Wiki FKKT - User contributions [en]

Seminarji SB 2023/24

2024-05-06T18:05:02Z

Kostadin Mitkov:

V študijskem letu 2023/24 študenti in študentke pri Sintezni biologiji predstavljajo naslednje teme:

RAZISKOVALNI ČLANKI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sinteznobiološki_pristop_k_sestavljanju_in_ponovnemu_zagonu_klinično_pomembnih_fagov_Pseudomonas_aeruginosa Sinteznobiološki pristop k sestavljanju in ponovnemu zagonu klinično pomembnih fagov ''Pseudomonas aeruginosa''] (Bor Krajnik)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Optogenetsko_prostorsko_vzorčenje_kooperacije_pri_glivah_kvasovkah Optogenetsko prostorsko vzorčenje kooperacije pri glivah kvasovkah] (Martin Stanonik)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sintetična_celična_linija_za_inducibilno_pakiranje_virusa_influence_A Sintetična celična linija za inducibilno pakiranje virusa influence A] (Klara Razboršek)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Uporaba_sesalskega_RNA-vezavnega_proteina_Musashi-1_kot_alosterično_reguliranega_translacijskega_represorja_v_E._coli Uporaba sesalskega RNA-vezavnega proteina Musashi-1 kot alosterično reguliranega translacijskega represorja v ''E. coli''] (Marko Kovačić)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Kaskadno_ojačano_genetsko_vezje_za_detekcijo_glivnih_patogenov Kaskadno ojačano genetsko vezje za detekcijo glivnih patogenov] (Jakob Tomšič)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sintetična_mRNA-stikala_s_povratno_zanko,_ki_omogočajo_zaznavanje_miRNA Sintetična mRNA-stikala s povratno zanko, ki omogočajo zaznavanje miRNA] (Ana Pervanja)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Molekularni_nabor_navzkrižno_hranjenih_sevov_za_pripravo_sintetičnih_skupnosti_kvasovk Molekularni nabor navzkrižno hranjenih sevov za pripravo sintetičnih skupnosti kvasovk] (Teja Spruk)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Inženiring_dinamike_rasti_sesalskih_celic_za_bioproizvodnjo Inženiring dinamike rasti sesalskih celic za bioproizvodnjo] (Zarja Rožanc)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Inženirane_mRNA-ribosomske_fuzije_za_lažjo_biosintezo_selenoproteinov Inženirane mRNA-ribosomske fuzije za lažjo biosintezo selenoproteinov] (Kostadin Mitkov)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Razvoj_novih_binarnih_ekspresijskih_sistemov_za_sintezno_biologijo_rastlin Razvoj novih binarnih ekspresijskih sistemov za sintezno biologijo rastlin] (Alliana Kolar)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Kombinatorična_biosinteza_terpenoidov_v_kvasovkah Kombinatorična biosinteza terpenoidov v kvasovkah] (Jan Kogovšek)
#[http://wiki.fkkt.unilj.si/index.php/Identifikacija_genov,_ki_se_odzivajo_na_stres_kislega_okolja_in_inženiring_odpornosti_na_kislo_okolje_v_cianobakteriji_Synechococcus_elongatus_PCC_7942 Identifikacija genov, ki se odzivajo na stres kislega okolja in inženiring odpornosti na kislo okolje v cianobakteriji Synechococcus elongatus PCC 7942] (Ela Kovač)

NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/PhaseOut Biološka proizvodnja bioplastike] (Sašo Jakob)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BeeYeast Inženiring kvasovk za boj proti virusnim okužbam čebel] (Mateja Milošević)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Cellect Cellect - Fenotipsko stabilne celične linije] (Lucija Voga)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/oPHAelia oPHAelia - Inovativna rešitev za zmanjšanje onesnaževanja s plastiko] (Irina Kostadinoska)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/ReMixHD ReMixHD - Recikliranje mešanih plastičnih odpadkov] (Ema Kavčič)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/DARWINS DARWINS - Usmerjena posodobitev proteinov Ago z idealno proteinsko termično stabilnostjo] (Rahela Petrovčič)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/PET-2-Protein PET-2-Protein - Proizvodnja mikrobnih proteinov iz polietilen tereftalata] (Zala Perko)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/48C_Cadmium_catcher_LBP 48C Cadmium catcher LBP- Proizvodnja bioterapevtika za vezavo kadmija] (Maja Deutsch)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Proteus Proteus - Sistem za ciljanje onkogenov in induciranje piroptoze] (Gašper Struna)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Silinker Silinker] (Nuša Brdnik)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sublimestone Sublimestone - uporaba bakterij za ohranjanje kulturne dediščine] (Ana Maučec)
----

Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Povzetek je treba objaviti dva dni pred predstavitvijo do polnoči (za seminarje v sredo torej v ponedeljek). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo približno 5-minutna razprava.

Terminski razpored je razviden iz preglednice na strežniku Google Drive.

Kako je videti seznam seminarjev, lahko preverite pri lanskem letniku: [[Seminarji_SB_2022/23]].

Seminarji SB 2023/24

2024-05-06T18:04:04Z

Kostadin Mitkov:

V študijskem letu 2023/24 študenti in študentke pri Sintezni biologiji predstavljajo naslednje teme:

RAZISKOVALNI ČLANKI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sinteznobiološki_pristop_k_sestavljanju_in_ponovnemu_zagonu_klinično_pomembnih_fagov_Pseudomonas_aeruginosa Sinteznobiološki pristop k sestavljanju in ponovnemu zagonu klinično pomembnih fagov ''Pseudomonas aeruginosa''] (Bor Krajnik)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Optogenetsko_prostorsko_vzorčenje_kooperacije_pri_glivah_kvasovkah Optogenetsko prostorsko vzorčenje kooperacije pri glivah kvasovkah] (Martin Stanonik)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sintetična_celična_linija_za_inducibilno_pakiranje_virusa_influence_A Sintetična celična linija za inducibilno pakiranje virusa influence A] (Klara Razboršek)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Uporaba_sesalskega_RNA-vezavnega_proteina_Musashi-1_kot_alosterično_reguliranega_translacijskega_represorja_v_E._coli Uporaba sesalskega RNA-vezavnega proteina Musashi-1 kot alosterično reguliranega translacijskega represorja v ''E. coli''] (Marko Kovačić)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Kaskadno_ojačano_genetsko_vezje_za_detekcijo_glivnih_patogenov Kaskadno ojačano genetsko vezje za detekcijo glivnih patogenov] (Jakob Tomšič)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sintetična_mRNA-stikala_s_povratno_zanko,_ki_omogočajo_zaznavanje_miRNA Sintetična mRNA-stikala s povratno zanko, ki omogočajo zaznavanje miRNA] (Ana Pervanja)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Molekularni_nabor_navzkrižno_hranjenih_sevov_za_pripravo_sintetičnih_skupnosti_kvasovk Molekularni nabor navzkrižno hranjenih sevov za pripravo sintetičnih skupnosti kvasovk] (Teja Spruk)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Inženiring_dinamike_rasti_sesalskih_celic_za_bioproizvodnjo Inženiring dinamike rasti sesalskih celic za bioproizvodnjo] (Zarja Rožanc)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Inženirane_mRNA-ribosomske_fuzije_za_lažjo_biosintezo_selenoproteinov Inženirane mRNA-ribosomske fuzije za lažjo biosintezo selenoproteinov] (Kostadin Mitkov)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Razvoj_novih_binarnih_ekspresijskih_sistemov_za_sintezno_biologijo_rastlin Razvoj novih binarnih ekspresijskih sistemov za sintezno biologijo rastlin] (Alliana Kolar)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Kombinatorična_biosinteza_terpenoidov_v_kvasovkah Kombinatorična biosinteza terpenoidov v kvasovkah] (Jan Kogovšek)
# [http://wiki.fkkt.unilj.si/index.php/Identifikacija_genov,_ki_se_odzivajo_na_stres_kislega_okolja_in_inženiring_odpornosti_na_kislo_okolje_v_cianobakteriji_Synechococcus_elongatus_PCC_7942 Identifikacija genov, ki se odzivajo na stres kislega okolja in inženiring odpornosti na kislo okolje v cianobakteriji Synechococcus elongatus PCC 7942] (Ela Kovač)

NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/PhaseOut Biološka proizvodnja bioplastike] (Sašo Jakob)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BeeYeast Inženiring kvasovk za boj proti virusnim okužbam čebel] (Mateja Milošević)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Cellect Cellect - Fenotipsko stabilne celične linije] (Lucija Voga)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/oPHAelia oPHAelia - Inovativna rešitev za zmanjšanje onesnaževanja s plastiko] (Irina Kostadinoska)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/ReMixHD ReMixHD - Recikliranje mešanih plastičnih odpadkov] (Ema Kavčič)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/DARWINS DARWINS - Usmerjena posodobitev proteinov Ago z idealno proteinsko termično stabilnostjo] (Rahela Petrovčič)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/PET-2-Protein PET-2-Protein - Proizvodnja mikrobnih proteinov iz polietilen tereftalata] (Zala Perko)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/48C_Cadmium_catcher_LBP 48C Cadmium catcher LBP- Proizvodnja bioterapevtika za vezavo kadmija] (Maja Deutsch)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Proteus Proteus - Sistem za ciljanje onkogenov in induciranje piroptoze] (Gašper Struna)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Silinker Silinker] (Nuša Brdnik)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sublimestone Sublimestone - uporaba bakterij za ohranjanje kulturne dediščine] (Ana Maučec)
----

Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Povzetek je treba objaviti dva dni pred predstavitvijo do polnoči (za seminarje v sredo torej v ponedeljek). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo približno 5-minutna razprava.

Terminski razpored je razviden iz preglednice na strežniku Google Drive.

Kako je videti seznam seminarjev, lahko preverite pri lanskem letniku: [[Seminarji_SB_2022/23]].

Seminarji SB 2023/24

2024-05-06T18:03:00Z

Kostadin Mitkov:

V študijskem letu 2023/24 študenti in študentke pri Sintezni biologiji predstavljajo naslednje teme:

RAZISKOVALNI ČLANKI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sinteznobiološki_pristop_k_sestavljanju_in_ponovnemu_zagonu_klinično_pomembnih_fagov_Pseudomonas_aeruginosa Sinteznobiološki pristop k sestavljanju in ponovnemu zagonu klinično pomembnih fagov ''Pseudomonas aeruginosa''] (Bor Krajnik)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Optogenetsko_prostorsko_vzorčenje_kooperacije_pri_glivah_kvasovkah Optogenetsko prostorsko vzorčenje kooperacije pri glivah kvasovkah] (Martin Stanonik)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sintetična_celična_linija_za_inducibilno_pakiranje_virusa_influence_A Sintetična celična linija za inducibilno pakiranje virusa influence A] (Klara Razboršek)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Uporaba_sesalskega_RNA-vezavnega_proteina_Musashi-1_kot_alosterično_reguliranega_translacijskega_represorja_v_E._coli Uporaba sesalskega RNA-vezavnega proteina Musashi-1 kot alosterično reguliranega translacijskega represorja v ''E. coli''] (Marko Kovačić)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Kaskadno_ojačano_genetsko_vezje_za_detekcijo_glivnih_patogenov Kaskadno ojačano genetsko vezje za detekcijo glivnih patogenov] (Jakob Tomšič)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sintetična_mRNA-stikala_s_povratno_zanko,_ki_omogočajo_zaznavanje_miRNA Sintetična mRNA-stikala s povratno zanko, ki omogočajo zaznavanje miRNA] (Ana Pervanja)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Molekularni_nabor_navzkrižno_hranjenih_sevov_za_pripravo_sintetičnih_skupnosti_kvasovk Molekularni nabor navzkrižno hranjenih sevov za pripravo sintetičnih skupnosti kvasovk] (Teja Spruk)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Inženiring_dinamike_rasti_sesalskih_celic_za_bioproizvodnjo Inženiring dinamike rasti sesalskih celic za bioproizvodnjo] (Zarja Rožanc)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Inženirane_mRNA-ribosomske_fuzije_za_lažjo_biosintezo_selenoproteinov Inženirane mRNA-ribosomske fuzije za lažjo biosintezo selenoproteinov] (Kostadin Mitkov)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Razvoj_novih_binarnih_ekspresijskih_sistemov_za_sintezno_biologijo_rastlin Razvoj novih binarnih ekspresijskih sistemov za sintezno biologijo rastlin] (Alliana Kolar)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Kombinatorična_biosinteza_terpenoidov_v_kvasovkah Kombinatorična biosinteza terpenoidov v kvasovkah] (Jan Kogovšek)
# [http://wiki.fkkt.unilj.si/index.php/Identifikacija_genov,_ki_se_odzivajo_na_stres_kislega_okolja_in_inženiring_odpornosti_na_kislo_okolje_v_cianobakteriji_Synechococcus_elongatus_PCC_7942 Identifikacija_genov,_ki_se_odzivajo_na_stres_kislega_okolja_in_inženiring_odpornosti_na_kislo_okolje_v_cianobakteriji_Synechococcus_elongatus_PCC_7942] (Ela Kovač)

NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/PhaseOut Biološka proizvodnja bioplastike] (Sašo Jakob)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BeeYeast Inženiring kvasovk za boj proti virusnim okužbam čebel] (Mateja Milošević)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Cellect Cellect - Fenotipsko stabilne celične linije] (Lucija Voga)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/oPHAelia oPHAelia - Inovativna rešitev za zmanjšanje onesnaževanja s plastiko] (Irina Kostadinoska)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/ReMixHD ReMixHD - Recikliranje mešanih plastičnih odpadkov] (Ema Kavčič)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/DARWINS DARWINS - Usmerjena posodobitev proteinov Ago z idealno proteinsko termično stabilnostjo] (Rahela Petrovčič)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/PET-2-Protein PET-2-Protein - Proizvodnja mikrobnih proteinov iz polietilen tereftalata] (Zala Perko)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/48C_Cadmium_catcher_LBP 48C Cadmium catcher LBP- Proizvodnja bioterapevtika za vezavo kadmija] (Maja Deutsch)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Proteus Proteus - Sistem za ciljanje onkogenov in induciranje piroptoze] (Gašper Struna)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Silinker Silinker] (Nuša Brdnik)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sublimestone Sublimestone - uporaba bakterij za ohranjanje kulturne dediščine] (Ana Maučec)
----

Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Povzetek je treba objaviti dva dni pred predstavitvijo do polnoči (za seminarje v sredo torej v ponedeljek). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo približno 5-minutna razprava.

Terminski razpored je razviden iz preglednice na strežniku Google Drive.

Kako je videti seznam seminarjev, lahko preverite pri lanskem letniku: [[Seminarji_SB_2022/23]].

Inženirane mRNA-ribosomske fuzije za lažjo biosintezo selenoproteinov

2024-05-05T10:20:14Z

Kostadin Mitkov: /* Masna spektrometrija potrjuje mestno-specifičen vnos ostanka Sec v rekombinantni tarčni protein z RiboU */

Izhodiščni članek: [https://www.pnas.org/doi/10.1073/pnas.2321700121 Engineered mRNA–ribosome fusions for facile biosynthesis of selenoproteins]

==Uvod==

V genetskem kodu, kot ga poznamo, vse možne kombinacije tripletov nukleotidov kodirajo za 20 aminokislin, zato te aminokisline imenujemo standardne ali proteinogene [1]. Kljub temu v naravi obstajajo tudi selenoproteini, to so proteini, ki v svojem zaporedju vsebujejo aminokislino, imenovano selenocistein (Sec), ki ne sodi med 20 standardnih aminokislin. Zato se pojavi vprašanje, kako se med translacijo v polipeptidno verigo vključi selenocistein, če zanj ni kodona? V naravi je Sec kodiran s kodonom UGA, ki je stop kodon. Da se zagotovi prevod kodona UGA v Sec, namesto v stop kodon, ima ta stop kodon na 3’ koncu dodano od 20 do 60 nukleotidov dolgo specializirano zaporedje, imenovano SECIS (vstavitveno zaporedje za selenocistein) [2]. SECIS element omogoča mRNA selenoproteinov, da rekrutirajo elongacijski faktor SelB, ki se nato veže na specializirani tRNASec, ki prinaša Sec na aktivno mesto ribosoma. Ker selenoproteini kažejo višje katalitične hitrosti in odpornost proti nepovratni oksidaciji, kar omogoča Sec-vsebujočim proteinom hitrejše in daljše delovanje v primerjavi s Cys-vsebujočimi analogi, je sinteza načrtovanih selenoproteinov privlačna smer sintezne biologije [3]. Poznanih je že več strategij za sintezo selenoproteinov, vendar imajo nekatere pomanjkljivosti, saj zahtevajo dragocene in časovno zahtevne, včasih tudi nemogoče spremembe genetskega koda po celotnem genomu. Zato v članku A. Thaenert in sod. poročajo o novem pristopu k inženiringu ribosoma za sintezo načrtovanih selenoproteinov, ki temelji na fuziji med mRNA in ribosomom [4].

==Rezultati in diskusija==

===Načrtovanje ribosomov za biosintezo selenoproteinov===

V izhodiščnem članku so A. Thaenert in sod. želeli ustvariti ribosome, ki bi lahko v bakterijskih celicah vgradili selenocistein (Sec) na določenem mestu tarčnega proteina. Ker zaporedja SECIS rekrutirajo potrebne komponente za sintezo selenoproteinov k naravnim SECIS-mRNA, so domnevali, da vstavljanje SECIS elementa v rRNA lahko proizvede ribosome, ki so trajno povezani s kompleksom za sintezo selenoproteinov. Pričakovali so, da bo ta povezava omogočila ribosomom prevajanje UAG kodonov v Sec, namesto v stop kodon.

Da bi preverili to idejo, so uporabili znano strukturo ribosoma E. coli, vezanega na protein SelB in mRNA, ki vsebuje SECIS. Struktura je pokazala, da se med naravno sintezo selenoproteinov tako SECIS kot SelB vežeta na ribosom v tesni bližini heliksa 16 (h16) 16S rRNA. Zato so h16 uporabili kot mesto za vstavljanje zaporedja SECIS in proizvedli fuzijske molekule SECIS–16S rRNA. Pripravili so različne fuzijske molekule, ki so se razlikovale v dolžini povezovalnih zaporedij, preko katerih je bil element SECIS kovalentno povezan s h16, in v mestu vstavitve, torej za katerim nukleotidom je bil element vstavljen. Zaporedje SECIS, ki so ga uporabili, je bilo minimalno funkcionalno zaporedje SECIS iz mRNA selenoproteina format dehidrogenaze (FDH) iz bakterije E. coli. Prav tako so mutirali proti-Shine-Dalgarnovo zaporedje (anti-SD) v fuzijskih molekulah, da bi zagotovili vezavo le na rekombinantno pripravljene in ne na naravne mRNA molekule. Te modificirane fuzijske molekule so poimenovali variante RiboU, kar pomeni, da lahko prevajajo stop kodone v Sec, ki mu pripada enočrkovna oznaka "U". Tako so ustvarili knjižnico, ki je vsebovala 32 različnih variant in vsaka varianta je bila nato vstavljena v plazmid za nadaljnje študije in izboljšave [4].

===Vzpostavitev eksperimentalnega sistema za testiranje aktivnosti RiboU===

Da bi preizkusili, ali lahko RiboU sintetizira selenoproteine v E. coli, so ustvarili sistem, ki temelji na specifičnem genu in modificiranem sevu E. coli. Kot izhodiščni gen so izbrali gen fdhF, ki kodira selenoprotein FDH, katerega aktivnost je odvisna od Sec ostanka na položaju 140 in ki jo je lahko enostavno meriti in vivo. Gen so modificirali tako, da so odstranili naravno zaporedje SECIS in spremenili Sec kodon (UGA) v stop kodon (UAG), nato pa prilagodili Shine–Dalgarnovo zaporedje (SD), da se ujema z zaporedjem v RiboU. Ta modificiran gen so nato vstavili v plazmid skupaj z genom selC, ki kodira za tRNASec, modificiran tako, da prepozna UAG kodone namesto UGA kodone. Uporabili so sev E. coli, imenovan C321, pri katerem so vsi naravni UAG kodoni spremenjeni v UAA stop kodone, in ga modificirali tako, da so odstranili naravne kopije genov fdhF in selC, da bi preprečili FDH aktivnost v ozadju. Nato so te celice kotransformirali s plazmidi, ki vsebujejo različne variante RiboU in modificirane gene fdhF in selC. Eksperimenti so pokazali, da je 24 od 32 variant RiboU lahko proizvedlo FDH z različno učinkovitostjo. To nakazuje, da lahko ribosomi v fuziji z zaporedjem SECIS tvorijo funkcionalne selenoproteine iz mRNA molekul, ki jim manjka zaporedje SECIS [4].

===Izboljšanje aktivnosti RiboU s spremembo mesta vnosa zaporedja SECIS in dodajanjem mutacij v 16S rRNA===

V nadaljevanju so želeli preveriti, ali lahko delovanje RiboU izboljšajo tako, da poiščejo boljše mesto za vstavljanje SECIS v 16S rRNA, zato so preizkusili šest različnih mest v h16. Ko so vstavili SECIS med bazama 419 in 420 ali med 420 in 421, so variante RiboU pokazale približno petkrat višjo aktivnost v primerjavi z originalno verzijo (RiboU-v24-424-OR2). Nato so izbrali eno od novih variant RiboU (RiboU-v24-419-OR2) za nadaljnje izboljšave, kar kaže, da izbira boljšega mesta za vstavljanje SECIS lahko bistveno poveča učinkovitost RiboU.

Nato so preiskali, ali lahko specifične mutacije v 16S rRNA še dodatno povečajo aktivnost RiboU. Prejšnje raziskave so nakazovale, da mutaciji C1100U in G1516U povečata sintezo naravnih selenoproteinov, medtem ko mutaciji U531G in U534A izboljšata sposobnost ribosoma za interpretacijo UAG kodonov kot smiselne kodone in zmanjšata njegovo afiniteto do sprostitvenega faktorja RF1, zaradi česa je RF1 manj konkurenčen tRNA za prepoznavanje UAG. Mutacije so vstavili v konstrukt RiboU-v24-419-OR2 in preučili njihov vpliv na sintezo selenoproteinov. Ugotovili so, da mutacija G1516U (in C1100U) ni povečala proizvodnje selenoproteinov, vendar pa sta mutaciji U531G in U534A povečali aktivnost RiboU za približno desetkrat. Tako izboljšanje so opazili tudi pri sevu brez RF1, kar kaže, da te mutacije lahko vplivajo na prepoznavanje UAG neodvisno od RF1.

Želeli so si tudi povečati proizvodnjo selenoproteinov z optimizacijo parov SD/anti-SD. Primerjali so tri alternative ortogonalnih parov SD/anti-SD in ugotovili, da je zamenjava OR2 z ortogonalnim zaporedjem SD/anti-SD OR1 povečala aktivnost FDH za tri rede velikosti. Posledično so razvili izboljšano različico RiboU-v24-419-OR1, ki presega prejšnji RiboU-v24-419-OR2 [4].

===Povečano izražanje RiboU omogoča učinkovito sintezo rekombinantnih selenoproteinov===

Nadaljevali so s preizkušanjem aktivnosti RiboU z uporabo sistema, ki bolj natančno odraža proizvodnjo rekombinantnih selenoproteinov. Uporabili so reporterje na osnovi inteinov, ki tvorijo neaktivni prekurzor reporterskega proteina, ki postane aktiven s samoizrezovanjem. V protein, ki zagotavlja odpornost proti kanamicinu (KanR), so vstavili intein imenovan DnaB, ki za svoje samoizrezovanje potrebuje N-terminalni Cys ali Sec ostanek. To jim je omogočilo zaznavanje prisotnosti Sec z merjenjem odpornosti na kanamicin. Sprva njihovi eksperimenti niso pokazali pomembnih sprememb v odpornosti na kanamicin pri izražanju RiboU, kar kaže, da njihov konstrukt RiboU ni bil primeren za sintezo selenoproteinov v večjem obsegu.

Da bi konstrukt izboljšali, so izvedli tri prilagoditve. Prvič so prenesli rRNA-SECIS fuzijsko zaporedje v plazmid z večjim številom kopij, pri čemer so ciljali na 15 do 20 kopij na celico. Drugič so zamenjali originalni promotor (promotor, induciran s anhidrotetraciklinom) s promotorjem, induciran z arabinozo, saj je ta manj toksična molekula. Nazadnje so zamenjali E. coli sev BW25113 z B-95.ΔAΔfabR, ki ima izbit gen za RF1. Po teh spremembah so opazili izrazit porast odpornosti na kanamicin (do 75 μg/mL) ob izražanju RiboU, kar kaže na signifikantno proizvodnjo aktivnega reporterskega selenoproteina [4].

===Masna spektrometrija potrjuje mestno-specifičen vnos ostanka Sec v rekombinantni tarčni protein z RiboU===

V končnem poskusu so preizkusili sposobnost variante RiboU-v24-419-OR1, da na specifičnih mestih vstavi Sec ostanke v polipeptidno verigo. Kot model selenoproteina so uporabili majhen protein glutation oksidoreduktazo iz E. coli (Grx1). Grx1 lahko kot katalitičen ostanek v aktivnem mestu vsebuje bodisi Cys11 ali Sec11, pri čemer mutacije v Ser11 naredijo protein neaktiven. Ustvarili so tri variante Grx1: Grx1(C11) kot pozitivno kontrolo, Grx1(S11) kot negativno kontrolo in Grx1(UAG11) kot reporter za merjenje vstavljanja Sec s pomočjo RiboU. Variante so bile proizvedene v celicah B-95.ΔAΔfabR, ki izražajo RiboU-v24-419-OR1, nato pa so reporterske proteine izolirali za analizo. Preizkusi encimske aktivnosti so pokazali, da je Grx1(Ser11) neaktiven, medtem ko sta Grx1(C11) in Grx1(U11) pokazala podobne ravni aktivnosti.

Analiza masne spektrometrije je potrdila vstavljanje Sec na specifično mesto v Grx1(UAG11), pri čemer je bil Sec11 prisoten v 34,4 % proteinov, medtem ko je v preostalih 65,6 % UAG11 bil preveden kot Gln, Tyr in Ser. Preostanek Grx1(UAG11), ki vsebuje Ser11, kaže na nepopolno pretvorbo Ser-tRNASec v Sec-tRNASec. Ti rezultati so pokazali, da nepopolni RiboU omogoča natančno in specifično vključevanje Sec v rekombinantne proteine, proizvedene v celicah E. coli [4].

==Zaključek==

V študiji so A. Thaenert in sod. predstavili RiboU, ki predstavlja strategijo modificiranja ribosoma, ki omogoča vstavljanje selenocisteina na specifična mesta v tarčne proteine brez potrebe po spreminjanju kodonov po celem genomu. Z integracijo zaporedja SECIS v 16S rRNA lahko RiboU prevaja UAG kodone kot Sec in razširi sposobnosti sinteze selenoproteinov. Čeprav trenutne variante RiboU kažejo nekaj omejitev v učinkovitosti, predstavljajo pomemben napredek pri uporabi inženiringa ribosoma za namene sintezne biologije. Prihodnje izboljšave, kot so izboljšanje natančnosti vstavljanja Sec in povečanje izkoristkov proteinov, imajo potencial za nadaljnji razvoj te tehnologije. Opisan inovativen pristop poudarja potencial združevanja rRNA z regulatornimi elementi mRNA za spreminjanje interpretacije genetskega koda, kar obeta visoka pričakovanja v biotehnologiji in znanstvenem raziskovanju [4].

==Literatura==

[1] Genetic Code | Definition, Characteristics, Table, & Facts | Britannica. 5 Apr. 2024, https://www.britannica.com/science/genetic-code.

[2] Berry, Maria J., et al. “Recognition of UGA as a Selenocysteine Codon in Type I Deiodinase Requires Sequences in the 3′ Untranslated Region.” Nature, vol. 353, no. 6341, Sept. 1991, pp. 273–76. www.nature.com, https://doi.org/10.1038/353273a0.

[3] Stock, Tilmann, and Michael Rother. “Selenoproteins in Archaea and Gram-Positive Bacteria.” Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects, vol. 1790, no. 11, Nov. 2009, pp. 1520–32. ScienceDirect, https://doi.org/10.1016/j.bbagen.2009.03.022.

[4] Thaenert, Anna, et al. “Engineered mRNA–Ribosome Fusions for Facile Biosynthesis of Selenoproteins.” Proceedings of the National Academy of Sciences, vol. 121, no. 11, Mar. 2024, p. e2321700121. DOI.org (Crossref), https://doi.org/10.1073/pnas.2321700121.

Inženirane mRNA-ribosomske fuzije za lažjo biosintezo selenoproteinov

2024-05-05T10:18:55Z

Kostadin Mitkov: /* Povečano izražanje RiboU omogoča učinkovito sintezo rekombinantnih selenoproteinov */

Izhodiščni članek: [https://www.pnas.org/doi/10.1073/pnas.2321700121 Engineered mRNA–ribosome fusions for facile biosynthesis of selenoproteins]

==Uvod==

V genetskem kodu, kot ga poznamo, vse možne kombinacije tripletov nukleotidov kodirajo za 20 aminokislin, zato te aminokisline imenujemo standardne ali proteinogene [1]. Kljub temu v naravi obstajajo tudi selenoproteini, to so proteini, ki v svojem zaporedju vsebujejo aminokislino, imenovano selenocistein (Sec), ki ne sodi med 20 standardnih aminokislin. Zato se pojavi vprašanje, kako se med translacijo v polipeptidno verigo vključi selenocistein, če zanj ni kodona? V naravi je Sec kodiran s kodonom UGA, ki je stop kodon. Da se zagotovi prevod kodona UGA v Sec, namesto v stop kodon, ima ta stop kodon na 3’ koncu dodano od 20 do 60 nukleotidov dolgo specializirano zaporedje, imenovano SECIS (vstavitveno zaporedje za selenocistein) [2]. SECIS element omogoča mRNA selenoproteinov, da rekrutirajo elongacijski faktor SelB, ki se nato veže na specializirani tRNASec, ki prinaša Sec na aktivno mesto ribosoma. Ker selenoproteini kažejo višje katalitične hitrosti in odpornost proti nepovratni oksidaciji, kar omogoča Sec-vsebujočim proteinom hitrejše in daljše delovanje v primerjavi s Cys-vsebujočimi analogi, je sinteza načrtovanih selenoproteinov privlačna smer sintezne biologije [3]. Poznanih je že več strategij za sintezo selenoproteinov, vendar imajo nekatere pomanjkljivosti, saj zahtevajo dragocene in časovno zahtevne, včasih tudi nemogoče spremembe genetskega koda po celotnem genomu. Zato v članku A. Thaenert in sod. poročajo o novem pristopu k inženiringu ribosoma za sintezo načrtovanih selenoproteinov, ki temelji na fuziji med mRNA in ribosomom [4].

==Rezultati in diskusija==

===Načrtovanje ribosomov za biosintezo selenoproteinov===

V izhodiščnem članku so A. Thaenert in sod. želeli ustvariti ribosome, ki bi lahko v bakterijskih celicah vgradili selenocistein (Sec) na določenem mestu tarčnega proteina. Ker zaporedja SECIS rekrutirajo potrebne komponente za sintezo selenoproteinov k naravnim SECIS-mRNA, so domnevali, da vstavljanje SECIS elementa v rRNA lahko proizvede ribosome, ki so trajno povezani s kompleksom za sintezo selenoproteinov. Pričakovali so, da bo ta povezava omogočila ribosomom prevajanje UAG kodonov v Sec, namesto v stop kodon.

Da bi preverili to idejo, so uporabili znano strukturo ribosoma E. coli, vezanega na protein SelB in mRNA, ki vsebuje SECIS. Struktura je pokazala, da se med naravno sintezo selenoproteinov tako SECIS kot SelB vežeta na ribosom v tesni bližini heliksa 16 (h16) 16S rRNA. Zato so h16 uporabili kot mesto za vstavljanje zaporedja SECIS in proizvedli fuzijske molekule SECIS–16S rRNA. Pripravili so različne fuzijske molekule, ki so se razlikovale v dolžini povezovalnih zaporedij, preko katerih je bil element SECIS kovalentno povezan s h16, in v mestu vstavitve, torej za katerim nukleotidom je bil element vstavljen. Zaporedje SECIS, ki so ga uporabili, je bilo minimalno funkcionalno zaporedje SECIS iz mRNA selenoproteina format dehidrogenaze (FDH) iz bakterije E. coli. Prav tako so mutirali proti-Shine-Dalgarnovo zaporedje (anti-SD) v fuzijskih molekulah, da bi zagotovili vezavo le na rekombinantno pripravljene in ne na naravne mRNA molekule. Te modificirane fuzijske molekule so poimenovali variante RiboU, kar pomeni, da lahko prevajajo stop kodone v Sec, ki mu pripada enočrkovna oznaka "U". Tako so ustvarili knjižnico, ki je vsebovala 32 različnih variant in vsaka varianta je bila nato vstavljena v plazmid za nadaljnje študije in izboljšave [4].

===Vzpostavitev eksperimentalnega sistema za testiranje aktivnosti RiboU===

Da bi preizkusili, ali lahko RiboU sintetizira selenoproteine v E. coli, so ustvarili sistem, ki temelji na specifičnem genu in modificiranem sevu E. coli. Kot izhodiščni gen so izbrali gen fdhF, ki kodira selenoprotein FDH, katerega aktivnost je odvisna od Sec ostanka na položaju 140 in ki jo je lahko enostavno meriti in vivo. Gen so modificirali tako, da so odstranili naravno zaporedje SECIS in spremenili Sec kodon (UGA) v stop kodon (UAG), nato pa prilagodili Shine–Dalgarnovo zaporedje (SD), da se ujema z zaporedjem v RiboU. Ta modificiran gen so nato vstavili v plazmid skupaj z genom selC, ki kodira za tRNASec, modificiran tako, da prepozna UAG kodone namesto UGA kodone. Uporabili so sev E. coli, imenovan C321, pri katerem so vsi naravni UAG kodoni spremenjeni v UAA stop kodone, in ga modificirali tako, da so odstranili naravne kopije genov fdhF in selC, da bi preprečili FDH aktivnost v ozadju. Nato so te celice kotransformirali s plazmidi, ki vsebujejo različne variante RiboU in modificirane gene fdhF in selC. Eksperimenti so pokazali, da je 24 od 32 variant RiboU lahko proizvedlo FDH z različno učinkovitostjo. To nakazuje, da lahko ribosomi v fuziji z zaporedjem SECIS tvorijo funkcionalne selenoproteine iz mRNA molekul, ki jim manjka zaporedje SECIS [4].

===Izboljšanje aktivnosti RiboU s spremembo mesta vnosa zaporedja SECIS in dodajanjem mutacij v 16S rRNA===

V nadaljevanju so želeli preveriti, ali lahko delovanje RiboU izboljšajo tako, da poiščejo boljše mesto za vstavljanje SECIS v 16S rRNA, zato so preizkusili šest različnih mest v h16. Ko so vstavili SECIS med bazama 419 in 420 ali med 420 in 421, so variante RiboU pokazale približno petkrat višjo aktivnost v primerjavi z originalno verzijo (RiboU-v24-424-OR2). Nato so izbrali eno od novih variant RiboU (RiboU-v24-419-OR2) za nadaljnje izboljšave, kar kaže, da izbira boljšega mesta za vstavljanje SECIS lahko bistveno poveča učinkovitost RiboU.

Nato so preiskali, ali lahko specifične mutacije v 16S rRNA še dodatno povečajo aktivnost RiboU. Prejšnje raziskave so nakazovale, da mutaciji C1100U in G1516U povečata sintezo naravnih selenoproteinov, medtem ko mutaciji U531G in U534A izboljšata sposobnost ribosoma za interpretacijo UAG kodonov kot smiselne kodone in zmanjšata njegovo afiniteto do sprostitvenega faktorja RF1, zaradi česa je RF1 manj konkurenčen tRNA za prepoznavanje UAG. Mutacije so vstavili v konstrukt RiboU-v24-419-OR2 in preučili njihov vpliv na sintezo selenoproteinov. Ugotovili so, da mutacija G1516U (in C1100U) ni povečala proizvodnje selenoproteinov, vendar pa sta mutaciji U531G in U534A povečali aktivnost RiboU za približno desetkrat. Tako izboljšanje so opazili tudi pri sevu brez RF1, kar kaže, da te mutacije lahko vplivajo na prepoznavanje UAG neodvisno od RF1.

Želeli so si tudi povečati proizvodnjo selenoproteinov z optimizacijo parov SD/anti-SD. Primerjali so tri alternative ortogonalnih parov SD/anti-SD in ugotovili, da je zamenjava OR2 z ortogonalnim zaporedjem SD/anti-SD OR1 povečala aktivnost FDH za tri rede velikosti. Posledično so razvili izboljšano različico RiboU-v24-419-OR1, ki presega prejšnji RiboU-v24-419-OR2 [4].

===Povečano izražanje RiboU omogoča učinkovito sintezo rekombinantnih selenoproteinov===

Nadaljevali so s preizkušanjem aktivnosti RiboU z uporabo sistema, ki bolj natančno odraža proizvodnjo rekombinantnih selenoproteinov. Uporabili so reporterje na osnovi inteinov, ki tvorijo neaktivni prekurzor reporterskega proteina, ki postane aktiven s samoizrezovanjem. V protein, ki zagotavlja odpornost proti kanamicinu (KanR), so vstavili intein imenovan DnaB, ki za svoje samoizrezovanje potrebuje N-terminalni Cys ali Sec ostanek. To jim je omogočilo zaznavanje prisotnosti Sec z merjenjem odpornosti na kanamicin. Sprva njihovi eksperimenti niso pokazali pomembnih sprememb v odpornosti na kanamicin pri izražanju RiboU, kar kaže, da njihov konstrukt RiboU ni bil primeren za sintezo selenoproteinov v večjem obsegu.

Da bi konstrukt izboljšali, so izvedli tri prilagoditve. Prvič so prenesli rRNA-SECIS fuzijsko zaporedje v plazmid z večjim številom kopij, pri čemer so ciljali na 15 do 20 kopij na celico. Drugič so zamenjali originalni promotor (promotor, induciran s anhidrotetraciklinom) s promotorjem, induciran z arabinozo, saj je ta manj toksična molekula. Nazadnje so zamenjali E. coli sev BW25113 z B-95.ΔAΔfabR, ki ima izbit gen za RF1. Po teh spremembah so opazili izrazit porast odpornosti na kanamicin (do 75 μg/mL) ob izražanju RiboU, kar kaže na signifikantno proizvodnjo aktivnega reporterskega selenoproteina [4].

===Masna spektrometrija potrjuje mestno-specifičen vnos ostanka Sec v rekombinantni tarčni protein z RiboU===

V končnem poskusu so preizkusili sposobnost variante RiboU-v24-419-OR1, da na specifičnih mestih vstavi Sec ostanke v polipeptidno verigo. Kot model selenoproteina so uporabili majhen protein glutation oksidoreduktazo iz E. coli (Grx1). Grx1 lahko kot katalitičen ostanek v aktivnem mestu vsebuje bodisi Cys11 ali Sec11, pri čemer mutacije v Ser11 naredijo protein neaktiven. Ustvarili so tri variante Grx1: Grx1(C11) kot pozitivno kontrolo, Grx1(S11) kot negativno kontrolo in Grx1(UAG11) kot reporter za merjenje vstavljanja Sec s pomočjo RiboU. Variante so bile proizvedene v celicah B-95.ΔAΔfabR, ki izražajo RiboU-v24-419-OR1, nato pa so reporterske proteine izolirali za analizo. Preizkusi encimske aktivnosti so pokazali, da je Grx1(Ser11) neaktiven, medtem ko sta Grx1(C11) in Grx1(U11) pokazala podobne ravni aktivnosti.

Analiza masne spektrometrije je potrdila vstavljanje Sec na specifično mesto v Grx1(UAG11), pri čemer je bil Sec11 prisoten v 34,4 % proteinov, medtem ko je v preostalih 65,6 % UAG11 bil preveden kot Gln, Tyr in Ser. Preostanek Grx1(UAG11), ki vsebuje Ser11, kaže na nepopolno pretvorbo Ser-tRNASec v Sec-tRNASec. Ti rezultati so pokazali, da nepopolni RiboU omogoča natančno in specifično vključevanje Sec v rekombinantne proteine, proizvedene v celicah E. coli [4].

==Zaključek==

V študiji so A. Thaenert in sod. predstavili RiboU, ki predstavlja strategijo modificiranja ribosoma, ki omogoča vstavljanje selenocisteina na specifična mesta v tarčne proteine brez potrebe po spreminjanju kodonov po celem genomu. Z integracijo zaporedja SECIS v 16S rRNA lahko RiboU prevaja UAG kodone kot Sec in razširi sposobnosti sinteze selenoproteinov. Čeprav trenutne variante RiboU kažejo nekaj omejitev v učinkovitosti, predstavljajo pomemben napredek pri uporabi inženiringa ribosoma za namene sintezne biologije. Prihodnje izboljšave, kot so izboljšanje natančnosti vstavljanja Sec in povečanje izkoristkov proteinov, imajo potencial za nadaljnji razvoj te tehnologije. Opisan inovativen pristop poudarja potencial združevanja rRNA z regulatornimi elementi mRNA za spreminjanje interpretacije genetskega koda, kar obeta visoka pričakovanja v biotehnologiji in znanstvenem raziskovanju [4].

==Literatura==

[1] Genetic Code | Definition, Characteristics, Table, & Facts | Britannica. 5 Apr. 2024, https://www.britannica.com/science/genetic-code.

[2] Berry, Maria J., et al. “Recognition of UGA as a Selenocysteine Codon in Type I Deiodinase Requires Sequences in the 3′ Untranslated Region.” Nature, vol. 353, no. 6341, Sept. 1991, pp. 273–76. www.nature.com, https://doi.org/10.1038/353273a0.

[3] Stock, Tilmann, and Michael Rother. “Selenoproteins in Archaea and Gram-Positive Bacteria.” Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects, vol. 1790, no. 11, Nov. 2009, pp. 1520–32. ScienceDirect, https://doi.org/10.1016/j.bbagen.2009.03.022.

[4] Thaenert, Anna, et al. “Engineered mRNA–Ribosome Fusions for Facile Biosynthesis of Selenoproteins.” Proceedings of the National Academy of Sciences, vol. 121, no. 11, Mar. 2024, p. e2321700121. DOI.org (Crossref), https://doi.org/10.1073/pnas.2321700121.

Inženirane mRNA-ribosomske fuzije za lažjo biosintezo selenoproteinov

2024-05-05T10:17:21Z

Kostadin Mitkov: /* Vzpostavitev eksperimentalnega sistema za testiranje aktivnosti RiboU */

Izhodiščni članek: [https://www.pnas.org/doi/10.1073/pnas.2321700121 Engineered mRNA–ribosome fusions for facile biosynthesis of selenoproteins]

==Uvod==

V genetskem kodu, kot ga poznamo, vse možne kombinacije tripletov nukleotidov kodirajo za 20 aminokislin, zato te aminokisline imenujemo standardne ali proteinogene [1]. Kljub temu v naravi obstajajo tudi selenoproteini, to so proteini, ki v svojem zaporedju vsebujejo aminokislino, imenovano selenocistein (Sec), ki ne sodi med 20 standardnih aminokislin. Zato se pojavi vprašanje, kako se med translacijo v polipeptidno verigo vključi selenocistein, če zanj ni kodona? V naravi je Sec kodiran s kodonom UGA, ki je stop kodon. Da se zagotovi prevod kodona UGA v Sec, namesto v stop kodon, ima ta stop kodon na 3’ koncu dodano od 20 do 60 nukleotidov dolgo specializirano zaporedje, imenovano SECIS (vstavitveno zaporedje za selenocistein) [2]. SECIS element omogoča mRNA selenoproteinov, da rekrutirajo elongacijski faktor SelB, ki se nato veže na specializirani tRNASec, ki prinaša Sec na aktivno mesto ribosoma. Ker selenoproteini kažejo višje katalitične hitrosti in odpornost proti nepovratni oksidaciji, kar omogoča Sec-vsebujočim proteinom hitrejše in daljše delovanje v primerjavi s Cys-vsebujočimi analogi, je sinteza načrtovanih selenoproteinov privlačna smer sintezne biologije [3]. Poznanih je že več strategij za sintezo selenoproteinov, vendar imajo nekatere pomanjkljivosti, saj zahtevajo dragocene in časovno zahtevne, včasih tudi nemogoče spremembe genetskega koda po celotnem genomu. Zato v članku A. Thaenert in sod. poročajo o novem pristopu k inženiringu ribosoma za sintezo načrtovanih selenoproteinov, ki temelji na fuziji med mRNA in ribosomom [4].

==Rezultati in diskusija==

===Načrtovanje ribosomov za biosintezo selenoproteinov===

V izhodiščnem članku so A. Thaenert in sod. želeli ustvariti ribosome, ki bi lahko v bakterijskih celicah vgradili selenocistein (Sec) na določenem mestu tarčnega proteina. Ker zaporedja SECIS rekrutirajo potrebne komponente za sintezo selenoproteinov k naravnim SECIS-mRNA, so domnevali, da vstavljanje SECIS elementa v rRNA lahko proizvede ribosome, ki so trajno povezani s kompleksom za sintezo selenoproteinov. Pričakovali so, da bo ta povezava omogočila ribosomom prevajanje UAG kodonov v Sec, namesto v stop kodon.

Da bi preverili to idejo, so uporabili znano strukturo ribosoma E. coli, vezanega na protein SelB in mRNA, ki vsebuje SECIS. Struktura je pokazala, da se med naravno sintezo selenoproteinov tako SECIS kot SelB vežeta na ribosom v tesni bližini heliksa 16 (h16) 16S rRNA. Zato so h16 uporabili kot mesto za vstavljanje zaporedja SECIS in proizvedli fuzijske molekule SECIS–16S rRNA. Pripravili so različne fuzijske molekule, ki so se razlikovale v dolžini povezovalnih zaporedij, preko katerih je bil element SECIS kovalentno povezan s h16, in v mestu vstavitve, torej za katerim nukleotidom je bil element vstavljen. Zaporedje SECIS, ki so ga uporabili, je bilo minimalno funkcionalno zaporedje SECIS iz mRNA selenoproteina format dehidrogenaze (FDH) iz bakterije E. coli. Prav tako so mutirali proti-Shine-Dalgarnovo zaporedje (anti-SD) v fuzijskih molekulah, da bi zagotovili vezavo le na rekombinantno pripravljene in ne na naravne mRNA molekule. Te modificirane fuzijske molekule so poimenovali variante RiboU, kar pomeni, da lahko prevajajo stop kodone v Sec, ki mu pripada enočrkovna oznaka "U". Tako so ustvarili knjižnico, ki je vsebovala 32 različnih variant in vsaka varianta je bila nato vstavljena v plazmid za nadaljnje študije in izboljšave [4].

===Vzpostavitev eksperimentalnega sistema za testiranje aktivnosti RiboU===

Da bi preizkusili, ali lahko RiboU sintetizira selenoproteine v E. coli, so ustvarili sistem, ki temelji na specifičnem genu in modificiranem sevu E. coli. Kot izhodiščni gen so izbrali gen fdhF, ki kodira selenoprotein FDH, katerega aktivnost je odvisna od Sec ostanka na položaju 140 in ki jo je lahko enostavno meriti in vivo. Gen so modificirali tako, da so odstranili naravno zaporedje SECIS in spremenili Sec kodon (UGA) v stop kodon (UAG), nato pa prilagodili Shine–Dalgarnovo zaporedje (SD), da se ujema z zaporedjem v RiboU. Ta modificiran gen so nato vstavili v plazmid skupaj z genom selC, ki kodira za tRNASec, modificiran tako, da prepozna UAG kodone namesto UGA kodone. Uporabili so sev E. coli, imenovan C321, pri katerem so vsi naravni UAG kodoni spremenjeni v UAA stop kodone, in ga modificirali tako, da so odstranili naravne kopije genov fdhF in selC, da bi preprečili FDH aktivnost v ozadju. Nato so te celice kotransformirali s plazmidi, ki vsebujejo različne variante RiboU in modificirane gene fdhF in selC. Eksperimenti so pokazali, da je 24 od 32 variant RiboU lahko proizvedlo FDH z različno učinkovitostjo. To nakazuje, da lahko ribosomi v fuziji z zaporedjem SECIS tvorijo funkcionalne selenoproteine iz mRNA molekul, ki jim manjka zaporedje SECIS [4].

===Izboljšanje aktivnosti RiboU s spremembo mesta vnosa zaporedja SECIS in dodajanjem mutacij v 16S rRNA===

V nadaljevanju so želeli preveriti, ali lahko delovanje RiboU izboljšajo tako, da poiščejo boljše mesto za vstavljanje SECIS v 16S rRNA, zato so preizkusili šest različnih mest v h16. Ko so vstavili SECIS med bazama 419 in 420 ali med 420 in 421, so variante RiboU pokazale približno petkrat višjo aktivnost v primerjavi z originalno verzijo (RiboU-v24-424-OR2). Nato so izbrali eno od novih variant RiboU (RiboU-v24-419-OR2) za nadaljnje izboljšave, kar kaže, da izbira boljšega mesta za vstavljanje SECIS lahko bistveno poveča učinkovitost RiboU.

Nato so preiskali, ali lahko specifične mutacije v 16S rRNA še dodatno povečajo aktivnost RiboU. Prejšnje raziskave so nakazovale, da mutaciji C1100U in G1516U povečata sintezo naravnih selenoproteinov, medtem ko mutaciji U531G in U534A izboljšata sposobnost ribosoma za interpretacijo UAG kodonov kot smiselne kodone in zmanjšata njegovo afiniteto do sprostitvenega faktorja RF1, zaradi česa je RF1 manj konkurenčen tRNA za prepoznavanje UAG. Mutacije so vstavili v konstrukt RiboU-v24-419-OR2 in preučili njihov vpliv na sintezo selenoproteinov. Ugotovili so, da mutacija G1516U (in C1100U) ni povečala proizvodnje selenoproteinov, vendar pa sta mutaciji U531G in U534A povečali aktivnost RiboU za približno desetkrat. Tako izboljšanje so opazili tudi pri sevu brez RF1, kar kaže, da te mutacije lahko vplivajo na prepoznavanje UAG neodvisno od RF1.

Želeli so si tudi povečati proizvodnjo selenoproteinov z optimizacijo parov SD/anti-SD. Primerjali so tri alternative ortogonalnih parov SD/anti-SD in ugotovili, da je zamenjava OR2 z ortogonalnim zaporedjem SD/anti-SD OR1 povečala aktivnost FDH za tri rede velikosti. Posledično so razvili izboljšano različico RiboU-v24-419-OR1, ki presega prejšnji RiboU-v24-419-OR2 [4].

===Povečano izražanje RiboU omogoča učinkovito sintezo rekombinantnih selenoproteinov===

Nadaljevali so s preizkušanjem aktivnosti RiboU z uporabo sistema, ki bolj natančno odraža proizvodnjo rekombinantnih selenoproteinov. Uporabili so reporterje na osnovi inteinov, ki tvorijo neaktivni prekurzor reporterskega proteina, ki postane aktiven s samoizrezovanjem. V protein, ki zagotavlja odpornost proti kanamicinu (KanR), so vstavili intein imenovan DnaB, ki za svoje samoizrezovanje potrebuje N-terminalni Cys ali Sec ostanek. To jim je omogočilo zaznavanje prisotnosti Sec z merjenjem odpornosti na kanamicin. Sprva njihovi eksperimenti niso pokazali pomembnih sprememb v odpornosti na kanamicin pri izražanju RiboU, kar kaže, da njihov konstrukt RiboU ni bil primeren za sintezo selenoproteinov v večjem obsegu.

Da bi konstrukt izboljšali, so izvedli tri prilagoditve. Prvič so prenesli rRNA-SECIS fuzijsko zaporedje v plazmid z večjim številom kopij, pri čemer so ciljali na 15 do 20 kopij na celico. Drugič so zamenjali originalni promotor (promotor, induciran s anhidrotetraciklinom) s promotorjem, induciran z arabinozo, saj je ta manj toksična molekula. Nazadnje so zamenjali E. coli sev BW25113 z B-95.ΔAΔfabR, ki ima izbit gen za RF1. Po teh spremembah so opazili izrazit porast odpornosti na kanamicin (do 75 μg/mL) ob izražanju RiboU, kar kaže na signifikantno proizvodnjo aktivnega reporterskega selenoproteina [4].

===Masna spektrometrija potrjuje mestno-specifičen vnos ostanka Sec v rekombinantni tarčni protein z RiboU===

V končnem poskusu so preizkusili sposobnost variante RiboU-v24-419-OR1, da na specifičnih mestih vstavi Sec ostanke v polipeptidno verigo. Kot model selenoproteina so uporabili majhen protein glutation oksidoreduktazo iz E. coli (Grx1). Grx1 lahko kot katalitičen ostanek v aktivnem mestu vsebuje bodisi Cys11 ali Sec11, pri čemer mutacije v Ser11 naredijo protein neaktiven. Ustvarili so tri variante Grx1: Grx1(C11) kot pozitivno kontrolo, Grx1(S11) kot negativno kontrolo in Grx1(UAG11) kot reporter za merjenje vstavljanja Sec s pomočjo RiboU. Variante so bile proizvedene v celicah B-95.ΔAΔfabR, ki izražajo RiboU-v24-419-OR1, nato pa so reporterske proteine izolirali za analizo. Preizkusi encimske aktivnosti so pokazali, da je Grx1(Ser11) neaktiven, medtem ko sta Grx1(C11) in Grx1(U11) pokazala podobne ravni aktivnosti.

Analiza masne spektrometrije je potrdila vstavljanje Sec na specifično mesto v Grx1(UAG11), pri čemer je bil Sec11 prisoten v 34,4 % proteinov, medtem ko je v preostalih 65,6 % UAG11 bil preveden kot Gln, Tyr in Ser. Preostanek Grx1(UAG11), ki vsebuje Ser11, kaže na nepopolno pretvorbo Ser-tRNASec v Sec-tRNASec. Ti rezultati so pokazali, da nepopolni RiboU omogoča natančno in specifično vključevanje Sec v rekombinantne proteine, proizvedene v celicah E. coli [4].

==Zaključek==

V študiji so A. Thaenert in sod. predstavili RiboU, ki predstavlja strategijo modificiranja ribosoma, ki omogoča vstavljanje selenocisteina na specifična mesta v tarčne proteine brez potrebe po spreminjanju kodonov po celem genomu. Z integracijo zaporedja SECIS v 16S rRNA lahko RiboU prevaja UAG kodone kot Sec in razširi sposobnosti sinteze selenoproteinov. Čeprav trenutne variante RiboU kažejo nekaj omejitev v učinkovitosti, predstavljajo pomemben napredek pri uporabi inženiringa ribosoma za namene sintezne biologije. Prihodnje izboljšave, kot so izboljšanje natančnosti vstavljanja Sec in povečanje izkoristkov proteinov, imajo potencial za nadaljnji razvoj te tehnologije. Opisan inovativen pristop poudarja potencial združevanja rRNA z regulatornimi elementi mRNA za spreminjanje interpretacije genetskega koda, kar obeta visoka pričakovanja v biotehnologiji in znanstvenem raziskovanju [4].

==Literatura==

[1] Genetic Code | Definition, Characteristics, Table, & Facts | Britannica. 5 Apr. 2024, https://www.britannica.com/science/genetic-code.

[2] Berry, Maria J., et al. “Recognition of UGA as a Selenocysteine Codon in Type I Deiodinase Requires Sequences in the 3′ Untranslated Region.” Nature, vol. 353, no. 6341, Sept. 1991, pp. 273–76. www.nature.com, https://doi.org/10.1038/353273a0.

[3] Stock, Tilmann, and Michael Rother. “Selenoproteins in Archaea and Gram-Positive Bacteria.” Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects, vol. 1790, no. 11, Nov. 2009, pp. 1520–32. ScienceDirect, https://doi.org/10.1016/j.bbagen.2009.03.022.

[4] Thaenert, Anna, et al. “Engineered mRNA–Ribosome Fusions for Facile Biosynthesis of Selenoproteins.” Proceedings of the National Academy of Sciences, vol. 121, no. 11, Mar. 2024, p. e2321700121. DOI.org (Crossref), https://doi.org/10.1073/pnas.2321700121.

Inženirane mRNA-ribosomske fuzije za lažjo biosintezo selenoproteinov

2024-05-05T10:16:33Z

Kostadin Mitkov: /* Vzpostavitev eksperimentalnega sistema za testiranje aktivnosti RiboU */

Izhodiščni članek: [https://www.pnas.org/doi/10.1073/pnas.2321700121 Engineered mRNA–ribosome fusions for facile biosynthesis of selenoproteins]

==Uvod==

V genetskem kodu, kot ga poznamo, vse možne kombinacije tripletov nukleotidov kodirajo za 20 aminokislin, zato te aminokisline imenujemo standardne ali proteinogene [1]. Kljub temu v naravi obstajajo tudi selenoproteini, to so proteini, ki v svojem zaporedju vsebujejo aminokislino, imenovano selenocistein (Sec), ki ne sodi med 20 standardnih aminokislin. Zato se pojavi vprašanje, kako se med translacijo v polipeptidno verigo vključi selenocistein, če zanj ni kodona? V naravi je Sec kodiran s kodonom UGA, ki je stop kodon. Da se zagotovi prevod kodona UGA v Sec, namesto v stop kodon, ima ta stop kodon na 3’ koncu dodano od 20 do 60 nukleotidov dolgo specializirano zaporedje, imenovano SECIS (vstavitveno zaporedje za selenocistein) [2]. SECIS element omogoča mRNA selenoproteinov, da rekrutirajo elongacijski faktor SelB, ki se nato veže na specializirani tRNASec, ki prinaša Sec na aktivno mesto ribosoma. Ker selenoproteini kažejo višje katalitične hitrosti in odpornost proti nepovratni oksidaciji, kar omogoča Sec-vsebujočim proteinom hitrejše in daljše delovanje v primerjavi s Cys-vsebujočimi analogi, je sinteza načrtovanih selenoproteinov privlačna smer sintezne biologije [3]. Poznanih je že več strategij za sintezo selenoproteinov, vendar imajo nekatere pomanjkljivosti, saj zahtevajo dragocene in časovno zahtevne, včasih tudi nemogoče spremembe genetskega koda po celotnem genomu. Zato v članku A. Thaenert in sod. poročajo o novem pristopu k inženiringu ribosoma za sintezo načrtovanih selenoproteinov, ki temelji na fuziji med mRNA in ribosomom [4].

==Rezultati in diskusija==

===Načrtovanje ribosomov za biosintezo selenoproteinov===

V izhodiščnem članku so A. Thaenert in sod. želeli ustvariti ribosome, ki bi lahko v bakterijskih celicah vgradili selenocistein (Sec) na določenem mestu tarčnega proteina. Ker zaporedja SECIS rekrutirajo potrebne komponente za sintezo selenoproteinov k naravnim SECIS-mRNA, so domnevali, da vstavljanje SECIS elementa v rRNA lahko proizvede ribosome, ki so trajno povezani s kompleksom za sintezo selenoproteinov. Pričakovali so, da bo ta povezava omogočila ribosomom prevajanje UAG kodonov v Sec, namesto v stop kodon.

Da bi preverili to idejo, so uporabili znano strukturo ribosoma E. coli, vezanega na protein SelB in mRNA, ki vsebuje SECIS. Struktura je pokazala, da se med naravno sintezo selenoproteinov tako SECIS kot SelB vežeta na ribosom v tesni bližini heliksa 16 (h16) 16S rRNA. Zato so h16 uporabili kot mesto za vstavljanje zaporedja SECIS in proizvedli fuzijske molekule SECIS–16S rRNA. Pripravili so različne fuzijske molekule, ki so se razlikovale v dolžini povezovalnih zaporedij, preko katerih je bil element SECIS kovalentno povezan s h16, in v mestu vstavitve, torej za katerim nukleotidom je bil element vstavljen. Zaporedje SECIS, ki so ga uporabili, je bilo minimalno funkcionalno zaporedje SECIS iz mRNA selenoproteina format dehidrogenaze (FDH) iz bakterije E. coli. Prav tako so mutirali proti-Shine-Dalgarnovo zaporedje (anti-SD) v fuzijskih molekulah, da bi zagotovili vezavo le na rekombinantno pripravljene in ne na naravne mRNA molekule. Te modificirane fuzijske molekule so poimenovali variante RiboU, kar pomeni, da lahko prevajajo stop kodone v Sec, ki mu pripada enočrkovna oznaka "U". Tako so ustvarili knjižnico, ki je vsebovala 32 različnih variant in vsaka varianta je bila nato vstavljena v plazmid za nadaljnje študije in izboljšave [4].

===Vzpostavitev eksperimentalnega sistema za testiranje aktivnosti RiboU===

Da bi preizkusili, ali lahko RiboU sintetizira selenoproteine v E. coli, so ustvarili sistem, ki temelji na specifičnem genu in modificiranem sevu E. coli. Kot izhodiščni gen so izbrali gen fdhF, ki kodira selenoprotein FDH, katerega aktivnost je odvisna od Sec ostanka na položaju 140 in ki jo je lahko enostavno meriti in vivo. Gen so modificirali tako, da so odstranili naravno zaporedje SECIS in spremenili Sec kodon (UGA) v stop kodon (UAG), nato pa prilagodili Shine–Dalgarnovo zaporedje (SD), da se ujema z zaporedjem v RiboU. Ta modificiran gen so nato vstavili v plazmid skupaj z genom selC, ki kodira za tRNASec, modificiran tako, da prepozna UAG kodone namesto UGA kodone. Uporabili so sev E. coli, imenovan C321, pri katerem so vsi naravni UAG kodoni spremenjeni v UAA stop kodone, in ga modificirali tako, da so odstranili naravne kopije genov fdhF in selC, da bi preprečili FDH aktivnost v ozadju. Nato so te celice kotransformirali s plazmidi, ki vsebujejo različne variante RiboU in modificirane gene fdhF in selC. Eksperimenti so pokazali, da je 24 od 32 variant RiboU lahko proizvedlo FDH z različno učinkovitostjo. To nakazuje, da lahko ribosomi v fuziji z zaporedjem SECIS tvorijo funkcionalne selenoproteine iz mRNA molekul, ki jim manjka zaporedje SECIS [4].

===Izboljšanje aktivnosti RiboU s spremembo mesta vnosa zaporedja SECIS in dodajanjem mutacij v 16S rRNA===

V nadaljevanju so želeli preveriti, ali lahko delovanje RiboU izboljšajo tako, da poiščejo boljše mesto za vstavljanje SECIS v 16S rRNA, zato so preizkusili šest različnih mest v h16. Ko so vstavili SECIS med bazama 419 in 420 ali med 420 in 421, so variante RiboU pokazale približno petkrat višjo aktivnost v primerjavi z originalno verzijo (RiboU-v24-424-OR2). Nato so izbrali eno od novih variant RiboU (RiboU-v24-419-OR2) za nadaljnje izboljšave, kar kaže, da izbira boljšega mesta za vstavljanje SECIS lahko bistveno poveča učinkovitost RiboU.

Nato so preiskali, ali lahko specifične mutacije v 16S rRNA še dodatno povečajo aktivnost RiboU. Prejšnje raziskave so nakazovale, da mutaciji C1100U in G1516U povečata sintezo naravnih selenoproteinov, medtem ko mutaciji U531G in U534A izboljšata sposobnost ribosoma za interpretacijo UAG kodonov kot smiselne kodone in zmanjšata njegovo afiniteto do sprostitvenega faktorja RF1, zaradi česa je RF1 manj konkurenčen tRNA za prepoznavanje UAG. Mutacije so vstavili v konstrukt RiboU-v24-419-OR2 in preučili njihov vpliv na sintezo selenoproteinov. Ugotovili so, da mutacija G1516U (in C1100U) ni povečala proizvodnje selenoproteinov, vendar pa sta mutaciji U531G in U534A povečali aktivnost RiboU za približno desetkrat. Tako izboljšanje so opazili tudi pri sevu brez RF1, kar kaže, da te mutacije lahko vplivajo na prepoznavanje UAG neodvisno od RF1.

Želeli so si tudi povečati proizvodnjo selenoproteinov z optimizacijo parov SD/anti-SD. Primerjali so tri alternative ortogonalnih parov SD/anti-SD in ugotovili, da je zamenjava OR2 z ortogonalnim zaporedjem SD/anti-SD OR1 povečala aktivnost FDH za tri rede velikosti. Posledično so razvili izboljšano različico RiboU-v24-419-OR1, ki presega prejšnji RiboU-v24-419-OR2 [4].

===Povečano izražanje RiboU omogoča učinkovito sintezo rekombinantnih selenoproteinov===

Nadaljevali so s preizkušanjem aktivnosti RiboU z uporabo sistema, ki bolj natančno odraža proizvodnjo rekombinantnih selenoproteinov. Uporabili so reporterje na osnovi inteinov, ki tvorijo neaktivni prekurzor reporterskega proteina, ki postane aktiven s samoizrezovanjem. V protein, ki zagotavlja odpornost proti kanamicinu (KanR), so vstavili intein imenovan DnaB, ki za svoje samoizrezovanje potrebuje N-terminalni Cys ali Sec ostanek. To jim je omogočilo zaznavanje prisotnosti Sec z merjenjem odpornosti na kanamicin. Sprva njihovi eksperimenti niso pokazali pomembnih sprememb v odpornosti na kanamicin pri izražanju RiboU, kar kaže, da njihov konstrukt RiboU ni bil primeren za sintezo selenoproteinov v večjem obsegu.

Da bi konstrukt izboljšali, so izvedli tri prilagoditve. Prvič so prenesli rRNA-SECIS fuzijsko zaporedje v plazmid z večjim številom kopij, pri čemer so ciljali na 15 do 20 kopij na celico. Drugič so zamenjali originalni promotor (promotor, induciran s anhidrotetraciklinom) s promotorjem, induciran z arabinozo, saj je ta manj toksična molekula. Nazadnje so zamenjali E. coli sev BW25113 z B-95.ΔAΔfabR, ki ima izbit gen za RF1. Po teh spremembah so opazili izrazit porast odpornosti na kanamicin (do 75 μg/mL) ob izražanju RiboU, kar kaže na signifikantno proizvodnjo aktivnega reporterskega selenoproteina [4].

===Masna spektrometrija potrjuje mestno-specifičen vnos ostanka Sec v rekombinantni tarčni protein z RiboU===

V končnem poskusu so preizkusili sposobnost variante RiboU-v24-419-OR1, da na specifičnih mestih vstavi Sec ostanke v polipeptidno verigo. Kot model selenoproteina so uporabili majhen protein glutation oksidoreduktazo iz E. coli (Grx1). Grx1 lahko kot katalitičen ostanek v aktivnem mestu vsebuje bodisi Cys11 ali Sec11, pri čemer mutacije v Ser11 naredijo protein neaktiven. Ustvarili so tri variante Grx1: Grx1(C11) kot pozitivno kontrolo, Grx1(S11) kot negativno kontrolo in Grx1(UAG11) kot reporter za merjenje vstavljanja Sec s pomočjo RiboU. Variante so bile proizvedene v celicah B-95.ΔAΔfabR, ki izražajo RiboU-v24-419-OR1, nato pa so reporterske proteine izolirali za analizo. Preizkusi encimske aktivnosti so pokazali, da je Grx1(Ser11) neaktiven, medtem ko sta Grx1(C11) in Grx1(U11) pokazala podobne ravni aktivnosti.

Analiza masne spektrometrije je potrdila vstavljanje Sec na specifično mesto v Grx1(UAG11), pri čemer je bil Sec11 prisoten v 34,4 % proteinov, medtem ko je v preostalih 65,6 % UAG11 bil preveden kot Gln, Tyr in Ser. Preostanek Grx1(UAG11), ki vsebuje Ser11, kaže na nepopolno pretvorbo Ser-tRNASec v Sec-tRNASec. Ti rezultati so pokazali, da nepopolni RiboU omogoča natančno in specifično vključevanje Sec v rekombinantne proteine, proizvedene v celicah E. coli [4].

==Zaključek==

V študiji so A. Thaenert in sod. predstavili RiboU, ki predstavlja strategijo modificiranja ribosoma, ki omogoča vstavljanje selenocisteina na specifična mesta v tarčne proteine brez potrebe po spreminjanju kodonov po celem genomu. Z integracijo zaporedja SECIS v 16S rRNA lahko RiboU prevaja UAG kodone kot Sec in razširi sposobnosti sinteze selenoproteinov. Čeprav trenutne variante RiboU kažejo nekaj omejitev v učinkovitosti, predstavljajo pomemben napredek pri uporabi inženiringa ribosoma za namene sintezne biologije. Prihodnje izboljšave, kot so izboljšanje natančnosti vstavljanja Sec in povečanje izkoristkov proteinov, imajo potencial za nadaljnji razvoj te tehnologije. Opisan inovativen pristop poudarja potencial združevanja rRNA z regulatornimi elementi mRNA za spreminjanje interpretacije genetskega koda, kar obeta visoka pričakovanja v biotehnologiji in znanstvenem raziskovanju [4].

==Literatura==

[1] Genetic Code | Definition, Characteristics, Table, & Facts | Britannica. 5 Apr. 2024, https://www.britannica.com/science/genetic-code.

[2] Berry, Maria J., et al. “Recognition of UGA as a Selenocysteine Codon in Type I Deiodinase Requires Sequences in the 3′ Untranslated Region.” Nature, vol. 353, no. 6341, Sept. 1991, pp. 273–76. www.nature.com, https://doi.org/10.1038/353273a0.

[3] Stock, Tilmann, and Michael Rother. “Selenoproteins in Archaea and Gram-Positive Bacteria.” Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects, vol. 1790, no. 11, Nov. 2009, pp. 1520–32. ScienceDirect, https://doi.org/10.1016/j.bbagen.2009.03.022.

[4] Thaenert, Anna, et al. “Engineered mRNA–Ribosome Fusions for Facile Biosynthesis of Selenoproteins.” Proceedings of the National Academy of Sciences, vol. 121, no. 11, Mar. 2024, p. e2321700121. DOI.org (Crossref), https://doi.org/10.1073/pnas.2321700121.

Inženirane mRNA-ribosomske fuzije za lažjo biosintezo selenoproteinov

2024-05-05T10:14:24Z

Kostadin Mitkov: /* Načrtovanje ribosomov za biosintezo selenoproteinov */

Izhodiščni članek: [https://www.pnas.org/doi/10.1073/pnas.2321700121 Engineered mRNA–ribosome fusions for facile biosynthesis of selenoproteins]

==Uvod==

V genetskem kodu, kot ga poznamo, vse možne kombinacije tripletov nukleotidov kodirajo za 20 aminokislin, zato te aminokisline imenujemo standardne ali proteinogene [1]. Kljub temu v naravi obstajajo tudi selenoproteini, to so proteini, ki v svojem zaporedju vsebujejo aminokislino, imenovano selenocistein (Sec), ki ne sodi med 20 standardnih aminokislin. Zato se pojavi vprašanje, kako se med translacijo v polipeptidno verigo vključi selenocistein, če zanj ni kodona? V naravi je Sec kodiran s kodonom UGA, ki je stop kodon. Da se zagotovi prevod kodona UGA v Sec, namesto v stop kodon, ima ta stop kodon na 3’ koncu dodano od 20 do 60 nukleotidov dolgo specializirano zaporedje, imenovano SECIS (vstavitveno zaporedje za selenocistein) [2]. SECIS element omogoča mRNA selenoproteinov, da rekrutirajo elongacijski faktor SelB, ki se nato veže na specializirani tRNASec, ki prinaša Sec na aktivno mesto ribosoma. Ker selenoproteini kažejo višje katalitične hitrosti in odpornost proti nepovratni oksidaciji, kar omogoča Sec-vsebujočim proteinom hitrejše in daljše delovanje v primerjavi s Cys-vsebujočimi analogi, je sinteza načrtovanih selenoproteinov privlačna smer sintezne biologije [3]. Poznanih je že več strategij za sintezo selenoproteinov, vendar imajo nekatere pomanjkljivosti, saj zahtevajo dragocene in časovno zahtevne, včasih tudi nemogoče spremembe genetskega koda po celotnem genomu. Zato v članku A. Thaenert in sod. poročajo o novem pristopu k inženiringu ribosoma za sintezo načrtovanih selenoproteinov, ki temelji na fuziji med mRNA in ribosomom [4].

==Rezultati in diskusija==

===Načrtovanje ribosomov za biosintezo selenoproteinov===

V izhodiščnem članku so A. Thaenert in sod. želeli ustvariti ribosome, ki bi lahko v bakterijskih celicah vgradili selenocistein (Sec) na določenem mestu tarčnega proteina. Ker zaporedja SECIS rekrutirajo potrebne komponente za sintezo selenoproteinov k naravnim SECIS-mRNA, so domnevali, da vstavljanje SECIS elementa v rRNA lahko proizvede ribosome, ki so trajno povezani s kompleksom za sintezo selenoproteinov. Pričakovali so, da bo ta povezava omogočila ribosomom prevajanje UAG kodonov v Sec, namesto v stop kodon.

Da bi preverili to idejo, so uporabili znano strukturo ribosoma E. coli, vezanega na protein SelB in mRNA, ki vsebuje SECIS. Struktura je pokazala, da se med naravno sintezo selenoproteinov tako SECIS kot SelB vežeta na ribosom v tesni bližini heliksa 16 (h16) 16S rRNA. Zato so h16 uporabili kot mesto za vstavljanje zaporedja SECIS in proizvedli fuzijske molekule SECIS–16S rRNA. Pripravili so različne fuzijske molekule, ki so se razlikovale v dolžini povezovalnih zaporedij, preko katerih je bil element SECIS kovalentno povezan s h16, in v mestu vstavitve, torej za katerim nukleotidom je bil element vstavljen. Zaporedje SECIS, ki so ga uporabili, je bilo minimalno funkcionalno zaporedje SECIS iz mRNA selenoproteina format dehidrogenaze (FDH) iz bakterije E. coli. Prav tako so mutirali proti-Shine-Dalgarnovo zaporedje (anti-SD) v fuzijskih molekulah, da bi zagotovili vezavo le na rekombinantno pripravljene in ne na naravne mRNA molekule. Te modificirane fuzijske molekule so poimenovali variante RiboU, kar pomeni, da lahko prevajajo stop kodone v Sec, ki mu pripada enočrkovna oznaka "U". Tako so ustvarili knjižnico, ki je vsebovala 32 različnih variant in vsaka varianta je bila nato vstavljena v plazmid za nadaljnje študije in izboljšave [4].

===Vzpostavitev eksperimentalnega sistema za testiranje aktivnosti RiboU===

Da bi preizkusili, ali lahko RiboU sintetizira selenoproteine v E. coli, so ustvarili sistem, ki temelji na specifičnem genu in modificiranem sevu E. coli. Kot izhodiščni gen so izbrali gen fdhF, ki kodira selenoprotein FDH, katerega aktivnost je odvisna od Sec ostanka na položaju 140 in ki jo je lahko enostavno meriti in vivo. Gen so modificirali tako, da so odstranili naravno zaporedje SECIS in spremenili Sec kodon (UGA) v stop kodon (UAG), nato pa prilagodili Shine–Dalgarnovo zaporedje (SD), da se ujema z zaporedjem v RiboU. Ta modificiran gen so nato vstavili v plazmid skupaj z genom selC, ki kodira za tRNASec, modificiran tako, da prepozna UAG kodone namesto UGA kodone. Uporabili so sev E. coli, imenovan C321, pri katerem so vsi naravni UAG kodoni spremenjeni v UAA stop kodone, in ga modificirali tako, da so odstranili naravne kopije genov fdhF in selC, da bi preprečili FDH aktivnost v ozadju. Nato so te celice kotransformirali s plazmidi, ki vsebujejo različne variante RiboU in modificirane gene fdhF in selC. Eksperimenti so pokazali, da je 24 od 32 variant RiboU lahko proizvedlo FDH z različno učinkovitostjo. To nakazuje, da lahko ribosomi v fuziji z zaporedjem SECIS tvorijo funkcionalne selenoproteine iz mRNA molekul, ki jim manjka zaporedje SECIS [4].

===Izboljšanje aktivnosti RiboU s spremembo mesta vnosa zaporedja SECIS in dodajanjem mutacij v 16S rRNA===

V nadaljevanju so želeli preveriti, ali lahko delovanje RiboU izboljšajo tako, da poiščejo boljše mesto za vstavljanje SECIS v 16S rRNA, zato so preizkusili šest različnih mest v h16. Ko so vstavili SECIS med bazama 419 in 420 ali med 420 in 421, so variante RiboU pokazale približno petkrat višjo aktivnost v primerjavi z originalno verzijo (RiboU-v24-424-OR2). Nato so izbrali eno od novih variant RiboU (RiboU-v24-419-OR2) za nadaljnje izboljšave, kar kaže, da izbira boljšega mesta za vstavljanje SECIS lahko bistveno poveča učinkovitost RiboU.

Nato so preiskali, ali lahko specifične mutacije v 16S rRNA še dodatno povečajo aktivnost RiboU. Prejšnje raziskave so nakazovale, da mutaciji C1100U in G1516U povečata sintezo naravnih selenoproteinov, medtem ko mutaciji U531G in U534A izboljšata sposobnost ribosoma za interpretacijo UAG kodonov kot smiselne kodone in zmanjšata njegovo afiniteto do sprostitvenega faktorja RF1, zaradi česa je RF1 manj konkurenčen tRNA za prepoznavanje UAG. Mutacije so vstavili v konstrukt RiboU-v24-419-OR2 in preučili njihov vpliv na sintezo selenoproteinov. Ugotovili so, da mutacija G1516U (in C1100U) ni povečala proizvodnje selenoproteinov, vendar pa sta mutaciji U531G in U534A povečali aktivnost RiboU za približno desetkrat. Tako izboljšanje so opazili tudi pri sevu brez RF1, kar kaže, da te mutacije lahko vplivajo na prepoznavanje UAG neodvisno od RF1.

Želeli so si tudi povečati proizvodnjo selenoproteinov z optimizacijo parov SD/anti-SD. Primerjali so tri alternative ortogonalnih parov SD/anti-SD in ugotovili, da je zamenjava OR2 z ortogonalnim zaporedjem SD/anti-SD OR1 povečala aktivnost FDH za tri rede velikosti. Posledično so razvili izboljšano različico RiboU-v24-419-OR1, ki presega prejšnji RiboU-v24-419-OR2 [4].

===Povečano izražanje RiboU omogoča učinkovito sintezo rekombinantnih selenoproteinov===

Nadaljevali so s preizkušanjem aktivnosti RiboU z uporabo sistema, ki bolj natančno odraža proizvodnjo rekombinantnih selenoproteinov. Uporabili so reporterje na osnovi inteinov, ki tvorijo neaktivni prekurzor reporterskega proteina, ki postane aktiven s samoizrezovanjem. V protein, ki zagotavlja odpornost proti kanamicinu (KanR), so vstavili intein imenovan DnaB, ki za svoje samoizrezovanje potrebuje N-terminalni Cys ali Sec ostanek. To jim je omogočilo zaznavanje prisotnosti Sec z merjenjem odpornosti na kanamicin. Sprva njihovi eksperimenti niso pokazali pomembnih sprememb v odpornosti na kanamicin pri izražanju RiboU, kar kaže, da njihov konstrukt RiboU ni bil primeren za sintezo selenoproteinov v večjem obsegu.

Da bi konstrukt izboljšali, so izvedli tri prilagoditve. Prvič so prenesli rRNA-SECIS fuzijsko zaporedje v plazmid z večjim številom kopij, pri čemer so ciljali na 15 do 20 kopij na celico. Drugič so zamenjali originalni promotor (promotor, induciran s anhidrotetraciklinom) s promotorjem, induciran z arabinozo, saj je ta manj toksična molekula. Nazadnje so zamenjali E. coli sev BW25113 z B-95.ΔAΔfabR, ki ima izbit gen za RF1. Po teh spremembah so opazili izrazit porast odpornosti na kanamicin (do 75 μg/mL) ob izražanju RiboU, kar kaže na signifikantno proizvodnjo aktivnega reporterskega selenoproteina [4].

===Masna spektrometrija potrjuje mestno-specifičen vnos ostanka Sec v rekombinantni tarčni protein z RiboU===

V končnem poskusu so preizkusili sposobnost variante RiboU-v24-419-OR1, da na specifičnih mestih vstavi Sec ostanke v polipeptidno verigo. Kot model selenoproteina so uporabili majhen protein glutation oksidoreduktazo iz E. coli (Grx1). Grx1 lahko kot katalitičen ostanek v aktivnem mestu vsebuje bodisi Cys11 ali Sec11, pri čemer mutacije v Ser11 naredijo protein neaktiven. Ustvarili so tri variante Grx1: Grx1(C11) kot pozitivno kontrolo, Grx1(S11) kot negativno kontrolo in Grx1(UAG11) kot reporter za merjenje vstavljanja Sec s pomočjo RiboU. Variante so bile proizvedene v celicah B-95.ΔAΔfabR, ki izražajo RiboU-v24-419-OR1, nato pa so reporterske proteine izolirali za analizo. Preizkusi encimske aktivnosti so pokazali, da je Grx1(Ser11) neaktiven, medtem ko sta Grx1(C11) in Grx1(U11) pokazala podobne ravni aktivnosti.

Analiza masne spektrometrije je potrdila vstavljanje Sec na specifično mesto v Grx1(UAG11), pri čemer je bil Sec11 prisoten v 34,4 % proteinov, medtem ko je v preostalih 65,6 % UAG11 bil preveden kot Gln, Tyr in Ser. Preostanek Grx1(UAG11), ki vsebuje Ser11, kaže na nepopolno pretvorbo Ser-tRNASec v Sec-tRNASec. Ti rezultati so pokazali, da nepopolni RiboU omogoča natančno in specifično vključevanje Sec v rekombinantne proteine, proizvedene v celicah E. coli [4].

==Zaključek==

V študiji so A. Thaenert in sod. predstavili RiboU, ki predstavlja strategijo modificiranja ribosoma, ki omogoča vstavljanje selenocisteina na specifična mesta v tarčne proteine brez potrebe po spreminjanju kodonov po celem genomu. Z integracijo zaporedja SECIS v 16S rRNA lahko RiboU prevaja UAG kodone kot Sec in razširi sposobnosti sinteze selenoproteinov. Čeprav trenutne variante RiboU kažejo nekaj omejitev v učinkovitosti, predstavljajo pomemben napredek pri uporabi inženiringa ribosoma za namene sintezne biologije. Prihodnje izboljšave, kot so izboljšanje natančnosti vstavljanja Sec in povečanje izkoristkov proteinov, imajo potencial za nadaljnji razvoj te tehnologije. Opisan inovativen pristop poudarja potencial združevanja rRNA z regulatornimi elementi mRNA za spreminjanje interpretacije genetskega koda, kar obeta visoka pričakovanja v biotehnologiji in znanstvenem raziskovanju [4].

==Literatura==

[1] Genetic Code | Definition, Characteristics, Table, & Facts | Britannica. 5 Apr. 2024, https://www.britannica.com/science/genetic-code.

[2] Berry, Maria J., et al. “Recognition of UGA as a Selenocysteine Codon in Type I Deiodinase Requires Sequences in the 3′ Untranslated Region.” Nature, vol. 353, no. 6341, Sept. 1991, pp. 273–76. www.nature.com, https://doi.org/10.1038/353273a0.

[3] Stock, Tilmann, and Michael Rother. “Selenoproteins in Archaea and Gram-Positive Bacteria.” Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects, vol. 1790, no. 11, Nov. 2009, pp. 1520–32. ScienceDirect, https://doi.org/10.1016/j.bbagen.2009.03.022.

[4] Thaenert, Anna, et al. “Engineered mRNA–Ribosome Fusions for Facile Biosynthesis of Selenoproteins.” Proceedings of the National Academy of Sciences, vol. 121, no. 11, Mar. 2024, p. e2321700121. DOI.org (Crossref), https://doi.org/10.1073/pnas.2321700121.

Inženirane mRNA-ribosomske fuzije za lažjo biosintezo selenoproteinov

2024-05-05T10:13:28Z

Kostadin Mitkov: /* Načrtovanje ribosomov za biosintezo selenoproteinov */

Izhodiščni članek: [https://www.pnas.org/doi/10.1073/pnas.2321700121 Engineered mRNA–ribosome fusions for facile biosynthesis of selenoproteins]

==Uvod==

V genetskem kodu, kot ga poznamo, vse možne kombinacije tripletov nukleotidov kodirajo za 20 aminokislin, zato te aminokisline imenujemo standardne ali proteinogene [1]. Kljub temu v naravi obstajajo tudi selenoproteini, to so proteini, ki v svojem zaporedju vsebujejo aminokislino, imenovano selenocistein (Sec), ki ne sodi med 20 standardnih aminokislin. Zato se pojavi vprašanje, kako se med translacijo v polipeptidno verigo vključi selenocistein, če zanj ni kodona? V naravi je Sec kodiran s kodonom UGA, ki je stop kodon. Da se zagotovi prevod kodona UGA v Sec, namesto v stop kodon, ima ta stop kodon na 3’ koncu dodano od 20 do 60 nukleotidov dolgo specializirano zaporedje, imenovano SECIS (vstavitveno zaporedje za selenocistein) [2]. SECIS element omogoča mRNA selenoproteinov, da rekrutirajo elongacijski faktor SelB, ki se nato veže na specializirani tRNASec, ki prinaša Sec na aktivno mesto ribosoma. Ker selenoproteini kažejo višje katalitične hitrosti in odpornost proti nepovratni oksidaciji, kar omogoča Sec-vsebujočim proteinom hitrejše in daljše delovanje v primerjavi s Cys-vsebujočimi analogi, je sinteza načrtovanih selenoproteinov privlačna smer sintezne biologije [3]. Poznanih je že več strategij za sintezo selenoproteinov, vendar imajo nekatere pomanjkljivosti, saj zahtevajo dragocene in časovno zahtevne, včasih tudi nemogoče spremembe genetskega koda po celotnem genomu. Zato v članku A. Thaenert in sod. poročajo o novem pristopu k inženiringu ribosoma za sintezo načrtovanih selenoproteinov, ki temelji na fuziji med mRNA in ribosomom [4].

==Rezultati in diskusija==

===Načrtovanje ribosomov za biosintezo selenoproteinov===

V izhodiščnem članku so A. Thaenert in sod. želeli ustvariti ribosome, ki bi lahko v bakterijskih celicah vgradili selenocistein (Sec) na določenem mestu tarčnega proteina. Ker zaporedja SECIS rekrutirajo potrebne komponente za sintezo selenoproteinov k naravnim SECIS-mRNA, so domnevali, da vstavljanje SECIS elementa v rRNA lahko proizvede ribosome, ki so trajno povezani s kompleksom za sintezo selenoproteinov. Pričakovali so, da bo ta povezava omogočila ribosomom prevajanje UAG kodonov v Sec, namesto v stop kodon.

Da bi preverili to idejo, so uporabili znano strukturo ribosoma E. coli, vezanega na protein SelB in mRNA, ki vsebuje SECIS. Struktura je pokazala, da se med naravno sintezo selenoproteinov tako SECIS kot SelB vežeta na ribosom v tesni bližini heliksa 16 (h16) 16S rRNA. Zato so h16 uporabili kot mesto za vstavljanje zaporedja SECIS in proizvedli fuzijske molekule SECIS–16S rRNA. Pripravili so različne fuzijske molekule, ki so se razlikovale v dolžini povezovalnih zaporedij, preko katerih je bil element SECIS kovalentno povezan s h16, in v mestu vstavitve, torej za katerim nukleotidom je bil element vstavljen. Zaporedje SECIS, ki so ga uporabili, je bilo minimalno funkcionalno zaporedje SECIS iz mRNA selenoproteina format dehidrogenaze (FDH) iz bakterije E. coli. Prav tako so mutirali proti-Shine-Dalgarnovo zaporedje (anti-SD) v fuzijskih molekulah, da bi zagotovili vezavo le na rekombinantno pripravljene in ne na naravne mRNA molekule. Te modificirane fuzijske molekule so poimenovali variante RiboU, kar pomeni, da lahko prevajajo stop kodone v Sec, ki mu pripada enočrkovna oznaka "U". Tako so ustvarili knjižnico, ki je vsebovala 32 različnih variant in vsaka varianta je bila nato vstavljena v plazmid za nadaljnje študije in izboljšave [4].

===Vzpostavitev eksperimentalnega sistema za testiranje aktivnosti RiboU===

Da bi preizkusili, ali lahko RiboU sintetizira selenoproteine v E. coli, so ustvarili sistem, ki temelji na specifičnem genu in modificiranem sevu E. coli. Kot izhodiščni gen so izbrali gen fdhF, ki kodira selenoprotein FDH, katerega aktivnost je odvisna od Sec ostanka na položaju 140 in ki jo je lahko enostavno meriti in vivo. Gen so modificirali tako, da so odstranili naravno zaporedje SECIS in spremenili Sec kodon (UGA) v stop kodon (UAG), nato pa prilagodili Shine–Dalgarnovo zaporedje (SD), da se ujema z zaporedjem v RiboU. Ta modificiran gen so nato vstavili v plazmid skupaj z genom selC, ki kodira za tRNASec, modificiran tako, da prepozna UAG kodone namesto UGA kodone. Uporabili so sev E. coli, imenovan C321, pri katerem so vsi naravni UAG kodoni spremenjeni v UAA stop kodone, in ga modificirali tako, da so odstranili naravne kopije genov fdhF in selC, da bi preprečili FDH aktivnost v ozadju. Nato so te celice kotransformirali s plazmidi, ki vsebujejo različne variante RiboU in modificirane gene fdhF in selC. Eksperimenti so pokazali, da je 24 od 32 variant RiboU lahko proizvedlo FDH z različno učinkovitostjo. To nakazuje, da lahko ribosomi v fuziji z zaporedjem SECIS tvorijo funkcionalne selenoproteine iz mRNA molekul, ki jim manjka zaporedje SECIS [4].

===Izboljšanje aktivnosti RiboU s spremembo mesta vnosa zaporedja SECIS in dodajanjem mutacij v 16S rRNA===

V nadaljevanju so želeli preveriti, ali lahko delovanje RiboU izboljšajo tako, da poiščejo boljše mesto za vstavljanje SECIS v 16S rRNA, zato so preizkusili šest različnih mest v h16. Ko so vstavili SECIS med bazama 419 in 420 ali med 420 in 421, so variante RiboU pokazale približno petkrat višjo aktivnost v primerjavi z originalno verzijo (RiboU-v24-424-OR2). Nato so izbrali eno od novih variant RiboU (RiboU-v24-419-OR2) za nadaljnje izboljšave, kar kaže, da izbira boljšega mesta za vstavljanje SECIS lahko bistveno poveča učinkovitost RiboU.

Nato so preiskali, ali lahko specifične mutacije v 16S rRNA še dodatno povečajo aktivnost RiboU. Prejšnje raziskave so nakazovale, da mutaciji C1100U in G1516U povečata sintezo naravnih selenoproteinov, medtem ko mutaciji U531G in U534A izboljšata sposobnost ribosoma za interpretacijo UAG kodonov kot smiselne kodone in zmanjšata njegovo afiniteto do sprostitvenega faktorja RF1, zaradi česa je RF1 manj konkurenčen tRNA za prepoznavanje UAG. Mutacije so vstavili v konstrukt RiboU-v24-419-OR2 in preučili njihov vpliv na sintezo selenoproteinov. Ugotovili so, da mutacija G1516U (in C1100U) ni povečala proizvodnje selenoproteinov, vendar pa sta mutaciji U531G in U534A povečali aktivnost RiboU za približno desetkrat. Tako izboljšanje so opazili tudi pri sevu brez RF1, kar kaže, da te mutacije lahko vplivajo na prepoznavanje UAG neodvisno od RF1.

Želeli so si tudi povečati proizvodnjo selenoproteinov z optimizacijo parov SD/anti-SD. Primerjali so tri alternative ortogonalnih parov SD/anti-SD in ugotovili, da je zamenjava OR2 z ortogonalnim zaporedjem SD/anti-SD OR1 povečala aktivnost FDH za tri rede velikosti. Posledično so razvili izboljšano različico RiboU-v24-419-OR1, ki presega prejšnji RiboU-v24-419-OR2 [4].

===Povečano izražanje RiboU omogoča učinkovito sintezo rekombinantnih selenoproteinov===

Nadaljevali so s preizkušanjem aktivnosti RiboU z uporabo sistema, ki bolj natančno odraža proizvodnjo rekombinantnih selenoproteinov. Uporabili so reporterje na osnovi inteinov, ki tvorijo neaktivni prekurzor reporterskega proteina, ki postane aktiven s samoizrezovanjem. V protein, ki zagotavlja odpornost proti kanamicinu (KanR), so vstavili intein imenovan DnaB, ki za svoje samoizrezovanje potrebuje N-terminalni Cys ali Sec ostanek. To jim je omogočilo zaznavanje prisotnosti Sec z merjenjem odpornosti na kanamicin. Sprva njihovi eksperimenti niso pokazali pomembnih sprememb v odpornosti na kanamicin pri izražanju RiboU, kar kaže, da njihov konstrukt RiboU ni bil primeren za sintezo selenoproteinov v večjem obsegu.

Da bi konstrukt izboljšali, so izvedli tri prilagoditve. Prvič so prenesli rRNA-SECIS fuzijsko zaporedje v plazmid z večjim številom kopij, pri čemer so ciljali na 15 do 20 kopij na celico. Drugič so zamenjali originalni promotor (promotor, induciran s anhidrotetraciklinom) s promotorjem, induciran z arabinozo, saj je ta manj toksična molekula. Nazadnje so zamenjali E. coli sev BW25113 z B-95.ΔAΔfabR, ki ima izbit gen za RF1. Po teh spremembah so opazili izrazit porast odpornosti na kanamicin (do 75 μg/mL) ob izražanju RiboU, kar kaže na signifikantno proizvodnjo aktivnega reporterskega selenoproteina [4].

===Masna spektrometrija potrjuje mestno-specifičen vnos ostanka Sec v rekombinantni tarčni protein z RiboU===

V končnem poskusu so preizkusili sposobnost variante RiboU-v24-419-OR1, da na specifičnih mestih vstavi Sec ostanke v polipeptidno verigo. Kot model selenoproteina so uporabili majhen protein glutation oksidoreduktazo iz E. coli (Grx1). Grx1 lahko kot katalitičen ostanek v aktivnem mestu vsebuje bodisi Cys11 ali Sec11, pri čemer mutacije v Ser11 naredijo protein neaktiven. Ustvarili so tri variante Grx1: Grx1(C11) kot pozitivno kontrolo, Grx1(S11) kot negativno kontrolo in Grx1(UAG11) kot reporter za merjenje vstavljanja Sec s pomočjo RiboU. Variante so bile proizvedene v celicah B-95.ΔAΔfabR, ki izražajo RiboU-v24-419-OR1, nato pa so reporterske proteine izolirali za analizo. Preizkusi encimske aktivnosti so pokazali, da je Grx1(Ser11) neaktiven, medtem ko sta Grx1(C11) in Grx1(U11) pokazala podobne ravni aktivnosti.

Analiza masne spektrometrije je potrdila vstavljanje Sec na specifično mesto v Grx1(UAG11), pri čemer je bil Sec11 prisoten v 34,4 % proteinov, medtem ko je v preostalih 65,6 % UAG11 bil preveden kot Gln, Tyr in Ser. Preostanek Grx1(UAG11), ki vsebuje Ser11, kaže na nepopolno pretvorbo Ser-tRNASec v Sec-tRNASec. Ti rezultati so pokazali, da nepopolni RiboU omogoča natančno in specifično vključevanje Sec v rekombinantne proteine, proizvedene v celicah E. coli [4].

==Zaključek==

V študiji so A. Thaenert in sod. predstavili RiboU, ki predstavlja strategijo modificiranja ribosoma, ki omogoča vstavljanje selenocisteina na specifična mesta v tarčne proteine brez potrebe po spreminjanju kodonov po celem genomu. Z integracijo zaporedja SECIS v 16S rRNA lahko RiboU prevaja UAG kodone kot Sec in razširi sposobnosti sinteze selenoproteinov. Čeprav trenutne variante RiboU kažejo nekaj omejitev v učinkovitosti, predstavljajo pomemben napredek pri uporabi inženiringa ribosoma za namene sintezne biologije. Prihodnje izboljšave, kot so izboljšanje natančnosti vstavljanja Sec in povečanje izkoristkov proteinov, imajo potencial za nadaljnji razvoj te tehnologije. Opisan inovativen pristop poudarja potencial združevanja rRNA z regulatornimi elementi mRNA za spreminjanje interpretacije genetskega koda, kar obeta visoka pričakovanja v biotehnologiji in znanstvenem raziskovanju [4].

==Literatura==

[1] Genetic Code | Definition, Characteristics, Table, & Facts | Britannica. 5 Apr. 2024, https://www.britannica.com/science/genetic-code.

[2] Berry, Maria J., et al. “Recognition of UGA as a Selenocysteine Codon in Type I Deiodinase Requires Sequences in the 3′ Untranslated Region.” Nature, vol. 353, no. 6341, Sept. 1991, pp. 273–76. www.nature.com, https://doi.org/10.1038/353273a0.

[3] Stock, Tilmann, and Michael Rother. “Selenoproteins in Archaea and Gram-Positive Bacteria.” Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects, vol. 1790, no. 11, Nov. 2009, pp. 1520–32. ScienceDirect, https://doi.org/10.1016/j.bbagen.2009.03.022.

[4] Thaenert, Anna, et al. “Engineered mRNA–Ribosome Fusions for Facile Biosynthesis of Selenoproteins.” Proceedings of the National Academy of Sciences, vol. 121, no. 11, Mar. 2024, p. e2321700121. DOI.org (Crossref), https://doi.org/10.1073/pnas.2321700121.

Inženirane mRNA-ribosomske fuzije za lažjo biosintezo selenoproteinov

2024-05-05T10:12:42Z

Kostadin Mitkov: /* Načrtovanje ribosomov za biosintezo selenoproteinov */

Izhodiščni članek: [https://www.pnas.org/doi/10.1073/pnas.2321700121 Engineered mRNA–ribosome fusions for facile biosynthesis of selenoproteins]

==Uvod==

V genetskem kodu, kot ga poznamo, vse možne kombinacije tripletov nukleotidov kodirajo za 20 aminokislin, zato te aminokisline imenujemo standardne ali proteinogene [1]. Kljub temu v naravi obstajajo tudi selenoproteini, to so proteini, ki v svojem zaporedju vsebujejo aminokislino, imenovano selenocistein (Sec), ki ne sodi med 20 standardnih aminokislin. Zato se pojavi vprašanje, kako se med translacijo v polipeptidno verigo vključi selenocistein, če zanj ni kodona? V naravi je Sec kodiran s kodonom UGA, ki je stop kodon. Da se zagotovi prevod kodona UGA v Sec, namesto v stop kodon, ima ta stop kodon na 3’ koncu dodano od 20 do 60 nukleotidov dolgo specializirano zaporedje, imenovano SECIS (vstavitveno zaporedje za selenocistein) [2]. SECIS element omogoča mRNA selenoproteinov, da rekrutirajo elongacijski faktor SelB, ki se nato veže na specializirani tRNASec, ki prinaša Sec na aktivno mesto ribosoma. Ker selenoproteini kažejo višje katalitične hitrosti in odpornost proti nepovratni oksidaciji, kar omogoča Sec-vsebujočim proteinom hitrejše in daljše delovanje v primerjavi s Cys-vsebujočimi analogi, je sinteza načrtovanih selenoproteinov privlačna smer sintezne biologije [3]. Poznanih je že več strategij za sintezo selenoproteinov, vendar imajo nekatere pomanjkljivosti, saj zahtevajo dragocene in časovno zahtevne, včasih tudi nemogoče spremembe genetskega koda po celotnem genomu. Zato v članku A. Thaenert in sod. poročajo o novem pristopu k inženiringu ribosoma za sintezo načrtovanih selenoproteinov, ki temelji na fuziji med mRNA in ribosomom [4].

==Rezultati in diskusija==

===Načrtovanje ribosomov za biosintezo selenoproteinov===

V izhodiščnem članku so A. Thaenert in sod. želeli ustvariti ribosome, ki bi lahko v bakterijskih celicah vgradili selenocistein (Sec) na določenem mestu tarčnega proteina. Ker zaporedja SECIS rekrutirajo potrebne komponente za sintezo selenoproteinov k naravnim SECIS-mRNA, so domnevali, da vstavljanje SECIS elementa v rRNA lahko proizvede ribosome, ki so trajno povezani s kompleksom za sintezo selenoproteinov. Pričakovali so, da bo ta povezava omogočila ribosomom prevajanje UAG kodonov v Sec, namesto v stop kodon.

Da bi preverili to idejo, so uporabili znano strukturo ribosoma E. coli, vezanega na protein SelB in mRNA, ki vsebuje SECIS. Struktura je pokazala, da se med naravno sintezo selenoproteinov tako SECIS kot SelB vežeta na ribosom v tesni bližini heliksa 16 (h16) 16S rRNA. Zato so h16 uporabili kot mesto za vstavljanje zaporedja SECIS in proizvedli fuzijske molekule SECIS–16S rRNA. Pripravili so različne fuzijske molekule, ki so se razlikovale v dolžini povezovalnih zaporedij, preko katerih je bil element SECIS kovalentno povezan s h16, in v mestu vstavitve, torej za katerim nukleotidom je bil element vstavljen. Zaporedje SECIS, ki so ga uporabili, je bilo minimalno funkcionalno zaporedje SECIS iz mRNA selenoproteina format dehidrogenaze (FDH) iz bakterije E. coli. Prav tako so mutirali proti-Shine-Dalgarnovo zaporedje (anti-SD) v fuzijskih molekulah, da bi zagotovili vezavo le na rekombinantno pripravljene in ne na naravne mRNA molekule. Te modificirane fuzijske molekule so poimenovali variante RiboU, kar pomeni, da lahko prevajajo stop kodone v Sec, ki mu pripada enočrkovna oznaka "U". Tako so ustvarili knjižnico, ki je vsebovala 32 različnih variant in vsaka varianta je bila nato vstavljena v plazmid za nadaljnje študije in izboljšave [4].

===Vzpostavitev eksperimentalnega sistema za testiranje aktivnosti RiboU===

Da bi preizkusili, ali lahko RiboU sintetizira selenoproteine v E. coli, so ustvarili sistem, ki temelji na specifičnem genu in modificiranem sevu E. coli. Kot izhodiščni gen so izbrali gen fdhF, ki kodira selenoprotein FDH, katerega aktivnost je odvisna od Sec ostanka na položaju 140 in ki jo je lahko enostavno meriti in vivo. Gen so modificirali tako, da so odstranili naravno zaporedje SECIS in spremenili Sec kodon (UGA) v stop kodon (UAG), nato pa prilagodili Shine–Dalgarnovo zaporedje (SD), da se ujema z zaporedjem v RiboU. Ta modificiran gen so nato vstavili v plazmid skupaj z genom selC, ki kodira za tRNASec, modificiran tako, da prepozna UAG kodone namesto UGA kodone. Uporabili so sev E. coli, imenovan C321, pri katerem so vsi naravni UAG kodoni spremenjeni v UAA stop kodone, in ga modificirali tako, da so odstranili naravne kopije genov fdhF in selC, da bi preprečili FDH aktivnost v ozadju. Nato so te celice kotransformirali s plazmidi, ki vsebujejo različne variante RiboU in modificirane gene fdhF in selC. Eksperimenti so pokazali, da je 24 od 32 variant RiboU lahko proizvedlo FDH z različno učinkovitostjo. To nakazuje, da lahko ribosomi v fuziji z zaporedjem SECIS tvorijo funkcionalne selenoproteine iz mRNA molekul, ki jim manjka zaporedje SECIS [4].

===Izboljšanje aktivnosti RiboU s spremembo mesta vnosa zaporedja SECIS in dodajanjem mutacij v 16S rRNA===

V nadaljevanju so želeli preveriti, ali lahko delovanje RiboU izboljšajo tako, da poiščejo boljše mesto za vstavljanje SECIS v 16S rRNA, zato so preizkusili šest različnih mest v h16. Ko so vstavili SECIS med bazama 419 in 420 ali med 420 in 421, so variante RiboU pokazale približno petkrat višjo aktivnost v primerjavi z originalno verzijo (RiboU-v24-424-OR2). Nato so izbrali eno od novih variant RiboU (RiboU-v24-419-OR2) za nadaljnje izboljšave, kar kaže, da izbira boljšega mesta za vstavljanje SECIS lahko bistveno poveča učinkovitost RiboU.

Nato so preiskali, ali lahko specifične mutacije v 16S rRNA še dodatno povečajo aktivnost RiboU. Prejšnje raziskave so nakazovale, da mutaciji C1100U in G1516U povečata sintezo naravnih selenoproteinov, medtem ko mutaciji U531G in U534A izboljšata sposobnost ribosoma za interpretacijo UAG kodonov kot smiselne kodone in zmanjšata njegovo afiniteto do sprostitvenega faktorja RF1, zaradi česa je RF1 manj konkurenčen tRNA za prepoznavanje UAG. Mutacije so vstavili v konstrukt RiboU-v24-419-OR2 in preučili njihov vpliv na sintezo selenoproteinov. Ugotovili so, da mutacija G1516U (in C1100U) ni povečala proizvodnje selenoproteinov, vendar pa sta mutaciji U531G in U534A povečali aktivnost RiboU za približno desetkrat. Tako izboljšanje so opazili tudi pri sevu brez RF1, kar kaže, da te mutacije lahko vplivajo na prepoznavanje UAG neodvisno od RF1.

Želeli so si tudi povečati proizvodnjo selenoproteinov z optimizacijo parov SD/anti-SD. Primerjali so tri alternative ortogonalnih parov SD/anti-SD in ugotovili, da je zamenjava OR2 z ortogonalnim zaporedjem SD/anti-SD OR1 povečala aktivnost FDH za tri rede velikosti. Posledično so razvili izboljšano različico RiboU-v24-419-OR1, ki presega prejšnji RiboU-v24-419-OR2 [4].

===Povečano izražanje RiboU omogoča učinkovito sintezo rekombinantnih selenoproteinov===

Nadaljevali so s preizkušanjem aktivnosti RiboU z uporabo sistema, ki bolj natančno odraža proizvodnjo rekombinantnih selenoproteinov. Uporabili so reporterje na osnovi inteinov, ki tvorijo neaktivni prekurzor reporterskega proteina, ki postane aktiven s samoizrezovanjem. V protein, ki zagotavlja odpornost proti kanamicinu (KanR), so vstavili intein imenovan DnaB, ki za svoje samoizrezovanje potrebuje N-terminalni Cys ali Sec ostanek. To jim je omogočilo zaznavanje prisotnosti Sec z merjenjem odpornosti na kanamicin. Sprva njihovi eksperimenti niso pokazali pomembnih sprememb v odpornosti na kanamicin pri izražanju RiboU, kar kaže, da njihov konstrukt RiboU ni bil primeren za sintezo selenoproteinov v večjem obsegu.

Da bi konstrukt izboljšali, so izvedli tri prilagoditve. Prvič so prenesli rRNA-SECIS fuzijsko zaporedje v plazmid z večjim številom kopij, pri čemer so ciljali na 15 do 20 kopij na celico. Drugič so zamenjali originalni promotor (promotor, induciran s anhidrotetraciklinom) s promotorjem, induciran z arabinozo, saj je ta manj toksična molekula. Nazadnje so zamenjali E. coli sev BW25113 z B-95.ΔAΔfabR, ki ima izbit gen za RF1. Po teh spremembah so opazili izrazit porast odpornosti na kanamicin (do 75 μg/mL) ob izražanju RiboU, kar kaže na signifikantno proizvodnjo aktivnega reporterskega selenoproteina [4].

===Masna spektrometrija potrjuje mestno-specifičen vnos ostanka Sec v rekombinantni tarčni protein z RiboU===

V končnem poskusu so preizkusili sposobnost variante RiboU-v24-419-OR1, da na specifičnih mestih vstavi Sec ostanke v polipeptidno verigo. Kot model selenoproteina so uporabili majhen protein glutation oksidoreduktazo iz E. coli (Grx1). Grx1 lahko kot katalitičen ostanek v aktivnem mestu vsebuje bodisi Cys11 ali Sec11, pri čemer mutacije v Ser11 naredijo protein neaktiven. Ustvarili so tri variante Grx1: Grx1(C11) kot pozitivno kontrolo, Grx1(S11) kot negativno kontrolo in Grx1(UAG11) kot reporter za merjenje vstavljanja Sec s pomočjo RiboU. Variante so bile proizvedene v celicah B-95.ΔAΔfabR, ki izražajo RiboU-v24-419-OR1, nato pa so reporterske proteine izolirali za analizo. Preizkusi encimske aktivnosti so pokazali, da je Grx1(Ser11) neaktiven, medtem ko sta Grx1(C11) in Grx1(U11) pokazala podobne ravni aktivnosti.

Analiza masne spektrometrije je potrdila vstavljanje Sec na specifično mesto v Grx1(UAG11), pri čemer je bil Sec11 prisoten v 34,4 % proteinov, medtem ko je v preostalih 65,6 % UAG11 bil preveden kot Gln, Tyr in Ser. Preostanek Grx1(UAG11), ki vsebuje Ser11, kaže na nepopolno pretvorbo Ser-tRNASec v Sec-tRNASec. Ti rezultati so pokazali, da nepopolni RiboU omogoča natančno in specifično vključevanje Sec v rekombinantne proteine, proizvedene v celicah E. coli [4].

==Zaključek==

V študiji so A. Thaenert in sod. predstavili RiboU, ki predstavlja strategijo modificiranja ribosoma, ki omogoča vstavljanje selenocisteina na specifična mesta v tarčne proteine brez potrebe po spreminjanju kodonov po celem genomu. Z integracijo zaporedja SECIS v 16S rRNA lahko RiboU prevaja UAG kodone kot Sec in razširi sposobnosti sinteze selenoproteinov. Čeprav trenutne variante RiboU kažejo nekaj omejitev v učinkovitosti, predstavljajo pomemben napredek pri uporabi inženiringa ribosoma za namene sintezne biologije. Prihodnje izboljšave, kot so izboljšanje natančnosti vstavljanja Sec in povečanje izkoristkov proteinov, imajo potencial za nadaljnji razvoj te tehnologije. Opisan inovativen pristop poudarja potencial združevanja rRNA z regulatornimi elementi mRNA za spreminjanje interpretacije genetskega koda, kar obeta visoka pričakovanja v biotehnologiji in znanstvenem raziskovanju [4].

==Literatura==

[1] Genetic Code | Definition, Characteristics, Table, & Facts | Britannica. 5 Apr. 2024, https://www.britannica.com/science/genetic-code.

[2] Berry, Maria J., et al. “Recognition of UGA as a Selenocysteine Codon in Type I Deiodinase Requires Sequences in the 3′ Untranslated Region.” Nature, vol. 353, no. 6341, Sept. 1991, pp. 273–76. www.nature.com, https://doi.org/10.1038/353273a0.

[3] Stock, Tilmann, and Michael Rother. “Selenoproteins in Archaea and Gram-Positive Bacteria.” Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects, vol. 1790, no. 11, Nov. 2009, pp. 1520–32. ScienceDirect, https://doi.org/10.1016/j.bbagen.2009.03.022.

[4] Thaenert, Anna, et al. “Engineered mRNA–Ribosome Fusions for Facile Biosynthesis of Selenoproteins.” Proceedings of the National Academy of Sciences, vol. 121, no. 11, Mar. 2024, p. e2321700121. DOI.org (Crossref), https://doi.org/10.1073/pnas.2321700121.

Inženirane mRNA-ribosomske fuzije za lažjo biosintezo selenoproteinov

2024-05-05T10:12:12Z

Kostadin Mitkov: /* Načrtovanje ribosomov za biosintezo selenoproteinov */

Izhodiščni članek: [https://www.pnas.org/doi/10.1073/pnas.2321700121 Engineered mRNA–ribosome fusions for facile biosynthesis of selenoproteins]

==Uvod==

V genetskem kodu, kot ga poznamo, vse možne kombinacije tripletov nukleotidov kodirajo za 20 aminokislin, zato te aminokisline imenujemo standardne ali proteinogene [1]. Kljub temu v naravi obstajajo tudi selenoproteini, to so proteini, ki v svojem zaporedju vsebujejo aminokislino, imenovano selenocistein (Sec), ki ne sodi med 20 standardnih aminokislin. Zato se pojavi vprašanje, kako se med translacijo v polipeptidno verigo vključi selenocistein, če zanj ni kodona? V naravi je Sec kodiran s kodonom UGA, ki je stop kodon. Da se zagotovi prevod kodona UGA v Sec, namesto v stop kodon, ima ta stop kodon na 3’ koncu dodano od 20 do 60 nukleotidov dolgo specializirano zaporedje, imenovano SECIS (vstavitveno zaporedje za selenocistein) [2]. SECIS element omogoča mRNA selenoproteinov, da rekrutirajo elongacijski faktor SelB, ki se nato veže na specializirani tRNASec, ki prinaša Sec na aktivno mesto ribosoma. Ker selenoproteini kažejo višje katalitične hitrosti in odpornost proti nepovratni oksidaciji, kar omogoča Sec-vsebujočim proteinom hitrejše in daljše delovanje v primerjavi s Cys-vsebujočimi analogi, je sinteza načrtovanih selenoproteinov privlačna smer sintezne biologije [3]. Poznanih je že več strategij za sintezo selenoproteinov, vendar imajo nekatere pomanjkljivosti, saj zahtevajo dragocene in časovno zahtevne, včasih tudi nemogoče spremembe genetskega koda po celotnem genomu. Zato v članku A. Thaenert in sod. poročajo o novem pristopu k inženiringu ribosoma za sintezo načrtovanih selenoproteinov, ki temelji na fuziji med mRNA in ribosomom [4].

==Rezultati in diskusija==

===Načrtovanje ribosomov za biosintezo selenoproteinov===

V izhodiščnem članku so A. Thaenert in sod. želeli ustvariti ribosome, ki bi lahko v bakterijskih celicah vgradili selenocistein (Sec) na določenem mestu tarčnega proteina. Ker zaporedja SECIS rekrutirajo potrebne komponente za sintezo selenoproteinov k naravnim SECIS-mRNA, so domnevali, da vstavljanje SECIS elementa v rRNA lahko proizvede ribosome, ki so trajno povezani s kompleksom za sintezo selenoproteinov. Pričakovali so, da bo ta povezava omogočila ribosomom prevajanje UAG kodonov v Sec, namesto v stop kodon.

Da bi preverili to idejo, so uporabili znano strukturo ribosoma *E. coli*, vezanega na protein SelB in mRNA, ki vsebuje SECIS. Struktura je pokazala, da se med naravno sintezo selenoproteinov tako SECIS kot SelB vežeta na ribosom v tesni bližini heliksa 16 (h16) 16S rRNA. Zato so h16 uporabili kot mesto za vstavljanje zaporedja SECIS in proizvedli fuzijske molekule SECIS–16S rRNA. Pripravili so različne fuzijske molekule, ki so se razlikovale v dolžini povezovalnih zaporedij, preko katerih je bil element SECIS kovalentno povezan s h16, in v mestu vstavitve, torej za katerim nukleotidom je bil element vstavljen. Zaporedje SECIS, ki so ga uporabili, je bilo minimalno funkcionalno zaporedje SECIS iz mRNA selenoproteina format dehidrogenaze (FDH) iz bakterije E. coli. Prav tako so mutirali proti-Shine-Dalgarnovo zaporedje (anti-SD) v fuzijskih molekulah, da bi zagotovili vezavo le na rekombinantno pripravljene in ne na naravne mRNA molekule. Te modificirane fuzijske molekule so poimenovali variante RiboU, kar pomeni, da lahko prevajajo stop kodone v Sec, ki mu pripada enočrkovna oznaka "U". Tako so ustvarili knjižnico, ki je vsebovala 32 različnih variant in vsaka varianta je bila nato vstavljena v plazmid za nadaljnje študije in izboljšave [4].

===Vzpostavitev eksperimentalnega sistema za testiranje aktivnosti RiboU===

Da bi preizkusili, ali lahko RiboU sintetizira selenoproteine v E. coli, so ustvarili sistem, ki temelji na specifičnem genu in modificiranem sevu E. coli. Kot izhodiščni gen so izbrali gen fdhF, ki kodira selenoprotein FDH, katerega aktivnost je odvisna od Sec ostanka na položaju 140 in ki jo je lahko enostavno meriti in vivo. Gen so modificirali tako, da so odstranili naravno zaporedje SECIS in spremenili Sec kodon (UGA) v stop kodon (UAG), nato pa prilagodili Shine–Dalgarnovo zaporedje (SD), da se ujema z zaporedjem v RiboU. Ta modificiran gen so nato vstavili v plazmid skupaj z genom selC, ki kodira za tRNASec, modificiran tako, da prepozna UAG kodone namesto UGA kodone. Uporabili so sev E. coli, imenovan C321, pri katerem so vsi naravni UAG kodoni spremenjeni v UAA stop kodone, in ga modificirali tako, da so odstranili naravne kopije genov fdhF in selC, da bi preprečili FDH aktivnost v ozadju. Nato so te celice kotransformirali s plazmidi, ki vsebujejo različne variante RiboU in modificirane gene fdhF in selC. Eksperimenti so pokazali, da je 24 od 32 variant RiboU lahko proizvedlo FDH z različno učinkovitostjo. To nakazuje, da lahko ribosomi v fuziji z zaporedjem SECIS tvorijo funkcionalne selenoproteine iz mRNA molekul, ki jim manjka zaporedje SECIS [4].

===Izboljšanje aktivnosti RiboU s spremembo mesta vnosa zaporedja SECIS in dodajanjem mutacij v 16S rRNA===

V nadaljevanju so želeli preveriti, ali lahko delovanje RiboU izboljšajo tako, da poiščejo boljše mesto za vstavljanje SECIS v 16S rRNA, zato so preizkusili šest različnih mest v h16. Ko so vstavili SECIS med bazama 419 in 420 ali med 420 in 421, so variante RiboU pokazale približno petkrat višjo aktivnost v primerjavi z originalno verzijo (RiboU-v24-424-OR2). Nato so izbrali eno od novih variant RiboU (RiboU-v24-419-OR2) za nadaljnje izboljšave, kar kaže, da izbira boljšega mesta za vstavljanje SECIS lahko bistveno poveča učinkovitost RiboU.

Nato so preiskali, ali lahko specifične mutacije v 16S rRNA še dodatno povečajo aktivnost RiboU. Prejšnje raziskave so nakazovale, da mutaciji C1100U in G1516U povečata sintezo naravnih selenoproteinov, medtem ko mutaciji U531G in U534A izboljšata sposobnost ribosoma za interpretacijo UAG kodonov kot smiselne kodone in zmanjšata njegovo afiniteto do sprostitvenega faktorja RF1, zaradi česa je RF1 manj konkurenčen tRNA za prepoznavanje UAG. Mutacije so vstavili v konstrukt RiboU-v24-419-OR2 in preučili njihov vpliv na sintezo selenoproteinov. Ugotovili so, da mutacija G1516U (in C1100U) ni povečala proizvodnje selenoproteinov, vendar pa sta mutaciji U531G in U534A povečali aktivnost RiboU za približno desetkrat. Tako izboljšanje so opazili tudi pri sevu brez RF1, kar kaže, da te mutacije lahko vplivajo na prepoznavanje UAG neodvisno od RF1.

Želeli so si tudi povečati proizvodnjo selenoproteinov z optimizacijo parov SD/anti-SD. Primerjali so tri alternative ortogonalnih parov SD/anti-SD in ugotovili, da je zamenjava OR2 z ortogonalnim zaporedjem SD/anti-SD OR1 povečala aktivnost FDH za tri rede velikosti. Posledično so razvili izboljšano različico RiboU-v24-419-OR1, ki presega prejšnji RiboU-v24-419-OR2 [4].

===Povečano izražanje RiboU omogoča učinkovito sintezo rekombinantnih selenoproteinov===

Nadaljevali so s preizkušanjem aktivnosti RiboU z uporabo sistema, ki bolj natančno odraža proizvodnjo rekombinantnih selenoproteinov. Uporabili so reporterje na osnovi inteinov, ki tvorijo neaktivni prekurzor reporterskega proteina, ki postane aktiven s samoizrezovanjem. V protein, ki zagotavlja odpornost proti kanamicinu (KanR), so vstavili intein imenovan DnaB, ki za svoje samoizrezovanje potrebuje N-terminalni Cys ali Sec ostanek. To jim je omogočilo zaznavanje prisotnosti Sec z merjenjem odpornosti na kanamicin. Sprva njihovi eksperimenti niso pokazali pomembnih sprememb v odpornosti na kanamicin pri izražanju RiboU, kar kaže, da njihov konstrukt RiboU ni bil primeren za sintezo selenoproteinov v večjem obsegu.

Da bi konstrukt izboljšali, so izvedli tri prilagoditve. Prvič so prenesli rRNA-SECIS fuzijsko zaporedje v plazmid z večjim številom kopij, pri čemer so ciljali na 15 do 20 kopij na celico. Drugič so zamenjali originalni promotor (promotor, induciran s anhidrotetraciklinom) s promotorjem, induciran z arabinozo, saj je ta manj toksična molekula. Nazadnje so zamenjali E. coli sev BW25113 z B-95.ΔAΔfabR, ki ima izbit gen za RF1. Po teh spremembah so opazili izrazit porast odpornosti na kanamicin (do 75 μg/mL) ob izražanju RiboU, kar kaže na signifikantno proizvodnjo aktivnega reporterskega selenoproteina [4].

===Masna spektrometrija potrjuje mestno-specifičen vnos ostanka Sec v rekombinantni tarčni protein z RiboU===

V končnem poskusu so preizkusili sposobnost variante RiboU-v24-419-OR1, da na specifičnih mestih vstavi Sec ostanke v polipeptidno verigo. Kot model selenoproteina so uporabili majhen protein glutation oksidoreduktazo iz E. coli (Grx1). Grx1 lahko kot katalitičen ostanek v aktivnem mestu vsebuje bodisi Cys11 ali Sec11, pri čemer mutacije v Ser11 naredijo protein neaktiven. Ustvarili so tri variante Grx1: Grx1(C11) kot pozitivno kontrolo, Grx1(S11) kot negativno kontrolo in Grx1(UAG11) kot reporter za merjenje vstavljanja Sec s pomočjo RiboU. Variante so bile proizvedene v celicah B-95.ΔAΔfabR, ki izražajo RiboU-v24-419-OR1, nato pa so reporterske proteine izolirali za analizo. Preizkusi encimske aktivnosti so pokazali, da je Grx1(Ser11) neaktiven, medtem ko sta Grx1(C11) in Grx1(U11) pokazala podobne ravni aktivnosti.

Analiza masne spektrometrije je potrdila vstavljanje Sec na specifično mesto v Grx1(UAG11), pri čemer je bil Sec11 prisoten v 34,4 % proteinov, medtem ko je v preostalih 65,6 % UAG11 bil preveden kot Gln, Tyr in Ser. Preostanek Grx1(UAG11), ki vsebuje Ser11, kaže na nepopolno pretvorbo Ser-tRNASec v Sec-tRNASec. Ti rezultati so pokazali, da nepopolni RiboU omogoča natančno in specifično vključevanje Sec v rekombinantne proteine, proizvedene v celicah E. coli [4].

==Zaključek==

V študiji so A. Thaenert in sod. predstavili RiboU, ki predstavlja strategijo modificiranja ribosoma, ki omogoča vstavljanje selenocisteina na specifična mesta v tarčne proteine brez potrebe po spreminjanju kodonov po celem genomu. Z integracijo zaporedja SECIS v 16S rRNA lahko RiboU prevaja UAG kodone kot Sec in razširi sposobnosti sinteze selenoproteinov. Čeprav trenutne variante RiboU kažejo nekaj omejitev v učinkovitosti, predstavljajo pomemben napredek pri uporabi inženiringa ribosoma za namene sintezne biologije. Prihodnje izboljšave, kot so izboljšanje natančnosti vstavljanja Sec in povečanje izkoristkov proteinov, imajo potencial za nadaljnji razvoj te tehnologije. Opisan inovativen pristop poudarja potencial združevanja rRNA z regulatornimi elementi mRNA za spreminjanje interpretacije genetskega koda, kar obeta visoka pričakovanja v biotehnologiji in znanstvenem raziskovanju [4].

==Literatura==

[1] Genetic Code | Definition, Characteristics, Table, & Facts | Britannica. 5 Apr. 2024, https://www.britannica.com/science/genetic-code.

[2] Berry, Maria J., et al. “Recognition of UGA as a Selenocysteine Codon in Type I Deiodinase Requires Sequences in the 3′ Untranslated Region.” Nature, vol. 353, no. 6341, Sept. 1991, pp. 273–76. www.nature.com, https://doi.org/10.1038/353273a0.

[3] Stock, Tilmann, and Michael Rother. “Selenoproteins in Archaea and Gram-Positive Bacteria.” Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects, vol. 1790, no. 11, Nov. 2009, pp. 1520–32. ScienceDirect, https://doi.org/10.1016/j.bbagen.2009.03.022.

[4] Thaenert, Anna, et al. “Engineered mRNA–Ribosome Fusions for Facile Biosynthesis of Selenoproteins.” Proceedings of the National Academy of Sciences, vol. 121, no. 11, Mar. 2024, p. e2321700121. DOI.org (Crossref), https://doi.org/10.1073/pnas.2321700121.

Inženirane mRNA-ribosomske fuzije za lažjo biosintezo selenoproteinov

2024-05-05T10:07:05Z

Kostadin Mitkov: /* Uvod */

Izhodiščni članek: [https://www.pnas.org/doi/10.1073/pnas.2321700121 Engineered mRNA–ribosome fusions for facile biosynthesis of selenoproteins]

==Uvod==

V genetskem kodu, kot ga poznamo, vse možne kombinacije tripletov nukleotidov kodirajo za 20 aminokislin, zato te aminokisline imenujemo standardne ali proteinogene [1]. Kljub temu v naravi obstajajo tudi selenoproteini, to so proteini, ki v svojem zaporedju vsebujejo aminokislino, imenovano selenocistein (Sec), ki ne sodi med 20 standardnih aminokislin. Zato se pojavi vprašanje, kako se med translacijo v polipeptidno verigo vključi selenocistein, če zanj ni kodona? V naravi je Sec kodiran s kodonom UGA, ki je stop kodon. Da se zagotovi prevod kodona UGA v Sec, namesto v stop kodon, ima ta stop kodon na 3’ koncu dodano od 20 do 60 nukleotidov dolgo specializirano zaporedje, imenovano SECIS (vstavitveno zaporedje za selenocistein) [2]. SECIS element omogoča mRNA selenoproteinov, da rekrutirajo elongacijski faktor SelB, ki se nato veže na specializirani tRNASec, ki prinaša Sec na aktivno mesto ribosoma. Ker selenoproteini kažejo višje katalitične hitrosti in odpornost proti nepovratni oksidaciji, kar omogoča Sec-vsebujočim proteinom hitrejše in daljše delovanje v primerjavi s Cys-vsebujočimi analogi, je sinteza načrtovanih selenoproteinov privlačna smer sintezne biologije [3]. Poznanih je že več strategij za sintezo selenoproteinov, vendar imajo nekatere pomanjkljivosti, saj zahtevajo dragocene in časovno zahtevne, včasih tudi nemogoče spremembe genetskega koda po celotnem genomu. Zato v članku A. Thaenert in sod. poročajo o novem pristopu k inženiringu ribosoma za sintezo načrtovanih selenoproteinov, ki temelji na fuziji med mRNA in ribosomom [4].

==Rezultati in diskusija==

===Načrtovanje ribosomov za biosintezo selenoproteinov===

V izhodiščnem članku so A. Thaenert in sod. želeli ustvariti ribosome, ki bi lahko v bakterijskih celicah vgradili selenocistein (Sec) na določenem mestu tarčnega proteina. Ker zaporedja SECIS rekrutirajo potrebne komponente za sintezo selenoproteinov k naravnim SECIS-mRNA, so domnevali, da vstavljanje SECIS elementa v rRNA lahko proizvede ribosome, ki so trajno povezani s kompleksom za sintezo selenoproteinov. Pričakovali so, da bo ta povezava omogočila ribosomom prevajanje UAG kodonov v Sec, namesto v stop kodon.

Da bi preverili to idejo, so uporabili znano strukturo ribosoma E. coli, vezanega na protein SelB in mRNA, ki vsebuje SECIS. Struktura je pokazala, da se med naravno sintezo selenoproteinov tako SECIS kot SelB vežeta na ribosom v tesni bližini heliksa 16 (h16) 16S rRNA. Zato so h16 uporabili kot mesto za vstavljanje zaporedja SECIS in proizvedli fuzijske molekule SECIS–16S rRNA. Pripravili so različne fuzijske molekule, ki so se razlikovale v dolžini povezovalnih zaporedij, preko katerih je bil element SECIS kovalentno povezan s h16, in v mestu vstavitve, torej za katerim nukleotidom je bil element vstavljen. Zaporedje SECIS, ki so ga uporabili, je bilo minimalno funkcionalno zaporedje SECIS iz mRNA selenoproteina format dehidrogenaze (FDH) iz bakterije E. coli. Prav tako so mutirali proti-Shine-Dalgarnovo zaporedje (anti-SD) v fuzijskih molekulah, da bi zagotovili vezavo le na rekombinantno pripravljene in ne na naravne mRNA molekule. Te modificirane fuzijske molekule so poimenovali variante RiboU, kar pomeni, da lahko prevajajo stop kodone v Sec, ki mu pripada enočrkovna oznaka "U". Tako so ustvarili knjižnico, ki je vsebovala 32 različnih variant in vsaka varianta je bila nato vstavljena v plazmid za nadaljnje študije in izboljšave [4].

===Vzpostavitev eksperimentalnega sistema za testiranje aktivnosti RiboU===

Da bi preizkusili, ali lahko RiboU sintetizira selenoproteine v E. coli, so ustvarili sistem, ki temelji na specifičnem genu in modificiranem sevu E. coli. Kot izhodiščni gen so izbrali gen fdhF, ki kodira selenoprotein FDH, katerega aktivnost je odvisna od Sec ostanka na položaju 140 in ki jo je lahko enostavno meriti in vivo. Gen so modificirali tako, da so odstranili naravno zaporedje SECIS in spremenili Sec kodon (UGA) v stop kodon (UAG), nato pa prilagodili Shine–Dalgarnovo zaporedje (SD), da se ujema z zaporedjem v RiboU. Ta modificiran gen so nato vstavili v plazmid skupaj z genom selC, ki kodira za tRNASec, modificiran tako, da prepozna UAG kodone namesto UGA kodone. Uporabili so sev E. coli, imenovan C321, pri katerem so vsi naravni UAG kodoni spremenjeni v UAA stop kodone, in ga modificirali tako, da so odstranili naravne kopije genov fdhF in selC, da bi preprečili FDH aktivnost v ozadju. Nato so te celice kotransformirali s plazmidi, ki vsebujejo različne variante RiboU in modificirane gene fdhF in selC. Eksperimenti so pokazali, da je 24 od 32 variant RiboU lahko proizvedlo FDH z različno učinkovitostjo. To nakazuje, da lahko ribosomi v fuziji z zaporedjem SECIS tvorijo funkcionalne selenoproteine iz mRNA molekul, ki jim manjka zaporedje SECIS [4].

===Izboljšanje aktivnosti RiboU s spremembo mesta vnosa zaporedja SECIS in dodajanjem mutacij v 16S rRNA===

V nadaljevanju so želeli preveriti, ali lahko delovanje RiboU izboljšajo tako, da poiščejo boljše mesto za vstavljanje SECIS v 16S rRNA, zato so preizkusili šest različnih mest v h16. Ko so vstavili SECIS med bazama 419 in 420 ali med 420 in 421, so variante RiboU pokazale približno petkrat višjo aktivnost v primerjavi z originalno verzijo (RiboU-v24-424-OR2). Nato so izbrali eno od novih variant RiboU (RiboU-v24-419-OR2) za nadaljnje izboljšave, kar kaže, da izbira boljšega mesta za vstavljanje SECIS lahko bistveno poveča učinkovitost RiboU.

Nato so preiskali, ali lahko specifične mutacije v 16S rRNA še dodatno povečajo aktivnost RiboU. Prejšnje raziskave so nakazovale, da mutaciji C1100U in G1516U povečata sintezo naravnih selenoproteinov, medtem ko mutaciji U531G in U534A izboljšata sposobnost ribosoma za interpretacijo UAG kodonov kot smiselne kodone in zmanjšata njegovo afiniteto do sprostitvenega faktorja RF1, zaradi česa je RF1 manj konkurenčen tRNA za prepoznavanje UAG. Mutacije so vstavili v konstrukt RiboU-v24-419-OR2 in preučili njihov vpliv na sintezo selenoproteinov. Ugotovili so, da mutacija G1516U (in C1100U) ni povečala proizvodnje selenoproteinov, vendar pa sta mutaciji U531G in U534A povečali aktivnost RiboU za približno desetkrat. Tako izboljšanje so opazili tudi pri sevu brez RF1, kar kaže, da te mutacije lahko vplivajo na prepoznavanje UAG neodvisno od RF1.

Želeli so si tudi povečati proizvodnjo selenoproteinov z optimizacijo parov SD/anti-SD. Primerjali so tri alternative ortogonalnih parov SD/anti-SD in ugotovili, da je zamenjava OR2 z ortogonalnim zaporedjem SD/anti-SD OR1 povečala aktivnost FDH za tri rede velikosti. Posledično so razvili izboljšano različico RiboU-v24-419-OR1, ki presega prejšnji RiboU-v24-419-OR2 [4].

===Povečano izražanje RiboU omogoča učinkovito sintezo rekombinantnih selenoproteinov===

Nadaljevali so s preizkušanjem aktivnosti RiboU z uporabo sistema, ki bolj natančno odraža proizvodnjo rekombinantnih selenoproteinov. Uporabili so reporterje na osnovi inteinov, ki tvorijo neaktivni prekurzor reporterskega proteina, ki postane aktiven s samoizrezovanjem. V protein, ki zagotavlja odpornost proti kanamicinu (KanR), so vstavili intein imenovan DnaB, ki za svoje samoizrezovanje potrebuje N-terminalni Cys ali Sec ostanek. To jim je omogočilo zaznavanje prisotnosti Sec z merjenjem odpornosti na kanamicin. Sprva njihovi eksperimenti niso pokazali pomembnih sprememb v odpornosti na kanamicin pri izražanju RiboU, kar kaže, da njihov konstrukt RiboU ni bil primeren za sintezo selenoproteinov v večjem obsegu.

Da bi konstrukt izboljšali, so izvedli tri prilagoditve. Prvič so prenesli rRNA-SECIS fuzijsko zaporedje v plazmid z večjim številom kopij, pri čemer so ciljali na 15 do 20 kopij na celico. Drugič so zamenjali originalni promotor (promotor, induciran s anhidrotetraciklinom) s promotorjem, induciran z arabinozo, saj je ta manj toksična molekula. Nazadnje so zamenjali E. coli sev BW25113 z B-95.ΔAΔfabR, ki ima izbit gen za RF1. Po teh spremembah so opazili izrazit porast odpornosti na kanamicin (do 75 μg/mL) ob izražanju RiboU, kar kaže na signifikantno proizvodnjo aktivnega reporterskega selenoproteina [4].

===Masna spektrometrija potrjuje mestno-specifičen vnos ostanka Sec v rekombinantni tarčni protein z RiboU===

V končnem poskusu so preizkusili sposobnost variante RiboU-v24-419-OR1, da na specifičnih mestih vstavi Sec ostanke v polipeptidno verigo. Kot model selenoproteina so uporabili majhen protein glutation oksidoreduktazo iz E. coli (Grx1). Grx1 lahko kot katalitičen ostanek v aktivnem mestu vsebuje bodisi Cys11 ali Sec11, pri čemer mutacije v Ser11 naredijo protein neaktiven. Ustvarili so tri variante Grx1: Grx1(C11) kot pozitivno kontrolo, Grx1(S11) kot negativno kontrolo in Grx1(UAG11) kot reporter za merjenje vstavljanja Sec s pomočjo RiboU. Variante so bile proizvedene v celicah B-95.ΔAΔfabR, ki izražajo RiboU-v24-419-OR1, nato pa so reporterske proteine izolirali za analizo. Preizkusi encimske aktivnosti so pokazali, da je Grx1(Ser11) neaktiven, medtem ko sta Grx1(C11) in Grx1(U11) pokazala podobne ravni aktivnosti.

Analiza masne spektrometrije je potrdila vstavljanje Sec na specifično mesto v Grx1(UAG11), pri čemer je bil Sec11 prisoten v 34,4 % proteinov, medtem ko je v preostalih 65,6 % UAG11 bil preveden kot Gln, Tyr in Ser. Preostanek Grx1(UAG11), ki vsebuje Ser11, kaže na nepopolno pretvorbo Ser-tRNASec v Sec-tRNASec. Ti rezultati so pokazali, da nepopolni RiboU omogoča natančno in specifično vključevanje Sec v rekombinantne proteine, proizvedene v celicah E. coli [4].

==Zaključek==

V študiji so A. Thaenert in sod. predstavili RiboU, ki predstavlja strategijo modificiranja ribosoma, ki omogoča vstavljanje selenocisteina na specifična mesta v tarčne proteine brez potrebe po spreminjanju kodonov po celem genomu. Z integracijo zaporedja SECIS v 16S rRNA lahko RiboU prevaja UAG kodone kot Sec in razširi sposobnosti sinteze selenoproteinov. Čeprav trenutne variante RiboU kažejo nekaj omejitev v učinkovitosti, predstavljajo pomemben napredek pri uporabi inženiringa ribosoma za namene sintezne biologije. Prihodnje izboljšave, kot so izboljšanje natančnosti vstavljanja Sec in povečanje izkoristkov proteinov, imajo potencial za nadaljnji razvoj te tehnologije. Opisan inovativen pristop poudarja potencial združevanja rRNA z regulatornimi elementi mRNA za spreminjanje interpretacije genetskega koda, kar obeta visoka pričakovanja v biotehnologiji in znanstvenem raziskovanju [4].

==Literatura==

[1] Genetic Code | Definition, Characteristics, Table, & Facts | Britannica. 5 Apr. 2024, https://www.britannica.com/science/genetic-code.

[2] Berry, Maria J., et al. “Recognition of UGA as a Selenocysteine Codon in Type I Deiodinase Requires Sequences in the 3′ Untranslated Region.” Nature, vol. 353, no. 6341, Sept. 1991, pp. 273–76. www.nature.com, https://doi.org/10.1038/353273a0.

[3] Stock, Tilmann, and Michael Rother. “Selenoproteins in Archaea and Gram-Positive Bacteria.” Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects, vol. 1790, no. 11, Nov. 2009, pp. 1520–32. ScienceDirect, https://doi.org/10.1016/j.bbagen.2009.03.022.

[4] Thaenert, Anna, et al. “Engineered mRNA–Ribosome Fusions for Facile Biosynthesis of Selenoproteins.” Proceedings of the National Academy of Sciences, vol. 121, no. 11, Mar. 2024, p. e2321700121. DOI.org (Crossref), https://doi.org/10.1073/pnas.2321700121.

Inženirane mRNA-ribosomske fuzije za lažjo biosintezo selenoproteinov

2024-05-05T10:06:07Z

Kostadin Mitkov:

Izhodiščni članek: [https://www.pnas.org/doi/10.1073/pnas.2321700121 Engineered mRNA–ribosome fusions for facile biosynthesis of selenoproteins]

==Uvod==

V genetskem kodu, kot ga poznamo, vse možne kombinacije tripletov nukleotidov kodirajo za 20 aminokislin, zato te aminokisline imenujemo standardne ali proteinogene [1]. Kljub temu v naravi obstajajo tudi selenoproteini, to so proteini, ki v svojem zaporedju vsebujejo aminokislino, imenovano selenocistein (Sec), ki ne sodi med 20 standardnih aminokislin. Zato se pojavi vprašanje, kako se med translacijo v polipeptidno verigo vključi selenocistein, če zanj ni kodona? V naravi je Sec kodiran s kodonom UGA, ki je stop kodon. Da se zagotovi prevod kodona UGA v Sec, namesto v stop kodon, ima ta stop kodon na 3’ koncu dodano od 20 do 60 nukleotidov dolgo specializirano zaporedje, imenovano SECIS (vstavitveno zaporedje za selenocistein) [2]. SECIS element omogoča mRNA selenoproteinov, da rekrutirajo elongacijski faktor SelB, ki se nato veže na specializirani tRNASec, ki prinaša Sec na aktivno mesto ribosoma. Ker selenoproteini kažejo višje katalitične hitrosti in odpornost proti nepovratni oksidaciji, kar omogoča Sec-vsebujočim proteinom hitrejše in daljše delovanje v primerjavi s Cys-vsebujočimi analogi, je sinteza načrtovanih selenoproteinov privlačna smer sintezne biologije [3]. Poznanih je že več strategij za sintezo selenoproteinov, vendar imajo nekatere pomanjkljivosti, saj zahtevajo dragocene in časovno zahtevne, včasih tudi nemogoče spremembe genetskega koda po celotnem genomu. Zato v članku A. Thaenert in sod. poročajo o novem pristopu k inženiringu ribosoma za sintezo načrtovanih selenoproteinov, ki temelji na fuziji med mRNA in ribosomom [4].

==Rezultati in diskusija==

===Načrtovanje ribosomov za biosintezo selenoproteinov===

V izhodiščnem članku so A. Thaenert in sod. želeli ustvariti ribosome, ki bi lahko v bakterijskih celicah vgradili selenocistein (Sec) na določenem mestu tarčnega proteina. Ker zaporedja SECIS rekrutirajo potrebne komponente za sintezo selenoproteinov k naravnim SECIS-mRNA, so domnevali, da vstavljanje SECIS elementa v rRNA lahko proizvede ribosome, ki so trajno povezani s kompleksom za sintezo selenoproteinov. Pričakovali so, da bo ta povezava omogočila ribosomom prevajanje UAG kodonov v Sec, namesto v stop kodon.

Da bi preverili to idejo, so uporabili znano strukturo ribosoma E. coli, vezanega na protein SelB in mRNA, ki vsebuje SECIS. Struktura je pokazala, da se med naravno sintezo selenoproteinov tako SECIS kot SelB vežeta na ribosom v tesni bližini heliksa 16 (h16) 16S rRNA. Zato so h16 uporabili kot mesto za vstavljanje zaporedja SECIS in proizvedli fuzijske molekule SECIS–16S rRNA. Pripravili so različne fuzijske molekule, ki so se razlikovale v dolžini povezovalnih zaporedij, preko katerih je bil element SECIS kovalentno povezan s h16, in v mestu vstavitve, torej za katerim nukleotidom je bil element vstavljen. Zaporedje SECIS, ki so ga uporabili, je bilo minimalno funkcionalno zaporedje SECIS iz mRNA selenoproteina format dehidrogenaze (FDH) iz bakterije E. coli. Prav tako so mutirali proti-Shine-Dalgarnovo zaporedje (anti-SD) v fuzijskih molekulah, da bi zagotovili vezavo le na rekombinantno pripravljene in ne na naravne mRNA molekule. Te modificirane fuzijske molekule so poimenovali variante RiboU, kar pomeni, da lahko prevajajo stop kodone v Sec, ki mu pripada enočrkovna oznaka "U". Tako so ustvarili knjižnico, ki je vsebovala 32 različnih variant in vsaka varianta je bila nato vstavljena v plazmid za nadaljnje študije in izboljšave [4].

===Vzpostavitev eksperimentalnega sistema za testiranje aktivnosti RiboU===

Da bi preizkusili, ali lahko RiboU sintetizira selenoproteine v E. coli, so ustvarili sistem, ki temelji na specifičnem genu in modificiranem sevu E. coli. Kot izhodiščni gen so izbrali gen fdhF, ki kodira selenoprotein FDH, katerega aktivnost je odvisna od Sec ostanka na položaju 140 in ki jo je lahko enostavno meriti in vivo. Gen so modificirali tako, da so odstranili naravno zaporedje SECIS in spremenili Sec kodon (UGA) v stop kodon (UAG), nato pa prilagodili Shine–Dalgarnovo zaporedje (SD), da se ujema z zaporedjem v RiboU. Ta modificiran gen so nato vstavili v plazmid skupaj z genom selC, ki kodira za tRNASec, modificiran tako, da prepozna UAG kodone namesto UGA kodone. Uporabili so sev E. coli, imenovan C321, pri katerem so vsi naravni UAG kodoni spremenjeni v UAA stop kodone, in ga modificirali tako, da so odstranili naravne kopije genov fdhF in selC, da bi preprečili FDH aktivnost v ozadju. Nato so te celice kotransformirali s plazmidi, ki vsebujejo različne variante RiboU in modificirane gene fdhF in selC. Eksperimenti so pokazali, da je 24 od 32 variant RiboU lahko proizvedlo FDH z različno učinkovitostjo. To nakazuje, da lahko ribosomi v fuziji z zaporedjem SECIS tvorijo funkcionalne selenoproteine iz mRNA molekul, ki jim manjka zaporedje SECIS [4].

===Izboljšanje aktivnosti RiboU s spremembo mesta vnosa zaporedja SECIS in dodajanjem mutacij v 16S rRNA===

V nadaljevanju so želeli preveriti, ali lahko delovanje RiboU izboljšajo tako, da poiščejo boljše mesto za vstavljanje SECIS v 16S rRNA, zato so preizkusili šest različnih mest v h16. Ko so vstavili SECIS med bazama 419 in 420 ali med 420 in 421, so variante RiboU pokazale približno petkrat višjo aktivnost v primerjavi z originalno verzijo (RiboU-v24-424-OR2). Nato so izbrali eno od novih variant RiboU (RiboU-v24-419-OR2) za nadaljnje izboljšave, kar kaže, da izbira boljšega mesta za vstavljanje SECIS lahko bistveno poveča učinkovitost RiboU.

Nato so preiskali, ali lahko specifične mutacije v 16S rRNA še dodatno povečajo aktivnost RiboU. Prejšnje raziskave so nakazovale, da mutaciji C1100U in G1516U povečata sintezo naravnih selenoproteinov, medtem ko mutaciji U531G in U534A izboljšata sposobnost ribosoma za interpretacijo UAG kodonov kot smiselne kodone in zmanjšata njegovo afiniteto do sprostitvenega faktorja RF1, zaradi česa je RF1 manj konkurenčen tRNA za prepoznavanje UAG. Mutacije so vstavili v konstrukt RiboU-v24-419-OR2 in preučili njihov vpliv na sintezo selenoproteinov. Ugotovili so, da mutacija G1516U (in C1100U) ni povečala proizvodnje selenoproteinov, vendar pa sta mutaciji U531G in U534A povečali aktivnost RiboU za približno desetkrat. Tako izboljšanje so opazili tudi pri sevu brez RF1, kar kaže, da te mutacije lahko vplivajo na prepoznavanje UAG neodvisno od RF1.

Želeli so si tudi povečati proizvodnjo selenoproteinov z optimizacijo parov SD/anti-SD. Primerjali so tri alternative ortogonalnih parov SD/anti-SD in ugotovili, da je zamenjava OR2 z ortogonalnim zaporedjem SD/anti-SD OR1 povečala aktivnost FDH za tri rede velikosti. Posledično so razvili izboljšano različico RiboU-v24-419-OR1, ki presega prejšnji RiboU-v24-419-OR2 [4].

===Povečano izražanje RiboU omogoča učinkovito sintezo rekombinantnih selenoproteinov===

Nadaljevali so s preizkušanjem aktivnosti RiboU z uporabo sistema, ki bolj natančno odraža proizvodnjo rekombinantnih selenoproteinov. Uporabili so reporterje na osnovi inteinov, ki tvorijo neaktivni prekurzor reporterskega proteina, ki postane aktiven s samoizrezovanjem. V protein, ki zagotavlja odpornost proti kanamicinu (KanR), so vstavili intein imenovan DnaB, ki za svoje samoizrezovanje potrebuje N-terminalni Cys ali Sec ostanek. To jim je omogočilo zaznavanje prisotnosti Sec z merjenjem odpornosti na kanamicin. Sprva njihovi eksperimenti niso pokazali pomembnih sprememb v odpornosti na kanamicin pri izražanju RiboU, kar kaže, da njihov konstrukt RiboU ni bil primeren za sintezo selenoproteinov v večjem obsegu.

Da bi konstrukt izboljšali, so izvedli tri prilagoditve. Prvič so prenesli rRNA-SECIS fuzijsko zaporedje v plazmid z večjim številom kopij, pri čemer so ciljali na 15 do 20 kopij na celico. Drugič so zamenjali originalni promotor (promotor, induciran s anhidrotetraciklinom) s promotorjem, induciran z arabinozo, saj je ta manj toksična molekula. Nazadnje so zamenjali E. coli sev BW25113 z B-95.ΔAΔfabR, ki ima izbit gen za RF1. Po teh spremembah so opazili izrazit porast odpornosti na kanamicin (do 75 μg/mL) ob izražanju RiboU, kar kaže na signifikantno proizvodnjo aktivnega reporterskega selenoproteina [4].

===Masna spektrometrija potrjuje mestno-specifičen vnos ostanka Sec v rekombinantni tarčni protein z RiboU===

V končnem poskusu so preizkusili sposobnost variante RiboU-v24-419-OR1, da na specifičnih mestih vstavi Sec ostanke v polipeptidno verigo. Kot model selenoproteina so uporabili majhen protein glutation oksidoreduktazo iz E. coli (Grx1). Grx1 lahko kot katalitičen ostanek v aktivnem mestu vsebuje bodisi Cys11 ali Sec11, pri čemer mutacije v Ser11 naredijo protein neaktiven. Ustvarili so tri variante Grx1: Grx1(C11) kot pozitivno kontrolo, Grx1(S11) kot negativno kontrolo in Grx1(UAG11) kot reporter za merjenje vstavljanja Sec s pomočjo RiboU. Variante so bile proizvedene v celicah B-95.ΔAΔfabR, ki izražajo RiboU-v24-419-OR1, nato pa so reporterske proteine izolirali za analizo. Preizkusi encimske aktivnosti so pokazali, da je Grx1(Ser11) neaktiven, medtem ko sta Grx1(C11) in Grx1(U11) pokazala podobne ravni aktivnosti.

Analiza masne spektrometrije je potrdila vstavljanje Sec na specifično mesto v Grx1(UAG11), pri čemer je bil Sec11 prisoten v 34,4 % proteinov, medtem ko je v preostalih 65,6 % UAG11 bil preveden kot Gln, Tyr in Ser. Preostanek Grx1(UAG11), ki vsebuje Ser11, kaže na nepopolno pretvorbo Ser-tRNASec v Sec-tRNASec. Ti rezultati so pokazali, da nepopolni RiboU omogoča natančno in specifično vključevanje Sec v rekombinantne proteine, proizvedene v celicah E. coli [4].

==Zaključek==

V študiji so A. Thaenert in sod. predstavili RiboU, ki predstavlja strategijo modificiranja ribosoma, ki omogoča vstavljanje selenocisteina na specifična mesta v tarčne proteine brez potrebe po spreminjanju kodonov po celem genomu. Z integracijo zaporedja SECIS v 16S rRNA lahko RiboU prevaja UAG kodone kot Sec in razširi sposobnosti sinteze selenoproteinov. Čeprav trenutne variante RiboU kažejo nekaj omejitev v učinkovitosti, predstavljajo pomemben napredek pri uporabi inženiringa ribosoma za namene sintezne biologije. Prihodnje izboljšave, kot so izboljšanje natančnosti vstavljanja Sec in povečanje izkoristkov proteinov, imajo potencial za nadaljnji razvoj te tehnologije. Opisan inovativen pristop poudarja potencial združevanja rRNA z regulatornimi elementi mRNA za spreminjanje interpretacije genetskega koda, kar obeta visoka pričakovanja v biotehnologiji in znanstvenem raziskovanju [4].

==Literatura==

[1] Genetic Code | Definition, Characteristics, Table, & Facts | Britannica. 5 Apr. 2024, https://www.britannica.com/science/genetic-code.

[2] Berry, Maria J., et al. “Recognition of UGA as a Selenocysteine Codon in Type I Deiodinase Requires Sequences in the 3′ Untranslated Region.” Nature, vol. 353, no. 6341, Sept. 1991, pp. 273–76. www.nature.com, https://doi.org/10.1038/353273a0.

[3] Stock, Tilmann, and Michael Rother. “Selenoproteins in Archaea and Gram-Positive Bacteria.” Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects, vol. 1790, no. 11, Nov. 2009, pp. 1520–32. ScienceDirect, https://doi.org/10.1016/j.bbagen.2009.03.022.

[4] Thaenert, Anna, et al. “Engineered mRNA–Ribosome Fusions for Facile Biosynthesis of Selenoproteins.” Proceedings of the National Academy of Sciences, vol. 121, no. 11, Mar. 2024, p. e2321700121. DOI.org (Crossref), https://doi.org/10.1073/pnas.2321700121.

Inženirane mRNA-ribosomske fuzije za lažjo biosintezo selenoproteinov

2024-05-05T10:05:49Z

Kostadin Mitkov:

Izhodiščni članek: [https://www.pnas.org/doi/10.1073/pnas.2321700121 Engineered mRNA–ribosome fusions for facile biosynthesis of selenoproteins]

==Uvod==

V genetskem kodu, kot ga poznamo, vse možne kombinacije tripletov nukleotidov kodirajo za 20 aminokislin, zato te aminokisline imenujemo standardne ali proteinogene [1]. Kljub temu v naravi obstajajo tudi selenoproteini, to so proteini, ki v svojem zaporedju vsebujejo aminokislino, imenovano selenocistein (Sec), ki ne sodi med 20 standardnih aminokislin. Zato se pojavi vprašanje, kako se med translacijo v polipeptidno verigo vključi selenocistein, če zanj ni kodona? V naravi je Sec kodiran s kodonom UGA, ki je stop kodon. Da se zagotovi prevod kodona UGA v Sec, namesto v stop kodon, ima ta stop kodon na 3’ koncu dodano od 20 do 60 nukleotidov dolgo specializirano zaporedje, imenovano SECIS (vstavitveno zaporedje za selenocistein) [2]. SECIS element omogoča mRNA selenoproteinov, da rekrutirajo elongacijski faktor SelB, ki se nato veže na specializirani tRN Sec , ki prinaša Sec na aktivno mesto ribosoma. Ker selenoproteini kažejo višje katalitične hitrosti in odpornost proti nepovratni oksidaciji, kar omogoča Sec-vsebujočim proteinom hitrejše in daljše delovanje v primerjavi s Cys-vsebujočimi analogi, je sinteza načrtovanih selenoproteinov privlačna smer sintezne biologije [3]. Poznanih je že več strategij za sintezo selenoproteinov, vendar imajo nekatere pomanjkljivosti, saj zahtevajo dragocene in časovno zahtevne, včasih tudi nemogoče spremembe genetskega koda po celotnem genomu. Zato v članku A. Thaenert in sod. poročajo o novem pristopu k inženiringu ribosoma za sintezo načrtovanih selenoproteinov, ki temelji na fuziji med mRNA in ribosomom [4].

==Rezultati in diskusija==

===Načrtovanje ribosomov za biosintezo selenoproteinov===

V izhodiščnem članku so A. Thaenert in sod. želeli ustvariti ribosome, ki bi lahko v bakterijskih celicah vgradili selenocistein (Sec) na določenem mestu tarčnega proteina. Ker zaporedja SECIS rekrutirajo potrebne komponente za sintezo selenoproteinov k naravnim SECIS-mRNA, so domnevali, da vstavljanje SECIS elementa v rRNA lahko proizvede ribosome, ki so trajno povezani s kompleksom za sintezo selenoproteinov. Pričakovali so, da bo ta povezava omogočila ribosomom prevajanje UAG kodonov v Sec, namesto v stop kodon.

Da bi preverili to idejo, so uporabili znano strukturo ribosoma E. coli, vezanega na protein SelB in mRNA, ki vsebuje SECIS. Struktura je pokazala, da se med naravno sintezo selenoproteinov tako SECIS kot SelB vežeta na ribosom v tesni bližini heliksa 16 (h16) 16S rRNA. Zato so h16 uporabili kot mesto za vstavljanje zaporedja SECIS in proizvedli fuzijske molekule SECIS–16S rRNA. Pripravili so različne fuzijske molekule, ki so se razlikovale v dolžini povezovalnih zaporedij, preko katerih je bil element SECIS kovalentno povezan s h16, in v mestu vstavitve, torej za katerim nukleotidom je bil element vstavljen. Zaporedje SECIS, ki so ga uporabili, je bilo minimalno funkcionalno zaporedje SECIS iz mRNA selenoproteina format dehidrogenaze (FDH) iz bakterije E. coli. Prav tako so mutirali proti-Shine-Dalgarnovo zaporedje (anti-SD) v fuzijskih molekulah, da bi zagotovili vezavo le na rekombinantno pripravljene in ne na naravne mRNA molekule. Te modificirane fuzijske molekule so poimenovali variante RiboU, kar pomeni, da lahko prevajajo stop kodone v Sec, ki mu pripada enočrkovna oznaka "U". Tako so ustvarili knjižnico, ki je vsebovala 32 različnih variant in vsaka varianta je bila nato vstavljena v plazmid za nadaljnje študije in izboljšave [4].

===Vzpostavitev eksperimentalnega sistema za testiranje aktivnosti RiboU===

Da bi preizkusili, ali lahko RiboU sintetizira selenoproteine v E. coli, so ustvarili sistem, ki temelji na specifičnem genu in modificiranem sevu E. coli. Kot izhodiščni gen so izbrali gen fdhF, ki kodira selenoprotein FDH, katerega aktivnost je odvisna od Sec ostanka na položaju 140 in ki jo je lahko enostavno meriti in vivo. Gen so modificirali tako, da so odstranili naravno zaporedje SECIS in spremenili Sec kodon (UGA) v stop kodon (UAG), nato pa prilagodili Shine–Dalgarnovo zaporedje (SD), da se ujema z zaporedjem v RiboU. Ta modificiran gen so nato vstavili v plazmid skupaj z genom selC, ki kodira za tRNASec, modificiran tako, da prepozna UAG kodone namesto UGA kodone. Uporabili so sev E. coli, imenovan C321, pri katerem so vsi naravni UAG kodoni spremenjeni v UAA stop kodone, in ga modificirali tako, da so odstranili naravne kopije genov fdhF in selC, da bi preprečili FDH aktivnost v ozadju. Nato so te celice kotransformirali s plazmidi, ki vsebujejo različne variante RiboU in modificirane gene fdhF in selC. Eksperimenti so pokazali, da je 24 od 32 variant RiboU lahko proizvedlo FDH z različno učinkovitostjo. To nakazuje, da lahko ribosomi v fuziji z zaporedjem SECIS tvorijo funkcionalne selenoproteine iz mRNA molekul, ki jim manjka zaporedje SECIS [4].

===Izboljšanje aktivnosti RiboU s spremembo mesta vnosa zaporedja SECIS in dodajanjem mutacij v 16S rRNA===

V nadaljevanju so želeli preveriti, ali lahko delovanje RiboU izboljšajo tako, da poiščejo boljše mesto za vstavljanje SECIS v 16S rRNA, zato so preizkusili šest različnih mest v h16. Ko so vstavili SECIS med bazama 419 in 420 ali med 420 in 421, so variante RiboU pokazale približno petkrat višjo aktivnost v primerjavi z originalno verzijo (RiboU-v24-424-OR2). Nato so izbrali eno od novih variant RiboU (RiboU-v24-419-OR2) za nadaljnje izboljšave, kar kaže, da izbira boljšega mesta za vstavljanje SECIS lahko bistveno poveča učinkovitost RiboU.

Nato so preiskali, ali lahko specifične mutacije v 16S rRNA še dodatno povečajo aktivnost RiboU. Prejšnje raziskave so nakazovale, da mutaciji C1100U in G1516U povečata sintezo naravnih selenoproteinov, medtem ko mutaciji U531G in U534A izboljšata sposobnost ribosoma za interpretacijo UAG kodonov kot smiselne kodone in zmanjšata njegovo afiniteto do sprostitvenega faktorja RF1, zaradi česa je RF1 manj konkurenčen tRNA za prepoznavanje UAG. Mutacije so vstavili v konstrukt RiboU-v24-419-OR2 in preučili njihov vpliv na sintezo selenoproteinov. Ugotovili so, da mutacija G1516U (in C1100U) ni povečala proizvodnje selenoproteinov, vendar pa sta mutaciji U531G in U534A povečali aktivnost RiboU za približno desetkrat. Tako izboljšanje so opazili tudi pri sevu brez RF1, kar kaže, da te mutacije lahko vplivajo na prepoznavanje UAG neodvisno od RF1.

Želeli so si tudi povečati proizvodnjo selenoproteinov z optimizacijo parov SD/anti-SD. Primerjali so tri alternative ortogonalnih parov SD/anti-SD in ugotovili, da je zamenjava OR2 z ortogonalnim zaporedjem SD/anti-SD OR1 povečala aktivnost FDH za tri rede velikosti. Posledično so razvili izboljšano različico RiboU-v24-419-OR1, ki presega prejšnji RiboU-v24-419-OR2 [4].

===Povečano izražanje RiboU omogoča učinkovito sintezo rekombinantnih selenoproteinov===

Nadaljevali so s preizkušanjem aktivnosti RiboU z uporabo sistema, ki bolj natančno odraža proizvodnjo rekombinantnih selenoproteinov. Uporabili so reporterje na osnovi inteinov, ki tvorijo neaktivni prekurzor reporterskega proteina, ki postane aktiven s samoizrezovanjem. V protein, ki zagotavlja odpornost proti kanamicinu (KanR), so vstavili intein imenovan DnaB, ki za svoje samoizrezovanje potrebuje N-terminalni Cys ali Sec ostanek. To jim je omogočilo zaznavanje prisotnosti Sec z merjenjem odpornosti na kanamicin. Sprva njihovi eksperimenti niso pokazali pomembnih sprememb v odpornosti na kanamicin pri izražanju RiboU, kar kaže, da njihov konstrukt RiboU ni bil primeren za sintezo selenoproteinov v večjem obsegu.

Da bi konstrukt izboljšali, so izvedli tri prilagoditve. Prvič so prenesli rRNA-SECIS fuzijsko zaporedje v plazmid z večjim številom kopij, pri čemer so ciljali na 15 do 20 kopij na celico. Drugič so zamenjali originalni promotor (promotor, induciran s anhidrotetraciklinom) s promotorjem, induciran z arabinozo, saj je ta manj toksična molekula. Nazadnje so zamenjali E. coli sev BW25113 z B-95.ΔAΔfabR, ki ima izbit gen za RF1. Po teh spremembah so opazili izrazit porast odpornosti na kanamicin (do 75 μg/mL) ob izražanju RiboU, kar kaže na signifikantno proizvodnjo aktivnega reporterskega selenoproteina [4].

===Masna spektrometrija potrjuje mestno-specifičen vnos ostanka Sec v rekombinantni tarčni protein z RiboU===

V končnem poskusu so preizkusili sposobnost variante RiboU-v24-419-OR1, da na specifičnih mestih vstavi Sec ostanke v polipeptidno verigo. Kot model selenoproteina so uporabili majhen protein glutation oksidoreduktazo iz E. coli (Grx1). Grx1 lahko kot katalitičen ostanek v aktivnem mestu vsebuje bodisi Cys11 ali Sec11, pri čemer mutacije v Ser11 naredijo protein neaktiven. Ustvarili so tri variante Grx1: Grx1(C11) kot pozitivno kontrolo, Grx1(S11) kot negativno kontrolo in Grx1(UAG11) kot reporter za merjenje vstavljanja Sec s pomočjo RiboU. Variante so bile proizvedene v celicah B-95.ΔAΔfabR, ki izražajo RiboU-v24-419-OR1, nato pa so reporterske proteine izolirali za analizo. Preizkusi encimske aktivnosti so pokazali, da je Grx1(Ser11) neaktiven, medtem ko sta Grx1(C11) in Grx1(U11) pokazala podobne ravni aktivnosti.

Analiza masne spektrometrije je potrdila vstavljanje Sec na specifično mesto v Grx1(UAG11), pri čemer je bil Sec11 prisoten v 34,4 % proteinov, medtem ko je v preostalih 65,6 % UAG11 bil preveden kot Gln, Tyr in Ser. Preostanek Grx1(UAG11), ki vsebuje Ser11, kaže na nepopolno pretvorbo Ser-tRNASec v Sec-tRNASec. Ti rezultati so pokazali, da nepopolni RiboU omogoča natančno in specifično vključevanje Sec v rekombinantne proteine, proizvedene v celicah E. coli [4].

==Zaključek==

V študiji so A. Thaenert in sod. predstavili RiboU, ki predstavlja strategijo modificiranja ribosoma, ki omogoča vstavljanje selenocisteina na specifična mesta v tarčne proteine brez potrebe po spreminjanju kodonov po celem genomu. Z integracijo zaporedja SECIS v 16S rRNA lahko RiboU prevaja UAG kodone kot Sec in razširi sposobnosti sinteze selenoproteinov. Čeprav trenutne variante RiboU kažejo nekaj omejitev v učinkovitosti, predstavljajo pomemben napredek pri uporabi inženiringa ribosoma za namene sintezne biologije. Prihodnje izboljšave, kot so izboljšanje natančnosti vstavljanja Sec in povečanje izkoristkov proteinov, imajo potencial za nadaljnji razvoj te tehnologije. Opisan inovativen pristop poudarja potencial združevanja rRNA z regulatornimi elementi mRNA za spreminjanje interpretacije genetskega koda, kar obeta visoka pričakovanja v biotehnologiji in znanstvenem raziskovanju [4].

==Literatura==

[1] Genetic Code | Definition, Characteristics, Table, & Facts | Britannica. 5 Apr. 2024, https://www.britannica.com/science/genetic-code.

[2] Berry, Maria J., et al. “Recognition of UGA as a Selenocysteine Codon in Type I Deiodinase Requires Sequences in the 3′ Untranslated Region.” Nature, vol. 353, no. 6341, Sept. 1991, pp. 273–76. www.nature.com, https://doi.org/10.1038/353273a0.

[3] Stock, Tilmann, and Michael Rother. “Selenoproteins in Archaea and Gram-Positive Bacteria.” Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects, vol. 1790, no. 11, Nov. 2009, pp. 1520–32. ScienceDirect, https://doi.org/10.1016/j.bbagen.2009.03.022.

[4] Thaenert, Anna, et al. “Engineered mRNA–Ribosome Fusions for Facile Biosynthesis of Selenoproteins.” Proceedings of the National Academy of Sciences, vol. 121, no. 11, Mar. 2024, p. e2321700121. DOI.org (Crossref), https://doi.org/10.1073/pnas.2321700121.

Inženirane mRNA-ribosomske fuzije za lažjo biosintezo selenoproteinov

2024-05-05T10:05:26Z

Kostadin Mitkov:

Izhodiščni članek: [https://www.pnas.org/doi/10.1073/pnas.2321700121 Engineered mRNA–ribosome fusions for facile biosynthesis of selenoproteins]

==Uvod==

V genetskem kodu, kot ga poznamo, vse možne kombinacije tripletov nukleotidov kodirajo za 20 aminokislin, zato te aminokisline imenujemo standardne ali proteinogene [1]. Kljub temu v naravi obstajajo tudi selenoproteini, to so proteini, ki v svojem zaporedju vsebujejo aminokislino, imenovano selenocistein (Sec), ki ne sodi med 20 standardnih aminokislin. Zato se pojavi vprašanje, kako se med translacijo v polipeptidno verigo vključi selenocistein, če zanj ni kodona? V naravi je Sec kodiran s kodonom UGA, ki je stop kodon. Da se zagotovi prevod kodona UGA v Sec, namesto v stop kodon, ima ta stop kodon na 3’ koncu dodano od 20 do 60 nukleotidov dolgo specializirano zaporedje, imenovano SECIS (vstavitveno zaporedje za selenocistein) [2]. SECIS element omogoča mRNA selenoproteinov, da rekrutirajo elongacijski faktor SelB, ki se nato veže na specializirani tRNSec, ki prinaša Sec na aktivno mesto ribosoma. Ker selenoproteini kažejo višje katalitične hitrosti in odpornost proti nepovratni oksidaciji, kar omogoča Sec-vsebujočim proteinom hitrejše in daljše delovanje v primerjavi s Cys-vsebujočimi analogi, je sinteza načrtovanih selenoproteinov privlačna smer sintezne biologije [3]. Poznanih je že več strategij za sintezo selenoproteinov, vendar imajo nekatere pomanjkljivosti, saj zahtevajo dragocene in časovno zahtevne, včasih tudi nemogoče spremembe genetskega koda po celotnem genomu. Zato v članku A. Thaenert in sod. poročajo o novem pristopu k inženiringu ribosoma za sintezo načrtovanih selenoproteinov, ki temelji na fuziji med mRNA in ribosomom [4].

==Rezultati in diskusija==

===Načrtovanje ribosomov za biosintezo selenoproteinov===

V izhodiščnem članku so A. Thaenert in sod. želeli ustvariti ribosome, ki bi lahko v bakterijskih celicah vgradili selenocistein (Sec) na določenem mestu tarčnega proteina. Ker zaporedja SECIS rekrutirajo potrebne komponente za sintezo selenoproteinov k naravnim SECIS-mRNA, so domnevali, da vstavljanje SECIS elementa v rRNA lahko proizvede ribosome, ki so trajno povezani s kompleksom za sintezo selenoproteinov. Pričakovali so, da bo ta povezava omogočila ribosomom prevajanje UAG kodonov v Sec, namesto v stop kodon.

Da bi preverili to idejo, so uporabili znano strukturo ribosoma E. coli, vezanega na protein SelB in mRNA, ki vsebuje SECIS. Struktura je pokazala, da se med naravno sintezo selenoproteinov tako SECIS kot SelB vežeta na ribosom v tesni bližini heliksa 16 (h16) 16S rRNA. Zato so h16 uporabili kot mesto za vstavljanje zaporedja SECIS in proizvedli fuzijske molekule SECIS–16S rRNA. Pripravili so različne fuzijske molekule, ki so se razlikovale v dolžini povezovalnih zaporedij, preko katerih je bil element SECIS kovalentno povezan s h16, in v mestu vstavitve, torej za katerim nukleotidom je bil element vstavljen. Zaporedje SECIS, ki so ga uporabili, je bilo minimalno funkcionalno zaporedje SECIS iz mRNA selenoproteina format dehidrogenaze (FDH) iz bakterije E. coli. Prav tako so mutirali proti-Shine-Dalgarnovo zaporedje (anti-SD) v fuzijskih molekulah, da bi zagotovili vezavo le na rekombinantno pripravljene in ne na naravne mRNA molekule. Te modificirane fuzijske molekule so poimenovali variante RiboU, kar pomeni, da lahko prevajajo stop kodone v Sec, ki mu pripada enočrkovna oznaka "U". Tako so ustvarili knjižnico, ki je vsebovala 32 različnih variant in vsaka varianta je bila nato vstavljena v plazmid za nadaljnje študije in izboljšave [4].

===Vzpostavitev eksperimentalnega sistema za testiranje aktivnosti RiboU===

Da bi preizkusili, ali lahko RiboU sintetizira selenoproteine v E. coli, so ustvarili sistem, ki temelji na specifičnem genu in modificiranem sevu E. coli. Kot izhodiščni gen so izbrali gen fdhF, ki kodira selenoprotein FDH, katerega aktivnost je odvisna od Sec ostanka na položaju 140 in ki jo je lahko enostavno meriti in vivo. Gen so modificirali tako, da so odstranili naravno zaporedje SECIS in spremenili Sec kodon (UGA) v stop kodon (UAG), nato pa prilagodili Shine–Dalgarnovo zaporedje (SD), da se ujema z zaporedjem v RiboU. Ta modificiran gen so nato vstavili v plazmid skupaj z genom selC, ki kodira za tRNASec, modificiran tako, da prepozna UAG kodone namesto UGA kodone. Uporabili so sev E. coli, imenovan C321, pri katerem so vsi naravni UAG kodoni spremenjeni v UAA stop kodone, in ga modificirali tako, da so odstranili naravne kopije genov fdhF in selC, da bi preprečili FDH aktivnost v ozadju. Nato so te celice kotransformirali s plazmidi, ki vsebujejo različne variante RiboU in modificirane gene fdhF in selC. Eksperimenti so pokazali, da je 24 od 32 variant RiboU lahko proizvedlo FDH z različno učinkovitostjo. To nakazuje, da lahko ribosomi v fuziji z zaporedjem SECIS tvorijo funkcionalne selenoproteine iz mRNA molekul, ki jim manjka zaporedje SECIS [4].

===Izboljšanje aktivnosti RiboU s spremembo mesta vnosa zaporedja SECIS in dodajanjem mutacij v 16S rRNA===

V nadaljevanju so želeli preveriti, ali lahko delovanje RiboU izboljšajo tako, da poiščejo boljše mesto za vstavljanje SECIS v 16S rRNA, zato so preizkusili šest različnih mest v h16. Ko so vstavili SECIS med bazama 419 in 420 ali med 420 in 421, so variante RiboU pokazale približno petkrat višjo aktivnost v primerjavi z originalno verzijo (RiboU-v24-424-OR2). Nato so izbrali eno od novih variant RiboU (RiboU-v24-419-OR2) za nadaljnje izboljšave, kar kaže, da izbira boljšega mesta za vstavljanje SECIS lahko bistveno poveča učinkovitost RiboU.

Nato so preiskali, ali lahko specifične mutacije v 16S rRNA še dodatno povečajo aktivnost RiboU. Prejšnje raziskave so nakazovale, da mutaciji C1100U in G1516U povečata sintezo naravnih selenoproteinov, medtem ko mutaciji U531G in U534A izboljšata sposobnost ribosoma za interpretacijo UAG kodonov kot smiselne kodone in zmanjšata njegovo afiniteto do sprostitvenega faktorja RF1, zaradi česa je RF1 manj konkurenčen tRNA za prepoznavanje UAG. Mutacije so vstavili v konstrukt RiboU-v24-419-OR2 in preučili njihov vpliv na sintezo selenoproteinov. Ugotovili so, da mutacija G1516U (in C1100U) ni povečala proizvodnje selenoproteinov, vendar pa sta mutaciji U531G in U534A povečali aktivnost RiboU za približno desetkrat. Tako izboljšanje so opazili tudi pri sevu brez RF1, kar kaže, da te mutacije lahko vplivajo na prepoznavanje UAG neodvisno od RF1.

Želeli so si tudi povečati proizvodnjo selenoproteinov z optimizacijo parov SD/anti-SD. Primerjali so tri alternative ortogonalnih parov SD/anti-SD in ugotovili, da je zamenjava OR2 z ortogonalnim zaporedjem SD/anti-SD OR1 povečala aktivnost FDH za tri rede velikosti. Posledično so razvili izboljšano različico RiboU-v24-419-OR1, ki presega prejšnji RiboU-v24-419-OR2 [4].

===Povečano izražanje RiboU omogoča učinkovito sintezo rekombinantnih selenoproteinov===

Nadaljevali so s preizkušanjem aktivnosti RiboU z uporabo sistema, ki bolj natančno odraža proizvodnjo rekombinantnih selenoproteinov. Uporabili so reporterje na osnovi inteinov, ki tvorijo neaktivni prekurzor reporterskega proteina, ki postane aktiven s samoizrezovanjem. V protein, ki zagotavlja odpornost proti kanamicinu (KanR), so vstavili intein imenovan DnaB, ki za svoje samoizrezovanje potrebuje N-terminalni Cys ali Sec ostanek. To jim je omogočilo zaznavanje prisotnosti Sec z merjenjem odpornosti na kanamicin. Sprva njihovi eksperimenti niso pokazali pomembnih sprememb v odpornosti na kanamicin pri izražanju RiboU, kar kaže, da njihov konstrukt RiboU ni bil primeren za sintezo selenoproteinov v večjem obsegu.

Da bi konstrukt izboljšali, so izvedli tri prilagoditve. Prvič so prenesli rRNA-SECIS fuzijsko zaporedje v plazmid z večjim številom kopij, pri čemer so ciljali na 15 do 20 kopij na celico. Drugič so zamenjali originalni promotor (promotor, induciran s anhidrotetraciklinom) s promotorjem, induciran z arabinozo, saj je ta manj toksična molekula. Nazadnje so zamenjali E. coli sev BW25113 z B-95.ΔAΔfabR, ki ima izbit gen za RF1. Po teh spremembah so opazili izrazit porast odpornosti na kanamicin (do 75 μg/mL) ob izražanju RiboU, kar kaže na signifikantno proizvodnjo aktivnega reporterskega selenoproteina [4].

===Masna spektrometrija potrjuje mestno-specifičen vnos ostanka Sec v rekombinantni tarčni protein z RiboU===

V končnem poskusu so preizkusili sposobnost variante RiboU-v24-419-OR1, da na specifičnih mestih vstavi Sec ostanke v polipeptidno verigo. Kot model selenoproteina so uporabili majhen protein glutation oksidoreduktazo iz E. coli (Grx1). Grx1 lahko kot katalitičen ostanek v aktivnem mestu vsebuje bodisi Cys11 ali Sec11, pri čemer mutacije v Ser11 naredijo protein neaktiven. Ustvarili so tri variante Grx1: Grx1(C11) kot pozitivno kontrolo, Grx1(S11) kot negativno kontrolo in Grx1(UAG11) kot reporter za merjenje vstavljanja Sec s pomočjo RiboU. Variante so bile proizvedene v celicah B-95.ΔAΔfabR, ki izražajo RiboU-v24-419-OR1, nato pa so reporterske proteine izolirali za analizo. Preizkusi encimske aktivnosti so pokazali, da je Grx1(Ser11) neaktiven, medtem ko sta Grx1(C11) in Grx1(U11) pokazala podobne ravni aktivnosti.

Analiza masne spektrometrije je potrdila vstavljanje Sec na specifično mesto v Grx1(UAG11), pri čemer je bil Sec11 prisoten v 34,4 % proteinov, medtem ko je v preostalih 65,6 % UAG11 bil preveden kot Gln, Tyr in Ser. Preostanek Grx1(UAG11), ki vsebuje Ser11, kaže na nepopolno pretvorbo Ser-tRNASec v Sec-tRNASec. Ti rezultati so pokazali, da nepopolni RiboU omogoča natančno in specifično vključevanje Sec v rekombinantne proteine, proizvedene v celicah E. coli [4].

==Zaključek==

V študiji so A. Thaenert in sod. predstavili RiboU, ki predstavlja strategijo modificiranja ribosoma, ki omogoča vstavljanje selenocisteina na specifična mesta v tarčne proteine brez potrebe po spreminjanju kodonov po celem genomu. Z integracijo zaporedja SECIS v 16S rRNA lahko RiboU prevaja UAG kodone kot Sec in razširi sposobnosti sinteze selenoproteinov. Čeprav trenutne variante RiboU kažejo nekaj omejitev v učinkovitosti, predstavljajo pomemben napredek pri uporabi inženiringa ribosoma za namene sintezne biologije. Prihodnje izboljšave, kot so izboljšanje natančnosti vstavljanja Sec in povečanje izkoristkov proteinov, imajo potencial za nadaljnji razvoj te tehnologije. Opisan inovativen pristop poudarja potencial združevanja rRNA z regulatornimi elementi mRNA za spreminjanje interpretacije genetskega koda, kar obeta visoka pričakovanja v biotehnologiji in znanstvenem raziskovanju [4].

==Literatura==

[1] Genetic Code | Definition, Characteristics, Table, & Facts | Britannica. 5 Apr. 2024, https://www.britannica.com/science/genetic-code.

[2] Berry, Maria J., et al. “Recognition of UGA as a Selenocysteine Codon in Type I Deiodinase Requires Sequences in the 3′ Untranslated Region.” Nature, vol. 353, no. 6341, Sept. 1991, pp. 273–76. www.nature.com, https://doi.org/10.1038/353273a0.

[3] Stock, Tilmann, and Michael Rother. “Selenoproteins in Archaea and Gram-Positive Bacteria.” Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects, vol. 1790, no. 11, Nov. 2009, pp. 1520–32. ScienceDirect, https://doi.org/10.1016/j.bbagen.2009.03.022.

[4] Thaenert, Anna, et al. “Engineered mRNA–Ribosome Fusions for Facile Biosynthesis of Selenoproteins.” Proceedings of the National Academy of Sciences, vol. 121, no. 11, Mar. 2024, p. e2321700121. DOI.org (Crossref), https://doi.org/10.1073/pnas.2321700121.

Inženirane mRNA-ribosomske fuzije za lažjo biosintezo selenoproteinov

2024-05-05T09:32:19Z

Kostadin Mitkov:

Izhodiščni članek: [https://www.pnas.org/doi/10.1073/pnas.2321700121 Engineered mRNA–ribosome fusions for facile biosynthesis of selenoproteins]

==Uvod==

V genetskem kodu, kot ga poznamo, vse možne kombinacije tripletov nukleotidov kodirajo za 20 aminokislin, zato te aminokisline imenujemo standardne ali proteinogene [1]. Kljub temu v naravi obstajajo tudi selenoproteini, to so proteini, ki v svojem zaporedju vsebujejo aminokislino, imenovano selenocistein (Sec), ki ne sodi med 20 standardnih aminokislin. Zato se pojavi vprašanje, kako se med translacijo v polipeptidno verigo vključi selenocistein, če zanj ni kodona? V naravi je Sec kodiran s kodonom UGA, ki je stop kodon. Da se zagotovi prevod kodona UGA v Sec, namesto v stop kodon, ima ta stop kodon na 3’ koncu dodano od 20 do 60 nukleotidov dolgo specializirano zaporedje, imenovano SECIS (vstavitveno zaporedje za selenocistein) [2]. SECIS element omogoča mRNA selenoproteinov, da rekrutirajo elongacijski faktor SelB, ki se nato veže na specializirani tRNASec, ki prinaša Sec na aktivno mesto ribosoma. Ker selenoproteini kažejo višje katalitične hitrosti in odpornost proti nepovratni oksidaciji, kar omogoča Sec-vsebujočim proteinom hitrejše in daljše delovanje v primerjavi s Cys-vsebujočimi analogi, je sinteza načrtovanih selenoproteinov privlačna smer sintezne biologije [3]. Poznanih je že več strategij za sintezo selenoproteinov, vendar imajo nekatere pomanjkljivosti, saj zahtevajo dragocene in časovno zahtevne, včasih tudi nemogoče spremembe genetskega koda po celotnem genomu. Zato v članku A. Thaenert in sod. poročajo o novem pristopu k inženiringu ribosoma za sintezo načrtovanih selenoproteinov, ki temelji na fuziji med mRNA in ribosomom [4].

==Rezultati in diskusija==

===Načrtovanje ribosomov za biosintezo selenoproteinov===

V izhodiščnem članku so A. Thaenert in sod. želeli ustvariti ribosome, ki bi lahko v bakterijskih celicah vgradili selenocistein (Sec) na določenem mestu tarčnega proteina. Ker zaporedja SECIS rekrutirajo potrebne komponente za sintezo selenoproteinov k naravnim SECIS-mRNA, so domnevali, da vstavljanje SECIS elementa v rRNA lahko proizvede ribosome, ki so trajno povezani s kompleksom za sintezo selenoproteinov. Pričakovali so, da bo ta povezava omogočila ribosomom prevajanje UAG kodonov v Sec, namesto v stop kodon.

Da bi preverili to idejo, so uporabili znano strukturo ribosoma E. coli, vezanega na protein SelB in mRNA, ki vsebuje SECIS. Struktura je pokazala, da se med naravno sintezo selenoproteinov tako SECIS kot SelB vežeta na ribosom v tesni bližini heliksa 16 (h16) 16S rRNA. Zato so h16 uporabili kot mesto za vstavljanje zaporedja SECIS in proizvedli fuzijske molekule SECIS–16S rRNA. Pripravili so različne fuzijske molekule, ki so se razlikovale v dolžini povezovalnih zaporedij, preko katerih je bil element SECIS kovalentno povezan s h16, in v mestu vstavitve, torej za katerim nukleotidom je bil element vstavljen. Zaporedje SECIS, ki so ga uporabili, je bilo minimalno funkcionalno zaporedje SECIS iz mRNA selenoproteina format dehidrogenaze (FDH) iz bakterije E. coli. Prav tako so mutirali proti-Shine-Dalgarnovo zaporedje (anti-SD) v fuzijskih molekulah, da bi zagotovili vezavo le na rekombinantno pripravljene in ne na naravne mRNA molekule. Te modificirane fuzijske molekule so poimenovali variante RiboU, kar pomeni, da lahko prevajajo stop kodone v Sec, ki mu pripada enočrkovna oznaka "U". Tako so ustvarili knjižnico, ki je vsebovala 32 različnih variant in vsaka varianta je bila nato vstavljena v plazmid za nadaljnje študije in izboljšave [4].

===Vzpostavitev eksperimentalnega sistema za testiranje aktivnosti RiboU===

Da bi preizkusili, ali lahko RiboU sintetizira selenoproteine v E. coli, so ustvarili sistem, ki temelji na specifičnem genu in modificiranem sevu E. coli. Kot izhodiščni gen so izbrali gen fdhF, ki kodira selenoprotein FDH, katerega aktivnost je odvisna od Sec ostanka na položaju 140 in ki jo je lahko enostavno meriti in vivo. Gen so modificirali tako, da so odstranili naravno zaporedje SECIS in spremenili Sec kodon (UGA) v stop kodon (UAG), nato pa prilagodili Shine–Dalgarnovo zaporedje (SD), da se ujema z zaporedjem v RiboU. Ta modificiran gen so nato vstavili v plazmid skupaj z genom selC, ki kodira za tRNASec, modificiran tako, da prepozna UAG kodone namesto UGA kodone. Uporabili so sev E. coli, imenovan C321, pri katerem so vsi naravni UAG kodoni spremenjeni v UAA stop kodone, in ga modificirali tako, da so odstranili naravne kopije genov fdhF in selC, da bi preprečili FDH aktivnost v ozadju. Nato so te celice kotransformirali s plazmidi, ki vsebujejo različne variante RiboU in modificirane gene fdhF in selC. Eksperimenti so pokazali, da je 24 od 32 variant RiboU lahko proizvedlo FDH z različno učinkovitostjo. To nakazuje, da lahko ribosomi v fuziji z zaporedjem SECIS tvorijo funkcionalne selenoproteine iz mRNA molekul, ki jim manjka zaporedje SECIS [4].

===Izboljšanje aktivnosti RiboU s spremembo mesta vnosa zaporedja SECIS in dodajanjem mutacij v 16S rRNA===

V nadaljevanju so želeli preveriti, ali lahko delovanje RiboU izboljšajo tako, da poiščejo boljše mesto za vstavljanje SECIS v 16S rRNA, zato so preizkusili šest različnih mest v h16. Ko so vstavili SECIS med bazama 419 in 420 ali med 420 in 421, so variante RiboU pokazale približno petkrat višjo aktivnost v primerjavi z originalno verzijo (RiboU-v24-424-OR2). Nato so izbrali eno od novih variant RiboU (RiboU-v24-419-OR2) za nadaljnje izboljšave, kar kaže, da izbira boljšega mesta za vstavljanje SECIS lahko bistveno poveča učinkovitost RiboU.

Nato so preiskali, ali lahko specifične mutacije v 16S rRNA še dodatno povečajo aktivnost RiboU. Prejšnje raziskave so nakazovale, da mutaciji C1100U in G1516U povečata sintezo naravnih selenoproteinov, medtem ko mutaciji U531G in U534A izboljšata sposobnost ribosoma za interpretacijo UAG kodonov kot smiselne kodone in zmanjšata njegovo afiniteto do sprostitvenega faktorja RF1, zaradi česa je RF1 manj konkurenčen tRNA za prepoznavanje UAG. Mutacije so vstavili v konstrukt RiboU-v24-419-OR2 in preučili njihov vpliv na sintezo selenoproteinov. Ugotovili so, da mutacija G1516U (in C1100U) ni povečala proizvodnje selenoproteinov, vendar pa sta mutaciji U531G in U534A povečali aktivnost RiboU za približno desetkrat. Tako izboljšanje so opazili tudi pri sevu brez RF1, kar kaže, da te mutacije lahko vplivajo na prepoznavanje UAG neodvisno od RF1.

Želeli so si tudi povečati proizvodnjo selenoproteinov z optimizacijo parov SD/anti-SD. Primerjali so tri alternative ortogonalnih parov SD/anti-SD in ugotovili, da je zamenjava OR2 z ortogonalnim zaporedjem SD/anti-SD OR1 povečala aktivnost FDH za tri rede velikosti. Posledično so razvili izboljšano različico RiboU-v24-419-OR1, ki presega prejšnji RiboU-v24-419-OR2 [4].

===Povečano izražanje RiboU omogoča učinkovito sintezo rekombinantnih selenoproteinov===

Nadaljevali so s preizkušanjem aktivnosti RiboU z uporabo sistema, ki bolj natančno odraža proizvodnjo rekombinantnih selenoproteinov. Uporabili so reporterje na osnovi inteinov, ki tvorijo neaktivni prekurzor reporterskega proteina, ki postane aktiven s samoizrezovanjem. V protein, ki zagotavlja odpornost proti kanamicinu (KanR), so vstavili intein imenovan DnaB, ki za svoje samoizrezovanje potrebuje N-terminalni Cys ali Sec ostanek. To jim je omogočilo zaznavanje prisotnosti Sec z merjenjem odpornosti na kanamicin. Sprva njihovi eksperimenti niso pokazali pomembnih sprememb v odpornosti na kanamicin pri izražanju RiboU, kar kaže, da njihov konstrukt RiboU ni bil primeren za sintezo selenoproteinov v večjem obsegu.

Da bi konstrukt izboljšali, so izvedli tri prilagoditve. Prvič so prenesli rRNA-SECIS fuzijsko zaporedje v plazmid z večjim številom kopij, pri čemer so ciljali na 15 do 20 kopij na celico. Drugič so zamenjali originalni promotor (promotor, induciran s anhidrotetraciklinom) s promotorjem, induciran z arabinozo, saj je ta manj toksična molekula. Nazadnje so zamenjali E. coli sev BW25113 z B-95.ΔAΔfabR, ki ima izbit gen za RF1. Po teh spremembah so opazili izrazit porast odpornosti na kanamicin (do 75 μg/mL) ob izražanju RiboU, kar kaže na signifikantno proizvodnjo aktivnega reporterskega selenoproteina [4].

===Masna spektrometrija potrjuje mestno-specifičen vnos ostanka Sec v rekombinantni tarčni protein z RiboU===

V končnem poskusu so preizkusili sposobnost variante RiboU-v24-419-OR1, da na specifičnih mestih vstavi Sec ostanke v polipeptidno verigo. Kot model selenoproteina so uporabili majhen protein glutation oksidoreduktazo iz E. coli (Grx1). Grx1 lahko kot katalitičen ostanek v aktivnem mestu vsebuje bodisi Cys11 ali Sec11, pri čemer mutacije v Ser11 naredijo protein neaktiven. Ustvarili so tri variante Grx1: Grx1(C11) kot pozitivno kontrolo, Grx1(S11) kot negativno kontrolo in Grx1(UAG11) kot reporter za merjenje vstavljanja Sec s pomočjo RiboU. Variante so bile proizvedene v celicah B-95.ΔAΔfabR, ki izražajo RiboU-v24-419-OR1, nato pa so reporterske proteine izolirali za analizo. Preizkusi encimske aktivnosti so pokazali, da je Grx1(Ser11) neaktiven, medtem ko sta Grx1(C11) in Grx1(U11) pokazala podobne ravni aktivnosti.

Analiza masne spektrometrije je potrdila vstavljanje Sec na specifično mesto v Grx1(UAG11), pri čemer je bil Sec11 prisoten v 34,4 % proteinov, medtem ko je v preostalih 65,6 % UAG11 bil preveden kot Gln, Tyr in Ser. Preostanek Grx1(UAG11), ki vsebuje Ser11, kaže na nepopolno pretvorbo Ser-tRNASec v Sec-tRNASec. Ti rezultati so pokazali, da nepopolni RiboU omogoča natančno in specifično vključevanje Sec v rekombinantne proteine, proizvedene v celicah E. coli [4].

==Zaključek==

V študiji so A. Thaenert in sod. predstavili RiboU, ki predstavlja strategijo modificiranja ribosoma, ki omogoča vstavljanje selenocisteina na specifična mesta v tarčne proteine brez potrebe po spreminjanju kodonov po celem genomu. Z integracijo zaporedja SECIS v 16S rRNA lahko RiboU prevaja UAG kodone kot Sec in razširi sposobnosti sinteze selenoproteinov. Čeprav trenutne variante RiboU kažejo nekaj omejitev v učinkovitosti, predstavljajo pomemben napredek pri uporabi inženiringa ribosoma za namene sintezne biologije. Prihodnje izboljšave, kot so izboljšanje natančnosti vstavljanja Sec in povečanje izkoristkov proteinov, imajo potencial za nadaljnji razvoj te tehnologije. Opisan inovativen pristop poudarja potencial združevanja rRNA z regulatornimi elementi mRNA za spreminjanje interpretacije genetskega koda, kar obeta visoka pričakovanja v biotehnologiji in znanstvenem raziskovanju [4].

==Literatura==

[1] Genetic Code | Definition, Characteristics, Table, & Facts | Britannica. 5 Apr. 2024, https://www.britannica.com/science/genetic-code.

[2] Berry, Maria J., et al. “Recognition of UGA as a Selenocysteine Codon in Type I Deiodinase Requires Sequences in the 3′ Untranslated Region.” Nature, vol. 353, no. 6341, Sept. 1991, pp. 273–76. www.nature.com, https://doi.org/10.1038/353273a0.

[3] Stock, Tilmann, and Michael Rother. “Selenoproteins in Archaea and Gram-Positive Bacteria.” Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects, vol. 1790, no. 11, Nov. 2009, pp. 1520–32. ScienceDirect, https://doi.org/10.1016/j.bbagen.2009.03.022.

[4] Thaenert, Anna, et al. “Engineered mRNA–Ribosome Fusions for Facile Biosynthesis of Selenoproteins.” Proceedings of the National Academy of Sciences, vol. 121, no. 11, Mar. 2024, p. e2321700121. DOI.org (Crossref), https://doi.org/10.1073/pnas.2321700121.

Inženirane mRNA-ribosomske fuzije za lažjo biosintezo selenoproteinov

2024-05-05T09:23:57Z

Kostadin Mitkov: Created page with "Izhodiščni članek: [https://www.pnas.org/doi/10.1073/pnas.2321700121 Engineered mRNA–ribosome fusions for facile biosynthesis of selenoproteins]"

Izhodiščni članek: [https://www.pnas.org/doi/10.1073/pnas.2321700121 Engineered mRNA–ribosome fusions for facile biosynthesis of selenoproteins]

Seminarji SB 2023/24

2024-05-05T09:17:45Z

Kostadin Mitkov:

V študijskem letu 2023/24 študenti in študentke pri Sintezni biologiji predstavljajo naslednje teme:

RAZISKOVALNI ČLANKI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sinteznobiološki_pristop_k_sestavljanju_in_ponovnemu_zagonu_klinično_pomembnih_fagov_Pseudomonas_aeruginosa Sinteznobiološki pristop k sestavljanju in ponovnemu zagonu klinično pomembnih fagov ''Pseudomonas aeruginosa''] (Bor Krajnik)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Optogenetsko_prostorsko_vzorčenje_kooperacije_pri_glivah_kvasovkah Optogenetsko prostorsko vzorčenje kooperacije pri glivah kvasovkah] (Martin Stanonik)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sintetična_celična_linija_za_inducibilno_pakiranje_virusa_influence_A Sintetična celična linija za inducibilno pakiranje virusa influence A] (Klara Razboršek)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Uporaba_sesalskega_RNA-vezavnega_proteina_Musashi-1_kot_alosterično_reguliranega_translacijskega_represorja_v_E._coli Uporaba sesalskega RNA-vezavnega proteina Musashi-1 kot alosterično reguliranega translacijskega represorja v ''E. coli''] (Marko Kovačić)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Kaskadno_ojačano_genetsko_vezje_za_detekcijo_glivnih_patogenov Kaskadno ojačano genetsko vezje za detekcijo glivnih patogenov] (Jakob Tomšič)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sintetična_mRNA-stikala_s_povratno_zanko,_ki_omogočajo_zaznavanje_miRNA Sintetična mRNA-stikala s povratno zanko, ki omogočajo zaznavanje miRNA] (Ana Pervanja)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Molekularni_nabor_navzkrižno_hranjenih_sevov_za_pripravo_sintetičnih_skupnosti_kvasovk Molekularni nabor navzkrižno hranjenih sevov za pripravo sintetičnih skupnosti kvasovk] (Teja Spruk)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Inženiring_dinamike_rasti_sesalskih_celic_za_bioproizvodnjo Inženiring dinamike rasti sesalskih celic za bioproizvodnjo] (Zarja Rožanc)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Inženirane_mRNA-ribosomske_fuzije_za_lažjo_biosintezo_selenoproteinov Inženirane mRNA-ribosomske fuzije za lažjo biosintezo selenoproteinov] (Kostadin Mitkov)

NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/PhaseOut Biološka proizvodnja bioplastike] (Sašo Jakob)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BeeYeast Inženiring kvasovk za boj proti virusnim okužbam čebel] (Mateja Milošević)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Cellect Cellect - Fenotipsko stabilne celične linije] (Lucija Voga)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/oPHAelia oPHAelia - Inovativna rešitev za zmanjšanje onesnaževanja s plastiko] (Irina Kostadinoska)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/ReMixHD ReMixHD - Recikliranje mešanih plastičnih odpadkov] (Ema Kavčič)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/DARWINS DARWINS - Usmerjena posodobitev proteinov Ago z idealno proteinsko termično stabilnostjo] (Rahela Petrovčič)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/PET-2-Protein PET-2-Protein - Proizvodnja mikrobnih proteinov iz polietilen tereftalata] (Zala Perko)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/48C_Cadmium_catcher_LBP 48C Cadmium catcher LBP- Proizvodnja bioterapevtika za vezavo kadmija] (Maja Deutsch)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Proteus Proteus - Sistem za ciljanje onkogenov in induciranje piroptoze] (Gašper Struna)
----

Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Povzetek je treba objaviti dva dni pred predstavitvijo do polnoči (za seminarje v sredo torej v ponedeljek). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo približno 5-minutna razprava.

Terminski razpored je razviden iz preglednice na strežniku Google Drive.

Kako je videti seznam seminarjev, lahko preverite pri lanskem letniku: [[Seminarji_SB_2022/23]].

Seminarji SB 2023/24

2024-05-05T09:16:03Z

Kostadin Mitkov:

V študijskem letu 2023/24 študenti in študentke pri Sintezni biologiji predstavljajo naslednje teme:

RAZISKOVALNI ČLANKI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sinteznobiološki_pristop_k_sestavljanju_in_ponovnemu_zagonu_klinično_pomembnih_fagov_Pseudomonas_aeruginosa Sinteznobiološki pristop k sestavljanju in ponovnemu zagonu klinično pomembnih fagov ''Pseudomonas aeruginosa''] (Bor Krajnik)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Optogenetsko_prostorsko_vzorčenje_kooperacije_pri_glivah_kvasovkah Optogenetsko prostorsko vzorčenje kooperacije pri glivah kvasovkah] (Martin Stanonik)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sintetična_celična_linija_za_inducibilno_pakiranje_virusa_influence_A Sintetična celična linija za inducibilno pakiranje virusa influence A] (Klara Razboršek)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Uporaba_sesalskega_RNA-vezavnega_proteina_Musashi-1_kot_alosterično_reguliranega_translacijskega_represorja_v_E._coli Uporaba sesalskega RNA-vezavnega proteina Musashi-1 kot alosterično reguliranega translacijskega represorja v ''E. coli''] (Marko Kovačić)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Kaskadno_ojačano_genetsko_vezje_za_detekcijo_glivnih_patogenov Kaskadno ojačano genetsko vezje za detekcijo glivnih patogenov] (Jakob Tomšič)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sintetična_mRNA-stikala_s_povratno_zanko,_ki_omogočajo_zaznavanje_miRNA Sintetična mRNA-stikala s povratno zanko, ki omogočajo zaznavanje miRNA] (Ana Pervanja)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Molekularni_nabor_navzkrižno_hranjenih_sevov_za_pripravo_sintetičnih_skupnosti_kvasovk Molekularni nabor navzkrižno hranjenih sevov za pripravo sintetičnih skupnosti kvasovk] (Teja Spruk)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Inženiring_dinamike_rasti_sesalskih_celic_za_bioproizvodnjo Inženiring dinamike rasti sesalskih celic za bioproizvodnjo] (Zarja Rožanc)

NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/PhaseOut Biološka proizvodnja bioplastike] (Sašo Jakob)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BeeYeast Inženiring kvasovk za boj proti virusnim okužbam čebel] (Mateja Milošević)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Cellect Cellect - Fenotipsko stabilne celične linije] (Lucija Voga)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/oPHAelia oPHAelia - Inovativna rešitev za zmanjšanje onesnaževanja s plastiko] (Irina Kostadinoska)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/ReMixHD ReMixHD - Recikliranje mešanih plastičnih odpadkov] (Ema Kavčič)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/DARWINS DARWINS - Usmerjena posodobitev proteinov Ago z idealno proteinsko termično stabilnostjo] (Rahela Petrovčič)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/PET-2-Protein PET-2-Protein - Proizvodnja mikrobnih proteinov iz polietilen tereftalata] (Zala Perko)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/48C_Cadmium_catcher_LBP 48C Cadmium catcher LBP- Proizvodnja bioterapevtika za vezavo kadmija] (Maja Deutsch)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Proteus Proteus - Sistem za ciljanje onkogenov in induciranje piroptoze] (Gašper Struna)
----

Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Povzetek je treba objaviti dva dni pred predstavitvijo do polnoči (za seminarje v sredo torej v ponedeljek). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo približno 5-minutna razprava.

Terminski razpored je razviden iz preglednice na strežniku Google Drive.

Kako je videti seznam seminarjev, lahko preverite pri lanskem letniku: [[Seminarji_SB_2022/23]].

Seminarji SB 2023/24

2024-05-05T09:15:28Z

Kostadin Mitkov:

V študijskem letu 2023/24 študenti in študentke pri Sintezni biologiji predstavljajo naslednje teme:

RAZISKOVALNI ČLANKI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sinteznobiološki_pristop_k_sestavljanju_in_ponovnemu_zagonu_klinično_pomembnih_fagov_Pseudomonas_aeruginosa Sinteznobiološki pristop k sestavljanju in ponovnemu zagonu klinično pomembnih fagov ''Pseudomonas aeruginosa''] (Bor Krajnik)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Optogenetsko_prostorsko_vzorčenje_kooperacije_pri_glivah_kvasovkah Optogenetsko prostorsko vzorčenje kooperacije pri glivah kvasovkah] (Martin Stanonik)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sintetična_celična_linija_za_inducibilno_pakiranje_virusa_influence_A Sintetična celična linija za inducibilno pakiranje virusa influence A] (Klara Razboršek)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Uporaba_sesalskega_RNA-vezavnega_proteina_Musashi-1_kot_alosterično_reguliranega_translacijskega_represorja_v_E._coli Uporaba sesalskega RNA-vezavnega proteina Musashi-1 kot alosterično reguliranega translacijskega represorja v ''E. coli''] (Marko Kovačić)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Kaskadno_ojačano_genetsko_vezje_za_detekcijo_glivnih_patogenov Kaskadno ojačano genetsko vezje za detekcijo glivnih patogenov] (Jakob Tomšič)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sintetična_mRNA-stikala_s_povratno_zanko,_ki_omogočajo_zaznavanje_miRNA Sintetična mRNA-stikala s povratno zanko, ki omogočajo zaznavanje miRNA] (Ana Pervanja)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Molekularni_nabor_navzkrižno_hranjenih_sevov_za_pripravo_sintetičnih_skupnosti_kvasovk Molekularni nabor navzkrižno hranjenih sevov za pripravo sintetičnih skupnosti kvasovk] (Teja Spruk)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Inženiring_dinamike_rasti_sesalskih_celic_za_bioproizvodnjo Inženiring dinamike rasti sesalskih celic za bioproizvodnjo] (Zarja Rožanc)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Inženirane_mRNA-ribosomske_fuzije_za_lažjo_biosintezo_selenoproteinov (Kostadin Mitkov)

NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/PhaseOut Biološka proizvodnja bioplastike] (Sašo Jakob)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BeeYeast Inženiring kvasovk za boj proti virusnim okužbam čebel] (Mateja Milošević)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Cellect Cellect - Fenotipsko stabilne celične linije] (Lucija Voga)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/oPHAelia oPHAelia - Inovativna rešitev za zmanjšanje onesnaževanja s plastiko] (Irina Kostadinoska)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/ReMixHD ReMixHD - Recikliranje mešanih plastičnih odpadkov] (Ema Kavčič)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/DARWINS DARWINS - Usmerjena posodobitev proteinov Ago z idealno proteinsko termično stabilnostjo] (Rahela Petrovčič)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/PET-2-Protein PET-2-Protein - Proizvodnja mikrobnih proteinov iz polietilen tereftalata] (Zala Perko)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/48C_Cadmium_catcher_LBP 48C Cadmium catcher LBP- Proizvodnja bioterapevtika za vezavo kadmija] (Maja Deutsch)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Proteus Proteus - Sistem za ciljanje onkogenov in induciranje piroptoze] (Gašper Struna)
----

Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Povzetek je treba objaviti dva dni pred predstavitvijo do polnoči (za seminarje v sredo torej v ponedeljek). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo približno 5-minutna razprava.

Terminski razpored je razviden iz preglednice na strežniku Google Drive.

Kako je videti seznam seminarjev, lahko preverite pri lanskem letniku: [[Seminarji_SB_2022/23]].

Seminarji SB 2023/24

2024-05-05T09:14:28Z

Kostadin Mitkov:

V študijskem letu 2023/24 študenti in študentke pri Sintezni biologiji predstavljajo naslednje teme:

RAZISKOVALNI ČLANKI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sinteznobiološki_pristop_k_sestavljanju_in_ponovnemu_zagonu_klinično_pomembnih_fagov_Pseudomonas_aeruginosa Sinteznobiološki pristop k sestavljanju in ponovnemu zagonu klinično pomembnih fagov ''Pseudomonas aeruginosa''] (Bor Krajnik)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Optogenetsko_prostorsko_vzorčenje_kooperacije_pri_glivah_kvasovkah Optogenetsko prostorsko vzorčenje kooperacije pri glivah kvasovkah] (Martin Stanonik)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sintetična_celična_linija_za_inducibilno_pakiranje_virusa_influence_A Sintetična celična linija za inducibilno pakiranje virusa influence A] (Klara Razboršek)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Uporaba_sesalskega_RNA-vezavnega_proteina_Musashi-1_kot_alosterično_reguliranega_translacijskega_represorja_v_E._coli Uporaba sesalskega RNA-vezavnega proteina Musashi-1 kot alosterično reguliranega translacijskega represorja v ''E. coli''] (Marko Kovačić)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Kaskadno_ojačano_genetsko_vezje_za_detekcijo_glivnih_patogenov Kaskadno ojačano genetsko vezje za detekcijo glivnih patogenov] (Jakob Tomšič)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sintetična_mRNA-stikala_s_povratno_zanko,_ki_omogočajo_zaznavanje_miRNA Sintetična mRNA-stikala s povratno zanko, ki omogočajo zaznavanje miRNA] (Ana Pervanja)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Molekularni_nabor_navzkrižno_hranjenih_sevov_za_pripravo_sintetičnih_skupnosti_kvasovk Molekularni nabor navzkrižno hranjenih sevov za pripravo sintetičnih skupnosti kvasovk] (Teja Spruk)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Inženiring_dinamike_rasti_sesalskih_celic_za_bioproizvodnjo Inženiring dinamike rasti sesalskih celic za bioproizvodnjo] (Zarja Rožanc)

NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/PhaseOut Biološka proizvodnja bioplastike] (Sašo Jakob)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BeeYeast Inženiring kvasovk za boj proti virusnim okužbam čebel] (Mateja Milošević)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Cellect Cellect - Fenotipsko stabilne celične linije] (Lucija Voga)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/oPHAelia oPHAelia - Inovativna rešitev za zmanjšanje onesnaževanja s plastiko] (Irina Kostadinoska)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/ReMixHD ReMixHD - Recikliranje mešanih plastičnih odpadkov] (Ema Kavčič)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/DARWINS DARWINS - Usmerjena posodobitev proteinov Ago z idealno proteinsko termično stabilnostjo] (Rahela Petrovčič)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/PET-2-Protein PET-2-Protein - Proizvodnja mikrobnih proteinov iz polietilen tereftalata] (Zala Perko)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/48C_Cadmium_catcher_LBP 48C Cadmium catcher LBP- Proizvodnja bioterapevtika za vezavo kadmija] (Maja Deutsch)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Proteus Proteus - Sistem za ciljanje onkogenov in induciranje piroptoze] (Gašper Struna)
----

Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Povzetek je treba objaviti dva dni pred predstavitvijo do polnoči (za seminarje v sredo torej v ponedeljek). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo približno 5-minutna razprava.

Terminski razpored je razviden iz preglednice na strežniku Google Drive.

Kako je videti seznam seminarjev, lahko preverite pri lanskem letniku: [[Seminarji_SB_2022/23]].

Seminarji SB 2023/24

2024-05-05T09:13:48Z

Kostadin Mitkov:

V študijskem letu 2023/24 študenti in študentke pri Sintezni biologiji predstavljajo naslednje teme:

RAZISKOVALNI ČLANKI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sinteznobiološki_pristop_k_sestavljanju_in_ponovnemu_zagonu_klinično_pomembnih_fagov_Pseudomonas_aeruginosa Sinteznobiološki pristop k sestavljanju in ponovnemu zagonu klinično pomembnih fagov ''Pseudomonas aeruginosa''] (Bor Krajnik)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Optogenetsko_prostorsko_vzorčenje_kooperacije_pri_glivah_kvasovkah Optogenetsko prostorsko vzorčenje kooperacije pri glivah kvasovkah] (Martin Stanonik)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sintetična_celična_linija_za_inducibilno_pakiranje_virusa_influence_A Sintetična celična linija za inducibilno pakiranje virusa influence A] (Klara Razboršek)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Uporaba_sesalskega_RNA-vezavnega_proteina_Musashi-1_kot_alosterično_reguliranega_translacijskega_represorja_v_E._coli Uporaba sesalskega RNA-vezavnega proteina Musashi-1 kot alosterično reguliranega translacijskega represorja v ''E. coli''] (Marko Kovačić)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Kaskadno_ojačano_genetsko_vezje_za_detekcijo_glivnih_patogenov Kaskadno ojačano genetsko vezje za detekcijo glivnih patogenov] (Jakob Tomšič)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sintetična_mRNA-stikala_s_povratno_zanko,_ki_omogočajo_zaznavanje_miRNA Sintetična mRNA-stikala s povratno zanko, ki omogočajo zaznavanje miRNA] (Ana Pervanja)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Molekularni_nabor_navzkrižno_hranjenih_sevov_za_pripravo_sintetičnih_skupnosti_kvasovk Molekularni nabor navzkrižno hranjenih sevov za pripravo sintetičnih skupnosti kvasovk] (Teja Spruk)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Inženiring_dinamike_rasti_sesalskih_celic_za_bioproizvodnjo Inženiring dinamike rasti sesalskih celic za bioproizvodnjo] (Zarja Rožanc)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Inženirane_mRNA-ribosomske_fuzije_za_lažjo_biosintezo_selenoproteinov Inženirane mRNA-ribosomske fuzije za lažjo biosintezo selenoproteinov (Kostadin Mitkov)

NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/PhaseOut Biološka proizvodnja bioplastike] (Sašo Jakob)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BeeYeast Inženiring kvasovk za boj proti virusnim okužbam čebel] (Mateja Milošević)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Cellect Cellect - Fenotipsko stabilne celične linije] (Lucija Voga)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/oPHAelia oPHAelia - Inovativna rešitev za zmanjšanje onesnaževanja s plastiko] (Irina Kostadinoska)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/ReMixHD ReMixHD - Recikliranje mešanih plastičnih odpadkov] (Ema Kavčič)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/DARWINS DARWINS - Usmerjena posodobitev proteinov Ago z idealno proteinsko termično stabilnostjo] (Rahela Petrovčič)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/PET-2-Protein PET-2-Protein - Proizvodnja mikrobnih proteinov iz polietilen tereftalata] (Zala Perko)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/48C_Cadmium_catcher_LBP 48C Cadmium catcher LBP- Proizvodnja bioterapevtika za vezavo kadmija] (Maja Deutsch)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Proteus Proteus - Sistem za ciljanje onkogenov in induciranje piroptoze] (Gašper Struna)
----

Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Povzetek je treba objaviti dva dni pred predstavitvijo do polnoči (za seminarje v sredo torej v ponedeljek). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo približno 5-minutna razprava.

Terminski razpored je razviden iz preglednice na strežniku Google Drive.

Kako je videti seznam seminarjev, lahko preverite pri lanskem letniku: [[Seminarji_SB_2022/23]].

TE pri vnetnih boleznih

2022-05-08T10:35:47Z

Kostadin Mitkov:

== UVOD ==

Transpozicijski elementi (TE) so mobilni elementi DNA, ki se lahko replicirajo in vstavijo na različne lokacije znotraj gostiteljskega genoma. Retrotranspozoni so transpozicijski elementi, ki se mobilizirajo preko RNA intermediatov s pomočjo reverzne transkriptaze. HERV in LINE-1 sta dve glavni vrsti retrotranspozonov. Njuni inserciji sta se kopičili skozi evolucijo, dokler so se gostiteljski genomi razvijali in z uporabo različnih dejavnikov so zavirali njuni aktivnosti. Znanstveniki so odkrili, da transpozicijski elementi bolj prispevajo k patogenezi človeških bolezni, kot so do takrat mislili.

== TRANSPOZICIJSKI ELEMENTI ==

Transpozicijski elemnti obsegajo vsaj 45% človeškega genoma, medtem ko kodirajoče zaporedje zasede manj kot 3% genoma. Razvrščamo jih kot transpozoni, ki so ves čas v obliki DNA (II razred) in retrotranspozoni, ki za izvedbo traspozicije potrebujejo RNA-intermediat (I razred). Transpozoni II razreda delujejo po mehanizmu „izreži in prilepi“, pri čemer se zaporedje s pomočjo encima transpozaze izreže iz ene regije in integrira v drugo določeno regijo v genomu. Retrotranspozoni pa delujejo po mehanizmu „kopiraj in prilepi“ kar omogoča aktivnim retrotranspozonim, da ohranijo svojo prvotno lokacijo v genomu, medtem ko kopičijo število kopij drugje. Te retrotranspozone pa lahko razdelimo v dve skupini LTR in ne-LTR. V LTR skupino pa uvrščamo človeške endogene retroviruse (HERV) in retrotranspozone pri sesalcih (MaLR). Ne-LTR pa razvrčamo v dva podtipa: LINE (Long Interspersed Nuclear Elements) in SINE (Short Interspersed Nuclear Elements).

=== HERV ===

HERV retrotranspozoni imajo podobno genomsko strukturo kot eksogeni retrovirusi, kot je HIV. Ti retrotranspozoni poleg LTR zaporedja vključujejo regije gag, pol in env. Gen gag kodira proteine za ovojnico retrotranspozonskega delca. Pol pa prestavlja gen za reverzno transkriptazo, integrazo in proteazo. HERV vsebuje tudi gen, ki kodira protein env oziroma ostanek njihovega eksogenega retrovirusnega izvora pred vstavitvijo in endogenizacijo v zarodne celice. Pokazalo se je, da transkripcijsko aktivne poddružine HERV prispevajo k različnim patofiziološkim motnjam. Leta 1993 so prišli do ugotovitve, da dodatek virusa herpes simpleksa tipa 1 (HSV-1) celicam izoliranim od bolnika z multiplo sklerozo, povzroči močno stimulacijo aktivnosti specifične reverzne transkriptaze. Iz tega so sklepali da je prvotno zaporedje retrovirusa, povezaneg z multiplo sklerozo (MSRV), zelo zastopano v človeški DNA in tako odkrili poddružine skupine HERV, ki prispevajo k patologiji različnih nevroloških motnjah.

=== LINE-1 RETROTRANSPOZONI ===

Transpozoni LINE-1 so avtonomni retrotranspozoni, ki jih vsebuje človeški genom. Večina kopij LINE-1 je nepremičnih i njih ni mogoče retrotransponirati, bodisi zaradi 5' skrajšanja ali inverzij, uvedenih v zaporedje. Retrotranspozicijsko kompetentna LINE-1 ( RC LINE-1) je dolga 6kb in vsebuje 5' neprevedeno regijo (5' UTR), dva odprta bralna okvirja ( ORF1/2) in 3' UTR, prekinjeno s poli-A repom. ORF 1 predstavlja gen za protein, ki ima aktivnost spremenljevalca nukleinske kisline in RNA vezavno domeno. ORF2 kodira protein z encimsko aktivnostjo, ki je potreben za retrotranspozicijo LINE-1. ORF2p ima tako aktivnosti endonukleaze (EN) kot reverzne transkriptaze (RT). Transkripcija LINE-1 se začne na promotorju RNA olimeraze II ali natačneje znotraj prvih 100 baznih parov 5' UTR. Potem ko je prepisana, poliadenilirana LINE-1 mRNA se izvozi v citoplazmo, kjer se združi z proteini ORF1 in ORF2 in tvorijo komleks z ribonukleotidi (RNP). Potem se uvozi v jedro, da se začne obratna transkripcija in integracija. EN zareže spodnjo verigo DNA in izpostavi 3' OH, ki služi kot primer za RT za nastanek cDNA iz LINE-1 mRNA.

=== HETEROGENOST INSERCIJSKIH PREFERENC IN PORAZDELITEV RETROTRANSPOZONOV MED RAZLIČNIMI POPULACIJAMI ===

Po različnih študijah so ugotovili, da pri integracji LINE1 ne ciljajo na izražene gene, odprt kromatin, ampak se namesto tega povezujejo z replikacijo DNA gostitelja. Te ugotovitve zagotavljajo prve namige, da sta integracija LINE-1 in replikacija DNK lahko mehansko povezani. Obstaja heterogenost v porazdelitvi endogenih retrotranspozonov po različnih človeških populacijah: od prisotnosti/odsotnosti transpozona do polimorfizmov posameznih nukleotidov (SNP). Polimorfizmi pri vstavitvah retroelementov nastanejo bodisi v zarodni liniji bodisi zgodaj v embrionalnem razvoju. To omogoča genomski mozaizem znotraj določeneg posameznika ko kar med različnimi človeškimi populacijami.

== CELIČNI VPLIVI RETROTRANSPOZICIJE LINE-1 ==

Retrotranspozoni LINE-1 ustvarjajo strukturno nestabilnost znotraj genoma in posledično motijo izražanje gostiteljskega gena. Vstavitve LINE-1 lahko generirajo napačno spojene ali prezgodaj okrnjene transkripte, spodbujajo prekinitev transkripcije ali celo spodbujajo spremembe našega epigenoma. Retrotranspozoni, ki prispevajo k genomski variaciji, spreminjajo ekspresijo gostiteljskega gena na epigenetski, transkripcijski in translacijski ravni.

== CELIČNI ODZIVI NA RETROTRANSPOZICIJE ==
Glede na to, da lahko retroelementi vplivajo na celico na veliko načinov, se je gostiteljski genom razvil tako, da uporablja različne odzive za zaviranje njihove aktivnosti. Transkripcijsko represijo dosežemo z represivnimi epigenetskimi modifikacijami, kot je npr. metilacija DNA. Znatna hipometilacija med embriogenezo je povezana z višjimi stopnjami retrotranspozicije. V mišjih zarodkih, ki so bili izjemno hipometilirani, se genomska integriteta vzdržuje s pomočjo faktorja CAF-1, ki zamenja histon 3.3 s histonom 3.1/3.2, ki deluje kot represivni modifikator in ščiti zarodek od retrotranspozicijske aktivnosti. Ker transpozicijski elementi vsebujejo tudi vezavna mesta za transkripcijske faktorje, to omogoča specifično transkripcijsko regulacijo, kot način transkripcijske represije. Kruppel-associated box (KRAB), ki vsebuje proteine cinkovih prstov (KZFP), so ključni regulatorji transpozicijske aktivnosti, ki se vežejo na regulatorna zaporedja TE in zavirajo izražanje TE v zgodnjih zarodkih.

Post-transkripcijska regulacija LINE-1 elementov z majhnimi RNA kot so miRNA ali piRNA, je še en celični odziv na retrotranspozicijo. Majhne RNA molekule lahko delujejo preko tarčne razgradnje RNA. Od RNA induciran kompleks za utišanje (RISC) z uporabo endonukleolitične cepitve razgrajuje TE transkriptov in, če je Dicer protein, ki je sestaven del RISC kompleksa, mutiran, povzroča povečano transkripcijo LINE-1 elementov. Odkrili so da miRNA-128 omejuje aktivnost LINE-1 preko dveh mehanizmov: lahko direktno cilja na ORF2 RNA za razgradnjo ali cilja na 3’-UTR zaporedje kofaktorja TNPO1, ki olajša transport kompleksa LINE-1 RNP v jedro. piRNA so pomembni zaviralci aktivnosti TE v zarodni liniji. Vzajemno delujejo s poddružino PIWI nukleaz Argonaute in cepijo TE transkripte v citoplazmi.

LINE-1 RNP kompleks, ki je retrotranspozicijski intermediat, je tudi tarča za razgradnjo. Protein cinkovega prsta (ZAP) se veže z LINE-1 mRNA v citoplazemskih stresnih granulah, povzroči zgubljanje integritete RNP kompleksa in zavira retrotranspozicijo LINE-1. TUT7, ki je uridil transferaza, prenaša ostanke uridina na LINE-1 mRNA v citoplazmi, nato MOV10, ki je helikaza, premakne ORF1p, da omogoči uridilacijo in posledično zavirajo reverzne transkripcije ORF2p v jedru. Družina encimov APOBEC zavirajo retrotranspozijo, najverjetneje z destabilizacijo kompleksa RNP. Kljub številnim gostiteljskim mehanizmom za zaviranje retrotranspozicije, de novo insercije so še vedno prisotne v somatskih tkivih z znatno retrotranspozicijo v nevronskih linijah.

== LINE-1 V RAZVOJU PRI MOŽGANIH ==

Najzgodnejši dokumentirani primer somatske retrotranspozicije in vivo je bil v mišjih možganih. Nekaj let pozneje so odkrili endogeno LINE-1 mRNA v nevronskih matičnih celicah izoliranih iz možganov človeških plodov. S pomočjo RC-seq, visoko zmogljivo metodo sekvenciranja, ki cilja na 3’ in 5’ konca LINE-1, ki so jo uporabili na DNA ekstrahirane iz različnih tkiv, identificirali so bistveno več kopij ORF2 in LINE-1 CNV v hipokampusu v primerjavi s srcem in jetri istega posameznika. Zanimivo je, da so v nedavni analizi 24 hipokampalnih nevronov odkrili, da se somatske insercije, ki se pojavijo med nevrodiferenciacijo v matične celice človeškega zarodka, lahko pojavijo zaradi mutacije v Ying Yang 1 (YY1) vezavnem mestu za transkripcijski faktor. YY1 vezavno mesto v promotorski regiji LINE-1 posreduje pri metilaciji CpG otočkov in epigenetski represiji. Retrotranspozicija med nevronskim razvojem lahko prispeva k nevronski raznolikosti, saj omogoča varijacijo genomske DNA od celice do celice.

== MOBILNI ELEMENTI IN NEVRODEGENERATIVNE BOLEZNI ==

Amiotrofična lateralna skleroza(ALS) je nevrodegenerativna bolezen, za katero je značilna izguba zgornjih in spodnjih motoričnih nevronov. . Številne študije so ugotovile prisotnost retrovirusne aktivnosti reverzne transkriptaze v serumu bolnikov z ALS. V kortikalnih piramidnih in hrbteničnih nevronih v posmrtnem možganskem tkivu bolnikov z ALS opazimo večjo ekspresijo HERV K-Env ki je močni imunopatogeni protein ovojnice . Aktivacija gena za HERV-K posledično zmanjšuje dolžino dendrita in tudi razvejanost in kompleksnost motoričnih nevronov transgenih miši. Še ni znano, kaj sproži izražanje HERV-K pri odraslih nevronih.

Aktivacija retrotranspozona je bila povezana tudi s sporadično obliko Alzheimerjeve bolezni, vendar so raziskave pokazale nedosledne rezultate o tem, ali so LINE-1 povišane pri bolnikih. V nevronih bolnikov so odkrili mozaične genomske rekombinacije znotraj gena, povezanega z Alzheimerjevo boleznijo, amiloidnega prekurzorskega proteina (APP). Te različice niso imele introničnih zaporedij in so bile imenovane "genomske cDNA" (gencDNA). Predpostavili so da izvirajo iz RNA in da zahtevajo endogeno aktivnost reverzne transkriptaze da se vstavijo v prelome dvojnih verig.

Pri pojavi Parkinsonove bolezni (PD) je odkrito pet različnih strukturnih variacij v genu PRKN (parkin RBR E3 ubiquitin protein ligase). Predvideva se, da se strukturne variacije pojavijo z nealelno homologno rekombinacijo. LTR in ne-LTR retrotranspozonske sekvence so bile identificirane znotraj dveh kilobaz od točke prekinitve delecije. To lahko pomeni da so delecije morda nastale zaradi retrotranspozicije. Povezava med aktivacijo retrotranspozona pri nevrodegenerativnih boleznih ni v celoti ugotovljena.

== TRANSPOZICIJSKI ELEMENTI IN VNETJA ==

Malo je znanega o prispevku transpozonih elementov k imunskim odzivom. Ko imamo prisotno DNA v citoplazmi npr. virusno DNA, sproži se aktivacija poti cGAS-STING. cGAS-STING posledično proizvaja interferone, ki sprožijo vnetni odziv. Interferonski odzivi so lahko mehansko povezani z deregulacijo proizvodnje retrotranspozona.
Vse je več dokazov, da imajo transpozoni vlogo pri sprožitvi nevroinflamacije. Detekcija endogene nukleinske kisline s strani imunskega sistema je v osnovah številnih avtoimunskih bolezni. Retrotranspozoni so povezani z boleznimi kot so Multiple skleroza in Aicardi-Goutièresovim sindromom, kot glavni vnetni efektorji.

Multipla skleroza je kronična avtoimunska bolezen, ki prizadene osrednje živčevje in za katero ni znanega zdravila. Za bolezen so značilne lezije v beli snovi, ki vodijo do razgradnje krvno-možganske pregrade in aksonskih motenj po hrbtenjači. Izražanje HERV proteina se šteje za dejavnik za napredovanje bolezni. Iz supernatantov celične kulture vzorcev bolnikov so izolirani retrovirusima podobni delci, in je bilo dokazano da izvirajo iz elementov HERV.

Pri sistemskom eritematoznem lupusu je ugotovljena povišana transkripcija HERV. V študijah so pokazali da so ravni ekspresije mRNA HERV-E v celicah CD4+ T lupusa višje kot v zdravih celicah. Še ni znan popoln prispevek aktivnosti HERV.

Motnje avtističnega spectra so razvojne motnje, ki ovirajo komunikacijo in vedenje. Ugotovljeno je da je pri bolnikih bila zmanjšanja metilacija in povečano izražanje LINE-1 v možganih. Vse je več dokazov da lahko kronično vnetje prispeva k simptomatologiji avtizma.

Rettov sindrom je X-povezana progresivna nevrorazvojna motnja z avtističnimi značilnostmi. Pri Rettovom sindromu imamo prisotne različne mutacije v metil CpG vezavnem proteinu-2 (MeCP2). Analizirani vzorci možganskega tkiva ob smrti so pokazali višje genomske sekvence LINE-1 ORF2 pri bolnikih.

Aicardi-Goutièresov sindrom je progresivna vnetna motnja, ki prizadene novorojenčke in ima za posledico hudo duševno in telesno prizadetost ter močno skrajšano življenjsko dobo. Lahko nastane zaradi mutacij v TREX1(three-prime repair exonuclease 1). TREX1 deluje tako, da razgradi dvoverižno DNA(dsDNA)/enoverižno DNA(ssDNA). Mutacije v genu povzročijo znatno kopičenje vrst DNA v citoplazmi, ki sprožijo prirojen imunski odziv, kot je indukcija interferona. Večina teh vrst DNA je sestavljena iz citoplazemske ssDNA LINE-1. V nevronskih celicah mišjih s pomanjkanjem TREX-1 se izrazilo 70 % več elementov LINE-1Hs.

== VIRI IN LITERATURA ==

[1] Saleh, Aurian, et al. “Transposable Elements, Inflammation, and Neurological Disease.” Frontiers in Neurology, vol. 10, 2019. Frontiers, https://www.frontiersin.org/article/10.3389/fneur.2019.00894.

[2] Volkman HE, Stetson DB. The enemy within: endogenous retroelements and autoimmune disease. Nat Immunol. (2014) 15:415–22. doi: 10.1038/ni.2872

[3] Richardson SR, Morell S, Faulkner GJ. L1 retrotransposons and somatic mosaicism in the brain. Annu Rev Genet. (2014) 48:1–27. doi: 10.1146/annurev-genet-120213-092412

[4] Nelson PN, Carnegie PR, Martin J, Davari Ejtehadi H, Hooley P, Roden D, et al. Demystified. Human endogenous retroviruses. Mol Pathol. (2003) 56:11–8. doi: 10.1136/mp.56.1.11

[5] Levin HL, Moran JV. Dynamic interactions between transposable elements and their hosts. Nat Rev Genet. (2011) 12:615–27. doi: 10.1038/nrg3030

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

TE pri vnetnih boleznih

2022-05-08T10:26:59Z

Kostadin Mitkov:

== UVOD ==

Transpozicijski elementi (TE) so mobilni elementi DNA, ki se lahko replicirajo in vstavijo na različne lokacije znotraj gostiteljskega genoma. Retrotranspozoni so transpozicijski elementi, ki se mobilizirajo preko RNA intermediatov s pomočjo reverzne transkriptaze. HERV in LINE-1 sta dve glavni vrsti retrotranspozonov. Njuni inserciji sta se kopičili skozi evolucijo, dokler so se gostiteljski genomi razvijali in z uporabo različnih dejavnikov so zavirali njuni aktivnosti. Znanstveniki so odkrili, da transpozicijski elementi bolj prispevajo k patogenezi človeških bolezni, kot so do takrat mislili.

== TRANSPOZICIJSKI ELEMENTI ==

Transpozicijski elemnti obsegajo vsaj 45% človeškega genoma, medtem ko kodirajoče zaporedje zasede manj kot 3% genoma. Razvrščamo jih kot transpozoni, ki so ves čas v obliki DNA (II razred) in retrotranspozoni, ki za izvedbo traspozicije potrebujejo RNA-intermediat (I razred). Transpozoni II razreda delujejo po mehanizmu „izreži in prilepi“, pri čemer se zaporedje s pomočjo encima transpozaze izreže iz ene regije in integrira v drugo določeno regijo v genomu. Retrotranspozoni pa delujejo po mehanizmu „kopiraj in prilepi“ kar omogoča aktivnim retrotranspozonim, da ohranijo svojo prvotno lokacijo v genomu, medtem ko kopičijo število kopij drugje. Te retrotranspozone pa lahko razdelimo v dve skupini LTR in ne-LTR. V LTR skupino pa uvrščamo človeške endogene retroviruse (HERV) in retrotranspozone pri sesalcih (MaLR). Ne-LTR pa razvrčamo v dva podtipa: LINE (Long Interspersed Nuclear Elements) in SINE (Short Interspersed Nuclear Elements).

=== HERV ===

HERV retrotranspozoni imajo podobno genomsko strukturo kot eksogeni retrovirusi, kot je HIV. Ti retrotranspozoni poleg LTR zaporedja vključujejo regije gag, pol in env. Gen gag kodira proteine za ovojnico retrotranspozonskega delca. Pol pa prestavlja gen za reverzno transkriptazo, integrazo in proteazo. HERV vsebuje tudi gen, ki kodira protein env oziroma ostanek njihovega eksogenega retrovirusnega izvora pred vstavitvijo in endogenizacijo v zarodne celice. Pokazalo se je, da transkripcijsko aktivne poddružine HERV prispevajo k različnim patofiziološkim motnjam. Leta 1993 so prišli do ugotovitve, da dodatek virusa herpes simpleksa tipa 1 (HSV-1) celicam izoliranim od bolnika z multiplo sklerozo, povzroči močno stimulacijo aktivnosti specifične reverzne transkriptaze. Iz tega so sklepali da je prvotno zaporedje retrovirusa, povezaneg z multiplo sklerozo (MSRV), zelo zastopano v človeški DNK in tako odkrili poddružine skupine HERV, ki prispevajo k patologiji različnih nevroloških motnjah.

=== LINE-1 RETROTRANSPOZONI ===

Transpozoni LINE-1 so avtonomni retrotranspozoni, ki jih vsebuje človeški genom. Večina kopij LINE-1 je nepremičnih i njih ni mogoče retrotransponirati, bodisi zaradi 5' skrajšanja ali inverzij, uvedenih v zaporedje. Retrotranspozicijsko kompetentna LINE-1 ( RC LINE-1) je dolga 6kb in vsebuje 5' neprevedeno regijo (5' UTR), dva odprta bralna okvirja ( ORF1/2) in 3' UTR, prekinjeno s poli-A repom. ORF 1 predstavlja gen za protein, ki ima aktivnost spremenljevalca nukleinske kisline in RNA vezavno domeno. ORF2 kodira protein z encimsko aktivnostjo, ki je potreben za retrotranspozicijo LINE-1. ORF2p ima tako aktivnosti endonukleaze (EN) kot reverzne transkriptaze (RT). Transkripcija LINE-1 se začne na promotorju RNA olimeraze II ali natačneje znotraj prvih 100 baznih parov 5' UTR. Potem ko je prepisana, poliadenilirana LINE-1 mRNA se izvozi v citoplazmo, kjer se združi z proteini ORF1 in ORF2 in tvorijo komleks z ribonukleotidi (RNP). Potem se uvozi v jedro, da se začne obratna transkripcija in integracija. EN zareže spodnjo verigo DNK in izpostavi 3' OH, ki služi kot primer za RT za nastanek cDNA iz LINE-1 mRNA.

=== HETEROGENOST INSERCIJSKIH PREFERENC IN PORAZDELITEV RETROTRANSPOZONOV MED RAZLIČNIMI POPULACIJAMI ===

Po različnih študijah so ugotovili, da pri integracji LINE1 ne ciljajo na izražene gene, odprt kromatin, ampak se namesto tega povezujejo z replikacijo DNK gostitelja. Te ugotovitve zagotavljajo prve namige, da sta integracija LINE-1 in replikacija DNK lahko mehansko povezani. Obstaja heterogenost v porazdelitvi endogenih retrotranspozonov po različnih človeških populacijah: od prisotnosti/odsotnosti transpozona do polimorfizmov posameznih nukleotidov (SNP). Polimorfizmi pri vstavitvah retroelementov nastanejo bodisi v zarodni liniji bodisi zgodaj v embrionalnem razvoju. To omogoča genomski mozaizem znotraj določeneg posameznika ko kar med različnimi človeškimi populacijami.

== CELIČNI VPLIVI RETROTRANSPOZICIJE LINE-1 ==

Retrotranspozoni LINE-1 ustvarjajo strukturno nestabilnost znotraj genoma in posledično motijo izražanje gostiteljskega gena. Vstavitve LINE-1 lahko generirajo napačno spojene ali prezgodaj okrnjene transkripte, spodbujajo prekinitev transkripcije ali celo spodbujajo spremembe našega epigenoma. Retrotranspozoni, ki prispevajo k genomski variaciji, spreminjajo ekspresijo gostiteljskega gena na epigenetski, transkripcijski in translacijski ravni.

== CELIČNI ODZIVI NA RETROTRANSPOZICIJE ==
Glede na to, da lahko retroelementi vplivajo na celico na veliko načinov, se je gostiteljski genom razvil tako, da uporablja različne odzive za zaviranje njihove aktivnosti. Transkripcijsko represijo dosežemo z represivnimi epigenetskimi modifikacijami, kot je npr. metilacija DNA. Znatna hipometilacija med embriogenezo je povezana z višjimi stopnjami retrotranspozicije. V mišjih zarodkih, ki so bili izjemno hipometilirani, se genomska integriteta vzdržuje s pomočjo faktorja CAF-1, ki zamenja histon 3.3 s histonom 3.1/3.2, ki deluje kot represivni modifikator in ščiti zarodek od retrotranspozicijske aktivnosti. Ker transpozicijski elementi vsebujejo tudi vezavna mesta za transkripcijske faktorje, to omogoča specifično transkripcijsko regulacijo, kot način transkripcijske represije. Kruppel-associated box (KRAB), ki vsebuje proteine cinkovih prstov (KZFP), so ključni regulatorji transpozicijske aktivnosti, ki se vežejo na regulatorna zaporedja TE in zavirajo izražanje TE v zgodnjih zarodkih.

Post-transkripcijska regulacija LINE-1 elementov z majhnimi RNA kot so miRNA ali piRNA, je še en celični odziv na retrotranspozicijo. Majhne RNA molekule lahko delujejo preko tarčne razgradnje RNA. Od RNA induciran kompleks za utišanje (RISC) z uporabo endonukleolitične cepitve razgrajuje TE transkriptov in, če je Dicer protein, ki je sestaven del RISC kompleksa, mutiran, povzroča povečano transkripcijo LINE-1 elementov. Odkrili so da miRNA-128 omejuje aktivnost LINE-1 preko dveh mehanizmov: lahko direktno cilja na ORF2 RNA za razgradnjo ali cilja na 3’-UTR zaporedje kofaktorja TNPO1, ki olajša transport kompleksa LINE-1 RNP v jedro. piRNA so pomembni zaviralci aktivnosti TE v zarodni liniji. Vzajemno delujejo s poddružino PIWI nukleaz Argonaute in cepijo TE transkripte v citoplazmi.

LINE-1 RNP kompleks, ki je retrotranspozicijski intermediat, je tudi tarča za razgradnjo. Protein cinkovega prsta (ZAP) se veže z LINE-1 mRNA v citoplazemskih stresnih granulah, povzroči zgubljanje integritete RNP kompleksa in zavira retrotranspozicijo LINE-1. TUT7, ki je uridil transferaza, prenaša ostanke uridina na LINE-1 mRNA v citoplazmi, nato MOV10, ki je helikaza, premakne ORF1p, da omogoči uridilacijo in posledično zavirajo reverzne transkripcije ORF2p v jedru. Družina encimov APOBEC zavirajo retrotranspozijo, najverjetneje z destabilizacijo kompleksa RNP. Kljub številnim gostiteljskim mehanizmom za zaviranje retrotranspozicije, de novo insercije so še vedno prisotne v somatskih tkivih z znatno retrotranspozicijo v nevronskih linijah.

== LINE-1 V RAZVOJU PRI MOŽGANIH ==

Najzgodnejši dokumentirani primer somatske retrotranspozicije in vivo je bil v mišjih možganih. Nekaj let pozneje so odkrili endogeno LINE-1 mRNA v nevronskih matičnih celicah izoliranih iz možganov človeških plodov. S pomočjo RC-seq, visoko zmogljivo metodo sekvenciranja, ki cilja na 3’ in 5’ konca LINE-1, ki so jo uporabili na DNA ekstrahirane iz različnih tkiv, identificirali so bistveno več kopij ORF2 in LINE-1 CNV v hipokampusu v primerjavi s srcem in jetri istega posameznika. Zanimivo je, da so v nedavni analizi 24 hipokampalnih nevronov odkrili, da se somatske insercije, ki se pojavijo med nevrodiferenciacijo v matične celice človeškega zarodka, lahko pojavijo zaradi mutacije v Ying Yang 1 (YY1) vezavnem mestu za transkripcijski faktor. YY1 vezavno mesto v promotorski regiji LINE-1 posreduje pri metilaciji CpG otočkov in epigenetski represiji. Retrotranspozicija med nevronskim razvojem lahko prispeva k nevronski raznolikosti, saj omogoča varijacijo genomske DNA od celice do celice.

== MOBILNI ELEMENTI IN NEVRODEGENERATIVNE BOLEZNI ==

Amiotrofična lateralna skleroza(ALS) je nevrodegenerativna bolezen, za katero je značilna izguba zgornjih in spodnjih motoričnih nevronov. . Številne študije so ugotovile prisotnost retrovirusne aktivnosti reverzne transkriptaze v serumu bolnikov z ALS. V kortikalnih piramidnih in hrbteničnih nevronih v posmrtnem možganskem tkivu bolnikov z ALS opazimo večjo ekspresijo HERV K-Env ki je močni imunopatogeni protein ovojnice . Aktivacija gena za HERV-K posledično zmanjšuje dolžino dendrita in tudi razvejanost in kompleksnost motoričnih nevronov transgenih miši. Še ni znano, kaj sproži izražanje HERV-K pri odraslih nevronih.

Aktivacija retrotranspozona je bila povezana tudi s sporadično obliko Alzheimerjeve bolezni, vendar so raziskave pokazale nedosledne rezultate o tem, ali so LINE-1 povišane pri bolnikih. V nevronih bolnikov so odkrili mozaične genomske rekombinacije znotraj gena, povezanega z Alzheimerjevo boleznijo, amiloidnega prekurzorskega proteina (APP). Te različice niso imele introničnih zaporedij in so bile imenovane "genomske cDNA" (gencDNA). Predpostavili so da izvirajo iz RNA in da zahtevajo endogeno aktivnost reverzne transkriptaze da se vstavijo v prelome dvojnih verig.

Pri pojavi Parkinsonove bolezni (PD) je odkrito pet različnih strukturnih variacij v genu PRKN (parkin RBR E3 ubiquitin protein ligase). Predvideva se, da se strukturne variacije pojavijo z nealelno homologno rekombinacijo. LTR in ne-LTR retrotranspozonske sekvence so bile identificirane znotraj dveh kilobaz od točke prekinitve delecije. To lahko pomeni da so delecije morda nastale zaradi retrotranspozicije. Povezava med aktivacijo retrotranspozona pri nevrodegenerativnih boleznih ni v celoti ugotovljena.

== TRANSPOZICIJSKI ELEMENTI IN VNETJA ==

Malo je znanega o prispevku transpozonih elementov k imunskim odzivom. Ko imamo prisotno DNA v citoplazmi npr. virusno DNA, sproži se aktivacija poti cGAS-STING. cGAS-STING posledično proizvaja interferone, ki sprožijo vnetni odziv. Interferonski odzivi so lahko mehansko povezani z deregulacijo proizvodnje retrotranspozona.
Vse je več dokazov, da imajo transpozoni vlogo pri sprožitvi nevroinflamacije. Detekcija endogene nukleinske kisline s strani imunskega sistema je v osnovah številnih avtoimunskih bolezni. Retrotranspozoni so povezani z boleznimi kot so Multiple skleroza in Aicardi-Goutièresovim sindromom, kot glavni vnetni efektorji.

Multipla skleroza je kronična avtoimunska bolezen, ki prizadene osrednje živčevje in za katero ni znanega zdravila. Za bolezen so značilne lezije v beli snovi, ki vodijo do razgradnje krvno-možganske pregrade in aksonskih motenj po hrbtenjači. Izražanje HERV proteina se šteje za dejavnik za napredovanje bolezni. Iz supernatantov celične kulture vzorcev bolnikov so izolirani retrovirusima podobni delci, in je bilo dokazano da izvirajo iz elementov HERV.

Pri sistemskom eritematoznem lupusu je ugotovljena povišana transkripcija HERV. V študijah so pokazali da so ravni ekspresije mRNA HERV-E v celicah CD4+ T lupusa višje kot v zdravih celicah. Še ni znan popoln prispevek aktivnosti HERV.

Motnje avtističnega spectra so razvojne motnje, ki ovirajo komunikacijo in vedenje. Ugotovljeno je da je pri bolnikih bila zmanjšanja metilacija in povečano izražanje LINE-1 v možganih. Vse je več dokazov da lahko kronično vnetje prispeva k simptomatologiji avtizma.

Rettov sindrom je X-povezana progresivna nevrorazvojna motnja z avtističnimi značilnostmi. Pri Rettovom sindromu imamo prisotne različne mutacije v metil CpG vezavnem proteinu-2 (MeCP2). Analizirani vzorci možganskega tkiva ob smrti so pokazali višje genomske sekvence LINE-1 ORF2 pri bolnikih.

Aicardi-Goutièresov sindrom je progresivna vnetna motnja, ki prizadene novorojenčke in ima za posledico hudo duševno in telesno prizadetost ter močno skrajšano življenjsko dobo. Lahko nastane zaradi mutacij v TREX1(three-prime repair exonuclease 1). TREX1 deluje tako, da razgradi dvoverižno DNA(dsDNA)/enoverižno DNA(ssDNA). Mutacije v genu povzročijo znatno kopičenje vrst DNA v citoplazmi, ki sprožijo prirojen imunski odziv, kot je indukcija interferona. Večina teh vrst DNA je sestavljena iz citoplazemske ssDNA LINE-1. V nevronskih celicah mišjih s pomanjkanjem TREX-1 se izrazilo 70 % več elementov LINE-1Hs.

== VIRI IN LITERATURA ==

[1] Saleh, Aurian, et al. “Transposable Elements, Inflammation, and Neurological Disease.” Frontiers in Neurology, vol. 10, 2019. Frontiers, https://www.frontiersin.org/article/10.3389/fneur.2019.00894.

[2] Volkman HE, Stetson DB. The enemy within: endogenous retroelements and autoimmune disease. Nat Immunol. (2014) 15:415–22. doi: 10.1038/ni.2872

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

TE pri vnetnih boleznih

2022-05-08T10:19:39Z

Kostadin Mitkov:

== UVOD ==

Transpozicijski elementi (TE) so mobilni elementi DNA, ki se lahko replicirajo in vstavijo na različne lokacije znotraj gostiteljskega genoma. Retrotranspozoni so transpozicijski elementi, ki se mobilizirajo preko RNA intermediatov s pomočjo reverzne transkriptaze. HERV in LINE-1 sta dve glavni vrsti retrotranspozonov. Njuni inserciji sta se kopičili skozi evolucijo, dokler so se gostiteljski genomi razvijali in z uporabo različnih dejavnikov so zavirali njuni aktivnosti. Znanstveniki so odkrili, da transpozicijski elementi bolj prispevajo k patogenezi človeških bolezni, kot so do takrat mislili.

== TRANSPOZICIJSKI ELEMENTI ==

Transpozicijski elemnti obsegajo vsaj 45% človeškega genoma, medtem ko kodirajoče zaporedje zasede manj kot 3% genoma. Razvrščamo jih kot transpozoni, ki so ves čas v obliki DNA (II razred) in retrotranspozoni, ki za izvedbo traspozicije potrebujejo RNA-intermediat (I razred). Transpozoni II razreda delujejo po mehanizmu „izreži in prilepi“, pri čemer se zaporedje s pomočjo encima transpozaze izreže iz ene regije in integrira v drugo določeno regijo v genomu. Retrotranspozoni pa delujejo po mehanizmu „kopiraj in prilepi“ kar omogoča aktivnim retrotranspozonim, da ohranijo svojo prvotno lokacijo v genomu, medtem ko kopičijo število kopij drugje. Te retrotranspozone pa lahko razdelimo v dve skupini LTR in ne-LTR. V LTR skupino pa uvrščamo človeške endogene retroviruse (HERV) in retrotranspozone pri sesalcih (MaLR). Ne-LTR pa razvrčamo v dva podtipa: LINE (Long Interspersed Nuclear Elements) in SINE (Short Interspersed Nuclear Elements).

=== HERV ===

HERV retrotranspozoni imajo podobno genomsko strukturo kot eksogeni retrovirusi, kot je HIV. Ti retrotranspozoni poleg LTR zaporedja vključujejo regije gag, pol in env. Gen gag kodira proteine za ovojnico retrotranspozonskega delca. Pol pa prestavlja gen za reverzno transkriptazo, integrazo in proteazo. HERV vsebuje tudi gen, ki kodira protein env oziroma ostanek njihovega eksogenega retrovirusnega izvora pred vstavitvijo in endogenizacijo v zarodne celice. Pokazalo se je, da transkripcijsko aktivne poddružine HERV prispevajo k različnim patofiziološkim motnjam. Leta 1993 so prišli do ugotovitve, da dodatek virusa herpes simpleksa tipa 1 (HSV-1) celicam izoliranim od bolnika z multiplo sklerozo, povzroči močno stimulacijo aktivnosti specifične reverzne transkriptaze. Iz tega so sklepali da je prvotno zaporedje retrovirusa, povezaneg z multiplo sklerozo (MSRV), zelo zastopano v človeški DNK in tako odkrili poddružine skupine HERV, ki prispevajo k patologiji različnih nevroloških motnjah.

=== LINE-1 RETROTRANSPOZONI ===

Transpozoni LINE-1 so avtonomni retrotranspozoni, ki jih vsebuje človeški genom. Večina kopij LINE-1 je nepremičnih i njih ni mogoče retrotransponirati, bodisi zaradi 5' skrajšanja ali inverzij, uvedenih v zaporedje. Retrotranspozicijsko kompetentna LINE-1 ( RC LINE-1) je dolga 6kb in vsebuje 5' neprevedeno regijo (5' UTR), dva odprta bralna okvirja ( ORF1/2) in 3' UTR, prekinjeno s poli-A repom. ORF 1 predstavlja gen za protein, ki ima aktivnost spremenljevalca nukleinske kisline in RNA vezavno domeno. ORF2 kodira protein z encimsko aktivnostjo, ki je potreben za retrotranspozicijo LINE-1. ORF2p ima tako aktivnosti endonukleaze (EN) kot reverzne transkriptaze (RT). Transkripcija LINE-1 se začne na promotorju RNA olimeraze II ali natačneje znotraj prvih 100 baznih parov 5' UTR. Potem ko je prepisana, poliadenilirana LINE-1 mRNA se izvozi v citoplazmo, kjer se združi z proteini ORF1 in ORF2 in tvorijo komleks z ribonukleotidi (RNP). Potem se uvozi v jedro, da se začne obratna transkripcija in integracija. EN zareže spodnjo verigo DNK in izpostavi 3' OH, ki služi kot primer za RT za nastanek cDNA iz LINE-1 mRNA.

Heterogenost insercijskih preferenc in porazdelitev retrotranspozonov med različnimi populacijami:
Po različnih študijah so ugotovili, da pri integracji LINE1 ne ciljajo na izražene gene, odprt kromatin, ampak se namesto tega povezujejo z replikacijo DNK gostitelja. Te ugotovitve zagotavljajo prve namige, da sta integracija LINE-1 in replikacija DNK lahko mehansko povezani. Obstaja heterogenost v porazdelitvi endogenih retrotranspozonov po različnih človeških populacijah: od prisotnosti/odsotnosti transpozona do polimorfizmov posameznih nukleotidov (SNP). Polimorfizmi pri vstavitvah retroelementov nastanejo bodisi v zarodni liniji bodisi zgodaj v embrionalnem razvoju. To omogoča genomski mozaizem znotraj določeneg posameznika ko kar med različnimi človeškimi populacijami.

== CELIČNI VPLIVI RETROTRANSPOZICIJE LINE-1 ==

Retrotranspozoni LINE-1 ustvarjajo strukturno nestabilnost znotraj genoma in posledično motijo izražanje gostiteljskega gena. Vstavitve LINE-1 lahko generirajo napačno spojene ali prezgodaj okrnjene transkripte, spodbujajo prekinitev transkripcije ali celo spodbujajo spremembe našega epigenoma. Retrotranspozoni, ki prispevajo k genomski variaciji, spreminjajo ekspresijo gostiteljskega gena na epigenetski, transkripcijski in translacijski ravni.

== CELIČNI ODZIVI NA RETROTRANSPOZICIJE ==
Glede na to, da lahko retroelementi vplivajo na celico na veliko načinov, se je gostiteljski genom razvil tako, da uporablja različne odzive za zaviranje njihove aktivnosti. Transkripcijsko represijo dosežemo z represivnimi epigenetskimi modifikacijami, kot je npr. metilacija DNA. Znatna hipometilacija med embriogenezo je povezana z višjimi stopnjami retrotranspozicije. V mišjih zarodkih, ki so bili izjemno hipometilirani, se genomska integriteta vzdržuje s pomočjo faktorja CAF-1, ki zamenja histon 3.3 s histonom 3.1/3.2, ki deluje kot represivni modifikator in ščiti zarodek od retrotranspozicijske aktivnosti. Ker transpozicijski elementi vsebujejo tudi vezavna mesta za transkripcijske faktorje, to omogoča specifično transkripcijsko regulacijo, kot način transkripcijske represije. Kruppel-associated box (KRAB), ki vsebuje proteine cinkovih prstov (KZFP), so ključni regulatorji transpozicijske aktivnosti, ki se vežejo na regulatorna zaporedja TE in zavirajo izražanje TE v zgodnjih zarodkih.

Post-transkripcijska regulacija LINE-1 elementov z majhnimi RNA kot so miRNA ali piRNA, je še en celični odziv na retrotranspozicijo. Majhne RNA molekule lahko delujejo preko tarčne razgradnje RNA. Od RNA induciran kompleks za utišanje (RISC) z uporabo endonukleolitične cepitve razgrajuje TE transkriptov in, če je Dicer protein, ki je sestaven del RISC kompleksa, mutiran, povzroča povečano transkripcijo LINE-1 elementov. Odkrili so da miRNA-128 omejuje aktivnost LINE-1 preko dveh mehanizmov: lahko direktno cilja na ORF2 RNA za razgradnjo ali cilja na 3’-UTR zaporedje kofaktorja TNPO1, ki olajša transport kompleksa LINE-1 RNP v jedro. piRNA so pomembni zaviralci aktivnosti TE v zarodni liniji. Vzajemno delujejo s poddružino PIWI nukleaz Argonaute in cepijo TE transkripte v citoplazmi.

LINE-1 RNP kompleks, ki je retrotranspozicijski intermediat, je tudi tarča za razgradnjo. Protein cinkovega prsta (ZAP) se veže z LINE-1 mRNA v citoplazemskih stresnih granulah, povzroči zgubljanje integritete RNP kompleksa in zavira retrotranspozicijo LINE-1. TUT7, ki je uridil transferaza, prenaša ostanke uridina na LINE-1 mRNA v citoplazmi, nato MOV10, ki je helikaza, premakne ORF1p, da omogoči uridilacijo in posledično zavirajo reverzne transkripcije ORF2p v jedru. Družina encimov APOBEC zavirajo retrotranspozijo, najverjetneje z destabilizacijo kompleksa RNP. Kljub številnim gostiteljskim mehanizmom za zaviranje retrotranspozicije, de novo insercije so še vedno prisotne v somatskih tkivih z znatno retrotranspozicijo v nevronskih linijah.

== LINE-1 V RAZVOJU PRI MOŽGANIH ==

Najzgodnejši dokumentirani primer somatske retrotranspozicije in vivo je bil v mišjih možganih. Nekaj let pozneje so odkrili endogeno LINE-1 mRNA v nevronskih matičnih celicah izoliranih iz možganov človeških plodov. S pomočjo RC-seq, visoko zmogljivo metodo sekvenciranja, ki cilja na 3’ in 5’ konca LINE-1, ki so jo uporabili na DNA ekstrahirane iz različnih tkiv, identificirali so bistveno več kopij ORF2 in LINE-1 CNV v hipokampusu v primerjavi s srcem in jetri istega posameznika. Zanimivo je, da so v nedavni analizi 24 hipokampalnih nevronov odkrili, da se somatske insercije, ki se pojavijo med nevrodiferenciacijo v matične celice človeškega zarodka, lahko pojavijo zaradi mutacije v Ying Yang 1 (YY1) vezavnem mestu za transkripcijski faktor. YY1 vezavno mesto v promotorski regiji LINE-1 posreduje pri metilaciji CpG otočkov in epigenetski represiji. Retrotranspozicija med nevronskim razvojem lahko prispeva k nevronski raznolikosti, saj omogoča varijacijo genomske DNA od celice do celice.

== MOBILNI ELEMENTI IN NEVRODEGENERATIVNE BOLEZNI ==

Amiotrofična lateralna skleroza(ALS) je nevrodegenerativna bolezen, za katero je značilna izguba zgornjih in spodnjih motoričnih nevronov. . Številne študije so ugotovile prisotnost retrovirusne aktivnosti reverzne transkriptaze v serumu bolnikov z ALS. V kortikalnih piramidnih in hrbteničnih nevronih v posmrtnem možganskem tkivu bolnikov z ALS opazimo večjo ekspresijo HERV K-Env ki je močni imunopatogeni protein ovojnice . Aktivacija gena za HERV-K posledično zmanjšuje dolžino dendrita in tudi razvejanost in kompleksnost motoričnih nevronov transgenih miši. Še ni znano, kaj sproži izražanje HERV-K pri odraslih nevronih.

Aktivacija retrotranspozona je bila povezana tudi s sporadično obliko Alzheimerjeve bolezni, vendar so raziskave pokazale nedosledne rezultate o tem, ali so LINE-1 povišane pri bolnikih. V nevronih bolnikov so odkrili mozaične genomske rekombinacije znotraj gena, povezanega z Alzheimerjevo boleznijo, amiloidnega prekurzorskega proteina (APP). Te različice niso imele introničnih zaporedij in so bile imenovane "genomske cDNA" (gencDNA). Predpostavili so da izvirajo iz RNA in da zahtevajo endogeno aktivnost reverzne transkriptaze da se vstavijo v prelome dvojnih verig.

Pri pojavi Parkinsonove bolezni (PD) je odkrito pet različnih strukturnih variacij v genu PRKN (parkin RBR E3 ubiquitin protein ligase). Predvideva se, da se strukturne variacije pojavijo z nealelno homologno rekombinacijo. LTR in ne-LTR retrotranspozonske sekvence so bile identificirane znotraj dveh kilobaz od točke prekinitve delecije. To lahko pomeni da so delecije morda nastale zaradi retrotranspozicije. Povezava med aktivacijo retrotranspozona pri nevrodegenerativnih boleznih ni v celoti ugotovljena.

== TRANSPOZICIJSKI ELEMENTI IN VNETJA ==

Malo je znanega o prispevku transpozonih elementov k imunskim odzivom, ki so izvzeti za virusne okužbe. Ko iamo prisotno DNA v citoplazmi npr. virusno DNA, sproži se aktivacija poti cGAS-STING. cGAS-STING posledično proizvaja interferone, ki sprožijo vnetni odziv. Interferonski odzivi so lahko mehansko povezani z deregulacijo proizvodnje retrotranspozona.
Vse je več dokazov, da imajo transpozoni vlogo pri sprožitvi nevroinflamacije. Detekcija endogene nukleinske kisline s strani imunskega sistema je v osnovah številnih avtoimunskih bolezni. Retrotranspozoni so povezani z boleznimi kot so Multiple skleroza in Aicardi-Goutièresovim sindromom, kot glavni vnetni efektorji.

Multipla skleroza je kronična avtoimunska bolezen, ki prizadene osrednje živčevje in za katero ni znanega zdravila. Za bolezen so značilne lezije v beli snovi, ki vodijo do razgradnje krvno-možganske pregrade in aksonskih motenj po hrbtenjači. Izražanje HERV proteina se šteje za dejavnik za napredovanje bolezni. Iz supernatantov celične kulture vzorcev bolnikov so izolirani retrovirusima podobni delci, in je bilo dokazano da izvirajo iz elementov HERV.

Pri sistemskom eritematoznem lupusu je ugotovljena povišana transkripcija HERV. V študijah so pokazali da so ravni ekspresije mRNA HERV-E v celicah CD4+ T lupusa višje kot v zdravih celicah. Še ni znan popoln prispevek aktivnosti HERV.

Motnje avtističnega spectra so razvojne motnje, ki ovirajo komunikacijo in vedenje. Ugotovljeno je da je pri bolnikih bila zmanjšanja metilacija in povečano izražanje LINE-1 v možganih. Vse je več dokazov da lahko kronično vnetje prispeva k simptomatologiji avtizma.

Rettov sindrom je X-povezana progresivna nevrorazvojna motnja z avtističnimi značilnostmi. Pri Rettovom sindromu imamo prisotne različne mutacije v metil CpG vezavnem proteinu-2 (MeCP2). Analizirani vzorci možganskega tkiva ob smrti so pokazali višje genomske sekvence LINE-1 ORF2 pri bolnikih.

Aicardi-Goutièresov sindrom je progresivna vnetna motnja, ki prizadene novorojenčke in ima za posledico hudo duševno in telesno prizadetost ter močno skrajšano življenjsko dobo. Lahko nastane zaradi mutacij v TREX1(three-prime repair exonuclease 1). TREX1 deluje tako, da razgradi dvoverižno DNA(dsDNA)/enoverižno DNA(ssDNA). Mutacije v genu povzročijo znatno kopičenje vrst DNA v citoplazmi, ki sprožijo prirojen imunski odziv, kot je indukcija interferona. Večina teh vrst DNA je sestavljena iz citoplazemske ssDNA LINE-1. V nevronskih celicah mišjih s pomanjkanjem TREX-1 se izrazilo 70 % več elementov LINE-1Hs.

== VIRI IN LITERATURA ==

[1] Saleh, Aurian, et al. “Transposable Elements, Inflammation, and Neurological Disease.” Frontiers in Neurology, vol. 10, 2019. Frontiers, https://www.frontiersin.org/article/10.3389/fneur.2019.00894.

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

TE pri vnetnih boleznih

2022-05-08T10:18:27Z

Kostadin Mitkov:

== UVOD ==

Transpozicijski elementi (TE) so mobilni elementi DNA, ki se lahko replicirajo in vstavijo na različne lokacije znotraj gostiteljskega genoma. Retrotranspozoni so transpozicijski elementi, ki se mobilizirajo preko RNA intermediatov s pomočjo reverzne transkriptaze. HERV in LINE-1 sta dve glavni vrsti retrotranspozonov. Njuni inserciji sta se kopičili skozi evolucijo, dokler so se gostiteljski genomi razvijali in z uporabo različnih dejavnikov so zavirali njuni aktivnosti. Znanstveniki so odkrili, da transpozicijski elementi bolj prispevajo k patogenezi človeških bolezni, kot so do takrat mislili.

== TRANSPOZICIJSKI ELEMENTI ==

Transpozicijski elemnti obsegajo vsaj 45% človeškega genoma, medtem ko kodirajoče zaporedje zasede manj kot 3% genoma. Razvrščamo jih kot transpozoni, ki so ves čas v obliki DNA (II razred) in retrotranspozoni, ki za izvedbo traspozicije potrebujejo RNA-intermediat (I razred). Transpozoni II razreda delujejo po mehanizmu „izreži in prilepi“, pri čemer se zaporedje s pomočjo encima transpozaze izreže iz ene regije in integrira v drugo določeno regijo v genomu. Retrotranspozoni pa delujejo po mehanizmu „kopiraj in prilepi“ kar omogoča aktivnim retrotranspozonim, da ohranijo svojo prvotno lokacijo v genomu, medtem ko kopičijo število kopij drugje. Te retrotranspozone pa lahko razdelimo v dve skupini LTR in ne-LTR. V LTR skupino pa uvrščamo človeške endogene retroviruse (HERV) in retrotranspozone pri sesalcih (MaLR). Ne-LTR pa razvrčamo v dva podtipa: LINE (Long Interspersed Nuclear Elements) in SINE (Short Interspersed Nuclear Elements).

=== HERV ===

HERV retrotranspozoni imajo podobno genomsko strukturo kot eksogeni retrovirusi, kot je HIV. Ti retrotranspozoni poleg LTR zaporedja vključujejo regije gag, pol in env. Gen gag kodira proteine za ovojnico retrotranspozonskega delca. Pol pa prestavlja gen za reverzno transkriptazo, integrazo in proteazo. HERV vsebuje tudi gen, ki kodira protein env oziroma ostanek njihovega eksogenega retrovirusnega izvora pred vstavitvijo in endogenizacijo v zarodne celice. Pokazalo se je, da transkripcijsko aktivne poddružine HERV prispevajo k različnim patofiziološkim motnjam. Leta 1993 so prišli do ugotovitve, da dodatek virusa herpes simpleksa tipa 1 (HSV-1) celicam izoliranim od bolnika z multiplo sklerozo, povzroči močno stimulacijo aktivnosti specifične reverzne transkriptaze. Iz tega so sklepali da je prvotno zaporedje retrovirusa, povezaneg z multiplo sklerozo (MSRV), zelo zastopano v človeški DNK in tako odkrili poddružine skupine HERV, ki prispevajo k patologiji različnih nevroloških motnjah.

=== LINE-1 RETROTRANSPOZONI ===

Transpozoni LINE-1 so avtonomni retrotranspozoni, ki jih vsebuje človeški genom. Večina kopij LINE-1 je nepremičnih i njih ni mogoče retrotransponirati, bodisi zaradi 5' skrajšanja ali inverzij, uvedenih v zaporedje. Retrotranspozicijsko kompetentna LINE-1 ( RC LINE-1) je dolga 6kb in vsebuje 5' neprevedeno regijo (5' UTR), dva odprta bralna okvirja ( ORF1/2) in 3' UTR, prekinjeno s poli-A repom. ORF 1 predstavlja gen za protein, ki ima aktivnost spremenljevalca nukleinske kisline in RNA vezavno domeno. ORF2 kodira protein z encimsko aktivnostjo, ki je potreben za retrotranspozicijo LINE-1. ORF2p ima tako aktivnosti endonukleaze (EN) kot reverzne transkriptaze (RT). Transkripcija LINE-1 se začne na promotorju RNA olimeraze II ali natačneje znotraj prvih 100 baznih parov 5' UTR. Potem ko je prepisana, poliadenilirana LINE-1 mRNA se izvozi v citoplazmo, kjer se združi z proteini ORF1 in ORF2 in tvorijo komleks z ribonukleotidi (RNP). Potem se uvozi v jedro, da se začne obratna transkripcija in integracija. EN zareže spodnjo verigo DNK in izpostavi 3' OH, ki služi kot primer za RT za nastanek cDNA iz LINE-1 mRNA.

Heterogenost insercijskih preferenc in porazdelitev retrotranspozonov med različnimi populacijami:
Po različnih študijah so ugotovili, da pri integracji LINE1 ne ciljajo na izražene gene, odprt kromatin, ampak se namesto tega povezujejo z replikacijo DNK gostitelja. Te ugotovitve zagotavljajo prve namige, da sta integracija LINE-1 in replikacija DNK lahko mehansko povezani. Obstaja heterogenost v porazdelitvi endogenih retrotranspozonov po različnih človeških populacijah: od prisotnosti/odsotnosti transpozona do polimorfizmov posameznih nukleotidov (SNP). Polimorfizmi pri vstavitvah retroelementov nastanejo bodisi v zarodni liniji bodisi zgodaj v embrionalnem razvoju. To omogoča genomski mozaizem znotraj določeneg posameznika ko kar med različnimi človeškimi populacijami.

== CELIČNI VPLIVI RETROTRANSPOZICIJE LINE-1 ==

Retrotranspozoni LINE-1 ustvarjajo strukturno nestabilnost znotraj genoma in posledično motijo izražanje gostiteljskega gena. Vstavitve LINE-1 lahko generirajo napačno spojene ali prezgodaj okrnjene transkripte, spodbujajo prekinitev transkripcije ali celo spodbujajo spremembe našega epigenoma. Retrotranspozoni, ki prispevajo k genomski variaciji, spreminjajo ekspresijo gostiteljskega gena na epigenetski, transkripcijski in translacijski ravni.

== CELIČNI ODZIVI NA RETROTRANSPOZICIJE ==
Glede na to, da lahko retroelementi vplivajo na celico na veliko načinov, se je gostiteljski genom razvil tako, da uporablja različne odzive za zaviranje njihove aktivnosti. Transkripcijsko represijo dosežemo z represivnimi epigenetskimi modifikacijami, kot je npr. metilacija DNA. Znatna hipometilacija med embriogenezo je povezana z višjimi stopnjami retrotranspozicije. V mišjih zarodkih, ki so bili izjemno hipometilirani, se genomska integriteta vzdržuje s pomočjo faktorja CAF-1, ki zamenja histon 3.3 s histonom 3.1/3.2, ki deluje kot represivni modifikator in ščiti zarodek od retrotranspozicijske aktivnosti. Ker transpozicijski elementi vsebujejo tudi vezavna mesta za transkripcijske faktorje, to omogoča specifično transkripcijsko regulacijo, kot način transkripcijske represije. Kruppel-associated box (KRAB), ki vsebuje proteine cinkovih prstov (KZFP), so ključni regulatorji transpozicijske aktivnosti, ki se vežejo na regulatorna zaporedja TE in zavirajo izražanje TE v zgodnjih zarodkih.

Post-transkripcijska regulacija LINE-1 elementov z majhnimi RNA kot so miRNA ali piRNA, je še en celični odziv na retrotranspozicijo. Majhne RNA molekule lahko delujejo preko tarčne razgradnje RNA. Od RNA induciran kompleks za utišanje (RISC) z uporabo endonukleolitične cepitve razgrajuje TE transkriptov in, če je Dicer protein, ki je sestaven del RISC kompleksa, mutiran, povzroča povečano transkripcijo LINE-1 elementov. Odkrili so da miRNA-128 omejuje aktivnost LINE-1 preko dveh mehanizmov: lahko direktno cilja na ORF2 RNA za razgradnjo ali cilja na 3’-UTR zaporedje kofaktorja TNPO1, ki olajša transport kompleksa LINE-1 RNP v jedro. piRNA so pomembni zaviralci aktivnosti TE v zarodni liniji. Vzajemno delujejo s poddružino PIWI nukleaz Argonaute in cepijo TE transkripte v citoplazmi.

LINE-1 RNP kompleks, ki je retrotranspozicijski intermediat, je tudi tarča za razgradnjo. Protein cinkovega prsta (ZAP) se veže z LINE-1 mRNA v citoplazemskih stresnih granulah, povzroči zgubljanje integritete RNP kompleksa in zavira retrotranspozicijo LINE-1. TUT7, ki je uridil transferaza, prenaša ostanke uridina na LINE-1 mRNA v citoplazmi, nato MOV10, ki je helikaza, premakne ORF1p, da omogoči uridilacijo in posledično zavirajo reverzne transkripcije ORF2p v jedru. Družina encimov APOBEC zavirajo retrotranspozijo, najverjetneje z destabilizacijo kompleksa RNP. Kljub številnim gostiteljskim mehanizmom za zaviranje retrotranspozicije, de novo insercije so še vedno prisotne v somatskih tkivih z znatno retrotranspozicijo v nevronskih linijah.

== LINE-1 V RAZVOJU PRI MOŽGANIH ==

Najzgodnejši dokumentirani primer somatske retrotranspozicije in vivo je bil v mišjih možganih. Nekaj let pozneje so odkrili endogeno LINE-1 mRNA v nevronskih matičnih celicah izoliranih iz možganov človeških plodov. S pomočjo RC-seq, visoko zmogljivo metodo sekvenciranja, ki cilja na 3’ in 5’ konca LINE-1, ki so jo uporabili na DNA ekstrahirane iz različnih tkiv, identificirali so bistveno več kopij ORF2 in LINE-1 CNV v hipokampusu v primerjavi s srcem in jetri istega posameznika. Zanimivo je, da so v nedavni analizi 24 hipokampalnih nevronov odkrili, da se somatske insercije, ki se pojavijo med nevrodiferenciacijo v matične celice človeškega zarodka, lahko pojavijo zaradi mutacije v Ying Yang 1 (YY1) vezavnem mestu za transkripcijski faktor. YY1 vezavno mesto v promotorski regiji LINE-1 posreduje pri metilaciji CpG otočkov in epigenetski represiji. Retrotranspozicija med nevronskim razvojem lahko prispeva k nevronski raznolikosti, saj omogoča varijacijo genomske DNA od celice do celice.

== MOBILNI ELEMENTI IN NEVRODEGENERATIVNE BOLEZNI ==

Amiotrofična lateralna skleroza(ALS) je nevrodegenerativna bolezen, za katero je značilna izguba zgornjih in spodnjih motoričnih nevronov. . Številne študije so ugotovile prisotnost retrovirusne aktivnosti reverzne transkriptaze v serumu bolnikov z ALS. V kortikalnih piramidnih in hrbteničnih nevronih v posmrtnem možganskem tkivu bolnikov z ALS opazimo večjo ekspresijo HERV K-Env ki je močni imunopatogeni protein ovojnice . Aktivacija gena za HERV-K posledično zmanjšuje dolžino dendrita in tudi razvejanost in kompleksnost motoričnih nevronov transgenih miši. Še ni znano, kaj sproži izražanje HERV-K pri odraslih nevronih.

Aktivacija retrotranspozona je bila povezana tudi s sporadično obliko Alzheimerjeve bolezni, vendar so raziskave pokazale nedosledne rezultate o tem, ali so LINE-1 povišane pri bolnikih. V nevronih bolnikov so odkrili mozaične genomske rekombinacije znotraj gena, povezanega z Alzheimerjevo boleznijo, amiloidnega prekurzorskega proteina (APP). Te različice niso imele introničnih zaporedij in so bile imenovane "genomske cDNA" (gencDNA). Predpostavili so da izvirajo iz RNA in da zahtevajo endogeno aktivnost reverzne transkriptaze da se vstavijo v prelome dvojnih verig.

Pri pojavi Parkinsonove bolezni (PD) je odkrito pet različnih strukturnih variacij v genu PRKN (parkin RBR E3 ubiquitin protein ligase). Predvideva se, da se strukturne variacije pojavijo z nealelno homologno rekombinacijo. LTR in ne-LTR retrotranspozonske sekvence so bile identificirane znotraj dveh kilobaz od točke prekinitve delecije. To lahko pomeni da so delecije morda nastale zaradi retrotranspozicije. Povezava med aktivacijo retrotranspozona pri nevrodegenerativnih boleznih ni v celoti ugotovljena.

== TRANSPOZICIJSKI ELEMENTI IN VNETJA ==

Malo je znanega o prispevku transpozonih elementov k imunskim odzivom, ki so izvzeti za virusne okužbe. Ko iamo prisotno DNA v citoplazmi npr. virusno DNA, sproži se aktivacija poti cGAS-STING. cGAS-STING posledično proizvaja interferone, ki sprožijo vnetni odziv. Interferonski odzivi so lahko mehansko povezani z deregulacijo proizvodnje retrotranspozona.
Vse je več dokazov, da imajo transpozoni vlogo pri sprožitvi nevroinflamacije. Detekcija endogene nukleinske kisline s strani imunskega sistema je v osnovah številnih avtoimunskih bolezni. Retrotranspozoni so povezani z boleznimi kot so Multiple skleroza in Aicardi-Goutièresovim sindromom, kot glavni vnetni efektorji.

Multipla skleroza je kronična avtoimunska bolezen, ki prizadene osrednje živčevje in za katero ni znanega zdravila. Za bolezen so značilne lezije v beli snovi, ki vodijo do razgradnje krvno-možganske pregrade in aksonskih motenj po hrbtenjači. Izražanje HERV proteina se šteje za dejavnik za napredovanje bolezni. Iz supernatantov celične kulture vzorcev bolnikov so izolirani retrovirusima podobni delci, in je bilo dokazano da izvirajo iz elementov HERV.

Pri sistemskom eritematoznem lupusu je ugotovljena povišana transkripcija HERV. V študijah so pokazali da so ravni ekspresije mRNA HERV-E v celicah CD4+ T lupusa višje kot v zdravih celicah. Še ni znan popoln prispevek aktivnosti HERV.

Motnje avtističnega spectra so razvojne motnje, ki ovirajo komunikacijo in vedenje. Ugotovljeno je da je pri bolnikih bila zmanjšanja metilacija in povečano izražanje LINE-1 v možganih. Vse je več dokazov da lahko kronično vnetje prispeva k simptomatologiji avtizma.

Rettov sindrom je X-povezana progresivna nevrorazvojna motnja z avtističnimi značilnostmi. Pri Rettovom sindromu imamo prisotne različne mutacije v metil CpG vezavnem proteinu-2 (MeCP2). Analizirani vzorci možganskega tkiva ob smrti so pokazali višje genomske sekvence LINE-1 ORF2 pri bolnikih.

Aicardi-Goutièresov sindrom je progresivna vnetna motnja, ki prizadene novorojenčke in ima za posledico hudo duševno in telesno prizadetost ter močno skrajšano življenjsko dobo. Lahko nastane zaradi mutacij v TREX1(three-prime repair exonuclease 1). TREX1 deluje tako, da razgradi dvoverižno DNA(dsDNA)/enoverižno DNA(ssDNA). Mutacije v genu povzročijo znatno kopičenje vrst DNA v citoplazmi, ki sprožijo prirojen imunski odziv, kot je indukcija interferona. Večina teh vrst DNA je sestavljena iz citoplazemske ssDNA LINE-1. V nevronskih celicah mišjih s pomanjkanjem TREX-1 se izrazilo 70 % več elementov LINE-1Hs.

== VIRI ==

[1] Saleh, Aurian, et al. “Transposable Elements, Inflammation, and Neurological Disease.” Frontiers in Neurology, vol. 10, 2019. Frontiers, https://www.frontiersin.org/article/10.3389/fneur.2019.00894.

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Talk:TE pri vnetnih boleznih

2022-05-08T10:18:13Z

Kostadin Mitkov:

'''Kostadin Mitkov''': Uvod, Celični odzivi na retrotranspozicije, LINE-1 v razvoju pri možganih

'''Ena Kartal''': Transpozicijski elementi, Celični vplivi retrotranspozicije LINE-1

'''Nataša Vujovič''': Mobilni elementi in nevrodegenerativne bolezni, Transpozicijski elementi in vnetja

TE pri vnetnih boleznih

2022-05-08T10:16:48Z

Kostadin Mitkov:

== UVOD ==

Transpozicijski elementi (TE) so mobilni elementi DNA, ki se lahko replicirajo in vstavijo na različne lokacije znotraj gostiteljskega genoma. Retrotranspozoni so transpozicijski elementi, ki se mobilizirajo preko RNA intermediatov s pomočjo reverzne transkriptaze. HERV in LINE-1 sta dve glavni vrsti retrotranspozonov. Njuni inserciji sta se kopičili skozi evolucijo, dokler so se gostiteljski genomi razvijali in z uporabo različnih dejavnikov so zavirali njuni aktivnosti. Znanstveniki so odkrili, da transpozicijski elementi bolj prispevajo k patogenezi človeških bolezni, kot so do takrat mislili.

== TRANSPOZICIJSKI ELEMENTI ==

Transpozicijski elemnti obsegajo vsaj 45% človeškega genoma, medtem ko kodirajoče zaporedje zasede manj kot 3% genoma. Razvrščamo jih kot transpozoni, ki so ves čas v obliki DNA (II razred) in retrotranspozoni, ki za izvedbo traspozicije potrebujejo RNA-intermediat (I razred). Transpozoni II razreda delujejo po mehanizmu „izreži in prilepi“, pri čemer se zaporedje s pomočjo encima transpozaze izreže iz ene regije in integrira v drugo določeno regijo v genomu. Retrotranspozoni pa delujejo po mehanizmu „kopiraj in prilepi“ kar omogoča aktivnim retrotranspozonim, da ohranijo svojo prvotno lokacijo v genomu, medtem ko kopičijo število kopij drugje. Te retrotranspozone pa lahko razdelimo v dve skupini LTR in ne-LTR. V LTR skupino pa uvrščamo človeške endogene retroviruse (HERV) in retrotranspozone pri sesalcih (MaLR). Ne-LTR pa razvrčamo v dva podtipa: LINE (Long Interspersed Nuclear Elements) in SINE (Short Interspersed Nuclear Elements).

=== HERV ===

HERV retrotranspozoni imajo podobno genomsko strukturo kot eksogeni retrovirusi, kot je HIV. Ti retrotranspozoni poleg LTR zaporedja vključujejo regije gag, pol in env. Gen gag kodira proteine za ovojnico retrotranspozonskega delca. Pol pa prestavlja gen za reverzno transkriptazo, integrazo in proteazo. HERV vsebuje tudi gen, ki kodira protein env oziroma ostanek njihovega eksogenega retrovirusnega izvora pred vstavitvijo in endogenizacijo v zarodne celice. Pokazalo se je, da transkripcijsko aktivne poddružine HERV prispevajo k različnim patofiziološkim motnjam. Leta 1993 so prišli do ugotovitve, da dodatek virusa herpes simpleksa tipa 1 (HSV-1) celicam izoliranim od bolnika z multiplo sklerozo, povzroči močno stimulacijo aktivnosti specifične reverzne transkriptaze. Iz tega so sklepali da je prvotno zaporedje retrovirusa, povezaneg z multiplo sklerozo (MSRV), zelo zastopano v človeški DNK in tako odkrili poddružine skupine HERV, ki prispevajo k patologiji različnih nevroloških motnjah.

=== LINE-1 RETROTRANSPOZONI ===

Transpozoni LINE-1 so avtonomni retrotranspozoni, ki jih vsebuje človeški genom. Večina kopij LINE-1 je nepremičnih i njih ni mogoče retrotransponirati, bodisi zaradi 5' skrajšanja ali inverzij, uvedenih v zaporedje. Retrotranspozicijsko kompetentna LINE-1 ( RC LINE-1) je dolga 6kb in vsebuje 5' neprevedeno regijo (5' UTR), dva odprta bralna okvirja ( ORF1/2) in 3' UTR, prekinjeno s poli-A repom. ORF 1 predstavlja gen za protein, ki ima aktivnost spremenljevalca nukleinske kisline in RNA vezavno domeno. ORF2 kodira protein z encimsko aktivnostjo, ki je potreben za retrotranspozicijo LINE-1. ORF2p ima tako aktivnosti endonukleaze (EN) kot reverzne transkriptaze (RT). Transkripcija LINE-1 se začne na promotorju RNA olimeraze II ali natačneje znotraj prvih 100 baznih parov 5' UTR. Potem ko je prepisana, poliadenilirana LINE-1 mRNA se izvozi v citoplazmo, kjer se združi z proteini ORF1 in ORF2 in tvorijo komleks z ribonukleotidi (RNP). Potem se uvozi v jedro, da se začne obratna transkripcija in integracija. EN zareže spodnjo verigo DNK in izpostavi 3' OH, ki služi kot primer za RT za nastanek cDNA iz LINE-1 mRNA.

Heterogenost insercijskih preferenc in porazdelitev retrotranspozonov med različnimi populacijami:
Po različnih študijah so ugotovili, da pri integracji LINE1 ne ciljajo na izražene gene, odprt kromatin, ampak se namesto tega povezujejo z replikacijo DNK gostitelja. Te ugotovitve zagotavljajo prve namige, da sta integracija LINE-1 in replikacija DNK lahko mehansko povezani. Obstaja heterogenost v porazdelitvi endogenih retrotranspozonov po različnih človeških populacijah: od prisotnosti/odsotnosti transpozona do polimorfizmov posameznih nukleotidov (SNP). Polimorfizmi pri vstavitvah retroelementov nastanejo bodisi v zarodni liniji bodisi zgodaj v embrionalnem razvoju. To omogoča genomski mozaizem znotraj določeneg posameznika ko kar med različnimi človeškimi populacijami.

== CELIČNI VPLIVI RETROTRANSPOZICIJE LINE-1 ==

Retrotranspozoni LINE-1 ustvarjajo strukturno nestabilnost znotraj genoma in posledično motijo izražanje gostiteljskega gena. Vstavitve LINE-1 lahko generirajo napačno spojene ali prezgodaj okrnjene transkripte, spodbujajo prekinitev transkripcije ali celo spodbujajo spremembe našega epigenoma. Retrotranspozoni, ki prispevajo k genomski variaciji, spreminjajo ekspresijo gostiteljskega gena na epigenetski, transkripcijski in translacijski ravni.

== CELIČNI ODZIVI NA RETROTRANSPOZICIJE ==
Glede na to, da lahko retroelementi vplivajo na celico na veliko načinov, se je gostiteljski genom razvil tako, da uporablja različne odzive za zaviranje njihove aktivnosti. Transkripcijsko represijo dosežemo z represivnimi epigenetskimi modifikacijami, kot je npr. metilacija DNA. Znatna hipometilacija med embriogenezo je povezana z višjimi stopnjami retrotranspozicije. V mišjih zarodkih, ki so bili izjemno hipometilirani, se genomska integriteta vzdržuje s pomočjo faktorja CAF-1, ki zamenja histon 3.3 s histonom 3.1/3.2, ki deluje kot represivni modifikator in ščiti zarodek od retrotranspozicijske aktivnosti. Ker transpozicijski elementi vsebujejo tudi vezavna mesta za transkripcijske faktorje, to omogoča specifično transkripcijsko regulacijo, kot način transkripcijske represije. Kruppel-associated box (KRAB), ki vsebuje proteine cinkovih prstov (KZFP), so ključni regulatorji transpozicijske aktivnosti, ki se vežejo na regulatorna zaporedja TE in zavirajo izražanje TE v zgodnjih zarodkih.

Post-transkripcijska regulacija LINE-1 elementov z majhnimi RNA kot so miRNA ali piRNA, je še en celični odziv na retrotranspozicijo. Majhne RNA molekule lahko delujejo preko tarčne razgradnje RNA. Od RNA induciran kompleks za utišanje (RISC) z uporabo endonukleolitične cepitve razgrajuje TE transkriptov in, če je Dicer protein, ki je sestaven del RISC kompleksa, mutiran, povzroča povečano transkripcijo LINE-1 elementov. Odkrili so da miRNA-128 omejuje aktivnost LINE-1 preko dveh mehanizmov: lahko direktno cilja na ORF2 RNA za razgradnjo ali cilja na 3’-UTR zaporedje kofaktorja TNPO1, ki olajša transport kompleksa LINE-1 RNP v jedro. piRNA so pomembni zaviralci aktivnosti TE v zarodni liniji. Vzajemno delujejo s poddružino PIWI nukleaz Argonaute in cepijo TE transkripte v citoplazmi.

LINE-1 RNP kompleks, ki je retrotranspozicijski intermediat, je tudi tarča za razgradnjo. Protein cinkovega prsta (ZAP) se veže z LINE-1 mRNA v citoplazemskih stresnih granulah, povzroči zgubljanje integritete RNP kompleksa in zavira retrotranspozicijo LINE-1. TUT7, ki je uridil transferaza, prenaša ostanke uridina na LINE-1 mRNA v citoplazmi, nato MOV10, ki je helikaza, premakne ORF1p, da omogoči uridilacijo in posledično zavirajo reverzne transkripcije ORF2p v jedru. Družina encimov APOBEC zavirajo retrotranspozijo, najverjetneje z destabilizacijo kompleksa RNP. Kljub številnim gostiteljskim mehanizmom za zaviranje retrotranspozicije, de novo insercije so še vedno prisotne v somatskih tkivih z znatno retrotranspozicijo v nevronskih linijah.

== LINE-1 V RAZVOJU PRI MOŽGANIH ==

Najzgodnejši dokumentirani primer somatske retrotranspozicije in vivo je bil v mišjih možganih. Nekaj let pozneje so odkrili endogeno LINE-1 mRNA v nevronskih matičnih celicah izoliranih iz možganov človeških plodov. S pomočjo RC-seq, visoko zmogljivo metodo sekvenciranja, ki cilja na 3’ in 5’ konca LINE-1, ki so jo uporabili na DNA ekstrahirane iz različnih tkiv, identificirali so bistveno več kopij ORF2 in LINE-1 CNV v hipokampusu v primerjavi s srcem in jetri istega posameznika. Zanimivo je, da so v nedavni analizi 24 hipokampalnih nevronov odkrili, da se somatske insercije, ki se pojavijo med nevrodiferenciacijo v matične celice človeškega zarodka, lahko pojavijo zaradi mutacije v Ying Yang 1 (YY1) vezavnem mestu za transkripcijski faktor. YY1 vezavno mesto v promotorski regiji LINE-1 posreduje pri metilaciji CpG otočkov in epigenetski represiji. Retrotranspozicija med nevronskim razvojem lahko prispeva k nevronski raznolikosti, saj omogoča varijacijo genomske DNA od celice do celice.

== MOBILNI ELEMENTI IN NEVRODEGENERATIVNE BOLEZNI ==

Amiotrofična lateralna skleroza(ALS) je nevrodegenerativna bolezen, za katero je značilna izguba zgornjih in spodnjih motoričnih nevronov. . Številne študije so ugotovile prisotnost retrovirusne aktivnosti reverzne transkriptaze v serumu bolnikov z ALS. V kortikalnih piramidnih in hrbteničnih nevronih v posmrtnem možganskem tkivu bolnikov z ALS opazimo večjo ekspresijo HERV K-Env ki je močni imunopatogeni protein ovojnice . Aktivacija gena za HERV-K posledično zmanjšuje dolžino dendrita in tudi razvejanost in kompleksnost motoričnih nevronov transgenih miši. Še ni znano, kaj sproži izražanje HERV-K pri odraslih nevronih.

Aktivacija retrotranspozona je bila povezana tudi s sporadično obliko Alzheimerjeve bolezni, vendar so raziskave pokazale nedosledne rezultate o tem, ali so LINE-1 povišane pri bolnikih. V nevronih bolnikov so odkrili mozaične genomske rekombinacije znotraj gena, povezanega z Alzheimerjevo boleznijo, amiloidnega prekurzorskega proteina (APP). Te različice niso imele introničnih zaporedij in so bile imenovane "genomske cDNA" (gencDNA). Predpostavili so da izvirajo iz RNA in da zahtevajo endogeno aktivnost reverzne transkriptaze da se vstavijo v prelome dvojnih verig.

Pri pojavi Parkinsonove bolezni (PD) je odkrito pet različnih strukturnih variacij v genu PRKN (parkin RBR E3 ubiquitin protein ligase). Predvideva se, da se strukturne variacije pojavijo z nealelno homologno rekombinacijo. LTR in ne-LTR retrotranspozonske sekvence so bile identificirane znotraj dveh kilobaz od točke prekinitve delecije. To lahko pomeni da so delecije morda nastale zaradi retrotranspozicije. Povezava med aktivacijo retrotranspozona pri nevrodegenerativnih boleznih ni v celoti ugotovljena.

== TRANSPOZICIJSKI ELEMENTI IN VNETJA ==

Malo je znanega o prispevku transpozonih elementov k imunskim odzivom, ki so izvzeti za virusne okužbe. Ko iamo prisotno DNA v citoplazmi npr. virusno DNA, sproži se aktivacija poti cGAS-STING. cGAS-STING posledično proizvaja interferone, ki sprožijo vnetni odziv. Interferonski odzivi so lahko mehansko povezani z deregulacijo proizvodnje retrotranspozona.
Vse je več dokazov, da imajo transpozoni vlogo pri sprožitvi nevroinflamacije. Detekcija endogene nukleinske kisline s strani imunskega sistema je v osnovah številnih avtoimunskih bolezni. Retrotranspozoni so povezani z boleznimi kot so Multiple skleroza in Aicardi-Goutièresovim sindromom, kot glavni vnetni efektorji.

Multipla skleroza je kronična avtoimunska bolezen, ki prizadene osrednje živčevje in za katero ni znanega zdravila. Za bolezen so značilne lezije v beli snovi, ki vodijo do razgradnje krvno-možganske pregrade in aksonskih motenj po hrbtenjači. Izražanje HERV proteina se šteje za dejavnik za napredovanje bolezni. Iz supernatantov celične kulture vzorcev bolnikov so izolirani retrovirusima podobni delci, in je bilo dokazano da izvirajo iz elementov HERV.

Pri sistemskom eritematoznem lupusu je ugotovljena povišana transkripcija HERV. V študijah so pokazali da so ravni ekspresije mRNA HERV-E v celicah CD4+ T lupusa višje kot v zdravih celicah. Še ni znan popoln prispevek aktivnosti HERV.

Motnje avtističnega spectra so razvojne motnje, ki ovirajo komunikacijo in vedenje. Ugotovljeno je da je pri bolnikih bila zmanjšanja metilacija in povečano izražanje LINE-1 v možganih. Vse je več dokazov da lahko kronično vnetje prispeva k simptomatologiji avtizma.

Rettov sindrom je X-povezana progresivna nevrorazvojna motnja z avtističnimi značilnostmi. Pri Rettovom sindromu imamo prisotne različne mutacije v metil CpG vezavnem proteinu-2 (MeCP2). Analizirani vzorci možganskega tkiva ob smrti so pokazali višje genomske sekvence LINE-1 ORF2 pri bolnikih.

Aicardi-Goutièresov sindrom je progresivna vnetna motnja, ki prizadene novorojenčke in ima za posledico hudo duševno in telesno prizadetost ter močno skrajšano življenjsko dobo. Lahko nastane zaradi mutacij v TREX1(three-prime repair exonuclease 1). TREX1 deluje tako, da razgradi dvoverižno DNA(dsDNA)/enoverižno DNA(ssDNA). Mutacije v genu povzročijo znatno kopičenje vrst DNA v citoplazmi, ki sprožijo prirojen imunski odziv, kot je indukcija interferona. Večina teh vrst DNA je sestavljena iz citoplazemske ssDNA LINE-1. V nevronskih celicah mišjih s pomanjkanjem TREX-1 se izrazilo 70 % več elementov LINE-1Hs.

== VIRI ==

[1] Saleh, Aurian, et al. “Transposable Elements, Inflammation, and Neurological Disease.” Frontiers in Neurology, vol. 10, 2019. Frontiers, https://www.frontiersin.org/article/10.3389/fneur.2019.00894.

TE pri vnetnih boleznih

2022-05-08T10:13:35Z

Kostadin Mitkov:

== UVOD ==

Transpozicijski elementi (TE) so mobilni elementi DNA, ki se lahko replicirajo in vstavijo na različne lokacije znotraj gostiteljskega genoma. Retrotranspozoni so transpozicijski elementi, ki se mobilizirajo preko RNA intermediatov s pomočjo reverzne transkriptaze. HERV in LINE-1 sta dve glavni vrsti retrotranspozonov. Njuni inserciji sta se kopičili skozi evolucijo, dokler so se gostiteljski genomi razvijali in z uporabo različnih dejavnikov so zavirali njuni aktivnosti. Znanstveniki so odkrili, da transpozicijski elementi bolj prispevajo k patogenezi človeških bolezni, kot so do takrat mislili.

== TRANSPOZICIJSKI ELEMENTI ==

Transpozicijski elemnti obsegajo vsaj 45% človeškega genoma, medtem ko kodirajoče zaporedje zasede manj kot 3% genoma. Razvrščamo jih kot transpozoni, ki so ves čas v obliki DNA (II razred) in retrotranspozoni, ki za izvedbo traspozicije potrebujejo RNA-intermediat (I razred). Transpozoni II razreda delujejo po mehanizmu „izreži in prilepi“, pri čemer se zaporedje s pomočjo encima transpozaze izreže iz ene regije in integrira v drugo določeno regijo v genomu. Retrotranspozoni pa delujejo po mehanizmu „kopiraj in prilepi“ kar omogoča aktivnim retrotranspozonim, da ohranijo svojo prvotno lokacijo v genomu, medtem ko kopičijo število kopij drugje. Te retrotranspozone pa lahko razdelimo v dve skupini LTR in ne-LTR. V LTR skupino pa uvrščamo človeške endogene retroviruse (HERV) in retrotranspozone pri sesalcih (MaLR). Ne-LTR pa razvrčamo v dva podtipa: LINE (Long Interspersed Nuclear Elements) in SINE (Short Interspersed Nuclear Elements).

=== HERV ===

HERV retrotranspozoni imajo podobno genomsko strukturo kot eksogeni retrovirusi, kot je HIV. Ti retrotranspozoni poleg LTR zaporedja vključujejo regije gag, pol in env. Gen gag kodira proteine za ovojnico retrotranspozonskega delca. Pol pa prestavlja gen za reverzno transkriptazo, integrazo in proteazo. HERV vsebuje tudi gen, ki kodira protein env oziroma ostanek njihovega eksogenega retrovirusnega izvora pred vstavitvijo in endogenizacijo v zarodne celice. Pokazalo se je, da transkripcijsko aktivne poddružine HERV prispevajo k različnim patofiziološkim motnjam. Leta 1993 so prišli do ugotovitve, da dodatek virusa herpes simpleksa tipa 1 (HSV-1) celicam izoliranim od bolnika z multiplo sklerozo, povzroči močno stimulacijo aktivnosti specifične reverzne transkriptaze. Iz tega so sklepali da je prvotno zaporedje retrovirusa, povezaneg z multiplo sklerozo (MSRV), zelo zastopano v človeški DNK in tako odkrili poddružine skupine HERV, ki prispevajo k patologiji različnih nevroloških motnjah.

=== LINE-1 RETROTRANSPOZONI ===

Transpozoni LINE-1 so avtonomni retrotranspozoni, ki jih vsebuje človeški genom. Večina kopij LINE-1 je nepremičnih i njih ni mogoče retrotransponirati, bodisi zaradi 5' skrajšanja ali inverzij, uvedenih v zaporedje. Retrotranspozicijsko kompetentna LINE-1 ( RC LINE-1) je dolga 6kb in vsebuje 5' neprevedeno regijo (5' UTR), dva odprta bralna okvirja ( ORF1/2) in 3' UTR, prekinjeno s poli-A repom. ORF 1 predstavlja gen za protein, ki ima aktivnost spremenljevalca nukleinske kisline in RNA vezavno domeno. ORF2 kodira protein z encimsko aktivnostjo, ki je potreben za retrotranspozicijo LINE-1. ORF2p ima tako aktivnosti endonukleaze (EN) kot reverzne transkriptaze (RT). Transkripcija LINE-1 se začne na promotorju RNA olimeraze II ali natačneje znotraj prvih 100 baznih parov 5' UTR. Potem ko je prepisana, poliadenilirana LINE-1 mRNA se izvozi v citoplazmo, kjer se združi z proteini ORF1 in ORF2 in tvorijo komleks z ribonukleotidi (RNP). Potem se uvozi v jedro, da se začne obratna transkripcija in integracija. EN zareže spodnjo verigo DNK in izpostavi 3' OH, ki služi kot primer za RT za nastanek cDNA iz LINE-1 mRNA.

Heterogenost insercijskih preferenc in porazdelitev retrotranspozonov med različnimi populacijami:
Po različnih študijah so ugotovili, da pri integracji LINE1 ne ciljajo na izražene gene, odprt kromatin, ampak se namesto tega povezujejo z replikacijo DNK gostitelja. Te ugotovitve zagotavljajo prve namige, da sta integracija LINE-1 in replikacija DNK lahko mehansko povezani. Obstaja heterogenost v porazdelitvi endogenih retrotranspozonov po različnih človeških populacijah: od prisotnosti/odsotnosti transpozona do polimorfizmov posameznih nukleotidov (SNP). Polimorfizmi pri vstavitvah retroelementov nastanejo bodisi v zarodni liniji bodisi zgodaj v embrionalnem razvoju. To omogoča genomski mozaizem znotraj določeneg posameznika ko kar med različnimi človeškimi populacijami.

== CELIČNI VPLIVI RETROTRANSPOZICIJE LINE-1 ==

Retrotranspozoni LINE-1 ustvarjajo strukturno nestabilnost znotraj genoma in posledično motijo izražanje gostiteljskega gena. Vstavitve LINE-1 lahko generirajo napačno spojene ali prezgodaj okrnjene transkripte, spodbujajo prekinitev transkripcije ali celo spodbujajo spremembe našega epigenoma. Retrotranspozoni, ki prispevajo k genomski variaciji, spreminjajo ekspresijo gostiteljskega gena na epigenetski, transkripcijski in translacijski ravni.

== CELIČNI ODZIVI NA RETROTRANSPOZICIJE ==
Glede na to, da lahko retroelementi vplivajo na celico na veliko načinov, se je gostiteljski genom razvil tako, da uporablja različne odzive za zaviranje njihove aktivnosti. Transkripcijsko represijo dosežemo z represivnimi epigenetskimi modifikacijami, kot je npr. metilacija DNA. Znatna hipometilacija med embriogenezo je povezana z višjimi stopnjami retrotranspozicije. V mišjih zarodkih, ki so bili izjemno hipometilirani, se genomska integriteta vzdržuje s pomočjo faktorja CAF-1, ki zamenja histon 3.3 s histonom 3.1/3.2, ki deluje kot represivni modifikator in ščiti zarodek od retrotranspozicijske aktivnosti. Ker transpozicijski elementi vsebujejo tudi vezavna mesta za transkripcijske faktorje, to omogoča specifično transkripcijsko regulacijo, kot način transkripcijske represije. Kruppel-associated box (KRAB), ki vsebuje proteine cinkovih prstov (KZFP), so ključni regulatorji transpozicijske aktivnosti, ki se vežejo na regulatorna zaporedja TE in zavirajo izražanje TE v zgodnjih zarodkih.

Post-transkripcijska regulacija LINE-1 elementov z majhnimi RNA kot so miRNA ali piRNA, je še en celični odziv na retrotranspozicijo. Majhne RNA molekule lahko delujejo preko tarčne razgradnje RNA. Od RNA induciran kompleks za utišanje (RISC) z uporabo endonukleolitične cepitve razgrajuje TE transkriptov in, če je Dicer protein, ki je sestaven del RISC kompleksa, mutiran, povzroča povečano transkripcijo LINE-1 elementov. Odkrili so da miRNA-128 omejuje aktivnost LINE-1 preko dveh mehanizmov: lahko direktno cilja na ORF2 RNA za razgradnjo ali cilja na 3’-UTR zaporedje kofaktorja TNPO1, ki olajša transport kompleksa LINE-1 RNP v jedro. piRNA so pomembni zaviralci aktivnosti TE v zarodni liniji. Vzajemno delujejo s poddružino PIWI nukleaz Argonaute in cepijo TE transkripte v citoplazmi.

LINE-1 RNP kompleks, ki je retrotranspozicijski intermediat, je tudi tarča za razgradnjo. Protein cinkovega prsta (ZAP) se veže z LINE-1 mRNA v citoplazemskih stresnih granulah, povzroči zgubljanje integritete RNP kompleksa in zavira retrotranspozicijo LINE-1. TUT7, ki je uridil transferaza, prenaša ostanke uridina na LINE-1 mRNA v citoplazmi, nato MOV10, ki je helikaza, premakne ORF1p, da omogoči uridilacijo in posledično zavirajo reverzne transkripcije ORF2p v jedru. Družina encimov APOBEC zavirajo retrotranspozijo, najverjetneje z destabilizacijo kompleksa RNP. Kljub številnim gostiteljskim mehanizmom za zaviranje retrotranspozicije, de novo insercije so še vedno prisotne v somatskih tkivih z znatno retrotranspozicijo v nevronskih linijah.

== LINE-1 V RAZVOJU PRI MOŽGANIH ==

Najzgodnejši dokumentirani primer somatske retrotranspozicije in vivo je bil v mišjih možganih. Nekaj let pozneje so odkrili endogeno LINE-1 mRNA v nevronskih matičnih celicah izoliranih iz možganov človeških plodov. S pomočjo RC-seq, visoko zmogljivo metodo sekvenciranja, ki cilja na 3’ in 5’ konca LINE-1, ki so jo uporabili na DNA ekstrahirane iz različnih tkiv, identificirali so bistveno več kopij ORF2 in LINE-1 CNV v hipokampusu v primerjavi s srcem in jetri istega posameznika. Zanimivo je, da so v nedavni analizi 24 hipokampalnih nevronov odkrili, da se somatske insercije, ki se pojavijo med nevrodiferenciacijo v matične celice človeškega zarodka, lahko pojavijo zaradi mutacije v Ying Yang 1 (YY1) vezavnem mestu za transkripcijski faktor. YY1 vezavno mesto v promotorski regiji LINE-1 posreduje pri metilaciji CpG otočkov in epigenetski represiji. Retrotranspozicija med nevronskim razvojem lahko prispeva k nevronski raznolikosti, saj omogoča varijacijo genomske DNA od celice do celice.

== MOBILNI ELEMENTI IN NEVRODEGENERATIVNE BOLEZNI ==

Amiotrofična lateralna skleroza(ALS) je nevrodegenerativna bolezen, za katero je značilna izguba zgornjih in spodnjih motoričnih nevronov. . Številne študije so ugotovile prisotnost retrovirusne aktivnosti reverzne transkriptaze v serumu bolnikov z ALS. V kortikalnih piramidnih in hrbteničnih nevronih v posmrtnem možganskem tkivu bolnikov z ALS opazimo večjo ekspresijo HERV K-Env ki je močni imunopatogeni protein ovojnice . Aktivacija gena za HERV-K posledično zmanjšuje dolžino dendrita in tudi razvejanost in kompleksnost motoričnih nevronov transgenih miši. Še ni znano, kaj sproži izražanje HERV-K pri odraslih nevronih.

Aktivacija retrotranspozona je bila povezana tudi s sporadično obliko Alzheimerjeve bolezni, vendar so raziskave pokazale nedosledne rezultate o tem, ali so LINE-1 povišane pri bolnikih. V nevronih bolnikov so odkrili mozaične genomske rekombinacije znotraj gena, povezanega z Alzheimerjevo boleznijo, amiloidnega prekurzorskega proteina (APP). Te različice niso imele introničnih zaporedij in so bile imenovane "genomske cDNA" (gencDNA). Predpostavili so da izvirajo iz RNA in da zahtevajo endogeno aktivnost reverzne transkriptaze da se vstavijo v prelome dvojnih verig.

Pri pojavi Parkinsonove bolezni (PD) je odkrito pet različnih strukturnih variacij v genu PRKN (parkin RBR E3 ubiquitin protein ligase). Predvideva se, da se strukturne variacije pojavijo z nealelno homologno rekombinacijo. LTR in ne-LTR retrotranspozonske sekvence so bile identificirane znotraj dveh kilobaz od točke prekinitve delecije. To lahko pomeni da so delecije morda nastale zaradi retrotranspozicije. Povezava med aktivacijo retrotranspozona pri nevrodegenerativnih boleznih ni v celoti ugotovljena.

== TRANSPOZICIJSKI ELEMENTI IN VNETJA ==

Malo je znanega o prispevku transpozonih elementov k imunskim odzivom, ki so izvzeti za virusne okužbe. Ko iamo prisotno DNA v citoplazmi npr. virusno DNA, sproži se aktivacija poti cGAS-STING. cGAS-STING posledično proizvaja interferone, ki sprožijo vnetni odziv. Interferonski odzivi so lahko mehansko povezani z deregulacijo proizvodnje retrotranspozona.
Vse je več dokazov, da imajo transpozoni vlogo pri sprožitvi nevroinflamacije. Detekcija endogene nukleinske kisline s strani imunskega sistema je v osnovah številnih avtoimunskih bolezni. Retrotranspozoni so povezani z boleznimi kot so Multiple skleroza in Aicardi-Goutièresovim sindromom, kot glavni vnetni efektorji.
Multipla skleroza je kronična avtoimunska bolezen, ki prizadene osrednje živčevje in za katero ni znanega zdravila. Za bolezen so značilne lezije v beli snovi, ki vodijo do razgradnje krvno-možganske pregrade in aksonskih motenj po hrbtenjači. Izražanje HERV proteina se šteje za dejavnik za napredovanje bolezni. Iz supernatantov celične kulture vzorcev bolnikov so izolirani retrovirusima podobni delci, in je bilo dokazano da izvirajo iz elementov HERV.
Pri sistemskom eritematoznem lupusu je ugotovljena povišana transkripcija HERV. V študijah so pokazali da so ravni ekspresije mRNA HERV-E v celicah CD4+ T lupusa višje kot v zdravih celicah. Še ni znan popoln prispevek aktivnosti HERV.

Motnje avtističnega spectra so razvojne motnje, ki ovirajo komunikacijo in vedenje. Ugotovljeno je da je pri bolnikih bila zmanjšanja metilacija in povečano izražanje LINE-1 v možganih. Vse je več dokazov da lahko kronično vnetje prispeva k simptomatologiji avtizma.

Rettov sindrom je X-povezana progresivna nevrorazvojna motnja z avtističnimi značilnostmi. Pri Rettovom sindromu imamo prisotne različne mutacije v metil CpG vezavnem proteinu-2 (MeCP2). Analizirani vzorci možganskega tkiva ob smrti so pokazali višje genomske sekvence LINE-1 ORF2 pri bolnikih.
Aicardi-Goutièresov sindrom je progresivna vnetna motnja, ki prizadene novorojenčke in ima za posledico hudo duševno in telesno prizadetost ter močno skrajšano življenjsko dobo. Lahko nastane zaradi mutacij v TREX1(three-prime repair exonuclease 1). TREX1 deluje tako, da razgradi dvoverižno DNA(dsDNA)/enoverižno DNA(ssDNA). Mutacije v genu povzročijo znatno kopičenje vrst DNA v citoplazmi, ki sprožijo prirojen imunski odziv, kot je indukcija interferona. Večina teh vrst DNA je sestavljena iz citoplazemske ssDNA LINE-1. V nevronskih celicah mišjih s pomanjkanjem TREX-1 se izrazilo 70 % več elementov LINE-1Hs .

Talk:TE pri vnetnih boleznih

2022-05-08T10:12:53Z

Kostadin Mitkov: New page: '''Kostadin Mitkov''': Uvod, Celični odzivi na retrotranspozicije, LINE-1 v razvoju pri možganih '''Ena Kartal''': Transpozicijski elementi, Celični vplivi retrotranspozicije LINE-1 '...

TE pri vnetnih boleznih

2022-05-08T10:07:55Z

Kostadin Mitkov:

== UVOD ==

Transpozicijski elementi (TE) so mobilni elementi DNA, ki se lahko replicirajo in vstavijo na različne lokacije znotraj gostiteljskega genoma. Retrotranspozoni so transpozicijski elementi, ki se mobilizirajo preko RNA intermediatov s pomočjo reverzne transkriptaze. HERV in LINE-1 sta dve glavni vrsti retrotranspozonov. Njuni inserciji sta se kopičili skozi evolucijo, dokler so se gostiteljski genomi razvijali in z uporabo različnih dejavnikov so zavirali njuni aktivnosti. Znanstveniki so odkrili, da transpozicijski elementi bolj prispevajo k patogenezi človeških bolezni, kot so do takrat mislili.

== TRANSPOZICIJSKI ELEMENTI ==

Transpozicijski elemnti obsegajo vsaj 45% človeškega genoma, medtem ko kodirajoče zaporedje zasede manj kot 3% genoma. Razvrščamo jih kot transpozoni, ki o ves čas v obliki DNA (II razred) in retrotranspozoni, ki za izvedbo traspozicije potrebujejo RNA-intermediat (I razred). Transpozoni II razreda delujejo po mehanizmu „izreži in prilepi“, pri čemer se zaporedje s pomočjo encima transpozaze izreže iz ene regije in integrira v drugo določeno regijo v genomu. Retrotranspozoni pa delujejo po mehanizmu „kopiraj in prilepi“ kar omogoča aktivnim retrotranspozonim, da ohanijo svojo prvotno lokacijo v genomu, medtem ko kopičijo število kopij drugje. Te retrotranspozone pa lahko razdelimo v dve skupini LTR in ne-LTR. V LTR skupino pa uvrščamo človeške endogene retroviruse (HERV) in retrotranspozone pri sesalcih (MaLR). Ne-LTR pa razvrčamo v dva podtipa: LINE (Long Interspersed Nuclear Elements) in SINE (Short Interspersed Nuclear Elements).

=== HERV ===

HERV retrotranspozoni imajo podobno genomsko strukturo kot eksogeni retrovirusi, kot je HIV. Ti retrotranspozoni poleg LTR zaporedja vključujejo regije gag, pol in env. Gen gag kodira proteine za ovojnico retrotranspozonskega delca. Pol pa prestavlja gen za reverzno transkriptazo, integrazo in proteazo. HERV vsebuje tudi gen, ki kodira protein env oziroma ostanek njihovega eksogenega retrovirusnega izvora pred vstavitvijo in endogenizacijo v zarodne celice. Pokazalo se je, da transkripcijsko aktivne poddružine HERV prispevajo k različnim patofiziološkim motnjam. Leta 1993 so prišli do ugotovitve, da dodatek virusa herpes simpleksa tipa 1 (HSV-1) celicam izoliranim od bolnika z multiplo sklerozo, povzroči močno stimulacijo aktivnosti specifične reverzne transkriptaze. Iz tega so sklepali da je prvotno zaporedje retrovirusa, povezaneg z multiplo sklerozo (MSRV), zelo zastopano v človeški DNK in tako odkrili poddružine skupine HERV, ki prispevajo k patologiji različnih nevroloških motnjah.

=== LINE-1 RETROTRANSPOZONI ===

Transpozoni LINE-1 so avtonomni retrotranspozoni, ki jih vsebuje človeški genom. Večina kopij LINE-1 je nepremičnih i njih ni mogoče retrotransponirati, bodisi zaradi 5' skrajšanja ali inverzij, uvedenih v zaporedje. Retrotranspozicijsko kompetentna LINE-1 ( RC LINE-1) je dolga 6kb in vsebuje 5' neprevedeno regijo (5' UTR), dva odprta bralna okvirja ( ORF1/2) in 3' UTR, prekinjeno s poli-A repom. ORF 1 predstavlja gen za protein, ki ima aktivnost spremenljevalca nukleinske kisline in RNA vezavno domeno. ORF2 kodira protein z encimsko aktivnostjo, ki je potreben za retrotranspozicijo LINE-1. ORF2p ima tako aktivnosti endonukleaze (EN) kot reverzne transkriptaze (RT). Transkripcija LINE-1 se začne na promotorju RNA olimeraze II ali natačneje znotraj prvih 100 baznih parov 5' UTR. Potem ko je prepisana, poliadenilirana LINE-1 mRNA se izvozi v citoplazmo, kjer se združi z proteini ORF1 in ORF2 in tvorijo komleks z ribonukleotidi (RNP). Potem se uvozi v jedro, da se začne obratna transkripcija in integracija. EN zareže spodnjo verigo DNK in izpostavi 3' OH, ki služi kot primer za RT za nastanek cDNA iz LINE-1 mRNA.

Heterogenost insercijskih preferenc in porazdelitev retrotranspozonov med različnimi populacijami:
Po različnih študijah so ugotovili, da pri integracji LINE1 ne ciljajo na izražene gene, odprt kromatin, ampak se namesto tega povezujejo z replikacijo DNK gostitelja. Te ugotovitve zagotavljajo prve namige, da sta integracija LINE-1 in replikacija DNK lahko mehansko povezani. Obstaja heterogenost v porazdelitvi endogenih retrotranspozonov po različnih človeških populacijah: od prisotnosti/odsotnosti transpozona do polimorfizmov posameznih nukleotidov (SNP). Polimorfizmi pri vstavitvah retroelementov nastanejo bodisi v zarodni liniji bodisi zgodaj v embrionalnem razvoju. To omogoča genomski mozaizem znotraj določeneg posameznika ko kar med različnimi človeškimi populacijami.

== CELIČNI VPLIVI RETROTRANSPOZICIJE LINE-1 ==

Retrotranspozoni LINE-1 ustvarjajo strukturno nestabilnost znotraj genoma in posledično motijo izražanje gostiteljskega gena. Vstavitve LINE-1 lahko generirajo napačno spojene ali prezgodaj okrnjene transkripte, spodbujajo prekinitev transkripcije ali celo spodbujajo spremembe našega epigenoma. Retrotranspozoni, ki prispevajo k genomski variaciji, spreminjajo ekspresijo gostiteljskega gena na epigenetski, transkripcijski in translacijski ravni.

== CELIČNI ODZIVI NA RETROTRANSPOZICIJE ==
Glede na to, da lahko retroelementi vplivajo na celico na veliko načinov, se je gostiteljski genom razvil tako, da uporablja različne odzive za zaviranje njihove aktivnosti. Transkripcijsko represijo dosežemo z represivnimi epigenetskimi modifikacijami, kot je npr. metilacija DNA. Znatna hipometilacija med embriogenezo je povezana z višjimi stopnjami retrotranspozicije. V mišjih zarodkih, ki so bili izjemno hipometilirani, se genomska integriteta vzdržuje s pomočjo faktorja CAF-1, ki zamenja histon 3.3 s histonom 3.1/3.2, ki deluje kot represivni modifikator in ščiti zarodek od retrotranspozicijske aktivnosti. Ker transpozicijski elementi vsebujejo tudi vezavna mesta za transkripcijske faktorje, to omogoča specifično transkripcijsko regulacijo, kot način transkripcijske represije. Kruppel-associated box (KRAB), ki vsebuje proteine cinkovih prstov (KZFP), so ključni regulatorji transpozicijske aktivnosti, ki se vežejo na regulatorna zaporedja TE in zavirajo izražanje TE v zgodnjih zarodkih.

Post-transkripcijska regulacija LINE-1 elementov z majhnimi RNA kot so miRNA ali piRNA, je še en celični odziv na retrotranspozicijo. Majhne RNA molekule lahko delujejo preko tarčne razgradnje RNA. Od RNA induciran kompleks za utišanje (RISC) z uporabo endonukleolitične cepitve razgrajuje TE transkriptov in, če je Dicer protein, ki je sestaven del RISC kompleksa, mutiran, povzroča povečano transkripcijo LINE-1 elementov. Odkrili so da miRNA-128 omejuje aktivnost LINE-1 preko dveh mehanizmov: lahko direktno cilja na ORF2 RNA za razgradnjo ali cilja na 3’-UTR zaporedje kofaktorja TNPO1, ki olajša transport kompleksa LINE-1 RNP v jedro. piRNA so pomembni zaviralci aktivnosti TE v zarodni liniji. Vzajemno delujejo s poddružino PIWI nukleaz Argonaute in cepijo TE transkripte v citoplazmi.

LINE-1 RNP kompleks, ki je retrotranspozicijski intermediat, je tudi tarča za razgradnjo. Protein cinkovega prsta (ZAP) se veže z LINE-1 mRNA v citoplazemskih stresnih granulah, povzroči zgubljanje integritete RNP kompleksa in zavira retrotranspozicijo LINE-1. TUT7, ki je uridil transferaza, prenaša ostanke uridina na LINE-1 mRNA v citoplazmi, nato MOV10, ki je helikaza, premakne ORF1p, da omogoči uridilacijo in posledično zavirajo reverzne transkripcije ORF2p v jedru. Družina encimov APOBEC zavirajo retrotranspozijo, najverjetneje z destabilizacijo kompleksa RNP. Kljub številnim gostiteljskim mehanizmom za zaviranje retrotranspozicije, de novo insercije so še vedno prisotne v somatskih tkivih z znatno retrotranspozicijo v nevronskih linijah.

== LINE-1 V RAZVOJU PRI MOŽGANIH ==

Najzgodnejši dokumentirani primer somatske retrotranspozicije in vivo je bil v mišjih možganih. Nekaj let pozneje so odkrili endogeno LINE-1 mRNA v nevronskih matičnih celicah izoliranih iz možganov človeških plodov. S pomočjo RC-seq, visoko zmogljivo metodo sekvenciranja, ki cilja na 3’ in 5’ konca LINE-1, ki so jo uporabili na DNA ekstrahirane iz različnih tkiv, identificirali so bistveno več kopij ORF2 in LINE-1 CNV v hipokampusu v primerjavi s srcem in jetri istega posameznika. Zanimivo je, da so v nedavni analizi 24 hipokampalnih nevronov odkrili, da se somatske insercije, ki se pojavijo med nevrodiferenciacijo v matične celice človeškega zarodka, lahko pojavijo zaradi mutacije v Ying Yang 1 (YY1) vezavnem mestu za transkripcijski faktor. YY1 vezavno mesto v promotorski regiji LINE-1 posreduje pri metilaciji CpG otočkov in epigenetski represiji. Retrotranspozicija med nevronskim razvojem lahko prispeva k nevronski raznolikosti, saj omogoča varijacijo genomske DNA od celice do celice.

== MOBILNI ELEMENTI IN NEVRODEGENERATIVNE BOLEZNI ==

Amiotrofična lateralna skleroza(ALS) je nevrodegenerativna bolezen, za katero je značilna izguba zgornjih in spodnjih motoričnih nevronov. . Številne študije so ugotovile prisotnost retrovirusne aktivnosti reverzne transkriptaze v serumu bolnikov z ALS. V kortikalnih piramidnih in hrbteničnih nevronih v posmrtnem možganskem tkivu bolnikov z ALS opazimo večjo ekspresijo HERV K-Env ki je močni imunopatogeni protein ovojnice . Aktivacija gena za HERV-K posledično zmanjšuje dolžino dendrita in tudi razvejanost in kompleksnost motoričnih nevronov transgenih miši. Še ni znano, kaj sproži izražanje HERV-K pri odraslih nevronih.
Aktivacija retrotranspozona je bila povezana tudi s sporadično obliko Alzheimerjeve bolezni, vendar so raziskave pokazale nedosledne rezultate o tem, ali so LINE-1 povišane pri bolnikih. V nevronih bolnikov so odkrili mozaične genomske rekombinacije znotraj gena, povezanega z Alzheimerjevo boleznijo, amiloidnega prekurzorskega proteina (APP). Te različice niso imele introničnih zaporedij in so bile imenovane "genomske cDNA" (gencDNA). Predpostavili so da izvirajo iz RNA in da zahtevajo endogeno aktivnost reverzne transkriptaze da se vstavijo v prelome dvojnih verig.
Pri pojavi Parkinsonove bolezni (PD) je odkrito pet različnih strukturnih variacij v genu PRKN (parkin RBR E3 ubiquitin protein ligase). Predvideva se, da se strukturne variacije pojavijo z nealelno homologno rekombinacijo. LTR in ne-LTR retrotranspozonske sekvence so bile identificirane znotraj dveh kilobaz od točke prekinitve delecije. To lahko pomeni da so delecije morda nastale zaradi retrotranspozicije. Povezava med aktivacijo retrotranspozona pri nevrodegenerativnih boleznih ni v celoti ugotovljena.

== TRANSPOZICIJSKI ELEMENTI IN VNETJA ==

Malo je znanega o prispevku transpozonih elementov k imunskim odzivom, ki so izvzeti za virusne okužbe. Ko iamo prisotno DNA v citoplazmi npr. virusno DNA, sproži se aktivacija poti cGAS-STING. cGAS-STING posledično proizvaja interferone, ki sprožijo vnetni odziv. Interferonski odzivi so lahko mehansko povezani z deregulacijo proizvodnje retrotranspozona.
Vse je več dokazov, da imajo transpozoni vlogo pri sprožitvi nevroinflamacije. Detekcija endogene nukleinske kisline s strani imunskega sistema je v osnovah številnih avtoimunskih bolezni. Retrotranspozoni so povezani z boleznimi kot so Multiple skleroza in Aicardi-Goutièresovim sindromom, kot glavni vnetni efektorji.
Multipla skleroza je kronična avtoimunska bolezen, ki prizadene osrednje živčevje in za katero ni znanega zdravila. Za bolezen so značilne lezije v beli snovi, ki vodijo do razgradnje krvno-možganske pregrade in aksonskih motenj po hrbtenjači. Izražanje HERV proteina se šteje za dejavnik za napredovanje bolezni. Iz supernatantov celične kulture vzorcev bolnikov so izolirani retrovirusima podobni delci, in je bilo dokazano da izvirajo iz elementov HERV.
Pri sistemskom eritematoznem lupusu je ugotovljena povišana transkripcija HERV. V študijah so pokazali da so ravni ekspresije mRNA HERV-E v celicah CD4+ T lupusa višje kot v zdravih celicah. Še ni znan popoln prispevek aktivnosti HERV.
Motnje avtističnega spectra so razvojne motnje, ki ovirajo komunikacijo in vedenje. Ugotovljeno je da je pri bolnikih bila zmanjšanja metilacija in povečano izražanje LINE-1 v možganih. Vse je več dokazov da lahko kronično vnetje prispeva k simptomatologiji avtizma.
Rettov sindrom je X-povezana progresivna nevrorazvojna motnja z avtističnimi značilnostmi. Pri Rettovom sindromu imamo prisotne različne mutacije v metil CpG vezavnem proteinu-2 (MeCP2). Analizirani vzorci možganskega tkiva ob smrti so pokazali višje genomske sekvence LINE-1 ORF2 pri bolnikih.
Aicardi-Goutièresov sindrom je progresivna vnetna motnja, ki prizadene novorojenčke in ima za posledico hudo duševno in telesno prizadetost ter močno skrajšano življenjsko dobo. Lahko nastane zaradi mutacij v TREX1(three-prime repair exonuclease 1). TREX1 deluje tako, da razgradi dvoverižno DNA(dsDNA)/enoverižno DNA(ssDNA). Mutacije v genu povzročijo znatno kopičenje vrst DNA v citoplazmi, ki sprožijo prirojen imunski odziv, kot je indukcija interferona. Večina teh vrst DNA je sestavljena iz citoplazemske ssDNA LINE-1. V nevronskih celicah mišjih s pomanjkanjem TREX-1 se izrazilo 70 % več elementov LINE-1Hs .

TE pri vnetnih boleznih

2022-05-08T10:05:24Z

Kostadin Mitkov: New page: == UVOD == Transpozicijski elementi (TE) so mobilni elementi DNA, ki se lahko replicirajo in vstavijo na različne lokacije znotraj gostiteljskega genoma. Retrotranspozoni so transpozici...

== UVOD ==

Transpozicijski elementi (TE) so mobilni elementi DNA, ki se lahko replicirajo in vstavijo na različne lokacije znotraj gostiteljskega genoma. Retrotranspozoni so transpozicijski elementi, ki se mobilizirajo preko RNA intermediatov s pomočjo reverzne transkriptaze. HERV in LINE-1 sta dve glavni vrsti retrotranspozonov. Njuni inserciji sta se kopičili skozi evolucijo, dokler so se gostiteljski genomi razvijali in z uporabo različnih dejavnikov so zavirali njuni aktivnosti. Znanstveniki so odkrili, da transpozicijski elementi bolj prispevajo k patogenezi človeških bolezni, kot so do takrat mislili.

== TRANSPOZICIJSKI ELEMENTI ==

Transpozicijski elemnti obsegajo vsaj 45% človeškega genoma, medtem ko kodirajoče zaporedje zasede manj kot 3% genoma. Razvrščamo jih kot transpozoni, ki o ves čas v obliki DNA (II razred) in retrotranspozoni, ki za izvedbo traspozicije potrebujejo RNA-intermediat (I razred). Transpozoni II razreda delujejo po mehanizmu „izreži in prilepi“, pri čemer se zaporedje s pomočjo encima transpozaze izreže iz ene regije in integrira v drugo določeno regijo v genomu. Retrotranspozoni pa delujejo po mehanizmu „kopiraj in prilepi“ kar omogoča aktivnim retrotranspozonim, da ohanijo svojo prvotno lokacijo v genomu, medtem ko kopičijo število kopij drugje. Te retrotranspozone pa lahko razdelimo v dve skupini LTR in ne-LTR. V LTR skupino pa uvrščamo človeške endogene retroviruse (HERV) in retrotranspozone pri sesalcih (MaLR). Ne-LTR pa razvrčamo v dva podtipa: LINE (Long Interspersed Nuclear Elements) in SINE (Short Interspersed Nuclear Elements).

=== HERV ===

HERV retrotranspozoni imajo podobno genomsko strukturo kot eksogeni retrovirusi, kot je HIV. Ti retrotranspozoni poleg LTR zaporedja vključujejo regije gag, pol in env (slika 1). Gen gag kodira proteine za ovojnico retrotranspozonskega delca. Pol pa prestavlja gen za reverzno transkriptazo, integrazo in proteazo. HERV vsebuje tudi gen, ki kodira protein env oziroma ostanek njihovega eksogenega retrovirusnega izvora pred vstavitvijo in endogenizacijo v zarodne celice. Pokazalo se je, da transkripcijsko aktivne poddružine HERV prispevajo k različnim patofiziološkim motnjam. Leta 1993 so prišli do ugotovitve, da dodatek virusa herpes simpleksa tipa 1 (HSV-1) celicam izoliranim od bolnika z multiplo sklerozo, povzroči močno stimulacijo aktivnosti specifične reverzne transkriptaze. Iz tega so sklepali da je prvotno zaporedje retrovirusa, povezaneg z multiplo sklerozo (MSRV), zelo zastopano v človeški DNK in tako odkrili poddružine skupine HERV, ki prispevajo k patologiji različnih nevroloških motnjah.

=== LINE-1 RETROTRANSPOZONI ===

Transpozoni LINE-1 so avtonomni retrotranspozoni, ki jih vsebuje človeški genom. Večina kopij LINE-1 je nepremičnih i njih ni mogoče retrotransponirati, bodisi zaradi 5' skrajšanja ali inverzij, uvedenih v zaporedje. Retrotranspozicijsko kompetentna LINE-1 ( RC LINE-1) je dolga 6kb in vsebuje 5' neprevedeno regijo (5' UTR), dva odprta bralna okvirja ( ORF1/2) in 3' UTR, prekinjeno s poli-A repom. ORF 1 predstavlja gen za protein, ki ima aktivnost spremenljevalca nukleinske kisline in RNA vezavno domeno. ORF2 kodira protein z encimsko aktivnostjo, ki je potreben za retrotranspozicijo LINE-1. ORF2p ima tako aktivnosti endonukleaze (EN) kot reverzne transkriptaze (RT). Transkripcija LINE-1 se začne na promotorju RNA olimeraze II ali natačneje znotraj prvih 100 baznih parov 5' UTR. Potem ko je prepisana, poliadenilirana LINE-1 mRNA se izvozi v citoplazmo, kjer se združi z proteini ORF1 in ORF2 in tvorijo komleks z ribonukleotidi (RNP). Potem se uvozi v jedro, da se začne obratna transkripcija in integracija. EN zareže spodnjo verigo DNK in izpostavi 3' OH, ki služi kot primer za RT za nastanek cDNA iz LINE-1 mRNA.

Heterogenost insercijskih preferenc in porazdelitev retrotranspozonov med različnimi populacijami:
Po različnih študijah so ugotovili, da pri integracji LINE1 ne ciljajo na izražene gene, odprt kromatin, ampak se namesto tega povezujejo z replikacijo DNK gostitelja. Te ugotovitve zagotavljajo prve namige, da sta integracija LINE-1 in replikacija DNK lahko mehansko povezani. Obstaja heterogenost v porazdelitvi endogenih retrotranspozonov po različnih človeških populacijah: od prisotnosti/odsotnosti transpozona do polimorfizmov posameznih nukleotidov (SNP). Polimorfizmi pri vstavitvah retroelementov nastanejo bodisi v zarodni liniji bodisi zgodaj v embrionalnem razvoju. To omogoča genomski mozaizem znotraj določeneg posameznika ko kar med različnimi človeškimi populacijami.

== CELIČNI VPLIVI RETROTRANSPOZICIJE LINE-1 ==

Retrotranspozoni LINE-1 ustvarjajo strukturno nestabilnost znotraj genoma in posledično motijo izražanje gostiteljskega gena. Vstavitve LINE-1 lahko generirajo napačno spojene ali prezgodaj okrnjene transkripte, spodbujajo prekinitev transkripcije ali celo spodbujajo spremembe našega epigenoma. Retrotranspozoni, ki prispevajo k genomski variaciji, spreminjajo ekspresijo gostiteljskega gena na epigenetski, transkripcijski in translacijski ravni.

== CELIČNI ODZIVI NA RETROTRANSPOZICIJE ==
Glede na to, da lahko retroelementi vplivajo na celico na veliko načinov, se je gostiteljski genom razvil tako, da uporablja različne odzive za zaviranje njihove aktivnosti. Transkripcijsko represijo dosežemo z represivnimi epigenetskimi modifikacijami, kot je npr. metilacija DNA. Znatna hipometilacija med embriogenezo je povezana z višjimi stopnjami retrotranspozicije. V mišjih zarodkih, ki so bili izjemno hipometilirani, se genomska integriteta vzdržuje s pomočjo faktorja CAF-1, ki zamenja histon 3.3 s histonom 3.1/3.2, ki deluje kot represivni modifikator in ščiti zarodek od retrotranspozicijske aktivnosti. Ker transpozicijski elementi vsebujejo tudi vezavna mesta za transkripcijske faktorje, to omogoča specifično transkripcijsko regulacijo, kot način transkripcijske represije. Kruppel-associated box (KRAB), ki vsebuje proteine cinkovih prstov (KZFP), so ključni regulatorji transpozicijske aktivnosti, ki se vežejo na regulatorna zaporedja TE in zavirajo izražanje TE v zgodnjih zarodkih.
Post-transkripcijska regulacija LINE-1 elementov z majhnimi RNA kot so miRNA ali piRNA, je še en celični odziv na retrotranspozicijo. Majhne RNA molekule lahko delujejo preko tarčne razgradnje RNA. Od RNA induciran kompleks za utišanje (RISC) z uporabo endonukleolitične cepitve razgrajuje TE transkriptov in, če je Dicer protein, ki je sestaven del RISC kompleksa, mutiran, povzroča povečano transkripcijo LINE-1 elementov. Odkrili so da miRNA-128 omejuje aktivnost LINE-1 preko dveh mehanizmov: lahko direktno cilja na ORF2 RNA za razgradnjo ali cilja na 3’-UTR zaporedje kofaktorja TNPO1, ki olajša transport kompleksa LINE-1 RNP v jedro. piRNA so pomembni zaviralci aktivnosti TE v zarodni liniji. Vzajemno delujejo s poddružino PIWI nukleaz Argonaute in cepijo TE transkripte v citoplazmi.
LINE-1 RNP kompleks, ki je retrotranspozicijski intermediat, je tudi tarča za razgradnjo. Protein cinkovega prsta (ZAP) se veže z LINE-1 mRNA v citoplazemskih stresnih granulah, povzroči zgubljanje integritete RNP kompleksa in zavira retrotranspozicijo LINE-1. TUT7, ki je uridil transferaza, prenaša ostanke uridina na LINE-1 mRNA v citoplazmi, nato MOV10, ki je helikaza, premakne ORF1p, da omogoči uridilacijo in posledično zavirajo reverzne transkripcije ORF2p v jedru. Družina encimov APOBEC zavirajo retrotranspozijo, najverjetneje z destabilizacijo kompleksa RNP. Kljub številnim gostiteljskim mehanizmom za zaviranje retrotranspozicije, de novo insercije so še vedno prisotne v somatskih tkivih z znatno retrotranspozicijo v nevronskih linijah.

== LINE-1 V RAZVOJU PRI MOŽGANIH ==

Najzgodnejši dokumentirani primer somatske retrotranspozicije in vivo je bil v mišjih možganih. Nekaj let pozneje so odkrili endogeno LINE-1 mRNA v nevronskih matičnih celicah izoliranih iz možganov človeških plodov. S pomočjo RC-seq, visoko zmogljivo metodo sekvenciranja, ki cilja na 3’ in 5’ konca LINE-1, ki so jo uporabili na DNA ekstrahirane iz različnih tkiv, identificirali so bistveno več kopij ORF2 in LINE-1 CNV v hipokampusu v primerjavi s srcem in jetri istega posameznika. Zanimivo je, da so v nedavni analizi 24 hipokampalnih nevronov odkrili, da se somatske insercije, ki se pojavijo med nevrodiferenciacijo v matične celice človeškega zarodka, lahko pojavijo zaradi mutacije v Ying Yang 1 (YY1) vezavnem mestu za transkripcijski faktor. YY1 vezavno mesto v promotorski regiji LINE-1 posreduje pri metilaciji CpG otočkov in epigenetski represiji. Retrotranspozicija med nevronskim razvojem lahko prispeva k nevronski raznolikosti, saj omogoča varijacijo genomske DNA od celice do celice.

== MOBILNI ELEMENTI IN NEVRODEGENERATIVNE BOLEZNI ==

Amiotrofična lateralna skleroza(ALS) je nevrodegenerativna bolezen, za katero je značilna izguba zgornjih in spodnjih motoričnih nevronov. . Številne študije so ugotovile prisotnost retrovirusne aktivnosti reverzne transkriptaze v serumu bolnikov z ALS. V kortikalnih piramidnih in hrbteničnih nevronih v posmrtnem možganskem tkivu bolnikov z ALS opazimo večjo ekspresijo HERV K-Env ki je močni imunopatogeni protein ovojnice . Aktivacija gena za HERV-K posledično zmanjšuje dolžino dendrita in tudi razvejanost in kompleksnost motoričnih nevronov transgenih miši. Še ni znano, kaj sproži izražanje HERV-K pri odraslih nevronih.
Aktivacija retrotranspozona je bila povezana tudi s sporadično obliko Alzheimerjeve bolezni, vendar so raziskave pokazale nedosledne rezultate o tem, ali so LINE-1 povišane pri bolnikih. V nevronih bolnikov so odkrili mozaične genomske rekombinacije znotraj gena, povezanega z Alzheimerjevo boleznijo, amiloidnega prekurzorskega proteina (APP). Te različice niso imele introničnih zaporedij in so bile imenovane "genomske cDNA" (gencDNA). Predpostavili so da izvirajo iz RNA in da zahtevajo endogeno aktivnost reverzne transkriptaze da se vstavijo v prelome dvojnih verig.
Pri pojavi Parkinsonove bolezni (PD) je odkrito pet različnih strukturnih variacij v genu PRKN (parkin RBR E3 ubiquitin protein ligase). Predvideva se, da se strukturne variacije pojavijo z nealelno homologno rekombinacijo. LTR in ne-LTR retrotranspozonske sekvence so bile identificirane znotraj dveh kilobaz od točke prekinitve delecije. To lahko pomeni da so delecije morda nastale zaradi retrotranspozicije. Povezava med aktivacijo retrotranspozona pri nevrodegenerativnih boleznih ni v celoti ugotovljena.

== TRANSPOZICIJSKI ELEMENTI IN VNETJA ==

Malo je znanega o prispevku transpozonih elementov k imunskim odzivom, ki so izvzeti za virusne okužbe. Ko iamo prisotno DNA v citoplazmi npr. virusno DNA, sproži se aktivacija poti cGAS-STING. cGAS-STING posledično proizvaja interferone, ki sprožijo vnetni odziv. Interferonski odzivi so lahko mehansko povezani z deregulacijo proizvodnje retrotranspozona.
Vse je več dokazov, da imajo transpozoni vlogo pri sprožitvi nevroinflamacije. Detekcija endogene nukleinske kisline s strani imunskega sistema je v osnovah številnih avtoimunskih bolezni. Retrotranspozoni so povezani z boleznimi kot so Multiple skleroza in Aicardi-Goutièresovim sindromom, kot glavni vnetni efektorji.
Multipla skleroza je kronična avtoimunska bolezen, ki prizadene osrednje živčevje in za katero ni znanega zdravila. Za bolezen so značilne lezije v beli snovi, ki vodijo do razgradnje krvno-možganske pregrade in aksonskih motenj po hrbtenjači. Izražanje HERV proteina se šteje za dejavnik za napredovanje bolezni. Iz supernatantov celične kulture vzorcev bolnikov so izolirani retrovirusima podobni delci, in je bilo dokazano da izvirajo iz elementov HERV.
Pri sistemskom eritematoznem lupusu je ugotovljena povišana transkripcija HERV. V študijah so pokazali da so ravni ekspresije mRNA HERV-E v celicah CD4+ T lupusa višje kot v zdravih celicah. Še ni znan popoln prispevek aktivnosti HERV.
Motnje avtističnega spectra so razvojne motnje, ki ovirajo komunikacijo in vedenje. Ugotovljeno je da je pri bolnikih bila zmanjšanja metilacija in povečano izražanje LINE-1 v možganih. Vse je več dokazov da lahko kronično vnetje prispeva k simptomatologiji avtizma.
Rettov sindrom je X-povezana progresivna nevrorazvojna motnja z avtističnimi značilnostmi. Pri Rettovom sindromu imamo prisotne različne mutacije v metil CpG vezavnem proteinu-2 (MeCP2). Analizirani vzorci možganskega tkiva ob smrti so pokazali višje genomske sekvence LINE-1 ORF2 pri bolnikih.
Aicardi-Goutièresov sindrom je progresivna vnetna motnja, ki prizadene novorojenčke in ima za posledico hudo duševno in telesno prizadetost ter močno skrajšano življenjsko dobo. Lahko nastane zaradi mutacij v TREX1(three-prime repair exonuclease 1). TREX1 deluje tako, da razgradi dvoverižno DNA(dsDNA)/enoverižno DNA(ssDNA). Mutacije v genu povzročijo znatno kopičenje vrst DNA v citoplazmi, ki sprožijo prirojen imunski odziv, kot je indukcija interferona. Večina teh vrst DNA je sestavljena iz citoplazemske ssDNA LINE-1. V nevronskih celicah mišjih s pomanjkanjem TREX-1 se izrazilo 70 % več elementov LINE-1Hs .

BIO2 Povzetki seminarjev 2021

2022-01-02T18:35:59Z

Kostadin Mitkov: /* POVZETKI SEMINARJEV BIOKEMIJA 2021/22 */

= POVZETKI SEMINARJEV BIOKEMIJA 2021/22 =

==Klara Ažbe - Vpliv metabolitov Krebsovega cikla na fiziologijo in bolezni==

Mitohondrij je celični organel, ki pomembno prispeva k delovanju celice. Njegova glavna naloga je proizvodnja energije, poleg tega pa ne smemo zanemariti vloge stranskih produktov, ki ob proizvodnji energije nastanejo. Pri pridobivanje energije ima pomembno vlogo Krebsov cikel, v katerem nastane kar nekaj metabolitov. Njihova pomembnost je bila prvotno prepoznana pri sintezi makromolekul (nukleotidov, proteinov, lipidov), kasneje pa se je izkazalo, da so tudi zelo pomembne signalne molekule, ki nadzorujejo modifikacije kromatina, hipoksični odziv, metilacije DNA in imunski odziv. Količina posameznega intermediata je v celici natančno regulirana, vendar pa se lahko zgodi, da pride do določene mutacije, na primer mutacije encima za razgradnjo metabolita, posledično pa se ta metabolit začne kopičiti v celici. To lahko privede do sprememb v fiziologiji celice in do različnih bolezni, kakšne bodo te spremembe in bolezni pa je odvisno od vrste metabolita. Med bolj vplivne metabolite spadajo acetil-CoA, α-ketoglutarat, sukcinat in fumarat, pomemben je tudi 2-hidroksiglutarat, ki sicer ni intermediat cikla TCA, vendar pa je povezan s ciklom tako, da se sintetizira iz α-ketoglutarata. Ugotovitve, kako povečane količine metabolitov vplivajo na celico in posledično na organizem ter bolezni, so pomembne predvsem za zdravljenje bolezni, zato se za prihodnost pričakuje, da bo še večja količina znanja na tem področju prenesena v klinično uporabo.

==Pia Mencin - Akonitaza in njena vloga v celici==

Načeloma pripisujemo določenemu proteinu eno funkcijo, poznamo pa tudi proteine, ki imajo dve popolnoma različni nalogi v celici. To so tako imenovani »moonlighting proteins« oziroma večnamenski proteini. Tak večnamenski protein je tudi citosolna akonitaza (cAcn). Ko je nanj vezana prostetična skupina: Fe-S kletka, deluje kot katalizator pretvorbe citrata v izocitrat. Ob razdružitvi Fe-S kletke deluje kot IRP1 (odzivni protein za železo). Ta ima zmožnost vezave na mRNA proteinov, ki sodelujejo pri metabolizmu železa, ter tako zagotavlja homeostazo železa v celici. Ob razdružitvi kletke cAcn in nastanku apoencima znanega kot IRP1 pride do konformacijskih sprememb v proteinu pri katerih nastane mesto za vezavo na IRE (odzivni element za železo), to je reža, ki na novo nastane med domenama 3 in 4 cAcn.
Poleg citosolne poznamo tudi mitohondrijsko akonitazo (mAcn), ki je njena izooblika. Sodeluje v TCA ciklu, in sicer katalizira pretvorbo citrata v izocitrat, ter ščiti mtDNA pred oksidativnimi poškodbami.
Proteina sta tarča ROS, ti ju poškodujejo (oksidirajo) in inaktivirajo. mAcn ob inaktivaciji z ROS posredno inhibira nastanek ROS v mitohondriju in tako deluje kot regulator oksidativnega stresa. Za preprečevanje kopičenja oksidirane mAcn v mitohondriju poskrbi Lon proteaza.
Izocima mAcn ter cAcn sta še en izmed mnogih dokazov kako natančno nadzorovano in prepleteno je delovanje procesov v celici.

==Marko Kovačić - Vloga citokinov poddružine IL-1 pri regulaciji glikolize in njihov vpliv na bolezni, povezane z glikolizo==

Citokini so proteini z majhno molekulsko maso (približno 5-25 kDa), ki so pomembni v celičnem signaliziranju. Delujejo tako, da se vežejo na specifične membranske receptorje in s tem regulirajo transkripcijo genov ali njihovih transkripcijskih faktorjev. Tako sprožijo imunski odziv na vnetje, infekcijo ali na druga stanja. S svojimi signalnimi mehanizmi kontrolirajo rast in aktivnost drugih celic imunskega sistema ter krvnih celic. Interlevkini so skupina citokinov, ki imajo različne funkcije, predvsem so pomembni pri komunikaciji med celicami imunskega sistema, pri vnetnih in imunomodulatornih procesih. Citokini IL-1a, IL-1β, IL-1Ra in IL-33 so zelo pomembni člani družine interlevkinov interlevkin-1 (IL-1). Številne raziskave so pokazale, da je ta poddružina interlevkinov pomembna pri regulaciji glikolize, tj. poti, ki je pomembna za pridobivanje energije v obliki ATP. Glikolizo lahko regulirajo na nivoju vnosa glukoze v celice ali pa na nivoju reguliranja glikolitičnih encimov, ker se njihove signalne poti prepletajo s signalnimi potmi, ki so ključne pri regulaciji glikolize. Disregulacija glikolize lahko vodi do številnih bolezni (rak, diabetes tipa 2, reumatoidni artritis, osteoartritis, astma), poddružina IL-1 pa z regulacijo glikolize lahko vpliva na potek le-teh. Vpliv na delovanje citokinov IL-1a, IL-1β, IL-1Ra in IL-33 tako daje številne možnosti pri zdravljenju z glikolizo povezanih bolezni in prav to je predmet številnih raziskav.

==Janja Bohte - Vloga in regulacija aerobne glikolize pri hepatocelularnem karcinomu==

Rak jeter je šesta najpogostejša oblika raka na svetu. Kar 90% primarnih rakov jeter predstavlja hepatocelularni karcinom (HCC). Za zdravljenje te bolezni se med drugim uporabljalo zdravila za zaviranje specifičnih signalnih poti, ki so odgovorne za rast tumorja. Tako zdravilo je sorafenib, zaviralec tirozin kinaze, na katerega organizem zaradi povečane aerobne glikolize v nekem časovnem obdobju razvije odpornost. Aerobna glikoliza oziroma Warburgov učinek je pojav, ko tumorske celice pretvarjajo glukozo v laktat kljub zadostni količini kisika. Prehod z metabolične poti oksidativne fosforilacije na pot glikolize pri HCC spodbuja celično proliferacijo ter ponuja ugodno mikrookolje za napredovanje tumorja. Odgovorna je za regulacijo invazije, metastaze, angiogeneze in odpornosti na zdravila pri HCC. Mehanizem Warburgovega učinka je kompleksen, pomembno vlogo pa imajo trije encimi, ki sodelujejo v sami presnovi glukoze: heksokinaza 2 (HK2), fosfofruktokinaza 1 (PFK1) in piruvat kinaza tipa M2 (PKM2). Ti so regulirani na več načinov in s številnimi transkripcijskimi faktorji ter metaboličnimi potmi, kot so AMPK, PI3K/Akt metabolična pot, HIF-1α, c-Myc ter nekodirajoče RNA. Zaradi pomembne vloge glikolize pri napredovanju tumorja, je usmerjanje na glavne dejavnike na tej poti, kot je inhibicija HK2, PFK ali PKM2, ključnega pomena za razvoj novih terapevtskih pristopov za zdravljenje HCC.

==Urša Štefan - Signalizacija STING - obseg delovanja in povezava z rakavimi obolenji==

Pojav dvovijačne DNA v citosolu je v celici največkrat pokazatelj celične abnormalnosti – virusne okužbe, poškodbe dednega materiala, oksidativnega stresa ali rakave transformacije. Celice so zato razvile načine zaznavanja prisotnosti DNA v citosolu. Eden izmed takšnih je signalna pot STING. Protein ciklična GMP-AMP sintetaza po vezavi z DNA sintetizira cGAMP, ki aktivira protein STING, vezan v membrani endoplazmatskega retikuluma. Ta se transportira do Golgijevega aparata, kjer mu vezava kinaze TBK1 omogoča aktivacijo transkripcijskih faktorjev IRF3 in NF-κB za citokine. Poleg odziva na citosolno DNA protein STING sodeluje tudi v regulaciji celičnega metabolizma, celičnega cikla, pri indukciji avtofagije, regulaciji ravni kalcija in kot senzor poškodb DNA. Zaradi svojega velikega obsega delovanja je signalna pot STING tarča razvoja številnih zdravil, ki pa je do zdaj bil le delno uspešen. Članek opiše signalno pot STING, njene funkcije v celici in na kratko povzame vlogo signalne poti pri zdravljenju rakavih obolenj.

==Hana Glavnik - S-glutationilacija proteinov kot globalni inhibitor celičnega metabolizma za zmanjšanje občutljivosti signalov vodikovega peroksida==

S-glutationilacija proteinov ima v celici pomembno vlogo. Ob zvišanju koncentracije reaktivnih kisikovih spojin (ROS), se v celici vzpostavi stanje oksidativnega stresa. Ker so za celico te spojine toksične, je razvila mehanizme, ki ji pomagajo uravnavati njihovo koncentracijo in zaščitijo ostale spojine v celici pred ireverzibilno oksidacijo. Najbolj pomembna spojina med ROS je vodikov peroksid, ki ima poleg toksičnih vplivov tudi lastnosti sekundarnega sporočevalca. Ob nastopu oksidativnega stresa v celici in povišane koncentracije vodikovega peroksida, zaznata signale encima GRX1 in GRX2, ki glutationilirata proteine z vezavo glutationa (GSH) na tiolne skupine cisteinov (-SH) in jih tako zaščitita pred poškodbami. Hkrati se s potekom S-glutationilacije aktivirajo tiste metabolične poti, pri katerih nastajajo antioksidanti, največkrat NADPH, ki pomagajo razgraditi vodikov peroksid in ostale ROS spojine. Tiste poti, pri katerih nastajajo ROS spojine so inhibirane s strani S-glutationilacije, dokler ne pride do signala, ki ga sprejmeta GRX1/2. To sproži njune deglutationilacijske aktivnosti in z deglutationilacijo encimov se stanje v celici se normalizira in metabolične poti lahko potekajo nemoteno.

==Tinkara Butara - Transmembranska signalizacija v bakterijskih kemoreceptorjih==
Kemotaksija je oblika gibanja, kjer se organizem giba k ugodnemu kemijskemu gradientu ali stran od toksičnega oziroma neugodnega. Oblika gibanja je značilna za premikajoče se bakterije in arheje. Kemotaksija igra pomembno vlogo pri iskanju hrane, oblikovanju biofilma in tudi pri patogenezi. Takšno gibanje, s prepoznavanjem različnih kemijskih zvrsti, nadzorujejo kemoreceptorji. To so transmembranski proteini, ki vežejo snovi iz okolice in tako sprožijo nadaljnjo signalizacijo znotraj celice, ta pa vodi do spremembe v rotaciji bička. Vezava ugodne signalne molekule vodi do konformacijskih sprememb v kemoreceptorju, ki preprečijo avtofosforilacijo kinaze CheA, ki omogoča fosforilacijo proteina CheY. Fosforiliran CheY se namreč veže na motor bička in tako spremeni njegovo rotacijo iz nasprotne smeri urinega kazalca v smer urinega kazalca. Ko biček rotira v smeri urinega kazalca, to spodbudi naključno gibanje v prostoru, ki na novo orientira bakterijsko celico. Če biček rotira v nasprotni smeri urinega kazalca, pa se celica giba naravnost proti ugodnemu kemijskemu gradientu. Prilagoditev na signal nadzorujejo regulatorni proteini (CheR, CheB, za zaključek signala pa je pomemben protein CheZ, ki hidrolizira CheY-P. Kemoreceptorji se nahajajo na polih bakterijske celice in se združujejo v skupke, kar predstavlja dodatno možnost prilagoditve na kemijski signal.

==David Valte - Jedrni hormonski receptorji in izražanje genov==

Jedrni hormonski receptorji (NHR) so poleg g-proteinov, receptorjev z encimsko aktivnostjo in ionskih kanalčkov le še eden od načinov biosignalizacije, ki pa se po načinu delovanja od drugih precej razlikuje. Jedrni hormonski receptorji neposredno vplivajo na transkripcijo in tako posledično tudi na izražanje genov. Z vezavo ligandov, kot so na primer vitamin d, retinoidni hormoni, tiroidni hormoni in steroidi, na receptor, pride na hormonskih receptorjih do konformacijskih sprememb. Spremembe v konformaciji receptorja pa omogočajo interakcije receptorja s specifičnimi sekvencami DNA. Te sekvence imenujemo hormonski odzivni elementi HRE/HREs, HRE se ponavadi nahajajo znotraj promotorja tarčnega gena, na teh mestih NHR delujejo kot aktivatorji transkripcije DNA. Transkripcija DNA povzroči nastanek mRNA z zapisom za nastanek proteinov, katere celica potrebuje, preko teh pa se lahko odzove na zunanje motnje. Prepoznavo zaporedij HRE in vezavo na DNA omogoča specifična sestava jedrnih receptorjev. Te so sestavljeni iz večih domen, vsaka od teh ima specifično funkcijo brez katere delovanje NR ni mogoče. Posebne domene omogočajo prepoznavo HRE, vezavo na DNA in dimerizacijo z drugimi NR. Na hormonske odzivne elemente se lahko NHR vežejo v obliki monomerov, lahko pa se NHR-ji vežejo drug z drugim, tako nastajajo dimeri. Dimeri omogočajo drugačne afinitete za vezavo z DNA.

==Alliana Kolar - Pomen upravljanja z agonisti, antagonisti in signalnimi modulatorji receptorjev abscizinske kisline (ABA) v agronomiji==
Abscizinska kislina (ABA) je naravno prisoten rastlinski hormon, katerega koncentracija se poviša, ko je rastlina pod vplivom stresa in se na stres tudi odzove. Igra vlogo pri zapiranju listnih rež, ko rastlini primanjkuje vode, inhibira kalitev, spodbuja dormanco, vpliva na cvetenje, staranje listov, zorenju plodov ipd. Ker je sintetična ABA nestabilna in ob zunanjem nanosu ne pokaže vpliva na rastlino, je potrebno z modeliranjem antagonistov oziroma agonistov sintetizirati analoge, ki bi bodisi promovirali/oponašali ali zavirali njeno delovanje. Z njimi bi agronomi lahko manipulirali na delovanje rastline in imeli nadzor nad njim, kar bi posledično prineslo večji donos zaradi večje količine in kakovosti proizvodov. Za to pa je potrebno dobro poznati molekulo in njeno biokemijsko delovanje ob signalizaciji in tudi druge spojine, s katerimi regulira procese v rastlini. Ker pa je to področje še dokaj neraziskano in nepojasnjeno, je zelo težko najti prave analoge in dodatno sintetizirati še boljše. Vendar pa po odkritju sintetične molekule pirabaktin, ki je delovala kot primeren agonist, so odkrili še 14 receptorjev ABA, imenovanih PYR (Pyrabactin Resistance)/PYR-like/(RCARs)Regulatory Components of ABA Receptors in s tem še boljše razumeli delovanje ABA in njene signalizacije.

== Gaja Starc - Medsebojni vpliv vodikovega sulfida in drugih signalnih molekul pri uravnavanju signaliziranja celic zapiralk in odzivu na abiotski oziroma biotski stres==

Vse daljša sušna obdobja, visoke temperature in nizka vlažnost, od pritrjenih organizmov zahtevajo prilagoditve, s katerimi lahko izboljšajo uporabo energije in kemijskih virov v raznovrstnih razmerah. Kot mehanizem, ki omogoča nadzor nad ravnotežjem med izgubo vode in izmenjavo plinov, so rastline v krovnih tkivih razvile aktivno regulirane odprtine – reže. Reže so ključne za fiksacijo atmosferskega ogljika pri fotosintezi, hkrati pa rastline zaradi rež izgubijo 95 % vode v ozračje. Regulacija premikanja listnih rež je ključna za uspešno rast in razvoj rastline. Premikanje rež je tesno povezano z zaporedjem kompleksnih procesov zaznavanja, prenosa in uravnavanja signalov v celicah zapiralkah. Vodikov sulfid (H2S) uravnava premikanje celic zapiralk in sodeluje pri uravnavanju in prenosu signalov v organizmih ter tako sodeluje pri prilagajanju rastline na spremembe v okolju in odzivih na abiotski oziroma biotski stres. Novejše študije pri navadnem repnjakovcu (''Arabidopsis thaliana'') so pokazale, da zunanji H2S spodbuja zapiranje listnih rež, pri čemer sodeluje s fitohormoni in signalnimi molekulami. Glavna signalna pot, pri kateri sodeluje, je persulfidacija proteinov – post-translacijska modifikacija pri kateri so tiolne skupine cisteinskih ostankov modificirane v persulfidne. Sodeluje tudi pri uravnavanju aktivnosti ionskih kanalčkov v celicah zapiralkah, ki so ključni pri nadzoru premikanja listnih rež in pomaga omiliti oksidativni stres z vplivom na koncentracijo reaktivnih kisikovih zvrsti v celicah zapiralkah.

== Andraž Rotar - Vloga signalne poti JAK/STAT in njeni inhibitorji pri človeških boleznih==
Signalna pot kinaze janus (angl. janus kinase-JAK) in signalnega prenašalca in aktivatorja transkripcije (angl. signal transducer and activator of transcription-STAT), krajše JAK/STAT, je prisotna v večini večceličnih organizmih. Mehanizem poti je eleganten in presenetljivo preprost način, s katerim zunajcelični faktorji povzročijo gensko izražanje. Prepisani geni so nujni pri bioloških procesih kot so celična rast, diferenciacija, apoptoza in imunskem odzivu. Signalizacija JAK/STAT je v celici močno regulirana. Primarni regulatorji spadajo v tri skupine, in sicer med zaviralce citokinske signalizacije (angl. suppressor of cytokine signaling-SOCS), proteinske inhibitorje aktiviranih STAT (angl. protein inhibitors of activated STAT-PIAS) in protein tirozinske fosfataze (angl. protein tyrosine phosphatase-PTP). Če se v organizmu pojavi okvara signalne poti ali njene regulacije to privede do raznih avtoimunih bolezni kot so revmatoidni artritis, Parkinsonova bolezen ter multipla skleroza. Ker pa pot nadzira tudi celični cikel, lahko mutacije genov, odgovornih za sintezo sestavnih delov poti, privedejo do rakavih obolenj. Da bi se z temi patološkimi stanji lahko spopadali, raziskovalci z veliko vnemo iščejo nove vedno boljše inhibitorje signale poti. Do ne daljnega smo poznali le inhibitorje za JAK, sedaj pa jih razvijajo tudi za STAT. V seminarski nalogi so predstavljeni vsi zgoraj našteti proteini, patološka stanja povezana z JAK/STAT, ter inhibitorji za njihovo zdravljenje.

== Pia Špehar - Integrini in njihova vloga pri vezikularnem transportu==
Integrini so adhezijski receptorski proteini, zgrajeni iz dveh podenot. Imajo mnogo različnih funkcij, in sicer povezujejo citoskelet in zunajcelični matriks, s tem posledično povežejo notranjost celice z njeno okolico. Delujejo kot prenašalci signalov in spodbujevalci celične proliferacije in preživetja. Sodelujejo pri imunskem odzivu, apoptozi, celični diferenciaciji, mnoge raziskave pa so pokazale, da so ključni tudi pri signalizaciji in regulaciji vezikularnega transporta. Ključno vlogo imajo pri eksocitozi biosintetskih in sekretornih veziklov, saj nase vežejo mikrotubule in preko njih usmerjajo vezikle do celične površine. Sodelujejo tudi pri procesu degranulacije v trombocitih in levkocitih, pri agregaciji trombocitov in posledično pri hemostazi, ki je prva stopnja celjenja ran. V citotoksičnih limfocitih prepoznava antigena na tarčni celici povzroči sidranje mikrotubulov na integrine. Ti se nato povežejo z medcelično adhezijsko molekulo in tako sprožijo prenos signala za celično smrt tarčne celice. V trombocitih pa integrin-posredovana degranulacija α-granul omogoči agregacijo trombocitov in s tem nastanek krvnega strdka, ki zaustavi krvavitev. Integrini sodelujejo tudi pri endocitozi, in sicer pri vnosu virusov in zunajceličnih veziklov v celico. V celico se lahko prenese virus, vsebina veziklov ali pa samo signal, ki sproži nadaljnje procese znotraj celice. Pomembni so tudi za prenos signalov pri endocitotskem recikliranju receptorjev tirozin kinaz (RTK).

==Tina Urh - Nevrotransmiterji, agonisti in antagonisti receptorjev kot tarča zdravljenja==
Nevrotransmiterji acetilholin, norepinefrin, dopamin, serotonin, subtanca P, GABA in glutamat posredujejo stimulatorne ali inhibitorne živčne funkcije preko vezave na specifične receptorje. Izločajo se iz avtonomnih živcev, ganglijev, nadledvične žleze, rakavih celic in celic imunskega sistema. Spremenjena komunikacija med živčnim in imunskim sistemom in uporaba receptorskih agonistov/antagonistov je vedno pogosteje tarča zdravljenja nevrodegenerativnih, imunopatoloških in avtoimunskih bolezni. E in NE sta stresna hormona in interagirata z α in β adrenergičnimi receptorji; aktivacija β2-AR (agonist izoprotenerol) spoodbuja rast tumorja. Blokira jo antagonist propranolol. GABA je pomirjevalo in antidiabetično sredstvo, stimulira rakavo proliferacijo preko GABAA; A receptorski agonist je muscimol. Vendar pa je vpliv GABA odvisen od tipa raka in receptorja. Serotonin (5-HT) ima vlogo vazokonstriktorja; proizvajajo ga imunske celice. Antagonisti 5-HT2AR imajo antipsihotične in antidepresivne lastnosti. Povečanje števila receptorjev 5-HT1A kaže na zaviranje izločanja serotonina in posledično povečano depresivnost. Dopamin oz. agonisti DA receptorjev izkazujejo inhibitorni efekt na rast tumorja. Neselektivni agonisti so učinkoviti za zdravljenje bolezni CŽS. Tudi vloge dopamin receptorjev so specifične glede na tip tumorja. Substanca P spada v družino nevropeptidov in spodbuja razvoj raka. Inhibicija receptorja NK-1 s specifičnimi antagonisti povzroči antitumorske učinke. Glutagonski agonisti lahko sprožijo smrt T celic, odvečni Glu vpliva na razvoj epilepsije in raka. Za zdravljenje bi se lahko uporabljalo inhibitorje mGluR1.

== Katja Resnik - Signalna omrežja, ki povzročajo raka ==
Normalno delovanje vsake posamezne celice in posledično organizma kot celote nam omogočajo številni procesi, kjer je ključnega pomena njihova regulacija. Tako lahko spremenjene signalne poti, ki v naših celicah uravnavajo predvsem procese celične proliferacije, diferenciacije, apoptoze in na splošno celičnega cikla privedejo do številnih bolezni, med drugim tudi do razvoja raka. Dve ključni poti, ki sta pri večini človeških oblik raka napačno regulirani sta signalni poti RAS in APC. RAS proteini so vrsta G proteinov, ki regulirajo normalen potek celičnega cikla preko povezovanja z efektorskimi proteini. Onkogene oblike RAS proteinov, ki so posledica mutacij, povzročijo njihovo nenehno aktivnost, kar vodi v transformacijo signalne poti. Ta se odraža v izražanju genov, ki se sicer naj ne bi izražali, kar lahko vodi v nenehno spodbujanje celične proliferacije. Po drugi strani pa do podobnega učinka pride tudi zaradi napak v signalni poti APC, ko okvarjen protein APC ne more več opravljati funkcije zmanjševanja koncentracije ključnega proteina za regulacijo in prehod iz faze celične proliferacije v fazo diferenciacije in staranja celic. Proučevanje takšnih signalnih poti nam omogoča spoznavanje vplivov določenih mutacij na posamezne procese in njihovo prispevanje k razvoju raka. Pomembno je le, da na signalne poti gledamo kot na prepletena omrežja, kar lahko ključno prispeva k razvoju uspešnih zdravil in metod zdravljenja omenjene bolezni.

== Nuša Kos Thaler - Motnje metabolizma glikogena in njihove posledice ==
Glikogen je makromolekula, sestavljena iz enot glukoze, ki jo najdemo predvsem v jetrih in mišicah. Njegov metabolizem je ključnega pomena za pridobivanje in shranjevanje energije v človeškem telesu. Če ne deluje pravilno, lahko povzroča različne bolezni, ki jim s skupnim imenom rečemo bolezni kopičenja glikogena (glycogen storage diseases – GSD). Te so praviloma genetske in povezane z mutacijami genov, ki kodirajo encime za sintezo, razgradnjo ali regulacijo dolžine glikogenskih verig. Pri bolezni kopičenja glikogena tipa I je mutiran encim α-glukoza-6-fosfataza, ki katalizira pretvorbo iz glukoze-6-fosfata v glukozo, kar lahko povzroči hipoglikemijo pacientov. Pri bolezni kopičenja glikogena tipa II je mutiran encim za razgradnjo glikogena v lizosomu (kisla α-glukozidaza). Zaradi neaktivnosti encima se glikogen ne more razgraditi in se nalaga v lizosomih. Če ti počijo, lahko poškodujejo celico, kar privede do mnogih okvar v telesu, predvsem do progresivne mišične oslabelosti. Zelo poseben tip bolezni je Laforina bolezen, kjer se pokaže pomembnost glikogena še v drugih organih, možganih. Pri njej se zgodijo mutacije na genih za laforin in malin, ki skupaj regulirata dolžine stranskih verig glikogena. Pogosta posledica so epileptični napadi. Kljub mnogim raziskavam na tem področju najučinkovitejših rešitev za zdravljenje omenjenih bolezni še nismo odkrili.

== Karidia Kolbl - Metabolizem možganskega glikogena; povezava z motnjami spanja in glavobolom ==
Povezava med funkcijo spanja in nevropsihiatričnimi boleznimi, kot je depresija, ter nevrološkimi motnjami v obliki migren, je danes raziskovano a precej neopredeljeno področje. Nedavne študije so pokazale, da med spancem obnavljamo zaloge glikogena, ki jih med budnostjo porabimo. Kasneje pa so ugotovili, da pomanjkanje spanca povzroča povišano količino možganskega glikogena, kar opisuje “glikogenetska” hipoteza. Ta pravi, da sinteza in poraba glikogena potekata med budnostjo so časno, medtem ko upad prenosa vzdražnostnih signalov med nevroni v stanju spanja ustvarja neravnovesje. Zmanjšana aktivnost se odraža v kopičenju glikogena med spanjem. Njegova vloga je namreč energijsko zalagati celice, še posebej med aktivno nevrološko signalizacijo (sinaptične povezave) in s tem vzpostavljati koncentracijo kalija in glutamata. Pri osebkih, ki pa jim spanca primanjkuje, prihaja do transkripcijskih sprememb, kar lahko povzroča migrene. Njihova raven možganskega glikogena je namreč znatno manjša in so posledično nezmožni ohranjati ustrezne količine kalija in glutamata znotraj in zunaj celic. To se odraža v kortikalni depolarizaciji, ki se širi po možganski skorji med živčnimi vlakni in se elektrofiziološko gledano povezuje z avro (drugo fazo) migrene. Namen seminarske naloge je torej pregled nekaterih ugotovitev in domnev v zvezi z glikogenezo in glikogenolizo, ter posledicami njune aktivnosti.

==Zarja Weingerl - Sukcinat in njegova vloga v metabolizmu==
Sukcinat ima v Krebsovem ciklu vlogo enega od intermediatov. Gre za dianion dikarboksilne kisline, torej se od sukcinske kisline razlikuje le v številu dveh H atomov na karboksilnih skupinah. Njegova vloga v metabolizmu pa ni omejena le na Krebsov cikel. Je namreč pomemben medcelični komunikator ter vpliva na vnetni odziv organizma. Veže se na receptor GPR91, ki je eden od regulatornih modulatorjev pri različnih podskupinah celic, in sodeluje pri regulaciji krvnega tlaka. Sukcinat je lahko eden od vzrokov za nastanek psevdohipoksičnega stanja, ki nastane zaradi aktivacije hipoksijske signalne poti kljub zadostni meri kisika. Deluje lahko kot kemoatraktant (snov, ki inducira premike). Zaradi njegove povezave z GABA šantom (poteka tudi v anaerobnih pogojih) pa sinteza sukcinata ni odvisna le od anaerobnih pogojev, ki so potrebni za delovanje Krebsovega cikla. Sukcinat deluje kot promotor metilacije DNA, ter vpliva na potek sukcinilacije. Sukcinilacija je posttranslacijska modifikacija pri kateri pride do vezave sukcinilnih skupin na lizinske ostanke. Da je zmožen opravljati vse te in še mnoge druge naloge igra pomembno vlogo njegov transport. Transportira se lahko preko obeh membran mitohondrija, ter tako prispe v citosol, možen pa je tudi njegov transport v medcelični prostor.

==Ena Kartal - Metabolizem lipojske kisline in mitohondrijska redoks regulacija==
Lipojska kislina je kofaktor mitohondrijskih multiencimskih kompleksov, ki vsebuje žveplo, in je kovalentno vezan z encimom preko lizina. Prav zaradi tega, ker se nahaja v vsaki celici v našemu organizmu in kot kofaktor sodeluje pri nastanku energije organizma, je predmet različnih raziskav. Ključna njegova funkcionalna lastnost je, da se lahko podvrže redoks reakcijam. Po vsaki reakciji kjer sodeluje lipoilni kofaktor z svojo disulfidno obliko, ki deluje kot akceptor elektronov, mora potekati reoksidacija dihidrolipoamida, ki jo katalizira flavoencim lipoamid dehidrogenaza. Do danes je lipojska kislina spregledan kofaktor mitohondrijskih multiencimskih kompleksov. Ko so jo prvič izolirali iz živalskih jeter, so jo primerjali z vitaminom, ker je povezana z biosintezo maščobnih kislin, SAM (ki sodelujejo pri biosintezi biotina) in biosintezo železo-žveplovega žepka z oksidativno sposobnostjo cikla trikarboksilnih kislin. Danes se uporablja tudi kot prehransko dopolnilo. Pomanjkanje LA kofaktora vodi do disfunkcije bistvenih encimskih kompleksov, ki sodelujejo v mitohondrijskem metabolizmu, kar provzroča različne bolezni. Za zdravljenje bolzni, ki nastajajo zaradi pomanjkanja regulacije lipoilacije encimov, so še vedno potrebne dodatne raziskave, ker še obstajajo neodgovorjena vprašanja glede ''reciklažne poti'' pri biosintezi LA pri ljudeh.

==Sara Jerič - Vpliv intermediatov Krebsovega cikla na metiliranje histonov in DNA ter posledično na proces staranja==
Intermediati cikla citronske kisline imajo pomembno vlogo pri regulaciji epigenetskih in neepigenetskih sprememb. Pri tem so najbolj pomembni 2-oksoglutarat, sukcinat in fumarat, ki z aktivacijo oz. inhibicijo vplivajo na veliko družino encimov dioksidaz, ki so odvisne od 2-oksoglutarata (2-OGDO). Ti encimi pri regulaciji neepigenetskih sprememb vplivajo na sintezo kolagena in nadzorujejo količino kisika v celici (npr. Sprožijo primeren odziv, če pride do hipoksije). Pri regulaciji epigenetskih sprememb pa 2-OGDO encimi vplivajo na metilacijo DNA in histonov ter posledično transkripcijo in izražanjem genov. Metilacija DNA poteka z encimoma DNA metiltranferaza in DNA demetilaza, metilacija histonov pa z encimoma histon metiltransferaza in histon demetilaza. Spremembe pri metilaciji DNA in histonov povzročijo tudi spremembe pri kromatinu, kar pa povezujemo s procesom staranja. S staranjem se torej zmanjša količina obnovitvenih procesov (npr. ob staranju matične celice zmanjšajo količino popravil poškodb tkiv). Proces staranja ni točno programiran v celici, temveč je naključen degradirajoč proces, ki so ga sprožile epigenetske spremembe. Intermediati Krebsovega cikla pa lahko povzročijo tudi epigenetske spremembe, ki se kažejo pri boleznih povezanih s staranjem, npr. Alzheimerjeva bolezen. Čeprav vloga intermediatov Krebsovega cikla in njihov mehanizem pri procesu staranja še ni točno določen, lahko zagotovimo, da predstavljajo enega kjučnih regulatorjev epigenetskih sprememb, ki pa vplivajo na proces staranja.

==Nik Vidmar - Presnova, učinki ter bolezenska stanja kot posledica povišanih koncentracij ketonskih telesc==
Ketonska telesca nastajajo v jetrih v okoliščinah, ko je prisotnost glukoze prenizka za normalno delovanje organov, kot so na primer možgani. Predstavljajo jih molekule acetoacetata, ki nastaja pri presnovi maščobnih kislin ob pomankanju glukoze, 3-β-hidroksibutirata, ki nastaja v mitohondrijih jetrnih celic in acetona. Najpomembnejša med ketonskimi telesci sta acetoacetat in 3-β-hidroksibutirat, saj se transportirata kot vir energije iz jeter v druga tkiva. Tretje ketonsko telo aceton ni zelo pomembno, saj se ne porablja kot vir energije in se preko pljuč izloča iz telesa. Ketonska telesca so pomembna zato, ker pripomorejo k varčevanju glukoze in zmanjšujejo proteolizo v času, ko je glukoze v telesu premalo, kar pomaga pri ohranjanju zdravja in funkcionalnosti telesa. Nekateri organi, kot so možgani, niso zmožni uporabiti maščobnih kislin kot vir energije, zato uporabijo ketonska telesca, ki so alternativni vir energije v primeru daljše lakote ali posta. Uravnavajo tudi nivo sproščanja inzulina in povzročijo peroksidacijo lipidov. V nižjih koncentracijah se v krvi neprestano nahajajo pri zdravih ljudeh. Njihove koncentracije se delno povečajo pri dolgi telovadbi in postu. Povišana koncentracija ketonskih telesc je lahko posledica zastrupitve, na primer z alkoholom, kar vodi do alkoholne ketoacidoze. V primeru diabetesa pa lahko povišana koncentracija vodi do diabetične ketoacidoze. Tako stanje je zelo nevarno in lahko, če ga ne zdravimo, privede do smrti.

==Gašper Struna - Oksidacija maščobnih kislin v peroksisomih==
Oksidacija maščobnih kislin je pomemben proces, ki je vključen tako v anabolne kot katabolne metabolične poti. Ta proces poteka v mitohondrijih, kjer ima predvsem katabolno vlogo, ter v peroksisomih, kjer pa ima bolj anabolno vlogo. β-oksidaciji maščobnih kislin sta v obeh organelih zelo podobni. Obstajajo pa tudi mnoge razlike. Geni za encime, ki sodelujejo pri oksidaciji v posameznem organelu, so različni. V prenosu maščobnih kislin skozi membrano sodelujeta različna transporterja. V prvem koraku β-oksidacije se peroksisomski FADH2 takoj oksidira nazaj, pri tem pa elektrone sprejme kisik, medtem ko pri mitohondriju vstopi v elektronsko prenašalno verigo. Multifunkcijski protein (MP) pri peroksisomu za razliko od mitohondrijskega ne vsebuje tiolazne aktivnosti; ima pa peroksisom dva MP, pri čemer eden lahko reagira tudi z D-izomeri β-hidroksiacil-CoA.
V peroksisomu se maščobne kisline le delno oksidirajo, dokončna oksidacija poteče v mitohondriju, lahko pa oksidacija maščobnih kislin v peroksisomu služi le skrajševanju verige v anabolnih poteh, na primer pri biosintezi nekaterih lipidov. Peroksisomska oksidacija je predvsem pomembna pri oksidaciji dolgoverižnih in razvejanih maščobnih kislin. Veliko podrobnosti o oksidaciji v tem organelu pa je še vedno nepojasnjenih ali pa za njih obstajajo le modeli kot na primer pri načinu reoksidacije NADH in transportu acil-CoA skozi membrano. Pomembnost tega procesa pa nakazujejo tudi številne bolezni povezane s peroksisomsko β-oksidacijo, zaradi česar je razumevanje tega procesa zelo pomembno.

==Neža Peternel - Uravnavanje oksidacije maščobnih kislin v skeletnih mišicah s prehrano in telesno vadbo==
Maščobe poleg ogljikovih hidratov predstavljajo pomemben vir energije za delovanje naših organizmov. Maščobne kisline (MK) se v mišicah oksidirajo in vodijo do nastanka ATP molekul. Poznavanje mehanizma oksidacije MK omogoča lažje razumevanje regulacije procesa pod vplivom različnih zunanjih dejavnikov. Med pomembnejše regulatorne proteine štejemo maščobno-kislinsko translokazo CD36, ki se nahaja v sarkolemi in regulira vnos MK v mišične celice, in karnitin-aciltransferaze (CPT1, CPT2 in CACT), ki nadzirajo vnos MK v mitohondrij. Pri procesu β-oksidacije maščobnih kislin je pomemben encim β-hidroksi-acil-CoA dehidrogenaza, ki omejuje hitrost reakcije. Dokazali so, da vzdržljivostna zmerna vadba in povečan vnos maščob pozitivno vplivata na regulacijo proteinov, ki so vključeni v proces oksidacije. Maščobne kisline in krčenje skeletnih mišic v tem primeru delujejo kot signali, ki navidezno inducirajo izražanje beljakovin v metabolnih poteh lipidov in s tem povečajo presnovno sposobnost maščobnih kislin. Pomembni signalni receptorji so jedrni transkripcijski faktorji PPAR, ki vplivajo na izražanje genov za regulatorne proteine.
V zadnjem času se zelo razvija farmacevtsko področje vadbene mimetike (ang. exercise mimetics). Z različnimi zdravili in prehranskimi dodatki želijo posnemati pozitivne učinke vadbe na organizem in tako olajšati poteke določenih bolezni ter zmanjšati delež ljudi s prekomerno telesno težo. Hkrati pa z razvojem takšnih zdravil prihaja tudi do dopinških zlorab v vrhunskem športu.

== Urša Zevnik - Genetske napake mitohondrijske oksidacije maščobnih kislin in karnitinskega transporta==
Mitohondrijska oksidacija maščobnih kislin je ključen metabolni proces za zagotavljanje energije, ko se izpraznijo zaloge glikogena, za nekatere procese pa predstavlja preferenčni vir energije tudi, ko je glukoze dovolj. Za skoraj vse proteine, ki sodelujejo v procesu β-oksidacije maščobnih kislin ali karnitinskemu transportu le teh v mitohondrij, so znane genetske napake, ki povzročijo pomanjkanje ali zmanjšano aktivnost teh proteinov. Popolna odsotnost večinoma vodi v smrt v prvih dneh življenja, za delno pomanjkanje pa so značilna srčna, mišična in ledvična obolenja ter pogoste hipoglikemije. Simptomi so odvisni od posameznika, stopnje pomanjkanja in vrste okvarjenega proteina. So posledica porušene energijske homeostaze in nabiranja toksičnih metabolitov. Trajno zdravilo ne obstaja, zdravljenje pa temelji na preprečevanju katabolizma z izogibanjem postenja ali naporne fizične aktivnosti in na dieti z manjšim deležem maščob. Na voljo so tudi zdravila, ki na različne načine, na primer z obnavljanjem metabolitov cikla citronske kisline ali spodbujanjem transkripcije encimov β-oksidacije lahko omilijo simptome, vendar je njihova učinkovitost omejena. Kljub zanesljivim metodam diagnostike in presejalnim testiranjem novorojenčkov smrtnost zaradi teh bolezni ostaja visoka.

== Tina Javeršek - Nedavni napredek pri zdravljenju hiperamoniemije==
Hiperamoniemija (HA) je stanje povišane koncentracije amonijaka v krvi, ko pride do neravnovesja med količino nastalega in odstranjenega amonijaka. Ta se v naravi nahaja predvsem v reducirani obliki kot amonijev ion NH₄⁺. Vzroka za nastanek HA sta največkrat prekomerno nastajanje odvečnega amonijaka v debelem črevesu in nezadostno razstrupljanje pri motnjah v ciklu uree. Razlikujemo med primarno in sekundarno (pridobljeno) HA. Za zdravljenje se uporablja predvsem laktuloza, sintetični disaharid, ki se v našem telesu ne presnavlja. Pogosto je tudi zdravljenje z antibiotikom rifaksiminom, ki inhibira sintezo bakterijske RNA in tako preprečuje rast bakterij, ki proizvajajo encim urezo. Ta katalizira hidrolizo sečnine, pri tem pa nastajajo amonijevi ioni. Pri visokih koncentracijah imajo toksične učinke in lahko povzročijo ireverzibilne okvare centralnega živčnega sistema. Natrijev benzoat in fenilacetat nase vežeta glicin in glutamin, nastala hipurat in fenilacetilglutamin pa se izločata z urinom. Kot sredstva za zdravljenje hiperamoniemije se uporabljajo še aminokisline z razvejano verigo, L- arginin, L-citrulin in kargluminska kislina. Ob akutnem povišanju koncentracij amonijaka v krvi se ta odstranjuje s hemodializo, s čimer v najkrajšem možnem času dosežemo znižanje njegovih koncentracij. Genska in celična terapija obljubljata učinkovit pristop pri zdravljenju, vendar so potrebne še številne raziskave na tem področju.

== Klara Kočman - Bowman-Birkov inhibitor ==
Bowman-Birkov inhibitor, inhibira tako tripsin kot tudi α-kimotripsin. Z njima tvori kompleks 1:1 oz. 1:1:1 ko sta na inhibitor vezana oba encima. Reakcijsko mesto za inhibicijo tripsina se nahaja na mestu Lys 16–Ser 17, za inhibicijo kimotripsina pa na mestu Leu 42–Ser 44. Naloga tripsina in kimotripsina je cepitev večjih peptidov na manjše peptide v trebušni slinavki. Bowman-Birkov inhibitor najdemo v nekaterih travniških rastlinah in vseh stročnicah, predvsem v soji. Uživanje surove soje lahko vodi do hipertrofije trebušne slinavke pri živalih. Je tudi zelo učinkovit pri preprečevanju karcinogeneze, zato iščejo način kaki bi lahko z Bowman-Birkovim inhibitorjem preventivno preprečevali raka brez toksičnosti za maligne celice in vitro. V soji pa najdemo tudi Bowman-Birkovem inhibitorju podoben Kunitzov inhibitor. Znanstveniki so ugotovili, da sta Bowman-Birkovemu inhibitorju v določenih sekvencah podobna tudi inhibitor limskega ter vrtnega fižola. Bowman-Birkov inhibitor se lahko zaradi svojih sedmih disulfidnih vezi cepi na več različnih peptidov, ki ohranijo svojo inhibitorno aktivnost. Inhibitor se v raztopinah z visoko koncentracijo inhibitorja med seboj reverzibilno poveže v dimere in trimere, kar lahko vidimo tudi pri inhibitorju, izoliranem iz soje, ki je v obliki trimera.

== Miha Razdevšek - Motnje razgradnje glicina in njihove posledice ==

Glicin je najmanjša aminokislina, ki se razgrajuje po treh poteh. Pri ljudeh je najpogostejša razgradnja z glicin cepitvenim encimom (glycine cleavage enzyme, GCE). Ta encim je sestavljen iz štirih proteinov, ki glicin pretvarjajo v CO2 in NH4+. Ko pride do mutacij GCE, se glicin po tej poti ne more več razgrajevati in se posledično kopiči v celici. To stanje imenujemo neketotska hiperglicinemija (nonkertotic hyperglicemia, NKH). V eni izmed metabolnih poti, ki se pri takšnih pogojih aktivirajo nastane zelo reaktivna molekula metilglioksal (MGO). MGO se kovalentno poveže s proteini in DNA, kar imenujemo glikacija. Produkte, ki pri tem nastanejo pa končni produkti napredovane glikacije (advanced glycation end products, AGE). Primarno se MGO poveže z argininom na proteinih in deoksigvanozinom na DNA. Glikacija proteinov vpliva na izgubo njihove funkcije in povezavo ekstracelularnih ter intracelularnih proteinov. Reakcija z DNA pa predstavlja nevarnosti povezane z genomsko nestabilnostjo. Povišane vrednosti MGO se povezuje z boleznimi staranja, diabetesom, debelostjo, rakom in nevrodegenerativnimi boleznimi. Izziv predstavlja predvsem razumevanje pomena MGO pri normalnem fiziološkem stanju, koncentracija, pri kateri postane MGO toksičen in možnost uporabe MGO za specifično diagnostiko bolezni.

== Jan Trebušak - Vloga Karbamoil Fosfat Sintetaze 1 ==

Karbamoil fosfat sintetaza 1 (CPS1) je kompleksen, večdomenski ter evolucijsko konservativen encim, ki katalizira prvo reakcijo v ciklu uree. Encim je sestavljen iz okoli 1500 aminokislin in ima dve katalitični mesti na katerih poteka fosforilacija substratov, njegov alosterični efektor pa je N-acetil-L-glutamat (NAG). Ker reakcije na CSP1 predstavljajo ‘vstopni’ korak v cikel uree ima vsakršna okvara lahko hude posledice. Najočitnejši simptom je akutna hiperamonemija oz. povišanje koncentracije amoniaka v krvi, ki lahko ob kronični izpostavitvi vodi v nevrodegenerativna obolenja. Čeprav je hiperamonemija glavni in najbolj akutni zaplet pri okvari CSP1, pa ni edini. Raziskave so pokazale, da ima CSP1 vpliv tudi na nastanek in rast raka, razvoj kardiovaskularnih obolenj in tudi zmožnost posameznikov za vzdrževanje konstantne telesne mase. Trenutne oblike zdravljenja vključujejo strogo izogibanje aminokislinam v prehrani in uživanje dodatkov, ki nase vežejo dušik iz organizma. Naprednejše oblike zdravljenja, kot so genska terapija in jemanje analogov NAG, ki bi spodbudili delovanje tudi nepravilno delujoče CSP1 so v začetnih fazah kliničnih testiranj. Pri genskem zdravljenju predstavlja težavo tudi to, da je večina inaktivirajočih mutacij na CSP1 specifičnih za posamezne družine ali majhne populacije, kar pomeni, da vsaka od the potrebuje posebaj prilagojeno zdravljenje. Na tem področju je potrebno opraviti še veliko raziskav, da bi odkrili zdravilo za nedelujočo CSP1.

== Lana Kores - VLOGA METABOLIZMA RAZVEJANIH AMINOKISLIN PRI BOLEZNI JAVORJEVEGA SIRUPA (MSUD)==

Prirejene napake metabolizma (IEM) so pogosto posledica redkih monogenskih napak, ki sledijo mendelskim vzorcem dedovanja za avtosomne-recesivne lastnosti. Prizadeti posamezniki imajo mutacijo na obeh alelih na monogenskem mestu, medtem ko njihovi starši po definiciji nosijo le en mutiran alel in se pri njih fenotip bolezni ne izraža. Bolezen javorjevega sirupa (MSUD) je primer take monogenske bolezni. Povzroči jo okvara razvejane α-ketokislinske dehidrogenaze (BCKD). BCKD je multiencimski kompleks, zgrajen iz treh katalitičnih komponent: E1 – dekarboksilaze, sestavljene iz 2α in 2β podenot; E2 – transciklaze; in E3 – dehidrogenaze. Gen za E1α najdemo na kromosomu 19, gen za E1β na kromosomu 6, gen za E2 na kromosomu 1 in gen za E3 na kromosomu 7. Pri normalnem delovanju (v zdravem človeku) bi v prvem koraku metabolizma BCAA izocimi razvejane aminokislinske transaminaze (BCATs) transaminirale BCAAs do razvejanih α-ketokislin (BCKAs), torej iz levcina do α-ketoizokaproata (KIC), iz izolevcina do α-keto-β-metilvalerata (KMV) in iz valina do α-ketoizovalerata (KIV). V naslednjem koraku metabolne poti bi razvejan ketokislinski dehidrogenazni kompleks (BCKDC) kataliziral ireverzibilno oksidativno dekarboksilacijo α-ketokislin (vendar se pri MSUD zaradi okvare BCKD to ne zgodi). Zaradi tega pride do kopičenja razvejanih aminokislin in posledično do hudih nevroloških motenj.

== Maša Mencigar - Reaktivne kisikove zvrsti in njihova vloga pri rakavih obolenjih ==

Reaktivne kisikove zvrsti (ROS, ang. reactive oxygen species) so skupina reduciranih nestabilnih derivatov kisika, ki imajo dobre oksidativne lastnosti. V celici nastajajo pri normalnem delovanju celičnega metabolizma v nizkih koncentracijah in so potrebne za homeostazo celice in celično signaliziranje, delujejo kot sekundarni sporočevalci. Ob povišani koncentraciji pa so za celico lahko nevarni, saj privedejo do oksitadivnega stresa. Oksidativni stres lahko povzroči poškodbe in mutacije DNA ter pripomore k drugim obolenjem kot so nevrodegenerativne bolezni in rakava obolenja. Antioksidanti, kot so superoksid dismutaze (SOD), Glutation (GSH) in Jedrni faktor eritroid 2 (NFR2), preprečujejo povišanje koncentracije ROS v celici, saj pretvarjajo ROS do manj reaktivnih spojin oziroma vode. Različne koncentracije reaktivnih kisikovih zvrsti različno vplivajo na celico, ob povišani koncentraciji ROS se poveča nastanek malignih mutacij, ROS torej deluje kot tumor promotor. Ob previsokih koncentracijah ROS pa privede do celične smrti, torej deluje ROS kot tumor supresor.Delovanje ROS kot tumor promotor ali supresor pa ni odvisno le od njegove koncentracije v celici, ampak tudi od stopnje razvoja in lokacije tumorja. Za zdravljenje rakavih obolenj uporabljajo nekatere kemoterapetvike (cisplatin, bleomicin in arsenični trioksid), ki povišajo koncentracije ROS in s tem povzroči nepopravljive poškodbe celic, ter privede do celične smrti.

== Klara Razboršek - Regulacija apoptoze v zdravju in bolezni: uravnoteženo delovanje BCL-2 družine proteinov ==

Apoptotska celična smrt je ključen proces za ohranjanje tkivne homeostaze. Poznamo ekstrinzično pot apoptoze, ki je rezultat zunajceličnih signalov, in intrinzično ali mitohondrijsko pot. Le-ta je rezultat signalov, ki delujejo direktno na tarče znotraj celic. Pomembni regulatorji te poti so proteini iz družine BCL-2. Gre za globularne proteine, ki se nahajajo v citosolu v bližini mitohondrija ali pa se sidrajo v zunanjo mitohondrijsko membrano. Razdelimo jih v tri skupine, glede na njihovo vlogo pri regulaciji procesa apoptoze. Pro-apoptotski proteini se aktivirajo kot odziv na celični stres in sprožijo začetek procesa apoptoze. Anti-apoptotski proteini kljubujejo pro-apoptotskim tako, da jih vežejo nase in jih s tem deaktivirajo, kar lahko zaustavi proces apoptoze. Če anti-apoptotskih proteinov ni dovolj ali pa so deaktivirani, se pro-apoptotski proteini vežejo na pro-apoptotske efektorske proteine – BAK in BAX. Ta dva proteina se sidrata v zunanjo mitohondrijsko membrano in preko oligomerizacije tvorita makropore. To povzroči permeabilizacijo zunanje mitohondrijske membrane. Iz medmembranskega prostora mitohondrija se sprosti citokrom c, kar povzroči aktivacijo kaspaz, ki povzročijo programirano celično smrt. Če pride do napak pri regulaciji BCL-2 proteinov lahko to privede do različnih obolenj, kot so nevrodegenerativne in avtoimune bolezni ter raka. Nepravilna regulacija v času prenatalnega razvoja pa lahko privede v smrt embria.

== Špela Rapuš - Zlivanje in cepitev mitohondrijev ==

Mitohondriji imajo veliko pomembnih funkcij v celici, zato je pomembno njihovo pravilno delovanje. Pri tem sta pomembna zlivanje in delitve mitohondrijev, ki vplivata, da so procesi, med katerimi je tudi oksidativna fosforilacija, pravilno regulirani. Ključni faktorji za ta procesa spadajo v superdružino dinaminov in izkoriščajo hidrolizo GTP za svoje delovanje. Za zlivanje membran so ključni mitofuzina Mfn1 in Mfn2 ter protein Opa1. Pri delitvi pa sodelujejo Drp1 in njegovi adaptorji na površini membrane, ki oblikujejo delitveni kompleks. Pri delitvi so pomembni tudi ostali dejavniki, ki pripomorejo k delitvi na primer endoplazemski retikulum in polimerizacija aktina okoli mitohondrija, ki začetno zoži mesto delitve. Morfologija mitohondrija, ki jo regulirata zlivanja in cepitve, je povezana tudi z metaboličnim stanjem celice. Od oblike krist je namreč odvisno tudi delovanje kompleksov oksidativne fosforilacije. Mutacije v zapisih za proteine, ki sodelujejo pri zlivanju oziroma cepitvi, vodijo v nepravilno delovanje pomembnih procesov v mitohondriju in kot posledica nastopijo mnoge bolezni, predvsem nevrodegenerativne kot tudi rak.

== Vanja Ivošević - Kompleksonst biosinteze ubikinona ==

Ubikinon (koencim Q_10) je koencim, ki je prisoten pri vseh živalih in pri večini bakterij, sestavni je del transportne verige elektronov ter tako sodeluje pri aerobnem celičnem metabolizmu, ki proizvaja energijo v obliki ATP. Najdemo ga predvsem v mitohondrijih, največ ga ima v mitohondrijih organov, ki imajo visoko potrebo po energiji kot so srce, jetra in ledvice. Obstajajo tri redoks stanja ubikinona, popolnoma oksidirano (ubikinon), ubisemikinon in popolnoma reducirano stanje (ubikinol). Ubikinon ima bistveno vlogo kot elektronski prenašalec med kompleksom NADH: ubikinon oksidoreduktazo (kompleks I), sukcinat dehidrogenazo (kompleks II) in citokrom bc_1 kompleksom (kompleks III) dihalne verige, lahko prenaša dva ali en elektorn. Biosinteza je glavni vir ubikinona. Za biosintezo je potrebno vsaj 12 genov, če se zgodi mutacija na enem ali več teh genov, prihaja do pomanjkanja ubikinona v organizmu. Mutacije v človeških genih za sintezo ubikinona povzročajo stanje, ki se imenuje primarno pomanjkanje ubikinona, mitohondrijsko motnjo, ki se manifestira na različne načine kot so multisistemske motnje, encefalopatija ali nefropatija. Direktna posledica pomanjkanja ubikinona je zmanjašana proizvodnja ATP in prekomerna tvorba ROS- reaktivnih kisikovih zvrst. Za razliko od večine ostalih mitohondrijskih motenj, za zdravljenje te motnje je na voljo učinkovito zdravljenje.

==Lev Jošt - Tvorba ROS in njen prispevek k signalizaciji in k razumevanju bolezni ==

Mitohondriji so dobro znani po svoji osrednji vlogi pri proizvodnji ATP, homeostazi kalcija ter biosintezi hema in steroidov. Označili so jih za t.i. "elektrarno" celice.
Mitohondrijska elektronska transportna veriga (ETC) uporablja vrsto reakcij prenosa elektronov za ustvarjanje celičnega ATP z oksidativno fosforilacijo. Posledica prenosa elektronov je nastajanje reaktivnih kisikovih vrst (ROS). Za omenjene ROS, pri katerih je ključen superoksid in tudi vodikov peroksid, se je sprva menilo, da so strupeni stranski produkti mitohondrijske fiziološke aktivnosti, a so na podlagi raziskav dokazali, da so to pomembne molekule, katerih proizvodnja, pretvorba in uničenje so zelo regulirani. Torej funkcije ETC so tesno povezane s tvorbo ROS ter proizvodnjo ATP in glede nato da ETC uravnava celično homeostazo s tema dvema procesoma in da so bile odkrite spremembe v obeh teh procesih povezane s patologijo neštetih bolezni, ki zajemajo skoraj vse organske sisteme, je logično sklepati, da nam lahko zmožnost natančnega in učinkovitega merjenja delovanja ETC pri ljudeh, zagotovi koristne diagnostične in mehanistične informacije.

== Žan Žnidar – Signalizacija bioaktivnih sfingolipidov ==
Lipidi s svojo barierno funkcijo igrajo ključno vlogo za obstoj življenja. Poleg tega, da so gradniki celičnih membran, pa se v zadnjih desetletjih razgrinja tudi njihov signalizacijski pomen. Bioaktivni sfingolipidi kot sporočevalci vplivajo na pestro množico celičnih dogodkov. Z vezavo na encim ali v njegovo bližino alosterično regulirajo njegovo delovanje, s tvorjenjem proteinskih kanalčkov pa omogočajo prehod proapoptotskih proteinov skozi mitohondrijsko membrano.
Zaradi hidrofobne narave so omejeni na mesto svoje sinteze – na membrano celice ali kakega membranskega celičnega organela. Tako so zmožni vplivati le na membranske proteine. Za prenos med posameznimi membranami se mora tvoriti vezikel ali pa je potreben prenašalni protein. Hidrofobno značaj omogoča gibanje flip-flop med slojema posamezne membrane, medtem ko ga hidrofilni predeli otežujejo ali celo preprečujejo.
Kopičenje posameznega sfingolipida je lahko znak porušene homeostaze v organizmu. Poškodovani encimi, ki so ključni za linearni del mreže pretvarjanj, imajo za posledico pomanjkanje sfingolipidov naprej po verigi in presežek tistih, ki so na poti do njih. V takih primerih pride do različnih obolenj.

==Nuša Brdnik - Vloga šaperonov v biogenezi encima Rubisco ==
Rubisco je eden najbolj ključnih encimov, saj katalizira reakcijo vezave CO2 na petogljični sladkor ribulozo 1,5-bisfosfat in s tem razkroj nestabilnega 6-ogljičnega intermediata na dve molekuli s tremi ogljiki. Hkrati pa je katalitično zelo neučinkovit, zato je že dolgo tarča genetskega inženirstva, saj želimo izboljšati njegovo učinkovitost in s tem optimizirati proces fotosinteze v rastlinah. Napredek na tem področju je zelo oviran, ker je rubisco močno odvisen od šaperonov in pomožnih faktorjev. Zadnje raziskave pa so razkrile mehanizme šaperonov in pomožnih faktorjev, ki so vključeni v biogenezo rubisca. Šaperonini Cpn60 zvijajo velike podenote rubisca, nato so v biogenezo vključeni faktorji RbcX, Raf1, BSD2 in Raf2. Rekombinantno izražanje rastlinskega rubisca v E. coli je bilo uspešno le z vsemi štirimi pomožnimi faktorji. Izkaže se, da vsi faktorji promovirajo oblikovanje jedrnega kompleksa velikih podenot rubisca, ampak vsak po različnih vezavnih mehanizmih. Po dokončani biogenezi rubisco aktivaza vzdržuje in popravlja funkcijo rubisca. Možnost za izboljšanje katalitične učinkovitosti predstavlja predvsem inženirstvo cianobakterijskih mehanizmov koncentriranja CO2. Natančno razumevanje vloge pomožnih faktorjev je omogočilo uspešno rekombinantno izražanje rubisca v E. coli in predstavlja podlago za nadaljnje raziskave v smeri ekstenzivne mutageneze rubisca, s čimer bi optimizirali njegovo funkcijo.

==Petja Premrl - Encimi Calvinovega cikla in GAPDH/CP12/PRK kompleks ==
Kisikovi fototrofi uporabljajo Calvinov cikel za fiksacijo CO2 in s tem sintetizirajo ogljikove hidrate. Pri reakcijah, ki si sledijo v tem ciklu, nastopata encima PRK ter GAPDH, katerih aktivnost je regulirana s proteinom CP12. V temi, ko fotosinteza ne poteka, ta dva encima Calvinovega cikla, skupaj s proteinom CP12 tvorita ternarni kompleks GAPDH/CP12/PRK. GAPDH se najprej poveže z oksidiranim CP12, da nastane binarni kompleks GAPDH/CP12. Ta kompleks pa se nato poveže še z encimom PRK, ni pa pomembno ali je slednji v reducirani ali oksidirani obliki. V tako nastalem ternarnem kompleksu sta encima inhibirana, in se aktivirata šele na svetlobi, ko se ta kompleks razdre. Nastanek tega kompleksa je reguliran s tioredoksini ter piridinskima nukleotidoma NAD/NADH ter NADP/NAPDH. Kompleks je stabiliziran z nizkimi koncentracijami NAD(H) oz. NADP(H), katere naj bi se nahajale v zatemnjenih kloroplastih ter cianobakterijah, iz česar lahko sklepamo, da je kompleks stabilnejši v temi.

==Ema Kavčič - Sinteza celične stene: vir ogljika in regulacija ==
Ogljik, ki se v procesu fotosinteze fiksira v sladkorje, se v veliki meri porabi za sintezo celične stene. Do celic, kjer fotosinteza ne poteka, ogljik potuje v obliki saharoze in lahko kot tak tudi vstopi v celico, ali pa prej razpade na heksoze. Sladkorji se v celici z encimskimi reakcijami pretvorijo v UDP sladkorje, osnovne gradnike celične stene. Celično steno sestavljajo polisaharidi. Sinteza celuloze poteka na rozetah, ki so zasidrane v membrano. Nastajajoče verige polisaharidov se med seboj povežejo v fibrilo. Sinteza hemiceluloze in pektinov poteka v Golgijevem aparatu. Njihovo sintezo katalizirajo različne glikoziltransferaze. Hemiceluloze se povezujejo s celulozo in tvorijo omrežje. Pektini vežejo vodo in tako hidrirajo steno. Sinteza celične stene je regulirana na več načinov. Kadar je na voljo malo ogljika (npr. ponoči) se ta v večjem deležu porabi za sintezo komponent celične stene. Sinteza celične stene mora biti usklajena tudi s širitvijo celice. Širitev celične stene poteka predvsem na račun privzema vode, kar se zgodi zvečer. Sinteza celične stene pa je intenzivnejša podnevi zaradi večje količine fiksiranega ogljika. Na sintezo stene vplivajo tudi drugi transkripcijski faktorji, signalne poti (npr. signal CWI), osmotski in solni stres in fosforilacjia proteinov.

== Jan Kogovšek - Karbonska anhidraza in molekularna evolucija C4 fotosinteze ==
Fotosinteza rastlinam omogoča rast, razvoj in nadaljevanje vrste, istočasno pa njeni stranski produkti omogočajo življenje ostalim organizmom. Zaradi temperaturnih in okoljskih dejavnikov, ki se razlikujejo glede na lokacijo, nekatere rastline niso sposobne preživeti v vseh okoljih, kar močno vpliva na njihovo zmožnost obstoja. Da zmanjšajo vpliv okolja na njihovo življenje, so razvile dodatne mehanizme, s katerimi preprečijo povečano izhlapevanje vode in izgubo vgrajenih ogljikovih atomov, kar se pojavi zaradi nespecifičnosti glavnega encima fotosinteze – encima Rubisco. Ta vrsta fotosinteze se imenuje C4 fotosinteza. Glavni adut teh rastlin je karbonska anhidraza, ki pretvarja CO2 v hidrogenkarbonat, ki se nato prenese v celice žilnega ovoja s kloroplasti, kjer se pretvori nazaj v CO2. To zmanjša dostop kisika do Rubisca, tako ga ta ne more porabiti, kar zmanjša fotorespiracijo, kjer rastlina izgubi ogljik, hkrati pa produkti te reakcije porabijo ogromno energije, da se pretvorijo nazaj v uporabno obliko. Znanstevnike je zanimalo, kako se je C4 razvila in če je kakorkoli povezana s C3 rastlinami. S primerjavami različnih vrst C3 in C4 rastlin so ugotovili, da nekatere izkazujejo podobne lastnosti, kar nakazuje, da izhajajo iz istega prednika. Poleg tega so raziskali tudi sestavo encimov, ki so odgovorni, da C4 fotosinteza sploh lahko poteka.

== Tina Zajec - Avtotrofna fiksacija oglijka pri mikroorganizmih ==
Poglavitni in hkrati tudi najbolj razširjen način avtotrofne vgradnje anorganskega ogljika v organske skelete predstavlja Calvin-Benson-Basshamov cikel, ki je sklopljen s svetlobnimi reakcijami fotosinteze. Poleg Calvinovega cikla, pa je pri bakterijah in arhejah, predvsem tistih, ki uspevajo v okoljih brez prisotnosti kisika in pogosto tudi brez energije sončne svetlobe prisotnih še kar nekaj dodatnih načinov asimilacije anorganskega ogljika preko sledečih metabolnih poti: reduktivni cikel citronske kisline (rTCA), 3-hidroksipropionatni bicikel (3-HP), reduktivna acetil-CoA metabolna pot (Wood-Ljungdahl metabolna pot), 3-hidroksipropionat/4-hidroksibutiratni cikel (3-HP/4-HB) in pa dikarboksilat/4-hidroksibutiratni cikel (DC/4-HB). Potek redukcijskih poti v anaerobnih pogojih je glede na porabo ATP veliko ugodnejši, končni produkt pa je v večini primerov acetat, ponekod pa tudi piruvat. V seminarju se bom posvetila predvsem podrobnejšemu opisu cikla rTCA in pa Wood-Ljungdahl poti. Reduktivni cikel TCA preko dveh karboksilacijskih reakcij s pomočjo poti, ki je pravzaprav obratna poteku Krebsovega cikla sintetizira acetat, W.L.- pot pa po linearni poti direktno asimilira dve CO2 molekuli v prisotnosti H2 prav tako v acetat. Relativna enostavnost katalitskih komponent, analognost encimov z drugimi metabolnimi potmi, predvsem pa sposobnost delovanja v anoksičnih pogojih nakazujeta na izvornost poti in možne evolucijske implikacije o razvoju avtotrofnega življenja na Zemlji.

==Pia Sotlar - Metabolizem purinov in purinergična signalizacija==
Purini in njihovi derivati sodelujejo pri številnih procesih v celicah, zato je ključno, da njihov metabolizem deluje brez napak. Poznamo dve poti ohranjanja purinskega 'bazena', de novo sintezno pot in reciklažno pot (ang. salvage pathway). De novo sinteza se običajno začne z porabo fosforibozil pirofosfata in konča, ko se producira IMP. Sinteza je sestavljena iz 10 reakcij, ki pa jih regulira samo 6 encimov, ki se zaradi bolj učinkovite sinteze povežejo v kompleks imenovan purinosom. De novo sinteza je energijsko bolj potratna kot recikažna, ki sintetizira nukleotide z recikliranjem degradiranih baz. Tudi katabolizem purinov je uravnan proces, ki vodi do končnega produkta, sečne kisline. Motnje lahko povzročijo prekomerno odlaganje urata (sol sečne kisline) v sklepih in tkivih, kar imenujemo hiperurikemija ter vodi do bolezni imenovane protin, pri kateri se sklepi vnamejo. Purini pa imajo lahko poleg na primer sinteze DNA, še dodatno vlogo. Predstavljajo namreč ligand, ki se veže na tako imenovane purinoreceptorje, ki jih delimo na P1 in P2 receptorje. V splošnem so P1 receptorji vključeni v protivnetni odziv, P2 pa v provnetni odziv in ker jih najdemo v skoraj vseh tkivih, predstavljajo potencialno možnost za zdravljenje številnih bolezni z njihovimi agonisti in antagonisti. To sta na primer alzheimerjeva bolezen in protin.

==Mark Loborec - Cirkadiana regulacija metabolizma lipidov==
Organizmi imajo v sebi tako imenovano notranjo uro. Ta ura vzdržuje cirkadiani ritem, to je ritem, ki se ponavlja na približno 24 ur. Ta je odgovoren za regulacijo mnogih celičnih procesov, med njegovimi pomembnejšimi vlogami pa je regulacija metabolizma lipidov. Cirkadiani ritem se po celem telesu vzdržuje s pomočjo glavne ure, ki se nahaja v SCN. Ta nato z regulacijo telesne temperature, kortizola in melatonina lahko neposredno vpliva na notranje ure v drugih tkivih, lahko pa nanje vpliva tudi posredno, s spreminjanjem vzorca spanja in prehranjevanja. Ob svetlobnem dražljaju se sproži signalna kaskada, ki pripelje do tvorbe kompleksa BMAL1/CLOCK. Ta nato z promoviranjem in represijo različnih genov povzroči ciklično izražanje proteinov cirkadianega ritma. Te proteini nato vplivajo na izražanje proteinov, ki so odgovorni za metabolizem lipidov. Veliko proteinov, ki so cirkadiano regulirani, je ključnega pomena pri sintezi, razgradnji, skladiščenju ali transportu lipidov. Zanimivo pa je izražanje cirkadianosti proteinov različno od tkiva do tkiva. Spremembe v cirkadianem ritmu ali njegove okvare lahko vodijo do različnih bolezenskih stanj, najpogosteje debelosti. Mehanizmi cirkadiane regulacije še niso povsem raziskani, a vemo, da so ključnega pomena za normalno delovanje organizma.

==Ana Kastelic - Prolaktin in diferenciacija mlečnih žlez med nosečnostjo in dojenjem==
Žensko telo se že veliko pred rodnim obdobjem pripravlja na sprejem in preživetje potomcev. Sesalci so veja toplokrvnih vretenčarjev, ki jim je skupno to, da je preživetje zaroda odvisno od materinega mleka. Struktura mlečnih žlez pa tudi sestava mleka je med sesalci precej dobro ohranjena, kljub temu pa sta vodilni hormon prolaktin in njegov receptor PRLR vrstno specifična, ker pomeni, da se npr. prolaktin iz primatov ne more vezati na človeški receptor za prolaktin. Specializacija celic, ki sodelujejo pri dojenju, se začne že v embironalnem razvoju, nadaljuje med adolescenco in doseže višek med nosečnostjo in aktivnim dojenjem. Ob prenehanju dojenja se tkivo povrne v prednosečniško stanje, lahko pa se ob ponovni nosečnosti zopet preoblikuje. V večini procesov diferenciacije je vodilni hormon prolaktin, sodeluje pa tudi veliko drugih hormonov. Specializacija tkiva za laktacijo pa ni njegova edina vloga, odgovoren je tudi za sintezo in vzdrževanje mleka, sintezo lipidov, postopen propad tkiva ob prenehanju dojenja in drugo. Prolaktin je pleotropični hormon in sodeluje v veliko signalnih poteh, deluje lahko tako ekso-, kot para- in endokrino. Izloča se iz hipofize in deluje na mlečne žleze (pa tudi druga tkiva). V mlečnih žlezah sproži kaskado reakcij, ki vodijo bodisi v diferenciacijo in specializacijo celic mlečnih žlez, ali pa v tvorbo mleka.

=== Metka Rus - Regulacija lipidnega metabolizma v jetrih s hormoni ščitnice ===
Hormonska regulacija med drugim koordinira metabolne procese v različnih tkivih. Ena od hormonalinih žlez je ščitnica ki primarno izloča hormona T3 in T4, ki sta derivata tirozina. T3 je veliko bolj aktivna oblika, zato se T4 navadno ob vstopu v ciljno celico pretvori v T3 s pomočjo encima dejodaze. S hormonom T3 pa se v jetrih regulira tako de novo lipogeneza kot β-oksidacije. Hormon v osnovi vpliva na transkripcijo proteinov potrebnih v omenjenih procesih, vplivajo pa tudi na prenos maščobnih kislin v jetra, razgradnjo prehranskih maščob, izdelavo VLDL in LDL, regulirajo pa tudi sintezo holesterola in bolj kompleksnih lipidov. V zadnjem času pa se pojavlja vse več dokazov da regulacija ni le transkriptivna ampak vpliva tudi direktno na delovanje določenih proteinov. Reguliranje hormonov ščitnice je potencialen način zdravljena različnih bolezni lipidnega metabolizma kot sta na primer hiperholesterolemija in nealkoholna maščobna jetrna bolezen. Za obe se v zadnjem času razvijajo oblike zdravljenja ki temeljijo na regulaciji izražanja ali delovanja ščitničnih hormonov, sploh pa na razvoju analogov T3 s specifičnimi funkcijami.

=== Gašper Možina - Učinki alkohola na jetrni metabolizem lipidov ===
Jetrna presnova lipidov je zaporedje kompleksnih procesov, ki nadzorujejo dotok in iztok hepatičnih in eksogenih lipidov. Homeostaza toka lipidov je strogo nadzorovana z izražanjem metaboličnih proteinov, oskrbo s substratom, oksidacijo in izločanjem. Ti procesi ohranjajo jetrne lipidne zaloge relativno konstantne, vendar pa lahko motnje katerega koli od njih povzročijo kopičenje lipidov v jetrih. Etanol je edinstven med toksini, saj moti skoraj vse vidike presnove lipidov v jetrih. Ta kompleksen odziv je deloma posledica velikih presnovnih potreb, ki jih od organa zahteva etanol, vključuje pa tudi bolj raznolike spremembe v izražanju in oskrbi s substrati. Etanol zviša vnos maščobnih kislin v hepatocitih, slabša njihovo oksidacijo, promovira de novo lipogenezo in skladiščenje lipidov, zavira izvoz oz. izločanje lipidov ter inhibira katabolizem maščobnih kapljic. Boljše in natančnejše razumevanje mehanizmov, s katerimi alkohol povzroča steatozo in naprej tudi težje oblike alkoholne jetrne bolezni, je ključno za zdravljenje in preprečevanje napredovanja bolezni.

=== Kostadin Mitkov - Heme biosynthesis and congenital erythropoietic porphyria ===
The heme biosynthetic pathway is consisted of eight enzyme catalyzed steps in the conversion of glycine and succinyl-coenzyme A to heme, each step catalyzed by a different enzyme. A mutation or a deficiency of each of those enzymes results in a specific metabolic disorder also known as porphyria. Porphyrias are classified as either hepatic or erythropoietic, according to whether the excess production of porphyrin precursors and porphyrins occurs primarily in the liver or in the erythron. Congenital erythropoietic porphyria (CEP) is an erythropoietic porphyria and has a distinct phenotype and typically presents with significantly more severe cutaneous involvement and debilitating complications than the other erythropoietic porphyrias. The clinical spectrum of CEP depends on the level of residual uroporphyrinogen III synthase (UROS) activity, which is determined by the underlying pathogenic loss-of-function UROS mutations. The clinical characteristics of CEP include exquisite photosensitivity to visible light, resulting in bullous vesicular lesions which, when infected lead to progressive photomutilation of sun-exposed areas such as the face and hands. Because of the photosensitivity this disease is often referred to as ‘vampire disease’. Hemolysis is also always present and that’s why patients are transfusion-dependent throughout their life. The only curative approach is bone marrow or hematopoietic stem cell transplantation, otherwise management of CEP consists of strict avoidance of exposure to visible light which leads to a very restricted social and family life.

BIO2 Seminar 2021

2021-12-26T13:45:47Z

Kostadin Mitkov: /* Seznam seminarjev */

= Biokemijski seminar =
doc. dr. Gregor Gunčar, K2.022

== Seznam seminarjev ==
{| {{table}}
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''priimek, ime'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''poglavje'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''naslov seminarja'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''recenzent 1'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''recenzent 2'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''datum oddaje'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''datum recenzije'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''datum predstavitve'''
|-
| Valte, David||12||Jedrni hormonski receptorji in izražanje genov||Mitkov, Kostadin||Brdnik, Nuša||29/10/21||01/11/21||03/11/21
|-
| Kolar, Alliana||12||Pomen upravljanja z agonisti, antagonisti in signalnimi modulatorji receptorjev abscizinske kisline (ABA) v agronomiji||Vukšinić, Ivana||Premrl, Petja||29/10/21||01/11/21||03/11/21
|-
| Glavnik, Hana||12||S-glutationilacija proteinov kot globalni inhibitor celičnega metabolizma za zmanjšanje občutljivosti signalov vodikovega peroksida||Kovač, Ela||Kavčič, Ema||29/10/21||01/11/21||03/11/21
|-
| Štefan, Urša||12||Signalizacija STING - obseg delovanja in povezava z rakavimi obolenji||Vujović, Nataša||Zajec, Tina||29/10/21||01/11/21||03/11/21
|-
| Butara, Tinkara||12||Transmembranska signalizacija v bakterijskih kemoreceptorjih||Sotlar, Špela||Žnidar, Žan||29/10/21||01/11/21||03/11/21
|-
| Špehar, Pia||12||Integrini in njihova vloga pri vezikularnem transportu||Trošt, Pia||Rus, Metka||05/11/21||08/11/21||10/11/21
|-
| Urh, Tina||12|| Nevrotransmiterji, agonisti in antagonisti kot tarča zdravljenja ||Maučec, Ana||Loborec, Mark||05/11/21||08/11/21||10/11/21
|-
| Rotar, Andraž||12||Vloga signalne poti JAK/STAT in njeni inhibitorji pri človeških boleznih||Priveršek, Maj||Kastelic, Ana||05/11/21||08/11/21||10/11/21
|-
| Starc, Gaja||12||Medsebojni vpliv vodikovega sulfida in drugih signalnih molekul pri uravnavanju signaliziranja celic zapiralk in odzivu na abiotski oziroma biotski stres||Spruk, Teja||Možina, Gašper||05/11/21||08/11/21||10/11/21
|-
| Resnik, Katja||12||Signalna omrežja, ki povzročajo raka||Deutsch, Maja||Sotlar, Pia||05/11/21||08/11/21||10/11/21
|-
| Bohte, Janja||14-15||Vloga in regulacija aerobne glikolize pri hepatocelularnem karcinomu||Valte, David||Mitkov, Kostadin||12/11/21||15/11/21||17/11/21
|-
| Miklošič, Maja||14-15||ni opravila||Kolar, Alliana||Vukšinić, Ivana||12/11/21||15/11/21||17/11/21
|-
| Kovačić, Marko||14-15||Vloga citokinov poddružine IL-1 pri regulaciji glikolize in njihov vpliv na bolezni, povezane z glikolizo||Glavnik, Hana||Kovač, Ela||12/11/21||15/11/21||17/11/21
|-
| Kolbl, Karidia||14-15||Metabolizem možganskega glikogena; povezava z motnjami spanja in glavobolom||Štefan, Urša||Vujović, Nataša||12/11/21||15/11/21||17/11/21
|-
| Kos Thaler, Nuša||14-15||Motnje metabolizma glikogena in njihove posledice||Butara, Tinkara||Sotlar, Špela||12/11/21||15/11/21||17/11/21
|-
| Ažbe, Klara||16||Vpliv metabolitov Krebsovega cikla na fiziologijo in bolezni||Špehar, Pia||Trošt, Pia||19/11/21||22/11/21||24/11/21
|-
| Jerič, Sara||16||Vpliv intermediatov Krebsovega cikla na metiliranje histonov in DNA ter posledično na proces staranja||Urh, Tina||Maučec, Ana||19/11/21||22/11/21||24/11/21
|-
| Mencin, Pia||16||Akonitaza in njena vloga v celici||Rotar, Andraž||Priveršek, Maj||19/11/21||22/11/21||24/11/21
|-
| Weingerl, Zarja||16||Sukcinat in njegova vloga v metabolizmu||Starc, Gaja||Spruk, Teja||19/11/21||22/11/21||24/11/21
|-
| Kartal, Ena||16||Metabolizem lipojske kisline in mitohondrijska redoks regulacija||Resnik, Katja||Deutsch, Maja||19/11/21||22/11/21||24/11/21
|-
| Struna, Gašper||17||Oksidacija maščobnih kislin v peroksisomih||Bohte, Janja||Valte, David||26/11/21||29/11/21||01/12/21
|-
| Špenko, Andrej||17||||Miklošič, Maja||Kolar, Alliana||26/11/21||29/11/21||01/12/21
|-
| Zevnik, Urša||17||Genetske napake mitohondrijske oksidacije maščobnih kislin in karnitinskega transporta||Kovačić, Marko||Glavnik, Hana||26/11/21||29/11/21||01/12/21
|-
| Peternel, Neža||17||Uravnavanje oksidacije maščobnih kislin s prehrano in telesno vadbo||Kolbl, Karidia||Štefan, Urša||26/11/21||29/11/21||01/12/21
|-
| Vidmar, Nik||17||Presnova, učinki ter bolezenska stanja kot posledica povišanih koncentracij ketonskih telesc||Kos Thaler, Nuša||Butara, Tinkara||26/11/21||29/11/21||01/12/21
|-
| Trebušak, Jan||18||Vloga karbamoil fosfat sintetaze||Ažbe, Klara||Špehar, Pia||03/12/21||06/12/21||08/12/21
|-
| Kores, Lana||18||Urinska bolezen javorjevega sirupa (MSUD)||Jerič, Sara||Urh, Tina||03/12/21||06/12/21||08/12/21
|-
| Razdevšek, Miha||18||Motnje razgradnje glicina in njihove posledice||Mencin, Pia||Rotar, Andraž||03/12/21||06/12/21||08/12/21
|-
| Javeršek, Tina||18||Nedavni napredek pri zdravljenju hiperamoniemije||Weingerl, Zarja||Starc, Gaja||03/12/21||06/12/21||08/12/21
|-
| Kočman, Klara||18||Bowman-Birkov inhibitor||Kartal, Ena||Resnik, Katja||03/12/21||06/12/21||08/12/21
|-
| Jošt, Lev||19||Tvorba ROS in njihov prispevek k signalizaciji in razumevanju bolezni||Struna, Gašper||Bohte, Janja||10/12/21||13/12/21||15/12/21
|-
| Razboršek, Klara||19||Regulacija apoptoze v zdravju in bolezni: uravnoteženo delovanje BCL-2 proteinov ||Špenko, Andrej||Miklošič, Maja||10/12/21||13/12/21||15/12/21
|-
| Rapuš, Špela||19||Zlivanje in cepitve mitohondrijev||Zevnik, Urša||Kovačić, Marko||10/12/21||13/12/21||15/12/21
|-
| Mencigar, Maša||19||Reaktivne kisikove zvrsti in njihova vloga pri rakavih obolenjih||Peternel, Neža||Kolbl, Karidia||10/12/21||13/12/21||15/12/21
|-
| Ivošević, Vanja*gg||19||Kompleksnost biosinteze ubikinona||Vidmar, Nik||Kos Thaler, Nuša||10/12/21||13/12/21||15/12/21
|-
| Kogovšek, Jan||20||Karbonska anhidraza in molekularna evolucija C4 fotosinteze||Trebušak, Jan||Ažbe, Klara||17/12/21||20/12/21||22/12/21
|-
| Brdnik, Nuša||20||Vloga šaperonov v biogenezi encima Rubisco||Kores, Lana||Jerič, Sara||17/12/21||20/12/21||22/12/21
|-
| Premrl, Petja||20||Encimi Calvinovega cikla ter GAPDH/CP12/PRK kompleks||Razdevšek, Miha||Mencin, Pia||17/12/21||20/12/21||22/12/21
|-
| Kavčič, Ema||20||Sinteza celične stene: vir ogljika in regulacija||Javeršek, Tina||Weingerl, Zarja||17/12/21||20/12/21||22/12/21
|-
| Zajec, Tina||20||Avtotrofna asimilacija ogljika pri mikroorganizmih||Kočman, Klara||Kartal, Ena||17/12/21||20/12/21||22/12/21
|-
| Žnidar, Žan||21||Signalizacija bioaktivnih (sfingo)lipidov||Jošt, Lev||Struna, Gašper||17/12/21||20/12/21||22/12/21
|-
| Rus, Metka||21||Vpliv hormonov ščitnice na biosintezo lipidov v jetrih||Razboršek, Klara||Špenko, Andrej||31/12/21||03/01/22||05/01/22
|-
| Loborec, Mark||21||||Rapuš, Špela||Zevnik, Urša||31/12/21||03/01/22||05/01/22
|-
| Kastelic, Ana||21||Prolaktin in diferenciacija mlečnih žlez med nosečnostjo in dojenjem||Mencigar, Maša||Peternel, Neža||31/12/21||03/01/22||05/01/22
|-
| Možina, Gašper||21||Učinki alkohola na jetrni metabolizem lipidov||Ivošević, Vanja||Vidmar, Nik||31/12/21||03/01/22||05/01/22
|-
| Sotlar, Pia||22||Metabolizem purinov in z njim povezane bolezni||Kogovšek, Jan||Trebušak, Jan||31/12/21||03/01/22||05/01/22
|-
| Mitkov, Kostadin||22||Heme biosynthesis and congenital erythropoietic porphyria||Brdnik, Nuša||Kores, Lana||03/01/22||06/01/22||11/01/22
|-
| Vukšinić, Ivana||22||Vloga bilirubina kot signalne molekule||Premrl, Petja||Razdevšek, Miha||04/01/22||07/01/22||11/01/22
|-
| Kovač, Ela||22||Aminokislinska regulacija skeletnih mišic||Kavčič, Ema||Javeršek, Tina||05/01/22||08/01/22||11/01/22
|-
| Vujović, Nataša||22||||Zajec, Tina||Kočman, Klara||06/01/22||09/01/22||11/01/22
|-
| Sotlar, Špela||23||||Žnidar, Žan||Jošt, Lev||07/01/22||10/01/22||12/01/22
|-
| Trošt, Pia||23||||Rus, Metka||Razboršek, Klara||07/01/22||10/01/22||12/01/22
|-
| Maučec, Ana||23||Vloga tiroidnih hormonov v razvoju kosti||Loborec, Mark||Rapuš, Špela||07/01/22||10/01/22||12/01/22
|-
| Priveršek, Maj||23||||Kastelic, Ana||Mencigar, Maša||07/01/22||10/01/22||12/01/22
|-
| Spruk, Teja||23||||Možina, Gašper||Ivošević, Vanja||07/01/22||10/01/22||12/01/22
|-
| Deutsch, Maja||23||Mehanizem delovanja tiroidnih hormonov||Sotlar, Pia||Kogovšek, Jan||07/01/22||10/01/22||12/01/22
|}

*številka v okencu za temo pomeni poglavje v Lehningerju, v katerega naj izbrana tema spada
Razporeditev je začasna in se lahko še spremeni, načeloma pa se termini do vključno 18. poglavja ne bodo spreminjali.
Prosim, da mi sporočite morebitne napake ali če vas nisem razporedil.

== Gradivo za predavanja ==
Gradivo za predavanja in seminarje najdete na http://bio.ijs.si/~zajec/bio2/
username: bio2
password: samozame

==Naloga==
'''Vaša naloga za seminar je: '''
Samostojno pripraviti seminar o seminarski temi, ki vam je bila dodeljena. Za osnovo morate vzeti pregledni članek iz revije, ki ima faktor vpliva nad 5 (npr. [http://www.sciencedirect.com/science/journal/09680004/ TIBS]. Poiskati morate še vsaj tri znanstvene članke, ki se nanašajo na opisano temo, in jih uporabiti kot podlago za seminarsko nalogo! Članki so dostopni [https://libgen.is/ tukaj].

Za pripravo seminarja velja naslednje: 
* [[BIO2 Povzetki seminarjev 2021|Povzetek seminarja]] opišete na wikiju '''v 200 besedah''' (+- dvajset besed) - najkasneje do dne, ko morate oddati seminar recenzentom.
* Povezavo do povzetka vnesete v tabelo seminarjev tekočega letnika.
* Seminar pripravite v obliki seminarske naloge na ~5–12 straneh A4 (pisava 12, enojni razmak, 2,5 cm robovi). Obseg seminarja naj bo 2700 do 3000 besed , a ne več kot 3500 besed. Seminarska naloga mora vsebovati najmanj tri slike, bolje več. Eno sliko morate narisati sami in to pod sliko posebej označiti. Slika mora imeti legendo in v besedilu mora biti na ustreznem mestu sklic na sliko. 
* Seminar oddajte do datuma oddaje, ki je naveden v tabeli, v elektronski obliki z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/ tega obrazca].
* Vsi seminarji so v elektronski obliki dostopni [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/bioseminar/ tukaj].
* Recenzenti do dneva, določenega v tabeli, določijo popravke (v elektronski obliki) in podajo oceno pisnega dela. Popravljen seminar oddajte z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/ tega obrazca].
* Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Za predstavitev je na voljo 20–25 minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni.
* Predstavitvi sledi razprava. Recenzenti podajo oceno predstavitve in postavijo najmanj dve vprašanji. Vsi ostali morajo postaviti še dve dodatni vprašanji v okviru celega seminarskega obdobja. Vprašanja, ki ste jih postavili, vpišite na [https://docs.google.com/forms/d/e/1FAIpQLSdV9OFlNzI3XyS8FRGnuIbG89gwH_36uwz29ocigV--2CXSbQ/viewform tukaj].
* Na dan predstavitve morate docentu še pred predstavitvijo oddati končno (popravljeno) in natisnjeno verzijo seminarja v enem izvodu, elektronsko verzijo seminarja in predstavitev pa oddati na strežnik na dan predstavitve do polnoči.
* Seminarska naloga in povzetek morajo biti v slovenskem jeziku, razen za študente, katerih materni jezik ni slovenščina. Ti lahko oddajo seminar v angleškem jeziku.

==Imena datotek==
Prosim vas, da vse datoteke, ki mi jih pošiljate, poimenujete po naslednjem receptu:
* 312_BIO_Priimek_Ime.docx za seminar, npr. 312_BIO_Guncar_Gregor.docx
* 312_BIO_Priimek_ime_final.docx za končno verzijo seminarja
* 312_BIO_Priimek_Ime_rec_Priimek2.docx za recenzijo, kjer je Priimek2 priimek recenzenta, npr. 312_BIO_Guncar_Gregor_rec_Scott.docx (če se pišete Scott in odajate recenzijo za seminar, ki ga je napisal Gunčar)
* 312_BIO_Priimek_Ime.pptx za prezentacijo, npr 312_BIO_Guncar_Gregor.pptx
* 312_BIO_Priimek_ime_poprava.doc(x) za popravljeno končno verzijo seminarja, če so popravki manjši

==Ocenjevanje seminarjev==
Recenzenti ocenijo seminar tako, da izpolnijo [https://docs.google.com/forms/d/1EQDYwFO-DEzZ2R7jf8DhLqIeV4FFxRd3-ScceEASpt4/viewform recenzentsko poročilo] na spletu. Recenzentsko poročilo morate oddati najkasneje do 21:00, en dan pred predstavitvijo seminarja.

== Mnenje o predstavitvi ==
Vsak posameznik odda svoje mnenje o predstavitvi takoj po predstavitvi z online glasovanjem.

==Urejanje spletnih strani na wikiju==
Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje ... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''

==Citiranje virov==
Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se držite ene same. V seminarskih nalogah in diplomskih nalogah FKKT uprabljajte shemo citiranja, ki je pobarvana zeleno.
Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati.
Za citate v naravoslovju je najpogostejše citiranje po pravilniku ISO 690. [http://www.zveza-zotks.si/gzm/dokumenti/literatura.html Pravila], ki upoštevajo omenjeni standard, so pripravili pri ZTKS. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati. 
'''Citiranje knjig:''' 
Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica. 
Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN. 

Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005. 
Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4. 
Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.).

'''Citiranje člankov:''' 
Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani. 
Lartigue, C., Glass, J. I., Alperovich, N., Pieper, R., Parmar, P. P., Hutchison III, C. A., Smith, H. O. in Venter, J. C.
Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, 317, str. 632-638.

Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole: 
Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani. 
Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.

Revija Science uporablja skrajšani zapis: 
C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007) 

V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne). Navesti morate tudi vse avtorje dela, razen v primeru, ko jih je 10 ali več. Takrat navedite le prvih devet, za ostale pa uporabite okrajšavo in sod. (in sodelavci). Pred zadnjim avtorjem naj bo vedno besedica "in".

'''Citiranje spletnih virov:''' 
Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov 
strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life 
Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.

TBK2020 Povzetki seminarjev

2020-04-02T14:31:37Z

Kostadin Mitkov:

=== Anna Scott: Notting Hill ===
William Thacker (Hugh Grant) is a London bookstore owner whose humdrum existence is thrown into romantic turmoil when famous American actress Anna Scott (Julia Roberts) appears in his shop. A chance encounter over spilled orange juice leads to a kiss that blossoms into a full-blown affair. As the average bloke and glamorous movie star draw closer and closer together, they struggle to reconcile their radically different lifestyles in the name of love.

=== Sara Golob: Vpliv virusa Herpesa simpleksa tipa 1 na razvoj Alzheimerjeve bolezni ===

Pri Alzheimerjevi bolezni pride do padca kognitivnih funkcij, kot so spomin, govor, pozornost, učenje, itd. Razvije se zaradi različnih dejavnikov, ki so lahko dedni ali okoljski. Eden od okoljskih dejavnikov je okužba z virusom Herpes simpleks tip 1. Ta povzroči večje izražanje ε4 alela apolipoproteina E, ki povzroča nalaganje Tau proteina in amiloida beta, ki sestavljata senilne plake pri Alzheimerjevi bolezni. To povezavo so odkrili s protitelesi proti virusu Herpes simpleks tipa 1 ter preko lizosomske okvare, zaradi katere pride do nalaganja amiloida beta v možganih. Dokazana je bila tudi povezava med Alzheimerjevo boleznijo in drugimi boleznimi (epilepsija, demenca, shizofrenija, fibromialgija, demenca), pri katerih je opazna kognitivna disfunkcija. Pri bolnikih z epilepsijo so odkrili amiloidne plake, ki so značilni za Alzheimerjevo bolezen, zaradi česar je večja verjetnost, da oboleli za epilepsijo zbolijo še za Alzheimerjevo boleznijo in obratno. Herpes simpleks virus redko povzroča tudi akutni encefalitis, katerega posledica so epileptični napadi, izguba spomina in spremembe v vedenju. Zato znanstveniki menijo, da je povezava med epilepsijo in Alzheimerjevo boleznijo tudi v apolipoproteinu E.

=== Ena Kartal: Kako celično staranje vodi do nevrodegeneracije ===
Čeprav je bila vzpostavljena povezava med kroničnim vnetjem in nevrodegenerativnimi boleznimi, je bilo veliko odprtih vprašanj v zvezi s tem, kako celično staranje, proces, pri katerem celice, ki se nehajo deliti pod stresom, izločijo mešanico vnetnih beljakovin, vplivajo na te patologije. Raziskovalci poročajo, da staranje v astrocitih, ki je najbolj razširjena vrsta celic v možganih, vodi do škodljive '' ekscitotoksičnosti '' na kortikalnih nevronih, ki so vključeni v spomin.In pri tem pride do Alzheimerjeve bolezni,ki je najpogostejši vzrok demence pri starejših, je nepopravljiva, napredujoča možganska motnja, ki ubija možganske celice in postopoma uničuje spomin.

=== Lenka Stanković: Optimizirano antiangiogeno reprogramiranje tumorskega mikrookolja potencira imunoterapijo CD40 ===

Karakteristika raka je njegova sposobnost spodbujanja angiogeneze, oziroma tvorba novih krvnih žil. Angiogeneza prispeva k rasti in napredovanju tumorja z induciranjem in vzdrževanjem kislega / hipoksičnega in imunosupresivnega okolja. Krvne žile v rakih so pogosto nefunkcionalne in omejujejo promet s T-celicami. Odkritje angiogenih zaviralcev naj bi pripomoglo k zmanjšanju umrljivosti zaradi karcinomov. Tukaj prikazujemo, da imunoterapija proti CD40 poveča tumorsko infiltracijo CD8+T, vendar regresijo tumorja dosežemo močneje, če anti-CD40 kombinirano z dvojno blokado Ang2 in VEGFA. Kombinacija anti-VEGFA, anti-Ang2 in agonističkih protiteles proti anti-CD40 omogoča zavrnitev tumorjev pri sintetičnih modelih tumorjev. Proučevali so odzive tumorjev na anti-VEGFA, anti-Ang2 in agonistična protitelesa proti CD40 v različnih modelih mišjega raka. V raziskavi so pokazali, da kombinacija agonističnih protiteles CD40 z dvojno blokado VEGFA/Ang2 povečuje protitumorski odziv v modelnih raka miši s pomočjo sinergistične regulacije genov in indukcije imunskega permisivnega mikrookruženja tumorja, za katero je značilno provnetno (M1 podobno) aktivacijo makrofagov, vaskularno normalizacija ter izboljšanja infiltracije in prostorska lokalizacija efektorskih T-celic. T-celice pošljejo signale drugim vrstam imunskih celic, vključno s citotoksičnimi T celicami CD8+. Citotoksične T-celice, znane tudi kot CD8 + T-celice, izražajo svoje TCR, ki jih spremlja glikoprotein CD8. CD8 + T-celice so povezane z učinkovitim ubijanjem rakavih celic: med antigensko specifično aktivacijo afiniteta med CD8 glikoproteinom, izraženim s celico CD8 + T, in molekulo MHC razreda I, izraženo z rakavo celico, ohranja obe vrsti celic skupaj. Tesna vezava T celic in rakavih celic skozi kompleks CD8 / TCR in kompleks antigen / MHC-I povzroči, da celice CD8 + T izločajo perforin in grancime, kar vodi v lizo rakavih celic.

=== Nika Tomsič: Pomembnost in delovanje sladkornega prenašalca PfHT1 v parazitu malarije ===
Po oceni World Health Organisation- World malaria report 2019 je v letu 2018 bilo 228 milijonov primerov malarije. Sladkor je glavni vir energije parazita, zato je razumevanje presnove sladkorjev pomembna tema, ki bi lahko predstavljala pomoč pri sestavljanju zdravil in izrivanju tega parazita. Glavna razlika v presnovi sladkorjev med parazitom in drugimi organizmi je prenašalec, ki sladkorje prenaša v celico. Za to je odgovoren šeskotni prenašalec PfHT1, ki je sposoben transportirati bodisi glukozo kot fruktozo. Strukturno pa je zelo podoben prenašalcem človeške celice GLUT. Prenašalec obsega 12 transmembranskih vijačnic, ki tvorijo osrednjo pot za vstop glukoze. Ključni del proteina pa predstavljajo izrastki ki delujejo kot receptorji za sladkorje. Sladkorne prenašalce še nadaljnjo stabilizirajo solne medcelične povezave. Druga velika razlika med PfHT1 in drugimi prenašalci je brez dvoma način odpiranja in zapiranja prenašalca, saj ni sestavljenen samo iz treh običajnih stanj (odprto navznoter, zaprto, odprto navznoter), temveč ga zaznamujejo še dve vmesni stanji (zaprto navznoter in zaprto navzven, angl. inward–occluded in outward-occluded). Nadaljnjo raziskovanje bi torej lahko omogočilo razvoja novih antimalaričnih zdravil, ki blokirajo uvoz sladkorja in zastrašujejo parazita do smrti oz. razvoja novih zaviralcev, ki so bolj specifični za blokiranje funkcije PfHT1, ne da bi pri tem vplivali na transport sladkorja v človeških celicah.

=== Maša Mencigar: Vpliv apoptotskih celic na imunski sistem ===
Apoptotske celice v telesu lahko nadzorujejo imunski sistem in preprečijo nezaželene imunske odzive na telesu lastna tkiva oziroma celice. Avtoimune bolezni so kronične, neozdravljive in predstavlajo velik zdravstven problem, saj bolniki trpijo, hkrati pa povzročajo velike stroške. Znanstveniki iz nemškega centra za raziskave rakavih bolezni (DKFZ - Deutsches Krebsforschungszentrum; angl: German Cancer Research Center) so našli receptor na imunskih celicah miši, ki aktivira ta zaščitni mehanizem in prepreči nevarne avtoimunske reakcije. Ta receptor se imenuje dektin-1, ki ima dvojno vlogo, saj veže beta-glukane in aksin proteine. Pomankanje dektina-1 vodi do simptomov avtoimunih bolezni šele proti koncu življenske dobe. Ključna pa je povezava med encimom NAHPH oksidazo-2 in dektinom-1, zato imajo ljudje, ki nimajo tega encima avtoimune bolezni.

=== Ema Kovačič: Izpostavljenost ploda materini mikrobioti ===
Študija o prehodu materine mikrobiote skozi placento pri otrocih, ki so se rodili s carskim rezom prezgodaj in normalno. Mamam so vzeli brise iz različnih delov telesa, otrokom pa takoj po rojstvu vzorce iz ustne votline in mekonija. Imunski sistem pri otrocih se razvije že v prenatalnem obdobju. Našli so DNK nekaterih bakterij v posteljici, plodovnici in mekoniju, kar kaže, da se zarodek spopade z bakterijami že v prenatalnem obdobju. Odkritje bakterijskih zapisov v materničnem okolju nakazuje na koesistenco mehanizmov za kontorolo izpostavljenosti pri plodu in materini mikrobioti.

=== Zala Puklavec: Globoko učenje void do odkritja novih antibiotikov===
Zaradi naglega pojava bakterij, ki so odporne na antibiotike, raste potreba po odkritju novih antibiotikov. Zato so naučili globoko nevronsko mrežo napovedati molekule, ki imajo antibakterijske lastnosti. S tem računalniškim modelom so odkrili, da ima halicin (c-Jun N-terminal kinase inhibitor SU3327) zelo močne antibakterijske lastnosti. Nadaljni eksperimenti so pokazali, da deluje na drugačen način kot večina antibiotikov. Za razliko od ostalih je halicin proti E.coli bakteriociden, ne le bakteriostatski. Testirali so ga tudi na bakterijah, za katere po mnenju Svetovne zdravstvene organizacije najnujneje potrebujemo neko obliko zdravljenja, in proti veliki večini je deloval zelo uspešno. Z daljšo izpostavljenostjo E.coli halicinu so poskušali izolirati mutantske celice, ki so razvile odpornost nanj, vendar jim ni uspelo, kar kaže na to, da te odpornosti ni možno ali pa se vsaj veliko težje razvije. Z še nekaj eksperimenti pa so prišli do zaključka, da halicin disipatira transmembranski pH potencial in najverjetneje veže Fe3+ pred pH disipacijo in povezavo z membrano.

=== Martin Stanonik: De novo pojavitev adapterskih membranskih proteinov iz timinsko bogatih genskih sekvenc===
Odkrivamo vedno več proteinov, ki so nastali iz de novo genov. To pomeni, da so se kodirali iz nekodirajočih delov DNA, kar velja za redek proces. V laboratorijskih poskusih je preveliko izražanje teh nastajajočih genov omogočalo boljše delovanje celice v primerjavi z prevelikim izražanjem že vzpostavljenih genov in motenje tega procesa ni vplivalo na delovanje celice. za osebek so uporabili kvas, saj glive kvasovke vsebujejo najboljše lastnosti za izražanje genov.To prikazuje velik potencial, še posebej za timinsko bogate sekvence za izdelavo transmembranskih proteinov. Iz kombinacij različnih analiz je bil predlagan nov model genskega nastanka. Ta odkritja, bi lahko omogočala nov način izdelave polipeptidov, ki nastanejo iz teh, de novo, delov DNA.

=== Klara Kočman: Koronavirus: SARS-CoV in SARS-CoV-2 ===
Koronavirusi so veliki, pozitivni RNA virusi. Okuženost z virusom lahko opazimo z značilni simptomi kot so vročina, kašelj in pomanjkanje zraka. Najnovejši tip koronavirusa, SARS-CoV-2, tudi 2019-nCoV, se je prvič pojavil 31. decembra 2019 v mestu Wuhan na Kitajskem. Transport virusa s človeka na človeka je pogost pri telesnih stikih z bolnikom. SARS-CoV-2 primerjajo z virusama MERS-CoV in SARS-CoV. Na podlagi celotne analize genoma in proteinov je virus bližje SARS-CoV kot MERS-CoV, saj obstaja več kot 90% genetska podobnost s SARS-CoV, medtem kot je s MERS-CoV-jem neznatna. Genom virusa SARS-CoV-2 je sestavljen iz približno 30 kilobaz, ki jih kodira več strukturnih in nestrukturnih proteinov. S SARS-CoV si je podoben po dolžini genoma ter podobnem mehanizmu vstopa v celico ter uporabi celičnih receptorjev (ACE2). Glikoprotein ACE2 se nahaja na površini membrane in je pomemben za vezavo receptorjev gostiteljskih celic in gostitelja. Transmembranski proteini virusa se vežejo na človeško celico preko receptorjev ACE2 (encim za pretvorbo angiotenzina 2). Med 120 sekvencami virusa SARS-CoV-2 ni bila zanana niti ena mutacija, zato lahko s ciljenjem slednjih nudimo zaščito. Znanstveniki z opazovanjem odziva na protitelesa pri miših raziskujejo cepivo.

===Timotej Sotošek: Protivirusni remdesivir potentno inhibira RNA-odvisno RNA polimerazo od Srednje Vzhodni respiratorni sindrom koronavirusa===
Zdravilo remdesivir (bolj natančno Remdesivir trifosfat) je preiskovalna spojina, ki je bilo sprva ustvarjeno za zdravit Ebolo. Ima širok spektrum protivirusnih aktivnosti proti RNA virusih kot na primer koronavirusi , Filovirusi,… Njegova tarča je multi-podenotni RNA sintezni kompleks znan pod imenom RNA-odvisna RNA polimeraza na katerem s pomočjo drugih proteinov poteka sinteza virusne RNA verige. Remdesivir je nukleotidni analog ATP-ja s katerim tekmuje za vezavo v nastajajočo se virusno RNA verigo po tem, ko je virus že okuži celico. V primeru, da se Remdesivir uspe vezat v virusno RNA verigo bo ta prenehala rast in tako postala ne uporabna. To pomeni, da je Remdesivir le inhibitor, ki upočasnjuje oz. preprečuje nadaljno širjenje virusa. Raziskave so preiskovale mehanizem inhibicije na virusu Srednje Vzhodni respiratorni sindrom(MERS-CoV) in ga primerjali kako je učinkovit v primerjavi inhibicije virusa Ebola, ter na splošno kako zelo je njegov mehanizem učinkovit. Ker sta si MERS-CoV in SARS-CoV-2 sorodna virusa bi lahko zdravilo Remdesivir pomagal ozdravit obolele z SARS-CoV-2 koronavirusom.

===Nika Perko: Enkapsulacija eteričnega olja pomarančevca v celice gliv kvasovk===
Komarji vrste Aedes aegypti so eni glavnih povzročiteljev bolezni kot so denga, rumena mrzlica, zika in čikungunja. Najdemo jih v tropskem in subtropskem pasu ter celo v Evropi. Znanstveniki Univerze Nove Mehike so poiskali način, kako preprečiti širitev omenjenih bolezni. Ustvarili so naraven insekticid, ki prepreči razvoj komarjev, ko so ti še v stopnji ličinke. Larvicid je sestavljen iz enostavnih komponent: eteričnega olja pomarančevca Citrus sinensis in gliv kvasovk vrste Saccharomyces cervevisiae. Sintetiziran je bil s postopkom enkapsulacije eteričnega olja pomarančevca v celice gliv kvasovk. Med korake tega procesa so vpeljali še enega novega. Z njim so odstranili odvečno eterično olje, ki je ostalo na zunanji strani celic. To je bilo izredno pomembno, saj je odvečno olje delovalo kot repelent. Z različnimi analizami in primerjavami so ugotovili, da struktura celične stene, membrane in oljnih kapljic ostane po enkapsulaciji nespremenjena. Pomembna ugotovitev je bila tudi, da se kvasovke po enkapsulaciji niso mogle več razmnoževat. Testi efektivnosti so bili vzpodbudni, saj je bil larvicid učinkovit pri vseh ličinkah. Najbolj pa je bil učinkovit pri začetni razvojni stopnji ličink. Novi larvicid ima kar nekaj dobrih lastnosti: je naraven, ne more se nenadzorovano širit in tako škodit vodnemu okolju, izdelava je relativno poceni, je neškodljiv za ljudi, dolgo učinkuje…

=== Anja Moškrič: Povezava med infekcijo s temperiranimi bakteriofagi in izgubo sistema CRISPR-Cas tipa I ===
Sistem CRISPR-Cas je imunski mehanizem, ki je značilen za veliko prokariontov in arhej. Gre za gruče enakomerno prekinjenih palindromskih ponovitev, ki nosijo zapis za obrambo proti vdoru tujega dednega materiala (virusov in plazmidov). Kratica Cas pa predstavlja s CRISPR povezane gene, ki kodirajo zapis za nekatere encime, ki cepijo DNA. CRISPR lokus je sestavljen iz ponavljajočih CRISPR genov, med katerimi so vmesniki. Na teh pa je shranjena kopija dela zapisa virusa oz. plazmida. S študijo so želeli izvedeti vpliv infekcije bakterije Pseudomonas aeruginosa, s temperiranim oziroma lizogenim bakteriofagom (DMS3), ki se v obliki profaga vključi v dedni material gostiteljske celice. Izbrana bakterijska vrsta vrši sistem CRISPR-Cas tipa I-F. Za primerjavo so za eksperimente uporabljali tudi nekatere mutirane vrste bakterij,ki so imele napako v CRISPR lokusu. Eksperimenti so pokazali, da ob infekciji z nemutiranimi bakteriofagi bakterije niso sposobne uspešno odstranit le-teh. Iz zbranih rezultatov so ugotovili, da je v tem primeru imunski mehanizem slabo prilagojen celicam, saj povzroča imunopatološki efekt (avtoimunost). Do tega pride zaradi nepopolnega ujemanja zapisa na CRISPR vmesnikih s profagi. Če bakteriofagi ne kodirajo zapisa za acr gene (anti-CRISPR geni, ki zatirajo omenjen mehanizem), lahko to privede do izgube sistema CRISPR-Cas skozi evolucijo.

===Maja Deutsch: Globalni kemični učinki mikrobioma vključujejo nove konjugacije žolčne kisline===
Med vsemi mnogoceličarji in njihovimi mikrobiomi se pojavijo številne medsebojne kemične interakcije. Številne molekule, za katere je znano, da jih proizvaja mikrobiom, izrazito vplivajo na ravnovesje med zdravjem in boleznijo. Z uporabo masne spektrometrije in vizualizacije podatkov so bili ocenjeni učinki mikrobioma na celotno kemijo sesalca s primerjavo podatkov metabolomike pri aseptičnih miši in specifičnih-mikroorganizmov-prostih miši. Ugotovljeno je bilo, da mikrobiota vpliva na kemijo vseh organov. To je vključevalo aminokislinske konjugacije žolčnih kislin, ki so bile uporabljene za proizvodnjo fenilalanoholne kisline, tirozoholne kisline in levcoholne kisline, ki prej še niso bile identificirane, kljub obsežnim raziskavam kemije žolčnih kislin. Ti konjugati žolčne kisline so bili najdeni tudi pri ljudeh, vendar so bile bolj pogoste pri bolnikih z vnetnimi črevesnimi boleznmi, cistično fibrozo in pri dojenčkih. Te spojine so agonizirale farnezodini receptor X (FXR) in miši, ki so imele na novo odkrite kisline, so pokazale zmanjšano izražanje genov za sintezo žolčne kisline. Potrebne pa so nadaljnje raziskave, da se ugotovi, ali imajo te spojine fiziološko vlogo v sesalcih in ali prispevajo k črevesnim boleznim, ki so povezane z mikrobiomsko disbiozo.

=== Hana Glavnik: Kako paraziti malarije zaznajo imunske celice in se pred njimi zaščitijo ===
Pri raziskovanju malarije so znanstveniki odkrili pojav, ki so ga poimenovali rozeta. Rozeta je skupek neokuženih rdečih krvnih celic, ki s pomočjo proteinov, ki jih sintetizira parazit obkolijo okuženo rdečo krvno celico. Parazit se tako zaščiti pred gostiteljevim imunskim sistemom, saj ga monocite tako obkoljenega težje zaznajo. Raziskovali so tvorjenje rozet pri različnih pogojih. Izoliranim parazitom so dodali različne vrste monocitov in opazovali njihovo reakcijo. S tem so odkrili tudi protein IGFBP7, ki inducira tvorjenje rozet, vendar le ob prisotnosti dodatnih serumskih faktorjev. Odkritje proteina IGFBP7 je vodilo v odkritje novega načina tvorjenja rozet, tako imenovanega tipa II, saj za razliko od prvotnega tipa I, ta ne poteče spontano. Nato so pod drobnogled vzeli tvorjenje rozet s proteinom IGFBP7. Z namenom, da bi lahko razložili ta pojav, so eritrocite zdravili z encimom Heparinaza in jih nato izpostavili pogojem, ugodnim za nastanek rozet ter opazovali dobljene rezultate. IGFBP7 opozori parazite na prihod monocitov, nato parazit ta protein uporabi kot most, ki se poveže še z dvema človeškima proteinoma na zdravem eritrocitu in tako pomaga pri tvorjenju.

=== Eva Ratajc: Z-DNA vezavni protein 1 kot ključni dejavnik kontrolirane replikacije virusa Zahodnega Nila in virusa zika ===
Virus Zahodnega Nila (WNV) je glavni povzročitelj virusnega encefalitisa v Združenih državah Amerike. Tudi okužbe z virusom zika (ZIKV) povzročajo resne nevrološke bolezni in prirojene napake. Znano je, da ima pri sproženju imunskega odziva pomembno vlogo Z-DNA vezavni protein 1 (ZBP1). Z-DNA vezavni protein (ZBP1) je citoplazmatski DNA-senzor, ki služi kot receptor za prepoznavanje molekularnih vzorcev. Ob okužbi telesa z virusom zika in virusom Zahodnega Nila se poveča izražanje ZBP1 v mišjih možganih. Zaradi tega so raziskovalci želeli raziskati vlogo ZBP1 pri omejitvi patogeneze pri osebkih, okuženih z navedenima virusoma. Pri miših z izbitim genom za ZBP1 −/− so zaznali višjo stopnjo okužb in višjo smrtnost po okužbi tako s smrtonosno kot z nesmrtonosno obliko virusa Zahodnega Nila kot pri miših divjega tipa (WT). Raziskovalci so ugotovili, da ima ZBP1 ključno vlogo pri omejitvi patogeneze pri miših. ZBP1 prepreči širjenje okužbe WNV in ZIKV v primarnih mišjih celicah in je pomemben za preživetje osebkov z boleznimi, ki ju povzročata omenjena virusa. Pomanjkanje ZBP1 je povzročilo večje količine virusa v serumu in možganih pri ZBP1−/− miših v primerjavi z divjim tipom. Pri ZBP1−/− miših so zaznali tudi višje virusne titre, ki so jih povezali z znižanimi leveli protivirusnih citokinov in kemokinov.

=== Lana Kores: Preučevanje ionskega kanalčka TRPA1 in bolečine s toksinom avstralskega škorpijona ===
Ionski kanalček TRPA1 (znan tudi kot wasabi receptor) je receptor za dražilce, ki povzročajo akutno bolečino in nevrogeno vnetje. Toksin za wasabi receptor WaTx je toksin avstralskega škorpijona, ki s pasivno difuzijo preide čez membrano celice in se nato veže na TRPA1. WaTx deluje na podoben način kot elektofilni dražilci receptorja, le da v nasprotju z njimi kanalčka ne odpre direktno, ampak le stabilizira njegovo odprto stanje in tako zmanjša prepustnost za Ca2+ ione. Koncentracija Ca2+ ionov je zato zadostna, da povzroči akutno bolečino, ne pa dovolj velika, da bi prišlo do nevrogenega vnetja, kot npr. pri elektrofilnem dražilcu AITC.

=== Eva Vene: Nevtralizacija denge v komarjih, ki izražajo načrtovano protitelo ===
Neuspešnost cepiva ter dejstvo, da je, zaradi širjenja življenjskega prostora A. aegypti, ogroženih 50% svetovnega prebivalstva, je vodilo v nadaljnje raziskave, ki bi omogočile zaustavitev širjenja virusa z restrikcijo slednjega že v samih prenašalcih. Možnost za uspeh obetajo protitelesa s širokim spektrom nevtralizacije (ang. broadly neutralizing antibodies), saj so slednja uspešna proti antigensko različnim virusom. Zaenkrat tovrstna protitelesa kot možnost zatiranja širjenja bolezni še niso bila uporabljena proti katerikoli vrsti virusa, njihova upešnost pa se je pokazala pri drugi veji mikroorganizmov.
Za raziskave so uporabili človeško protitelo 1C19, katerega uspešnost proti serotipom DENV je bila znana že iz prejšnjih let. V genom transgenih komarjev je bil dodan modificiran gen za scFv 1C19 (človeško protitelo, ki deluje proti DENV) in fluorescenčni označevalec, ki se sintetizira za protitelesom, tipa tdTomato. V komarje je bil določen serotip virusa vnešen z okuženo krvjo. Določili so dva možna izida okužbe: ponekod je DENV prosto prehajal čez srednje črevo – komarji so postali prenašalci virusa; v drugem primeru pa so izražena protitelesa nevtralizirala serotip virusa in s tem preprečila prenos okužbe naprej.

=== Nina Žgajnar: In vitro samostojno podvojevanje in policistronsko izražanje večjih sintetičnih genomov ===
Konvencionalne metode genskega inženirstva za reševanje zapletenih problemov se običajno osredotočajo na prilagajanje enega ali več genov. Sintezna biologija pa k tem težavam pristopa z novega vidika: ukvarja se z večjimi spremembami obstoječih celičnih struktur in z izgradnjo bolj zapletenih sistemov. Sinteza kemičnega sistema, ki je sposoben razmnoževanja in razvoja, je glavni cilj sintezne biologije. To bi lahko dosegli z in vitro rekonstrukcijo minimalno samozadostne centralne dogme. Znanstveniki so ustvarili sistem in vitro translacije, ki omogoča samostojno podvajanje in izražanje večjih genomov. Demonstrirali so samostojno podvojevanje genoma iz več kot 116 kilobaz, ki zajema celoten niz translacijskih faktorjev E. coli, vse tri ribosomske RNA, sistem za obnavljanje energije ter RNA in DNA polimeraze. Vzporedno z replikacijo DNA sistem omogoča sintezo vsaj 30 kodiranih translacijskih faktorjev, od katerih je polovica izražena v enakih ali večjih količinah od njihovih vhodnih nivojev. Vprašanje, kaj vse lahko dosežemo s samosestavljanjem kemijskih spojin, velja za eno izmed pomembnejših vprašanj v znanosti. Sintezna biologija tukaj postavlja nov cilj: sestaviti organizem izključno iz majhnih molekul. Potencialno bi tako lahko ustvarili organizme, ki bi čistili nevarne odpadke na nedostopnih mestih, rastline, ki bi zaznavale določene kemikalije in se nanje ustrezno odzvale, proizvedli čisto gorivo na učinkovit in trajnosten način ali prepoznavali in uničevali tumorje.

=== Jan Kogovšek: Inhibitor plazmepsina zmoti več stanj življenjskega cikla parazita malarije ===
Parazit Plasmodium falciparum je najpogostejši povzročitelj malarije pri ljudeh. S to boleznijo zboli več milijonov ljudi, umre pa jih približno 400 000 vsako leto. Antimalariki, ki so v uporabi, počasi izgubljajo svojo moč, kajti parazit je postal rezistenten na do sedaj najbolj učinkovito terapijo, imenovano artemisinin combination therapy (ATC). Znanstveniki so v ta namen odkrili tri nove zdravilne učinkovine, ki delujejo kot inhibitorji plazmepsina IX in plazmepsina X, ki ju izloča Plasmodium. Odkrili so, da inhibitorji zavrejo izločanje dodatnih proteinov iz celic, ki parazitu omogočajo vstop v eritrocite. S testi so ugotovili, da WM4 in WM5, ki sta prva na novo odkrita inhibitorja, delujeta na isti princip, vendar ne vplivata na dozorevanje in širjenje oocist parazita. WM382, naknadno odkrit inhibitor, pa poleg istih mehanizmov, kot jih imata WM4 in WM5, deluje tudi na dozorevanje oocist v fazi rasti parazita v jetrih. Za vse tri učinkovine so tudi dokazali specifično delovanje na oba plazmepsina. S tem ko WM382 zavira rast in zorenje oocist parazita, se tudi zmanjša prenašanje parazita na komarje in možnost prenosa rezistence na že obstoječe antimalarike.

=== Kostadin Mitkov: Heat shock factor 2 helps the cells to maintain cell adhesion and protect themselves against stress ===
Maintenance of protein homeostasis is essential for the cell viability and growth. The cells in the human body are constantly exposed to environmental stress factors, which tend to disturb that protein homeostasis maintenance. For the first time, research shows that the contacts between cells, known as cell adhesion, are essential for cells to survive stress and maintain protein homeostasis. Cell adhesion is relied on heat shock factors (HSFs). HSFs mediate their protective functions through diverse genetic programs, which are composed of genes encoding molecular chaperones and other genes crucial for cell survival. Scientists have found that HSF2 is critical for cell survival during prolonged proteotoxicity, and their RNA sequencing (RNA-seq) analyses revealed that cells that lack HSF2 have weakened viability which is not caused by inadequate induction of molecular chaperones but is due to marked downregulation of cadherin superfamily genes. They demonstrated that maintenance of cadherin-mediated cell-cell adhesion is dependent on HSF2 and it is also required for protection against stress induced by proteasome inhibition. This study identifies HSF2 as a key regulator of cadherin superfamily genes and defines cell-cell adhesion as a determinant of proteotoxic stress resistance.

Konec klepeta
Napiši sporočilo ...

TBK2020 Povzetki seminarjev

2020-04-02T14:29:28Z

Kostadin Mitkov:

=== Anna Scott: Notting Hill ===
William Thacker (Hugh Grant) is a London bookstore owner whose humdrum existence is thrown into romantic turmoil when famous American actress Anna Scott (Julia Roberts) appears in his shop. A chance encounter over spilled orange juice leads to a kiss that blossoms into a full-blown affair. As the average bloke and glamorous movie star draw closer and closer together, they struggle to reconcile their radically different lifestyles in the name of love.

=== Sara Golob: Vpliv virusa Herpesa simpleksa tipa 1 na razvoj Alzheimerjeve bolezni ===

Pri Alzheimerjevi bolezni pride do padca kognitivnih funkcij, kot so spomin, govor, pozornost, učenje, itd. Razvije se zaradi različnih dejavnikov, ki so lahko dedni ali okoljski. Eden od okoljskih dejavnikov je okužba z virusom Herpes simpleks tip 1. Ta povzroči večje izražanje ε4 alela apolipoproteina E, ki povzroča nalaganje Tau proteina in amiloida beta, ki sestavljata senilne plake pri Alzheimerjevi bolezni. To povezavo so odkrili s protitelesi proti virusu Herpes simpleks tipa 1 ter preko lizosomske okvare, zaradi katere pride do nalaganja amiloida beta v možganih. Dokazana je bila tudi povezava med Alzheimerjevo boleznijo in drugimi boleznimi (epilepsija, demenca, shizofrenija, fibromialgija, demenca), pri katerih je opazna kognitivna disfunkcija. Pri bolnikih z epilepsijo so odkrili amiloidne plake, ki so značilni za Alzheimerjevo bolezen, zaradi česar je večja verjetnost, da oboleli za epilepsijo zbolijo še za Alzheimerjevo boleznijo in obratno. Herpes simpleks virus redko povzroča tudi akutni encefalitis, katerega posledica so epileptični napadi, izguba spomina in spremembe v vedenju. Zato znanstveniki menijo, da je povezava med epilepsijo in Alzheimerjevo boleznijo tudi v apolipoproteinu E.

=== Ena Kartal: Kako celično staranje vodi do nevrodegeneracije ===
Čeprav je bila vzpostavljena povezava med kroničnim vnetjem in nevrodegenerativnimi boleznimi, je bilo veliko odprtih vprašanj v zvezi s tem, kako celično staranje, proces, pri katerem celice, ki se nehajo deliti pod stresom, izločijo mešanico vnetnih beljakovin, vplivajo na te patologije. Raziskovalci poročajo, da staranje v astrocitih, ki je najbolj razširjena vrsta celic v možganih, vodi do škodljive '' ekscitotoksičnosti '' na kortikalnih nevronih, ki so vključeni v spomin.In pri tem pride do Alzheimerjeve bolezni,ki je najpogostejši vzrok demence pri starejših, je nepopravljiva, napredujoča možganska motnja, ki ubija možganske celice in postopoma uničuje spomin.

=== Lenka Stanković: Optimizirano antiangiogeno reprogramiranje tumorskega mikrookolja potencira imunoterapijo CD40 ===

Karakteristika raka je njegova sposobnost spodbujanja angiogeneze, oziroma tvorba novih krvnih žil. Angiogeneza prispeva k rasti in napredovanju tumorja z induciranjem in vzdrževanjem kislega / hipoksičnega in imunosupresivnega okolja. Krvne žile v rakih so pogosto nefunkcionalne in omejujejo promet s T-celicami. Odkritje angiogenih zaviralcev naj bi pripomoglo k zmanjšanju umrljivosti zaradi karcinomov. Tukaj prikazujemo, da imunoterapija proti CD40 poveča tumorsko infiltracijo CD8+T, vendar regresijo tumorja dosežemo močneje, če anti-CD40 kombinirano z dvojno blokado Ang2 in VEGFA. Kombinacija anti-VEGFA, anti-Ang2 in agonističkih protiteles proti anti-CD40 omogoča zavrnitev tumorjev pri sintetičnih modelih tumorjev. Proučevali so odzive tumorjev na anti-VEGFA, anti-Ang2 in agonistična protitelesa proti CD40 v različnih modelih mišjega raka. V raziskavi so pokazali, da kombinacija agonističnih protiteles CD40 z dvojno blokado VEGFA/Ang2 povečuje protitumorski odziv v modelnih raka miši s pomočjo sinergistične regulacije genov in indukcije imunskega permisivnega mikrookruženja tumorja, za katero je značilno provnetno (M1 podobno) aktivacijo makrofagov, vaskularno normalizacija ter izboljšanja infiltracije in prostorska lokalizacija efektorskih T-celic. T-celice pošljejo signale drugim vrstam imunskih celic, vključno s citotoksičnimi T celicami CD8+. Citotoksične T-celice, znane tudi kot CD8 + T-celice, izražajo svoje TCR, ki jih spremlja glikoprotein CD8. CD8 + T-celice so povezane z učinkovitim ubijanjem rakavih celic: med antigensko specifično aktivacijo afiniteta med CD8 glikoproteinom, izraženim s celico CD8 + T, in molekulo MHC razreda I, izraženo z rakavo celico, ohranja obe vrsti celic skupaj. Tesna vezava T celic in rakavih celic skozi kompleks CD8 / TCR in kompleks antigen / MHC-I povzroči, da celice CD8 + T izločajo perforin in grancime, kar vodi v lizo rakavih celic.

=== Nika Tomsič: Pomembnost in delovanje sladkornega prenašalca PfHT1 v parazitu malarije ===
Po oceni World Health Organisation- World malaria report 2019 je v letu 2018 bilo 228 milijonov primerov malarije. Sladkor je glavni vir energije parazita, zato je razumevanje presnove sladkorjev pomembna tema, ki bi lahko predstavljala pomoč pri sestavljanju zdravil in izrivanju tega parazita. Glavna razlika v presnovi sladkorjev med parazitom in drugimi organizmi je prenašalec, ki sladkorje prenaša v celico. Za to je odgovoren šeskotni prenašalec PfHT1, ki je sposoben transportirati bodisi glukozo kot fruktozo. Strukturno pa je zelo podoben prenašalcem človeške celice GLUT. Prenašalec obsega 12 transmembranskih vijačnic, ki tvorijo osrednjo pot za vstop glukoze. Ključni del proteina pa predstavljajo izrastki ki delujejo kot receptorji za sladkorje. Sladkorne prenašalce še nadaljnjo stabilizirajo solne medcelične povezave. Druga velika razlika med PfHT1 in drugimi prenašalci je brez dvoma način odpiranja in zapiranja prenašalca, saj ni sestavljenen samo iz treh običajnih stanj (odprto navznoter, zaprto, odprto navznoter), temveč ga zaznamujejo še dve vmesni stanji (zaprto navznoter in zaprto navzven, angl. inward–occluded in outward-occluded). Nadaljnjo raziskovanje bi torej lahko omogočilo razvoja novih antimalaričnih zdravil, ki blokirajo uvoz sladkorja in zastrašujejo parazita do smrti oz. razvoja novih zaviralcev, ki so bolj specifični za blokiranje funkcije PfHT1, ne da bi pri tem vplivali na transport sladkorja v človeških celicah.

=== Maša Mencigar: Vpliv apoptotskih celic na imunski sistem ===
Apoptotske celice v telesu lahko nadzorujejo imunski sistem in preprečijo nezaželene imunske odzive na telesu lastna tkiva oziroma celice. Avtoimune bolezni so kronične, neozdravljive in predstavlajo velik zdravstven problem, saj bolniki trpijo, hkrati pa povzročajo velike stroške. Znanstveniki iz nemškega centra za raziskave rakavih bolezni (DKFZ - Deutsches Krebsforschungszentrum; angl: German Cancer Research Center) so našli receptor na imunskih celicah miši, ki aktivira ta zaščitni mehanizem in prepreči nevarne avtoimunske reakcije. Ta receptor se imenuje dektin-1, ki ima dvojno vlogo, saj veže beta-glukane in aksin proteine. Pomankanje dektina-1 vodi do simptomov avtoimunih bolezni šele proti koncu življenske dobe. Ključna pa je povezava med encimom NAHPH oksidazo-2 in dektinom-1, zato imajo ljudje, ki nimajo tega encima avtoimune bolezni.

=== Ema Kovačič: Izpostavljenost ploda materini mikrobioti ===
Študija o prehodu materine mikrobiote skozi placento pri otrocih, ki so se rodili s carskim rezom prezgodaj in normalno. Mamam so vzeli brise iz različnih delov telesa, otrokom pa takoj po rojstvu vzorce iz ustne votline in mekonija. Imunski sistem pri otrocih se razvije že v prenatalnem obdobju. Našli so DNK nekaterih bakterij v posteljici, plodovnici in mekoniju, kar kaže, da se zarodek spopade z bakterijami že v prenatalnem obdobju. Odkritje bakterijskih zapisov v materničnem okolju nakazuje na koesistenco mehanizmov za kontorolo izpostavljenosti pri plodu in materini mikrobioti.

=== Zala Puklavec: Globoko učenje void do odkritja novih antibiotikov===
Zaradi naglega pojava bakterij, ki so odporne na antibiotike, raste potreba po odkritju novih antibiotikov. Zato so naučili globoko nevronsko mrežo napovedati molekule, ki imajo antibakterijske lastnosti. S tem računalniškim modelom so odkrili, da ima halicin (c-Jun N-terminal kinase inhibitor SU3327) zelo močne antibakterijske lastnosti. Nadaljni eksperimenti so pokazali, da deluje na drugačen način kot večina antibiotikov. Za razliko od ostalih je halicin proti E.coli bakteriociden, ne le bakteriostatski. Testirali so ga tudi na bakterijah, za katere po mnenju Svetovne zdravstvene organizacije najnujneje potrebujemo neko obliko zdravljenja, in proti veliki večini je deloval zelo uspešno. Z daljšo izpostavljenostjo E.coli halicinu so poskušali izolirati mutantske celice, ki so razvile odpornost nanj, vendar jim ni uspelo, kar kaže na to, da te odpornosti ni možno ali pa se vsaj veliko težje razvije. Z še nekaj eksperimenti pa so prišli do zaključka, da halicin disipatira transmembranski pH potencial in najverjetneje veže Fe3+ pred pH disipacijo in povezavo z membrano.

=== Martin Stanonik: De novo pojavitev adapterskih membranskih proteinov iz timinsko bogatih genskih sekvenc===
Odkrivamo vedno več proteinov, ki so nastali iz de novo genov. To pomeni, da so se kodirali iz nekodirajočih delov DNA, kar velja za redek proces. V laboratorijskih poskusih je preveliko izražanje teh nastajajočih genov omogočalo boljše delovanje celice v primerjavi z prevelikim izražanjem že vzpostavljenih genov in motenje tega procesa ni vplivalo na delovanje celice. za osebek so uporabili kvas, saj glive kvasovke vsebujejo najboljše lastnosti za izražanje genov.To prikazuje velik potencial, še posebej za timinsko bogate sekvence za izdelavo transmembranskih proteinov. Iz kombinacij različnih analiz je bil predlagan nov model genskega nastanka. Ta odkritja, bi lahko omogočala nov način izdelave polipeptidov, ki nastanejo iz teh, de novo, delov DNA.

=== Klara Kočman: Koronavirus: SARS-CoV in SARS-CoV-2 ===
Koronavirusi so veliki, pozitivni RNA virusi. Okuženost z virusom lahko opazimo z značilni simptomi kot so vročina, kašelj in pomanjkanje zraka. Najnovejši tip koronavirusa, SARS-CoV-2, tudi 2019-nCoV, se je prvič pojavil 31. decembra 2019 v mestu Wuhan na Kitajskem. Transport virusa s človeka na človeka je pogost pri telesnih stikih z bolnikom. SARS-CoV-2 primerjajo z virusama MERS-CoV in SARS-CoV. Na podlagi celotne analize genoma in proteinov je virus bližje SARS-CoV kot MERS-CoV, saj obstaja več kot 90% genetska podobnost s SARS-CoV, medtem kot je s MERS-CoV-jem neznatna. Genom virusa SARS-CoV-2 je sestavljen iz približno 30 kilobaz, ki jih kodira več strukturnih in nestrukturnih proteinov. S SARS-CoV si je podoben po dolžini genoma ter podobnem mehanizmu vstopa v celico ter uporabi celičnih receptorjev (ACE2). Glikoprotein ACE2 se nahaja na površini membrane in je pomemben za vezavo receptorjev gostiteljskih celic in gostitelja. Transmembranski proteini virusa se vežejo na človeško celico preko receptorjev ACE2 (encim za pretvorbo angiotenzina 2). Med 120 sekvencami virusa SARS-CoV-2 ni bila zanana niti ena mutacija, zato lahko s ciljenjem slednjih nudimo zaščito. Znanstveniki z opazovanjem odziva na protitelesa pri miših raziskujejo cepivo.

===Timotej Sotošek: Protivirusni remdesivir potentno inhibira RNA-odvisno RNA polimerazo od Srednje Vzhodni respiratorni sindrom koronavirusa===
Zdravilo remdesivir (bolj natančno Remdesivir trifosfat) je preiskovalna spojina, ki je bilo sprva ustvarjeno za zdravit Ebolo. Ima širok spektrum protivirusnih aktivnosti proti RNA virusih kot na primer koronavirusi , Filovirusi,… Njegova tarča je multi-podenotni RNA sintezni kompleks znan pod imenom RNA-odvisna RNA polimeraza na katerem s pomočjo drugih proteinov poteka sinteza virusne RNA verige. Remdesivir je nukleotidni analog ATP-ja s katerim tekmuje za vezavo v nastajajočo se virusno RNA verigo po tem, ko je virus že okuži celico. V primeru, da se Remdesivir uspe vezat v virusno RNA verigo bo ta prenehala rast in tako postala ne uporabna. To pomeni, da je Remdesivir le inhibitor, ki upočasnjuje oz. preprečuje nadaljno širjenje virusa. Raziskave so preiskovale mehanizem inhibicije na virusu Srednje Vzhodni respiratorni sindrom(MERS-CoV) in ga primerjali kako je učinkovit v primerjavi inhibicije virusa Ebola, ter na splošno kako zelo je njegov mehanizem učinkovit. Ker sta si MERS-CoV in SARS-CoV-2 sorodna virusa bi lahko zdravilo Remdesivir pomagal ozdravit obolele z SARS-CoV-2 koronavirusom.

===Nika Perko: Enkapsulacija eteričnega olja pomarančevca v celice gliv kvasovk===
Komarji vrste Aedes aegypti so eni glavnih povzročiteljev bolezni kot so denga, rumena mrzlica, zika in čikungunja. Najdemo jih v tropskem in subtropskem pasu ter celo v Evropi. Znanstveniki Univerze Nove Mehike so poiskali način, kako preprečiti širitev omenjenih bolezni. Ustvarili so naraven insekticid, ki prepreči razvoj komarjev, ko so ti še v stopnji ličinke. Larvicid je sestavljen iz enostavnih komponent: eteričnega olja pomarančevca Citrus sinensis in gliv kvasovk vrste Saccharomyces cervevisiae. Sintetiziran je bil s postopkom enkapsulacije eteričnega olja pomarančevca v celice gliv kvasovk. Med korake tega procesa so vpeljali še enega novega. Z njim so odstranili odvečno eterično olje, ki je ostalo na zunanji strani celic. To je bilo izredno pomembno, saj je odvečno olje delovalo kot repelent. Z različnimi analizami in primerjavami so ugotovili, da struktura celične stene, membrane in oljnih kapljic ostane po enkapsulaciji nespremenjena. Pomembna ugotovitev je bila tudi, da se kvasovke po enkapsulaciji niso mogle več razmnoževat. Testi efektivnosti so bili vzpodbudni, saj je bil larvicid učinkovit pri vseh ličinkah. Najbolj pa je bil učinkovit pri začetni razvojni stopnji ličink. Novi larvicid ima kar nekaj dobrih lastnosti: je naraven, ne more se nenadzorovano širit in tako škodit vodnemu okolju, izdelava je relativno poceni, je neškodljiv za ljudi, dolgo učinkuje…

=== Anja Moškrič: Povezava med infekcijo s temperiranimi bakteriofagi in izgubo sistema CRISPR-Cas tipa I ===
Sistem CRISPR-Cas je imunski mehanizem, ki je značilen za veliko prokariontov in arhej. Gre za gruče enakomerno prekinjenih palindromskih ponovitev, ki nosijo zapis za obrambo proti vdoru tujega dednega materiala (virusov in plazmidov). Kratica Cas pa predstavlja s CRISPR povezane gene, ki kodirajo zapis za nekatere encime, ki cepijo DNA. CRISPR lokus je sestavljen iz ponavljajočih CRISPR genov, med katerimi so vmesniki. Na teh pa je shranjena kopija dela zapisa virusa oz. plazmida. S študijo so želeli izvedeti vpliv infekcije bakterije Pseudomonas aeruginosa, s temperiranim oziroma lizogenim bakteriofagom (DMS3), ki se v obliki profaga vključi v dedni material gostiteljske celice. Izbrana bakterijska vrsta vrši sistem CRISPR-Cas tipa I-F. Za primerjavo so za eksperimente uporabljali tudi nekatere mutirane vrste bakterij,ki so imele napako v CRISPR lokusu. Eksperimenti so pokazali, da ob infekciji z nemutiranimi bakteriofagi bakterije niso sposobne uspešno odstranit le-teh. Iz zbranih rezultatov so ugotovili, da je v tem primeru imunski mehanizem slabo prilagojen celicam, saj povzroča imunopatološki efekt (avtoimunost). Do tega pride zaradi nepopolnega ujemanja zapisa na CRISPR vmesnikih s profagi. Če bakteriofagi ne kodirajo zapisa za acr gene (anti-CRISPR geni, ki zatirajo omenjen mehanizem), lahko to privede do izgube sistema CRISPR-Cas skozi evolucijo.

===Maja Deutsch: Globalni kemični učinki mikrobioma vključujejo nove konjugacije žolčne kisline===
Med vsemi mnogoceličarji in njihovimi mikrobiomi se pojavijo številne medsebojne kemične interakcije. Številne molekule, za katere je znano, da jih proizvaja mikrobiom, izrazito vplivajo na ravnovesje med zdravjem in boleznijo. Z uporabo masne spektrometrije in vizualizacije podatkov so bili ocenjeni učinki mikrobioma na celotno kemijo sesalca s primerjavo podatkov metabolomike pri aseptičnih miši in specifičnih-mikroorganizmov-prostih miši. Ugotovljeno je bilo, da mikrobiota vpliva na kemijo vseh organov. To je vključevalo aminokislinske konjugacije žolčnih kislin, ki so bile uporabljene za proizvodnjo fenilalanoholne kisline, tirozoholne kisline in levcoholne kisline, ki prej še niso bile identificirane, kljub obsežnim raziskavam kemije žolčnih kislin. Ti konjugati žolčne kisline so bili najdeni tudi pri ljudeh, vendar so bile bolj pogoste pri bolnikih z vnetnimi črevesnimi boleznmi, cistično fibrozo in pri dojenčkih. Te spojine so agonizirale farnezodini receptor X (FXR) in miši, ki so imele na novo odkrite kisline, so pokazale zmanjšano izražanje genov za sintezo žolčne kisline. Potrebne pa so nadaljnje raziskave, da se ugotovi, ali imajo te spojine fiziološko vlogo v sesalcih in ali prispevajo k črevesnim boleznim, ki so povezane z mikrobiomsko disbiozo.

=== Hana Glavnik: Kako paraziti malarije zaznajo imunske celice in se pred njimi zaščitijo ===
Pri raziskovanju malarije so znanstveniki odkrili pojav, ki so ga poimenovali rozeta. Rozeta je skupek neokuženih rdečih krvnih celic, ki s pomočjo proteinov, ki jih sintetizira parazit obkolijo okuženo rdečo krvno celico. Parazit se tako zaščiti pred gostiteljevim imunskim sistemom, saj ga monocite tako obkoljenega težje zaznajo. Raziskovali so tvorjenje rozet pri različnih pogojih. Izoliranim parazitom so dodali različne vrste monocitov in opazovali njihovo reakcijo. S tem so odkrili tudi protein IGFBP7, ki inducira tvorjenje rozet, vendar le ob prisotnosti dodatnih serumskih faktorjev. Odkritje proteina IGFBP7 je vodilo v odkritje novega načina tvorjenja rozet, tako imenovanega tipa II, saj za razliko od prvotnega tipa I, ta ne poteče spontano. Nato so pod drobnogled vzeli tvorjenje rozet s proteinom IGFBP7. Z namenom, da bi lahko razložili ta pojav, so eritrocite zdravili z encimom Heparinaza in jih nato izpostavili pogojem, ugodnim za nastanek rozet ter opazovali dobljene rezultate. IGFBP7 opozori parazite na prihod monocitov, nato parazit ta protein uporabi kot most, ki se poveže še z dvema človeškima proteinoma na zdravem eritrocitu in tako pomaga pri tvorjenju.

=== Eva Ratajc: Z-DNA vezavni protein 1 kot ključni dejavnik kontrolirane replikacije virusa Zahodnega Nila in virusa zika ===
Virus Zahodnega Nila (WNV) je glavni povzročitelj virusnega encefalitisa v Združenih državah Amerike. Tudi okužbe z virusom zika (ZIKV) povzročajo resne nevrološke bolezni in prirojene napake. Znano je, da ima pri sproženju imunskega odziva pomembno vlogo Z-DNA vezavni protein 1 (ZBP1). Z-DNA vezavni protein (ZBP1) je citoplazmatski DNA-senzor, ki služi kot receptor za prepoznavanje molekularnih vzorcev. Ob okužbi telesa z virusom zika in virusom Zahodnega Nila se poveča izražanje ZBP1 v mišjih možganih. Zaradi tega so raziskovalci želeli raziskati vlogo ZBP1 pri omejitvi patogeneze pri osebkih, okuženih z navedenima virusoma. Pri miših z izbitim genom za ZBP1 −/− so zaznali višjo stopnjo okužb in višjo smrtnost po okužbi tako s smrtonosno kot z nesmrtonosno obliko virusa Zahodnega Nila kot pri miših divjega tipa (WT). Raziskovalci so ugotovili, da ima ZBP1 ključno vlogo pri omejitvi patogeneze pri miših. ZBP1 prepreči širjenje okužbe WNV in ZIKV v primarnih mišjih celicah in je pomemben za preživetje osebkov z boleznimi, ki ju povzročata omenjena virusa. Pomanjkanje ZBP1 je povzročilo večje količine virusa v serumu in možganih pri ZBP1−/− miših v primerjavi z divjim tipom. Pri ZBP1−/− miših so zaznali tudi višje virusne titre, ki so jih povezali z znižanimi leveli protivirusnih citokinov in kemokinov.

=== Lana Kores: Preučevanje ionskega kanalčka TRPA1 in bolečine s toksinom avstralskega škorpijona ===
Ionski kanalček TRPA1 (znan tudi kot wasabi receptor) je receptor za dražilce, ki povzročajo akutno bolečino in nevrogeno vnetje. Toksin za wasabi receptor WaTx je toksin avstralskega škorpijona, ki s pasivno difuzijo preide čez membrano celice in se nato veže na TRPA1. WaTx deluje na podoben način kot elektofilni dražilci receptorja, le da v nasprotju z njimi kanalčka ne odpre direktno, ampak le stabilizira njegovo odprto stanje in tako zmanjša prepustnost za Ca2+ ione. Koncentracija Ca2+ ionov je zato zadostna, da povzroči akutno bolečino, ne pa dovolj velika, da bi prišlo do nevrogenega vnetja, kot npr. pri elektrofilnem dražilcu AITC.

=== Eva Vene: Nevtralizacija denge v komarjih, ki izražajo načrtovano protitelo ===
Neuspešnost cepiva ter dejstvo, da je, zaradi širjenja življenjskega prostora A. aegypti, ogroženih 50% svetovnega prebivalstva, je vodilo v nadaljnje raziskave, ki bi omogočile zaustavitev širjenja virusa z restrikcijo slednjega že v samih prenašalcih. Možnost za uspeh obetajo protitelesa s širokim spektrom nevtralizacije (ang. broadly neutralizing antibodies), saj so slednja uspešna proti antigensko različnim virusom. Zaenkrat tovrstna protitelesa kot možnost zatiranja širjenja bolezni še niso bila uporabljena proti katerikoli vrsti virusa, njihova upešnost pa se je pokazala pri drugi veji mikroorganizmov.
Za raziskave so uporabili človeško protitelo 1C19, katerega uspešnost proti serotipom DENV je bila znana že iz prejšnjih let. V genom transgenih komarjev je bil dodan modificiran gen za scFv 1C19 (človeško protitelo, ki deluje proti DENV) in fluorescenčni označevalec, ki se sintetizira za protitelesom, tipa tdTomato. V komarje je bil določen serotip virusa vnešen z okuženo krvjo. Določili so dva možna izida okužbe: ponekod je DENV prosto prehajal čez srednje črevo – komarji so postali prenašalci virusa; v drugem primeru pa so izražena protitelesa nevtralizirala serotip virusa in s tem preprečila prenos okužbe naprej.

=== Nina Žgajnar: In vitro samostojno podvojevanje in policistronsko izražanje večjih sintetičnih genomov ===
Konvencionalne metode genskega inženirstva za reševanje zapletenih problemov se običajno osredotočajo na prilagajanje enega ali več genov. Sintezna biologija pa k tem težavam pristopa z novega vidika: ukvarja se z večjimi spremembami obstoječih celičnih struktur in z izgradnjo bolj zapletenih sistemov. Sinteza kemičnega sistema, ki je sposoben razmnoževanja in razvoja, je glavni cilj sintezne biologije. To bi lahko dosegli z in vitro rekonstrukcijo minimalno samozadostne centralne dogme. Znanstveniki so ustvarili sistem in vitro translacije, ki omogoča samostojno podvajanje in izražanje večjih genomov. Demonstrirali so samostojno podvojevanje genoma iz več kot 116 kilobaz, ki zajema celoten niz translacijskih faktorjev E. coli, vse tri ribosomske RNA, sistem za obnavljanje energije ter RNA in DNA polimeraze. Vzporedno z replikacijo DNA sistem omogoča sintezo vsaj 30 kodiranih translacijskih faktorjev, od katerih je polovica izražena v enakih ali večjih količinah od njihovih vhodnih nivojev. Vprašanje, kaj vse lahko dosežemo s samosestavljanjem kemijskih spojin, velja za eno izmed pomembnejših vprašanj v znanosti. Sintezna biologija tukaj postavlja nov cilj: sestaviti organizem izključno iz majhnih molekul. Potencialno bi tako lahko ustvarili organizme, ki bi čistili nevarne odpadke na nedostopnih mestih, rastline, ki bi zaznavale določene kemikalije in se nanje ustrezno odzvale, proizvedli čisto gorivo na učinkovit in trajnosten način ali prepoznavali in uničevali tumorje.

=== Jan Kogovšek: Inhibitor plazmepsina zmoti več stanj življenjskega cikla parazita malarije ===
Parazit Plasmodium falciparum je najpogostejši povzročitelj malarije pri ljudeh. S to boleznijo zboli več milijonov ljudi, umre pa jih približno 400 000 vsako leto. Antimalariki, ki so v uporabi, počasi izgubljajo svojo moč, kajti parazit je postal rezistenten na do sedaj najbolj učinkovito terapijo, imenovano artemisinin combination therapy (ATC). Znanstveniki so v ta namen odkrili tri nove zdravilne učinkovine, ki delujejo kot inhibitorji plazmepsina IX in plazmepsina X, ki ju izloča Plasmodium. Odkrili so, da inhibitorji zavrejo izločanje dodatnih proteinov iz celic, ki parazitu omogočajo vstop v eritrocite. S testi so ugotovili, da WM4 in WM5, ki sta prva na novo odkrita inhibitorja, delujeta na isti princip, vendar ne vplivata na dozorevanje in širjenje oocist parazita. WM382, naknadno odkrit inhibitor, pa poleg istih mehanizmov, kot jih imata WM4 in WM5, deluje tudi na dozorevanje oocist v fazi rasti parazita v jetrih. Za vse tri učinkovine so tudi dokazali specifično delovanje na oba plazmepsina. S tem ko WM382 zavira rast in zorenje oocist parazita, se tudi zmanjša prenašanje parazita na komarje in možnost prenosa rezistence na že obstoječe antimalarike.

=== Kostadin Mitkov: Maintenance of protein homeostasis is essential for the cell viability and growth. The cells in the human body are constantly exposed to environmental stress factors, which tend to disturb that protein homeostasis maintenance. For the first time, research shows that the contacts between cells, known as cell adhesion, are essential for cells to survive stress and maintain protein homeostasis. Cell adhesion is relied on heat shock factors (HSFs). HSFs mediate their protective functions through diverse genetic programs, which are composed of genes encoding molecular chaperones and other genes crucial for cell survival. Scientists have found that HSF2 is critical for cell survival during prolonged proteotoxicity, and their RNA sequencing (RNA-seq) analyses revealed that cells that lack HSF2 have weakened viability which is not caused by inadequate induction of molecular chaperones but is due to marked downregulation of cadherin superfamily genes. They demonstrated that maintenance of cadherin-mediated cell-cell adhesion is dependent on HSF2 and it is also required for protection against stress induced by proteasome inhibition. This study identifies HSF2 as a key regulator of cadherin superfamily genes and defines cell-cell adhesion as a determinant of proteotoxic stress resistance.

Konec klepeta
Napiši sporočilo ...

TBK2020-seminar

2020-03-31T20:27:36Z

Kostadin Mitkov: /* Seznam seminarjev */

= Temelji biokemije- seminar =

Seminarje vodi prof. dr. Brigita Lenarčič. Seminarji so obvezni.

Ocena seminarjev (6-10) predstavlja enako število odstotkov, ki se prišteje h končni pisni oceni izpita.
Stran na strežniku s seminarskimi nalogami je zaščitena.
Uporabniško ime je: tbk, password pa: samozame## "##" sta dve številki, ki ju izveste na predavanjih.
Tudi za urejanje Wiki strani potrebujete geslo, ki se od zgornjega razlikuje. Postopek pridobitve Wiki uporabniškega imena in gesla je opisan [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Main_Page tukaj].

== Seznam seminarjev ==

{| {{table}}
{| border="1" cellspacing="0" style="border:#c9c9c9 1px solid; margin: 1em 1em 1em 0; border-collapse: collapse;"
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Ime in priimek'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Naslov seminarja'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Povezava'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Rok za oddajo'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Rok za recenzijo'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Datum predstavitve'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 1'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 2'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 3'''
|-
| Anna Scott ||[[TBK2020_Povzetki_seminarjev#Anna_Scott:_Notting_Hill|Moj naslov v slovenščini, link pa kaže na povzetek]]||[https://www.sciencedaily.com/releases/2019/02/190214100038.htm povezava] || 28.10. || 05.11. || 07.11. || r1 || r2 || r3
|-
| Lenka Stanković || Optimizirano antiangiogeno reprogramiranje tumorskega mikrookolja potencira imunoterapijo CD40 || https://www.pnas.org/content/117/1/541 || 24.02. || 27.02. || 03.03. || Špela Došler || Zala Perko || Marija Dujaković
|-
| Ena Kartal || Kako celično staranje vodi do nevrodegeneracije || https://www.sciencedaily.com/releases/2020/01/200129174540.htm || 24.02. || 27.02. || 03.03. || Jasmina Bešić || Ana Žagar || Neža Leskovar
|-
| Ema Kovačič ||Izpostavljenost ploda materinski mikrobioti || https://insight.jci.org/articles/view/127806 || 24.02. || 27.02. || 03.03. || Nikola Janakievski || Karin Rak || Luka Hafner
|-
| Nika Tomsič || Pomembnost in delovanje sladkornega prenašalca PfHT1 v parazitu malarije || 24.02. || 27.02. || 03.03. || Maja Deutsch || Jakob Tomšič || Marigona Beqiraj
|-
| Sara Golob ||Vpliv virusa Herpesa simpleksa tipa 1 na razvoj Alzheimerjeve bolezni || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/10/181019100702.htm || 24.02. || 27.02. || 03.03. || Manca Pirc || Maja Kobal || Rebeka Jerina
|-
| Zala Puklavec ||Globoko učenje vodi do odkritja novih antibiotikov || https://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-8674(20)30102-1?_returnURL=https%3A%2F%2Flinkinghub.elsevier.com%2Fretrieve%2Fpii%2FS0092867420301021%3Fshowall%3Dtrue || 04.03. || 07.03. || 10.03. || Nika Bedrač || Špela Došler || Zala Perko
|-
| Martin Stanonik || De novo pojavitev adapterskih membranskih proteinov iz timinsko bogatih genskih sekvenc || https://www.sciencedaily.com/releases/2020/02/200218104740.htm || 04.03. || 07.03. || 10.03. || Ivana Trifunovska || Jasmina Bešić || Ana Žagar
|-
| Klara Kočman || Novi koronavirus SARS-CoV-2 in SARS-CoV || https://www.sciencedaily.com/releases/2020/01/200131114755.htm || 04.03. || 07.03. || 10.03. || Bor Krajnik || Nikola Janakievski || Karin Rak
|-
| Maša Mencigar || Vpliv apoptotskih celic na imunski sistem || https://www.sciencedaily.com/releases/2020/01/200108123137.htm || 04.03. || 07.03. || 10.03. || Erik Putar || Maja Deutsch || Jakob Tomšič
|-
| Nevena Ješić || Nepravilne komunikacije med celicami vodijo v levkemijo || https://www.sciencedaily.com/releases/2020/02/200206144824.htm || 04.03. || 07.03. || 10.03. || Ela Bizjak || Manca Pirc || Maja Kobal
|-
| Nika Perko ||Enkapsulacija eteričnega olja pomarančevca v celice gliv kvasovk ||https://parasitesandvectors.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13071-019-3870-4 || 10.03. || 13.03. || 24.03. || Lenka Stanković || Nika Bedrač || Špela Došler
|-
| Timotej Sotošek || Protivirusni remdesivir potentno inhibira RNA-odvisno RNA polimerazo od Srednje vzhodni respiratorni sindrome koronavirusa|| || 10.03. || 13.03. || 24.03. || Ena Kartal || Ivana Trifunovska || Jasmina Bešić
|-
| Hana Glavnik || Kako paraziti malarije zaznajo imunske celice in se pred njimi zaščitijo || https://www.sciencedaily.com/releases/2020/02/200218124346.htm || 10.03. || 13.03. || 24.03. || Ema Kovačič || Bor Krajnik || Nikola Janakievski
|-
| Maja Deutsch || Globalni kemični učinki mikrobioma vključujejo nove konjugacije žolčne kisline || https://www.nature.com/articles/s41586-020-2047-9 || 17.03. || 20.03. || 24.03. || Martin Stanonik || Ena Kartal || Ivana Trifunovska
|-
| Eva Ratajc || Z-DNA vezavni protein 1 kot ključni dejavnik kontrolirane replikacije virusa Zahodnega Nila in virusa zika || https://www.readcube.com/articles/10.3389/fmicb.2019.02089 || 17.03. || 20.03. || 24.03. || Anja Moškrič || Ema Kovačič || Bor Krajnik
|-
| Lana Kores || Preučevanje ionskega kanalčka TRPA1 in bolečine s toksinom avstralskega škorpijona || https://www.sciencedaily.com/releases/2019/08/190822113400.htm || 17.03. || 20.03. || 24.03. || Maša Mencigar || Nika Tomsič || Erik Putar
|-
| Jan Kogovšek || Inhibitor plazmepsina zmoti več stanj življenjskega cikla parazita malarije || https://www.sciencedaily.com/releases/2020/03/200304141514.htm || 24.03. || 27.03. || 31.03. || Nika Perko || Zala Puklavec || Lenka Stanković
|-
| Nina Žgajnar || In vitro samostojno podvojevanje in policistronsko izražanje večjih sintetičnih genomov || https://www.sciencedaily.com/releases/2020/02/200218130501.htm || 24.03. || 27.03. || 31.03. || Timotej Sotošek || Martin Stanonik || Ena Kartal
|-
| Erika Rihter || Mikrobiomska analiza krvi in tkiv kot pristop k diagnosticiranju rakavih obolenj || https://www.sciencedaily.com/releases/2020/03/200311123302.htm || 24.03. || 27.03. || 31.03. || Hana Glavnik || Anja Moškrič || Ema Kovačič
|-
| Luka Šegota || Sulfolipid-1 je sprožilec kašlja, ki prenaša tuberkulozo ||https://www.sciencedaily.com/releases/2020/03/200306183349.htm || 24.03. || 27.03. || 31.03. || Klara Kočman || Maša Mencigar || Nika Tomsič
|-
| Eva Vene ||Nevtralizacija denge v komarjih, ki izražajo načrtovano protitelo || https://www.sciencedaily.com/releases/2020/01/200116141710.htm || 24.03. || 27.03. || 31.03. || Gaja Osojnik || Nevena Ješić || Sara Golob
|-
| Ajda Beltram || Predhodna identifikacija potencialnih tarč cepiva za COVID-19 koronavirus na podlagi imunoloških raziskav za Sars-CoV || https://www.sciencedaily.com/releases/2020/02/200226091227.htm|| 31.03. || 03.04. || 07.04. || Aleksandra Pajović || Nika Perko || Zala Puklavec
|-
| Jan Trebušak || || || 31.03. || 03.04. || 07.04. || Aljaž Simonič || Timotej Sotošek || Martin Stanonik
|-
| Jan Bregar || || || 31.03. || 03.04. || 07.04. || Eva Ratajc || Hana Glavnik || Anja Moškrič
|-
| Gregor Strniša || Vpliv genoma okroglega gobija na njegovo invazivnost || https://www.sciencedaily.com/releases/2020/02/200211103721.htm || 31.03. || 03.04. || 07.04. || Lana Kores || Klara Kočman || Maša Mencigar
|-
| Petra Pahor || || || 31.03. || 03.04. || 07.04. || Sara Borišek || Gaja Osojnik || Nevena Ješić
|-
| Nadja Dolničar || || || 08.04. || 11.04. || 14.04. || Jan Kogovšek || Aleksandra Pajović || Nika Perko
|-
| Tina Javeršek || || || 08.04. || 11.04. || 14.04. || Nina Žgajnar || Aljaž Simonič || Timotej Sotošek
|-
| Vid Dobrovoljc || || || 08.04. || 11.04. || 14.04. || Erika Rihter || Eva Ratajc || Hana Glavnik
|-
| Tinkara Božič ||Atomske strukture zaprtega in odprtega protonskega kanalčka M2 razkrivajo transportni mehanizem gripe tipa B ||https://www.sciencedaily.com/releases/2020/02/200203141435.htm || 08.04. || 11.04. || 14.04. || Luka Šegota || Lana Kores || Klara Kočman
|-
| Kostadin Mitkov ||Heat shock factor 2 helps the cells to maintain cell adhesion and protect themselves against stress ||https://www.sciencedaily.com/releases/2020/01/200116112548.htm || 08.04. || 11.04. || 14.04. || Eva Vene || Sara Borišek || Gaja Osojnik
|-
| Sara Jerič || || || 15.04. || 18.04. || 21.04. || Ajda Beltram || Jan Kogovšek || Aleksandra Pajović
|-
| Polona Leban || || || 15.04. || 18.04. || 21.04. || Jan Trebušak || Nina Žgajnar || Aljaž Simonič
|-
| Stefanija Ivanova || || || 15.04. || 18.04. || 21.04. || Jan Bregar || Erika Rihter || Eva Ratajc
|-
| Luka Stanković || || || 15.04. || 18.04. || 21.04. || Gregor Strniša || Luka Šegota || Lana Kores
|-
| Ana Pervanja || Biomaterial za sintezo umetnih žilnih struktur || https://www.sciencedaily.com/releases/2020/03/200304141557.htm || 15.04. || 18.04. || 21.04. || Petra Pahor || Eva Vene || Sara Borišek
|-
| Marija Dujaković || || || 29.04. || 02.05. || 05.05. || Nadja Dolničar || Ajda Beltram || Jan Kogovšek
|-
| Neža Leskovar || || || 29.04. || 02.05. || 05.05. || Tina Javeršek || Jan Trebušak || Nina Žgajnar
|-
| Luka Hafner || || || 29.04. || 02.05. || 05.05. || Vid Dobrovoljc || Jan Bregar || Erika Rihter
|-
| Anja Moškrič || Povezava med infekcijo s temperiranimi bakteriofagi in izgubo sistema CRISPR - Cas tipa I|| https://www.nature.com/articles/s41586-020-1936-2 || 29.04. || 02.05. || 05.05. || Tinkara Božič || Gregor Strniša || Luka Šegota
|-
| Rebeka Jerina || || || 29.04. || 02.05. || 05.05. || Kostadin Mitkov || Petra Pahor || Eva Vene
|-
| Zala Perko || Regulacija s staranjem povezanih patoloških stanj z acetilacijo proteina NLRP3 || https://www.sciencedaily.com/releases/2020/02/200206144837.htm || 06.05. || 09.05. || 12.05. || Sara Jerič || Nadja Dolničar || Ajda Beltram
|-
| Ana Žagar || || || 06.05. || 09.05. || 12.05. || Polona Leban || Tina Javeršek || Jan Trebušak
|-
| Karin Rak || || || 06.05. || 09.05. || 12.05. || Stefanija Ivanova || Vid Dobrovoljc || Jan Bregar
|-
| Jakob Tomšič || || || 06.05. || 09.05. || 12.05. || Luka Stanković || Tinkara Božič || Gregor Strniša
|-
| Maja Kobal || || || 06.05. || 09.05. || 12.05. || Ana Pervanja || Kostadin Mitkov || Petra Pahor
|-
|Erika Rihter || || || 13.05. || 16.05. || 19.05. || Marija Dujaković || Sara Jerič || Nadja Dolničar
|-
| Jasmina Bešić || Kako matične celice popravijo škodo zaradi srčnih napadov || https://www.sciencedaily.com/releases/2020/03/200313112144.htm || 13.05. || 16.05. || 19.05. || Neža Leskovar || Polona Leban || Tina Javeršek
|-
| Nikola Janakievski || || || 13.05. || 16.05. || 19.05. || Luka Hafner || Stefanija Ivanova || Vid Dobrovoljc
|-
| Aljaž Simonič || || || 13.05. || 16.05. || 19.05. || Marigona Beqiraj || Luka Stanković || Tinkara Božič
|-
| Manca Pirc || || || 13.05. || 16.05. || 19.05. || Rebeka Jerina || Ana Pervanja || Kostadin Mitkov
|-
| Nika Bedrač || Nižji vnos žveplo vsebujočih amino kislin niža tveganje za razvoj kardiometaboličnih bolezni || https://www.sciencedaily.com/releases/2020/02/200203141501.htm || 20.05. || 23.05. || 26.05. || Zala Perko || Marija Dujaković || Sara Jerič
|-
| Ivana Trifunovska || || || 20.05. || 23.05. || 26.05. || Ana Žagar || Neža Leskovar || Polona Leban
|-
| Bor Krajnik || || || 20.05. || 23.05. || 26.05. || Karin Rak || Luka Hafner || Stefanija Ivanova
|-
| Erik Putar || || || 20.05. || 23.05. || 26.05. || Jakob Tomšič || Marigona Beqiraj || Luka Stanković
|-
| Ela Bizjak || || || 20.05. || 23.05. || 26.05. || Maja Kobal || Rebeka Jerina || Ana Pervanja
|}

==Naloga==
* samostojno pripraviti seminar, katerega tema je novica iz področja biokemije na portalu [http://www.sciencedaily.com ScienceDaily], ki je bila objavljena kasneje kot 1. avgusta 2018. Osnova za seminar naj bo znanstveni članek, ki je podlaga za to novico. Poleg tega članka za seminar uporabite še najmanj pet drugih virov, od teh vsaj še dva druga znanstvena članka, ki se navezujeta na to vsebino.
* članke na temo lahko iščete [https://scholar.google.com/ z Google učenjakom].
* naslov izbrane teme in povezavo do novice vpišite v tabelo seminarjev takoj ko ste si izbrali temo, najkasneje pa en teden pred rokom za oddajo
* [[TBK2020 Povzetki seminarjev|Povzetek seminarja]] opišete na wikiju v približno 200 besedah - najkasneje do dne, ko morate oddati seminar recenzentom.
* Povezavo do povzetka vnesete v tabelo seminarjev tekočega letnika.
* Seminar pripravite v obliki seminarske naloge (pisava Cambria, font 11, enojni razmak, 2,5 cm robovi; tekst naj obsega okoli 1000 besed), vsebuje naj 1-2 sliki. Slika mora imeti legendo in v besedilu mora biti na ustreznem mestu sklic na sliko. Vse uporabljene vire citirajte v tekstu, kot npr. (Nobel, 2010), na koncu pa navedite točen seznam literature, kot je opisano spodaj!
*Celotni seminar naj obsega 2 strani A4 formata (po možnosti dvostransko tiskanje).
* Seminar oddajte do datuma oddaje, ki je naveden v tabeli v elektronski obliki z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/tbk/poslji/ tega obrazca].
* vsi seminarji so v elektronski obliki dostopni [http://bio.ijs.si/~zajec/tbk/poslji//bioseminar/ tukaj].
* Recenzenti do dneva določenega v tabeli določijo popravke in podajo oceno pisnega dela, v predpisanem formatu elektronskega obrazca na internetu.
* Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Za predstavitev je na voljo 10 minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni. Prvi recenzent vodi predstavitve in razpravo ter skrbi za to, da vse poteka v zastavljenih časovnih okvirih.
* Predstavitvi sledi razprava do 5 minut. Sledijo vprašanja prisotnih, recenzenti postavijo vsak vsaj dve vprašanji in na koncu podajo oceno predstavitve.
* En dan pred predstavitvijo na strežnik oddajte tudi končno verzijo. Na dan predstavitve morate oddati tudi končno (popravljeno) in natisnjeno verzijo seminarja v enem izvodu.
* Seminarska naloga in povzetek na wikiju morajo biti v slovenskem jeziku!

==Imena datotek==
Prosim vas, da vse datoteke, ki jih pošiljate poimenujete po spodnjih pravilih. Ne uporabljajte ČŽŠčžš!
Poslati morate naslednje datoteke:
* TBK_2020_Priimek_Ime.doc(x) za seminar, npr. TBK_2020_Guncar_Gregor.docx
* TBK_2020_Priimek_ime_final.doc(x) za končno verzijo seminarja
* TBK_2020_Priimek_Ime_rec_Priimek2.doc(x) za recenzijo, kjer je Priimek2 priimek recenzenta, npr. TBK_2020_Guncar_Gregor_rec_Scott.docx (če se pišete Scott in odajate recenzijo za seminar, ki ga je napisal Gunčar)
* TBK_2020_Priimek_Ime.ppt(x) za prezentacijo, npr TBK_2020_Guncar_Gregor.pptx
* TBK_2020_Priimek_Ime_clanek.pdf za datoteko PDF, ki vsebuje izvirni članek, npr. TBK_2020_Guncar_Gregor_clanek.pdf

==Ocenjevanje seminarjev==
Recenzenti ocenijo seminar tako, da izpolnijo [[https://docs.google.com/forms/d/1Hdg2OHCyG24qwLTnFt09yZTng46RIwaIiUqnKOdsJxQ/viewform recenzentsko poročilo]] na spletu.

== Mnenje o predstavitvi ==
Vsak posameznik '''mora''' oceniti seminar tako, da odda svoje [https://docs.google.com/forms/d/1VvE-jaKikfiDO5Gdybqgp9mf_0uJZfBbIK8PLXKDaS0/viewform mnenje] najkasneje v enem tednu po predstavitvi. Kdor na seminarju ni bil prisoten, mnenja '''ne sme''' oddati.

==Urejanje spletnih strani na wikiju==
Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''

==Faktor vpliva==
Faktor vpliva (angl. impact factor) neke revije pove, kolikokrat so bili v poprečju citirani članki v tej reviji v dveh letih skupaj pred objavo tega faktorja. Faktorje vpliva za posamezno revijo lahko najdete v [http://www.cobiss.si/scripts/cobiss?command=CONNECT&base=JCR COBISS-u]. V polje "Naslov revije" vnesite ime revije za katero želite izvedeti faktor vpliva in pritisnite na gumb POIŠČI. V skrajnem desnem stolpcu se bodo izpisali faktorji vpliva za revije, ki ustrezajo vašim iskalnim kriterijem. Zadetkov za posamezno revijo je več zato, ker so navedeni faktorji vpliva za posamezno leto. Za tekoče leto faktorji vpliva še niso objavljeni, zato se orientirajte po faktorjih vpliva zadnjih par let. Če faktorja vpliva za vašo izbrano revijo ne najdete v bazi COBISS, potem izberite članek iz kakšne druge revije.

==Citiranje virov==Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se v seminarju držite ene same. Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati. '''Citiranje knjig:''' Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica. Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN. Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005. Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4. Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.). '''Citiranje člankov:''' Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani. Lartigue C. ''et al''. Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, letn. 317, str. 632-638.Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole: Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani. Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.Revija Science uporablja skrajšani zapis: C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007) V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne). '''Citiranje spletnih virov:''' Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.

TBK2020-seminar

2020-03-31T20:26:16Z

Kostadin Mitkov: /* Seznam seminarjev */

= Temelji biokemije- seminar =

Seminarje vodi prof. dr. Brigita Lenarčič. Seminarji so obvezni.

Ocena seminarjev (6-10) predstavlja enako število odstotkov, ki se prišteje h končni pisni oceni izpita.
Stran na strežniku s seminarskimi nalogami je zaščitena.
Uporabniško ime je: tbk, password pa: samozame## "##" sta dve številki, ki ju izveste na predavanjih.
Tudi za urejanje Wiki strani potrebujete geslo, ki se od zgornjega razlikuje. Postopek pridobitve Wiki uporabniškega imena in gesla je opisan [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Main_Page tukaj].

== Seznam seminarjev ==

{| {{table}}
{| border="1" cellspacing="0" style="border:#c9c9c9 1px solid; margin: 1em 1em 1em 0; border-collapse: collapse;"
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Ime in priimek'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Naslov seminarja'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Povezava'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Rok za oddajo'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Rok za recenzijo'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Datum predstavitve'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 1'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 2'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 3'''
|-
| Anna Scott ||[[TBK2020_Povzetki_seminarjev#Anna_Scott:_Notting_Hill|Moj naslov v slovenščini, link pa kaže na povzetek]]||[https://www.sciencedaily.com/releases/2019/02/190214100038.htm povezava] || 28.10. || 05.11. || 07.11. || r1 || r2 || r3
|-
| Lenka Stanković || Optimizirano antiangiogeno reprogramiranje tumorskega mikrookolja potencira imunoterapijo CD40 || https://www.pnas.org/content/117/1/541 || 24.02. || 27.02. || 03.03. || Špela Došler || Zala Perko || Marija Dujaković
|-
| Ena Kartal || Kako celično staranje vodi do nevrodegeneracije || https://www.sciencedaily.com/releases/2020/01/200129174540.htm || 24.02. || 27.02. || 03.03. || Jasmina Bešić || Ana Žagar || Neža Leskovar
|-
| Ema Kovačič ||Izpostavljenost ploda materinski mikrobioti || https://insight.jci.org/articles/view/127806 || 24.02. || 27.02. || 03.03. || Nikola Janakievski || Karin Rak || Luka Hafner
|-
| Nika Tomsič || Pomembnost in delovanje sladkornega prenašalca PfHT1 v parazitu malarije || 24.02. || 27.02. || 03.03. || Maja Deutsch || Jakob Tomšič || Marigona Beqiraj
|-
| Sara Golob ||Vpliv virusa Herpesa simpleksa tipa 1 na razvoj Alzheimerjeve bolezni || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/10/181019100702.htm || 24.02. || 27.02. || 03.03. || Manca Pirc || Maja Kobal || Rebeka Jerina
|-
| Zala Puklavec ||Globoko učenje vodi do odkritja novih antibiotikov || https://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-8674(20)30102-1?_returnURL=https%3A%2F%2Flinkinghub.elsevier.com%2Fretrieve%2Fpii%2FS0092867420301021%3Fshowall%3Dtrue || 04.03. || 07.03. || 10.03. || Nika Bedrač || Špela Došler || Zala Perko
|-
| Martin Stanonik || De novo pojavitev adapterskih membranskih proteinov iz timinsko bogatih genskih sekvenc || https://www.sciencedaily.com/releases/2020/02/200218104740.htm || 04.03. || 07.03. || 10.03. || Ivana Trifunovska || Jasmina Bešić || Ana Žagar
|-
| Klara Kočman || Novi koronavirus SARS-CoV-2 in SARS-CoV || https://www.sciencedaily.com/releases/2020/01/200131114755.htm || 04.03. || 07.03. || 10.03. || Bor Krajnik || Nikola Janakievski || Karin Rak
|-
| Maša Mencigar || Vpliv apoptotskih celic na imunski sistem || https://www.sciencedaily.com/releases/2020/01/200108123137.htm || 04.03. || 07.03. || 10.03. || Erik Putar || Maja Deutsch || Jakob Tomšič
|-
| Nevena Ješić || Nepravilne komunikacije med celicami vodijo v levkemijo || https://www.sciencedaily.com/releases/2020/02/200206144824.htm || 04.03. || 07.03. || 10.03. || Ela Bizjak || Manca Pirc || Maja Kobal
|-
| Nika Perko ||Enkapsulacija eteričnega olja pomarančevca v celice gliv kvasovk ||https://parasitesandvectors.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13071-019-3870-4 || 10.03. || 13.03. || 24.03. || Lenka Stanković || Nika Bedrač || Špela Došler
|-
| Timotej Sotošek || Protivirusni remdesivir potentno inhibira RNA-odvisno RNA polimerazo od Srednje vzhodni respiratorni sindrome koronavirusa|| || 10.03. || 13.03. || 24.03. || Ena Kartal || Ivana Trifunovska || Jasmina Bešić
|-
| Hana Glavnik || Kako paraziti malarije zaznajo imunske celice in se pred njimi zaščitijo || https://www.sciencedaily.com/releases/2020/02/200218124346.htm || 10.03. || 13.03. || 24.03. || Ema Kovačič || Bor Krajnik || Nikola Janakievski
|-
| Maja Deutsch || Globalni kemični učinki mikrobioma vključujejo nove konjugacije žolčne kisline || https://www.nature.com/articles/s41586-020-2047-9 || 17.03. || 20.03. || 24.03. || Martin Stanonik || Ena Kartal || Ivana Trifunovska
|-
| Eva Ratajc || Z-DNA vezavni protein 1 kot ključni dejavnik kontrolirane replikacije virusa Zahodnega Nila in virusa zika || https://www.readcube.com/articles/10.3389/fmicb.2019.02089 || 17.03. || 20.03. || 24.03. || Anja Moškrič || Ema Kovačič || Bor Krajnik
|-
| Lana Kores || Preučevanje ionskega kanalčka TRPA1 in bolečine s toksinom avstralskega škorpijona || https://www.sciencedaily.com/releases/2019/08/190822113400.htm || 17.03. || 20.03. || 24.03. || Maša Mencigar || Nika Tomsič || Erik Putar
|-
| Jan Kogovšek || Inhibitor plazmepsina zmoti več stanj življenjskega cikla parazita malarije || https://www.sciencedaily.com/releases/2020/03/200304141514.htm || 24.03. || 27.03. || 31.03. || Nika Perko || Zala Puklavec || Lenka Stanković
|-
| Nina Žgajnar || In vitro samostojno podvojevanje in policistronsko izražanje večjih sintetičnih genomov || https://www.sciencedaily.com/releases/2020/02/200218130501.htm || 24.03. || 27.03. || 31.03. || Timotej Sotošek || Martin Stanonik || Ena Kartal
|-
| Erika Rihter || Mikrobiomska analiza krvi in tkiv kot pristop k diagnosticiranju rakavih obolenj || https://www.sciencedaily.com/releases/2020/03/200311123302.htm || 24.03. || 27.03. || 31.03. || Hana Glavnik || Anja Moškrič || Ema Kovačič
|-
| Luka Šegota || Sulfolipid-1 je sprožilec kašlja, ki prenaša tuberkulozo ||https://www.sciencedaily.com/releases/2020/03/200306183349.htm || 24.03. || 27.03. || 31.03. || Klara Kočman || Maša Mencigar || Nika Tomsič
|-
| Eva Vene ||Nevtralizacija denge v komarjih, ki izražajo načrtovano protitelo || https://www.sciencedaily.com/releases/2020/01/200116141710.htm || 24.03. || 27.03. || 31.03. || Gaja Osojnik || Nevena Ješić || Sara Golob
|-
| Ajda Beltram || Predhodna identifikacija potencialnih tarč cepiva za COVID-19 koronavirus na podlagi imunoloških raziskav za Sars-CoV || https://www.sciencedaily.com/releases/2020/02/200226091227.htm|| 31.03. || 03.04. || 07.04. || Aleksandra Pajović || Nika Perko || Zala Puklavec
|-
| Jan Trebušak || || || 31.03. || 03.04. || 07.04. || Aljaž Simonič || Timotej Sotošek || Martin Stanonik
|-
| Jan Bregar || || || 31.03. || 03.04. || 07.04. || Eva Ratajc || Hana Glavnik || Anja Moškrič
|-
| Gregor Strniša || Vpliv genoma okroglega gobija na njegovo invazivnost || https://www.sciencedaily.com/releases/2020/02/200211103721.htm || 31.03. || 03.04. || 07.04. || Lana Kores || Klara Kočman || Maša Mencigar
|-
| Petra Pahor || || || 31.03. || 03.04. || 07.04. || Sara Borišek || Gaja Osojnik || Nevena Ješić
|-
| Nadja Dolničar || || || 08.04. || 11.04. || 14.04. || Jan Kogovšek || Aleksandra Pajović || Nika Perko
|-
| Tina Javeršek || || || 08.04. || 11.04. || 14.04. || Nina Žgajnar || Aljaž Simonič || Timotej Sotošek
|-
| Vid Dobrovoljc || || || 08.04. || 11.04. || 14.04. || Erika Rihter || Eva Ratajc || Hana Glavnik
|-
| Tinkara Božič ||Atomske strukture zaprtega in odprtega protonskega kanalčka M2 razkrivajo transportni mehanizem gripe tipa B ||https://www.sciencedaily.com/releases/2020/02/200203141435.htm || 08.04. || 11.04. || 14.04. || Luka Šegota || Lana Kores || Klara Kočman
|-
| Kostadin Mitkov ||Heat shock factor two helps the cells to maintain cell adhesion and protect themselves against stress ||https://www.sciencedaily.com/releases/2020/01/200116112548.htm || 08.04. || 11.04. || 14.04. || Eva Vene || Sara Borišek || Gaja Osojnik
|-
| Sara Jerič || || || 15.04. || 18.04. || 21.04. || Ajda Beltram || Jan Kogovšek || Aleksandra Pajović
|-
| Polona Leban || || || 15.04. || 18.04. || 21.04. || Jan Trebušak || Nina Žgajnar || Aljaž Simonič
|-
| Stefanija Ivanova || || || 15.04. || 18.04. || 21.04. || Jan Bregar || Erika Rihter || Eva Ratajc
|-
| Luka Stanković || || || 15.04. || 18.04. || 21.04. || Gregor Strniša || Luka Šegota || Lana Kores
|-
| Ana Pervanja || Biomaterial za sintezo umetnih žilnih struktur || https://www.sciencedaily.com/releases/2020/03/200304141557.htm || 15.04. || 18.04. || 21.04. || Petra Pahor || Eva Vene || Sara Borišek
|-
| Marija Dujaković || || || 29.04. || 02.05. || 05.05. || Nadja Dolničar || Ajda Beltram || Jan Kogovšek
|-
| Neža Leskovar || || || 29.04. || 02.05. || 05.05. || Tina Javeršek || Jan Trebušak || Nina Žgajnar
|-
| Luka Hafner || || || 29.04. || 02.05. || 05.05. || Vid Dobrovoljc || Jan Bregar || Erika Rihter
|-
| Anja Moškrič || Povezava med infekcijo s temperiranimi bakteriofagi in izgubo sistema CRISPR - Cas tipa I|| https://www.nature.com/articles/s41586-020-1936-2 || 29.04. || 02.05. || 05.05. || Tinkara Božič || Gregor Strniša || Luka Šegota
|-
| Rebeka Jerina || || || 29.04. || 02.05. || 05.05. || Kostadin Mitkov || Petra Pahor || Eva Vene
|-
| Zala Perko || Regulacija s staranjem povezanih patoloških stanj z acetilacijo proteina NLRP3 || https://www.sciencedaily.com/releases/2020/02/200206144837.htm || 06.05. || 09.05. || 12.05. || Sara Jerič || Nadja Dolničar || Ajda Beltram
|-
| Ana Žagar || || || 06.05. || 09.05. || 12.05. || Polona Leban || Tina Javeršek || Jan Trebušak
|-
| Karin Rak || || || 06.05. || 09.05. || 12.05. || Stefanija Ivanova || Vid Dobrovoljc || Jan Bregar
|-
| Jakob Tomšič || || || 06.05. || 09.05. || 12.05. || Luka Stanković || Tinkara Božič || Gregor Strniša
|-
| Maja Kobal || || || 06.05. || 09.05. || 12.05. || Ana Pervanja || Kostadin Mitkov || Petra Pahor
|-
|Erika Rihter || || || 13.05. || 16.05. || 19.05. || Marija Dujaković || Sara Jerič || Nadja Dolničar
|-
| Jasmina Bešić || Kako matične celice popravijo škodo zaradi srčnih napadov || https://www.sciencedaily.com/releases/2020/03/200313112144.htm || 13.05. || 16.05. || 19.05. || Neža Leskovar || Polona Leban || Tina Javeršek
|-
| Nikola Janakievski || || || 13.05. || 16.05. || 19.05. || Luka Hafner || Stefanija Ivanova || Vid Dobrovoljc
|-
| Aljaž Simonič || || || 13.05. || 16.05. || 19.05. || Marigona Beqiraj || Luka Stanković || Tinkara Božič
|-
| Manca Pirc || || || 13.05. || 16.05. || 19.05. || Rebeka Jerina || Ana Pervanja || Kostadin Mitkov
|-
| Nika Bedrač || Nižji vnos žveplo vsebujočih amino kislin niža tveganje za razvoj kardiometaboličnih bolezni || https://www.sciencedaily.com/releases/2020/02/200203141501.htm || 20.05. || 23.05. || 26.05. || Zala Perko || Marija Dujaković || Sara Jerič
|-
| Ivana Trifunovska || || || 20.05. || 23.05. || 26.05. || Ana Žagar || Neža Leskovar || Polona Leban
|-
| Bor Krajnik || || || 20.05. || 23.05. || 26.05. || Karin Rak || Luka Hafner || Stefanija Ivanova
|-
| Erik Putar || || || 20.05. || 23.05. || 26.05. || Jakob Tomšič || Marigona Beqiraj || Luka Stanković
|-
| Ela Bizjak || || || 20.05. || 23.05. || 26.05. || Maja Kobal || Rebeka Jerina || Ana Pervanja
|}

==Naloga==
* samostojno pripraviti seminar, katerega tema je novica iz področja biokemije na portalu [http://www.sciencedaily.com ScienceDaily], ki je bila objavljena kasneje kot 1. avgusta 2018. Osnova za seminar naj bo znanstveni članek, ki je podlaga za to novico. Poleg tega članka za seminar uporabite še najmanj pet drugih virov, od teh vsaj še dva druga znanstvena članka, ki se navezujeta na to vsebino.
* članke na temo lahko iščete [https://scholar.google.com/ z Google učenjakom].
* naslov izbrane teme in povezavo do novice vpišite v tabelo seminarjev takoj ko ste si izbrali temo, najkasneje pa en teden pred rokom za oddajo
* [[TBK2020 Povzetki seminarjev|Povzetek seminarja]] opišete na wikiju v približno 200 besedah - najkasneje do dne, ko morate oddati seminar recenzentom.
* Povezavo do povzetka vnesete v tabelo seminarjev tekočega letnika.
* Seminar pripravite v obliki seminarske naloge (pisava Cambria, font 11, enojni razmak, 2,5 cm robovi; tekst naj obsega okoli 1000 besed), vsebuje naj 1-2 sliki. Slika mora imeti legendo in v besedilu mora biti na ustreznem mestu sklic na sliko. Vse uporabljene vire citirajte v tekstu, kot npr. (Nobel, 2010), na koncu pa navedite točen seznam literature, kot je opisano spodaj!
*Celotni seminar naj obsega 2 strani A4 formata (po možnosti dvostransko tiskanje).
* Seminar oddajte do datuma oddaje, ki je naveden v tabeli v elektronski obliki z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/tbk/poslji/ tega obrazca].
* vsi seminarji so v elektronski obliki dostopni [http://bio.ijs.si/~zajec/tbk/poslji//bioseminar/ tukaj].
* Recenzenti do dneva določenega v tabeli določijo popravke in podajo oceno pisnega dela, v predpisanem formatu elektronskega obrazca na internetu.
* Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Za predstavitev je na voljo 10 minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni. Prvi recenzent vodi predstavitve in razpravo ter skrbi za to, da vse poteka v zastavljenih časovnih okvirih.
* Predstavitvi sledi razprava do 5 minut. Sledijo vprašanja prisotnih, recenzenti postavijo vsak vsaj dve vprašanji in na koncu podajo oceno predstavitve.
* En dan pred predstavitvijo na strežnik oddajte tudi končno verzijo. Na dan predstavitve morate oddati tudi končno (popravljeno) in natisnjeno verzijo seminarja v enem izvodu.
* Seminarska naloga in povzetek na wikiju morajo biti v slovenskem jeziku!

==Imena datotek==
Prosim vas, da vse datoteke, ki jih pošiljate poimenujete po spodnjih pravilih. Ne uporabljajte ČŽŠčžš!
Poslati morate naslednje datoteke:
* TBK_2020_Priimek_Ime.doc(x) za seminar, npr. TBK_2020_Guncar_Gregor.docx
* TBK_2020_Priimek_ime_final.doc(x) za končno verzijo seminarja
* TBK_2020_Priimek_Ime_rec_Priimek2.doc(x) za recenzijo, kjer je Priimek2 priimek recenzenta, npr. TBK_2020_Guncar_Gregor_rec_Scott.docx (če se pišete Scott in odajate recenzijo za seminar, ki ga je napisal Gunčar)
* TBK_2020_Priimek_Ime.ppt(x) za prezentacijo, npr TBK_2020_Guncar_Gregor.pptx
* TBK_2020_Priimek_Ime_clanek.pdf za datoteko PDF, ki vsebuje izvirni članek, npr. TBK_2020_Guncar_Gregor_clanek.pdf

==Ocenjevanje seminarjev==
Recenzenti ocenijo seminar tako, da izpolnijo [[https://docs.google.com/forms/d/1Hdg2OHCyG24qwLTnFt09yZTng46RIwaIiUqnKOdsJxQ/viewform recenzentsko poročilo]] na spletu.

== Mnenje o predstavitvi ==
Vsak posameznik '''mora''' oceniti seminar tako, da odda svoje [https://docs.google.com/forms/d/1VvE-jaKikfiDO5Gdybqgp9mf_0uJZfBbIK8PLXKDaS0/viewform mnenje] najkasneje v enem tednu po predstavitvi. Kdor na seminarju ni bil prisoten, mnenja '''ne sme''' oddati.

==Urejanje spletnih strani na wikiju==
Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''

==Faktor vpliva==
Faktor vpliva (angl. impact factor) neke revije pove, kolikokrat so bili v poprečju citirani članki v tej reviji v dveh letih skupaj pred objavo tega faktorja. Faktorje vpliva za posamezno revijo lahko najdete v [http://www.cobiss.si/scripts/cobiss?command=CONNECT&base=JCR COBISS-u]. V polje "Naslov revije" vnesite ime revije za katero želite izvedeti faktor vpliva in pritisnite na gumb POIŠČI. V skrajnem desnem stolpcu se bodo izpisali faktorji vpliva za revije, ki ustrezajo vašim iskalnim kriterijem. Zadetkov za posamezno revijo je več zato, ker so navedeni faktorji vpliva za posamezno leto. Za tekoče leto faktorji vpliva še niso objavljeni, zato se orientirajte po faktorjih vpliva zadnjih par let. Če faktorja vpliva za vašo izbrano revijo ne najdete v bazi COBISS, potem izberite članek iz kakšne druge revije.

==Citiranje virov==Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se v seminarju držite ene same. Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati. '''Citiranje knjig:''' Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica. Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN. Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005. Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4. Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.). '''Citiranje člankov:''' Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani. Lartigue C. ''et al''. Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, letn. 317, str. 632-638.Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole: Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani. Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.Revija Science uporablja skrajšani zapis: C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007) V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne). '''Citiranje spletnih virov:''' Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.

TBK2020-seminar

2020-03-31T20:08:50Z

Kostadin Mitkov: /* Seznam seminarjev */

= Temelji biokemije- seminar =

Seminarje vodi prof. dr. Brigita Lenarčič. Seminarji so obvezni.

Ocena seminarjev (6-10) predstavlja enako število odstotkov, ki se prišteje h končni pisni oceni izpita.
Stran na strežniku s seminarskimi nalogami je zaščitena.
Uporabniško ime je: tbk, password pa: samozame## "##" sta dve številki, ki ju izveste na predavanjih.
Tudi za urejanje Wiki strani potrebujete geslo, ki se od zgornjega razlikuje. Postopek pridobitve Wiki uporabniškega imena in gesla je opisan [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Main_Page tukaj].

== Seznam seminarjev ==

{| {{table}}
{| border="1" cellspacing="0" style="border:#c9c9c9 1px solid; margin: 1em 1em 1em 0; border-collapse: collapse;"
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Ime in priimek'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Naslov seminarja'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Povezava'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Rok za oddajo'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Rok za recenzijo'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Datum predstavitve'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 1'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 2'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 3'''
|-
| Anna Scott ||[[TBK2020_Povzetki_seminarjev#Anna_Scott:_Notting_Hill|Moj naslov v slovenščini, link pa kaže na povzetek]]||[https://www.sciencedaily.com/releases/2019/02/190214100038.htm povezava] || 28.10. || 05.11. || 07.11. || r1 || r2 || r3
|-
| Lenka Stanković || Optimizirano antiangiogeno reprogramiranje tumorskega mikrookolja potencira imunoterapijo CD40 || https://www.pnas.org/content/117/1/541 || 24.02. || 27.02. || 03.03. || Špela Došler || Zala Perko || Marija Dujaković
|-
| Ena Kartal || Kako celično staranje vodi do nevrodegeneracije || https://www.sciencedaily.com/releases/2020/01/200129174540.htm || 24.02. || 27.02. || 03.03. || Jasmina Bešić || Ana Žagar || Neža Leskovar
|-
| Ema Kovačič ||Izpostavljenost ploda materinski mikrobioti || https://insight.jci.org/articles/view/127806 || 24.02. || 27.02. || 03.03. || Nikola Janakievski || Karin Rak || Luka Hafner
|-
| Nika Tomsič || Pomembnost in delovanje sladkornega prenašalca PfHT1 v parazitu malarije || 24.02. || 27.02. || 03.03. || Maja Deutsch || Jakob Tomšič || Marigona Beqiraj
|-
| Sara Golob ||Vpliv virusa Herpesa simpleksa tipa 1 na razvoj Alzheimerjeve bolezni || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/10/181019100702.htm || 24.02. || 27.02. || 03.03. || Manca Pirc || Maja Kobal || Rebeka Jerina
|-
| Zala Puklavec ||Globoko učenje vodi do odkritja novih antibiotikov || https://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-8674(20)30102-1?_returnURL=https%3A%2F%2Flinkinghub.elsevier.com%2Fretrieve%2Fpii%2FS0092867420301021%3Fshowall%3Dtrue || 04.03. || 07.03. || 10.03. || Nika Bedrač || Špela Došler || Zala Perko
|-
| Martin Stanonik || De novo pojavitev adapterskih membranskih proteinov iz timinsko bogatih genskih sekvenc || https://www.sciencedaily.com/releases/2020/02/200218104740.htm || 04.03. || 07.03. || 10.03. || Ivana Trifunovska || Jasmina Bešić || Ana Žagar
|-
| Klara Kočman || Novi koronavirus SARS-CoV-2 in SARS-CoV || https://www.sciencedaily.com/releases/2020/01/200131114755.htm || 04.03. || 07.03. || 10.03. || Bor Krajnik || Nikola Janakievski || Karin Rak
|-
| Maša Mencigar || Vpliv apoptotskih celic na imunski sistem || https://www.sciencedaily.com/releases/2020/01/200108123137.htm || 04.03. || 07.03. || 10.03. || Erik Putar || Maja Deutsch || Jakob Tomšič
|-
| Nevena Ješić || Nepravilne komunikacije med celicami vodijo v levkemijo || https://www.sciencedaily.com/releases/2020/02/200206144824.htm || 04.03. || 07.03. || 10.03. || Ela Bizjak || Manca Pirc || Maja Kobal
|-
| Nika Perko ||Enkapsulacija eteričnega olja pomarančevca v celice gliv kvasovk ||https://parasitesandvectors.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13071-019-3870-4 || 10.03. || 13.03. || 24.03. || Lenka Stanković || Nika Bedrač || Špela Došler
|-
| Timotej Sotošek || Protivirusni remdesivir potentno inhibira RNA-odvisno RNA polimerazo od Srednje vzhodni respiratorni sindrome koronavirusa|| || 10.03. || 13.03. || 24.03. || Ena Kartal || Ivana Trifunovska || Jasmina Bešić
|-
| Hana Glavnik || Kako paraziti malarije zaznajo imunske celice in se pred njimi zaščitijo || https://www.sciencedaily.com/releases/2020/02/200218124346.htm || 10.03. || 13.03. || 24.03. || Ema Kovačič || Bor Krajnik || Nikola Janakievski
|-
| Maja Deutsch || Globalni kemični učinki mikrobioma vključujejo nove konjugacije žolčne kisline || https://www.nature.com/articles/s41586-020-2047-9 || 17.03. || 20.03. || 24.03. || Martin Stanonik || Ena Kartal || Ivana Trifunovska
|-
| Eva Ratajc || Z-DNA vezavni protein 1 kot ključni dejavnik kontrolirane replikacije virusa Zahodnega Nila in virusa zika || https://www.readcube.com/articles/10.3389/fmicb.2019.02089 || 17.03. || 20.03. || 24.03. || Anja Moškrič || Ema Kovačič || Bor Krajnik
|-
| Lana Kores || Preučevanje ionskega kanalčka TRPA1 in bolečine s toksinom avstralskega škorpijona || https://www.sciencedaily.com/releases/2019/08/190822113400.htm || 17.03. || 20.03. || 24.03. || Maša Mencigar || Nika Tomsič || Erik Putar
|-
| Jan Kogovšek || Inhibitor plazmepsina zmoti več stanj življenjskega cikla parazita malarije || https://www.sciencedaily.com/releases/2020/03/200304141514.htm || 24.03. || 27.03. || 31.03. || Nika Perko || Zala Puklavec || Lenka Stanković
|-
| Nina Žgajnar || In vitro samostojno podvojevanje in policistronsko izražanje večjih sintetičnih genomov || https://www.sciencedaily.com/releases/2020/02/200218130501.htm || 24.03. || 27.03. || 31.03. || Timotej Sotošek || Martin Stanonik || Ena Kartal
|-
| Erika Rihter || Mikrobiomska analiza krvi in tkiv kot pristop k diagnosticiranju rakavih obolenj || https://www.sciencedaily.com/releases/2020/03/200311123302.htm || 24.03. || 27.03. || 31.03. || Hana Glavnik || Anja Moškrič || Ema Kovačič
|-
| Luka Šegota || Sulfolipid-1 je sprožilec kašlja, ki prenaša tuberkulozo ||https://www.sciencedaily.com/releases/2020/03/200306183349.htm || 24.03. || 27.03. || 31.03. || Klara Kočman || Maša Mencigar || Nika Tomsič
|-
| Eva Vene ||Nevtralizacija denge v komarjih, ki izražajo načrtovano protitelo || https://www.sciencedaily.com/releases/2020/01/200116141710.htm || 24.03. || 27.03. || 31.03. || Gaja Osojnik || Nevena Ješić || Sara Golob
|-
| Ajda Beltram || Predhodna identifikacija potencialnih tarč cepiva za COVID-19 koronavirus na podlagi imunoloških raziskav za Sars-CoV || https://www.sciencedaily.com/releases/2020/02/200226091227.htm|| 31.03. || 03.04. || 07.04. || Aleksandra Pajović || Nika Perko || Zala Puklavec
|-
| Jan Trebušak || || || 31.03. || 03.04. || 07.04. || Aljaž Simonič || Timotej Sotošek || Martin Stanonik
|-
| Jan Bregar || || || 31.03. || 03.04. || 07.04. || Eva Ratajc || Hana Glavnik || Anja Moškrič
|-
| Gregor Strniša || Vpliv genoma okroglega gobija na njegovo invazivnost || https://www.sciencedaily.com/releases/2020/02/200211103721.htm || 31.03. || 03.04. || 07.04. || Lana Kores || Klara Kočman || Maša Mencigar
|-
| Petra Pahor || || || 31.03. || 03.04. || 07.04. || Sara Borišek || Gaja Osojnik || Nevena Ješić
|-
| Nadja Dolničar || || || 08.04. || 11.04. || 14.04. || Jan Kogovšek || Aleksandra Pajović || Nika Perko
|-
| Tina Javeršek || || || 08.04. || 11.04. || 14.04. || Nina Žgajnar || Aljaž Simonič || Timotej Sotošek
|-
| Vid Dobrovoljc || || || 08.04. || 11.04. || 14.04. || Erika Rihter || Eva Ratajc || Hana Glavnik
|-
| Tinkara Božič ||Atomske strukture zaprtega in odprtega protonskega kanalčka M2 razkrivajo transportni mehanizem gripe tipa B ||https://www.sciencedaily.com/releases/2020/02/200203141435.htm || 08.04. || 11.04. || 14.04. || Luka Šegota || Lana Kores || Klara Kočman
|-
| Kostadin Mitkov || ||https://www.sciencedaily.com/releases/2020/01/200116112548.htm || 08.04. || 11.04. || 14.04. || Eva Vene || Sara Borišek || Gaja Osojnik
|-
| Sara Jerič || || || 15.04. || 18.04. || 21.04. || Ajda Beltram || Jan Kogovšek || Aleksandra Pajović
|-
| Polona Leban || || || 15.04. || 18.04. || 21.04. || Jan Trebušak || Nina Žgajnar || Aljaž Simonič
|-
| Stefanija Ivanova || || || 15.04. || 18.04. || 21.04. || Jan Bregar || Erika Rihter || Eva Ratajc
|-
| Luka Stanković || || || 15.04. || 18.04. || 21.04. || Gregor Strniša || Luka Šegota || Lana Kores
|-
| Ana Pervanja || Biomaterial za sintezo umetnih žilnih struktur || https://www.sciencedaily.com/releases/2020/03/200304141557.htm || 15.04. || 18.04. || 21.04. || Petra Pahor || Eva Vene || Sara Borišek
|-
| Marija Dujaković || || || 29.04. || 02.05. || 05.05. || Nadja Dolničar || Ajda Beltram || Jan Kogovšek
|-
| Neža Leskovar || || || 29.04. || 02.05. || 05.05. || Tina Javeršek || Jan Trebušak || Nina Žgajnar
|-
| Luka Hafner || || || 29.04. || 02.05. || 05.05. || Vid Dobrovoljc || Jan Bregar || Erika Rihter
|-
| Anja Moškrič || Povezava med infekcijo s temperiranimi bakteriofagi in izgubo sistema CRISPR - Cas tipa I|| https://www.nature.com/articles/s41586-020-1936-2 || 29.04. || 02.05. || 05.05. || Tinkara Božič || Gregor Strniša || Luka Šegota
|-
| Rebeka Jerina || || || 29.04. || 02.05. || 05.05. || Kostadin Mitkov || Petra Pahor || Eva Vene
|-
| Zala Perko || Regulacija s staranjem povezanih patoloških stanj z acetilacijo proteina NLRP3 || https://www.sciencedaily.com/releases/2020/02/200206144837.htm || 06.05. || 09.05. || 12.05. || Sara Jerič || Nadja Dolničar || Ajda Beltram
|-
| Ana Žagar || || || 06.05. || 09.05. || 12.05. || Polona Leban || Tina Javeršek || Jan Trebušak
|-
| Karin Rak || || || 06.05. || 09.05. || 12.05. || Stefanija Ivanova || Vid Dobrovoljc || Jan Bregar
|-
| Jakob Tomšič || || || 06.05. || 09.05. || 12.05. || Luka Stanković || Tinkara Božič || Gregor Strniša
|-
| Maja Kobal || || || 06.05. || 09.05. || 12.05. || Ana Pervanja || Kostadin Mitkov || Petra Pahor
|-
|Erika Rihter || || || 13.05. || 16.05. || 19.05. || Marija Dujaković || Sara Jerič || Nadja Dolničar
|-
| Jasmina Bešić || Kako matične celice popravijo škodo zaradi srčnih napadov || https://www.sciencedaily.com/releases/2020/03/200313112144.htm || 13.05. || 16.05. || 19.05. || Neža Leskovar || Polona Leban || Tina Javeršek
|-
| Nikola Janakievski || || || 13.05. || 16.05. || 19.05. || Luka Hafner || Stefanija Ivanova || Vid Dobrovoljc
|-
| Aljaž Simonič || || || 13.05. || 16.05. || 19.05. || Marigona Beqiraj || Luka Stanković || Tinkara Božič
|-
| Manca Pirc || || || 13.05. || 16.05. || 19.05. || Rebeka Jerina || Ana Pervanja || Kostadin Mitkov
|-
| Nika Bedrač || Nižji vnos žveplo vsebujočih amino kislin niža tveganje za razvoj kardiometaboličnih bolezni || https://www.sciencedaily.com/releases/2020/02/200203141501.htm || 20.05. || 23.05. || 26.05. || Zala Perko || Marija Dujaković || Sara Jerič
|-
| Ivana Trifunovska || || || 20.05. || 23.05. || 26.05. || Ana Žagar || Neža Leskovar || Polona Leban
|-
| Bor Krajnik || || || 20.05. || 23.05. || 26.05. || Karin Rak || Luka Hafner || Stefanija Ivanova
|-
| Erik Putar || || || 20.05. || 23.05. || 26.05. || Jakob Tomšič || Marigona Beqiraj || Luka Stanković
|-
| Ela Bizjak || || || 20.05. || 23.05. || 26.05. || Maja Kobal || Rebeka Jerina || Ana Pervanja
|}

==Naloga==
* samostojno pripraviti seminar, katerega tema je novica iz področja biokemije na portalu [http://www.sciencedaily.com ScienceDaily], ki je bila objavljena kasneje kot 1. avgusta 2018. Osnova za seminar naj bo znanstveni članek, ki je podlaga za to novico. Poleg tega članka za seminar uporabite še najmanj pet drugih virov, od teh vsaj še dva druga znanstvena članka, ki se navezujeta na to vsebino.
* članke na temo lahko iščete [https://scholar.google.com/ z Google učenjakom].
* naslov izbrane teme in povezavo do novice vpišite v tabelo seminarjev takoj ko ste si izbrali temo, najkasneje pa en teden pred rokom za oddajo
* [[TBK2020 Povzetki seminarjev|Povzetek seminarja]] opišete na wikiju v približno 200 besedah - najkasneje do dne, ko morate oddati seminar recenzentom.
* Povezavo do povzetka vnesete v tabelo seminarjev tekočega letnika.
* Seminar pripravite v obliki seminarske naloge (pisava Cambria, font 11, enojni razmak, 2,5 cm robovi; tekst naj obsega okoli 1000 besed), vsebuje naj 1-2 sliki. Slika mora imeti legendo in v besedilu mora biti na ustreznem mestu sklic na sliko. Vse uporabljene vire citirajte v tekstu, kot npr. (Nobel, 2010), na koncu pa navedite točen seznam literature, kot je opisano spodaj!
*Celotni seminar naj obsega 2 strani A4 formata (po možnosti dvostransko tiskanje).
* Seminar oddajte do datuma oddaje, ki je naveden v tabeli v elektronski obliki z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/tbk/poslji/ tega obrazca].
* vsi seminarji so v elektronski obliki dostopni [http://bio.ijs.si/~zajec/tbk/poslji//bioseminar/ tukaj].
* Recenzenti do dneva določenega v tabeli določijo popravke in podajo oceno pisnega dela, v predpisanem formatu elektronskega obrazca na internetu.
* Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Za predstavitev je na voljo 10 minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni. Prvi recenzent vodi predstavitve in razpravo ter skrbi za to, da vse poteka v zastavljenih časovnih okvirih.
* Predstavitvi sledi razprava do 5 minut. Sledijo vprašanja prisotnih, recenzenti postavijo vsak vsaj dve vprašanji in na koncu podajo oceno predstavitve.
* En dan pred predstavitvijo na strežnik oddajte tudi končno verzijo. Na dan predstavitve morate oddati tudi končno (popravljeno) in natisnjeno verzijo seminarja v enem izvodu.
* Seminarska naloga in povzetek na wikiju morajo biti v slovenskem jeziku!

==Imena datotek==
Prosim vas, da vse datoteke, ki jih pošiljate poimenujete po spodnjih pravilih. Ne uporabljajte ČŽŠčžš!
Poslati morate naslednje datoteke:
* TBK_2020_Priimek_Ime.doc(x) za seminar, npr. TBK_2020_Guncar_Gregor.docx
* TBK_2020_Priimek_ime_final.doc(x) za končno verzijo seminarja
* TBK_2020_Priimek_Ime_rec_Priimek2.doc(x) za recenzijo, kjer je Priimek2 priimek recenzenta, npr. TBK_2020_Guncar_Gregor_rec_Scott.docx (če se pišete Scott in odajate recenzijo za seminar, ki ga je napisal Gunčar)
* TBK_2020_Priimek_Ime.ppt(x) za prezentacijo, npr TBK_2020_Guncar_Gregor.pptx
* TBK_2020_Priimek_Ime_clanek.pdf za datoteko PDF, ki vsebuje izvirni članek, npr. TBK_2020_Guncar_Gregor_clanek.pdf

==Ocenjevanje seminarjev==
Recenzenti ocenijo seminar tako, da izpolnijo [[https://docs.google.com/forms/d/1Hdg2OHCyG24qwLTnFt09yZTng46RIwaIiUqnKOdsJxQ/viewform recenzentsko poročilo]] na spletu.

== Mnenje o predstavitvi ==
Vsak posameznik '''mora''' oceniti seminar tako, da odda svoje [https://docs.google.com/forms/d/1VvE-jaKikfiDO5Gdybqgp9mf_0uJZfBbIK8PLXKDaS0/viewform mnenje] najkasneje v enem tednu po predstavitvi. Kdor na seminarju ni bil prisoten, mnenja '''ne sme''' oddati.

==Urejanje spletnih strani na wikiju==
Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''

==Faktor vpliva==
Faktor vpliva (angl. impact factor) neke revije pove, kolikokrat so bili v poprečju citirani članki v tej reviji v dveh letih skupaj pred objavo tega faktorja. Faktorje vpliva za posamezno revijo lahko najdete v [http://www.cobiss.si/scripts/cobiss?command=CONNECT&base=JCR COBISS-u]. V polje "Naslov revije" vnesite ime revije za katero želite izvedeti faktor vpliva in pritisnite na gumb POIŠČI. V skrajnem desnem stolpcu se bodo izpisali faktorji vpliva za revije, ki ustrezajo vašim iskalnim kriterijem. Zadetkov za posamezno revijo je več zato, ker so navedeni faktorji vpliva za posamezno leto. Za tekoče leto faktorji vpliva še niso objavljeni, zato se orientirajte po faktorjih vpliva zadnjih par let. Če faktorja vpliva za vašo izbrano revijo ne najdete v bazi COBISS, potem izberite članek iz kakšne druge revije.

==Citiranje virov==Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se v seminarju držite ene same. Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati. '''Citiranje knjig:''' Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica. Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN. Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005. Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4. Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.). '''Citiranje člankov:''' Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani. Lartigue C. ''et al''. Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, letn. 317, str. 632-638.Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole: Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani. Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.Revija Science uporablja skrajšani zapis: C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007) V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne). '''Citiranje spletnih virov:''' Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.