Wiki FKKT - User contributions [en]

Of CO2urse - sistem za zmanjševanje izpustov ogljikovega dioksida v industriji

2018-12-17T22:58:08Z

Kity Požek:

Of CO2urse je projekt študentske ekipe 'NCKU Tainan' iz Tajvana, ki je bil nagrajen kot najboljši okoljski projekt na tekmovanju iz sintezne biologije, iGEM 2018. Namen projekta je s pristopi sintezne biologije prispevati k oblikovanju nizkoogljične družbe <ref>iGEM 2018 Team NCKU Tainan. ''Of CO2urse.'' Dostopno na: http://2018.igem.org/Team:NCKU_Tainan [pridobljeno 13.12.2018].</ref>.

==UVOD==
Globalno segrevanje je danes eden največjih okoljskih problemov in med najpomembnejšimi vzroki za učinek tople grede je pretiran izpust ogljikovega dioksida (CO2) v ozračje. Za izpust so v glavnem odgovorne človeške dejavnosti, kot so transport, proizvodnja električne energije in industrija, zaradi katerih se koncentracija tega toplogrednega plina v zraku izrazito povišuje vse od industrijske revolucije dalje. S hkratnim pretiranim izpustom CO2 in krčenjem naravnih ponorov CO2, kot so npr. gozdovi, se ruši naravni cikel ogljika, na kar kaže tudi dejstvo, da se je od leta 1960 do leta 2018 koncentracija CO2 v ozračju dvignila iz 320 ppm na več kot 400 ppm <ref>ProOxygen. ''CO2 Acceleration.'' Dostopno na: https://www.co2.earth/co2-acceleration [pridobljeno 13.12.2018].</ref>, <ref>US EPA. ''Overview of Greenhouse Gases.'' Dostopno na: https://www.epa.gov/ghgemissions/overview-greenhouse-gases [pridobljeno 13.12.2018].</ref>. Učinek tople grede ima za planet že vidne in zaskrbljujoče posledice, kot je npr. taljenje polarnega ledu, posledično dvigovanje gladine morja in manjšanje primernih površin ter pogojev za preživetje obstoječih vrst, višanje temperature morja in s tem rušenje morskega ekosistema itd. Pri obvladovanju izpustov CO2 med drugim pripomorejo raziskave, usmerjene v razvoj načinov za nadzor izpustov in za privzem CO2 iz ozračja. iGEM ekipa iz Tajvana si je v ta namen zamislila projekt, v sklopu katerega so pripravili sinteznobiološki sistem, ki bi lahko v industrijskih obratih asimiliral nastali CO2 [1].

==PRISTOP IN IZVEDBA PROJEKTA==
==='''Of CO2urse'''===
Študenti so pripravili prototip bioreaktorja z bakterijami ''E. coli'', v katere so po sistemu biokock vnesli gene cianobakterij za fiksiranje ogljika iz zraka. V bioreaktor so dovajali rastno gojišče s ksilozo kot edinim virom organskega ogljika in CO2 iz jeklenke, pripravljene s tehnologijo zajema in shranjevanja CO2 v industrijskem obratu. Bakterije so privzele CO2 iz zraka in ga pretvorile do piruvata, tega pa bi lahko v nadaljnjih procesih uporabili za pripravo raznih uporabnih spojin (npr. glutamina). Napravo so opremili tudi s senzorji za spremljanje stanja procesa in razvili aplikacijo za enostaven dostop do teh podatkov. Glede dizajna so se posvetovali s strokovnjaki iz tega področja in s končnimi uporabniki v industriji ter skušali upoštevati njihove nasvete in pripraviti učinkovit, varen, čim bolj donosen in cenovno ugoden sistem za pomoč pri zmanjševanju izpustov CO2 v industriji [1].

==='''Priprava ''E.coli'', ki fiksira CO2 '''===

Za pripravo CO2-fiksirajoče ''E.coli'' so konstruirali biokocke z geni za izražanje fosforibulokinaze (PRK), ogljikove anhidraze (CA) in ribuloza-1,5-bisfosfat karboksilaze/oksigenaze (Rubisco). Geni izvirajo iz dveh sevov cianobakterij - ''Synechococcus elongatus'' PCC 7942 in PCC 7002. Zanje so se odločili, ker so v literaturi zasledili, da so se že izkazali kot uspešni za ta namen <ref>Gong F, Liu G, Zhai X, s sod. ''Quantitative analysis of an engineered CO2-fixing Escherichia coli reveals great potential of heterotrophic CO2 fixation.'' Biotechnology for Biofuels 2015;8(1):86.</ref>. Prvi dve biokocki so vstavili v vektor pSB3K3, tretjo pa v pSB1C3 in bakterije kotransformirali z vektorjema. Tako so v ''E.coli'' omogočili potek Calvinovega cikla, ki je ena najpomembnejših poti za fiksiranje ogljika v naravi. Kot šasijo so preizkusili 3 seve ''E.coli'' - BL21 (DE3), W3110, W3110 (L5T7). Odločili so se za uporabo ''E.coli'' BL21 (DE3), ki je dobro rastla ob pogojih v bioreaktorju in se je po vnosu genov za fiksiranje ogljika izkazala kot najsposobnejša izrabe CO2. Prednost ''E.coli'' pred rastlinami, algami in cianobakterijami je, da raste hitreje in bolj robustno, ne potrebuje svetlobe in zato uspešnost gojenja ni odvisna od vremena ter zahteva manjše površine za gojenje [1], [4].

==='''Potek nove presnovne poti v ''E.coli'' '''===

Pripravljene bakterije najprej prek lastne, pentoza-fosfatne poti presnovijo ksilozo iz rastnega gojišča v ribulozo-5-fosfat (Ru5P), ki jo nato z rekombinantnim encimom PRK fosforilirajo do ribuloze-1,5-bisfosfata (RuBP). Sledi karboksilacija RuBP s CO2 iz zraka, s pomočjo rekombinantnega encima Rubisco, pri čemer nastane 3-fosfoglicerat (3-PGA), ki se pretvori v piruvat. Piruvat je multifunkcionalen intermediat različnih anabolnih poti [1].

Pomembno vlogo pri fiksaciji ogljika ima tudi encim CA, ki s pretvarjanjem CO2 v ogljikovo kislino oz. HCO3-, poveča difuzijo plina v celice. Tako imajo bakterije na razpolago več CO2 za fiksiranje, kar je pomembno predvsem zato, ker CO2 tekmuje s kisikom za vezavo na Rubisco. Kljub temu, da ima ''E.coli'' lastno CA, so vanje vstavili še CA cianobakterij, ki je sposobna hitrejše katalize [1], [4].

==='''Učinkovitost izrabe CO2 v ''E.coli'' '''===
Glavni presnovni poti ksiloze v divjem tipu ''E.coli'' sta pentoza-fosfatna pot in glikoliza, v rekombinantni ''E.coli'' pa poleg teh originalnih poti poteka v manjši meri še 'obvozna pot oz. obvoznica CO2' (ang. ''CO2 bypass pathway''). Študenti so razvili matematični model za napoved pretoka ogljika prek ene in druge poti. Obe poti se zaključita z nastankom piruvata, ki vstopa v Krebsov cikel, zato so tudi tega vključili v model presnove ksiloze. S pripravljenim modelom so napovedali količino nastale biomase ''E.coli'' ob pogojih v bioreaktorju oziroma vpliv prisotnosti alternativne presnovne poti ksiloze na rast bakterij. Pravilnost modela so preverili eksperimentalno in pokazali, da lahko z njegovo pomočjo uspešno napovejo obnašanje sistema. S tem so prihranili čas in denar, saj so lahko z uporabo modela v laboratoriju delali bolj usmerjeno. Med drugim so z modelom pokazali, da lahko količino nastalega piruvata spremljajo prek meritev optične gostote (O.D.600) suspenzije bakterij in si s tem olajšali eksperimentalno delo. Ugotovili so, da možnost izrabe CO2 vpliva na rast bakterij, saj so rekombinantne bakterije v atmosferi s 5% CO2 proizvedle več piruvata oziroma so v istem času dosegle višjo O.D.600 kakor v atmosferi brez dodanega CO2 [1].

Za vrednotenje učinkovitosti izrabe obvozne poti CO2 so uvedli indeks izrabe ksiloze (XUI, ang. ''xylose utilisation index'') – hiter, enostaven in uporaben način za oceno sposobnosti bakterij za fiksiranje ogljika, prek meritev O.D.600 celične kulture. XUI omogoča dokaz sposobnosti izrabe CO2 in primerjavo med sevi ''E.coli'' in različnimi pogoji v bioreaktorju. Za opredelitev XUI so naredili 2 predpostavki – da O.D.600 korelira s suho maso bakterij, kar so tudi eksperimentalno dokazali in da je delež ogljika v celici ''E.coli'' stalen oz. se spreminja v ozkem intervalu, kar lahko zanemarimo. Iz tega sledi, da je količina ogljika pri dani O.D.600 stalna in lahko privzamemo, da je izmerjena vrednost O.D.600 ekvivalentna masi ogljika v celicah. XUI je definiran kot razmerje med porabo ksiloze in O.D.600. Divji tip ''E.coli'' lahko v bioreaktorju kot vir ogljika v glavnem izrablja le ksilozo, torej bo v tem primeru XUI visok. Rekombinantna ''E.coli'' pa lahko izrablja tudi CO2, zato porabi manj ksiloze za rast do iste O.D.600 in je njen XUI nižji. S primerjavo XUI so izbrali najučinkovitejši sev za fiksiranje ogljika, ''E.coli'' BL21 (DE3) in optimizirali rastne pogoje v bioreaktorju. Najnižje XUI so določili pri uporabi gojišča M9 brez glukoze in z 0,4% ksiloze ter v atmosferi s 5% CO2. Za določitev hitrosti fiksiranja ogljika so uporabili pravilo o ohranitvi mase, po postopku opisanem v literaturi [4]. Določili so, da je pripravljen sinteznobiološki sistem sposoben fiksirati ogljik s hitrostjo 0,575 mg/L/h in da v biomasi rekombinantne ''E.coli'' 9,1% ogljika izvira iz CO2 [1], [4].

==='''Oblikovanje bioreaktorja'''===

Študenti so pripravili prototip bioreaktorja, ki črpa CO2 in zaznava njegovo koncentracijo, meri temperaturo in pH gojišča ter podatke pošilja v oblak. Sestavljajo ga wi-fi vmesnik, črpalka CO2, zalogovnik za gojišče, predel za gojenje bakterij z magnetnim mešalom, odpad in tri merilni sistemi – termometer, senzor CO2, pH meter in sinteznobiološki sistem za zaznavo spremembe pH. Slednji je bil stranski projekt tekmovalne skupine. Pripravili so ''E.coli'', ki se odziva na spremembo pH gojišča, tako da v nevtralnem pH izraža GFP, v kislem pa sfGFP. Posledično se ob zakisanju gojišča njegova barva spremeni iz rumene v zeleno. Kot osnovo so uporabili že obstoječe biokocke iz registra bioloških delov, s pH-občutljivimi promotorji in jih optimizirali za višji nivo izražanja [1].

==='''Programska oprema bioreaktorja'''===

Izdelali so program za spremljanje pogojev bioreaktorja v realnem času in aplikacijo, s katero lahko uporabnik kadarkoli prek wi-fija preveril stanje oz. napredek bioreaktorja [1].

==='''Biovarnost'''===
Uporabljen sev BL21 (DE3) ni patogen za človeka, zato ni nevarnosti okužb ob morebitnem izpustu. Tudi vanj vneseni geni izvirajo iz človeku nenevarnih organizmov. Poleg tega so na bioreaktor namestili filtre in s testom potrdili, da uspešno preprečujejo izpust GSO v okolje. Načrtovali so tudi povezavo bioreaktorja s sistemom za uporabo odvečne toplote v industriji, s pomočjo katerega bi lahko sterilizirali odpadno gojišče [1].

==ZAKLJUČEK==
Ekipa je razvila sinteznobiološki sistem za zmanjšanje izpustov CO2, ostaja pa veliko možnosti za izboljšave, ki bi naredile sistem bolj učinkovit in privlačen za industrijo. V ta namen so se povezali z iGEM ekipo UESTC-China, ki je razvila sistem za predelavo slame v biogorivo, pri katerem nastaja ksiloza kot stranski produkt <ref>iGEM 2018 Team UESTC-China. ''Straw-degrading Energy E.coli.'' Dostopno na: http://2018.igem.org/Team:UESTC-China [pridobljeno 15.12.2018].</ref>. Z umestitvijo bioreaktorja za fiksiranje ogljika navzdol od procesa predelave slame, bi bistveno znižali svoj ogljični odtis in se izognili nabavi velikih količin ksiloze, potrebne za delovanje bioreaktorja. Lahko bi tudi razvili sistem, ki za izrabo CO2 ne potrebuje sladkorja [4], <ref>Antonovsky N, Gleizer S, Noor E, s sod. ''Sugar Synthesis from CO2 in Escherichia coli.'' Cell 2016;166(1):115–25.</ref>. Z uvedbo procesa predelave piruvata v glutamin, bi industrijskemu obratu omogočili dodaten vir zaslužka. Za pospešitev fiksiranja ogljika bi lahko ''E.coli'' gojili v anaerobnih pogojih, kar je zahtevno, a poviša učinkovitost Rubisco, zaradi odsotnosti kisika, ki s CO2 tekmuje za vezavo nanj ali pa bi poiskali alternativo temu encimu <ref>Bar-Even A, Noor E, Lewis NE, Milo R. ''Design and analysis of synthetic carbon fixation pathways.'' PNAS 2010;107(19):8889–94.</ref>.

==VIRI==

<references/>

Of CO2urse - sistem za zmanjševanje izpustov ogljikovega dioksida v industriji

2018-12-17T18:48:37Z

Kity Požek:

Of CO2urse je projekt študentske ekipe 'NCKU Tainan' iz Tajvana, ki je bil nagrajen kot najboljši okoljski projekt na tekmovanju iz sintezne biologije, iGEM 2018. Namen projekta je s pristopi sintezne biologije prispevati k oblikovanju nizkoogljične družbe <ref>iGEM 2018 Team NCKU Tainan. ''Of CO2urse.'' Dostopno na: http://2018.igem.org/Team:NCKU_Tainan [pridobljeno 13.12.2018].</ref>.

==UVOD==
Globalno segrevanje je danes eden največjih okoljskih problemov in med najpomembnejšimi vzroki za učinek tople grede je pretiran izpust ogljikovega dioksida (CO2) v ozračje. Za izpust so v glavnem odgovorne človeške dejavnosti, kot so transport, proizvodnja električne energije in industrija, zaradi katerih se koncentracija tega toplogrednega plina v zraku izrazito povišuje vse od industrijske revolucije dalje. S hkratnim pretiranim izpustom CO2 in krčenjem naravnih ponorov CO2, kot so npr. gozdovi, se ruši naravni cikel ogljika, na kar kaže tudi dejstvo, da se je od leta 1960 do leta 2018 koncentracija CO2 v ozračju dvignila iz 320 ppm na več kot 400 ppm <ref>ProOxygen. ''CO2 Acceleration.'' Dostopno na: https://www.co2.earth/co2-acceleration [pridobljeno 13.12.2018].</ref>, <ref>US EPA. ''Overview of Greenhouse Gases.'' Dostopno na: https://www.epa.gov/ghgemissions/overview-greenhouse-gases [pridobljeno 13.12.2018].</ref>. Učinek tople grede ima za planet že vidne in zaskrbljujoče posledice, kot je npr. taljenje polarnega ledu, posledično dvigovanje gladine morja in manjšanje primernih površin ter pogojev za preživetje obstoječih vrst, višanje temperature morja in s tem rušenje morskega ekosistema itd. Pri obvladovanju izpustov CO2 med drugim pripomorejo raziskave, usmerjene v razvoj načinov za nadzor izpustov in za privzem CO2 iz ozračja. iGEM ekipa iz Tajvana si je v ta namen zamislila projekt, v sklopu katerega so pripravili sinteznobiološki sistem, ki bi lahko v industrijskih obratih asimiliral nastali CO2 [1].

==PRISTOP IN IZVEDBA PROJEKTA==
==='''Of CO2urse'''===
Študenti so pripravili prototip bioreaktorja z bakterijami ''E. coli'', v katere so po sistemu biokock vnesli gene cianobakterij za fiksiranje ogljika iz zraka. V bioreaktor so dovajali rastno gojišče s ksilozo kot edinim virom organskega ogljika in CO2 iz jeklenke, pripravljene s tehnologijo zajema in shranjevanja CO2 v industrijskem obratu. Bakterije so privzele CO2 iz zraka in ga pretvorile do piruvata, tega pa bi lahko v nadaljnjih procesih uporabili za pripravo raznih uporabnih spojin (npr. glutamina). Napravo so opremili tudi s senzorji za spremljanje stanja procesa in razvili aplikacijo za enostaven dostop do teh podatkov. Glede dizajna so se posvetovali s strokovnjaki iz tega področja in s končnimi uporabniki v industriji ter skušali upoštevati njihove nasvete in pripraviti učinkovit, varen, čim bolj donosen in cenovno ugoden sistem za pomoč pri zmanjševanju izpustov CO2 v industriji [1].

==='''Priprava ''E.coli'', ki fiksira CO2 '''===

Za pripravo CO2-fiksirajoče ''E.coli'' so konstruirali biokocke z geni za izražanje fosforibulokinaze (PRK), ogljikove anhidraze (CA) in ribuloza-1,5-bisfosfat karboksilaze/oksigenaze (Rubisco). Geni izvirajo iz dveh sevov cianobakterij - ''Synechococcus elongatus'' PCC 7942 in PCC 7002. Zanje so se odločili, ker so v literaturi zasledili, da so se že izkazali kot uspešni za ta namen <ref>Gong F, Liu G, Zhai X, s sod. ''Quantitative analysis of an engineered CO2-fixing Escherichia coli reveals great potential of heterotrophic CO2 fixation.'' Biotechnology for Biofuels 2015;8(1):86.</ref>. Prvi dve biokocki so vstavili v vektor pSB3K3, tretjo pa v pSB1C3 in bakterije kotransformirali z vektorjema. Tako so v ''E.coli'' omogočili potek Calvinovega cikla, ki je ena najpomembnejših poti za fiksiranje ogljika v naravi. Kot šasijo so preizkusili 3 seve ''E.coli'' - BL21 (DE3), W3110, W3110 (L5T7). Odločili so se za uporabo ''E.coli'' BL21 (DE3), ki je dobro rastla ob pogojih v bioreaktorju in se je po vnosu genov za fiksiranje ogljika izkazala kot najsposobnejša izrabe CO2. Prednost ''E.coli'' pred rastlinami, algami in cianobakterijami je, da raste hitreje in bolj robustno, ne potrebuje svetlobe in zato uspešnost gojenja ni odvisna od vremena ter zahteva manjše površine za gojenje [1], [4].

==='''Potek nove presnovne poti v ''E.coli'' '''===

Pripravljene bakterije najprej prek lastne, pentoza-fosfatne poti presnovijo ksilozo iz rastnega gojišča v ribulozo-5-fosfat (Ru5P), ki jo nato z rekombinantnim encimom PRK fosforilirajo do ribuloze-1,5-bisfosfata (RuBP). Sledi karboksilacija RuBP s CO2 iz zraka, s pomočjo rekombinantnega encima Rubisco, pri čemer nastane 3-fosfoglicerat (3-PGA), ki se pretvori v piruvat. Piruvat je multifunkcionalen intermediat različnih anabolnih poti [1].

Pomembno vlogo pri fiksaciji ogljika ima tudi encim CA, ki s pretvarjanjem CO2 v ogljikovo kislino oz. HCO3-, poveča difuzijo plina v celice. Tako imajo bakterije na razpolago več CO2 za fiksiranje, kar je pomembno predvsem zato, ker CO2 tekmuje s kisikom za vezavo na Rubisco. Kljub temu, da ima ''E.coli'' lastno CA, so vanje vstavili še CA cianobakterij, ki je sposobna hitrejše katalize [1], [4].

==='''Učinkovitost izrabe CO2 v ''E.coli'' '''===
Glavni presnovni poti ksiloze v divjem tipu ''E.coli'' sta pentoza-fosfatna pot in glikoliza, v rekombinantni ''E.coli'' pa poleg teh originalnih poti poteka v manjši meri še 'obvozna pot oz. obvoznica CO2' (ang. ''CO2 bypass pathway''). Študenti so razvili matematični model za napoved pretoka ogljika prek ene in druge poti. Obe poti se zaključita z nastankom piruvata, ki vstopa v Krebsov cikel, zato so tudi tega vključili v model presnove ksiloze. S pripravljenim modelom so napovedali količino nastale biomase ''E.coli'' ob pogojih v bioreaktorju oziroma vpliv prisotnosti alternativne presnovne poti ksiloze na rast bakterij. Pravilnost modela so preverili eksperimentalno in pokazali, da lahko z njegovo pomočjo uspešno napovejo obnašanje sistema. S tem so prihranili čas in denar, saj so lahko z uporabo modela v laboratoriju delali bolj usmerjeno. Med drugim so z modelom pokazali, da lahko količino nastalega piruvata spremljajo prek meritev optične gostote (O.D.600) suspenzije bakterij in si s tem olajšali eksperimentalno delo. Ugotovili so, da možnost izrabe CO2 vpliva na rast bakterij, saj so rekombinantne bakterije v atmosferi s 5% CO2 proizvedle več piruvata oziroma so v istem času dosegle višjo O.D.600 kakor v atmosferi brez dodanega CO2 [1].

Za vrednotenje učinkovitosti izrabe obvozne poti CO2 so uvedli indeks izrabe ksiloze (XUI, ang. ''xylose utilisation index'') – hiter, enostaven in uporaben način za oceno sposobnosti bakterij za fiksiranje ogljika, prek meritev O.D.600 celične kulture. XUI omogoča dokaz sposobnosti izrabe CO2 in primerjavo med sevi ''E.coli'' in različnimi pogoji v bioreaktorju. Za opredelitev XUI so naredili 2 predpostavki – da O.D.600 korelira s suho maso bakterij, kar so tudi eksperimentalno dokazali in da je delež ogljika v celici ''E.coli'' stalen oz. se spreminja v ozkem intervalu, kar lahko zanemarimo. Iz tega sledi, da je količina ogljika pri dani O.D.600 fiksna in lahko privzamemo, da je izmerjena vrednost O.D.600 ekvivalentna masi ogljika v celicah. XUI je definiran kot razmerje med porabo ksiloze in O.D.600. Divji tip ''E.coli'' lahko v bioreaktorju kot vir ogljika v glavnem izrablja le ksilozo, torej bo v tem primeru XUI visok. Rekombinantna ''E.coli'' pa lahko izrablja tudi CO2, zato porabi manj ksiloze za rast do iste O.D.600 in je njen XUI nižji. S primerjavo XUI so izbrali najučinkovitejši sev za fiksiranje ogljika, ''E.coli'' BL21 (DE3) in optimizirali rastne pogoje v bioreaktorju. Najnižje XUI so določili pri uporabi gojišča M9 brez glukoze in z 0,4% ksiloze ter v atmosferi s 5% CO2. Za določitev hitrosti fiksiranja ogljika so uporabili pravilo o ohranitvi mase, po postopku opisanem v literaturi [4]. Določili so, da je pripravljen sinteznobiološki sistem sposoben fiksirati ogljik s hitrostjo 0,575 mg/L/h in da v biomasi rekombinantne ''E.coli'' 9,1% ogljika izvira iz CO2 [1], [4].

==='''Oblikovanje bioreaktorja'''===

Študenti so pripravili prototip bioreaktorja, ki črpa CO2 in zaznava njegovo koncentracijo, meri temperaturo in pH gojišča ter podatke pošilja v oblak. Sestavljajo ga wi-fi vmesnik, črpalka CO2, zalogovnik za gojišče, predel za gojenje bakterij z magnetnim mešalom, odpad in tri merilni sistemi – termometer, senzor CO2, pH meter in sinteznobiološki sistem za zaznavo spremembe pH. Slednji je bil stranski projekt tekmovalne skupine. Pripravili so ''E.coli'', ki se odziva na spremembo pH gojišča, tako da v nevtralnem pH izraža GFP, v kislem pa sfGFP. Posledično se ob zakisanju gojišča njegova barva spremeni iz rumene v zeleno. Kot osnovo so uporabili že obstoječe biokocke iz registra bioloških delov, s pH-občutljivimi promotorji in jih optimizirali za višji nivo izražanja [1].

==='''Programska oprema bioreaktorja'''===

Izdelali so program za spremljanje pogojev bioreaktorja v realnem času in aplikacijo, s katero lahko uporabnik kadarkoli prek wi-fija preveril stanje oz. napredek bioreaktorja [1].

==='''Biovarnost'''===
Uporabljen sev BL21 (DE3) ni patogen za človeka, zato ni nevarnosti okužb ob morebitnem izpustu. Tudi vanj vneseni geni izvirajo iz človeku nenevarnih organizmov. Poleg tega so na bioreaktor namestili filtre in s testom potrdili, da uspešno preprečujejo izpust GSO v okolje. Načrtovali so tudi povezavo bioreaktorja s sistemom za uporabo odvečne toplote v industriji, s pomočjo katerega bi lahko sterilizirali odpadno gojišče [1].

==ZAKLJUČEK==
Ekipa je razvila sinteznobiološki sistem za zmanjšanje izpustov CO2, ostaja pa veliko možnosti za izboljšave, ki bi naredile sistem bolj učinkovit in privlačen za industrijo. V ta namen so se povezali z iGEM ekipo UESTC-China, ki je razvila sistem za predelavo slame v biogorivo, pri katerem nastaja ksiloza kot stranski produkt <ref>iGEM 2018 Team UESTC-China. ''Straw-degrading Energy E.coli.'' Dostopno na: http://2018.igem.org/Team:UESTC-China [pridobljeno 15.12.2018].</ref>. Z umestitvijo bioreaktorja za fiksiranje ogljika navzdol od procesa predelave slame, bi bistveno znižali svoj ogljični odtis in se izognili nabavi velikih količin ksiloze, potrebne za delovanje bioreaktorja. Lahko bi tudi razvili sistem, ki za izrabo CO2 ne potrebuje sladkorja [4], <ref>Antonovsky N, Gleizer S, Noor E, s sod. ''Sugar Synthesis from CO2 in Escherichia coli.'' Cell 2016;166(1):115–25.</ref>. Z uvedbo procesa predelave piruvata v glutamin, bi industrijskemu obratu omogočili dodaten vir zaslužka. Za pospešitev fiksiranja ogljika bi lahko ''E.coli'' gojili v anaerobnih pogojih, kar je zahtevno, a poviša učinkovitost Rubisco, zaradi odsotnosti kisika, ki s CO2 tekmuje za vezavo nanj ali pa bi poiskali alternativo temu encimu <ref>Bar-Even A, Noor E, Lewis NE, Milo R. ''Design and analysis of synthetic carbon fixation pathways.'' PNAS 2010;107(19):8889–94.</ref>.

==VIRI==

<references/>

Of CO2urse - sistem za zmanjševanje izpustov ogljikovega dioksida v industriji

2018-12-17T17:58:31Z

Kity Požek:

Of CO2urse je projekt študentske ekipe 'NCKU Tainan' iz Tajvana, ki je bil nagrajen kot najboljši okoljski projekt na tekmovanju iz sintezne biologije, iGEM 2018. Namen projekta je s pristopi sintezne biologije prispevati k oblikovanju nizkoogljične družbe <ref>iGEM 2018 Team NCKU Tainan. ''Of CO2urse.'' Dostopno na: http://2018.igem.org/Team:NCKU_Tainan [pridobljeno 13.12.2018].</ref>.

==UVOD==
Globalno segrevanje je danes eden največjih okoljskih problemov in med najpomembnejšimi vzroki za učinek tople grede je pretiran izpust ogljikovega dioksida (CO2) v ozračje. Za izpust so v glavnem odgovorne človeške dejavnosti, kot so transport, proizvodnja električne energije in industrija, zaradi katerih se koncentracija tega toplogrednega plina v zraku izrazito povišuje vse od industrijske revolucije dalje. S hkratnim pretiranim izpustom CO2 in krčenjem naravnih ponorov CO2, kot so npr. gozdovi, se ruši naravni cikel ogljika, na kar kaže tudi dejstvo, da se je od leta 1960 do leta 2018 koncentracija CO2 v ozračju dvignila iz 320 ppm na več kot 400 ppm <ref>ProOxygen. ''CO2 Acceleration.'' Dostopno na: https://www.co2.earth/co2-acceleration [pridobljeno 13.12.2018].</ref>, <ref>US EPA. ''Overview of Greenhouse Gases.'' Dostopno na: https://www.epa.gov/ghgemissions/overview-greenhouse-gases [pridobljeno 13.12.2018].</ref>. Učinek tople grede ima za planet že vidne in zaskrbljujoče posledice, kot je npr. taljenje polarnega ledu, posledično dvigovanje gladine morja in manjšanje primernih površin ter pogojev za preživetje obstoječih vrst, višanje temperature morja in s tem rušenje morskega ekosistema itd. Pri obvladovanju izpustov CO2 med drugim pripomorejo raziskave, usmerjene v razvoj načinov za nadzor izpustov in za privzem CO2 iz ozračja. iGEM ekipa iz Tajvana si je v ta namen zamislila projekt, v sklopu katerega so pripravili sintezno biološki sistem, ki bi lahko v industrijskih obratih asimiliral nastali CO2 [1].

==PRISTOP IN IZVEDBA PROJEKTA==
==='''Of CO2urse'''===
Študenti so pripravili prototip bioreaktorja z bakterijami ''E. coli'', v katere so po sistemu biokock vnesli gene cianobakterij za fiksiranje ogljika iz zraka. V bioreaktor so dovajali rastno gojišče s ksilozo kot edinim virom organskega ogljika in CO2 iz jeklenke, pripravljene s tehnologijo zajema in shranjevanja CO2 v industrijskem obratu. Bakterije so privzele CO2 iz zraka in ga pretvorile do piruvata, tega pa bi lahko v nadaljnjih procesih uporabili za pripravo raznih uporabnih spojin (npr. glutamina). Napravo so opremili tudi s senzorji za spremljanje stanja procesa in razvili aplikacijo za enostaven dostop do teh podatkov. Glede dizajna so se posvetovali s strokovnjaki iz tega področja in s končnimi uporabniki v industriji ter skušali upoštevati njihove nasvete in pripraviti učinkovit, varen, čim bolj donosen in cenovno ugoden sistem za pomoč pri zmanjševanju izpustov CO2 v industriji [1].

==='''Priprava ''E.coli'', ki fiksira CO2 '''===

Za pripravo CO2-fiksirajoče ''E.coli'' so konstruirali biokocke z geni za izražanje fosforibulokinaze (PRK), ogljikove anhidraze (CA) in ribuloza-1,5-bisfosfat karboksilaze/oksigenaze (Rubisco). Geni izvirajo iz dveh sevov cianobakterij - ''Synechococcus elongatus'' PCC 7942 in PCC 7002. Zanje so se odločili, ker so v literaturi zasledili, da so se že izkazali kot uspešni za ta namen <ref>Gong F, Liu G, Zhai X, s sod. ''Quantitative analysis of an engineered CO2-fixing Escherichia coli reveals great potential of heterotrophic CO2 fixation.'' Biotechnology for Biofuels 2015;8(1):86.</ref>. Prvi dve biokocki so vstavili v vektor pSB3K3, tretjo pa v pSB1C3 in bakterije kotransformirali z vektorjema. Tako so v ''E.coli'' omogočili potek Calvinovega cikla, ki je ena najpomembnejših poti za fiksiranje ogljika v naravi. Kot šasijo so preizkusili 3 seve ''E.coli'' - BL21 (DE3), W3110, W3110 (L5T7). Odločili so se za uporabo ''E.coli'' BL21 (DE3), ki je dobro rastla ob pogojih v bioreaktorju in se je po vnosu genov za fiksiranje ogljika izkazala kot najsposobnejša izrabe CO2. Prednost ''E.coli'' pred rastlinami, algami in cianobakterijami je, da raste hitreje in bolj robustno, ne potrebuje svetlobe in zato uspešnost gojenja ni odvisna od vremena ter zahteva manjše površine za gojenje [1], [4].

==='''Potek nove presnovne poti v ''E.coli'' '''===

Pripravljene bakterije najprej prek lastne, pentoza-fosfatne poti presnovijo ksilozo iz rastnega gojišča v ribulozo-5-fosfat (Ru5P), ki jo nato z rekombinantnim encimom PRK fosforilirajo do ribuloze-1,5-bisfosfata (RuBP). Sledi karboksilacija RuBP s CO2 iz zraka, s pomočjo rekombinantnega encima Rubisco, pri čemer nastane 3-fosfoglicerat (3-PGA), ki se pretvori v piruvat. Piruvat je multifunkcionalen intermediat različnih anabolnih poti [1].

Pomembno vlogo pri fiksaciji ogljika ima tudi encim CA, ki s pretvarjanjem CO2 v ogljikovo kislino oz. HCO3-, poveča difuzijo plina v celice. Tako imajo bakterije na razpolago več CO2 za fiksiranje, kar je pomembno predvsem zato, ker CO2 tekmuje s kisikom za vezavo na Rubisco. Kljub temu, da ima ''E.coli'' lastno CA, so vanje vstavili še CA cianobakterij, ki je sposobna hitrejše katalize [1], [4].

==='''Učinkovitost izrabe CO2 v ''E.coli'' '''===
Glavni presnovni poti ksiloze v divjem tipu ''E.coli'' sta pentoza-fosfatna pot in glikoliza, v rekombinantni ''E.coli'' pa poleg teh originalnih poti poteka v manjši meri še 'obvozna pot oz. obvoznica CO2' (ang. ''CO2 bypass pathway''). Študenti so razvili matematični model za napoved pretoka ogljika prek ene in druge poti. Obe poti se zaključita z nastankom piruvata, ki vstopa v Krebsov cikel, zato so tudi tega vključili v model presnove ksiloze. S pripravljenim modelom so napovedali količino nastale biomase ''E.coli'' ob pogojih v bioreaktorju oziroma vpliv prisotnosti alternativne presnovne poti ksiloze na rast bakterij. Pravilnost modela so preverili eksperimentalno in pokazali, da lahko z njegovo pomočjo uspešno napovejo obnašanje sistema. S tem so prihranili čas in denar, saj so lahko z uporabo modela v laboratoriju delali bolj usmerjeno. Med drugim so z modelom pokazali, da lahko količino nastalega piruvata spremljajo prek meritev optične gostote (O.D.600) suspenzije bakterij in si s tem olajšali eksperimentalno delo. Ugotovili so, da možnost izrabe CO2 vpliva na rast bakterij, saj so rekombinantne bakterije v atmosferi s 5% CO2 proizvedle več piruvata oziroma so v istem času dosegle višjo O.D.600 kakor v atmosferi brez dodanega CO2 [1].

Za vrednotenje učinkovitosti izrabe obvozne poti CO2 so uvedli indeks izrabe ksiloze (XUI, ang. ''xylose utilisation index'') – hiter, enostaven in uporaben način za oceno sposobnosti bakterij za fiksiranje ogljika, prek meritev O.D.600 celične kulture. XUI omogoča dokaz sposobnosti izrabe CO2 in primerjavo med sevi ''E.coli'' in različnimi pogoji v bioreaktorju. Za opredelitev XUI so naredili 2 predpostavki – da O.D.600 korelira s suho maso bakterij, kar so tudi eksperimentalno dokazali in da je delež ogljika v celici ''E.coli'' stalen oz. se spreminja v ozkem intervalu, kar lahko zanemarimo. Iz tega sledi, da je količina ogljika pri dani O.D.600 fiksna in lahko privzamemo, da je izmerjena vrednost O.D.600 ekvivalentna masi ogljika v celicah. XUI je definiran kot razmerje med porabo ksiloze in O.D.600. Divji tip ''E.coli'' lahko v bioreaktorju kot vir ogljika v glavnem izrablja le ksilozo, torej bo v tem primeru XUI visok. Rekombinantna ''E.coli'' pa lahko izrablja tudi CO2, zato porabi manj ksiloze za rast do iste O.D.600 in je njen XUI nižji. S primerjavo XUI so izbrali najučinkovitejši sev za fiksiranje ogljika, ''E.coli'' BL21 (DE3) in optimizirali rastne pogoje v bioreaktorju. Najnižje XUI so določili pri uporabi gojišča M9 brez glukoze in z 0,4% ksiloze ter v atmosferi s 5% CO2. Za določitev hitrosti fiksiranja ogljika so uporabili pravilo o ohranitvi mase, po postopku opisanem v literaturi [4]. Določili so, da je pripravljen sintezno biološki sistem sposoben fiksirati ogljik s hitrostjo 0,575 mg/L/h in da v biomasi rekombinantne ''E.coli'' 9,1% ogljika izvira iz CO2 [1], [4].

==='''Oblikovanje bioreaktorja'''===

Študenti so pripravili prototip bioreaktorja, ki črpa CO2 in zaznava njegovo koncentracijo, meri temperaturo in pH gojišča ter podatke pošilja v oblak. Sestavljajo ga wi-fi vmesnik, črpalka CO2, zalogovnik za gojišče, predel za gojenje bakterij z magnetnim mešalom, odpad in tri merilni sistemi – termometer, senzor CO2, pH meter in sintezno biološki sistem za zaznavo spremembe pH. Slednji je bil stranski projekt tekmovalne skupine. Pripravili so ''E.coli'', ki se odziva na spremembo pH gojišča, tako da v nevtralnem pH izraža GFP, v kislem pa sfGFP. Posledično se ob zakisanju gojišča njegova barva spremeni iz rumene v zeleno. Kot osnovo so uporabili že obstoječe biokocke iz registra bioloških delov, s pH-občutljivimi promotorji in jih optimizirali za višji nivo izražanja [1].

==='''Programska oprema bioreaktorja'''===

Izdelali so program za spremljanje pogojev bioreaktorja v realnem času in aplikacijo, s katero lahko uporabnik kadarkoli prek wi-fija preveril stanje oz. napredek bioreaktorja [1].

==='''Biovarnost'''===
Uporabljen sev BL21 (DE3) ni patogen za človeka, zato ni nevarnosti okužb ob morebitnem izpustu. Tudi vanj vneseni geni izvirajo iz človeku nenevarnih organizmov. Poleg tega so na bioreaktor namestili filtre in s testom potrdili, da uspešno preprečujejo izpust GSO v okolje. Načrtovali so tudi povezavo bioreaktorja s sistemom za uporabo odvečne toplote v industriji, s pomočjo katerega bi lahko sterilizirali odpadno gojišče [1].

==ZAKLJUČEK==
Ekipa je razvila sintezno biološki sistem za zmanjšanje izpustov CO2, ostaja pa veliko možnosti za izboljšave, ki bi naredile sistem bolj učinkovit in privlačen za industrijo. V ta namen so se povezali z iGEM ekipo UESTC-China, ki je razvila sistem za predelavo slame v biogorivo, pri katerem nastaja ksiloza kot stranski produkt <ref>iGEM 2018 Team UESTC-China. ''Straw-degrading Energy E.coli.'' Dostopno na: http://2018.igem.org/Team:UESTC-China [pridobljeno 15.12.2018].</ref>. Z umestitvijo bioreaktorja za fiksiranje ogljika navzdol od procesa predelave slame, bi bistveno znižali svoj ogljični odtis in se izognili nabavi velikih količin ksiloze, potrebne za delovanje bioreaktorja. Lahko bi tudi razvili sistem, ki za izrabo CO2 ne potrebuje sladkorja [4], <ref>Antonovsky N, Gleizer S, Noor E, s sod. ''Sugar Synthesis from CO2 in Escherichia coli.'' Cell 2016;166(1):115–25.</ref>. Z uvedbo procesa predelave piruvata v glutamin, bi industrijskemu obratu omogočili dodaten vir zaslužka. Za pospešitev fiksiranja ogljika bi lahko ''E.coli'' gojili v anaerobnih pogojih, kar je zahtevno, a poviša učinkovitost Rubisco, zaradi odsotnosti kisika, ki s CO2 tekmuje za vezavo nanj ali pa bi poiskali alternativo temu encimu <ref>Bar-Even A, Noor E, Lewis NE, Milo R. ''Design and analysis of synthetic carbon fixation pathways.'' PNAS 2010;107(19):8889–94.</ref>.

==VIRI==

<references/>

Seminarji SB 2018/19

2018-12-17T17:42:22Z

Kity Požek:

V študijskem letu 2018/19 študentje predstavljajo naslednje teme:

RAZISKOVALNI ČLANKI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) 

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/MoClo:_modularni_klonirni_sistem_za_standardizirano_sestavljanje_ve%C4%8Dgenskih_konstruktov MoClo: modularni klonirni sistem za standardizirano sestavljanje večgenskih konstruktov] (Valentina Levak)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/RNA-stikala_tipa_%C2%BBToehold%C2%AB:_de_novo_oblikovani_regulatorji_izra%C5%BEanja_genov RNA-stikala tipa Toehold: de novo oblikovani regulatorji izražanja genov] (Špela Malenšek)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Raznoliko_in_modelno_zasnovana_priprava_sinteti%C4%8Dnih_genskih_vezij_s_predvidenimi_lastnostmi Raznoliko in modelno zasnovana priprava sintetičnih genskih vezij s predvidenimi lastnostmi] (Matej Kolarič)

[[Dispersing biofilms with engineered enzymatic bacteriophage]] (Fran Krstanović)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Nekaj_pogledov_na_sistemsko_biologijo_kvasovke Nekaj pogledov na sistemsko biologijo kvasovke] (Gašper Žun)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Organizacija_znotrajceli%C4%8Dnih_reakcij_z_razumsko_na%C4%8Drtovanimi_RNA_sestavi#Na.C4.8Drtovanje_in_sestavljanje_RNA_sestavov Organizacija znotrajceličnih reakcij z razumsko načrtovanimi RNA sestavi] (Urška Jelenovec)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Biolo%C5%A1ko_vezje_na_osnovi_RNA-interference_za_identifikacijo_specifi%C4%8Dnih_rakavih_celic Biološko vezje na osnovi RNA-interference za identifikacijo specifičnih rakavih celic] (Gašper Marinšek)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Kontrola_hitrosti_translacije_preko_pomožnega_mesta_5’-UTR:_energijski_kompromis_med_dostopnostjo%2C_selektivnim_razvijanjem_RNA-struktur_in_drsenjem_30S_ribosomske_podenote_po_RNA-strukturah Kontrola hitrosti translacije preko pomožnega mesta 5’-UTR: energijski kompromis med dostopnostjo, selektivnim razvijanjem RNA-struktur in drsenjem 30S ribosomske podenote po RNA-strukturah] (Neža Koritnik)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Preoblikovanje_genskega_skupka_za_fiksacijo_dušika_bakterije_Klebsiella_oxytoca Preoblikovanje genskega skupka za fiksacijo dušika bakterije ''Klebsiella oxytoca''] (Gašper Virant)

NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.) 
[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Phactory:_proizvodnja_bakteriofagov_za_precizno_zdravljenje Phactory: proizvodnja bakteriofagov za precizno zdravljenje] (Rok Miklavčič)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Canditect:_hitra_detekcija_vaginalne_infekcije_s_Candido_albicans_z_uporabo_sistema_CRISPR/dCas9 Canditect – hitra detekcija vaginalne infekcije s Candido albicans z uporabo sistema CRISPR/dCas9] (Jerneja Ovčar)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/CAPOEIRA_-_razvoj_personaliziranega_cepiva_proti_raku_in_sistema_za_spremljanje_odziva_na_zdravljenje CAPOEIRA – razvoj personaliziranega cepiva proti raku in sistema za spremljanje odziva na zdravljenje] (Anamarija Habič)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Biotic_Blue_-_encimska_razgradnja_zdravilnih_u%C4%8Dinkovin_v_odpadnih_vodah#BIOTIC_BLUE BIOTIC BLUE - encimska razgradnja zdravilnih učinkovin v odpadnih vodah] (Tina Požun)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Of_CO2urse_-_sistem_za_zmanj%C5%A1evanje_izpustov_ogljikovega_dioksida_v_industriji Of CO2urse - sistem za zmanjševanje izpustov ogljikovega dioksida v industriji] (Kity Požek)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Cockroach_terminator Cockroach terminator]] (Roberta Mulac)

Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo razprava, ki praviloma ne bo daljša od 5 minut.

----

Razpored po datumih predstavitev (pri vsakem terminu je navedeno število možnih seminarjev; vpišite ime in priimek pri dnevu, ko želite predstaviti seminar ter dopišite naslov seminarja, ki naj bo povezan s povzetkom):

22.11. 
1 
2 Valentina Levak 

27.11. 
1 
2 
3 
4 

29.11. 
1 Matej Kolarič 
2 Špela Malenšek 
3 
4 

4.12. 
1 Gašper Žun 
2 Fran Krstanovic 
3 
4 

6.12. 
1 Urška Jelenovec 
2 Rok Miklavčič 
3 
4 

11.12. 
1 Jerneja Ovčar 
2 Neža Koritnik 
3 Gašper Virant 
4 Gašper Marinšek 

18.12. 
1 Tina Požun 
2 Anamarija Habič 
3 Roberta Mulac 
4 Kity Požek 

3.1. 
1 Urška Kašnik 
2 Nina Mavec 
3 Primož Tič 
4 Ernest Šprager 

8.1. 
1 Marija Atanasova 
2 Bine Tršavec 
3 Peter Pečan 
4 Tjaša Sorčan 

10.1. 
1 Špela Koren 
2 Natalija Pucihar 
3 Karmen Žbogar 
4 Uroš Zavrtanik 

15.1. 
1 Jerneja Kocutar 
2 Blaž Lebar 
3 Tadej Satler 
4 Miha Koprivnikar Krajnc 

17.1. 
1 Milena Stojkovska 
2

Of CO2urse - sistem za zmanjševanje izpustov ogljikovega dioksida v industriji

2018-12-17T17:41:11Z

Kity Požek:

Of CO2urse je projekt študentske ekipe 'NCKU Tainan' iz Tajvana, ki je bil nagrajen kot najboljši okoljski projekt na tekmovanju iz sintezne biologije, iGEM 2018. Namen projekta je s pristopi sintezne biologije prispevati k oblikovanju nizkoogljične družbe <ref>iGEM 2018 Team NCKU Tainan. ''Of CO2urse.'' Dostopno na: http://2018.igem.org/Team:NCKU_Tainan [pridobljeno 13.12.2018].</ref>.

==UVOD==
Globalno segrevanje je danes eden največjih okoljskih problemov in med najpomembnejšimi vzroki za učinek tople grede je pretiran izpust ogljikovega dioksida (CO2) v ozračje. Za izpust so v glavnem odgovorne človeške dejavnosti, kot so transport, proizvodnja električne energije in industrija, zaradi katerih se koncentracija tega toplogrednega plina v zraku izrazito povišuje vse od industrijske revolucije dalje. S hkratnim pretiranim izpustom CO2 in krčenjem naravnih ponorov CO2, kot so npr. gozdovi, se ruši naravni cikel ogljika, na kar kaže tudi dejstvo, da se je od leta 1960 do leta 2018 koncentracija CO2 v ozračju dvignila iz 320 ppm na več kot 400 ppm <ref>ProOxygen. ''CO2 Acceleration.'' Dostopno na: https://www.co2.earth/co2-acceleration [pridobljeno 13.12.2018].</ref>, <ref>US EPA. ''Overview of Greenhouse Gases.'' Dostopno na: https://www.epa.gov/ghgemissions/overview-greenhouse-gases [pridobljeno 13.12.2018].</ref>. Učinek tople grede ima za planet že vidne in zaskrbljujoče posledice, kot je npr. taljenje polarnega ledu, posledično dvigovanje gladine morja in manjšanje primernih površin ter pogojev za preživetje obstoječih vrst, višanje temperature morja in s tem rušenje morskega ekosistema itd. Pri obvladovanju izpustov CO2 med drugim pripomorejo raziskave, usmerjene v razvoj načinov za nadzor izpustov in za privzem CO2 iz ozračja. iGEM ekipa iz Tajvana si je v ta namen zamislila projekt, v sklopu katerega so pripravili sintezno biološki sistem, ki bi lahko v industrijskih obratih asimiliral nastali CO2 [1].

==PRISTOP IN IZVEDBA PROJEKTA==
==='''Of CO2urse'''===
Študenti so pripravili prototip bioreaktorja z bakterijami ''E. coli'', v katere so po sistemu biokock vnesli gene cianobakterij za fiksiranje ogljika iz zraka. V bioreaktor so dovajali rastno gojišče s ksilozo kot edinim virom organskega ogljika in CO2 iz jeklenke, pripravljene s tehnologijo zajema in shranjevanja CO2 v industrijskem obratu. Bakterije so privzele CO2 iz zraka in ga pretvorile do piruvata, tega pa bi lahko v nadaljnjih procesih uporabili za pripravo raznih uporabnih spojin (npr. glutamina). Napravo so opremili tudi s senzorji za spremljanje stanja procesa in razvili aplikacijo za enostaven dostop do teh podatkov. Glede dizajna so se posvetovali s strokovnjaki iz tega področja in s končnimi uporabniki v industriji ter skušali upoštevati njihove nasvete in pripraviti učinkovit, varen, čim bolj donosen in cenovno ugoden sistem za pomoč pri zmanjševanju izpustov CO2 v industriji [1].

==='''Priprava ''E.coli'', ki fiksira CO2 '''===

Za pripravo CO2-fiksirajoče ''E.coli'' so konstruirali biokocke z geni za izražanje fosforibulokinaze (PRK), ogljikove anhidraze (CA) in ribuloza-1,5-bisfosfat karboksilaze/oksigenaze (Rubisco). Geni izvirajo iz dveh sevov cianobakterij - ''Synechococcus elongatus'' PCC 7942 in PCC 7002. Zanje so se odločili, ker so v literaturi zasledili, da so se že izkazali kot uspešni za ta namen <ref>Gong F, Liu G, Zhai X, in dr. ''Quantitative analysis of an engineered CO2-fixing Escherichia coli reveals great potential of heterotrophic CO2 fixation.'' Biotechnology for Biofuels 2015;8(1):86.</ref>. Prvi dve biokocki so vstavili v vektor pSB3K3, tretjo pa v pSB1C3 in bakterije kotransformirali z vektorjema. Tako so v ''E.coli'' omogočili potek Calvinovega cikla, ki je ena najpomembnejših poti za fiksiranje ogljika v naravi. Kot šasijo so preizkusili 3 seve ''E.coli'' - BL21 (DE3), W3110, W3110 (L5T7). Odločili so se za uporabo ''E.coli'' BL21 (DE3), ki je dobro rastla ob pogojih v bioreaktorju in se je po vnosu genov za fiksiranje ogljika izkazala kot najsposobnejša izrabe CO2. Prednost ''E.coli'' pred rastlinami, algami in cianobakterijami je, da raste hitreje in bolj robustno, ne potrebuje svetlobe in zato uspešnost gojenja ni odvisna od vremena ter zahteva manjše površine za gojenje [1], [4].

==='''Potek nove presnovne poti v ''E.coli'' '''===

Pripravljene bakterije najprej prek lastne, pentoza-fosfatne poti presnovijo ksilozo iz rastnega gojišča v ribulozo-5-fosfat (Ru5P), ki jo nato z rekombinantnim encimom PRK fosforilirajo do ribuloze-1,5-bisfosfata (RuBP). Sledi karboksilacija RuBP s CO2 iz zraka, s pomočjo rekombinantnega encima Rubisco, pri čemer nastane 3-fosfoglicerat (3-PGA), ki se pretvori v piruvat. Piruvat je multifunkcionalen intermediat različnih anabolnih poti [1].

Pomembno vlogo pri fiksaciji ogljika ima tudi encim CA, ki s pretvarjanjem CO2 v ogljikovo kislino oz. HCO3-, poveča difuzijo plina v celice. Tako imajo bakterije na razpolago več CO2 za fiksiranje, kar je pomembno predvsem zato, ker CO2 tekmuje s kisikom za vezavo na Rubisco. Kljub temu, da ima ''E.coli'' lastno CA, so vanje vstavili še CA cianobakterij, ki je sposobna hitrejše katalize [1], [4].

==='''Učinkovitost izrabe CO2 v ''E.coli'' '''===
Glavni presnovni poti ksiloze v divjem tipu ''E.coli'' sta pentoza-fosfatna pot in glikoliza, v rekombinantni ''E.coli'' pa poleg teh originalnih poti poteka v manjši meri še 'obvozna pot oz. obvoznica CO2' (ang. ''CO2 bypass pathway''). Študenti so razvili matematični model za napoved pretoka ogljika prek ene in druge poti. Obe poti se zaključita z nastankom piruvata, ki vstopa v Krebsov cikel, zato so tudi tega vključili v model presnove ksiloze. S pripravljenim modelom so napovedali količino nastale biomase ''E.coli'' ob pogojih v bioreaktorju oziroma vpliv prisotnosti alternativne presnovne poti ksiloze na rast bakterij. Pravilnost modela so preverili eksperimentalno in pokazali, da lahko z njegovo pomočjo uspešno napovejo obnašanje sistema. S tem so prihranili čas in denar, saj so lahko z uporabo modela v laboratoriju delali bolj usmerjeno. Med drugim so z modelom pokazali, da lahko količino nastalega piruvata spremljajo prek meritev optične gostote (O.D.600) suspenzije bakterij in si s tem olajšali eksperimentalno delo. Ugotovili so, da možnost izrabe CO2 vpliva na rast bakterij, saj so rekombinantne bakterije v atmosferi s 5% CO2 proizvedle več piruvata oziroma so v istem času dosegle višjo O.D.600 kakor v atmosferi brez dodanega CO2 [1].

Za vrednotenje učinkovitosti izrabe obvozne poti CO2 so uvedli indeks izrabe ksiloze (XUI, ang. ''xylose utilisation index'') – hiter, enostaven in uporaben način za oceno sposobnosti bakterij za fiksiranje ogljika, prek meritev O.D.600 celične kulture. XUI omogoča dokaz sposobnosti izrabe CO2 in primerjavo med sevi ''E.coli'' in različnimi pogoji v bioreaktorju. Za opredelitev XUI so naredili 2 predpostavki – da O.D.600 korelira s suho maso bakterij, kar so tudi eksperimentalno dokazali in da je delež ogljika v celici ''E.coli'' stalen oz. se spreminja v ozkem intervalu, kar lahko zanemarimo. Iz tega sledi, da je količina ogljika pri dani O.D.600 fiksna in lahko privzamemo, da je izmerjena vrednost O.D.600 ekvivalentna masi ogljika v celicah. XUI je definiran kot razmerje med porabo ksiloze in O.D.600. Divji tip ''E.coli'' lahko v bioreaktorju kot vir ogljika v glavnem izrablja le ksilozo, torej bo v tem primeru XUI visok. Rekombinantna ''E.coli'' pa lahko izrablja tudi CO2, zato porabi manj ksiloze za rast do iste O.D.600 in je njen XUI nižji. S primerjavo XUI so izbrali najučinkovitejši sev za fiksiranje ogljika, ''E.coli'' BL21 (DE3) in optimizirali rastne pogoje v bioreaktorju. Najnižje XUI so določili pri uporabi gojišča M9 brez glukoze in z 0,4% ksiloze ter v atmosferi s 5% CO2. Za določitev hitrosti fiksiranja ogljika so uporabili pravilo o ohranitvi mase, po postopku opisanem v literaturi [4]. Določili so, da je pripravljen sintezno biološki sistem sposoben fiksirati ogljik s hitrostjo 0,575 mg/L/h in da v biomasi rekombinantne ''E.coli'' 9,1% ogljika izvira iz CO2 [1], [4].

==='''Oblikovanje bioreaktorja'''===

Študenti so pripravili prototip bioreaktorja, ki črpa CO2 in zaznava njegovo koncentracijo, meri temperaturo in pH gojišča ter podatke pošilja v oblak. Sestavljajo ga wi-fi vmesnik, črpalka CO2, zalogovnik za gojišče, predel za gojenje bakterij z magnetnim mešalom, odpad in tri merilni sistemi – termometer, senzor CO2, pH meter in sintezno biološki sistem za zaznavo spremembe pH. Slednji je bil stranski projekt tekmovalne skupine. Pripravili so ''E.coli'', ki se odziva na spremembo pH gojišča, tako da v nevtralnem pH izraža GFP, v kislem pa sfGFP. Posledično se ob zakisanju gojišča njegova barva spremeni iz rumene v zeleno. Kot osnovo so uporabili že obstoječe biokocke iz registra bioloških delov, s pH-občutljivimi promotorji in jih optimizirali za višji nivo izražanja [1].

==='''Programska oprema bioreaktorja'''===

Izdelali so program za spremljanje pogojev bioreaktorja v realnem času in aplikacijo, s katero lahko uporabnik kadarkoli prek wi-fija preveril stanje oz. napredek bioreaktorja [1].

==='''Biovarnost'''===
Uporabljen sev BL21 (DE3) ni patogen za človeka, zato ni nevarnosti okužb ob morebitnem izpustu. Tudi vanj vneseni geni izvirajo iz človeku nenevarnih organizmov. Poleg tega so na bioreaktor namestili filtre in s testom potrdili, da uspešno preprečujejo izpust GSO v okolje. Načrtovali so tudi povezavo bioreaktorja s sistemom za uporabo odvečne toplote v industriji, s pomočjo katerega bi lahko sterilizirali odpadno gojišče [1].

==ZAKLJUČEK==
Ekipa je razvila sintezno biološki sistem za zmanjšanje izpustov CO2, ostaja pa veliko možnosti za izboljšave, ki bi naredile sistem bolj učinkovit in privlačen za industrijo. V ta namen so se povezali z iGEM ekipo UESTC-China, ki je razvila sistem za predelavo slame v biogorivo, pri katerem nastaja ksiloza kot stranski produkt <ref>iGEM 2018 Team UESTC-China. ''Straw-degrading Energy E.coli.'' Dostopno na: http://2018.igem.org/Team:UESTC-China [pridobljeno 15.12.2018].</ref>. Z umestitvijo bioreaktorja za fiksiranje ogljika navzdol od procesa predelave slame, bi bistveno znižali svoj ogljični odtis in se izognili nabavi velikih količin ksiloze, potrebne za delovanje bioreaktorja. Lahko bi tudi razvili sistem, ki za izrabo CO2 ne potrebuje sladkorja [4], <ref>Antonovsky N, Gleizer S, Noor E, in dr. ''Sugar Synthesis from CO2 in Escherichia coli.'' Cell 2016;166(1):115–25.</ref>. Z uvedbo procesa predelave piruvata v glutamin, bi industrijskemu obratu omogočili dodaten vir zaslužka. Za pospešitev fiksiranja ogljika bi lahko ''E.coli'' gojili v anaerobnih pogojih, kar je zahtevno, a poviša učinkovitost Rubisco, zaradi odsotnosti kisika, ki s CO2 tekmuje za vezavo nanj ali pa bi poiskali alternativo temu encimu <ref>Bar-Even A, Noor E, Lewis NE, Milo R. ''Design and analysis of synthetic carbon fixation pathways.'' PNAS 2010;107(19):8889–94.</ref>.

==VIRI==

<references/>

Of CO2urse - sistem za zmanjševanje izpustov ogljikovega dioksida v industriji

2018-12-17T17:36:19Z

Kity Požek:

Of CO2urse je projekt študentske ekipe 'NCKU Tainan' iz Tajvana, ki je bil nagrajen kot najboljši okoljski projekt na tekmovanju iz sintezne biologije, iGEM 2018. Namen projekta je s pristopi sintezne biologije prispevati k oblikovanju nizkoogljične družbe <ref>iGEM 2018 Team NCKU Tainan. ''Of CO2urse.'' Dostopno na: http://2018.igem.org/Team:NCKU_Tainan [pridobljeno 13.12.2018].</ref>.

==UVOD==
Globalno segrevanje je danes eden največjih okoljskih problemov in med najpomembnejšimi vzroki za učinek tople grede je pretiran izpust ogljikovega dioksida (CO2) v ozračje. Za izpust so v glavnem odgovorne človeške dejavnosti, kot so transport, proizvodnja električne energije in industrija, zaradi katerih se koncentracija tega toplogrednega plina v zraku izrazito povišuje vse od industrijske revolucije dalje. S hkratnim pretiranim izpustom CO2 in krčenjem naravnih ponorov CO2, kot so npr. gozdovi, se ruši naravni cikel ogljika, na kar kaže tudi dejstvo, da se je od leta 1960 do leta 2018 koncentracija CO2 v ozračju dvignila iz 320 ppm na več kot 400 ppm <ref>ProOxygen. ''CO2 Acceleration.'' Dostopno na: https://www.co2.earth/co2-acceleration [pridobljeno 13.12.2018].</ref>, <ref>US EPA. ''Overview of Greenhouse Gases.'' Dostopno na: https://www.epa.gov/ghgemissions/overview-greenhouse-gases [pridobljeno 13.12.2018].</ref>. Učinek tople grede ima za planet že vidne in zaskrbljujoče posledice, kot je npr. taljenje polarnega ledu, posledično dvigovanje gladine morja in manjšanje primernih površin ter pogojev za preživetje obstoječih vrst, višanje temperature morja in s tem rušenje morskega ekosistema itd. Pri obvladovanju izpustov CO2 med drugim pripomorejo raziskave, usmerjene v razvoj načinov za nadzor izpustov in za privzem CO2 iz ozračja. iGEM ekipa iz Tajvana si je v ta namen zamislila projekt, v sklopu katerega so pripravili sintezno biološki sistem, ki bi lahko v industrijskih obratih asimiliral nastali CO2 [1].

==PRISTOP IN IZVEDBA PROJEKTA==
==='''Of CO2urse'''===
Študenti so pripravili prototip bioreaktorja z bakterijami ''E. coli'', v katere so po sistemu biokock vnesli gene cianobakterij za fiksiranje ogljika iz zraka. V bioreaktor so dovajali rastno gojišče s ksilozo kot edinim virom organskega ogljika in CO2 iz jeklenke, pripravljene s tehnologijo zajema in shranjevanja CO2 v industrijskem obratu. Bakterije so privzele CO2 iz zraka in ga pretvorile do piruvata, tega pa bi lahko v nadaljnjih procesih uporabili za pripravo raznih uporabnih spojin (npr. glutamina). Napravo so opremili tudi s senzorji za spremljanje stanja procesa in razvili aplikacijo za enostaven dostop do teh podatkov. Glede dizajna so se posvetovali s strokovnjaki iz tega področja in s končnimi uporabniki v industriji ter skušali upoštevati njihove nasvete in pripraviti učinkovit, varen, čim bolj donosen in cenovno ugoden sistem za pomoč pri zmanjševanju izpustov CO2 v industriji [1].

==='''Priprava ''E.coli'', ki fiksira CO2 '''===

Za pripravo CO2-fiksirajoče ''E.coli'' so konstruirali biokocke z geni za izražanje fosforibulokinaze (PRK), ogljikove anhidraze (CA) in ribuloza-1,5-bisfosfat karboksilaze/oksigenaze (Rubisco). Geni izvirajo iz dveh sevov cianobakterij - ''Synechococcus elongatus'' PCC 7942 in PCC 7002. Zanje so se odločili, ker so v literaturi zasledili, da so se že izkazali kot uspešni za ta namen <ref>Gong F, Liu G, Zhai X, in dr. ''Quantitative analysis of an engineered CO2-fixing Escherichia coli reveals great potential of heterotrophic CO2 fixation.'' Biotechnology for Biofuels 2015;8(1):86.</ref>. Prvi dve biokocki so vstavili v vektor pSB3K3, tretjo pa v pSB1C3 in bakterije kotransformirali z vektorjema. Tako so v ''E.coli'' omogočili potek Calvinovega cikla, ki je ena najpomembnejših poti za fiksiranje ogljika v naravi. Kot šasijo so preizkusili 3 seve ''E.coli'' - BL21 (DE3), W3110, W3110 (L5T7). Odločili so se za uporabo ''E.coli'' BL21 (DE3), ki je dobro rastla ob pogojih v bioreaktorju in se je po vnosu genov za fiksiranje ogljika izkazala kot najsposobnejša izrabe CO2. Prednost ''E.coli'' pred rastlinami, algami in cianobakterijami je, da raste hitreje in bolj robustno, ne potrebuje svetlobe in zato uspešnost gojenja ni odvisna od vremena ter zahteva manjše površine za gojenje [1], [4].

==='''Potek nove presnovne poti v ''E.coli'' '''===

Pripravljene bakterije najprej prek lastne, pentoza-fosfatne poti presnovijo ksilozo iz rastnega gojišča v ribulozo-5-fosfat (Ru5P), ki jo nato z rekombinantnim encimom PRK fosforilirajo do ribuloze-1,5-bisfosfata (RuBP). Sledi karboksilacija RuBP s CO2 iz zraka, s pomočjo rekombinantnega encima Rubisco, pri čemer nastane 3-fosfoglicerat (3-PGA), ki se pretvori v piruvat. Piruvat je multifunkcionalen intermediat različnih anabolnih poti [1].

Pomembno vlogo pri fiksaciji ogljika ima tudi encim CA, ki s pretvarjanjem CO2 v ogljikovo kislino oz. HCO3-, poveča difuzijo plina v celice. Tako imajo bakterije na razpolago več CO2 za fiksiranje, kar je pomembno predvsem zato, ker CO2 tekmuje s kisikom za vezavo na Rubisco. Kljub temu, da ima ''E.coli'' lastno CA, so vanje vstavili še CA cianobakterij, ki je sposobna hitrejše katalize [1], [4].

==='''Učinkovitost izrabe CO2 v ''E.coli'' '''===
Glavni presnovni poti ksiloze v divjem tipu ''E.coli'' sta pentoza-fosfatna pot in glikoliza, v rekombinantni ''E.coli'' pa poleg teh originalnih poti poteka v manjši meri še 'obvozna pot oz. obvoznica CO2' (ang. ''CO2 bypass pathway''). Študenti so razvili matematični model za napoved pretoka ogljika prek ene in druge poti. Obe poti se zaključita z nastankom piruvata, ki vstopa v Krebsov cikel, zato so tudi tega vključili v model presnove ksiloze. S pripravljenim modelom so napovedali količino nastale biomase ''E.coli'' ob pogojih v bioreaktorju oziroma vpliv prisotnosti alternativne presnovne poti ksiloze na rast bakterij. Pravilnost modela so preverili eksperimentalno in pokazali, da lahko z njegovo pomočjo uspešno napovejo obnašanje sistema. S tem so prihranili čas in denar, saj so lahko z uporabo modela v laboratoriju delali bolj usmerjeno. Med drugim so z modelom pokazali, da lahko količino nastalega piruvata spremljajo prek meritev optične gostote (O.D.600) suspenzije bakterij in si s tem olajšali eksperimentalno delo. Ugotovili so, da možnost izrabe CO2 vpliva na rast bakterij, saj so rekombinantne bakterije v atmosferi s 5% CO2 proizvedle več piruvata oziroma so v istem času dosegle višjo O.D.600 kakor v atmosferi brez dodanega CO2 [1].

Za vrednotenje učinkovitosti izrabe obvozne poti CO2 so uvedli indeks izrabe ksiloze (XUI, ang. ''xylose utilisation index'') – hiter, enostaven in uporaben način za oceno sposobnosti bakterij za fiksiranje ogljika, prek meritev O.D.600 celične kulture. XUI omogoča dokaz sposobnosti izrabe CO2 in primerjavo med sevi ''E.coli'' in različnimi pogoji v bioreaktorju. Za opredelitev XUI so naredili 2 predpostavki – da O.D.600 korelira s suho maso bakterij, kar so tudi eksperimentalno dokazali in da je delež ogljika v celici ''E.coli'' stalen oz. se spreminja v ozkem intervalu, kar lahko zanemarimo. Iz tega sledi, da je količina ogljika pri dani O.D.600 fiksna in lahko privzamemo, da je izmerjena vrednost O.D.600 ekvivalentna masi ogljika v celicah. XUI je definiran kot razmerje med porabo ksiloze in O.D.600. Divji tip ''E.coli'' lahko v bioreaktorju kot vir ogljika v glavnem izrablja le ksilozo, torej bo v tem primeru XUI visok. Rekombinantna ''E.coli'' pa lahko izrablja tudi CO2, zato porabi manj ksiloze za rast do iste O.D.600 in je njen XUI nižji. S primerjavo XUI so izbrali najučinkovitejši sev za fiksiranje ogljika, ''E.coli'' BL21 (DE3) in optimizirali rastne pogoje v bioreaktorju. Najnižje XUI so določili pri uporabi gojišča M9 brez glukoze in z 0,4% ksiloze ter v atmosferi s 5% CO2. Za določitev hitrosti fiksiranja ogljika so uporabili pravilo o ohranitvi mase, po postopku opisanem v literaturi [4]. Določili so, da je pripravljen sintezno biološki sistem sposoben fiksirati ogljik s hitrostjo 0,575 mg/L/h in da v biomasi rekombinantne ''E.coli'' 9,1% ogljika izvira iz CO2 [1], [4].

==='''Oblikovanje bioreaktorja'''===

Študenti so pripravili prototip bioreaktorja, ki črpa CO2 in zaznava njegovo koncentracijo, meri temperaturo in pH gojišča ter podatke pošilja v oblak. Sestavljajo ga wi-fi vmesnik, črpalka CO2, zalogovnik za gojišče, predel za gojenje bakterij z magnetnim mešalom, odpad in tri merilni sistemi – termometer, senzor CO2, pH meter in sintezno biološki sistem za zaznavo spremembe pH. Slednji je bil stranski projekt tekmovalne skupine. Pripravili so ''E.coli'', ki se odziva na spremembo pH gojišča, tako da v nevtralnem pH izraža GFP, v kislem pa sfGFP. Posledično se ob zakisanju gojišča njegova barva spremeni iz rumene v zeleno. Kot osnovo so uporabili že obstoječe biokocke iz registra bioloških delov, s pH-občutljivimi promotorji in jih optimizirali za višji nivo izražanja [1].

==='''Programska oprema bioreaktorja'''===

Izdelali so program za spremljanje pogojev bioreaktorja v realnem času in aplikacijo, s katero lahko uporabnik kadarkoli prek wi-fija preveril stanje oz. napredek bioreaktorja [1].

==='''Biovarnost'''===
Uporabljen sev BL21 (DE3) ni patogen za človeka, zato ni nevarnosti okužb ob morebitnem izpustu. Tudi vanj vneseni geni izvirajo iz človeku nenevarnih organizmov. Poleg tega so na bioreaktor namestili filtre in s testom potrdili, da uspešno preprečujejo izpust GSO v okolje. Načrtovali so tudi povezavo bioreaktorja s sistemom za uporabo odvečne toplote v industriji, s pomočjo katerega bi lahko sterilizirali odpadno gojišče [1].

==ZAKLJUČEK==
Ekipa je razvila sintezno biološki sistem za zmanjšanje izpustov CO2, ostaja pa veliko možnosti za izboljšave, ki bi naredile sistem bolj učinkovit in privlačen za industrijo. V ta namen so se povezali z iGEM ekipo UESTC-China, ki je razvila sistem za predelavo slame v biogorivo, pri katerem nastaja ksiloza kot stranski produkt <ref>iGEM 2018 Team UESTC-China. ''Straw-degrading Energy E.coli.'' Dostopno na: http://2018.igem.org/Team:UESTC-China [pridobljeno 15.12.2018].</ref>. Z umestitvijo bioreaktorja za fiksiranje ogljika navzdol od procesa predelave slame, bi bistveno znižali svoj ogljični odtis in se izognili nabavi velikih količin ksiloze, potrebne za delovanje bioreaktorja. Lahko bi tudi razvili sistem, ki za izrabo CO2 ne potrebuje sladkorja [4], <ref>Antonovsky N, Gleizer S, Noor E, in dr. ''Sugar Synthesis from CO2 in Escherichia coli.'' Cell 2016;166(1):115–25.</ref>. Z uvedbo procesa predelave piruvata v glutamin, bi industrijskemu obratu omogočili dodaten vir zaslužka. Za pospešitev fiksiranja ogljika bi lahko ''E.coli'' gojili v anaerobnih pogojih, kar je zahtevno, a poviša učinkovitost Rubisco, zaradi odsotnosti kisika, ki s CO2 tekmuje za vezavo nanj ali pa bi poiskali alternativo temu encimu <ref>Bar-Even A, Noor E, Lewis NE, Milo R. ''Design and analysis of synthetic carbon fixation pathways.'' PNAS 2010;107(19):8889–94.</ref>.

==VIRI==

<references/>

Of CO2urse - sistem za zmanjševanje izpustov ogljikovega dioksida v industriji

2018-12-17T17:34:18Z

Kity Požek:

Of CO2urse je projekt študentske ekipe 'NCKU Tainan' iz Tajvana, ki je bil nagrajen kot najboljši okoljski projekt na tekmovanju iz sintezne biologije, iGEM 2018. Namen projekta je s pristopi sintezne biologije prispevati k oblikovanju nizkoogljične družbe <ref>iGEM 2018 Team NCKU Tainan. ''Of CO2urse.'' Dostopno na: http://2018.igem.org/Team:NCKU_Tainan [pridobljeno 13.12.2018].</ref>.

==UVOD==
Globalno segrevanje je danes eden največjih okoljskih problemov in med najpomembnejšimi vzroki za učinek tople grede je pretiran izpust ogljikovega dioksida (CO2) v ozračje. Za izpust so v glavnem odgovorne človeške dejavnosti, kot so transport, proizvodnja električne energije in industrija, zaradi katerih se koncentracija tega toplogrednega plina v zraku izrazito povišuje vse od industrijske revolucije dalje. S hkratnim pretiranim izpustom CO2 in krčenjem naravnih ponorov CO2, kot so npr. gozdovi, se ruši naravni cikel ogljika, na kar kaže tudi dejstvo, da se je od leta 1960 do leta 2018 koncentracija CO2 v ozračju dvignila iz 320 ppm na več kot 400 ppm <ref>ProOxygen. ''CO2 Acceleration.'' Dostopno na: https://www.co2.earth/co2-acceleration [pridobljeno 13.12.2018].</ref>, <ref>US EPA. ''Overview of Greenhouse Gases.'' Dostopno na: https://www.epa.gov/ghgemissions/overview-greenhouse-gases [pridobljeno 13.12.2018].</ref>. Učinek tople grede ima za planet že vidne in zaskrbljujoče posledice, kot je npr. taljenje polarnega ledu, posledično dvigovanje gladine morja in manjšanje primernih površin ter pogojev za preživetje obstoječih vrst, višanje temperature morja in s tem rušenje morskega ekosistema itd. Pri obvladovanju izpustov CO2 med drugim pripomorejo raziskave, usmerjene v razvoj načinov za nadzor izpustov in za privzem CO2 iz ozračja. iGEM ekipa iz Tajvana si je v ta namen zamislila projekt, v sklopu katerega so pripravili sintezno biološki sistem, ki bi lahko v industrijskih obratih asimiliral nastali CO2 [1].

==PRISTOP IN IZVEDBA PROJEKTA==
==='''Of CO2urse'''===
Študenti so pripravili prototip bioreaktorja z bakterijami ''E. coli'', v katere so po sistemu biokock vnesli gene cianobakterij za fiksiranje ogljika iz zraka. V bioreaktor so dovajali rastno gojišče s ksilozo kot edinim virom organskega ogljika in CO2 iz jeklenke, pripravljene s tehnologijo zajema in shranjevanja CO2 v industrijskem obratu. Bakterije so privzele CO2 iz zraka in ga pretvorile do piruvata, tega pa bi lahko v nadaljnjih procesih uporabili za pripravo raznih uporabnih spojin (npr. glutamina). Napravo so opremili tudi s senzorji za spremljanje stanja procesa in razvili aplikacijo za enostaven dostop do teh podatkov. Glede dizajna so se posvetovali s strokovnjaki iz tega področja in s končnimi uporabniki v industriji ter skušali upoštevati njihove nasvete in pripraviti učinkovit, varen, čim bolj donosen in cenovno ugoden sistem za pomoč pri zmanjševanju izpustov CO2 v industriji [1].

==='''Priprava ''E.coli'', ki fiksira CO2 '''===

Za pripravo CO2-fiksirajoče ''E.coli'' so konstruirali biokocke z geni za izražanje fosforibulokinaze (PRK), ogljikove anhidraze (CA) in ribuloza-1,5-bisfosfat karboksilaze/oksigenaze (Rubisco). Geni izvirajo iz dveh sevov cianobakterij - ''Synechococcus elongatus'' PCC 7942 in PCC 7002. Zanje so se odločili, ker so v literaturi zasledili, da so se že izkazali kot uspešni za ta namen <ref>Gong F, Liu G, Zhai X, in dr. ''Quantitative analysis of an engineered CO2-fixing Escherichia coli reveals great potential of heterotrophic CO2 fixation.'' Biotechnology for Biofuels 2015;8(1):86.</ref>. Prvi dve biokocki so vstavili v vektor pSB3K3, tretjo pa v pSB1C3 in bakterije kotransformirali z vektorjema. Tako so v ''E.coli'' omogočili potek Calvinovega cikla, ki je ena najpomembnejših poti za fiksiranje ogljika v naravi. Kot šasijo so preizkusili 3 seve ''E.coli'' - BL21 (DE3), W3110, W3110 (L5T7). Odločili so se za uporabo ''E.coli'' BL21 (DE3), ki je dobro rastla ob pogojih v bioreaktorju in se je po vnosu genov za fiksiranje ogljika izkazala kot najsposobnejša izrabe CO2. Prednost ''E.coli'' pred rastlinami, algami in cianobakterijami je, da raste hitreje in bolj robustno, ne potrebuje svetlobe in zato uspešnost gojenja ni odvisna od vremena ter zahteva manjše površine za gojenje [1], [4].

==='''Potek nove presnovne poti v ''E.coli'' '''===

Pripravljene bakterije najprej prek lastne, pentoza-fosfatne poti presnovijo ksilozo iz rastnega gojišča v ribulozo-5-fosfat (Ru5P), ki jo nato z rekombinantnim encimom PRK fosforilirajo do ribuloze-1,5-bisfosfata (RuBP). Sledi karboksilacija RuBP s CO2 iz zraka, s pomočjo rekombinantnega encima Rubisco, pri čemer nastane 3-fosfoglicerat (3-PGA), ki se pretvori v piruvat. Piruvat je multifunkcionalen intermediat različnih anabolnih poti [1].

Pomembno vlogo pri fiksaciji ogljika ima tudi encim CA, ki s pretvarjanjem CO2 v ogljikovo kislino oz. HCO3-, poveča difuzijo plina v celice. Tako imajo bakterije na razpolago več CO2 za fiksiranje, kar je pomembno predvsem zato, ker CO2 tekmuje s kisikom za vezavo na Rubisco. Kljub temu, da ima ''E.coli'' lastno CA, so vanje vstavili še CA cianobakterij, ki je sposobna hitrejše katalize [1], [4].

==='''Učinkovitost izrabe CO2 v ''E.coli'' '''===
Glavni presnovni poti ksiloze v divjem tipu ''E.coli'' sta pentoza-fosfatna pot in glikoliza, v rekombinantni ''E.coli'' pa poleg teh originalnih poti poteka v manjši meri še 'obvozna pot oz. obvoznica CO2' (ang. ''CO2 bypass pathway''). Študenti so razvili matematični model za napoved pretoka ogljika prek ene in druge poti. Obe poti se zaključita z nastankom piruvata, ki vstopa v Krebsov cikel, zato so tudi tega vključili v model presnove ksiloze. S pripravljenim modelom so napovedali količino nastale biomase ''E.coli'' ob pogojih v bioreaktorju oziroma vpliv prisotnosti alternativne presnovne poti ksiloze na rast bakterij. Pravilnost modela so preverili eksperimentalno in pokazali, da lahko z njegovo pomočjo uspešno napovejo obnašanje sistema. S tem so prihranili čas in denar, saj so lahko z uporabo modela v laboratoriju delali bolj usmerjeno. Med drugim so z modelom pokazali, da lahko količino nastalega piruvata spremljajo prek meritev optične gostote (O.D.600) suspenzije bakterij in si s tem olajšali eksperimentalno delo. Ugotovili so, da možnost izrabe CO2 vpliva na rast bakterij, saj so rekombinantne bakterije v atmosferi s 5% CO2 proizvedle več piruvata oziroma so v istem času dosegle višjo O.D.600 kakor v atmosferi brez dodanega CO2 [1].

Za vrednotenje učinkovitosti izrabe obvozne poti CO2 so uvedli indeks izrabe ksiloze (XUI, ang. ''xylose utilisation index'') – hiter, enostaven in uporaben način za oceno sposobnosti bakterij za fiksiranje ogljika, prek meritev O.D.600 celične kulture. XUI omogoča dokaz sposobnosti izrabe CO2 in primerjavo med sevi ''E.coli'' in različnimi pogoji v bioreaktorju. Za opredelitev XUI so naredili 2 predpostavki – da O.D.600 korelira s suho maso bakterij, kar so tudi eksperimentalno dokazali in da je delež ogljika v celici ''E.coli'' stalen oz. se spreminja v ozkem intervalu, kar lahko zanemarimo. Iz tega sledi, da je količina ogljika pri dani O.D.600 fiksna in lahko privzamemo, da je izmerjena vrednost O.D.600 ekvivalentna masi ogljika v celicah. XUI je definiran kot razmerje med porabo ksiloze in O.D.600. Divji tip ''E.coli'' lahko v bioreaktorju kot vir ogljika v glavnem izrablja le ksilozo, torej bo v tem primeru XUI visok. Rekombinantna ''E.coli'' pa lahko izrablja tudi CO2, zato porabi manj ksiloze za rast do iste O.D.600 in je njen XUI nižji. S primerjavo XUI so izbrali najučinkovitejši sev za fiksiranje ogljika, ''E.coli'' BL21 (DE3) in optimizirali rastne pogoje v bioreaktorju. Najnižje XUI so določili pri uporabi gojišča M9 brez glukoze in z 0,4% ksiloze ter v atmosferi s 5% CO2. Za določitev hitrosti fiksiranja ogljika so uporabili pravilo o ohranitvi mase, po postopku opisanem v literaturi [4]. Določili so, da je pripravljen sintezno biološki sistem sposoben fiksirati ogljik s hitrostjo 0,575 mg/L/h in da v biomasi rekombinantne ''E.coli'' 9,1% ogljika izvira iz CO2 [1], [4].

==='''Oblikovanje bioreaktorja'''===

Študenti so pripravili prototip bioreaktorja, ki črpa CO2 in zaznava njegovo koncentracijo, meri temperaturo in pH gojišča ter podatke pošilja v oblak. Sestavljajo ga wi-fi vmesnik, črpalka CO2, zalogovnik za gojišče, predel za gojenje bakterij z magnetnim mešalom, odpad in tri merilni sistemi – termometer, senzor CO2, pH meter in sintezno biološki sistem za zaznavo spremembe pH. Slednji je bil stranski projekt tekmovalne skupine. Pripravili so ''E.coli'', ki se odziva na spremembo pH gojišča, tako da v nevtralnem pH izraža GFP, v kislem pa sfGFP. Posledično se ob zakisanju gojišča njegova barva spremeni iz rumene v zeleno. Kot osnovo so uporabili že obstoječe biokocke iz registra bioloških delov, s pH-občutljivimi promotorji in jih optimizirali za višji nivo izražanja [1].

==='''Programska oprema bioreaktorja'''===

Izdelali so program za spremljanje pogojev bioreaktorja v realnem času in aplikacijo, s katero lahko uporabnik kadarkoli prek wi-fija preveril stanje oz. napredek bioreaktorja [1].

==='''Biovarnost'''===
Uporabljen sev BL21 (DE3) ni patogen za človeka, zato ni nevarnosti okužb ob morebitnem izpustu. Tudi vanj vneseni geni izvirajo iz človeku nenevarnih organizmov. Poleg tega so na bioreaktor namestili filtre in s testom potrdili, da uspešno preprečujejo izpust GSO v okolje. Načrtovali so tudi povezavo bioreaktorja s sistemom za uporabo odvečne toplote v industriji, s pomočjo katerega bi lahko sterilizirali odpadno gojišče [1].

==ZAKLJUČEK==
Ekipa je razvila sintezno biološki sistem za zmanjšanje izpustov CO2, ostaja pa veliko možnosti za izboljšave, ki bi naredile sistem bolj učinkovit in privlačen za industrijo. V ta namen so se povezali z iGEM ekipo UESTC-China, ki je razvila sistem za predelavo slame v biogorivo, pri katerem nastaja ksiloza kot stranski produkt <ref>iGEM 2018 Team UESTC-China. ''Straw-degrading Energy E.coli.'' Dostopno na: http://2018.igem.org/Team:UESTC-China [pridobljeno 15.12.2018].</ref>. Z umestitvijo bioreaktorja za fiksiranje ogljika navzdol od procesa predelave slame, bi bistveno znižali svoj ogljični odtis in se izognili nabavi velikih količin ksiloze, potrebne za delovanje bioreaktorja. Lahko bi tudi razvili sistem, ki za izrabo CO2 ne potrebuje sladkorja [4], <ref>Antonovsky N, Gleizer S, Noor E, in dr. ''Sugar Synthesis from CO2 in Escherichia coli.'' Cell 2016;166(1):115–25.</ref>. Z uvedbo procesa predelave piruvata v glutamin, bi industrijskemu obratu omogočili dodaten vir zaslužka. Za pospešitev fiksiranja ogljika bi lahko ''E.coli'' gojili v anaerobnih pogojih, kar je zahtevno, a poviša učinkovitost Rubisco, zaradi odsotnosti kisika, ki s CO2 tekmuje za vezavo nanj ali pa bi poiskali alternativo temu encimu <ref>Bar-Even A, Noor E, Lewis NE, Milo R. ''Design and analysis of synthetic carbon fixation pathways.'' PNAS 2010;107(19):8889–94.</ref>.

==VIRI==

<references/>

Of CO2urse - sistem za zmanjševanje izpustov ogljikovega dioksida v industriji

2018-12-17T17:32:44Z

Kity Požek:

Of CO2urse je projekt študentske ekipe 'NCKU Tainan' iz Tajvana, ki je bil nagrajen kot najboljši okoljski projekt na tekmovanju iz sintezne biologije, iGEM 2018. Namen projekta je s pristopi sintezne biologije prispevati k oblikovanju nizkoogljične družbe <ref>iGEM 2018 Team NCKU Tainan. ''Of CO2urse.'' Dostopno na: http://2018.igem.org/Team:NCKU_Tainan [pridobljeno 13.12.2018].</ref>.

==UVOD==
Globalno segrevanje je danes eden največjih okoljskih problemov in med najpomembnejšimi vzroki za učinek tople grede je pretiran izpust ogljikovega dioksida (CO2) v ozračje. Za izpust so v glavnem odgovorne človeške dejavnosti, kot so transport, proizvodnja električne energije in industrija, zaradi katerih se koncentracija tega toplogrednega plina v zraku izrazito povišuje vse od industrijske revolucije dalje. S hkratnim pretiranim izpustom CO2 in krčenjem naravnih ponorov CO2, kot so npr. gozdovi, se ruši naravni cikel ogljika, na kar kaže tudi dejstvo, da se je od leta 1960 do leta 2018 koncentracija CO2 v ozračju dvignila iz 320 ppm na več kot 400 ppm <ref>ProOxygen. ''CO2 Acceleration.'' Dostopno na: https://www.co2.earth/co2-acceleration [pridobljeno 13.12.2018].</ref>, <ref>US EPA. ''Overview of Greenhouse Gases.'' Dostopno na: https://www.epa.gov/ghgemissions/overview-greenhouse-gases [pridobljeno 13.12.2018].</ref>. Učinek tople grede ima za planet že vidne in zaskrbljujoče posledice, kot je npr. taljenje polarnega ledu, posledično dvigovanje gladine morja in manjšanje primernih površin ter pogojev za preživetje obstoječih vrst, višanje temperature morja in s tem rušenje morskega ekosistema itd. Pri obvladovanju izpustov CO2 med drugim pripomorejo raziskave, usmerjene v razvoj načinov za nadzor izpustov in za privzem CO2 iz ozračja. iGEM ekipa iz Tajvana si je v ta namen zamislila projekt, v sklopu katerega so pripravili sintezno biološki sistem, ki bi lahko v industrijskih obratih asimiliral nastali CO2 [1].

==PRISTOP IN IZVEDBA PROJEKTA==
==='''Of CO2urse'''===
Študenti so pripravili prototip bioreaktorja z bakterijami ''E. coli'', v katere so po sistemu biokock vnesli gene cianobakterij za fiksiranje ogljika iz zraka. V bioreaktor so dovajali rastno gojišče s ksilozo kot edinim virom organskega ogljika in CO2 iz jeklenke, pripravljene s tehnologijo zajema in shranjevanja CO2 v industrijskem obratu. Bakterije so privzele CO2 iz zraka in ga pretvorile do piruvata, tega pa bi lahko v nadaljnjih procesih uporabili za pripravo raznih uporabnih spojin (npr. glutamina). Napravo so opremili tudi s senzorji za spremljanje stanja procesa in razvili aplikacijo za enostaven dostop do teh podatkov. Glede dizajna so se posvetovali s strokovnjaki iz tega področja in s končnimi uporabniki v industriji ter skušali upoštevati njihove nasvete in pripraviti učinkovit, varen, čim bolj donosen in cenovno ugoden sistem za pomoč pri zmanjševanju izpustov CO2 v industriji [1].

==='''Priprava ''E.coli'', ki fiksira CO2 '''===

Za pripravo CO2-fiksirajoče ''E.coli'' so konstruirali biokocke z geni za izražanje fosforibulokinaze (PRK), ogljikove anhidraze (CA) in ribuloza-1,5-bisfosfat karboksilaze/oksigenaze (Rubisco). Geni izvirajo iz dveh sevov cianobakterij - ''Synechococcus elongatus'' PCC 7942 in PCC 7002. Zanje so se odločili, ker so v literaturi zasledili, da so se že izkazali kot uspešni za ta namen <ref>Gong F, Liu G, Zhai X, in dr. ''Quantitative analysis of an engineered CO2-fixing Escherichia coli reveals great potential of heterotrophic CO2 fixation.'' Biotechnology for Biofuels 2015;8(1):86.</ref>. Prvi dve biokocki so vstavili v vektor pSB3K3, tretjo pa v pSB1C3 in bakterije kotransformirali z vektorjema. Tako so v ''E.coli'' omogočili potek Calvinovega cikla, ki je ena najpomembnejših poti za fiksiranje ogljika v naravi. Kot šasijo so preizkusili 3 seve ''E.coli'' - BL21 (DE3), W3110, W3110 (L5T7). Odločili so se za uporabo ''E.coli'' BL21 (DE3), ki je dobro rastla ob pogojih v bioreaktorju in se je po vnosu genov za fiksiranje ogljika izkazala kot najsposobnejša izrabe CO2. Prednost ''E.coli'' pred rastlinami, algami in cianobakterijami je, da raste hitreje in bolj robustno, ne potrebuje svetlobe in zato uspešnost gojenja ni odvisna od vremena ter zahteva manjše površine za gojenje [1], [4].

==='''Potek nove presnovne poti v ''E.coli'' '''===

Pripravljene bakterije najprej prek lastne, pentoza-fosfatne poti presnovijo ksilozo iz rastnega gojišča v ribulozo-5-fosfat (Ru5P), ki jo nato z rekombinantnim encimom PRK fosforilirajo do ribuloze-1,5-bisfosfata (RuBP). Sledi karboksilacija RuBP s CO2 iz zraka, s pomočjo rekombinantnega encima Rubisco, pri čemer nastane 3-fosfoglicerat (3-PGA), ki se pretvori v piruvat. Piruvat je multifunkcionalen intermediat različnih anabolnih poti [1].

Pomembno vlogo pri fiksaciji ogljika ima tudi encim CA, ki s pretvarjanjem CO2 v ogljikovo kislino oz. HCO3-, poveča difuzijo plina v celice. Tako imajo bakterije na razpolago več CO2 za fiksiranje, kar je pomembno predvsem zato, ker CO2 tekmuje s kisikom za vezavo na Rubisco. Kljub temu, da ima ''E.coli'' lastno CA, so vanje vstavili še CA cianobakterij, ki je sposobna hitrejše katalize [1], [4].

==='''Učinkovitost izrabe CO2 v ''E.coli'' '''===
Glavni presnovni poti ksiloze v divjem tipu ''E.coli'' sta pentoza-fosfatna pot in glikoliza, v rekombinantni ''E.coli'' pa poleg teh originalnih poti poteka v manjši meri še 'obvozna pot oz. obvoznica CO2' (ang. ''CO2 bypass pathway''). Študenti so razvili matematični model za napoved pretoka ogljika prek ene in druge poti. Obe poti se zaključita z nastankom piruvata, ki vstopa v Krebsov cikel, zato so tudi tega vključili v model presnove ksiloze. S pripravljenim modelom so napovedali količino nastale biomase ''E.coli'' ob pogojih v bioreaktorju oziroma vpliv prisotnosti alternativne presnovne poti ksiloze na rast bakterij. Pravilnost modela so preverili eksperimentalno in pokazali, da lahko z njegovo pomočjo uspešno napovejo obnašanje sistema. S tem so prihranili čas in denar, saj so lahko z uporabo modela v laboratoriju delali bolj usmerjeno. Med drugim so z modelom pokazali, da lahko količino nastalega piruvata spremljajo prek meritev optične gostote (O.D.600) suspenzije bakterij in si s tem olajšali eksperimentalno delo. Ugotovili so, da možnost izrabe CO2 vpliva na rast bakterij, saj so rekombinantne bakterije v atmosferi s 5% CO2 proizvedle več piruvata oziroma so v istem času dosegle višjo O.D.600 kakor v atmosferi brez dodanega CO2 [1].

Za vrednotenje učinkovitosti izrabe obvozne poti CO2 so uvedli indeks izrabe ksiloze (XUI, ang. ''xylose utilisation index'') – hiter, enostaven in uporaben način za oceno sposobnosti bakterij za fiksiranje ogljika, prek meritev O.D.600 celične kulture. XUI omogoča dokaz sposobnosti izrabe CO2 in primerjavo med sevi ''E.coli'' in različnimi pogoji v bioreaktorju. Za opredelitev XUI so naredili 2 predpostavki – da O.D.600 korelira s suho maso bakterij, kar so tudi eksperimentalno dokazali in da je delež ogljika v celici ''E.coli'' stalen oz. se spreminja v ozkem intervalu, kar lahko zanemarimo. Iz tega sledi, da je količina ogljika pri dani O.D.600 fiksna in lahko privzamemo, da je izmerjena vrednost O.D.600 ekvivalentna masi ogljika v celicah. XUI je definiran kot razmerje med porabo ksiloze in O.D.600. Divji tip ''E.coli'' lahko v bioreaktorju kot vir ogljika v glavnem izrablja le ksilozo, torej bo v tem primeru XUI visok. Rekombinantna ''E.coli'' pa lahko izrablja tudi CO2, zato porabi manj ksiloze za rast do iste O.D.600 in je njen XUI nižji. S primerjavo XUI so izbrali najučinkovitejši sev za fiksiranje ogljika, ''E.coli'' BL21 (DE3) in optimizirali rastne pogoje v bioreaktorju. Najnižje XUI so določili pri uporabi gojišča M9 brez glukoze in z 0,4% ksiloze ter v atmosferi s 5% CO2. Za določitev hitrosti fiksiranja ogljika so uporabili pravilo o ohranitvi mase, po postopku opisanem v literaturi [4]. Določili so, da je pripravljen sintezno biološki sistem sposoben fiksirati ogljik s hitrostjo 0,575 mg/L/h in da v biomasi rekombinantne ''E.coli'' 9,1% ogljika izvira iz CO2 [1], [4].

==='''Oblikovanje bioreaktorja'''===

Študenti so pripravili prototip bioreaktorja, ki črpa CO2 in zaznava njegovo koncentracijo, meri temperaturo in pH gojišča ter podatke pošilja v oblak. Sestavljajo ga wi-fi vmesnik, črpalka CO2, zalogovnik za gojišče, predel za gojenje bakterij z magnetnim mešalom, odpad in tri merilni sistemi – termometer, senzor CO2, pH meter in sintezno biološki sistem za zaznavo spremembe pH. Slednji je bil stranski projekt tekmovalne skupine. Pripravili so ''E.coli'', ki se odziva na spremembo pH gojišča, tako da v nevtralnem pH izraža GFP, v kislem pa sfGFP. Posledično se ob zakisanju gojišča njegova barva spremeni iz rumene v zeleno. Kot osnovo so uporabili že obstoječe biokocke iz registra bioloških delov, s pH-občutljivimi promotorji in jih optimizirali za višji nivo izražanja [1].

==='''Programska oprema bioreaktorja'''===

Izdelali so program za spremljanje pogojev bioreaktorja v realnem času in aplikacijo, s katero lahko uporabnik kadarkoli prek wi-fija preveril stanje oz. napredek bioreaktorja [1].

==='''Biovarnost'''===
Uporabljen sev BL21 (DE3) ni patogen za človeka, zato ni nevarnosti okužb ob izpustu. Tudi vanj vneseni geni izvirajo iz človeku nenevarnih organizmov. Poleg tega so na bioreaktor namestili filtre in s testom potrdili, da uspešno preprečujejo izpust GSO v okolje. Načrtovali so tudi povezavo bioreaktorja s sistemom za uporabo odvečne toplote v industriji, s pomočjo katerega bi lahko sterilizirali odpadno gojišče [1].

==ZAKLJUČEK==
Ekipa je razvila sintezno biološki sistem za zmanjšanje izpustov CO2, ostaja pa veliko možnosti za izboljšave, ki bi naredile sistem bolj učinkovit in privlačen za industrijo. V ta namen so se povezali z iGEM ekipo UESTC-China, ki je razvila sistem za predelavo slame v biogorivo, pri katerem nastaja ksiloza kot stranski produkt <ref>iGEM 2018 Team UESTC-China. ''Straw-degrading Energy E.coli.'' Dostopno na: http://2018.igem.org/Team:UESTC-China [pridobljeno 15.12.2018].</ref>. Z umestitvijo bioreaktorja za fiksiranje ogljika navzdol od procesa predelave slame, bi bistveno znižali svoj ogljični odtis in se izognili nabavi velikih količin ksiloze, potrebne za delovanje bioreaktorja. Lahko bi tudi razvili sistem, ki za izrabo CO2 ne potrebuje sladkorja [4], <ref>Antonovsky N, Gleizer S, Noor E, in dr. ''Sugar Synthesis from CO2 in Escherichia coli.'' Cell 2016;166(1):115–25.</ref>. Z uvedbo procesa predelave piruvata v glutamin, bi industrijskemu obratu omogočili dodaten vir zaslužka. Za pospešitev fiksiranja ogljika bi lahko ''E.coli'' gojili v anaerobnih pogojih, kar je zahtevno, a poviša učinkovitost Rubisco, zaradi odsotnosti kisika, ki s CO2 tekmuje za vezavo nanj ali pa bi poiskali alternativo temu encimu <ref>Bar-Even A, Noor E, Lewis NE, Milo R. ''Design and analysis of synthetic carbon fixation pathways.'' PNAS 2010;107(19):8889–94.</ref>.

==VIRI==

<references/>

Of CO2urse - sistem za zmanjševanje izpustov ogljikovega dioksida v industriji

2018-12-17T17:28:51Z

Kity Požek:

Of CO2urse je projekt študentske ekipe 'NCKU Tainan' iz Tajvana, ki je bil nagrajen kot najboljši okoljski projekt na tekmovanju iz sintezne biologije, iGEM 2018. Namen projekta je s pristopi sintezne biologije prispevati k oblikovanju nizkoogljične družbe <ref>iGEM 2018 Team NCKU Tainan. ''Of CO2urse.'' Dostopno na: http://2018.igem.org/Team:NCKU_Tainan [pridobljeno 13.12.2018].</ref>.

==UVOD==
Globalno segrevanje je danes eden največjih okoljskih problemov in med najpomembnejšimi vzroki za učinek tople grede je pretiran izpust ogljikovega dioksida (CO2) v ozračje. Za izpust so v glavnem odgovorne človeške dejavnosti, kot so transport, proizvodnja električne energije in industrija, zaradi katerih se koncentracija tega toplogrednega plina v zraku izrazito povišuje vse od industrijske revolucije dalje. S hkratnim pretiranim izpustom CO2 in krčenjem naravnih ponorov CO2, kot so npr. gozdovi, se ruši naravni cikel ogljika, na kar kaže tudi dejstvo, da se je od leta 1960 do leta 2018 koncentracija CO2 v ozračju dvignila iz 320 ppm na več kot 400 ppm <ref>ProOxygen. ''CO2 Acceleration.'' Dostopno na: https://www.co2.earth/co2-acceleration [pridobljeno 13.12.2018].</ref>, <ref>US EPA. ''Overview of Greenhouse Gases.'' Dostopno na: https://www.epa.gov/ghgemissions/overview-greenhouse-gases [pridobljeno 13.12.2018].</ref>. Učinek tople grede ima za planet že vidne in zaskrbljujoče posledice, kot je npr. taljenje polarnega ledu, posledično dvigovanje gladine morja in manjšanje primernih površin ter pogojev za preživetje obstoječih vrst, višanje temperature morja in s tem rušenje morskega ekosistema itd. Pri obvladovanju izpustov CO2 med drugim pripomorejo raziskave, usmerjene v razvoj načinov za nadzor izpustov in za privzem CO2 iz ozračja. iGEM ekipa iz Tajvana si je v ta namen zamislila projekt, v sklopu katerega so pripravili sintezno biološki sistem, ki bi lahko v industrijskih obratih asimiliral nastali CO2 [1].

==PRISTOP IN IZVEDBA PROJEKTA==
==='''Of CO2urse'''===
Študenti so pripravili prototip bioreaktorja z bakterijami ''E. coli'', v katere so po sistemu biokock vnesli gene cianobakterij za fiksiranje ogljika iz zraka. V bioreaktor so dovajali rastno gojišče s ksilozo kot edinim virom organskega ogljika in CO2 iz jeklenke, pripravljene s tehnologijo zajema in shranjevanja CO2 v industrijskem obratu. Bakterije so privzele CO2 iz zraka in ga pretvorile do piruvata, tega pa bi lahko v nadaljnjih procesih uporabili za pripravo raznih uporabnih spojin (npr. glutamina). Napravo so opremili tudi s senzorji za spremljanje stanja procesa in razvili aplikacijo za enostaven dostop do teh podatkov. Glede dizajna so se posvetovali s strokovnjaki iz tega področja in s končnimi uporabniki v industriji ter skušali upoštevati njihove nasvete in pripraviti učinkovit, varen, čim bolj donosen in cenovno ugoden sistem za pomoč pri zmanjševanju izpustov CO2 v industriji [1].

==='''Priprava ''E.coli'', ki fiksira CO2 '''===

Za pripravo CO2-fiksirajoče ''E.coli'' so konstruirali biokocke z geni za izražanje fosforibulokinaze (PRK), ogljikove anhidraze (CA) in ribuloza-1,5-bisfosfat karboksilaze/oksigenaze (Rubisco). Geni izvirajo iz dveh sevov cianobakterij - ''Synechococcus elongatus'' PCC 7942 in PCC 7002. Zanje so se odločili, ker so v literaturi zasledili, da so se že izkazali kot uspešni za ta namen <ref>Gong F, Liu G, Zhai X, in dr. ''Quantitative analysis of an engineered CO2-fixing Escherichia coli reveals great potential of heterotrophic CO2 fixation.'' Biotechnology for Biofuels 2015;8(1):86.</ref>. Prvi dve biokocki so vstavili v vektor pSB3K3, tretjo pa v pSB1C3 in bakterije kotransformirali z vektorjema. Tako so v ''E.coli'' omogočili potek Calvinovega cikla, ki je ena najpomembnejših poti za fiksiranje ogljika v naravi. Kot šasijo so preizkusili 3 seve ''E.coli'' - BL21 (DE3), W3110, W3110 (L5T7). Odločili so se za uporabo ''E.coli'' BL21 (DE3), ki je dobro rastla ob pogojih v bioreaktorju in se je po vnosu genov za fiksiranje ogljika izkazala kot najsposobnejša izrabe CO2. Prednost ''E.coli'' pred rastlinami, algami in cianobakterijami je, da raste hitreje in bolj robustno, ne potrebuje svetlobe in zato uspešnost gojenja ni odvisna od vremena ter zahteva manjše površine za gojenje [1], [4].

==='''Potek nove presnovne poti v ''E.coli'' '''===

Pripravljene bakterije najprej prek lastne, pentoza-fosfatne poti presnovijo ksilozo iz rastnega gojišča v ribulozo-5-fosfat (Ru5P), ki jo nato z rekombinantnim encimom PRK fosforilirajo do ribuloze-1,5-bisfosfata (RuBP). Sledi karboksilacija RuBP s CO2 iz zraka, s pomočjo rekombinantnega encima Rubisco, pri čemer nastane 3-fosfoglicerat (3-PGA), ki se pretvori v piruvat. Piruvat je multifunkcionalen intermediat različnih anabolnih poti [1].

Pomembno vlogo pri fiksaciji ogljika ima tudi encim CA, ki s pretvarjanjem CO2 v ogljikovo kislino oz. HCO3-, poveča difuzijo plina v celice. Tako imajo bakterije na razpolago več CO2 za fiksiranje, kar je pomembno predvsem zato, ker CO2 tekmuje s kisikom za vezavo na Rubisco. Kljub temu, da ima ''E.coli'' lastno CA, so vanje vstavili še CA cianobakterij, ki je sposobna hitrejše katalize [1], [4].

==='''Učinkovitost izrabe CO2 v ''E.coli'' '''===
Glavni presnovni poti ksiloze v divjem tipu ''E.coli'' sta pentoza-fosfatna pot in glikoliza, v rekombinantni ''E.coli'' pa poleg teh originalnih poti poteka v manjši meri še 'obvozna pot oz. obvoznica CO2' (ang. ''CO2 bypass pathway''). Študenti so razvili matematični model za napoved pretoka ogljika prek ene in druge poti. Obe poti se zaključita z nastankom piruvata, ki vstopa v Krebsov cikel, zato so tudi tega vključili v model presnove ksiloze. S pripravljenim modelom so napovedali količino nastale biomase ''E.coli'' ob pogojih v bioreaktorju oziroma vpliv prisotnosti alternativne presnovne poti ksiloze na rast bakterij. Pravilnost modela so preverili eksperimentalno in pokazali, da lahko z njegovo pomočjo uspešno napovejo obnašanje sistema. S tem so prihranili čas in denar, saj so lahko z uporabo modela v laboratoriju delali bolj usmerjeno. Med drugim so z modelom pokazali, da lahko količino nastalega piruvata spremljajo prek meritev optične gostote (O.D.600) suspenzije bakterij in si s tem olajšali eksperimentalno delo. Ugotovili so, da možnost izrabe CO2 vpliva na rast bakterij, saj so rekombinantne bakterije v atmosferi s 5% CO2 proizvedle več piruvata oziroma so v istem času dosegle višjo O.D.600 kakor v atmosferi brez dodanega CO2 [1].

Za vrednotenje učinkovitosti izrabe obvozne poti CO2 so uvedli indeks izrabe ksiloze (XUI, ang. ''xylose utilisation index'') – hiter, enostaven in uporaben način za oceno sposobnosti bakterij za fiksiranje ogljika, prek meritev O.D.600 celične kulture. XUI omogoča dokaz sposobnosti izrabe CO2 in primerjavo med sevi ''E.coli'' in različnimi pogoji v bioreaktorju. Za opredelitev XUI so naredili 2 predpostavki – da O.D.600 korelira s suho maso bakterij, kar so tudi eksperimentalno dokazali in da je delež ogljika v celici ''E.coli'' stalen oz. se spreminja v ozkem intervalu, kar lahko zanemarimo. Iz tega sledi, da je količina ogljika pri dani O.D.600 fiksna in lahko privzamemo, da je izmerjena vrednost O.D.600 ekvivalentna masi ogljika v celicah. XUI je definiran kot razmerje med porabo ksiloze in O.D.600. Divji tip ''E.coli'' lahko v bioreaktorju kot vir ogljika v glavnem izrablja le ksilozo, torej bo v tem primeru XUI visok. Rekombinantna ''E.coli'' pa lahko izrablja tudi CO2, zato porabi manj ksiloze za rast do iste O.D.600 in je njen XUI nižji. S primerjavo XUI so izbrali najučinkovitejši sev za fiksiranje ogljika, E.coli BL21 (DE3) in optimizirali rastne pogoje v bioreaktorju. Najnižje XUI so določili pri uporabi gojišča M9 brez glukoze in z 0,4% ksiloze ter v atmosferi s 5% CO2. Za določitev hitrosti fiksiranja ogljika so uporabili pravilo o ohranitvi mase, po postopku opisanem v literaturi [4]. Določili so, da je pripravljen sintezno biološki sistem sposoben fiksirati ogljik s hitrostjo 0,575 mg/L/h in da v biomasi rekombinantne ''E.coli'' 9,1% ogljika izvira iz CO2 [1], [4].

==='''Oblikovanje bioreaktorja'''===

Študenti so pripravili prototip bioreaktorja, ki črpa CO2 in zaznava njegovo koncentracijo, meri temperaturo in pH gojišča ter podatke pošilja v oblak. Sestavljajo ga wi-fi vmesnik, črpalka CO2, zalogovnik za gojišče, predel za gojenje bakterij z magnetnim mešalom, odpad in tri merilni sistemi – termometer, senzor CO2, pH meter in sintezno biološki sistem za zaznavo spremembe pH. Slednji je bil stranski projekt tekmovalne skupine. Pripravili so ''E.coli'', ki se odziva na spremembo pH gojišča, tako da v nevtralnem pH izraža GFP, v kislem pa sfGFP. Posledično se ob zakisanju gojišča njegova barva spremeni iz rumene v zeleno. Kot osnovo so uporabili že obstoječe biokocke iz registra bioloških delov, s pH-občutljivimi promotorji in jih optimizirali za višji nivo izražanja [1].

==='''Programska oprema bioreaktorja'''===

Izdelali so program za spremljanje pogojev bioreaktorja v realnem času in aplikacijo, s katero lahko uporabnik kadarkoli prek wi-fija preveril stanje oz. napredek bioreaktorja [1].

==='''Biovarnost'''===
Uporabljen sev BL21 (DE3) ni patogen za človeka, zato ni nevarnosti okužb ob izpustu. Tudi vanj vneseni geni izvirajo iz človeku nenevarnih organizmov. Poleg tega so na bioreaktor namestili filtre in s testom potrdili, da uspešno preprečujejo izpust GSO v okolje. Načrtovali so tudi povezavo bioreaktorja s sistemom za uporabo odvečne toplote v industriji, s pomočjo katerega bi lahko sterilizirali odpadno gojišče [1].

==ZAKLJUČEK==
Ekipa je razvila sintezno biološki sistem za zmanjšanje izpustov CO2, ostaja pa veliko možnosti za izboljšave, ki bi naredile sistem bolj učinkovit in privlačen za industrijo. V ta namen so se povezali z iGEM ekipo UESTC-China, ki je razvila sistem za predelavo slame v biogorivo, pri katerem nastaja ksiloza kot stranski produkt <ref>iGEM 2018 Team UESTC-China. ''Straw-degrading Energy E.coli.'' Dostopno na: http://2018.igem.org/Team:UESTC-China [pridobljeno 15.12.2018].</ref>. Z umestitvijo bioreaktorja za fiksiranje ogljika navzdol od procesa predelave slame, bi bistveno znižali svoj ogljični odtis in se izognili nabavi velikih količin ksiloze, potrebne za delovanje bioreaktorja. Lahko bi tudi razvili sistem, ki za izrabo CO2 ne potrebuje sladkorja [4], <ref>Antonovsky N, Gleizer S, Noor E, in dr. ''Sugar Synthesis from CO2 in Escherichia coli.'' Cell 2016;166(1):115–25.</ref>. Z uvedbo procesa predelave piruvata v glutamin, bi industrijskemu obratu omogočili dodaten vir zaslužka. Za pospešitev fiksiranja ogljika bi lahko ''E.coli'' gojili v anaerobnih pogojih, kar je zahtevno, a poviša učinkovitost Rubisco, zaradi odsotnosti kisika, ki s CO2 tekmuje za vezavo nanj ali pa bi poiskali alternativo temu encimu <ref>Bar-Even A, Noor E, Lewis NE, Milo R. ''Design and analysis of synthetic carbon fixation pathways.'' PNAS 2010;107(19):8889–94.</ref>.

==VIRI==

<references/>

Of CO2urse - sistem za zmanjševanje izpustov ogljikovega dioksida v industriji

2018-12-17T17:27:53Z

Kity Požek:

Of CO2urse je projekt študentske ekipe 'NCKU Tainan' iz Tajvana, ki je bil nagrajen kot najboljši okoljski projekt na tekmovanju iz sintezne biologije, iGEM 2018. Namen projekta je s pristopi sintezne biologije prispevati k oblikovanju nizkoogljične družbe <ref>iGEM 2018 Team NCKU Tainan. ''Of CO2urse.'' Dostopno na: http://2018.igem.org/Team:NCKU_Tainan [pridobljeno 13.12.2018].</ref>.

==UVOD==
Globalno segrevanje je danes eden največjih okoljskih problemov in med najpomembnejšimi vzroki za učinek tople grede je pretiran izpust ogljikovega dioksida (CO2) v ozračje. Za izpust so v glavnem odgovorne človeške dejavnosti, kot so transport, proizvodnja električne energije in industrija, zaradi katerih se koncentracija tega toplogrednega plina v zraku izrazito povišuje vse od industrijske revolucije dalje. S hkratnim pretiranim izpustom CO2 in krčenjem naravnih ponorov CO2, kot so npr. gozdovi, se ruši naravni cikel ogljika, na kar kaže tudi dejstvo, da se je od leta 1960 do leta 2018 koncentracija CO2 v ozračju dvignila iz 320 ppm na več kot 400 ppm <ref>ProOxygen. ''CO2 Acceleration.'' Dostopno na: https://www.co2.earth/co2-acceleration [pridobljeno 13.12.2018].</ref>, <ref>US EPA. ''Overview of Greenhouse Gases.'' Dostopno na: https://www.epa.gov/ghgemissions/overview-greenhouse-gases [pridobljeno 13.12.2018].</ref>. Učinek tople grede ima za planet že vidne in zaskrbljujoče posledice, kot je npr. taljenje polarnega ledu, posledično dvigovanje gladine morja in manjšanje primernih površin ter pogojev za preživetje obstoječih vrst, višanje temperature morja in s tem rušenje morskega ekosistema itd. Pri obvladovanju izpustov CO2 med drugim pripomorejo raziskave, usmerjene v razvoj načinov za nadzor izpustov in za privzem CO2 iz ozračja. iGEM ekipa iz Tajvana si je v ta namen zamislila projekt, v sklopu katerega so pripravili sintezno biološki sistem, ki bi lahko v industrijskih obratih asimiliral nastali CO2 [1].

==PRISTOP IN IZVEDBA PROJEKTA==
==='''Of CO2urse'''===
Študenti so pripravili prototip bioreaktorja z bakterijami ''E. coli'', v katere so po sistemu biokock vnesli gene cianobakterij za fiksiranje ogljika iz zraka. V bioreaktor so dovajali rastno gojišče s ksilozo kot edinim virom organskega ogljika in CO2 iz jeklenke, pripravljene s tehnologijo zajema in shranjevanja CO2 v industrijskem obratu. Bakterije so privzele CO2 iz zraka in ga pretvorile do piruvata, tega pa bi lahko v nadaljnjih procesih uporabili za pripravo raznih uporabnih spojin (npr. glutamina). Napravo so opremili tudi s senzorji za spremljanje stanja procesa in razvili aplikacijo za enostaven dostop do teh podatkov. Glede dizajna so se posvetovali s strokovnjaki iz tega področja in s končnimi uporabniki v industriji ter skušali upoštevati njihove nasvete in pripraviti učinkovit, varen, čim bolj donosen in cenovno ugoden sistem za pomoč pri zmanjševanju izpustov CO2 v industriji [1].

==='''Priprava ''E.coli'', ki fiksira CO2 '''===

Za pripravo CO2-fiksirajoče ''E.coli'' so konstruirali biokocke z geni za izražanje fosforibulokinaze (PRK), ogljikove anhidraze (CA) in ribuloza-1,5-bisfosfat karboksilaze/oksigenaze (Rubisco). Geni izvirajo iz dveh sevov cianobakterij - ''Synechococcus elongatus'' PCC 7942 in PCC 7002. Zanje so se odločili, ker so v literaturi zasledili, da so se že izkazali kot uspešni za ta namen <ref>Gong F, Liu G, Zhai X, in dr. ''Quantitative analysis of an engineered CO2-fixing Escherichia coli reveals great potential of heterotrophic CO2 fixation.'' Biotechnology for Biofuels 2015;8(1):86.</ref>. Prvi dve biokocki so vstavili v vektor pSB3K3, tretjo pa v pSB1C3 in bakterije kotransformirali z vektorjema. Tako so v ''E.coli'' omogočili potek Calvinovega cikla, ki je ena najpomembnejših poti za fiksiranje ogljika v naravi. Kot šasijo so preizkusili 3 seve ''E.coli'' - BL21 (DE3), W3110, W3110 (L5T7). Odločili so se za uporabo ''E.coli'' BL21 (DE3), ki je dobro rastla ob pogojih v bioreaktorju in se je po vnosu genov za fiksiranje ogljika izkazala kot najsposobnejša izrabe CO2. Prednost ''E.coli'' pred rastlinami, algami in cianobakterijami je, da raste hitreje in bolj robustno, ne potrebuje svetlobe in zato uspešnost gojenja ni odvisna od vremena ter zahteva manjše površine za gojenje [1], [4].

==='''Potek nove presnovne poti v ''E.coli'' '''===

Pripravljene bakterije najprej prek lastne, pentoza-fosfatne poti presnovijo ksilozo iz rastnega gojišča v ribulozo-5-fosfat (Ru5P), ki jo nato z rekombinantnim encimom PRK fosforilirajo do ribuloze-1,5-bisfosfata (RuBP). Sledi karboksilacija RuBP s CO2 iz zraka, s pomočjo rekombinantnega encima Rubisco, pri čemer nastane 3-fosfoglicerat (3-PGA), ki se pretvori v piruvat. Piruvat je multifunkcionalen intermediat različnih anabolnih poti [1].

Pomembno vlogo pri fiksaciji ogljika ima tudi encim CA, ki s pretvarjanjem CO2 v ogljikovo kislino oz. HCO3-, poveča difuzijo plina v celice. Tako imajo bakterije na razpolago več CO2 za fiksiranje, kar je pomembno predvsem zato, ker CO2 tekmuje s kisikom za vezavo na Rubisco. Kljub temu, da ima E.coli lastno CA, so vanje vstavili še CA cianobakterij, ki je sposobna hitrejše katalize [1], [4].

==='''Učinkovitost izrabe CO2 v ''E.coli'' '''===
Glavni presnovni poti ksiloze v divjem tipu ''E.coli'' sta pentoza-fosfatna pot in glikoliza, v rekombinantni ''E.coli'' pa poleg teh originalnih poti poteka v manjši meri še 'obvozna pot oz. obvoznica CO2' (ang. ''CO2 bypass pathway''). Študenti so razvili matematični model za napoved pretoka ogljika prek ene in druge poti. Obe poti se zaključita z nastankom piruvata, ki vstopa v Krebsov cikel, zato so tudi tega vključili v model presnove ksiloze. S pripravljenim modelom so napovedali količino nastale biomase ''E.coli'' ob pogojih v bioreaktorju oziroma vpliv prisotnosti alternativne presnovne poti ksiloze na rast bakterij. Pravilnost modela so preverili eksperimentalno in pokazali, da lahko z njegovo pomočjo uspešno napovejo obnašanje sistema. S tem so prihranili čas in denar, saj so lahko z uporabo modela v laboratoriju delali bolj usmerjeno. Med drugim so z modelom pokazali, da lahko količino nastalega piruvata spremljajo prek meritev optične gostote (O.D.600) suspenzije bakterij in si s tem olajšali eksperimentalno delo. Ugotovili so, da možnost izrabe CO2 vpliva na rast bakterij, saj so rekombinantne bakterije v atmosferi s 5% CO2 proizvedle več piruvata oziroma so v istem času dosegle višjo O.D.600 kakor v atmosferi brez dodanega CO2 [1].

Za vrednotenje učinkovitosti izrabe obvozne poti CO2 so uvedli indeks izrabe ksiloze (XUI, ang. ''xylose utilisation index'') – hiter, enostaven in uporaben način za oceno sposobnosti bakterij za fiksiranje ogljika, prek meritev O.D.600 celične kulture. XUI omogoča dokaz sposobnosti izrabe CO2 in primerjavo med sevi ''E.coli'' in različnimi pogoji v bioreaktorju. Za opredelitev XUI so naredili 2 predpostavki – da O.D.600 korelira s suho maso bakterij, kar so tudi eksperimentalno dokazali in da je delež ogljika v celici ''E.coli'' stalen oz. se spreminja v ozkem intervalu, kar lahko zanemarimo. Iz tega sledi, da je količina ogljika pri dani O.D.600 fiksna in lahko privzamemo, da je izmerjena vrednost O.D.600 ekvivalentna masi ogljika v celicah. XUI je definiran kot razmerje med porabo ksiloze in O.D.600. Divji tip ''E.coli'' lahko v bioreaktorju kot vir ogljika v glavnem izrablja le ksilozo, torej bo v tem primeru XUI visok. Rekombinantna ''E.coli'' pa lahko izrablja tudi CO2, zato porabi manj ksiloze za rast do iste O.D.600 in je njen XUI nižji. S primerjavo XUI so izbrali najučinkovitejši sev za fiksiranje ogljika, E.coli BL21 (DE3) in optimizirali rastne pogoje v bioreaktorju. Najnižje XUI so določili pri uporabi gojišča M9 brez glukoze in z 0,4% ksiloze ter v atmosferi s 5% CO2. Za določitev hitrosti fiksiranja ogljika so uporabili pravilo o ohranitvi mase, po postopku opisanem v literaturi [4]. Določili so, da je pripravljen sintezno biološki sistem sposoben fiksirati ogljik s hitrostjo 0,575 mg/L/h in da v biomasi rekombinantne ''E.coli'' 9,1% ogljika izvira iz CO2 [1], [4].

==='''Oblikovanje bioreaktorja'''===

Študenti so pripravili prototip bioreaktorja, ki črpa CO2 in zaznava njegovo koncentracijo, meri temperaturo in pH gojišča ter podatke pošilja v oblak. Sestavljajo ga wi-fi vmesnik, črpalka CO2, zalogovnik za gojišče, predel za gojenje bakterij z magnetnim mešalom, odpad in tri merilni sistemi – termometer, senzor CO2, pH meter in sintezno biološki sistem za zaznavo spremembe pH. Slednji je bil stranski projekt tekmovalne skupine. Pripravili so ''E.coli'', ki se odziva na spremembo pH gojišča, tako da v nevtralnem pH izraža GFP, v kislem pa sfGFP. Posledično se ob zakisanju gojišča njegova barva spremeni iz rumene v zeleno. Kot osnovo so uporabili že obstoječe biokocke iz registra bioloških delov, s pH-občutljivimi promotorji in jih optimizirali za višji nivo izražanja [1].

==='''Programska oprema bioreaktorja'''===

Izdelali so program za spremljanje pogojev bioreaktorja v realnem času in aplikacijo, s katero lahko uporabnik kadarkoli prek wi-fija preveril stanje oz. napredek bioreaktorja [1].

==='''Biovarnost'''===
Uporabljen sev BL21 (DE3) ni patogen za človeka, zato ni nevarnosti okužb ob izpustu. Tudi vanj vneseni geni izvirajo iz človeku nenevarnih organizmov. Poleg tega so na bioreaktor namestili filtre in s testom potrdili, da uspešno preprečujejo izpust GSO v okolje. Načrtovali so tudi povezavo bioreaktorja s sistemom za uporabo odvečne toplote v industriji, s pomočjo katerega bi lahko sterilizirali odpadno gojišče [1].

==ZAKLJUČEK==
Ekipa je razvila sintezno biološki sistem za zmanjšanje izpustov CO2, ostaja pa veliko možnosti za izboljšave, ki bi naredile sistem bolj učinkovit in privlačen za industrijo. V ta namen so se povezali z iGEM ekipo UESTC-China, ki je razvila sistem za predelavo slame v biogorivo, pri katerem nastaja ksiloza kot stranski produkt <ref>iGEM 2018 Team UESTC-China. ''Straw-degrading Energy E.coli.'' Dostopno na: http://2018.igem.org/Team:UESTC-China [pridobljeno 15.12.2018].</ref>. Z umestitvijo bioreaktorja za fiksiranje ogljika navzdol od procesa predelave slame, bi bistveno znižali svoj ogljični odtis in se izognili nabavi velikih količin ksiloze, potrebne za delovanje bioreaktorja. Lahko bi tudi razvili sistem, ki za izrabo CO2 ne potrebuje sladkorja [4], <ref>Antonovsky N, Gleizer S, Noor E, in dr. ''Sugar Synthesis from CO2 in Escherichia coli.'' Cell 2016;166(1):115–25.</ref>. Z uvedbo procesa predelave piruvata v glutamin, bi industrijskemu obratu omogočili dodaten vir zaslužka. Za pospešitev fiksiranja ogljika bi lahko ''E.coli'' gojili v anaerobnih pogojih, kar je zahtevno, a poviša učinkovitost Rubisco, zaradi odsotnosti kisika, ki s CO2 tekmuje za vezavo nanj ali pa bi poiskali alternativo temu encimu <ref>Bar-Even A, Noor E, Lewis NE, Milo R. ''Design and analysis of synthetic carbon fixation pathways.'' PNAS 2010;107(19):8889–94.</ref>.

==VIRI==

<references/>

Of CO2urse - sistem za zmanjševanje izpustov ogljikovega dioksida v industriji

2018-12-17T17:26:02Z

Kity Požek:

Of CO2urse je projekt študentske ekipe 'NCKU Tainan' iz Tajvana, ki je bil nagrajen kot najboljši okoljski projekt na tekmovanju iz sintezne biologije, iGEM 2018. Namen projekta je s pristopi sintezne biologije prispevati k oblikovanju nizkoogljične družbe <ref>iGEM 2018 Team NCKU Tainan. ''Of CO2urse.'' Dostopno na: http://2018.igem.org/Team:NCKU_Tainan [pridobljeno 13.12.2018].</ref>.

==UVOD==
Globalno segrevanje je danes eden največjih okoljskih problemov in med najpomembnejšimi vzroki za učinek tople grede je pretiran izpust ogljikovega dioksida (CO2) v ozračje. Za izpust so v glavnem odgovorne človeške dejavnosti, kot so transport, proizvodnja električne energije in industrija, zaradi katerih se koncentracija tega toplogrednega plina v zraku izrazito povišuje vse od industrijske revolucije dalje. S hkratnim pretiranim izpustom CO2 in krčenjem naravnih ponorov CO2, kot so npr. gozdovi, se ruši naravni cikel ogljika, na kar kaže tudi dejstvo, da se je od leta 1960 do leta 2018 koncentracija CO2 v ozračju dvignila iz 320 ppm na več kot 400 ppm <ref>ProOxygen. ''CO2 Acceleration.'' Dostopno na: https://www.co2.earth/co2-acceleration [pridobljeno 13.12.2018].</ref>, <ref>US EPA. ''Overview of Greenhouse Gases.'' Dostopno na: https://www.epa.gov/ghgemissions/overview-greenhouse-gases [pridobljeno 13.12.2018].</ref>. Učinek tople grede ima za planet že vidne in zaskrbljujoče posledice, kot je npr. taljenje polarnega ledu, posledično dvigovanje gladine morja in manjšanje primernih površin ter pogojev za preživetje obstoječih vrst, višanje temperature morja in s tem rušenje morskega ekosistema itd. Pri obvladovanju izpustov CO2 med drugim pripomorejo raziskave, usmerjene v razvoj načinov za nadzor izpustov in za privzem CO2 iz ozračja. iGEM ekipa iz Tajvana si je v ta namen zamislila projekt, v sklopu katerega so pripravili sintezno biološki sistem, ki bi lahko v industrijskih obratih asimiliral nastali CO2 [1].

==PRISTOP IN IZVEDBA PROJEKTA==
==='''Of CO2urse'''===
Študenti so pripravili prototip bioreaktorja z bakterijami ''E. coli'', v katere so po sistemu biokock vnesli gene cianobakterij za fiksiranje ogljika iz zraka. V bioreaktor so dovajali rastno gojišče s ksilozo kot edinim virom organskega ogljika in CO2 iz jeklenke, pripravljene s tehnologijo zajema in shranjevanja CO2 v industrijskem obratu. Bakterije so privzele CO2 iz zraka in ga pretvorile do piruvata, tega pa bi lahko v nadaljnjih procesih uporabili za pripravo raznih uporabnih spojin (npr. glutamina). Napravo so opremili tudi s senzorji za spremljanje stanja procesa in razvili aplikacijo za enostaven dostop do teh podatkov. Glede dizajna so se posvetovali s strokovnjaki iz tega področja in s končnimi uporabniki v industriji ter skušali upoštevati njihove nasvete in pripraviti učinkovit, varen, čim bolj donosen in cenovno ugoden sistem za pomoč pri zmanjševanju izpustov CO2 v industriji [1].

==='''Priprava ''E.coli'', ki fiksira CO2 '''===

Za pripravo CO2-fiksirajoče ''E.coli'' so konstruirali biokocke z geni za izražanje fosforibulokinaze (PRK), ogljikove anhidraze (CA) in ribuloza-1,5-bisfosfat karboksilaze/oksigenaze (Rubisco). Geni izvirajo iz dveh sevov cianobakterij - ''Synechococcus elongatus'' PCC 7942 in PCC 7002. Zanje so se odločili, ker so v literaturi zasledili, da so se že izkazali kot uspešni za ta namen <ref>Gong F, Liu G, Zhai X, in dr. ''Quantitative analysis of an engineered CO2-fixing Escherichia coli reveals great potential of heterotrophic CO2 fixation.'' Biotechnology for Biofuels 2015;8(1):86.</ref>. Prvi dve biokocki so vstavili v vektor pSB3K3, tretjo pa v pSB1C3 in bakterije kotransformirali z vektorjema. Tako so v ''E.coli'' omogočili potek Calvinovega cikla, ki je ena najpomembnejših poti za fiksiranje ogljika v naravi. Kot šasijo so preizkusili 3 seve ''E.coli'' - BL21 (DE3), W3110, W3110 (L5T7). Odločili so se za uporabo ''E.coli'' BL21 (DE3), ki je dobro rastla ob pogojih v bioreaktorju in se je po vnosu genov za fiksiranje ogljika izkazala kot najsposobnejša izrabe CO2. Prednost ''E.coli'' pred rastlinami, algami in cianobakterijami je, da raste hitreje in bolj robustno, ne potrebuje svetlobe in zato uspešnost gojenja ni odvisna od vremena ter zahteva manjše površine za gojenje [1], [4].

==='''Potek nove presnovne poti v ''E.coli'' '''===

Pripravljene bakterije najprej prek lastne, pentoza-fosfatne poti presnovijo ksilozo iz rastnega gojišča v ribulozo-5-fosfat (Ru5P), ki jo nato z rekombinantnim encimom PRK fosforilirajo do ribuloze-1,5-bisfosfata (RuBP). Sledi karboksilacija RuBP s CO2 iz zraka, s pomočjo rekombinantnega encima Rubisco, pri čemer nastane 3-fosfoglicerat (3-PGA), ki se pretvori v piruvat. Piruvat je multifunkcionalen intermediat različnih anabolnih poti [1].

Pomembno vlogo pri fiksaciji ogljika ima tudi encim CA, ki s pretvarjanjem CO2 v ogljikovo kislino oz. HCO3-, poveča difuzijo plina v celice. Tako imajo bakterije na razpolago več CO2 za fiksiranje, kar je pomembno predvsem zato, ker CO2 tekmuje s kisikom za vezavo na Rubisco. Kljub temu, da ima E.coli lastno CA, so vanje vstavili še CA cianobakterij, ki je sposobna hitrejše katalize [1], [4].

==='''Učinkovitost izrabe CO2 v ''E.coli'' '''===
Glavni presnovni poti ksiloze v divjem tipu ''E.coli'' sta pentoza-fosfatna pot in glikoliza, v rekombinantni ''E.coli'' pa poleg teh originalnih poti poteka v manjši meri še 'obvozna pot oz. obvoznica CO2' (ang. ''CO2 bypass pathway''). Študenti so razvili matematični model za napoved pretoka ogljika prek ene in druge poti. Obe poti se zaključita z nastankom piruvata, ki vstopa v Krebsov cikel, zato so tudi tega vključili v model presnove ksiloze. S pripravljenim modelom so napovedali količino nastale biomase ''E.coli'' ob pogojih v bioreaktorju oziroma vpliv prisotnosti alternativne presnovne poti ksiloze na rast bakterij. Pravilnost modela so preverili eksperimentalno in pokazali, da lahko z njegovo pomočjo uspešno napovejo obnašanje sistema. S tem so prihranili čas in denar, saj so lahko z uporabo modela v laboratoriju delali bolj usmerjeno. Med drugim so z modelom pokazali, da lahko količino nastalega piruvata spremljajo prek meritev optične gostote (O.D.600) suspenzije bakterij in si s tem olajšali eksperimentalno delo. Ugotovili so, da možnost izrabe CO2 vpliva na rast bakterij, saj so rekombinantne bakterije v atmosferi s 5% CO2 proizvedle več piruvata oziroma so v istem času dosegle višjo O.D.600 kakor v atmosferi brez dodanega CO2 [1].

Za vrednotenje učinkovitosti izrabe obvozne poti CO2 so uvedli indeks izrabe ksiloze (XUI, ang. ''xylose utilisation index'') – hiter, enostaven in uporaben način za oceno sposobnosti bakterij za fiksiranje ogljika, prek meritev O.D.600 celične kulture. XUI omogoča dokaz sposobnosti izrabe CO2 in primerjavo med sevi ''E.coli'' in različnimi pogoji v bioreaktorju. Za opredelitev XUI so naredili 2 predpostavki – da O.D.600 korelira s suho maso bakterij, kar so tudi eksperimentalno dokazali in da je delež ogljika v celici ''E.coli'' stalen oz. se spreminja v ozkem intervalu, kar lahko zanemarimo. Iz tega sledi, da je količina ogljika pri dani O.D.600 fiksna in lahko privzamemo, da je izmerjena vrednost O.D.600 ekvivalentna masi ogljika v celicah. XUI je definiran kot razmerje med porabo ksiloze in O.D.600. Divji tip ''E.coli'' lahko v bioreaktorju kot vir ogljika v glavnem izrablja le ksilozo, torej bo v tem primeru XUI visok. Rekombinantna ''E.coli'' pa lahko izrablja tudi CO2, zato porabi manj ksiloze za rast do iste O.D.600 in je njen XUI nižji. S primerjavo XUI so izbrali najučinkovitejši sev za fiksiranje ogljika, E.coli BL21 (DE3) in optimizirali rastne pogoje v bioreaktorju. Najnižje XUI so določili pri uporabi gojišča M9 brez glukoze in z 0,4% ksiloze ter v atmosferi s 5% CO2. Za določitev hitrosti fiksiranja ogljika so uporabili pravilo o ohranitvi mase, po postopku opisanem v literaturi [4]. Določili so, da je pripravljen sintezno biološki sistem sposoben fiksirati ogljik s hitrostjo 0,575 mg/L/h in da v biomasi rekombinantne ''E.coli'' 9,1% ogljika izvira iz CO2 [1], [4].

==='''Oblikovanje bioreaktorja'''===

Študenti so pripravili prototip bioreaktorja, ki črpa CO2 in zaznava njegovo koncentracijo, meri temperaturo in pH gojišča ter podatke pošilja v oblak. Sestavljajo ga wi-fi vmesnik, črpalka CO2, zalogovnik za gojišče, predel za gojenje bakterij z magnetnim mešalom, odpad in tri merilni sistemi – termometer, senzor CO2, pH meter in sintezno biološki sistem za zaznavo spremembe pH. Slednji je bil stranski projekt tekmovalne skupine. Pripravili so ''E.coli'', ki se odziva na spremembo pH gojišča, tako da v nevtralnem pH izraža GFP, v kislem pa sfGFP. Posledično se ob zakisanju gojišča njegova barva spremeni iz rumene v zeleno. Kot osnovo so uporabili že obstoječe biokocke iz registra bioloških delov, s pH-občutljivimi promotorji in jih optimizirali za višji nivo izražanja [1].

==='''Programska oprema bioreaktorja'''===

Izdelali so program za spremljanje pogojev bioreaktorja v realnem času in aplikacijo, s katero lahko uporabnik kadarkoli prek wi-fija preveril stanje oz. napredek bioreaktorja [1].

==='''Biovarnost'''===
Uporabljen sev BL21 (DE3) ni patogen za človeka, zato ni nevarnosti okužb ob izpustu. Tudi vanj vneseni geni izvirajo iz človeku nenevarnih organizmov. Poleg tega so na bioreaktor namestili filtre in s testom potrdili, da uspešno preprečujejo izpust GSO v okolje. Načrtovali so tudi povezavo bioreaktorja s sistemom za uporabo odvečne toplote v industriji, s pomočjo katerega bi lahko sterilizirali odpadno gojišče [1].

==ZAKLJUČEK==
Ekipa je razvila sintezno biološki sistem za zmanjšanje izpustov CO2, ostaja pa veliko možnosti za izboljšave, ki bi naredile sistem bolj učinkovit in privlačen za industrijo. V ta namen so se povezali z iGEM ekipo UESTC-China, ki je razvila sistem za predelavo slame v biogorivo, pri katerem nastaja ksiloza kot stranski produkt <ref>iGEM 2018 Team UESTC-China. ''Straw-degrading Energy E.coli.'' Dostopno na: http://2018.igem.org/Team:UESTC-China [pridobljeno 15.12.2018].</ref>. Z umestitvijo bioreaktorja za fiksiranje ogljika navzdol od procesa predelave slame, bi bistveno znižali svoj ogljični odtis in se izognili nabavi velikih količin ksiloze, potrebne za delovanje bioreaktorja. Lahko bi tudi razvili sistem, ki za izrabo CO2 ne potrebuje sladkorja [4], <ref>Antonovsky N, Gleizer S, Noor E, in dr. ''Sugar Synthesis from CO2 in Escherichia coli.'' Cell 2016;166(1):115–25.</ref>. Z uvedbo procesa predelave piruvata v glutamin, bi industrijskemu obratu omogočili dodaten vir zaslužka. Za pospešitev fiksiranja ogljika bi lahko ''E.coli'' gojili v anaerobnih pogojih, kar je zahtevno, a poviša učinkovitost Rubisco, zaradi odsotnosti kisika, ki s CO2 tekmuje za vezavo nanj ali pa bi poiskali alternativo temu encimu <ref>Bar-Even A, Noor E, Lewis NE, Milo R. ''Design and analysis of synthetic carbon fixation pathways.'' PNAS 2010;107(19):8889–94.</ref>.

==VIRI==

<references/>

Of CO2urse - sistem za zmanjševanje izpustov ogljikovega dioksida v industriji

2018-12-17T17:22:57Z

Kity Požek:

Of CO2urse je projekt študentske ekipe 'NCKU Tainan' iz Tajvana, ki je bil nagrajen kot najboljši okoljski projekt na tekmovanju iz sintezne biologije, iGEM 2018. Namen projekta je s pristopi sintezne biologije prispevati k oblikovanju nizkoogljične družbe <ref>iGEM 2018 Team NCKU Tainan. ''Of CO2urse.'' Dostopno na: http://2018.igem.org/Team:NCKU_Tainan [pridobljeno 13.12.2018].</ref>.

==UVOD==
Globalno segrevanje je danes eden največjih okoljskih problemov in med najpomembnejšimi vzroki za učinek tople grede je pretiran izpust ogljikovega dioksida (CO2) v ozračje. Za izpust so v glavnem odgovorne človeške dejavnosti, kot so transport, proizvodnja električne energije in industrija, zaradi katerih se koncentracija tega toplogrednega plina v zraku izrazito povišuje vse od industrijske revolucije dalje. S hkratnim pretiranim izpustom CO2 in krčenjem naravnih ponorov CO2, kot so npr. gozdovi, se ruši naravni cikel ogljika, na kar kaže tudi dejstvo, da se je od leta 1960 do leta 2018 koncentracija CO2 v ozračju dvignila iz 320 ppm na več kot 400 ppm <ref>ProOxygen. ''CO2 Acceleration.'' Dostopno na: https://www.co2.earth/co2-acceleration [pridobljeno 13.12.2018].</ref>, <ref>US EPA. ''Overview of Greenhouse Gases.'' Dostopno na: https://www.epa.gov/ghgemissions/overview-greenhouse-gases [pridobljeno 13.12.2018].</ref>. Učinek tople grede ima za planet že vidne in zaskrbljujoče posledice, kot je npr. taljenje polarnega ledu, posledično dvigovanje gladine morja in manjšanje primernih površin ter pogojev za preživetje obstoječih vrst, višanje temperature morja in s tem rušenje morskega ekosistema itd. Pri obvladovanju izpustov CO2 med drugim pripomorejo raziskave, usmerjene v razvoj načinov za nadzor izpustov in za privzem CO2 iz ozračja. iGEM ekipa iz Tajvana si je v ta namen zamislila projekt, v sklopu katerega so pripravili sintezno biološki sistem, ki bi lahko v industrijskih obratih asimiliral nastali CO2 [1].

==PRISTOP IN IZVEDBA PROJEKTA==
==='''Of CO2urse'''===
Študenti so pripravili prototip bioreaktorja z bakterijami ''E. coli'', v katere so po sistemu biokock vnesli gene cianobakterij za fiksiranje ogljika iz zraka. V bioreaktor so dovajali rastno gojišče s ksilozo kot edinim virom organskega ogljika in CO2 iz jeklenke, pripravljene s tehnologijo zajema in shranjevanja CO2 v industrijskem obratu. Bakterije so privzele CO2 iz zraka in ga pretvorile do piruvata, tega pa bi lahko v nadaljnjih procesih uporabili za pripravo raznih uporabnih spojin (npr. glutamina). Napravo so opremili tudi s senzorji za spremljanje stanja procesa in razvili aplikacijo za enostaven dostop do teh podatkov. Glede dizajna so se posvetovali s strokovnjaki iz tega področja in s končnimi uporabniki v industriji ter skušali upoštevati njihove nasvete in pripraviti učinkovit, varen, čim bolj donosen in cenovno ugoden sistem za pomoč pri zmanjševanju izpustov CO2 v industriji [1].

==='''Priprava ''E.coli'', ki fiksira CO2 '''===

Za pripravo CO2-fiksirajoče ''E.coli'' so konstruirali biokocke z geni za izražanje fosforibulokinaze (PRK), ogljikove anhidraze (CA) in ribuloza-1,5-bisfosfat karboksilaze/oksigenaze (Rubisco). Geni izvirajo iz dveh sevov cianobakterij - ''Synechococcus elongatus'' PCC 7942 in PCC 7002. Zanje so se odločili, ker so v literaturi zasledili, da so se že izkazali kot uspešni za ta namen <ref>Gong F, Liu G, Zhai X, in dr. ''Quantitative analysis of an engineered CO2-fixing Escherichia coli reveals great potential of heterotrophic CO2 fixation.'' Biotechnology for Biofuels 2015;8(1):86.</ref>. Prvi dve biokocki so vstavili v vektor pSB3K3, tretjo pa v pSB1C3 in bakterije kotransformirali z vektorjema. Tako so v ''E.coli'' omogočili potek Calvinovega cikla, ki je ena najpomembnejših poti za fiksiranje ogljika v naravi. Kot šasijo so preizkusili 3 seve ''E.coli'' - BL21 (DE3), W3110, W3110 (L5T7). Odločili so se za uporabo ''E.coli'' BL21 (DE3), ki je dobro rastla ob pogojih v bioreaktorju in se je po vnosu genov za fiksiranje ogljika izkazala kot najsposobnejša izrabe CO2. Prednost ''E.coli'' pred rastlinami, algami in cianobakterijami je, da raste hitreje in bolj robustno, ne potrebuje svetlobe in zato uspešnost gojenja ni odvisna od vremena ter zahteva manjše površine za gojenje [1], [4].

==='''Potek nove presnovne poti v ''E.coli'' '''===

Pripravljene bakterije najprej prek lastne, pentoza-fosfatne poti presnovijo ksilozo iz rastnega gojišča v ribulozo-5-fosfat (Ru5P), ki jo nato z rekombinantnim encimom PRK fosforilirajo do ribuloze-1,5-bisfosfata (RuBP). Sledi karboksilacija RuBP s CO2 iz zraka, s pomočjo rekombinantnega encima Rubisco, pri čemer nastane 3-fosfoglicerat (3-PGA), ki se pretvori v piruvat. Piruvat je multifunkcionalen intermediat različnih anabolnih poti [1].
Pomembno vlogo pri fiksaciji ogljika ima tudi encim CA, ki s pretvarjanjem CO2 v ogljikovo kislino oz. HCO3-, poveča difuzijo plina v celice. Tako imajo bakterije na razpolago več CO2 za fiksiranje, kar je pomembno predvsem zato, ker CO2 tekmuje s kisikom za vezavo na Rubisco. Kljub temu, da ima E.coli lastno CA, so vanje vstavili še CA cianobakterij, ki je sposobna hitrejše katalize [1], [4].

==='''Učinkovitost izrabe CO2 v ''E.coli'' '''===
Glavni presnovni poti ksiloze v divjem tipu ''E.coli'' sta pentoza-fosfatna pot in glikoliza, v rekombinantni ''E.coli'' pa poleg teh originalnih poti poteka v manjši meri še 'obvozna pot oz. obvoznica CO2' (ang. ''CO2 bypass pathway''). Študenti so razvili matematični model za napoved pretoka ogljika prek ene in druge poti. Obe poti se zaključita z nastankom piruvata, ki vstopa v Krebsov cikel, zato so tudi tega vključili v model presnove ksiloze. S pripravljenim modelom so napovedali količino nastale biomase ''E.coli'' ob pogojih v bioreaktorju oziroma vpliv prisotnosti alternativne presnovne poti ksiloze na rast bakterij. Pravilnost modela so preverili eksperimentalno in pokazali, da lahko z njegovo pomočjo uspešno napovejo obnašanje sistema. S tem so prihranili čas in denar, saj so lahko z uporabo modela v laboratoriju delali bolj usmerjeno. Med drugim so z modelom pokazali, da lahko količino nastalega piruvata spremljajo prek meritev optične gostote (O.D.600) suspenzije bakterij in si s tem olajšali eksperimentalno delo. Ugotovili so, da možnost izrabe CO2 vpliva na rast bakterij, saj so rekombinantne bakterije v atmosferi s 5% CO2 proizvedle več piruvata oziroma so v istem času dosegle višjo O.D.600 kakor v atmosferi brez dodanega CO2 [1].

Za vrednotenje učinkovitosti izrabe obvozne poti CO2 so uvedli indeks izrabe ksiloze (XUI, ang. ''xylose utilisation index'') – hiter, enostaven in uporaben način za oceno sposobnosti bakterij za fiksiranje ogljika, prek meritev O.D.600 celične kulture. XUI omogoča dokaz sposobnosti izrabe CO2 in primerjavo med sevi ''E.coli'' in različnimi pogoji v bioreaktorju. Za opredelitev XUI so naredili 2 predpostavki – da O.D.600 korelira s suho maso bakterij, kar so tudi eksperimentalno dokazali in da je delež ogljika v celici ''E.coli'' stalen oz. se spreminja v ozkem intervalu, kar lahko zanemarimo. Iz tega sledi, da je količina ogljika pri dani O.D.600 fiksna in lahko privzamemo, da je izmerjena vrednost O.D.600 ekvivalentna masi ogljika v celicah. XUI je definiran kot razmerje med porabo ksiloze in O.D.600. Divji tip ''E.coli'' lahko v bioreaktorju kot vir ogljika v glavnem izrablja le ksilozo, torej bo v tem primeru XUI visok. Rekombinantna ''E.coli'' pa lahko izrablja tudi CO2, zato porabi manj ksiloze za rast do iste O.D.600 in je njen XUI nižji. S primerjavo XUI so izbrali najučinkovitejši sev za fiksiranje ogljika, E.coli BL21 (DE3) in optimizirali rastne pogoje v bioreaktorju. Najnižje XUI so določili pri uporabi gojišča M9 brez glukoze in z 0,4% ksiloze ter v atmosferi s 5% CO2. Za določitev hitrosti fiksiranja ogljika so uporabili pravilo o ohranitvi mase, po postopku opisanem v literaturi [4]. Določili so, da je pripravljen sintezno biološki sistem sposoben fiksirati ogljik s hitrostjo 0,575 mg/L/h in da v biomasi rekombinantne ''E.coli'' 9,1% ogljika izvira iz CO2 [1], [4].

==='''Oblikovanje bioreaktorja'''===

Študenti so pripravili prototip bioreaktorja, ki črpa CO2 in zaznava njegovo koncentracijo, meri temperaturo in pH gojišča ter podatke pošilja v oblak. Sestavljajo ga wi-fi vmesnik, črpalka CO2, zalogovnik za gojišče, predel za gojenje bakterij z magnetnim mešalom, odpad in tri merilni sistemi – termometer, senzor CO2, pH meter in sintezno biološki sistem za zaznavo spremembe pH. Slednji je bil stranski projekt tekmovalne skupine. Pripravili so ''E.coli'', ki se odziva na spremembo pH gojišča, tako da v nevtralnem pH izraža GFP, v kislem pa sfGFP. Posledično se ob zakisanju gojišča njegova barva spremeni iz rumene v zeleno. Kot osnovo so uporabili že obstoječe biokocke iz registra bioloških delov, s pH-občutljivimi promotorji in jih optimizirali za višji nivo izražanja [1].

==='''Programska oprema bioreaktorja'''===

Izdelali so program za spremljanje pogojev bioreaktorja v realnem času in aplikacijo, s katero lahko uporabnik kadarkoli prek wi-fija preveril stanje oz. napredek bioreaktorja [1].

==='''Biovarnost'''===
Uporabljen sev BL21 (DE3) ni patogen za človeka, zato ni nevarnosti okužb ob izpustu. Tudi vanj vneseni geni izvirajo iz človeku nenevarnih organizmov. Poleg tega so na bioreaktor namestili filtre in s testom potrdili, da uspešno preprečujejo izpust GSO v okolje. Načrtovali so tudi povezavo bioreaktorja s sistemom za uporabo odvečne toplote v industriji, s pomočjo katerega bi lahko sterilizirali odpadno gojišče [1].

==ZAKLJUČEK==
Ekipa je razvila sintezno biološki sistem za zmanjšanje izpustov CO2, ostaja pa veliko možnosti za izboljšave, ki bi naredile sistem bolj učinkovit in privlačen za industrijo. V ta namen so se povezali z iGEM ekipo UESTC-China, ki je razvila sistem za predelavo slame v biogorivo, pri katerem nastaja ksiloza kot stranski produkt <ref>iGEM 2018 Team UESTC-China. ''Straw-degrading Energy E.coli.'' Dostopno na: http://2018.igem.org/Team:UESTC-China [pridobljeno 15.12.2018].</ref>. Z umestitvijo bioreaktorja za fiksiranje ogljika navzdol od procesa predelave slame, bi bistveno znižali svoj ogljični odtis in se izognili nabavi velikih količin ksiloze, potrebne za delovanje bioreaktorja. Lahko bi tudi razvili sistem, ki za izrabo CO2 ne potrebuje sladkorja [4], <ref>Antonovsky N, Gleizer S, Noor E, in dr. ''Sugar Synthesis from CO2 in Escherichia coli.'' Cell 2016;166(1):115–25.</ref>. Z uvedbo procesa predelave piruvata v glutamin, bi industrijskemu obratu omogočili dodaten vir zaslužka. Za pospešitev fiksiranja ogljika bi lahko ''E.coli'' gojili v anaerobnih pogojih, kar je zahtevno, a poviša učinkovitost Rubisco, zaradi odsotnosti kisika, ki s CO2 tekmuje za vezavo nanj ali pa bi poiskali alternativo temu encimu <ref>Bar-Even A, Noor E, Lewis NE, Milo R. ''Design and analysis of synthetic carbon fixation pathways.'' PNAS 2010;107(19):8889–94.</ref>.

==VIRI==

<references/>

Of CO2urse - sistem za zmanjševanje izpustov ogljikovega dioksida v industriji

2018-12-17T17:22:21Z

Kity Požek:

Of CO2urse je projekt študentske ekipe 'NCKU Tainan' iz Tajvana, ki je bil nagrajen kot najboljši okoljski projekt na tekmovanju iz sintezne biologije, iGEM 2018. Namen projekta je s pristopi sintezne biologije prispevati k oblikovanju nizkoogljične družbe <ref>iGEM 2018 Team NCKU Tainan. ''Of CO2urse.'' Dostopno na: http://2018.igem.org/Team:NCKU_Tainan [pridobljeno 13.12.2018].</ref>.

==UVOD==
Globalno segrevanje je danes eden največjih okoljskih problemov in med najpomembnejšimi vzroki za učinek tople grede je pretiran izpust ogljikovega dioksida (CO2) v ozračje. Za izpust so v glavnem odgovorne človeške dejavnosti, kot so transport, proizvodnja električne energije in industrija, zaradi katerih se koncentracija tega toplogrednega plina v zraku izrazito povišuje vse od industrijske revolucije dalje. S hkratnim pretiranim izpustom CO2 in krčenjem naravnih ponorov CO2, kot so npr. gozdovi, se ruši naravni cikel ogljika, na kar kaže tudi dejstvo, da se je od leta 1960 do leta 2018 koncentracija CO2 v ozračju dvignila iz 320 ppm na več kot 400 ppm <ref>ProOxygen. ''CO2 Acceleration.'' Dostopno na: https://www.co2.earth/co2-acceleration [pridobljeno 13.12.2018].</ref>, <ref>US EPA. ''Overview of Greenhouse Gases.'' Dostopno na: https://www.epa.gov/ghgemissions/overview-greenhouse-gases [pridobljeno 13.12.2018].</ref>. Učinek tople grede ima za planet že vidne in zaskrbljujoče posledice, kot je npr. taljenje polarnega ledu, posledično dvigovanje gladine morja in manjšanje primernih površin ter pogojev za preživetje obstoječih vrst, višanje temperature morja in s tem rušenje morskega ekosistema itd. Pri obvladovanju izpustov CO2 med drugim pripomorejo raziskave, usmerjene v razvoj načinov za nadzor izpustov in za privzem CO2 iz ozračja. iGEM ekipa iz Tajvana si je v ta namen zamislila projekt, v sklopu katerega so pripravili sintezno biološki sistem, ki bi lahko v industrijskih obratih asimiliral nastali CO2 [1].

==PRISTOP IN IZVEDBA PROJEKTA==
==='''Of CO2urse'''===
Študenti so pripravili prototip bioreaktorja z bakterijami ''E. coli'', v katere so po sistemu biokock vnesli gene cianobakterij za fiksiranje ogljika iz zraka. V bioreaktor so dovajali rastno gojišče s ksilozo kot edinim virom organskega ogljika in CO2 iz jeklenke, pripravljene s tehnologijo zajema in shranjevanja CO2 v industrijskem obratu. Bakterije so privzele CO2 iz zraka in ga pretvorile do piruvata, tega pa bi lahko v nadaljnjih procesih uporabili za pripravo raznih uporabnih spojin (npr. glutamina). Napravo so opremili tudi s senzorji za spremljanje stanja procesa in razvili aplikacijo za enostaven dostop do teh podatkov. Glede dizajna so se posvetovali s strokovnjaki iz tega področja in s končnimi uporabniki v industriji ter skušali upoštevati njihove nasvete in pripraviti učinkovit, varen, čim bolj donosen in cenovno ugoden sistem za pomoč pri zmanjševanju izpustov CO2 v industriji [1].

==='''Priprava ''E.coli'', ki fiksira CO2 '''===

Za pripravo CO2-fiksirajoče ''E.coli'' so konstruirali biokocke z geni za izražanje fosforibulokinaze (PRK), ogljikove anhidraze (CA) in ribuloza-1,5-bisfosfat karboksilaze/oksigenaze (Rubisco). Geni izvirajo iz dveh sevov cianobakterij - ''Synechococcus elongatus'' PCC 7942 in PCC 7002. Zanje so se odločili, ker so v literaturi zasledili, da so se že izkazali kot uspešni za ta namen <ref>Gong F, Liu G, Zhai X, in dr. ''Quantitative analysis of an engineered CO2-fixing Escherichia coli reveals great potential of heterotrophic CO2 fixation.'' Biotechnology for Biofuels 2015;8(1):86.</ref>. Prvi dve biokocki so vstavili v vektor pSB3K3, tretjo pa v pSB1C3 in bakterije kotransformirali z vektorjema. Tako so v ''E.coli'' omogočili potek Calvinovega cikla, ki je ena najpomembnejših poti za fiksiranje ogljika v naravi. Kot šasijo so preizkusili 3 seve ''E.coli'' - BL21 (DE3), W3110, W3110 (L5T7). Odločili so se za uporabo ''E.coli'' BL21 (DE3), ki je dobro rastla ob pogojih v bioreaktorju in se je po vnosu genov za fiksiranje ogljika izkazala kot najsposobnejša izrabe CO2. Prednost ''E.coli'' pred rastlinami, algami in cianobakterijami je, da raste hitreje in bolj robustno, ne potrebuje svetlobe in zato uspešnost gojenja ni odvisna od vremena ter zahteva manjše površine za gojenje [1], [4].

==='''Potek nove presnovne poti v ''E.coli'' '''===

Pripravljene bakterije najprej prek lastne, pentoza-fosfatne poti presnovijo ksilozo iz rastnega gojišča v ribulozo-5-fosfat (Ru5P), ki jo nato z rekombinantnim encimom PRK fosforilirajo do ribuloze-1,5-bisfosfata (RuBP). Sledi karboksilacija RuBP s CO2 iz zraka, s pomočjo rekombinantnega encima Rubisco, pri čemer nastane 3-fosfoglicerat (3-PGA), ki se pretvori v piruvat. Piruvat je multifunkcionalen intermediat različnih anabolnih poti [1].
Pomembno vlogo pri fiksaciji ogljika ima tudi encim CA, ki s pretvarjanjem CO2 v ogljikovo kislino oz. HCO3-, poveča difuzijo plina v celice. Tako imajo bakterije na razpolago več CO2 za fiksiranje, kar je pomembno predvsem zato, ker CO2 tekmuje s kisikom za vezavo na Rubisco. Kljub temu, da ima E.coli lastno CA, so vanje vstavili še CA cianobakterij, ki je sposobna hitrejše katalize [1], [4].

==='''Učinkovitost izrabe CO2 v ''E.coli'' '''===
Glavni presnovni poti ksiloze v divjem tipu ''E.coli'' sta pentoza-fosfatna pot in glikoliza, v rekombinantni ''E.coli'' pa poleg teh originalnih poti poteka v manjši meri še 'obvozna pot oz. obvoznica CO2' (ang. ''CO2 bypass pathway''). Študenti so razvili matematični model za napoved pretoka ogljika prek ene in druge poti. Obe poti se zaključita z nastankom piruvata, ki vstopa v Krebsov cikel, zato so tudi tega vključili v model presnove ksiloze. S pripravljenim modelom so napovedali količino nastale biomase ''E.coli'' ob pogojih v bioreaktorju oziroma vpliv prisotnosti alternativne presnovne poti ksiloze na rast bakterij. Pravilnost modela so preverili eksperimentalno in pokazali, da lahko z njegovo pomočjo uspešno napovejo obnašanje sistema. S tem so prihranili čas in denar, saj so lahko z uporabo modela v laboratoriju delali bolj usmerjeno. Med drugim so z modelom pokazali, da lahko količino nastalega piruvata spremljajo prek meritev optične gostote (O.D.600) suspenzije bakterij in si s tem olajšali eksperimentalno delo. Ugotovili so, da možnost izrabe CO2 vpliva na rast bakterij, saj so rekombinantne bakterije v atmosferi s 5% CO2 proizvedle več piruvata oziroma so v istem času dosegle višjo O.D.600 kakor v atmosferi brez dodanega CO2 [1].

Za vrednotenje učinkovitosti izrabe obvozne poti CO2 so uvedli indeks izrabe ksiloze (XUI, ang. ''xylose utilisation index'') – hiter, enostaven in uporaben način za oceno sposobnosti bakterij za fiksiranje ogljika, prek meritev O.D.600 celične kulture. XUI omogoča dokaz sposobnosti izrabe CO2 in primerjavo med sevi ''E.coli'' in različnimi pogoji v bioreaktorju. Za opredelitev XUI so naredili 2 predpostavki – da O.D.600 korelira s suho maso bakterij, kar so tudi eksperimentalno dokazali in da je delež ogljika v celici ''E.coli'' stalen oz. se spreminja v ozkem intervalu, kar lahko zanemarimo. Iz tega sledi, da je količina ogljika pri dani O.D.600 fiksna in lahko privzamemo, da je izmerjena vrednost O.D.600 ekvivalentna masi ogljika v celicah. XUI je definiran kot razmerje med porabo ksiloze in O.D.600. Divji tip ''E.coli'' lahko v bioreaktorju kot vir ogljika v glavnem izrablja le ksilozo, torej bo v tem primeru XUI visok. Rekombinantna ''E.coli'' pa lahko izrablja tudi CO2, zato porabi manj ksiloze za rast do iste O.D.600 in je njen XUI nižji. S primerjavo XUI so izbrali najučinkovitejši sev za fiksiranje ogljika, E.coli BL21 (DE3) in optimizirali rastne pogoje v bioreaktorju. Najnižje XUI so določili pri uporabi gojišča M9 brez glukoze in z 0,4% ksiloze ter v atmosferi s 5% CO2. Za določitev hitrosti fiksiranja ogljika so uporabili pravilo o ohranitvi mase, po postopku opisanem v literaturi [4]. Določili so, da je pripravljen sintezno biološki sistem sposoben fiksirati ogljik s hitrostjo 0,575 mg/L/h in da v biomasi rekombinantne ''E.coli'' 9,1% ogljika izvira iz CO2 [1], [4].

==='''Oblikovanje bioreaktorja'''===

Študenti so pripravili prototip bioreaktorja, ki črpa CO2 in zaznava njegovo koncentracijo, meri temperaturo in pH gojišča ter podatke pošilja v oblak. Sestavljajo ga wi-fi vmesnik, črpalka CO2, zalogovnik za gojišče, predel za gojenje bakterij z magnetnim mešalom, odpad in tri merilni sistemi – termometer, senzor CO2, pH meter in sintezno biološki sistem za zaznavo spremembe pH. Slednji je bil stranski projekt tekmovalne skupine. Pripravili so ''E.coli'', ki se odziva na spremembo pH gojišča, tako da v nevtralnem pH izraža GFP, v kislem pa sfGFP. Posledično se ob zakisanju gojišča njegova barva spremeni iz rumene v zeleno. Kot osnovo so uporabili že obstoječe biokocke iz registra bioloških delov, s pH-občutljivimi promotorji in jih optimizirali za višji nivo izražanja [1].

==='''Programska oprema bioreaktorja'''===

Izdelali so program za spremljanje pogojev bioreaktorja v realnem času in aplikacijo, s katero lahko uporabnik kadarkoli prek wi-fija preveril stanje oz. napredek bioreaktorja [1].

==='''Biovarnost'''===
Uporabljen sev BL21 (DE3) ni patogen za človeka, zato ni nevarnosti okužb ob izpustu. Tudi vanj vneseni geni izvirajo iz človeku nenevarnih organizmov. Poleg tega so na bioreaktor namestili filtre in s testom potrdili, da uspešno preprečujejo izpust GSO v okolje. Načrtovali so tudi povezavo bioreaktorja s sistemom za uporabo odvečne toplote v industriji, s pomočjo katerega bi lahko sterilizirali odpadno gojišče [1].

==ZAKLJUČEK==
Ekipa je razvila sintezno biološki sistem za zmanjšanje izpustov CO2, ostaja pa veliko možnosti za izboljšave, ki bi naredile sistem bolj učinkovit in privlačen za industrijo. V ta namen so se povezali z iGEM ekipo UESTC-China, ki je razvila sistem za predelavo slame v biogorivo, pri katerem nastaja ksiloza kot stranski produkt <ref>iGEM 2018 Team UESTC-China. ''Straw-degrading Energy E.coli.'' Dostopno na: http://2018.igem.org/Team:UESTC-China [pridobljeno 15.12.2018].</ref>. Z umestitvijo bioreaktorja za fiksiranje ogljika navzdol od procesa predelave slame, bi bistveno znižali svoj ogljični odtis in se izognili nabavi velikih količin ksiloze, potrebne za delovanje bioreaktorja. Lahko bi tudi razvili sistem, ki za izrabo CO2 ne potrebuje sladkorja [4], <ref>Antonovsky N, Gleizer S, Noor E, in dr. ''Sugar Synthesis from CO2 in Escherichia coli.'' Cell 2016;166(1):115–25.</ref>. Z uvedbo procesa predelave piruvata v glutamin, bi industrijskemu obratu omogočili dodaten vir zaslužka. Za pospešitev fiksiranja ogljika bi lahko ''E.coli'' gojili v anaerobnih pogojih, kar je zahtevno, a poviša učinkovitost Rubisco, zaradi odsotnosti kisika, ki s CO2 tekmuje za vezavo nanj ali pa bi poiskali alternativo temu encimu <ref>Bar-Even A, Noor E, Lewis NE, Milo R. ''Design and analysis of synthetic carbon fixation pathways.'' PNAS 2010;107(19):8889–94.</ref>.

==VIRI==

<references/>

Of CO2urse - sistem za zmanjševanje izpustov ogljikovega dioksida v industriji

2018-12-17T17:20:39Z

Kity Požek:

Of CO2urse je projekt študentske ekipe 'NCKU Tainan' iz Tajvana, ki je bil nagrajen kot najboljši okoljski projekt na tekmovanju iz sintezne biologije, iGEM 2018. Namen projekta je s pristopi sintezne biologije prispevati k oblikovanju nizkoogljične družbe <ref>iGEM 2018 Team NCKU Tainan. ''Of CO2urse.'' Dostopno na: http://2018.igem.org/Team:NCKU_Tainan [pridobljeno 13.12.2018].</ref>.

==UVOD==
Globalno segrevanje je danes eden največjih okoljskih problemov in med najpomembnejšimi vzroki za učinek tople grede je pretiran izpust ogljikovega dioksida (CO2) v ozračje. Za izpust so v glavnem odgovorne človeške dejavnosti, kot so transport, proizvodnja električne energije in industrija, zaradi katerih se koncentracija tega toplogrednega plina v zraku izrazito povišuje vse od industrijske revolucije dalje. S hkratnim pretiranim izpustom CO2 in krčenjem naravnih ponorov CO2, kot so npr. gozdovi, se ruši naravni cikel ogljika, na kar kaže tudi dejstvo, da se je od leta 1960 do leta 2018 koncentracija CO2 v ozračju dvignila iz 320 ppm na več kot 400 ppm <ref>ProOxygen. ''CO2 Acceleration.'' Dostopno na: https://www.co2.earth/co2-acceleration [pridobljeno 13.12.2018].</ref>, <ref>US EPA. ''Overview of Greenhouse Gases.'' Dostopno na: https://www.epa.gov/ghgemissions/overview-greenhouse-gases [pridobljeno 13.12.2018].</ref>. Učinek tople grede ima za planet že vidne in zaskrbljujoče posledice, kot je npr. taljenje polarnega ledu, posledično dvigovanje gladine morja in manjšanje primernih površin ter pogojev za preživetje obstoječih vrst, višanje temperature morja in s tem rušenje morskega ekosistema itd. K obvladovanju izpustov CO2 med drugim pripomorejo raziskave, usmerjene v razvoj načinov za nadzor izpustov in za privzem CO2 iz ozračja. iGEM ekipa iz Tajvana si je v ta namen zamislila projekt, v sklopu katerega so pripravili sintezno biološki sistem, ki bi lahko v industrijskih obratih asimiliral nastali CO2 [1].

==PRISTOP IN IZVEDBA PROJEKTA==
==='''Of CO2urse'''===
Študenti so pripravili prototip bioreaktorja z bakterijami ''E. coli'', v katere so po sistemu biokock vnesli gene cianobakterij za fiksiranje ogljika iz zraka. V bioreaktor so dovajali rastno gojišče s ksilozo kot edinim virom organskega ogljika in CO2 iz jeklenke, pripravljene s tehnologijo zajema in shranjevanja CO2 v industrijskem obratu. Bakterije so privzele CO2 iz zraka in ga pretvorile do piruvata, tega pa bi lahko v nadaljnjih procesih uporabili za pripravo raznih uporabnih spojin (npr. glutamina). Napravo so opremili tudi s senzorji za spremljanje stanja procesa in razvili aplikacijo za enostaven dostop do teh podatkov. Glede dizajna so se posvetovali s strokovnjaki iz tega področja in s končnimi uporabniki v industriji ter skušali upoštevati njihove nasvete in pripraviti učinkovit, varen, čim bolj donosen in cenovno ugoden sistem za pomoč pri zmanjševanju izpustov CO2 v industriji [1].

==='''Priprava ''E.coli'', ki fiksira CO2 '''===

Za pripravo CO2-fiksirajoče ''E.coli'' so konstruirali biokocke z geni za izražanje fosforibulokinaze (PRK), ogljikove anhidraze (CA) in ribuloza-1,5-bisfosfat karboksilaze/oksigenaze (Rubisco). Geni izvirajo iz dveh sevov cianobakterij - ''Synechococcus elongatus'' PCC 7942 in PCC 7002. Zanje so se odločili, ker so v literaturi zasledili, da so se že izkazali kot uspešni za ta namen <ref>Gong F, Liu G, Zhai X, in dr. ''Quantitative analysis of an engineered CO2-fixing Escherichia coli reveals great potential of heterotrophic CO2 fixation.'' Biotechnology for Biofuels 2015;8(1):86.</ref>. Prvi dve biokocki so vstavili v vektor pSB3K3, tretjo pa v pSB1C3 in bakterije kotransformirali z vektorjema. Tako so v ''E.coli'' omogočili potek Calvinovega cikla, ki je ena najpomembnejših poti za fiksiranje ogljika v naravi. Kot šasijo so preizkusili 3 seve ''E.coli'' - BL21 (DE3), W3110, W3110 (L5T7). Odločili so se za uporabo ''E.coli'' BL21 (DE3), ki je dobro rastla ob pogojih v bioreaktorju in se je po vnosu genov za fiksiranje ogljika izkazala kot najsposobnejša izrabe CO2. Prednost ''E.coli'' pred rastlinami, algami in cianobakterijami je, da raste hitreje in bolj robustno, ne potrebuje svetlobe in zato uspešnost gojenja ni odvisna od vremena ter zahteva manjše površine za gojenje [1], [4].

==='''Potek nove presnovne poti v ''E.coli'' '''===

Pripravljene bakterije najprej prek lastne, pentoza-fosfatne poti presnovijo ksilozo iz rastnega gojišča v ribulozo-5-fosfat (Ru5P), ki jo nato z rekombinantnim encimom PRK fosforilirajo do ribuloze-1,5-bisfosfata (RuBP). Sledi karboksilacija RuBP s CO2 iz zraka, s pomočjo rekombinantnega encima Rubisco, pri čemer nastane 3-fosfoglicerat (3-PGA), ki se pretvori v piruvat. Piruvat je multifunkcionalen intermediat različnih anabolnih poti [1].
Pomembno vlogo pri fiksaciji ogljika ima tudi encim CA, ki s pretvarjanjem CO2 v ogljikovo kislino oz. HCO3-, poveča difuzijo plina v celice. Tako imajo bakterije na razpolago več CO2 za fiksiranje, kar je pomembno predvsem zato, ker CO2 tekmuje s kisikom za vezavo na Rubisco. Kljub temu, da ima E.coli lastno CA, so vanje vstavili še CA cianobakterij, ki je sposobna hitrejše katalize [1], [4].

==='''Učinkovitost izrabe CO2 v ''E.coli'' '''===
Glavni presnovni poti ksiloze v divjem tipu ''E.coli'' sta pentoza-fosfatna pot in glikoliza, v rekombinantni ''E.coli'' pa poleg teh originalnih poti poteka v manjši meri še 'obvozna pot oz. obvoznica CO2' (ang. ''CO2 bypass pathway''). Študenti so razvili matematični model za napoved pretoka ogljika prek ene in druge poti. Obe poti se zaključita z nastankom piruvata, ki vstopa v Krebsov cikel, zato so tudi tega vključili v model presnove ksiloze. S pripravljenim modelom so napovedali količino nastale biomase ''E.coli'' ob pogojih v bioreaktorju oziroma vpliv prisotnosti alternativne presnovne poti ksiloze na rast bakterij. Pravilnost modela so preverili eksperimentalno in pokazali, da lahko z njegovo pomočjo uspešno napovejo obnašanje sistema. S tem so prihranili čas in denar, saj so lahko z uporabo modela v laboratoriju delali bolj usmerjeno. Med drugim so z modelom pokazali, da lahko količino nastalega piruvata spremljajo prek meritev optične gostote (O.D.600) suspenzije bakterij in si s tem olajšali eksperimentalno delo. Ugotovili so, da možnost izrabe CO2 vpliva na rast bakterij, saj so rekombinantne bakterije v atmosferi s 5% CO2 proizvedle več piruvata oziroma so v istem času dosegle višjo O.D.600 kakor v atmosferi brez dodanega CO2 [1].

Za vrednotenje učinkovitosti izrabe obvozne poti CO2 so uvedli indeks izrabe ksiloze (XUI, ang. ''xylose utilisation index'') – hiter, enostaven in uporaben način za oceno sposobnosti bakterij za fiksiranje ogljika, prek meritev O.D.600 celične kulture. XUI omogoča dokaz sposobnosti izrabe CO2 in primerjavo med sevi ''E.coli'' in različnimi pogoji v bioreaktorju. Za opredelitev XUI so naredili 2 predpostavki – da O.D.600 korelira s suho maso bakterij, kar so tudi eksperimentalno dokazali in da je delež ogljika v celici ''E.coli'' stalen oz. se spreminja v ozkem intervalu, kar lahko zanemarimo. Iz tega sledi, da je količina ogljika pri dani O.D.600 fiksna in lahko privzamemo, da je izmerjena vrednost O.D.600 ekvivalentna masi ogljika v celicah. XUI je definiran kot razmerje med porabo ksiloze in O.D.600. Divji tip ''E.coli'' lahko v bioreaktorju kot vir ogljika v glavnem izrablja le ksilozo, torej bo v tem primeru XUI visok. Rekombinantna ''E.coli'' pa lahko izrablja tudi CO2, zato porabi manj ksiloze za rast do iste O.D.600 in je njen XUI nižji. S primerjavo XUI so izbrali najučinkovitejši sev za fiksiranje ogljika, E.coli BL21 (DE3) in optimizirali rastne pogoje v bioreaktorju. Najnižje XUI so določili pri uporabi gojišča M9 brez glukoze in z 0,4% ksiloze ter v atmosferi s 5% CO2. Za določitev hitrosti fiksiranja ogljika so uporabili pravilo o ohranitvi mase, po postopku opisanem v literaturi [4]. Določili so, da je pripravljen sintezno biološki sistem sposoben fiksirati ogljik s hitrostjo 0,575 mg/L/h in da v biomasi rekombinantne ''E.coli'' 9,1% ogljika izvira iz CO2 [1], [4].

==='''Oblikovanje bioreaktorja'''===

Študenti so pripravili prototip bioreaktorja, ki črpa CO2 in zaznava njegovo koncentracijo, meri temperaturo in pH gojišča ter podatke pošilja v oblak. Sestavljajo ga wi-fi vmesnik, črpalka CO2, zalogovnik za gojišče, predel za gojenje bakterij z magnetnim mešalom, odpad in tri merilni sistemi – termometer, senzor CO2, pH meter in sintezno biološki sistem za zaznavo spremembe pH. Slednji je bil stranski projekt tekmovalne skupine. Pripravili so ''E.coli'', ki se odziva na spremembo pH gojišča, tako da v nevtralnem pH izraža GFP, v kislem pa sfGFP. Posledično se ob zakisanju gojišča njegova barva spremeni iz rumene v zeleno. Kot osnovo so uporabili že obstoječe biokocke iz registra bioloških delov, s pH-občutljivimi promotorji in jih optimizirali za višji nivo izražanja [1].

==='''Programska oprema bioreaktorja'''===

Izdelali so program za spremljanje pogojev bioreaktorja v realnem času in aplikacijo, s katero lahko uporabnik kadarkoli prek wi-fija preveril stanje oz. napredek bioreaktorja [1].

==='''Biovarnost'''===
Uporabljen sev BL21 (DE3) ni patogen za človeka, zato ni nevarnosti okužb ob izpustu. Tudi vanj vneseni geni izvirajo iz človeku nenevarnih organizmov. Poleg tega so na bioreaktor namestili filtre in s testom potrdili, da uspešno preprečujejo izpust GSO v okolje. Načrtovali so tudi povezavo bioreaktorja s sistemom za uporabo odvečne toplote v industriji, s pomočjo katerega bi lahko sterilizirali odpadno gojišče [1].

==ZAKLJUČEK==
Ekipa je razvila sintezno biološki sistem za zmanjšanje izpustov CO2, ostaja pa veliko možnosti za izboljšave, ki bi naredile sistem bolj učinkovit in privlačen za industrijo. V ta namen so se povezali z iGEM ekipo UESTC-China, ki je razvila sistem za predelavo slame v biogorivo, pri katerem nastaja ksiloza kot stranski produkt <ref>iGEM 2018 Team UESTC-China. ''Straw-degrading Energy E.coli.'' Dostopno na: http://2018.igem.org/Team:UESTC-China [pridobljeno 15.12.2018].</ref>. Z umestitvijo bioreaktorja za fiksiranje ogljika navzdol od procesa predelave slame, bi bistveno znižali svoj ogljični odtis in se izognili nabavi velikih količin ksiloze, potrebne za delovanje bioreaktorja. Lahko bi tudi razvili sistem, ki za izrabo CO2 ne potrebuje sladkorja [4], <ref>Antonovsky N, Gleizer S, Noor E, in dr. ''Sugar Synthesis from CO2 in Escherichia coli.'' Cell 2016;166(1):115–25.</ref>. Z uvedbo procesa predelave piruvata v glutamin, bi industrijskemu obratu omogočili dodaten vir zaslužka. Za pospešitev fiksiranja ogljika bi lahko ''E.coli'' gojili v anaerobnih pogojih, kar je zahtevno, a poviša učinkovitost Rubisco, zaradi odsotnosti kisika, ki s CO2 tekmuje za vezavo nanj ali pa bi poiskali alternativo temu encimu <ref>Bar-Even A, Noor E, Lewis NE, Milo R. ''Design and analysis of synthetic carbon fixation pathways.'' PNAS 2010;107(19):8889–94.</ref>.

==VIRI==

<references/>

Of CO2urse - sistem za zmanjševanje izpustov ogljikovega dioksida v industriji

2018-12-17T17:19:42Z

Kity Požek:

Of CO2urse je projekt študentske ekipe 'NCKU Tainan' iz Tajvana, ki je bil nagrajen kot najboljši okoljski projekt na tekmovanju iz sintezne biologije, iGEM 2018. Namen projekta je s pristopi sintezne biologije prispevati k oblikovanju nizkoogljične družbe <ref>iGEM 2018 Team NCKU Tainan. ''Of CO2urse.'' Dostopno na: http://2018.igem.org/Team:NCKU_Tainan [pridobljeno 13.12.2018].</ref>.

==UVOD==
Globalno segrevanje je danes eden največjih okoljskih problemov in med najpomembnejšimi vzroki za učinek tople grede je pretiran izpust ogljikovega dioksida (CO2) v ozračje. Za izpust so v glavnem odgovorne človeške dejavnosti, kot so transport, proizvodnja električne energije in industrija, zaradi katerih se koncentracija tega toplogrednega plina v zraku izrazito povišuje vse od industrijske revolucije dalje. S hkratnim pretiranim izpustom CO2 in krčenjem naravnih ponorov CO2, kot so npr. gozdovi, se ruši naravni cikel ogljika, na kar kaže tudi dejstvo, da se je od leta 1960 do leta 2018 koncentracija CO2 v ozračju dvignila iz 320 ppm na več kot 400 ppm <ref>ProOxygen. ''CO2 Acceleration.'' Dostopno na: https://www.co2.earth/co2-acceleration [pridobljeno 13.12.2018].</ref>, <ref>US EPA. ''Overview of Greenhouse Gases.'' Dostopno na: https://www.epa.gov/ghgemissions/overview-greenhouse-gases [pridobljeno 13.12.2018].</ref>. Učinek tople grede ima za planet že vidne in zaskrbljujoče posledice, kot je npr. taljenje polarnega ledu, posledično dvigovanje gladine morja in manjšanje primernih površin ter pogojev za preživetje obstoječih vrst, višanje temperature morja in s tem rušenje morskega ekosistema itd. K obvladovanju izpustov CO2 med drugim pripomorejo raziskave, usmerjene v razvoj načinov za nadzor izpustov in za privzem CO2 iz ozračja. iGEM ekipa iz Tajvana si je v ta namen zamislila projekt, v sklopu katerega so pripravili sintezno biološki sistem, ki bi lahko v industrijskih obratih asimiliral nastali CO2 [1].

==PRISTOP IN IZVEDBA PROJEKTA==
==='''Of CO2urse'''===
Študenti so pripravili prototip bioreaktorja z bakterijami ''E. coli'', v katere so po sistemu biokock vnesli gene cianobakterij za fiksiranje ogljika iz zraka. V bioreaktor so dovajali rastno gojišče s ksilozo kot edinim virom organskega ogljika in CO2 iz jeklenke, pripravljene s tehnologijo zajema in shranjevanja CO2 v industrijskem obratu. Bakterije so privzele CO2 iz zraka in ga pretvorile do piruvata, tega pa bi lahko v nadaljnjih procesih uporabili za pripravo raznih uporabnih spojin (npr. glutamina). Napravo so opremili tudi s senzorji za spremljanje stanja procesa in razvili aplikacijo za enostaven dostop do teh podatkov. Glede dizajna so se posvetovali s strokovnjaki iz tega področja in s končnimi uporabniki v industriji ter skušali upoštevati njihove nasvete in pripraviti učinkovit, varen, čim bolj donosen in cenovno ugoden sistem za pomoč pri zmanjševanju izpustov CO2 v industriji [1].

==='''Priprava ''E. coli'', ki fiksira CO2 '''===

Za pripravo CO2-fiksirajoče ''E.coli'' so konstruirali biokocke z geni za izražanje fosforibulokinaze (PRK), ogljikove anhidraze (CA) in ribuloza-1,5-bisfosfat karboksilaze/oksigenaze (Rubisco). Geni izvirajo iz dveh sevov cianobakterij - ''Synechococcus elongatus'' PCC 7942 in PCC 7002. Zanje so se odločili, ker so v literaturi zasledili, da so se že izkazali kot uspešni za ta namen <ref>Gong F, Liu G, Zhai X, in dr. ''Quantitative analysis of an engineered CO2-fixing Escherichia coli reveals great potential of heterotrophic CO2 fixation.'' Biotechnology for Biofuels 2015;8(1):86.</ref>. Prvi dve biokocki so vstavili v vektor pSB3K3, tretjo pa v pSB1C3 in bakterije kotransformirali z vektorjema. Tako so v ''E.coli'' omogočili potek Calvinovega cikla, ki je ena najpomembnejših poti za fiksiranje ogljika v naravi. Kot šasijo so preizkusili 3 seve ''E.coli'' - BL21 (DE3), W3110, W3110 (L5T7). Odločili so se za uporabo ''E.coli'' BL21 (DE3), ki je dobro rastla ob pogojih v bioreaktorju in se je po vnosu genov za fiksiranje ogljika izkazala kot najsposobnejša izrabe CO2. Prednost ''E.coli'' pred rastlinami, algami in cianobakterijami je, da raste hitreje in bolj robustno, ne potrebuje svetlobe in zato uspešnost gojenja ni odvisna od vremena ter zahteva manjše površine za gojenje [1], [4].

==='''Potek nove presnovne poti v ''E.coli'' '''===

Pripravljene bakterije najprej prek lastne, pentoza-fosfatne poti presnovijo ksilozo iz rastnega gojišča v ribulozo-5-fosfat (Ru5P), ki jo nato z rekombinantnim encimom PRK fosforilirajo do ribuloze-1,5-bisfosfata (RuBP). Sledi karboksilacija RuBP s CO2 iz zraka, s pomočjo rekombinantnega encima Rubisco, pri čemer nastane 3-fosfoglicerat (3-PGA), ki se pretvori v piruvat. Piruvat je multifunkcionalen intermediat različnih anabolnih poti [1].
Pomembno vlogo pri fiksaciji ogljika ima tudi encim CA, ki s pretvarjanjem CO2 v ogljikovo kislino oz. HCO3-, poveča difuzijo plina v celice. Tako imajo bakterije na razpolago več CO2 za fiksiranje, kar je pomembno predvsem zato, ker CO2 tekmuje s kisikom za vezavo na Rubisco. Kljub temu, da ima E.coli lastno CA, so vanje vstavili še CA cianobakterij, ki je sposobna hitrejše katalize [1], [4].

==='''Učinkovitost izrabe CO2 v ''E.coli'' '''===
Glavni presnovni poti ksiloze v divjem tipu ''E.coli'' sta pentoza-fosfatna pot in glikoliza, v rekombinantni ''E.coli'' pa poleg teh originalnih poti poteka v manjši meri še 'obvozna pot oz. obvoznica CO2' (ang. ''CO2 bypass pathway''). Študenti so razvili matematični model za napoved pretoka ogljika prek ene in druge poti. Obe poti se zaključita z nastankom piruvata, ki vstopa v Krebsov cikel, zato so tudi tega vključili v model presnove ksiloze. S pripravljenim modelom so napovedali količino nastale biomase ''E.coli'' ob pogojih v bioreaktorju oziroma vpliv prisotnosti alternativne presnovne poti ksiloze na rast bakterij. Pravilnost modela so preverili eksperimentalno in pokazali, da lahko z njegovo pomočjo uspešno napovejo obnašanje sistema. S tem so prihranili čas in denar, saj so lahko z uporabo modela v laboratoriju delali bolj usmerjeno. Med drugim so z modelom pokazali, da lahko količino nastalega piruvata spremljajo prek meritev optične gostote (O.D.600) suspenzije bakterij in si s tem olajšali eksperimentalno delo. Ugotovili so, da možnost izrabe CO2 vpliva na rast bakterij, saj so rekombinantne bakterije v atmosferi s 5% CO2 proizvedle več piruvata oziroma so v istem času dosegle višjo O.D.600 kakor v atmosferi brez dodanega CO2 [1].

Za vrednotenje učinkovitosti izrabe obvozne poti CO2 so uvedli indeks izrabe ksiloze (XUI, ang. ''xylose utilisation index'') – hiter, enostaven in uporaben način za oceno sposobnosti bakterij za fiksiranje ogljika, prek meritev O.D.600 celične kulture. XUI omogoča dokaz sposobnosti izrabe CO2 in primerjavo med sevi ''E.coli'' in različnimi pogoji v bioreaktorju. Za opredelitev XUI so naredili 2 predpostavki – da O.D.600 korelira s suho maso bakterij, kar so tudi eksperimentalno dokazali in da je delež ogljika v celici ''E.coli'' stalen oz. se spreminja v ozkem intervalu, kar lahko zanemarimo. Iz tega sledi, da je količina ogljika pri dani O.D.600 fiksna in lahko privzamemo, da je izmerjena vrednost O.D.600 ekvivalentna masi ogljika v celicah. XUI je definiran kot razmerje med porabo ksiloze in O.D.600. Divji tip ''E.coli'' lahko v bioreaktorju kot vir ogljika v glavnem izrablja le ksilozo, torej bo v tem primeru XUI visok. Rekombinantna ''E.coli'' pa lahko izrablja tudi CO2, zato porabi manj ksiloze za rast do iste O.D.600 in je njen XUI nižji. S primerjavo XUI so izbrali najučinkovitejši sev za fiksiranje ogljika, E.coli BL21 (DE3) in optimizirali rastne pogoje v bioreaktorju. Najnižje XUI so določili pri uporabi gojišča M9 brez glukoze in z 0,4% ksiloze ter v atmosferi s 5% CO2. Za določitev hitrosti fiksiranja ogljika so uporabili pravilo o ohranitvi mase, po postopku opisanem v literaturi [4]. Določili so, da je pripravljen sintezno biološki sistem sposoben fiksirati ogljik s hitrostjo 0,575 mg/L/h in da v biomasi rekombinantne ''E.coli'' 9,1% ogljika izvira iz CO2 [1], [4].

==='''Oblikovanje bioreaktorja'''===

Študenti so pripravili prototip bioreaktorja, ki črpa CO2 in zaznava njegovo koncentracijo, meri temperaturo in pH gojišča ter podatke pošilja v oblak. Sestavljajo ga wi-fi vmesnik, črpalka CO2, zalogovnik za gojišče, predel za gojenje bakterij z magnetnim mešalom, odpad in tri merilni sistemi – termometer, senzor CO2, pH meter in sintezno biološki sistem za zaznavo spremembe pH. Slednji je bil stranski projekt tekmovalne skupine. Pripravili so ''E.coli'', ki se odziva na spremembo pH gojišča, tako da v nevtralnem pH izraža GFP, v kislem pa sfGFP. Posledično se ob zakisanju gojišča njegova barva spremeni iz rumene v zeleno. Kot osnovo so uporabili že obstoječe biokocke iz registra bioloških delov, s pH-občutljivimi promotorji in jih optimizirali za višji nivo izražanja [1].

==='''Programska oprema bioreaktorja'''===

Izdelali so program za spremljanje pogojev bioreaktorja v realnem času in aplikacijo, s katero lahko uporabnik kadarkoli prek wi-fija preveril stanje oz. napredek bioreaktorja [1].

==='''Biovarnost'''===
Uporabljen sev BL21 (DE3) ni patogen za človeka, zato ni nevarnosti okužb ob izpustu. Tudi vanj vneseni geni izvirajo iz človeku nenevarnih organizmov. Poleg tega so na bioreaktor namestili filtre in s testom potrdili, da uspešno preprečujejo izpust GSO v okolje. Načrtovali so tudi povezavo bioreaktorja s sistemom za uporabo odvečne toplote v industriji, s pomočjo katerega bi lahko sterilizirali odpadno gojišče [1].

==ZAKLJUČEK==
Ekipa je razvila sintezno biološki sistem za zmanjšanje izpustov CO2, ostaja pa veliko možnosti za izboljšave, ki bi naredile sistem bolj učinkovit in privlačen za industrijo. V ta namen so se povezali z iGEM ekipo UESTC-China, ki je razvila sistem za predelavo slame v biogorivo, pri katerem nastaja ksiloza kot stranski produkt <ref>iGEM 2018 Team UESTC-China. ''Straw-degrading Energy E.coli.'' Dostopno na: http://2018.igem.org/Team:UESTC-China [pridobljeno 15.12.2018].</ref>. Z umestitvijo bioreaktorja za fiksiranje ogljika navzdol od procesa predelave slame, bi bistveno znižali svoj ogljični odtis in se izognili nabavi velikih količin ksiloze, potrebne za delovanje bioreaktorja. Lahko bi tudi razvili sistem, ki za izrabo CO2 ne potrebuje sladkorja [4], <ref>Antonovsky N, Gleizer S, Noor E, in dr. ''Sugar Synthesis from CO2 in Escherichia coli.'' Cell 2016;166(1):115–25.</ref>. Z uvedbo procesa predelave piruvata v glutamin, bi industrijskemu obratu omogočili dodaten vir zaslužka. Za pospešitev fiksiranja ogljika bi lahko ''E.coli'' gojili v anaerobnih pogojih, kar je zahtevno, a poviša učinkovitost Rubisco, zaradi odsotnosti kisika, ki s CO2 tekmuje za vezavo nanj ali pa bi poiskali alternativo temu encimu <ref>Bar-Even A, Noor E, Lewis NE, Milo R. ''Design and analysis of synthetic carbon fixation pathways.'' PNAS 2010;107(19):8889–94.</ref>.

==VIRI==

<references/>

Of CO2urse - sistem za zmanjševanje izpustov ogljikovega dioksida v industriji

2018-12-17T17:18:25Z

Kity Požek:

Of CO2urse je projekt študentske ekipe 'NCKU Tainan' iz Tajvana, ki je bil nagrajen kot najboljši okoljski projekt na tekmovanju iz sintezne biologije, iGEM 2018. Namen projekta je s pristopi sintezne biologije prispevati k oblikovanju nizkoogljične družbe <ref>iGEM 2018 Team NCKU Tainan. ''Of CO2urse.'' Dostopno na: http://2018.igem.org/Team:NCKU_Tainan [pridobljeno 13.12.2018].</ref>.

==UVOD==
Globalno segrevanje je danes eden največjih okoljskih problemov in med najpomembnejšimi vzroki za učinek tople grede je pretiran izpust ogljikovega dioksida (CO2) v ozračje. Za izpust so v glavnem odgovorne človeške dejavnosti, kot so transport, proizvodnja električne energije in industrija, zaradi katerih se koncentracija tega toplogrednega plina v zraku izrazito povišuje vse od industrijske revolucije dalje. S hkratnim pretiranim izpustom CO2 in krčenjem naravnih ponorov CO2, kot so npr. gozdovi, se ruši naravni cikel ogljika, na kar kaže tudi dejstvo, da se je od leta 1960 do leta 2018 koncentracija CO2 v ozračju dvignila iz 320 ppm na več kot 400 ppm <ref>ProOxygen. ''CO2 Acceleration.'' Dostopno na: https://www.co2.earth/co2-acceleration [pridobljeno 13.12.2018].</ref>, <ref>US EPA. ''Overview of Greenhouse Gases.'' Dostopno na: https://www.epa.gov/ghgemissions/overview-greenhouse-gases [pridobljeno 13.12.2018].</ref>. Učinek tople grede ima za planet že vidne in zaskrbljujoče posledice, kot je npr. taljenje polarnega ledu, posledično dvigovanje gladine morja in manjšanje primernih površin ter pogojev za preživetje obstoječih vrst, višanje temperature morja in s tem rušenje morskega ekosistema itd. K obvladovanju izpustov CO2 med drugim pripomorejo raziskave, usmerjene v razvoj načinov za nadzor izpustov in za privzem CO2 iz ozračja. iGEM ekipa iz Tajvana si je v ta namen zamislila projekt, v sklopu katerega so pripravili sintezno biološki sistem, ki bi lahko v industrijskih obratih asimiliral nastali CO2 [1].

==PRISTOP IN IZVEDBA==
==='''Of CO2urse'''===
Študenti so pripravili prototip bioreaktorja z bakterijami ''E. coli'', v katere so po sistemu biokock vnesli gene cianobakterij za fiksiranje ogljika iz zraka. V bioreaktor so dovajali rastno gojišče s ksilozo kot edinim virom organskega ogljika in CO2 iz jeklenke, pripravljene s tehnologijo zajema in shranjevanja CO2 v industrijskem obratu. Bakterije so privzele CO2 iz zraka in ga pretvorile do piruvata, tega pa bi lahko v nadaljnjih procesih uporabili za pripravo raznih uporabnih spojin (npr. glutamina). Napravo so opremili tudi s senzorji za spremljanje stanja procesa in razvili aplikacijo za enostaven dostop do teh podatkov. Glede dizajna so se posvetovali s strokovnjaki iz tega področja in s končnimi uporabniki v industriji ter skušali upoštevati njihove nasvete in pripraviti učinkovit, varen, čim bolj donosen in cenovno ugoden sistem za pomoč pri zmanjševanju izpustov CO2 v industriji [1].

==='''Priprava ''E. coli'', ki fiksira CO2 '''===

Za pripravo CO2-fiksirajoče ''E.coli'' so konstruirali biokocke z geni za izražanje fosforibulokinaze (PRK), ogljikove anhidraze (CA) in ribuloza-1,5-bisfosfat karboksilaze/oksigenaze (Rubisco). Geni izvirajo iz dveh sevov cianobakterij - ''Synechococcus elongatus'' PCC 7942 in PCC 7002. Zanje so se odločili, ker so v literaturi zasledili, da so se že izkazali kot uspešni za ta namen <ref>Gong F, Liu G, Zhai X, in dr. ''Quantitative analysis of an engineered CO2-fixing Escherichia coli reveals great potential of heterotrophic CO2 fixation.'' Biotechnology for Biofuels 2015;8(1):86.</ref>. Prvi dve biokocki so vstavili v vektor pSB3K3, tretjo pa v pSB1C3 in bakterije kotransformirali z vektorjema. Tako so v ''E.coli'' omogočili potek Calvinovega cikla, ki je ena najpomembnejših poti za fiksiranje ogljika v naravi. Kot šasijo so preizkusili 3 seve ''E.coli'' - BL21 (DE3), W3110, W3110 (L5T7). Odločili so se za uporabo ''E.coli'' BL21 (DE3), ki je dobro rastla ob pogojih v bioreaktorju in se je po vnosu genov za fiksiranje ogljika izkazala kot najsposobnejša izrabe CO2. Prednost ''E.coli'' pred rastlinami, algami in cianobakterijami je, da raste hitreje in bolj robustno, ne potrebuje svetlobe in zato uspešnost gojenja ni odvisna od vremena ter zahteva manjše površine za gojenje [1], [4].

==='''Potek nove presnovne poti v ''E.coli'''''===

Pripravljene bakterije najprej prek lastne, pentoza-fosfatne poti presnovijo ksilozo iz rastnega gojišča v ribulozo-5-fosfat (Ru5P), ki jo nato z rekombinantnim encimom PRK fosforilirajo do ribuloze-1,5-bisfosfata (RuBP). Sledi karboksilacija RuBP s CO2 iz zraka, s pomočjo rekombinantnega encima Rubisco, pri čemer nastane 3-fosfoglicerat (3-PGA), ki se pretvori v piruvat. Piruvat je multifunkcionalen intermediat različnih anabolnih poti [1].
Pomembno vlogo pri fiksaciji ogljika ima tudi encim CA, ki s pretvarjanjem CO2 v ogljikovo kislino oz. HCO3-, poveča difuzijo plina v celice. Tako imajo bakterije na razpolago več CO2 za fiksiranje, kar je pomembno predvsem zato, ker CO2 tekmuje s kisikom za vezavo na Rubisco. Kljub temu, da ima E.coli lastno CA, so vanje vstavili še CA cianobakterij, ki je sposobna hitrejše katalize [1], [4].

==='''Učinkovitost izrabe CO2 v ''E.coli'''''===
Glavni presnovni poti ksiloze v divjem tipu ''E.coli'' sta pentoza-fosfatna pot in glikoliza, v rekombinantni ''E.coli'' pa poleg teh originalnih poti poteka v manjši meri še 'obvozna pot oz. obvoznica CO2' (ang. ''CO2 bypass pathway''). Študenti so razvili matematični model za napoved pretoka ogljika prek ene in druge poti. Obe poti se zaključita z nastankom piruvata, ki vstopa v Krebsov cikel, zato so tudi tega vključili v model presnove ksiloze. S pripravljenim modelom so napovedali količino nastale biomase ''E.coli'' ob pogojih v bioreaktorju oziroma vpliv prisotnosti alternativne presnovne poti ksiloze na rast bakterij. Pravilnost modela so preverili eksperimentalno in pokazali, da lahko z njegovo pomočjo uspešno napovejo obnašanje sistema. S tem so prihranili čas in denar, saj so lahko z uporabo modela v laboratoriju delali bolj usmerjeno. Med drugim so z modelom pokazali, da lahko količino nastalega piruvata spremljajo prek meritev optične gostote (O.D.600) suspenzije bakterij in si s tem olajšali eksperimentalno delo. Ugotovili so, da možnost izrabe CO2 vpliva na rast bakterij, saj so rekombinantne bakterije v atmosferi s 5% CO2 proizvedle več piruvata oziroma so v istem času dosegle višjo O.D.600 kakor v atmosferi brez dodanega CO2 [1].

Za vrednotenje učinkovitosti izrabe obvozne poti CO2 so uvedli indeks izrabe ksiloze (XUI, ang. ''xylose utilisation index'') – hiter, enostaven in uporaben način za oceno sposobnosti bakterij za fiksiranje ogljika, prek meritev O.D.600 celične kulture. XUI omogoča dokaz sposobnosti izrabe CO2 in primerjavo med sevi ''E.coli'' in različnimi pogoji v bioreaktorju. Za opredelitev XUI so naredili 2 predpostavki – da O.D.600 korelira s suho maso bakterij, kar so tudi eksperimentalno dokazali in da je delež ogljika v celici ''E.coli'' stalen oz. se spreminja v ozkem intervalu, kar lahko zanemarimo. Iz tega sledi, da je količina ogljika pri dani O.D.600 fiksna in lahko privzamemo, da je izmerjena vrednost O.D.600 ekvivalentna masi ogljika v celicah. XUI je definiran kot razmerje med porabo ksiloze in O.D.600. Divji tip ''E.coli'' lahko v bioreaktorju kot vir ogljika v glavnem izrablja le ksilozo, torej bo v tem primeru XUI visok. Rekombinantna ''E.coli'' pa lahko izrablja tudi CO2, zato porabi manj ksiloze za rast do iste O.D.600 in je njen XUI nižji. S primerjavo XUI so izbrali najučinkovitejši sev za fiksiranje ogljika, E.coli BL21 (DE3) in optimizirali rastne pogoje v bioreaktorju. Najnižje XUI so določili pri uporabi gojišča M9 brez glukoze in z 0,4% ksiloze ter v atmosferi s 5% CO2. Za določitev hitrosti fiksiranja ogljika so uporabili pravilo o ohranitvi mase, po postopku opisanem v literaturi [4]. Določili so, da je pripravljen sintezno biološki sistem sposoben fiksirati ogljik s hitrostjo 0,575 mg/L/h in da v biomasi rekombinantne ''E.coli'' 9,1% ogljika izvira iz CO2 [1], [4].

==='''Oblikovanje bioreaktorja'''===

Študenti so pripravili prototip bioreaktorja, ki črpa CO2 in zaznava njegovo koncentracijo, meri temperaturo in pH gojišča ter podatke pošilja v oblak. Sestavljajo ga wi-fi vmesnik, črpalka CO2, zalogovnik za gojišče, predel za gojenje bakterij z magnetnim mešalom, odpad in tri merilni sistemi – termometer, senzor CO2, pH meter in sintezno biološki sistem za zaznavo spremembe pH. Slednji je bil stranski projekt tekmovalne skupine. Pripravili so ''E.coli'', ki se odziva na spremembo pH gojišča, tako da v nevtralnem pH izraža GFP, v kislem pa sfGFP. Posledično se ob zakisanju gojišča njegova barva spremeni iz rumene v zeleno. Kot osnovo so uporabili že obstoječe biokocke iz registra bioloških delov, s pH-občutljivimi promotorji in jih optimizirali za višji nivo izražanja [1].

==='''Programska oprema bioreaktorja'''===

Izdelali so program za spremljanje pogojev bioreaktorja v realnem času in aplikacijo, s katero lahko uporabnik kadarkoli prek wi-fija preveril stanje oz. napredek bioreaktorja [1].

==='''Biovarnost'''===
Uporabljen sev BL21 (DE3) ni patogen za človeka, zato ni nevarnosti okužb ob izpustu. Tudi vanj vneseni geni izvirajo iz človeku nenevarnih organizmov. Poleg tega so na bioreaktor namestili filtre in s testom potrdili, da uspešno preprečujejo izpust GSO v okolje. Načrtovali so tudi povezavo bioreaktorja s sistemom za uporabo odvečne toplote v industriji, s pomočjo katerega bi lahko sterilizirali odpadno gojišče [1].

==ZAKLJUČEK==
Ekipa je razvila sintezno biološki sistem za zmanjšanje izpustov CO2, ostaja pa veliko možnosti za izboljšave, ki bi naredile sistem bolj učinkovit in privlačen za industrijo. V ta namen so se povezali z iGEM ekipo UESTC-China, ki je razvila sistem za predelavo slame v biogorivo, pri katerem nastaja ksiloza kot stranski produkt <ref>iGEM 2018 Team UESTC-China. ''Straw-degrading Energy E.coli.'' Dostopno na: http://2018.igem.org/Team:UESTC-China [pridobljeno 15.12.2018].</ref>. Z umestitvijo bioreaktorja za fiksiranje ogljika navzdol od procesa predelave slame, bi bistveno znižali svoj ogljični odtis in se izognili nabavi velikih količin ksiloze, potrebne za delovanje bioreaktorja. Lahko bi tudi razvili sistem, ki za izrabo CO2 ne potrebuje sladkorja [4], <ref>Antonovsky N, Gleizer S, Noor E, in dr. ''Sugar Synthesis from CO2 in Escherichia coli.'' Cell 2016;166(1):115–25.</ref>. Z uvedbo procesa predelave piruvata v glutamin, bi industrijskemu obratu omogočili dodaten vir zaslužka. Za pospešitev fiksiranja ogljika bi lahko ''E.coli'' gojili v anaerobnih pogojih, kar je zahtevno, a poviša učinkovitost Rubisco, zaradi odsotnosti kisika, ki s CO2 tekmuje za vezavo nanj ali pa bi poiskali alternativo temu encimu <ref>Bar-Even A, Noor E, Lewis NE, Milo R. ''Design and analysis of synthetic carbon fixation pathways.'' PNAS 2010;107(19):8889–94.</ref>.

==VIRI==

<references/>

Of CO2urse - sistem za zmanjševanje izpustov ogljikovega dioksida v industriji

2018-12-17T17:13:09Z

Kity Požek:

Of CO2urse je projekt študentske ekipe 'NCKU Tainan' iz Tajvana, ki je bil nagrajen kot najboljši okoljski projekt na tekmovanju iz sintezne biologije, iGEM 2018. Namen projekta je s pristopi sintezne biologije prispevati k oblikovanju nizkoogljične družbe <ref>iGEM 2018 Team NCKU Tainan. ''Of CO2urse.'' Dostopno na: http://2018.igem.org/Team:NCKU_Tainan [pridobljeno 13.12.2018].</ref>.

==UVOD==
Globalno segrevanje je danes eden največjih okoljskih problemov in med najpomembnejšimi vzroki za učinek tople grede je pretiran izpust ogljikovega dioksida (CO2) v ozračje. Za izpust so v glavnem odgovorne človeške dejavnosti, kot so transport, proizvodnja električne energije in industrija, zaradi katerih se koncentracija tega toplogrednega plina v zraku izrazito povišuje vse od industrijske revolucije dalje. S hkratnim pretiranim izpustom CO2 in krčenjem naravnih ponorov CO2, kot so npr. gozdovi, se ruši naravni cikel ogljika, na kar kaže tudi dejstvo, da se je od leta 1960 do leta 2018 koncentracija CO2 v ozračju dvignila iz 320 ppm na več kot 400 ppm <ref>ProOxygen. ''CO2 Acceleration.'' Dostopno na: https://www.co2.earth/co2-acceleration [pridobljeno 13.12.2018].</ref>, <ref>US EPA. ''Overview of Greenhouse Gases.'' Dostopno na: https://www.epa.gov/ghgemissions/overview-greenhouse-gases [pridobljeno 13.12.2018].</ref>. Učinek tople grede ima za planet že vidne in zaskrbljujoče posledice, kot je npr. taljenje polarnega ledu, posledično dvigovanje gladine morja in manjšanje primernih površin ter pogojev za preživetje obstoječih vrst, višanje temperature morja in s tem rušenje morskega ekosistema itd. K obvladovanju izpustov CO2 med drugim pripomorejo raziskave, usmerjene v razvoj načinov za nadzor izpustov in za privzem CO2 iz ozračja. iGEM ekipa iz Tajvana si je v ta namen zamislila projekt, v sklopu katerega so pripravili sintezno biološki sistem, ki bi lahko v industrijskih obratih asimiliral nastali CO2 [1].

==PRISTOP IN IZVEDBA==
==='''Of CO2urse'''===
Študenti so pripravili prototip bioreaktorja z bakterijami ''E. coli'', v katere so po sistemu biokock vnesli gene cianobakterij za fiksiranje ogljika iz zraka. V bioreaktor so dovajali rastno gojišče s ksilozo kot edinim virom organskega ogljika in CO2 iz jeklenke, pripravljene s tehnologijo zajema in shranjevanja CO2 v industrijskem obratu. Bakterije so privzele CO2 iz zraka in ga pretvorile do piruvata, tega pa bi lahko v nadaljnjih procesih uporabili za pripravo raznih uporabnih spojin (npr. glutamina). Napravo so opremili tudi s senzorji za spremljanje stanja procesa in razvili aplikacijo za enostaven dostop do teh podatkov. Glede dizajna so se posvetovali s strokovnjaki iz tega področja in s končnimi uporabniki v industriji ter skušali upoštevati njihove nasvete in pripraviti učinkovit, varen, čim bolj donosen in cenovno ugoden sistem za pomoč pri zmanjševanju izpustov CO2 v industriji [1].

==='''Priprava ''E. coli'', ki fiksira CO2 '''===

Za pripravo CO2-fiksirajoče ''E.coli'' so konstruirali biokocke z geni za izražanje fosforibulokinaze (PRK), ogljikove anhidraze (CA) in ribuloza-1,5-bisfosfat karboksilaze/oksigenaze (Rubisco). Geni izvirajo iz dveh sevov cianobakterij - ''Synechococcus elongatus'' PCC 7942 in PCC 7002. Zanje so se odločili, ker so v literaturi zasledili, da so se že izkazali kot uspešni za ta namen <ref>Gong F, Liu G, Zhai X, in dr. ''Quantitative analysis of an engineered CO2-fixing Escherichia coli reveals great potential of heterotrophic CO2 fixation.'' Biotechnology for Biofuels 2015;8(1):86.</ref>. Prvi dve biokocki so vstavili v vektor pSB3K3, tretjo pa v pSB1C3 in bakterije kotransformirali z vektorjema. Tako so v ''E.coli'' omogočili potek Calvinovega cikla, ki je ena najpomembnejših poti za fiksiranje ogljika v naravi. Kot šasijo so preizkusili 3 seve ''E.coli'' - BL21 (DE3), W3110, W3110 (L5T7). Odločili so se za uporabo ''E.coli'' BL21 (DE3), ki je dobro rastla ob pogojih v bioreaktorju in se je po vnosu genov za fiksiranje ogljika izkazala kot najsposobnejša izrabe CO2. Prednost ''E.coli'' pred rastlinami, algami in cianobakterijami je, da raste hitreje in bolj robustno, ne potrebuje svetlobe in zato uspešnost gojenja ni odvisna od vremena ter zahteva manjše površine za gojenje [1], [4].

==='''Potek nove presnovne poti v ''E.coli'''''===

Pripravljene bakterije najprej prek lastne, pentoza-fosfatne poti presnovijo ksilozo iz rastnega gojišča v ribulozo-5-fosfat (Ru5P), ki jo nato z rekombinantnim encimom PRK fosforilirajo do ribuloze-1,5-bisfosfata (RuBP). Sledi karboksilacija RuBP s CO2 iz zraka, s pomočjo rekombinantnega encima Rubisco, pri čemer nastane 3-fosfoglicerat (3-PGA), ki se pretvori v piruvat. Piruvat je multifunkcionalen intermediat različnih anabolnih poti [1].
Pomembno vlogo pri fiksaciji ogljika ima tudi encim CA, ki s pretvarjanjem CO2 v ogljikovo kislino oz. HCO3-, poveča difuzijo plina v celice. Tako imajo bakterije na razpolago več CO2 za fiksiranje, kar je pomembno predvsem zato, ker CO2 tekmuje s kisikom za vezavo na Rubisco. Kljub temu, da ima E.coli lastno CA, so vanje vstavili še CA cianobakterij, ki je sposobna hitrejše katalize [1], [4].

==='''Učinkovitost izrabe CO2 v ''E.coli'''''===
Glavni presnovni poti ksiloze v divjem tipu ''E.coli'' sta pentoza-fosfatna pot in glikoliza, v rekombinantni ''E.coli'' pa poleg teh originalnih poti poteka v manjši meri še 'obvozna pot oz. obvoznica CO2' (ang. ''CO2 bypass pathway''). Študenti so razvili matematični model za napoved pretoka ogljika prek ene in druge poti. Obe poti se zaključita z nastankom piruvata, ki vstopa v Krebsov cikel, zato so tudi tega vključili v model presnove ksiloze. S pripravljenim modelom so napovedali količino nastale biomase ''E.coli'' ob pogojih v bioreaktorju oziroma vpliv prisotnosti alternativne presnovne poti ksiloze na rast bakterij. Pravilnost modela so preverili eksperimentalno in pokazali, da lahko z njegovo pomočjo uspešno napovejo obnašanje sistema. S tem so prihranili čas in denar, saj so lahko z uporabo modela v laboratoriju delali bolj usmerjeno. Med drugim so z modelom pokazali, da lahko količino nastalega piruvata spremljajo prek meritev optične gostote (O.D.600) suspenzije bakterij in si s tem olajšali eksperimentalno delo. Ugotovili so, da možnost izrabe CO2 vpliva na rast bakterij, saj so rekombinantne bakterije v atmosferi s 5% CO2 proizvedle več piruvata oziroma so v istem času dosegle višjo O.D.600 kakor v atmosferi brez dodanega CO2 [1].

Za vrednotenje učinkovitosti izrabe obvozne poti CO2 so uvedli indeks izrabe ksiloze (XUI, ang. ''xylose utilisation index'') – hiter, enostaven in uporaben način za oceno sposobnosti bakterij za fiksiranje ogljika, prek meritev O.D.600 celične kulture. XUI omogoča dokaz sposobnosti izrabe CO2 in primerjavo med sevi ''E.coli'' in različnimi pogoji v bioreaktorju. Za opredelitev XUI so naredili 2 predpostavki – da O.D.600 korelira s suho maso bakterij, kar so tudi eksperimentalno dokazali in da je delež ogljika v celici ''E.coli'' stalen oz. se spreminja v ozkem intervalu, kar lahko zanemarimo. Iz tega sledi, da je količina ogljika pri dani O.D.600 fiksna in lahko privzamemo, da je izmerjena vrednost O.D.600 ekvivalentna masi ogljika v celicah. XUI je definiran kot razmerje med porabo ksiloze in O.D.600. Divji tip ''E.coli'' lahko v bioreaktorju kot vir ogljika v glavnem izrablja le ksilozo, torej bo v tem primeru XUI visok. Rekombinantna ''E.coli'' pa lahko izrablja tudi CO2, zato porabi manj ksiloze za rast do iste O.D.600 in je njen XUI nižji. S primerjavo XUI so izbrali najučinkovitejši sev za fiksiranje ogljika, E.coli BL21 (DE3) in optimizirali rastne pogoje v bioreaktorju. Najnižje XUI so določili pri uporabi gojišča M9 brez glukoze in z 0,4% ksiloze ter v atmosferi s 5% CO2. Za določitev hitrosti fiksiranja ogljika so uporabili pravilo o ohranitvi mase, po postopku opisanem v literaturi [4]. Določili so, da je pripravljen sintezno biološki sistem sposoben fiksirati ogljik s hitrostjo 0,575 mg/L/h in da v biomasi rekombinantne ''E.coli'' 9,1% ogljika izvira iz CO2 [1], [4].

==='''Oblikovanje bioreaktorja'''===

Študenti so pripravili prototip bioreaktorja, ki črpa CO2 in zaznava njegovo koncentracijo, meri temperaturo in pH gojišča ter podatke pošilja v oblak. Sestavljajo ga wi-fi vmesnik, črpalka CO2, zalogovnik za gojišče, predel za gojenje bakterij z magnetnim mešalom, odpad in tri merilni sistemi – termometer, senzor CO2, pH meter in sintezno biološki sistem za zaznavo spremembe pH. Slednji je bil stranski projekt tekmovalne skupine. Pripravili so ''E.coli'', ki se odziva na spremembo pH gojišča, tako da v nevtralnem pH izraža GFP, v kislem pa sfGFP. Posledično se ob zakisanju gojišča njegova barva spremeni iz rumene v zeleno. Kot osnovo so uporabili že obstoječe biokocke iz registra bioloških delov, s pH-občutljivimi promotorji in jih optimizirali za višji nivo izražanja [1].

==VIRI==

<references/>

Of CO2urse - sistem za zmanjševanje izpustov ogljikovega dioksida v industriji

2018-12-17T17:10:49Z

Kity Požek:

Of CO2urse je projekt študentske ekipe 'NCKU Tainan' iz Tajvana, ki je bil nagrajen kot najboljši okoljski projekt na tekmovanju iz sintezne biologije, iGEM 2018. Namen projekta je s pristopi sintezne biologije prispevati k oblikovanju nizkoogljične družbe <ref>iGEM 2018 Team NCKU Tainan. ''Of CO2urse.'' Dostopno na: http://2018.igem.org/Team:NCKU_Tainan [pridobljeno 13.12.2018].</ref>.

==UVOD==
Globalno segrevanje je danes eden največjih okoljskih problemov in med najpomembnejšimi vzroki za učinek tople grede je pretiran izpust ogljikovega dioksida (CO2) v ozračje. Za izpust so v glavnem odgovorne človeške dejavnosti, kot so transport, proizvodnja električne energije in industrija, zaradi katerih se koncentracija tega toplogrednega plina v zraku izrazito povišuje vse od industrijske revolucije dalje. S hkratnim pretiranim izpustom CO2 in krčenjem naravnih ponorov CO2, kot so npr. gozdovi, se ruši naravni cikel ogljika, na kar kaže tudi dejstvo, da se je od leta 1960 do leta 2018 koncentracija CO2 v ozračju dvignila iz 320 ppm na več kot 400 ppm <ref>ProOxygen. ''CO2 Acceleration.'' Dostopno na: https://www.co2.earth/co2-acceleration [pridobljeno 13.12.2018].</ref>, <ref>US EPA. ''Overview of Greenhouse Gases.'' Dostopno na: https://www.epa.gov/ghgemissions/overview-greenhouse-gases [pridobljeno 13.12.2018].</ref>. Učinek tople grede ima za planet že vidne in zaskrbljujoče posledice, kot je npr. taljenje polarnega ledu, posledično dvigovanje gladine morja in manjšanje primernih površin ter pogojev za preživetje obstoječih vrst, višanje temperature morja in s tem rušenje morskega ekosistema itd. K obvladovanju izpustov CO2 med drugim pripomorejo raziskave, usmerjene v razvoj načinov za nadzor izpustov in za privzem CO2 iz ozračja. iGEM ekipa iz Tajvana si je v ta namen zamislila projekt, v sklopu katerega so pripravili sintezno biološki sistem, ki bi lahko v industrijskih obratih asimiliral nastali CO2 [1].

==PRISTOP IN IZVEDBA==
==='''Of CO2urse'''===
Študenti so pripravili prototip bioreaktorja z bakterijami ''E. coli'', v katere so po sistemu biokock vnesli gene cianobakterij za fiksiranje ogljika iz zraka. V bioreaktor so dovajali rastno gojišče s ksilozo kot edinim virom organskega ogljika in CO2 iz jeklenke, pripravljene s tehnologijo zajema in shranjevanja CO2 v industrijskem obratu. Bakterije so privzele CO2 iz zraka in ga pretvorile do piruvata, tega pa bi lahko v nadaljnjih procesih uporabili za pripravo raznih uporabnih spojin (npr. glutamina). Napravo so opremili tudi s senzorji za spremljanje stanja procesa in razvili aplikacijo za enostaven dostop do teh podatkov. Glede dizajna so se posvetovali s strokovnjaki iz tega področja in s končnimi uporabniki v industriji ter skušali upoštevati njihove nasvete in pripraviti učinkovit, varen, čim bolj donosen in cenovno ugoden sistem za pomoč pri zmanjševanju izpustov CO2 v industriji [1].

==='''Priprava ''E. coli'', ki fiksira CO2 '''===

Za pripravo CO2-fiksirajoče ''E.coli'' so konstruirali biokocke z geni za izražanje fosforibulokinaze (PRK), ogljikove anhidraze (CA) in ribuloza-1,5-bisfosfat karboksilaze/oksigenaze (Rubisco). Geni izvirajo iz dveh sevov cianobakterij - ''Synechococcus elongatus'' PCC 7942 in PCC 7002. Zanje so se odločili, ker so v literaturi zasledili, da so se že izkazali kot uspešni za ta namen <ref>Gong F, Liu G, Zhai X, in dr. ''Quantitative analysis of an engineered CO2-fixing Escherichia coli reveals great potential of heterotrophic CO2 fixation.'' Biotechnology for Biofuels 2015;8(1):86.</ref>. Prvi dve biokocki so vstavili v vektor pSB3K3, tretjo pa v pSB1C3 in bakterije kotransformirali z vektorjema. Tako so v ''E.coli'' omogočili potek Calvinovega cikla, ki je ena najpomembnejših poti za fiksiranje ogljika v naravi. Kot šasijo so preizkusili 3 seve ''E.coli'' - BL21 (DE3), W3110, W3110 (L5T7). Odločili so se za uporabo ''E.coli'' BL21 (DE3), ki je dobro rastla ob pogojih v bioreaktorju in se je po vnosu genov za fiksiranje ogljika izkazala kot najsposobnejša izrabe CO2. Prednost ''E.coli'' pred rastlinami, algami in cianobakterijami je, da raste hitreje in bolj robustno, ne potrebuje svetlobe in zato uspešnost gojenja ni odvisna od vremena ter zahteva manjše površine za gojenje [1], [4].

==='''Potek nove presnovne poti v ''E.coli'''''===

Pripravljene bakterije najprej prek lastne, pentoza-fosfatne poti presnovijo ksilozo iz rastnega gojišča v ribulozo-5-fosfat (Ru5P), ki jo nato z rekombinantnim encimom PRK fosforilirajo do ribuloze-1,5-bisfosfata (RuBP). Sledi karboksilacija RuBP s CO2 iz zraka, s pomočjo rekombinantnega encima Rubisco, pri čemer nastane 3-fosfoglicerat (3-PGA), ki se pretvori v piruvat. Piruvat je multifunkcionalen intermediat različnih anabolnih poti [1].
Pomembno vlogo pri fiksaciji ogljika ima tudi encim CA, ki s pretvarjanjem CO2 v ogljikovo kislino oz. HCO3-, poveča difuzijo plina v celice. Tako imajo bakterije na razpolago več CO2 za fiksiranje, kar je pomembno predvsem zato, ker CO2 tekmuje s kisikom za vezavo na Rubisco. Kljub temu, da ima E.coli lastno CA, so vanje vstavili še CA cianobakterij, ki je sposobna hitrejše katalize [1], [4].

==='''Učinkovitost izrabe CO2 v ''E.coli''''''===
Glavni presnovni poti ksiloze v divjem tipu ''E.coli'' sta pentoza-fosfatna pot in glikoliza, v rekombinantni ''E.coli'' pa poleg teh originalnih poti poteka v manjši meri še 'obvozna pot oz. obvoznica CO2' (ang. ''CO2 bypass pathway''). Študenti so razvili matematični model za napoved pretoka ogljika prek ene in druge poti. Obe poti se zaključita z nastankom piruvata, ki vstopa v Krebsov cikel, zato so tudi tega vključili v model presnove ksiloze. S pripravljenim modelom so napovedali količino nastale biomase ''E.coli'' ob pogojih v bioreaktorju oziroma vpliv prisotnosti alternativne presnovne poti ksiloze na rast bakterij. Pravilnost modela so preverili eksperimentalno in pokazali, da lahko z njegovo pomočjo uspešno napovejo obnašanje sistema. S tem so prihranili čas in denar, saj so lahko z uporabo modela v laboratoriju delali bolj usmerjeno. Med drugim so z modelom pokazali, da lahko količino nastalega piruvata spremljajo prek meritev optične gostote (O.D.600) suspenzije bakterij in si s tem olajšali eksperimentalno delo. Ugotovili so, da možnost izrabe CO2 vpliva na rast bakterij, saj so rekombinantne bakterije v atmosferi s 5% CO2 proizvedle več piruvata oziroma so v istem času dosegle višjo O.D.600 kakor v atmosferi brez dodanega CO2 [1].

Za vrednotenje učinkovitosti izrabe obvozne poti CO2 so uvedli indeks izrabe ksiloze (XUI, ang. ''xylose utilisation index'') – hiter, enostaven in uporaben način za oceno sposobnosti bakterij za fiksiranje ogljika, prek meritev O.D.600 celične kulture. XUI omogoča dokaz sposobnosti izrabe CO2 in primerjavo med sevi ''E.coli'' in različnimi pogoji v bioreaktorju. Za opredelitev XUI so naredili 2 predpostavki – da O.D.600 korelira s suho maso bakterij, kar so tudi eksperimentalno dokazali in da je delež ogljika v celici ''E.coli'' stalen oz. se spreminja v ozkem intervalu, kar lahko zanemarimo. Iz tega sledi, da je količina ogljika pri dani O.D.600 fiksna in lahko privzamemo, da je izmerjena vrednost O.D.600 ekvivalentna masi ogljika v celicah. XUI je definiran kot razmerje med porabo ksiloze in O.D.600. Divji tip ''E.coli'' lahko v bioreaktorju kot vir ogljika v glavnem izrablja le ksilozo, torej bo v tem primeru XUI visok. Rekombinantna ''E.coli'' pa lahko izrablja tudi CO2, zato porabi manj ksiloze za rast do iste O.D.600 in je njen XUI nižji. S primerjavo XUI so izbrali najučinkovitejši sev za fiksiranje ogljika, E.coli BL21 (DE3) in optimizirali rastne pogoje v bioreaktorju. Najnižje XUI so določili pri uporabi gojišča M9 brez glukoze in z 0,4% ksiloze ter v atmosferi s 5% CO2. Za določitev hitrosti fiksiranja ogljika so uporabili pravilo o ohranitvi mase, po postopku opisanem v literaturi [4]. Določili so, da je pripravljen sintezno biološki sistem sposoben fiksirati ogljik s hitrostjo 0,575 mg/L/h in da v biomasi rekombinantne E.coli 9,1% ogljika izvira iz CO2 [1], [4].

<references/>

Of CO2urse - sistem za zmanjševanje izpustov ogljikovega dioksida v industriji

2018-12-17T17:07:31Z

Kity Požek:

Of CO2urse - sistem za zmanjševanje izpustov ogljikovega dioksida v industriji

2018-12-17T17:04:33Z

Kity Požek:

Of CO2urse - sistem za zmanjševanje izpustov ogljikovega dioksida v industriji

2018-12-17T16:58:41Z

Kity Požek:

Of CO2urse - sistem za zmanjševanje izpustov ogljikovega dioksida v industriji

2018-12-17T16:55:11Z

Kity Požek:

Of CO2urse - sistem za zmanjševanje izpustov ogljikovega dioksida v industriji

2018-12-17T16:52:58Z

Kity Požek:

Of CO2urse - sistem za zmanjševanje izpustov ogljikovega dioksida v industriji

2018-12-17T16:50:15Z

Kity Požek:

Of CO2urse - sistem za zmanjševanje izpustov ogljikovega dioksida v industriji

2018-12-17T16:49:57Z

Kity Požek:

Of CO2urse - sistem za zmanjševanje izpustov ogljikovega dioksida v industriji

2018-12-17T16:47:55Z

Kity Požek:

Of CO2urse - sistem za zmanjševanje izpustov ogljikovega dioksida v industriji

2018-12-17T16:45:38Z

Kity Požek: New page: Of CO2urse je projekt študentske ekipe 'NCKU Tainan' iz Tajvana, ki je bil nagrajen kot najboljši okoljski projekt na tekmovanju iz sintezne biologije, iGEM 2018. Namen projek...

Seminarji SB 2018/19

2018-12-17T16:30:52Z

Kity Požek:

V študijskem letu 2018/19 študentje predstavljajo naslednje teme:

RAZISKOVALNI ČLANKI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) 

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/MoClo:_modularni_klonirni_sistem_za_standardizirano_sestavljanje_ve%C4%8Dgenskih_konstruktov MoClo: modularni klonirni sistem za standardizirano sestavljanje večgenskih konstruktov] (Valentina Levak)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/RNA-stikala_tipa_%C2%BBToehold%C2%AB:_de_novo_oblikovani_regulatorji_izra%C5%BEanja_genov RNA-stikala tipa Toehold: de novo oblikovani regulatorji izražanja genov] (Špela Malenšek)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Raznoliko_in_modelno_zasnovana_priprava_sinteti%C4%8Dnih_genskih_vezij_s_predvidenimi_lastnostmi Raznoliko in modelno zasnovana priprava sintetičnih genskih vezij s predvidenimi lastnostmi] (Matej Kolarič)

[[Dispersing biofilms with engineered enzymatic bacteriophage]] (Fran Krstanović)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Nekaj_pogledov_na_sistemsko_biologijo_kvasovke Nekaj pogledov na sistemsko biologijo kvasovke] (Gašper Žun)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Organizacija_znotrajceli%C4%8Dnih_reakcij_z_razumsko_na%C4%8Drtovanimi_RNA_sestavi#Na.C4.8Drtovanje_in_sestavljanje_RNA_sestavov Organizacija znotrajceličnih reakcij z razumsko načrtovanimi RNA sestavi] (Urška Jelenovec)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Biolo%C5%A1ko_vezje_na_osnovi_RNA-interference_za_identifikacijo_specifi%C4%8Dnih_rakavih_celic Biološko vezje na osnovi RNA-interference za identifikacijo specifičnih rakavih celic] (Gašper Marinšek)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Kontrola_hitrosti_translacije_preko_pomožnega_mesta_5’-UTR:_energijski_kompromis_med_dostopnostjo%2C_selektivnim_razvijanjem_RNA-struktur_in_drsenjem_30S_ribosomske_podenote_po_RNA-strukturah Kontrola hitrosti translacije preko pomožnega mesta 5’-UTR: energijski kompromis med dostopnostjo, selektivnim razvijanjem RNA-struktur in drsenjem 30S ribosomske podenote po RNA-strukturah] (Neža Koritnik)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Preoblikovanje_genskega_skupka_za_fiksacijo_dušika_bakterije_Klebsiella_oxytoca Preoblikovanje genskega skupka za fiksacijo dušika bakterije ''Klebsiella oxytoca''] (Gašper Virant)

NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.) 
[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Phactory:_proizvodnja_bakteriofagov_za_precizno_zdravljenje Phactory: proizvodnja bakteriofagov za precizno zdravljenje] (Rok Miklavčič)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Canditect:_hitra_detekcija_vaginalne_infekcije_s_Candido_albicans_z_uporabo_sistema_CRISPR/dCas9 Canditect – hitra detekcija vaginalne infekcije s Candido albicans z uporabo sistema CRISPR/dCas9] (Jerneja Ovčar)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/CAPOEIRA_-_razvoj_personaliziranega_cepiva_proti_raku_in_sistema_za_spremljanje_odziva_na_zdravljenje CAPOEIRA – razvoj personaliziranega cepiva proti raku in sistema za spremljanje odziva na zdravljenje] (Anamarija Habič)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Biotic_Blue_-_encimska_razgradnja_zdravilnih_u%C4%8Dinkovin_v_odpadnih_vodah#BIOTIC_BLUE BIOTIC BLUE - encimska razgradnja zdravilnih učinkovin v odpadnih vodah] (Tina Požun)

Of CO2urse - sistem za zmanjševanje izpustov ogljikovega dioksida v industriji (Kity Požek)

Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo razprava, ki praviloma ne bo daljša od 5 minut.

----

Razpored po datumih predstavitev (pri vsakem terminu je navedeno število možnih seminarjev; vpišite ime in priimek pri dnevu, ko želite predstaviti seminar ter dopišite naslov seminarja, ki naj bo povezan s povzetkom):

22.11. 
1 
2 Valentina Levak 

27.11. 
1 
2 
3 
4 

29.11. 
1 Matej Kolarič 
2 Špela Malenšek 
3 
4 

4.12. 
1 Gašper Žun 
2 Fran Krstanovic 
3 
4 

6.12. 
1 Urška Jelenovec 
2 Rok Miklavčič 
3 
4 

11.12. 
1 Jerneja Ovčar 
2 Neža Koritnik 
3 Gašper Virant 
4 Gašper Marinšek 

18.12. 
1 Tina Požun 
2 Anamarija Habič 
3 Roberta Mulac 
4 Kity Požek 

3.1. 
1 Urška Kašnik 
2 Nina Mavec 
3 Primož Tič 
4 Ernest Šprager 

8.1. 
1 Marija Atanasova 
2 Bine Tršavec 
3 Peter Pečan 
4 Tjaša Sorčan 

10.1. 
1 Špela Koren 
2 Natalija Pucihar 
3 Karmen Žbogar 
4 Uroš Zavrtanik 

15.1. 
1 Jerneja Kocutar 
2 Blaž Lebar 
3 Tadej Satler 
4 Miha Koprivnikar Krajnc 

17.1. 
1 Milena Stojkovska 
2

Seminarji SB 2018/19

2018-12-17T10:56:16Z

Kity Požek:

V študijskem letu 2018/19 študentje predstavljajo naslednje teme:

RAZISKOVALNI ČLANKI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) 

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/MoClo:_modularni_klonirni_sistem_za_standardizirano_sestavljanje_ve%C4%8Dgenskih_konstruktov MoClo: modularni klonirni sistem za standardizirano sestavljanje večgenskih konstruktov] (Valentina Levak)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/RNA-stikala_tipa_%C2%BBToehold%C2%AB:_de_novo_oblikovani_regulatorji_izra%C5%BEanja_genov RNA-stikala tipa Toehold: de novo oblikovani regulatorji izražanja genov] (Špela Malenšek)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Raznoliko_in_modelno_zasnovana_priprava_sinteti%C4%8Dnih_genskih_vezij_s_predvidenimi_lastnostmi Raznoliko in modelno zasnovana priprava sintetičnih genskih vezij s predvidenimi lastnostmi] (Matej Kolarič)

[[Dispersing biofilms with engineered enzymatic bacteriophage]] (Fran Krstanović)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Nekaj_pogledov_na_sistemsko_biologijo_kvasovke Nekaj pogledov na sistemsko biologijo kvasovke] (Gašper Žun)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Organizacija_znotrajceli%C4%8Dnih_reakcij_z_razumsko_na%C4%8Drtovanimi_RNA_sestavi#Na.C4.8Drtovanje_in_sestavljanje_RNA_sestavov Organizacija znotrajceličnih reakcij z razumsko načrtovanimi RNA sestavi] (Urška Jelenovec)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Biolo%C5%A1ko_vezje_na_osnovi_RNA-interference_za_identifikacijo_specifi%C4%8Dnih_rakavih_celic Biološko vezje na osnovi RNA-interference za identifikacijo specifičnih rakavih celic] (Gašper Marinšek)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Kontrola_hitrosti_translacije_preko_pomožnega_mesta_5’-UTR:_energijski_kompromis_med_dostopnostjo%2C_selektivnim_razvijanjem_RNA-struktur_in_drsenjem_30S_ribosomske_podenote_po_RNA-strukturah Kontrola hitrosti translacije preko pomožnega mesta 5’-UTR: energijski kompromis med dostopnostjo, selektivnim razvijanjem RNA-struktur in drsenjem 30S ribosomske podenote po RNA-strukturah] (Neža Koritnik)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Preoblikovanje_genskega_skupka_za_fiksacijo_dušika_bakterije_Klebsiella_oxytoca Preoblikovanje genskega skupka za fiksacijo dušika bakterije ''Klebsiella oxytoca''] (Gašper Virant)

NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.) 
[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Phactory:_proizvodnja_bakteriofagov_za_precizno_zdravljenje Phactory: proizvodnja bakteriofagov za precizno zdravljenje] (Rok Miklavčič)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Canditect:_hitra_detekcija_vaginalne_infekcije_s_Candido_albicans_z_uporabo_sistema_CRISPR/dCas9 Canditect – hitra detekcija vaginalne infekcije s Candido albicans z uporabo sistema CRISPR/dCas9] (Jerneja Ovčar)

CAPOEIRA – razvoj personaliziranega cepiva proti raku in sistema za spremljanje odziva na zdravljenje (Anamarija Habič)

BIOTIC BLUE - encimska razgradnja zdravilnih učinkovin v odpadnih vodah (Tina Požun)

Of CO2urse - s sintezno biologijo korak bližje nizkoogljični družbi (Kity Požek)

Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo razprava, ki praviloma ne bo daljša od 5 minut.

----

Razpored po datumih predstavitev (pri vsakem terminu je navedeno število možnih seminarjev; vpišite ime in priimek pri dnevu, ko želite predstaviti seminar ter dopišite naslov seminarja, ki naj bo povezan s povzetkom):

22.11. 
1 
2 Valentina Levak 

27.11. 
1 
2 
3 
4 

29.11. 
1 Matej Kolarič 
2 Špela Malenšek 
3 
4 

4.12. 
1 Gašper Žun 
2 Fran Krstanovic 
3 
4 

6.12. 
1 Urška Jelenovec 
2 Rok Miklavčič 
3 
4 

11.12. 
1 Jerneja Ovčar 
2 Neža Koritnik 
3 Gašper Virant 
4 Gašper Marinšek 

18.12. 
1 Tina Požun 
2 Anamarija Habič 
3 Roberta Mulac 
4 Kity Požek 

3.1. 
1 Urška Kašnik 
2 Nina Mavec 
3 Primož Tič 
4 Ernest Šprager 

8.1. 
1 Marija Atanasova 
2 Bine Tršavec 
3 Peter Pečan 
4 Tjaša Sorčan 

10.1. 
1 Špela Koren 
2 Natalija Pucihar 
3 Karmen Žbogar 
4 Uroš Zavrtanik 

15.1. 
1 Jerneja Kocutar 
2 Blaž Lebar 
3 Tadej Satler 
4 Miha Koprivnikar Krajnc 

17.1. 
1 Milena Stojkovska 
2