https://wiki.fkkt.uni-lj.si/api.php?action=feedcontributions&feedformat=atom&user=Katarina+Gomirsek 2026-06-19T10:17:32Z User contributions MediaWiki 1.45.3 https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=NRPieceS&diff=26095 2026-05-13T06:50:24Z

<p>Katarina Gomirsek: </p> <hr /> <div>[https://2025.igem.wiki/marburg/ NRPieceS] je projekt ekipe študentov iz Marburga v Nemčiji, ki je dosegel nagrado za najboljšo zbirko delov, najboljši projekt na področju kužnih bolezni in najboljši program, uvrščen pa je bil tudi med najboljših 10 na iGEM tekmovanju.<br /> <br /> ==Uvod==<br /> <br /> Predvideva se, da bo antimikrobna rezistenca do leta 2050 postala glavni vzrok smrti na svetu, kar pomeni, da bo ena oseba zaradi tega umrla približno vsake 3 sekunde. Ta pojav imenujejo tudi tiha pandemija. Zanjo so v večini dgovorne t. i. ESKAPE bakterije, kamor spadajo &lt;em&gt;Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa&lt;/em&gt; in &lt;em&gt;Enterobacter species&lt;/em&gt;. Za borbo proti antimikrobni rezistenci je ključno čim hitrejše in učinkovitejše odkrivanje novih protimikrobnih učinkovin. Cilj je bil razviti inovativen pristop za pospešitev odkrivanja novih alternativ klasičnim antibiotikom. Obrnili so se na neribosomske peptid sintetaze (NRPS), ki jih že naravno vsebujejo določene bakterijske vrste. Gre za velike modularne encime, kjer ima vsak modul točno določeno funkcijo za selekcijo, aktivacijo in dodajanje ustrezne aminokisline na rastočo peptidno verigo, določena kombinacija in zaporedje modulov pa omogoči sintezo točno določenega neribosomnega peptida (NRP). S kombinacijo NRPS modulov iz različnih organizmov bi lahko ustvarili nove peptide, ki ne obstajajo v naravi in imajo potencialno antimikrobno aktivnost. Idejo so dobili po zgledu drugih znanih biološko aktivnih spojin, kot so penicilin, romidepsin in lovastatin, katerih sintezo katalizirajo NRPS. Trenutno je že več kot 20 NRP odobrenih za uporabo v medicini. Pri sintezi neribosomnih peptidov se poleg 20 proteinogenih aminokislin lahko uporabijo tudi druge aminokisline, poleg tega so sintetizirani peptidi lahko linearni ali ciklični, aminokisline pa zaradi možnosti epimerizacije v njih nastopajo tako v L kot v D konfiguraciji, kar da izredno raznolike možnosti sinteze novih NRP. Ekipa študentov je razvila sinteznobiološko platformo NRPieceS, ki omogoča enostavno ustvarjanje vellikih knjižnic NRP. Osnova je kombinatorična sintezna knjižnica, ki omogoča načrtovanje in sintezo novih peptidov z uporabo NRPS. Zbirka NRPieceS vsebuje 160 plazmidov. Za enostavnejše načrtovanje novih NRPS so ustvarili tudi program mATChmaker.<br /> <br /> ==Izdelava NRPieceS knjižnice==<br /> <br /> Za osnovo knjižnice so uporabili nukleotidna zaporedja za 5 nativnih NRPS, ki katalizirajo sintezo cikličnih peptidov, vendar so zaradi visoko ponavljajočih se zaporedij s PCR uspešno pomnožili le 4 zapise za NRPS, kasneje se ena od preostalih NRPS tudi ni uspešno izražala. Delo so zato nadaljevali le s tremi NRPS. Osredotočili so se na ciklične peptide, ker se ti na tarče vežejo z več kontaktnimi točkami kot linearni peptidi, kar jim poveča afiniteto vezave. Ta lahko doseže rede velikosti, ki jih najdemo pri protitelesih. Zapise za nativne NRPS so vstavili v ekspresijske vektorje. Sestavili so še 35 donorskih vektorjev, izmed katerih je vsak nosil zapis za en modul za izmenjavo, in akceptorske vektorje, znotraj katerih je bila na točno določenih mestih omogočena enostavna izmenjava modulov.<br /> <br /> Ker so zaporedja za nativne NRPS dolga več deset kbp, so za vstavljanje v vektorje in transformacijo gostiteljskih celic neprimerna. Zato so njihove zapise razcepili na 3 dele in vsakega vstavili v enega od plazmidov pACYC, pCOLA in pCDF, ker so ti optimizirani za ekspresijo proteinov z večplazmidnimi sistemi v &lt;em&gt;E. Coli&lt;/em&gt;. To omogoča hkratno transformacijo &lt;em&gt;E. Coli&lt;/em&gt; z vsemi tremi plazmidi in izražanje NRPS. Vsak plazmid nosi gen za rezistenco na drug antibiotik za selekcijo in rast le tistih celic, ki so hkrati sprejele vse 3 plazmide. Zapisi za NRPS so bili razdeljeni na XUT&lt;sup&gt;I&lt;/sup&gt; (eXchange Unit) mestih na 3 segmente: iniciacijski, elongacijski in terminacijski. Tako so dobili 9 vektorjev z razcepljenimi zapisi za nativne NRPS.<br /> Ekspresijska kaseta za nativne NRPS vključuje inducibilen araBAD promotor, RBS, zapise za razcepljene inteine, ki se nahajajo na ustreznih koncih inserta, in terminator. Razcepljeni inteini omogočijo posttranslacijsko sestavljanje treh polipeptidnih verig NRPS v en funkcionalen encim. Vnos arabinoze v celico se lahko zgodi, ker se v bakterijah po transformaciji izražata arabinozni transporter AraE in regulator AraC pod konstitutivnim promotorjem in sta zapisana na vseh treh plazmidih.<br /> <br /> NRPieceS knjižnici so dodali še akceptorske vektorje. Njihova osnova so bili na 3 dele razdeljeni zapisi za nativne NRPS, na identificiranih mestih XUT&lt;sup&gt;I&lt;/sup&gt; znotraj zaporedij pa so uvedli restrikcijska mesta za BsaI in ekspresijsko kaseto za mCherry namesto posameznih modulov. Ta mesta so namenjena izmenjevanju modulov NRPS in v primeru, da sta restrikcija in ligacija pravilno potekli, se iz zapisa za NRPS izreže kaseta za mCherry in kolonije bakterij bojo bele barve. To služi za hitro vizualno identifikacijo ustreznih bakterijskih kolonij.<br /> Hkrati so skonstruirali tudi donorske vektorje z NRPS moduli, ki se jih lahko zamenjuje z moduli na mestih XUTI. Zamenjava katerega izmed modulov bi povzročila spremembo aminokislinskega zaporedja NRPS, s tem pa tudi spremenila zaporedje končnega peptida. Konstrukcija teh treh vrst vektorjev je bila izvedena s sestavljanjem Gibsonu. Posamezne module v akceptorskih vektorjih so izmenjevali z Golden Gate metodo.<br /> <br /> ==Izražanje NRPS==<br /> <br /> Po sestavljanju NRPieces knjižnice so testirali ekspresijo novoustvarjenih NRPS. Kot gostiteljski organizem so izbrali &lt;em&gt;E. Coli&lt;/em&gt;. Izbrali so jo, ker je enostavno dostopna in genetsko precej sorodna bakterijam iz rodov &lt;em&gt;Photorhabdus&lt;/em&gt; in &lt;em&gt;Xenorhabdus&lt;/em&gt;, ki naravno izražajo NRPS. V njej so izražali tako že poznane NRPS, ki so prisotne v naravi, kot novoustvarjene NRPS, ki so jih dobili ali s kombiniranjem delov razcepljenih zapisov za nativne NRPS ali z izmenjavo posameznih modulov. Ustvarili so knjižnico hibridnih NRPS, ki so jih dobili s kombinacijo delov razcepljenih nativnih NRPS in NRPS, ki so jim izmenjali posamezne module. Za induciranje izražanja NRPS so v gojišča dodali arabinozo. Za negativno kontrolo so bakterije nanesli na gojišče brez arabinoze. Ob uspešni ekspresiji se iz vsakega plazmida izrazi del NRPS skupaj z inteini. Inteini sprožijo samoizrezovanje in sestavljanje NRPS v celoto, funkcionalna NRPS pa katalizira sintezo NRP. Iz prisotnosti produkta, ki ga pričakujemo z določeno NRPS, se sklepa na uspešno izražanje. Da bi bile meritve čim bolj zanesljive in ponovljive, so za določanje prisotnosti in količine nastalih peptidov uporabljali LC-MS s kalibracijskimi krivuljami, slepimi vzorci in dodatnimi kontrolami. Za čiščenje vzorcev so se poslužili HPLC ter NMR analize za dodatno oceno čistosti in potrditev strukture produkta.<br /> <br /> ==Testiranje antimikrobne aktivnosti==<br /> <br /> Nastale NRP so testirali proti ESKAPE bakterijam, ki so odporne na antibiotike. V praksi so testiranje izvedli na določenih bakterijah iz te skupine, v nekaterih primerih pa so uporabili njim sorodne organizme. Peptide so testirali tudi na visokoobčutljivem sevu &lt;em&gt;Bacillus subtilis&lt;/em&gt;, ki se tipično uporablja za zaznavanje nizkih koncentracij antibiotikov. Posamezno vrsto bakterije so razmazali na ploščo s trdnim LB gojiščem. Nato so nanjo v ustreznih razmikih nakapali posamezne kapljice ekstraktov NRP. Eksperiment so ponovili tudi z diski filtrirnega papirja, prepojenimi z ekstrakti. To so čez noč inkubirali in naslednji dan opazovali velikosti lis, kjer bakterije niso zrasle. Za pozitivno kontrolo so uporabili gentamicin s koncentracijo 10 mg/mL, za negativno kontrolo pa ekstrakte neinduciranih kultur in kultur, ki so vsebovale plazmide brez zapisov za NRPS. Ker so skoraj vsi testirani ekstrakti dali pozitivne rezultate, so sklepali, da so ti lažno pozitivni. Ugotovili so, da so v ekstraktih prisotni antibiotiki iz gojišč in so zato transformirane bakterije namnožili v gojiščih brez antibiotikov in eksperiment ponovili. Ob ponovitvi testiranja so jim izmed 63 NRP, ki so jih sintetizirale NRPS z izmenjanimi moduli, dali pozitiven rezultat 4 vzorci. NRPS, ki so jih ustvarili s kombiniranjem razcepljenih zapisov nativnih NRPS, niso dale nobenega pozitivnega rezultata. Opazili so tudi razliko med grampozitivnimi in gramnegativnimi bakterijami. Slednje so bile na antibiotike manj občutljive, najverjetneje zaradi dodatne zunanje membrane, ki je oteževala vnos antibiotikov v celice. Zato so želeli preizkusiti še drugačen način dostave NRP.<br /> <br /> ==Dostava NRP v bakterije==<br /> <br /> Za dostavo NRP v celice so se odločili za strategijo trojanskega konja. To pomeni, da so antimikrobne peptide vezali na druge molekule, ki jih bakterije naravno transportirajo v celico. Tako se antimikrobne učinkovine izognejo obrambnim mehanizmom bakterije in pridejo do tarče v večji količini. Skupina je poskusila z vezavo NRP na sideroforje s klik kemijo. Tak pristop zahteva prisotnost komponent s funkcionalnimi skupinami, kot so terminalni alkini in azidi. Za ta namen so sintetizirali amid, ki vsebuje kateholno in alkinsko skupino. Prva deluje kot siderofor in se koordinira na Fe&lt;sup&gt;3+&lt;/sup&gt; ione za olajšan vnos v bakterije, druga pa omogoča izvedbo klik reakcije. Pripravli so tudi donorski vektor, ki nosi zapis za modul NRPS, ki v NRP omogoči dodajanje 4-azido-L-fenilalanina (AzF). Tega so vključili na zadnjo možno pozicijo v zapisu za NRPS na terminacijskem plazmidu. Za vezavo NRP na siderofor so izvedli z bakrom katalizirano azid-alkin cikloadicijo. Katalitsko aktiven Cu(I) so razvijali in situ z redukcijo CuSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; z natrijevim askorbatom v prisotnosti THPTA, ki stabilizira Cu(I). Z LC-MS so potrdili nastanek želenih produktov, zaradi časovne stiske pa niso uspeli testirati učinkovitosti vnosa na siderofor vezanih NRP v bakterije.<br /> <br /> ==Zaključek==<br /> <br /> V okviru študentskega projekta NRPieceS je bila izdelana knjižnica plazmidov, ki omogočajo hitrejše načrtovanje, izražanje in testiranje protimikrobne aktivnosti novih NRP, ki v naravi ne obstajajo. Ustvarili so 9 ekspresijskih plazmidov, ki vsebujejo razcepljene zapise za 3 nativne NRPS, 9 akceptorskih plazmidov in 35 donorskih plazmidov z zapisi za posamezne NRPS module, ki se jih lahko izmenjuje z moduli na določenih mestih v 9 akceptorskih plazmidih. S kombinacijo delov posameznih nativnih NRPS in izmenjavo modulov so uspešno sestavili in karakterizirali 105 plazmidov z zaporedji, ki kodirajo za nove NRPS. Od tega so uspešno izrazili 95 NRPS, antimikrobno aktivnost pa so preverjali 93 novim NRP in kot učinkovite proti ESKAPE bakterijam identificirali 4 NRP.<br /> <br /> ==Viri==<br /> <br /> https://2025.igem.wiki/marburg/</div>

Katarina Gomirsek https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=NRPieceS&diff=26089 2026-05-12T14:08:31Z

<p>Katarina Gomirsek: </p> <hr /> <div>[https://2025.igem.wiki/marburg/ NRPieceS] je projekt ekipe študentov iz Marburga v Nemčiji, ki je dosegel nagrado za najboljšo zbirko delov, najboljši projekt na področju kužnih bolezni in najboljši program, uvrščen pa je bil tudi med najboljših 10 na iGEM tekmovanju.<br /> <br /> ==Uvod==<br /> <br /> Predvideva se, da bo antimikrobna rezistenca do leta 2050 postala glavni vzrok smrti na svetu, kar pomeni, da bo ena oseba zaradi tega umrla približno vsake 3 sekunde. Ta pojav imenujejo tudi tiha pandemija. Zanjo so v večini dgovorne t. i. ESKAPE bakterije, kamor spadajo &lt;em&gt;Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa&lt;/em&gt; in &lt;em&gt;Enterobacter species&lt;/em&gt;. Za borbo proti antimikrobni rezistenci je ključno čim hitrejše in učinkovitejše odkrivanje novih protimikrobnih učinkovin. Cilj je bil razviti inovativen pristop za pospešitev odkrivanja novih alternativ klasičnim antibiotikom. Obrnili so se na neribosomske peptid sintetaze (NRPS), ki jih že naravno vsebujejo določene bakterijske vrste. Gre za velike modularne encime, kjer ima vsak modul točno določeno funkcijo za selekcijo, aktivacijo in dodajanje ustrezne aminokisline na rastočo peptidno verigo, določena kombinacija in zaporedje modulov pa omogoči sintezo točno določenega neribosomnega peptida (NRP). S kombinacijo NRPS modulov iz različnih organizmov bi lahko ustvarili nove peptide, ki ne obstajajo v naravi in imajo potencialno antimikrobno aktivnost. Idejo so dobili po zgledu drugih znanih biološko aktivnih spojin, kot so penicilin, romidepsin in lovastatin, katerih sintezo katalizirajo NRPS. Trenutno je že več kot 20 NRP odobrenih za uporabo v medicini. Pri sintezi neribosomnih peptidov se poleg 20 proteinogenih aminokislin lahko uporabijo tudi druge aminokisline, poleg tega so sintetizirani peptidi lahko linearni ali ciklični, aminokisline pa zaradi možnosti epimerizacije v njih nastopajo tako v L kot v D konfiguraciji, kar da izredno raznolike možnosti sinteze novih NRP. Ekipa študentov je razvila sinteznobiološko platformo NRPieceS, ki omogoča enostavno ustvarjanje vellikih knjižnic NRP. Osnova je kombinatorična sintezna knjižnica, ki omogoča načrtovanje in sintezo novih peptidov z uporabo NRPS. Zbirka NRPieceS vsebuje 160 plazmidov. Za enostavnejše načrtovanje novih NRPS so ustvarili tudi program mATChmaker.<br /> <br /> ==Izdelava NRPieceS knjižnice==<br /> <br /> Za osnovo knjižnice so uporabili nukleotidna zaporedja za 5 nativnih NRPS, ki katalizirajo sintezo cikličnih peptidov, vendar so zaradi visoko ponavljajočih se zaporedij s PCR uspešno pomnožili le 4 zapise za NRPS, kasneje se ena od preostalih NRPS tudi ni uspešno izražala. Delo so zato nadaljevali le s tremi NRPS. Osredotočili so se na ciklične peptide, ker se ti na tarče vežejo z več kontaktnimi točkami kot linearni peptidi, kar jim poveča afiniteto vezave. Ta lahko doseže rede velikosti, ki jih najdemo pri protitelesih. Zapise za nativne NRPS so vstavili v ekspresijske vektorje. Sestavili so še 35 donorskih vektorjev, izmed katerih je vsak nosil zapis za en modul za izmenjavo, in akceptorske vektorje, znotraj katerih je bila na točno določenih mestih omogočena enostavna izmenjava modulov.<br /> <br /> Ker so zaporedja za nativne NRPS dolga več deset kbp, so za vstavljanje v vektorje in transformacijo gostiteljskih celic neprimerna. Zato so njihove zapise razcepili na 3 dele in vsakega vstavili v enega od plazmidov pACYC, pCOLA in pCDF, ker so ti optimizirani za ekspresijo proteinov z večplazmidnimi sistemi v &lt;em&gt;E. Coli&lt;/em&gt;. To omogoča hkratno transformacijo &lt;em&gt;E. Coli&lt;/em&gt; z vsemi tremi plazmidi in izražanje NRPS. Vsak plazmid nosi gen za rezistenco na drug antibiotik za selekcijo in rast le tistih celic, ki so hkrati sprejele vse 3 plazmide. Zapisi za NRPS so bili razdeljeni na XUT&lt;sup&gt;I&lt;/sup&gt; (eXchange Unit) mestih na 3 segmente: iniciacijski, elongacijski in terminacijski. Tako so dobili 9 vektorjev z razcepljenimi zapisi za nativne NRPS.<br /> Ekspresijska kaseta za nativne NRPS vključuje inducibilen araBAD promotor, RBS, zapise za razcepljene inteine, ki se nahajajo na ustreznih koncih inserta, in terminator. Razcepljeni inteini omogočijo posttranslacijsko sestavljanje treh polipeptidnih verig NRPS v en funkcionalen encim. Vnos arabinoze v celico se lahko zgodi, ker se v bakterijah po transformaciji izražata arabinozni transporter AraE in regulator AraC pod konstitutivnim promotorjem in sta zapisana na vseh treh plazmidih.<br /> <br /> NRPieceS knjižnici so dodali še akceptorske vektorje. Njihova osnova so bili na 3 dele razdeljeni zapisi za nativne NRPS, na identificiranih mestih XUT&lt;sup&gt;I&lt;/sup&gt; znotraj zaporedij pa so uvedli restrikcijska mesta za BsaI, kamor so nato vstavili ekspresijsko kaseto za mCherry. Ta mesta so namenjena izmenjevanju modulov NRPS in v primeru, da sta restrikcija in ligacija pravilno potekli, se iz zapisa za NRPS izreže kaseta za mCherry in kolonije bakterij bojo bele barve. To služi za hitro vizualno identifikacijo ustreznih bakterijskih kolonij.<br /> Hkrati so skonstruirali tudi donorske vektorje z NRPS moduli, ki se jih lahko zamenjuje z moduli na mestih XUT&lt;sup&gt;I&lt;/sup&gt;. Zamenjava katerega izmed modulov bi povzročila spremembo aminokislinskega zaporedja NRPS, s tem pa tudi spremenila zaporedje končnega peptida. Konstrukcija teh treh vrst vektorjev je bila izvedena z Gibbson Assembly metodo. Zapise za NRPS so nato kombinirali in izmenjevali module z Golden Gate tehniko kloniranja.<br /> <br /> ==Izražanje NRPS==<br /> <br /> Po sestavljanju NRPieces knjižnice so testirali ekspresijo novoustvarjenih NRPS. Kot gostiteljski organizem so izbrali &lt;em&gt;E. Coli&lt;/em&gt;. Izbrali so jo, ker je enostavno dostopna in genetsko precej sorodna bakterijam iz rodov &lt;em&gt;Photorhabdus&lt;/em&gt; in &lt;em&gt;Xenorhabdus&lt;/em&gt;, ki naravno izražajo NRPS. V njej so izražali tako že poznane NRPS, ki so prisotne v naravi, kot novoustvarjene NRPS, ki so jih dobili ali s kombiniranjem delov razcepljenih zapisov za nativne NRPS ali z izmenjavo posameznih modulov. Ustvarili so knjižnico hibridnih NRPS, ki so jih dobili s kombinacijo delov razcepljenih nativnih NRPS in NRPS, ki so jim izmenjali posamezne module. Za induciranje izražanja NRPS so v gojišča dodali arabinozo. Za negativno kontrolo so bakterije nanesli na gojišče brez arabinoze. Ob uspešni ekspresiji se iz vsakega plazmida izrazi del NRPS skupaj z inteini. Inteini sprožijo samoizrezovanje in sestavljanje NRPS v celoto, funkcionalna NRPS pa katalizira sintezo NRP. Iz prisotnosti produkta, ki ga pričakujemo z določeno NRPS, se sklepa na uspešno izražanje. Da bi bile meritve čim bolj zanesljive in ponovljive, so za določanje prisotnosti in količine nastalih peptidov uporabljali LC-MS s kalibracijskimi krivuljami, slepimi vzorci in dodatnimi kontrolami. Za čiščenje vzorcev so se poslužili HPLC ter NMR analize za dodatno oceno čistosti in potrditev strukture produkta.<br /> <br /> ==Testiranje antimikrobne aktivnosti==<br /> <br /> Cilj je bil testirati nastale NRP proti ESKAPE bakterijam, ki so odporne na antibiotike. V praksi so testiranje izvedli na določenih bakterijah iz te skupine, v nekaterih primerih pa so uporabili njim sorodne organizme. Peptide so testirali tudi na visokoobčutljivem sevu &lt;em&gt;Bacillus subtilis&lt;/em&gt;, ki se tipično uporablja za zaznavanje nizkih koncentracij antibiotikov. Posamezno vrsto bakterije so razmazali na ploščo s trdnim LB gojiščem. Nato so nanjo v ustreznih razmikih nakapali posamezne kapljice ekstraktov NRP. Eksperiment so ponovili tudi z diski filtrirnega papirja, prepojenimi z ekstrakti. To so čez noč inkubirali in naslednji dan opazovali velikosti lis, kjer bakterije niso zrasle. Za pozitivno kontrolo so uporabili gentamicin s koncentracijo 10 mg/mL, za negativno kontrolo pa ekstrakte neinduciranih kultur in kultur, ki so vsebovale plazmide brez zapisov za NRPS. Ker so skoraj vsi testirani ekstrakti dali pozitivne rezultate, so sklepali, da so ti lažno pozitivni. Ugotovili so, da so v ekstraktih prisotni antibiotiki iz gojišč in so zato transformirane bakterije namnožili v gojiščih brez antibiotikov in eksperiment ponovili. Ob ponovitvi testiranja so jim izmed 63 NRP, ki so jih sintetizirale NRPS z izmenjanimi moduli, dali pozitiven rezultat 4 vzorci. NRPS, ki so jih ustvarili s kombiniranjem razcepljenih zapisov nativnih NRPS, niso dale nobenega pozitivnega rezultata. Opazili so tudi razliko med grampozitivnimi in gramnegativnimi bakterijami. Slednje so bile na antibiotike manj občutljive, najverjetneje zaradi dodatne zunanje membrane, ki je oteževala vnos antibiotikov v celice. Zato so želeli preizkusiti še drugačen način dostave NRP.<br /> <br /> ==Dostava NRP v bakterije==<br /> <br /> Za dostavo NRP v celice so se odločili za strategijo trojanskega konja. To pomeni, da so antimikrobne peptide vezali na druge molekule, ki jih bakterije naravno transportirajo v celico. Tako se antimikrobne učinkovine izognejo obrambnim mehanizmom bakterije in pridejo do tarče v večji količini. Skupina je poskusila z vezavo NRP na sideroforje s klik kemijo. Tak pristop zahteva prisotnost komponent s funkcionalnimi skupinami, kot so terminalni alkini in azidi. Za ta namen so sintetizirali amid, ki vsebuje kateholno in alkinsko skupino. Prva deluje kot siderofor in se koordinira na Fe&lt;sup&gt;3+&lt;/sup&gt; ione za olajšan vnos v bakterije, druga pa omogoča izvedbo klik reakcije. Pripravli so tudi donorski vektor, ki nosi zapis za modul NRPS, ki v NRP omogoči dodajanje 4-azido-L-fenilalanina (AzF). Tega so vključili na zadnjo možno pozicijo v zapisu za NRPS na terminacijskem plazmidu, ker ta položaj najmanj ovira zvijanje polipeptidne verige NRPS, hkrati pa terminalni AzF predstavlja bolje dostopno mesto, da lahko poteče klik reakcija. Za vezavo NRP na siderofor so izvedli z bakrom katalizirano azid-alkin cikloadicijo. Katalitsko aktiven Cu(I) so razvijali in situ z redukcijo CuSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; z natrijevim askorbatom v prisotnosti THPTA, ki stabilizira Cu(I). Z LC-MS so potrdili nastanek želenih produktov, zaradi časovne stiske pa niso uspeli testirati učinkovitosti vnosa na siderofor vezanih NRP v bakterije.<br /> <br /> ==Zaključek==<br /> <br /> V okviru študentskega projekta NRPieceS je bila izdelana knjižnica plazmidov, ki omogočajo hitrejše načrtovanje, izražanje in testiranje protimikrobne aktivnosti novih NRP, ki v naravi ne obstajajo. Ustvarili so 9 ekspresijskih plazmidov, ki vsebujejo razcepljene zapise za 3 nativne NRPS, 9 akceptorskih plazmidov in 35 donorskih plazmidov z zapisi za posamezne NRPS module, ki se jih lahko izmenjuje z moduli na določenih mestih v 9 akceptorskih plazmidih. S kombinacijo delov posameznih nativnih NRPS in izmenjavo modulov so uspešno sestavili in karakterizirali 105 plazmidov z zaporedji, ki kodirajo za nove NRPS. Od tega so uspešno izrazili 95 NRPS, antimikrobno aktivnost pa so preverjali 93 novim NRP in kot učinkovite proti ESKAPE bakterijam identificirali 4 NRP.<br /> <br /> ==Viri==<br /> <br /> https://2025.igem.wiki/marburg/</div>

Katarina Gomirsek https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=NRPieceS&diff=26063 2026-05-11T19:01:50Z

<p>Katarina Gomirsek: </p> <hr /> <div>[https://2025.igem.wiki/marburg/ NRPieceS] je projekt ekipe študentov iz Marburga v Nemčiji, ki je dosegel nagrado za najboljšo zbirko delov, najboljši projekt na področju kužnih bolezni in najboljši program, uvrščen pa je bil tudi med najboljših 10 na iGEM tekmovanju.<br /> <br /> ==Uvod==<br /> <br /> Predvideva se, da bo antimikrobna rezistenca do leta 2050 postala glavni vzrok smrti na svetu, kar pomeni, da bo ena oseba zaradi tega umrla približno vsake 3 sekunde. Ta pojav imenujejo tudi tiha pandemija. Zanjo so v večini dgovorne t. i. ESKAPE bakterije, kamor spadajo &lt;em&gt;Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa&lt;/em&gt; in &lt;em&gt;Enterobacter species&lt;/em&gt;. Za borbo proti antimikrobni rezistenci je ključno čim hitrejše in učinkovitejše odkrivanje novih protimikrobnih učinkovin. Cilj je bil razviti inovativen pristop za pospešitev odkrivanja novih alternativ klasičnim antibiotikom. Obrnili so se na neribosomske peptid sintetaze (NRPS), ki jih že naravno vsebujejo določene bakterijske vrste. Gre za velike modularne encime, kjer ima vsak modul točno določeno funkcijo za selekcijo, aktivacijo in dodajanje ustrezne aminokisline na rastočo peptidno verigo, določena kombinacija in zaporedje modulov pa omogoči sintezo točno določenega neribosomnega peptida (NRP). S kombinacijo NRPS modulov iz različnih organizmov bi lahko ustvarili nove peptide, ki ne obstajajo v naravi in imajo potencialno antimikrobno aktivnost. Idejo so dobili po zgledu drugih znanih biološko aktivnih spojin, kot so penicilin, romidepsin in lovastatin, katerih sintezo katalizirajo NRPS. Trenutno je že več kot 20 NRP odobrenih za uporabo v medicini. Pri sintezi neribosomnih peptidov se poleg 20 proteinogenih aminokislin lahko uporabijo tudi druge aminokisline, poleg tega so sintetizirani peptidi lahko linearni ali ciklični, aminokisline pa zaradi možnosti epimerizacije v njih nastopajo tako v L kot v D konfiguraciji, kar da izredno raznolike možnosti sinteze novih NRP. Ekipa študentov je razvila sinteznobiološko platformo NRPieceS, ki omogoča enostavno ustvarjanje vellikih knjižnic NRP. Osnova je kombinatorična sintezna knjižnica, ki omogoča načrtovanje in sintezo novih peptidov z uporabo NRPS. Zbirka NRPieceS vsebuje 160 plazmidov. Za enostavnejše načrtovanje novih NRPS so ustvarili tudi program mATChmaker.<br /> <br /> ==Izdelava NRPieceS knjižnice==<br /> <br /> Za osnovo knjižnice so uporabili nukleotidna zaporedja za 5 nativnih NRPS, ki katalizirajo sintezo cikličnih peptidov, vendar so zaradi visoko ponavljajočih se zaporedij s PCR uspešno pomnožili le 4 zapise za NRPS, kasneje se ena od preostalih NRPS tudi ni uspešno izražala. Delo so zato nadaljevali le s tremi NRPS. Osredotočili so se na ciklične peptide, ker se ti na tarče vežejo z več kontaktnimi točkami kot linearni peptidi, kar jim poveča afiniteto vezave. Ta lahko doseže rede velikosti, ki jih najdemo pri protitelesih. Zapise za nativne NRPS so vstavili v ekspresijske vektorje. Sestavili so še 35 donorskih vektorjev, izmed katerih je vsak nosil zapis za en modul za izmenjavo, in akceptorske vektorje, znotraj katerih je bila na točno določenih mestih omogočena enostavna izmenjava modulov.<br /> <br /> Ker so zaporedja za nativne NRPS dolga več deset kbp, so za vstavljanje v vektorje in transformacijo gostiteljskih celic neprimerna. Zato so njihove zapise razcepili na 3 dele in vsakega vstavili v enega od plazmidov pACYC, pCOLA in pCDF, ker so ti optimizirani za ekspresijo proteinov z večplazmidnimi sistemi v &lt;em&gt;E. Coli&lt;/em&gt;. To omogoča hkratno transformacijo &lt;em&gt;E. Coli&lt;/em&gt; z vsemi tremi plazmidi in izražanje NRPS. Vsak plazmid nosi gen za rezistenco na drug antibiotik za selekcijo in rast le tistih celic, ki so hkrati sprejele vse 3 plazmide. Zapisi za NRPS so bili razdeljeni na XUT&lt;sup&gt;I&lt;/sup&gt; (eXchange Unit) mestih na 3 segmente: iniciacijski, elongacijski in terminacijski. Tako so dobili 9 vektorjev z razcepljenimi zapisi za nativne NRPS.<br /> Ekspresijska kaseta za nativne NRPS vključuje inducibilen araBAD promotor, RBS, zapise za razcepljene inteine, ki se nahajajo na ustreznih koncih inserta, in terminator. Razcepljeni inteini omogočijo posttranslacijsko sestavljanje treh polipeptidnih verig NRPS v en funkcionalen encim. Vnos arabinoze v celico se lahko zgodi, ker se v bakterijah po transformaciji izražata arabinozni transporter AraE in regulator AraC pod konstitutivnim promotorjem in sta zapisana na vseh treh plazmidih.<br /> <br /> NRPieceS knjižnici so dodali še akceptorske vektorje. Njihova osnova so bili na 3 dele razdeljeni zapisi za nativne NRPS, na identificiranih mestih XUT&lt;sup&gt;I&lt;/sup&gt; znotraj zaporedij pa so uvedli restrikcijska mesta za BsaI, kamor so nato vstavili ekspresijsko kaseto za mCherry. Ta mesta so namenjena izmenjevanju modulov NRPS in v primeru, da sta restrikcija in ligacija pravilno potekli, se iz zapisa za NRPS izreže kaseta za mCherry in kolonije bakterij bojo bele barve. To služi za hitro vizualno identifikacijo ustreznih bakterijskih kolonij.<br /> Hkrati so skonstruirali tudi donorske vektorje z NRPS moduli, ki se jih lahko zamenjuje z moduli na mestih XUT&lt;sup&gt;I&lt;/sup&gt;. Zamenjava katerega izmed modulov bi povzročila spremembo aminokislinskega zaporedja NRPS, s tem pa tudi spremenila zaporedje končnega peptida. Konstrukcija teh treh vrst vektorjev je bila izvedena z Gibbson Assembly metodo. Zapise za NRPS so nato kombinirali in izmenjevali module z Golden Gate tehniko kloniranja.<br /> <br /> ==Izražanje NRPS==<br /> <br /> Po sestavljanju NRPieces knjižnice so testirali ekspresijo novoustvarjenih NRPS. Kot gostiteljski organizem so izbrali &lt;em&gt;E. Coli&lt;/em&gt;. Izbrali so jo, ker je enostavno dostopna in genetsko precej sorodna bakterijam iz rodov &lt;em&gt;Photorhabdus&lt;/em&gt; in &lt;em&gt;Xenorhabdus&lt;/em&gt;, ki naravno izražajo NRPS. V njej so izražali tako že poznane NRPS, ki so prisotne v naravi, kot novoustvarjene NRPS, ki so jih dobili ali s kombiniranjem delov razcepljenih zapisov za nativne NRPS ali z izmenjavo posameznih modulov. Ustvarili so knjižnico hibridnih NRPS, ki so jih dobili s kombinacijo delov razcepljenih nativnih NRPS in NRPS, ki so jim izmenjali posamezne module. Za induciranje izražanja NRPS so v gojišča dodali arabinozo. Za negativno kontrolo so bakterije nanesli na gojišče brez arabinoze. Ob uspešni ekspresiji se iz vsakega plazmida izrazi del NRPS skupaj z inteini. Inteini sprožijo samoizrezovanje in sestavljanje NRPS v celoto, funkcionalna NRPS pa katalizira sintezo NRP. Iz prisotnosti produkta, ki ga pričakujemo z določeno NRPS, se sklepa na uspešno izražanje. Da bi bile meritve čim bolj zanesljive in ponovljive, so za določanje prisotnosti in količine nastalih peptidov uporabljali LC-MS s kalibracijskimi krivuljami, slepimi vzorci in dodatnimi kontrolami. Za čiščenje vzorcev so se poslužili HPLC ter NMR analize za dodatno oceno čistosti in potrditev strukture produkta.<br /> <br /> ==Testiranje antimikrobne aktivnosti==<br /> <br /> Cilj je bil testirati nastale NRP proti ESKAPE bakterijam, ki so odporne na antibiotike. V praksi so testiranje izvedli na določenih bakterijah iz te skupine, v nekaterih primerih pa so uporabili njim sorodne organizme. Peptide so testirali tudi na visokoobčutljivem sevu &lt;em&gt;Bacillus subtilis&lt;/em&gt;, ki se tipično uporablja za zaznavanje nizkih koncentracij antibiotikov. Posamezno vrsto bakterije so razmazali na ploščo s trdnim LB gojiščem. Nato so nanjo v ustreznih razmikih nakapali posamezne kapljice ekstraktov NRP. Eksperiment so ponovili tudi z diski filtrirnega papirja, prepojenimi z ekstrakti. To so čez noč inkubirali in naslednji dan opazovali velikosti lis, kjer bakterije niso zrasle. Za pozitivno kontrolo so uporabili gentamicin s koncentracijo 10 mg/mL, za negativno kontrolo pa ekstrakte neinduciranih kultur in kultur, ki so vsebovale plazmide brez zapisov za NRPS. Ker so skoraj vsi testirani ekstrakti dali pozitivne rezultate, so sklepali, da so ti lažno pozitivni. Ugotovili so, da so v ekstraktih prisotni antibiotiki iz gojišč in so zato transformirane bakterije namnožili v gojiščih brez antibiotikov in eksperiment ponovili. Ob ponovitvi testiranja so jim izmed 63 NRP, ki so jih sintetizirale NRPS z izmenjanimi moduli, dali pozitiven rezultat 4 vzorci. NRPS, ki so jih ustvarili s kombiniranjem razcepljenih zapisov nativnih NRPS, niso dale nobenega pozitivnega rezultata. Opazili so tudi razliko med grampozitivnimi in gramnegativnimi bakterijami. Slednje so bile na antibiotike manj občutljive, najverjetneje zaradi dodatne zunanje membrane, ki je oteževala vnos antibiotikov v celice. Zato so želeli preizkusiti še drugačen način dostave NRP.<br /> <br /> ==Dostava NRP v bakterije==<br /> <br /> Za dostavo NRP v celice so se odločili za strategijo trojanskega konja. To pomeni, da so antimikrobne peptide vezali na druge molekule, ki jih bakterije naravno transportirajo v celico. Tako se antimikrobne učinkovine izognejo obrambnim mehanizmom bakterije in pridejo do tarče v večji količini. Skupina je poskusila z vezavo NRP na sideroforje s klik kemijo. Tak pristop zahteva prisotnost komponent s funkcionalnimi skupinami, kot so terminalni alkini in azidi. Za ta namen so sintetizirali amid, ki vsebuje kateholno in alkinsko skupino. Prva deluje kot siderofor in se koordinira na Fe&lt;sup&gt;3+&lt;/sup&gt; ione za olajšan vnos v bakterije, druga pa omogoča izvedbo klik reakcije. Pripravli so tudi donorski vektor, ki nosi zapis za modul NRPS, ki v NRP doda 4-azido-L-fenilalanin (AzF). Tega so vključili na zadnjo možno pozicijo v zapisu za NRPS na terminacijskem plazmidu, ker ta položaj najmanj ovira zvijanje polipeptidne verige NRPS, hkrati pa terminalni AzF predstavlja bolje dostopno mesto, da lahko poteče klik reakcija. Za vezavo NRP na siderofor so izvedli z bakrom katalizirano azid-alkin cikloadicijo. Katalitsko aktiven Cu(I) so razvijali in situ z redukcijo CuSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; z natrijevim askorbatom v prisotnosti THPTA, ki stabilizira Cu(I). Z LC-MS so potrdili nastanek želenih produktov, zaradi časovne stiske pa niso uspeli testirati učinkovitosti vnosa na siderofor vezanih NRP v bakterije.<br /> <br /> ==Zaključek==<br /> <br /> V okviru študentskega projekta NRPieceS je bila izdelana knjižnica plazmidov, ki omogočajo hitrejše načrtovanje, izražanje in testiranje protimikrobne aktivnosti novih NRP, ki v naravi ne obstajajo. Ustvarili so 9 ekspresijskih plazmidov, ki vsebujejo razcepljene zapise za 3 nativne NRPS, 9 akceptorskih plazmidov in 35 donorskih plazmidov z zapisi za posamezne NRPS module, ki se jih lahko izmenjuje z moduli na določenih mestih v 9 akceptorskih plazmidih. S kombinacijo delov posameznih nativnih NRPS in izmenjavo modulov so uspešno sestavili in karakterizirali 105 plazmidov z zaporedji, ki kodirajo za nove NRPS. Od tega so uspešno izrazili 95 NRPS, antimikrobno aktivnost pa so preverjali 93 novim NRP in kot učinkovite proti ESKAPE bakterijam identificirali 4 NRP.<br /> <br /> ==Viri==<br /> <br /> https://2025.igem.wiki/marburg/</div>

Katarina Gomirsek https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=NRPieceS&diff=26050 2026-05-11T17:22:22Z

<p>Katarina Gomirsek: </p> <hr /> <div>[https://2025.igem.wiki/marburg/ NRPieceS] je projekt ekipe študentov iz Marburga v Nemčiji, ki je dosegel nagrado za najboljšo zbirko delov, najboljši projekt na področju kužnih bolezni in najboljši program, uvrščen pa je bil tudi med najboljših 10 na iGEM tekmovanju.<br /> <br /> ==Uvod==<br /> <br /> Predvideva se, da bo antimikrobna rezistenca do leta 2050 postala glavni vzrok smrti na svetu, kar pomeni, da bo ena oseba zaradi tega umrla približno vsake 3 sekunde. Ta pojav imenujejo tudi tiha pandemija. Zanjo so v večini dgovorne t. i. ESKAPE bakterije, kamor spadajo &lt;em&gt;Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa&lt;/em&gt; in &lt;em&gt;Enterobacter species&lt;/em&gt;. Za borbo proti antimikrobni rezistenci je ključno čim hitrejše in učinkovitejše odkrivanje novih protimikrobnih učinkovin. Cilj je bil razviti inovativen pristop za pospešitev odkrivanja novih alternativ klasičnim antibiotikom. Obrnili so se na neribosomske peptid sintetaze (NRPS), ki jih že naravno vsebujejo določene bakterijske vrste. Gre za velike modularne encime, kjer ima vsak modul točno določeno funkcijo za selekcijo, aktivacijo in dodajanje ustrezne aminokisline na rastočo peptidno verigo, določena kombinacija in zaporedje modulov pa omogoči sintezo točno določenega neribosomnega peptida (NRP). S kombinacijo NRPS modulov iz različnih organizmov bi lahko ustvarili nove peptide, ki ne obstajajo v naravi in imajo potencialno antimikrobno aktivnost. Idejo so dobili po zgledu drugih znanih biološko aktivnih spojin, kot so penicilin, romidepsin in lovastatin, katerih sintezo katalizirajo NRPS. Trenutno je že več kot 20 NRP odobrenih za uporabo v medicini. Pri sintezi neribosomnih peptidov se poleg 20 proteinogenih aminokislin lahko uporabijo tudi druge aminokisline, poleg tega so sintetizirani peptidi lahko linearni ali ciklični, aminokisline pa zaradi možnosti epimerizacije v njih nastopajo tako v L kot v D konfiguraciji, kar da izredno raznolike možnosti sinteze novih NRP. Ekipa študentov je razvila sinteznobiološko platformo NRPieceS, ki omogoča enostavno ustvarjanje vellikih knjižnic NRP. Osnova je kombinatorična sintezna knjižnica, ki omogoča načrtovanje in sintezo novih peptidov z uporabo NRPS. Zbirka NRPieceS vsebuje 160 plazmidov. Za enostavnejše načrtovanje novih NRPS so ustvarili tudi program mATChmaker.<br /> <br /> ==Izdelava NRPieceS knjižnice==<br /> <br /> Za osnovo knjižnice so uporabili nukleotidna zaporedja za 5 nativnih NRPS, ki katalizirajo sintezo cikličnih peptidov, vendar so zaradi visoko ponavljajočih se zaporedij s PCR uspešno pomnožili le 3 zapise za NRPS. Delo so zato nadaljevali le s tremi NRPS. Osredotočili so se na ciklične peptide, ker se ti na tarče vežejo z več kontaktnimi točkami kot linearni peptidi, kar jim poveča afiniteto vezave. Ta lahko doseže rede velikosti, ki jih najdemo pri protitelesih. Zapise za nativne NRPS so vstavili v ekspresijske vektorje. Sestavili so še 35 donorskih vektorjev, izmed katerih je vsak nosil zapis za en modul za izmenjavo, in akceptorske vektorje, znotraj katerih je bila na točno določenih mestih omogočena enostavna izmenjava modulov.<br /> <br /> Ker so zaporedja za nativne NRPS dolga več deset kbp, so za vstavljanje v vektorje in transformacijo gostiteljskih celic neprimerna. Zato so njihove zapise razcepili na 3 dele in vsakega vstavili v enega od plazmidov pACYC, pCOLA in pCDF, ker so ti optimizirani za ekspresijo proteinov z večplazmidnimi sistemi v &lt;em&gt;E. Coli&lt;/em&gt;. To omogoča hkratno transformacijo &lt;em&gt;E. Coli&lt;/em&gt; z vsemi tremi plazmidi in izražanje NRPS. Vsak plazmid nosi gen za rezistenco na drug antibiotik za selekcijo in rast le tistih celic, ki so hkrati sprejele vse 3 plazmide. Zapisi za NRPS so bili razdeljeni na XUT&lt;sup&gt;I&lt;/sup&gt; (eXchange Unit) mestih na 3 segmente: iniciacijski, elongacijski in terminacijski. Tako so dobili 9 vektorjev z razcepljenimi zapisi za nativne NRPS.<br /> Ekspresijska kaseta za nativne NRPS vključuje inducibilen araBAD promotor, RBS, zapise za razcepljene inteine, ki se nahajajo na ustreznih koncih inserta, in terminator. Razcepljeni inteini omogočijo posttranslacijsko sestavljanje treh polipeptidnih verig NRPS v en funkcionalen encim. Vnos arabinoze v celico se lahko zgodi, ker se v bakterijah po transformaciji izražata arabinozni transporter AraE in regulator AraC pod konstitutivnim promotorjem in sta zapisana na vseh treh plazmidih.<br /> <br /> NRPieceS knjižnici so dodali še akceptorske vektorje. Njihova osnova so bili na 3 dele razdeljeni zapisi za nativne NRPS, na identificiranih mestih XUT&lt;sup&gt;I&lt;/sup&gt; znotraj zaporedij pa so uvedli restrikcijska mesta za BsaI, kamor so nato vstavili ekspresijsko kaseto za mCherry. Ta mesta so namenjena izmenjevanju modulov NRPS in v primeru, da sta restrikcija in ligacija pravilno potekli, se iz zapisa za NRPS izreže kaseta za mCherry in kolonije bakterij bojo bele barve. To služi za hitro vizualno identifikacijo ustreznih bakterijskih kolonij.<br /> Hkrati so skonstruirali tudi donorske vektorje z NRPS moduli, ki se jih lahko zamenjuje z moduli na mestih XUT&lt;sup&gt;I&lt;/sup&gt;. Zamenjava katerega izmed modulov bi povzročila spremembo aminokislinskega zaporedja NRPS, s tem pa tudi spremenila zaporedje končnega peptida. Konstrukcija teh treh vrst vektorjev je bila izvedena z Gibbson Assembly metodo. Zapise za NRPS so nato kombinirali in izmenjevali module z Golden Gate tehniko kloniranja.<br /> <br /> ==Izražanje NRPS==<br /> <br /> Po sestavljanju NRPieces knjižnice so testirali ekspresijo novoustvarjenih NRPS. Kot gostiteljski organizem so izbrali &lt;em&gt;E. Coli&lt;/em&gt;. Izbrali so jo, ker je enostavno dostopna in genetsko precej sorodna bakterijam iz rodov &lt;em&gt;Photorhabdus&lt;/em&gt; in &lt;em&gt;Xenorhabdus&lt;/em&gt;, ki naravno izražajo NRPS. V njej so izražali tako že poznane NRPS, ki so prisotne v naravi, kot novoustvarjene NRPS, ki so jih dobili ali s kombiniranjem delov razcepljenih zapisov za nativne NRPS ali z izmenjavo posameznih modulov. Ustvarili so knjižnico hibridnih NRPS, ki so jih dobili s kombinacijo delov razcepljenih nativnih NRPS in NRPS, ki so jim izmenjali posamezne module. Za induciranje izražanja NRPS so v gojišča dodali arabinozo. Za negativno kontrolo so bakterije nanesli na gojišče brez arabinoze. Ob uspešni ekspresiji se iz vsakega plazmida izrazi del NRPS skupaj z inteini. Inteini sprožijo samoizrezovanje in sestavljanje NRPS v celoto, funkcionalna NRPS pa katalizira sintezo NRP. Iz prisotnosti produkta, ki ga pričakujemo z določeno NRPS, se sklepa na uspešno izražanje. Da bi bile meritve čim bolj zanesljive in ponovljive, so za določanje prisotnosti in količine nastalih peptidov uporabljali LC-MS s kalibracijskimi krivuljami, slepimi vzorci in dodatnimi kontrolami. Za čiščenje vzorcev so se poslužili HPLC ter NMR analize za dodatno oceno čistosti in potrditev strukture produkta.<br /> <br /> ==Testiranje antimikrobne aktivnosti==<br /> <br /> Cilj je bil testirati nastale NRP proti ESKAPE bakterijam, ki so odporne na antibiotike. V praksi so testiranje izvedli na določenih bakterijah iz te skupine, v nekaterih primerih pa so uporabili njim sorodne organizme. Peptide so testirali tudi na visokoobčutljivem sevu &lt;em&gt;Bacillus subtilis&lt;/em&gt;, ki se tipično uporablja za zaznavanje nizkih koncentracij antibiotikov. Posamezno vrsto bakterije so razmazali na ploščo s trdnim LB gojiščem. Nato so nanjo v ustreznih razmikih nakapali posamezne kapljice ekstraktov NRP. Eksperiment so ponovili tudi z diski filtrirnega papirja, prepojenimi z ekstrakti. To so čez noč inkubirali in naslednji dan opazovali velikosti lis, kjer bakterije niso zrasle. Za pozitivno kontrolo so uporabili gentamicin s koncentracijo 10 mg/mL, za negativno kontrolo pa ekstrakte neinduciranih kultur in kultur, ki so vsebovale plazmide brez zapisov za NRPS. Ker so skoraj vsi testirani ekstrakti dali pozitivne rezultate, so sklepali, da so ti lažno pozitivni. Ugotovili so, da so v ekstraktih prisotni antibiotiki iz gojišč in so zato transformirane bakterije namnožili v gojiščih brez antibiotikov in eksperiment ponovili. Ob ponovitvi testiranja so jim izmed 63 NRP, ki so jih sintetizirale NRPS z izmenjanimi moduli, dali pozitiven rezultat 4 vzorci. NRPS, ki so jih ustvarili s kombiniranjem razcepljenih zapisov nativnih NRPS, niso dale nobenega pozitivnega rezultata. Opazili so tudi razliko med grampozitivnimi in gramnegativnimi bakterijami. Slednje so bile na antibiotike manj občutljive, najverjetneje zaradi dodatne zunanje membrane, ki je oteževala vnos antibiotikov v celice. Zato so želeli preizkusiti še drugačen način dostave NRP.<br /> <br /> ==Dostava NRP v bakterije==<br /> <br /> Za dostavo NRP v celice so se odločili za strategijo trojanskega konja. To pomeni, da so antimikrobne peptide vezali na druge molekule, ki jih bakterije naravno transportirajo v celico. Tako se antimikrobne učinkovine izognejo obrambnim mehanizmom bakterije in pridejo do tarče v večji količini. Skupina je poskusila z vezavo NRP na sideroforje s klik kemijo. Tak pristop zahteva prisotnost komponent s funkcionalnimi skupinami, kot so terminalni alkini in azidi. Za ta namen so sintetizirali amid, ki vsebuje kateholno in alkinsko skupino. Prva deluje kot siderofor in se koordinira na Fe&lt;sup&gt;3+&lt;/sup&gt; ione za olajšan vnos v bakterije, druga pa omogoča izvedbo klik reakcije. Pripravli so tudi donorski vektor, ki nosi zapis za modul NRPS, ki v NRP doda 4-azido-L-fenilalanin (AzF). Tega so vključili na zadnjo možno pozicijo v zapisu za NRPS na terminacijskem plazmidu, ker ta položaj najmanj ovira zvijanje polipeptidne verige NRPS, hkrati pa terminalni AzF predstavlja bolje dostopno mesto, da lahko poteče klik reakcija. Za vezavo NRP na siderofor so izvedli z bakrom katalizirano azid-alkin cikloadicijo. Katalitsko aktiven Cu(I) so razvijali in situ z redukcijo CuSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; z natrijevim askorbatom v prisotnosti THPTA, ki stabilizira Cu(I). Z LC-MS so potrdili nastanek želenih produktov, zaradi časovne stiske pa niso uspeli testirati učinkovitosti vnosa na siderofor vezanih NRP v bakterije.<br /> <br /> ==Zaključek==<br /> <br /> V okviru študentskega projekta NRPieceS je bila izdelana knjižnica plazmidov, ki omogočajo hitrejše načrtovanje, izražanje in testiranje protimikrobne aktivnosti novih NRP, ki v naravi ne obstajajo. Ustvarili so 9 ekspresijskih plazmidov, ki vsebujejo razcepljene zapise za 3 nativne NRPS, 9 akceptorskih plazmidov in 35 donorskih plazmidov z zapisi za posamezne NRPS module, ki se jih lahko izmenjuje z moduli na določenih mestih v 9 akceptorskih plazmidih. S kombinacijo delov posameznih nativnih NRPS in izmenjavo modulov so uspešno sestavili in karakterizirali 105 plazmidov z zaporedji, ki kodirajo za nove NRPS. Od tega so uspešno izrazili 95 NRPS, antimikrobno aktivnost pa so preverjali 93 novim NRP in kot učinkovite proti ESKAPE bakterijam identificirali 4 NRP.<br /> <br /> ==Viri==<br /> <br /> https://2025.igem.wiki/marburg/</div>

Katarina Gomirsek https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=NRPieceS&diff=26048 2026-05-11T17:21:07Z

<p>Katarina Gomirsek: Created page with &quot;[https://2025.igem.wiki/marburg/ NRPieceS] je projekt ekipe študentov iz Marburga v Nemčiji, ki je dosegla nagrado za najboljšo zbirko delov, najboljši projekt na področju kužnih bolezni in najboljši program, uvrščena pa je bila tudi med najboljših 10 na iGEM tekmovanju. ==Uvod== Predvideva se, da bo antimikrobna rezistenca do leta 2050 postala glavni vzrok smrti na svetu, kar pomeni, da bo ena oseba zaradi tega umrla približno vsake 3 sekunde. Ta pojav imen...&quot;</p> <hr /> <div>[https://2025.igem.wiki/marburg/ NRPieceS] je projekt ekipe študentov iz Marburga v Nemčiji, ki je dosegla nagrado za najboljšo zbirko delov, najboljši projekt na področju kužnih bolezni in najboljši program, uvrščena pa je bila tudi med najboljših 10 na iGEM tekmovanju.<br /> <br /> ==Uvod==<br /> <br /> Predvideva se, da bo antimikrobna rezistenca do leta 2050 postala glavni vzrok smrti na svetu, kar pomeni, da bo ena oseba zaradi tega umrla približno vsake 3 sekunde. Ta pojav imenujejo tudi tiha pandemija. Zanjo so v večini dgovorne t. i. ESKAPE bakterije, kamor spadajo &lt;em&gt;Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa&lt;/em&gt; in &lt;em&gt;Enterobacter species&lt;/em&gt;. Za borbo proti antimikrobni rezistenci je ključno čim hitrejše in učinkovitejše odkrivanje novih protimikrobnih učinkovin. Cilj je bil razviti inovativen pristop za pospešitev odkrivanja novih alternativ klasičnim antibiotikom. Obrnili so se na neribosomske peptid sintetaze (NRPS), ki jih že naravno vsebujejo določene bakterijske vrste. Gre za velike modularne encime, kjer ima vsak modul točno določeno funkcijo za selekcijo, aktivacijo in dodajanje ustrezne aminokisline na rastočo peptidno verigo, določena kombinacija in zaporedje modulov pa omogoči sintezo točno določenega neribosomnega peptida (NRP). S kombinacijo NRPS modulov iz različnih organizmov bi lahko ustvarili nove peptide, ki ne obstajajo v naravi in imajo potencialno antimikrobno aktivnost. Idejo so dobili po zgledu drugih znanih biološko aktivnih spojin, kot so penicilin, romidepsin in lovastatin, katerih sintezo katalizirajo NRPS. Trenutno je že več kot 20 NRP odobrenih za uporabo v medicini. Pri sintezi neribosomnih peptidov se poleg 20 proteinogenih aminokislin lahko uporabijo tudi druge aminokisline, poleg tega so sintetizirani peptidi lahko linearni ali ciklični, aminokisline pa zaradi možnosti epimerizacije v njih nastopajo tako v L kot v D konfiguraciji, kar da izredno raznolike možnosti sinteze novih NRP. Ekipa študentov je razvila sinteznobiološko platformo NRPieceS, ki omogoča enostavno ustvarjanje vellikih knjižnic NRP. Osnova je kombinatorična sintezna knjižnica, ki omogoča načrtovanje in sintezo novih peptidov z uporabo NRPS. Zbirka NRPieceS vsebuje 160 plazmidov. Za enostavnejše načrtovanje novih NRPS so ustvarili tudi program mATChmaker.<br /> <br /> ==Izdelava NRPieceS knjižnice==<br /> <br /> Za osnovo knjižnice so uporabili nukleotidna zaporedja za 5 nativnih NRPS, ki katalizirajo sintezo cikličnih peptidov, vendar so zaradi visoko ponavljajočih se zaporedij s PCR uspešno pomnožili le 3 zapise za NRPS. Delo so zato nadaljevali le s tremi NRPS. Osredotočili so se na ciklične peptide, ker se ti na tarče vežejo z več kontaktnimi točkami kot linearni peptidi, kar jim poveča afiniteto vezave. Ta lahko doseže rede velikosti, ki jih najdemo pri protitelesih. Zapise za nativne NRPS so vstavili v ekspresijske vektorje. Sestavili so še 35 donorskih vektorjev, izmed katerih je vsak nosil zapis za en modul za izmenjavo, in akceptorske vektorje, znotraj katerih je bila na točno določenih mestih omogočena enostavna izmenjava modulov.<br /> <br /> Ker so zaporedja za nativne NRPS dolga več deset kbp, so za vstavljanje v vektorje in transformacijo gostiteljskih celic neprimerna. Zato so njihove zapise razcepili na 3 dele in vsakega vstavili v enega od plazmidov pACYC, pCOLA in pCDF, ker so ti optimizirani za ekspresijo proteinov z večplazmidnimi sistemi v &lt;em&gt;E. Coli&lt;/em&gt;. To omogoča hkratno transformacijo &lt;em&gt;E. Coli&lt;/em&gt; z vsemi tremi plazmidi in izražanje NRPS. Vsak plazmid nosi gen za rezistenco na drug antibiotik za selekcijo in rast le tistih celic, ki so hkrati sprejele vse 3 plazmide. Zapisi za NRPS so bili razdeljeni na XUT&lt;sup&gt;I&lt;/sup&gt; (eXchange Unit) mestih na 3 segmente: iniciacijski, elongacijski in terminacijski. Tako so dobili 9 vektorjev z razcepljenimi zapisi za nativne NRPS.<br /> Ekspresijska kaseta za nativne NRPS vključuje inducibilen araBAD promotor, RBS, zapise za razcepljene inteine, ki se nahajajo na ustreznih koncih inserta, in terminator. Razcepljeni inteini omogočijo posttranslacijsko sestavljanje treh polipeptidnih verig NRPS v en funkcionalen encim. Vnos arabinoze v celico se lahko zgodi, ker se v bakterijah po transformaciji izražata arabinozni transporter AraE in regulator AraC pod konstitutivnim promotorjem in sta zapisana na vseh treh plazmidih.<br /> <br /> NRPieceS knjižnici so dodali še akceptorske vektorje. Njihova osnova so bili na 3 dele razdeljeni zapisi za nativne NRPS, na identificiranih mestih XUT&lt;sup&gt;I&lt;/sup&gt; znotraj zaporedij pa so uvedli restrikcijska mesta za BsaI, kamor so nato vstavili ekspresijsko kaseto za mCherry. Ta mesta so namenjena izmenjevanju modulov NRPS in v primeru, da sta restrikcija in ligacija pravilno potekli, se iz zapisa za NRPS izreže kaseta za mCherry in kolonije bakterij bojo bele barve. To služi za hitro vizualno identifikacijo ustreznih bakterijskih kolonij.<br /> Hkrati so skonstruirali tudi donorske vektorje z NRPS moduli, ki se jih lahko zamenjuje z moduli na mestih XUT&lt;sup&gt;I&lt;/sup&gt;. Zamenjava katerega izmed modulov bi povzročila spremembo aminokislinskega zaporedja NRPS, s tem pa tudi spremenila zaporedje končnega peptida. Konstrukcija teh treh vrst vektorjev je bila izvedena z Gibbson Assembly metodo. Zapise za NRPS so nato kombinirali in izmenjevali module z Golden Gate tehniko kloniranja.<br /> <br /> ==Izražanje NRPS==<br /> <br /> Po sestavljanju NRPieces knjižnice so testirali ekspresijo novoustvarjenih NRPS. Kot gostiteljski organizem so izbrali &lt;em&gt;E. Coli&lt;/em&gt;. Izbrali so jo, ker je enostavno dostopna in genetsko precej sorodna bakterijam iz rodov &lt;em&gt;Photorhabdus&lt;/em&gt; in &lt;em&gt;Xenorhabdus&lt;/em&gt;, ki naravno izražajo NRPS. V njej so izražali tako že poznane NRPS, ki so prisotne v naravi, kot novoustvarjene NRPS, ki so jih dobili ali s kombiniranjem delov razcepljenih zapisov za nativne NRPS ali z izmenjavo posameznih modulov. Ustvarili so knjižnico hibridnih NRPS, ki so jih dobili s kombinacijo delov razcepljenih nativnih NRPS in NRPS, ki so jim izmenjali posamezne module. Za induciranje izražanja NRPS so v gojišča dodali arabinozo. Za negativno kontrolo so bakterije nanesli na gojišče brez arabinoze. Ob uspešni ekspresiji se iz vsakega plazmida izrazi del NRPS skupaj z inteini. Inteini sprožijo samoizrezovanje in sestavljanje NRPS v celoto, funkcionalna NRPS pa katalizira sintezo NRP. Iz prisotnosti produkta, ki ga pričakujemo z določeno NRPS, se sklepa na uspešno izražanje. Da bi bile meritve čim bolj zanesljive in ponovljive, so za določanje prisotnosti in količine nastalih peptidov uporabljali LC-MS s kalibracijskimi krivuljami, slepimi vzorci in dodatnimi kontrolami. Za čiščenje vzorcev so se poslužili HPLC ter NMR analize za dodatno oceno čistosti in potrditev strukture produkta.<br /> <br /> ==Testiranje antimikrobne aktivnosti==<br /> <br /> Cilj je bil testirati nastale NRP proti ESKAPE bakterijam, ki so odporne na antibiotike. V praksi so testiranje izvedli na določenih bakterijah iz te skupine, v nekaterih primerih pa so uporabili njim sorodne organizme. Peptide so testirali tudi na visokoobčutljivem sevu &lt;em&gt;Bacillus subtilis&lt;/em&gt;, ki se tipično uporablja za zaznavanje nizkih koncentracij antibiotikov. Posamezno vrsto bakterije so razmazali na ploščo s trdnim LB gojiščem. Nato so nanjo v ustreznih razmikih nakapali posamezne kapljice ekstraktov NRP. Eksperiment so ponovili tudi z diski filtrirnega papirja, prepojenimi z ekstrakti. To so čez noč inkubirali in naslednji dan opazovali velikosti lis, kjer bakterije niso zrasle. Za pozitivno kontrolo so uporabili gentamicin s koncentracijo 10 mg/mL, za negativno kontrolo pa ekstrakte neinduciranih kultur in kultur, ki so vsebovale plazmide brez zapisov za NRPS. Ker so skoraj vsi testirani ekstrakti dali pozitivne rezultate, so sklepali, da so ti lažno pozitivni. Ugotovili so, da so v ekstraktih prisotni antibiotiki iz gojišč in so zato transformirane bakterije namnožili v gojiščih brez antibiotikov in eksperiment ponovili. Ob ponovitvi testiranja so jim izmed 63 NRP, ki so jih sintetizirale NRPS z izmenjanimi moduli, dali pozitiven rezultat 4 vzorci. NRPS, ki so jih ustvarili s kombiniranjem razcepljenih zapisov nativnih NRPS, niso dale nobenega pozitivnega rezultata. Opazili so tudi razliko med grampozitivnimi in gramnegativnimi bakterijami. Slednje so bile na antibiotike manj občutljive, najverjetneje zaradi dodatne zunanje membrane, ki je oteževala vnos antibiotikov v celice. Zato so želeli preizkusiti še drugačen način dostave NRP.<br /> <br /> ==Dostava NRP v bakterije==<br /> <br /> Za dostavo NRP v celice so se odločili za strategijo trojanskega konja. To pomeni, da so antimikrobne peptide vezali na druge molekule, ki jih bakterije naravno transportirajo v celico. Tako se antimikrobne učinkovine izognejo obrambnim mehanizmom bakterije in pridejo do tarče v večji količini. Skupina je poskusila z vezavo NRP na sideroforje s klik kemijo. Tak pristop zahteva prisotnost komponent s funkcionalnimi skupinami, kot so terminalni alkini in azidi. Za ta namen so sintetizirali amid, ki vsebuje kateholno in alkinsko skupino. Prva deluje kot siderofor in se koordinira na Fe&lt;sup&gt;3+&lt;/sup&gt; ione za olajšan vnos v bakterije, druga pa omogoča izvedbo klik reakcije. Pripravli so tudi donorski vektor, ki nosi zapis za modul NRPS, ki v NRP doda 4-azido-L-fenilalanin (AzF). Tega so vključili na zadnjo možno pozicijo v zapisu za NRPS na terminacijskem plazmidu, ker ta položaj najmanj ovira zvijanje polipeptidne verige NRPS, hkrati pa terminalni AzF predstavlja bolje dostopno mesto, da lahko poteče klik reakcija. Za vezavo NRP na siderofor so izvedli z bakrom katalizirano azid-alkin cikloadicijo. Katalitsko aktiven Cu(I) so razvijali in situ z redukcijo CuSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; z natrijevim askorbatom v prisotnosti THPTA, ki stabilizira Cu(I). Z LC-MS so potrdili nastanek želenih produktov, zaradi časovne stiske pa niso uspeli testirati učinkovitosti vnosa na siderofor vezanih NRP v bakterije.<br /> <br /> ==Zaključek==<br /> <br /> V okviru študentskega projekta NRPieceS je bila izdelana knjižnica plazmidov, ki omogočajo hitrejše načrtovanje, izražanje in testiranje protimikrobne aktivnosti novih NRP, ki v naravi ne obstajajo. Ustvarili so 9 ekspresijskih plazmidov, ki vsebujejo razcepljene zapise za 3 nativne NRPS, 9 akceptorskih plazmidov in 35 donorskih plazmidov z zapisi za posamezne NRPS module, ki se jih lahko izmenjuje z moduli na določenih mestih v 9 akceptorskih plazmidih. S kombinacijo delov posameznih nativnih NRPS in izmenjavo modulov so uspešno sestavili in karakterizirali 105 plazmidov z zaporedji, ki kodirajo za nove NRPS. Od tega so uspešno izrazili 95 NRPS, antimikrobno aktivnost pa so preverjali 93 novim NRP in kot učinkovite proti ESKAPE bakterijam identificirali 4 NRP.<br /> <br /> ==Viri==<br /> <br /> https://2025.igem.wiki/marburg/</div>

Katarina Gomirsek https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Seminarji_SB_2025/26&diff=26041 2026-05-11T16:54:28Z

<p>Katarina Gomirsek: </p> <hr /> <div>V študijskem letu 2025/26 študenti in študentke pri Sintezni biologiji predstavljajo naslednje teme: <br /> <br /> RAZISKOVALNI ČLANKI<br /> <br /> (Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) &lt;br&gt;<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/OrthologTransformer OrthologTransformer] (Tim David Agrež)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Genetsko_kodirani_biosenzor_za_spremljanje_depolimerizacije_morskih_polisarahidov Genetsko kodirani biosenzor za spremljanje depolimerizacije morskih polisarahidov] (Vanja Vogrič)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Komunikacije_na_podlagi_RNA_v_heterogenih_populacijah_mimetičnih_celic Komunikacije na podlagi RNA v heterogenih populacijah mimetičnih celic] (Marcel Tušek)<br /> # [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Na%C4%8Drtovanje_oscilatorjev_proteinov_na_membrani_vodenih_s_%C5%A1umom_v_%C5%BEivih_celicah Načrtovanje oscilatorjev proteinov na membrani vodenih s šumom v živih celicah] (Varvara Titova)<br /> # [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Samoinducibilno_molekulsko_stikalo_za_biosintezo_hialuronske_kisline_z_nizko_molekulsko_maso Samoinducibilno molekulsko stikalo za biosintezo hialuronske kisline z nizko molekulsko maso] (Nejc Horvat)<br /> # [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Reprogramiranje_metabolizma_bakterije_E.coli_za_fiksacijo_CO₂ Reprogramiranje metabolizma bakterije E. coli za fiksacijo CO₂] (Ana Kastelic)<br /> # [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Organokataliziran_nastanek_protocelic_od_spodaj_navzgor Organokataliziran nastanek protocelic od spodaj navzgor] (Maruša Kristan)<br /> # [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Programabilen_ribocim_za_prenos_signala_RNA Programabilen ribocim za prenos signala RNA] (Klemen Klopčič)<br /> # [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Vnos CU-bogatega elementa v 3′ UTR poveča stabilnost in izražanje sintetične mRNA In Vivo] (Lea Jarm)<br /> # [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Preoblikovanje_centralnega_metabolizma_pri_Komagataella_phaffii_za_učinkovito_sintezo_D-manoze Preoblikovanje centralnega metabolizma pri Komagataella phaffii za učinkovito sintezo D-manoze] (Špela Auer)<br /> # [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Medvrstni_prenos_kromosomov_v_kvasovkah_vodi_do_izboljšanja_fenotipa_in_raznolikih_transkripcijskih_odzivov Medvrstni prenos kromosomov v kvasovkah vodi do izboljšanja fenotipa in raznolikih transkripcijskih odzivov] (Anja Novak)<br /> # [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Logično_vezje_IN,_ki_vključuje_sistem_CRISPR/Cas9_in_HCR_za_natančno_detekcijo_ctDNA Logično vezje IN, ki vključuje sistem CRISPR/Cas9 in HCR za natančno detekcijo ctDNA] (Tiara Pšeničnik)<br /> # [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Ekspresijska_kaseta_za_sintezo_heterolognih_proteinov_v_Y._lipolytica Ekspresijska kaseta za sintezo heterolognih proteinov v Y. lipolytica] (Tonja Oman Sušnik)<br /> # [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Uravnavanje_evolucijskega_potenciala_s_številom_kopij_plazmida_in_regulatorno_arhitekturo Uravnavanje evolucijskega potenciala s številom kopij plazmida in regulatorno arhitekturo] (Neža Pezo Zupančič)<br /> # [[Vpliv sestave gojišča na delovanje vezja na osnovi izločevalnega sistema tipa III]]<br /> <br /> <br /> NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI<br /> <br /> (Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.)<br /> # [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/NomNomNylon NomNomNylon] (Rebeka Ribič)<br /> # [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/FoCas FoCas] (Amber Bervar)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/TasAnchor TasAnchor] (Jasna Čarman)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/SKIPPIT SKIPPIT] (Brina Klinar)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/InkSight InkSight] (Lucija Kovaček)<br /> # [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=KunPeng KunPeng] (Lara Ferjančič)<br /> # [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/NRPieceS NRPieceS] (Katarina Gomiršek)<br /> <br /> (zgornji primer nadomestite s prvim letošnjim seminarjem iz študentskih projektov)<br /> <br /> <br /> <br /> Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Povzetek je treba objaviti dva dni pred predstavitvijo do polnoči (za seminarje v sredo torej najkasneje v ponedeljek do 23:59). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo približno 5-minutna razprava.<br /> <br /> Terminski razpored je razviden iz preglednice na strežniku Google Drive (dostopno samo študentom tekočega letnika).<br /> <br /> Kako je videti končni seznam seminarjev, lahko preverite pri lanskem letniku: [[Seminarji_SB_2024/25]].</div>

Katarina Gomirsek https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=2026-BNT-seminar&diff=25328 2026-03-28T09:16:37Z

<p>Katarina Gomirsek: </p> <hr /> <div>= Bionanotehnologija 2026- seminar =<br /> doc. dr. Gregor Gunčar, K2.022<br /> <br /> == Seznam seminarjev ==<br /> V tabelo] prosim vpišite temo vašega projekta in kratko oznako.<br /> <br /> {| class=&quot;wikitable&quot;<br /> ! datum predstavitve !! naslov !! kratka koda projekta !! predstavlja !! recenzent 1 !! recenzent 2<br /> |-<br /> | 18/03/2025 || Bionanotehnološki pristop k dolgoročnemu arhiviranju digitalnih podatkov z DNA zaporedjem || DNArchive || Kozel, Vid || Bajramovikj, Denis || Ribič, Rebeka<br /> |-<br /> | 18/03/2025 || Sistem za adsorpcijo in razgradnjo gliadina (uporaba v medicini in prehranski industriji) || GlutenBlock || Horvat, Nejc || Šenica Pavletič, Primož || Hvalec, Jan<br /> |-<br /> | 18/03/2025 || Zaščita titanovih implantantov s samoobnovljivim nanofilmom || ImplantShield || Perc, Anže || Agrež, Tim-David || Klopčič, Klemen<br /> |-<br /> | 18/03/2025 || Bionanosenzorski obliž za merjenje cirkadianega ritma preko sline || CircAlign || Kovaček, Lucija || Bervar, Amber || Mohar, Teja<br /> |-<br /> | 25/03/2025 || Mazilo z odzivnimi nanodelci za selektivno zdravljenje atopijskega dermatitisa || SmartDerm || Pezo Zupančič, Neža || Habot, Hanna || Vogrič, Vanja<br /> |-<br /> | 25/03/2025 || Verižica za zaznavanje drog || SafeSip || Bogataj, Lenart || Jarm, Lea || Bajramovikj, Denis<br /> |-<br /> | 25/03/2025 || Nalepka za kožo za neinvazivno spremljanje hidracijskega stanja preko znoja|| HydraShow || Ferjančič, Lara || Todorovska, Milena || Šenica Pavletič, Primož<br /> |-<br /> | 25/03/2025 || Injekcija za hitrejšo rekonstrukcijo sprednje križne vezi (ACL) || RegelAcl || Briševac, Tea || Klinar, Brina || Agrež, Tim-David<br /> |-<br /> | 01/04/2025 || Kontaktne leče za zdravljenje migrene || MigraLens || Pšeničnik, Tiara || Kozel, Vid || Bervar, Amber<br /> |-<br /> | 01/04/2025 || Zaščitna nanoprevleka proti adheziji bakterij v prebavilih || FloraCoat || Jukić, Lea || Horvat, Nejc || Habot, Hanna<br /> |-<br /> | 01/04/2025 || Personalizirana indukcija in moduliranje spanja z uporabo nanoteles || NanoNap || Petrovič, Filip || Perc, Anže || Jarm, Lea<br /> |-<br /> | 01/04/2025 || Sistem za predčasno zaznavanje cvetenja alg in cianobakterij || BloomSense || Novak, Anja || Kovaček, Lucija || Todorovska, Milena<br /> |-<br /> | 01/04/2025 || Sistem za začasno dodatno oskrbo s kisikom pri ovirani ventilaciji || Atmos || Oman Sušnik, Tonja || Pezo Zupančič, Neža || Klinar, Brina<br /> |-<br /> | 08/04/2025 || Pristop k zdravljenju neonatalne zlatenice || ZlatoHome || Auer, Špela || Bogataj, Lenart || Kozel, Vid<br /> |-<br /> | 08/04/2025 || || || Dimovska, Andreja || Ferjančič, Lara || Horvat, Nejc<br /> |-<br /> | 08/04/2025 || Injekcija za regeneracijo zob || ReDent || Gomiršek, Katarina || Briševac, Tea || Perc, Anže<br /> |-<br /> | 08/04/2025 || Detektor Salmonelle v jajcih (doma, male farme) || EggGuard || Titova, Varvara || Pšeničnik, Tiara || Kovaček, Lucija<br /> |-<br /> | 08/04/2025 || || || Kristan, Maruša || Jukić, Lea || Pezo Zupančič, Neža<br /> |-<br /> | 15/04/2025 || || || Škorjanc, Meri || Petrovič, Filip || Bogataj, Lenart<br /> |-<br /> | 15/04/2025 || || || Bregar, Jana || Novak, Anja || Ferjančič, Lara<br /> |-<br /> | 15/04/2025 || || || Smrečnik, Meta || Oman Sušnik, Tonja || Briševac, Tea<br /> |-<br /> | 15/04/2025 || || || Tušek, Marcel || Auer, Špela || Pšeničnik, Tiara<br /> |-<br /> | 15/04/2025 || || || Zupan, Zala || Dimovska, Andreja || Jukić, Lea<br /> |-<br /> | 22/04/2025 || Mikrofluidni nanosenzorski sistem za zgodnje zaznavanje bolezni mačk preko analize urina || LitterLab || Lešnik, Tjaša || Gomiršek, Katarina || Petrovič, Filip<br /> |-<br /> | 22/04/2025 || Nalepka za grlo, ki sprošča aktivne snovi za lajšanje bolečin v grlu ter za regeneracijo in zaščito sluznice || ThroatFix || Čarman, Jasna || Titova, Varvara || Novak, Anja<br /> |-<br /> | 22/04/2025 || || || Ribič, Rebeka || Kristan, Maruša || Oman Sušnik, Tonja<br /> |-<br /> | 06/05/2025 || || || Hvalec, Jan || Škorjanc, Meri || Auer, Špela<br /> |-<br /> | 06/05/2025 || || || Klopčič, Klemen || Bregar, Jana || Dimovska, Andreja<br /> |-<br /> | 06/05/2025 || || || Mohar, Teja || Smrečnik, Meta || Gomiršek, Katarina<br /> |-<br /> | 06/05/2025 || || || Vogrič, Vanja || Tušek, Marcel || Titova, Varvara<br /> |-<br /> | 13/05/2025 || || || Bajramovikj, Denis || Zupan, Zala || Kristan, Maruša<br /> |-<br /> | 13/05/2025 || || || Šenica Pavletič, Primož || Lešnik, Tjaša || Škorjanc, Meri<br /> |-<br /> | 13/05/2025 || || || Agrež, Tim-David || Čarman, Jasna || Bregar, Jana<br /> |-<br /> | 13/05/2025 || || || Bervar, Amber || Ribič, Rebeka || Smrečnik, Meta<br /> |-<br /> | 20/05/2025 || || || Habot, Hanna || Hvalec, Jan || Tušek, Marcel<br /> |-<br /> | 20/05/2025 || || || Jarm, Lea || Klopčič, Klemen || Zupan, Zala<br /> |-<br /> | 20/05/2025 || || || Todorovska, Milena || Mohar, Teja || Lešnik, Tjaša<br /> |-<br /> | 20/05/2025 || || || Klinar, Brina || Vogrič, Vanja || Čarman, Jasna<br /> |-<br /> | 27/05/2025 || || || kratke predstavitve || || <br /> |}<br /> <br /> ==Naloga==<br /> Pripravite projektno nalogo iz področja Bionanotehnologije. Najpomembnejša je originalna ideja za nek izvedljiv projekt, ki pa mora biti takšen, da pritegne investitorje. Ker je pomembno tudi kako boste to naredili, morate predstaviti tudi metodo in ne samo ideje. Natančno morate vedeti, kako boste projekt izvedli.<br /> <br /> Predlagana struktura teksta:<br /> * Uvod<br /> * Predstavitev problema, znanstvena izhodišča, cilji<br /> * Izvedba projekta, metodologija, tehnike, materiali, vprašanja, hipoteze<br /> * Literatura<br /> <br /> Za pripravo seminarja velja naslednje:&lt;br&gt;<br /> * Elektronska verzija seminarja: avtor, naslov projekta, razširjeni povzetek projekta- 350-400 besed (brez literature) in grafični povzetek (čez približno pol strani). Vse naj bo na maksimalno dveh straneh, a ne sme vsebovati manj kot 350 besed (sem se ne šteje literatura). <br /> * Elektronsko verzijo seminarja oddajte '''dva dni pred predstavitvijo,''' kasneje pa boste vsebino še prekopirali na za to določeno spletno stran, predstavitev pa eno uro pred seminarjem na [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/ strežnik].<br /> * Vsi seminarji so v elektronski obliki dostopni [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/bioseminar/ tukaj].<br /> * Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Predstavitev naj bo dolga 15 minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni.<br /> * Predstavitvi sledi razprava. Recenzenta morata predlagati vsaj eno izboljšavo predstavljenega projekta.<br /> <br /> ==&lt;font color=green&gt;Imena datotek&lt;/font&gt;==<br /> Prosim vas, da vse datoteke poimenujete po naslednjem modelu:<br /> * 25_nano_Priimek.doc za seminar, npr. 25_nano_Craik_Venter.doc<br /> * 25_nano_Priimek.ppt za prezentacijo, npr. 25_nano_Craik_Venter.ppt<br /> <br /> ==Urejanje spletnih strani na wikiju==<br /> Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''<br /> <br /> ==Citiranje virov==<br /> Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se držite ene same. V seminarskih nalogah in diplomskih nalogah FKKT uprabljajte shemo citiranja, ki je pobarvana &lt;font color=green&gt;zeleno&lt;/font&gt;.<br /> Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati.<br /> Za citate v naravoslovju je najpogostejše citiranje po pravilniku ISO 690. [http://www.zveza-zotks.si/gzm/dokumenti/literatura.html Pravila], ki upoštevajo omenjeni standard, so pripravili pri ZTKS. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati.&lt;br&gt;<br /> '''Citiranje knjig:'''&lt;br&gt;<br /> Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica.&lt;br&gt;<br /> Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN.&lt;br&gt;<br /> <br /> Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005.&lt;br&gt;<br /> Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4.&lt;br&gt;<br /> Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.). <br /> <br /> '''Citiranje člankov:'''&lt;br&gt;<br /> Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani.&lt;br&gt;<br /> &lt;font color=green&gt;Lartigue, C., Glass, J. I., Alperovich, N., Pieper, R., Parmar, P. P., Hutchison III, C. A., Smith, H. O. in Venter, J. C.<br /> Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, 317, str. 632-638.&lt;/font&gt;<br /> <br /> Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole:&lt;br&gt;<br /> Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani.&lt;br&gt;<br /> Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.<br /> <br /> Revija Science uporablja skrajšani zapis:&lt;br&gt;<br /> C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007)&lt;br&gt;<br /> <br /> V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne). Navesti morate tudi vse avtorje dela, razen v primeru, ko jih je 10 ali več. Takrat navedite le prvih devet, za ostale pa uporabite okrajšavo in sod. (in sodelavci). Pred zadnjim avtorjem naj bo vedno besedica &quot;in&quot;. <br /> <br /> <br /> '''Citiranje spletnih virov:'''&lt;br&gt;<br /> Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov&lt;br&gt;<br /> strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life&lt;br&gt;<br /> Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.</div>

Katarina Gomirsek https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Talk:Pomen_plazmida_Ti_za_patogenost_agrobakterij&diff=23480 2024-05-06T20:17:56Z

<p>Katarina Gomirsek: </p> <hr /> <div>Osterc Igor: Mehanizem prenosa DNA<br /> <br /> Gomiršek Katarina: Klasifikacija, Karakteristične regije Ti plazmidov, Bakterijska konjugacija pri agrobakterijah, Plazmid Ti v praktični uporabi</div>

Katarina Gomirsek https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Talk:Pomen_plazmida_Ti_za_patogenost_agrobakterij&diff=23479 2024-05-06T20:17:46Z

<p>Katarina Gomirsek: </p> <hr /> <div>Osterc Igor: Mehanizem prenosa DNA<br /> Gomiršek Katarina: Klasifikacija, Karakteristične regije Ti plazmidov, Bakterijska konjugacija pri agrobakterijah, Plazmid Ti v praktični uporabi</div>

Katarina Gomirsek https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Talk:Pomen_plazmida_Ti_za_patogenost_agrobakterij&diff=23474 2024-05-06T20:09:49Z

<p>Katarina Gomirsek: </p> <hr /> <div>Gomiršek Katarina: Klasifikacija</div>

Katarina Gomirsek https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Pomen_plazmida_Ti_za_patogenost_agrobakterij&diff=23466 2024-05-06T18:37:23Z

<p>Katarina Gomirsek: /* Viri */</p> <hr /> <div>==Uvod==<br /> <br /> ==Klasifikacija==<br /> <br /> Običajno se plazmidi Ti razvrščajo glede na specifične opine, ki se sintetizirajo v tumorjih okuženih rastlin, ter predstavljajo temelj klasifikacije Ti plazmidov v 6 tipov. Tip 1 zajema nopalinske Ti plazmide, ki se naprej delijo v dva podtipa, od katerih se je en naprej razvil v sukcinamopinske Ti plazmide. Tip 2 so oktopinski Ti plazmidi. Plazmidi tipa 3 so agropinski in krizopinski. V isto skupino spadajo zaradi visoke identičnosti nukleotidnih zaporedij v določenih regijah DNA. Tipi 4, 5 in 6 predstavljajo večje in kompleksnejše plazmide in so posledica rekombinacije dveh Ti oziroma enega Ti in enega Ri plazmida. Do združitve dveh takih plazmidov lahko pride v celicah agrobakterij, predvsem, ko se v njih znajdeta dva med seboj inkompatibilna plazmida, na primer oktopinski in nopalinski plazmid, ki nato skupaj tvorita nov plazmid. Plazmidi, ki vsebujejo dve regiji repABC, najverjetneje pripadajo tipu 4, 5 ali 6.<br /> <br /> ==Karakteristične regije Ti plazmidov==<br /> Plazmidi Ti imajo tri zanje karakteristične regije. Prva regija je zaporedje približno 30 virulentnih genov, ki so odgovorni za prenos T-DNA v rastlinske celice. Ti geni sestavljajo regulon. Od tega je 25 genov, ki sestavljajo 7 operonov, zelo dobro ohranjenih v vseh Ti plazmidih. Vsak Ti plazmid vsebuje tudi eno ali več T-regij z geni, ki kodirajo za encime, potrebne za sintezo avksinov, citokininov in opinov. Vse T-regije so obdane z dobro ohranjenimi robnimi zaporedji, dolgimi okoli 25 bp. T-regije se same po sebi sicer precej razlikujejo po velikosti in po vrstah genov, ki jih vsebujejo. Tretja značilna regija so geni, povezani s privzemom in katabolizmom specifičnih opinov.<br /> <br /> ==Bakterijska konjugacija pri agrobakterijah==<br /> Ugotovili so, da si agrobakterije lahko Ti plazmide med sabo izmenjujejo s konjugacijo, ki zahteva indukcijo s specifičnimi opini. Proces regulira TraR in je pozitivni regulator transkripcije genov, ki sodelujejo pri konjugaciji. Do konjugacije pride le pri dovolj visoki gostoti celic agrobakterij, saj je TraR protein, ki se aktivira ob dovolj visoki količini acilhomoserin laktonskega avtoinduktorja, ki ga ob aktivaciji z opini sintetizira TraI.<br /> <br /> ==Plazmid Ti v praktični uporabi==<br /> AMT (agrobacterium-mediated transformation) oziroma transformacija z agrobakterijo je tehnika, ki se uporablja za vnos genov za izboljšanje ali spremembo lastnosti rastlin. Postopek najprej zajema pripravo in vnos ekspresijskega vektorja v agrobakterije. Izbrani gen se vstavi v Ti plazmid med levo in desno robno zaporedje T-DNA regije. S tem se zamenja gene v T-DNA regiji z geni za lastnost, ki jo želimo vnesti v rastlino. Koščke rastlinskega tkiva se izpostavi agrobakterijam, na primer tako da se jih potopi v suspenzijo transformiranih agrobakterij, nato pa se jih prenese na regeneracijsko gojišče, ki spodbudi rast poganjkov transgenih rastlin. Uporabi se različne eksplantate rastlinskih tkiv, med katerimi prevladujejo koščki listov in vršički. Slabost te metode je, da je relativno dolgotrajna, poleg tega pa taka vrsta transformacije pomeni, da se transgena DNA lahko vključi na naključne lokacije v rastlinskem genomu. Pri tem lahko pride do precej variabilnega izražanja transgena, pa tudi do neželenih modifikacij drugih genov. Na uspešnost transformacije vplivajo dejavniki kot so rastlinska vrsta in njen genotip, izbira vektorja, vrsta uporabljenega rastlinskega tkiva, temperatura, vrsta antibiotika v gojišču in njegov pH.<br /> AMT se uporablja tudi pri agroinfekciji in raziskavah v povezavi z njo. Tu v T-DNA regijo plazmida Ti vključijo genom virusov, ki so sposobni okužiti rastlinske celice, nato pa virusni genom vnesejo v rastlinske celice s pomočjo agrobakterije.<br /> Testi s prehodno transformacijo se uporabljajo za proučevanje odziva kultivarjev na faktorje patogenosti v poskusih, da bi odkrili gene za odpornost na patogene. Pomembno je tudi odkritje dejstva, da lahko agrobakterije transformirajo tudi glivne celice, kar je omogočilo podrobnejše študije rastlinskih patogenov. Preko agrobakterije je prišlo tudi do novih odkritij v povezavi s kemijsko komunikacijo med bakterijami in rastlinami.<br /> <br /> ==Viri==<br /> Hooykaas, P.J.J. The Ti Plasmid, Driver of Agrobacterium Pathogenesis. Phytopathology 2023 113 (4). https://doi.org/10.1094/PHYTO-11-22-0432-IA<br /> <br /> Rahman, S.U., Khan, M.O., Ullah, R. et al. Agrobacterium-Mediated Transformation for the Development of Transgenic Crops; Present and Future Prospects. Molecular Biotechnology 2023. https://doi.org/10.1007/s12033-023-00826-8</div>

Katarina Gomirsek https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Pomen_plazmida_Ti_za_patogenost_agrobakterij&diff=23465 2024-05-06T18:36:55Z

<p>Katarina Gomirsek: </p> <hr /> <div>==Uvod==<br /> <br /> ==Klasifikacija==<br /> <br /> Običajno se plazmidi Ti razvrščajo glede na specifične opine, ki se sintetizirajo v tumorjih okuženih rastlin, ter predstavljajo temelj klasifikacije Ti plazmidov v 6 tipov. Tip 1 zajema nopalinske Ti plazmide, ki se naprej delijo v dva podtipa, od katerih se je en naprej razvil v sukcinamopinske Ti plazmide. Tip 2 so oktopinski Ti plazmidi. Plazmidi tipa 3 so agropinski in krizopinski. V isto skupino spadajo zaradi visoke identičnosti nukleotidnih zaporedij v določenih regijah DNA. Tipi 4, 5 in 6 predstavljajo večje in kompleksnejše plazmide in so posledica rekombinacije dveh Ti oziroma enega Ti in enega Ri plazmida. Do združitve dveh takih plazmidov lahko pride v celicah agrobakterij, predvsem, ko se v njih znajdeta dva med seboj inkompatibilna plazmida, na primer oktopinski in nopalinski plazmid, ki nato skupaj tvorita nov plazmid. Plazmidi, ki vsebujejo dve regiji repABC, najverjetneje pripadajo tipu 4, 5 ali 6.<br /> <br /> ==Karakteristične regije Ti plazmidov==<br /> Plazmidi Ti imajo tri zanje karakteristične regije. Prva regija je zaporedje približno 30 virulentnih genov, ki so odgovorni za prenos T-DNA v rastlinske celice. Ti geni sestavljajo regulon. Od tega je 25 genov, ki sestavljajo 7 operonov, zelo dobro ohranjenih v vseh Ti plazmidih. Vsak Ti plazmid vsebuje tudi eno ali več T-regij z geni, ki kodirajo za encime, potrebne za sintezo avksinov, citokininov in opinov. Vse T-regije so obdane z dobro ohranjenimi robnimi zaporedji, dolgimi okoli 25 bp. T-regije se same po sebi sicer precej razlikujejo po velikosti in po vrstah genov, ki jih vsebujejo. Tretja značilna regija so geni, povezani s privzemom in katabolizmom specifičnih opinov.<br /> <br /> ==Bakterijska konjugacija pri agrobakterijah==<br /> Ugotovili so, da si agrobakterije lahko Ti plazmide med sabo izmenjujejo s konjugacijo, ki zahteva indukcijo s specifičnimi opini. Proces regulira TraR in je pozitivni regulator transkripcije genov, ki sodelujejo pri konjugaciji. Do konjugacije pride le pri dovolj visoki gostoti celic agrobakterij, saj je TraR protein, ki se aktivira ob dovolj visoki količini acilhomoserin laktonskega avtoinduktorja, ki ga ob aktivaciji z opini sintetizira TraI.<br /> <br /> ==Plazmid Ti v praktični uporabi==<br /> AMT (agrobacterium-mediated transformation) oziroma transformacija z agrobakterijo je tehnika, ki se uporablja za vnos genov za izboljšanje ali spremembo lastnosti rastlin. Postopek najprej zajema pripravo in vnos ekspresijskega vektorja v agrobakterije. Izbrani gen se vstavi v Ti plazmid med levo in desno robno zaporedje T-DNA regije. S tem se zamenja gene v T-DNA regiji z geni za lastnost, ki jo želimo vnesti v rastlino. Koščke rastlinskega tkiva se izpostavi agrobakterijam, na primer tako da se jih potopi v suspenzijo transformiranih agrobakterij, nato pa se jih prenese na regeneracijsko gojišče, ki spodbudi rast poganjkov transgenih rastlin. Uporabi se različne eksplantate rastlinskih tkiv, med katerimi prevladujejo koščki listov in vršički. Slabost te metode je, da je relativno dolgotrajna, poleg tega pa taka vrsta transformacije pomeni, da se transgena DNA lahko vključi na naključne lokacije v rastlinskem genomu. Pri tem lahko pride do precej variabilnega izražanja transgena, pa tudi do neželenih modifikacij drugih genov. Na uspešnost transformacije vplivajo dejavniki kot so rastlinska vrsta in njen genotip, izbira vektorja, vrsta uporabljenega rastlinskega tkiva, temperatura, vrsta antibiotika v gojišču in njegov pH.<br /> AMT se uporablja tudi pri agroinfekciji in raziskavah v povezavi z njo. Tu v T-DNA regijo plazmida Ti vključijo genom virusov, ki so sposobni okužiti rastlinske celice, nato pa virusni genom vnesejo v rastlinske celice s pomočjo agrobakterije.<br /> Testi s prehodno transformacijo se uporabljajo za proučevanje odziva kultivarjev na faktorje patogenosti v poskusih, da bi odkrili gene za odpornost na patogene. Pomembno je tudi odkritje dejstva, da lahko agrobakterije transformirajo tudi glivne celice, kar je omogočilo podrobnejše študije rastlinskih patogenov. Preko agrobakterije je prišlo tudi do novih odkritij v povezavi s kemijsko komunikacijo med bakterijami in rastlinami.<br /> <br /> ==Viri==<br /> Hooykaas, P.J.J. The Ti Plasmid, Driver of Agrobacterium Pathogenesis. Phytopathology 2023 113 (4). https://doi.org/10.1094/PHYTO-11-22-0432-IA<br /> <br /> Rahman, S.U., Khan, M.O., Ullah, R. et al. Agrobacterium-Mediated Transformation for the Development of Transgenic Crops Present and Future Prospects. Molecular Biotechnology 2023. https://doi.org/10.1007/s12033-023-00826-8</div>

Katarina Gomirsek https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Pomen_plazmida_Ti_za_patogenost_agrobakterij&diff=23462 2024-05-06T18:22:54Z

<p>Katarina Gomirsek: </p> <hr /> <div>==Uvod==<br /> <br /> ==Klasifikacija==<br /> <br /> Običajno se plazmidi Ti razvrščajo glede na specifične opine, ki se sintetizirajo v tumorjih okuženih rastlin, ter predstavljajo temelj klasifikacije Ti plazmidov v 6 tipov. Tip 1 zajema nopalinske Ti plazmide, ki se naprej delijo v dva podtipa, od katerih se je en naprej razvil v sukcinamopinske Ti plazmide. Tip 2 so oktopinski Ti plazmidi. Plazmidi tipa 3 so agropinski in krizopinski. V isto skupino spadajo zaradi visoke identičnosti nukleotidnih zaporedij v določenih regijah DNA. Tipi 4, 5 in 6 predstavljajo večje in kompleksnejše plazmide in so posledica rekombinacije dveh Ti oziroma enega Ti in enega Ri plazmida. Do združitve dveh takih plazmidov lahko pride v celicah agrobakterij, predvsem, ko se v njih znajdeta dva med seboj inkompatibilna plazmida, na primer oktopinski in nopalinski plazmid, ki nato skupaj tvorita nov plazmid. Plazmidi, ki vsebujejo dve regiji repABC, najverjetneje pripadajo tipu 4, 5 ali 6.<br /> <br /> ==Karakteristične regije Ti plazmidov==<br /> Plazmidi Ti imajo tri zanje karakteristične regije. Prva regija je zaporedje približno 30 virulentnih genov, ki so odgovorni za prenos T-DNA v rastlinske celice. Ti geni sestavljajo regulon. Od tega je 25 genov, ki sestavljajo 7 operonov, zelo dobro ohranjenih v vseh Ti plazmidih. Vsak Ti plazmid vsebuje tudi eno ali več T-regij z geni, ki kodirajo za encime, potrebne za sintezo avksinov, citokininov in opinov. Vse T-regije so obdane z dobro ohranjenimi robnimi zaporedji, dolgimi okoli 25 bp. T-regije se same po sebi sicer precej razlikujejo po velikosti in po vrstah genov, ki jih vsebujejo. Tretja značilna regija so geni, povezani s privzemom in katabolizmom specifičnih opinov.<br /> <br /> ==Bakterijska konjugacija pri agrobakterijah==<br /> Ugotovili so, da si agrobakterije lahko Ti plazmide med sabo izmenjujejo s konjugacijo, ki zahteva indukcijo s specifičnimi opini. Proces regulira TraR in je pozitivni regulator transkripcije genov, ki sodelujejo pri konjugaciji. Do konjugacije pride le pri dovolj visoki gostoti celic agrobakterij, saj je TraR protein, ki se aktivira ob dovolj visoki količini acilhomoserin laktonskega avtoinduktorja, ki ga ob aktivaciji z opini sintetizira TraI.<br /> <br /> ==Praktična uporaba==<br /> AMT (agrobacterium-mediated transformation) oziroma transformacija z agrobakterijo je tehnika, ki se uporablja za vnos genov za izboljšanje ali spremembo lastnosti rastlin. Postopek najprej zajema pripravo in vnos ekspresijskega vektorja v agrobakterije. Izbrani gen se vstavi v Ti plazmid med levo in desno robno zaporedje T-DNA regije. S tem se zamenja gene v T-DNA regiji z geni za lastnost, ki jo želimo vnesti v rastlino. Koščke rastlinskega tkiva se izpostavi agrobakterijam, na primer tako da se jih potopi v suspenzijo transformiranih agrobakterij, nato pa se jih prenese na regeneracijsko gojišče, ki spodbudi rast poganjkov transgenih rastlin. Uporabi se različne eksplantate rastlinskih tkiv, med katerimi prevladujejo koščki listov in vršički. Slabost te metode je, da je relativno dolgotrajna, poleg tega pa taka vrsta transformacije pomeni, da se transgena DNA lahko vključi na naključne lokacije v rastlinskem genomu. Pri tem lahko pride do precej variabilnega izražanja transgena, pa tudi do neželenih modifikacij drugih genov. Na uspešnost transformacije vplivajo dejavniki kot so rastlinska vrsta in njen genotip, izbira vektorja, vrsta uporabljenega rastlinskega tkiva, temperatura, vrsta antibiotika v gojišču in njegov pH.<br /> AMT se uporablja tudi pri agroinfekciji in raziskavah v povezavi z njo. Tu v T-DNA regijo plazmida Ti vključijo genom virusov, ki so sposobni okužiti rastlinske celice, nato pa virusni genom vnesejo v rastlinske celice s pomočjo agrobakterije.<br /> Testi s prehodno transformacijo se uporabljajo za proučevanje odziva kultivarjev na faktorje patogenosti v poskusih, da bi odkrili gene za odpornost na patogene. Pomembno je tudi odkritje dejstva, da lahko agrobakterije transformirajo tudi glivne celice, kar je omogočilo podrobnejše študije rastlinskih patogenov. Preko agrobakterije je prišlo tudi do novih odkritij v povezavi s kemijsko komunikacijo med bakterijami in rastlinami.<br /> <br /> ==Viri==<br /> Hooykaas, P.J.J. The Ti Plasmid, Driver of Agrobacterium Pathogenesis. Phytopathology (2023). https://doi.org/10.1094/PHYTO-11-22-0432-IA<br /> <br /> Rahman, S.U., Khan, M.O., Ullah, R. et al. Agrobacterium-Mediated Transformation for the Development of Transgenic Crops Present and Future Prospects. Molecular Biotechnology (2023). https://doi.org/10.1007/s12033-023-00826-8</div>

Katarina Gomirsek https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Pomen_plazmida_Ti_za_patogenost_agrobakterij&diff=23451 2024-05-06T13:58:23Z

<p>Katarina Gomirsek: </p> <hr /> <div>==Uvod==<br /> <br /> ==Klasifikacija==<br /> <br /> Običajno se plazmidi Ti razvrščajo glede na specifične opine, ki se sintetizirajo v tumorjih okuženih rastlin, ter predstavljajo temelj klasifikacije Ti plazmidov v 6 tipov. Tip 1 zajema nopalinske Ti plazmide, ki se naprej delijo v dva podtipa, od katerih se je en naprej razvil v sukcinamopinske Ti plazmide. Tip 2 so oktopinski Ti plazmidi. Plazmidi tipa 3 so agropinski in krizopinski. V isto skupino spadajo zaradi visoke identičnosti nukleotidnih zaporedij v določenih regijah DNA. Tipi 4, 5 in 6 predstavljajo večje in kompleksnejše plazmide in so posledica rekombinacije dveh Ti oziroma enega Ti in enega Ri plazmida. Do združitve dveh takih plazmidov lahko pride v celicah agrobakterij, predvsem, ko se v njih znajdeta dva med seboj inkompatibilna plazmida, na primer oktopinski in nopalinski plazmid, ki nato skupaj tvorita nov plazmid. Plazmidi, ki vsebujejo dve regiji repABC, najverjetneje pripadajo tipu 4, 5 ali 6.<br /> <br /> ==Karakteristične regije Ti plazmidov==<br /> Plazmidi Ti imajo tri zanje karakteristične regije. Prva regija je zaporedje približno 30 virulentnih genov, ki so odgovorni za prenos T-DNA v rastlinske celice. Ti geni sestavljajo regulon. Od tega je 25 genov, ki sestavljajo 7 operonov, zelo dobro ohranjenih v vseh Ti plazmidih. Vsak Ti plazmid vsebuje tudi eno ali več T-regij z geni, ki kodirajo za encime, potrebne za sintezo avksinov, citokininov in opinov. Vse T-regije so obdane z dobro ohranjenimi robnimi zaporedji, dolgimi okoli 25 bp. T-regije se same po sebi sicer precej razlikujejo po velikosti in po vrstah genov, ki jih vsebujejo. Tretja značilna regija so geni, povezani s privzemom in katabolizmom specifičnih opinov.<br /> <br /> ==Bakterijska konjugacija pri agrobakterijah==<br /> Ugotovili so, da si agrobakterije lahko Ti plazmide med sabo izmenjujejo s konjugacijo, ki zahteva indukcijo s specifičnimi opini. Proces regulira TraR in je pozitivni regulator transkripcije genov, ki sodelujejo pri konjugaciji. Do konjugacije pride le pri dovolj visoki gostoti celic agrobakterij, saj je TraR protein, ki se aktivira ob dovolj visoki količini acilhomoserin laktonskega avtoinduktorja, ki ga ob aktivaciji z opini sintetizira TraI.<br /> <br /> ==Praktična uporaba==<br /> AMT (agrobacterium-mediated transformation) oziroma transformacija z agrobakterijo je tehnika, ki se uporablja za vnos genov za izboljšanje ali spremembo lastnosti rastlin. Postopek najprej zajema pripravo in vnos ekspresijskega vektorja v agrobakterije. Izbrani gen se vstavi v Ti plazmid med levo in desno robno zaporedje T-DNA regije. S tem se zamenja gene v T-DNA regiji z geni za lastnost, ki jo želimo vnesti v rastlino. Koščke rastlinskega tkiva se izpostavi agrobakterijam, na primer tako da se jih potopi v suspenzijo transformiranih agrobakterij, nato pa se jih prenese na regeneracijsko gojišče, ki spodbudi rast poganjkov transgenih rastlin. Uporabi se različne eksplantate rastlinskih tkiv, med katerimi prevladujejo koščki listov in vršički. Slabost te metode je, da je relativno dolgotrajna, poleg tega pa taka vrsta transformacije pomeni, da se transgena DNA lahko vključi na naključne lokacije v rastlinskem genomu. Pri tem lahko pride do precej variabilnega izražanja transgena, pa tudi do neželenih modifikacij drugih genov. Na uspešnost transformacije vplivajo dejavniki kot so rastlinska vrsta in njen genotip, izbira vektorja, vrsta uporabljenega rastlinskega tkiva, temperatura, vrsta antibiotika v gojišču in njegov pH.<br /> AMT se uporablja tudi pri agroinfekciji in raziskavah v povezavi z njo. Tu v T-DNA regijo plazmida Ti vključijo genom virusov, ki so sposobni okužiti rastlinske celice, nato pa virusni genom vnesejo v rastlinske celice s pomočjo agrobakterije.<br /> Testi s prehodno transformacijo se uporabljajo za proučevanje odziva kultivarjev na faktorje patogenosti v poskusih, da bi odkrili gene za odpornost na patogene. Pomembno je tudi odkritje dejstva, da lahko agrobakterije transformirajo tudi glivne celice, kar je omogočilo podrobnejše študije rastlinskih patogenov. Preko agrobakterije je prišlo tudi do novih odkritij v povezavi s kemijsko komunikacijo med bakterijami in rastlinami.<br /> <br /> ==Viri==<br /> Hooykaas, P.J.J. The Ti Plasmid, Driver of Agrobacterium Pathogenesis. Phytopathology (2023). https://doi.org/10.1094/PHYTO-11-22-0432-IA<br /> <br /> Rahman, S.U., Khan, M.O., Ullah, R. et al. Agrobacterium-Mediated Transformation for the Development of Transgenic Crops Present and Future Prospects. Mol Biotechnol (2023). https://doi.org/10.1007/s12033-023-00826-8</div>

Katarina Gomirsek https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Pomen_plazmida_Ti_za_patogenost_agrobakterij&diff=23450 2024-05-06T13:50:52Z

<p>Katarina Gomirsek: </p> <hr /> <div>==Uvod==<br /> <br /> ==Klasifikacija==<br /> <br /> Običajno se plazmidi Ti razvrščajo glede na specifične opine, ki se sintetizirajo v tumorjih okuženih rastlin, ter predstavljajo temelj klasifikacije Ti plazmidov v 6 tipov. Tip 1 zajema nopalinske Ti plazmide, ki se naprej delijo v dva podtipa, od katerih se je en naprej razvil v sukcinamopinske Ti plazmide. Tip 2 so oktopinski Ti plazmidi. Plazmidi tipa 3 so agropinski in krizopinski. V isto skupino spadajo zaradi visoke identičnosti nukleotidnih zaporedij v določenih regijah DNA. Tipi 4, 5 in 6 predstavljajo večje in kompleksnejše plazmide in so posledica rekombinacije dveh Ti oziroma enega Ti in enega Ri plazmida. Do združitve dveh takih plazmidov lahko pride v celicah agrobakterij, predvsem, ko se v njih znajdeta dva med seboj inkompatibilna plazmida, na primer oktopinski in nopalinski plazmid, ki nato skupaj tvorita nov plazmid. Plazmidi, ki vsebujejo dve regiji repABC, najverjetneje pripadajo tipu 4, 5 ali 6.<br /> <br /> ==Karakteristične regije Ti plazmidov==<br /> Plazmidi Ti imajo tri zanje karakteristične regije. Prva regija je zaporedje približno 30 virulentnih genov, ki so odgovorni za prenos T-DNA v rastlinske celice. Ti geni sestavljajo regulon. Od tega je 25 genov, ki sestavljajo 7 operonov, zelo dobro ohranjenih v vseh Ti plazmidih. Vsak Ti plazmid vsebuje tudi eno ali več T-regij z geni, ki kodirajo za encime, potrebne za sintezo avksinov, citokininov in opinov. Vse T-regije so obdane z dobro ohranjenimi robnimi zaporedji, dolgimi okoli 25 bp. T-regije se same po sebi sicer precej razlikujejo po velikosti in po vrstah genov, ki jih vsebujejo. Tretja značilna regija so geni, povezani s privzemom in katabolizmom specifičnih opinov.<br /> <br /> ==Bakterijska konjugacija pri agrobakterijah==<br /> Ugotovili so, da si agrobakterije lahko Ti plazmide med sabo izmenjujejo s konjugacijo, ki zahteva indukcijo s specifičnimi opini. Proces regulira TraR in je pozitivni regulator transkripcije genov, ki sodelujejo pri konjugaciji. Do konjugacije pride le pri dovolj visoki gostoti celic agrobakterij, saj je TraR protein, ki se aktivira ob dovolj visoki količini acilhomoserin laktonskega avtoinduktorja, ki ga ob aktivaciji z opini sintetizira TraI.<br /> <br /> ==Praktična uporaba==<br /> AMT (agrobacterium-mediated transformation) oziroma transformacija z agrobakterijo je tehnika, ki se uporablja za vnos genov za izboljšanje ali spremembo lastnosti rastlin. Postopek najprej zajema pripravo in vnos ekspresijskega vektorja v agrobakterije. Izbrani gen se vstavi v Ti plazmid med levo in desno robno zaporedje T-DNA regije. S tem se zamenja gene v T-DNA regiji z geni za lastnost, ki jo želimo vnesti v rastlino. Koščke rastlinskega tkiva se izpostavi agrobakterijam, na primer tako da se jih potopi v suspenzijo transformiranih agrobakterij, nato pa se jih prenese na regeneracijsko gojišče, ki spodbudi rast poganjkov transgenih rastlin. Uporabi se različne eksplantate rastlinskih tkiv, med katerimi prevladujejo koščki listov in vršički. Slabost te metode je, da je relativno dolgotrajna, poleg tega pa taka vrsta transformacije pomeni, da se transgena DNA lahko vključi na naključne lokacije v rastlinskem genomu. Pri tem lahko pride do precej variabilnega izražanja transgena, pa tudi do neželenih modifikacij drugih genov. Na uspešnost transformacije vplivajo dejavniki kot so rastlinska vrsta in njen genotip, izbira vektorja, vrsta uporabljenega rastlinskega tkiva, temperatura, vrsta antibiotika v gojišču in njegov pH.<br /> AMT se uporablja tudi pri agroinfekciji in raziskavah v povezavi z njo. Tu v T-DNA regijo plazmida Ti vključijo genom virusov, ki so sposobni okužiti rastlinske celice, nato pa virusni genom vnesejo v rastlinske celice s pomočjo agrobakterije.<br /> Testi s prehodno transformacijo se uporabljajo za proučevanje odziva kultivarjev na faktorje patogenosti v poskusih, da bi odkrili gene za odpornost na patogene. Pomembno je tudi odkritje dejstva, da lahko agrobakterije transformirajo tudi glivne celice, kar je omogočilo podrobnejše študije rastlinskih patogenov. Preko agrobakterije je prišlo tudi do novih odkritij v povezavi s kemijsko komunikacijo med bakterijami in rastlinami.</div>

Katarina Gomirsek