibira transkripcijo mazF. V odsotnosti arabinoze bo araC inhibiral izražanje cI, torej bo transkripcija mazF lahko potekala.
Pripravili so eksperiment, kjer so celice z inverterjem gojili v prisotnosti ali odsotnosti arabinoze. Rast bakterij so določili s štetjem CFU po različnih časih inkubacije. Ob prisotnosti arabinoze niso opazili znatnih sprememb v številu kolonij, medtem ko je pri odsotnosti arabinoze število kolonij izrazito upadlo v roku 8 h.

=Stikalo za sistem degradacije=
Sistem za degradacijo glifosata bi predvidoma deloval tako, da bi suspenzijo bakterij vnesli neposredno v prst, v kateri želimo odstraniti glifosat. Da bi preprečili nenadzorovano širjenje gensko spremenjenih bakterij, bi stikalo za smrt poskrbelo, da bakterije uspešno razgradijo glifosat, nato pa po opravljeni nalogi odmrejo. Zamislili so si napravo, ki bi ob prisotnosti glifosata zavirala izražanje mazF, v njegovi odsotnosti pa se bi mazF izražal in vodil v smrt.
Biokocka BBa_K3332078 deluje kot inverter. Namesto neposredne detekcije glifosata, so kot merilo njegove prisotnosti uporabili formaldehid, ki je eden od produktov ob razgradnji glifosata. HxlR je transkripcijski faktor, ki ob vezavi formaldehida deluje kot aktivator promotorja pHCHO [13]. pHCHO nadzoruje izražanje cI, promotor pR pa izražanje mazF. Ob prisotnosti formaldehida, bo HxlR aktiviral transkripcijo cI, cI pa bo onemogočil izražanje mazF. Kadar pa je formaldehid odsoten, transkripcija cI ne bo potekala in posledično se mazF lahko izraža.
Zaradi omejenega časa za eksperimentalno delo, so utegnili preizkusiti le delovanje posameznih sestavnih delov tega stikala, niso pa uspeli izvesti eksperimenta s celotno biokocko.

=Viri=

1. S. Singh, V. Kumar, S. Datta, A. B. Wani, D. S. Dhanjal, R. Romero, J. Singh: Glyphosate Uptake, Translocation, Resistance Emergence in Crops, Analytical Monitoring, Toxicity and Degradation: A Review. Environmental Chemistry Letters. Springer May 1, 2020, pp. 663–702.
2. World Health Organization: Glyphosate and AMPA in Drinking-water http://www.who.int/water_sanitation_health/ (pridobljeno 18. 4. 2021).
3. L. Pan, Q. Yu, H. Han, L. Mao, A. Nyporko, L. J. Fan, L. Bai, S. Powles: Aldo-keto reductase metabolizes glyphosate and confers glyphosate resistance in Echinochloa colona. Plant Physiol. 2019, 181(4), str. 1519–1534.
4. G. Rumsby, D. P. Cregeen: Identification and expression of a cDNA for human hydroxypyruvate/glyoxylate reductase. Biochim. Biophys. Acta - Gene Struct. Expr. 1999, 1446(3), str. 383–388.
5. R. Tao, Y. Zhao, H. Chu, A. Wang, J. Zhu, X. Chen, Y. Zou, M. Shi, R. Liu, … Y. Yang: Genetically encoded fluorescent sensors reveal dynamic regulation of NADPH metabolism. Nat. Methods 2017, 14(7), str. 720–728.
6. B. Hove-Jensen, D. L. Zechel, B. Jochimsen: Utilization of Glyphosate as Phosphate Source: Biochemistry and Genetics of Bacterial Carbon-Phosphorus Lyase. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2014, 78(1), str. 176–197.
7. Y. V. Kryuchkova, G. L. Burygin, N. E. Gogoleva, Y. V. Gogolev, M. P. Chernyshova, O. E. Makarov, E. E. Fedorov, O. V. Turkovskaya: Isolation and characterization of a glyphosate-degrading rhizosphere strain, Enterobacter cloacae K7. Microbiol. Res. 2014, 169(1), str. 99–105.
8. J. C. Errey, J. S. Blanchard: Functional annotation and kinetic characterization of PhnO from Salmonella enterica. Biochemistry 2006, 45(9), str. 3033–3039.
9. C. M. Liu, P. A. McLean, C. C. Sookdeo, F. C. Cannon: Degradation of the herbicide glyphosate by members of the family Rhizobiaceae. Appl. Environ. Microbiol. 1991, 57(6), str. 1799–1804.
10. M. J. Hansen, L. ‐H Chen, M. L. S. Fejzo, J. G. Beiasco: The ompA 5′ untranslated region impedes a major pathway for mRNA degradation in Escherichia coli. Mol. Microbiol. 1994, 12(5), str. 707–716.
11. G. M. Cech, A. Szalewska-Palasz, K. Kubiak, A. Malabirade, W. Grange, V. Arluison, G. Wegrzyn: The Escherichia Coli Hfq Protein: An Unattended DNA-Transactions Regulator. Frontiers in Molecular Biosciences. Frontiers Media S.A. July 28, 2016, p. 36.
12. Y. Zhang, J. Zhang, K. P. Hoeflich, M. Ikura, G. Qing, M. Inouye: MazF cleaves cellular mRNAs specifically at ACA to block protein synthesis in Escherichia coli. Mol. Cell 2003, 12(4), str. 913–923.
13. R. Zhu, G. Zhang, M. Jing, Y. Han, J. Li, J. Zhao, Y. Li, P. R. Chen: Genetically encoded formaldehyde sensors inspired by a protein intra-helical crosslinking reaction. Nat. Commun. 2021, 12(1), str. 1–13.

Antea-Glyphosate: Detekcija in razgradnja glifosata

2021-04-19T17:13:26Z

JernejI: New page: Antea-Glyphosate je projekt v okviru tekmovanja iGEM, ki so ga pripravili študentje z univerze Xiamen na Kitajskem. Povezava do projekta: [https://2020.igem.org/Team:XMU-China] =Uvod= ...

Antea-Glyphosate je projekt v okviru tekmovanja iGEM, ki so ga pripravili študentje z univerze Xiamen na Kitajskem.
Povezava do projekta: [https://2020.igem.org/Team:XMU-China]

=Uvod=

Glifosat je eden od najširše uporabljanih herbicidov in mnoge raziskave nakazujejo na možne škodljive učinke za netarčne rastline, mikroorganizme in živali [1]. Kljub temu da človek v vsakdanjem življenju ni izpostavljen nevarnim količinam glifosata [1, 2], je njegova prisotnost v prsti in vodi zaskrbljujoča.
Ker glifosat v strukturi ne vsebuje nobenih kromofornih ali fluorofornih skupin, je njegova detekcija zapletena in zamudna. Prav tako bi bilo za učinkovito odstranjevanje glifosata iz okolja potrebno razviti hitro metodo, ki bi delovala pod različnimi okolijskimi pogoji [1].
Skupina iGEM iz univerze Xiamen na Kitajskem si je za cilj zadala rešiti ta dva problema in vzpostaviti sinteznobiološko rešitev za detekcijo in razgradnjo glifosata v prsti. Projekt so poimenovali Antea-Glyphosate, saj jim je idejo za projekt dal razmislek o intenzivni uporabi herbicidov pri pridelavi čaja. Pripravili so sistem za detekcijo glifosata in sistem za razgradnjo glifosata v prsti v vzorcu ter vsakega opremili s svojim stikalom smrti.
Poleg gensko spremenjenih bakterij so pripravili tudi merilni aparat, ki temelji na uporabi njihovega sistema za detekcijo glifosata in rezultate posreduje mobilni aplikaciji. V nadaljevanju je predstavljena predvsem sinteznobiološka plat njihovega projekta. Zaradi pandemije COVID-19 in omejenega časa za eksperimente so predstavljeni eksperimenti pretežno preliminarne narave (»proof of concept«).

=Detekcija=

==Osnovni princip==
Sistem za detekcijo glifosata z rekombinantno E. coli temelji na njegovi delni razgradnji in posrednem merjenju koncentracije NADPH, ki se ob reakciji porablja. Encim glifosat oksidoreduktaza (GOX) katalizira cepitev vezi C-N, kar vodi do nastanka glioksilata in aminometilfosfonske kisline (AMPA) [3]. Glioksilat reduktaza (GRHPR) nato katalizira redukcijo glioksilata v glikolno kislino, ob čemer se NADPH oksidira v NADP+ [4]. Protein iNap na koncu deluje kot senzor za NADPH, saj se ob vezavi tega kofaktorja konformacijsko spremeni in odda fluorescenčni signal [5]. Kadar je v raztopini torej prisoten glifosat, se bo ob njegovi encimski razgradnji NADPH pretvarjal v NADP+, kar pa bi lahko zaznali z merjenjem upada fluorescence iNap in tako določili koncentracijo glifosata.
Da bi se izognili alternativnim metabolnim potem in lažnim rezultatom zaradi citosolnega NADPH, so encime želeli pritrditi na zunanjo površino bakterijske celice, tako da bi jih fuzirali z membranskimi proteini. Kot fuzijske partnerje so preizkusili proteine INPNC, BrkA in AIDA.

==Eksperiment==
V eksperimentu so želeli preizkusiti delovanje proteinov, ko so bili ti pritrjeni na površino celic. V predhodnih eksperimentih so potrdili uspešno izražanje izbranih proteinov na površini celice. Pripravili so biokocke BBa_K2922060, BBa_K3332057, BBa_K3332059 (za GRHPR), BBa_K3332052, BBa_K3332054, BBa_K3332055 (za GOX), BBa_K3332047, BBa_K3332049, BBa_K3332050 (za iNap), kjer je bil vsak izmed treh proteinov fuziran na tri različne membranske proteine: INPNC, BrkA ali AIDA. Biokocke so vsebovale promotor J23100, RBS BBa_B0034 in terminator BBa_B0015. Proteine so predstavili na površini E. coli DH5α in jih preizkusili v seriji eksperimentov.
- Suspenziji celic z izraženim GRHPR so dodali glioksilat in NADPH ter merili upadanje A340 zaradi porabe NADPH. Primerjali so učinkovitost encima z različnimi fuzijskimi partnerji in sklenili, da je bila izmed vseh najučinkovitejša kombinacija INPNC-GRHPR.
- V naslednjem eksperimentu so suspenziji celic z izraženim GOX dodali glifosat, NADPH in topno obliko encima GRHPR. Na podlagi upada A340 so določili, da je GOX uspešno kataliziral reakcijo in vsi fuzijski proteini so bili podobno učinkoviti.
- Zaradi omejenega časa za eksperimente so uspeli preizkusiti le kombinaciji INPNC-iNap in iNap-AIDA. Merili so časovno odvisnost fluorescence pri različnih koncentracijah NADPH in tudi tokrat pokazali uspešno delovanje obeh fuzijskih proteinov.
- Pripravili so suspenzijo, kjer so hkrati dodali celice z vsakim od treh proteinov (pritrjenih preko INPNC). Suspenziji so dodali glifosat in NADPH ter spremljali fluorescenco skozi čas. V primerjavi s kontrolo brez izraženih proteinov je v suspenziji prišlo do znatnega upada fluorescence, s čimer so potrdili delovanje njihovega sistema.

=Razgradnja=

==Osnovni princip==
Poleg sistema za detekcijo glifosata v vzorcu so želeli pripraviti tudi gensko spremenjeno bakterijo E. coli, ki bi lahko glifosat in njegov derivat AMPA v okolju razgradila v neškodljive produkte. Za razliko od pristopa za detekcijo glifosata, bi tokrat njegova razgradnja potekala po alternativni poti, ki temelji na cepitvi vezi C-P. Za tak mehanizem razgradnje so odgovorni encimi, ki so zapisani na operonu phn, ki ga najdemo pri številnih bakterijah, tudi E. coli. Proteini PhnC, D in E predstavljajo sistem za aktivni transport fosfonskih kislin v celico, medtem ko kompleks PhnGHIJK, katerega glavna katalitična komponenta je PhnJ, katalizira cepitev vezi C-P s hkratno hidrolizo ATP. Po odstranitvi fosfitne skupine z glifosata, se sprosti N-metilglicin, ki pa se lahko v celici naprej oksidira do formaldehida in glicina.
Encim PhnO katalizira prenos acetilne skupine iz acetil koencima A na AMPA. Acetiliran AMPA lahko deluje kot substrat za PhnGHIJK, ki ga razgradi do N-metilacetamida. PhnO in PhnGHIJK lahko torej razgrajujejo tako glifosat kot tudi AMPA [6].

==Eksperimenti==
Da bi izboljšali razgradnjo glifosata in AMPA v E. coli so želeli nekatere gene phn nadomestiti s homologi iz drugih organizmov, kjer ta razgradnja poteka učinkoviteje. Vstaviti so želeli gene phnJ iz Enterobacter cloacae K7 [7], phnO iz Salmonella enterica [8] in phnE1/E2 iz Sinorhizobium meliloti 1021 [9]. Hkrati so želeli inhibirati izražanje endognih zapisov za PhnF, ki deluje kot represor za nekatere gene phn [6], in PhnJ, ki bi lahko z rekombninantnim PhnJ tekmoval za podenote kompleksa PhnGHJIK. Kot metodo inhibicije izražanja so izbrali siRNA.
Pripravili so biokocko BBa_K3332099, ki je vsebovala vse potrebne zapise. Izražanje genov za proteine so nadzorovali promotorji J23100 in RBS BBa_B0034, tako da sta imela phnJ in phnO vsak svoj promotor in RBS, phnE1 in phnE2 pa sta bila povezana policistronsko. Uporabili so terminator BBa_B0015. Za siRNA so uporabili promotor BBa_J23101 in terminator BBa_J61048, zaporedjem pa so za boljšo stabilnost in učinkovitost dodali še zaporedje OmpA 5' UTR [10] in vezavno mesto za Hfq [11].
S konstruktom, ki je vseboval pripravljeno biokocko, so transformirali E. coli BL21(DE3). Bakterije so gojili v gojišču z glifosatom in po 5 h določili koncentracijo preostalega glifosata v gojišču tako, da so uporabili svoj sistem za detekcijo. Primerjali so konstrukte z različnimi kombinacijami zapisov, vendar je bila najuspešnejša biokocka opisana zgoraj, ki je vsebovala vse zapise hkrati. Medtem ko so bakterije v negativni kontroli po 5 h privzele 8,6 % glifosata iz gojišča, so E. coli z biokocko privzele 43,1 %.

=Stikala smrti=

=Stikalo za sistem detekcije=
Stikalo smrti pri sistemu detekcije glifosata bi zagotovilo, da bi gensko spremenjene E. coli odmrle, če bi se sprostile v okolje. Gojišče, v katerem bi potekala detekcija glifosata v vzorcu, bi vsebovalo arabinozo, ki bi inhibirala sintezo citotoksične nukleaze MazF [12]. V primeru, da bi bakterije zapustile to goijšče, bi se mazF lahko izražal in privedel do celične smrti.
Pripravili so preprosto napravo BBa_K3332078, ki deluje kot inverter. Promotor pBAD nadzoruje izražanje zapisa za cI, promotor pR pa nadzoruje izražanje mazF. Arabinoza povzroči preklop araC iz represorske v aktivatorsko obliko, kar spodbudi izražanje cI, cI pa inhibira transkripcijo mazF. V odsotnosti arabinoze bo araC inhibiral izražanje cI, torej bo transkripcija mazF lahko potekala.
Pripravili so eksperiment, kjer so celice z inverterjem gojili v prisotnosti ali odsotnosti arabinoze. Rast bakterij so določili s štetjem CFU po različnih časih inkubacije. Ob prisotnosti arabinoze niso opazili znatnih sprememb v številu kolonij, medtem ko je pri odsotnosti arabinoze število kolonij izrazito upadlo v roku 8 h.

=Stikalo za sistem degradacije=
Sistem za degradacijo glifosata bi predvidoma deloval tako, da bi suspenzijo bakterij vnesli neposredno v prst, v kateri želimo odstraniti glifosat. Da bi preprečili nenadzorovano širjenje gensko spremenjenih bakterij, bi stikalo za smrt poskrbelo, da bakterije uspešno razgradijo glifosat, nato pa po opravljeni nalogi odmrejo. Zamislili so si napravo, ki bi ob prisotnosti glifosata zavirala izražanje mazF, v njegovi odsotnosti pa se bi mazF izražal in vodil v smrt.
Biokocka BBa_K3332078 deluje kot inverter. Namesto neposredne detekcije glifosata, so kot merilo njegove prisotnosti uporabili formaldehid, ki je eden od produktov ob razgradnji glifosata. HxlR je transkripcijski faktor, ki ob vezavi formaldehida deluje kot aktivator promotorja pHCHO [13]. pHCHO nadzoruje izražanje cI, promotor pR pa izražanje mazF. Ob prisotnosti formaldehida, bo HxlR aktiviral transkripcijo cI, cI pa bo onemogočil izražanje mazF. Kadar pa je formaldehid odsoten, transkripcija cI ne bo potekala in posledično se mazF lahko izraža.
Zaradi omejenega časa za eksperimentalno delo, so utegnili preizkusiti le delovanje posameznih sestavnih delov tega stikala, niso pa uspeli izvesti eksperimenta s celotno biokocko.

=Viri=

1. S. Singh, V. Kumar, S. Datta, A. B. Wani, D. S. Dhanjal, R. Romero, J. Singh: Glyphosate Uptake, Translocation, Resistance Emergence in Crops, Analytical Monitoring, Toxicity and Degradation: A Review. Environmental Chemistry Letters. Springer May 1, 2020, pp. 663–702.
2. World Health Organization: Glyphosate and AMPA in Drinking-water http://www.who.int/water_sanitation_health/ (pridobljeno 18. 4. 2021).
3. L. Pan, Q. Yu, H. Han, L. Mao, A. Nyporko, L. J. Fan, L. Bai, S. Powles: Aldo-keto reductase metabolizes glyphosate and confers glyphosate resistance in Echinochloa colona. Plant Physiol. 2019, 181(4), str. 1519–1534.
4. G. Rumsby, D. P. Cregeen: Identification and expression of a cDNA for human hydroxypyruvate/glyoxylate reductase. Biochim. Biophys. Acta - Gene Struct. Expr. 1999, 1446(3), str. 383–388.
5. R. Tao, Y. Zhao, H. Chu, A. Wang, J. Zhu, X. Chen, Y. Zou, M. Shi, R. Liu, … Y. Yang: Genetically encoded fluorescent sensors reveal dynamic regulation of NADPH metabolism. Nat. Methods 2017, 14(7), str. 720–728.
6. B. Hove-Jensen, D. L. Zechel, B. Jochimsen: Utilization of Glyphosate as Phosphate Source: Biochemistry and Genetics of Bacterial Carbon-Phosphorus Lyase. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2014, 78(1), str. 176–197.
7. Y. V. Kryuchkova, G. L. Burygin, N. E. Gogoleva, Y. V. Gogolev, M. P. Chernyshova, O. E. Makarov, E. E. Fedorov, O. V. Turkovskaya: Isolation and characterization of a glyphosate-degrading rhizosphere strain, Enterobacter cloacae K7. Microbiol. Res. 2014, 169(1), str. 99–105.
8. J. C. Errey, J. S. Blanchard: Functional annotation and kinetic characterization of PhnO from Salmonella enterica. Biochemistry 2006, 45(9), str. 3033–3039.
9. C. M. Liu, P. A. McLean, C. C. Sookdeo, F. C. Cannon: Degradation of the herbicide glyphosate by members of the family Rhizobiaceae. Appl. Environ. Microbiol. 1991, 57(6), str. 1799–1804.
10. M. J. Hansen, L. ‐H Chen, M. L. S. Fejzo, J. G. Beiasco: The ompA 5′ untranslated region impedes a major pathway for mRNA degradation in Escherichia coli. Mol. Microbiol. 1994, 12(5), str. 707–716.
11. G. M. Cech, A. Szalewska-Palasz, K. Kubiak, A. Malabirade, W. Grange, V. Arluison, G. Wegrzyn: The Escherichia Coli Hfq Protein: An Unattended DNA-Transactions Regulator. Frontiers in Molecular Biosciences. Frontiers Media S.A. July 28, 2016, p. 36.
12. Y. Zhang, J. Zhang, K. P. Hoeflich, M. Ikura, G. Qing, M. Inouye: MazF cleaves cellular mRNAs specifically at ACA to block protein synthesis in Escherichia coli. Mol. Cell 2003, 12(4), str. 913–923.
13. R. Zhu, G. Zhang, M. Jing, Y. Han, J. Li, J. Zhao, Y. Li, P. R. Chen: Genetically encoded formaldehyde sensors inspired by a protein intra-helical crosslinking reaction. Nat. Commun. 2021, 12(1), str. 1–13.

Seminarji SB 2020/21

2021-04-19T17:00:19Z

JernejI:

V študijskem letu 2020/21 študentje 1. letnika predstavljajo naslednje teme:

RAZISKOVALNI ČLANKI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) 

1 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Proizvodnja_1,3-propandiola_iz_različnih_ogljikovodikov_po_nenaravni_poti_preko_3-hidroksipropanojske_kisline Proizvodnja 1,3-propandiola iz različnih ogljikovodikov po nenaravni poti preko 3-hidroksipropanojske kisline]
(Liza Ulčakar) 
2 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Doseganje_asimetri%C4%8Dnosti_in_asimetri%C4%8Dne_delitve_pri_E._coli Doseganje asimetričnosti in asimetrične delitve pri E. coli] (Aljaž Bratina) 
3 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Zmanj%C5%A1ana_procesivnost_ribosomov_v_sistemu_PURE Zmanjšana procesivnost ribosomov v sistemu PURE] (Tina Kolenc Milavec) 
4 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Na%C4%8Drtovana_pot_zvijanja_proteinskih_origamijev Načrtovana pot zvijanja proteinskih origamijev] (Anamarija Agnič) 
5 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/U%C4%8Dinkovita_svetlobno_inducibilna_Dre_rekombinaza_za_%C4%8Dasovno_in_prostorsko_celi%C4%8Dno_specifi%C4%8Dno_urejanje_genoma_v_mi%C5%A1jih_modelih#VIRI Učinkovita svetlobno inducibilna Dre rekombinaza za časovno in prostorsko celično specifično urejanje genoma v mišjih modelih] (Nika Mikulič Vernik) 
6 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Vzpostavitev_termometra_tRNA_za_dolo%C4%8Danje_temperature_optimalne_rasti_mikroorganizmov Vzpostavitev termometra tRNA za določanje temperature optimalne rasti mikroorganizmov] (Urša Štrancar) 
7 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Racionalna_zasnova_minimalnih_sinteti%C4%8Dnih_promotorjev_za_rastline#Construction_of_plasmids Racionalna zasnova minimalnih sintetičnih promotorjev za rastline] (Almina Tahirović) 

NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.) 

1 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/RESHAPE_-_spreminjanje_morfologije_nitastih_gliv RESHAPE - spreminjanje morfologije nitastih gliv]
(Špela Supej) 
2 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/The_Chlamy_Cleaner:_razgradnja_pesticida_z_zeleno_algo The Chlamy Cleaner: razgradnja pesticida z zeleno algo] (Doroteja Armič) 
3 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/TheraPUFA:_nazalni_probiotik_proti_okužbam_in_vnetjem TheraPUFA- nazalni probiotik proti okužbam in vnetjem] (Barbara Slapnik) 
4 [[S-POP: Modularni biosenzor za zaznavanje obstojnih organskih onesnaževal v okoljskih vodah]] (Tadej Medved) 
5 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/MARS-magnetni_sistem_za_recikliranje_ATP MARS-magnetni sistem za recikliranje ATP] (David Miškić) 
6 [[B.O.T.: Bakterijska oscilacijska terapija za zdravljenje kolorektalnega raka]] (Neža Pavko) 
7 [[iGEMINI: Kvasovke kot prehransko dopolnilo v vesolju]] (Klementina Polanec) 
8 [[Antea-Glyphosate: Detekcija in razgradnja glifosata]] (Jernej Imperl) 
----

Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Povzetek je treba objaviti dva dni pred predstavitvijo do polnoči (za seminarje v sredo torej v ponedeljek). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo razprava, ki praviloma ne bo daljša od 5 minut.

Razvoj ekspresijskega sistema za proizvodnjo farmacevtskih proteinov v rastlini Mucuna bracteata

2021-03-17T14:48:38Z

JernejI:

==''Mucuna bracteata''==

''Mucuna bracteata'' je stročnica, ki se pogosto uporablja pri kolobarjenju na plantažah v tropskih delih sveta [1]. Njene glavne koristne lastnosti so preprostost sejanja, sposobnost vezave dušika v prst (preko simbiotskih bakterij) in odvračanje plevela z alelopatskimi kemikalijami. Ker gre za hitro rastočo rastlino, ki se ne uporablja kot živilo, predstavlja ''M. bracteata'' zanimivo potencialno alternativo sesalskim celicam za proizvodnjo farmacevtskih proteinov [1, 2].

==Protitelesa proti ''Toxoplasma gondii''==
Raziskovalci so v ''M. bracteati'' pripravili himerna protitelesa proti parazitu ''Toxoplasma gondii''. Protitelesa so bila pripravljena na podlagi mišjih protiteles, ki so jih optimizirali z naključno mutagenezo na zankah CDR fragmentov scFv. Variabilni domeni iz fragmentov scFv so povezali s človeško regijo Fc in tako pripravili himerna protitelesa [3].

==Potek eksperimenta==

V raziskavi so v vektor pTRAkc-rfp-ERH ligirali zapisa za težko in lahko verigo himernega protitelesa proti T. gondii, tako da sta se oba nahajala med levo in desno mejo območja T-DNA. Zapisa sta bila vstavljena vsak pod svoj CaMV 35S promotor. Težki verigi so na C-konec dodali tudi zaporedje KDEL, ki omogoča izvoz proteina v endoplazemski retikulum [2].

Za transformacijo rastlinskih celic so uporabili bakterijo ''Agrobacterium tumefaciens''. Namesto klasične stabilne transformacije so se odločili za prehodno transformacijo, kjer so transformirali že rastoče rastlinsko tkivo. Na tak način je izražanje željenega proteina kratkotrajnejše in rastlina ni v celoti gensko spremenjena, vendar pa je sama metoda bistveno hitrejša in primernejša za proizvodnjo v velikem merilu [4].
''A. tumefaciens'' so transformirali z vektorjem in jo vnesli v rastlino s pomočjo vakumske infiltracije. 5 tednov staro rastlino so potopili v 1 L suspenzije z ''A. tumefaciens'', nato pa s pomočjo vakuuma dosegli prehod suspenzije v rastlinsko tkivo. 2, 4 ali 6 dni po transformaciji so z rastline pobrali liste in jih analizirali. Ker ''M. bracteata'' vsebuje razmeroma visoke koncentracije fenolov, ki lahko oborijo proteine, so pri ekstrakciji proteinov dodali reagente za vezavo fenolov. Protitelesa proti ''T. gondii'' so iz proteinskega ekstrakta izolirali s pomočjo afinitetne kromatografije s proteinom A [2].

Celokupno koncentracijo proteinov v listih so določili z metodo po Bradfordu. Koncentracijo izoliranih protiteles so določili z absorbanco pri 280 nm. Njihovo velikost so določili s prenosom western s protitelesi proti človeškemu Fab, vezavo rekombinantnih protiteles na antigene ''T. gondii'' pa so določili z metodo ELISA [2].

==Rezultati==

Ker so uporabili rastlino staro le 5 tednov, je imela ta le tri sete listov. Ugotovili so, da je bila v najnižjih (najstarejših) listih najvišja koncentracija rekombinantnih protiteles. V najnižjih listih je bila koncentracija protiteles v povprečju 314 µg/g svežega lista, medtem ko je bila v srednjih in najvišjih listih okoli 200 µg/g svežega lista. Odstopanje bi lahko bilo posledica nekaterih strukturnih značilnosti mladih listov, ki bi lahko ovirale infiltracijo ''A. tumefaciens'' [2].

Ker so liste odvzemali tudi ob različnih dnevih po transformaciji, so lahko tako spremljali izražanje skozi čas. 2 dni po transformaciji so izmerili koncentracijo protiteles 271 µg/g svežega lista, 4 dni po transformaciji 234 µg/g in po 6 dneh le 155 µg/g svežega lista. Takšno upadanje koncentracije rekombinantnega proteina skozi čas je značilno za prehodno transformacijo v rastlinah in je najverjetneje posledica endogenih ihnibitornih mehanizmov kot sta utiševanje RNA in proteolitična razgradnja [2].

Izražanje v ''M. bracteata'' so primerjali tudi s tobakom (''Nicotiana benthamiana''). Pokazali so, da je z optimiziranim postopkom ''M. bracteata'' proizvedla okoli dvakrat večjo koncentracijo protiteles (591 µg/g svežega lista) v primerjavi z ''N. benthamiana'' (276 µg/g svežega lista) [2].

Pridobljena rekombinantna protitelesa so natančneje analizirali tudi s prenosom western in metodo ELISA. Ugotovili so, da je pri ''M. bracteata'' prišlo do nastajanja dveh različno velikih produktov (51 in 58 kDa). Ker manjši izmed produktov ustreza velikosti neglikoziliranega protitelesa, so sklepali, da je prišlo do razlik v masi zaradi različnega nivoja glikozilacije. Do razlike bi lahko prišlo zaradi nepopolne posttranslacijske glikozilacije ali pa zaradi naknadne odcepitve glikanov. Kljub tem strukturnim razlikam je test ELISA pokazal, da so protitelesa pridobljena iz ''M. bracteata'' podobno učinkovita kot protitelesa pridobljena z ''N. benthamiana'' [2].

==Zaključki==

Raziskava je pokazala možnost uporabe rastline ''M. bracteata'' kot ekspresijski sistem za pripravo rekombinantnih protiteles. Prehodna transformacija z uporabo vakuumske infiltracije je hitro in omogoča uporabo tudi v velikem merilu. Najvišjo koncentracijo rekombinantnih protiteles v 5 tednov stari rastlini so dosegli v najnižjem setu listov 2 dni po transformaciji, znašala pa je tudi do dvakrat več kot v tobaku [2].

==Viri==

1. M. Cheriachangel: The Introduction and Establishment of a New Leguminous Cover Plant, Mucuna bracteata under Oil Palm in Malaysia. ''Planter'' '''1998''', ''74(860)'', str. 359–368.

2. N. Abd-Aziz, B. C. Tan, N. A. Rejab, R. Y. Othman, N. Khalid: A New Plant Expression System for Producing Pharmaceutical Proteins. ''Mol. Biotechnol.'' '''2020''', ''62(4)'', str. 240–251.

3. S. S. Y. Lim, K. H. Chua, G. Nölke, H. Spiegel, W. L. Goh, S. C. Chow, B. P. Kee, R. Fischer, S. Schillberg, R. Y. Othman: Plant-derived chimeric antibodies inhibit the invasion of human fibroblasts by Toxoplasma gondii. ''PeerJ'' '''2018''', ''2018(12)''.

4. P. Krenek, O. Samajova, I. Luptovciak, A. Doskocilova, G. Komis, J. Samaj: Transient Plant Transformation Mediated by Agrobacterium Tumefaciens: Principles, Methods and Applications. ''Biotechnology Advances.'' Elsevier Inc. November 1, 2015, pp. 1024–1042.

Razvoj ekspresijskega sistema za proizvodnjo farmacevtskih proteinov v rastlini Mucuna bracteata

2021-03-17T08:29:35Z

JernejI:

==''Mucuna bracteata''==

''Mucuna bracteata'' je stročnica, ki se pogosto uporablja pri kolobarjenju na plantažah v tropskih delih sveta [1]. Njene glavne koristne lastnosti so preprostost sejanja, sposobnost vezave dušika v prst (preko simbiotskih bakterij) in odvračanje plevela z alelopatskimi kemikalijami. Ker gre za hitro rastočo rastlino, ki se ne uporablja kot živilo, predstavlja ''M. bracteata'' zanimivo potencialno alternativo sesalskim celicam za proizvodnjo farmacevtskih proteinov [1, 2].

==Protitelesa proti ''Toxoplasma gondii''==
Raziskovalci so v ''M. bracteati'' pripravili himerna protitelesa proti parazitu ''Toxoplasma gondii''. Protitelesa so bila pripravljena na podlagi mišjih protiteles, ki so jih optimizirali z naključno mutagenezo na zankah CDR fragmentov scFv. Variabilni domeni iz fragmentov scFv so povezali s človeško regijo Fc in tako pripravili himerna protitelesa [3].

==Potek eksperimenta==

V raziskavi so v vektor pTRAkc-rfp-ERH ligirali zapisa za težko in lahko verigo himernega protitelesa proti T. gondii, tako da sta se oba nahajala med levo in desno mejo območja T-DNA. Zapisa sta bila vstavljena vsak pod svoj CaMV 35S promotor. Težki verigi so na C-konec dodali tudi zaporedje KDEL, ki omogoča izvoz proteina v endoplazemski retikulum [2].

Za transformacijo rastlinskih celic so uporabili bakterijo ''Agrobacterium tumefaciens''. Namesto klasične stabilne transformacije so se odločili za prehodno transformacijo, kjer so transformirali že rastoče rastlinsko tkivo. Na tak način je izražanje željenega proteina kratkotrajnejše in rastlina ni v celoti gensko spremenjena, vendar pa je sama metoda bistveno hitrejša in primernejša za proizvodnjo v velikem merilu [4].
''A. tumefaciens'' so transformirali z vektorjem in jo vnesli v rastlino s pomočjo vakumske infiltracije. 5 tednov staro rastlino so potopili v 1 L suspenzije z ''A. tumefaciens'', nato pa s pomočjo vakuuma dosegli prehod suspenzije v rastlinsko tkivo. 2, 4 ali 6 dni po transformaciji so z rastline pobrali liste in jih analizirali. Ker ''M. bracteata'' vsebuje razmeroma visoke koncentracije fenolov, ki lahko oborijo proteine, so pri ekstrakciji proteinov dodali reagente za vezavo fenolov. Protitelesa proti ''T. gondii'' so iz proteinskega ekstrakta izolirali s pomočjo afinitetne kromatografije s proteinom A [2].

Celokupno koncentracijo proteinov v listih so določili z metodo po Bradfordu. Koncentracijo izoliranih protiteles so določili z absorbanco pri 280 nm. Njihovo velikost so določili s prenosom Western s protitelesi proti človeškemu Fab, vezavo rekombinantnih protiteles na antigene ''T. gondii'' pa so določili z metodo ELISA [2].

==Rezultati==

Ker so uporabili rastlino staro le 5 tednov, je imela ta le tri sete listov. Ugotovili so, da je bila v najnižjih (najstarejših) listih najvišja koncentracija rekombinantnih protiteles. V najnižjih listih je bila koncentracija protiteles v povprečju 314 µg/g svežega lista, medtem ko je bila v srednjih in najvišjih listih okoli 200 µg/g svežega lista. Odstopanje bi lahko bilo posledica nekaterih strukturnih značilnosti mladih listov, ki bi lahko ovirale infiltracijo ''A. tumefaciens'' [2].

Ker so liste odvzemali tudi ob različnih dnevih po transformaciji, so lahko tako spremljali izražanje skozi čas. 2 dni po transformaciji so izmerili koncentracijo protiteles 271 µg/g svežega lista, 4 dni po transformaciji 234 µg/g in po 6 dneh le 155 µg/g svežega lista. Takšno upadanje koncentracije rekombinantnega proteina skozi čas je značilno za prehodno transformacijo v rastlinah in je najverjetneje posledica endogenih ihnibitornih mehanizmov kot sta utiševanje RNA in proteolitična razgradnja [2].

Izražanje v ''M. bracteata'' so primerjali tudi s tobakom (''Nicotiana benthamiana''). Pokazali so, da je z optimiziranim postopkom ''M. bracteata'' proizvedla okoli dvakrat večjo koncentracijo protiteles (591 µg/g svežega lista) v primerjavi z ''N. benthamiana'' (276 µg/g svežega lista) [2].

Pridobljena rekombinantna protitelesa so natančneje analizirali tudi s prenosom Western in metodo ELISA. Ugotovili so, da je pri ''M. bracteata'' prišlo do nastajanja dveh različno velikih produktov (51 in 58 kDa). Ker manjši izmed produktov ustreza velikosti neglikoziliranega protitelesa, so sklepali, da je prišlo do razlik v masi zaradi različnega nivoja glikozilacije. Do razlike bi lahko prišlo zaradi nepopolne posttranslacijske glikozilacije ali pa zaradi naknadne odcepitve glikanov. Kljub tem strukturnim razlikam je test ELISA pokazal, da so protitelesa pridobljena iz ''M. bracteata'' podobno učinkovita kot protitelesa pridobljena z ''N. benthamiana'' [2].

==Zaključki==

Raziskava je pokazala možnost uporabe rastline ''M. bracteata'' kot ekspresijski sistem za pripravo rekombinantnih protiteles. Prehodna transformacija z uporabo vakuumske infiltracije je hitro in omogoča uporabo tudi v velikem merilu. Najvišjo koncentracijo rekombinantnih protiteles v 5 tednov stari rastlini so dosegli v najnižjem setu listov 2 dni po transformaciji, znašala pa je tudi do dvakrat več kot v tobaku [2].

==Viri==

1. M. Cheriachangel: The Introduction and Establishment of a New Leguminous Cover Plant, Mucuna bracteata under Oil Palm in Malaysia. ''Planter'' '''1998''', ''74(860)'', str. 359–368.

2. N. Abd-Aziz, B. C. Tan, N. A. Rejab, R. Y. Othman, N. Khalid: A New Plant Expression System for Producing Pharmaceutical Proteins. ''Mol. Biotechnol.'' '''2020''', ''62(4)'', str. 240–251.

3. S. S. Y. Lim, K. H. Chua, G. Nölke, H. Spiegel, W. L. Goh, S. C. Chow, B. P. Kee, R. Fischer, S. Schillberg, R. Y. Othman: Plant-derived chimeric antibodies inhibit the invasion of human fibroblasts by Toxoplasma gondii. ''PeerJ'' '''2018''', ''2018(12)''.

4. P. Krenek, O. Samajova, I. Luptovciak, A. Doskocilova, G. Komis, J. Samaj: Transient Plant Transformation Mediated by Agrobacterium Tumefaciens: Principles, Methods and Applications. ''Biotechnology Advances.'' Elsevier Inc. November 1, 2015, pp. 1024–1042.

Razvoj ekspresijskega sistema za proizvodnjo farmacevtskih proteinov v rastlini Mucuna bracteata

2021-03-16T18:22:26Z

JernejI:

==''Mucuna bracteata''==

''Mucuna bracteata'' je stročnica, ki se pogosto uporablja pri kolobarjenju na plantažah v tropskih delih sveta [1]. Njene glavne koristne lastnosti so preprostost sejanja, sposobnost vezave dušika v prst (preko simbiotskih bakterij) in odvračanje plevela z alelopatskimi kemikalijami. Ker gre za hitro rastočo rastlino, ki se ne uporablja kot živilo, predstavlja ''M. bracteata'' zanimivo potencialno alternativo sesalskim celicam za proizvodnjo farmacevtskih proteinov [1, 2].

==Protitelesa proti ''Toxoplasma gondii''==
Raziskovalci so v ''M. bracteati'' pripravili himerna protitelesa proti parazitu ''Toxoplasma gondii''. Protitelesa so bila pripravljena na podlagi mišjih protiteles, ki so jih optimizirali z naključno mutagenezo na zankah CDR fragmentov scFv. Variabilni domeni iz fragmentov scFv so povezali s človeško regijo Fc in tako pripravili himerna protitelesa [3].

==Potek eksperimenta==

V raziskavi so v vektor pTRAkc-rfp-ERH ligirali zapisa za težko in lahko verigo himernega protitelesa proti T. gondii, tako da sta se oba nahajala med levo in desno mejo območja T-DNA. Zapisa sta bila vstavljena vsak pod svoj CaMV 35S promotor. Težki verigi so na C-konec dodali tudi zaporedje KDEL, ki omogoča izvoz proteina v endoplazemski retikulum [2].

Za transformacijo rastlinskih celic so uporabili bakterijo ''Agrobacterium tumefaciens''. Namesto klasične stabilne transformacije so se odločili za prehodno izražanje, kjer so transformirali že rastoče rastlinsko tkivo. Na tak način je izražanje željenega proteina kratkotrajnejše in rastlina ni v celoti gensko spremenjena, vendar pa je sama metoda bistveno hitrejša in primernejša za proizvodnjo v velikem merilu [4].
''A. tumefaciens'' so transformirali z vektorjem in jo vnesli v rastlino s pomočjo vakumske infiltracije. 5 tednov staro rastlino so potopili v 1 L suspenzije z ''A. tumefaciens'', nato pa s pomočjo vakuuma dosegli prehod suspenzije v rastlinsko tkivo. 2, 4 ali 6 dni po transformaciji so z rastline pobrali liste in jih analizirali. Ker ''M. bracteata'' vsebuje razmeroma visoke koncentracije fenolov, ki lahko oborijo proteine, so pri ekstrakciji proteinov dodali reagente za vezavo fenolov. Protitelesa proti ''T. gondii'' so iz proteinskega ekstrakta izolirali s pomočjo afinitetne kromatografije s proteinom A [2].

Celokupno koncentracijo proteinov v listih so določili z metodo po Bradfordu. Koncentracijo izoliranih protiteles so določili z absorbanco pri 280 nm. Njihovo velikost so določili s prenosom Western s protitelesi proti človeškemu Fab, vezavo rekombinantnih protiteles na antigene ''T. gondii'' pa so določili z metodo ELISA [2].

==Rezultati==

Ker so uporabili rastlino staro le 5 tednov, je imela ta le tri sete listov. Ugotovili so, da je bila v najnižjih (najstarejših) listih najvišja koncentracija rekombinantnih protiteles. V najnižjih listih je bila koncentracija protiteles v povprečju 314 µg/g svežega lista, medtem ko je bila v srednjih in najvišjih listih okoli 200 µg/g svežega lista. Odstopanje bi lahko bilo posledica nekaterih strukturnih značilnosti mladih listov, ki bi lahko ovirale infiltracijo ''A. tumefaciens'' [2].

Ker so liste odvzemali tudi ob različnih dnevih po transformaciji, so lahko tako spremljali izražanje skozi čas. 2 dni po transformaciji so izmerili koncentracijo protiteles 271 µg/g svežega lista, 4 dni po transformaciji 234 µg/g in po 6 dneh le 155 µg/g svežega lista. Takšno upadanje koncentracije rekombinantnega proteina skozi čas je značilno za prehodno izražanje v rastlinah in je najverjetneje posledica endogenih ihnibitornih mehanizmov kot sta utiševanje RNA in proteolitična razgradnja [2].

Izražanje v ''M. bracteata'' so primerjali tudi s tobakom (''Nicotiana benthamiana''). Pokazali so, da je z optimiziranim postopkom ''M. bracteata'' proizvedla okoli dvakrat večjo koncentracijo protiteles (591 µg/g svežega lista) v primerjavi z ''N. benthamiana'' (276 µg/g svežega lista) [2].

Pridobljena rekombinantna protitelesa so natančneje analizirali tudi s prenosom Western in metodo ELISA. Ugotovili so, da je pri ''M. bracteata'' prišlo do nastajanja dveh različno velikih produktov (51 in 58 kDa). Ker manjši izmed produktov ustreza velikosti neglikoziliranega protitelesa, so sklepali, da je prišlo do razlik v masi zaradi različnega nivoja glikozilacije. Do razlike bi lahko prišlo zaradi nepopolne posttranslacijske glikozilacije ali pa zaradi naknadne odcepitve glikanov. Kljub tem strukturnim razlikam je test ELISA pokazal, da so protitelesa pridobljena iz ''M. bracteata'' podobno učinkovita kot protitelesa pridobljena z ''N. benthamiana'' [2].

==Zaključki==

Raziskava je pokazala možnost uporabe rastline ''M. bracteata'' kot ekspresijski sistem za pripravo rekombinantnih protiteles. Prehodno izražanje z uporabo vakuumske infiltracije je hitro in omogoča uporabo tudi v velikem merilu. Najvišjo koncentracijo rekombinantnih protiteles v 5 tednov stari rastlini so dosegli v najnižjem setu listov 2 dni po transformaciji, znašala pa je tudi do dvakrat več kot v tobaku [2].

==Viri==

1. M. Cheriachangel: The Introduction and Establishment of a New Leguminous Cover Plant, Mucuna bracteata under Oil Palm in Malaysia. ''Planter'' '''1998''', ''74(860)'', str. 359–368.

2. N. Abd-Aziz, B. C. Tan, N. A. Rejab, R. Y. Othman, N. Khalid: A New Plant Expression System for Producing Pharmaceutical Proteins. ''Mol. Biotechnol.'' '''2020''', ''62(4)'', str. 240–251.

3. S. S. Y. Lim, K. H. Chua, G. Nölke, H. Spiegel, W. L. Goh, S. C. Chow, B. P. Kee, R. Fischer, S. Schillberg, R. Y. Othman: Plant-derived chimeric antibodies inhibit the invasion of human fibroblasts by Toxoplasma gondii. ''PeerJ'' '''2018''', ''2018(12)''.

4. P. Krenek, O. Samajova, I. Luptovciak, A. Doskocilova, G. Komis, J. Samaj: Transient Plant Transformation Mediated by Agrobacterium Tumefaciens: Principles, Methods and Applications. ''Biotechnology Advances.'' Elsevier Inc. November 1, 2015, pp. 1024–1042.

Razvoj ekspresijskega sistema za proizvodnjo farmacevtskih proteinov v rastlini Mucuna bracteata

2021-03-14T18:55:05Z

JernejI:

==''Mucuna bracteata''==

''Mucuna bracteata'' je stročnica, ki se pogosto uporablja pri kolobarjenju na plantažah v tropskih delih sveta [1]. Njene glavne koristne lastnosti so preprostost sejanja, sposobnost vezave dušika v prst (preko simbiotskih bakterij) in odvračanje plevela z alelopatskimi kemikalijami. Ker gre za hitro rastočo rastlino, ki se ne uporablja kot živilo, predstavlja ''M. bracteata'' zanimivo potencialno alternativo sesalskim celicam za proizvodnjo farmacevtskih proteinov [1, 2].

==Protitelesa proti ''Toxoplasma gondii''==
Raziskovalci so v ''M. bracteati'' pripravili himerna protitelesa proti parazitu ''Toxoplasma gondii''. Protitelesa so bila pripravljena na podlagi mišjih protiteles, ki so jih optimizirali z naključno mutagenezo na zankah CDR fragmentov ScFv. Variabilni domeni iz fragmentov ScFv so povezali s človeško regijo Fc in tako pripravili himerna protitelesa [3].

==Potek eksperimenta==

V raziskavi so v vektor pTRAkc-rfp-ERH ligirali zapisa za težko in lahko verigo himernega protitelesa proti T. gondii, tako da sta se oba nahajala med levo in desno mejo območja T-DNA. Zapisa sta bila vstavljena vsak pod svoj CaMV 35S promotor. Težki verigi so na C-konec dodali tudi zaporedje KDEL, ki omogoča izvoz proteina v endoplazemski retikulum [2].

Za transformacijo rastlinskih celic so uporabili bakterijo ''Agrobacterium tumefaciens''. Namesto klasične stabilne transformacije so se odločili za prehodno izražanje, kjer so transformirali že rastoče rastlinsko tkivo. Na tak način je izražanje željenega proteina kratkotrajnejše in rastlina ni v celoti gensko spremenjena, vendar pa je sama metoda bistveno hitrejša in primernejša za proizvodnjo v velikem merilu [4].
''A. tumefaciens'' so transformirali z vektorjem in jo vnesli v rastlino s pomočjo vakumske infiltracije. 5 tednov staro rastlino so potopili v 1 L suspenzije z ''A. tumefaciens'', nato pa s pomočjo vakuuma dosegli prehod suspenzije v rastlinsko tkivo. 2, 4 ali 6 dni po transformaciji so z rastline pobrali liste in jih analizirali. Ker ''M. bracteata'' vsebuje razmeroma visoke koncentracije fenolov, ki lahko oborijo proteine, so pri ekstrakciji proteinov dodali reagente za vezavo fenolov. Protitelesa proti ''T. gondii'' so iz proteinskega ekstrakta izolirali s pomočjo afinitetne kromatografije s proteinom A [2].

Celokupno koncentracijo proteinov v listih so določili z metodo po Bradfordu. Koncentracijo izoliranih protiteles so določili z absorbanco pri 280 nm. Njihovo velikost so določili s prenosom Western s protitelesi proti človeškemu Fab, vezavo rekombinantnih protiteles na antigene ''T. gondii'' pa so določili z metodo ELISA [2].

==Rezultati==

Ker so uporabili rastlino staro le 5 tednov, je imela ta le tri sete listov. Ugotovili so, da je bila v najnižjih (najstarejših) listih najvišja koncentracija rekombinantnih protiteles. V najnižjih listih je bila koncentracija protiteles v povprečju 314 µg/g svežega lista, medtem ko je bila v srednjih in najvišjih listih okoli 200 µg/g svežega lista. Odstopanje bi lahko bilo posledica nekaterih strukturnih značilnosti mladih listov, ki bi lahko ovirale infiltracijo ''A. tumefaciens'' [2].

Ker so liste odvzemali tudi ob različnih dnevih po transformaciji, so lahko tako spremljali izražanje skozi čas. 2 dni po transformaciji so izmerili koncentracijo protiteles 271 µg/g svežega lista, 4 dni po transformaciji 234 µg/g in po 6 dneh le 155 µg/g svežega lista. Takšno upadanje koncentracije rekombinantnega proteina skozi čas je značilno za prehodno izražanje v rastlinah in je najverjetneje posledica endogenih ihnibitornih mehanizmov kot sta utiševanje RNA in proteolitična razgradnja [2].

Izražanje v ''M. bracteata'' so primerjali tudi s tobakom (''Nicotiana benthamiana''). Pokazali so, da je z optimiziranim postopkom ''M. bracteata'' proizvedla okoli dvakrat večjo koncentracijo protiteles (591 µg/g svežega lista) v primerjavi z ''N. benthamiana'' (276 µg/g svežega lista) [2].

Pridobljena rekombinantna protitelesa so natančneje analizirali tudi s prenosom Western in metodo ELISA. Ugotovili so, da je pri ''M. bracteata'' prišlo do nastajanja dveh različno velikih produktov (51 in 58 kDa). Ker manjši izmed produktov ustreza velikosti neglikoziliranega protitelesa, so sklepali, da je prišlo do razlik v masi zaradi različnega nivoja glikozilacije. Do razlike bi lahko prišlo zaradi nepopolne posttranslacijske glikozilacije ali pa zaradi naknadne odcepitve glikanov. Kljub tem strukturnim razlikam je test ELISA pokazal, da so protitelesa pridobljena iz ''M. bracteata'' podobno učinkovita kot protitelesa pridobljena z ''N. benthamiana'' [2].

==Zaključki==

Raziskava je pokazala možnost uporabe rastline ''M. bracteata'' kot ekspresijski sistem za pripravo rekombinantnih protiteles. Prehodno izražanje z uporabo vakuumske infiltracije je hitro in omogoča uporabo tudi v velikem merilu. Najvišjo koncentracijo rekombinantnih protiteles v 5 tednov stari rastlini so dosegli v najnižjem setu listov 2 dni po transformaciji, znašala pa je tudi do dvakrat več kot v tobaku [2].

==Viri==

1. M. Cheriachangel: The Introduction and Establishment of a New Leguminous Cover Plant, Mucuna bracteata under Oil Palm in Malaysia. ''Planter'' '''1998''', ''74(860)'', str. 359–368.

2. N. Abd-Aziz, B. C. Tan, N. A. Rejab, R. Y. Othman, N. Khalid: A New Plant Expression System for Producing Pharmaceutical Proteins. ''Mol. Biotechnol.'' '''2020''', ''62(4)'', str. 240–251.

3. S. S. Y. Lim, K. H. Chua, G. Nölke, H. Spiegel, W. L. Goh, S. C. Chow, B. P. Kee, R. Fischer, S. Schillberg, R. Y. Othman: Plant-derived chimeric antibodies inhibit the invasion of human fibroblasts by Toxoplasma gondii. ''PeerJ'' '''2018''', ''2018(12)''.

4. P. Krenek, O. Samajova, I. Luptovciak, A. Doskocilova, G. Komis, J. Samaj: Transient Plant Transformation Mediated by Agrobacterium Tumefaciens: Principles, Methods and Applications. ''Biotechnology Advances.'' Elsevier Inc. November 1, 2015, pp. 1024–1042.

Razvoj ekspresijskega sistema za proizvodnjo farmacevtskih proteinov v rastlini Mucuna bracteata

2021-03-14T18:54:39Z

JernejI: /* Viri */

==''Mucuna bracteata''==

''Mucuna bracteata'' je stročnica, ki se pogosto uporablja pri kolobarjenju na plantažah v tropskih delih sveta [1]. Njene glavne koristne lastnosti so preprostost sejanja, sposobnost vezave dušika v prst (preko simbiotskih bakterij) in odvračanje plevela z alelopatskimi kemikalijami. Ker gre za hitro rastočo rastlino, ki se ne uporablja kot živilo, predstavlja ''M. bracteata'' zanimivo potencialno alternativo sesalskim celicam za proizvodnjo farmacevtskih proteinov [1, 2].

==Protitelesa proti ''Toxoplasma gondii''==
Raziskovalci so v ''M. bracteati'' pripravili himerna protitelesa proti parazitu ''Toxoplasma gondii''. Protitelesa so bila pripravljena na podlagi mišjih protiteles, ki so jih optimizirali z naključno mutagenezo na zankah CDR fragmentov ScFv. Variabilni domeni iz fragmentov ScFv so povezali s človeško regijo Fc in tako pripravili himerna protitelesa [3].

==Potek eksperimenta==

V raziskavi so v vektor pTRAkc-rfp-ERH ligirali zapisa za težko in lahko verigo himernega protitelesa proti T. gondii, tako da sta se oba nahajala med levo in desno mejo območja T-DNA. Zapisa sta bila vstavljena vsak pod svoj CaMV 35S promotor. Težki verigi so na C-konec dodali tudi zaporedje KDEL, ki omogoča izvoz proteina v endoplazemski retikulum [2].

Za transformacijo rastlinskih celic so uporabili bakterijo ''Agrobacterium tumefaciens''. Namesto klasične stabilne transformacije so se odločili za prehodno izražanje, kjer so transformirali že rastoče rastlinsko tkivo. Na tak način je izražanje željenega proteina kratkotrajnejše in rastlina ni v celoti gensko spremenjena, vendar pa je sama metoda bistveno hitrejša in primernejša za proizvodnjo v velikem merilu [4].
''A. tumefaciens'' so transformirali z vektorjem in jo vnesli v rastlino s pomočjo vakumske infiltracije. 5 tednov staro rastlino so potopili v 1 L suspenzije z ''A. tumefaciens'', nato pa s pomočjo vakuuma dosegli prehod suspenzije v rastlinsko tkivo. 2, 4 ali 6 dni po transformaciji so z rastline pobrali liste in jih analizirali. Ker ''M. bracteata'' vsebuje razmeroma visoke koncentracije fenolov, ki lahko oborijo proteine, so pri ekstrakciji proteinov dodali reagente za vezavo fenolov. Protitelesa proti ''T. gondii'' so iz proteinskega ekstrakta izolirali s pomočjo afinitetne kromatografije s proteinom A [2].

Celokupno koncentracijo proteinov v listih so določili z metodo po Bradfordu. Koncentracijo izoliranih protiteles so določili z absorbanco pri 280 nm. Njihovo velikost so določili s prenosom Western s protitelesi proti človeškemu Fab, vezavo rekombinantnih protiteles na antigene ''T. gondii'' pa so določili z metodo ELISA [2].

==Rezultati==

Ker so uporabili rastlino staro le 5 tednov, je imela ta le tri sete listov. Ugotovili so, da je bila v najnižjih (najstarejših) listih najvišja koncentracija rekombinantnih protiteles. V najnižjih listih je bila koncentracija protiteles v povprečju 314 µg/g svežega lista, medtem ko je bila v srednjih in najvišjih listih okoli 200 µg/g svežega lista. Odstopanje bi lahko bilo posledica nekaterih strukturnih značilnosti mladih listov, ki bi lahko ovirale infiltracijo ''A. tumefaciens'' [2].

Ker so liste odvzemali tudi ob različnih dnevih po transformaciji, so lahko tako spremljali izražanje skozi čas. 2 dni po transformaciji so izmerili koncentracijo protiteles 271 µg/g svežega lista, 4 dni po transformaciji 234 µg/g in po 6 dneh le 155 µg/g svežega lista. Takšno upadanje koncentracije rekombinantnega proteina skozi čas je značilno za prehodno izražanje v rastlinah in je najverjetneje posledica endogenih ihnibitornih mehanizmov kot sta utiševanje RNA in proteolitična razgradnja [2].

Izražanje v ''M. bracteata'' so primerjali tudi s tobakom (''Nicotiana benthamiana''). Pokazali so, da je z optimiziranim postopkom ''M. bracteata'' proizvedla okoli dvakrat večjo koncentracijo protiteles (591 µg/g svežega lista) v primerjavi z ''N. benthamiana'' (276 µg/g svežega lista) [2].

Pridobljena rekombinantna protitelesa so natančneje analizirali tudi s prenosom Western in metodo ELISA. Ugotovili so, da je pri ''M. bracteata'' prišlo do nastajanja dveh različno velikih produktov (51 in 58 kDa). Ker manjši izmed produktov ustreza velikosti neglikoziliranega protitelesa, so sklepali, da je prišlo do razlik v masi zaradi različnega nivoja glikozilacije. Do razlike bi lahko prišlo zaradi nepopolne posttranslacijske glikozilacije ali pa zaradi naknadne odcepitve glikanov. Kljub tem strukturnim razlikam je test ELISA pokazal, da so protitelesa pridobljena iz ''M. bracteata'' podobno učinkovita kot protitelesa pridobljena z ''N. benthamiana'' [2].

==Zaključki==

Raziskava je pokazala možnost uporabe rastline ''M. bracteata'' kot ekspresijski sistem za pripravo rekombinantnih protiteles. Prehodno izražanje z uporabo vakuumske infiltracije je hitro in omogoča uporabo tudi v velikem merilu. Najvišjo koncentracijo rekombinantnih protiteles v 5 tednov stari rastlini so dosegli v najnižjem setu listov 2 dni po transformaciji, znašala pa je tudi do dvakrat več kot v tobaku [2].

==Viri==

1. M. Cheriachangel: The Introduction and Establishment of a New Leguminous Cover Plant, Mucuna bracteata under Oil Palm in Malaysia. ''Planter'' '''1998''', ''74(860)'', str. 359–368.

2. N. Abd-Aziz, B. C. Tan, N. A. Rejab, R. Y. Othman, N. Khalid: A New Plant Expression System for Producing Pharmaceutical Proteins. ''Mol. Biotechnol.'' '''2020''', ''62(4)'', str. 240–251.

3. S. S. Y. Lim, K. H. Chua, G. Nölke, H. Spiegel, W. L. Goh, S. C. Chow, B. P. Kee, R. Fischer, S. Schillberg, R. Y. Othman: Plant-derived chimeric antibodies inhibit the invasion of human fibroblasts by Toxoplasma gondii. ''PeerJ'' '''2018''', ''2018(12)''.

4. P. Krenek, O. Samajova, I. Luptovciak, A. Doskocilova, G. Komis, J. Samaj: Transient Plant Transformation Mediated by Agrobacterium Tumefaciens: Principles, Methods and Applications. ''Biotechnology Advances.'' Elsevier Inc. November 1, 2015, pp. 1024–1042.

Razvoj ekspresijskega sistema za proizvodnjo farmacevtskih proteinov v rastlini Mucuna bracteata

2021-03-14T18:51:26Z

JernejI:

==''Mucuna bracteata''==

''Mucuna bracteata'' je stročnica, ki se pogosto uporablja pri kolobarjenju na plantažah v tropskih delih sveta [1]. Njene glavne koristne lastnosti so preprostost sejanja, sposobnost vezave dušika v prst (preko simbiotskih bakterij) in odvračanje plevela z alelopatskimi kemikalijami. Ker gre za hitro rastočo rastlino, ki se ne uporablja kot živilo, predstavlja ''M. bracteata'' zanimivo potencialno alternativo sesalskim celicam za proizvodnjo farmacevtskih proteinov [1, 2].

==Protitelesa proti ''Toxoplasma gondii''==
Raziskovalci so v ''M. bracteati'' pripravili himerna protitelesa proti parazitu ''Toxoplasma gondii''. Protitelesa so bila pripravljena na podlagi mišjih protiteles, ki so jih optimizirali z naključno mutagenezo na zankah CDR fragmentov ScFv. Variabilni domeni iz fragmentov ScFv so povezali s človeško regijo Fc in tako pripravili himerna protitelesa [3].

==Potek eksperimenta==

V raziskavi so v vektor pTRAkc-rfp-ERH ligirali zapisa za težko in lahko verigo himernega protitelesa proti T. gondii, tako da sta se oba nahajala med levo in desno mejo območja T-DNA. Zapisa sta bila vstavljena vsak pod svoj CaMV 35S promotor. Težki verigi so na C-konec dodali tudi zaporedje KDEL, ki omogoča izvoz proteina v endoplazemski retikulum [2].

Za transformacijo rastlinskih celic so uporabili bakterijo ''Agrobacterium tumefaciens''. Namesto klasične stabilne transformacije so se odločili za prehodno izražanje, kjer so transformirali že rastoče rastlinsko tkivo. Na tak način je izražanje željenega proteina kratkotrajnejše in rastlina ni v celoti gensko spremenjena, vendar pa je sama metoda bistveno hitrejša in primernejša za proizvodnjo v velikem merilu [4].
''A. tumefaciens'' so transformirali z vektorjem in jo vnesli v rastlino s pomočjo vakumske infiltracije. 5 tednov staro rastlino so potopili v 1 L suspenzije z ''A. tumefaciens'', nato pa s pomočjo vakuuma dosegli prehod suspenzije v rastlinsko tkivo. 2, 4 ali 6 dni po transformaciji so z rastline pobrali liste in jih analizirali. Ker ''M. bracteata'' vsebuje razmeroma visoke koncentracije fenolov, ki lahko oborijo proteine, so pri ekstrakciji proteinov dodali reagente za vezavo fenolov. Protitelesa proti ''T. gondii'' so iz proteinskega ekstrakta izolirali s pomočjo afinitetne kromatografije s proteinom A [2].

Celokupno koncentracijo proteinov v listih so določili z metodo po Bradfordu. Koncentracijo izoliranih protiteles so določili z absorbanco pri 280 nm. Njihovo velikost so določili s prenosom Western s protitelesi proti človeškemu Fab, vezavo rekombinantnih protiteles na antigene ''T. gondii'' pa so določili z metodo ELISA [2].

==Rezultati==

Ker so uporabili rastlino staro le 5 tednov, je imela ta le tri sete listov. Ugotovili so, da je bila v najnižjih (najstarejših) listih najvišja koncentracija rekombinantnih protiteles. V najnižjih listih je bila koncentracija protiteles v povprečju 314 µg/g svežega lista, medtem ko je bila v srednjih in najvišjih listih okoli 200 µg/g svežega lista. Odstopanje bi lahko bilo posledica nekaterih strukturnih značilnosti mladih listov, ki bi lahko ovirale infiltracijo ''A. tumefaciens'' [2].

Ker so liste odvzemali tudi ob različnih dnevih po transformaciji, so lahko tako spremljali izražanje skozi čas. 2 dni po transformaciji so izmerili koncentracijo protiteles 271 µg/g svežega lista, 4 dni po transformaciji 234 µg/g in po 6 dneh le 155 µg/g svežega lista. Takšno upadanje koncentracije rekombinantnega proteina skozi čas je značilno za prehodno izražanje v rastlinah in je najverjetneje posledica endogenih ihnibitornih mehanizmov kot sta utiševanje RNA in proteolitična razgradnja [2].

Izražanje v ''M. bracteata'' so primerjali tudi s tobakom (''Nicotiana benthamiana''). Pokazali so, da je z optimiziranim postopkom ''M. bracteata'' proizvedla okoli dvakrat večjo koncentracijo protiteles (591 µg/g svežega lista) v primerjavi z ''N. benthamiana'' (276 µg/g svežega lista) [2].

Pridobljena rekombinantna protitelesa so natančneje analizirali tudi s prenosom Western in metodo ELISA. Ugotovili so, da je pri ''M. bracteata'' prišlo do nastajanja dveh različno velikih produktov (51 in 58 kDa). Ker manjši izmed produktov ustreza velikosti neglikoziliranega protitelesa, so sklepali, da je prišlo do razlik v masi zaradi različnega nivoja glikozilacije. Do razlike bi lahko prišlo zaradi nepopolne posttranslacijske glikozilacije ali pa zaradi naknadne odcepitve glikanov. Kljub tem strukturnim razlikam je test ELISA pokazal, da so protitelesa pridobljena iz ''M. bracteata'' podobno učinkovita kot protitelesa pridobljena z ''N. benthamiana'' [2].

==Zaključki==

Raziskava je pokazala možnost uporabe rastline ''M. bracteata'' kot ekspresijski sistem za pripravo rekombinantnih protiteles. Prehodno izražanje z uporabo vakuumske infiltracije je hitro in omogoča uporabo tudi v velikem merilu. Najvišjo koncentracijo rekombinantnih protiteles v 5 tednov stari rastlini so dosegli v najnižjem setu listov 2 dni po transformaciji, znašala pa je tudi do dvakrat več kot v tobaku [2].

==Viri==

1. M. Cheriachangel: The Introduction and Establishment of a New Leguminous Cover Plant, Mucuna bracteata under Oil Palm in Malaysia. Planter 1998, 74(860), str. 359–368.

2. N. Abd-Aziz, B. C. Tan, N. A. Rejab, R. Y. Othman, N. Khalid: A New Plant Expression System for Producing Pharmaceutical Proteins. Mol. Biotechnol. 2020, 62(4), str. 240–251.

3. S. S. Y. Lim, K. H. Chua, G. Nölke, H. Spiegel, W. L. Goh, S. C. Chow, B. P. Kee, R. Fischer, S. Schillberg, R. Y. Othman: Plant-derived chimeric antibodies inhibit the invasion of human fibroblasts by Toxoplasma gondii. PeerJ 2018, 2018(12).

4. P. Krenek, O. Samajova, I. Luptovciak, A. Doskocilova, G. Komis, J. Samaj: Transient Plant Transformation Mediated by Agrobacterium Tumefaciens: Principles, Methods and Applications. Biotechnology Advances. Elsevier Inc. November 1, 2015, pp. 1024–1042.

Razvoj ekspresijskega sistema za proizvodnjo farmacevtskih proteinov v rastlini Mucuna bracteata

2021-03-14T18:50:51Z

JernejI:

==''Mucuna bracteata''==

''Mucuna bracteata'' je stročnica, ki se pogosto uporablja pri kolobarjenju na plantažah v tropskih delih sveta [1]. Njene glavne koristne lastnosti so preprostost sejanja, sposobnost vezave dušika v prst (preko simbiotskih bakterij) in odvračanje plevela z alelopatskimi kemikalijami. Ker gre za hitro rastočo rastlino, ki se ne uporablja kot živilo, predstavlja ''M. bracteata'' zanimivo potencialno alternativo sesalskim celicam za proizvodnjo farmacevtskih proteinov [1, 2].

==Protitelesa proti ''Toxoplasma gondii''==
Raziskovalci so v ''M. bracteati'' pripravili himerna protitelesa proti parazitu ''Toxoplasma gondii''. Protitelesa so bila pripravljena na podlagi mišjih protiteles, ki so jih optimizirali z naključno mutagenezo na zankah CDR fragmentov ScFv. Variabilni domeni iz fragmentov ScFv so povezali s človeško regijo Fc in tako pripravili himerna protitelesa [3].

==Potek eksperimenta==

V raziskavi so v vektor pTRAkc-rfp-ERH ligirali zapisa za težko in lahko verigo himernega protitelesa proti T. gondii, tako da sta se oba nahajala med levo in desno mejo območja T-DNA. Zapisa sta bila vstavljena vsak pod svoj CaMV 35S promotor. Težki verigi so na C-konec dodali tudi zaporedje KDEL, ki omogoča izvoz proteina v endoplazemski retikulum [2].

Za transformacijo rastlinskih celic so uporabili bakterijo ''Agrobacterium tumefaciens''. Namesto klasične stabilne transformacije so se odločili za prehodno izražanje, kjer so transformirali že rastoče rastlinsko tkivo. Na tak način je izražanje željenega proteina kratkotrajnejše in rastlina ni v celoti gensko spremenjena, vendar pa je sama metoda bistveno hitrejša in primernejša za proizvodnjo v velikem merilu [4].
''A. tumefaciens'' so transformirali z vektorjem in jo vnesli v rastlino s pomočjo vakumske infiltracije. 5 tednov staro rastlino so potopili v 1 L suspenzije z ''A. tumefaciens'', nato pa s pomočjo vakuuma dosegli prehod suspenzije v rastlinsko tkivo. 2, 4 ali 6 dni po transformaciji so z rastline pobrali liste in jih analizirali. Ker ''M. bracteata'' vsebuje razmeroma visoke koncentracije fenolov, ki lahko oborijo proteine, so pri ekstrakciji proteinov dodali reagente za vezavo fenolov. Protitelesa proti ''T. gondii'' so iz proteinskega ekstrakta izolirali s pomočjo afinitetne kromatografije s proteinom A [2].

Celokupno koncentracijo proteinov v listih so določili z metodo po Bradfordu. Koncentracijo izoliranih protiteles so določili z absorbanco pri 280 nm. Njihovo velikost so določili s prenosom Western s protitelesi proti človeškemu Fab, vezavo rekombinantnih protiteles na antigene ''T. gondii'' pa so določili z metodo ELISA [2].

==Rezultati==

Ker so uporabili rastlino staro le 5 tednov, je imela ta le tri sete listov. Ugotovili so, da je bila v najnižjih (najstarejših) listih najvišja koncentracija rekombinantnih protiteles. V najnižjih listih je bila koncentracija protiteles v povprečju 314 µg/g svežega lista, medtem ko je bila v srednjih in najvišjih listih okoli 200 µg/g svežega lista. Odstopanje bi lahko bilo posledica nekaterih strukturnih značilnosti mladih listov, ki bi lahko ovirale infiltracijo ''A. tumefaciens'' [2].

Ker so liste odvzemali tudi ob različnih dnevih po transformaciji, so lahko tako spremljali izražanje skozi čas. 2 dni po transformaciji so izmerili koncentracijo protiteles 271 µg/g svežega lista, 4 dni po transformaciji 234 µg/g in po 6 dneh le 155 µg/g svežega lista. Takšno upadanje koncentracije rekombinantnega proteina skozi čas je značilno za prehodno izražanje v rastlinah in je najverjetneje posledica endogenih ihnibitornih mehanizmov kot sta utiševanje RNA in proteolitična razgradnja [2].

Izražanje v ''M. bracteata'' so primerjali tudi s tobakom (''Nicotiana benthamiana''). Pokazali so, da je z optimiziranim postopkom ''M. bracteata'' proizvedla okoli dvakrat večjo koncentracijo protiteles (591 µg/g svežega lista) v primerjavi z ''N. benthamiana'' (276 µg/g svežega lista) [2].

Pridobljena rekombinantna protitelesa so natančneje analizirali tudi s prenosom Western in metodo ELISA. Ugotovili so, da je pri ''M. bracteata'' prišlo do nastajanja dveh različno velikih produktov (51 in 58 kDa). Ker manjši izmed produktov ustreza velikosti neglikoziliranega protitelesa, so sklepali, da je prišlo do razlik v masi zaradi različnega nivoja glikozilacije. Do razlike bi lahko prišlo zaradi nepopolne posttranslacijske glikozilacije ali pa zaradi naknadne odcepitve glikanov. Kljub tem strukturnim razlikam je test ELISA pokazal, da so protitelesa pridobljena iz ''M. bracteata'' podobno učinkovita kot protitelesa pridobljena z ''N. benthamiana'' [2].

==Zaključki==

Raziskava je pokazala možnost uporabe rastline ''M. bracteata'' kot ekspresijski sistem za pripravo rekombinantnih protiteles. Prehodno izražanje z uporabo vakuumske infiltracije je hitro in omogoča uporabo tudi v velikem merilu. Najvišjo koncentracijo rekombinantnih protiteles v 5 tednov stari rastlini so dosegli v najnižjem setu listov 2 dni po transformaciji, znašala pa je tudi do dvakrat več kot v tobaku.

==Viri==

1. M. Cheriachangel: The Introduction and Establishment of a New Leguminous Cover Plant, Mucuna bracteata under Oil Palm in Malaysia. Planter 1998, 74(860), str. 359–368.

2. N. Abd-Aziz, B. C. Tan, N. A. Rejab, R. Y. Othman, N. Khalid: A New Plant Expression System for Producing Pharmaceutical Proteins. Mol. Biotechnol. 2020, 62(4), str. 240–251.

3. S. S. Y. Lim, K. H. Chua, G. Nölke, H. Spiegel, W. L. Goh, S. C. Chow, B. P. Kee, R. Fischer, S. Schillberg, R. Y. Othman: Plant-derived chimeric antibodies inhibit the invasion of human fibroblasts by Toxoplasma gondii. PeerJ 2018, 2018(12).

4. P. Krenek, O. Samajova, I. Luptovciak, A. Doskocilova, G. Komis, J. Samaj: Transient Plant Transformation Mediated by Agrobacterium Tumefaciens: Principles, Methods and Applications. Biotechnology Advances. Elsevier Inc. November 1, 2015, pp. 1024–1042.

Razvoj ekspresijskega sistema za proizvodnjo farmacevtskih proteinov v rastlini Mucuna bracteata

2021-03-14T18:47:37Z

JernejI:

==Mucuna bracteata==

''Mucuna bracteata'' je stročnica, ki se pogosto uporablja pri kolobarjenju na plantažah v tropskih delih sveta [1]. Njene glavne koristne lastnosti so preprostost sejanja, sposobnost vezave dušika v prst (preko simbiotskih bakterij) in odvračanje plevela z alelopatskimi kemikalijami. Ker gre za hitro rastočo rastlino, ki se ne uporablja kot živilo, predstavlja ''M. bracteata'' zanimivo potencialno alternativo sesalskim celicam za proizvodnjo farmacevtskih proteinov [1, 2].

==Protitelesa proti ''Toxoplasma gondii''==
Raziskovalci so v ''M. bracteati'' pripravili himerna protitelesa proti parazitu ''Toxoplasma gondii''. Protitelesa so bila pripravljena na podlagi mišjih protiteles, ki so jih optimizirali z naključno mutagenezo na zankah CDR fragmentov ScFv. Variabilni domeni iz fragmentov ScFv so povezali s človeško regijo Fc in tako pripravili himerna protitelesa [3].

==Potek eksperimenta==

V raziskavi so v vektor pTRAkc-rfp-ERH ligirali zapisa za težko in lahko verigo himernega protitelesa proti T. gondii, tako da sta se oba nahajala med levo in desno mejo območja T-DNA. Zapisa sta bila vstavljena vsak pod svoj CaMV 35S promotor. Težki verigi so na C-konec dodali tudi zaporedje KDEL, ki omogoča izvoz proteina v endoplazemski retikulum [2].

Za transformacijo rastlinskih celic so uporabili bakterijo ''Agrobacterium tumefaciens''. Namesto klasične stabilne transformacije so se odločili za prehodno izražanje, kjer so transformirali že rastoče rastlinsko tkivo. Na tak način je izražanje željenega proteina kratkotrajnejše in rastlina ni v celoti gensko spremenjena, vendar pa je sama metoda bistveno hitrejša in primernejša za proizvodnjo v velikem merilu [4].
''A. tumefaciens'' so transformirali z vektorjem in jo vnesli v rastlino s pomočjo vakumske infiltracije. 5 tednov staro rastlino so potopili v 1 L suspenzije z ''A. tumefaciens'', nato pa s pomočjo vakuuma dosegli prehod suspenzije v rastlinsko tkivo. 2, 4 ali 6 dni po transformaciji so z rastline pobrali liste in jih analizirali. Ker ''M. bracteata'' vsebuje razmeroma visoke koncentracije fenolov, ki lahko oborijo proteine, so pri ekstrakciji proteinov dodali reagente za vezavo fenolov. Protitelesa proti ''T. gondii'' so iz proteinskega ekstrakta izolirali s pomočjo afinitetne kromatografije s proteinom A [2].

Celokupno koncentracijo proteinov v listih so določili z metodo po Bradfordu. Koncentracijo izoliranih protiteles so določili z absorbanco pri 280 nm. Njihovo velikost so določili s prenosom Western s protitelesi proti človeškemu Fab, vezavo rekombinantnih protiteles na antigene ''T. gondii'' pa so določili z metodo ELISA [2].

==Rezultati==

Ker so uporabili rastlino staro le 5 tednov, je imela ta le tri sete listov. Ugotovili so, da je bila v najnižjih (najstarejših) listih najvišja koncentracija rekombinantnih protiteles. V najnižjih listih je bila koncentracija protiteles v povprečju 314 µg/g svežega lista, medtem ko je bila v srednjih in najvišjih listih okoli 200 µg/g svežega lista. Odstopanje bi lahko bilo posledica nekaterih strukturnih značilnosti mladih listov, ki bi lahko ovirale infiltracijo ''A. tumefaciens'' [2].

Ker so liste odvzemali tudi ob različnih dnevih po transformaciji, so lahko tako spremljali izražanje skozi čas. 2 dni po transformaciji so izmerili koncentracijo protiteles 271 µg/g svežega lista, 4 dni po transformaciji 234 µg/g in po 6 dneh le 155 µg/g svežega lista. Takšno upadanje koncentracije rekombinantnega proteina skozi čas je značilno za prehodno izražanje v rastlinah in je najverjetneje posledica endogenih ihnibitornih mehanizmov kot sta utiševanje RNA in proteolitična razgradnja [2].

Izražanje v ''M. bracteata'' so primerjali tudi s tobakom (''Nicotiana benthamiana''). Pokazali so, da je z optimiziranim postopkom ''M. bracteata'' proizvedla okoli dvakrat večjo koncentracijo protiteles (591 µg/g svežega lista) v primerjavi z ''N. benthamiana'' (276 µg/g svežega lista) [2].

Pridobljena rekombinantna protitelesa so natančneje analizirali tudi s prenosom Western in metodo ELISA. Ugotovili so, da je pri ''M. bracteata'' prišlo do nastajanja dveh različno velikih produktov (51 in 58 kDa). Ker manjši izmed produktov ustreza velikosti neglikoziliranega protitelesa, so sklepali, da je prišlo do razlik v masi zaradi različnega nivoja glikozilacije. Do razlike bi lahko prišlo zaradi nepopolne posttranslacijske glikozilacije ali pa zaradi naknadne odcepitve glikanov. Kljub tem strukturnim razlikam je test ELISA pokazal, da so protitelesa pridobljena iz ''M. bracteata'' podobno učinkovita kot protitelesa pridobljena z ''N. benthamiana'' [2].

==Zaključki==

Raziskava je pokazala možnost uporabe rastline ''M. bracteata'' kot ekspresijski sistem za pripravo rekombinantnih protiteles. Prehodno izražanje z uporabo vakuumske infiltracije je hitro in omogoča uporabo tudi v velikem merilu. Najvišjo koncentracijo rekombinantnih protiteles v 5 tednov stari rastlini so dosegli v najnižjem setu listov 2 dni po transformaciji, znašala pa je tudi do dvakrat več kot v tobaku.

==Viri==

1. M. Cheriachangel: The Introduction and Establishment of a New Leguminous Cover Plant, Mucuna bracteata under Oil Palm in Malaysia. Planter 1998, 74(860), str. 359–368.

2. N. Abd-Aziz, B. C. Tan, N. A. Rejab, R. Y. Othman, N. Khalid: A New Plant Expression System for Producing Pharmaceutical Proteins. Mol. Biotechnol. 2020, 62(4), str. 240–251.

3. S. S. Y. Lim, K. H. Chua, G. Nölke, H. Spiegel, W. L. Goh, S. C. Chow, B. P. Kee, R. Fischer, S. Schillberg, R. Y. Othman: Plant-derived chimeric antibodies inhibit the invasion of human fibroblasts by Toxoplasma gondii. PeerJ 2018, 2018(12).

4. P. Krenek, O. Samajova, I. Luptovciak, A. Doskocilova, G. Komis, J. Samaj: Transient Plant Transformation Mediated by Agrobacterium Tumefaciens: Principles, Methods and Applications. Biotechnology Advances. Elsevier Inc. November 1, 2015, pp. 1024–1042.

Razvoj ekspresijskega sistema za proizvodnjo farmacevtskih proteinov v rastlini Mucuna bracteata

2021-03-14T18:33:56Z

JernejI:

{{DISPLAYTITLE:Razvoj ekspresijskega sistema za proizvodnjo farmacevtskih proteinov v rastlini ''Mucuna bracteata''}}

Razvoj ekspresijskega sistema za proizvodnjo farmacevtskih proteinov v rastlini Mucuna bracteata

2021-03-14T18:33:37Z

JernejI: New page: {{DISPLAYTITLE: Editing Razvoj ekspresijskega sistema za proizvodnjo farmacevtskih proteinov v rastlini ''Mucuna bracteata''}}

{{DISPLAYTITLE: Editing Razvoj ekspresijskega sistema za proizvodnjo farmacevtskih proteinov v rastlini ''Mucuna bracteata''}}

MBT seminarji 2021

2021-03-14T18:32:53Z

JernejI:

Seminarji iz Molekularne biotehnologije so letos organizirani tako, da vsak študent (praviloma v paru, lahko pa tudi samostojno) obdela temo s področja cepiv proti virusu SARS-CoV-2 in o tem pripravi kratek poljudno napisan povzetek. Ta del seminarjev je predstavljen na [[protikovidna cepiva|ločeni strani]].
V drugem delu vsak študent predstavi nek raziskovalni dosežek s širšega področja molekularne biotehnologije. Seznam tem in predstavitev za študijsko leto 2020/21 je predstavljen tu.

Povzetke morate objaviti do torka do polnoči v tednu, ko imate seminar (v četrtek). Angleški naslov prevedite tudi v slovenščino - to bo naslov povzetka, ki ga objavite na posebni strani, tako kot so to naredili kolegi pred vami (oz. predlani).

Način vnosa:

The importance of ''Arabidopsis'' glutathione peroxidase 8 for protecting ''Arabidopsis'' plant and ''E. coli'' cells against oxidative stress (A. Gaber; GM Crops & Food 5(1), 2014; http://dx.doi.org/10.4161/gmcr.26979) Pomen glutation peroksidaze 8 iz repnjakovca za zaščito rastline ''Arabidopsis thaliana'' in bakterije ''Escherichia coli'' pred oksidativnim stresom. Janez Novak (28.2.) 
(slovenski naslov povežite z novo stranjo, na kateri bo povzetek)

----

Naslovi odobrenih člankov po temah:

'''Farmacevtsko pomembni proteini''' 
# Development of Antibody-Fragment-Producing Rice for Neutralization of Human Norovirus (A. Sasou ''et. al''; Frontiers in Plant Science 12, 2021; https://doi.org/10.3389/fpls.2021.639953). [[Proizvodnja riža za sintezo fragmentov protiteles proti humanemu norovirusu.]] Mateja Žvipelj (11.3.)
# A New Plant Expression System for Producing Pharmaceutical Proteins (N. Abd-Aziz ''et. al''; Molecular Biotechnology 62, 2020; https://doi.org/10.1007/s12033-020-00242-2). [[Razvoj ekspresijskega sistema za proizvodnjo farmacevtskih proteinov v rastlini Mucuna bracteata]]. Jernej Imperl (18.3.)
# Nika Zaveršek (18.3.)

'''Cepiva''' 
# Paula Horvat (25.3.) 
# Neža Pavko (25.3.) 

'''Gensko spremenjene rastline''' 
# (1.4.) 
# (1.4.) 
# Andrej Race (7.4.)
# (7.4.)

'''Gensko spremenjene živali in celične linije''' 
# Urša Lovše (8.4.)
# Matija Ruparčič (8.4.)

'''Nizkomolekularni biotehnološki produkti''' 
# Saša Slabe (14.4.)
# Luka Gnidovec (15.4.)
# Liza Ulčakar (15.4.)

'''Biotehnološki polimeri''' 
# Anže Karlek (21.4.)
# Ana Maklin (22.4.)
# Urban Hribar(22.4.)

'''Biotehnološko pridobljeni encimi''' 
# Urška Fajdiga (5.5.)
# Mirsad Mešić (6.5.)
# Martina Lokar (6.5.)

'''Metabolno inženirstvo v biotehnologiji''' 
# Jerneja Nimac (12.5.)
# Urška Pečarič Strnad (12.5.)
# Klementina Polanec (13.5.)
# Ernestina Lavrih (13.5.)

'''Biomasa in biogoriva''' 
# Željka Erić (19.5.)
# Karin Dobravc Škof (20.5.)
# Katja Doberšek(20.5.)

'''Okoljski vidiki biotehnologije in bioremediacija''' 
# Almina Tahirović (26.5.)
# Eva Keber (27.5.)
# Nina Lukančič (27.5.)

MBT seminarji 2021

2021-03-14T18:31:53Z

JernejI:

Seminarji iz Molekularne biotehnologije so letos organizirani tako, da vsak študent (praviloma v paru, lahko pa tudi samostojno) obdela temo s področja cepiv proti virusu SARS-CoV-2 in o tem pripravi kratek poljudno napisan povzetek. Ta del seminarjev je predstavljen na [[protikovidna cepiva|ločeni strani]].
V drugem delu vsak študent predstavi nek raziskovalni dosežek s širšega področja molekularne biotehnologije. Seznam tem in predstavitev za študijsko leto 2020/21 je predstavljen tu.

Povzetke morate objaviti do torka do polnoči v tednu, ko imate seminar (v četrtek). Angleški naslov prevedite tudi v slovenščino - to bo naslov povzetka, ki ga objavite na posebni strani, tako kot so to naredili kolegi pred vami (oz. predlani).

Način vnosa:

The importance of ''Arabidopsis'' glutathione peroxidase 8 for protecting ''Arabidopsis'' plant and ''E. coli'' cells against oxidative stress (A. Gaber; GM Crops & Food 5(1), 2014; http://dx.doi.org/10.4161/gmcr.26979) Pomen glutation peroksidaze 8 iz repnjakovca za zaščito rastline ''Arabidopsis thaliana'' in bakterije ''Escherichia coli'' pred oksidativnim stresom. Janez Novak (28.2.) 
(slovenski naslov povežite z novo stranjo, na kateri bo povzetek)

----

Naslovi odobrenih člankov po temah:

'''Farmacevtsko pomembni proteini''' 
# Development of Antibody-Fragment-Producing Rice for Neutralization of Human Norovirus (A. Sasou ''et. al''; Frontiers in Plant Science 12, 2021; https://doi.org/10.3389/fpls.2021.639953). [[Proizvodnja riža za sintezo fragmentov protiteles proti humanemu norovirusu.]] Mateja Žvipelj (11.3.)
# A New Plant Expression System for Producing Pharmaceutical Proteins (N. Abd-Aziz ''et. al''; Molecular Biotechnology 62, 2020; https://doi.org/10.1007/s12033-020-00242-2). [[[Razvoj ekspresijskega sistema za proizvodnjo farmacevtskih proteinov v rastlini ''Mucuna bracteata'']]. Jernej Imperl (18.3.)
# Nika Zaveršek (18.3.)

'''Cepiva''' 
# Paula Horvat (25.3.) 
# Neža Pavko (25.3.) 

'''Gensko spremenjene rastline''' 
# (1.4.) 
# (1.4.) 
# Andrej Race (7.4.)
# (7.4.)

'''Gensko spremenjene živali in celične linije''' 
# Urša Lovše (8.4.)
# Matija Ruparčič (8.4.)

'''Nizkomolekularni biotehnološki produkti''' 
# Saša Slabe (14.4.)
# Luka Gnidovec (15.4.)
# Liza Ulčakar (15.4.)

'''Biotehnološki polimeri''' 
# Anže Karlek (21.4.)
# Ana Maklin (22.4.)
# Urban Hribar(22.4.)

'''Biotehnološko pridobljeni encimi''' 
# Urška Fajdiga (5.5.)
# Mirsad Mešić (6.5.)
# Martina Lokar (6.5.)

'''Metabolno inženirstvo v biotehnologiji''' 
# Jerneja Nimac (12.5.)
# Urška Pečarič Strnad (12.5.)
# Klementina Polanec (13.5.)
# Ernestina Lavrih (13.5.)

'''Biomasa in biogoriva''' 
# Željka Erić (19.5.)
# Karin Dobravc Škof (20.5.)
# Katja Doberšek(20.5.)

'''Okoljski vidiki biotehnologije in bioremediacija''' 
# Almina Tahirović (26.5.)
# Eva Keber (27.5.)
# Nina Lukančič (27.5.)

MBT seminarji 2021

2021-03-14T18:08:25Z

JernejI:

BNT-seminar

2021-03-08T16:52:00Z

JernejI: /* Bionanotehnologija 2021- seminar */

= Bionanotehnologija 2021- seminar =
doc. dr. Gregor Gunčar, K2.022

== Seznam seminarjev ==

{| {{table}}
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Vpisna številka'''
30170005 
30019057 
30170078 
30170177
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''datum predstavitve'''
16.3.2021 
30.3.2021 
6.4.2021 
13.4.2021
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''recenzent1'''
Anamarija Agnič 
Barbara Slapnik 
Klementina Polanec 
Martin Špendl
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''recenzent2'''
Urška Pečarič Strnad 
Sara Laznik 
Irma Zeljković 
Jernej Imperl
|-

==Naloga==
Pripravite projektno nalogo iz področja Bionanotehnologije. Najpomembnejša je originalna ideja za nek izvedljiv projekt, ki pa mora biti takšen, da pritegne investitorje. Ker je pomembno tudi kako boste to naredili, morate predstaviti tudi metodo in ne samo ideje. Natančno morate vedeti, kako boste projekt izvedli.

Predlagana struktura teksta:
* Uvod
* Predstavitev problema, znanstvena izhodišča, cilji
* Izvedba projekta, metodologija, tehnike, materiali, vprašanja, hipoteze
* Literatura

Za pripravo seminarja velja naslednje: 
* Elektronska verzija seminarja: avtor, naslov projekta, razširjeni povzetek projekta- 350-400 besed (brez literature) in grafični povzetek (čez približno pol strani). Vse naj bo na maksimalno dveh straneh, a ne sme vsebovati manj kot 350 besed (sem se ne šteje literatura).
* Elektronsko verzijo seminarja oddajte en dan pred predstavitvijo, kasneje pa boste vsebino še prekopirali na za to določeno spletno stran, predstavitev pa eno uro pred seminarjem na [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/ strežnik].
* Vsi seminarji so v elektronski obliki dostopni [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/bioseminar/ tukaj].
* Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Za predstavitev je na voljo XY minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni.
* Predstavitvi sledi razprava. Recenzenta morate predlagati vsaj eno izboljšavo predstavljenega projekta.

==Imena datotek==
Prosim vas, da vse datoteke poimenujete po naslednjem modelu:
* 20_nano_Priimek.doc za seminar, npr. 20_nano_Craik_Venter.doc
* 20_nano_Priimek.ppt za prezentacijo, npr. 20_nano_Craik_Venter.ppt

==Urejanje spletnih strani na wikiju==
Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''

==Citiranje virov==
Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se držite ene same. V seminarskih nalogah in diplomskih nalogah FKKT uprabljajte shemo citiranja, ki je pobarvana zeleno.
Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati.
Za citate v naravoslovju je najpogostejše citiranje po pravilniku ISO 690. [http://www.zveza-zotks.si/gzm/dokumenti/literatura.html Pravila], ki upoštevajo omenjeni standard, so pripravili pri ZTKS. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati. 
'''Citiranje knjig:''' 
Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica. 
Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN. 

Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005. 
Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4. 
Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.).

'''Citiranje člankov:''' 
Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani. 
Lartigue, C., Glass, J. I., Alperovich, N., Pieper, R., Parmar, P. P., Hutchison III, C. A., Smith, H. O. in Venter, J. C.
Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, 317, str. 632-638.

Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole: 
Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani. 
Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.

Revija Science uporablja skrajšani zapis: 
C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007) 

V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne). Navesti morate tudi vse avtorje dela, razen v primeru, ko jih je 10 ali več. Takrat navedite le prvih devet, za ostale pa uporabite okrajšavo in sod. (in sodelavci). Pred zadnjim avtorjem naj bo vedno besedica "in".

'''Citiranje spletnih virov:''' 
Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov 
strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life 
Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.

BNT-seminar

2021-03-08T16:50:37Z

JernejI: /* Bionanotehnologija 2021- seminar */

= Bionanotehnologija 2021- seminar =
doc. dr. Gregor Gunčar, K2.022

== Seznam seminarjev ==

{| {{table}}
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Vpisna številka'''
30170005 
30019057 
30170078 
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''datum predstavitve'''
16.3.2021 
30.3.2021 
6.4.2021
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''recenzent1'''
Anamarija Agnič 
Barbara Slapnik 
Klementina Polanec
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''recenzent2'''
Urška Pečarič Strnad 
Sara Laznik 
Irma Zeljković
|-

==Naloga==
Pripravite projektno nalogo iz področja Bionanotehnologije. Najpomembnejša je originalna ideja za nek izvedljiv projekt, ki pa mora biti takšen, da pritegne investitorje. Ker je pomembno tudi kako boste to naredili, morate predstaviti tudi metodo in ne samo ideje. Natančno morate vedeti, kako boste projekt izvedli.

Predlagana struktura teksta:
* Uvod
* Predstavitev problema, znanstvena izhodišča, cilji
* Izvedba projekta, metodologija, tehnike, materiali, vprašanja, hipoteze
* Literatura

Za pripravo seminarja velja naslednje: 
* Elektronska verzija seminarja: avtor, naslov projekta, razširjeni povzetek projekta- 350-400 besed (brez literature) in grafični povzetek (čez približno pol strani). Vse naj bo na maksimalno dveh straneh, a ne sme vsebovati manj kot 350 besed (sem se ne šteje literatura).
* Elektronsko verzijo seminarja oddajte en dan pred predstavitvijo, kasneje pa boste vsebino še prekopirali na za to določeno spletno stran, predstavitev pa eno uro pred seminarjem na [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/ strežnik].
* Vsi seminarji so v elektronski obliki dostopni [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/bioseminar/ tukaj].
* Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Za predstavitev je na voljo XY minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni.
* Predstavitvi sledi razprava. Recenzenta morate predlagati vsaj eno izboljšavo predstavljenega projekta.

==Imena datotek==
Prosim vas, da vse datoteke poimenujete po naslednjem modelu:
* 20_nano_Priimek.doc za seminar, npr. 20_nano_Craik_Venter.doc
* 20_nano_Priimek.ppt za prezentacijo, npr. 20_nano_Craik_Venter.ppt

==Urejanje spletnih strani na wikiju==
Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''

==Citiranje virov==
Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se držite ene same. V seminarskih nalogah in diplomskih nalogah FKKT uprabljajte shemo citiranja, ki je pobarvana zeleno.
Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati.
Za citate v naravoslovju je najpogostejše citiranje po pravilniku ISO 690. [http://www.zveza-zotks.si/gzm/dokumenti/literatura.html Pravila], ki upoštevajo omenjeni standard, so pripravili pri ZTKS. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati. 
'''Citiranje knjig:''' 
Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica. 
Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN. 

Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005. 
Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4. 
Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.).

'''Citiranje člankov:''' 
Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani. 
Lartigue, C., Glass, J. I., Alperovich, N., Pieper, R., Parmar, P. P., Hutchison III, C. A., Smith, H. O. in Venter, J. C.
Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, 317, str. 632-638.

Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole: 
Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani. 
Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.

Revija Science uporablja skrajšani zapis: 
C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007) 

V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne). Navesti morate tudi vse avtorje dela, razen v primeru, ko jih je 10 ali več. Takrat navedite le prvih devet, za ostale pa uporabite okrajšavo in sod. (in sodelavci). Pred zadnjim avtorjem naj bo vedno besedica "in".

'''Citiranje spletnih virov:''' 
Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov 
strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life 
Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.

BIO2 Povzetki seminarjev 2018

2019-01-11T22:59:25Z

JernejI: /* Biokemija- Povzetki seminarjev 2018/2019 */

== Biokemija- Povzetki seminarjev 2018/2019 ==
Nazaj na osnovno [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Seminar_2018 stran]

===Karmen Mlinar: Signalizacija in odzivi na abiotski stres pri rastlinah===
Rastline živijo v stalno spreminjajočem se okolju, ki je pogosto neugodno in stresno za njihovo rast in razvoj. Primer abiotskega stresa so suša, ekstremne temperature, slanost tal, pomanjkanje hranil v prsti ipd. Rastline lahko stres preživijo tako, da se mu prilagodijo ali pa izognejo. V nasprotnem primeru so obsojene na smrt. Identificiranih je le malo senzorjev, ki zaznavajo stres. Pri signalizaciji odzivov na stresna okolja pogosto sodeluje družina kinaz SnRK, ki zaznajo spremembe v energijskem statusu rastline, ki jih povzroči stres. Znane so tri poddružine SnRKs: SnRK1s, SnRK2s, ki sodelujejo pri osmotskem stresu in ABA signalizaciji, in SnRK3s, ki so ključni regulatorji ionske homeostaze pri spopadanju s solnim stresom. Pri ionskem stresu pogosto problem predstavlja Na+. Pri njegovi signalizaciji je ključna SOS signalna pot. Signalizacija temperaturnega stresa se začne s spremembami v fluidnosti membrane, kar zaznajo integralni membranski proteini. Pri signalizaciji pogosto sodelujejo tudi MAPKs, CPKs in stresni hormon ABA, pomembno vlogo pa nosijo sekundarni sporočevalci kot sta kalcij in ROS. Vse to stremi k vzpostavitvi ionske in vodne homeostaze ter celične stabilnosti v stresnem okolju. Z razumevanjem signalizacije stresa in odzivov, ki sledijo, bomo lahko izboljšali odpornost pridelkov na stres in s tem zagotovili kmetijsko stabilnost in preskrbo s hrano za rastoče svetovno prebivalstvo.

===Aljaž Bratina: Pomen različnih signalnih poti pri staranju===
Staranje je postopna izguba fiziološke integritete in vodi v prizadeto funkcionalnost ter povečano možnost za smrt. Hitremu staranju nasprotna je dolgoživost, to je stanje, v katerem organizem ne izgublja funkcionalnosti ali jo izgublja počasneje. Staranje lahko opredelimo z devetimi splošnimi lastnostmi, ki jih opazimo v večini organizmov. Pri preučevanju staranja opazujemo organizem C. elegans, ki lahko med razvojem v primeru neugodnih razmer razvije stanje dauer, v katerem je razvoj ustavljen in je tako organizem sposoben preživeti dalj časa. Pri regulaciji staranja in dolgoživosti so pomembne mnoge celične signalne poti, kot del njih pa predvsem jedrni receptorji, ki uravnavajo prepisovanje genov, ki imajo vpliv na hitrost staranja oz. vzdrževanje dolgoživosti. V seminarski nalogi so opisane štiri pomembne signalne poti in njihov vpliv na staranje. Pri prvi je pomemben jedrni receptor DAF-12, ki za svoje delovanje potrebuje steroid DA. Neugodne razmere ga deaktivirajo, kar vodi v razvoj stanja dauer. Na dolgoživost pozitivno vpliva tudi aktiviran kompleks NSBP-1 in jedrnega receptorja DAF-16, ki sta del signalne poti IIS. To pot regulira tudi količina holesterola v celici. Dolgoživost povzročajo tudi prekinitveni post, pri katerem se aktivira jedrni receptor AP-1, pa tudi odstranitev zarodnih celic, ki poleg prej omenjene DAF-12 in DAF-16 aktivira tudi nekatere druge receptorje, npr. NHR-80 in NH3-49.

===Eva Gartner: Wnt signalizacija in njena vloga pri srčni fibrozi===
Wnt signalizacija zajema skupino signalnih poti, ki jih regulirajo wnt proteini. Ti se vežejo na posebne receptorje v membrani celice, preko katerih se signal prenese v notranjost. Wnt signalizacijo sestavljajo tri glavne signalizacijske poti: kanonična wnt pot, ki vključuje protein β-katenin, nekanonična (PCP) pot in nekanonična pot, ki sodeluje pri regulaciji kalcija. Vse poti se začnejo z vezavo wnt-liganda na transmembranske Fz receptorje in prenosom signala do znotrajceličnega proteina Dsh. Od tu naprej se poti razcepijo vsaka v svojo smer. Wnt signalizacija sodeluje v mnogih procesih, potrebnih za normalen razvoj organizma, kot so npr. razmnoževanje, specializacija in migracije celic. Prisotnost regulacije z wnt signalizacijo so odkrili tudi pri srčni fibrozi in z njo povezanih boleznih in poškodbah srca. V zdravih celicah wnt signalizacija navadno ni prisotna. Izraz fibroza se nanaša na povečanje količine zunajceličnega matriksa, zaradi česar postane srčna mišica otrdela in krčenje manj intenzivno. Pride do prekomerne namnožitve fibroblastov in diferenciacije v miofibroblaste, ki so fenotipsko med fibroblasti in mišičnimi celicami. Kljub številnim raziskavam, ki dokazujejo vpletenost wnt signalizacije v razvoju fibroze, natančni mehanizmi vseh signalnih poti še vedno niso znani. Potrebne so še nadaljnje raziskave za razumevanje zapletene celične komunikacije in odkritje novih terapevtskih možnosti.

===Neža Žerjav: Vloga kaspaz pri celični smrti===
Kaspaze so cisteinske peptidaze, ki sodelujejo v signalnih poteh celične smrti. Poznamo več vrst celične smrti, med njii tudi apoptozo, nekrozo, nekroptozo in piroptozo. Vloga kaspaz pri apoptozi je dobro znana, so adapterski proteini ali pa aktivno sodelujejo pri postopni razgradnji celice, saj sprožijo nastajanje apoptotskih veziklov in fagocitozo celice. Nekrozo označujemo kot neprogramirano celično smrt, vendar to za nekroptozo, ki ji pravimo tudi programirana nekroza, ne drži. Slednja je namreč v celici konkurenčna apoptozi, preko kaspaz sta recipročno regulirani. Nekroptozo kaspaze zavirajo, saj inhibirajo kompleks RIPK1/RIPK3, ki z aktivacijo proteina MLKL povzroči razlitje celične vsebine, značilno za nekrozo. Kaspaze sodelujejo tudi pri piroptozi, ki je posledica stresnih dejavnikov iz okolice – poškodb, patogenih organizmov ali njihovih toksinov. Kaspaze pri piroptozi povzročijo aktivacijo gasdermina D, ki sproži celično lizo, in vnetni odziv. Poznavanje delovanja kaspaz nam omogoča tako vpogled v razvoj in mehanizem vzdrževanja homeostaze organizmov, kakor tudi razumevanje patoloških procesov, na primer multiple in amiotrofične lateralne skleroze, ishemične bolezni srca ter vnetnih odzivov zaradi okužb.

===Meta Kodrič: Svetlobne signalne poti za uravnavanje fotomorfogeneze===
Svetloba je za rastline eden od najpomembnejših okoljskih signalov, ki vplivajo na rast in razvoj. V odvisnosti od intenzitete in valovne dolžine svetlobe se pri rastlinah pojavljata dva kontrastna razvojna procesa. Fotomorfogeneza je osnovna oblika rasti, saj rastlinam omogoča razvoj v avtotrofne organizme, sposobne opravljati fotosintezo, skotomorfogeneza pa je le zavrta oblika fotomorfogeneze, ki se odvija v temi. Potek teh dveh procesov rastline uravnavajo pod vplivom svetlobnega signala v svetlobni signalni poti. V njej sodelujejo fotoreceptorji ter pozitivni in negativni regulatorji fotomorfogeneze. V temi se fotoreceptor fitokrom nahaja v biološko neaktivni obliki v citosolu rastlinske celice. Negativni regulatorji se tako lahko v jedru prosto vežejo na druge molekule. Transkripcijski faktorji PIF se v obliki dimerov vežejo na promotorske regije na molekuli DNA in s tem preprečijo prepisovanje genov za fotomorfogenezo. Proteini COP/DET/FUS delujejo kot E3 ligaze pozitivnih regulatorjev HY5, HFR1, LAF1 in tako sodelujejo pri njihovi razgradnji. Z vzajemnim delovanjem tako negativni regulatorji zatirajo potek fotomorfogeneze. Na svetlobi se fitokrom konformacijsko spremeni in preide v jedro. Tam v sodelovanju z drugimi molekulami inhibira negativne regulatorje, bodisi s preprečitvijo njihovega encimskega delovanja, bodisi s sodelovanjem pri njihovi razgradnji. Posledično lahko postanejo aktivni pozitivni regulatorji, ki se vežejo poleg promotorskih regij na DNA in tako aktivirajo prepisovanje genov za fotomorfogenezo.

===Tina Zavodnik: Mehanična transdukcija in proteini Piezo===
Praktično vsi organizmi so občutljivi na mehanske dražljaje. Fizične sile regulirajo številne fiziološke procese, nezadostni oz. napačni odzivi nanje pa lahko vodijo do številnih okvar ali bolezni. Naše zaznavanje teh dražljajev in njihova pretvorba v biokemijske informacije, imenovana tudi mehanotransdukcija, sta torej ključna za dojemanje sveta okoli nas in odzivanje nanj. To nam omogočajo čutila, navadno sestavljena iz čutilne celice ali receptorja in senzoričnega nevrona. Zaradi obstoja mnogo različnih vrst in intenzitet dražljajev so se tudi čutnice in senzorični nevroni specializirali v zaznavanje vsakega od stimulusov. Merklovi živčni končiči so mehanski receptorji, sposobni zaznavati nežen pritisk na koži. To pa jim omogočajo posebni ionski kanalčki, imenovani proteini Piezo. Nežen dotik na površini kože sproži prenos mehaničnega dražljaja do Merklovih živčnih končičev, kjer se aktivira kanalček Piezo2 v Merklovi celici. Aktivacija kanalčka omogoči prehod kalcijevih in natrijevih ionov v notranjost celice. Merklova celica se depolarizira in sproži akcijski potencial v pripadajočem aferentnem nevronu. Mehanični dražljaj pa aktivira tudi kanalčke Piezo2 v membrani SA1 aferentnega nevrona in s tem sproži dodatno vzpostavitev akcijskega potenciala. Pred kratkim je bila odkrita struktura proteina Piezo, kar pa še vedno ne razkriva natančnega mehanizma aktivacije ionskega kanalčka zaradi mehanskega dražljaja. Najverjetneje se zaradi mehanskega dražljaja spremeni konformacija proteina Piezo. Kanalček se odpre in ioni lahko pod vplivom koncentracijskega gradienta prehajajo skozi membrano.

===Doroteja Armič: Bifunkcionalen encim PFK-2/FBPaza-2 in njegova vloga v metabolizmu glukoze===
PFK-2/FBPaza-2 (fosfofruktokinaza-2/fruktoza-2,6-bisfosfataza) je eden izmed encimov, ki sodelujejo pri regulaciji metabolizma glukoze v evkariontih. Je bifunkcionalen encim, ki uravnava, ali bo v celici potekala glikoliza ali glukoneogeneza. Za to je odgovoren posredno, saj regulira količino alosteričnega efektorja encimov PFK-1 in FBPaza-1 – fruktoze-2,6-bisfosfata. En encim ima dve katalitični domeni. Kinazna domena katalizira sintezo, bisfosfatazna domena pa razgradnjo fruktoze-2,6-bisfosfata. Delovanje encima je regulirano na nivoju posttranslacijske modifikacije, in sicer s fosforilacijo/defosforilacijo. Pri sesalcih obstajajo štirje različni izocimi, vsakega kodira drug gen. Ti izocimi so jetrni, srčni, možganski in izocim testisov. Vsak izocim pa ima več izooblik, ki nastanejo z alternativnim spajanjem eksonov. Izooblike se razlikujejo v regulatornih regijah. Fosforilirajo in defosforilirajo jih drugačne kinaze, nekatere izooblike pa fosforilacijskih mest sploh nimajo. Encim PFK-2/FBPaza-2 je nastal s fuzijo dveh genov. Encim se je razvil tako, da je funkcionalen samo, če sta prisotni obe domeni. Tudi pri tripanosomatidih in kvasovkah, kjer je encim monofunkcionalen, je zato še vedno zapis za obe domeni. V razvoju je prišlo do različnih izooblik v različnih tkivih oziroma organizmih zaradi drugačnih potreb za metabolizem glukoze. Ker PFK-2/FBPaza uravnava glikolizo in glukoneogenezo, bi lahko tarčno reguliranje encima postalo nov način zdravljenja diabetesa.

===Martina Lokar: Biotinilacija proteinov ===
Biotin je pomemben encimski kofaktor, saj olajša prenos karboksilne skupine med metaboliti pri karboksilaciji, dekarboksilaciji in transkarboksilaciji. Biotin protein ligaza (BPL) ga v procesu biotinilacije veže na tarčni biotin-odvisen encim. Biotinilacija je dvostopenjski proces, pri katerem pride v prvem koraku do ligacije biotina in ATP ter nastanka intermediata biotinil-AMP. V drugem koraku se biotin iz biotinil-AMP veže na tarčni encim in pride do sprostitve molekule AMP. Ker je biotin v naravi redek, organizmi natančno uravnavajo njegovo porabo. Evkarionti so nezmožni sami sintetizirati biotin, zato ga pridobivajo iz okolja. Zadostno količino ohranjajo v biotinskem ciklu z reciklacijo biotina iz biotin-odvisnih encimov. Pri metaboličnih procesih sesalcev sodeluje pet biotin-odvisnih karboksilaz, ki so v splošnem zgrajene iz treh domen: domene BC, domene CT in domene BCCD. Biotin je kovalentno vezan na lizinski ostanek v domeni BCCD in se preko modela zibajoče roke ali modela zibajoče domene med katalizo translocira iz domene BC v domeno CT. Karboksilaze katalizirajo reakcijo prenosa karboksilne skupine na substrat v dveh korakih. Najprej se v domeni BC karboksilna skupina veže na biotin. Slednji se nato premakne v domeno CT, kjer se karboksilna skupina iz biotina prenese na substrat. Če telo ni sposobno uravnavati in izkoriščati zaloge biotina, človek oboli za boleznijo MCD.

===Lara Drinovec: AMPK in avtofagija pri glukoznem/glikogenem metabolizmu===
Glukozni/glikogeni metabolizem je primarna metabolična pot, ki je uravnavana na najrazličnejših nivojih, glede na potrebe celice. Znano je, da raven glukoze v krvi uravnavata dva hormona: inzulin, ki omogoča prevzem glukoze v celico in glukagon z nasprotno učinkovitostjo. Metabolni regulator, ki deluje od inzulina neodvisno in se odziva na krčenje mišic, je AMPK (AMP-aktivirana protein kinaza). Aktivira jo lahko AMP, tako da se veže na vezavno mesto na eni izmed treh podenot AMPK. Spremembo koncentracije AMP lahko AMPK zazna hitreje kot spremembo koncentracije ATP. Aktivirana AMPK inhibira anabolne poti in aktivira katabolne procese, ter tako vzdržuje energijsko homoestazo v aktivnih celicah. Pomembno vlogo pri vzdrževanju nivoja glukoze v celici igra tudi avtofagija, ki povzroči razgradnjo hranilnih snovi, kot so glikogen in lipidne kapljice, s tem zagotovi celici zadostno količino glukoze, in tako deluje kot nadomesten proces za glukoneogenezo. Tudi ta proces je v celicah uravnavan, in sicer z različnimi signalnimi molekulami. Mnogo bolezni, kot sta na primer diabetes in rak, sta tesno povezani z nefunkcionalnostjo nekaterih metaboličnih senzorjev ali avtofagije, zato je razumevanje njihovih funkcionalnih interakcij osnova za nove terapevtske možnosti.

=== Tina Kolenc Milavec: Intermediati Krebsovega cikla kot signalne molekule pri vnetnem in protivnetnem odgovoru===
Intermediati Krebsovega cikla imajo v celici pomembno vlogo, saj ne služijo le kot vmesni produkti v procesu nastanka molekul ATP, temveč tudi kot prekurzorji za sintezo drugih biološko pomembnih molekul ter kot signalne molekule v številnih metaboličnih poteh. Ko se na tolične receptorje (TLR4) na površini makrofaga vežejo s patogeni povezani molekulski vzorci, pride v celici do preklopa metabolizma z oksidativne fosforilacije na glikolizo za namene pridobivanja energije v obliki ATP, kar neposredno vpliva na vnetno stanje v celici. Krebsov cikel, ki sedaj nima več vloge zagotavljanja energije celici, se prekine na dveh mestih: za sukcinatom ter pri izocitrat dehidrogenazi, kar omogoči, da intermediati citratnega cikla delujejo kot signalne molekule. Pri vnetnem odzivu organizma na patogene sta zelo pomembna sukcinat in citrat. Prvi povzroči povišanje koncentracije Hif1α v celici ter nastanek reaktivnih kisikovih spojin (ROS) zaradi vzvratnega elektronskega transporta, citrat pa deluje kot substrat za verigo reakcij, ki prav tako vodijo do nastanka ROS. Pri ponovni vzpostavitvi normalnih razmer v celici po uspešni odstranitvi patogenov pa ima pomembno vlogo itakonat - molekula, ki nastane iz cis-akonitata. Ta vpliva na tri pomembne molekule (sukcinat dehidrogenazo, Nrf2 ter ATF3), ki sprožijo vsaka svojo kaskado reakcij protivnetnega odgovora.

===Valeriya Musina: Vpliv intermediatov Krebsovega cikla na celične procese===
Krebsov cikel je bil oblikovan osedemdeset let nazaj, vloge njegovih inermediatov, zlasti sukcinata in fumarata, pa so bile odkrite nedavno. V zadnjem času so bile narejene številne raziskave človeških bolezni, zlasti niza specifičnih vrst raka, ki so razkrile pomembne vloge intermediatov Krebsovega cikla pri metilaciji genov in s tem pri preoblikovanju celic. Intermediati Krebsovega cikla lahko delujejo kot primarni substrati, signalne molekule ali sodelujejo pri posttranslacijskih modifikacijah. Vedno več dokazov kaže, da ima epigenetika pomembno vlogo pri regulaciji dobe zdravja, in je vključena v proces staranja. 2-oksoglutarat (α-ketoglutarat) je ključni metabolit v Krebsovem ciklu, vendar je tudi obvezen substrat za 2-oksoglutarat odvisne dioksigenaze (2-OGDO). Družina encimov 2-OGDO vključuje glavne encime za demetilacijo DNA in histonov, encime Ten-Eleven translocation (TETs) in encime z domeno Jumonji C (JmjC). Poleg tega lahko člani družine 2-OGDO regulirajo sintezo kolagena in odzive na hipoksično okolje tudi na neepigenetski način. 2-oksoglutarat je substrat 2-oksoglutarat dehidrogenaz (2-OGDH), zato lahko motnje v funkciji 2-OGDH v Krebsovem ciklu povzročijo globalne degenerativne spremembe v strukturi kromatina. Sukcinat in fumarat močna inhibitorja 2-OGDO encimov, zato ravnotežje reakcij v Krebsovem ciklu lahko vpliva na raven metilacije DNA in histonov ter tako nadzira izražanje genov.

===Marko Pavleković: Vloga sukcinata kot ligand z G proteini vezanega receptorja GPR91===
Znano je, da je cikel citronske kisline osrednjega pomena za presnovo celic in energetsko homeostazo. Vendar marsikateri intermediat cikla igra vlogo tudi v drugih procesih v telesu. Na primer sukcinat deluje kot ekstracelularni ligand z vezavo na z G proteinom vezan receptor, znan kot GPR91, izražen v ledvicah, jetrih, srcu, retinalnih celicah in morda v številnih drugih tkivih, kar vodi do širokega nabora fizioloških in patoloških učinkov. V normalnih pogojih se sukcinata ne sintetizira dovolj, da bi lahko aktiviral GPR91, šele v pogojih kot so ishemija, diabetes in hipoksija, sukcinata nastane dovolj. Ker pa sukcinat nastaja v matriksu mitohondrija mora na poti do receptorja, ki se nahaja na zunanji strani celic, prečkati še tri membrane. Skozi GPR91 je sukcinat vključen v funkcije, kot so uravnavanje krvnega tlaka, zaviranje lipolize v belem maščobnem tkivu, razvoj vaskularizacije mrežnice, srčna hipertrofija in aktivacija zvezdastih jetrnih celic z ishemičnimi hepatociti. Zaradi tega je sukcinatni receptor obetajoč cilj za zdravila za preprečevanje teh neželenih patoloških učinkov. Nedavni razvoj antagonistov, specifičnih za SUCNR1, odpira nove možnosti za raziskave v modelih za te motnje in lahko sčasoma zagotovi nove možnosti za zdravljenje bolnikov.

===Klementina Polanec: Sirtuini kot regulatorji oksidacije maščobnih kislin===
Sirtuini so družina visoko ohranjenih proteinov (SIRT1-SIRT7 pri sesalcih), ki imajo regulatorno vlogo v metabolizmu in staranju. Delujejo kot regulatorji oksidacije maščobnih kislin v odgovor na številne strese za celico, kot so omejitev kalorij, postenje, mraz. Ker se zniža nivo ATP v celici in je glukoze premalo, se poveča razgradnja glikogena, hkrati pa se pospeši oksidacija maščobnih kislin v mišicah in jetrih. Do nedavnega je veljajo prepričanje, da je aktivnost sirtuinov odvisna le od koncentracije NAD+ v celici. Raziskovalci so pred kratkim dokazali, da se lahko SIRT1 aktivira tudi s fosforilacijo, ki jo izvede protein kinaza A (PKA). Ko so sirtuini aktivirani, delujejo v glavnem kot deacetilaze številnih encimov, s čimer jih aktivirajo. SIRT1 tako deacetilira PGC1α, ki pospeši izražanje tarčnih genov, ki so povezani z oksidacijo maščobnih kislin. SIRT3 pa odvisno od koncentracije NAD+ deacetilira in s tem aktivira LCAD (long-chain acyl-CoA dehydrogenase). To je pri miših ključen encim, ki sodeluje v oksidaciji dolgoverižnih maščobnih kislin. S pospešeno oksidacijo celica dvigne nivo ATP in ponovno vzpostavi homeostazo. Sirtuini so zato lahko potencialna tarča za zdravljenje motenj v oksidaciji maščobnih kislin ter tudi za preprečevanje prekomerne teže oziroma debelosti.

===Tadej Medved: Vpliv oksidacije maščobnih kislin na usodo celic===
Usodo celic, tj. končne lastnosti, ki jih bo celica izražala po razvoju in diferenciaciji, določajo številni procesi. Mednje spada tudi metabolična β-oksidacija maščobnih kislin. Izkaže se, da je količina acetil-CoA, pridobljena preko oksidacije maščobnih kislin, pogosto odločilni dejavnik za izražanje lastnosti določenih tipov celic; do sedaj je bil ta vpliv raziskan v endotelijskih celicah limfnih žil in srca ter v limfocitih T. Ključna regulacija oksidacije MK se prične pri izražanju encima CPT1, ki omogoča transport maščobnih kislin v mitohondrij. V srčnem endoteliju vpliva ta proces na pretvorbo endotelijskih celic v mezenhimske, in sicer zaradi TGF-β signalizacije, ki z inhibicijo metabolizma MK sproži spremembe celičnih lastnosti v mezenhimske. V endoteliju limfnih žil je oksidacija MK pomembna za vršenje limfangiogeneze, tj. tvorbe novih limfnih žil s proliferacijo in diferenciacijo obstoječih limfnih endotelijskih celic. Ta proces je odvisen od signalov VEGF-C in PROX1; slednji poveča izražanje CPT1 in pripravi celico do migracije in proliferacije. Količina acetil-CoA je relevanten dejavnik za diferenciacijo in dolgoživost spominskih T celic, povezana pa je preko aktivacije AMPK s signalno molekulo TRAF6. V T celicah na sploh pa močno učinkuje PD-1, ki pospeši tako hidrolizo MK kot tudi njihovo oksidacijo in omogoča preživetje teh celic v pogojih, kjer niso sposobne sprejemanja drugih hranilnih snovi, kot je glukoza.

===Rebeka Dajčman: Metabolizen, signalizacija in farmakološka funkcija ketonskih teles===
ketonska telesa nastanejo kot stranski produk pri presnovi maščobnih kislin. mednje sodijo acetoacetat, aceton in najobstojnejši beta hidroksibutirat. njihova sinteza se poveča, ko telesu primanjkuje ogljikovih hidratov. to je med stradanjem, po športni aktivnosti, med nosečnostjo ali med ketonsko dieto. v seminarski nalogi bom predstavila metabolično bot ketonskih teles. od sinteze v jetrih do njihovega transporta v ostala tkiva. to so predvsem skeletne mišice, srce in možgani ter njihovo oksidacijo nazaj v acetil-CoA. sinteza ketonskih teles je regulirana s transkripcijsko in post-translacijsko regulacijo. pri tem gre predvsem za regulacijo encimov, ki sodelujejo v sintezi in razgradnji teles. ketonska telesa pa imajo vlogo regulacije dveh membranskih receptorje ali histonske deacetilaze. ketonska telesa se že desetletja uporabljajo v zdravljenju nevrodegenerativnih bolezni in v tej smeri tudi tečejo prihodnje raziskave

===Sumeja Kudelić: Transsulfuracijska pot kot obrambni mehanizem celic pri oksidativnem stresu===
Transsulfuracijska pot, kot novo raziskovalno področje nam podarja veliko pozitivnih načinov v boju proti oksidativnemu stresu. Oksidativni stres, kot negativni dejavnik celic s svojimi reaktivnimi kisikovim zvrsti, poškoduje različne celične organele, kar vodi do celične smrti. Pri transsulfuraciji poti je ugotovljeno, da bistveni pomen ima cistein y-liaza, ki je biosintetični encim cisteina. Pri razgradnji cisteina lahko pridobimo vodikov sulfid (H2S), ki je v zelo majhnih koncentracijah pomemben signalizator celice. Več mehanizmov pozitivnega delovanja transsulfuracije poti (posredne ali neposredne) je raziskano, te so prišli do rezultatov, ki bi lahko pomagali pri izboljšanem terapevtskem zdravljenju nevrodegenerativnih bolezni, ki so povezane z metabolizmom aminokislin. Važno je iztakniti, da s pomočjo tega mehanizma ali z njeno inhibicijo bi tudi vplivali na bakterijsko smrt. Saj se pri bakterijah razvila obrambna stimulacija transsulfuracijske poti, pri čemer so bakterije postale 'imune' na antibiotike. Vodikov sulfid kot pomemben dejavnik transsulfuracijske poti vpliva na to, da veže proste ione, ki bi lahko v oksidativnih pogojih (H2O2) reagirali s to spojino. Kot posledica reakcije nastanejo prosti kisikovi radikali, ki poškodujejo celične organele. Nevrodegenerativne bolezni uporabljajo transsulfuracijsko pot kod pomemben vir aminokislin in tudi s tem preprečujejo, da so njihove celice izpostavljene oksidativnemu stresu.

===Matija Ruparčič: Ureaze in njihova vloga v živih bitjih===
Ureaze so metaloencimi, ki katalizirajo hidrolizo uree oziroma sečnine. Pri tem nastaneta dve molekuli amoniaka ter ena molekula ogljikovega dioksida. Najdemo jih v veliko organizmih kot so rastline, glive in bakterije. Le živali jih nimajo, saj se pri njih sečnina tvori kot odpadni produkt. Strukturno se razlikujejo glede na vrsto organizma, zapis za njihove sestavne dele pa se skriva v velikem številu genov. Za organizme, ki jih vsebujejo, predstavljajo ključen faktor za življenje. S pomočjo njih lahko bakterije ''Helicobacter pylori'' preživijo v ekstremno kislih razmerah želodca, bakterijam ''Proteus mirabilis'' omogočajo tvorbo zaščitnih biofilmov, rastlinam pa zagotavljajo bogat vir dušika in jim pomagajo pri katabolizmu arginina. Pred kratkim pa so odkrili, da imajo poleg tega ureaze še druge naloge, ki niso povezane z njihovo katalitično sposobnostjo. Med te štejemo vlogo medcelične komunikacije pri lišajih, obramba pred oksidativnim stresom kot odgovor imunskega sistema in še veliko več. Poznamo jih sicer že skoraj 150 let, vendar o njih vemo še vedno relativno malo. Motivacija za njihovo preučevanje pa je velika, saj nam lahko pomagajo k napredkom na raznih področjih kot sta medicina in agronomija.
===Maks Kumek: Vloga metabolizma arginina v celični regulaciji in erekcija===
Izmed vseh intermediatov ureinega ciklusa je pravzagotovo arginin najbolj prepleten v razne regulacijske sisteme celice. Metabolične poti arginina so kompleksne in se mnogokrat prepletajo med seboj. Sinteza arginina poteka v različnih predelih telesa v ti. črevesno renalni osi. Pretvorba glutamina vse do citrulina poteka v celicah tankega črevesja. Citrulin se izloči v krvni obtok in potuje do ledvic, kjer se nadaljnjo sintetizira do argenina. Regulacija nastajanja produktov je tesno povezana z transportnimi regulatorji družine SLC7 ( CAT 1, CAT-2A, y+LAT, b0,+, CAT-2B) . Regulacija transporterjev ne poteka le na transkripcijskem nivoju temveč tudi na posttranslacijskem nivoju (npr. spermin). Kompleksnost s poglabljanjem le narašča.Vrste encimov, pri katerih igra arginin vlogo substrata so: arginaza, NOS (ang. nitric oxide synthase), arginin dekarboksilaza (ADC), arginin:glicil amidinotransferaza. Posebno pomembnost ima NOS,ki so trije izocimi: iNOS, nNOS, eNOS. Ti trije encimi so prostorsko in regulacijsko ločeni med seboj, vendar pa je moč tudi pri njih zapaziti prepletanje delovanja v procesu, kot je erekcija.Razumevanje vloge metaboličnih produktov arginina v celic pomaga razumeti širšo sliko imunološkega odziva, preprečevanje bolezenskih stanj (npr. impotence) in konec koncev pomaga tudi pri razumevanju lastnega telesa.

===Anže Šumah: Delovanje proteina termogenina in njegov pomen pri termogenezi===
Ohranjanje stalne telesne temperature je za toplokrvne organizme življenjskega pomena. Eden izmed mehanizmov termoregulacije je termogeneza – proizvodnja toplote. Pri sesalcih se je razvilo posebno tkivo, katerega osnovna naloga je termogeneza. To je rjavo maščobno tkivo, ki je pomembno predvsem za majhne sesalce, pri ljudeh pa se v večji meri pojavlja pri novorojenčkih. V notranji membrani mitohondrijev tega tkiva se nahaja protein termogenin, imenovan tudi UCP1, ki energijo protonskega gradienta, nastalega pri dihalni verigi, porabi za proizvodnjo toplote, namesto da bi se le-ta porabila za sintezo ATP. Glavni regulatorji termogenina so proste maščobne kisline in purinski nukleotidi, pri čemer delujejo prve kot aktivatorji, slednji pa kot inhibitorji. Sam mehanizem prenosa protonov iz medmembranskega prostora v matriks še ni popolnoma jasen, sta se pa uveljavila dva modela. Prvi predpostavlja, da deluje termogenin kot simporter maščobnih kislin in protonov. Drugi model pa ugotavlja, da je termogenin uniporter za maščobne kisline, katere prenaša v medmembranski prostor. Tam se protoni vežejo na njih in lahko tako skupaj difundirajo skozi membrano. Ker številni znanstveniki menijo, da bi lahko uporabili izsledke o delovanja in regulacije termogenina v boju proti debelosti in z njo povezanih bolezni, je pomembno, da se raziskave na tem področju nadaljujejo.

===Liza Praznik: Dinamična strukture mitohondrija za opravljanje raznolikih funkcij===
Sposobnost opravljanja raznolikih funkcij mitohondrija je posledica dveh prilagodljivih membran znotraj njega. Tvorita dinamičen organel s sposobnostjo nenehnega spreminjanja svoje oblike. Za to so zadolženi proteini MTC (mitochondria shaping proteins), ki so zasidrani v obeh membranah, od koder skrbijo za pravilno urejenost mitohondrija, primer takšnih proteinov je OPA1, MTF1 in MTF2, Drp1 ter proteinski kompleks MICOS. Najzaznavnejše so spremembe v mitohondrijskih kristah, ki jih tvori notranja membrana. Gre za kompartment, bogat s proteini, preko katerega je regulirana struktura mitohondrija. Ta organel se deli neodvisno od celice, v kateri se nahaja, razvil je lasten življenski cikel mitohondrija. Gre za nenehne procese fuzije (spajanje) in fizije (cepitve), preko katerih mitohondrij uravnava število organelov, hkrati pa izloča in razgradi tiste dele, ki delujejo nepravilno oziroma so poškodovani. S tem istim mehanizmom se odzove tudi na različno količino hranil, ki je celici na voljo. V presežkih razpade na krajše fragmente, v primankljaju pa tvori podaljšano obliko z večjo gostoto krist, v katerih pospešeno nastaja ATP. Takšno obliko tvori tudi kot odgovor na avtofagijo in se zato ne razgradi, temveč preskrbi celico z energijo. Pomemben je odgovor mitohondrija na apoptozo, signal zanjo povzroči spremembe v delovanju proteinov, OPA1 se razpre in citokrom c se iz krist je preko kanalčkov sprosti v citosol.

===Barbara Jaklič: Vloga proton-črpajočega rodopsina pri fotofosforilaciji in drugih procesih odvisnih od protonske gonilne sile===
Poznamo več vrst rodopsinskih kompleksov: signalni pretvorniki, ionske črpalke in protonske črpalke. Slednje sestavlja 7 transmembranskih alfa vijačnic, z vmesnimi kratkimi zankami. V sredini je na aspartatni kislinski ostanek s svojim N-koncem vezana molekula retinala. Retinal je večinoma edini pigment v proton črpajočih rodopsinih (PPR), njegova vijolična barva se odraža v barvi celotnega kompleksa. Retinal je tudi ključnega pomena za delovanje PPR, saj absorpcija fotonov povzroči njegovo konformacijsko spremembo in s tem črpanje protonov skozi membrano. V eni od vrst PPR imenovani ksantorodopsini so prisotni antenski pigmenti keto-karotenoidi, ki razširijo absorpcijski spekter, saj je v osnovi omejen na ozek pas zeleno-modre vidne svetlobe. Potencialna uporaba PPR v genskem inženiringu je usmerjena predvsem v heterologno ekspresijo v gostiteljskih celicah, s katero lahko v heterotrofne organizme uvedemo avtotrofijo ali pa PPR izrazimo le kot dodaten vir črpanja protonov, saj so številni metabolični procesi odvisni prav od protonske gonilne sile. Rodopsinski proton-črpajoči kompleksi so dokazano manj učinkoviti za ustvarjanje protonskega gradienta kot klorofilni, ker lahko v enem fotociklu prečrpajo največ en proton, vendar je njihova heterologna ekspresija bolj preprosta, ker jih poleg genov za sam rodopsin kodira samo 5 dodatnih genov za biosintezo retinala.

===Gašper Anton Komatar: Telesna aktivnost poveča učinkovitost mitohondrijskega sistema in zviša raven telesne energije===
Človek, kot heterotrofen organizem, mora energijo za delovanje dobiti iz energijsko bogatih molekul, ki jih je nekoč pridelal avtotrof. Zaužito hrano prebavi in transportira v celice, kjer sledi zaključek katabolizma. Metabolni poti glukoze in maščobnih kislin, kot glavnih virov energije za človeka, se združita v mitohondriju v krebsovem ciklu in zaključita z dihalno verigo. Tam proizvede večino kemijske energije za uravnavanje procesovp, potrebnih organizmu. Pri tem je zanimivo, da povprečen človek naše predebele družbe zaužije več energijsko bogatih hranil, kot jih porabi, a je kljub temu večino časa utrujen, brez energije... Kaj v metabolizmu snovi gre torej narobe, da se kljub presežku energije shranjene v našem telesu tako počutimo? Kako je možno, da sedeč človek, ki se počuti, kot da je popolnoma brez energije, v naslednjem hipu teče na avtobus? Znanstveniki so ugotovili, da se ob daljši fizični neaktivnosti učinkovitost mitohondrijev drastično zmanjša in v obdobju povečane aktivnosti izboljša. Vzrok je v tem, da telo med aktivnostjo potrebuje več energije kot ponavadi. Zato pospeši razgradnjo poškodovanih, neefektivnih mitohondrijev, pospeši mitohondrijske biosintetske poti ter njihovo fuzijo in sistem mitohondrijev po taki spremembi je bolj efektiven. Še bolj zanimivo je, da se telo prilagodi redni telesni aktivnosti in tudi v mirovanju proizvaja več energije.

===Lara Hrvatin: Mehanizmi koncentriranja ogljika===
Ribuloza-1,5-bisfosfat karboksilaza/oksigenaza ali krajše Rubisco je ključnega pomena za fiksacijo ogljikovega dioksida v energetsko bogate molekule. Kot bifunkcionalen encim lahko katalizira karboksilacijo ali oksidacijo ribuloze-1,5-bisfosfata. V primeru, da deluje kot oksigenaza, pride do sprostitve CO2 ob porabi O2 in sončne energije pri procesu fotorespiracije. V naravi so se razvili različni mehanizmi koncenrtiranja ogljika v bližini Rubisca kot odgovor na neugodne razmere. Najdemo jih pri rastlinah, ki naseljujejo topla in suha področja, saj je tam povečana oksigenazna aktivnost Rubisca. Med slednje spadajo C4 rastline, ki fiksirajo ogljikov dioksid v obliki bikarbonata v oksaloacetat. Razvile iz ''navadnih'' C3 rastlin, ki fiksirajo ogljikov dioksid v 3-fosfoglicerat. Mehanizmi koncentriranja ogljika so prisotni tudi pri algah in cianobakterijah, ki imajo kot vodni organizmi na razpolago več bikarbonata kot ogljikovega dioksida. Alge in cianobakterije imajo na membranah različne transporteje anorgaskega ogljika, ki črpajo bikarbonat, tega pa karbonske anhidraze pretvorijo v ogljikov dioksid v bližini Rubisca. Vse cianobakterije imajo tudi karboksisome in nekatere alge piranoide. Karboksisomi in piranoidi so mikrokompartmenti, v katerih je zbran Rubisco skupaj s karbonskimi anhidrazami. Zmanjšanje oksigenazne aktivnosti Rubisca (oziroma izgub pri fotorespiraciji) v rastlinah pomembnih za poljedelstvo je v zanimanju raziskovalcev že desetletja. Ena od potencialnih strategij, kako to uspeti, je vpeljava mehanizmov koncentriranja ogljika, ki bi povečali karboksilazno aktivnost Rubisca.

===Sonja Gabrijelčič - Biosinteza bakterijske celuloze===
Od vseh bioloških polimerov je na svetu največ celuloze. Organizme, ki jo sintetizirajo, najdemo v skoraj vseh kraljestvih živega. Celuloza je sestavljena iz monomernih enot D-glukoze, povezanih z acetalnimi vezmi med C1 in C4 glukopiranoznega obroča in stabiliziranih z vodikovimi vezmi. Bakterijsko celulozo odlikuje visoka kemijska čistost in kristaliničnost (ko opazujemo celulozo, urejeno v mikrofibrile, in ne amorfne oblike). Poleg tega je tudi lahka, močna, odporna in ima dobre absorpcijske sposobnosti. Biosinteza poteka v nekaj korakih – najprej iz D-glukoze dobimo UDP-glukozo, ki jo nato polimerizira encim celulozna sintaza (CeS). Osrednji katalitični del CeS je močno ohranjen, praktično enako strukturo najdemo v bakterijah in rastlinah. Je integralni membranski encim, ki katalizira reakcijo glikoziltransferaze – prenese glukozno enoto z UDP-glukoze na nastajajoči glukozni polimer. Obenem del katalitične domene tvori tudi transmembranski kanalček, saj sinteza poteka v celici, produkt pa mora celica premakniti v ekstracelular. Dodajanje novih enot na polimerno verigo je procesivno, torej potekajo reakcije polimerizacije ena za drugo, ne da bi se vmes substrat odpel. Ecim mora zato po vsaki opravljeni katalizi podaljšani polimer premakniti za eno enoto ven iz celice – nazadnje dodano glukozno enoto mora postaviti tako, da je na mestu akceptorja in se nanjo v naslednji reakciji lahko doda nova glukozna enota. Aktivnost CeS nadzoruje majhna regulatorna molekula ciklični digvanilat (c-di-GMP), ki je alosterični aktivator tega encima.

===Anastasija Nechevska: Biosynthesis of bacterial peptidoglycan and inhibition by β-lactam antibiotics===
The peptidoglycan biosynthetic pathway is one of the most studied anabolic pathways today. Many years of scientific research have led humans to not only better understanding of how the bacterial cell wall enzymes act, but also discovering the main structures and functions of many proteins and complexes involved in this process. Considering that nowdays we find ourselves in an inescapable and ongoing battle with pathogenic bacteria that constantly evolve, it is therefore almost necessary to understand the biochemistry of bacterial cell in order to protect ourselves from diseases caused by them. Here is an overview of how β—lactam antibiotics, as most widely used group of antibiotics act on inhibiting cell wall biosynthesis in the bacterial organism, in order for us to better understand how are treated the most of bacterial infections. Constant update and furthermore research of this biosynthetic pathway where bacteria orchestrate the building and maintenance of their protective sacculus, leads hope of inventing new effective antibiotic strategies that will reduce the rate of today’s global health problem of antibiotic resistance.

===Maja Škof: Sinteza sfingolipidov===
Sfingolipidi so kompleksna in številčna družina membranskih lipidov, ki so pomembna komponenta plazmaleme, sodelujejo pa tudi kot signalne molekule ali receptorji. Njihovo zgradbo razdelimo na tri glavne komponente: sfingozin ali eden njegovih derivatov, maščobna kislina in polarna molekula. Glede na vrsto polarne molekule jih razvrstimo v eno od treh skupin- sfingomieline, glikosfingolipide in gangliozide. Prva stopnja v sintezi tipičnih sfingolipidov je kondenzacija palmitoil-CoA in serina s sledečo redukcijo, pri čemer nastane molekula sfinganin. Sledita vezava maščobne kisline in desaturacija; nastane ceramid, ki predstavlja nekakšno središče pri metabolizmu sfingolipidov. Dejansko gre za skupino molekul, ki se med seboj razlikujejo v dolžini in nasičenosti maščobne kisline. Do te točke sinteza poteka v ER, nato se ceramidi transportirajo v Golgijev aparat, kjer se nanje vežejo polarne molekule. Z vezavo fosfoholina ali fosfoetanolamina nastanejo sfingomielini, z vezavo ene ali več sladkornih komponent glikosfingolipidi, če pa se na ceramid veže oligosaharid z eno ali več sialično kislino, je nastal gangliozid. Večina reakcij pri sintezi sfingolipidov lahko teče tudi v nasprotno smer- z razgradnjo kompleksnejših sfingolipidov se tvori ceramid, ki se lahko porabi za sintezo drugih sfingolipidov, ki jih celica bolj potrebuje.

===Liza Ulčakar: Vloga interakcij med lipidnimi kapljicami in organeli v celici===
Lipidne kapljice so intracelularne strukture, prisotne v vseh evkariontih. Sestavljene so iz hidrofobnega jedra in fosfolipidnega monosloja. Zaradi te edinstvene strukture imajo tudi zelo specifičen proteom, saj se niso zmožni vsi proteini vsidrati v monosloj. Kapljice se preko stikov z drugimi organeli aktivno vključujejo v metabolizem celice. Z ER tvorijo lipidne mostičke, preko katerih ER daruje nekatere proteine kapljici. najbolj znan protein na stiku je seipin, ki nadzira rast kapljic, izbirno kontrolira transport proteinov po mostičkih ter utrjuje mostiček. Lipidni mostički naj bi bili biosintetski ostanki tvorbe lipidnih kapljic, lahko pa se tvorijo tudi de nuovo, s pomočjo kompleksa ARF1/COPI. Interakcija kapljic z vakuolo (v kvasu) oz lizosomom (pri sesalcih) je pomembna, ko celici primanjuje hranil. V kvasu poteka mikrolipofagija, pri kateri se kapljice zlijejo z vakuolo, ki hidrolizira lipide, v sesalcih pa poteka makrolipofagija, pri kateri se tvori avtofagosom, ki se nato združi z lizosomom. Ko celici primanjkuje glukoze, tvorijo kapljice direktne stike z mitohondriji. Najprej se morata organela "najti", pri tem pa jima pomaga AMPK. V kvasu poteka beta oksidacije samo v peroksisomih. Ti s kapljicami tvorijo lipidna mostičke, preko katerih z notranjim slojem membrane vdrejo v notranjost kapljice. Znanje o interakcijah lipidnih kapljic z drugimi organeli je pomembno pri razumevanju nekaterih patoloških stanj, kot so diabetes, lipodistrofija, debelost in drugi.

===Ajda Godec: Biosinteza levkotriena B4 ===
Levkotrieni sodijo v družino biološko aktivnih molekul, ki se nahajajo v celicah, sodelujočih predvsem pri odzivu na imunološki stimulus (levkociti, makrofagi, tkivni bazofilci). Odgovorni so za vrsto bioloških pojavov, kot so npr. krčenje bronhialnega gladkega mišičevja, stimulacija vaskularne permeabilnosti (prepustnosti), aktivacija in usmerjen transport levkocitov do tarčnih celic. Po kemijski zgradbi sodijo med eikozanoide. Levkotrien B4 - LTB4 se sintetizira v belih krvničkah, predvsem v monocitih in nevtrofilcih, kot produkt encimsko katalizirane reakcije encima LTA4H in molekule LTA4 (levkotriena A4). Celotna biosintezna pot LTB4 vključuje kot primarni prekurzor arahidonsko kislino, ki se pod vplivom delovanja fosfolipaze A2 odcepi iz fosfolipidne membrane. Molekula arahidonske kisline se v teku 3 encimsko kataliziranih reakcij, s strani 3 različnih encimov, in sicer 5-LOX, ( 5-lipokisgenaza ), in ogrodnega FLAP proteina (5-lipoksigenazno aktivirajočega proteina) ter bifunkiconalnega encima LTA4H (levkotiren A4 hidrolaza/ aminopeptidaza) pretvori v molekulo LTB4. Glavna funkcija levkotriena B4 je aktivacija sinteze celic vnetnega odziva (nevtrofilcev) in molekul (citokinov) in jih transport nevtrofilcev do tarčnih. Pri alergijskem renitisu povzroči aktivacijo nevtrofilcev. Vendar pa lahko hiperprodukcija levkotrien B4 vodi do mnogih kroničnih bolezni in sindromov, kot so: artritis, kardiovaskularne bolezni, nekatere vrste rakavega obolenja, metaboličnih motenj.

===Neža Blaznik: Biosinteza in vloga kreatina v mišicah in živčnem sistemu ===
Kreatin je v človeškem telesu naravno prisotna dušikova organska kislina. Pod vplivom dveh encimov, arginin glicin amidinotransferaze (AGAT) in gvanidinoacetat metil transferaze (GAMT) se sintetizira iz arginina, glicina in metionina. Glavna mesta sinteze so jetra, ledvice, trebušna slinavka in v manjši meri tudi možgani. Kreatin se v največji meri nahaja v mišicah, kamor se transportira po krvi prek kreatinskih transporterjev SLC6A8. Pod vplivom encima kreatin kinaze se pretvori v fosfokreatin, s katerim imata predvsem v mišicah pomembno vlogo pri hitri obnovi ATP ter vzdrževanju ugodnega razmerja ATP/ADP. Vsak dan se spontano pretvorita v kreatinin, ki se izloči z urinom. Zaloge kreatina obnavljamo z endogeno sintezo in vnosom hrane bogate s kreatinom ali dodatkom izolirane oblike kreatina v obliki kreatin monohidrata, česar se poslužujejo predvsem športniki, ki zaradi hitrejše regeneracije ATP zaznajo povečanje moči, eksplozivnosti ter hitrejšo regeneracijo. V zadnjih letih pa se znanstveniki osredotočajo tudi na nepogrešljivo vlogo kreatina v živčnem sistemu, kjer sodeluje pri vzdrževanju visokih energijskih nivojev in nevtrotransmisiji, ima pa tudi nevroprotektivni in antioksidativni učinek. Živčni sistem lahko nekaj kreatina sprejme iz krvi, večinoma pa ga za svoje potrebe sintetizirajo tudi določene živčne celice. Pomanjkanje encimov sinteze ali kreatinskih transporterjev vodi do raznih psiholoških bolezenskih stanj.

===Urša Štrancar: Metabolizem serina in glicina pri raku ===
Vse celice tako rakave kot normalne za svoje pravilno delovanje in odzivnost potrebujejo natančno usklajene in regulirane metabolne poti. Že dlje časa vemo, da se metabolizem rakavih celic nekoliko razlikuje od tistega pri zdravih celicah. Raziskave so pokazale, da imata predvsem aminokislini serin in glicin v rakavih celicah veliko večjo vlogo pri uravnavanju metabolizma kot v zdravih celicah. Biosinteza serina in glicina sta zelo povezani. Tako pri pretvorbi serina v glicin kot pri razgradnji glicina pride do oddaje eno-ogljične skupine (»one-carbon unit«), ki se prenese v t.i. eno-ogljični metabolizem (»one-carbon metabolism«). Eno-ogljični metabolizem sestavljata dva cikla, folatni ter cikel metionina, ki sta med seboj povezana. Tak bicikličen metabolizem je zelo pomemben, saj nastajajo ob prenosu eno-ogljične skupine različne makromolekule, ki so biosintetsko ključne in omogočajo nastanek ostalih končnih produktov za celico (proteini, lipidi, nukleotidi…). Eno-ogljični bicikel tako omogoča rast in razmnoževanje celic. Na podlagi znanstvenih ugotovitev se zdravljenje rakavih obolenj razvija predvsem v smeri omejevanja vnosa ali sinteze serina in posledično glicina. Prav tako bi se lahko za ustrezno zdravljenje uporabilo specifične inhibitorje, ki bi zavirali določene metabolne poti in tako zmanjšali/povečali nastajanje intermediatov, ki zavirajo razvoj in rast tumorja.

===Anamarija Agnič: Metabolne spremembe bakterij iz rodu Rhizobium v koreninskih mešičkih stročnic ===
Eno kmetijsko in ekološko pomembnejših sožitij predstavlja odnos med bakterijami iz rodu Rhizobium in rastlino iz družine stročnic, saj omogoča sklenitev kroženja dušika v biosferi. S procesom fiksacije dušika, ki se vrši v visoko specializiranem organu – koreninskem mešičku oz. nodulu – simbioza letno doprinese približno 40 milijonov ton oz. okoli 70 % vsega biološko uporabnega dušika, ki ga organizmi nadalje uporabijo za biosintezo celičnih sestavin kot so aminokisline, nukleotidi, hormoni, koencimi, alkaloidi, porfirini, antibiotiki, pigmenti, nevrotransmiterji in drugi. Bakterija rastlino v zameno za reduciran ogljik in večino ostalih za metabolizem ključnih hranil preskrbuje z reduciranim dušikom. Da bi do organogeneze koreninskega mešička sploh prišlo, je potrebna kopica specifičnih signalov obeh simbiontov, ki se morajo ustrezno ujemati. Tovrstna specifičnost obvaruje rastlino pred vstopom morebitnih patogenih bakterij. Simbiontska fiksacija dušika zahteva precizno usklajenost bakterijskega in rastlinskega metabolizma. Tekom evolucije so simbiontske bakterije izgubile sposobnost lastne sinteze razvejanih aminokislin, kar je omejilo njihovo rast in vzpostavilo sožitje, ki ga lahko kontrolira rastlina. V citoplazmi rastlinskih celic koreninskega mešička se tekom vzpostavitve simbioze pojavi poseben protein leghemoglobin, ki z visoko afiniteto do kisika »obvaruje« za kisik labilno bakterijsko nitrogenazo. Pomembno vlogo pripisujemo tudi transporterjem, ki omogočajo prenos metabolitov med simbiontoma.

===Sanja Stanković: Asprozin – novoodkriti hormon maščobnega tkiva, ki uravnava hepatično glukozo in apetit ter deluje zaščitno===
Asprozin je glikoproteinski hormon, ki je bil odkrit leta 2016 v belem maščobnem tkivu. Vsebuje 140 aminokislin in 3 oligosaharide na asparaginskih ostankih. Tridimenzionalna struktura asprozina je neznana in verjetno podobna dimernim glikoproteinskim hormonom. Znane so naslednje funkcije asprozina v človeku in pri drugih sesalcih: 1) zagotavlja zadostno količino energije iz hranil – sprošča hepatično glukozo v kri (glikogenoliza in glukoneogeneza – po delovanju podoben glukagonu) in spodbuja apetit v času lakote ali stradanja (deluje na nevrona AgRP in POMC v hipotalamusu, podobno kot grelin); 2) ima zaščitno funkcijo (podobno kot grelin) – protivnetno funkcijo (sproži antiinflamatorne citokine in ovira proinflamatorne citokine) in antioksidativno funkcijo (sproži antioksidativne encime proti reaktivnim kisikovim vrstam in drugim reaktivnim spojinam). Mehanizem delovanja asprozina na molekulski ravni je bil ugotovljen samo do sprožitve proteinske kinaze: gre za kaskadno os G-protein – adenilil-ciklaza – cAMP – proteinska kinaza A, nadaljnji potek kaskad pa je verjetno podoben tistim pri glukagonu ali grelinu. Receptorji asprozina, vezani na G-proteine, do danes niso bili identificirani. Pomembne motnje v homeostazi asprozina povzročajo resne zdravstvene težave in bolezni. Pomanjkanje asprozina je vzrok lipodistrofije, ekstremne shujšanosti in Marfanovega sindroma. Odvečni asprozin je etiološki dejavnik sladkorne bolezni tipa 2 in njenih zapletov, debelosti in hiperfagije. Obetajoče so možne terapije zaviranja asprozina (sladkorna bolezen, debelost) ali terapije z asprozinom (opekline, vnetja, srčne težave).

===Laura Gašperšič: Delovanje leptina in grelina ter njuna vloga pri debelosti ===
V današnjem svetu predstavlja debelost vedno večji problem, saj je z njo povezanih kar nekaj bolezni. Do debelosti pride ob pozitivni energijski bilanci, kar pomeni, da je vnos energije večji od porabe. Pri tem ima pomembno vlogo več hormonov, med najpomembnejšimi sta leptin in grelin. Leptin je hormon, ki iz maščobnega tkiva pride v možgane, kjer sproži anoreksigen odziv (zavira apetit) in spodbuja metabolizem. Njegova koncentracija v krvi je sorazmerna s količino maščobnega tkiva, kar se sklada tudi z izmerjenimi povišanimi koncentracijami leptina pri debelih. Vendar pa pri debelosti pride do odpornosti na leptin, zato ne more učinkovito opravljati svoje funkcije zaviranja apetita. Poleg leptina je pomemben grelin, ki pa ima ravno nasproten učinek. Grelin je hormon, ki se izraža iz želodca in v možganih sproži oreksigen odziv (spodbuja apetit) in shranjevanje energije. Koncentracija grelina se pred obrokom poveča, po obroku pa zmanjša. Pri debelosti je nivo grelina nižji od normalnega, po obroku pa ne pride do zmanjšanja njegove koncentracije. Poleg odpornosti na leptin se namreč pri debelosti pojavi tudi odpornost na grelin, mehanizmi obeh pa so še nedefinirani. V prihodnje bodo zato potrebne nove raziskave mehanizmov, saj bi na njihovi podlagi lahko razvili učinkovite načine zdravljenja z debelostjo povezanih bolezni.

===Nika Boštic: Delovanje glukokortikoidov pri GIOP===
Glukokortikoidi (GC) so steroidni hormoni, ki poleg mineralokortikoidov spadajo med kortikosteroide. Glavne funkcije GC so regulacija metabolizma, imunskega odziva in razvoja. So tudi pomembni stresni hormoni. Delujejo prek vezave na jedrne receptorje glukokortikoidov (GR) in mineralokortikoidov (MR). GR so v odsotnosti liganda vezani v kompleks z drugimi proteini. Ko pa se vežejo nanje GC, pride do konformacijskih sprememb in translokacije GR v jedro, kjer inducirajo ali zavirajo transkripcijo genov. GC igrajo pomembno vlogo pri zdravljenju različnih bolezni zaradi imunosupresorskega in protivnetnega delovanja. Od 40. let prejšnjega stoletja so ena izmed najpogosteje predpisanih in najučinkovitejših terapij za zdravljenje inflamatornih in avtoimunih bolezni. Terapija z GC pa ima tudi negativne posledice, ena izmed njih je z glukokortikoidi inducirana osteoporoza (GIOP). GC prek GR spodbujajo sintezo nekaterih antagonistov kanonične Wnt poti in posledično inhibirajo izražanje OPG, proteina, ki zavira diferenciacijo in aktivnost osteoklastov, ter povečajo koncentracijo regulatorjev adipogeneze C/EBP in PPARγ. Posledica slednjega je preusmeritev osteoblastogeneze v adipogenezo. Prav tako GC spodbujajo izražanje proapoptotičnih genov in zavirajo transkripcijo antiapoptotičnih genov v osteoblastih. Delujejo pa tudi na druga tkiva: zmanjšajo mišično maso in zavirajo absorbcijo Ca2+ prek prebavnega sistema ter pospešujejo izgubo Ca2+ prek ledvic.

===Jernej Imperl: Prostaglandini in vnetje===
Eikozanoidi so zanimiv primer nesteroidnih lipidov, ki v telesu opravljajo signalno vlogo. Njihovo delovanje je predvsem kratkega dometa (parakrino) in pomaga pri regulaciji homeostaze, nekateri izmed njih pa imajo zanimivo vlogo tudi pri pomembnem in skrbno nadzorovanem procesu vnetja. Povezava prostaglandinov, enih izmed bolj znanih eikozanoidov, z vnetjem je bila ugotovljena že zelo zgodaj po njihovem odkritju: injiciranje prostaglandinov v tkivo povzroči simptome vnetja, v velikih količinah pa jih lahko najdemo prav na vnetem tkivu. Učinek se zdi na prvi pogled preprost, v resnici pa predstavlja zgolj vidno posledico zapletenega biokemijskega omrežja mediatorjev, ki so nenehno v reguliranem ravnotežju in skrbijo, da se vnetje prične, ko se pojavi goržnja, in ob pravem času tudi konča. Prostaglandini PGE2, PGI2 in PGF2-alfa imajo v telesu pretežno pro-vnetne vloge, medtem ko PGD2 deluje anti-vnetno, vsi pa so v nekaterih primerih zmožni obojega. Večina ugotovitev o posledicah posameznih prostaglandinov v kontekstu vnetja je bila ugotovljenih posredno, z opazovanjem simptomov induciranih bolezni, in šele nadaljnje raziskave bodo lahko pojasnile natančnejše molekularne interakcije. S kombinacijo posameznih ugotovitev takih raziskav lahko poskusimo sestaviti splošen pregled nad potekom vnetja.

BIO2 Seminar 2018

2019-01-11T22:50:28Z

JernejI: /* Seznam seminarjev */

= Biokemijski seminar =
doc. dr. Gregor Gunčar, K2.022

== Seznam seminarjev ==
{| {{table}}
| align="left" style="background:#f0f0f0;"|'''ime in priimek'''
| align="left" style="background:#f0f0f0;"|'''poglavje'''
| align="left" style="background:#f0f0f0;"|'''naslov seminarja'''
| align="left" style="background:#f0f0f0;"|'''recenzent 1'''
| align="left" style="background:#f0f0f0;"|'''recenzent 2'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''datum oddaje'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''datum recenzije'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''datum predstavitve'''
|-
| Eva Gartner || 12 || [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2018#Eva_Gartner:_Wnt_signalizacija_in_njena_vloga_pri_sr.C4.8Dni_fibrozi Wnt signalizacija in njena vloga pri srčni fibrozi] || Anamarija Agnič || Anastasija Nechevska || 15/10/2018 || 16/10/2018 || 17/10/2018
|-
| Aljaž Bratina || 12 || [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2018#Alja.C5.BE_Bratina:_Pomen_razli.C4.8Dnih_signalnih_poti_pri_staranju Pomen različnih signalnih poti pri staranju]|| Lara Drinovec || Liza Ulčakar || 15/10/2018 || 16/10/2018 || 17/10/2018
|-
| Karmen Mlinar || 12 || [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2018#Karmen_Mlinar:_Signalizacija_in_odzivi_na_abiotski_stres_pri_rastlinah Signalizacija in odzivi na abiotski stres v rastlinah] || Luka Gnidovec || Maja Škof || 15/10/2018 || 16/10/2018 || 17/10/2018
|-
| Tina Zavodnik || 12 || [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2018#Tina_Zavodnik:_Mehani.C4.8Dna_transdukcija_in_proteini_Piezo Mehanična transdukcija in proteini Piezo] || Jernej Imperl || Ajda Godec || 19/10/2018 || 22/10/2018 || 24/10/2018
|-
| Meta Kodrič || 12 || [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2018#Meta_Kodri.C4.8D:_Svetlobne_signalne_poti_za_uravnavanje_fotomorfogeneze Svetlobne signalne poti za uravnavanje fotomorfogeneze] || Laura Gašperšič || Neža Blaznik || 19/10/2018 || 22/10/2018 || 24/10/2018
|-
| Neža Žerjav || 12 || [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2018#Ne.C5.BEa_.C5.BDerjav:_Vloga_kaspaz_pri_celi.C4.8Dni_smrti Vloga kaspaz pri celični smrti] || Nika Boštic || Urša Štrancar || 19/10/2018 || 22/10/2018 || 24/10/2018
|-
| Doroteja Armič || 14-15 || [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2018#Doroteja_Armi.C4.8D:_Bifunkcionalen_encim_PFK-2.2FFBPaza-2_in_njegova_vloga_v_metabolizmu_glukoze Bifunkcionalen encim PFK-2/FBPaza-2 in njegova vloga v metabolizmu glukoze] || Eva Gartner || Anamarija Agnič || 02/11/2018 || 05/11/2018 || 07/11/2018
|-
| Lara Drinovec || 14-15 || AMPK in avtofagija pri glukoznem/glikogenem metabolizmu || Aljaž Bratina || Barbara Jaklič || 02/11/2018 || 05/11/2018 || 07/11/2018
|-
| Martina Lokar || 14-15 || [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2018#Martina_Lokar:_Biotinilacija_proteinov Biotinilacija proteinov]|| Karmen Mlinar || Luka Gnidovec || 02/11/2018 || 05/11/2018 || 07/11/2018
|-
| Marko Pavleković || 16 || Vloga sukcinata kot ligand z G proteini vezanega receptorja GPR91 || Tina Zavodnik || Jernej Imperl || 09/11/2018 || 12/11/2018 || 14/11/2018
|-
| Valeriya Musina || 16 || Vpliv intermediatov Krebsovega cikla na celične procese || Meta Kodrič || Laura Gašperšič || 09/11/2018 || 12/11/2018 || 14/11/2018
|-
| Tina Kolenc Milavec || 16 || [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2018#Tina_Kolenc_Milavec:_Intermediati_Krebsovega_cikla_kot_signalne_molekule_pri_vnetnem_in_protivnetnem_odgovoru Intermediati Krebsovega cikla kot signalne molekule pri vnetnem in protivnetnem odgovoru]|| Neža Žerjav || Nika Boštic || 09/11/2018 || 12/11/2018 || 14/11/2018
|-
| Andrej Špenko || 17 || Regulacija oksidacije maščobnih kislin v skeletnih mišicah || Doroteja Armič || Eva Gartner || 16/11/2018 || 19/11/2018 || 21/11/2018
|-
| Tadej Medved || 17 || [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2018#Tadej_Medved:_Vpliv_oksidacije_ma.C5.A1.C4.8Dobnih_kislin_na_usodo_celic Vpliv oksidacije maščobnih kislin na usodo celic] || Sanja Stanković || Aljaž Bratina || 16/11/2018 || 19/11/2018 || 21/11/2018
|-
| Klementina Polanec || 17 || Sirtuini kot regulatorji oksidacije maščobnih kislin || Martina Lokar || Karmen Mlinar || 16/11/2018 || 19/11/2018 || 21/11/2018
|-
| Rebeka Dajčman || 17 || Ketonska telesa kot signalni metaboliti || Marko Pavleković || Tina Zavodnik || 16/11/2018 || 19/11/2018 || 21/11/2018
|-
| Sumeja Kudelić || 18 || Transsulfuracijska pot kot obrambni mehanizem celic pri oksidativnem stresu || Valeriya Musina || Meta Kodrič || 23/11/2018 || 26/11/2018 || 28/11/2018
|-
| Matija Ruparčič || 18 || Ureaze in njihova vloga v živih bitjih || Tina Kolenc Milavec || Neža Žerjav || 23/11/2018 || 26/11/2018 || 28/11/2018
|-
| Maks Kumek || 18 || Vloga metabolizma arginina v celični regulaciji in erekcija || Andrej Špenko || Doroteja Armič || 23/11/2018 || 26/11/2018 || 28/11/2018
|-
| Anže Šumah || 19 || Delovanje proteina termogenina in njegov pomen pri termogenezi || Tadej Medved || Sanja Stanković || 30/11/2018 || 03/12/2018 || 05/12/2018
|-
| Barbara Jaklič || 19 || Vloga proton-črpajočega rodopsina pri fotofosforilaciji in drugih procesih odvisnih od protonske gonilne sile || Klementina Polanec || Martina Lokar || 30/11/2018 || 03/12/2018 || 05/12/2018
|-
| Gašper Anton Komatar || 19 || Telesna aktivnost poveča učinkovitost mitohondrijskega sistema in zviša raven telesne energije || Rebeka Dajčman || Marko Pavleković || 30/11/2018 || 03/12/2018 || 05/12/2018
|-
| Praznik Liza || 19 || Dinamična struktura mitohondrija za opravljanje raznolikih funkcij || Sumeja Kudelić || Valeriya Musina || 30/11/2018 || 03/12/2018 || 05/12/2018
|-
| Lara Hrvatin || 20 || Mehanizmi koncentriranja ogljika || Matija Ruparčič || Tina Kolenc Milavec || 07/12/2018 || 10/12/2018 || 12/12/2018
|-
| Sonja Gabrijelčič || 20 || [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2018#Sonja_Gabrijel.C4.8Di.C4.8D_-_Biosinteza_bakterijske_celuloze Biosinteza bakterijske celuloze] || Maks Kumek || Andrej Špenko || 07/12/2018 || 10/12/2018 || 12/12/2018
|-
| Anastasija Nechevska || 20 || Biosynthesis of bacterial peptidoglycan and inhibition by β-lactam antibiotics || Anže Šumah || Tadej Medved || 07/12/2018 || 10/12/2018 || 12/12/2018
|-
| Liza Ulčakar || 21 || Vloga interakcij med lipidnimi kapljicami in organeli v celici|| Barbara Jaklič || Klementina Polanec || 14/12/2018 || 17/12/2018 || 19/12/2018
|-
| Maja Škof || 21 || [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2018#Maja_.C5.A0kof:_Sinteza_sfingolipidov Sinteza sfingolipidov] || Gašper Anton Komatar || Rebeka Dajčman || 14/12/2018 || 17/12/2018 || 19/12/2018
|-
| Ajda Godec || 21 || Biosinteza levkotriena B4 || Praznik Liza || Sumeja Kudelić || 14/12/2018 || 17/12/2018 || 19/12/2018
|-
| Neža Blaznik || 22 || Biointeza in vloga kreatina v mišicah in živčnem sistemu || Lara Hrvatin || Matija Ruparčič || 04/01/2019 || 07/01/2019 || 09/01/2019
|-
| Urša Štrancar || 22 || Metabolizem serina in glicina pri raku || Sonja Gabrijelčič || Maks Kumek || 04/01/2019 || 07/01/2019 || 09/01/2019
|-
| Anamarija Agnič || 22 || [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2018#Anamarija_Agni.C4.8D:_Metabolne_spremembe_bakterij_iz_rodu_Rhizobium_v_koreninskih_me.C5.A1i.C4.8Dkih_stro.C4.8Dnic Metabolne spremembe bakterij iz rodu Rhizobium v koreninskih mešičkih stročnic]
|| Anastasija Nechevska || Anže Šumah || 04/01/2019 || 07/01/2019 || 09/01/2019
|-
| Sanja Stanković || 23 || Asprozin – novoodkriti hormon maščobnega tkiva, ki uravnava hepatično glukozo in apetit ter deluje zaščitno || Liza Ulčakar || Lara Drinovec|| 04/01/2019 || 07/01/2019 || 09/01/2019
|-
| Luka Gnidovec || 23 || Negenomski učinki steroidnih hormonov || Maja Škof || Gašper Anton Komatar || 11/01/2019 || 14/01/2019 || 16/01/2019
|-
| Jernej Imperl || 23 || Prostaglandini in vnetje || Ajda Godec || Praznik Liza || 11/01/2019 || 14/01/2019 || 16/01/2019
|-
| Laura Gašperšič || 23 || Delovanje leptina in grelina ter njuna vloga pri debelosti || Neža Blaznik || Lara Hrvatin || 11/01/2019 || 14/01/2019 || 16/01/2019
|-
| Nika Boštic || 23 || [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2018#Nika_Bo.C5.A1tic:_Delovanje_glukokortikoidov_pri_GIOP Delovanje glukokortikoidov pri GIOP] || Urša Štrancar || Sonja Gabrijelčič || 11/01/2019 || 14/01/2019 || 16/01/2019
|}

*številka v okencu za temo pomeni poglavje v Lehningerju, v katerega naj izbrana tema spada
Sporočite mi morebitne napake ali če vas nisem razporedil.

== Gradivo za predavanja ==
Gradivo za predavanja in seminarje najdete na http://bio.ijs.si/~zajec/bio2/
username: bio2
password: samozame

==Naloga==
'''Vaša naloga za seminar je: '''
Samostojno pripraviti seminar o seminarski temi, ki vam je bila dodeljena. Za osnovo morate vzeti pregledni članek iz revije, ki ima faktor vpliva nad 5 (npr. [http://www.sciencedirect.com/science/journal/09680004/ TIBS]. Poiskati morate še vsaj tri znanstvene članke, ki se nanašajo na opisano temo in jih uporabiti kot podlago za seminarsko nalogo! Članki so dostopni [http://93.174.95.27/scimag/ tukaj].

Za pripravo seminarja velja naslednje: 
* [[BIO2 Povzetki seminarjev 2018|Povzetek seminarja]] opišete na wikiju '''v 200 besedah''' (+- dvajset besed) - najkasneje do dne ko morate oddati seminar recenzentom.
* Povezavo do povzetka vnesete v tabelo seminarjev tekočega letnika.
* Seminar pripravite v obliki seminarske naloge na ~5-12 straneh A4 (pisava 12, enojni razmak, 2,5 cm robovi). Zelo pomembno je, da je obseg od 2700 do 3000 besed , a ne več kot 3500 besed. Seminarska naloga mora vsebovati najmanj tri slike. Eno sliko morate narisati sami in to pod sliko posebej označiti. Slika mora imeti legendo in v besedilu mora biti na ustreznem mestu sklic na sliko. 
* Seminar oddajte do datuma oddaje, ki je naveden v tabeli v elektronski obliki z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/ tega obrazca].
* Vsi seminarji so v elektronski obliki dostopni [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/bioseminar/ tukaj].
* Recenzenti do dneva določenega v tabeli določijo popravke (v elektronski obliki) in podajo oceno pisnega dela. Popravljen seminar oddajte z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/ tega obrazca].
* Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Za predstavitev je na voljo 20 minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni.
* Predstavitvi sledi razprava. Recenzenti podajo oceno predstavitve in postavijo najmanj dve vprašanji.Vsi ostali morajo postaviti še dve dodatni vprašanji v toku celega seminarskega obdobja. Vprašanja, ki ste jih postavili vpišite na [https://docs.google.com/forms/d/e/1FAIpQLSdV9OFlNzI3XyS8FRGnuIbG89gwH_36uwz29ocigV--2CXSbQ/viewform tukaj].
* Na dan predstavitve morate docentu še pred predstavitvijo oddati končno (popravljeno) in natisnjeno verzijo seminarja v enem izvodu, elektronsko verzijo seminarja in predstavitev pa oddati na strežnik na dan predstavitve do polnoči.
* Seminarska naloga in povzetek morajo biti v slovenskem jeziku, razen za študente, katerih materni jezik ni slovenščina. Ti lahko oddajo seminar v angleškem jeziku.

==Imena datotek==
Prosim vas, da vse datoteke, ki mi jih pošiljate poimenujete po naslednjem receptu:
* 312_BIO_Priimek_Ime.doc(x) za seminar, npr. 312_BIO_Guncar_Gregor.docx
* 312_BIO_Priimek_ime_final.doc(x) za končno verzijo seminarja
* 312_BIO_Priimek_Ime_rec_Priimek2.doc(x) za recenzijo, kjer je Priimek2 priimek recenzenta, npr. 312_BIO_Guncar_Gregor_rec_Scott.docx (če se pišete Scott in odajate recenzijo za seminar, ki ga je napisal Gunčar)
* 312_BIO_Priimek_Ime.ppt(x) za prezentacijo, npr 312_BIO_Guncar_Gregor.pptx
* 312_BIO_Priimek_ime_poprava.doc(x) za popravljeno končno verzijo seminarja, če so popravki manjši

==Ocenjevanje seminarjev==
Recenzenti ocenijo seminar tako, da izpolnijo [https://docs.google.com/forms/d/1EQDYwFO-DEzZ2R7jf8DhLqIeV4FFxRd3-ScceEASpt4/viewform recenzentsko poročilo] na spletu. Recenzentsko poročilo morate oddati najkasneje do 21:00, en dan pred predstavitvijo seminarja.

== Mnenje o predstavitvi ==
Vsak posameznik odda svoje mnenje o predstavitvi takoj po predstavitvi z online glasovanjem.

==Urejanje spletnih strani na wikiju==
Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''

==Citiranje virov==
Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se držite ene same. V seminarskih nalogah in diplomskih nalogah FKKT uprabljajte shemo citiranja, ki je pobarvana zeleno.
Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati.
Za citate v naravoslovju je najpogostejše citiranje po pravilniku ISO 690. [http://www.zveza-zotks.si/gzm/dokumenti/literatura.html Pravila], ki upoštevajo omenjeni standard, so pripravili pri ZTKS. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati. 
'''Citiranje knjig:''' 
Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica. 
Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN. 

Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005. 
Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4. 
Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.).

'''Citiranje člankov:''' 
Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani. 
Lartigue, C., Glass, J. I., Alperovich, N., Pieper, R., Parmar, P. P., Hutchison III, C. A., Smith, H. O. in Venter, J. C.
Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, 317, str. 632-638.

Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole: 
Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani. 
Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.

Revija Science uporablja skrajšani zapis: 
C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007) 

V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne). Navesti morate tudi vse avtorje dela, razen v primeru, ko jih je 10 ali več. Takrat navedite le prvih devet, za ostale pa uporabite okrajšavo in sod. (in sodelavci). Pred zadnjim avtorjem naj bo vedno besedica "in".

'''Citiranje spletnih virov:''' 
Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov 
strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life 
Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.

BIO2 Seminar 2018

2018-12-28T20:06:12Z

JernejI: /* Seznam seminarjev */

= Biokemijski seminar =
doc. dr. Gregor Gunčar, K2.022

== Seznam seminarjev ==
{| {{table}}
| align="left" style="background:#f0f0f0;"|'''ime in priimek'''
| align="left" style="background:#f0f0f0;"|'''poglavje'''
| align="left" style="background:#f0f0f0;"|'''naslov seminarja'''
| align="left" style="background:#f0f0f0;"|'''recenzent 1'''
| align="left" style="background:#f0f0f0;"|'''recenzent 2'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''datum oddaje'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''datum recenzije'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''datum predstavitve'''
|-
| Eva Gartner || 12 || [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2018#Eva_Gartner:_Wnt_signalizacija_in_njena_vloga_pri_sr.C4.8Dni_fibrozi Wnt signalizacija in njena vloga pri srčni fibrozi] || Anamarija Agnič || Anastasija Nechevska || 15/10/2018 || 16/10/2018 || 17/10/2018
|-
| Aljaž Bratina || 12 || [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2018#Alja.C5.BE_Bratina:_Pomen_razli.C4.8Dnih_signalnih_poti_pri_staranju Pomen različnih signalnih poti pri staranju]|| Lara Drinovec || Liza Ulčakar || 15/10/2018 || 16/10/2018 || 17/10/2018
|-
| Karmen Mlinar || 12 || [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2018#Karmen_Mlinar:_Signalizacija_in_odzivi_na_abiotski_stres_pri_rastlinah Signalizacija in odzivi na abiotski stres v rastlinah] || Luka Gnidovec || Maja Škof || 15/10/2018 || 16/10/2018 || 17/10/2018
|-
| Tina Zavodnik || 12 || [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2018#Tina_Zavodnik:_Mehani.C4.8Dna_transdukcija_in_proteini_Piezo Mehanična transdukcija in proteini Piezo] || Jernej Imperl || Ajda Godec || 19/10/2018 || 22/10/2018 || 24/10/2018
|-
| Meta Kodrič || 12 || [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2018#Meta_Kodri.C4.8D:_Svetlobne_signalne_poti_za_uravnavanje_fotomorfogeneze Svetlobne signalne poti za uravnavanje fotomorfogeneze] || Laura Gašperšič || Neža Blaznik || 19/10/2018 || 22/10/2018 || 24/10/2018
|-
| Neža Žerjav || 12 || [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2018#Ne.C5.BEa_.C5.BDerjav:_Vloga_kaspaz_pri_celi.C4.8Dni_smrti Vloga kaspaz pri celični smrti] || Nika Boštic || Urša Štrancar || 19/10/2018 || 22/10/2018 || 24/10/2018
|-
| Doroteja Armič || 14-15 || [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2018#Doroteja_Armi.C4.8D:_Bifunkcionalen_encim_PFK-2.2FFBPaza-2_in_njegova_vloga_v_metabolizmu_glukoze Bifunkcionalen encim PFK-2/FBPaza-2 in njegova vloga v metabolizmu glukoze] || Eva Gartner || Anamarija Agnič || 02/11/2018 || 05/11/2018 || 07/11/2018
|-
| Lara Drinovec || 14-15 || AMPK in avtofagija pri glukoznem/glikogenem metabolizmu || Aljaž Bratina || Barbara Jaklič || 02/11/2018 || 05/11/2018 || 07/11/2018
|-
| Martina Lokar || 14-15 || [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2018#Martina_Lokar:_Biotinilacija_proteinov Biotinilacija proteinov]|| Karmen Mlinar || Luka Gnidovec || 02/11/2018 || 05/11/2018 || 07/11/2018
|-
| Marko Pavleković || 16 || Vloga sukcinata kot ligand z G proteini vezanega receptorja GPR91 || Tina Zavodnik || Jernej Imperl || 09/11/2018 || 12/11/2018 || 14/11/2018
|-
| Valeriya Musina || 16 || Vpliv intermediatov Krebsovega cikla na celične procese || Meta Kodrič || Laura Gašperšič || 09/11/2018 || 12/11/2018 || 14/11/2018
|-
| Tina Kolenc Milavec || 16 || [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2018#Tina_Kolenc_Milavec:_Intermediati_Krebsovega_cikla_kot_signalne_molekule_pri_vnetnem_in_protivnetnem_odgovoru Intermediati Krebsovega cikla kot signalne molekule pri vnetnem in protivnetnem odgovoru]|| Neža Žerjav || Nika Boštic || 09/11/2018 || 12/11/2018 || 14/11/2018
|-
| Andrej Špenko || 17 || Regulacija oksidacije maščobnih kislin v skeletnih mišicah || Doroteja Armič || Eva Gartner || 16/11/2018 || 19/11/2018 || 21/11/2018
|-
| Tadej Medved || 17 || [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2018#Tadej_Medved:_Vpliv_oksidacije_ma.C5.A1.C4.8Dobnih_kislin_na_usodo_celic Vpliv oksidacije maščobnih kislin na usodo celic] || Sanja Stanković || Aljaž Bratina || 16/11/2018 || 19/11/2018 || 21/11/2018
|-
| Klementina Polanec || 17 || Sirtuini kot regulatorji oksidacije maščobnih kislin || Martina Lokar || Karmen Mlinar || 16/11/2018 || 19/11/2018 || 21/11/2018
|-
| Rebeka Dajčman || 17 || Ketonska telesa kot signalni metaboliti || Marko Pavleković || Tina Zavodnik || 16/11/2018 || 19/11/2018 || 21/11/2018
|-
| Sumeja Kudelić || 18 || Transsulfuracijska pot kot obrambni mehanizem celic pri oksidativnem stresu || Valeriya Musina || Meta Kodrič || 23/11/2018 || 26/11/2018 || 28/11/2018
|-
| Matija Ruparčič || 18 || Ureaze in njihova vloga v živih bitjih || Tina Kolenc Milavec || Neža Žerjav || 23/11/2018 || 26/11/2018 || 28/11/2018
|-
| Maks Kumek || 18 || Vloga metabolizma arginina v celični regulaciji in erekcija || Andrej Špenko || Doroteja Armič || 23/11/2018 || 26/11/2018 || 28/11/2018
|-
| Anže Šumah || 19 || Delovanje proteina termogenina in njegov pomen pri termogenezi || Tadej Medved || Sanja Stanković || 30/11/2018 || 03/12/2018 || 05/12/2018
|-
| Barbara Jaklič || 19 || Vloga proton-črpajočega rodopsina pri fotofosforilaciji in drugih procesih odvisnih od protonske gonilne sile || Klementina Polanec || Martina Lokar || 30/11/2018 || 03/12/2018 || 05/12/2018
|-
| Gašper Anton Komatar || 19 || Telesna aktivnost poveča učinkovitost mitohondrijskega sistema in zviša raven telesne energije || Rebeka Dajčman || Marko Pavleković || 30/11/2018 || 03/12/2018 || 05/12/2018
|-
| Praznik Liza || 19 || Dinamična struktura mitohondrija za opravljanje raznolikih funkcij || Sumeja Kudelić || Valeriya Musina || 30/11/2018 || 03/12/2018 || 05/12/2018
|-
| Lara Hrvatin || 20 || Mehanizmi koncentriranja ogljika || Matija Ruparčič || Tina Kolenc Milavec || 07/12/2018 || 10/12/2018 || 12/12/2018
|-
| Sonja Gabrijelčič || 20 || [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2018#Sonja_Gabrijel.C4.8Di.C4.8D_-_Biosinteza_bakterijske_celuloze Biosinteza bakterijske celuloze] || Maks Kumek || Andrej Špenko || 07/12/2018 || 10/12/2018 || 12/12/2018
|-
| Anastasija Nechevska || 20 || Biosynthesis of bacterial peptidoglycan and inhibition by β-lactam antibiotics || Anže Šumah || Tadej Medved || 07/12/2018 || 10/12/2018 || 12/12/2018
|-
| Liza Ulčakar || 21 || Vloga interakcij med lipidnimi kapljicami in organeli v celici|| Barbara Jaklič || Klementina Polanec || 14/12/2018 || 17/12/2018 || 19/12/2018
|-
| Maja Škof || 21 || [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2018#Maja_.C5.A0kof:_Sinteza_sfingolipidov Sinteza sfingolipidov] || Gašper Anton Komatar || Rebeka Dajčman || 14/12/2018 || 17/12/2018 || 19/12/2018
|-
| Ajda Godec || 21 || Biosinteza levkotriena B4 || Praznik Liza || Sumeja Kudelić || 14/12/2018 || 17/12/2018 || 19/12/2018
|-
| Neža Blaznik || 22 || Sinteza in vloga kreatina || Lara Hrvatin || Matija Ruparčič || 04/01/2019 || 07/01/2019 || 09/01/2019
|-
| Urša Štrancar || 22 || Metabolizem serina in glicina pri raku || Sonja Gabrijelčič || Maks Kumek || 04/01/2019 || 07/01/2019 || 09/01/2019
|-
| Anamarija Agnič || 22 || Metabolne spremembe bakterij iz rodu rhizobia v koreninskih mešičkih stročnic || Anastasija Nechevska || Anže Šumah || 04/01/2019 || 07/01/2019 || 09/01/2019
|-
| Sanja Stanković || 23 || moj naslov || Liza Ulčakar || Lara Drinovec|| 04/01/2019 || 07/01/2019 || 09/01/2019
|-
| Luka Gnidovec || 23 || Negenomski učinki steroidnih hormonov || Maja Škof || Gašper Anton Komatar || 11/01/2019 || 14/01/2019 || 16/01/2019
|-
| Jernej Imperl || 23 || Sesalčji hormoni v mikrobih || Ajda Godec || Praznik Liza || 11/01/2019 || 14/01/2019 || 16/01/2019
|-
| Laura Gašperšič || 23 || Delovanje leptina in grelina ter njuna vloga pri debelosti || Neža Blaznik || Lara Hrvatin || 11/01/2019 || 14/01/2019 || 16/01/2019
|-
| Nika Boštic || 23 || Vloga sintetičnih in endogenih glukokortikosteroidov pri programiranju zarodka || Urša Štrancar || Sonja Gabrijelčič || 11/01/2019 || 14/01/2019 || 16/01/2019
|}

*številka v okencu za temo pomeni poglavje v Lehningerju, v katerega naj izbrana tema spada
Sporočite mi morebitne napake ali če vas nisem razporedil.

== Gradivo za predavanja ==
Gradivo za predavanja in seminarje najdete na http://bio.ijs.si/~zajec/bio2/
username: bio2
password: samozame

==Naloga==
'''Vaša naloga za seminar je: '''
Samostojno pripraviti seminar o seminarski temi, ki vam je bila dodeljena. Za osnovo morate vzeti pregledni članek iz revije, ki ima faktor vpliva nad 5 (npr. [http://www.sciencedirect.com/science/journal/09680004/ TIBS]. Poiskati morate še vsaj tri znanstvene članke, ki se nanašajo na opisano temo in jih uporabiti kot podlago za seminarsko nalogo! Članki so dostopni [http://93.174.95.27/scimag/ tukaj].

Za pripravo seminarja velja naslednje: 
* [[BIO2 Povzetki seminarjev 2018|Povzetek seminarja]] opišete na wikiju '''v 200 besedah''' (+- dvajset besed) - najkasneje do dne ko morate oddati seminar recenzentom.
* Povezavo do povzetka vnesete v tabelo seminarjev tekočega letnika.
* Seminar pripravite v obliki seminarske naloge na ~5-12 straneh A4 (pisava 12, enojni razmak, 2,5 cm robovi). Zelo pomembno je, da je obseg od 2700 do 3000 besed , a ne več kot 3500 besed. Seminarska naloga mora vsebovati najmanj tri slike. Eno sliko morate narisati sami in to pod sliko posebej označiti. Slika mora imeti legendo in v besedilu mora biti na ustreznem mestu sklic na sliko. 
* Seminar oddajte do datuma oddaje, ki je naveden v tabeli v elektronski obliki z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/ tega obrazca].
* Vsi seminarji so v elektronski obliki dostopni [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/bioseminar/ tukaj].
* Recenzenti do dneva določenega v tabeli določijo popravke (v elektronski obliki) in podajo oceno pisnega dela. Popravljen seminar oddajte z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/ tega obrazca].
* Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Za predstavitev je na voljo 20 minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni.
* Predstavitvi sledi razprava. Recenzenti podajo oceno predstavitve in postavijo najmanj dve vprašanji.Vsi ostali morajo postaviti še dve dodatni vprašanji v toku celega seminarskega obdobja. Vprašanja, ki ste jih postavili vpišite na [https://docs.google.com/forms/d/e/1FAIpQLSdV9OFlNzI3XyS8FRGnuIbG89gwH_36uwz29ocigV--2CXSbQ/viewform tukaj].
* Na dan predstavitve morate docentu še pred predstavitvijo oddati končno (popravljeno) in natisnjeno verzijo seminarja v enem izvodu, elektronsko verzijo seminarja in predstavitev pa oddati na strežnik na dan predstavitve do polnoči.
* Seminarska naloga in povzetek morajo biti v slovenskem jeziku, razen za študente, katerih materni jezik ni slovenščina. Ti lahko oddajo seminar v angleškem jeziku.

==Imena datotek==
Prosim vas, da vse datoteke, ki mi jih pošiljate poimenujete po naslednjem receptu:
* 312_BIO_Priimek_Ime.doc(x) za seminar, npr. 312_BIO_Guncar_Gregor.docx
* 312_BIO_Priimek_ime_final.doc(x) za končno verzijo seminarja
* 312_BIO_Priimek_Ime_rec_Priimek2.doc(x) za recenzijo, kjer je Priimek2 priimek recenzenta, npr. 312_BIO_Guncar_Gregor_rec_Scott.docx (če se pišete Scott in odajate recenzijo za seminar, ki ga je napisal Gunčar)
* 312_BIO_Priimek_Ime.ppt(x) za prezentacijo, npr 312_BIO_Guncar_Gregor.pptx
* 312_BIO_Priimek_ime_poprava.doc(x) za popravljeno končno verzijo seminarja, če so popravki manjši

==Ocenjevanje seminarjev==
Recenzenti ocenijo seminar tako, da izpolnijo [https://docs.google.com/forms/d/1EQDYwFO-DEzZ2R7jf8DhLqIeV4FFxRd3-ScceEASpt4/viewform recenzentsko poročilo] na spletu. Recenzentsko poročilo morate oddati najkasneje do 21:00, en dan pred predstavitvijo seminarja.

== Mnenje o predstavitvi ==
Vsak posameznik odda svoje mnenje o predstavitvi takoj po predstavitvi z online glasovanjem.

==Urejanje spletnih strani na wikiju==
Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''

==Citiranje virov==
Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se držite ene same. V seminarskih nalogah in diplomskih nalogah FKKT uprabljajte shemo citiranja, ki je pobarvana zeleno.
Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati.
Za citate v naravoslovju je najpogostejše citiranje po pravilniku ISO 690. [http://www.zveza-zotks.si/gzm/dokumenti/literatura.html Pravila], ki upoštevajo omenjeni standard, so pripravili pri ZTKS. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati. 
'''Citiranje knjig:''' 
Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica. 
Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN. 

Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005. 
Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4. 
Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.).

'''Citiranje člankov:''' 
Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani. 
Lartigue, C., Glass, J. I., Alperovich, N., Pieper, R., Parmar, P. P., Hutchison III, C. A., Smith, H. O. in Venter, J. C.
Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, 317, str. 632-638.

Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole: 
Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani. 
Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.

Revija Science uporablja skrajšani zapis: 
C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007) 

V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne). Navesti morate tudi vse avtorje dela, razen v primeru, ko jih je 10 ali več. Takrat navedite le prvih devet, za ostale pa uporabite okrajšavo in sod. (in sodelavci). Pred zadnjim avtorjem naj bo vedno besedica "in".

'''Citiranje spletnih virov:''' 
Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov 
strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life 
Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.

TBK2017 Povzetki seminarjev

2018-04-23T21:40:03Z

JernejI: /* Ana Scott: Naslov seminarja */

[[TBK2017-seminar|Nazaj na osnovno stran]]
===Ana Scott: Naslov seminarja===
Tekst ....

'''Uroš Prešern: Nukleaza, ki povzroči partanatos oziroma od PARP-1 odvisno celično smrt'''

Partanatos je ena izmed vrst celične smrti, ki nastopi zaradi prevelike aktivnosti poli(ADP-riboza) polimeraze 1 (PARP-1) v jedru. Pogost je v primeru možganske kapi, infarkta in nevrodegenerativnih boleznih, zaradi česar bi boljše poznavanje samega procesa omogočilo razvoj novih načinov zdravljenja teh obolenj. V predhodnih raziskavah so ugotovili, da partanatos nastopi, ko molekule poli-ADP-riboze, ki jih PARP-1 sintetizira, preidejo iz jedra v citosol, kjer aktivirajo premestitev indukcijskega faktorja apoptoze (AIF) iz mitohondrijev v jedro. Temu sledi razrez DNA. Nukleaza, ki povzroči razrez DNA, je bila do nedavnega manjkajoči člen v partanatosu. Skupini raziskovalcev je uspelo odkriti, da je iskana nukleaza inhibitorni dejavnik migracije makrofagov (MIF). Pokazali so, da se med partanatosom MIF veže na AIF in se skupaj z njim premesti v jedro, kjer povzroči fragmentacijo DNA. Inhibicija nukleazne aktivnosti MIF se je v modelu možganske kapi pri miših odrazila v 75-odstotnem zmanjšanju volumna prizadetega tkiva, pospešeno pa je bilo tudi okrevanje. Rezultati raziskave odpirajo potencialne možnosti za zdravljenje akutnih in kroničnih nevroloških bolezni, v katerih nastopi partanatos.

'''Doroteja Armič: Pretvorba mišjih fibroblastov v pluripotentne matične celice s pomočjo tehnologije CRISPR'''

Pluripotentne matične celice so še nediferencirane celice, ki imajo sposobnost, da se diferencirajo v skoraj vse tipe celic. Poznamo več vrst pluripotentnih matičnih celic. Ene izmed njih so inducirane pluripotentne matične celice (celice iPS). To so pluripotentne celice, ki jih umetno dediferencirajo iz odraslih somatskih celic. Leta 2006 so odkrili postopek pridobivanja celic iPS iz mišjih fibroblastov. Ugotovili so, da so za reprogramiranje somatskih celic najpomembnejši štirje transkripcijski dejavniki, in sicer Oct4, Sox2, Klf4 in c-Myc. Letos pa je skupini znanstvenikov uspelo odkriti nov, bolj enostaven postopek pridobivanja celic iPS. Ugotovili so namreč, da lahko sprožijo njihov nastanek že z aktivacijo enega samega gena – Oct4 ali Sox2. Aktivacija Sox2-promotorja oziroma Oct4-promotorja in Oct4-ojačevalca hkrati pa nato povzroči aktivacijo ostalih genov, ki sodelujejo pri vzpostavitvi pluripotentnosti v celicah. Za aktivacijo genov so uporabili tehnologijo CRISPR. Primerjali so uporabo dveh sistemov – dCas9-SunTag-VP64 in dCas9-SunTag-p300core. V obeh primerih so dobili primerljive rezultate. Uporaba celic iPS je pomembna v regenerativni medicini, saj lahko zamenja uporabo človeških embrionalnih matičnih celic. Z uporabo celic iPS, generiranih iz pacientovih lastnih celic, ne bi prišlo do zavrnitvenih reakcij, prav tako pa bi se izognili etičnih pomislekov. Znanstveniki predvidevajo, da lahko tehnologija reprogramiranja celic, ki so jo uporabili na mišjih celicah, z manjšimi spremembami deluje tudi na človeških celicah.

'''Dea Simonič: Sprožilci avtoimunskih bolezni in vzroki za nekontrolirano širjenje le-teh po telesu'''

Avtoimunska bolezen je bolezen, ki nastane zaradi pretiranega odziva imunskega sistema na celice, ki so last organizma. Veliko vlogo pri nastanku avtoimunske bolezni imajo limfociti B, ki omogočajo humoralni imunski odziv. Transkripcijski faktor T-bet v limfocitih B povzroči razvoj ABC, te celice so pa »pogon« avtoimunske bolezni. Avtoimunska bolezen se v veliki večini primerov razširi po telesu . Vzrok tega so ravno limfociti B, ki razširijo svoj napad po telesu in pride do širjenja epitopa. Ta proces se začne, ko imunski sistem napade antigene na drugih delih telesa, ki jih na začetku ni hotel uničiti. Telo začne pospeševano uničevati lastna tkiva. Da bi razumeli, zakaj pride do tega mehanizma so raziskovalci uporabili fluorescenčne markerje beljakovin, ki razlikujejo različne celične skupke limfocitov B (oziroma germinalne centre), na miših obolelih z lupusom. V germinalnih centrih limfociti B »tekmujejo« med sabo, kateri bo naredil najboljše protitelo, ki bo nevtraliziralo zaznano grožnjo. Te germinalne skupke so s pomočjo markerjev zaznali kot 10 različnih barv. Po tednu ali dveh začne prevladovati ena sama barva. Ta germinalni skupek je ustvaril najboljše protitelo in skupaj z ostalimi limfociti aktiviral avtoimunski protinapad. S to študijo so raziskovalci naredili velik korak v smer zaustavitve oziroma zdravljenja avtoimunske bolezni.

'''Valeriya Musina: Metalopeptid bakrov(II) fenantrolin tarčno onemogoči delovanje mitohondrijev v matičnih celicah raka dojke'''

Uničenje mitohondrijev je eden najbolj obetavnih pristopov pri razvoju novih zdravil proti raku. Znanstveniki so sintetizirali peptid, ki vsebuje baker, ki ga zlahka sprejmejo mitohondriji v matičnih celicah raka dojk, kjer le ta učinkovito povzroča apoptozo. Rakaste celice, ki imajo povečani metabolizem, ne samo, da vsebujejo več mitohondrijev kot zdrave celice, temveč so te tudi drugačni, strukturno in funkcionalno. Zaradi posebnih značilnosti in njihove odločilne vloge v presnovi celic so maligne mitohondrije pomembne tarčej za nove terapevtske spojine. Mitohondrije je možno uničiti z uvajanjem sredstev za proizvajanje reaktivnih vrst kisika (ROS). Te reaktivne spojine ovirajo metabolizem mitohondrijev. Kot močan ROS generator je bila predlagana organokovinska spojina bakrov(II) fenantrolin. Za dostavo in prenos skozi zunanjo membrano mitohondrija pa so bakrov(II) fenantrolin vezali na specifičen peptid, ki prodira v mitohondrije. Preizkusi so bili izvedeni z dvema celicnima linijama raka dojke, ena celična linija je vsebovala matične celice raka dojk. Rezultati so bili : odvisna od količine odmerka izguba sposobnosti za preživetje, razpad membran mitohondrijev, nastanek ROS in slabši metabolizma mitohondrijev. Zdravilo je bolj vplivalo na matične celice raka, kar je bilo razloženo z večjo vsebnostjo mitohondrijev. Ta študija izpostavlja potencial metalopeptida tako za dostavo kot tudi za uničenje mitohondrijev, zlasti v matičnih celicah raka.

'''Neža Štremfelj: Delovanje inzulinskih receptorjev'''

Človeški inzulinski receptorji igrajo pomembno vlogo v človeškem telesu. Signalizacija z inzulinskimi receptorji igra ključno vlogo pri regulaciji metabolizma in pri rasti v večceličnih organizmih. Nepravilno delovanje inzulinskih receptorjev je povezano z mnogimi hujšimi obolenji, na primer z rakavim obolenjem, diabetesom in Alzheimerjevo boleznijo.
Glavna ideja raziskave, ki jo opisuje članek, ki sem si ga izbrala za osnovo moje seminarske naloge je, da vezava inzulina na inzulinski receptor preoblikuje zunajcelični del transmembranskih proteinov (ektodomeno) receptorja iz U-konformacije v T-konformacijo. Prerazporeditev v ektodomeni se razširi tudi na transmembranske domene, ki so, ko je receptor neaktiviran pomaknjene narazen, ob vezavi inzulina pa se pomaknejo skupaj, kar omogoči fosforilizacijo tirozin kinaze v citoplazmi. Pri transmembranski signalizaciji z inzulinskim receptorjem poleg dimerizacije z vezavo liganda pride tudi do strukturnih sprememb znotraj receptorskega dimera.

'''Marko Pavleković: Prehajanje imunskih celic, povzročiteljic multiple skleroze, skozi krvno-možgansko pregrado'''

Multipla skleroza je avtoimunska bolezen, pri kateri limfociti napadejo živčne celice in jih demielinizirajo ter tako škodujejo prenosu signalov med nevroni. Iz predhodnih raziskav so odkrili, da sta za multiplo sklerozo najbolj krivi celiti pomagalki T 1 in T 17. Da bi prišli do centralnega živčnega sistema morata celici najprej prečkati vaskularno pregrado. Kako to dosežeta so raziskovali znanstveniki z univerze v Kolumbiji in z univerze v Kaliforniji. Z dvo-fotonsko mikroskopijo so opazovali tesne stike pri miših obolelih za eksperimentalnim avtoimunskim encefalomielitisom, ki je živalski primer multiple skleroze. Ugotovili so, da krvno-možgansko pregrado preideta na dva različna načina: s transcitozo in skozi prekinjene tesne stike med endotelnimi celicami. S pomočjo miši, ki jim je primanjkovalo kaveol (kaveolina1) pa so dokazali, da za prehod do centralnega živčnega sistema celica T 1 izkorišča transcitozo, medtem ko celica T 17 prehaja skozi prekinjene tesne stike. Te ugotovitve bi lahko močno pomagale pri nadaljnjem zdravljenju bolezni, kjer bi se osredotočili na preprečevanje dostopa imunskih celic do centralnega živčnega sistema.

'''Rebeka Dajčman: več mehanizmov poganja dinamiko kalcijevega signala okoli lasersko povzročene rane epitelija'''

Kalcij igra ključno vlogo pri skoraj vseh procesih v celici. Razni signali, kot je na primer sinteza RNA in DNA ali pa migracija celic, je posledica spremembe intracelularne koncentracije kalcija. Spremembo koncentracije lahko zaznamo z merjenjem intenzivnosti fluorescentne svetlobe, ki jo oddajajo GCaMP proteini. Če celice poškodujemo z laserskim mehurčkom, ustvarimo rano, ki je podobna udarcu. Sledijo trije mehanizmi signaliziranja, ki so odvisni od velikosti rane. Takoj po poškodbi celične membrane uide kalcij iz ekstracelularne tekočine v citosol, kjer se koncentracija kalcija dvigne. Kalcij nato skupaj s signalnimi molekulami difundira v okoliške celice in temu pravimo prvi val oz. takojšnji odziv. Po 45 sekundah mu sledi drugi močnejši valj, ki pa se širi počasneje, ker skozi membrano prehajajo večji signalni proteini. Ti signali sprožijo sistemski odziv na poškodbo, ki poskrbi, da se celice v najkrajšem možnem času regenerirajo. Da pri regeneraciji povrhnjice kože ne nastanejo brazgotine poskušamo v tkivo, ki je bilo poškodovano, vstaviti lasne mešičke. Ti pripomorejo k nastajanju maščobe in tako preprečijo brazgotinjenje. Če se poškoduje žilna stena pa sistem poskrbi za nastanek strdkov, ki so sestavljeni iz krvnih celic in fibrina. Trombociti navijejo fibrin v toge zvitke in ti se s pomočjo posebnih encimov raztopijo v krvi. Nova odkritja o celičnemu celjenju pripomorejo k hitrejšemu in učinkovitejšemu celjenju ran.

'''Gašper Anton Komatar: Tvorba kompleksa receptorjev ApoER2, ephirinB2 in AMPAR, ki jih povezuje GRIP1, sodeluje pri vorbi spomina'''

LTP ali dolgoročna potenciacija pomeni povečanje sinaptične moči za dolgo časa in ker gre pri tvorbi spominov prav za povečanje sinaptične aktivnosti, je med znanstveniki priznan kot najverjetnejši model učenja in tvorbe spomina na celični ravni. Med LTP se poveča število receptorjev AMPA v postsinaptični membrani, kar še dodatno poveča sinaptično moč.
Kakšen je mehanizem in katere molekule sodelujejo pri prenosu in vgradnji AMPAR v postsinaptično membrano, to je bilo glavno vprašanje raziskovalcev v članku, ki sem si ga izbral za seminarsko nalogo. Že dlje časa je bilo znano, da ephirinB2, ApoER2 in Reelin sodelujejo pri razvoju možganov kot regulatorji migracije nevronov. Znanstveniki so preverili, če sodelujejo tudi pri procesih prenosa in vgradnje AMPAR v membrano. S tehniko knockout (inaktivacija določenih genov) ter z imunoprecepcijo, so selektivno inhibirali interakcije med proteini, rezultate pa so beležili s fluorescentnimi analizami in prenosom western. Ugotovili so, da tvorba kompleksa multiplih receptorjev ApoER2/ephirinB2/AMPAR in GRIP1 povzroči vgradnjo tega AMPAR na membrano dendrita in sproži signalne kaskade, ki regulirajo vgradnjo novih AMPAR. Ko je bila interakcija med temi proteini inhibirana, so bili nevroni nezmožni reagirati na spremembe v njihovem omrežju, kar je zmanjšano sinaptično aktivnost. To pomeni, da skupki teh proteinov vzdržujejo oz. ojačajo sinaptično aktivnost. S tem so znanstveniki dokazali, da zgoraj omenjen kompleks receptorjev zares sodeluje pri tvorbi spominov.

'''Laura Gašperšič: Alzheimerjeva bolezen: povrnitev zmožnosti pomnjenja z inhibicijo interakcije med Sp3 in HDAC2'''

Pri Alzheimerjevi bolezni je glavni simptom okvara spomina, do česar pride zaradi utišanja genov, ki sodelujejo pri tvorbi novih spominov. Do utišanja pride zaradi deacetilacije histonov, ki jo povzročijo encimi histonske deacetilaze (HDAC). Pri utišanju genov za tvorbo spominov je najpomembnejši HDAC2. Njegova raven je pri bolnikih z Alzheimerjevo boleznijo povišana. Encimi HDAC so si po zgradbi podobni, poleg tega tvori en encim več različnih kompleksov, kar lahko pri inhibiciji encimov HDAC sproži tudi stranske učinke. Raziskovalci so zato želeli najti molekulo, s katero se HDAC2 veže na promotorje genov za učenje in spomin. S prvimi raziskavami so določili 3 najbolj verjetne proteine: Tdp2, Sap30 in Sp3, z meritvami pa so ugotovili, da Sp3 vpliva na delovanje sinapse. V nadaljnjih raziskavah so dokazali, da kompleks med HDAC2 in Sp3 v bolezenskem stanju z vezavo na promotorje negativno uravnava izražanje genov povezanih z delovanjem sinapse. V zadnjem delu raziskave so želeli določiti del HDAC2, ki se veže na Sp3 in inhibirati nastanek kompleksa med HDAC2 in Sp3. Ugotovili so, da se na Sp3 veže C-konec HDAC2. C-končni fragment HDAC2 se že sam veže na Sp3, s čimer se zmanjša število kompleksov med HDAC2 in Sp3 na promotorjih. Fragment HDAC2 pa se ne veže na druge proteine, s katerimi HDAC nadzorujejo druge pomembne procese. Izražanje C-končnega fragmenta HDAC2 torej predstavlja obetaven način, s katerim bi lahko zdravili nevrološke bolezni povezane z okvarami spomina.

'''Maja Škof: Pomen S-proteinov pri prilagajanju koronavirusov na okolje'''

Koronavirusi so razširjeni po vsem svetu in največkrat povzročajo okužbe dihal pri ljudeh in živalih. Spadajo med RNA viruse, za katere je značilna visoka stopnja genskih mutacij, kar jim omogoča, da se uspešno prilagajajo na okolje. S-proteini so trimerni proteini, s katerimi se koronavirusi vežejo na gostiteljsko celico, nato pa sprožijo spojitev virusne in celične membrane, kar omoči, da virusna RNA preide v celico. S-proteini so sestavljeni iz dveh podenot, S1 in S2. Pri vezavi na celični protein sodeluje zunanji del podenote S1, ki je v obliki treh podaljšanih zank (receptorsko-vezavne zanke). Med aminokislinami S-proteina in receptorskega proteina se vzpostavijo medmolekulske vezi, nato pa podenota S2 sproži spojitev s celično membrano. S1 je tudi glavna tarča protiteles, ki preprečujejo virusu, da bi vstopil v celico. A protitelo, ki se uspešno veže na sev virusa, ob ponovni okužbi virusa ne prepozna več. To je posledica naključnih genskih mutacij. Analiza genomov koronavirusov, izoliranih v zadnjih 50-ih letih, je pokazala, da se receptorsko-vezavne zanke S-proteinon med seboj občutno razlikujejo. Kar 73% aminokislin na receptorsko-vezavnih zankah variira. Odstotek je ravno dovolj velik, da se koronavirusi še vedno lahko vežejo na receptor, protitelesa pa jih ne zaznajo več.

'''Tadej Medved: Identifikacija vezavnih mest proteinov WASP na aktinski ojedritveni kompleks Arp2/3'''

Ključnega pomena za procese, kot so celično gibanje in endocitoza, so aktinski filamenti. Nastanek in prerazporeditev le-teh nadzorujejo določeni proteinski kompleksi; za razvejane aktinske filamente je to Arp2/3. Le-ta je sestavljen iz več podenot; najpomembnejši sta Arp2 in Arp3, ki sta po strukturi podobni aktinu. Na Arp2/3 se vežejo proteini družine WASP, ki spravijo proteinski kompleks v konformacijo, pri kateri lahko dejansko vrši nastanek novih filamentov. Za vse WASP-e velja, da se na Arp2/3 vežejo z odsekom VCA(verprolin, central, acidic), a do podatkov o strukturah takšnih vezi se znanost še ni dokopala. S pomočjo "cross-linking" masne spektrometrije in "reversed phase liquid" kromatografije je pred kratkim nastal model, ki zadovoljivo opisuje mesta, na katera se vežejo WASP-i. Vezava namreč poteka na dveh mestih: na hrbtni strani Arp2/3 in na spodnji strani kompleksa, pri Arp2 in poddomeno ARPC1. Na Arp2/3 se pri WASP-u veže odsek CA, konec odseka V pa ostaja prost za vezavo aktina. Izkazalo se je, da se za uspešno nukleacijo aktina vezavni mesti za aktin in CA ne smeta prekrivati; odsek WASP C pa je še zlasti pomemben za aktivacijo Arp2/3.

'''Tina Zavodnik: Disfunkcionalni mitohondriji s pomočjo ROS zavirajo translacijsko aktivnost'''

Mitohondriji so zelo kompleksni organeli, ki za normalno opravljanje svojih funkcij potrebujejo številne proteine. Večina teh proteinov se sintetizira v citoplazmi, nato pa so uvoženi nazaj v mitohondrije. Ob morebitni okvari transportnih mehanizmov in posledično okvarjenih mitohondrijih pa pride do akumulacije proteinov v citoplazmi, kar poruši celično ravnovesje. Skupina znanstvenikov iz Nemčije in Poljske pa je odkrila mehanizem, ki poškodovanim mitohondrijem omogoča nadzor nad sintezo proteinov z induciranjem reverzibilnih sprememb na translacijskem mehanizmu. Kot signal uporabijo ROS, ki povzroči oksidacijo tiolov na peptidih, ki so sestavni deli translacijskega mehanizma. Do odkritja so prišli s kvantitativno analizo cisteinskih ostankov oz. tiolnih skupin na proteomu kvasovke Saccharomyces cerevisia ter izdelali obsežno zbirko oksidacijskih stanj peptidov, ki so vsebovali tiolne skupine. Analizo so ponovili še na gojenih celicah kvasovke, ki so bile izpostavljene induciranemu oksidativnemu stresu s pomočjo H2O2, ter na mutiranih celicah z disfunkcionalnimi mitohondriji. Pri obojih so zaznali povečano oksidacijo Cys-peptidov in zmanjšano translacijsko aktivnost. Z odstranitvijo stresorskega faktorja pa se je translacijska aktivnost delno do popolnoma obnovila, kar dokazuje, da je oksidacija peptidov, ki so del mehanizmov za sintetiziranje novih proteinov, reverzibilen proces. Cisteinski ostanki torej delujejo kot nekakšni senzorji za ROS in ob oksidativnem stresu inhibirajo sintetiziranje novih proteinov.

'''Tina Kolenc Milavec: Vezava kalcija na karboksilni konec α-sinukleina uravnava interakcije med sinaptičnimi vezikli'''

Alfa-sinuklein je majhen, v vodi topen protein brez stabilne terciarne strukture, ki ga genetsko in nevropatološko povezujejo s Parkinsonovo boleznijo, o njegovi vlogi pri razvoju bolezni pa še marsikaj ni znano. Nahaja se predvsem v živčnih končičih, kjer je ravnovesje med α-sinukleinom raztopljenim v citosolu in tistim vezanim na fosfolipidni dvosloj močno regulirano. Ker se α-sinuklein nahaja na območju, kjer koncentracija kalcija ves čas močno niha, so raziskovalci Lautenschläger ''et al.'' predpostavili, da je normalna fiziološka funkcija α-sinukleina odvisna od kalcija. Da bi bolje razumeli funkcijo tega proteina, so v raziskavi izvedli več ''ex vivo'' ter ''in vitro'' eksperimentov, s katerimi so skušali ugotoviti predvsem to, kako se α-sinuklein veže na membrano sinaptičnega vezikla ter kako koncentraciji kalcija in α-sinukleina vplivata na homeostazo sinaptičnih veziklov ter na združevanje α-sinukleina v fibrilarne skupke. Povečana koncentracija kalcija in/ali α-sinukleina namreč pod določenimi pogoji povzroča toksičnost in posledično celično smrt, saj α-sinuklein oligomerizira ter tvori dolge in debele netopne fibrile, ki so del Lewyjevih telesc – citoplazemskih vključkov, značilnih za Parkinsonovo bolezen. Iz medicinskega stališča pa je zanimiva ugotovitev, da isradipin (antagonist kalicevih kanalčkov) preprečuje fibrilizacijo, saj znižuje znotrajcelično koncentracijo kalcija, kar odpira nove možnosti za razvoj zdravil proti Parkinsonovi bolezni.

'''Anže Šumah: Razvoj genskega senzorja za uničevanje celic s pomanjkanjem proteina p53'''

Protein p53 je tumorski zatiralec (tumor supresor), ki je zaradi svoje nadvse pomembne vloge pri ohranjanju celovitosti celičnega genoma pogosto deležen naziva »varuh genoma«. V normalnih primerih je izražanje tega proteina na nizki ravni, v primeru celičnega stresa pa deluje kot prepisovalni dejavnik, ki uravnava izražanje genov, ki so vključeni v nadzor celičnega cikla, popravljanje DNA in apoptozo. Ugotovili so, da je okoli 50 % vseh človeških oblik raka povezanih z mutacijami gena TP53 (gena za sintezo p53), zato so v raziskavi želeli razviti genski senzor, ki bi bil sposoben uničiti celice, ki ne sintetizirajo p53 (so rakave). Na podlagi promotorjev, ki jih p53 kot prepisovalni dejavnik zavira ali aktivira, so razvili senzor, ki v primeru pomanjkanja p53 sintetizira protein »Herpes simplex virus thymidine kinase« (HSV-TK), preko katerega lahko z zdravilom Ganciclovir uničimo rakasto celico, ki je brez p53. V primeru, da je p53 prisoten (je celica »zdrava«), pa je sinteza HSV-TK zavirana preko različnih mehanizmov. Senzor so najprej testirali na celični kulturi HCT116 (rakaste človeške črevesne celice) s fluorescentnima proteinskima markerjema, nato pa še v živih organizmih, in sicer golih miših brez imunosti. Tako so dokazali tako in vitro kot tudi in vivo uporabnost izdelanega genskega senzorja, ki bi ga bilo mogoče uporabiti v terapevtske namene.

'''Liza Praznik: Vpliv šaperonov Skp in SurA na zvijanje izvenmembranskih proteinov FhuA v terciarno strukturo'''

Naloga posebne vrste proteinov, imenovanih šaperoni je, da preoblikujejo polipeptidne verige v terciarno strukturo, v kateri so ti zmožni aktivnega delovanja. Delovanje in odzivanje šaperonov na različne dejavnike je še dokaj neznano, zato je skupina znanstvenikov Univerze v Baslu raziskovalo šaperona Skp in SurA, holdaz, ki delujeta na protein FhuA. Ta se nahaja na zunanji membrani gram negativnih bakterij, kjer služi kot receptor za ferikrom in tvori obliko beta-sodčka. Z večkratnimi ponovitvami poskusov so ugotovili, da se v prisotnosti obeh šaperonov struktura proteina, vgrajenega v membrano, ne podere, če jo delno razvijemo, ne glede na to, do katere stopnje. Šaperona sta obenem zmožna delno razvit protein preoblikovati nazaj v funkcionalno obliko, ki omogoča ponovno delovanje v membrani. Naloga obeh šaperonov je, da zadržujeta zvit polipeptid v dinamični, termodinamsko najugodnejši konformaciji, s katero se posamezni beta-zavoji polipeptida lahko vstavljajo v membrano. Ugotovljeno pa je bilo, da je šaperon SurA pri tem znatno učinkovitejši. Rezultati raziskave omogočajo boljši vpogled v mehanizme delovanja šaperonov in nakazujejo, kako pomembni so za učinkovito delovanje proteinov.

'''Urša Štrancar: Predstavitev združitve avtofagosoma in lizosoma s pomočjo para fret'''

Mitofagija je kataboličen proces razgradnje mitohondrijev s pomočjo encimov v lizosomih, pri čemer se neuporabni deli mitohondrija razgradijo in reciklirajo. Da bi tak proces lahko opazovali in ga podrobno preučili, so znanstveniki v eksperimentu ob raziskovanju mitofagije uporabili eno novejših metod za prikaz celičnih procesov v živih celicah, par FRET, ki temelji na visoki vezavni afiniteti med dvema sintetičnima molekulama (kromoforoma) CB[7]-Cy3 in AdA-Cy5. Konfokalna laserska skenirna mikroskopija je pokazala, da sta bili molekuli CB[7]-Cy3 in AdA-Cy5 najprej intracelularno ločeni in zbrani v mitohondriju oz. lizosomu, nato pa sta po združitvi lizosoma in mitohondrija tvorili kompleks gost-gostitelj, prikazan kot fluorescenčni signal para FRET, ki ga človeško oko ob opazovanju na mikroskopu lahko zazna. Ta ugotovitev pa ni prikazala le zelo stabilne vezi med CB[7] in AdA v živi celici, temveč je potrdila tudi, da par FRET lahko prikaže dinamične procese spajanja celičnih organelov v mitofagiji. Kompleks, ki ga tvorita zgoraj navedeni molekuli, prav tako ni citotoksičen, zato je zelo uporaben za raziskovanje procesa mitofagije, nadaljno pa tudi procesov avtofagije v drugih celičnih organelih.

'''Neža Žerjav: Dodajanje enega samega nukleotida omejuje aktivnost človeške telomeraze'''

Telomeraza je vrsta DNA-polimeraze, ki na konce kromosomov dodaja nukleotidna zaporedja (GGTTAG) ob pomoči matrične RNA. Procesivni katabolni cikel telomeraze sestavljajo translokacija matrice, dodajanje prvega nukleotida in dodajanje preostalih petih nukleotdov. Zanimanje znanstvenikov je vzbudila zaradi počasnega delovanja v primerjavi z ostalimi DNA-polimerazami. Za pojasnitev mehanizma, ki omejuje njeno delovanje, so znanstveniki raziskovali vpliv prekinitvenega signala matrične RNA na visoko Michaelisovo konstanto prvega nukleotida, odvisnost procesivnosti in hitrosti telomeraze v odvisnosti od koncentracije dGTP, vpliv spremenjenega prvega nukleotida in posledice odstranitve prekinitvenega signala. Prišli so do zaključka, da prekinitveni signal povzroča počasnejše dodajanje prvega nukleotida v telomerno zaporedje, kar zmanjša procesivnost in hitrost telomeraze, ki pa ju lahko lahko povečano s povečano koncentracijo ustreznega deoksinukleozid fosfata.

'''Aljaž Bratina: Intrinzična destabilizacija ribosoma'''

Sinteza proteinov v celici poteka na ribosomih, ki so sestavljeni iz dveh podenot. Med prevajanjem RNA (translacija) se genski zapis pretvori v zaporedje aminokislin, ki se zvijejo v protein. Polipeptidno verigo, ki nastaja na ribosomu, in je vezana na tRNA, imenujemo nascenti polipeptid. Hitrost translacije ni vedno enaka in je podvržena mnogim anomalijam. Včasih se od ribosoma predčasno odcepi tRNA z vezanim nascentnim polipeptidom, lahko pa določeno zaporedje v nascentnem polipeptidu celo povzroči disociacijo ribosoma na dve podenoti in s tem prekine sintezo proteina. To imenujemo intrinzična destabilizacija ribosoma (IRD). IRD-inducirajoče zaporedje je ponavadi sestavljeno iz negativno nabitih aminokislin (aspartata in glutamata) ali prolina v različnih kombinacijah. Ugotovljeno je bilo, da nekatera zaporedja povzročajo IRD le in vitro, druga pa tudi in vivo. To pomeni, da ribosom vsebuje nek mehanizem, ki IRD zavira. To je protein bL31, ki povezuje podenoti ribosoma in s tem stabilizira ribosom. Celica IRD izkorišča tudi za nadzorovanje koncentracije magnezijevih ionov. Večja kot je ta koncentracija, manj proteina MgtA (prenašalec Mg2+) se bo tvorilo. Pomembno vlogo pri tem razmerju ima MgtL, polipeptid, ki je kodiran tik pred MgtA, in vsebuje IRD zaporedje. IRD je raziskana le na prokariontskih organizmih, vendar je možno, da je ta proces prisoten tudi v evkariontih.

'''Anamarija Agnič: ATP-aza P4 s premeščanjem fosfolipidov uravnava uvihanost membrane'''

ATP-azo P4 uvrščamo v skupino membranskih proteinov, ki ob hidrolizi ATP sodelujejo pri vzdrževanju asimetrične porazdelitve lipidov v membrani; omogočajo npr. prenos membranskih fosfolipidov fosfatidilserina in fosfatidiletanolamina iz monomolekularnega sloja celične membrane na zunajcelični strani v monomolekularni sloj membrane na citosolni strani membrane. Spremembe v razporeditvi lipidov v dvosloju, ki jih povzročajo flipaze, so ključnega pomena za deformacijo membrane, česar dokaz je bil tudi temeljni znanstveni problem skupine celičnih biologov iz univerze v Kjotu. V okviru raziskave so znanstveniki preko sistema, ki na membrano iz citoplazme inducirano veže t.i. domene Bin/amphiphysin/Rvs (domene BAR), natančno opazovali stopnje membranske tubulacije. S fluorescirajočimi molekulami so označili citosolne proteine BAR, ki so občutljivi na ukrivljenost membrane, in opazovali njihovo obnašanje. Povečana aktivnost flipaze za fosfatidilholin ATP10A, ki sodi v družino ATP-az P4, je zaradi vzpostavljene neuravnovešenosti med lipidnima slojema omogočila vezavo domen BAR ter s tem spodbudila proces membranske tubulacije. Povečana aktivnost flipaze ATP10A, ki omogoči uvihanost celične membrane, velja za enega pomembnih gonilnih mehanizmov endocitoze. Plazmalema drastično spreminja obliko tudi med celičnimi migracijami, invazijo rakastih celic, celično delitvijo, sprejemanjem hrane in vstopom patogenov ter virusov v celico. Ta raziskava je prvi dokaz, da imajo spremembe v trans-lipidnem dvosloju, ki jih povzročijo ATP-aze P4, pri deformiranju bioloških membran pomembno vlogo.

'''Simona Gorgievska: Optical tools to detect metabolic changes linked to diseases'''

Metabolic changes in cell can occur at the earliest stages of disease. In most cases, knowledge of those signals is limited, since we usually detect diseases only after it has done significant damage. Now, a team led by engineers at Tufts University School of Engineering has opened a window into the cell by developing an optical tool that can read metabolism at subcellular resolution, without having to perturb cells with contrasts agents or destroy them to conduct assays.The method is based on the fluorescence of two important coenzymes (biomolecules that work in concert with enzymes) when excited by a laser beam. The coenzymes –nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) and Flavin adenine dinucleotide (FAD) are involved in a large number of metabolic pathways in every cell. In order to find out the specific metabolic pathways affected by disease or stress, scientists have looked at three parameters. Those are: the ratio of FAD and NADH, the fluorescence “fade” of NADH and the organization of mitochondria as revealed by the spatial distribution of NADH within a cell (the energy producing “batteries” of the cell). The first parameter-the relative amounts of FAD to NADH -can reveal how well the cell is consuming oxygen, metabolizing sugars, or producing or breaking down fat molecules. The second parameter -the fluorescence "fade" of NADH -reveals details about the local environment of the NADH. The third parameter -the spatial distribution of NADH in the cells -shows how the mitochondria split and fuse in response to cellular growth and stress.

'''Matej Jereb: Gradnja človeške pluripotentne matične celice v funkcionalno skeletno mišično tkivo'''

V študiji so razvili prvo popolnoma delujočo 3D skeletno mišično vlakno iz človeške pluripotentne matične celice. Z uporabo štirih različnih hPSC virov so razvili ponovljivo metodo za generacijo miogenskih celic prednic (iMPC), ki so sposobne učinkovite diferenciacije v večcelične miotubule v 2D kulturi. Če je gojena v 3D okolju hidrogela se iMPC strukturno preoblikuje tako, da tvori poravnano funkcionalno skeletno mišično vlakno (iSKM vretena), ki se lahko skrči in kot odgovor na električno ali nevrotransmitersko stimulacijo prenaša kalcijeve ione (Ca2+). V obdobju štirih tednov so 3D iSKM vretena doživela hipertrofijo miotubulov in funkcionalno izboljšanje ter naprednejšo stopnjo miogenske diferenciacije v primerjavi z 2D kulturo enake starosti. Pokazali so tudi, da se da iSKM vretena uspešno implantirati. Poskusi na miših nakazujejo potencial za uporabo teh metod in vitro in in vivo.

'''Neža Blaznik: Glikozilirana sialična kislina na protitelesu IgA inhibira virus influence tipa A'''

Nekateri virusi za vezavo na gostiteljsko celico uporabljajo receptorje, ki so glikozilirani s sialično kislino. V to skupino virusov spada tudi virus tipa influence A, ki povzroča gripo. Virus se prek glikoproteina hemaglutinina veže na sialično kislino v receptorjih in tako okuži gostiteljsko celico. Protitelesa imunoglobulini G (IgG), ki se uporabljajo v cepivih za gripo, imajo glikozilirane polipeptidne verige in prav tako vsebujejo nekaj sialične kisline, vendar je vsebnost sialične kisline v imunoglobulinih A (IgA) veliko večja. Znanstveniki so primerjali delovanje dveh tipov IgG in IgA na enega izmed tipov virusa influenze A (H5N3). Ugotovili so, da oba tipa IgA nevtralizirata virus v večji meri kot IgG, poleg tega pa so s križanjem komponent obeh imunoglobulinov tudi določili domeno na IgA, ki največ prispeva k povečani nevtralizaciji virusa. S tem so torej ugotovili, da glikozilirana sialična kislina na IgA inhibira virus influence tipa A, saj se veže še na dodatno mesto virusa in tako blokira povezavo med virusom in gostiteljsko telesno celico. To znanje je uporabno v razvoju novih cepiv proti gripi, vendar zaradi same zahtevnosti testiranja IgA in vivo, želijo znanstveniki v prihodnosti sintetizirati protitelo tipa IgG, ki bi vsebovalo del verige IgA, ter tako združiti prednost obeh protiteles.

'''Liza Ulčakar: Kombinirana DNA-RNA/neoantigen nanocepiva - učinkovita imunoterapevtska metoda'''

Cepiva proti raku postajajo vedno bolj raziskana tema. Znanstveniki so zato sintetizirali kombinirano zdravilo, ki vsebuje CpG (kratka enoverižna DNA), shRNA in rakave neoantigene. CpG deluje kot imunostimulator, saj se veže na receptor TLR9 v membrani endosomov antigen prezentirajočih celic in sproži imunski odgovor na rakave celice. shRNA preko RNA-interference preprečuje translacijo transkripcijskega faktorja STAT3, ki deluje imunosupresivno. Da bi zdravilo nemoteno potovalo po limfnem sistemu in prehajalo v celice, so sintetizirali kopolimer PPT-g-PEG, ki je skrčil kombinirano zdravilo. Cepivo so najprej preizkusili in vitro in ugotovili, da cepivo deluje imunostimulativno - antigen prezentirajoče celice so začele sproščati več citokinov, proizvodnja proteina STAT3 se je zmanjšala. Nato so poskus ponovili še in vivo, miših, ki so bile okužene z adenokarcinomom debelega črevesa. Mišim so nato odstranili organe z metastazami in opazili, da se je tumor pri miših, ki so bile zdravljene s kombiniranim zdravilom v primerjavi z mišmi, ki zdravila niso dobile, močno zmanjšal.

'''Matija Ruparčič: Od strupenih kompleksov do zlatih zrnc s ''Cupriavidus mellidurans'''''

Kakor voda, ogljik in dušik, tudi zlato kroži v naravi. Eden izmed organizmov, ki to omogoča, je ''Cupriavidus metallidurans''. Ta betaproteobakterija je skozi čas razvila vrsto mehanizmov, ki jo ščitijo pred velikimi koncentracijami težkih kovin. Problem pa se pojavi, ko je v prsteh prisotno zlato. To namreč inhibira glavno črpalko bakrovih ionov CupA in tako vodi do sinergistične toksičnosti bakra in zlata. Bakterija črpalk za zlato nima, zato je morala razviti mehanizem, ki bi preprečil sam vstop zlata v citoplazmo. Ker imajo bakterije, ki živijo v prsteh z večjo koncentracijo Au, v povprečju večje število encima CopA, ki ga skupaj z drugimi proteini kodirajo geni ''copABCD'', so se znanstveniki osredotočili nanj. Ugotovili so, da so produkti genov ''copABCD'' zasluženi za povečano odpornost na Cu/Au mešanice, CopA pa poleg Cu(I) oksidira tudi Au(I) ione v Au(III), nato pa pomaga pri redukciji le-teh do Au(0) nanodelcev. Rezultati raziskave tako predstavljajo nov korak k popolnemu razumevanju biogeokemičnega cikla zlata.

'''Jernej Imperl: Optimizacija protimikrobnih peptidov s pomočjo virtualnih metod'''

Gramnegativne bakterije premorejo vrsto mehanizmov za obrambo pred antibiotiki in s časom so na mnoge od njih postale celo imune. Skupaj z dejstvom, da je proizvodnja novih antibiotikov zapleten in drag proces, lahko predstavljajo resno dolgoročno grožnjo. Da bi bakterije "presenetili", so se znanstveniki obrnili na izdelavo protimikrobnih peptidov po šabloni peptidov rastlinskega izvora, ki se zaradi zapletene zgradbe na trgu še ne uporabljajo, a so znani v tradicionalni medicini že zelo dolgo časa. Peptid sadeža guave, Pg-AMP1, v osnovni obliki neugodnega za komercialno rabo, so s pomočjo računalniškega algoritma, ki posnema proces evolucije, in funkcije, ki peptide ovrednoti na podlagi verjetnosti tvorbe vijačnic, postopoma spreminjali in optimizirali. S simulacijo, ki so jo zagnali kar 100-krat, vsakič z naborom 250 začetnih peptidov, so uspeli odkriti guavanin 2, prvaka med stotimi kandidati vsake od simulacij, ki se je izkazal za učinkovitega proti gramnegativnim bakterijam in neškodljiv za človeške celice. Uspešnost guavanina 2 in njegova pomenljiva drugačnost od že obstoječih protimikrobnih peptidov nakazuje obetaven korak za nadaljnjo raziskovanje antibiotikov rastlinskega izvora.

TBK2018-seminar

2018-04-21T12:23:44Z

JernejI: /* Seznam seminarjev */

= Temelji biokemije- seminar =

Seminarje vodi prof. dr. Brigita Lenarčič. Seminarji so obvezni.

Ocena seminarjev (6-10) predstavlja enako število odstotkov, ki se prišteje h končni pisni oceni izpita.
Stran na strežniku s seminarskimi nalogami je zaščitena.
Uporabniško ime je: tbk, password pa: samozame## "##" sta dve številki, ki ju izveste na predavanjih.
Tudi za urejanje Wiki strani potrebujete geslo, ki se od zgornjega razlikuje. Postopek pridobitve Wiki uporabniškega imena in gesla je opisan [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Main_Page tukaj].

== Seznam seminarjev ==

{| border="1" cellpadding="4" cellspacing="0" style="border:#c9c9c9 1px solid; margin: 1em 1em 1em 0; border-collapse: collapse;"
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Ime in priimek'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Naslov seminarja'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Povezava'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Rok za oddajo'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Rok za recenzijo'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Datum predstavitve'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 1'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 2'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 3'''
|-
| Anna Scott||Moj naslov v slovenščini||http://www.bioscirep.org/content/36/1/e00291.long||28.10.||05.11.||07.11.||r1||r2||r3
|-
| Doroteja Armič || Pretvorba mišjih fibroblastov v pluripotentne matične celice s pomočjo tehnologije CRISPR || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/01/180118162449.htm || 27.02. || 02.03. || 05.03. || Martina Lokar || Liza Ulčakar || Zoja Siter
|-
| Valeriya Musina || Metalopeptid bakrov(II) fenantrolin tarčno onemogoči delovanje mitohondrijev v matičnih celicah raka dojke || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/12/171213124751.htm || 27.02. || 02.03. || 05.03. || Nika Boštic || Tiana Karmen Kokalj || Aljaž Bratina
|-
| Dea Simonič || Sprožilci avtoimunskih bolezni in vzroki za nekontrolirano širjenje le-teh po telesu ||https://www.sciencedaily.com/releases/2017/08/170824141207.htm|| 27.02. || 02.03. || 05.03. || Sumeja Kudelić || Jernej Imperl || Anamarija Agnič
|-
| Neža Štremfelj ||Delovanje inzulinskih receptorjev||https://www.sciencedaily.com/releases/2018/02/180219103256.htm|| 27.02. || 02.03. || 05.03. || Luka Gnidovec || Matija Ruparčič || Simona Gorgievska
|-
| Gašper Komatar || Tvorba kompleksa receptorjev ApoER2, ephirinB2 in AMPAR, ki jih povezuje GRIP1, sodeluje pri tvorbi spomina || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/10/171009093207.htm || 06.03. || 09.03. || 12.03. || Lara Hrvatin || Tiana Karmen Kokalj || Matej Jereb
|-
| Marko Pavleković || Prehajanje imunskih celic, povzročiteljic multiple skleroze, skozi krvno-možgansko pregrado || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/11/171121155811.htm || 06.03. || 09.03. || 12.03. || Klementina Polanec || Meta Kodrič || Lara Drinovec
|-
| Laura Gašperšič || Alzheimerjeva bolezen: povrnitev zmožnosti pomnjenja z inhibicijo interakcije med Sp3 in HDAC2 || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/08/170808150001.htm || 06.03. || 09.03. || 12.03. || Karmen Mlinar || Ana Menegalija || Maks Kumek
|-
| Rebeka Dajčman || Več mehanizmov poganja dinamiko kalcijevega signala okoli lasersko povzročene rane epitelija || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/10/171003124646.htm || 06.03. || 09.03. || 12.03. || Ula Nikolaja Ratajec || Andreja Marija Belič || Neža Blaznik
|-
| Maja Škof || Pomen S-proteinov pri prilagajanju koronavirusov na okolje. || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/11/171127105937.htm || 13.03. || 16.03. || 19.03. || Doroteja Armič || Barbara Jaklič || Liza Ulčakar
|-
| Tina Kolenc Milavec || Vezava kalcija na karboksilni konec α-sinukleina uravnava interakcije med sinaptičnimi vezikli || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/02/180219071758.htm || 13.03. || 16.03. || 19.03. || Valeriya Musina || Eva Gartner || Jana Rajchevska
|-
| Tina Zavodnik || Disfunkcionalni mitohondriji s pomočjo ROS zavirajo translacijsko aktivnost || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/02/180202112629.htm || 13.03. || 16.03. || 19.03. || Dea Simonič || Martina Lokar || Jernej Imperl
|-
| Tadej Medved || Identifikacija vezavnih mest proteinov WASP na aktinski ojedritveni kompleks Arp2/3 || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/03/180305130632.htm || 13.03. || 16.03. || 19.03. || Neža Štremfelj || Nika Boštic || Matija Ruparčič
|-
| Bogdan Jovićević || || || 20.03. || 23.03. || 26.03. || Laura Gašperšič || Lara Hrvatin || Ana Menegalija
|-
| Polona Kalan || || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/02/180214111055.htm || 20.03. || 23.03. || 26.03. || Rebeka Dajčman || Klementina Polanec || Andreja Marija Belič
|-
| Liza Praznik ||Vpliv šaperono Skp in SurA na zvijanje proteinov FhuA v terciarno strukturo ||https://www.sciencedaily.com/releases/2015/09/150907113757.htm || 20.03. || 23.03. || 26.03. || Maja Škof || Karmen Mlinar || Barbara Jaklič
|-
| Anže Šumah || Razvoj genskega senzorja za uničevanje celic s pomanjkanjem proteina p53 || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/11/171114104201.htm || 20.03. || 23.03. || 26.03. || Tina Kolenc Milavec || Ula Nikolaja Ratajec || Eva Gartner
|-
| Neža Žerjav|| Dodajanje enega samega nukleotida omejuje aktivnost človeške telomeraze ||https://www.sciencedaily.com/releases/2018/02/180227142114.htm || 03.04. || 06.04. || 09.04. || Tina Zavodnik || Doroteja Armič || Martina Lokar
|-
| Urša Štrancar || Predstavitev združitve avtofagosoma in lizosoma s pomočjo supermolekularnega para FRET || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/02/180219103254.htm || 03.04. || 06.04. || 09.04. || Tadej Medved || Valeriya Musina || Nika Boštic
|-
| Zoja Siter || || || 03.04. || 06.04. || 09.04. || Neža Žerjav || Dea Simonič || Sumeja Kudelić
|-
| Aljaž Bratina || Intrinzična destabilizacija ribosoma || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/11/171120101314.htm || 03.04. || 06.04. || 09.04. || Anastasija Nechevska || Neža Štremfelj || Luka Gnidovec
|-
| Anamarija Agnič || ATP-aza P4 s premeščanjem fosfolipidov uravnava uvihanost membrane || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/03/180329141014.htm || 10.04. || 13.04. || 16.04. || Bogdan Jovićević || Sumeja Kudelić || Lara Hrvatin
|-
| Simona Gorgievska || Optical tools to detect metabolic changes linked to disease || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/03/180307161351.htm|| 10.04. || 13.04. || 16.04. || Polona Kalan || Marko Pavleković || Klementina Polanec
|-
| Matej Jereb || Gradnja človeške pluripotentne matične celice v funkcionalno skeletno mišično tkivo|| https://www.sciencedaily.com/releases/2018/01/180109104707.htm || 10.04. || 13.04. || 16.04. || Liza Praznik || Laura Gašperšič || Karmen Mlinar
|-
| Lara Drinovec || Tavrin pomaga obnoviti zaradi multiple skleroze poškodovane celice || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/12/171208143024.htm || 10.04. || 13.04. || 16.04. || Anže Šumah || Rebeka Dajčman || Ula Nikolaja Ratajec
|-
| Maks Kumek || Dinamični izvor sprememb specifčne toplote v encimsko kataliziranih reakcijah || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/03/180321090854.htm || 17.04. || 20.04. || 23.04. || Marko Pavleković || Maja Škof || Doroteja Armič
|-
| Neža Blaznik || Glikozilirana sialična kislina na protitelesu IgA inhibira virus influence tipa A || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/04/180403111203.htm || 17.04. || 20.04. || 23.04. || Urša Štrancar || Tina Kolenc Milavec || Valeriya Musina
|-
| Liza Ulčakar || Kombinirana DNA-RNA/antigen nanocepiva - učinkovita imunoterapevtska metoda ||https://www.sciencedaily.com/releases/2017/11/171129163851.htm || 17.04. || 20.04. || 23.04. || Zoja Siter || Tina Zavodnik || Dea Simonič
|-
| Anastasija Nechevska || || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/03/180319155730.htm || 17.04. || 20.04. || 23.04. || Aljaž Bratina || Tadej Medved || Neža Štremfelj
|-
| Jernej Imperl || Optimizacija protimikrobnih peptidov s pomočjo virtualnih metod || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/04/180416085922.htm || 23.04. || 26.04. || 07.05. || Anamarija Agnič || Neža Žerjav || Luka Gnidovec
|-
| Matija Ruparčič || || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/01/180131095453.htm || 23.04. || 26.04. || 07.05. || Simona Gorgievska || Anastasija Nechevska || Marko Pavleković
|-
| Tiana Karmen Kokalj || B-1a limfociti spodbujajo oligodendrogenezo med razvojem možganov || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/03/180313091702.htm || 23.04. || 26.04. || 07.05. || Matej Jereb || Bogdan Jovićević || Laura Gašperšič
|-
| Meta Kodrič || || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/01/180125101321.htm || 23.04. || 26.04. || 07.05. || Lara Drinovec || Polona Kalan || Rebeka Dajčman
|-
| Ana Menegalija || || || 08.05. || 11.05. || 14.05. || Maks Kumek || Liza Praznik || Maja Škof
|-
| Andreja Marija Belič || || || 08.05. || 11.05. || 14.05. || Neža Blaznik || Anže Šumah || Tina Kolenc Milavec
|-
| Barbara Jaklič || || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/02/180220161201.htm || 08.05. || 11.05. || 14.05. || Liza Ulčakar || Meta Kodrič || Tina Zavodnik
|-
| Eva Gartner || || || 08.05. || 11.05. || 14.05. || Gašper Komatar || Urša Štrancar || Tadej Medved
|-
| Martina Lokar || || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/03/180301144138.htm || 15.05. || 18.05. || 21.05. || Jernej Imperl || Zoja Siter || Neža Žerjav
|-
| Nika Boštic || || || 15.05. || 18.05. || 21.05. || Matija Ruparčič || Aljaž Bratina || Anastasija Nechevska
|-
| Sumeja Kudelić || ||https://www.sciencedaily.com/releases/2017/12/171221122927.htm || 15.05. || 18.05. || 21.05. || Tiana Karmen Kokalj || Anamarija Agnič || Bogdan Jovićević
|-
| Luka Gnidovec || || || 15.05. || 18.05. || 21.05. || Meta Kodrič || Simona Gorgievska || Polona Kalan
|-
| Lara Hrvatin || Mg2+ ioni omogočajo kondenzacijo kromosomov || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/02/180201104559.htm || 22.05. || 25.05. || 28.05. || Ana Menegalija || Matej Jereb || Liza Praznik
|-
| Klementina Polanec || || || 22.05. || 25.05. || 28.05. || Andreja Marija Belič || Lara Drinovec || Anže Šumah
|-
| Karmen Mlinar || || || 22.05. || 25.05. || 28.05. || Barbara Jaklič || Maks Kumek || Gašper Komatar
|-
| Ula Nikolaja Ratajec || || || 22.05. || 25.05. || 28.05. || Eva Gartner || Neža Blaznik || Urša Štrancar
|-
| rezerva || || || 29.05. || 01.06. || 04.06. || || ||
|}

==Naloga==
* samostojno pripraviti seminar, katerega tema je novica iz področja biokemije na portalu [http://www.sciencedaily.com ScienceDaily], ki je bila objavljena kasneje kot 1. avgusta 2016. Osnova za seminar naj bo znanstveni članek, ki je podlaga za to novico. Poleg tega članka za seminar uporabite še najmanj pet drugih virov, od teh vsaj še dva druga znanstvena članka, ki se navezujeta na to vsebino.
* članke na temo lahko iščete [https://scholar.google.com/ z Google učenjakom].
* naslov izbrane teme in povezavo do novice vpišite v tabelo seminarjev takoj ko ste si izbrali temo, najkasneje pa en teden pred rokom za oddajo
* [[TBK2017 Povzetki seminarjev|Povzetek seminarja]] opišete na wikiju v približno 200 besedah - najkasneje do dne, ko morate oddati seminar recenzentom.
* Povezavo do povzetka vnesete v tabelo seminarjev tekočega letnika.
* Seminar pripravite v obliki seminarske naloge (pisava Cambria, font 11, enojni razmak, 2,5 cm robovi; tekst naj obsega okoli 1000 besed), vsebuje naj 1-2 sliki. Slika mora imeti legendo in v besedilu mora biti na ustreznem mestu sklic na sliko. Vse uporabljene vire citirajte v tekstu, kot npr. (Nobel, 2010), na koncu pa navedite točen seznam literature, kot je opisano spodaj!
*Celotni seminar naj obsega 2 strani A4 formata (po možnosti dvostransko tiskanje).
* Seminar oddajte do datuma oddaje, ki je naveden v tabeli v elektronski obliki z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/tbk/poslji/ tega obrazca].
* vsi seminarji so v elektronski obliki dostopni [http://bio.ijs.si/~zajec/tbk/poslji//bioseminar/ tukaj].
* Recenzenti do dneva določenega v tabeli določijo popravke in podajo oceno pisnega dela, v predpisanem formatu elektronskega obrazca na internetu.
* Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Za predstavitev je na voljo 12 minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni. Prvi recenzent vodi predstavitve in razpravo ter skrbi za to, da vse poteka v zastavljenih časovnih okvirih.
* Predstavitvi sledi razprava do 8 minut. Sledijo vprašanja prisotnih, recenzenti postavijo vsak vsaj dve vprašanji in na koncu podajo oceno predstavitve.
* En dan pred predstavitvijo na strežnik oddajte tudi končno verzijo. Na dan predstavitve morate oddati tudi končno (popravljeno) in natisnjeno verzijo seminarja v enem izvodu.
* Seminarska naloga in povzetek na wikiju morajo biti v slovenskem jeziku!

==Imena datotek==
Prosim vas, da vse datoteke, ki jih pošiljate poimenujete po spodnjih pravilih. Ne uporabljajte ČŽŠčžš!
Poslati morate naslednje datoteke:
* TBK_2018_Priimek_Ime.doc(x) za seminar, npr. TBK_2017_Guncar_Gregor.docx
* TBK_2018_Priimek_ime_final.doc(x) za končno verzijo seminarja
* TBK_2018_Priimek_Ime_rec_Priimek2.doc(x) za recenzijo, kjer je Priimek2 priimek recenzenta, npr. TBK_2017_Guncar_Gregor_rec_Scott.docx (če se pišete Scott in odajate recenzijo za seminar, ki ga je napisal Gunčar)
* TBK_2018_Priimek_Ime.ppt(x) za prezentacijo, npr TBK_2017_Guncar_Gregor.pptx
* TBK_2018_Priimek_Ime_clanek.pdf za datoteko PDF, ki vsebuje izvirni članek, npr. TBK_2017_Guncar_Gregor_clanek.pdf

==Ocenjevanje seminarjev==
Recenzenti ocenijo seminar tako, da izpolnijo [[https://docs.google.com/forms/d/1Hdg2OHCyG24qwLTnFt09yZTng46RIwaIiUqnKOdsJxQ/viewform recenzentsko poročilo]] na spletu.

== Mnenje o predstavitvi ==
Vsak posameznik '''mora''' oceniti seminar tako, da odda svoje [https://docs.google.com/forms/d/1VvE-jaKikfiDO5Gdybqgp9mf_0uJZfBbIK8PLXKDaS0/viewform mnenje] najkasneje v enem tednu po predstavitvi. Kdor na seminarju ni bil prisoten, mnenja '''ne sme''' oddati.

==Urejanje spletnih strani na wikiju==
Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''

==Faktor vpliva==
Faktor vpliva (angl. impact factor) neke revije pove, kolikokrat so bili v poprečju citirani članki v tej reviji v dveh letih skupaj pred objavo tega faktorja. Faktorje vpliva za posamezno revijo lahko najdete v [http://www.cobiss.si/scripts/cobiss?command=CONNECT&base=JCR COBISS-u]. V polje "Naslov revije" vnesite ime revije za katero želite izvedeti faktor vpliva in pritisnite na gumb POIŠČI. V skrajnem desnem stolpcu se bodo izpisali faktorji vpliva za revije, ki ustrezajo vašim iskalnim kriterijem. Zadetkov za posamezno revijo je več zato, ker so navedeni faktorji vpliva za posamezno leto. Za tekoče leto faktorji vpliva še niso objavljeni, zato se orientirajte po faktorjih vpliva zadnjih par let. Če faktorja vpliva za vašo izbrano revijo ne najdete v bazi COBISS, potem izberite članek iz kakšne druge revije.

==Citiranje virov==Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se v seminarju držite ene same. Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati. '''Citiranje knjig:''' Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica. Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN. Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005. Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4. Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.). '''Citiranje člankov:''' Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani. Lartigue C. ''et al''. Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, letn. 317, str. 632-638.Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole: Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani. Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.Revija Science uporablja skrajšani zapis: C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007) V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne). '''Citiranje spletnih virov:''' Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.

TBK2018-seminar

2018-04-16T17:28:20Z

JernejI: /* Seznam seminarjev */

= Temelji biokemije- seminar =

Seminarje vodi prof. dr. Brigita Lenarčič. Seminarji so obvezni.

Ocena seminarjev (6-10) predstavlja enako število odstotkov, ki se prišteje h končni pisni oceni izpita.
Stran na strežniku s seminarskimi nalogami je zaščitena.
Uporabniško ime je: tbk, password pa: samozame## "##" sta dve številki, ki ju izveste na predavanjih.
Tudi za urejanje Wiki strani potrebujete geslo, ki se od zgornjega razlikuje. Postopek pridobitve Wiki uporabniškega imena in gesla je opisan [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Main_Page tukaj].

== Seznam seminarjev ==

{| border="1" cellpadding="4" cellspacing="0" style="border:#c9c9c9 1px solid; margin: 1em 1em 1em 0; border-collapse: collapse;"
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Ime in priimek'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Naslov seminarja'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Povezava'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Rok za oddajo'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Rok za recenzijo'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Datum predstavitve'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 1'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 2'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 3'''
|-
| Anna Scott||Moj naslov v slovenščini||http://www.bioscirep.org/content/36/1/e00291.long||28.10.||05.11.||07.11.||r1||r2||r3
|-
| Doroteja Armič || Pretvorba mišjih fibroblastov v pluripotentne matične celice s pomočjo tehnologije CRISPR || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/01/180118162449.htm || 27.02. || 02.03. || 05.03. || Martina Lokar || Liza Ulčakar || Zoja Siter
|-
| Valeriya Musina || Metalopeptid bakrov(II) fenantrolin tarčno onemogoči delovanje mitohondrijev v matičnih celicah raka dojke || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/12/171213124751.htm || 27.02. || 02.03. || 05.03. || Nika Boštic || Tiana Karmen Kokalj || Aljaž Bratina
|-
| Dea Simonič || Sprožilci avtoimunskih bolezni in vzroki za nekontrolirano širjenje le-teh po telesu ||https://www.sciencedaily.com/releases/2017/08/170824141207.htm|| 27.02. || 02.03. || 05.03. || Sumeja Kudelić || Jernej Imperl || Anamarija Agnič
|-
| Neža Štremfelj ||Delovanje inzulinskih receptorjev||https://www.sciencedaily.com/releases/2018/02/180219103256.htm|| 27.02. || 02.03. || 05.03. || Luka Gnidovec || Matija Ruparčič || Simona Gorgievska
|-
| Gašper Komatar || Tvorba kompleksa receptorjev ApoER2, ephirinB2 in AMPAR, ki jih povezuje GRIP1, sodeluje pri tvorbi spomina || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/10/171009093207.htm || 06.03. || 09.03. || 12.03. || Lara Hrvatin || Tiana Karmen Kokalj || Matej Jereb
|-
| Marko Pavleković || Prehajanje imunskih celic, povzročiteljic multiple skleroze, skozi krvno-možgansko pregrado || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/11/171121155811.htm || 06.03. || 09.03. || 12.03. || Klementina Polanec || Meta Kodrič || Lara Drinovec
|-
| Laura Gašperšič || Alzheimerjeva bolezen: povrnitev zmožnosti pomnjenja z inhibicijo interakcije med Sp3 in HDAC2 || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/08/170808150001.htm || 06.03. || 09.03. || 12.03. || Karmen Mlinar || Ana Menegalija || Maks Kumek
|-
| Rebeka Dajčman || Več mehanizmov poganja dinamiko kalcijevega signala okoli lasersko povzročene rane epitelija || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/10/171003124646.htm || 06.03. || 09.03. || 12.03. || Ula Nikolaja Ratajec || Andreja Marija Belič || Neža Blaznik
|-
| Maja Škof || Pomen S-proteinov pri prilagajanju koronavirusov na okolje. || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/11/171127105937.htm || 13.03. || 16.03. || 19.03. || Doroteja Armič || Barbara Jaklič || Liza Ulčakar
|-
| Tina Kolenc Milavec || Vezava kalcija na karboksilni konec α-sinukleina uravnava interakcije med sinaptičnimi vezikli || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/02/180219071758.htm || 13.03. || 16.03. || 19.03. || Valeriya Musina || Eva Gartner || Jana Rajchevska
|-
| Tina Zavodnik || Disfunkcionalni mitohondriji s pomočjo ROS zavirajo translacijsko aktivnost || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/02/180202112629.htm || 13.03. || 16.03. || 19.03. || Dea Simonič || Martina Lokar || Jernej Imperl
|-
| Tadej Medved || Identifikacija vezavnih mest proteinov WASP na aktinski ojedritveni kompleks Arp2/3 || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/03/180305130632.htm || 13.03. || 16.03. || 19.03. || Neža Štremfelj || Nika Boštic || Matija Ruparčič
|-
| Bogdan Jovićević || || || 20.03. || 23.03. || 26.03. || Laura Gašperšič || Lara Hrvatin || Ana Menegalija
|-
| Polona Kalan || || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/02/180214111055.htm || 20.03. || 23.03. || 26.03. || Rebeka Dajčman || Klementina Polanec || Andreja Marija Belič
|-
| Liza Praznik ||Vpliv šaperono Skp in SurA na zvijanje proteinov FhuA v terciarno strukturo ||https://www.sciencedaily.com/releases/2015/09/150907113757.htm || 20.03. || 23.03. || 26.03. || Maja Škof || Karmen Mlinar || Barbara Jaklič
|-
| Anže Šumah || Razvoj genskega senzorja za uničevanje celic s pomanjkanjem proteina p53 || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/11/171114104201.htm || 20.03. || 23.03. || 26.03. || Tina Kolenc Milavec || Ula Nikolaja Ratajec || Eva Gartner
|-
| Neža Žerjav|| Dodajanje enega samega nukleotida omejuje aktivnost človeške telomeraze ||https://www.sciencedaily.com/releases/2018/02/180227142114.htm || 03.04. || 06.04. || 09.04. || Tina Zavodnik || Doroteja Armič || Martina Lokar
|-
| Urša Štrancar || Predstavitev združitve avtofagosoma in lizosoma s pomočjo supermolekularnega para FRET || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/02/180219103254.htm || 03.04. || 06.04. || 09.04. || Tadej Medved || Valeriya Musina || Nika Boštic
|-
| Zoja Siter || || || 03.04. || 06.04. || 09.04. || Neža Žerjav || Dea Simonič || Sumeja Kudelić
|-
| Aljaž Bratina || Intrinzična destabilizacija ribosoma || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/11/171120101314.htm || 03.04. || 06.04. || 09.04. || Anastasija Nechevska || Neža Štremfelj || Luka Gnidovec
|-
| Anamarija Agnič || ATP-aza P4 s premeščanjem fosfolipidov uravnava uvihanost membrane || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/03/180329141014.htm || 10.04. || 13.04. || 16.04. || Bogdan Jovićević || Sumeja Kudelić || Lara Hrvatin
|-
| Simona Gorgievska || Optical tools to detect metabolic changes linked to disease || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/03/180307161351.htm|| 10.04. || 13.04. || 16.04. || Polona Kalan || Marko Pavleković || Klementina Polanec
|-
| Matej Jereb || Gradnja človeške pluripotentne matične celice v funkcionalno skeletno mišično tkivo|| https://www.sciencedaily.com/releases/2018/01/180109104707.htm || 10.04. || 13.04. || 16.04. || Liza Praznik || Laura Gašperšič || Karmen Mlinar
|-
| Lara Drinovec || Tavrin pomaga obnoviti zaradi multiple skleroze poškodovane celice || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/12/171208143024.htm || 10.04. || 13.04. || 16.04. || Anže Šumah || Rebeka Dajčman || Ula Nikolaja Ratajec
|-
| Maks Kumek || || || 17.04. || 20.04. || 23.04. || Marko Pavleković || Maja Škof || Doroteja Armič
|-
| Neža Blaznik || Glikozilirana sialična kislina na protitelesu IgA inhibira virus influence tipa A || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/04/180403111203.htm || 17.04. || 20.04. || 23.04. || Urša Štrancar || Tina Kolenc Milavec || Valeriya Musina
|-
| Liza Ulčakar || ||https://www.sciencedaily.com/releases/2017/11/171129163851.htm || 17.04. || 20.04. || 23.04. || Zoja Siter || Tina Zavodnik || Dea Simonič
|-
| Anastasija Nechevska || || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/03/180319155730.htm || 17.04. || 20.04. || 23.04. || Aljaž Bratina || Tadej Medved || Neža Štremfelj
|-
| Jernej Imperl || Optimizacija antimikrobnih peptidov s pomočjo virtualnih metod || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/04/180416085922.htm || 23.04. || 26.04. || 07.05. || Anamarija Agnič || Neža Žerjav || Luka Gnidovec
|-
| Matija Ruparčič || || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/01/180131095453.htm || 23.04. || 26.04. || 07.05. || Simona Gorgievska || Anastasija Nechevska || Marko Pavleković
|-
| Tiana Karmen Kokalj || B-1a limfociti spodbujajo oligodendrogenezo med razvojem možganov || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/03/180313091702.htm || 23.04. || 26.04. || 07.05. || Matej Jereb || Bogdan Jovićević || Laura Gašperšič
|-
| Meta Kodrič || || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/01/180125101321.htm || 23.04. || 26.04. || 07.05. || Lara Drinovec || Polona Kalan || Rebeka Dajčman
|-
| Ana Menegalija || || || 08.05. || 11.05. || 14.05. || Maks Kumek || Liza Praznik || Maja Škof
|-
| Andreja Marija Belič || || || 08.05. || 11.05. || 14.05. || Neža Blaznik || Anže Šumah || Tina Kolenc Milavec
|-
| Barbara Jaklič || || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/02/180220161201.htm || 08.05. || 11.05. || 14.05. || Liza Ulčakar || Meta Kodrič || Tina Zavodnik
|-
| Eva Gartner || || || 08.05. || 11.05. || 14.05. || Gašper Komatar || Urša Štrancar || Tadej Medved
|-
| Martina Lokar || || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/03/180301144138.htm || 15.05. || 18.05. || 21.05. || Jernej Imperl || Zoja Siter || Neža Žerjav
|-
| Nika Boštic || || || 15.05. || 18.05. || 21.05. || Matija Ruparčič || Aljaž Bratina || Anastasija Nechevska
|-
| Sumeja Kudelić || ||https://www.sciencedaily.com/releases/2017/12/171221122927.htm || 15.05. || 18.05. || 21.05. || Tiana Karmen Kokalj || Anamarija Agnič || Bogdan Jovićević
|-
| Luka Gnidovec || || || 15.05. || 18.05. || 21.05. || Meta Kodrič || Simona Gorgievska || Polona Kalan
|-
| Lara Hrvatin || Mg2+ ioni omogočajo kondenzacijo kromosomov || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/02/180201104559.htm || 22.05. || 25.05. || 28.05. || Ana Menegalija || Matej Jereb || Liza Praznik
|-
| Klementina Polanec || || || 22.05. || 25.05. || 28.05. || Andreja Marija Belič || Lara Drinovec || Anže Šumah
|-
| Karmen Mlinar || || || 22.05. || 25.05. || 28.05. || Barbara Jaklič || Maks Kumek || Gašper Komatar
|-
| Ula Nikolaja Ratajec || || || 22.05. || 25.05. || 28.05. || Eva Gartner || Neža Blaznik || Urša Štrancar
|-
| rezerva || || || 29.05. || 01.06. || 04.06. || || ||
|}

==Naloga==
* samostojno pripraviti seminar, katerega tema je novica iz področja biokemije na portalu [http://www.sciencedaily.com ScienceDaily], ki je bila objavljena kasneje kot 1. avgusta 2016. Osnova za seminar naj bo znanstveni članek, ki je podlaga za to novico. Poleg tega članka za seminar uporabite še najmanj pet drugih virov, od teh vsaj še dva druga znanstvena članka, ki se navezujeta na to vsebino.
* članke na temo lahko iščete [https://scholar.google.com/ z Google učenjakom].
* naslov izbrane teme in povezavo do novice vpišite v tabelo seminarjev takoj ko ste si izbrali temo, najkasneje pa en teden pred rokom za oddajo
* [[TBK2017 Povzetki seminarjev|Povzetek seminarja]] opišete na wikiju v približno 200 besedah - najkasneje do dne, ko morate oddati seminar recenzentom.
* Povezavo do povzetka vnesete v tabelo seminarjev tekočega letnika.
* Seminar pripravite v obliki seminarske naloge (pisava Cambria, font 11, enojni razmak, 2,5 cm robovi; tekst naj obsega okoli 1000 besed), vsebuje naj 1-2 sliki. Slika mora imeti legendo in v besedilu mora biti na ustreznem mestu sklic na sliko. Vse uporabljene vire citirajte v tekstu, kot npr. (Nobel, 2010), na koncu pa navedite točen seznam literature, kot je opisano spodaj!
*Celotni seminar naj obsega 2 strani A4 formata (po možnosti dvostransko tiskanje).
* Seminar oddajte do datuma oddaje, ki je naveden v tabeli v elektronski obliki z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/tbk/poslji/ tega obrazca].
* vsi seminarji so v elektronski obliki dostopni [http://bio.ijs.si/~zajec/tbk/poslji//bioseminar/ tukaj].
* Recenzenti do dneva določenega v tabeli določijo popravke in podajo oceno pisnega dela, v predpisanem formatu elektronskega obrazca na internetu.
* Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Za predstavitev je na voljo 12 minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni. Prvi recenzent vodi predstavitve in razpravo ter skrbi za to, da vse poteka v zastavljenih časovnih okvirih.
* Predstavitvi sledi razprava do 8 minut. Sledijo vprašanja prisotnih, recenzenti postavijo vsak vsaj dve vprašanji in na koncu podajo oceno predstavitve.
* En dan pred predstavitvijo na strežnik oddajte tudi končno verzijo. Na dan predstavitve morate oddati tudi končno (popravljeno) in natisnjeno verzijo seminarja v enem izvodu.
* Seminarska naloga in povzetek na wikiju morajo biti v slovenskem jeziku!

==Imena datotek==
Prosim vas, da vse datoteke, ki jih pošiljate poimenujete po spodnjih pravilih. Ne uporabljajte ČŽŠčžš!
Poslati morate naslednje datoteke:
* TBK_2018_Priimek_Ime.doc(x) za seminar, npr. TBK_2017_Guncar_Gregor.docx
* TBK_2018_Priimek_ime_final.doc(x) za končno verzijo seminarja
* TBK_2018_Priimek_Ime_rec_Priimek2.doc(x) za recenzijo, kjer je Priimek2 priimek recenzenta, npr. TBK_2017_Guncar_Gregor_rec_Scott.docx (če se pišete Scott in odajate recenzijo za seminar, ki ga je napisal Gunčar)
* TBK_2018_Priimek_Ime.ppt(x) za prezentacijo, npr TBK_2017_Guncar_Gregor.pptx
* TBK_2018_Priimek_Ime_clanek.pdf za datoteko PDF, ki vsebuje izvirni članek, npr. TBK_2017_Guncar_Gregor_clanek.pdf

==Ocenjevanje seminarjev==
Recenzenti ocenijo seminar tako, da izpolnijo [[https://docs.google.com/forms/d/1Hdg2OHCyG24qwLTnFt09yZTng46RIwaIiUqnKOdsJxQ/viewform recenzentsko poročilo]] na spletu.

== Mnenje o predstavitvi ==
Vsak posameznik '''mora''' oceniti seminar tako, da odda svoje [https://docs.google.com/forms/d/1VvE-jaKikfiDO5Gdybqgp9mf_0uJZfBbIK8PLXKDaS0/viewform mnenje] najkasneje v enem tednu po predstavitvi. Kdor na seminarju ni bil prisoten, mnenja '''ne sme''' oddati.

==Urejanje spletnih strani na wikiju==
Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''

==Faktor vpliva==
Faktor vpliva (angl. impact factor) neke revije pove, kolikokrat so bili v poprečju citirani članki v tej reviji v dveh letih skupaj pred objavo tega faktorja. Faktorje vpliva za posamezno revijo lahko najdete v [http://www.cobiss.si/scripts/cobiss?command=CONNECT&base=JCR COBISS-u]. V polje "Naslov revije" vnesite ime revije za katero želite izvedeti faktor vpliva in pritisnite na gumb POIŠČI. V skrajnem desnem stolpcu se bodo izpisali faktorji vpliva za revije, ki ustrezajo vašim iskalnim kriterijem. Zadetkov za posamezno revijo je več zato, ker so navedeni faktorji vpliva za posamezno leto. Za tekoče leto faktorji vpliva še niso objavljeni, zato se orientirajte po faktorjih vpliva zadnjih par let. Če faktorja vpliva za vašo izbrano revijo ne najdete v bazi COBISS, potem izberite članek iz kakšne druge revije.

==Citiranje virov==Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se v seminarju držite ene same. Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati. '''Citiranje knjig:''' Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica. Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN. Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005. Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4. Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.). '''Citiranje člankov:''' Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani. Lartigue C. ''et al''. Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, letn. 317, str. 632-638.Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole: Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani. Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.Revija Science uporablja skrajšani zapis: C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007) V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne). '''Citiranje spletnih virov:''' Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.