https://wiki.fkkt.uni-lj.si/api.php?action=feedcontributions&feedformat=atom&user=Jure+Zabret 2026-08-07T05:03:05Z User contributions MediaWiki 1.45.3 https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=User:Jure_Zabret&diff=11097 2016-01-04T16:50:08Z

<p>Jure Zabret: </p> <hr /> <div>==Uvod==<br /> Zadnjo stoletje so bili mikrobni sekundarni metaboliti pogosto vir pri odkrivanju novih vodilnih spojin za nadaljnji razvoj v farmacevtske učinkovine, vendar se število na ta način odkritih vodilnih spojin iz leta v leto manjša. Nasprotno temu pa je razvoj tehnologij visoko zmogljivostnega sekvenciranja in sočasen pojav programskih orodji za in-silico iskanje hipotetičnih biosinteznih genov in poti oziroma operonov. Eden izmed najodmevnejših je antiSMASH (ang. ”antibiotics &amp; Secondary Metabolite Analysis Shell)[2], ki omogoča (meta)genomske raziskave, ki lahko privedejo do odkritja novih (hipotetičnih)biosinteznih genov in operonov. <br /> Vendar se je pojavila težava, da večina teh se ne izraža pod laboratorijskimi pogoji, zato so raziskovalci takšne operone in gene, ki jih sestavljajo poimenovali tihi ali kriptični genski skupki (ang. “silent or cryptic gene clusters”). Tukaj se je bakterijski rod Actinobacteria izkazal za še posebej bogatega, vendar je ta pristop tudi pokazal nadaljnji potencial, ze te namene že izrabljenega, rodu Streptomyces. Posebej obetajoč je pristop heterologne ekspresije kriptičnih genskih skupkov v šasijah, ki bile prirejene prav za tovrstne namene[1]. <br /> Prvi korak pri optimizaciji šasije je poenostavitev njenega genoma. Ta bi zavzemala odstranitev nepotrebnih biosinteznih in metabolnih poti, čigar namen je zagotoviti nemoteno delovanje vnesenih genetskih naprav, oziroma biosinteznih genov ali celotnih operonov. Zadnje desetletje je preko genomskih in metagenomskih raziskav pokazalo enormno zapletenost delovanja bakterijske celice predvsem zaradi nepoznavanja mehanizmov, ki regulirajo v njej prisotna genetska vezja. Slednje za sintezno biologijo pogosto predstavlja problem, saj je v nepoznanih šasijah interakcija z vzneseno napravo pogosto neizogibna[1]. Tukaj je tudi potrebno omeniti koncept osrednjega genoma (ang.”core genome”), ki predstavlja skupino genov, ki so nepogrešljivi za delovanje določenega klada in njegovim predstavnikom daje fiziološke in morfološke značilnosti[3]. Čeprav je osredji genom dobro izhodišče za zagotavljaje ortolognosti ekspresijskih sistemov, se pri šasijah, namenjenih iskanju ekonomsko zanimivih sekundarnih metabolitov, koncept osrednjega genoma izkaže za neuporabnega. Biosintezne poti, oziroma koraki znotraj teh, potrebujejo določene prekurzorke spojine, katerih samo osrednji genom ne more zagotoviti. Torej so za iskanje novih ekonomsko zanimivih sekundarnih metabolitov bolj primerne šasije z reduciranim kot pa osrednjim genomom[1].<br /> ==Orodja za urejanje genoma==<br /> Priprava šasije z reduciranim genomom zajema obširno urejanje genoma izvornega organizma. Metode, ki to omogočajo pogosto temeljijo na homologni rekombinaciji preko organizmu lastnih ali tujih rekombinaz. Med slednjihmi sistemi se najpogosteje uporablja λRED rekombinacijski sistem in njihova prednost leži v večji učinkovitost rekombinacije[3]. <br /> Možna je pa tudi rekombinacija brez uporabe rekombinaze, ki temelji na delovanju DNA polimeraze. Tukaj se v gram negativne bakterije vnese med 20 in 120 bp dolge sintetične enoverižne olilgonukleotide, ki so komplementarni želenemu predelu genoma ampak nosijo točkovno mutacijo ali privedejo do delecije predela gena. Te se vstavijo v DNA med njenim podvojevanjem in sicer v obliki okazakijevaih fragmentov[4]. Razširitev tega pristopa je metoda MAGE (ang. “Multiplex Automated Genome Engineering”), ki temelji na večih ciklih tovrstne mutageneze in omogoča pripravo bakterisjkih sevov preko usmerjene evolucije[1].<br /> Tovrstnim namenom pogosto tudi služijo mestno-specifične rekombinaze, ki večinoma temeljijo na fagmen Cre/loxP ali kvasjem Flp/FRT sistemu. Cre in Flp sta rekombinazi, ki prepoznata 34 bp dolgo zaporedje DNA. Takšna zaporedja so vstavljena na 5’ in 3’ konce določenega gena in odvisno od njune orientacije omogočata rekombinazi izrez, oziroma delecijo (direktni ponovitvi) ali obrat (obrnjeni ponovitvi) željnega gena[1].<br /> Zadnje čase se pa vedno bolj uveljavlja sistem za urejanje DNA imenovann CRISPR/Cas9 (ang. “Clusterd Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/CRISPR assosiated (Cas) proteins”), ki izvira iz bakterijskega adaptivnega imunskega sistema. Poznamo tri različne CRISPR sisteme, ki se ločijo po številu potrebnih Cas proteinov. Najbolj uporaben je CRISPER/Cas9, saj za mestno specifični dvoverižni prelom DNA potrebuje le endonukleazo Cas9 in vodilno RNA[1].<br /> ==Od zgoraj navzdol ali ang.”top-down” pristop==<br /> Od zgoraj navzdol ali ang.”top-down” pristop je biotehnološko najbolj zanimiv in zajema postopno odstranjevanje nezaželjenih genov iz že obstoječega genoma. Takšen pristop se je v preteklosti že izkazal za uporabnega saj je izbitje ne-esencialnih genov privedlo do stabilnejšega genoma, hitrejše rasti, zmanjšanje sekrecijskega metaboloma in (najpomembnejše) sprostitev prekurzorkih molekul za industrisjsko zanimive biosintezne poti in posledično višjih titrov želenega metabolita. Vedno znova se pa je izkazalo, da je redukcija genoma možna samo za okoli 25%, in sicer pri Escherichia coli 15.3, B. subtilis 20.7, S. avermitilis 16.9-18.6 in Corinebacterium glutamicum 22%. Tovrstni pristopi usmerjene mutageneze za optimizacijo šasij so se iskazali za učinkovite tudi pri bakterijah rodu Streptomyces, vendar njihovo uporabnost omejuje pomankljivo poznavanja genetskih vezji prisotnih v produkcijskih organizmih, saj se je zaradi tega težko odločiti katere gene lahko izbijemo brez da vplivamo na sposobnost rasti in produkcije sekundarnih metabolitov[1]. <br /> Tukaj nastopi uporaba naključne mutageneze, saj ta ne potrebuje poznavanja vseh genetskih elementov, ampak temelji na selekciji mutant, ki ustrezajo zastavljenim kriterijem in pristop predstavlja nekakšno usmerjeno evolucijo. Pristop je bil že uporabljen za redukcijo genoma bakterije P. putida za 7.4% preko uporabe transpozonov z vstavljenim selekcijskim markerjem in FRT mestom, kar je omogočilo izrez segmenta genoma med dvema tovrstnima transpozicijskema elementa[1]. <br /> Zgoraj že omenjena metoda MAGE predstavlja vmesno pot, saj omogoča naključno mutagenezo natančno določenega segmenta genoma. Avtorji so tukaj preko specifičnih oligonukletidov v večih ciklih izvedeli naključno mutagenezo genov biosintezne poti za 1-deoksi-d-ksiloze-5-fosfata (DXP) in tako ustvarili sev, ki je imel petkrat višji titer DXP kot izvorni mikroorganizem[5]. <br /> ==Rod Streptomyces==<br /> Produkcija industrijsko zanimivih spojin pa potrebuje šasijo, ki poseduje primerno zalogo ustreznih metabolitov, saj te služijo kot njihovi prekurzorji. Bakterije rodu Streptomyces se ravno zaradi tega smatrajo kot idealni kandidati za pripravo optimiziranega ekspresijskega seva za kriptične biosintezne gene in operone, <br /> Prvi korak tovrsnega razvoja predstavljata priprava specializiranih ekspresijskih sevov S. avermitilis, za namene izražanja kriptičnih biosinteznih poti. Optimizacijo njenega genoma so dosegli preko odstranitve približno 1.4 Mb od 9.02 Mb wild-tipe genoma. Odstranili so bolj variabilne predele njenega genoma preko homologne in mestno specifične Cre/loxP rekombinacije in tako pripravili dva omembe vredna seva S. avermitilis SUKA17 in 22., ki imata genom reduciran za 17.9 in 18.5%, kar je preprečilo produkcijo endogenih sekundarnih metaboitov prisotnih v wilde-type sevu. Pomembno je tudi izpostaviti, da ti sevi niso izkazali počasnejše rasti kot izvorni wilde-type sev. Primernost tako pripravljenih sevov za heterologno ekspresijo biosinteznih poti so preverili preko izražanja biosinteznih poti za streptomicin, amicin C in pladienolid[6]. Prvi spojini sta antibiotika in druga je makrociklični lakton, ki izkazuje protitumorsko delovanje preko inhibicije zorenja mRNA[7]. Produkcija obeh antibiotikov je bila višja kot v izvornih organimih, proizvodnje pladienolida pa sprve niso opazili. Njegovo produkcijo so pa kasneje omogočili z uvedbo dodatne kopije zapisa za regulatorni protein PldR, ki je transkripcijski aktivator pladenoidnih biosinteznih genov[6]. <br /> Bolj ciljna optimizacija bakterije S. coelicolor M145 je bila izvedene z namenom zmanjšanja odtoka ogljika in dušika preko nativnih biosinteznih poti. Raziskovalci so izbili biosintezne gene za aktinorhodin, prodigin, CPK (ang.”cryptic type I polyketide syntetase”) in CDA (ang.”calcium-dependent antibiotic”), uvedli so tudi točkovne mutacije znotraj genov rpoB in rpsL, ki zapisujeta β podenoto RNA polimeraze in 30S ribosomalno podenoto[8]. Točkovne mutacije v teh genih, poleg antibiotične rezistence, povzročijo podoben odziv kot vezava ppGpp na ribosom. Povzročita indukcijo “odziva na težavne razmere” ali ang.”stringent response” in ta privede do aktivacije biosinteznih poti za sekundarne metabolite v rodu Streptomyces[9]. Tako so pleiotropno povišali kočne titre proizvedenih sekundarnih metabolitov, hipoteze so preverili preko vstavitve nativnega antihondrin biosinteznega operona in dveh biosinteznih poti za heterologno proukcijo kloramfenikola in kongocidina in pri vseh so opazili večjo produkcijo kot v izvornem sevu. Dodatna prednost uporabe produkcijkih sevov z reduciranim genomom je tudi lažja analiza proizvedenih spojin zaradi poenostavitve ekstracelularnega metabolitnega profila. Slednje je še posebej pomembno pri presejanju za industrijsko zanimive kriptične biosintezne operone in gene[8].<br /> ==“Od spodaj navzgor” (ang.”bottom-up”) pristop in naravno optimirani genomi==<br /> Od spodaj navzgor strategije predpostavljajo uporabo šasij, izdelanih de-novo za namen iskanja industrijsko zanimivih sekundarnih metabolitov. Tako zajemajo sestavo sintetičnih metabolnih poti, ki bi bile prirejena tako, da drastično zmanjšajo metabolno interferenco in preko tega bi lahko omogočil izdelavo polno ortolognega ekspresijskega sistema. Vendar so takšni cilji zaenkrat še neuresničljivi, saj je največji dosedanji uspeh na tem področju popolna sinteza genoma bakterije Mycoplasma mycoides in njegov prenos v celico M. capricolum, kateri je bil predhodno odstranjen lastni genom[1]. <br /> Naravno oprimiran genom pa bi lahko predstavljala bakterija Streptomyces albus J1074, saj je njen genom najmanjši znotraj tega rodu. Njegova velikost (~6.8 Mb) je posledica zmanjšanja števila genskih podvojitev, kar je dobro vodilo za optimiranje drugih predstavnikov tega rodu. Poleg majhnega genoma je ta bakterijska vrsta primerna kot šasija za iskanje industrijsko zanimivih sekundarnih metabolitov tudi zaradi relativno enostavne genetske manipulacije in je v preteklosti že bila uspešno uporabljena za produkcijo stefimicina, ferderikamicina in drugih industrijsko pomembnih spojin[1]. <br /> ==Viri==<br /> 1.Tiago Beites in Marta V. Mendes. Chassis optimization as acornerstone for the application of synthetic biology based strategies in microbial secondary metabolism. Frontiers in Microbiology (2015)<br /> <br /> 2.Marnix H. Medema, Kai Blin, Peter Cimermancic et al. antiSMASH: rapid identification, annotation and analysis of secondary metabolite biosynthesis gene clusters in bacterial and fungal genome sequences. Nucleic Acid Reserch (2011) <br /> <br /> 3.George Vernikos, Duccio Medini, David R Riley et al. Ten years of pan-genome analyses. Current Opinion in Microbiology (2015)<br /> <br /> 4.Li X., T.Thomason, L. C. Sawitzke et al. Bacterial DNA polymerases participate in oligonucleotide recombination. Molecular Microbiology (2013).<br /> <br /> <br /> 5.Harris H. Wang1, Farren J. Isaacs1, Peter A. Carr et al. Programming cells by multiplex genome engineering and accelerated evolution. Nature (2009)<br /> <br /> 6.Mamoru Komatsua, Takuma Uchiyamaa, Satoshi Omurab et al. Genome-minimized Streptomyces host for the heterologous expression of secondary metabolism. PNAS (2010)<br /> <br /> 7.Akira Yokoi, Yoshihiko Kotake, Kentaro Takahashi et al. Biological validation that SF3b is a target of the antitumormacrolide pladienolide. FEBS Journal (2011)<br /> <br /> 8.Juan Pablo Gomez-Escribano in Mervyn J. Bibb. Engineering Streptomyces coelicolor for heterologous expression of secondary metabolite gene clusters. Microbial Biotechnology (2011)<br /> <br /> 9.Haifeng Hu, Qin Zhang in Kozo Ochi. Activation of Antibiotic Biosynthesis by Specified Mutations in the rpoB Gene (Encoding the RNA Polymerase Subunit) of Streptomyces lividans. Journal of Bacteriology (2002)</div>

Jure Zabret https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=User:Jure_Zabret&diff=11044 2016-01-02T17:46:42Z

<p>Jure Zabret: Removing all content from page</p> <hr /> <div></div>

Jure Zabret https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Oprimizacija_%C5%A1asij_kot_osnovni_korak_pri_uporabi_sintezno_biolo%C5%A1kega_pristopa_pri_karakterizaciji_mikrobnega_sekundarnega_metabolizma&diff=11043 2016-01-02T17:46:37Z

<p>Jure Zabret: New page: ==Uvod== Zadnjo stoletje so bili mikrobni sekundarni metaboliti pogosto vir pri odkrivanju novih vodilnih spojin za nadaljnji razvoj v farmacevtske učinkovine, vendar se število na ta na...</p> <hr /> <div>==Uvod==<br /> Zadnjo stoletje so bili mikrobni sekundarni metaboliti pogosto vir pri odkrivanju novih vodilnih spojin za nadaljnji razvoj v farmacevtske učinkovine, vendar se število na ta način odkritih vodilnih spojin iz leta v leto manjša. Nasprotno temu pa je razvoj tehnologij visoko zmogljivostnega sekvenciranja in sočasen pojav programskih orodji za in-silico iskanje hipotetičnih biosinteznih genov in poti oziroma operonov. Eden izmed najodmevnejših je antiSMASH (ang. ”antibiotics &amp; Secondary Metabolite Analysis Shell&quot;)[2], ki omogoča (meta)genomske raziskave, ki lahko privedejo do odkritja novih (hipotetičnih)biosinteznih genov in operonov. <br /> Vendar se je pojavila težava, da večina teh se ne izraža pod laboratorijskimi pogoji, zato so raziskovalci takšne operone in gene, ki jih sestavljajo poimenovali tihi ali kriptični genski skupki (ang. “silent or cryptic gene clusters”). Tukaj se je bakterijski rod Actinobacteria izkazal za še posebej bogatega, vendar je ta pristop tudi pokazal nadaljnji potencial, ze te namene že izrabljenega, rodu Streptomyces. Posebej obetajoč je pristop heterologne ekspresije kriptičnih genskih skupkov v šasijah, ki bile prirejene prav za tovrstne namene[1]. <br /> Prvi korak pri optimizaciji šasije je poenostavitev njenega genoma. Ta bi zavzemala odstranitev nepotrebnih biosinteznih in metabolnih poti, čigar namen je zagotoviti nemoteno delovanje vnesenih genetskih naprav, oziroma biosinteznih genov ali celotnih operonov. Zadnje desetletje je preko genomskih in metagenomskih raziskav pokazalo enormno zapletenost delovanja bakterijske celice predvsem zaradi nepoznavanja mehanizmov, ki regulirajo v njej prisotna genetska vezja. Slednje za sintezno biologijo pogosto predstavlja problem, saj je v nepoznanih šasijah interakcija z vzneseno napravo pogosto neizogibna[1]. Tukaj je tudi potrebno omeniti koncept osrednjega genoma (ang.”core genome”), ki predstavlja skupino genov, ki so nepogrešljivi za delovanje določenega klada in njegovim predstavnikom daje fiziološke in morfološke značilnosti[3]. Čeprav je osredji genom dobro izhodišče za zagotavljaje ortolognosti ekspresijskih sistemov, se pri šasijah, namenjenih iskanju ekonomsko zanimivih sekundarnih metabolitov, koncept osrednjega genoma izkaže za neuporabnega. Biosintezne poti, oziroma koraki znotraj teh, potrebujejo določene prekurzorke spojine, katerih samo osrednji genom ne more zagotoviti. Torej so za iskanje novih ekonomsko zanimivih sekundarnih metabolitov bolj primerne šasije z reduciranim kot pa osrednjim genomom[1].<br /> ==Orodja za urejanje genoma==<br /> Priprava šasije z reduciranim genomom zajema obširno urejanje genoma izvornega organizma. Metode, ki to omogočajo pogosto temeljijo na homologni rekombinaciji preko organizmu lastnih ali tujih rekombinaz. Med slednjihmi sistemi se najpogosteje uporablja λRED rekombinacijski sistem in njihova prednost leži v večji učinkovitost rekombinacije[3]. <br /> Možna je pa tudi rekombinacija brez uporabe rekombinaze, ki temelji na delovanju DNA polimeraze. Tukaj se v gram negativne bakterije vnese med 20 in 120 bp dolge sintetične enoverižne olilgonukleotide, ki so komplementarni želenemu predelu genoma ampak nosijo točkovno mutacijo ali privedejo do delecije predela gena. Te se vstavijo v DNA med njenim podvojevanjem in sicer v obliki okazakijevaih fragmentov[4]. Razširitev tega pristopa je metoda MAGE (ang. “Multiplex Automated Genome Engineering”), ki temelji na večih ciklih tovrstne mutageneze in omogoča pripravo bakterisjkih sevov preko usmerjene evolucije[1].<br /> Tovrstnim namenom pogosto tudi služijo mestno-specifične rekombinaze, ki večinoma temeljijo na fagmen Cre/loxP ali kvasjem Flp/FRT sistemu. Cre in Flp sta rekombinazi, ki prepoznata 34 bp dolgo zaporedje DNA. Takšna zaporedja so vstavljena na 5’ in 3’ konce določenega gena in odvisno od njune orientacije omogočata rekombinazi izrez, oziroma delecijo (direktni ponovitvi) ali obrat (obrnjeni ponovitvi) željnega gena[1].<br /> Zadnje čase se pa vedno bolj uveljavlja sistem za urejanje DNA imenovann CRISPR/Cas9 (ang. “Clusterd Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/CRISPR assosiated (Cas) proteins”), ki izvira iz bakterijskega adaptivnega imunskega sistema. Poznamo tri različne CRISPR sisteme, ki se ločijo po številu potrebnih Cas proteinov. Najbolj uporaben je CRISPER/Cas9, saj za mestno specifični dvoverižni prelom DNA potrebuje le endonukleazo Cas9 in vodilno RNA[1].<br /> ==Od zgoraj navzdol ali ang.”top-down” pristop==<br /> Od zgoraj navzdol ali ang.”top-down” pristop je biotehnološko najbolj zanimiv in zajema postopno odstranjevanje nezaželjenih genov iz že obstoječega genoma. Takšen pristop se je v preteklosti že izkazal za uporabnega saj je izbitje ne-esencialnih genov privedlo do stabilnejšega genoma, hitrejše rasti, zmanjšanje sekrecijskega metaboloma in (najpomembnejše) sprostitev prekurzorkih molekul za industrisjsko zanimive biosintezne poti in posledično višjih titrov želenega metabolita. Vedno znova se pa je izkazalo, da je redukcija genoma možna samo za okoli 25%, in sicer pri Escherichia coli 15.3, B. subtilis 20.7, S. avermitilis 16.9-18.6 in Corinebacterium glutamicum 22%. Tovrstni pristopi usmerjene mutageneze za optimizacijo šasij so se iskazali za učinkovite tudi pri bakterijah rodu Streptomyces, vendar njihovo uporabnost omejuje pomankljivo poznavanja genetskih vezji prisotnih v produkcijskih organizmih, saj se je zaradi tega težko odločiti katere gene lahko izbijemo brez da vplivamo na sposobnost rasti in produkcije sekundarnih metabolitov[1]. <br /> Tukaj nastopi uporaba naključne mutageneze, saj ta ne potrebuje poznavanja vseh genetskih elementov, ampak temelji na selekciji mutant, ki ustrezajo zastavljenim kriterijem in pristop predstavlja nekakšno usmerjeno evolucijo. Pristop je bil že uporabljen za redukcijo genoma bakterije P. putida za 7.4% preko uporabe transpozonov z vstavljenim selekcijskim markerjem in FRT mestom, kar je omogočilo izrez segmenta genoma med dvema tovrstnima transpozicijskema elementa[1]. <br /> Zgoraj že omenjena metoda MAGE predstavlja vmesno pot, saj omogoča naključno mutagenezo natančno določenega segmenta genoma. Avtorji so tukaj preko specifičnih oligonukletidov v večih ciklih izvedeli naključno mutagenezo genov biosintezne poti za 1-deoksi-d-ksiloze-5-fosfata (DXP) in tako ustvarili sev, ki je imel petkrat višji titer DXP kot izvorni mikroorganizem[5]. <br /> ==Rod Streptomyces==<br /> Produkcija industrijsko zanimivih spojin pa potrebuje šasijo, ki poseduje primerno zalogo ustreznih metabolitov, saj te služijo kot njihovi prekurzorji. Bakterije rodu Streptomyces se ravno zaradi tega smatrajo kot idealni kandidati za pripravo optimiziranega ekspresijskega seva za kriptične biosintezne gene in operone, <br /> Prvi korak tovrsnega razvoja predstavljata priprava specializiranih ekspresijskih sevov S. avermitilis, za namene izražanja kriptičnih biosinteznih poti. Optimizacijo njenega genoma so dosegli preko odstranitve približno 1.4 Mb od 9.02 Mb wild-tipe genoma. Odstranili so bolj variabilne predele njenega genoma preko homologne in mestno specifične Cre/loxP rekombinacije in tako pripravili dva omembe vredna seva S. avermitilis SUKA17 in 22., ki imata genom reduciran za 17.9 in 18.5%, kar je preprečilo produkcijo endogenih sekundarnih metaboitov prisotnih v wilde-type sevu. Pomembno je tudi izpostaviti, da ti sevi niso izkazali počasnejše rasti kot izvorni wilde-type sev. Primernost tako pripravljenih sevov za heterologno ekspresijo biosinteznih poti so preverili preko izražanja biosinteznih poti za streptomicin, amicin C in pladienolid[6]. Prvi spojini sta antibiotika in druga je makrociklični lakton, ki izkazuje protitumorsko delovanje preko inhibicije zorenja mRNA[7]. Produkcija obeh antibiotikov je bila višja kot v izvornih organimih, proizvodnje pladienolida pa sprve niso opazili. Njegovo produkcijo so pa kasneje omogočili z uvedbo dodatne kopije zapisa za regulatorni protein PldR, ki je transkripcijski aktivator pladenoidnih biosinteznih genov[6]. <br /> Bolj ciljna optimizacija bakterije S. coelicolor M145 je bila izvedene z namenom zmanjšanja odtoka ogljika in dušika preko nativnih biosinteznih poti. Raziskovalci so izbili biosintezne gene za aktinorhodin, prodigin, CPK (ang.”cryptic type I polyketide syntetase”) in CDA (ang.”calcium-dependent antibiotic”), uvedli so tudi točkovne mutacije znotraj genov rpoB in rpsL, ki zapisujeta β podenoto RNA polimeraze in 30S ribosomalno podenoto[8]. Točkovne mutacije v teh genih, poleg antibiotične rezistence, povzročijo podoben odziv kot vezava ppGpp na ribosom. Povzročita indukcijo “odziva na težavne razmere” ali ang.”stringent response” in ta privede do aktivacije biosinteznih poti za sekundarne metabolite v rodu Streptomyces[9]. Tako so pleiotropno povišali kočne titre proizvedenih sekundarnih metabolitov, hipoteze so preverili preko vstavitve nativnega antihondrin biosinteznega operona in dveh biosinteznih poti za heterologno proukcijo kloramfenikola in kongocidina in pri vseh so opazili večjo produkcijo kot v izvornem sevu. Dodatna prednost uporabe produkcijkih sevov z reduciranim genomom je tudi lažja analiza proizvedenih spojin zaradi poenostavitve ekstracelularnega metabolitnega profila. Slednje je še posebej pomembno pri presejanju za industrijsko zanimive kriptične biosintezne operone in gene[8].<br /> ==“Od spodaj navzgor” (ang.”bottom-up”) pristop in naravno optimirani genomi==<br /> Od spodaj navzgor strategije predpostavljajo uporabo šasij, izdelanih de-novo za namen iskanja industrijsko zanimivih sekundarnih metabolitov. Tako zajemajo sestavo sintetičnih metabolnih poti, ki bi bile prirejena tako, da drastično zmanjšajo metabolno interferenco in preko tega bi lahko omogočil izdelavo polno ortolognega ekspresijskega sistema. Vendar so takšni cilji zaenkrat še neuresničljivi, saj je največji dosedanji uspeh na tem področju popolna sinteza genoma bakterije Mycoplasma mycoides in njegov prenos v celico M. capricolum, kateri je bil predhodno odstranjen lastni genom[1]. <br /> Naravno oprimiran genom pa bi lahko predstavljala bakterija Streptomyces albus J1074, saj je njen genom najmanjši znotraj tega rodu. Njegova velikost (~6.8 Mb) je posledica zmanjšanja števila genskih podvojitev, kar je dobro vodilo za optimiranje drugih predstavnikov tega rodu. Poleg majhnega genoma je ta bakterijska vrsta primerna kot šasija za iskanje industrijsko zanimivih sekundarnih metabolitov tudi zaradi relativno enostavne genetske manipulacije in je v preteklosti že bila uspešno uporabljena za produkcijo stefimicina, ferderikamicina in drugih industrijsko pomembnih spojin[1]. <br /> ==Viri==<br /> 1.Tiago Beites in Marta V. Mendes. Chassis optimization as acornerstone for the application of synthetic biology based strategies in microbial secondary metabolism. Frontiers in Microbiology (2015)<br /> <br /> 2.Marnix H. Medema, Kai Blin, Peter Cimermancic et al. antiSMASH: rapid identification, annotation and analysis of secondary metabolite biosynthesis gene clusters in bacterial and fungal genome sequences. Nucleic Acid Reserch (2011) <br /> <br /> 3.George Vernikos, Duccio Medini, David R Riley et al. Ten years of pan-genome analyses. Current Opinion in Microbiology (2015)<br /> <br /> 4.Bryan Swingle, Eric Markel, Nina Costantino, et al. Oligonucleotide recombination in Gram-negative bacteria. Molecular Microbiology (2010)<br /> <br /> 5.Harris H. Wang1, Farren J. Isaacs1, Peter A. Carr et al. Programming cells by multiplex genome engineering and accelerated evolution. Nature (2009)<br /> <br /> 6.Mamoru Komatsua, Takuma Uchiyamaa, Satoshi Omurab et al. Genome-minimized Streptomyces host for the heterologous expression of secondary metabolism. PNAS (2010)<br /> <br /> 7.Akira Yokoi, Yoshihiko Kotake, Kentaro Takahashi et al. Biological validation that SF3b is a target of the antitumormacrolide pladienolide. FEBS Journal (2011)<br /> <br /> 8.Juan Pablo Gomez-Escribano in Mervyn J. Bibb. Engineering Streptomyces coelicolor for heterologous expression of secondary metabolite gene clusters. Microbial Biotechnology (2011)<br /> <br /> 9.Haifeng Hu, Qin Zhang in Kozo Ochi. Activation of Antibiotic Biosynthesis by Specified Mutations in the rpoB Gene (Encoding the RNA Polymerase Subunit) of Streptomyces lividans. Journal of Bacteriology (2002)</div>

Jure Zabret https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Seminarji_SB_2015/16&diff=11042 2016-01-02T17:46:14Z

<p>Jure Zabret: </p> <hr /> <div>Seminarji iz Sintezne biologije v študijskem letu 2015/16 so:<br /> <br /> Vir: knjiga [http://journal.frontiersin.org/researchtopic/2866/synthetic-biology-engineering-complexity-and-refactoring-cell-capabilities SYNTHETIC BIOLOGY: ENGINEERING COMPLEXITY AND REFACTORING CELL CAPABILITIES]<br /> <br /> * Production of fatty acid-derived valuable chemicals in synthetic microbes ([[Proizvodnja kemikalij iz derivatov maščobnih kislin s pomočjo sintetičnih mikroorganizmov]]) (Maja Grdadolnik)&lt;br&gt;<br /> * Optimization of the IPP precursor supply for the production of lycopene, decaprenoxanthin and astaxanthin by Corynebacterium glutamicum ([[Optimizacija sinteze IPP kot prekursorja za produkcijo likopena, dekaprenoksantina in astaksantina v Corynebacterium glutamicum]]) (Griša Prinčič)&lt;br&gt;<br /> * Engineering sugar utilization and microbial tolerance toward lignocellulose conversion [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Konverzija_lignoceluloze_s_pomočjo_izkoriščanja_mikrobne_tolerance_in_inženiringa_sladkorjev] (Kim Potočnik) &lt;br&gt;<br /> * Cofactor engineering for enhancing the flux of metabolic pathways [[INŽENIRING KOFAKTORJEV ZA IZBOLJŠANJE METABOLIČNIH POTI]] (Nastja Štemberger)&lt;br&gt;<br /> * [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4354409/ Can the natural diversity of quorum-sensing advance synthetic biology?] ([[Ali lahko naravna diverziteta quorum sensinga pripomore k napredku v sintezni biologiji?]]) (Tina Snoj)&lt;br&gt;<br /> * [http://journal.frontiersin.org/article/10.3389/fbioe.2015.00093/full Signal-to-noise ratio measures efficacy of biological computing devices and circuits] ([[Določanje učinkovitosti bioloških naprav in vezij z razmerjem signal-šum]]) (Jakob G. Lavrenčič)&lt;br&gt;<br /> * A sense of balance: experimental investigation and modeling of a malonyl-CoA sensor in Escherichia coli ([[Senzor za malonil-CoA v bakteriji Escherichia coli]]) (Ajda Rojc)&lt;br&gt;<br /> * [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4211546/ New transposon tools tailored for metabolic engineering of Gram-negative microbial cell factories] ([[Metabolični inženiring gram-negativnih bakterij s transpozonskim sistemom]]) (Rok Razpotnik)&lt;br&gt;<br /> <br /> <br /> Vir: knjiga [http://journal.frontiersin.org/researchtopic/455/synthetic-biology-applications-in-industrial-microbiology SYNTHETIC BIOLOGY APPLICATIONS IN INDUSTRIAL MICROBIOLOGY]<br /> <br /> * Recent Progress in Synthetic Biology for Microbial Production of C3–C10 Alcohols (Urška Rauter) ([[Napredki v sintezni biologiji pri proizvodnji C3-C10 alkoholov v mikroorganizmih]])<br /> * Visualizing Evolution in Real-Time Method for Strain Engineering ([[Vizualizacija evolucije v realnem času – metoda za sevno inženirstvo]]) (Samo Zakotnik)<br /> * [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3367458/ Engineering Microbial Consortia to Enhance Biomining and Bioremediation] ([[Načrtovanje mikrobnih konzorcijev za izboljšanje biorudarstva in bioremediacije]]) (Maja Kostanjevec)<br /> * Engineering Microbial Chemical Factories to Produce Renewable “Biomonomers” ([[Mikrobiološka proizvodnja obnovljivih biomonomerov in bioplastike]])(Nastja Pirman)<br /> * Application of Synthetic Biology in Cyanobacteria and Algae (Špela Tomaž)<br /> * Synthetic Feedback Loop Model for Increasing Microbial Biofuel Production Using a Biosensor (Jernej Pušnik)<br /> * Balance of XYL1 and XYL2 Expression in Different Yeast Chassis for Improved xylose Fermentation (Monika Praznik)<br /> * [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3630320/ Design and Development of Synthetic Microbial Platform Cells for Bioenergy] (Erik Mršnik)<br /> * [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3616241/ Microbial Production of Isoprenoids Enabled by Synthetic Biology] ([[Mikrobna produkcija izoprenoidov s sintezno biologijo]]) (Dominik Kert) <br /> * Chemical synthetic biology: a mini-review ([[Kratki predogled kemijske sintezne biologije]]) (Anka Hotko)<br /> <br /> <br /> Seminarji iz preglednih člankov:<br /> <br /> * Towards engineering biological systems in a broader context (Aleksander Benčič)<br /> * Synthetic biology: Novel approaches for microbiology (Daša Janeš)<br /> * Tools and principles for microbial gene circuit engineering (Marko Radojković)<br /> * Sensitive cells: enabling tools for static and dynamic control of microbial metabolic pathways (Katja Leben)<br /> * Chassis optimization as a cornerstone for the application of synthetic biology based strategies in microbial secondary metabolism ([[Oprimizacija šasij kot osnovni korak pri uporabi sintezno biološkega pristopa pri karakterizaciji mikrobnega sekundarnega metabolizma]]) (Jure Zabret)<br /> * Recent advances and opportunities in synthetic logic gates engineering in living cells (Monika Biasizzo)<br /> * Programmable genetic circuits for pathway engineering (Urban Javoršek)<br /> * Better together: engineering and application of microbial symbioses (Nejc Petrišič)<br /> * Synthetic biology for microbial production of lipid-based biofuels (Urška Pevec)<br /> * Engineering Biosynthesis Mechanisms for Diversifying Polyhydroxyalkanoates (Mojca Banič)<br /> * Synthetic biology of fungal natural products (Estera Merljak)<br /> * Synthetic biology and biomimetic chemistry as converging technologies fostering a new generation of smart biosensors (Benjamin Bajželj)<br /> * How Synthetic Biology Would Reconsider Natural Bioluminescence and its Application (Ana Grom &amp; Ana Unkovič)<br /> * Synthetic Biology-Toward Therapeutic Solutions (Tanja Korpar)<br /> * Synthetically modified mRNA for efficient and fast human iPS cell generation and direct transdifferentiation to myoblasts (Mirjana Malnar)<br /> * Mammalian synthetic biology: emerging medical applications (Maša Mirkovič)<br /> * Synthetic biology devices and circuits for RNA-based ‘smart vaccines’: a propositional review (Monika Škrjanc)</div>

Jure Zabret https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=User:Jure_Zabret&diff=11041 2016-01-02T17:41:03Z

<p>Jure Zabret: </p> <hr /> <div>==Uvod==<br /> Zadnjo stoletje so bili mikrobni sekundarni metaboliti pogosto vir pri odkrivanju novih vodilnih spojin za nadaljnji razvoj v farmacevtske učinkovine, vendar se število na ta način odkritih vodilnih spojin iz leta v leto manjša. Nasprotno temu pa je razvoj tehnologij visoko zmogljivostnega sekvenciranja in sočasen pojav programskih orodji za in-silico iskanje hipotetičnih biosinteznih genov in poti oziroma operonov. Eden izmed najodmevnejših je antiSMASH (ang. ”antibiotics &amp; Secondary Metabolite Analysis Shell)[2], ki omogoča (meta)genomske raziskave, ki lahko privedejo do odkritja novih (hipotetičnih)biosinteznih genov in operonov. <br /> Vendar se je pojavila težava, da večina teh se ne izraža pod laboratorijskimi pogoji, zato so raziskovalci takšne operone in gene, ki jih sestavljajo poimenovali tihi ali kriptični genski skupki (ang. “silent or cryptic gene clusters”). Tukaj se je bakterijski rod Actinobacteria izkazal za še posebej bogatega, vendar je ta pristop tudi pokazal nadaljnji potencial, ze te namene že izrabljenega, rodu Streptomyces. Posebej obetajoč je pristop heterologne ekspresije kriptičnih genskih skupkov v šasijah, ki bile prirejene prav za tovrstne namene[1]. <br /> Prvi korak pri optimizaciji šasije je poenostavitev njenega genoma. Ta bi zavzemala odstranitev nepotrebnih biosinteznih in metabolnih poti, čigar namen je zagotoviti nemoteno delovanje vnesenih genetskih naprav, oziroma biosinteznih genov ali celotnih operonov. Zadnje desetletje je preko genomskih in metagenomskih raziskav pokazalo enormno zapletenost delovanja bakterijske celice predvsem zaradi nepoznavanja mehanizmov, ki regulirajo v njej prisotna genetska vezja. Slednje za sintezno biologijo pogosto predstavlja problem, saj je v nepoznanih šasijah interakcija z vzneseno napravo pogosto neizogibna[1]. Tukaj je tudi potrebno omeniti koncept osrednjega genoma (ang.”core genome”), ki predstavlja skupino genov, ki so nepogrešljivi za delovanje določenega klada in njegovim predstavnikom daje fiziološke in morfološke značilnosti[3]. Čeprav je osredji genom dobro izhodišče za zagotavljaje ortolognosti ekspresijskih sistemov, se pri šasijah, namenjenih iskanju ekonomsko zanimivih sekundarnih metabolitov, koncept osrednjega genoma izkaže za neuporabnega. Biosintezne poti, oziroma koraki znotraj teh, potrebujejo določene prekurzorke spojine, katerih samo osrednji genom ne more zagotoviti. Torej so za iskanje novih ekonomsko zanimivih sekundarnih metabolitov bolj primerne šasije z reduciranim kot pa osrednjim genomom[1].<br /> ==Orodja za urejanje genoma==<br /> Priprava šasije z reduciranim genomom zajema obširno urejanje genoma izvornega organizma. Metode, ki to omogočajo pogosto temeljijo na homologni rekombinaciji preko organizmu lastnih ali tujih rekombinaz. Med slednjihmi sistemi se najpogosteje uporablja λRED rekombinacijski sistem in njihova prednost leži v večji učinkovitost rekombinacije[3]. <br /> Možna je pa tudi rekombinacija brez uporabe rekombinaze, ki temelji na delovanju DNA polimeraze. Tukaj se v gram negativne bakterije vnese med 20 in 120 bp dolge sintetične enoverižne olilgonukleotide, ki so komplementarni želenemu predelu genoma ampak nosijo točkovno mutacijo ali privedejo do delecije predela gena. Te se vstavijo v DNA med njenim podvojevanjem in sicer v obliki okazakijevaih fragmentov[4]. Razširitev tega pristopa je metoda MAGE (ang. “Multiplex Automated Genome Engineering”), ki temelji na večih ciklih tovrstne mutageneze in omogoča pripravo bakterisjkih sevov preko usmerjene evolucije[1].<br /> Tovrstnim namenom pogosto tudi služijo mestno-specifične rekombinaze, ki večinoma temeljijo na fagmen Cre/loxP ali kvasjem Flp/FRT sistemu. Cre in Flp sta rekombinazi, ki prepoznata 34 bp dolgo zaporedje DNA. Takšna zaporedja so vstavljena na 5’ in 3’ konce določenega gena in odvisno od njune orientacije omogočata rekombinazi izrez, oziroma delecijo (direktni ponovitvi) ali obrat (obrnjeni ponovitvi) željnega gena[1].<br /> Zadnje čase se pa vedno bolj uveljavlja sistem za urejanje DNA imenovann CRISPR/Cas9 (ang. “Clusterd Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/CRISPR assosiated (Cas) proteins”), ki izvira iz bakterijskega adaptivnega imunskega sistema. Poznamo tri različne CRISPR sisteme, ki se ločijo po številu potrebnih Cas proteinov. Najbolj uporaben je CRISPER/Cas9, saj za mestno specifični dvoverižni prelom DNA potrebuje le endonukleazo Cas9 in vodilno RNA[1].<br /> ==Od zgoraj navzdol ali ang.”top-down” pristop==<br /> Od zgoraj navzdol ali ang.”top-down” pristop je biotehnološko najbolj zanimiv in zajema postopno odstranjevanje nezaželjenih genov iz že obstoječega genoma. Takšen pristop se je v preteklosti že izkazal za uporabnega saj je izbitje ne-esencialnih genov privedlo do stabilnejšega genoma, hitrejše rasti, zmanjšanje sekrecijskega metaboloma in (najpomembnejše) sprostitev prekurzorkih molekul za industrisjsko zanimive biosintezne poti in posledično višjih titrov želenega metabolita. Vedno znova se pa je izkazalo, da je redukcija genoma možna samo za okoli 25%, in sicer pri Escherichia coli 15.3, B. subtilis 20.7, S. avermitilis 16.9-18.6 in Corinebacterium glutamicum 22%. Tovrstni pristopi usmerjene mutageneze za optimizacijo šasij so se iskazali za učinkovite tudi pri bakterijah rodu Streptomyces, vendar njihovo uporabnost omejuje pomankljivo poznavanja genetskih vezji prisotnih v produkcijskih organizmih, saj se je zaradi tega težko odločiti katere gene lahko izbijemo brez da vplivamo na sposobnost rasti in produkcije sekundarnih metabolitov[1]. <br /> Tukaj nastopi uporaba naključne mutageneze, saj ta ne potrebuje poznavanja vseh genetskih elementov, ampak temelji na selekciji mutant, ki ustrezajo zastavljenim kriterijem in pristop predstavlja nekakšno usmerjeno evolucijo. Pristop je bil že uporabljen za redukcijo genoma bakterije P. putida za 7.4% preko uporabe transpozonov z vstavljenim selekcijskim markerjem in FRT mestom, kar je omogočilo izrez segmenta genoma med dvema tovrstnima transpozicijskema elementa[1]. <br /> Zgoraj že omenjena metoda MAGE predstavlja vmesno pot, saj omogoča naključno mutagenezo natančno določenega segmenta genoma. Avtorji so tukaj preko specifičnih oligonukletidov v večih ciklih izvedeli naključno mutagenezo genov biosintezne poti za 1-deoksi-d-ksiloze-5-fosfata (DXP) in tako ustvarili sev, ki je imel petkrat višji titer DXP kot izvorni mikroorganizem[5]. <br /> ==Rod Streptomyces==<br /> Produkcija industrijsko zanimivih spojin pa potrebuje šasijo, ki poseduje primerno zalogo ustreznih metabolitov, saj te služijo kot njihovi prekurzorji. Bakterije rodu Streptomyces se ravno zaradi tega smatrajo kot idealni kandidati za pripravo optimiziranega ekspresijskega seva za kriptične biosintezne gene in operone, <br /> Prvi korak tovrsnega razvoja predstavljata priprava specializiranih ekspresijskih sevov S. avermitilis, za namene izražanja kriptičnih biosinteznih poti. Optimizacijo njenega genoma so dosegli preko odstranitve približno 1.4 Mb od 9.02 Mb wild-tipe genoma. Odstranili so bolj variabilne predele njenega genoma preko homologne in mestno specifične Cre/loxP rekombinacije in tako pripravili dva omembe vredna seva S. avermitilis SUKA17 in 22., ki imata genom reduciran za 17.9 in 18.5%, kar je preprečilo produkcijo endogenih sekundarnih metaboitov prisotnih v wilde-type sevu. Pomembno je tudi izpostaviti, da ti sevi niso izkazali počasnejše rasti kot izvorni wilde-type sev. Primernost tako pripravljenih sevov za heterologno ekspresijo biosinteznih poti so preverili preko izražanja biosinteznih poti za streptomicin, amicin C in pladienolid[6]. Prvi spojini sta antibiotika in druga je makrociklični lakton, ki izkazuje protitumorsko delovanje preko inhibicije zorenja mRNA[7]. Produkcija obeh antibiotikov je bila višja kot v izvornih organimih, proizvodnje pladienolida pa sprve niso opazili. Njegovo produkcijo so pa kasneje omogočili z uvedbo dodatne kopije zapisa za regulatorni protein PldR, ki je transkripcijski aktivator pladenoidnih biosinteznih genov[6]. <br /> Bolj ciljna optimizacija bakterije S. coelicolor M145 je bila izvedene z namenom zmanjšanja odtoka ogljika in dušika preko nativnih biosinteznih poti. Raziskovalci so izbili biosintezne gene za aktinorhodin, prodigin, CPK (ang.”cryptic type I polyketide syntetase”) in CDA (ang.”calcium-dependent antibiotic”), uvedli so tudi točkovne mutacije znotraj genov rpoB in rpsL, ki zapisujeta β podenoto RNA polimeraze in 30S ribosomalno podenoto[8]. Točkovne mutacije v teh genih, poleg antibiotične rezistence, povzročijo podoben odziv kot vezava ppGpp na ribosom. Povzročita indukcijo “odziva na težavne razmere” ali ang.”stringent response” in ta privede do aktivacije biosinteznih poti za sekundarne metabolite v rodu Streptomyces[9]. Tako so pleiotropno povišali kočne titre proizvedenih sekundarnih metabolitov, hipoteze so preverili preko vstavitve nativnega antihondrin biosinteznega operona in dveh biosinteznih poti za heterologno proukcijo kloramfenikola in kongocidina in pri vseh so opazili večjo produkcijo kot v izvornem sevu. Dodatna prednost uporabe produkcijkih sevov z reduciranim genomom je tudi lažja analiza proizvedenih spojin zaradi poenostavitve ekstracelularnega metabolitnega profila. Slednje je še posebej pomembno pri presejanju za industrijsko zanimive kriptične biosintezne operone in gene[8].<br /> ==“Od spodaj navzgor” (ang.”bottom-up”) pristop in naravno optimirani genomi==<br /> Od spodaj navzgor strategije predpostavljajo uporabo šasij, izdelanih de-novo za namen iskanja industrijsko zanimivih sekundarnih metabolitov. Tako zajemajo sestavo sintetičnih metabolnih poti, ki bi bile prirejena tako, da drastično zmanjšajo metabolno interferenco in preko tega bi lahko omogočil izdelavo polno ortolognega ekspresijskega sistema. Vendar so takšni cilji zaenkrat še neuresničljivi, saj je največji dosedanji uspeh na tem področju popolna sinteza genoma bakterije Mycoplasma mycoides in njegov prenos v celico M. capricolum, kateri je bil predhodno odstranjen lastni genom[1]. <br /> Naravno oprimiran genom pa bi lahko predstavljala bakterija Streptomyces albus J1074, saj je njen genom najmanjši znotraj tega rodu. Njegova velikost (~6.8 Mb) je posledica zmanjšanja števila genskih podvojitev, kar je dobro vodilo za optimiranje drugih predstavnikov tega rodu. Poleg majhnega genoma je ta bakterijska vrsta primerna kot šasija za iskanje industrijsko zanimivih sekundarnih metabolitov tudi zaradi relativno enostavne genetske manipulacije in je v preteklosti že bila uspešno uporabljena za produkcijo stefimicina, ferderikamicina in drugih industrijsko pomembnih spojin[1]. <br /> ==Viri==<br /> 1.Tiago Beites in Marta V. Mendes. Chassis optimization as acornerstone for the application of synthetic biology based strategies in microbial secondary metabolism. Frontiers in Microbiology (2015)<br /> <br /> 2.Marnix H. Medema, Kai Blin, Peter Cimermancic et al. antiSMASH: rapid identification, annotation and analysis of secondary metabolite biosynthesis gene clusters in bacterial and fungal genome sequences. Nucleic Acid Reserch (2011) <br /> <br /> 3.George Vernikos, Duccio Medini, David R Riley et al. Ten years of pan-genome analyses. Current Opinion in Microbiology (2015)<br /> <br /> 4.Bryan Swingle, Eric Markel, Nina Costantino, et al. Oligonucleotide recombination in Gram-negative bacteria. Molecular Microbiology (2010)<br /> <br /> 5.Harris H. Wang1, Farren J. Isaacs1, Peter A. Carr et al. Programming cells by multiplex genome engineering and accelerated evolution. Nature (2009)<br /> <br /> 6.Mamoru Komatsua, Takuma Uchiyamaa, Satoshi Omurab et al. Genome-minimized Streptomyces host for the heterologous expression of secondary metabolism. PNAS (2010)<br /> <br /> 7.Akira Yokoi, Yoshihiko Kotake, Kentaro Takahashi et al. Biological validation that SF3b is a target of the antitumormacrolide pladienolide. FEBS Journal (2011)<br /> <br /> 8.Juan Pablo Gomez-Escribano in Mervyn J. Bibb. Engineering Streptomyces coelicolor for heterologous expression of secondary metabolite gene clusters. Microbial Biotechnology (2011)<br /> <br /> 9.Haifeng Hu, Qin Zhang in Kozo Ochi. Activation of Antibiotic Biosynthesis by Specified Mutations in the rpoB Gene (Encoding the RNA Polymerase Subunit) of Streptomyces lividans. Journal of Bacteriology (2002)</div>

Jure Zabret https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=User:Jure_Zabret&diff=11040 2016-01-02T17:40:04Z

<p>Jure Zabret: </p> <hr /> <div>Zadnjo stoletje so bili mikrobni sekundarni metaboliti pogosto vir pri odkrivanju novih vodilnih spojin za nadaljnji razvoj v farmacevtske učinkovine, vendar se število na ta način odkritih vodilnih spojin iz leta v leto manjša. Nasprotno temu pa je razvoj tehnologij visoko zmogljivostnega sekvenciranja in sočasen pojav programskih orodji za in-silico iskanje hipotetičnih biosinteznih genov in poti oziroma operonov. Eden izmed najodmevnejših je antiSMASH (ang. ”antibiotics &amp; Secondary Metabolite Analysis Shell)[2], ki omogoča (meta)genomske raziskave, ki lahko privedejo do odkritja novih (hipotetičnih)biosinteznih genov in operonov. <br /> Vendar se je pojavila težava, da večina teh se ne izraža pod laboratorijskimi pogoji, zato so raziskovalci takšne operone in gene, ki jih sestavljajo poimenovali tihi ali kriptični genski skupki (ang. “silent or cryptic gene clusters”). Tukaj se je bakterijski rod Actinobacteria izkazal za še posebej bogatega, vendar je ta pristop tudi pokazal nadaljnji potencial, ze te namene že izrabljenega, rodu Streptomyces. Posebej obetajoč je pristop heterologne ekspresije kriptičnih genskih skupkov v šasijah, ki bile prirejene prav za tovrstne namene[1]. <br /> Prvi korak pri optimizaciji šasije je poenostavitev njenega genoma. Ta bi zavzemala odstranitev nepotrebnih biosinteznih in metabolnih poti, čigar namen je zagotoviti nemoteno delovanje vnesenih genetskih naprav, oziroma biosinteznih genov ali celotnih operonov. Zadnje desetletje je preko genomskih in metagenomskih raziskav pokazalo enormno zapletenost delovanja bakterijske celice predvsem zaradi nepoznavanja mehanizmov, ki regulirajo v njej prisotna genetska vezja. Slednje za sintezno biologijo pogosto predstavlja problem, saj je v nepoznanih šasijah interakcija z vzneseno napravo pogosto neizogibna[1]. Tukaj je tudi potrebno omeniti koncept osrednjega genoma (ang.”core genome”), ki predstavlja skupino genov, ki so nepogrešljivi za delovanje določenega klada in njegovim predstavnikom daje fiziološke in morfološke značilnosti[3]. Čeprav je osredji genom dobro izhodišče za zagotavljaje ortolognosti ekspresijskih sistemov, se pri šasijah, namenjenih iskanju ekonomsko zanimivih sekundarnih metabolitov, koncept osrednjega genoma izkaže za neuporabnega. Biosintezne poti, oziroma koraki znotraj teh, potrebujejo določene prekurzorke spojine, katerih samo osrednji genom ne more zagotoviti. Torej so za iskanje novih ekonomsko zanimivih sekundarnih metabolitov bolj primerne šasije z reduciranim kot pa osrednjim genomom[1].<br /> ==Orodja za urejanje genoma==<br /> Priprava šasije z reduciranim genomom zajema obširno urejanje genoma izvornega organizma. Metode, ki to omogočajo pogosto temeljijo na homologni rekombinaciji preko organizmu lastnih ali tujih rekombinaz. Med slednjihmi sistemi se najpogosteje uporablja λRED rekombinacijski sistem in njihova prednost leži v večji učinkovitost rekombinacije[3]. <br /> Možna je pa tudi rekombinacija brez uporabe rekombinaze, ki temelji na delovanju DNA polimeraze. Tukaj se v gram negativne bakterije vnese med 20 in 120 bp dolge sintetične enoverižne olilgonukleotide, ki so komplementarni želenemu predelu genoma ampak nosijo točkovno mutacijo ali privedejo do delecije predela gena. Te se vstavijo v DNA med njenim podvojevanjem in sicer v obliki okazakijevaih fragmentov[4]. Razširitev tega pristopa je metoda MAGE (ang. “Multiplex Automated Genome Engineering”), ki temelji na večih ciklih tovrstne mutageneze in omogoča pripravo bakterisjkih sevov preko usmerjene evolucije[1].<br /> Tovrstnim namenom pogosto tudi služijo mestno-specifične rekombinaze, ki večinoma temeljijo na fagmen Cre/loxP ali kvasjem Flp/FRT sistemu. Cre in Flp sta rekombinazi, ki prepoznata 34 bp dolgo zaporedje DNA. Takšna zaporedja so vstavljena na 5’ in 3’ konce določenega gena in odvisno od njune orientacije omogočata rekombinazi izrez, oziroma delecijo (direktni ponovitvi) ali obrat (obrnjeni ponovitvi) željnega gena[1].<br /> Zadnje čase se pa vedno bolj uveljavlja sistem za urejanje DNA imenovann CRISPR/Cas9 (ang. “Clusterd Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/CRISPR assosiated (Cas) proteins”), ki izvira iz bakterijskega adaptivnega imunskega sistema. Poznamo tri različne CRISPR sisteme, ki se ločijo po številu potrebnih Cas proteinov. Najbolj uporaben je CRISPER/Cas9, saj za mestno specifični dvoverižni prelom DNA potrebuje le endonukleazo Cas9 in vodilno RNA[1].<br /> ==Od zgoraj navzdol ali ang.”top-down” pristop==<br /> Od zgoraj navzdol ali ang.”top-down” pristop je biotehnološko najbolj zanimiv in zajema postopno odstranjevanje nezaželjenih genov iz že obstoječega genoma. Takšen pristop se je v preteklosti že izkazal za uporabnega saj je izbitje ne-esencialnih genov privedlo do stabilnejšega genoma, hitrejše rasti, zmanjšanje sekrecijskega metaboloma in (najpomembnejše) sprostitev prekurzorkih molekul za industrisjsko zanimive biosintezne poti in posledično višjih titrov želenega metabolita. Vedno znova se pa je izkazalo, da je redukcija genoma možna samo za okoli 25%, in sicer pri Escherichia coli 15.3, B. subtilis 20.7, S. avermitilis 16.9-18.6 in Corinebacterium glutamicum 22%. Tovrstni pristopi usmerjene mutageneze za optimizacijo šasij so se iskazali za učinkovite tudi pri bakterijah rodu Streptomyces, vendar njihovo uporabnost omejuje pomankljivo poznavanja genetskih vezji prisotnih v produkcijskih organizmih, saj se je zaradi tega težko odločiti katere gene lahko izbijemo brez da vplivamo na sposobnost rasti in produkcije sekundarnih metabolitov[1]. <br /> Tukaj nastopi uporaba naključne mutageneze, saj ta ne potrebuje poznavanja vseh genetskih elementov, ampak temelji na selekciji mutant, ki ustrezajo zastavljenim kriterijem in pristop predstavlja nekakšno usmerjeno evolucijo. Pristop je bil že uporabljen za redukcijo genoma bakterije P. putida za 7.4% preko uporabe transpozonov z vstavljenim selekcijskim markerjem in FRT mestom, kar je omogočilo izrez segmenta genoma med dvema tovrstnima transpozicijskema elementa[1]. <br /> Zgoraj že omenjena metoda MAGE predstavlja vmesno pot, saj omogoča naključno mutagenezo natančno določenega segmenta genoma. Avtorji so tukaj preko specifičnih oligonukletidov v večih ciklih izvedeli naključno mutagenezo genov biosintezne poti za 1-deoksi-d-ksiloze-5-fosfata (DXP) in tako ustvarili sev, ki je imel petkrat višji titer DXP kot izvorni mikroorganizem[5]. <br /> ==Rod Streptomyces==<br /> Produkcija industrijsko zanimivih spojin pa potrebuje šasijo, ki poseduje primerno zalogo ustreznih metabolitov, saj te služijo kot njihovi prekurzorji. Bakterije rodu Streptomyces se ravno zaradi tega smatrajo kot idealni kandidati za pripravo optimiziranega ekspresijskega seva za kriptične biosintezne gene in operone, <br /> Prvi korak tovrsnega razvoja predstavljata priprava specializiranih ekspresijskih sevov S. avermitilis, za namene izražanja kriptičnih biosinteznih poti. Optimizacijo njenega genoma so dosegli preko odstranitve približno 1.4 Mb od 9.02 Mb wild-tipe genoma. Odstranili so bolj variabilne predele njenega genoma preko homologne in mestno specifične Cre/loxP rekombinacije in tako pripravili dva omembe vredna seva S. avermitilis SUKA17 in 22., ki imata genom reduciran za 17.9 in 18.5%, kar je preprečilo produkcijo endogenih sekundarnih metaboitov prisotnih v wilde-type sevu. Pomembno je tudi izpostaviti, da ti sevi niso izkazali počasnejše rasti kot izvorni wilde-type sev. Primernost tako pripravljenih sevov za heterologno ekspresijo biosinteznih poti so preverili preko izražanja biosinteznih poti za streptomicin, amicin C in pladienolid[6]. Prvi spojini sta antibiotika in druga je makrociklični lakton, ki izkazuje protitumorsko delovanje preko inhibicije zorenja mRNA[7]. Produkcija obeh antibiotikov je bila višja kot v izvornih organimih, proizvodnje pladienolida pa sprve niso opazili. Njegovo produkcijo so pa kasneje omogočili z uvedbo dodatne kopije zapisa za regulatorni protein PldR, ki je transkripcijski aktivator pladenoidnih biosinteznih genov[6]. <br /> Bolj ciljna optimizacija bakterije S. coelicolor M145 je bila izvedene z namenom zmanjšanja odtoka ogljika in dušika preko nativnih biosinteznih poti. Raziskovalci so izbili biosintezne gene za aktinorhodin, prodigin, CPK (ang.”cryptic type I polyketide syntetase”) in CDA (ang.”calcium-dependent antibiotic”), uvedli so tudi točkovne mutacije znotraj genov rpoB in rpsL, ki zapisujeta β podenoto RNA polimeraze in 30S ribosomalno podenoto[8]. Točkovne mutacije v teh genih, poleg antibiotične rezistence, povzročijo podoben odziv kot vezava ppGpp na ribosom. Povzročita indukcijo “odziva na težavne razmere” ali ang.”stringent response” in ta privede do aktivacije biosinteznih poti za sekundarne metabolite v rodu Streptomyces[9]. Tako so pleiotropno povišali kočne titre proizvedenih sekundarnih metabolitov, hipoteze so preverili preko vstavitve nativnega antihondrin biosinteznega operona in dveh biosinteznih poti za heterologno proukcijo kloramfenikola in kongocidina in pri vseh so opazili večjo produkcijo kot v izvornem sevu. Dodatna prednost uporabe produkcijkih sevov z reduciranim genomom je tudi lažja analiza proizvedenih spojin zaradi poenostavitve ekstracelularnega metabolitnega profila. Slednje je še posebej pomembno pri presejanju za industrijsko zanimive kriptične biosintezne operone in gene[8].<br /> ==“Od spodaj navzgor” (ang.”bottom-up”) pristop in naravno optimirani genomi==<br /> Od spodaj navzgor strategije predpostavljajo uporabo šasij, izdelanih de-novo za namen iskanja industrijsko zanimivih sekundarnih metabolitov. Tako zajemajo sestavo sintetičnih metabolnih poti, ki bi bile prirejena tako, da drastično zmanjšajo metabolno interferenco in preko tega bi lahko omogočil izdelavo polno ortolognega ekspresijskega sistema. Vendar so takšni cilji zaenkrat še neuresničljivi, saj je največji dosedanji uspeh na tem področju popolna sinteza genoma bakterije Mycoplasma mycoides in njegov prenos v celico M. capricolum, kateri je bil predhodno odstranjen lastni genom[1]. <br /> Naravno oprimiran genom pa bi lahko predstavljala bakterija Streptomyces albus J1074, saj je njen genom najmanjši znotraj tega rodu. Njegova velikost (~6.8 Mb) je posledica zmanjšanja števila genskih podvojitev, kar je dobro vodilo za optimiranje drugih predstavnikov tega rodu. Poleg majhnega genoma je ta bakterijska vrsta primerna kot šasija za iskanje industrijsko zanimivih sekundarnih metabolitov tudi zaradi relativno enostavne genetske manipulacije in je v preteklosti že bila uspešno uporabljena za produkcijo stefimicina, ferderikamicina in drugih industrijsko pomembnih spojin[1]. <br /> ==Viri==<br /> 1.Tiago Beites in Marta V. Mendes. Chassis optimization as acornerstone for the application of synthetic biology based strategies in microbial secondary metabolism. Frontiers in Microbiology (2015)<br /> <br /> 2.Marnix H. Medema, Kai Blin, Peter Cimermancic et al. antiSMASH: rapid identification, annotation and analysis of secondary metabolite biosynthesis gene clusters in bacterial and fungal genome sequences. Nucleic Acid Reserch (2011) <br /> <br /> 3.George Vernikos, Duccio Medini, David R Riley et al. Ten years of pan-genome analyses. Current Opinion in Microbiology (2015)<br /> <br /> 4.Bryan Swingle, Eric Markel, Nina Costantino, et al. Oligonucleotide recombination in Gram-negative bacteria. Molecular Microbiology (2010)<br /> <br /> 5.Harris H. Wang1, Farren J. Isaacs1, Peter A. Carr et al. Programming cells by multiplex genome engineering and accelerated evolution. Nature (2009)<br /> <br /> 6.Mamoru Komatsua, Takuma Uchiyamaa, Satoshi Omurab et al. Genome-minimized Streptomyces host for the heterologous expression of secondary metabolism. PNAS (2010)<br /> <br /> 7.Akira Yokoi, Yoshihiko Kotake, Kentaro Takahashi et al. Biological validation that SF3b is a target of the antitumormacrolide pladienolide. FEBS Journal (2011)<br /> <br /> 8.Juan Pablo Gomez-Escribano in Mervyn J. Bibb. Engineering Streptomyces coelicolor for heterologous expression of secondary metabolite gene clusters. Microbial Biotechnology (2011)<br /> <br /> 9.Haifeng Hu, Qin Zhang in Kozo Ochi. Activation of Antibiotic Biosynthesis by Specified Mutations in the rpoB Gene (Encoding the RNA Polymerase Subunit) of Streptomyces lividans. Journal of Bacteriology (2002)</div>

Jure Zabret https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=User:Jure_Zabret&diff=11039 2016-01-02T17:38:51Z

<p>Jure Zabret: New page: Zadnjo stoletje so bili mikrobni sekundarni metaboliti pogosto vir pri odkrivanju novih vodilnih spojin za nadaljnji razvoj v farmacevtske učinkovine, vendar se število na ta način odkr...</p> <hr /> <div>Zadnjo stoletje so bili mikrobni sekundarni metaboliti pogosto vir pri odkrivanju novih vodilnih spojin za nadaljnji razvoj v farmacevtske učinkovine, vendar se število na ta način odkritih vodilnih spojin iz leta v leto manjša. Nasprotno temu pa je razvoj tehnologij visoko zmogljivostnega sekvenciranja in sočasen pojav programskih orodji za in-silico iskanje hipotetičnih biosinteznih genov in poti oziroma operonov. Eden izmed najodmevnejših je antiSMASH (ang. ”antibiotics &amp; Secondary Metabolite Analysis Shell)[2], ki omogoča (meta)genomske raziskave, ki lahko privedejo do odkritja novih (hipotetičnih)biosinteznih genov in operonov. <br /> Vendar se je pojavila težava, da večina teh se ne izraža pod laboratorijskimi pogoji, zato so raziskovalci takšne operone in gene, ki jih sestavljajo poimenovali tihi ali kriptični genski skupki (ang. “silent or cryptic gene clusters”). Tukaj se je bakterijski rod Actinobacteria izkazal za še posebej bogatega, vendar je ta pristop tudi pokazal nadaljnji potencial, ze te namene že izrabljenega, rodu Streptomyces. Posebej obetajoč je pristop heterologne ekspresije kriptičnih genskih skupkov v šasijah, ki bile prirejene prav za tovrstne namene[1]. <br /> Prvi korak pri optimizaciji šasije je poenostavitev njenega genoma. Ta bi zavzemala odstranitev nepotrebnih biosinteznih in metabolnih poti, čigar namen je zagotoviti nemoteno delovanje vnesenih genetskih naprav, oziroma biosinteznih genov ali celotnih operonov. Zadnje desetletje je preko genomskih in metagenomskih raziskav pokazalo enormno zapletenost delovanja bakterijske celice predvsem zaradi nepoznavanja mehanizmov, ki regulirajo v njej prisotna genetska vezja. Slednje za sintezno biologijo pogosto predstavlja problem, saj je v nepoznanih šasijah interakcija z vzneseno napravo pogosto neizogibna[1]. Tukaj je tudi potrebno omeniti koncept osrednjega genoma (ang.”core genome”), ki predstavlja skupino genov, ki so nepogrešljivi za delovanje določenega klada in njegovim predstavnikom daje fiziološke in morfološke značilnosti[3]. Čeprav je osredji genom dobro izhodišče za zagotavljaje ortolognosti ekspresijskih sistemov, se pri šasijah, namenjenih iskanju ekonomsko zanimivih sekundarnih metabolitov, koncept osrednjega genoma izkaže za neuporabnega. Biosintezne poti, oziroma koraki znotraj teh, potrebujejo določene prekurzorke spojine, katerih samo osrednji genom ne more zagotoviti. Torej so za iskanje novih ekonomsko zanimivih sekundarnih metabolitov bolj primerne šasije z reduciranim kot pa osrednjim genomom[1].<br /> ==Orodja za urejanje genoma==<br /> Priprava šasije z reduciranim genomom zajema obširno urejanje genoma izvornega organizma. Metode, ki to omogočajo pogosto temeljijo na homologni rekombinaciji preko organizmu lastnih ali tujih rekombinaz. Med slednjihmi sistemi se najpogosteje uporablja λRED rekombinacijski sistem in njihova prednost leži v večji učinkovitost rekombinacije[3]. <br /> Možna je pa tudi rekombinacija brez uporabe rekombinaze, ki temelji na delovanju DNA polimeraze. Tukaj se v gram negativne bakterije vnese med 20 in 120 bp dolge sintetične enoverižne olilgonukleotide, ki so komplementarni želenemu predelu genoma ampak nosijo točkovno mutacijo ali privedejo do delecije predela gena. Te se vstavijo v DNA med njenim podvojevanjem in sicer v obliki okazakijevaih fragmentov[4]. Razširitev tega pristopa je metoda MAGE (ang. “Multiplex Automated Genome Engineering”), ki temelji na večih ciklih tovrstne mutageneze in omogoča pripravo bakterisjkih sevov preko usmerjene evolucije[1].<br /> Tovrstnim namenom pogosto tudi služijo mestno-specifične rekombinaze, ki večinoma temeljijo na fagmen Cre/loxP ali kvasjem Flp/FRT sistemu. Cre in Flp sta rekombinazi, ki prepoznata 34 bp dolgo zaporedje DNA. Takšna zaporedja so vstavljena na 5’ in 3’ konce določenega gena in odvisno od njune orientacije omogočata rekombinazi izrez, oziroma delecijo (direktni ponovitvi) ali obrat (obrnjeni ponovitvi) željnega gena[1].<br /> Zadnje čase se pa vedno bolj uveljavlja sistem za urejanje DNA imenovann CRISPR/Cas9 (ang. “Clusterd Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/CRISPR assosiated (Cas) proteins”), ki izvira iz bakterijskega adaptivnega imunskega sistema. Poznamo tri različne CRISPR sisteme, ki se ločijo po številu potrebnih Cas proteinov. Najbolj uporaben je CRISPER/Cas9, saj za mestno specifični dvoverižni prelom DNA potrebuje le endonukleazo Cas9 in vodilno RNA[1].<br /> ==Od zgoraj navzdol ali ang.”top-down” pristop==<br /> Od zgoraj navzdol ali ang.”top-down” pristop je biotehnološko najbolj zanimiv in zajema postopno odstranjevanje nezaželjenih genov iz že obstoječega genoma. Takšen pristop se je v preteklosti že izkazal za uporabnega saj je izbitje ne-esencialnih genov privedlo do stabilnejšega genoma, hitrejše rasti, zmanjšanje sekrecijskega metaboloma in (najpomembnejše) sprostitev prekurzorkih molekul za industrisjsko zanimive biosintezne poti in posledično višjih titrov želenega metabolita. Vedno znova se pa je izkazalo, da je redukcija genoma možna samo za okoli 25%, in sicer pri Escherichia coli 15.3, B. subtilis 20.7, S. avermitilis 16.9-18.6 in Corinebacterium glutamicum 22%. Tovrstni pristopi usmerjene mutageneze za optimizacijo šasij so se iskazali za učinkovite tudi pri bakterijah rodu Streptomyces, vendar njihovo uporabnost omejuje pomankljivo poznavanja genetskih vezji prisotnih v produkcijskih organizmih, saj se je zaradi tega težko odločiti katere gene lahko izbijemo brez da vplivamo na sposobnost rasti in produkcije sekundarnih metabolitov[1]. <br /> Tukaj nastopi uporaba naključne mutageneze, saj ta ne potrebuje poznavanja vseh genetskih elementov, ampak temelji na selekciji mutant, ki ustrezajo zastavljenim kriterijem in pristop predstavlja nekakšno usmerjeno evolucijo. Pristop je bil že uporabljen za redukcijo genoma bakterije P. putida za 7.4% preko uporabe transpozonov z vstavljenim selekcijskim markerjem in FRT mestom, kar je omogočilo izrez segmenta genoma med dvema tovrstnima transpozicijskema elementa[1]. <br /> Zgoraj že omenjena metoda MAGE predstavlja vmesno pot, saj omogoča naključno mutagenezo natančno določenega segmenta genoma. Avtorji so tukaj preko specifičnih oligonukletidov v večih ciklih izvedeli naključno mutagenezo genov biosintezne poti za 1-deoksi-d-ksiloze-5-fosfata (DXP) in tako ustvarili sev, ki je imel petkrat višji titer DXP kot izvorni mikroorganizem[5]. <br /> ==Rod Streptomyces==<br /> Produkcija industrijsko zanimivih spojin pa potrebuje šasijo, ki poseduje primerno zalogo ustreznih metabolitov, saj te služijo kot njihovi prekurzorji. Bakterije rodu Streptomyces se ravno zaradi tega smatrajo kot idealni kandidati za pripravo optimiziranega ekspresijskega seva za kriptične biosintezne gene in operone, <br /> Prvi korak tovrsnega razvoja predstavljata priprava specializiranih ekspresijskih sevov S. avermitilis, za namene izražanja kriptičnih biosinteznih poti. Optimizacijo njenega genoma so dosegli preko odstranitve približno 1.4 Mb od 9.02 Mb wild-tipe genoma. Odstranili so bolj variabilne predele njenega genoma preko homologne in mestno specifične Cre/loxP rekombinacije in tako pripravili dva omembe vredna seva S. avermitilis SUKA17 in 22., ki imata genom reduciran za 17.9 in 18.5%, kar je preprečilo produkcijo endogenih sekundarnih metaboitov prisotnih v wilde-type sevu. Pomembno je tudi izpostaviti, da ti sevi niso izkazali počasnejše rasti kot izvorni wilde-type sev. Primernost tako pripravljenih sevov za heterologno ekspresijo biosinteznih poti so preverili preko izražanja biosinteznih poti za streptomicin, amicin C in pladienolid[6]. Prvi spojini sta antibiotika in druga je makrociklični lakton, ki izkazuje protitumorsko delovanje preko inhibicije zorenja mRNA[7]. Produkcija obeh antibiotikov je bila višja kot v izvornih organimih, proizvodnje pladienolida pa sprve niso opazili. Njegovo produkcijo so pa kasneje omogočili z uvedbo dodatne kopije zapisa za regulatorni protein PldR, ki je transkripcijski aktivator pladenoidnih biosinteznih genov[6]. <br /> Bolj ciljna optimizacija bakterije S. coelicolor M145 je bila izvedene z namenom zmanjšanja odtoka ogljika in dušika preko nativnih biosinteznih poti. Raziskovalci so izbili biosintezne gene za aktinorhodin, prodigin, CPK (ang.”cryptic type I polyketide syntetase”) in CDA (ang.”calcium-dependent antibiotic”), uvedli so tudi točkovne mutacije znotraj genov rpoB in rpsL, ki zapisujeta β podenoto RNA polimeraze in 30S ribosomalno podenoto[8]. Točkovne mutacije v teh genih, poleg antibiotične rezistence, povzročijo podoben odziv kot vezava ppGpp na ribosom. Povzročita indukcijo “odziva na težavne razmere” ali ang.”stringent response” in ta privede do aktivacije biosinteznih poti za sekundarne metabolite v rodu Streptomyces[9]. Tako so pleiotropno povišali kočne titre proizvedenih sekundarnih metabolitov, hipoteze so preverili preko vstavitve nativnega antihondrin biosinteznega operona in dveh biosinteznih poti za heterologno proukcijo kloramfenikola in kongocidina in pri vseh so opazili večjo produkcijo kot v izvornem sevu. Dodatna prednost uporabe produkcijkih sevov z reduciranim genomom je tudi lažja analiza proizvedenih spojin zaradi poenostavitve ekstracelularnega metabolitnega profila. Slednje je še posebej pomembno pri presejanju za industrijsko zanimive kriptične biosintezne operone in gene[8].<br /> ==“Od spodaj navzgor” (ang.”bottom-up”) pristop in naravno optimirani genomi==<br /> Od spodaj navzgor strategije predpostavljajo uporabo šasij, izdelanih de-novo za namen iskanja industrijsko zanimivih sekundarnih metabolitov. Tako zajemajo sestavo sintetičnih metabolnih poti, ki bi bile prirejena tako, da drastično zmanjšajo metabolno interferenco in preko tega bi lahko omogočil izdelavo polno ortolognega ekspresijskega sistema. Vendar so takšni cilji zaenkrat še neuresničljivi, saj je največji dosedanji uspeh na tem področju popolna sinteza genoma bakterije Mycoplasma mycoides in njegov prenos v celico M. capricolum, kateri je bil predhodno odstranjen lastni genom[1]. <br /> Naravno oprimiran genom pa bi lahko predstavljala bakterija Streptomyces albus J1074, saj je njen genom najmanjši znotraj tega rodu. Njegova velikost (~6.8 Mb) je posledica zmanjšanja števila genskih podvojitev, kar je dobro vodilo za optimiranje drugih predstavnikov tega rodu. Poleg majhnega genoma je ta bakterijska vrsta primerna kot šasija za iskanje industrijsko zanimivih sekundarnih metabolitov tudi zaradi relativno enostavne genetske manipulacije in je v preteklosti že bila uspešno uporabljena za produkcijo stefimicina, ferderikamicina in drugih industrijsko pomembnih spojin[1]. <br /> ==Viri==<br /> 1.Tiago Beites in Marta V. Mendes. Chassis optimization as acornerstone for the application of synthetic biology based strategies in microbial secondary metabolism. Frontiers in Microbiology (2015)<br /> 2.Marnix H. Medema, Kai Blin, Peter Cimermancic et al. antiSMASH: rapid identification, annotation and analysis of secondary metabolite biosynthesis gene clusters in bacterial and fungal genome sequences. Nucleic Acid Reserch (2011) <br /> 3.George Vernikos, Duccio Medini, David R Riley et al. Ten years of pan-genome analyses. Current Opinion in Microbiology (2015)<br /> 4.Bryan Swingle, Eric Markel, Nina Costantino, et al. Oligonucleotide recombination in Gram-negative bacteria. Molecular Microbiology (2010)<br /> 5.Harris H. Wang1, Farren J. Isaacs1, Peter A. Carr et al. Programming cells by multiplex genome engineering and accelerated evolution. Nature (2009)<br /> 6.Mamoru Komatsua, Takuma Uchiyamaa, Satoshi Omurab et al. Genome-minimized Streptomyces host for the heterologous expression of secondary metabolism. PNAS (2010)<br /> 7.Akira Yokoi, Yoshihiko Kotake, Kentaro Takahashi et al. Biological validation that SF3b is a target of the antitumormacrolide pladienolide. FEBS Journal (2011)<br /> 8.Juan Pablo Gomez-Escribano in Mervyn J. Bibb. Engineering Streptomyces coelicolor for heterologous expression of secondary metabolite gene clusters. Microbial Biotechnology (2011)<br /> 9.Haifeng Hu, Qin Zhang in Kozo Ochi. Activation of Antibiotic Biosynthesis by Specified Mutations in the rpoB Gene (Encoding the RNA Polymerase Subunit) of Streptomyces lividans. Journal of Bacteriology (2002)</div>

Jure Zabret https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Seminarji_SB_2015/16&diff=11038 2016-01-02T17:23:02Z

<p>Jure Zabret: </p> <hr /> <div>Seminarji iz Sintezne biologije v študijskem letu 2015/16 so:<br /> <br /> Vir: knjiga [http://journal.frontiersin.org/researchtopic/2866/synthetic-biology-engineering-complexity-and-refactoring-cell-capabilities SYNTHETIC BIOLOGY: ENGINEERING COMPLEXITY AND REFACTORING CELL CAPABILITIES]<br /> <br /> * Production of fatty acid-derived valuable chemicals in synthetic microbes ([[Proizvodnja kemikalij iz derivatov maščobnih kislin s pomočjo sintetičnih mikroorganizmov]]) (Maja Grdadolnik)&lt;br&gt;<br /> * Optimization of the IPP precursor supply for the production of lycopene, decaprenoxanthin and astaxanthin by Corynebacterium glutamicum ([[Optimizacija sinteze IPP kot prekursorja za produkcijo likopena, dekaprenoksantina in astaksantina v Corynebacterium glutamicum]]) (Griša Prinčič)&lt;br&gt;<br /> * Engineering sugar utilization and microbial tolerance toward lignocellulose conversion [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Konverzija_lignoceluloze_s_pomočjo_izkoriščanja_mikrobne_tolerance_in_inženiringa_sladkorjev] (Kim Potočnik) &lt;br&gt;<br /> * Cofactor engineering for enhancing the flux of metabolic pathways [[INŽENIRING KOFAKTORJEV ZA IZBOLJŠANJE METABOLIČNIH POTI]] (Nastja Štemberger)&lt;br&gt;<br /> * [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4354409/ Can the natural diversity of quorum-sensing advance synthetic biology?] ([[Ali lahko naravna diverziteta quorum sensinga pripomore k napredku v sintezni biologiji?]]) (Tina Snoj)&lt;br&gt;<br /> * [http://journal.frontiersin.org/article/10.3389/fbioe.2015.00093/full Signal-to-noise ratio measures efficacy of biological computing devices and circuits] ([[Določanje učinkovitosti bioloških naprav in vezij z razmerjem signal-šum]]) (Jakob G. Lavrenčič)&lt;br&gt;<br /> * A sense of balance: experimental investigation and modeling of a malonyl-CoA sensor in Escherichia coli ([[Senzor za malonil-CoA v bakteriji Escherichia coli]]) (Ajda Rojc)&lt;br&gt;<br /> * [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4211546/ New transposon tools tailored for metabolic engineering of Gram-negative microbial cell factories] ([[Metabolični inženiring gram-negativnih bakterij s transpozonskim sistemom]]) (Rok Razpotnik)&lt;br&gt;<br /> <br /> <br /> Vir: knjiga [http://journal.frontiersin.org/researchtopic/455/synthetic-biology-applications-in-industrial-microbiology SYNTHETIC BIOLOGY APPLICATIONS IN INDUSTRIAL MICROBIOLOGY]<br /> <br /> * Recent Progress in Synthetic Biology for Microbial Production of C3–C10 Alcohols (Urška Rauter) ([[Napredki v sintezni biologiji pri proizvodnji C3-C10 alkoholov v mikroorganizmih]])<br /> * Visualizing Evolution in Real-Time Method for Strain Engineering ([[Vizualizacija evolucije v realnem času – metoda za sevno inženirstvo]]) (Samo Zakotnik)<br /> * [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3367458/ Engineering Microbial Consortia to Enhance Biomining and Bioremediation] ([[Načrtovanje mikrobnih konzorcijev za izboljšanje biorudarstva in bioremediacije]]) (Maja Kostanjevec)<br /> * Engineering Microbial Chemical Factories to Produce Renewable “Biomonomers” ([[Mikrobiološka proizvodnja obnovljivih biomonomerov in bioplastike]])(Nastja Pirman)<br /> * Application of Synthetic Biology in Cyanobacteria and Algae (Špela Tomaž)<br /> * Synthetic Feedback Loop Model for Increasing Microbial Biofuel Production Using a Biosensor (Jernej Pušnik)<br /> * Balance of XYL1 and XYL2 Expression in Different Yeast Chassis for Improved xylose Fermentation (Monika Praznik)<br /> * [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3630320/ Design and Development of Synthetic Microbial Platform Cells for Bioenergy] (Erik Mršnik)<br /> * [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3616241/ Microbial Production of Isoprenoids Enabled by Synthetic Biology] ([[Mikrobna produkcija izoprenoidov s sintezno biologijo]]) (Dominik Kert) <br /> * Chemical synthetic biology: a mini-review ([[Kratki predogled kemijske sintezne biologije]]) (Anka Hotko)<br /> <br /> <br /> Seminarji iz preglednih člankov:<br /> <br /> * Towards engineering biological systems in a broader context (Aleksander Benčič)<br /> * Synthetic biology: Novel approaches for microbiology (Daša Janeš)<br /> * Tools and principles for microbial gene circuit engineering (Marko Radojković)<br /> * Sensitive cells: enabling tools for static and dynamic control of microbial metabolic pathways (Katja Leben)<br /> * Chassis optimization as a cornerstone for the application of synthetic biology based strategies in microbial secondary metabolism ([Oprimizacija šasij kot osnovni korak pri uporabi sintezno biološkega pristopa pri karakterizaciji mikrobnega sekundarnega metabolizma]) (Jure Zabret)<br /> * Recent advances and opportunities in synthetic logic gates engineering in living cells (Monika Biasizzo)<br /> * Programmable genetic circuits for pathway engineering (Urban Javoršek)<br /> * Better together: engineering and application of microbial symbioses (Nejc Petrišič)<br /> * Synthetic biology for microbial production of lipid-based biofuels (Urška Pevec)<br /> * Engineering Biosynthesis Mechanisms for Diversifying Polyhydroxyalkanoates (Mojca Banič)<br /> * Synthetic biology of fungal natural products (Estera Merljak)<br /> * Synthetic biology and biomimetic chemistry as converging technologies fostering a new generation of smart biosensors (Benjamin Bajželj)<br /> * How Synthetic Biology Would Reconsider Natural Bioluminescence and its Application (Ana Grom &amp; Ana Unkovič)<br /> * Synthetic Biology-Toward Therapeutic Solutions (Tanja Korpar)<br /> * Synthetically modified mRNA for efficient and fast human iPS cell generation and direct transdifferentiation to myoblasts (Mirjana Malnar)<br /> * Mammalian synthetic biology: emerging medical applications (Maša Mirkovič)<br /> * Synthetic biology devices and circuits for RNA-based ‘smart vaccines’: a propositional review (Monika Škrjanc)</div>

Jure Zabret https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Metabolno_in%C5%BEenirstvo_Klebsiella_pneumoniae_za_produkcijo_cis,cis-mukoni%C4%8Dne_kisline&diff=10614 2015-05-26T21:19:06Z

<p>Jure Zabret: </p> <hr /> <div>==UVOD==<br /> Spojine z dodano vrednostjo za svojo sintezo potrebujejo začetne spojine, ki večinoma izhajajo iz naftne industrije. To predstavlja vedno večji problem, saj se pri pridobivanju teh začetnih spojin v atmosfero izpusti velike količine toplogrednih plinov. Ekološke težave pa niso edine, ki ta način pridobivanja seboj prinese. Potrebno je tudi vzeti v obzir vedno večje ekonomsko breme, ki ga predstavljajo vedno višje cene surove nafte. Zaradi teh in mnogih drugih razlogov je potrebno zmanjšati našo odvisnost od fosilnih goriv. Možna rešitev tega specifičnega problema je mikrobna produkcija teh, začetnih spojin.<br /> Primer ravno tega je adipična kislina (AK), prekurzor najlona-6,6. Omenjeno kislino je možno pridobiti preko mikrobne sinteze, natančneje njen prekurzor cis,cis-mukonično kislino (ccMA), ki je naravni metabolni intermediat mnogih bakterijskih vrst. Ena izmed teh je tudi Klebsiella pneumoniae, ki je ko produkcijski mikroorganizem bila izbrana zaradi pestrega nabora možnih virov ogljika za njeno preživetje. Druagče bakterija sodi med patogene mikroorganizme saj povzroča mnoge bolnišnične okužbe, pljučnice in okužbe sečil. Raziskovalci so preko izbijanja določenih genov in prekomerne ekspresije drugih preusmerili znotrajcelični ogljikov tok in tako pripravili mikroorganizem, ki je ob optimalnih pogojih sposoben produkcije 2,1g ccMA na liter kulture.<br /> ==METODE IN MATERIALI==<br /> Genetske manipulacije so opravili znotraj bakterije Eschericchia coli DH5α, ki so jo gojili v navadnem Luria-Bartani (LB) gojišču. Kot izvorni sev K. pneumoniae so uporabili sev KMK-02, ki je bil v njihovem laboratoriju pripravljen v okviru druge raziskave. Tamu sevu sta utišana gena wagG in ldhA. Prvi sodeluje pri sintezi lipopolisaradidov, ki so pomembni za patogenost bakterije in drugi sodeluje pri sintezi mlečne kisline. <br /> Genske konstrukte so v bakterije vnašali preko elektroporacije. Za utišanje določenih genov znotraj K.pneumoniae so uporabili »α red« rekombinacijski sistem in za prekomerno ekspresijo so uporabili eksresijski plazmid pBTBX-2.<br /> Analiza izvenceličnih metabolitov je bila izvedena preko HPLC in detekcija katehola ter ccMA preko merjenja absorbance pri 225nm.<br /> ==REZULTATI IN DISKUSIJA==<br /> K. pneumoniae proizvaja ccMA kot naravni metabolni intermediat v sintezi acetil in sukcinil-CoA, preko katehol razgradnje poti. Najprej so preverili, če izvorni sev KMK-02 proizvaja ccMA. Ugotovili so, da po 24h proizvede le 34mg/ml katehola, ki je prekurzor ccMA. Naslednji korak je bil preusmerjanje znotrajceličnega ogljikovega toka v smeri produkcije ccMA preko delecije šikimatne poti sinteze aminokislin. To so naredili z izbitjem gena aroE, ki zapisuje za 3-dehidroksiškimat dehidrogenazo. Nastali sev KMK-101 je proizvedel 343g/ml katehola, vendar ccMA e vedno niso mogli zaznati. Možen odgovor so videli v odtekanju nastalega bazena ccMA, preko delovanja mukonolat cikloizomerazev acetil in sukcinil-CoA. Torej so izbili še gen catA, ki zapisuje prej omenjen encim. Nastali sev (KMK-102) je prizvedel plibližno enako količino katehola in ccMA še vedno niso mogli zaznati. Sklepali so, da težava želi v nezadostnem pritekanju ogljika v želeno metabolno pot. Torej so izbili represor tyrR (sev KMK-103), ki ob zadostnih količina aromatskih aminoskilin preprečuje njihovo sintezo preko šikimatne poti. Zadnji sev, ki so ga pripravili preko izbijanja genov je bil sev KMK-107. Tamu so izbili gen pcaH, ki zapisuje protokatehat 3,4-dioksigenazo saj ta encim preusmeri ogljikov tok starn od ccMA. <br /> Zadnji sev (KMK-107) je preizvedel več katehola kot KMK-103, vendat ccMA še vedno ni bil zaznan. Torej raziskovalci sklepali, da pretvorba iz katehola v ccMA ne poteka dovolj hitro. Za pretvorbo je odgovoren encim katehol 1,2-dioksigenaza (catA). Dodane kopije catB so raziskovalci vnesli v vse pripravljene seve.<br /> Končni sev se je imenoval KMK-107C in je proizvedel 2,1g ccMA na litrer kulture po 72h.</div>

Jure Zabret https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Metabolno_in%C5%BEenirstvo_Klebsiella_pneumoniae_za_produkcijo_cis,cis-mukoni%C4%8Dne_kisline&diff=10604 2015-05-26T17:52:49Z

<p>Jure Zabret: New page: ==UVOD==</p> <hr /> <div>==UVOD==</div>

Jure Zabret https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=MBT_seminarji_2015&diff=10603 2015-05-26T17:50:47Z

<p>Jure Zabret: </p> <hr /> <div>'''Seznam seminarjev iz Molekularne biotehnologije v študijskem letu 2014/15'''<br /> <br /> Tabela za razpored po tednih bo objavljena v spletni učilnici, vanjo pa se vpišite tudi za kratke predstavitve novic (3 min, dvakrat v semestru). Na tej strani bo samo seznam odobrenih člankov za seminar in povezave do člankov in do povzetkov, ki jih morate objaviti najkasneje tri dni pred predstavitvijo (ponedeljek oz. torek). Angleški naslov prevedite tudi v slovenščino - to bo naslov povzetka, ki ga objavite na posebni strani, tako kot so to naredili kolegi pred vami (oz. lani).<br /> <br /> Način vnosa:<br /> <br /> # The importance of ''Arabidopsis'' glutathione peroxidase 8 for protecting ''Arabidopsis'' plant and ''E. coli'' cells against oxidative stress (A. Gaber; GM Crops &amp; Food 5(1), 2014; http://dx.doi.org/10.4161/gmcr.26979) Pomen glutation peroksidaze 8 iz repnjakovca za zaščito rastline ''Arabidopsis thaliana'' in bakterije ''Escherichia coli'' pred oksidativnim stresom. Janez Novak, 15. marca 2014<br /> (slovenski naslov povežite z novo stranjo, na kateri bo povzetek)<br /> <br /> <br /> '''Naslovi odobrenih člankov po temah:'''<br /> <br /> '''Gensko spremenjene rastline'''&lt;br&gt;<br /> # Successful high-level accumulation of fish oil omega-3 long-chain polyunsaturated fatty acids in a transgenic oilseed crop (Ruiz-Lopez, N., et al; The plant journal 77, 198-208, 2014; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24308505). [[Uspešna priprava gensko spremenjene oljne rastline z visoko vsebnostjo omega-3 polinenasičenih maščobnih kislin.]] Petra Malavašič, 20. marca 2015<br /> #A simplified and accurate detection of the genetically modified wheat MON71800 with one calibrator plasmid (Jae Juan, S.,et al; Food Chemistry 176, 1-6, ;http://www.sciencedirect.com.nukweb.nuk.uni-lj.si/science/article/pii/S03088146140196572015 [[Poenostavljena in točna detekcija gensko spemenjene pšenice MON71800 z enim kalibratorskim plazmidom]]. Matej Lesar, 20. marca 2015<br /> <br /> '''Gensko spremenjene živali'''&lt;br&gt;<br /> # [[A novel adenoviral vector carrying an all-in-one Tet-On system with an autoregulatory loop for tight, inducible transgene expresion]] (H. Chen; et all.; BMC Biotechnology 2015, 15:4, doi:10.1186/s12896-015-0121-4; http://www.biomedcentral.com/1472-6750/15/4). Edvinas Grauželis, 27. marca 2015 (in English)<br /> # Production of functional active human growth factors in insects used as living biofactories (B. Dudognon, et al; Journal of Biotechnology 184, 229–239, 2014; http://dx.doi.org/10.1016/j.jbiotec.2014.05.030). [[Proizvodnja funkcionalno aktivnih človeških rastnih faktorjev v insektih uporabljenih kot žive biotovarne]] Maxi Sagmeister, 27. marca 2015<br /> <br /> '''Okolje'''&lt;br&gt;<br /> # Bioremediation of pesticide contaminated water using an organophosphate degrading enzyme immobilized on nonwoven polyester textiles (Yuan Gao ''et al.'', Enzyme and Microbial Technology, vol. 54, pages 38-44, 10.1.2014, http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0141022913002044). [[Bioremediacija s pesticidi okužene vode z uporabo encima, ki razgrajuje organofosfate in je vezan na netkan poliestrski tekstil]]. Mitja Crček, 3. aprila 2015<br /> # Biodegradation of atrazine by three transgenic grasses and alfalfa expressing a modified bacterial atrazine chlorohydrolase gene (A. W. Vail ''et al.''; Transgenic Research, 29. 11. 2014; http://link.springer.com/article/10.1007/s11248-014-9851-7). [[Biorazgradnja atrazina s tremi transgenskimi travami in lucerno, ki izražajo gen za modificirano bakterijsko atrazin klorohidrolazo]]. Mirjam Kmetič, 3. aprila 2015 <br /> <br /> '''Terapevtiki'''&lt;br&gt;<br /> # Glycosylated enfuvirtide: A long-lasting glycopeptide with potent anti-HIV activity; http://pubs.acs.org/doi/full/10.1021/jm5016582 [[Glikoliziran Enfuvirtid: glikopeptid z močno proti HIV aktivnostjo s podaljšanim delovanjem]]. Sebastian Pleško, 10. aprila <br /> # Microbicidal effects of α- and θ-defensins against antibiotic-resistant Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa; http://ini.sagepub.com/content/21/1/17.long. [[Mikrobicidno delovanje α in θ defenzinov na antibiotik-odporne Staphylococcus aureus in Pseudomonas aeruginosa]]. Ana Kapraljević, 10. aprila<br /> <br /> '''Encimi'''&lt;br&gt;<br /> # Immobilization and controlled release of β-galactosidase from chitosan-grafted hydrogels; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0308814615001028. [[Imobilizacija in nadzorovano sproščanje β-galaktozidaze iz hitozanskega hidrogela]]. Mojca Banič, 16. aprila 2015<br /> # Construction of efficient xylose utilizing ''Pichia pastoris'' for industrial enzyme production (Li ''et al''; Microbial Cell Factories 14:22, 1-10, 2015; http://www.microbialcellfactories.com/content/14/1/22). [[Priprava Pichie pastoris, ki učinkovito uporablja ksilozo, za industrijsko proizvodnjo encimov]]. Špela Tomaž, 17. aprila 2015<br /> # Postharvest application of a novel chitinase cloned from ''Metschnikowia fructicola'' and overexpressed in ''Pichia pastoris'' to control brown rot of peaches; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0168160515000033. [[Uporaba hitinaze, klonirane iz Metschnikowie fructicola in prekomerno izražene v Pichii pastoris za nadzor rjave gnilobe breskev po obiranju]] Špela Pohleven, 17. aprila 2015<br /> <br /> '''Protitelesa'''&lt;br&gt; <br /> # Optimization of heavy chain and light chain signal peptides for high level expression of therapeutic antibodies in CHO cells; http://dx.plos.org/10.1371/journal.pone.0116878. Optimizacija signalnih peptidov težkih in lahkih verig za večjo ekspresijo terapevtskih protiteles v CHO celičnih linijah. [[Optimizacija signalnih peptidov težkih in lahkih verig za večjo ekspresijo terapevtskih protiteles v CHO celičnih linijah]] Tjaša Blatnik, 23. aprila 2015<br /> # Ethanol precipitation for purification of recombinant antibodies (A. Tscheliessnig ''et al''; Journal of Biotechnology 188, 17-28, 2014; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0168165614007810). [[Čiščenje rekombinantnih protiteles z obarjanjem z etanolom]]. Urška Rauter, 24. aprila 2015<br /> # Functional mutations in and characterization of VHH against ''Helicobacter pylori'' urease (R. Hoseinpoor ''et al''; Applied Biochemistry and Biotechnology 172, 3079-3091, 2014; http://link.springer.com/article/10.1007/s12010-014-0750-4). [[Funkcionalne mutacije in karakterizacija VHH proti ureazi Helicobacter pylori]]. Marko Radojković, 7. maja 2015<br /> <br /> '''Cepiva'''&lt;br&gt;<br /> # Development of anti-E6 pegylated lipoplexes for mucosal application in the context of cervical preneoplastic lesions; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0378517315001507. [[Razvoj pegiliranih lipopleksov proti E6 za aplikacijo na sluznico pri predrakavih spremembah materničnega vratu]]. Tanja Korpar, 7. maja 2015<br /> # A novel “priming-boosting” strategy for immune interventions in cervical cancer (S. Liao et al.; Molecular Immunology 64, 295-305, 2015, http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0161589014003460. [[Nova &quot;priming-boosting&quot; strategija za imunsko posredovanje pri raku materničnega vratu]]. Anita Kustec, 8. maja 2015<br /> # Potentiation of anthrax vaccines using protective antigen-expressing viral replicon vectors (H.C. Wang et al.; Immunology letters 163, 206-213, 2015, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25102364 ) [[Izboljšava cepiv proti antraksu z uporabo iz virusnih replikonov izvedenih vektorjev, ki omogočajo izražanje zaščitnega antigena.]] Daša Pavc, 8. maja 2015<br /> <br /> '''Male molekule in polimeri'''&lt;br&gt;<br /> # Methanol-induced chain termination in poly(3-hydroxybutyrate) biopolymers: Molecular weight control; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0141813014008307. [[Z metanolom inducirana terminacija polimerizacije poli(3-hidroksibutiratnih) polimerov: Vpliv na molekulsko maso]]. Gašper Lavrenčič, 14. maja 2015<br /> # Purification and characterization of gamma poly glutamic acid from newly Bacillus licheniformis NRC20; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0141813014008216. Uroš Stupar, 14. maja 2015<br /> # Sequence-specific antimicrobials using efficiently delivered RNA-guided nucleases (Citorik RJ. ''et al''; Nature Biotechnology 32, 1141-1145, 2014; http://www.nature.com/nbt/journal/v32/n11/full/nbt.3011.html). [[Sekven%C4%8Dno specifi%C4%8Dna protimikrobna sredstva]] Iza Ogris, 15. maja 2015<br /> # Chromosomal integration of hyaluronic acid synthesis (''has'') genes enhances the molecular weight of hyaluronan produced in ''Lactococcus lactis'' (R. V. Hmar et al; Biotechnol. J. 9 (12), 2014; http://dx.doi.org/10.1002/biot.201400215) [[Integracija genov za sintezo hialuronske kisline v kromosom bakterije Lactococcus lactis izboljša sintezo visokomolekularne hialuronske kisline]] Maja Grdadolnik, 15. maja 2015<br /> <br /> '''Pretvorba biomase'''&lt;br&gt;<br /> # Effect of pretreatment methods on the synergism of cellulase and xylanase during the hydrolysis of bagasse (L. Jia ''et al''; Bioresource Technology 185, 2015; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0960852415002114) [[Vpliv metod predobdelave na sinergizem celulaze in ksilanaze pri hidrolizi bagase]]. Eva Lucija Kozak, 21. maja 2015<br /> # Third generation biohydrogen production by Clostridium butyricum and adapted mixed cultures from Scenedesmus obliquus microalga biomass; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0016236115002550?np=y [[Tretja generacija proizvodnje biovodika s pomočjo, z mikroalgami Scenedesmus obliquus hranjenimi bakterijami Clostridium butyricum in mešanico prilagojenih mikroorganizmov]] Nives Naraglav, 22. maja 2015<br /> # Bio-catalytic action of twin-screw extruder enzymatic hydrolysis on the deconstruction of annual plant material: Case of sweet corn co-products; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0926669015000436 [[Biokatalitični učinek encimske hidrolize dvovijačnega ekstruderja na destrukturiranje rastlinskega materiala]]. Griša Prinčič, 22. maja 2015<br /> <br /> '''Metabolično inženirstvo'''&lt;br&gt;<br /> # Engineering lipid overproduction in the oleaginous yeast Yarrowia lipolytica;http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1096717615000166. Andreja Bratovš, 28. maja 2015<br /> # Metabolic engineering of Saccharomyces cerevisiae for production of fatty acid-derived biofuels and chemicals (Weerawat Runguphana, Jay D. Keasling; Metabolic Engineering, vol 21, January 2014, Pages 103–113; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1096717613000670). [[[Metabolično inženirstvo ''Saccharomyces cerevisiae'' za proizvodn]jo biogoriv in kemikalij iz maščobnih kislin]]. Dominik Kert, 29. maja 2015<br /> # Metabolic engineering of Klebsiella pneumoniae for the production of cis,cis-muconic acid (Jung,H.-M. Jung,M.-Y. Oh, M.-K.;Applied Microbiology and Biotechnology, Published online: 14 February 2015; http://link.springer.com/article/10.1007/s00253-015-6442-3). [[Metabolno inženirstvo Klebsiella pneumoniae za produkcijo cis,cis-mukonične kisline]]. Jure Zabret, 29. maja 2015<br /> <br /> '''Biološki viri energije'''&lt;br&gt;<br /> # Anodic and cathodic microbial communities in single chamber microbial fuel cells; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1871678414021694. Tamara Marić, 4. junija 2015<br /> # Combination of dry dark fermentation and mechanical pretreatment for lignocellulosic deconstruction: An innovative strategy for biofuels and volatile fatty acids recovery; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0306261915002196. Jernej Pušnik, 4. junija 2015<br /> # Potential use of feedlot cattle manure for bioethanol production; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0960852415001960. Nastja Pirman, 5. junija 2015<br /> # Cellulolytic enzymes produced by a newly isolated soil fungus Penicillium sp. TG2 with potential for use in cellulosic ethanol production; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0960148114007022. Jana Verbančič, 5. junija 2015<br /> <br /> '''Novi pristopi v molekularni biotehnologiji'''&lt;br&gt;<br /> # Exploring the potential of algae/bacteria interactions; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0958166915000269. Matja Zalar, 11. junija<br /> # How close we are to achieving commercially viable large-scale photobiological hydrogen production by cyanobacteria: A review of the biological aspects; http://www.mdpi.com/2075-1729/5/1/997/htm. Monika Škrjanc, 11. junija<br /> # Mind-controlled transgene expression by a wireless-powered optogenetic designer cell implant (M. Folcher; Nature Communications 5, 1–11, 2014; http://www.nature.com/ncomms/2014/141111/ncomms6392/full/ncomms6392.html) Z EEG nadzorovano izražanje transgena preko brezžično napajanega optogenetskega celičnega vsadka. Luka Smole, 11. junija 2015</div>

Jure Zabret https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=MBT_seminarji_2015&diff=10179 2015-03-15T18:13:12Z

<p>Jure Zabret: </p> <hr /> <div>'''Seznam seminarjev iz Molekularne biotehnologije v študijskem letu 2014/15'''<br /> <br /> Tabela za razpored po tednih bo objavljena v spletni učilnici, vanjo pa se vpišite tudi za kratke predstavitve novic (3 min, dvakrat v semestru). Na tej strani bo samo seznam odobrenih člankov za seminar in povezave do člankov in do povzetkov, ki jih morate objaviti najkasneje tri dni pred predstavitvijo (ponedeljek oz. torek). Angleški naslov prevedite tudi v slovenščino - to bo naslov povzetka, ki ga objavite na posebni strani, tako kot so to naredili kolegi pred vami (oz. lani).<br /> <br /> Način vnosa:<br /> <br /> # The importance of ''Arabidopsis'' glutathione peroxidase 8 for protecting ''Arabidopsis'' plant and ''E. coli'' cells against oxidative stress (A. Gaber; GM Crops &amp; Food 5(1), 2014; http://dx.doi.org/10.4161/gmcr.26979) Pomen glutation peroksidaze 8 iz repnjakovca za zaščito rastline ''Arabidopsis thaliana'' in bakterije ''Escherichia coli'' pred oksidativnim stresom. Janez Novak, 15. marca 2014<br /> (slovenski naslov povežite z novo stranjo, na kateri bo povzetek)<br /> <br /> <br /> '''Naslovi odobrenih člankov po temah:'''<br /> <br /> '''Gensko spremenjene rastline'''&lt;br&gt;<br /> <br /> # Successful high-level accumulation of fish oil omega-3 long-chain polyunsaturated fatty acids in a transgenic oilseed crop (Ruiz-Lopez, N., et al; The plant journal 77, 198-208, 2014; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24308505). [[Uspešna priprava gensko spremenjene oljne rastline z visoko vsebnostjo omega-3 polinenasičenih maščobnih kislin.]] Petra Malavašič, 20. marca 2015<br /> # Matej Lesar, 20.marca 2015<br /> <br /> '''Gensko spremenjene živali'''&lt;br&gt;<br /> <br /> # A novel adenoviral vector carrying an all-in-one Tet-On system with an autoregulatory loop for tight, inducible transgene expresion (H. Chen; et all.; BMC Biotechnology 2015, 15:4, doi:10.1186/s12896-015-0121-4; http://www.biomedcentral.com/1472-6750/15/4). Edvinas Grauželis, 27. marca 2015 (in English)<br /> # Production of functional active human growth factors in insects used as living biofactories (B. Dudognon, et al; Journal of Biotechnology 184, 229–239, 2014; http://dx.doi.org/10.1016/j.jbiotec.2014.05.030). Proizvodnja funkcionalno aktivnih človeških rastnih faktorjev v insektih uporabljenih kot žive biotovarne. Maxi Sagmeister, 27. marca 2015<br /> <br /> '''Okolje'''&lt;br&gt;<br /> # Bioremediation of pesticide contaminated water using an organophosphate degrading enzyme immobilized on nonwoven polyester textiles (Yuan Gao ''et al.'', Enzyme and Microbial Technology, vol. 54, pages 38-44, 10.1.2014, http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0141022913002044). Bioremediacija s pesticidi okužene vode z uporabo encima, ki razgrajuje organofosfate in je vezan na netkan poliesterski tekstil. Mitja Crček,<br /> # Biodegradation of atrazine by three transgenic grasses and alfalfa expressing a modified bacterial atrazine chlorohydrolase gene (A. W. Vail ''et al.''; Transgenic Research, 29. 11. 2014; http://link.springer.com/article/10.1007/s11248-014-9851-7). Biorazgradnja atrazina s tremi transgenskimi travami in alfalfo, ki izražajo gen za modificirano bakterijsko atrazin klorohidrolazo. Mirjam Kmetič, <br /> <br /> '''Terapevtiki'''&lt;br&gt;<br /> # Mind-controlled transgene expression by a wireless-powered optogenetic designer cell implant (M. Folcher; Nature Communications 5, 1–11, 2014; http://www.nature.com/ncomms/2014/141111/ncomms6392/full/ncomms6392.html) Z EEG nadzorovano izražanje transgena preko brezžično napajanega optogenetskega celičnega vsadka. Luka Smole, 9. marca 2015<br /> <br /> '''Encimi'''&lt;br&gt;<br /> <br /> # Construction of efficient xylose utilizing ''Pichia pastoris'' for industrial enzyme production (Li ''et al''; Microbial Cell Factories 14:22, 1-10, 2015; http://www.microbialcellfactories.com/content/14/1/22). Priprava ''Pichie pastoris'', ki učinkovito uporablja ksilozo, za industrijsko proizvodnjo encimov. Špela Tomaž<br /> <br /> '''Protitelesa'''&lt;br&gt; <br /> <br /> # Functional mutations in and characterization of VHH against Helicobacter pylori urease (R. Hoseinpoor ''et al''; Applied Biochemistry and Biotechnology 172, 3079-3091, 2014; http://link.springer.com/article/10.1007/s12010-014-0750-4). Funkcionalne mutacije in karakterizacija VHH proti ureazi ''Helicobacter pylori''. Marko Radojković, 9. marca 2015<br /> #Ethanol precipitation for purification of recombinant antibodies (A. Tscheliessnig ''et al''; Journal of Biotechnology 188, 17-28, 2014; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0168165614007810). Čiščenje rekombinantnih protiteles z obarjanjem z etanolom. Urška Rauter, 10. marca 2015<br /> <br /> '''Cepiva'''&lt;br&gt;<br /> <br /> # A novel “priming-boosting” strategy for immune interventions in cervical cancer (S. Liao et al.; Molecular Immunology 64, 295-305, 2015, http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0161589014003460. Nova &quot;priming-boosting&quot; strategija za imunsko posredovanje pri raku materničnega vratu. Anita Kustec, 11. marca 2015<br /> # Potentiation of anthrax vaccines using protective antigen-expressing viral replicon vectors (H.C. Wang et al.; Immunology letters 163, 206-213, 2015, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25102364 ) Izboljšava cepiv proti antraksu z uporabo iz virusnih replikonov izvedenih vektorjev, ki omogočajo izražanje zaščitnega antigena. Daša Pavc<br /> <br /> '''Male molekule in polimeri'''&lt;br&gt;<br /> Iza Ogris&lt;br&gt;<br /> Maja Grdadolnik<br /> <br /> '''Pretvorba biomase'''&lt;br&gt;<br /> <br /> '''Metabolično inženirstvo'''&lt;br&gt;<br /> <br /> # Metabolic engineering of Saccharomyces cerevisiae for production of fatty acid-derived biofuels and chemicals (Weerawat Runguphana, Jay D. Keasling; Metabolic Engineering, vol 21, January 2014, Pages 103–113; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1096717613000670). Metabolično inženirstvo ''Saccharomyces cerevisiae'' za proizvodnjo derivatov maščobnih kislin, ki so primerni za biogorivo in kemikalije. Dominik Kert, 9. marca 2015<br /> <br /> # Metabolic engineering of Klebsiella pneumoniae for the production of cis,cis-muconic acid (Jung,H.-M. Jung,M.-Y. Oh, M.-K.;Applied Microbiology and Biotechnology, Published online: 14 February 2015; http://link.springer.com/article/10.1007/s00253-015-6442-3). Metabolno inženirstvo Klebsiella pneumoniae za produkcijo cis,cis-mukonične kisline. Jure Zabret, 15. marca 2015<br /> '''Biološki viri energije'''&lt;br&gt;</div>

Jure Zabret https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=MBT_seminarji_2015&diff=10178 2015-03-15T18:12:19Z

<p>Jure Zabret: </p> <hr /> <div>'''Seznam seminarjev iz Molekularne biotehnologije v študijskem letu 2014/15'''<br /> <br /> Tabela za razpored po tednih bo objavljena v spletni učilnici, vanjo pa se vpišite tudi za kratke predstavitve novic (3 min, dvakrat v semestru). Na tej strani bo samo seznam odobrenih člankov za seminar in povezave do člankov in do povzetkov, ki jih morate objaviti najkasneje tri dni pred predstavitvijo (ponedeljek oz. torek). Angleški naslov prevedite tudi v slovenščino - to bo naslov povzetka, ki ga objavite na posebni strani, tako kot so to naredili kolegi pred vami (oz. lani).<br /> <br /> Način vnosa:<br /> <br /> # The importance of ''Arabidopsis'' glutathione peroxidase 8 for protecting ''Arabidopsis'' plant and ''E. coli'' cells against oxidative stress (A. Gaber; GM Crops &amp; Food 5(1), 2014; http://dx.doi.org/10.4161/gmcr.26979) Pomen glutation peroksidaze 8 iz repnjakovca za zaščito rastline ''Arabidopsis thaliana'' in bakterije ''Escherichia coli'' pred oksidativnim stresom. Janez Novak, 15. marca 2014<br /> (slovenski naslov povežite z novo stranjo, na kateri bo povzetek)<br /> <br /> <br /> '''Naslovi odobrenih člankov po temah:'''<br /> <br /> '''Gensko spremenjene rastline'''&lt;br&gt;<br /> <br /> # Successful high-level accumulation of fish oil omega-3 long-chain polyunsaturated fatty acids in a transgenic oilseed crop (Ruiz-Lopez, N., et al; The plant journal 77, 198-208, 2014; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24308505). [[Uspešna priprava gensko spremenjene oljne rastline z visoko vsebnostjo omega-3 polinenasičenih maščobnih kislin.]] Petra Malavašič, 20. marca 2015<br /> # Matej Lesar, 20.marca 2015<br /> <br /> '''Gensko spremenjene živali'''&lt;br&gt;<br /> <br /> # A novel adenoviral vector carrying an all-in-one Tet-On system with an autoregulatory loop for tight, inducible transgene expresion (H. Chen; et all.; BMC Biotechnology 2015, 15:4, doi:10.1186/s12896-015-0121-4; http://www.biomedcentral.com/1472-6750/15/4). Edvinas Grauželis, 27. marca 2015 (in English)<br /> # Production of functional active human growth factors in insects used as living biofactories (B. Dudognon, et al; Journal of Biotechnology 184, 229–239, 2014; http://dx.doi.org/10.1016/j.jbiotec.2014.05.030). Proizvodnja funkcionalno aktivnih človeških rastnih faktorjev v insektih uporabljenih kot žive biotovarne. Maxi Sagmeister, 27. marca 2015<br /> <br /> '''Okolje'''&lt;br&gt;<br /> # Bioremediation of pesticide contaminated water using an organophosphate degrading enzyme immobilized on nonwoven polyester textiles (Yuan Gao ''et al.'', Enzyme and Microbial Technology, vol. 54, pages 38-44, 10.1.2014, http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0141022913002044). Bioremediacija s pesticidi okužene vode z uporabo encima, ki razgrajuje organofosfate in je vezan na netkan poliesterski tekstil. Mitja Crček,<br /> # Biodegradation of atrazine by three transgenic grasses and alfalfa expressing a modified bacterial atrazine chlorohydrolase gene (A. W. Vail ''et al.''; Transgenic Research, 29. 11. 2014; http://link.springer.com/article/10.1007/s11248-014-9851-7). Biorazgradnja atrazina s tremi transgenskimi travami in alfalfo, ki izražajo gen za modificirano bakterijsko atrazin klorohidrolazo. Mirjam Kmetič, <br /> <br /> '''Terapevtiki'''&lt;br&gt;<br /> # Mind-controlled transgene expression by a wireless-powered optogenetic designer cell implant (M. Folcher; Nature Communications 5, 1–11, 2014; http://www.nature.com/ncomms/2014/141111/ncomms6392/full/ncomms6392.html) Z EEG nadzorovano izražanje transgena preko brezžično napajanega optogenetskega celičnega vsadka. Luka Smole, 9. marca 2015<br /> <br /> '''Encimi'''&lt;br&gt;<br /> <br /> # Construction of efficient xylose utilizing ''Pichia pastoris'' for industrial enzyme production (Li ''et al''; Microbial Cell Factories 14:22, 1-10, 2015; http://www.microbialcellfactories.com/content/14/1/22). Priprava ''Pichie pastoris'', ki učinkovito uporablja ksilozo, za industrijsko proizvodnjo encimov. Špela Tomaž<br /> <br /> '''Protitelesa'''&lt;br&gt; <br /> <br /> # Functional mutations in and characterization of VHH against Helicobacter pylori urease (R. Hoseinpoor ''et al''; Applied Biochemistry and Biotechnology 172, 3079-3091, 2014; http://link.springer.com/article/10.1007/s12010-014-0750-4). Funkcionalne mutacije in karakterizacija VHH proti ureazi ''Helicobacter pylori''. Marko Radojković, 9. marca 2015<br /> #Ethanol precipitation for purification of recombinant antibodies (A. Tscheliessnig ''et al''; Journal of Biotechnology 188, 17-28, 2014; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0168165614007810). Čiščenje rekombinantnih protiteles z obarjanjem z etanolom. Urška Rauter, 10. marca 2015<br /> <br /> '''Cepiva'''&lt;br&gt;<br /> <br /> # A novel “priming-boosting” strategy for immune interventions in cervical cancer (S. Liao et al.; Molecular Immunology 64, 295-305, 2015, http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0161589014003460. Nova &quot;priming-boosting&quot; strategija za imunsko posredovanje pri raku materničnega vratu. Anita Kustec, 11. marca 2015<br /> # Potentiation of anthrax vaccines using protective antigen-expressing viral replicon vectors (H.C. Wang et al.; Immunology letters 163, 206-213, 2015, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25102364 ) Izboljšava cepiv proti antraksu z uporabo iz virusnih replikonov izvedenih vektorjev, ki omogočajo izražanje zaščitnega antigena. Daša Pavc<br /> <br /> '''Male molekule in polimeri'''&lt;br&gt;<br /> Iza Ogris&lt;br&gt;<br /> Maja Grdadolnik<br /> <br /> '''Pretvorba biomase'''&lt;br&gt;<br /> <br /> '''Metabolično inženirstvo'''&lt;br&gt;<br /> <br /> # Metabolic engineering of Saccharomyces cerevisiae for production of fatty acid-derived biofuels and chemicals (Weerawat Runguphana, Jay D. Keasling; Metabolic Engineering, vol 21, January 2014, Pages 103–113; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1096717613000670). Metabolično inženirstvo ''Saccharomyces cerevisiae'' za proizvodnjo derivatov maščobnih kislin, ki so primerni za biogorivo in kemikalije. Dominik Kert, 9. marca 2015<br /> <br /> # Metabolic engineering of Klebsiella pneumoniae for the production of cis,cis-muconic acid (Jung,H.-M. Jung,M.-Y. Oh, M.-K.;Applied Microbiology and Biotechnology, Published online: 14 February 2015; http://link.springer.com/article/10.1007/s00253-015-6442-3). Metabolno inženirstvo Klebsiella pneumoniae za produkcijo cis,cis-mukonične kiline. Jure Zabret, 15. marca 2015<br /> '''Biološki viri energije'''&lt;br&gt;</div>

Jure Zabret