Wiki FKKT - User contributions [en]

Uporaba CIVT-SELEX za izbiro aptamerov kot genskih delov za regulacijo genetskih vezij v brezceličnem sistemu

2023-05-15T10:58:30Z

Klemen Kunej: /* Zaključek */

''Povzeto po članku: [https://www.mdpi.com/1422-0067/24/3/2833 Guo S, Xu Z, Lin L, Guo Y, Li J, Lu C, Shi X, Yang H. Using CIVT-SELEX to Select Aptamers as Genetic Parts to Regulate Gene Circuits in a Cell-Free System. Int J Mol Sci. 2023 Feb 1;24(3):2833. ]''

==Uvod==

Napredki v sintezni biologiji nam omogočajo načrtovanje dinamičnih in kompleksnih funkcij v živih organizmih. Realizacija teh kompleksnih funkcij je odvisna od ustvarjanja raznih delujočih genetskih vezij. Ustvarjena so bila številna sintetična genetska vezja, pri katerih je ključna regulacija genske ekspresije. Trenutno se pri večini relevantnih študij za regulacijo genske ekspresije uporablja transkripcijske faktorje in njihove operatorje (LacI/lacO, TetR/tetO). Čeprav je uporaba transkripcijskih faktorjev robustna, pa se pojavi pomanjkljivost v omejenem številu parov transkripcijski faktor-operator. Da bi rešili ta problem, so znanstveniki začeli preizkušati pare DNA aptamer- ligand kot genetske dele za regulacijo izražanja genov. DNA aptameri se specifično vežejo na ligand, ki je lahko majhna molekula ali protein, in tako tvorijo kompleks sposoben regulacije genske ekspresije. Ker so DNA aptameri enoverižne DNA, lahko tako teoretično obstaja na milijone različnih parov aptamer-ligand [1].

Najbolj uporabljen model aptamera je trombinski aptamer. Že v preteklosti se je raziskovala njegova uporaba kot biološkega dela, pri čemer so ga vstavljali na različne lokacije ob promotorju in preučevali, kako to vpliva na ekspresijo tarčnih genov. S tem so se ukvarjali tudi v tej študiji. Poleg tega, so razvili metodo CIVT-SELEX (angl. Capture and In Vitro Transcription-SELEX) s pomočjo katere so izbrali trombinske aptamere primerne za regulacijo genske transkripcije [1]. Gre za nadgradnjo metode SELEX (angl. systematic evolution of ligands by exponential enrichment), pri kateri aptamere presejamo in izberemo le tiste z visoko afiniteto za željen ligand [2].

==Raziskave z že obstoječim aptamernim zaporedjem==

===Regulacija in-vitro transkripcije===

Da bi znanstveniki preverili izvedljivost uporabe aptamerov kot genskih regulatorjev, so na začetku uporabili, do sedaj dobro preučen, 29 nukleotidov dolg trombinski aptamer. Tega so vključili na različne lokacije blizu promotorske regije. Zanimalo jih je, kako bo vključitev aptamernega zaporedja v linearno DNA vplivala na in vitro transkripcijsko aktivnost, še bolj pa jih je zanimalo, kako bo na prepisovanje vplivala vezava liganda (človeškega trombina) na to aptamerno zaporedje. Transkripcijsko aktivnost so spremljali preko fluorescence reporterskega zaporedja 3WJdB, ki omogoča spremljanje transkripcijske aktivnosti v realnem času. Ugotovili so, da vključitev aptamera blizu promotorskega zaporedja zniža transkripcijsko aktivnost reporterskega zaporedja, saj ta s svojo sekundarno strukturo blokira potovanje RNA polimeraze po verigi [1].

Ob dodatku človeškega trombina, v večini primerov ni prišlo do očitnih sprememb transkripcijske aktivnosti v primerjavi s kontrolnim poskusom. Je pa v primeru vključitve trombinskega aptamera v smerno verigo navzdol od promotorja, prišlo do povišane transkripcije. Ob vezavi RNA polimeraze na promotorsko regijo pride namreč do odvitja dvojne vijačnice DNA. Ustvari se transkripcijski mehurček, ki izpostavi aptamerno zaporedje, ki lahko, kot omenjeno prej, blokira migracijo RNA polimeraze in s tem zniža efektivnost transkripcije ali pa jo celo prepreči. Vezava liganda na aptamerno zaporedje povzroči njegovo konformacijsko spremembo, kar lahko vpliva na transkripcijsko aktivnost. Ker je v slednjem primeru prišlo do povišanja ravni prepisovanja, se je torej zgodila takšna konformacijska sprememba strukture aptamera, ki je omogočila bolj ugodno potovanje RNA polimeraze navzdol po verigi [1].

===Regulacija transkripcije v brezceličnem sistemu===

Znanstveniki so želeli preveriti, ali pride do podobnih stimulatornih odzivov kot pri in vitro eksperimentih, tudi v brezceličnih sistemih. Za te namene so uporabili plazmidno DNA, ki je vsebovala enako promotorsko in reportersko zaporedje kot pri prejšnjem poskusu. Vezava človeškega trombina na trombinski aptamer je tudi v tem primeru povišala raven prepisovanja. Ugotovili so, da je fluorescenca, ki torej odraža transkripcijsko aktivnost, na začetku naraščala, nato pa je začela kar naenkrat padati. Razumeti moramo namreč, da je brezceličen sistem kompleksen in lahko prihaja do interakcij med različnimi komponentami. Padanje fluorescence se lahko pojasni s prisotnimi RNazami v sistemu, ki razgradijo prepisana RNA zaporedja 3WJdB. Na začetku je torej nivo transkripcije višji od degradacije, kar se kaže z naraščajočo fluorescenco. Po približno 30-60 min fluorescenca doseže vrh in začne padati, torej postane razgrajanje fluorescenčnega zaporedja 3WJdB hitrejše kot njegovo prepisovanje. Po 3-4 urah pride do razgradnje večine zaporedij 3WJdB, in s tem do znižanja fluorescence na bazalni nivo [1].
Ugotovili so tudi, da je nivo fluorescence bistveno nižji v brezceličnem sistemu, kot pri in vitro poskusih [1].

==Pridobivanje in preizkušanje novih aptamerov (CIVT-SELEX)==

===Capture-SELEX===

Ker so bili efekti vezave liganda na aptamerno zaporedje, torej povišanja transkripcije, premalo izraziti, so želeli pridobiti nove aptamere, ki se bodo odzivali na manjše koncentracije liganda, hkrati pa se jih bo lahko vključilo v biološka vezja. Za ta namen so uporabili metodo imenovano Capture-SELEX [1].

Oligonukleotidi iz knjižnice za Capture-SELEX so vsebovali 2 restrikcijski mesti, mesta za prepoznavo začetnih oligonukleotidov, ter seriji 40 in 10 naključnih nukleotidov, med njima pa se je nahajalo umestitveno zaporedje. To zaporedje je bilo komplementarno zaporedju za zajem, ki je bilo na 3' koncu biotinilirano [1].

DNA iz knjižnice so imobilizirali na magnetne kroglice s streptavidinom. Nato so uporabili človeški trombin kot tarčo za selekcijo specifičnih aptamerov. Ob vezavi oligonukleotidov na človeški trombin je prišlo do spremembe tridimenzionalne strukture oligov, kar je povzročilo sproščanje enoverižne DNA iz kompleksa DNA-magnetna kroglica. Enoverižne DNA so z uporabo začetnih oligonukleotidov na obeh koncih pomnožili in dobili več kopij dvoverižne DNA, nato pa so z eksonukleazo razrezali le novo nastalo verigo. Kopije enoverižnih DNA so uporabili za nov krog selekcije in to ponovili 8 krat, pri čemer so pri vsakem krogu znižali koncentracijo liganda [1].

Po 8 krogih je sledilo negativno presejanje. V tem primeru so bili kompleksi DNA-magnetna kroglica, pred inkubacijo z ligandom, postavljeni v brezcelični sistem. S tem so želeli izločiti tiste aptamere, ki bi se lahko vezali na komponentne brezceličnega sistema. Po 4 krogih so dobili zaporedja, ki so bila visoka specifična in afinitetna proti človeškemu trombinu [1].

===Selekcija aptamerov s pomočjo brezceličnega transkripcijskega presejanja===

Dobljena knjižnica enoverižnih DNA pri postopku Capture-SELEX je bila pomnožena v dvoverižne DNA in vstavljena v vektorsko ogrodje s pomočjo metode sestavljanja Golden Gate. Vektor, ki je vseboval še promotor J23151, reportersko zaporedje 3WJdB in terminator, je bil transformiran v E. coli DH5α. Izbranih je bilo 1000 posameznih kolonij, ki so jih pomnožili in na podlagi agarozne gelske elektroforeze določili 832 takšnih DNA, ki so vsebovale pravilna zaporedja promotorja, aptamera, reporterja in terminatorja. Da so zmanjšali obseg dela, so 2 posamezni linearni DNA združili v skupni vzorec in tako dobili 416 poskusnih skupin [1].

Vsaka poskusna skupina je bila prepisana direktno v brezcelični sistem, z ali brez človeškega trombina. Primerjali so razlike v fluorescenci ob dodatku trombina. Pri tistih skupinah, kjer so bile razlike najočitnejše, so ponovili postopek, le da so tokrat v brezcelični sistem prepisali le individualne linearne DNA, ne več v paru, in zopet spremljali razlike v fluorescenci ob dodatku 0,5 uM človeškega trombina. Pri 6 aptamernih zaporedjih (AS1-76, AS2-3, AS2-70, AS7-36, AS7-83, AS8-22) je prišlo do znatnega upada fluorescence ob prisotnosti liganda – človeškega trombina. Ko so jih posekvencirali, so ugotovili, da so 3 zaporedja (AS2-3, AS7-36 in AS7-83) identična. V nadaljevanju so trem izbranim aptamernim zaporedjem (AS2-3, AS2-70 in AS8-22), poleg kontrolnega 29 nukleotidov dolgega aptamera, s pomočjo programa napovedali njihove sekundarne strukture. Njihova ∆G je bila pri vseh negativna, torej so sledeče sekundarne strukture stabilne pri 25°C [1].

3 omenjena aptamerna zaporedja so vstavili v stabilnejšo plazmidno obliko, da bi preverili odziv na tarčni ligand, zopet v brezceličnem sistemu. Rezultati so pokazali, da vsa 3 zaporedja povzročijo inhibicijo transkripcije ob dodatku 0,5 uM in 1 uM človeškega trombina, v primerjavi z negativno kontrolo brez vnesenega aptamernega zaporedja. Molekularni mehanizem takšne transkripcijske regulacije je enak kot je bil opisan prej. Pri prepisovanju, se ob vezavi RNA polimeraze na promotorsko zaporedje ustvari transkripcijski mehurček, ki izpostavi enoverižno aptamerno zaporedje, na katerega se lahko nato veže človeški trombin. Ker je v našem primeru prišlo do nižjega nivoja prepisovanja, je moralo torej ob vezavi liganda priti do takšnih konformacijskih sprememb v strukturi aptamera, da je prišlo do oteženega premikanja RNA polimeraze navzdol po verigi [1].

Zanimivi so pridobljeni rezultati kontrolnega poskusa, kjer plazmid ni vseboval aptamernega zaporedja. Ob dodatku 1 uM trombina je vseeno prišlo do inhibicije translacije. Človeški trombin naj bi namreč vplival na ekspresijo zaporedij v pripravljenem brezceličnem sistemu, v smislu nespecifične inhibicije. S tem se kažejo toksične lastnosti večjih koncentracij človeškega trombina v brezceličnih sistemih [1].

==Zaključek==

Aptameri imajo mnoge molekularne aplikacije zaradi njihove preproste in poceni priprave, majhne velikosti in velike pestrosti. Brezcelični transkripcijsko-translacijski sistem ponuja velik potencial kot platforma za hitro presejanje aptamerov in preizkušanje prototipov novih bioloških vezij. V tej študiji so znanstveniki z uporabo metode CIVT-SELEX, ki je sestavljena iz Capture-SELEX in iz in vitro presejalne transkripcije, uspeli izbrati takšne aptamere, ki so bili visoko specifični in afinitetni proti človeškemu trombinu, in so ob vezavi povzročili inhibitorne efekte na transkripcijsko aktivnost. Takšni rezultatu potrjujejo robustnost uporabe aptamerov kot genetskih delov, tako v linearnih DNA, kot tudi v plazmidih [1].

==Literatura==

[1] Guo S, Xu Z, Lin L, Guo Y, Li J, Lu C, Shi X, Yang H. Using CIVT-SELEX to Select Aptamers as Genetic Parts to Regulate Gene Circuits in a Cell-Free System. Int J Mol Sci. 2023 Feb 1;24(3):2833.

[2] Kohlberger M, Gadermaier G. SELEX: Critical factors and optimization strategies for successful aptamer selection. Biotechnol Appl Biochem. 2022 Oct;69(5):1771-1792.

Uporaba CIVT-SELEX za izbiro aptamerov kot genskih delov za regulacijo genetskih vezij v brezceličnem sistemu

2023-05-15T10:30:55Z

Klemen Kunej: /* Selekcija aptamerov s pomočjo brezceličnega transkripcijskega presejanja */

''Povzeto po članku: [https://www.mdpi.com/1422-0067/24/3/2833 Guo S, Xu Z, Lin L, Guo Y, Li J, Lu C, Shi X, Yang H. Using CIVT-SELEX to Select Aptamers as Genetic Parts to Regulate Gene Circuits in a Cell-Free System. Int J Mol Sci. 2023 Feb 1;24(3):2833. ]''

==Uvod==

Napredki v sintezni biologiji nam omogočajo načrtovanje dinamičnih in kompleksnih funkcij v živih organizmih. Realizacija teh kompleksnih funkcij je odvisna od ustvarjanja raznih delujočih genetskih vezij. Ustvarjena so bila številna sintetična genetska vezja, pri katerih je ključna regulacija genske ekspresije. Trenutno se pri večini relevantnih študij za regulacijo genske ekspresije uporablja transkripcijske faktorje in njihove operatorje (LacI/lacO, TetR/tetO). Čeprav je uporaba transkripcijskih faktorjev robustna, pa se pojavi pomanjkljivost v omejenem številu parov transkripcijski faktor-operator. Da bi rešili ta problem, so znanstveniki začeli preizkušati pare DNA aptamer- ligand kot genetske dele za regulacijo izražanja genov. DNA aptameri se specifično vežejo na ligand, ki je lahko majhna molekula ali protein, in tako tvorijo kompleks sposoben regulacije genske ekspresije. Ker so DNA aptameri enoverižne DNA, lahko tako teoretično obstaja na milijone različnih parov aptamer-ligand [1].

Najbolj uporabljen model aptamera je trombinski aptamer. Že v preteklosti se je raziskovala njegova uporaba kot biološkega dela, pri čemer so ga vstavljali na različne lokacije ob promotorju in preučevali, kako to vpliva na ekspresijo tarčnih genov. S tem so se ukvarjali tudi v tej študiji. Poleg tega, so razvili metodo CIVT-SELEX (angl. Capture and In Vitro Transcription-SELEX) s pomočjo katere so izbrali trombinske aptamere primerne za regulacijo genske transkripcije [1]. Gre za nadgradnjo metode SELEX (angl. systematic evolution of ligands by exponential enrichment), pri kateri aptamere presejamo in izberemo le tiste z visoko afiniteto za željen ligand [2].

==Raziskave z že obstoječim aptamernim zaporedjem==

===Regulacija in-vitro transkripcije===

Da bi znanstveniki preverili izvedljivost uporabe aptamerov kot genskih regulatorjev, so na začetku uporabili, do sedaj dobro preučen, 29 nukleotidov dolg trombinski aptamer. Tega so vključili na različne lokacije blizu promotorske regije. Zanimalo jih je, kako bo vključitev aptamernega zaporedja v linearno DNA vplivala na in vitro transkripcijsko aktivnost, še bolj pa jih je zanimalo, kako bo na prepisovanje vplivala vezava liganda (človeškega trombina) na to aptamerno zaporedje. Transkripcijsko aktivnost so spremljali preko fluorescence reporterskega zaporedja 3WJdB, ki omogoča spremljanje transkripcijske aktivnosti v realnem času. Ugotovili so, da vključitev aptamera blizu promotorskega zaporedja zniža transkripcijsko aktivnost reporterskega zaporedja, saj ta s svojo sekundarno strukturo blokira potovanje RNA polimeraze po verigi [1].

Ob dodatku človeškega trombina, v večini primerov ni prišlo do očitnih sprememb transkripcijske aktivnosti v primerjavi s kontrolnim poskusom. Je pa v primeru vključitve trombinskega aptamera v smerno verigo navzdol od promotorja, prišlo do povišane transkripcije. Ob vezavi RNA polimeraze na promotorsko regijo pride namreč do odvitja dvojne vijačnice DNA. Ustvari se transkripcijski mehurček, ki izpostavi aptamerno zaporedje, ki lahko, kot omenjeno prej, blokira migracijo RNA polimeraze in s tem zniža efektivnost transkripcije ali pa jo celo prepreči. Vezava liganda na aptamerno zaporedje povzroči njegovo konformacijsko spremembo, kar lahko vpliva na transkripcijsko aktivnost. Ker je v slednjem primeru prišlo do povišanja ravni prepisovanja, se je torej zgodila takšna konformacijska sprememba strukture aptamera, ki je omogočila bolj ugodno potovanje RNA polimeraze navzdol po verigi [1].

===Regulacija transkripcije v brezceličnem sistemu===

Znanstveniki so želeli preveriti, ali pride do podobnih stimulatornih odzivov kot pri in vitro eksperimentih, tudi v brezceličnih sistemih. Za te namene so uporabili plazmidno DNA, ki je vsebovala enako promotorsko in reportersko zaporedje kot pri prejšnjem poskusu. Vezava človeškega trombina na trombinski aptamer je tudi v tem primeru povišala raven prepisovanja. Ugotovili so, da je fluorescenca, ki torej odraža transkripcijsko aktivnost, na začetku naraščala, nato pa je začela kar naenkrat padati. Razumeti moramo namreč, da je brezceličen sistem kompleksen in lahko prihaja do interakcij med različnimi komponentami. Padanje fluorescence se lahko pojasni s prisotnimi RNazami v sistemu, ki razgradijo prepisana RNA zaporedja 3WJdB. Na začetku je torej nivo transkripcije višji od degradacije, kar se kaže z naraščajočo fluorescenco. Po približno 30-60 min fluorescenca doseže vrh in začne padati, torej postane razgrajanje fluorescenčnega zaporedja 3WJdB hitrejše kot njegovo prepisovanje. Po 3-4 urah pride do razgradnje večine zaporedij 3WJdB, in s tem do znižanja fluorescence na bazalni nivo [1].
Ugotovili so tudi, da je nivo fluorescence bistveno nižji v brezceličnem sistemu, kot pri in vitro poskusih [1].

==Pridobivanje in preizkušanje novih aptamerov (CIVT-SELEX)==

===Capture-SELEX===

Ker so bili efekti vezave liganda na aptamerno zaporedje, torej povišanja transkripcije, premalo izraziti, so želeli pridobiti nove aptamere, ki se bodo odzivali na manjše koncentracije liganda, hkrati pa se jih bo lahko vključilo v biološka vezja. Za ta namen so uporabili metodo imenovano Capture-SELEX [1].

Oligonukleotidi iz knjižnice za Capture-SELEX so vsebovali 2 restrikcijski mesti, mesta za prepoznavo začetnih oligonukleotidov, ter seriji 40 in 10 naključnih nukleotidov, med njima pa se je nahajalo umestitveno zaporedje. To zaporedje je bilo komplementarno zaporedju za zajem, ki je bilo na 3' koncu biotinilirano [1].

DNA iz knjižnice so imobilizirali na magnetne kroglice s streptavidinom. Nato so uporabili človeški trombin kot tarčo za selekcijo specifičnih aptamerov. Ob vezavi oligonukleotidov na človeški trombin je prišlo do spremembe tridimenzionalne strukture oligov, kar je povzročilo sproščanje enoverižne DNA iz kompleksa DNA-magnetna kroglica. Enoverižne DNA so z uporabo začetnih oligonukleotidov na obeh koncih pomnožili in dobili več kopij dvoverižne DNA, nato pa so z eksonukleazo razrezali le novo nastalo verigo. Kopije enoverižnih DNA so uporabili za nov krog selekcije in to ponovili 8 krat, pri čemer so pri vsakem krogu znižali koncentracijo liganda [1].

Po 8 krogih je sledilo negativno presejanje. V tem primeru so bili kompleksi DNA-magnetna kroglica, pred inkubacijo z ligandom, postavljeni v brezcelični sistem. S tem so želeli izločiti tiste aptamere, ki bi se lahko vezali na komponentne brezceličnega sistema. Po 4 krogih so dobili zaporedja, ki so bila visoka specifična in afinitetna proti človeškemu trombinu [1].

===Selekcija aptamerov s pomočjo brezceličnega transkripcijskega presejanja===

Dobljena knjižnica enoverižnih DNA pri postopku Capture-SELEX je bila pomnožena v dvoverižne DNA in vstavljena v vektorsko ogrodje s pomočjo metode sestavljanja Golden Gate. Vektor, ki je vseboval še promotor J23151, reportersko zaporedje 3WJdB in terminator, je bil transformiran v E. coli DH5α. Izbranih je bilo 1000 posameznih kolonij, ki so jih pomnožili in na podlagi agarozne gelske elektroforeze določili 832 takšnih DNA, ki so vsebovale pravilna zaporedja promotorja, aptamera, reporterja in terminatorja. Da so zmanjšali obseg dela, so 2 posamezni linearni DNA združili v skupni vzorec in tako dobili 416 poskusnih skupin [1].

Vsaka poskusna skupina je bila prepisana direktno v brezcelični sistem, z ali brez človeškega trombina. Primerjali so razlike v fluorescenci ob dodatku trombina. Pri tistih skupinah, kjer so bile razlike najočitnejše, so ponovili postopek, le da so tokrat v brezcelični sistem prepisali le individualne linearne DNA, ne več v paru, in zopet spremljali razlike v fluorescenci ob dodatku 0,5 uM človeškega trombina. Pri 6 aptamernih zaporedjih (AS1-76, AS2-3, AS2-70, AS7-36, AS7-83, AS8-22) je prišlo do znatnega upada fluorescence ob prisotnosti liganda – človeškega trombina. Ko so jih posekvencirali, so ugotovili, da so 3 zaporedja (AS2-3, AS7-36 in AS7-83) identična. V nadaljevanju so trem izbranim aptamernim zaporedjem (AS2-3, AS2-70 in AS8-22), poleg kontrolnega 29 nukleotidov dolgega aptamera, s pomočjo programa napovedali njihove sekundarne strukture. Njihova ∆G je bila pri vseh negativna, torej so sledeče sekundarne strukture stabilne pri 25°C [1].

3 omenjena aptamerna zaporedja so vstavili v stabilnejšo plazmidno obliko, da bi preverili odziv na tarčni ligand, zopet v brezceličnem sistemu. Rezultati so pokazali, da vsa 3 zaporedja povzročijo inhibicijo transkripcije ob dodatku 0,5 uM in 1 uM človeškega trombina, v primerjavi z negativno kontrolo brez vnesenega aptamernega zaporedja. Molekularni mehanizem takšne transkripcijske regulacije je enak kot je bil opisan prej. Pri prepisovanju, se ob vezavi RNA polimeraze na promotorsko zaporedje ustvari transkripcijski mehurček, ki izpostavi enoverižno aptamerno zaporedje, na katerega se lahko nato veže človeški trombin. Ker je v našem primeru prišlo do nižjega nivoja prepisovanja, je moralo torej ob vezavi liganda priti do takšnih konformacijskih sprememb v strukturi aptamera, da je prišlo do oteženega premikanja RNA polimeraze navzdol po verigi [1].

Zanimivi so pridobljeni rezultati kontrolnega poskusa, kjer plazmid ni vseboval aptamernega zaporedja. Ob dodatku 1 uM trombina je vseeno prišlo do inhibicije translacije. Človeški trombin naj bi namreč vplival na ekspresijo zaporedij v pripravljenem brezceličnem sistemu, v smislu nespecifične inhibicije. S tem se kažejo toksične lastnosti večjih koncentracij človeškega trombina v brezceličnih sistemih [1].

==Zaključek==

Aptameri imajo mnoge molekularne aplikacije zaradi njihove preproste in poceni priprave, majhne velikosti in velike pestrosti. Brezcelični transkripcijsko-translacijski sistem ponuja velik potencial kot platforma za hitro presajanje aptamerov in preizkušanje prototipov novih bioloških vezij. V tej študiji so znanstveniki z uporabo metode CIVT-SELEX, ki je sestavljena iz Capture-SELEX in iz in vitro presejalne transkripcije, uspeli izbrati takšne aptamere, ki so bili visoko specifični in afinitetni proti človeškemu trombinu, in so ob vezavi povzročili inhibitorne efekte na transkripcijsko aktivnost. Takšni rezultatu potrjujejo robustnost uporabe aptamerov kot genetskih delov, tako v linearnih DNA, kot tudi v plazmidih [1].

==Literatura==

[1] Guo S, Xu Z, Lin L, Guo Y, Li J, Lu C, Shi X, Yang H. Using CIVT-SELEX to Select Aptamers as Genetic Parts to Regulate Gene Circuits in a Cell-Free System. Int J Mol Sci. 2023 Feb 1;24(3):2833.

[2] Kohlberger M, Gadermaier G. SELEX: Critical factors and optimization strategies for successful aptamer selection. Biotechnol Appl Biochem. 2022 Oct;69(5):1771-1792.

Uporaba CIVT-SELEX za izbiro aptamerov kot genskih delov za regulacijo genetskih vezij v brezceličnem sistemu

2023-05-15T10:08:21Z

Klemen Kunej: /* Capture-SELEX */

''Povzeto po članku: [https://www.mdpi.com/1422-0067/24/3/2833 Guo S, Xu Z, Lin L, Guo Y, Li J, Lu C, Shi X, Yang H. Using CIVT-SELEX to Select Aptamers as Genetic Parts to Regulate Gene Circuits in a Cell-Free System. Int J Mol Sci. 2023 Feb 1;24(3):2833. ]''

==Uvod==

Napredki v sintezni biologiji nam omogočajo načrtovanje dinamičnih in kompleksnih funkcij v živih organizmih. Realizacija teh kompleksnih funkcij je odvisna od ustvarjanja raznih delujočih genetskih vezij. Ustvarjena so bila številna sintetična genetska vezja, pri katerih je ključna regulacija genske ekspresije. Trenutno se pri večini relevantnih študij za regulacijo genske ekspresije uporablja transkripcijske faktorje in njihove operatorje (LacI/lacO, TetR/tetO). Čeprav je uporaba transkripcijskih faktorjev robustna, pa se pojavi pomanjkljivost v omejenem številu parov transkripcijski faktor-operator. Da bi rešili ta problem, so znanstveniki začeli preizkušati pare DNA aptamer- ligand kot genetske dele za regulacijo izražanja genov. DNA aptameri se specifično vežejo na ligand, ki je lahko majhna molekula ali protein, in tako tvorijo kompleks sposoben regulacije genske ekspresije. Ker so DNA aptameri enoverižne DNA, lahko tako teoretično obstaja na milijone različnih parov aptamer-ligand [1].

Najbolj uporabljen model aptamera je trombinski aptamer. Že v preteklosti se je raziskovala njegova uporaba kot biološkega dela, pri čemer so ga vstavljali na različne lokacije ob promotorju in preučevali, kako to vpliva na ekspresijo tarčnih genov. S tem so se ukvarjali tudi v tej študiji. Poleg tega, so razvili metodo CIVT-SELEX (angl. Capture and In Vitro Transcription-SELEX) s pomočjo katere so izbrali trombinske aptamere primerne za regulacijo genske transkripcije [1]. Gre za nadgradnjo metode SELEX (angl. systematic evolution of ligands by exponential enrichment), pri kateri aptamere presejamo in izberemo le tiste z visoko afiniteto za željen ligand [2].

==Raziskave z že obstoječim aptamernim zaporedjem==

===Regulacija in-vitro transkripcije===

Da bi znanstveniki preverili izvedljivost uporabe aptamerov kot genskih regulatorjev, so na začetku uporabili, do sedaj dobro preučen, 29 nukleotidov dolg trombinski aptamer. Tega so vključili na različne lokacije blizu promotorske regije. Zanimalo jih je, kako bo vključitev aptamernega zaporedja v linearno DNA vplivala na in vitro transkripcijsko aktivnost, še bolj pa jih je zanimalo, kako bo na prepisovanje vplivala vezava liganda (človeškega trombina) na to aptamerno zaporedje. Transkripcijsko aktivnost so spremljali preko fluorescence reporterskega zaporedja 3WJdB, ki omogoča spremljanje transkripcijske aktivnosti v realnem času. Ugotovili so, da vključitev aptamera blizu promotorskega zaporedja zniža transkripcijsko aktivnost reporterskega zaporedja, saj ta s svojo sekundarno strukturo blokira potovanje RNA polimeraze po verigi [1].

Ob dodatku človeškega trombina, v večini primerov ni prišlo do očitnih sprememb transkripcijske aktivnosti v primerjavi s kontrolnim poskusom. Je pa v primeru vključitve trombinskega aptamera v smerno verigo navzdol od promotorja, prišlo do povišane transkripcije. Ob vezavi RNA polimeraze na promotorsko regijo pride namreč do odvitja dvojne vijačnice DNA. Ustvari se transkripcijski mehurček, ki izpostavi aptamerno zaporedje, ki lahko, kot omenjeno prej, blokira migracijo RNA polimeraze in s tem zniža efektivnost transkripcije ali pa jo celo prepreči. Vezava liganda na aptamerno zaporedje povzroči njegovo konformacijsko spremembo, kar lahko vpliva na transkripcijsko aktivnost. Ker je v slednjem primeru prišlo do povišanja ravni prepisovanja, se je torej zgodila takšna konformacijska sprememba strukture aptamera, ki je omogočila bolj ugodno potovanje RNA polimeraze navzdol po verigi [1].

===Regulacija transkripcije v brezceličnem sistemu===

Znanstveniki so želeli preveriti, ali pride do podobnih stimulatornih odzivov kot pri in vitro eksperimentih, tudi v brezceličnih sistemih. Za te namene so uporabili plazmidno DNA, ki je vsebovala enako promotorsko in reportersko zaporedje kot pri prejšnjem poskusu. Vezava človeškega trombina na trombinski aptamer je tudi v tem primeru povišala raven prepisovanja. Ugotovili so, da je fluorescenca, ki torej odraža transkripcijsko aktivnost, na začetku naraščala, nato pa je začela kar naenkrat padati. Razumeti moramo namreč, da je brezceličen sistem kompleksen in lahko prihaja do interakcij med različnimi komponentami. Padanje fluorescence se lahko pojasni s prisotnimi RNazami v sistemu, ki razgradijo prepisana RNA zaporedja 3WJdB. Na začetku je torej nivo transkripcije višji od degradacije, kar se kaže z naraščajočo fluorescenco. Po približno 30-60 min fluorescenca doseže vrh in začne padati, torej postane razgrajanje fluorescenčnega zaporedja 3WJdB hitrejše kot njegovo prepisovanje. Po 3-4 urah pride do razgradnje večine zaporedij 3WJdB, in s tem do znižanja fluorescence na bazalni nivo [1].
Ugotovili so tudi, da je nivo fluorescence bistveno nižji v brezceličnem sistemu, kot pri in vitro poskusih [1].

==Pridobivanje in preizkušanje novih aptamerov (CIVT-SELEX)==

===Capture-SELEX===

Ker so bili efekti vezave liganda na aptamerno zaporedje, torej povišanja transkripcije, premalo izraziti, so želeli pridobiti nove aptamere, ki se bodo odzivali na manjše koncentracije liganda, hkrati pa se jih bo lahko vključilo v biološka vezja. Za ta namen so uporabili metodo imenovano Capture-SELEX [1].

Oligonukleotidi iz knjižnice za Capture-SELEX so vsebovali 2 restrikcijski mesti, mesta za prepoznavo začetnih oligonukleotidov, ter seriji 40 in 10 naključnih nukleotidov, med njima pa se je nahajalo umestitveno zaporedje. To zaporedje je bilo komplementarno zaporedju za zajem, ki je bilo na 3' koncu biotinilirano [1].

DNA iz knjižnice so imobilizirali na magnetne kroglice s streptavidinom. Nato so uporabili človeški trombin kot tarčo za selekcijo specifičnih aptamerov. Ob vezavi oligonukleotidov na človeški trombin je prišlo do spremembe tridimenzionalne strukture oligov, kar je povzročilo sproščanje enoverižne DNA iz kompleksa DNA-magnetna kroglica. Enoverižne DNA so z uporabo začetnih oligonukleotidov na obeh koncih pomnožili in dobili več kopij dvoverižne DNA, nato pa so z eksonukleazo razrezali le novo nastalo verigo. Kopije enoverižnih DNA so uporabili za nov krog selekcije in to ponovili 8 krat, pri čemer so pri vsakem krogu znižali koncentracijo liganda [1].

Po 8 krogih je sledilo negativno presejanje. V tem primeru so bili kompleksi DNA-magnetna kroglica, pred inkubacijo z ligandom, postavljeni v brezcelični sistem. S tem so želeli izločiti tiste aptamere, ki bi se lahko vezali na komponentne brezceličnega sistema. Po 4 krogih so dobili zaporedja, ki so bila visoka specifična in afinitetna proti človeškemu trombinu [1].

===Selekcija aptamerov s pomočjo brezceličnega transkripcijskega presejanja===

Dobljena knjižnica enoverižnih DNA pri postopku Capture-SELEX je bila pomnožena v dvoverižne DNA in vstavljena v vektorsko ogrodje s pomočjo metode sestavljanja Golden Gate. Vektor, ki je vseboval še promotor J23151, reportersko zaporedje 3WJdB in terminator, je bil transformiran v E. coli DH5α. Izbranih je bilo 1000 posameznih kolonij, ki so jih pomnožili in na podlagi agarozne gelske elektroforeze določili 832 takšnih DNA, ki so vsebovale pravilna zaporedja promotorja, aptamera, reporterja in terminatorja. Da so zmanjšali obseg dela, so 2 posamezni linearni DNA združili v skupni vzorec in tako dobili 416 poskusnih skupin [1].

Vsaka poskusna skupina je bila prepisana direktno v brezcelični sistem, z ali brez človeškega trombina. Primerjali so razlike v fluorescenci ob dodatku trombina. Pri tistih skupinah, kjer so bile razlike najočitnejše, so ponovili postopek, le da so tokrat v brezcelični sistem prepisali le individualne linearne DNA, ne več v paru, in zopet spremljali razlike v fluorescenci ob dodatku 0,5 uM človeškega trombina. Pri 6 aptamernih zaporedij (AS1-76, AS2-3, AS2-70, AS7-36, AS7-83, AS8-22) je prišlo do znatnega upada fluorescence ob prisotnosti liganda – človeškega trombina. Ko so jih posekvencirali, so ugotovili, da so 3 zaporedja (AS2-3, AS7-36 in AS7-83) identična. V nadaljevanju so trem izbranim aptamernim zaporedjem (AS2-3, AS2-70 in AS8-22), poleg kontrolnega 29 nukleotidov dolgega aptamera, s pomočjo programa napovedali njihove sekundarne strukture. Njihova ∆G je bila pri vseh negativna, torej so sledeče sekundarne strukture stabilne pri 25°C [1].

3 omenjena aptamerna zaporedja so vstavili v stabilnejšo plazmidno obliko, da bi preverili odziv na tarčni ligand, zopet v brezceličnem sistemu. Rezultati so pokazali, da vsa 3 zaporedja povzročijo inhibicijo transkripcije ob dodatku 0,5 uM in 1 uM človeškega trombina, v primerjavi z negativno kontrolo brez vnesenega aptamernega zaporedja. Molekularni mehanizem takšne transkripcijske regulacije je enak kot je bil opisan prej. Pri prepisovanju, se ob vezavi RNA polimeraze na promotorsko zaporedje ustvari transkripcijski mehurček, ki izpostavi enoverižno aptamerno zaporedje, na katerega se lahko nato veže človeški trombin. Ker je v našem primeru prišlo do nižjega nivoja prepisovanja, je moralo torej ob vezavi liganda priti do takšnih konformacijskih sprememb v strukturi aptamera, da je prišlo do oteženega premikanja RNA polimeraze navzdol po verigi [1].

Zanimivi so pridobljeni rezultati kontrolnega poskusa, kjer plazmid ni vseboval aptamernega zaporedja. Ob dodatku 1 uM trombina je vseeno prišlo do inhibicije translacije. Človeški trombin naj bi namreč vplival na ekspresijo zaporedij v pripravljenem brezceličnem sistemu, v smislu nespecifične inhibicije. S tem se kažejo toksične lastnosti večjih koncentracij človeškega trombina v brezceličnih sistemih [1].

==Zaključek==

Aptameri imajo mnoge molekularne aplikacije zaradi njihove preproste in poceni priprave, majhne velikosti in velike pestrosti. Brezcelični transkripcijsko-translacijski sistem ponuja velik potencial kot platforma za hitro presajanje aptamerov in preizkušanje prototipov novih bioloških vezij. V tej študiji so znanstveniki z uporabo metode CIVT-SELEX, ki je sestavljena iz Capture-SELEX in iz in vitro presejalne transkripcije, uspeli izbrati takšne aptamere, ki so bili visoko specifični in afinitetni proti človeškemu trombinu, in so ob vezavi povzročili inhibitorne efekte na transkripcijsko aktivnost. Takšni rezultatu potrjujejo robustnost uporabe aptamerov kot genetskih delov, tako v linearnih DNA, kot tudi v plazmidih [1].

==Literatura==

[1] Guo S, Xu Z, Lin L, Guo Y, Li J, Lu C, Shi X, Yang H. Using CIVT-SELEX to Select Aptamers as Genetic Parts to Regulate Gene Circuits in a Cell-Free System. Int J Mol Sci. 2023 Feb 1;24(3):2833.

[2] Kohlberger M, Gadermaier G. SELEX: Critical factors and optimization strategies for successful aptamer selection. Biotechnol Appl Biochem. 2022 Oct;69(5):1771-1792.

Uporaba CIVT-SELEX za izbiro aptamerov kot genskih delov za regulacijo genetskih vezij v brezceličnem sistemu

2023-05-15T07:56:22Z

Klemen Kunej: /* Selekcija aptamerov s pomočjo brezceličnega transkripcijskega presejanja */

''Povzeto po članku: [https://www.mdpi.com/1422-0067/24/3/2833 Guo S, Xu Z, Lin L, Guo Y, Li J, Lu C, Shi X, Yang H. Using CIVT-SELEX to Select Aptamers as Genetic Parts to Regulate Gene Circuits in a Cell-Free System. Int J Mol Sci. 2023 Feb 1;24(3):2833. ]''

==Uvod==

Napredki v sintezni biologiji nam omogočajo načrtovanje dinamičnih in kompleksnih funkcij v živih organizmih. Realizacija teh kompleksnih funkcij je odvisna od ustvarjanja raznih delujočih genetskih vezij. Ustvarjena so bila številna sintetična genetska vezja, pri katerih je ključna regulacija genske ekspresije. Trenutno se pri večini relevantnih študij za regulacijo genske ekspresije uporablja transkripcijske faktorje in njihove operatorje (LacI/lacO, TetR/tetO). Čeprav je uporaba transkripcijskih faktorjev robustna, pa se pojavi pomanjkljivost v omejenem številu parov transkripcijski faktor-operator. Da bi rešili ta problem, so znanstveniki začeli preizkušati pare DNA aptamer- ligand kot genetske dele za regulacijo izražanja genov. DNA aptameri se specifično vežejo na ligand, ki je lahko majhna molekula ali protein, in tako tvorijo kompleks sposoben regulacije genske ekspresije. Ker so DNA aptameri enoverižne DNA, lahko tako teoretično obstaja na milijone različnih parov aptamer-ligand [1].

Najbolj uporabljen model aptamera je trombinski aptamer. Že v preteklosti se je raziskovala njegova uporaba kot biološkega dela, pri čemer so ga vstavljali na različne lokacije ob promotorju in preučevali, kako to vpliva na ekspresijo tarčnih genov. S tem so se ukvarjali tudi v tej študiji. Poleg tega, so razvili metodo CIVT-SELEX (angl. Capture and In Vitro Transcription-SELEX) s pomočjo katere so izbrali trombinske aptamere primerne za regulacijo genske transkripcije [1]. Gre za nadgradnjo metode SELEX (angl. systematic evolution of ligands by exponential enrichment), pri kateri aptamere presejamo in izberemo le tiste z visoko afiniteto za željen ligand [2].

==Raziskave z že obstoječim aptamernim zaporedjem==

===Regulacija in-vitro transkripcije===

Da bi znanstveniki preverili izvedljivost uporabe aptamerov kot genskih regulatorjev, so na začetku uporabili, do sedaj dobro preučen, 29 nukleotidov dolg trombinski aptamer. Tega so vključili na različne lokacije blizu promotorske regije. Zanimalo jih je, kako bo vključitev aptamernega zaporedja v linearno DNA vplivala na in vitro transkripcijsko aktivnost, še bolj pa jih je zanimalo, kako bo na prepisovanje vplivala vezava liganda (človeškega trombina) na to aptamerno zaporedje. Transkripcijsko aktivnost so spremljali preko fluorescence reporterskega zaporedja 3WJdB, ki omogoča spremljanje transkripcijske aktivnosti v realnem času. Ugotovili so, da vključitev aptamera blizu promotorskega zaporedja zniža transkripcijsko aktivnost reporterskega zaporedja, saj ta s svojo sekundarno strukturo blokira potovanje RNA polimeraze po verigi [1].

Ob dodatku človeškega trombina, v večini primerov ni prišlo do očitnih sprememb transkripcijske aktivnosti v primerjavi s kontrolnim poskusom. Je pa v primeru vključitve trombinskega aptamera v smerno verigo navzdol od promotorja, prišlo do povišane transkripcije. Ob vezavi RNA polimeraze na promotorsko regijo pride namreč do odvitja dvojne vijačnice DNA. Ustvari se transkripcijski mehurček, ki izpostavi aptamerno zaporedje, ki lahko, kot omenjeno prej, blokira migracijo RNA polimeraze in s tem zniža efektivnost transkripcije ali pa jo celo prepreči. Vezava liganda na aptamerno zaporedje povzroči njegovo konformacijsko spremembo, kar lahko vpliva na transkripcijsko aktivnost. Ker je v slednjem primeru prišlo do povišanja ravni prepisovanja, se je torej zgodila takšna konformacijska sprememba strukture aptamera, ki je omogočila bolj ugodno potovanje RNA polimeraze navzdol po verigi [1].

===Regulacija transkripcije v brezceličnem sistemu===

Znanstveniki so želeli preveriti, ali pride do podobnih stimulatornih odzivov kot pri in vitro eksperimentih, tudi v brezceličnih sistemih. Za te namene so uporabili plazmidno DNA, ki je vsebovala enako promotorsko in reportersko zaporedje kot pri prejšnjem poskusu. Vezava človeškega trombina na trombinski aptamer je tudi v tem primeru povišala raven prepisovanja. Ugotovili so, da je fluorescenca, ki torej odraža transkripcijsko aktivnost, na začetku naraščala, nato pa je začela kar naenkrat padati. Razumeti moramo namreč, da je brezceličen sistem kompleksen in lahko prihaja do interakcij med različnimi komponentami. Padanje fluorescence se lahko pojasni s prisotnimi RNazami v sistemu, ki razgradijo prepisana RNA zaporedja 3WJdB. Na začetku je torej nivo transkripcije višji od degradacije, kar se kaže z naraščajočo fluorescenco. Po približno 30-60 min fluorescenca doseže vrh in začne padati, torej postane razgrajanje fluorescenčnega zaporedja 3WJdB hitrejše kot njegovo prepisovanje. Po 3-4 urah pride do razgradnje večine zaporedij 3WJdB, in s tem do znižanja fluorescence na bazalni nivo [1].
Ugotovili so tudi, da je nivo fluorescence bistveno nižji v brezceličnem sistemu, kot pri in vitro poskusih [1].

==Pridobivanje in preizkušanje novih aptamerov (CIVT-SELEX)==

===Capture-SELEX===

Ker so bili efekti vezave liganda na aptamerno zaporedje, torej povišanja transkripcije, premalo izraziti, so želeli pridobiti nove aptamere, ki se bodo odzivali na manjše koncentracije liganda, hkrati pa se jih bo lahko vključilo v biološka vezja. Za ta namen so uporabili metodo imenovano Capture-SELEX [1].

Oligonukleotidi iz knjižnice za Capture-SELEX so vsebovali 2 restrikcijski mesti, mesta za prepoznavo začetnih oligonukleotidov, ter seriji 40 in 10 naključnih nukleotidov, med njima pa se je nahajalo umestitveno zaporedje. To zaporedje je bilo komplementarno zaporedju za zajem, ki je bilo na 3' koncu biotinilirano [1].

DNA iz knjižnice so imobilizirali na magnetne kroglice s strepravidinom. Nato so uporabili človeški trombin kot tarčo za selekcijo specifičnih aptamerov. Ob vezavi oligonukleotidov na človeški trombin je prišlo do spremembe tridimenzionalne strukture oligov, kar je povzročilo sproščanje enoverižne DNA iz kompleksa DNA-magnetna kroglica. Enoverižne DNA so z uporabo začetnih oligonukleotidov na obeh koncih pomnožili in dobili več kopij dvoverižne DNA, nato pa so z eksonukleazo razrezali le novo nastalo verigo. Kopije enoverižnih DNA so uporabili za nov krog selekcije in to ponovili 8 krat, pri čemer so pri vsakem krogu znižali koncentracijo liganda [1].

Po 8 krogih je sledilo negativno presejanje. V tem primeru so bili kompleksi DNA-magnetna kroglica, pred inkubacijo z ligandom, postavljeni v brezcelični sistem. S tem so želeli izločiti tiste aptamere, ki bi se lahko vezali na komponentne brezceličnega sistema. Po 4 krogih so dobili zaporedja, ki so bila visoka specifična in afinitetna proti človeškemu trombinu [1].

===Selekcija aptamerov s pomočjo brezceličnega transkripcijskega presejanja===

Dobljena knjižnica enoverižnih DNA pri postopku Capture-SELEX je bila pomnožena v dvoverižne DNA in vstavljena v vektorsko ogrodje s pomočjo metode sestavljanja Golden Gate. Vektor, ki je vseboval še promotor J23151, reportersko zaporedje 3WJdB in terminator, je bil transformiran v E. coli DH5α. Izbranih je bilo 1000 posameznih kolonij, ki so jih pomnožili in na podlagi agarozne gelske elektroforeze določili 832 takšnih DNA, ki so vsebovale pravilna zaporedja promotorja, aptamera, reporterja in terminatorja. Da so zmanjšali obseg dela, so 2 posamezni linearni DNA združili v skupni vzorec in tako dobili 416 poskusnih skupin [1].

Vsaka poskusna skupina je bila prepisana direktno v brezcelični sistem, z ali brez človeškega trombina. Primerjali so razlike v fluorescenci ob dodatku trombina. Pri tistih skupinah, kjer so bile razlike najočitnejše, so ponovili postopek, le da so tokrat v brezcelični sistem prepisali le individualne linearne DNA, ne več v paru, in zopet spremljali razlike v fluorescenci ob dodatku 0,5 uM človeškega trombina. Pri 6 aptamernih zaporedij (AS1-76, AS2-3, AS2-70, AS7-36, AS7-83, AS8-22) je prišlo do znatnega upada fluorescence ob prisotnosti liganda – človeškega trombina. Ko so jih posekvencirali, so ugotovili, da so 3 zaporedja (AS2-3, AS7-36 in AS7-83) identična. V nadaljevanju so trem izbranim aptamernim zaporedjem (AS2-3, AS2-70 in AS8-22), poleg kontrolnega 29 nukleotidov dolgega aptamera, s pomočjo programa napovedali njihove sekundarne strukture. Njihova ∆G je bila pri vseh negativna, torej so sledeče sekundarne strukture stabilne pri 25°C [1].

3 omenjena aptamerna zaporedja so vstavili v stabilnejšo plazmidno obliko, da bi preverili odziv na tarčni ligand, zopet v brezceličnem sistemu. Rezultati so pokazali, da vsa 3 zaporedja povzročijo inhibicijo transkripcije ob dodatku 0,5 uM in 1 uM človeškega trombina, v primerjavi z negativno kontrolo brez vnesenega aptamernega zaporedja. Molekularni mehanizem takšne transkripcijske regulacije je enak kot je bil opisan prej. Pri prepisovanju, se ob vezavi RNA polimeraze na promotorsko zaporedje ustvari transkripcijski mehurček, ki izpostavi enoverižno aptamerno zaporedje, na katerega se lahko nato veže človeški trombin. Ker je v našem primeru prišlo do nižjega nivoja prepisovanja, je moralo torej ob vezavi liganda priti do takšnih konformacijskih sprememb v strukturi aptamera, da je prišlo do oteženega premikanja RNA polimeraze navzdol po verigi [1].

Zanimivi so pridobljeni rezultati kontrolnega poskusa, kjer plazmid ni vseboval aptamernega zaporedja. Ob dodatku 1 uM trombina je vseeno prišlo do inhibicije translacije. Človeški trombin naj bi namreč vplival na ekspresijo zaporedij v pripravljenem brezceličnem sistemu, v smislu nespecifične inhibicije. S tem se kažejo toksične lastnosti večjih koncentracij človeškega trombina v brezceličnih sistemih [1].

==Zaključek==

Aptameri imajo mnoge molekularne aplikacije zaradi njihove preproste in poceni priprave, majhne velikosti in velike pestrosti. Brezcelični transkripcijsko-translacijski sistem ponuja velik potencial kot platforma za hitro presajanje aptamerov in preizkušanje prototipov novih bioloških vezij. V tej študiji so znanstveniki z uporabo metode CIVT-SELEX, ki je sestavljena iz Capture-SELEX in iz in vitro presejalne transkripcije, uspeli izbrati takšne aptamere, ki so bili visoko specifični in afinitetni proti človeškemu trombinu, in so ob vezavi povzročili inhibitorne efekte na transkripcijsko aktivnost. Takšni rezultatu potrjujejo robustnost uporabe aptamerov kot genetskih delov, tako v linearnih DNA, kot tudi v plazmidih [1].

==Literatura==

[1] Guo S, Xu Z, Lin L, Guo Y, Li J, Lu C, Shi X, Yang H. Using CIVT-SELEX to Select Aptamers as Genetic Parts to Regulate Gene Circuits in a Cell-Free System. Int J Mol Sci. 2023 Feb 1;24(3):2833.

[2] Kohlberger M, Gadermaier G. SELEX: Critical factors and optimization strategies for successful aptamer selection. Biotechnol Appl Biochem. 2022 Oct;69(5):1771-1792.

Uporaba CIVT-SELEX za izbiro aptamerov kot genskih delov za regulacijo genetskih vezij v brezceličnem sistemu

2023-05-15T07:55:29Z

Klemen Kunej: /* Selekcija aptamerov s pomočjo brezceličnega transkripcijskega presejanja */

''Povzeto po članku: [https://www.mdpi.com/1422-0067/24/3/2833 Guo S, Xu Z, Lin L, Guo Y, Li J, Lu C, Shi X, Yang H. Using CIVT-SELEX to Select Aptamers as Genetic Parts to Regulate Gene Circuits in a Cell-Free System. Int J Mol Sci. 2023 Feb 1;24(3):2833. ]''

==Uvod==

Napredki v sintezni biologiji nam omogočajo načrtovanje dinamičnih in kompleksnih funkcij v živih organizmih. Realizacija teh kompleksnih funkcij je odvisna od ustvarjanja raznih delujočih genetskih vezij. Ustvarjena so bila številna sintetična genetska vezja, pri katerih je ključna regulacija genske ekspresije. Trenutno se pri večini relevantnih študij za regulacijo genske ekspresije uporablja transkripcijske faktorje in njihove operatorje (LacI/lacO, TetR/tetO). Čeprav je uporaba transkripcijskih faktorjev robustna, pa se pojavi pomanjkljivost v omejenem številu parov transkripcijski faktor-operator. Da bi rešili ta problem, so znanstveniki začeli preizkušati pare DNA aptamer- ligand kot genetske dele za regulacijo izražanja genov. DNA aptameri se specifično vežejo na ligand, ki je lahko majhna molekula ali protein, in tako tvorijo kompleks sposoben regulacije genske ekspresije. Ker so DNA aptameri enoverižne DNA, lahko tako teoretično obstaja na milijone različnih parov aptamer-ligand [1].

Najbolj uporabljen model aptamera je trombinski aptamer. Že v preteklosti se je raziskovala njegova uporaba kot biološkega dela, pri čemer so ga vstavljali na različne lokacije ob promotorju in preučevali, kako to vpliva na ekspresijo tarčnih genov. S tem so se ukvarjali tudi v tej študiji. Poleg tega, so razvili metodo CIVT-SELEX (angl. Capture and In Vitro Transcription-SELEX) s pomočjo katere so izbrali trombinske aptamere primerne za regulacijo genske transkripcije [1]. Gre za nadgradnjo metode SELEX (angl. systematic evolution of ligands by exponential enrichment), pri kateri aptamere presejamo in izberemo le tiste z visoko afiniteto za željen ligand [2].

==Raziskave z že obstoječim aptamernim zaporedjem==

===Regulacija in-vitro transkripcije===

Da bi znanstveniki preverili izvedljivost uporabe aptamerov kot genskih regulatorjev, so na začetku uporabili, do sedaj dobro preučen, 29 nukleotidov dolg trombinski aptamer. Tega so vključili na različne lokacije blizu promotorske regije. Zanimalo jih je, kako bo vključitev aptamernega zaporedja v linearno DNA vplivala na in vitro transkripcijsko aktivnost, še bolj pa jih je zanimalo, kako bo na prepisovanje vplivala vezava liganda (človeškega trombina) na to aptamerno zaporedje. Transkripcijsko aktivnost so spremljali preko fluorescence reporterskega zaporedja 3WJdB, ki omogoča spremljanje transkripcijske aktivnosti v realnem času. Ugotovili so, da vključitev aptamera blizu promotorskega zaporedja zniža transkripcijsko aktivnost reporterskega zaporedja, saj ta s svojo sekundarno strukturo blokira potovanje RNA polimeraze po verigi [1].

Ob dodatku človeškega trombina, v večini primerov ni prišlo do očitnih sprememb transkripcijske aktivnosti v primerjavi s kontrolnim poskusom. Je pa v primeru vključitve trombinskega aptamera v smerno verigo navzdol od promotorja, prišlo do povišane transkripcije. Ob vezavi RNA polimeraze na promotorsko regijo pride namreč do odvitja dvojne vijačnice DNA. Ustvari se transkripcijski mehurček, ki izpostavi aptamerno zaporedje, ki lahko, kot omenjeno prej, blokira migracijo RNA polimeraze in s tem zniža efektivnost transkripcije ali pa jo celo prepreči. Vezava liganda na aptamerno zaporedje povzroči njegovo konformacijsko spremembo, kar lahko vpliva na transkripcijsko aktivnost. Ker je v slednjem primeru prišlo do povišanja ravni prepisovanja, se je torej zgodila takšna konformacijska sprememba strukture aptamera, ki je omogočila bolj ugodno potovanje RNA polimeraze navzdol po verigi [1].

===Regulacija transkripcije v brezceličnem sistemu===

Znanstveniki so želeli preveriti, ali pride do podobnih stimulatornih odzivov kot pri in vitro eksperimentih, tudi v brezceličnih sistemih. Za te namene so uporabili plazmidno DNA, ki je vsebovala enako promotorsko in reportersko zaporedje kot pri prejšnjem poskusu. Vezava človeškega trombina na trombinski aptamer je tudi v tem primeru povišala raven prepisovanja. Ugotovili so, da je fluorescenca, ki torej odraža transkripcijsko aktivnost, na začetku naraščala, nato pa je začela kar naenkrat padati. Razumeti moramo namreč, da je brezceličen sistem kompleksen in lahko prihaja do interakcij med različnimi komponentami. Padanje fluorescence se lahko pojasni s prisotnimi RNazami v sistemu, ki razgradijo prepisana RNA zaporedja 3WJdB. Na začetku je torej nivo transkripcije višji od degradacije, kar se kaže z naraščajočo fluorescenco. Po približno 30-60 min fluorescenca doseže vrh in začne padati, torej postane razgrajanje fluorescenčnega zaporedja 3WJdB hitrejše kot njegovo prepisovanje. Po 3-4 urah pride do razgradnje večine zaporedij 3WJdB, in s tem do znižanja fluorescence na bazalni nivo [1].
Ugotovili so tudi, da je nivo fluorescence bistveno nižji v brezceličnem sistemu, kot pri in vitro poskusih [1].

==Pridobivanje in preizkušanje novih aptamerov (CIVT-SELEX)==

===Capture-SELEX===

Ker so bili efekti vezave liganda na aptamerno zaporedje, torej povišanja transkripcije, premalo izraziti, so želeli pridobiti nove aptamere, ki se bodo odzivali na manjše koncentracije liganda, hkrati pa se jih bo lahko vključilo v biološka vezja. Za ta namen so uporabili metodo imenovano Capture-SELEX [1].

Oligonukleotidi iz knjižnice za Capture-SELEX so vsebovali 2 restrikcijski mesti, mesta za prepoznavo začetnih oligonukleotidov, ter seriji 40 in 10 naključnih nukleotidov, med njima pa se je nahajalo umestitveno zaporedje. To zaporedje je bilo komplementarno zaporedju za zajem, ki je bilo na 3' koncu biotinilirano [1].

DNA iz knjižnice so imobilizirali na magnetne kroglice s strepravidinom. Nato so uporabili človeški trombin kot tarčo za selekcijo specifičnih aptamerov. Ob vezavi oligonukleotidov na človeški trombin je prišlo do spremembe tridimenzionalne strukture oligov, kar je povzročilo sproščanje enoverižne DNA iz kompleksa DNA-magnetna kroglica. Enoverižne DNA so z uporabo začetnih oligonukleotidov na obeh koncih pomnožili in dobili več kopij dvoverižne DNA, nato pa so z eksonukleazo razrezali le novo nastalo verigo. Kopije enoverižnih DNA so uporabili za nov krog selekcije in to ponovili 8 krat, pri čemer so pri vsakem krogu znižali koncentracijo liganda [1].

Po 8 krogih je sledilo negativno presejanje. V tem primeru so bili kompleksi DNA-magnetna kroglica, pred inkubacijo z ligandom, postavljeni v brezcelični sistem. S tem so želeli izločiti tiste aptamere, ki bi se lahko vezali na komponentne brezceličnega sistema. Po 4 krogih so dobili zaporedja, ki so bila visoka specifična in afinitetna proti človeškemu trombinu [1].

===Selekcija aptamerov s pomočjo brezceličnega transkripcijskega presejanja===

Dobljena knjižnica enoverižnih DNA pri postopku Capture-SELEX je bila pomnožena v dvoverižne DNA in vstavljena v vektorsko ogrodje s pomočjo metode sestavljanja Golden Gate. Vektor, ki je vseboval še promotor J23151, reportersko zaporedje 3WJdB in terminator, je bil transformiran v E. coli DH5α. Izbranih je bilo 1000 posameznih kolonij, ki so jih pomnožili in na podlagi agarozne gelske elektroforeze določili 832 takšnih DNA, ki so vsebovale pravilna zaporedja promotorja, aptamera, reporterja in terminatorja. Da so zmanjšali obseg dela, so 2 posamezni linearni DNA združili v skupni vzorec in tako dobili 416 poskusnih skupin [1].

Vsaka poskusna skupina je bila prepisana direktno v brezcelični sistem, z ali brez človeškega trombina. Primerjali so razlike v fluorescenci ob dodatku trombina. Pri tistih skupinah, kjer so bile razlike najočitnejše, so ponovili postopek, le da so tokrat v brezcelični sistem prepisali le individualne linearne DNA, ne več v paru, in zopet spremljali razlike v fluorescenci ob dodatku 0,5 uM človeškega trombina. Pri 6 aptamernih zaporedij (AS1-76, AS2-3, AS2-70, AS7-36, AS7-83, AS8-22) je prišlo do znatnega upada fluorescence ob prisotnosti liganda – človeškega trombina. Ko so jih posekvencirali, so ugotovili, da so 3 zaporedja (AS2-3, AS7-36 in AS7-83) identična. V nadaljevanju so trem izbranim aptamernim zaporedjem (AS2-3, AS2-70 in AS8-22), poleg kontrolnega 29 nukleotidov dolgega aptamera, s pomočjo programa napovedali njihove sekundarne strukture. Njihova ∆G je bila pri vseh negativna, torej so sledeče sekundarne strukture stabilne pri 25°C [1].

3 omenjena aptamerna zaporedja so vstavili v stabilnejšo plazmidno obliko, da bi preverili odziv na tarčni ligand, zopet v brezceličnem sistemu. Rezultati so pokazali, da vsa 3 zaporedja povzročijo inhibicijo transkripcije ob dodatku 0,5 uM in 1 uM človeškega trombina, v primerjavi z negativno kontrolo brez vnesenega aptamernega zaporedja. Molekularni mehanizem takšne transkripcijske regulacije je enak kot je bil opisan prej. Pri prepisovanju, se ob vezavi RNA polimeraze na promotorsko zaporedje ustvari transkripcijski mehurček, ki izpostavi enoverižno aptamerno zaporedje, na katerega se lahko nato veže človeški trombin. Ker je v našem primeru prišlo do nižjega nivoja prepisovanja, je moralo torej ob vezavi liganda priti do takšnih konformacijskih sprememb v strukturi aptamera, da je prišlo do oteženega premikanja RNA polimeraze naprej po verigi [1].

Zanimivi so pridobljeni rezultati kontrolnega poskusa, kjer plazmid ni vseboval aptamernega zaporedja. Ob dodatku 1 uM trombina je vseeno prišlo do inhibicije translacije. Človeški trombin naj bi namreč vplival na ekspresijo zaporedij v pripravljenem brezceličnem sistemu, v smislu nespecifične inhibicije. S tem se kažejo toksične lastnosti večjih koncentracij človeškega trombina v brezceličnih sistemih [1].

==Zaključek==

Aptameri imajo mnoge molekularne aplikacije zaradi njihove preproste in poceni priprave, majhne velikosti in velike pestrosti. Brezcelični transkripcijsko-translacijski sistem ponuja velik potencial kot platforma za hitro presajanje aptamerov in preizkušanje prototipov novih bioloških vezij. V tej študiji so znanstveniki z uporabo metode CIVT-SELEX, ki je sestavljena iz Capture-SELEX in iz in vitro presejalne transkripcije, uspeli izbrati takšne aptamere, ki so bili visoko specifični in afinitetni proti človeškemu trombinu, in so ob vezavi povzročili inhibitorne efekte na transkripcijsko aktivnost. Takšni rezultatu potrjujejo robustnost uporabe aptamerov kot genetskih delov, tako v linearnih DNA, kot tudi v plazmidih [1].

==Literatura==

[1] Guo S, Xu Z, Lin L, Guo Y, Li J, Lu C, Shi X, Yang H. Using CIVT-SELEX to Select Aptamers as Genetic Parts to Regulate Gene Circuits in a Cell-Free System. Int J Mol Sci. 2023 Feb 1;24(3):2833.

[2] Kohlberger M, Gadermaier G. SELEX: Critical factors and optimization strategies for successful aptamer selection. Biotechnol Appl Biochem. 2022 Oct;69(5):1771-1792.

Uporaba CIVT-SELEX za izbiro aptamerov kot genskih delov za regulacijo genetskih vezij v brezceličnem sistemu

2023-05-15T07:55:06Z

Klemen Kunej: /* Selekcija aptamerov s pomočjo brezceličnega transkripcijskega presejanja */

''Povzeto po članku: [https://www.mdpi.com/1422-0067/24/3/2833 Guo S, Xu Z, Lin L, Guo Y, Li J, Lu C, Shi X, Yang H. Using CIVT-SELEX to Select Aptamers as Genetic Parts to Regulate Gene Circuits in a Cell-Free System. Int J Mol Sci. 2023 Feb 1;24(3):2833. ]''

==Uvod==

Napredki v sintezni biologiji nam omogočajo načrtovanje dinamičnih in kompleksnih funkcij v živih organizmih. Realizacija teh kompleksnih funkcij je odvisna od ustvarjanja raznih delujočih genetskih vezij. Ustvarjena so bila številna sintetična genetska vezja, pri katerih je ključna regulacija genske ekspresije. Trenutno se pri večini relevantnih študij za regulacijo genske ekspresije uporablja transkripcijske faktorje in njihove operatorje (LacI/lacO, TetR/tetO). Čeprav je uporaba transkripcijskih faktorjev robustna, pa se pojavi pomanjkljivost v omejenem številu parov transkripcijski faktor-operator. Da bi rešili ta problem, so znanstveniki začeli preizkušati pare DNA aptamer- ligand kot genetske dele za regulacijo izražanja genov. DNA aptameri se specifično vežejo na ligand, ki je lahko majhna molekula ali protein, in tako tvorijo kompleks sposoben regulacije genske ekspresije. Ker so DNA aptameri enoverižne DNA, lahko tako teoretično obstaja na milijone različnih parov aptamer-ligand [1].

Najbolj uporabljen model aptamera je trombinski aptamer. Že v preteklosti se je raziskovala njegova uporaba kot biološkega dela, pri čemer so ga vstavljali na različne lokacije ob promotorju in preučevali, kako to vpliva na ekspresijo tarčnih genov. S tem so se ukvarjali tudi v tej študiji. Poleg tega, so razvili metodo CIVT-SELEX (angl. Capture and In Vitro Transcription-SELEX) s pomočjo katere so izbrali trombinske aptamere primerne za regulacijo genske transkripcije [1]. Gre za nadgradnjo metode SELEX (angl. systematic evolution of ligands by exponential enrichment), pri kateri aptamere presejamo in izberemo le tiste z visoko afiniteto za željen ligand [2].

==Raziskave z že obstoječim aptamernim zaporedjem==

===Regulacija in-vitro transkripcije===

Da bi znanstveniki preverili izvedljivost uporabe aptamerov kot genskih regulatorjev, so na začetku uporabili, do sedaj dobro preučen, 29 nukleotidov dolg trombinski aptamer. Tega so vključili na različne lokacije blizu promotorske regije. Zanimalo jih je, kako bo vključitev aptamernega zaporedja v linearno DNA vplivala na in vitro transkripcijsko aktivnost, še bolj pa jih je zanimalo, kako bo na prepisovanje vplivala vezava liganda (človeškega trombina) na to aptamerno zaporedje. Transkripcijsko aktivnost so spremljali preko fluorescence reporterskega zaporedja 3WJdB, ki omogoča spremljanje transkripcijske aktivnosti v realnem času. Ugotovili so, da vključitev aptamera blizu promotorskega zaporedja zniža transkripcijsko aktivnost reporterskega zaporedja, saj ta s svojo sekundarno strukturo blokira potovanje RNA polimeraze po verigi [1].

Ob dodatku človeškega trombina, v večini primerov ni prišlo do očitnih sprememb transkripcijske aktivnosti v primerjavi s kontrolnim poskusom. Je pa v primeru vključitve trombinskega aptamera v smerno verigo navzdol od promotorja, prišlo do povišane transkripcije. Ob vezavi RNA polimeraze na promotorsko regijo pride namreč do odvitja dvojne vijačnice DNA. Ustvari se transkripcijski mehurček, ki izpostavi aptamerno zaporedje, ki lahko, kot omenjeno prej, blokira migracijo RNA polimeraze in s tem zniža efektivnost transkripcije ali pa jo celo prepreči. Vezava liganda na aptamerno zaporedje povzroči njegovo konformacijsko spremembo, kar lahko vpliva na transkripcijsko aktivnost. Ker je v slednjem primeru prišlo do povišanja ravni prepisovanja, se je torej zgodila takšna konformacijska sprememba strukture aptamera, ki je omogočila bolj ugodno potovanje RNA polimeraze navzdol po verigi [1].

===Regulacija transkripcije v brezceličnem sistemu===

Znanstveniki so želeli preveriti, ali pride do podobnih stimulatornih odzivov kot pri in vitro eksperimentih, tudi v brezceličnih sistemih. Za te namene so uporabili plazmidno DNA, ki je vsebovala enako promotorsko in reportersko zaporedje kot pri prejšnjem poskusu. Vezava človeškega trombina na trombinski aptamer je tudi v tem primeru povišala raven prepisovanja. Ugotovili so, da je fluorescenca, ki torej odraža transkripcijsko aktivnost, na začetku naraščala, nato pa je začela kar naenkrat padati. Razumeti moramo namreč, da je brezceličen sistem kompleksen in lahko prihaja do interakcij med različnimi komponentami. Padanje fluorescence se lahko pojasni s prisotnimi RNazami v sistemu, ki razgradijo prepisana RNA zaporedja 3WJdB. Na začetku je torej nivo transkripcije višji od degradacije, kar se kaže z naraščajočo fluorescenco. Po približno 30-60 min fluorescenca doseže vrh in začne padati, torej postane razgrajanje fluorescenčnega zaporedja 3WJdB hitrejše kot njegovo prepisovanje. Po 3-4 urah pride do razgradnje večine zaporedij 3WJdB, in s tem do znižanja fluorescence na bazalni nivo [1].
Ugotovili so tudi, da je nivo fluorescence bistveno nižji v brezceličnem sistemu, kot pri in vitro poskusih [1].

==Pridobivanje in preizkušanje novih aptamerov (CIVT-SELEX)==

===Capture-SELEX===

Ker so bili efekti vezave liganda na aptamerno zaporedje, torej povišanja transkripcije, premalo izraziti, so želeli pridobiti nove aptamere, ki se bodo odzivali na manjše koncentracije liganda, hkrati pa se jih bo lahko vključilo v biološka vezja. Za ta namen so uporabili metodo imenovano Capture-SELEX [1].

Oligonukleotidi iz knjižnice za Capture-SELEX so vsebovali 2 restrikcijski mesti, mesta za prepoznavo začetnih oligonukleotidov, ter seriji 40 in 10 naključnih nukleotidov, med njima pa se je nahajalo umestitveno zaporedje. To zaporedje je bilo komplementarno zaporedju za zajem, ki je bilo na 3' koncu biotinilirano [1].

DNA iz knjižnice so imobilizirali na magnetne kroglice s strepravidinom. Nato so uporabili človeški trombin kot tarčo za selekcijo specifičnih aptamerov. Ob vezavi oligonukleotidov na človeški trombin je prišlo do spremembe tridimenzionalne strukture oligov, kar je povzročilo sproščanje enoverižne DNA iz kompleksa DNA-magnetna kroglica. Enoverižne DNA so z uporabo začetnih oligonukleotidov na obeh koncih pomnožili in dobili več kopij dvoverižne DNA, nato pa so z eksonukleazo razrezali le novo nastalo verigo. Kopije enoverižnih DNA so uporabili za nov krog selekcije in to ponovili 8 krat, pri čemer so pri vsakem krogu znižali koncentracijo liganda [1].

Po 8 krogih je sledilo negativno presejanje. V tem primeru so bili kompleksi DNA-magnetna kroglica, pred inkubacijo z ligandom, postavljeni v brezcelični sistem. S tem so želeli izločiti tiste aptamere, ki bi se lahko vezali na komponentne brezceličnega sistema. Po 4 krogih so dobili zaporedja, ki so bila visoka specifična in afinitetna proti človeškemu trombinu [1].

===Selekcija aptamerov s pomočjo brezceličnega transkripcijskega presejanja===

Dobljena knjižnica enoverižnih DNA pri postopku Capture-SELEX je bila pomnožena v dvoverižne DNA in vstavljena v vektorsko ogrodje s pomočjo metode sestavljanja Golden Gate. Vektor, ki je vseboval še promotor J23151, reportersko zaporedje 3WJdB in terminator, je bil transformiran v E. coli DH5α. Izbranih je bilo 1000 posameznih kolonij, ki so jih pomnožili in na podlagi agarozne gelske elektroforeze določili 832 takšnih DNA, ki so vsebovale pravilna zaporedja promotorja, aptamera, reporterja in terminatorja. Da so zmanjšali obseg dela, so 2 posamezni linearni DNA združili v skupni vzorec in tako dobili 416 poskusnih skupin [1].

Vsaka poskusna skupina je bila prepisana direktno v brezcelični sistem, z ali brez človeškega trombina. Primerjali so razlike v fluorescenci ob dodatku trombina. Pri tistih skupinah, kjer so bile razlike najočitnejše, so ponovili postopek, le da so tokrat v brezcelični sistem prepisali le individualne linearne DNA, ne več v paru, in zopet spremljali razlike v fluorescenci ob dodatku 0,5 uM človeškega trombina. Pri 6 aptamernih zaporedij (AS1-76, AS2-3, AS2-70, AS7-36, AS7-83, AS8-22) je prišlo do znatnega upada fluorescence ob prisotnosti liganda – človeškega trombina. Ko so jih posekvencirali, so ugotovili, da so 3 zaporedja (AS2-3, AS7-36 in AS7-83) identična. V nadaljevanju so trem izbranim aptamernim zaporedjem (AS2-3, AS2-70 in AS8-22), poleg kontrolnega 29 nukleotidov dolgega aptamera, s pomočjo programa napovedali njihove sekundarne strukture. Njihova ∆G je bila pri vseh negativna, torej so sledeče sekundarne strukture stabilne pri 25°C [1].

Tri omenjena aptamerna zaporedja so vstavili v stabilnejšo plazmidno obliko, da bi preverili odziv na tarčni ligand, zopet v brezceličnem sistemu. Rezultati so pokazali, da vsa 3 zaporedja povzročijo inhibicijo transkripcije ob dodatku 0,5 uM in 1 uM človeškega trombina, v primerjavi z negativno kontrolo brez vnesenega aptamernega zaporedja. Molekularni mehanizem takšne transkripcijske regulacije je enak kot je bil opisan prej. Pri prepisovanju, se ob vezavi RNA polimeraze na promotorsko zaporedje ustvari transkripcijski mehurček, ki izpostavi enoverižno aptamerno zaporedje, na katerega se lahko nato veže človeški trombin. Ker je v našem primeru prišlo do nižjega nivoja prepisovanja, je moralo torej ob vezavi liganda priti do takšnih konformacijskih sprememb v strukturi aptamera, da je prišlo do oteženega premikanja RNA polimeraze naprej po verigi [1].

Zanimivi so pridobljeni rezultati kontrolnega poskusa, kjer plazmid ni vseboval aptamernega zaporedja. Ob dodatku 1 uM trombina je vseeno prišlo do inhibicije translacije. Človeški trombin naj bi namreč vplival na ekspresijo zaporedij v pripravljenem brezceličnem sistemu, v smislu nespecifične inhibicije. S tem se kažejo toksične lastnosti večjih koncentracij človeškega trombina v brezceličnih sistemih [1].

==Zaključek==

Aptameri imajo mnoge molekularne aplikacije zaradi njihove preproste in poceni priprave, majhne velikosti in velike pestrosti. Brezcelični transkripcijsko-translacijski sistem ponuja velik potencial kot platforma za hitro presajanje aptamerov in preizkušanje prototipov novih bioloških vezij. V tej študiji so znanstveniki z uporabo metode CIVT-SELEX, ki je sestavljena iz Capture-SELEX in iz in vitro presejalne transkripcije, uspeli izbrati takšne aptamere, ki so bili visoko specifični in afinitetni proti človeškemu trombinu, in so ob vezavi povzročili inhibitorne efekte na transkripcijsko aktivnost. Takšni rezultatu potrjujejo robustnost uporabe aptamerov kot genetskih delov, tako v linearnih DNA, kot tudi v plazmidih [1].

==Literatura==

[1] Guo S, Xu Z, Lin L, Guo Y, Li J, Lu C, Shi X, Yang H. Using CIVT-SELEX to Select Aptamers as Genetic Parts to Regulate Gene Circuits in a Cell-Free System. Int J Mol Sci. 2023 Feb 1;24(3):2833.

[2] Kohlberger M, Gadermaier G. SELEX: Critical factors and optimization strategies for successful aptamer selection. Biotechnol Appl Biochem. 2022 Oct;69(5):1771-1792.

Uporaba CIVT-SELEX za izbiro aptamerov kot genskih delov za regulacijo genetskih vezij v brezceličnem sistemu

2023-05-15T07:54:16Z

Klemen Kunej: /* Selekcija aptamerov s pomočjo brezceličnega transkripcijskega presejanja */

''Povzeto po članku: [https://www.mdpi.com/1422-0067/24/3/2833 Guo S, Xu Z, Lin L, Guo Y, Li J, Lu C, Shi X, Yang H. Using CIVT-SELEX to Select Aptamers as Genetic Parts to Regulate Gene Circuits in a Cell-Free System. Int J Mol Sci. 2023 Feb 1;24(3):2833. ]''

==Uvod==

Napredki v sintezni biologiji nam omogočajo načrtovanje dinamičnih in kompleksnih funkcij v živih organizmih. Realizacija teh kompleksnih funkcij je odvisna od ustvarjanja raznih delujočih genetskih vezij. Ustvarjena so bila številna sintetična genetska vezja, pri katerih je ključna regulacija genske ekspresije. Trenutno se pri večini relevantnih študij za regulacijo genske ekspresije uporablja transkripcijske faktorje in njihove operatorje (LacI/lacO, TetR/tetO). Čeprav je uporaba transkripcijskih faktorjev robustna, pa se pojavi pomanjkljivost v omejenem številu parov transkripcijski faktor-operator. Da bi rešili ta problem, so znanstveniki začeli preizkušati pare DNA aptamer- ligand kot genetske dele za regulacijo izražanja genov. DNA aptameri se specifično vežejo na ligand, ki je lahko majhna molekula ali protein, in tako tvorijo kompleks sposoben regulacije genske ekspresije. Ker so DNA aptameri enoverižne DNA, lahko tako teoretično obstaja na milijone različnih parov aptamer-ligand [1].

Najbolj uporabljen model aptamera je trombinski aptamer. Že v preteklosti se je raziskovala njegova uporaba kot biološkega dela, pri čemer so ga vstavljali na različne lokacije ob promotorju in preučevali, kako to vpliva na ekspresijo tarčnih genov. S tem so se ukvarjali tudi v tej študiji. Poleg tega, so razvili metodo CIVT-SELEX (angl. Capture and In Vitro Transcription-SELEX) s pomočjo katere so izbrali trombinske aptamere primerne za regulacijo genske transkripcije [1]. Gre za nadgradnjo metode SELEX (angl. systematic evolution of ligands by exponential enrichment), pri kateri aptamere presejamo in izberemo le tiste z visoko afiniteto za željen ligand [2].

==Raziskave z že obstoječim aptamernim zaporedjem==

===Regulacija in-vitro transkripcije===

Da bi znanstveniki preverili izvedljivost uporabe aptamerov kot genskih regulatorjev, so na začetku uporabili, do sedaj dobro preučen, 29 nukleotidov dolg trombinski aptamer. Tega so vključili na različne lokacije blizu promotorske regije. Zanimalo jih je, kako bo vključitev aptamernega zaporedja v linearno DNA vplivala na in vitro transkripcijsko aktivnost, še bolj pa jih je zanimalo, kako bo na prepisovanje vplivala vezava liganda (človeškega trombina) na to aptamerno zaporedje. Transkripcijsko aktivnost so spremljali preko fluorescence reporterskega zaporedja 3WJdB, ki omogoča spremljanje transkripcijske aktivnosti v realnem času. Ugotovili so, da vključitev aptamera blizu promotorskega zaporedja zniža transkripcijsko aktivnost reporterskega zaporedja, saj ta s svojo sekundarno strukturo blokira potovanje RNA polimeraze po verigi [1].

Ob dodatku človeškega trombina, v večini primerov ni prišlo do očitnih sprememb transkripcijske aktivnosti v primerjavi s kontrolnim poskusom. Je pa v primeru vključitve trombinskega aptamera v smerno verigo navzdol od promotorja, prišlo do povišane transkripcije. Ob vezavi RNA polimeraze na promotorsko regijo pride namreč do odvitja dvojne vijačnice DNA. Ustvari se transkripcijski mehurček, ki izpostavi aptamerno zaporedje, ki lahko, kot omenjeno prej, blokira migracijo RNA polimeraze in s tem zniža efektivnost transkripcije ali pa jo celo prepreči. Vezava liganda na aptamerno zaporedje povzroči njegovo konformacijsko spremembo, kar lahko vpliva na transkripcijsko aktivnost. Ker je v slednjem primeru prišlo do povišanja ravni prepisovanja, se je torej zgodila takšna konformacijska sprememba strukture aptamera, ki je omogočila bolj ugodno potovanje RNA polimeraze navzdol po verigi [1].

===Regulacija transkripcije v brezceličnem sistemu===

Znanstveniki so želeli preveriti, ali pride do podobnih stimulatornih odzivov kot pri in vitro eksperimentih, tudi v brezceličnih sistemih. Za te namene so uporabili plazmidno DNA, ki je vsebovala enako promotorsko in reportersko zaporedje kot pri prejšnjem poskusu. Vezava človeškega trombina na trombinski aptamer je tudi v tem primeru povišala raven prepisovanja. Ugotovili so, da je fluorescenca, ki torej odraža transkripcijsko aktivnost, na začetku naraščala, nato pa je začela kar naenkrat padati. Razumeti moramo namreč, da je brezceličen sistem kompleksen in lahko prihaja do interakcij med različnimi komponentami. Padanje fluorescence se lahko pojasni s prisotnimi RNazami v sistemu, ki razgradijo prepisana RNA zaporedja 3WJdB. Na začetku je torej nivo transkripcije višji od degradacije, kar se kaže z naraščajočo fluorescenco. Po približno 30-60 min fluorescenca doseže vrh in začne padati, torej postane razgrajanje fluorescenčnega zaporedja 3WJdB hitrejše kot njegovo prepisovanje. Po 3-4 urah pride do razgradnje večine zaporedij 3WJdB, in s tem do znižanja fluorescence na bazalni nivo [1].
Ugotovili so tudi, da je nivo fluorescence bistveno nižji v brezceličnem sistemu, kot pri in vitro poskusih [1].

==Pridobivanje in preizkušanje novih aptamerov (CIVT-SELEX)==

===Capture-SELEX===

Ker so bili efekti vezave liganda na aptamerno zaporedje, torej povišanja transkripcije, premalo izraziti, so želeli pridobiti nove aptamere, ki se bodo odzivali na manjše koncentracije liganda, hkrati pa se jih bo lahko vključilo v biološka vezja. Za ta namen so uporabili metodo imenovano Capture-SELEX [1].

Oligonukleotidi iz knjižnice za Capture-SELEX so vsebovali 2 restrikcijski mesti, mesta za prepoznavo začetnih oligonukleotidov, ter seriji 40 in 10 naključnih nukleotidov, med njima pa se je nahajalo umestitveno zaporedje. To zaporedje je bilo komplementarno zaporedju za zajem, ki je bilo na 3' koncu biotinilirano [1].

DNA iz knjižnice so imobilizirali na magnetne kroglice s strepravidinom. Nato so uporabili človeški trombin kot tarčo za selekcijo specifičnih aptamerov. Ob vezavi oligonukleotidov na človeški trombin je prišlo do spremembe tridimenzionalne strukture oligov, kar je povzročilo sproščanje enoverižne DNA iz kompleksa DNA-magnetna kroglica. Enoverižne DNA so z uporabo začetnih oligonukleotidov na obeh koncih pomnožili in dobili več kopij dvoverižne DNA, nato pa so z eksonukleazo razrezali le novo nastalo verigo. Kopije enoverižnih DNA so uporabili za nov krog selekcije in to ponovili 8 krat, pri čemer so pri vsakem krogu znižali koncentracijo liganda [1].

Po 8 krogih je sledilo negativno presejanje. V tem primeru so bili kompleksi DNA-magnetna kroglica, pred inkubacijo z ligandom, postavljeni v brezcelični sistem. S tem so želeli izločiti tiste aptamere, ki bi se lahko vezali na komponentne brezceličnega sistema. Po 4 krogih so dobili zaporedja, ki so bila visoka specifična in afinitetna proti človeškemu trombinu [1].

===Selekcija aptamerov s pomočjo brezceličnega transkripcijskega presejanja===

Dobljena knjižnica enoverižnih DNA pri postopku Capture-SELEX je bila pomnožena v dvoverižne DNA in vstavljena v vektorsko ogrodje s pomočjo metode sestavljanja Golden Gate. Vektor, ki je vseboval še promotor J23151, reportersko zaporedje 3WJdB in terminator, je bil transformiran v E. coli DH5α. Izbranih je bilo 1000 posameznih kolonij, ki so jih pomnožili in na podlagi agarozne gelske elektroforeze določili 832 takšnih DNA, ki so vsebovale pravilna zaporedja promotorja, aptamera, reporterja in terminatorja. Da so zmanjšali obseg dela, so 2 posamezni linearni DNA združili v skupni vzorec in tako dobili 416 poskusnih skupin [1].

Vsaka poskusna skupina je bila prepisana direktno v brezcelični sistem, z ali brez človeškega trombina. Primerjali so razlike v fluorescenci ob dodatku trombina. Pri tistih skupinah, kjer so bile razlike najočitnejše, so ponovili postopek, le da so tokrat v brezcelični sistem prepisali le individualne linearne DNA, ne več v paru, in zopet spremljali razlike v fluorescenci ob dodatku 0,5 uM človeškega trombina. Pri 6 aptamernih zaporedij (AS1-76, AS2-3, AS2-70, AS7-36, AS7-83, AS8-22) je prišlo do znatnega upada fluorescence ob prisotnosti liganda – človeškega trombina. Ko so jih posekvencirali, so ugotovili, da so 3 zaporedja (AS2-3, AS7-36 in AS7-83) identična. V nadaljevanju so trem izbranim aptamernim zaporedjem (AS2-3, AS2-70 in AS8-22), poleg kontrolnega 29 nukleotidov dolgega aptamera, s pomočjo programa napovedali njihove sekundarne strukture. Njihova ∆G je bila pri vseh negativna, torej so sledeče sekundarne strukture stabilne pri 25°C [1].

3 omenjena aptamerna zaporedja so vstavili v stabilnejšo plazmidno obliko, da bi preverili odziv na tarčni ligand, zopet v brezceličnem sistemu. Rezultati so pokazali, da vsa 3 zaporedja povzročijo inhibicijo transkripcije ob dodatku 0,5 uM in 1 uM človeškega trombina, v primerjavi z negativno kontrolo brez vnesenega aptamernega zaporedja. Molekularni mehanizem takšne transkripcijske regulacije je enak kot je bil opisan prej. Pri prepisovanju, se ob vezavi RNA polimeraze na promotorsko zaporedje ustvari transkripcijski mehurček, ki izpostavi enoverižno aptamerno zaporedje, na katerega se lahko nato veže človeški trombin. Ker je v našem primeru prišlo do nižjega nivoja prepisovanja, je moralo torej ob vezavi liganda priti do takšnih konformacijskih sprememb v strukturi aptamera, da je prišlo do oteženega premikanja RNA polimeraze naprej po verigi [1].

Zanimivi so pridobljeni rezultati kontrolnega poskusa, kjer plazmid ni vseboval aptamernega zaporedja. Ob dodatku 1 uM trombina je vseeno prišlo do inhibicije translacije. Človeški trombin naj bi namreč vplival na ekspresijo zaporedij v pripravljenem brezceličnem sistemu, v smislu nespecifične inhibicije. S tem se kažejo toksične lastnosti večjih koncentracij človeškega trombina v brezceličnih sistemih [1].

==Zaključek==

Aptameri imajo mnoge molekularne aplikacije zaradi njihove preproste in poceni priprave, majhne velikosti in velike pestrosti. Brezcelični transkripcijsko-translacijski sistem ponuja velik potencial kot platforma za hitro presajanje aptamerov in preizkušanje prototipov novih bioloških vezij. V tej študiji so znanstveniki z uporabo metode CIVT-SELEX, ki je sestavljena iz Capture-SELEX in iz in vitro presejalne transkripcije, uspeli izbrati takšne aptamere, ki so bili visoko specifični in afinitetni proti človeškemu trombinu, in so ob vezavi povzročili inhibitorne efekte na transkripcijsko aktivnost. Takšni rezultatu potrjujejo robustnost uporabe aptamerov kot genetskih delov, tako v linearnih DNA, kot tudi v plazmidih [1].

==Literatura==

[1] Guo S, Xu Z, Lin L, Guo Y, Li J, Lu C, Shi X, Yang H. Using CIVT-SELEX to Select Aptamers as Genetic Parts to Regulate Gene Circuits in a Cell-Free System. Int J Mol Sci. 2023 Feb 1;24(3):2833.

[2] Kohlberger M, Gadermaier G. SELEX: Critical factors and optimization strategies for successful aptamer selection. Biotechnol Appl Biochem. 2022 Oct;69(5):1771-1792.

Uporaba CIVT-SELEX za izbiro aptamerov kot genskih delov za regulacijo genetskih vezij v brezceličnem sistemu

2023-05-15T07:52:22Z

Klemen Kunej: /* Capture-SELEX */

''Povzeto po članku: [https://www.mdpi.com/1422-0067/24/3/2833 Guo S, Xu Z, Lin L, Guo Y, Li J, Lu C, Shi X, Yang H. Using CIVT-SELEX to Select Aptamers as Genetic Parts to Regulate Gene Circuits in a Cell-Free System. Int J Mol Sci. 2023 Feb 1;24(3):2833. ]''

==Uvod==

Napredki v sintezni biologiji nam omogočajo načrtovanje dinamičnih in kompleksnih funkcij v živih organizmih. Realizacija teh kompleksnih funkcij je odvisna od ustvarjanja raznih delujočih genetskih vezij. Ustvarjena so bila številna sintetična genetska vezja, pri katerih je ključna regulacija genske ekspresije. Trenutno se pri večini relevantnih študij za regulacijo genske ekspresije uporablja transkripcijske faktorje in njihove operatorje (LacI/lacO, TetR/tetO). Čeprav je uporaba transkripcijskih faktorjev robustna, pa se pojavi pomanjkljivost v omejenem številu parov transkripcijski faktor-operator. Da bi rešili ta problem, so znanstveniki začeli preizkušati pare DNA aptamer- ligand kot genetske dele za regulacijo izražanja genov. DNA aptameri se specifično vežejo na ligand, ki je lahko majhna molekula ali protein, in tako tvorijo kompleks sposoben regulacije genske ekspresije. Ker so DNA aptameri enoverižne DNA, lahko tako teoretično obstaja na milijone različnih parov aptamer-ligand [1].

Najbolj uporabljen model aptamera je trombinski aptamer. Že v preteklosti se je raziskovala njegova uporaba kot biološkega dela, pri čemer so ga vstavljali na različne lokacije ob promotorju in preučevali, kako to vpliva na ekspresijo tarčnih genov. S tem so se ukvarjali tudi v tej študiji. Poleg tega, so razvili metodo CIVT-SELEX (angl. Capture and In Vitro Transcription-SELEX) s pomočjo katere so izbrali trombinske aptamere primerne za regulacijo genske transkripcije [1]. Gre za nadgradnjo metode SELEX (angl. systematic evolution of ligands by exponential enrichment), pri kateri aptamere presejamo in izberemo le tiste z visoko afiniteto za željen ligand [2].

==Raziskave z že obstoječim aptamernim zaporedjem==

===Regulacija in-vitro transkripcije===

Da bi znanstveniki preverili izvedljivost uporabe aptamerov kot genskih regulatorjev, so na začetku uporabili, do sedaj dobro preučen, 29 nukleotidov dolg trombinski aptamer. Tega so vključili na različne lokacije blizu promotorske regije. Zanimalo jih je, kako bo vključitev aptamernega zaporedja v linearno DNA vplivala na in vitro transkripcijsko aktivnost, še bolj pa jih je zanimalo, kako bo na prepisovanje vplivala vezava liganda (človeškega trombina) na to aptamerno zaporedje. Transkripcijsko aktivnost so spremljali preko fluorescence reporterskega zaporedja 3WJdB, ki omogoča spremljanje transkripcijske aktivnosti v realnem času. Ugotovili so, da vključitev aptamera blizu promotorskega zaporedja zniža transkripcijsko aktivnost reporterskega zaporedja, saj ta s svojo sekundarno strukturo blokira potovanje RNA polimeraze po verigi [1].

Ob dodatku človeškega trombina, v večini primerov ni prišlo do očitnih sprememb transkripcijske aktivnosti v primerjavi s kontrolnim poskusom. Je pa v primeru vključitve trombinskega aptamera v smerno verigo navzdol od promotorja, prišlo do povišane transkripcije. Ob vezavi RNA polimeraze na promotorsko regijo pride namreč do odvitja dvojne vijačnice DNA. Ustvari se transkripcijski mehurček, ki izpostavi aptamerno zaporedje, ki lahko, kot omenjeno prej, blokira migracijo RNA polimeraze in s tem zniža efektivnost transkripcije ali pa jo celo prepreči. Vezava liganda na aptamerno zaporedje povzroči njegovo konformacijsko spremembo, kar lahko vpliva na transkripcijsko aktivnost. Ker je v slednjem primeru prišlo do povišanja ravni prepisovanja, se je torej zgodila takšna konformacijska sprememba strukture aptamera, ki je omogočila bolj ugodno potovanje RNA polimeraze navzdol po verigi [1].

===Regulacija transkripcije v brezceličnem sistemu===

Znanstveniki so želeli preveriti, ali pride do podobnih stimulatornih odzivov kot pri in vitro eksperimentih, tudi v brezceličnih sistemih. Za te namene so uporabili plazmidno DNA, ki je vsebovala enako promotorsko in reportersko zaporedje kot pri prejšnjem poskusu. Vezava človeškega trombina na trombinski aptamer je tudi v tem primeru povišala raven prepisovanja. Ugotovili so, da je fluorescenca, ki torej odraža transkripcijsko aktivnost, na začetku naraščala, nato pa je začela kar naenkrat padati. Razumeti moramo namreč, da je brezceličen sistem kompleksen in lahko prihaja do interakcij med različnimi komponentami. Padanje fluorescence se lahko pojasni s prisotnimi RNazami v sistemu, ki razgradijo prepisana RNA zaporedja 3WJdB. Na začetku je torej nivo transkripcije višji od degradacije, kar se kaže z naraščajočo fluorescenco. Po približno 30-60 min fluorescenca doseže vrh in začne padati, torej postane razgrajanje fluorescenčnega zaporedja 3WJdB hitrejše kot njegovo prepisovanje. Po 3-4 urah pride do razgradnje večine zaporedij 3WJdB, in s tem do znižanja fluorescence na bazalni nivo [1].
Ugotovili so tudi, da je nivo fluorescence bistveno nižji v brezceličnem sistemu, kot pri in vitro poskusih [1].

==Pridobivanje in preizkušanje novih aptamerov (CIVT-SELEX)==

===Capture-SELEX===

Ker so bili efekti vezave liganda na aptamerno zaporedje, torej povišanja transkripcije, premalo izraziti, so želeli pridobiti nove aptamere, ki se bodo odzivali na manjše koncentracije liganda, hkrati pa se jih bo lahko vključilo v biološka vezja. Za ta namen so uporabili metodo imenovano Capture-SELEX [1].

Oligonukleotidi iz knjižnice za Capture-SELEX so vsebovali 2 restrikcijski mesti, mesta za prepoznavo začetnih oligonukleotidov, ter seriji 40 in 10 naključnih nukleotidov, med njima pa se je nahajalo umestitveno zaporedje. To zaporedje je bilo komplementarno zaporedju za zajem, ki je bilo na 3' koncu biotinilirano [1].

DNA iz knjižnice so imobilizirali na magnetne kroglice s strepravidinom. Nato so uporabili človeški trombin kot tarčo za selekcijo specifičnih aptamerov. Ob vezavi oligonukleotidov na človeški trombin je prišlo do spremembe tridimenzionalne strukture oligov, kar je povzročilo sproščanje enoverižne DNA iz kompleksa DNA-magnetna kroglica. Enoverižne DNA so z uporabo začetnih oligonukleotidov na obeh koncih pomnožili in dobili več kopij dvoverižne DNA, nato pa so z eksonukleazo razrezali le novo nastalo verigo. Kopije enoverižnih DNA so uporabili za nov krog selekcije in to ponovili 8 krat, pri čemer so pri vsakem krogu znižali koncentracijo liganda [1].

Po 8 krogih je sledilo negativno presejanje. V tem primeru so bili kompleksi DNA-magnetna kroglica, pred inkubacijo z ligandom, postavljeni v brezcelični sistem. S tem so želeli izločiti tiste aptamere, ki bi se lahko vezali na komponentne brezceličnega sistema. Po 4 krogih so dobili zaporedja, ki so bila visoka specifična in afinitetna proti človeškemu trombinu [1].

===Selekcija aptamerov s pomočjo brezceličnega transkripcijskega presejanja===

Dobljena knjižnica enoverižnih DNA pri postopku Capture-SELEX je bila pomnožena v dvoverižne DNA in vstavljena v vektorsko ogrodje s pomočjo metode sestavljanja Golden Gate. Vektor, ki je vseboval še promotor J23151, reportersko zaporedje 3WJdB in terminator, je bil transformiran v E. coli DH5α. Izbranih je bilo 1000 posameznih kolonij, ki so jih pomnožili in na podlagi agarozne gelske elektroforeze določili 832 takšnih DNA, ki so vsebovale pravilna zaporedja promotorja, aptamera, reporterja in terminatorja. Da so zmanjšali obseg dela, so 2 posamezni linearni DNA združili v skupni vzorec in tako dobili 416 poskusnih skupin [1].

Vsaka poskusna skupina je bila prepisana direktno v brezcelični sistem, z ali brez človeškega trombina. Primerjali so razlike v fluorescenci ob dodatku trombina. Pri tistih skupinah, kjer so bile razlike najočitnejše, so ponovili postopek, le da so tokrat v brezcelični sistem prepisali le individualne linearne DNA, ne več v paru, in zopet spremljali razlike v fluorescenci ob dodatku 0,5 uM človeškega trombina. Pri 6 aptamernih zaporedij (AS1-76, AS2-3, AS2-70, AS7-36, AS7-83, AS8-22) je prišlo do znatnega upada fluorescence ob prisotnosti liganda – človeškega trombina. Ko so jih posekvencirali so ugotovili, da so 3 zaporedja (AS2-3, AS7-36 in AS7-83) identična. V nadaljevanju so trem izbranim aptamernim zaporedjem (AS2-3, AS2-70 in AS8-22), poleg kontrolnega 29 nukleotidov dolgega aptamera, s pomočjo programa napovedali njihove sekundarne strukture. Njihova ∆G je bila pri vseh negativna, torej so sledeče sekundarne strukture stabilne pri 25°C [1].

3 omenjena aptamerna zaporedja so vstavili v stabilnejšo plazmidno obliko, da bi preverili odziv na tarčni ligand, zopet v brezceličnem sistemu. Rezultati so pokazali, da vsa 3 zaporedja povzročijo inhibicijo transkripcije ob dodatku 0,5 uM in 1 uM človeškega trombina, v primerjavi z negativno kontrolo brez vnesenega aptamernega zaporedja. Molekularni mehanizem takšne transkripcijske regulacije je enak kot je bil opisan prej. Pri prepisovanju, se ob vezavi RNA polimeraze na promotorsko zaporedje ustvari transkripcijski mehurček, ki izpostavi enoverižno aptamerno zaporedje, na katerega se lahko nato veže človeški trombin. Ker je v našem primeru prišlo do nižjega nivoja prepisovanja, je moralo torej ob vezavi liganda priti do takšnih konformacijskih sprememb v strukturi aptamera, da je prišlo do oteženega premikanja RNA polimeraze naprej po verigi [1].

Zanimivi so pridobljeni rezultati kontrolnega poskusa, kjer plazmid ni vseboval aptamernega zaporedja. Ob dodatku 1 uM trombina je vseeno prišlo do inhibicije translacije. Človeški trombin naj bi namreč vplival na ekspresijo zaporedij v pripravljenem brezceličnem sistemu, v smislu nespecifične inhibicije. S tem se kažejo toksične lastnosti večjih koncentracij človeškega trombina v brezceličnih sistemih [1].

==Zaključek==

Aptameri imajo mnoge molekularne aplikacije zaradi njihove preproste in poceni priprave, majhne velikosti in velike pestrosti. Brezcelični transkripcijsko-translacijski sistem ponuja velik potencial kot platforma za hitro presajanje aptamerov in preizkušanje prototipov novih bioloških vezij. V tej študiji so znanstveniki z uporabo metode CIVT-SELEX, ki je sestavljena iz Capture-SELEX in iz in vitro presejalne transkripcije, uspeli izbrati takšne aptamere, ki so bili visoko specifični in afinitetni proti človeškemu trombinu, in so ob vezavi povzročili inhibitorne efekte na transkripcijsko aktivnost. Takšni rezultatu potrjujejo robustnost uporabe aptamerov kot genetskih delov, tako v linearnih DNA, kot tudi v plazmidih [1].

==Literatura==

[1] Guo S, Xu Z, Lin L, Guo Y, Li J, Lu C, Shi X, Yang H. Using CIVT-SELEX to Select Aptamers as Genetic Parts to Regulate Gene Circuits in a Cell-Free System. Int J Mol Sci. 2023 Feb 1;24(3):2833.

[2] Kohlberger M, Gadermaier G. SELEX: Critical factors and optimization strategies for successful aptamer selection. Biotechnol Appl Biochem. 2022 Oct;69(5):1771-1792.

Uporaba CIVT-SELEX za izbiro aptamerov kot genskih delov za regulacijo genetskih vezij v brezceličnem sistemu

2023-05-15T07:51:41Z

Klemen Kunej: /* Capture-SELEX */

''Povzeto po članku: [https://www.mdpi.com/1422-0067/24/3/2833 Guo S, Xu Z, Lin L, Guo Y, Li J, Lu C, Shi X, Yang H. Using CIVT-SELEX to Select Aptamers as Genetic Parts to Regulate Gene Circuits in a Cell-Free System. Int J Mol Sci. 2023 Feb 1;24(3):2833. ]''

==Uvod==

Napredki v sintezni biologiji nam omogočajo načrtovanje dinamičnih in kompleksnih funkcij v živih organizmih. Realizacija teh kompleksnih funkcij je odvisna od ustvarjanja raznih delujočih genetskih vezij. Ustvarjena so bila številna sintetična genetska vezja, pri katerih je ključna regulacija genske ekspresije. Trenutno se pri večini relevantnih študij za regulacijo genske ekspresije uporablja transkripcijske faktorje in njihove operatorje (LacI/lacO, TetR/tetO). Čeprav je uporaba transkripcijskih faktorjev robustna, pa se pojavi pomanjkljivost v omejenem številu parov transkripcijski faktor-operator. Da bi rešili ta problem, so znanstveniki začeli preizkušati pare DNA aptamer- ligand kot genetske dele za regulacijo izražanja genov. DNA aptameri se specifično vežejo na ligand, ki je lahko majhna molekula ali protein, in tako tvorijo kompleks sposoben regulacije genske ekspresije. Ker so DNA aptameri enoverižne DNA, lahko tako teoretično obstaja na milijone različnih parov aptamer-ligand [1].

Najbolj uporabljen model aptamera je trombinski aptamer. Že v preteklosti se je raziskovala njegova uporaba kot biološkega dela, pri čemer so ga vstavljali na različne lokacije ob promotorju in preučevali, kako to vpliva na ekspresijo tarčnih genov. S tem so se ukvarjali tudi v tej študiji. Poleg tega, so razvili metodo CIVT-SELEX (angl. Capture and In Vitro Transcription-SELEX) s pomočjo katere so izbrali trombinske aptamere primerne za regulacijo genske transkripcije [1]. Gre za nadgradnjo metode SELEX (angl. systematic evolution of ligands by exponential enrichment), pri kateri aptamere presejamo in izberemo le tiste z visoko afiniteto za željen ligand [2].

==Raziskave z že obstoječim aptamernim zaporedjem==

===Regulacija in-vitro transkripcije===

Da bi znanstveniki preverili izvedljivost uporabe aptamerov kot genskih regulatorjev, so na začetku uporabili, do sedaj dobro preučen, 29 nukleotidov dolg trombinski aptamer. Tega so vključili na različne lokacije blizu promotorske regije. Zanimalo jih je, kako bo vključitev aptamernega zaporedja v linearno DNA vplivala na in vitro transkripcijsko aktivnost, še bolj pa jih je zanimalo, kako bo na prepisovanje vplivala vezava liganda (človeškega trombina) na to aptamerno zaporedje. Transkripcijsko aktivnost so spremljali preko fluorescence reporterskega zaporedja 3WJdB, ki omogoča spremljanje transkripcijske aktivnosti v realnem času. Ugotovili so, da vključitev aptamera blizu promotorskega zaporedja zniža transkripcijsko aktivnost reporterskega zaporedja, saj ta s svojo sekundarno strukturo blokira potovanje RNA polimeraze po verigi [1].

Ob dodatku človeškega trombina, v večini primerov ni prišlo do očitnih sprememb transkripcijske aktivnosti v primerjavi s kontrolnim poskusom. Je pa v primeru vključitve trombinskega aptamera v smerno verigo navzdol od promotorja, prišlo do povišane transkripcije. Ob vezavi RNA polimeraze na promotorsko regijo pride namreč do odvitja dvojne vijačnice DNA. Ustvari se transkripcijski mehurček, ki izpostavi aptamerno zaporedje, ki lahko, kot omenjeno prej, blokira migracijo RNA polimeraze in s tem zniža efektivnost transkripcije ali pa jo celo prepreči. Vezava liganda na aptamerno zaporedje povzroči njegovo konformacijsko spremembo, kar lahko vpliva na transkripcijsko aktivnost. Ker je v slednjem primeru prišlo do povišanja ravni prepisovanja, se je torej zgodila takšna konformacijska sprememba strukture aptamera, ki je omogočila bolj ugodno potovanje RNA polimeraze navzdol po verigi [1].

===Regulacija transkripcije v brezceličnem sistemu===

Znanstveniki so želeli preveriti, ali pride do podobnih stimulatornih odzivov kot pri in vitro eksperimentih, tudi v brezceličnih sistemih. Za te namene so uporabili plazmidno DNA, ki je vsebovala enako promotorsko in reportersko zaporedje kot pri prejšnjem poskusu. Vezava človeškega trombina na trombinski aptamer je tudi v tem primeru povišala raven prepisovanja. Ugotovili so, da je fluorescenca, ki torej odraža transkripcijsko aktivnost, na začetku naraščala, nato pa je začela kar naenkrat padati. Razumeti moramo namreč, da je brezceličen sistem kompleksen in lahko prihaja do interakcij med različnimi komponentami. Padanje fluorescence se lahko pojasni s prisotnimi RNazami v sistemu, ki razgradijo prepisana RNA zaporedja 3WJdB. Na začetku je torej nivo transkripcije višji od degradacije, kar se kaže z naraščajočo fluorescenco. Po približno 30-60 min fluorescenca doseže vrh in začne padati, torej postane razgrajanje fluorescenčnega zaporedja 3WJdB hitrejše kot njegovo prepisovanje. Po 3-4 urah pride do razgradnje večine zaporedij 3WJdB, in s tem do znižanja fluorescence na bazalni nivo [1].
Ugotovili so tudi, da je nivo fluorescence bistveno nižji v brezceličnem sistemu, kot pri in vitro poskusih [1].

==Pridobivanje in preizkušanje novih aptamerov (CIVT-SELEX)==

===Capture-SELEX===

Ker so bili efekti vezave liganda na aptamerno zaporedje, torej povišanja transkripcije, premalo izraziti, so želeli pridobiti nove aptamere, ki se bodo odzivali na manjše koncentracije liganda, hkrati pa se jih bo lahko vključilo v biološka vezja. Za ta namen so uporabili metodo imenovano Capture-SELEX [1].

Oligonukleotidi iz knjižnice za Capture-SELEX so vsebovali 2 restrikcijski mesti, mesta za prepoznavo začetnih oligonukleotidov, ter seriji 40 in 10 naključnih nukleotidov, med njima pa se je nahajalo umestitveno zaporedje. To zaporedje je bilo komplementarno zaporedju za zajem, ki je bilo na 3' koncu biotinilirano [1].

DNA iz knjižnice so imobilizirali na magnetne kroglice s strepravidinom. Nato so uporabili človeški trombin kot tarčo za selekcijo specifičnih aptamerov. Ob vezavi oligonukleotidov na človeški trombin je prišlo do spremembe tridimenzionalne strukture oligov, kar je povzročilo sproščanje enoverižne DNA iz kompleksa DNA-magnetna kroglica. Enoverižne DNA so z uporabo začetnih oligonukleotidov na obeh koncih pomnožili in dobili več kopij dvoverižne DNA, nato pa so z eksonukleazo razrezali le novo nastalo verigo. Kopije enoverižnih DNA so uporabili za nov krog selekcije in to ponovili 8 krat, pri čemer so pri vsakem krogu znižali koncentracijo liganda [1].

Po 8 krogih je sledilo negativno presejanje. V tem primeru so bili kompleksi DNA-magnetna kroglica, pred inkubacijo s ligandom, postavljeni v brezcelični sistem. S tem so želeli izločiti tiste aptamere, ki bi se lahko vezali na komponentne brezceličnega sistema. Po 4 krogih so dobili zaporedja, ki so bila visoka specifična in afinitetna proti človeškemu trombinu [1].

===Selekcija aptamerov s pomočjo brezceličnega transkripcijskega presejanja===

Dobljena knjižnica enoverižnih DNA pri postopku Capture-SELEX je bila pomnožena v dvoverižne DNA in vstavljena v vektorsko ogrodje s pomočjo metode sestavljanja Golden Gate. Vektor, ki je vseboval še promotor J23151, reportersko zaporedje 3WJdB in terminator, je bil transformiran v E. coli DH5α. Izbranih je bilo 1000 posameznih kolonij, ki so jih pomnožili in na podlagi agarozne gelske elektroforeze določili 832 takšnih DNA, ki so vsebovale pravilna zaporedja promotorja, aptamera, reporterja in terminatorja. Da so zmanjšali obseg dela, so 2 posamezni linearni DNA združili v skupni vzorec in tako dobili 416 poskusnih skupin [1].

Vsaka poskusna skupina je bila prepisana direktno v brezcelični sistem, z ali brez človeškega trombina. Primerjali so razlike v fluorescenci ob dodatku trombina. Pri tistih skupinah, kjer so bile razlike najočitnejše, so ponovili postopek, le da so tokrat v brezcelični sistem prepisali le individualne linearne DNA, ne več v paru, in zopet spremljali razlike v fluorescenci ob dodatku 0,5 uM človeškega trombina. Pri 6 aptamernih zaporedij (AS1-76, AS2-3, AS2-70, AS7-36, AS7-83, AS8-22) je prišlo do znatnega upada fluorescence ob prisotnosti liganda – človeškega trombina. Ko so jih posekvencirali so ugotovili, da so 3 zaporedja (AS2-3, AS7-36 in AS7-83) identična. V nadaljevanju so trem izbranim aptamernim zaporedjem (AS2-3, AS2-70 in AS8-22), poleg kontrolnega 29 nukleotidov dolgega aptamera, s pomočjo programa napovedali njihove sekundarne strukture. Njihova ∆G je bila pri vseh negativna, torej so sledeče sekundarne strukture stabilne pri 25°C [1].

3 omenjena aptamerna zaporedja so vstavili v stabilnejšo plazmidno obliko, da bi preverili odziv na tarčni ligand, zopet v brezceličnem sistemu. Rezultati so pokazali, da vsa 3 zaporedja povzročijo inhibicijo transkripcije ob dodatku 0,5 uM in 1 uM človeškega trombina, v primerjavi z negativno kontrolo brez vnesenega aptamernega zaporedja. Molekularni mehanizem takšne transkripcijske regulacije je enak kot je bil opisan prej. Pri prepisovanju, se ob vezavi RNA polimeraze na promotorsko zaporedje ustvari transkripcijski mehurček, ki izpostavi enoverižno aptamerno zaporedje, na katerega se lahko nato veže človeški trombin. Ker je v našem primeru prišlo do nižjega nivoja prepisovanja, je moralo torej ob vezavi liganda priti do takšnih konformacijskih sprememb v strukturi aptamera, da je prišlo do oteženega premikanja RNA polimeraze naprej po verigi [1].

Zanimivi so pridobljeni rezultati kontrolnega poskusa, kjer plazmid ni vseboval aptamernega zaporedja. Ob dodatku 1 uM trombina je vseeno prišlo do inhibicije translacije. Človeški trombin naj bi namreč vplival na ekspresijo zaporedij v pripravljenem brezceličnem sistemu, v smislu nespecifične inhibicije. S tem se kažejo toksične lastnosti večjih koncentracij človeškega trombina v brezceličnih sistemih [1].

==Zaključek==

Aptameri imajo mnoge molekularne aplikacije zaradi njihove preproste in poceni priprave, majhne velikosti in velike pestrosti. Brezcelični transkripcijsko-translacijski sistem ponuja velik potencial kot platforma za hitro presajanje aptamerov in preizkušanje prototipov novih bioloških vezij. V tej študiji so znanstveniki z uporabo metode CIVT-SELEX, ki je sestavljena iz Capture-SELEX in iz in vitro presejalne transkripcije, uspeli izbrati takšne aptamere, ki so bili visoko specifični in afinitetni proti človeškemu trombinu, in so ob vezavi povzročili inhibitorne efekte na transkripcijsko aktivnost. Takšni rezultatu potrjujejo robustnost uporabe aptamerov kot genetskih delov, tako v linearnih DNA, kot tudi v plazmidih [1].

==Literatura==

[1] Guo S, Xu Z, Lin L, Guo Y, Li J, Lu C, Shi X, Yang H. Using CIVT-SELEX to Select Aptamers as Genetic Parts to Regulate Gene Circuits in a Cell-Free System. Int J Mol Sci. 2023 Feb 1;24(3):2833.

[2] Kohlberger M, Gadermaier G. SELEX: Critical factors and optimization strategies for successful aptamer selection. Biotechnol Appl Biochem. 2022 Oct;69(5):1771-1792.

Uporaba CIVT-SELEX za izbiro aptamerov kot genskih delov za regulacijo genetskih vezij v brezceličnem sistemu

2023-05-15T07:49:16Z

Klemen Kunej: /* Regulacija transkripcije v brezceličnem sistemu */

''Povzeto po članku: [https://www.mdpi.com/1422-0067/24/3/2833 Guo S, Xu Z, Lin L, Guo Y, Li J, Lu C, Shi X, Yang H. Using CIVT-SELEX to Select Aptamers as Genetic Parts to Regulate Gene Circuits in a Cell-Free System. Int J Mol Sci. 2023 Feb 1;24(3):2833. ]''

==Uvod==

Napredki v sintezni biologiji nam omogočajo načrtovanje dinamičnih in kompleksnih funkcij v živih organizmih. Realizacija teh kompleksnih funkcij je odvisna od ustvarjanja raznih delujočih genetskih vezij. Ustvarjena so bila številna sintetična genetska vezja, pri katerih je ključna regulacija genske ekspresije. Trenutno se pri večini relevantnih študij za regulacijo genske ekspresije uporablja transkripcijske faktorje in njihove operatorje (LacI/lacO, TetR/tetO). Čeprav je uporaba transkripcijskih faktorjev robustna, pa se pojavi pomanjkljivost v omejenem številu parov transkripcijski faktor-operator. Da bi rešili ta problem, so znanstveniki začeli preizkušati pare DNA aptamer- ligand kot genetske dele za regulacijo izražanja genov. DNA aptameri se specifično vežejo na ligand, ki je lahko majhna molekula ali protein, in tako tvorijo kompleks sposoben regulacije genske ekspresije. Ker so DNA aptameri enoverižne DNA, lahko tako teoretično obstaja na milijone različnih parov aptamer-ligand [1].

Najbolj uporabljen model aptamera je trombinski aptamer. Že v preteklosti se je raziskovala njegova uporaba kot biološkega dela, pri čemer so ga vstavljali na različne lokacije ob promotorju in preučevali, kako to vpliva na ekspresijo tarčnih genov. S tem so se ukvarjali tudi v tej študiji. Poleg tega, so razvili metodo CIVT-SELEX (angl. Capture and In Vitro Transcription-SELEX) s pomočjo katere so izbrali trombinske aptamere primerne za regulacijo genske transkripcije [1]. Gre za nadgradnjo metode SELEX (angl. systematic evolution of ligands by exponential enrichment), pri kateri aptamere presejamo in izberemo le tiste z visoko afiniteto za željen ligand [2].

==Raziskave z že obstoječim aptamernim zaporedjem==

===Regulacija in-vitro transkripcije===

Da bi znanstveniki preverili izvedljivost uporabe aptamerov kot genskih regulatorjev, so na začetku uporabili, do sedaj dobro preučen, 29 nukleotidov dolg trombinski aptamer. Tega so vključili na različne lokacije blizu promotorske regije. Zanimalo jih je, kako bo vključitev aptamernega zaporedja v linearno DNA vplivala na in vitro transkripcijsko aktivnost, še bolj pa jih je zanimalo, kako bo na prepisovanje vplivala vezava liganda (človeškega trombina) na to aptamerno zaporedje. Transkripcijsko aktivnost so spremljali preko fluorescence reporterskega zaporedja 3WJdB, ki omogoča spremljanje transkripcijske aktivnosti v realnem času. Ugotovili so, da vključitev aptamera blizu promotorskega zaporedja zniža transkripcijsko aktivnost reporterskega zaporedja, saj ta s svojo sekundarno strukturo blokira potovanje RNA polimeraze po verigi [1].

Ob dodatku človeškega trombina, v večini primerov ni prišlo do očitnih sprememb transkripcijske aktivnosti v primerjavi s kontrolnim poskusom. Je pa v primeru vključitve trombinskega aptamera v smerno verigo navzdol od promotorja, prišlo do povišane transkripcije. Ob vezavi RNA polimeraze na promotorsko regijo pride namreč do odvitja dvojne vijačnice DNA. Ustvari se transkripcijski mehurček, ki izpostavi aptamerno zaporedje, ki lahko, kot omenjeno prej, blokira migracijo RNA polimeraze in s tem zniža efektivnost transkripcije ali pa jo celo prepreči. Vezava liganda na aptamerno zaporedje povzroči njegovo konformacijsko spremembo, kar lahko vpliva na transkripcijsko aktivnost. Ker je v slednjem primeru prišlo do povišanja ravni prepisovanja, se je torej zgodila takšna konformacijska sprememba strukture aptamera, ki je omogočila bolj ugodno potovanje RNA polimeraze navzdol po verigi [1].

===Regulacija transkripcije v brezceličnem sistemu===

Znanstveniki so želeli preveriti, ali pride do podobnih stimulatornih odzivov kot pri in vitro eksperimentih, tudi v brezceličnih sistemih. Za te namene so uporabili plazmidno DNA, ki je vsebovala enako promotorsko in reportersko zaporedje kot pri prejšnjem poskusu. Vezava človeškega trombina na trombinski aptamer je tudi v tem primeru povišala raven prepisovanja. Ugotovili so, da je fluorescenca, ki torej odraža transkripcijsko aktivnost, na začetku naraščala, nato pa je začela kar naenkrat padati. Razumeti moramo namreč, da je brezceličen sistem kompleksen in lahko prihaja do interakcij med različnimi komponentami. Padanje fluorescence se lahko pojasni s prisotnimi RNazami v sistemu, ki razgradijo prepisana RNA zaporedja 3WJdB. Na začetku je torej nivo transkripcije višji od degradacije, kar se kaže z naraščajočo fluorescenco. Po približno 30-60 min fluorescenca doseže vrh in začne padati, torej postane razgrajanje fluorescenčnega zaporedja 3WJdB hitrejše kot njegovo prepisovanje. Po 3-4 urah pride do razgradnje večine zaporedij 3WJdB, in s tem do znižanja fluorescence na bazalni nivo [1].
Ugotovili so tudi, da je nivo fluorescence bistveno nižji v brezceličnem sistemu, kot pri in vitro poskusih [1].

==Pridobivanje in preizkušanje novih aptamerov (CIVT-SELEX)==

===Capture-SELEX===

Ker so bili efekti vezave liganda na aptamerno zaporedje, torej povišanja transkripcije, premalo izraziti, so želeli pridobiti nove aptamere, ki se bodo odzivali na manjše koncentracije liganda, hkrati pa se jih bo lahko vključilo v biološka vezja. Za ta namen so uporabili metodo imenovano Capture-SELEX [1].

Oligonukleotidi iz knjižnice za Capture-SELEX so vsebovali 2 restrikcijski mesti, mesta za prepoznavo začetnih oligonukleotidov, ter seriji 40 in 10 naključnih nukleotidov, med njima pa se je nahajalo umestitveno zaporedje. To zaporedje je bilo komplementarno zaporedju za zajem, ki je bilo na 3' koncu biotinilirano [1].

DNA iz knjižnice so imobilizirali na magnetne kroglice s strepravidinom. Nato so uporabili človeški trombin kot tarčo za selekcijo specifičnih aptamerov. Ob vezavi oligonukleotidov na človeški trombin je prišlo do spremembe tri dimenzionalne strukture oligov, kar je povzročilo sproščanje enoverižne DNA iz kompleksa DNA-magnetna kroglica. Enoverižne DNA so z uporabo začetnih oligonukleotidov na obeh koncih pomnožili in dobili več kopij dvoverižne DNA, nato pa so z eksonukleazo razrezali le novo nastalo verigo. Kopije enoverižnih DNA so uporabili za nov krog selekcije in to ponovili 8 krat, pri čemer so pri vsakem krogu znižali koncentracijo liganda [1].

Po 8 krogih je sledilo negativno presejanje. V tem primeru so bili kompleksi DNA-magnetna kroglica, pred inkubacijo s ligandom, postavljeni v brezcelični sistem. S tem so želeli izločiti tiste aptamere, ki bi se lahko vezali na komponentne brezceličnega sistema. Po 4 krogih so dobili zaporedja, ki so bila visoka specifična in afinitetna proti človeškemu trombinu [1].

===Selekcija aptamerov s pomočjo brezceličnega transkripcijskega presejanja===

Dobljena knjižnica enoverižnih DNA pri postopku Capture-SELEX je bila pomnožena v dvoverižne DNA in vstavljena v vektorsko ogrodje s pomočjo metode sestavljanja Golden Gate. Vektor, ki je vseboval še promotor J23151, reportersko zaporedje 3WJdB in terminator, je bil transformiran v E. coli DH5α. Izbranih je bilo 1000 posameznih kolonij, ki so jih pomnožili in na podlagi agarozne gelske elektroforeze določili 832 takšnih DNA, ki so vsebovale pravilna zaporedja promotorja, aptamera, reporterja in terminatorja. Da so zmanjšali obseg dela, so 2 posamezni linearni DNA združili v skupni vzorec in tako dobili 416 poskusnih skupin [1].

Vsaka poskusna skupina je bila prepisana direktno v brezcelični sistem, z ali brez človeškega trombina. Primerjali so razlike v fluorescenci ob dodatku trombina. Pri tistih skupinah, kjer so bile razlike najočitnejše, so ponovili postopek, le da so tokrat v brezcelični sistem prepisali le individualne linearne DNA, ne več v paru, in zopet spremljali razlike v fluorescenci ob dodatku 0,5 uM človeškega trombina. Pri 6 aptamernih zaporedij (AS1-76, AS2-3, AS2-70, AS7-36, AS7-83, AS8-22) je prišlo do znatnega upada fluorescence ob prisotnosti liganda – človeškega trombina. Ko so jih posekvencirali so ugotovili, da so 3 zaporedja (AS2-3, AS7-36 in AS7-83) identična. V nadaljevanju so trem izbranim aptamernim zaporedjem (AS2-3, AS2-70 in AS8-22), poleg kontrolnega 29 nukleotidov dolgega aptamera, s pomočjo programa napovedali njihove sekundarne strukture. Njihova ∆G je bila pri vseh negativna, torej so sledeče sekundarne strukture stabilne pri 25°C [1].

3 omenjena aptamerna zaporedja so vstavili v stabilnejšo plazmidno obliko, da bi preverili odziv na tarčni ligand, zopet v brezceličnem sistemu. Rezultati so pokazali, da vsa 3 zaporedja povzročijo inhibicijo transkripcije ob dodatku 0,5 uM in 1 uM človeškega trombina, v primerjavi z negativno kontrolo brez vnesenega aptamernega zaporedja. Molekularni mehanizem takšne transkripcijske regulacije je enak kot je bil opisan prej. Pri prepisovanju, se ob vezavi RNA polimeraze na promotorsko zaporedje ustvari transkripcijski mehurček, ki izpostavi enoverižno aptamerno zaporedje, na katerega se lahko nato veže človeški trombin. Ker je v našem primeru prišlo do nižjega nivoja prepisovanja, je moralo torej ob vezavi liganda priti do takšnih konformacijskih sprememb v strukturi aptamera, da je prišlo do oteženega premikanja RNA polimeraze naprej po verigi [1].

Zanimivi so pridobljeni rezultati kontrolnega poskusa, kjer plazmid ni vseboval aptamernega zaporedja. Ob dodatku 1 uM trombina je vseeno prišlo do inhibicije translacije. Človeški trombin naj bi namreč vplival na ekspresijo zaporedij v pripravljenem brezceličnem sistemu, v smislu nespecifične inhibicije. S tem se kažejo toksične lastnosti večjih koncentracij človeškega trombina v brezceličnih sistemih [1].

==Zaključek==

Aptameri imajo mnoge molekularne aplikacije zaradi njihove preproste in poceni priprave, majhne velikosti in velike pestrosti. Brezcelični transkripcijsko-translacijski sistem ponuja velik potencial kot platforma za hitro presajanje aptamerov in preizkušanje prototipov novih bioloških vezij. V tej študiji so znanstveniki z uporabo metode CIVT-SELEX, ki je sestavljena iz Capture-SELEX in iz in vitro presejalne transkripcije, uspeli izbrati takšne aptamere, ki so bili visoko specifični in afinitetni proti človeškemu trombinu, in so ob vezavi povzročili inhibitorne efekte na transkripcijsko aktivnost. Takšni rezultatu potrjujejo robustnost uporabe aptamerov kot genetskih delov, tako v linearnih DNA, kot tudi v plazmidih [1].

==Literatura==

[1] Guo S, Xu Z, Lin L, Guo Y, Li J, Lu C, Shi X, Yang H. Using CIVT-SELEX to Select Aptamers as Genetic Parts to Regulate Gene Circuits in a Cell-Free System. Int J Mol Sci. 2023 Feb 1;24(3):2833.

[2] Kohlberger M, Gadermaier G. SELEX: Critical factors and optimization strategies for successful aptamer selection. Biotechnol Appl Biochem. 2022 Oct;69(5):1771-1792.

Uporaba CIVT-SELEX za izbiro aptamerov kot genskih delov za regulacijo genetskih vezij v brezceličnem sistemu

2023-05-15T07:48:43Z

Klemen Kunej: /* Regulacija transkripcije v brezceličnem sistemu */

''Povzeto po članku: [https://www.mdpi.com/1422-0067/24/3/2833 Guo S, Xu Z, Lin L, Guo Y, Li J, Lu C, Shi X, Yang H. Using CIVT-SELEX to Select Aptamers as Genetic Parts to Regulate Gene Circuits in a Cell-Free System. Int J Mol Sci. 2023 Feb 1;24(3):2833. ]''

==Uvod==

Napredki v sintezni biologiji nam omogočajo načrtovanje dinamičnih in kompleksnih funkcij v živih organizmih. Realizacija teh kompleksnih funkcij je odvisna od ustvarjanja raznih delujočih genetskih vezij. Ustvarjena so bila številna sintetična genetska vezja, pri katerih je ključna regulacija genske ekspresije. Trenutno se pri večini relevantnih študij za regulacijo genske ekspresije uporablja transkripcijske faktorje in njihove operatorje (LacI/lacO, TetR/tetO). Čeprav je uporaba transkripcijskih faktorjev robustna, pa se pojavi pomanjkljivost v omejenem številu parov transkripcijski faktor-operator. Da bi rešili ta problem, so znanstveniki začeli preizkušati pare DNA aptamer- ligand kot genetske dele za regulacijo izražanja genov. DNA aptameri se specifično vežejo na ligand, ki je lahko majhna molekula ali protein, in tako tvorijo kompleks sposoben regulacije genske ekspresije. Ker so DNA aptameri enoverižne DNA, lahko tako teoretično obstaja na milijone različnih parov aptamer-ligand [1].

Najbolj uporabljen model aptamera je trombinski aptamer. Že v preteklosti se je raziskovala njegova uporaba kot biološkega dela, pri čemer so ga vstavljali na različne lokacije ob promotorju in preučevali, kako to vpliva na ekspresijo tarčnih genov. S tem so se ukvarjali tudi v tej študiji. Poleg tega, so razvili metodo CIVT-SELEX (angl. Capture and In Vitro Transcription-SELEX) s pomočjo katere so izbrali trombinske aptamere primerne za regulacijo genske transkripcije [1]. Gre za nadgradnjo metode SELEX (angl. systematic evolution of ligands by exponential enrichment), pri kateri aptamere presejamo in izberemo le tiste z visoko afiniteto za željen ligand [2].

==Raziskave z že obstoječim aptamernim zaporedjem==

===Regulacija in-vitro transkripcije===

Da bi znanstveniki preverili izvedljivost uporabe aptamerov kot genskih regulatorjev, so na začetku uporabili, do sedaj dobro preučen, 29 nukleotidov dolg trombinski aptamer. Tega so vključili na različne lokacije blizu promotorske regije. Zanimalo jih je, kako bo vključitev aptamernega zaporedja v linearno DNA vplivala na in vitro transkripcijsko aktivnost, še bolj pa jih je zanimalo, kako bo na prepisovanje vplivala vezava liganda (človeškega trombina) na to aptamerno zaporedje. Transkripcijsko aktivnost so spremljali preko fluorescence reporterskega zaporedja 3WJdB, ki omogoča spremljanje transkripcijske aktivnosti v realnem času. Ugotovili so, da vključitev aptamera blizu promotorskega zaporedja zniža transkripcijsko aktivnost reporterskega zaporedja, saj ta s svojo sekundarno strukturo blokira potovanje RNA polimeraze po verigi [1].

Ob dodatku človeškega trombina, v večini primerov ni prišlo do očitnih sprememb transkripcijske aktivnosti v primerjavi s kontrolnim poskusom. Je pa v primeru vključitve trombinskega aptamera v smerno verigo navzdol od promotorja, prišlo do povišane transkripcije. Ob vezavi RNA polimeraze na promotorsko regijo pride namreč do odvitja dvojne vijačnice DNA. Ustvari se transkripcijski mehurček, ki izpostavi aptamerno zaporedje, ki lahko, kot omenjeno prej, blokira migracijo RNA polimeraze in s tem zniža efektivnost transkripcije ali pa jo celo prepreči. Vezava liganda na aptamerno zaporedje povzroči njegovo konformacijsko spremembo, kar lahko vpliva na transkripcijsko aktivnost. Ker je v slednjem primeru prišlo do povišanja ravni prepisovanja, se je torej zgodila takšna konformacijska sprememba strukture aptamera, ki je omogočila bolj ugodno potovanje RNA polimeraze navzdol po verigi [1].

===Regulacija transkripcije v brezceličnem sistemu===

Znanstveniki so želeli preveriti, ali pride do podobnih stimulatornih odzivov kot pri in vitro eksperimentih, tudi v brezceličnih sistemih. Za te namene so uporabili plazmidno DNA, ki je vsebovala enako promotorsko in reportersko zaporedje kot pri in vivo eksperimentih. Vezava človeškega trombina na trombinski aptamer je tudi v tem primeru povišala raven prepisovanja. Ugotovili so, da je fluorescenca, ki torej odraža transkripcijsko aktivnost, na začetku naraščala, nato pa je začela kar naenkrat padati. Razumeti moramo namreč, da je brezceličen sistem kompleksen in lahko prihaja do interakcij med različnimi komponentami. Padanje fluorescence se lahko pojasni s prisotnimi RNazami v sistemu, ki razgradijo prepisana RNA zaporedja 3WJdB. Na začetku je torej nivo transkripcije višji od degradacije, kar se kaže z naraščajočo fluorescenco. Po približno 30-60 min fluorescenca doseže vrh in začne padati, torej postane razgrajanje fluorescenčnega zaporedja 3WJdB hitrejše kot njegovo prepisovanje. Po 3-4 urah pride do razgradnje večine zaporedij 3WJdB, in s tem do znižanja fluorescence na bazalni nivo [1].
Ugotovili so tudi, da je nivo fluorescence bistveno nižji v brezceličnem sistemu, kot pri in vitro poskusih [1].

==Pridobivanje in preizkušanje novih aptamerov (CIVT-SELEX)==

===Capture-SELEX===

Ker so bili efekti vezave liganda na aptamerno zaporedje, torej povišanja transkripcije, premalo izraziti, so želeli pridobiti nove aptamere, ki se bodo odzivali na manjše koncentracije liganda, hkrati pa se jih bo lahko vključilo v biološka vezja. Za ta namen so uporabili metodo imenovano Capture-SELEX [1].

Oligonukleotidi iz knjižnice za Capture-SELEX so vsebovali 2 restrikcijski mesti, mesta za prepoznavo začetnih oligonukleotidov, ter seriji 40 in 10 naključnih nukleotidov, med njima pa se je nahajalo umestitveno zaporedje. To zaporedje je bilo komplementarno zaporedju za zajem, ki je bilo na 3' koncu biotinilirano [1].

DNA iz knjižnice so imobilizirali na magnetne kroglice s strepravidinom. Nato so uporabili človeški trombin kot tarčo za selekcijo specifičnih aptamerov. Ob vezavi oligonukleotidov na človeški trombin je prišlo do spremembe tri dimenzionalne strukture oligov, kar je povzročilo sproščanje enoverižne DNA iz kompleksa DNA-magnetna kroglica. Enoverižne DNA so z uporabo začetnih oligonukleotidov na obeh koncih pomnožili in dobili več kopij dvoverižne DNA, nato pa so z eksonukleazo razrezali le novo nastalo verigo. Kopije enoverižnih DNA so uporabili za nov krog selekcije in to ponovili 8 krat, pri čemer so pri vsakem krogu znižali koncentracijo liganda [1].

Po 8 krogih je sledilo negativno presejanje. V tem primeru so bili kompleksi DNA-magnetna kroglica, pred inkubacijo s ligandom, postavljeni v brezcelični sistem. S tem so želeli izločiti tiste aptamere, ki bi se lahko vezali na komponentne brezceličnega sistema. Po 4 krogih so dobili zaporedja, ki so bila visoka specifična in afinitetna proti človeškemu trombinu [1].

===Selekcija aptamerov s pomočjo brezceličnega transkripcijskega presejanja===

Dobljena knjižnica enoverižnih DNA pri postopku Capture-SELEX je bila pomnožena v dvoverižne DNA in vstavljena v vektorsko ogrodje s pomočjo metode sestavljanja Golden Gate. Vektor, ki je vseboval še promotor J23151, reportersko zaporedje 3WJdB in terminator, je bil transformiran v E. coli DH5α. Izbranih je bilo 1000 posameznih kolonij, ki so jih pomnožili in na podlagi agarozne gelske elektroforeze določili 832 takšnih DNA, ki so vsebovale pravilna zaporedja promotorja, aptamera, reporterja in terminatorja. Da so zmanjšali obseg dela, so 2 posamezni linearni DNA združili v skupni vzorec in tako dobili 416 poskusnih skupin [1].

Vsaka poskusna skupina je bila prepisana direktno v brezcelični sistem, z ali brez človeškega trombina. Primerjali so razlike v fluorescenci ob dodatku trombina. Pri tistih skupinah, kjer so bile razlike najočitnejše, so ponovili postopek, le da so tokrat v brezcelični sistem prepisali le individualne linearne DNA, ne več v paru, in zopet spremljali razlike v fluorescenci ob dodatku 0,5 uM človeškega trombina. Pri 6 aptamernih zaporedij (AS1-76, AS2-3, AS2-70, AS7-36, AS7-83, AS8-22) je prišlo do znatnega upada fluorescence ob prisotnosti liganda – človeškega trombina. Ko so jih posekvencirali so ugotovili, da so 3 zaporedja (AS2-3, AS7-36 in AS7-83) identična. V nadaljevanju so trem izbranim aptamernim zaporedjem (AS2-3, AS2-70 in AS8-22), poleg kontrolnega 29 nukleotidov dolgega aptamera, s pomočjo programa napovedali njihove sekundarne strukture. Njihova ∆G je bila pri vseh negativna, torej so sledeče sekundarne strukture stabilne pri 25°C [1].

3 omenjena aptamerna zaporedja so vstavili v stabilnejšo plazmidno obliko, da bi preverili odziv na tarčni ligand, zopet v brezceličnem sistemu. Rezultati so pokazali, da vsa 3 zaporedja povzročijo inhibicijo transkripcije ob dodatku 0,5 uM in 1 uM človeškega trombina, v primerjavi z negativno kontrolo brez vnesenega aptamernega zaporedja. Molekularni mehanizem takšne transkripcijske regulacije je enak kot je bil opisan prej. Pri prepisovanju, se ob vezavi RNA polimeraze na promotorsko zaporedje ustvari transkripcijski mehurček, ki izpostavi enoverižno aptamerno zaporedje, na katerega se lahko nato veže človeški trombin. Ker je v našem primeru prišlo do nižjega nivoja prepisovanja, je moralo torej ob vezavi liganda priti do takšnih konformacijskih sprememb v strukturi aptamera, da je prišlo do oteženega premikanja RNA polimeraze naprej po verigi [1].

Zanimivi so pridobljeni rezultati kontrolnega poskusa, kjer plazmid ni vseboval aptamernega zaporedja. Ob dodatku 1 uM trombina je vseeno prišlo do inhibicije translacije. Človeški trombin naj bi namreč vplival na ekspresijo zaporedij v pripravljenem brezceličnem sistemu, v smislu nespecifične inhibicije. S tem se kažejo toksične lastnosti večjih koncentracij človeškega trombina v brezceličnih sistemih [1].

==Zaključek==

Aptameri imajo mnoge molekularne aplikacije zaradi njihove preproste in poceni priprave, majhne velikosti in velike pestrosti. Brezcelični transkripcijsko-translacijski sistem ponuja velik potencial kot platforma za hitro presajanje aptamerov in preizkušanje prototipov novih bioloških vezij. V tej študiji so znanstveniki z uporabo metode CIVT-SELEX, ki je sestavljena iz Capture-SELEX in iz in vitro presejalne transkripcije, uspeli izbrati takšne aptamere, ki so bili visoko specifični in afinitetni proti človeškemu trombinu, in so ob vezavi povzročili inhibitorne efekte na transkripcijsko aktivnost. Takšni rezultatu potrjujejo robustnost uporabe aptamerov kot genetskih delov, tako v linearnih DNA, kot tudi v plazmidih [1].

==Literatura==

[1] Guo S, Xu Z, Lin L, Guo Y, Li J, Lu C, Shi X, Yang H. Using CIVT-SELEX to Select Aptamers as Genetic Parts to Regulate Gene Circuits in a Cell-Free System. Int J Mol Sci. 2023 Feb 1;24(3):2833.

[2] Kohlberger M, Gadermaier G. SELEX: Critical factors and optimization strategies for successful aptamer selection. Biotechnol Appl Biochem. 2022 Oct;69(5):1771-1792.

Uporaba CIVT-SELEX za izbiro aptamerov kot genskih delov za regulacijo genetskih vezij v brezceličnem sistemu

2023-05-15T07:47:52Z

Klemen Kunej: /* Regulacija transkripcije v brezceličnem sistemu */

''Povzeto po članku: [https://www.mdpi.com/1422-0067/24/3/2833 Guo S, Xu Z, Lin L, Guo Y, Li J, Lu C, Shi X, Yang H. Using CIVT-SELEX to Select Aptamers as Genetic Parts to Regulate Gene Circuits in a Cell-Free System. Int J Mol Sci. 2023 Feb 1;24(3):2833. ]''

==Uvod==

Napredki v sintezni biologiji nam omogočajo načrtovanje dinamičnih in kompleksnih funkcij v živih organizmih. Realizacija teh kompleksnih funkcij je odvisna od ustvarjanja raznih delujočih genetskih vezij. Ustvarjena so bila številna sintetična genetska vezja, pri katerih je ključna regulacija genske ekspresije. Trenutno se pri večini relevantnih študij za regulacijo genske ekspresije uporablja transkripcijske faktorje in njihove operatorje (LacI/lacO, TetR/tetO). Čeprav je uporaba transkripcijskih faktorjev robustna, pa se pojavi pomanjkljivost v omejenem številu parov transkripcijski faktor-operator. Da bi rešili ta problem, so znanstveniki začeli preizkušati pare DNA aptamer- ligand kot genetske dele za regulacijo izražanja genov. DNA aptameri se specifično vežejo na ligand, ki je lahko majhna molekula ali protein, in tako tvorijo kompleks sposoben regulacije genske ekspresije. Ker so DNA aptameri enoverižne DNA, lahko tako teoretično obstaja na milijone različnih parov aptamer-ligand [1].

Najbolj uporabljen model aptamera je trombinski aptamer. Že v preteklosti se je raziskovala njegova uporaba kot biološkega dela, pri čemer so ga vstavljali na različne lokacije ob promotorju in preučevali, kako to vpliva na ekspresijo tarčnih genov. S tem so se ukvarjali tudi v tej študiji. Poleg tega, so razvili metodo CIVT-SELEX (angl. Capture and In Vitro Transcription-SELEX) s pomočjo katere so izbrali trombinske aptamere primerne za regulacijo genske transkripcije [1]. Gre za nadgradnjo metode SELEX (angl. systematic evolution of ligands by exponential enrichment), pri kateri aptamere presejamo in izberemo le tiste z visoko afiniteto za željen ligand [2].

==Raziskave z že obstoječim aptamernim zaporedjem==

===Regulacija in-vitro transkripcije===

Da bi znanstveniki preverili izvedljivost uporabe aptamerov kot genskih regulatorjev, so na začetku uporabili, do sedaj dobro preučen, 29 nukleotidov dolg trombinski aptamer. Tega so vključili na različne lokacije blizu promotorske regije. Zanimalo jih je, kako bo vključitev aptamernega zaporedja v linearno DNA vplivala na in vitro transkripcijsko aktivnost, še bolj pa jih je zanimalo, kako bo na prepisovanje vplivala vezava liganda (človeškega trombina) na to aptamerno zaporedje. Transkripcijsko aktivnost so spremljali preko fluorescence reporterskega zaporedja 3WJdB, ki omogoča spremljanje transkripcijske aktivnosti v realnem času. Ugotovili so, da vključitev aptamera blizu promotorskega zaporedja zniža transkripcijsko aktivnost reporterskega zaporedja, saj ta s svojo sekundarno strukturo blokira potovanje RNA polimeraze po verigi [1].

Ob dodatku človeškega trombina, v večini primerov ni prišlo do očitnih sprememb transkripcijske aktivnosti v primerjavi s kontrolnim poskusom. Je pa v primeru vključitve trombinskega aptamera v smerno verigo navzdol od promotorja, prišlo do povišane transkripcije. Ob vezavi RNA polimeraze na promotorsko regijo pride namreč do odvitja dvojne vijačnice DNA. Ustvari se transkripcijski mehurček, ki izpostavi aptamerno zaporedje, ki lahko, kot omenjeno prej, blokira migracijo RNA polimeraze in s tem zniža efektivnost transkripcije ali pa jo celo prepreči. Vezava liganda na aptamerno zaporedje povzroči njegovo konformacijsko spremembo, kar lahko vpliva na transkripcijsko aktivnost. Ker je v slednjem primeru prišlo do povišanja ravni prepisovanja, se je torej zgodila takšna konformacijska sprememba strukture aptamera, ki je omogočila bolj ugodno potovanje RNA polimeraze navzdol po verigi [1].

===Regulacija transkripcije v brezceličnem sistemu===

Znanstveniki so želeli preveriti, ali pride do podobnih stimulatornih odzivov kot pri in vitro eksperimentih, tudi v brezceličnih sistemih. Za te namene so uporabili plazmidno DNA, ki je vsebovala enako promotorsko in reportersko zaporedje. Vezava človeškega trombina na trombinski aptamer je tudi v tem primeru povišala raven prepisovanja. Ugotovili so, da je fluorescenca, ki torej odraža transkripcijsko aktivnost, na začetku naraščala, nato pa je začela kar naenkrat padati. Razumeti moramo namreč, da je brezceličen sistem kompleksen in lahko prihaja do interakcij med različnimi komponentami. Padanje fluorescence se lahko pojasni s prisotnimi RNazami v sistemu, ki razgradijo prepisana RNA zaporedja 3WJdB. Na začetku je torej nivo transkripcije višji od degradacije, kar se kaže z naraščajočo fluorescenco. Po približno 30-60 min fluorescenca doseže vrh in začne padati, torej postane razgrajanje fluorescenčnega zaporedja 3WJdB hitrejše kot njegovo prepisovanje. Po 3-4 urah pride do razgradnje večine zaporedij 3WJdB, in s tem do znižanja fluorescence na bazalni nivo [1].
Ugotovili so tudi, da je nivo fluorescence bistveno nižji v brezceličnem sistemu, kot pri in vitro poskusih [1].

==Pridobivanje in preizkušanje novih aptamerov (CIVT-SELEX)==

===Capture-SELEX===

Ker so bili efekti vezave liganda na aptamerno zaporedje, torej povišanja transkripcije, premalo izraziti, so želeli pridobiti nove aptamere, ki se bodo odzivali na manjše koncentracije liganda, hkrati pa se jih bo lahko vključilo v biološka vezja. Za ta namen so uporabili metodo imenovano Capture-SELEX [1].

Oligonukleotidi iz knjižnice za Capture-SELEX so vsebovali 2 restrikcijski mesti, mesta za prepoznavo začetnih oligonukleotidov, ter seriji 40 in 10 naključnih nukleotidov, med njima pa se je nahajalo umestitveno zaporedje. To zaporedje je bilo komplementarno zaporedju za zajem, ki je bilo na 3' koncu biotinilirano [1].

DNA iz knjižnice so imobilizirali na magnetne kroglice s strepravidinom. Nato so uporabili človeški trombin kot tarčo za selekcijo specifičnih aptamerov. Ob vezavi oligonukleotidov na človeški trombin je prišlo do spremembe tri dimenzionalne strukture oligov, kar je povzročilo sproščanje enoverižne DNA iz kompleksa DNA-magnetna kroglica. Enoverižne DNA so z uporabo začetnih oligonukleotidov na obeh koncih pomnožili in dobili več kopij dvoverižne DNA, nato pa so z eksonukleazo razrezali le novo nastalo verigo. Kopije enoverižnih DNA so uporabili za nov krog selekcije in to ponovili 8 krat, pri čemer so pri vsakem krogu znižali koncentracijo liganda [1].

Po 8 krogih je sledilo negativno presejanje. V tem primeru so bili kompleksi DNA-magnetna kroglica, pred inkubacijo s ligandom, postavljeni v brezcelični sistem. S tem so želeli izločiti tiste aptamere, ki bi se lahko vezali na komponentne brezceličnega sistema. Po 4 krogih so dobili zaporedja, ki so bila visoka specifična in afinitetna proti človeškemu trombinu [1].

===Selekcija aptamerov s pomočjo brezceličnega transkripcijskega presejanja===

Dobljena knjižnica enoverižnih DNA pri postopku Capture-SELEX je bila pomnožena v dvoverižne DNA in vstavljena v vektorsko ogrodje s pomočjo metode sestavljanja Golden Gate. Vektor, ki je vseboval še promotor J23151, reportersko zaporedje 3WJdB in terminator, je bil transformiran v E. coli DH5α. Izbranih je bilo 1000 posameznih kolonij, ki so jih pomnožili in na podlagi agarozne gelske elektroforeze določili 832 takšnih DNA, ki so vsebovale pravilna zaporedja promotorja, aptamera, reporterja in terminatorja. Da so zmanjšali obseg dela, so 2 posamezni linearni DNA združili v skupni vzorec in tako dobili 416 poskusnih skupin [1].

Vsaka poskusna skupina je bila prepisana direktno v brezcelični sistem, z ali brez človeškega trombina. Primerjali so razlike v fluorescenci ob dodatku trombina. Pri tistih skupinah, kjer so bile razlike najočitnejše, so ponovili postopek, le da so tokrat v brezcelični sistem prepisali le individualne linearne DNA, ne več v paru, in zopet spremljali razlike v fluorescenci ob dodatku 0,5 uM človeškega trombina. Pri 6 aptamernih zaporedij (AS1-76, AS2-3, AS2-70, AS7-36, AS7-83, AS8-22) je prišlo do znatnega upada fluorescence ob prisotnosti liganda – človeškega trombina. Ko so jih posekvencirali so ugotovili, da so 3 zaporedja (AS2-3, AS7-36 in AS7-83) identična. V nadaljevanju so trem izbranim aptamernim zaporedjem (AS2-3, AS2-70 in AS8-22), poleg kontrolnega 29 nukleotidov dolgega aptamera, s pomočjo programa napovedali njihove sekundarne strukture. Njihova ∆G je bila pri vseh negativna, torej so sledeče sekundarne strukture stabilne pri 25°C [1].

3 omenjena aptamerna zaporedja so vstavili v stabilnejšo plazmidno obliko, da bi preverili odziv na tarčni ligand, zopet v brezceličnem sistemu. Rezultati so pokazali, da vsa 3 zaporedja povzročijo inhibicijo transkripcije ob dodatku 0,5 uM in 1 uM človeškega trombina, v primerjavi z negativno kontrolo brez vnesenega aptamernega zaporedja. Molekularni mehanizem takšne transkripcijske regulacije je enak kot je bil opisan prej. Pri prepisovanju, se ob vezavi RNA polimeraze na promotorsko zaporedje ustvari transkripcijski mehurček, ki izpostavi enoverižno aptamerno zaporedje, na katerega se lahko nato veže človeški trombin. Ker je v našem primeru prišlo do nižjega nivoja prepisovanja, je moralo torej ob vezavi liganda priti do takšnih konformacijskih sprememb v strukturi aptamera, da je prišlo do oteženega premikanja RNA polimeraze naprej po verigi [1].

Zanimivi so pridobljeni rezultati kontrolnega poskusa, kjer plazmid ni vseboval aptamernega zaporedja. Ob dodatku 1 uM trombina je vseeno prišlo do inhibicije translacije. Človeški trombin naj bi namreč vplival na ekspresijo zaporedij v pripravljenem brezceličnem sistemu, v smislu nespecifične inhibicije. S tem se kažejo toksične lastnosti večjih koncentracij človeškega trombina v brezceličnih sistemih [1].

==Zaključek==

Aptameri imajo mnoge molekularne aplikacije zaradi njihove preproste in poceni priprave, majhne velikosti in velike pestrosti. Brezcelični transkripcijsko-translacijski sistem ponuja velik potencial kot platforma za hitro presajanje aptamerov in preizkušanje prototipov novih bioloških vezij. V tej študiji so znanstveniki z uporabo metode CIVT-SELEX, ki je sestavljena iz Capture-SELEX in iz in vitro presejalne transkripcije, uspeli izbrati takšne aptamere, ki so bili visoko specifični in afinitetni proti človeškemu trombinu, in so ob vezavi povzročili inhibitorne efekte na transkripcijsko aktivnost. Takšni rezultatu potrjujejo robustnost uporabe aptamerov kot genetskih delov, tako v linearnih DNA, kot tudi v plazmidih [1].

==Literatura==

[1] Guo S, Xu Z, Lin L, Guo Y, Li J, Lu C, Shi X, Yang H. Using CIVT-SELEX to Select Aptamers as Genetic Parts to Regulate Gene Circuits in a Cell-Free System. Int J Mol Sci. 2023 Feb 1;24(3):2833.

[2] Kohlberger M, Gadermaier G. SELEX: Critical factors and optimization strategies for successful aptamer selection. Biotechnol Appl Biochem. 2022 Oct;69(5):1771-1792.

Uporaba CIVT-SELEX za izbiro aptamerov kot genskih delov za regulacijo genetskih vezij v brezceličnem sistemu

2023-05-15T07:47:10Z

Klemen Kunej: /* Regulacija transkripcije v brezceličnem sistemu */

''Povzeto po članku: [https://www.mdpi.com/1422-0067/24/3/2833 Guo S, Xu Z, Lin L, Guo Y, Li J, Lu C, Shi X, Yang H. Using CIVT-SELEX to Select Aptamers as Genetic Parts to Regulate Gene Circuits in a Cell-Free System. Int J Mol Sci. 2023 Feb 1;24(3):2833. ]''

==Uvod==

Napredki v sintezni biologiji nam omogočajo načrtovanje dinamičnih in kompleksnih funkcij v živih organizmih. Realizacija teh kompleksnih funkcij je odvisna od ustvarjanja raznih delujočih genetskih vezij. Ustvarjena so bila številna sintetična genetska vezja, pri katerih je ključna regulacija genske ekspresije. Trenutno se pri večini relevantnih študij za regulacijo genske ekspresije uporablja transkripcijske faktorje in njihove operatorje (LacI/lacO, TetR/tetO). Čeprav je uporaba transkripcijskih faktorjev robustna, pa se pojavi pomanjkljivost v omejenem številu parov transkripcijski faktor-operator. Da bi rešili ta problem, so znanstveniki začeli preizkušati pare DNA aptamer- ligand kot genetske dele za regulacijo izražanja genov. DNA aptameri se specifično vežejo na ligand, ki je lahko majhna molekula ali protein, in tako tvorijo kompleks sposoben regulacije genske ekspresije. Ker so DNA aptameri enoverižne DNA, lahko tako teoretično obstaja na milijone različnih parov aptamer-ligand [1].

Najbolj uporabljen model aptamera je trombinski aptamer. Že v preteklosti se je raziskovala njegova uporaba kot biološkega dela, pri čemer so ga vstavljali na različne lokacije ob promotorju in preučevali, kako to vpliva na ekspresijo tarčnih genov. S tem so se ukvarjali tudi v tej študiji. Poleg tega, so razvili metodo CIVT-SELEX (angl. Capture and In Vitro Transcription-SELEX) s pomočjo katere so izbrali trombinske aptamere primerne za regulacijo genske transkripcije [1]. Gre za nadgradnjo metode SELEX (angl. systematic evolution of ligands by exponential enrichment), pri kateri aptamere presejamo in izberemo le tiste z visoko afiniteto za željen ligand [2].

==Raziskave z že obstoječim aptamernim zaporedjem==

===Regulacija in-vitro transkripcije===

Da bi znanstveniki preverili izvedljivost uporabe aptamerov kot genskih regulatorjev, so na začetku uporabili, do sedaj dobro preučen, 29 nukleotidov dolg trombinski aptamer. Tega so vključili na različne lokacije blizu promotorske regije. Zanimalo jih je, kako bo vključitev aptamernega zaporedja v linearno DNA vplivala na in vitro transkripcijsko aktivnost, še bolj pa jih je zanimalo, kako bo na prepisovanje vplivala vezava liganda (človeškega trombina) na to aptamerno zaporedje. Transkripcijsko aktivnost so spremljali preko fluorescence reporterskega zaporedja 3WJdB, ki omogoča spremljanje transkripcijske aktivnosti v realnem času. Ugotovili so, da vključitev aptamera blizu promotorskega zaporedja zniža transkripcijsko aktivnost reporterskega zaporedja, saj ta s svojo sekundarno strukturo blokira potovanje RNA polimeraze po verigi [1].

Ob dodatku človeškega trombina, v večini primerov ni prišlo do očitnih sprememb transkripcijske aktivnosti v primerjavi s kontrolnim poskusom. Je pa v primeru vključitve trombinskega aptamera v smerno verigo navzdol od promotorja, prišlo do povišane transkripcije. Ob vezavi RNA polimeraze na promotorsko regijo pride namreč do odvitja dvojne vijačnice DNA. Ustvari se transkripcijski mehurček, ki izpostavi aptamerno zaporedje, ki lahko, kot omenjeno prej, blokira migracijo RNA polimeraze in s tem zniža efektivnost transkripcije ali pa jo celo prepreči. Vezava liganda na aptamerno zaporedje povzroči njegovo konformacijsko spremembo, kar lahko vpliva na transkripcijsko aktivnost. Ker je v slednjem primeru prišlo do povišanja ravni prepisovanja, se je torej zgodila takšna konformacijska sprememba strukture aptamera, ki je omogočila bolj ugodno potovanje RNA polimeraze navzdol po verigi [1].

===Regulacija transkripcije v brezceličnem sistemu===

Znanstveniki so želeli preveriti, ali pride do podobnih stimulatornih odzivov kot pri in vitro eksperimentih, tudi v brezceličnih sistemih. Za te namene so uporabili plazmidno DNA, ki je vsebovala enako promotorsko in reportersko zaporedje kot prej. Vezava človeškega trombina na trombinski aptamer je tudi v tem primeru povišala raven prepisovanja. Ugotovili so, da je fluorescenca, ki torej odraža transkripcijsko aktivnost, na začetku naraščala, nato pa je začela kar naenkrat padati. Razumeti moramo namreč, da je brezceličen sistem kompleksen in lahko prihaja do interakcij med različnimi komponentami. Padanje fluorescence se lahko pojasni s prisotnimi RNazami v sistemu, ki razgradijo prepisana RNA zaporedja 3WJdB. Na začetku je torej nivo transkripcije višji od degradacije, kar se kaže z naraščajočo fluorescenco. Po približno 30-60 min fluorescenca doseže vrh in začne padati, torej postane razgrajanje fluorescenčnega zaporedja 3WJdB hitrejše kot njegovo prepisovanje. Po 3-4 urah pride do razgradnje večine zaporedij 3WJdB, in s tem do znižanja fluorescence na bazalni nivo [1].
Ugotovili so tudi, da je nivo fluorescence bistveno nižji v brezceličnem sistemu, kot pri in vitro poskusih [1].

==Pridobivanje in preizkušanje novih aptamerov (CIVT-SELEX)==

===Capture-SELEX===

Ker so bili efekti vezave liganda na aptamerno zaporedje, torej povišanja transkripcije, premalo izraziti, so želeli pridobiti nove aptamere, ki se bodo odzivali na manjše koncentracije liganda, hkrati pa se jih bo lahko vključilo v biološka vezja. Za ta namen so uporabili metodo imenovano Capture-SELEX [1].

Oligonukleotidi iz knjižnice za Capture-SELEX so vsebovali 2 restrikcijski mesti, mesta za prepoznavo začetnih oligonukleotidov, ter seriji 40 in 10 naključnih nukleotidov, med njima pa se je nahajalo umestitveno zaporedje. To zaporedje je bilo komplementarno zaporedju za zajem, ki je bilo na 3' koncu biotinilirano [1].

DNA iz knjižnice so imobilizirali na magnetne kroglice s strepravidinom. Nato so uporabili človeški trombin kot tarčo za selekcijo specifičnih aptamerov. Ob vezavi oligonukleotidov na človeški trombin je prišlo do spremembe tri dimenzionalne strukture oligov, kar je povzročilo sproščanje enoverižne DNA iz kompleksa DNA-magnetna kroglica. Enoverižne DNA so z uporabo začetnih oligonukleotidov na obeh koncih pomnožili in dobili več kopij dvoverižne DNA, nato pa so z eksonukleazo razrezali le novo nastalo verigo. Kopije enoverižnih DNA so uporabili za nov krog selekcije in to ponovili 8 krat, pri čemer so pri vsakem krogu znižali koncentracijo liganda [1].

Po 8 krogih je sledilo negativno presejanje. V tem primeru so bili kompleksi DNA-magnetna kroglica, pred inkubacijo s ligandom, postavljeni v brezcelični sistem. S tem so želeli izločiti tiste aptamere, ki bi se lahko vezali na komponentne brezceličnega sistema. Po 4 krogih so dobili zaporedja, ki so bila visoka specifična in afinitetna proti človeškemu trombinu [1].

===Selekcija aptamerov s pomočjo brezceličnega transkripcijskega presejanja===

Dobljena knjižnica enoverižnih DNA pri postopku Capture-SELEX je bila pomnožena v dvoverižne DNA in vstavljena v vektorsko ogrodje s pomočjo metode sestavljanja Golden Gate. Vektor, ki je vseboval še promotor J23151, reportersko zaporedje 3WJdB in terminator, je bil transformiran v E. coli DH5α. Izbranih je bilo 1000 posameznih kolonij, ki so jih pomnožili in na podlagi agarozne gelske elektroforeze določili 832 takšnih DNA, ki so vsebovale pravilna zaporedja promotorja, aptamera, reporterja in terminatorja. Da so zmanjšali obseg dela, so 2 posamezni linearni DNA združili v skupni vzorec in tako dobili 416 poskusnih skupin [1].

Vsaka poskusna skupina je bila prepisana direktno v brezcelični sistem, z ali brez človeškega trombina. Primerjali so razlike v fluorescenci ob dodatku trombina. Pri tistih skupinah, kjer so bile razlike najočitnejše, so ponovili postopek, le da so tokrat v brezcelični sistem prepisali le individualne linearne DNA, ne več v paru, in zopet spremljali razlike v fluorescenci ob dodatku 0,5 uM človeškega trombina. Pri 6 aptamernih zaporedij (AS1-76, AS2-3, AS2-70, AS7-36, AS7-83, AS8-22) je prišlo do znatnega upada fluorescence ob prisotnosti liganda – človeškega trombina. Ko so jih posekvencirali so ugotovili, da so 3 zaporedja (AS2-3, AS7-36 in AS7-83) identična. V nadaljevanju so trem izbranim aptamernim zaporedjem (AS2-3, AS2-70 in AS8-22), poleg kontrolnega 29 nukleotidov dolgega aptamera, s pomočjo programa napovedali njihove sekundarne strukture. Njihova ∆G je bila pri vseh negativna, torej so sledeče sekundarne strukture stabilne pri 25°C [1].

3 omenjena aptamerna zaporedja so vstavili v stabilnejšo plazmidno obliko, da bi preverili odziv na tarčni ligand, zopet v brezceličnem sistemu. Rezultati so pokazali, da vsa 3 zaporedja povzročijo inhibicijo transkripcije ob dodatku 0,5 uM in 1 uM človeškega trombina, v primerjavi z negativno kontrolo brez vnesenega aptamernega zaporedja. Molekularni mehanizem takšne transkripcijske regulacije je enak kot je bil opisan prej. Pri prepisovanju, se ob vezavi RNA polimeraze na promotorsko zaporedje ustvari transkripcijski mehurček, ki izpostavi enoverižno aptamerno zaporedje, na katerega se lahko nato veže človeški trombin. Ker je v našem primeru prišlo do nižjega nivoja prepisovanja, je moralo torej ob vezavi liganda priti do takšnih konformacijskih sprememb v strukturi aptamera, da je prišlo do oteženega premikanja RNA polimeraze naprej po verigi [1].

Zanimivi so pridobljeni rezultati kontrolnega poskusa, kjer plazmid ni vseboval aptamernega zaporedja. Ob dodatku 1 uM trombina je vseeno prišlo do inhibicije translacije. Človeški trombin naj bi namreč vplival na ekspresijo zaporedij v pripravljenem brezceličnem sistemu, v smislu nespecifične inhibicije. S tem se kažejo toksične lastnosti večjih koncentracij človeškega trombina v brezceličnih sistemih [1].

==Zaključek==

Aptameri imajo mnoge molekularne aplikacije zaradi njihove preproste in poceni priprave, majhne velikosti in velike pestrosti. Brezcelični transkripcijsko-translacijski sistem ponuja velik potencial kot platforma za hitro presajanje aptamerov in preizkušanje prototipov novih bioloških vezij. V tej študiji so znanstveniki z uporabo metode CIVT-SELEX, ki je sestavljena iz Capture-SELEX in iz in vitro presejalne transkripcije, uspeli izbrati takšne aptamere, ki so bili visoko specifični in afinitetni proti človeškemu trombinu, in so ob vezavi povzročili inhibitorne efekte na transkripcijsko aktivnost. Takšni rezultatu potrjujejo robustnost uporabe aptamerov kot genetskih delov, tako v linearnih DNA, kot tudi v plazmidih [1].

==Literatura==

[1] Guo S, Xu Z, Lin L, Guo Y, Li J, Lu C, Shi X, Yang H. Using CIVT-SELEX to Select Aptamers as Genetic Parts to Regulate Gene Circuits in a Cell-Free System. Int J Mol Sci. 2023 Feb 1;24(3):2833.

[2] Kohlberger M, Gadermaier G. SELEX: Critical factors and optimization strategies for successful aptamer selection. Biotechnol Appl Biochem. 2022 Oct;69(5):1771-1792.

Uporaba CIVT-SELEX za izbiro aptamerov kot genskih delov za regulacijo genetskih vezij v brezceličnem sistemu

2023-05-15T07:46:10Z

Klemen Kunej: /* Regulacija in-vitro transkripcije */

''Povzeto po članku: [https://www.mdpi.com/1422-0067/24/3/2833 Guo S, Xu Z, Lin L, Guo Y, Li J, Lu C, Shi X, Yang H. Using CIVT-SELEX to Select Aptamers as Genetic Parts to Regulate Gene Circuits in a Cell-Free System. Int J Mol Sci. 2023 Feb 1;24(3):2833. ]''

==Uvod==

Napredki v sintezni biologiji nam omogočajo načrtovanje dinamičnih in kompleksnih funkcij v živih organizmih. Realizacija teh kompleksnih funkcij je odvisna od ustvarjanja raznih delujočih genetskih vezij. Ustvarjena so bila številna sintetična genetska vezja, pri katerih je ključna regulacija genske ekspresije. Trenutno se pri večini relevantnih študij za regulacijo genske ekspresije uporablja transkripcijske faktorje in njihove operatorje (LacI/lacO, TetR/tetO). Čeprav je uporaba transkripcijskih faktorjev robustna, pa se pojavi pomanjkljivost v omejenem številu parov transkripcijski faktor-operator. Da bi rešili ta problem, so znanstveniki začeli preizkušati pare DNA aptamer- ligand kot genetske dele za regulacijo izražanja genov. DNA aptameri se specifično vežejo na ligand, ki je lahko majhna molekula ali protein, in tako tvorijo kompleks sposoben regulacije genske ekspresije. Ker so DNA aptameri enoverižne DNA, lahko tako teoretično obstaja na milijone različnih parov aptamer-ligand [1].

Najbolj uporabljen model aptamera je trombinski aptamer. Že v preteklosti se je raziskovala njegova uporaba kot biološkega dela, pri čemer so ga vstavljali na različne lokacije ob promotorju in preučevali, kako to vpliva na ekspresijo tarčnih genov. S tem so se ukvarjali tudi v tej študiji. Poleg tega, so razvili metodo CIVT-SELEX (angl. Capture and In Vitro Transcription-SELEX) s pomočjo katere so izbrali trombinske aptamere primerne za regulacijo genske transkripcije [1]. Gre za nadgradnjo metode SELEX (angl. systematic evolution of ligands by exponential enrichment), pri kateri aptamere presejamo in izberemo le tiste z visoko afiniteto za željen ligand [2].

==Raziskave z že obstoječim aptamernim zaporedjem==

===Regulacija in-vitro transkripcije===

Da bi znanstveniki preverili izvedljivost uporabe aptamerov kot genskih regulatorjev, so na začetku uporabili, do sedaj dobro preučen, 29 nukleotidov dolg trombinski aptamer. Tega so vključili na različne lokacije blizu promotorske regije. Zanimalo jih je, kako bo vključitev aptamernega zaporedja v linearno DNA vplivala na in vitro transkripcijsko aktivnost, še bolj pa jih je zanimalo, kako bo na prepisovanje vplivala vezava liganda (človeškega trombina) na to aptamerno zaporedje. Transkripcijsko aktivnost so spremljali preko fluorescence reporterskega zaporedja 3WJdB, ki omogoča spremljanje transkripcijske aktivnosti v realnem času. Ugotovili so, da vključitev aptamera blizu promotorskega zaporedja zniža transkripcijsko aktivnost reporterskega zaporedja, saj ta s svojo sekundarno strukturo blokira potovanje RNA polimeraze po verigi [1].

Ob dodatku človeškega trombina, v večini primerov ni prišlo do očitnih sprememb transkripcijske aktivnosti v primerjavi s kontrolnim poskusom. Je pa v primeru vključitve trombinskega aptamera v smerno verigo navzdol od promotorja, prišlo do povišane transkripcije. Ob vezavi RNA polimeraze na promotorsko regijo pride namreč do odvitja dvojne vijačnice DNA. Ustvari se transkripcijski mehurček, ki izpostavi aptamerno zaporedje, ki lahko, kot omenjeno prej, blokira migracijo RNA polimeraze in s tem zniža efektivnost transkripcije ali pa jo celo prepreči. Vezava liganda na aptamerno zaporedje povzroči njegovo konformacijsko spremembo, kar lahko vpliva na transkripcijsko aktivnost. Ker je v slednjem primeru prišlo do povišanja ravni prepisovanja, se je torej zgodila takšna konformacijska sprememba strukture aptamera, ki je omogočila bolj ugodno potovanje RNA polimeraze navzdol po verigi [1].

===Regulacija transkripcije v brezceličnem sistemu===

Znanstveniki so želeli preveriti, ali pride do podobnih stimulatornih odzivov kot pri in vitro eksperimentih, tudi v brezceličnih sistemih. Za te namene so uporabili plazmidno DNA, ki je vsebovala enako promotorsko in reportersko zaporedje. Vezava človeškega trombina na trombinski aptamer je tudi v tem primeru povišala raven prepisovanja. Ugotovili so, da je fluorescenca, ki torej odraža transkripcijsko aktivnost, na začetku naraščala, nato pa je začela kar naenkrat padati. Razumeti moramo namreč, da je brezceličen sistem kompleksen in lahko prihaja do interakcij med različnimi komponentami. Padanje fluorescence se lahko pojasni s prisotnimi RNazami v sistemu, ki razgradijo prepisana RNA zaporedja 3WJdB. Na začetku je torej nivo transkripcije višji od degradacije, kar se kaže z naraščajočo fluorescenco. Po približno 30-60 min fluorescenca doseže vrh in začne padati, torej postane razgrajanje fluorescenčnega zaporedja 3WJdB hitrejše kot njegovo prepisovanje. Po 3-4 urah pride do razgradnje večine zaporedij 3WJdB, in s tem do znižanja fluorescence na bazalni nivo [1].
Ugotovili so tudi, da je nivo fluorescence bistveno nižji v brezceličnem sistemu, kot pri in vitro poskusih [1].

==Pridobivanje in preizkušanje novih aptamerov (CIVT-SELEX)==

===Capture-SELEX===

Ker so bili efekti vezave liganda na aptamerno zaporedje, torej povišanja transkripcije, premalo izraziti, so želeli pridobiti nove aptamere, ki se bodo odzivali na manjše koncentracije liganda, hkrati pa se jih bo lahko vključilo v biološka vezja. Za ta namen so uporabili metodo imenovano Capture-SELEX [1].

Oligonukleotidi iz knjižnice za Capture-SELEX so vsebovali 2 restrikcijski mesti, mesta za prepoznavo začetnih oligonukleotidov, ter seriji 40 in 10 naključnih nukleotidov, med njima pa se je nahajalo umestitveno zaporedje. To zaporedje je bilo komplementarno zaporedju za zajem, ki je bilo na 3' koncu biotinilirano [1].

DNA iz knjižnice so imobilizirali na magnetne kroglice s strepravidinom. Nato so uporabili človeški trombin kot tarčo za selekcijo specifičnih aptamerov. Ob vezavi oligonukleotidov na človeški trombin je prišlo do spremembe tri dimenzionalne strukture oligov, kar je povzročilo sproščanje enoverižne DNA iz kompleksa DNA-magnetna kroglica. Enoverižne DNA so z uporabo začetnih oligonukleotidov na obeh koncih pomnožili in dobili več kopij dvoverižne DNA, nato pa so z eksonukleazo razrezali le novo nastalo verigo. Kopije enoverižnih DNA so uporabili za nov krog selekcije in to ponovili 8 krat, pri čemer so pri vsakem krogu znižali koncentracijo liganda [1].

Po 8 krogih je sledilo negativno presejanje. V tem primeru so bili kompleksi DNA-magnetna kroglica, pred inkubacijo s ligandom, postavljeni v brezcelični sistem. S tem so želeli izločiti tiste aptamere, ki bi se lahko vezali na komponentne brezceličnega sistema. Po 4 krogih so dobili zaporedja, ki so bila visoka specifična in afinitetna proti človeškemu trombinu [1].

===Selekcija aptamerov s pomočjo brezceličnega transkripcijskega presejanja===

Dobljena knjižnica enoverižnih DNA pri postopku Capture-SELEX je bila pomnožena v dvoverižne DNA in vstavljena v vektorsko ogrodje s pomočjo metode sestavljanja Golden Gate. Vektor, ki je vseboval še promotor J23151, reportersko zaporedje 3WJdB in terminator, je bil transformiran v E. coli DH5α. Izbranih je bilo 1000 posameznih kolonij, ki so jih pomnožili in na podlagi agarozne gelske elektroforeze določili 832 takšnih DNA, ki so vsebovale pravilna zaporedja promotorja, aptamera, reporterja in terminatorja. Da so zmanjšali obseg dela, so 2 posamezni linearni DNA združili v skupni vzorec in tako dobili 416 poskusnih skupin [1].

Vsaka poskusna skupina je bila prepisana direktno v brezcelični sistem, z ali brez človeškega trombina. Primerjali so razlike v fluorescenci ob dodatku trombina. Pri tistih skupinah, kjer so bile razlike najočitnejše, so ponovili postopek, le da so tokrat v brezcelični sistem prepisali le individualne linearne DNA, ne več v paru, in zopet spremljali razlike v fluorescenci ob dodatku 0,5 uM človeškega trombina. Pri 6 aptamernih zaporedij (AS1-76, AS2-3, AS2-70, AS7-36, AS7-83, AS8-22) je prišlo do znatnega upada fluorescence ob prisotnosti liganda – človeškega trombina. Ko so jih posekvencirali so ugotovili, da so 3 zaporedja (AS2-3, AS7-36 in AS7-83) identična. V nadaljevanju so trem izbranim aptamernim zaporedjem (AS2-3, AS2-70 in AS8-22), poleg kontrolnega 29 nukleotidov dolgega aptamera, s pomočjo programa napovedali njihove sekundarne strukture. Njihova ∆G je bila pri vseh negativna, torej so sledeče sekundarne strukture stabilne pri 25°C [1].

3 omenjena aptamerna zaporedja so vstavili v stabilnejšo plazmidno obliko, da bi preverili odziv na tarčni ligand, zopet v brezceličnem sistemu. Rezultati so pokazali, da vsa 3 zaporedja povzročijo inhibicijo transkripcije ob dodatku 0,5 uM in 1 uM človeškega trombina, v primerjavi z negativno kontrolo brez vnesenega aptamernega zaporedja. Molekularni mehanizem takšne transkripcijske regulacije je enak kot je bil opisan prej. Pri prepisovanju, se ob vezavi RNA polimeraze na promotorsko zaporedje ustvari transkripcijski mehurček, ki izpostavi enoverižno aptamerno zaporedje, na katerega se lahko nato veže človeški trombin. Ker je v našem primeru prišlo do nižjega nivoja prepisovanja, je moralo torej ob vezavi liganda priti do takšnih konformacijskih sprememb v strukturi aptamera, da je prišlo do oteženega premikanja RNA polimeraze naprej po verigi [1].

Zanimivi so pridobljeni rezultati kontrolnega poskusa, kjer plazmid ni vseboval aptamernega zaporedja. Ob dodatku 1 uM trombina je vseeno prišlo do inhibicije translacije. Človeški trombin naj bi namreč vplival na ekspresijo zaporedij v pripravljenem brezceličnem sistemu, v smislu nespecifične inhibicije. S tem se kažejo toksične lastnosti večjih koncentracij človeškega trombina v brezceličnih sistemih [1].

==Zaključek==

Aptameri imajo mnoge molekularne aplikacije zaradi njihove preproste in poceni priprave, majhne velikosti in velike pestrosti. Brezcelični transkripcijsko-translacijski sistem ponuja velik potencial kot platforma za hitro presajanje aptamerov in preizkušanje prototipov novih bioloških vezij. V tej študiji so znanstveniki z uporabo metode CIVT-SELEX, ki je sestavljena iz Capture-SELEX in iz in vitro presejalne transkripcije, uspeli izbrati takšne aptamere, ki so bili visoko specifični in afinitetni proti človeškemu trombinu, in so ob vezavi povzročili inhibitorne efekte na transkripcijsko aktivnost. Takšni rezultatu potrjujejo robustnost uporabe aptamerov kot genetskih delov, tako v linearnih DNA, kot tudi v plazmidih [1].

==Literatura==

[1] Guo S, Xu Z, Lin L, Guo Y, Li J, Lu C, Shi X, Yang H. Using CIVT-SELEX to Select Aptamers as Genetic Parts to Regulate Gene Circuits in a Cell-Free System. Int J Mol Sci. 2023 Feb 1;24(3):2833.

[2] Kohlberger M, Gadermaier G. SELEX: Critical factors and optimization strategies for successful aptamer selection. Biotechnol Appl Biochem. 2022 Oct;69(5):1771-1792.

Uporaba CIVT-SELEX za izbiro aptamerov kot genskih delov za regulacijo genetskih vezij v brezceličnem sistemu

2023-05-15T07:45:48Z

Klemen Kunej: /* Regulacija in-vitro transkripcije */

''Povzeto po članku: [https://www.mdpi.com/1422-0067/24/3/2833 Guo S, Xu Z, Lin L, Guo Y, Li J, Lu C, Shi X, Yang H. Using CIVT-SELEX to Select Aptamers as Genetic Parts to Regulate Gene Circuits in a Cell-Free System. Int J Mol Sci. 2023 Feb 1;24(3):2833. ]''

==Uvod==

Napredki v sintezni biologiji nam omogočajo načrtovanje dinamičnih in kompleksnih funkcij v živih organizmih. Realizacija teh kompleksnih funkcij je odvisna od ustvarjanja raznih delujočih genetskih vezij. Ustvarjena so bila številna sintetična genetska vezja, pri katerih je ključna regulacija genske ekspresije. Trenutno se pri večini relevantnih študij za regulacijo genske ekspresije uporablja transkripcijske faktorje in njihove operatorje (LacI/lacO, TetR/tetO). Čeprav je uporaba transkripcijskih faktorjev robustna, pa se pojavi pomanjkljivost v omejenem številu parov transkripcijski faktor-operator. Da bi rešili ta problem, so znanstveniki začeli preizkušati pare DNA aptamer- ligand kot genetske dele za regulacijo izražanja genov. DNA aptameri se specifično vežejo na ligand, ki je lahko majhna molekula ali protein, in tako tvorijo kompleks sposoben regulacije genske ekspresije. Ker so DNA aptameri enoverižne DNA, lahko tako teoretično obstaja na milijone različnih parov aptamer-ligand [1].

Najbolj uporabljen model aptamera je trombinski aptamer. Že v preteklosti se je raziskovala njegova uporaba kot biološkega dela, pri čemer so ga vstavljali na različne lokacije ob promotorju in preučevali, kako to vpliva na ekspresijo tarčnih genov. S tem so se ukvarjali tudi v tej študiji. Poleg tega, so razvili metodo CIVT-SELEX (angl. Capture and In Vitro Transcription-SELEX) s pomočjo katere so izbrali trombinske aptamere primerne za regulacijo genske transkripcije [1]. Gre za nadgradnjo metode SELEX (angl. systematic evolution of ligands by exponential enrichment), pri kateri aptamere presejamo in izberemo le tiste z visoko afiniteto za željen ligand [2].

==Raziskave z že obstoječim aptamernim zaporedjem==

===Regulacija in-vitro transkripcije===

Da bi znanstveniki preverili izvedljivost uporabe aptamerov kot genskih regulatorjev, so na začetku uporabili, do sedaj dobro preučen, 29 nukleotidov dolg trombinski aptamer. Tega so vključili na različne lokacije blizu promotorske regije. Zanimalo jih je, kako bo vključitev aptamernega zaporedja v linearno DNA vplivala na in vitro transkripcijsko aktivnost, še bolj pa jih je zanimalo, kako bo na prepisovanje vplivala vezava liganda (človeškega trombina) na to aptamerno zaporedje. Transkripcijsko aktivnost so spremljali preko fluorescence reporterskega zaporedja 3WJdB, ki omogoča spremljanje transkripcijske aktivnosti v realnem času. Ugotovili so, da vključitev aptamera blizu promotorskega zaporedja zniža transkripcijsko aktivnost reporterskega zaporedja, saj ta s svojo sekundarno strukturo blokira potovanje RNA polimeraze navzdol po verigi [1].

Ob dodatku človeškega trombina, v večini primerov ni prišlo do očitnih sprememb transkripcijske aktivnosti v primerjavi s kontrolnim poskusom. Je pa v primeru vključitve trombinskega aptamera v smerno verigo navzdol od promotorja, prišlo do povišane transkripcije. Ob vezavi RNA polimeraze na promotorsko regijo pride namreč do odvitja dvojne vijačnice DNA. Ustvari se transkripcijski mehurček, ki izpostavi aptamerno zaporedje, ki lahko, kot omenjeno prej, blokira migracijo RNA polimeraze in s tem zniža efektivnost transkripcije ali pa jo celo prepreči. Vezava liganda na aptamerno zaporedje povzroči njegovo konformacijsko spremembo, kar lahko vpliva na transkripcijsko aktivnost. Ker je v slednjem primeru prišlo do povišanja ravni prepisovanja, se je torej zgodila takšna konformacijska sprememba strukture aptamera, ki je omogočila bolj ugodno potovanje RNA polimeraze navzdol po verigi [1].

===Regulacija transkripcije v brezceličnem sistemu===

Znanstveniki so želeli preveriti, ali pride do podobnih stimulatornih odzivov kot pri in vitro eksperimentih, tudi v brezceličnih sistemih. Za te namene so uporabili plazmidno DNA, ki je vsebovala enako promotorsko in reportersko zaporedje. Vezava človeškega trombina na trombinski aptamer je tudi v tem primeru povišala raven prepisovanja. Ugotovili so, da je fluorescenca, ki torej odraža transkripcijsko aktivnost, na začetku naraščala, nato pa je začela kar naenkrat padati. Razumeti moramo namreč, da je brezceličen sistem kompleksen in lahko prihaja do interakcij med različnimi komponentami. Padanje fluorescence se lahko pojasni s prisotnimi RNazami v sistemu, ki razgradijo prepisana RNA zaporedja 3WJdB. Na začetku je torej nivo transkripcije višji od degradacije, kar se kaže z naraščajočo fluorescenco. Po približno 30-60 min fluorescenca doseže vrh in začne padati, torej postane razgrajanje fluorescenčnega zaporedja 3WJdB hitrejše kot njegovo prepisovanje. Po 3-4 urah pride do razgradnje večine zaporedij 3WJdB, in s tem do znižanja fluorescence na bazalni nivo [1].
Ugotovili so tudi, da je nivo fluorescence bistveno nižji v brezceličnem sistemu, kot pri in vitro poskusih [1].

==Pridobivanje in preizkušanje novih aptamerov (CIVT-SELEX)==

===Capture-SELEX===

Ker so bili efekti vezave liganda na aptamerno zaporedje, torej povišanja transkripcije, premalo izraziti, so želeli pridobiti nove aptamere, ki se bodo odzivali na manjše koncentracije liganda, hkrati pa se jih bo lahko vključilo v biološka vezja. Za ta namen so uporabili metodo imenovano Capture-SELEX [1].

Oligonukleotidi iz knjižnice za Capture-SELEX so vsebovali 2 restrikcijski mesti, mesta za prepoznavo začetnih oligonukleotidov, ter seriji 40 in 10 naključnih nukleotidov, med njima pa se je nahajalo umestitveno zaporedje. To zaporedje je bilo komplementarno zaporedju za zajem, ki je bilo na 3' koncu biotinilirano [1].

DNA iz knjižnice so imobilizirali na magnetne kroglice s strepravidinom. Nato so uporabili človeški trombin kot tarčo za selekcijo specifičnih aptamerov. Ob vezavi oligonukleotidov na človeški trombin je prišlo do spremembe tri dimenzionalne strukture oligov, kar je povzročilo sproščanje enoverižne DNA iz kompleksa DNA-magnetna kroglica. Enoverižne DNA so z uporabo začetnih oligonukleotidov na obeh koncih pomnožili in dobili več kopij dvoverižne DNA, nato pa so z eksonukleazo razrezali le novo nastalo verigo. Kopije enoverižnih DNA so uporabili za nov krog selekcije in to ponovili 8 krat, pri čemer so pri vsakem krogu znižali koncentracijo liganda [1].

Po 8 krogih je sledilo negativno presejanje. V tem primeru so bili kompleksi DNA-magnetna kroglica, pred inkubacijo s ligandom, postavljeni v brezcelični sistem. S tem so želeli izločiti tiste aptamere, ki bi se lahko vezali na komponentne brezceličnega sistema. Po 4 krogih so dobili zaporedja, ki so bila visoka specifična in afinitetna proti človeškemu trombinu [1].

===Selekcija aptamerov s pomočjo brezceličnega transkripcijskega presejanja===

Dobljena knjižnica enoverižnih DNA pri postopku Capture-SELEX je bila pomnožena v dvoverižne DNA in vstavljena v vektorsko ogrodje s pomočjo metode sestavljanja Golden Gate. Vektor, ki je vseboval še promotor J23151, reportersko zaporedje 3WJdB in terminator, je bil transformiran v E. coli DH5α. Izbranih je bilo 1000 posameznih kolonij, ki so jih pomnožili in na podlagi agarozne gelske elektroforeze določili 832 takšnih DNA, ki so vsebovale pravilna zaporedja promotorja, aptamera, reporterja in terminatorja. Da so zmanjšali obseg dela, so 2 posamezni linearni DNA združili v skupni vzorec in tako dobili 416 poskusnih skupin [1].

Vsaka poskusna skupina je bila prepisana direktno v brezcelični sistem, z ali brez človeškega trombina. Primerjali so razlike v fluorescenci ob dodatku trombina. Pri tistih skupinah, kjer so bile razlike najočitnejše, so ponovili postopek, le da so tokrat v brezcelični sistem prepisali le individualne linearne DNA, ne več v paru, in zopet spremljali razlike v fluorescenci ob dodatku 0,5 uM človeškega trombina. Pri 6 aptamernih zaporedij (AS1-76, AS2-3, AS2-70, AS7-36, AS7-83, AS8-22) je prišlo do znatnega upada fluorescence ob prisotnosti liganda – človeškega trombina. Ko so jih posekvencirali so ugotovili, da so 3 zaporedja (AS2-3, AS7-36 in AS7-83) identična. V nadaljevanju so trem izbranim aptamernim zaporedjem (AS2-3, AS2-70 in AS8-22), poleg kontrolnega 29 nukleotidov dolgega aptamera, s pomočjo programa napovedali njihove sekundarne strukture. Njihova ∆G je bila pri vseh negativna, torej so sledeče sekundarne strukture stabilne pri 25°C [1].

3 omenjena aptamerna zaporedja so vstavili v stabilnejšo plazmidno obliko, da bi preverili odziv na tarčni ligand, zopet v brezceličnem sistemu. Rezultati so pokazali, da vsa 3 zaporedja povzročijo inhibicijo transkripcije ob dodatku 0,5 uM in 1 uM človeškega trombina, v primerjavi z negativno kontrolo brez vnesenega aptamernega zaporedja. Molekularni mehanizem takšne transkripcijske regulacije je enak kot je bil opisan prej. Pri prepisovanju, se ob vezavi RNA polimeraze na promotorsko zaporedje ustvari transkripcijski mehurček, ki izpostavi enoverižno aptamerno zaporedje, na katerega se lahko nato veže človeški trombin. Ker je v našem primeru prišlo do nižjega nivoja prepisovanja, je moralo torej ob vezavi liganda priti do takšnih konformacijskih sprememb v strukturi aptamera, da je prišlo do oteženega premikanja RNA polimeraze naprej po verigi [1].

Zanimivi so pridobljeni rezultati kontrolnega poskusa, kjer plazmid ni vseboval aptamernega zaporedja. Ob dodatku 1 uM trombina je vseeno prišlo do inhibicije translacije. Človeški trombin naj bi namreč vplival na ekspresijo zaporedij v pripravljenem brezceličnem sistemu, v smislu nespecifične inhibicije. S tem se kažejo toksične lastnosti večjih koncentracij človeškega trombina v brezceličnih sistemih [1].

==Zaključek==

Aptameri imajo mnoge molekularne aplikacije zaradi njihove preproste in poceni priprave, majhne velikosti in velike pestrosti. Brezcelični transkripcijsko-translacijski sistem ponuja velik potencial kot platforma za hitro presajanje aptamerov in preizkušanje prototipov novih bioloških vezij. V tej študiji so znanstveniki z uporabo metode CIVT-SELEX, ki je sestavljena iz Capture-SELEX in iz in vitro presejalne transkripcije, uspeli izbrati takšne aptamere, ki so bili visoko specifični in afinitetni proti človeškemu trombinu, in so ob vezavi povzročili inhibitorne efekte na transkripcijsko aktivnost. Takšni rezultatu potrjujejo robustnost uporabe aptamerov kot genetskih delov, tako v linearnih DNA, kot tudi v plazmidih [1].

==Literatura==

[1] Guo S, Xu Z, Lin L, Guo Y, Li J, Lu C, Shi X, Yang H. Using CIVT-SELEX to Select Aptamers as Genetic Parts to Regulate Gene Circuits in a Cell-Free System. Int J Mol Sci. 2023 Feb 1;24(3):2833.

[2] Kohlberger M, Gadermaier G. SELEX: Critical factors and optimization strategies for successful aptamer selection. Biotechnol Appl Biochem. 2022 Oct;69(5):1771-1792.

Uporaba CIVT-SELEX za izbiro aptamerov kot genskih delov za regulacijo genetskih vezij v brezceličnem sistemu

2023-05-14T22:16:03Z

Klemen Kunej: /* Selekcija aptamerov s pomočjo brezceličnega transkripcijskega presejanja */

''Povzeto po članku: [https://www.mdpi.com/1422-0067/24/3/2833 Guo S, Xu Z, Lin L, Guo Y, Li J, Lu C, Shi X, Yang H. Using CIVT-SELEX to Select Aptamers as Genetic Parts to Regulate Gene Circuits in a Cell-Free System. Int J Mol Sci. 2023 Feb 1;24(3):2833. ]''

==Uvod==

Napredki v sintezni biologiji nam omogočajo načrtovanje dinamičnih in kompleksnih funkcij v živih organizmih. Realizacija teh kompleksnih funkcij je odvisna od ustvarjanja raznih delujočih genetskih vezij. Ustvarjena so bila številna sintetična genetska vezja, pri katerih je ključna regulacija genske ekspresije. Trenutno se pri večini relevantnih študij za regulacijo genske ekspresije uporablja transkripcijske faktorje in njihove operatorje (LacI/lacO, TetR/tetO). Čeprav je uporaba transkripcijskih faktorjev robustna, pa se pojavi pomanjkljivost v omejenem številu parov transkripcijski faktor-operator. Da bi rešili ta problem, so znanstveniki začeli preizkušati pare DNA aptamer- ligand kot genetske dele za regulacijo izražanja genov. DNA aptameri se specifično vežejo na ligand, ki je lahko majhna molekula ali protein, in tako tvorijo kompleks sposoben regulacije genske ekspresije. Ker so DNA aptameri enoverižne DNA, lahko tako teoretično obstaja na milijone različnih parov aptamer-ligand [1].

Najbolj uporabljen model aptamera je trombinski aptamer. Že v preteklosti se je raziskovala njegova uporaba kot biološkega dela, pri čemer so ga vstavljali na različne lokacije ob promotorju in preučevali, kako to vpliva na ekspresijo tarčnih genov. S tem so se ukvarjali tudi v tej študiji. Poleg tega, so razvili metodo CIVT-SELEX (angl. Capture and In Vitro Transcription-SELEX) s pomočjo katere so izbrali trombinske aptamere primerne za regulacijo genske transkripcije [1]. Gre za nadgradnjo metode SELEX (angl. systematic evolution of ligands by exponential enrichment), pri kateri aptamere presejamo in izberemo le tiste z visoko afiniteto za željen ligand [2].

==Raziskave z že obstoječim aptamernim zaporedjem==

===Regulacija in-vitro transkripcije===

Da bi znanstveniki preverili izvedljivost uporabe aptamerov kot genskih regulatorjev, so na začetku uporabili, do sedaj dobro preučen, 29 nukleotidov dolg trombinski aptamer. Tega so vključili na različne lokacije blizu promotorske regije. Zanimalo jih je, kako bo vključitev aptamernega zaporedja v linearno DNA vplivala na in vitro transkripcijsko aktivnost, še bolj pa jih je zanimalo, kako bo na prepisovanje vplivala vezava liganda (človeškega trombina) na to aptamerno zaporedje. Transkripcijsko aktivnost so spremljali preko fluorescence reporterskega zaporedja 3WJdB, ki omogoča spremljanje transkripcijske aktivnosti v realnem času. Ugotovili so, da vključitev aptamera blizu promotorskega zaporedja zniža transkripcijsko aktivnost reporterskega zaporedja, saj ta s svojo sekundarno strukturo blokira potovanje RNA polimeraze navzdol po verigi [1].

Ob dodatku človeškega trombina, v večini primerov ni prišlo do očitnih sprememb transkripcijske aktivnosti v primerjavi s kontrolnim poskusom. Je pa v primeru vključitve trombinskega aptamera v smerno verigo navzdol od promotorja, prišlo do povišane transkripcije. Ob vezavi RNA polimeraze na promotorsko regijo pride namreč do odvitja dvojne vijačnice DNA. Ustvari se transkripcijski mehurček, ki izpostavi aptamerno zaporedje, ki lahko, kot omenjeno prej, blokira migracijo RNA polimeraze in s tem zniža efektivnost transkripcije ali pa jo celo prepreči. Vezava liganda na aptamerno zaporedje povzroči njegovo konformacijsko spremembo, kar lahko vplivan na transkripcijsko aktivnost. Ker je v slednjem primeru prišlo do povišanja ravni prepisovanja, se je torej zgodila takšna konformacijska sprememba strukture aptamera, ki je omogočila bolj ugodno potovanje RNA polimeraze navzdol po verigi [1].

===Regulacija transkripcije v brezceličnem sistemu===

Znanstveniki so želeli preveriti, ali pride do podobnih stimulatornih odzivov kot pri in vitro eksperimentih, tudi v brezceličnih sistemih. Za te namene so uporabili plazmidno DNA, ki je vsebovala enako promotorsko in reportersko zaporedje. Vezava človeškega trombina na trombinski aptamer je tudi v tem primeru povišala raven prepisovanja. Ugotovili so, da je fluorescenca, ki torej odraža transkripcijsko aktivnost, na začetku naraščala, nato pa je začela kar naenkrat padati. Razumeti moramo namreč, da je brezceličen sistem kompleksen in lahko prihaja do interakcij med različnimi komponentami. Padanje fluorescence se lahko pojasni s prisotnimi RNazami v sistemu, ki razgradijo prepisana RNA zaporedja 3WJdB. Na začetku je torej nivo transkripcije višji od degradacije, kar se kaže z naraščajočo fluorescenco. Po približno 30-60 min fluorescenca doseže vrh in začne padati, torej postane razgrajanje fluorescenčnega zaporedja 3WJdB hitrejše kot njegovo prepisovanje. Po 3-4 urah pride do razgradnje večine zaporedij 3WJdB, in s tem do znižanja fluorescence na bazalni nivo [1].
Ugotovili so tudi, da je nivo fluorescence bistveno nižji v brezceličnem sistemu, kot pri in vitro poskusih [1].

==Pridobivanje in preizkušanje novih aptamerov (CIVT-SELEX)==

===Capture-SELEX===

Ker so bili efekti vezave liganda na aptamerno zaporedje, torej povišanja transkripcije, premalo izraziti, so želeli pridobiti nove aptamere, ki se bodo odzivali na manjše koncentracije liganda, hkrati pa se jih bo lahko vključilo v biološka vezja. Za ta namen so uporabili metodo imenovano Capture-SELEX [1].

Oligonukleotidi iz knjižnice za Capture-SELEX so vsebovali 2 restrikcijski mesti, mesta za prepoznavo začetnih oligonukleotidov, ter seriji 40 in 10 naključnih nukleotidov, med njima pa se je nahajalo umestitveno zaporedje. To zaporedje je bilo komplementarno zaporedju za zajem, ki je bilo na 3' koncu biotinilirano [1].

DNA iz knjižnice so imobilizirali na magnetne kroglice s strepravidinom. Nato so uporabili človeški trombin kot tarčo za selekcijo specifičnih aptamerov. Ob vezavi oligonukleotidov na človeški trombin je prišlo do spremembe tri dimenzionalne strukture oligov, kar je povzročilo sproščanje enoverižne DNA iz kompleksa DNA-magnetna kroglica. Enoverižne DNA so z uporabo začetnih oligonukleotidov na obeh koncih pomnožili in dobili več kopij dvoverižne DNA, nato pa so z eksonukleazo razrezali le novo nastalo verigo. Kopije enoverižnih DNA so uporabili za nov krog selekcije in to ponovili 8 krat, pri čemer so pri vsakem krogu znižali koncentracijo liganda [1].

Po 8 krogih je sledilo negativno presejanje. V tem primeru so bili kompleksi DNA-magnetna kroglica, pred inkubacijo s ligandom, postavljeni v brezcelični sistem. S tem so želeli izločiti tiste aptamere, ki bi se lahko vezali na komponentne brezceličnega sistema. Po 4 krogih so dobili zaporedja, ki so bila visoka specifična in afinitetna proti človeškemu trombinu [1].

===Selekcija aptamerov s pomočjo brezceličnega transkripcijskega presejanja===

Dobljena knjižnica enoverižnih DNA pri postopku Capture-SELEX je bila pomnožena v dvoverižne DNA in vstavljena v vektorsko ogrodje s pomočjo metode sestavljanja Golden Gate. Vektor, ki je vseboval še promotor J23151, reportersko zaporedje 3WJdB in terminator, je bil transformiran v E. coli DH5α. Izbranih je bilo 1000 posameznih kolonij, ki so jih pomnožili in na podlagi agarozne gelske elektroforeze določili 832 takšnih DNA, ki so vsebovale pravilna zaporedja promotorja, aptamera, reporterja in terminatorja. Da so zmanjšali obseg dela, so 2 posamezni linearni DNA združili v skupni vzorec in tako dobili 416 poskusnih skupin [1].

Vsaka poskusna skupina je bila prepisana direktno v brezcelični sistem, z ali brez človeškega trombina. Primerjali so razlike v fluorescenci ob dodatku trombina. Pri tistih skupinah, kjer so bile razlike najočitnejše, so ponovili postopek, le da so tokrat v brezcelični sistem prepisali le individualne linearne DNA, ne več v paru, in zopet spremljali razlike v fluorescenci ob dodatku 0,5 uM človeškega trombina. Pri 6 aptamernih zaporedij (AS1-76, AS2-3, AS2-70, AS7-36, AS7-83, AS8-22) je prišlo do znatnega upada fluorescence ob prisotnosti liganda – človeškega trombina. Ko so jih posekvencirali so ugotovili, da so 3 zaporedja (AS2-3, AS7-36 in AS7-83) identična. V nadaljevanju so trem izbranim aptamernim zaporedjem (AS2-3, AS2-70 in AS8-22), poleg kontrolnega 29 nukleotidov dolgega aptamera, s pomočjo programa napovedali njihove sekundarne strukture. Njihova ∆G je bila pri vseh negativna, torej so sledeče sekundarne strukture stabilne pri 25°C [1].

3 omenjena aptamerna zaporedja so vstavili v stabilnejšo plazmidno obliko, da bi preverili odziv na tarčni ligand, zopet v brezceličnem sistemu. Rezultati so pokazali, da vsa 3 zaporedja povzročijo inhibicijo transkripcije ob dodatku 0,5 uM in 1 uM človeškega trombina, v primerjavi z negativno kontrolo brez vnesenega aptamernega zaporedja. Molekularni mehanizem takšne transkripcijske regulacije je enak kot je bil opisan prej. Pri prepisovanju, se ob vezavi RNA polimeraze na promotorsko zaporedje ustvari transkripcijski mehurček, ki izpostavi enoverižno aptamerno zaporedje, na katerega se lahko nato veže človeški trombin. Ker je v našem primeru prišlo do nižjega nivoja prepisovanja, je moralo torej ob vezavi liganda priti do takšnih konformacijskih sprememb v strukturi aptamera, da je prišlo do oteženega premikanja RNA polimeraze naprej po verigi [1].

Zanimivi so pridobljeni rezultati kontrolnega poskusa, kjer plazmid ni vseboval aptamernega zaporedja. Ob dodatku 1 uM trombina je vseeno prišlo do inhibicije translacije. Človeški trombin naj bi namreč vplival na ekspresijo zaporedij v pripravljenem brezceličnem sistemu, v smislu nespecifične inhibicije. S tem se kažejo toksične lastnosti večjih koncentracij človeškega trombina v brezceličnih sistemih [1].

==Zaključek==

Aptameri imajo mnoge molekularne aplikacije zaradi njihove preproste in poceni priprave, majhne velikosti in velike pestrosti. Brezcelični transkripcijsko-translacijski sistem ponuja velik potencial kot platforma za hitro presajanje aptamerov in preizkušanje prototipov novih bioloških vezij. V tej študiji so znanstveniki z uporabo metode CIVT-SELEX, ki je sestavljena iz Capture-SELEX in iz in vitro presejalne transkripcije, uspeli izbrati takšne aptamere, ki so bili visoko specifični in afinitetni proti človeškemu trombinu, in so ob vezavi povzročili inhibitorne efekte na transkripcijsko aktivnost. Takšni rezultatu potrjujejo robustnost uporabe aptamerov kot genetskih delov, tako v linearnih DNA, kot tudi v plazmidih [1].

==Literatura==

[1] Guo S, Xu Z, Lin L, Guo Y, Li J, Lu C, Shi X, Yang H. Using CIVT-SELEX to Select Aptamers as Genetic Parts to Regulate Gene Circuits in a Cell-Free System. Int J Mol Sci. 2023 Feb 1;24(3):2833.

[2] Kohlberger M, Gadermaier G. SELEX: Critical factors and optimization strategies for successful aptamer selection. Biotechnol Appl Biochem. 2022 Oct;69(5):1771-1792.

Uporaba CIVT-SELEX za izbiro aptamerov kot genskih delov za regulacijo genetskih vezij v brezceličnem sistemu

2023-05-14T22:14:08Z

Klemen Kunej: /* Zaključek */

''Povzeto po članku: [https://www.mdpi.com/1422-0067/24/3/2833 Guo S, Xu Z, Lin L, Guo Y, Li J, Lu C, Shi X, Yang H. Using CIVT-SELEX to Select Aptamers as Genetic Parts to Regulate Gene Circuits in a Cell-Free System. Int J Mol Sci. 2023 Feb 1;24(3):2833. ]''

==Uvod==

Napredki v sintezni biologiji nam omogočajo načrtovanje dinamičnih in kompleksnih funkcij v živih organizmih. Realizacija teh kompleksnih funkcij je odvisna od ustvarjanja raznih delujočih genetskih vezij. Ustvarjena so bila številna sintetična genetska vezja, pri katerih je ključna regulacija genske ekspresije. Trenutno se pri večini relevantnih študij za regulacijo genske ekspresije uporablja transkripcijske faktorje in njihove operatorje (LacI/lacO, TetR/tetO). Čeprav je uporaba transkripcijskih faktorjev robustna, pa se pojavi pomanjkljivost v omejenem številu parov transkripcijski faktor-operator. Da bi rešili ta problem, so znanstveniki začeli preizkušati pare DNA aptamer- ligand kot genetske dele za regulacijo izražanja genov. DNA aptameri se specifično vežejo na ligand, ki je lahko majhna molekula ali protein, in tako tvorijo kompleks sposoben regulacije genske ekspresije. Ker so DNA aptameri enoverižne DNA, lahko tako teoretično obstaja na milijone različnih parov aptamer-ligand [1].

Najbolj uporabljen model aptamera je trombinski aptamer. Že v preteklosti se je raziskovala njegova uporaba kot biološkega dela, pri čemer so ga vstavljali na različne lokacije ob promotorju in preučevali, kako to vpliva na ekspresijo tarčnih genov. S tem so se ukvarjali tudi v tej študiji. Poleg tega, so razvili metodo CIVT-SELEX (angl. Capture and In Vitro Transcription-SELEX) s pomočjo katere so izbrali trombinske aptamere primerne za regulacijo genske transkripcije [1]. Gre za nadgradnjo metode SELEX (angl. systematic evolution of ligands by exponential enrichment), pri kateri aptamere presejamo in izberemo le tiste z visoko afiniteto za željen ligand [2].

==Raziskave z že obstoječim aptamernim zaporedjem==

===Regulacija in-vitro transkripcije===

Da bi znanstveniki preverili izvedljivost uporabe aptamerov kot genskih regulatorjev, so na začetku uporabili, do sedaj dobro preučen, 29 nukleotidov dolg trombinski aptamer. Tega so vključili na različne lokacije blizu promotorske regije. Zanimalo jih je, kako bo vključitev aptamernega zaporedja v linearno DNA vplivala na in vitro transkripcijsko aktivnost, še bolj pa jih je zanimalo, kako bo na prepisovanje vplivala vezava liganda (človeškega trombina) na to aptamerno zaporedje. Transkripcijsko aktivnost so spremljali preko fluorescence reporterskega zaporedja 3WJdB, ki omogoča spremljanje transkripcijske aktivnosti v realnem času. Ugotovili so, da vključitev aptamera blizu promotorskega zaporedja zniža transkripcijsko aktivnost reporterskega zaporedja, saj ta s svojo sekundarno strukturo blokira potovanje RNA polimeraze navzdol po verigi [1].

Ob dodatku človeškega trombina, v večini primerov ni prišlo do očitnih sprememb transkripcijske aktivnosti v primerjavi s kontrolnim poskusom. Je pa v primeru vključitve trombinskega aptamera v smerno verigo navzdol od promotorja, prišlo do povišane transkripcije. Ob vezavi RNA polimeraze na promotorsko regijo pride namreč do odvitja dvojne vijačnice DNA. Ustvari se transkripcijski mehurček, ki izpostavi aptamerno zaporedje, ki lahko, kot omenjeno prej, blokira migracijo RNA polimeraze in s tem zniža efektivnost transkripcije ali pa jo celo prepreči. Vezava liganda na aptamerno zaporedje povzroči njegovo konformacijsko spremembo, kar lahko vplivan na transkripcijsko aktivnost. Ker je v slednjem primeru prišlo do povišanja ravni prepisovanja, se je torej zgodila takšna konformacijska sprememba strukture aptamera, ki je omogočila bolj ugodno potovanje RNA polimeraze navzdol po verigi [1].

===Regulacija transkripcije v brezceličnem sistemu===

Znanstveniki so želeli preveriti, ali pride do podobnih stimulatornih odzivov kot pri in vitro eksperimentih, tudi v brezceličnih sistemih. Za te namene so uporabili plazmidno DNA, ki je vsebovala enako promotorsko in reportersko zaporedje. Vezava človeškega trombina na trombinski aptamer je tudi v tem primeru povišala raven prepisovanja. Ugotovili so, da je fluorescenca, ki torej odraža transkripcijsko aktivnost, na začetku naraščala, nato pa je začela kar naenkrat padati. Razumeti moramo namreč, da je brezceličen sistem kompleksen in lahko prihaja do interakcij med različnimi komponentami. Padanje fluorescence se lahko pojasni s prisotnimi RNazami v sistemu, ki razgradijo prepisana RNA zaporedja 3WJdB. Na začetku je torej nivo transkripcije višji od degradacije, kar se kaže z naraščajočo fluorescenco. Po približno 30-60 min fluorescenca doseže vrh in začne padati, torej postane razgrajanje fluorescenčnega zaporedja 3WJdB hitrejše kot njegovo prepisovanje. Po 3-4 urah pride do razgradnje večine zaporedij 3WJdB, in s tem do znižanja fluorescence na bazalni nivo [1].
Ugotovili so tudi, da je nivo fluorescence bistveno nižji v brezceličnem sistemu, kot pri in vitro poskusih [1].

==Pridobivanje in preizkušanje novih aptamerov (CIVT-SELEX)==

===Capture-SELEX===

Ker so bili efekti vezave liganda na aptamerno zaporedje, torej povišanja transkripcije, premalo izraziti, so želeli pridobiti nove aptamere, ki se bodo odzivali na manjše koncentracije liganda, hkrati pa se jih bo lahko vključilo v biološka vezja. Za ta namen so uporabili metodo imenovano Capture-SELEX [1].

Oligonukleotidi iz knjižnice za Capture-SELEX so vsebovali 2 restrikcijski mesti, mesta za prepoznavo začetnih oligonukleotidov, ter seriji 40 in 10 naključnih nukleotidov, med njima pa se je nahajalo umestitveno zaporedje. To zaporedje je bilo komplementarno zaporedju za zajem, ki je bilo na 3' koncu biotinilirano [1].

DNA iz knjižnice so imobilizirali na magnetne kroglice s strepravidinom. Nato so uporabili človeški trombin kot tarčo za selekcijo specifičnih aptamerov. Ob vezavi oligonukleotidov na človeški trombin je prišlo do spremembe tri dimenzionalne strukture oligov, kar je povzročilo sproščanje enoverižne DNA iz kompleksa DNA-magnetna kroglica. Enoverižne DNA so z uporabo začetnih oligonukleotidov na obeh koncih pomnožili in dobili več kopij dvoverižne DNA, nato pa so z eksonukleazo razrezali le novo nastalo verigo. Kopije enoverižnih DNA so uporabili za nov krog selekcije in to ponovili 8 krat, pri čemer so pri vsakem krogu znižali koncentracijo liganda [1].

Po 8 krogih je sledilo negativno presejanje. V tem primeru so bili kompleksi DNA-magnetna kroglica, pred inkubacijo s ligandom, postavljeni v brezcelični sistem. S tem so želeli izločiti tiste aptamere, ki bi se lahko vezali na komponentne brezceličnega sistema. Po 4 krogih so dobili zaporedja, ki so bila visoka specifična in afinitetna proti človeškemu trombinu [1].

===Selekcija aptamerov s pomočjo brezceličnega transkripcijskega presejanja===

Dobljena knjižnica enoverižnih DNA pri postopku Capture-SELEX je bila pomnožena v dvoverižne DNA in vstavljena v vektorsko ogrodje s pomočjo metode sestavljanja Golden Gate. Vektor, ki je vseboval še promotor J23151, reportersko zaporedje 3WJdB in terminator, je bil transformiran v E. coli DH5α. Izbranih je bilo 1000 posameznih kolonij, ki so jih pomnožili in na podlagi agarozne gelske elektroforeze določili 832 takšnih DNA, ki so vsebovale pravilna zaporedja promotorja, aptamera, reporterja in terminatorja. Da so zmanjšali obseg dela, so 2 posamezni linearni DNA združili v skupni vzorec in tako dobili 416 poskusnih skupin [1].

Vsaka poskusna skupina je bila prepisana direktno v brezcelični sistem, z ali brez človeškega trombina. Primerjali so razlike v fluorescenci ob dodatku trombina. Pri tistih skupinah, kjer so bile razlike najočitnejše, so ponovili postopek, le da so tokrat v brezcelični sistem prepisali le individualne linearne DNA, ne več v paru, in zopet spremljali razlike v fluorescenci ob dodatku 0,5 M človeškega trombina. Pri 6 aptamernih zaporedij (AS1-76, AS2-3, AS2-70, AS7-36, AS7-83, AS8-22) je prišlo do znatnega upada fluorescence ob prisotnosti liganda – človeškega trombina. Ko so jih posekvencirali so ugotovili, da so 3 zaporedja (AS2-3, AS7-36 in AS7-83) identična. V nadaljevanju so trem izbranim aptamernim zaporedjem (AS2-3, AS2-70 in AS8-22), poleg kontrolnega 29 nukleotidov dolgega aptamera, s pomočjo programa napovedali njihove sekundarne strukture. Njihova ∆G je bila pri vseh negativna, torej so sledeče sekundarne strukture stabilne pri 25°C [1].

3 omenjena aptamerna zaporedja so vstavili v stabilnejšo plazmidno obliko, da bi preverili odziv na tarčni ligand, zopet v brezceličnem sistemu. Rezultati so pokazali, da vsa 3 zaporedja povzročijo inhibicijo transkripcije ob dodatku 0,5 M in 1 M človeškega trombina, v primerjavi z negativno kontrolo brez vnesenega aptamernega zaporedja. Molekularni mehanizem takšne transkripcijske regulacije je enak kot je bil opisan prej. Pri prepisovanju, se ob vezavi RNA polimeraze na promotorsko zaporedje ustvari transkripcijski mehurček, ki izpostavi enoverižno aptamerno zaporedje, na katerega se lahko nato veže človeški trombin. Ker je v našem primeru prišlo do nižjega nivoja prepisovanja, je moralo torej ob vezavi liganda priti do takšnih konformacijskih sprememb v strukturi aptamera, da je prišlo do oteženega premikanja RNA polimeraze naprej po verigi [1].

Zanimivi so pridobljeni rezultati kontrolnega poskusa, kjer plazmid ni vseboval aptamernega zaporedja. Ob dodatku 1 M trombina je vseeno prišlo do inhibicije translacije. Človeški trombin naj bi namreč vplival na ekspresijo zaporedij v pripravljenem brezceličnem sistemu, v smislu nespecifične inhibicije. S tem se kažejo toksične lastnosti večjih koncentracij človeškega trombina v brezceličnih sistemih [1].

==Zaključek==

Aptameri imajo mnoge molekularne aplikacije zaradi njihove preproste in poceni priprave, majhne velikosti in velike pestrosti. Brezcelični transkripcijsko-translacijski sistem ponuja velik potencial kot platforma za hitro presajanje aptamerov in preizkušanje prototipov novih bioloških vezij. V tej študiji so znanstveniki z uporabo metode CIVT-SELEX, ki je sestavljena iz Capture-SELEX in iz in vitro presejalne transkripcije, uspeli izbrati takšne aptamere, ki so bili visoko specifični in afinitetni proti človeškemu trombinu, in so ob vezavi povzročili inhibitorne efekte na transkripcijsko aktivnost. Takšni rezultatu potrjujejo robustnost uporabe aptamerov kot genetskih delov, tako v linearnih DNA, kot tudi v plazmidih [1].

==Literatura==

[1] Guo S, Xu Z, Lin L, Guo Y, Li J, Lu C, Shi X, Yang H. Using CIVT-SELEX to Select Aptamers as Genetic Parts to Regulate Gene Circuits in a Cell-Free System. Int J Mol Sci. 2023 Feb 1;24(3):2833.

[2] Kohlberger M, Gadermaier G. SELEX: Critical factors and optimization strategies for successful aptamer selection. Biotechnol Appl Biochem. 2022 Oct;69(5):1771-1792.

Uporaba CIVT-SELEX za izbiro aptamerov kot genskih delov za regulacijo genetskih vezij v brezceličnem sistemu

2023-05-14T22:13:45Z

Klemen Kunej: /* Selekcija aptamerov s pomočjo brezceličnega transkripcijskega presejanja */

''Povzeto po članku: [https://www.mdpi.com/1422-0067/24/3/2833 Guo S, Xu Z, Lin L, Guo Y, Li J, Lu C, Shi X, Yang H. Using CIVT-SELEX to Select Aptamers as Genetic Parts to Regulate Gene Circuits in a Cell-Free System. Int J Mol Sci. 2023 Feb 1;24(3):2833. ]''

==Uvod==

Napredki v sintezni biologiji nam omogočajo načrtovanje dinamičnih in kompleksnih funkcij v živih organizmih. Realizacija teh kompleksnih funkcij je odvisna od ustvarjanja raznih delujočih genetskih vezij. Ustvarjena so bila številna sintetična genetska vezja, pri katerih je ključna regulacija genske ekspresije. Trenutno se pri večini relevantnih študij za regulacijo genske ekspresije uporablja transkripcijske faktorje in njihove operatorje (LacI/lacO, TetR/tetO). Čeprav je uporaba transkripcijskih faktorjev robustna, pa se pojavi pomanjkljivost v omejenem številu parov transkripcijski faktor-operator. Da bi rešili ta problem, so znanstveniki začeli preizkušati pare DNA aptamer- ligand kot genetske dele za regulacijo izražanja genov. DNA aptameri se specifično vežejo na ligand, ki je lahko majhna molekula ali protein, in tako tvorijo kompleks sposoben regulacije genske ekspresije. Ker so DNA aptameri enoverižne DNA, lahko tako teoretično obstaja na milijone različnih parov aptamer-ligand [1].

Najbolj uporabljen model aptamera je trombinski aptamer. Že v preteklosti se je raziskovala njegova uporaba kot biološkega dela, pri čemer so ga vstavljali na različne lokacije ob promotorju in preučevali, kako to vpliva na ekspresijo tarčnih genov. S tem so se ukvarjali tudi v tej študiji. Poleg tega, so razvili metodo CIVT-SELEX (angl. Capture and In Vitro Transcription-SELEX) s pomočjo katere so izbrali trombinske aptamere primerne za regulacijo genske transkripcije [1]. Gre za nadgradnjo metode SELEX (angl. systematic evolution of ligands by exponential enrichment), pri kateri aptamere presejamo in izberemo le tiste z visoko afiniteto za željen ligand [2].

==Raziskave z že obstoječim aptamernim zaporedjem==

===Regulacija in-vitro transkripcije===

Da bi znanstveniki preverili izvedljivost uporabe aptamerov kot genskih regulatorjev, so na začetku uporabili, do sedaj dobro preučen, 29 nukleotidov dolg trombinski aptamer. Tega so vključili na različne lokacije blizu promotorske regije. Zanimalo jih je, kako bo vključitev aptamernega zaporedja v linearno DNA vplivala na in vitro transkripcijsko aktivnost, še bolj pa jih je zanimalo, kako bo na prepisovanje vplivala vezava liganda (človeškega trombina) na to aptamerno zaporedje. Transkripcijsko aktivnost so spremljali preko fluorescence reporterskega zaporedja 3WJdB, ki omogoča spremljanje transkripcijske aktivnosti v realnem času. Ugotovili so, da vključitev aptamera blizu promotorskega zaporedja zniža transkripcijsko aktivnost reporterskega zaporedja, saj ta s svojo sekundarno strukturo blokira potovanje RNA polimeraze navzdol po verigi [1].

Ob dodatku človeškega trombina, v večini primerov ni prišlo do očitnih sprememb transkripcijske aktivnosti v primerjavi s kontrolnim poskusom. Je pa v primeru vključitve trombinskega aptamera v smerno verigo navzdol od promotorja, prišlo do povišane transkripcije. Ob vezavi RNA polimeraze na promotorsko regijo pride namreč do odvitja dvojne vijačnice DNA. Ustvari se transkripcijski mehurček, ki izpostavi aptamerno zaporedje, ki lahko, kot omenjeno prej, blokira migracijo RNA polimeraze in s tem zniža efektivnost transkripcije ali pa jo celo prepreči. Vezava liganda na aptamerno zaporedje povzroči njegovo konformacijsko spremembo, kar lahko vplivan na transkripcijsko aktivnost. Ker je v slednjem primeru prišlo do povišanja ravni prepisovanja, se je torej zgodila takšna konformacijska sprememba strukture aptamera, ki je omogočila bolj ugodno potovanje RNA polimeraze navzdol po verigi [1].

===Regulacija transkripcije v brezceličnem sistemu===

Znanstveniki so želeli preveriti, ali pride do podobnih stimulatornih odzivov kot pri in vitro eksperimentih, tudi v brezceličnih sistemih. Za te namene so uporabili plazmidno DNA, ki je vsebovala enako promotorsko in reportersko zaporedje. Vezava človeškega trombina na trombinski aptamer je tudi v tem primeru povišala raven prepisovanja. Ugotovili so, da je fluorescenca, ki torej odraža transkripcijsko aktivnost, na začetku naraščala, nato pa je začela kar naenkrat padati. Razumeti moramo namreč, da je brezceličen sistem kompleksen in lahko prihaja do interakcij med različnimi komponentami. Padanje fluorescence se lahko pojasni s prisotnimi RNazami v sistemu, ki razgradijo prepisana RNA zaporedja 3WJdB. Na začetku je torej nivo transkripcije višji od degradacije, kar se kaže z naraščajočo fluorescenco. Po približno 30-60 min fluorescenca doseže vrh in začne padati, torej postane razgrajanje fluorescenčnega zaporedja 3WJdB hitrejše kot njegovo prepisovanje. Po 3-4 urah pride do razgradnje večine zaporedij 3WJdB, in s tem do znižanja fluorescence na bazalni nivo [1].
Ugotovili so tudi, da je nivo fluorescence bistveno nižji v brezceličnem sistemu, kot pri in vitro poskusih [1].

==Pridobivanje in preizkušanje novih aptamerov (CIVT-SELEX)==

===Capture-SELEX===

Ker so bili efekti vezave liganda na aptamerno zaporedje, torej povišanja transkripcije, premalo izraziti, so želeli pridobiti nove aptamere, ki se bodo odzivali na manjše koncentracije liganda, hkrati pa se jih bo lahko vključilo v biološka vezja. Za ta namen so uporabili metodo imenovano Capture-SELEX [1].

Oligonukleotidi iz knjižnice za Capture-SELEX so vsebovali 2 restrikcijski mesti, mesta za prepoznavo začetnih oligonukleotidov, ter seriji 40 in 10 naključnih nukleotidov, med njima pa se je nahajalo umestitveno zaporedje. To zaporedje je bilo komplementarno zaporedju za zajem, ki je bilo na 3' koncu biotinilirano [1].

DNA iz knjižnice so imobilizirali na magnetne kroglice s strepravidinom. Nato so uporabili človeški trombin kot tarčo za selekcijo specifičnih aptamerov. Ob vezavi oligonukleotidov na človeški trombin je prišlo do spremembe tri dimenzionalne strukture oligov, kar je povzročilo sproščanje enoverižne DNA iz kompleksa DNA-magnetna kroglica. Enoverižne DNA so z uporabo začetnih oligonukleotidov na obeh koncih pomnožili in dobili več kopij dvoverižne DNA, nato pa so z eksonukleazo razrezali le novo nastalo verigo. Kopije enoverižnih DNA so uporabili za nov krog selekcije in to ponovili 8 krat, pri čemer so pri vsakem krogu znižali koncentracijo liganda [1].

Po 8 krogih je sledilo negativno presejanje. V tem primeru so bili kompleksi DNA-magnetna kroglica, pred inkubacijo s ligandom, postavljeni v brezcelični sistem. S tem so želeli izločiti tiste aptamere, ki bi se lahko vezali na komponentne brezceličnega sistema. Po 4 krogih so dobili zaporedja, ki so bila visoka specifična in afinitetna proti človeškemu trombinu [1].

===Selekcija aptamerov s pomočjo brezceličnega transkripcijskega presejanja===

Dobljena knjižnica enoverižnih DNA pri postopku Capture-SELEX je bila pomnožena v dvoverižne DNA in vstavljena v vektorsko ogrodje s pomočjo metode sestavljanja Golden Gate. Vektor, ki je vseboval še promotor J23151, reportersko zaporedje 3WJdB in terminator, je bil transformiran v E. coli DH5α. Izbranih je bilo 1000 posameznih kolonij, ki so jih pomnožili in na podlagi agarozne gelske elektroforeze določili 832 takšnih DNA, ki so vsebovale pravilna zaporedja promotorja, aptamera, reporterja in terminatorja. Da so zmanjšali obseg dela, so 2 posamezni linearni DNA združili v skupni vzorec in tako dobili 416 poskusnih skupin [1].

Vsaka poskusna skupina je bila prepisana direktno v brezcelični sistem, z ali brez človeškega trombina. Primerjali so razlike v fluorescenci ob dodatku trombina. Pri tistih skupinah, kjer so bile razlike najočitnejše, so ponovili postopek, le da so tokrat v brezcelični sistem prepisali le individualne linearne DNA, ne več v paru, in zopet spremljali razlike v fluorescenci ob dodatku 0,5 M človeškega trombina. Pri 6 aptamernih zaporedij (AS1-76, AS2-3, AS2-70, AS7-36, AS7-83, AS8-22) je prišlo do znatnega upada fluorescence ob prisotnosti liganda – človeškega trombina. Ko so jih posekvencirali so ugotovili, da so 3 zaporedja (AS2-3, AS7-36 in AS7-83) identična. V nadaljevanju so trem izbranim aptamernim zaporedjem (AS2-3, AS2-70 in AS8-22), poleg kontrolnega 29 nukleotidov dolgega aptamera, s pomočjo programa napovedali njihove sekundarne strukture. Njihova ∆G je bila pri vseh negativna, torej so sledeče sekundarne strukture stabilne pri 25°C [1].

3 omenjena aptamerna zaporedja so vstavili v stabilnejšo plazmidno obliko, da bi preverili odziv na tarčni ligand, zopet v brezceličnem sistemu. Rezultati so pokazali, da vsa 3 zaporedja povzročijo inhibicijo transkripcije ob dodatku 0,5 M in 1 M človeškega trombina, v primerjavi z negativno kontrolo brez vnesenega aptamernega zaporedja. Molekularni mehanizem takšne transkripcijske regulacije je enak kot je bil opisan prej. Pri prepisovanju, se ob vezavi RNA polimeraze na promotorsko zaporedje ustvari transkripcijski mehurček, ki izpostavi enoverižno aptamerno zaporedje, na katerega se lahko nato veže človeški trombin. Ker je v našem primeru prišlo do nižjega nivoja prepisovanja, je moralo torej ob vezavi liganda priti do takšnih konformacijskih sprememb v strukturi aptamera, da je prišlo do oteženega premikanja RNA polimeraze naprej po verigi [1].

Zanimivi so pridobljeni rezultati kontrolnega poskusa, kjer plazmid ni vseboval aptamernega zaporedja. Ob dodatku 1 M trombina je vseeno prišlo do inhibicije translacije. Človeški trombin naj bi namreč vplival na ekspresijo zaporedij v pripravljenem brezceličnem sistemu, v smislu nespecifične inhibicije. S tem se kažejo toksične lastnosti večjih koncentracij človeškega trombina v brezceličnih sistemih [1].

==Zaključek==

Aptameri imajo mnoge molekularne aplikacije zaradi njihove preproste in poceni priprave, majhne velikosti in velike pestrosti. Brezcelični transkripcijsko-translacijski sistem ponuja velik potencial kot platforma za hitro presajanje aptamerov in preizkušanje prototipov novih bioloških vezij. V tej študiji so znanstveniki z uporabo metode CIVT-SELEX, ki je sestavljena iz Capture-SELEX in iz in vitro presejalne transkripcije, uspeli izbrati takšne aptamere, ki so bili visoko specifični in afinitetni proti človeškemu trombinu, in so ob vezavi povzročili inhibitorne efekte na transkripcijsko aktivnost. Takšni rezultatu potrjujejo robustnost uporabe aptamerov kot genetskih delov, tako v linearnih DNA, kot tudi v plazmidih [1].

==Literatura==

[1] Guo S, Xu Z, Lin L, Guo Y, Li J, Lu C, Shi X, Yang H. Using CIVT-SELEX to Select Aptamers as Genetic Parts to Regulate Gene Circuits in a Cell-Free System. Int J Mol Sci. 2023 Feb 1;24(3):2833.

[2] Kohlberger M, Gadermaier G. SELEX: Critical factors and optimization strategies for successful aptamer selection. Biotechnol Appl Biochem. 2022 Oct;69(5):1771-1792.

Uporaba CIVT-SELEX za izbiro aptamerov kot genskih delov za regulacijo genetskih vezij v brezceličnem sistemu

2023-05-14T22:13:19Z

Klemen Kunej: /* Capture-SELEX */

''Povzeto po članku: [https://www.mdpi.com/1422-0067/24/3/2833 Guo S, Xu Z, Lin L, Guo Y, Li J, Lu C, Shi X, Yang H. Using CIVT-SELEX to Select Aptamers as Genetic Parts to Regulate Gene Circuits in a Cell-Free System. Int J Mol Sci. 2023 Feb 1;24(3):2833. ]''

==Uvod==

Napredki v sintezni biologiji nam omogočajo načrtovanje dinamičnih in kompleksnih funkcij v živih organizmih. Realizacija teh kompleksnih funkcij je odvisna od ustvarjanja raznih delujočih genetskih vezij. Ustvarjena so bila številna sintetična genetska vezja, pri katerih je ključna regulacija genske ekspresije. Trenutno se pri večini relevantnih študij za regulacijo genske ekspresije uporablja transkripcijske faktorje in njihove operatorje (LacI/lacO, TetR/tetO). Čeprav je uporaba transkripcijskih faktorjev robustna, pa se pojavi pomanjkljivost v omejenem številu parov transkripcijski faktor-operator. Da bi rešili ta problem, so znanstveniki začeli preizkušati pare DNA aptamer- ligand kot genetske dele za regulacijo izražanja genov. DNA aptameri se specifično vežejo na ligand, ki je lahko majhna molekula ali protein, in tako tvorijo kompleks sposoben regulacije genske ekspresije. Ker so DNA aptameri enoverižne DNA, lahko tako teoretično obstaja na milijone različnih parov aptamer-ligand [1].

Najbolj uporabljen model aptamera je trombinski aptamer. Že v preteklosti se je raziskovala njegova uporaba kot biološkega dela, pri čemer so ga vstavljali na različne lokacije ob promotorju in preučevali, kako to vpliva na ekspresijo tarčnih genov. S tem so se ukvarjali tudi v tej študiji. Poleg tega, so razvili metodo CIVT-SELEX (angl. Capture and In Vitro Transcription-SELEX) s pomočjo katere so izbrali trombinske aptamere primerne za regulacijo genske transkripcije [1]. Gre za nadgradnjo metode SELEX (angl. systematic evolution of ligands by exponential enrichment), pri kateri aptamere presejamo in izberemo le tiste z visoko afiniteto za željen ligand [2].

==Raziskave z že obstoječim aptamernim zaporedjem==

===Regulacija in-vitro transkripcije===

Da bi znanstveniki preverili izvedljivost uporabe aptamerov kot genskih regulatorjev, so na začetku uporabili, do sedaj dobro preučen, 29 nukleotidov dolg trombinski aptamer. Tega so vključili na različne lokacije blizu promotorske regije. Zanimalo jih je, kako bo vključitev aptamernega zaporedja v linearno DNA vplivala na in vitro transkripcijsko aktivnost, še bolj pa jih je zanimalo, kako bo na prepisovanje vplivala vezava liganda (človeškega trombina) na to aptamerno zaporedje. Transkripcijsko aktivnost so spremljali preko fluorescence reporterskega zaporedja 3WJdB, ki omogoča spremljanje transkripcijske aktivnosti v realnem času. Ugotovili so, da vključitev aptamera blizu promotorskega zaporedja zniža transkripcijsko aktivnost reporterskega zaporedja, saj ta s svojo sekundarno strukturo blokira potovanje RNA polimeraze navzdol po verigi [1].

Ob dodatku človeškega trombina, v večini primerov ni prišlo do očitnih sprememb transkripcijske aktivnosti v primerjavi s kontrolnim poskusom. Je pa v primeru vključitve trombinskega aptamera v smerno verigo navzdol od promotorja, prišlo do povišane transkripcije. Ob vezavi RNA polimeraze na promotorsko regijo pride namreč do odvitja dvojne vijačnice DNA. Ustvari se transkripcijski mehurček, ki izpostavi aptamerno zaporedje, ki lahko, kot omenjeno prej, blokira migracijo RNA polimeraze in s tem zniža efektivnost transkripcije ali pa jo celo prepreči. Vezava liganda na aptamerno zaporedje povzroči njegovo konformacijsko spremembo, kar lahko vplivan na transkripcijsko aktivnost. Ker je v slednjem primeru prišlo do povišanja ravni prepisovanja, se je torej zgodila takšna konformacijska sprememba strukture aptamera, ki je omogočila bolj ugodno potovanje RNA polimeraze navzdol po verigi [1].

===Regulacija transkripcije v brezceličnem sistemu===

Znanstveniki so želeli preveriti, ali pride do podobnih stimulatornih odzivov kot pri in vitro eksperimentih, tudi v brezceličnih sistemih. Za te namene so uporabili plazmidno DNA, ki je vsebovala enako promotorsko in reportersko zaporedje. Vezava človeškega trombina na trombinski aptamer je tudi v tem primeru povišala raven prepisovanja. Ugotovili so, da je fluorescenca, ki torej odraža transkripcijsko aktivnost, na začetku naraščala, nato pa je začela kar naenkrat padati. Razumeti moramo namreč, da je brezceličen sistem kompleksen in lahko prihaja do interakcij med različnimi komponentami. Padanje fluorescence se lahko pojasni s prisotnimi RNazami v sistemu, ki razgradijo prepisana RNA zaporedja 3WJdB. Na začetku je torej nivo transkripcije višji od degradacije, kar se kaže z naraščajočo fluorescenco. Po približno 30-60 min fluorescenca doseže vrh in začne padati, torej postane razgrajanje fluorescenčnega zaporedja 3WJdB hitrejše kot njegovo prepisovanje. Po 3-4 urah pride do razgradnje večine zaporedij 3WJdB, in s tem do znižanja fluorescence na bazalni nivo [1].
Ugotovili so tudi, da je nivo fluorescence bistveno nižji v brezceličnem sistemu, kot pri in vitro poskusih [1].

==Pridobivanje in preizkušanje novih aptamerov (CIVT-SELEX)==

===Capture-SELEX===

Ker so bili efekti vezave liganda na aptamerno zaporedje, torej povišanja transkripcije, premalo izraziti, so želeli pridobiti nove aptamere, ki se bodo odzivali na manjše koncentracije liganda, hkrati pa se jih bo lahko vključilo v biološka vezja. Za ta namen so uporabili metodo imenovano Capture-SELEX [1].

Oligonukleotidi iz knjižnice za Capture-SELEX so vsebovali 2 restrikcijski mesti, mesta za prepoznavo začetnih oligonukleotidov, ter seriji 40 in 10 naključnih nukleotidov, med njima pa se je nahajalo umestitveno zaporedje. To zaporedje je bilo komplementarno zaporedju za zajem, ki je bilo na 3' koncu biotinilirano [1].

DNA iz knjižnice so imobilizirali na magnetne kroglice s strepravidinom. Nato so uporabili človeški trombin kot tarčo za selekcijo specifičnih aptamerov. Ob vezavi oligonukleotidov na človeški trombin je prišlo do spremembe tri dimenzionalne strukture oligov, kar je povzročilo sproščanje enoverižne DNA iz kompleksa DNA-magnetna kroglica. Enoverižne DNA so z uporabo začetnih oligonukleotidov na obeh koncih pomnožili in dobili več kopij dvoverižne DNA, nato pa so z eksonukleazo razrezali le novo nastalo verigo. Kopije enoverižnih DNA so uporabili za nov krog selekcije in to ponovili 8 krat, pri čemer so pri vsakem krogu znižali koncentracijo liganda [1].

Po 8 krogih je sledilo negativno presejanje. V tem primeru so bili kompleksi DNA-magnetna kroglica, pred inkubacijo s ligandom, postavljeni v brezcelični sistem. S tem so želeli izločiti tiste aptamere, ki bi se lahko vezali na komponentne brezceličnega sistema. Po 4 krogih so dobili zaporedja, ki so bila visoka specifična in afinitetna proti človeškemu trombinu [1].

===Selekcija aptamerov s pomočjo brezceličnega transkripcijskega presejanja===

Dobljena knjižnica enoverižnih DNA pri postopku Capture-SELEX je bila pomnožena v dvoverižne DNA in vstavljena v vektorsko ogrodje s pomočjo metode sestavljanja Golden Gate. Vektor, ki je vseboval še promotor J23151, reportersko zaporedje 3WJdB in terminator, je bil transformiran v E. coli DH5α. Izbranih je bilo 1000 posameznih kolonij, ki so jih pomnožili in na podlagi agarozne gelske elektroforeze določili 832 takšnih DNA, ki so vsebovale pravilna zaporedja promotorja, aptamera, reporterja in terminatorja. Da so zmanjšali obseg dela, so 2 posamezni linearni DNA združili v skupni vzorec in tako dobili 416 poskusnih skupin [1].
Vsaka poskusna skupina je bila prepisana direktno v brezcelični sistem, z ali brez človeškega trombina. Primerjali so razlike v fluorescenci ob dodatku trombina. Pri tistih skupinah, kjer so bile razlike najočitnejše, so ponovili postopek, le da so tokrat v brezcelični sistem prepisali le individualne linearne DNA, ne več v paru, in zopet spremljali razlike v fluorescenci ob dodatku 0,5 M človeškega trombina. Pri 6 aptamernih zaporedij (AS1-76, AS2-3, AS2-70, AS7-36, AS7-83, AS8-22) je prišlo do znatnega upada fluorescence ob prisotnosti liganda – človeškega trombina. Ko so jih posekvencirali so ugotovili, da so 3 zaporedja (AS2-3, AS7-36 in AS7-83) identična. V nadaljevanju so trem izbranim aptamernim zaporedjem (AS2-3, AS2-70 in AS8-22), poleg kontrolnega 29 nukleotidov dolgega aptamera, s pomočjo programa napovedali njihove sekundarne strukture. Njihova ∆G je bila pri vseh negativna, torej so sledeče sekundarne strukture stabilne pri 25°C [1].
3 omenjena aptamerna zaporedja so vstavili v stabilnejšo plazmidno obliko, da bi preverili odziv na tarčni ligand, zopet v brezceličnem sistemu. Rezultati so pokazali, da vsa 3 zaporedja povzročijo inhibicijo transkripcije ob dodatku 0,5 M in 1 M človeškega trombina, v primerjavi z negativno kontrolo brez vnesenega aptamernega zaporedja. Molekularni mehanizem takšne transkripcijske regulacije je enak kot je bil opisan prej. Pri prepisovanju, se ob vezavi RNA polimeraze na promotorsko zaporedje ustvari transkripcijski mehurček, ki izpostavi enoverižno aptamerno zaporedje, na katerega se lahko nato veže človeški trombin. Ker je v našem primeru prišlo do nižjega nivoja prepisovanja, je moralo torej ob vezavi liganda priti do takšnih konformacijskih sprememb v strukturi aptamera, da je prišlo do oteženega premikanja RNA polimeraze naprej po verigi [1].
Zanimivi so pridobljeni rezultati kontrolnega poskusa, kjer plazmid ni vseboval aptamernega zaporedja. Ob dodatku 1 M trombina je vseeno prišlo do inhibicije translacije. Človeški trombin naj bi namreč vplival na ekspresijo zaporedij v pripravljenem brezceličnem sistemu, v smislu nespecifične inhibicije. S tem se kažejo toksične lastnosti večjih koncentracij človeškega trombina v brezceličnih sistemih [1].

==Zaključek==

Aptameri imajo mnoge molekularne aplikacije zaradi njihove preproste in poceni priprave, majhne velikosti in velike pestrosti. Brezcelični transkripcijsko-translacijski sistem ponuja velik potencial kot platforma za hitro presajanje aptamerov in preizkušanje prototipov novih bioloških vezij. V tej študiji so znanstveniki z uporabo metode CIVT-SELEX, ki je sestavljena iz Capture-SELEX in iz in vitro presejalne transkripcije, uspeli izbrati takšne aptamere, ki so bili visoko specifični in afinitetni proti človeškemu trombinu, in so ob vezavi povzročili inhibitorne efekte na transkripcijsko aktivnost. Takšni rezultatu potrjujejo robustnost uporabe aptamerov kot genetskih delov, tako v linearnih DNA, kot tudi v plazmidih [1].

==Literatura==

[1] Guo S, Xu Z, Lin L, Guo Y, Li J, Lu C, Shi X, Yang H. Using CIVT-SELEX to Select Aptamers as Genetic Parts to Regulate Gene Circuits in a Cell-Free System. Int J Mol Sci. 2023 Feb 1;24(3):2833.

[2] Kohlberger M, Gadermaier G. SELEX: Critical factors and optimization strategies for successful aptamer selection. Biotechnol Appl Biochem. 2022 Oct;69(5):1771-1792.

Uporaba CIVT-SELEX za izbiro aptamerov kot genskih delov za regulacijo genetskih vezij v brezceličnem sistemu

2023-05-14T22:12:51Z

Klemen Kunej: /* Regulacija transkripcije v brezceličnem sistemu */

''Povzeto po članku: [https://www.mdpi.com/1422-0067/24/3/2833 Guo S, Xu Z, Lin L, Guo Y, Li J, Lu C, Shi X, Yang H. Using CIVT-SELEX to Select Aptamers as Genetic Parts to Regulate Gene Circuits in a Cell-Free System. Int J Mol Sci. 2023 Feb 1;24(3):2833. ]''

==Uvod==

Napredki v sintezni biologiji nam omogočajo načrtovanje dinamičnih in kompleksnih funkcij v živih organizmih. Realizacija teh kompleksnih funkcij je odvisna od ustvarjanja raznih delujočih genetskih vezij. Ustvarjena so bila številna sintetična genetska vezja, pri katerih je ključna regulacija genske ekspresije. Trenutno se pri večini relevantnih študij za regulacijo genske ekspresije uporablja transkripcijske faktorje in njihove operatorje (LacI/lacO, TetR/tetO). Čeprav je uporaba transkripcijskih faktorjev robustna, pa se pojavi pomanjkljivost v omejenem številu parov transkripcijski faktor-operator. Da bi rešili ta problem, so znanstveniki začeli preizkušati pare DNA aptamer- ligand kot genetske dele za regulacijo izražanja genov. DNA aptameri se specifično vežejo na ligand, ki je lahko majhna molekula ali protein, in tako tvorijo kompleks sposoben regulacije genske ekspresije. Ker so DNA aptameri enoverižne DNA, lahko tako teoretično obstaja na milijone različnih parov aptamer-ligand [1].

Najbolj uporabljen model aptamera je trombinski aptamer. Že v preteklosti se je raziskovala njegova uporaba kot biološkega dela, pri čemer so ga vstavljali na različne lokacije ob promotorju in preučevali, kako to vpliva na ekspresijo tarčnih genov. S tem so se ukvarjali tudi v tej študiji. Poleg tega, so razvili metodo CIVT-SELEX (angl. Capture and In Vitro Transcription-SELEX) s pomočjo katere so izbrali trombinske aptamere primerne za regulacijo genske transkripcije [1]. Gre za nadgradnjo metode SELEX (angl. systematic evolution of ligands by exponential enrichment), pri kateri aptamere presejamo in izberemo le tiste z visoko afiniteto za željen ligand [2].

==Raziskave z že obstoječim aptamernim zaporedjem==

===Regulacija in-vitro transkripcije===

Da bi znanstveniki preverili izvedljivost uporabe aptamerov kot genskih regulatorjev, so na začetku uporabili, do sedaj dobro preučen, 29 nukleotidov dolg trombinski aptamer. Tega so vključili na različne lokacije blizu promotorske regije. Zanimalo jih je, kako bo vključitev aptamernega zaporedja v linearno DNA vplivala na in vitro transkripcijsko aktivnost, še bolj pa jih je zanimalo, kako bo na prepisovanje vplivala vezava liganda (človeškega trombina) na to aptamerno zaporedje. Transkripcijsko aktivnost so spremljali preko fluorescence reporterskega zaporedja 3WJdB, ki omogoča spremljanje transkripcijske aktivnosti v realnem času. Ugotovili so, da vključitev aptamera blizu promotorskega zaporedja zniža transkripcijsko aktivnost reporterskega zaporedja, saj ta s svojo sekundarno strukturo blokira potovanje RNA polimeraze navzdol po verigi [1].

Ob dodatku človeškega trombina, v večini primerov ni prišlo do očitnih sprememb transkripcijske aktivnosti v primerjavi s kontrolnim poskusom. Je pa v primeru vključitve trombinskega aptamera v smerno verigo navzdol od promotorja, prišlo do povišane transkripcije. Ob vezavi RNA polimeraze na promotorsko regijo pride namreč do odvitja dvojne vijačnice DNA. Ustvari se transkripcijski mehurček, ki izpostavi aptamerno zaporedje, ki lahko, kot omenjeno prej, blokira migracijo RNA polimeraze in s tem zniža efektivnost transkripcije ali pa jo celo prepreči. Vezava liganda na aptamerno zaporedje povzroči njegovo konformacijsko spremembo, kar lahko vplivan na transkripcijsko aktivnost. Ker je v slednjem primeru prišlo do povišanja ravni prepisovanja, se je torej zgodila takšna konformacijska sprememba strukture aptamera, ki je omogočila bolj ugodno potovanje RNA polimeraze navzdol po verigi [1].

===Regulacija transkripcije v brezceličnem sistemu===

Znanstveniki so želeli preveriti, ali pride do podobnih stimulatornih odzivov kot pri in vitro eksperimentih, tudi v brezceličnih sistemih. Za te namene so uporabili plazmidno DNA, ki je vsebovala enako promotorsko in reportersko zaporedje. Vezava človeškega trombina na trombinski aptamer je tudi v tem primeru povišala raven prepisovanja. Ugotovili so, da je fluorescenca, ki torej odraža transkripcijsko aktivnost, na začetku naraščala, nato pa je začela kar naenkrat padati. Razumeti moramo namreč, da je brezceličen sistem kompleksen in lahko prihaja do interakcij med različnimi komponentami. Padanje fluorescence se lahko pojasni s prisotnimi RNazami v sistemu, ki razgradijo prepisana RNA zaporedja 3WJdB. Na začetku je torej nivo transkripcije višji od degradacije, kar se kaže z naraščajočo fluorescenco. Po približno 30-60 min fluorescenca doseže vrh in začne padati, torej postane razgrajanje fluorescenčnega zaporedja 3WJdB hitrejše kot njegovo prepisovanje. Po 3-4 urah pride do razgradnje večine zaporedij 3WJdB, in s tem do znižanja fluorescence na bazalni nivo [1].
Ugotovili so tudi, da je nivo fluorescence bistveno nižji v brezceličnem sistemu, kot pri in vitro poskusih [1].

==Pridobivanje in preizkušanje novih aptamerov (CIVT-SELEX)==

===Capture-SELEX===

Ker so bili efekti vezave liganda na aptamerno zaporedje, torej povišanja transkripcije, premalo izraziti, so želeli pridobiti nove aptamere, ki se bodo odzivali na manjše koncentracije liganda, hkrati pa se jih bo lahko vključilo v biološka vezja. Za ta namen so uporabili metodo imenovano Capture-SELEX [1].

Oligonukleotidi iz knjižnice za Capture-SELEX so vsebovali 2 restrikcijski mesti, mesta za prepoznavo začetnih oligonukleotidov, ter seriji 40 in 10 naključnih nukleotidov, med njima pa se je nahajalo umestitveno zaporedje. To zaporedje je bilo komplementarno zaporedju za zajem, ki je bilo na 3' koncu biotinilirano [1].

DNA iz knjižnice so imobilizirali na magnetne kroglice s strepravidinom. Nato so uporabili človeški trombin kot tarčo za selekcijo specifičnih aptamerov. Ob vezavi oligonukleotidov na človeški trombin je prišlo do spremembe tri dimenzionalne strukture oligov, kar je povzročilo sproščanje enoverižne DNA iz kompleksa DNA-magnetna kroglica. Enoverižne DNA so z uporabo začetnih oligonukleotidov na obeh koncih pomnožili in dobili več kopij dvoverižne DNA, nato pa so z eksonukleazo razrezali le novo nastalo verigo. Kopije enoverižnih DNA so uporabili za nov krog selekcije in to ponovili 8 krat, pri čemer so pri vsakem krogu znižali koncentracijo liganda [1].
Po 8 krogih je sledilo negativno presejanje. V tem primeru so bili kompleksi DNA-magnetna kroglica, pred inkubacijo s ligandom, postavljeni v brezcelični sistem. S tem so želeli izločiti tiste aptamere, ki bi se lahko vezali na komponentne brezceličnega sistema. Po 4 krogih so dobili zaporedja, ki so bila visoka specifična in afinitetna proti človeškemu trombinu [1].

===Selekcija aptamerov s pomočjo brezceličnega transkripcijskega presejanja===

Dobljena knjižnica enoverižnih DNA pri postopku Capture-SELEX je bila pomnožena v dvoverižne DNA in vstavljena v vektorsko ogrodje s pomočjo metode sestavljanja Golden Gate. Vektor, ki je vseboval še promotor J23151, reportersko zaporedje 3WJdB in terminator, je bil transformiran v E. coli DH5α. Izbranih je bilo 1000 posameznih kolonij, ki so jih pomnožili in na podlagi agarozne gelske elektroforeze določili 832 takšnih DNA, ki so vsebovale pravilna zaporedja promotorja, aptamera, reporterja in terminatorja. Da so zmanjšali obseg dela, so 2 posamezni linearni DNA združili v skupni vzorec in tako dobili 416 poskusnih skupin [1].
Vsaka poskusna skupina je bila prepisana direktno v brezcelični sistem, z ali brez človeškega trombina. Primerjali so razlike v fluorescenci ob dodatku trombina. Pri tistih skupinah, kjer so bile razlike najočitnejše, so ponovili postopek, le da so tokrat v brezcelični sistem prepisali le individualne linearne DNA, ne več v paru, in zopet spremljali razlike v fluorescenci ob dodatku 0,5 M človeškega trombina. Pri 6 aptamernih zaporedij (AS1-76, AS2-3, AS2-70, AS7-36, AS7-83, AS8-22) je prišlo do znatnega upada fluorescence ob prisotnosti liganda – človeškega trombina. Ko so jih posekvencirali so ugotovili, da so 3 zaporedja (AS2-3, AS7-36 in AS7-83) identična. V nadaljevanju so trem izbranim aptamernim zaporedjem (AS2-3, AS2-70 in AS8-22), poleg kontrolnega 29 nukleotidov dolgega aptamera, s pomočjo programa napovedali njihove sekundarne strukture. Njihova ∆G je bila pri vseh negativna, torej so sledeče sekundarne strukture stabilne pri 25°C [1].
3 omenjena aptamerna zaporedja so vstavili v stabilnejšo plazmidno obliko, da bi preverili odziv na tarčni ligand, zopet v brezceličnem sistemu. Rezultati so pokazali, da vsa 3 zaporedja povzročijo inhibicijo transkripcije ob dodatku 0,5 M in 1 M človeškega trombina, v primerjavi z negativno kontrolo brez vnesenega aptamernega zaporedja. Molekularni mehanizem takšne transkripcijske regulacije je enak kot je bil opisan prej. Pri prepisovanju, se ob vezavi RNA polimeraze na promotorsko zaporedje ustvari transkripcijski mehurček, ki izpostavi enoverižno aptamerno zaporedje, na katerega se lahko nato veže človeški trombin. Ker je v našem primeru prišlo do nižjega nivoja prepisovanja, je moralo torej ob vezavi liganda priti do takšnih konformacijskih sprememb v strukturi aptamera, da je prišlo do oteženega premikanja RNA polimeraze naprej po verigi [1].
Zanimivi so pridobljeni rezultati kontrolnega poskusa, kjer plazmid ni vseboval aptamernega zaporedja. Ob dodatku 1 M trombina je vseeno prišlo do inhibicije translacije. Človeški trombin naj bi namreč vplival na ekspresijo zaporedij v pripravljenem brezceličnem sistemu, v smislu nespecifične inhibicije. S tem se kažejo toksične lastnosti večjih koncentracij človeškega trombina v brezceličnih sistemih [1].

==Zaključek==

Aptameri imajo mnoge molekularne aplikacije zaradi njihove preproste in poceni priprave, majhne velikosti in velike pestrosti. Brezcelični transkripcijsko-translacijski sistem ponuja velik potencial kot platforma za hitro presajanje aptamerov in preizkušanje prototipov novih bioloških vezij. V tej študiji so znanstveniki z uporabo metode CIVT-SELEX, ki je sestavljena iz Capture-SELEX in iz in vitro presejalne transkripcije, uspeli izbrati takšne aptamere, ki so bili visoko specifični in afinitetni proti človeškemu trombinu, in so ob vezavi povzročili inhibitorne efekte na transkripcijsko aktivnost. Takšni rezultatu potrjujejo robustnost uporabe aptamerov kot genetskih delov, tako v linearnih DNA, kot tudi v plazmidih [1].

==Literatura==

[1] Guo S, Xu Z, Lin L, Guo Y, Li J, Lu C, Shi X, Yang H. Using CIVT-SELEX to Select Aptamers as Genetic Parts to Regulate Gene Circuits in a Cell-Free System. Int J Mol Sci. 2023 Feb 1;24(3):2833.

[2] Kohlberger M, Gadermaier G. SELEX: Critical factors and optimization strategies for successful aptamer selection. Biotechnol Appl Biochem. 2022 Oct;69(5):1771-1792.

Uporaba CIVT-SELEX za izbiro aptamerov kot genskih delov za regulacijo genetskih vezij v brezceličnem sistemu

2023-05-14T22:12:26Z

Klemen Kunej: /* Uvod */

''Povzeto po članku: [https://www.mdpi.com/1422-0067/24/3/2833 Guo S, Xu Z, Lin L, Guo Y, Li J, Lu C, Shi X, Yang H. Using CIVT-SELEX to Select Aptamers as Genetic Parts to Regulate Gene Circuits in a Cell-Free System. Int J Mol Sci. 2023 Feb 1;24(3):2833. ]''

==Uvod==

Napredki v sintezni biologiji nam omogočajo načrtovanje dinamičnih in kompleksnih funkcij v živih organizmih. Realizacija teh kompleksnih funkcij je odvisna od ustvarjanja raznih delujočih genetskih vezij. Ustvarjena so bila številna sintetična genetska vezja, pri katerih je ključna regulacija genske ekspresije. Trenutno se pri večini relevantnih študij za regulacijo genske ekspresije uporablja transkripcijske faktorje in njihove operatorje (LacI/lacO, TetR/tetO). Čeprav je uporaba transkripcijskih faktorjev robustna, pa se pojavi pomanjkljivost v omejenem številu parov transkripcijski faktor-operator. Da bi rešili ta problem, so znanstveniki začeli preizkušati pare DNA aptamer- ligand kot genetske dele za regulacijo izražanja genov. DNA aptameri se specifično vežejo na ligand, ki je lahko majhna molekula ali protein, in tako tvorijo kompleks sposoben regulacije genske ekspresije. Ker so DNA aptameri enoverižne DNA, lahko tako teoretično obstaja na milijone različnih parov aptamer-ligand [1].

Najbolj uporabljen model aptamera je trombinski aptamer. Že v preteklosti se je raziskovala njegova uporaba kot biološkega dela, pri čemer so ga vstavljali na različne lokacije ob promotorju in preučevali, kako to vpliva na ekspresijo tarčnih genov. S tem so se ukvarjali tudi v tej študiji. Poleg tega, so razvili metodo CIVT-SELEX (angl. Capture and In Vitro Transcription-SELEX) s pomočjo katere so izbrali trombinske aptamere primerne za regulacijo genske transkripcije [1]. Gre za nadgradnjo metode SELEX (angl. systematic evolution of ligands by exponential enrichment), pri kateri aptamere presejamo in izberemo le tiste z visoko afiniteto za željen ligand [2].

==Raziskave z že obstoječim aptamernim zaporedjem==

===Regulacija in-vitro transkripcije===

Da bi znanstveniki preverili izvedljivost uporabe aptamerov kot genskih regulatorjev, so na začetku uporabili, do sedaj dobro preučen, 29 nukleotidov dolg trombinski aptamer. Tega so vključili na različne lokacije blizu promotorske regije. Zanimalo jih je, kako bo vključitev aptamernega zaporedja v linearno DNA vplivala na in vitro transkripcijsko aktivnost, še bolj pa jih je zanimalo, kako bo na prepisovanje vplivala vezava liganda (človeškega trombina) na to aptamerno zaporedje. Transkripcijsko aktivnost so spremljali preko fluorescence reporterskega zaporedja 3WJdB, ki omogoča spremljanje transkripcijske aktivnosti v realnem času. Ugotovili so, da vključitev aptamera blizu promotorskega zaporedja zniža transkripcijsko aktivnost reporterskega zaporedja, saj ta s svojo sekundarno strukturo blokira potovanje RNA polimeraze navzdol po verigi [1].

Ob dodatku človeškega trombina, v večini primerov ni prišlo do očitnih sprememb transkripcijske aktivnosti v primerjavi s kontrolnim poskusom. Je pa v primeru vključitve trombinskega aptamera v smerno verigo navzdol od promotorja, prišlo do povišane transkripcije. Ob vezavi RNA polimeraze na promotorsko regijo pride namreč do odvitja dvojne vijačnice DNA. Ustvari se transkripcijski mehurček, ki izpostavi aptamerno zaporedje, ki lahko, kot omenjeno prej, blokira migracijo RNA polimeraze in s tem zniža efektivnost transkripcije ali pa jo celo prepreči. Vezava liganda na aptamerno zaporedje povzroči njegovo konformacijsko spremembo, kar lahko vplivan na transkripcijsko aktivnost. Ker je v slednjem primeru prišlo do povišanja ravni prepisovanja, se je torej zgodila takšna konformacijska sprememba strukture aptamera, ki je omogočila bolj ugodno potovanje RNA polimeraze navzdol po verigi [1].

===Regulacija transkripcije v brezceličnem sistemu===

Znanstveniki so želeli preveriti, ali pride do podobnih stimulatornih odzivov kot pri in vitro eksperimentih, tudi v brezceličnih sistemih. Za te namene so uporabili plazmidno DNA, ki je vsebovala enako promotorsko in reportersko zaporedje. Vezava človeškega trombina na trombinski aptamer je tudi v tem primeru povišala raven prepisovanja. Ugotovili so, da je fluorescenca, ki torej odraža transkripcijsko aktivnost, na začetku naraščala, nato pa je začela kar naenkrat padati. Razumeti moramo namreč, da je brezceličen sistem kompleksen in lahko prihaja do interakcij med različnimi komponentami. Padanje fluorescence se lahko pojasni s prisotnimi RNazami v sistemu, ki razgradijo prepisana RNA zaporedja 3WJdB. Na začetku je torej nivo transkripcije višji od degradacije, kar se kaže z naraščajočo fluorescenco. Po približno 30-60 min fluorescenca doseže vrh in začne padati, torej postane razgrajanje fluorescenčnega zaporedja 3WJdB hitrejše kot njegovo prepisovanje. Po 3-4 urah pride do razgradnje večine zaporedij 3WJdB, in s tem do znižanja fluorescence na bazalni nivo [1].
Ugotovili so tudi, da je nivo fluorescence bistveno nižji v brezceličnem sistemu, kot pri in vitro poskusih [1].

==Pridobivanje in preizkušanje novih aptamerov (CIVT-SELEX)==

===Capture-SELEX===

Ker so bili efekti vezave liganda na aptamerno zaporedje, torej povišanja transkripcije, premalo izraziti, so želeli pridobiti nove aptamere, ki se bodo odzivali na manjše koncentracije liganda, hkrati pa se jih bo lahko vključilo v biološka vezja. Za ta namen so uporabili metodo imenovano Capture-SELEX [1].

Oligonukleotidi iz knjižnice za Capture-SELEX so vsebovali 2 restrikcijski mesti, mesta za prepoznavo začetnih oligonukleotidov, ter seriji 40 in 10 naključnih nukleotidov, med njima pa se je nahajalo umestitveno zaporedje. To zaporedje je bilo komplementarno zaporedju za zajem, ki je bilo na 3' koncu biotinilirano [1].

DNA iz knjižnice so imobilizirali na magnetne kroglice s strepravidinom. Nato so uporabili človeški trombin kot tarčo za selekcijo specifičnih aptamerov. Ob vezavi oligonukleotidov na človeški trombin je prišlo do spremembe tri dimenzionalne strukture oligov, kar je povzročilo sproščanje enoverižne DNA iz kompleksa DNA-magnetna kroglica. Enoverižne DNA so z uporabo začetnih oligonukleotidov na obeh koncih pomnožili in dobili več kopij dvoverižne DNA, nato pa so z eksonukleazo razrezali le novo nastalo verigo. Kopije enoverižnih DNA so uporabili za nov krog selekcije in to ponovili 8 krat, pri čemer so pri vsakem krogu znižali koncentracijo liganda [1].
Po 8 krogih je sledilo negativno presejanje. V tem primeru so bili kompleksi DNA-magnetna kroglica, pred inkubacijo s ligandom, postavljeni v brezcelični sistem. S tem so želeli izločiti tiste aptamere, ki bi se lahko vezali na komponentne brezceličnega sistema. Po 4 krogih so dobili zaporedja, ki so bila visoka specifična in afinitetna proti človeškemu trombinu [1].

===Selekcija aptamerov s pomočjo brezceličnega transkripcijskega presejanja===

Dobljena knjižnica enoverižnih DNA pri postopku Capture-SELEX je bila pomnožena v dvoverižne DNA in vstavljena v vektorsko ogrodje s pomočjo metode sestavljanja Golden Gate. Vektor, ki je vseboval še promotor J23151, reportersko zaporedje 3WJdB in terminator, je bil transformiran v E. coli DH5α. Izbranih je bilo 1000 posameznih kolonij, ki so jih pomnožili in na podlagi agarozne gelske elektroforeze določili 832 takšnih DNA, ki so vsebovale pravilna zaporedja promotorja, aptamera, reporterja in terminatorja. Da so zmanjšali obseg dela, so 2 posamezni linearni DNA združili v skupni vzorec in tako dobili 416 poskusnih skupin [1].
Vsaka poskusna skupina je bila prepisana direktno v brezcelični sistem, z ali brez človeškega trombina. Primerjali so razlike v fluorescenci ob dodatku trombina. Pri tistih skupinah, kjer so bile razlike najočitnejše, so ponovili postopek, le da so tokrat v brezcelični sistem prepisali le individualne linearne DNA, ne več v paru, in zopet spremljali razlike v fluorescenci ob dodatku 0,5 M človeškega trombina. Pri 6 aptamernih zaporedij (AS1-76, AS2-3, AS2-70, AS7-36, AS7-83, AS8-22) je prišlo do znatnega upada fluorescence ob prisotnosti liganda – človeškega trombina. Ko so jih posekvencirali so ugotovili, da so 3 zaporedja (AS2-3, AS7-36 in AS7-83) identična. V nadaljevanju so trem izbranim aptamernim zaporedjem (AS2-3, AS2-70 in AS8-22), poleg kontrolnega 29 nukleotidov dolgega aptamera, s pomočjo programa napovedali njihove sekundarne strukture. Njihova ∆G je bila pri vseh negativna, torej so sledeče sekundarne strukture stabilne pri 25°C [1].
3 omenjena aptamerna zaporedja so vstavili v stabilnejšo plazmidno obliko, da bi preverili odziv na tarčni ligand, zopet v brezceličnem sistemu. Rezultati so pokazali, da vsa 3 zaporedja povzročijo inhibicijo transkripcije ob dodatku 0,5 M in 1 M človeškega trombina, v primerjavi z negativno kontrolo brez vnesenega aptamernega zaporedja. Molekularni mehanizem takšne transkripcijske regulacije je enak kot je bil opisan prej. Pri prepisovanju, se ob vezavi RNA polimeraze na promotorsko zaporedje ustvari transkripcijski mehurček, ki izpostavi enoverižno aptamerno zaporedje, na katerega se lahko nato veže človeški trombin. Ker je v našem primeru prišlo do nižjega nivoja prepisovanja, je moralo torej ob vezavi liganda priti do takšnih konformacijskih sprememb v strukturi aptamera, da je prišlo do oteženega premikanja RNA polimeraze naprej po verigi [1].
Zanimivi so pridobljeni rezultati kontrolnega poskusa, kjer plazmid ni vseboval aptamernega zaporedja. Ob dodatku 1 M trombina je vseeno prišlo do inhibicije translacije. Človeški trombin naj bi namreč vplival na ekspresijo zaporedij v pripravljenem brezceličnem sistemu, v smislu nespecifične inhibicije. S tem se kažejo toksične lastnosti večjih koncentracij človeškega trombina v brezceličnih sistemih [1].

==Zaključek==

Aptameri imajo mnoge molekularne aplikacije zaradi njihove preproste in poceni priprave, majhne velikosti in velike pestrosti. Brezcelični transkripcijsko-translacijski sistem ponuja velik potencial kot platforma za hitro presajanje aptamerov in preizkušanje prototipov novih bioloških vezij. V tej študiji so znanstveniki z uporabo metode CIVT-SELEX, ki je sestavljena iz Capture-SELEX in iz in vitro presejalne transkripcije, uspeli izbrati takšne aptamere, ki so bili visoko specifični in afinitetni proti človeškemu trombinu, in so ob vezavi povzročili inhibitorne efekte na transkripcijsko aktivnost. Takšni rezultatu potrjujejo robustnost uporabe aptamerov kot genetskih delov, tako v linearnih DNA, kot tudi v plazmidih [1].

==Literatura==

[1] Guo S, Xu Z, Lin L, Guo Y, Li J, Lu C, Shi X, Yang H. Using CIVT-SELEX to Select Aptamers as Genetic Parts to Regulate Gene Circuits in a Cell-Free System. Int J Mol Sci. 2023 Feb 1;24(3):2833.

[2] Kohlberger M, Gadermaier G. SELEX: Critical factors and optimization strategies for successful aptamer selection. Biotechnol Appl Biochem. 2022 Oct;69(5):1771-1792.

Uporaba CIVT-SELEX za izbiro aptamerov kot genskih delov za regulacijo genetskih vezij v brezceličnem sistemu

2023-05-14T22:12:16Z

Klemen Kunej: /* Uvod */

''Povzeto po članku: [https://www.mdpi.com/1422-0067/24/3/2833 Guo S, Xu Z, Lin L, Guo Y, Li J, Lu C, Shi X, Yang H. Using CIVT-SELEX to Select Aptamers as Genetic Parts to Regulate Gene Circuits in a Cell-Free System. Int J Mol Sci. 2023 Feb 1;24(3):2833. ]''

==Uvod==

Napredki v sintezni biologiji nam omogočajo načrtovanje dinamičnih in kompleksnih funkcij v živih organizmih. Realizacija teh kompleksnih funkcij je odvisna od ustvarjanja raznih delujočih genetskih vezij. Ustvarjena so bila številna sintetična genetska vezja, pri katerih je ključna regulacija genske ekspresije. Trenutno se pri večini relevantnih študij za regulacijo genske ekspresije uporablja transkripcijske faktorje in njihove operatorje (LacI/lacO, TetR/tetO). Čeprav je uporaba transkripcijskih faktorjev robustna, pa se pojavi pomanjkljivost v omejenem številu parov transkripcijski faktor-operator. Da bi rešili ta problem, so znanstveniki začeli preizkušati pare DNA aptamer- ligand kot genetske dele za regulacijo izražanja genov. DNA aptameri se specifično vežejo na ligand, ki je lahko majhna molekula ali protein, in tako tvorijo kompleks sposoben regulacije genske ekspresije. Ker so DNA aptameri enoverižne DNA, lahko tako teoretično obstaja na milijone različnih parov aptamer-ligand [1].

Najbolj uporabljen model aptamera je trombinski aptamer. Že v preteklosti se je raziskovala njegova uporaba kot biološkega dela, pri čemer so ga vstavljali na različne lokacije ob promotorju in preučevali, kako to vpliva na ekspresijo tarčnih genov. S tem so se ukvarjali tudi v tej študiji. Poleg tega, so razvili metodo CIVT-SELEX (angl. Capture and In Vitro Transcription-SELEX) s pomočjo katere so izbrali trombinske aptamere primerne za regulacijo genske transkripcije [1]. Gre za nadgradnjo metode SELEX (angl. systematic evolution of ligands by exponential enrichment), pri kateri aptamere presejamo in izberemo le tiste z visoko afiniteto za željen ligand [2].

==Raziskave z že obstoječim aptamernim zaporedjem==

===Regulacija in-vitro transkripcije===

Da bi znanstveniki preverili izvedljivost uporabe aptamerov kot genskih regulatorjev, so na začetku uporabili, do sedaj dobro preučen, 29 nukleotidov dolg trombinski aptamer. Tega so vključili na različne lokacije blizu promotorske regije. Zanimalo jih je, kako bo vključitev aptamernega zaporedja v linearno DNA vplivala na in vitro transkripcijsko aktivnost, še bolj pa jih je zanimalo, kako bo na prepisovanje vplivala vezava liganda (človeškega trombina) na to aptamerno zaporedje. Transkripcijsko aktivnost so spremljali preko fluorescence reporterskega zaporedja 3WJdB, ki omogoča spremljanje transkripcijske aktivnosti v realnem času. Ugotovili so, da vključitev aptamera blizu promotorskega zaporedja zniža transkripcijsko aktivnost reporterskega zaporedja, saj ta s svojo sekundarno strukturo blokira potovanje RNA polimeraze navzdol po verigi [1].

Ob dodatku človeškega trombina, v večini primerov ni prišlo do očitnih sprememb transkripcijske aktivnosti v primerjavi s kontrolnim poskusom. Je pa v primeru vključitve trombinskega aptamera v smerno verigo navzdol od promotorja, prišlo do povišane transkripcije. Ob vezavi RNA polimeraze na promotorsko regijo pride namreč do odvitja dvojne vijačnice DNA. Ustvari se transkripcijski mehurček, ki izpostavi aptamerno zaporedje, ki lahko, kot omenjeno prej, blokira migracijo RNA polimeraze in s tem zniža efektivnost transkripcije ali pa jo celo prepreči. Vezava liganda na aptamerno zaporedje povzroči njegovo konformacijsko spremembo, kar lahko vplivan na transkripcijsko aktivnost. Ker je v slednjem primeru prišlo do povišanja ravni prepisovanja, se je torej zgodila takšna konformacijska sprememba strukture aptamera, ki je omogočila bolj ugodno potovanje RNA polimeraze navzdol po verigi [1].

===Regulacija transkripcije v brezceličnem sistemu===

Znanstveniki so želeli preveriti, ali pride do podobnih stimulatornih odzivov kot pri in vitro eksperimentih, tudi v brezceličnih sistemih. Za te namene so uporabili plazmidno DNA, ki je vsebovala enako promotorsko in reportersko zaporedje. Vezava človeškega trombina na trombinski aptamer je tudi v tem primeru povišala raven prepisovanja. Ugotovili so, da je fluorescenca, ki torej odraža transkripcijsko aktivnost, na začetku naraščala, nato pa je začela kar naenkrat padati. Razumeti moramo namreč, da je brezceličen sistem kompleksen in lahko prihaja do interakcij med različnimi komponentami. Padanje fluorescence se lahko pojasni s prisotnimi RNazami v sistemu, ki razgradijo prepisana RNA zaporedja 3WJdB. Na začetku je torej nivo transkripcije višji od degradacije, kar se kaže z naraščajočo fluorescenco. Po približno 30-60 min fluorescenca doseže vrh in začne padati, torej postane razgrajanje fluorescenčnega zaporedja 3WJdB hitrejše kot njegovo prepisovanje. Po 3-4 urah pride do razgradnje večine zaporedij 3WJdB, in s tem do znižanja fluorescence na bazalni nivo [1].
Ugotovili so tudi, da je nivo fluorescence bistveno nižji v brezceličnem sistemu, kot pri in vitro poskusih [1].

==Pridobivanje in preizkušanje novih aptamerov (CIVT-SELEX)==

===Capture-SELEX===

Ker so bili efekti vezave liganda na aptamerno zaporedje, torej povišanja transkripcije, premalo izraziti, so želeli pridobiti nove aptamere, ki se bodo odzivali na manjše koncentracije liganda, hkrati pa se jih bo lahko vključilo v biološka vezja. Za ta namen so uporabili metodo imenovano Capture-SELEX [1].

Oligonukleotidi iz knjižnice za Capture-SELEX so vsebovali 2 restrikcijski mesti, mesta za prepoznavo začetnih oligonukleotidov, ter seriji 40 in 10 naključnih nukleotidov, med njima pa se je nahajalo umestitveno zaporedje. To zaporedje je bilo komplementarno zaporedju za zajem, ki je bilo na 3' koncu biotinilirano [1].

DNA iz knjižnice so imobilizirali na magnetne kroglice s strepravidinom. Nato so uporabili človeški trombin kot tarčo za selekcijo specifičnih aptamerov. Ob vezavi oligonukleotidov na človeški trombin je prišlo do spremembe tri dimenzionalne strukture oligov, kar je povzročilo sproščanje enoverižne DNA iz kompleksa DNA-magnetna kroglica. Enoverižne DNA so z uporabo začetnih oligonukleotidov na obeh koncih pomnožili in dobili več kopij dvoverižne DNA, nato pa so z eksonukleazo razrezali le novo nastalo verigo. Kopije enoverižnih DNA so uporabili za nov krog selekcije in to ponovili 8 krat, pri čemer so pri vsakem krogu znižali koncentracijo liganda [1].
Po 8 krogih je sledilo negativno presejanje. V tem primeru so bili kompleksi DNA-magnetna kroglica, pred inkubacijo s ligandom, postavljeni v brezcelični sistem. S tem so želeli izločiti tiste aptamere, ki bi se lahko vezali na komponentne brezceličnega sistema. Po 4 krogih so dobili zaporedja, ki so bila visoka specifična in afinitetna proti človeškemu trombinu [1].

===Selekcija aptamerov s pomočjo brezceličnega transkripcijskega presejanja===

Dobljena knjižnica enoverižnih DNA pri postopku Capture-SELEX je bila pomnožena v dvoverižne DNA in vstavljena v vektorsko ogrodje s pomočjo metode sestavljanja Golden Gate. Vektor, ki je vseboval še promotor J23151, reportersko zaporedje 3WJdB in terminator, je bil transformiran v E. coli DH5α. Izbranih je bilo 1000 posameznih kolonij, ki so jih pomnožili in na podlagi agarozne gelske elektroforeze določili 832 takšnih DNA, ki so vsebovale pravilna zaporedja promotorja, aptamera, reporterja in terminatorja. Da so zmanjšali obseg dela, so 2 posamezni linearni DNA združili v skupni vzorec in tako dobili 416 poskusnih skupin [1].
Vsaka poskusna skupina je bila prepisana direktno v brezcelični sistem, z ali brez človeškega trombina. Primerjali so razlike v fluorescenci ob dodatku trombina. Pri tistih skupinah, kjer so bile razlike najočitnejše, so ponovili postopek, le da so tokrat v brezcelični sistem prepisali le individualne linearne DNA, ne več v paru, in zopet spremljali razlike v fluorescenci ob dodatku 0,5 M človeškega trombina. Pri 6 aptamernih zaporedij (AS1-76, AS2-3, AS2-70, AS7-36, AS7-83, AS8-22) je prišlo do znatnega upada fluorescence ob prisotnosti liganda – človeškega trombina. Ko so jih posekvencirali so ugotovili, da so 3 zaporedja (AS2-3, AS7-36 in AS7-83) identična. V nadaljevanju so trem izbranim aptamernim zaporedjem (AS2-3, AS2-70 in AS8-22), poleg kontrolnega 29 nukleotidov dolgega aptamera, s pomočjo programa napovedali njihove sekundarne strukture. Njihova ∆G je bila pri vseh negativna, torej so sledeče sekundarne strukture stabilne pri 25°C [1].
3 omenjena aptamerna zaporedja so vstavili v stabilnejšo plazmidno obliko, da bi preverili odziv na tarčni ligand, zopet v brezceličnem sistemu. Rezultati so pokazali, da vsa 3 zaporedja povzročijo inhibicijo transkripcije ob dodatku 0,5 M in 1 M človeškega trombina, v primerjavi z negativno kontrolo brez vnesenega aptamernega zaporedja. Molekularni mehanizem takšne transkripcijske regulacije je enak kot je bil opisan prej. Pri prepisovanju, se ob vezavi RNA polimeraze na promotorsko zaporedje ustvari transkripcijski mehurček, ki izpostavi enoverižno aptamerno zaporedje, na katerega se lahko nato veže človeški trombin. Ker je v našem primeru prišlo do nižjega nivoja prepisovanja, je moralo torej ob vezavi liganda priti do takšnih konformacijskih sprememb v strukturi aptamera, da je prišlo do oteženega premikanja RNA polimeraze naprej po verigi [1].
Zanimivi so pridobljeni rezultati kontrolnega poskusa, kjer plazmid ni vseboval aptamernega zaporedja. Ob dodatku 1 M trombina je vseeno prišlo do inhibicije translacije. Človeški trombin naj bi namreč vplival na ekspresijo zaporedij v pripravljenem brezceličnem sistemu, v smislu nespecifične inhibicije. S tem se kažejo toksične lastnosti večjih koncentracij človeškega trombina v brezceličnih sistemih [1].

==Zaključek==

Aptameri imajo mnoge molekularne aplikacije zaradi njihove preproste in poceni priprave, majhne velikosti in velike pestrosti. Brezcelični transkripcijsko-translacijski sistem ponuja velik potencial kot platforma za hitro presajanje aptamerov in preizkušanje prototipov novih bioloških vezij. V tej študiji so znanstveniki z uporabo metode CIVT-SELEX, ki je sestavljena iz Capture-SELEX in iz in vitro presejalne transkripcije, uspeli izbrati takšne aptamere, ki so bili visoko specifični in afinitetni proti človeškemu trombinu, in so ob vezavi povzročili inhibitorne efekte na transkripcijsko aktivnost. Takšni rezultatu potrjujejo robustnost uporabe aptamerov kot genetskih delov, tako v linearnih DNA, kot tudi v plazmidih [1].

==Literatura==

[1] Guo S, Xu Z, Lin L, Guo Y, Li J, Lu C, Shi X, Yang H. Using CIVT-SELEX to Select Aptamers as Genetic Parts to Regulate Gene Circuits in a Cell-Free System. Int J Mol Sci. 2023 Feb 1;24(3):2833.

[2] Kohlberger M, Gadermaier G. SELEX: Critical factors and optimization strategies for successful aptamer selection. Biotechnol Appl Biochem. 2022 Oct;69(5):1771-1792.

Uporaba CIVT-SELEX za izbiro aptamerov kot genskih delov za regulacijo genetskih vezij v brezceličnem sistemu

2023-05-14T22:11:59Z

Klemen Kunej: /* Pridobivanje in preizkušanje novih aptamerov (CIVT-SELEX) */

''Povzeto po članku: [https://www.mdpi.com/1422-0067/24/3/2833 Guo S, Xu Z, Lin L, Guo Y, Li J, Lu C, Shi X, Yang H. Using CIVT-SELEX to Select Aptamers as Genetic Parts to Regulate Gene Circuits in a Cell-Free System. Int J Mol Sci. 2023 Feb 1;24(3):2833. ]''

==Uvod==

Napredki v sintezni biologiji nam omogočajo načrtovanje dinamičnih in kompleksnih funkcij v živih organizmih. Realizacija teh kompleksnih funkcij je odvisna od ustvarjanja raznih delujočih genetskih vezij. Ustvarjena so bila številna sintetična genetska vezja, pri katerih je ključna regulacija genske ekspresije. Trenutno se pri večini relevantnih študij za regulacijo genske ekspresije uporablja transkripcijske faktorje in njihove operatorje (LacI/lacO, TetR/tetO). Čeprav je uporaba transkripcijskih faktorjev robustna, pa se pojavi pomanjkljivost v omejenem številu parov transkripcijski faktor-operator. Da bi rešili ta problem, so znanstveniki začeli preizkušati pare DNA aptamer- ligand kot genetske dele za regulacijo izražanja genov. DNA aptameri se specifično vežejo na ligand, ki je lahko majhna molekula ali protein, in tako tvorijo kompleks sposoben regulacije genske ekspresije. Ker so DNA aptameri enoverižne DNA, lahko tako teoretično obstaja na milijone različnih parov aptamer-ligand [1].

Najbolj uporabljen model aptamera je trombinski aptamer. Že v preteklosti se je raziskovala njegova uporaba kot biološkega dela, pri čemer so ga vstavljali na različne lokacije ob promotorju in preučevali, kako to vpliva na ekspresijo tarčnih genov. S tem so se ukvarjali tudi v tej študiji. Poleg tega, so razvili metodo CIVT-SELEX (angl. Capture and In Vitro Transcription-SELEX) s pomočjo katere so izbrali trombinske aptamere primerne za regulacijo genske transkripcije [1]. Gre za nadgradnjo metode SELEX (angl. systematic evolution of ligands by exponential enrichment), pri kateri aptamere presejamo in izberemo le tiste z visoko afiniteto za željen ligand [2].

==Raziskave z že obstoječim aptamernim zaporedjem==

===Regulacija in-vitro transkripcije===

Da bi znanstveniki preverili izvedljivost uporabe aptamerov kot genskih regulatorjev, so na začetku uporabili, do sedaj dobro preučen, 29 nukleotidov dolg trombinski aptamer. Tega so vključili na različne lokacije blizu promotorske regije. Zanimalo jih je, kako bo vključitev aptamernega zaporedja v linearno DNA vplivala na in vitro transkripcijsko aktivnost, še bolj pa jih je zanimalo, kako bo na prepisovanje vplivala vezava liganda (človeškega trombina) na to aptamerno zaporedje. Transkripcijsko aktivnost so spremljali preko fluorescence reporterskega zaporedja 3WJdB, ki omogoča spremljanje transkripcijske aktivnosti v realnem času. Ugotovili so, da vključitev aptamera blizu promotorskega zaporedja zniža transkripcijsko aktivnost reporterskega zaporedja, saj ta s svojo sekundarno strukturo blokira potovanje RNA polimeraze navzdol po verigi [1].

Ob dodatku človeškega trombina, v večini primerov ni prišlo do očitnih sprememb transkripcijske aktivnosti v primerjavi s kontrolnim poskusom. Je pa v primeru vključitve trombinskega aptamera v smerno verigo navzdol od promotorja, prišlo do povišane transkripcije. Ob vezavi RNA polimeraze na promotorsko regijo pride namreč do odvitja dvojne vijačnice DNA. Ustvari se transkripcijski mehurček, ki izpostavi aptamerno zaporedje, ki lahko, kot omenjeno prej, blokira migracijo RNA polimeraze in s tem zniža efektivnost transkripcije ali pa jo celo prepreči. Vezava liganda na aptamerno zaporedje povzroči njegovo konformacijsko spremembo, kar lahko vplivan na transkripcijsko aktivnost. Ker je v slednjem primeru prišlo do povišanja ravni prepisovanja, se je torej zgodila takšna konformacijska sprememba strukture aptamera, ki je omogočila bolj ugodno potovanje RNA polimeraze navzdol po verigi [1].

===Regulacija transkripcije v brezceličnem sistemu===

Znanstveniki so želeli preveriti, ali pride do podobnih stimulatornih odzivov kot pri in vitro eksperimentih, tudi v brezceličnih sistemih. Za te namene so uporabili plazmidno DNA, ki je vsebovala enako promotorsko in reportersko zaporedje. Vezava človeškega trombina na trombinski aptamer je tudi v tem primeru povišala raven prepisovanja. Ugotovili so, da je fluorescenca, ki torej odraža transkripcijsko aktivnost, na začetku naraščala, nato pa je začela kar naenkrat padati. Razumeti moramo namreč, da je brezceličen sistem kompleksen in lahko prihaja do interakcij med različnimi komponentami. Padanje fluorescence se lahko pojasni s prisotnimi RNazami v sistemu, ki razgradijo prepisana RNA zaporedja 3WJdB. Na začetku je torej nivo transkripcije višji od degradacije, kar se kaže z naraščajočo fluorescenco. Po približno 30-60 min fluorescenca doseže vrh in začne padati, torej postane razgrajanje fluorescenčnega zaporedja 3WJdB hitrejše kot njegovo prepisovanje. Po 3-4 urah pride do razgradnje večine zaporedij 3WJdB, in s tem do znižanja fluorescence na bazalni nivo [1].
Ugotovili so tudi, da je nivo fluorescence bistveno nižji v brezceličnem sistemu, kot pri in vitro poskusih [1].

==Pridobivanje in preizkušanje novih aptamerov (CIVT-SELEX)==

===Capture-SELEX===

Ker so bili efekti vezave liganda na aptamerno zaporedje, torej povišanja transkripcije, premalo izraziti, so želeli pridobiti nove aptamere, ki se bodo odzivali na manjše koncentracije liganda, hkrati pa se jih bo lahko vključilo v biološka vezja. Za ta namen so uporabili metodo imenovano Capture-SELEX [1].

Oligonukleotidi iz knjižnice za Capture-SELEX so vsebovali 2 restrikcijski mesti, mesta za prepoznavo začetnih oligonukleotidov, ter seriji 40 in 10 naključnih nukleotidov, med njima pa se je nahajalo umestitveno zaporedje. To zaporedje je bilo komplementarno zaporedju za zajem, ki je bilo na 3' koncu biotinilirano [1].

DNA iz knjižnice so imobilizirali na magnetne kroglice s strepravidinom. Nato so uporabili človeški trombin kot tarčo za selekcijo specifičnih aptamerov. Ob vezavi oligonukleotidov na človeški trombin je prišlo do spremembe tri dimenzionalne strukture oligov, kar je povzročilo sproščanje enoverižne DNA iz kompleksa DNA-magnetna kroglica. Enoverižne DNA so z uporabo začetnih oligonukleotidov na obeh koncih pomnožili in dobili več kopij dvoverižne DNA, nato pa so z eksonukleazo razrezali le novo nastalo verigo. Kopije enoverižnih DNA so uporabili za nov krog selekcije in to ponovili 8 krat, pri čemer so pri vsakem krogu znižali koncentracijo liganda [1].
Po 8 krogih je sledilo negativno presejanje. V tem primeru so bili kompleksi DNA-magnetna kroglica, pred inkubacijo s ligandom, postavljeni v brezcelični sistem. S tem so želeli izločiti tiste aptamere, ki bi se lahko vezali na komponentne brezceličnega sistema. Po 4 krogih so dobili zaporedja, ki so bila visoka specifična in afinitetna proti človeškemu trombinu [1].

===Selekcija aptamerov s pomočjo brezceličnega transkripcijskega presejanja===

Dobljena knjižnica enoverižnih DNA pri postopku Capture-SELEX je bila pomnožena v dvoverižne DNA in vstavljena v vektorsko ogrodje s pomočjo metode sestavljanja Golden Gate. Vektor, ki je vseboval še promotor J23151, reportersko zaporedje 3WJdB in terminator, je bil transformiran v E. coli DH5α. Izbranih je bilo 1000 posameznih kolonij, ki so jih pomnožili in na podlagi agarozne gelske elektroforeze določili 832 takšnih DNA, ki so vsebovale pravilna zaporedja promotorja, aptamera, reporterja in terminatorja. Da so zmanjšali obseg dela, so 2 posamezni linearni DNA združili v skupni vzorec in tako dobili 416 poskusnih skupin [1].
Vsaka poskusna skupina je bila prepisana direktno v brezcelični sistem, z ali brez človeškega trombina. Primerjali so razlike v fluorescenci ob dodatku trombina. Pri tistih skupinah, kjer so bile razlike najočitnejše, so ponovili postopek, le da so tokrat v brezcelični sistem prepisali le individualne linearne DNA, ne več v paru, in zopet spremljali razlike v fluorescenci ob dodatku 0,5 M človeškega trombina. Pri 6 aptamernih zaporedij (AS1-76, AS2-3, AS2-70, AS7-36, AS7-83, AS8-22) je prišlo do znatnega upada fluorescence ob prisotnosti liganda – človeškega trombina. Ko so jih posekvencirali so ugotovili, da so 3 zaporedja (AS2-3, AS7-36 in AS7-83) identična. V nadaljevanju so trem izbranim aptamernim zaporedjem (AS2-3, AS2-70 in AS8-22), poleg kontrolnega 29 nukleotidov dolgega aptamera, s pomočjo programa napovedali njihove sekundarne strukture. Njihova ∆G je bila pri vseh negativna, torej so sledeče sekundarne strukture stabilne pri 25°C [1].
3 omenjena aptamerna zaporedja so vstavili v stabilnejšo plazmidno obliko, da bi preverili odziv na tarčni ligand, zopet v brezceličnem sistemu. Rezultati so pokazali, da vsa 3 zaporedja povzročijo inhibicijo transkripcije ob dodatku 0,5 M in 1 M človeškega trombina, v primerjavi z negativno kontrolo brez vnesenega aptamernega zaporedja. Molekularni mehanizem takšne transkripcijske regulacije je enak kot je bil opisan prej. Pri prepisovanju, se ob vezavi RNA polimeraze na promotorsko zaporedje ustvari transkripcijski mehurček, ki izpostavi enoverižno aptamerno zaporedje, na katerega se lahko nato veže človeški trombin. Ker je v našem primeru prišlo do nižjega nivoja prepisovanja, je moralo torej ob vezavi liganda priti do takšnih konformacijskih sprememb v strukturi aptamera, da je prišlo do oteženega premikanja RNA polimeraze naprej po verigi [1].
Zanimivi so pridobljeni rezultati kontrolnega poskusa, kjer plazmid ni vseboval aptamernega zaporedja. Ob dodatku 1 M trombina je vseeno prišlo do inhibicije translacije. Človeški trombin naj bi namreč vplival na ekspresijo zaporedij v pripravljenem brezceličnem sistemu, v smislu nespecifične inhibicije. S tem se kažejo toksične lastnosti večjih koncentracij človeškega trombina v brezceličnih sistemih [1].

==Zaključek==

Aptameri imajo mnoge molekularne aplikacije zaradi njihove preproste in poceni priprave, majhne velikosti in velike pestrosti. Brezcelični transkripcijsko-translacijski sistem ponuja velik potencial kot platforma za hitro presajanje aptamerov in preizkušanje prototipov novih bioloških vezij. V tej študiji so znanstveniki z uporabo metode CIVT-SELEX, ki je sestavljena iz Capture-SELEX in iz in vitro presejalne transkripcije, uspeli izbrati takšne aptamere, ki so bili visoko specifični in afinitetni proti človeškemu trombinu, in so ob vezavi povzročili inhibitorne efekte na transkripcijsko aktivnost. Takšni rezultatu potrjujejo robustnost uporabe aptamerov kot genetskih delov, tako v linearnih DNA, kot tudi v plazmidih [1].

==Literatura==

[1] Guo S, Xu Z, Lin L, Guo Y, Li J, Lu C, Shi X, Yang H. Using CIVT-SELEX to Select Aptamers as Genetic Parts to Regulate Gene Circuits in a Cell-Free System. Int J Mol Sci. 2023 Feb 1;24(3):2833.

[2] Kohlberger M, Gadermaier G. SELEX: Critical factors and optimization strategies for successful aptamer selection. Biotechnol Appl Biochem. 2022 Oct;69(5):1771-1792.

Uporaba CIVT-SELEX za izbiro aptamerov kot genskih delov za regulacijo genetskih vezij v brezceličnem sistemu

2023-05-14T22:11:35Z

Klemen Kunej: /* Raziskave z že obstoječim aptamernim zaporedjem */

''Povzeto po članku: [https://www.mdpi.com/1422-0067/24/3/2833 Guo S, Xu Z, Lin L, Guo Y, Li J, Lu C, Shi X, Yang H. Using CIVT-SELEX to Select Aptamers as Genetic Parts to Regulate Gene Circuits in a Cell-Free System. Int J Mol Sci. 2023 Feb 1;24(3):2833. ]''

==Uvod==

Napredki v sintezni biologiji nam omogočajo načrtovanje dinamičnih in kompleksnih funkcij v živih organizmih. Realizacija teh kompleksnih funkcij je odvisna od ustvarjanja raznih delujočih genetskih vezij. Ustvarjena so bila številna sintetična genetska vezja, pri katerih je ključna regulacija genske ekspresije. Trenutno se pri večini relevantnih študij za regulacijo genske ekspresije uporablja transkripcijske faktorje in njihove operatorje (LacI/lacO, TetR/tetO). Čeprav je uporaba transkripcijskih faktorjev robustna, pa se pojavi pomanjkljivost v omejenem številu parov transkripcijski faktor-operator. Da bi rešili ta problem, so znanstveniki začeli preizkušati pare DNA aptamer- ligand kot genetske dele za regulacijo izražanja genov. DNA aptameri se specifično vežejo na ligand, ki je lahko majhna molekula ali protein, in tako tvorijo kompleks sposoben regulacije genske ekspresije. Ker so DNA aptameri enoverižne DNA, lahko tako teoretično obstaja na milijone različnih parov aptamer-ligand [1].

Najbolj uporabljen model aptamera je trombinski aptamer. Že v preteklosti se je raziskovala njegova uporaba kot biološkega dela, pri čemer so ga vstavljali na različne lokacije ob promotorju in preučevali, kako to vpliva na ekspresijo tarčnih genov. S tem so se ukvarjali tudi v tej študiji. Poleg tega, so razvili metodo CIVT-SELEX (angl. Capture and In Vitro Transcription-SELEX) s pomočjo katere so izbrali trombinske aptamere primerne za regulacijo genske transkripcije [1]. Gre za nadgradnjo metode SELEX (angl. systematic evolution of ligands by exponential enrichment), pri kateri aptamere presejamo in izberemo le tiste z visoko afiniteto za željen ligand [2].

==Raziskave z že obstoječim aptamernim zaporedjem==

===Regulacija in-vitro transkripcije===

Da bi znanstveniki preverili izvedljivost uporabe aptamerov kot genskih regulatorjev, so na začetku uporabili, do sedaj dobro preučen, 29 nukleotidov dolg trombinski aptamer. Tega so vključili na različne lokacije blizu promotorske regije. Zanimalo jih je, kako bo vključitev aptamernega zaporedja v linearno DNA vplivala na in vitro transkripcijsko aktivnost, še bolj pa jih je zanimalo, kako bo na prepisovanje vplivala vezava liganda (človeškega trombina) na to aptamerno zaporedje. Transkripcijsko aktivnost so spremljali preko fluorescence reporterskega zaporedja 3WJdB, ki omogoča spremljanje transkripcijske aktivnosti v realnem času. Ugotovili so, da vključitev aptamera blizu promotorskega zaporedja zniža transkripcijsko aktivnost reporterskega zaporedja, saj ta s svojo sekundarno strukturo blokira potovanje RNA polimeraze navzdol po verigi [1].

Ob dodatku človeškega trombina, v večini primerov ni prišlo do očitnih sprememb transkripcijske aktivnosti v primerjavi s kontrolnim poskusom. Je pa v primeru vključitve trombinskega aptamera v smerno verigo navzdol od promotorja, prišlo do povišane transkripcije. Ob vezavi RNA polimeraze na promotorsko regijo pride namreč do odvitja dvojne vijačnice DNA. Ustvari se transkripcijski mehurček, ki izpostavi aptamerno zaporedje, ki lahko, kot omenjeno prej, blokira migracijo RNA polimeraze in s tem zniža efektivnost transkripcije ali pa jo celo prepreči. Vezava liganda na aptamerno zaporedje povzroči njegovo konformacijsko spremembo, kar lahko vplivan na transkripcijsko aktivnost. Ker je v slednjem primeru prišlo do povišanja ravni prepisovanja, se je torej zgodila takšna konformacijska sprememba strukture aptamera, ki je omogočila bolj ugodno potovanje RNA polimeraze navzdol po verigi [1].

===Regulacija transkripcije v brezceličnem sistemu===

Znanstveniki so želeli preveriti, ali pride do podobnih stimulatornih odzivov kot pri in vitro eksperimentih, tudi v brezceličnih sistemih. Za te namene so uporabili plazmidno DNA, ki je vsebovala enako promotorsko in reportersko zaporedje. Vezava človeškega trombina na trombinski aptamer je tudi v tem primeru povišala raven prepisovanja. Ugotovili so, da je fluorescenca, ki torej odraža transkripcijsko aktivnost, na začetku naraščala, nato pa je začela kar naenkrat padati. Razumeti moramo namreč, da je brezceličen sistem kompleksen in lahko prihaja do interakcij med različnimi komponentami. Padanje fluorescence se lahko pojasni s prisotnimi RNazami v sistemu, ki razgradijo prepisana RNA zaporedja 3WJdB. Na začetku je torej nivo transkripcije višji od degradacije, kar se kaže z naraščajočo fluorescenco. Po približno 30-60 min fluorescenca doseže vrh in začne padati, torej postane razgrajanje fluorescenčnega zaporedja 3WJdB hitrejše kot njegovo prepisovanje. Po 3-4 urah pride do razgradnje večine zaporedij 3WJdB, in s tem do znižanja fluorescence na bazalni nivo [1].
Ugotovili so tudi, da je nivo fluorescence bistveno nižji v brezceličnem sistemu, kot pri in vitro poskusih [1].

==Pridobivanje in preizkušanje novih aptamerov (CIVT-SELEX)==

===Capture-SELEX===

Ker so bili efekti vezave liganda na aptamerno zaporedje, torej povišanja transkripcije, premalo izraziti, so želeli pridobiti nove aptamere, ki se bodo odzivali na manjše koncentracije liganda, hkrati pa se jih bo lahko vključilo v biološka vezja. Za ta namen so uporabili metodo imenovano Capture-SELEX [1].

Oligonukleotidi iz knjižnice za Capture-SELEX so vsebovali 2 restrikcijski mesti, mesta za prepoznavo začetnih oligonukleotidov, ter seriji 40 in 10 naključnih nukleotidov, med njima pa se je nahajalo umestitveno zaporedje. To zaporedje je bilo komplementarno zaporedju za zajem, ki je bilo na 3' koncu biotinilirano [1].

DNA iz knjižnice so imobilizirali na magnetne kroglice s strepravidinom. Nato so uporabili človeški trombin kot tarčo za selekcijo specifičnih aptamerov. Ob vezavi oligonukleotidov na človeški trombin je prišlo do spremembe tri dimenzionalne strukture oligov, kar je povzročilo sproščanje enoverižne DNA iz kompleksa DNA-magnetna kroglica. Enoverižne DNA so z uporabo začetnih oligonukleotidov na obeh koncih pomnožili in dobili več kopij dvoverižne DNA, nato pa so z eksonukleazo razrezali le novo nastalo verigo. Kopije enoverižnih DNA so uporabili za nov krog selekcije in to ponovili 8 krat, pri čemer so pri vsakem krogu znižali koncentracijo liganda [1].
Po 8 krogih je sledilo negativno presejanje. V tem primeru so bili kompleksi DNA-magnetna kroglica, pred inkubacijo s ligandom, postavljeni v brezcelični sistem. S tem so želeli izločiti tiste aptamere, ki bi se lahko vezali na komponentne brezceličnega sistema. Po 4 krogih so dobili zaporedja, ki so bila visoka specifična in afinitetna proti človeškemu trombinu [1].

===Selekcija aptamerov s pomočjo brezceličnega transkripcijskega presejanja===

Dobljena knjižnica enoverižnih DNA pri postopku Capture-SELEX je bila pomnožena v dvoverižne DNA in vstavljena v vektorsko ogrodje s pomočjo metode sestavljanja Golden Gate. Vektor, ki je vseboval še promotor J23151, reportersko zaporedje 3WJdB in terminator, je bil transformiran v E. coli DH5α. Izbranih je bilo 1000 posameznih kolonij, ki so jih pomnožili in na podlagi agarozne gelske elektroforeze določili 832 takšnih DNA, ki so vsebovale pravilna zaporedja promotorja, aptamera, reporterja in terminatorja. Da so zmanjšali obseg dela, so 2 posamezni linearni DNA združili v skupni vzorec in tako dobili 416 poskusnih skupin [1].
Vsaka poskusna skupina je bila prepisana direktno v brezcelični sistem, z ali brez človeškega trombina. Primerjali so razlike v fluorescenci ob dodatku trombina. Pri tistih skupinah, kjer so bile razlike najočitnejše, so ponovili postopek, le da so tokrat v brezcelični sistem prepisali le individualne linearne DNA, ne več v paru, in zopet spremljali razlike v fluorescenci ob dodatku 0,5 M človeškega trombina. Pri 6 aptamernih zaporedij (AS1-76, AS2-3, AS2-70, AS7-36, AS7-83, AS8-22) je prišlo do znatnega upada fluorescence ob prisotnosti liganda – človeškega trombina. Ko so jih posekvencirali so ugotovili, da so 3 zaporedja (AS2-3, AS7-36 in AS7-83) identična. V nadaljevanju so trem izbranim aptamernim zaporedjem (AS2-3, AS2-70 in AS8-22), poleg kontrolnega 29 nukleotidov dolgega aptamera, s pomočjo programa napovedali njihove sekundarne strukture. Njihova ∆G je bila pri vseh negativna, torej so sledeče sekundarne strukture stabilne pri 25°C [1].
3 omenjena aptamerna zaporedja so vstavili v stabilnejšo plazmidno obliko, da bi preverili odziv na tarčni ligand, zopet v brezceličnem sistemu. Rezultati so pokazali, da vsa 3 zaporedja povzročijo inhibicijo transkripcije ob dodatku 0,5 M in 1 M človeškega trombina, v primerjavi z negativno kontrolo brez vnesenega aptamernega zaporedja. Molekularni mehanizem takšne transkripcijske regulacije je enak kot je bil opisan prej. Pri prepisovanju, se ob vezavi RNA polimeraze na promotorsko zaporedje ustvari transkripcijski mehurček, ki izpostavi enoverižno aptamerno zaporedje, na katerega se lahko nato veže človeški trombin. Ker je v našem primeru prišlo do nižjega nivoja prepisovanja, je moralo torej ob vezavi liganda priti do takšnih konformacijskih sprememb v strukturi aptamera, da je prišlo do oteženega premikanja RNA polimeraze naprej po verigi [1].
Zanimivi so pridobljeni rezultati kontrolnega poskusa, kjer plazmid ni vseboval aptamernega zaporedja. Ob dodatku 1 M trombina je vseeno prišlo do inhibicije translacije. Človeški trombin naj bi namreč vplival na ekspresijo zaporedij v pripravljenem brezceličnem sistemu, v smislu nespecifične inhibicije. S tem se kažejo toksične lastnosti večjih koncentracij človeškega trombina v brezceličnih sistemih [1].

==Zaključek==

Aptameri imajo mnoge molekularne aplikacije zaradi njihove preproste in poceni priprave, majhne velikosti in velike pestrosti. Brezcelični transkripcijsko-translacijski sistem ponuja velik potencial kot platforma za hitro presajanje aptamerov in preizkušanje prototipov novih bioloških vezij. V tej študiji so znanstveniki z uporabo metode CIVT-SELEX, ki je sestavljena iz Capture-SELEX in iz in vitro presejalne transkripcije, uspeli izbrati takšne aptamere, ki so bili visoko specifični in afinitetni proti človeškemu trombinu, in so ob vezavi povzročili inhibitorne efekte na transkripcijsko aktivnost. Takšni rezultatu potrjujejo robustnost uporabe aptamerov kot genetskih delov, tako v linearnih DNA, kot tudi v plazmidih [1].

==Literatura==

[1] Guo S, Xu Z, Lin L, Guo Y, Li J, Lu C, Shi X, Yang H. Using CIVT-SELEX to Select Aptamers as Genetic Parts to Regulate Gene Circuits in a Cell-Free System. Int J Mol Sci. 2023 Feb 1;24(3):2833.

[2] Kohlberger M, Gadermaier G. SELEX: Critical factors and optimization strategies for successful aptamer selection. Biotechnol Appl Biochem. 2022 Oct;69(5):1771-1792.

Uporaba CIVT-SELEX za izbiro aptamerov kot genskih delov za regulacijo genetskih vezij v brezceličnem sistemu

2023-05-14T22:10:56Z

Klemen Kunej: /* Capture-SELEX */

''Povzeto po članku: [https://www.mdpi.com/1422-0067/24/3/2833 Guo S, Xu Z, Lin L, Guo Y, Li J, Lu C, Shi X, Yang H. Using CIVT-SELEX to Select Aptamers as Genetic Parts to Regulate Gene Circuits in a Cell-Free System. Int J Mol Sci. 2023 Feb 1;24(3):2833. ]''

==Uvod==

Napredki v sintezni biologiji nam omogočajo načrtovanje dinamičnih in kompleksnih funkcij v živih organizmih. Realizacija teh kompleksnih funkcij je odvisna od ustvarjanja raznih delujočih genetskih vezij. Ustvarjena so bila številna sintetična genetska vezja, pri katerih je ključna regulacija genske ekspresije. Trenutno se pri večini relevantnih študij za regulacijo genske ekspresije uporablja transkripcijske faktorje in njihove operatorje (LacI/lacO, TetR/tetO). Čeprav je uporaba transkripcijskih faktorjev robustna, pa se pojavi pomanjkljivost v omejenem številu parov transkripcijski faktor-operator. Da bi rešili ta problem, so znanstveniki začeli preizkušati pare DNA aptamer- ligand kot genetske dele za regulacijo izražanja genov. DNA aptameri se specifično vežejo na ligand, ki je lahko majhna molekula ali protein, in tako tvorijo kompleks sposoben regulacije genske ekspresije. Ker so DNA aptameri enoverižne DNA, lahko tako teoretično obstaja na milijone različnih parov aptamer-ligand [1].

Najbolj uporabljen model aptamera je trombinski aptamer. Že v preteklosti se je raziskovala njegova uporaba kot biološkega dela, pri čemer so ga vstavljali na različne lokacije ob promotorju in preučevali, kako to vpliva na ekspresijo tarčnih genov. S tem so se ukvarjali tudi v tej študiji. Poleg tega, so razvili metodo CIVT-SELEX (angl. Capture and In Vitro Transcription-SELEX) s pomočjo katere so izbrali trombinske aptamere primerne za regulacijo genske transkripcije [1]. Gre za nadgradnjo metode SELEX (angl. systematic evolution of ligands by exponential enrichment), pri kateri aptamere presejamo in izberemo le tiste z visoko afiniteto za željen ligand [2].

==Raziskave z že obstoječim aptamernim zaporedjem==

===Regulacija in-vitro transkripcije===

Da bi znanstveniki preverili izvedljivost uporabe aptamerov kot genskih regulatorjev, so na začetku uporabili, do sedaj dobro preučen, 29 nukleotidov dolg trombinski aptamer. Tega so vključili na različne lokacije blizu promotorske regije. Zanimalo jih je, kako bo vključitev aptamernega zaporedja v linearno DNA vplivala na in vitro transkripcijsko aktivnost, še bolj pa jih je zanimalo, kako bo na prepisovanje vplivala vezava liganda (človeškega trombina) na to aptamerno zaporedje. Transkripcijsko aktivnost so spremljali preko fluorescence reporterskega zaporedja 3WJdB, ki omogoča spremljanje transkripcijske aktivnosti v realnem času. Ugotovili so, da vključitev aptamera blizu promotorskega zaporedja zniža transkripcijsko aktivnost reporterskega zaporedja, saj ta s svojo sekundarno strukturo blokira potovanje RNA polimeraze navzdol po verigi [1].

Ob dodatku človeškega trombina, v večini primerov ni prišlo do očitnih sprememb transkripcijske aktivnosti v primerjavi s kontrolnim poskusom. Je pa v primeru vključitve trombinskega aptamera v smerno verigo navzdol od promotorja, prišlo do povišane transkripcije. Ob vezavi RNA polimeraze na promotorsko regijo pride namreč do odvitja dvojne vijačnice DNA. Ustvari se transkripcijski mehurček, ki izpostavi aptamerno zaporedje, ki lahko, kot omenjeno prej, blokira migracijo RNA polimeraze in s tem zniža efektivnost transkripcije ali pa jo celo prepreči. Vezava liganda na aptamerno zaporedje povzroči njegovo konformacijsko spremembo, kar lahko vplivan na transkripcijsko aktivnost. Ker je v slednjem primeru prišlo do povišanja ravni prepisovanja, se je torej zgodila takšna konformacijska sprememba strukture aptamera, ki je omogočila bolj ugodno potovanje RNA polimeraze navzdol po verigi [1].

===Regulacija transkripcije v brezceličnem sistemu===

Znanstveniki so želeli preveriti, ali pride do podobnih stimulatornih odzivov kot pri in vitro eksperimentih, tudi v brezceličnih sistemih. Za te namene so uporabili plazmidno DNA, ki je vsebovala enako promotorsko in reportersko zaporedje. Vezava človeškega trombina na trombinski aptamer je tudi v tem primeru povišala raven prepisovanja. Ugotovili so, da je fluorescenca, ki torej odraža transkripcijsko aktivnost, na začetku naraščala, nato pa je začela kar naenkrat padati. Razumeti moramo namreč, da je brezceličen sistem kompleksen in lahko prihaja do interakcij med različnimi komponentami. Padanje fluorescence se lahko pojasni s prisotnimi RNazami v sistemu, ki razgradijo prepisana RNA zaporedja 3WJdB. Na začetku je torej nivo transkripcije višji od degradacije, kar se kaže z naraščajočo fluorescenco. Po približno 30-60 min fluorescenca doseže vrh in začne padati, torej postane razgrajanje fluorescenčnega zaporedja 3WJdB hitrejše kot njegovo prepisovanje. Po 3-4 urah pride do razgradnje večine zaporedij 3WJdB, in s tem do znižanja fluorescence na bazalni nivo [1].
Ugotovili so tudi, da je nivo fluorescence bistveno nižji v brezceličnem sistemu, kot pri in vitro poskusih [1].

==Pridobivanje in preizkušanje novih aptamerov (CIVT-SELEX)==

===Capture-SELEX===

Ker so bili efekti vezave liganda na aptamerno zaporedje, torej povišanja transkripcije, premalo izraziti, so želeli pridobiti nove aptamere, ki se bodo odzivali na manjše koncentracije liganda, hkrati pa se jih bo lahko vključilo v biološka vezja. Za ta namen so uporabili metodo imenovano Capture-SELEX [1].

Oligonukleotidi iz knjižnice za Capture-SELEX so vsebovali 2 restrikcijski mesti, mesta za prepoznavo začetnih oligonukleotidov, ter seriji 40 in 10 naključnih nukleotidov, med njima pa se je nahajalo umestitveno zaporedje. To zaporedje je bilo komplementarno zaporedju za zajem, ki je bilo na 3' koncu biotinilirano [1].

DNA iz knjižnice so imobilizirali na magnetne kroglice s strepravidinom. Nato so uporabili človeški trombin kot tarčo za selekcijo specifičnih aptamerov. Ob vezavi oligonukleotidov na človeški trombin je prišlo do spremembe tri dimenzionalne strukture oligov, kar je povzročilo sproščanje enoverižne DNA iz kompleksa DNA-magnetna kroglica. Enoverižne DNA so z uporabo začetnih oligonukleotidov na obeh koncih pomnožili in dobili več kopij dvoverižne DNA, nato pa so z eksonukleazo razrezali le novo nastalo verigo. Kopije enoverižnih DNA so uporabili za nov krog selekcije in to ponovili 8 krat, pri čemer so pri vsakem krogu znižali koncentracijo liganda [1].
Po 8 krogih je sledilo negativno presejanje. V tem primeru so bili kompleksi DNA-magnetna kroglica, pred inkubacijo s ligandom, postavljeni v brezcelični sistem. S tem so želeli izločiti tiste aptamere, ki bi se lahko vezali na komponentne brezceličnega sistema. Po 4 krogih so dobili zaporedja, ki so bila visoka specifična in afinitetna proti človeškemu trombinu [1].

===Selekcija aptamerov s pomočjo brezceličnega transkripcijskega presejanja===

Dobljena knjižnica enoverižnih DNA pri postopku Capture-SELEX je bila pomnožena v dvoverižne DNA in vstavljena v vektorsko ogrodje s pomočjo metode sestavljanja Golden Gate. Vektor, ki je vseboval še promotor J23151, reportersko zaporedje 3WJdB in terminator, je bil transformiran v E. coli DH5α. Izbranih je bilo 1000 posameznih kolonij, ki so jih pomnožili in na podlagi agarozne gelske elektroforeze določili 832 takšnih DNA, ki so vsebovale pravilna zaporedja promotorja, aptamera, reporterja in terminatorja. Da so zmanjšali obseg dela, so 2 posamezni linearni DNA združili v skupni vzorec in tako dobili 416 poskusnih skupin [1].
Vsaka poskusna skupina je bila prepisana direktno v brezcelični sistem, z ali brez človeškega trombina. Primerjali so razlike v fluorescenci ob dodatku trombina. Pri tistih skupinah, kjer so bile razlike najočitnejše, so ponovili postopek, le da so tokrat v brezcelični sistem prepisali le individualne linearne DNA, ne več v paru, in zopet spremljali razlike v fluorescenci ob dodatku 0,5 M človeškega trombina. Pri 6 aptamernih zaporedij (AS1-76, AS2-3, AS2-70, AS7-36, AS7-83, AS8-22) je prišlo do znatnega upada fluorescence ob prisotnosti liganda – človeškega trombina. Ko so jih posekvencirali so ugotovili, da so 3 zaporedja (AS2-3, AS7-36 in AS7-83) identična. V nadaljevanju so trem izbranim aptamernim zaporedjem (AS2-3, AS2-70 in AS8-22), poleg kontrolnega 29 nukleotidov dolgega aptamera, s pomočjo programa napovedali njihove sekundarne strukture. Njihova ∆G je bila pri vseh negativna, torej so sledeče sekundarne strukture stabilne pri 25°C [1].
3 omenjena aptamerna zaporedja so vstavili v stabilnejšo plazmidno obliko, da bi preverili odziv na tarčni ligand, zopet v brezceličnem sistemu. Rezultati so pokazali, da vsa 3 zaporedja povzročijo inhibicijo transkripcije ob dodatku 0,5 M in 1 M človeškega trombina, v primerjavi z negativno kontrolo brez vnesenega aptamernega zaporedja. Molekularni mehanizem takšne transkripcijske regulacije je enak kot je bil opisan prej. Pri prepisovanju, se ob vezavi RNA polimeraze na promotorsko zaporedje ustvari transkripcijski mehurček, ki izpostavi enoverižno aptamerno zaporedje, na katerega se lahko nato veže človeški trombin. Ker je v našem primeru prišlo do nižjega nivoja prepisovanja, je moralo torej ob vezavi liganda priti do takšnih konformacijskih sprememb v strukturi aptamera, da je prišlo do oteženega premikanja RNA polimeraze naprej po verigi [1].
Zanimivi so pridobljeni rezultati kontrolnega poskusa, kjer plazmid ni vseboval aptamernega zaporedja. Ob dodatku 1 M trombina je vseeno prišlo do inhibicije translacije. Človeški trombin naj bi namreč vplival na ekspresijo zaporedij v pripravljenem brezceličnem sistemu, v smislu nespecifične inhibicije. S tem se kažejo toksične lastnosti večjih koncentracij človeškega trombina v brezceličnih sistemih [1].

==Zaključek==

Aptameri imajo mnoge molekularne aplikacije zaradi njihove preproste in poceni priprave, majhne velikosti in velike pestrosti. Brezcelični transkripcijsko-translacijski sistem ponuja velik potencial kot platforma za hitro presajanje aptamerov in preizkušanje prototipov novih bioloških vezij. V tej študiji so znanstveniki z uporabo metode CIVT-SELEX, ki je sestavljena iz Capture-SELEX in iz in vitro presejalne transkripcije, uspeli izbrati takšne aptamere, ki so bili visoko specifični in afinitetni proti človeškemu trombinu, in so ob vezavi povzročili inhibitorne efekte na transkripcijsko aktivnost. Takšni rezultatu potrjujejo robustnost uporabe aptamerov kot genetskih delov, tako v linearnih DNA, kot tudi v plazmidih [1].

==Literatura==

[1] Guo S, Xu Z, Lin L, Guo Y, Li J, Lu C, Shi X, Yang H. Using CIVT-SELEX to Select Aptamers as Genetic Parts to Regulate Gene Circuits in a Cell-Free System. Int J Mol Sci. 2023 Feb 1;24(3):2833.

[2] Kohlberger M, Gadermaier G. SELEX: Critical factors and optimization strategies for successful aptamer selection. Biotechnol Appl Biochem. 2022 Oct;69(5):1771-1792.

Uporaba CIVT-SELEX za izbiro aptamerov kot genskih delov za regulacijo genetskih vezij v brezceličnem sistemu

2023-05-14T22:10:05Z

Klemen Kunej: /* Regulacija in-vitro transkripcije */

''Povzeto po članku: [https://www.mdpi.com/1422-0067/24/3/2833 Guo S, Xu Z, Lin L, Guo Y, Li J, Lu C, Shi X, Yang H. Using CIVT-SELEX to Select Aptamers as Genetic Parts to Regulate Gene Circuits in a Cell-Free System. Int J Mol Sci. 2023 Feb 1;24(3):2833. ]''

==Uvod==

Napredki v sintezni biologiji nam omogočajo načrtovanje dinamičnih in kompleksnih funkcij v živih organizmih. Realizacija teh kompleksnih funkcij je odvisna od ustvarjanja raznih delujočih genetskih vezij. Ustvarjena so bila številna sintetična genetska vezja, pri katerih je ključna regulacija genske ekspresije. Trenutno se pri večini relevantnih študij za regulacijo genske ekspresije uporablja transkripcijske faktorje in njihove operatorje (LacI/lacO, TetR/tetO). Čeprav je uporaba transkripcijskih faktorjev robustna, pa se pojavi pomanjkljivost v omejenem številu parov transkripcijski faktor-operator. Da bi rešili ta problem, so znanstveniki začeli preizkušati pare DNA aptamer- ligand kot genetske dele za regulacijo izražanja genov. DNA aptameri se specifično vežejo na ligand, ki je lahko majhna molekula ali protein, in tako tvorijo kompleks sposoben regulacije genske ekspresije. Ker so DNA aptameri enoverižne DNA, lahko tako teoretično obstaja na milijone različnih parov aptamer-ligand [1].

Najbolj uporabljen model aptamera je trombinski aptamer. Že v preteklosti se je raziskovala njegova uporaba kot biološkega dela, pri čemer so ga vstavljali na različne lokacije ob promotorju in preučevali, kako to vpliva na ekspresijo tarčnih genov. S tem so se ukvarjali tudi v tej študiji. Poleg tega, so razvili metodo CIVT-SELEX (angl. Capture and In Vitro Transcription-SELEX) s pomočjo katere so izbrali trombinske aptamere primerne za regulacijo genske transkripcije [1]. Gre za nadgradnjo metode SELEX (angl. systematic evolution of ligands by exponential enrichment), pri kateri aptamere presejamo in izberemo le tiste z visoko afiniteto za željen ligand [2].

==Raziskave z že obstoječim aptamernim zaporedjem==

===Regulacija in-vitro transkripcije===

Da bi znanstveniki preverili izvedljivost uporabe aptamerov kot genskih regulatorjev, so na začetku uporabili, do sedaj dobro preučen, 29 nukleotidov dolg trombinski aptamer. Tega so vključili na različne lokacije blizu promotorske regije. Zanimalo jih je, kako bo vključitev aptamernega zaporedja v linearno DNA vplivala na in vitro transkripcijsko aktivnost, še bolj pa jih je zanimalo, kako bo na prepisovanje vplivala vezava liganda (človeškega trombina) na to aptamerno zaporedje. Transkripcijsko aktivnost so spremljali preko fluorescence reporterskega zaporedja 3WJdB, ki omogoča spremljanje transkripcijske aktivnosti v realnem času. Ugotovili so, da vključitev aptamera blizu promotorskega zaporedja zniža transkripcijsko aktivnost reporterskega zaporedja, saj ta s svojo sekundarno strukturo blokira potovanje RNA polimeraze navzdol po verigi [1].

Ob dodatku človeškega trombina, v večini primerov ni prišlo do očitnih sprememb transkripcijske aktivnosti v primerjavi s kontrolnim poskusom. Je pa v primeru vključitve trombinskega aptamera v smerno verigo navzdol od promotorja, prišlo do povišane transkripcije. Ob vezavi RNA polimeraze na promotorsko regijo pride namreč do odvitja dvojne vijačnice DNA. Ustvari se transkripcijski mehurček, ki izpostavi aptamerno zaporedje, ki lahko, kot omenjeno prej, blokira migracijo RNA polimeraze in s tem zniža efektivnost transkripcije ali pa jo celo prepreči. Vezava liganda na aptamerno zaporedje povzroči njegovo konformacijsko spremembo, kar lahko vplivan na transkripcijsko aktivnost. Ker je v slednjem primeru prišlo do povišanja ravni prepisovanja, se je torej zgodila takšna konformacijska sprememba strukture aptamera, ki je omogočila bolj ugodno potovanje RNA polimeraze navzdol po verigi [1].

===Regulacija transkripcije v brezceličnem sistemu===

Znanstveniki so želeli preveriti, ali pride do podobnih stimulatornih odzivov kot pri in vitro eksperimentih, tudi v brezceličnih sistemih. Za te namene so uporabili plazmidno DNA, ki je vsebovala enako promotorsko in reportersko zaporedje. Vezava človeškega trombina na trombinski aptamer je tudi v tem primeru povišala raven prepisovanja. Ugotovili so, da je fluorescenca, ki torej odraža transkripcijsko aktivnost, na začetku naraščala, nato pa je začela kar naenkrat padati. Razumeti moramo namreč, da je brezceličen sistem kompleksen in lahko prihaja do interakcij med različnimi komponentami. Padanje fluorescence se lahko pojasni s prisotnimi RNazami v sistemu, ki razgradijo prepisana RNA zaporedja 3WJdB. Na začetku je torej nivo transkripcije višji od degradacije, kar se kaže z naraščajočo fluorescenco. Po približno 30-60 min fluorescenca doseže vrh in začne padati, torej postane razgrajanje fluorescenčnega zaporedja 3WJdB hitrejše kot njegovo prepisovanje. Po 3-4 urah pride do razgradnje večine zaporedij 3WJdB, in s tem do znižanja fluorescence na bazalni nivo [1].
Ugotovili so tudi, da je nivo fluorescence bistveno nižji v brezceličnem sistemu, kot pri in vitro poskusih [1].

==Pridobivanje in preizkušanje novih aptamerov (CIVT-SELEX)==

===Capture-SELEX===

Ker so bili efekti vezave liganda na aptamerno zaporedje, torej povišanja transkripcije, premalo izraziti, so želeli pridobiti nove aptamere, ki se bodo odzivali na manjše koncentracije liganda, hkrati pa se jih bo lahko vključilo v biološka vezja. Za ta namen so uporabili metodo imenovano Capture-SELEX [1].
Oligonukleotidi iz knjižnice za Capture-SELEX so vsebovali 2 restrikcijski mesti, mesta za prepoznavo začetnih oligonukleotidov, ter seriji 40 in 10 naključnih nukleotidov, med njima pa se je nahajalo umestitveno zaporedje. To zaporedje je bilo komplementarno zaporedju za zajem, ki je bilo na 3' koncu biotinilirano [1].
DNA iz knjižnice so imobilizirali na magnetne kroglice s strepravidinom. Nato so uporabili človeški trombin kot tarčo za selekcijo specifičnih aptamerov. Ob vezavi oligonukleotidov na človeški trombin je prišlo do spremembe tri dimenzionalne strukture oligov, kar je povzročilo sproščanje enoverižne DNA iz kompleksa DNA-magnetna kroglica. Enoverižne DNA so z uporabo začetnih oligonukleotidov na obeh koncih pomnožili in dobili več kopij dvoverižne DNA, nato pa so z eksonukleazo razrezali le novo nastalo verigo. Kopije enoverižnih DNA so uporabili za nov krog selekcije in to ponovili 8 krat, pri čemer so pri vsakem krogu znižali koncentracijo liganda [1].
Po 8 krogih je sledilo negativno presejanje. V tem primeru so bili kompleksi DNA-magnetna kroglica, pred inkubacijo s ligandom, postavljeni v brezcelični sistem. S tem so želeli izločiti tiste aptamere, ki bi se lahko vezali na komponentne brezceličnega sistema. Po 4 krogih so dobili zaporedja, ki so bila visoka specifična in afinitetna proti človeškemu trombinu [1].

===Selekcija aptamerov s pomočjo brezceličnega transkripcijskega presejanja===

Dobljena knjižnica enoverižnih DNA pri postopku Capture-SELEX je bila pomnožena v dvoverižne DNA in vstavljena v vektorsko ogrodje s pomočjo metode sestavljanja Golden Gate. Vektor, ki je vseboval še promotor J23151, reportersko zaporedje 3WJdB in terminator, je bil transformiran v E. coli DH5α. Izbranih je bilo 1000 posameznih kolonij, ki so jih pomnožili in na podlagi agarozne gelske elektroforeze določili 832 takšnih DNA, ki so vsebovale pravilna zaporedja promotorja, aptamera, reporterja in terminatorja. Da so zmanjšali obseg dela, so 2 posamezni linearni DNA združili v skupni vzorec in tako dobili 416 poskusnih skupin [1].
Vsaka poskusna skupina je bila prepisana direktno v brezcelični sistem, z ali brez človeškega trombina. Primerjali so razlike v fluorescenci ob dodatku trombina. Pri tistih skupinah, kjer so bile razlike najočitnejše, so ponovili postopek, le da so tokrat v brezcelični sistem prepisali le individualne linearne DNA, ne več v paru, in zopet spremljali razlike v fluorescenci ob dodatku 0,5 M človeškega trombina. Pri 6 aptamernih zaporedij (AS1-76, AS2-3, AS2-70, AS7-36, AS7-83, AS8-22) je prišlo do znatnega upada fluorescence ob prisotnosti liganda – človeškega trombina. Ko so jih posekvencirali so ugotovili, da so 3 zaporedja (AS2-3, AS7-36 in AS7-83) identična. V nadaljevanju so trem izbranim aptamernim zaporedjem (AS2-3, AS2-70 in AS8-22), poleg kontrolnega 29 nukleotidov dolgega aptamera, s pomočjo programa napovedali njihove sekundarne strukture. Njihova ∆G je bila pri vseh negativna, torej so sledeče sekundarne strukture stabilne pri 25°C [1].
3 omenjena aptamerna zaporedja so vstavili v stabilnejšo plazmidno obliko, da bi preverili odziv na tarčni ligand, zopet v brezceličnem sistemu. Rezultati so pokazali, da vsa 3 zaporedja povzročijo inhibicijo transkripcije ob dodatku 0,5 M in 1 M človeškega trombina, v primerjavi z negativno kontrolo brez vnesenega aptamernega zaporedja. Molekularni mehanizem takšne transkripcijske regulacije je enak kot je bil opisan prej. Pri prepisovanju, se ob vezavi RNA polimeraze na promotorsko zaporedje ustvari transkripcijski mehurček, ki izpostavi enoverižno aptamerno zaporedje, na katerega se lahko nato veže človeški trombin. Ker je v našem primeru prišlo do nižjega nivoja prepisovanja, je moralo torej ob vezavi liganda priti do takšnih konformacijskih sprememb v strukturi aptamera, da je prišlo do oteženega premikanja RNA polimeraze naprej po verigi [1].
Zanimivi so pridobljeni rezultati kontrolnega poskusa, kjer plazmid ni vseboval aptamernega zaporedja. Ob dodatku 1 M trombina je vseeno prišlo do inhibicije translacije. Človeški trombin naj bi namreč vplival na ekspresijo zaporedij v pripravljenem brezceličnem sistemu, v smislu nespecifične inhibicije. S tem se kažejo toksične lastnosti večjih koncentracij človeškega trombina v brezceličnih sistemih [1].

==Zaključek==

Aptameri imajo mnoge molekularne aplikacije zaradi njihove preproste in poceni priprave, majhne velikosti in velike pestrosti. Brezcelični transkripcijsko-translacijski sistem ponuja velik potencial kot platforma za hitro presajanje aptamerov in preizkušanje prototipov novih bioloških vezij. V tej študiji so znanstveniki z uporabo metode CIVT-SELEX, ki je sestavljena iz Capture-SELEX in iz in vitro presejalne transkripcije, uspeli izbrati takšne aptamere, ki so bili visoko specifični in afinitetni proti človeškemu trombinu, in so ob vezavi povzročili inhibitorne efekte na transkripcijsko aktivnost. Takšni rezultatu potrjujejo robustnost uporabe aptamerov kot genetskih delov, tako v linearnih DNA, kot tudi v plazmidih [1].

==Literatura==

[1] Guo S, Xu Z, Lin L, Guo Y, Li J, Lu C, Shi X, Yang H. Using CIVT-SELEX to Select Aptamers as Genetic Parts to Regulate Gene Circuits in a Cell-Free System. Int J Mol Sci. 2023 Feb 1;24(3):2833.

[2] Kohlberger M, Gadermaier G. SELEX: Critical factors and optimization strategies for successful aptamer selection. Biotechnol Appl Biochem. 2022 Oct;69(5):1771-1792.

Uporaba CIVT-SELEX za izbiro aptamerov kot genskih delov za regulacijo genetskih vezij v brezceličnem sistemu

2023-05-14T22:09:42Z

Klemen Kunej: /* Uvod */

''Povzeto po članku: [https://www.mdpi.com/1422-0067/24/3/2833 Guo S, Xu Z, Lin L, Guo Y, Li J, Lu C, Shi X, Yang H. Using CIVT-SELEX to Select Aptamers as Genetic Parts to Regulate Gene Circuits in a Cell-Free System. Int J Mol Sci. 2023 Feb 1;24(3):2833. ]''

==Uvod==

Napredki v sintezni biologiji nam omogočajo načrtovanje dinamičnih in kompleksnih funkcij v živih organizmih. Realizacija teh kompleksnih funkcij je odvisna od ustvarjanja raznih delujočih genetskih vezij. Ustvarjena so bila številna sintetična genetska vezja, pri katerih je ključna regulacija genske ekspresije. Trenutno se pri večini relevantnih študij za regulacijo genske ekspresije uporablja transkripcijske faktorje in njihove operatorje (LacI/lacO, TetR/tetO). Čeprav je uporaba transkripcijskih faktorjev robustna, pa se pojavi pomanjkljivost v omejenem številu parov transkripcijski faktor-operator. Da bi rešili ta problem, so znanstveniki začeli preizkušati pare DNA aptamer- ligand kot genetske dele za regulacijo izražanja genov. DNA aptameri se specifično vežejo na ligand, ki je lahko majhna molekula ali protein, in tako tvorijo kompleks sposoben regulacije genske ekspresije. Ker so DNA aptameri enoverižne DNA, lahko tako teoretično obstaja na milijone različnih parov aptamer-ligand [1].

Najbolj uporabljen model aptamera je trombinski aptamer. Že v preteklosti se je raziskovala njegova uporaba kot biološkega dela, pri čemer so ga vstavljali na različne lokacije ob promotorju in preučevali, kako to vpliva na ekspresijo tarčnih genov. S tem so se ukvarjali tudi v tej študiji. Poleg tega, so razvili metodo CIVT-SELEX (angl. Capture and In Vitro Transcription-SELEX) s pomočjo katere so izbrali trombinske aptamere primerne za regulacijo genske transkripcije [1]. Gre za nadgradnjo metode SELEX (angl. systematic evolution of ligands by exponential enrichment), pri kateri aptamere presejamo in izberemo le tiste z visoko afiniteto za željen ligand [2].

==Raziskave z že obstoječim aptamernim zaporedjem==

===Regulacija in-vitro transkripcije===

Da bi znanstveniki preverili izvedljivost uporabe aptamerov kot genskih regulatorjev, so na začetku uporabili, do sedaj dobro preučen, 29 nukleotidov dolg trombinski aptamer. Tega so vključili na različne lokacije blizu promotorske regije. Zanimalo jih je, kako bo vključitev aptamernega zaporedja v linearno DNA vplivala na in vitro transkripcijsko aktivnost, še bolj pa jih je zanimalo, kako bo na prepisovanje vplivala vezava liganda (človeškega trombina) na to aptamerno zaporedje. Transkripcijsko aktivnost so spremljali preko fluorescence reporterskega zaporedja 3WJdB, ki omogoča spremljanje transkripcijske aktivnosti v realnem času. Ugotovili so, da vključitev aptamera blizu promotorskega zaporedja zniža transkripcijsko aktivnost reporterskega zaporedja, saj ta s svojo sekundarno strukturo blokira potovanje RNA polimeraze navzdol po verigi [1].
Ob dodatku človeškega trombina, v večini primerov ni prišlo do očitnih sprememb transkripcijske aktivnosti v primerjavi s kontrolnim poskusom. Je pa v primeru vključitve trombinskega aptamera v smerno verigo navzdol od promotorja, prišlo do povišane transkripcije. Ob vezavi RNA polimeraze na promotorsko regijo pride namreč do odvitja dvojne vijačnice DNA. Ustvari se transkripcijski mehurček, ki izpostavi aptamerno zaporedje, ki lahko, kot omenjeno prej, blokira migracijo RNA polimeraze in s tem zniža efektivnost transkripcije ali pa jo celo prepreči. Vezava liganda na aptamerno zaporedje povzroči njegovo konformacijsko spremembo, kar lahko vplivan na transkripcijsko aktivnost. Ker je v slednjem primeru prišlo do povišanja ravni prepisovanja, se je torej zgodila takšna konformacijska sprememba strukture aptamera, ki je omogočila bolj ugodno potovanje RNA polimeraze navzdol po verigi [1].

===Regulacija transkripcije v brezceličnem sistemu===

Znanstveniki so želeli preveriti, ali pride do podobnih stimulatornih odzivov kot pri in vitro eksperimentih, tudi v brezceličnih sistemih. Za te namene so uporabili plazmidno DNA, ki je vsebovala enako promotorsko in reportersko zaporedje. Vezava človeškega trombina na trombinski aptamer je tudi v tem primeru povišala raven prepisovanja. Ugotovili so, da je fluorescenca, ki torej odraža transkripcijsko aktivnost, na začetku naraščala, nato pa je začela kar naenkrat padati. Razumeti moramo namreč, da je brezceličen sistem kompleksen in lahko prihaja do interakcij med različnimi komponentami. Padanje fluorescence se lahko pojasni s prisotnimi RNazami v sistemu, ki razgradijo prepisana RNA zaporedja 3WJdB. Na začetku je torej nivo transkripcije višji od degradacije, kar se kaže z naraščajočo fluorescenco. Po približno 30-60 min fluorescenca doseže vrh in začne padati, torej postane razgrajanje fluorescenčnega zaporedja 3WJdB hitrejše kot njegovo prepisovanje. Po 3-4 urah pride do razgradnje večine zaporedij 3WJdB, in s tem do znižanja fluorescence na bazalni nivo [1].
Ugotovili so tudi, da je nivo fluorescence bistveno nižji v brezceličnem sistemu, kot pri in vitro poskusih [1].

==Pridobivanje in preizkušanje novih aptamerov (CIVT-SELEX)==

===Capture-SELEX===

Ker so bili efekti vezave liganda na aptamerno zaporedje, torej povišanja transkripcije, premalo izraziti, so želeli pridobiti nove aptamere, ki se bodo odzivali na manjše koncentracije liganda, hkrati pa se jih bo lahko vključilo v biološka vezja. Za ta namen so uporabili metodo imenovano Capture-SELEX [1].
Oligonukleotidi iz knjižnice za Capture-SELEX so vsebovali 2 restrikcijski mesti, mesta za prepoznavo začetnih oligonukleotidov, ter seriji 40 in 10 naključnih nukleotidov, med njima pa se je nahajalo umestitveno zaporedje. To zaporedje je bilo komplementarno zaporedju za zajem, ki je bilo na 3' koncu biotinilirano [1].
DNA iz knjižnice so imobilizirali na magnetne kroglice s strepravidinom. Nato so uporabili človeški trombin kot tarčo za selekcijo specifičnih aptamerov. Ob vezavi oligonukleotidov na človeški trombin je prišlo do spremembe tri dimenzionalne strukture oligov, kar je povzročilo sproščanje enoverižne DNA iz kompleksa DNA-magnetna kroglica. Enoverižne DNA so z uporabo začetnih oligonukleotidov na obeh koncih pomnožili in dobili več kopij dvoverižne DNA, nato pa so z eksonukleazo razrezali le novo nastalo verigo. Kopije enoverižnih DNA so uporabili za nov krog selekcije in to ponovili 8 krat, pri čemer so pri vsakem krogu znižali koncentracijo liganda [1].
Po 8 krogih je sledilo negativno presejanje. V tem primeru so bili kompleksi DNA-magnetna kroglica, pred inkubacijo s ligandom, postavljeni v brezcelični sistem. S tem so želeli izločiti tiste aptamere, ki bi se lahko vezali na komponentne brezceličnega sistema. Po 4 krogih so dobili zaporedja, ki so bila visoka specifična in afinitetna proti človeškemu trombinu [1].

===Selekcija aptamerov s pomočjo brezceličnega transkripcijskega presejanja===

Dobljena knjižnica enoverižnih DNA pri postopku Capture-SELEX je bila pomnožena v dvoverižne DNA in vstavljena v vektorsko ogrodje s pomočjo metode sestavljanja Golden Gate. Vektor, ki je vseboval še promotor J23151, reportersko zaporedje 3WJdB in terminator, je bil transformiran v E. coli DH5α. Izbranih je bilo 1000 posameznih kolonij, ki so jih pomnožili in na podlagi agarozne gelske elektroforeze določili 832 takšnih DNA, ki so vsebovale pravilna zaporedja promotorja, aptamera, reporterja in terminatorja. Da so zmanjšali obseg dela, so 2 posamezni linearni DNA združili v skupni vzorec in tako dobili 416 poskusnih skupin [1].
Vsaka poskusna skupina je bila prepisana direktno v brezcelični sistem, z ali brez človeškega trombina. Primerjali so razlike v fluorescenci ob dodatku trombina. Pri tistih skupinah, kjer so bile razlike najočitnejše, so ponovili postopek, le da so tokrat v brezcelični sistem prepisali le individualne linearne DNA, ne več v paru, in zopet spremljali razlike v fluorescenci ob dodatku 0,5 M človeškega trombina. Pri 6 aptamernih zaporedij (AS1-76, AS2-3, AS2-70, AS7-36, AS7-83, AS8-22) je prišlo do znatnega upada fluorescence ob prisotnosti liganda – človeškega trombina. Ko so jih posekvencirali so ugotovili, da so 3 zaporedja (AS2-3, AS7-36 in AS7-83) identična. V nadaljevanju so trem izbranim aptamernim zaporedjem (AS2-3, AS2-70 in AS8-22), poleg kontrolnega 29 nukleotidov dolgega aptamera, s pomočjo programa napovedali njihove sekundarne strukture. Njihova ∆G je bila pri vseh negativna, torej so sledeče sekundarne strukture stabilne pri 25°C [1].
3 omenjena aptamerna zaporedja so vstavili v stabilnejšo plazmidno obliko, da bi preverili odziv na tarčni ligand, zopet v brezceličnem sistemu. Rezultati so pokazali, da vsa 3 zaporedja povzročijo inhibicijo transkripcije ob dodatku 0,5 M in 1 M človeškega trombina, v primerjavi z negativno kontrolo brez vnesenega aptamernega zaporedja. Molekularni mehanizem takšne transkripcijske regulacije je enak kot je bil opisan prej. Pri prepisovanju, se ob vezavi RNA polimeraze na promotorsko zaporedje ustvari transkripcijski mehurček, ki izpostavi enoverižno aptamerno zaporedje, na katerega se lahko nato veže človeški trombin. Ker je v našem primeru prišlo do nižjega nivoja prepisovanja, je moralo torej ob vezavi liganda priti do takšnih konformacijskih sprememb v strukturi aptamera, da je prišlo do oteženega premikanja RNA polimeraze naprej po verigi [1].
Zanimivi so pridobljeni rezultati kontrolnega poskusa, kjer plazmid ni vseboval aptamernega zaporedja. Ob dodatku 1 M trombina je vseeno prišlo do inhibicije translacije. Človeški trombin naj bi namreč vplival na ekspresijo zaporedij v pripravljenem brezceličnem sistemu, v smislu nespecifične inhibicije. S tem se kažejo toksične lastnosti večjih koncentracij človeškega trombina v brezceličnih sistemih [1].

==Zaključek==

Aptameri imajo mnoge molekularne aplikacije zaradi njihove preproste in poceni priprave, majhne velikosti in velike pestrosti. Brezcelični transkripcijsko-translacijski sistem ponuja velik potencial kot platforma za hitro presajanje aptamerov in preizkušanje prototipov novih bioloških vezij. V tej študiji so znanstveniki z uporabo metode CIVT-SELEX, ki je sestavljena iz Capture-SELEX in iz in vitro presejalne transkripcije, uspeli izbrati takšne aptamere, ki so bili visoko specifični in afinitetni proti človeškemu trombinu, in so ob vezavi povzročili inhibitorne efekte na transkripcijsko aktivnost. Takšni rezultatu potrjujejo robustnost uporabe aptamerov kot genetskih delov, tako v linearnih DNA, kot tudi v plazmidih [1].

==Literatura==

[1] Guo S, Xu Z, Lin L, Guo Y, Li J, Lu C, Shi X, Yang H. Using CIVT-SELEX to Select Aptamers as Genetic Parts to Regulate Gene Circuits in a Cell-Free System. Int J Mol Sci. 2023 Feb 1;24(3):2833.

[2] Kohlberger M, Gadermaier G. SELEX: Critical factors and optimization strategies for successful aptamer selection. Biotechnol Appl Biochem. 2022 Oct;69(5):1771-1792.

Uporaba CIVT-SELEX za izbiro aptamerov kot genskih delov za regulacijo genetskih vezij v brezceličnem sistemu

2023-05-14T22:09:14Z

Klemen Kunej: /* Uvod */

''Povzeto po članku: [https://www.mdpi.com/1422-0067/24/3/2833 Guo S, Xu Z, Lin L, Guo Y, Li J, Lu C, Shi X, Yang H. Using CIVT-SELEX to Select Aptamers as Genetic Parts to Regulate Gene Circuits in a Cell-Free System. Int J Mol Sci. 2023 Feb 1;24(3):2833. ]''

==Uvod==

Napredki v sintezni biologiji nam omogočajo načrtovanje dinamičnih in kompleksnih funkcij v živih organizmih. Realizacija teh kompleksnih funkcij je odvisna od ustvarjanja raznih delujočih genetskih vezij. Ustvarjena so bila številna sintetična genetska vezja, pri katerih je ključna regulacija genske ekspresije. Trenutno se pri večini relevantnih študij za regulacijo genske ekspresije uporablja transkripcijske faktorje in njihove operatorje (LacI/lacO, TetR/tetO). Čeprav je uporaba transkripcijskih faktorjev robustna, pa se pojavi pomanjkljivost v omejenem številu parov transkripcijski faktor-operator. Da bi rešili ta problem, so znanstveniki začeli preizkušati pare DNA aptamer- ligand kot genetske dele za regulacijo izražanja genov. DNA aptameri se specifično vežejo na ligand, ki je lahko majhna molekula ali protein, in tako tvorijo kompleks sposoben regulacije genske ekspresije. Ker so DNA aptameri enoverižne DNA, lahko tako teoretično obstaja na milijone različnih parov aptamer-ligand [1].
Najbolj uporabljen model aptamera je trombinski aptamer. Že v preteklosti se je raziskovala njegova uporaba kot biološkega dela, pri čemer so ga vstavljali na različne lokacije ob promotorju in preučevali, kako to vpliva na ekspresijo tarčnih genov. S tem so se ukvarjali tudi v tej študiji. Poleg tega, so razvili metodo CIVT-SELEX (angl. Capture and In Vitro Transcription-SELEX) s pomočjo katere so izbrali trombinske aptamere primerne za regulacijo genske transkripcije [1]. Gre za nadgradnjo metode SELEX (angl. systematic evolution of ligands by exponential enrichment), pri kateri aptamere presejamo in izberemo le tiste z visoko afiniteto za željen ligand [2].

==Raziskave z že obstoječim aptamernim zaporedjem==

===Regulacija in-vitro transkripcije===

Da bi znanstveniki preverili izvedljivost uporabe aptamerov kot genskih regulatorjev, so na začetku uporabili, do sedaj dobro preučen, 29 nukleotidov dolg trombinski aptamer. Tega so vključili na različne lokacije blizu promotorske regije. Zanimalo jih je, kako bo vključitev aptamernega zaporedja v linearno DNA vplivala na in vitro transkripcijsko aktivnost, še bolj pa jih je zanimalo, kako bo na prepisovanje vplivala vezava liganda (človeškega trombina) na to aptamerno zaporedje. Transkripcijsko aktivnost so spremljali preko fluorescence reporterskega zaporedja 3WJdB, ki omogoča spremljanje transkripcijske aktivnosti v realnem času. Ugotovili so, da vključitev aptamera blizu promotorskega zaporedja zniža transkripcijsko aktivnost reporterskega zaporedja, saj ta s svojo sekundarno strukturo blokira potovanje RNA polimeraze navzdol po verigi [1].
Ob dodatku človeškega trombina, v večini primerov ni prišlo do očitnih sprememb transkripcijske aktivnosti v primerjavi s kontrolnim poskusom. Je pa v primeru vključitve trombinskega aptamera v smerno verigo navzdol od promotorja, prišlo do povišane transkripcije. Ob vezavi RNA polimeraze na promotorsko regijo pride namreč do odvitja dvojne vijačnice DNA. Ustvari se transkripcijski mehurček, ki izpostavi aptamerno zaporedje, ki lahko, kot omenjeno prej, blokira migracijo RNA polimeraze in s tem zniža efektivnost transkripcije ali pa jo celo prepreči. Vezava liganda na aptamerno zaporedje povzroči njegovo konformacijsko spremembo, kar lahko vplivan na transkripcijsko aktivnost. Ker je v slednjem primeru prišlo do povišanja ravni prepisovanja, se je torej zgodila takšna konformacijska sprememba strukture aptamera, ki je omogočila bolj ugodno potovanje RNA polimeraze navzdol po verigi [1].

===Regulacija transkripcije v brezceličnem sistemu===

Znanstveniki so želeli preveriti, ali pride do podobnih stimulatornih odzivov kot pri in vitro eksperimentih, tudi v brezceličnih sistemih. Za te namene so uporabili plazmidno DNA, ki je vsebovala enako promotorsko in reportersko zaporedje. Vezava človeškega trombina na trombinski aptamer je tudi v tem primeru povišala raven prepisovanja. Ugotovili so, da je fluorescenca, ki torej odraža transkripcijsko aktivnost, na začetku naraščala, nato pa je začela kar naenkrat padati. Razumeti moramo namreč, da je brezceličen sistem kompleksen in lahko prihaja do interakcij med različnimi komponentami. Padanje fluorescence se lahko pojasni s prisotnimi RNazami v sistemu, ki razgradijo prepisana RNA zaporedja 3WJdB. Na začetku je torej nivo transkripcije višji od degradacije, kar se kaže z naraščajočo fluorescenco. Po približno 30-60 min fluorescenca doseže vrh in začne padati, torej postane razgrajanje fluorescenčnega zaporedja 3WJdB hitrejše kot njegovo prepisovanje. Po 3-4 urah pride do razgradnje večine zaporedij 3WJdB, in s tem do znižanja fluorescence na bazalni nivo [1].
Ugotovili so tudi, da je nivo fluorescence bistveno nižji v brezceličnem sistemu, kot pri in vitro poskusih [1].

==Pridobivanje in preizkušanje novih aptamerov (CIVT-SELEX)==

===Capture-SELEX===

Ker so bili efekti vezave liganda na aptamerno zaporedje, torej povišanja transkripcije, premalo izraziti, so želeli pridobiti nove aptamere, ki se bodo odzivali na manjše koncentracije liganda, hkrati pa se jih bo lahko vključilo v biološka vezja. Za ta namen so uporabili metodo imenovano Capture-SELEX [1].
Oligonukleotidi iz knjižnice za Capture-SELEX so vsebovali 2 restrikcijski mesti, mesta za prepoznavo začetnih oligonukleotidov, ter seriji 40 in 10 naključnih nukleotidov, med njima pa se je nahajalo umestitveno zaporedje. To zaporedje je bilo komplementarno zaporedju za zajem, ki je bilo na 3' koncu biotinilirano [1].
DNA iz knjižnice so imobilizirali na magnetne kroglice s strepravidinom. Nato so uporabili človeški trombin kot tarčo za selekcijo specifičnih aptamerov. Ob vezavi oligonukleotidov na človeški trombin je prišlo do spremembe tri dimenzionalne strukture oligov, kar je povzročilo sproščanje enoverižne DNA iz kompleksa DNA-magnetna kroglica. Enoverižne DNA so z uporabo začetnih oligonukleotidov na obeh koncih pomnožili in dobili več kopij dvoverižne DNA, nato pa so z eksonukleazo razrezali le novo nastalo verigo. Kopije enoverižnih DNA so uporabili za nov krog selekcije in to ponovili 8 krat, pri čemer so pri vsakem krogu znižali koncentracijo liganda [1].
Po 8 krogih je sledilo negativno presejanje. V tem primeru so bili kompleksi DNA-magnetna kroglica, pred inkubacijo s ligandom, postavljeni v brezcelični sistem. S tem so želeli izločiti tiste aptamere, ki bi se lahko vezali na komponentne brezceličnega sistema. Po 4 krogih so dobili zaporedja, ki so bila visoka specifična in afinitetna proti človeškemu trombinu [1].

===Selekcija aptamerov s pomočjo brezceličnega transkripcijskega presejanja===

Dobljena knjižnica enoverižnih DNA pri postopku Capture-SELEX je bila pomnožena v dvoverižne DNA in vstavljena v vektorsko ogrodje s pomočjo metode sestavljanja Golden Gate. Vektor, ki je vseboval še promotor J23151, reportersko zaporedje 3WJdB in terminator, je bil transformiran v E. coli DH5α. Izbranih je bilo 1000 posameznih kolonij, ki so jih pomnožili in na podlagi agarozne gelske elektroforeze določili 832 takšnih DNA, ki so vsebovale pravilna zaporedja promotorja, aptamera, reporterja in terminatorja. Da so zmanjšali obseg dela, so 2 posamezni linearni DNA združili v skupni vzorec in tako dobili 416 poskusnih skupin [1].
Vsaka poskusna skupina je bila prepisana direktno v brezcelični sistem, z ali brez človeškega trombina. Primerjali so razlike v fluorescenci ob dodatku trombina. Pri tistih skupinah, kjer so bile razlike najočitnejše, so ponovili postopek, le da so tokrat v brezcelični sistem prepisali le individualne linearne DNA, ne več v paru, in zopet spremljali razlike v fluorescenci ob dodatku 0,5 M človeškega trombina. Pri 6 aptamernih zaporedij (AS1-76, AS2-3, AS2-70, AS7-36, AS7-83, AS8-22) je prišlo do znatnega upada fluorescence ob prisotnosti liganda – človeškega trombina. Ko so jih posekvencirali so ugotovili, da so 3 zaporedja (AS2-3, AS7-36 in AS7-83) identična. V nadaljevanju so trem izbranim aptamernim zaporedjem (AS2-3, AS2-70 in AS8-22), poleg kontrolnega 29 nukleotidov dolgega aptamera, s pomočjo programa napovedali njihove sekundarne strukture. Njihova ∆G je bila pri vseh negativna, torej so sledeče sekundarne strukture stabilne pri 25°C [1].
3 omenjena aptamerna zaporedja so vstavili v stabilnejšo plazmidno obliko, da bi preverili odziv na tarčni ligand, zopet v brezceličnem sistemu. Rezultati so pokazali, da vsa 3 zaporedja povzročijo inhibicijo transkripcije ob dodatku 0,5 M in 1 M človeškega trombina, v primerjavi z negativno kontrolo brez vnesenega aptamernega zaporedja. Molekularni mehanizem takšne transkripcijske regulacije je enak kot je bil opisan prej. Pri prepisovanju, se ob vezavi RNA polimeraze na promotorsko zaporedje ustvari transkripcijski mehurček, ki izpostavi enoverižno aptamerno zaporedje, na katerega se lahko nato veže človeški trombin. Ker je v našem primeru prišlo do nižjega nivoja prepisovanja, je moralo torej ob vezavi liganda priti do takšnih konformacijskih sprememb v strukturi aptamera, da je prišlo do oteženega premikanja RNA polimeraze naprej po verigi [1].
Zanimivi so pridobljeni rezultati kontrolnega poskusa, kjer plazmid ni vseboval aptamernega zaporedja. Ob dodatku 1 M trombina je vseeno prišlo do inhibicije translacije. Človeški trombin naj bi namreč vplival na ekspresijo zaporedij v pripravljenem brezceličnem sistemu, v smislu nespecifične inhibicije. S tem se kažejo toksične lastnosti večjih koncentracij človeškega trombina v brezceličnih sistemih [1].

==Zaključek==

Aptameri imajo mnoge molekularne aplikacije zaradi njihove preproste in poceni priprave, majhne velikosti in velike pestrosti. Brezcelični transkripcijsko-translacijski sistem ponuja velik potencial kot platforma za hitro presajanje aptamerov in preizkušanje prototipov novih bioloških vezij. V tej študiji so znanstveniki z uporabo metode CIVT-SELEX, ki je sestavljena iz Capture-SELEX in iz in vitro presejalne transkripcije, uspeli izbrati takšne aptamere, ki so bili visoko specifični in afinitetni proti človeškemu trombinu, in so ob vezavi povzročili inhibitorne efekte na transkripcijsko aktivnost. Takšni rezultatu potrjujejo robustnost uporabe aptamerov kot genetskih delov, tako v linearnih DNA, kot tudi v plazmidih [1].

==Literatura==

[1] Guo S, Xu Z, Lin L, Guo Y, Li J, Lu C, Shi X, Yang H. Using CIVT-SELEX to Select Aptamers as Genetic Parts to Regulate Gene Circuits in a Cell-Free System. Int J Mol Sci. 2023 Feb 1;24(3):2833.

[2] Kohlberger M, Gadermaier G. SELEX: Critical factors and optimization strategies for successful aptamer selection. Biotechnol Appl Biochem. 2022 Oct;69(5):1771-1792.

Uporaba CIVT-SELEX za izbiro aptamerov kot genskih delov za regulacijo genetskih vezij v brezceličnem sistemu

2023-05-14T22:03:39Z

Klemen Kunej:

''Povzeto po članku: [https://www.mdpi.com/1422-0067/24/3/2833 Guo S, Xu Z, Lin L, Guo Y, Li J, Lu C, Shi X, Yang H. Using CIVT-SELEX to Select Aptamers as Genetic Parts to Regulate Gene Circuits in a Cell-Free System. Int J Mol Sci. 2023 Feb 1;24(3):2833. ]''

==Uvod==

Napredki v sintezni biologiji nam omogočajo načrtovanje dinamičnih in kompleksnih funkcij v živih organizmih. Realizacija teh kompleksnih funkcij je odvisna od ustvarjanja raznih delujočih genetskih vezij. Ustvarjena so bila številna sintetična genetska vezja, pri katerih je ključna regulacija genske ekspresije. Trenutno se pri večini relevantnih študij za regulacijo genske ekspresije uporablja transkripcijske faktorje in njihove operatorje (LacI/lacO, TetR/tetO). Čeprav je uporaba transkripcijskih faktorjev robustna, pa se pojavi pomanjkljivost v omejenem številu parov transkripcijski faktor-operator. Da bi rešili ta problem, so znanstveniki začeli preizkušati pare DNA aptamer- ligand kot genetske dele za regulacijo izražanja genov. DNA aptameri se specifično vežejo na ligand, ki je lahko majhna molekula ali protein, in tako tvorijo kompleks sposoben regulacije genske ekspresije. Ker so DNA aptameri enoverižne DNA, lahko tako teoretično obstaja na milijone različnih parov aptamer-ligand [1].
Najbolj uporabljen model aptamera je trombinski aptamer. Že v preteklosti se je raziskovala njegova uporaba kot biološkega dela, pri čemer so ga vstavljali na različne lokacije ob promotorju in preučevali, kako to vpliva na ekspresijo tarčnih genov. S tem so se ukvarjali tudi v tej študiji. Poleg tega, so razvili metodo CIVT-SELEX (angl. Capture and In Vitro Transcription-SELEX) s pomočjo katere so izbrali trombinske aptamere primerne za regulacijo genske transkripcije [1]. Gre za nadgradnjo metode SELEX (angl. systematic evolution of ligands by exponential enrichment), pri kateri aptamere presejamo in izberemo le tiste z visoko afiniteto za željen ligand [2].

==Raziskave z že obstoječim aptamernim zaporedjem==

===Regulacija in-vitro transkripcije===

Da bi znanstveniki preverili izvedljivost uporabe aptamerov kot genskih regulatorjev, so na začetku uporabili, do sedaj dobro preučen, 29 nukleotidov dolg trombinski aptamer. Tega so vključili na različne lokacije blizu promotorske regije. Zanimalo jih je, kako bo vključitev aptamernega zaporedja v linearno DNA vplivala na in vitro transkripcijsko aktivnost, še bolj pa jih je zanimalo, kako bo na prepisovanje vplivala vezava liganda (človeškega trombina) na to aptamerno zaporedje. Transkripcijsko aktivnost so spremljali preko fluorescence reporterskega zaporedja 3WJdB, ki omogoča spremljanje transkripcijske aktivnosti v realnem času. Ugotovili so, da vključitev aptamera blizu promotorskega zaporedja zniža transkripcijsko aktivnost reporterskega zaporedja, saj ta s svojo sekundarno strukturo blokira potovanje RNA polimeraze navzdol po verigi [1].
Ob dodatku človeškega trombina, v večini primerov ni prišlo do očitnih sprememb transkripcijske aktivnosti v primerjavi s kontrolnim poskusom. Je pa v primeru vključitve trombinskega aptamera v smerno verigo navzdol od promotorja, prišlo do povišane transkripcije. Ob vezavi RNA polimeraze na promotorsko regijo pride namreč do odvitja dvojne vijačnice DNA. Ustvari se transkripcijski mehurček, ki izpostavi aptamerno zaporedje, ki lahko, kot omenjeno prej, blokira migracijo RNA polimeraze in s tem zniža efektivnost transkripcije ali pa jo celo prepreči. Vezava liganda na aptamerno zaporedje povzroči njegovo konformacijsko spremembo, kar lahko vplivan na transkripcijsko aktivnost. Ker je v slednjem primeru prišlo do povišanja ravni prepisovanja, se je torej zgodila takšna konformacijska sprememba strukture aptamera, ki je omogočila bolj ugodno potovanje RNA polimeraze navzdol po verigi [1].

===Regulacija transkripcije v brezceličnem sistemu===

Znanstveniki so želeli preveriti, ali pride do podobnih stimulatornih odzivov kot pri in vitro eksperimentih, tudi v brezceličnih sistemih. Za te namene so uporabili plazmidno DNA, ki je vsebovala enako promotorsko in reportersko zaporedje. Vezava človeškega trombina na trombinski aptamer je tudi v tem primeru povišala raven prepisovanja. Ugotovili so, da je fluorescenca, ki torej odraža transkripcijsko aktivnost, na začetku naraščala, nato pa je začela kar naenkrat padati. Razumeti moramo namreč, da je brezceličen sistem kompleksen in lahko prihaja do interakcij med različnimi komponentami. Padanje fluorescence se lahko pojasni s prisotnimi RNazami v sistemu, ki razgradijo prepisana RNA zaporedja 3WJdB. Na začetku je torej nivo transkripcije višji od degradacije, kar se kaže z naraščajočo fluorescenco. Po približno 30-60 min fluorescenca doseže vrh in začne padati, torej postane razgrajanje fluorescenčnega zaporedja 3WJdB hitrejše kot njegovo prepisovanje. Po 3-4 urah pride do razgradnje večine zaporedij 3WJdB, in s tem do znižanja fluorescence na bazalni nivo [1].
Ugotovili so tudi, da je nivo fluorescence bistveno nižji v brezceličnem sistemu, kot pri in vitro poskusih [1].

==Pridobivanje in preizkušanje novih aptamerov (CIVT-SELEX)==

===Capture-SELEX===

Ker so bili efekti vezave liganda na aptamerno zaporedje, torej povišanja transkripcije, premalo izraziti, so želeli pridobiti nove aptamere, ki se bodo odzivali na manjše koncentracije liganda, hkrati pa se jih bo lahko vključilo v biološka vezja. Za ta namen so uporabili metodo imenovano Capture-SELEX [1].
Oligonukleotidi iz knjižnice za Capture-SELEX so vsebovali 2 restrikcijski mesti, mesta za prepoznavo začetnih oligonukleotidov, ter seriji 40 in 10 naključnih nukleotidov, med njima pa se je nahajalo umestitveno zaporedje. To zaporedje je bilo komplementarno zaporedju za zajem, ki je bilo na 3' koncu biotinilirano [1].
DNA iz knjižnice so imobilizirali na magnetne kroglice s strepravidinom. Nato so uporabili človeški trombin kot tarčo za selekcijo specifičnih aptamerov. Ob vezavi oligonukleotidov na človeški trombin je prišlo do spremembe tri dimenzionalne strukture oligov, kar je povzročilo sproščanje enoverižne DNA iz kompleksa DNA-magnetna kroglica. Enoverižne DNA so z uporabo začetnih oligonukleotidov na obeh koncih pomnožili in dobili več kopij dvoverižne DNA, nato pa so z eksonukleazo razrezali le novo nastalo verigo. Kopije enoverižnih DNA so uporabili za nov krog selekcije in to ponovili 8 krat, pri čemer so pri vsakem krogu znižali koncentracijo liganda [1].
Po 8 krogih je sledilo negativno presejanje. V tem primeru so bili kompleksi DNA-magnetna kroglica, pred inkubacijo s ligandom, postavljeni v brezcelični sistem. S tem so želeli izločiti tiste aptamere, ki bi se lahko vezali na komponentne brezceličnega sistema. Po 4 krogih so dobili zaporedja, ki so bila visoka specifična in afinitetna proti človeškemu trombinu [1].

===Selekcija aptamerov s pomočjo brezceličnega transkripcijskega presejanja===

Dobljena knjižnica enoverižnih DNA pri postopku Capture-SELEX je bila pomnožena v dvoverižne DNA in vstavljena v vektorsko ogrodje s pomočjo metode sestavljanja Golden Gate. Vektor, ki je vseboval še promotor J23151, reportersko zaporedje 3WJdB in terminator, je bil transformiran v E. coli DH5α. Izbranih je bilo 1000 posameznih kolonij, ki so jih pomnožili in na podlagi agarozne gelske elektroforeze določili 832 takšnih DNA, ki so vsebovale pravilna zaporedja promotorja, aptamera, reporterja in terminatorja. Da so zmanjšali obseg dela, so 2 posamezni linearni DNA združili v skupni vzorec in tako dobili 416 poskusnih skupin [1].
Vsaka poskusna skupina je bila prepisana direktno v brezcelični sistem, z ali brez človeškega trombina. Primerjali so razlike v fluorescenci ob dodatku trombina. Pri tistih skupinah, kjer so bile razlike najočitnejše, so ponovili postopek, le da so tokrat v brezcelični sistem prepisali le individualne linearne DNA, ne več v paru, in zopet spremljali razlike v fluorescenci ob dodatku 0,5 M človeškega trombina. Pri 6 aptamernih zaporedij (AS1-76, AS2-3, AS2-70, AS7-36, AS7-83, AS8-22) je prišlo do znatnega upada fluorescence ob prisotnosti liganda – človeškega trombina. Ko so jih posekvencirali so ugotovili, da so 3 zaporedja (AS2-3, AS7-36 in AS7-83) identična. V nadaljevanju so trem izbranim aptamernim zaporedjem (AS2-3, AS2-70 in AS8-22), poleg kontrolnega 29 nukleotidov dolgega aptamera, s pomočjo programa napovedali njihove sekundarne strukture. Njihova ∆G je bila pri vseh negativna, torej so sledeče sekundarne strukture stabilne pri 25°C [1].
3 omenjena aptamerna zaporedja so vstavili v stabilnejšo plazmidno obliko, da bi preverili odziv na tarčni ligand, zopet v brezceličnem sistemu. Rezultati so pokazali, da vsa 3 zaporedja povzročijo inhibicijo transkripcije ob dodatku 0,5 M in 1 M človeškega trombina, v primerjavi z negativno kontrolo brez vnesenega aptamernega zaporedja. Molekularni mehanizem takšne transkripcijske regulacije je enak kot je bil opisan prej. Pri prepisovanju, se ob vezavi RNA polimeraze na promotorsko zaporedje ustvari transkripcijski mehurček, ki izpostavi enoverižno aptamerno zaporedje, na katerega se lahko nato veže človeški trombin. Ker je v našem primeru prišlo do nižjega nivoja prepisovanja, je moralo torej ob vezavi liganda priti do takšnih konformacijskih sprememb v strukturi aptamera, da je prišlo do oteženega premikanja RNA polimeraze naprej po verigi [1].
Zanimivi so pridobljeni rezultati kontrolnega poskusa, kjer plazmid ni vseboval aptamernega zaporedja. Ob dodatku 1 M trombina je vseeno prišlo do inhibicije translacije. Človeški trombin naj bi namreč vplival na ekspresijo zaporedij v pripravljenem brezceličnem sistemu, v smislu nespecifične inhibicije. S tem se kažejo toksične lastnosti večjih koncentracij človeškega trombina v brezceličnih sistemih [1].

==Zaključek==

Aptameri imajo mnoge molekularne aplikacije zaradi njihove preproste in poceni priprave, majhne velikosti in velike pestrosti. Brezcelični transkripcijsko-translacijski sistem ponuja velik potencial kot platforma za hitro presajanje aptamerov in preizkušanje prototipov novih bioloških vezij. V tej študiji so znanstveniki z uporabo metode CIVT-SELEX, ki je sestavljena iz Capture-SELEX in iz in vitro presejalne transkripcije, uspeli izbrati takšne aptamere, ki so bili visoko specifični in afinitetni proti človeškemu trombinu, in so ob vezavi povzročili inhibitorne efekte na transkripcijsko aktivnost. Takšni rezultatu potrjujejo robustnost uporabe aptamerov kot genetskih delov, tako v linearnih DNA, kot tudi v plazmidih [1].

==Literatura==

[1] Guo S, Xu Z, Lin L, Guo Y, Li J, Lu C, Shi X, Yang H. Using CIVT-SELEX to Select Aptamers as Genetic Parts to Regulate Gene Circuits in a Cell-Free System. Int J Mol Sci. 2023 Feb 1;24(3):2833.

[2] Kohlberger M, Gadermaier G. SELEX: Critical factors and optimization strategies for successful aptamer selection. Biotechnol Appl Biochem. 2022 Oct;69(5):1771-1792.

Uporaba CIVT-SELEX za izbiro aptamerov kot genskih delov za regulacijo genetskih vezij v brezceličnem sistemu

2023-05-14T22:02:43Z

Klemen Kunej:

''Povzeto po članku: [https://www.mdpi.com/1422-0067/24/3/2833 Guo S, Xu Z, Lin L, Guo Y, Li J, Lu C, Shi X, Yang H. Using CIVT-SELEX to Select Aptamers as Genetic Parts to Regulate Gene Circuits in a Cell-Free System. Int J Mol Sci. 2023 Feb 1;24(3):2833. ]''

==Uvod==

Napredki v sintezni biologiji nam omogočajo načrtovanje dinamičnih in kompleksnih funkcij v živih organizmih. Realizacija teh kompleksnih funkcij je odvisna od ustvarjanja raznih delujočih genetskih vezij. Ustvarjena so bila številna sintetična genetska vezja, pri katerih je ključna regulacija genske ekspresije. Trenutno se pri večini relevantnih študij za regulacijo genske ekspresije uporablja transkripcijske faktorje in njihove operatorje (LacI/lacO, TetR/tetO). Čeprav je uporaba transkripcijskih faktorjev robustna, pa se pojavi pomanjkljivost v omejenem številu parov transkripcijski faktor-operator. Da bi rešili ta problem, so znanstveniki začeli preizkušati pare DNA aptamer- ligand kot genetske dele za regulacijo izražanja genov. DNA aptameri se specifično vežejo na ligand, ki je lahko majhna molekula ali protein, in tako tvorijo kompleks sposoben regulacije genske ekspresije. Ker so DNA aptameri enoverižne DNA, lahko tako teoretično obstaja na milijone različnih parov aptamer-ligand [1].
Najbolj uporabljen model aptamera je trombinski aptamer. Že v preteklosti se je raziskovala njegova uporaba kot biološkega dela, pri čemer so ga vstavljali na različne lokacije ob promotorju in preučevali, kako to vpliva na ekspresijo tarčnih genov. S tem so se ukvarjali tudi v tej študiji. Poleg tega, so razvili metodo CIVT-SELEX (angl. Capture and In Vitro Transcription-SELEX) s pomočjo katere so izbrali trombinske aptamere primerne za regulacijo genske transkripcije [1]. Gre za nadgradnjo metode SELEX (angl. systematic evolution of ligands by exponential enrichment), pri kateri aptamere presejamo in izberemo le tiste z visoko afiniteto za željen ligand [2].

==Raziskave z že obstoječim aptamernim zaporedjem==

===Regulacija in-vitro transkripcije===

Da bi znanstveniki preverili izvedljivost uporabe aptamerov kot genskih regulatorjev, so na začetku uporabili, do sedaj dobro preučen, 29 nukleotidov dolg trombinski aptamer. Tega so vključili na različne lokacije blizu promotorske regije. Zanimalo jih je, kako bo vključitev aptamernega zaporedja v linearno DNA vplivala na in vitro transkripcijsko aktivnost, še bolj pa jih je zanimalo, kako bo na prepisovanje vplivala vezava liganda (človeškega trombina) na to aptamerno zaporedje. Transkripcijsko aktivnost so spremljali preko fluorescence reporterskega zaporedja 3WJdB, ki omogoča spremljanje transkripcijske aktivnosti v realnem času. Ugotovili so, da vključitev aptamera blizu promotorskega zaporedja zniža transkripcijsko aktivnost reporterskega zaporedja, saj ta s svojo sekundarno strukturo blokira potovanje RNA polimeraze navzdol po verigi [1].
Ob dodatku človeškega trombina, v večini primerov ni prišlo do očitnih sprememb transkripcijske aktivnosti v primerjavi s kontrolnim poskusom. Je pa v primeru vključitve trombinskega aptamera v smerno verigo navzdol od promotorja, prišlo do povišane transkripcije. Ob vezavi RNA polimeraze na promotorsko regijo pride namreč do odvitja dvojne vijačnice DNA. Ustvari se transkripcijski mehurček, ki izpostavi aptamerno zaporedje, ki lahko, kot omenjeno prej, blokira migracijo RNA polimeraze in s tem zniža efektivnost transkripcije ali pa jo celo prepreči. Vezava liganda na aptamerno zaporedje povzroči njegovo konformacijsko spremembo, kar lahko vplivan na transkripcijsko aktivnost. Ker je v slednjem primeru prišlo do povišanja ravni prepisovanja, se je torej zgodila takšna konformacijska sprememba strukture aptamera, ki je omogočila bolj ugodno potovanje RNA polimeraze navzdol po verigi [1].

===Regulacija transkripcije v brezceličnem sistemu===

Znanstveniki so želeli preveriti, ali pride do podobnih stimulatornih odzivov kot pri in vitro eksperimentih, tudi v brezceličnih sistemih. Za te namene so uporabili plazmidno DNA, ki je vsebovala enako promotorsko in reportersko zaporedje. Vezava človeškega trombina na trombinski aptamer je tudi v tem primeru povišala raven prepisovanja. Ugotovili so, da je fluorescenca, ki torej odraža transkripcijsko aktivnost, na začetku naraščala, nato pa je začela kar naenkrat padati. Razumeti moramo namreč, da je brezceličen sistem kompleksen in lahko prihaja do interakcij med različnimi komponentami. Padanje fluorescence se lahko pojasni s prisotnimi RNazami v sistemu, ki razgradijo prepisana RNA zaporedja 3WJdB. Na začetku je torej nivo transkripcije višji od degradacije, kar se kaže z naraščajočo fluorescenco. Po približno 30-60 min fluorescenca doseže vrh in začne padati, torej postane razgrajanje fluorescenčnega zaporedja 3WJdB hitrejše kot njegovo prepisovanje. Po 3-4 urah pride do razgradnje večine zaporedij 3WJdB, in s tem do znižanja fluorescence na bazalni nivo [1].
Ugotovili so tudi, da je nivo fluorescence bistveno nižji v brezceličnem sistemu, kot pri in vitro poskusih [1].

==Pridobivanje in preizkušanje novih aptamerov (CIVT-SELEX)==

===Capture-SELEX===

Ker so bili efekti vezave liganda na aptamerno zaporedje, torej povišanja transkripcije, premalo izraziti, so želeli pridobiti nove aptamere, ki se bodo odzivali na manjše koncentracije liganda, hkrati pa se jih bo lahko vključilo v biološka vezja. Za ta namen so uporabili metodo imenovano Capture-SELEX [1].
Oligonukleotidi iz knjižnice za Capture-SELEX so vsebovali 2 restrikcijski mesti, mesta za prepoznavo začetnih oligonukleotidov, ter seriji 40 in 10 naključnih nukleotidov, med njima pa se je nahajalo umestitveno zaporedje. To zaporedje je bilo komplementarno zaporedju za zajem, ki je bilo na 3' koncu biotinilirano [1].
DNA iz knjižnice so imobilizirali na magnetne kroglice s strepravidinom. Nato so uporabili človeški trombin kot tarčo za selekcijo specifičnih aptamerov. Ob vezavi oligonukleotidov na človeški trombin je prišlo do spremembe tri dimenzionalne strukture oligov, kar je povzročilo sproščanje enoverižne DNA iz kompleksa DNA-magnetna kroglica. Enoverižne DNA so z uporabo začetnih oligonukleotidov na obeh koncih pomnožili in dobili več kopij dvoverižne DNA, nato pa so z eksonukleazo razrezali le novo nastalo verigo. Kopije enoverižnih DNA so uporabili za nov krog selekcije in to ponovili 8 krat, pri čemer so pri vsakem krogu znižali koncentracijo liganda [1].
Po 8 krogih je sledilo negativno presejanje. V tem primeru so bili kompleksi DNA-magnetna kroglica, pred inkubacijo s ligandom, postavljeni v brezcelični sistem. S tem so želeli izločiti tiste aptamere, ki bi se lahko vezali na komponentne brezceličnega sistema. Po 4 krogih so dobili zaporedja, ki so bila visoka specifična in afinitetna proti človeškemu trombinu [1].

===Selekcija aptamerov s pomočjo brezceličnega transkripcijskega presejanja===

Dobljena knjižnica enoverižnih DNA pri postopku Capture-SELEX je bila pomnožena v dvoverižne DNA in vstavljena v vektorsko ogrodje s pomočjo metode sestavljanja Golden Gate. Vektor, ki je vseboval še promotor J23151, reportersko zaporedje 3WJdB in terminator, je bil transformiran v E. coli DH5α. Izbranih je bilo 1000 posameznih kolonij, ki so jih pomnožili in na podlagi agarozne gelske elektroforeze določili 832 takšnih DNA, ki so vsebovale pravilna zaporedja promotorja, aptamera, reporterja in terminatorja. Da so zmanjšali obseg dela, so 2 posamezni linearni DNA združili v skupni vzorec in tako dobili 416 poskusnih skupin [1].
Vsaka poskusna skupina je bila prepisana direktno v brezcelični sistem, z ali brez človeškega trombina. Primerjali so razlike v fluorescenci ob dodatku trombina. Pri tistih skupinah, kjer so bile razlike najočitnejše, so ponovili postopek, le da so tokrat v brezcelični sistem prepisali le individualne linearne DNA, ne več v paru, in zopet spremljali razlike v fluorescenci ob dodatku 0,5 M človeškega trombina. Pri 6 aptamernih zaporedij (AS1-76, AS2-3, AS2-70, AS7-36, AS7-83, AS8-22) je prišlo do znatnega upada fluorescence ob prisotnosti liganda – človeškega trombina. Ko so jih posekvencirali so ugotovili, da so 3 zaporedja (AS2-3, AS7-36 in AS7-83) identična. V nadaljevanju so trem izbranim aptamernim zaporedjem (AS2-3, AS2-70 in AS8-22), poleg kontrolnega 29 nukleotidov dolgega aptamera, s pomočjo programa napovedali njihove sekundarne strukture. Njihova ∆G je bila pri vseh negativna, torej so sledeče sekundarne strukture stabilne pri 25°C [1].
3 omenjena aptamerna zaporedja so vstavili v stabilnejšo plazmidno obliko, da bi preverili odziv na tarčni ligand, zopet v brezceličnem sistemu. Rezultati so pokazali, da vsa 3 zaporedja povzročijo inhibicijo transkripcije ob dodatku 0,5 M in 1 M človeškega trombina, v primerjavi z negativno kontrolo brez vnesenega aptamernega zaporedja. Molekularni mehanizem takšne transkripcijske regulacije je enak kot je bil opisan prej. Pri prepisovanju, se ob vezavi RNA polimeraze na promotorsko zaporedje ustvari transkripcijski mehurček, ki izpostavi enoverižno aptamerno zaporedje, na katerega se lahko nato veže človeški trombin. Ker je v našem primeru prišlo do nižjega nivoja prepisovanja, je moralo torej ob vezavi liganda priti do takšnih konformacijskih sprememb v strukturi aptamera, da je prišlo do oteženega premikanja RNA polimeraze naprej po verigi [1].
Zanimivi so pridobljeni rezultati kontrolnega poskusa, kjer plazmid ni vseboval aptamernega zaporedja. Ob dodatku 1 M trombina je vseeno prišlo do inhibicije translacije. Človeški trombin naj bi namreč vplival na ekspresijo zaporedij v pripravljenem brezceličnem sistemu, v smislu nespecifične inhibicije. S tem se kažejo toksične lastnosti večjih koncentracij človeškega trombina v brezceličnih sistemih [1].

==Zaključek==

Aptameri imajo mnoge molekularne aplikacije zaradi njihove preproste in poceni priprave, majhne velikosti in velike pestrosti. Brezcelični transkripcijsko-translacijski sistem ponuja velik potencial kot platforma za hitro presajanje aptamerov in preizkušanje prototipov novih bioloških vezij. V tej študiji so znanstveniki z uporabo metode CIVT-SELEX, ki je sestavljena iz Capture-SELEX in iz in vitro presejalne transkripcije, uspeli izbrati takšne aptamere, ki so bili visoko specifični in afinitetni proti človeškemu trombinu, in so ob vezavi povzročili inhibitorne efekte na transkripcijsko aktivnost. Takšni rezultatu potrjujejo robustnost uporabe aptamerov kot genetskih delov, tako v linearnih DNA, kot tudi v plazmidih [1].

==Literatura==

[1] Guo S, Xu Z, Lin L, Guo Y, Li J, Lu C, Shi X, Yang H. Using CIVT-SELEX to Select Aptamers as Genetic Parts to Regulate Gene Circuits in a Cell-Free System. Int J Mol Sci. 2023 Feb 1;24(3):2833.

[2] Kohlberger M, Gadermaier G. SELEX: Critical factors and optimization strategies for successful aptamer selection. Biotechnol Appl Biochem. 2022 Oct;69(5):1771-1792.

Uporaba CIVT-SELEX za izbiro aptamerov kot genskih delov za regulacijo genetskih vezij v brezceličnem sistemu

2023-05-14T21:56:39Z

Klemen Kunej:

''Povzeto po članku: [https://www.mdpi.com/1422-0067/24/3/2833 Guo S, Xu Z, Lin L, Guo Y, Li J, Lu C, Shi X, Yang H. Using CIVT-SELEX to Select Aptamers as Genetic Parts to Regulate Gene Circuits in a Cell-Free System. Int J Mol Sci. 2023 Feb 1;24(3):2833. ]''

==UVOD==

Napredki v sintezni biologiji nam omogočajo načrtovanje dinamičnih in kompleksnih funkcij v živih organizmih. Realizacija teh kompleksnih funkcij je odvisna od ustvarjanja raznih delujočih genetskih vezij. Ustvarjena so bila številna sintetična genetska vezja, pri katerih je ključna regulacija genske ekspresije. Trenutno se pri večini relevantnih študij za regulacijo genske ekspresije uporablja transkripcijske faktorje in njihove operatorje (LacI/lacO, TetR/tetO). Čeprav je uporaba transkripcijskih faktorjev robustna, pa se pojavi pomanjkljivost v omejenem številu parov transkripcijski faktor-operator. Da bi rešili ta problem, so znanstveniki začeli preizkušati pare DNA aptamer- ligand kot genetske dele za regulacijo izražanja genov. DNA aptameri se specifično vežejo na ligand, ki je lahko majhna molekula ali protein, in tako tvorijo kompleks sposoben regulacije genske ekspresije. Ker so DNA aptameri enoverižne DNA, lahko tako teoretično obstaja na milijone različnih parov aptamer-ligand [1].
Najbolj uporabljen model aptamera je trombinski aptamer. Že v preteklosti se je raziskovala njegova uporaba kot biološkega dela, pri čemer so ga vstavljali na različne lokacije ob promotorju in preučevali, kako to vpliva na ekspresijo tarčnih genov. S tem so se ukvarjali tudi v tej študiji. Poleg tega, so razvili metodo CIVT-SELEX (angl. Capture and In Vitro Transcription-SELEX) s pomočjo katere so izbrali trombinske aptamere primerne za regulacijo genske transkripcije [1]. Gre za nadgradnjo metode SELEX (angl. systematic evolution of ligands by exponential enrichment), pri kateri aptamere presejamo in izberemo le tiste z visoko afiniteto za željen ligand [2].

==Raziskave z že obstoječim aptamernim zaporedjem==

===Plazmid pSC101===

Delovanje Tulipa temelji na mehanizmu podvojevanja plazmida pSC101. Ta plazmid v svojem zapisu vsebuje gen za protein repA, ki je dolg 316 aminokislin in se lahko v monomerni obliki veže na vezavno mesto na mestu ori plazmida pSC101. Vezan tvori povezavo z drugimi proteini in spodbudi podvojevanje plazmida. Ob višji koncentraciji v celici protein repA tvori dimere. Kot tak se ne more vezati na vezavno mesto na mestu ori in ne more spodbujati procesa podvojevanje, ampak se veže na lastno regulatorno regijo in inhibira lastno transkripcijo. Zaradi ravnotežja med monomerno in dimerno obliko proteina repA, je število kopij plazmida pSC101 navadno omejeno na 3 kopije na celico [1, 3].

===Mutacije v proteinu repA===

Mutacije v zapisu za protein repA lahko zmanjšajo medsebojno afiniteto monomerov, da bi tvorili dimere, kar vpliva na število kopij plazmida v celici. Z mutacijami ključnih aminokislinskih ostankov, pomembnih za dimerizacijo, so dobili več mutant proteina repA, katerih zapise so vgradili v vključek, ki je imel vključen še zapis za robustno obliko zelenega fluorescenčnega proteina (sfGFP) pod konstitutivnim promotorjem. Merili so fluorescenco sfGFP v odvisnosti od števila kopij plazmida v celici, ki so ga merili s PCR v realnem času. Ugotovili so, da je fluorescenca sfGFP sorazmerna s številom kopij plazmida v celici [1].

V naslednjem eksperimentu so delali z mutiranim repA, ki ni več tvoril dimerov (repAv7), se je bil pa še vedno zmožen vezati na svoje vezavno mesto na mestu ori plazmida pSC101. Zapis za repAv7 so dali na drug plazmid pod inducibilni promotor PCymRC. Na operatorsko regijo pred promotorjem PCymRC se veže represor cymRAM. Ob prisotnosti kuminske kisline (4-izopropil benzojska kislina), ki se veže na cymRAM, se cymRAM ne more več vezati na opreratorsko regijo in transkripcija genov pod promotorjem PCymRC lahko steče. Poleg tega vektorja so v bakterijske celice transformirali še divji tip vektorja pSC101 z zapisom za sfGFP pod konstitutivnim promotorjem. Ob dodatku kuminske kisline v gojišče pride do sinteze repAv7, ki se veže na mesto ori plazmida pSC101 in inducira njegovo podvojevanje. Ob povečanju koncentracije kuminske kisline so zaznali večjo fluorescenco sfGFP in večje število kopij vektorja pSC101 v bakterijskih celicah [1, 4].

==Optimizacija Tulipa==

Za lažjo uporabo so se odločili združiti celoten sistem na en sam konstrukt. Pod promotor PCymRC so vključili zapisa za proteina repAv7 in cymRAM. Ob dodatku kuminske kisline se cymRAM ni več mogel vezati na promotor, torej je potekala transkripcija genov za repAv7 in cymRAM. Zaradi povišanje koncentracije repAv7 je prišlo do višanja števila kopij plazmida v celici. Ko je količina sintetiziranega cymRAM presegla raven kuminske kisline v celici, se je cymRAM zopet vezal na promotor PCymRC, do transkripcije ni prišlo, število kopij plazmida v celici pa se je ustalilo. Spreminjanje koncentracije kuminske kisline v rastnem mediju celic je učinkovito delovalo na spreminjanje števila kopij plazmida v bakterijskih celicah [1].

===Spreminjanje RBS in dodajanje degradacijske oznake===

Sistem Tulip so dodatno izboljšali z optimizacijo ribosom vezavnih mest pred zapisoma za repAv7 in cymRAM. Naredili so plazmidne knjižnice z različnimi RBS, ki so jih transformirali v bakterijske celice, s pretočno citometrijo pa so merili fluorescenco konstitutivno izraženega sfGFP. Pri nizkih koncentracijah kuminske kisline je pogosto prišlo do prevelikega števila kopij plazmida v celici, kar so pripisali prepočasni razgradnji repAv7. Problem so rešili tako, da so zapisu za repAv7 dodali zapis za degradacijsko oznako. Degradacijska oznaka poveča hitrost razgradnje proteina tako, da omogoči lažjo vezavo na proteaze, ki so odgovorne za razgradnjo drugih endogenih proteinov v celici. Preizkušali so delovanje dveh degradacijskih oznak (AAV in AVS), kot boljša se je izkazala oznaka AAV [1, 5].

===Karakterizacija Tulipa===

Sistem Tulip so vključili v vektor in ga transformirali v bakterije seva NEBStable. Sev NEBStable je posebej primeren za transformacijo in pomnoževanje plazmidov. Na njem so okarakterizirali delovanje Tulipa tako, da so merili fluorescenco sfGFP v odvisnosti od koncentracije kuminske kisline. S PCR v realnem času so ugotovili, da lahko spreminjamo vrednost števila kopij plazmida med 2,9 in 50,9. Fluorescenca GFP je bila sorazmerna dodani kuminski kislini in številu kopij plazmida. Preverjali so tudi rast bakterijskih celic in ugotovili, da sistem Tulip ne predstavlja dodatnega bremena celicam, rast celic je bila primerljiva pri različnih koncentracijah kuminske kisline [1].

==Lastnosti Tulipa==

===Obstojnost v drugih bakterijskih sevih===

Učinkovitost Tulipa so preverili tudi v drugih pogosto uporabljenih bakterijskih sevih: DH10B (klonirni sev), NEBExpress (modificiran ekspresijski sev), BW25113 in MG1655 (modelni sev). Vse seve so transformirali s sistemom Tulip s konstitutivno izraženim zapisom za sfGFP. Vsi sevi razen seva NEBExpress so imeli število kopij plazmida sorazmerno s koncentracijo kuminske kisline, dodane gojišču. Sev NEBExpress je imel izmerjeno višjo fluorescenco sfGFP in višje število kopij plazmida že pri nizki koncentraciji kuminske kisline. Sev NEBExpress ima okvarjenih več proteinov, ki so odgovorni za razgradnjo drugih proteinov v celici, zato je v njem prišlo do kopičenja repAv7 in do sorazmernega povečanja števila kopij plazmida in fluorescence [1].

===Regulacija Tulipa===

Lastnosti Tulipa v daljšem časovnem obdobju so opazovali preko gojenja celic z vključkom s Tulipom v turbidostatu. Turbidostat omogoča gojenje celic pri konstantnih pogojih (temperatura, sestava gojišča). Celice so v turbidostatu gojili 48 ur, med katerimi so v dvanajsturnih intervalih spreminjali koncentracijo kuminske kisline v gojišču. Ugotovili so, da do spremembe fluorescence, ki je posledica spremembe koncentracije kuminske kisline, pride v treh do štirih urah. Rast celic je bila skozi celotno časovno obdobje konstantna. Tudi po 50 urah gojenja se je sistem Tulip obdržal v celicah. V kontrolnem poskusu, kjer je gojenje celic potekalo v gojišču brez antibiotika, pa so opazili, da je pri nizkih koncentracijah kuminske kisline prišlo do izgube vključka v bakterijah, zato moramo ob gojenju celic s sistemom Tulip obvezno izvajati selekcijo z antibiotiki [1].

==Uporaba Tulipa==

Sistem Tulip omogoča hitrejšo izbiro pravega števila kopij plazmida v celici. Sistem Tulip so vgradili v dva vektorja, ki sta že imela vključena sistema za zaznavanje homoserin laktona (AHL) ali vanilne kisline. Ob prisotnosti liganda je v vsakem sistemu prišlo do transkripcije gena za škrlaten fluorescenčni protein (mScarI). Vsak vektor je imel vključen še zapis za sfGFP pod konstitutivnem promotorju. Oba vektorja so transformirali v bakterijske celice. Ob različnih koncentracijah kuminske kisline in induktorja (AHL ali vanilna kislina) v gojišču so opazovali fluorescenco sfGFP in mScarI. Pri višjih koncentracijah kuminske kisline je prišlo do višje ekspresije mScarI (sorazmerno z dodatkom AHL ali vanilne kisline). Višje izražanje mScarI je negativno vplivalo na izražanje sfGFP pri isti koncentraciji kuminske kisline, kar so pripisali tekmovanju za aminokisline, potrebne za sintezo obeh fluorescenčnih proteinov. Podobne rezultate dobimo tudi pri plazmidih z velikim številom kopij v celici [1].

==Zaključek==

Za izražanje proteinov je poleg učinkovitega promotorja pomembno tudi število kopij plazmida v celicah, kar omogoča sistem Tulip. Omogoča dinamično regulacijo števila kopij plazmida v celici skozi čas, je obstojen v celicah, uporaben v več bakterijskih sevih in ne povzroča dodatnega bremena celicam. Prava prednost Tulipa leži v krajšem času, ki je potreben za izbiro pravega števila kopij plazmida. Namesto, da vključke kloniramo v vektorje z različnimi števili kopij na celico in vsak vektor posebej transformiramo v celice, lahko v celice vključimo sistem Tulip in s spreminjanjem koncentracije kuminske kisline izberemo pravo število kopij plazmida, s čimer prihranimo na času in denarju.

==Literatura==

[1] S. H. N. Joshi, C. Yong, A. Gyorgy: Inducible plasmid copy number control for synthetic biology in commonly used E. coli strains. Nat. Commun. 2022, 13.

[2] K. Friehs: Plasmid copy number and plasmid stability. Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 2004, 86, 47–82.

[3] D. Manen, L. Caro: The replication of plasmid pSC101. Mol. Microbiol. 1991, 5, 233–237.

[4] A. Mullick, Y. Xu, R. Warren, M. Koutroumanis, C. Guilbault, S. Broussau, F. Malenfant, L. Bourget, L. Lamoureux, R. Lo, et al.: The cumate gene-switch: A system for regulated expression in mammalian cells. BMC Biotechnol. 2006, 6, 1–18.

[5] D. E. Cameron, J. J. Collins: Tunable protein degradation in bacteria. Nat. Biotechnol. 2014, 32, 1276–1281.

Uporaba CIVT-SELEX za izbiro aptamerov kot genskih delov za regulacijo genetskih vezij v brezceličnem sistemu

2023-05-14T21:51:44Z

Klemen Kunej: New page: ''Povzeto po članku: [https://www.nature.com/articles/s41467-022-34390-7 S. H. N. Joshi, C. Yong, A. Gyorgy: Inducible plasmid copy number control for synthetic biology in commonly used E...

''Povzeto po članku: [https://www.nature.com/articles/s41467-022-34390-7 S. H. N. Joshi, C. Yong, A. Gyorgy: Inducible plasmid copy number control for synthetic biology in commonly used E. coli strains. Nat. Commun. 2022, 13. ]''

==Uvod==
Ekspresija proteinov obsega več korakov in zahteva poznavanje več sistemov. Da učinkovito izražamo proteine v bakterijskih celicah moramo razumeti potek transkripcije in translacije. Za razliko od različnih možnosti uravnavanja izražanja proteinov na transkripcijskem in translacijskem nivoju, je na regulacijo števila kopij plazmidov v celici težje vplivati. Vsak plazmid ima fiksno število kopij v bakterijski celici, na katerega navadno ne moremo vplivati. Da bi našli pravo število kopij plazmida v celici, ki je potrebno za ekspresijo proteina, moramo za vsak eksperiment naš konstrukt klonirati v vektorje z različnimi števili kopij v celici in te vektorje transformirati v bakterijske celice. Pri tem dolgotrajnem delu pogosto pride do napak, zato so razvili sistem Tulip (TUnable Ligand Inducible Plasmid), ki omogoča enostavno in učinkovito spreminjanje števila kopij plazmida v celici [1, 2].

==Razvoj Tulipa==

===Plazmid pSC101===

Delovanje Tulipa temelji na mehanizmu podvojevanja plazmida pSC101. Ta plazmid v svojem zapisu vsebuje gen za protein repA, ki je dolg 316 aminokislin in se lahko v monomerni obliki veže na vezavno mesto na mestu ori plazmida pSC101. Vezan tvori povezavo z drugimi proteini in spodbudi podvojevanje plazmida. Ob višji koncentraciji v celici protein repA tvori dimere. Kot tak se ne more vezati na vezavno mesto na mestu ori in ne more spodbujati procesa podvojevanje, ampak se veže na lastno regulatorno regijo in inhibira lastno transkripcijo. Zaradi ravnotežja med monomerno in dimerno obliko proteina repA, je število kopij plazmida pSC101 navadno omejeno na 3 kopije na celico [1, 3].

===Mutacije v proteinu repA===

Mutacije v zapisu za protein repA lahko zmanjšajo medsebojno afiniteto monomerov, da bi tvorili dimere, kar vpliva na število kopij plazmida v celici. Z mutacijami ključnih aminokislinskih ostankov, pomembnih za dimerizacijo, so dobili več mutant proteina repA, katerih zapise so vgradili v vključek, ki je imel vključen še zapis za robustno obliko zelenega fluorescenčnega proteina (sfGFP) pod konstitutivnim promotorjem. Merili so fluorescenco sfGFP v odvisnosti od števila kopij plazmida v celici, ki so ga merili s PCR v realnem času. Ugotovili so, da je fluorescenca sfGFP sorazmerna s številom kopij plazmida v celici [1].

V naslednjem eksperimentu so delali z mutiranim repA, ki ni več tvoril dimerov (repAv7), se je bil pa še vedno zmožen vezati na svoje vezavno mesto na mestu ori plazmida pSC101. Zapis za repAv7 so dali na drug plazmid pod inducibilni promotor PCymRC. Na operatorsko regijo pred promotorjem PCymRC se veže represor cymRAM. Ob prisotnosti kuminske kisline (4-izopropil benzojska kislina), ki se veže na cymRAM, se cymRAM ne more več vezati na opreratorsko regijo in transkripcija genov pod promotorjem PCymRC lahko steče. Poleg tega vektorja so v bakterijske celice transformirali še divji tip vektorja pSC101 z zapisom za sfGFP pod konstitutivnim promotorjem. Ob dodatku kuminske kisline v gojišče pride do sinteze repAv7, ki se veže na mesto ori plazmida pSC101 in inducira njegovo podvojevanje. Ob povečanju koncentracije kuminske kisline so zaznali večjo fluorescenco sfGFP in večje število kopij vektorja pSC101 v bakterijskih celicah [1, 4].

==Optimizacija Tulipa==

Za lažjo uporabo so se odločili združiti celoten sistem na en sam konstrukt. Pod promotor PCymRC so vključili zapisa za proteina repAv7 in cymRAM. Ob dodatku kuminske kisline se cymRAM ni več mogel vezati na promotor, torej je potekala transkripcija genov za repAv7 in cymRAM. Zaradi povišanje koncentracije repAv7 je prišlo do višanja števila kopij plazmida v celici. Ko je količina sintetiziranega cymRAM presegla raven kuminske kisline v celici, se je cymRAM zopet vezal na promotor PCymRC, do transkripcije ni prišlo, število kopij plazmida v celici pa se je ustalilo. Spreminjanje koncentracije kuminske kisline v rastnem mediju celic je učinkovito delovalo na spreminjanje števila kopij plazmida v bakterijskih celicah [1].

===Spreminjanje RBS in dodajanje degradacijske oznake===

Sistem Tulip so dodatno izboljšali z optimizacijo ribosom vezavnih mest pred zapisoma za repAv7 in cymRAM. Naredili so plazmidne knjižnice z različnimi RBS, ki so jih transformirali v bakterijske celice, s pretočno citometrijo pa so merili fluorescenco konstitutivno izraženega sfGFP. Pri nizkih koncentracijah kuminske kisline je pogosto prišlo do prevelikega števila kopij plazmida v celici, kar so pripisali prepočasni razgradnji repAv7. Problem so rešili tako, da so zapisu za repAv7 dodali zapis za degradacijsko oznako. Degradacijska oznaka poveča hitrost razgradnje proteina tako, da omogoči lažjo vezavo na proteaze, ki so odgovorne za razgradnjo drugih endogenih proteinov v celici. Preizkušali so delovanje dveh degradacijskih oznak (AAV in AVS), kot boljša se je izkazala oznaka AAV [1, 5].

===Karakterizacija Tulipa===

Sistem Tulip so vključili v vektor in ga transformirali v bakterije seva NEBStable. Sev NEBStable je posebej primeren za transformacijo in pomnoževanje plazmidov. Na njem so okarakterizirali delovanje Tulipa tako, da so merili fluorescenco sfGFP v odvisnosti od koncentracije kuminske kisline. S PCR v realnem času so ugotovili, da lahko spreminjamo vrednost števila kopij plazmida med 2,9 in 50,9. Fluorescenca GFP je bila sorazmerna dodani kuminski kislini in številu kopij plazmida. Preverjali so tudi rast bakterijskih celic in ugotovili, da sistem Tulip ne predstavlja dodatnega bremena celicam, rast celic je bila primerljiva pri različnih koncentracijah kuminske kisline [1].

==Lastnosti Tulipa==

===Obstojnost v drugih bakterijskih sevih===

Učinkovitost Tulipa so preverili tudi v drugih pogosto uporabljenih bakterijskih sevih: DH10B (klonirni sev), NEBExpress (modificiran ekspresijski sev), BW25113 in MG1655 (modelni sev). Vse seve so transformirali s sistemom Tulip s konstitutivno izraženim zapisom za sfGFP. Vsi sevi razen seva NEBExpress so imeli število kopij plazmida sorazmerno s koncentracijo kuminske kisline, dodane gojišču. Sev NEBExpress je imel izmerjeno višjo fluorescenco sfGFP in višje število kopij plazmida že pri nizki koncentraciji kuminske kisline. Sev NEBExpress ima okvarjenih več proteinov, ki so odgovorni za razgradnjo drugih proteinov v celici, zato je v njem prišlo do kopičenja repAv7 in do sorazmernega povečanja števila kopij plazmida in fluorescence [1].

===Regulacija Tulipa===

Lastnosti Tulipa v daljšem časovnem obdobju so opazovali preko gojenja celic z vključkom s Tulipom v turbidostatu. Turbidostat omogoča gojenje celic pri konstantnih pogojih (temperatura, sestava gojišča). Celice so v turbidostatu gojili 48 ur, med katerimi so v dvanajsturnih intervalih spreminjali koncentracijo kuminske kisline v gojišču. Ugotovili so, da do spremembe fluorescence, ki je posledica spremembe koncentracije kuminske kisline, pride v treh do štirih urah. Rast celic je bila skozi celotno časovno obdobje konstantna. Tudi po 50 urah gojenja se je sistem Tulip obdržal v celicah. V kontrolnem poskusu, kjer je gojenje celic potekalo v gojišču brez antibiotika, pa so opazili, da je pri nizkih koncentracijah kuminske kisline prišlo do izgube vključka v bakterijah, zato moramo ob gojenju celic s sistemom Tulip obvezno izvajati selekcijo z antibiotiki [1].

==Uporaba Tulipa==

Sistem Tulip omogoča hitrejšo izbiro pravega števila kopij plazmida v celici. Sistem Tulip so vgradili v dva vektorja, ki sta že imela vključena sistema za zaznavanje homoserin laktona (AHL) ali vanilne kisline. Ob prisotnosti liganda je v vsakem sistemu prišlo do transkripcije gena za škrlaten fluorescenčni protein (mScarI). Vsak vektor je imel vključen še zapis za sfGFP pod konstitutivnem promotorju. Oba vektorja so transformirali v bakterijske celice. Ob različnih koncentracijah kuminske kisline in induktorja (AHL ali vanilna kislina) v gojišču so opazovali fluorescenco sfGFP in mScarI. Pri višjih koncentracijah kuminske kisline je prišlo do višje ekspresije mScarI (sorazmerno z dodatkom AHL ali vanilne kisline). Višje izražanje mScarI je negativno vplivalo na izražanje sfGFP pri isti koncentraciji kuminske kisline, kar so pripisali tekmovanju za aminokisline, potrebne za sintezo obeh fluorescenčnih proteinov. Podobne rezultate dobimo tudi pri plazmidih z velikim številom kopij v celici [1].

==Zaključek==

Za izražanje proteinov je poleg učinkovitega promotorja pomembno tudi število kopij plazmida v celicah, kar omogoča sistem Tulip. Omogoča dinamično regulacijo števila kopij plazmida v celici skozi čas, je obstojen v celicah, uporaben v več bakterijskih sevih in ne povzroča dodatnega bremena celicam. Prava prednost Tulipa leži v krajšem času, ki je potreben za izbiro pravega števila kopij plazmida. Namesto, da vključke kloniramo v vektorje z različnimi števili kopij na celico in vsak vektor posebej transformiramo v celice, lahko v celice vključimo sistem Tulip in s spreminjanjem koncentracije kuminske kisline izberemo pravo število kopij plazmida, s čimer prihranimo na času in denarju.

==Literatura==

[1] S. H. N. Joshi, C. Yong, A. Gyorgy: Inducible plasmid copy number control for synthetic biology in commonly used E. coli strains. Nat. Commun. 2022, 13.

[2] K. Friehs: Plasmid copy number and plasmid stability. Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 2004, 86, 47–82.

[3] D. Manen, L. Caro: The replication of plasmid pSC101. Mol. Microbiol. 1991, 5, 233–237.

[4] A. Mullick, Y. Xu, R. Warren, M. Koutroumanis, C. Guilbault, S. Broussau, F. Malenfant, L. Bourget, L. Lamoureux, R. Lo, et al.: The cumate gene-switch: A system for regulated expression in mammalian cells. BMC Biotechnol. 2006, 6, 1–18.

[5] D. E. Cameron, J. J. Collins: Tunable protein degradation in bacteria. Nat. Biotechnol. 2014, 32, 1276–1281.

Seminarji SB 2022/23

2023-05-14T21:46:06Z

Klemen Kunej:

V študijskem letu 2022/23 študentje pri Sintezni biologiji predstavljajo naslednje teme:

RAZISKOVALNI ČLANKI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) <br>
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Rudarjenje_in_uporaba_konstitutivnih_promotorjev_iz_Rhodosporidium_toruloides Rudarjenje in uporaba konstitutivnih promotorjev iz ''Rhodosporidium toruloides''] (Ana Babnik)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Biomolekularni_aktuatorji_za_gensko_selektivno_akusti%C4%8Dno_manipulacijo_celic Biomolekularni aktuatorji za gensko selektivno akustično manipulacijo celic] (Greta Junger)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/IN_VIVO_SAMOSESTAVLJENA_siRNA_KOT_NA%C4%8CIN_KOMBINIRANEGA_ZDRAVLJENJA_ULCEROZNEGA_KOLITISA#ZAKLJU.C4.8CEK In vivo samosestavljena siRNA kot način kombiniranega zdravljenja ulceroznega kolitisa] (Tjaša Kos)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Priprava_kompleta_orodij_za_zaznavanje_kvoruma_pri_cianobakterijah:_Razvoj_medceli%C4%8Dne_koordinacije_v_me%C5%A1anih_avtotrofno-heterotrofnih_skupnostih Priprava kompleta orodij za zaznavanje kvoruma pri cianobakterijah: Razvoj medcelične koordinacije v mešanih avtotrofno-heterotrofnih skupnostih] (Nuša Tkalec)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Razvoj_temperaturno_inducibilnega_transkripcijskega_reostata_pri_Neurospori_crassi Razvoj temperaturno inducibilnega transkripcijskega reostata pri ''Neurospori crassi''] (Luka Šegota)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Priprava_tumor_ciljajočih_bakterij_s_stikalnim_sistemom,_ki_se_odziva_na_dušikov(II)_oksid Priprava tumor ciljajočih bakterij s stikalnim sistemom, ki se odziva na dušikov(II) oksid] (Ana Kodra)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Razcepljeni_ribocim%2C_ki_signale_nativnih_RNA_pove%C5%BEe_z_ortogonalnimi_proteinskimi_izhodnimi_signali Razcepljeni ribocim, ki signale nativnih RNA poveže z ortogonalnimi proteinskimi izhodnimi signali] (Ajda Beltram)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sistem_za_nadzor_%C5%A1tevila_plazmidov_v_celici_%28Tulip%29 Sistem za nadzor števila plazmidov v celici (Tulip)] (Gregor Strniša)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Skupnostna_znanost_je_na%C4%8Drtovala_ribosome_s_koristnimi_fenotipi Skupnostna znanost je načrtovala ribosome s koristnimi fenotipi] (Tanja Gošnjak)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Pristop_sintezne_biologije_za_načrtovanje_kandidata_za_cepivo_proti_delta_različici_SARSCoV2_je_razkril_prekinitev_favoriziranega_para_kodonov_kot_boljšo_strategijo_pred_uporabo_redkih_kodonov Pristop sintezne biologije za načrtovanje kandidata za cepivo proti delta različici SARS-CoV-2 je razkril prekinitev favoriziranega para kodonov kot boljšo strategijo pred uporabo redkih kodonov] (Stefanija Ivanova)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Dvosmerni_hibridni_eritritol_–_inducibilni_promotor_za_sintezno_biologijo_v_Yarrowia_lipolytica Dvosmerni hibridni eritritol – inducibilni promotor za sintezno biologijo v ''Yarrowia lipolytica''] (Maša Andoljšek)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Utišanje_izražanja_genov_s_strukturo_definirano_zankasto_strukturo_male_nekodirajoče_RNA_s_programiranimi_regulatornimi_aktivnostmi Utišanje izražanja genov s strukturno definirano zankasto strukturo male nekodirajoče RNA s programiranimi regulatornimi aktivnostmi] (Nika Bedrač)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Izbolj%C5%A1anje_evolucijske_stabilnosti_obremenjujo%C4%8Dih_in_toksi%C4%8Dnih_funkcij_v_E.coli_z_diferenciacijskim_genetskim_vezjem_posredovanim_z_integrazo Izboljšanje evolucijske stabilnosti obremenjujočih in toksičnih funkcij v E.coli z diferenciacijskim genetskim vezjem posredovanim z integrazo] (Nika Banovšek)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Nova_sintetična_mala_RNA%2C_ki_promovira_prekomerno_izražanje_proteinov_v_brezceličnem_sistemu Nova sintetična mala RNA, ki promovira prekomerno izražanje proteinov v brez-celičnem sistemu] (Ana Godeša)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sistem_za_kontrolo_hitrosti_rasti_celic%2C_ki_zmanj%C5%A1uje_breme_aktivacije_genov Sistem za kontrolo hitrosti rasti celic, ki zmanjšuje breme aktivacije genov] (Neža Ribnikar)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Biohibridne_membrane_za_odstranjevanje_te%C5%BEkih_kovin_iz_vode Biohibridne membrane za odstranjevanje težkih kovin iz vode] (Tadej Uršič)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Uporaba_CIVT-SELEX_za_izbiro_aptamerov_kot_genskih_delov_za_regulacijo_genetskih_vezij_v_brezceličnem_sistemu Uporaba CIVT-SELEX za izbiro aptamerov kot genskih delov za regulacijo genetskih vezij v brezceličnem sistemu] (Klemen Kunej)

NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/MonChassis MonChassis] (Nika Tomsič)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/FIAT_LUX FIAT LUX] (Neža Lanišek)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/NETLANTIS NETLANTIS] (Maša Gabrič)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BINANOX BINANOX] (Vivian Nemanič)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/CoBiota CoBiota] (Petra Sintič)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sporadicate Sporadicate] (Gašper Možina)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/FISHERLY FISHERLY] (Lucija Pišek)
----

Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Povzetek je treba objaviti dva dni pred predstavitvijo do polnoči (za seminarje v sredo torej v ponedeljek). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo približno 5-minutna razprava.

Terminski razpored je razviden iz preglednice na strežniku Google Drive.

Kako je videti seznam seminarjev, lahko preverite pri lanskem letniku: [[Seminarji_SB_2021/22]].