Wiki FKKT - User contributions [en]

Inženiring bakterij Escherichia coli odzivnih na svetlobo

2019-01-09T21:29:37Z

Karmenzbogar: /* Testiranje aktivnosti fitokromov */

Izvorni članek: Levskaya, A. et al. Engineering ''Escherichia coli'' to see light, Nature, 438, 441–442 (2005). [https://www.nature.com/articles/nature04405]

== Uvod ==
Študenti Univerze v Teksasu so leta 2005 v sodelovanju s Kalifornijsko Univerzo v San Franciscu pod vodstvom Christopher-ja Voigt pripravili prve bakterijske fotografije v sklopu tekmovanja (Intercollegiate Genetically Engineered Machine competition) na MIT (Massachusetts Institute of Technology). S pomočjo sintezne biologije so zasnovali bakterijski sistem, ki preklaplja med različnimi stanji pod svetlobo v rdečem območju vidnega spektra. S pomočjo projekcije svetlobe na biološki film so proizvedli visoko ločljivo dvodimenzionalno živo sliko (100 megapikslov na kvadratni palec) [1].

== Odziv na svetlobo ==
Ustvarili so svetlobni senzor, ki deluje v ''Escherichia coli''. Enterobakterije, kot je ''E. coli'', same po sebi niso sposobne zaznavati svetlobe, ker v njih ne najdemo fotoreceptorjev. Medtem ko rastline, alge in cianobakterije vsebujejo proteinske fotoreceptorje, znane kot fitokromi in jih uporabljajo za nadzor fotosinteze ter fototakse. Zato so uporabili fitokrom iz cianobakterije ''Synechocystis'' in sicer tako, da so ustvarili himere z bakterijsko histidin kinazo [1].

Fitokrom sestavljata dve komponenti, membransko vezan zunajcelični senzor, ki se odziva na svetlobo in znotrajcelični regulator. Zato fitokromu rečemo dvokomponentni sistem. Znotrajcelični regulatorji v večini fitokromov ne uravnavajo izražanja genov direktno, saj nimajo DNA vezavnih domen. V ta namen so pripravili fitokrom s fuzijo fotoreceptorja cianobakterij Cph1 in histidin kinaze EnvZ.

=== Sistem EnvZ-OmpR ===
EnvZ je del dobro preučenega dvokomponentnega regulatornega sistema EnvZ-OmpR, ki ob pojavu osmotskega šoka uravnava izražanje porinov OmpC in OmpF. Ob visoki osmolarnosti je EnvZ podvržen avtofosforilaciji in prenese fosforilne skupine na OmpR preko tvorbe kompleksa. Ko se število fosforiliranih proteinov OmpR poveča, pride do vezave le-tega na aktivatorska mesta promotorja ''ompC'' in spodbujeno je izražanje porina OmpC. Pri nizki osmolarnosti se poveča izražanje porina OmpF, ki ima večji premer por in tako poveča difuzijo hranil ob osmotskem šoku [1], [2].

=== Fikocianobilin ===
Dodatno, fitokromi imajo linearne tetrapirolne prostetične skupine, ki omogočajo absorpcijo vidne svetlobe in se imenujejo bilini. Bilini izhajajo iz od kisika odvisnega odpiranja obroča hema. Cianobakterije ''Synechocystis'' imajo zapis za dva encima, ki prispevata k pretvorbi hema v fikocianobilin (PCB). Ta dva encima sta hem oksigenaza (HO1) in fikocianobilin: feredoksin oksidoreduktaza (PcyA), ki katalizirata pretvorbo hema v biliverdin IXa (BV) oziroma BV v PCB. [3]

V ''E. coli'' PCB ni naravno sintetiziran, zato je bila njegova biosintezna pot uvedena preko plazmida pPL-PCB, ki je bil pridobljen od J. C. Lagarias in je bil predhodno pripravljen za biosintezo fitokroma v bakterijah. Plazmid vsebuje mesto začetka replikacije p15a in vsebuje gena ''ho1'' in ''pcyA'', za pretvorbo hema v PCB, pod kontrolo promotorja Para/lac. Zamenjali so le odpornost na kanamicin z odpornostjo na ampicilin [1].

== Testiranje aktivnosti fitokromov ==
Za pregledovanje aktivnosti fotoreceptorjev so uporabili ''E. coli'' RU1012 [MC4100 ara + Φ(OmpC-''lacZ'') 10-25 Δ''envZ'' :: KanR]. Sev ima v kromosomu zapis za promotor ''ompC'', fuziran z ''lacZ'' reporterjem.

Iz cianobakterije Synechocystis so izolirali fitokrom Cph1. Pred tem so izvedli poravnavo CLUSTALW različnih fitokromov Cph1 z EnvZ. Izdelali so knjižnico s spreminjanjem števila aminokislin Cph1 (+/- 9 aminokislin). S spreminjanjem števila aminokislin Cph1 so konstruirali vrsto himer z variabilno dolžino dela, ki povezuje fotoreceptor z znotrajceličnim regulatorjem, saj dolžina in sestava peptida lahko vpliva na signalno transdukcijo. Število aminokislin pri EnvZ je bilo ohranjeno in sicer zadnjih 229 aminokislin.
Himerne fitokrome so ligirali v plazmid pPOROTet. Plazmid vsebuje tetraciklinski promotor, odpornost na kloramfenikol in mesto začetka replikacije ColE1. Najprej je bila histidin kinazna domena ''envZ'' ligirana v ogrodje pPROTet in s tem so tvorili plazmid pPRO-HK. Fragment ''envZ'' so pomnožili s pomočjo reakcije PCR z uporabo začetnih oligonukleotidov, ki so vsebovali restrikcijska mesta ''Nde''I in ''Xba''I. Sledila je ligacija preko teh restrikcijskih mest v ogrodje. Fragmente fitokromov so nato vstavili preko ''Kpn''I in ''Nde''I restrikcisjkih mest [1].

=== Millerjev poskus ===
Seve RU1012, transformirane s pPL-PCB in plazmidom, ki kodira eno od himer, so gojili čez noč. Kulture so bile razredčene in izpostavljene širokemu spektru svetlobe (ena ploščica s 24 luknjicami) oziroma zaščitene pred svetlobo (druga ploščica zavita v aluminijasto folijo). Nato so izvedli Millerjev poskus, kjer gre za določanje koncentracije β-galaktozidaze. Poleg laktoze, lahko cepi tudi sintetično spojino o-nitrofenil-β-D-galaktozid (ONPG) in kot produkt nastane galaktoza in o-nitrofenol, ki ima rumeno barvo. Kadar je ONPG v reakciji presežen nad encimom, je proizvodnja o-nitrofenola na enoto časa sorazmerna koncentraciji β-galaktozidaze. Tako se lahko za določitev koncentracije encima uporabi rumena barva. Eksperiment je zasnovan tako, da se promotor združi z genom ''lacZ''. Celice so tako zbrali za analizo izražanja β-galaktozidaze pod kontrolo promotorja ''ompC'' [1], [4].

Izkazalo se je, da je najbolj aktivna himera Cph8, ki pa ima eno aminokislino manj kot himera, ki se je izkazala za najbolj aktivno po poravnavi. Ta vsebuje prvih 517 aminokislin Cph1 in zadnjih 229 aminokislin EnvZ. Himera je bila ligirana v pPRO-HK in pri tem so tvorili pCPH8. V domeni Cph1 ni bilo nobenih substitucij aminokislin, medtem ko obstaja mutacija I v V na mestu 136 domene EnvZ. Millerjev poskus je pokazal, da je Cph8 v prisotnosti PCB v temi aktivna in na svetlobi neaktivna. V odsotnosti Cph8 ni svetlobno odvisne aktivnosti in obstaja konstitutivna aktivnost, kadar je izražena samo domena histidin kinaze EnvZ, ali kadar ni inducirana presnovna pot PCB [1].

== Snemanje bakterijskih fotografij ==
Vse bakterijske slike so bile posnete z uporabo ''E. coli'', seva CP919, ki je izpeljan iz RU1012 in nosi dodaten transpozon. Transpozon povzroči inaktivacijo genov ''rbsK'' in ''rbsB'', ki zapisujeta za ribokinazo ter protein, ki veže ribozo. Sev je bil transformiran s pPCB in pCPH8, kar je ustvarilo svetlobno občutljiv sev za poskuse bakterijske fotografije. Bakterije so gojili na agarnih ploščah. Ob aktivaciji s svetlobo je prišlo do izražanja LacZ, ki pa katalizira tvorbo stabilne črne oborine iz S-gal (3,4-cikloheksenoskuletin-β-D-galaktopiranozid). Rdeča svetloba poganja senzor v stanje, v katerem je avtofosforilacija EnvZ inhibirana, kar zavre izražanje genov in tako ne pride do tvorbe črne spojine. Na območju svetlobe se zato pojavijo svetli deli, na temnih območjih pa temni deli slike. Z naraščajočo intenzivnostjo svetlobe so pokazali tudi stopenjski odziv sistema. Aktivnost pri najbolj intenzivni svetlobi je bila minimalna [1].

=== Kamera ===
Bakterijska kamera, ki se uporablja za snemanje slik je sestavljena iz vira svetlobe, ki je 100W svetilka in slikovnega projektorja z objektivom za ostrenje slike. Slednji je nameščen 75 mm nad 632 nm ozkim optičnim pasovnim filtrom. Pod filtrom je 35-milimetrski diapozitiv, na katerega je posneta fotografija, ki je nameščena na električni pogon, ki se uporablja za nastavitev ostrine. Slika je projicirana 38 cm pod objektiv v inkubator in na veliko ploščo, ki vsebuje biofilm [1].

== Napredki v bakterijski fotografiji ==
Leta 2017 je Christopher A. Voigt s sodelavci objavil publikacijo v kateri opisujejo gensko kodiran sistem, ki daje ''E. coli'' zmožnost razlikovanja med rdečo, zeleno in modro (RGB) svetlobo ter se odziva s spreminjanjem izražanja genov. Ta sistem so uporabili za izdelavo barvnih fotografij na ploščah bakterijske kulture z nadzorovanjem proizvodnje pigmentov.
Barvno fotografijo so dosegli z združitvijo svetlobnih senzorjev, ki se odzivajo na različne valovne dolžine. Rdeči in zeleni senzorji temeljijo na fitokromih s fikocianobilinom (PCB). Rdeča svetloba je zaznana s Cph8, ki jo vklopi infrardeča (705 nm) svetloba in izključena z rdečo (650 nm) svetlobo. Ta senzor je bil prej uporabljen za ustvarjanje črno-belih bakterijskih fotografij (opisano zgoraj). Senzor zelene svetlobe temelji na ''Synechocystis'' CcaSR, ki se vklopi z zeleno (535 nm) svetlobo in izklopi pri daljno rdeči (672 nm) svetlobi. Senzor modre svetlobe uporablja himerno histidin kinazo (YF1), ki vsebuje flavin mononukleotid (FMN). Izklopi se s svetlobo pri 470 nm in je vklopljen v njeni odsotnosti. Šlo pa je za sistem kjer pride do izražanja encimov, ki so ustvarjajo barvne pigmente na ploščici. Rdeče, zelene in modre barve so proizvedli z izražanjem glukuronidaze (GusA), β-galaktozidaze (LacZ) in monooksigenaze (bFMO) in dodatkom IPTG ter Rose-gluc, X-Gal, ali triptofana (Trp) [5] .
Več podrobnosti najdete v publikaciji na spletni strani revije Nature: https://www.nature.com/articles/nchembio.2390

== Zaključek ==
Njihovo ustvarjanje novega genetskega vezja leta 2005 s funkcijo obdelave slik z izražanjem črnega barvila prikazuje uporabnost ter dostopnost orodij in metod, poleg tega pa napredek v nastajajočem polju sintezne biologije. Prostorski in časovni nadzor izražanja genov v posameznih celicah in populacijah bi se lahko uporabil za preučevanje signalnih poti, večceličnih signalnih omrežij, izdelavi kompozitov bioloških materialov ter v bakterijski mikrolitografiji. Razmišljali so v smeri, da bi namesto izdelave črnega pigmenta bakterije sintetizirale proteine, kot je pajkova mreža.
Do leta 2017 je opazen viden napredek v bakterijski fotografiji in uporabi svetlobnih senzorjev v druge namene. Posamezni senzorji svetlobe so bili uporabljeni za induciranje lize, urejanje genoma in tudi biomedicinske aplikacije. Popolno izkoriščanje celotnega spektra svetlobnih senzorjev hkrati v posameznih celicah zagotavlja številne gumbe, s katerimi lahko nadziramo celice hitro in, prostorsko in od daleč.

== Viri in literatura ==
[1] Levskaya, A. et al. Engineering Escherichia coli to see light, Nature, 438, 441–442 (2005).

[2] Sheng Jian Cai and Masayori Inouye, EnvZ-OmpR Interaction and Osmoregulation in Escherichia coli, The Journal of Biological Chemistry, 277, 24155-24161 (2002).

[3] G. A. Gambetta and J. C. Lagarias, Genetic engineering of phytochrome biosynthesis in bacteria, Proc. Natl Acad. Sci. USA 98, 10566–10571 (2001).

[4] Smale ST., Beta-galactosidase assay, Cold Spring Harb Protoc. (2010).

[5] J. Fernandez-Rodriguez, F. Moser, M. Song and C. A. Voigt, Engineering RGB color vision into Escherichia coli, Nature Chemical Biology, 13, 706–708 (2017)

Inženiring bakterij Escherichia coli odzivnih na svetlobo

2019-01-09T21:23:24Z

Karmenzbogar: /* Testiranje aktivnosti fitokromov */

Izvorni članek: Levskaya, A. et al. Engineering ''Escherichia coli'' to see light, Nature, 438, 441–442 (2005). [https://www.nature.com/articles/nature04405]

== Uvod ==
Študenti Univerze v Teksasu so leta 2005 v sodelovanju s Kalifornijsko Univerzo v San Franciscu pod vodstvom Christopher-ja Voigt pripravili prve bakterijske fotografije v sklopu tekmovanja (Intercollegiate Genetically Engineered Machine competition) na MIT (Massachusetts Institute of Technology). S pomočjo sintezne biologije so zasnovali bakterijski sistem, ki preklaplja med različnimi stanji pod svetlobo v rdečem območju vidnega spektra. S pomočjo projekcije svetlobe na biološki film so proizvedli visoko ločljivo dvodimenzionalno živo sliko (100 megapikslov na kvadratni palec) [1].

== Odziv na svetlobo ==
Ustvarili so svetlobni senzor, ki deluje v ''Escherichia coli''. Enterobakterije, kot je ''E. coli'', same po sebi niso sposobne zaznavati svetlobe, ker v njih ne najdemo fotoreceptorjev. Medtem ko rastline, alge in cianobakterije vsebujejo proteinske fotoreceptorje, znane kot fitokromi in jih uporabljajo za nadzor fotosinteze ter fototakse. Zato so uporabili fitokrom iz cianobakterije ''Synechocystis'' in sicer tako, da so ustvarili himere z bakterijsko histidin kinazo [1].

Fitokrom sestavljata dve komponenti, membransko vezan zunajcelični senzor, ki se odziva na svetlobo in znotrajcelični regulator. Zato fitokromu rečemo dvokomponentni sistem. Znotrajcelični regulatorji v večini fitokromov ne uravnavajo izražanja genov direktno, saj nimajo DNA vezavnih domen. V ta namen so pripravili fitokrom s fuzijo fotoreceptorja cianobakterij Cph1 in histidin kinaze EnvZ.

=== Sistem EnvZ-OmpR ===
EnvZ je del dobro preučenega dvokomponentnega regulatornega sistema EnvZ-OmpR, ki ob pojavu osmotskega šoka uravnava izražanje porinov OmpC in OmpF. Ob visoki osmolarnosti je EnvZ podvržen avtofosforilaciji in prenese fosforilne skupine na OmpR preko tvorbe kompleksa. Ko se število fosforiliranih proteinov OmpR poveča, pride do vezave le-tega na aktivatorska mesta promotorja ''ompC'' in spodbujeno je izražanje porina OmpC. Pri nizki osmolarnosti se poveča izražanje porina OmpF, ki ima večji premer por in tako poveča difuzijo hranil ob osmotskem šoku [1], [2].

=== Fikocianobilin ===
Dodatno, fitokromi imajo linearne tetrapirolne prostetične skupine, ki omogočajo absorpcijo vidne svetlobe in se imenujejo bilini. Bilini izhajajo iz od kisika odvisnega odpiranja obroča hema. Cianobakterije ''Synechocystis'' imajo zapis za dva encima, ki prispevata k pretvorbi hema v fikocianobilin (PCB). Ta dva encima sta hem oksigenaza (HO1) in fikocianobilin: feredoksin oksidoreduktaza (PcyA), ki katalizirata pretvorbo hema v biliverdin IXa (BV) oziroma BV v PCB. [3]

V ''E. coli'' PCB ni naravno sintetiziran, zato je bila njegova biosintezna pot uvedena preko plazmida pPL-PCB, ki je bil pridobljen od J. C. Lagarias in je bil predhodno pripravljen za biosintezo fitokroma v bakterijah. Plazmid vsebuje mesto začetka replikacije p15a in vsebuje gena ''ho1'' in ''pcyA'', za pretvorbo hema v PCB, pod kontrolo promotorja Para/lac. Zamenjali so le odpornost na kanamicin z odpornostjo na ampicilin [1].

== Testiranje aktivnosti fitokromov ==
Za pregledovanje aktivnosti fotoreceptorjev so uporabili ''E. coli'' RU1012 [MC4100 ara + Φ(OmpC-''lacZ'') 10-25 Δ''envZ'' :: KanR]. Sev ima v kromosomu zapis za promotor ''ompC'', fuziran z ''lacZ'' reporterjem.

Iz cianobakterije Synechocystis so izolirali fitokrom Cph1. Pred tem so izvedli poravnavo CLUSTALW različnih fitokromov z EnvZ. Izdelali so knjižnico s spreminjanjem števila aminokislin Cph1 (+/- 9 aminokislin). S spreminjanjem števila aminokislin Cph1 so konstruirali vrsto himer z variabilno dolžino dela, ki povezuje fotoreceptor z znotrajceličnim regulatorjem, saj dolžina in sestava peptida lahko vpliva na signalno transdukcijo. Število aminokislin pri EnvZ je bilo ohranjeno in sicer zadnjih 229 aminokislin.
Himerne fitokrome so ligirali v plazmid pPOROTet. Plazmid vsebuje tetraciklinski promotor, odpornost na kloramfenikol in mesto začetka replikacije ColE1. Najprej je bila histidin kinazna domena ''envZ'' ligirana v ogrodje pPROTet in s tem so tvorili plazmid pPRO-HK. Fragment ''envZ'' so pomnožili s pomočjo reakcije PCR z uporabo začetnih oligonukleotidov, ki so vsebovali restrikcijska mesta ''Nde''I in ''Xba''I. Sledila je ligacija preko teh restrikcijskih mest v ogrodje. Fragmente fitokromov so nato vstavili preko ''Kpn''I in ''Nde''I restrikcisjkih mest [1].

=== Millerjev poskus ===
Seve RU1012, transformirane s pPL-PCB in plazmidom, ki kodira eno od himer, so gojili čez noč. Kulture so bile razredčene in izpostavljene širokemu spektru svetlobe (ena ploščica s 24 luknjicami) oziroma zaščitene pred svetlobo (druga ploščica zavita v aluminijasto folijo). Nato so izvedli Millerjev poskus, kjer gre za določanje koncentracije β-galaktozidaze. Poleg laktoze, lahko cepi tudi sintetično spojino o-nitrofenil-β-D-galaktozid (ONPG) in kot produkt nastane galaktoza in o-nitrofenol, ki ima rumeno barvo. Kadar je ONPG v reakciji presežen nad encimom, je proizvodnja o-nitrofenola na enoto časa sorazmerna koncentraciji β-galaktozidaze. Tako se lahko za določitev koncentracije encima uporabi rumena barva. Eksperiment je zasnovan tako, da se promotor združi z genom ''lacZ''. Celice so tako zbrali za analizo izražanja β-galaktozidaze pod kontrolo promotorja ''ompC'' [1], [4].

Izkazalo se je, da je najbolj aktivna himera Cph8, ki pa ima eno aminokislino manj kot himera, ki se je izkazala za najbolj aktivno po poravnavi. Ta vsebuje prvih 517 aminokislin Cph1 in zadnjih 229 aminokislin EnvZ. Himera je bila ligirana v pPRO-HK in pri tem so tvorili pCPH8. V domeni Cph1 ni bilo nobenih substitucij aminokislin, medtem ko obstaja mutacija I v V na mestu 136 domene EnvZ. Millerjev poskus je pokazal, da je Cph8 v prisotnosti PCB v temi aktivna in na svetlobi neaktivna. V odsotnosti Cph8 ni svetlobno odvisne aktivnosti in obstaja konstitutivna aktivnost, kadar je izražena samo domena histidin kinaze EnvZ, ali kadar ni inducirana presnovna pot PCB [1].

== Snemanje bakterijskih fotografij ==
Vse bakterijske slike so bile posnete z uporabo ''E. coli'', seva CP919, ki je izpeljan iz RU1012 in nosi dodaten transpozon. Transpozon povzroči inaktivacijo genov ''rbsK'' in ''rbsB'', ki zapisujeta za ribokinazo ter protein, ki veže ribozo. Sev je bil transformiran s pPCB in pCPH8, kar je ustvarilo svetlobno občutljiv sev za poskuse bakterijske fotografije. Bakterije so gojili na agarnih ploščah. Ob aktivaciji s svetlobo je prišlo do izražanja LacZ, ki pa katalizira tvorbo stabilne črne oborine iz S-gal (3,4-cikloheksenoskuletin-β-D-galaktopiranozid). Rdeča svetloba poganja senzor v stanje, v katerem je avtofosforilacija EnvZ inhibirana, kar zavre izražanje genov in tako ne pride do tvorbe črne spojine. Na območju svetlobe se zato pojavijo svetli deli, na temnih območjih pa temni deli slike. Z naraščajočo intenzivnostjo svetlobe so pokazali tudi stopenjski odziv sistema. Aktivnost pri najbolj intenzivni svetlobi je bila minimalna [1].

=== Kamera ===
Bakterijska kamera, ki se uporablja za snemanje slik je sestavljena iz vira svetlobe, ki je 100W svetilka in slikovnega projektorja z objektivom za ostrenje slike. Slednji je nameščen 75 mm nad 632 nm ozkim optičnim pasovnim filtrom. Pod filtrom je 35-milimetrski diapozitiv, na katerega je posneta fotografija, ki je nameščena na električni pogon, ki se uporablja za nastavitev ostrine. Slika je projicirana 38 cm pod objektiv v inkubator in na veliko ploščo, ki vsebuje biofilm [1].

== Napredki v bakterijski fotografiji ==
Leta 2017 je Christopher A. Voigt s sodelavci objavil publikacijo v kateri opisujejo gensko kodiran sistem, ki daje ''E. coli'' zmožnost razlikovanja med rdečo, zeleno in modro (RGB) svetlobo ter se odziva s spreminjanjem izražanja genov. Ta sistem so uporabili za izdelavo barvnih fotografij na ploščah bakterijske kulture z nadzorovanjem proizvodnje pigmentov.
Barvno fotografijo so dosegli z združitvijo svetlobnih senzorjev, ki se odzivajo na različne valovne dolžine. Rdeči in zeleni senzorji temeljijo na fitokromih s fikocianobilinom (PCB). Rdeča svetloba je zaznana s Cph8, ki jo vklopi infrardeča (705 nm) svetloba in izključena z rdečo (650 nm) svetlobo. Ta senzor je bil prej uporabljen za ustvarjanje črno-belih bakterijskih fotografij (opisano zgoraj). Senzor zelene svetlobe temelji na ''Synechocystis'' CcaSR, ki se vklopi z zeleno (535 nm) svetlobo in izklopi pri daljno rdeči (672 nm) svetlobi. Senzor modre svetlobe uporablja himerno histidin kinazo (YF1), ki vsebuje flavin mononukleotid (FMN). Izklopi se s svetlobo pri 470 nm in je vklopljen v njeni odsotnosti. Šlo pa je za sistem kjer pride do izražanja encimov, ki so ustvarjajo barvne pigmente na ploščici. Rdeče, zelene in modre barve so proizvedli z izražanjem glukuronidaze (GusA), β-galaktozidaze (LacZ) in monooksigenaze (bFMO) in dodatkom IPTG ter Rose-gluc, X-Gal, ali triptofana (Trp) [5] .
Več podrobnosti najdete v publikaciji na spletni strani revije Nature: https://www.nature.com/articles/nchembio.2390

== Zaključek ==
Njihovo ustvarjanje novega genetskega vezja leta 2005 s funkcijo obdelave slik z izražanjem črnega barvila prikazuje uporabnost ter dostopnost orodij in metod, poleg tega pa napredek v nastajajočem polju sintezne biologije. Prostorski in časovni nadzor izražanja genov v posameznih celicah in populacijah bi se lahko uporabil za preučevanje signalnih poti, večceličnih signalnih omrežij, izdelavi kompozitov bioloških materialov ter v bakterijski mikrolitografiji. Razmišljali so v smeri, da bi namesto izdelave črnega pigmenta bakterije sintetizirale proteine, kot je pajkova mreža.
Do leta 2017 je opazen viden napredek v bakterijski fotografiji in uporabi svetlobnih senzorjev v druge namene. Posamezni senzorji svetlobe so bili uporabljeni za induciranje lize, urejanje genoma in tudi biomedicinske aplikacije. Popolno izkoriščanje celotnega spektra svetlobnih senzorjev hkrati v posameznih celicah zagotavlja številne gumbe, s katerimi lahko nadziramo celice hitro in, prostorsko in od daleč.

== Viri in literatura ==
[1] Levskaya, A. et al. Engineering Escherichia coli to see light, Nature, 438, 441–442 (2005).

[2] Sheng Jian Cai and Masayori Inouye, EnvZ-OmpR Interaction and Osmoregulation in Escherichia coli, The Journal of Biological Chemistry, 277, 24155-24161 (2002).

[3] G. A. Gambetta and J. C. Lagarias, Genetic engineering of phytochrome biosynthesis in bacteria, Proc. Natl Acad. Sci. USA 98, 10566–10571 (2001).

[4] Smale ST., Beta-galactosidase assay, Cold Spring Harb Protoc. (2010).

[5] J. Fernandez-Rodriguez, F. Moser, M. Song and C. A. Voigt, Engineering RGB color vision into Escherichia coli, Nature Chemical Biology, 13, 706–708 (2017)

Main Page

2019-01-08T22:54:08Z

Karmenzbogar: Removing all content from page

Seminarji SB 2018/19

2019-01-08T22:51:37Z

Karmenzbogar:

V študijskem letu 2018/19 študentje predstavljajo naslednje teme:

RAZISKOVALNI ČLANKI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) 

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/MoClo:_modularni_klonirni_sistem_za_standardizirano_sestavljanje_ve%C4%8Dgenskih_konstruktov MoClo: modularni klonirni sistem za standardizirano sestavljanje večgenskih konstruktov] (Valentina Levak)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/RNA-stikala_tipa_%C2%BBToehold%C2%AB:_de_novo_oblikovani_regulatorji_izra%C5%BEanja_genov RNA-stikala tipa Toehold: de novo oblikovani regulatorji izražanja genov] (Špela Malenšek)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Raznoliko_in_modelno_zasnovana_priprava_sinteti%C4%8Dnih_genskih_vezij_s_predvidenimi_lastnostmi Raznoliko in modelno zasnovana priprava sintetičnih genskih vezij s predvidenimi lastnostmi] (Matej Kolarič)

[[Dispersing biofilms with engineered enzymatic bacteriophage]] (Fran Krstanović)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Nekaj_pogledov_na_sistemsko_biologijo_kvasovke Nekaj pogledov na sistemsko biologijo kvasovke] (Gašper Žun)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Organizacija_znotrajceli%C4%8Dnih_reakcij_z_razumsko_na%C4%8Drtovanimi_RNA_sestavi#Na.C4.8Drtovanje_in_sestavljanje_RNA_sestavov Organizacija znotrajceličnih reakcij z razumsko načrtovanimi RNA sestavi] (Urška Jelenovec)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Biolo%C5%A1ko_vezje_na_osnovi_RNA-interference_za_identifikacijo_specifi%C4%8Dnih_rakavih_celic Biološko vezje na osnovi RNA-interference za identifikacijo specifičnih rakavih celic] (Gašper Marinšek)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Kontrola_hitrosti_translacije_preko_pomožnega_mesta_5’-UTR:_energijski_kompromis_med_dostopnostjo%2C_selektivnim_razvijanjem_RNA-struktur_in_drsenjem_30S_ribosomske_podenote_po_RNA-strukturah Kontrola hitrosti translacije preko pomožnega mesta 5’-UTR: energijski kompromis med dostopnostjo, selektivnim razvijanjem RNA-struktur in drsenjem 30S ribosomske podenote po RNA-strukturah] (Neža Koritnik)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Preoblikovanje_genskega_skupka_za_fiksacijo_dušika_bakterije_Klebsiella_oxytoca Preoblikovanje genskega skupka za fiksacijo dušika bakterije ''Klebsiella oxytoca''] (Gašper Virant)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Negativna_samoregulacija_linearizira_odziv_na_odmerek_in_zavira_heterogenost_genskega_izražanja Negativna samoregulacija linearizira odziv na odmerek in zavira heterogenost genskega izražanja] (Primož Tič)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Design_and_analysis_of_synthetic_carbon_fixation_pathways Design and analysis of synthetic carbon fixation pathways] (Marija Atanasova)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Pol-sinteti%C4%8Den_organizem_z_raz%C5%A1irjeno_gensko_abecedo Pol-sintetičen organizem z razširjeno gensko abecedo] (Peter Pečan)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Programirano_uti%C5%A1anje_in_aktivacija_izra%C5%BEanja_bakterijskega_gena_z_uporabo_konstruiranega_CRISPR-Cas_sistema Programirano utišanje in aktivacija izražanja bakterijskega gena z uporabo konstruiranega CRISPR-Cas sistema] (Tjaša Sorčan)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sintezna_optogenetska_transkripcijska_naprava_za_izboljšanje_homeostaze_krvnega_sladkorja_pri_miših Sintezna optogenetska transkripcijska naprava za izboljšanje homeostaze krvnega sladkorja pri miših] (Natalija Pucihar)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Inženiring_bakterij_Escherichia_coli_odzivnih_na_svetlobo Inženiring bakterij ''Escherichia coli'' odzivnih na svetlobo] (Karmen Žbogar)

NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.) 
[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Phactory:_proizvodnja_bakteriofagov_za_precizno_zdravljenje Phactory: proizvodnja bakteriofagov za precizno zdravljenje] (Rok Miklavčič)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Canditect:_hitra_detekcija_vaginalne_infekcije_s_Candido_albicans_z_uporabo_sistema_CRISPR/dCas9 Canditect – hitra detekcija vaginalne infekcije s Candido albicans z uporabo sistema CRISPR/dCas9] (Jerneja Ovčar)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/CAPOEIRA_-_razvoj_personaliziranega_cepiva_proti_raku_in_sistema_za_spremljanje_odziva_na_zdravljenje CAPOEIRA – razvoj personaliziranega cepiva proti raku in sistema za spremljanje odziva na zdravljenje] (Anamarija Habič)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Biotic_Blue_-_encimska_razgradnja_zdravilnih_u%C4%8Dinkovin_v_odpadnih_vodah#BIOTIC_BLUE BIOTIC BLUE - encimska razgradnja zdravilnih učinkovin v odpadnih vodah] (Tina Požun)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Of_CO2urse_-_sistem_za_zmanj%C5%A1evanje_izpustov_ogljikovega_dioksida_v_industriji Of CO2urse - sistem za zmanjševanje izpustov ogljikovega dioksida v industriji] (Kity Požek)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Cockroach_terminator Cockroach terminator]] (Roberta Mulac)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/MiBiome_-_probioti%C4%8Dna_bakterija_za_zdravljenje_kroni%C4%8Dne_vnetne_%C4%8Drevesne_bolezni MiBiome - probiotična bakterija za zdravljenje kronične vnetne črevesne bolezni] (Ernest Šprager)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BioWatcher_pametna_ura_za_sledenje_ravni_biomarkerjev_za_bolezni BioWatcher: Pametna ura za sledenje ravni biomarkerjev za bolezni] (Nina Mavec)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/CAT-Seq:_Visokoprepustna_metoda_za_analizo_katalitske_aktivnosti_biomolekul CAT-Seq: Visokoprepustna metoda za analizo katalitske aktivnosti biomolekul] (Bine Tršavec)

Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo razprava, ki praviloma ne bo daljša od 5 minut.

----

Razpored po datumih predstavitev (pri vsakem terminu je navedeno število možnih seminarjev; vpišite ime in priimek pri dnevu, ko želite predstaviti seminar ter dopišite naslov seminarja, ki naj bo povezan s povzetkom):

22.11. 
1 
2 Valentina Levak 

27.11. 
1 
2 
3 
4 

29.11. 
1 Matej Kolarič 
2 Špela Malenšek 
3 
4 

4.12. 
1 Gašper Žun 
2 Fran Krstanovic 
3 
4 

6.12. 
1 Urška Jelenovec 
2 Rok Miklavčič 
3 
4 

11.12. 
1 Jerneja Ovčar 
2 Neža Koritnik 
3 Gašper Virant 
4 Gašper Marinšek 

18.12. 
1 Tina Požun 
2 Anamarija Habič 
3 Roberta Mulac 
4 Kity Požek 

3.1. 
1 Nina Mavec 
2 Primož Tič 
3 Ernest Šprager 
4 

8.1. 
1 Marija Atanasova 
2 Bine Tršavec 
3 Peter Pečan 
4 Tjaša Sorčan 

10.1. 
1 Urška Kašnik 
2 Natalija Pucihar 
3 Karmen Žbogar 
4 Uroš Zavrtanik 

15.1. 
1 Jerneja Kocutar 
2 Blaž Lebar 
3 Tadej Satler 
4 Miha Koprivnikar Krajnc 

17.1. 
1 Milena Stojkovska 
2 Špela Koren

Seminarji SB 2018/19

2019-01-08T22:49:06Z

Karmenzbogar:

V študijskem letu 2018/19 študentje predstavljajo naslednje teme:

RAZISKOVALNI ČLANKI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) 

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/MoClo:_modularni_klonirni_sistem_za_standardizirano_sestavljanje_ve%C4%8Dgenskih_konstruktov MoClo: modularni klonirni sistem za standardizirano sestavljanje večgenskih konstruktov] (Valentina Levak)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/RNA-stikala_tipa_%C2%BBToehold%C2%AB:_de_novo_oblikovani_regulatorji_izra%C5%BEanja_genov RNA-stikala tipa Toehold: de novo oblikovani regulatorji izražanja genov] (Špela Malenšek)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Raznoliko_in_modelno_zasnovana_priprava_sinteti%C4%8Dnih_genskih_vezij_s_predvidenimi_lastnostmi Raznoliko in modelno zasnovana priprava sintetičnih genskih vezij s predvidenimi lastnostmi] (Matej Kolarič)

[[Dispersing biofilms with engineered enzymatic bacteriophage]] (Fran Krstanović)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Nekaj_pogledov_na_sistemsko_biologijo_kvasovke Nekaj pogledov na sistemsko biologijo kvasovke] (Gašper Žun)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Organizacija_znotrajceli%C4%8Dnih_reakcij_z_razumsko_na%C4%8Drtovanimi_RNA_sestavi#Na.C4.8Drtovanje_in_sestavljanje_RNA_sestavov Organizacija znotrajceličnih reakcij z razumsko načrtovanimi RNA sestavi] (Urška Jelenovec)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Biolo%C5%A1ko_vezje_na_osnovi_RNA-interference_za_identifikacijo_specifi%C4%8Dnih_rakavih_celic Biološko vezje na osnovi RNA-interference za identifikacijo specifičnih rakavih celic] (Gašper Marinšek)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Kontrola_hitrosti_translacije_preko_pomožnega_mesta_5’-UTR:_energijski_kompromis_med_dostopnostjo%2C_selektivnim_razvijanjem_RNA-struktur_in_drsenjem_30S_ribosomske_podenote_po_RNA-strukturah Kontrola hitrosti translacije preko pomožnega mesta 5’-UTR: energijski kompromis med dostopnostjo, selektivnim razvijanjem RNA-struktur in drsenjem 30S ribosomske podenote po RNA-strukturah] (Neža Koritnik)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Preoblikovanje_genskega_skupka_za_fiksacijo_dušika_bakterije_Klebsiella_oxytoca Preoblikovanje genskega skupka za fiksacijo dušika bakterije ''Klebsiella oxytoca''] (Gašper Virant)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Negativna_samoregulacija_linearizira_odziv_na_odmerek_in_zavira_heterogenost_genskega_izražanja Negativna samoregulacija linearizira odziv na odmerek in zavira heterogenost genskega izražanja] (Primož Tič)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Design_and_analysis_of_synthetic_carbon_fixation_pathways Design and analysis of synthetic carbon fixation pathways] (Marija Atanasova)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Pol-sinteti%C4%8Den_organizem_z_raz%C5%A1irjeno_gensko_abecedo Pol-sintetičen organizem z razširjeno gensko abecedo] (Peter Pečan)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Programirano_uti%C5%A1anje_in_aktivacija_izra%C5%BEanja_bakterijskega_gena_z_uporabo_konstruiranega_CRISPR-Cas_sistema Programirano utišanje in aktivacija izražanja bakterijskega gena z uporabo konstruiranega CRISPR-Cas sistema] (Tjaša Sorčan)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sintezna_optogenetska_transkripcijska_naprava_za_izboljšanje_homeostaze_krvnega_sladkorja_pri_miših Sintezna optogenetska transkripcijska naprava za izboljšanje homeostaze krvnega sladkorja pri miših] (Natalija Pucihar)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Inženiring_bakterij_''Escherichia_coli''_odzivnih_na_svetlobo Inženiring bakterij ''Escherichia coli'' odzivnih na svetlobo] (Karmen Žbogar)

NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.) 
[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Phactory:_proizvodnja_bakteriofagov_za_precizno_zdravljenje Phactory: proizvodnja bakteriofagov za precizno zdravljenje] (Rok Miklavčič)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Canditect:_hitra_detekcija_vaginalne_infekcije_s_Candido_albicans_z_uporabo_sistema_CRISPR/dCas9 Canditect – hitra detekcija vaginalne infekcije s Candido albicans z uporabo sistema CRISPR/dCas9] (Jerneja Ovčar)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/CAPOEIRA_-_razvoj_personaliziranega_cepiva_proti_raku_in_sistema_za_spremljanje_odziva_na_zdravljenje CAPOEIRA – razvoj personaliziranega cepiva proti raku in sistema za spremljanje odziva na zdravljenje] (Anamarija Habič)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Biotic_Blue_-_encimska_razgradnja_zdravilnih_u%C4%8Dinkovin_v_odpadnih_vodah#BIOTIC_BLUE BIOTIC BLUE - encimska razgradnja zdravilnih učinkovin v odpadnih vodah] (Tina Požun)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Of_CO2urse_-_sistem_za_zmanj%C5%A1evanje_izpustov_ogljikovega_dioksida_v_industriji Of CO2urse - sistem za zmanjševanje izpustov ogljikovega dioksida v industriji] (Kity Požek)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Cockroach_terminator Cockroach terminator]] (Roberta Mulac)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/MiBiome_-_probioti%C4%8Dna_bakterija_za_zdravljenje_kroni%C4%8Dne_vnetne_%C4%8Drevesne_bolezni MiBiome - probiotična bakterija za zdravljenje kronične vnetne črevesne bolezni] (Ernest Šprager)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BioWatcher_pametna_ura_za_sledenje_ravni_biomarkerjev_za_bolezni BioWatcher: Pametna ura za sledenje ravni biomarkerjev za bolezni] (Nina Mavec)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/CAT-Seq:_Visokoprepustna_metoda_za_analizo_katalitske_aktivnosti_biomolekul CAT-Seq: Visokoprepustna metoda za analizo katalitske aktivnosti biomolekul] (Bine Tršavec)

Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo razprava, ki praviloma ne bo daljša od 5 minut.

----

Razpored po datumih predstavitev (pri vsakem terminu je navedeno število možnih seminarjev; vpišite ime in priimek pri dnevu, ko želite predstaviti seminar ter dopišite naslov seminarja, ki naj bo povezan s povzetkom):

22.11. 
1 
2 Valentina Levak 

27.11. 
1 
2 
3 
4 

29.11. 
1 Matej Kolarič 
2 Špela Malenšek 
3 
4 

4.12. 
1 Gašper Žun 
2 Fran Krstanovic 
3 
4 

6.12. 
1 Urška Jelenovec 
2 Rok Miklavčič 
3 
4 

11.12. 
1 Jerneja Ovčar 
2 Neža Koritnik 
3 Gašper Virant 
4 Gašper Marinšek 

18.12. 
1 Tina Požun 
2 Anamarija Habič 
3 Roberta Mulac 
4 Kity Požek 

3.1. 
1 Nina Mavec 
2 Primož Tič 
3 Ernest Šprager 
4 

8.1. 
1 Marija Atanasova 
2 Bine Tršavec 
3 Peter Pečan 
4 Tjaša Sorčan 

10.1. 
1 Urška Kašnik 
2 Natalija Pucihar 
3 Karmen Žbogar 
4 Uroš Zavrtanik 

15.1. 
1 Jerneja Kocutar 
2 Blaž Lebar 
3 Tadej Satler 
4 Miha Koprivnikar Krajnc 

17.1. 
1 Milena Stojkovska 
2 Špela Koren

2017-05-16T21:23:29Z

Karmenzbogar: /* Antibiotiki, ki inhibirajo transkripcijo in/ali translacijo */

== Uvod ==
Kot odziv na učinke antibiotikov so mikrobi razvili genetske in biokemijske poti za rezistenco na večino dolgo uporabljenih antimikrobnih sredstev. Edini način s katerim se bomo lahko še naprej zanašali na zdravljenje z antibiotiki je prek stalnih prizadevanj za odkrivanje novih antimikrobnih učinkovin in opredeliti nove genetske in biokemijske poti, ki vodijo v smrt celice.

'''Toksin-antitoksin sistemi'''

V bakteriji je ena najbolj raziskanih oblik programirane celične smrti posredovana preko specifičnih genskih modulov imenovanih moduli odvisnosti ali toksin-antitoksin sistemi (TA). Vsak modul je sestavljen iz para genov, ki določata dve komponenti. Drugi gen kodira stabilni toksin, prvi gen pa kodira labilni antitoksin, ki ovira delovanje toksina. TA sistemi so bili odkriti predvsem v bakterijah ''Escherichia coli'' na plazmidih z nizkim številom kopij in še nekaterih drugih ekstra-kromosomskih. Genetske enote toksina in antitoksina so poimenovali moduli odvisnosti, ker so celice odvisne od kratko obstoječega produkta, saj se labilni antitoksin razgradi hitreje kot stabilni toksin, njihova sinteza ''de novo'' pa je ključna za preživetje tovrstnih celic. TA sistemi, od katerih so nekateri homologni ekstra-kromosomskim modulom odvisnosti se pojavljajo tudi v kromosomu bakterije ''E. coli'' in številnih drugih bakterij. Prvi modul na bakterijskem kromosomu, opisan kot reguliran in odgovoren za PCS je ''mazEF'' modul, ki spada pod TA sistem tipa II. Toksin-antitoksin sistem ''mazEF'' je bil dokazan kot prisoten in funkcionalen v sevih MC4100 in MG1655.

'''rel operon in mehanizem celične smrti'''

Gena ''mazE'' in ''mazF'' sta kromosomska gena, ki sta del ''rel'' operona bakterije ''E. coli''. Gen ''mazE'' je lociran pred genom ''mazF'', pod skupnim promotorjem. Na operonu bakterije ''E. coli'' seva MC4100 so trije promotorji; P1, P2 in P3, ki so bili identificirani pred genom ''mazE''. Proteinska produkta MazE and MazF tvorita kompleks, ki inhibira transkripcijo genov promotorjev P2 in P3 in tako zagotavlja avto-regulacijo transkripcije. Koncentracija antitoksina glede na koncentracijo toksina je limitni faktor pri vklopu in izklopu operona. Natančneje ''rel'' operon bakterije ''E. coli'' sestoji iz štirih genov ''relA, mazE, mazF'' in ''mazG''. Transkripcija z P2 in P3 promotorjev vodi do produkcije MazEF mRNA in translacija proizvaja MazE in MazF proteinske produkte. MazE in MazF tvori kompleks v 4:2 stehiometriji. Kompleks zavira nadaljnjo transkripcijo teh genov. MazE je konstitutivno cepljen s ClpAP in sproščen MazF cepi RNA, kar vodi do celične smrti.

== Antibiotiki, ki inhibirajo transkripcijo in/ali translacijo ==
Antibiotiki, ki inhibirajo transkripcijo in/ali translacijo, škodljivo vplivajo preko indukcije mazEF-posredovane PCD na celico. Zmanjšana stopnja transkripcije in translacije zmanjša količino MazE. To bo skupaj z dejstvom, da je MazE razgrajen z celičnimi proteazami, vodilo do povečanja koncentracije prostega MazF. Najprej so testirali učinke na sistemu številnih antibiotikov, vključno z rifampicinom, kloramfenikolom in spektinomicinom. V ne mutiranih verzijah genov je bilo ugotovljeno, da že kratko inhibiranje transkripcije ali translacije z temi antibiotiki, zadostuje za sprožitev mazEF-posredovane smrti. Nasprotno izbris mazEF iz bakterijskega kromosoma prepreči celično smrt v prisotnosti antibiotikov. Treba je opozoriti na to, da je bila od mazEF odvisna bakteriocidnost opažena pri kloramfenikolu in spektomicinu, ko so celice rastle na minimalnem nebogatem mediju. Tako vidimo, da je bakteriocidnost teh dveh antibiotikov odvisna od okoljskih pogojev.

== ROS odvisna/neodvisna celična smrt==

Kasneje je bilo ugotovljeno, da ti antibiotiki, ki vplivajo na transkripcijo in translacijo povzročijo ROS odvisno celično smrt, posredovano z mazEF sistemom, medtem ko ti, ki povzročijo poškodbe DNA inducirane celične smrti (npr. kinoloni) pa po ROS neodvisni poti. Poleg tega so popolni anaerobni pogoji preprečili smrt posredovano z antibiotiki, ki inhibirajo transkripcijo in translacijo, ne pa smrti povzročene z antibiotiki, ki povzročijo DNA poškodbe. Dodajanje EDF-ja je povečalo tako za ROS odvisno mazEF- posredovano celično smrt za rifampicin kot tudi za ROS-neodvisno mazEF-posredovano celično smrt za nalidiksinske kisline-antibiotike, ki poškodujejo DNA. Pri tvorjenju PCD z reaktivnimi kisikovimi spojinami (ROS) proces zahteva prisotnost zunajceličnega smrtnega faktorja (EDF). Ta način delovanja nakazuje, da uporaba sintetičnega EDF skupaj z kinoloni, lahko poveča učinkovitost ubijanja bakterij. Poleg tega se lahko bakteriostatični antibiotiki pretvorijo v baktericidne z uporabo EDF za vključitev mazEF sistema.
Neka druga skupina raziskovalcev je z merjenjem povečanja fluorescence HPF (hidroksifenil fluorescein) dokazala, da ROS niso bile nujno prisotne in verjetno tudi neodgovorne za ubijanje z antibiotiki, ker ni bilo razlike v preživetju celic, ko je bila E.Coli tretirana v aerobnih in anaerobnih pogojih. Različni avtorji so torej poročali o različnih rezultatih, ki so se med sabo izključevali.

== Viri ==
B. C. Mohan Ramisetty, B. Natarajan, R. Sarojini Santhosh, ''mazEF''-mediated programmed cell death in bacteria: ‘‘What is this?’’, Crit Rev Microbiol, Published online, 24 June, 2013

H. Engelberg-Kulka, B. Sat, M. Reches, S. Amitai and R. Hazan, TRENDS in Microbiology, Bacterial programmed cell death systems as targets for antibiotics, Vol.12, No.2, 2004

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

I. Kolodkin-Gal, B. Sat, A. Keshet, H. Endelberg-Kulka, The Communication Factor EDF and the Toxin-Antitoxin Module mazEF Determine the Mode of Action of Antibiotics, 16 December, 2008, Research article.

Mehanizem celične smrti po delovanju antibiotikov

2017-05-16T21:21:50Z

Karmenzbogar: /* Viri */

== Uvod ==
Kot odziv na učinke antibiotikov so mikrobi razvili genetske in biokemijske poti za rezistenco na večino dolgo uporabljenih antimikrobnih sredstev. Edini način s katerim se bomo lahko še naprej zanašali na zdravljenje z antibiotiki je prek stalnih prizadevanj za odkrivanje novih antimikrobnih učinkovin in opredeliti nove genetske in biokemijske poti, ki vodijo v smrt celice.

'''Toksin-antitoksin sistemi'''

V bakteriji je ena najbolj raziskanih oblik programirane celične smrti posredovana preko specifičnih genskih modulov imenovanih moduli odvisnosti ali toksin-antitoksin sistemi (TA). Vsak modul je sestavljen iz para genov, ki določata dve komponenti. Drugi gen kodira stabilni toksin, prvi gen pa kodira labilni antitoksin, ki ovira delovanje toksina. TA sistemi so bili odkriti predvsem v bakterijah ''Escherichia coli'' na plazmidih z nizkim številom kopij in še nekaterih drugih ekstra-kromosomskih. Genetske enote toksina in antitoksina so poimenovali moduli odvisnosti, ker so celice odvisne od kratko obstoječega produkta, saj se labilni antitoksin razgradi hitreje kot stabilni toksin, njihova sinteza ''de novo'' pa je ključna za preživetje tovrstnih celic. TA sistemi, od katerih so nekateri homologni ekstra-kromosomskim modulom odvisnosti se pojavljajo tudi v kromosomu bakterije ''E. coli'' in številnih drugih bakterij. Prvi modul na bakterijskem kromosomu, opisan kot reguliran in odgovoren za PCS je ''mazEF'' modul, ki spada pod TA sistem tipa II. Toksin-antitoksin sistem ''mazEF'' je bil dokazan kot prisoten in funkcionalen v sevih MC4100 in MG1655.

'''rel operon in mehanizem celične smrti'''

Gena ''mazE'' in ''mazF'' sta kromosomska gena, ki sta del ''rel'' operona bakterije ''E. coli''. Gen ''mazE'' je lociran pred genom ''mazF'', pod skupnim promotorjem. Na operonu bakterije ''E. coli'' seva MC4100 so trije promotorji; P1, P2 in P3, ki so bili identificirani pred genom ''mazE''. Proteinska produkta MazE and MazF tvorita kompleks, ki inhibira transkripcijo genov promotorjev P2 in P3 in tako zagotavlja avto-regulacijo transkripcije. Koncentracija antitoksina glede na koncentracijo toksina je limitni faktor pri vklopu in izklopu operona. Natančneje ''rel'' operon bakterije ''E. coli'' sestoji iz štirih genov ''relA, mazE, mazF'' in ''mazG''. Transkripcija z P2 in P3 promotorjev vodi do produkcije MazEF mRNA in translacija proizvaja MazE in MazF proteinske produkte. MazE in MazF tvori kompleks v 4:2 stehiometriji. Kompleks zavira nadaljnjo transkripcijo teh genov. MazE je konstitutivno cepljen s ClpAP in sproščen MazF cepi RNA, kar vodi do celične smrti.

== Antibiotiki, ki inhibirajo transkripcijo in/ali translacijo==
Antibiotiki, ki inhibirajo transkripcijo in/ali translacijo, škodljivo vplivajo preko indukcije mazEF-posredovane PCD na celico. Zmanjšana stopnja transkripcije in translacije zmanjša količino MazE. To bo skupaj z dejstvom, da je MazE razgrajen z celičnimi proteazami, vodilo do povečanja koncentracije prostega MazF. Najprej so testirali učinke na sistemu številnih antibiotikov, vključno z rifampicinom, kloramfenikolom in spektinomicinom. V ne mutiranih verzijah genov je bilo ugotovljeno, da že kratko inhibiranje transkripcije ali translacije z temi antibiotiki, zadostuje za sprožitev mazEF-posredovane smrti. Nasprotno izbris mazEF iz bakterijskega kromosoma prepreči celično smrt v prisotnosti antibiotikov. Treba je opozoriti na to, da je bila od mazEF odvisna bakteriocidnost opažena pri kloramfenikolu in spektomicinu, ko so celice rastle na minimalnem nebogatem mediju. Tako vidimo, da je bakteriocidnost teh dveh antibiotikov odvisna od okoljskih pogojev.

== ROS odvisna/neodvisna celična smrt==

Kasneje je bilo ugotovljeno, da ti antibiotiki, ki vplivajo na transkripcijo in translacijo povzročijo ROS odvisno celično smrt, posredovano z mazEF sistemom, medtem ko ti, ki povzročijo poškodbe DNA inducirane celične smrti (npr. kinoloni) pa po ROS neodvisni poti. Poleg tega so popolni anaerobni pogoji preprečili smrt posredovano z antibiotiki, ki inhibirajo transkripcijo in translacijo, ne pa smrti povzročene z antibiotiki, ki povzročijo DNA poškodbe. Dodajanje EDF-ja je povečalo tako za ROS odvisno mazEF- posredovano celično smrt za rifampicin kot tudi za ROS-neodvisno mazEF-posredovano celično smrt za nalidiksinske kisline-antibiotike, ki poškodujejo DNA. Pri tvorjenju PCD z reaktivnimi kisikovimi spojinami (ROS) proces zahteva prisotnost zunajceličnega smrtnega faktorja (EDF). Ta način delovanja nakazuje, da uporaba sintetičnega EDF skupaj z kinoloni, lahko poveča učinkovitost ubijanja bakterij. Poleg tega se lahko bakteriostatični antibiotiki pretvorijo v baktericidne z uporabo EDF za vključitev mazEF sistema.
Neka druga skupina raziskovalcev je z merjenjem povečanja fluorescence HPF (hidroksifenil fluorescein) dokazala, da ROS niso bile nujno prisotne in verjetno tudi neodgovorne za ubijanje z antibiotiki, ker ni bilo razlike v preživetju celic, ko je bila E.Coli tretirana v aerobnih in anaerobnih pogojih. Različni avtorji so torej poročali o različnih rezultatih, ki so se med sabo izključevali.

== Viri ==
B. C. Mohan Ramisetty, B. Natarajan, R. Sarojini Santhosh, ''mazEF''-mediated programmed cell death in bacteria: ‘‘What is this?’’, Crit Rev Microbiol, Published online, 24 June, 2013

H. Engelberg-Kulka, B. Sat, M. Reches, S. Amitai and R. Hazan, TRENDS in Microbiology, Bacterial programmed cell death systems as targets for antibiotics, Vol.12, No.2, 2004

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

I. Kolodkin-Gal, B. Sat, A. Keshet, H. Endelberg-Kulka, The Communication Factor EDF and the Toxin-Antitoxin Module mazEF Determine the Mode of Action of Antibiotics, 16 December, 2008, Research article.

Mehanizem celične smrti po delovanju antibiotikov

2017-05-16T20:43:32Z

Karmenzbogar:

Mehanizem celične smrti po delovanju antibiotikov

2017-05-16T20:41:41Z

Karmenzbogar:

Mehanizem celične smrti po delovanju antibiotikov

2017-05-16T20:41:24Z

Karmenzbogar:

Mehanizem celične smrti po delovanju antibiotikov

2017-05-16T20:40:46Z

Karmenzbogar: /* rel operon in mehanizem celične smrti */

Mehanizem celične smrti po delovanju antibiotikov

2017-05-16T20:37:58Z

Karmenzbogar: /* Toksin-antitoksin sistemi */

Mehanizem celične smrti po delovanju antibiotikov

2017-05-16T20:32:25Z

Karmenzbogar: /* rel operon in izražanje genov */

Talk:Mehanizem celične smrti po delovanju antibiotikov

2017-05-16T20:31:50Z

Karmenzbogar: New page: Uvod, toksin-antitoksin sistemi, rel operon in mehanizem celične smrti - Karmen Žbogar

Uvod, toksin-antitoksin sistemi, rel operon in mehanizem celične smrti - Karmen Žbogar

Mehanizem celične smrti po delovanju antibiotikov

2017-05-16T20:24:37Z

Karmenzbogar:

Mehanizem celične smrti po delovanju antibiotikov

2017-05-16T20:24:01Z

Karmenzbogar:

Mehanizem celične smrti po delovanju antibiotikov

2017-05-16T20:22:27Z

Karmenzbogar:

Mehanizem celične smrti po delovanju antibiotikov

2017-05-16T20:04:21Z

Karmenzbogar:

Mehanizem celične smrti po delovanju antibiotikov

2017-05-16T19:56:58Z

Karmenzbogar: New page: Kot odziv na učinke antibiotikov so mikrobi razvili genetske in biokemijske poti za rezistenco na večino dolgo uporabljenih antimikrobnih sredstev. Edini način s katerim se bomo lahko ...

Kot odziv na učinke antibiotikov so mikrobi razvili genetske in biokemijske poti za rezistenco na večino dolgo uporabljenih antimikrobnih sredstev. Edini način s katerim se bomo lahko še naprej zanašali na zdravljenje z antibiotiki je prek stalnih prizadevanj za odkrivanje novih antimikrobnih učinkovin in opredeliti nove genetske in biokemijske poti, ki vodijo v smrt celice.

V bakteriji je ena najbolj raziskanih oblik programirane celične smrti posredovana preko specifičnih genskih modulov imenovanih ''moduli odvisnosti'' ali toksin-antitoksin sistemi (TA). Vsak modul je sestavljen iz para genov, ki določata dve komponenti. Drugi gen kodira stabilni toksin, prvi gen pa kodira labilni antitoksin, ki ovira delovanje toksina. TA sistemi so bili odkriti predvsem v bakterijah Escherichia coli na plazmidih z nizkim številom kopij in še nekaterih drugih ekstra-kromosomskih. Genetske enote toksina in antitoksina so poimenovali ''moduli odvisnosti'', ker so celice ''odvisne'' od kratko obstoječega produkta, saj se labilni antitoksin razgradi hitreje kot stabilni toksin, njihova sinteza de novo pa je ključna za preživetje tovrstnih celic. TA sistemi, od katerih so nekateri homologni ekstra-kromosomskim ''modulom odvisnosti'' se pojavljajo tudi v kromosomu bakterije E. coli in številnih drugih bakterij. Prvi modul na bakterijskem kromosomu, opisan kot reguliran in odgovoren za PCS je mazEF modul, ki spada pod TA sistem tipa II. Toksin-antitoksin sistem mazEF je bil dokazan kot prisoten in funkcionalen v sevih MC4100 in MG1655.

Gena mazE in mazF sta kromosomska gena, ki sta del rel operona bakterije E. coli. Gen mazE je lociran pred genom mazF, pod skupnim promotorjem. Na operonu bakterije E. coli seva MC4100 so trije promotorji; P1, P2 in P3, ki so bili identificirani pred genom mazE. Proteinska produkta MazE and MazF tvorita kompleks, ki inhibira transkripcijo genov promotorjev P2 in P3 in tako zagotavlja avto-regulacijo transkripcije. Koncentracija antitoksina glede na koncentracijo toksina je limitni faktor pri vklopu in izklopu operona. Natančneje rel operon E. coli sestoji iz štirih genov relA, mazE, mazF in mazG. Transkripcija z P2 in P3 promotorjev vodi do produkcije MazEF mRNA in translacija proizvaja MazE in MazF proteinske produkte. MazE in MazF tvori kompleks v 4:2 stehiometriji. MazE2-MazF2-MazE2 kompleks zavira nadaljnjo transkripcijo teh genov. MazE je konstitutivno cepljen s ClpAP in sproščen MazF cepi RNA, kar vodi do celične smrti.

Mehanizmi delovanja in odpornosti proti antibiotikom

2017-05-16T19:55:48Z

Karmenzbogar:

V študijskem letu 2016/17 seminarji obravnavajo področje antibiotikov: kako delujejo in kako pride do razvoja odpornosti proti njim. Tema je razdeljena na 16 poglavij. Naslovi so navedeni na prvem seznamu le kot okvirne teme in jih lahko spremenite, ne smete pa se odmakniti od osnovne teme seminarja.

Vsako temo obdelajo praviloma trije, lahko pa tudi samo dva študenta. Predlagate lahko tudi dodatne teme. Vsaka skupina pripravi povzetek seminarja z vsaj 1000 besedami in ne več kot 1500 besedami in ga objavi na tem wikiju. Povzetek ne vsebuje slikovnega gradiva, lahko pa vključuje povezave do slik in videov na spletu. Navedite do 5 ključnih virov (ti ne štejejo v vsoto 1000 besed), ki ste jih uporabili. Osredotočite se na osnovno temo, ki ste si jo izbrali in vključite čim manj splošnega uvoda. Ne opisujte potekov bolezni! Pripravite tudi predstavitev, dolgo pribl. 15 min. Razširjenega seminarja ni treba pripraviti v pisni obliki; napišete samo povzetek na wikiju in predstavite seminar v predavalnici.

Vsaka skupina mora objaviti povzetek seminarja na wikiju najkasneje en dan pred predstavitvijo (do polnoči), torej najkasneje v nedeljo ali v torek za ponedeljkove oziroma sredine seminarje. Predstavitve seminarjev 1-4 bodo 22. maja, 5-8 24. maja, 9-12 29. maja, 13-16 31. maja 2017. Za vsak seminar imate na voljo 14-18 minut časa, da ga predstavite, sledi pa razprava (~5 min.). Vsak član skupine mora predstaviti en del seminarja, pri čemer mora biti delo enakomerno razdeljeno med vse. V povzetku navedite, kdo je napisal kateri del (na wiki strani uporabite zavihek 'discussion').

Vsebina seminarjev je izpitna snov. Iz teme seminarjev sta običajno dve vprašanji od ~30, kolikor jih ima celoten izpit.

Poglavja za seminarje so:

# Mehanizem delovanja kinolonov
# Mehanizem delovanja rifamicinov
# Mehanizem delovanja betalaktamov in glikopeptidov
# Inhibitorji podenote 30 S ribosoma
# Inhibitorji podenote 50 S ribosoma
# Mehanizem celične smrti po delovanju antibiotikov
# Protimikrobna sredstva v živilski industriji - peptidni antibiotiki
# Protimikrobni polimeri
# Delovanje rastlinskih fenolnih spojin na bakterije
# Strategije v boju proti biofilmom
# Proti antibiotikom občutljivi koki (enterokoki, stafilokoki, streptokoki)
# Proti antibiotikom odporne mikobakterije in nejserije
# Entereobakterije, ki proizvajajo ESBL in odporne proti karbapenemu
# Proti antibiotikom odporni psevdomonas in acinetobakter
# Delovanje na plazmide za zmanjševanje širjenja odpornosti med bakterijami
# Fagi v boju proti patogenim bakterijam

----

Vpišite se v oklepaj za naslovom seminarja:

# [[Mehanizem delovanja kinolonov]] (Pia Lavriha, Domen Vaupotič, Neli Sedej)
# [[Mehanizem delovanja rifamicinov]] ( Urban Ferčec, Aljaž Božič, Mateja Luzar)
# [[Mehanizem delovanja betalaktamov in glikopeptidov]] (Ivančir, Lenardič, Cafun)
# Inhibitorji podenote 30 S ribosoma
# [[Inhibitorji podenote 50 S ribosoma]] (Tomaž Žigon, Ana Potočnik)
# [[Mehanizem celične smrti po delovanju antibiotikov ]] (Karmen Žbogar, Natalija Pucihar, Katja Malensek)
# Protimikrobna sredstva v živilski industriji - peptidni antibiotiki
# [[Protimikrobni polimeri]] (David Dolhar, Jaka Kos)
# Delovanje rastlinskih fenolnih spojin na bakterije (Valentina Novak, Tanja Peric, Maksimiljan Adamek)
# Strategije v boju proti biofilmom(Klemenčič, Vogrinec, Hudovernik)
# Proti antibiotikom občutljivi koki (enterokoki, stafilokoki, streptokoki)
# Proti antibiotikom odporne mikobakterije in nejserije (David Titovsek, Iztok Štuhec, Maša Zorman)
# Entereobakterije, ki proizvajajo ESBL in odporne proti karbapenemu (Anja Šantl, Liza Otorepec, Dominik Rebek)
# Proti antibiotikom odporni psevdomonas in acinetobakter(Janja Murn, Katarina van Midden, Vida Štrancar)
# Delovanje na plazmide za zmanjševanje širjenja odpornosti med bakterijami (Zala Živič, Ana Halužan Vasle)
# Fagi v boju proti patogenim bakterijam (Jošt Hočevar, Nejc Arh, Aljoša Marinko)

Ko boste pripravljali povzetek, naslov teme povežite z novo wiki-stranjo s povzetkom. Na koncu besedila (pod viri) v novo vrstico dodajte oznaki:
<nowiki>[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]</nowiki>

Primer, kako so bili urejeni seminarji v prejšnjih letih, si lahko ogledate na strani [[Struktura kromatina]] (2013/14).