Wiki FKKT - User contributions [en]

Priprava in ovrednotenje novega seva bakterij Lactococcus lactis za proizvodnjo protimikrobnega peptida

2021-05-11T18:11:02Z

KlementinaP:

==Problem==
Patogeni, ki jih lahko najdemo v hrani, predstavljajo velik problem človeškemu zdravju, saj povzročajo številne bolezni. Problematične so predvsem bakterije, ki lahko tvorijo biofilme, saj jih ti zavarujejo pred antibiotiki, posledično pa je take bakterije težje eliminirati iz živilskih obratov [1,2]. Raziskovalci zato iščejo nove načine, kako se boriti proti patogenom v hrani in zagotoviti varno pridelavo hrane.

==Protimikrobni peptidi==
Protimikrobne peptide najdemo v vseh živih organizmih. Pri višjih organizmih so del prirojenega imunskega sistema in učinkujejo proti različnim mikroorganizmom. Povprečno jih sestavlja od 10 do 50 aminokislin in so pozitivno nabiti. So naravna alternativa kemičnim konzervansom, dobro pa delujejo tudi proti patogenim bakterijam, ki tvorijo biofilme [3]. V dotični raziskavi so uporabili fuzijo 2 protimikrobnih peptidov, ki izvirata iz kameljega laktoferina (protein, ki ima že sam po sebi protimikrobno delovanje). Ta peptida sta laktoferampin in laktofericin, fuzijo pa so poimenovali cLFchimera [4].

==''Lactococcus lactis''==
''L. lactis'' je gram pozitivna bakterija, ki se zaradi številnih ugodnih lastnosti že stoletja uporablja za fermentacijo mlečnih izdelkov in kot konzervans. Ni sposobna kolonizacije črevesja, ne proizvaja endotoksinov, je splošno prepoznana kot varna in ima številne probiotične lastnosti. Uporablja se tudi v biotehnologiji, predvsem za proizvodnjo rekombinantnih proteinov [5]. Zaradi omenjenih lastnosti in potencialne uporabe v prehranski industriji so si jo raziskovalci izbrali kot sistem za izražanje cLFchimere [4].

==Potek eksperimenta==
Izražanje rekombinantnega peptida so izvedli v ''L. lactis'' AMJ1453. Posebnost tega seva je, da je avksotrofen za D-alanin (ključna komponenta celične stene), zato lahko izvajamo selekcijo na osnovi alanin racemaze, ki pretvarja L-alanin v D-alanin. Uporabili so ekspresijski vektor pAMJ1653, ki je namenjen izražanju v ''L. lactis''. Preko restrikcijskih mest ''Sap''I in ''Sal''I so pod promotor P170 vstavili sintezni gen za cLFchimero s C-končno heksahistidinsko oznako. Zapis za signalni peptid na vektorju omogoča izločanje cLFchimere v gojišče [4].

Bakterije so transformirali z elektroporacijo in jih gojili v gojišču M17 brez D-alanina. S PCR na osnovi kolonije so preverili prisotnost vključka v vektorju. Izražanje gena za cLFchimero so preverili tudi tako, da so supernatant iz gojišča očistili z nikelj-afinitetno kromatografijo in ga analizirali z NaDS-PAGE [4].

Protimikrobno aktivnost supernatanta so preverili z metodo difuzije z diski in merjenjem premerov con inhibicij. Minimalno inhibitorno koncentracijo cLFchimere so določili z metodo razredčevanja v mikrotitrski plošči. Inhibitorni učinek cLFchimere na tvorbo biofilmov so preverjali tako, da so bakterije gojili ob prisotnosti cLFchimere, dodali kristal vijolično in izmerili absorbanco pri 590 nm. Sledile so še analiza termične stabilnosti cLFchimere, analiza antioksidativne sposobnosti in računalniška analiza interakcij cLFchimere z DNA oz. LPS [4].

==Rezultati==
Analiza supernatanta z NaDS-PAGE je pokazala, da so transformirane bakterije proizvajale rekombinanten peptid in ga izločale v gojišče. Po čiščenju so pridobili 0,13 mg cLFchimere na mL gojišča [4].

Pri metodi difuzije z diski je supernatant s cLFchimero deloval protibakterijsko proti vsem uporabljenim patogenim bakterijam (''E. coli, S. aureus, S. typhimurium, E. faecalis, L. monocytogenes'' in ''P. aeroginosa''). V vseh primerih je večji volumen supernatanta na disku povzročil večjo cono inhibicije. V primeru ''E. coli'' in ''S. aureus'' je disk z 40 µL supernatanta povzročil večjo cono inhibicije kot disk z 10 mg gentamicina. Prav tako je cLFchimera inhibirala tvorbo biofilma pri vseh analiziranih patogenih bakterijah (''P. aeruginosa, S. aureus, E. faecalis'' in ''E. coli''). 40 minutno gretje pri 100 °C ni imelo znatnega vpliva na protibakterijsko sposobnost cLFchimere proti ''S. aureus'' kot modelni grampozitivni bakteriji [4].

Z analizo antioksidativne sposobnosti so ugotovili, da cLFchimera deluje tudi kot antioksidant, saj reagira s prostimi radikali (v raziskavi so uporabili DPPH). Koncentracija 300 µg/mL je inaktivirala približno polovico DPPH. Z uporabo še višje koncentracije cLFchimere je antioksidativna aktivnost upadla [4].

Računalniške simulacije molekulske dinamike so pokazale, da cLFchimera ob vezavi na DNA oz. LPS spremeni strukturo. Ugotovili so, da je v LPS glavna tarča peptida lipid A. V povprečju je cLFchimera z LPS tvorila 5 vodikovih vezi, z DNA pa 4. K ugodni prosti energiji vezanja so največ prispevale pozitivno nabite aminokisline in celokupno gledano je prosta energija vezanja na DNA bila nekoliko nižja kot na LPS [4].

==Zaključek==
Fuzijski peptid cLFchimera učinkuje proti različnim patogenim bakterijam, inhibira tvorbo biofilmov in ima antioksidativne lastnosti. ''In silico'' izkazuje visoko afiniteto do DNA in LPS kot glavni bakterijski tarči. Z vnosom gena za cLFchimero v L. lactis je raziskovalcem uspelo pripraviti sev, ki ima potencial za uporabo v prehranski industriji [4].

==Literatura==
[1] T. Bintsis: Foodborne pathogens. ''AIMS Microbiol.'' '''2017''', ''3(3)'', str. 529–563.

[2] M. Schirone, P. Visciano, R. Tofalo, G. Suzzi: Editorial: Foodborne Pathogens: Hygiene and Safety. ''Front. Microbiol.'' '''2019''', ''10''.

[3] M. Mahlapuu, J. Håkansson, L. Ringstad, C. Björn: Antimicrobial Peptides: An Emerging Category of Therapeutic Agents. ''Front. Cell. Infect. Microbiol.'' '''2016''', ''6''.

[4] A. Tanhaeian, M. Mirzaii, Z. Pirkhezranian, M. H. Sekhavati: Generation of an engineered food-grade Lactococcus lactis strain for production of an antimicrobial peptide: in vitro and in silico evaluation. ''BMC Biotechnol.'' '''2020''', ''20(1)'', str. 19.

[5] A. A.-L. Song, L. L. A. In, S. H. E. Lim, R. A. Rahim: A review on Lactococcus lactis: from food to factory. ''Microb. Cell Fact.'' '''2017''','' 16(1)'', str. 55.

Priprava in ovrednotenje novega seva bakterij Lactococcus lactis za proizvodnjo protimikrobnega peptida

2021-05-11T18:06:15Z

KlementinaP: New page: ==Problem== Patogeni, ki jih lahko najdemo v hrani, predstavljajo velik problem človeškemu zdravju, saj povzročajo številne bolezni. Problematične so predvsem bakterije, ki lahko tvor...

==Problem==
Patogeni, ki jih lahko najdemo v hrani, predstavljajo velik problem človeškemu zdravju, saj povzročajo številne bolezni. Problematične so predvsem bakterije, ki lahko tvorijo biofilme, saj jih ti zavarujejo pred antibiotiki, posledično pa je take bakterije težje eliminirati iz živilskih obratov [1,2]. Raziskovalci zato iščejo nove načine, kako se boriti proti patogenom v hrani in zagotoviti varno pridelavo hrane.

==Protimikrobni peptidi==
Protimikrobne peptide najdemo v vseh živih organizmih. Pri višjih organizmih so del prirojenega imunskega sistema in učinkujejo proti različnim mikroorganizmom. Povprečno jih sestavlja od 10 do 50 aminokislin in so pozitivno nabiti. So naravna alternativa kemičnim konzervansom, dobro pa delujejo tudi proti patogenim bakterijam, ki tvorijo biofilme [3]. V dotični raziskavi so uporabili fuzijo 2 protimikrobnih peptidov, ki izvirata iz kameljega laktoferina (protein, ki ima že sam po sebi protimikrobno delovanje). Ta peptida sta laktoferampin in laktofericin, fuzijo pa so poimenovali cLFchimera [4].

==''Lactococcus lactis''==
''L. lactis'' je gram pozitivna bakterija, ki se zaradi številnih ugodnih lastnosti že stoletja uporablja za fermentacijo mlečnih izdelkov in kot konzervans. Ni sposobna kolonizacije črevesja, ne proizvaja endotoksinov, je splošno prepoznana kot varna in ima številne probiotične lastnosti. Uporablja se tudi v biotehnologiji, predvsem za proizvodnjo rekombinantnih proteinov [5]. Zaradi omenjenih lastnosti in potencialne uporabe v prehranski industriji so si jo raziskovalci izbrali kot sistem za izražanje cLFchimere [4].

==Potek eksperimenta==
Izražanje rekombinantnega peptida so izvedli v ''L. lactis'' AMJ1453. Posebnost tega seva je, da je avksotrofen za D-alanin (ključna komponenta celične stene), zato lahko izvajamo selekcijo na osnovi alanin racemaze, ki pretvarja L-alanin v D-alanin. Uporabili so ekspresijski vektor pAMJ1653, ki je namenjen izražanju v ''L. lactis''. Preko restrikcijskih mest ''Sap''I in ''Sal''I so pod promotor P170 vstavili sintezni gen za cLFchimero s C-končno heksahistidinsko oznako. Zapis za signalni peptid na vektorju omogoča izločanje cLFchimere v gojišče [4].

Bakterije so transformirali z elektroporacijo in jih gojili v gojišču M17 brez D-alanina. S PCR na osnovi kolonije so preverili prisotnost vključka v vektorju. Izražanje gena za cLFchimero so preverili tudi tako, da so supernatant iz gojišča očistili z nikelj-afinitetno kromatografijo in ga analizirali z NaDS-PAGE [4].

Protimikrobno aktivnost supernatanta so preverili z metodo difuzije z diski in merjenjem premerov con inhibicij. Minimalno inhibitorno koncentracijo cLFchimere so določili z metodo razredčevanja v mikrotitrski plošči. Inhibitorni učinek cLFchimere na tvorbo biofilmov so preverjali tako, da so bakterije gojili ob prisotnosti cLFchimere, dodali kristal vijolično in izmerili absorbanco pri 590 nm. Sledile so še analiza termične stabilnosti cLFchimere, analiza antioksidativne sposobnosti in računalniška analiza interakcij cLFchimere z DNA oz. LPS [4].

==Rezultati==
Analiza supernatanta z NaDS-PAGE je pokazala, da so transformirane bakterije proizvajale rekombinanten peptid in ga izločale v gojišče. Po čiščenju so pridobili 0,13 mg cLFchimere na mL gojišča [4].

Pri metodi difuzije z diski je supernatant s cLFchimero deloval protibakterijsko proti vsem uporabljenim patogenim bakterijam (''E. coli, S. aureus, S. typhimurium, E. faecalis, L. monocytogenes'' in ''P. aeroginosa''). V vseh primerih je večji volumen supernatanta na disku povzročil večjo cono inhibicije. V primeru ''E. coli'' in ''S. aureus'' je disk z 40 µL supernatanta povzročil večjo cono inhibicije kot disk z 10 mg gentamicina. Prav tako je cLFchimera inhibirala tvorbo biofilma pri vseh analiziranih patogenih bakterijah (''P. aeruginosa, S. aureus, E. faecalis'' in ''E. coli''). 40 minutno gretje pri 100 °C ni imelo znatnega vpliva na protibakterijsko sposobnost cLFchimere proti ''S. aureus'' kot modelni grampozitivni bakteriji [4].

Z analizo antioksidativne sposobnosti so ugotovili, da cLFchimera deluje tudi kot antioksidant, saj reagira s prostimi radikali (v raziskavi so uporabili DPPH). Koncentracija 300 µg/mL je inaktivirala približno polovico DPPH. Z uporabo še višje koncentracije cLFchimere je antioksidativna aktivnost upadla [4].

Računalniške simulacije molekulske dinamike so pokazale, da cLFchimera ob vezavi na DNA oz. LPS spremeni strukturo. Ugotovili so, da je v LPS glavna tarča peptida lipid A. V povprečju je cLFchimera z LPS tvorila 5 vodikovih vezi, z DNA pa 4. K ugodni prosti energiji vezanja so največ prispevale pozitivno nabite aminokisline in celokupno gledano je prosta energija vezanja na DNA bila nekoliko nižja kot na LPS [4].

==Zaključek==
Fuzijski peptid cLFchimera učinkuje proti različnim patogenim bakterijam, inhibira tvorbo biofilmov in ima antioksidativne lastnosti. ''In silico'' izkazuje visoko afiniteto do DNA in LPS kot glavni bakterijski tarči. Z vnosom gena za cLFchimero v L. lactis je raziskovalcem uspelo pripraviti sev, ki ima potencial za uporabo v prehranski industriji [4].

==Literatura==
[1] T. Bintsis: Foodborne pathogens. AIMS Microbiol. 2017, 3(3), str. 529–563.

[2] M. Schirone, P. Visciano, R. Tofalo, G. Suzzi: Editorial: Foodborne Pathogens: Hygiene and Safety. Front. Microbiol. 2019, 10.

[3] M. Mahlapuu, J. Håkansson, L. Ringstad, C. Björn: Antimicrobial Peptides: An Emerging Category of Therapeutic Agents. Front. Cell. Infect. Microbiol. 2016, 6.

[4] A. Tanhaeian, M. Mirzaii, Z. Pirkhezranian, M. H. Sekhavati: Generation of an engineered food-grade Lactococcus lactis strain for production of an antimicrobial peptide: in vitro and in silico evaluation. BMC Biotechnol. 2020, 20(1), str. 19.

[5] A. A.-L. Song, L. L. A. In, S. H. E. Lim, R. A. Rahim: A review on Lactococcus lactis: from food to factory. Microb. Cell Fact. 2017, 16(1), str. 55.

MBT seminarji 2021

2021-05-11T17:59:23Z

KlementinaP:

Seminarji iz Molekularne biotehnologije so letos organizirani tako, da vsak študent (praviloma v paru, lahko pa tudi samostojno) obdela temo s področja cepiv proti virusu SARS-CoV-2 in o tem pripravi kratek poljudno napisan povzetek. Ta del seminarjev je predstavljen na [[protikovidna cepiva|ločeni strani]].
V drugem delu vsak študent predstavi nek raziskovalni dosežek s širšega področja molekularne biotehnologije. Seznam tem in predstavitev za študijsko leto 2020/21 je predstavljen tu.

Povzetke morate objaviti do torka do polnoči v tednu, ko imate seminar (v četrtek). Angleški naslov prevedite tudi v slovenščino - to bo naslov povzetka, ki ga objavite na posebni strani, tako kot so to naredili kolegi pred vami (oz. predlani).

Način vnosa:

The importance of ''Arabidopsis'' glutathione peroxidase 8 for protecting ''Arabidopsis'' plant and ''E. coli'' cells against oxidative stress (A. Gaber; GM Crops & Food 5(1), 2014; http://dx.doi.org/10.4161/gmcr.26979) Pomen glutation peroksidaze 8 iz repnjakovca za zaščito rastline ''Arabidopsis thaliana'' in bakterije ''Escherichia coli'' pred oksidativnim stresom. Janez Novak (28.2.) 
(slovenski naslov povežite z novo stranjo, na kateri bo povzetek)

----

Naslovi odobrenih člankov po temah:

'''Farmacevtsko pomembni proteini''' 
# Development of Antibody-Fragment-Producing Rice for Neutralization of Human Norovirus (A. Sasou ''et. al''; Frontiers in Plant Science 12, 2021; https://doi.org/10.3389/fpls.2021.639953). [[Proizvodnja riža za sintezo fragmentov protiteles proti humanemu norovirusu.]] Mateja Žvipelj (11.3.)
# A New Plant Expression System for Producing Pharmaceutical Proteins (N. Abd-Aziz ''et. al''; Molecular Biotechnology 62, 2020; https://doi.org/10.1007/s12033-020-00242-2). [[Razvoj ekspresijskega sistema za proizvodnjo farmacevtskih proteinov v rastlini Mucuna bracteata]]. Jernej Imperl (18.3.)
# Development of a Recombinant Monospecific Anti-PLGF Bivalent Nanobody and Evaluation of it in Angiogenesis Modulation (A. Nikooharf "et all"; Molecular Biotechnology 62, 2020; https://link.springer.com/article/10.1007/s12033-020-00275-7#additional-information) [[Razvoj rekombinantnih monospecifičnih bivalentnih nanoteles proti PLGF-u]]. Nika Zaveršek (18.3.)

'''Cepiva''' 
# Development of a DNA Vaccine for Melanoma Metastasis by Inhalation Based on an Analysis of Transgene Expression Characteristics of Naked pDNA and a Ternary Complex in Mouse Lung Tissues (Kodama ''et.al'';Pharmaceutics 12,2020; https://www.mdpi.com/1999-4923/12/6/540#framed_div_cited_count) [[ Razvoj DNA cepiva proti metastazam melanoma z vdihavanjem na podlagi analize značilnosti transgene ekspresije gole pDNA in trojni kompleks v mišjem pljučnem tkivu]]. Paula Horvat (25.3.) 
# An AMA1/MSP119 Adjuvanted Malaria Transplastomic Plant‑Based Vaccine Induces Immune Responses in Test Animals (Evelia M. Milán‑Noris ''et. al''; Molecular Biotechnology 62, 2020; https://doi.org/10.1007/s12033-020-00271-x) [[V rastlinah proizvedeno transplastomsko antimalarijsko cepivo z AMA1/MSP119 in dodanim adjuvansom inducira imunski odziv v testnih živalih]]. Neža Pavko (25.3.) 

'''Gensko spremenjene rastline''' 
# A wheat cysteine-rich receptor-like kinase confers broad-spectrum resistance against Septoria tritici blotch (C. Saintenac ''et al.''; Nat. Commun. 12, 2021, https://doi.org/10.1038/s41467-020-20685-0). [[Receptorju podobna kinaza bogata s cisteini, pšenici daje odpornost proti širokemu spektru pegavosti Septoria tritici]]. Andrej Race (7.4.)
# RNAi silenced ζ-carotene desaturase developed variegated tomato transformants with increased phytoene content (M. A. Babu ''et. al''; Plant Growth Regul. 93, 2021; https://doi.org/10.1007/s10725-020-00678-1). [[Vpliv utišanja ζ-karoten desaturaze na vsebnost karotenoidov v gensko spremenjenih paradižnikih]]. Peter Škrinjar (7.4.)

'''Gensko spremenjene živali in celične linije''' 
# Engineering carotenoid production in mammalian cells for nutritionally enhanced cell-cultured foods (A. J. Stout "et. al"; Metabolic Engineering 62, 2020; https://doi.org/10.1016/j.ymben.2020.07.011). [[Razvoj proizvodnje karotenoidov v sesalskih celicah za prehransko izboljšano celično pridobljeno meso]]. Urša Lovše (8.4.)
# Efficient photoactivatable Dre recombinase for cell type-specific spatiotemporal control of genome engineering in the mouse (H. Li ''et. al''; Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 117(52), 2021; https://doi.org/10.1073/pnas.2003991117). [[Priprava fotoinducibilne rekombinaze Dre kot orodje za prostorsko in časovno odvisno urejanje genoma v specifičnih mišjih celicah.]] Matija Ruparčič (8.4.)

'''Nizkomolekularni biotehnološki produkti''' 
# Fermentative N-Methylanthranilate Production by Engineered ''Corynebacterium glutamicum''. (T. Walter ''et. al.''; Microorganisms 8(6), 2020; https://doi.org/10.3390/microorganisms8060866). [[Fermentativna proizvodnja N-metilantranilata z inženirsko spremenjeno Corynebacterium glutamicum]]. Saša Slabe (14.4.)
# Efficient Biosynthesis of Vanillin from Isoeugenol by Recombinant Isoeugenol Monooxygenase from ''Pseudomonas nitroreducens'' Jin1. (Wang Q, Wu X, Lu X, He Y, Ma B, Xu Y. Efficient Biosynthesis of Vanillin from Isoeugenol by Recombinant Isoeugenol Monooxygenase from Pseudomonas nitroreducens Jin1. Appl Biochem Biotechnol. 2021:1116-1128. doi:10.1007/s12010-020-03478-5). [[Učinkovita biosinteza vanilina iz izoevgenola z uporabo rekombinantne izoevgenol monooksigenaze Jin1 iz bakterije Pseudomonas nitroreducens]]. Luka Gnidovec (15.4.)
# One-pot production of butyl butyrate from glucose using a cognate “diamond-shaped” ''E. coli'' consortium (J. P. Sinumvayo "et. al"; Bioresources and Bioprocessing 8, 2021; https://bioresourcesbioprocessing.springeropen.com/articles/10.1186/s40643-021-00372-8#Sec9). [[Proizvodnja butil butirata iz glukoze z uporabo "diamantnega" konzorcija E. coli]] Liza Ulčakar (15.4.)

'''Biotehnološki polimeri''' 
# Biotechnologically produced fucosylated oligosaccharides inhibit the binding of human noroviruses to their natural receptors (S. M. Derya et al., “Biotechnologically produced fucosylated oligosaccharides inhibit the binding of human noroviruses to their natural receptors,” ''J. Biotechnol.'', vol. 318, no. April, pp. 31–38, 2020, doi: 10.1016/j.jbiotec.2020.05.001). [[Inhibicija vezave humanega norovirusa na naravni receptor z biotehnološko proizvedenimi fukoziliranimi oligosaharidi]] Anže Karlek (21.4.)
# Complete biosynthesis of a sulfated chondroitin in ''Escherichia coli'' (Badri, A., ''et al''; Nature communications 12 (2021); https://doi.org/10.1038/s41467-021-21692-5). [[Popolna biosinteza hondroitin sulfata v E. coli]] Ana Maklin (22.4.)
# Optimization of cultivation medium and cyclic fed-batch fermentation strategy for enhanced polyhydroxyalkanoate production by Bacillus thuringiensis using a glucose-rich hydrolyzate (Singh et al. Bioresour. Bioprocess. (2021) 8:11, https://doi.org/10.1186/s40643-021-00361-x) [[Optimizacija fermentacijske proizvodnje PHA-bioplastike z b. thuringiensis in z glukozo bogatimi hidrolizati]] Urban Hribar (22.4.)

'''Biotehnološko pridobljeni encimi''' 
# Engineering a carboxypeptidase from ''Aspergillus niger'' M00988 by mutation to increase its ability in high Fischer ratio oligopeptide preparation (Xiong K., Liu J., Wang X., Sun B., Zhang Y., Zhao Z., Pei P., & Li X.; Journal of Biotechnology, 330, 1–8, 2021, https://doi.org/10.1016/j.jbiotec.2021.02.015). [[Priprava karboksipeptidaze iz glive Aspergillus niger M00988 za izboljšanje priprave oligopeptidov z visokim Fischerjevim razmerjem]] Urška Fajdiga (5.5.)
# Cell-Based High-Throughput Screening Protocol for Discovering Antiviral Inhibitors Against SARS-COV-2 Main Protease (3CLpro) (Rothan, H.A., Teoh, T.C; Mol Biotechnol 63, 240–248 (2021); https://doi.org/10.1007/s12033-021-00299-7) [[Visoko zmogljiv presejalni protokol na osnovi celic za raziskovanje antivirusnih inhibitorjev proti Sars-Cov-2 glavni proteazi (3CLpro)]] Mirsad Mešić (6.5.)
# A novel cold-active type I pullulanase from a hot-spring metagenome for effective debranching and production of resistant starch (M. Thakur ''et al''.; Bioresource Technology 320, 2021; https://doi.org/10.1016/j.biortech.2020.124288). [[Pri nizkih temperaturah aktivna pululanaza tipa I iz metagenoma vročih vrelcev omogoča učinkovito klestenje in proizvodnjo odpornega škroba]] Martina Lokar (6.5.)

'''Metabolno inženirstvo v biotehnologiji''' 
# Production of Tyrian purple indigoid dye from tryptophan in ''Escherichia coli'' (J. Lee ''et al.''; Nat. Chem. Biol. 17, 2021; https://doi.org/10.1038/s41589-020-00684-4). [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Proizvodnja_%C5%A1krlatnega_indigoidnega_barvila_iz_triptofana_v_bakteriji_Escherichia_coli Proizvodnja škrlatnega indigoidnega barvila iz triptofana v bakteriji ''Escherichia coli''] Jerneja Nimac (12.5.)
# Development of ''Pseudomonas asiatica'' as a host for the production of 3-hydroxypropionic acid from glycerol (T. Thi Nguyen et al., Bioresource Technology, vol. 329, 2021; https://doi.org/10.1016/j.biortech.2021.124867). [[Razvoj gostiteljskega organizma Pseudomonas asiatica za proizvodnjo 3-hidroksipropionske kisline iz glicerola]] Urška Pečarič Strnad (12.5.)
# Generation of an engineered food-grade ''Lactococcus lactis'' strain for production of an antimicrobial peptide: ''in vitro'' and ''in silico'' evaluation (A. Tanhaeian ''et. al''; BMC Biotechnol. 20(1), 2020; https://doi.org/10.1186/s12896-020-00612-3). [[Priprava in ovrednotenje novega seva bakterij Lactococcus lactis za proizvodnjo protimikrobnega peptida]]. Klementina Polanec (13.5.)
# Ernestina Lavrih (13.5.)

'''Biomasa in biogoriva''' 
# Željka Erić (19.5.)
# Karin Dobravc Škof (20.5.)
# Katja Doberšek (20.5.)

'''Okoljski vidiki biotehnologije in bioremediacija''' 
# Almina Tahirović (26.5.)
# Eva Keber (27.5.)
# Nina Lukančič (27.5.)

Značilnosti cepiva Novavax (proteinsko)

2021-05-04T18:24:40Z

KlementinaP:

Cepivo NVX-CoV2373 (v nadaljevanju: cepivo Novavax) je cepivo ameriškega podjetja Novavax proti COVID-19. Cepivo temelji na nanodelcih z rekombinantnim proteinom bodice virusa SARS-CoV-2. V času pisanja cepivo še ni odobreno v Evropi.

=Osnovne značilnosti cepiva=
Cepivo Novavax je sestavljeno iz treh ključnih sestavin: rekombinantni protein bodice, polisorbat 80 in adjuvant Matrix-M.
==Rekombinantni protein bodice==

Protein bodice je antigen, ki ga s cepivom želimo predstaviti imunskemu sistemu. S tega vidika je to cepivo podobno konkurenčnim cepivom, vendar pa je cepivo Novavax eno redkih, ki uporablja očiščen protein neposredno v cepivu (namesto mRNA ali virusnega vektorja). V zaporedje proteina so uvedli dva seta mutacij. Najprej so spremenili tarčno zaporedje za cepitev (682-QQAQ-685), kar onemogoči aktivacijo proteina v našem telesu, z naslednjo spremembo (K986P in V987P) pa so povečali stabilnost strukture. Prilagojen protein je stabilen pri različnih pogojih in je primeren za vzpostavitev imunosti na SARS-CoV-2 [1].

Za pridobivanje proteina so izbrali kulture celic vešče ''Spodoptera frugiperda'' (Sf9), saj omogočajo pridobivanje proteina bodice v velikih količinah in s pravilno strukturo. S pomočjo insektnega virusa so v celice vnesli gen za mutiran protein bodice, ki se je nato izražal na površini celic. Celice so razgradili, očistili pridobljen protein bodice in ga uporabili za pripravo cepiva [1, 2].

==Polisorbat 80==

Polisorbat 80 je neionski detergent, ki se uporablja v živilski industriji, kozmetiki in medicini [3]. V vodnih raztopinah lahko polisorbat 80 spontano tvori micele – 10 nm velike lipidne strukture v obliki valja [4]. V cepivu Novavax te micele služijo kot ogrodje, v katerega se lahko zasidrajo proteini bodice. Tako nastanejo nanodelci veliki okoli 30 nm, ki lahko vsebujejo hkrati tudi do 14 proteinov bodice. Ker nanodelec predstavlja večjo strukturo kot pa sam protein bodice in navzven celo spominja na virus, sproži močnejši imunski odziv in poveča učinkovitost cepiva [4, 5].

==Matrix-M==

Adjuvanti so sestavine cepiva, ki spodbudijo imunski sistem in povečajo učinkovitost cepiva. Cepivu Novavax je dodan adjuvant Matrix-M, ki je sestavljen iz saponina rastline ''Quillaja saponaria'', holesterola in fosfolipidov. Tvori okrogle kletke podobne velikosti kot nanodelci s proteinom bodice [5, 6].

=Klinična preskušanja cepiva=

Prva preskušanja varnosti in imunogenosti cepiva Novavax so potekala na miših in pavijanih. Po prejemu 2 odmerkov cepiva so živali proizvedle protitelesa proti proteinu bodice, ki so bila sposobna nevtralizirati divji tip SARS-CoV-2. Tako se virus ni mogel vezati na receptorje na površini celic in jih okužiti. S tem so raziskovalci potrdili delovanje in varnost cepiva, s čimer so prešli na klinična preskušanja na ljudeh [7,8].

'''1. faza''' kliničnega preskušanja se je začela maja 2020 v Avstraliji. Sodelovalo je 131 zdravih prostovoljcev, starih od 18 do 59 let. Prvi in drugi odmerek so prejeli 21 dni narazen, pri čemer jih je 83 prejelo cepivo z adjuvantom, 25 brez adjuvanta in 23 placebo. Najbolj pogosta lokalna stranska učinka sta bila bolečina in oteklina na mestu vboda, sistemski stranski učinki pa utrujenost, glavobol in bolečine v mišicah. Stranski učinki so bili v glavnem kratkotrajni in blagi. Cepivo z adjuvantom je sprožilo močnejši imunski odziv in spodbudilo nastanek večje količine protiteles, kot so jih zaznali v krvi posameznikov, ki so preboleli COVID-19. Zaznali so tudi močan odziv T-celic pomagalk tipa 1 [8].

'''2. fazo''' kliničnega preskušanja so začeli avgusta 2020 v ZDA in Avstraliji. Sodelovalo je 1256 prostovoljcev, starih od 18 do 84 let, pri čemer jih je 45 % predstavljajo skupino starejših (60-84 let). Sodelujoče so razdelili v 5 skupin, od tega so 4 prejele različne doze cepiva z adjuvantom, 1 pa placebo. Rezultati 2. faze so bili v glavnem enaki kot rezultati 1. faze. Ugotovili so, da je cepivo varno tudi za starejšo populacijo. Stranski učinki so bili pri starejših redkejši in blažji, imunski odziv na cepivo pa je bil nekoliko slabši zaradi staranja imunskega sistema. Ugotovili so, da je nižja doza cepiva (5 µg) bolj primerna kot višja (25 µg), saj pri cepljenih povzroči manj stranskih učinkov, razvije pa se približno enaka količina protiteles [9,10].

'''3. faza''' kliničnega preskušanja se je začela septembra 2020 v Združenem kraljestvu. Sodelovalo je več kot 15.000 prostovoljcev, od tega 27 % starih nad 65 let. Polovica sodelujočih je prejela 2 odmerka cepiva, druga polovica dva odmerka placeba. Rezultati preskušanja še niso objavljeni v obliki znanstvenega članka, je pa podjetje Novavax sporočilo, da učinkovitost cepiva proti originalnemu sevu virusa znaša 96,4 %, proti britanski različici pa 86,3 %. Cepivo nudi 100 % zaščito pred hudim potekom COVID-19 [11].

==Ostala klinična preskušanja==

*Rezultati faze 2b iz Republike Južne Afrike so pokazali, da je učinkovitost cepiva proti južnoafriški različici 55,4 % (za HIV-negativno populacijo) [11].
*V ZDA in Mehiki trenutno še poteka 3. faza kliničnega preskušanja, v kateri sodeluje okoli 30.000 prostovoljcev starejših od 18 let [7].
*Od februarja 2021 v Združenem kraljestvu poteka raziskava, v kateri so prostovoljce cepili s kombinacijo različnih cepiv (Astrazeneca, Pfizer, Moderna in Novavax). Prvi in drugi odmerek sta predstavljali enako ali pa različni cepivi [12].

=Viri=
# J. H. Tian, N. Patel, R. Haupt, H. Zhou, S. Weston, H. Hammond, J. Logue, A. D. Portnoff, J. Norton, … G. Smith: SARS-CoV-2 spike glycoprotein vaccine candidate NVX-CoV2373 immunogenicity in baboons and protection in mice. ''Nat. Commun.'' '''2021''', ''12(1)'', str. 1–14.
# Urgent global health needs addressed by Novavax https://www.novavax.com/our-unique-technology (pridobljeno 3. 5. 2021).
#Polysorbate 80 - Wikipedia https://en.wikipedia.org/wiki/Polysorbate_80 (pridobljeno 3. 5. 2021).
# C. Boutin: NIST Clarifies Structure of Prospective Vaccine for Respiratory Virus | NIST https://www.nist.gov/news-events/news/2020/12/nist-clarifies-structure-prospective-vaccine-respiratory-virus (pridobljeno 3. 5. 2021).
# S. Bangaru, G. Ozorowski, H. L. Turner, A. Antanasijevic, D. Huang, X. Wang, J. L. Torres, J. K. Diedrich, J. H. Tian, … A. B. Ward: Structural analysis of full-length SARS-CoV-2 spike protein from an advanced vaccine candidate. ''Science''. '''2020''', ''370(6520)'', str. 1089–1094.
#J. M. Reimer, K. H. Karlsson, K. Lövgren-Bengtsson, S. E. Magnusson, A. Fuentes, L. Stertman: Matrix-MTM Adjuvant Induces Local Recruitment, Activation and Maturation of Central Immune Cells in Absence of Antigen. ''PLoS One.'' '''2012''', ''7(7)'', str. e41451.
#Phase 3 trial of Novavax investigational COVID-19 vaccine opens | National Institutes of Health (NIH) https://www.nih.gov/news-events/news-releases/phase-3-trial-novavax-investigational-covid-19-vaccine-opens (pridobljeno 4. 5. 2021).
#C. Keech, G. Albert, I. Cho, A. Robertson, P. Reed, S. Neal, J. S. Plested, M. Zhu, S. Cloney-Clark, … G. M. Glenn: Phase 1–2 Trial of a SARS-CoV-2 Recombinant Spike Protein Nanoparticle Vaccine. ''N. Engl. J. Med.'' '''2020''', ''383(24)'', str. 2320–2332.
#Novavax Initiates Phase 2 Portion of Phase 1/2 Clinical Trial of COVID-19 Vaccine | Novavax Inc. - IR Site https://ir.novavax.com/news-releases/news-release-details/novavax-initiates-phase-2-portion-phase-12-clinical-trial-covid (pridobljeno 4. 5. 2021).
#N. Formica, R. Mallory, G. Albert, M. Robinson, J. S. Plested, I. Cho, A. Robertson, F. Dubovsky, G. M. Glenn: Evaluation of a SARS-CoV-2 Vaccine NVX-CoV2373 in Younger and Older Adults. ''medRxiv'' '''2021''', str. 2021.02.26.21252482.
#Novavax Confirms High Levels of Efficacy Against Original and Variant COVID-19 Strains in United Kingdom and South Africa Trials | Novavax Inc. - IR Site https://ir.novavax.com/news-releases/news-release-details/novavax-confirms-high-levels-efficacy-against-original-and-0 (pridobljeno 4. 5. 2021).
#E. Mahase: Covid-19: Moderna and Novavax vaccines to be tested in mixing vaccines trial. ''BMJ'' '''2021''', ''372'', str. n971.

Značilnosti cepiva Novavax (proteinsko)

2021-05-04T18:23:10Z

KlementinaP:

Cepivo NVX-CoV2373 (v nadaljevanju: cepivo Novavax) je cepivo ameriškega podjetja Novavax proti COVID-19. Cepivo temelji na nanodelcih z rekombinantnim proteinom bodice virusa SARS-CoV-2. V času pisanja cepivo še ni odobreno v Evropi.

=Osnovne značilnosti cepiva=
Cepivo Novavax je sestavljeno iz treh ključnih sestavin: rekombinantni protein bodice, polisorbat 80 in adjuvant Matrix-M.
==Rekombinantni protein bodice==

Protein bodice je antigen, ki ga s cepivom želimo predstaviti imunskemu sistemu. S tega vidika je to cepivo podobno konkurenčnim cepivom, vendar pa je cepivo Novavax eno redkih, ki uporablja očiščen protein neposredno v cepivu (namesto mRNA ali virusnega vektorja). V zaporedje proteina so uvedli dva seta mutacij. Najprej so spremenili tarčno zaporedje za cepitev (682-QQAQ-685), kar onemogoči aktivacijo proteina v našem telesu, z naslednjo spremembo (K986P in V987P) pa so povečali stabilnost strukture. Prilagojen protein je stabilen pri različnih pogojih in je primeren za vzpostavitev imunosti na SARS-CoV-2 [1].

Za pridobivanje proteina so izbrali kulture celic vešče Spodoptera frugiperda (Sf9), saj omogočajo pridobivanje proteina bodice v velikih količinah in s pravilno strukturo. S pomočjo insektnega virusa so v celice vnesli gen za mutiran protein bodice, ki se je nato izražal na površini celic. Celice so razgradili, očistili pridobljen protein bodice in ga uporabili za pripravo cepiva [1, 2].

==Polisorbat 80==

Polisorbat 80 je neionski detergent, ki se uporablja v živilski industriji, kozmetiki in medicini [3]. V vodnih raztopinah lahko polisorbat 80 spontano tvori micele – 10 nm velike lipidne strukture v obliki valja [4]. V cepivu Novavax te micele služijo kot ogrodje, v katerega se lahko zasidrajo proteini bodice. Tako nastanejo nanodelci veliki okoli 30 nm, ki lahko vsebujejo hkrati tudi do 14 proteinov bodice. Ker nanodelec predstavlja večjo strukturo kot pa sam protein bodice in navzven celo spominja na virus, sproži močnejši imunski odziv in poveča učinkovitost cepiva [4, 5].

==Matrix-M==

Adjuvanti so sestavine cepiva, ki spodbudijo imunski sistem in povečajo učinkovitost cepiva. Cepivu Novavax je dodan adjuvant Matrix-M, ki je sestavljen iz saponina rastline ''Quillaja saponaria'', holesterola in fosfolipidov. Tvori okrogle kletke podobne velikosti kot nanodelci s proteinom bodice [5, 6].

=Klinična preskušanja cepiva=

Prva preskušanja varnosti in imunogenosti cepiva Novavax so potekala na miših in pavijanih. Po prejemu 2 odmerkov cepiva so živali proizvedle protitelesa proti proteinu bodice, ki so bila sposobna nevtralizirati divji tip SARS-CoV-2. Tako se virus ni mogel vezati na receptorje na površini celic in jih okužiti. S tem so raziskovalci potrdili delovanje in varnost cepiva, s čimer so prešli na klinična preskušanja na ljudeh [7,8].

'''1. faza''' kliničnega preskušanja se je začela maja 2020 v Avstraliji. Sodelovalo je 131 zdravih prostovoljcev, starih od 18 do 59 let. Prvi in drugi odmerek so prejeli 21 dni narazen, pri čemer jih je 83 prejelo cepivo z adjuvantom, 25 brez adjuvanta in 23 placebo. Najbolj pogosta lokalna stranska učinka sta bila bolečina in oteklina na mestu vboda, sistemski stranski učinki pa utrujenost, glavobol in bolečine v mišicah. Stranski učinki so bili v glavnem kratkotrajni in blagi. Cepivo z adjuvantom je sprožilo močnejši imunski odziv in spodbudilo nastanek večje količine protiteles, kot so jih zaznali v krvi posameznikov, ki so preboleli COVID-19. Zaznali so tudi močan odziv T-celic pomagalk tipa 1 [8].

'''2. fazo''' kliničnega preskušanja so začeli avgusta 2020 v ZDA in Avstraliji. Sodelovalo je 1256 prostovoljcev, starih od 18 do 84 let, pri čemer jih je 45 % predstavljajo skupino starejših (60-84 let). Sodelujoče so razdelili v 5 skupin, od tega so 4 prejele različne doze cepiva z adjuvantom, 1 pa placebo. Rezultati 2. faze so bili v glavnem enaki kot rezultati 1. faze. Ugotovili so, da je cepivo varno tudi za starejšo populacijo. Stranski učinki so bili pri starejših redkejši in blažji, imunski odziv na cepivo pa je bil nekoliko slabši zaradi staranja imunskega sistema. Ugotovili so, da je nižja doza cepiva (5 µg) bolj primerna kot višja (25 µg), saj pri cepljenih povzroči manj stranskih učinkov, razvije pa se približno enaka količina protiteles [9,10].

'''3. faza''' kliničnega preskušanja se je začela septembra 2020 v Združenem kraljestvu. Sodelovalo je več kot 15.000 prostovoljcev, od tega 27 % starih nad 65 let. Polovica sodelujočih je prejela 2 odmerka cepiva, druga polovica dva odmerka placeba. Rezultati preskušanja še niso objavljeni v obliki znanstvenega članka, je pa podjetje Novavax sporočilo, da učinkovitost cepiva proti originalnemu sevu virusa znaša 96,4 %, proti britanski različici pa 86,3 %. Cepivo nudi 100 % zaščito pred hudim potekom COVID-19 [11].

==Ostala klinična preskušanja==

*Rezultati faze 2b iz Republike Južne Afrike so pokazali, da je učinkovitost cepiva proti južnoafriški različici 55,4 % (za HIV-negativno populacijo) [11].
*V ZDA in Mehiki trenutno še poteka 3. faza kliničnega preskušanja, v kateri sodeluje okoli 30.000 prostovoljcev starejših od 18 let [7].
*Od februarja 2021 v Združenem kraljestvu poteka raziskava, v kateri so prostovoljce cepili s kombinacijo različnih cepiv (Astrazeneca, Pfizer, Moderna in Novavax). Prvi in drugi odmerek sta predstavljali enako ali pa različni cepivi [12].

=Viri=
# J. H. Tian, N. Patel, R. Haupt, H. Zhou, S. Weston, H. Hammond, J. Logue, A. D. Portnoff, J. Norton, … G. Smith: SARS-CoV-2 spike glycoprotein vaccine candidate NVX-CoV2373 immunogenicity in baboons and protection in mice. ''Nat. Commun.'' '''2021''', ''12(1)'', str. 1–14.
# Urgent global health needs addressed by Novavax https://www.novavax.com/our-unique-technology (pridobljeno 3. 5. 2021).
#Polysorbate 80 - Wikipedia https://en.wikipedia.org/wiki/Polysorbate_80 (pridobljeno 3. 5. 2021).
# C. Boutin: NIST Clarifies Structure of Prospective Vaccine for Respiratory Virus | NIST https://www.nist.gov/news-events/news/2020/12/nist-clarifies-structure-prospective-vaccine-respiratory-virus (pridobljeno 3. 5. 2021).
# S. Bangaru, G. Ozorowski, H. L. Turner, A. Antanasijevic, D. Huang, X. Wang, J. L. Torres, J. K. Diedrich, J. H. Tian, … A. B. Ward: Structural analysis of full-length SARS-CoV-2 spike protein from an advanced vaccine candidate. ''Science''. '''2020''', ''370(6520)'', str. 1089–1094.
#J. M. Reimer, K. H. Karlsson, K. Lövgren-Bengtsson, S. E. Magnusson, A. Fuentes, L. Stertman: Matrix-MTM Adjuvant Induces Local Recruitment, Activation and Maturation of Central Immune Cells in Absence of Antigen. ''PLoS One.'' '''2012''', ''7(7)'', str. e41451.
#Phase 3 trial of Novavax investigational COVID-19 vaccine opens | National Institutes of Health (NIH) https://www.nih.gov/news-events/news-releases/phase-3-trial-novavax-investigational-covid-19-vaccine-opens (pridobljeno 4. 5. 2021).
#C. Keech, G. Albert, I. Cho, A. Robertson, P. Reed, S. Neal, J. S. Plested, M. Zhu, S. Cloney-Clark, … G. M. Glenn: Phase 1–2 Trial of a SARS-CoV-2 Recombinant Spike Protein Nanoparticle Vaccine. ''N. Engl. J. Med.'' '''2020''', ''383(24)'', str. 2320–2332.
#Novavax Initiates Phase 2 Portion of Phase 1/2 Clinical Trial of COVID-19 Vaccine | Novavax Inc. - IR Site https://ir.novavax.com/news-releases/news-release-details/novavax-initiates-phase-2-portion-phase-12-clinical-trial-covid (pridobljeno 4. 5. 2021).
#N. Formica, R. Mallory, G. Albert, M. Robinson, J. S. Plested, I. Cho, A. Robertson, F. Dubovsky, G. M. Glenn: Evaluation of a SARS-CoV-2 Vaccine NVX-CoV2373 in Younger and Older Adults. ''medRxiv'' '''2021''', str. 2021.02.26.21252482.
#Novavax Confirms High Levels of Efficacy Against Original and Variant COVID-19 Strains in United Kingdom and South Africa Trials | Novavax Inc. - IR Site https://ir.novavax.com/news-releases/news-release-details/novavax-confirms-high-levels-efficacy-against-original-and-0 (pridobljeno 4. 5. 2021).
#E. Mahase: Covid-19: Moderna and Novavax vaccines to be tested in mixing vaccines trial. ''BMJ'' '''2021''', ''372'', str. n971.

IGEMINI: Kvasovke kot prehransko dopolnilo v vesolju

2021-04-19T18:30:16Z

KlementinaP:

iGEMINI je projekt v okviru tekmovanja iGEM, ki ga je leta 2020 pripravila ekipa dodiplomskih študentov iz Toulouse v Franciji.

Spletna stran projekta iGEMINI: https://2020.igem.org/Team:Toulouse_INSA-UPS

Avtorica povzetka: Klementina Polanec

==Problem==
Astronavti so v vesolju izpostavljeni ekstremnemu okolju, ki lahko ima škodljiv vpliv na njihovo zdravje. Večja izpostavljenost sevanju, višje koncentracije CO2 in mikrogravitacija kratkoročno vplivajo na počutje, dolgoročno gledano pa lahko astronavti začnejo izgubljati mišično maso in kosti, imajo povečano tveganje za kardiovaskularne težave in oslabljeno delovanje imunskega sistema. Uravnotežena prehrana bogata s hranili je za astronavte ključna, saj lahko zmanjša negativne vplive okolja na zdravje [1]. Pomemben del uravnotežene prehrane so vitamini, med katerimi je 13 esencialnih in se priporoča njihovo vsakodnevno uživanje [2].

Trenutno si astronavti na mednarodni vesoljski postaji hrane ne pripravljajo sami, temveč vsakih nekaj mesecev dobijo z Zemlje pošiljko sveže ter dehidrirane in konzervirane hrane [3]. Prvi problem vnaprej pripravljene hrane je, da se med samo pripravo razgradijo številni esencialni vitamini, predvsem manj odporni (vitamin A oziroma retinol, vitamin C, folat in tiamin) [4]. Drug in še večji problem pa je, da se konzervirana hrana shranjuje tudi po več mesecev in daljši čas shrambe pomeni več razgrajenih vitaminov [5]. Tako je na primer razgradnja retinola v odvisnosti od časa eksponentna in po 6 mesecih shrambe se ga razgradi kar 44 % [5, 6].

Zaradi opisanih problemov je v vesolju težje poskrbeti za prehrano dovolj bogato z vitamini, prav tako pa so daljša potovanja po vesolju zaenkrat nemogoča [1,2].

==Rešitev: projekt iGEMINI==
Ekipa iz Toulouse si je zamislila kokulturo, ki bi jo astronavti lahko gojili na raketi in z njo pridobivali prehranska dopolnila. Ekipa se je odločila za pridobivanje β-karotena (provitamin A), saj je vitamin A eden najmanj stabilnih vitaminov [5], prav tako pa ima pomembno vlogo pri celični diferenciaciji in vidu [7]. Prehransko dopolnilo bi lahko astronavti prilagodili svojemu okusu in s pomočjo optogenetske regulacije izbirali med 3 okusi: naraven okus kvasovke, limona ali sladka vrtnica [6].

==Osnove o kokulturi==
Kokulturo bi sestavljali kvasovka ''Saccharomyces cerevisiae'' in bakterija ''Clostridium ljungdahlii''. Kokulturo so zasnovali na tak način, da bi kot vir ogljika in dušika uporabljala odpadke, ki nastanejo pri recikliranju organskih snovi na raketi. Vir ogljika bi predstavljal CO2 iz zraka, vir dušika pa organske molekule iz urina [6].

===''Saccharomyces cerevisiae''===
Kvasovko bi gensko spremenili, tako da bi lahko proizvajala β-karoten, dodali pa bi ji tudi optogenetske elemente, preko katerih bi s spremembo svetlobe spremenili njen okus [6]. Ker je kvasovka splošno prepoznana kot varna, prav tako pa že sama po sebi proizvaja tudi vitamine B in druga hranila [8], bi jo astronavti lahko uživali kot prehransko dopolnilo [6]. To je že ustaljena praksa na Zemlji [9].

===''Clostridium ljungdahlii''===
Ker je kvasovka heterotrofna, ni zmožna uporabljati odpadnega CO2 kot vir ogljika [10]. Ekipa se je zato odločila za kokulturo z bakterijo ''C. ljungdahlii'', ki lahko raste tudi avtotrofno, pri čemer reducira CO2 do organskih spojin, kot vir elektronov pri pretvorbi pa uporablja H2 (prav tako odpadek na raketi) [11]. Bakterija lahko torej na osnovi odpadnih virov proizvede etanol in acetat, ki kvasovki predstavljata vir ogljika [6].

==Moduli sistema==
===Modul 1: sinteza hranil in okusa===
Prvi modul sestavljajo biokocke, ki so namenjene integraciji v genom kvasovke:
{| border=1 style="border-collapse: collapse;"
|-
|Koda || Opis biokocke
|-
|[http://parts.igem.org/Part:BBa_K3570002 BBa_K3570002]
|Konstitutivna sinteza β-karotena v kvasovki.
|-
|[http://parts.igem.org/Part:BBa_K3570000 BBa_K3570000]
|Konstitutivna povečana sinteza geranilgeranil pirofosfata v kvasovki.
|-
|[http://parts.igem.org/Part:BBa_K3570001 BBa_K3570001]
|Kvasovki da okus po sladki vrtnici.
|-
|[http://parts.igem.org/Part:BBa_K3570003 BBa_K3570003]
|Kvasovki da okus po limoni.
|}

'''Biokocka BBa_K3570002'''

Ekipa je v kvasovki želela proizvajati β-karoten, za kar sta potrebna 2 encima iz kvasovke ''Xanthophyllomyces dendrorhous'': fitoen desaturaza (CrtI) in likopen ciklaza/fitoen sintaza (CrtYB). Encima katalizirata serijo reakcij, pri katerih iz geranilgeranil pirofosfata (GGPP) nastane β-karoten ([https://2020.igem.org/wiki/images/0/07/T--Toulouse_INSA-UPS--2020_betacarotene_pathway.jpeg slika sintezne poti]) [6, 12]. Ker je CrtYB transmembranski protein, CrtI pa citosolni, so se odločili za fuzijo obeh encimov, s čimer je encimska pretvorba hitrejša [12].

'''Biokocka BBa_K3570000'''

β-karoten nastaja iz GGPP, zato se je ekipa odločila, da bo v kvasovki skušala povečati sintezo GGPP. To so želeli doseči s pomočjo 2 encimov: GGPP sintaze (CrtE) iz ''X. dendrorhous'' in krajše verzije 3-hidroksi-3-metilglutaril-koencim A reduktaze 1 (tHMG1) iz ''S. cerevisiae'' ([https://2020.igem.org/wiki/images/7/76/T--Toulouse_INSA-UPS--2020_pathway_resume.png slika obeh pretvorb]) [6].

'''Biokocki BBa_K3570001 in BBa_K3570003'''

Izbiro okusa kvasovk bi ekipa prepustila astronavtom, zato so se odločili, da bo sinteza molekul, ki dajo okus, inducibilna s pomočjo optogenetike. Zaradi preprostosti so izbrali okusa po sladki vrtnici ter po limoni, saj obe molekuli za okus nastaneta iz geranil pirofosfata ([https://2020.igem.org/wiki/images/7/76/T--Toulouse_INSA-UPS--2020_pathway_resume.png prekuzor GGPP]) z eno samo encimsko pretvorbo [6]. Za okus po sladki vrtnici sta potrebni 2 molekuli: geraniol, ki ima aromo vrtnice [13] in brazzein, ki je majhen polipeptid z izjemno sladkim okusom [14]. Geraniol nastane iz geranil pirofosfata z encimom geraniol sintaza iz ''Catharanthus roseus''. Biokocka BBa_K3570001 je sestavljena tako, da vsebuje dvosmerni inducibilni promotor Gal1/10, tako da se v eno smer izrazi gen za geraniol sintazo, v drugo smer pa gen za brazzein. Preko restrikcijskih mest XbaI in BamHI se lahko vstavi ustrezno optogenetsko vezje [6].

Za okus po limoni je potrebna ena sama molekula: limonen, ki nastane iz geranil pirofosfata z encimom limonen sintaza. Biokocka BBa_K3570003 vsebuje gen za limonen sintazo pod dvosmernim inducibilnim promotorjem Gal1/10, vsebuje pa tudi restrikcijski mesti XbaI in BamHI za vnos optogenetskega vezja [6].

===Modul 2: regulacija okusa preko optogenetike===
Optogenetika temelji na uporabi proteinov, ki ob prisotnosti svetlobe točno določene valovne dolžine spremenijo konformacijo in s tem postanejo aktivni transkripcijski faktorji (TF) [15].
Ekipa si je zamislila, da bi lahko astronavti z izbiro modre ali rdeče svetlobe inducirali nastajanje molekul za okus v kvasovkah in tako spremenili okus prehranskega dopolnila. Odločili so se za uporabo modrega optogenetskega sistema EL222 in rdečega optogenetskega sistema PhyA/FHY1 [6]. Razvili so biokocki:
{| border=1 style="border-collapse: collapse;"
|-
|Koda || Opis biokocke
|-
|[http://parts.igem.org/Part:BBa_K3570005 BBa_K3570005]
|Moder optogenetski sistem v kvasovki.
|-
|[http://parts.igem.org/Part:BBa_K3570004 BBa_K3570004]
|Rdeč optogenetski sistem v kvasovki.
|}

Moder optogenetski sistem temelji na uporabi TF EL222 iz bakterije ''Erythrobacter litoralis''. Na modri svetlobi (450 nm) EL222 homodimerizira in izpostavi DNA-vezavno domeno, s katero se lahko veže na umetni promotor C120. V kvasovkah EL222 sam po sebi ne more delovati kot TF, zato je potrebna fuzija s proteinom VP16 (protein virusa herpes simplex, ki deluje kot TF) in jedrnim lokalizacijskim signalom (NLS) [16]. Sistem torej deluje tako, da modra svetloba inducira izražanje gena pod promotorjem C120.

Biokocka za moder optogenetski sistem vsebuje gen za NLS-EL222-VP16 pod konstitutivnim promotorjem ter gen za GFP pod dvosmernim inducibilnim promotorjem C120. Deli biokocke so namenjeni vnosu v biokocko za okus, in sicer se lahko promotor C120 preko restrikcijskih mest XmaI-SalI zamenja s promotorjem Gal1/10, preko restrikcijskih mest XbaI-BamHI pa se lahko vstavi gen za NLS-EL222-VP16 skupaj s promotorjem in terminatorjem ([https://2020.igem.org/wiki/images/a/a8/T--Toulouse_INSA-UPS--2020_Schemadefin.png slika levo spodaj]). Ekipa je želela združiti moder optogenetski sistem z okusom po limoni, tako da bi kvasovke na modri svetlobi začele proizvajati limonen [6].

Rdeč optogenetski sistem deluje na podoben način kot moder ([https://2020.igem.org/Team:Toulouse_INSA-UPS/Design#red-optogenetic-system-phya-fhy1 več informacij]), le da je tu potreben promotor Gal1/10. Biokocka za rdeč optogenetski sistem vsebuje pod dvosmernim konstitutivnim promotorjem gena za fuzijska proteina, ki na rdeči svetlobi interagirata in tvorita aktiven transkripcijski faktor. Celotno biokocko lahko preko restrikcijskih mest XbaI-BamHI vstavimo v biokocko za okus ([https://2020.igem.org/wiki/images/a/a8/T--Toulouse_INSA-UPS--2020_Schemadefin.png slika desno spodaj]). Na tak način je ekipa želela združiti rdeč optogenetski sistem z okusom po sladki vrtnici [6].

===Modul 3: gojenje kokulture===
Ekipa si je zamislila, da bi z ustreznim bioreaktorjem kvasovko in bakterijo med seboj ločili, saj bakterija ni prepoznana kot varna za uživanje, omogočili pa bi kroženje gojišča in s tem hranil. Sestavine gojišča so prikazane na [https://2020.igem.org/wiki/images/e/ea/T--Toulouse_INSA-UPS--2020_table.png sliki], prav tako pa bi v bioreaktor dovajali pline (CO2, H2 in O2) ter odpadni dušik iz urina. Kisik kvasovka nujno potrebuje za rast in bakterija je aerotolerantna do 8 % p(O2) v gojišču. Kokulturo bi gojili pri temperaturi 33 °C in pH 5,5 [6].

==Eksperimenti in rezultati==
Pandemija COVID-19 je ekipi otežila delo v laboratoriju, zato večino zastavljenih eksperimentov niso mogli izvesti. V omejenem času jim je uspelo narediti številna kloniranja, s čimer so želeli sestaviti in okarakterizirati vse v modulih omenjene biokocke. Do končne funkcionalne oblike jim je uspelo sestaviti le eno, in sicer biokocko za povečano sintezo GGPP (BBa_K3570000) [6].

Nato so za biokocko preverili, če res omogoča povišano nastajanje GGPP. Transformirali so ''S. cerevisiae'' BY4741 in izvedli ustrezno selekcijo. Zraslim kolonijam so s PCR preverili, če se je biokocka uspešno integrirala v genom in ugotovili so, da se je. Nato so transformirane kvasovke primerjali s kvasovkami divjega tipa, in sicer so z LC-MS primerjali količino GGPP v celicah. Ugotovili so, da so transformirane kvasovke imele petkrat več GGPP na biomaso kot kvasovke divjega tipa ([http://parts.igem.org/wiki/images/3/37/T--Toulouse_INSA-UPS--2020_GGPP.png graf]). S tem so potrdili, da biokocka deluje, kot so si zamislili [6].

Sledili so še eksperimenti z monokulturama kvasovke in bakterije, s katerimi so ugotovili [6]:
*zamišljeno [https://2020.igem.org/wiki/images/e/ea/T--Toulouse_INSA-UPS--2020_table.png gojišče]vsebuje snov, ki kvasovki preprečuje rast na acetatu in etanolu kot viru ogljika
*bakterija uspešno raste v fermentorju, uporablja CO2 in H2 ter pri tem proizvaja etanol in acetat
*kvasovka lahko uporablja etanol in acetat kot vir ogljika, prav tako pa začne rasti že pri nizkih koncentracijah enega izmed virov
*kvasovka porablja acetat in etanol hkrati

==Zaključki==
Kljub temu da ekipi eksperimentalno ni uspelo dokazati delovanje sistema, so s pomočjo modeliranja ugotovili, da bi z 1 L kokulture lahko v 24 urah proizvedli 3 dnevne doze β-karotena. To predstavlja velik uspeh za projekt iGEMINI in prislužili so si 2. mesto v skupini dodiplomskih študentov [6].

==Viri==
[1] A Successful Mission Starts With Nutrition | Science Mission Directorate https://science.nasa.gov/science-news/news-articles/a-successful-mission-starts-with-nutrition (pridobljeno 19. 4. 2021).

[2] Vitamins and Minerals for Older Adults | National Institute on Aging https://www.nia.nih.gov/health/vitamins-and-minerals-older-adults (pridobljeno 19. 4. 2021).

[3] G. L. Douglas, S. R. Zwart, S. M. Smith: Space Food for Thought: Challenges and Considerations for Food and Nutrition on Exploration Missions. J. Nutr. 2020, 150(9), str. 2242–2244.

[4] E. Lešková, J. Kubíková, E. Kováčiková, M. Košická, J. Porubská, K. Holčíková: Vitamin losses: Retention during heat treatment and continual changes expressed by mathematical models. J. Food Compos. Anal. 2006, 19(4), str. 252–276.

[5] P. Berry Ottaway: Stability of vitamins during food processing and storage. V: Chemical Deterioration and Physical Instability of Food and Beverages. Elsevier 2010, str. 539–560.

[6] Team:Toulouse INSA-UPS - 2020.igem.org https://2020.igem.org/Team:Toulouse_INSA-UPS (pridobljeno 19. 4. 2021).

[7] J. A. Olson: Benefits and Liabilities of Vitamin A and Carotenoids. J. Nutr. 1996, 126(suppl_4), str. 1208S-1212S.

[8] M. E. Jach, A. Serefko: Nutritional Yeast Biomass: Characterization and Application. V: Diet, Microbiome and Health. Elsevier 2018, str. 237–270.

[9] Nutritional yeast - Wikipedia https://en.wikipedia.org/wiki/Nutritional_yeast (pridobljeno 19. 4. 2021).

[10] A. La, P. Perré, B. Taidi: Process for symbiotic culture of Saccharomyces cerevisiae and Chlorella vulgaris for in situ CO2 mitigation. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2019, 103(2), str. 731–745.

[11] C. Leang, T. Ueki, K. P. Nevin, D. R. Lovley: A Genetic System for Clostridium ljungdahlii: a Chassis for Autotrophic Production of Biocommodities and a Model Homoacetogen. Appl. Environ. Microbiol. 2013, 79(4), str. 1102–1109.

[12] H. Rabeharindranto, S. Castaño-Cerezo, T. Lautier, L. F. Garcia-Alles, C. Treitz, A. Tholey, G. Truan: Enzyme-fusion strategies for redirecting and improving carotenoid synthesis in S. cerevisiae. Metab. Eng. Commun. 2019, 8, str. e00086.

[13] W. Chen, A. M. Viljoen: Geraniol — A review of a commercially important fragrance material. South African J. Bot. 2010, 76(4), str. 643–651.

[14] G. Hellekant: Brazzein a Small, Sweet Protein: Discovery and Physiological Overview. Chem. Senses 2005, 30(Supplement 1), str. i88–i89.

[15] R. M. Hughes, S. Bolger, H. Tapadia, C. L. Tucker: Light-mediated control of DNA transcription in yeast. Methods 2012, 58(4), str. 385–391.

[16] L. B. Motta-Mena, A. Reade, M. J. Mallory, S. Glantz, O. D. Weiner, K. W. Lynch, K. H. Gardner: An optogenetic gene expression system with rapid activation and deactivation kinetics. Nat. Chem. Biol. 2014, 10(3), str. 196–202.

IGEMINI: Kvasovke kot prehransko dopolnilo v vesolju

2021-04-19T18:27:54Z

KlementinaP:

iGEMINI je projekt v okviru tekmovanja iGEM, ki ga je leta 2020 pripravila ekipa dodiplomskih študentov iz Toulouse v Franciji.

Spletna stran projekta iGEMINI: https://2020.igem.org/Team:Toulouse_INSA-UPS

Avtorica povzetka: Klementina Polanec

==Problem==
Astronavti so v vesolju izpostavljeni ekstremnemu okolju, ki lahko ima škodljiv vpliv na njihovo zdravje. Večja izpostavljenost sevanju, višje koncentracije CO2 in mikrogravitacija kratkoročno vplivajo na počutje, dolgoročno gledano pa lahko astronavti začnejo izgubljati mišično maso in kosti, imajo povečano tveganje za kardiovaskularne težave in oslabljeno delovanje imunskega sistema. Uravnotežena prehrana bogata s hranili je za astronavte ključna, saj lahko zmanjša negativne vplive okolja na zdravje [1]. Pomemben del uravnotežene prehrane so vitamini, med katerimi je 13 esencialnih in se priporoča njihovo vsakodnevno uživanje [2].

Trenutno si astronavti na mednarodni vesoljski postaji hrane ne pripravljajo sami, temveč vsakih nekaj mesecev dobijo z Zemlje pošiljko sveže ter dehidrirane in konzervirane hrane [3]. Prvi problem vnaprej pripravljene hrane je, da se med samo pripravo razgradijo številni esencialni vitamini, predvsem manj odporni (vitamin A oziroma retinol, vitamin C, folat in tiamin) [4]. Drug in še večji problem pa je, da se konzervirana hrana shranjuje tudi po več mesecev in daljši čas shrambe pomeni več razgrajenih vitaminov [5]. Tako je na primer razgradnja retinola v odvisnosti od časa eksponentna in po 6 mesecih shrambe se ga razgradi kar 44 % [5, 6].

Zaradi opisanih problemov je v vesolju težje poskrbeti za prehrano dovolj bogato z vitamini, prav tako pa so daljša potovanja po vesolju zaenkrat nemogoča [1,2].

==Rešitev: projekt iGEMINI==
Ekipa iz Toulouse si je zamislila kokulturo, ki bi jo astronavti lahko gojili na raketi in z njo pridobivali prehranska dopolnila. Ekipa se je odločila za pridobivanje β-karotena (provitamin A), saj je vitamin A eden najmanj stabilnih vitaminov [5], prav tako pa ima pomembno vlogo pri celični diferenciaciji in vidu [7]. Prehransko dopolnilo bi lahko astronavti prilagodili svojemu okusu in s pomočjo optogenetske regulacije izbirali med 3 okusi: naraven okus kvasovke, limona ali sladka vrtnica [6].

==Osnove o kokulturi==
Kokulturo bi sestavljali kvasovka ''Saccharomyces cerevisiae'' in bakterija ''Clostridium ljungdahlii''. Kokulturo so zasnovali na tak način, da bi kot vir ogljika in dušika uporabljala odpadke, ki nastanejo pri recikliranju organskih snovi na raketi. Vir ogljika bi predstavljal CO2 iz zraka, vir dušika pa organske molekule iz urina [6].

===''Saccharomyces cerevisiae''===
Kvasovko bi gensko spremenili, tako da bi lahko proizvajala β-karoten, dodali pa bi ji tudi optogenetske elemente, preko katerih bi s spremembo svetlobe spremenili njen okus [6]. Ker je kvasovka splošno prepoznana kot varna, prav tako pa že sama po sebi proizvaja tudi vitamine B in druga hranila [8], bi jo astronavti lahko uživali kot prehransko dopolnilo [6]. To je že ustaljena praksa na Zemlji [9].

===''Clostridium ljungdahlii''===
Ker je kvasovka heterotrofna, ni zmožna uporabljati odpadnega CO2 kot vir ogljika [10]. Ekipa se je zato odločila za kokulturo z bakterijo ''C. ljungdahlii'', ki lahko raste tudi avtotrofno, pri čemer reducira CO2 do organskih spojin, kot vir elektronov pri pretvorbi pa uporablja H2 (prav tako odpadek na raketi) [11]. Bakterija lahko torej na osnovi odpadnih virov proizvede etanol in acetat, ki kvasovki predstavljata vir ogljika [6].

==Moduli sistema==
===Modul 1: sinteza hranil in okusa===
Prvi modul sestavljajo biokocke, ki so namenjene integraciji v genom kvasovke:
{| border=1 style="border-collapse: collapse;"
|-
|Koda || Opis biokocke
|-
|[http://parts.igem.org/Part:BBa_K3570002 BBa_K3570002]
|Konstitutivna sinteza β-karotena v kvasovki.
|-
|[http://parts.igem.org/Part:BBa_K3570000 BBa_K3570000]
|Konstitutivna povečana sinteza geranilgeranil pirofosfata v kvasovki.
|-
|[http://parts.igem.org/Part:BBa_K3570001 BBa_K3570001]
|Kvasovki da okus po sladki vrtnici.
|-
|[http://parts.igem.org/Part:BBa_K3570003 BBa_K3570003]
|Kvasovki da okus po limoni.
|}

'''Biokocka BBa_K3570002'''

Ekipa je v kvasovki želela proizvajati β-karoten, za kar sta potrebna 2 encima iz kvasovke ''Xanthophyllomyces dendrorhous'': fitoen desaturaza (CrtI) in likopen ciklaza/fitoen sintaza (CrtYB). Encima katalizirata serijo reakcij, pri katerih iz geranilgeranil pirofosfata (GGPP) nastane β-karoten ([https://2020.igem.org/wiki/images/0/07/T--Toulouse_INSA-UPS--2020_betacarotene_pathway.jpeg slika sintezne poti]) [6, 12]. Ker je CrtYB transmembranski protein, CrtI pa citosolni, so se odločili za fuzijo obeh encimov, s čimer je encimska pretvorba hitrejša [12].

'''Biokocka BBa_K3570000'''

β-karoten nastaja iz GGPP, zato se je ekipa odločila, da bo v kvasovki skušala povečati sintezo GGPP. To so želeli doseči s pomočjo 2 encimov: GGPP sintaze (CrtE) iz ''X. dendrorhous'' in krajše verzije 3-hidroksi-3-metilglutaril-koencim A reduktaze 1 (tHMG1) iz ''S. cerevisiae'' ([https://2020.igem.org/wiki/images/7/76/T--Toulouse_INSA-UPS--2020_pathway_resume.png slika obeh pretvorb]) [6].

'''Biokocki BBa_K3570001 in BBa_K3570003'''

Izbiro okusa kvasovk bi ekipa prepustila astronavtom, zato so se odločili, da bo sinteza molekul, ki dajo okus, inducibilna s pomočjo optogenetike. Zaradi preprostosti so izbrali okusa po sladki vrtnici ter po limoni, saj obe molekuli za okus nastaneta iz geranil pirofosfata ([https://2020.igem.org/wiki/images/7/76/T--Toulouse_INSA-UPS--2020_pathway_resume.png prekuzor GGPP]) z eno samo encimsko pretvorbo [6]. Za okus po sladki vrtnici sta potrebni 2 molekuli: geraniol, ki ima aromo vrtnice [13] in brazzein, ki je majhen polipeptid z izjemno sladkim okusom [14]. Geraniol nastane iz geranil pirofosfata z encimom geraniol sintaza iz ''Catharanthus roseus''. Biokocka BBa_K3570001 je sestavljena tako, da vsebuje dvosmerni inducibilni promotor Gal1/10, tako da se v eno smer izrazi gen za geraniol sintazo, v drugo smer pa gen za brazzein. Preko restrikcijskih mest XbaI in BamHI se lahko vstavi ustrezno optogenetsko vezje [6].

Za okus po limoni je potrebna ena sama molekula: limonen, ki nastane iz geranil pirofosfata z encimom limonen sintaza. Biokocka BBa_K3570003 vsebuje gen za limonen sintazo pod dvosmernim inducibilnim promotorjem Gal1/10, vsebuje pa tudi restrikcijski mesti XbaI in BamHI za vnos optogenetskega vezja [6].

===Modul 2: regulacija okusa preko optogenetike===
Optogenetika temelji na uporabi proteinov, ki ob prisotnosti svetlobe točno določene valovne dolžine spremenijo konformacijo in s tem postanejo aktivni transkripcijski faktorji (TF) [15].
Ekipa si je zamislila, da bi lahko astronavti z izbiro modre ali rdeče svetlobe inducirali nastajanje molekul za okus v kvasovkah in tako spremenili okus prehranskega dopolnila. Odločili so se za uporabo modrega optogenetskega sistema EL222 in rdečega optogenetskega sistema PhyA/FHY1 [6]. Razvili so biokocki:
{| border=1 style="border-collapse: collapse;"
|-
|Koda || Opis biokocke
|-
|[http://parts.igem.org/Part:BBa_K3570005 BBa_K3570005]
|Moder optogenetski sistem v kvasovki.
|-
|[http://parts.igem.org/Part:BBa_K3570004 BBa_K3570004]
|Rdeč optogenetski sistem v kvasovki.
|}

Moder optogenetski sistem temelji na uporabi TF EL222 iz bakterije ''Erythrobacter litoralis''. Na modri svetlobi (450 nm) EL222 homodimerizira in izpostavi DNA-vezavno domeno, s katero se lahko veže na umetni promotor C120. V kvasovkah EL222 sam po sebi ne more delovati kot TF, zato je potrebna fuzija s proteinom VP16 (protein virusa herpes simplex, ki deluje kot TF) in jedrnim lokalizacijskim signalom (NLS) [16]. Sistem torej deluje tako, da modra svetloba inducira izražanje gena pod promotorjem C120.

Biokocka za moder optogenetski sistem vsebuje gen za NLS-EL222-VP16 pod konstitutivnim promotorjem ter gen za GFP pod dvosmernim inducibilnim promotorjem C120. Deli biokocke so namenjeni vnosu v biokocko za okus, in sicer se lahko promotor C120 preko restrikcijskih mest XmaI-SalI zamenja s promotorjem Gal1/10, preko restrikcijskih mest XbaI-BamHI pa se lahko vstavi gen za NLS-EL222-VP16 skupaj s promotorjem in terminatorjem ([https://2020.igem.org/wiki/images/a/a8/T--Toulouse_INSA-UPS--2020_Schemadefin.png slika levo spodaj]). Ekipa je želela združiti moder optogenetski sistem z okusom po limoni, tako da bi kvasovke na modri svetlobi začele proizvajati limonen [6].

Rdeč optogenetski sistem deluje na podoben način kot moder ([https://2020.igem.org/Team:Toulouse_INSA-UPS/Design#red-optogenetic-system-phya-fhy1 več informacij]), le da je tu potreben promotor Gal1/10 [6]. Biokocka za rdeč optogenetski sistem vsebuje pod dvosmernim konstitutivnim promotorjem gena za fuzijska proteina, ki na rdeči svetlobi interagirata in tvorita aktiven transkripcijski faktor. Celotno biokocko lahko preko restrikcijskih mest XbaI-BamHI vstavimo v biokocko za okus ([https://2020.igem.org/wiki/images/a/a8/T--Toulouse_INSA-UPS--2020_Schemadefin.png slika desno spodaj]). Na tak način je ekipa želela združiti rdeč optogenetski sistem z okusom po sladki vrtnici [6].

===Modul 3: gojenje kokulture===
Ekipa si je zamislila, da bi z ustreznim bioreaktorjem kvasovko in bakterijo med seboj ločili, saj bakterija ni prepoznana kot varna za uživanje, omogočili pa bi kroženje gojišča in s tem hranil. Sestavine gojišča so prikazane na [https://2020.igem.org/wiki/images/e/ea/T--Toulouse_INSA-UPS--2020_table.png sliki], prav tako pa bi v bioreaktor dovajali pline (CO2, H2 in O2) ter odpadni dušik iz urina. Kisik kvasovka nujno potrebuje za rast in bakterija je aerotolerantna do 8 % p(O2) v gojišču. Kokulturo bi gojili pri temperaturi 33 °C in pH 5,5 [6].

==Eksperimenti in rezultati==
Pandemija COVID-19 je ekipi otežila delo v laboratoriju, zato večino zastavljenih eksperimentov niso mogli izvesti. V omejenem času jim je uspelo narediti številna kloniranja, s čimer so želeli sestaviti in okarakterizirati vse v modulih omenjene biokocke. Do končne funkcionalne oblike jim je uspelo sestaviti le eno, in sicer biokocko za povečano sintezo GGPP (BBa_K3570000) [6].

Nato so za biokocko preverili, če res omogoča povišano nastajanje GGPP. Transformirali so ''S. cerevisiae'' BY4741 in izvedli ustrezno selekcijo. Zraslim kolonijam so s PCR preverili, če se je biokocka uspešno integrirala v genom in ugotovili so, da se je. Nato so transformirane kvasovke primerjali s kvasovkami divjega tipa, in sicer so z LC-MS primerjali količino GGPP v celicah. Ugotovili so, da so transformirane kvasovke imele petkrat več GGPP na biomaso kot kvasovke divjega tipa ([http://parts.igem.org/wiki/images/3/37/T--Toulouse_INSA-UPS--2020_GGPP.png graf]). S tem so potrdili, da biokocka deluje, kot so si zamislili [6].

Sledili so še eksperimenti z monokulturama kvasovke in bakterije, s katerimi so ugotovili [6]:
*zamišljeno [https://2020.igem.org/wiki/images/e/ea/T--Toulouse_INSA-UPS--2020_table.png gojišče]vsebuje snov, ki kvasovki preprečuje rast na acetatu in etanolu kot viru ogljika
*bakterija uspešno raste v fermentorju, uporablja CO2 in H2 ter pri tem proizvaja etanol in acetat
*kvasovka lahko uporablja etanol in acetat kot vir ogljika, prav tako pa začne rasti že pri nizkih koncentracijah enega izmed virov
*kvasovka porablja acetat in etanol hkrati

==Zaključki==
Kljub temu da ekipi eksperimentalno ni uspelo dokazati delovanje sistema, so s pomočjo modeliranja ugotovili, da bi z 1 L kokulture lahko v 24 urah proizvedli 3 dnevne doze β-karotena. To predstavlja velik uspeh za projekt iGEMINI in prislužili so si 2. mesto v skupini dodiplomskih študentov [6].

==Viri==
[1] A Successful Mission Starts With Nutrition | Science Mission Directorate https://science.nasa.gov/science-news/news-articles/a-successful-mission-starts-with-nutrition (pridobljeno 19. 4. 2021).

[2] Vitamins and Minerals for Older Adults | National Institute on Aging https://www.nia.nih.gov/health/vitamins-and-minerals-older-adults (pridobljeno 19. 4. 2021).

[3] G. L. Douglas, S. R. Zwart, S. M. Smith: Space Food for Thought: Challenges and Considerations for Food and Nutrition on Exploration Missions. J. Nutr. 2020, 150(9), str. 2242–2244.

[4] E. Lešková, J. Kubíková, E. Kováčiková, M. Košická, J. Porubská, K. Holčíková: Vitamin losses: Retention during heat treatment and continual changes expressed by mathematical models. J. Food Compos. Anal. 2006, 19(4), str. 252–276.

[5] P. Berry Ottaway: Stability of vitamins during food processing and storage. V: Chemical Deterioration and Physical Instability of Food and Beverages. Elsevier 2010, str. 539–560.

[6] Team:Toulouse INSA-UPS - 2020.igem.org https://2020.igem.org/Team:Toulouse_INSA-UPS (pridobljeno 19. 4. 2021).

[7] J. A. Olson: Benefits and Liabilities of Vitamin A and Carotenoids. J. Nutr. 1996, 126(suppl_4), str. 1208S-1212S.

[8] M. E. Jach, A. Serefko: Nutritional Yeast Biomass: Characterization and Application. V: Diet, Microbiome and Health. Elsevier 2018, str. 237–270.

[9] Nutritional yeast - Wikipedia https://en.wikipedia.org/wiki/Nutritional_yeast (pridobljeno 19. 4. 2021).

[10] A. La, P. Perré, B. Taidi: Process for symbiotic culture of Saccharomyces cerevisiae and Chlorella vulgaris for in situ CO2 mitigation. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2019, 103(2), str. 731–745.

[11] C. Leang, T. Ueki, K. P. Nevin, D. R. Lovley: A Genetic System for Clostridium ljungdahlii: a Chassis for Autotrophic Production of Biocommodities and a Model Homoacetogen. Appl. Environ. Microbiol. 2013, 79(4), str. 1102–1109.

[12] H. Rabeharindranto, S. Castaño-Cerezo, T. Lautier, L. F. Garcia-Alles, C. Treitz, A. Tholey, G. Truan: Enzyme-fusion strategies for redirecting and improving carotenoid synthesis in S. cerevisiae. Metab. Eng. Commun. 2019, 8, str. e00086.

[13] W. Chen, A. M. Viljoen: Geraniol — A review of a commercially important fragrance material. South African J. Bot. 2010, 76(4), str. 643–651.

[14] G. Hellekant: Brazzein a Small, Sweet Protein: Discovery and Physiological Overview. Chem. Senses 2005, 30(Supplement 1), str. i88–i89.

[15] R. M. Hughes, S. Bolger, H. Tapadia, C. L. Tucker: Light-mediated control of DNA transcription in yeast. Methods 2012, 58(4), str. 385–391.

[16] L. B. Motta-Mena, A. Reade, M. J. Mallory, S. Glantz, O. D. Weiner, K. W. Lynch, K. H. Gardner: An optogenetic gene expression system with rapid activation and deactivation kinetics. Nat. Chem. Biol. 2014, 10(3), str. 196–202.

IGEMINI: Kvasovke kot prehransko dopolnilo v vesolju

2021-04-19T18:24:34Z

KlementinaP:

iGEMINI je projekt v okviru tekmovanja iGEM, ki ga je leta 2020 pripravila ekipa dodiplomskih študentov iz Toulouse v Franciji.

Spletna stran projekta iGEMINI: https://2020.igem.org/Team:Toulouse_INSA-UPS

Avtorica povzetka: Klementina Polanec

==Problem==
Astronavti so v vesolju izpostavljeni ekstremnemu okolju, ki lahko ima škodljiv vpliv na njihovo zdravje. Večja izpostavljenost sevanju, višje koncentracije CO2 in mikrogravitacija kratkoročno vplivajo na počutje, dolgoročno gledano pa lahko astronavti začnejo izgubljati mišično maso in kosti, imajo povečano tveganje za kardiovaskularne težave in oslabljeno delovanje imunskega sistema. Uravnotežena prehrana bogata s hranili je za astronavte ključna, saj lahko zmanjša negativne vplive okolja na zdravje [1]. Pomemben del uravnotežene prehrane so vitamini, med katerimi je 13 esencialnih in se priporoča njihovo vsakodnevno uživanje [2].

Trenutno si astronavti na mednarodni vesoljski postaji hrane ne pripravljajo sami, temveč vsakih nekaj mesecev dobijo z Zemlje pošiljko sveže ter dehidrirane in konzervirane hrane [3]. Prvi problem vnaprej pripravljene hrane je, da se med samo pripravo razgradijo številni esencialni vitamini, predvsem manj odporni (vitamin A oziroma retinol, vitamin C, folat in tiamin) [4]. Drug in še večji problem pa je, da se konzervirana hrana shranjuje tudi po več mesecev in daljši čas shrambe pomeni več razgrajenih vitaminov [5]. Tako je na primer razgradnja retinola v odvisnosti od časa eksponentna in po 6 mesecih shrambe se ga razgradi kar 44 % [5, 6].

Zaradi opisanih problemov je v vesolju težje poskrbeti za prehrano dovolj bogato z vitamini, prav tako pa so daljša potovanja po vesolju zaenkrat nemogoča [1,2].

==Rešitev: projekt iGEMINI==
Ekipa iz Toulouse si je zamislila kokulturo, ki bi jo astronavti lahko gojili na raketi in z njo pridobivali prehranska dopolnila. Ekipa se je odločila za pridobivanje β-karotena (provitamin A), saj je vitamin A eden najmanj stabilnih vitaminov [5], prav tako pa ima pomembno vlogo pri celični diferenciaciji in vidu [7]. Prehransko dopolnilo bi lahko astronavti prilagodili svojemu okusu in s pomočjo optogenetske regulacije izbirali med 3 okusi: naraven okus kvasovke, limona ali sladka vrtnica [6].

==Osnove o kokulturi==
Kokulturo bi sestavljali kvasovka ''Saccharomyces cerevisiae'' in bakterija ''Clostridium ljungdahlii''. Kokulturo so zasnovali na tak način, da bi kot vir ogljika in dušika uporabljala odpadke, ki nastanejo pri recikliranju organskih snovi na raketi. Vir ogljika bi predstavljal CO2 iz zraka, vir dušika pa organske molekule iz urina [6].

===''Saccharomyces cerevisiae''===
Kvasovko bi gensko spremenili, tako da bi lahko proizvajala β-karoten, dodali pa bi ji tudi optogenetske elemente, preko katerih bi s spremembo svetlobe spremenili njen okus [6]. Ker je kvasovka splošno prepoznana kot varna, prav tako pa že sama po sebi proizvaja tudi vitamine B in druga hranila [8], bi jo astronavti lahko uživali kot prehransko dopolnilo [6]. To je že ustaljena praksa na Zemlji [9].

===''Clostridium ljungdahlii''===
Ker je kvasovka heterotrofna, ni zmožna uporabljati odpadnega CO2 kot vir ogljika [10]. Ekipa se je zato odločila za kokulturo z bakterijo ''C. ljungdahlii'', ki lahko raste tudi avtotrofno, pri čemer reducira CO2 do organskih spojin, kot vir elektronov pri pretvorbi pa uporablja H2 (prav tako odpadek na raketi) [11]. Bakterija lahko torej na osnovi odpadnih virov proizvede etanol in acetat, ki kvasovki predstavljata vir ogljika [6].

==Moduli sistema==
===Modul 1: sinteza hranil in okusa===
Prvi modul sestavljajo biokocke:
{| border=1 style="border-collapse: collapse;"
|-
|Koda || Opis biokocke
|-
|[http://parts.igem.org/Part:BBa_K3570002 BBa_K3570002]
|Konstitutivna sinteza β-karotena v kvasovki.
|-
|[http://parts.igem.org/Part:BBa_K3570000 BBa_K3570000]
|Konstitutivna povečana sinteza geranilgeranil pirofosfata v kvasovki.
|-
|[http://parts.igem.org/Part:BBa_K3570001 BBa_K3570001]
|Kvasovki da okus po sladki vrtnici.
|-
|[http://parts.igem.org/Part:BBa_K3570003 BBa_K3570003]
|Kvasovki da okus po limoni.
|}

'''Biokocka BBa_K3570002'''

Ekipa je v kvasovki želela proizvajati β-karoten, za kar sta potrebna 2 encima iz kvasovke ''Xanthophyllomyces dendrorhous'': fitoen desaturaza (CrtI) in likopen ciklaza/fitoen sintaza (CrtYB). Encima katalizirata serijo reakcij, pri katerih iz geranilgeranil pirofosfata (GGPP) nastane β-karoten ([https://2020.igem.org/wiki/images/0/07/T--Toulouse_INSA-UPS--2020_betacarotene_pathway.jpeg slika sintezne poti]) [6, 12]. Ker je CrtYB transmembranski protein, CrtI pa citosolni, so se odločili za fuzijo obeh encimov, s čimer je encimska pretvorba hitrejša [12].

'''Biokocka BBa_K3570000'''

β-karoten nastaja iz GGPP, zato se je ekipa odločila, da bo v kvasovki skušala povečati sintezo GGPP. To so želeli doseči s pomočjo 2 encimov: GGPP sintaze (CrtE) iz ''X. dendrorhous'' in krajše verzije 3-hidroksi-3-metilglutaril-koencim A reduktaze 1 (tHMG1) iz ''S. cerevisiae'' ([https://2020.igem.org/wiki/images/7/76/T--Toulouse_INSA-UPS--2020_pathway_resume.png slika obeh pretvorb]) [6].

'''Biokocki BBa_K3570001 in BBa_K3570003'''

Izbiro okusa kvasovk bi ekipa prepustila astronavtom, zato so se odločili, da bo sinteza molekul, ki dajo okus, inducibilna s pomočjo optogenetike. Zaradi preprostosti so izbrali okusa po sladki vrtnici ter po limoni, saj obe molekuli za okus nastaneta iz geranil pirofosfata ([https://2020.igem.org/wiki/images/7/76/T--Toulouse_INSA-UPS--2020_pathway_resume.png prekuzor GGPP]) z eno samo encimsko pretvorbo [6]. Za okus po sladki vrtnici sta potrebni 2 molekuli: geraniol, ki ima aromo vrtnice [13] in brazzein, ki je majhen polipeptid z izjemno sladkim okusom [14]. Geraniol nastane iz geranil pirofosfata z encimom geraniol sintaza iz ''Catharanthus roseus''. Biokocka BBa_K3570001 je sestavljena tako, da vsebuje dvosmerni inducibilni promotor Gal1/10, tako da se v eno smer izrazi gen za geraniol sintazo, v drugo smer pa gen za brazzein. Preko restrikcijskih mest XbaI in BamHI se lahko vstavi ustrezno optogenetsko vezje [6].

Za okus po limoni je potrebna ena sama molekula: limonen, ki nastane iz geranil pirofosfata z encimom limonen sintaza. Biokocka BBa_K3570003 vsebuje gen za limonen sintazo pod dvosmernim inducibilnim promotorjem Gal1/10, vsebuje pa tudi restrikcijski mesti XbaI in BamHI za vnos optogenetskega vezja [6].

===Modul 2: regulacija okusa preko optogenetike===
Optogenetika temelji na uporabi proteinov, ki ob prisotnosti svetlobe točno določene valovne dolžine spremenijo konformacijo in s tem postanejo aktivni transkripcijski faktorji (TF) [15].
Ekipa si je zamislila, da bi lahko astronavti z izbiro modre ali rdeče svetlobe inducirali nastajanje molekul za okus v kvasovkah in tako spremenili okus prehranskega dopolnila. Odločili so se za uporabo modrega optogenetskega sistema EL222 in rdečega optogenetskega sistema PhyA/FHY1 [6]. Razvili so biokocki:
{| border=1 style="border-collapse: collapse;"
|-
|Koda || Opis biokocke
|-
|[http://parts.igem.org/Part:BBa_K3570005 BBa_K3570005]
|Moder optogenetski sistem v kvasovki.
|-
|[http://parts.igem.org/Part:BBa_K3570004 BBa_K3570004]
|Rdeč optogenetski sistem v kvasovki.
|}

Moder optogenetski sistem temelji na uporabi TF EL222 iz bakterije ''Erythrobacter litoralis''. Na modri svetlobi (450 nm) EL222 homodimerizira in izpostavi DNA-vezavno domeno, s katero se lahko veže na umetni promotor C120. V kvasovkah EL222 sam po sebi ne more delovati kot TF, zato je potrebna fuzija s proteinom VP16 (protein virusa herpes simplex, ki deluje kot TF) in jedrnim lokalizacijskim signalom (NLS) [16]. Sistem torej deluje tako, da modra svetloba inducira izražanje gena pod promotorjem C120.

Biokocka za moder optogenetski sistem vsebuje gen za NLS-EL222-VP16 pod konstitutivnim promotorjem ter gen za GFP pod dvosmernim inducibilnim promotorjem C120. Deli biokocke so namenjeni vnosu v biokocko za okus, in sicer se lahko promotor C120 preko restrikcijskih mest XmaI-SalI zamenja s promotorjem Gal1/10, preko restrikcijskih mest XbaI-BamHI pa se lahko vstavi gen za NLS-EL222-VP16 skupaj s promotorjem in terminatorjem ([https://2020.igem.org/wiki/images/a/a8/T--Toulouse_INSA-UPS--2020_Schemadefin.png slika levo spodaj]). Ekipa je želela združiti moder optogenetski sistem z okusom po limoni, tako da bi kvasovke na modri svetlobi začele proizvajati limonen [6].

Rdeč optogenetski sistem deluje na podoben način kot moder ([https://2020.igem.org/Team:Toulouse_INSA-UPS/Design#red-optogenetic-system-phya-fhy1 več informacij]), le da je tu potreben promotor Gal1/10 [6]. Biokocka za rdeč optogenetski sistem vsebuje pod dvosmernim konstitutivnim promotorjem gena za fuzijska proteina, ki na rdeči svetlobi interagirata in tvorita aktiven transkripcijski faktor. Celotno biokocko lahko preko restrikcijskih mest XbaI-BamHI vstavimo v biokocko za okus ([https://2020.igem.org/wiki/images/a/a8/T--Toulouse_INSA-UPS--2020_Schemadefin.png slika desno spodaj]). Na tak način je ekipa želela združiti rdeč optogenetski sistem z okusom po sladki vrtnici [6].

===Modul 3: gojenje kokulture===
Ekipa si je zamislila, da bi z ustreznim bioreaktorjem kvasovko in bakterijo med seboj ločili, saj bakterija ni prepoznana kot varna za uživanje, omogočili pa bi kroženje gojišča in s tem hranil. Sestavine gojišča so prikazane na [https://2020.igem.org/wiki/images/e/ea/T--Toulouse_INSA-UPS--2020_table.png sliki], prav tako pa bi v bioreaktor dovajali pline (CO2, H2 in O2) ter odpadni dušik iz urina. Kisik kvasovka nujno potrebuje za rast in bakterija je aerotolerantna do 8 % p(O2) v gojišču. Kokulturo bi gojili pri temperaturi 33 °C in pH 5,5 [6].

==Eksperimenti in rezultati==
Pandemija COVID-19 je ekipi otežila delo v laboratoriju, zato večino zastavljenih eksperimentov niso mogli izvesti. V omejenem času jim je uspelo narediti številna kloniranja, s čimer so želeli sestaviti in okarakterizirati vse v modulih omenjene biokocke. Do končne funkcionalne oblike jim je uspelo sestaviti le eno, in sicer biokocko za povečano sintezo GGPP (BBa_K3570000) [6].

Nato so za biokocko preverili, če res omogoča povišano nastajanje GGPP. Transformirali so ''S. cerevisiae'' BY4741 in izvedli ustrezno selekcijo. Zraslim kolonijam so s PCR preverili, če se je biokocka uspešno integrirala v genom in ugotovili so, da se je. Nato so transformirane kvasovke primerjali s kvasovkami divjega tipa, in sicer so z LC-MS primerjali količino GGPP v celicah. Ugotovili so, da so transformirane kvasovke imele petkrat več GGPP na biomaso kot kvasovke divjega tipa ([http://parts.igem.org/wiki/images/3/37/T--Toulouse_INSA-UPS--2020_GGPP.png graf]). S tem so potrdili, da biokocka deluje, kot so si zamislili [6].

Sledili so še eksperimenti z monokulturama kvasovke in bakterije, s katerimi so ugotovili [6]:
*zamišljeno [https://2020.igem.org/wiki/images/e/ea/T--Toulouse_INSA-UPS--2020_table.png gojišče]vsebuje snov, ki kvasovki preprečuje rast na acetatu in etanolu kot viru ogljika
*bakterija uspešno raste v fermentorju, uporablja CO2 in H2 ter pri tem proizvaja etanol in acetat
*kvasovka lahko uporablja etanol in acetat kot vir ogljika, prav tako pa začne rasti že pri nizkih koncentracijah enega izmed virov
*kvasovka porablja acetat in etanol hkrati

==Zaključki==
Kljub temu da ekipi eksperimentalno ni uspelo dokazati delovanje sistema, so s pomočjo modeliranja ugotovili, da bi z 1 L kokulture lahko v 24 urah proizvedli 3 dnevne doze β-karotena. To predstavlja velik uspeh za projekt iGEMINI in prislužili so si 2. mesto v skupini dodiplomskih študentov [6].

==Viri==
[1] A Successful Mission Starts With Nutrition | Science Mission Directorate https://science.nasa.gov/science-news/news-articles/a-successful-mission-starts-with-nutrition (pridobljeno 19. 4. 2021).

[2] Vitamins and Minerals for Older Adults | National Institute on Aging https://www.nia.nih.gov/health/vitamins-and-minerals-older-adults (pridobljeno 19. 4. 2021).

[3] G. L. Douglas, S. R. Zwart, S. M. Smith: Space Food for Thought: Challenges and Considerations for Food and Nutrition on Exploration Missions. J. Nutr. 2020, 150(9), str. 2242–2244.

[4] E. Lešková, J. Kubíková, E. Kováčiková, M. Košická, J. Porubská, K. Holčíková: Vitamin losses: Retention during heat treatment and continual changes expressed by mathematical models. J. Food Compos. Anal. 2006, 19(4), str. 252–276.

[5] P. Berry Ottaway: Stability of vitamins during food processing and storage. V: Chemical Deterioration and Physical Instability of Food and Beverages. Elsevier 2010, str. 539–560.

[6] Team:Toulouse INSA-UPS - 2020.igem.org https://2020.igem.org/Team:Toulouse_INSA-UPS (pridobljeno 19. 4. 2021).

[7] J. A. Olson: Benefits and Liabilities of Vitamin A and Carotenoids. J. Nutr. 1996, 126(suppl_4), str. 1208S-1212S.

[8] M. E. Jach, A. Serefko: Nutritional Yeast Biomass: Characterization and Application. V: Diet, Microbiome and Health. Elsevier 2018, str. 237–270.

[9] Nutritional yeast - Wikipedia https://en.wikipedia.org/wiki/Nutritional_yeast (pridobljeno 19. 4. 2021).

[10] A. La, P. Perré, B. Taidi: Process for symbiotic culture of Saccharomyces cerevisiae and Chlorella vulgaris for in situ CO2 mitigation. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2019, 103(2), str. 731–745.

[11] C. Leang, T. Ueki, K. P. Nevin, D. R. Lovley: A Genetic System for Clostridium ljungdahlii: a Chassis for Autotrophic Production of Biocommodities and a Model Homoacetogen. Appl. Environ. Microbiol. 2013, 79(4), str. 1102–1109.

[12] H. Rabeharindranto, S. Castaño-Cerezo, T. Lautier, L. F. Garcia-Alles, C. Treitz, A. Tholey, G. Truan: Enzyme-fusion strategies for redirecting and improving carotenoid synthesis in S. cerevisiae. Metab. Eng. Commun. 2019, 8, str. e00086.

[13] W. Chen, A. M. Viljoen: Geraniol — A review of a commercially important fragrance material. South African J. Bot. 2010, 76(4), str. 643–651.

[14] G. Hellekant: Brazzein a Small, Sweet Protein: Discovery and Physiological Overview. Chem. Senses 2005, 30(Supplement 1), str. i88–i89.

[15] R. M. Hughes, S. Bolger, H. Tapadia, C. L. Tucker: Light-mediated control of DNA transcription in yeast. Methods 2012, 58(4), str. 385–391.

[16] L. B. Motta-Mena, A. Reade, M. J. Mallory, S. Glantz, O. D. Weiner, K. W. Lynch, K. H. Gardner: An optogenetic gene expression system with rapid activation and deactivation kinetics. Nat. Chem. Biol. 2014, 10(3), str. 196–202.

IGEMINI: Kvasovke kot prehransko dopolnilo v vesolju

2021-04-19T18:13:21Z

KlementinaP:

iGEMINI je projekt v okviru tekmovanja iGEM, ki ga je leta 2020 pripravila ekipa dodiplomskih študentov iz Toulouse v Franciji.

Spletna stran projekta iGEMINI: https://2020.igem.org/Team:Toulouse_INSA-UPS

Avtorica povzetka: Klementina Polanec

==Problem==
Astronavti so v vesolju izpostavljeni ekstremnemu okolju, ki lahko ima škodljiv vpliv na njihovo zdravje. Večja izpostavljenost sevanju, višje koncentracije CO2 in mikrogravitacija kratkoročno vplivajo na počutje, dolgoročno gledano pa lahko astronavti začnejo izgubljati mišično maso in kosti, imajo povečano tveganje za kardiovaskularne težave in oslabljeno delovanje imunskega sistema. Uravnotežena prehrana bogata s hranili je za astronavte ključna, saj lahko zmanjša negativne vplive okolja na zdravje [1]. Pomemben del uravnotežene prehrane so vitamini, med katerimi je 13 esencialnih in se priporoča njihovo vsakodnevno uživanje [2].

Trenutno si astronavti na mednarodni vesoljski postaji hrane ne pripravljajo sami, temveč vsakih nekaj mesecev dobijo z Zemlje pošiljko sveže ter dehidrirane in konzervirane hrane [3]. Prvi problem vnaprej pripravljene hrane je, da se med samo pripravo razgradijo številni esencialni vitamini, predvsem manj odporni (vitamin A oziroma retinol, vitamin C, folat in tiamin) [4]. Drug in še večji problem pa je, da se konzervirana hrana shranjuje tudi po več mesecev in daljši čas shrambe pomeni več razgrajenih vitaminov [5]. Tako je na primer razgradnja retinola v odvisnosti od časa eksponentna in po 6 mesecih shrambe se ga razgradi kar 44 % [5, 6].

Zaradi opisanih problemov je v vesolju težje poskrbeti za prehrano dovolj bogato z vitamini, prav tako pa so daljša potovanja po vesolju zaenkrat nemogoča [1,2].

==Rešitev: projekt iGEMINI==
Ekipa iz Toulouse si je zamislila kokulturo, ki bi jo astronavti lahko gojili na raketi in z njo pridobivali prehranska dopolnila. Ekipa se je odločila za pridobivanje β-karotena (provitamin A), saj je vitamin A eden najmanj stabilnih vitaminov [5], prav tako pa ima pomembno vlogo pri celični diferenciaciji in vidu [7]. Prehransko dopolnilo bi lahko astronavti prilagodili svojemu okusu in s pomočjo optogenetske regulacije izbirali med 3 okusi: naraven okus kvasovke, limona ali sladka vrtnica [6].

==Osnove o kokulturi==
Kokulturo bi sestavljali kvasovka ''Saccharomyces cerevisiae'' in bakterija ''Clostridium ljungdahlii''. Kokulturo so zasnovali na tak način, da bi kot vir ogljika in dušika uporabljala odpadke, ki nastanejo pri recikliranju organskih snovi na raketi. Vir ogljika bi predstavljal CO2 iz zraka, vir dušika pa organske molekule iz urina [6].

===''Saccharomyces cerevisiae''===
Kvasovko bi gensko spremenili, tako da bi lahko proizvajala β-karoten, dodali pa bi ji tudi optogenetske elemente, preko katerih bi s spremembo svetlobe spremenili njen okus [6]. Ker je kvasovka splošno prepoznana kot varna, prav tako pa že sama po sebi proizvaja tudi vitamine B in druga hranila [8], bi jo astronavti lahko uživali kot prehransko dopolnilo [6]. To je že ustaljena praksa na Zemlji [9].

===''Clostridium ljungdahlii''===
Ker je kvasovka heterotrofna, ni zmožna uporabljati odpadnega CO2 kot vir ogljika [10]. Ekipa se je zato odločila za kokulturo z bakterijo ''C. ljungdahlii'', ki lahko raste tudi avtotrofno, pri čemer reducira CO2 do organskih spojin, kot vir elektronov pri pretvorbi pa uporablja H2 (prav tako odpadek na raketi) [11]. Bakterija lahko torej na osnovi odpadnih virov proizvede etanol in acetat, ki kvasovki predstavljata vir ogljika [6].

==Moduli sistema==
===Modul 1: sinteza hranil in okusa===
Prvi modul sestavljajo biokocke:
{| border=1 style="border-collapse: collapse;"
|-
|Koda || Opis biokocke
|-
|[http://parts.igem.org/Part:BBa_K3570002 BBa_K3570002]
|Konstitutivna sinteza β-karotena v kvasovki.
|-
|[http://parts.igem.org/Part:BBa_K3570000 BBa_K3570000]
|Konstitutivna povečana sinteza geranilgeranil pirofosfata v kvasovki.
|-
|[http://parts.igem.org/Part:BBa_K3570001 BBa_K3570001]
|Kvasovki da okus po sladki vrtnici.
|-
|[http://parts.igem.org/Part:BBa_K3570003 BBa_K3570003]
|Kvasovki da okus po limoni.
|}

'''Biokocka BBa_K3570002'''

Ekipa je v kvasovki želela proizvajati β-karoten, za kar sta potrebna 2 encima iz kvasovke ''Xanthophyllomyces dendrorhous'': fitoen desaturaza (CrtI) in likopen ciklaza/fitoen sintaza (CrtYB). Encima katalizirata serijo reakcij, pri katerih iz geranilgeranil pirofosfata (GGPP) nastane β-karoten ([https://2020.igem.org/wiki/images/0/07/T--Toulouse_INSA-UPS--2020_betacarotene_pathway.jpeg slika sintezne poti]) [6, 12]. Ker je CrtYB transmembranski protein, CrtI pa citosolni, so se odločili za fuzijo obeh encimov, s čimer je encimska pretvorba hitrejša [12].

'''Biokocka BBa_K3570000'''

β-karoten nastaja iz GGPP, zato se je ekipa odločila, da bo v kvasovki skušala povečati sintezo GGPP. To so želeli doseči s pomočjo 2 encimov: GGPP sintaze (CrtE) iz ''X. dendrorhous'' in krajše verzije 3-hidroksi-3-metilglutaril-koencim A reduktaze 1 (tHMG1) iz ''S. cerevisiae'' ([https://2020.igem.org/wiki/images/7/76/T--Toulouse_INSA-UPS--2020_pathway_resume.png slika obeh pretvorb]) [6].

'''Biokocki BBa_K3570001 in BBa_K3570003'''

Izbiro okusa kvasovk bi ekipa prepustila astronavtom, zato so se odločili, da bo sinteza molekul, ki dajo okus, inducibilna s pomočjo optogenetike. Zaradi preprostosti so izbrali okusa po sladki vrtnici ter po limoni, saj obe molekuli za okus nastaneta iz geranil pirofosfata ([https://2020.igem.org/wiki/images/7/76/T--Toulouse_INSA-UPS--2020_pathway_resume.png prekuzor GGPP]) z eno samo encimsko pretvorbo [6]. Za okus po sladki vrtnici sta potrebni 2 molekuli: geraniol, ki ima aromo vrtnice [13] in brazzein, ki je majhen polipeptid z izjemno sladkim okusom [14]. Geraniol nastane iz geranil pirofosfata z encimom geraniol sintaza iz ''Catharanthus roseus''. Biokocka BBa_K3570001 je sestavljena tako, da vsebuje dvosmerni inducibilni promotor Gal1/10, tako da se v eno smer izrazi gen za geraniol sintazo, v drugo smer pa gen za brazzein. Preko restrikcijskih mest XbaI in BamHI se lahko vstavi ustrezno optogenetsko vezje [6]. Za okus po limoni je potrebna ena sama molekula: limonen, ki nastane iz geranil pirofosfata z encimom limonen sintaza. Biokocka BBa_K3570003 vsebuje gen za limonen sintazo pod dvosmernim inducibilnim promotorjem Gal1/10, vsebuje pa tudi restrikcijski mesti XbaI in BamHI za vnos optogenetskega vezja [6].

===Modul 2: regulacija okusa preko optogenetike===
Optogenetika temelji na uporabi proteinov, ki ob prisotnosti svetlobe točno določene valovne dolžine spremenijo konformacijo in s tem postanejo aktivni transkripcijski faktorji (TF) [15].
Ekipa si je zamislila, da bi lahko astronavti z izbiro modre ali rdeče svetlobe inducirali nastajanje molekul za okus v kvasovkah in tako spremenili okus prehranskega dopolnila. Odločili so se za uporabo modrega optogenetskega sistema EL222 in rdečega optogenetskega sistema PhyA/FHY1 [6]. Razvili so biokocki:
{| border=1 style="border-collapse: collapse;"
|-
|Koda || Opis biokocke
|-
|[http://parts.igem.org/Part:BBa_K3570005 BBa_K3570005]
|Moder optogenetski sistem v kvasovki.
|-
|[http://parts.igem.org/Part:BBa_K3570004 BBa_K3570004]
|Rdeč optogenetski sistem v kvasovki.
|}

Moder optogenetski sistem temelji na uporabi TF EL222 iz bakterije ''Erythrobacter litoralis''. Na modri svetlobi (450 nm) EL222 homodimerizira in izpostavi DNA-vezavno domeno, s katero se lahko veže na umetni promotor C120. V kvasovkah EL222 sam po sebi ne more delovati kot TF, zato je potrebna fuzija s proteinom VP16 (protein virusa herpes simplex, ki deluje kot TF) in jedrnim lokalizacijskim signalom (NLS) [16]. Sistem torej deluje tako, da modra svetloba inducira izražanje gena pod promotorjem C120.

Biokocka za moder optogenetski sistem vsebuje gen za NLS-EL222-VP16 pod konstitutivnim promotorjem ter gen za GFP pod dvosmernim inducibilnim promotorjem C120. Deli biokocke so namenjeni vnosu v biokocko za okus, in sicer se lahko promotor C120 preko restrikcijskih mest XmaI-SalI zamenja s promotorjem Gal1/10, preko restrikcijskih mest XbaI-BamHI pa se lahko vstavi gen za NLS-EL222-VP16 skupaj s promotorjem in terminatorjem ([https://2020.igem.org/wiki/images/a/a8/T--Toulouse_INSA-UPS--2020_Schemadefin.png slika levo spodaj]). Ekipa je želela združiti moder optogenetski sistem z okusom po limoni, tako da bi kvasovke na modri svetlobi začele proizvajati limonen [6].

Rdeč optogenetski sistem deluje na podoben način kot moder ([https://2020.igem.org/Team:Toulouse_INSA-UPS/Design#red-optogenetic-system-phya-fhy1 več informacij]), le da je tu potreben promotor Gal1/10 [6]. Biokocka za rdeč optogenetski sistem vsebuje pod dvosmernim konstitutivnim promotorjem gena za fuzijska proteina, ki na rdeči svetlobi interagirata in tvorita aktiven transkripcijski faktor. Celotno biokocko lahko preko restrikcijskih mest XbaI-BamHI vstavimo v biokocko za okus ([https://2020.igem.org/wiki/images/a/a8/T--Toulouse_INSA-UPS--2020_Schemadefin.png slika desno spodaj]). Na tak način je ekipa želela združiti rdeč optogenetski sistem z okusom po sladki vrtnici [6].

===Modul 3: gojenje kokulture===
Ekipa si je zamislila, da bi z ustreznim bioreaktorjem kvasovko in bakterijo med seboj ločili, saj bakterija ni prepoznana kot varna za uživanje, omogočili pa bi kroženje gojišča in s tem hranil. Sestavine gojišča so prikazane na [https://2020.igem.org/wiki/images/e/ea/T--Toulouse_INSA-UPS--2020_table.png sliki], prav tako pa bi v bioreaktor dovajali pline (CO2, H2 in O2) ter odpadni dušik iz urina. Kisik kvasovka nujno potrebuje za rast in bakterija je aerotolerantna do 8 % p(O2) v gojišču. Kokulturo bi gojili pri temperaturi 33 °C in pH 5,5 [6].

==Eksperimenti in rezultati==
Pandemija COVID-19 je ekipi otežila delo v laboratoriju, zato večino zastavljenih eksperimentov niso mogli izvesti. V omejenem času jim je uspelo narediti številna kloniranja, s čimer so želeli sestaviti in okarakterizirati vse v modulih omenjene biokocke. Do končne funkcionalne oblike jim je uspelo sestaviti le eno, in sicer biokocko za povečano sintezo GGPP (BBa_K3570000) [6].

Nato so za biokocko preverili, če res omogoča povišano nastajanje GGPP. Transformirali so ''S. cerevisiae'' BY4741 in izvedli ustrezno selekcijo. Zraslim kolonijam so s PCR preverili, če se je biokocka uspešno integrirala v genom in ugotovili so, da se je. Nato so transformirane kvasovke primerjali s kvasovkami divjega tipa, in sicer so z LC-MS primerjali količino GGPP v celicah. Ugotovili so, da so transformirane kvasovke imele petkrat več GGPP na biomaso kot kvasovke divjega tipa ([http://parts.igem.org/wiki/images/3/37/T--Toulouse_INSA-UPS--2020_GGPP.png graf]). S tem so potrdili, da biokocka deluje, kot so si zamislili [6].

Sledili so še eksperimenti z monokulturama kvasovke in bakterije, s katerimi so ugotovili [6]:
*zamišljeno [https://2020.igem.org/wiki/images/e/ea/T--Toulouse_INSA-UPS--2020_table.png gojišče]vsebuje snov, ki kvasovki preprečuje rast na acetatu in etanolu kot viru ogljika
*bakterija uspešno raste v fermentorju, uporablja CO2 in H2 ter pri tem proizvaja etanol in acetat
*kvasovka lahko uporablja etanol in acetat kot vir ogljika, prav tako pa začne rasti že pri nizkih koncentracijah enega izmed virov
*kvasovka porablja acetat in etanol hkrati

==Zaključki==
Kljub temu da ekipi eksperimentalno ni uspelo dokazati delovanje sistema, so s pomočjo modeliranja ugotovili, da bi z 1 L kokulture lahko v 24 urah proizvedli 3 dnevne doze β-karotena. To predstavlja velik uspeh za projekt iGEMINI in prislužili so si 2. mesto v skupini dodiplomskih študentov [6].

==Viri==
[1] A Successful Mission Starts With Nutrition | Science Mission Directorate https://science.nasa.gov/science-news/news-articles/a-successful-mission-starts-with-nutrition (pridobljeno 19. 4. 2021).

[2] Vitamins and Minerals for Older Adults | National Institute on Aging https://www.nia.nih.gov/health/vitamins-and-minerals-older-adults (pridobljeno 19. 4. 2021).

[3] G. L. Douglas, S. R. Zwart, S. M. Smith: Space Food for Thought: Challenges and Considerations for Food and Nutrition on Exploration Missions. J. Nutr. 2020, 150(9), str. 2242–2244.

[4] E. Lešková, J. Kubíková, E. Kováčiková, M. Košická, J. Porubská, K. Holčíková: Vitamin losses: Retention during heat treatment and continual changes expressed by mathematical models. J. Food Compos. Anal. 2006, 19(4), str. 252–276.

[5] P. Berry Ottaway: Stability of vitamins during food processing and storage. V: Chemical Deterioration and Physical Instability of Food and Beverages. Elsevier 2010, str. 539–560.

[6] Team:Toulouse INSA-UPS - 2020.igem.org https://2020.igem.org/Team:Toulouse_INSA-UPS (pridobljeno 19. 4. 2021).

[7] J. A. Olson: Benefits and Liabilities of Vitamin A and Carotenoids. J. Nutr. 1996, 126(suppl_4), str. 1208S-1212S.

[8] M. E. Jach, A. Serefko: Nutritional Yeast Biomass: Characterization and Application. V: Diet, Microbiome and Health. Elsevier 2018, str. 237–270.

[9] Nutritional yeast - Wikipedia https://en.wikipedia.org/wiki/Nutritional_yeast (pridobljeno 19. 4. 2021).

[10] A. La, P. Perré, B. Taidi: Process for symbiotic culture of Saccharomyces cerevisiae and Chlorella vulgaris for in situ CO2 mitigation. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2019, 103(2), str. 731–745.

[11] C. Leang, T. Ueki, K. P. Nevin, D. R. Lovley: A Genetic System for Clostridium ljungdahlii: a Chassis for Autotrophic Production of Biocommodities and a Model Homoacetogen. Appl. Environ. Microbiol. 2013, 79(4), str. 1102–1109.

[12] H. Rabeharindranto, S. Castaño-Cerezo, T. Lautier, L. F. Garcia-Alles, C. Treitz, A. Tholey, G. Truan: Enzyme-fusion strategies for redirecting and improving carotenoid synthesis in S. cerevisiae. Metab. Eng. Commun. 2019, 8, str. e00086.

[13] W. Chen, A. M. Viljoen: Geraniol — A review of a commercially important fragrance material. South African J. Bot. 2010, 76(4), str. 643–651.

[14] G. Hellekant: Brazzein a Small, Sweet Protein: Discovery and Physiological Overview. Chem. Senses 2005, 30(Supplement 1), str. i88–i89.

[15] R. M. Hughes, S. Bolger, H. Tapadia, C. L. Tucker: Light-mediated control of DNA transcription in yeast. Methods 2012, 58(4), str. 385–391.

[16] L. B. Motta-Mena, A. Reade, M. J. Mallory, S. Glantz, O. D. Weiner, K. W. Lynch, K. H. Gardner: An optogenetic gene expression system with rapid activation and deactivation kinetics. Nat. Chem. Biol. 2014, 10(3), str. 196–202.

IGEMINI: Kvasovke kot prehransko dopolnilo v vesolju

2021-04-19T18:03:47Z

KlementinaP:

IGEMINI: Kvasovke kot prehransko dopolnilo v vesolju

2021-04-19T17:32:13Z

KlementinaP:

IGEMINI: Kvasovke kot prehransko dopolnilo v vesolju

2021-04-19T17:28:57Z

KlementinaP:

IGEMINI: Kvasovke kot prehransko dopolnilo v vesolju

2021-04-19T17:19:49Z

KlementinaP:

IGEMINI: Kvasovke kot prehransko dopolnilo v vesolju

2021-04-19T17:19:21Z

KlementinaP:

IGEMINI: Kvasovke kot prehransko dopolnilo v vesolju

2021-04-19T16:50:01Z

KlementinaP:

IGEMINI: Kvasovke kot prehransko dopolnilo v vesolju

2021-04-19T16:49:00Z

KlementinaP: New page: iGEMINI je projekt v okviru tekmovanja iGEM, ki ga je leta 2020 pripravila ekipa dodiplomskih študentov iz Toulouse v Franciji. Spletna stran projekta iGEMINI: https://2020.igem.org/Tea...

Seminarji SB 2020/21

2021-04-19T16:22:08Z

KlementinaP:

V študijskem letu 2020/21 študentje 1. letnika predstavljajo naslednje teme:

RAZISKOVALNI ČLANKI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) 

1 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Proizvodnja_1,3-propandiola_iz_različnih_ogljikovodikov_po_nenaravni_poti_preko_3-hidroksipropanojske_kisline Proizvodnja 1,3-propandiola iz različnih ogljikovodikov po nenaravni poti preko 3-hidroksipropanojske kisline]
(Liza Ulčakar) 
2 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Doseganje_asimetri%C4%8Dnosti_in_asimetri%C4%8Dne_delitve_pri_E._coli Doseganje asimetričnosti in asimetrične delitve pri E. coli] (Aljaž Bratina) 
3 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Zmanj%C5%A1ana_procesivnost_ribosomov_v_sistemu_PURE Zmanjšana procesivnost ribosomov v sistemu PURE] (Tina Kolenc Milavec) 
4 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Na%C4%8Drtovana_pot_zvijanja_proteinskih_origamijev Načrtovana pot zvijanja proteinskih origamijev] (Anamarija Agnič) 
5 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/U%C4%8Dinkovita_svetlobno_inducibilna_Dre_rekombinaza_za_%C4%8Dasovno_in_prostorsko_celi%C4%8Dno_specifi%C4%8Dno_urejanje_genoma_v_mi%C5%A1jih_modelih#VIRI Učinkovita svetlobno inducibilna Dre rekombinaza za časovno in prostorsko celično specifično urejanje genoma v mišjih modelih] (Nika Mikulič Vernik) 
6 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Vzpostavitev_termometra_tRNA_za_dolo%C4%8Danje_temperature_optimalne_rasti_mikroorganizmov Vzpostavitev termometra tRNA za določanje temperature optimalne rasti mikroorganizmov] (Urša Štrancar) 
7 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Racionalna_zasnova_minimalnih_sinteti%C4%8Dnih_promotorjev_za_rastline#Construction_of_plasmids Racionalna zasnova minimalnih sintetičnih promotorjev za rastline] (Almina Tahirović) 

NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.) 

1 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/RESHAPE_-_spreminjanje_morfologije_nitastih_gliv RESHAPE - spreminjanje morfologije nitastih gliv]
(Špela Supej) 
2 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/The_Chlamy_Cleaner:_razgradnja_pesticida_z_zeleno_algo The Chlamy Cleaner: razgradnja pesticida z zeleno algo] (Doroteja Armič) 
3 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/TheraPUFA:_nazalni_probiotik_proti_okužbam_in_vnetjem TheraPUFA- nazalni probiotik proti okužbam in vnetjem] (Barbara Slapnik) 
4 [[S-POP: Modularni biosenzor za zaznavanje obstojnih organskih onesnaževal v okoljskih vodah]] (Tadej Medved) 
5 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/MARS-magnetni_sistem_za_recikliranje_ATP MARS-magnetni sistem za recikliranje ATP] (David Miškić) 
6 [[B.O.T.: Bakterijska oscilacijska terapija za zdravljenje kolorektalnega raka]] (Neža Pavko) 
7 [[iGEMINI: Kvasovke kot prehransko dopolnilo v vesolju]] (Klementina Polanec) 
----

Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Povzetek je treba objaviti dva dni pred predstavitvijo do polnoči (za seminarje v sredo torej v ponedeljek). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo razprava, ki praviloma ne bo daljša od 5 minut.

Mehanizem delovanja kompleksa Cascade in sistem CRISPR/Cas pri E. coli

2019-04-16T19:14:12Z

KlementinaP: /* Vezava kompleksa Cascade na DNA */

==Uvod==
Tako kot mnogi ostali prokarionti tudi ''E. coli'' pridobiva odpornost proti bakteriofagom z vgraditvijo kratkih fragmentov fagne DNA v lastno DNA. Ti odseki na bakterijski DNA se imenujejo CRISPR, oziroma gruče enakomerno prekinjenih kratkih palindromnih ponovitev (ang: ''»clustered regularly interspaced short palindromic repeats«''), in skupaj z geni za proteine Cas predstavljajo bakterijski imunski sistem CRISPR/Cas tipa 1-E. Pri ''E. coli'' ima ključno vlogo 8 različnih Cas proteinov. Od tega jih 5 sestavlja kompleks Cascade. Cilj obrambnega sistema je prepoznati tujo DNA in jo s pomočjo Cas endonukleaz razrezati na manjše fragmente. V splošnem sistem CRISPR/Cas deluje v 3 korakih: 
 
1. '''ADAPTACIJA''': proteini Cas prepoznajo tujo DNA in jo vključijo v CRISPR. 
2. '''BIOSINTEZA''': sinteza proteinov Cas in transkripcija CRISPR. 
3. '''INTERFERENCA''': uničenje tuje DNA.

==Lokus CRISPR==
Kromosom ''E. coli'' vsebuje 2 lokusa CRISPR, imenovana CRISPR-I in CRISPR-II. Glavne strukturne značilnosti lokusa so vodilno zaporedje, vmesniki in ponovitve. CRISPR-I vsebuje 13 vmesnikov, CRISPR-II pa le 6. K lokusu CRISPR-I spadajo tudi geni cas. 
8 genov cas, ki zapisujejo proteine Cas, se nahaja navzgor od vodilnega zaporedja na lokusu CRISPR-I in si od 5' proti 3' koncu po vrsti sledijo: ''cas3, cse1, cse2, cas7, cas5e, cas6e, cas1'' in ''cas2''. ''Cas3'' ima lasten promotor, medtem ko so ostali geni ''cas'' del istega operona, ki ga negativno regulira protein H-NS. Cas3 je endonukleaza in helikaza. Njena glavna naloga je cepitev in razgraditev tuje DNA. Cas1 in Cas2, obe endonukleazi, tvorita kompleks, ki lahko v bakterijsko DNA vgradi del tuje DNA. Ostali proteini Cas tvorijo kompleks Cascade. 
Navzdol od vodilnega zaporedja na obeh lokusih sledi območje CRISPR, sestavljeno iz izmenjavajočih se vmesnikov in ponovitev, ki so delno palindromske. Vmesniki izvirajo iz fagne DNA in predstavljajo imunost proti posameznim bakteriofagom, saj se po prepisovanju v pre-crRNA in procesiranju v crRNA vgradijo v kompleks CRISPR. S pomočjo crRNA kompleks prepozna tujo DNA, ki je komplementarna vmesnikom (protovmesniki) in vsebuje prepoznavno zaporedje PAM (ang: ''»protospacer adjacent motif«''). 
Sistem CRISPR/Cas pri ''E. coli'' se uvršča v tip 1-E, za katerega je značilna prisotnost genov ''cse1'' in ''cse2'' ter odsotnost gena ''cas4''.

==Kompleks Cascade in procesiranje crRNA==
Cascade je ribonukleoproteinski kompleks, ki ga sestavljajo proteini Cas in crRNA. Ti proteini so Cse1, Cse2, Cas7, Cas5e in Cas6e v stehiometričnem razmerju 1:2:6:1:1, skupaj s pre-crRNA pa se iz lokusa CRISPR prepisujejo v procesu biosinteze. Celoten kompleks enajstih podenot ima značilno obliko morskega konjička. 
Vsaka izmed proteinskih podenot ima specifično funkcijo: 
 
- '''Cse1''' prepozna zaporedje PAM na tuji DNA, tvori interakcije s 5' koncem crRNA in veže Cas3. 
- '''Cse2''' ne tvori interakcij s crRNA, pomaga pa pri sestavljanju kompleksa, saj tvori interakcije s Cse1, Cas7 in Cas5e. 
- Vsaka izmed šestih podenot '''Cas7''' vsebuje žleb s pozitivno nabitimi aminokislinskimi ostanki, v katere se lahko skrije vsaka šesta baza crRNA. Posledično te baze ne morejo tvoriti interakcij z bazami na tuji DNA, kar zmanjša specifičnost kompleksa. 
- '''Cas5e''' zasidra 5' konec crRNA v kompleks. 
- '''Cas6e''' procesira pre-crRNA v crRNA in njen 3' konec zasidra v kompleks. 
 
Prepisana pre-crRNA vsebuje več vmesnikov in ponovitev. Zaradi palindromskega zaporedja v ponovitvah se lahko v pre-crRNA vzpostavijo bazni pari in pride do nastanka lasnične zanke, ki jo Cas6e cepi na 3' koncu. S tem nastane zrela 61 nukleotidov dolga crRNA, na kateri je vmesnik (32 nt) obdan z deli palindromskih ponovitev: krajšim delom na 5' koncu in lasnično zanko na 3' koncu. Podenota Cas6e po obdelavi ostane vezana na 3' konec crRNA, ni pa še znano, ali je tekom procesiranja že vključena v Cascade. V kompleksu Cascade tvori interakcije s crRNA devet od enajstih podenot, postavljena je pa tako, da sta 5' konec in lasnična zanka vpeta med proteina Cas5e in Cas6e. 
Brouns in sodelavci so v raziskavi iz leta 2008 dokazali, da pri samem procesiranju pre-crRNA sodeluje le Cas6e podenota. Poskuse so opravili na ''E. coli'' seva K12 in bakterijam izbili gene za posamezne podenote. Zrelo crRNA so zaznali le v bakterijah, ki so imele gen cas6e. Ugotovili so tudi, da Cas6e za svoje delovanje ne potrebuje dvovalentnih kovinskih kationov ali ATP, prav tako pa lahko pre-crRNA cepi neodvisno od ostalih podenot. Ko so Cas6e primerjali z ostalimi proteini iz njegove družine, so ugotovili, da vsebuje dobro ohranjen His20, ki je verjetno vključen v samo katalizo cepitve pre-crRNA, ni pa nujno potreben za izgradnjo kompleksa. Če so ta aminokislinski ostanek zamenjali z Ala, se je kompleks Cascade vseeno sestavil, crRNA pa ni nastala.

==Vezava kompleksa Cascade na DNA==

Cascade se na DNA veže na več načinov. Zaradi para zank bogatih z lizini na dveh izmed podenot Cas7 se lahko z nespecifičnimi elektrostatskimi interakcijami veže na negativno nabito ogrodje DNA, poleg tega pa je za delovanje kompleksa bistvenega pomena vezava na protovmesnik (zaporedja komplementarna vmesnikom na crRNA) in PAM. PAM so trije nukleotidi neposredno ob protovmesniku, s katerimi v malem žlebu interagira podenota Cse1, in so bistvenega pomena za ločevanje bakteriji tuje in lastne DNA. Za interakcije s PAM so ključni trije strukturni vzorci na N-koncu Cse1: lizinski prst, glicinska zanka in glutaminska zagozda. Izmed 64 možnih kombinacij na mestu PAM jih le majhno število tvori optimalne vezave s Cse1. V primeru, da je interakcija med PAM in Cse1 ugodna, lahko podenota s konformacijsko spremembo povzroči destabilizacijo in razklenitev tarčne DNA, tako da se lahko crRNA približa eni od verig. V primeru komplementarnosti vmesnika in tarčne DNA, se vezava kompleksa okrepi in omogoči nadaljevanje imunskega odziva CRISPR/cas, izpodrinjena veriga DNA pa tvori značilno zanko R. 
Chaoyou Xue in sodelavci so leta 2017 v ''E. coli'' proučevali mehanizme, s katerimi se lahko Cascade veže na DNA. Uporabili so metodo FRET (ang: ''"Förster resonance energy transfer"''), kjer so s fluorescenčnim »donorjem« (Cy3) označili DNA v bližini tarčnega zaporedja, z »akceptorjem« (Cy5) pa podenoto Cas5e kompleksa Cascade. Metoda temelji na pojavu, kjer fluorescenca določene valovne dolžine donorskega označevalca vzburi akceptorski označevalec, če je ta dovolj blizu. Akceptorski označevalec nato fluorescira z drugo valovno dolžino, kar signalizira približanje označevalcev. Označevalca sta bila nameščena tako, da nista ovirala vezave Cascade na DNA, zaradi učinka FRET pa sta omogočala detekcijo vezave kompleksa. 
V raziskavi so delali z molekulo DNA, ki je vsebovala popoln komplement uporabljenemu vmesniku in eno izmed ugodnih zaporedij PAM. Ugotovili so, da je v 20 % primerov prišlo do močne in dolgotrajne vezave, kjer je učinek FRET trajal tudi do 190 sekund, sicer pa so bile vezave krajše in najverjetneje poledica nespecifične interakcije ali nepopolne tvorbe zanke R. Nadaljnji eksperimenti z drugimi crRNA in DNA so pokazali, da se tudi v primeru, ko DNA ne vsebuje protovmesnika, Cascade lahko kratkotrajno veže. Ta pojav so povezali s prisotnostjo ugodnih PAM v DNA, saj je bilo takšnih vezav znatno manj v primeru, ko so delali z DNA brez PAM. Njihov končni model predpostavlja, da Cascade naključno »skenira« DNA s pomočjo nespecifičnih elektrostatskih interakcij, se upočasni in bolje veže ob prisotnosti PAM, do močne in trajne interakcije pa pride ob ujemanju vmesnika s protovmesnikom.

==Interferenca in adaptacija, ki temelji na recikliranju ostankov tuje DNA po razgradnji s Cas3==

Zdaj vemo, kako Cascade prepozna tujo DNA. Vprašajmo se, kaj sledi? Poznamo dva mehanizma. 
Pri interferenci vzpostavitvi R-zanke sledi vpoklic Cas3. To je protein sestavljen iz treh domen, ki imajo helikazno in nukleazno aktivnost. Od ATP odvisna helikazna domena razvije izpodrinjeno verigo, nukleazna domena na C-koncu jo cepi, nato pa od Mg2+ odvisna HD-nukleazna domena do konca uniči ssDNA. Izpodrinjena veriga je tako uničena, ostane le še tarčna veriga. Mehanizem njenega uničenja zaenkrat še ni pojasnjen, obstaja le nekaj domnev, zagotovo pa vemo, da je na ta način prepisovanje tuje DNA onemogočeno in obramba uspešno izvedena. 
Adaptacija, ki temelji na recikliranju ostankov tuje DNA po razgradnji s Cas3 (ang: ''»Primed adaptation«''), pa z vpoklicem Cas1-Cas2 kompleksa poskrbi za vstavitev novega vmesnika v lokus CRISPR. Preden razložimo, kako se to zgodi, pa si poglejmo še nekaj dejstev. Še do pred nedavnim so bili znanstveniki prepričani, da v celici poteka ali adaptacija ali interferenca. Po raziskavah opisanih spodaj pa danes vemo, da ta trditev ne drži povsem. 
Izkazalo se je, da je ključna determinanta, ki določa način nadaljnjega poteka obrambnega mehanizma interakcija med PAM in Cse1. PAM je sestavljen iz treh nukleotidov, kar pomeni, da obstaja 64 različnih možnosti tega zaporedja. 
Že dalj časa vemo, da Cse1 specifično prepozna PAM sestavljen iz AAG. Temu sledi močna interferenca. Vendar pa tudi drugačni PAM sprožijo določen odziv, saj se Cse1 na različna zaporedja veže z različno visoko afiniteto. Odziv, ki temu sledi lahko razdelimo v tri skupine. V raziskavi Olge Musharova in sodelavcev narejeni marca letos, so ugotovili, da 17 PAM zaporedij sproži močno interferenco. 11 PAM je takih, ki sprožijo počasno interferenco, pri 36 pa interference ni možno zaznati. Zanimivo v tej raziskavi je bilo predvsem dejstvo, da v 36 primerih brez interference prav tako ni bilo možno zaznati adaptacije. To pa pomeni, da je predpostavka o nesklopljenosti adaptacije in interference napačna. 
Danes vemo, da je zaradi metodoloških omejitev v primeru močne interference zelo težko zaznati tako vrsto adaptacije in obratno. 
Zato lahko predpostavimo sledeč mehanizem adaptacije, ki temelji na recikliranju ostankov tuje DNA po interferenčni razgradnji s Cas3 (ang: ''»Primed adaptation«'') in predpostavlja z interferenco sklopljeno aktivnost Cas1 in Cas2. Ta dva proteina tvorita stabilen kompleks Cas1-Cas2 v razmerju 4:2, kjer je dimer Cas2 objet z dvema dimeroma Cas1. Ob prepoznavi PAM najprej poteče interferenčna cepitev tuje DNA s Cas 3 in pri tem nastanejo manjši fragmenti. Cas1-Cas2 specifično prepozna pravi 33 nt velik oligodeoksinukleotid , ki predstavlja protovmesnik . Kako kompleks prepozna pravi protovmesnik bo opisano spodaj, Cas1-Cas2 naloga pa je še njegova vstavitev v lokus CRISPR .

==Naivna adaptacija==

Obrambni odziv ''E. Coli'' pa sestavlja še tretji mehanizem, ki ne vključuje Cascade. Izkaže se, da Cas1-Cas2 kompleks lahko tudi sam prepozna in cepi tujo DNA. Mehanizem se začne, ko en izmed dimerov Cas1 prepozna PAM in cepi vez med 2. in 3. nukleotidom. Drug izmed dimerov Cas1 pa poskrbi za cepitev po 33. nukleotidu, tako da nastane protovmesnik ravno prave dolžine. Tak protovmesnik se veže v kompleks Cas1-Cas2 in vstavi v lokus CRISPR.

==Uporabnost==
Zaradi vseh opisanih značilnosti znanstveniki CRISPR/Cas sistem 1-E prepoznavajo kot potencialno zelo uporabno metodo genskega inženiringa. Zdi se, da bomo s pomočjo tega mehanizma kmalu lahko dosegli tako zelo specifično delecijo in zamenjavo genov, kot tudi specifično aktivacijo in inaktivacijo genov. Tao. S in sodelavci so, tako kot tudi druge raziskovalne skupine, v svojih raziskavah celo že uspešno uporabili metodo CRISPRi (ang: ''CRISPR interference''), ki temelji na zgoraj opisanem znanju. 

Trenutno je ena izmed glavnih omejitev te metode nespecifično vezanje Cascade na DNA tudi izven tarčnih območij. Da bomo lahko povečali učinkovitosti tehnik modificiranja genoma, moramo najprej opraviti še nekaj raziskav o mehanizmu CRISPR/Cas in bolje razumeti potek procesov, ki so nam trenutno še neznani.

==Viri==
- Tao, S., Qian, Y., Wang, X., Cao, W., Ma, W., Chen, K., & Ouyang, P. (2018). Regulation of ATP levels in Escherichia coli using CRISPR interference for enhanced pinocembrin production. Microbial Cell Factories, 17(1). 

- Musharova, O., Sitnik, V., Vlot, M., Savitskaya, E., Datsenko, K. A., Krivoy, A., … Severinov, K. (2019). Systematic analysis of Type I‐E Escherichia coli CRISPR‐Cas PAM sequences ability to promote interference and primed adaptation. Molecular Microbiology. 

- Xue, C., Zhu, Y., Zhang, X., Shin, Y.-K., & Sashital, D. G. (2017). Real-Time Observation of Target Search by the CRISPR Surveillance Complex Cascade. Cell Reports, 21(13), 3717–3727. 

- Brouns, S.J., Jore, M.M., Lundgren, M., Westra, E.R., Slijkhuis, R.J., Snijders, A.P., Dickman, M.J., Makarova, K.S., Koonin, E.V., van der Oost, J. (2008). Small CRISPR RNAs guide antiviral defense in prokaryotes. Science, 321, 961-964. 

- Cooper, L. A. Mechanistic Analysis of the Type I-E CRISPR-Cas System in Escherichia coli. New York: ProQuest, 2018. 

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Mehanizem delovanja kompleksa Cascade in sistem CRISPR/Cas pri E. coli

2019-04-16T09:20:35Z

KlementinaP: /* Lokus CRISPR */

==Uvod==
Tako kot mnogi ostali prokarionti tudi ''E. coli'' pridobiva odpornost proti bakteriofagom z vgraditvijo kratkih fragmentov fagne DNA v lastno DNA. Ti odseki na bakterijski DNA se imenujejo CRISPR, oziroma gruče enakomerno prekinjenih kratkih palindromnih ponovitev (ang: ''»clustered regularly interspaced short palindromic repeats«''), in skupaj z geni za proteine Cas predstavljajo bakterijski imunski sistem CRISPR/Cas tipa 1-E. Pri ''E. coli'' ima ključno vlogo 8 različnih Cas proteinov. Od tega jih 5 sestavlja kompleks Cascade. Cilj obrambnega sistema je prepoznati tujo DNA in jo s pomočjo Cas endonukleaz razrezati na manjše fragmente. V splošnem sistem CRISPR/Cas deluje v 3 korakih: 
 
1. '''ADAPTACIJA''': proteini Cas prepoznajo tujo DNA in jo vključijo v CRISPR. 
2. '''BIOSINTEZA''': sinteza proteinov Cas in transkripcija CRISPR. 
3. '''INTERFERENCA''': uničenje tuje DNA.

==Lokus CRISPR==
Kromosom ''E. coli'' vsebuje 2 lokusa CRISPR, imenovana CRISPR-I in CRISPR-II. Glavne strukturne značilnosti lokusa so vodilno zaporedje, vmesniki in ponovitve. CRISPR-I vsebuje 13 vmesnikov, CRISPR-II pa le 6. K lokusu CRISPR-I spadajo tudi geni cas. 
8 genov cas, ki zapisujejo proteine Cas, se nahaja navzgor od vodilnega zaporedja na lokusu CRISPR-I in si od 5' proti 3' koncu po vrsti sledijo: ''cas3, cse1, cse2, cas7, cas5e, cas6e, cas1'' in ''cas2''. ''Cas3'' ima lasten promotor, medtem ko so ostali geni ''cas'' del istega operona, ki ga negativno regulira protein H-NS. Cas3 je endonukleaza in helikaza. Njena glavna naloga je cepitev in razgraditev tuje DNA. Cas1 in Cas2, obe endonukleazi, tvorita kompleks, ki lahko v bakterijsko DNA vgradi del tuje DNA. Ostali proteini Cas tvorijo kompleks Cascade. 
Navzdol od vodilnega zaporedja na obeh lokusih sledi območje CRISPR, sestavljeno iz izmenjavajočih se vmesnikov in ponovitev, ki so delno palindromske. Vmesniki izvirajo iz fagne DNA in predstavljajo imunost proti posameznim bakteriofagom, saj se po prepisovanju v pre-crRNA in procesiranju v crRNA vgradijo v kompleks CRISPR. S pomočjo crRNA kompleks prepozna tujo DNA, ki je komplementarna vmesnikom (protovmesniki) in vsebuje prepoznavno zaporedje PAM (ang: ''»protospacer adjacent motif«''). 
Sistem CRISPR/Cas pri ''E. coli'' se uvršča v tip 1-E, za katerega je značilna prisotnost genov ''cse1'' in ''cse2'' ter odsotnost gena ''cas4''.

==Kompleks Cascade in procesiranje crRNA==
Cascade je ribonukleoproteinski kompleks, ki ga sestavljajo proteini Cas in crRNA. Ti proteini so Cse1, Cse2, Cas7, Cas5e in Cas6e v stehiometričnem razmerju 1:2:6:1:1, skupaj s pre-crRNA pa se iz lokusa CRISPR prepisujejo v procesu biosinteze. Celoten kompleks enajstih podenot ima značilno obliko morskega konjička. 
Vsaka izmed proteinskih podenot ima specifično funkcijo: 
 
- '''Cse1''' prepozna zaporedje PAM na tuji DNA, tvori interakcije s 5' koncem crRNA in veže Cas3. 
- '''Cse2''' ne tvori interakcij s crRNA, pomaga pa pri sestavljanju kompleksa, saj tvori interakcije s Cse1, Cas7 in Cas5e. 
- Vsaka izmed šestih podenot '''Cas7''' vsebuje žleb s pozitivno nabitimi aminokislinskimi ostanki, v katere se lahko skrije vsaka šesta baza crRNA. Posledično te baze ne morejo tvoriti interakcij z bazami na tuji DNA, kar zmanjša specifičnost kompleksa. 
- '''Cas5e''' zasidra 5' konec crRNA v kompleks. 
- '''Cas6e''' procesira pre-crRNA v crRNA in njen 3' konec zasidra v kompleks. 
 
Prepisana pre-crRNA vsebuje več vmesnikov in ponovitev. Zaradi palindromskega zaporedja v ponovitvah se lahko v pre-crRNA vzpostavijo bazni pari in pride do nastanka lasnične zanke, ki jo Cas6e cepi na 3' koncu. S tem nastane zrela 61 nukleotidov dolga crRNA, na kateri je vmesnik (32 nt) obdan z deli palindromskih ponovitev: krajšim delom na 5' koncu in lasnično zanko na 3' koncu. Podenota Cas6e po obdelavi ostane vezana na 3' konec crRNA, ni pa še znano, ali je tekom procesiranja že vključena v Cascade. V kompleksu Cascade tvori interakcije s crRNA devet od enajstih podenot, postavljena je pa tako, da sta 5' konec in lasnična zanka vpeta med proteina Cas5e in Cas6e. 
Brouns in sodelavci so v raziskavi iz leta 2008 dokazali, da pri samem procesiranju pre-crRNA sodeluje le Cas6e podenota. Poskuse so opravili na ''E. coli'' seva K12 in bakterijam izbili gene za posamezne podenote. Zrelo crRNA so zaznali le v bakterijah, ki so imele gen cas6e. Ugotovili so tudi, da Cas6e za svoje delovanje ne potrebuje dvovalentnih kovinskih kationov ali ATP, prav tako pa lahko pre-crRNA cepi neodvisno od ostalih podenot. Ko so Cas6e primerjali z ostalimi proteini iz njegove družine, so ugotovili, da vsebuje dobro ohranjen His20, ki je verjetno vključen v samo katalizo cepitve pre-crRNA, ni pa nujno potreben za izgradnjo kompleksa. Če so ta aminokislinski ostanek zamenjali z Ala, se je kompleks Cascade vseeno sestavil, crRNA pa ni nastala.

==Vezava kompleksa Cascade na DNA==

Cascade se na DNA veže na več načinov. Zaradi para zank bogatih z lizini na dveh izmed podenot Cas7 se lahko z nespecifičnimi elektrostatskimi interakcijami veže na negativno nabito ogrodje DNA, poleg tega pa je za delovanje kompleksa bistvenega pomena vezava na protovmesnik (zaporedja komplementarna vmesnikom na crRNA) in PAM. PAM so trije nukleotidi neposredno ob protovmesniku, s katerimi v malem žlebu interagira podenota Cse1, in so bistvenega pomena za ločevanje bakteriji tuje in lastne DNA. Za interakcije s PAM so ključni trije strukturni vzorci na N-koncu Cse1: lizinski prst, glicinska zanka in glutaminska zagozda. Izmed 64 možnih kombinacij na mestu PAM jih le majhno število tvori optimalne vezave s Cse1. V primeru, da je interakcija med PAM in Cse1 ugodna, lahko podenota s konformacijsko spremembo povzroči destabilizacijo in razklenitev tarčne DNA, tako da se lahko crRNA približa eni od verig. V primeru komplementarnosti vmesnika in tarčne DNA, se vezava kompleksa okrepi in omogoči nadaljevanje imunskega odziva CRISPR/cas, izpodrinjena veriga DNA pa tvori značilno zanko R. 
Chaoyou Xue in sodelavci so leta 2017 v ''E. coli'' proučevali mehanizme, s katerimi se lahko Cascade veže na DNA. Uporabili so metodo FRET, kjer so s fluorescenčnim »donorjem« (Cy3) označili DNA v bližini tarčnega zaporedja, z »akceptorjem« (Cy5) pa podenoto Cas5e kompleksa Cascade. Metoda temelji na pojavu, kjer fluorescenca določene valovne dolžine donorskega označevalca vzburi akceptorski označevalec, če je ta dovolj blizu. Akceptorski označevalec nato fluorescira z drugo valovno dolžino, kar signalizira približanje označevalcev. Označevalca sta bila nameščena tako, da nista ovirala vezave Cascade na DNA, zaradi učinka FRET pa sta omogočala detekcijo vezave kompleksa. 
V raziskavi so delali z molekulo DNA, ki je vsebovala popoln komplement uporabljenemu vmesniku in eno izmed ugodnih zaporedij PAM. Ugotovili so, da je v 20 % primerov prišlo do močne in dolgotrajne vezave, kjer je učinek FRET trajal tudi do 190 sekund, sicer pa so bile vezave krajše in najverjetneje poledica nespecifične interakcije ali nepopolne tvorbe zanke R. Nadaljnji eksperimenti z drugimi crRNA in DNA so pokazali, da se tudi v primeru, ko DNA ne vsebuje protovmesnika, Cascade lahko kratkotrajno veže. Ta pojav so povezali s prisotnostjo ugodnih PAM v DNA, saj je bilo takšnih vezav znatno manj v primeru, ko so delali z DNA brez PAM. Njihov končni model predpostavlja, da Cascade naključno »skenira« DNA s pomočjo nespecifičnih elektrostatskih interakcij, se upočasni in bolje veže ob prisotnosti PAM, do močne in trajne interakcije pa pride ob ujemanju vmesnika s protovmesnikom.

==Interferenca in adaptacija, ki temelji na recikliranju ostankov tuje DNA po razgradnji s Cas3==

Zdaj vemo, kako Cascade prepozna tujo DNA. Vprašajmo se, kaj sledi? Poznamo dva mehanizma. 
Pri interferenci vzpostavitvi R-zanke sledi vpoklic Cas3. To je protein sestavljen iz treh domen, ki imajo helikazno in nukleazno aktivnost. Od ATP odvisna helikazna domena razvije izpodrinjeno verigo, nukleazna domena na C-koncu jo cepi, nato pa od Mg2+ odvisna HD-nukleazna domena do konca uniči ssDNA. Izpodrinjena veriga je tako uničena, ostane le še tarčna veriga. Mehanizem njenega uničenja zaenkrat še ni pojasnjen, obstaja le nekaj domnev, zagotovo pa vemo, da je na ta način prepisovanje tuje DNA onemogočeno in obramba uspešno izvedena. 
Adaptacija, ki temelji na recikliranju ostankov tuje DNA po razgradnji s Cas3 (ang: ''»Primed adaptation«''), pa z vpoklicem Cas1-Cas2 kompleksa poskrbi za vstavitev novega vmesnika v lokus CRISPR. Preden razložimo, kako se to zgodi, pa si poglejmo še nekaj dejstev. Še do pred nedavnim so bili znanstveniki prepričani, da v celici poteka ali adaptacija ali interferenca. Po raziskavah opisanih spodaj pa danes vemo, da ta trditev ne drži povsem. 
Izkazalo se je, da je ključna determinanta, ki določa način nadaljnjega poteka obrambnega mehanizma interakcija med PAM in Cse1. PAM je sestavljen iz treh nukleotidov, kar pomeni, da obstaja 64 različnih možnosti tega zaporedja. 
Že dalj časa vemo, da Cse1 specifično prepozna PAM sestavljen iz AAG. Temu sledi močna interferenca. Vendar pa tudi drugačni PAM sprožijo določen odziv, saj se Cse1 na različna zaporedja veže z različno visoko afiniteto. Odziv, ki temu sledi lahko razdelimo v tri skupine. V raziskavi Olge Musharova in sodelavcev narejeni marca letos, so ugotovili, da 17 PAM zaporedij sproži močno interferenco. 11 PAM je takih, ki sprožijo počasno interferenco, pri 36 pa interference ni možno zaznati. Zanimivo v tej raziskavi je bilo predvsem dejstvo, da v 36 primerih brez interference prav tako ni bilo možno zaznati adaptacije. To pa pomeni, da je predpostavka o nesklopljenosti adaptacije in interference napačna. 
Danes vemo, da je zaradi metodoloških omejitev v primeru močne interference zelo težko zaznati tako vrsto adaptacije in obratno. 
Zato lahko predpostavimo sledeč mehanizem adaptacije, ki temelji na recikliranju ostankov tuje DNA po interferenčni razgradnji s Cas3 (ang: ''»Primed adaptation«'') in predpostavlja z interferenco sklopljeno aktivnost Cas1 in Cas2. Ta dva proteina tvorita stabilen kompleks Cas1-Cas2 v razmerju 4:2, kjer je dimer Cas2 objet z dvema dimeroma Cas1. Ob prepoznavi PAM najprej poteče interferenčna cepitev tuje DNA s Cas 3 in pri tem nastanejo manjši fragmenti. Cas1-Cas2 specifično prepozna pravi 33 nt velik oligodeoksinukleotid , ki predstavlja protovmesnik . Kako kompleks prepozna pravi protovmesnik bo opisano spodaj, Cas1-Cas2 naloga pa je še njegova vstavitev v lokus CRISPR .

==Naivna adaptacija==

Obrambni odziv ''E. Coli'' pa sestavlja še tretji mehanizem, ki ne vključuje Cascade. Izkaže se, da Cas1-Cas2 kompleks lahko tudi sam prepozna in cepi tujo DNA. Mehanizem se začne, ko en izmed dimerov Cas1 prepozna PAM in cepi vez med 2. in 3. nukleotidom. Drug izmed dimerov Cas1 pa poskrbi za cepitev po 33. nukleotidu, tako da nastane protovmesnik ravno prave dolžine. Tak protovmesnik se veže v kompleks Cas1-Cas2 in vstavi v lokus CRISPR.

==Uporabnost==
Zaradi vseh opisanih značilnosti znanstveniki CRISPR/Cas sistem 1-E prepoznavajo kot potencialno zelo uporabno metodo genskega inženiringa. Zdi se, da bomo s pomočjo tega mehanizma kmalu lahko dosegli tako zelo specifično delecijo in zamenjavo genov, kot tudi specifično aktivacijo in inaktivacijo genov. Tao. S in sodelavci so, tako kot tudi druge raziskovalne skupine, v svojih raziskavah celo že uspešno uporabili metodo CRISPRi (ang: ''CRISPR interference''), ki temelji na zgoraj opisanem znanju. 

Trenutno je ena izmed glavnih omejitev te metode nespecifično vezanje Cascade na DNA tudi izven tarčnih območij. Da bomo lahko povečali učinkovitosti tehnik modificiranja genoma, moramo najprej opraviti še nekaj raziskav o mehanizmu CRISPR/Cas in bolje razumeti potek procesov, ki so nam trenutno še neznani.

==Viri==
- Tao, S., Qian, Y., Wang, X., Cao, W., Ma, W., Chen, K., & Ouyang, P. (2018). Regulation of ATP levels in Escherichia coli using CRISPR interference for enhanced pinocembrin production. Microbial Cell Factories, 17(1). 

- Musharova, O., Sitnik, V., Vlot, M., Savitskaya, E., Datsenko, K. A., Krivoy, A., … Severinov, K. (2019). Systematic analysis of Type I‐E Escherichia coli CRISPR‐Cas PAM sequences ability to promote interference and primed adaptation. Molecular Microbiology. 

- Xue, C., Zhu, Y., Zhang, X., Shin, Y.-K., & Sashital, D. G. (2017). Real-Time Observation of Target Search by the CRISPR Surveillance Complex Cascade. Cell Reports, 21(13), 3717–3727. 

- Brouns, S.J., Jore, M.M., Lundgren, M., Westra, E.R., Slijkhuis, R.J., Snijders, A.P., Dickman, M.J., Makarova, K.S., Koonin, E.V., van der Oost, J. (2008). Small CRISPR RNAs guide antiviral defense in prokaryotes. Science, 321, 961-964. 

- Cooper, L. A. Mechanistic Analysis of the Type I-E CRISPR-Cas System in Escherichia coli. New York: ProQuest, 2018. 

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Mehanizem delovanja kompleksa Cascade in sistem CRISPR/Cas pri E. coli

2019-04-15T22:30:37Z

KlementinaP: /* Interferenca in adaptacija, ki temelji na recikliranju ostankov tuje DNA po razgradnji s Cas3 */

==Uvod==
Tako kot mnogi ostali prokarionti tudi ''E. coli'' pridobiva odpornost proti bakteriofagom z vgraditvijo kratkih fragmentov fagne DNA v lastno DNA. Ti odseki na bakterijski DNA se imenujejo CRISPR, oziroma gruče enakomerno prekinjenih kratkih palindromnih ponovitev (ang: ''»clustered regularly interspaced short palindromic repeats«''), in skupaj z geni za proteine Cas predstavljajo bakterijski imunski sistem CRISPR/Cas tipa 1-E. Pri ''E. coli'' ima ključno vlogo 8 različnih Cas proteinov. Od tega jih 5 sestavlja kompleks Cascade. Cilj obrambnega sistema je prepoznati tujo DNA in jo s pomočjo Cas endonukleaz razrezati na manjše fragmente. V splošnem sistem CRISPR/Cas deluje v 3 korakih: 
 
1. '''ADAPTACIJA''': proteini Cas prepoznajo tujo DNA in jo vključijo v CRISPR. 
2. '''BIOSINTEZA''': sinteza proteinov Cas in transkripcija CRISPR. 
3. '''INTERFERENCA''': uničenje tuje DNA.

==Lokus CRISPR==
Kromosom ''E. coli'' vsebuje 2 lokusa CRISPR, imenovana CRISPR-I in CRISPR-II. Glavne strukturne značilnosti lokusa so vodilno zaporedje, vmesniki in ponovitve. CRISPR-I vsebuje 13 vmesnikov, CRISPR-II pa le 6. K lokusu CRISPR-I spadajo tudi geni cas. 
8 genov cas, ki zapisujejo proteine Cas, se nahaja navzgor od vodilnega zaporedja na lokusu CRISPR-I in si od 5' proti 3' koncu po vrsti sledijo: ''cas3, cse1, cse2, cas7, cas5, cas6e, cas1'' in ''cas2''. ''Cas3'' ima lasten promotor, medtem ko so ostali geni ''cas'' del istega operona, ki ga negativno regulira protein H-NS. Cas3 je endonukleaza in helikaza. Njena glavna naloga je cepitev in razgraditev tuje DNA. Cas1 in Cas2, obe endonukleazi, tvorita kompleks, ki lahko v bakterijsko DNA vgradi del tuje DNA. Ostali proteini Cas tvorijo kompleks Cascade. 
Navzdol od vodilnega zaporedja na obeh lokusih sledi območje CRISPR, sestavljeno iz izmenjavajočih se vmesnikov in ponovitev, ki so delno palindromske. Vmesniki izvirajo iz fagne DNA in predstavljajo imunost proti posameznim bakteriofagom, saj se po prepisovanju v pre-crRNA in procesiranju v crRNA vgradijo v kompleks CRISPR. S pomočjo crRNA kompleks prepozna tujo DNA, ki je komplementarna vmesnikom (protovmesniki) in vsebuje prepoznavno zaporedje PAM (ang: ''»protospacer adjacent motif«''). 
Sistem CRISPR/Cas pri ''E. coli'' se uvršča v tip 1-E, za katerega je značilna prisotnost genov ''cse1'' in ''cse2'' ter odsotnost gena ''cas4''.

==Kompleks Cascade in procesiranje crRNA==
Cascade je ribonukleoproteinski kompleks, ki ga sestavljajo proteini Cas in crRNA. Ti proteini so Cse1, Cse2, Cas7, Cas5e in Cas6e v stehiometričnem razmerju 1:2:6:1:1, skupaj s pre-crRNA pa se iz lokusa CRISPR prepisujejo v procesu biosinteze. Celoten kompleks enajstih podenot ima značilno obliko morskega konjička. 
Vsaka izmed proteinskih podenot ima specifično funkcijo: 
 
- '''Cse1''' prepozna zaporedje PAM na tuji DNA, tvori interakcije s 5' koncem crRNA in veže Cas3. 
- '''Cse2''' ne tvori interakcij s crRNA, pomaga pa pri sestavljanju kompleksa, saj tvori interakcije s Cse1, Cas7 in Cas5e. 
- Vsaka izmed šestih podenot '''Cas7''' vsebuje žleb s pozitivno nabitimi aminokislinskimi ostanki, v katere se lahko skrije vsaka šesta baza crRNA. Posledično te baze ne morejo tvoriti interakcij z bazami na tuji DNA, kar zmanjša specifičnost kompleksa. 
- '''Cas5e''' zasidra 5' konec crRNA v kompleks. 
- '''Cas6e''' procesira pre-crRNA v crRNA in njen 3' konec zasidra v kompleks. 
 
Prepisana pre-crRNA vsebuje več vmesnikov in ponovitev. Zaradi palindromskega zaporedja v ponovitvah se lahko v pre-crRNA vzpostavijo bazni pari in pride do nastanka lasnične zanke, ki jo Cas6e cepi na 3' koncu. S tem nastane zrela 61 nukleotidov dolga crRNA, na kateri je vmesnik (32 nt) obdan z deli palindromskih ponovitev: krajšim delom na 5' koncu in lasnično zanko na 3' koncu. Podenota Cas6e po obdelavi ostane vezana na 3' konec crRNA, ni pa še znano, ali je tekom procesiranja že vključena v Cascade. V kompleksu Cascade tvori interakcije s crRNA devet od enajstih podenot, postavljena je pa tako, da sta 5' konec in lasnična zanka vpeta med proteina Cas5e in Cas6e. 
Brouns in sodelavci so v raziskavi iz leta 2008 dokazali, da pri samem procesiranju pre-crRNA sodeluje le Cas6e podenota. Poskuse so opravili na ''E. coli'' seva K12 in bakterijam izbili gene za posamezne podenote. Zrelo crRNA so zaznali le v bakterijah, ki so imele gen cas6e. Ugotovili so tudi, da Cas6e za svoje delovanje ne potrebuje dvovalentnih kovinskih kationov ali ATP, prav tako pa lahko pre-crRNA cepi neodvisno od ostalih podenot. Ko so Cas6e primerjali z ostalimi proteini iz njegove družine, so ugotovili, da vsebuje dobro ohranjen His20, ki je verjetno vključen v samo katalizo cepitve pre-crRNA, ni pa nujno potreben za izgradnjo kompleksa. Če so ta aminokislinski ostanek zamenjali z Ala, se je kompleks Cascade vseeno sestavil, crRNA pa ni nastala.

==Vezava kompleksa Cascade na DNA==

Cascade se na DNA veže na več načinov. Zaradi para zank bogatih z lizini na dveh izmed podenot Cas7 se lahko z nespecifičnimi elektrostatskimi interakcijami veže na negativno nabito ogrodje DNA, poleg tega pa je za delovanje kompleksa bistvenega pomena vezava na protovmesnik (zaporedja komplementarna vmesnikom na crRNA) in PAM. PAM so trije nukleotidi neposredno ob protovmesniku, s katerimi v malem žlebu interagira podenota Cse1, in so bistvenega pomena za ločevanje bakteriji tuje in lastne DNA. Za interakcije s PAM so ključni trije strukturni vzorci na N-koncu Cse1: lizinski prst, glicinska zanka in glutaminska zagozda. Izmed 64 možnih kombinacij na mestu PAM jih le majhno število tvori optimalne vezave s Cse1. V primeru, da je interakcija med PAM in Cse1 ugodna, lahko podenota s konformacijsko spremembo povzroči destabilizacijo in razklenitev tarčne DNA, tako da se lahko crRNA približa eni od verig. V primeru komplementarnosti vmesnika in tarčne DNA, se vezava kompleksa okrepi in omogoči nadaljevanje imunskega odziva CRISPR/cas, izpodrinjena veriga DNA pa tvori značilno zanko R. 
Chaoyou Xue in sodelavci so leta 2017 v ''E. coli'' proučevali mehanizme, s katerimi se lahko Cascade veže na DNA. Uporabili so metodo FRET, kjer so s fluorescenčnim »donorjem« (Cy3) označili DNA v bližini tarčnega zaporedja, z »akceptorjem« (Cy5) pa podenoto Cas5e kompleksa Cascade. Metoda temelji na pojavu, kjer fluorescenca določene valovne dolžine donorskega označevalca vzburi akceptorski označevalec, če je ta dovolj blizu. Akceptorski označevalec nato fluorescira z drugo valovno dolžino, kar signalizira približanje označevalcev. Označevalca sta bila nameščena tako, da nista ovirala vezave Cascade na DNA, zaradi učinka FRET pa sta omogočala detekcijo vezave kompleksa. 
V raziskavi so delali z molekulo DNA, ki je vsebovala popoln komplement uporabljenemu vmesniku in eno izmed ugodnih zaporedij PAM. Ugotovili so, da je v 20 % primerov prišlo do močne in dolgotrajne vezave, kjer je učinek FRET trajal tudi do 190 sekund, sicer pa so bile vezave krajše in najverjetneje poledica nespecifične interakcije ali nepopolne tvorbe zanke R. Nadaljnji eksperimenti z drugimi crRNA in DNA so pokazali, da se tudi v primeru, ko DNA ne vsebuje protovmesnika, Cascade lahko kratkotrajno veže. Ta pojav so povezali s prisotnostjo ugodnih PAM v DNA, saj je bilo takšnih vezav znatno manj v primeru, ko so delali z DNA brez PAM. Njihov končni model predpostavlja, da Cascade naključno »skenira« DNA s pomočjo nespecifičnih elektrostatskih interakcij, se upočasni in bolje veže ob prisotnosti PAM, do močne in trajne interakcije pa pride ob ujemanju vmesnika s protovmesnikom.

==Interferenca in adaptacija, ki temelji na recikliranju ostankov tuje DNA po razgradnji s Cas3==

Zdaj vemo, kako Cascade prepozna tujo DNA. Vprašajmo se, kaj sledi? Poznamo dva mehanizma. 
Pri interferenci vzpostavitvi R-zanke sledi vpoklic Cas3. To je protein sestavljen iz treh domen, ki imajo helikazno in nukleazno aktivnost. Od ATP odvisna helikazna domena razvije izpodrinjeno verigo, nukleazna domena na C-koncu jo cepi, nato pa od Mg2+ odvisna HD-nukleazna domena do konca uniči ssDNA. Izpodrinjena veriga je tako uničena, ostane le še tarčna veriga. Mehanizem njenega uničenja zaenkrat še ni pojasnjen, obstaja le nekaj domnev, zagotovo pa vemo, da je na ta način prepisovanje tuje DNA onemogočeno in obramba uspešno izvedena. 
Adaptacija, ki temelji na recikliranju ostankov tuje DNA po razgradnji s Cas3 (ang: ''»Primed adaptation«''), pa z vpoklicem Cas1-Cas2 kompleksa poskrbi za vstavitev novega vmesnika v lokus CRISPR. Preden razložimo, kako se to zgodi, pa si poglejmo še nekaj dejstev. Še do pred nedavnim so bili znanstveniki prepričani, da v celici poteka ali adaptacija ali interferenca. Po raziskavah opisanih spodaj pa danes vemo, da ta trditev ne drži povsem. 
Izkazalo se je, da je ključna determinanta, ki določa način nadaljnjega poteka obrambnega mehanizma interakcija med PAM in Cse1. PAM je sestavljen iz treh nukleotidov, kar pomeni, da obstaja 64 različnih možnosti tega zaporedja. 
Že dalj časa vemo, da Cse1 specifično prepozna PAM sestavljen iz AAG. Temu sledi močna interferenca. Vendar pa tudi drugačni PAM sprožijo določen odziv, saj se Cse1 na različna zaporedja veže z različno visoko afiniteto. Odziv, ki temu sledi lahko razdelimo v tri skupine. V raziskavi Olge Musharova in sodelavcev narejeni marca letos, so ugotovili, da 17 PAM zaporedij sproži močno interferenco. 11 PAM je takih, ki sprožijo počasno interferenco, pri 36 pa interference ni možno zaznati. Zanimivo v tej raziskavi je bilo predvsem dejstvo, da v 36 primerih brez interference prav tako ni bilo možno zaznati adaptacije. To pa pomeni, da je predpostavka o nesklopljenosti adaptacije in interference napačna. 
Danes vemo, da je zaradi metodoloških omejitev v primeru močne interference zelo težko zaznati tako vrsto adaptacije in obratno. 
Zato lahko predpostavimo sledeč mehanizem adaptacije, ki temelji na recikliranju ostankov tuje DNA po interferenčni razgradnji s Cas3 (ang: ''»Primed adaptation«'') in predpostavlja z interferenco sklopljeno aktivnost Cas1 in Cas2. Ta dva proteina tvorita stabilen kompleks Cas1-Cas2 v razmerju 4:2, kjer je dimer Cas2 objet z dvema dimeroma Cas1. Ob prepoznavi PAM najprej poteče interferenčna cepitev tuje DNA s Cas 3 in pri tem nastanejo manjši fragmenti. Cas1-Cas2 specifično prepozna pravi 33 nt velik oligodeoksinukleotid , ki predstavlja protovmesnik . Kako kompleks prepozna pravi protovmesnik bo opisano spodaj, Cas1-Cas2 naloga pa je še njegova vstavitev v lokus CRISPR .

==Naivna adaptacija==

Obrambni odziv ''E. Coli'' pa sestavlja še tretji mehanizem, ki ne vključuje Cascade. Izkaže se, da Cas1-Cas2 kompleks lahko tudi sam prepozna in cepi tujo DNA. Mehanizem se začne, ko en izmed dimerov Cas1 prepozna PAM in cepi vez med 2. in 3. nukleotidom. Drug izmed dimerov Cas1 pa poskrbi za cepitev po 33. nukleotidu, tako da nastane protovmesnik ravno prave dolžine. Tak protovmesnik se veže v kompleks Cas1-Cas2 in vstavi v lokus CRISPR.

==Uporabnost==
Zaradi vseh opisanih značilnosti znanstveniki CRISPR/Cas sistem 1-E prepoznavajo kot potencialno zelo uporabno metodo genskega inženiringa. Zdi se, da bomo s pomočjo tega mehanizma kmalu lahko dosegli tako zelo specifično delecijo in zamenjavo genov, kot tudi specifično aktivacijo in inaktivacijo genov. Tao. S in sodelavci so, tako kot tudi druge raziskovalne skupine, v svojih raziskavah celo že uspešno uporabili metodo CRISPRi (ang: ''CRISPR interference''), ki temelji na zgoraj opisanem znanju. 

Trenutno je ena izmed glavnih omejitev te metode nespecifično vezanje Cascade na DNA tudi izven tarčnih območij. Da bomo lahko povečali učinkovitosti tehnik modificiranja genoma, moramo najprej opraviti še nekaj raziskav o mehanizmu CRISPR/Cas in bolje razumeti potek procesov, ki so nam trenutno še neznani.

==Viri==
- Tao, S., Qian, Y., Wang, X., Cao, W., Ma, W., Chen, K., & Ouyang, P. (2018). Regulation of ATP levels in Escherichia coli using CRISPR interference for enhanced pinocembrin production. Microbial Cell Factories, 17(1). 

- Musharova, O., Sitnik, V., Vlot, M., Savitskaya, E., Datsenko, K. A., Krivoy, A., … Severinov, K. (2019). Systematic analysis of Type I‐E Escherichia coli CRISPR‐Cas PAM sequences ability to promote interference and primed adaptation. Molecular Microbiology. 

- Xue, C., Zhu, Y., Zhang, X., Shin, Y.-K., & Sashital, D. G. (2017). Real-Time Observation of Target Search by the CRISPR Surveillance Complex Cascade. Cell Reports, 21(13), 3717–3727. 

- Brouns, S.J., Jore, M.M., Lundgren, M., Westra, E.R., Slijkhuis, R.J., Snijders, A.P., Dickman, M.J., Makarova, K.S., Koonin, E.V., van der Oost, J. (2008). Small CRISPR RNAs guide antiviral defense in prokaryotes. Science, 321, 961-964. 

- Cooper, L. A. Mechanistic Analysis of the Type I-E CRISPR-Cas System in Escherichia coli. New York: ProQuest, 2018. 

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Mehanizem delovanja kompleksa Cascade in sistem CRISPR/Cas pri E. coli

2019-04-15T22:28:04Z

KlementinaP:

==Uvod==
Tako kot mnogi ostali prokarionti tudi ''E. coli'' pridobiva odpornost proti bakteriofagom z vgraditvijo kratkih fragmentov fagne DNA v lastno DNA. Ti odseki na bakterijski DNA se imenujejo CRISPR, oziroma gruče enakomerno prekinjenih kratkih palindromnih ponovitev (ang: ''»clustered regularly interspaced short palindromic repeats«''), in skupaj z geni za proteine Cas predstavljajo bakterijski imunski sistem CRISPR/Cas tipa 1-E. Pri ''E. coli'' ima ključno vlogo 8 različnih Cas proteinov. Od tega jih 5 sestavlja kompleks Cascade. Cilj obrambnega sistema je prepoznati tujo DNA in jo s pomočjo Cas endonukleaz razrezati na manjše fragmente. V splošnem sistem CRISPR/Cas deluje v 3 korakih: 
 
1. '''ADAPTACIJA''': proteini Cas prepoznajo tujo DNA in jo vključijo v CRISPR. 
2. '''BIOSINTEZA''': sinteza proteinov Cas in transkripcija CRISPR. 
3. '''INTERFERENCA''': uničenje tuje DNA.

==Lokus CRISPR==
Kromosom ''E. coli'' vsebuje 2 lokusa CRISPR, imenovana CRISPR-I in CRISPR-II. Glavne strukturne značilnosti lokusa so vodilno zaporedje, vmesniki in ponovitve. CRISPR-I vsebuje 13 vmesnikov, CRISPR-II pa le 6. K lokusu CRISPR-I spadajo tudi geni cas. 
8 genov cas, ki zapisujejo proteine Cas, se nahaja navzgor od vodilnega zaporedja na lokusu CRISPR-I in si od 5' proti 3' koncu po vrsti sledijo: ''cas3, cse1, cse2, cas7, cas5, cas6e, cas1'' in ''cas2''. ''Cas3'' ima lasten promotor, medtem ko so ostali geni ''cas'' del istega operona, ki ga negativno regulira protein H-NS. Cas3 je endonukleaza in helikaza. Njena glavna naloga je cepitev in razgraditev tuje DNA. Cas1 in Cas2, obe endonukleazi, tvorita kompleks, ki lahko v bakterijsko DNA vgradi del tuje DNA. Ostali proteini Cas tvorijo kompleks Cascade. 
Navzdol od vodilnega zaporedja na obeh lokusih sledi območje CRISPR, sestavljeno iz izmenjavajočih se vmesnikov in ponovitev, ki so delno palindromske. Vmesniki izvirajo iz fagne DNA in predstavljajo imunost proti posameznim bakteriofagom, saj se po prepisovanju v pre-crRNA in procesiranju v crRNA vgradijo v kompleks CRISPR. S pomočjo crRNA kompleks prepozna tujo DNA, ki je komplementarna vmesnikom (protovmesniki) in vsebuje prepoznavno zaporedje PAM (ang: ''»protospacer adjacent motif«''). 
Sistem CRISPR/Cas pri ''E. coli'' se uvršča v tip 1-E, za katerega je značilna prisotnost genov ''cse1'' in ''cse2'' ter odsotnost gena ''cas4''.

==Kompleks Cascade in procesiranje crRNA==
Cascade je ribonukleoproteinski kompleks, ki ga sestavljajo proteini Cas in crRNA. Ti proteini so Cse1, Cse2, Cas7, Cas5e in Cas6e v stehiometričnem razmerju 1:2:6:1:1, skupaj s pre-crRNA pa se iz lokusa CRISPR prepisujejo v procesu biosinteze. Celoten kompleks enajstih podenot ima značilno obliko morskega konjička. 
Vsaka izmed proteinskih podenot ima specifično funkcijo: 
 
- '''Cse1''' prepozna zaporedje PAM na tuji DNA, tvori interakcije s 5' koncem crRNA in veže Cas3. 
- '''Cse2''' ne tvori interakcij s crRNA, pomaga pa pri sestavljanju kompleksa, saj tvori interakcije s Cse1, Cas7 in Cas5e. 
- Vsaka izmed šestih podenot '''Cas7''' vsebuje žleb s pozitivno nabitimi aminokislinskimi ostanki, v katere se lahko skrije vsaka šesta baza crRNA. Posledično te baze ne morejo tvoriti interakcij z bazami na tuji DNA, kar zmanjša specifičnost kompleksa. 
- '''Cas5e''' zasidra 5' konec crRNA v kompleks. 
- '''Cas6e''' procesira pre-crRNA v crRNA in njen 3' konec zasidra v kompleks. 
 
Prepisana pre-crRNA vsebuje več vmesnikov in ponovitev. Zaradi palindromskega zaporedja v ponovitvah se lahko v pre-crRNA vzpostavijo bazni pari in pride do nastanka lasnične zanke, ki jo Cas6e cepi na 3' koncu. S tem nastane zrela 61 nukleotidov dolga crRNA, na kateri je vmesnik (32 nt) obdan z deli palindromskih ponovitev: krajšim delom na 5' koncu in lasnično zanko na 3' koncu. Podenota Cas6e po obdelavi ostane vezana na 3' konec crRNA, ni pa še znano, ali je tekom procesiranja že vključena v Cascade. V kompleksu Cascade tvori interakcije s crRNA devet od enajstih podenot, postavljena je pa tako, da sta 5' konec in lasnična zanka vpeta med proteina Cas5e in Cas6e. 
Brouns in sodelavci so v raziskavi iz leta 2008 dokazali, da pri samem procesiranju pre-crRNA sodeluje le Cas6e podenota. Poskuse so opravili na ''E. coli'' seva K12 in bakterijam izbili gene za posamezne podenote. Zrelo crRNA so zaznali le v bakterijah, ki so imele gen cas6e. Ugotovili so tudi, da Cas6e za svoje delovanje ne potrebuje dvovalentnih kovinskih kationov ali ATP, prav tako pa lahko pre-crRNA cepi neodvisno od ostalih podenot. Ko so Cas6e primerjali z ostalimi proteini iz njegove družine, so ugotovili, da vsebuje dobro ohranjen His20, ki je verjetno vključen v samo katalizo cepitve pre-crRNA, ni pa nujno potreben za izgradnjo kompleksa. Če so ta aminokislinski ostanek zamenjali z Ala, se je kompleks Cascade vseeno sestavil, crRNA pa ni nastala.

==Vezava kompleksa Cascade na DNA==

Cascade se na DNA veže na več načinov. Zaradi para zank bogatih z lizini na dveh izmed podenot Cas7 se lahko z nespecifičnimi elektrostatskimi interakcijami veže na negativno nabito ogrodje DNA, poleg tega pa je za delovanje kompleksa bistvenega pomena vezava na protovmesnik (zaporedja komplementarna vmesnikom na crRNA) in PAM. PAM so trije nukleotidi neposredno ob protovmesniku, s katerimi v malem žlebu interagira podenota Cse1, in so bistvenega pomena za ločevanje bakteriji tuje in lastne DNA. Za interakcije s PAM so ključni trije strukturni vzorci na N-koncu Cse1: lizinski prst, glicinska zanka in glutaminska zagozda. Izmed 64 možnih kombinacij na mestu PAM jih le majhno število tvori optimalne vezave s Cse1. V primeru, da je interakcija med PAM in Cse1 ugodna, lahko podenota s konformacijsko spremembo povzroči destabilizacijo in razklenitev tarčne DNA, tako da se lahko crRNA približa eni od verig. V primeru komplementarnosti vmesnika in tarčne DNA, se vezava kompleksa okrepi in omogoči nadaljevanje imunskega odziva CRISPR/cas, izpodrinjena veriga DNA pa tvori značilno zanko R. 
Chaoyou Xue in sodelavci so leta 2017 v ''E. coli'' proučevali mehanizme, s katerimi se lahko Cascade veže na DNA. Uporabili so metodo FRET, kjer so s fluorescenčnim »donorjem« (Cy3) označili DNA v bližini tarčnega zaporedja, z »akceptorjem« (Cy5) pa podenoto Cas5e kompleksa Cascade. Metoda temelji na pojavu, kjer fluorescenca določene valovne dolžine donorskega označevalca vzburi akceptorski označevalec, če je ta dovolj blizu. Akceptorski označevalec nato fluorescira z drugo valovno dolžino, kar signalizira približanje označevalcev. Označevalca sta bila nameščena tako, da nista ovirala vezave Cascade na DNA, zaradi učinka FRET pa sta omogočala detekcijo vezave kompleksa. 
V raziskavi so delali z molekulo DNA, ki je vsebovala popoln komplement uporabljenemu vmesniku in eno izmed ugodnih zaporedij PAM. Ugotovili so, da je v 20 % primerov prišlo do močne in dolgotrajne vezave, kjer je učinek FRET trajal tudi do 190 sekund, sicer pa so bile vezave krajše in najverjetneje poledica nespecifične interakcije ali nepopolne tvorbe zanke R. Nadaljnji eksperimenti z drugimi crRNA in DNA so pokazali, da se tudi v primeru, ko DNA ne vsebuje protovmesnika, Cascade lahko kratkotrajno veže. Ta pojav so povezali s prisotnostjo ugodnih PAM v DNA, saj je bilo takšnih vezav znatno manj v primeru, ko so delali z DNA brez PAM. Njihov končni model predpostavlja, da Cascade naključno »skenira« DNA s pomočjo nespecifičnih elektrostatskih interakcij, se upočasni in bolje veže ob prisotnosti PAM, do močne in trajne interakcije pa pride ob ujemanju vmesnika s protovmesnikom.

==Interferenca in adaptacija, ki temelji na recikliranju ostankov tuje DNA po razgradnji s Cas3==

Zdaj vemo, kako Cascade prepozna tujo DNA. Vprašajmo se, kaj sledi? Poznamo dva mehanizma. 
Pri interferenci vzpostavitvi R-zanke sledi vpoklic Cas3. To je protein sestavljen iz treh domen, ki imajo helikazno in nukleazno aktivnost. Od ATP odvisna helikazna domena razvije izpodrinjeno verigo, nukleazna domena na C-koncu jo cepi, nato pa od Mg2+ odvisna HD-nukleazna domena do konca uniči ssDNA. Izpodrinjena veriga je tako uničena, ostane le še tarčna veriga. Mehanizem njenega uničenja zaenkrat še ni pojasnjen, obstaja le nekaj domnev, zagotovo pa vemo, da je na ta način prepisovanje tuje DNA onemogočeno in obramba uspešno izvedena. 
Adaptacija, ki temelji na recikliranju ostankov tuje DNA po razgradnji s Cas3 (ang: ''»Primed adaptation«''), pa z vpoklicem Cas1-Cas2 kompleksa poskrbi za vstavitev novega vmesnika v lokus CRISPR. Preden razložimo, kako se to zgodi, pa si poglejmo še nekaj dejstev. Še do pred nedavnim so bili znanstveniki prepričani, da v celici poteka ali adaptacija ali interferenca. Po raziskavah opisanih spodaj pa danes vemo, da ta trditev ne drži povsem. 
Izkazalo se je, da je ključna determinanta, ki določa način nadaljnjega poteka obrambnega mehanizma interakcija med PAM in Cse1. PAM je sestavljen iz treh nukleotidov, kar pomeni, da obstaja 64 različnih možnosti tega zaporedja. 
Že dalj časa vemo, da Cse1 specifično prepozna PAM sestavljen iz AAG. Temu sledi močna interferenca. Vendar pa tudi drugačni PAM sprožijo določen odziv, saj se Cse1 na različna zaporedja veže z različno visoko afiniteto. Odziv, ki temu sledi lahko razdelimo v tri skupine. V raziskavi Olge Musharova in sodelavcev narejeni marca letos, so ugotovili, da 17 PAM zaporedij sproži močno interferenco. 11 PAM je takih, ki sprožijo počasno interferenco, pri 36 pa interference ni možno zaznati. Zanimivo v tej raziskavi je bilo predvsem dejstvo, da v 36 primerih brez interference prav tako ni bilo možno zaznati adaptacije. To pa pomeni, da je predpostavka o nesklopljenosti adaptacije in interference napačna. 
Danes vemo, da je zaradi metodoloških omejitev v primeru močne interference zelo težko zaznati tako vrsto adaptacije in obratno. 
Zato lahko predpostavimo sledeč mehanizem adaptacije, ki temelji na recikliranju ostankov tuje DNA po interferenčni razgradnji s Cas3 (ang: ''»Primed adaptation«'') in predpostavlja z interferenco sklopljeno aktivnost Cas1 in Cas2. Ta dva proteina tvorita stabilen kompleks Cas14:Cas22, kjer je dimer Cas2 objet z dvema dimeroma Cas1. Ob prepoznavi PAM najprej poteče interferenčna cepitev tuje DNA s Cas 3 in pri tem nastanejo manjši fragmenti. Cas1-Cas2 specifično prepozna pravi 33 nt velik oligodeoksinukleotid , ki predstavlja protovmesnik . Kako kompleks prepozna pravi protovmesnik bo opisano spodaj, Cas1-Cas2 naloga pa je še njegova vstavitev v lokus CRISPR .

==Naivna adaptacija==

Obrambni odziv ''E. Coli'' pa sestavlja še tretji mehanizem, ki ne vključuje Cascade. Izkaže se, da Cas1-Cas2 kompleks lahko tudi sam prepozna in cepi tujo DNA. Mehanizem se začne, ko en izmed dimerov Cas1 prepozna PAM in cepi vez med 2. in 3. nukleotidom. Drug izmed dimerov Cas1 pa poskrbi za cepitev po 33. nukleotidu, tako da nastane protovmesnik ravno prave dolžine. Tak protovmesnik se veže v kompleks Cas1-Cas2 in vstavi v lokus CRISPR.

==Uporabnost==
Zaradi vseh opisanih značilnosti znanstveniki CRISPR/Cas sistem 1-E prepoznavajo kot potencialno zelo uporabno metodo genskega inženiringa. Zdi se, da bomo s pomočjo tega mehanizma kmalu lahko dosegli tako zelo specifično delecijo in zamenjavo genov, kot tudi specifično aktivacijo in inaktivacijo genov. Tao. S in sodelavci so, tako kot tudi druge raziskovalne skupine, v svojih raziskavah celo že uspešno uporabili metodo CRISPRi (ang: ''CRISPR interference''), ki temelji na zgoraj opisanem znanju. 

Trenutno je ena izmed glavnih omejitev te metode nespecifično vezanje Cascade na DNA tudi izven tarčnih območij. Da bomo lahko povečali učinkovitosti tehnik modificiranja genoma, moramo najprej opraviti še nekaj raziskav o mehanizmu CRISPR/Cas in bolje razumeti potek procesov, ki so nam trenutno še neznani.

==Viri==
- Tao, S., Qian, Y., Wang, X., Cao, W., Ma, W., Chen, K., & Ouyang, P. (2018). Regulation of ATP levels in Escherichia coli using CRISPR interference for enhanced pinocembrin production. Microbial Cell Factories, 17(1). 

- Musharova, O., Sitnik, V., Vlot, M., Savitskaya, E., Datsenko, K. A., Krivoy, A., … Severinov, K. (2019). Systematic analysis of Type I‐E Escherichia coli CRISPR‐Cas PAM sequences ability to promote interference and primed adaptation. Molecular Microbiology. 

- Xue, C., Zhu, Y., Zhang, X., Shin, Y.-K., & Sashital, D. G. (2017). Real-Time Observation of Target Search by the CRISPR Surveillance Complex Cascade. Cell Reports, 21(13), 3717–3727. 

- Brouns, S.J., Jore, M.M., Lundgren, M., Westra, E.R., Slijkhuis, R.J., Snijders, A.P., Dickman, M.J., Makarova, K.S., Koonin, E.V., van der Oost, J. (2008). Small CRISPR RNAs guide antiviral defense in prokaryotes. Science, 321, 961-964. 

- Cooper, L. A. Mechanistic Analysis of the Type I-E CRISPR-Cas System in Escherichia coli. New York: ProQuest, 2018. 

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Mehanizem delovanja kompleksa Cascade in sistem CRISPR/Cas pri E. coli

2019-04-15T22:27:40Z

KlementinaP:

==Uvod==
Tako kot mnogi ostali prokarionti tudi ''E. coli'' pridobiva odpornost proti bakteriofagom z vgraditvijo kratkih fragmentov fagne DNA v lastno DNA. Ti odseki na bakterijski DNA se imenujejo CRISPR, oziroma gruče enakomerno prekinjenih kratkih palindromnih ponovitev (ang: ''»clustered regularly interspaced short palindromic repeats«''), in skupaj z geni za proteine Cas predstavljajo bakterijski imunski sistem CRISPR/Cas tipa 1-E. Pri ''E. coli'' ima ključno vlogo 8 različnih Cas proteinov. Od tega jih 5 sestavlja kompleks Cascade. Cilj obrambnega sistema je prepoznati tujo DNA in jo s pomočjo Cas endonukleaz razrezati na manjše fragmente. V splošnem sistem CRISPR/Cas deluje v 3 korakih: 
 
1. '''ADAPTACIJA''': proteini Cas prepoznajo tujo DNA in jo vključijo v CRISPR. 
2. '''BIOSINTEZA''': sinteza proteinov Cas in transkripcija CRISPR. 
3. '''INTERFERENCA''': uničenje tuje DNA.

==Lokus CRISPR==
Kromosom ''E. coli'' vsebuje 2 lokusa CRISPR, imenovana CRISPR-I in CRISPR-II. Glavne strukturne značilnosti lokusa so vodilno zaporedje, vmesniki in ponovitve. CRISPR-I vsebuje 13 vmesnikov, CRISPR-II pa le 6. K lokusu CRISPR-I spadajo tudi geni cas. 
8 genov cas, ki zapisujejo proteine Cas, se nahaja navzgor od vodilnega zaporedja na lokusu CRISPR-I in si od 5' proti 3' koncu po vrsti sledijo: ''cas3, cse1, cse2, cas7, cas5, cas6e, cas1'' in ''cas2''. ''Cas3'' ima lasten promotor, medtem ko so ostali geni ''cas'' del istega operona, ki ga negativno regulira protein H-NS. Cas3 je endonukleaza in helikaza. Njena glavna naloga je cepitev in razgraditev tuje DNA. Cas1 in Cas2, obe endonukleazi, tvorita kompleks, ki lahko v bakterijsko DNA vgradi del tuje DNA. Ostali proteini Cas tvorijo kompleks Cascade. 
Navzdol od vodilnega zaporedja na obeh lokusih sledi območje CRISPR, sestavljeno iz izmenjavajočih se vmesnikov in ponovitev, ki so delno palindromske. Vmesniki izvirajo iz fagne DNA in predstavljajo imunost proti posameznim bakteriofagom, saj se po prepisovanju v pre-crRNA in procesiranju v crRNA vgradijo v kompleks CRISPR. S pomočjo crRNA kompleks prepozna tujo DNA, ki je komplementarna vmesnikom (protovmesniki) in vsebuje prepoznavno zaporedje PAM (ang: ''»protospacer adjacent motif«''). 
Sistem CRISPR/Cas pri ''E. coli'' se uvršča v tip 1-E, za katerega je značilna prisotnost genov ''cse1'' in ''cse2'' ter odsotnost gena ''cas4''.

==Kompleks Cascade in procesiranje crRNA==
Cascade je ribonukleoproteinski kompleks, ki ga sestavljajo proteini Cas in crRNA. Ti proteini so Cse1, Cse2, Cas7, Cas5e in Cas6e v stehiometričnem razmerju 1:2:6:1:1, skupaj s pre-crRNA pa se iz lokusa CRISPR prepisujejo v procesu biosinteze. Celoten kompleks enajstih podenot ima značilno obliko morskega konjička. 
Vsaka izmed proteinskih podenot ima specifično funkcijo: 
 
- '''Cse1''' prepozna zaporedje PAM na tuji DNA, tvori interakcije s 5' koncem crRNA in veže Cas3. 
- '''Cse2''' ne tvori interakcij s crRNA, pomaga pa pri sestavljanju kompleksa, saj tvori interakcije s Cse1, Cas7 in Cas5e. 
- Vsaka izmed šestih podenot '''Cas7''' vsebuje žleb s pozitivno nabitimi aminokislinskimi ostanki, v katere se lahko skrije vsaka šesta baza crRNA. Posledično te baze ne morejo tvoriti interakcij z bazami na tuji DNA, kar zmanjša specifičnost kompleksa. 
- '''Cas5e''' zasidra 5' konec crRNA v kompleks. 
- '''Cas6e''' procesira pre-crRNA v crRNA in njen 3' konec zasidra v kompleks. 
 
Prepisana pre-crRNA vsebuje več vmesnikov in ponovitev. Zaradi palindromskega zaporedja v ponovitvah se lahko v pre-crRNA vzpostavijo bazni pari in pride do nastanka lasnične zanke, ki jo Cas6e cepi na 3' koncu. S tem nastane zrela 61 nukleotidov dolga crRNA, na kateri je vmesnik (32 nt) obdan z deli palindromskih ponovitev: krajšim delom na 5' koncu in lasnično zanko na 3' koncu. Podenota Cas6e po obdelavi ostane vezana na 3' konec crRNA, ni pa še znano, ali je tekom procesiranja že vključena v Cascade. V kompleksu Cascade tvori interakcije s crRNA devet od enajstih podenot, postavljena je pa tako, da sta 5' konec in lasnična zanka vpeta med proteina Cas5e in Cas6e. 
Brouns in sodelavci so v raziskavi iz leta 2008 dokazali, da pri samem procesiranju pre-crRNA sodeluje le Cas6e podenota. Poskuse so opravili na ''E. coli'' seva K12 in bakterijam izbili gene za posamezne podenote. Zrelo crRNA so zaznali le v bakterijah, ki so imele gen cas6e. Ugotovili so tudi, da Cas6e za svoje delovanje ne potrebuje dvovalentnih kovinskih kationov ali ATP, prav tako pa lahko pre-crRNA cepi neodvisno od ostalih podenot. Ko so Cas6e primerjali z ostalimi proteini iz njegove družine, so ugotovili, da vsebuje dobro ohranjen His20, ki je verjetno vključen v samo katalizo cepitve pre-crRNA, ni pa nujno potreben za izgradnjo kompleksa. Če so ta aminokislinski ostanek zamenjali z Ala, se je kompleks Cascade vseeno sestavil, crRNA pa ni nastala.

==Vezava kompleksa Cascade na DNA==

Cascade se na DNA veže na več načinov. Zaradi para zank bogatih z lizini na dveh izmed podenot Cas7 se lahko z nespecifičnimi elektrostatskimi interakcijami veže na negativno nabito ogrodje DNA, poleg tega pa je za delovanje kompleksa bistvenega pomena vezava na protovmesnik (zaporedja komplementarna vmesnikom na crRNA) in PAM. PAM so trije nukleotidi neposredno ob protovmesniku, s katerimi v malem žlebu interagira podenota Cse1, in so bistvenega pomena za ločevanje bakteriji tuje in lastne DNA. Za interakcije s PAM so ključni trije strukturni vzorci na N-koncu Cse1: lizinski prst, glicinska zanka in glutaminska zagozda. Izmed 64 možnih kombinacij na mestu PAM jih le majhno število tvori optimalne vezave s Cse1. V primeru, da je interakcija med PAM in Cse1 ugodna, lahko podenota s konformacijsko spremembo povzroči destabilizacijo in razklenitev tarčne DNA, tako da se lahko crRNA približa eni od verig. V primeru komplementarnosti vmesnika in tarčne DNA, se vezava kompleksa okrepi in omogoči nadaljevanje imunskega odziva CRISPR/cas, izpodrinjena veriga DNA pa tvori značilno zanko R. 
Chaoyou Xue in sodelavci so leta 2017 v ''E. coli'' proučevali mehanizme, s katerimi se lahko Cascade veže na DNA. Uporabili so metodo FRET, kjer so s fluorescenčnim »donorjem« (Cy3) označili DNA v bližini tarčnega zaporedja, z »akceptorjem« (Cy5) pa podenoto Cas5e kompleksa Cascade. Metoda temelji na pojavu, kjer fluorescenca določene valovne dolžine donorskega označevalca vzburi akceptorski označevalec, če je ta dovolj blizu. Akceptorski označevalec nato fluorescira z drugo valovno dolžino, kar signalizira približanje označevalcev. Označevalca sta bila nameščena tako, da nista ovirala vezave Cascade na DNA, zaradi učinka FRET pa sta omogočala detekcijo vezave kompleksa. 
V raziskavi so delali z molekulo DNA, ki je vsebovala popoln komplement uporabljenemu vmesniku in eno izmed ugodnih zaporedij PAM. Ugotovili so, da je v 20 % primerov prišlo do močne in dolgotrajne vezave, kjer je učinek FRET trajal tudi do 190 sekund, sicer pa so bile vezave krajše in najverjetneje poledica nespecifične interakcije ali nepopolne tvorbe zanke R. Nadaljnji eksperimenti z drugimi crRNA in DNA so pokazali, da se tudi v primeru, ko DNA ne vsebuje protovmesnika, Cascade lahko kratkotrajno veže. Ta pojav so povezali s prisotnostjo ugodnih PAM v DNA, saj je bilo takšnih vezav znatno manj v primeru, ko so delali z DNA brez PAM. Njihov končni model predpostavlja, da Cascade naključno »skenira« DNA s pomočjo nespecifičnih elektrostatskih interakcij, se upočasni in bolje veže ob prisotnosti PAM, do močne in trajne interakcije pa pride ob ujemanju vmesnika s protovmesnikom.

==Interferenca in adaptacija, ki temelji na recikliranju ostankov tuje DNA po razgradnji s Cas3==

Zdaj vemo, kako Cascade prepozna tujo DNA. Vprašajmo se, kaj sledi? Poznamo dva mehanizma. 
Pri interferenci vzpostavitvi R-zanke sledi vpoklic Cas3. To je protein sestavljen iz treh domen, ki imajo helikazno in nukleazno aktivnost. Od ATP odvisna helikazna domena razvije izpodrinjeno verigo, nukleazna domena na C-koncu jo cepi, nato pa od Mg2+ odvisna HD-nukleazna domena do konca uniči ssDNA. Izpodrinjena veriga je tako uničena, ostane le še tarčna veriga. Mehanizem njenega uničenja zaenkrat še ni pojasnjen, obstaja le nekaj domnev, zagotovo pa vemo, da je na ta način prepisovanje tuje DNA onemogočeno in obramba uspešno izvedena. 
Adaptacija, ki temelji na recikliranju ostankov tuje DNA po razgradnji s Cas3 (ang: ''»Primed adaptation«''), pa z vpoklicem Cas1-Cas2 kompleksa poskrbi za vstavitev novega vmesnika v lokus CRISPR. Preden razložimo, kako se to zgodi, pa si poglejmo še nekaj dejstev. Še do pred nedavnim so bili znanstveniki prepričani, da v celici poteka ali adaptacija ali interferenca. Po raziskavah opisanih spodaj pa danes vemo, da ta trditev ne drži povsem. 
Izkazalo se je, da je ključna determinanta, ki določa način nadaljnjega poteka obrambnega mehanizma interakcija med PAM in Cse1. PAM je sestavljen iz treh nukleotidov, kar pomeni, da obstaja 64 različnih možnosti tega zaporedja. 
Že dalj časa vemo, da Cse1 specifično prepozna PAM sestavljen iz AAG. Temu sledi močna interferenca. Vendar pa tudi drugačni PAM sprožijo določen odziv, saj se Cse1 na različna zaporedja veže z različno visoko afiniteto. Odziv, ki temu sledi lahko razdelimo v tri skupine. V raziskavi Olge Musharova in sodelavcev narejeni marca letos, so ugotovili, da 17 PAM zaporedij sproži močno interferenco. 11 PAM je takih, ki sprožijo počasno interferenco, pri 36 pa interference ni možno zaznati. Zanimivo v tej raziskavi je bilo predvsem dejstvo, da v 36 primerih brez interference prav tako ni bilo možno zaznati adaptacije. To pa pomeni, da je predpostavka o nesklopljenosti adaptacije in interference napačna. 
Danes vemo, da je zaradi metodoloških omejitev v primeru močne interference zelo težko zaznati tako vrsto adaptacije in obratno. 
Zato lahko predpostavimo sledeč mehanizem adaptacije, ki temelji na recikliranju ostankov tuje DNA po interferenčni razgradnji s Cas3 (ang: ''»Primed adaptation«'') in predpostavlja z interferenco sklopljeno aktivnost Cas1 in Cas2. Ta dva proteina tvorita stabilen kompleks Cas14:Cas22, kjer je dimer Cas2 objet z dvema dimeroma Cas1. Ob prepoznavi PAM najprej poteče interferenčna cepitev tuje DNA s Cas 3 in pri tem nastanejo manjši fragmenti. Cas1-Cas2 specifično prepozna pravi 33 nt velik oligodeoksinukleotid , ki predstavlja protovmesnik . Kako kompleks prepozna pravi protovmesnik bo opisano spodaj, Cas1-Cas2 naloga pa je še njegova vstavitev v lokus CRISPR .

==Naivna adaptacija==

Obrambni odziv ''E. Coli'' pa sestavlja še tretji mehanizem, ki ne vključuje Cascade. Izkaže se, da Cas1-Cas2 kompleks lahko tudi sam prepozna in cepi tujo DNA. Mehanizem se začne, ko en izmed dimerov Cas1 prepozna PAM in cepi vez med 2. in 3. nukleotidom. Drug izmed dimerov Cas1 pa poskrbi za cepitev po 33. nukleotidu, tako da nastane protovmesnik ravno prave dolžine. Tak protovmesnik se veže v kompleks Cas1-Cas2 in vstavi v lokus CRISPR.

==Uporabnost==
Zaradi vseh opisanih značilnosti znanstveniki CRISPR/Cas sistem 1-E prepoznavajo kot potencialno zelo uporabno metodo genskega inženiringa. Zdi se, da bomo s pomočjo tega mehanizma kmalu lahko dosegli tako zelo specifično delecijo in zamenjavo genov, kot tudi specifično aktivacijo in inaktivacijo genov. Tao. S in sodelavci so, tako kot tudi druge raziskovalne skupine, v svojih raziskavah celo že uspešno uporabili metodo CRISPRi (ang: ''CRISPR interference''), ki temelji na zgoraj opisanem znanju. 

Trenutno je ena izmed glavnih omejitev te metode nespecifično vezanje Cascade na DNA tudi izven tarčnih območij. Da bomo lahko povečali učinkovitosti tehnik modificiranja genoma, moramo najprej opraviti še nekaj raziskav o mehanizmu CRISPR/Cas in bolje razumeti potek procesov, ki so nam trenutno še neznani.

==Viri==
- Tao, S., Qian, Y., Wang, X., Cao, W., Ma, W., Chen, K., & Ouyang, P. (2018). Regulation of ATP levels in Escherichia coli using CRISPR interference for enhanced pinocembrin production. Microbial Cell Factories, 17(1). 

- Musharova, O., Sitnik, V., Vlot, M., Savitskaya, E., Datsenko, K. A., Krivoy, A., … Severinov, K. (2019). Systematic analysis of Type I‐E Escherichia coli CRISPR‐Cas PAM sequences ability to promote interference and primed adaptation. Molecular Microbiology. 

- Xue, C., Zhu, Y., Zhang, X., Shin, Y.-K., & Sashital, D. G. (2017). Real-Time Observation of Target Search by the CRISPR Surveillance Complex Cascade. Cell Reports, 21(13), 3717–3727. 

- Brouns, S.J., Jore, M.M., Lundgren, M., Westra, E.R., Slijkhuis, R.J., Snijders, A.P., Dickman, M.J., Makarova, K.S., Koonin, E.V., van der Oost, J. (2008). Small CRISPR RNAs guide antiviral defense in prokaryotes. Science, 321, 961-964. 

- Cooper, L. A. Mechanistic Analysis of the Type I-E CRISPR-Cas System in Escherichia coli. New York: ProQuest, 2018. 

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Talk:Mehanizem delovanja kompleksa Cascade in sistem CRISPR/Cas pri E. coli

2019-04-15T22:16:41Z

KlementinaP:

Klementina Polanec: Uvod, Lokus CRISPR, Kompleks Cascade in procesiranje crRNA (Razen predzadnjega odstavka: "Prepisana pre-crRNA ...") 
Jernej Imperl: Predzadnji odstavek pri Kompleks Cascade in procesiranje crRNA, Vezava kompleksa Cascade na DNA 
Gašper Komatar: Interferenca in adaptacija, ki temelji na recikliranju ostankov tuje DNA po razgradnji s Cas3, Naivna adaptacija, Uporabnost

Talk:Mehanizem delovanja kompleksa Cascade in sistem CRISPR/Cas pri E. coli

2019-04-15T22:16:19Z

KlementinaP: New page: Klementina Polanec: Uvod, Lokus CRISPR, Kompleks Cascade in procesiranje crRNA (Razen predzadnjega odstavka: "Prepisana pre-crRNA ...") Jernej Imperl: Predzadnji odstavek pri Kompleks Casc...

Klementina Polanec: Uvod, Lokus CRISPR, Kompleks Cascade in procesiranje crRNA (Razen predzadnjega odstavka: "Prepisana pre-crRNA ...")
Jernej Imperl: Predzadnji odstavek pri Kompleks Cascade in procesiranje crRNA, Vezava kompleksa Cascade na DNA
Gašper Komatar: Interferenca in adaptacija, ki temelji na recikliranju ostankov tuje DNA po razgradnji s Cas3, Naivna adaptacija, Uporabnost

Mehanizem delovanja kompleksa Cascade in sistem CRISPR/Cas pri E. coli

2019-04-15T22:12:56Z

KlementinaP:

==Uvod==
Tako kot mnogi ostali prokarionti tudi ''E. coli'' pridobiva odpornost proti bakteriofagom z vgraditvijo kratkih fragmentov fagne DNA v lastno DNA. Ti odseki na bakterijski DNA se imenujejo CRISPR, oziroma gruče enakomerno prekinjenih kratkih palindromnih ponovitev (ang: ''»clustered regularly interspaced short palindromic repeats«''), in skupaj z geni za proteine Cas predstavljajo bakterijski imunski sistem CRISPR/Cas tipa 1-E. Pri ''E. coli'' ima ključno vlogo 8 različnih Cas proteinov. Od tega jih 5 sestavlja kompleks Cascade. Cilj obrambnega sistema je prepoznati tujo DNA in jo s pomočjo Cas endonukleaz razrezati na manjše fragmente. V splošnem sistem CRISPR/Cas deluje v 3 korakih: 
 
1. '''ADAPTACIJA''': proteini Cas prepoznajo tujo DNA in jo vključijo v CRISPR. 
2. '''BIOSINTEZA''': sinteza proteinov Cas in transkripcija CRISPR. 
3. '''INTERFERENCA''': uničenje tuje DNA.

==Lokus CRISPR==
Kromosom ''E. coli'' vsebuje 2 lokusa CRISPR, imenovana CRISPR-I in CRISPR-II. Glavne strukturne značilnosti lokusa so vodilno zaporedje, vmesniki in ponovitve. CRISPR-I vsebuje 13 vmesnikov, CRISPR-II pa le 6. K lokusu CRISPR-I spadajo tudi geni cas. 
8 genov cas, ki zapisujejo proteine Cas, se nahaja navzgor od vodilnega zaporedja na lokusu CRISPR-I in si od 5' proti 3' koncu po vrsti sledijo: ''cas3, cse1, cse2, cas7, cas5, cas6e, cas1'' in ''cas2''. ''Cas3'' ima lasten promotor, medtem ko so ostali geni ''cas'' del istega operona, ki ga negativno regulira protein H-NS. Cas3 je endonukleaza in helikaza. Njena glavna naloga je cepitev in razgraditev tuje DNA. Cas1 in Cas2, obe endonukleazi, tvorita kompleks, ki lahko v bakterijsko DNA vgradi del tuje DNA. Ostali proteini Cas tvorijo kompleks Cascade. 
Navzdol od vodilnega zaporedja na obeh lokusih sledi območje CRISPR, sestavljeno iz izmenjavajočih se vmesnikov in ponovitev, ki so delno palindromske. Vmesniki izvirajo iz fagne DNA in predstavljajo imunost proti posameznim bakteriofagom, saj se po prepisovanju v pre-crRNA in procesiranju v crRNA vgradijo v kompleks CRISPR. S pomočjo crRNA kompleks prepozna tujo DNA, ki je komplementarna vmesnikom (protovmesniki) in vsebuje prepoznavno zaporedje PAM (ang: ''»protospacer adjacent motif«''). 
Sistem CRISPR/Cas pri ''E. coli'' se uvršča v tip 1-E, za katerega je značilna prisotnost genov ''cse1'' in ''cse2'' ter odsotnost gena ''cas4''.

==Kompleks Cascade in procesiranje crRNA==
Cascade je ribonukleoproteinski kompleks, ki ga sestavljajo proteini Cas in crRNA. Ti proteini so Cse1, Cse2, Cas7, Cas5e in Cas6e v stehiometričnem razmerju 1:2:6:1:1, skupaj s pre-crRNA pa se iz lokusa CRISPR prepisujejo v procesu biosinteze. Celoten kompleks enajstih podenot ima značilno obliko morskega konjička. 
Vsaka izmed proteinskih podenot ima specifično funkcijo: 
 
- '''Cse1''' prepozna zaporedje PAM na tuji DNA, tvori interakcije s 5' koncem crRNA in veže Cas3. 
- '''Cse2''' ne tvori interakcij s crRNA, pomaga pa pri sestavljanju kompleksa, saj tvori interakcije s Cse1, Cas7 in Cas5e. 
- Vsaka izmed šestih podenot '''Cas7''' vsebuje žleb s pozitivno nabitimi aminokislinskimi ostanki, v katere se lahko skrije vsaka šesta baza crRNA. Posledično te baze ne morejo tvoriti interakcij z bazami na tuji DNA, kar zmanjša specifičnost kompleksa. 
- '''Cas5e''' zasidra 5' konec crRNA v kompleks. 
- '''Cas6e''' procesira pre-crRNA v crRNA in njen 3' konec zasidra v kompleks. 
 
Prepisana pre-crRNA vsebuje več vmesnikov in ponovitev. Zaradi palindromskega zaporedja v ponovitvah se lahko v pre-crRNA vzpostavijo bazni pari in pride do nastanka lasnične zanke, ki jo Cas6e cepi na 3' koncu. S tem nastane zrela 61 nukleotidov dolga crRNA, na kateri je vmesnik (32 nt) obdan z deli palindromskih ponovitev: krajšim delom na 5' koncu in lasnično zanko na 3' koncu. Podenota Cas6e po obdelavi ostane vezana na 3' konec crRNA, ni pa še znano, ali je tekom procesiranja že vključena v Cascade. V kompleksu Cascade tvori interakcije s crRNA devet od enajstih podenot, postavljena je pa tako, da sta 5' konec in lasnična zanka vpeta med proteina Cas5e in Cas6e. 
Brouns in sodelavci so v raziskavi iz leta 2008 dokazali, da pri samem procesiranju pre-crRNA sodeluje le Cas6e podenota. Poskuse so opravili na ''E. coli'' seva K12 in bakterijam izbili gene za posamezne podenote. Zrelo crRNA so zaznali le v bakterijah, ki so imele gen cas6e. Ugotovili so tudi, da Cas6e za svoje delovanje ne potrebuje dvovalentnih kovinskih kationov ali ATP, prav tako pa lahko pre-crRNA cepi neodvisno od ostalih podenot. Ko so Cas6e primerjali z ostalimi proteini iz njegove družine, so ugotovili, da vsebuje dobro ohranjen His20, ki je verjetno vključen v samo katalizo cepitve pre-crRNA, ni pa nujno potreben za izgradnjo kompleksa. Če so ta aminokislinski ostanek zamenjali z Ala, se je kompleks Cascade vseeno sestavil, crRNA pa ni nastala.

==Vezava kompleksa Cascade na DNA==

Cascade se na DNA veže na več načinov. Zaradi para zank bogatih z lizini na dveh izmed podenot Cas7 se lahko z nespecifičnimi elektrostatskimi interakcijami veže na negativno nabito ogrodje DNA, poleg tega pa je za delovanje kompleksa bistvenega pomena vezava na protovmesnik (zaporedja komplementarna vmesnikom na crRNA) in PAM. PAM so trije nukleotidi neposredno ob protovmesniku, s katerimi v malem žlebu interagira podenota Cse1, in so bistvenega pomena za ločevanje bakteriji tuje in lastne DNA. Za interakcije s PAM so ključni trije strukturni vzorci na N-koncu Cse1: lizinski prst, glicinska zanka in glutaminska zagozda. Izmed 64 možnih kombinacij na mestu PAM jih le majhno število tvori optimalne vezave s Cse1. V primeru, da je interakcija med PAM in Cse1 ugodna, lahko podenota s konformacijsko spremembo povzroči destabilizacijo in razklenitev tarčne DNA, tako da se lahko crRNA približa eni od verig. V primeru komplementarnosti vmesnika in tarčne DNA, se vezava kompleksa okrepi in omogoči nadaljevanje imunskega odziva CRISPR/cas, izpodrinjena veriga DNA pa tvori značilno zanko R. 
Chaoyou Xue in sodelavci so leta 2017 v ''E. coli'' proučevali mehanizme, s katerimi se lahko Cascade veže na DNA. Uporabili so metodo FRET, kjer so s fluorescenčnim »donorjem« (Cy3) označili DNA v bližini tarčnega zaporedja, z »akceptorjem« (Cy5) pa podenoto Cas5e kompleksa Cascade. Metoda temelji na pojavu, kjer fluorescenca določene valovne dolžine donorskega označevalca vzburi akceptorski označevalec, če je ta dovolj blizu. Akceptorski označevalec nato fluorescira z drugo valovno dolžino, kar signalizira približanje označevalcev. Označevalca sta bila nameščena tako, da nista ovirala vezave Cascade na DNA, zaradi učinka FRET pa sta omogočala detekcijo vezave kompleksa. 
V raziskavi so delali z molekulo DNA, ki je vsebovala popoln komplement uporabljenemu vmesniku in eno izmed ugodnih zaporedij PAM. Ugotovili so, da je v 20 % primerov prišlo do močne in dolgotrajne vezave, kjer je učinek FRET trajal tudi do 190 sekund, sicer pa so bile vezave krajše in najverjetneje poledica nespecifične interakcije ali nepopolne tvorbe zanke R. Nadaljnji eksperimenti z drugimi crRNA in DNA so pokazali, da se tudi v primeru, ko DNA ne vsebuje protovmesnika, Cascade lahko kratkotrajno veže. Ta pojav so povezali s prisotnostjo ugodnih PAM v DNA, saj je bilo takšnih vezav znatno manj v primeru, ko so delali z DNA brez PAM. Njihov končni model predpostavlja, da Cascade naključno »skenira« DNA s pomočjo nespecifičnih elektrostatskih interakcij, se upočasni in bolje veže ob prisotnosti PAM, do močne in trajne interakcije pa pride ob ujemanju vmesnika s protovmesnikom.

==Interferenca in adaptacija, ki temelji na recikliranju ostankov tuje DNA po razgradnji s Cas3==

Zdaj vemo, kako Cascade prepozna tujo DNA. Vprašajmo se, kaj sledi? Poznamo dva mehanizma. 
Pri interferenci vzpostavitvi R-zanke sledi vpoklic Cas3. To je protein sestavljen iz treh domen, ki imajo helikazno in nukleazno aktivnost. Od ATP odvisna helikazna domena razvije izpodrinjeno verigo, nukleazna domena na C-koncu jo cepi, nato pa od Mg2+ odvisna HD-nukleazna domena do konca uniči ssDNA. Izpodrinjena veriga je tako uničena, ostane le še tarčna veriga. Mehanizem njenega uničenja zaenkrat še ni pojasnjen, obstaja le nekaj domnev, zagotovo pa vemo, da je na ta način prepisovanje tuje DNA onemogočeno in obramba uspešno izvedena. 
Adaptacija, ki temelji na recikliranju ostankov tuje DNA po razgradnji s Cas3 (ang: ''»Primed adaptation«''), pa z vpoklicem Cas1-Cas2 kompleksa poskrbi za vstavitev novega vmesnika v lokus CRISPR. Preden razložimo, kako se to zgodi, pa si poglejmo še nekaj dejstev. Še do pred nedavnim so bili znanstveniki prepričani, da v celici poteka ali adaptacija ali interferenca. Po raziskavah opisanih spodaj pa danes vemo, da ta trditev ne drži povsem. 
Izkazalo se je, da je ključna determinanta, ki določa način nadaljnjega poteka obrambnega mehanizma interakcija med PAM in Cse1. PAM je sestavljen iz treh nukleotidov, kar pomeni, da obstaja 64 različnih možnosti tega zaporedja. 
Že dalj časa vemo, da Cse1 specifično prepozna PAM sestavljen iz AAG. Temu sledi močna interferenca. Vendar pa tudi drugačni PAM sprožijo določen odziv, saj se Cse1 na različna zaporedja veže z različno visoko afiniteto. Odziv, ki temu sledi lahko razdelimo v tri skupine. V raziskavi Olge Musharova in sodelavcev narejeni marca letos, so ugotovili, da 17 PAM zaporedij sproži močno interferenco. 11 PAM je takih, ki sprožijo počasno interferenco, pri 36 pa interference ni možno zaznati. Zanimivo v tej raziskavi je bilo predvsem dejstvo, da v 36 primerih brez interference prav tako ni bilo možno zaznati adaptacije. To pa pomeni, da je predpostavka o nesklopljenosti adaptacije in interference napačna. 
Danes vemo, da je zaradi metodoloških omejitev v primeru močne interference zelo težko zaznati tako vrsto adaptacije in obratno. 
Zato lahko predpostavimo sledeč mehanizem adaptacije, ki temelji na recikliranju ostankov tuje DNA po interferenčni razgradnji s Cas3 (ang: ''»Primed adaptation«'') in predpostavlja z interferenco sklopljeno aktivnost Cas1 in Cas2. Ta dva proteina tvorita stabilen kompleks Cas14:Cas22, kjer je dimer Cas2 objet z dvema dimeroma Cas1. Ob prepoznavi PAM najprej poteče interferenčna cepitev tuje DNA s Cas 3 in pri tem nastanejo manjši fragmenti. Cas1-Cas2 specifično prepozna pravi 33 nt velik oligodeoksinukleotid , ki predstavlja protovmesnik . Kako kompleks prepozna pravi protovmesnik bo opisano spodaj, Cas1-Cas2 naloga pa je še njegova vstavitev v lokus CRISPR .

==Naivna adaptacija==

Obrambni odziv ''E. Coli'' pa sestavlja še tretji mehanizem, ki ne vključuje Cascade. Izkaže se, da Cas1-Cas2 kompleks lahko tudi sam prepozna in cepi tujo DNA. Mehanizem se začne, ko en izmed dimerov Cas1 prepozna PAM in cepi vez med 2. in 3. nukleotidom. Drug izmed dimerov Cas1 pa poskrbi za cepitev po 33. nukleotidu, tako da nastane protovmesnik ravno prave dolžine. Tak protovmesnik se veže v kompleks Cas1-Cas2 in vstavi v lokus CRISPR.

==Uporabnost==
Zaradi vseh opisanih značilnosti znanstveniki CRISPR/Cas sistem 1-E prepoznavajo kot potencialno zelo uporabno metodo genskega inženiringa. Zdi se, da bomo s pomočjo tega mehanizma kmalu lahko dosegli tako zelo specifično delecijo in zamenjavo genov, kot tudi specifično aktivacijo in inaktivacijo genov. Tao. S in sodelavci so, tako kot tudi druge raziskovalne skupine, v svojih raziskavah celo že uspešno uporabili metodo CRISPRi (ang: ''CRISPR interference''), ki temelji na zgoraj opisanem znanju. 

Trenutno je ena izmed glavnih omejitev te metode nespecifično vezanje Cascade na DNA tudi izven tarčnih območij. Da bomo lahko povečali učinkovitosti tehnik modificiranja genoma, moramo najprej opraviti še nekaj raziskav o mehanizmu CRISPR/Cas in bolje razumeti potek procesov, ki so nam trenutno še neznani.

==Viri==

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Mehanizem delovanja kompleksa Cascade in sistem CRISPR/Cas pri E. coli

2019-04-15T22:02:51Z

KlementinaP:

==Uvod==
Tako kot mnogi ostali prokarionti tudi ''E. coli'' pridobiva odpornost proti bakteriofagom z vgraditvijo kratkih fragmentov fagne DNA v lastno DNA. Ti odseki na bakterijski DNA se imenujejo CRISPR, oziroma gruče enakomerno prekinjenih kratkih palindromnih ponovitev (ang: ''»clustered regularly interspaced short palindromic repeats«''), in skupaj z geni za proteine Cas predstavljajo bakterijski imunski sistem CRISPR/Cas tipa 1-E. Pri ''E. coli'' ima ključno vlogo 8 različnih Cas proteinov. Od tega jih 5 sestavlja kompleks Cascade. Cilj obrambnega sistema je prepoznati tujo DNA in jo s pomočjo Cas endonukleaz razrezati na manjše fragmente. V splošnem sistem CRISPR/Cas deluje v 3 korakih: 
 
1. '''ADAPTACIJA''': proteini Cas prepoznajo tujo DNA in jo vključijo v CRISPR. 
2. '''BIOSINTEZA''': sinteza proteinov Cas in transkripcija CRISPR. 
3. '''INTERFERENCA''': uničenje tuje DNA.

==Lokus CRISPR==
Kromosom ''E. coli'' vsebuje 2 lokusa CRISPR, imenovana CRISPR-I in CRISPR-II. Glavne strukturne značilnosti lokusa so vodilno zaporedje, vmesniki in ponovitve. CRISPR-I vsebuje 13 vmesnikov, CRISPR-II pa le 6. K lokusu CRISPR-I spadajo tudi geni cas. 
8 genov cas, ki zapisujejo proteine Cas, se nahaja navzgor od vodilnega zaporedja na lokusu CRISPR-I in si od 5' proti 3' koncu po vrsti sledijo: ''cas3, cse1, cse2, cas7, cas5, cas6e, cas1'' in ''cas2''. ''Cas3'' ima lasten promotor, medtem ko so ostali geni ''cas'' del istega operona, ki ga negativno regulira protein H-NS. Cas3 je endonukleaza in helikaza. Njena glavna naloga je cepitev in razgraditev tuje DNA. Cas1 in Cas2, obe endonukleazi, tvorita kompleks, ki lahko v bakterijsko DNA vgradi del tuje DNA. Ostali proteini Cas tvorijo kompleks Cascade. 
Navzdol od vodilnega zaporedja na obeh lokusih sledi območje CRISPR, sestavljeno iz izmenjavajočih se vmesnikov in ponovitev, ki so delno palindromske. Vmesniki izvirajo iz fagne DNA in predstavljajo imunost proti posameznim bakteriofagom, saj se po prepisovanju v pre-crRNA in procesiranju v crRNA vgradijo v kompleks CRISPR. S pomočjo crRNA kompleks prepozna tujo DNA, ki je komplementarna vmesnikom (protovmesniki) in vsebuje prepoznavno zaporedje PAM (ang: ''»protospacer adjacent motif«''). 
Sistem CRISPR/Cas pri ''E. coli'' se uvršča v tip 1-E, za katerega je značilna prisotnost genov ''cse1'' in ''cse2'' ter odsotnost gena ''cas4''.

==Kompleks Cascade in procesiranje crRNA==
Cascade je ribonukleoproteinski kompleks, ki ga sestavljajo proteini Cas in crRNA. Ti proteini so Cse1, Cse2, Cas7, Cas5e in Cas6e v stehiometričnem razmerju 1:2:6:1:1, skupaj s pre-crRNA pa se iz lokusa CRISPR prepisujejo v procesu biosinteze. Celoten kompleks enajstih podenot ima značilno obliko morskega konjička. 
Vsaka izmed proteinskih podenot ima specifično funkcijo: 
 
- '''Cse1''' prepozna zaporedje PAM na tuji DNA, tvori interakcije s 5' koncem crRNA in veže Cas3. 
- '''Cse2''' ne tvori interakcij s crRNA, pomaga pa pri sestavljanju kompleksa, saj tvori interakcije s Cse1, Cas7 in Cas5e. 
- Vsaka izmed šestih podenot '''Cas7''' vsebuje žleb s pozitivno nabitimi aminokislinskimi ostanki, v katere se lahko skrije vsaka šesta baza crRNA. Posledično te baze ne morejo tvoriti interakcij z bazami na tuji DNA, kar zmanjša specifičnost kompleksa. 
- '''Cas5e''' zasidra 5' konec crRNA v kompleks. 
- '''Cas6e''' procesira pre-crRNA v crRNA in njen 3' konec zasidra v kompleks. 
 
Prepisana pre-crRNA vsebuje več vmesnikov in ponovitev. Zaradi palindromskega zaporedja v ponovitvah se lahko v pre-crRNA vzpostavijo bazni pari in pride do nastanka lasnične zanke, ki jo Cas6e cepi na 3' koncu. S tem nastane zrela 61 nukleotidov dolga crRNA, na kateri je vmesnik (32 nt) obdan z deli palindromskih ponovitev: krajšim delom na 5' koncu in lasnično zanko na 3' koncu. Podenota Cas6e po obdelavi ostane vezana na 3' konec crRNA, ni pa še znano, ali je tekom procesiranja že vključena v Cascade. V kompleksu Cascade tvori interakcije s crRNA devet od enajstih podenot, postavljena je pa tako, da sta 5' konec in lasnična zanka vpeta med proteina Cas5e in Cas6e. 
Brouns in sodelavci so v raziskavi iz leta 2008 dokazali, da pri samem procesiranju pre-crRNA sodeluje le Cas6e podenota. Poskuse so opravili na ''E. coli'' seva K12 in bakterijam izbili gene za posamezne podenote. Zrelo crRNA so zaznali le v bakterijah, ki so imele gen cas6e. Ugotovili so tudi, da Cas6e za svoje delovanje ne potrebuje dvovalentnih kovinskih kationov ali ATP, prav tako pa lahko pre-crRNA cepi neodvisno od ostalih podenot. Ko so Cas6e primerjali z ostalimi proteini iz njegove družine, so ugotovili, da vsebuje dobro ohranjen His20, ki je verjetno vključen v samo katalizo cepitve pre-crRNA, ni pa nujno potreben za izgradnjo kompleksa. Če so ta aminokislinski ostanek zamenjali z Ala, se je kompleks Cascade vseeno sestavil, crRNA pa ni nastala.

==Vezava kompleksa Cascade na DNA==

Cascade se na DNA veže na več načinov. Zaradi para zank bogatih z lizini na dveh izmed podenot Cas7 se lahko z nespecifičnimi elektrostatskimi interakcijami veže na negativno nabito ogrodje DNA, poleg tega pa je za delovanje kompleksa bistvenega pomena vezava na protovmesnik (zaporedja komplementarna vmesnikom na crRNA) in PAM. PAM so trije nukleotidi neposredno ob protovmesniku, s katerimi v malem žlebu interagira podenota Cse1, in so bistvenega pomena za ločevanje bakteriji tuje in lastne DNA. Za interakcije s PAM so ključni trije strukturni vzorci na N-koncu Cse1: lizinski prst, glicinska zanka in glutaminska zagozda. Izmed 64 možnih kombinacij na mestu PAM jih le majhno število tvori optimalne vezave s Cse1. V primeru, da je interakcija med PAM in Cse1 ugodna, lahko podenota s konformacijsko spremembo povzroči destabilizacijo in razklenitev tarčne DNA, tako da se lahko crRNA približa eni od verig. V primeru komplementarnosti vmesnika in tarčne DNA, se vezava kompleksa okrepi in omogoči nadaljevanje imunskega odziva CRISPR/cas, izpodrinjena veriga DNA pa tvori značilno zanko R. 
Chaoyou Xue in sodelavci so leta 2017 v ''E. coli'' proučevali mehanizme, s katerimi se lahko Cascade veže na DNA. Uporabili so metodo FRET, kjer so s fluorescenčnim »donorjem« (Cy3) označili DNA v bližini tarčnega zaporedja, z »akceptorjem« (Cy5) pa podenoto Cas5e kompleksa Cascade. Metoda temelji na pojavu, kjer fluorescenca določene valovne dolžine donorskega označevalca vzburi akceptorski označevalec, če je ta dovolj blizu. Akceptorski označevalec nato fluorescira z drugo valovno dolžino, kar signalizira približanje označevalcev. Označevalca sta bila nameščena tako, da nista ovirala vezave Cascade na DNA, zaradi učinka FRET pa sta omogočala detekcijo vezave kompleksa. 
V raziskavi so delali z molekulo DNA, ki je vsebovala popoln komplement uporabljenemu vmesniku in eno izmed ugodnih zaporedij PAM. Ugotovili so, da je v 20 % primerov prišlo do močne in dolgotrajne vezave, kjer je učinek FRET trajal tudi do 190 sekund, sicer pa so bile vezave krajše in najverjetneje poledica nespecifične interakcije ali nepopolne tvorbe zanke R. Nadaljnji eksperimenti z drugimi crRNA in DNA so pokazali, da se tudi v primeru, ko DNA ne vsebuje protovmesnika, Cascade lahko kratkotrajno veže. Ta pojav so povezali s prisotnostjo ugodnih PAM v DNA, saj je bilo takšnih vezav znatno manj v primeru, ko so delali z DNA brez PAM. Njihov končni model predpostavlja, da Cascade naključno »skenira« DNA s pomočjo nespecifičnih elektrostatskih interakcij, se upočasni in bolje veže ob prisotnosti PAM, do močne in trajne interakcije pa pride ob ujemanju vmesnika s protovmesnikom.

==Interferenca in adaptacija, ki temelji na recikliranju ostankov tuje DNA po razgradnji s Cas3==

Zdaj vemo, kako Cascade prepozna tujo DNA. Vprašajmo se, kaj sledi? Poznamo dva mehanizma. 
Pri interferenci vzpostavitvi R-zanke sledi vpoklic Cas3. To je protein sestavljen iz treh domen, ki imajo helikazno in nukleazno aktivnost. Od ATP odvisna helikazna domena razvije izpodrinjeno verigo, nukleazna domena na C-koncu jo cepi, nato pa od Mg2+ odvisna HD-nukleazna domena do konca uniči ssDNA. Izpodrinjena veriga je tako uničena, ostane le še tarčna veriga. Mehanizem njenega uničenja zaenkrat še ni pojasnjen, obstaja le nekaj domnev, zagotovo pa vemo, da je na ta način prepisovanje tuje DNA onemogočeno in obramba uspešno izvedena. 
Adaptacija, ki temelji na recikliranju ostankov tuje DNA po razgradnji s Cas3 (ang: ''»Primed adaptation«''), pa z vpoklicem Cas1-Cas2 kompleksa poskrbi za vstavitev novega vmesnika v lokus CRISPR. Preden razložimo, kako se to zgodi, pa si poglejmo še nekaj dejstev. Še do pred nedavnim so bili znanstveniki prepričani, da v celici poteka ali adaptacija ali interferenca. Po raziskavah opisanih spodaj pa danes vemo, da ta trditev ne drži povsem. 
Izkazalo se je, da je ključna determinanta, ki določa način nadaljnjega poteka obrambnega mehanizma interakcija med PAM in Cse1. PAM je sestavljen iz treh nukleotidov, kar pomeni, da obstaja 64 različnih možnosti tega zaporedja. 
Že dalj časa vemo, da Cse1 specifično prepozna PAM sestavljen iz AAG. Temu sledi močna interferenca. Vendar pa tudi drugačni PAM sprožijo določen odziv, saj se Cse1 na različna zaporedja veže z različno visoko afiniteto. Odziv, ki temu sledi lahko razdelimo v tri skupine. V raziskavi Olge Musharova in sodelavcev narejeni marca letos, so ugotovili, da 17 PAM zaporedij sproži močno interferenco. 11 PAM je takih, ki sprožijo počasno interferenco, pri 36 pa interference ni možno zaznati. Zanimivo v tej raziskavi je bilo predvsem dejstvo, da v 36 primerih brez interference prav tako ni bilo možno zaznati adaptacije. To pa pomeni, da je predpostavka o nesklopljenosti adaptacije in interference napačna. 
Danes vemo, da je zaradi metodoloških omejitev v primeru močne interference zelo težko zaznati tako vrsto adaptacije in obratno. 
Zato lahko predpostavimo sledeč mehanizem adaptacije, ki temelji na recikliranju ostankov tuje DNA po interferenčni razgradnji s Cas3 (ang: ''»Primed adaptation«'') in predpostavlja z interferenco sklopljeno aktivnost Cas1 in Cas2. Ta dva proteina tvorita stabilen kompleks Cas14:Cas22, kjer je dimer Cas2 objet z dvema dimeroma Cas1. Ob prepoznavi PAM najprej poteče interferenčna cepitev tuje DNA s Cas 3 in pri tem nastanejo manjši fragmenti. Cas1-Cas2 specifično prepozna pravi 33 nt velik oligodeoksinukleotid , ki predstavlja protovmesnik . Kako kompleks prepozna pravi protovmesnik bo opisano spodaj, Cas1-Cas2 naloga pa je še njegova vstavitev v lokus CRISPR .

==Naivna adaptacija==

Obrambni odziv ''E. Coli'' pa sestavlja še tretji mehanizem, ki ne vključuje Cascade. Izkaže se, da Cas1-Cas2 kompleks lahko tudi sam prepozna in cepi tujo DNA. Mehanizem se začne, ko en izmed dimerov Cas1 prepozna PAM in cepi vez med 2. in 3. nukleotidom. Drug izmed dimerov Cas1 pa poskrbi za cepitev po 33. nukleotidu, tako da nastane protovmesnik ravno prave dolžine. Tak protovmesnik se veže v kompleks Cas1-Cas2 in vstavi v lokus CRISPR.

Mehanizem delovanja kompleksa Cascade in sistem CRISPR/Cas pri E. coli

2019-04-15T22:02:09Z

KlementinaP:

==Uvod==
Tako kot mnogi ostali prokarionti tudi ''E. coli'' pridobiva odpornost proti bakteriofagom z vgraditvijo kratkih fragmentov fagne DNA v lastno DNA. Ti odseki na bakterijski DNA se imenujejo CRISPR, oziroma gruče enakomerno prekinjenih kratkih palindromnih ponovitev (ang: ''»clustered regularly interspaced short palindromic repeats«''), in skupaj z geni za proteine Cas predstavljajo bakterijski imunski sistem CRISPR/Cas tipa 1-E. Pri ''E. coli'' ima ključno vlogo 8 različnih Cas proteinov. Od tega jih 5 sestavlja kompleks Cascade. Cilj obrambnega sistema je prepoznati tujo DNA in jo s pomočjo Cas endonukleaz razrezati na manjše fragmente. V splošnem sistem CRISPR/Cas deluje v 3 korakih: 
1. '''ADAPTACIJA''': proteini Cas prepoznajo tujo DNA in jo vključijo v CRISPR. 
2. '''BIOSINTEZA''': sinteza proteinov Cas in transkripcija CRISPR. 
3. '''INTERFERENCA''': uničenje tuje DNA.

==Lokus CRISPR==
Kromosom ''E. coli'' vsebuje 2 lokusa CRISPR, imenovana CRISPR-I in CRISPR-II. Glavne strukturne značilnosti lokusa so vodilno zaporedje, vmesniki in ponovitve. CRISPR-I vsebuje 13 vmesnikov, CRISPR-II pa le 6. K lokusu CRISPR-I spadajo tudi geni cas. 
8 genov cas, ki zapisujejo proteine Cas, se nahaja navzgor od vodilnega zaporedja na lokusu CRISPR-I in si od 5' proti 3' koncu po vrsti sledijo: ''cas3, cse1, cse2, cas7, cas5, cas6e, cas1'' in ''cas2''. ''Cas3'' ima lasten promotor, medtem ko so ostali geni ''cas'' del istega operona, ki ga negativno regulira protein H-NS. Cas3 je endonukleaza in helikaza. Njena glavna naloga je cepitev in razgraditev tuje DNA. Cas1 in Cas2, obe endonukleazi, tvorita kompleks, ki lahko v bakterijsko DNA vgradi del tuje DNA. Ostali proteini Cas tvorijo kompleks Cascade. 
Navzdol od vodilnega zaporedja na obeh lokusih sledi območje CRISPR, sestavljeno iz izmenjavajočih se vmesnikov in ponovitev, ki so delno palindromske. Vmesniki izvirajo iz fagne DNA in predstavljajo imunost proti posameznim bakteriofagom, saj se po prepisovanju v pre-crRNA in procesiranju v crRNA vgradijo v kompleks CRISPR. S pomočjo crRNA kompleks prepozna tujo DNA, ki je komplementarna vmesnikom (protovmesniki) in vsebuje prepoznavno zaporedje PAM (ang: ''»protospacer adjacent motif«''). 
Sistem CRISPR/Cas pri ''E. coli'' se uvršča v tip 1-E, za katerega je značilna prisotnost genov ''cse1'' in ''cse2'' ter odsotnost gena ''cas4''.

==Kompleks Cascade in procesiranje crRNA==
Cascade je ribonukleoproteinski kompleks, ki ga sestavljajo proteini Cas in crRNA. Ti proteini so Cse1, Cse2, Cas7, Cas5e in Cas6e v stehiometričnem razmerju 1:2:6:1:1, skupaj s pre-crRNA pa se iz lokusa CRISPR prepisujejo v procesu biosinteze. Celoten kompleks enajstih podenot ima značilno obliko morskega konjička. 
Vsaka izmed proteinskih podenot ima specifično funkcijo: 
- '''Cse1''' prepozna zaporedje PAM na tuji DNA, tvori interakcije s 5' koncem crRNA in veže Cas3. 
- '''Cse2''' ne tvori interakcij s crRNA, pomaga pa pri sestavljanju kompleksa, saj tvori interakcije s Cse1, Cas7 in Cas5e. 
- Vsaka izmed šestih podenot '''Cas7''' vsebuje žleb s pozitivno nabitimi aminokislinskimi ostanki, v katere se lahko skrije vsaka šesta baza crRNA. Posledično te baze ne morejo tvoriti interakcij z bazami na tuji DNA, kar zmanjša specifičnost kompleksa. 
- '''Cas5e''' zasidra 5' konec crRNA v kompleks. 
- '''Cas6e''' procesira pre-crRNA v crRNA in njen 3' konec zasidra v kompleks. 
Prepisana pre-crRNA vsebuje več vmesnikov in ponovitev. Zaradi palindromskega zaporedja v ponovitvah se lahko v pre-crRNA vzpostavijo bazni pari in pride do nastanka lasnične zanke, ki jo Cas6e cepi na 3' koncu. S tem nastane zrela 61 nukleotidov dolga crRNA, na kateri je vmesnik (32 nt) obdan z deli palindromskih ponovitev: krajšim delom na 5' koncu in lasnično zanko na 3' koncu. Podenota Cas6e po obdelavi ostane vezana na 3' konec crRNA, ni pa še znano, ali je tekom procesiranja že vključena v Cascade. V kompleksu Cascade tvori interakcije s crRNA devet od enajstih podenot, postavljena je pa tako, da sta 5' konec in lasnična zanka vpeta med proteina Cas5e in Cas6e. 
Brouns in sodelavci so v raziskavi iz leta 2008 dokazali, da pri samem procesiranju pre-crRNA sodeluje le Cas6e podenota. Poskuse so opravili na ''E. coli'' seva K12 in bakterijam izbili gene za posamezne podenote. Zrelo crRNA so zaznali le v bakterijah, ki so imele gen cas6e. Ugotovili so tudi, da Cas6e za svoje delovanje ne potrebuje dvovalentnih kovinskih kationov ali ATP, prav tako pa lahko pre-crRNA cepi neodvisno od ostalih podenot. Ko so Cas6e primerjali z ostalimi proteini iz njegove družine, so ugotovili, da vsebuje dobro ohranjen His20, ki je verjetno vključen v samo katalizo cepitve pre-crRNA, ni pa nujno potreben za izgradnjo kompleksa. Če so ta aminokislinski ostanek zamenjali z Ala, se je kompleks Cascade vseeno sestavil, crRNA pa ni nastala.

==Vezava kompleksa Cascade na DNA==

Cascade se na DNA veže na več načinov. Zaradi para zank bogatih z lizini na dveh izmed podenot Cas7 se lahko z nespecifičnimi elektrostatskimi interakcijami veže na negativno nabito ogrodje DNA, poleg tega pa je za delovanje kompleksa bistvenega pomena vezava na protovmesnik (zaporedja komplementarna vmesnikom na crRNA) in PAM. PAM so trije nukleotidi neposredno ob protovmesniku, s katerimi v malem žlebu interagira podenota Cse1, in so bistvenega pomena za ločevanje bakteriji tuje in lastne DNA. Za interakcije s PAM so ključni trije strukturni vzorci na N-koncu Cse1: lizinski prst, glicinska zanka in glutaminska zagozda. Izmed 64 možnih kombinacij na mestu PAM jih le majhno število tvori optimalne vezave s Cse1. V primeru, da je interakcija med PAM in Cse1 ugodna, lahko podenota s konformacijsko spremembo povzroči destabilizacijo in razklenitev tarčne DNA, tako da se lahko crRNA približa eni od verig. V primeru komplementarnosti vmesnika in tarčne DNA, se vezava kompleksa okrepi in omogoči nadaljevanje imunskega odziva CRISPR/cas, izpodrinjena veriga DNA pa tvori značilno zanko R. 
Chaoyou Xue in sodelavci so leta 2017 v ''E. coli'' proučevali mehanizme, s katerimi se lahko Cascade veže na DNA. Uporabili so metodo FRET, kjer so s fluorescenčnim »donorjem« (Cy3) označili DNA v bližini tarčnega zaporedja, z »akceptorjem« (Cy5) pa podenoto Cas5e kompleksa Cascade. Metoda temelji na pojavu, kjer fluorescenca določene valovne dolžine donorskega označevalca vzburi akceptorski označevalec, če je ta dovolj blizu. Akceptorski označevalec nato fluorescira z drugo valovno dolžino, kar signalizira približanje označevalcev. Označevalca sta bila nameščena tako, da nista ovirala vezave Cascade na DNA, zaradi učinka FRET pa sta omogočala detekcijo vezave kompleksa. 
V raziskavi so delali z molekulo DNA, ki je vsebovala popoln komplement uporabljenemu vmesniku in eno izmed ugodnih zaporedij PAM. Ugotovili so, da je v 20 % primerov prišlo do močne in dolgotrajne vezave, kjer je učinek FRET trajal tudi do 190 sekund, sicer pa so bile vezave krajše in najverjetneje poledica nespecifične interakcije ali nepopolne tvorbe zanke R. Nadaljnji eksperimenti z drugimi crRNA in DNA so pokazali, da se tudi v primeru, ko DNA ne vsebuje protovmesnika, Cascade lahko kratkotrajno veže. Ta pojav so povezali s prisotnostjo ugodnih PAM v DNA, saj je bilo takšnih vezav znatno manj v primeru, ko so delali z DNA brez PAM. Njihov končni model predpostavlja, da Cascade naključno »skenira« DNA s pomočjo nespecifičnih elektrostatskih interakcij, se upočasni in bolje veže ob prisotnosti PAM, do močne in trajne interakcije pa pride ob ujemanju vmesnika s protovmesnikom.

==Interferenca in adaptacija, ki temelji na recikliranju ostankov tuje DNA po razgradnji s Cas3==

Zdaj vemo, kako Cascade prepozna tujo DNA. Vprašajmo se, kaj sledi? Poznamo dva mehanizma. 
Pri interferenci vzpostavitvi R-zanke sledi vpoklic Cas3. To je protein sestavljen iz treh domen, ki imajo helikazno in nukleazno aktivnost. Od ATP odvisna helikazna domena razvije izpodrinjeno verigo, nukleazna domena na C-koncu jo cepi, nato pa od Mg2+ odvisna HD-nukleazna domena do konca uniči ssDNA. Izpodrinjena veriga je tako uničena, ostane le še tarčna veriga. Mehanizem njenega uničenja zaenkrat še ni pojasnjen, obstaja le nekaj domnev, zagotovo pa vemo, da je na ta način prepisovanje tuje DNA onemogočeno in obramba uspešno izvedena. 
Adaptacija, ki temelji na recikliranju ostankov tuje DNA po razgradnji s Cas3 (ang: ''»Primed adaptation«''), pa z vpoklicem Cas1-Cas2 kompleksa poskrbi za vstavitev novega vmesnika v lokus CRISPR. Preden razložimo, kako se to zgodi, pa si poglejmo še nekaj dejstev. Še do pred nedavnim so bili znanstveniki prepričani, da v celici poteka ali adaptacija ali interferenca. Po raziskavah opisanih spodaj pa danes vemo, da ta trditev ne drži povsem. 
Izkazalo se je, da je ključna determinanta, ki določa način nadaljnjega poteka obrambnega mehanizma interakcija med PAM in Cse1. PAM je sestavljen iz treh nukleotidov, kar pomeni, da obstaja 64 različnih možnosti tega zaporedja. 
Že dalj časa vemo, da Cse1 specifično prepozna PAM sestavljen iz AAG. Temu sledi močna interferenca. Vendar pa tudi drugačni PAM sprožijo določen odziv, saj se Cse1 na različna zaporedja veže z različno visoko afiniteto. Odziv, ki temu sledi lahko razdelimo v tri skupine. V raziskavi Olge Musharova in sodelavcev narejeni marca letos, so ugotovili, da 17 PAM zaporedij sproži močno interferenco. 11 PAM je takih, ki sprožijo počasno interferenco, pri 36 pa interference ni možno zaznati. Zanimivo v tej raziskavi je bilo predvsem dejstvo, da v 36 primerih brez interference prav tako ni bilo možno zaznati adaptacije. To pa pomeni, da je predpostavka o nesklopljenosti adaptacije in interference napačna. 
Danes vemo, da je zaradi metodoloških omejitev v primeru močne interference zelo težko zaznati tako vrsto adaptacije in obratno. 
Zato lahko predpostavimo sledeč mehanizem adaptacije, ki temelji na recikliranju ostankov tuje DNA po interferenčni razgradnji s Cas3 (ang: ''»Primed adaptation«'') in predpostavlja z interferenco sklopljeno aktivnost Cas1 in Cas2. Ta dva proteina tvorita stabilen kompleks Cas14:Cas22, kjer je dimer Cas2 objet z dvema dimeroma Cas1. Ob prepoznavi PAM najprej poteče interferenčna cepitev tuje DNA s Cas 3 in pri tem nastanejo manjši fragmenti. Cas1-Cas2 specifično prepozna pravi 33 nt velik oligodeoksinukleotid , ki predstavlja protovmesnik . Kako kompleks prepozna pravi protovmesnik bo opisano spodaj, Cas1-Cas2 naloga pa je še njegova vstavitev v lokus CRISPR .

==Naivna adaptacija==

Obrambni odziv ''E. Coli'' pa sestavlja še tretji mehanizem, ki ne vključuje Cascade. Izkaže se, da Cas1-Cas2 kompleks lahko tudi sam prepozna in cepi tujo DNA. Mehanizem se začne, ko en izmed dimerov Cas1 prepozna PAM in cepi vez med 2. in 3. nukleotidom. Drug izmed dimerov Cas1 pa poskrbi za cepitev po 33. nukleotidu, tako da nastane protovmesnik ravno prave dolžine. Tak protovmesnik se veže v kompleks Cas1-Cas2 in vstavi v lokus CRISPR.

Mehanizem delovanja kompleksa Cascade in sistem CRISPR/Cas pri E. coli

2019-04-15T21:58:54Z

KlementinaP:

==Uvod==
Tako kot mnogi ostali prokarionti tudi ''E. coli'' pridobiva odpornost proti bakteriofagom z vgraditvijo kratkih fragmentov fagne DNA v lastno DNA. Ti odseki na bakterijski DNA se imenujejo CRISPR, oziroma gruče enakomerno prekinjenih kratkih palindromnih ponovitev (ang: ''»clustered regularly interspaced short palindromic repeats«''), in skupaj z geni za proteine Cas predstavljajo bakterijski imunski sistem CRISPR/Cas tipa 1-E. Pri ''E. coli'' ima ključno vlogo 8 različnih Cas proteinov. Od tega jih 5 sestavlja kompleks Cascade. Cilj obrambnega sistema je prepoznati tujo DNA in jo s pomočjo Cas endonukleaz razrezati na manjše fragmente. V splošnem sistem CRISPR/Cas deluje v 3 korakih:
1. ADAPTACIJA: proteini Cas prepoznajo tujo DNA in jo vključijo v CRISPR.
2. BIOSINTEZA: sinteza proteinov Cas in transkripcija CRISPR.
3. INTERFERENCA: uničenje tuje DNA.

==Lokus CRISPR==
Kromosom ''E. coli'' vsebuje 2 lokusa CRISPR, imenovana CRISPR-I in CRISPR-II. Glavne strukturne značilnosti lokusa so vodilno zaporedje, vmesniki in ponovitve. CRISPR-I vsebuje 13 vmesnikov, CRISPR-II pa le 6. K lokusu CRISPR-I spadajo tudi geni cas.
8 genov cas, ki zapisujejo proteine Cas, se nahaja navzgor od vodilnega zaporedja na lokusu CRISPR-I in si od 5' proti 3' koncu po vrsti sledijo: ''cas3, cse1, cse2, cas7, cas5, cas6e, cas1'' in ''cas2''. ''Cas3'' ima lasten promotor, medtem ko so ostali geni ''cas'' del istega operona, ki ga negativno regulira protein H-NS. Cas3 je endonukleaza in helikaza. Njena glavna naloga je cepitev in razgraditev tuje DNA. Cas1 in Cas2, obe endonukleazi, tvorita kompleks, ki lahko v bakterijsko DNA vgradi del tuje DNA. Ostali proteini Cas tvorijo kompleks Cascade.
Navzdol od vodilnega zaporedja na obeh lokusih sledi območje CRISPR, sestavljeno iz izmenjavajočih se vmesnikov in ponovitev, ki so delno palindromske. Vmesniki izvirajo iz fagne DNA in predstavljajo imunost proti posameznim bakteriofagom, saj se po prepisovanju v pre-crRNA in procesiranju v crRNA vgradijo v kompleks CRISPR. S pomočjo crRNA kompleks prepozna tujo DNA, ki je komplementarna vmesnikom (protovmesniki) in vsebuje prepoznavno zaporedje PAM (ang: ''»protospacer adjacent motif«'').
Sistem CRISPR/Cas pri ''E. coli'' se uvršča v tip 1-E, za katerega je značilna prisotnost genov ''cse1'' in ''cse2'' ter odsotnost gena ''cas4''.

==Kompleks Cascade in procesiranje crRNA==
Cascade je ribonukleoproteinski kompleks, ki ga sestavljajo proteini Cas in crRNA. Ti proteini so Cse1, Cse2, Cas7, Cas5e in Cas6e v stehiometričnem razmerju 1:2:6:1:1, skupaj s pre-crRNA pa se iz lokusa CRISPR prepisujejo v procesu biosinteze. Celoten kompleks enajstih podenot ima značilno obliko morskega konjička.
Vsaka izmed proteinskih podenot ima specifično funkcijo:
- Cse1 prepozna zaporedje PAM na tuji DNA, tvori interakcije s 5' koncem crRNA in veže Cas3.
- Cse2 ne tvori interakcij s crRNA, pomaga pa pri sestavljanju kompleksa, saj tvori interakcije s Cse1, Cas7 in Cas5e.
- Vsaka izmed šestih podenot Cas7 vsebuje žleb s pozitivno nabitimi aminokislinskimi ostanki, v katere se lahko skrije vsaka šesta baza crRNA. Posledično te baze ne morejo tvoriti interakcij z bazami na tuji DNA, kar zmanjša specifičnost kompleksa.
- Cas5e zasidra 5' konec crRNA v kompleks.
- Cas6e procesira pre-crRNA v crRNA in njen 3' konec zasidra v kompleks.
Prepisana pre-crRNA vsebuje več vmesnikov in ponovitev. Zaradi palindromskega zaporedja v ponovitvah se lahko v pre-crRNA vzpostavijo bazni pari in pride do nastanka lasnične zanke, ki jo Cas6e cepi na 3' koncu. S tem nastane zrela 61 nukleotidov dolga crRNA, na kateri je vmesnik (32 nt) obdan z deli palindromskih ponovitev: krajšim delom na 5' koncu in lasnično zanko na 3' koncu. Podenota Cas6e po obdelavi ostane vezana na 3' konec crRNA, ni pa še znano, ali je tekom procesiranja že vključena v Cascade. V kompleksu Cascade tvori interakcije s crRNA devet od enajstih podenot, postavljena je pa tako, da sta 5' konec in lasnična zanka vpeta med proteina Cas5e in Cas6e.
Brouns in sodelavci so v raziskavi iz leta 2008 dokazali, da pri samem procesiranju pre-crRNA sodeluje le Cas6e podenota. Poskuse so opravili na ''E. coli'' seva K12 in bakterijam izbili gene za posamezne podenote. Zrelo crRNA so zaznali le v bakterijah, ki so imele gen cas6e. Ugotovili so tudi, da Cas6e za svoje delovanje ne potrebuje dvovalentnih kovinskih kationov ali ATP, prav tako pa lahko pre-crRNA cepi neodvisno od ostalih podenot. Ko so Cas6e primerjali z ostalimi proteini iz njegove družine, so ugotovili, da vsebuje dobro ohranjen His20, ki je verjetno vključen v samo katalizo cepitve pre-crRNA, ni pa nujno potreben za izgradnjo kompleksa. Če so ta aminokislinski ostanek zamenjali z Ala, se je kompleks Cascade vseeno sestavil, crRNA pa ni nastala.

==Vezava kompleksa Cascade na DNA==

Cascade se na DNA veže na več načinov. Zaradi para zank bogatih z lizini na dveh izmed podenot Cas7 se lahko z nespecifičnimi elektrostatskimi interakcijami veže na negativno nabito ogrodje DNA, poleg tega pa je za delovanje kompleksa bistvenega pomena vezava na protovmesnik (zaporedja komplementarna vmesnikom na crRNA) in PAM. PAM so trije nukleotidi neposredno ob protovmesniku, s katerimi v malem žlebu interagira podenota Cse1, in so bistvenega pomena za ločevanje bakteriji tuje in lastne DNA. Za interakcije s PAM so ključni trije strukturni vzorci na N-koncu Cse1: lizinski prst, glicinska zanka in glutaminska zagozda. Izmed 64 možnih kombinacij na mestu PAM jih le majhno število tvori optimalne vezave s Cse1. V primeru, da je interakcija med PAM in Cse1 ugodna, lahko podenota s konformacijsko spremembo povzroči destabilizacijo in razklenitev tarčne DNA, tako da se lahko crRNA približa eni od verig. V primeru komplementarnosti vmesnika in tarčne DNA, se vezava kompleksa okrepi in omogoči nadaljevanje imunskega odziva CRISPR/cas, izpodrinjena veriga DNA pa tvori značilno zanko R.
Chaoyou Xue in sodelavci so leta 2017 v ''E. coli'' proučevali mehanizme, s katerimi se lahko Cascade veže na DNA. Uporabili so metodo FRET, kjer so s fluorescenčnim »donorjem« (Cy3) označili DNA v bližini tarčnega zaporedja, z »akceptorjem« (Cy5) pa podenoto Cas5e kompleksa Cascade. Metoda temelji na pojavu, kjer fluorescenca določene valovne dolžine donorskega označevalca vzburi akceptorski označevalec, če je ta dovolj blizu. Akceptorski označevalec nato fluorescira z drugo valovno dolžino, kar signalizira približanje označevalcev. Označevalca sta bila nameščena tako, da nista ovirala vezave Cascade na DNA, zaradi učinka FRET pa sta omogočala detekcijo vezave kompleksa.
V raziskavi so delali z molekulo DNA, ki je vsebovala popoln komplement uporabljenemu vmesniku in eno izmed ugodnih zaporedij PAM. Ugotovili so, da je v 20 % primerov prišlo do močne in dolgotrajne vezave, kjer je učinek FRET trajal tudi do 190 sekund, sicer pa so bile vezave krajše in najverjetneje poledica nespecifične interakcije ali nepopolne tvorbe zanke R. Nadaljnji eksperimenti z drugimi crRNA in DNA so pokazali, da se tudi v primeru, ko DNA ne vsebuje protovmesnika, Cascade lahko kratkotrajno veže. Ta pojav so povezali s prisotnostjo ugodnih PAM v DNA, saj je bilo takšnih vezav znatno manj v primeru, ko so delali z DNA brez PAM. Njihov končni model predpostavlja, da Cascade naključno »skenira« DNA s pomočjo nespecifičnih elektrostatskih interakcij, se upočasni in bolje veže ob prisotnosti PAM, do močne in trajne interakcije pa pride ob ujemanju vmesnika s protovmesnikom.

==Interferenca in adaptacija, ki temelji na recikliranju ostankov tuje DNA po razgradnji s Cas3==

Zdaj vemo, kako Cascade prepozna tujo DNA. Vprašajmo se, kaj sledi? Poznamo dva mehanizma.
Pri interferenci vzpostavitvi R-zanke sledi vpoklic Cas3. To je protein sestavljen iz treh domen, ki imajo helikazno in nukleazno aktivnost. Od ATP odvisna helikazna domena razvije izpodrinjeno verigo, nukleazna domena na C-koncu jo cepi, nato pa od Mg2+ odvisna HD-nukleazna domena do konca uniči ssDNA. Izpodrinjena veriga je tako uničena, ostane le še tarčna veriga. Mehanizem njenega uničenja zaenkrat še ni pojasnjen, obstaja le nekaj domnev, zagotovo pa vemo, da je na ta način prepisovanje tuje DNA onemogočeno in obramba uspešno izvedena.
Adaptacija, ki temelji na recikliranju ostankov tuje DNA po razgradnji s Cas3 (ang: ''»Primed adaptation«''), pa z vpoklicem Cas1-Cas2 kompleksa poskrbi za vstavitev novega vmesnika v lokus CRISPR. Preden razložimo, kako se to zgodi, pa si poglejmo še nekaj dejstev. Še do pred nedavnim so bili znanstveniki prepričani, da v celici poteka ali adaptacija ali interferenca. Po raziskavah opisanih spodaj pa danes vemo, da ta trditev ne drži povsem.
Izkazalo se je, da je ključna determinanta, ki določa način nadaljnjega poteka obrambnega mehanizma interakcija med PAM in Cse1. PAM je sestavljen iz treh nukleotidov, kar pomeni, da obstaja 64 različnih možnosti tega zaporedja.
Že dalj časa vemo, da Cse1 specifično prepozna PAM sestavljen iz AAG. Temu sledi močna interferenca. Vendar pa tudi drugačni PAM sprožijo določen odziv, saj se Cse1 na različna zaporedja veže z različno visoko afiniteto. Odziv, ki temu sledi lahko razdelimo v tri skupine. V raziskavi Olge Musharova in sodelavcev narejeni marca letos, so ugotovili, da 17 PAM zaporedij sproži močno interferenco. 11 PAM je takih, ki sprožijo počasno interferenco, pri 36 pa interference ni možno zaznati. Zanimivo v tej raziskavi je bilo predvsem dejstvo, da v 36 primerih brez interference prav tako ni bilo možno zaznati adaptacije. To pa pomeni, da je predpostavka o nesklopljenosti adaptacije in interference napačna.
Danes vemo, da je zaradi metodoloških omejitev v primeru močne interference zelo težko zaznati tako vrsto adaptacije in obratno.
Zato lahko predpostavimo sledeč mehanizem adaptacije, ki temelji na recikliranju ostankov tuje DNA po interferenčni razgradnji s Cas3 (ang: ''»Primed adaptation«'') in predpostavlja z interferenco sklopljeno aktivnost Cas1 in Cas2. Ta dva proteina tvorita stabilen kompleks Cas14:Cas22, kjer je dimer Cas2 objet z dvema dimeroma Cas1. Ob prepoznavi PAM najprej poteče interferenčna cepitev tuje DNA s Cas 3 in pri tem nastanejo manjši fragmenti. Cas1-Cas2 specifično prepozna pravi 33 nt velik oligodeoksinukleotid , ki predstavlja protovmesnik . Kako kompleks prepozna pravi protovmesnik bo opisano spodaj, Cas1-Cas2 naloga pa je še njegova vstavitev v lokus CRISPR .

==Naivna adaptacija==

Obrambni odziv ''E. Coli'' pa sestavlja še tretji mehanizem, ki ne vključuje Cascade. Izkaže se, da Cas1-Cas2 kompleks lahko tudi sam prepozna in cepi tujo DNA. Mehanizem se začne, ko en izmed dimerov Cas1 prepozna PAM in cepi vez med 2. in 3. nukleotidom. Drug izmed dimerov Cas1 pa poskrbi za cepitev po 33. nukleotidu, tako da nastane protovmesnik ravno prave dolžine. Tak protovmesnik se veže v kompleks Cas1-Cas2 in vstavi v lokus CRISPR.

Mehanizem delovanja kompleksa Cascade in sistem CRISPR/Cas pri E. coli

2019-04-15T21:56:22Z

KlementinaP:

==Uvod==
Tako kot mnogi ostali prokarionti tudi ''E. coli'' pridobiva odpornost proti bakteriofagom z vgraditvijo kratkih fragmentov fagne DNA v lastno DNA. Ti odseki na bakterijski DNA se imenujejo CRISPR, oziroma gruče enakomerno prekinjenih kratkih palindromnih ponovitev (ang: ''»clustered regularly interspaced short palindromic repeats«''), in skupaj z geni za proteine Cas predstavljajo bakterijski imunski sistem CRISPR/Cas tipa 1-E. Pri ''E. coli'' ima ključno vlogo 8 različnih Cas proteinov. Od tega jih 5 sestavlja kompleks Cascade. Cilj obrambnega sistema je prepoznati tujo DNA in jo s pomočjo Cas endonukleaz razrezati na manjše fragmente. V splošnem sistem CRISPR/Cas deluje v 3 korakih:
1. ADAPTACIJA: proteini Cas prepoznajo tujo DNA in jo vključijo v CRISPR.
2. BIOSINTEZA: sinteza proteinov Cas in transkripcija CRISPR.
3. INTERFERENCA: uničenje tuje DNA.

==Lokus CRISPR==
Kromosom ''E. coli'' vsebuje 2 lokusa CRISPR, imenovana CRISPR-I in CRISPR-II. Glavne strukturne značilnosti lokusa so vodilno zaporedje, vmesniki in ponovitve. CRISPR-I vsebuje 13 vmesnikov, CRISPR-II pa le 6. K lokusu CRISPR-I spadajo tudi geni cas.
8 genov cas, ki zapisujejo proteine Cas, se nahaja navzgor od vodilnega zaporedja na lokusu CRISPR-I in si od 5' proti 3' koncu po vrsti sledijo: ''cas3, cse1, cse2, cas7, cas5, cas6e, cas1'' in ''cas2''. ''Cas3'' ima lasten promotor, medtem ko so ostali geni ''cas'' del istega operona, ki ga negativno regulira protein H-NS. Cas3 je endonukleaza in helikaza. Njena glavna naloga je cepitev in razgraditev tuje DNA. Cas1 in Cas2, obe endonukleazi, tvorita kompleks, ki lahko v bakterijsko DNA vgradi del tuje DNA. Ostali proteini Cas tvorijo kompleks Cascade.
Navzdol od vodilnega zaporedja na obeh lokusih sledi območje CRISPR, sestavljeno iz izmenjavajočih se vmesnikov in ponovitev, ki so delno palindromske. Vmesniki izvirajo iz fagne DNA in predstavljajo imunost proti posameznim bakteriofagom, saj se po prepisovanju v pre-crRNA in procesiranju v crRNA vgradijo v kompleks CRISPR. S pomočjo crRNA kompleks prepozna tujo DNA, ki je komplementarna vmesnikom (protovmesniki) in vsebuje prepoznavno zaporedje PAM (ang: ''»protospacer adjacent motif«'').
Sistem CRISPR/Cas pri ''E. coli'' se uvršča v tip 1-E, za katerega je značilna prisotnost genov ''cse1'' in ''cse2'' ter odsotnost gena ''cas4''.

==Kompleks Cascade in procesiranje crRNA==
Cascade je ribonukleoproteinski kompleks, ki ga sestavljajo proteini Cas in crRNA. Ti proteini so Cse1, Cse2, Cas7, Cas5e in Cas6e v stehiometričnem razmerju 1:2:6:1:1, skupaj s pre-crRNA pa se iz lokusa CRISPR prepisujejo v procesu biosinteze. Celoten kompleks enajstih podenot ima značilno obliko morskega konjička.
Vsaka izmed proteinskih podenot ima specifično funkcijo:
• Cse1 prepozna zaporedje PAM na tuji DNA, tvori interakcije s 5' koncem crRNA in veže Cas3.
• Cse2 ne tvori interakcij s crRNA, pomaga pa pri sestavljanju kompleksa, saj tvori interakcije s Cse1, Cas7 in Cas5e.
• Vsaka izmed šestih podenot Cas7 vsebuje žleb s pozitivno nabitimi aminokislinskimi ostanki, v katere se lahko skrije vsaka šesta baza crRNA. Posledično te baze ne morejo tvoriti interakcij z bazami na tuji DNA, kar zmanjša specifičnost kompleksa.
• Cas5e zasidra 5' konec crRNA v kompleks.
• Cas6e procesira pre-crRNA v crRNA in njen 3' konec zasidra v kompleks.
Prepisana pre-crRNA vsebuje več vmesnikov in ponovitev. Zaradi palindromskega zaporedja v ponovitvah se lahko v pre-crRNA vzpostavijo bazni pari in pride do nastanka lasnične zanke, ki jo Cas6e cepi na 3' koncu. S tem nastane zrela 61 nukleotidov dolga crRNA, na kateri je vmesnik (32 nt) obdan z deli palindromskih ponovitev: krajšim delom na 5' koncu in lasnično zanko na 3' koncu. Podenota Cas6e po obdelavi ostane vezana na 3' konec crRNA, ni pa še znano, ali je tekom procesiranja že vključena v Cascade. V kompleksu Cascade tvori interakcije s crRNA devet od enajstih podenot, postavljena je pa tako, da sta 5' konec in lasnična zanka vpeta med proteina Cas5e in Cas6e.
Brouns in sodelavci so v raziskavi iz leta 2008 dokazali, da pri samem procesiranju pre-crRNA sodeluje le Cas6e podenota. Poskuse so opravili na ''E. coli'' seva K12 in bakterijam izbili gene za posamezne podenote. Zrelo crRNA so zaznali le v bakterijah, ki so imele gen cas6e. Ugotovili so tudi, da Cas6e za svoje delovanje ne potrebuje dvovalentnih kovinskih kationov ali ATP, prav tako pa lahko pre-crRNA cepi neodvisno od ostalih podenot. Ko so Cas6e primerjali z ostalimi proteini iz njegove družine, so ugotovili, da vsebuje dobro ohranjen His20, ki je verjetno vključen v samo katalizo cepitve pre-crRNA, ni pa nujno potreben za izgradnjo kompleksa. Če so ta aminokislinski ostanek zamenjali z Ala, se je kompleks Cascade vseeno sestavil, crRNA pa ni nastala.

==Vezava kompleksa Cascade na DNA==

Cascade se na DNA veže na več načinov. Zaradi para zank bogatih z lizini na dveh izmed podenot Cas7 se lahko z nespecifičnimi elektrostatskimi interakcijami veže na negativno nabito ogrodje DNA, poleg tega pa je za delovanje kompleksa bistvenega pomena vezava na protovmesnik (zaporedja komplementarna vmesnikom na crRNA) in PAM. PAM so trije nukleotidi neposredno ob protovmesniku, s katerimi v malem žlebu interagira podenota Cse1, in so bistvenega pomena za ločevanje bakteriji tuje in lastne DNA. Za interakcije s PAM so ključni trije strukturni vzorci na N-koncu Cse1: lizinski prst, glicinska zanka in glutaminska zagozda. Izmed 64 možnih kombinacij na mestu PAM jih le majhno število tvori optimalne vezave s Cse1. V primeru, da je interakcija med PAM in Cse1 ugodna, lahko podenota s konformacijsko spremembo povzroči destabilizacijo in razklenitev tarčne DNA, tako da se lahko crRNA približa eni od verig. V primeru komplementarnosti vmesnika in tarčne DNA, se vezava kompleksa okrepi in omogoči nadaljevanje imunskega odziva CRISPR/cas, izpodrinjena veriga DNA pa tvori značilno zanko R.
Chaoyou Xue in sodelavci so leta 2017 v ''E. coli'' proučevali mehanizme, s katerimi se lahko Cascade veže na DNA. Uporabili so metodo FRET, kjer so s fluorescenčnim »donorjem« (Cy3) označili DNA v bližini tarčnega zaporedja, z »akceptorjem« (Cy5) pa podenoto Cas5e kompleksa Cascade. Metoda temelji na pojavu, kjer fluorescenca določene valovne dolžine donorskega označevalca vzburi akceptorski označevalec, če je ta dovolj blizu. Akceptorski označevalec nato fluorescira z drugo valovno dolžino, kar signalizira približanje označevalcev. Označevalca sta bila nameščena tako, da nista ovirala vezave Cascade na DNA, zaradi učinka FRET pa sta omogočala detekcijo vezave kompleksa.
V raziskavi so delali z molekulo DNA, ki je vsebovala popoln komplement uporabljenemu vmesniku in eno izmed ugodnih zaporedij PAM. Ugotovili so, da je v 20 % primerov prišlo do močne in dolgotrajne vezave, kjer je učinek FRET trajal tudi do 190 sekund, sicer pa so bile vezave krajše in najverjetneje poledica nespecifične interakcije ali nepopolne tvorbe zanke R. Nadaljnji eksperimenti z drugimi crRNA in DNA so pokazali, da se tudi v primeru, ko DNA ne vsebuje protovmesnika, Cascade lahko kratkotrajno veže. Ta pojav so povezali s prisotnostjo ugodnih PAM v DNA, saj je bilo takšnih vezav znatno manj v primeru, ko so delali z DNA brez PAM. Njihov končni model predpostavlja, da Cascade naključno »skenira« DNA s pomočjo nespecifičnih elektrostatskih interakcij, se upočasni in bolje veže ob prisotnosti PAM, do močne in trajne interakcije pa pride ob ujemanju vmesnika s protovmesnikom.

==Interferenca in adaptacija, ki temelji na recikliranju ostankov tuje DNA po razgradnji s Cas3==

Zdaj vemo, kako Cascade prepozna tujo DNA. Vprašajmo se, kaj sledi? Poznamo dva mehanizma.
Pri interferenci vzpostavitvi R-zanke sledi vpoklic Cas3. To je protein sestavljen iz treh domen, ki imajo helikazno in nukleazno aktivnost. Od ATP odvisna helikazna domena razvije izpodrinjeno verigo, nukleazna domena na C-koncu jo cepi, nato pa od Mg2+ odvisna HD-nukleazna domena do konca uniči ssDNA. Izpodrinjena veriga je tako uničena, ostane le še tarčna veriga. Mehanizem njenega uničenja zaenkrat še ni pojasnjen, obstaja le nekaj domnev, zagotovo pa vemo, da je na ta način prepisovanje tuje DNA onemogočeno in obramba uspešno izvedena.
Adaptacija, ki temelji na recikliranju ostankov tuje DNA po razgradnji s Cas3 (ang: ''»Primed adaptation«''), pa z vpoklicem Cas1-Cas2 kompleksa poskrbi za vstavitev novega vmesnika v lokus CRISPR. Preden razložimo, kako se to zgodi, pa si poglejmo še nekaj dejstev. Še do pred nedavnim so bili znanstveniki prepričani, da v celici poteka ali adaptacija ali interferenca. Po raziskavah opisanih spodaj pa danes vemo, da ta trditev ne drži povsem.
Izkazalo se je, da je ključna determinanta, ki določa način nadaljnjega poteka obrambnega mehanizma interakcija med PAM in Cse1. PAM je sestavljen iz treh nukleotidov, kar pomeni, da obstaja 64 različnih možnosti tega zaporedja.
Že dalj časa vemo, da Cse1 specifično prepozna PAM sestavljen iz AAG. Temu sledi močna interferenca. Vendar pa tudi drugačni PAM sprožijo določen odziv, saj se Cse1 na različna zaporedja veže z različno visoko afiniteto. Odziv, ki temu sledi lahko razdelimo v tri skupine. V raziskavi Olge Musharova in sodelavcev narejeni marca letos, so ugotovili, da 17 PAM zaporedij sproži močno interferenco. 11 PAM je takih, ki sprožijo počasno interferenco, pri 36 pa interference ni možno zaznati. Zanimivo v tej raziskavi je bilo predvsem dejstvo, da v 36 primerih brez interference prav tako ni bilo možno zaznati adaptacije. To pa pomeni, da je predpostavka o nesklopljenosti adaptacije in interference napačna.
Danes vemo, da je zaradi metodoloških omejitev v primeru močne interference zelo težko zaznati tako vrsto adaptacije in obratno.
Zato lahko predpostavimo sledeč mehanizem adaptacije, ki temelji na recikliranju ostankov tuje DNA po interferenčni razgradnji s Cas3 (ang: ''»Primed adaptation«'') in predpostavlja z interferenco sklopljeno aktivnost Cas1 in Cas2. Ta dva proteina tvorita stabilen kompleks Cas14:Cas22, kjer je dimer Cas2 objet z dvema dimeroma Cas1. Ob prepoznavi PAM najprej poteče interferenčna cepitev tuje DNA s Cas 3 in pri tem nastanejo manjši fragmenti. Cas1-Cas2 specifično prepozna pravi 33 nt velik oligodeoksinukleotid , ki predstavlja protovmesnik . Kako kompleks prepozna pravi protovmesnik bo opisano spodaj, Cas1-Cas2 naloga pa je še njegova vstavitev v lokus CRISPR .

==Naivna adaptacija==

Obrambni odziv ''E. Coli'' pa sestavlja še tretji mehanizem, ki ne vključuje Cascade. Izkaže se, da Cas1-Cas2 kompleks lahko tudi sam prepozna in cepi tujo DNA. Mehanizem se začne, ko en izmed dimerov Cas1 prepozna PAM in cepi vez med 2. in 3. nukleotidom. Drug izmed dimerov Cas1 pa poskrbi za cepitev po 33. nukleotidu, tako da nastane protovmesnik ravno prave dolžine. Tak protovmesnik se veže v kompleks Cas1-Cas2 in vstavi v lokus CRISPR.

Mehanizem delovanja kompleksa Cascade in sistem CRISPR/Cas pri E. coli

2019-04-15T21:45:08Z

KlementinaP: New page: ==Uvod== Tako kot mnogi ostali prokarionti tudi ''E. coli'' pridobiva odpornost proti bakteriofagom z vgraditvijo kratkih fragmentov fagne DNA v lastno DNA. Ti odseki na bakterijski DNA se...

==Uvod==
Tako kot mnogi ostali prokarionti tudi ''E. coli'' pridobiva odpornost proti bakteriofagom z vgraditvijo kratkih fragmentov fagne DNA v lastno DNA. Ti odseki na bakterijski DNA se imenujejo CRISPR, oziroma gruèe enakomerno prekinjenih kratkih palindromnih ponovitev (ang: »clustered regularly interspaced short palindromic repeats«), in skupaj z geni za proteine Cas predstavljajo bakterijski imunski sistem CRISPR/Cas tipa 1-E. Pri ''E. coli'' ima kljuèno vlogo 8 razliènih Cas proteinov. Od tega jih 5 sestavlja kompleks Cascade. Cilj obrambnega sistema je prepoznati tujo DNA in jo s pomoèjo Cas endonukleaz razrezati na manjše fragmente. V splošnem sistem CRISPR/Cas deluje v 3 korakih:
1. ADAPTACIJA: proteini Cas prepoznajo tujo DNA in jo vkljuèijo v CRISPR.
2. BIOSINTEZA: sinteza proteinov Cas in transkripcija CRISPR.
3. INTERFERENCA: unièenje tuje DNA.

==Lokus CRISPR==
Kromosom ''E. coli'' vsebuje 2 lokusa CRISPR, imenovana CRISPR-I in CRISPR-II. Glavne strukturne znaèilnosti lokusa so vodilno zaporedje, vmesniki in ponovitve. CRISPR-I vsebuje 13 vmesnikov, CRISPR-II pa le 6. K lokusu CRISPR-I spadajo tudi geni cas.
8 genov cas, ki zapisujejo proteine Cas, se nahaja navzgor od vodilnega zaporedja na lokusu CRISPR-I in si od 5' proti 3' koncu po vrsti sledijo: cas3, cse1, cse2, cas7, cas5, cas6e, cas1 in cas2. Cas3 ima lasten promotor, medtem ko so ostali geni cas del istega operona, ki ga negativno regulira protein H-NS. Cas3 je endonukleaza in helikaza. Njena glavna naloga je cepitev in razgraditev tuje DNA. Cas1 in Cas2, obe endonukleazi, tvorita kompleks, ki lahko v bakterijsko DNA vgradi del tuje DNA. Ostali proteini Cas tvorijo kompleks Cascade.
Navzdol od vodilnega zaporedja na obeh lokusih sledi obmoèje CRISPR, sestavljeno iz izmenjavajoèih se vmesnikov in ponovitev, ki so delno palindromske. Vmesniki izvirajo iz fagne DNA in predstavljajo imunost proti posameznim bakteriofagom, saj se po prepisovanju v pre-crRNA in procesiranju v crRNA vgradijo v kompleks CRISPR. S pomoèjo crRNA kompleks prepozna tujo DNA, ki je komplementarna vmesnikom (protovmesniki) in vsebuje prepoznavno zaporedje PAM (ang: »protospacer adjacent motif«).
Sistem CRISPR/Cas pri ''E. coli'' se uvršèa v tip 1-E, za katerega je znaèilna prisotnost genov cse1 in cse2 ter odsotnost gena cas4.

==Kompleks Cascade in procesiranje crRNA==
Cascade je ribonukleoproteinski kompleks, ki ga sestavljajo proteini Cas in crRNA. Ti proteini so Cse1, Cse2, Cas7, Cas5e in Cas6e v stehiometriènem razmerju 1:2:6:1:1, skupaj s pre-crRNA pa se iz lokusa CRISPR prepisujejo v procesu biosinteze. Celoten kompleks enajstih podenot ima znaèilno obliko morskega konjièka.
Vsaka izmed proteinskih podenot ima specifièno funkcijo:
• Cse1 prepozna zaporedje PAM na tuji DNA, tvori interakcije s 5' koncem crRNA in veže Cas3.
• Cse2 ne tvori interakcij s crRNA, pomaga pa pri sestavljanju kompleksa, saj tvori interakcije s Cse1, Cas7 in Cas5e.
• Vsaka izmed šestih podenot Cas7 vsebuje žleb s pozitivno nabitimi aminokislinskimi ostanki, v katere se lahko skrije vsaka šesta baza crRNA. Posledièno te baze ne morejo tvoriti interakcij z bazami na tuji DNA, kar zmanjša specifiènost kompleksa.
• Cas5e zasidra 5' konec crRNA v kompleks.
• Cas6e procesira pre-crRNA v crRNA in njen 3' konec zasidra v kompleks.
Prepisana pre-crRNA vsebuje veè vmesnikov in ponovitev. Zaradi palindromskega zaporedja v ponovitvah se lahko v pre-crRNA vzpostavijo bazni pari in pride do nastanka lasniène zanke, ki jo Cas6e cepi na 3' koncu. S tem nastane zrela 61 nukleotidov dolga crRNA, na kateri je vmesnik (32 nt) obdan z deli palindromskih ponovitev: krajšim delom na 5' koncu in lasnièno zanko na 3' koncu. Podenota Cas6e po obdelavi ostane vezana na 3' konec crRNA, ni pa še znano, ali je tekom procesiranja že vkljuèena v Cascade. V kompleksu Cascade tvori interakcije s crRNA devet od enajstih podenot, postavljena je pa tako, da sta 5' konec in lasnièna zanka vpeta med proteina Cas5e in Cas6e.
Brouns in sodelavci so v raziskavi iz leta 2008 dokazali, da pri samem procesiranju pre-crRNA sodeluje le Cas6e podenota. Poskuse so opravili na ''E. coli'' seva K12 in bakterijam izbili gene za posamezne podenote. Zrelo crRNA so zaznali le v bakterijah, ki so imele gen cas6e. Ugotovili so tudi, da Cas6e za svoje delovanje ne potrebuje dvovalentnih kovinskih kationov ali ATP, prav tako pa lahko pre-crRNA cepi neodvisno od ostalih podenot. Ko so Cas6e primerjali z ostalimi proteini iz njegove družine, so ugotovili, da vsebuje dobro ohranjen His20, ki je verjetno vkljuèen v samo katalizo cepitve pre-crRNA, ni pa nujno potreben za izgradnjo kompleksa. Èe so ta aminokislinski ostanek zamenjali z Ala, se je kompleks Cascade vseeno sestavil, crRNA pa ni nastala.

==Vezava kompleksa Cascade na DNA==

Cascade se na DNA veže na veè naèinov. Zaradi para zank bogatih z lizini na dveh izmed podenot Cas7 se lahko z nespecifiènimi elektrostatskimi interakcijami veže na negativno nabito ogrodje DNA, poleg tega pa je za delovanje kompleksa bistvenega pomena vezava na protovmesnik (zaporedja komplementarna vmesnikom na crRNA) in PAM. PAM so trije nukleotidi neposredno ob protovmesniku, s katerimi v malem žlebu interagira podenota Cse1, in so bistvenega pomena za loèevanje bakteriji tuje in lastne DNA. Za interakcije s PAM so kljuèni trije strukturni vzorci na N-koncu Cse1: lizinski prst, glicinska zanka in glutaminska zagozda. Izmed 64 možnih kombinacij na mestu PAM jih le majhno število tvori optimalne vezave s Cse1. V primeru, da je interakcija med PAM in Cse1 ugodna, lahko podenota s konformacijsko spremembo povzroèi destabilizacijo in razklenitev tarène DNA, tako da se lahko crRNA približa eni od verig. V primeru komplementarnosti vmesnika in tarène DNA, se vezava kompleksa okrepi in omogoèi nadaljevanje imunskega odziva CRISPR/cas, izpodrinjena veriga DNA pa tvori znaèilno zanko R.
Chaoyou Xue in sodelavci so leta 2017 v ''E. coli'' prouèevali mehanizme, s katerimi se lahko Cascade veže na DNA. Uporabili so metodo FRET, kjer so s fluorescenènim »donorjem« (Cy3) oznaèili DNA v bližini tarènega zaporedja, z »akceptorjem« (Cy5) pa podenoto Cas5e kompleksa Cascade. Metoda temelji na pojavu, kjer fluorescenca doloèene valovne dolžine donorskega oznaèevalca vzburi akceptorski oznaèevalec, èe je ta dovolj blizu. Akceptorski oznaèevalec nato fluorescira z drugo valovno dolžino, kar signalizira približanje oznaèevalcev. Oznaèevalca sta bila namešèena tako, da nista ovirala vezave Cascade na DNA, zaradi uèinka FRET pa sta omogoèala detekcijo vezave kompleksa.
V raziskavi so delali z molekulo DNA, ki je vsebovala popoln komplement uporabljenemu vmesniku in eno izmed ugodnih zaporedij PAM. Ugotovili so, da je v 20 % primerov prišlo do moène in dolgotrajne vezave, kjer je uèinek FRET trajal tudi do 190 sekund, sicer pa so bile vezave krajše in najverjetneje poledica nespecifiène interakcije ali nepopolne tvorbe zanke R. Nadaljnji eksperimenti z drugimi crRNA in DNA so pokazali, da se tudi v primeru, ko DNA ne vsebuje protovmesnika, Cascade lahko kratkotrajno veže. Ta pojav so povezali s prisotnostjo ugodnih PAM v DNA, saj je bilo takšnih vezav znatno manj v primeru, ko so delali z DNA brez PAM. Njihov konèni model predpostavlja, da Cascade nakljuèno »skenira« DNA s pomoèjo nespecifiènih elektrostatskih interakcij, se upoèasni in bolje veže ob prisotnosti PAM, do moène in trajne interakcije pa pride ob ujemanju vmesnika s protovmesnikom.

==Interferenca in adaptacija, ki temelji na recikliranju ostankov tuje DNA po razgradnji s Cas3==

Zdaj vemo, kako Cascade prepozna tujo DNA. Vprašajmo se, kaj sledi? Poznamo dva mehanizma.
Pri interferenci vzpostavitvi R-zanke sledi vpoklic Cas3. To je protein sestavljen iz treh domen, ki imajo helikazno in nukleazno aktivnost. Od ATP odvisna helikazna domena razvije izpodrinjeno verigo, nukleazna domena na C-koncu jo cepi, nato pa od Mg2+ odvisna HD-nukleazna domena do konca unièi ssDNA. Izpodrinjena veriga je tako unièena, ostane le še tarèna veriga. Mehanizem njenega unièenja zaenkrat še ni pojasnjen, obstaja le nekaj domnev, zagotovo pa vemo, da je na ta naèin prepisovanje tuje DNA onemogoèeno in obramba uspešno izvedena.
Adaptacija, ki temelji na recikliranju ostankov tuje DNA po razgradnji s Cas3 (ang: »Primed adaptation«), pa z vpoklicom Cas1-Cas2 kompleksa poskrbi za vstavitev novega vmesnika v lokus CRISPR. Preden razložimo, kako se to zgodi, pa si poglejmo še nekaj dejstev. Še do pred nedavnim so bili znanstveniki preprièani, da v celici poteka ali adaptacija ali interferenca. Po raziskavah opisanih spodaj pa danes vemo, da ta trditev ne drži povsem.
Izkazalo se je, da je kljuèna determinanta, ki doloèa naèin nadaljnjega poteka obrambnega mehanizma interakcija med PAM in Cse1. PAM je sestavljen iz treh nukleotidov, kar pomeni, da obstaja 64 razliènih možnosti tega zaporedja.
Že dalj èasa vemo, da Cse1 specifièno prepozna PAM sestavljen iz AAG. Temu sledi moèna interferenca. Vendar pa tudi drugaèni PAM sprožijo doloèen odziv, saj se Cse1 na razlièna zaporedja veže z razlièno visoko afiniteto. Odziv, ki temu sledi lahko razdelimo v tri skupine. V raziskavi Olge Musharova in sodelavcev narejeni marca letos, so ugotovili, da 17 PAM zaporedij sproži moèno interferenco. 11 PAM je takih, ki sprožijo poèasno interferenco, pri 36 pa interference ni možno zaznati. Zanimivo v tej raziskavi je bilo predvsem dejstvo, da v 36 primerih brez interference prav tako ni bilo možno zaznati adaptacije. To pa pomeni, da je predpostavka o nesklopljnosti adaptacije in interference napaèna.
Danes vemo, da je zaradi metodoloških omejitev v primeru moène interference zelo težko zaznati tako vrsto adaptacije in obratno.
Zato lahko predpostavimo sledeè mehanizem adaptacije, ki temelji na recikliranju ostankov tuje DNA po interferenèni razgradnji s Cas3 (ang: »Primed adaptation«) in predpostavlja z interferenco sklopljeno aktivnost Cas1 in Cas2. Ta dva proteina tvorita stabilen kompleks Cas14:Cas22, kjer je dimer Cas2 objet z dvema dimeroma Cas1. Ob prepoznavi PAM najprej poteèe interferenèna cepitev tuje DNA s Cas 3 in pri tem nastanejo manjši fragmenti. Cas1-Cas2 specifièno prepozna pravi 33 nt velik oligodeoksinukleotid , ki predstavlja protovmesnik . Kako kompleks prepozna pravi protovmesnik bo opisano spodaj, Cas1-Cas2 naloga pa je še njegova vstavitev v lokus CRISPR .

==Naivna adaptacija==

Obrambni odziv ''E. Coli'' pa sestavlja še tretji mehanizem, ki ne vkljuèuje Cascade. Izkaže se, da Cas1-Cas2 kompleks lahko tudi sam prepozna in cepi tujo DNA. Mehanizem se zaène, ko en izmed dimerov Cas1 prepozna PAM in cepi vez med 2. in 3. nukleotidom. Drug izmed dimerov Cas1 pa poskrbi za cepitev po 33. nukleotidu, tako da nastane protovmesnik ravno prave dolžine. Tak protovmesnik se veže v kompleks Cas1-Cas2 in vstavi v lokus CRISPR.

Odgovor bakterij na tujo DNA

2019-04-15T21:30:52Z

KlementinaP:

Seminarji pri Molekularni biologiji v študijskem letu 2018/19 obravnavajo odziv bakterijskih celic na tujo DNA, ki vstopi vanje, oziroma na okužbo z bakteriofagi. Okvirni naslovi oz. teme so navedeni na prvem seznamu. Za orientacijo in splošno poznavanje tematike si preberite [https://www.nature.com/articles/nrmicro2315 pregledni članek] v Nature Rev. Microbiol. iz leta 2010. V okviru posameznih poglavij znotraj osnovne teme lahko predlagate še kakšen seminar po lastni presoji (pošljite predlog po e-pošti!).

Vsako temo obdelajo praviloma trije študenti. Vsaka skupina mora pripraviti povzetek seminarja z vsaj 1200 besedami in ne več kot 1800 besedami in ga objaviti na tem wikiju. Povzetek ne vsebuje slikovnega gradiva, lahko pa vključuje povezave do slik in videov na spletu. Navedite do 5 ključnih virov (ti ne štejejo v vsoto 1200 besed), ki ste jih uporabili.

Vsaka skupina mora objaviti povzetek seminarja na wikiju najkasneje 24 h pred predstavitvijo svojega seminarja. Kateri del povzetka je napisal kdo, navedite v zavihku 'discussion'.
Predstavitev naj bo dolga pribl. 20 minut (tolerančni okvir je 18-23 min.), temu pa bo sledila razprava, dolga 5-10 min. Vsak član skupine mora predstaviti en del seminarja, pri čemer mora biti delo enakomerno razdeljeno med vse. Osredotočite se na osnovno temo, ki ste si jo izbrali in vključite čim manj splošnega uvoda.

Razpored seminarjev po datumih bo razviden iz spletne učilnice. Začetek seminarjev bo 8. aprila, na dve uri (ponedeljek, četrtek) pa so predvideni po trije seminarji.

Vsebina seminarjev je izpitna snov. Iz teme seminarjev so 2-3 vprašanja od ~30, kolikor jih ima celoten izpit.

Poglavja za seminarje so:

'''Preprečevanje adsorpcije fagov na celično površino''' 
1. Blokiranje receptorjev za fage 
2. Proizvodnja zunajceličnega matriksa 
3. Proizvodnja kompetitivnih inhibitorjev 

'''Preprečevanje ponovne okužbe z istim fagom s preprečitvijo vstopa fagne DNA''' 
4. Sistem Sie pri gramnegativnih bakterijah 
5. Sistem Sie pri grampozitivnih bakterijah 

'''Bakterijski restrikcijsko-modifikacijski sistem''' 
6. Odkritje prvih restrikcijskih endonukleaz ''(npr. Nobelovo predavanje Hamiltona Smitha 1978 in njegov članek iz 1970)'' 
7. Metilacijski sistem pri bakterijah 
8. Struktura in mehanizem restriktaz tipa II 
9. Prilagoditve fagov na bakterijske restrikcijsko-modifikacijske sisteme 

'''Sistem CRISP/Cas proti fagom in plazmidom''' 
10. Odkritje in opis regij CRISPR in Cas (do leta ~2002) 
11. Odkritje izvora ponavljajočih se zaporedij (Mojica et al., 2005) 
12. Odkritje vloge CRISPR/Cas pri omejevanju vnosa plazmidov (Marraffini&Sontheimer, 2008) 
13. Mehanizem delovanja kompleksa Cascade in sistem CRISPR/Cas pri ''E. coli'' (Brouns et al., 2008) 
14. Struktura in delovanje sistema CRISPR/Cas pri bakteriji ''Streptococcus pyogenes'' 

'''Sistemi abortivne infekcije (Abi)''' 
15. Sistem Rex pri bakteriji ''Escherichia coli'' 
16. Bakterijski sistemi toksin-antitoksin, usmerjeni proti fagom 

''Kjer so ob temi navedeni članki, naj ti služijo kot osnova za iskanje dodatnih virov.''

----

Za seminar se prijavite tako, da se vpišete v oklepaj za naslovom seminarja:

1. [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Blokiranje_receptorjev_za_fage Blokiranje receptorjev za fage] (Martina Lokar, Tina Kolenc Milavec, Urša Štrancar) 
2. [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Proizvodnja_zunajceli%C4%8Dnega_matriksa Proizvodnja zunajceličnega matriksa] (Patricija Miklavc, Benjamin Malovrh, Vid Modic) 
3. [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Proizvodnja_kompetitivnih_inhibitorjev Proizvodnja kompetitivnih inhibitorjev] (Ajda Godec,Liza Ulčakar,Luka Gnidovec) 
4. [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sistem_izklju%C4%8Ditve_naknadne_oku%C5%BEbe Izključitev naknadne okužbe] (Anamarija Agnič, Aljaž Bratina, Anže Šumah) 
5. Sistem Sie pri grampozitivnih bakterijah 
6. [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Odkritje_prvih_restrikcijskih_endonukleaz Odkritje prvih restrikcijskih endonukleaz] (Alen Šadl, Bor Klančnik) 
7. [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Metilacijski_sistem_pri_bakterijah Metilacijski sistem pri bakterijah] (Sumeja Kudelić, Maja Škof, Maks Kumek) 
8. [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Struktura_in_mehanizem_restriktaz_tipa_II Struktura in mehanizem restriktaz tipa II] (Meta Kodrič, Barbara Jaklič, Laura Gašperšič) 
9. [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Prilagoditve_fagov_na_bakterijske_restrikcijsko-modifikacijske_sisteme Prilagoditve fagov na bakterijske restrikcijsko-modifikacijske sisteme] (Nika Boštic, Tadej Medved, Sonja Gabrijelčič) 
10. [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Odkritje_in_opis_regij_CRISPR_in_Cas_%28do_leta_~2002%29 Odkritje in opis regij CRISPR in Cas (do leta ~2002)] (Eva Gartner, Neža Blaznik, Tina Zavodnik ) 
11. Odkritje izvora ponavljajočih se zaporedij (Mateja Špegel, Špela Friškovec Vončina, Anja Truden) 
12. [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Odkritje_vloge_CRISPR/Cas_pri_omejevanju_vnosa_plazmidov Odkritje vloge CRISPR/Cas pri omejevanju vnosa plazmidov] (Urška Zagorc, Nika Mikulič Vernik, Anja Tavčar) 
13. [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Mehanizem_delovanja_kompleksa_Cascade_in_sistem_CRISPR/Cas_pri_E._coli Mehanizem delovanja kompleksa Cascade in sistem CRISPR/Cas pri ''E. coli''] (Jernej Imperl, Klementina Polanec, Gašper Anton Komatar) 
14. Struktura in delovanje sistema CRISPR/Cas pri bakteriji ''Streptococcus pyogenes'' (Lara Hrvatin, Doroteja Armič, Matija Ruparčič) 
15. Sistem Rex pri bakteriji ''Escherichia coli'' (Karmen Mlinar, Marko Pavleković, Valeriya Musina) 
16. Bakterijski sistemi toksin-antitoksin, usmerjeni proti fagom (Sanja Stanković, Karin Dobravc Škof, Neža Žerjav ) 

Ko boste pripravljali povzetek, naslov teme na spodnjem seznamu povežite z novo wiki stranjo, ki bo vsebovala povzetek. Na koncu besedila (pod viri) v novo vrstico dodajte oznaki: <nowiki>[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]</nowiki> 

Primer, kako so bili urejeni seminarji v prejšnjih letih, si lahko ogledate na primer na strani [[Struktura kromatina]] (2013/14).

#[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Herpesvirusi_in_sorodni_dsDNA_virusi Herpesvirusi in sorodni dsDNA virusi] (Veronika Razpotnik, Ines Medved, Andrej Ivanovski)

Odgovor bakterij na tujo DNA

2019-04-15T21:29:52Z

KlementinaP:

Seminarji pri Molekularni biologiji v študijskem letu 2018/19 obravnavajo odziv bakterijskih celic na tujo DNA, ki vstopi vanje, oziroma na okužbo z bakteriofagi. Okvirni naslovi oz. teme so navedeni na prvem seznamu. Za orientacijo in splošno poznavanje tematike si preberite [https://www.nature.com/articles/nrmicro2315 pregledni članek] v Nature Rev. Microbiol. iz leta 2010. V okviru posameznih poglavij znotraj osnovne teme lahko predlagate še kakšen seminar po lastni presoji (pošljite predlog po e-pošti!).

Vsako temo obdelajo praviloma trije študenti. Vsaka skupina mora pripraviti povzetek seminarja z vsaj 1200 besedami in ne več kot 1800 besedami in ga objaviti na tem wikiju. Povzetek ne vsebuje slikovnega gradiva, lahko pa vključuje povezave do slik in videov na spletu. Navedite do 5 ključnih virov (ti ne štejejo v vsoto 1200 besed), ki ste jih uporabili.

Vsaka skupina mora objaviti povzetek seminarja na wikiju najkasneje 24 h pred predstavitvijo svojega seminarja. Kateri del povzetka je napisal kdo, navedite v zavihku 'discussion'.
Predstavitev naj bo dolga pribl. 20 minut (tolerančni okvir je 18-23 min.), temu pa bo sledila razprava, dolga 5-10 min. Vsak član skupine mora predstaviti en del seminarja, pri čemer mora biti delo enakomerno razdeljeno med vse. Osredotočite se na osnovno temo, ki ste si jo izbrali in vključite čim manj splošnega uvoda.

Razpored seminarjev po datumih bo razviden iz spletne učilnice. Začetek seminarjev bo 8. aprila, na dve uri (ponedeljek, četrtek) pa so predvideni po trije seminarji.

Vsebina seminarjev je izpitna snov. Iz teme seminarjev so 2-3 vprašanja od ~30, kolikor jih ima celoten izpit.

Poglavja za seminarje so:

'''Preprečevanje adsorpcije fagov na celično površino''' 
1. Blokiranje receptorjev za fage 
2. Proizvodnja zunajceličnega matriksa 
3. Proizvodnja kompetitivnih inhibitorjev 

'''Preprečevanje ponovne okužbe z istim fagom s preprečitvijo vstopa fagne DNA''' 
4. Sistem Sie pri gramnegativnih bakterijah 
5. Sistem Sie pri grampozitivnih bakterijah 

'''Bakterijski restrikcijsko-modifikacijski sistem''' 
6. Odkritje prvih restrikcijskih endonukleaz ''(npr. Nobelovo predavanje Hamiltona Smitha 1978 in njegov članek iz 1970)'' 
7. Metilacijski sistem pri bakterijah 
8. Struktura in mehanizem restriktaz tipa II 
9. Prilagoditve fagov na bakterijske restrikcijsko-modifikacijske sisteme 

'''Sistem CRISP/Cas proti fagom in plazmidom''' 
10. Odkritje in opis regij CRISPR in Cas (do leta ~2002) 
11. Odkritje izvora ponavljajočih se zaporedij (Mojica et al., 2005) 
12. Odkritje vloge CRISPR/Cas pri omejevanju vnosa plazmidov (Marraffini&Sontheimer, 2008) 
13. Mehanizem delovanja kompleksa Cascade in sistem CRISPR/Cas pri ''E. coli'' (Brouns et al., 2008) 
14. Struktura in delovanje sistema CRISPR/Cas pri bakteriji ''Streptococcus pyogenes'' 

'''Sistemi abortivne infekcije (Abi)''' 
15. Sistem Rex pri bakteriji ''Escherichia coli'' 
16. Bakterijski sistemi toksin-antitoksin, usmerjeni proti fagom 

''Kjer so ob temi navedeni članki, naj ti služijo kot osnova za iskanje dodatnih virov.''

----

Za seminar se prijavite tako, da se vpišete v oklepaj za naslovom seminarja:

1. [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Blokiranje_receptorjev_za_fage Blokiranje receptorjev za fage] (Martina Lokar, Tina Kolenc Milavec, Urša Štrancar) 
2. [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Proizvodnja_zunajceli%C4%8Dnega_matriksa Proizvodnja zunajceličnega matriksa] (Patricija Miklavc, Benjamin Malovrh, Vid Modic) 
3. [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Proizvodnja_kompetitivnih_inhibitorjev Proizvodnja kompetitivnih inhibitorjev] (Ajda Godec,Liza Ulčakar,Luka Gnidovec) 
4. [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sistem_izklju%C4%8Ditve_naknadne_oku%C5%BEbe Izključitev naknadne okužbe] (Anamarija Agnič, Aljaž Bratina, Anže Šumah) 
5. Sistem Sie pri grampozitivnih bakterijah 
6. [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Odkritje_prvih_restrikcijskih_endonukleaz Odkritje prvih restrikcijskih endonukleaz] (Alen Šadl, Bor Klančnik) 
7. [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Metilacijski_sistem_pri_bakterijah Metilacijski sistem pri bakterijah] (Sumeja Kudelić, Maja Škof, Maks Kumek) 
8. [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Struktura_in_mehanizem_restriktaz_tipa_II Struktura in mehanizem restriktaz tipa II] (Meta Kodrič, Barbara Jaklič, Laura Gašperšič) 
9. [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Prilagoditve_fagov_na_bakterijske_restrikcijsko-modifikacijske_sisteme Prilagoditve fagov na bakterijske restrikcijsko-modifikacijske sisteme] (Nika Boštic, Tadej Medved, Sonja Gabrijelčič) 
10. [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Odkritje_in_opis_regij_CRISPR_in_Cas_%28do_leta_~2002%29 Odkritje in opis regij CRISPR in Cas (do leta ~2002)] (Eva Gartner, Neža Blaznik, Tina Zavodnik ) 
11. Odkritje izvora ponavljajočih se zaporedij (Mateja Špegel, Špela Friškovec Vončina, Anja Truden) 
12. [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Odkritje_vloge_CRISPR/Cas_pri_omejevanju_vnosa_plazmidov Odkritje vloge CRISPR/Cas pri omejevanju vnosa plazmidov] (Urška Zagorc, Nika Mikulič Vernik, Anja Tavčar) 
13. [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Prilagoditve_fagov_na_bakterijske_restrikcijsko-modifikacijske_sisteme Mehanizem delovanja kompleksa Cascade in sistem CRISPR/Cas pri ''E. coli''] (Jernej Imperl, Klementina Polanec, Gašper Anton Komatar) 
14. Struktura in delovanje sistema CRISPR/Cas pri bakteriji ''Streptococcus pyogenes'' (Lara Hrvatin, Doroteja Armič, Matija Ruparčič) 
15. Sistem Rex pri bakteriji ''Escherichia coli'' (Karmen Mlinar, Marko Pavleković, Valeriya Musina) 
16. Bakterijski sistemi toksin-antitoksin, usmerjeni proti fagom (Sanja Stanković, Karin Dobravc Škof, Neža Žerjav ) 

Ko boste pripravljali povzetek, naslov teme na spodnjem seznamu povežite z novo wiki stranjo, ki bo vsebovala povzetek. Na koncu besedila (pod viri) v novo vrstico dodajte oznaki: <nowiki>[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]</nowiki> 

Primer, kako so bili urejeni seminarji v prejšnjih letih, si lahko ogledate na primer na strani [[Struktura kromatina]] (2013/14).

#[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Herpesvirusi_in_sorodni_dsDNA_virusi Herpesvirusi in sorodni dsDNA virusi] (Veronika Razpotnik, Ines Medved, Andrej Ivanovski)

Odgovor bakterij na tujo DNA

2019-04-15T21:29:08Z

KlementinaP:

Seminarji pri Molekularni biologiji v študijskem letu 2018/19 obravnavajo odziv bakterijskih celic na tujo DNA, ki vstopi vanje, oziroma na okužbo z bakteriofagi. Okvirni naslovi oz. teme so navedeni na prvem seznamu. Za orientacijo in splošno poznavanje tematike si preberite [https://www.nature.com/articles/nrmicro2315 pregledni članek] v Nature Rev. Microbiol. iz leta 2010. V okviru posameznih poglavij znotraj osnovne teme lahko predlagate še kakšen seminar po lastni presoji (pošljite predlog po e-pošti!).

Vsako temo obdelajo praviloma trije študenti. Vsaka skupina mora pripraviti povzetek seminarja z vsaj 1200 besedami in ne več kot 1800 besedami in ga objaviti na tem wikiju. Povzetek ne vsebuje slikovnega gradiva, lahko pa vključuje povezave do slik in videov na spletu. Navedite do 5 ključnih virov (ti ne štejejo v vsoto 1200 besed), ki ste jih uporabili.

Vsaka skupina mora objaviti povzetek seminarja na wikiju najkasneje 24 h pred predstavitvijo svojega seminarja. Kateri del povzetka je napisal kdo, navedite v zavihku 'discussion'.
Predstavitev naj bo dolga pribl. 20 minut (tolerančni okvir je 18-23 min.), temu pa bo sledila razprava, dolga 5-10 min. Vsak član skupine mora predstaviti en del seminarja, pri čemer mora biti delo enakomerno razdeljeno med vse. Osredotočite se na osnovno temo, ki ste si jo izbrali in vključite čim manj splošnega uvoda.

Razpored seminarjev po datumih bo razviden iz spletne učilnice. Začetek seminarjev bo 8. aprila, na dve uri (ponedeljek, četrtek) pa so predvideni po trije seminarji.

Vsebina seminarjev je izpitna snov. Iz teme seminarjev so 2-3 vprašanja od ~30, kolikor jih ima celoten izpit.

Poglavja za seminarje so:

'''Preprečevanje adsorpcije fagov na celično površino''' 
1. Blokiranje receptorjev za fage 
2. Proizvodnja zunajceličnega matriksa 
3. Proizvodnja kompetitivnih inhibitorjev 

'''Preprečevanje ponovne okužbe z istim fagom s preprečitvijo vstopa fagne DNA''' 
4. Sistem Sie pri gramnegativnih bakterijah 
5. Sistem Sie pri grampozitivnih bakterijah 

'''Bakterijski restrikcijsko-modifikacijski sistem''' 
6. Odkritje prvih restrikcijskih endonukleaz ''(npr. Nobelovo predavanje Hamiltona Smitha 1978 in njegov članek iz 1970)'' 
7. Metilacijski sistem pri bakterijah 
8. Struktura in mehanizem restriktaz tipa II 
9. Prilagoditve fagov na bakterijske restrikcijsko-modifikacijske sisteme 

'''Sistem CRISP/Cas proti fagom in plazmidom''' 
10. Odkritje in opis regij CRISPR in Cas (do leta ~2002) 
11. Odkritje izvora ponavljajočih se zaporedij (Mojica et al., 2005) 
12. Odkritje vloge CRISPR/Cas pri omejevanju vnosa plazmidov (Marraffini&Sontheimer, 2008) 
13. Mehanizem delovanja kompleksa Cascade in sistem CRISPR/Cas pri ''E. coli'' (Brouns et al., 2008) 
14. Struktura in delovanje sistema CRISPR/Cas pri bakteriji ''Streptococcus pyogenes'' 

'''Sistemi abortivne infekcije (Abi)''' 
15. Sistem Rex pri bakteriji ''Escherichia coli'' 
16. Bakterijski sistemi toksin-antitoksin, usmerjeni proti fagom 

''Kjer so ob temi navedeni članki, naj ti služijo kot osnova za iskanje dodatnih virov.''

----

Za seminar se prijavite tako, da se vpišete v oklepaj za naslovom seminarja:

1. [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Blokiranje_receptorjev_za_fage Blokiranje receptorjev za fage] (Martina Lokar, Tina Kolenc Milavec, Urša Štrancar) 
2. [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Proizvodnja_zunajceli%C4%8Dnega_matriksa Proizvodnja zunajceličnega matriksa] (Patricija Miklavc, Benjamin Malovrh, Vid Modic) 
3. [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Proizvodnja_kompetitivnih_inhibitorjev Proizvodnja kompetitivnih inhibitorjev] (Ajda Godec,Liza Ulčakar,Luka Gnidovec) 
4. [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sistem_izklju%C4%8Ditve_naknadne_oku%C5%BEbe Izključitev naknadne okužbe] (Anamarija Agnič, Aljaž Bratina, Anže Šumah) 
5. Sistem Sie pri grampozitivnih bakterijah 
6. [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Odkritje_prvih_restrikcijskih_endonukleaz Odkritje prvih restrikcijskih endonukleaz] (Alen Šadl, Bor Klančnik) 
7. [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Metilacijski_sistem_pri_bakterijah Metilacijski sistem pri bakterijah] (Sumeja Kudelić, Maja Škof, Maks Kumek) 
8. [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Struktura_in_mehanizem_restriktaz_tipa_II Struktura in mehanizem restriktaz tipa II] (Meta Kodrič, Barbara Jaklič, Laura Gašperšič) 
9. [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Prilagoditve_fagov_na_bakterijske_restrikcijsko-modifikacijske_sisteme Prilagoditve fagov na bakterijske restrikcijsko-modifikacijske sisteme] (Nika Boštic, Tadej Medved, Sonja Gabrijelčič) 
10. [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Odkritje_in_opis_regij_CRISPR_in_Cas_%28do_leta_~2002%29 Odkritje in opis regij CRISPR in Cas (do leta ~2002)] (Eva Gartner, Neža Blaznik, Tina Zavodnik ) 
11. Odkritje izvora ponavljajočih se zaporedij (Mateja Špegel, Špela Friškovec Vončina, Anja Truden) 
12. [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Odkritje_vloge_CRISPR/Cas_pri_omejevanju_vnosa_plazmidov Odkritje vloge CRISPR/Cas pri omejevanju vnosa plazmidov] (Urška Zagorc, Nika Mikulič Vernik, Anja Tavčar) 
13. [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Prilagoditve_fagov_na_bakterijske_restrikcijsko-modifikacijske_sisteme]Mehanizem delovanja kompleksa Cascade in sistem CRISPR/Cas pri ''E. coli'' (Jernej Imperl, Klementina Polanec, Gašper Anton Komatar) 
14. Struktura in delovanje sistema CRISPR/Cas pri bakteriji ''Streptococcus pyogenes'' (Lara Hrvatin, Doroteja Armič, Matija Ruparčič) 
15. Sistem Rex pri bakteriji ''Escherichia coli'' (Karmen Mlinar, Marko Pavleković, Valeriya Musina) 
16. Bakterijski sistemi toksin-antitoksin, usmerjeni proti fagom (Sanja Stanković, Karin Dobravc Škof, Neža Žerjav ) 

Ko boste pripravljali povzetek, naslov teme na spodnjem seznamu povežite z novo wiki stranjo, ki bo vsebovala povzetek. Na koncu besedila (pod viri) v novo vrstico dodajte oznaki: <nowiki>[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]</nowiki> 

Primer, kako so bili urejeni seminarji v prejšnjih letih, si lahko ogledate na primer na strani [[Struktura kromatina]] (2013/14).

#[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Herpesvirusi_in_sorodni_dsDNA_virusi Herpesvirusi in sorodni dsDNA virusi] (Veronika Razpotnik, Ines Medved, Andrej Ivanovski)

Odgovor bakterij na tujo DNA

2019-03-08T17:05:31Z

KlementinaP:

Seminarji pri Molekularni biologiji v študijskem letu 2018/19 obravnavajo odziv bakterijskih celic na tujo DNA, ki vstopi vanje, oziroma na okužbo z bakteriofagi. Okvirni naslovi oz. teme so navedeni na prvem seznamu. Za orientacijo in splošno poznavanje tematike si preberite [https://www.nature.com/articles/nrmicro2315|pregledni članek] v Nature Rev. Microbiol. iz leta 2010. V okviru posameznih poglavij znotraj osnovne teme lahko predlagate še kakšen seminar po lastni presoji (pošljite predlog po e-pošti!).

Vsako temo obdelajo praviloma trije študenti. Vsaka skupina mora pripraviti povzetek seminarja z vsaj 1200 besedami in ne več kot 1800 besedami in ga objaviti na tem wikiju. Povzetek ne vsebuje slikovnega gradiva, lahko pa vključuje povezave do slik in videov na spletu. Navedite do 5 ključnih virov (ti ne štejejo v vsoto 1200 besed), ki ste jih uporabili.

Vsaka skupina mora objaviti povzetek seminarja na wikiju najkasneje 24 h pred predstavitvijo svojega seminarja. Kateri del povzetka je napisal kdo, navedite v zavihku 'discussion'.
Predstavitev naj bo dolga pribl. 20 minut (tolerančni okvir je 18-23 min.), temu pa bo sledila razprava, dolga 5-10 min. Vsak član skupine mora predstaviti en del seminarja, pri čemer mora biti delo enakomerno razdeljeno med vse. Osredotočite se na osnovno temo, ki ste si jo izbrali in vključite čim manj splošnega uvoda.

Razpored seminarjev po datumih bo razviden iz spletne učilnice. Začetek seminarjev bo 8. aprila, na dve uri (ponedeljek, četrtek) pa so predvideni po trije seminarji.

Vsebina seminarjev je izpitna snov. Iz teme seminarjev so 2-3 vprašanja od ~30, kolikor jih ima celoten izpit.

Poglavja za seminarje so (seznam v pripravi):

'''Preprečevanje adsorpcije fagov na celično površino''' 
1. Blokiranje receptorjev za fage 
2. Proizvodnja zunajceličnega matriksa 
3. Proizvodnja kompetitivnih inhibitorjev 

'''Preprečevanje ponovne okužbe z istim fagom s preprečitvijo vstopa fagne DNA''' 
4. Sistem Sie pri gramnegativnih bakterijah 
5. Sistem Sie pri grampozitivnih bakterijah 

'''Bakterijski restrikcijsko-modifikacijski sistem''' 
6. Odkritje prvih restrikcijskih endonukleaz ''(npr. Nobelovo predavanje Hamiltona Smitha 1978 in njegov članek iz 1970)'' 
7. Metilacijski sistem pri bakterijah 
8. Struktura in mehanizem restriktaz tipa II 
9. Prilagoditve fagov na bakterijske restrikcijsko-modifikacijske sisteme 

'''Sistem CRISP/Cas proti fagom in plazmidom''' 
10. Odkritje in opis regij CRISPR in Cas (do leta ~2002) 
11. Odkritje izvora ponavljajočih se zaporedij (Mojica et al., 2005) 
12. Odkritje vloge CRISPR/Cas pri omejevanju vnosa plazmidov (Marraffini&Sontheimer, 2008) 
13. Mehanizem delovanja kompleksa Cascade in sistem CRISPR/Cas pri ''E. coli'' (Brouns et al., 2008) 
14. Struktura in delovanje sistema CRISPR/Cas pri bakteriji ''Streptococcus pyogenes'' 

'''Sistemi abortivne infekcije (Abi)''' 
15. Sistem Rex pri bakteriji ''Escherichia coli'' 
16. Bakterijski sistemi toksin-antitoksin, usmerjeni proti fagom 

''Kjer so ob temi navedeni članki, naj ti služijo kot osnova za iskanje dodatnih virov.''

----

Za seminar se prijavite tako, da se vpišete v oklepaj za naslovom seminarja:

1. Blokiranje receptorjev za fage 
2. Proizvodnja zunajceličnega matriksa 
3. Proizvodnja kompetitivnih inhibitorjev 
4. Sistem Sie pri gramnegativnih bakterijah 
5. Sistem Sie pri grampozitivnih bakterijah 
6. Odkritje prvih restrikcijskih endonukleaz 
7. Metilacijski sistem pri bakterijah 
8. Struktura in mehanizem restriktaz tipa II 
9. Prilagoditve fagov na bakterijske restrikcijsko-modifikacijske sisteme 
10. Odkritje in opis regij CRISPR in Cas (do leta ~2002) 
11. Odkritje izvora ponavljajočih se zaporedij 
12. Odkritje vloge CRISPR/Cas pri omejevanju vnosa plazmidov 
13. Mehanizem delovanja kompleksa Cascade in sistem CRISPR/Cas pri ''E. coli'' (Jernej Imperl, Klementina Polanec, ) 
14. Struktura in delovanje sistema CRISPR/Cas pri bakteriji ''Streptococcus pyogenes'' 

'''Sistemi abortivne infekcije (Abi)''' 
15. Sistem Rex pri bakteriji ''Escherichia coli'' 
16. Bakterijski sistemi toksin-antitoksin, usmerjeni proti fagom 

Ko boste pripravljali povzetek, naslov teme na spodnjem seznamu povežite z novo wiki stranjo, ki bo vsebovala povzetek. Na koncu besedila (pod viri) v novo vrstico dodajte oznaki: <nowiki>[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]</nowiki> 

Primer, kako so bili urejeni seminarji v prejšnjih letih, si lahko ogledate na primer na strani [[Struktura kromatina]] (2013/14).

#[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Herpesvirusi_in_sorodni_dsDNA_virusi Herpesvirusi in sorodni dsDNA virusi] (Veronika Razpotnik, Ines Medved, Andrej Ivanovski)

BIO2 Povzetki seminarjev 2018

2018-11-16T14:37:37Z

KlementinaP: /* Biokemija- Povzetki seminarjev 2018/2019 */

== Biokemija- Povzetki seminarjev 2018/2019 ==
Nazaj na osnovno [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Seminar_2018 stran]

===Karmen Mlinar: Signalizacija in odzivi na abiotski stres pri rastlinah===
Rastline živijo v stalno spreminjajočem se okolju, ki je pogosto neugodno in stresno za njihovo rast in razvoj. Primer abiotskega stresa so suša, ekstremne temperature, slanost tal, pomanjkanje hranil v prsti ipd. Rastline lahko stres preživijo tako, da se mu prilagodijo ali pa izognejo. V nasprotnem primeru so obsojene na smrt. Identificiranih je le malo senzorjev, ki zaznavajo stres. Pri signalizaciji odzivov na stresna okolja pogosto sodeluje družina kinaz SnRK, ki zaznajo spremembe v energijskem statusu rastline, ki jih povzroči stres. Znane so tri poddružine SnRKs: SnRK1s, SnRK2s, ki sodelujejo pri osmotskem stresu in ABA signalizaciji, in SnRK3s, ki so ključni regulatorji ionske homeostaze pri spopadanju s solnim stresom. Pri ionskem stresu pogosto problem predstavlja Na+. Pri njegovi signalizaciji je ključna SOS signalna pot. Signalizacija temperaturnega stresa se začne s spremembami v fluidnosti membrane, kar zaznajo integralni membranski proteini. Pri signalizaciji pogosto sodelujejo tudi MAPKs, CPKs in stresni hormon ABA, pomembno vlogo pa nosijo sekundarni sporočevalci kot sta kalcij in ROS. Vse to stremi k vzpostavitvi ionske in vodne homeostaze ter celične stabilnosti v stresnem okolju. Z razumevanjem signalizacije stresa in odzivov, ki sledijo, bomo lahko izboljšali odpornost pridelkov na stres in s tem zagotovili kmetijsko stabilnost in preskrbo s hrano za rastoče svetovno prebivalstvo.

===Aljaž Bratina: Pomen različnih signalnih poti pri staranju===
Staranje je postopna izguba fiziološke integritete in vodi v prizadeto funkcionalnost ter povečano možnost za smrt. Hitremu staranju nasprotna je dolgoživost, to je stanje, v katerem organizem ne izgublja funkcionalnosti ali jo izgublja počasneje. Staranje lahko opredelimo z devetimi splošnimi lastnostmi, ki jih opazimo v večini organizmov. Pri preučevanju staranja opazujemo organizem C. elegans, ki lahko med razvojem v primeru neugodnih razmer razvije stanje dauer, v katerem je razvoj ustavljen in je tako organizem sposoben preživeti dalj časa. Pri regulaciji staranja in dolgoživosti so pomembne mnoge celične signalne poti, kot del njih pa predvsem jedrni receptorji, ki uravnavajo prepisovanje genov, ki imajo vpliv na hitrost staranja oz. vzdrževanje dolgoživosti. V seminarski nalogi so opisane štiri pomembne signalne poti in njihov vpliv na staranje. Pri prvi je pomemben jedrni receptor DAF-12, ki za svoje delovanje potrebuje steroid DA. Neugodne razmere ga deaktivirajo, kar vodi v razvoj stanja dauer. Na dolgoživost pozitivno vpliva tudi aktiviran kompleks NSBP-1 in jedrnega receptorja DAF-16, ki sta del signalne poti IIS. To pot regulira tudi količina holesterola v celici. Dolgoživost povzročajo tudi prekinitveni post, pri katerem se aktivira jedrni receptor AP-1, pa tudi odstranitev zarodnih celic, ki poleg prej omenjene DAF-12 in DAF-16 aktivira tudi nekatere druge receptorje, npr. NHR-80 in NH3-49.

===Eva Gartner: Wnt signalizacija in njena vloga pri srčni fibrozi===
Wnt signalizacija zajema skupino signalnih poti, ki jih regulirajo wnt proteini. Ti se vežejo na posebne receptorje v membrani celice, preko katerih se signal prenese v notranjost. Wnt signalizacijo sestavljajo tri glavne signalizacijske poti: kanonična wnt pot, ki vključuje protein β-katenin, nekanonična (PCP) pot in nekanonična pot, ki sodeluje pri regulaciji kalcija. Vse poti se začnejo z vezavo wnt-liganda na transmembranske Fz receptorje in prenosom signala do znotrajceličnega proteina Dsh. Od tu naprej se poti razcepijo vsaka v svojo smer. Wnt signalizacija sodeluje v mnogih procesih, potrebnih za normalen razvoj organizma, kot so npr. razmnoževanje, specializacija in migracije celic. Prisotnost regulacije z wnt signalizacijo so odkrili tudi pri srčni fibrozi in z njo povezanih boleznih in poškodbah srca. V zdravih celicah wnt signalizacija navadno ni prisotna. Izraz fibroza se nanaša na povečanje količine zunajceličnega matriksa, zaradi česar postane srčna mišica otrdela in krčenje manj intenzivno. Pride do prekomerne namnožitve fibroblastov in diferenciacije v miofibroblaste, ki so fenotipsko med fibroblasti in mišičnimi celicami. Kljub številnim raziskavam, ki dokazujejo vpletenost wnt signalizacije v razvoju fibroze, natančni mehanizmi vseh signalnih poti še vedno niso znani. Potrebne so še nadaljnje raziskave za razumevanje zapletene celične komunikacije in odkritje novih terapevtskih možnosti.

===Neža Žerjav: Vloga kaspaz pri celični smrti===
Kaspaze so cisteinske peptidaze, ki sodelujejo v signalnih poteh celične smrti. Poznamo več vrst celične smrti, med njii tudi apoptozo, nekrozo, nekroptozo in piroptozo. Vloga kaspaz pri apoptozi je dobro znana, so adapterski proteini ali pa aktivno sodelujejo pri postopni razgradnji celice, saj sprožijo nastajanje apoptotskih veziklov in fagocitozo celice. Nekrozo označujemo kot neprogramirano celično smrt, vendar to za nekroptozo, ki ji pravimo tudi programirana nekroza, ne drži. Slednja je namreč v celici konkurenčna apoptozi, preko kaspaz sta recipročno regulirani. Nekroptozo kaspaze zavirajo, saj inhibirajo kompleks RIPK1/RIPK3, ki z aktivacijo proteina MLKL povzroči razlitje celične vsebine, značilno za nekrozo. Kaspaze sodelujejo tudi pri piroptozi, ki je posledica stresnih dejavnikov iz okolice – poškodb, patogenih organizmov ali njihovih toksinov. Kaspaze pri piroptozi povzročijo aktivacijo gasdermina D, ki sproži celično lizo, in vnetni odziv. Poznavanje delovanja kaspaz nam omogoča tako vpogled v razvoj in mehanizem vzdrževanja homeostaze organizmov, kakor tudi razumevanje patoloških procesov, na primer multiple in amiotrofične lateralne skleroze, ishemične bolezni srca ter vnetnih odzivov zaradi okužb.

===Meta Kodrič: Svetlobne signalne poti za uravnavanje fotomorfogeneze===
Svetloba je za rastline eden od najpomembnejših okoljskih signalov, ki vplivajo na rast in razvoj. V odvisnosti od intenzitete in valovne dolžine svetlobe se pri rastlinah pojavljata dva kontrastna razvojna procesa. Fotomorfogeneza je osnovna oblika rasti, saj rastlinam omogoča razvoj v avtotrofne organizme, sposobne opravljati fotosintezo, skotomorfogeneza pa je le zavrta oblika fotomorfogeneze, ki se odvija v temi. Potek teh dveh procesov rastline uravnavajo pod vplivom svetlobnega signala v svetlobni signalni poti. V njej sodelujejo fotoreceptorji ter pozitivni in negativni regulatorji fotomorfogeneze. V temi se fotoreceptor fitokrom nahaja v biološko neaktivni obliki v citosolu rastlinske celice. Negativni regulatorji se tako lahko v jedru prosto vežejo na druge molekule. Transkripcijski faktorji PIF se v obliki dimerov vežejo na promotorske regije na molekuli DNA in s tem preprečijo prepisovanje genov za fotomorfogenezo. Proteini COP/DET/FUS delujejo kot E3 ligaze pozitivnih regulatorjev HY5, HFR1, LAF1 in tako sodelujejo pri njihovi razgradnji. Z vzajemnim delovanjem tako negativni regulatorji zatirajo potek fotomorfogeneze. Na svetlobi se fitokrom konformacijsko spremeni in preide v jedro. Tam v sodelovanju z drugimi molekulami inhibira negativne regulatorje, bodisi s preprečitvijo njihovega encimskega delovanja, bodisi s sodelovanjem pri njihovi razgradnji. Posledično lahko postanejo aktivni pozitivni regulatorji, ki se vežejo poleg promotorskih regij na DNA in tako aktivirajo prepisovanje genov za fotomorfogenezo.

===Tina Zavodnik: Mehanična transdukcija in proteini Piezo===
Praktično vsi organizmi so občutljivi na mehanske dražljaje. Fizične sile regulirajo številne fiziološke procese, nezadostni oz. napačni odzivi nanje pa lahko vodijo do številnih okvar ali bolezni. Naše zaznavanje teh dražljajev in njihova pretvorba v biokemijske informacije, imenovana tudi mehanotransdukcija, sta torej ključna za dojemanje sveta okoli nas in odzivanje nanj. To nam omogočajo čutila, navadno sestavljena iz čutilne celice ali receptorja in senzoričnega nevrona. Zaradi obstoja mnogo različnih vrst in intenzitet dražljajev so se tudi čutnice in senzorični nevroni specializirali v zaznavanje vsakega od stimulusov. Merklovi živčni končiči so mehanski receptorji, sposobni zaznavati nežen pritisk na koži. To pa jim omogočajo posebni ionski kanalčki, imenovani proteini Piezo. Nežen dotik na površini kože sproži prenos mehaničnega dražljaja do Merklovih živčnih končičev, kjer se aktivira kanalček Piezo2 v Merklovi celici. Aktivacija kanalčka omogoči prehod kalcijevih in natrijevih ionov v notranjost celice. Merklova celica se depolarizira in sproži akcijski potencial v pripadajočem aferentnem nevronu. Mehanični dražljaj pa aktivira tudi kanalčke Piezo2 v membrani SA1 aferentnega nevrona in s tem sproži dodatno vzpostavitev akcijskega potenciala. Pred kratkim je bila odkrita struktura proteina Piezo, kar pa še vedno ne razkriva natančnega mehanizma aktivacije ionskega kanalčka zaradi mehanskega dražljaja. Najverjetneje se zaradi mehanskega dražljaja spremeni konformacija proteina Piezo. Kanalček se odpre in ioni lahko pod vplivom koncentracijskega gradienta prehajajo skozi membrano.

===Doroteja Armič: Bifunkcionalen encim PFK-2/FBPaza-2 in njegova vloga v metabolizmu glukoze===
PFK-2/FBPaza-2 (fosfofruktokinaza-2/fruktoza-2,6-bisfosfataza) je eden izmed encimov, ki sodelujejo pri regulaciji metabolizma glukoze v evkariontih. Je bifunkcionalen encim, ki uravnava, ali bo v celici potekala glikoliza ali glukoneogeneza. Za to je odgovoren posredno, saj regulira količino alosteričnega efektorja encimov PFK-1 in FBPaza-1 – fruktoze-2,6-bisfosfata. En encim ima dve katalitični domeni. Kinazna domena katalizira sintezo, bisfosfatazna domena pa razgradnjo fruktoze-2,6-bisfosfata. Delovanje encima je regulirano na nivoju posttranslacijske modifikacije, in sicer s fosforilacijo/defosforilacijo. Pri sesalcih obstajajo štirje različni izocimi, vsakega kodira drug gen. Ti izocimi so jetrni, srčni, možganski in izocim testisov. Vsak izocim pa ima več izooblik, ki nastanejo z alternativnim spajanjem eksonov. Izooblike se razlikujejo v regulatornih regijah. Fosforilirajo in defosforilirajo jih drugačne kinaze, nekatere izooblike pa fosforilacijskih mest sploh nimajo. Encim PFK-2/FBPaza-2 je nastal s fuzijo dveh genov. Encim se je razvil tako, da je funkcionalen samo, če sta prisotni obe domeni. Tudi pri tripanosomatidih in kvasovkah, kjer je encim monofunkcionalen, je zato še vedno zapis za obe domeni. V razvoju je prišlo do različnih izooblik v različnih tkivih oziroma organizmih zaradi drugačnih potreb za metabolizem glukoze. Ker PFK-2/FBPaza uravnava glikolizo in glukoneogenezo, bi lahko tarčno reguliranje encima postalo nov način zdravljenja diabetesa.

===Martina Lokar: Biotinilacija proteinov ===
Biotin je pomemben encimski kofaktor, saj olajša prenos karboksilne skupine med metaboliti pri karboksilaciji, dekarboksilaciji in transkarboksilaciji. Biotin protein ligaza (BPL) ga v procesu biotinilacije veže na tarčni biotin-odvisen encim. Biotinilacija je dvostopenjski proces, pri katerem pride v prvem koraku do ligacije biotina in ATP ter nastanka intermediata biotinil-AMP. V drugem koraku se biotin iz biotinil-AMP veže na tarčni encim in pride do sprostitve molekule AMP. Ker je biotin v naravi redek, organizmi natančno uravnavajo njegovo porabo. Evkarionti so nezmožni sami sintetizirati biotin, zato ga pridobivajo iz okolja. Zadostno količino ohranjajo v biotinskem ciklu z reciklacijo biotina iz biotin-odvisnih encimov. Pri metaboličnih procesih sesalcev sodeluje pet biotin-odvisnih karboksilaz, ki so v splošnem zgrajene iz treh domen: domene BC, domene CT in domene BCCD. Biotin je kovalentno vezan na lizinski ostanek v domeni BCCD in se preko modela zibajoče roke ali modela zibajoče domene med katalizo translocira iz domene BC v domeno CT. Karboksilaze katalizirajo reakcijo prenosa karboksilne skupine na substrat v dveh korakih. Najprej se v domeni BC karboksilna skupina veže na biotin. Slednji se nato premakne v domeno CT, kjer se karboksilna skupina iz biotina prenese na substrat. Če telo ni sposobno uravnavati in izkoriščati zaloge biotina, človek oboli za boleznijo MCD.

===Lara Drinovec: AMPK in avtofagija pri glukoznem/glikogenem metabolizmu===
Glukozni/glikogeni metabolizem je primarna metabolična pot, ki je uravnavana na najrazličnejših nivojih, glede na potrebe celice. Znano je, da raven glukoze v krvi uravnavata dva hormona: inzulin, ki omogoča prevzem glukoze v celico in glukagon z nasprotno učinkovitostjo. Metabolni regulator, ki deluje od inzulina neodvisno in se odziva na krčenje mišic, je AMPK (AMP-aktivirana protein kinaza). Aktivira jo lahko AMP, tako da se veže na vezavno mesto na eni izmed treh podenot AMPK. Spremembo koncentracije AMP lahko AMPK zazna hitreje kot spremembo koncentracije ATP. Aktivirana AMPK inhibira anabolne poti in aktivira katabolne procese, ter tako vzdržuje energijsko homoestazo v aktivnih celicah. Pomembno vlogo pri vzdrževanju nivoja glukoze v celici igra tudi avtofagija, ki povzroči razgradnjo hranilnih snovi, kot so glikogen in lipidne kapljice, s tem zagotovi celici zadostno količino glukoze, in tako deluje kot nadomesten proces za glukoneogenezo. Tudi ta proces je v celicah uravnavan, in sicer z različnimi signalnimi molekulami. Mnogo bolezni, kot sta na primer diabetes in rak, sta tesno povezani z nefunkcionalnostjo nekaterih metaboličnih senzorjev ali avtofagije, zato je razumevanje njihovih funkcionalnih interakcij osnova za nove terapevtske možnosti.

=== Tina Kolenc Milavec: Intermediati Krebsovega cikla kot signalne molekule pri vnetnem in protivnetnem odgovoru===
Intermediati Krebsovega cikla imajo v celici pomembno vlogo, saj ne služijo le kot vmesni produkti v procesu nastanka molekul ATP, temveč tudi kot prekurzorji za sintezo drugih biološko pomembnih molekul ter kot signalne molekule v številnih metaboličnih poteh. Ko se na tolične receptorje (TLR4) na površini makrofaga vežejo s patogeni povezani molekulski vzorci, pride v celici do preklopa metabolizma z oksidativne fosforilacije na glikolizo za namene pridobivanja energije v obliki ATP, kar neposredno vpliva na vnetno stanje v celici. Krebsov cikel, ki sedaj nima več vloge zagotavljanja energije celici, se prekine na dveh mestih: za sukcinatom ter pri izocitrat dehidrogenazi, kar omogoči, da intermediati citratnega cikla delujejo kot signalne molekule. Pri vnetnem odzivu organizma na patogene sta zelo pomembna sukcinat in citrat. Prvi povzroči povišanje koncentracije Hif1α v celici ter nastanek reaktivnih kisikovih spojin (ROS) zaradi vzvratnega elektronskega transporta, citrat pa deluje kot substrat za verigo reakcij, ki prav tako vodijo do nastanka ROS. Pri ponovni vzpostavitvi normalnih razmer v celici po uspešni odstranitvi patogenov pa ima pomembno vlogo itakonat - molekula, ki nastane iz cis-akonitata. Ta vpliva na tri pomembne molekule (sukcinat dehidrogenazo, Nrf2 ter ATF3), ki sprožijo vsaka svojo kaskado reakcij protivnetnega odgovora.

===Valeriya Musina: Vpliv intermediatov Krebsovega cikla na celične procese===
Krebsov cikel je bil oblikovan osedemdeset let nazaj, vloge njegovih inermediatov, zlasti sukcinata in fumarata, pa so bile odkrite nedavno. V zadnjem času so bile narejene številne raziskave človeških bolezni, zlasti niza specifičnih vrst raka, ki so razkrile pomembne vloge intermediatov Krebsovega cikla pri metilaciji genov in s tem pri preoblikovanju celic. Intermediati Krebsovega cikla lahko delujejo kot primarni substrati, signalne molekule ali sodelujejo pri posttranslacijskih modifikacijah. Vedno več dokazov kaže, da ima epigenetika pomembno vlogo pri regulaciji dobe zdravja, in je vključena v proces staranja. 2-oksoglutarat (α-ketoglutarat) je ključni metabolit v Krebsovem ciklu, vendar je tudi obvezen substrat za 2-oksoglutarat odvisne dioksigenaze (2-OGDO). Družina encimov 2-OGDO vključuje glavne encime za demetilacijo DNA in histonov, encime Ten-Eleven translocation (TETs) in encime z domeno Jumonji C (JmjC). Poleg tega lahko člani družine 2-OGDO regulirajo sintezo kolagena in odzive na hipoksično okolje tudi na neepigenetski način. 2-oksoglutarat je substrat 2-oksoglutarat dehidrogenaz (2-OGDH), zato lahko motnje v funkciji 2-OGDH v Krebsovem ciklu povzročijo globalne degenerativne spremembe v strukturi kromatina. Sukcinat in fumarat močna inhibitorja 2-OGDO encimov, zato ravnotežje reakcij v Krebsovem ciklu lahko vpliva na raven metilacije DNA in histonov ter tako nadzira izražanje genov.

===Marko Pavleković: Vloga sukcinata kot ligand z G proteini vezanega receptorja GPR91===
Znano je, da je cikel citronske kisline osrednjega pomena za presnovo celic in energetsko homeostazo. Vendar marsikateri intermediat cikla igra vlogo tudi v drugih procesih v telesu. Na primer sukcinat deluje kot ekstracelularni ligand z vezavo na z G proteinom vezan receptor, znan kot GPR91, izražen v ledvicah, jetrih, srcu, retinalnih celicah in morda v številnih drugih tkivih, kar vodi do širokega nabora fizioloških in patoloških učinkov. V normalnih pogojih se sukcinata ne sintetizira dovolj, da bi lahko aktiviral GPR91, šele v pogojih kot so ishemija, diabetes in hipoksija, sukcinata nastane dovolj. Ker pa sukcinat nastaja v matriksu mitohondrija mora na poti do receptorja, ki se nahaja na zunanji strani celic, prečkati še tri membrane. Skozi GPR91 je sukcinat vključen v funkcije, kot so uravnavanje krvnega tlaka, zaviranje lipolize v belem maščobnem tkivu, razvoj vaskularizacije mrežnice, srčna hipertrofija in aktivacija zvezdastih jetrnih celic z ishemičnimi hepatociti. Zaradi tega je sukcinatni receptor obetajoč cilj za zdravila za preprečevanje teh neželenih patoloških učinkov. Nedavni razvoj antagonistov, specifičnih za SUCNR1, odpira nove možnosti za raziskave v modelih za te motnje in lahko sčasoma zagotovi nove možnosti za zdravljenje bolnikov.

===Klementina Polanec: Sirtuini kot regulatorji oksidacije maščobnih kislin===
Sirtuini so družina visoko ohranjenih proteinov (SIRT1-SIRT7 pri sesalcih), ki imajo regulatorno vlogo v metabolizmu in staranju. Delujejo kot regulatorji oksidacije maščobnih kislin v odgovor na številne strese za celico, kot so omejitev kalorij, postenje, mraz. Ker se zniža nivo ATP v celici in je glukoze premalo, se poveča razgradnja glikogena, hkrati pa se pospeši oksidacija maščobnih kislin v mišicah in jetrih. Do nedavnega je veljajo prepričanje, da je aktivnost sirtuinov odvisna le od koncentracije NAD+ v celici. Raziskovalci so pred kratkim dokazali, da se lahko SIRT1 aktivira tudi s fosforilacijo, ki jo izvede protein kinaza A (PKA). Ko so sirtuini aktivirani, delujejo v glavnem kot deacetilaze številnih encimov, s čimer jih aktivirajo. SIRT1 tako deacetilira PGC1α, ki pospeši izražanje tarčnih genov, ki so povezani z oksidacijo maščobnih kislin. SIRT3 pa odvisno od koncentracije NAD+ deacetilira in s tem aktivira LCAD (long-chain acyl-CoA dehydrogenase). To je pri miših ključen encim, ki sodeluje v oksidaciji dolgoverižnih maščobnih kislin. S pospešeno oksidacijo celica dvigne nivo ATP in ponovno vzpostavi homeostazo. Sirtuini so zato lahko potencialna tarča za zdravljenje motenj v oksidaciji maščobnih kislin ter tudi za preprečevanje prekomerne teže oziroma debelosti.

BIO2 Seminar 2018

2018-11-16T07:00:07Z

KlementinaP: /* Seznam seminarjev */

= Biokemijski seminar =
doc. dr. Gregor Gunčar, K2.022

== Seznam seminarjev ==
{| {{table}}
| align="left" style="background:#f0f0f0;"|'''ime in priimek'''
| align="left" style="background:#f0f0f0;"|'''poglavje'''
| align="left" style="background:#f0f0f0;"|'''naslov seminarja'''
| align="left" style="background:#f0f0f0;"|'''recenzent 1'''
| align="left" style="background:#f0f0f0;"|'''recenzent 2'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''datum oddaje'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''datum recenzije'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''datum predstavitve'''
|-
| Eva Gartner || 12 || [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2018#Eva_Gartner:_Wnt_signalizacija_in_njena_vloga_pri_sr.C4.8Dni_fibrozi Wnt signalizacija in njena vloga pri srčni fibrozi] || Anamarija Agnič || Anastasija Nechevska || 15/10/2018 || 16/10/2018 || 17/10/2018
|-
| Aljaž Bratina || 12 || [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2018#Alja.C5.BE_Bratina:_Pomen_razli.C4.8Dnih_signalnih_poti_pri_staranju Pomen različnih signalnih poti pri staranju]|| Lara Drinovec || Liza Ulčakar || 15/10/2018 || 16/10/2018 || 17/10/2018
|-
| Karmen Mlinar || 12 || [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2018#Karmen_Mlinar:_Signalizacija_in_odzivi_na_abiotski_stres_pri_rastlinah Signalizacija in odzivi na abiotski stres v rastlinah] || Luka Gnidovec || Maja Škof || 15/10/2018 || 16/10/2018 || 17/10/2018
|-
| Tina Zavodnik || 12 || [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2018#Tina_Zavodnik:_Mehani.C4.8Dna_transdukcija_in_proteini_Piezo Mehanična transdukcija in proteini Piezo] || Jernej Imperl || Ajda Godec || 19/10/2018 || 22/10/2018 || 24/10/2018
|-
| Meta Kodrič || 12 || [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2018#Meta_Kodri.C4.8D:_Svetlobne_signalne_poti_za_uravnavanje_fotomorfogeneze Svetlobne signalne poti za uravnavanje fotomorfogeneze] || Laura Gašperšič || Neža Blaznik || 19/10/2018 || 22/10/2018 || 24/10/2018
|-
| Neža Žerjav || 12 || [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2018#Ne.C5.BEa_.C5.BDerjav:_Vloga_kaspaz_pri_celi.C4.8Dni_smrti Vloga kaspaz pri celični smrti] || Nika Boštic || Urša Štrancar || 19/10/2018 || 22/10/2018 || 24/10/2018
|-
| Doroteja Armič || 14-15 || [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2018#Doroteja_Armi.C4.8D:_Bifunkcionalen_encim_PFK-2.2FFBPaza-2_in_njegova_vloga_v_metabolizmu_glukoze Bifunkcionalen encim PFK-2/FBPaza-2 in njegova vloga v metabolizmu glukoze] || Eva Gartner || Anamarija Agnič || 02/11/2018 || 05/11/2018 || 07/11/2018
|-
| Lara Drinovec || 14-15 || AMPK in avtofagija pri glukoznem/glikogenem metabolizmu || Aljaž Bratina || Barbara Jaklič || 02/11/2018 || 05/11/2018 || 07/11/2018
|-
| Martina Lokar || 14-15 || [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2018#Martina_Lokar:_Biotinilacija_proteinov Biotinilacija proteinov]|| Karmen Mlinar || Luka Gnidovec || 02/11/2018 || 05/11/2018 || 07/11/2018
|-
| Marko Pavleković || 16 || Vloga sukcinata kot ligand z G proteini vezanega receptorja GPR91 || Tina Zavodnik || Jernej Imperl || 09/11/2018 || 12/11/2018 || 14/11/2018
|-
| Valeriya Musina || 16 || Vpliv intermediatov Krebsovega cikla na celične procese || Meta Kodrič || Laura Gašperšič || 09/11/2018 || 12/11/2018 || 14/11/2018
|-
| Tina Kolenc Milavec || 16 || [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2018#Tina_Kolenc_Milavec:_Intermediati_Krebsovega_cikla_kot_signalne_molekule_pri_vnetnem_in_protivnetnem_odgovoru Intermediati Krebsovega cikla kot signalne molekule pri vnetnem in protivnetnem odgovoru]|| Neža Žerjav || Nika Boštic || 09/11/2018 || 12/11/2018 || 14/11/2018
|-
| Andrej Špenko || 17 || Regulacija oksidacije maščobnih kislin v skeletnih mišicah || Doroteja Armič || Eva Gartner || 16/11/2018 || 19/11/2018 || 21/11/2018
|-
| Tadej Medved || 17 || Vpliv oksidacije maščobnih kislin na usodo celic || Sanja Stanković || Aljaž Bratina || 16/11/2018 || 19/11/2018 || 21/11/2018
|-
| Klementina Polanec || 17 || Sirtuini kot regulatorji oksidacije maščobnih kislin || Martina Lokar || Karmen Mlinar || 16/11/2018 || 19/11/2018 || 21/11/2018
|-
| Rebeka Dajčman || 17 || Ketonska telesa kot signalni metaboliti || Marko Pavleković || Tina Zavodnik || 16/11/2018 || 19/11/2018 || 21/11/2018
|-
| Sumeja Kudelić || 18 || Vpliv cistationin γ-liaze in ATF4 pri Huntingtonovi bolezni|| Valeriya Musina || Meta Kodrič || 23/11/2018 || 26/11/2018 || 28/11/2018
|-
| Matija Ruparčič || 18 || moj naslov || Tina Kolenc Milavec || Neža Žerjav || 23/11/2018 || 26/11/2018 || 28/11/2018
|-
| Maks Kumek || 18 || moj naslov || Andrej Špenko || Doroteja Armič || 23/11/2018 || 26/11/2018 || 28/11/2018
|-
| Anže Šumah || 19 || moj naslov || Tadej Medved || Sanja Stanković || 30/11/2018 || 03/12/2018 || 05/12/2018
|-
| Barbara Jaklič || 19 || moj naslov || Klementina Polanec || Martina Lokar || 30/11/2018 || 03/12/2018 || 05/12/2018
|-
| Gašper Anton Komatar || 19 || Kako športna vadba pospeši biosintezo mitohondrijev in vpliva na zdravje || Rebeka Dajčman || Marko Pavleković || 30/11/2018 || 03/12/2018 || 05/12/2018
|-
| Praznik Liza || 19 || moj naslov || Sumeja Kudelić || Valeriya Musina || 30/11/2018 || 03/12/2018 || 05/12/2018
|-
| Lara Hrvatin || 20 || Fotorespiracija in načini izboljšanja fotosinteze || Matija Ruparčič || Tina Kolenc Milavec || 07/12/2018 || 10/12/2018 || 12/12/2018
|-
| Sonja Gabrijelčič || 20 || moj naslov || Maks Kumek || Andrej Špenko || 07/12/2018 || 10/12/2018 || 12/12/2018
|-
| Anastasija Nechevska || 20 || moj naslov || Anže Šumah || Tadej Medved || 07/12/2018 || 10/12/2018 || 12/12/2018
|-
| Liza Ulčakar || 21 || Vloga interakcij med lipidnimi kapljicami in organeli pri homeostazi lipidov|| Barbara Jaklič || Klementina Polanec || 14/12/2018 || 17/12/2018 || 19/12/2018
|-
| Maja Škof || 21 || moj naslov || Gašper Anton Komatar || Rebeka Dajčman || 14/12/2018 || 17/12/2018 || 19/12/2018
|-
| Ajda Godec || 21 || Biosinteza leukotriena B4 || Praznik Liza || Sumeja Kudelić || 14/12/2018 || 17/12/2018 || 19/12/2018
|-
| Neža Blaznik || 22 || moj naslov || Lara Hrvatin || Matija Ruparčič || 04/01/2019 || 07/01/2019 || 09/01/2019
|-
| Urša Štrancar || 22 || moj naslov || Sonja Gabrijelčič || Maks Kumek || 04/01/2019 || 07/01/2019 || 09/01/2019
|-
| Anamarija Agnič || 22 || moj naslov || Anastasija Nechevska || Anže Šumah || 04/01/2019 || 07/01/2019 || 09/01/2019
|-
| Sanja Stanković || 23 || moj naslov || Liza Ulčakar || Lara Drinovec|| 04/01/2019 || 07/01/2019 || 09/01/2019
|-
| Luka Gnidovec || 23 || moj naslov || Maja Škof || Gašper Anton Komatar || 11/01/2019 || 14/01/2019 || 16/01/2019
|-
| Jernej Imperl || 23 || moj naslov || Ajda Godec || Praznik Liza || 11/01/2019 || 14/01/2019 || 16/01/2019
|-
| Laura Gašperšič || 23 || moj naslov || Neža Blaznik || Lara Hrvatin || 11/01/2019 || 14/01/2019 || 16/01/2019
|-
| Nika Boštic || 23 || moj naslov || Urša Štrancar || Sonja Gabrijelčič || 11/01/2019 || 14/01/2019 || 16/01/2019
|}

*številka v okencu za temo pomeni poglavje v Lehningerju, v katerega naj izbrana tema spada
Sporočite mi morebitne napake ali če vas nisem razporedil.

== Gradivo za predavanja ==
Gradivo za predavanja in seminarje najdete na http://bio.ijs.si/~zajec/bio2/
username: bio2
password: samozame

==Naloga==
'''Vaša naloga za seminar je: '''
Samostojno pripraviti seminar o seminarski temi, ki vam je bila dodeljena. Za osnovo morate vzeti pregledni članek iz revije, ki ima faktor vpliva nad 5 (npr. [http://www.sciencedirect.com/science/journal/09680004/ TIBS]. Poiskati morate še vsaj tri znanstvene članke, ki se nanašajo na opisano temo in jih uporabiti kot podlago za seminarsko nalogo! Članki so dostopni [http://93.174.95.27/scimag/ tukaj].

Za pripravo seminarja velja naslednje: 
* [[BIO2 Povzetki seminarjev 2018|Povzetek seminarja]] opišete na wikiju '''v 200 besedah''' (+- dvajset besed) - najkasneje do dne ko morate oddati seminar recenzentom.
* Povezavo do povzetka vnesete v tabelo seminarjev tekočega letnika.
* Seminar pripravite v obliki seminarske naloge na ~5-12 straneh A4 (pisava 12, enojni razmak, 2,5 cm robovi). Zelo pomembno je, da je obseg od 2700 do 3000 besed , a ne več kot 3500 besed. Seminarska naloga mora vsebovati najmanj tri slike. Eno sliko morate narisati sami in to pod sliko posebej označiti. Slika mora imeti legendo in v besedilu mora biti na ustreznem mestu sklic na sliko. 
* Seminar oddajte do datuma oddaje, ki je naveden v tabeli v elektronski obliki z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/ tega obrazca].
* Vsi seminarji so v elektronski obliki dostopni [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/bioseminar/ tukaj].
* Recenzenti do dneva določenega v tabeli določijo popravke (v elektronski obliki) in podajo oceno pisnega dela. Popravljen seminar oddajte z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/ tega obrazca].
* Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Za predstavitev je na voljo 20 minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni.
* Predstavitvi sledi razprava. Recenzenti podajo oceno predstavitve in postavijo najmanj dve vprašanji.Vsi ostali morajo postaviti še dve dodatni vprašanji v toku celega seminarskega obdobja. Vprašanja, ki ste jih postavili vpišite na [https://docs.google.com/forms/d/e/1FAIpQLSdV9OFlNzI3XyS8FRGnuIbG89gwH_36uwz29ocigV--2CXSbQ/viewform tukaj].
* Na dan predstavitve morate docentu še pred predstavitvijo oddati končno (popravljeno) in natisnjeno verzijo seminarja v enem izvodu, elektronsko verzijo seminarja in predstavitev pa oddati na strežnik na dan predstavitve do polnoči.
* Seminarska naloga in povzetek morajo biti v slovenskem jeziku, razen za študente, katerih materni jezik ni slovenščina. Ti lahko oddajo seminar v angleškem jeziku.

==Imena datotek==
Prosim vas, da vse datoteke, ki mi jih pošiljate poimenujete po naslednjem receptu:
* 312_BIO_Priimek_Ime.doc(x) za seminar, npr. 312_BIO_Guncar_Gregor.docx
* 312_BIO_Priimek_ime_final.doc(x) za končno verzijo seminarja
* 312_BIO_Priimek_Ime_rec_Priimek2.doc(x) za recenzijo, kjer je Priimek2 priimek recenzenta, npr. 312_BIO_Guncar_Gregor_rec_Scott.docx (če se pišete Scott in odajate recenzijo za seminar, ki ga je napisal Gunčar)
* 312_BIO_Priimek_Ime.ppt(x) za prezentacijo, npr 312_BIO_Guncar_Gregor.pptx
* 312_BIO_Priimek_ime_poprava.doc(x) za popravljeno končno verzijo seminarja, če so popravki manjši

==Ocenjevanje seminarjev==
Recenzenti ocenijo seminar tako, da izpolnijo [https://docs.google.com/forms/d/1EQDYwFO-DEzZ2R7jf8DhLqIeV4FFxRd3-ScceEASpt4/viewform recenzentsko poročilo] na spletu. Recenzentsko poročilo morate oddati najkasneje do 21:00, en dan pred predstavitvijo seminarja.

== Mnenje o predstavitvi ==
Vsak posameznik odda svoje mnenje o predstavitvi takoj po predstavitvi z online glasovanjem.

==Urejanje spletnih strani na wikiju==
Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''

==Citiranje virov==
Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se držite ene same. V seminarskih nalogah in diplomskih nalogah FKKT uprabljajte shemo citiranja, ki je pobarvana zeleno.
Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati.
Za citate v naravoslovju je najpogostejše citiranje po pravilniku ISO 690. [http://www.zveza-zotks.si/gzm/dokumenti/literatura.html Pravila], ki upoštevajo omenjeni standard, so pripravili pri ZTKS. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati. 
'''Citiranje knjig:''' 
Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica. 
Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN. 

Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005. 
Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4. 
Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.).

'''Citiranje člankov:''' 
Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani. 
Lartigue, C., Glass, J. I., Alperovich, N., Pieper, R., Parmar, P. P., Hutchison III, C. A., Smith, H. O. in Venter, J. C.
Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, 317, str. 632-638.

Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole: 
Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani. 
Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.

Revija Science uporablja skrajšani zapis: 
C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007) 

V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne). Navesti morate tudi vse avtorje dela, razen v primeru, ko jih je 10 ali več. Takrat navedite le prvih devet, za ostale pa uporabite okrajšavo in sod. (in sodelavci). Pred zadnjim avtorjem naj bo vedno besedica "in".

'''Citiranje spletnih virov:''' 
Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov 
strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life 
Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.

TBK2018-seminar

2018-05-27T19:48:04Z

KlementinaP: /* Seznam seminarjev */

= Temelji biokemije- seminar =

Seminarje vodi prof. dr. Brigita Lenarčič. Seminarji so obvezni.

Ocena seminarjev (6-10) predstavlja enako število odstotkov, ki se prišteje h končni pisni oceni izpita.
Stran na strežniku s seminarskimi nalogami je zaščitena.
Uporabniško ime je: tbk, password pa: samozame## "##" sta dve številki, ki ju izveste na predavanjih.
Tudi za urejanje Wiki strani potrebujete geslo, ki se od zgornjega razlikuje. Postopek pridobitve Wiki uporabniškega imena in gesla je opisan [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Main_Page tukaj].

== Seznam seminarjev ==

{| border="1" cellpadding="4" cellspacing="0" style="border:#c9c9c9 1px solid; margin: 1em 1em 1em 0; border-collapse: collapse;"
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Ime in priimek'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Naslov seminarja'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Povezava'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Rok za oddajo'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Rok za recenzijo'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Datum predstavitve'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 1'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 2'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 3'''
|-
| Anna Scott||Moj naslov v slovenščini||http://www.bioscirep.org/content/36/1/e00291.long||28.10.||05.11.||07.11.||r1||r2||r3
|-
| Doroteja Armič || Pretvorba mišjih fibroblastov v pluripotentne matične celice s pomočjo tehnologije CRISPR || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/01/180118162449.htm || 27.02. || 02.03. || 05.03. || Martina Lokar || Liza Ulčakar || Zoja Siter
|-
| Valeriya Musina || Metalopeptid bakrov(II) fenantrolin tarčno onemogoči delovanje mitohondrijev v matičnih celicah raka dojke || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/12/171213124751.htm || 27.02. || 02.03. || 05.03. || Nika Boštic || Tiana Karmen Kokalj || Aljaž Bratina
|-
| Dea Simonič || Sprožilci avtoimunskih bolezni in vzroki za nekontrolirano širjenje le-teh po telesu ||https://www.sciencedaily.com/releases/2017/08/170824141207.htm|| 27.02. || 02.03. || 05.03. || Sumeja Kudelić || Jernej Imperl || Anamarija Agnič
|-
| Neža Štremfelj ||Delovanje inzulinskih receptorjev||https://www.sciencedaily.com/releases/2018/02/180219103256.htm|| 27.02. || 02.03. || 05.03. || Luka Gnidovec || Matija Ruparčič || Simona Gorgievska
|-
| Gašper Komatar || Tvorba kompleksa receptorjev ApoER2, ephirinB2 in AMPAR, ki jih povezuje GRIP1, sodeluje pri tvorbi spomina || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/10/171009093207.htm || 06.03. || 09.03. || 12.03. || Lara Hrvatin || Tiana Karmen Kokalj || Matej Jereb
|-
| Marko Pavleković || Prehajanje imunskih celic, povzročiteljic multiple skleroze, skozi krvno-možgansko pregrado || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/11/171121155811.htm || 06.03. || 09.03. || 12.03. || Klementina Polanec || Meta Kodrič || Lara Drinovec
|-
| Laura Gašperšič || Alzheimerjeva bolezen: povrnitev zmožnosti pomnjenja z inhibicijo interakcije med Sp3 in HDAC2 || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/08/170808150001.htm || 06.03. || 09.03. || 12.03. || Karmen Mlinar || Ana Menegalija || Maks Kumek
|-
| Rebeka Dajčman || Več mehanizmov poganja dinamiko kalcijevega signala okoli lasersko povzročene rane epitelija || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/10/171003124646.htm || 06.03. || 09.03. || 12.03. || Ula Nikolaja Ratajec || Andreja Marija Belič || Neža Blaznik
|-
| Maja Škof || Pomen S-proteinov pri prilagajanju koronavirusov na okolje. || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/11/171127105937.htm || 13.03. || 16.03. || 19.03. || Doroteja Armič || Barbara Jaklič || Liza Ulčakar
|-
| Tina Kolenc Milavec || Vezava kalcija na karboksilni konec α-sinukleina uravnava interakcije med sinaptičnimi vezikli || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/02/180219071758.htm || 13.03. || 16.03. || 19.03. || Valeriya Musina || Eva Gartner || Jana Rajchevska
|-
| Tina Zavodnik || Disfunkcionalni mitohondriji s pomočjo ROS zavirajo translacijsko aktivnost || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/02/180202112629.htm || 13.03. || 16.03. || 19.03. || Dea Simonič || Martina Lokar || Jernej Imperl
|-
| Tadej Medved || Identifikacija vezavnih mest proteinov WASP na aktinski ojedritveni kompleks Arp2/3 || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/03/180305130632.htm || 13.03. || 16.03. || 19.03. || Neža Štremfelj || Nika Boštic || Matija Ruparčič
|-
| Bogdan Jovićević || || || 20.03. || 23.03. || 26.03. || Laura Gašperšič || Lara Hrvatin || Ana Menegalija
|-
| Polona Kalan || || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/02/180214111055.htm || 20.03. || 23.03. || 26.03. || Rebeka Dajčman || Klementina Polanec || Andreja Marija Belič
|-
| Liza Praznik ||Vpliv šaperono Skp in SurA na zvijanje proteinov FhuA v terciarno strukturo ||https://www.sciencedaily.com/releases/2015/09/150907113757.htm || 20.03. || 23.03. || 26.03. || Maja Škof || Karmen Mlinar || Barbara Jaklič
|-
| Anže Šumah || Razvoj genskega senzorja za uničevanje celic s pomanjkanjem proteina p53 || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/11/171114104201.htm || 20.03. || 23.03. || 26.03. || Tina Kolenc Milavec || Ula Nikolaja Ratajec || Eva Gartner
|-
| Neža Žerjav|| Dodajanje enega samega nukleotida omejuje aktivnost človeške telomeraze ||https://www.sciencedaily.com/releases/2018/02/180227142114.htm || 03.04. || 06.04. || 09.04. || Tina Zavodnik || Doroteja Armič || Martina Lokar
|-
| Urša Štrancar || Predstavitev združitve avtofagosoma in lizosoma s pomočjo supermolekularnega para FRET || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/02/180219103254.htm || 03.04. || 06.04. || 09.04. || Tadej Medved || Valeriya Musina || Nika Boštic
|-
| Zoja Siter || || || 03.04. || 06.04. || 09.04. || Neža Žerjav || Dea Simonič || Sumeja Kudelić
|-
| Aljaž Bratina || Intrinzična destabilizacija ribosoma || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/11/171120101314.htm || 03.04. || 06.04. || 09.04. || Anastasija Nechevska || Neža Štremfelj || Luka Gnidovec
|-
| Anamarija Agnič || ATP-aza P4 s premeščanjem fosfolipidov uravnava uvihanost membrane || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/03/180329141014.htm || 10.04. || 13.04. || 16.04. || Bogdan Jovićević || Sumeja Kudelić || Lara Hrvatin
|-
| Simona Gorgievska || Optical tools to detect metabolic changes linked to disease || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/03/180307161351.htm|| 10.04. || 13.04. || 16.04. || Polona Kalan || Marko Pavleković || Klementina Polanec
|-
| Matej Jereb || Gradnja človeške pluripotentne matične celice v funkcionalno skeletno mišično tkivo|| https://www.sciencedaily.com/releases/2018/01/180109104707.htm || 10.04. || 13.04. || 16.04. || Liza Praznik || Laura Gašperšič || Karmen Mlinar
|-
| Lara Drinovec || Tavrin pomaga obnoviti zaradi multiple skleroze poškodovane celice || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/12/171208143024.htm || 10.04. || 13.04. || 16.04. || Anže Šumah || Rebeka Dajčman || Ula Nikolaja Ratajec
|-
| Maks Kumek || Dinamični izvor sprememb specifčne toplote v encimsko kataliziranih reakcijah || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/03/180321090854.htm || 17.04. || 20.04. || 23.04. || Marko Pavleković || Maja Škof || Doroteja Armič
|-
| Neža Blaznik || Glikozilirana sialična kislina na protitelesu IgA inhibira virus influence tipa A || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/04/180403111203.htm || 17.04. || 20.04. || 23.04. || Urša Štrancar || Tina Kolenc Milavec || Valeriya Musina
|-
| Liza Ulčakar || Kombinirana DNA-RNA/antigen nanocepiva - učinkovita imunoterapevtska metoda ||https://www.sciencedaily.com/releases/2017/11/171129163851.htm || 17.04. || 20.04. || 23.04. || Zoja Siter || Tina Zavodnik || Dea Simonič
|-
| Anastasija Nechevska || || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/03/180319155730.htm || 17.04. || 20.04. || 23.04. || Aljaž Bratina || Tadej Medved || Neža Štremfelj
|-
| Jernej Imperl || Optimizacija protimikrobnih peptidov s pomočjo virtualnih metod || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/04/180416085922.htm || 23.04. || 26.04. || 07.05. || Anamarija Agnič || Neža Žerjav || Luka Gnidovec
|-
| Matija Ruparčič || Od strupenih kompleksov do zlatih zrnc s ''Cupriavidus metallidurans'' || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/01/180131095453.htm || 23.04. || 26.04. || 07.05. || Simona Gorgievska || Anastasija Nechevska || Marko Pavleković
|-
| Tiana Karmen Kokalj || B-1a limfociti spodbujajo oligodendrogenezo med razvojem možganov || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/03/180313091702.htm || 23.04. || 26.04. || 07.05. || Matej Jereb || Bogdan Jovićević || Laura Gašperšič
|-
| Meta Kodrič || Naključna izboljšava bakterijskega encima za razgradnjo plastike || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/04/180416155619.htm || 23.04. || 26.04. || 07.05. || Lara Drinovec || Polona Kalan || Rebeka Dajčman
|-
| Ana Menegalija || METTL3 nova potencialna terapevtska tarča pri akutni mieloični levkemiji || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/11/171127135838.htm || 08.05. || 11.05. || 14.05. || Maks Kumek || Liza Praznik || Maja Škof
|-
| Andreja Marija Belič || || || 08.05. || 11.05. || 14.05. || Neža Blaznik || Anže Šumah || Tina Kolenc Milavec
|-
| Barbara Jaklič || I-motif DNA strukture nastajajo tudi v jedrih človeških celic || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/04/180423135054.htm || 08.05. || 11.05. || 14.05. || Liza Ulčakar || Meta Kodrič || Tina Zavodnik
|-
| Eva Gartner ||Vloga neobičajnega prohibitina pri regulaciji mitohondrijskega membranskega potenciala in razvoju malarije. ||https://www.sciencedaily.com/releases/2018/04/180418111615.htm || 08.05. || 11.05. || 14.05. || Gašper Komatar || Urša Štrancar || Tadej Medved
|-
| Martina Lokar || Mitohondrijska povratna signalizacija pri sesalcih je uravnavana s transkripcijskim kofaktorjem GPS2 preko direktne translokacije od mitohondrija do jedra || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/03/180301144138.htm || 15.05. || 18.05. || 21.05. || Jernej Imperl || Zoja Siter || Neža Žerjav
|-
| Nika Boštic ||Oksidativni stres kontrolira apoptozo regulatornih celic T in njihovo zaviralno aktivnost ter odpornost na blokado PD-L1 v tumorjih ||https://www.sciencedaily.com/releases/2017/10/171030154424.htm || 15.05. || 18.05. || 21.05. || Matija Ruparčič || Aljaž Bratina || Anastasija Nechevska
|-
| Sumeja Kudelić ||Kolaboranti alergijskih reakcij ||https://www.sciencedaily.com/releases/2017/12/171221122927.htm || 15.05. || 18.05. || 21.05. || Tiana Karmen Kokalj || Anamarija Agnič || Bogdan Jovićević
|-
| Luka Gnidovec ||Fibrinogen aktivira BMP signalizacijo v oligodendrocitskih predhodnih celicah in inhibira remielinacijo ||https://www.sciencedaily.com/releases/2017/11/171102124907.htm || 15.05. || 18.05. || 21.05. || Meta Kodrič || Simona Gorgievska || Polona Kalan
|-
| Lara Hrvatin || Nihanje koncentracije, temperature in pH omogoča prebiotično sintezo nukleozidov || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/01/180117131129.htm || 22.05. || 25.05. || 28.05. || Ana Menegalija || Matej Jereb || Liza Praznik
|-
| Klementina Polanec || Knjižnica lantipeptidov v pomoč pri iskanju inhibitorja interakcije protein-protein || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/03/180312115405.htm || 22.05. || 25.05. || 28.05. || Andreja Marija Belič || Lara Drinovec || Anže Šumah
|-
| Karmen Mlinar || Učinkovito in vivo zdravljenje ALI s spiralnimi, amfipatičnimi, peptoidnimi posnemalci proteinov v pljučnem surfaktantu || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/05/180501085533.htm || 22.05. || 25.05. || 28.05. || Barbara Jaklič || Maks Kumek || Gašper Komatar
|-
| Ula Nikolaja Ratajec || ||https://www.sciencedaily.com/releases/2018/02/180208141346.htm || 22.05. || 25.05. || 28.05. || Eva Gartner || Neža Blaznik || Urša Štrancar
|-
| rezerva || || || 29.05. || 01.06. || 04.06. || || ||
|}

==Naloga==
* samostojno pripraviti seminar, katerega tema je novica iz področja biokemije na portalu [http://www.sciencedaily.com ScienceDaily], ki je bila objavljena kasneje kot 1. avgusta 2016. Osnova za seminar naj bo znanstveni članek, ki je podlaga za to novico. Poleg tega članka za seminar uporabite še najmanj pet drugih virov, od teh vsaj še dva druga znanstvena članka, ki se navezujeta na to vsebino.
* članke na temo lahko iščete [https://scholar.google.com/ z Google učenjakom].
* naslov izbrane teme in povezavo do novice vpišite v tabelo seminarjev takoj ko ste si izbrali temo, najkasneje pa en teden pred rokom za oddajo
* [[TBK2017 Povzetki seminarjev|Povzetek seminarja]] opišete na wikiju v približno 200 besedah - najkasneje do dne, ko morate oddati seminar recenzentom.
* Povezavo do povzetka vnesete v tabelo seminarjev tekočega letnika.
* Seminar pripravite v obliki seminarske naloge (pisava Cambria, font 11, enojni razmak, 2,5 cm robovi; tekst naj obsega okoli 1000 besed), vsebuje naj 1-2 sliki. Slika mora imeti legendo in v besedilu mora biti na ustreznem mestu sklic na sliko. Vse uporabljene vire citirajte v tekstu, kot npr. (Nobel, 2010), na koncu pa navedite točen seznam literature, kot je opisano spodaj!
*Celotni seminar naj obsega 2 strani A4 formata (po možnosti dvostransko tiskanje).
* Seminar oddajte do datuma oddaje, ki je naveden v tabeli v elektronski obliki z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/tbk/poslji/ tega obrazca].
* vsi seminarji so v elektronski obliki dostopni [http://bio.ijs.si/~zajec/tbk/poslji//bioseminar/ tukaj].
* Recenzenti do dneva določenega v tabeli določijo popravke in podajo oceno pisnega dela, v predpisanem formatu elektronskega obrazca na internetu.
* Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Za predstavitev je na voljo 12 minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni. Prvi recenzent vodi predstavitve in razpravo ter skrbi za to, da vse poteka v zastavljenih časovnih okvirih.
* Predstavitvi sledi razprava do 8 minut. Sledijo vprašanja prisotnih, recenzenti postavijo vsak vsaj dve vprašanji in na koncu podajo oceno predstavitve.
* En dan pred predstavitvijo na strežnik oddajte tudi končno verzijo. Na dan predstavitve morate oddati tudi končno (popravljeno) in natisnjeno verzijo seminarja v enem izvodu.
* Seminarska naloga in povzetek na wikiju morajo biti v slovenskem jeziku!

==Imena datotek==
Prosim vas, da vse datoteke, ki jih pošiljate poimenujete po spodnjih pravilih. Ne uporabljajte ČŽŠčžš!
Poslati morate naslednje datoteke:
* TBK_2018_Priimek_Ime.doc(x) za seminar, npr. TBK_2017_Guncar_Gregor.docx
* TBK_2018_Priimek_ime_final.doc(x) za končno verzijo seminarja
* TBK_2018_Priimek_Ime_rec_Priimek2.doc(x) za recenzijo, kjer je Priimek2 priimek recenzenta, npr. TBK_2017_Guncar_Gregor_rec_Scott.docx (če se pišete Scott in odajate recenzijo za seminar, ki ga je napisal Gunčar)
* TBK_2018_Priimek_Ime.ppt(x) za prezentacijo, npr TBK_2017_Guncar_Gregor.pptx
* TBK_2018_Priimek_Ime_clanek.pdf za datoteko PDF, ki vsebuje izvirni članek, npr. TBK_2017_Guncar_Gregor_clanek.pdf

==Ocenjevanje seminarjev==
Recenzenti ocenijo seminar tako, da izpolnijo [[https://docs.google.com/forms/d/1Hdg2OHCyG24qwLTnFt09yZTng46RIwaIiUqnKOdsJxQ/viewform recenzentsko poročilo]] na spletu.

== Mnenje o predstavitvi ==
Vsak posameznik '''mora''' oceniti seminar tako, da odda svoje [https://docs.google.com/forms/d/1VvE-jaKikfiDO5Gdybqgp9mf_0uJZfBbIK8PLXKDaS0/viewform mnenje] najkasneje v enem tednu po predstavitvi. Kdor na seminarju ni bil prisoten, mnenja '''ne sme''' oddati.

==Urejanje spletnih strani na wikiju==
Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''

==Faktor vpliva==
Faktor vpliva (angl. impact factor) neke revije pove, kolikokrat so bili v poprečju citirani članki v tej reviji v dveh letih skupaj pred objavo tega faktorja. Faktorje vpliva za posamezno revijo lahko najdete v [http://www.cobiss.si/scripts/cobiss?command=CONNECT&base=JCR COBISS-u]. V polje "Naslov revije" vnesite ime revije za katero želite izvedeti faktor vpliva in pritisnite na gumb POIŠČI. V skrajnem desnem stolpcu se bodo izpisali faktorji vpliva za revije, ki ustrezajo vašim iskalnim kriterijem. Zadetkov za posamezno revijo je več zato, ker so navedeni faktorji vpliva za posamezno leto. Za tekoče leto faktorji vpliva še niso objavljeni, zato se orientirajte po faktorjih vpliva zadnjih par let. Če faktorja vpliva za vašo izbrano revijo ne najdete v bazi COBISS, potem izberite članek iz kakšne druge revije.

==Citiranje virov==Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se v seminarju držite ene same. Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati. '''Citiranje knjig:''' Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica. Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN. Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005. Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4. Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.). '''Citiranje člankov:''' Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani. Lartigue C. ''et al''. Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, letn. 317, str. 632-638.Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole: Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani. Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.Revija Science uporablja skrajšani zapis: C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007) V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne). '''Citiranje spletnih virov:''' Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.

TBK2017 Povzetki seminarjev

2018-05-22T15:21:16Z

KlementinaP: /* Klementina Polanec: Knjižnica lantipeptidov v pomoč pri iskanju inhibitorja interakcije protein-protein */

[[TBK2017-seminar|Nazaj na osnovno stran]]
===Ana Scott: Naslov seminarja===
Tekst ....

'''Uroš Prešern: Nukleaza, ki povzroči partanatos oziroma od PARP-1 odvisno celično smrt'''

Partanatos je ena izmed vrst celične smrti, ki nastopi zaradi prevelike aktivnosti poli(ADP-riboza) polimeraze 1 (PARP-1) v jedru. Pogost je v primeru možganske kapi, infarkta in nevrodegenerativnih boleznih, zaradi česar bi boljše poznavanje samega procesa omogočilo razvoj novih načinov zdravljenja teh obolenj. V predhodnih raziskavah so ugotovili, da partanatos nastopi, ko molekule poli-ADP-riboze, ki jih PARP-1 sintetizira, preidejo iz jedra v citosol, kjer aktivirajo premestitev indukcijskega faktorja apoptoze (AIF) iz mitohondrijev v jedro. Temu sledi razrez DNA. Nukleaza, ki povzroči razrez DNA, je bila do nedavnega manjkajoči člen v partanatosu. Skupini raziskovalcev je uspelo odkriti, da je iskana nukleaza inhibitorni dejavnik migracije makrofagov (MIF). Pokazali so, da se med partanatosom MIF veže na AIF in se skupaj z njim premesti v jedro, kjer povzroči fragmentacijo DNA. Inhibicija nukleazne aktivnosti MIF se je v modelu možganske kapi pri miših odrazila v 75-odstotnem zmanjšanju volumna prizadetega tkiva, pospešeno pa je bilo tudi okrevanje. Rezultati raziskave odpirajo potencialne možnosti za zdravljenje akutnih in kroničnih nevroloških bolezni, v katerih nastopi partanatos.

'''Doroteja Armič: Pretvorba mišjih fibroblastov v pluripotentne matične celice s pomočjo tehnologije CRISPR'''

Pluripotentne matične celice so še nediferencirane celice, ki imajo sposobnost, da se diferencirajo v skoraj vse tipe celic. Poznamo več vrst pluripotentnih matičnih celic. Ene izmed njih so inducirane pluripotentne matične celice (celice iPS). To so pluripotentne celice, ki jih umetno dediferencirajo iz odraslih somatskih celic. Leta 2006 so odkrili postopek pridobivanja celic iPS iz mišjih fibroblastov. Ugotovili so, da so za reprogramiranje somatskih celic najpomembnejši štirje transkripcijski dejavniki, in sicer Oct4, Sox2, Klf4 in c-Myc. Letos pa je skupini znanstvenikov uspelo odkriti nov, bolj enostaven postopek pridobivanja celic iPS. Ugotovili so namreč, da lahko sprožijo njihov nastanek že z aktivacijo enega samega gena – Oct4 ali Sox2. Aktivacija Sox2-promotorja oziroma Oct4-promotorja in Oct4-ojačevalca hkrati pa nato povzroči aktivacijo ostalih genov, ki sodelujejo pri vzpostavitvi pluripotentnosti v celicah. Za aktivacijo genov so uporabili tehnologijo CRISPR. Primerjali so uporabo dveh sistemov – dCas9-SunTag-VP64 in dCas9-SunTag-p300core. V obeh primerih so dobili primerljive rezultate. Uporaba celic iPS je pomembna v regenerativni medicini, saj lahko zamenja uporabo človeških embrionalnih matičnih celic. Z uporabo celic iPS, generiranih iz pacientovih lastnih celic, ne bi prišlo do zavrnitvenih reakcij, prav tako pa bi se izognili etičnih pomislekov. Znanstveniki predvidevajo, da lahko tehnologija reprogramiranja celic, ki so jo uporabili na mišjih celicah, z manjšimi spremembami deluje tudi na človeških celicah.

'''Dea Simonič: Sprožilci avtoimunskih bolezni in vzroki za nekontrolirano širjenje le-teh po telesu'''

Avtoimunska bolezen je bolezen, ki nastane zaradi pretiranega odziva imunskega sistema na celice, ki so last organizma. Veliko vlogo pri nastanku avtoimunske bolezni imajo limfociti B, ki omogočajo humoralni imunski odziv. Transkripcijski faktor T-bet v limfocitih B povzroči razvoj ABC, te celice so pa »pogon« avtoimunske bolezni. Avtoimunska bolezen se v veliki večini primerov razširi po telesu . Vzrok tega so ravno limfociti B, ki razširijo svoj napad po telesu in pride do širjenja epitopa. Ta proces se začne, ko imunski sistem napade antigene na drugih delih telesa, ki jih na začetku ni hotel uničiti. Telo začne pospeševano uničevati lastna tkiva. Da bi razumeli, zakaj pride do tega mehanizma so raziskovalci uporabili fluorescenčne markerje beljakovin, ki razlikujejo različne celične skupke limfocitov B (oziroma germinalne centre), na miših obolelih z lupusom. V germinalnih centrih limfociti B »tekmujejo« med sabo, kateri bo naredil najboljše protitelo, ki bo nevtraliziralo zaznano grožnjo. Te germinalne skupke so s pomočjo markerjev zaznali kot 10 različnih barv. Po tednu ali dveh začne prevladovati ena sama barva. Ta germinalni skupek je ustvaril najboljše protitelo in skupaj z ostalimi limfociti aktiviral avtoimunski protinapad. S to študijo so raziskovalci naredili velik korak v smer zaustavitve oziroma zdravljenja avtoimunske bolezni.

'''Valeriya Musina: Metalopeptid bakrov(II) fenantrolin tarčno onemogoči delovanje mitohondrijev v matičnih celicah raka dojke'''

Uničenje mitohondrijev je eden najbolj obetavnih pristopov pri razvoju novih zdravil proti raku. Znanstveniki so sintetizirali peptid, ki vsebuje baker, ki ga zlahka sprejmejo mitohondriji v matičnih celicah raka dojk, kjer le ta učinkovito povzroča apoptozo. Rakaste celice, ki imajo povečani metabolizem, ne samo, da vsebujejo več mitohondrijev kot zdrave celice, temveč so te tudi drugačni, strukturno in funkcionalno. Zaradi posebnih značilnosti in njihove odločilne vloge v presnovi celic so maligne mitohondrije pomembne tarčej za nove terapevtske spojine. Mitohondrije je možno uničiti z uvajanjem sredstev za proizvajanje reaktivnih vrst kisika (ROS). Te reaktivne spojine ovirajo metabolizem mitohondrijev. Kot močan ROS generator je bila predlagana organokovinska spojina bakrov(II) fenantrolin. Za dostavo in prenos skozi zunanjo membrano mitohondrija pa so bakrov(II) fenantrolin vezali na specifičen peptid, ki prodira v mitohondrije. Preizkusi so bili izvedeni z dvema celicnima linijama raka dojke, ena celična linija je vsebovala matične celice raka dojk. Rezultati so bili : odvisna od količine odmerka izguba sposobnosti za preživetje, razpad membran mitohondrijev, nastanek ROS in slabši metabolizma mitohondrijev. Zdravilo je bolj vplivalo na matične celice raka, kar je bilo razloženo z večjo vsebnostjo mitohondrijev. Ta študija izpostavlja potencial metalopeptida tako za dostavo kot tudi za uničenje mitohondrijev, zlasti v matičnih celicah raka.

'''Neža Štremfelj: Delovanje inzulinskih receptorjev'''

Človeški inzulinski receptorji igrajo pomembno vlogo v človeškem telesu. Signalizacija z inzulinskimi receptorji igra ključno vlogo pri regulaciji metabolizma in pri rasti v večceličnih organizmih. Nepravilno delovanje inzulinskih receptorjev je povezano z mnogimi hujšimi obolenji, na primer z rakavim obolenjem, diabetesom in Alzheimerjevo boleznijo.
Glavna ideja raziskave, ki jo opisuje članek, ki sem si ga izbrala za osnovo moje seminarske naloge je, da vezava inzulina na inzulinski receptor preoblikuje zunajcelični del transmembranskih proteinov (ektodomeno) receptorja iz U-konformacije v T-konformacijo. Prerazporeditev v ektodomeni se razširi tudi na transmembranske domene, ki so, ko je receptor neaktiviran pomaknjene narazen, ob vezavi inzulina pa se pomaknejo skupaj, kar omogoči fosforilizacijo tirozin kinaze v citoplazmi. Pri transmembranski signalizaciji z inzulinskim receptorjem poleg dimerizacije z vezavo liganda pride tudi do strukturnih sprememb znotraj receptorskega dimera.

'''Marko Pavleković: Prehajanje imunskih celic, povzročiteljic multiple skleroze, skozi krvno-možgansko pregrado'''

Multipla skleroza je avtoimunska bolezen, pri kateri limfociti napadejo živčne celice in jih demielinizirajo ter tako škodujejo prenosu signalov med nevroni. Iz predhodnih raziskav so odkrili, da sta za multiplo sklerozo najbolj krivi celiti pomagalki T 1 in T 17. Da bi prišli do centralnega živčnega sistema morata celici najprej prečkati vaskularno pregrado. Kako to dosežeta so raziskovali znanstveniki z univerze v Kolumbiji in z univerze v Kaliforniji. Z dvo-fotonsko mikroskopijo so opazovali tesne stike pri miših obolelih za eksperimentalnim avtoimunskim encefalomielitisom, ki je živalski primer multiple skleroze. Ugotovili so, da krvno-možgansko pregrado preideta na dva različna načina: s transcitozo in skozi prekinjene tesne stike med endotelnimi celicami. S pomočjo miši, ki jim je primanjkovalo kaveol (kaveolina1) pa so dokazali, da za prehod do centralnega živčnega sistema celica T 1 izkorišča transcitozo, medtem ko celica T 17 prehaja skozi prekinjene tesne stike. Te ugotovitve bi lahko močno pomagale pri nadaljnjem zdravljenju bolezni, kjer bi se osredotočili na preprečevanje dostopa imunskih celic do centralnega živčnega sistema.

'''Rebeka Dajčman: več mehanizmov poganja dinamiko kalcijevega signala okoli lasersko povzročene rane epitelija'''

Kalcij igra ključno vlogo pri skoraj vseh procesih v celici. Razni signali, kot je na primer sinteza RNA in DNA ali pa migracija celic, je posledica spremembe intracelularne koncentracije kalcija. Spremembo koncentracije lahko zaznamo z merjenjem intenzivnosti fluorescentne svetlobe, ki jo oddajajo GCaMP proteini. Če celice poškodujemo z laserskim mehurčkom, ustvarimo rano, ki je podobna udarcu. Sledijo trije mehanizmi signaliziranja, ki so odvisni od velikosti rane. Takoj po poškodbi celične membrane uide kalcij iz ekstracelularne tekočine v citosol, kjer se koncentracija kalcija dvigne. Kalcij nato skupaj s signalnimi molekulami difundira v okoliške celice in temu pravimo prvi val oz. takojšnji odziv. Po 45 sekundah mu sledi drugi močnejši valj, ki pa se širi počasneje, ker skozi membrano prehajajo večji signalni proteini. Ti signali sprožijo sistemski odziv na poškodbo, ki poskrbi, da se celice v najkrajšem možnem času regenerirajo. Da pri regeneraciji povrhnjice kože ne nastanejo brazgotine poskušamo v tkivo, ki je bilo poškodovano, vstaviti lasne mešičke. Ti pripomorejo k nastajanju maščobe in tako preprečijo brazgotinjenje. Če se poškoduje žilna stena pa sistem poskrbi za nastanek strdkov, ki so sestavljeni iz krvnih celic in fibrina. Trombociti navijejo fibrin v toge zvitke in ti se s pomočjo posebnih encimov raztopijo v krvi. Nova odkritja o celičnemu celjenju pripomorejo k hitrejšemu in učinkovitejšemu celjenju ran.

'''Gašper Anton Komatar: Tvorba kompleksa receptorjev ApoER2, ephirinB2 in AMPAR, ki jih povezuje GRIP1, sodeluje pri vorbi spomina'''

LTP ali dolgoročna potenciacija pomeni povečanje sinaptične moči za dolgo časa in ker gre pri tvorbi spominov prav za povečanje sinaptične aktivnosti, je med znanstveniki priznan kot najverjetnejši model učenja in tvorbe spomina na celični ravni. Med LTP se poveča število receptorjev AMPA v postsinaptični membrani, kar še dodatno poveča sinaptično moč.
Kakšen je mehanizem in katere molekule sodelujejo pri prenosu in vgradnji AMPAR v postsinaptično membrano, to je bilo glavno vprašanje raziskovalcev v članku, ki sem si ga izbral za seminarsko nalogo. Že dlje časa je bilo znano, da ephirinB2, ApoER2 in Reelin sodelujejo pri razvoju možganov kot regulatorji migracije nevronov. Znanstveniki so preverili, če sodelujejo tudi pri procesih prenosa in vgradnje AMPAR v membrano. S tehniko knockout (inaktivacija določenih genov) ter z imunoprecepcijo, so selektivno inhibirali interakcije med proteini, rezultate pa so beležili s fluorescentnimi analizami in prenosom western. Ugotovili so, da tvorba kompleksa multiplih receptorjev ApoER2/ephirinB2/AMPAR in GRIP1 povzroči vgradnjo tega AMPAR na membrano dendrita in sproži signalne kaskade, ki regulirajo vgradnjo novih AMPAR. Ko je bila interakcija med temi proteini inhibirana, so bili nevroni nezmožni reagirati na spremembe v njihovem omrežju, kar je zmanjšano sinaptično aktivnost. To pomeni, da skupki teh proteinov vzdržujejo oz. ojačajo sinaptično aktivnost. S tem so znanstveniki dokazali, da zgoraj omenjen kompleks receptorjev zares sodeluje pri tvorbi spominov.

'''Laura Gašperšič: Alzheimerjeva bolezen: povrnitev zmožnosti pomnjenja z inhibicijo interakcije med Sp3 in HDAC2'''

Pri Alzheimerjevi bolezni je glavni simptom okvara spomina, do česar pride zaradi utišanja genov, ki sodelujejo pri tvorbi novih spominov. Do utišanja pride zaradi deacetilacije histonov, ki jo povzročijo encimi histonske deacetilaze (HDAC). Pri utišanju genov za tvorbo spominov je najpomembnejši HDAC2. Njegova raven je pri bolnikih z Alzheimerjevo boleznijo povišana. Encimi HDAC so si po zgradbi podobni, poleg tega tvori en encim več različnih kompleksov, kar lahko pri inhibiciji encimov HDAC sproži tudi stranske učinke. Raziskovalci so zato želeli najti molekulo, s katero se HDAC2 veže na promotorje genov za učenje in spomin. S prvimi raziskavami so določili 3 najbolj verjetne proteine: Tdp2, Sap30 in Sp3, z meritvami pa so ugotovili, da Sp3 vpliva na delovanje sinapse. V nadaljnjih raziskavah so dokazali, da kompleks med HDAC2 in Sp3 v bolezenskem stanju z vezavo na promotorje negativno uravnava izražanje genov povezanih z delovanjem sinapse. V zadnjem delu raziskave so želeli določiti del HDAC2, ki se veže na Sp3 in inhibirati nastanek kompleksa med HDAC2 in Sp3. Ugotovili so, da se na Sp3 veže C-konec HDAC2. C-končni fragment HDAC2 se že sam veže na Sp3, s čimer se zmanjša število kompleksov med HDAC2 in Sp3 na promotorjih. Fragment HDAC2 pa se ne veže na druge proteine, s katerimi HDAC nadzorujejo druge pomembne procese. Izražanje C-končnega fragmenta HDAC2 torej predstavlja obetaven način, s katerim bi lahko zdravili nevrološke bolezni povezane z okvarami spomina.

'''Maja Škof: Pomen S-proteinov pri prilagajanju koronavirusov na okolje'''

Koronavirusi so razširjeni po vsem svetu in največkrat povzročajo okužbe dihal pri ljudeh in živalih. Spadajo med RNA viruse, za katere je značilna visoka stopnja genskih mutacij, kar jim omogoča, da se uspešno prilagajajo na okolje. S-proteini so trimerni proteini, s katerimi se koronavirusi vežejo na gostiteljsko celico, nato pa sprožijo spojitev virusne in celične membrane, kar omoči, da virusna RNA preide v celico. S-proteini so sestavljeni iz dveh podenot, S1 in S2. Pri vezavi na celični protein sodeluje zunanji del podenote S1, ki je v obliki treh podaljšanih zank (receptorsko-vezavne zanke). Med aminokislinami S-proteina in receptorskega proteina se vzpostavijo medmolekulske vezi, nato pa podenota S2 sproži spojitev s celično membrano. S1 je tudi glavna tarča protiteles, ki preprečujejo virusu, da bi vstopil v celico. A protitelo, ki se uspešno veže na sev virusa, ob ponovni okužbi virusa ne prepozna več. To je posledica naključnih genskih mutacij. Analiza genomov koronavirusov, izoliranih v zadnjih 50-ih letih, je pokazala, da se receptorsko-vezavne zanke S-proteinon med seboj občutno razlikujejo. Kar 73% aminokislin na receptorsko-vezavnih zankah variira. Odstotek je ravno dovolj velik, da se koronavirusi še vedno lahko vežejo na receptor, protitelesa pa jih ne zaznajo več.

'''Tadej Medved: Identifikacija vezavnih mest proteinov WASP na aktinski ojedritveni kompleks Arp2/3'''

Ključnega pomena za procese, kot so celično gibanje in endocitoza, so aktinski filamenti. Nastanek in prerazporeditev le-teh nadzorujejo določeni proteinski kompleksi; za razvejane aktinske filamente je to Arp2/3. Le-ta je sestavljen iz več podenot; najpomembnejši sta Arp2 in Arp3, ki sta po strukturi podobni aktinu. Na Arp2/3 se vežejo proteini družine WASP, ki spravijo proteinski kompleks v konformacijo, pri kateri lahko dejansko vrši nastanek novih filamentov. Za vse WASP-e velja, da se na Arp2/3 vežejo z odsekom VCA(verprolin, central, acidic), a do podatkov o strukturah takšnih vezi se znanost še ni dokopala. S pomočjo "cross-linking" masne spektrometrije in "reversed phase liquid" kromatografije je pred kratkim nastal model, ki zadovoljivo opisuje mesta, na katera se vežejo WASP-i. Vezava namreč poteka na dveh mestih: na hrbtni strani Arp2/3 in na spodnji strani kompleksa, pri Arp2 in poddomeno ARPC1. Na Arp2/3 se pri WASP-u veže odsek CA, konec odseka V pa ostaja prost za vezavo aktina. Izkazalo se je, da se za uspešno nukleacijo aktina vezavni mesti za aktin in CA ne smeta prekrivati; odsek WASP C pa je še zlasti pomemben za aktivacijo Arp2/3.

'''Tina Zavodnik: Disfunkcionalni mitohondriji s pomočjo ROS zavirajo translacijsko aktivnost'''

Mitohondriji so zelo kompleksni organeli, ki za normalno opravljanje svojih funkcij potrebujejo številne proteine. Večina teh proteinov se sintetizira v citoplazmi, nato pa so uvoženi nazaj v mitohondrije. Ob morebitni okvari transportnih mehanizmov in posledično okvarjenih mitohondrijih pa pride do akumulacije proteinov v citoplazmi, kar poruši celično ravnovesje. Skupina znanstvenikov iz Nemčije in Poljske pa je odkrila mehanizem, ki poškodovanim mitohondrijem omogoča nadzor nad sintezo proteinov z induciranjem reverzibilnih sprememb na translacijskem mehanizmu. Kot signal uporabijo ROS, ki povzroči oksidacijo tiolov na peptidih, ki so sestavni deli translacijskega mehanizma. Do odkritja so prišli s kvantitativno analizo cisteinskih ostankov oz. tiolnih skupin na proteomu kvasovke Saccharomyces cerevisia ter izdelali obsežno zbirko oksidacijskih stanj peptidov, ki so vsebovali tiolne skupine. Analizo so ponovili še na gojenih celicah kvasovke, ki so bile izpostavljene induciranemu oksidativnemu stresu s pomočjo H2O2, ter na mutiranih celicah z disfunkcionalnimi mitohondriji. Pri obojih so zaznali povečano oksidacijo Cys-peptidov in zmanjšano translacijsko aktivnost. Z odstranitvijo stresorskega faktorja pa se je translacijska aktivnost delno do popolnoma obnovila, kar dokazuje, da je oksidacija peptidov, ki so del mehanizmov za sintetiziranje novih proteinov, reverzibilen proces. Cisteinski ostanki torej delujejo kot nekakšni senzorji za ROS in ob oksidativnem stresu inhibirajo sintetiziranje novih proteinov.

'''Tina Kolenc Milavec: Vezava kalcija na karboksilni konec α-sinukleina uravnava interakcije med sinaptičnimi vezikli'''

Alfa-sinuklein je majhen, v vodi topen protein brez stabilne terciarne strukture, ki ga genetsko in nevropatološko povezujejo s Parkinsonovo boleznijo, o njegovi vlogi pri razvoju bolezni pa še marsikaj ni znano. Nahaja se predvsem v živčnih končičih, kjer je ravnovesje med α-sinukleinom raztopljenim v citosolu in tistim vezanim na fosfolipidni dvosloj močno regulirano. Ker se α-sinuklein nahaja na območju, kjer koncentracija kalcija ves čas močno niha, so raziskovalci Lautenschläger ''et al.'' predpostavili, da je normalna fiziološka funkcija α-sinukleina odvisna od kalcija. Da bi bolje razumeli funkcijo tega proteina, so v raziskavi izvedli več ''ex vivo'' ter ''in vitro'' eksperimentov, s katerimi so skušali ugotoviti predvsem to, kako se α-sinuklein veže na membrano sinaptičnega vezikla ter kako koncentraciji kalcija in α-sinukleina vplivata na homeostazo sinaptičnih veziklov ter na združevanje α-sinukleina v fibrilarne skupke. Povečana koncentracija kalcija in/ali α-sinukleina namreč pod določenimi pogoji povzroča toksičnost in posledično celično smrt, saj α-sinuklein oligomerizira ter tvori dolge in debele netopne fibrile, ki so del Lewyjevih telesc – citoplazemskih vključkov, značilnih za Parkinsonovo bolezen. Iz medicinskega stališča pa je zanimiva ugotovitev, da isradipin (antagonist kalicevih kanalčkov) preprečuje fibrilizacijo, saj znižuje znotrajcelično koncentracijo kalcija, kar odpira nove možnosti za razvoj zdravil proti Parkinsonovi bolezni.

'''Anže Šumah: Razvoj genskega senzorja za uničevanje celic s pomanjkanjem proteina p53'''

Protein p53 je tumorski zatiralec (tumor supresor), ki je zaradi svoje nadvse pomembne vloge pri ohranjanju celovitosti celičnega genoma pogosto deležen naziva »varuh genoma«. V normalnih primerih je izražanje tega proteina na nizki ravni, v primeru celičnega stresa pa deluje kot prepisovalni dejavnik, ki uravnava izražanje genov, ki so vključeni v nadzor celičnega cikla, popravljanje DNA in apoptozo. Ugotovili so, da je okoli 50 % vseh človeških oblik raka povezanih z mutacijami gena TP53 (gena za sintezo p53), zato so v raziskavi želeli razviti genski senzor, ki bi bil sposoben uničiti celice, ki ne sintetizirajo p53 (so rakave). Na podlagi promotorjev, ki jih p53 kot prepisovalni dejavnik zavira ali aktivira, so razvili senzor, ki v primeru pomanjkanja p53 sintetizira protein »Herpes simplex virus thymidine kinase« (HSV-TK), preko katerega lahko z zdravilom Ganciclovir uničimo rakasto celico, ki je brez p53. V primeru, da je p53 prisoten (je celica »zdrava«), pa je sinteza HSV-TK zavirana preko različnih mehanizmov. Senzor so najprej testirali na celični kulturi HCT116 (rakaste človeške črevesne celice) s fluorescentnima proteinskima markerjema, nato pa še v živih organizmih, in sicer golih miših brez imunosti. Tako so dokazali tako in vitro kot tudi in vivo uporabnost izdelanega genskega senzorja, ki bi ga bilo mogoče uporabiti v terapevtske namene.

'''Liza Praznik: Vpliv šaperonov Skp in SurA na zvijanje izvenmembranskih proteinov FhuA v terciarno strukturo'''

Naloga posebne vrste proteinov, imenovanih šaperoni je, da preoblikujejo polipeptidne verige v terciarno strukturo, v kateri so ti zmožni aktivnega delovanja. Delovanje in odzivanje šaperonov na različne dejavnike je še dokaj neznano, zato je skupina znanstvenikov Univerze v Baslu raziskovalo šaperona Skp in SurA, holdaz, ki delujeta na protein FhuA. Ta se nahaja na zunanji membrani gram negativnih bakterij, kjer služi kot receptor za ferikrom in tvori obliko beta-sodčka. Z večkratnimi ponovitvami poskusov so ugotovili, da se v prisotnosti obeh šaperonov struktura proteina, vgrajenega v membrano, ne podere, če jo delno razvijemo, ne glede na to, do katere stopnje. Šaperona sta obenem zmožna delno razvit protein preoblikovati nazaj v funkcionalno obliko, ki omogoča ponovno delovanje v membrani. Naloga obeh šaperonov je, da zadržujeta zvit polipeptid v dinamični, termodinamsko najugodnejši konformaciji, s katero se posamezni beta-zavoji polipeptida lahko vstavljajo v membrano. Ugotovljeno pa je bilo, da je šaperon SurA pri tem znatno učinkovitejši. Rezultati raziskave omogočajo boljši vpogled v mehanizme delovanja šaperonov in nakazujejo, kako pomembni so za učinkovito delovanje proteinov.

'''Urša Štrancar: Predstavitev združitve avtofagosoma in lizosoma s pomočjo para fret'''

Mitofagija je kataboličen proces razgradnje mitohondrijev s pomočjo encimov v lizosomih, pri čemer se neuporabni deli mitohondrija razgradijo in reciklirajo. Da bi tak proces lahko opazovali in ga podrobno preučili, so znanstveniki v eksperimentu ob raziskovanju mitofagije uporabili eno novejših metod za prikaz celičnih procesov v živih celicah, par FRET, ki temelji na visoki vezavni afiniteti med dvema sintetičnima molekulama (kromoforoma) CB[7]-Cy3 in AdA-Cy5. Konfokalna laserska skenirna mikroskopija je pokazala, da sta bili molekuli CB[7]-Cy3 in AdA-Cy5 najprej intracelularno ločeni in zbrani v mitohondriju oz. lizosomu, nato pa sta po združitvi lizosoma in mitohondrija tvorili kompleks gost-gostitelj, prikazan kot fluorescenčni signal para FRET, ki ga človeško oko ob opazovanju na mikroskopu lahko zazna. Ta ugotovitev pa ni prikazala le zelo stabilne vezi med CB[7] in AdA v živi celici, temveč je potrdila tudi, da par FRET lahko prikaže dinamične procese spajanja celičnih organelov v mitofagiji. Kompleks, ki ga tvorita zgoraj navedeni molekuli, prav tako ni citotoksičen, zato je zelo uporaben za raziskovanje procesa mitofagije, nadaljno pa tudi procesov avtofagije v drugih celičnih organelih.

'''Neža Žerjav: Dodajanje enega samega nukleotida omejuje aktivnost človeške telomeraze'''

Telomeraza je vrsta DNA-polimeraze, ki na konce kromosomov dodaja nukleotidna zaporedja (GGTTAG) ob pomoči matrične RNA. Procesivni katabolni cikel telomeraze sestavljajo translokacija matrice, dodajanje prvega nukleotida in dodajanje preostalih petih nukleotdov. Zanimanje znanstvenikov je vzbudila zaradi počasnega delovanja v primerjavi z ostalimi DNA-polimerazami. Za pojasnitev mehanizma, ki omejuje njeno delovanje, so znanstveniki raziskovali vpliv prekinitvenega signala matrične RNA na visoko Michaelisovo konstanto prvega nukleotida, odvisnost procesivnosti in hitrosti telomeraze v odvisnosti od koncentracije dGTP, vpliv spremenjenega prvega nukleotida in posledice odstranitve prekinitvenega signala. Prišli so do zaključka, da prekinitveni signal povzroča počasnejše dodajanje prvega nukleotida v telomerno zaporedje, kar zmanjša procesivnost in hitrost telomeraze, ki pa ju lahko lahko povečano s povečano koncentracijo ustreznega deoksinukleozid fosfata.

'''Aljaž Bratina: Intrinzična destabilizacija ribosoma'''

Sinteza proteinov v celici poteka na ribosomih, ki so sestavljeni iz dveh podenot. Med prevajanjem RNA (translacija) se genski zapis pretvori v zaporedje aminokislin, ki se zvijejo v protein. Polipeptidno verigo, ki nastaja na ribosomu, in je vezana na tRNA, imenujemo nascenti polipeptid. Hitrost translacije ni vedno enaka in je podvržena mnogim anomalijam. Včasih se od ribosoma predčasno odcepi tRNA z vezanim nascentnim polipeptidom, lahko pa določeno zaporedje v nascentnem polipeptidu celo povzroči disociacijo ribosoma na dve podenoti in s tem prekine sintezo proteina. To imenujemo intrinzična destabilizacija ribosoma (IRD). IRD-inducirajoče zaporedje je ponavadi sestavljeno iz negativno nabitih aminokislin (aspartata in glutamata) ali prolina v različnih kombinacijah. Ugotovljeno je bilo, da nekatera zaporedja povzročajo IRD le in vitro, druga pa tudi in vivo. To pomeni, da ribosom vsebuje nek mehanizem, ki IRD zavira. To je protein bL31, ki povezuje podenoti ribosoma in s tem stabilizira ribosom. Celica IRD izkorišča tudi za nadzorovanje koncentracije magnezijevih ionov. Večja kot je ta koncentracija, manj proteina MgtA (prenašalec Mg2+) se bo tvorilo. Pomembno vlogo pri tem razmerju ima MgtL, polipeptid, ki je kodiran tik pred MgtA, in vsebuje IRD zaporedje. IRD je raziskana le na prokariontskih organizmih, vendar je možno, da je ta proces prisoten tudi v evkariontih.

'''Anamarija Agnič: ATP-aza P4 s premeščanjem fosfolipidov uravnava uvihanost membrane'''

ATP-azo P4 uvrščamo v skupino membranskih proteinov, ki ob hidrolizi ATP sodelujejo pri vzdrževanju asimetrične porazdelitve lipidov v membrani; omogočajo npr. prenos membranskih fosfolipidov fosfatidilserina in fosfatidiletanolamina iz monomolekularnega sloja celične membrane na zunajcelični strani v monomolekularni sloj membrane na citosolni strani membrane. Spremembe v razporeditvi lipidov v dvosloju, ki jih povzročajo flipaze, so ključnega pomena za deformacijo membrane, česar dokaz je bil tudi temeljni znanstveni problem skupine celičnih biologov iz univerze v Kjotu. V okviru raziskave so znanstveniki preko sistema, ki na membrano iz citoplazme inducirano veže t.i. domene Bin/amphiphysin/Rvs (domene BAR), natančno opazovali stopnje membranske tubulacije. S fluorescirajočimi molekulami so označili citosolne proteine BAR, ki so občutljivi na ukrivljenost membrane, in opazovali njihovo obnašanje. Povečana aktivnost flipaze za fosfatidilholin ATP10A, ki sodi v družino ATP-az P4, je zaradi vzpostavljene neuravnovešenosti med lipidnima slojema omogočila vezavo domen BAR ter s tem spodbudila proces membranske tubulacije. Povečana aktivnost flipaze ATP10A, ki omogoči uvihanost celične membrane, velja za enega pomembnih gonilnih mehanizmov endocitoze. Plazmalema drastično spreminja obliko tudi med celičnimi migracijami, invazijo rakastih celic, celično delitvijo, sprejemanjem hrane in vstopom patogenov ter virusov v celico. Ta raziskava je prvi dokaz, da imajo spremembe v trans-lipidnem dvosloju, ki jih povzročijo ATP-aze P4, pri deformiranju bioloških membran pomembno vlogo.

'''Simona Gorgievska: Optical tools to detect metabolic changes linked to diseases'''

Metabolic changes in cell can occur at the earliest stages of disease. In most cases, knowledge of those signals is limited, since we usually detect diseases only after it has done significant damage. Now, a team led by engineers at Tufts University School of Engineering has opened a window into the cell by developing an optical tool that can read metabolism at subcellular resolution, without having to perturb cells with contrasts agents or destroy them to conduct assays.The method is based on the fluorescence of two important coenzymes (biomolecules that work in concert with enzymes) when excited by a laser beam. The coenzymes –nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) and Flavin adenine dinucleotide (FAD) are involved in a large number of metabolic pathways in every cell. In order to find out the specific metabolic pathways affected by disease or stress, scientists have looked at three parameters. Those are: the ratio of FAD and NADH, the fluorescence “fade” of NADH and the organization of mitochondria as revealed by the spatial distribution of NADH within a cell (the energy producing “batteries” of the cell). The first parameter-the relative amounts of FAD to NADH -can reveal how well the cell is consuming oxygen, metabolizing sugars, or producing or breaking down fat molecules. The second parameter -the fluorescence "fade" of NADH -reveals details about the local environment of the NADH. The third parameter -the spatial distribution of NADH in the cells -shows how the mitochondria split and fuse in response to cellular growth and stress.

'''Matej Jereb: Gradnja človeške pluripotentne matične celice v funkcionalno skeletno mišično tkivo'''

V študiji so razvili prvo popolnoma delujočo 3D skeletno mišično vlakno iz človeške pluripotentne matične celice. Z uporabo štirih različnih hPSC virov so razvili ponovljivo metodo za generacijo miogenskih celic prednic (iMPC), ki so sposobne učinkovite diferenciacije v večcelične miotubule v 2D kulturi. Če je gojena v 3D okolju hidrogela se iMPC strukturno preoblikuje tako, da tvori poravnano funkcionalno skeletno mišično vlakno (iSKM vretena), ki se lahko skrči in kot odgovor na električno ali nevrotransmitersko stimulacijo prenaša kalcijeve ione (Ca2+). V obdobju štirih tednov so 3D iSKM vretena doživela hipertrofijo miotubulov in funkcionalno izboljšanje ter naprednejšo stopnjo miogenske diferenciacije v primerjavi z 2D kulturo enake starosti. Pokazali so tudi, da se da iSKM vretena uspešno implantirati. Poskusi na miših nakazujejo potencial za uporabo teh metod in vitro in in vivo.

'''Neža Blaznik: Glikozilirana sialična kislina na protitelesu IgA inhibira virus influence tipa A'''

Nekateri virusi za vezavo na gostiteljsko celico uporabljajo receptorje, ki so glikozilirani s sialično kislino. V to skupino virusov spada tudi virus tipa influence A, ki povzroča gripo. Virus se prek glikoproteina hemaglutinina veže na sialično kislino v receptorjih in tako okuži gostiteljsko celico. Protitelesa imunoglobulini G (IgG), ki se uporabljajo v cepivih za gripo, imajo glikozilirane polipeptidne verige in prav tako vsebujejo nekaj sialične kisline, vendar je vsebnost sialične kisline v imunoglobulinih A (IgA) veliko večja. Znanstveniki so primerjali delovanje dveh tipov IgG in IgA na enega izmed tipov virusa influenze A (H5N3). Ugotovili so, da oba tipa IgA nevtralizirata virus v večji meri kot IgG, poleg tega pa so s križanjem komponent obeh imunoglobulinov tudi določili domeno na IgA, ki največ prispeva k povečani nevtralizaciji virusa. S tem so torej ugotovili, da glikozilirana sialična kislina na IgA inhibira virus influence tipa A, saj se veže še na dodatno mesto virusa in tako blokira povezavo med virusom in gostiteljsko telesno celico. To znanje je uporabno v razvoju novih cepiv proti gripi, vendar zaradi same zahtevnosti testiranja IgA in vivo, želijo znanstveniki v prihodnosti sintetizirati protitelo tipa IgG, ki bi vsebovalo del verige IgA, ter tako združiti prednost obeh protiteles.

'''Liza Ulčakar: Kombinirana DNA-RNA/neoantigen nanocepiva - učinkovita imunoterapevtska metoda'''

Cepiva proti raku postajajo vedno bolj raziskana tema. Znanstveniki so zato sintetizirali kombinirano zdravilo, ki vsebuje CpG (kratka enoverižna DNA), shRNA in rakave neoantigene. CpG deluje kot imunostimulator, saj se veže na receptor TLR9 v membrani endosomov antigen prezentirajočih celic in sproži imunski odgovor na rakave celice. shRNA preko RNA-interference preprečuje translacijo transkripcijskega faktorja STAT3, ki deluje imunosupresivno. Da bi zdravilo nemoteno potovalo po limfnem sistemu in prehajalo v celice, so sintetizirali kopolimer PPT-g-PEG, ki je skrčil kombinirano zdravilo. Cepivo so najprej preizkusili in vitro in ugotovili, da cepivo deluje imunostimulativno - antigen prezentirajoče celice so začele sproščati več citokinov, proizvodnja proteina STAT3 se je zmanjšala. Nato so poskus ponovili še in vivo, miših, ki so bile okužene z adenokarcinomom debelega črevesa. Mišim so nato odstranili organe z metastazami in opazili, da se je tumor pri miših, ki so bile zdravljene s kombiniranim zdravilom v primerjavi z mišmi, ki zdravila niso dobile, močno zmanjšal.

'''Matija Ruparčič: Od strupenih kompleksov do zlatih zrnc s ''Cupriavidus mellidurans'''''

Kakor voda, ogljik in dušik, tudi zlato kroži v naravi. Eden izmed organizmov, ki to omogoča, je ''Cupriavidus metallidurans''. Ta betaproteobakterija je skozi čas razvila vrsto mehanizmov, ki jo ščitijo pred velikimi koncentracijami težkih kovin. Problem pa se pojavi, ko je v prsteh prisotno zlato. To namreč inhibira glavno črpalko bakrovih ionov CupA in tako vodi do sinergistične toksičnosti bakra in zlata. Bakterija črpalk za zlato nima, zato je morala razviti mehanizem, ki bi preprečil sam vstop zlata v citoplazmo. Ker imajo bakterije, ki živijo v prsteh z večjo koncentracijo Au, v povprečju večje število encima CopA, ki ga skupaj z drugimi proteini kodirajo geni ''copABCD'', so se znanstveniki osredotočili nanj. Ugotovili so, da so produkti genov ''copABCD'' zasluženi za povečano odpornost na Cu/Au mešanice, CopA pa poleg Cu(I) oksidira tudi Au(I) ione v Au(III), nato pa pomaga pri redukciji le-teh do Au(0) nanodelcev. Rezultati raziskave tako predstavljajo nov korak k popolnemu razumevanju biogeokemičnega cikla zlata.

'''Jernej Imperl: Optimizacija protimikrobnih peptidov s pomočjo virtualnih metod'''

Gramnegativne bakterije premorejo vrsto mehanizmov za obrambo pred antibiotiki in s časom so na mnoge od njih postale celo imune. Skupaj z dejstvom, da je proizvodnja novih antibiotikov zapleten in drag proces, lahko predstavljajo resno dolgoročno grožnjo. Da bi bakterije "presenetili", so se znanstveniki obrnili na izdelavo protimikrobnih peptidov po šabloni peptidov rastlinskega izvora, ki se zaradi zapletene zgradbe na trgu še ne uporabljajo, a so znani v tradicionalni medicini že zelo dolgo časa. Peptid sadeža guave, Pg-AMP1, v osnovni obliki neugodnega za komercialno rabo, so s pomočjo računalniškega algoritma, ki posnema proces evolucije, in funkcije, ki peptide ovrednoti na podlagi verjetnosti tvorbe vijačnic, postopoma spreminjali in optimizirali. S simulacijo, ki so jo zagnali kar 100-krat, vsakič z naborom 250 začetnih peptidov, so uspeli odkriti guavanin 2, prvaka med stotimi kandidati vsake od simulacij, ki se je izkazal za učinkovitega proti gramnegativnim bakterijam in neškodljiv za človeške celice. Uspešnost guavanina 2 in njegova pomenljiva drugačnost od že obstoječih protimikrobnih peptidov nakazuje obetaven korak za nadaljnjo raziskovanje antibiotikov rastlinskega izvora.

'''Tiana Karmen Kokalj: B-1a limfociti spodbudijo oligodendrogenezo med razvojem možganov'''

Oligodendrociti so celice v centralnem živčnem sistemu, ki tvorijo mielinske ovojnice aksonov. Imajo ključno vlogo v razvoju in delovanju možganov, kar ima tudi limfni sistem, specifično periferni limfociti. Specifično T celice sodelujejo pri spominu, med embrionalnim razvojem pa prehaja v možgane diferenciirana oblika teh, B-1a celice. Te že v embrionalni fazi dozorijo in dosežejo največjo količino tik po rojstvu. Iz krvi v možgane prehajajo preko signalnega kompleksa CXCL13-CXCR5. Ko so enkrat te celice v možganih pa vidimo, da vplivajo na oligodendrogenezo, saj je kultivacija živčnih matičnih celic z B-1a celicami pokazala večji delež zrelih oligodendrocitov. B-1a celice direktno vplivajo na oligodendrogenezo s spodbuditvijo razmnoževanje oligodendrocitskih predhodnih celic (OPC) preko IgM-Fcα/µR signalizacije. B.1a celice izločajo IgM - polireaktivna protitelesa, ki se vežejo na Fcα/µR, katerega izražajo OPC, ki veže Fc regijo IgM. Delež B-1a celic v možganih pa pada s starostjo, zato predvidevajo da imajo največjo vlogo pri razmnoževanju oligodendrocitov, pri spontani obnovitvi mielinskih ovojnic pa naj ne bi imeli velikega pomena. Študija tega procesa lahko pripomore k boljšem razumevanju in preučevanju nevrorazvojnih motenj.

'''Ana Menegalija: METTL3 nova potencialna terapevtska tarča pri akutni mieloični levkemiji'''

Rak je skupek bolezni, za katere je značilna nenormalna celična rast, lahko pa imajo tudi sposobnost naselitve v drugih tkivih. Ena izmed hujših oblik raka je akutna mieloična levkemija (AML), za katero je zaradi mesta in oblike razvoja težko najti zanesljivo metodo zdravljenja. Raziskave potekajo v smeri preučevanja metiltransferaz pri razvoju celic AML. Metiltransferaze so enimi, ki na substrat pripnejo metilno skupino. Med njih spada tudi METTL3, ki ima pomembno vlogo v celicah AML. Z metiliranjem RNA namreč pospešuje hitrost translacije v proteine in s tem pripomore k proliferaciji levkemičnih celic. Dokazano je bilo, da se s prekinitvijo katalitične aktivnosti METTL3 celice AML ne razvijajo več, kar pomeni, da je mehanizem METTL3 nujno potreben za preživetje celic. Tako metilacije RNA ni in je translacija upočasnjena. Hkrati je bilo ugotovljeno tudi, da METTL3 nima nobenega vpliva na zdrave embrionalne in primarne hematopoetske celice v primerjavi s kontrolo, zaradi česar bi bil primeren za tarčno zdravljenje AML. Študija je pripomogla k razumevanju vloge METTL3 v levkemičnih celicah in posledično k iskanju potencialnih zdravil za akutno mieloično levkemijo.

'''Barbara Jaklič: I-motif DNA strukture nastajajo tudi v jedrih človeških celic'''

Prva znana in najpogostejša strukturna oblika DNA je dvojna vijačnica, katere model sta predlagala Watson in Crick. Je desnosučna, sestavljena iz velikega in malega žleba, imenujemo pa jo A-DNA. Poleg te oblike sta dobro proučeni še B-DNA, ki je prav tako desnosučna, vendar dehidrirana in zato bolj stisnjena, in Z-DNA, ki pa je levosučna in dodatno zvita struktura v sintetičnih verigah DNA. Znano pa je, da lahko DNA in vitro tvori tudi drugačne inter- in intramolekularne sekundarne strukture, med katerimi je najbolj raziskana G-quadruplex (G4) v regijah genoma bogatih z gvaninom. Nekoliko manj poznana je struktura imenovana »intercalated motif« (i-motif), ki nastaja v regijah bogatih s citozinom. Sestavljajo jo štiri verige, povezane z vrinjenimi baznimi pari delno protoniranega in nevtralnega citozina (C+:C). Za to strukturo predvidevajo, da sodeluje pri uravnavanju replikacije in transkripcije, vendar je njen obstoj in vivo dolgo ostajal dvomljiv zaradi stabilizacije v kislem pH. V raziskavi so karakterizirali protitelesni fragment iMab, ki se zelo specifično in z veliko afiniteto veže na strukturo i-motif, in s tem dokazali njeno prisotnost v jedrih človeških celic. Preučili so tudi stabilnost i-motif strukture v različnih pH razmerah in fazah celičnega cikla ter s tem omogočili nadaljnje raziskave na področju regulacijske in biološke vloge te strukture v človeških celicah.

'''Meta Kodrič: Naključna izboljšava bakterijskega encima za razgradnjo plastike'''

Plastika je kot lahek, trpežen, cenovno ugoden in nerazgradljiv material zelo priročna za vsakodnevno rabo, a ravno njena biološka nerazgradljivost predstavlja velik globalni problem, s katerim se spopadamo v zadnjih desetletjih. Za plastenke in embalažo se uporablja plastika narejena iz semiaromatičnega poliestra poli(etilen tereftalata) oz. PET. Do sedaj poznani načini razgradnje njegovih močnih in težko dostopnih esterskih vezi so dragi, produkti, ki pri tem nastanejo, pa prav tako škodljivi za okolje kot plastika sama. V iskanju učinkovitejših metod znanstveniki med drugim preučujejo mikroorganizme, ki so skozi desetletja onesnaževanja okolja s plastiko razvili uspešne mehanizme za njeno razgradnjo. Raziskovalci inštituta Portsmouth so pod drobnogled vzeli encim PETazo leta 2016 odkrite bakterije Ideonella sakaiensis 201-F6. Primerjali so ga s podobnimi α/β-hidrolazami, ki so prav tako sposobne depolimerizirati PET, le v manjši meri. Na podlagi razlik v strukturah preučevanih encimov so ustvarili mutante PETaze, ki so bili v določenih lastnostih bolj podobni encimom s slabšo sposobnostjo razgrajevanja PET. Kljub predpostavki, da bodo takšni mutanti manj učinkoviti od PETaze, se je na veliko presenečenje eden izmed mutantov izkazal za bolj učinkovitega. Tako mutant kot PETaza sta se dobro odrezala tudi pri razgradnji semiaromatičnega poliestra PEF, pri depolimerizaciji alifatskih poliestrov pa sta bila neučinkovita. Študija tako nakazuje, da se z nadaljnjim preučevanjem α/β-hidrolaz odpirajo možnosti sinteze še učinkovitejših encimov, ki bi jih nekoč lahko uporabljali pri razgradnji plastike v industrijskem merilu.

'''Eva Gartner: Vloga neobičajnega prohibitina pri regulaciji mitohondrijskega membranskega potenciala in razvoju malarije.'''

Malárija, starinsko tudi močvirska mrzlica, je nalezljiva bolezen, ki jo povzročajo nekatere vrste zajedavskih praživali iz razreda trosovcev, plazmodiji. Življenjski krog plazmodija sestavljajo tri stopnje: okužba človeka s sporozoiti, nespolno razmnoževanje, ki poteka v človeku, ter spolno razmnoževanje, ki poteka v komarju. Za zdravljenje malarije se uporabljajo različni antibiotiki in antimalariki, vendar se je zaradi vse večje odpornosti parazitov pojavila potreba po novih zdravilih. Znanstveniki so v raziskavi odkrili protein v mitohondriju parazita, ki bi lahko bil tarča za novo zdravilo. Pomanjkanje tega proteina oslabi nespolno razmnoževanje, nujno pa je potreben predvsem pri spolnem razmnoževanju. Razlog za neuspešen spolni razvoj je vse večja depolarizacija mitohondrija, ki pa je ključen organel za preživetje parazita, saj dovaja energijo za vse celične procese. Ob odsotnosti proteina prenašanje okužbe ni mogoče. Ta protein pa ima še eno prednost in sicer, da ni prisoten v človeku, ki mu zato onesposobljenost delovanja proteina ne škodi.

'''Martina Lokar: Mitohondrijska povratna signalizacija pri sesalcih je uravnana s transkripcijskim kofaktorjem GPS2 preko direktne translokacije od mitohondrija do jedra'''

Večina mitohondrijskih proteinov je kodiranih v jedru, zato je signalna povezava med mitohondrijem in jedrom izjemno pomembna za vzdrževanje mitohondrijske homeostaze. Znanstveniki so v raziskavi poskušali odkriti vlogo proteina GPS2 pri mitohondrijski povratni signalizaciji, tj. signalni poti od mitohondrija do jedra, preko katere se v jedru uravnava transkripcija mitohondrijskih genov. Najprej so določili intracelularno lokacijo proteina GPS2 in ugotovili, da se nahaja v jedru, citosolu in mitohondrijih. V nadaljevanju so preverili sekvence DNA, na katerih so odkrili povečano koncentracijo GPS2. Z nadaljnjimi eksperimenti so podrobneje raziskali pomen v mitohondriju lokaliziranega GPS2 in na koncu so poskuse izvedene na celičnih linijah ponovili še na mišjem maščobnem tkivu in vivo. Prišli so do zaključka, da GPS2 aktivira transkripcijo v jedru kodiranih mitohondrijskih genov in drugih genov, ki so pomembni pri odzivu na stres in raznih fizioloških procesih (npr. pri adipogenezi), preko direktne translokacije od mitohondrija do jedra. Proces uravnava SUMO proteaza SENP1, ki protein GPS2 desumoilira in tako povzroči njegovo premestitev. GPS2 deluje v jedru kot transkripcijski kofaktor, ki regulira demetilacijo histona H3K9 in aktivacijo RNA-polimeraze II z inhibicijo encima Ubc13.

'''Luka Gnidovec: Fibrinogen aktivira BMP signalizacijo v oligodendrocitskih predhodnih celicah in inhibira remielinacijo'''

Aksone v centralnem živčevčnem sistemu (CNS) obdajajo mielinske ovojnice, ki pospešujejo prenos signala. Pri določenih boleznih, npr. pri multipli sklerozi, pride do demielinacije, tj. propada mielinske ovojnice. V zgodnjih fazah te bolezni ter po nekaterih drugih bolezenskih stanjih bi moralo priti do remielinacije – obnove mielina, vendar pogosto pride do težav pri diferenciaciji oligodendrocitskih predhodnih celic (OPC) v zrele oligodendrocite (OL), ki v CNS gradijo mielinsko ovojnico. Znanstveniki so domnevali, da diferenciacijo inhibira fibrinogen, ki vstopa v CNS ob povečanju prepustnosti krvno-možganske pregrade (BBB). Povečana prepustnost se pojavi ob številnih bolezenskih stanjih, vključno z multiplo sklerozo in možgansko kapjo. Ugotovili so, da fibrinogen poveča signalno pot kostnega morfogenega proteina (BMP), kar je znan zaviralec diferenciacije OPC v OL. Fibrinogen se veže na znotrajcelično domeno receptorja ACVR1, ki sodeluje pri BMP signalizaciji, ter s tem sproži izražanje določenih genov, ki jih BMP signalizacija regulira. Nogin, naravni inhibitor BMP signalizacije v CNS, inhibicije diferenciacije OPC zaradi fibirnogena ne more preprečiti, saj se veže na zunajcelične BMP molekule in le njim prepreči vezavo na receptor. Z določenimi inhibitorji, ki delujejo na receptor ACVR1 (npr. DMH1), bi lahko preprečili učinek fibrinogena in s tem vzpostavili ugodno okolje za remielinacijo.

'''Sumeja Kudelić: Kolaboranti alergijskih reakcij'''

Vsaka tuja snov, ki lahko spodbudi imunski odziv, je potencialni alergen. Alergijska senzibilizacija se začne, ko izpostavljanje alergenu povzroči imunski odziv. Znanstveniki so se že od nekdaj spraševali, zakaj nekateri proteini povzročajo alergije, čeprav so zelo podobne drugim, ki niso škodljivi.
V raziskavi so odkrili, da je naravni ligand Pru p 3, ki povzroča alergijo na breskve, sodeluje pri imunskem odzivu alergijskih reakcij. Ligand Pru p 3 je derivat alkaloidnega kamptotecina, ki je vezan na hidrofobni rep fitosfingozina. Rezultati raziskave nam povejo, da je lipidni ligand Pru p 3 kolokaliziral s CD1 receptorjem, ki je omogočil njegovo aktivnost pri alergijski senzibilizaciji. Celice, ki so uporabljali v poskusih, so v tem primeru, proizvajale večjo koncentracijo IgE, kot celice, v katerih je bil sam Pru p 3. Povečana koncentracija IgE je značilna za alergijske reakcije. Na osnovi tega so prišli do rezultata, da alergeni potrebujejo kolaborante, ki jim pomagajo spodbuditi imunski odziv.

'''Nika Boštic: Oksidativni stres kontrolira apoptozo regulatornih T-celic in njihovo zaviralno aktivnost ter odpornost na blokado PD-L1 v tumorjih'''

Celice Treg igrajo pomembno vlogo pri regulaciji imunskega sistema in preventivi proti avtoimunimi boleznimi. Na različne načine inhibirajo delovanje drugih celic T, pogosto z izločanjem snovi, ki preprečijo izražanje citokinov – signalnih molekul. Z inhibicijo izražanja citokinov pa onemogočijo proliferacijo in diferenciacijo drugih limfocitov ter aktivacijo makrofagov. V preteklih letih je bilo narejenih že veliko študij o celicah Treg , vendar pa do sedaj ni bilo znano, kaj povzroči imunosupresivnost Treg celic v tumorskem mikrookolju. V tumorju postanejo celice Treg izredno imunosupresivne kljub prisotnosti antigenov, ki se izražajo specifično pri tumorjih. Raziskovalci iz Univerze v Michiganu so ugotovili, da so celice Treg v tumorskem okolju zelo apoptotične. Na apoptotičnost celic Treg pa vpliva velika koncentracija ROS. Apoptotične celice Treg so celo boljši zaviralci imunskega odziva kot žive celice Treg. Vzrok za imunosupresijo je proizvodnja in sproščanje ATP iz celice in nato pretvorba tega s pomočjo membranskih proteinov CD39 in CD73 v adenozin. Adenozin pa preko receptorja A2A zavira izražanje citokinov v T-celicah. Apoptotične celice Treg lahko ravno na ta način zmanjšajo efektivnost imunoterapije z blokado PD-L1.

'''Klementina Polanec: Knjižnica lantipeptidov v pomoč pri iskanju inhibitorja interakcije protein-protein'''

Interakcije protein-protein (PPI) so pogoste in lahko so tarča raznih zdravil. Pomembni zaviralci PPI so ribosomsko sintetizirani in posttranslacijsko modificirani peptidi, med katere uvrščamo tudi lantipeptide, za katere so značilne tioeterske vezi, ki vodijo do ciklične oblike. V študiji so raziskovalci s pomočjo tehnologije rekombinantne DNA sintetizirali značilne peptide, ki jih je lantipeptid sintetaza (ProcM) dehidrirala in ciklizirala do nastanka dvocikličnih lantipeptidov. Med njimi so iskali takšne, ki bi lahko inhibirali interakcijo med p6 (protein virusa HIV) in UEV (ubikvitin E2 domena človeškega proteina TSG101). Z bakterijskim reverznim dvohibridnim sistemom so odkrili lantipeptid XY3-3, ki je deloval kot specifični inhibitor, zato so preverili njegovo delovanje z merjenjem IC50. Z odstranitvijo vodilnega zaporedja peptida so dobili boljše rezultate, torej k inhibiciji najbolj prispeva protein sredice, prav tako pa je pomembno pravilno zaporedje aminokislin. S poskusi in vivo so določilo mejo citotoksičnosti in dokazali, da lahko XY3-3-Tat inhibira tudi virusno brstenje. Raziskovalcem je tako uspelo ustvariti knjižnico dvocikličnih lantipeptidov in spodbuditi k nadaljnjemu raziskovanju njihove biološke aktivnosti (predvsem inhibicija PPI).

TBK2018-seminar

2018-05-14T20:01:54Z

KlementinaP: /* Seznam seminarjev */

= Temelji biokemije- seminar =

Seminarje vodi prof. dr. Brigita Lenarčič. Seminarji so obvezni.

Ocena seminarjev (6-10) predstavlja enako število odstotkov, ki se prišteje h končni pisni oceni izpita.
Stran na strežniku s seminarskimi nalogami je zaščitena.
Uporabniško ime je: tbk, password pa: samozame## "##" sta dve številki, ki ju izveste na predavanjih.
Tudi za urejanje Wiki strani potrebujete geslo, ki se od zgornjega razlikuje. Postopek pridobitve Wiki uporabniškega imena in gesla je opisan [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Main_Page tukaj].

== Seznam seminarjev ==

{| border="1" cellpadding="4" cellspacing="0" style="border:#c9c9c9 1px solid; margin: 1em 1em 1em 0; border-collapse: collapse;"
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Ime in priimek'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Naslov seminarja'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Povezava'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Rok za oddajo'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Rok za recenzijo'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Datum predstavitve'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 1'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 2'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 3'''
|-
| Anna Scott||Moj naslov v slovenščini||http://www.bioscirep.org/content/36/1/e00291.long||28.10.||05.11.||07.11.||r1||r2||r3
|-
| Doroteja Armič || Pretvorba mišjih fibroblastov v pluripotentne matične celice s pomočjo tehnologije CRISPR || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/01/180118162449.htm || 27.02. || 02.03. || 05.03. || Martina Lokar || Liza Ulčakar || Zoja Siter
|-
| Valeriya Musina || Metalopeptid bakrov(II) fenantrolin tarčno onemogoči delovanje mitohondrijev v matičnih celicah raka dojke || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/12/171213124751.htm || 27.02. || 02.03. || 05.03. || Nika Boštic || Tiana Karmen Kokalj || Aljaž Bratina
|-
| Dea Simonič || Sprožilci avtoimunskih bolezni in vzroki za nekontrolirano širjenje le-teh po telesu ||https://www.sciencedaily.com/releases/2017/08/170824141207.htm|| 27.02. || 02.03. || 05.03. || Sumeja Kudelić || Jernej Imperl || Anamarija Agnič
|-
| Neža Štremfelj ||Delovanje inzulinskih receptorjev||https://www.sciencedaily.com/releases/2018/02/180219103256.htm|| 27.02. || 02.03. || 05.03. || Luka Gnidovec || Matija Ruparčič || Simona Gorgievska
|-
| Gašper Komatar || Tvorba kompleksa receptorjev ApoER2, ephirinB2 in AMPAR, ki jih povezuje GRIP1, sodeluje pri tvorbi spomina || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/10/171009093207.htm || 06.03. || 09.03. || 12.03. || Lara Hrvatin || Tiana Karmen Kokalj || Matej Jereb
|-
| Marko Pavleković || Prehajanje imunskih celic, povzročiteljic multiple skleroze, skozi krvno-možgansko pregrado || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/11/171121155811.htm || 06.03. || 09.03. || 12.03. || Klementina Polanec || Meta Kodrič || Lara Drinovec
|-
| Laura Gašperšič || Alzheimerjeva bolezen: povrnitev zmožnosti pomnjenja z inhibicijo interakcije med Sp3 in HDAC2 || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/08/170808150001.htm || 06.03. || 09.03. || 12.03. || Karmen Mlinar || Ana Menegalija || Maks Kumek
|-
| Rebeka Dajčman || Več mehanizmov poganja dinamiko kalcijevega signala okoli lasersko povzročene rane epitelija || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/10/171003124646.htm || 06.03. || 09.03. || 12.03. || Ula Nikolaja Ratajec || Andreja Marija Belič || Neža Blaznik
|-
| Maja Škof || Pomen S-proteinov pri prilagajanju koronavirusov na okolje. || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/11/171127105937.htm || 13.03. || 16.03. || 19.03. || Doroteja Armič || Barbara Jaklič || Liza Ulčakar
|-
| Tina Kolenc Milavec || Vezava kalcija na karboksilni konec α-sinukleina uravnava interakcije med sinaptičnimi vezikli || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/02/180219071758.htm || 13.03. || 16.03. || 19.03. || Valeriya Musina || Eva Gartner || Jana Rajchevska
|-
| Tina Zavodnik || Disfunkcionalni mitohondriji s pomočjo ROS zavirajo translacijsko aktivnost || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/02/180202112629.htm || 13.03. || 16.03. || 19.03. || Dea Simonič || Martina Lokar || Jernej Imperl
|-
| Tadej Medved || Identifikacija vezavnih mest proteinov WASP na aktinski ojedritveni kompleks Arp2/3 || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/03/180305130632.htm || 13.03. || 16.03. || 19.03. || Neža Štremfelj || Nika Boštic || Matija Ruparčič
|-
| Bogdan Jovićević || || || 20.03. || 23.03. || 26.03. || Laura Gašperšič || Lara Hrvatin || Ana Menegalija
|-
| Polona Kalan || || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/02/180214111055.htm || 20.03. || 23.03. || 26.03. || Rebeka Dajčman || Klementina Polanec || Andreja Marija Belič
|-
| Liza Praznik ||Vpliv šaperono Skp in SurA na zvijanje proteinov FhuA v terciarno strukturo ||https://www.sciencedaily.com/releases/2015/09/150907113757.htm || 20.03. || 23.03. || 26.03. || Maja Škof || Karmen Mlinar || Barbara Jaklič
|-
| Anže Šumah || Razvoj genskega senzorja za uničevanje celic s pomanjkanjem proteina p53 || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/11/171114104201.htm || 20.03. || 23.03. || 26.03. || Tina Kolenc Milavec || Ula Nikolaja Ratajec || Eva Gartner
|-
| Neža Žerjav|| Dodajanje enega samega nukleotida omejuje aktivnost človeške telomeraze ||https://www.sciencedaily.com/releases/2018/02/180227142114.htm || 03.04. || 06.04. || 09.04. || Tina Zavodnik || Doroteja Armič || Martina Lokar
|-
| Urša Štrancar || Predstavitev združitve avtofagosoma in lizosoma s pomočjo supermolekularnega para FRET || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/02/180219103254.htm || 03.04. || 06.04. || 09.04. || Tadej Medved || Valeriya Musina || Nika Boštic
|-
| Zoja Siter || || || 03.04. || 06.04. || 09.04. || Neža Žerjav || Dea Simonič || Sumeja Kudelić
|-
| Aljaž Bratina || Intrinzična destabilizacija ribosoma || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/11/171120101314.htm || 03.04. || 06.04. || 09.04. || Anastasija Nechevska || Neža Štremfelj || Luka Gnidovec
|-
| Anamarija Agnič || ATP-aza P4 s premeščanjem fosfolipidov uravnava uvihanost membrane || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/03/180329141014.htm || 10.04. || 13.04. || 16.04. || Bogdan Jovićević || Sumeja Kudelić || Lara Hrvatin
|-
| Simona Gorgievska || Optical tools to detect metabolic changes linked to disease || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/03/180307161351.htm|| 10.04. || 13.04. || 16.04. || Polona Kalan || Marko Pavleković || Klementina Polanec
|-
| Matej Jereb || Gradnja človeške pluripotentne matične celice v funkcionalno skeletno mišično tkivo|| https://www.sciencedaily.com/releases/2018/01/180109104707.htm || 10.04. || 13.04. || 16.04. || Liza Praznik || Laura Gašperšič || Karmen Mlinar
|-
| Lara Drinovec || Tavrin pomaga obnoviti zaradi multiple skleroze poškodovane celice || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/12/171208143024.htm || 10.04. || 13.04. || 16.04. || Anže Šumah || Rebeka Dajčman || Ula Nikolaja Ratajec
|-
| Maks Kumek || Dinamični izvor sprememb specifčne toplote v encimsko kataliziranih reakcijah || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/03/180321090854.htm || 17.04. || 20.04. || 23.04. || Marko Pavleković || Maja Škof || Doroteja Armič
|-
| Neža Blaznik || Glikozilirana sialična kislina na protitelesu IgA inhibira virus influence tipa A || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/04/180403111203.htm || 17.04. || 20.04. || 23.04. || Urša Štrancar || Tina Kolenc Milavec || Valeriya Musina
|-
| Liza Ulčakar || Kombinirana DNA-RNA/antigen nanocepiva - učinkovita imunoterapevtska metoda ||https://www.sciencedaily.com/releases/2017/11/171129163851.htm || 17.04. || 20.04. || 23.04. || Zoja Siter || Tina Zavodnik || Dea Simonič
|-
| Anastasija Nechevska || || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/03/180319155730.htm || 17.04. || 20.04. || 23.04. || Aljaž Bratina || Tadej Medved || Neža Štremfelj
|-
| Jernej Imperl || Optimizacija protimikrobnih peptidov s pomočjo virtualnih metod || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/04/180416085922.htm || 23.04. || 26.04. || 07.05. || Anamarija Agnič || Neža Žerjav || Luka Gnidovec
|-
| Matija Ruparčič || Od strupenih kompleksov do zlatih zrnc s ''Cupriavidus metallidurans'' || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/01/180131095453.htm || 23.04. || 26.04. || 07.05. || Simona Gorgievska || Anastasija Nechevska || Marko Pavleković
|-
| Tiana Karmen Kokalj || B-1a limfociti spodbujajo oligodendrogenezo med razvojem možganov || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/03/180313091702.htm || 23.04. || 26.04. || 07.05. || Matej Jereb || Bogdan Jovićević || Laura Gašperšič
|-
| Meta Kodrič || Naključna izboljšava bakterijskega encima za razgradnjo plastike || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/04/180416155619.htm || 23.04. || 26.04. || 07.05. || Lara Drinovec || Polona Kalan || Rebeka Dajčman
|-
| Ana Menegalija || METTL3 nova potencialna terapevtska tarča pri akutni mieloični levkemiji || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/11/171127135838.htm || 08.05. || 11.05. || 14.05. || Maks Kumek || Liza Praznik || Maja Škof
|-
| Andreja Marija Belič || || || 08.05. || 11.05. || 14.05. || Neža Blaznik || Anže Šumah || Tina Kolenc Milavec
|-
| Barbara Jaklič || I-motif DNA strukture nastajajo tudi v jedrih človeških celic || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/04/180423135054.htm || 08.05. || 11.05. || 14.05. || Liza Ulčakar || Meta Kodrič || Tina Zavodnik
|-
| Eva Gartner ||Vloga neobičajnega prohibitina pri regulaciji mitohondrijskega membranskega potenciala in razvoju malarije. ||https://www.sciencedaily.com/releases/2018/04/180418111615.htm || 08.05. || 11.05. || 14.05. || Gašper Komatar || Urša Štrancar || Tadej Medved
|-
| Martina Lokar || Mitohondrijska povratna signalizacija pri sesalcih je uravnana s transkripcijskim kofaktorjem GPS2 preko direktne translokacije od mitohondrija do jedra || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/03/180301144138.htm || 15.05. || 18.05. || 21.05. || Jernej Imperl || Zoja Siter || Neža Žerjav
|-
| Nika Boštic || ||https://www.sciencedaily.com/releases/2017/10/171030154424.htm || 15.05. || 18.05. || 21.05. || Matija Ruparčič || Aljaž Bratina || Anastasija Nechevska
|-
| Sumeja Kudelić || ||https://www.sciencedaily.com/releases/2017/12/171221122927.htm || 15.05. || 18.05. || 21.05. || Tiana Karmen Kokalj || Anamarija Agnič || Bogdan Jovićević
|-
| Luka Gnidovec || ||https://www.sciencedaily.com/releases/2017/11/171102124907.htm || 15.05. || 18.05. || 21.05. || Meta Kodrič || Simona Gorgievska || Polona Kalan
|-
| Lara Hrvatin || || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/01/180117131129.htm || 22.05. || 25.05. || 28.05. || Ana Menegalija || Matej Jereb || Liza Praznik
|-
| Klementina Polanec || || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/03/180312115405.htm || 22.05. || 25.05. || 28.05. || Andreja Marija Belič || Lara Drinovec || Anže Šumah
|-
| Karmen Mlinar || || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/05/180501085533.htm || 22.05. || 25.05. || 28.05. || Barbara Jaklič || Maks Kumek || Gašper Komatar
|-
| Ula Nikolaja Ratajec || ||https://www.sciencedaily.com/releases/2018/02/180208141346.htm || 22.05. || 25.05. || 28.05. || Eva Gartner || Neža Blaznik || Urša Štrancar
|-
| rezerva || || || 29.05. || 01.06. || 04.06. || || ||
|}

==Naloga==
* samostojno pripraviti seminar, katerega tema je novica iz področja biokemije na portalu [http://www.sciencedaily.com ScienceDaily], ki je bila objavljena kasneje kot 1. avgusta 2016. Osnova za seminar naj bo znanstveni članek, ki je podlaga za to novico. Poleg tega članka za seminar uporabite še najmanj pet drugih virov, od teh vsaj še dva druga znanstvena članka, ki se navezujeta na to vsebino.
* članke na temo lahko iščete [https://scholar.google.com/ z Google učenjakom].
* naslov izbrane teme in povezavo do novice vpišite v tabelo seminarjev takoj ko ste si izbrali temo, najkasneje pa en teden pred rokom za oddajo
* [[TBK2017 Povzetki seminarjev|Povzetek seminarja]] opišete na wikiju v približno 200 besedah - najkasneje do dne, ko morate oddati seminar recenzentom.
* Povezavo do povzetka vnesete v tabelo seminarjev tekočega letnika.
* Seminar pripravite v obliki seminarske naloge (pisava Cambria, font 11, enojni razmak, 2,5 cm robovi; tekst naj obsega okoli 1000 besed), vsebuje naj 1-2 sliki. Slika mora imeti legendo in v besedilu mora biti na ustreznem mestu sklic na sliko. Vse uporabljene vire citirajte v tekstu, kot npr. (Nobel, 2010), na koncu pa navedite točen seznam literature, kot je opisano spodaj!
*Celotni seminar naj obsega 2 strani A4 formata (po možnosti dvostransko tiskanje).
* Seminar oddajte do datuma oddaje, ki je naveden v tabeli v elektronski obliki z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/tbk/poslji/ tega obrazca].
* vsi seminarji so v elektronski obliki dostopni [http://bio.ijs.si/~zajec/tbk/poslji//bioseminar/ tukaj].
* Recenzenti do dneva določenega v tabeli določijo popravke in podajo oceno pisnega dela, v predpisanem formatu elektronskega obrazca na internetu.
* Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Za predstavitev je na voljo 12 minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni. Prvi recenzent vodi predstavitve in razpravo ter skrbi za to, da vse poteka v zastavljenih časovnih okvirih.
* Predstavitvi sledi razprava do 8 minut. Sledijo vprašanja prisotnih, recenzenti postavijo vsak vsaj dve vprašanji in na koncu podajo oceno predstavitve.
* En dan pred predstavitvijo na strežnik oddajte tudi končno verzijo. Na dan predstavitve morate oddati tudi končno (popravljeno) in natisnjeno verzijo seminarja v enem izvodu.
* Seminarska naloga in povzetek na wikiju morajo biti v slovenskem jeziku!

==Imena datotek==
Prosim vas, da vse datoteke, ki jih pošiljate poimenujete po spodnjih pravilih. Ne uporabljajte ČŽŠčžš!
Poslati morate naslednje datoteke:
* TBK_2018_Priimek_Ime.doc(x) za seminar, npr. TBK_2017_Guncar_Gregor.docx
* TBK_2018_Priimek_ime_final.doc(x) za končno verzijo seminarja
* TBK_2018_Priimek_Ime_rec_Priimek2.doc(x) za recenzijo, kjer je Priimek2 priimek recenzenta, npr. TBK_2017_Guncar_Gregor_rec_Scott.docx (če se pišete Scott in odajate recenzijo za seminar, ki ga je napisal Gunčar)
* TBK_2018_Priimek_Ime.ppt(x) za prezentacijo, npr TBK_2017_Guncar_Gregor.pptx
* TBK_2018_Priimek_Ime_clanek.pdf za datoteko PDF, ki vsebuje izvirni članek, npr. TBK_2017_Guncar_Gregor_clanek.pdf

==Ocenjevanje seminarjev==
Recenzenti ocenijo seminar tako, da izpolnijo [[https://docs.google.com/forms/d/1Hdg2OHCyG24qwLTnFt09yZTng46RIwaIiUqnKOdsJxQ/viewform recenzentsko poročilo]] na spletu.

== Mnenje o predstavitvi ==
Vsak posameznik '''mora''' oceniti seminar tako, da odda svoje [https://docs.google.com/forms/d/1VvE-jaKikfiDO5Gdybqgp9mf_0uJZfBbIK8PLXKDaS0/viewform mnenje] najkasneje v enem tednu po predstavitvi. Kdor na seminarju ni bil prisoten, mnenja '''ne sme''' oddati.

==Urejanje spletnih strani na wikiju==
Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''

==Faktor vpliva==
Faktor vpliva (angl. impact factor) neke revije pove, kolikokrat so bili v poprečju citirani članki v tej reviji v dveh letih skupaj pred objavo tega faktorja. Faktorje vpliva za posamezno revijo lahko najdete v [http://www.cobiss.si/scripts/cobiss?command=CONNECT&base=JCR COBISS-u]. V polje "Naslov revije" vnesite ime revije za katero želite izvedeti faktor vpliva in pritisnite na gumb POIŠČI. V skrajnem desnem stolpcu se bodo izpisali faktorji vpliva za revije, ki ustrezajo vašim iskalnim kriterijem. Zadetkov za posamezno revijo je več zato, ker so navedeni faktorji vpliva za posamezno leto. Za tekoče leto faktorji vpliva še niso objavljeni, zato se orientirajte po faktorjih vpliva zadnjih par let. Če faktorja vpliva za vašo izbrano revijo ne najdete v bazi COBISS, potem izberite članek iz kakšne druge revije.

==Citiranje virov==Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se v seminarju držite ene same. Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati. '''Citiranje knjig:''' Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica. Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN. Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005. Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4. Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.). '''Citiranje člankov:''' Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani. Lartigue C. ''et al''. Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, letn. 317, str. 632-638.Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole: Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani. Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.Revija Science uporablja skrajšani zapis: C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007) V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne). '''Citiranje spletnih virov:''' Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.