Wiki FKKT - User contributions [en]

Crafting crocin – vzpostavitev biosintezne poti za pridobivanje krocina v bakteriji Escherichia coli

2017-12-03T22:49:27Z

Kimm Fuhrmann: /* Biosintezna pot od farnezil pirofosfata do zeaksantina */

Povzeto po [http://2017.igem.org/Team:Uppsala projektu iGEM ekipe s švedske univerze Upsalla, 2017]

(Sara Kimm Fuhrmann)

==Uvod==
Skupina študentov s švedske univerze Upsalla je na iGem tekmovanju leta 2017 predstavila projekt, ki so ga poimenovali Crafting crocin. Njihov namen je bil vzpostaviti biosintezno pot za pridobivanje krocina v bakteriji ''Escherichia coli''. Krocin je apokarotenoidni pigment v žafranu, začimbi, ki jo pridobivamo iz rastline ''Crocus sativus''. Krocin in njegovi prekurzorji so potencialne nevroprotektivne in protitumorske učinkovine, vendar je potrebno opraviti več raziskav za ugotavljanje njihove uporabnosti v medicinske namene. Prav tako bi jih lahko uporabljali v industriji kot barvila. Vendar pa je cena žafrana zaradi pogojev pridelave zelo visoka, izolacija posameznih spojin pa je ekonomsko neugodna. S pridobivanjem krocina v bakteriji ''E. coli'' želi iGEM ekipa bistveno znižati proizvodne stroške in s tem odpreti več možnosti za nadaljnje raziskave.

==Biosintezna pot krocina==
Ekipa je želela v ''E. coli'' vzpostaviti biosintezno pot iz osmih korakov, ki se začne z endogenim farnezil pirofosfatom. Geranilgeranil difosfat-sintaza pretvori farnezil pirofosfat v geranilgeranil pirofosfat. Sledi pretvorba v fitoen s fitoen-sintazo. Fitoen-desaturaza pretvori fitoen v likopen, tega pa pretvori likopen-ciklaza v β-karoten. Z delovanjem β-karoten-hidroksilaze nastane zeaksantin. Karotenoid-cepitvena-dioksigenaza pretvori zeaksantin v krocetin dialdehid. Aldehiddehidrogenaza nato oksidira aldehidni skupini na vsakem koncu, da nastane krocetin. Krocin nastane po delovanju UDP-glukuronoziltransferaze.

===Biosintezna pot od farnezil pirofosfata do zeaksantina===
Že ekipe iz prejšnjih tekmovanj so uspele pripraviti sev ''E.coli'', ki je proizvajal zeaksantin po transformaciji z ustreznimi plazmidi. Uporabili so 5 genov iz bakterije ''Pantoea ananatis'', ''crtE'' (kodira za geranilgeranil pirofosfat-sintazo), ''crtB'' (kodira za fitoen-sintazo), ''crtI'' (kodira za fitoen-dehidrognazo), ''crtY'' (kodira za likopen-ciklazo) in ''crtZ'' (kodira za β-karoten-hidroksilazo) [Edinburgh iGEM 2007].
Letošnja ekipa pa se je odločila te gene prenesti na kromosom bakterije, s čimer bi se znebili tudi potrebe po stalnem izvajanju selekcijskega pritiska.
Uporabili so sistem rekombinacije, posredovane s proteini bakteriofaga lambda Red. Pri tej metodi v sev ''E. coli'', ki izraža gene bakteriofaga lambda Red, vnesemo linearno donorsko DNA matrico, ki je lahko dvo ali enoverižna. Proteini Gam (preprečuje razgradnjo linearne DNA matrice z endogenima nukleazama RecBCD in SbcCD), Exo (eksonukleaza, ki ustvari 3' štrleče konce ) in Beta (ščiti ssDNA in sodeluje pri prileganju na tarčo) katalizirajo homologno rekombinacijo med donorsko in tarčno DNA. Če uporabljamo enoverižno donorsko DNA, potrebujemo samo proteine Beta [Kenkel, 2016]. Donorska DNA matrica mora vsebovati na obeh koncih vsaj 35 bp dolgo zaporedje, ki je homologno ciljani regiji. Ker inserti ne smejo biti daljši od 3000 bp, so pripravili več donorskih DNA matric, ki so jih ali naročili ali pa pripravili sami z reakcijo PCR, pri čemer so uporabili ustrezne začetne oligonukleotide. Na koncu so dobili tri donorske DNA matrice: prva s ''crtE'' in ''crtB'', druga s ''crtZ'' in ''crtY'' in tretja s ''crtI''. Želeli so jih vključiti na različna mesta na kromosomu. Vsaka matrica vsebuje drugačen konstitutiven promotor, da med matricami ni neželjene homologije, ki bi lahko motile sestavljanje.
Sev ''E.coli'', ki so ga uporabili za rekombinacijo, vsebuje plazmid z zapisi za proteine lambda Red in rezistenco na tetraciklin (pSIM5-tet ali pSIM6). Ori plazmida je občutljiv na temperaturo, kar nam omogoča, da se rekombinaznega sistema enostavno znebimo, ko ga ne potrebujemo več [Kenkel, 2016].
Pripravili so tri seve ''E.coli'', ki so vsebovali selekcijsko kaseto ''cat-SacB'' (gen za rezistenco na kloramfenikol in gen, ki kodira levansukrazo, ki ob prisotnosti sukroze povzroči propad gramnegativnih bakterij) na različnih tarčnih mestih.
Z metodo lambda Red so najprej zamenjali selekcijsko kaseto ''cat-sacB'' s ''crtI'' v prvem sevu. Če do zamenjave kasete s ''crtI'' ne pride, bakterije na gojišču z dodano sukrozo ne zrastejo.
Na enak način so pripravili drugi sev, le da so selekcijsko kaseto ''cat-sacB'' zamenjali s ''crtZ'' in ''crtY''. S transdukcijo posredovano z bakteriofagom P1 so v prvi sev (s ''crtI'') vnesli novo selekcijsko kaseto ''cat-sacB''. Nato pa so z metodo lambda Red selekcijsko kaseto zamenjali s ''crtE'' in ''crtB''. Kolonije, ki so uspešno prejele vključek, so se obarvale svetlo rdeče, saj so pričele sintetizirati likopen.
S transdukcijo posredovano z bakteriofagom P1, kjer so kot donorski sev uporabili sev s ''crtZ'' in ''crtY'', kot prejemniški sev pa sev s ''crtI'', ''crtE'' in ''crtB'', so pripravili končni sev ''E.coli'', ki je sintetiziral zeaksantin. Kolonije so se zato obarvale rumeno.
Uspešnost posameznih korakov so potrdili z reakcijo PCR, gelsko elektroforezo in sekvenciranjem. Zeaksantin so uspešno izolirali in očistili iz proizvodnega seva. Da pa je bil izoliran produkt resnično zeaksantin, so potrdili s primerjavo absorpcijskih spektrov izoliranega zeaksantina in standarda.

===Biosintezna pod od zeaksantina do krocina===
Na podlagi literaturnih podatkov so izbrali zadnje tri encime v biosintezni poti krocina. Izbrali so karotenoid-cepitveno-dioksigenazo iz rastline ''Crocus Ancyrensis'' (CaCCD2), aldehiddehidrogenazo 2946 (CsADH2946) in UDP-glukuronoziltransferazo 2 (UGTCs2) iz rastline ''Crocus Sativus''. Kodon so optimizirali za izražanje v bakteriji ''E.coli''. S homolognim modeliranjem so ugotovili, da so N konci usmerjeni navzven (stran od proteina), zato so se odločili, da lahko na N konce dodajo še his-tag. Gene so naročili pri podjetju IDT.
Z metodo sestavljanja po Gibsonu so posamezne gene vključili v plazmide pSB1CR, ki so jih predhodno linearizirali v reakciji PCR z DNA polimerazo Phusion. Za vsak encim so pripravili dve različni biokocki, eno s konstitutivnim promotorjem in drugo z inducibilnim lac promotorjem. Biokocke z inducibilnimi promotorji so sestavili v en plazmid z načinom sestavljanja 3A.
Plazmid so z elektroporacijo vnesli v prej pripravljen sev ''E. coli'', ki proizvaja zeaksantin. Tako pripravljen sev ''E. coli'' vsebuje celotno biosintezno pot za sintezo krocina. Kolonije so rumene barve.
Za analizo spojin izoliranih iz bakterij so uporabili tankoplastno kromatografijo - TLC. Zaradi velikega števila različnih pigmentov, ki nastanejo v biosintezni poti, TLC ne omogoča dovolj dobre ločljivosti za identifikacijo posameznih pigmentov. Zato želijo v prihodnosti izolirane spojine analizirati in identificirati s primernejšimi metodami kot je npr. tekočinska kromatografija v povezavi z masno spektrometrijo – HPLC-MS.

==Modeliranje==
Encimi odgovorni za katalizo zadnjih treh stopenj v biosintezni poti so dokaj novo odkriti in še niso dobro okarakterizirani. Prav tako strukture teh encimov niso poznane.
S pomočjo homolognega modeliranja, ki temelji na podobnosti aminokislinskega zaporedja med matričnim proteinom z znano 3D strukturo in preiskovanim proteinom, so prikazali možne 3D strukture za vse tri encime. Na podlagi teh rezultatov predpostavljajo, da sta UGTCs2 in CaCCD2 monomera, CsADH2946 pa je tetramer. S simulacijami molekulske dinamike so pokazali, da so tako pripravljeni modeli stabilni pri pogojih, ki so podobni fiziološkim.
S simulacijami so preučevali tudi afiniteto CsADH2946 do substrata. Primerjali so vrednosti za substrat krocetin dialdehid in acetaldehid. Pokazali so, da je encim specifičen za krocetin dialdehid in da je afiniteta vezave v µM rangu. CsADH2946 so s kovinsko-kelatno afinitetno kromatografijo tudi izolirali in preverili njegovo aktivnost. Na podlagi rezultatov testiranja encimske aktivnosti, kjer so spremljali razlike v absorbanci po izpostavitvi substrata encimu, so določili Michaelisovo konstanto (Km = 20.7842 µM ± 3.5264). Nizka vrednost konstante nakazuje na visoko afiniteto do krocetin dialdehida, kar se sklada z njihovimi simulacijskimi analizami.

==Zaključek==
Ekipa s švedske univerze Upsalla je uspela pripraviti sev ''E.coli'', ki vsebuje celotno biosintezno pot krocina. Prvih pet genov v biosintezni poti so prenesli na bakterijski kromosom, preostali trije geni pa so na plazmidu. V prihodnosti želijo tudi te prenesti na kromosom. So prvi, ki so očistili, potrdili aktivnost CsADH2946 in določili kinetične parametre encima.
Iz seva ''E. coli'', ki vsebuje biosintezno pot za zeaksantin so uspešno izolirali in očistili omenjeni produkt. Koliko je znašal titer, niso navedli.
Pigmentov izoliranih iz seva ''E. coli'', ki vsebuje celotno biosintezno pot krocina, žal niso uspeli identificirati, ker niso imeli na voljo ustrezne metode.

==Viri==
Crafting crocin. iGEM. Pridobljeno 1.12.2017. Dostopno na naslovu: http://2017.igem.org/Team:Uppsala

Kenkel B. 2016. Lambda Red: A Homologous Recombination-based Technique for Genetic Engineering. Addgene. Pridobljeno 1.12.2017. Dostopno na naslovu: http://blog.addgene.org/lambda-red-a-homologous-recombination-based-technique-for-genetic-engineering

Edinburgh 2007 iGEM Team Parts. iGEM. Pridobljeno 2.12.2017. Dostopno na naslovu: http://parts.igem.org/cgi/partsdb/pgroup.cgi?pgroup=iGEM2007&group=Edinburgh

Crafting crocin – vzpostavitev biosintezne poti za pridobivanje krocina v bakteriji Escherichia coli

2017-12-03T22:47:34Z

Kimm Fuhrmann: /* Biosintezna pot od farnezil pirofosfata do zeaksantina */

Povzeto po [http://2017.igem.org/Team:Uppsala projektu iGEM ekipe s švedske univerze Upsalla, 2017]

(Sara Kimm Fuhrmann)

==Uvod==
Skupina študentov s švedske univerze Upsalla je na iGem tekmovanju leta 2017 predstavila projekt, ki so ga poimenovali Crafting crocin. Njihov namen je bil vzpostaviti biosintezno pot za pridobivanje krocina v bakteriji ''Escherichia coli''. Krocin je apokarotenoidni pigment v žafranu, začimbi, ki jo pridobivamo iz rastline ''Crocus sativus''. Krocin in njegovi prekurzorji so potencialne nevroprotektivne in protitumorske učinkovine, vendar je potrebno opraviti več raziskav za ugotavljanje njihove uporabnosti v medicinske namene. Prav tako bi jih lahko uporabljali v industriji kot barvila. Vendar pa je cena žafrana zaradi pogojev pridelave zelo visoka, izolacija posameznih spojin pa je ekonomsko neugodna. S pridobivanjem krocina v bakteriji ''E. coli'' želi iGEM ekipa bistveno znižati proizvodne stroške in s tem odpreti več možnosti za nadaljnje raziskave.

==Biosintezna pot krocina==
Ekipa je želela v ''E. coli'' vzpostaviti biosintezno pot iz osmih korakov, ki se začne z endogenim farnezil pirofosfatom. Geranilgeranil difosfat-sintaza pretvori farnezil pirofosfat v geranilgeranil pirofosfat. Sledi pretvorba v fitoen s fitoen-sintazo. Fitoen-desaturaza pretvori fitoen v likopen, tega pa pretvori likopen-ciklaza v β-karoten. Z delovanjem β-karoten-hidroksilaze nastane zeaksantin. Karotenoid-cepitvena-dioksigenaza pretvori zeaksantin v krocetin dialdehid. Aldehiddehidrogenaza nato oksidira aldehidni skupini na vsakem koncu, da nastane krocetin. Krocin nastane po delovanju UDP-glukuronoziltransferaze.

===Biosintezna pot od farnezil pirofosfata do zeaksantina===
Že ekipe iz prejšnjih tekmovanj so uspele pripraviti sev ''E.coli'', ki je proizvajal zeaksantin po transformaciji z ustreznimi plazmidi. Uporabili so 5 genov iz bakterije ''Pantoea ananatis'', ''crtE'' (kodira za geranilgeranil pirofosfat-sintazo), ''crtB'' (kodira za fitoen-sintazo), ''crtI'' (kodira za fitoen-dehidrognazo), ''crtY'' (kodira za likopen-ciklazo) in ''crtZ'' (kodira za β-karoten-hidroksilazo) [Edinburgh iGEM 2007].
Letošnja ekipa pa se je odločila te gene prenesti na kromosom bakterije, s čimer bi se znebili tudi potrebe po stalnem izvajanju selekcijskega pritiska.
Uporabili so sistem rekombinacije, posredovane s proteini bakteriofaga lambda Red. Pri tej metodi v sev ''E. coli'', ki izraža proteine bakteriofaga lambda Red, vnesemo linearno donorsko DNA matrico, ki je lahko dvo ali enoverižna. Proteini Gam (preprečuje razgradnjo linearne DNA matrice z endogenima nukleazama RecBCD in SbcCD), Exo (eksonukleaza, ki ustvari 3' štrleče konce ) in Beta (ščiti ssDNA in sodeluje pri prileganju na tarčo) katalizirajo homologno rekombinacijo med donorsko in tarčno DNA. Če uporabljamo enoverižno donorsko DNA, potrebujemo samo proteine Beta [Kenkel, 2016]. Donorska DNA matrica mora vsebovati na obeh koncih vsaj 35 bp dolgo zaporedje, ki je homologno ciljani regiji. Ker inserti ne smejo biti daljši od 3000 bp, so pripravili več donorskih DNA matric, ki so jih ali naročili ali pa pripravili sami z reakcijo PCR, pri čemer so uporabili ustrezne začetne oligonukleotide. Na koncu so dobili tri donorske DNA matrice: prva s ''crtE'' in ''crtB'', druga s ''crtZ'' in ''crtY'' in tretja s ''crtI''. Želeli so jih vključiti na različna mesta na kromosomu. Vsaka matrica vsebuje drugačen konstitutiven promotor, da med matricami ni neželjene homologije, ki bi lahko motile sestavljanje.
Sev ''E.coli'', ki so ga uporabili za rekombinacijo, vsebuje plazmid z zapisi za proteine lambda Red in rezistenco na tetraciklin (pSIM5-tet ali pSIM6). Ori plazmida je občutljiv na temperaturo, kar nam omogoča, da se rekombinaznega sistema enostavno znebimo, ko ga ne potrebujemo več [Kenkel, 2016].
Pripravili so tri seve ''E.coli'', ki so vsebovali selekcijsko kaseto ''cat-SacB'' (gen za rezistenco na kloramfenikol in gen, ki kodira levansukrazo, ki ob prisotnosti sukroze povzroči propad gramnegativnih bakterij) na različnih tarčnih mestih.
Z metodo lambda Red so najprej zamenjali selekcijsko kaseto ''cat-sacB'' s ''crtI'' v prvem sevu. Če do zamenjave kasete s ''crtI'' ne pride, bakterije na gojišču z dodano sukrozo ne zrastejo.
Na enak način so pripravili drugi sev, le da so selekcijsko kaseto ''cat-sacB'' zamenjali s ''crtZ'' in ''crtY''. S transdukcijo posredovano z bakteriofagom P1 so v prvi sev (s ''crtI'') vnesli novo selekcijsko kaseto ''cat-sacB''. Nato pa so z metodo lambda Red selekcijsko kaseto zamenjali s ''crtE'' in ''crtB''. Kolonije, ki so uspešno prejele vključek, so se obarvale svetlo rdeče, saj so pričele sintetizirati likopen.
S transdukcijo posredovano z bakteriofagom P1, kjer so kot donorski sev uporabili sev s ''crtZ'' in ''crtY'', kot prejemniški sev pa sev s ''crtI'', ''crtE'' in ''crtB'', so pripravili končni sev ''E.coli'', ki je sintetiziral zeaksantin. Kolonije so se zato obarvale rumeno.
Uspešnost posameznih korakov so potrdili z reakcijo PCR, gelsko elektroforezo in sekvenciranjem. Zeaksantin so uspešno izolirali in očistili iz proizvodnega seva. Da pa je bil izoliran produkt resnično zeaksantin, so potrdili s primerjavo absorpcijskih spektrov izoliranega zeaksantina in standarda.

===Biosintezna pod od zeaksantina do krocina===
Na podlagi literaturnih podatkov so izbrali zadnje tri encime v biosintezni poti krocina. Izbrali so karotenoid-cepitveno-dioksigenazo iz rastline ''Crocus Ancyrensis'' (CaCCD2), aldehiddehidrogenazo 2946 (CsADH2946) in UDP-glukuronoziltransferazo 2 (UGTCs2) iz rastline ''Crocus Sativus''. Kodon so optimizirali za izražanje v bakteriji ''E.coli''. S homolognim modeliranjem so ugotovili, da so N konci usmerjeni navzven (stran od proteina), zato so se odločili, da lahko na N konce dodajo še his-tag. Gene so naročili pri podjetju IDT.
Z metodo sestavljanja po Gibsonu so posamezne gene vključili v plazmide pSB1CR, ki so jih predhodno linearizirali v reakciji PCR z DNA polimerazo Phusion. Za vsak encim so pripravili dve različni biokocki, eno s konstitutivnim promotorjem in drugo z inducibilnim lac promotorjem. Biokocke z inducibilnimi promotorji so sestavili v en plazmid z načinom sestavljanja 3A.
Plazmid so z elektroporacijo vnesli v prej pripravljen sev ''E. coli'', ki proizvaja zeaksantin. Tako pripravljen sev ''E. coli'' vsebuje celotno biosintezno pot za sintezo krocina. Kolonije so rumene barve.
Za analizo spojin izoliranih iz bakterij so uporabili tankoplastno kromatografijo - TLC. Zaradi velikega števila različnih pigmentov, ki nastanejo v biosintezni poti, TLC ne omogoča dovolj dobre ločljivosti za identifikacijo posameznih pigmentov. Zato želijo v prihodnosti izolirane spojine analizirati in identificirati s primernejšimi metodami kot je npr. tekočinska kromatografija v povezavi z masno spektrometrijo – HPLC-MS.

==Modeliranje==
Encimi odgovorni za katalizo zadnjih treh stopenj v biosintezni poti so dokaj novo odkriti in še niso dobro okarakterizirani. Prav tako strukture teh encimov niso poznane.
S pomočjo homolognega modeliranja, ki temelji na podobnosti aminokislinskega zaporedja med matričnim proteinom z znano 3D strukturo in preiskovanim proteinom, so prikazali možne 3D strukture za vse tri encime. Na podlagi teh rezultatov predpostavljajo, da sta UGTCs2 in CaCCD2 monomera, CsADH2946 pa je tetramer. S simulacijami molekulske dinamike so pokazali, da so tako pripravljeni modeli stabilni pri pogojih, ki so podobni fiziološkim.
S simulacijami so preučevali tudi afiniteto CsADH2946 do substrata. Primerjali so vrednosti za substrat krocetin dialdehid in acetaldehid. Pokazali so, da je encim specifičen za krocetin dialdehid in da je afiniteta vezave v µM rangu. CsADH2946 so s kovinsko-kelatno afinitetno kromatografijo tudi izolirali in preverili njegovo aktivnost. Na podlagi rezultatov testiranja encimske aktivnosti, kjer so spremljali razlike v absorbanci po izpostavitvi substrata encimu, so določili Michaelisovo konstanto (Km = 20.7842 µM ± 3.5264). Nizka vrednost konstante nakazuje na visoko afiniteto do krocetin dialdehida, kar se sklada z njihovimi simulacijskimi analizami.

==Zaključek==
Ekipa s švedske univerze Upsalla je uspela pripraviti sev ''E.coli'', ki vsebuje celotno biosintezno pot krocina. Prvih pet genov v biosintezni poti so prenesli na bakterijski kromosom, preostali trije geni pa so na plazmidu. V prihodnosti želijo tudi te prenesti na kromosom. So prvi, ki so očistili, potrdili aktivnost CsADH2946 in določili kinetične parametre encima.
Iz seva ''E. coli'', ki vsebuje biosintezno pot za zeaksantin so uspešno izolirali in očistili omenjeni produkt. Koliko je znašal titer, niso navedli.
Pigmentov izoliranih iz seva ''E. coli'', ki vsebuje celotno biosintezno pot krocina, žal niso uspeli identificirati, ker niso imeli na voljo ustrezne metode.

==Viri==
Crafting crocin. iGEM. Pridobljeno 1.12.2017. Dostopno na naslovu: http://2017.igem.org/Team:Uppsala

Kenkel B. 2016. Lambda Red: A Homologous Recombination-based Technique for Genetic Engineering. Addgene. Pridobljeno 1.12.2017. Dostopno na naslovu: http://blog.addgene.org/lambda-red-a-homologous-recombination-based-technique-for-genetic-engineering

Edinburgh 2007 iGEM Team Parts. iGEM. Pridobljeno 2.12.2017. Dostopno na naslovu: http://parts.igem.org/cgi/partsdb/pgroup.cgi?pgroup=iGEM2007&group=Edinburgh

Crafting crocin – vzpostavitev biosintezne poti za pridobivanje krocina v bakteriji Escherichia coli

2017-12-03T22:12:45Z

Kimm Fuhrmann: /* Modeliranje */

Povzeto po [http://2017.igem.org/Team:Uppsala projektu iGEM ekipe s švedske univerze Upsalla, 2017]

(Sara Kimm Fuhrmann)

==Uvod==
Skupina študentov s švedske univerze Upsalla je na iGem tekmovanju leta 2017 predstavila projekt, ki so ga poimenovali Crafting crocin. Njihov namen je bil vzpostaviti biosintezno pot za pridobivanje krocina v bakteriji ''Escherichia coli''. Krocin je apokarotenoidni pigment v žafranu, začimbi, ki jo pridobivamo iz rastline ''Crocus sativus''. Krocin in njegovi prekurzorji so potencialne nevroprotektivne in protitumorske učinkovine, vendar je potrebno opraviti več raziskav za ugotavljanje njihove uporabnosti v medicinske namene. Prav tako bi jih lahko uporabljali v industriji kot barvila. Vendar pa je cena žafrana zaradi pogojev pridelave zelo visoka, izolacija posameznih spojin pa je ekonomsko neugodna. S pridobivanjem krocina v bakteriji ''E. coli'' želi iGEM ekipa bistveno znižati proizvodne stroške in s tem odpreti več možnosti za nadaljnje raziskave.

==Biosintezna pot krocina==
Ekipa je želela v ''E. coli'' vzpostaviti biosintezno pot iz osmih korakov, ki se začne z endogenim farnezil pirofosfatom. Geranilgeranil difosfat-sintaza pretvori farnezil pirofosfat v geranilgeranil pirofosfat. Sledi pretvorba v fitoen s fitoen-sintazo. Fitoen-desaturaza pretvori fitoen v likopen, tega pa pretvori likopen-ciklaza v β-karoten. Z delovanjem β-karoten-hidroksilaze nastane zeaksantin. Karotenoid-cepitvena-dioksigenaza pretvori zeaksantin v krocetin dialdehid. Aldehiddehidrogenaza nato oksidira aldehidni skupini na vsakem koncu, da nastane krocetin. Krocin nastane po delovanju UDP-glukuronoziltransferaze.

===Biosintezna pot od farnezil pirofosfata do zeaksantina===
Že ekipe iz prejšnjih tekmovanj so uspele pripraviti sev ''E.coli'', ki je proizvajal zeaksantin po transformaciji z ustreznimi plazmidi. Uporabili so 5 genov iz bakterije ''Pantoea ananatis'', ''crtE'' (kodira za geranilgeranil pirofosfat-sintazo), ''crtB'' (kodira za fitoen-sintazo), ''crtI'' (kodira za fitoen-dehidrognazo), ''crtY'' (kodira za likopen-ciklazo) in ''crtZ'' (kodira za β-karoten-hidroksilazo) [Edinburgh iGEM 2007].
Letošnja ekipa pa se je odločila te gene prenesti na kromosom bakterije, s čimer bi se znebili tudi potrebe po stalnem izvajanju selekcijskega pritiska.
Uporabili so sistem rekombinacije, posredovane s proteini bakteriofaga lambda red. Pri tej metodi v sev ''E. coli'', ki izraža proteine bakteriofaga lambda red, vnesemo linearno donorsko DNA matrico, ki je lahko dvo ali enoverižna. Proteini Gam (preprečuje razgradnjo linearne DNA matrice z endogenima nukleazama RecBCD in SbcCD), Exo (eksonukleaza, ki ustvari 3' štrleče konce ) in Beta (ščiti ssDNA in sodeluje pri prileganju na tarčo) katalizirajo homologno rekombinacijo med donorsko in tarčno DNA. Če uporabljamo enoverižno donorsko DNA, potrebujemo samo proteine Beta [Kenkel, 2016]. Donorska DNA matrica mora vsebovati na obeh koncih vsaj 35 bp dolgo zaporedje, ki je homologno ciljani regiji. Ker inserti ne smejo biti daljši od 3000 bp, so pripravili več donorskih DNA matric, ki so jih ali naročili ali pa pripravili sami z reakcijo PCR, pri čemer so uporabili ustrezne začetne oligonukleotide. Na koncu so dobili tri donorske DNA matrice: prva s ''crtE'' in ''crtB'', druga s ''crtZ'' in ''crtY'' in tretja s ''crtI''. Želeli so jih vključiti na različna mesta na kromosomu. Vsaka matrica vsebuje drugačen konstitutiven promotor, da med matricami ni neželjene homologije, ki bi lahko motile sestavljanje.
Sev ''E.coli'', ki so ga uporabili za rekombinacijo, vsebuje plazmid z zapisi za proteine lambda red in rezistenco na tetraciklin (pSIM5-tet ali pSIM6). Ori plazmida je občutljiv na temperaturo, kar nam omogoča, da se rekombinaznega sistema enostavno znebimo, ko ga ne potrebujemo več [Kenkel, 2016].
Pripravili so tri seve ''E.coli'', ki so vsebovali selekcijsko kaseto ''cat-SacB'' (gen za rezistenco na kloramfenikol in gen, ki kodira levansukrazo, ki ob prisotnosti sukroze povzroči propad gramnegativnih bakterij) na različnih tarčnih mestih.
Z metodo lambda red so najprej zamenjali selekcijsko kaseto ''cat-sacB'' s ''crtI'' v prvem sevu. Če do zamenjave kasete s ''crtI'' ne pride, bakterije na gojišču z dodano sukrozo ne zrastejo.
Na enak način so pripravili drugi sev, le da so selekcijsko kaseto ''cat-sacB'' zamenjali s ''crtZ'' in ''crtY''. S transdukcijo posredovano z bakteriofagom P1 so v prvi sev (s ''crtI'') vnesli novo selekcijsko kaseto ''cat-sacB''. Nato pa so z metodo lambda red selekcijsko kaseto zamenjali s ''crtE'' in ''crtB''. Kolonije, ki so uspešno prejele vključek, so se obarvale svetlo rdeče, saj so pričele sintetizirati likopen.
S transdukcijo posredovano z bakteriofagom P1, kjer so kot donorski sev uporabili sev s ''crtZ'' in ''crtY'', kot prejemniški sev pa sev s ''crtI'', ''crtE'' in ''crtB'', so pripravili končni sev ''E.coli'', ki je sintetiziral zeaksantin. Kolonije so se zato obarvale rumeno.
Uspešnost posameznih korakov so potrdili z reakcijo PCR, gelsko elektroforezo in sekvenciranjem. Zeaksantin so uspešno izolirali in očistili iz proizvodnega seva. Da pa je bil izoliran produkt resnično zeaksantin, so potrdili s primerjavo absorpcijskih spektrov izoliranega zeaksantina in standarda.

===Biosintezna pod od zeaksantina do krocina===
Na podlagi literaturnih podatkov so izbrali zadnje tri encime v biosintezni poti krocina. Izbrali so karotenoid-cepitveno-dioksigenazo iz rastline ''Crocus Ancyrensis'' (CaCCD2), aldehiddehidrogenazo 2946 (CsADH2946) in UDP-glukuronoziltransferazo 2 (UGTCs2) iz rastline ''Crocus Sativus''. Kodon so optimizirali za izražanje v bakteriji ''E.coli''. S homolognim modeliranjem so ugotovili, da so N konci usmerjeni navzven (stran od proteina), zato so se odločili, da lahko na N konce dodajo še his-tag. Gene so naročili pri podjetju IDT.
Z metodo sestavljanja po Gibsonu so posamezne gene vključili v plazmide pSB1CR, ki so jih predhodno linearizirali v reakciji PCR z DNA polimerazo Phusion. Za vsak encim so pripravili dve različni biokocki, eno s konstitutivnim promotorjem in drugo z inducibilnim lac promotorjem. Biokocke z inducibilnimi promotorji so sestavili v en plazmid z načinom sestavljanja 3A.
Plazmid so z elektroporacijo vnesli v prej pripravljen sev ''E. coli'', ki proizvaja zeaksantin. Tako pripravljen sev ''E. coli'' vsebuje celotno biosintezno pot za sintezo krocina. Kolonije so rumene barve.
Za analizo spojin izoliranih iz bakterij so uporabili tankoplastno kromatografijo - TLC. Zaradi velikega števila različnih pigmentov, ki nastanejo v biosintezni poti, TLC ne omogoča dovolj dobre ločljivosti za identifikacijo posameznih pigmentov. Zato želijo v prihodnosti izolirane spojine analizirati in identificirati s primernejšimi metodami kot je npr. tekočinska kromatografija v povezavi z masno spektrometrijo – HPLC-MS.

==Modeliranje==
Encimi odgovorni za katalizo zadnjih treh stopenj v biosintezni poti so dokaj novo odkriti in še niso dobro okarakterizirani. Prav tako strukture teh encimov niso poznane.
S pomočjo homolognega modeliranja, ki temelji na podobnosti aminokislinskega zaporedja med matričnim proteinom z znano 3D strukturo in preiskovanim proteinom, so prikazali možne 3D strukture za vse tri encime. Na podlagi teh rezultatov predpostavljajo, da sta UGTCs2 in CaCCD2 monomera, CsADH2946 pa je tetramer. S simulacijami molekulske dinamike so pokazali, da so tako pripravljeni modeli stabilni pri pogojih, ki so podobni fiziološkim.
S simulacijami so preučevali tudi afiniteto CsADH2946 do substrata. Primerjali so vrednosti za substrat krocetin dialdehid in acetaldehid. Pokazali so, da je encim specifičen za krocetin dialdehid in da je afiniteta vezave v µM rangu. CsADH2946 so s kovinsko-kelatno afinitetno kromatografijo tudi izolirali in preverili njegovo aktivnost. Na podlagi rezultatov testiranja encimske aktivnosti, kjer so spremljali razlike v absorbanci po izpostavitvi substrata encimu, so določili Michaelisovo konstanto (Km = 20.7842 µM ± 3.5264). Nizka vrednost konstante nakazuje na visoko afiniteto do krocetin dialdehida, kar se sklada z njihovimi simulacijskimi analizami.

==Zaključek==
Ekipa s švedske univerze Upsalla je uspela pripraviti sev ''E.coli'', ki vsebuje celotno biosintezno pot krocina. Prvih pet genov v biosintezni poti so prenesli na bakterijski kromosom, preostali trije geni pa so na plazmidu. V prihodnosti želijo tudi te prenesti na kromosom. So prvi, ki so očistili, potrdili aktivnost CsADH2946 in določili kinetične parametre encima.
Iz seva ''E. coli'', ki vsebuje biosintezno pot za zeaksantin so uspešno izolirali in očistili omenjeni produkt. Koliko je znašal titer, niso navedli.
Pigmentov izoliranih iz seva ''E. coli'', ki vsebuje celotno biosintezno pot krocina, žal niso uspeli identificirati, ker niso imeli na voljo ustrezne metode.

==Viri==
Crafting crocin. iGEM. Pridobljeno 1.12.2017. Dostopno na naslovu: http://2017.igem.org/Team:Uppsala

Kenkel B. 2016. Lambda Red: A Homologous Recombination-based Technique for Genetic Engineering. Addgene. Pridobljeno 1.12.2017. Dostopno na naslovu: http://blog.addgene.org/lambda-red-a-homologous-recombination-based-technique-for-genetic-engineering

Edinburgh 2007 iGEM Team Parts. iGEM. Pridobljeno 2.12.2017. Dostopno na naslovu: http://parts.igem.org/cgi/partsdb/pgroup.cgi?pgroup=iGEM2007&group=Edinburgh

Crafting crocin – vzpostavitev biosintezne poti za pridobivanje krocina v bakteriji Escherichia coli

2017-12-03T21:51:37Z

Kimm Fuhrmann:

Povzeto po [http://2017.igem.org/Team:Uppsala projektu iGEM ekipe s švedske univerze Upsalla, 2017]

(Sara Kimm Fuhrmann)

==Uvod==
Skupina študentov s švedske univerze Upsalla je na iGem tekmovanju leta 2017 predstavila projekt, ki so ga poimenovali Crafting crocin. Njihov namen je bil vzpostaviti biosintezno pot za pridobivanje krocina v bakteriji ''Escherichia coli''. Krocin je apokarotenoidni pigment v žafranu, začimbi, ki jo pridobivamo iz rastline ''Crocus sativus''. Krocin in njegovi prekurzorji so potencialne nevroprotektivne in protitumorske učinkovine, vendar je potrebno opraviti več raziskav za ugotavljanje njihove uporabnosti v medicinske namene. Prav tako bi jih lahko uporabljali v industriji kot barvila. Vendar pa je cena žafrana zaradi pogojev pridelave zelo visoka, izolacija posameznih spojin pa je ekonomsko neugodna. S pridobivanjem krocina v bakteriji ''E. coli'' želi iGEM ekipa bistveno znižati proizvodne stroške in s tem odpreti več možnosti za nadaljnje raziskave.

==Biosintezna pot krocina==
Ekipa je želela v ''E. coli'' vzpostaviti biosintezno pot iz osmih korakov, ki se začne z endogenim farnezil pirofosfatom. Geranilgeranil difosfat-sintaza pretvori farnezil pirofosfat v geranilgeranil pirofosfat. Sledi pretvorba v fitoen s fitoen-sintazo. Fitoen-desaturaza pretvori fitoen v likopen, tega pa pretvori likopen-ciklaza v β-karoten. Z delovanjem β-karoten-hidroksilaze nastane zeaksantin. Karotenoid-cepitvena-dioksigenaza pretvori zeaksantin v krocetin dialdehid. Aldehiddehidrogenaza nato oksidira aldehidni skupini na vsakem koncu, da nastane krocetin. Krocin nastane po delovanju UDP-glukuronoziltransferaze.

===Biosintezna pot od farnezil pirofosfata do zeaksantina===
Že ekipe iz prejšnjih tekmovanj so uspele pripraviti sev ''E.coli'', ki je proizvajal zeaksantin po transformaciji z ustreznimi plazmidi. Uporabili so 5 genov iz bakterije ''Pantoea ananatis'', ''crtE'' (kodira za geranilgeranil pirofosfat-sintazo), ''crtB'' (kodira za fitoen-sintazo), ''crtI'' (kodira za fitoen-dehidrognazo), ''crtY'' (kodira za likopen-ciklazo) in ''crtZ'' (kodira za β-karoten-hidroksilazo) [Edinburgh iGEM 2007].
Letošnja ekipa pa se je odločila te gene prenesti na kromosom bakterije, s čimer bi se znebili tudi potrebe po stalnem izvajanju selekcijskega pritiska.
Uporabili so sistem rekombinacije, posredovane s proteini bakteriofaga lambda red. Pri tej metodi v sev ''E. coli'', ki izraža proteine bakteriofaga lambda red, vnesemo linearno donorsko DNA matrico, ki je lahko dvo ali enoverižna. Proteini Gam (preprečuje razgradnjo linearne DNA matrice z endogenima nukleazama RecBCD in SbcCD), Exo (eksonukleaza, ki ustvari 3' štrleče konce ) in Beta (ščiti ssDNA in sodeluje pri prileganju na tarčo) katalizirajo homologno rekombinacijo med donorsko in tarčno DNA. Če uporabljamo enoverižno donorsko DNA, potrebujemo samo proteine Beta [Kenkel, 2016]. Donorska DNA matrica mora vsebovati na obeh koncih vsaj 35 bp dolgo zaporedje, ki je homologno ciljani regiji. Ker inserti ne smejo biti daljši od 3000 bp, so pripravili več donorskih DNA matric, ki so jih ali naročili ali pa pripravili sami z reakcijo PCR, pri čemer so uporabili ustrezne začetne oligonukleotide. Na koncu so dobili tri donorske DNA matrice: prva s ''crtE'' in ''crtB'', druga s ''crtZ'' in ''crtY'' in tretja s ''crtI''. Želeli so jih vključiti na različna mesta na kromosomu. Vsaka matrica vsebuje drugačen konstitutiven promotor, da med matricami ni neželjene homologije, ki bi lahko motile sestavljanje.
Sev ''E.coli'', ki so ga uporabili za rekombinacijo, vsebuje plazmid z zapisi za proteine lambda red in rezistenco na tetraciklin (pSIM5-tet ali pSIM6). Ori plazmida je občutljiv na temperaturo, kar nam omogoča, da se rekombinaznega sistema enostavno znebimo, ko ga ne potrebujemo več [Kenkel, 2016].
Pripravili so tri seve ''E.coli'', ki so vsebovali selekcijsko kaseto ''cat-SacB'' (gen za rezistenco na kloramfenikol in gen, ki kodira levansukrazo, ki ob prisotnosti sukroze povzroči propad gramnegativnih bakterij) na različnih tarčnih mestih.
Z metodo lambda red so najprej zamenjali selekcijsko kaseto ''cat-sacB'' s ''crtI'' v prvem sevu. Če do zamenjave kasete s ''crtI'' ne pride, bakterije na gojišču z dodano sukrozo ne zrastejo.
Na enak način so pripravili drugi sev, le da so selekcijsko kaseto ''cat-sacB'' zamenjali s ''crtZ'' in ''crtY''. S transdukcijo posredovano z bakteriofagom P1 so v prvi sev (s ''crtI'') vnesli novo selekcijsko kaseto ''cat-sacB''. Nato pa so z metodo lambda red selekcijsko kaseto zamenjali s ''crtE'' in ''crtB''. Kolonije, ki so uspešno prejele vključek, so se obarvale svetlo rdeče, saj so pričele sintetizirati likopen.
S transdukcijo posredovano z bakteriofagom P1, kjer so kot donorski sev uporabili sev s ''crtZ'' in ''crtY'', kot prejemniški sev pa sev s ''crtI'', ''crtE'' in ''crtB'', so pripravili končni sev ''E.coli'', ki je sintetiziral zeaksantin. Kolonije so se zato obarvale rumeno.
Uspešnost posameznih korakov so potrdili z reakcijo PCR, gelsko elektroforezo in sekvenciranjem. Zeaksantin so uspešno izolirali in očistili iz proizvodnega seva. Da pa je bil izoliran produkt resnično zeaksantin, so potrdili s primerjavo absorpcijskih spektrov izoliranega zeaksantina in standarda.

===Biosintezna pod od zeaksantina do krocina===
Na podlagi literaturnih podatkov so izbrali zadnje tri encime v biosintezni poti krocina. Izbrali so karotenoid-cepitveno-dioksigenazo iz rastline ''Crocus Ancyrensis'' (CaCCD2), aldehiddehidrogenazo 2946 (CsADH2946) in UDP-glukuronoziltransferazo 2 (UGTCs2) iz rastline ''Crocus Sativus''. Kodon so optimizirali za izražanje v bakteriji ''E.coli''. S homolognim modeliranjem so ugotovili, da so N konci usmerjeni navzven (stran od proteina), zato so se odločili, da lahko na N konce dodajo še his-tag. Gene so naročili pri podjetju IDT.
Z metodo sestavljanja po Gibsonu so posamezne gene vključili v plazmide pSB1CR, ki so jih predhodno linearizirali v reakciji PCR z DNA polimerazo Phusion. Za vsak encim so pripravili dve različni biokocki, eno s konstitutivnim promotorjem in drugo z inducibilnim lac promotorjem. Biokocke z inducibilnimi promotorji so sestavili v en plazmid z načinom sestavljanja 3A.
Plazmid so z elektroporacijo vnesli v prej pripravljen sev ''E. coli'', ki proizvaja zeaksantin. Tako pripravljen sev ''E. coli'' vsebuje celotno biosintezno pot za sintezo krocina. Kolonije so rumene barve.
Za analizo spojin izoliranih iz bakterij so uporabili tankoplastno kromatografijo - TLC. Zaradi velikega števila različnih pigmentov, ki nastanejo v biosintezni poti, TLC ne omogoča dovolj dobre ločljivosti za identifikacijo posameznih pigmentov. Zato želijo v prihodnosti izolirane spojine analizirati in identificirati s primernejšimi metodami kot je npr. tekočinska kromatografija v povezavi z masno spektrometrijo – HPLC-MS.

==Modeliranje==
Encimi odgovorni za katalizo zadnjih treh stopenj v biosintezni poti so dokaj novo odkriti in še niso dobro okarakterizirani. Prav tako strukture teh encimov niso poznane.
S pomočjo homolognega modeliranja, ki temelji na podobnosti aminokislinskega zaporedja med matričnim proteinom z znano 3D strukturo in preiskovanim proteinom, so prikazali možne 3D strukture za vse tri encime. Na podlagi teh rezultatov predpostavljajo, da sta UGTCs2 in CaCCD2 monomera, CsADH2946 pa je tetramer. S simulacijami molekulske dinamike so pokazali, da so tako pripravljeni modeli stabilni pri pogojih, ki so podobni fiziološkim.
S simulacijami so preučevali tudi afiniteto med CsADH2946 in substratom. Primerjali so vrednosti za substrat krocetin dialdehid in acetaldehid. Pokazali so, da je encim specifičen za krocetin dialdehid in da je afiniteta vezave v µM rangu. CsADH2946 so s kovinsko-kelatno afinitetno kromatografijo tudi izolirali in preverili njegovo aktivnost. Na podlagi rezultatov testiranja encimske aktivnosti, kjer so spremljali razlike v absorbanci po izpostavitvi substrata encimu, so določili Michaelisovo konstanto (Km = 20.7842 µM ± 3.5264). Nizka vrednost konstante nakazuje na visoko afiniteto do krocetin dialdehida, kar se sklada z njihovimi simulacijskimi analizami.

==Zaključek==
Ekipa s švedske univerze Upsalla je uspela pripraviti sev ''E.coli'', ki vsebuje celotno biosintezno pot krocina. Prvih pet genov v biosintezni poti so prenesli na bakterijski kromosom, preostali trije geni pa so na plazmidu. V prihodnosti želijo tudi te prenesti na kromosom. So prvi, ki so očistili, potrdili aktivnost CsADH2946 in določili kinetične parametre encima.
Iz seva ''E. coli'', ki vsebuje biosintezno pot za zeaksantin so uspešno izolirali in očistili omenjeni produkt. Koliko je znašal titer, niso navedli.
Pigmentov izoliranih iz seva ''E. coli'', ki vsebuje celotno biosintezno pot krocina, žal niso uspeli identificirati, ker niso imeli na voljo ustrezne metode.

==Viri==
Crafting crocin. iGEM. Pridobljeno 1.12.2017. Dostopno na naslovu: http://2017.igem.org/Team:Uppsala

Kenkel B. 2016. Lambda Red: A Homologous Recombination-based Technique for Genetic Engineering. Addgene. Pridobljeno 1.12.2017. Dostopno na naslovu: http://blog.addgene.org/lambda-red-a-homologous-recombination-based-technique-for-genetic-engineering

Edinburgh 2007 iGEM Team Parts. iGEM. Pridobljeno 2.12.2017. Dostopno na naslovu: http://parts.igem.org/cgi/partsdb/pgroup.cgi?pgroup=iGEM2007&group=Edinburgh

Seminarji SB 2017/18

2017-12-03T19:53:10Z

Kimm Fuhrmann:

V študijskem letu 2017/18 študentje predstavljajo naslednje teme:

RAZISKOVALNI ČLANKI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Metabolno_in%C5%BEenirstvo_kvasovke_Saccharomyces_cerevisiae_za_pridobivanje_n-butanola Metabolno inženirstvo kvasovke Saccharomyces cerevisiae za pridobivanje n-butanola] 
#

NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/No_problem NO problem]
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Croc_%27n_Cholera_-_mikrobni_sistem_za_zaznavanje_in_odstranjevanje_Vibrio_cholerae Croc 'n Cholera - mikrobni sistem za zaznavanje in odstranjevanje Vibrio cholerae]
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Aptasense Aptasense]
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Crafting_crocin_%E2%80%93_vzpostavitev_biosintezne_poti_za_pridobivanje_krocina_v_bakteriji_Escherichia_coli Crafting crocin – vzpostavitev biosintezne poti za pridobivanje krocina v bakteriji ''Escherichia coli'' ]

Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo razprava, ki praviloma ne bo daljša od 5 minut.

---------------------------
Razpored po datumih predstavitev (pri vsakem terminu je navedeno število možnih seminarjev; vpišite ime in priimek pri dnevu, ko želite predstaviti seminar ter dopišite naslov seminarja, ki naj bo povezan s povzetkom):

27.11. 
1 Marija Srnko -[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/No_problem NO problem] 
2 Neža Brezovar - [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/SLOVO_RAKU Slovo raku] 

28.11. 
1 Tjaša Grum - [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Metabolno_in%C5%BEenirstvo_kvasovke_Saccharomyces_cerevisiae_za_pridobivanje_n-butanola Metabolno inženirstvo kvasovke Saccharomyces cerevisiae za pridobivanje n-butanola] 
2 Urška Černe [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Croc_%27n_Cholera_-_mikrobni_sistem_za_zaznavanje_in_odstranjevanje_Vibrio_cholerae Croc 'n Cholera - mikrobni sistem za zaznavanje in odstranjevanje Vibrio cholerae] 
3 Petra Vivod - [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Aptasense Aptasense] 
4 

4.12. 
1 Sara Kimm Fuhrmann - [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Crafting_crocin_%E2%80%93_vzpostavitev_biosintezne_poti_za_pridobivanje_krocina_v_bakteriji_Escherichia_coli Crafting crocin – vzpostavitev biosintezne poti za pridobivanje krocina v bakteriji ''Escherichia coli'' ] 
2 Anja Tanšek 

5.12. 
1 Urška Furar [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Visoko_frekven%C4%8Dna_mutageneza_na_ne_pravem_mestu%2C_ki_jo_inducirajo_nukleaze_sistema_CRISPR-Cas_v_%C4%8Dlove%C5%A1kih_celicah Visoko frekvenčna mutageneza na ne pravem mestu, ki jo inducirajo nukleaze sistema CRISPR-Cas v človeških celicah] 
2 Tina Lekan 
3 Katja Malovrh 
4 Jernej Vidmar 

12.12. 
1 Helena Jakše 
2 Tjaša Bensa 
3 Sabina Štukelj 
4 Amadeja Lapornik 

19.12. 
1 Ana Krišelj 
2 Vanna Imširović 
3 Dominik Dekleva 
4 Neža Gaube 

9.1. 
1 Nastja Marondini 
2 Elizabeta Jevnikar 
3 Nina Roštan 
4 Barbara Lipovšek 

15.1. 
1 Matic Kovačič - [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/%C5%A0irjenje_genetskega_koda Širjenje genetskega koda] 

16.1. 
1 Inge Sotlar 
2 Marija Kisilak 
3 Nataša Traven 
4 Tina Šimunović 

22.1. 
1 Mojca Hunski 
2 Tomaž Žagar 
3 Tadej Ulčnik 
4 Jakob Rupert 

23.1. 
1 Ana Cirnski 
2 
3 
4

Crafting crocin – vzpostavitev biosintezne poti za pridobivanje krocina v bakteriji Escherichia coli

2017-12-03T19:50:41Z

Kimm Fuhrmann: New page: Povzeto po [http://2017.igem.org/Team:Uppsala projektu iGEM ekipe s švedske univerze Upsalla, 2017] (Sara Kimm Fuhrmann) ==Uvod== Skupina študentov s švedske univerze Upsalla je na i...

Povzeto po [http://2017.igem.org/Team:Uppsala projektu iGEM ekipe s švedske univerze Upsalla, 2017]

(Sara Kimm Fuhrmann)

==Uvod==
Skupina študentov s švedske univerze Upsalla je na iGem tekmovanju leta 2017 predstavila projekt, ki so ga poimenovali Crafting crocin. Njihov namen je bil vzpostaviti biosintezno pot za pridobivanje krocina v bakteriji ''Escherichia coli''. Krocin je apokarotenoidni pigment v žafranu, začimbi, ki jo pridobivamo iz rastline ''Crocus sativus''. Krocin in njegovi prekurzorji so potencialne nevroprotektivne in protitumorske učinkovine, vendar je potrebno opraviti več raziskav za ugotavljanje njihove uporabnosti v medicinske namene. Prav tako bi jih lahko uporabljali v industriji kot barvila. Vendar pa je cena žafrana zaradi pogojev pridelave zelo visoka, izolacija posameznih spojin pa je ekonomsko neugodna. S pridobivanjem krocina v bakteriji ''E. coli'' želi iGEM ekipa bistveno znižati proizvodne stroške in s tem odpreti več možnosti za nadaljnje raziskave.

==Biosintezna pot krocina==
Ekipa je želela v ''E. coli'' vzpostaviti biosintezno pot iz osmih korakov, ki se začne z endogenim farnezil pirofosfatom. Geranilgeranil difosfat-sintaza pretvori farnezil pirofosfat v geranilgeranil pirofosfat. Sledi pretvorba v fitoen s fitoen-sintazo. Fitoen-desaturaza pretvori fitoen v likopen, tega pa pretvori likopen-ciklaza v β-karoten. Z delovanjem β-karoten-hidroksilaze nastane zeaksantin. Karotenoid-cepitvena-dioksigenaza pretvori zeaksantin v krocetin dialdehid. Aldehiddehidrogenaza nato oksidira aldehidni skupini na vsakem koncu, da nastane krocetin. Krocin nastane po delovanju UDP-glukuronoziltransferaze.

===Biosintezna pot od farnezil pirofosfata do zeaksantina===
Že ekipe iz prejšnjih tekmovanj so uspele pripraviti sev ''E.coli'', ki je proizvajal zeaksantin po transformaciji z ustreznimi plazmidi. Uporabili so 5 genov iz bakterije ''Pantoea ananatis'', ''crtE'' (kodira za geranilgeranil pirofosfat-sintazo), ''crtB'' (kodira za fitoen-sintazo), ''crtI'' (kodira za fitoen-dehidrognazo), ''crtY'' (kodira za likopen-ciklazo) in ''crtZ'' (kodira za β-karoten-hidroksilazo) [Edinburgh iGEM 2007].
Letošnja ekipa pa se je odločila te gene prenesti na kromosom bakterije, s čimer bi se znebili tudi potrebe po stalnem izvajanju selekcijskega pritiska.
Uporabili so sistem rekombinacije, posredovane s proteini bakteriofaga lambda red. Pri tej metodi v sev ''E. coli'', ki izraža proteine bakteriofaga lambda red, vnesemo linearno donorsko DNA matrico, ki je lahko dvo ali enoverižna. Proteini Gam (preprečuje razgradnjo linearne DNA matrice z endogenima nukleazama RecBCD in SbcCD), Exo (eksonukleaza, ki ustvari 3' štrleče konce ) in Beta (ščiti ssDNA in sodeluje pri prileganju na tarčo) katalizirajo homologno rekombinacijo med donorsko in tarčno DNA. Če uporabljamo enoverižno donorsko DNA, potrebujemo samo proteine Beta [Kenkel, 2016]. Donorska DNA matrica mora vsebovati na obeh koncih vsaj 35 bp dolgo zaporedje, ki je homologno ciljani regiji. Ker inserti ne smejo biti daljši od 3000 bp, so pripravili več donorskih DNA matric, ki so jih ali naročili ali pa pripravili sami z reakcijo PCR, pri čemer so uporabili ustrezne začetne oligonukleotide. Na koncu so dobili tri donorske DNA matrice: prva s ''crtE'' in ''crtB'', druga s ''crtZ'' in ''crtY'' in tretja s ''crtI''. Želeli so jih vključiti na različna mesta na kromosomu. Vsaka matrica vsebuje drugačen konstitutiven promotor, da med matricami ni neželjene homologije, ki bi lahko motile sestavljanje.
Sev ''E.coli'', ki so ga uporabili za rekombinacijo, vsebuje plazmid z zapisi za proteine lambda red in rezistenco na tetraciklin (pSIM5-tet ali pSIM6). Ori plazmida je občutljiv na temperaturo, kar nam omogoča, da se rekombinaznega sistema enostavno znebimo, ko ga ne potrebujemo več [Kenkel, 2016].
Pripravili so tri seve ''E.coli'', ki so vsebovali selekcijsko kaseto ''cat-SacB'' (gen za rezistenco na kloramfenikol in gen, ki kodira levansukrazo, ki ob prisotnosti sukroze povzroči propad gramnegativnih bakterij) na različnih tarčnih mestih.
Z metodo lambda red so najprej zamenjali selekcijsko kaseto ''cat-sacB'' s ''crtI'' v prvem sevu. Če do zamenjave kasete s ''crtI'' ne pride, bakterije na gojišču z dodano sukrozo ne zrastejo.
Na enak način so pripravili drugi sev, le da so selekcijsko kaseto ''cat-sacB'' zamenjali s ''crtZ'' in ''crtY''. S transdukcijo posredovano z bakteriofagom P1 so v prvi sev (s ''crtI'') vnesli novo selekcijsko kaseto ''cat-sacB''. Nato pa so z metodo lambda red selekcijsko kaseto zamenjali s ''crtE'' in ''crtB''. Kolonije, ki so uspešno prejele vključek, so se obarvale svetlo rdeče, saj so pričele sintetizirati likopen.
S transdukcijo posredovano z bakteriofagom P1, kjer so kot donorski sev uporabili sev s ''crtZ'' in ''crtY'', kot prejemniški sev pa sev s ''crtI'', ''crtE'' in ''crtB'', so pripravili končni sev ''E.coli'', ki je sintetiziral zeaksantin. Kolonije so se zato obarvale rumeno.
Uspešnost posameznih korakov so potrdili z reakcijo PCR, gelsko elektroforezo in sekvenciranjem. Zeaksantin so uspešno izolirali in očistili iz proizvodnega seva. Da pa je bil izoliran produkt resnično zeaksantin, so potrdili s primerjavo absorpcijskih spektrov izoliranega zeaksantina in standarda.

===Biosintezna pod od zeaksantina do krocina===
Na podlagi literaturnih podatkov so izbrali zadnje tri encime v biosintezni poti krocina. Izbrali so karotenoid-cepitveno-dioksigenazo iz rastline ''Crocus Ancyrensis'' (CaCCD2), aldehid dehidrogenazo 2946 (CsADH2946) in UDP-glukuronoziltransferazo 2 (UGTCs2) iz rastline ''Crocus Sativus''. Kodon so optimizirali za izražanje v bakteriji ''E.coli''. S homolognim modeliranjem so ugotovili, da so N konci usmerjeni navzven (stran od proteina), zato so se odločili, da lahko na N konce dodajo še his-tag. Gene so naročili pri podjetju IDT.
Z metodo sestavljanja po Gibsonu so posamezne gene vključili v plazmide pSB1CR, ki so jih predhodno linearizirali v reakciji PCR z DNA polimerazo Phusion. Za vsak encim so pripravili dve različni biokocki, eno s konstitutivnim promotorjem in drugo z inducibilnim lac promotorjem. Biokocke z inducibilnimi promotorji so sestavili v en plazmid z načinom sestavljanja 3A.
Plazmid so z elektroporacijo vnesli v prej pripravljen sev ''E. coli'', ki proizvaja zeaksantin. Tako pripravljen sev ''E. coli'' vsebuje celotno biosintezno pot za sintezo krocina. Kolonije so rumene barve.
Za analizo spojin izoliranih iz bakterij so uporabili tankoplastno kromatografijo - TLC. Zaradi velikega števila različnih pigmentov, ki nastanejo v biosintezni poti, TLC ne omogoča dovolj dobre ločljivosti za identifikacijo posameznih pigmentov. Zato želijo v prihodnosti izolirane spojine analizirati in identificirati s primernejšimi metodami kot je npr. tekočinska kromatografija v povezavi z masno spektrometrijo – HPLC-MS.

==Modeliranje==
Encimi odgovorni za katalizo zadnjih treh stopenj v biosintezni poti so dokaj novo odkriti in še niso dobro okarakterizirani. Prav tako strukture teh encimov niso poznane.
S pomočjo homolognega modeliranja, ki temelji na podobnosti aminokislinskega zaporedja med matričnim proteinom z znano 3D strukturo in preiskovanim proteinom, so prikazali možne 3D strukture za vse tri encime. Na podlagi teh rezultatov predpostavljajo, da sta UGTCs2 in CaCCD2 monomera, CsADH2946 pa je tetramer. S simulacijami molekulske dinamike so pokazali, da so tako pripravljeni modeli stabilni pri pogojih, ki so podobni fiziološkim.
S simulacijami so preučevali tudi afiniteto med CsADH2946 in substratom. Primerjali so vrednosti za substrat krocetin dialdehid in acetaldehid. Pokazali so, da je encim specifičen za krocetin dialdehid in da je afiniteta vezave v µM rangu. CsADH2946 so s kovinsko-kelatno afinitetno kromatografijo tudi izolirali in preverili njegovo aktivnost. Na podlagi rezultatov testiranja encimske aktivnosti, kjer so spremljali razlike v absorbanci po izpostavitvi substrata encimu, so določili Michaelisovo konstanto (Km = 20.7842 µM ± 3.5264). Nizka vrednost konstante nakazuje na visoko afiniteto do krocetin dialdehida, kar se sklada z njihovimi simulacijskimi analizami.

==Zaključek==
Ekipa s švedske univerze Upsalla je uspela pripraviti sev ''E.coli'', ki vsebuje celotno biosintezno pot krocina. Prvih pet genov v biosintezni poti so prenesli na bakterijski kromosom, preostali trije geni pa so na plazmidu. V prihodnosti želijo tudi te prenesti na kromosom. So prvi, ki so očistili, potrdili aktivnost CsADH2946 in določili kinetične parametre encima.
Iz seva ''E. coli'', ki vsebuje biosintezno pot za zeaksantin so uspešno izolirali in očistili omenjeni produkt. Koliko je znašal titer, niso navedli.
Pigmentov izoliranih iz seva ''E. coli'', ki vsebuje celotno biosintezno pot krocina, žal niso uspeli identificirati, ker niso imeli na voljo ustrezne metode.

==Viri==
Crafting crocin. iGEM. Pridobljeno 1.12.2017. Dostopno na naslovu: http://2017.igem.org/Team:Uppsala

Kenkel B. 2016. Lambda Red: A Homologous Recombination-based Technique for Genetic Engineering. Addgene. Pridobljeno 1.12.2017. Dostopno na naslovu: http://blog.addgene.org/lambda-red-a-homologous-recombination-based-technique-for-genetic-engineering

Edinburgh 2007 iGEM Team Parts. iGEM. Pridobljeno 2.12.2017. Dostopno na naslovu: http://parts.igem.org/cgi/partsdb/pgroup.cgi?pgroup=iGEM2007&group=Edinburgh

Vzpostavitev nove biosintezne poti za pridobivanje 3,4-dihidroksibutirične kisline iz ksiloze v bakteriji Escherichia coli

2017-05-22T19:55:40Z

Kimm Fuhrmann:

[http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1096717616302737 '''Establishing a novel biosynthetic pathway for the production of 3,4-dihydroxybutyric acid from xylose in ''Escherichia coli'' ''']

3,4-dihidroksibutirična kislina (v nadaljevanju: 3,4-DHBA) je hidrolizirana oblika 3-hidroksi-γ-butirolaktona. Veliko se uporabljata v farmacevtski industriji (prekurzor številnih kiralnih zdravilnih učinkovin), pa tudi pri izdelavi polimernih materialov in topil.
Trenutna kemična sinteza temelji na uporabi petrokemičnih surovin, za katere pa v današnjem času iščemo primerne nadomestke iz obnovljivih materialov. Kot alternativo bi lahko uporabili ligno-celulozno biomaso, ki vsebuje tudi D-ksilozo.
V nadaljevanju bomo opisali pet stopenjsko biosintezno pot za pridobivanje 3,4-DHBA iz D-ksiloze na osnovi nefosfrilacijskega metabolizma D-ksiloze v ''E. coli''. Biosintezno pot so optimizirali z uporabo učinkovitih encimov na vsaki stopnji in s preprečevanjem konkurenčnih metabolnih poti v gostiteljskem sevu.

==Načrtovanje biosintezne poti==
Najprej se D-ksiloza pretvori v 2-keto-3-deoksi-D-ksilonat z encimi D-ksiloza-dehidrogenaza, D-ksilonolaktonaza in D-ksilonat-dehidrataza. 2-keto-3-deoksi-D-ksilonat se pretvori v D-3,4-dihidroksibutanal s keto kislina-dekarboksilazo, nato pride do oksidacije v 3,4-DHBA z aldehiddehidrogenazo.

==Izbira encimov za izgradnjo biosintezne poti==
XylB (D-ksiloza-dehidrogenaza) in XylC (D-ksilonolaktonaza) iz ''Caulobacter crescentus'' so uporabili, saj že obstajajo študije, kjer so ugotovili, da oba encima učinkovito pretvarjata D-ksilozo v D-ksilonat v ''E. coli''.
Za tretji korak, kjer je potrebno delovanje D-ksilonat-dehidrataze, so z ''in vitro'' encimskimi testi preverjali učinkovitost treh encimov; YjhG in YagF iz ''E.coli'' in XylD iz ''C. crescentus''. Največjo aktivnost ima XylD.
Za četrti korak, kjer je potrebno delovanje keto kislina-dekarboksilaze, so z ''in vitro'' encimskimi testi preverjali učinkovitost benzoil formiat-dekarboksilaze (MdlC) iz bakterije ''Pseudomonas Putida'' in α-ketoizovalerat dekarboksilaze (KivD) iz ''Lactococcus Lactis''. Oba encima sta približno enako aktivna.
V ''E. coli'' lahko pride do oksidacije aldehidne skupine z različnimi endogenimi aldehid dehidrogenazami.

==''In vivo'' pridobivanje 3,4-DHBA==
Gena ''xylB'' in ''xylC'' so klonirali v plazmid pCS7 (v celicah se pojavlja v srednjem številu kopij). Ostale gene so klonirali v vektor pZE12-luc (v celicah se pojavlja v visokem številu kopij). Sev ''E. coli'' BW25113 so transformirali s plazmidom, ki vsebuje ''xylB'' in ''xylC'' in plazmidom, ki vsebuje ''xylD'' in ''kivD''. Bakterije so gojili v stresalnih steklenicah v gojišču LB z 20 g/l D-ksiloze. Za induciranje izražanja so uporabili IPTG. Vzorce so zbirali 48 h po indukciji.
Prvotni sev je proizvedel 0,13 g/L 3,4-DHBA, več je bilo stranskega produkta 1,2,4-butantriola. V ''E.coli'' je namreč veliko endogenih aldoketoreduktaz in alkohol-dehidrogenaz, ki lahko aldehide pretvorijo v alkohole.

==Izbira učinkovite D-3,4-dihidroksibutanal-dehidrogenaze za povečano pridobivanje 3,4-DHBA==
Za povečanje koncentracije 3,4-DHBA in zmanjšanje 1,2,4-butantriola so želeli čezmerno izražati D-3,4-dihidroksibutanal-dehidrogenazo. Domnevali so, da sta od NADP+ odvisna sukcinat-semialdehid-dehidrogenazi GabD iz ''P. Putide'' in YneI iz ''E. coli'' sposobni pretvarjati 3,4-dihidroksibutanal v 3,4-DHBA. Sukcinat-semialdehid in D-3,4-dihidroksibutanal sta si strukturno namreč podobna. Z ''in vitro'' encimskimi testi so ugotovili, da ima YneI trikrat večjo aktivnost. ''YneI'' so klonirali v plazmid, ki je nosil tudi zapis za ''xylD'' in ''kivD'' in kotransformirali ''E. coli'' s plazmidom z zapisoma za ''xylB'' in ''xylC''.
Koncentracija 3,4-DHBA je bila 6-krat večja kot v originalnem sevu, koncentracija 1,2,4-butantriola se je zmanjšala.

==Optimizacija s prekinitvijo kompetitivnih poti==
V divjem tipu ''E.coli'' se D-ksiloza metabolizira v pentoza fosfatni poti, D-ksilonat pa se lahko pretvori v piruvat in glikoaldehid v Dahmsovi poti. Pentoza fosfatno pot so preprečili z izbitjem ''xylA'', ki nosi zapis za D-ksiloza-izomerazo. Za onemogočenje Dahmsove poti so onesposobili ''yjhH'' in ''yagE''.

==Zaključek==
Končni sev je proizvedel 1,27 g/l 3,4-DHBA v stresalnih steklenicah, kar je največja pridobljena koncentracija do sedaj in kaže na velik potencial za proizvodnjo 3,4-DHBA v večjem obsegu. Koncentracija stranskega produkta 1,2,4-butantriola je znašala 0,18 g/l, ki pa bi jo lahko še zmanjšali z inaktivacijo endogenih D-3,4-dihidroksibutanal-reduktaz.

==Vir==
Wang J., Shen X., et al. Establishing a novel biosynthetic pathway for the production of 3,4-dihydroxybutyric acid from xylose in Escherichia coli. Metabolic Engineering. 2017; 41: 39-45

Vzpostavitev nove biosintezne poti za pridobivanje 3,4-dihidroksibutirične kisline iz ksiloze v bakteriji Escherichia coli

2017-05-22T15:00:05Z

Kimm Fuhrmann:

[http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1096717616302737 '''Establishing a novel biosynthetic pathway for the production of 3,4-dihydroxybutyric acid from xylose in ''Escherichia coli'' ''']

3,4-dihidroksibutirična kislina (v nadaljevanju: 3,4-DHBA) je hidrolizirana oblika 3-hidroksi-γ-butirolaktona. Veliko se uporabljata v farmacevtski industriji (prekurzor številnih kiralnih zdravilnih učinkovin), pa tudi pri izdelavi polimernih materialov in topil.
Trenutna kemična sinteza temelji na uporabi petrokemičnih surovin, za katere pa v današnjem času iščemo primerne nadomestke iz obnovljivih materialov. Kot alternativo bi lahko uporabili ligno-celulozno biomaso, ki vsebuje tudi D-ksilozo.
V nadaljevanju bomo opisali pet stopenjsko biosintezno pot za pridobivanje 3,4-DHBA iz D-ksiloze na osnovi nefosfrilacijskega metabolizma D-ksiloze v ''E. coli''. Biosintezno pot so optimizirali z uporabo učinkovitih encimov na vsaki stopnji in s preprečevanjem konkurenčnih metabolnih poti v gostiteljskem sevu.

==Načrtovanje biosintezne poti==
Najprej se D-ksiloza pretvori v 2-keto-3-deoksi-D-ksilonat z encimi D-ksiloza-dehidrogenaza, D-ksilonolaktonaza in D-ksilonat-dehidrataza. 2-keto-3-deoksi-D-ksilonat se pretvori v D-3,4-dihidroksibutanal s keto kislina-dekarboksilazo, nato pride do oksidacije v 3,4-DHBA z aldehiddehidrogenazo.

==Izbira encimov za izgradnjo biosintezne poti==
XylB (D-ksiloza-dehidrogenaza) in XylC (D-ksilonolaktonaza) iz ''Caulobacter crescentus'' so uporabili, saj že obstajajo študije, kjer so ugotovili, da oba encima učinkovito pretvarjata D-ksilozo v D-ksilonat v ''E. coli''.
Za tretji korak, kjer je potrebno delovanje D-ksilonat-dehidrataze, so z ''in vitro'' encimskimi testi preverjali učinkovitost treh encimov; YjhG in YagF iz ''E.coli'' in XylD iz ''C. crescentus''. Največjo aktivnost ima XylD.
Za četrti korak, kjer je potrebno delovanje keto kislina-dekarboksilaze, so z ''in vitro'' encimskimi testi preverjali učinkovitost benzoil formiat-dekarboksilaze (MdlC) iz bakterije ''Pseudomonas Putida'' in α-ketoizovalerat dekarboksilaze (KivD) iz ''Lactococcus Lactis''. Oba encima sta približno enako aktivna.
V ''E. coli'' lahko pride do oksidacije aldehidne skupine z različnimi endogenimi aldehid dehidrogenazami.

==''In vivo'' pridobivanje 3,4-DHBA==
Gena ''xylB'' in ''xylC'' so klonirali v plazmid pCS7 (v celicah se pojavlja v visokem številu kopij). Ostale gene so klonirali v vektor pZE12-luc (v celicah se pojavlja v visokem številu kopij). Sev ''E. coli'' BW25113 so transformirali s plazmidom, ki vsebuje ''xylB'' in ''xylC'' in plazmidom, ki vsebuje ''xylD'' in ''kivD''. Bakterije so gojili v stresalnih steklenicah v gojišču LB z 20 g/l D-ksiloze. Za induciranje izražanja so uporabili IPTG. Vzorce so zbirali 48 h po indukciji.
Prvotni sev je proizvedel 0,13 g/L 3,4-DHBA, več je bilo stranskega produkta 1,2,4-butantriola. V ''E.coli'' je namreč veliko endogenih aldoketoreduktaz in alkohol-dehidrogenaz, ki lahko aldehide pretvorijo v alkohole.

==Izbira učinkovite D-3,4-dihidroksibutanal-dehidrogenaze za povečano pridobivanje 3,4-DHBA==
Za povečanje koncentracije 3,4-DHBA in zmanjšanje 1,2,4-butantriola so želeli čezmerno izražati D-3,4-dihidroksibutanal-dehidrogenazo. Domnevali so, da sta od NADP+ odvisna sukcinat-semialdehid-dehidrogenazi GabD iz ''P. Putide'' in YneI iz ''E. coli'' sposobni pretvarjati 3,4-dihidroksibutanal v 3,4-DHBA. Sukcinat-semialdehid in D-3,4-dihidroksibutanal sta si strukturno namreč podobna. Z ''in vitro'' encimskimi testi so ugotovili, da ima YneI trikrat večjo aktivnost. ''YneI'' so klonirali v plazmid, ki je nosil tudi zapis za ''xylD'' in ''kivD'' in kotransformirali ''E. coli'' s plazmidom z zapisoma za ''xylB'' in ''xylC''.
Koncentracija 3,4-DHBA je bila 6-krat večja kot v originalnem sevu, koncentracija 1,2,4-butantriola se je zmanjšala.

==Optimizacija s prekinitvijo kompetitivnih poti==
V divjem tipu ''E.coli'' se D-ksiloza metabolizira v pentoza fosfatni poti, D-ksilonat pa se lahko pretvori v piruvat in glikoaldehid v Dahmsovi poti. Pentoza fosfatno pot so preprečili z izbitjem ''xylA'', ki nosi zapis za D-ksiloza-izomerazo. Za onemogočenje Dahmsove poti so onesposobili ''yjhH'' in ''yagE''.

==Zaključek==
Končni sev je proizvedel 1,27 g/l 3,4-DHBA v stresalnih steklenicah, kar je največja pridobljena koncentracija do sedaj in kaže na velik potencial za proizvodnjo 3,4-DHBA v večjem obsegu. Koncentracija stranskega produkta 1,2,4-butantriola je znašala 0,18 g/l, ki pa bi jo lahko še zmanjšali z inaktivacijo endogenih D-3,4-dihidroksibutanal-reduktaz.

==Vir==
Wang J., Shen X., et al. Establishing a novel biosynthetic pathway for the production of 3,4-dihydroxybutyric acid from xylose in Escherichia coli. Metabolic Engineering. 2017; 41: 39-45

Vzpostavitev nove biosintezne poti za pridobivanje 3,4-dihidroksibutirične kisline iz ksiloze v bakteriji Escherichia coli

2017-05-22T14:58:30Z

Kimm Fuhrmann:

[http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1096717616302737 '''Establishing a novel biosynthetic pathway for the production of 3,4-dihydroxybutyric acid from xylose in ''Escherichia coli'' ''']

3,4-dihidroksibutirična kislina (v nadaljevanju: 3,4-DHBA) je hidrolizirana oblika 3-hidroksi-γ-butirolaktona. Veliko se uporabljata v farmacevtski industriji (prekurzor številnih kiralnih zdravilnih učinkovin), pa tudi pri izdelavi polimernih materialov in topil.
Trenutna kemična sinteza temelji na uporabi petrokemičnih surovin, za katere pa v današnjem času iščemo primerne nadomestke iz obnovljivih materialov. Kot alternativo bi lahko uporabili ligno-celulozno biomaso, ki vsebuje tudi D-ksilozo.
V nadaljevanju bomo opisali pet stopenjsko biosintezno pot za pridobivanje 3,4-DHBA iz D-ksiloze na osnovi nefosfrilacijskega metabolizma D-ksiloze v ''E. coli''. Biosintezno pot so optimizirali z uporabo učinkovitih encimov na vsaki stopnji in s preprečevanjem konkurenčnih metabolnih poti v gostiteljskem sevu.

==Načrtovanje biosintezne poti==
Najprej se D-ksiloza pretvori v 2-keto-3-deoksi-D-ksilonat z encimi D-ksiloza-dehidrogenaza, D-ksilonolaktonaza in D-ksilonat-dehidrataza. 2-keto-3-deoksi-D-ksilonat se pretvori v D-3,4-dihidroksibutanal s keto kislina-dekarboksilazo, nato pride do oksidacije v 3,4-DHBA z aldehiddehidrogenazo.

==Izbira encimov za izgradnjo biosintezne poti==
XylB (D-ksiloza-dehidrogenaza) in XylC (D-ksilonolaktonaza) iz ''Caulobacter crescentus'' so uporabili, saj že obstajajo študije, kjer so ugotovili, da oba encima učinkovito pretvarjata D-ksilozo v D-ksilonat v ''E. coli''.
Za tretji korak, kjer je potrebno delovanje D-ksilonat-dehidrataze, so z ''in vitro'' encimskimi testi preverjali učinkovitost treh encimov; YjhG in YagF iz ''E.coli'' in XylD iz ''C. crescentus''. Največjo aktivnost ima XylD.
Za četrti korak, kjer je potrebno delovanje keto kislina-dekarboksilaze, so z ''in vitro'' encimskimi testi preverjali učinkovitost benzoil formiat-dekarboksilaze (MdlC) iz bakterije ''Pseudomonas Putida'' in α-ketoizovalerat dekarboksilaze (KivD) iz ''Lactococcus Lactis''. Oba encima sta približno enako aktivna.
V ''E. coli'' lahko pride do oksidacije aldehidne skupine z različnimi endogenimi aldehid dehidrogenazami.

==''In vivo'' pridobivanje 3,4-DHBA==
Gena ''xylB'' in ''xylC'' so klonirali v plazmid pCS7 (v celicah se pojavlja v visokem številu kopij). Ostale gene so klonirali v vektor pZE12-luc (v celicah se pojavlja v visokem številu kopij). Sev ''E. coli'' BW25113 so transformirali s plazmidom, ki vsebuje ''xylB'' in ''xylC'' in plazmidom, ki vsebuje ''xylD'' in ''kivD''. Bakterije so gojili v stresalnih steklenicah v gojišču LB z 20 g/l D-ksiloze. Za induciranje izražanja so uporabili IPTG. Vzorce so zbirali 48 h po indukciji.
Prvotni sev je proizvedel 0,13 g/L 3,4-DHBA, več je bilo stranskega produkta 1,2,4-butantriola. V ''E.coli'' je namreč veliko endigenih aldoketoreduktaz in alkohol-dehidrogenaz, ki lahko aldehide pretvorijo v alkohole.

==Izbira učinkovite D-3,4-dihidroksibutanal-dehidrogenaze za povečano pridobivanje 3,4-DHBA==
Za povečanje koncentracije 3,4-DHBA in zmanjšanje 1,2,4-butantriola so želeli čezmerno izražati D-3,4-dihidroksibutanal-dehidrogenazo. Domnevali so, da sta od NADP+ odvisna sukcinat-semialdehid-dehidrogenazi GabD iz ''P. Putide'' in YneI iz ''E. coli'' sposobni pretvarjati 3,4-dihidroksibutanal v 3,4-DHBA. Sukcinat-semialdehid in D-3,4-dihidroksibutanal sta si strukturno namreč podobna. Z ''in vitro'' encimskimi testi so ugotovili, da ima YneI trikrat večjo aktivnost. ''YneI'' so klonirali v plazmid, ki je nosil tudi zapis za ''xylD'' in ''kivD'' in kotransformirali ''E. coli'' s plazmidom z zapisoma za ''xylB'' in ''xylC''.
Koncentracija 3,4-DHBA je bila 6-krat večja kot v originalnem sevu, koncentracija 1,2,4-butantriola se je zmanjšala.

==Optimizacija s prekinitvijo kompetitivnih poti==
V divjem tipu ''E.coli'' se D-ksiloza metabolizira v pentoza fosfatni poti, D-ksilonat pa se lahko pretvori v piruvat in glikoaldehid v Dahmsovi poti. Pentoza fosfatno pot so preprečili z izbitjem ''xylA'', ki nosi zapis za D-ksiloza-izomerazo. Za onemogočenje Dahmsove poti so onesposobili ''yjhH'' in ''yagE''.

==Zaključek==
Končni sev je proizvedel 1,27 g/l 3,4-DHBA v stresalnih steklenicah, kar je največja pridobljena koncentracija do sedaj in kaže na velik potencial za proizvodnjo 3,4-DHBA v večjem obsegu. Koncentracija stranskega produkta 1,2,4-butantriola je znašala 0,18 g/l, ki pa bi jo lahko še zmanjšali z inaktivacijo endogenih D-3,4-dihidroksibutanal-reduktaz.

==Vir==
Wang J., Shen X., et al. Establishing a novel biosynthetic pathway for the production of 3,4-dihydroxybutyric acid from xylose in Escherichia coli. Metabolic Engineering. 2017; 41: 39-45

Vzpostavitev nove biosintezne poti za pridobivanje 3,4-dihidroksibutirične kisline iz ksiloze v bakteriji Escherichia coli

2017-05-22T08:05:11Z

Kimm Fuhrmann:

[http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1096717616302737 '''Establishing a novel biosynthetic pathway for the production of 3,4-dihydroxybutyric acid from xylose in ''Escherichia coli'' ''']

3,4-dihidroksibutirična kislina (v nadaljevanju: 3,4-DHBA) je hidrolizirana oblika 3-hidroksi-γ-butirolaktona. Veliko se uporabljata v farmacevtski industriji (prekurzor številnih kiralnih zdravilnih učinkovin), pa tudi pri izdelavi polimernih materialov in topil.
Trenutna kemična sinteza temelji na uporabi petrokemičnih surovin, za katere pa v današnjem času iščemo primerne nadomestke iz obnovljivih materialov. Kot alternativo bi lahko uporabili ligno-celulozno biomaso, ki vsebuje tudi D-ksilozo.
V nadaljevanju bomo opisali pet stopenjsko biosintezno pot za pridobivanje 3,4-DHBA iz D-ksiloze na osnovi nefosfrilacijskega metabolizma D-ksiloze v ''E. coli''. Biosintezno pot so optimizirali z uporabo učinkovitih encimov na vsaki stopnji in s preprečevanjem konkurenčnih metabolnih poti v gostiteljskem sevu.

==Načrtovanje biosintezne poti==
Najprej se D-ksiloza pretvori v 2-keto-3-deoksi-D-ksilonat z encimi D-ksiloza-dehidrogenaza, D-ksilonolaktonaza in D-ksilonat-dehidrataza. 2-keto-3-deoksi-D-ksilonat se pretvori v D-3,4-dihidroksibutanal s keto kislina-dekarboksilazo, nato pride do oksidacije v 3,4-DHBA z aldehiddehidrogenazo.

==Izbira encimov za izgradnjo biosintezne poti==
XylB (D-ksiloza-dehidrogenaza) in XylC (D-ksilonolaktonaza) iz ''C. crescentus'' so uporabili, saj že obstajajo študije, kjer so ugotovili, da oba encima učinkovito pretvarjata D-ksilozo v D-ksilonat v ''E. coli''.
Za tretji korak, kjer je potrebno delovanje D-ksilonat-dehidrataze, so z ''in vitro'' encimskimi testi preverjali učinkovitost treh encimov; YjhG in YagF iz ''E.coli'' in XylD iz ''C. crescentus''. Največjo aktivnost ima XylD.
Za četrti korak, kjer je potrebno delovanje keto kislina-dekarboksilaze, so z ''in vitro'' encimskimi testi preverjali učinkovitost benzoil formiat-dekarboksilaze (MdlC) iz ''P. Putide'' in α-ketoizovalerat dekarboksilaze (KivD) iz ''L. Lactis''. Oba encima sta približno enako aktivna.
V ''E. coli'' lahko pride do oksidacije aldehidne skupine z različnimi endogenimi aldehid dehidrogenazami.

==''In vivo'' pridobivanje 3,4-DHBA==
Gena ''xylB'' in ''xylC'' so klonirali v plazmid pCS7 (v celicah se pojavlja v visokem številu kopij). Ostale gene so klonirali v vektor pZE12-luc (v celicah se pojavlja v visokem številu kopij). Sev ''E. coli'' BW25113 so transformirali s plazmidom, ki vsebuje ''xylB'' in ''xylC'' in plazmidom, ki vsebuje ''xylD'' in ''kivD''. Bakterije so gojili v stresalnih steklenicah v gojišču LB z 20 g/l D-ksiloze. Za induciranje izražanja so uporabili IPTG. Vzorce so zbirali 48 h po indukciji.
Prvotni sev je proizvedel 0,13 g/L 3,4-DHBA, več je bilo stranskega produkta 1,2,4-butantriola. V ''E.coli'' je namreč veliko endigenih aldoketoreduktaz in alkohol-dehidrogenaz, ki lahko aldehide pretvorijo v alkohole.

==Izbira učinkovite D-3,4-dihidroksibutanal-dehidrogenaze za povečano pridobivanje 3,4-DHBA==
Za povečanje koncentracije 3,4-DHBA in zmanjšanje 1,2,4-butantriola so želeli čezmerno izražati D-3,4-dihidroksibutanal-dehidrogenazo. Domnevali so, da sta od NADP+ odvisna sukcinat-semialdehid-dehidrogenazi GabD iz ''P. Putide'' in YneI iz ''E. coli'' sposobni pretvarjati 3,4-dihidroksibutanal v 3,4-DHBA. Sukcinat-semialdehid in D-3,4-dihidroksibutanal sta si strukturno namreč podobna. Z ''in vitro'' encimskimi testi so ugotovili, da ima YneI trikrat večjo aktivnost. ''YneI'' so klonirali v plazmid, ki je nosil tudi zapis za ''xylD'' in ''kivD'' in kotransformirali ''E. coli'' s plazmidom z zapisoma za ''xylB'' in ''xylC''.
Koncentracija 3,4-DHBA je bila 6-krat večja kot v originalnem sevu, koncentracija 1,2,4-butantriola se je zmanjšala.

==Optimizacija s prekinitvijo kompetitivnih poti==
V divjem tipu ''E.coli'' se D-ksiloza metabolizira v pentoza fosfatni poti, D-ksilonat pa se lahko pretvori v piruvat in glikoaldehid v Dahmsovi poti. Pentoza fosfatno pot so preprečili z izbitjem ''xylA'', ki nosi zapis za D-ksiloza-izomerazo. Za onemogočenje Dahmsove poti so onesposobili ''yjhH'' in ''yagE''.

==Zaključek==
Končni sev je proizvedel 1,27 g/l 3,4-DHBA v stresalnih steklenicah, kar je največja pridobljena koncentracija do sedaj in kaže na velik potencial za proizvodnjo 3,4-DHBA v večjem obsegu. Koncentracija stranskega produkta 1,2,4-butantriola je znašala 0,18 g/l, ki pa bi jo lahko še zmanjšali z inaktivacijo endogenih D-3,4-dihidroksibutanal-reduktaz.

==Vir==
Wang J., Shen X., et al. Establishing a novel biosynthetic pathway for the production of 3,4-dihydroxybutyric acid from xylose in Escherichia coli. Metabolic Engineering. 2017; 41: 39-45

Vzpostavitev nove biosintezne poti za pridobivanje 3,4-dihidroksibutirične kisline iz ksiloze v bakteriji Escherichia coli

2017-05-21T19:48:29Z

Kimm Fuhrmann:

[http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1096717616302737 '''Establishing a novel biosynthetic pathway for the production of 3,4-dihydroxybutyric acid from xylose in ''Escherichia coli'' ''']

3,4-dihidroksibutirična kislina (v nadaljevanju: 3,4-DHBA) je hidrolizirana oblika 3-hidroksi-γ-butirolaktona. Veliko se uporabljata v farmacevtski industriji (prekurzor številnih kiralnih zdravilnih učinkovin), pa tudi pri izdelavi polimernih materialov in topil.
Trenutna kemična sinteza temelji na uporabi petrokemičnih surovin, za katere pa v današnjem času iščemo primerne nadomestke iz obnovljivih materialov. Kot alternativo bi lahko uporabili ligno-celulozno biomaso, ki vsebuje tudi D-ksilozo.
V nadaljevanju bomo opisali pet stopenjsko biosintezno pot za pridobivanje 3,4-DHBA iz D-ksiloze na osnovi nefosfrilacijskega metabolizma D-ksiloze v ''E. coli''. Biosintezno pot so optimizirali z uporabo učinkovitih encimov na vsaki stopnji in s preprečevanjem konkurenčnih metabolnih poti v gostiteljskem sevu.

==Načrtovanje biosintezne poti==
Najprej se D-ksiloza pretvori v 2-keto-3-deoksi-D-ksilonat z encimi D-ksiloza-dehidrogenaza, D-ksilonolaktonaza in D-ksilonat-dehidrataza. 2-keto-3-deoksi-D-ksilonat se pretvori v D-3,4-dihidroksibutanal s keto kislina-dekarboksilazo, nato pride do oksidacije v 3,4-DHBA z aldehiddehidrogenazo.

==Izbira encimov za izgradnjo biosintezne poti==
XylB (D-ksiloza-dehidrogenaza) in XylC (D-ksilonolaktonaza) iz ''C. crescentus'' so uporabili, saj že obstajajo študije, kjer so ugotovili, da oba encima učinkovito pretvarjata D-ksilozo v D-ksilonat v ''E. coli''.
Za tretji korak, kjer je potrebno delovanje D-ksilonat-dehidrataze, so z ''in vitro'' encimskimi testi preverjali učinkovitost treh encimov; YjhG in YagF iz ''E.coli'' in XylD iz ''C. crescentus''. Največjo aktivnost ima XylD.
Za četrti korak, kjer je potrebno delovanje keto kislina-dekarboksilaze, so z ''in vitro'' encimskimi testi preverjali učinkovitost benzoil formiat-dekarboksilaze (MdlC) iz ''P. Putide'' in α-ketoizovalerat dekarboksilaze (KivD) iz ''L. Lactis''. Oba encima sta približno enako aktivna.
V ''E. coli'' lahko pride do oksidacije aldehidne skupine z različnimi endogenimi aldehid dehidrogenazami.

==''In vivo'' pridobivanje 3,4-DHBA==
Gena ''xylB'' in ''xylC'' so klonirali v plazmid pCS7 (v celicah se pojavlja v visokem številu kopij). Ostale gene so klonirali v vektor pZE12-luc (v celicah se pojavlja v visokem številu kopij). Sev ''E. coli'' BW25113 so transformirali z plazmidom, ki vsebuje ''xylB'' in ''xylC'' in plazmidom, ki vsebuje ''xylD'' in ''kivD''. Bakterije so gojili v stresalnih steklenicah v gojišču LB z 20 g/l D-ksiloze. Za induciranje izražanja so uporabili IPTG. Vzorce so zbirali 48 h po indukciji.
Prvotni sev je proizvedel 0,13 g/L 3,4-DHBA, več je bilo stranskega produkta 1,2,4-butantriola. V ''E.coli'' je namreč veliko endigenih aldoketoreduktaz in alkohol-dehidrogenaz, ki lahko aldehide pretvorijo v alkohole.

==Izbira učinkovite D-3,4-dihidroksibutanal-dehidrogenaze za povečano pridobivanje 3,4-DHBA==
Za povečanje koncentracije 3,4-DHBA in zmanjšanje 1,2,4-butantriola so želeli čezmerno izražati D-3,4-dihidroksibutanal-dehidrogenazo. Domnevali so, da sta od NADP+ odvisna sukcinat-semialdehid-dehidrogenazi GabD iz ''P. Putide'' in YneI iz ''E. coli'' sposobni pretvarjati 3,4-dihidroksibutanal v 3,4-DHBA. Sukcinat-semialdehid in D-3,4-dihidroksibutanal sta si strukturno namreč podobna. Z ''in vitro'' encimskimi testi so ugotovili, da ima YneI trikrat večjo aktivnost. ''YneI'' so klonirali v plazmid, ki je nosil tudi zapis za ''xylD'' in ''kivD'' in kotransformirali ''E. coli'' s plazmidom z zapisoma za ''xylB'' in ''xylC''.
Koncentracija 3,4-DHBA je bila 6-krat večja kot v originalnem sevu, koncentracija 1,2,4-butantriola se je zmanjšala.

==Optimizacija s prekinitvijo kompetitivnih poti==
V divjem tipu ''E.coli'' se D-ksiloza metabolizira v pentoza fosfatni poti, D-ksilonat pa se lahko pretvori v piruvat in glikoaldehid v Dahmsovi poti. Pentoza fosfatno pot so preprečili z izbitjem ''xylA'', ki nosi zapis za D-ksiloza-izomerazo. Za onemogočenje Dahmsove poti so onesposobili ''yjhH'' in ''yagE''.

==Zaključek==
Končni sev je proizvedel 1,27 g/l 3,4-DHBA v stresalnih steklenicah, kar je največja pridobljena koncentracija do sedaj in kaže na velik potencial za proizvodnjo 3,4-DHBA v večjem obsegu. Koncentracija stranskega produkta 1,2,4-butantriola je znašala 0,18 g/l, ki pa bi jo lahko še zmanjšali z inaktivacijo endogenih D-3,4-dihidroksibutanal-reduktaz.

==Vir==
Wang J., Shen X., et al. Establishing a novel biosynthetic pathway for the production of 3,4-dihydroxybutyric acid from xylose in Escherichia coli. Metabolic Engineering. 2017; 41: 39-45

Vzpostavitev nove biosintezne poti za pridobivanje 3,4-dihidroksibutirične kisline iz ksiloze v bakteriji Escherichia coli

2017-05-21T19:45:59Z

Kimm Fuhrmann:

[http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1096717616302737 '''Establishing a novel biosynthetic pathway for the production of 3,4-dihydroxybutyric acid from xylose in ''Escherichia coli'' ''']

3,4-dihidroksibutirična kislina (v nadaljevanju: 3,4-DHBA) je hidrolizirana oblika 3-hidroksi-γ-butirolaktona. Veliko se uporabljata v farmacevtski industriji (prekurzor številnih kiralnih zdravilnih učinkovin), pa tudi pri izdelavi polimernih materialov in topil.
Trenutna kemična sinteza temelji na uporabi petrokemičnih surovin, za katere pa v današnjem času iščemo primerne nadomestke iz obnovljivih materialov. Kot alternativo bi lahko uporabili ligno-celulozno biomaso, ki vsebuje tudi D-ksilozo.
V nadaljevanju bomo opisali pet stopenjsko biosintezno pot za pridobivanje 3,4-DHBA iz D-ksiloze na osnovi nefosfrilacijskega metabolizma D-ksiloze v ''E. coli''. Biosintezno pot so optimizirali z uporabo učinkovitih encimov na vsaki stopnji in s preprečevanjem konkurenčnih metabolnih poti v gostiteljskem sevu.

==Načrtovanje biosintezne poti==
Najprej se D-ksiloza pretvori v 2-keto-3-deoksi-D-ksilonat z encimi D-ksiloza-dehidrogenaza, D-ksilonolaktonaza in D-ksilonat-dehidrataza. 2-keto-3-deoksi-D-ksilonat se pretvori v D-3,4-dihidroksibutanal s keto kislina-dekarboksilazo, nato pride do oksidacije v 3,4-DHBA z aldehiddehidrogenazo.

==Izbira encimov za izgradnjo biosintezne poti==
XylB (D-ksiloza-dehidrogenaza) in XylC (D-ksilonolaktonaza) iz ''C. crescentus'' so uporabili, saj že obstajajo študije, kjer so ugotovili, da oba encima učinkovito pretvarjata D-ksilozo v D-ksilonat v ''E. coli''.
Za tretji korak, kjer je potrebno delovanje D-ksilonat-dehidrataze, so z ''in vitro'' encimskimi testi testirali učinkovitost treh encimov; YjhG in YagF iz ''E.coli'' in XylD iz ''C. crescentus''. Največjo aktivnost ima XylD.
Za četrti korak, kjer je potrebno delovanje keto kislina-dekarboksilaze, so z ''in vitro'' encimskimi testi testirali učinkovitost benzoil formiat-dekarboksilaze (MdlC) iz ''P. Putide'' in α-ketoizovalerat dekarboksilaze (KivD) iz ''L. Lactis''. Oba encima sta približno enako aktivna.
V ''E. coli'' lahko pride do oksidacije aldehidne skupine z različnimi endogenimi aldehid dehidrogenazami.

==''In vivo'' pridobivanje 3,4-DHBA==
Gena ''xylB'' in ''xylC'' so klonirali v plazmid pCS7 (v celicah se pojavlja v visokem številu kopij). Ostale gene so klonirali v vektor pZE12-luc (v celicah se pojavlja v visokem številu kopij). Sev ''E. coli'' BW25113 so transformirali z plazmidom, ki vsebuje ''xylB'' in ''xylC'' in plazmidom, ki vsebuje ''xylD'' in ''kivD''. Bakterije so gojili v stresalnih steklenicah v gojišču LB z 20 g/l D-ksiloze. Za induciranje izražanja so uporabili IPTG. Vzorce so zbirali 48 h po indukciji.
Prvotni sev je proizvedel 0,13 g/L 3,4-DHBA, več je bilo stranskega produkta 1,2,4-butantriola. V ''E.coli'' je namreč veliko endigenih aldoketoreduktaz in alkohol-dehidrogenaz, ki lahko aldehide pretvorijo v alkohole.

==Izbira učinkovite D-3,4-dihidroksibutanal-dehidrogenaze za povečano pridobivanje 3,4-DHBA==
Za povečanje koncentracije 3,4-DHBA in zmanjšanje 1,2,4-butantriola so želeli čezmerno izražati D-3,4-dihidroksibutanal-dehidrogenazo. Domnevali so, da sta od NADP+ odvisna sukcinat-semialdehid-dehidrogenazi GabD iz ''P. Putide'' in YneI iz ''E. coli'' sposobni pretvarjati 3,4-dihidroksibutanal v 3,4-DHBA. Sukcinat-semialdehid in D-3,4-dihidroksibutanal sta si strukturno namreč podobna. Z ''in vitro'' encimskimi testi so ugotovili, da ima YneI trikrat večjo aktivnost. ''YneI'' so klonirali v plazmid, ki je nosil tudi zapis za ''xylD'' in ''kivD'' in kotransformirali ''E. coli'' s plazmidom z zapisoma za ''xylB'' in ''xylC''.
Koncentracija 3,4-DHBA je bila 6-krat večja kot v originalnem sevu, koncentracija 1,2,4-butantriola se je zmanjšala.

==Optimizacija s prekinitvijo kompetitivnih poti==
V divjem tipu ''E.coli'' se D-ksiloza metabolizira v pentoza fosfatni poti, D-ksilonat pa se lahko pretvori v piruvat in glikoaldehid v Dahmsovi poti. Pentoza fosfatno pot so preprečili z izbitjem ''xylA'', ki nosi zapis za D-ksiloza-izomerazo. Za onemogočenje Dahmsove poti so onesposobili ''yjhH'' in ''yagE''.

==Zaključek==
Končni sev je proizvedel 1,27 g/l 3,4-DHBA v stresalnih steklenicah, kar je največja pridobljena koncentracija do sedaj in kaže na velik potencial za proizvodnjo 3,4-DHBA v večjem obsegu. Koncentracija stranskega produkta 1,2,4-butantriola je znašala 0,18 g/l, ki pa bi jo lahko še zmanjšali z inaktivacijo endogenih D-3,4-dihidroksibutanal-reduktaz.

==Vir==
Wang J., Shen X., et al. Establishing a novel biosynthetic pathway for the production of 3,4-dihydroxybutyric acid from xylose in Escherichia coli. Metabolic Engineering. 2017; 41: 39-45

MBT seminarji 2017

2017-05-21T19:42:42Z

Kimm Fuhrmann:

'''Seznam seminarjev iz Molekularne biotehnologije v študijskem letu 2016/17'''

Na tej strani je seznam odobrenih člankov za seminar ter povezave do člankov in do povzetkov, ki jih morate objaviti najkasneje do ponedeljka do polnoči v tednu, ko imate seminar (v sredo). Angleški naslov prevedite tudi v slovenščino - to bo naslov povzetka, ki ga objavite na posebni strani, tako kot so to naredili kolegi pred vami (oz. predlani).

Način vnosa:

# The importance of ''Arabidopsis'' glutathione peroxidase 8 for protecting ''Arabidopsis'' plant and ''E. coli'' cells against oxidative stress (A. Gaber; GM Crops & Food 5(1), 2014; http://dx.doi.org/10.4161/gmcr.26979) Pomen glutation peroksidaze 8 iz repnjakovca za zaščito rastline ''Arabidopsis thaliana'' in bakterije ''Escherichia coli'' pred oksidativnim stresom. Janez Novak, 15. marca 2017
(slovenski naslov povežite z novo stranjo, na kateri bo povzetek)

'''Naslovi odobrenih člankov po temah:'''

'''Gensko spremenjene rastline''' (8. marec) 
# Synthesis of bacteriophage lytic proteins against ''Streptococcus pneumoniae'' in the chloroplast of ''Chlamydomonas reinhardtii'' (L. Stoffels ''et al''; Plant Biotechnol. J., 2017; http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/pbi.12703/epdf) [[Sinteza bakteriofagnih litičnih proteinov proti Streptococcus pneumoniae v kloroplastih alge Chlamydomonas reinhardtii]]. Eva Vidak, 8. marec 2017
# Bioengineering of the Plant Culture of ''Capsicum frutescens'' with Vanillin Synthase Gene for the Production of Vanillin (M. Jenn Yang Chee ''et al''; Molecular Biotechnology 59(1), 2017; http://link.springer.com/article/10.1007/s12033-016-9986-2) [[Bioinženiring rastlinske kulture Capsicum frutescens z genom za vanilin sintazo za pridobivanje vanilina]]. Mojca Juteršek, 8. marec 2017
# The production of human glucocerebrosidase in glyco-engineered ''Nicotiana benthamiana'' plants (Limkul, J. ''et al''; Plant Biotechnol J., 2016; http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/pbi.12529/full) [[Proizvodnja človeške glukocerebrozidaze v rastlini Nicotiana benthamiana s spremenjeno glikozilacijo]]. Vita Vidmar, 8. marec 2017

'''Gensko spremenjene živali''' (15. marec) 
# Evaluation of porcine stem cells competence for somatic cell nuclear transfer and production of cloned animals (J. O. Secher; Animal Reproduction Science, 2017;http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0378432016304274) [[Določanje kompetence prašičjih matičnih celic za somatski jedrni prenos in kloniranje živali]]. Jerneja Kocutar, 15. marec 2017
# High-level expression of a novel recombinant human plasminogen activator (rhPA) in the milk of transgenic rabbits and its thrombolytic bioactivity ''in vitro'' (Song, S. ''et al''; Molecular Biology Reports ,2016; https://link-springer-com.nukweb.nuk.uni-lj.si/article/10.1007%2Fs11033-016-4020-0) [[Visoka stopnja izražanja rekombinantnega tkivnega aktivatorja plazminogena v mleku transgenskih zajcev in njegova trombolitična aktivnost in vitro]]. Tjaša Lapanja, 15. marec 2017
# Precision engineering for PRRSV resistance in pigs: Macrophages from genome edited pigs lacking CD163 SRCR5 domain are fully resistant to both PRRSV genotypes while maintaining biological function (C. Burcard ''et al''; PLOS Pathogens 13 (2) 2017; http://journals.plos.org/plospathogens/article?id=10.1371/journal.ppat.1006206) [[Makrofagi iz gensko spremenjenih prašičev z delecijo domene CD163 SRCR5 odporni na okužbo s PRRSV]]. Urška Černe, 15. marec 2017

'''Okolje''' (22. marec) 
# Decorating outer membrane vesicles with organophosphorus hydrolase and cellulose binding domain for organophosphate pesticide degradation (S. Fu-Hsiang ''et al''; Chemical Engineering Journal, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1385894716312815) [[Predstavitev organofosfatne hidrolaze in celuloza vezavne domene na površini veziklov zunanje membrane za razgradnjo organofosfatnih pesticidov]]. Nina Roštan, 22. marec 2017
# Bacterial Exopolysaccharide mediated heavy metal removal: A Review on biosynthesis, mechanism and remediation strategies (P. Gupta in B. Diwan; Biotechnology Reports, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2215017X16301382) [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Odstranjevanje_te%C5%BEkih_kovin_s_pomo%C4%8Djo_bakterijskih_eksopolisaharidov:_biosinteza%2C_mehanizem_in_strategije_remediacije Odstranjevanje težkih kovin s pomočjo bakterijskih eksopolisaharidov: biosinteza, mehanizem in strategije remediacije]. Eva Korošec, 22. marec 2017
# Disulfide isomerase-like protein AtPDIL1–2 is a good candidate for trichlorophenol phytodetoxification (Peng, R.-H. in sod.; Sci. Rep. 7, 2017; http://www.nature.com/articles/srep40130#s1) [[Disulfid izomerazi podoben protein AtPDIL1-2 kot kandidat za fitodetoksifikacijo 2,4,6-triklorofenola]]. Ana Cirnski, 22. marca 2017

'''Terapevtski proteini''' (29. marec) 
# Production of functional human nerve growth factor from the saliva of transgenic mice by using salivary glands as bioreactors (F. Zeng in sodelavci; Scientific Reports 7(41270), 2017; http://www.nature.com/articles/srep41270) [[Proizvodnja humanega živčnega rastnega faktorja v slini transgenskih miši z uporabo žlez slinavk kot bioreaktorjev]]. Neža Levičnik, 29. marca 2017
# Mechano growth factor-C24E, a potential promoting biochemical factor for ligament tissue engineering (Y. Song in sodelavci; Biochemical Engineering Journal 105(2016) 249-263,2016, http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1369703X15300681) [[MGF-C24E, potencialni promovirajoči biokemijski faktor za tkivno inženirstvo ligamentov]] . Peter Prezelj, 29. marca 2017
# Secretion of biologically active pancreatitis-associated protein I (PAP) by genetically modified dairy ''Lactococcus lactis'' NZ9000 in the prevention of intestinal mucositis (R. D. Carvalho ''et al''; Microbial cell factories, 2017; http://microbialcellfactories.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12934-017-0624-x) [[Preprečevanje vnetja sluznice prebavnega trakta z gensko spremenjenimi bakterijami Lactococcus lactis NZ9000, ki izločajo biološko aktivni s pankreatitisom povezani protein I (PAP)]]. Domen Klofutar, 29. marec 2017

'''Protitelesa kot terapevtiki''' (5. april) 
# Therapeutic antibody targeting of indoleamine-2,3-dioxygenase (IDO2) inhibits autoimmune arthritis (L. M. F. Merlo "et al"; Clinical Immunology, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1521661616306052). [[Terapevtska protitelesa proti indolamin 2,3-dioksigenazi zavirajo avtoimunski artritis]]. Ema Guštin, 5. aprila 2017
# Production of a tumor-targeting antibody with a human-compatible glycosylation profile in ''N. benthamiana'' hairy root cultures (C. Lonoce ''et al''; Biotechnology Journal, 2016; http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/biot.201500628/abstract) [[Proizvodnja protitumorskih protiteles s človeku kompatibilnim glikozilacijskim profilom v kulturah koreninskih laskov v Nicotiani benthamiani]]. Jan Rozman, 5.4.2017
# A Therapeutic Antibody for Cancer, Derived from Single Human B Cells (R. T. Bushey ''et al''; Cell Reports 15(7), 2016, http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S221112471630465X) [[Terapevtsko protitelo proti raku, pridobljeno iz človeške B celice]]. Alja Zgonc, 5. april 2017

'''Diagnostiki''' (12. april) 
# Diagnostic value of recombinant Tp0821 protein in serodiagnosis for syphilis (Yafeng, ''et al''; Letters in applied microbiology, 2016, 62.4: 336-343; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26853900)[[Diagnostična vrednost rekombinantnega proteina Tp0821 v serodiagnostiki sifilisa]]. Tjaša Košir, 19. april 2017.
# Detection of urinary cell-free miR-210 as a potential tool of liquid biopsy for clear cell renal cell carcinoma (G. Li ''et al''; Urologic Oncology: Seminars and Original Investigations, 2017; http://dx.doi.org/10.1016/j.urolonc.2016.12.007) [[Zaznavanje zunajcelične miR-210 v urinu kot potencialni diagnostični test za odkrivanje svetloceličnega karcinoma ledvičnih celic]]. Petra Vivod, 12. april 2017
# Multiplex Detection of Extensively Drug Resistant Tuberculosis using Binary Deoxyribozyme Sensors (H. N. Bengtson ''et al''; Biosensors and Bioelectronics 94, 2017; http://dx.doi.org/10.1016/j.bios.2017.02.051) [[Multipleksna detekcija na zdravila odporne tuberkuloze z binarnimi deoksiribocimnimi senzorji]]. Marija Kisilak, 12. april 2017

'''Cepiva''' (19. april) 
#Enhanced humoral and CD8 + T cell immunity in mice vaccinated by DNA vaccine against human respiratory syncytial virus through targeting the encoded F protein to dendritic cells (Y. Hua ''et al''; International Immunopharmacology, Vol 46, 2017; http://doi.org/10.1016/j.intimp.2017.02.023) [[Ojačanje humoralne in T-celične CD8+ imunosti v miškah cepljenih s cepivom DNA proti človeškemu respiratornemu sincicijskemu virusu z usmerjanjem kodiranega proteina F na dendritske celice]]. Tomaž Rozmarič, 19. april
# A novel staphylococcal enterotoxin B subunit vaccine candidate elicits protective immune response in a mouse model (J. Y. Choi ''et al''; Toxicon 131, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0041010117301071) [[Novo cepivo proti stafilokoknem enterotoksinu B izzove zaščitni imunski odziv pri miši]]. Amadeja Lapornik, 19. april 2017
#Protective efficacy of six immunogenic recombinant proteins of ''Vibrio anguillarum'' and evaluation them as vaccine candidate for flounder (''Paralichthys olivaceus'') (J. Xing ''et al''; Microbial Pathogenesis 107, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0882401017301857) [[Ovrednotenje šestih imunogenih rekombinantnih proteinov bakterije Vibrio Anguillarum kot kandidatna cepiva za ribo Paralichthys olivaceus]]. Mojca Hunski, 19. aprila 2017

'''Antibiotiki in LMW učinkovine''' (26. april) 
# Structural Basis of ''Mycobacterium tuberculosis''Transcription and Transcription Inhibition http://doi.org/10.1016/j.molcel.2017.03.001, [[Strukturna osnova transkripcije in transripcijske inhibicije v Mycobacterium tuberculosis ]], Vid Jazbec
# Transcriptome analysis of the two unrelated fungal β-lactam producers Acremonium chrysogenum and Penicillium chrysogenum: Velvet-regulated genes are major targets during conventional strain improvement programs https://bmcgenomics.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12864-017-3663-0,[[Analiza transkriptoma Acremonium chrysogenum in Penicillium chrysogenum, dveh nesorodnih gliv, ki proizvajata β-laktame. Ključne tarče v programih izboljšave sevov so velvet-regulirani geni]] , Zala Gluhić
# Biosynthesis of indigo in Escherichia coli expressing self-sufficient CYP102A from ''Streptomyces cattleya'' (H. J. Kim »et al«; Dyes and Pigments, maj 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0143720817300700) [[Biosinteza indiga v E. coli s CYP102A iz Streptomyces cattleya]]. Katja Malovrh, 26. april 2017

'''Male molekule in polimeri''' (3. maj) 
# Engineering of a microbial coculture of ''Escherichia coli'' strains for the biosynthesis of resveratrol (José M. Camacho-Zaragoza ''et al''; Microbal Cell factories 15(163), 2016; https://microbialcellfactories.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12934-016-0562-z) [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/In%C5%BEeniring_mikrobne_kokulture_dveh_sevov_Escherichia_coli_za_biosintezo_resveratrola Inženiring mikrobne kokulture dveh sevov ''Escherichia coli'' za biosintezo resveratrola]. Petra Tavčar, 3. maj 2017
# Engineering ''S. equi'' subsp. ''zooepidemicus'' towards concurrent production of hyaluronic acid and chondroitin biopolymers of biomedical interest (Donatella Cimini ''et al''; AMB Express 7(61), 2017; https://amb-express.springeropen.com/articles/10.1186/s13568-017-0364-7) [[Inženiring Streptococcus zooepidemicus za sočasno proizvodnjo biomedicinsko zanimive hialuronske kisline in hondroitinskih biopolimerov]]. Tim Božič, 3. maj 2017
# CRISPRi-mediated metabolic engineering of ''E. coli'' for O-methylated anthocyanin production (Brady F. Cress ''et al''; Microbal Cell factories 16(10), 2017; https://microbialcellfactories.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12934-016-0623-3) [[Metabolni inženiring E. coli za produkcijo O-metiliranih antocianinov z uporabo CRISPRi]]. Tajda Buh, 3. maj 2017

'''Encimi''' (10. maj) 
# Production of the renewable extremophile lipase: Valuable biocatalyst with potential usage in food industry (M. Memarpoor-Yazdi ''et al''; Food and Bioproducts Processing 102, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0960308516301900)[[ Proizvodnja ekstremofilne lipaze: dragocen biokatalizator s potencialno uporabo v živilski industriji ]]. Nataša Traven, 10. maj 2017
# Optimized production and characterization of a detergent-stable protease from ''Lysinibacillus fusiformis'' C250R (S. Mechri ''et al''; International journal of biological macromolecules 101, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0141813017302805) [[Izboljšana produkcija in karakterizacija na detergent odporne proteaze iz bakterije Lysinobasillus fusiformis C250R]]. Bine Tršavec, 10. maj 2017
# Investigating the impact of α-amylase, α-glucosidase and glucoamylase action on yeast-mediated bread dough fermentation and bread sugar levels (Struyf Nore ''et al''; Journal of cereal science 75, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0733521016304775) [[Vpliv dodajanja amilaze, glikozidaze in glukoamilaze na kvasno fermentacijo krušnega testa in raven sladkorja v kruhu]]. Simon Bolta, 10. maj 2017

'''Pretvorba biomase''' (17. maj) 
# Enhancing digestibility and ethanol yield of ''Populus'' wood via expression of an engineered monolignol 4-O-methyltransferase (Y. Cai ''et al''; Nature Communications 7, 2016; http://www.nature.com/articles/ncomms11989) [[Povečana razgradnja biomase in večji izkoristek etanola z izražanjem mutirane monolignol 4-O-metiltransferaze v lesu rastlin rodu Populus]]. Inge Sotlar, 17. maj 2017
#
# The ''Podospora anserina'' lytic polysaccharide monooxygenase PaLPMO9H catalyzes oxidative cleavage of diverse plant cell wall matrix glycans (M. Fanuel ''et al''; Biotechnology for Biofuels, 2017; https://biotechnologyforbiofuels.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13068-017-0749-5) [[Litična polisaharid monooksigenaza PaLPMO9H, iz glive Podospora anserina, katalizira oksidativno cepitev raznolikih matričnih glikanov celične stene rastlin]]. Anja Tanšek, 17. maj 2017

'''Metabolno inženirstvo''' (24. maj) 
# In vitro metabolic engineering of bioelectricity generation by the complete oxidation of glucose http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1096717616301161 [[Metabolno inženirstvo in vitro za proizvodnjo bioelektrike preko popolne oksidacije glukoze]] Barbara Dušak
# Metabolic engineering of ''Saccharomyces cerevisiae'' for ''de novo'' production of dihydrochalcones with known antioxidant, antidiabetic, and sweet tasting properties (M. Eichenberger in sodelavci; Metabolic Engineering 39, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1096717616301859) [[Metabolno inženirstvo kvasovke Saccharomyces cerevisiae za namen de novo proizvodnje dihidrohalkonov z znanimi antioksidantnimi in antidiabetičnimi učinki ter s sladkim okusom.]]Tjaša Grum, 24. maj 2017
# Establishing a novel biosynthetic pathway for the production of 3,4-dihydroxybutyric acid from xylose in ''Escherichia coli'' (J. Wang et al; Metabolic Engineering 41, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1096717616302737) [[Vzpostavitev nove biosintezne poti za pridobivanje 3,4-dihidroksibutirične kisline iz ksiloze v bakteriji Escherichia coli]]. Sara Kimm Fuhrmann, 24. maj 2017

'''Biološki viri energije''' (31. maj) 
# Self-regulated 1-butanol production in ''Escherichia coli'' based on the endogenous fermentative control (RC. Wen, CR. Shen; Biotechnol Biofuels, 2016; http://biotechnologyforbiofuels.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13068-016-0680-1) Samoregulirana proizvodnja 1-butanola v ''Escherichia coli'', ki temelji na endogeni kontroli fermentacije. Barbara Lipovšek, 31. maj 2017
# A Ferrocene-Based Conjugated Oligoelectrolyte Catalyzes Bacterial Electrode Respiration (N. D. Kirchhofer in sodelavci; Chem 2, 240-257, 2017; http://www.cell.com/chem/abstract/S2451-9294(17)30001-3). Konjugirani oligoelektrolit na osnovi ferocena katalizira bakterijsko elektrodno respiracijo. Matic Kovačič, 31. maj 2017
# Anja Herceg

'''Novi pristopi v molekularni biotehnologiji''' (7. junij) 
# Matjaž Ivanuša
# Danijela Jošić
#

Nazaj na predmet [[Molekularna_biotehnologija]].

Vzpostavitev nove biosintezne poti za pridobivanje 3,4-dihidroksibutirične kisline iz ksiloze v bakteriji Escherichia coli

2017-05-21T19:35:22Z

Kimm Fuhrmann: New page: [http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1096717616302737 '''Establishing a novel biosynthetic pathway for the production of 3,4-dihydroxybutyric acid from xylose in ''Escherichi...

[http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1096717616302737 '''Establishing a novel biosynthetic pathway for the production of 3,4-dihydroxybutyric acid from xylose in ''Escherichia coli'' ''']

3,4-dihidroksibutirična kislina (v nadaljevanju: 3,4-DHBA) je hidrolizirana oblika 3-hidroksi-γ-butirolaktona. Veliko se uporabljata v farmacevtski industriji (prekurzor številnih kiralnih zdravilnih učinkovin), pa tudi pri izdelavi polimernih materialov in topil.
Trenutna kemična sinteza temelji na uporabi petrokemičnih surovin, za katere pa v današnjem času iščemo primerne nadomestke iz obnovljivih materialov. Kot alternativo bi lahko uporabili ligno-celulozno biomaso, ki vsebuje tudi D-ksilozo.
V nadaljevanju bomo opisali pet stopenjsko biosintezno pot za pridobivanje 3,4-DHBA iz D-ksiloze na osnovi nefosfrilacijskega metabolizma D-ksiloze v ''E. coli''. Biosintezno pot so optimizirali z uporabo učinkovitih encimov na vsaki stopnji in s preprečevanjem konkurenčnih metabolnih poti v gostiteljskem sevu.

==Načrtovanje biosintezne poti==
Najprej se D-ksiloza pretvori v 2-keto-3-deoksi-D-ksilonat z encimi D-ksiloza-dehidrogenaza, D-ksilonolaktonaza in D-ksilonat-dehidrataza. 2-keto-3-deoksi-D-ksilonat se pretvori v D-3,4-dihidroksibutanal s keto kislina-dekarboksilazo, nato pride do oksidacije v 3,4-DHBA z aldehiddehidrogenazo.

==Izbira encimov za izgradnjo biosintezne poti==
XylB (D-ksiloza-dehidrogenaza) in XylC (D-ksilonolaktonaza) iz ''C. crescentus'' so uporabili, saj že obstajajo študije, kjer so ugotovili, da oba encima učinkovito pretvarjata D-ksilozo v D-ksilonat v ''E. coli''.
Za tretji korak, kjer je potrebno delovanje D-ksilonat-dehidrataze, so z ''in vitro'' encimskimi testi testirali učinkovitost treh encimov; YjhG in YagF iz ''E.coli'' in XylD iz ''C. crescentus''. Največjo aktivnost ima XylD.
Za četrti korak, kjer je potrebno delovanje keto kislina-dekarboksilaze, so z ''in vitro'' encimskimi testi testirali učinkovitost benzoil formiat-dekarboksilaze (MdlC) iz ''P. Putide'' in α-ketoizovalerat dekarboksilaze (KivD) iz ''L. Lactis''. Oba encima sta približno enako aktivna.
V ''E. coli'' lahko pride do oksidacije aldehidne skupine z različnimi endogenimi aldehid dehidrogenazami.

==''In vivo'' pridobivanje 3,4-DHBA==
Gena ''xylB'' in ''xylC'' so klonirali v plazmid pCS7 (v celicah se pojavlja v visokem številu kopij). Ostale gene so klonirali v vektor pZE12-luc (v celicah se pojavlja v visokem številu kopij). Sev ''E. coli'' BW25113 so transformirali z plazmidom, ki vsebuje ''xylB'' in ''xylC'' in plazmidom, ki vsebuje ''xylD'' in ''kivD''. Bakterije so gojili v stresalnih steklenicah v gojišču LB z 20 g/l D-ksiloze. Za induciranje izražanja so uporabili IPTG. Vzorce so zbirali 48 h po indukciji.
Prvotni sev je proizvedel 0,13 g/L 3,4-DHBA, več je bilo stranskega produkta 1,2,4-butantriola. V ''E.coli'' je namreč veliko endigenih aldoketoreduktaz in alkohol-dehidrogenaz, ki lahko aldehide pretvorijo v alkohole.

==Izbira učinkovite D-3,4-dihidroksibutanal-dehidrogenaze za povečano pridobivanje 3,4-DHBA==
Za povečanje koncentracije 3,4-DHBA in zmanjšanje 1,2,4-butantriola so želeli čezmerno izražati D-3,4-dihidroksibutanal-dehidrogenazo. Domnevali so, da sta od NADP+ odvisna sukcinat-semialdehid-dehidrogenazi GabD iz ''P. Putide'' in YneI iz ''E. coli'' sposobni pretvarjati 3,4-dihidroksibutanal v 3,4-DHBA. Sukcinat-semialdehid in D-3,4-dihidroksibutanal sta si strukturno namreč podobna. Z ''in vitro'' encimskimi testi so ugotovili, da ima YneI trikrat večjo aktivnost. ''YneI'' so klonirali v plazmid, ki je nosil tudi zapis za ''xylD'' in ''kivD'' in kotransformirali ''E. coli'' s plazmidom z zapisoma za ''xylB'' in ''xylC''.
Koncentracija 3,4-DHBA je bila 6-krat večja kot v originalnem sevu, koncentracija 1,2,4-butantriola se je zmanjšala.

==Optimizacija s prekinitvijo kompetitivnih poti==
V divjem tipu ''E.coli'' se D-ksiloza metabolizira v pentoza fosfatni poti, D-ksilonat pa se lahko pretvori v piruvat in glikoaldehid v Dahmsovi poti. Pentoza fosfatno pot so preprečili z izbitjem ''xylA'', ki nosi zapis za D-ksiloza-izomerazo. Za onemogočenje Dahmsove poti so onesposobili ''yjhH'' in ''yagE''.

==Zaključek==
Končni sev je proizvedel 1,27g/l 3,4-DHBA v stresalnih steklenicah, kar je največja pridobljena koncentracija do sedaj in kaže na velik potencial za proizvodnjo 3,4-DHBA v večjem obsegu. Koncentracija stranskega produkta 1,2,4-butantriola je znašala 0,18 g/l, ki pa bi jo lahko še zmanjšali z inaktivacijo endogenih D-3,4-dihidroksibutanal-reduktaz.

==Vir==
Wang J., Shen X., et al. Establishing a novel biosynthetic pathway for the production of 3,4-dihydroxybutyric acid from xylose in Escherichia coli. Metabolic Engineering. 2017; 41: 39-45

MBT seminarji 2017

2017-05-21T19:14:33Z

Kimm Fuhrmann:

'''Seznam seminarjev iz Molekularne biotehnologije v študijskem letu 2016/17'''

Na tej strani je seznam odobrenih člankov za seminar ter povezave do člankov in do povzetkov, ki jih morate objaviti najkasneje do ponedeljka do polnoči v tednu, ko imate seminar (v sredo). Angleški naslov prevedite tudi v slovenščino - to bo naslov povzetka, ki ga objavite na posebni strani, tako kot so to naredili kolegi pred vami (oz. predlani).

Način vnosa:

# The importance of ''Arabidopsis'' glutathione peroxidase 8 for protecting ''Arabidopsis'' plant and ''E. coli'' cells against oxidative stress (A. Gaber; GM Crops & Food 5(1), 2014; http://dx.doi.org/10.4161/gmcr.26979) Pomen glutation peroksidaze 8 iz repnjakovca za zaščito rastline ''Arabidopsis thaliana'' in bakterije ''Escherichia coli'' pred oksidativnim stresom. Janez Novak, 15. marca 2017
(slovenski naslov povežite z novo stranjo, na kateri bo povzetek)

'''Naslovi odobrenih člankov po temah:'''

'''Gensko spremenjene rastline''' (8. marec) 
# Synthesis of bacteriophage lytic proteins against ''Streptococcus pneumoniae'' in the chloroplast of ''Chlamydomonas reinhardtii'' (L. Stoffels ''et al''; Plant Biotechnol. J., 2017; http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/pbi.12703/epdf) [[Sinteza bakteriofagnih litičnih proteinov proti Streptococcus pneumoniae v kloroplastih alge Chlamydomonas reinhardtii]]. Eva Vidak, 8. marec 2017
# Bioengineering of the Plant Culture of ''Capsicum frutescens'' with Vanillin Synthase Gene for the Production of Vanillin (M. Jenn Yang Chee ''et al''; Molecular Biotechnology 59(1), 2017; http://link.springer.com/article/10.1007/s12033-016-9986-2) [[Bioinženiring rastlinske kulture Capsicum frutescens z genom za vanilin sintazo za pridobivanje vanilina]]. Mojca Juteršek, 8. marec 2017
# The production of human glucocerebrosidase in glyco-engineered ''Nicotiana benthamiana'' plants (Limkul, J. ''et al''; Plant Biotechnol J., 2016; http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/pbi.12529/full) [[Proizvodnja človeške glukocerebrozidaze v rastlini Nicotiana benthamiana s spremenjeno glikozilacijo]]. Vita Vidmar, 8. marec 2017

'''Gensko spremenjene živali''' (15. marec) 
# Evaluation of porcine stem cells competence for somatic cell nuclear transfer and production of cloned animals (J. O. Secher; Animal Reproduction Science, 2017;http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0378432016304274) [[Določanje kompetence prašičjih matičnih celic za somatski jedrni prenos in kloniranje živali]]. Jerneja Kocutar, 15. marec 2017
# High-level expression of a novel recombinant human plasminogen activator (rhPA) in the milk of transgenic rabbits and its thrombolytic bioactivity ''in vitro'' (Song, S. ''et al''; Molecular Biology Reports ,2016; https://link-springer-com.nukweb.nuk.uni-lj.si/article/10.1007%2Fs11033-016-4020-0) [[Visoka stopnja izražanja rekombinantnega tkivnega aktivatorja plazminogena v mleku transgenskih zajcev in njegova trombolitična aktivnost in vitro]]. Tjaša Lapanja, 15. marec 2017
# Precision engineering for PRRSV resistance in pigs: Macrophages from genome edited pigs lacking CD163 SRCR5 domain are fully resistant to both PRRSV genotypes while maintaining biological function (C. Burcard ''et al''; PLOS Pathogens 13 (2) 2017; http://journals.plos.org/plospathogens/article?id=10.1371/journal.ppat.1006206) [[Makrofagi iz gensko spremenjenih prašičev z delecijo domene CD163 SRCR5 odporni na okužbo s PRRSV]]. Urška Černe, 15. marec 2017

'''Okolje''' (22. marec) 
# Decorating outer membrane vesicles with organophosphorus hydrolase and cellulose binding domain for organophosphate pesticide degradation (S. Fu-Hsiang ''et al''; Chemical Engineering Journal, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1385894716312815) [[Predstavitev organofosfatne hidrolaze in celuloza vezavne domene na površini veziklov zunanje membrane za razgradnjo organofosfatnih pesticidov]]. Nina Roštan, 22. marec 2017
# Bacterial Exopolysaccharide mediated heavy metal removal: A Review on biosynthesis, mechanism and remediation strategies (P. Gupta in B. Diwan; Biotechnology Reports, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2215017X16301382) [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Odstranjevanje_te%C5%BEkih_kovin_s_pomo%C4%8Djo_bakterijskih_eksopolisaharidov:_biosinteza%2C_mehanizem_in_strategije_remediacije Odstranjevanje težkih kovin s pomočjo bakterijskih eksopolisaharidov: biosinteza, mehanizem in strategije remediacije]. Eva Korošec, 22. marec 2017
# Disulfide isomerase-like protein AtPDIL1–2 is a good candidate for trichlorophenol phytodetoxification (Peng, R.-H. in sod.; Sci. Rep. 7, 2017; http://www.nature.com/articles/srep40130#s1) [[Disulfid izomerazi podoben protein AtPDIL1-2 kot kandidat za fitodetoksifikacijo 2,4,6-triklorofenola]]. Ana Cirnski, 22. marca 2017

'''Terapevtski proteini''' (29. marec) 
# Production of functional human nerve growth factor from the saliva of transgenic mice by using salivary glands as bioreactors (F. Zeng in sodelavci; Scientific Reports 7(41270), 2017; http://www.nature.com/articles/srep41270) [[Proizvodnja humanega živčnega rastnega faktorja v slini transgenskih miši z uporabo žlez slinavk kot bioreaktorjev]]. Neža Levičnik, 29. marca 2017
# Mechano growth factor-C24E, a potential promoting biochemical factor for ligament tissue engineering (Y. Song in sodelavci; Biochemical Engineering Journal 105(2016) 249-263,2016, http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1369703X15300681) [[MGF-C24E, potencialni promovirajoči biokemijski faktor za tkivno inženirstvo ligamentov]] . Peter Prezelj, 29. marca 2017
# Secretion of biologically active pancreatitis-associated protein I (PAP) by genetically modified dairy ''Lactococcus lactis'' NZ9000 in the prevention of intestinal mucositis (R. D. Carvalho ''et al''; Microbial cell factories, 2017; http://microbialcellfactories.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12934-017-0624-x) [[Preprečevanje vnetja sluznice prebavnega trakta z gensko spremenjenimi bakterijami Lactococcus lactis NZ9000, ki izločajo biološko aktivni s pankreatitisom povezani protein I (PAP)]]. Domen Klofutar, 29. marec 2017

'''Protitelesa kot terapevtiki''' (5. april) 
# Therapeutic antibody targeting of indoleamine-2,3-dioxygenase (IDO2) inhibits autoimmune arthritis (L. M. F. Merlo "et al"; Clinical Immunology, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1521661616306052). [[Terapevtska protitelesa proti indolamin 2,3-dioksigenazi zavirajo avtoimunski artritis]]. Ema Guštin, 5. aprila 2017
# Production of a tumor-targeting antibody with a human-compatible glycosylation profile in ''N. benthamiana'' hairy root cultures (C. Lonoce ''et al''; Biotechnology Journal, 2016; http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/biot.201500628/abstract) [[Proizvodnja protitumorskih protiteles s človeku kompatibilnim glikozilacijskim profilom v kulturah koreninskih laskov v Nicotiani benthamiani]]. Jan Rozman, 5.4.2017
# A Therapeutic Antibody for Cancer, Derived from Single Human B Cells (R. T. Bushey ''et al''; Cell Reports 15(7), 2016, http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S221112471630465X) [[Terapevtsko protitelo proti raku, pridobljeno iz človeške B celice]]. Alja Zgonc, 5. april 2017

'''Diagnostiki''' (12. april) 
# Diagnostic value of recombinant Tp0821 protein in serodiagnosis for syphilis (Yafeng, ''et al''; Letters in applied microbiology, 2016, 62.4: 336-343; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26853900)[[Diagnostična vrednost rekombinantnega proteina Tp0821 v serodiagnostiki sifilisa]]. Tjaša Košir, 19. april 2017.
# Detection of urinary cell-free miR-210 as a potential tool of liquid biopsy for clear cell renal cell carcinoma (G. Li ''et al''; Urologic Oncology: Seminars and Original Investigations, 2017; http://dx.doi.org/10.1016/j.urolonc.2016.12.007) [[Zaznavanje zunajcelične miR-210 v urinu kot potencialni diagnostični test za odkrivanje svetloceličnega karcinoma ledvičnih celic]]. Petra Vivod, 12. april 2017
# Multiplex Detection of Extensively Drug Resistant Tuberculosis using Binary Deoxyribozyme Sensors (H. N. Bengtson ''et al''; Biosensors and Bioelectronics 94, 2017; http://dx.doi.org/10.1016/j.bios.2017.02.051) [[Multipleksna detekcija na zdravila odporne tuberkuloze z binarnimi deoksiribocimnimi senzorji]]. Marija Kisilak, 12. april 2017

'''Cepiva''' (19. april) 
#Enhanced humoral and CD8 + T cell immunity in mice vaccinated by DNA vaccine against human respiratory syncytial virus through targeting the encoded F protein to dendritic cells (Y. Hua ''et al''; International Immunopharmacology, Vol 46, 2017; http://doi.org/10.1016/j.intimp.2017.02.023) [[Ojačanje humoralne in T-celične CD8+ imunosti v miškah cepljenih s cepivom DNA proti človeškemu respiratornemu sincicijskemu virusu z usmerjanjem kodiranega proteina F na dendritske celice]]. Tomaž Rozmarič, 19. april
# A novel staphylococcal enterotoxin B subunit vaccine candidate elicits protective immune response in a mouse model (J. Y. Choi ''et al''; Toxicon 131, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0041010117301071) [[Novo cepivo proti stafilokoknem enterotoksinu B izzove zaščitni imunski odziv pri miši]]. Amadeja Lapornik, 19. april 2017
#Protective efficacy of six immunogenic recombinant proteins of ''Vibrio anguillarum'' and evaluation them as vaccine candidate for flounder (''Paralichthys olivaceus'') (J. Xing ''et al''; Microbial Pathogenesis 107, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0882401017301857) [[Ovrednotenje šestih imunogenih rekombinantnih proteinov bakterije Vibrio Anguillarum kot kandidatna cepiva za ribo Paralichthys olivaceus]]. Mojca Hunski, 19. aprila 2017

'''Antibiotiki in LMW učinkovine''' (26. april) 
# Structural Basis of ''Mycobacterium tuberculosis''Transcription and Transcription Inhibition http://doi.org/10.1016/j.molcel.2017.03.001, [[Strukturna osnova transkripcije in transripcijske inhibicije v Mycobacterium tuberculosis ]], Vid Jazbec
# Transcriptome analysis of the two unrelated fungal β-lactam producers Acremonium chrysogenum and Penicillium chrysogenum: Velvet-regulated genes are major targets during conventional strain improvement programs https://bmcgenomics.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12864-017-3663-0,[[Analiza transkriptoma Acremonium chrysogenum in Penicillium chrysogenum, dveh nesorodnih gliv, ki proizvajata β-laktame. Ključne tarče v programih izboljšave sevov so velvet-regulirani geni]] , Zala Gluhić
# Biosynthesis of indigo in Escherichia coli expressing self-sufficient CYP102A from ''Streptomyces cattleya'' (H. J. Kim »et al«; Dyes and Pigments, maj 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0143720817300700) [[Biosinteza indiga v E. coli s CYP102A iz Streptomyces cattleya]]. Katja Malovrh, 26. april 2017

'''Male molekule in polimeri''' (3. maj) 
# Engineering of a microbial coculture of ''Escherichia coli'' strains for the biosynthesis of resveratrol (José M. Camacho-Zaragoza ''et al''; Microbal Cell factories 15(163), 2016; https://microbialcellfactories.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12934-016-0562-z) [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/In%C5%BEeniring_mikrobne_kokulture_dveh_sevov_Escherichia_coli_za_biosintezo_resveratrola Inženiring mikrobne kokulture dveh sevov ''Escherichia coli'' za biosintezo resveratrola]. Petra Tavčar, 3. maj 2017
# Engineering ''S. equi'' subsp. ''zooepidemicus'' towards concurrent production of hyaluronic acid and chondroitin biopolymers of biomedical interest (Donatella Cimini ''et al''; AMB Express 7(61), 2017; https://amb-express.springeropen.com/articles/10.1186/s13568-017-0364-7) [[Inženiring Streptococcus zooepidemicus za sočasno proizvodnjo biomedicinsko zanimive hialuronske kisline in hondroitinskih biopolimerov]]. Tim Božič, 3. maj 2017
# CRISPRi-mediated metabolic engineering of ''E. coli'' for O-methylated anthocyanin production (Brady F. Cress ''et al''; Microbal Cell factories 16(10), 2017; https://microbialcellfactories.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12934-016-0623-3) [[Metabolni inženiring E. coli za produkcijo O-metiliranih antocianinov z uporabo CRISPRi]]. Tajda Buh, 3. maj 2017

'''Encimi''' (10. maj) 
# Production of the renewable extremophile lipase: Valuable biocatalyst with potential usage in food industry (M. Memarpoor-Yazdi ''et al''; Food and Bioproducts Processing 102, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0960308516301900)[[ Proizvodnja ekstremofilne lipaze: dragocen biokatalizator s potencialno uporabo v živilski industriji ]]. Nataša Traven, 10. maj 2017
# Optimized production and characterization of a detergent-stable protease from ''Lysinibacillus fusiformis'' C250R (S. Mechri ''et al''; International journal of biological macromolecules 101, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0141813017302805) [[Izboljšana produkcija in karakterizacija na detergent odporne proteaze iz bakterije Lysinobasillus fusiformis C250R]]. Bine Tršavec, 10. maj 2017
# Investigating the impact of α-amylase, α-glucosidase and glucoamylase action on yeast-mediated bread dough fermentation and bread sugar levels (Struyf Nore ''et al''; Journal of cereal science 75, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0733521016304775) [[Vpliv dodajanja amilaze, glikozidaze in glukoamilaze na kvasno fermentacijo krušnega testa in raven sladkorja v kruhu]]. Simon Bolta, 10. maj 2017

'''Pretvorba biomase''' (17. maj) 
# Enhancing digestibility and ethanol yield of ''Populus'' wood via expression of an engineered monolignol 4-O-methyltransferase (Y. Cai ''et al''; Nature Communications 7, 2016; http://www.nature.com/articles/ncomms11989) [[Povečana razgradnja biomase in večji izkoristek etanola z izražanjem mutirane monolignol 4-O-metiltransferaze v lesu rastlin rodu Populus]]. Inge Sotlar, 17. maj 2017
#
# The ''Podospora anserina'' lytic polysaccharide monooxygenase PaLPMO9H catalyzes oxidative cleavage of diverse plant cell wall matrix glycans (M. Fanuel ''et al''; Biotechnology for Biofuels, 2017; https://biotechnologyforbiofuels.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13068-017-0749-5) [[Litična polisaharid monooksigenaza PaLPMO9H, iz glive Podospora anserina, katalizira oksidativno cepitev raznolikih matričnih glikanov celične stene rastlin]]. Anja Tanšek, 17. maj 2017

'''Metabolno inženirstvo''' (24. maj) 
# In vitro metabolic engineering of bioelectricity generation by the complete oxidation of glucose http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1096717616301161 [[Metabolno inženirstvo in vitro za proizvodnjo bioelektrike preko popolne oksidacije glukoze]] Barbara Dušak
# Metabolic engineering of ''Saccharomyces cerevisiae'' for ''de novo'' production of dihydrochalcones with known antioxidant, antidiabetic, and sweet tasting properties (M. Eichenberger in sodelavci; Metabolic Engineering 39, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1096717616301859) [[Metabolno inženirstvo kvasovke Saccharomyces cerevisiae za namen de novo proizvodnje dihidrohalkonov z znanimi antioksidantnimi in antidiabetičnimi učinki ter s sladkim okusom.]]Tjaša Grum, 24. maj 2017
# Establishing a novel biosynthetic pathway for the production of 3,4-dihydroxybutyric acid from xylose in ''Escherichia coli'' (J. Wang et al; Metabolic Engineering 41, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1096717616302737) Vzpostavitev nove biosintezne poti za pridobivanje 3,4-dihidroksibutirične kisline iz ksiloze v bakteriji ''Escherichia coli''. Sara Kimm Fuhrmann, 24. maj 2017

'''Biološki viri energije''' (31. maj) 
# Self-regulated 1-butanol production in ''Escherichia coli'' based on the endogenous fermentative control (RC. Wen, CR. Shen; Biotechnol Biofuels, 2016; http://biotechnologyforbiofuels.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13068-016-0680-1) Samoregulirana proizvodnja 1-butanola v ''Escherichia coli'', ki temelji na endogeni kontroli fermentacije. Barbara Lipovšek, 31. maj 2017
# A Ferrocene-Based Conjugated Oligoelectrolyte Catalyzes Bacterial Electrode Respiration (N. D. Kirchhofer in sodelavci; Chem 2, 240-257, 2017; http://www.cell.com/chem/abstract/S2451-9294(17)30001-3). Konjugirani oligoelektrolit na osnovi ferocena katalizira bakterijsko elektrodno respiracijo. Matic Kovačič, 31. maj 2017
# Anja Herceg

'''Novi pristopi v molekularni biotehnologiji''' (7. junij) 
# Matjaž Ivanuša
# Danijela Jošić
#

Nazaj na predmet [[Molekularna_biotehnologija]].

MBT seminarji 2017

2017-05-21T19:13:42Z

Kimm Fuhrmann:

'''Seznam seminarjev iz Molekularne biotehnologije v študijskem letu 2016/17'''

Na tej strani je seznam odobrenih člankov za seminar ter povezave do člankov in do povzetkov, ki jih morate objaviti najkasneje do ponedeljka do polnoči v tednu, ko imate seminar (v sredo). Angleški naslov prevedite tudi v slovenščino - to bo naslov povzetka, ki ga objavite na posebni strani, tako kot so to naredili kolegi pred vami (oz. predlani).

Način vnosa:

# The importance of ''Arabidopsis'' glutathione peroxidase 8 for protecting ''Arabidopsis'' plant and ''E. coli'' cells against oxidative stress (A. Gaber; GM Crops & Food 5(1), 2014; http://dx.doi.org/10.4161/gmcr.26979) Pomen glutation peroksidaze 8 iz repnjakovca za zaščito rastline ''Arabidopsis thaliana'' in bakterije ''Escherichia coli'' pred oksidativnim stresom. Janez Novak, 15. marca 2017
(slovenski naslov povežite z novo stranjo, na kateri bo povzetek)

'''Naslovi odobrenih člankov po temah:'''

'''Gensko spremenjene rastline''' (8. marec) 
# Synthesis of bacteriophage lytic proteins against ''Streptococcus pneumoniae'' in the chloroplast of ''Chlamydomonas reinhardtii'' (L. Stoffels ''et al''; Plant Biotechnol. J., 2017; http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/pbi.12703/epdf) [[Sinteza bakteriofagnih litičnih proteinov proti Streptococcus pneumoniae v kloroplastih alge Chlamydomonas reinhardtii]]. Eva Vidak, 8. marec 2017
# Bioengineering of the Plant Culture of ''Capsicum frutescens'' with Vanillin Synthase Gene for the Production of Vanillin (M. Jenn Yang Chee ''et al''; Molecular Biotechnology 59(1), 2017; http://link.springer.com/article/10.1007/s12033-016-9986-2) [[Bioinženiring rastlinske kulture Capsicum frutescens z genom za vanilin sintazo za pridobivanje vanilina]]. Mojca Juteršek, 8. marec 2017
# The production of human glucocerebrosidase in glyco-engineered ''Nicotiana benthamiana'' plants (Limkul, J. ''et al''; Plant Biotechnol J., 2016; http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/pbi.12529/full) [[Proizvodnja človeške glukocerebrozidaze v rastlini Nicotiana benthamiana s spremenjeno glikozilacijo]]. Vita Vidmar, 8. marec 2017

'''Gensko spremenjene živali''' (15. marec) 
# Evaluation of porcine stem cells competence for somatic cell nuclear transfer and production of cloned animals (J. O. Secher; Animal Reproduction Science, 2017;http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0378432016304274) [[Določanje kompetence prašičjih matičnih celic za somatski jedrni prenos in kloniranje živali]]. Jerneja Kocutar, 15. marec 2017
# High-level expression of a novel recombinant human plasminogen activator (rhPA) in the milk of transgenic rabbits and its thrombolytic bioactivity ''in vitro'' (Song, S. ''et al''; Molecular Biology Reports ,2016; https://link-springer-com.nukweb.nuk.uni-lj.si/article/10.1007%2Fs11033-016-4020-0) [[Visoka stopnja izražanja rekombinantnega tkivnega aktivatorja plazminogena v mleku transgenskih zajcev in njegova trombolitična aktivnost in vitro]]. Tjaša Lapanja, 15. marec 2017
# Precision engineering for PRRSV resistance in pigs: Macrophages from genome edited pigs lacking CD163 SRCR5 domain are fully resistant to both PRRSV genotypes while maintaining biological function (C. Burcard ''et al''; PLOS Pathogens 13 (2) 2017; http://journals.plos.org/plospathogens/article?id=10.1371/journal.ppat.1006206) [[Makrofagi iz gensko spremenjenih prašičev z delecijo domene CD163 SRCR5 odporni na okužbo s PRRSV]]. Urška Černe, 15. marec 2017

'''Okolje''' (22. marec) 
# Decorating outer membrane vesicles with organophosphorus hydrolase and cellulose binding domain for organophosphate pesticide degradation (S. Fu-Hsiang ''et al''; Chemical Engineering Journal, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1385894716312815) [[Predstavitev organofosfatne hidrolaze in celuloza vezavne domene na površini veziklov zunanje membrane za razgradnjo organofosfatnih pesticidov]]. Nina Roštan, 22. marec 2017
# Bacterial Exopolysaccharide mediated heavy metal removal: A Review on biosynthesis, mechanism and remediation strategies (P. Gupta in B. Diwan; Biotechnology Reports, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2215017X16301382) [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Odstranjevanje_te%C5%BEkih_kovin_s_pomo%C4%8Djo_bakterijskih_eksopolisaharidov:_biosinteza%2C_mehanizem_in_strategije_remediacije Odstranjevanje težkih kovin s pomočjo bakterijskih eksopolisaharidov: biosinteza, mehanizem in strategije remediacije]. Eva Korošec, 22. marec 2017
# Disulfide isomerase-like protein AtPDIL1–2 is a good candidate for trichlorophenol phytodetoxification (Peng, R.-H. in sod.; Sci. Rep. 7, 2017; http://www.nature.com/articles/srep40130#s1) [[Disulfid izomerazi podoben protein AtPDIL1-2 kot kandidat za fitodetoksifikacijo 2,4,6-triklorofenola]]. Ana Cirnski, 22. marca 2017

'''Terapevtski proteini''' (29. marec) 
# Production of functional human nerve growth factor from the saliva of transgenic mice by using salivary glands as bioreactors (F. Zeng in sodelavci; Scientific Reports 7(41270), 2017; http://www.nature.com/articles/srep41270) [[Proizvodnja humanega živčnega rastnega faktorja v slini transgenskih miši z uporabo žlez slinavk kot bioreaktorjev]]. Neža Levičnik, 29. marca 2017
# Mechano growth factor-C24E, a potential promoting biochemical factor for ligament tissue engineering (Y. Song in sodelavci; Biochemical Engineering Journal 105(2016) 249-263,2016, http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1369703X15300681) [[MGF-C24E, potencialni promovirajoči biokemijski faktor za tkivno inženirstvo ligamentov]] . Peter Prezelj, 29. marca 2017
# Secretion of biologically active pancreatitis-associated protein I (PAP) by genetically modified dairy ''Lactococcus lactis'' NZ9000 in the prevention of intestinal mucositis (R. D. Carvalho ''et al''; Microbial cell factories, 2017; http://microbialcellfactories.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12934-017-0624-x) [[Preprečevanje vnetja sluznice prebavnega trakta z gensko spremenjenimi bakterijami Lactococcus lactis NZ9000, ki izločajo biološko aktivni s pankreatitisom povezani protein I (PAP)]]. Domen Klofutar, 29. marec 2017

'''Protitelesa kot terapevtiki''' (5. april) 
# Therapeutic antibody targeting of indoleamine-2,3-dioxygenase (IDO2) inhibits autoimmune arthritis (L. M. F. Merlo "et al"; Clinical Immunology, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1521661616306052). [[Terapevtska protitelesa proti indolamin 2,3-dioksigenazi zavirajo avtoimunski artritis]]. Ema Guštin, 5. aprila 2017
# Production of a tumor-targeting antibody with a human-compatible glycosylation profile in ''N. benthamiana'' hairy root cultures (C. Lonoce ''et al''; Biotechnology Journal, 2016; http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/biot.201500628/abstract) [[Proizvodnja protitumorskih protiteles s človeku kompatibilnim glikozilacijskim profilom v kulturah koreninskih laskov v Nicotiani benthamiani]]. Jan Rozman, 5.4.2017
# A Therapeutic Antibody for Cancer, Derived from Single Human B Cells (R. T. Bushey ''et al''; Cell Reports 15(7), 2016, http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S221112471630465X) [[Terapevtsko protitelo proti raku, pridobljeno iz človeške B celice]]. Alja Zgonc, 5. april 2017

'''Diagnostiki''' (12. april) 
# Diagnostic value of recombinant Tp0821 protein in serodiagnosis for syphilis (Yafeng, ''et al''; Letters in applied microbiology, 2016, 62.4: 336-343; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26853900)[[Diagnostična vrednost rekombinantnega proteina Tp0821 v serodiagnostiki sifilisa]]. Tjaša Košir, 19. april 2017.
# Detection of urinary cell-free miR-210 as a potential tool of liquid biopsy for clear cell renal cell carcinoma (G. Li ''et al''; Urologic Oncology: Seminars and Original Investigations, 2017; http://dx.doi.org/10.1016/j.urolonc.2016.12.007) [[Zaznavanje zunajcelične miR-210 v urinu kot potencialni diagnostični test za odkrivanje svetloceličnega karcinoma ledvičnih celic]]. Petra Vivod, 12. april 2017
# Multiplex Detection of Extensively Drug Resistant Tuberculosis using Binary Deoxyribozyme Sensors (H. N. Bengtson ''et al''; Biosensors and Bioelectronics 94, 2017; http://dx.doi.org/10.1016/j.bios.2017.02.051) [[Multipleksna detekcija na zdravila odporne tuberkuloze z binarnimi deoksiribocimnimi senzorji]]. Marija Kisilak, 12. april 2017

'''Cepiva''' (19. april) 
#Enhanced humoral and CD8 + T cell immunity in mice vaccinated by DNA vaccine against human respiratory syncytial virus through targeting the encoded F protein to dendritic cells (Y. Hua ''et al''; International Immunopharmacology, Vol 46, 2017; http://doi.org/10.1016/j.intimp.2017.02.023) [[Ojačanje humoralne in T-celične CD8+ imunosti v miškah cepljenih s cepivom DNA proti človeškemu respiratornemu sincicijskemu virusu z usmerjanjem kodiranega proteina F na dendritske celice]]. Tomaž Rozmarič, 19. april
# A novel staphylococcal enterotoxin B subunit vaccine candidate elicits protective immune response in a mouse model (J. Y. Choi ''et al''; Toxicon 131, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0041010117301071) [[Novo cepivo proti stafilokoknem enterotoksinu B izzove zaščitni imunski odziv pri miši]]. Amadeja Lapornik, 19. april 2017
#Protective efficacy of six immunogenic recombinant proteins of ''Vibrio anguillarum'' and evaluation them as vaccine candidate for flounder (''Paralichthys olivaceus'') (J. Xing ''et al''; Microbial Pathogenesis 107, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0882401017301857) [[Ovrednotenje šestih imunogenih rekombinantnih proteinov bakterije Vibrio Anguillarum kot kandidatna cepiva za ribo Paralichthys olivaceus]]. Mojca Hunski, 19. aprila 2017

'''Antibiotiki in LMW učinkovine''' (26. april) 
# Structural Basis of ''Mycobacterium tuberculosis''Transcription and Transcription Inhibition http://doi.org/10.1016/j.molcel.2017.03.001, [[Strukturna osnova transkripcije in transripcijske inhibicije v Mycobacterium tuberculosis ]], Vid Jazbec
# Transcriptome analysis of the two unrelated fungal β-lactam producers Acremonium chrysogenum and Penicillium chrysogenum: Velvet-regulated genes are major targets during conventional strain improvement programs https://bmcgenomics.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12864-017-3663-0,[[Analiza transkriptoma Acremonium chrysogenum in Penicillium chrysogenum, dveh nesorodnih gliv, ki proizvajata β-laktame. Ključne tarče v programih izboljšave sevov so velvet-regulirani geni]] , Zala Gluhić
# Biosynthesis of indigo in Escherichia coli expressing self-sufficient CYP102A from ''Streptomyces cattleya'' (H. J. Kim »et al«; Dyes and Pigments, maj 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0143720817300700) [[Biosinteza indiga v E. coli s CYP102A iz Streptomyces cattleya]]. Katja Malovrh, 26. april 2017

'''Male molekule in polimeri''' (3. maj) 
# Engineering of a microbial coculture of ''Escherichia coli'' strains for the biosynthesis of resveratrol (José M. Camacho-Zaragoza ''et al''; Microbal Cell factories 15(163), 2016; https://microbialcellfactories.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12934-016-0562-z) [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/In%C5%BEeniring_mikrobne_kokulture_dveh_sevov_Escherichia_coli_za_biosintezo_resveratrola Inženiring mikrobne kokulture dveh sevov ''Escherichia coli'' za biosintezo resveratrola]. Petra Tavčar, 3. maj 2017
# Engineering ''S. equi'' subsp. ''zooepidemicus'' towards concurrent production of hyaluronic acid and chondroitin biopolymers of biomedical interest (Donatella Cimini ''et al''; AMB Express 7(61), 2017; https://amb-express.springeropen.com/articles/10.1186/s13568-017-0364-7) [[Inženiring Streptococcus zooepidemicus za sočasno proizvodnjo biomedicinsko zanimive hialuronske kisline in hondroitinskih biopolimerov]]. Tim Božič, 3. maj 2017
# CRISPRi-mediated metabolic engineering of ''E. coli'' for O-methylated anthocyanin production (Brady F. Cress ''et al''; Microbal Cell factories 16(10), 2017; https://microbialcellfactories.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12934-016-0623-3) [[Metabolni inženiring E. coli za produkcijo O-metiliranih antocianinov z uporabo CRISPRi]]. Tajda Buh, 3. maj 2017

'''Encimi''' (10. maj) 
# Production of the renewable extremophile lipase: Valuable biocatalyst with potential usage in food industry (M. Memarpoor-Yazdi ''et al''; Food and Bioproducts Processing 102, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0960308516301900)[[ Proizvodnja ekstremofilne lipaze: dragocen biokatalizator s potencialno uporabo v živilski industriji ]]. Nataša Traven, 10. maj 2017
# Optimized production and characterization of a detergent-stable protease from ''Lysinibacillus fusiformis'' C250R (S. Mechri ''et al''; International journal of biological macromolecules 101, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0141813017302805) [[Izboljšana produkcija in karakterizacija na detergent odporne proteaze iz bakterije Lysinobasillus fusiformis C250R]]. Bine Tršavec, 10. maj 2017
# Investigating the impact of α-amylase, α-glucosidase and glucoamylase action on yeast-mediated bread dough fermentation and bread sugar levels (Struyf Nore ''et al''; Journal of cereal science 75, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0733521016304775) [[Vpliv dodajanja amilaze, glikozidaze in glukoamilaze na kvasno fermentacijo krušnega testa in raven sladkorja v kruhu]]. Simon Bolta, 10. maj 2017

'''Pretvorba biomase''' (17. maj) 
# Enhancing digestibility and ethanol yield of ''Populus'' wood via expression of an engineered monolignol 4-O-methyltransferase (Y. Cai ''et al''; Nature Communications 7, 2016; http://www.nature.com/articles/ncomms11989) [[Povečana razgradnja biomase in večji izkoristek etanola z izražanjem mutirane monolignol 4-O-metiltransferaze v lesu rastlin rodu Populus]]. Inge Sotlar, 17. maj 2017
#
# The ''Podospora anserina'' lytic polysaccharide monooxygenase PaLPMO9H catalyzes oxidative cleavage of diverse plant cell wall matrix glycans (M. Fanuel ''et al''; Biotechnology for Biofuels, 2017; https://biotechnologyforbiofuels.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13068-017-0749-5) [[Litična polisaharid monooksigenaza PaLPMO9H, iz glive Podospora anserina, katalizira oksidativno cepitev raznolikih matričnih glikanov celične stene rastlin]]. Anja Tanšek, 17. maj 2017

'''Metabolno inženirstvo''' (24. maj) 
# In vitro metabolic engineering of bioelectricity generation by the complete oxidation of glucose http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1096717616301161 [[Metabolno inženirstvo in vitro za proizvodnjo bioelektrike preko popolne oksidacije glukoze]] Barbara Dušak
# Metabolic engineering of ''Saccharomyces cerevisiae'' for ''de novo'' production of dihydrochalcones with known antioxidant, antidiabetic, and sweet tasting properties (M. Eichenberger in sodelavci; Metabolic Engineering 39, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1096717616301859) [[Metabolno inženirstvo kvasovke Saccharomyces cerevisiae za namen de novo proizvodnje dihidrohalkonov z znanimi antioksidantnimi in antidiabetičnimi učinki ter s sladkim okusom.]]Tjaša Grum, 24. maj 2017
# Establishing a novel biosynthetic pathway for the production of 3,4-dihydroxybutyric acid from xylose in ''Escherichia coli'' (J. Wang et al; Metabolic Engineering 41, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1096717616302737) [[Vzpostavitev nove biosintezne poti za pridobivanje 3,4-dihidroksibutirične kisline iz ksiloze v bakteriji ''Escherichia coli'']]. Sara Kimm Fuhrmann, 24. maj 2017

'''Biološki viri energije''' (31. maj) 
# Self-regulated 1-butanol production in ''Escherichia coli'' based on the endogenous fermentative control (RC. Wen, CR. Shen; Biotechnol Biofuels, 2016; http://biotechnologyforbiofuels.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13068-016-0680-1) Samoregulirana proizvodnja 1-butanola v ''Escherichia coli'', ki temelji na endogeni kontroli fermentacije. Barbara Lipovšek, 31. maj 2017
# A Ferrocene-Based Conjugated Oligoelectrolyte Catalyzes Bacterial Electrode Respiration (N. D. Kirchhofer in sodelavci; Chem 2, 240-257, 2017; http://www.cell.com/chem/abstract/S2451-9294(17)30001-3). Konjugirani oligoelektrolit na osnovi ferocena katalizira bakterijsko elektrodno respiracijo. Matic Kovačič, 31. maj 2017
# Anja Herceg

'''Novi pristopi v molekularni biotehnologiji''' (7. junij) 
# Matjaž Ivanuša
# Danijela Jošić
#

Nazaj na predmet [[Molekularna_biotehnologija]].

MBT seminarji 2017

2017-05-21T19:09:12Z

Kimm Fuhrmann:

'''Seznam seminarjev iz Molekularne biotehnologije v študijskem letu 2016/17'''

Na tej strani je seznam odobrenih člankov za seminar ter povezave do člankov in do povzetkov, ki jih morate objaviti najkasneje do ponedeljka do polnoči v tednu, ko imate seminar (v sredo). Angleški naslov prevedite tudi v slovenščino - to bo naslov povzetka, ki ga objavite na posebni strani, tako kot so to naredili kolegi pred vami (oz. predlani).

Način vnosa:

# The importance of ''Arabidopsis'' glutathione peroxidase 8 for protecting ''Arabidopsis'' plant and ''E. coli'' cells against oxidative stress (A. Gaber; GM Crops & Food 5(1), 2014; http://dx.doi.org/10.4161/gmcr.26979) Pomen glutation peroksidaze 8 iz repnjakovca za zaščito rastline ''Arabidopsis thaliana'' in bakterije ''Escherichia coli'' pred oksidativnim stresom. Janez Novak, 15. marca 2017
(slovenski naslov povežite z novo stranjo, na kateri bo povzetek)

'''Naslovi odobrenih člankov po temah:'''

'''Gensko spremenjene rastline''' (8. marec) 
# Synthesis of bacteriophage lytic proteins against ''Streptococcus pneumoniae'' in the chloroplast of ''Chlamydomonas reinhardtii'' (L. Stoffels ''et al''; Plant Biotechnol. J., 2017; http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/pbi.12703/epdf) [[Sinteza bakteriofagnih litičnih proteinov proti Streptococcus pneumoniae v kloroplastih alge Chlamydomonas reinhardtii]]. Eva Vidak, 8. marec 2017
# Bioengineering of the Plant Culture of ''Capsicum frutescens'' with Vanillin Synthase Gene for the Production of Vanillin (M. Jenn Yang Chee ''et al''; Molecular Biotechnology 59(1), 2017; http://link.springer.com/article/10.1007/s12033-016-9986-2) [[Bioinženiring rastlinske kulture Capsicum frutescens z genom za vanilin sintazo za pridobivanje vanilina]]. Mojca Juteršek, 8. marec 2017
# The production of human glucocerebrosidase in glyco-engineered ''Nicotiana benthamiana'' plants (Limkul, J. ''et al''; Plant Biotechnol J., 2016; http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/pbi.12529/full) [[Proizvodnja človeške glukocerebrozidaze v rastlini Nicotiana benthamiana s spremenjeno glikozilacijo]]. Vita Vidmar, 8. marec 2017

'''Gensko spremenjene živali''' (15. marec) 
# Evaluation of porcine stem cells competence for somatic cell nuclear transfer and production of cloned animals (J. O. Secher; Animal Reproduction Science, 2017;http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0378432016304274) [[Določanje kompetence prašičjih matičnih celic za somatski jedrni prenos in kloniranje živali]]. Jerneja Kocutar, 15. marec 2017
# High-level expression of a novel recombinant human plasminogen activator (rhPA) in the milk of transgenic rabbits and its thrombolytic bioactivity ''in vitro'' (Song, S. ''et al''; Molecular Biology Reports ,2016; https://link-springer-com.nukweb.nuk.uni-lj.si/article/10.1007%2Fs11033-016-4020-0) [[Visoka stopnja izražanja rekombinantnega tkivnega aktivatorja plazminogena v mleku transgenskih zajcev in njegova trombolitična aktivnost in vitro]]. Tjaša Lapanja, 15. marec 2017
# Precision engineering for PRRSV resistance in pigs: Macrophages from genome edited pigs lacking CD163 SRCR5 domain are fully resistant to both PRRSV genotypes while maintaining biological function (C. Burcard ''et al''; PLOS Pathogens 13 (2) 2017; http://journals.plos.org/plospathogens/article?id=10.1371/journal.ppat.1006206) [[Makrofagi iz gensko spremenjenih prašičev z delecijo domene CD163 SRCR5 odporni na okužbo s PRRSV]]. Urška Černe, 15. marec 2017

'''Okolje''' (22. marec) 
# Decorating outer membrane vesicles with organophosphorus hydrolase and cellulose binding domain for organophosphate pesticide degradation (S. Fu-Hsiang ''et al''; Chemical Engineering Journal, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1385894716312815) [[Predstavitev organofosfatne hidrolaze in celuloza vezavne domene na površini veziklov zunanje membrane za razgradnjo organofosfatnih pesticidov]]. Nina Roštan, 22. marec 2017
# Bacterial Exopolysaccharide mediated heavy metal removal: A Review on biosynthesis, mechanism and remediation strategies (P. Gupta in B. Diwan; Biotechnology Reports, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2215017X16301382) [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Odstranjevanje_te%C5%BEkih_kovin_s_pomo%C4%8Djo_bakterijskih_eksopolisaharidov:_biosinteza%2C_mehanizem_in_strategije_remediacije Odstranjevanje težkih kovin s pomočjo bakterijskih eksopolisaharidov: biosinteza, mehanizem in strategije remediacije]. Eva Korošec, 22. marec 2017
# Disulfide isomerase-like protein AtPDIL1–2 is a good candidate for trichlorophenol phytodetoxification (Peng, R.-H. in sod.; Sci. Rep. 7, 2017; http://www.nature.com/articles/srep40130#s1) [[Disulfid izomerazi podoben protein AtPDIL1-2 kot kandidat za fitodetoksifikacijo 2,4,6-triklorofenola]]. Ana Cirnski, 22. marca 2017

'''Terapevtski proteini''' (29. marec) 
# Production of functional human nerve growth factor from the saliva of transgenic mice by using salivary glands as bioreactors (F. Zeng in sodelavci; Scientific Reports 7(41270), 2017; http://www.nature.com/articles/srep41270) [[Proizvodnja humanega živčnega rastnega faktorja v slini transgenskih miši z uporabo žlez slinavk kot bioreaktorjev]]. Neža Levičnik, 29. marca 2017
# Mechano growth factor-C24E, a potential promoting biochemical factor for ligament tissue engineering (Y. Song in sodelavci; Biochemical Engineering Journal 105(2016) 249-263,2016, http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1369703X15300681) [[MGF-C24E, potencialni promovirajoči biokemijski faktor za tkivno inženirstvo ligamentov]] . Peter Prezelj, 29. marca 2017
# Secretion of biologically active pancreatitis-associated protein I (PAP) by genetically modified dairy ''Lactococcus lactis'' NZ9000 in the prevention of intestinal mucositis (R. D. Carvalho ''et al''; Microbial cell factories, 2017; http://microbialcellfactories.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12934-017-0624-x) [[Preprečevanje vnetja sluznice prebavnega trakta z gensko spremenjenimi bakterijami Lactococcus lactis NZ9000, ki izločajo biološko aktivni s pankreatitisom povezani protein I (PAP)]]. Domen Klofutar, 29. marec 2017

'''Protitelesa kot terapevtiki''' (5. april) 
# Therapeutic antibody targeting of indoleamine-2,3-dioxygenase (IDO2) inhibits autoimmune arthritis (L. M. F. Merlo "et al"; Clinical Immunology, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1521661616306052). [[Terapevtska protitelesa proti indolamin 2,3-dioksigenazi zavirajo avtoimunski artritis]]. Ema Guštin, 5. aprila 2017
# Production of a tumor-targeting antibody with a human-compatible glycosylation profile in ''N. benthamiana'' hairy root cultures (C. Lonoce ''et al''; Biotechnology Journal, 2016; http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/biot.201500628/abstract) [[Proizvodnja protitumorskih protiteles s človeku kompatibilnim glikozilacijskim profilom v kulturah koreninskih laskov v Nicotiani benthamiani]]. Jan Rozman, 5.4.2017
# A Therapeutic Antibody for Cancer, Derived from Single Human B Cells (R. T. Bushey ''et al''; Cell Reports 15(7), 2016, http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S221112471630465X) [[Terapevtsko protitelo proti raku, pridobljeno iz človeške B celice]]. Alja Zgonc, 5. april 2017

'''Diagnostiki''' (12. april) 
# Diagnostic value of recombinant Tp0821 protein in serodiagnosis for syphilis (Yafeng, ''et al''; Letters in applied microbiology, 2016, 62.4: 336-343; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26853900)[[Diagnostična vrednost rekombinantnega proteina Tp0821 v serodiagnostiki sifilisa]]. Tjaša Košir, 19. april 2017.
# Detection of urinary cell-free miR-210 as a potential tool of liquid biopsy for clear cell renal cell carcinoma (G. Li ''et al''; Urologic Oncology: Seminars and Original Investigations, 2017; http://dx.doi.org/10.1016/j.urolonc.2016.12.007) [[Zaznavanje zunajcelične miR-210 v urinu kot potencialni diagnostični test za odkrivanje svetloceličnega karcinoma ledvičnih celic]]. Petra Vivod, 12. april 2017
# Multiplex Detection of Extensively Drug Resistant Tuberculosis using Binary Deoxyribozyme Sensors (H. N. Bengtson ''et al''; Biosensors and Bioelectronics 94, 2017; http://dx.doi.org/10.1016/j.bios.2017.02.051) [[Multipleksna detekcija na zdravila odporne tuberkuloze z binarnimi deoksiribocimnimi senzorji]]. Marija Kisilak, 12. april 2017

'''Cepiva''' (19. april) 
#Enhanced humoral and CD8 + T cell immunity in mice vaccinated by DNA vaccine against human respiratory syncytial virus through targeting the encoded F protein to dendritic cells (Y. Hua ''et al''; International Immunopharmacology, Vol 46, 2017; http://doi.org/10.1016/j.intimp.2017.02.023) [[Ojačanje humoralne in T-celične CD8+ imunosti v miškah cepljenih s cepivom DNA proti človeškemu respiratornemu sincicijskemu virusu z usmerjanjem kodiranega proteina F na dendritske celice]]. Tomaž Rozmarič, 19. april
# A novel staphylococcal enterotoxin B subunit vaccine candidate elicits protective immune response in a mouse model (J. Y. Choi ''et al''; Toxicon 131, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0041010117301071) [[Novo cepivo proti stafilokoknem enterotoksinu B izzove zaščitni imunski odziv pri miši]]. Amadeja Lapornik, 19. april 2017
#Protective efficacy of six immunogenic recombinant proteins of ''Vibrio anguillarum'' and evaluation them as vaccine candidate for flounder (''Paralichthys olivaceus'') (J. Xing ''et al''; Microbial Pathogenesis 107, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0882401017301857) [[Ovrednotenje šestih imunogenih rekombinantnih proteinov bakterije Vibrio Anguillarum kot kandidatna cepiva za ribo Paralichthys olivaceus]]. Mojca Hunski, 19. aprila 2017

'''Antibiotiki in LMW učinkovine''' (26. april) 
# Structural Basis of ''Mycobacterium tuberculosis''Transcription and Transcription Inhibition http://doi.org/10.1016/j.molcel.2017.03.001, [[Strukturna osnova transkripcije in transripcijske inhibicije v Mycobacterium tuberculosis ]], Vid Jazbec
# Transcriptome analysis of the two unrelated fungal β-lactam producers Acremonium chrysogenum and Penicillium chrysogenum: Velvet-regulated genes are major targets during conventional strain improvement programs https://bmcgenomics.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12864-017-3663-0,[[Analiza transkriptoma Acremonium chrysogenum in Penicillium chrysogenum, dveh nesorodnih gliv, ki proizvajata β-laktame. Ključne tarče v programih izboljšave sevov so velvet-regulirani geni]] , Zala Gluhić
# Biosynthesis of indigo in Escherichia coli expressing self-sufficient CYP102A from ''Streptomyces cattleya'' (H. J. Kim »et al«; Dyes and Pigments, maj 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0143720817300700) [[Biosinteza indiga v E. coli s CYP102A iz Streptomyces cattleya]]. Katja Malovrh, 26. april 2017

'''Male molekule in polimeri''' (3. maj) 
# Engineering of a microbial coculture of ''Escherichia coli'' strains for the biosynthesis of resveratrol (José M. Camacho-Zaragoza ''et al''; Microbal Cell factories 15(163), 2016; https://microbialcellfactories.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12934-016-0562-z) [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/In%C5%BEeniring_mikrobne_kokulture_dveh_sevov_Escherichia_coli_za_biosintezo_resveratrola Inženiring mikrobne kokulture dveh sevov ''Escherichia coli'' za biosintezo resveratrola]. Petra Tavčar, 3. maj 2017
# Engineering ''S. equi'' subsp. ''zooepidemicus'' towards concurrent production of hyaluronic acid and chondroitin biopolymers of biomedical interest (Donatella Cimini ''et al''; AMB Express 7(61), 2017; https://amb-express.springeropen.com/articles/10.1186/s13568-017-0364-7) [[Inženiring Streptococcus zooepidemicus za sočasno proizvodnjo biomedicinsko zanimive hialuronske kisline in hondroitinskih biopolimerov]]. Tim Božič, 3. maj 2017
# CRISPRi-mediated metabolic engineering of ''E. coli'' for O-methylated anthocyanin production (Brady F. Cress ''et al''; Microbal Cell factories 16(10), 2017; https://microbialcellfactories.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12934-016-0623-3) [[Metabolni inženiring E. coli za produkcijo O-metiliranih antocianinov z uporabo CRISPRi]]. Tajda Buh, 3. maj 2017

'''Encimi''' (10. maj) 
# Production of the renewable extremophile lipase: Valuable biocatalyst with potential usage in food industry (M. Memarpoor-Yazdi ''et al''; Food and Bioproducts Processing 102, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0960308516301900)[[ Proizvodnja ekstremofilne lipaze: dragocen biokatalizator s potencialno uporabo v živilski industriji ]]. Nataša Traven, 10. maj 2017
# Optimized production and characterization of a detergent-stable protease from ''Lysinibacillus fusiformis'' C250R (S. Mechri ''et al''; International journal of biological macromolecules 101, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0141813017302805) [[Izboljšana produkcija in karakterizacija na detergent odporne proteaze iz bakterije Lysinobasillus fusiformis C250R]]. Bine Tršavec, 10. maj 2017
# Investigating the impact of α-amylase, α-glucosidase and glucoamylase action on yeast-mediated bread dough fermentation and bread sugar levels (Struyf Nore ''et al''; Journal of cereal science 75, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0733521016304775) [[Vpliv dodajanja amilaze, glikozidaze in glukoamilaze na kvasno fermentacijo krušnega testa in raven sladkorja v kruhu]]. Simon Bolta, 10. maj 2017

'''Pretvorba biomase''' (17. maj) 
# Enhancing digestibility and ethanol yield of ''Populus'' wood via expression of an engineered monolignol 4-O-methyltransferase (Y. Cai ''et al''; Nature Communications 7, 2016; http://www.nature.com/articles/ncomms11989) [[Povečana razgradnja biomase in večji izkoristek etanola z izražanjem mutirane monolignol 4-O-metiltransferaze v lesu rastlin rodu Populus]]. Inge Sotlar, 17. maj 2017
#
# The ''Podospora anserina'' lytic polysaccharide monooxygenase PaLPMO9H catalyzes oxidative cleavage of diverse plant cell wall matrix glycans (M. Fanuel ''et al''; Biotechnology for Biofuels, 2017; https://biotechnologyforbiofuels.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13068-017-0749-5) [[Litična polisaharid monooksigenaza PaLPMO9H, iz glive Podospora anserina, katalizira oksidativno cepitev raznolikih matričnih glikanov celične stene rastlin]]. Anja Tanšek, 17. maj 2017

'''Metabolno inženirstvo''' (24. maj) 
# In vitro metabolic engineering of bioelectricity generation by the complete oxidation of glucose http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1096717616301161 [[Metabolno inženirstvo in vitro za proizvodnjo bioelektrike preko popolne oksidacije glukoze]] Barbara Dušak
# Metabolic engineering of ''Saccharomyces cerevisiae'' for ''de novo'' production of dihydrochalcones with known antioxidant, antidiabetic, and sweet tasting properties (M. Eichenberger in sodelavci; Metabolic Engineering 39, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1096717616301859) [[Metabolno inženirstvo kvasovke Saccharomyces cerevisiae za namen de novo proizvodnje dihidrohalkonov z znanimi antioksidantnimi in antidiabetičnimi učinki ter s sladkim okusom.]]Tjaša Grum, 24. maj 2017
# Establishing a novel biosynthetic pathway for the production of 3,4-dihydroxybutyric acid from xylose in ''Escherichia coli'' (J. Wang et al; Metabolic Engineering 41, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1096717616302737) Vzpostavitev nove biosintezne poti za pridobivanje 3,4-dihidroksibutirične kisline iz ksiloze v bakteriji ''Escherichia coli''. Sara Kimm Fuhrmann, 24. maj 2017

'''Biološki viri energije''' (31. maj) 
# Self-regulated 1-butanol production in ''Escherichia coli'' based on the endogenous fermentative control (RC. Wen, CR. Shen; Biotechnol Biofuels, 2016; http://biotechnologyforbiofuels.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13068-016-0680-1) Samoregulirana proizvodnja 1-butanola v ''Escherichia coli'', ki temelji na endogeni kontroli fermentacije. Barbara Lipovšek, 31. maj 2017
# A Ferrocene-Based Conjugated Oligoelectrolyte Catalyzes Bacterial Electrode Respiration (N. D. Kirchhofer in sodelavci; Chem 2, 240-257, 2017; http://www.cell.com/chem/abstract/S2451-9294(17)30001-3). Konjugirani oligoelektrolit na osnovi ferocena katalizira bakterijsko elektrodno respiracijo. Matic Kovačič, 31. maj 2017
# Anja Herceg

'''Novi pristopi v molekularni biotehnologiji''' (7. junij) 
# Matjaž Ivanuša
# Danijela Jošić
#

Nazaj na predmet [[Molekularna_biotehnologija]].