Wiki FKKT - User contributions [en]

Gutail Floractory - probiotične bakterije za zaščito črevesja pred vnetji

2022-04-12T18:23:53Z

Karmenmlinar: /* Terapevtske tarče */

Projekt »Gutail Floractory« je sodeloval na tekmovanju iGEM 2021 ter se uvrstil med najboljših 10 v kategoriji znanost in tehnologija. Zasnovala ga je skupina SZU-CHINA, ki je želela narediti 'koktejl' prilagojenih in gensko spremenjenih črevesnih probiotikov kot adjuvans za lajšanje kronične vnetne črevesne bolezni (KVČB). Predstavitev projekta je dostopna na spletni strani: [https://2021.igem.org/Team:SZU-China Team:SZU-China]

== UVOD ==
KVČB je ponavljajoča in nespecifična vnetna reakcija v črevesni sluznici. Organi gastrointestinalnega (GI) trakta imajo posledično oslabljeno/okvarjeno delovanje, kar vodi do simptomov, kot so dolgotrajna driska, bolečine v trebuhu, rektalna krvavitev, izguba teže in utrujenost. KVČB delimo na '''Crohnovo bolezen (CB)''' in '''ulcerozni kolitis (UK)'''. CB lahko prizadene katerikoli del GI trakta in vnetje se lahko razširi na celotno debelino črevesne stene. UK je omejen na debelo črevo in rektum, vnetje pa se pojavi le v notranji plasti črevesne sluznice. V redkih primerih je med CB in UK težko ločiti, zato takrat govorimo o '''intermediarnem kolitisu''' [2]. Natančna patogeneza KVČB je še vedno neznana, v splošnem pa velja, da je vnetje posledica nepravilnega imunskega odziva sluznice na črevesno floro v genetsko dovzetnih posameznikih. Eden glavnih patoloških mehanizmov KVČB je neravnovesje črevesne flore. Bolezen se v največjem merilu pojavlja v razvitih državah in prizadene 0,5 % populacije, v prihodnosti pa bo število bolnikov postopoma naraščalo [3]. Zdravljenje poteka z različnimi zdravili in striktno prehransko dieto. Glavni cilj je remisija (odsotnost simptomov), same bolezni pa ni mogoče popolnoma pozdraviti [2]. Konvencionalno zdravljenje z zdravili učinkuje le v omejenem obsegu, neželeni stranski učinki, visoki stroški in dolgotrajna zdravljenja, pa vplivajo na bolnikovo materialno in duševno stanje ter tudi na kakovost njihovega življenja. Poleg tega so bolniki s KVČB izpostavljeni večjemu tveganju za raka, krvne strdke in bolezni jeter [1,2].

== CILJI PROJEKTA ==
KVČB otežuje življenje že več kot 10 milijonom ljudi iz vseh družbenih slojev. V predhodnih študijah je bilo ugotovljeno, da uporaba probiotikov, kot so mlečnokislinske bakterije in bifidobakterije, ob običajnem zdravljenju dosega boljše rezultate. V okviru projekta »Gutail Floractory« so zato želeli razviti bakterijski adjuvans za lajšanje bolnikovega nelagodja v času okrevanja, dolgoročno izboljšanje kakovosti bolnikovega življenja in celo zdravljenje bolnikov, ki se ne odzivajo na konvencionalne terapije. Šlo bi za pomožno vzdrževalno zdravljenje KVČB s koktejlom modificiranih inženirskih bakterij, ki bi jih vakuumsko liofilizirali in dozirali v kapsulah. Želeli so poiskati dejavnike, ki so povezani z napredovanjem bolezni KVČB, in izbrati štiri za potencialne tarče koktejl terapije. Glede na izbrane tarče bi oblikovali terapevtske elemente. Le-te bi predhodno modularizirali, s poudarkom na zamenljivosti promotorjev in odprtih bralnih okvirjev, da bi lahko poljubno spreminjali terapevtske gene in metode njihovega izražanja [1].

== IZVEDBA ==

=== Izbira šasije ===

Zaradi zahtevnosti delovanja so za šasijo izbrali več bakterij [1]:

1) '''''E. coli DH5α/BL21(DE3)''''' – pogosto uporabljene inženirske bakterije, upali so, da v njih sistem ne glede na zahtevnost deluje.

2) '''''E. coli Nissle 1917''''' – spada med probiotike, je nepatogena bakterija in lahko kolonizira. Lahko izraža mikrobektin, ki zavira rast nekaterih mikroorganizmov v vnetem črevesju.

3) '''''Lactococcus lactis''''' – mlečnokislinska bakterija, spada med probiotike. Pri UK je njihovo število zmanjšano, kar je lahko tesno povezano s patogenezo KVČB. Povezuje se jih tudi s spodbujanjem proizvodnje kratkoverižnih maščobnih kislin. Zaradi časovne omejitev te šasije niso uspeli testirati.

===Terapevtske tarče ===

V raziskavi so našli veliko število dejavnikov, ki so povezani z napredovanjem KVČB. Med njimi so za terapevtske tarče koktejl terapije, na podlagi najboljše izvedljivosti le-te, izbrali štiri: spremembe v proizvodnji maslene kisline, lipopolisaharida in antibakterijskega proteina LL-37, superoksid dismutaze (SOD) in hidrolaze žolčnih soli (angl. bile salt hydrolase, BSH).

'''''Maslena kislina:'''''
Kratkoverižna maščobna kislina, katere proizvodnja je pri bolnikih s KVČB zmanjšana. Maščobne kisline so izjemno pomembne pri ohranjanju zdravja debelega črevesa, saj med drugimi predstavljajo glavni energijski vir za epitelijske celice in zavirajo vnetni odziv. Maslena kislina velja za idealno zdravilo za zdravljenje KVČB, vendar je ni mogoče dozirati peroralno. V sintezni poti maščobnih kislin družina tioesteraz prekine podaljšan cikel maščobnih kislin in sprostijo se proste maščobne kisline, katerih dolžina je odvisna od vrste tioesteraze. Za terapevtski gen so izbrali tioesterazo Tes4 iz ''Bacteroides polymorpha'' (biokocka: BBa_K3838613) [1,4].

'''''LL-37:'''''
Pri bolnikih z UK je zaradi neuravnotežene črevesne flore spremenjena pregradna funkcija in prepustnost sluznice, zato gramnegativne bakterije vstopijo v limfni in krvni sistem, njihov lipopolisaharid pa stimulira imunski sistem. LL-37 je antibakterijski peptid, ki ga izločajo človeške imunske celice in zavira nekatere škodljive bakterije. Koncentracija tega peptida (1-5 μg/ml), ki se običajno nahaja pri odraslih na površini sluznice, je prenizka za neposredno uničenje bakterij, vendar pa sodeluje pri imunski regulaciji in ščiti človeško telo pred endotoksemijo. Verjamejo, da bi z bakterijami, ki eksokrino izločajo LL-37, izboljšali vnetno stanje (biokocka: BBa_K3838555) [1,5].

'''''SOD:'''''
ROS poškodujejo lipide, proteine, nukleinske kisline, uničijo integriteto epitelijskih celic, so vključeni v različne znotrajcelične signalne poti in spodbujajo vnetni odziv. Črevesna sluznica ima kompleksen antioksidativni sistem, v katerem je SOD začetni encim za delovanje celotnega sistema. Pri bolnikih s KVČB je ta sistem okvarjen. Neposredno povečanje količine SOD v bolnikovem črevesnem traktu ni mogoče, zaradi zelo kratke razpolovne dobe. Za dolgoročne in stabilne terapevtske učinke je zato potreben eksokrini ekspresijski bakterijski sistem (biokocka: BBa_K3838233) [1,6].

'''''BSH:'''''
BSH katalizira hidrolizo konjugiranih žolčnih soli, pri čemer se sproščajo prosta žolčna kislina in aminokisline. Aktivnost BSH v prebavilih izvira predvsem iz ''Firmicutes, Bacteroides'' in ''Actinomycetes'', njihova številčnost pa je pri bolnikih s KVČB zmanjšana, kar vodi do motene presnove žolčnih kislin in povečanega vnetnega odziva. Zaužitje probiotikov z aktivnostjo BSH lahko spodbudi biotransformacijo žolčnih soli v črevesju in s tem ublaži vnetni odziv (biokocka: BBa_K3838666) [1,7].

=== Izražanje ===

Že na začetku projekta so vedeli, da uporaba promotorja T7 ne bo mogoča. Zato so izbrali najpogostejši močni konstitutivni promotor J23100, ki je sicer manj učinkovit od ekspresijskega sistema s T7 promotorjem, vendar kljub temu zagotovi zadostno in stabilno izražanje terapevtskih učinkovin.

Pri bolnikih s KVČB je zaradi kopičenja ocetne in mlečne kisline v debelem črevesju okolje kislo. Za dosego potrebne regulativne funkcije so uporabili promotor PrcfB ekipe SZPT-China 2019 [1]. Gre za izboljšano različico kislinskega promotorja p170 z višjo učinkovitostjo izražanja. Promotorju p170 je dodana operatorska regija, na katero se ob kislih pogojih veže RcfB in inducira izražanje [8]. RcfB je endogeni protein mlečnokislinskih bakterij, v E. coli pa so ga vnesli pod konstitutivnim promotorjem s pomožnim vektorjem [1].

Vse štiri terapevtske gene so vnesli v ekspresijske vektorje (pUC18/pJSG/pET) s konstitutivnim promotorjem in transformirali izbrane bakterije: ''BL21(DE3), DH5α'' in ''Nissle 1917''. Uspešnost in pravilnost izražanja proteina v pripravljenih bakterijah so preverili z gelsko elektroforezo, prenosom po Westernu in afinitetno kromatografijo. S tekočinsko kromatografijo so neposredno merili proizvodnjo terapevtskega produkta. Učinkovitost bakterij pri blaženju vnetnih simptomov pa so preverili z uporabo ustrezno pripravljene celične linije THP-1, ki je služila za tipičen model vnetja.

Terapevtski element Tes4, LL-37 on BSH so izražali v ''DH5α'' in ''Nissle 1917''. Potrdili so izražanje Tes4 s povečano koncentracijo maslene kisline v obeh šasijah. V obeh šasijah se je izražal tudi BSH, izražanje LL-37 na proteinski ravni pa so preverili in potrdili le v ''DH5α''. Izražanje SOD so raziskovali in tudi potrdili v vseh treh celicah, vendar v ''DH5α'' izločanje ni bilo eksokrino. S pomočjo celične linije THP-1, so za pripravljene bakterije ''Nissle 1917'' s posameznim terapevtskim elementom uspešno potrdili zaviralne učinke na vnetje [1].

=== Varnost ===

Koktejl terapija vključuje kolonizacijo ustvarjenih bakterij v debelem črevesu, zato so morali poskrbeti za njihovo varno uporabo preko samomorilskega stikala in varne odpornosti.

Pripravljene bakterije niso smele vsebovati genov za odpornost proti antibiotikom, zato so v bakterije vnesli zapis za proteine toplotnega šoka (BBa_K3838777) in gen za odpornost proti triklosanu (BBa_K3838789). Pri toplotnem presejanju pri 55°C preživijo le bakterije, ki izražajo proteine toplotnega šoka, le te pa bi bakterijam pomagali tudi pri kolonizaciji v kislem okolju debelega črevesja. Dodatno presejanje se opravi s triklosanom, ki je varna antibakterijska snov in je odobrena s strani FDA.

Ustvarjene bakterije so zasnovali tako, da v zunanjem okolju, kjer je koncentracija glukoze nižja kot v črevesju, ne preživijo. Uporabili so promotor PT-αcrp, ki se odzove na spremembe v koncentraciji glukoze, in samomorilski gen mazF, ki zapisuje endoribonukleazo. Le-ta cepi RNA in povzroči celično smrt brez lize (biokocka: BBa_K3838654).

Želeli so preprečiti še prenos terapevtskih bakterij v kri, kjer je koncentracija fosfatov bistveno večja kot v črevesju. Uporabili so promotor PhoB, ki ga regulira endogeni na fosfat občutljiv faktor iz E. coli. Pri nizkih koncentracijah fosfata ga aktivira, pri visokih pa zavira. Aktiviran promotor PhoB sproži izražanje proteina tetR, ki pa zavira promotor pTet, pod katerim se izražal samomorilski gen (biokocka: BBa_K3838321) [1].

== KONČNI PRODUKT ==

Njihova dolgoročna želja je vzpostaviti koncept imenovan ''zaprta zanka zdravljenja''. Za vsakega bolnika posebej bi glede na njegovo situacijo prilagodili razmerje terapevtskih elementov v koktejl terapiji in tako dosegli natančno zdravljenje več dejavnikov. Razmerje bi prilagajali tako, da bi spreminjali deleže inženirskih bakterij s posameznim terapevtskim elementom ali uporabljali različne promotorje. Ustrezno razmerje bi določali na podlagi rednega zbiranja vzorcev pacientovega blata in analize metagenomskega zaporedja, s katero bi spremljali njihovo črevesno floro in zdravje. Trenutne naprave za zbiranje blata imajo veliko pomanjkljivosti (npr. nezmožnost zbiranja tekočega blata), zato so v sklopu projekta zasnovali komplet za vzorčenje blata, ki bi ga uporabljali tako pacienti kot tudi bolnišnice.

Želijo vzpostaviti tudi spletno platformo, ki bi glede na bolnikove rezultate analiz blata in dnevnih zapisov njihove prehrane, predpisovala ustrezno dieto. Poleg tega pa bi platforma služila uporabnikom tudi za medsebojno komunikacijo in jim pomagala pri psihični stiski [1].

== VIRI ==

[1] “Team:SZU-CHINA - 2021.igem.org.” [Online]. Available: https://2021.igem.org/Team:SZU-China. [Accessed: 7-Apr-2022].

[2] Crohn's & colitis foundation of America: The facts about Inflammatory Bowel Diseases. New York, 2014.

[3] Yue B, Luo X, Yu Z, Mani S, Wang Z, Dou W. Inflammatory Bowel Disease: A Potential Result from the Collusion between Gut Microbiota and Mucosal Immune System. Microorganisms. 2019, 7(10), 440.

[4] Van Immerseel F, Ducatelle R, De Vos M, Boon N, Van De Wiele T, Verbeke K, Rutgeerts P, Sas B, Louis P, Flint HJ. Butyric acid-producing anaerobic bacteria as a novel probiotic treatment approach for inflammatory bowel disease. J Med Microbiol. 2010, 59(Pt 2), 141-143.

[5] Mookherjee N, Brown KL, Bowdish DM, Doria S, Falsafi R, Hokamp K, Roche FM, Mu R, Doho GH, Pistolic J, Powers JP, Bryan J, Brinkman FS, Hancock RE. Modulation of the TLR-mediated inflammatory response by the endogenous human host defense peptide LL-37. J Immunol. 2006, 176(4), 2455-64.

[6] Kruidenier L, Kuiper I, Lamers CB, et al. Intestinal oxidative damage in inflammatory bowel disease: semi-quantification, localization, and association with mucosal antioxidants. J Pathol. 2003, 201, 28Y36.

[7] Han W, Mercenier A, Ait-Belgnaoui A, Pavan S, Lamine F, van Swam II, Kleerebezem M, Salvador-Cartier C, Hisbergues M, Bueno L, Theodorou V, Fioramonti J. Improvement of an experimental colitis in rats by lactic acid bacteria producing superoxide dismutase. Inflamm Bowel Dis. 2006, 12(11), 1044-52.

[8] Akyol, I., Comlekcioglu, U., Karakas, A. et al. Regulation of the acid induciblercfB promoter inLactococcus lactis subsp.lactis . Ann. Microbiol. 2008, 58, 269.

Gutail Floractory - probiotične bakterije za zaščito črevesja pred vnetji

2022-04-12T18:22:51Z

Karmenmlinar: /* Izražanje */

Projekt »Gutail Floractory« je sodeloval na tekmovanju iGEM 2021 ter se uvrstil med najboljših 10 v kategoriji znanost in tehnologija. Zasnovala ga je skupina SZU-CHINA, ki je želela narediti 'koktejl' prilagojenih in gensko spremenjenih črevesnih probiotikov kot adjuvans za lajšanje kronične vnetne črevesne bolezni (KVČB). Predstavitev projekta je dostopna na spletni strani: [https://2021.igem.org/Team:SZU-China Team:SZU-China]

== UVOD ==
KVČB je ponavljajoča in nespecifična vnetna reakcija v črevesni sluznici. Organi gastrointestinalnega (GI) trakta imajo posledično oslabljeno/okvarjeno delovanje, kar vodi do simptomov, kot so dolgotrajna driska, bolečine v trebuhu, rektalna krvavitev, izguba teže in utrujenost. KVČB delimo na '''Crohnovo bolezen (CB)''' in '''ulcerozni kolitis (UK)'''. CB lahko prizadene katerikoli del GI trakta in vnetje se lahko razširi na celotno debelino črevesne stene. UK je omejen na debelo črevo in rektum, vnetje pa se pojavi le v notranji plasti črevesne sluznice. V redkih primerih je med CB in UK težko ločiti, zato takrat govorimo o '''intermediarnem kolitisu''' [2]. Natančna patogeneza KVČB je še vedno neznana, v splošnem pa velja, da je vnetje posledica nepravilnega imunskega odziva sluznice na črevesno floro v genetsko dovzetnih posameznikih. Eden glavnih patoloških mehanizmov KVČB je neravnovesje črevesne flore. Bolezen se v največjem merilu pojavlja v razvitih državah in prizadene 0,5 % populacije, v prihodnosti pa bo število bolnikov postopoma naraščalo [3]. Zdravljenje poteka z različnimi zdravili in striktno prehransko dieto. Glavni cilj je remisija (odsotnost simptomov), same bolezni pa ni mogoče popolnoma pozdraviti [2]. Konvencionalno zdravljenje z zdravili učinkuje le v omejenem obsegu, neželeni stranski učinki, visoki stroški in dolgotrajna zdravljenja, pa vplivajo na bolnikovo materialno in duševno stanje ter tudi na kakovost njihovega življenja. Poleg tega so bolniki s KVČB izpostavljeni večjemu tveganju za raka, krvne strdke in bolezni jeter [1,2].

== CILJI PROJEKTA ==
KVČB otežuje življenje že več kot 10 milijonom ljudi iz vseh družbenih slojev. V predhodnih študijah je bilo ugotovljeno, da uporaba probiotikov, kot so mlečnokislinske bakterije in bifidobakterije, ob običajnem zdravljenju dosega boljše rezultate. V okviru projekta »Gutail Floractory« so zato želeli razviti bakterijski adjuvans za lajšanje bolnikovega nelagodja v času okrevanja, dolgoročno izboljšanje kakovosti bolnikovega življenja in celo zdravljenje bolnikov, ki se ne odzivajo na konvencionalne terapije. Šlo bi za pomožno vzdrževalno zdravljenje KVČB s koktejlom modificiranih inženirskih bakterij, ki bi jih vakuumsko liofilizirali in dozirali v kapsulah. Želeli so poiskati dejavnike, ki so povezani z napredovanjem bolezni KVČB, in izbrati štiri za potencialne tarče koktejl terapije. Glede na izbrane tarče bi oblikovali terapevtske elemente. Le-te bi predhodno modularizirali, s poudarkom na zamenljivosti promotorjev in odprtih bralnih okvirjev, da bi lahko poljubno spreminjali terapevtske gene in metode njihovega izražanja [1].

== IZVEDBA ==

=== Izbira šasije ===

Zaradi zahtevnosti delovanja so za šasijo izbrali več bakterij [1]:

1) '''''E. coli DH5α/BL21(DE3)''''' – pogosto uporabljene inženirske bakterije, upali so, da v njih sistem ne glede na zahtevnost deluje.

2) '''''E. coli Nissle 1917''''' – spada med probiotike, je nepatogena bakterija in lahko kolonizira. Lahko izraža mikrobektin, ki zavira rast nekaterih mikroorganizmov v vnetem črevesju.

3) '''''Lactococcus lactis''''' – mlečnokislinska bakterija, spada med probiotike. Pri UK je njihovo število zmanjšano, kar je lahko tesno povezano s patogenezo KVČB. Povezuje se jih tudi s spodbujanjem proizvodnje kratkoverižnih maščobnih kislin. Zaradi časovne omejitev te šasije niso uspeli testirati.

===Terapevtske tarče ===

V raziskavi so našli veliko število dejavnikov, ki so povezani z napredovanjem KVČB. Med njimi so za terapevtske tarče koktejl terapije, na podlagi najboljše izvedljivosti le-te, izbrali štiri: spremembe v proizvodnji maslene kisline, lipopolisaharida in antibakterijskega proteina LL-37, superoksid dismutaze (SOD) in hidrolaze žolčnih soli (angl. bile salt hydrolase, BSH).

'''''Maslena kislina:'''''
Kratkoverižna maščobna kislina, katere proizvodnja je pri bolnikih s KVČB zmanjšana. Maščobne kisline so izjemno pomembne pri ohranjanju zdravja debelega črevesa, saj med drugimi predstavljajo glavni energijski vir za epitelijske celice in zavirajo vnetni odziv. Maslena kislina velja za idealno zdravilo za zdravljenje KVČB, vendar je ni mogoče dozirati peroralno. V sintezni poti maščobnih kislin družina tioesteraz prekine podaljšan cikel maščobnih kislin in sprostijo se proste maščobne kisline, katerih dolžina je odvisna od vrste tioesteraze. Za terapevtski gen so izbrali tioesterazo Tes4 iz ''Bacteroides polymorpha'' (biokocka: BBa_K3838613) [1,4].

'''''LL-37:'''''
Pri bolnikih z UK je zaradi neuravnotežene črevesne flore spremenjena pregradna funkcija in prepustnost sluznice, zato gramnegativne bakterije vstopijo v limfni in krvni sistem, njihov lipopolisaharid pa stimulira imunski sistem. LL-37 je antibakterijski peptid, ki ga izločajo človeške imunske celice in zavira nekatere škodljive bakterije. Koncentracija tega peptida (1-5 μg/ml), ki se običajno nahaja pri odraslih na površini sluznice, je prenizka za neposredno uničenje bakterij, vendar pa sodeluje pri imunski regulaciji in ščiti človeško telo pred endotoksemijo. Verjamejo, da bi z bakterijami, ki eksokrino izločajo LL-37, izboljšali vnetno stanje (biokocka: BBa_K3838555) [1,5].

'''''SOD:'''''
ROS poškodujejo lipide, proteine, nukleinske kisline, uničijo integriteto epitelijskih celic, so vključeni v različne znotrajcelične signalne poti in spodbujajo vnetni odziv. Črevesna sluznica ima kompleksen antioksidativni sistem, v katerem je SOD začetni encim za delovanje celotnega sistema. Pri bolnikih s KVČB je ta sistem okvarjen. Neposredno povečanje količine SOD v bolnikovem črevesnem traktu ni mogoče, zaradi zelo kratke razpolovne dobe. Za dolgoročne in stabilne terapevtske učinke je zato potreben eksokrini ekspresijski bakterijski sistem (biokocka: BBa_K3838233) [1,6].

'''''BSH:'''''
BSH katalizira hidrolizo kombiniranih žolčnih soli, pri čemer se sproščajo prosta žolčna kislina in aminokisline. Aktivnost BSH v prebavilih izvira predvsem iz ''Firmicutes, Bacteroides'' in ''Actinomycetes'', njihova številčnost pa je pri bolnikih s KVČB zmanjšana, kar vodi do motene presnove žolčnih kislin in povečanega vnetnega odziva. Zaužitje probiotikov z aktivnostjo BSH lahko spodbudi biotransformacijo žolčnih soli v črevesju in s tem ublaži vnetni odziv (biokocka: BBa_K3838666) [1,7].

=== Izražanje ===

Že na začetku projekta so vedeli, da uporaba promotorja T7 ne bo mogoča. Zato so izbrali najpogostejši močni konstitutivni promotor J23100, ki je sicer manj učinkovit od ekspresijskega sistema s T7 promotorjem, vendar kljub temu zagotovi zadostno in stabilno izražanje terapevtskih učinkovin.

Pri bolnikih s KVČB je zaradi kopičenja ocetne in mlečne kisline v debelem črevesju okolje kislo. Za dosego potrebne regulativne funkcije so uporabili promotor PrcfB ekipe SZPT-China 2019 [1]. Gre za izboljšano različico kislinskega promotorja p170 z višjo učinkovitostjo izražanja. Promotorju p170 je dodana operatorska regija, na katero se ob kislih pogojih veže RcfB in inducira izražanje [8]. RcfB je endogeni protein mlečnokislinskih bakterij, v E. coli pa so ga vnesli pod konstitutivnim promotorjem s pomožnim vektorjem [1].

Vse štiri terapevtske gene so vnesli v ekspresijske vektorje (pUC18/pJSG/pET) s konstitutivnim promotorjem in transformirali izbrane bakterije: ''BL21(DE3), DH5α'' in ''Nissle 1917''. Uspešnost in pravilnost izražanja proteina v pripravljenih bakterijah so preverili z gelsko elektroforezo, prenosom po Westernu in afinitetno kromatografijo. S tekočinsko kromatografijo so neposredno merili proizvodnjo terapevtskega produkta. Učinkovitost bakterij pri blaženju vnetnih simptomov pa so preverili z uporabo ustrezno pripravljene celične linije THP-1, ki je služila za tipičen model vnetja.

Terapevtski element Tes4, LL-37 on BSH so izražali v ''DH5α'' in ''Nissle 1917''. Potrdili so izražanje Tes4 s povečano koncentracijo maslene kisline v obeh šasijah. V obeh šasijah se je izražal tudi BSH, izražanje LL-37 na proteinski ravni pa so preverili in potrdili le v ''DH5α''. Izražanje SOD so raziskovali in tudi potrdili v vseh treh celicah, vendar v ''DH5α'' izločanje ni bilo eksokrino. S pomočjo celične linije THP-1, so za pripravljene bakterije ''Nissle 1917'' s posameznim terapevtskim elementom uspešno potrdili zaviralne učinke na vnetje [1].

=== Varnost ===

Koktejl terapija vključuje kolonizacijo ustvarjenih bakterij v debelem črevesu, zato so morali poskrbeti za njihovo varno uporabo preko samomorilskega stikala in varne odpornosti.

Pripravljene bakterije niso smele vsebovati genov za odpornost proti antibiotikom, zato so v bakterije vnesli zapis za proteine toplotnega šoka (BBa_K3838777) in gen za odpornost proti triklosanu (BBa_K3838789). Pri toplotnem presejanju pri 55°C preživijo le bakterije, ki izražajo proteine toplotnega šoka, le te pa bi bakterijam pomagali tudi pri kolonizaciji v kislem okolju debelega črevesja. Dodatno presejanje se opravi s triklosanom, ki je varna antibakterijska snov in je odobrena s strani FDA.

Ustvarjene bakterije so zasnovali tako, da v zunanjem okolju, kjer je koncentracija glukoze nižja kot v črevesju, ne preživijo. Uporabili so promotor PT-αcrp, ki se odzove na spremembe v koncentraciji glukoze, in samomorilski gen mazF, ki zapisuje endoribonukleazo. Le-ta cepi RNA in povzroči celično smrt brez lize (biokocka: BBa_K3838654).

Želeli so preprečiti še prenos terapevtskih bakterij v kri, kjer je koncentracija fosfatov bistveno večja kot v črevesju. Uporabili so promotor PhoB, ki ga regulira endogeni na fosfat občutljiv faktor iz E. coli. Pri nizkih koncentracijah fosfata ga aktivira, pri visokih pa zavira. Aktiviran promotor PhoB sproži izražanje proteina tetR, ki pa zavira promotor pTet, pod katerim se izražal samomorilski gen (biokocka: BBa_K3838321) [1].

== KONČNI PRODUKT ==

Njihova dolgoročna želja je vzpostaviti koncept imenovan ''zaprta zanka zdravljenja''. Za vsakega bolnika posebej bi glede na njegovo situacijo prilagodili razmerje terapevtskih elementov v koktejl terapiji in tako dosegli natančno zdravljenje več dejavnikov. Razmerje bi prilagajali tako, da bi spreminjali deleže inženirskih bakterij s posameznim terapevtskim elementom ali uporabljali različne promotorje. Ustrezno razmerje bi določali na podlagi rednega zbiranja vzorcev pacientovega blata in analize metagenomskega zaporedja, s katero bi spremljali njihovo črevesno floro in zdravje. Trenutne naprave za zbiranje blata imajo veliko pomanjkljivosti (npr. nezmožnost zbiranja tekočega blata), zato so v sklopu projekta zasnovali komplet za vzorčenje blata, ki bi ga uporabljali tako pacienti kot tudi bolnišnice.

Želijo vzpostaviti tudi spletno platformo, ki bi glede na bolnikove rezultate analiz blata in dnevnih zapisov njihove prehrane, predpisovala ustrezno dieto. Poleg tega pa bi platforma služila uporabnikom tudi za medsebojno komunikacijo in jim pomagala pri psihični stiski [1].

== VIRI ==

[1] “Team:SZU-CHINA - 2021.igem.org.” [Online]. Available: https://2021.igem.org/Team:SZU-China. [Accessed: 7-Apr-2022].

[2] Crohn's & colitis foundation of America: The facts about Inflammatory Bowel Diseases. New York, 2014.

[3] Yue B, Luo X, Yu Z, Mani S, Wang Z, Dou W. Inflammatory Bowel Disease: A Potential Result from the Collusion between Gut Microbiota and Mucosal Immune System. Microorganisms. 2019, 7(10), 440.

[4] Van Immerseel F, Ducatelle R, De Vos M, Boon N, Van De Wiele T, Verbeke K, Rutgeerts P, Sas B, Louis P, Flint HJ. Butyric acid-producing anaerobic bacteria as a novel probiotic treatment approach for inflammatory bowel disease. J Med Microbiol. 2010, 59(Pt 2), 141-143.

[5] Mookherjee N, Brown KL, Bowdish DM, Doria S, Falsafi R, Hokamp K, Roche FM, Mu R, Doho GH, Pistolic J, Powers JP, Bryan J, Brinkman FS, Hancock RE. Modulation of the TLR-mediated inflammatory response by the endogenous human host defense peptide LL-37. J Immunol. 2006, 176(4), 2455-64.

[6] Kruidenier L, Kuiper I, Lamers CB, et al. Intestinal oxidative damage in inflammatory bowel disease: semi-quantification, localization, and association with mucosal antioxidants. J Pathol. 2003, 201, 28Y36.

[7] Han W, Mercenier A, Ait-Belgnaoui A, Pavan S, Lamine F, van Swam II, Kleerebezem M, Salvador-Cartier C, Hisbergues M, Bueno L, Theodorou V, Fioramonti J. Improvement of an experimental colitis in rats by lactic acid bacteria producing superoxide dismutase. Inflamm Bowel Dis. 2006, 12(11), 1044-52.

[8] Akyol, I., Comlekcioglu, U., Karakas, A. et al. Regulation of the acid induciblercfB promoter inLactococcus lactis subsp.lactis . Ann. Microbiol. 2008, 58, 269.

Gutail Floractory - probiotične bakterije za zaščito črevesja pred vnetji

2022-04-10T18:16:04Z

Karmenmlinar:

Projekt »Gutail Floractory« je sodeloval na tekmovanju iGEM 2021 ter se uvrstil med najboljših 10 v kategoriji znanost in tehnologija. Zasnovala ga je skupina SZU-CHINA, ki je želela narediti 'koktejl' prilagojenih in gensko spremenjenih črevesnih probiotikov kot adjuvans za lajšanje kronične vnetne črevesne bolezni (KVČB). Predstavitev projekta je dostopna na spletni strani: [https://2021.igem.org/Team:SZU-China Team:SZU-China]

== UVOD ==
KVČB je ponavljajoča in nespecifična vnetna reakcija v črevesni sluznici. Organi gastrointestinalnega (GI) trakta imajo posledično oslabljeno/okvarjeno delovanje, kar vodi do simptomov, kot so dolgotrajna driska, bolečine v trebuhu, rektalna krvavitev, izguba teže in utrujenost. KVČB delimo na '''Crohnovo bolezen (CB)''' in '''ulcerozni kolitis (UK)'''. CB lahko prizadene katerikoli del GI trakta in vnetje se lahko razširi na celotno debelino črevesne stene. UK je omejen na debelo črevo in rektum, vnetje pa se pojavi le v notranji plasti črevesne sluznice. V redkih primerih je med CB in UK težko ločiti, zato takrat govorimo o '''intermediarnem kolitisu''' [2]. Natančna patogeneza KVČB je še vedno neznana, v splošnem pa velja, da je vnetje posledica nepravilnega imunskega odziva sluznice na črevesno floro v genetsko dovzetnih posameznikih. Eden glavnih patoloških mehanizmov KVČB je neravnovesje črevesne flore. Bolezen se v največjem merilu pojavlja v razvitih državah in prizadene 0,5 % populacije, v prihodnosti pa bo število bolnikov postopoma naraščalo [3]. Zdravljenje poteka z različnimi zdravili in striktno prehransko dieto. Glavni cilj je remisija (odsotnost simptomov), same bolezni pa ni mogoče popolnoma pozdraviti [2]. Konvencionalno zdravljenje z zdravili učinkuje le v omejenem obsegu, neželeni stranski učinki, visoki stroški in dolgotrajna zdravljenja, pa vplivajo na bolnikovo materialno in duševno stanje ter tudi na kakovost njihovega življenja. Poleg tega so bolniki s KVČB izpostavljeni večjemu tveganju za raka, krvne strdke in bolezni jeter [1,2].

== CILJI PROJEKTA ==
KVČB otežuje življenje že več kot 10 milijonom ljudi iz vseh družbenih slojev. V predhodnih študijah je bilo ugotovljeno, da uporaba probiotikov, kot so mlečnokislinske bakterije in bifidobakterije, ob običajnem zdravljenju dosega boljše rezultate. V okviru projekta »Gutail Floractory« so zato želeli razviti bakterijski adjuvans za lajšanje bolnikovega nelagodja v času okrevanja, dolgoročno izboljšanje kakovosti bolnikovega življenja in celo zdravljenje bolnikov, ki se ne odzivajo na konvencionalne terapije. Šlo bi za pomožno vzdrževalno zdravljenje KVČB s koktejlom modificiranih inženirskih bakterij, ki bi jih vakuumsko liofilizirali in dozirali v kapsulah. Želeli so poiskati dejavnike, ki so povezani z napredovanjem bolezni KVČB, in izbrati štiri za potencialne tarče koktejl terapije. Glede na izbrane tarče bi oblikovali terapevtske elemente. Le-te bi predhodno modularizirali, s poudarkom na zamenljivosti promotorjev in odprtih bralnih okvirjev, da bi lahko poljubno spreminjali terapevtske gene in metode njihovega izražanja [1].

== IZVEDBA ==

=== Izbira šasije ===

Zaradi zahtevnosti delovanja so za šasijo izbrali več bakterij [1]:

1) '''''E. coli DH5α/BL21(DE3)''''' – pogosto uporabljene inženirske bakterije, upali so, da v njih sistem ne glede na zahtevnost deluje.

2) '''''E. coli Nissle 1917''''' – spada med probiotike, je nepatogena bakterija in lahko kolonizira. Lahko izraža mikrobektin, ki zavira rast nekaterih mikroorganizmov v vnetem črevesju.

3) '''''Lactococcus lactis''''' – mlečnokislinska bakterija, spada med probiotike. Pri UK je njihovo število zmanjšano, kar je lahko tesno povezano s patogenezo KVČB. Povezuje se jih tudi s spodbujanjem proizvodnje kratkoverižnih maščobnih kislin. Zaradi časovne omejitev te šasije niso uspeli testirati.

===Terapevtske tarče ===

V raziskavi so našli veliko število dejavnikov, ki so povezani z napredovanjem KVČB. Med njimi so za terapevtske tarče koktejl terapije, na podlagi najboljše izvedljivosti le-te, izbrali štiri: spremembe v proizvodnji maslene kisline, lipopolisaharida in antibakterijskega proteina LL-37, superoksid dismutaze (SOD) in hidrolaze žolčnih soli (angl. bile salt hydrolase, BSH).

'''''Maslena kislina:'''''
Kratkoverižna maščobna kislina, katere proizvodnja je pri bolnikih s KVČB zmanjšana. Maščobne kisline so izjemno pomembne pri ohranjanju zdravja debelega črevesa, saj med drugimi predstavljajo glavni energijski vir za epitelijske celice in zavirajo vnetni odziv. Maslena kislina velja za idealno zdravilo za zdravljenje KVČB, vendar je ni mogoče dozirati peroralno. V sintezni poti maščobnih kislin družina tioesteraz prekine podaljšan cikel maščobnih kislin in sprostijo se proste maščobne kisline, katerih dolžina je odvisna od vrste tioesteraze. Za terapevtski gen so izbrali tioesterazo Tes4 iz ''Bacteroides polymorpha'' (biokocka: BBa_K3838613) [1,4].

'''''LL-37:'''''
Pri bolnikih z UK je zaradi neuravnotežene črevesne flore spremenjena pregradna funkcija in prepustnost sluznice, zato gramnegativne bakterije vstopijo v limfni in krvni sistem, njihov lipopolisaharid pa stimulira imunski sistem. LL-37 je antibakterijski peptid, ki ga izločajo človeške imunske celice in zavira nekatere škodljive bakterije. Koncentracija tega peptida (1-5 μg/ml), ki se običajno nahaja pri odraslih na površini sluznice, je prenizka za neposredno uničenje bakterij, vendar pa sodeluje pri imunski regulaciji in ščiti človeško telo pred endotoksemijo. Verjamejo, da bi z bakterijami, ki eksokrino izločajo LL-37, izboljšali vnetno stanje (biokocka: BBa_K3838555) [1,5].

'''''SOD:'''''
ROS poškodujejo lipide, proteine, nukleinske kisline, uničijo integriteto epitelijskih celic, so vključeni v različne znotrajcelične signalne poti in spodbujajo vnetni odziv. Črevesna sluznica ima kompleksen antioksidativni sistem, v katerem je SOD začetni encim za delovanje celotnega sistema. Pri bolnikih s KVČB je ta sistem okvarjen. Neposredno povečanje količine SOD v bolnikovem črevesnem traktu ni mogoče, zaradi zelo kratke razpolovne dobe. Za dolgoročne in stabilne terapevtske učinke je zato potreben eksokrini ekspresijski bakterijski sistem (biokocka: BBa_K3838233) [1,6].

'''''BSH:'''''
BSH katalizira hidrolizo kombiniranih žolčnih soli, pri čemer se sproščajo prosta žolčna kislina in aminokisline. Aktivnost BSH v prebavilih izvira predvsem iz ''Firmicutes, Bacteroides'' in ''Actinomycetes'', njihova številčnost pa je pri bolnikih s KVČB zmanjšana, kar vodi do motene presnove žolčnih kislin in povečanega vnetnega odziva. Zaužitje probiotikov z aktivnostjo BSH lahko spodbudi biotransformacijo žolčnih soli v črevesju in s tem ublaži vnetni odziv (biokocka: BBa_K3838666) [1,7].

=== Izražanje ===

Že na začetku projekta so vedeli, da uporaba promotorja T7 ne bo mogoča. Zato so izbrali najpogostejši močni konstitutivni promotor J23100, ki je sicer manj učinkovit od ekspresijskega sistema s T7 promotorjem, vendar kljub temu zagotovi zadostno in stabilno izražanje terapevtskih učinkovin.

Pri bolnikih s KVČB je zaradi kopičenja ocetne in mlečne kisline v debelem črevesju okolje kislo. Za dosego potrebne regulativne funkcije so uporabili promotor PrcfB ekipe SZPT-China 2019 [1]. Gre za izboljšano različico kislinskega promotorja p170 z višjo učinkovitostjo izražanja. Promotorju p170 je dodana operatorska regija, na katero se ob kislih pogojih veže RcfB in inducira izražanje [8]. RcfB je endogeni protein mlečnokislinskih bakterij, v E. coli pa so ga vnesli pod konstitutivnim promotorjem s pomožnim vektorjem [1].

Vse štiri terapevtske gene so vnesli v ekspresijske vektorje (pUC18/pJSG/pET) s promotorjem RcfB ali J23100 in transformirali izbrane bakterije: ''BL21(DE3), DH5α'' in ''Nissle 1917''. Uspešnost in pravilnost izražanja proteina v pripravljenih bakterijah so preverili z gelsko elektroforezo, prenosom po Westernu in afinitetno kromatografijo. S tekočinsko kromatografijo so neposredno merili proizvodnjo terapevtskega produkta. Učinkovitost bakterij pri blaženju vnetnih simptomov pa so preverili z uporabo ustrezno pripravljene celične linije THP-1, ki je služila za tipičen model vnetja.

Terapevtski element Tes4, LL-37 on BSH so izražali v ''DH5α'' in ''Nissle 1917''. Potrdili so izražanje Tes4 s povečano koncentracijo maslene kisline v obeh šasijah. V obeh šasijah se je izražal tudi BSH, med tem ko se je LL-37 izražal le v ''DH5α''. Izražanje SOD so raziskovali in tudi potrdili v vseh treh celicah, vendar v ''DH5α'' izločanje ni bilo eksokrino. S pomočjo celične linije THP-1, so za pripravljene bakterije ''Nissle 1917'' s posameznim terapevtskim elementom uspešno potrdili zaviralne učinke na vnetje [1].

=== Varnost ===

Koktejl terapija vključuje kolonizacijo ustvarjenih bakterij v debelem črevesu, zato so morali poskrbeti za njihovo varno uporabo preko samomorilskega stikala in varne odpornosti.

Pripravljene bakterije niso smele vsebovati genov za odpornost proti antibiotikom, zato so v bakterije vnesli zapis za proteine toplotnega šoka (BBa_K3838777) in gen za odpornost proti triklosanu (BBa_K3838789). Pri toplotnem presejanju pri 55°C preživijo le bakterije, ki izražajo proteine toplotnega šoka, le te pa bi bakterijam pomagali tudi pri kolonizaciji v kislem okolju debelega črevesja. Dodatno presejanje se opravi s triklosanom, ki je varna antibakterijska snov in je odobrena s strani FDA.

Ustvarjene bakterije so zasnovali tako, da v zunanjem okolju, kjer je koncentracija glukoze nižja kot v črevesju, ne preživijo. Uporabili so promotor PT-αcrp, ki se odzove na spremembe v koncentraciji glukoze, in samomorilski gen mazF, ki zapisuje endoribonukleazo. Le-ta cepi RNA in povzroči celično smrt brez lize (biokocka: BBa_K3838654).

Želeli so preprečiti še prenos terapevtskih bakterij v kri, kjer je koncentracija fosfatov bistveno večja kot v črevesju. Uporabili so promotor PhoB, ki ga regulira endogeni na fosfat občutljiv faktor iz E. coli. Pri nizkih koncentracijah fosfata ga aktivira, pri visokih pa zavira. Aktiviran promotor PhoB sproži izražanje proteina tetR, ki pa zavira promotor pTet, pod katerim se izražal samomorilski gen (biokocka: BBa_K3838321) [1].

== KONČNI PRODUKT ==

Njihova dolgoročna želja je vzpostaviti koncept imenovan ''zaprta zanka zdravljenja''. Za vsakega bolnika posebej bi glede na njegovo situacijo prilagodili razmerje terapevtskih elementov v koktejl terapiji in tako dosegli natančno zdravljenje več dejavnikov. Razmerje bi prilagajali tako, da bi spreminjali deleže inženirskih bakterij s posameznim terapevtskim elementom ali uporabljali različne promotorje. Ustrezno razmerje bi določali na podlagi rednega zbiranja vzorcev pacientovega blata in analize metagenomskega zaporedja, s katero bi spremljali njihovo črevesno floro in zdravje. Trenutne naprave za zbiranje blata imajo veliko pomanjkljivosti (npr. nezmožnost zbiranja tekočega blata), zato so v sklopu projekta zasnovali komplet za vzorčenje blata, ki bi ga uporabljali tako pacienti kot tudi bolnišnice.

Želijo vzpostaviti tudi spletno platformo, ki bi glede na bolnikove rezultate analiz blata in dnevnih zapisov njihove prehrane, predpisovala ustrezno dieto. Poleg tega pa bi platforma služila uporabnikom tudi za medsebojno komunikacijo in jim pomagala pri psihični stiski [1].

== VIRI ==

[1] “Team:SZU-CHINA - 2021.igem.org.” [Online]. Available: https://2021.igem.org/Team:SZU-China. [Accessed: 7-Apr-2022].

[2] Crohn's & colitis foundation of America: The facts about Inflammatory Bowel Diseases. New York, 2014.

[3] Yue B, Luo X, Yu Z, Mani S, Wang Z, Dou W. Inflammatory Bowel Disease: A Potential Result from the Collusion between Gut Microbiota and Mucosal Immune System. Microorganisms. 2019, 7(10), 440.

[4] Van Immerseel F, Ducatelle R, De Vos M, Boon N, Van De Wiele T, Verbeke K, Rutgeerts P, Sas B, Louis P, Flint HJ. Butyric acid-producing anaerobic bacteria as a novel probiotic treatment approach for inflammatory bowel disease. J Med Microbiol. 2010, 59(Pt 2), 141-143.

[5] Mookherjee N, Brown KL, Bowdish DM, Doria S, Falsafi R, Hokamp K, Roche FM, Mu R, Doho GH, Pistolic J, Powers JP, Bryan J, Brinkman FS, Hancock RE. Modulation of the TLR-mediated inflammatory response by the endogenous human host defense peptide LL-37. J Immunol. 2006, 176(4), 2455-64.

[6] Kruidenier L, Kuiper I, Lamers CB, et al. Intestinal oxidative damage in inflammatory bowel disease: semi-quantification, localization, and association with mucosal antioxidants. J Pathol. 2003, 201, 28Y36.

[7] Han W, Mercenier A, Ait-Belgnaoui A, Pavan S, Lamine F, van Swam II, Kleerebezem M, Salvador-Cartier C, Hisbergues M, Bueno L, Theodorou V, Fioramonti J. Improvement of an experimental colitis in rats by lactic acid bacteria producing superoxide dismutase. Inflamm Bowel Dis. 2006, 12(11), 1044-52.

[8] Akyol, I., Comlekcioglu, U., Karakas, A. et al. Regulation of the acid induciblercfB promoter inLactococcus lactis subsp.lactis . Ann. Microbiol. 2008, 58, 269.

Gutail Floractory - probiotične bakterije za zaščito črevesja pred vnetji

2022-04-10T18:13:12Z

Karmenmlinar:

Projekt »Gutail Floractory« je sodeloval na tekmovanju iGEM 2021 ter se uvrstil med najboljših 10 v kategoriji znanost in tehnologija. Zasnovala ga je skupina SZU-CHINA, ki je želela narediti 'koktejl' prilagojenih in gensko spremenjenih črevesnih probiotikov kot adjuvans za lajšanje kronične vnetne črevesne bolezni (KVČB). Predstavitev projekta je dostopna na spletni strani: [https://2021.igem.org/Team:SZU-China Team:SZU-China]

== UVOD ==
KVČB je ponavljajoča in nespecifična vnetna reakcija v črevesni sluznici. Organi gastrointestinalnega (GI) trakta imajo posledično oslabljeno/okvarjeno delovanje, kar vodi do simptomov, kot so dolgotrajna driska, bolečine v trebuhu, rektalna krvavitev, izguba teže in utrujenost. KVČB delimo na '''Crohnovo bolezen (CB)''' in '''ulcerozni kolitis (UK)'''. CB lahko prizadene katerikoli del GI trakta in vnetje se lahko razširi na celotno debelino črevesne stene. UK je omejen na debelo črevo in rektum, vnetje pa se pojavi le v notranji plasti črevesne sluznice. V redkih primerih je med CB in UK težko ločiti, zato takrat govorimo o '''intermediarnem kolitisu''' [2]. Natančna patogeneza KVČB je še vedno neznana, v splošnem pa velja, da je vnetje posledica nepravilnega imunskega odziva sluznice na črevesno floro v genetsko dovzetnih posameznikih. Eden glavnih patoloških mehanizmov KVČB je neravnovesje črevesne flore. Bolezen se v največjem merilu pojavlja v razvitih državah in prizadene 0,5 % populacije, v prihodnosti pa bo število bolnikov postopoma naraščalo [3]. Zdravljenje poteka z različnimi zdravili in striktno prehransko dieto. Glavni cilj je remisija (odsotnost simptomov), same bolezni pa ni mogoče popolnoma pozdraviti [2]. Konvencionalno zdravljenje z zdravili učinkuje le v omejenem obsegu, neželeni stranski učinki, visoki stroški in dolgotrajna zdravljenja, pa vplivajo na bolnikovo materialno in duševno stanje ter tudi na kakovost njihovega življenja. Poleg tega so bolniki s KVČB izpostavljeni večjemu tveganju za raka, krvne strdke in bolezni jeter [1,2].

== CILJI PROJEKTA ==
KVČB otežuje življenje že več kot 10 milijonom ljudi iz vseh družbenih slojev. V predhodnih študijah je bilo ugotovljeno, da uporaba probiotikov, kot so mlečnokislinske bakterije in bifidobakterije, ob običajnem zdravljenju dosega boljše rezultate. V okviru projekta »Gutail Floractory« so zato želeli razviti bakterijski adjuvans za lajšanje bolnikovega nelagodja v času okrevanja, dolgoročno izboljšanje kakovosti bolnikovega življenja in celo zdravljenje bolnikov, ki se ne odzivajo na konvencionalne terapije. Šlo bi za pomožno vzdrževalno zdravljenje KVČB s koktejlom modificiranih inženirskih bakterij, ki bi jih vakuumsko liofilizirali in dozirali v kapsulah. Želeli so poiskati dejavnike, ki so povezani z napredovanjem bolezni KVČB, in izbrati štiri za potencialne tarče koktejl terapije. Glede na izbrane tarče bi oblikovali terapevtske elemente. Le-te bi predhodno modularizirali, s poudarkom na zamenljivosti promotorjev in odprtih bralnih okvirjev, da bi lahko poljubno spreminjali terapevtske gene in metode njihovega izražanja [1].

== IZVEDBA ==

=== Izbira šasije ===

Zaradi zahtevnosti delovanja so za šasijo izbrali več bakterij [1]:

1) '''''E. coli DH5α/BL21(DE3)''''' – pogosto uporabljene inženirske bakterije, upali so, da v njih sistem ne glede na zahtevnost deluje.

2) '''''E. coli Nissle 1917''''' – spada med probiotike, je nepatogena bakterija in lahko kolonizira. Lahko izraža mikrobektin, ki zavira rast nekaterih mikroorganizmov v vnetem črevesju.

3) '''''Lactococcus lactis''''' – mlečnokislinska bakterija, spada med probiotike. Pri UK je njihovo število zmanjšano, kar je lahko tesno povezano s patogenezo KVČB. Povezuje se jih tudi s spodbujanjem proizvodnje kratkoverižnih maščobnih kislin. Zaradi časovne omejitev te šasije niso uspeli testirati.

===Terapevtske tarče ===

V raziskavi so našli veliko število dejavnikov, ki so povezani z napredovanjem KVČB. Med njimi so za terapevtske tarče koktejl terapije, na podlagi najboljše izvedljivosti le-te, izbrali štiri: spremembe v proizvodnji maslene kisline, lipopolisaharida in antibakterijskega proteina LL-37, superoksid dismutaze (SOD) in hidrolaze žolčnih soli (angl. bile salt hydrolase, BSH).

'''''Maslena kislina:'''''
Kratkoverižna maščobna kislina, katere proizvodnja je pri bolnikih s KVČB zmanjšana. Maščobne kisline so izjemno pomembne pri ohranjanju zdravja debelega črevesa, saj med drugimi predstavljajo glavni energijski vir za epitelijske celice in zavirajo vnetni odziv. Maslena kislina velja za idealno zdravilo za zdravljenje KVČB, vendar je ni mogoče dozirati peroralno. V sintezni poti maščobnih kislin družina tioesteraz prekine podaljšan cikel maščobnih kislin in sprostijo se proste maščobne kisline, katerih dolžina je odvisna od vrste tioesteraze. Za terapevtski gen so izbrali tioesterazo Tes4 iz ''Bacteroides polymorpha'' (biokocka: BBa_K3838613) [1,4].

'''''LL-37:'''''
Pri bolnikih z UK je zaradi neuravnotežene črevesne flore spremenjena pregradna funkcija in prepustnost sluznice, zato gramnegativne bakterije vstopijo v limfni in krvni sistem, njihov lipopolisaharid pa stimulira imunski sistem. LL-37 je antibakterijski peptid, ki ga izločajo človeške imunske celice in zavira nekatere škodljive bakterije. Koncentracija tega peptida (1-5 μg/ml), ki se običajno nahaja pri odraslih na površini sluznice, je prenizka za neposredno uničenje bakterij, vendar pa sodeluje pri imunski regulaciji in ščiti človeško telo pred endotoksemijo. Verjamejo, da bi z bakterijami, ki eksokrino izločajo LL-37, izboljšali vnetno stanje (biokocka: BBa_K3838555) [1,5].

'''''SOD:'''''
ROS poškodujejo lipide, proteine, nukleinske kisline, uničijo integriteto epitelijskih celic, so vključeni v različne znotrajcelične signalne poti in spodbujajo vnetni odziv. Črevesna sluznica ima kompleksen antioksidativni sistem, v katerem je SOD začetni encim za delovanje celotnega sistema. Pri bolnikih s KVČB je ta sistem okvarjen. Neposredno povečanje količine SOD v bolnikovem črevesnem traktu ni mogoče, zaradi zelo kratke razpolovne dobe. Za dolgoročne in stabilne terapevtske učinke je zato potreben eksokrini ekspresijski bakterijski sistem (biokocka: BBa_K3838233) [1,6].

'''''BSH:'''''
BSH katalizira hidrolizo kombiniranih žolčnih soli, pri čemer se sproščajo prosta žolčna kislina in aminokisline. Aktivnost BSH v prebavilih izvira predvsem iz ''Firmicutes, Bacteroides'' in ''Actinomycetes'', njihova številčnost pa je pri bolnikih s KVČB zmanjšana, kar vodi do motene presnove žolčnih kislin in povečanega vnetnega odziva. Zaužitje probiotikov z aktivnostjo BSH lahko spodbudi biotransformacijo žolčnih soli v črevesju in s tem ublaži vnetni odziv (biokocka: BBa_K3838666) [1,7].

=== Izražanje ===

Že na začetku projekta so vedeli, da uporaba promotorja T7 ne bo mogoča. Zato so izbrali najpogostejši močni konstitutivni promotor J23100, ki je sicer manj učinkovit od ekspresijskega sistema s T7 promotorjem, vendar kljub temu zagotovi zadostno in stabilno izražanje terapevtskih učinkovin.

Pri bolnikih s KVČB je zaradi kopičenja ocetne in mlečne kisline v debelem črevesju okolje kislo. Za dosego potrebne regulativne funkcije so uporabili promotor PrcfB ekipe SZPT-China 2019 [1]. Gre za izboljšano različico kislinskega promotorja p170 z višjo učinkovitostjo izražanja. Promotorju p170 je dodana operatorska regija, na katero se ob kislih pogojih veže RcfB in inducira izražanje [8]. RcfB je endogeni protein mlečnokislinskih bakterij, v E. coli pa so ga vnesli pod konstitutivnim promotorjem s pomožnim vektorjem [1].

Vse štiri terapevtske gene so vnesli v ekspresijske vektorje (pUC18/pJSG/pET) s promotorjem RcfB ali J23100 in transformirali izbrane bakterije: ''BL21(DE3), DH5α'' in ''Nissle 1917''. Uspešnost in pravilnost izražanja proteina v pripravljenih bakterijah so preverili z gelsko elektroforezo, prenosom po Westernu in afinitetno kromatografijo. S tekočinsko kromatografijo so neposredno merili proizvodnjo terapevtskega produkta. Učinkovitost bakterij pri blaženju vnetnih simptomov pa so preverili z uporabo ustrezno pripravljene celične linije THP-1, ki je služila za tipičen model vnetja.

Terapevtski element Tes4, LL-37 on BSH so izražali v ''DH5α'' in ''Nissle 1917''. Potrdili so izražanje Tes4 s povečano koncentracijo maslene kisline v obeh šasijah. V obeh šasijah se je izražal tudi BSH, med tem ko se je LL-37 izražal le v ''DH5α''. Izražanje SOD so raziskovali in tudi potrdili v vseh treh celicah, vendar v ''DH5α'' izločanje ni bilo eksokrino. S pomočjo celične linije THP-1, so za pripravljene bakterije ''Nissle 1917'' s posameznim terapevtskim elementom uspešno potrdili zaviralne učinke na vnetje [1].

=== Varnost ===

Koktejl terapija vključuje kolonizacijo ustvarjenih bakterij v debelem črevesu, zato so morali poskrbeti za njihovo varno uporabo preko samomorilskega stikala in varne odpornosti.

Pripravljene bakterije niso smele vsebovati genov za odpornost proti antibiotikom, zato so v bakterije vnesli zapis za proteine toplotnega šoka (BBa_K3838777) in gen za odpornost proti triklosanu (BBa_K3838789). Pri toplotnem presejanju pri 55°C preživijo le bakterije, ki izražajo proteine toplotnega šoka, le te pa bi bakterijam pomagali tudi pri kolonizaciji v kislem okolju debelega črevesja. Dodatno presejanje se opravi s triklosanom, ki je varna antibakterijska snov in je odobrena s strani FDA.

Ustvarjene bakterije so zasnovali tako, da v zunanjem okolju, kjer je koncentracija glukoze nižja kot v črevesju, ne preživijo. Uporabili so promotor PT-αcrp, ki se odzove na spremembe v koncentraciji glukoze, in samomorilski gen mazF, ki zapisuje endoribonukleazo. Le-ta cepi RNA in povzroči celično smrt brez lize (biokocka: BBa_K3838654).

Želeli so preprečiti še prenos terapevtskih bakterij v kri, kjer je koncentracija fosfatov bistveno večja kot v črevesju. Uporabili so promotor PhoB, ki ga regulira endogeni na fosfat občutljiv faktor iz E. coli. Pri nizkih koncentracijah fosfata ga aktivira, pri visokih pa zavira. Aktiviran promotor PhoB sproži izražanje proteina tetR, ki pa zavira promotor pTet, pod katerim se izražal samomorilski gen (biokocka: BBa_K3838321) [1].

== KONČNI PRODUKT ==

Njihova dolgoročna želja je vzpostaviti koncept imenovan zaprta zanka zdravljenja. Za vsakega bolnika posebej bi glede na njegovo situacijo prilagodili razmerje terapevtskih elementov v koktejl terapiji in tako dosegli natančno zdravljenje več dejavnikov. Razmerje bi prilagajali tako, da bi spreminjali deleže inženirskih bakterij s posameznim terapevtskim elementom ali uporabljali različne promotorje. Ustrezno razmerje bi določali na podlagi rednega zbiranja vzorcev pacientovega blata in analize metagenomskega zaporedja, s katero bi spremljali njihovo črevesno floro in zdravje. Trenutne naprave za zbiranje blata imajo veliko pomanjkljivosti (npr. nezmožnost zbiranja tekočega blata), zato so v sklopu projekta zasnovali komplet za vzorčenje blata, ki bi ga uporabljali tako pacienti kot tudi bolnišnice.

Želijo vzpostaviti tudi spletno platformo, ki bi glede na bolnikove rezultate analiz blata in dnevnih zapisov njihove prehrane, predpisovala ustrezno dieto. Poleg tega pa bi platforma služila uporabnikom tudi za medsebojno komunikacijo in jim pomagala pri psihični stiski [1].

== VIRI ==

[1] “Team:SZU-CHINA - 2021.igem.org.” [Online]. Available: https://2021.igem.org/Team:SZU-China. [Accessed: 7-Apr-2022].

[2] Crohn's & colitis foundation of America: The facts about Inflammatory Bowel Diseases. New York, 2014.

[3] Yue B, Luo X, Yu Z, Mani S, Wang Z, Dou W. Inflammatory Bowel Disease: A Potential Result from the Collusion between Gut Microbiota and Mucosal Immune System. Microorganisms. 2019, 7(10), 440.

[4] Van Immerseel F, Ducatelle R, De Vos M, Boon N, Van De Wiele T, Verbeke K, Rutgeerts P, Sas B, Louis P, Flint HJ. Butyric acid-producing anaerobic bacteria as a novel probiotic treatment approach for inflammatory bowel disease. J Med Microbiol. 2010, 59(Pt 2), 141-143.

[5] Mookherjee N, Brown KL, Bowdish DM, Doria S, Falsafi R, Hokamp K, Roche FM, Mu R, Doho GH, Pistolic J, Powers JP, Bryan J, Brinkman FS, Hancock RE. Modulation of the TLR-mediated inflammatory response by the endogenous human host defense peptide LL-37. J Immunol. 2006, 176(4), 2455-64.

[6] Kruidenier L, Kuiper I, Lamers CB, et al. Intestinal oxidative damage in inflammatory bowel disease: semi-quantification, localization, and association with mucosal antioxidants. J Pathol. 2003, 201, 28Y36.

[7] Han W, Mercenier A, Ait-Belgnaoui A, Pavan S, Lamine F, van Swam II, Kleerebezem M, Salvador-Cartier C, Hisbergues M, Bueno L, Theodorou V, Fioramonti J. Improvement of an experimental colitis in rats by lactic acid bacteria producing superoxide dismutase. Inflamm Bowel Dis. 2006, 12(11), 1044-52.

[8] Akyol, I., Comlekcioglu, U., Karakas, A. et al. Regulation of the acid induciblercfB promoter inLactococcus lactis subsp.lactis . Ann. Microbiol. 2008, 58, 269.

Gutail Floractory - probiotične bakterije za zaščito črevesja pred vnetji

2022-04-10T17:56:29Z

Karmenmlinar:

Projekt »Gutail Floractory« je sodeloval na tekmovanju iGEM 2021 ter se uvrstil med najboljših 10 v kategoriji znanost in tehnologija. Zasnovala ga je skupina SZU-CHINA, ki je želela narediti 'koktejl' prilagojenih in gensko spremenjenih črevesnih probiotikov kot adjuvans za lajšanje kronične vnetne črevesne bolezni (KVČB). Predstavitev projekta je dostopna na spletni strani: [https://2021.igem.org/Team:SZU-China Team:SZU-China]

== UVOD ==
KVČB je ponavljajoča in nespecifična vnetna reakcija v črevesni sluznici. Organi gastrointestinalnega (GI) trakta imajo posledično oslabljeno/okvarjeno delovanje, kar vodi do simptomov, kot so dolgotrajna driska, bolečine v trebuhu, rektalna krvavitev, izguba teže in utrujenost. KVČB delimo na '''Crohnovo bolezen (CB)''' in '''ulcerozni kolitis (UK)'''. CB lahko prizadene katerikoli del GI trakta in vnetje se lahko razširi na celotno debelino črevesne stene. UK je omejen na debelo črevo in rektum, vnetje pa se pojavi le v notranji plasti črevesne sluznice. V redkih primerih je med CB in UK težko ločiti, zato takrat govorimo o '''intermediarnem kolitisu''' [2]. Natančna patogeneza KVČB je še vedno neznana, v splošnem pa velja, da je vnetje posledica nepravilnega imunskega odziva sluznice na črevesno floro v genetsko dovzetnih posameznikih. Eden glavnih patoloških mehanizmov KVČB je neravnovesje črevesne flore. Bolezen se v največjem merilu pojavlja v razvitih državah in prizadene 0,5 % populacije, v prihodnosti pa bo število bolnikov postopoma naraščalo [3]. Zdravljenje poteka z različnimi zdravili in striktno prehransko dieto. Glavni cilj je remisija (odsotnost simptomov), same bolezni pa ni mogoče popolnoma pozdraviti [2]. Konvencionalno zdravljenje z zdravili učinkuje le v omejenem obsegu, neželeni stranski učinki, visoki stroški in dolgotrajna zdravljenja, pa vplivajo na bolnikovo materialno in duševno stanje ter tudi na kakovost njihovega življenja. Poleg tega so bolniki s KVČB izpostavljeni večjemu tveganju za raka, krvne strdke in bolezni jeter [1,2].

== CILJI PROJEKTA ==
KVČB otežuje življenje že več kot 10 milijonom ljudi iz vseh družbenih slojev. V predhodnih študijah je bilo ugotovljeno, da uporaba probiotikov, kot so mlečnokislinske bakterije in bifidobakterije, ob običajnem zdravljenju dosega boljše rezultate. V okviru projekta »Gutail Floractory« so zato želeli razviti bakterijski adjuvans za lajšanje bolnikovega nelagodja v času okrevanja, dolgoročno izboljšanje kakovosti bolnikovega življenja in celo zdravljenje bolnikov, ki se ne odzivajo na konvencionalne terapije. Šlo bi za pomožno vzdrževalno zdravljenje KVČB s koktejlom modificiranih inženirskih bakterij, ki bi jih vakuumsko liofilizirali in dozirali v kapsulah. Želeli so poiskati dejavnike, ki so povezani z napredovanjem bolezni KVČB, in izbrati štiri za potencialne tarče koktejl terapije. Glede na izbrane tarče bi oblikovali terapevtske elemente. Le-te bi predhodno modularizirali, s poudarkom na zamenljivosti promotorjev in odprtih bralnih okvirjev, da bi lahko poljubno spreminjali terapevtske gene in metode njihovega izražanja [1].

== IZVEDBA ==

=== Izbira šasije ===

Zaradi zahtevnosti delovanja so za šasijo izbrali več bakterij [1]:

1) '''''E. coli DH5α/BL21(DE3)''''' – pogosto uporabljene inženirske bakterije, upali so, da v njih sistem ne glede na zahtevnost deluje.

2) '''''E. coli Nissle 1917''''' – spada med probiotike, je nepatogena bakterija in lahko kolonizira. Lahko izraža mikrobektin, ki zavira rast nekaterih mikroorganizmov v vnetem črevesju.

3) '''''Lactococcus lactis''''' – mlečnokislinska bakterija, spada med probiotike. Pri UK je njihovo število zmanjšano, kar je lahko tesno povezano s patogenezo KVČB. Povezuje se jih tudi s spodbujanjem proizvodnje kratkoverižnih maščobnih kislin. Zaradi časovne omejitev te šasije niso uspeli testirati.

===Terapevtske tarče ===

V raziskavi so našli veliko število dejavnikov, ki so povezani z napredovanjem KVČB. Med njimi so za terapevtske tarče koktejl terapije, na podlagi najboljše izvedljivosti le-te, izbrali štiri: spremembe v proizvodnji maslene kisline, lipopolisaharida in antibakterijskega proteina LL-37, superoksid dismutaze (SOD) in hidrolaze žolčnih soli (angl. bile salt hydrolase, BSH).

'''''Maslena kislina:'''''
Kratkoverižna maščobna kislina, katere proizvodnja je pri bolnikih s KVČB zmanjšana. Maščobne kisline so izjemno pomembne pri ohranjanju zdravja debelega črevesa, saj med drugimi predstavljajo glavni energijski vir za epitelijske celice in zavirajo vnetni odziv. Maslena kislina velja za idealno zdravilo za zdravljenje KVČB, vendar je ni mogoče dozirati peroralno. V sintezni poti maščobnih kislin družina tioesteraz prekine podaljšan cikel maščobnih kislin in sprostijo se proste maščobne kisline, katerih dolžina je odvisna od vrste tioesteraze. Za terapevtski gen so izbrali tioesterazo Tes4 iz ''Bacteroides polymorpha'' (biokocka: BBa_K3838613) [1,4].

'''''LL-37:'''''
Pri bolnikih z UK je zaradi neuravnotežene črevesne flore spremenjena pregradna funkcija in prepustnost sluznice, zato gramnegativne bakterije vstopijo v limfni in krvni sistem, njihov lipopolisaharid pa stimulira imunski sistem. LL-37 je antibakterijski peptid, ki ga izločajo človeške imunske celice in zavira nekatere škodljive bakterije. Koncentracija tega peptida (1-5 μg/ml), ki se običajno nahaja pri odraslih na površini sluznice, je prenizka za neposredno uničenje bakterij, vendar pa sodeluje pri imunski regulaciji in ščiti človeško telo pred endotoksemijo. Verjamejo, da bi z bakterijami, ki eksokrino izločajo LL-37, izboljšali vnetno stanje (biokocka: BBa_K3838555) [1,5].

'''''SOD:'''''
ROS poškodujejo lipide, proteine, nukleinske kisline, uničijo integriteto epitelijskih celic, so vključeni v različne znotrajcelične signalne poti in spodbujajo vnetni odziv. Črevesna sluznica ima kompleksen antioksidativni sistem, v katerem je SOD začetni encim za delovanje celotnega sistema. Pri bolnikih s KVČB je ta sistem okvarjen. Neposredno povečanje količine SOD v bolnikovem črevesnem traktu ni mogoče, zaradi zelo kratke razpolovne dobe. Za dolgoročne in stabilne terapevtske učinke je zato potreben eksokrini ekspresijski bakterijski sistem (biokocka: BBa_K3838233) [1,6].

'''''BSH:'''''
BSH katalizira hidrolizo kombiniranih žolčnih soli, pri čemer se sproščajo prosta žolčna kislina in aminokisline. Aktivnost BSH v prebavilih izvira predvsem iz ''Firmicutes, Bacteroides'' in ''Actinomycetes'', njihova številčnost pa je pri bolnikih s KVČB zmanjšana, kar vodi do motene presnove žolčnih kislin in povečanega vnetnega odziva. Zaužitje probiotikov z aktivnostjo BSH lahko spodbudi biotransformacijo žolčnih soli v črevesju in s tem ublaži vnetni odziv (biokocka: BBa_K3838666) [1,7].

=== Izražanje ===

Že na začetku projekta so vedeli, da uporaba promotorja T7 ne bo mogoča. Zato so izbrali najpogostejši močni konstitutivni promotor J23100, ki je sicer manj učinkovit od ekspresijskega sistema s T7 promotorjem, vendar kljub temu zagotovi zadostno in stabilno izražanje terapevtskih učinkovin.

Pri bolnikih s KVČB je zaradi kopičenja ocetne in mlečne kisline v debelem črevesju okolje kislo. Za dosego potrebne regulativne funkcije so uporabili promotor PrcfB ekipe SZPT-China 2019 [1]. Gre za izboljšano različico kislinskega promotorja p170 z višjo učinkovitostjo izražanja. Promotorju p170 je dodana operatorska regija, na katero se ob kislih pogojih veže RcfB in inducira izražanje [8]. RcfB je endogeni protein mlečnokislinskih bakterij, v E. coli pa so ga vnesli pod konstitutivnim promotorjem s pomožnim vektorjem [1].

Vse štiri terapevtske gene so vnesli v ekspresijske vektorje (pUC18/pJSG/pET) s promotorjem RcfB ali J23100 in transformirali izbrane bakterije: ''BL21(DE3), DH5α'' in ''Nissle 1917''. Uspešnost in pravilnost izražanja proteina v pripravljenih bakterijah so preverili z gelsko elektroforezo, prenosom po Westernu in afinitetno kromatografijo. S tekočinsko kromatografijo so neposredno merili proizvodnjo terapevtskega produkta. Učinkovitost bakterij pri blaženju vnetnih simptomov pa so preverili z uporabo ustrezno pripravljene celične linije THP-1, ki je služila za tipičen model vnetja.

Terapevtski element Tes4, LL-37 on BSH so izražali v ''DH5α'' in ''Nissle 1917''. Potrdili so izražanje Tes4 s povečano koncentracijo maslene kisline v obeh šasijah. V obeh šasijah se je izražal tudi BSH, med tem ko se je LL-37 izražal le v ''DH5α''. Izražanje SOD so raziskovali in tudi potrdili v vseh treh celicah, vendar v ''DH5α'' izločanje ni bilo eksokrino. S pomočjo celične linije THP-1, so za pripravljene bakterije ''Nissle 1917'' s posameznim terapevtskim elementom uspešno potrdili zaviralne učinke na vnetje [1].

=== Varnost ===

Koktejl terapija vključuje kolonizacijo ustvarjenih bakterij v debelem črevesu, zato so morali poskrbeti za njihovo varno uporabo preko samomorilskega stikala in varne odpornosti.

Pripravljene bakterije niso smele vsebovati genov za odpornost proti antibiotikom, zato so v bakterije vnesli zapis za proteine toplotnega šoka (BBa_K3838777) in gen za odpornost na triklosan (BBa_K3838789 ). Pri toplotnem presejanju pri 55°C preživijo le bakterije, ki izražajo proteine toplotnega šoka, le te pa bi bakterijam pomagali tudi pri kolonizaciji v kislem okolju debelega črevesja. Dodatno presejanje se opravi s triklosanom, ki je varna antibakterijska snov in je odobrena s strani FDA.

Ustvarjene bakterije so zasnovali tako, da v zunanjem okolju, kjer je koncentracija glukoze nižja kot v črevesju, ne preživijo. Uporabili so promotor PT-αcrp, ki se odzove na spremembe v koncentraciji glukoze, in samomorilski gen mazF, ki zapisuje endoribonukleazo. Le-ta cepi RNA in povzroči celično smrt brez lize (biokocka: BBa_K3838654).

Želeli so preprečiti še prenos terapevtskih bakterij v kri, kjer je koncentracija fosfatov bistveno večja kot v črevesju. Uporabili so promotor PhoB, ki ga regulira endogeni na fosfat občutljiv faktor iz E. coli. Pri nizkih koncentracijah fosfata ga aktivira, pri visokih pa zavira. Aktiviran promotor PhoB sproži izražanje proteina tetR, ki pa zavira promotor pTet, pod katerim se izražal samomorilski gen (biokocka: BBa_K3838321) [1].

== KONČNI PRODUKT ==

Njihova dolgoročna želja je vzpostaviti koncept imenovan zaprta zanka zdravljenja. Za vsakega bolnika posebej bi glede na njegovo situacijo prilagodili razmerje terapevtskih elementov v koktejl terapiji in tako dosegli natančno zdravljenje več dejavnikov. Razmerje bi prilagajali tako, da bi spreminjali deleže inženirskih bakterij s posameznim terapevtskim elementom ali uporabljali različne promotorje. Ustrezno razmerje bi določali na podlagi rednega zbiranja vzorcev pacientovega blata in analize metagenomskega zaporedja, s katero bi spremljali njihovo črevesno floro in zdravje. Trenutne naprave za zbiranje blata imajo veliko pomanjkljivosti (npr. nezmožnost zbiranja tekočega blata), zato so v sklopu projekta zasnovali komplet za vzorčenje blata, ki bi ga uporabljali tako pacienti kot tudi bolnišnice.

Želijo vzpostaviti tudi spletno platformo, ki bi glede na bolnikove rezultate analiz blata in dnevnih zapisov njihove prehrane, predpisovala ustrezno dieto. Poleg tega pa bi platforma služila uporabnikom tudi za medsebojno komunikacijo in jim pomagala pri psihični stiski [1].

== VIRI ==

[1] “Team:SZU-CHINA - 2021.igem.org.” [Online]. Available: https://2021.igem.org/Team:SZU-China. [Accessed: 7-Apr-2022].

[2] Crohn's & colitis foundation of America: The facts about Inflammatory Bowel Diseases. New York, 2014.

[3] Yue B, Luo X, Yu Z, Mani S, Wang Z, Dou W. Inflammatory Bowel Disease: A Potential Result from the Collusion between Gut Microbiota and Mucosal Immune System. Microorganisms. 2019, 7(10), 440.

[4] Van Immerseel F, Ducatelle R, De Vos M, Boon N, Van De Wiele T, Verbeke K, Rutgeerts P, Sas B, Louis P, Flint HJ. Butyric acid-producing anaerobic bacteria as a novel probiotic treatment approach for inflammatory bowel disease. J Med Microbiol. 2010, 59(Pt 2), 141-143.

[5] Mookherjee N, Brown KL, Bowdish DM, Doria S, Falsafi R, Hokamp K, Roche FM, Mu R, Doho GH, Pistolic J, Powers JP, Bryan J, Brinkman FS, Hancock RE. Modulation of the TLR-mediated inflammatory response by the endogenous human host defense peptide LL-37. J Immunol. 2006, 176(4), 2455-64.

[6] Kruidenier L, Kuiper I, Lamers CB, et al. Intestinal oxidative damage in inflammatory bowel disease: semi-quantification, localization, and association with mucosal antioxidants. J Pathol. 2003, 201, 28Y36.

[7] Han W, Mercenier A, Ait-Belgnaoui A, Pavan S, Lamine F, van Swam II, Kleerebezem M, Salvador-Cartier C, Hisbergues M, Bueno L, Theodorou V, Fioramonti J. Improvement of an experimental colitis in rats by lactic acid bacteria producing superoxide dismutase. Inflamm Bowel Dis. 2006, 12(11), 1044-52.

[8] Akyol, I., Comlekcioglu, U., Karakas, A. et al. Regulation of the acid induciblercfB promoter inLactococcus lactis subsp.lactis . Ann. Microbiol. 2008, 58, 269.

Gutail Floractory - probiotične bakterije za zaščito črevesja pred vnetji

2022-04-10T17:53:21Z

Karmenmlinar:

Projekt »Gutail Floractory« je sodeloval na tekmovanju iGEM 2021 ter se uvrstil med najboljših 10 v kategoriji znanost in tehnologija. Zasnovala ga je skupina SZU-CHINA, ki je želela narediti 'koktejl' prilagojenih in gensko spremenjenih črevesnih probiotikov kot adjuvans za lajšanje kronične vnetne črevesne bolezni (KVČB). Predstavitev projekta je dostopna na spletni strani: [https://2021.igem.org/Team:SZU-China Team:SZU-China]

== UVOD ==
KVČB je ponavljajoča in nespecifična vnetna reakcija v črevesni sluznici. Organi gastrointestinalnega (GI) trakta imajo posledično oslabljeno/okvarjeno delovanje, kar vodi do simptomov, kot so dolgotrajna driska, bolečine v trebuhu, rektalna krvavitev, izguba teže in utrujenost. KVČB delimo na '''Crohnovo bolezen (CB)''' in '''ulcerozni kolitis (UK)'''. CB lahko prizadene katerikoli del GI trakta in vnetje se lahko razširi na celotno debelino črevesne stene. UK je omejen na debelo črevo in rektum, vnetje pa se pojavi le v notranji plasti črevesne sluznice. V redkih primerih je med CB in UK težko ločiti, zato takrat govorimo o '''intermediarnem kolitisu''' [2]. Natančna patogeneza KVČB je še vedno neznana, v splošnem pa velja, da je vnetje posledica nepravilnega imunskega odziva sluznice na črevesno floro v genetsko dovzetnih posameznikih. Eden glavnih patoloških mehanizmov KVČB je neravnovesje črevesne flore. Bolezen se v največjem merilu pojavlja v razvitih državah in prizadene 0,5 % populacije, v prihodnosti pa bo število bolnikov postopoma naraščalo [3]. Zdravljenje poteka z različnimi zdravili in striktno prehransko dieto. Glavni cilj je remisija (odsotnost simptomov), same bolezni pa ni mogoče popolnoma pozdraviti [2]. Konvencionalno zdravljenje z zdravili učinkuje le v omejenem obsegu, neželeni stranski učinki, visoki stroški in dolgotrajna zdravljenja, pa vplivajo na bolnikovo materialno in duševno stanje ter tudi na kakovost njihovega življenja. Poleg tega so bolniki s KVČB izpostavljeni večjemu tveganju za raka, krvne strdke in bolezni jeter [1,2].

== CILJI PROJEKTA ==
KVČB otežuje življenje že več kot 10 milijonom ljudi iz vseh družbenih slojev. V predhodnih študijah je bilo ugotovljeno, da uporaba probiotikov, kot so mlečnokislinske bakterije in bifidobakterije, ob običajnem zdravljenju dosega boljše rezultate. V okviru projekta »Gutail Floractory« so zato želeli razviti bakterijski adjuvans za lajšanje bolnikovega nelagodja v času okrevanja, dolgoročno izboljšanje kakovosti bolnikovega življenja in celo zdravljenje bolnikov, ki se ne odzivajo na konvencionalne terapije. Šlo bi za pomožno vzdrževalno zdravljenje KVČB s koktejlom modificiranih inženirskih bakterij, ki bi jih vakuumsko liofilizirali in dozirali v kapsulah. Želeli so poiskati dejavnike, ki so povezani z napredovanjem bolezni KVČB, in izbrati štiri za potencialne tarče koktejl terapije. Glede na izbrane tarče bi oblikovali terapevtske elemente. Le-te bi predhodno modularizirali, s poudarkom na zamenljivosti promotorjev in odprtih bralnih okvirjev, da bi lahko poljubno spreminjali terapevtske gene in metode njihovega izražanja [1].

== IZVEDBA ==

=== Izbira šasije ===

Zaradi zahtevnosti delovanja so za šasijo izbrali več bakterij [1]:

1) '''''E. coli DH5α/BL21(DE3)''''' – pogosto uporabljene inženirske bakterije v katerih so upali, da sistem ne glede na zahtevnost deluje.

2) '''''E. coli Nissle 1917''''' – spada med probiotike, je nepatogena bakterija in lahko kolonizira. Lahko izraža mikrobektin, ki zavira rast nekaterih mikroorganizmov v vnetem črevesju.

3) '''''Lactococcus lactis''''' – mlečnokislinska bakterija, spada med probiotike. Pri UK je njihovo število zmanjšano, kar je lahko tesno povezano s patogenezo KVČB. Povezuje se jih tudi s spodbujanjem proizvodnje kratkoverižnih maščobnih kislin. Zaradi časovne omejitev te šasije niso uspeli testirati.

===Terapevtske tarče ===

V raziskavi so našli veliko število dejavnikov, ki so povezani z napredovanjem KVČB. Med njimi so za terapevtske tarče koktejl terapije, na podlagi najboljše izvedljivosti le-te, izbrali štiri: spremembe v proizvodnji maslene kisline, lipopolisaharida in antibakterijskega proteina LL-37, superoksid dismutaze (SOD) in hidrolaze žolčnih soli (angl. bile salt hydrolase, BSH).

'''''Maslena kislina:'''''
Kratkoverižna maščobna kislina, katere proizvodnja je pri bolnikih s KVČB zmanjšana. Maščobne kisline so izjemno pomembne pri ohranjanju zdravja debelega črevesa, saj med drugimi predstavljajo glavni energijski vir za epitelijske celice in zavirajo vnetni odziv. Maslena kislina velja za idealno zdravilo za zdravljenje KVČB, vendar je ni mogoče dozirati peroralno. V sintezni poti maščobnih kislin družina tioesteraz prekine podaljšan cikel maščobnih kislin in sprostijo se proste maščobne kisline, katerih dolžina je odvisna od vrste tioesteraze. Za terapevtski gen so izbrali tioesterazo Tes4 iz ''Bacteroides polymorpha'' (biokocka: BBa_K3838613) [1,4].

'''''LL-37:'''''
Pri bolnikih z UK je zaradi neuravnotežene črevesne flore spremenjena pregradna funkcija in prepustnost sluznice, zato gramnegativne bakterije vstopijo v limfni in krvni sistem, njihov lipopolisaharid pa stimulira imunski sistem. LL-37 je antibakterijski peptid, ki ga izločajo človeške imunske celice in zavira nekatere škodljive bakterije. Koncentracija tega peptida (1-5 μg/ml), ki se običajno nahaja pri odraslih na površini sluznice, je prenizka za neposredno uničenje bakterij, vendar pa sodeluje pri imunski regulaciji in ščiti človeško telo pred endotoksemijo. Verjamejo, da bi z bakterijami, ki eksokrino izločajo LL-37, izboljšali vnetno stanje (biokocka: BBa_K3838555) [1,5].

'''''SOD:'''''
ROS poškodujejo lipide, proteine, nukleinske kisline, uničijo integriteto epitelijskih celic, so vključeni v različne znotrajcelične signalne poti in spodbujajo vnetni odziv. Črevesna sluznica ima kompleksen antioksidativni sistem, v katerem je SOD začetni encim za delovanje celotnega sistema. Pri bolnikih s KVČB je ta sistem okvarjen. Neposredno povečanje količine SOD v bolnikovem črevesnem traktu ni mogoče, zaradi zelo kratke razpolovne dobe. Za dolgoročne in stabilne terapevtske učinke je zato potreben eksokrini ekspresijski bakterijski sistem (biokocka: BBa_K3838233) [1,6].

'''''BSH:'''''
BSH katalizira hidrolizo kombiniranih žolčnih soli, pri čemer se sproščajo prosta žolčna kislina in aminokisline. Aktivnost BSH v prebavilih izvira predvsem iz ''Firmicutes, Bacteroides'' in ''Actinomycetes'', njihova številčnost pa je pri bolnikih s KVČB zmanjšana, kar vodi do motene presnove žolčnih kislin in povečanega vnetnega odziva. Zaužitje probiotikov z aktivnostjo BSH lahko spodbudi biotransformacijo žolčnih soli v črevesju in s tem ublaži vnetni odziv (biokocka: BBa_K3838666) [1,7].

=== Izražanje ===

Že na začetku projekta so vedeli, da uporaba promotorja T7 ne bo mogoča. Zato so izbrali najpogostejši močni konstitutivni promotor J23100, ki je sicer manj učinkovit od ekspresijskega sistema s T7 promotorjem, vendar kljub temu zagotovi zadostno in stabilno izražanje terapevtskih učinkovin.

Pri bolnikih s KVČB je zaradi kopičenja ocetne in mlečne kisline v debelem črevesju okolje kislo. Za dosego potrebne regulativne funkcije so uporabili promotor PrcfB ekipe SZPT-China 2019 [1]. Gre za izboljšano različico kislinskega promotorja p170 z višjo učinkovitostjo izražanja. Promotorju p170 je dodana operatorska regija, na katero se ob kislih pogojih veže RcfB in inducira izražanje [8]. RcfB je endogeni protein mlečnokislinskih bakterij, v E. coli pa so ga vnesli pod konstitutivnim promotorjem s pomožnim vektorjem [1].

Vse štiri terapevtske gene so vnesli v ekspresijske vektorje (pUC18/pJSG/pET) s promotorjem RcfB ali J23100 in transformirali izbrane bakterije: ''BL21(DE3), DH5α'' in ''Nissle 1917''. Uspešnost in pravilnost izražanja proteina v pripravljenih bakterijah so preverili z gelsko elektroforezo, prenosom po Westernu in afinitetno kromatografijo. S tekočinsko kromatografijo so neposredno merili proizvodnjo terapevtskega produkta. Učinkovitost bakterij pri blaženju vnetnih simptomov pa so preverili z uporabo ustrezno pripravljene celične linije THP-1, ki je služila za tipičen model vnetja.

Terapevtski element Tes4, LL-37 on BSH so izražali v ''DH5α'' in ''Nissle 1917''. Potrdili so izražanje Tes4 s povečano koncentracijo maslene kisline v obeh šasijah. V obeh šasijah se je izražal tudi BSH, med tem ko se je LL-37 izražal le v ''DH5α''. Izražanje SOD so raziskovali in tudi potrdili v vseh treh celicah, vendar v ''DH5α'' izločanje ni bilo eksokrino. S pomočjo celične linije THP-1, so za pripravljene bakterije ''Nissle 1917'' s posameznim terapevtskim elementom uspešno potrdili zaviralne učinke na vnetje [1].

=== Varnost ===

Koktejl terapija vključuje kolonizacijo ustvarjenih bakterij v debelem črevesu, zato so morali poskrbeti za njihovo varno uporabo preko samomorilskega stikala in varne odpornosti.

Pripravljene bakterije niso smele vsebovati genov za odpornost proti antibiotikom, zato so v bakterije vnesli zapis za proteine toplotnega šoka (BBa_K3838777) in gen za odpornost na triklosan (BBa_K3838789 ). Pri toplotnem presejanju pri 55°C preživijo le bakterije, ki izražajo proteine toplotnega šoka, le te pa bi bakterijam pomagali tudi pri kolonizaciji v kislem okolju debelega črevesja. Dodatno presejanje se opravi s triklosanom, ki je varna antibakterijska snov in je odobrena s strani FDA.

Ustvarjene bakterije so zasnovali tako, da v zunanjem okolju, kjer je koncentracija glukoze nižja kot v črevesju, ne preživijo. Uporabili so promotor PT-αcrp, ki se odzove na spremembe v koncentraciji glukoze, in samomorilski gen mazF, ki zapisuje endoribonukleazo. Le-ta cepi RNA in povzroči celično smrt brez lize (biokocka: BBa_K3838654).

Želeli so preprečiti še prenos terapevtskih bakterij v kri, kjer je koncentracija fosfatov bistveno večja kot v črevesju. Uporabili so promotor PhoB, ki ga regulira endogeni na fosfat občutljiv faktor iz E. coli. Pri nizkih koncentracijah fosfata ga aktivira, pri visokih pa zavira. Aktiviran promotor PhoB sproži izražanje proteina tetR, ki pa zavira promotor pTet, pod katerim se izražal samomorilski gen (biokocka: BBa_K3838321) [1].

== KONČNI PRODUKT ==

Njihova dolgoročna želja je vzpostaviti koncept imenovan zaprta zanka zdravljenja. Za vsakega bolnika posebej bi glede na njegovo situacijo prilagodili razmerje terapevtskih elementov v koktejl terapiji in tako dosegli natančno zdravljenje več dejavnikov. Razmerje bi prilagajali tako, da bi spreminjali deleže inženirskih bakterij s posameznim terapevtskim elementom ali uporabljali različne promotorje. Ustrezno razmerje bi določali na podlagi rednega zbiranja vzorcev pacientovega blata in analize metagenomskega zaporedja, s katero bi spremljali njihovo črevesno floro in zdravje. Trenutne naprave za zbiranje blata imajo veliko pomanjkljivosti (npr. nezmožnost zbiranja tekočega blata), zato so v sklopu projekta zasnovali komplet za vzorčenje blata, ki bi ga uporabljali tako pacienti kot tudi bolnišnice.

Želijo vzpostaviti tudi spletno platformo, ki bi glede na bolnikove rezultate analiz blata in dnevnih zapisov njihove prehrane, predpisovala ustrezno dieto. Poleg tega pa bi platforma služila uporabnikom tudi za medsebojno komunikacijo in jim pomagala pri psihični stiski [1].

== VIRI ==

[1] “Team:SZU-CHINA - 2021.igem.org.” [Online]. Available: https://2021.igem.org/Team:SZU-China. [Accessed: 7-Apr-2022].

[2] Crohn's & colitis foundation of America: The facts about Inflammatory Bowel Diseases. New York, 2014.

[3] Yue B, Luo X, Yu Z, Mani S, Wang Z, Dou W. Inflammatory Bowel Disease: A Potential Result from the Collusion between Gut Microbiota and Mucosal Immune System. Microorganisms. 2019, 7(10), 440.

[4] Van Immerseel F, Ducatelle R, De Vos M, Boon N, Van De Wiele T, Verbeke K, Rutgeerts P, Sas B, Louis P, Flint HJ. Butyric acid-producing anaerobic bacteria as a novel probiotic treatment approach for inflammatory bowel disease. J Med Microbiol. 2010, 59(Pt 2), 141-143.

[5] Mookherjee N, Brown KL, Bowdish DM, Doria S, Falsafi R, Hokamp K, Roche FM, Mu R, Doho GH, Pistolic J, Powers JP, Bryan J, Brinkman FS, Hancock RE. Modulation of the TLR-mediated inflammatory response by the endogenous human host defense peptide LL-37. J Immunol. 2006, 176(4), 2455-64.

[6] Kruidenier L, Kuiper I, Lamers CB, et al. Intestinal oxidative damage in inflammatory bowel disease: semi-quantification, localization, and association with mucosal antioxidants. J Pathol. 2003, 201, 28Y36.

[7] Han W, Mercenier A, Ait-Belgnaoui A, Pavan S, Lamine F, van Swam II, Kleerebezem M, Salvador-Cartier C, Hisbergues M, Bueno L, Theodorou V, Fioramonti J. Improvement of an experimental colitis in rats by lactic acid bacteria producing superoxide dismutase. Inflamm Bowel Dis. 2006, 12(11), 1044-52.

[8] Akyol, I., Comlekcioglu, U., Karakas, A. et al. Regulation of the acid induciblercfB promoter inLactococcus lactis subsp.lactis . Ann. Microbiol. 2008, 58, 269.

Gutail Floractory - probiotične bakterije za zaščito črevesja pred vnetji

2022-04-10T17:52:12Z

Karmenmlinar:

Projekt »Gutail Floractory« je sodeloval na tekmovanju iGEM 2021 ter se uvrstil med najboljših 10 v kategoriji znanost in tehnologija. Zasnovala ga je skupina SZU-CHINA, ki je želela narediti 'koktejl' prilagojenih in gensko spremenjenih črevesnih probiotikov kot adjuvans za lajšanje kronične vnetne črevesne bolezni (KVČB). Predstavitev projekta je dostopna na spletni strani: [https://2021.igem.org/Team:SZU-China Team:SZU-China]

== UVOD ==
KVČB je ponavljajoča in nespecifična vnetna reakcija v črevesni sluznici. Organi gastrointestinalnega (GI) trakta imajo posledično oslabljeno/okvarjeno delovanje, kar vodi do simptomov, kot so dolgotrajna driska, bolečine v trebuhu, rektalna krvavitev, izguba teže in utrujenost. KVČB delimo na '''Crohnovo bolezen (CB)''' in '''ulcerozni kolitis (UK)'''. CB lahko prizadene katerikoli del GI trakta in vnetje se lahko razširi na celotno debelino črevesne stene. UK je omejen na debelo črevo in rektum, vnetje pa se pojavi le v notranji plasti črevesne sluznice. V redkih primerih je med CB in UK težko ločiti, zato takrat govorimo o '''intermediarnem kolitisu''' [2]. Natančna patogeneza KVČB je še vedno neznana, v splošnem pa velja, da je vnetje posledica nepravilnega imunskega odziva sluznice na črevesno floro v genetsko dovzetnih posameznikih. Eden glavnih patoloških mehanizmov KVČB je neravnovesje črevesne flore. Bolezen se v največjem merilu pojavlja v razvitih državah in prizadene 0,5 % populacije, v prihodnosti pa bo število bolnikov postopoma naraščalo [3]. Zdravljenje poteka z različnimi zdravili in striktno prehransko dieto. Glavni cilj je remisija (odsotnost simptomov), same bolezni pa ni mogoče popolnoma pozdraviti [2]. Konvencionalno zdravljenje z zdravili učinkuje le v omejenem obsegu, neželeni stranski učinki, visoki stroški in dolgotrajna zdravljenja, pa vplivajo na bolnikovo materialno in duševno stanje ter tudi na kakovost njihovega življenja. Poleg tega so bolniki s KVČB izpostavljeni večjemu tveganju za raka, krvne strdke in bolezni jeter [1,2].

== CILJI PROJEKTA ==
KVČB otežuje življenje že več kot 10 milijonom ljudi iz vseh družbenih slojev. V predhodnih študijah je bilo ugotovljeno, da uporaba probiotikov, kot so mlečnokislinske bakterije in bifidobakterije, ob običajnem zdravljenju dosega boljše rezultate. V okviru projekta »Gutail Floractory« so zato želeli razviti bakterijski adjuvans za lajšanje bolnikovega nelagodja v času okrevanja, dolgoročno izboljšanje kakovosti bolnikovega življenja in celo zdravljenje bolnikov, ki se ne odzivajo na konvencionalne terapije. Šlo bi za pomožno vzdrževalno zdravljenje KVČB s koktejlom modificiranih inženirskih bakterij, ki bi jih vakuumsko liofilizirali in dozirali v kapsulah. Želeli so poiskati dejavnike, ki so povezani z napredovanjem bolezni KVČB, in izbrati štiri za potencialne tarče koktejl terapije. Glede na izbrane tarče bi oblikovali terapevtske elemente. Le-te bi predhodno modularizirali, s poudarkom na zamenljivosti promotorjev in odprtih bralnih okvirjev, da bi lahko poljubno spreminjali terapevtske gene in metode njihovega izražanja [1].

== IZVEDBA ==

=== Izbira šasije ===

Zaradi zahtevnosti delovanja so za šasijo izbrali več bakterij [1]:

1) '''''E. coli DH5α/BL21(DE3)''''' – pogosto uporabljene inženirske bakterije v katerih so upali, da sistem ne glede na zahtevnost deluje.

2) '''''E. coli Nissle 1917''''' – spada med probiotike, je nepatogena bakterija in lahko kolonizira. Lahko izraža mikrobektin, ki zavira rast nekaterih mikroorganizmov v vnetem črevesju.

3) '''''Lactococcus lactis''''' – mlečnokislinska bakterija, spada med probiotike. Pri UK je njihovo število zmanjšano, kar je lahko tesno povezano s patogenezo KVČB. Povezuje se jih tudi s spodbujanjem proizvodnje kratkoverižnih maščobnih kislin. Zaradi časovne omejitev te šasije niso uspeli testirati.

===Terapevtske tarče ===

V raziskavi so našli veliko število dejavnikov, ki so povezani z napredovanjem KVČB. Med njimi so za terapevtske tarče koktejl terapije, na podlagi najboljše izvedljivosti le-te, izbrali štiri: spremembe v proizvodnji maslene kisline, lipopolisaharida in antibakterijskega proteina LL-37, superoksid dismutaze (SOD) in hidrolaze žolčnih soli (angl. bile salt hydrolase, BSH).

'''''Maslena kislina:'''''
Kratkoverižna maščobna kislina, katere proizvodnja je pri bolnikih s KVČB zmanjšana. Maščobne kisline so izjemno pomembne pri ohranjanju zdravja debelega črevesa, saj med drugimi predstavljajo glavni energijski vir za epitelijske celice in zavirajo vnetni odziv. Maslena kislina velja za idealno zdravilo za zdravljenje KVČB, vendar je ni mogoče dozirati peroralno. V sintezni poti maščobnih kislin družina tioesteraz prekine podaljšan cikel maščobnih kislin in sprostijo se proste maščobne kisline, katerih dolžina je odvisna od vrste tioesteraze. Za terapevtski gen so izbrali tioesterazo Tes4 iz ''Bacteroides polymorpha'' (biokocka: BBa_K3838613) [1,4].

'''''LL-37:'''''
Pri bolnikih z UK je zaradi neuravnotežene črevesne flore spremenjena pregradna funkcija in prepustnost sluznice, zato gramnegativne bakterije vstopijo v limfni in krvni sistem, njihov lipopolisaharid pa stimulira imunski sistem. LL-37 je antibakterijski peptid, ki ga izločajo človeške imunske celice in zavira nekatere škodljive bakterije. Koncentracija tega peptida (1-5 μg/ml), ki se običajno nahaja pri odraslih na površini sluznice, je prenizka za neposredno uničenje bakterij, vendar pa sodeluje pri imunski regulaciji in ščiti človeško telo pred endotoksemijo. Verjamejo, da bi z bakterijami, ki eksokrino izločajo LL-37, izboljšali vnetno stanje (biokocka: BBa_K3838555) [1,5].

'''''SOD:'''''
ROS poškodujejo lipide, proteine, nukleinske kisline, uničijo integriteto epitelijskih celic, so vključeni v različne znotrajcelične signalne poti in spodbujajo vnetni odziv. Črevesna sluznica ima kompleksen antioksidativni sistem, v katerem je SOD začetni encim za delovanje celotnega sistema. Pri bolnikih s KVČB je ta sistem okvarjen. Neposredno povečanje količine SOD v bolnikovem črevesnem traktu ni mogoče, zaradi zelo kratke razpolovne dobe. Za dolgoročne in stabilne terapevtske učinke je zato potreben eksokrini ekspresijski bakterijski sistem (biokocka: BBa_K3838233) [1,6].

'''''BSH:'''''
BSH katalizira hidrolizo kombiniranih žolčnih soli, pri čemer se sproščajo prosta žolčna kislina in aminokisline. Aktivnost BSH v prebavilih izvira predvsem iz ''Firmicutes, Bacteroides'' in ''Actinomycetes'', njihova številčnost pa je pri bolnikih s KVČB zmanjšana, kar vodi do motene presnove žolčnih kislin in povečanega vnetnega odziva. Zaužitje probiotikov z aktivnostjo BSH lahko spodbudi biotransformacijo žolčnih soli v črevesju in s tem ublaži vnetni odziv (biokocka: BBa_K3838666) [1,7].

=== Izražanje ===

Že na začetku projekta so vedeli, da uporaba promotorja T7 ne bo mogoča. Zato so izbrali najpogostejši močni konstitutivni promotor J23100, ki je sicer manj učinkovit od ekspresijskega sistema s T7 promotorjem, vendar kljub temu zagotovi zadostno in stabilno izražanje terapevtskih učinkovin.

Pri bolnikih s KVČB je zaradi kopičenja ocetne in mlečne kisline v debelem črevesju okolje kislo. Za dosego potrebne regulativne funkcije so uporabili promotor PrcfB ekipe SZPT-China 2019 [1]. Gre za izboljšano različico kislinskega promotorja p170 z višjo učinkovitostjo izražanja. Promotorju p170 je dodana operatorska regija, na katero se ob kislih pogojih veže RcfB in inducira izražanje [8]. RcfB je endogeni protein mlečnokislinskih bakterij, v E. coli pa so ga vnesli pod konstitutivnim promotorjem s pomožnim vektorjem [1].

Vse štiri terapevtske gene so vnesli v ekspresijske vektorje (pUC18/pJSG/pET) s promotorjem RcfB ali J23100 in transformirali izbrane bakterije: ''BL21(DE3), DH5α'' in ''Nissle 1917''. Uspešnost in pravilnost izražanja proteina v pripravljenih bakterijah so preverili z gelsko elektroforezo, prenosom po Westernu in afinitetno kromatografijo. S tekočinsko kromatografijo so neposredno merili proizvodnjo terapevtskega produkta. Učinkovitost bakterij pri blaženju vnetnih simptomov pa so preverili z uporabo ustrezno pripravljene celične linije THP-1, ki je služila za tipičen model vnetja.

Terapevtski element Tes4, LL-37 on BSH so izražali v ''DH5α'' in ''Nissle 1917''. Potrdili so izražanje Tes4 s povečano koncentracijo maslene kisline v obeh šasijah. V obeh šasijah se je izražal tudi BSH, med tem ko se je LL-37 izražal le v ''DH5α''. Izražanje SOD so raziskovali in tudi potrdili v vseh treh celicah, vendar v ''DH5α'' izločanje ni bilo eksokrino. S pomočjo celične linije THP-1, so za pripravljene bakterije ''Nissle 1917'' s posameznim terapevtskim elementom uspešno potrdili zaviralne učinke na vnetje [1].

=== Varnost ===

Koktejl terapija vključuje kolonizacijo ustvarjenih bakterij v debelem črevesu, zato so morali poskrbeti za njihovo varno uporabo preko samomorilskega stikala in varne odpornosti.

Pripravljene bakterije niso smele vsebovati genov za odpornost proti antibiotikom, zato so v bakterije vnesli zapis za proteine toplotnega šoka (BBa_K3838777) in gen za odpornost na triklosan (BBa_K3838789 ). Pri toplotnem presejanju pri 55°C preživijo le bakterije, ki izražajo proteine toplotnega šoka, le te pa bi bakterijam pomagali tudi pri kolonizaciji v kislem okolju debelega črevesja. Dodatno presejanje se opravi s triklosanom, ki je varna antibakterijska snov in je odobrena s strani FDA.

Ustvarjene bakterije so zasnovali tako, da v zunanjem okolju, kjer je koncentracija glukoze nižja kot v črevesju, ne preživijo. Uporabili so promotor PT-αcrp, ki se odzove na spremembe v koncentraciji glukoze, in samomorilski gen mazF, ki zapisuje endoribonukleazo. Le-ta cepi RNA in povzroči celično smrt brez lize (biokocka: BBa_K3838654).

Želeli so preprečiti še prenos terapevtskih bakterij v kri, kjer je koncentracija fosfatov bistveno večja kot v črevesju. Uporabili so promotor PhoB, ki ga regulira endogeni na fosfat občutljiv faktor iz E. coli. Pri nizkih koncentracijah fosfata ga aktivira, pri visokih pa zavira. Aktiviran promotor PhoB sproži izražanje proteina tetR, ki pa zavira promotor pTet, pod katerim se izražal samomorilski gen (biokocka: BBa_K3838321) [1].

== KONČNI PRODUKT ==

Njihova dolgoročna želja je vzpostaviti koncept imenovan zaprta zanka zdravljenja. Za vsakega bolnika posebej bi glede na njegovo situacijo prilagodili razmerje terapevtskih elementov v koktejl terapiji in tako dosegli natančno zdravljenje več dejavnikov. Razmerje bi prilagajali tako, da bi spreminjali deleže inženirskih bakterij s posameznim terapevtskim elementom ali uporabljali različne promotorje. Ustrezno razmerje bi določali na podlagi rednega zbiranja vzorcev pacientovega blata in analize metagenomskega zaporedja, s katero bi spremljali njihovo črevesno floro in zdravje. Trenutne naprave za zbiranje blata imajo veliko pomanjkljivosti (npr. nezmožnost zbiranja tekočega blata), zato so v sklopu projekta zasnovali komplet za vzorčenje blata, ki bi ga uporabljali tako pacienti kot tudi bolnišnice.

Želijo vzpostaviti tudi spletno platformo, ki bi glede na bolnikove rezultate analiz blata in dnevnih zapisov njihove prehrane, predpisovala ustrezno dieto. Poleg tega pa bi platforma služila uporabnikom tudi za medsebojno komunikacijo in jim pomagala pri psihični stiski [1].

Gutail Floractory - probiotične bakterije za zaščito črevesja pred vnetji

2022-04-10T17:50:15Z

Karmenmlinar:

Projekt »Gutail Floractory« je sodeloval na tekmovanju iGEM 2021 ter se uvrstil med najboljših 10 v kategoriji znanost in tehnologija. Zasnovala ga je skupina SZU-CHINA, ki je želela narediti 'koktejl' prilagojenih in gensko spremenjenih črevesnih probiotikov kot adjuvans za lajšanje kronične vnetne črevesne bolezni (KVČB). Predstavitev projekta je dostopna na spletni strani: [https://2021.igem.org/Team:SZU-China Team:SZU-China]

== UVOD ==
KVČB je ponavljajoča in nespecifična vnetna reakcija v črevesni sluznici. Organi gastrointestinalnega (GI) trakta imajo posledično oslabljeno/okvarjeno delovanje, kar vodi do simptomov, kot so dolgotrajna driska, bolečine v trebuhu, rektalna krvavitev, izguba teže in utrujenost. KVČB delimo na '''Crohnovo bolezen (CB)''' in '''ulcerozni kolitis (UK)'''. CB lahko prizadene katerikoli del GI trakta in vnetje se lahko razširi na celotno debelino črevesne stene. UK je omejen na debelo črevo in rektum, vnetje pa se pojavi le v notranji plasti črevesne sluznice. V redkih primerih je med CB in UK težko ločiti, zato takrat govorimo o '''intermediarnem kolitisu''' [2]. Natančna patogeneza KVČB je še vedno neznana, v splošnem pa velja, da je vnetje posledica nepravilnega imunskega odziva sluznice na črevesno floro v genetsko dovzetnih posameznikih. Eden glavnih patoloških mehanizmov KVČB je neravnovesje črevesne flore. Bolezen se v največjem merilu pojavlja v razvitih državah in prizadene 0,5 % populacije, v prihodnosti pa bo število bolnikov postopoma naraščalo [3]. Zdravljenje poteka z različnimi zdravili in striktno prehransko dieto. Glavni cilj je remisija (odsotnost simptomov), same bolezni pa ni mogoče popolnoma pozdraviti [2]. Konvencionalno zdravljenje z zdravili učinkuje le v omejenem obsegu, neželeni stranski učinki, visoki stroški in dolgotrajna zdravljenja, pa vplivajo na bolnikovo materialno in duševno stanje ter tudi na kakovost njihovega življenja. Poleg tega so bolniki s KVČB izpostavljeni večjemu tveganju za raka, krvne strdke in bolezni jeter [1,2].

== CILJI PROJEKTA ==
KVČB otežuje življenje že več kot 10 milijonom ljudi iz vseh družbenih slojev. V predhodnih študijah je bilo ugotovljeno, da uporaba probiotikov, kot so mlečnokislinske bakterije in bifidobakterije, ob običajnem zdravljenju dosega boljše rezultate. V okviru projekta »Gutail Floractory« so zato želeli razviti bakterijski adjuvans za lajšanje bolnikovega nelagodja v času okrevanja, dolgoročno izboljšanje kakovosti bolnikovega življenja in celo zdravljenje bolnikov, ki se ne odzivajo na konvencionalne terapije. Šlo bi za pomožno vzdrževalno zdravljenje KVČB s koktejlom modificiranih inženirskih bakterij, ki bi jih vakuumsko liofilizirali in dozirali v kapsulah. Želeli so poiskati dejavnike, ki so povezani z napredovanjem bolezni KVČB, in izbrati štiri za potencialne tarče koktejl terapije. Glede na izbrane tarče bi oblikovali terapevtske elemente. Le-te bi predhodno modularizirali, s poudarkom na zamenljivosti promotorjev in odprtih bralnih okvirjev, da bi lahko poljubno spreminjali terapevtske gene in metode njihovega izražanja [1].

== IZVEDBA ==

=== Izbira šasije ===

Zaradi zahtevnosti delovanja so za šasijo izbrali več bakterij [1]:

1) '''''E. coli DH5α/BL21(DE3)''''' – pogosto uporabljene inženirske bakterije v katerih so upali, da sistem ne glede na zahtevnost deluje.

2) '''''E. coli Nissle 1917''''' – spada med probiotike, je nepatogena bakterija in lahko kolonizira. Lahko izraža mikrobektin, ki zavira rast nekaterih mikroorganizmov v vnetem črevesju.

3) '''''Lactococcus lactis''''' – mlečnokislinska bakterija, spada med probiotike. Pri UK je njihovo število zmanjšano, kar je lahko tesno povezano s patogenezo KVČB. Povezuje se jih tudi s spodbujanjem proizvodnje kratkoverižnih maščobnih kislin. Zaradi časovne omejitev te šasije niso uspeli testirati.

===Terapevtske tarče ===

V raziskavi so našli veliko število dejavnikov, ki so povezani z napredovanjem KVČB. Med njimi so za terapevtske tarče koktejl terapije, na podlagi najboljše izvedljivosti le-te, izbrali štiri: spremembe v proizvodnji maslene kisline, lipopolisaharida in antibakterijskega proteina LL-37, superoksid dismutaze (SOD) in hidrolaze žolčnih soli (angl. bile salt hydrolase, BSH).

'''''Maslena kislina:'''''
Kratkoverižna maščobna kislina, katere proizvodnja je pri bolnikih s KVČB zmanjšana. Maščobne kisline so izjemno pomembne pri ohranjanju zdravja debelega črevesa, saj med drugimi predstavljajo glavni energijski vir za epitelijske celice in zavirajo vnetni odziv. Maslena kislina velja za idealno zdravilo za zdravljenje KVČB, vendar je ni mogoče dozirati peroralno. V sintezni poti maščobnih kislin družina tioesteraz prekine podaljšan cikel maščobnih kislin in sprostijo se proste maščobne kisline, katerih dolžina je odvisna od vrste tioesteraze. Za terapevtski gen so izbrali tioesterazo Tes4 iz ''Bacteroides polymorpha'' (biokocka: BBa_K3838613) [1,4].

'''''LL-37:'''''
Pri bolnikih z UK je zaradi neuravnotežene črevesne flore spremenjena pregradna funkcija in prepustnost sluznice, zato gramnegativne bakterije vstopijo v limfni in krvni sistem, njihov lipopolisaharid pa stimulira imunski sistem. LL-37 je antibakterijski peptid, ki ga izločajo človeške imunske celice in zavira nekatere škodljive bakterije. Koncentracija tega peptida (1-5 μg/ml), ki se običajno nahaja pri odraslih na površini sluznice, je prenizka za neposredno uničenje bakterij, vendar pa sodeluje pri imunski regulaciji in ščiti človeško telo pred endotoksemijo. Verjamejo, da bi z bakterijami, ki eksokrino izločajo LL-37, izboljšali vnetno stanje (biokocka: BBa_K3838555) [1,5].

'''''SOD:'''''
ROS poškodujejo lipide, proteine, nukleinske kisline, uničijo integriteto epitelijskih celic, so vključeni v različne znotrajcelične signalne poti in spodbujajo vnetni odziv. Črevesna sluznica ima kompleksen antioksidativni sistem, v katerem je SOD začetni encim za delovanje celotnega sistema. Pri bolnikih s KVČB je ta sistem okvarjen. Neposredno povečanje količine SOD v bolnikovem črevesnem traktu ni mogoče, zaradi zelo kratke razpolovne dobe. Za dolgoročne in stabilne terapevtske učinke je zato potreben eksokrini ekspresijski bakterijski sistem (biokocka: BBa_K3838233) [1,6].

'''''BSH:'''''
BSH katalizira hidrolizo kombiniranih žolčnih soli, pri čemer se sproščajo prosta žolčna kislina in aminokisline. Aktivnost BSH v prebavilih izvira predvsem iz ''Firmicutes, Bacteroides'' in ''Actinomycetes'', njihova številčnost pa je pri bolnikih s KVČB zmanjšana, kar vodi do motene presnove žolčnih kislin in povečanega vnetnega odziva. Zaužitje probiotikov z aktivnostjo BSH lahko spodbudi biotransformacijo žolčnih soli v črevesju in s tem ublaži vnetni odziv (biokocka: BBa_K3838666) [1,7].

=== Izražanje ===

Že na začetku projekta so vedeli, da uporaba promotorja T7 ne bo mogoča. Zato so izbrali najpogostejši močni konstitutivni promotor J23100, ki je sicer manj učinkovit od ekspresijskega sistema s T7 promotorjem, vendar kljub temu zagotovi zadostno in stabilno izražanje terapevtskih učinkovin.
Pri bolnikih s KVČB je zaradi kopičenja ocetne in mlečne kisline v debelem črevesju okolje kislo. Za dosego potrebne regulativne funkcije so uporabili promotor PrcfB ekipe SZPT-China 2019 [1]. Gre za izboljšano različico kislinskega promotorja p170 z višjo učinkovitostjo izražanja. Promotorju p170 je dodana operatorska regija, na katero se ob kislih pogojih veže RcfB in inducira izražanje [8]. RcfB je endogeni protein mlečnokislinskih bakterij, v E. coli pa so ga vnesli pod konstitutivnim promotorjem s pomožnim vektorjem [1].
Vse štiri terapevtske gene so vnesli v ekspresijske vektorje (pUC18/pJSG/pET) s promotorjem RcfB ali J23100 in transformirali izbrane bakterije: ''BL21(DE3), DH5α'' in ''Nissle 1917''. Uspešnost in pravilnost izražanja proteina v pripravljenih bakterijah so preverili z gelsko elektroforezo, prenosom po Westernu in afinitetno kromatografijo. S tekočinsko kromatografijo so neposredno merili proizvodnjo terapevtskega produkta. Učinkovitost bakterij pri blaženju vnetnih simptomov pa so preverili z uporabo ustrezno pripravljene celične linije THP-1, ki je služila za tipičen model vnetja.
Terapevtski element Tes4, LL-37 on BSH so izražali v ''DH5α'' in ''Nissle 1917''. Potrdili so izražanje Tes4 s povečano koncentracijo maslene kisline v obeh šasijah. V obeh šasijah se je izražal tudi BSH, med tem ko se je LL-37 izražal le v ''DH5α''. Izražanje SOD so raziskovali in tudi potrdili v vseh treh celicah, vendar v ''DH5α'' izločanje ni bilo eksokrino. S pomočjo celične linije THP-1, so za pripravljene bakterije ''Nissle 1917'' s posameznim terapevtskim elementom uspešno potrdili zaviralne učinke na vnetje [1].

=== Varnost ===

Koktejl terapija vključuje kolonizacijo ustvarjenih bakterij v debelem črevesu, zato so morali poskrbeti za njihovo varno uporabo preko samomorilskega stikala in varne odpornosti.
Pripravljene bakterije niso smele vsebovati genov za odpornost proti antibiotikom, zato so v bakterije vnesli zapis za proteine toplotnega šoka (BBa_K3838777) in gen za odpornost na triklosan (BBa_K3838789 ). Pri toplotnem presejanju pri 55°C preživijo le bakterije, ki izražajo proteine toplotnega šoka, le te pa bi bakterijam pomagali tudi pri kolonizaciji v kislem okolju debelega črevesja. Dodatno presejanje se opravi s triklosanom, ki je varna antibakterijska snov in je odobrena s strani FDA.
Ustvarjene bakterije so zasnovali tako, da v zunanjem okolju, kjer je koncentracija glukoze nižja kot v črevesju, ne preživijo. Uporabili so promotor PT-αcrp, ki se odzove na spremembe v koncentraciji glukoze, in samomorilski gen mazF, ki zapisuje endoribonukleazo. Le-ta cepi RNA in povzroči celično smrt brez lize (biokocka: BBa_K3838654) .
Želeli so preprečiti še prenos terapevtskih bakterij v kri, kjer je koncentracija fosfatov bistveno večja kot v črevesju. Uporabili so promotor PhoB, ki ga regulira endogeni na fosfat občutljiv faktor iz E. coli. Pri nizkih koncentracijah fosfata ga aktivira, pri visokih pa zavira. Aktiviran promotor PhoB sproži izražanje proteina tetR, ki pa zavira promotor pTet, pod katerim se izražal samomorilski gen (biokocka: BBa_K3838321) [1].

== KONČNI PRODUKT ==

Njihova dolgoročna želja je vzpostaviti koncept imenovan zaprta zanka zdravljenja. Za vsakega bolnika posebej bi glede na njegovo situacijo prilagodili razmerje terapevtskih elementov v koktejl terapiji in tako dosegli natančno zdravljenje več dejavnikov. Razmerje bi prilagajali tako, da bi spreminjali deleže inženirskih bakterij s posameznim terapevtskim elementom ali uporabljali različne promotorje. Ustrezno razmerje bi določali na podlagi rednega zbiranja vzorcev pacientovega blata in analize metagenomskega zaporedja, s katero bi spremljali njihovo črevesno floro in zdravje. Trenutne naprave za zbiranje blata imajo veliko pomanjkljivosti (npr. nezmožnost zbiranja tekočega blata), zato so v sklopu projekta zasnovali komplet za vzorčenje blata, ki bi ga uporabljali tako pacienti kot tudi bolnišnice.
Želijo vzpostaviti tudi spletno platformo, ki bi glede na bolnikove rezultate analiz blata in dnevnih zapisov njihove prehrane, predpisovala ustrezno dieto. Poleg tega pa bi platforma služila uporabnikom tudi za medsebojno komunikacijo in jim pomagala pri psihični stiski [1].

Gutail Floractory - probiotične bakterije za zaščito črevesja pred vnetji

2022-04-10T17:50:01Z

Karmenmlinar:

Projekt »Gutail Floractory« je sodeloval na tekmovanju iGEM 2021 ter se uvrstil med najboljših 10 v kategoriji znanost in tehnologija. Zasnovala ga je skupina SZU-CHINA, ki je želela narediti 'koktejl' prilagojenih in gensko spremenjenih črevesnih probiotikov kot adjuvans za lajšanje kronične vnetne črevesne bolezni (KVČB). Predstavitev projekta je dostopna na spletni strani: [https://2021.igem.org/Team:SZU-China Team:SZU-China]

== UVOD ==
KVČB je ponavljajoča in nespecifična vnetna reakcija v črevesni sluznici. Organi gastrointestinalnega (GI) trakta imajo posledično oslabljeno/okvarjeno delovanje, kar vodi do simptomov, kot so dolgotrajna driska, bolečine v trebuhu, rektalna krvavitev, izguba teže in utrujenost. KVČB delimo na '''Crohnovo bolezen (CB)''' in '''ulcerozni kolitis (UK)'''. CB lahko prizadene katerikoli del GI trakta in vnetje se lahko razširi na celotno debelino črevesne stene. UK je omejen na debelo črevo in rektum, vnetje pa se pojavi le v notranji plasti črevesne sluznice. V redkih primerih je med CB in UK težko ločiti, zato takrat govorimo o '''intermediarnem kolitisu''' [2]. Natančna patogeneza KVČB je še vedno neznana, v splošnem pa velja, da je vnetje posledica nepravilnega imunskega odziva sluznice na črevesno floro v genetsko dovzetnih posameznikih. Eden glavnih patoloških mehanizmov KVČB je neravnovesje črevesne flore. Bolezen se v največjem merilu pojavlja v razvitih državah in prizadene 0,5 % populacije, v prihodnosti pa bo število bolnikov postopoma naraščalo [3]. Zdravljenje poteka z različnimi zdravili in striktno prehransko dieto. Glavni cilj je remisija (odsotnost simptomov), same bolezni pa ni mogoče popolnoma pozdraviti [2]. Konvencionalno zdravljenje z zdravili učinkuje le v omejenem obsegu, neželeni stranski učinki, visoki stroški in dolgotrajna zdravljenja, pa vplivajo na bolnikovo materialno in duševno stanje ter tudi na kakovost njihovega življenja. Poleg tega so bolniki s KVČB izpostavljeni večjemu tveganju za raka, krvne strdke in bolezni jeter [1,2].

== CILJI PROJEKTA ==
KVČB otežuje življenje že več kot 10 milijonom ljudi iz vseh družbenih slojev. V predhodnih študijah je bilo ugotovljeno, da uporaba probiotikov, kot so mlečnokislinske bakterije in bifidobakterije, ob običajnem zdravljenju dosega boljše rezultate. V okviru projekta »Gutail Floractory« so zato želeli razviti bakterijski adjuvans za lajšanje bolnikovega nelagodja v času okrevanja, dolgoročno izboljšanje kakovosti bolnikovega življenja in celo zdravljenje bolnikov, ki se ne odzivajo na konvencionalne terapije. Šlo bi za pomožno vzdrževalno zdravljenje KVČB s koktejlom modificiranih inženirskih bakterij, ki bi jih vakuumsko liofilizirali in dozirali v kapsulah. Želeli so poiskati dejavnike, ki so povezani z napredovanjem bolezni KVČB, in izbrati štiri za potencialne tarče koktejl terapije. Glede na izbrane tarče bi oblikovali terapevtske elemente. Le-te bi predhodno modularizirali, s poudarkom na zamenljivosti promotorjev in odprtih bralnih okvirjev, da bi lahko poljubno spreminjali terapevtske gene in metode njihovega izražanja [1].

== IZVEDBA ==

=== Izbira šasije ===

Zaradi zahtevnosti delovanja so za šasijo izbrali več bakterij [1]:
1) '''''E. coli DH5α/BL21(DE3)''''' – pogosto uporabljene inženirske bakterije v katerih so upali, da sistem ne glede na zahtevnost deluje.

2) '''''E. coli Nissle 1917''''' – spada med probiotike, je nepatogena bakterija in lahko kolonizira. Lahko izraža mikrobektin, ki zavira rast nekaterih mikroorganizmov v vnetem črevesju.

3) '''''Lactococcus lactis''''' – mlečnokislinska bakterija, spada med probiotike. Pri UK je njihovo število zmanjšano, kar je lahko tesno povezano s patogenezo KVČB. Povezuje se jih tudi s spodbujanjem proizvodnje kratkoverižnih maščobnih kislin. Zaradi časovne omejitev te šasije niso uspeli testirati.

===Terapevtske tarče ===

V raziskavi so našli veliko število dejavnikov, ki so povezani z napredovanjem KVČB. Med njimi so za terapevtske tarče koktejl terapije, na podlagi najboljše izvedljivosti le-te, izbrali štiri: spremembe v proizvodnji maslene kisline, lipopolisaharida in antibakterijskega proteina LL-37, superoksid dismutaze (SOD) in hidrolaze žolčnih soli (angl. bile salt hydrolase, BSH).

'''''Maslena kislina:'''''
Kratkoverižna maščobna kislina, katere proizvodnja je pri bolnikih s KVČB zmanjšana. Maščobne kisline so izjemno pomembne pri ohranjanju zdravja debelega črevesa, saj med drugimi predstavljajo glavni energijski vir za epitelijske celice in zavirajo vnetni odziv. Maslena kislina velja za idealno zdravilo za zdravljenje KVČB, vendar je ni mogoče dozirati peroralno. V sintezni poti maščobnih kislin družina tioesteraz prekine podaljšan cikel maščobnih kislin in sprostijo se proste maščobne kisline, katerih dolžina je odvisna od vrste tioesteraze. Za terapevtski gen so izbrali tioesterazo Tes4 iz ''Bacteroides polymorpha'' (biokocka: BBa_K3838613) [1,4].

'''''LL-37:'''''
Pri bolnikih z UK je zaradi neuravnotežene črevesne flore spremenjena pregradna funkcija in prepustnost sluznice, zato gramnegativne bakterije vstopijo v limfni in krvni sistem, njihov lipopolisaharid pa stimulira imunski sistem. LL-37 je antibakterijski peptid, ki ga izločajo človeške imunske celice in zavira nekatere škodljive bakterije. Koncentracija tega peptida (1-5 μg/ml), ki se običajno nahaja pri odraslih na površini sluznice, je prenizka za neposredno uničenje bakterij, vendar pa sodeluje pri imunski regulaciji in ščiti človeško telo pred endotoksemijo. Verjamejo, da bi z bakterijami, ki eksokrino izločajo LL-37, izboljšali vnetno stanje (biokocka: BBa_K3838555) [1,5].

'''''SOD:'''''
ROS poškodujejo lipide, proteine, nukleinske kisline, uničijo integriteto epitelijskih celic, so vključeni v različne znotrajcelične signalne poti in spodbujajo vnetni odziv. Črevesna sluznica ima kompleksen antioksidativni sistem, v katerem je SOD začetni encim za delovanje celotnega sistema. Pri bolnikih s KVČB je ta sistem okvarjen. Neposredno povečanje količine SOD v bolnikovem črevesnem traktu ni mogoče, zaradi zelo kratke razpolovne dobe. Za dolgoročne in stabilne terapevtske učinke je zato potreben eksokrini ekspresijski bakterijski sistem (biokocka: BBa_K3838233) [1,6].

'''''BSH:'''''
BSH katalizira hidrolizo kombiniranih žolčnih soli, pri čemer se sproščajo prosta žolčna kislina in aminokisline. Aktivnost BSH v prebavilih izvira predvsem iz ''Firmicutes, Bacteroides'' in ''Actinomycetes'', njihova številčnost pa je pri bolnikih s KVČB zmanjšana, kar vodi do motene presnove žolčnih kislin in povečanega vnetnega odziva. Zaužitje probiotikov z aktivnostjo BSH lahko spodbudi biotransformacijo žolčnih soli v črevesju in s tem ublaži vnetni odziv (biokocka: BBa_K3838666) [1,7].

=== Izražanje ===

Že na začetku projekta so vedeli, da uporaba promotorja T7 ne bo mogoča. Zato so izbrali najpogostejši močni konstitutivni promotor J23100, ki je sicer manj učinkovit od ekspresijskega sistema s T7 promotorjem, vendar kljub temu zagotovi zadostno in stabilno izražanje terapevtskih učinkovin.
Pri bolnikih s KVČB je zaradi kopičenja ocetne in mlečne kisline v debelem črevesju okolje kislo. Za dosego potrebne regulativne funkcije so uporabili promotor PrcfB ekipe SZPT-China 2019 [1]. Gre za izboljšano različico kislinskega promotorja p170 z višjo učinkovitostjo izražanja. Promotorju p170 je dodana operatorska regija, na katero se ob kislih pogojih veže RcfB in inducira izražanje [8]. RcfB je endogeni protein mlečnokislinskih bakterij, v E. coli pa so ga vnesli pod konstitutivnim promotorjem s pomožnim vektorjem [1].
Vse štiri terapevtske gene so vnesli v ekspresijske vektorje (pUC18/pJSG/pET) s promotorjem RcfB ali J23100 in transformirali izbrane bakterije: ''BL21(DE3), DH5α'' in ''Nissle 1917''. Uspešnost in pravilnost izražanja proteina v pripravljenih bakterijah so preverili z gelsko elektroforezo, prenosom po Westernu in afinitetno kromatografijo. S tekočinsko kromatografijo so neposredno merili proizvodnjo terapevtskega produkta. Učinkovitost bakterij pri blaženju vnetnih simptomov pa so preverili z uporabo ustrezno pripravljene celične linije THP-1, ki je služila za tipičen model vnetja.
Terapevtski element Tes4, LL-37 on BSH so izražali v ''DH5α'' in ''Nissle 1917''. Potrdili so izražanje Tes4 s povečano koncentracijo maslene kisline v obeh šasijah. V obeh šasijah se je izražal tudi BSH, med tem ko se je LL-37 izražal le v ''DH5α''. Izražanje SOD so raziskovali in tudi potrdili v vseh treh celicah, vendar v ''DH5α'' izločanje ni bilo eksokrino. S pomočjo celične linije THP-1, so za pripravljene bakterije ''Nissle 1917'' s posameznim terapevtskim elementom uspešno potrdili zaviralne učinke na vnetje [1].

=== Varnost ===

Koktejl terapija vključuje kolonizacijo ustvarjenih bakterij v debelem črevesu, zato so morali poskrbeti za njihovo varno uporabo preko samomorilskega stikala in varne odpornosti.
Pripravljene bakterije niso smele vsebovati genov za odpornost proti antibiotikom, zato so v bakterije vnesli zapis za proteine toplotnega šoka (BBa_K3838777) in gen za odpornost na triklosan (BBa_K3838789 ). Pri toplotnem presejanju pri 55°C preživijo le bakterije, ki izražajo proteine toplotnega šoka, le te pa bi bakterijam pomagali tudi pri kolonizaciji v kislem okolju debelega črevesja. Dodatno presejanje se opravi s triklosanom, ki je varna antibakterijska snov in je odobrena s strani FDA.
Ustvarjene bakterije so zasnovali tako, da v zunanjem okolju, kjer je koncentracija glukoze nižja kot v črevesju, ne preživijo. Uporabili so promotor PT-αcrp, ki se odzove na spremembe v koncentraciji glukoze, in samomorilski gen mazF, ki zapisuje endoribonukleazo. Le-ta cepi RNA in povzroči celično smrt brez lize (biokocka: BBa_K3838654) .
Želeli so preprečiti še prenos terapevtskih bakterij v kri, kjer je koncentracija fosfatov bistveno večja kot v črevesju. Uporabili so promotor PhoB, ki ga regulira endogeni na fosfat občutljiv faktor iz E. coli. Pri nizkih koncentracijah fosfata ga aktivira, pri visokih pa zavira. Aktiviran promotor PhoB sproži izražanje proteina tetR, ki pa zavira promotor pTet, pod katerim se izražal samomorilski gen (biokocka: BBa_K3838321) [1].

== KONČNI PRODUKT ==

Njihova dolgoročna želja je vzpostaviti koncept imenovan zaprta zanka zdravljenja. Za vsakega bolnika posebej bi glede na njegovo situacijo prilagodili razmerje terapevtskih elementov v koktejl terapiji in tako dosegli natančno zdravljenje več dejavnikov. Razmerje bi prilagajali tako, da bi spreminjali deleže inženirskih bakterij s posameznim terapevtskim elementom ali uporabljali različne promotorje. Ustrezno razmerje bi določali na podlagi rednega zbiranja vzorcev pacientovega blata in analize metagenomskega zaporedja, s katero bi spremljali njihovo črevesno floro in zdravje. Trenutne naprave za zbiranje blata imajo veliko pomanjkljivosti (npr. nezmožnost zbiranja tekočega blata), zato so v sklopu projekta zasnovali komplet za vzorčenje blata, ki bi ga uporabljali tako pacienti kot tudi bolnišnice.
Želijo vzpostaviti tudi spletno platformo, ki bi glede na bolnikove rezultate analiz blata in dnevnih zapisov njihove prehrane, predpisovala ustrezno dieto. Poleg tega pa bi platforma služila uporabnikom tudi za medsebojno komunikacijo in jim pomagala pri psihični stiski [1].

Gutail Floractory - probiotične bakterije za zaščito črevesja pred vnetji

2022-04-10T17:47:59Z

Karmenmlinar:

Projekt »Gutail Floractory« je sodeloval na tekmovanju iGEM 2021 ter se uvrstil med najboljših 10 v kategoriji znanost in tehnologija. Zasnovala ga je skupina SZU-CHINA, ki je želela narediti 'koktejl' prilagojenih in gensko spremenjenih črevesnih probiotikov kot adjuvans za lajšanje kronične vnetne črevesne bolezni (KVČB). Predstavitev projekta je dostopna na spletni strani: [https://2021.igem.org/Team:SZU-China Team:SZU-China]

== UVOD ==
KVČB je ponavljajoča in nespecifična vnetna reakcija v črevesni sluznici. Organi gastrointestinalnega (GI) trakta imajo posledično oslabljeno/okvarjeno delovanje, kar vodi do simptomov, kot so dolgotrajna driska, bolečine v trebuhu, rektalna krvavitev, izguba teže in utrujenost. KVČB delimo na '''Crohnovo bolezen (CB)''' in '''ulcerozni kolitis (UK)'''. CB lahko prizadene katerikoli del GI trakta in vnetje se lahko razširi na celotno debelino črevesne stene. UK je omejen na debelo črevo in rektum, vnetje pa se pojavi le v notranji plasti črevesne sluznice. V redkih primerih je med CB in UK težko ločiti, zato takrat govorimo o '''intermediarnem kolitisu''' [2]. Natančna patogeneza KVČB je še vedno neznana, v splošnem pa velja, da je vnetje posledica nepravilnega imunskega odziva sluznice na črevesno floro v genetsko dovzetnih posameznikih. Eden glavnih patoloških mehanizmov KVČB je neravnovesje črevesne flore. Bolezen se v največjem merilu pojavlja v razvitih državah in prizadene 0,5 % populacije, v prihodnosti pa bo število bolnikov postopoma naraščalo [3]. Zdravljenje poteka z različnimi zdravili in striktno prehransko dieto. Glavni cilj je remisija (odsotnost simptomov), same bolezni pa ni mogoče popolnoma pozdraviti [2]. Konvencionalno zdravljenje z zdravili učinkuje le v omejenem obsegu, neželeni stranski učinki, visoki stroški in dolgotrajna zdravljenja, pa vplivajo na bolnikovo materialno in duševno stanje ter tudi na kakovost njihovega življenja. Poleg tega so bolniki s KVČB izpostavljeni večjemu tveganju za raka, krvne strdke in bolezni jeter [1,2].

== CILJI PROJEKTA ==
KVČB otežuje življenje že več kot 10 milijonom ljudi iz vseh družbenih slojev. V predhodnih študijah je bilo ugotovljeno, da uporaba probiotikov, kot so mlečnokislinske bakterije in bifidobakterije, ob običajnem zdravljenju dosega boljše rezultate. V okviru projekta »Gutail Floractory« so zato želeli razviti bakterijski adjuvans za lajšanje bolnikovega nelagodja v času okrevanja, dolgoročno izboljšanje kakovosti bolnikovega življenja in celo zdravljenje bolnikov, ki se ne odzivajo na konvencionalne terapije. Šlo bi za pomožno vzdrževalno zdravljenje KVČB s koktejlom modificiranih inženirskih bakterij, ki bi jih vakuumsko liofilizirali in dozirali v kapsulah. Želeli so poiskati dejavnike, ki so povezani z napredovanjem bolezni KVČB, in izbrati štiri za potencialne tarče koktejl terapije. Glede na izbrane tarče bi oblikovali terapevtske elemente. Le-te bi predhodno modularizirali, s poudarkom na zamenljivosti promotorjev in odprtih bralnih okvirjev, da bi lahko poljubno spreminjali terapevtske gene in metode njihovega izražanja [1].

== IZVEDBA ==

=== Izbira šasije ===

Zaradi zahtevnosti delovanja so za šasijo izbrali več bakterij [1]:
1) '''''E. coli DH5α/BL21(DE3)''''' – pogosto uporabljene inženirske bakterije v katerih so upali, da sistem ne glede na zahtevnost deluje.
2) '''''E. coli Nissle 1917''''' – spada med probiotike, je nepatogena bakterija in lahko kolonizira. Lahko izraža mikrobektin, ki zavira rast nekaterih mikroorganizmov v vnetem črevesju.
3) '''''Lactococcus lactis''''' – mlečnokislinska bakterija, spada med probiotike. Pri UK je njihovo število zmanjšano, kar je lahko tesno povezano s patogenezo KVČB. Povezuje se jih tudi s spodbujanjem proizvodnje kratkoverižnih maščobnih kislin. Zaradi časovne omejitev te šasije niso uspeli testirati.

===Terapevtske tarče ===

V raziskavi so našli veliko število dejavnikov, ki so povezani z napredovanjem KVČB. Med njimi so za terapevtske tarče koktejl terapije, na podlagi najboljše izvedljivosti le-te, izbrali štiri: spremembe v proizvodnji maslene kisline, lipopolisaharida in antibakterijskega proteina LL-37, superoksid dismutaze (SOD) in hidrolaze žolčnih soli (angl. bile salt hydrolase, BSH).

'''''Maslena kislina:'''''
Kratkoverižna maščobna kislina, katere proizvodnja je pri bolnikih s KVČB zmanjšana. Maščobne kisline so izjemno pomembne pri ohranjanju zdravja debelega črevesa, saj med drugimi predstavljajo glavni energijski vir za epitelijske celice in zavirajo vnetni odziv. Maslena kislina velja za idealno zdravilo za zdravljenje KVČB, vendar je ni mogoče dozirati peroralno. V sintezni poti maščobnih kislin družina tioesteraz prekine podaljšan cikel maščobnih kislin in sprostijo se proste maščobne kisline, katerih dolžina je odvisna od vrste tioesteraze. Za terapevtski gen so izbrali tioesterazo Tes4 iz ''Bacteroides polymorpha'' (biokocka: BBa_K3838613) [1,4].

'''''LL-37:'''''
Pri bolnikih z UK je zaradi neuravnotežene črevesne flore spremenjena pregradna funkcija in prepustnost sluznice, zato gramnegativne bakterije vstopijo v limfni in krvni sistem, njihov lipopolisaharid pa stimulira imunski sistem. LL-37 je antibakterijski peptid, ki ga izločajo človeške imunske celice in zavira nekatere škodljive bakterije. Koncentracija tega peptida (1-5 μg/ml), ki se običajno nahaja pri odraslih na površini sluznice, je prenizka za neposredno uničenje bakterij, vendar pa sodeluje pri imunski regulaciji in ščiti človeško telo pred endotoksemijo. Verjamejo, da bi z bakterijami, ki eksokrino izločajo LL-37, izboljšali vnetno stanje (biokocka: BBa_K3838555) [1,5].

'''''SOD:'''''
ROS poškodujejo lipide, proteine, nukleinske kisline, uničijo integriteto epitelijskih celic, so vključeni v različne znotrajcelične signalne poti in spodbujajo vnetni odziv. Črevesna sluznica ima kompleksen antioksidativni sistem, v katerem je SOD začetni encim za delovanje celotnega sistema. Pri bolnikih s KVČB je ta sistem okvarjen. Neposredno povečanje količine SOD v bolnikovem črevesnem traktu ni mogoče, zaradi zelo kratke razpolovne dobe. Za dolgoročne in stabilne terapevtske učinke je zato potreben eksokrini ekspresijski bakterijski sistem (biokocka: BBa_K3838233) [1,6].

'''''BSH:'''''
BSH katalizira hidrolizo kombiniranih žolčnih soli, pri čemer se sproščajo prosta žolčna kislina in aminokisline. Aktivnost BSH v prebavilih izvira predvsem iz ''Firmicutes, Bacteroides'' in ''Actinomycetes'', njihova številčnost pa je pri bolnikih s KVČB zmanjšana, kar vodi do motene presnove žolčnih kislin in povečanega vnetnega odziva. Zaužitje probiotikov z aktivnostjo BSH lahko spodbudi biotransformacijo žolčnih soli v črevesju in s tem ublaži vnetni odziv (biokocka: BBa_K3838666) [1,7].

=== Izražanje ===

Že na začetku projekta so vedeli, da uporaba promotorja T7 ne bo mogoča. Zato so izbrali najpogostejši močni konstitutivni promotor J23100, ki je sicer manj učinkovit od ekspresijskega sistema s T7 promotorjem, vendar kljub temu zagotovi zadostno in stabilno izražanje terapevtskih učinkovin.
Pri bolnikih s KVČB je zaradi kopičenja ocetne in mlečne kisline v debelem črevesju okolje kislo. Za dosego potrebne regulativne funkcije so uporabili promotor PrcfB ekipe SZPT-China 2019 [1]. Gre za izboljšano različico kislinskega promotorja p170 z višjo učinkovitostjo izražanja. Promotorju p170 je dodana operatorska regija, na katero se ob kislih pogojih veže RcfB in inducira izražanje [8]. RcfB je endogeni protein mlečnokislinskih bakterij, v E. coli pa so ga vnesli pod konstitutivnim promotorjem s pomožnim vektorjem [1].
Vse štiri terapevtske gene so vnesli v ekspresijske vektorje (pUC18/pJSG/pET) s promotorjem RcfB ali J23100 in transformirali izbrane bakterije: ''BL21(DE3), DH5α'' in ''Nissle 1917''. Uspešnost in pravilnost izražanja proteina v pripravljenih bakterijah so preverili z gelsko elektroforezo, prenosom po Westernu in afinitetno kromatografijo. S tekočinsko kromatografijo so neposredno merili proizvodnjo terapevtskega produkta. Učinkovitost bakterij pri blaženju vnetnih simptomov pa so preverili z uporabo ustrezno pripravljene celične linije THP-1, ki je služila za tipičen model vnetja.
Terapevtski element Tes4, LL-37 on BSH so izražali v ''DH5α'' in ''Nissle 1917''. Potrdili so izražanje Tes4 s povečano koncentracijo maslene kisline v obeh šasijah. V obeh šasijah se je izražal tudi BSH, med tem ko se je LL-37 izražal le v ''DH5α''. Izražanje SOD so raziskovali in tudi potrdili v vseh treh celicah, vendar v ''DH5α'' izločanje ni bilo eksokrino. S pomočjo celične linije THP-1, so za pripravljene bakterije ''Nissle 1917'' s posameznim terapevtskim elementom uspešno potrdili zaviralne učinke na vnetje [1].

=== Varnost ===

Koktejl terapija vključuje kolonizacijo ustvarjenih bakterij v debelem črevesu, zato so morali poskrbeti za njihovo varno uporabo preko samomorilskega stikala in varne odpornosti.
Pripravljene bakterije niso smele vsebovati genov za odpornost proti antibiotikom, zato so v bakterije vnesli zapis za proteine toplotnega šoka (BBa_K3838777) in gen za odpornost na triklosan (BBa_K3838789 ). Pri toplotnem presejanju pri 55°C preživijo le bakterije, ki izražajo proteine toplotnega šoka, le te pa bi bakterijam pomagali tudi pri kolonizaciji v kislem okolju debelega črevesja. Dodatno presejanje se opravi s triklosanom, ki je varna antibakterijska snov in je odobrena s strani FDA.
Ustvarjene bakterije so zasnovali tako, da v zunanjem okolju, kjer je koncentracija glukoze nižja kot v črevesju, ne preživijo. Uporabili so promotor PT-αcrp, ki se odzove na spremembe v koncentraciji glukoze, in samomorilski gen mazF, ki zapisuje endoribonukleazo. Le-ta cepi RNA in povzroči celično smrt brez lize (biokocka: BBa_K3838654) .
Želeli so preprečiti še prenos terapevtskih bakterij v kri, kjer je koncentracija fosfatov bistveno večja kot v črevesju. Uporabili so promotor PhoB, ki ga regulira endogeni na fosfat občutljiv faktor iz E. coli. Pri nizkih koncentracijah fosfata ga aktivira, pri visokih pa zavira. Aktiviran promotor PhoB sproži izražanje proteina tetR, ki pa zavira promotor pTet, pod katerim se izražal samomorilski gen (biokocka: BBa_K3838321) [1].

== KONČNI PRODUKT ==

Njihova dolgoročna želja je vzpostaviti koncept imenovan zaprta zanka zdravljenja. Za vsakega bolnika posebej bi glede na njegovo situacijo prilagodili razmerje terapevtskih elementov v koktejl terapiji in tako dosegli natančno zdravljenje več dejavnikov. Razmerje bi prilagajali tako, da bi spreminjali deleže inženirskih bakterij s posameznim terapevtskim elementom ali uporabljali različne promotorje. Ustrezno razmerje bi določali na podlagi rednega zbiranja vzorcev pacientovega blata in analize metagenomskega zaporedja, s katero bi spremljali njihovo črevesno floro in zdravje. Trenutne naprave za zbiranje blata imajo veliko pomanjkljivosti (npr. nezmožnost zbiranja tekočega blata), zato so v sklopu projekta zasnovali komplet za vzorčenje blata, ki bi ga uporabljali tako pacienti kot tudi bolnišnice.
Želijo vzpostaviti tudi spletno platformo, ki bi glede na bolnikove rezultate analiz blata in dnevnih zapisov njihove prehrane, predpisovala ustrezno dieto. Poleg tega pa bi platforma služila uporabnikom tudi za medsebojno komunikacijo in jim pomagala pri psihični stiski [1].

Gutail Floractory - probiotične bakterije za zaščito črevesja pred vnetji

2022-04-10T17:45:41Z

Karmenmlinar:

Projekt »Gutail Floractory« je sodeloval na tekmovanju iGEM 2021 ter se uvrstil med najboljših 10 v kategoriji znanost in tehnologija. Zasnovala ga je skupina SZU-CHINA, ki je želela narediti 'koktejl' prilagojenih in gensko spremenjenih črevesnih probiotikov kot adjuvans za lajšanje kronične vnetne črevesne bolezni (KVČB). Predstavitev projekta je dostopna na spletni strani: [https://2021.igem.org/Team:SZU-China Team:SZU-China]

== UVOD ==
KVČB je ponavljajoča in nespecifična vnetna reakcija v črevesni sluznici. Organi gastrointestinalnega (GI) trakta imajo posledično oslabljeno/okvarjeno delovanje, kar vodi do simptomov, kot so dolgotrajna driska, bolečine v trebuhu, rektalna krvavitev, izguba teže in utrujenost. KVČB delimo na '''Crohnovo bolezen (CB)''' in '''ulcerozni kolitis (UK)'''. CB lahko prizadene katerikoli del GI trakta in vnetje se lahko razširi na celotno debelino črevesne stene. UK je omejen na debelo črevo in rektum, vnetje pa se pojavi le v notranji plasti črevesne sluznice. V redkih primerih je med CB in UK težko ločiti, zato takrat govorimo o '''intermediarnem kolitisu''' [2]. Natančna patogeneza KVČB je še vedno neznana, v splošnem pa velja, da je vnetje posledica nepravilnega imunskega odziva sluznice na črevesno floro v genetsko dovzetnih posameznikih. Eden glavnih patoloških mehanizmov KVČB je neravnovesje črevesne flore. Bolezen se v največjem merilu pojavlja v razvitih državah in prizadene 0,5 % populacije, v prihodnosti pa bo število bolnikov postopoma naraščalo [3]. Zdravljenje poteka z različnimi zdravili in striktno prehransko dieto. Glavni cilj je remisija (odsotnost simptomov), same bolezni pa ni mogoče popolnoma pozdraviti [2]. Konvencionalno zdravljenje z zdravili učinkuje le v omejenem obsegu, neželeni stranski učinki, visoki stroški in dolgotrajna zdravljenja, pa vplivajo na bolnikovo materialno in duševno stanje ter tudi na kakovost njihovega življenja. Poleg tega so bolniki s KVČB izpostavljeni večjemu tveganju za raka, krvne strdke in bolezni jeter [1,2].

== '''CILJI PROJEKTA''' ==
KVČB otežuje življenje že več kot 10 milijonom ljudi iz vseh družbenih slojev. V predhodnih študijah je bilo ugotovljeno, da uporaba probiotikov, kot so mlečnokislinske bakterije in bifidobakterije, ob običajnem zdravljenju dosega boljše rezultate. V okviru projekta »Gutail Floractory« so zato želeli razviti bakterijski adjuvans za lajšanje bolnikovega nelagodja v času okrevanja, dolgoročno izboljšanje kakovosti bolnikovega življenja in celo zdravljenje bolnikov, ki se ne odzivajo na konvencionalne terapije. Šlo bi za pomožno vzdrževalno zdravljenje KVČB s koktejlom modificiranih inženirskih bakterij, ki bi jih vakuumsko liofilizirali in dozirali v kapsulah. Želeli so poiskati dejavnike, ki so povezani z napredovanjem bolezni KVČB, in izbrati štiri za potencialne tarče koktejl terapije. Glede na izbrane tarče bi oblikovali terapevtske elemente. Le-te bi predhodno modularizirali, s poudarkom na zamenljivosti promotorjev in odprtih bralnih okvirjev, da bi lahko poljubno spreminjali terapevtske gene in metode njihovega izražanja [1].

== '''IZVEDBA''' ==

=== '''Izbira šasije''' ===

Zaradi zahtevnosti delovanja so za šasijo izbrali več bakterij [1]:
1) '''''E. coli DH5α/BL21(DE3)''''' – pogosto uporabljene inženirske bakterije v katerih so upali, da sistem ne glede na zahtevnost deluje.
2) '''''E. coli Nissle 1917''''' – spada med probiotike, je nepatogena bakterija in lahko kolonizira. Lahko izraža mikrobektin, ki zavira rast nekaterih mikroorganizmov v vnetem črevesju.
3) '''''Lactococcus lactis''''' – mlečnokislinska bakterija, spada med probiotike. Pri UK je njihovo število zmanjšano, kar je lahko tesno povezano s patogenezo KVČB. Povezuje se jih tudi s spodbujanjem proizvodnje kratkoverižnih maščobnih kislin. Zaradi časovne omejitev te šasije niso uspeli testirati.

===''' Terapevtske tarče''' ===

V raziskavi so našli veliko število dejavnikov, ki so povezani z napredovanjem KVČB. Med njimi so za terapevtske tarče koktejl terapije, na podlagi najboljše izvedljivosti le-te, izbrali štiri: spremembe v proizvodnji maslene kisline, lipopolisaharida in antibakterijskega proteina LL-37, superoksid dismutaze (SOD) in hidrolaze žolčnih soli (angl. bile salt hydrolase, BSH).

''Maslena kislina:''
Kratkoverižna maščobna kislina, katere proizvodnja je pri bolnikih s KVČB zmanjšana. Maščobne kisline so izjemno pomembne pri ohranjanju zdravja debelega črevesa, saj med drugimi predstavljajo glavni energijski vir za epitelijske celice in zavirajo vnetni odziv. Maslena kislina velja za idealno zdravilo za zdravljenje KVČB, vendar je ni mogoče dozirati peroralno. V sintezni poti maščobnih kislin družina tioesteraz prekine podaljšan cikel maščobnih kislin in sprostijo se proste maščobne kisline, katerih dolžina je odvisna od vrste tioesteraze. Za terapevtski gen so izbrali tioesterazo Tes4 iz ''Bacteroides polymorpha'' (biokocka: BBa_K3838613) [1,4].

''LL-37:''
Pri bolnikih z UK je zaradi neuravnotežene črevesne flore spremenjena pregradna funkcija in prepustnost sluznice, zato gramnegativne bakterije vstopijo v limfni in krvni sistem, njihov lipopolisaharid pa stimulira imunski sistem. LL-37 je antibakterijski peptid, ki ga izločajo človeške imunske celice in zavira nekatere škodljive bakterije. Koncentracija tega peptida (1-5 μg/ml), ki se običajno nahaja pri odraslih na površini sluznice, je prenizka za neposredno uničenje bakterij, vendar pa sodeluje pri imunski regulaciji in ščiti človeško telo pred endotoksemijo. Verjamejo, da bi z bakterijami, ki eksokrino izločajo LL-37, izboljšali vnetno stanje (biokocka: BBa_K3838555) [1,5].

''SOD:''
ROS poškodujejo lipide, proteine, nukleinske kisline, uničijo integriteto epitelijskih celic, so vključeni v različne znotrajcelične signalne poti in spodbujajo vnetni odziv. Črevesna sluznica ima kompleksen antioksidativni sistem, v katerem je SOD začetni encim za delovanje celotnega sistema. Pri bolnikih s KVČB je ta sistem okvarjen. Neposredno povečanje količine SOD v bolnikovem črevesnem traktu ni mogoče, zaradi zelo kratke razpolovne dobe. Za dolgoročne in stabilne terapevtske učinke je zato potreben eksokrini ekspresijski bakterijski sistem (biokocka: BBa_K3838233) [1,6].

''BSH:''
BSH katalizira hidrolizo kombiniranih žolčnih soli, pri čemer se sproščajo prosta žolčna kislina in aminokisline. Aktivnost BSH v prebavilih izvira predvsem iz ''Firmicutes, Bacteroides'' in ''Actinomycetes'', njihova številčnost pa je pri bolnikih s KVČB zmanjšana, kar vodi do motene presnove žolčnih kislin in povečanega vnetnega odziva. Zaužitje probiotikov z aktivnostjo BSH lahko spodbudi biotransformacijo žolčnih soli v črevesju in s tem ublaži vnetni odziv (biokocka: BBa_K3838666) [1,7].

=== '''Izražanje''' ===

Že na začetku projekta so vedeli, da uporaba promotorja T7 ne bo mogoča. Zato so izbrali najpogostejši močni konstitutivni promotor J23100, ki je sicer manj učinkovit od ekspresijskega sistema s T7 promotorjem, vendar kljub temu zagotovi zadostno in stabilno izražanje terapevtskih učinkovin.
Pri bolnikih s KVČB je zaradi kopičenja ocetne in mlečne kisline v debelem črevesju okolje kislo. Za dosego potrebne regulativne funkcije so uporabili promotor PrcfB ekipe SZPT-China 2019 [1]. Gre za izboljšano različico kislinskega promotorja p170 z višjo učinkovitostjo izražanja. Promotorju p170 je dodana operatorska regija, na katero se ob kislih pogojih veže RcfB in inducira izražanje [8]. RcfB je endogeni protein mlečnokislinskih bakterij, v E. coli pa so ga vnesli pod konstitutivnim promotorjem s pomožnim vektorjem [1].
Vse štiri terapevtske gene so vnesli v ekspresijske vektorje (pUC18/pJSG/pET) s promotorjem RcfB ali J23100 in transformirali izbrane bakterije: ''BL21(DE3), DH5α'' in ''Nissle 1917''. Uspešnost in pravilnost izražanja proteina v pripravljenih bakterijah so preverili z gelsko elektroforezo, prenosom po Westernu in afinitetno kromatografijo. S tekočinsko kromatografijo so neposredno merili proizvodnjo terapevtskega produkta. Učinkovitost bakterij pri blaženju vnetnih simptomov pa so preverili z uporabo ustrezno pripravljene celične linije THP-1, ki je služila za tipičen model vnetja.
Terapevtski element Tes4, LL-37 on BSH so izražali v ''DH5α'' in ''Nissle 1917''. Potrdili so izražanje Tes4 s povečano koncentracijo maslene kisline v obeh šasijah. V obeh šasijah se je izražal tudi BSH, med tem ko se je LL-37 izražal le v ''DH5α''. Izražanje SOD so raziskovali in tudi potrdili v vseh treh celicah, vendar v ''DH5α'' izločanje ni bilo eksokrino. S pomočjo celične linije THP-1, so za pripravljene bakterije ''Nissle 1917'' s posameznim terapevtskim elementom uspešno potrdili zaviralne učinke na vnetje [1].

=== '''Varnost''' ===

Koktejl terapija vključuje kolonizacijo ustvarjenih bakterij v debelem črevesu, zato so morali poskrbeti za njihovo varno uporabo preko samomorilskega stikala in varne odpornosti.
Pripravljene bakterije niso smele vsebovati genov za odpornost proti antibiotikom, zato so v bakterije vnesli zapis za proteine toplotnega šoka (BBa_K3838777) in gen za odpornost na triklosan (BBa_K3838789 ). Pri toplotnem presejanju pri 55°C preživijo le bakterije, ki izražajo proteine toplotnega šoka, le te pa bi bakterijam pomagali tudi pri kolonizaciji v kislem okolju debelega črevesja. Dodatno presejanje se opravi s triklosanom, ki je varna antibakterijska snov in je odobrena s strani FDA.
Ustvarjene bakterije so zasnovali tako, da v zunanjem okolju, kjer je koncentracija glukoze nižja kot v črevesju, ne preživijo. Uporabili so promotor PT-αcrp, ki se odzove na spremembe v koncentraciji glukoze, in samomorilski gen mazF, ki zapisuje endoribonukleazo. Le-ta cepi RNA in povzroči celično smrt brez lize (biokocka: BBa_K3838654) .
Želeli so preprečiti še prenos terapevtskih bakterij v kri, kjer je koncentracija fosfatov bistveno večja kot v črevesju. Uporabili so promotor PhoB, ki ga regulira endogeni na fosfat občutljiv faktor iz E. coli. Pri nizkih koncentracijah fosfata ga aktivira, pri visokih pa zavira. Aktiviran promotor PhoB sproži izražanje proteina tetR, ki pa zavira promotor pTet, pod katerim se izražal samomorilski gen (biokocka: BBa_K3838321) [1].

== '''KONČNI PRODUKT''' ==

Njihova dolgoročna želja je vzpostaviti koncept imenovan zaprta zanka zdravljenja. Za vsakega bolnika posebej bi glede na njegovo situacijo prilagodili razmerje terapevtskih elementov v koktejl terapiji in tako dosegli natančno zdravljenje več dejavnikov. Razmerje bi prilagajali tako, da bi spreminjali deleže inženirskih bakterij s posameznim terapevtskim elementom ali uporabljali različne promotorje. Ustrezno razmerje bi določali na podlagi rednega zbiranja vzorcev pacientovega blata in analize metagenomskega zaporedja, s katero bi spremljali njihovo črevesno floro in zdravje. Trenutne naprave za zbiranje blata imajo veliko pomanjkljivosti (npr. nezmožnost zbiranja tekočega blata), zato so v sklopu projekta zasnovali komplet za vzorčenje blata, ki bi ga uporabljali tako pacienti kot tudi bolnišnice.
Želijo vzpostaviti tudi spletno platformo, ki bi glede na bolnikove rezultate analiz blata in dnevnih zapisov njihove prehrane, predpisovala ustrezno dieto. Poleg tega pa bi platforma služila uporabnikom tudi za medsebojno komunikacijo in jim pomagala pri psihični stiski [1].

Gutail Floractory - probiotične bakterije za zaščito črevesja pred vnetji

2022-04-10T17:44:34Z

Karmenmlinar:

Projekt »Gutail Floractory« je sodeloval na tekmovanju iGEM 2021 ter se uvrstil med najboljših 10 v kategoriji znanost in tehnologija. Zasnovala ga je skupina SZU-CHINA, ki je želela narediti 'koktejl' prilagojenih in gensko spremenjenih črevesnih probiotikov kot adjuvans za lajšanje kronične vnetne črevesne bolezni (KVČB) [1]. Predstavitev projekta je dostopna na spletni strani: [https://2021.igem.org/Team:SZU-China Team:SZU-China]

== '''UVOD''' ==
KVČB je ponavljajoča in nespecifična vnetna reakcija v črevesni sluznici. Organi gastrointestinalnega (GI) trakta imajo posledično oslabljeno/okvarjeno delovanje, kar vodi do simptomov, kot so dolgotrajna driska, bolečine v trebuhu, rektalna krvavitev, izguba teže in utrujenost. KVČB delimo na '''Crohnovo bolezen (CB)''' in '''ulcerozni kolitis (UK)'''. CB lahko prizadene katerikoli del GI trakta in vnetje se lahko razširi na celotno debelino črevesne stene. UK je omejen na debelo črevo in rektum, vnetje pa se pojavi le v notranji plasti črevesne sluznice. V redkih primerih je med CB in UK težko ločiti, zato takrat govorimo o '''intermediarnem kolitisu''' [2]. Natančna patogeneza KVČB je še vedno neznana, v splošnem pa velja, da je vnetje posledica nepravilnega imunskega odziva sluznice na črevesno floro v genetsko dovzetnih posameznikih. Eden glavnih patoloških mehanizmov KVČB je neravnovesje črevesne flore. Bolezen se v največjem merilu pojavlja v razvitih državah in prizadene 0,5 % populacije, v prihodnosti pa bo število bolnikov postopoma naraščalo [3]. Zdravljenje poteka z različnimi zdravili in striktno prehransko dieto. Glavni cilj je remisija (odsotnost simptomov), same bolezni pa ni mogoče popolnoma pozdraviti [2]. Konvencionalno zdravljenje z zdravili učinkuje le v omejenem obsegu, neželeni stranski učinki, visoki stroški in dolgotrajna zdravljenja, pa vplivajo na bolnikovo materialno in duševno stanje ter tudi na kakovost njihovega življenja. Poleg tega so bolniki s KVČB izpostavljeni večjemu tveganju za raka, krvne strdke in bolezni jeter [1,2].

== '''CILJI PROJEKTA''' ==
KVČB otežuje življenje že več kot 10 milijonom ljudi iz vseh družbenih slojev. V predhodnih študijah je bilo ugotovljeno, da uporaba probiotikov, kot so mlečnokislinske bakterije in bifidobakterije, ob običajnem zdravljenju dosega boljše rezultate. V okviru projekta »Gutail Floractory« so zato želeli razviti bakterijski adjuvans za lajšanje bolnikovega nelagodja v času okrevanja, dolgoročno izboljšanje kakovosti bolnikovega življenja in celo zdravljenje bolnikov, ki se ne odzivajo na konvencionalne terapije. Šlo bi za pomožno vzdrževalno zdravljenje KVČB s koktejlom modificiranih inženirskih bakterij, ki bi jih vakuumsko liofilizirali in dozirali v kapsulah. Želeli so poiskati dejavnike, ki so povezani z napredovanjem bolezni KVČB, in izbrati štiri za potencialne tarče koktejl terapije. Glede na izbrane tarče bi oblikovali terapevtske elemente. Le-te bi predhodno modularizirali, s poudarkom na zamenljivosti promotorjev in odprtih bralnih okvirjev, da bi lahko poljubno spreminjali terapevtske gene in metode njihovega izražanja [1].

== '''IZVEDBA''' ==

=== '''Izbira šasije''' ===

Zaradi zahtevnosti delovanja so za šasijo izbrali več bakterij [1]:
1) '''''E. coli DH5α/BL21(DE3)''''' – pogosto uporabljene inženirske bakterije v katerih so upali, da sistem ne glede na zahtevnost deluje.
2) '''''E. coli Nissle 1917''''' – spada med probiotike, je nepatogena bakterija in lahko kolonizira. Lahko izraža mikrobektin, ki zavira rast nekaterih mikroorganizmov v vnetem črevesju.
3) '''''Lactococcus lactis''''' – mlečnokislinska bakterija, spada med probiotike. Pri UK je njihovo število zmanjšano, kar je lahko tesno povezano s patogenezo KVČB. Povezuje se jih tudi s spodbujanjem proizvodnje kratkoverižnih maščobnih kislin. Zaradi časovne omejitev te šasije niso uspeli testirati.

===''' Terapevtske tarče''' ===

V raziskavi so našli veliko število dejavnikov, ki so povezani z napredovanjem KVČB. Med njimi so za terapevtske tarče koktejl terapije, na podlagi najboljše izvedljivosti le-te, izbrali štiri: spremembe v proizvodnji maslene kisline, lipopolisaharida in antibakterijskega proteina LL-37, superoksid dismutaze (SOD) in hidrolaze žolčnih soli (angl. bile salt hydrolase, BSH).

''Maslena kislina:''
Kratkoverižna maščobna kislina, katere proizvodnja je pri bolnikih s KVČB zmanjšana. Maščobne kisline so izjemno pomembne pri ohranjanju zdravja debelega črevesa, saj med drugimi predstavljajo glavni energijski vir za epitelijske celice in zavirajo vnetni odziv. Maslena kislina velja za idealno zdravilo za zdravljenje KVČB, vendar je ni mogoče dozirati peroralno. V sintezni poti maščobnih kislin družina tioesteraz prekine podaljšan cikel maščobnih kislin in sprostijo se proste maščobne kisline, katerih dolžina je odvisna od vrste tioesteraze. Za terapevtski gen so izbrali tioesterazo Tes4 iz ''Bacteroides polymorpha'' (biokocka: BBa_K3838613) [1,4].

''LL-37:''
Pri bolnikih z UK je zaradi neuravnotežene črevesne flore spremenjena pregradna funkcija in prepustnost sluznice, zato gramnegativne bakterije vstopijo v limfni in krvni sistem, njihov lipopolisaharid pa stimulira imunski sistem. LL-37 je antibakterijski peptid, ki ga izločajo človeške imunske celice in zavira nekatere škodljive bakterije. Koncentracija tega peptida (1-5 μg/ml), ki se običajno nahaja pri odraslih na površini sluznice, je prenizka za neposredno uničenje bakterij, vendar pa sodeluje pri imunski regulaciji in ščiti človeško telo pred endotoksemijo. Verjamejo, da bi z bakterijami, ki eksokrino izločajo LL-37, izboljšali vnetno stanje (biokocka: BBa_K3838555) [1,5].

''SOD:''
ROS poškodujejo lipide, proteine, nukleinske kisline, uničijo integriteto epitelijskih celic, so vključeni v različne znotrajcelične signalne poti in spodbujajo vnetni odziv. Črevesna sluznica ima kompleksen antioksidativni sistem, v katerem je SOD začetni encim za delovanje celotnega sistema. Pri bolnikih s KVČB je ta sistem okvarjen. Neposredno povečanje količine SOD v bolnikovem črevesnem traktu ni mogoče, zaradi zelo kratke razpolovne dobe. Za dolgoročne in stabilne terapevtske učinke je zato potreben eksokrini ekspresijski bakterijski sistem (biokocka: BBa_K3838233) [1,6].

''BSH:''
BSH katalizira hidrolizo kombiniranih žolčnih soli, pri čemer se sproščajo prosta žolčna kislina in aminokisline. Aktivnost BSH v prebavilih izvira predvsem iz ''Firmicutes, Bacteroides'' in ''Actinomycetes'', njihova številčnost pa je pri bolnikih s KVČB zmanjšana, kar vodi do motene presnove žolčnih kislin in povečanega vnetnega odziva. Zaužitje probiotikov z aktivnostjo BSH lahko spodbudi biotransformacijo žolčnih soli v črevesju in s tem ublaži vnetni odziv (biokocka: BBa_K3838666) [1,7].

=== '''Izražanje''' ===

Že na začetku projekta so vedeli, da uporaba promotorja T7 ne bo mogoča. Zato so izbrali najpogostejši močni konstitutivni promotor J23100, ki je sicer manj učinkovit od ekspresijskega sistema s T7 promotorjem, vendar kljub temu zagotovi zadostno in stabilno izražanje terapevtskih učinkovin.
Pri bolnikih s KVČB je zaradi kopičenja ocetne in mlečne kisline v debelem črevesju okolje kislo. Za dosego potrebne regulativne funkcije so uporabili promotor PrcfB ekipe SZPT-China 2019 [1]. Gre za izboljšano različico kislinskega promotorja p170 z višjo učinkovitostjo izražanja. Promotorju p170 je dodana operatorska regija, na katero se ob kislih pogojih veže RcfB in inducira izražanje [8]. RcfB je endogeni protein mlečnokislinskih bakterij, v E. coli pa so ga vnesli pod konstitutivnim promotorjem s pomožnim vektorjem [1].
Vse štiri terapevtske gene so vnesli v ekspresijske vektorje (pUC18/pJSG/pET) s promotorjem RcfB ali J23100 in transformirali izbrane bakterije: ''BL21(DE3), DH5α'' in ''Nissle 1917''. Uspešnost in pravilnost izražanja proteina v pripravljenih bakterijah so preverili z gelsko elektroforezo, prenosom po Westernu in afinitetno kromatografijo. S tekočinsko kromatografijo so neposredno merili proizvodnjo terapevtskega produkta. Učinkovitost bakterij pri blaženju vnetnih simptomov pa so preverili z uporabo ustrezno pripravljene celične linije THP-1, ki je služila za tipičen model vnetja.
Terapevtski element Tes4, LL-37 on BSH so izražali v ''DH5α'' in ''Nissle 1917''. Potrdili so izražanje Tes4 s povečano koncentracijo maslene kisline v obeh šasijah. V obeh šasijah se je izražal tudi BSH, med tem ko se je LL-37 izražal le v ''DH5α''. Izražanje SOD so raziskovali in tudi potrdili v vseh treh celicah, vendar v ''DH5α'' izločanje ni bilo eksokrino. S pomočjo celične linije THP-1, so za pripravljene bakterije ''Nissle 1917'' s posameznim terapevtskim elementom uspešno potrdili zaviralne učinke na vnetje [1].

=== '''Varnost''' ===

Koktejl terapija vključuje kolonizacijo ustvarjenih bakterij v debelem črevesu, zato so morali poskrbeti za njihovo varno uporabo preko samomorilskega stikala in varne odpornosti.
Pripravljene bakterije niso smele vsebovati genov za odpornost proti antibiotikom, zato so v bakterije vnesli zapis za proteine toplotnega šoka (BBa_K3838777) in gen za odpornost na triklosan (BBa_K3838789 ). Pri toplotnem presejanju pri 55°C preživijo le bakterije, ki izražajo proteine toplotnega šoka, le te pa bi bakterijam pomagali tudi pri kolonizaciji v kislem okolju debelega črevesja. Dodatno presejanje se opravi s triklosanom, ki je varna antibakterijska snov in je odobrena s strani FDA.
Ustvarjene bakterije so zasnovali tako, da v zunanjem okolju, kjer je koncentracija glukoze nižja kot v črevesju, ne preživijo. Uporabili so promotor PT-αcrp, ki se odzove na spremembe v koncentraciji glukoze, in samomorilski gen mazF, ki zapisuje endoribonukleazo. Le-ta cepi RNA in povzroči celično smrt brez lize (biokocka: BBa_K3838654) .
Želeli so preprečiti še prenos terapevtskih bakterij v kri, kjer je koncentracija fosfatov bistveno večja kot v črevesju. Uporabili so promotor PhoB, ki ga regulira endogeni na fosfat občutljiv faktor iz E. coli. Pri nizkih koncentracijah fosfata ga aktivira, pri visokih pa zavira. Aktiviran promotor PhoB sproži izražanje proteina tetR, ki pa zavira promotor pTet, pod katerim se izražal samomorilski gen (biokocka: BBa_K3838321) [1].

== '''KONČNI PRODUKT''' ==

Njihova dolgoročna želja je vzpostaviti koncept imenovan zaprta zanka zdravljenja. Za vsakega bolnika posebej bi glede na njegovo situacijo prilagodili razmerje terapevtskih elementov v koktejl terapiji in tako dosegli natančno zdravljenje več dejavnikov. Razmerje bi prilagajali tako, da bi spreminjali deleže inženirskih bakterij s posameznim terapevtskim elementom ali uporabljali različne promotorje. Ustrezno razmerje bi določali na podlagi rednega zbiranja vzorcev pacientovega blata in analize metagenomskega zaporedja, s katero bi spremljali njihovo črevesno floro in zdravje. Trenutne naprave za zbiranje blata imajo veliko pomanjkljivosti (npr. nezmožnost zbiranja tekočega blata), zato so v sklopu projekta zasnovali komplet za vzorčenje blata, ki bi ga uporabljali tako pacienti kot tudi bolnišnice.
Želijo vzpostaviti tudi spletno platformo, ki bi glede na bolnikove rezultate analiz blata in dnevnih zapisov njihove prehrane, predpisovala ustrezno dieto. Poleg tega pa bi platforma služila uporabnikom tudi za medsebojno komunikacijo in jim pomagala pri psihični stiski [1].

Gutail Floractory - probiotične bakterije za zaščito črevesja pred vnetji

2022-04-10T17:43:17Z

Karmenmlinar: New page: Projekt »Gutail Floractory« je sodeloval na tekmovanju iGEM 2021 ter se uvrstil med najboljših 10 v kategoriji znanost in tehnologija. Zasnovala ga je skupina SZU-CHINA, ki je želela n...

Projekt »Gutail Floractory« je sodeloval na tekmovanju iGEM 2021 ter se uvrstil med najboljših 10 v kategoriji znanost in tehnologija. Zasnovala ga je skupina SZU-CHINA, ki je želela narediti 'koktejl' prilagojenih in gensko spremenjenih črevesnih probiotikov kot adjuvans za lajšanje kronične vnetne črevesne bolezni (KVČB) [1]. Predstavitev projekta je dostopna na spletni strani: [https://2021.igem.org/Team:SZU-China Team:SZU-China]

== '''UVOD''' ==
KVČB je ponavljajoča in nespecifična vnetna reakcija v črevesni sluznici. Organi gastrointestinalnega (GI) trakta imajo posledično oslabljeno/okvarjeno delovanje, kar vodi do simptomov, kot so dolgotrajna driska, bolečine v trebuhu, rektalna krvavitev, izguba teže in utrujenost. KVČB delimo na '''Crohnovo bolezen (CB)''' in '''ulcerozni kolitis (UK)'''. CB lahko prizadene katerikoli del GI trakta in vnetje se lahko razširi na celotno debelino črevesne stene. UK je omejen na debelo črevo in rektum, vnetje pa se pojavi le v notranji plasti črevesne sluznice. V redkih primerih je med CB in UK težko ločiti, zato takrat govorimo o '''intermediarnem kolitisu''' [2]. Natančna patogeneza KVČB je še vedno neznana, v splošnem pa velja, da je vnetje posledica nepravilnega imunskega odziva sluznice na črevesno floro v genetsko dovzetnih posameznikih. Eden glavnih patoloških mehanizmov KVČB je neravnovesje črevesne flore. Bolezen se v največjem merilu pojavlja v razvitih državah in prizadene 0,5 % populacije, v prihodnosti pa bo število bolnikov postopoma naraščalo [3]. Zdravljenje poteka z različnimi zdravili in striktno prehransko dieto. Glavni cilj je remisija (odsotnost simptomov), same bolezni pa ni mogoče popolnoma pozdraviti [2]. Konvencionalno zdravljenje z zdravili učinkuje le v omejenem obsegu, neželeni stranski učinki, visoki stroški in dolgotrajna zdravljenja, pa vplivajo na bolnikovo materialno in duševno stanje ter tudi na kakovost njihovega življenja. Poleg tega so bolniki s KVČB izpostavljeni večjemu tveganju za raka, krvne strdke in bolezni jeter [1,2].

== '''CILJI PROJEKTA''' ==
KVČB otežuje življenje že več kot 10 milijonom ljudi iz vseh družbenih slojev. V predhodnih študijah je bilo ugotovljeno, da uporaba probiotikov, kot so mlečnokislinske bakterije in bifidobakterije, ob običajnem zdravljenju dosega boljše rezultate. V okviru projekta »Gutail Floractory« so zato želeli razviti bakterijski adjuvans za lajšanje bolnikovega nelagodja v času okrevanja, dolgoročno izboljšanje kakovosti bolnikovega življenja in celo zdravljenje bolnikov, ki se ne odzivajo na konvencionalne terapije. Šlo bi za pomožno vzdrževalno zdravljenje KVČB s koktejlom modificiranih inženirskih bakterij, ki bi jih vakuumsko liofilizirali in dozirali v kapsulah. Želeli so poiskati dejavnike, ki so povezani z napredovanjem bolezni KVČB, in izbrati štiri za potencialne tarče koktejl terapije. Glede na izbrane tarče bi oblikovali terapevtske elemente. Le-te bi predhodno modularizirali, s poudarkom na zamenljivosti promotorjev in odprtih bralnih okvirjev, da bi lahko poljubno spreminjali terapevtske gene in metode njihovega izražanja [1].

== '''IZVEDBA''' ==

= '''Izbira šasije''' =

Zaradi zahtevnosti delovanja so za šasijo izbrali več bakterij [1]:
1) '''''E. coli DH5α/BL21(DE3)''''' – pogosto uporabljene inženirske bakterije v katerih so upali, da sistem ne glede na zahtevnost deluje.
2) '''''E. coli Nissle 1917''''' – spada med probiotike, je nepatogena bakterija in lahko kolonizira. Lahko izraža mikrobektin, ki zavira rast nekaterih mikroorganizmov v vnetem črevesju.
3) '''''Lactococcus lactis''''' – mlečnokislinska bakterija, spada med probiotike. Pri UK je njihovo število zmanjšano, kar je lahko tesno povezano s patogenezo KVČB. Povezuje se jih tudi s spodbujanjem proizvodnje kratkoverižnih maščobnih kislin. Zaradi časovne omejitev te šasije niso uspeli testirati.

=''' Terapevtske tarče''' =

V raziskavi so našli veliko število dejavnikov, ki so povezani z napredovanjem KVČB. Med njimi so za terapevtske tarče koktejl terapije, na podlagi najboljše izvedljivosti le-te, izbrali štiri: spremembe v proizvodnji maslene kisline, lipopolisaharida in antibakterijskega proteina LL-37, superoksid dismutaze (SOD) in hidrolaze žolčnih soli (angl. bile salt hydrolase, BSH).

''Maslena kislina:''
Kratkoverižna maščobna kislina, katere proizvodnja je pri bolnikih s KVČB zmanjšana. Maščobne kisline so izjemno pomembne pri ohranjanju zdravja debelega črevesa, saj med drugimi predstavljajo glavni energijski vir za epitelijske celice in zavirajo vnetni odziv. Maslena kislina velja za idealno zdravilo za zdravljenje KVČB, vendar je ni mogoče dozirati peroralno. V sintezni poti maščobnih kislin družina tioesteraz prekine podaljšan cikel maščobnih kislin in sprostijo se proste maščobne kisline, katerih dolžina je odvisna od vrste tioesteraze. Za terapevtski gen so izbrali tioesterazo Tes4 iz ''Bacteroides polymorpha'' (biokocka: BBa_K3838613) [1,4].

''LL-37:''
Pri bolnikih z UK je zaradi neuravnotežene črevesne flore spremenjena pregradna funkcija in prepustnost sluznice, zato gramnegativne bakterije vstopijo v limfni in krvni sistem, njihov lipopolisaharid pa stimulira imunski sistem. LL-37 je antibakterijski peptid, ki ga izločajo človeške imunske celice in zavira nekatere škodljive bakterije. Koncentracija tega peptida (1-5 μg/ml), ki se običajno nahaja pri odraslih na površini sluznice, je prenizka za neposredno uničenje bakterij, vendar pa sodeluje pri imunski regulaciji in ščiti človeško telo pred endotoksemijo. Verjamejo, da bi z bakterijami, ki eksokrino izločajo LL-37, izboljšali vnetno stanje (biokocka: BBa_K3838555) [1,5].

''SOD:''
ROS poškodujejo lipide, proteine, nukleinske kisline, uničijo integriteto epitelijskih celic, so vključeni v različne znotrajcelične signalne poti in spodbujajo vnetni odziv. Črevesna sluznica ima kompleksen antioksidativni sistem, v katerem je SOD začetni encim za delovanje celotnega sistema. Pri bolnikih s KVČB je ta sistem okvarjen. Neposredno povečanje količine SOD v bolnikovem črevesnem traktu ni mogoče, zaradi zelo kratke razpolovne dobe. Za dolgoročne in stabilne terapevtske učinke je zato potreben eksokrini ekspresijski bakterijski sistem (biokocka: BBa_K3838233) [1,6].

''BSH:''
BSH katalizira hidrolizo kombiniranih žolčnih soli, pri čemer se sproščajo prosta žolčna kislina in aminokisline. Aktivnost BSH v prebavilih izvira predvsem iz ''Firmicutes, Bacteroides'' in ''Actinomycetes'', njihova številčnost pa je pri bolnikih s KVČB zmanjšana, kar vodi do motene presnove žolčnih kislin in povečanega vnetnega odziva. Zaužitje probiotikov z aktivnostjo BSH lahko spodbudi biotransformacijo žolčnih soli v črevesju in s tem ublaži vnetni odziv (biokocka: BBa_K3838666) [1,7].

= '''Izražanje''' =

Že na začetku projekta so vedeli, da uporaba promotorja T7 ne bo mogoča. Zato so izbrali najpogostejši močni konstitutivni promotor J23100, ki je sicer manj učinkovit od ekspresijskega sistema s T7 promotorjem, vendar kljub temu zagotovi zadostno in stabilno izražanje terapevtskih učinkovin.
Pri bolnikih s KVČB je zaradi kopičenja ocetne in mlečne kisline v debelem črevesju okolje kislo. Za dosego potrebne regulativne funkcije so uporabili promotor PrcfB ekipe SZPT-China 2019 [1]. Gre za izboljšano različico kislinskega promotorja p170 z višjo učinkovitostjo izražanja. Promotorju p170 je dodana operatorska regija, na katero se ob kislih pogojih veže RcfB in inducira izražanje [8]. RcfB je endogeni protein mlečnokislinskih bakterij, v E. coli pa so ga vnesli pod konstitutivnim promotorjem s pomožnim vektorjem [1].
Vse štiri terapevtske gene so vnesli v ekspresijske vektorje (pUC18/pJSG/pET) s promotorjem RcfB ali J23100 in transformirali izbrane bakterije: ''BL21(DE3), DH5α'' in ''Nissle 1917''. Uspešnost in pravilnost izražanja proteina v pripravljenih bakterijah so preverili z gelsko elektroforezo, prenosom po Westernu in afinitetno kromatografijo. S tekočinsko kromatografijo so neposredno merili proizvodnjo terapevtskega produkta. Učinkovitost bakterij pri blaženju vnetnih simptomov pa so preverili z uporabo ustrezno pripravljene celične linije THP-1, ki je služila za tipičen model vnetja.
Terapevtski element Tes4, LL-37 on BSH so izražali v ''DH5α'' in ''Nissle 1917''. Potrdili so izražanje Tes4 s povečano koncentracijo maslene kisline v obeh šasijah. V obeh šasijah se je izražal tudi BSH, med tem ko se je LL-37 izražal le v ''DH5α''. Izražanje SOD so raziskovali in tudi potrdili v vseh treh celicah, vendar v ''DH5α'' izločanje ni bilo eksokrino. S pomočjo celične linije THP-1, so za pripravljene bakterije ''Nissle 1917'' s posameznim terapevtskim elementom uspešno potrdili zaviralne učinke na vnetje [1].

= '''Varnost''' =

Koktejl terapija vključuje kolonizacijo ustvarjenih bakterij v debelem črevesu, zato so morali poskrbeti za njihovo varno uporabo preko samomorilskega stikala in varne odpornosti.
Pripravljene bakterije niso smele vsebovati genov za odpornost proti antibiotikom, zato so v bakterije vnesli zapis za proteine toplotnega šoka (BBa_K3838777) in gen za odpornost na triklosan (BBa_K3838789 ). Pri toplotnem presejanju pri 55°C preživijo le bakterije, ki izražajo proteine toplotnega šoka, le te pa bi bakterijam pomagali tudi pri kolonizaciji v kislem okolju debelega črevesja. Dodatno presejanje se opravi s triklosanom, ki je varna antibakterijska snov in je odobrena s strani FDA.
Ustvarjene bakterije so zasnovali tako, da v zunanjem okolju, kjer je koncentracija glukoze nižja kot v črevesju, ne preživijo. Uporabili so promotor PT-αcrp, ki se odzove na spremembe v koncentraciji glukoze, in samomorilski gen mazF, ki zapisuje endoribonukleazo. Le-ta cepi RNA in povzroči celično smrt brez lize (biokocka: BBa_K3838654) .
Želeli so preprečiti še prenos terapevtskih bakterij v kri, kjer je koncentracija fosfatov bistveno večja kot v črevesju. Uporabili so promotor PhoB, ki ga regulira endogeni na fosfat občutljiv faktor iz E. coli. Pri nizkih koncentracijah fosfata ga aktivira, pri visokih pa zavira. Aktiviran promotor PhoB sproži izražanje proteina tetR, ki pa zavira promotor pTet, pod katerim se izražal samomorilski gen (biokocka: BBa_K3838321) [1].

== '''KONČNI PRODUKT''' ==

Njihova dolgoročna želja je vzpostaviti koncept imenovan zaprta zanka zdravljenja. Za vsakega bolnika posebej bi glede na njegovo situacijo prilagodili razmerje terapevtskih elementov v koktejl terapiji in tako dosegli natančno zdravljenje več dejavnikov. Razmerje bi prilagajali tako, da bi spreminjali deleže inženirskih bakterij s posameznim terapevtskim elementom ali uporabljali različne promotorje. Ustrezno razmerje bi določali na podlagi rednega zbiranja vzorcev pacientovega blata in analize metagenomskega zaporedja, s katero bi spremljali njihovo črevesno floro in zdravje. Trenutne naprave za zbiranje blata imajo veliko pomanjkljivosti (npr. nezmožnost zbiranja tekočega blata), zato so v sklopu projekta zasnovali komplet za vzorčenje blata, ki bi ga uporabljali tako pacienti kot tudi bolnišnice.
Želijo vzpostaviti tudi spletno platformo, ki bi glede na bolnikove rezultate analiz blata in dnevnih zapisov njihove prehrane, predpisovala ustrezno dieto. Poleg tega pa bi platforma služila uporabnikom tudi za medsebojno komunikacijo in jim pomagala pri psihični stiski [1].

Seminarji SB 2021/22

2022-04-10T17:30:09Z

Karmenmlinar:

V študijskem letu 2021/22 študentje pri Sintezni biologiji predstavljajo naslednje teme:

RAZISKOVALNI ČLANKI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) 
Lanski primer:

# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Proizvodnja_1,3-propandiola_iz_različnih_ogljikovodikov_po_nenaravni_poti_preko_3-hidroksipropanojske_kisline Proizvodnja 1,3-propandiola iz različnih ogljikovodikov po nenaravni poti preko 3-hidroksipropanojske kisline] (Liza Ulčakar) 
#

NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.) 

# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/MIBOM_-_biokompatibilni_material_iz_školjk MIBOM - biokompatibilni material iz školjk] (Manca Osolin) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BOOM_V_-_bakterijski_membranski_vezikli_za_zaščito_rastlin_pred_patogeni BOOM V - bakterijski membranski vezikli za zaščito rastlin pred patogeni] (Eva Gartner) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/LET.IT.BEE_-_paradižnik,_katerega_cvetovi_razgradijo_insekticid LET.IT.BEE - paradižnik, katerega cvetovi razgradijo insekticid] (Barbara Jaklič) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Kissed_by_light_-_sistem_proti_oku%C5%BEbi_opeklin Kissed by light - sistem proti okužbi opeklin] (Nina Varda)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Gutail_Floractory_-_probiotične_bakterije_za_zaščito_črevesja_pred_vnetji Gutail Floractory - probiotične bakterije za zaščito črevesja pred vnetji] (Karmen Mlinar)

----

Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Povzetek je treba objaviti dva dni pred predstavitvijo do polnoči (za seminarje v sredo torej v ponedeljek). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo razprava, ki praviloma ne bo daljša od 5 minut.

Talk:Sistem Rex pri bakteriji Escherichia coli

2019-04-22T21:20:06Z

Karmenmlinar:

Temo smo okvirno razdelili sledeče:
*Karmen Mlinar: Uvod in vse do vključno z RexA
*Valeriya Musina: RexB
*Marko Pavleković: Preprečevanje samoizključitve
Izkazalo se je, da se naše teme tako zelo prepletajo, da smo na koncu vsi sodelovali pri pisanju vsakega poglavja, a večina vsebine je bilo napisano po razporedu.

Talk:Sistem Rex pri bakteriji Escherichia coli

2019-04-22T21:19:41Z

Karmenmlinar: New page: Temo smo okvirno razdelili sledeče: Karmen Mlinar: Uvod in vse do vključno z RexA Valeriya Musina: RexB Marko Pavleković: Preprečevanje samoizključitve Izkazalo se je, da se naše tem...

Temo smo okvirno razdelili sledeče:
Karmen Mlinar: Uvod in vse do vključno z RexA
Valeriya Musina: RexB
Marko Pavleković: Preprečevanje samoizključitve
Izkazalo se je, da se naše teme tako zelo prepletajo, da smo na koncu vsi sodelovali pri pisanju vsakega poglavja, a večina vsebine je bilo napisano po razporedu.

Odgovor bakterij na tujo DNA

2019-04-22T21:12:04Z

Karmenmlinar:

Seminarji pri Molekularni biologiji v študijskem letu 2018/19 obravnavajo odziv bakterijskih celic na tujo DNA, ki vstopi vanje, oziroma na okužbo z bakteriofagi. Okvirni naslovi oz. teme so navedeni na prvem seznamu. Za orientacijo in splošno poznavanje tematike si preberite [https://www.nature.com/articles/nrmicro2315 pregledni članek] v Nature Rev. Microbiol. iz leta 2010. V okviru posameznih poglavij znotraj osnovne teme lahko predlagate še kakšen seminar po lastni presoji (pošljite predlog po e-pošti!).

Vsako temo obdelajo praviloma trije študenti. Vsaka skupina mora pripraviti povzetek seminarja z vsaj 1200 besedami in ne več kot 1800 besedami in ga objaviti na tem wikiju. Povzetek ne vsebuje slikovnega gradiva, lahko pa vključuje povezave do slik in videov na spletu. Navedite do 5 ključnih virov (ti ne štejejo v vsoto 1200 besed), ki ste jih uporabili.

Vsaka skupina mora objaviti povzetek seminarja na wikiju najkasneje 24 h pred predstavitvijo svojega seminarja. Kateri del povzetka je napisal kdo, navedite v zavihku 'discussion'.
Predstavitev naj bo dolga pribl. 20 minut (tolerančni okvir je 18-23 min.), temu pa bo sledila razprava, dolga 5-10 min. Vsak član skupine mora predstaviti en del seminarja, pri čemer mora biti delo enakomerno razdeljeno med vse. Osredotočite se na osnovno temo, ki ste si jo izbrali in vključite čim manj splošnega uvoda.

Razpored seminarjev po datumih bo razviden iz spletne učilnice. Začetek seminarjev bo 8. aprila, na dve uri (ponedeljek, četrtek) pa so predvideni po trije seminarji.

Vsebina seminarjev je izpitna snov. Iz teme seminarjev so 2-3 vprašanja od ~30, kolikor jih ima celoten izpit.

Poglavja za seminarje so:

'''Preprečevanje adsorpcije fagov na celično površino''' 
1. Blokiranje receptorjev za fage 
2. Proizvodnja zunajceličnega matriksa 
3. Proizvodnja kompetitivnih inhibitorjev 

'''Preprečevanje ponovne okužbe z istim fagom s preprečitvijo vstopa fagne DNA''' 
4. Sistem Sie pri gramnegativnih bakterijah 
5. Sistem Sie pri grampozitivnih bakterijah 

'''Bakterijski restrikcijsko-modifikacijski sistem''' 
6. Odkritje prvih restrikcijskih endonukleaz ''(npr. Nobelovo predavanje Hamiltona Smitha 1978 in njegov članek iz 1970)'' 
7. Metilacijski sistem pri bakterijah 
8. Struktura in mehanizem restriktaz tipa II 
9. Prilagoditve fagov na bakterijske restrikcijsko-modifikacijske sisteme 

'''Sistem CRISP/Cas proti fagom in plazmidom''' 
10. Odkritje in opis regij CRISPR in Cas (do leta ~2002) 
11. Odkritje izvora ponavljajočih se zaporedij (Mojica et al., 2005) 
12. Odkritje vloge CRISPR/Cas pri omejevanju vnosa plazmidov (Marraffini&Sontheimer, 2008) 
13. Mehanizem delovanja kompleksa Cascade in sistem CRISPR/Cas pri ''E. coli'' (Brouns et al., 2008) 
14. Struktura in delovanje sistema CRISPR/Cas pri bakteriji ''Streptococcus pyogenes'' 

'''Sistemi abortivne infekcije (Abi)''' 
15. Sistem Rex pri bakteriji ''Escherichia coli'' 
16. Bakterijski sistemi toksin-antitoksin, usmerjeni proti fagom 

''Kjer so ob temi navedeni članki, naj ti služijo kot osnova za iskanje dodatnih virov.''

----

Za seminar se prijavite tako, da se vpišete v oklepaj za naslovom seminarja:

1. [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Blokiranje_receptorjev_za_fage Blokiranje receptorjev za fage] (Martina Lokar, Tina Kolenc Milavec, Urša Štrancar) 
2. [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Proizvodnja_zunajceli%C4%8Dnega_matriksa Proizvodnja zunajceličnega matriksa] (Patricija Miklavc, Benjamin Malovrh, Vid Modic) 
3. [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Proizvodnja_kompetitivnih_inhibitorjev Proizvodnja kompetitivnih inhibitorjev] (Ajda Godec,Liza Ulčakar,Luka Gnidovec) 
4. [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sistem_izklju%C4%8Ditve_naknadne_oku%C5%BEbe Izključitev naknadne okužbe] (Anamarija Agnič, Aljaž Bratina, Anže Šumah) 
5. Sistem Sie pri grampozitivnih bakterijah 
6. [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Odkritje_prvih_restrikcijskih_endonukleaz Odkritje prvih restrikcijskih endonukleaz] (Alen Šadl, Bor Klančnik) 
7. [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Metilacijski_sistem_pri_bakterijah Metilacijski sistem pri bakterijah] (Sumeja Kudelić, Maja Škof, Maks Kumek) 
8. [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Struktura_in_mehanizem_restriktaz_tipa_II Struktura in mehanizem restriktaz tipa II] (Meta Kodrič, Barbara Jaklič, Laura Gašperšič) 
9. [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Prilagoditve_fagov_na_bakterijske_restrikcijsko-modifikacijske_sisteme Prilagoditve fagov na bakterijske restrikcijsko-modifikacijske sisteme] (Nika Boštic, Tadej Medved, Sonja Gabrijelčič) 
10. [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Odkritje_in_opis_regij_CRISPR_in_Cas_%28do_leta_~2002%29 Odkritje in opis regij CRISPR in Cas (do leta ~2002)] (Eva Gartner, Neža Blaznik, Tina Zavodnik ) 
11. [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Odkritje_izvora_vmesnikov Odkritje izvora vmesnikov](Mateja Špegel, Špela Friškovec Vončina, Anja Truden) 
12. [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Odkritje_vloge_CRISPR/Cas_pri_omejevanju_vnosa_plazmidov Odkritje vloge CRISPR/Cas pri omejevanju vnosa plazmidov] (Urška Zagorc, Nika Mikulič Vernik, Anja Tavčar) 
13. [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Mehanizem_delovanja_kompleksa_Cascade_in_sistem_CRISPR/Cas_pri_E._coli Mehanizem delovanja kompleksa Cascade in sistem CRISPR/Cas pri ''E. coli''] (Jernej Imperl, Klementina Polanec, Gašper Anton Komatar) 
14. [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Struktura_in_delovanje_sistema_CRISPR/Cas_pri_bakteriji_Streptococcus_pyogenes Struktura in delovanje sistema CRISPR/Cas pri bakteriji ''Streptococcus pyogenes''] (Lara Hrvatin, Doroteja Armič, Matija Ruparčič) 
15. [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sistem_Rex_pri_bakteriji_Escherichia_coli Sistem Rex pri bakteriji ''Escherichia coli''] (Karmen Mlinar, Marko Pavleković, Valeriya Musina) 
16. [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Bakterijski_sistemi_toksin-antitoksin%2C_usmerjeni_proti_fagom Bakterijski sistemi toksin-antitoksin, usmerjeni proti fagom] (Sanja Stanković, Karin Dobravc Škof, Neža Žerjav ) 

Ko boste pripravljali povzetek, naslov teme na spodnjem seznamu povežite z novo wiki stranjo, ki bo vsebovala povzetek. Na koncu besedila (pod viri) v novo vrstico dodajte oznaki: <nowiki>[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]</nowiki> 

Primer, kako so bili urejeni seminarji v prejšnjih letih, si lahko ogledate na primer na strani [[Struktura kromatina]] (2013/14).

#[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Herpesvirusi_in_sorodni_dsDNA_virusi Herpesvirusi in sorodni dsDNA virusi] (Veronika Razpotnik, Ines Medved, Andrej Ivanovski)

Odgovor bakterij na tujo DNA

2019-04-22T21:11:05Z

Karmenmlinar:

Seminarji pri Molekularni biologiji v študijskem letu 2018/19 obravnavajo odziv bakterijskih celic na tujo DNA, ki vstopi vanje, oziroma na okužbo z bakteriofagi. Okvirni naslovi oz. teme so navedeni na prvem seznamu. Za orientacijo in splošno poznavanje tematike si preberite [https://www.nature.com/articles/nrmicro2315 pregledni članek] v Nature Rev. Microbiol. iz leta 2010. V okviru posameznih poglavij znotraj osnovne teme lahko predlagate še kakšen seminar po lastni presoji (pošljite predlog po e-pošti!).

Vsako temo obdelajo praviloma trije študenti. Vsaka skupina mora pripraviti povzetek seminarja z vsaj 1200 besedami in ne več kot 1800 besedami in ga objaviti na tem wikiju. Povzetek ne vsebuje slikovnega gradiva, lahko pa vključuje povezave do slik in videov na spletu. Navedite do 5 ključnih virov (ti ne štejejo v vsoto 1200 besed), ki ste jih uporabili.

Vsaka skupina mora objaviti povzetek seminarja na wikiju najkasneje 24 h pred predstavitvijo svojega seminarja. Kateri del povzetka je napisal kdo, navedite v zavihku 'discussion'.
Predstavitev naj bo dolga pribl. 20 minut (tolerančni okvir je 18-23 min.), temu pa bo sledila razprava, dolga 5-10 min. Vsak član skupine mora predstaviti en del seminarja, pri čemer mora biti delo enakomerno razdeljeno med vse. Osredotočite se na osnovno temo, ki ste si jo izbrali in vključite čim manj splošnega uvoda.

Razpored seminarjev po datumih bo razviden iz spletne učilnice. Začetek seminarjev bo 8. aprila, na dve uri (ponedeljek, četrtek) pa so predvideni po trije seminarji.

Vsebina seminarjev je izpitna snov. Iz teme seminarjev so 2-3 vprašanja od ~30, kolikor jih ima celoten izpit.

Poglavja za seminarje so:

'''Preprečevanje adsorpcije fagov na celično površino''' 
1. Blokiranje receptorjev za fage 
2. Proizvodnja zunajceličnega matriksa 
3. Proizvodnja kompetitivnih inhibitorjev 

'''Preprečevanje ponovne okužbe z istim fagom s preprečitvijo vstopa fagne DNA''' 
4. Sistem Sie pri gramnegativnih bakterijah 
5. Sistem Sie pri grampozitivnih bakterijah 

'''Bakterijski restrikcijsko-modifikacijski sistem''' 
6. Odkritje prvih restrikcijskih endonukleaz ''(npr. Nobelovo predavanje Hamiltona Smitha 1978 in njegov članek iz 1970)'' 
7. Metilacijski sistem pri bakterijah 
8. Struktura in mehanizem restriktaz tipa II 
9. Prilagoditve fagov na bakterijske restrikcijsko-modifikacijske sisteme 

'''Sistem CRISP/Cas proti fagom in plazmidom''' 
10. Odkritje in opis regij CRISPR in Cas (do leta ~2002) 
11. Odkritje izvora ponavljajočih se zaporedij (Mojica et al., 2005) 
12. Odkritje vloge CRISPR/Cas pri omejevanju vnosa plazmidov (Marraffini&Sontheimer, 2008) 
13. Mehanizem delovanja kompleksa Cascade in sistem CRISPR/Cas pri ''E. coli'' (Brouns et al., 2008) 
14. Struktura in delovanje sistema CRISPR/Cas pri bakteriji ''Streptococcus pyogenes'' 

'''Sistemi abortivne infekcije (Abi)''' 
15. Sistem Rex pri bakteriji ''Escherichia coli'' 
16. Bakterijski sistemi toksin-antitoksin, usmerjeni proti fagom 

''Kjer so ob temi navedeni članki, naj ti služijo kot osnova za iskanje dodatnih virov.''

----

Za seminar se prijavite tako, da se vpišete v oklepaj za naslovom seminarja:

1. [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Blokiranje_receptorjev_za_fage Blokiranje receptorjev za fage] (Martina Lokar, Tina Kolenc Milavec, Urša Štrancar) 
2. [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Proizvodnja_zunajceli%C4%8Dnega_matriksa Proizvodnja zunajceličnega matriksa] (Patricija Miklavc, Benjamin Malovrh, Vid Modic) 
3. [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Proizvodnja_kompetitivnih_inhibitorjev Proizvodnja kompetitivnih inhibitorjev] (Ajda Godec,Liza Ulčakar,Luka Gnidovec) 
4. [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sistem_izklju%C4%8Ditve_naknadne_oku%C5%BEbe Izključitev naknadne okužbe] (Anamarija Agnič, Aljaž Bratina, Anže Šumah) 
5. Sistem Sie pri grampozitivnih bakterijah 
6. [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Odkritje_prvih_restrikcijskih_endonukleaz Odkritje prvih restrikcijskih endonukleaz] (Alen Šadl, Bor Klančnik) 
7. [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Metilacijski_sistem_pri_bakterijah Metilacijski sistem pri bakterijah] (Sumeja Kudelić, Maja Škof, Maks Kumek) 
8. [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Struktura_in_mehanizem_restriktaz_tipa_II Struktura in mehanizem restriktaz tipa II] (Meta Kodrič, Barbara Jaklič, Laura Gašperšič) 
9. [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Prilagoditve_fagov_na_bakterijske_restrikcijsko-modifikacijske_sisteme Prilagoditve fagov na bakterijske restrikcijsko-modifikacijske sisteme] (Nika Boštic, Tadej Medved, Sonja Gabrijelčič) 
10. [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Odkritje_in_opis_regij_CRISPR_in_Cas_%28do_leta_~2002%29 Odkritje in opis regij CRISPR in Cas (do leta ~2002)] (Eva Gartner, Neža Blaznik, Tina Zavodnik ) 
11. [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Odkritje_izvora_vmesnikov Odkritje izvora vmesnikov](Mateja Špegel, Špela Friškovec Vončina, Anja Truden) 
12. [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Odkritje_vloge_CRISPR/Cas_pri_omejevanju_vnosa_plazmidov Odkritje vloge CRISPR/Cas pri omejevanju vnosa plazmidov] (Urška Zagorc, Nika Mikulič Vernik, Anja Tavčar) 
13. [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Mehanizem_delovanja_kompleksa_Cascade_in_sistem_CRISPR/Cas_pri_E._coli Mehanizem delovanja kompleksa Cascade in sistem CRISPR/Cas pri ''E. coli''] (Jernej Imperl, Klementina Polanec, Gašper Anton Komatar) 
14. [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Struktura_in_delovanje_sistema_CRISPR/Cas_pri_bakteriji_Streptococcus_pyogenes Struktura in delovanje sistema CRISPR/Cas pri bakteriji ''Streptococcus pyogenes''] (Lara Hrvatin, Doroteja Armič, Matija Ruparčič) 
15. [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sistem_Rex_pri_bakteriji_Escherichia_coli]Sistem Rex pri bakteriji ''Escherichia coli'' (Karmen Mlinar, Marko Pavleković, Valeriya Musina) 
16. [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Bakterijski_sistemi_toksin-antitoksin%2C_usmerjeni_proti_fagom Bakterijski sistemi toksin-antitoksin, usmerjeni proti fagom] (Sanja Stanković, Karin Dobravc Škof, Neža Žerjav ) 

Ko boste pripravljali povzetek, naslov teme na spodnjem seznamu povežite z novo wiki stranjo, ki bo vsebovala povzetek. Na koncu besedila (pod viri) v novo vrstico dodajte oznaki: <nowiki>[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]</nowiki> 

Primer, kako so bili urejeni seminarji v prejšnjih letih, si lahko ogledate na primer na strani [[Struktura kromatina]] (2013/14).

#[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Herpesvirusi_in_sorodni_dsDNA_virusi Herpesvirusi in sorodni dsDNA virusi] (Veronika Razpotnik, Ines Medved, Andrej Ivanovski)

Sistem Rex pri bakteriji Escherichia coli

2019-04-22T21:09:27Z

Karmenmlinar: New page: ==UVOD== Bakterije se pred okužbo z bakteriofagi lahko branijo na več načinov, med drugimi tudi s sistemi abortivne infekcije (Abi). Ti sistemi vodijo okuženo celico v smrt in tako pre...

==UVOD==
Bakterije se pred okužbo z bakteriofagi lahko branijo na več načinov, med drugimi tudi s sistemi abortivne infekcije (Abi). Ti sistemi vodijo okuženo celico v smrt in tako preprečijo razmnoževanje fagov ter njihovo širitev v ostale celice. Tarče sistemov Abi so običajno ključni koraki razmnoževanja fagov: replikacija, transkripcija in translacija. Sisteme Abi se raziskuje že več kot 50 let, vendar jih še vedno ne razumemo dobro. Razlog se delno skriva v njihovi kompleksnosti, delno pa v samem pomanjkanju znanja o biologiji fagov.
==SISTEM REX==
Najbolj značilen sistem Abi je sistem Rex v bakteriji Escherichia coli. Odkrili so ga na bakteriofagu λ, ki se v celici nahaja v lizogenem ciklu. rexA in rexB sta ena izmed redkih genov, ki se izrazita iz profaga λ. V lizogenem ciklu niso odkrili nobene njune vloge. Ko pa pride do superinfekcije celice z nekim drugim bakteriofagom, pa igrata ključno vlogo pri obrambi. Ta obrambna vloga je bila najbolje raziskana na primeru faga T4. Ko je fag T4 normalen (wild type), je sposoben litično okužiti E. coli z lizogenim profagom λ, saj kodira dva proteina (RIIA in RIIB), ki se mu pomagata izogniti sistemu Rex. V primeru da ima T4 mutacijo na lokusu rII, kar pomeni, da ima mutirana rIIA in/ali rIIB, do lize ne pride, saj pride do aktivacije sistema Rex, kar sproži samomor celice in posledično izključitev faga T4rII. Ta se tako ne more razmnožiti in okužiti še sosednjih celic.
===REXA===
Okužba lizogenov λ s T4rII poteka normalno vse do začetka replikacije T4 DNA. Kot replikacijski oz. rekombinacijski intermediat nastane kompleks protein-DNA, kar povzroči aktivacijo proteina RexA, ki je produkt gena rexA. RexA je 31 kDA velik polipeptid, sestavljen iz 279 aminokislinskih ostankov. Vsebuje veliko hidrofilnih aminokislin, kar kaže na to, da gre za citoplazemski protein. Deluje kot znotrajcelični senzor, ki aktivira membranski protein RexB. Ta povzroči padec membranskega potenciala. Raziskave so pokazale, da sta za njegovo aktivacijo potrebna vsaj dva RexA proteina, kar kaže na to, da je za aktivnost sistema Rex pomembno razmerje koncentracij omenjenih proteinov.
Raziskave so pokazale, da mutanti T4, ki imajo pomanjkljivo replikacijo ali rekombinacijo, ne kažejo izgube membranskega potenciala.
===REXB===
Gen rexB kodira 16 kDa velik protein RexB, ki je sestavljen predvsem iz hidrofobnih aminokislinskih ostankov. Hidropatski profil proteina RexB vsebuje štiri hidrofobne vrhove, ki so značilni za membranske segmente transmembranskih proteinov. Nabite aminokisline so skoraj izključno omejene na hidrofilne regije. Na podlagi teh opažanj, skupaj s von Heije-vim pravilom “pozitivno znotraj” za porazdelitev nabitih aminokislin med hidrofilne regije transmembranskih proteinov, so predlagali topološki model proteina. RexB je notranji membranski protein s štirimi transmembranskimi domenami; amino in karboksilni konci, kot tudi osrednji hidrofilni segment, so citoplazemski, druga in četrta hidrofilna zaporedja pa sta periplazemska. RexB je po funkciji ionski kanalček, kar dokazujejo poročila, da je izključitev Rex odvisna od ionske sestave zunanjega medija. Izključitev Rex je občutljiva na zunajcelični pH in na koncentracijo monovalentnih kationov. Če je koncentracija monovalentnih kationov nizka (<1 mM), pride do izključitve pri pH 6, vendar ne pri nevtralnem pH. Topologija proteina RexB lahko razloži to odvisnost od zunajceličnega pH. Prva periplazemska domena vsebuje dva histidinska ostanka (ostanka 27 in 38), katerih ionizacija naj bi bila močno prizadeta v tem območju pH, kar pomembno vpliva na konformacijo RexB.
Izključitev T4rII zahteva prisotnost monovalentnih kationov, kot so H+, Na+, K+, NH4+ ali Cs+ v kulturi in je oslabljena ob prisotnosti dvovalentnih kationov, kot so Mg2+ ali Ca2+, poliaminov, saharoze, arginina, lizina, spermidina in več diaminov. Te ugotovitve so skladne z vlogo RexB kot ionskega kanalčka, hkrati pa kažejo, da je ionska izmenjava preko RexB nespecifična in ne razlikuje ionov niti po naboju niti po velikosti. Ker se zdi, da je ionska izmenjava regulirana samo s koncentracijo, je možno, da RexB deluje tako, da tvori lezijo v membrani gostitelja, kar moti ionski diferencial preko citoplazemske membrane.
Okužba lizogena, ki vsebuje genski zapis za proteine Rex, s T4rII povzroči zmanjšanje membranskega potenciala, protonske gibalne sile in hiter padec nivoja ATP. S tem se zmanjša sinteza makromolekul in prekine celično razmnoževanje. Med tem se prekine tudi okužba s fagom, saj ta potrebuje ATP ali od ATP odvisne celične komponente. Ko so lizogeni λ okuženi s T4rII mutanti, se okužba nadaljuje normalno, dokler se ne začne replikacija T4 DNA. Nato pride do padca membranskega potenciala, ki ga spremlja znižanje ravni celičnega ATP. Ta padec celične energije je največji, če so v mediju prisotni monovalentni kationi in če je pH nižji od 7. Padec ravni ATP je lahko posledica spremembe membranske ATPaze, ki jo povzroči zmanjšanje membranskega potenciala in ne blokiranje sinteze ATP, saj padca ravni ATP niso opazili v celicah, ki nimajo membranske ATPaze zaradi mutacije unc.
Dodatek Mg2+ ali poliaminov v zunanji medij pred deseto minuto okužbe lahko prepreči izključitev T4rll. Izključitev se po šesti minuti obrne z omejenim uspehom. To je verjetno posledica zmanjšanega vnosa magnezija ali poliaminov v tem času, ki ga lahko pripišemo zmanjšani celični energiji.
Zmanjšanje membranskega potenciala je odvisno od razmerja med RexA in RexB. Izguba membranskega potenciala se lahko sproži pri povečanju razmerja med RexA in RexB, tudi v neokuženih celicah. Prekomerno izražanje RexB glede na RexA pa povzroči zmanjšanje izključitve Rex.
Zaradi teh ugotovitev so prišli do modela izključitve Rex, ki deluje kot altruistični modul celične smrti, ki se aktivira ob okužbi z Rex občutljivim fagom. Po tem modelu RexB deluje kot "regulatorna" enota za tvorbo por v notranji membrani gostiteljske celice, vendar je neaktivna, kadar je izražena v enakih koncentracijah s senzorsko enoto RexA. Okužba gostitelja s T4rll povzroči povečanje razmerja med RexA in RexB in vodi do aktivacije por RexB preko neposredne interakcije z vsaj dvema proteinoma RexA. Če je RexB čezmerno izražen, potem se zmanjša verjetnost interakcije z več podenotami RexA, kar povzroči zmanjšanje izključitve.
===PREPREČEVANJE SAMOIZKLJUČITVE===
Izključitev Rex je odvisna od stopnje izražanja rex genov. Medtem ko v normalnih pogojih lizogeni λ izločajo le T4rII mutante, navadnih T4 pa ne, so z induciranim prekomernim izražanjem genov rex dosegli, da so lizogeni λ izločali tudi normalne T4. Poleg normalnih T4 so izločali tudi vse ostale testirane fage razen faga λ. To je raziskovalce privedlo do sklepa, da ima fag λ nek način s katerim prepreči izključitev samega sebe v primeru, da le-ta vstopi v litični cikel. Znano je bilo, da je za aktivacijo enega proteina RexB potrebnih več proteinov RexA, kar so so ugotovili z uvedbo prekomernega izražanja rexA ob prisotnosti RexB v nelizogenih celicah. Postavili so hipotezo, da bi lahko za preprečitev samoizključitve fag λ izkoristil prekomerno izražanje rexB. To bi povzročilo njihovo neaktivnost zaradi manjšega razmerja RexA/RexB v celici. Da so preverili posledice prekomernega izražanja rexB, so spremenili lizogen λ CR63(λ) z rexB izražajočim vektorjem pBS rexB phoA' in opazovali izločanje r638, ki je fag T4 z izbrisom na lokusu rII. Za kontrolo so uporabili še vektorje pBS in pBS phoA', ki ne povzročijo prekomernega izražanja rexB in normalen fag λ. Ugotovili so, da prekomerno izražanje rexB v lizogenu prepreči izločanje rII mutantov. Kot pričakovano vektorji brez gena za RexB (pBS in pBS phoA') niso preprečili izločanja rII mutantov. S tem so dokazali, da fag λ najverjetneje za preprečitev samoizključitve pri vstopu v litično fazo izkorišča namnoževanje proteina RexB in s tem povzroči njegovo deaktivacijo. Kasneje so ugotovili, da je za povečanje količine RexB zaslužen promotor pLIT, ki se aktivira samo med razvojem faga λ.

==VIRI==
*Labrie, S. J. et. al. Bacteriophage resistance mechanisms. Nature Reviews Microbiology, 2010, let. 8, str. 317-327.
*Slavcev, R.A. The Bacteriophage λ Rex-Centric Mutualism Phenotype, Conditional Rex, and Other Novel Rex Phenotypes. 2002
*Parma, D.H., Snyder, M., Sobolevski, S., Nawroz, M., Brody, E., Gold, L. The Rex system of bacteriophage k: tolerance and altruistic cell death. GENES & DEVELOPMENT, 1992, 6, 497-510.
*Snyder, L. Phage-exclusion enzymes: a bonanza of biochemical and cell biology reagents? Molecular Microbiology, 1995, 15(3), 415-420.
*Snyder, L., McWilliams, K. The rex genes of bacteriophage lambda can inhibit cell function without phage superinfection. Gene, 1989, str. 17-24.

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

BIO2 Povzetki seminarjev 2018

2018-10-16T14:23:04Z

Karmenmlinar: /* Karmen Mlinar: Signalizacija in odzivi na abiotski stres pri rastlinah */

===Karmen Mlinar: Signalizacija in odzivi na abiotski stres pri rastlinah===
Rastline živijo v stalno spreminjajočem se okolju, ki je pogosto neugodno in stresno za njihovo rast in razvoj. Primer abiotskega stresa so suša, ekstremne temperature, slanost tal, pomanjkanje hranil v prsti ipd. Rastline lahko stres preživijo tako, da se mu prilagodijo ali pa izognejo. V nasprotnem primeru so obsojene na smrt. Identificiranih je le malo senzorjev, ki zaznavajo stres. Pri signalizaciji odzivov na stresna okolja pogosto sodeluje družina kinaz SnRK, ki zaznajo spremembe v energijskem statusu rastline, ki jih povzroči stres. Znane so tri poddružine SnRKs: SnRK1s, SnRK2s, ki sodelujejo pri osmotskem stresu in ABA signalizaciji, in SnRK3s, ki so ključni regulatorji ionske homeostaze pri spopadanju s solnim stresom. Pri ionskem stresu pogosto problem predstavlja Na+. Pri njegovi signalizaciji je ključna SOS signalna pot. Signalizacija temperaturnega stresa se začne s spremembami v fluidnosti membrane, kar zaznajo integralni membranski proteini. Pri signalizaciji pogosto sodelujejo tudi MAPKs, CPKs in stresni hormon ABA, pomembno vlogo pa nosijo sekundarni sporočevalci kot sta kalcij in ROS. Vse to stremi k vzpostavitvi ionske in vodne homeostaze ter celične stabilnosti v stresnem okolju. Z razumevanjem signalizacije stresa in odzivov, ki sledijo, bomo lahko izboljšali odpornost pridelkov na stres in s tem zagotovili kmetijsko stabilnost in preskrbo s hrano za rastoče svetovno prebivalstvo.

===Aljaž Bratina: Pomen različnih signalnih poti pri staranju===
Staranje je postopna izguba fiziološke integritete in vodi v prizadeto funkcionalnost ter povečano možnost za smrt. Hitremu staranju nasprotna je dolgoživost, to je stanje, v katerem organizem ne izgublja funkcionalnosti ali jo izgublja počasneje. Staranje lahko opredelimo z devetimi splošnimi lastnostmi, ki jih opazimo v večini organizmov. Pri preučevanju staranja opazujemo organizem C. elegans, ki lahko med razvojem v primeru neugodnih razmer razvije stanje dauer, v katerem je razvoj ustavljen in je tako organizem sposoben preživeti dalj časa. Pri regulaciji staranja in dolgoživosti so pomembne mnoge celične signalne poti, kot del njih pa predvsem jedrni receptorji, ki uravnavajo prepisovanje genov, ki imajo vpliv na hitrost staranja oz. vzdrževanje dolgoživosti. V seminarski nalogi so opisane štiri pomembne signalne poti in njihov vpliv na staranje. Pri prvi je pomemben jedrni receptor DAF-12, ki za svoje delovanje potrebuje steroid DA. Neugodne razmere ga deaktivirajo, kar vodi v razvoj stanja dauer. Na dolgoživost pozitivno vpliva tudi aktiviran kompleks NSBP-1 in jedrnega receptorja DAF-16, ki sta del signalne poti IIS. To pot regulira tudi količina holesterola v celici. Dolgoživost povzročajo tudi prekinitveni post, pri katerem se aktivira jedrni receptor AP-1, pa tudi odstranitev zarodnih celic, ki poleg prej omenjene DAF-12 in DAF-16 aktivira tudi nekatere druge receptorje, npr. NHR-80 in NH3-49.

===Eva Gartner: Wnt signalizacija in njena vloga pri srčni fibrozi===
Wnt signalizacija zajema skupino signalnih poti, ki jih regulirajo wnt proteini. Ti se vežejo na posebne receptorje v membrani celice, preko katerih se signal prenese v notranjost. Wnt signalizacijo sestavljajo tri glavne signalizacijske poti: kanonična wnt pot, ki vključuje protein β-katenin, nekanonična (PCP) pot in nekanonična pot, ki sodeluje pri regulaciji kalcija. Vse poti se začnejo z vezavo wnt-liganda na transmembranske Fz receptorje in prenosom signala do znotrajceličnega proteina Dsh. Od tu naprej se poti razcepijo vsaka v svojo smer. Wnt signalizacija sodeluje v mnogih procesih, potrebnih za normalen razvoj organizma, kot so npr. razmnoževanje, specializacija in migracije celic. Prisotnost regulacije z wnt signalizacijo so odkrili tudi pri srčni fibrozi in z njo povezanih boleznih in poškodbah srca. V zdravih celicah wnt signalizacija navadno ni prisotna. Izraz fibroza se nanaša na povečanje količine zunajceličnega matriksa, zaradi česar postane srčna mišica otrdela in krčenje manj intenzivno. Pride do prekomerne namnožitve fibroblastov in diferenciacije v miofibroblaste, ki so fenotipsko med fibroblasti in mišičnimi celicami. Kljub številnim raziskavam, ki dokazujejo vpletenost wnt signalizacije v razvoju fibroze, natančni mehanizmi vseh signalnih poti še vedno niso znani. Potrebne so še nadaljnje raziskave za razumevanje zapletene celične komunikacije in odkritje novih terapevtskih možnosti.

BIO2 Seminar 2018

2018-10-15T15:00:16Z

Karmenmlinar: /* Seznam seminarjev */

= Biokemijski seminar =
doc. dr. Gregor Gunčar, K2.022

== Seznam seminarjev ==
{| {{table}}
| align="left" style="background:#f0f0f0;"|'''ime in priimek'''
| align="left" style="background:#f0f0f0;"|'''poglavje'''
| align="left" style="background:#f0f0f0;"|'''naslov seminarja'''
| align="left" style="background:#f0f0f0;"|'''recenzent 1'''
| align="left" style="background:#f0f0f0;"|'''recenzent 2'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''datum oddaje'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''datum recenzije'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''datum predstavitve'''
|-
| Eva Gartner || 12 || Wnt signalizacija in njena vloga pri srčni fibrozi || Anamarija Agnič || Anastasija Nechevska || 15/10/2018 || 16/10/2018 || 17/10/2018
|-
| Aljaž Bratina || 12 || Staranje in lipidne signalne molekule || Lara Drinovec || Liza Ulčakar || 15/10/2018 || 16/10/2018 || 17/10/2018
|-
| Karmen Mlinar || 12 || Signalizacija in odzivi na abiotski stres v rastlinah [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2018] || Luka Gnidovec || Maja Škof || 15/10/2018 || 16/10/2018 || 17/10/2018
|-
| Tina Zavodnik || 12 || moj naslov || Jernej Imperl || Ajda Godec || 19/10/2018 || 22/10/2018 || 24/10/2018
|-
| Meta Kodrič || 12 || moj naslov || Laura Gašperšič || Neža Blaznik || 19/10/2018 || 22/10/2018 || 24/10/2018
|-
| Neža Žerjav || 12 || Vloga kaspaz pri nekrozi || Nika Boštic || Urša Štrancar || 19/10/2018 || 22/10/2018 || 24/10/2018
|-
| Doroteja Armič || 14-15 || Vloga bifunkcionalnega encima PFK-2/FBPaza-2 v metabolizmu glukoze || Eva Gartner || Anamarija Agnič || 02/11/2018 || 05/11/2018 || 07/11/2018
|-
| Lara Drinovec || 14-15 || moj naslov || Aljaž Bratina || Barbara Jaklič || 02/11/2018 || 05/11/2018 || 07/11/2018
|-
| Martina Lokar || 14-15 || Mehanizmi biotinilacije proteinov || Karmen Mlinar || Luka Gnidovec || 02/11/2018 || 05/11/2018 || 07/11/2018
|-
| Marko Pavleković || 16 || moj naslov || Tina Zavodnik || Jernej Imperl || 09/11/2018 || 12/11/2018 || 14/11/2018
|-
| Valeriya Musina || 16 || moj naslov || Meta Kodrič || Laura Gašperšič || 09/11/2018 || 12/11/2018 || 14/11/2018
|-
| Tina Kolenc Milavec || 16 || moj naslov || Neža Žerjav || Nika Boštic || 09/11/2018 || 12/11/2018 || 14/11/2018
|-
| Andrej Špenko || 17 || moj naslov || Doroteja Armič || Eva Gartner || 16/11/2018 || 19/11/2018 || 21/11/2018
|-
| Tadej Medved || 17 || moj naslov || Sanja Stanković || Aljaž Bratina || 16/11/2018 || 19/11/2018 || 21/11/2018
|-
| Klementina Polanec || 17 || moj naslov || Martina Lokar || Karmen Mlinar || 16/11/2018 || 19/11/2018 || 21/11/2018
|-
| Rebeka Dajčman || 17 || moj naslov || Marko Pavleković || Tina Zavodnik || 16/11/2018 || 19/11/2018 || 21/11/2018
|-
| Sumeja Kudelić || 18 || moj naslov || Valeriya Musina || Meta Kodrič || 23/11/2018 || 26/11/2018 || 28/11/2018
|-
| Matija Ruparčič || 18 || moj naslov || Tina Kolenc Milavec || Neža Žerjav || 23/11/2018 || 26/11/2018 || 28/11/2018
|-
| Maks Kumek || 18 || moj naslov || Andrej Špenko || Doroteja Armič || 23/11/2018 || 26/11/2018 || 28/11/2018
|-
| Anže Šumah || 19 || moj naslov || Tadej Medved || Sanja Stanković || 30/11/2018 || 03/12/2018 || 05/12/2018
|-
| Barbara Jaklič || 19 || moj naslov || Klementina Polanec || Martina Lokar || 30/11/2018 || 03/12/2018 || 05/12/2018
|-
| Gašper Anton Komatar || 19 || moj naslov || Rebeka Dajčman || Marko Pavleković || 30/11/2018 || 03/12/2018 || 05/12/2018
|-
| Praznik Liza || 19 || moj naslov || Sumeja Kudelić || Valeriya Musina || 30/11/2018 || 03/12/2018 || 05/12/2018
|-
| Lara Hrvatin || 20 || moj naslov || Matija Ruparčič || Tina Kolenc Milavec || 07/12/2018 || 10/12/2018 || 12/12/2018
|-
| Sonja Gabrijelčič || 20 || moj naslov || Maks Kumek || Andrej Špenko || 07/12/2018 || 10/12/2018 || 12/12/2018
|-
| Anastasija Nechevska || 20 || moj naslov || Anže Šumah || Tadej Medved || 07/12/2018 || 10/12/2018 || 12/12/2018
|-
| Liza Ulčakar || 21 || moj naslov || Barbara Jaklič || Klementina Polanec || 14/12/2018 || 17/12/2018 || 19/12/2018
|-
| Maja Škof || 21 || moj naslov || Gašper Anton Komatar || Rebeka Dajčman || 14/12/2018 || 17/12/2018 || 19/12/2018
|-
| Ajda Godec || 21 || moj naslov || Praznik Liza || Sumeja Kudelić || 14/12/2018 || 17/12/2018 || 19/12/2018
|-
| Neža Blaznik || 22 || moj naslov || Lara Hrvatin || Matija Ruparčič || 04/01/2019 || 07/01/2019 || 09/01/2019
|-
| Urša Štrancar || 22 || moj naslov || Sonja Gabrijelčič || Maks Kumek || 04/01/2019 || 07/01/2019 || 09/01/2019
|-
| Anamarija Agnič || 22 || moj naslov || Anastasija Nechevska || Anže Šumah || 04/01/2019 || 07/01/2019 || 09/01/2019
|-
| Sanja Stanković || 23 || moj naslov || Liza Ulčakar || Lara Drinovec|| 04/01/2019 || 07/01/2019 || 09/01/2019
|-
| Luka Gnidovec || 23 || moj naslov || Maja Škof || Gašper Anton Komatar || 11/01/2019 || 14/01/2019 || 16/01/2019
|-
| Jernej Imperl || 23 || moj naslov || Ajda Godec || Praznik Liza || 11/01/2019 || 14/01/2019 || 16/01/2019
|-
| Laura Gašperšič || 23 || moj naslov || Neža Blaznik || Lara Hrvatin || 11/01/2019 || 14/01/2019 || 16/01/2019
|-
| Nika Boštic || 23 || moj naslov || Urša Štrancar || Sonja Gabrijelčič || 11/01/2019 || 14/01/2019 || 16/01/2019
|}

*številka v okencu za temo pomeni poglavje v Lehningerju, v katerega naj izbrana tema spada
Sporočite mi morebitne napake ali če vas nisem razporedil.

== Gradivo za predavanja ==
Gradivo za predavanja in seminarje najdete na http://bio.ijs.si/~zajec/bio2/
username: bio2
password: samozame

==Naloga==
'''Vaša naloga za seminar je: '''
Samostojno pripraviti seminar o seminarski temi, ki vam je bila dodeljena. Za osnovo morate vzeti pregledni članek iz revije, ki ima faktor vpliva nad 5 (npr. [http://www.sciencedirect.com/science/journal/09680004/ TIBS]. Poiskati morate še vsaj tri znanstvene članke, ki se nanašajo na opisano temo in jih uporabiti kot podlago za seminarsko nalogo! Članki so dostopni [http://93.174.95.27/scimag/ tukaj].

Za pripravo seminarja velja naslednje: 
* [[BIO2 Povzetki seminarjev 2017|Povzetek seminarja]] opišete na wikiju '''v 200 besedah''' (+- dvajset besed) - najkasneje do dne ko morate oddati seminar recenzentom.
* Povezavo do povzetka vnesete v tabelo seminarjev tekočega letnika.
* Seminar pripravite v obliki seminarske naloge na ~5-12 straneh A4 (pisava 12, enojni razmak, 2,5 cm robovi). Zelo pomembno je, da je obseg od 2700 do 3000 besed , a ne več kot 3500 besed. Seminarska naloga mora vsebovati najmanj tri slike. Eno sliko morate narisati sami in to pod sliko posebej označiti. Slika mora imeti legendo in v besedilu mora biti na ustreznem mestu sklic na sliko. 
* Seminar oddajte do datuma oddaje, ki je naveden v tabeli v elektronski obliki z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/ tega obrazca].
* Vsi seminarji so v elektronski obliki dostopni [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/bioseminar/ tukaj].
* Recenzenti do dneva določenega v tabeli določijo popravke (v elektronski obliki) in podajo oceno pisnega dela. Popravljen seminar oddajte z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/ tega obrazca].
* Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Za predstavitev je na voljo 20 minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni.
* Predstavitvi sledi razprava. Recenzenti podajo oceno predstavitve in postavijo najmanj dve vprašanji.Vsi ostali morajo postaviti še dve dodatni vprašanji v toku celega seminarskega obdobja. Vprašanja, ki ste jih postavili vpišite na [https://docs.google.com/forms/d/e/1FAIpQLSdV9OFlNzI3XyS8FRGnuIbG89gwH_36uwz29ocigV--2CXSbQ/viewform tukaj].
* Na dan predstavitve morate docentu še pred predstavitvijo oddati končno (popravljeno) in natisnjeno verzijo seminarja v enem izvodu, elektronsko verzijo seminarja in predstavitev pa oddati na strežnik na dan predstavitve do polnoči.
* Seminarska naloga in povzetek morajo biti v slovenskem jeziku, razen za študente, katerih materni jezik ni slovenščina. Ti lahko oddajo seminar v angleškem jeziku.

==Imena datotek==
Prosim vas, da vse datoteke, ki mi jih pošiljate poimenujete po naslednjem receptu:
* 312_BIO_Priimek_Ime.doc(x) za seminar, npr. 312_BIO_Guncar_Gregor.docx
* 312_BIO_Priimek_ime_final.doc(x) za končno verzijo seminarja
* 312_BIO_Priimek_Ime_rec_Priimek2.doc(x) za recenzijo, kjer je Priimek2 priimek recenzenta, npr. 312_BIO_Guncar_Gregor_rec_Scott.docx (če se pišete Scott in odajate recenzijo za seminar, ki ga je napisal Gunčar)
* 312_BIO_Priimek_Ime.ppt(x) za prezentacijo, npr 312_BIO_Guncar_Gregor.pptx
* 312_BIO_Priimek_ime_poprava.doc(x) za popravljeno končno verzijo seminarja, če so popravki manjši

==Ocenjevanje seminarjev==
Recenzenti ocenijo seminar tako, da izpolnijo [https://docs.google.com/forms/d/1EQDYwFO-DEzZ2R7jf8DhLqIeV4FFxRd3-ScceEASpt4/viewform recenzentsko poročilo] na spletu. Recenzentsko poročilo morate oddati najkasneje do 21:00, en dan pred predstavitvijo seminarja.

== Mnenje o predstavitvi ==
Vsak posameznik odda svoje mnenje o predstavitvi takoj po predstavitvi z online glasovanjem.

==Urejanje spletnih strani na wikiju==
Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''

==Citiranje virov==
Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se držite ene same. V seminarskih nalogah in diplomskih nalogah FKKT uprabljajte shemo citiranja, ki je pobarvana zeleno.
Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati.
Za citate v naravoslovju je najpogostejše citiranje po pravilniku ISO 690. [http://www.zveza-zotks.si/gzm/dokumenti/literatura.html Pravila], ki upoštevajo omenjeni standard, so pripravili pri ZTKS. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati. 
'''Citiranje knjig:''' 
Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica. 
Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN. 

Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005. 
Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4. 
Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.).

'''Citiranje člankov:''' 
Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani. 
Lartigue, C., Glass, J. I., Alperovich, N., Pieper, R., Parmar, P. P., Hutchison III, C. A., Smith, H. O. in Venter, J. C.
Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, 317, str. 632-638.

Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole: 
Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani. 
Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.

Revija Science uporablja skrajšani zapis: 
C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007) 

V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne). Navesti morate tudi vse avtorje dela, razen v primeru, ko jih je 10 ali več. Takrat navedite le prvih devet, za ostale pa uporabite okrajšavo in sod. (in sodelavci). Pred zadnjim avtorjem naj bo vedno besedica "in".

'''Citiranje spletnih virov:''' 
Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov 
strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life 
Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.

BIO2 Seminar 2018

2018-10-15T14:59:17Z

Karmenmlinar: /* Seznam seminarjev */

= Biokemijski seminar =
doc. dr. Gregor Gunčar, K2.022

== Seznam seminarjev ==
{| {{table}}
| align="left" style="background:#f0f0f0;"|'''ime in priimek'''
| align="left" style="background:#f0f0f0;"|'''poglavje'''
| align="left" style="background:#f0f0f0;"|'''naslov seminarja'''
| align="left" style="background:#f0f0f0;"|'''recenzent 1'''
| align="left" style="background:#f0f0f0;"|'''recenzent 2'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''datum oddaje'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''datum recenzije'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''datum predstavitve'''
|-
| Eva Gartner || 12 || Wnt signalizacija in njena vloga pri srčni fibrozi || Anamarija Agnič || Anastasija Nechevska || 15/10/2018 || 16/10/2018 || 17/10/2018
|-
| Aljaž Bratina || 12 || Staranje in lipidne signalne molekule || Lara Drinovec || Liza Ulčakar || 15/10/2018 || 16/10/2018 || 17/10/2018
|-
| Karmen Mlinar || 12 || [Signalizacija in odzivi na abiotski stres v rastlinah http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2018] || Luka Gnidovec || Maja Škof || 15/10/2018 || 16/10/2018 || 17/10/2018
|-
| Tina Zavodnik || 12 || moj naslov || Jernej Imperl || Ajda Godec || 19/10/2018 || 22/10/2018 || 24/10/2018
|-
| Meta Kodrič || 12 || moj naslov || Laura Gašperšič || Neža Blaznik || 19/10/2018 || 22/10/2018 || 24/10/2018
|-
| Neža Žerjav || 12 || Vloga kaspaz pri nekrozi || Nika Boštic || Urša Štrancar || 19/10/2018 || 22/10/2018 || 24/10/2018
|-
| Doroteja Armič || 14-15 || Vloga bifunkcionalnega encima PFK-2/FBPaza-2 v metabolizmu glukoze || Eva Gartner || Anamarija Agnič || 02/11/2018 || 05/11/2018 || 07/11/2018
|-
| Lara Drinovec || 14-15 || moj naslov || Aljaž Bratina || Barbara Jaklič || 02/11/2018 || 05/11/2018 || 07/11/2018
|-
| Martina Lokar || 14-15 || Mehanizmi biotinilacije proteinov || Karmen Mlinar || Luka Gnidovec || 02/11/2018 || 05/11/2018 || 07/11/2018
|-
| Marko Pavleković || 16 || moj naslov || Tina Zavodnik || Jernej Imperl || 09/11/2018 || 12/11/2018 || 14/11/2018
|-
| Valeriya Musina || 16 || moj naslov || Meta Kodrič || Laura Gašperšič || 09/11/2018 || 12/11/2018 || 14/11/2018
|-
| Tina Kolenc Milavec || 16 || moj naslov || Neža Žerjav || Nika Boštic || 09/11/2018 || 12/11/2018 || 14/11/2018
|-
| Andrej Špenko || 17 || moj naslov || Doroteja Armič || Eva Gartner || 16/11/2018 || 19/11/2018 || 21/11/2018
|-
| Tadej Medved || 17 || moj naslov || Sanja Stanković || Aljaž Bratina || 16/11/2018 || 19/11/2018 || 21/11/2018
|-
| Klementina Polanec || 17 || moj naslov || Martina Lokar || Karmen Mlinar || 16/11/2018 || 19/11/2018 || 21/11/2018
|-
| Rebeka Dajčman || 17 || moj naslov || Marko Pavleković || Tina Zavodnik || 16/11/2018 || 19/11/2018 || 21/11/2018
|-
| Sumeja Kudelić || 18 || moj naslov || Valeriya Musina || Meta Kodrič || 23/11/2018 || 26/11/2018 || 28/11/2018
|-
| Matija Ruparčič || 18 || moj naslov || Tina Kolenc Milavec || Neža Žerjav || 23/11/2018 || 26/11/2018 || 28/11/2018
|-
| Maks Kumek || 18 || moj naslov || Andrej Špenko || Doroteja Armič || 23/11/2018 || 26/11/2018 || 28/11/2018
|-
| Anže Šumah || 19 || moj naslov || Tadej Medved || Sanja Stanković || 30/11/2018 || 03/12/2018 || 05/12/2018
|-
| Barbara Jaklič || 19 || moj naslov || Klementina Polanec || Martina Lokar || 30/11/2018 || 03/12/2018 || 05/12/2018
|-
| Gašper Anton Komatar || 19 || moj naslov || Rebeka Dajčman || Marko Pavleković || 30/11/2018 || 03/12/2018 || 05/12/2018
|-
| Praznik Liza || 19 || moj naslov || Sumeja Kudelić || Valeriya Musina || 30/11/2018 || 03/12/2018 || 05/12/2018
|-
| Lara Hrvatin || 20 || moj naslov || Matija Ruparčič || Tina Kolenc Milavec || 07/12/2018 || 10/12/2018 || 12/12/2018
|-
| Sonja Gabrijelčič || 20 || moj naslov || Maks Kumek || Andrej Špenko || 07/12/2018 || 10/12/2018 || 12/12/2018
|-
| Anastasija Nechevska || 20 || moj naslov || Anže Šumah || Tadej Medved || 07/12/2018 || 10/12/2018 || 12/12/2018
|-
| Liza Ulčakar || 21 || moj naslov || Barbara Jaklič || Klementina Polanec || 14/12/2018 || 17/12/2018 || 19/12/2018
|-
| Maja Škof || 21 || moj naslov || Gašper Anton Komatar || Rebeka Dajčman || 14/12/2018 || 17/12/2018 || 19/12/2018
|-
| Ajda Godec || 21 || moj naslov || Praznik Liza || Sumeja Kudelić || 14/12/2018 || 17/12/2018 || 19/12/2018
|-
| Neža Blaznik || 22 || moj naslov || Lara Hrvatin || Matija Ruparčič || 04/01/2019 || 07/01/2019 || 09/01/2019
|-
| Urša Štrancar || 22 || moj naslov || Sonja Gabrijelčič || Maks Kumek || 04/01/2019 || 07/01/2019 || 09/01/2019
|-
| Anamarija Agnič || 22 || moj naslov || Anastasija Nechevska || Anže Šumah || 04/01/2019 || 07/01/2019 || 09/01/2019
|-
| Sanja Stanković || 23 || moj naslov || Liza Ulčakar || Lara Drinovec|| 04/01/2019 || 07/01/2019 || 09/01/2019
|-
| Luka Gnidovec || 23 || moj naslov || Maja Škof || Gašper Anton Komatar || 11/01/2019 || 14/01/2019 || 16/01/2019
|-
| Jernej Imperl || 23 || moj naslov || Ajda Godec || Praznik Liza || 11/01/2019 || 14/01/2019 || 16/01/2019
|-
| Laura Gašperšič || 23 || moj naslov || Neža Blaznik || Lara Hrvatin || 11/01/2019 || 14/01/2019 || 16/01/2019
|-
| Nika Boštic || 23 || moj naslov || Urša Štrancar || Sonja Gabrijelčič || 11/01/2019 || 14/01/2019 || 16/01/2019
|}

*številka v okencu za temo pomeni poglavje v Lehningerju, v katerega naj izbrana tema spada
Sporočite mi morebitne napake ali če vas nisem razporedil.

== Gradivo za predavanja ==
Gradivo za predavanja in seminarje najdete na http://bio.ijs.si/~zajec/bio2/
username: bio2
password: samozame

==Naloga==
'''Vaša naloga za seminar je: '''
Samostojno pripraviti seminar o seminarski temi, ki vam je bila dodeljena. Za osnovo morate vzeti pregledni članek iz revije, ki ima faktor vpliva nad 5 (npr. [http://www.sciencedirect.com/science/journal/09680004/ TIBS]. Poiskati morate še vsaj tri znanstvene članke, ki se nanašajo na opisano temo in jih uporabiti kot podlago za seminarsko nalogo! Članki so dostopni [http://93.174.95.27/scimag/ tukaj].

Za pripravo seminarja velja naslednje: 
* [[BIO2 Povzetki seminarjev 2017|Povzetek seminarja]] opišete na wikiju '''v 200 besedah''' (+- dvajset besed) - najkasneje do dne ko morate oddati seminar recenzentom.
* Povezavo do povzetka vnesete v tabelo seminarjev tekočega letnika.
* Seminar pripravite v obliki seminarske naloge na ~5-12 straneh A4 (pisava 12, enojni razmak, 2,5 cm robovi). Zelo pomembno je, da je obseg od 2700 do 3000 besed , a ne več kot 3500 besed. Seminarska naloga mora vsebovati najmanj tri slike. Eno sliko morate narisati sami in to pod sliko posebej označiti. Slika mora imeti legendo in v besedilu mora biti na ustreznem mestu sklic na sliko. 
* Seminar oddajte do datuma oddaje, ki je naveden v tabeli v elektronski obliki z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/ tega obrazca].
* Vsi seminarji so v elektronski obliki dostopni [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/bioseminar/ tukaj].
* Recenzenti do dneva določenega v tabeli določijo popravke (v elektronski obliki) in podajo oceno pisnega dela. Popravljen seminar oddajte z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/ tega obrazca].
* Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Za predstavitev je na voljo 20 minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni.
* Predstavitvi sledi razprava. Recenzenti podajo oceno predstavitve in postavijo najmanj dve vprašanji.Vsi ostali morajo postaviti še dve dodatni vprašanji v toku celega seminarskega obdobja. Vprašanja, ki ste jih postavili vpišite na [https://docs.google.com/forms/d/e/1FAIpQLSdV9OFlNzI3XyS8FRGnuIbG89gwH_36uwz29ocigV--2CXSbQ/viewform tukaj].
* Na dan predstavitve morate docentu še pred predstavitvijo oddati končno (popravljeno) in natisnjeno verzijo seminarja v enem izvodu, elektronsko verzijo seminarja in predstavitev pa oddati na strežnik na dan predstavitve do polnoči.
* Seminarska naloga in povzetek morajo biti v slovenskem jeziku, razen za študente, katerih materni jezik ni slovenščina. Ti lahko oddajo seminar v angleškem jeziku.

==Imena datotek==
Prosim vas, da vse datoteke, ki mi jih pošiljate poimenujete po naslednjem receptu:
* 312_BIO_Priimek_Ime.doc(x) za seminar, npr. 312_BIO_Guncar_Gregor.docx
* 312_BIO_Priimek_ime_final.doc(x) za končno verzijo seminarja
* 312_BIO_Priimek_Ime_rec_Priimek2.doc(x) za recenzijo, kjer je Priimek2 priimek recenzenta, npr. 312_BIO_Guncar_Gregor_rec_Scott.docx (če se pišete Scott in odajate recenzijo za seminar, ki ga je napisal Gunčar)
* 312_BIO_Priimek_Ime.ppt(x) za prezentacijo, npr 312_BIO_Guncar_Gregor.pptx
* 312_BIO_Priimek_ime_poprava.doc(x) za popravljeno končno verzijo seminarja, če so popravki manjši

==Ocenjevanje seminarjev==
Recenzenti ocenijo seminar tako, da izpolnijo [https://docs.google.com/forms/d/1EQDYwFO-DEzZ2R7jf8DhLqIeV4FFxRd3-ScceEASpt4/viewform recenzentsko poročilo] na spletu. Recenzentsko poročilo morate oddati najkasneje do 21:00, en dan pred predstavitvijo seminarja.

== Mnenje o predstavitvi ==
Vsak posameznik odda svoje mnenje o predstavitvi takoj po predstavitvi z online glasovanjem.

==Urejanje spletnih strani na wikiju==
Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''

==Citiranje virov==
Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se držite ene same. V seminarskih nalogah in diplomskih nalogah FKKT uprabljajte shemo citiranja, ki je pobarvana zeleno.
Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati.
Za citate v naravoslovju je najpogostejše citiranje po pravilniku ISO 690. [http://www.zveza-zotks.si/gzm/dokumenti/literatura.html Pravila], ki upoštevajo omenjeni standard, so pripravili pri ZTKS. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati. 
'''Citiranje knjig:''' 
Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica. 
Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN. 

Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005. 
Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4. 
Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.).

'''Citiranje člankov:''' 
Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani. 
Lartigue, C., Glass, J. I., Alperovich, N., Pieper, R., Parmar, P. P., Hutchison III, C. A., Smith, H. O. in Venter, J. C.
Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, 317, str. 632-638.

Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole: 
Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani. 
Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.

Revija Science uporablja skrajšani zapis: 
C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007) 

V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne). Navesti morate tudi vse avtorje dela, razen v primeru, ko jih je 10 ali več. Takrat navedite le prvih devet, za ostale pa uporabite okrajšavo in sod. (in sodelavci). Pred zadnjim avtorjem naj bo vedno besedica "in".

'''Citiranje spletnih virov:''' 
Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov 
strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life 
Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.

BIO2 Seminar 2018

2018-10-15T14:56:52Z

Karmenmlinar: /* Seznam seminarjev */

= Biokemijski seminar =
doc. dr. Gregor Gunčar, K2.022

== Seznam seminarjev ==
{| {{table}}
| align="left" style="background:#f0f0f0;"|'''ime in priimek'''
| align="left" style="background:#f0f0f0;"|'''poglavje'''
| align="left" style="background:#f0f0f0;"|'''naslov seminarja'''
| align="left" style="background:#f0f0f0;"|'''recenzent 1'''
| align="left" style="background:#f0f0f0;"|'''recenzent 2'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''datum oddaje'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''datum recenzije'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''datum predstavitve'''
|-
| Eva Gartner || 12 || Wnt signalizacija in njena vloga pri srčni fibrozi || Anamarija Agnič || Anastasija Nechevska || 15/10/2018 || 16/10/2018 || 17/10/2018
|-
| Aljaž Bratina || 12 || Staranje in lipidne signalne molekule || Lara Drinovec || Liza Ulčakar || 15/10/2018 || 16/10/2018 || 17/10/2018
|-
| Karmen Mlinar || 12 || Signalizacija in odzivi na abiotski stres v rastlinah[[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2018]] || Luka Gnidovec || Maja Škof || 15/10/2018 || 16/10/2018 || 17/10/2018
|-
| Tina Zavodnik || 12 || moj naslov || Jernej Imperl || Ajda Godec || 19/10/2018 || 22/10/2018 || 24/10/2018
|-
| Meta Kodrič || 12 || moj naslov || Laura Gašperšič || Neža Blaznik || 19/10/2018 || 22/10/2018 || 24/10/2018
|-
| Neža Žerjav || 12 || Vloga kaspaz pri nekrozi || Nika Boštic || Urša Štrancar || 19/10/2018 || 22/10/2018 || 24/10/2018
|-
| Doroteja Armič || 14-15 || Vloga bifunkcionalnega encima PFK-2/FBPaza-2 v metabolizmu glukoze || Eva Gartner || Anamarija Agnič || 02/11/2018 || 05/11/2018 || 07/11/2018
|-
| Lara Drinovec || 14-15 || moj naslov || Aljaž Bratina || Barbara Jaklič || 02/11/2018 || 05/11/2018 || 07/11/2018
|-
| Martina Lokar || 14-15 || Mehanizmi biotinilacije proteinov || Karmen Mlinar || Luka Gnidovec || 02/11/2018 || 05/11/2018 || 07/11/2018
|-
| Marko Pavleković || 16 || moj naslov || Tina Zavodnik || Jernej Imperl || 09/11/2018 || 12/11/2018 || 14/11/2018
|-
| Valeriya Musina || 16 || moj naslov || Meta Kodrič || Laura Gašperšič || 09/11/2018 || 12/11/2018 || 14/11/2018
|-
| Tina Kolenc Milavec || 16 || moj naslov || Neža Žerjav || Nika Boštic || 09/11/2018 || 12/11/2018 || 14/11/2018
|-
| Andrej Špenko || 17 || moj naslov || Doroteja Armič || Eva Gartner || 16/11/2018 || 19/11/2018 || 21/11/2018
|-
| Tadej Medved || 17 || moj naslov || Sanja Stanković || Aljaž Bratina || 16/11/2018 || 19/11/2018 || 21/11/2018
|-
| Klementina Polanec || 17 || moj naslov || Martina Lokar || Karmen Mlinar || 16/11/2018 || 19/11/2018 || 21/11/2018
|-
| Rebeka Dajčman || 17 || moj naslov || Marko Pavleković || Tina Zavodnik || 16/11/2018 || 19/11/2018 || 21/11/2018
|-
| Sumeja Kudelić || 18 || moj naslov || Valeriya Musina || Meta Kodrič || 23/11/2018 || 26/11/2018 || 28/11/2018
|-
| Matija Ruparčič || 18 || moj naslov || Tina Kolenc Milavec || Neža Žerjav || 23/11/2018 || 26/11/2018 || 28/11/2018
|-
| Maks Kumek || 18 || moj naslov || Andrej Špenko || Doroteja Armič || 23/11/2018 || 26/11/2018 || 28/11/2018
|-
| Anže Šumah || 19 || moj naslov || Tadej Medved || Sanja Stanković || 30/11/2018 || 03/12/2018 || 05/12/2018
|-
| Barbara Jaklič || 19 || moj naslov || Klementina Polanec || Martina Lokar || 30/11/2018 || 03/12/2018 || 05/12/2018
|-
| Gašper Anton Komatar || 19 || moj naslov || Rebeka Dajčman || Marko Pavleković || 30/11/2018 || 03/12/2018 || 05/12/2018
|-
| Praznik Liza || 19 || moj naslov || Sumeja Kudelić || Valeriya Musina || 30/11/2018 || 03/12/2018 || 05/12/2018
|-
| Lara Hrvatin || 20 || moj naslov || Matija Ruparčič || Tina Kolenc Milavec || 07/12/2018 || 10/12/2018 || 12/12/2018
|-
| Sonja Gabrijelčič || 20 || moj naslov || Maks Kumek || Andrej Špenko || 07/12/2018 || 10/12/2018 || 12/12/2018
|-
| Anastasija Nechevska || 20 || moj naslov || Anže Šumah || Tadej Medved || 07/12/2018 || 10/12/2018 || 12/12/2018
|-
| Liza Ulčakar || 21 || moj naslov || Barbara Jaklič || Klementina Polanec || 14/12/2018 || 17/12/2018 || 19/12/2018
|-
| Maja Škof || 21 || moj naslov || Gašper Anton Komatar || Rebeka Dajčman || 14/12/2018 || 17/12/2018 || 19/12/2018
|-
| Ajda Godec || 21 || moj naslov || Praznik Liza || Sumeja Kudelić || 14/12/2018 || 17/12/2018 || 19/12/2018
|-
| Neža Blaznik || 22 || moj naslov || Lara Hrvatin || Matija Ruparčič || 04/01/2019 || 07/01/2019 || 09/01/2019
|-
| Urša Štrancar || 22 || moj naslov || Sonja Gabrijelčič || Maks Kumek || 04/01/2019 || 07/01/2019 || 09/01/2019
|-
| Anamarija Agnič || 22 || moj naslov || Anastasija Nechevska || Anže Šumah || 04/01/2019 || 07/01/2019 || 09/01/2019
|-
| Sanja Stanković || 23 || moj naslov || Liza Ulčakar || Lara Drinovec|| 04/01/2019 || 07/01/2019 || 09/01/2019
|-
| Luka Gnidovec || 23 || moj naslov || Maja Škof || Gašper Anton Komatar || 11/01/2019 || 14/01/2019 || 16/01/2019
|-
| Jernej Imperl || 23 || moj naslov || Ajda Godec || Praznik Liza || 11/01/2019 || 14/01/2019 || 16/01/2019
|-
| Laura Gašperšič || 23 || moj naslov || Neža Blaznik || Lara Hrvatin || 11/01/2019 || 14/01/2019 || 16/01/2019
|-
| Nika Boštic || 23 || moj naslov || Urša Štrancar || Sonja Gabrijelčič || 11/01/2019 || 14/01/2019 || 16/01/2019
|}

*številka v okencu za temo pomeni poglavje v Lehningerju, v katerega naj izbrana tema spada
Sporočite mi morebitne napake ali če vas nisem razporedil.

== Gradivo za predavanja ==
Gradivo za predavanja in seminarje najdete na http://bio.ijs.si/~zajec/bio2/
username: bio2
password: samozame

==Naloga==
'''Vaša naloga za seminar je: '''
Samostojno pripraviti seminar o seminarski temi, ki vam je bila dodeljena. Za osnovo morate vzeti pregledni članek iz revije, ki ima faktor vpliva nad 5 (npr. [http://www.sciencedirect.com/science/journal/09680004/ TIBS]. Poiskati morate še vsaj tri znanstvene članke, ki se nanašajo na opisano temo in jih uporabiti kot podlago za seminarsko nalogo! Članki so dostopni [http://93.174.95.27/scimag/ tukaj].

Za pripravo seminarja velja naslednje: 
* [[BIO2 Povzetki seminarjev 2017|Povzetek seminarja]] opišete na wikiju '''v 200 besedah''' (+- dvajset besed) - najkasneje do dne ko morate oddati seminar recenzentom.
* Povezavo do povzetka vnesete v tabelo seminarjev tekočega letnika.
* Seminar pripravite v obliki seminarske naloge na ~5-12 straneh A4 (pisava 12, enojni razmak, 2,5 cm robovi). Zelo pomembno je, da je obseg od 2700 do 3000 besed , a ne več kot 3500 besed. Seminarska naloga mora vsebovati najmanj tri slike. Eno sliko morate narisati sami in to pod sliko posebej označiti. Slika mora imeti legendo in v besedilu mora biti na ustreznem mestu sklic na sliko. 
* Seminar oddajte do datuma oddaje, ki je naveden v tabeli v elektronski obliki z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/ tega obrazca].
* Vsi seminarji so v elektronski obliki dostopni [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/bioseminar/ tukaj].
* Recenzenti do dneva določenega v tabeli določijo popravke (v elektronski obliki) in podajo oceno pisnega dela. Popravljen seminar oddajte z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/ tega obrazca].
* Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Za predstavitev je na voljo 20 minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni.
* Predstavitvi sledi razprava. Recenzenti podajo oceno predstavitve in postavijo najmanj dve vprašanji.Vsi ostali morajo postaviti še dve dodatni vprašanji v toku celega seminarskega obdobja. Vprašanja, ki ste jih postavili vpišite na [https://docs.google.com/forms/d/e/1FAIpQLSdV9OFlNzI3XyS8FRGnuIbG89gwH_36uwz29ocigV--2CXSbQ/viewform tukaj].
* Na dan predstavitve morate docentu še pred predstavitvijo oddati končno (popravljeno) in natisnjeno verzijo seminarja v enem izvodu, elektronsko verzijo seminarja in predstavitev pa oddati na strežnik na dan predstavitve do polnoči.
* Seminarska naloga in povzetek morajo biti v slovenskem jeziku, razen za študente, katerih materni jezik ni slovenščina. Ti lahko oddajo seminar v angleškem jeziku.

==Imena datotek==
Prosim vas, da vse datoteke, ki mi jih pošiljate poimenujete po naslednjem receptu:
* 312_BIO_Priimek_Ime.doc(x) za seminar, npr. 312_BIO_Guncar_Gregor.docx
* 312_BIO_Priimek_ime_final.doc(x) za končno verzijo seminarja
* 312_BIO_Priimek_Ime_rec_Priimek2.doc(x) za recenzijo, kjer je Priimek2 priimek recenzenta, npr. 312_BIO_Guncar_Gregor_rec_Scott.docx (če se pišete Scott in odajate recenzijo za seminar, ki ga je napisal Gunčar)
* 312_BIO_Priimek_Ime.ppt(x) za prezentacijo, npr 312_BIO_Guncar_Gregor.pptx
* 312_BIO_Priimek_ime_poprava.doc(x) za popravljeno končno verzijo seminarja, če so popravki manjši

==Ocenjevanje seminarjev==
Recenzenti ocenijo seminar tako, da izpolnijo [https://docs.google.com/forms/d/1EQDYwFO-DEzZ2R7jf8DhLqIeV4FFxRd3-ScceEASpt4/viewform recenzentsko poročilo] na spletu. Recenzentsko poročilo morate oddati najkasneje do 21:00, en dan pred predstavitvijo seminarja.

== Mnenje o predstavitvi ==
Vsak posameznik odda svoje mnenje o predstavitvi takoj po predstavitvi z online glasovanjem.

==Urejanje spletnih strani na wikiju==
Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''

==Citiranje virov==
Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se držite ene same. V seminarskih nalogah in diplomskih nalogah FKKT uprabljajte shemo citiranja, ki je pobarvana zeleno.
Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati.
Za citate v naravoslovju je najpogostejše citiranje po pravilniku ISO 690. [http://www.zveza-zotks.si/gzm/dokumenti/literatura.html Pravila], ki upoštevajo omenjeni standard, so pripravili pri ZTKS. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati. 
'''Citiranje knjig:''' 
Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica. 
Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN. 

Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005. 
Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4. 
Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.).

'''Citiranje člankov:''' 
Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani. 
Lartigue, C., Glass, J. I., Alperovich, N., Pieper, R., Parmar, P. P., Hutchison III, C. A., Smith, H. O. in Venter, J. C.
Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, 317, str. 632-638.

Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole: 
Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani. 
Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.

Revija Science uporablja skrajšani zapis: 
C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007) 

V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne). Navesti morate tudi vse avtorje dela, razen v primeru, ko jih je 10 ali več. Takrat navedite le prvih devet, za ostale pa uporabite okrajšavo in sod. (in sodelavci). Pred zadnjim avtorjem naj bo vedno besedica "in".

'''Citiranje spletnih virov:''' 
Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov 
strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life 
Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.

BIO2 Povzetki seminarjev 2018

2018-10-15T14:54:15Z

Karmenmlinar:

BIO2 Povzetki seminarjev 2018

2018-10-15T14:52:14Z

Karmenmlinar: New page: '''Karmen Mlinar: Signalizacija in odzivi na abiotski stres pri rastlinah''' Rastline živijo v stalno spreminjajočem se okolju, ki je pogosto neugodno in stresno za njihovo rast in razvo...

'''Karmen Mlinar: Signalizacija in odzivi na abiotski stres pri rastlinah'''
Rastline živijo v stalno spreminjajočem se okolju, ki je pogosto neugodno in stresno za njihovo rast in razvoj. Primer abiotskega stresa so suša, ekstremne temperature, slanost tal, pomanjkanje hranil v prsti ipd. Rastline lahko stres preživijo tako, da se mu prilagodijo ali pa izognejo. V nasprotnem primeru so obsojene na smrt. Identificiranih je le malo senzorjev, ki zaznavajo stres. Pri signalizaciji odzivov na stresna okolja pogosto sodeluje družina kinaz SnRK, ki zaznajo spremembe v energijskem statusu rastline, ki jih povzroči stres. Znane so tri poddružine SnRKs: SnRK1s, ki sodelujejo pri uravnavanju metabolizma, SnRK2s, ki sodelujejo pri osmotskem stresu in ABA signalizaciji, in SnRK3s, ki so ključni regulatorji ionske homeostaze pri spopadanju s solnim stresom. Pri ionskem stresu pogosto problem predstavlja Na+. Pri njegovi signalizaciji je ključna SOS signalna pot. Signalizacija temperaturnega stresa se začne s spremembami v fluidnosti membrane, kar zaznajo integralni membranski proteini. Pri signalizaciji pogosto sodelujejo tudi MAPKs, CPKs in stresni hormon ABA, pomembno vlogo pa nosijo sekundarni sporočevalci kot sta kalcij in ROS. Vse to stremi k vzpostavitvi ionske in vodne homeostaze ter celične stabilnosti v stresnem okolju. Z razumevanjem signalizacije stresa in odzivov, ki sledijo, bomo lahko izboljšali odpornost pridelkov na stres in s tem zagotovili kmetijsko stabilnost in preskrbo s hrano za rastoče svetovno prebivalstvo.

BIO2 Seminar 2018

2018-10-10T17:08:45Z

Karmenmlinar: /* Seznam seminarjev */

= Biokemijski seminar =
doc. dr. Gregor Gunčar, K2.022

== Seznam seminarjev ==
{| {{table}}
| align="left" style="background:#f0f0f0;"|'''ime in priimek'''
| align="left" style="background:#f0f0f0;"|'''poglavje'''
| align="left" style="background:#f0f0f0;"|'''naslov seminarja'''
| align="left" style="background:#f0f0f0;"|'''recenzent 1'''
| align="left" style="background:#f0f0f0;"|'''recenzent 2'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''datum oddaje'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''datum recenzije'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''datum predstavitve'''
|-
| Eva Gartner || 12 || moj naslov || Anamarija Agnič || Anastasija Nechevska || 15/10/2018 || 16/10/2018 || 17/10/2018
|-
| Aljaž Bratina || 12 || Staranje in lipidne signalne molekule || Lara Drinovec || Liza Ulčakar || 15/10/2018 || 16/10/2018 || 17/10/2018
|-
| Karmen Mlinar || 12 || Signalizacija in odzivi na abiotski stres v rastlinah || Luka Gnidovec || Maja Škof || 15/10/2018 || 16/10/2018 || 17/10/2018
|-
| Tina Zavodnik || 12 || moj naslov || Jernej Imperl || Ajda Godec || 19/10/2018 || 22/10/2018 || 24/10/2018
|-
| Meta Kodrič || 12 || moj naslov || Laura Gašperšič || Neža Blaznik || 19/10/2018 || 22/10/2018 || 24/10/2018
|-
| Neža Žerjav || 12 || moj naslov || Nika Boštic || Urša Štrancar || 19/10/2018 || 22/10/2018 || 24/10/2018
|-
| Doroteja Armič || 14-15 || moj naslov || Eva Gartner || Anamarija Agnič || 02/11/2018 || 05/11/2018 || 07/11/2018
|-
| Sanja Stanković || 14-15 || moj naslov || Aljaž Bratina || Lara Drinovec || 02/11/2018 || 05/11/2018 || 07/11/2018
|-
| Martina Lokar || 14-15 || Mehanizmi biotinilacije proteinov || Karmen Mlinar || Luka Gnidovec || 02/11/2018 || 05/11/2018 || 07/11/2018
|-
| Marko Pavleković || 16 || moj naslov || Tina Zavodnik || Jernej Imperl || 09/11/2018 || 12/11/2018 || 14/11/2018
|-
| Valeriya Musina || 16 || moj naslov || Meta Kodrič || Laura Gašperšič || 09/11/2018 || 12/11/2018 || 14/11/2018
|-
| Tina Kolenc Milavec || 16 || moj naslov || Neža Žerjav || Nika Boštic || 09/11/2018 || 12/11/2018 || 14/11/2018
|-
| Andrej Špenko || 17 || moj naslov || Doroteja Armič || Eva Gartner || 16/11/2018 || 19/11/2018 || 21/11/2018
|-
| Tadej Medved || 17 || moj naslov || Sanja Stanković || Aljaž Bratina || 16/11/2018 || 19/11/2018 || 21/11/2018
|-
| Klementina Polanec || 17 || moj naslov || Martina Lokar || Karmen Mlinar || 16/11/2018 || 19/11/2018 || 21/11/2018
|-
| Rebeka Dajčman || 17 || moj naslov || Marko Pavleković || Tina Zavodnik || 16/11/2018 || 19/11/2018 || 21/11/2018
|-
| Sumeja Kudelić || 18 || moj naslov || Valeriya Musina || Meta Kodrič || 23/11/2018 || 26/11/2018 || 28/11/2018
|-
| Matija Ruparčič || 18 || moj naslov || Tina Kolenc Milavec || Neža Žerjav || 23/11/2018 || 26/11/2018 || 28/11/2018
|-
| Maks Kumek || 18 || moj naslov || Andrej Špenko || Doroteja Armič || 23/11/2018 || 26/11/2018 || 28/11/2018
|-
| Anže Šumah || 19 || moj naslov || Tadej Medved || Sanja Stanković || 30/11/2018 || 03/12/2018 || 05/12/2018
|-
| Barbara Jaklič || 19 || moj naslov || Klementina Polanec || Martina Lokar || 30/11/2018 || 03/12/2018 || 05/12/2018
|-
| Gašper Anton Komatar || 19 || moj naslov || Rebeka Dajčman || Marko Pavleković || 30/11/2018 || 03/12/2018 || 05/12/2018
|-
| Praznik Liza || 19 || moj naslov || Sumeja Kudelić || Valeriya Musina || 30/11/2018 || 03/12/2018 || 05/12/2018
|-
| Lara Hrvatin || 20 || moj naslov || Matija Ruparčič || Tina Kolenc Milavec || 07/12/2018 || 10/12/2018 || 12/12/2018
|-
| Sonja Gabrijelčič || 20 || moj naslov || Maks Kumek || Andrej Špenko || 07/12/2018 || 10/12/2018 || 12/12/2018
|-
| Anastasija Nechevska || 20 || moj naslov || Anže Šumah || Tadej Medved || 07/12/2018 || 10/12/2018 || 12/12/2018
|-
| Liza Ulčakar || 21 || moj naslov || Barbara Jaklič || Klementina Polanec || 14/12/2018 || 17/12/2018 || 19/12/2018
|-
| Maja Škof || 21 || moj naslov || Gašper Anton Komatar || Rebeka Dajčman || 14/12/2018 || 17/12/2018 || 19/12/2018
|-
| Ajda Godec || 21 || moj naslov || Praznik Liza || Sumeja Kudelić || 14/12/2018 || 17/12/2018 || 19/12/2018
|-
| Neža Blaznik || 22 || moj naslov || Lara Hrvatin || Matija Ruparčič || 04/01/2019 || 07/01/2019 || 09/01/2019
|-
| Urša Štrancar || 22 || moj naslov || Sonja Gabrijelčič || Maks Kumek || 04/01/2019 || 07/01/2019 || 09/01/2019
|-
| Anamarija Agnič || 22 || moj naslov || Anastasija Nechevska || Anže Šumah || 04/01/2019 || 07/01/2019 || 09/01/2019
|-
| Lara Drinovec || 23 || moj naslov || Liza Ulčakar || Barbara Jaklič || 04/01/2019 || 07/01/2019 || 09/01/2019
|-
| Luka Gnidovec || 23 || moj naslov || Maja Škof || Gašper Anton Komatar || 11/01/2019 || 14/01/2019 || 16/01/2019
|-
| Jernej Imperl || 23 || moj naslov || Ajda Godec || Praznik Liza || 11/01/2019 || 14/01/2019 || 16/01/2019
|-
| Laura Gašperšič || 23 || moj naslov || Neža Blaznik || Lara Hrvatin || 11/01/2019 || 14/01/2019 || 16/01/2019
|-
| Nika Boštic || 23 || moj naslov || Urša Štrancar || Sonja Gabrijelčič || 11/01/2019 || 14/01/2019 || 16/01/2019
|}

*številka v okencu za temo pomeni poglavje v Lehningerju, v katerega naj izbrana tema spada
Sporočite mi morebitne napake ali če vas nisem razporedil.

== Gradivo za predavanja ==
Gradivo za predavanja in seminarje najdete na http://bio.ijs.si/~zajec/bio2/
username: bio2
password: samozame

==Naloga==
'''Vaša naloga za seminar je: '''
Samostojno pripraviti seminar o seminarski temi, ki vam je bila dodeljena. Za osnovo morate vzeti pregledni članek iz revije, ki ima faktor vpliva nad 5 (npr. [http://www.sciencedirect.com/science/journal/09680004/ TIBS]. Poiskati morate še vsaj tri znanstvene članke, ki se nanašajo na opisano temo in jih uporabiti kot podlago za seminarsko nalogo! Članki so dostopni [http://93.174.95.27/scimag/ tukaj].

Za pripravo seminarja velja naslednje: 
* [[BIO2 Povzetki seminarjev 2017|Povzetek seminarja]] opišete na wikiju '''v 200 besedah''' (+- dvajset besed) - najkasneje do dne ko morate oddati seminar recenzentom.
* Povezavo do povzetka vnesete v tabelo seminarjev tekočega letnika.
* Seminar pripravite v obliki seminarske naloge na ~5-12 straneh A4 (pisava 12, enojni razmak, 2,5 cm robovi). Zelo pomembno je, da je obseg od 2700 do 3000 besed , a ne več kot 3500 besed. Seminarska naloga mora vsebovati najmanj tri slike. Eno sliko morate narisati sami in to pod sliko posebej označiti. Slika mora imeti legendo in v besedilu mora biti na ustreznem mestu sklic na sliko. 
* Seminar oddajte do datuma oddaje, ki je naveden v tabeli v elektronski obliki z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/ tega obrazca].
* Vsi seminarji so v elektronski obliki dostopni [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/bioseminar/ tukaj].
* Recenzenti do dneva določenega v tabeli določijo popravke (v elektronski obliki) in podajo oceno pisnega dela. Popravljen seminar oddajte z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/ tega obrazca].
* Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Za predstavitev je na voljo 20 minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni.
* Predstavitvi sledi razprava. Recenzenti podajo oceno predstavitve in postavijo najmanj dve vprašanji.Vsi ostali morajo postaviti še dve dodatni vprašanji v toku celega seminarskega obdobja. Vprašanja, ki ste jih postavili vpišite na [https://docs.google.com/forms/d/e/1FAIpQLSdV9OFlNzI3XyS8FRGnuIbG89gwH_36uwz29ocigV--2CXSbQ/viewform tukaj].
* Na dan predstavitve morate docentu še pred predstavitvijo oddati končno (popravljeno) in natisnjeno verzijo seminarja v enem izvodu, elektronsko verzijo seminarja in predstavitev pa oddati na strežnik na dan predstavitve do polnoči.
* Seminarska naloga in povzetek morajo biti v slovenskem jeziku, razen za študente, katerih materni jezik ni slovenščina. Ti lahko oddajo seminar v angleškem jeziku.

==Imena datotek==
Prosim vas, da vse datoteke, ki mi jih pošiljate poimenujete po naslednjem receptu:
* 312_BIO_Priimek_Ime.doc(x) za seminar, npr. 312_BIO_Guncar_Gregor.docx
* 312_BIO_Priimek_ime_final.doc(x) za končno verzijo seminarja
* 312_BIO_Priimek_Ime_rec_Priimek2.doc(x) za recenzijo, kjer je Priimek2 priimek recenzenta, npr. 312_BIO_Guncar_Gregor_rec_Scott.docx (če se pišete Scott in odajate recenzijo za seminar, ki ga je napisal Gunčar)
* 312_BIO_Priimek_Ime.ppt(x) za prezentacijo, npr 312_BIO_Guncar_Gregor.pptx
* 312_BIO_Priimek_ime_poprava.doc(x) za popravljeno končno verzijo seminarja, če so popravki manjši

==Ocenjevanje seminarjev==
Recenzenti ocenijo seminar tako, da izpolnijo [https://docs.google.com/forms/d/1EQDYwFO-DEzZ2R7jf8DhLqIeV4FFxRd3-ScceEASpt4/viewform recenzentsko poročilo] na spletu. Recenzentsko poročilo morate oddati najkasneje do 21:00, en dan pred predstavitvijo seminarja.

== Mnenje o predstavitvi ==
Vsak posameznik odda svoje mnenje o predstavitvi takoj po predstavitvi z online glasovanjem.

==Urejanje spletnih strani na wikiju==
Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''

==Citiranje virov==
Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se držite ene same. V seminarskih nalogah in diplomskih nalogah FKKT uprabljajte shemo citiranja, ki je pobarvana zeleno.
Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati.
Za citate v naravoslovju je najpogostejše citiranje po pravilniku ISO 690. [http://www.zveza-zotks.si/gzm/dokumenti/literatura.html Pravila], ki upoštevajo omenjeni standard, so pripravili pri ZTKS. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati. 
'''Citiranje knjig:''' 
Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica. 
Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN. 

Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005. 
Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4. 
Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.).

'''Citiranje člankov:''' 
Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani. 
Lartigue, C., Glass, J. I., Alperovich, N., Pieper, R., Parmar, P. P., Hutchison III, C. A., Smith, H. O. in Venter, J. C.
Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, 317, str. 632-638.

Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole: 
Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani. 
Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.

Revija Science uporablja skrajšani zapis: 
C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007) 

V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne). Navesti morate tudi vse avtorje dela, razen v primeru, ko jih je 10 ali več. Takrat navedite le prvih devet, za ostale pa uporabite okrajšavo in sod. (in sodelavci). Pred zadnjim avtorjem naj bo vedno besedica "in".

'''Citiranje spletnih virov:''' 
Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov 
strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life 
Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.

TBK2018-seminar

2018-05-22T19:54:28Z

Karmenmlinar: /* Seznam seminarjev */

= Temelji biokemije- seminar =

Seminarje vodi prof. dr. Brigita Lenarčič. Seminarji so obvezni.

Ocena seminarjev (6-10) predstavlja enako število odstotkov, ki se prišteje h končni pisni oceni izpita.
Stran na strežniku s seminarskimi nalogami je zaščitena.
Uporabniško ime je: tbk, password pa: samozame## "##" sta dve številki, ki ju izveste na predavanjih.
Tudi za urejanje Wiki strani potrebujete geslo, ki se od zgornjega razlikuje. Postopek pridobitve Wiki uporabniškega imena in gesla je opisan [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Main_Page tukaj].

== Seznam seminarjev ==

{| border="1" cellpadding="4" cellspacing="0" style="border:#c9c9c9 1px solid; margin: 1em 1em 1em 0; border-collapse: collapse;"
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Ime in priimek'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Naslov seminarja'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Povezava'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Rok za oddajo'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Rok za recenzijo'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Datum predstavitve'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 1'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 2'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 3'''
|-
| Anna Scott||Moj naslov v slovenščini||http://www.bioscirep.org/content/36/1/e00291.long||28.10.||05.11.||07.11.||r1||r2||r3
|-
| Doroteja Armič || Pretvorba mišjih fibroblastov v pluripotentne matične celice s pomočjo tehnologije CRISPR || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/01/180118162449.htm || 27.02. || 02.03. || 05.03. || Martina Lokar || Liza Ulčakar || Zoja Siter
|-
| Valeriya Musina || Metalopeptid bakrov(II) fenantrolin tarčno onemogoči delovanje mitohondrijev v matičnih celicah raka dojke || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/12/171213124751.htm || 27.02. || 02.03. || 05.03. || Nika Boštic || Tiana Karmen Kokalj || Aljaž Bratina
|-
| Dea Simonič || Sprožilci avtoimunskih bolezni in vzroki za nekontrolirano širjenje le-teh po telesu ||https://www.sciencedaily.com/releases/2017/08/170824141207.htm|| 27.02. || 02.03. || 05.03. || Sumeja Kudelić || Jernej Imperl || Anamarija Agnič
|-
| Neža Štremfelj ||Delovanje inzulinskih receptorjev||https://www.sciencedaily.com/releases/2018/02/180219103256.htm|| 27.02. || 02.03. || 05.03. || Luka Gnidovec || Matija Ruparčič || Simona Gorgievska
|-
| Gašper Komatar || Tvorba kompleksa receptorjev ApoER2, ephirinB2 in AMPAR, ki jih povezuje GRIP1, sodeluje pri tvorbi spomina || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/10/171009093207.htm || 06.03. || 09.03. || 12.03. || Lara Hrvatin || Tiana Karmen Kokalj || Matej Jereb
|-
| Marko Pavleković || Prehajanje imunskih celic, povzročiteljic multiple skleroze, skozi krvno-možgansko pregrado || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/11/171121155811.htm || 06.03. || 09.03. || 12.03. || Klementina Polanec || Meta Kodrič || Lara Drinovec
|-
| Laura Gašperšič || Alzheimerjeva bolezen: povrnitev zmožnosti pomnjenja z inhibicijo interakcije med Sp3 in HDAC2 || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/08/170808150001.htm || 06.03. || 09.03. || 12.03. || Karmen Mlinar || Ana Menegalija || Maks Kumek
|-
| Rebeka Dajčman || Več mehanizmov poganja dinamiko kalcijevega signala okoli lasersko povzročene rane epitelija || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/10/171003124646.htm || 06.03. || 09.03. || 12.03. || Ula Nikolaja Ratajec || Andreja Marija Belič || Neža Blaznik
|-
| Maja Škof || Pomen S-proteinov pri prilagajanju koronavirusov na okolje. || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/11/171127105937.htm || 13.03. || 16.03. || 19.03. || Doroteja Armič || Barbara Jaklič || Liza Ulčakar
|-
| Tina Kolenc Milavec || Vezava kalcija na karboksilni konec α-sinukleina uravnava interakcije med sinaptičnimi vezikli || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/02/180219071758.htm || 13.03. || 16.03. || 19.03. || Valeriya Musina || Eva Gartner || Jana Rajchevska
|-
| Tina Zavodnik || Disfunkcionalni mitohondriji s pomočjo ROS zavirajo translacijsko aktivnost || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/02/180202112629.htm || 13.03. || 16.03. || 19.03. || Dea Simonič || Martina Lokar || Jernej Imperl
|-
| Tadej Medved || Identifikacija vezavnih mest proteinov WASP na aktinski ojedritveni kompleks Arp2/3 || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/03/180305130632.htm || 13.03. || 16.03. || 19.03. || Neža Štremfelj || Nika Boštic || Matija Ruparčič
|-
| Bogdan Jovićević || || || 20.03. || 23.03. || 26.03. || Laura Gašperšič || Lara Hrvatin || Ana Menegalija
|-
| Polona Kalan || || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/02/180214111055.htm || 20.03. || 23.03. || 26.03. || Rebeka Dajčman || Klementina Polanec || Andreja Marija Belič
|-
| Liza Praznik ||Vpliv šaperono Skp in SurA na zvijanje proteinov FhuA v terciarno strukturo ||https://www.sciencedaily.com/releases/2015/09/150907113757.htm || 20.03. || 23.03. || 26.03. || Maja Škof || Karmen Mlinar || Barbara Jaklič
|-
| Anže Šumah || Razvoj genskega senzorja za uničevanje celic s pomanjkanjem proteina p53 || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/11/171114104201.htm || 20.03. || 23.03. || 26.03. || Tina Kolenc Milavec || Ula Nikolaja Ratajec || Eva Gartner
|-
| Neža Žerjav|| Dodajanje enega samega nukleotida omejuje aktivnost človeške telomeraze ||https://www.sciencedaily.com/releases/2018/02/180227142114.htm || 03.04. || 06.04. || 09.04. || Tina Zavodnik || Doroteja Armič || Martina Lokar
|-
| Urša Štrancar || Predstavitev združitve avtofagosoma in lizosoma s pomočjo supermolekularnega para FRET || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/02/180219103254.htm || 03.04. || 06.04. || 09.04. || Tadej Medved || Valeriya Musina || Nika Boštic
|-
| Zoja Siter || || || 03.04. || 06.04. || 09.04. || Neža Žerjav || Dea Simonič || Sumeja Kudelić
|-
| Aljaž Bratina || Intrinzična destabilizacija ribosoma || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/11/171120101314.htm || 03.04. || 06.04. || 09.04. || Anastasija Nechevska || Neža Štremfelj || Luka Gnidovec
|-
| Anamarija Agnič || ATP-aza P4 s premeščanjem fosfolipidov uravnava uvihanost membrane || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/03/180329141014.htm || 10.04. || 13.04. || 16.04. || Bogdan Jovićević || Sumeja Kudelić || Lara Hrvatin
|-
| Simona Gorgievska || Optical tools to detect metabolic changes linked to disease || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/03/180307161351.htm|| 10.04. || 13.04. || 16.04. || Polona Kalan || Marko Pavleković || Klementina Polanec
|-
| Matej Jereb || Gradnja človeške pluripotentne matične celice v funkcionalno skeletno mišično tkivo|| https://www.sciencedaily.com/releases/2018/01/180109104707.htm || 10.04. || 13.04. || 16.04. || Liza Praznik || Laura Gašperšič || Karmen Mlinar
|-
| Lara Drinovec || Tavrin pomaga obnoviti zaradi multiple skleroze poškodovane celice || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/12/171208143024.htm || 10.04. || 13.04. || 16.04. || Anže Šumah || Rebeka Dajčman || Ula Nikolaja Ratajec
|-
| Maks Kumek || Dinamični izvor sprememb specifčne toplote v encimsko kataliziranih reakcijah || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/03/180321090854.htm || 17.04. || 20.04. || 23.04. || Marko Pavleković || Maja Škof || Doroteja Armič
|-
| Neža Blaznik || Glikozilirana sialična kislina na protitelesu IgA inhibira virus influence tipa A || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/04/180403111203.htm || 17.04. || 20.04. || 23.04. || Urša Štrancar || Tina Kolenc Milavec || Valeriya Musina
|-
| Liza Ulčakar || Kombinirana DNA-RNA/antigen nanocepiva - učinkovita imunoterapevtska metoda ||https://www.sciencedaily.com/releases/2017/11/171129163851.htm || 17.04. || 20.04. || 23.04. || Zoja Siter || Tina Zavodnik || Dea Simonič
|-
| Anastasija Nechevska || || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/03/180319155730.htm || 17.04. || 20.04. || 23.04. || Aljaž Bratina || Tadej Medved || Neža Štremfelj
|-
| Jernej Imperl || Optimizacija protimikrobnih peptidov s pomočjo virtualnih metod || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/04/180416085922.htm || 23.04. || 26.04. || 07.05. || Anamarija Agnič || Neža Žerjav || Luka Gnidovec
|-
| Matija Ruparčič || Od strupenih kompleksov do zlatih zrnc s ''Cupriavidus metallidurans'' || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/01/180131095453.htm || 23.04. || 26.04. || 07.05. || Simona Gorgievska || Anastasija Nechevska || Marko Pavleković
|-
| Tiana Karmen Kokalj || B-1a limfociti spodbujajo oligodendrogenezo med razvojem možganov || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/03/180313091702.htm || 23.04. || 26.04. || 07.05. || Matej Jereb || Bogdan Jovićević || Laura Gašperšič
|-
| Meta Kodrič || Naključna izboljšava bakterijskega encima za razgradnjo plastike || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/04/180416155619.htm || 23.04. || 26.04. || 07.05. || Lara Drinovec || Polona Kalan || Rebeka Dajčman
|-
| Ana Menegalija || METTL3 nova potencialna terapevtska tarča pri akutni mieloični levkemiji || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/11/171127135838.htm || 08.05. || 11.05. || 14.05. || Maks Kumek || Liza Praznik || Maja Škof
|-
| Andreja Marija Belič || || || 08.05. || 11.05. || 14.05. || Neža Blaznik || Anže Šumah || Tina Kolenc Milavec
|-
| Barbara Jaklič || I-motif DNA strukture nastajajo tudi v jedrih človeških celic || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/04/180423135054.htm || 08.05. || 11.05. || 14.05. || Liza Ulčakar || Meta Kodrič || Tina Zavodnik
|-
| Eva Gartner ||Vloga neobičajnega prohibitina pri regulaciji mitohondrijskega membranskega potenciala in razvoju malarije. ||https://www.sciencedaily.com/releases/2018/04/180418111615.htm || 08.05. || 11.05. || 14.05. || Gašper Komatar || Urša Štrancar || Tadej Medved
|-
| Martina Lokar || Mitohondrijska povratna signalizacija pri sesalcih je uravnavana s transkripcijskim kofaktorjem GPS2 preko direktne translokacije od mitohondrija do jedra || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/03/180301144138.htm || 15.05. || 18.05. || 21.05. || Jernej Imperl || Zoja Siter || Neža Žerjav
|-
| Nika Boštic ||Oksidativni stres kontrolira apoptozo regulatornih celic T in njihovo zaviralno aktivnost ter odpornost na blokado PD-L1 v tumorjih ||https://www.sciencedaily.com/releases/2017/10/171030154424.htm || 15.05. || 18.05. || 21.05. || Matija Ruparčič || Aljaž Bratina || Anastasija Nechevska
|-
| Sumeja Kudelić ||Kolaboranti alergijskih reakcij ||https://www.sciencedaily.com/releases/2017/12/171221122927.htm || 15.05. || 18.05. || 21.05. || Tiana Karmen Kokalj || Anamarija Agnič || Bogdan Jovićević
|-
| Luka Gnidovec ||Fibrinogen aktivira BMP signalizacijo v oligodendrocitskih predhodnih celicah in inhibira remielinacijo ||https://www.sciencedaily.com/releases/2017/11/171102124907.htm || 15.05. || 18.05. || 21.05. || Meta Kodrič || Simona Gorgievska || Polona Kalan
|-
| Lara Hrvatin || Nihanje koncentracije, temperature in pH omogoča prebiotično sintezo nukleozidov || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/01/180117131129.htm || 22.05. || 25.05. || 28.05. || Ana Menegalija || Matej Jereb || Liza Praznik
|-
| Klementina Polanec || || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/03/180312115405.htm || 22.05. || 25.05. || 28.05. || Andreja Marija Belič || Lara Drinovec || Anže Šumah
|-
| Karmen Mlinar || Učinkovito in vivo zdravljenje ALI s spiralnimi, amfipatičnimi, peptoidnimi posnemalci proteinov v pljučnem surfaktantu || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/05/180501085533.htm || 22.05. || 25.05. || 28.05. || Barbara Jaklič || Maks Kumek || Gašper Komatar
|-
| Ula Nikolaja Ratajec || ||https://www.sciencedaily.com/releases/2018/02/180208141346.htm || 22.05. || 25.05. || 28.05. || Eva Gartner || Neža Blaznik || Urša Štrancar
|-
| rezerva || || || 29.05. || 01.06. || 04.06. || || ||
|}

==Naloga==
* samostojno pripraviti seminar, katerega tema je novica iz področja biokemije na portalu [http://www.sciencedaily.com ScienceDaily], ki je bila objavljena kasneje kot 1. avgusta 2016. Osnova za seminar naj bo znanstveni članek, ki je podlaga za to novico. Poleg tega članka za seminar uporabite še najmanj pet drugih virov, od teh vsaj še dva druga znanstvena članka, ki se navezujeta na to vsebino.
* članke na temo lahko iščete [https://scholar.google.com/ z Google učenjakom].
* naslov izbrane teme in povezavo do novice vpišite v tabelo seminarjev takoj ko ste si izbrali temo, najkasneje pa en teden pred rokom za oddajo
* [[TBK2017 Povzetki seminarjev|Povzetek seminarja]] opišete na wikiju v približno 200 besedah - najkasneje do dne, ko morate oddati seminar recenzentom.
* Povezavo do povzetka vnesete v tabelo seminarjev tekočega letnika.
* Seminar pripravite v obliki seminarske naloge (pisava Cambria, font 11, enojni razmak, 2,5 cm robovi; tekst naj obsega okoli 1000 besed), vsebuje naj 1-2 sliki. Slika mora imeti legendo in v besedilu mora biti na ustreznem mestu sklic na sliko. Vse uporabljene vire citirajte v tekstu, kot npr. (Nobel, 2010), na koncu pa navedite točen seznam literature, kot je opisano spodaj!
*Celotni seminar naj obsega 2 strani A4 formata (po možnosti dvostransko tiskanje).
* Seminar oddajte do datuma oddaje, ki je naveden v tabeli v elektronski obliki z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/tbk/poslji/ tega obrazca].
* vsi seminarji so v elektronski obliki dostopni [http://bio.ijs.si/~zajec/tbk/poslji//bioseminar/ tukaj].
* Recenzenti do dneva določenega v tabeli določijo popravke in podajo oceno pisnega dela, v predpisanem formatu elektronskega obrazca na internetu.
* Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Za predstavitev je na voljo 12 minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni. Prvi recenzent vodi predstavitve in razpravo ter skrbi za to, da vse poteka v zastavljenih časovnih okvirih.
* Predstavitvi sledi razprava do 8 minut. Sledijo vprašanja prisotnih, recenzenti postavijo vsak vsaj dve vprašanji in na koncu podajo oceno predstavitve.
* En dan pred predstavitvijo na strežnik oddajte tudi končno verzijo. Na dan predstavitve morate oddati tudi končno (popravljeno) in natisnjeno verzijo seminarja v enem izvodu.
* Seminarska naloga in povzetek na wikiju morajo biti v slovenskem jeziku!

==Imena datotek==
Prosim vas, da vse datoteke, ki jih pošiljate poimenujete po spodnjih pravilih. Ne uporabljajte ČŽŠčžš!
Poslati morate naslednje datoteke:
* TBK_2018_Priimek_Ime.doc(x) za seminar, npr. TBK_2017_Guncar_Gregor.docx
* TBK_2018_Priimek_ime_final.doc(x) za končno verzijo seminarja
* TBK_2018_Priimek_Ime_rec_Priimek2.doc(x) za recenzijo, kjer je Priimek2 priimek recenzenta, npr. TBK_2017_Guncar_Gregor_rec_Scott.docx (če se pišete Scott in odajate recenzijo za seminar, ki ga je napisal Gunčar)
* TBK_2018_Priimek_Ime.ppt(x) za prezentacijo, npr TBK_2017_Guncar_Gregor.pptx
* TBK_2018_Priimek_Ime_clanek.pdf za datoteko PDF, ki vsebuje izvirni članek, npr. TBK_2017_Guncar_Gregor_clanek.pdf

==Ocenjevanje seminarjev==
Recenzenti ocenijo seminar tako, da izpolnijo [[https://docs.google.com/forms/d/1Hdg2OHCyG24qwLTnFt09yZTng46RIwaIiUqnKOdsJxQ/viewform recenzentsko poročilo]] na spletu.

== Mnenje o predstavitvi ==
Vsak posameznik '''mora''' oceniti seminar tako, da odda svoje [https://docs.google.com/forms/d/1VvE-jaKikfiDO5Gdybqgp9mf_0uJZfBbIK8PLXKDaS0/viewform mnenje] najkasneje v enem tednu po predstavitvi. Kdor na seminarju ni bil prisoten, mnenja '''ne sme''' oddati.

==Urejanje spletnih strani na wikiju==
Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''

==Faktor vpliva==
Faktor vpliva (angl. impact factor) neke revije pove, kolikokrat so bili v poprečju citirani članki v tej reviji v dveh letih skupaj pred objavo tega faktorja. Faktorje vpliva za posamezno revijo lahko najdete v [http://www.cobiss.si/scripts/cobiss?command=CONNECT&base=JCR COBISS-u]. V polje "Naslov revije" vnesite ime revije za katero želite izvedeti faktor vpliva in pritisnite na gumb POIŠČI. V skrajnem desnem stolpcu se bodo izpisali faktorji vpliva za revije, ki ustrezajo vašim iskalnim kriterijem. Zadetkov za posamezno revijo je več zato, ker so navedeni faktorji vpliva za posamezno leto. Za tekoče leto faktorji vpliva še niso objavljeni, zato se orientirajte po faktorjih vpliva zadnjih par let. Če faktorja vpliva za vašo izbrano revijo ne najdete v bazi COBISS, potem izberite članek iz kakšne druge revije.

==Citiranje virov==Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se v seminarju držite ene same. Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati. '''Citiranje knjig:''' Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica. Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN. Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005. Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4. Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.). '''Citiranje člankov:''' Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani. Lartigue C. ''et al''. Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, letn. 317, str. 632-638.Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole: Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani. Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.Revija Science uporablja skrajšani zapis: C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007) V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne). '''Citiranje spletnih virov:''' Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.

TBK2017 Povzetki seminarjev

2018-05-22T19:49:15Z

Karmenmlinar: /* Ana Scott: Naslov seminarja */

[[TBK2017-seminar|Nazaj na osnovno stran]]
===Ana Scott: Naslov seminarja===
Tekst ....

'''Uroš Prešern: Nukleaza, ki povzroči partanatos oziroma od PARP-1 odvisno celično smrt'''

Partanatos je ena izmed vrst celične smrti, ki nastopi zaradi prevelike aktivnosti poli(ADP-riboza) polimeraze 1 (PARP-1) v jedru. Pogost je v primeru možganske kapi, infarkta in nevrodegenerativnih boleznih, zaradi česar bi boljše poznavanje samega procesa omogočilo razvoj novih načinov zdravljenja teh obolenj. V predhodnih raziskavah so ugotovili, da partanatos nastopi, ko molekule poli-ADP-riboze, ki jih PARP-1 sintetizira, preidejo iz jedra v citosol, kjer aktivirajo premestitev indukcijskega faktorja apoptoze (AIF) iz mitohondrijev v jedro. Temu sledi razrez DNA. Nukleaza, ki povzroči razrez DNA, je bila do nedavnega manjkajoči člen v partanatosu. Skupini raziskovalcev je uspelo odkriti, da je iskana nukleaza inhibitorni dejavnik migracije makrofagov (MIF). Pokazali so, da se med partanatosom MIF veže na AIF in se skupaj z njim premesti v jedro, kjer povzroči fragmentacijo DNA. Inhibicija nukleazne aktivnosti MIF se je v modelu možganske kapi pri miših odrazila v 75-odstotnem zmanjšanju volumna prizadetega tkiva, pospešeno pa je bilo tudi okrevanje. Rezultati raziskave odpirajo potencialne možnosti za zdravljenje akutnih in kroničnih nevroloških bolezni, v katerih nastopi partanatos.

'''Doroteja Armič: Pretvorba mišjih fibroblastov v pluripotentne matične celice s pomočjo tehnologije CRISPR'''

Pluripotentne matične celice so še nediferencirane celice, ki imajo sposobnost, da se diferencirajo v skoraj vse tipe celic. Poznamo več vrst pluripotentnih matičnih celic. Ene izmed njih so inducirane pluripotentne matične celice (celice iPS). To so pluripotentne celice, ki jih umetno dediferencirajo iz odraslih somatskih celic. Leta 2006 so odkrili postopek pridobivanja celic iPS iz mišjih fibroblastov. Ugotovili so, da so za reprogramiranje somatskih celic najpomembnejši štirje transkripcijski dejavniki, in sicer Oct4, Sox2, Klf4 in c-Myc. Letos pa je skupini znanstvenikov uspelo odkriti nov, bolj enostaven postopek pridobivanja celic iPS. Ugotovili so namreč, da lahko sprožijo njihov nastanek že z aktivacijo enega samega gena – Oct4 ali Sox2. Aktivacija Sox2-promotorja oziroma Oct4-promotorja in Oct4-ojačevalca hkrati pa nato povzroči aktivacijo ostalih genov, ki sodelujejo pri vzpostavitvi pluripotentnosti v celicah. Za aktivacijo genov so uporabili tehnologijo CRISPR. Primerjali so uporabo dveh sistemov – dCas9-SunTag-VP64 in dCas9-SunTag-p300core. V obeh primerih so dobili primerljive rezultate. Uporaba celic iPS je pomembna v regenerativni medicini, saj lahko zamenja uporabo človeških embrionalnih matičnih celic. Z uporabo celic iPS, generiranih iz pacientovih lastnih celic, ne bi prišlo do zavrnitvenih reakcij, prav tako pa bi se izognili etičnih pomislekov. Znanstveniki predvidevajo, da lahko tehnologija reprogramiranja celic, ki so jo uporabili na mišjih celicah, z manjšimi spremembami deluje tudi na človeških celicah.

'''Dea Simonič: Sprožilci avtoimunskih bolezni in vzroki za nekontrolirano širjenje le-teh po telesu'''

Avtoimunska bolezen je bolezen, ki nastane zaradi pretiranega odziva imunskega sistema na celice, ki so last organizma. Veliko vlogo pri nastanku avtoimunske bolezni imajo limfociti B, ki omogočajo humoralni imunski odziv. Transkripcijski faktor T-bet v limfocitih B povzroči razvoj ABC, te celice so pa »pogon« avtoimunske bolezni. Avtoimunska bolezen se v veliki večini primerov razširi po telesu . Vzrok tega so ravno limfociti B, ki razširijo svoj napad po telesu in pride do širjenja epitopa. Ta proces se začne, ko imunski sistem napade antigene na drugih delih telesa, ki jih na začetku ni hotel uničiti. Telo začne pospeševano uničevati lastna tkiva. Da bi razumeli, zakaj pride do tega mehanizma so raziskovalci uporabili fluorescenčne markerje beljakovin, ki razlikujejo različne celične skupke limfocitov B (oziroma germinalne centre), na miših obolelih z lupusom. V germinalnih centrih limfociti B »tekmujejo« med sabo, kateri bo naredil najboljše protitelo, ki bo nevtraliziralo zaznano grožnjo. Te germinalne skupke so s pomočjo markerjev zaznali kot 10 različnih barv. Po tednu ali dveh začne prevladovati ena sama barva. Ta germinalni skupek je ustvaril najboljše protitelo in skupaj z ostalimi limfociti aktiviral avtoimunski protinapad. S to študijo so raziskovalci naredili velik korak v smer zaustavitve oziroma zdravljenja avtoimunske bolezni.

'''Valeriya Musina: Metalopeptid bakrov(II) fenantrolin tarčno onemogoči delovanje mitohondrijev v matičnih celicah raka dojke'''

Uničenje mitohondrijev je eden najbolj obetavnih pristopov pri razvoju novih zdravil proti raku. Znanstveniki so sintetizirali peptid, ki vsebuje baker, ki ga zlahka sprejmejo mitohondriji v matičnih celicah raka dojk, kjer le ta učinkovito povzroča apoptozo. Rakaste celice, ki imajo povečani metabolizem, ne samo, da vsebujejo več mitohondrijev kot zdrave celice, temveč so te tudi drugačni, strukturno in funkcionalno. Zaradi posebnih značilnosti in njihove odločilne vloge v presnovi celic so maligne mitohondrije pomembne tarčej za nove terapevtske spojine. Mitohondrije je možno uničiti z uvajanjem sredstev za proizvajanje reaktivnih vrst kisika (ROS). Te reaktivne spojine ovirajo metabolizem mitohondrijev. Kot močan ROS generator je bila predlagana organokovinska spojina bakrov(II) fenantrolin. Za dostavo in prenos skozi zunanjo membrano mitohondrija pa so bakrov(II) fenantrolin vezali na specifičen peptid, ki prodira v mitohondrije. Preizkusi so bili izvedeni z dvema celicnima linijama raka dojke, ena celična linija je vsebovala matične celice raka dojk. Rezultati so bili : odvisna od količine odmerka izguba sposobnosti za preživetje, razpad membran mitohondrijev, nastanek ROS in slabši metabolizma mitohondrijev. Zdravilo je bolj vplivalo na matične celice raka, kar je bilo razloženo z večjo vsebnostjo mitohondrijev. Ta študija izpostavlja potencial metalopeptida tako za dostavo kot tudi za uničenje mitohondrijev, zlasti v matičnih celicah raka.

'''Neža Štremfelj: Delovanje inzulinskih receptorjev'''

Človeški inzulinski receptorji igrajo pomembno vlogo v človeškem telesu. Signalizacija z inzulinskimi receptorji igra ključno vlogo pri regulaciji metabolizma in pri rasti v večceličnih organizmih. Nepravilno delovanje inzulinskih receptorjev je povezano z mnogimi hujšimi obolenji, na primer z rakavim obolenjem, diabetesom in Alzheimerjevo boleznijo.
Glavna ideja raziskave, ki jo opisuje članek, ki sem si ga izbrala za osnovo moje seminarske naloge je, da vezava inzulina na inzulinski receptor preoblikuje zunajcelični del transmembranskih proteinov (ektodomeno) receptorja iz U-konformacije v T-konformacijo. Prerazporeditev v ektodomeni se razširi tudi na transmembranske domene, ki so, ko je receptor neaktiviran pomaknjene narazen, ob vezavi inzulina pa se pomaknejo skupaj, kar omogoči fosforilizacijo tirozin kinaze v citoplazmi. Pri transmembranski signalizaciji z inzulinskim receptorjem poleg dimerizacije z vezavo liganda pride tudi do strukturnih sprememb znotraj receptorskega dimera.

'''Marko Pavleković: Prehajanje imunskih celic, povzročiteljic multiple skleroze, skozi krvno-možgansko pregrado'''

Multipla skleroza je avtoimunska bolezen, pri kateri limfociti napadejo živčne celice in jih demielinizirajo ter tako škodujejo prenosu signalov med nevroni. Iz predhodnih raziskav so odkrili, da sta za multiplo sklerozo najbolj krivi celiti pomagalki T 1 in T 17. Da bi prišli do centralnega živčnega sistema morata celici najprej prečkati vaskularno pregrado. Kako to dosežeta so raziskovali znanstveniki z univerze v Kolumbiji in z univerze v Kaliforniji. Z dvo-fotonsko mikroskopijo so opazovali tesne stike pri miših obolelih za eksperimentalnim avtoimunskim encefalomielitisom, ki je živalski primer multiple skleroze. Ugotovili so, da krvno-možgansko pregrado preideta na dva različna načina: s transcitozo in skozi prekinjene tesne stike med endotelnimi celicami. S pomočjo miši, ki jim je primanjkovalo kaveol (kaveolina1) pa so dokazali, da za prehod do centralnega živčnega sistema celica T 1 izkorišča transcitozo, medtem ko celica T 17 prehaja skozi prekinjene tesne stike. Te ugotovitve bi lahko močno pomagale pri nadaljnjem zdravljenju bolezni, kjer bi se osredotočili na preprečevanje dostopa imunskih celic do centralnega živčnega sistema.

'''Rebeka Dajčman: več mehanizmov poganja dinamiko kalcijevega signala okoli lasersko povzročene rane epitelija'''

Kalcij igra ključno vlogo pri skoraj vseh procesih v celici. Razni signali, kot je na primer sinteza RNA in DNA ali pa migracija celic, je posledica spremembe intracelularne koncentracije kalcija. Spremembo koncentracije lahko zaznamo z merjenjem intenzivnosti fluorescentne svetlobe, ki jo oddajajo GCaMP proteini. Če celice poškodujemo z laserskim mehurčkom, ustvarimo rano, ki je podobna udarcu. Sledijo trije mehanizmi signaliziranja, ki so odvisni od velikosti rane. Takoj po poškodbi celične membrane uide kalcij iz ekstracelularne tekočine v citosol, kjer se koncentracija kalcija dvigne. Kalcij nato skupaj s signalnimi molekulami difundira v okoliške celice in temu pravimo prvi val oz. takojšnji odziv. Po 45 sekundah mu sledi drugi močnejši valj, ki pa se širi počasneje, ker skozi membrano prehajajo večji signalni proteini. Ti signali sprožijo sistemski odziv na poškodbo, ki poskrbi, da se celice v najkrajšem možnem času regenerirajo. Da pri regeneraciji povrhnjice kože ne nastanejo brazgotine poskušamo v tkivo, ki je bilo poškodovano, vstaviti lasne mešičke. Ti pripomorejo k nastajanju maščobe in tako preprečijo brazgotinjenje. Če se poškoduje žilna stena pa sistem poskrbi za nastanek strdkov, ki so sestavljeni iz krvnih celic in fibrina. Trombociti navijejo fibrin v toge zvitke in ti se s pomočjo posebnih encimov raztopijo v krvi. Nova odkritja o celičnemu celjenju pripomorejo k hitrejšemu in učinkovitejšemu celjenju ran.

'''Gašper Anton Komatar: Tvorba kompleksa receptorjev ApoER2, ephirinB2 in AMPAR, ki jih povezuje GRIP1, sodeluje pri vorbi spomina'''

LTP ali dolgoročna potenciacija pomeni povečanje sinaptične moči za dolgo časa in ker gre pri tvorbi spominov prav za povečanje sinaptične aktivnosti, je med znanstveniki priznan kot najverjetnejši model učenja in tvorbe spomina na celični ravni. Med LTP se poveča število receptorjev AMPA v postsinaptični membrani, kar še dodatno poveča sinaptično moč.
Kakšen je mehanizem in katere molekule sodelujejo pri prenosu in vgradnji AMPAR v postsinaptično membrano, to je bilo glavno vprašanje raziskovalcev v članku, ki sem si ga izbral za seminarsko nalogo. Že dlje časa je bilo znano, da ephirinB2, ApoER2 in Reelin sodelujejo pri razvoju možganov kot regulatorji migracije nevronov. Znanstveniki so preverili, če sodelujejo tudi pri procesih prenosa in vgradnje AMPAR v membrano. S tehniko knockout (inaktivacija določenih genov) ter z imunoprecepcijo, so selektivno inhibirali interakcije med proteini, rezultate pa so beležili s fluorescentnimi analizami in prenosom western. Ugotovili so, da tvorba kompleksa multiplih receptorjev ApoER2/ephirinB2/AMPAR in GRIP1 povzroči vgradnjo tega AMPAR na membrano dendrita in sproži signalne kaskade, ki regulirajo vgradnjo novih AMPAR. Ko je bila interakcija med temi proteini inhibirana, so bili nevroni nezmožni reagirati na spremembe v njihovem omrežju, kar je zmanjšano sinaptično aktivnost. To pomeni, da skupki teh proteinov vzdržujejo oz. ojačajo sinaptično aktivnost. S tem so znanstveniki dokazali, da zgoraj omenjen kompleks receptorjev zares sodeluje pri tvorbi spominov.

'''Laura Gašperšič: Alzheimerjeva bolezen: povrnitev zmožnosti pomnjenja z inhibicijo interakcije med Sp3 in HDAC2'''

Pri Alzheimerjevi bolezni je glavni simptom okvara spomina, do česar pride zaradi utišanja genov, ki sodelujejo pri tvorbi novih spominov. Do utišanja pride zaradi deacetilacije histonov, ki jo povzročijo encimi histonske deacetilaze (HDAC). Pri utišanju genov za tvorbo spominov je najpomembnejši HDAC2. Njegova raven je pri bolnikih z Alzheimerjevo boleznijo povišana. Encimi HDAC so si po zgradbi podobni, poleg tega tvori en encim več različnih kompleksov, kar lahko pri inhibiciji encimov HDAC sproži tudi stranske učinke. Raziskovalci so zato želeli najti molekulo, s katero se HDAC2 veže na promotorje genov za učenje in spomin. S prvimi raziskavami so določili 3 najbolj verjetne proteine: Tdp2, Sap30 in Sp3, z meritvami pa so ugotovili, da Sp3 vpliva na delovanje sinapse. V nadaljnjih raziskavah so dokazali, da kompleks med HDAC2 in Sp3 v bolezenskem stanju z vezavo na promotorje negativno uravnava izražanje genov povezanih z delovanjem sinapse. V zadnjem delu raziskave so želeli določiti del HDAC2, ki se veže na Sp3 in inhibirati nastanek kompleksa med HDAC2 in Sp3. Ugotovili so, da se na Sp3 veže C-konec HDAC2. C-končni fragment HDAC2 se že sam veže na Sp3, s čimer se zmanjša število kompleksov med HDAC2 in Sp3 na promotorjih. Fragment HDAC2 pa se ne veže na druge proteine, s katerimi HDAC nadzorujejo druge pomembne procese. Izražanje C-končnega fragmenta HDAC2 torej predstavlja obetaven način, s katerim bi lahko zdravili nevrološke bolezni povezane z okvarami spomina.

'''Maja Škof: Pomen S-proteinov pri prilagajanju koronavirusov na okolje'''

Koronavirusi so razširjeni po vsem svetu in največkrat povzročajo okužbe dihal pri ljudeh in živalih. Spadajo med RNA viruse, za katere je značilna visoka stopnja genskih mutacij, kar jim omogoča, da se uspešno prilagajajo na okolje. S-proteini so trimerni proteini, s katerimi se koronavirusi vežejo na gostiteljsko celico, nato pa sprožijo spojitev virusne in celične membrane, kar omoči, da virusna RNA preide v celico. S-proteini so sestavljeni iz dveh podenot, S1 in S2. Pri vezavi na celični protein sodeluje zunanji del podenote S1, ki je v obliki treh podaljšanih zank (receptorsko-vezavne zanke). Med aminokislinami S-proteina in receptorskega proteina se vzpostavijo medmolekulske vezi, nato pa podenota S2 sproži spojitev s celično membrano. S1 je tudi glavna tarča protiteles, ki preprečujejo virusu, da bi vstopil v celico. A protitelo, ki se uspešno veže na sev virusa, ob ponovni okužbi virusa ne prepozna več. To je posledica naključnih genskih mutacij. Analiza genomov koronavirusov, izoliranih v zadnjih 50-ih letih, je pokazala, da se receptorsko-vezavne zanke S-proteinon med seboj občutno razlikujejo. Kar 73% aminokislin na receptorsko-vezavnih zankah variira. Odstotek je ravno dovolj velik, da se koronavirusi še vedno lahko vežejo na receptor, protitelesa pa jih ne zaznajo več.

'''Tadej Medved: Identifikacija vezavnih mest proteinov WASP na aktinski ojedritveni kompleks Arp2/3'''

Ključnega pomena za procese, kot so celično gibanje in endocitoza, so aktinski filamenti. Nastanek in prerazporeditev le-teh nadzorujejo določeni proteinski kompleksi; za razvejane aktinske filamente je to Arp2/3. Le-ta je sestavljen iz več podenot; najpomembnejši sta Arp2 in Arp3, ki sta po strukturi podobni aktinu. Na Arp2/3 se vežejo proteini družine WASP, ki spravijo proteinski kompleks v konformacijo, pri kateri lahko dejansko vrši nastanek novih filamentov. Za vse WASP-e velja, da se na Arp2/3 vežejo z odsekom VCA(verprolin, central, acidic), a do podatkov o strukturah takšnih vezi se znanost še ni dokopala. S pomočjo "cross-linking" masne spektrometrije in "reversed phase liquid" kromatografije je pred kratkim nastal model, ki zadovoljivo opisuje mesta, na katera se vežejo WASP-i. Vezava namreč poteka na dveh mestih: na hrbtni strani Arp2/3 in na spodnji strani kompleksa, pri Arp2 in poddomeno ARPC1. Na Arp2/3 se pri WASP-u veže odsek CA, konec odseka V pa ostaja prost za vezavo aktina. Izkazalo se je, da se za uspešno nukleacijo aktina vezavni mesti za aktin in CA ne smeta prekrivati; odsek WASP C pa je še zlasti pomemben za aktivacijo Arp2/3.

'''Tina Zavodnik: Disfunkcionalni mitohondriji s pomočjo ROS zavirajo translacijsko aktivnost'''

Mitohondriji so zelo kompleksni organeli, ki za normalno opravljanje svojih funkcij potrebujejo številne proteine. Večina teh proteinov se sintetizira v citoplazmi, nato pa so uvoženi nazaj v mitohondrije. Ob morebitni okvari transportnih mehanizmov in posledično okvarjenih mitohondrijih pa pride do akumulacije proteinov v citoplazmi, kar poruši celično ravnovesje. Skupina znanstvenikov iz Nemčije in Poljske pa je odkrila mehanizem, ki poškodovanim mitohondrijem omogoča nadzor nad sintezo proteinov z induciranjem reverzibilnih sprememb na translacijskem mehanizmu. Kot signal uporabijo ROS, ki povzroči oksidacijo tiolov na peptidih, ki so sestavni deli translacijskega mehanizma. Do odkritja so prišli s kvantitativno analizo cisteinskih ostankov oz. tiolnih skupin na proteomu kvasovke Saccharomyces cerevisia ter izdelali obsežno zbirko oksidacijskih stanj peptidov, ki so vsebovali tiolne skupine. Analizo so ponovili še na gojenih celicah kvasovke, ki so bile izpostavljene induciranemu oksidativnemu stresu s pomočjo H2O2, ter na mutiranih celicah z disfunkcionalnimi mitohondriji. Pri obojih so zaznali povečano oksidacijo Cys-peptidov in zmanjšano translacijsko aktivnost. Z odstranitvijo stresorskega faktorja pa se je translacijska aktivnost delno do popolnoma obnovila, kar dokazuje, da je oksidacija peptidov, ki so del mehanizmov za sintetiziranje novih proteinov, reverzibilen proces. Cisteinski ostanki torej delujejo kot nekakšni senzorji za ROS in ob oksidativnem stresu inhibirajo sintetiziranje novih proteinov.

'''Tina Kolenc Milavec: Vezava kalcija na karboksilni konec α-sinukleina uravnava interakcije med sinaptičnimi vezikli'''

Alfa-sinuklein je majhen, v vodi topen protein brez stabilne terciarne strukture, ki ga genetsko in nevropatološko povezujejo s Parkinsonovo boleznijo, o njegovi vlogi pri razvoju bolezni pa še marsikaj ni znano. Nahaja se predvsem v živčnih končičih, kjer je ravnovesje med α-sinukleinom raztopljenim v citosolu in tistim vezanim na fosfolipidni dvosloj močno regulirano. Ker se α-sinuklein nahaja na območju, kjer koncentracija kalcija ves čas močno niha, so raziskovalci Lautenschläger ''et al.'' predpostavili, da je normalna fiziološka funkcija α-sinukleina odvisna od kalcija. Da bi bolje razumeli funkcijo tega proteina, so v raziskavi izvedli več ''ex vivo'' ter ''in vitro'' eksperimentov, s katerimi so skušali ugotoviti predvsem to, kako se α-sinuklein veže na membrano sinaptičnega vezikla ter kako koncentraciji kalcija in α-sinukleina vplivata na homeostazo sinaptičnih veziklov ter na združevanje α-sinukleina v fibrilarne skupke. Povečana koncentracija kalcija in/ali α-sinukleina namreč pod določenimi pogoji povzroča toksičnost in posledično celično smrt, saj α-sinuklein oligomerizira ter tvori dolge in debele netopne fibrile, ki so del Lewyjevih telesc – citoplazemskih vključkov, značilnih za Parkinsonovo bolezen. Iz medicinskega stališča pa je zanimiva ugotovitev, da isradipin (antagonist kalicevih kanalčkov) preprečuje fibrilizacijo, saj znižuje znotrajcelično koncentracijo kalcija, kar odpira nove možnosti za razvoj zdravil proti Parkinsonovi bolezni.

'''Anže Šumah: Razvoj genskega senzorja za uničevanje celic s pomanjkanjem proteina p53'''

Protein p53 je tumorski zatiralec (tumor supresor), ki je zaradi svoje nadvse pomembne vloge pri ohranjanju celovitosti celičnega genoma pogosto deležen naziva »varuh genoma«. V normalnih primerih je izražanje tega proteina na nizki ravni, v primeru celičnega stresa pa deluje kot prepisovalni dejavnik, ki uravnava izražanje genov, ki so vključeni v nadzor celičnega cikla, popravljanje DNA in apoptozo. Ugotovili so, da je okoli 50 % vseh človeških oblik raka povezanih z mutacijami gena TP53 (gena za sintezo p53), zato so v raziskavi želeli razviti genski senzor, ki bi bil sposoben uničiti celice, ki ne sintetizirajo p53 (so rakave). Na podlagi promotorjev, ki jih p53 kot prepisovalni dejavnik zavira ali aktivira, so razvili senzor, ki v primeru pomanjkanja p53 sintetizira protein »Herpes simplex virus thymidine kinase« (HSV-TK), preko katerega lahko z zdravilom Ganciclovir uničimo rakasto celico, ki je brez p53. V primeru, da je p53 prisoten (je celica »zdrava«), pa je sinteza HSV-TK zavirana preko različnih mehanizmov. Senzor so najprej testirali na celični kulturi HCT116 (rakaste človeške črevesne celice) s fluorescentnima proteinskima markerjema, nato pa še v živih organizmih, in sicer golih miših brez imunosti. Tako so dokazali tako in vitro kot tudi in vivo uporabnost izdelanega genskega senzorja, ki bi ga bilo mogoče uporabiti v terapevtske namene.

'''Liza Praznik: Vpliv šaperonov Skp in SurA na zvijanje izvenmembranskih proteinov FhuA v terciarno strukturo'''

Naloga posebne vrste proteinov, imenovanih šaperoni je, da preoblikujejo polipeptidne verige v terciarno strukturo, v kateri so ti zmožni aktivnega delovanja. Delovanje in odzivanje šaperonov na različne dejavnike je še dokaj neznano, zato je skupina znanstvenikov Univerze v Baslu raziskovalo šaperona Skp in SurA, holdaz, ki delujeta na protein FhuA. Ta se nahaja na zunanji membrani gram negativnih bakterij, kjer služi kot receptor za ferikrom in tvori obliko beta-sodčka. Z večkratnimi ponovitvami poskusov so ugotovili, da se v prisotnosti obeh šaperonov struktura proteina, vgrajenega v membrano, ne podere, če jo delno razvijemo, ne glede na to, do katere stopnje. Šaperona sta obenem zmožna delno razvit protein preoblikovati nazaj v funkcionalno obliko, ki omogoča ponovno delovanje v membrani. Naloga obeh šaperonov je, da zadržujeta zvit polipeptid v dinamični, termodinamsko najugodnejši konformaciji, s katero se posamezni beta-zavoji polipeptida lahko vstavljajo v membrano. Ugotovljeno pa je bilo, da je šaperon SurA pri tem znatno učinkovitejši. Rezultati raziskave omogočajo boljši vpogled v mehanizme delovanja šaperonov in nakazujejo, kako pomembni so za učinkovito delovanje proteinov.

'''Urša Štrancar: Predstavitev združitve avtofagosoma in lizosoma s pomočjo para fret'''

Mitofagija je kataboličen proces razgradnje mitohondrijev s pomočjo encimov v lizosomih, pri čemer se neuporabni deli mitohondrija razgradijo in reciklirajo. Da bi tak proces lahko opazovali in ga podrobno preučili, so znanstveniki v eksperimentu ob raziskovanju mitofagije uporabili eno novejših metod za prikaz celičnih procesov v živih celicah, par FRET, ki temelji na visoki vezavni afiniteti med dvema sintetičnima molekulama (kromoforoma) CB[7]-Cy3 in AdA-Cy5. Konfokalna laserska skenirna mikroskopija je pokazala, da sta bili molekuli CB[7]-Cy3 in AdA-Cy5 najprej intracelularno ločeni in zbrani v mitohondriju oz. lizosomu, nato pa sta po združitvi lizosoma in mitohondrija tvorili kompleks gost-gostitelj, prikazan kot fluorescenčni signal para FRET, ki ga človeško oko ob opazovanju na mikroskopu lahko zazna. Ta ugotovitev pa ni prikazala le zelo stabilne vezi med CB[7] in AdA v živi celici, temveč je potrdila tudi, da par FRET lahko prikaže dinamične procese spajanja celičnih organelov v mitofagiji. Kompleks, ki ga tvorita zgoraj navedeni molekuli, prav tako ni citotoksičen, zato je zelo uporaben za raziskovanje procesa mitofagije, nadaljno pa tudi procesov avtofagije v drugih celičnih organelih.

'''Neža Žerjav: Dodajanje enega samega nukleotida omejuje aktivnost človeške telomeraze'''

Telomeraza je vrsta DNA-polimeraze, ki na konce kromosomov dodaja nukleotidna zaporedja (GGTTAG) ob pomoči matrične RNA. Procesivni katabolni cikel telomeraze sestavljajo translokacija matrice, dodajanje prvega nukleotida in dodajanje preostalih petih nukleotdov. Zanimanje znanstvenikov je vzbudila zaradi počasnega delovanja v primerjavi z ostalimi DNA-polimerazami. Za pojasnitev mehanizma, ki omejuje njeno delovanje, so znanstveniki raziskovali vpliv prekinitvenega signala matrične RNA na visoko Michaelisovo konstanto prvega nukleotida, odvisnost procesivnosti in hitrosti telomeraze v odvisnosti od koncentracije dGTP, vpliv spremenjenega prvega nukleotida in posledice odstranitve prekinitvenega signala. Prišli so do zaključka, da prekinitveni signal povzroča počasnejše dodajanje prvega nukleotida v telomerno zaporedje, kar zmanjša procesivnost in hitrost telomeraze, ki pa ju lahko lahko povečano s povečano koncentracijo ustreznega deoksinukleozid fosfata.

'''Aljaž Bratina: Intrinzična destabilizacija ribosoma'''

Sinteza proteinov v celici poteka na ribosomih, ki so sestavljeni iz dveh podenot. Med prevajanjem RNA (translacija) se genski zapis pretvori v zaporedje aminokislin, ki se zvijejo v protein. Polipeptidno verigo, ki nastaja na ribosomu, in je vezana na tRNA, imenujemo nascenti polipeptid. Hitrost translacije ni vedno enaka in je podvržena mnogim anomalijam. Včasih se od ribosoma predčasno odcepi tRNA z vezanim nascentnim polipeptidom, lahko pa določeno zaporedje v nascentnem polipeptidu celo povzroči disociacijo ribosoma na dve podenoti in s tem prekine sintezo proteina. To imenujemo intrinzična destabilizacija ribosoma (IRD). IRD-inducirajoče zaporedje je ponavadi sestavljeno iz negativno nabitih aminokislin (aspartata in glutamata) ali prolina v različnih kombinacijah. Ugotovljeno je bilo, da nekatera zaporedja povzročajo IRD le in vitro, druga pa tudi in vivo. To pomeni, da ribosom vsebuje nek mehanizem, ki IRD zavira. To je protein bL31, ki povezuje podenoti ribosoma in s tem stabilizira ribosom. Celica IRD izkorišča tudi za nadzorovanje koncentracije magnezijevih ionov. Večja kot je ta koncentracija, manj proteina MgtA (prenašalec Mg2+) se bo tvorilo. Pomembno vlogo pri tem razmerju ima MgtL, polipeptid, ki je kodiran tik pred MgtA, in vsebuje IRD zaporedje. IRD je raziskana le na prokariontskih organizmih, vendar je možno, da je ta proces prisoten tudi v evkariontih.

'''Anamarija Agnič: ATP-aza P4 s premeščanjem fosfolipidov uravnava uvihanost membrane'''

ATP-azo P4 uvrščamo v skupino membranskih proteinov, ki ob hidrolizi ATP sodelujejo pri vzdrževanju asimetrične porazdelitve lipidov v membrani; omogočajo npr. prenos membranskih fosfolipidov fosfatidilserina in fosfatidiletanolamina iz monomolekularnega sloja celične membrane na zunajcelični strani v monomolekularni sloj membrane na citosolni strani membrane. Spremembe v razporeditvi lipidov v dvosloju, ki jih povzročajo flipaze, so ključnega pomena za deformacijo membrane, česar dokaz je bil tudi temeljni znanstveni problem skupine celičnih biologov iz univerze v Kjotu. V okviru raziskave so znanstveniki preko sistema, ki na membrano iz citoplazme inducirano veže t.i. domene Bin/amphiphysin/Rvs (domene BAR), natančno opazovali stopnje membranske tubulacije. S fluorescirajočimi molekulami so označili citosolne proteine BAR, ki so občutljivi na ukrivljenost membrane, in opazovali njihovo obnašanje. Povečana aktivnost flipaze za fosfatidilholin ATP10A, ki sodi v družino ATP-az P4, je zaradi vzpostavljene neuravnovešenosti med lipidnima slojema omogočila vezavo domen BAR ter s tem spodbudila proces membranske tubulacije. Povečana aktivnost flipaze ATP10A, ki omogoči uvihanost celične membrane, velja za enega pomembnih gonilnih mehanizmov endocitoze. Plazmalema drastično spreminja obliko tudi med celičnimi migracijami, invazijo rakastih celic, celično delitvijo, sprejemanjem hrane in vstopom patogenov ter virusov v celico. Ta raziskava je prvi dokaz, da imajo spremembe v trans-lipidnem dvosloju, ki jih povzročijo ATP-aze P4, pri deformiranju bioloških membran pomembno vlogo.

'''Simona Gorgievska: Optical tools to detect metabolic changes linked to diseases'''

Metabolic changes in cell can occur at the earliest stages of disease. In most cases, knowledge of those signals is limited, since we usually detect diseases only after it has done significant damage. Now, a team led by engineers at Tufts University School of Engineering has opened a window into the cell by developing an optical tool that can read metabolism at subcellular resolution, without having to perturb cells with contrasts agents or destroy them to conduct assays.The method is based on the fluorescence of two important coenzymes (biomolecules that work in concert with enzymes) when excited by a laser beam. The coenzymes –nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) and Flavin adenine dinucleotide (FAD) are involved in a large number of metabolic pathways in every cell. In order to find out the specific metabolic pathways affected by disease or stress, scientists have looked at three parameters. Those are: the ratio of FAD and NADH, the fluorescence “fade” of NADH and the organization of mitochondria as revealed by the spatial distribution of NADH within a cell (the energy producing “batteries” of the cell). The first parameter-the relative amounts of FAD to NADH -can reveal how well the cell is consuming oxygen, metabolizing sugars, or producing or breaking down fat molecules. The second parameter -the fluorescence "fade" of NADH -reveals details about the local environment of the NADH. The third parameter -the spatial distribution of NADH in the cells -shows how the mitochondria split and fuse in response to cellular growth and stress.

'''Matej Jereb: Gradnja človeške pluripotentne matične celice v funkcionalno skeletno mišično tkivo'''

V študiji so razvili prvo popolnoma delujočo 3D skeletno mišično vlakno iz človeške pluripotentne matične celice. Z uporabo štirih različnih hPSC virov so razvili ponovljivo metodo za generacijo miogenskih celic prednic (iMPC), ki so sposobne učinkovite diferenciacije v večcelične miotubule v 2D kulturi. Če je gojena v 3D okolju hidrogela se iMPC strukturno preoblikuje tako, da tvori poravnano funkcionalno skeletno mišično vlakno (iSKM vretena), ki se lahko skrči in kot odgovor na električno ali nevrotransmitersko stimulacijo prenaša kalcijeve ione (Ca2+). V obdobju štirih tednov so 3D iSKM vretena doživela hipertrofijo miotubulov in funkcionalno izboljšanje ter naprednejšo stopnjo miogenske diferenciacije v primerjavi z 2D kulturo enake starosti. Pokazali so tudi, da se da iSKM vretena uspešno implantirati. Poskusi na miših nakazujejo potencial za uporabo teh metod in vitro in in vivo.

'''Neža Blaznik: Glikozilirana sialična kislina na protitelesu IgA inhibira virus influence tipa A'''

Nekateri virusi za vezavo na gostiteljsko celico uporabljajo receptorje, ki so glikozilirani s sialično kislino. V to skupino virusov spada tudi virus tipa influence A, ki povzroča gripo. Virus se prek glikoproteina hemaglutinina veže na sialično kislino v receptorjih in tako okuži gostiteljsko celico. Protitelesa imunoglobulini G (IgG), ki se uporabljajo v cepivih za gripo, imajo glikozilirane polipeptidne verige in prav tako vsebujejo nekaj sialične kisline, vendar je vsebnost sialične kisline v imunoglobulinih A (IgA) veliko večja. Znanstveniki so primerjali delovanje dveh tipov IgG in IgA na enega izmed tipov virusa influenze A (H5N3). Ugotovili so, da oba tipa IgA nevtralizirata virus v večji meri kot IgG, poleg tega pa so s križanjem komponent obeh imunoglobulinov tudi določili domeno na IgA, ki največ prispeva k povečani nevtralizaciji virusa. S tem so torej ugotovili, da glikozilirana sialična kislina na IgA inhibira virus influence tipa A, saj se veže še na dodatno mesto virusa in tako blokira povezavo med virusom in gostiteljsko telesno celico. To znanje je uporabno v razvoju novih cepiv proti gripi, vendar zaradi same zahtevnosti testiranja IgA in vivo, želijo znanstveniki v prihodnosti sintetizirati protitelo tipa IgG, ki bi vsebovalo del verige IgA, ter tako združiti prednost obeh protiteles.

'''Liza Ulčakar: Kombinirana DNA-RNA/neoantigen nanocepiva - učinkovita imunoterapevtska metoda'''

Cepiva proti raku postajajo vedno bolj raziskana tema. Znanstveniki so zato sintetizirali kombinirano zdravilo, ki vsebuje CpG (kratka enoverižna DNA), shRNA in rakave neoantigene. CpG deluje kot imunostimulator, saj se veže na receptor TLR9 v membrani endosomov antigen prezentirajočih celic in sproži imunski odgovor na rakave celice. shRNA preko RNA-interference preprečuje translacijo transkripcijskega faktorja STAT3, ki deluje imunosupresivno. Da bi zdravilo nemoteno potovalo po limfnem sistemu in prehajalo v celice, so sintetizirali kopolimer PPT-g-PEG, ki je skrčil kombinirano zdravilo. Cepivo so najprej preizkusili in vitro in ugotovili, da cepivo deluje imunostimulativno - antigen prezentirajoče celice so začele sproščati več citokinov, proizvodnja proteina STAT3 se je zmanjšala. Nato so poskus ponovili še in vivo, miših, ki so bile okužene z adenokarcinomom debelega črevesa. Mišim so nato odstranili organe z metastazami in opazili, da se je tumor pri miših, ki so bile zdravljene s kombiniranim zdravilom v primerjavi z mišmi, ki zdravila niso dobile, močno zmanjšal.

'''Matija Ruparčič: Od strupenih kompleksov do zlatih zrnc s ''Cupriavidus mellidurans'''''

Kakor voda, ogljik in dušik, tudi zlato kroži v naravi. Eden izmed organizmov, ki to omogoča, je ''Cupriavidus metallidurans''. Ta betaproteobakterija je skozi čas razvila vrsto mehanizmov, ki jo ščitijo pred velikimi koncentracijami težkih kovin. Problem pa se pojavi, ko je v prsteh prisotno zlato. To namreč inhibira glavno črpalko bakrovih ionov CupA in tako vodi do sinergistične toksičnosti bakra in zlata. Bakterija črpalk za zlato nima, zato je morala razviti mehanizem, ki bi preprečil sam vstop zlata v citoplazmo. Ker imajo bakterije, ki živijo v prsteh z večjo koncentracijo Au, v povprečju večje število encima CopA, ki ga skupaj z drugimi proteini kodirajo geni ''copABCD'', so se znanstveniki osredotočili nanj. Ugotovili so, da so produkti genov ''copABCD'' zasluženi za povečano odpornost na Cu/Au mešanice, CopA pa poleg Cu(I) oksidira tudi Au(I) ione v Au(III), nato pa pomaga pri redukciji le-teh do Au(0) nanodelcev. Rezultati raziskave tako predstavljajo nov korak k popolnemu razumevanju biogeokemičnega cikla zlata.

'''Jernej Imperl: Optimizacija protimikrobnih peptidov s pomočjo virtualnih metod'''

Gramnegativne bakterije premorejo vrsto mehanizmov za obrambo pred antibiotiki in s časom so na mnoge od njih postale celo imune. Skupaj z dejstvom, da je proizvodnja novih antibiotikov zapleten in drag proces, lahko predstavljajo resno dolgoročno grožnjo. Da bi bakterije "presenetili", so se znanstveniki obrnili na izdelavo protimikrobnih peptidov po šabloni peptidov rastlinskega izvora, ki se zaradi zapletene zgradbe na trgu še ne uporabljajo, a so znani v tradicionalni medicini že zelo dolgo časa. Peptid sadeža guave, Pg-AMP1, v osnovni obliki neugodnega za komercialno rabo, so s pomočjo računalniškega algoritma, ki posnema proces evolucije, in funkcije, ki peptide ovrednoti na podlagi verjetnosti tvorbe vijačnic, postopoma spreminjali in optimizirali. S simulacijo, ki so jo zagnali kar 100-krat, vsakič z naborom 250 začetnih peptidov, so uspeli odkriti guavanin 2, prvaka med stotimi kandidati vsake od simulacij, ki se je izkazal za učinkovitega proti gramnegativnim bakterijam in neškodljiv za človeške celice. Uspešnost guavanina 2 in njegova pomenljiva drugačnost od že obstoječih protimikrobnih peptidov nakazuje obetaven korak za nadaljnjo raziskovanje antibiotikov rastlinskega izvora.

'''Tiana Karmen Kokalj: B-1a limfociti spodbudijo oligodendrogenezo med razvojem možganov'''

Oligodendrociti so celice v centralnem živčnem sistemu, ki tvorijo mielinske ovojnice aksonov. Imajo ključno vlogo v razvoju in delovanju možganov, kar ima tudi limfni sistem, specifično periferni limfociti. Specifično T celice sodelujejo pri spominu, med embrionalnim razvojem pa prehaja v možgane diferenciirana oblika teh, B-1a celice. Te že v embrionalni fazi dozorijo in dosežejo največjo količino tik po rojstvu. Iz krvi v možgane prehajajo preko signalnega kompleksa CXCL13-CXCR5. Ko so enkrat te celice v možganih pa vidimo, da vplivajo na oligodendrogenezo, saj je kultivacija živčnih matičnih celic z B-1a celicami pokazala večji delež zrelih oligodendrocitov. B-1a celice direktno vplivajo na oligodendrogenezo s spodbuditvijo razmnoževanje oligodendrocitskih predhodnih celic (OPC) preko IgM-Fcα/µR signalizacije. B.1a celice izločajo IgM - polireaktivna protitelesa, ki se vežejo na Fcα/µR, katerega izražajo OPC, ki veže Fc regijo IgM. Delež B-1a celic v možganih pa pada s starostjo, zato predvidevajo da imajo največjo vlogo pri razmnoževanju oligodendrocitov, pri spontani obnovitvi mielinskih ovojnic pa naj ne bi imeli velikega pomena. Študija tega procesa lahko pripomore k boljšem razumevanju in preučevanju nevrorazvojnih motenj.

'''Ana Menegalija: METTL3 nova potencialna terapevtska tarča pri akutni mieloični levkemiji'''

Rak je skupek bolezni, za katere je značilna nenormalna celična rast, lahko pa imajo tudi sposobnost naselitve v drugih tkivih. Ena izmed hujših oblik raka je akutna mieloična levkemija (AML), za katero je zaradi mesta in oblike razvoja težko najti zanesljivo metodo zdravljenja. Raziskave potekajo v smeri preučevanja metiltransferaz pri razvoju celic AML. Metiltransferaze so enimi, ki na substrat pripnejo metilno skupino. Med njih spada tudi METTL3, ki ima pomembno vlogo v celicah AML. Z metiliranjem RNA namreč pospešuje hitrost translacije v proteine in s tem pripomore k proliferaciji levkemičnih celic. Dokazano je bilo, da se s prekinitvijo katalitične aktivnosti METTL3 celice AML ne razvijajo več, kar pomeni, da je mehanizem METTL3 nujno potreben za preživetje celic. Tako metilacije RNA ni in je translacija upočasnjena. Hkrati je bilo ugotovljeno tudi, da METTL3 nima nobenega vpliva na zdrave embrionalne in primarne hematopoetske celice v primerjavi s kontrolo, zaradi česar bi bil primeren za tarčno zdravljenje AML. Študija je pripomogla k razumevanju vloge METTL3 v levkemičnih celicah in posledično k iskanju potencialnih zdravil za akutno mieloično levkemijo.

'''Barbara Jaklič: I-motif DNA strukture nastajajo tudi v jedrih človeških celic'''

Prva znana in najpogostejša strukturna oblika DNA je dvojna vijačnica, katere model sta predlagala Watson in Crick. Je desnosučna, sestavljena iz velikega in malega žleba, imenujemo pa jo A-DNA. Poleg te oblike sta dobro proučeni še B-DNA, ki je prav tako desnosučna, vendar dehidrirana in zato bolj stisnjena, in Z-DNA, ki pa je levosučna in dodatno zvita struktura v sintetičnih verigah DNA. Znano pa je, da lahko DNA in vitro tvori tudi drugačne inter- in intramolekularne sekundarne strukture, med katerimi je najbolj raziskana G-quadruplex (G4) v regijah genoma bogatih z gvaninom. Nekoliko manj poznana je struktura imenovana »intercalated motif« (i-motif), ki nastaja v regijah bogatih s citozinom. Sestavljajo jo štiri verige, povezane z vrinjenimi baznimi pari delno protoniranega in nevtralnega citozina (C+:C). Za to strukturo predvidevajo, da sodeluje pri uravnavanju replikacije in transkripcije, vendar je njen obstoj in vivo dolgo ostajal dvomljiv zaradi stabilizacije v kislem pH. V raziskavi so karakterizirali protitelesni fragment iMab, ki se zelo specifično in z veliko afiniteto veže na strukturo i-motif, in s tem dokazali njeno prisotnost v jedrih človeških celic. Preučili so tudi stabilnost i-motif strukture v različnih pH razmerah in fazah celičnega cikla ter s tem omogočili nadaljnje raziskave na področju regulacijske in biološke vloge te strukture v človeških celicah.

'''Meta Kodrič: Naključna izboljšava bakterijskega encima za razgradnjo plastike'''

Plastika je kot lahek, trpežen, cenovno ugoden in nerazgradljiv material zelo priročna za vsakodnevno rabo, a ravno njena biološka nerazgradljivost predstavlja velik globalni problem, s katerim se spopadamo v zadnjih desetletjih. Za plastenke in embalažo se uporablja plastika narejena iz semiaromatičnega poliestra poli(etilen tereftalata) oz. PET. Do sedaj poznani načini razgradnje njegovih močnih in težko dostopnih esterskih vezi so dragi, produkti, ki pri tem nastanejo, pa prav tako škodljivi za okolje kot plastika sama. V iskanju učinkovitejših metod znanstveniki med drugim preučujejo mikroorganizme, ki so skozi desetletja onesnaževanja okolja s plastiko razvili uspešne mehanizme za njeno razgradnjo. Raziskovalci inštituta Portsmouth so pod drobnogled vzeli encim PETazo leta 2016 odkrite bakterije Ideonella sakaiensis 201-F6. Primerjali so ga s podobnimi α/β-hidrolazami, ki so prav tako sposobne depolimerizirati PET, le v manjši meri. Na podlagi razlik v strukturah preučevanih encimov so ustvarili mutante PETaze, ki so bili v določenih lastnostih bolj podobni encimom s slabšo sposobnostjo razgrajevanja PET. Kljub predpostavki, da bodo takšni mutanti manj učinkoviti od PETaze, se je na veliko presenečenje eden izmed mutantov izkazal za bolj učinkovitega. Tako mutant kot PETaza sta se dobro odrezala tudi pri razgradnji semiaromatičnega poliestra PEF, pri depolimerizaciji alifatskih poliestrov pa sta bila neučinkovita. Študija tako nakazuje, da se z nadaljnjim preučevanjem α/β-hidrolaz odpirajo možnosti sinteze še učinkovitejših encimov, ki bi jih nekoč lahko uporabljali pri razgradnji plastike v industrijskem merilu.

'''Eva Gartner: Vloga neobičajnega prohibitina pri regulaciji mitohondrijskega membranskega potenciala in razvoju malarije.'''

Malárija, starinsko tudi močvirska mrzlica, je nalezljiva bolezen, ki jo povzročajo nekatere vrste zajedavskih praživali iz razreda trosovcev, plazmodiji. Življenjski krog plazmodija sestavljajo tri stopnje: okužba človeka s sporozoiti, nespolno razmnoževanje, ki poteka v človeku, ter spolno razmnoževanje, ki poteka v komarju. Za zdravljenje malarije se uporabljajo različni antibiotiki in antimalariki, vendar se je zaradi vse večje odpornosti parazitov pojavila potreba po novih zdravilih. Znanstveniki so v raziskavi odkrili protein v mitohondriju parazita, ki bi lahko bil tarča za novo zdravilo. Pomanjkanje tega proteina oslabi nespolno razmnoževanje, nujno pa je potreben predvsem pri spolnem razmnoževanju. Razlog za neuspešen spolni razvoj je vse večja depolarizacija mitohondrija, ki pa je ključen organel za preživetje parazita, saj dovaja energijo za vse celične procese. Ob odsotnosti proteina prenašanje okužbe ni mogoče. Ta protein pa ima še eno prednost in sicer, da ni prisoten v človeku, ki mu zato onesposobljenost delovanja proteina ne škodi.

'''Martina Lokar: Mitohondrijska povratna signalizacija pri sesalcih je uravnana s transkripcijskim kofaktorjem GPS2 preko direktne translokacije od mitohondrija do jedra'''

Večina mitohondrijskih proteinov je kodiranih v jedru, zato je signalna povezava med mitohondrijem in jedrom izjemno pomembna za vzdrževanje mitohondrijske homeostaze. Znanstveniki so v raziskavi poskušali odkriti vlogo proteina GPS2 pri mitohondrijski povratni signalizaciji, tj. signalni poti od mitohondrija do jedra, preko katere se v jedru uravnava transkripcija mitohondrijskih genov. Najprej so določili intracelularno lokacijo proteina GPS2 in ugotovili, da se nahaja v jedru, citosolu in mitohondrijih. V nadaljevanju so preverili sekvence DNA, na katerih so odkrili povečano koncentracijo GPS2. Z nadaljnjimi eksperimenti so podrobneje raziskali pomen v mitohondriju lokaliziranega GPS2 in na koncu so poskuse izvedene na celičnih linijah ponovili še na mišjem maščobnem tkivu in vivo. Prišli so do zaključka, da GPS2 aktivira transkripcijo v jedru kodiranih mitohondrijskih genov in drugih genov, ki so pomembni pri odzivu na stres in raznih fizioloških procesih (npr. pri adipogenezi), preko direktne translokacije od mitohondrija do jedra. Proces uravnava SUMO proteaza SENP1, ki protein GPS2 desumoilira in tako povzroči njegovo premestitev. GPS2 deluje v jedru kot transkripcijski kofaktor, ki regulira demetilacijo histona H3K9 in aktivacijo RNA-polimeraze II z inhibicijo encima Ubc13.

'''Luka Gnidovec: Fibrinogen aktivira BMP signalizacijo v oligodendrocitskih predhodnih celicah in inhibira remielinacijo'''

Aksone v centralnem živčevčnem sistemu (CNS) obdajajo mielinske ovojnice, ki pospešujejo prenos signala. Pri določenih boleznih, npr. pri multipli sklerozi, pride do demielinacije, tj. propada mielinske ovojnice. V zgodnjih fazah te bolezni ter po nekaterih drugih bolezenskih stanjih bi moralo priti do remielinacije – obnove mielina, vendar pogosto pride do težav pri diferenciaciji oligodendrocitskih predhodnih celic (OPC) v zrele oligodendrocite (OL), ki v CNS gradijo mielinsko ovojnico. Znanstveniki so domnevali, da diferenciacijo inhibira fibrinogen, ki vstopa v CNS ob povečanju prepustnosti krvno-možganske pregrade (BBB). Povečana prepustnost se pojavi ob številnih bolezenskih stanjih, vključno z multiplo sklerozo in možgansko kapjo. Ugotovili so, da fibrinogen poveča signalno pot kostnega morfogenega proteina (BMP), kar je znan zaviralec diferenciacije OPC v OL. Fibrinogen se veže na znotrajcelično domeno receptorja ACVR1, ki sodeluje pri BMP signalizaciji, ter s tem sproži izražanje določenih genov, ki jih BMP signalizacija regulira. Nogin, naravni inhibitor BMP signalizacije v CNS, inhibicije diferenciacije OPC zaradi fibirnogena ne more preprečiti, saj se veže na zunajcelične BMP molekule in le njim prepreči vezavo na receptor. Z določenimi inhibitorji, ki delujejo na receptor ACVR1 (npr. DMH1), bi lahko preprečili učinek fibrinogena in s tem vzpostavili ugodno okolje za remielinacijo.

'''Sumeja Kudelić: Kolaboranti alergijskih reakcij'''

Vsaka tuja snov, ki lahko spodbudi imunski odziv, je potencialni alergen. Alergijska senzibilizacija se začne, ko izpostavljanje alergenu povzroči imunski odziv. Znanstveniki so se že od nekdaj spraševali, zakaj nekateri proteini povzročajo alergije, čeprav so zelo podobne drugim, ki niso škodljivi.
V raziskavi so odkrili, da je naravni ligand Pru p 3, ki povzroča alergijo na breskve, sodeluje pri imunskem odzivu alergijskih reakcij. Ligand Pru p 3 je derivat alkaloidnega kamptotecina, ki je vezan na hidrofobni rep fitosfingozina. Rezultati raziskave nam povejo, da je lipidni ligand Pru p 3 kolokaliziral s CD1 receptorjem, ki je omogočil njegovo aktivnost pri alergijski senzibilizaciji. Celice, ki so uporabljali v poskusih, so v tem primeru, proizvajale večjo koncentracijo IgE, kot celice, v katerih je bil sam Pru p 3. Povečana koncentracija IgE je značilna za alergijske reakcije. Na osnovi tega so prišli do rezultata, da alergeni potrebujejo kolaborante, ki jim pomagajo spodbuditi imunski odziv.

'''Nika Boštic: Oksidativni stres kontrolira apoptozo regulatornih T-celic in njihovo zaviralno aktivnost ter odpornost na blokado PD-L1 v tumorjih'''

Celice Treg igrajo pomembno vlogo pri regulaciji imunskega sistema in preventivi proti avtoimunimi boleznimi. Na različne načine inhibirajo delovanje drugih celic T, pogosto z izločanjem snovi, ki preprečijo izražanje citokinov – signalnih molekul. Z inhibicijo izražanja citokinov pa onemogočijo proliferacijo in diferenciacijo drugih limfocitov ter aktivacijo makrofagov. V preteklih letih je bilo narejenih že veliko študij o celicah Treg , vendar pa do sedaj ni bilo znano, kaj povzroči imunosupresivnost Treg celic v tumorskem mikrookolju. V tumorju postanejo celice Treg izredno imunosupresivne kljub prisotnosti antigenov, ki se izražajo specifično pri tumorjih. Raziskovalci iz Univerze v Michiganu so ugotovili, da so celice Treg v tumorskem okolju zelo apoptotične. Na apoptotičnost celic Treg pa vpliva velika koncentracija ROS. Apoptotične celice Treg so celo boljši zaviralci imunskega odziva kot žive celice Treg. Vzrok za imunosupresijo je proizvodnja in sproščanje ATP iz celice in nato pretvorba tega s pomočjo membranskih proteinov CD39 in CD73 v adenozin. Adenozin pa preko receptorja A2A zavira izražanje citokinov v T-celicah. Apoptotične celice Treg lahko ravno na ta način zmanjšajo efektivnost imunoterapije z blokado PD-L1.

'''Klementina Polanec: Knjižnica lantipeptidov v pomoč pri iskanju inhibitorja interakcije protein-protein'''

Interakcije protein-protein (PPI) so pogoste in lahko so tarča raznih zdravil. Pomembni zaviralci PPI so ribosomsko sintetizirani in posttranslacijsko modificirani peptidi, med katere uvrščamo tudi lantipeptide, za katere so značilne tioeterske vezi, ki vodijo do ciklične oblike. V študiji so raziskovalci s pomočjo tehnologije rekombinantne DNA sintetizirali značilne peptide, ki jih je lantipeptid sintetaza (ProcM) dehidrirala in ciklizirala do nastanka dvocikličnih lantipeptidov. Med njimi so iskali takšne, ki bi lahko inhibirali interakcijo med p6 (protein virusa HIV) in UEV (ubikvitin E2 domena človeškega proteina TSG101). Z bakterijskim reverznim dvohibridnim sistemom so odkrili lantipeptid XY3-3, ki je deloval kot specifični inhibitor, zato so preverili njegovo delovanje z merjenjem IC50. Z odstranitvijo vodilnega zaporedja peptida so dobili boljše rezultate, torej k inhibiciji najbolj prispeva protein sredice, prav tako pa je pomembno pravilno zaporedje aminokislin. S poskusi in vivo so določilo mejo citotoksičnosti in dokazali, da lahko XY3-3-Tat inhibira tudi virusno brstenje. Raziskovalcem je tako uspelo ustvariti knjižnico dvocikličnih lantipeptidov in spodbuditi k nadaljnjemu raziskovanju njihove biološke aktivnosti (predvsem inhibicija PPI).

'''Lara Hrvatin: Nihanje koncentracije, temperature in ph omogoča prebiotično sintezo nukleozidov'''

Nukleozid je purinska ali primidnska baza povezana z ribozo ali deoksiribozo preko N-glikozidne vezi. S vezavo fosfatne skupine na hidroksilno skupino sladkorja nastanejo nukleotidi, ki poleg tega, da gradijo RNA in DNA, imajo še mnoge druge pomembne vloge. Glede na funkcije, ki jih ima RNA, znanstveniki sklepajo, da se je življenje začelo z njenim nastankom oziroma z nastankom njene prednice, saj bi bila ta zmožna samoreplikacije in sinteze proteinov. Sinteza gradnikov RNA (pre-RNA) v prebiotičnem svetu je zato ključnega pomena za začetek življenja. Raziskovalci iz Ludwig-Maximilians Univerzitete v Munchnu so na enostavem način, le s spreminjanjem koncentacije, temperature in pH, sintetizirali adenozin, gvanozin in njune derivate iz prebiotično priznanih spojin (mravljična kislina, ocetna kislina, natrijev nitrat, propandinitril, amidini, nikelj, železo). Vsi nastali nukleozidi so prisotni v vseh živih bitjih, zato lahko sklepamo, da so bili tudi prisotni v skupnem predniku.

'''Mlinar Karmen: Učinkovito in vivo zdravljenje ALI s spiralnimi, amfipatičnimi, peptoidnimi posnemalci proteinov v pljučnem surfaktantu'''

Med vdihom se alveoli razširijo in na njihovi površini se pojavi velika površinska napetost, ki jo zmanjšuje pljučni surfaktant (lipoproteinski kompleks). Pomanjkanje ali disfunkcija pljučnega surfaktanta vodi do akutne poškodbe pljuč (ALI), za katero ni znanega zdravila. Možna je terapija z nadomestnim surfaktantom, a ta pri kliničnih raziskavah ne kaže stalnih rezultatov in je precej draga. Dva izmed ključnih proteinov v pljučnem surfaktantu sta proteina B in C, ki ju je težko sintetizirati v aktivni obliki, zato so raziskovalci razvili njune peptoidne (poli-N-substituirane glicinske) posnemalce pB in pC. V raziskavi so preučili delovanje pB in pC ter njuno sposobnost ublažitve škodljivih fizioloških in biokemijskih odzivov povezanih z ALI. Ugotovili so, da so peptoidno izboljšani surfaktanti enako ali celo bolje učinkoviti pri blaženju stanj povezanih z ALI kot je živalski surfaktant. Najbolje se je izkazal surfaktant s pC, ki je v parih meritvah presegal živalskega. Surfaktant s pB se ni izkazal za preveč učinkovitega in je v povprečju imel le nekoliko boljše rezultate kot negativna kontrola. Za precej uspešnega pa se je izkazal tudi surfaktant z obema posnemalcema (pB in pC). Poleg tega pa je zdravljenje s peptoidno izboljšanimi surfaktanti v primerjavi z živalskimi cenovno ugodnejše, omogoča načrtovano zdravljenje, izogne se imunskemu odzivu ipd. Raziskava kaže, da imajo peptoidno izboljšani surfaktanti velik potencial, da postanejo uporaben biomaterial za zdravljenje ALI.

TBK2018-seminar

2018-05-08T19:10:03Z

Karmenmlinar: /* Seznam seminarjev */

= Temelji biokemije- seminar =

Seminarje vodi prof. dr. Brigita Lenarčič. Seminarji so obvezni.

Ocena seminarjev (6-10) predstavlja enako število odstotkov, ki se prišteje h končni pisni oceni izpita.
Stran na strežniku s seminarskimi nalogami je zaščitena.
Uporabniško ime je: tbk, password pa: samozame## "##" sta dve številki, ki ju izveste na predavanjih.
Tudi za urejanje Wiki strani potrebujete geslo, ki se od zgornjega razlikuje. Postopek pridobitve Wiki uporabniškega imena in gesla je opisan [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Main_Page tukaj].

== Seznam seminarjev ==

{| border="1" cellpadding="4" cellspacing="0" style="border:#c9c9c9 1px solid; margin: 1em 1em 1em 0; border-collapse: collapse;"
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Ime in priimek'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Naslov seminarja'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Povezava'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Rok za oddajo'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Rok za recenzijo'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Datum predstavitve'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 1'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 2'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 3'''
|-
| Anna Scott||Moj naslov v slovenščini||http://www.bioscirep.org/content/36/1/e00291.long||28.10.||05.11.||07.11.||r1||r2||r3
|-
| Doroteja Armič || Pretvorba mišjih fibroblastov v pluripotentne matične celice s pomočjo tehnologije CRISPR || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/01/180118162449.htm || 27.02. || 02.03. || 05.03. || Martina Lokar || Liza Ulčakar || Zoja Siter
|-
| Valeriya Musina || Metalopeptid bakrov(II) fenantrolin tarčno onemogoči delovanje mitohondrijev v matičnih celicah raka dojke || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/12/171213124751.htm || 27.02. || 02.03. || 05.03. || Nika Boštic || Tiana Karmen Kokalj || Aljaž Bratina
|-
| Dea Simonič || Sprožilci avtoimunskih bolezni in vzroki za nekontrolirano širjenje le-teh po telesu ||https://www.sciencedaily.com/releases/2017/08/170824141207.htm|| 27.02. || 02.03. || 05.03. || Sumeja Kudelić || Jernej Imperl || Anamarija Agnič
|-
| Neža Štremfelj ||Delovanje inzulinskih receptorjev||https://www.sciencedaily.com/releases/2018/02/180219103256.htm|| 27.02. || 02.03. || 05.03. || Luka Gnidovec || Matija Ruparčič || Simona Gorgievska
|-
| Gašper Komatar || Tvorba kompleksa receptorjev ApoER2, ephirinB2 in AMPAR, ki jih povezuje GRIP1, sodeluje pri tvorbi spomina || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/10/171009093207.htm || 06.03. || 09.03. || 12.03. || Lara Hrvatin || Tiana Karmen Kokalj || Matej Jereb
|-
| Marko Pavleković || Prehajanje imunskih celic, povzročiteljic multiple skleroze, skozi krvno-možgansko pregrado || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/11/171121155811.htm || 06.03. || 09.03. || 12.03. || Klementina Polanec || Meta Kodrič || Lara Drinovec
|-
| Laura Gašperšič || Alzheimerjeva bolezen: povrnitev zmožnosti pomnjenja z inhibicijo interakcije med Sp3 in HDAC2 || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/08/170808150001.htm || 06.03. || 09.03. || 12.03. || Karmen Mlinar || Ana Menegalija || Maks Kumek
|-
| Rebeka Dajčman || Več mehanizmov poganja dinamiko kalcijevega signala okoli lasersko povzročene rane epitelija || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/10/171003124646.htm || 06.03. || 09.03. || 12.03. || Ula Nikolaja Ratajec || Andreja Marija Belič || Neža Blaznik
|-
| Maja Škof || Pomen S-proteinov pri prilagajanju koronavirusov na okolje. || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/11/171127105937.htm || 13.03. || 16.03. || 19.03. || Doroteja Armič || Barbara Jaklič || Liza Ulčakar
|-
| Tina Kolenc Milavec || Vezava kalcija na karboksilni konec α-sinukleina uravnava interakcije med sinaptičnimi vezikli || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/02/180219071758.htm || 13.03. || 16.03. || 19.03. || Valeriya Musina || Eva Gartner || Jana Rajchevska
|-
| Tina Zavodnik || Disfunkcionalni mitohondriji s pomočjo ROS zavirajo translacijsko aktivnost || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/02/180202112629.htm || 13.03. || 16.03. || 19.03. || Dea Simonič || Martina Lokar || Jernej Imperl
|-
| Tadej Medved || Identifikacija vezavnih mest proteinov WASP na aktinski ojedritveni kompleks Arp2/3 || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/03/180305130632.htm || 13.03. || 16.03. || 19.03. || Neža Štremfelj || Nika Boštic || Matija Ruparčič
|-
| Bogdan Jovićević || || || 20.03. || 23.03. || 26.03. || Laura Gašperšič || Lara Hrvatin || Ana Menegalija
|-
| Polona Kalan || || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/02/180214111055.htm || 20.03. || 23.03. || 26.03. || Rebeka Dajčman || Klementina Polanec || Andreja Marija Belič
|-
| Liza Praznik ||Vpliv šaperono Skp in SurA na zvijanje proteinov FhuA v terciarno strukturo ||https://www.sciencedaily.com/releases/2015/09/150907113757.htm || 20.03. || 23.03. || 26.03. || Maja Škof || Karmen Mlinar || Barbara Jaklič
|-
| Anže Šumah || Razvoj genskega senzorja za uničevanje celic s pomanjkanjem proteina p53 || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/11/171114104201.htm || 20.03. || 23.03. || 26.03. || Tina Kolenc Milavec || Ula Nikolaja Ratajec || Eva Gartner
|-
| Neža Žerjav|| Dodajanje enega samega nukleotida omejuje aktivnost človeške telomeraze ||https://www.sciencedaily.com/releases/2018/02/180227142114.htm || 03.04. || 06.04. || 09.04. || Tina Zavodnik || Doroteja Armič || Martina Lokar
|-
| Urša Štrancar || Predstavitev združitve avtofagosoma in lizosoma s pomočjo supermolekularnega para FRET || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/02/180219103254.htm || 03.04. || 06.04. || 09.04. || Tadej Medved || Valeriya Musina || Nika Boštic
|-
| Zoja Siter || || || 03.04. || 06.04. || 09.04. || Neža Žerjav || Dea Simonič || Sumeja Kudelić
|-
| Aljaž Bratina || Intrinzična destabilizacija ribosoma || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/11/171120101314.htm || 03.04. || 06.04. || 09.04. || Anastasija Nechevska || Neža Štremfelj || Luka Gnidovec
|-
| Anamarija Agnič || ATP-aza P4 s premeščanjem fosfolipidov uravnava uvihanost membrane || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/03/180329141014.htm || 10.04. || 13.04. || 16.04. || Bogdan Jovićević || Sumeja Kudelić || Lara Hrvatin
|-
| Simona Gorgievska || Optical tools to detect metabolic changes linked to disease || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/03/180307161351.htm|| 10.04. || 13.04. || 16.04. || Polona Kalan || Marko Pavleković || Klementina Polanec
|-
| Matej Jereb || Gradnja človeške pluripotentne matične celice v funkcionalno skeletno mišično tkivo|| https://www.sciencedaily.com/releases/2018/01/180109104707.htm || 10.04. || 13.04. || 16.04. || Liza Praznik || Laura Gašperšič || Karmen Mlinar
|-
| Lara Drinovec || Tavrin pomaga obnoviti zaradi multiple skleroze poškodovane celice || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/12/171208143024.htm || 10.04. || 13.04. || 16.04. || Anže Šumah || Rebeka Dajčman || Ula Nikolaja Ratajec
|-
| Maks Kumek || Dinamični izvor sprememb specifčne toplote v encimsko kataliziranih reakcijah || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/03/180321090854.htm || 17.04. || 20.04. || 23.04. || Marko Pavleković || Maja Škof || Doroteja Armič
|-
| Neža Blaznik || Glikozilirana sialična kislina na protitelesu IgA inhibira virus influence tipa A || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/04/180403111203.htm || 17.04. || 20.04. || 23.04. || Urša Štrancar || Tina Kolenc Milavec || Valeriya Musina
|-
| Liza Ulčakar || Kombinirana DNA-RNA/antigen nanocepiva - učinkovita imunoterapevtska metoda ||https://www.sciencedaily.com/releases/2017/11/171129163851.htm || 17.04. || 20.04. || 23.04. || Zoja Siter || Tina Zavodnik || Dea Simonič
|-
| Anastasija Nechevska || || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/03/180319155730.htm || 17.04. || 20.04. || 23.04. || Aljaž Bratina || Tadej Medved || Neža Štremfelj
|-
| Jernej Imperl || Optimizacija protimikrobnih peptidov s pomočjo virtualnih metod || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/04/180416085922.htm || 23.04. || 26.04. || 07.05. || Anamarija Agnič || Neža Žerjav || Luka Gnidovec
|-
| Matija Ruparčič || Od strupenih kompleksov do zlatih zrnc s ''Cupriavidus metallidurans'' || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/01/180131095453.htm || 23.04. || 26.04. || 07.05. || Simona Gorgievska || Anastasija Nechevska || Marko Pavleković
|-
| Tiana Karmen Kokalj || B-1a limfociti spodbujajo oligodendrogenezo med razvojem možganov || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/03/180313091702.htm || 23.04. || 26.04. || 07.05. || Matej Jereb || Bogdan Jovićević || Laura Gašperšič
|-
| Meta Kodrič || || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/04/180416155619.htm || 23.04. || 26.04. || 07.05. || Lara Drinovec || Polona Kalan || Rebeka Dajčman
|-
| Ana Menegalija || || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/11/171127135838.htm || 08.05. || 11.05. || 14.05. || Maks Kumek || Liza Praznik || Maja Škof
|-
| Andreja Marija Belič || || || 08.05. || 11.05. || 14.05. || Neža Blaznik || Anže Šumah || Tina Kolenc Milavec
|-
| Barbara Jaklič || || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/02/180220161201.htm || 08.05. || 11.05. || 14.05. || Liza Ulčakar || Meta Kodrič || Tina Zavodnik
|-
| Eva Gartner || ||https://www.sciencedaily.com/releases/2018/04/180418111615.htm || 08.05. || 11.05. || 14.05. || Gašper Komatar || Urša Štrancar || Tadej Medved
|-
| Martina Lokar || || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/03/180301144138.htm || 15.05. || 18.05. || 21.05. || Jernej Imperl || Zoja Siter || Neža Žerjav
|-
| Nika Boštic || || || 15.05. || 18.05. || 21.05. || Matija Ruparčič || Aljaž Bratina || Anastasija Nechevska
|-
| Sumeja Kudelić || ||https://www.sciencedaily.com/releases/2017/12/171221122927.htm || 15.05. || 18.05. || 21.05. || Tiana Karmen Kokalj || Anamarija Agnič || Bogdan Jovićević
|-
| Luka Gnidovec || ||https://www.sciencedaily.com/releases/2017/11/171102124907.htm || 15.05. || 18.05. || 21.05. || Meta Kodrič || Simona Gorgievska || Polona Kalan
|-
| Lara Hrvatin || || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/01/180117131129.htm || 22.05. || 25.05. || 28.05. || Ana Menegalija || Matej Jereb || Liza Praznik
|-
| Klementina Polanec || || || 22.05. || 25.05. || 28.05. || Andreja Marija Belič || Lara Drinovec || Anže Šumah
|-
| Karmen Mlinar || || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/05/180501085533.htm || 22.05. || 25.05. || 28.05. || Barbara Jaklič || Maks Kumek || Gašper Komatar
|-
| Ula Nikolaja Ratajec || || || 22.05. || 25.05. || 28.05. || Eva Gartner || Neža Blaznik || Urša Štrancar
|-
| rezerva || || || 29.05. || 01.06. || 04.06. || || ||
|}

==Naloga==
* samostojno pripraviti seminar, katerega tema je novica iz področja biokemije na portalu [http://www.sciencedaily.com ScienceDaily], ki je bila objavljena kasneje kot 1. avgusta 2016. Osnova za seminar naj bo znanstveni članek, ki je podlaga za to novico. Poleg tega članka za seminar uporabite še najmanj pet drugih virov, od teh vsaj še dva druga znanstvena članka, ki se navezujeta na to vsebino.
* članke na temo lahko iščete [https://scholar.google.com/ z Google učenjakom].
* naslov izbrane teme in povezavo do novice vpišite v tabelo seminarjev takoj ko ste si izbrali temo, najkasneje pa en teden pred rokom za oddajo
* [[TBK2017 Povzetki seminarjev|Povzetek seminarja]] opišete na wikiju v približno 200 besedah - najkasneje do dne, ko morate oddati seminar recenzentom.
* Povezavo do povzetka vnesete v tabelo seminarjev tekočega letnika.
* Seminar pripravite v obliki seminarske naloge (pisava Cambria, font 11, enojni razmak, 2,5 cm robovi; tekst naj obsega okoli 1000 besed), vsebuje naj 1-2 sliki. Slika mora imeti legendo in v besedilu mora biti na ustreznem mestu sklic na sliko. Vse uporabljene vire citirajte v tekstu, kot npr. (Nobel, 2010), na koncu pa navedite točen seznam literature, kot je opisano spodaj!
*Celotni seminar naj obsega 2 strani A4 formata (po možnosti dvostransko tiskanje).
* Seminar oddajte do datuma oddaje, ki je naveden v tabeli v elektronski obliki z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/tbk/poslji/ tega obrazca].
* vsi seminarji so v elektronski obliki dostopni [http://bio.ijs.si/~zajec/tbk/poslji//bioseminar/ tukaj].
* Recenzenti do dneva določenega v tabeli določijo popravke in podajo oceno pisnega dela, v predpisanem formatu elektronskega obrazca na internetu.
* Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Za predstavitev je na voljo 12 minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni. Prvi recenzent vodi predstavitve in razpravo ter skrbi za to, da vse poteka v zastavljenih časovnih okvirih.
* Predstavitvi sledi razprava do 8 minut. Sledijo vprašanja prisotnih, recenzenti postavijo vsak vsaj dve vprašanji in na koncu podajo oceno predstavitve.
* En dan pred predstavitvijo na strežnik oddajte tudi končno verzijo. Na dan predstavitve morate oddati tudi končno (popravljeno) in natisnjeno verzijo seminarja v enem izvodu.
* Seminarska naloga in povzetek na wikiju morajo biti v slovenskem jeziku!

==Imena datotek==
Prosim vas, da vse datoteke, ki jih pošiljate poimenujete po spodnjih pravilih. Ne uporabljajte ČŽŠčžš!
Poslati morate naslednje datoteke:
* TBK_2018_Priimek_Ime.doc(x) za seminar, npr. TBK_2017_Guncar_Gregor.docx
* TBK_2018_Priimek_ime_final.doc(x) za končno verzijo seminarja
* TBK_2018_Priimek_Ime_rec_Priimek2.doc(x) za recenzijo, kjer je Priimek2 priimek recenzenta, npr. TBK_2017_Guncar_Gregor_rec_Scott.docx (če se pišete Scott in odajate recenzijo za seminar, ki ga je napisal Gunčar)
* TBK_2018_Priimek_Ime.ppt(x) za prezentacijo, npr TBK_2017_Guncar_Gregor.pptx
* TBK_2018_Priimek_Ime_clanek.pdf za datoteko PDF, ki vsebuje izvirni članek, npr. TBK_2017_Guncar_Gregor_clanek.pdf

==Ocenjevanje seminarjev==
Recenzenti ocenijo seminar tako, da izpolnijo [[https://docs.google.com/forms/d/1Hdg2OHCyG24qwLTnFt09yZTng46RIwaIiUqnKOdsJxQ/viewform recenzentsko poročilo]] na spletu.

== Mnenje o predstavitvi ==
Vsak posameznik '''mora''' oceniti seminar tako, da odda svoje [https://docs.google.com/forms/d/1VvE-jaKikfiDO5Gdybqgp9mf_0uJZfBbIK8PLXKDaS0/viewform mnenje] najkasneje v enem tednu po predstavitvi. Kdor na seminarju ni bil prisoten, mnenja '''ne sme''' oddati.

==Urejanje spletnih strani na wikiju==
Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''

==Faktor vpliva==
Faktor vpliva (angl. impact factor) neke revije pove, kolikokrat so bili v poprečju citirani članki v tej reviji v dveh letih skupaj pred objavo tega faktorja. Faktorje vpliva za posamezno revijo lahko najdete v [http://www.cobiss.si/scripts/cobiss?command=CONNECT&base=JCR COBISS-u]. V polje "Naslov revije" vnesite ime revije za katero želite izvedeti faktor vpliva in pritisnite na gumb POIŠČI. V skrajnem desnem stolpcu se bodo izpisali faktorji vpliva za revije, ki ustrezajo vašim iskalnim kriterijem. Zadetkov za posamezno revijo je več zato, ker so navedeni faktorji vpliva za posamezno leto. Za tekoče leto faktorji vpliva še niso objavljeni, zato se orientirajte po faktorjih vpliva zadnjih par let. Če faktorja vpliva za vašo izbrano revijo ne najdete v bazi COBISS, potem izberite članek iz kakšne druge revije.

==Citiranje virov==Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se v seminarju držite ene same. Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati. '''Citiranje knjig:''' Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica. Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN. Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005. Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4. Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.). '''Citiranje člankov:''' Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani. Lartigue C. ''et al''. Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, letn. 317, str. 632-638.Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole: Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani. Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.Revija Science uporablja skrajšani zapis: C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007) V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne). '''Citiranje spletnih virov:''' Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.