https://wiki.fkkt.uni-lj.si/api.php?action=feedcontributions&feedformat=atom&user=Lina+Kopa%C4%8D 2026-04-15T16:19:47Z User contributions MediaWiki 1.39.3 https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Heartecho:_presejalni_test_za_raka_pri_pacientih_po_miokardnem_infarktu&diff=24928 2025-05-12T22:17:10Z

<p>Lina Kopač: </p> <hr /> <div>Projekt Heartecho [https://2024.igem.wiki/cjuh-jlu-china/home] je na iGEM-u leta 2024 predstavila ekipa s Kitajske. Projekt je bil nagrajen z zlato medaljo in nominiran za najboljšega na področju diagnostike. <br /> <br /> = Uvod =<br /> <br /> Miokardni (srčni) infarkt in rak sta glavna vzroka smrti na svetu. V zadnjih letih so študije pokazale, da imajo kardiovaskularne bolezni (tudi miokardni infarkt) in rakava obolenja nekatere skupne značilnosti. Med pomembne dejavnike tveganja za obe bolezni sadajo kronično vnetje, debelost in kajenje. Študije so pokazale, da pri pacientih po srčnem infarktu obstaja povišano tveganje za nastanek raka [2]. Incidenca raka je pri pacientih po srčnem infarktu za 13 % višja kot v splošni populaciji. <br /> <br /> = Cilj =<br /> <br /> Namen projekta Heartecho je bil izdelava presejalnega testa za raka pri pacientih po miokardnem infarktu. Želeli so izdelati diagnostični test, ki bi temeljil na zaznavanju specifičnih miRNA s tehnologijo LIRA (Loop-initiated RNA Activator). S testom so želeli detektirati tiste miRNA, ki so visoko izražene pri pacientih s kardiovaskularnimi boleznimi in lahko hkrati spodbujajo nastanek raka. Študije so namreč pokazale, da se eksosomi, ki se ob ishemiji izločijo iz srčnih mišičnih celic, lahko nato absorbirajo v rakave celice. Ti eksosomi vsebujejo miRNA, ki v rakavih celicah zavirajo apoptozo in tako pripomorejo k napredovanju bolezni. <br /> <br /> = Načrtovanje =<br /> <br /> == Izbira tarčnih miRNA ==<br /> <br /> Prvi korak v načrtovanju metode je bil ugotoviti, katere miRNA izbrati za tarčo. S primerjavo podatkovnih baz GEO (Gene Expression Omnibus) in TCGA (Cancer Genome Atlas Program) so identificirali 24 miRNA, ki so drugače izražene tako po srčnem infarktu kot tudi pri raznih rakavih obolenjih. Pri izbiri kandidatov za tarčno miRNA so upoštevali še dva kriterija: količina miRNA v krvi mora biti dovolj visoka, izražanje miRNA pa mora biti povišano pri čim več tipih raka. Na podlagi teh kriterijev so nato izbrali miR-210-3p, ki se povišano izraža pri trinajstih različnih tipih raka in miR-142-3p, ki se povišano izraža pri desetih različnih tipih raka. Z analizo literature so ugotovili, da obe miRNA spodbujata migracijo in invazivnost tumorskih celic in sta tako primerna potencialna biološka označevalca. To so tudi eksperimentalno potrdili s testi celične migracije in invazije. Naslednji korak je bil ovrednotiti diagnostično vrednost miR-210-3p in miR-142-3p. Z analizo podatkov pridobljenih iz podatkovnih baz so ugotovili, da sočasna uporaba obeh miRNA kot bioloških označevalcev daje boljše rezultate, kot njuna posamična raba, saj zmanjša verjetnost lažno pozitivnih rezultatov. <br /> <br /> == LIRA ==<br /> <br /> Za detekcijo izbranih miRNA so se odločili uporabiti tehnologijo LIRA (Loop-initiated RNA Activator). LIRA tvori sekundarno strukturo steblo-zanka, ki vsebuje prepoznavno regijo, mesto za vezavo na ribosom (RBS) in začetni kodon AUG. Prepoznavna regija je 31 nukleotidov dolgo zaporedje, ki je reverzno komplementarno tarčni RNA. 21 nukleotidov prepoznavne regije tvori zanko, medtem ko je ostalih 10 nukleotidov v steblu. V odsotnosti tarčne RNA sta RBS in začetni kodon tesno vezana v steblo in tako ne moreta sprožiti prevajanja reporterskega gena. Vezava tarčne RNA na prepoznavno regijo sproži destabilizacijo zanke, kar povzroči izpostavitev RBS-ja in začetnega kodona ter omogoči prepisovanje reporterskega gena. Za potrebe diagnostičnega testa, so LIRA zaporedje prilagodili tako, da so prepoznavno regijo zamenjali z revezno komplementarnim zapisom za miR-210-3p oziroma miR-142-3p. Ker sta bili tarčni miRNA v tem primeru krajši od 31 nukleotidov (22 in 23 nukleotidov), so morali skrajšati prepozvano regijo, pri čemer so morali upoštevati, da so izbrali pravo razmerje med številom nukleotidov prepoznavne regije v zanki in steblu. Predvidevali so namreč, da je pravo razmerje ključno za aktivnosti LIRA, saj vpliva na interakcijo s tarčno RNA. Ker so to želeli tudi eksperimentalno preveriti, so si izbrali tri različna LIRA zaporedja proti miR-210-3p z razmerji steblo/zanka 2/20, 7/15 in 10/12 ter tri zaporedja proti miR-142-3p z razmerji steblo/zanka 3/20, 8/15 in 11/12. Da bi lahko zaznali dve miRNA hkrati, so načrtali takšno strukturo LIRA, ki je vsebovala dve roki ter logična vrata IN. Vezavno mesto za eno miRNA je bilo na prvi roki, vezavno mesto za drugo miRNA pa na drugi, daljši roki, ki je bila povezana z RBS in začetnim kodonom. Pričakovali so, da se bosta slednja izpostavila zgolj ob hkratni vezavi obeh tarčnih miRNA. Z računalniškimi simulacijami so nato identificirali tri zaporedja za katere so predvidevali, da bodo imela najboljše lastnosti.<br /> <br /> = Eksperimentalno delo =<br /> <br /> == Testiranje LIRA zaporedij za detekcijo ene miRNA ==<br /> <br /> Šest izbranih LIRA zaporedij so klonirali v plazmid pCOLADuet-1. Za povečanje izražanja so uporabili promotor T7. Za LIRA zaporedje so dodali še zapis za izboljšan zeleni fluorescenčni protein EGFP (angl. enchanced green flourescent protein), ki je služil kot reporterski gen. Predvidevali so, da bo vezava tarčne miRNA na LIRA zaporedje sprožila izražanje EGFP. Da bi zagotovili tudi izražanje tarčnih miRNA, so zaporedji za miR-210-3p in miR-142-3p klonirali v plazmida pET-15b in pCDFDuet-1. Trije uporabljeni plazmidi imajo kompatibilna mesta začetka podvojevanja (ORI) in različne selekcijske označevalce. Tako so jih lahko hkrati transformirali v bakterijske celice ter na gojišču z določeno kombinacijo antibiotika izbrali želene kolonije.<br /> Plazmide so tansformirali v E. coli seva BL21-D3. Celice so transformirali bodisi samo s plazmidom z LIRA zaporedjem ali pa s plazmidom z LIRA zaporedjem in hkrati s plazmidom z zapisom za tarčno miRNA. Iz uspešno transformiranih kolonij so nato pripravili kulture in izolirali plazmidno DNA. Da so potrdili ustrezne velikosti plazmidov, so jih razrezali z endonukelazami in analizirali z agarozno gelsko elektroforezo. Tranformirane celice so 4 ure inkubirali z IPTG ter nato pripravili celične lizate, ki so jim izmerili fluorescenco. Značilno razliko v fluorescenci med celicami transformiranimi samo s plazmidom z LIRA zaporedjem in s celicami transformiranimi s plazmidom z LIRA zaporedjem ter plazmidom z zapisom za tarčno miRNA so opazili samo v dveh primerih. To sta bili LIRA zaporedje proti miR-210-3p z razmerjem steblo/zanka 2/20 in LIRA zaporedje proti miR-142-3p z razmerjem steblo/zanka 11/12. Rezultati kažejo, da razmerje steblo/zanka morda vendarle nima takšnega vpliva na funkcijo LIRA, kot so sprva predvidevali.<br /> <br /> == Testiranje LIRA zaporedij za hkratno detekcijo dveh miRNA ==<br /> <br /> Tudi tri izbrana LIRA zaporedja z dvema rokama ki lahko hkrati vežejo obe tarčni miRNA so klonirali v plazmid pCOLADuet-1. Tudi v tem primeru s uporabili promotor T7 in EGFP kot reporterski gen. Konstrukte so označili kot LIRA1, LIRA2 in LIRA5. Plazmide so tansformirali v E. coli seva BL21-D3. Pripravili so celice, ki so vsebovale samo plazmid z izbranim LIRA zaporedjem, plazmid z LIRA zaporedjem in plazmidom za eno od tarčnih miRNA ter celice s plazmidom za LIRA zaporedje in obema plazmidoma z zapisom za tarčno miRNA. Tudi v tem primeru so celice so gojili na gojišču z dodatkom IPTG in nato pripravili celične lizate, ki so jim izmerili fluorescenco. Plazmidno DNA so izolirali in ustrezno velikost plazmidov potrdili z agarozno gelsko elektroforezo. Pri celicah transfromiranih z LIRA1 niso zaznali značilne razlike v fluorescenci ne glede na prisotnost katerekoli od tarčnih miRNA. Pri celicah transformiranih z LIRA2 so sicer opazili značilno povišanje fluorescence v prisotnosti obeh miRNA, vendar pa je bila fluorescenca značilno povišana tudi, kadar je bila prisotna zgolj miR-124-3p. Pri celicah transformiranih z LIRA5 so zaznali značilno povišanje fluorescence samo kadar sta bili prisotni obe tarčni miRNA, kar nakazuje, da je za aktivacijo tega LIRA zaporedja potrebna hkratna prisotnost miR-210-3p in miR-142-3p. <br /> <br /> == Brezcelični sistem ==<br /> <br /> Cilj projekta je bil zasnovati presejalni test za rutinsko diagnostiko. Ker bi bila transformacija miRNA iz krvi pacienta v bakterije težavna, so morali test prilagoditi za uporabo v brezceličnem sistemu. Plazmid z LIRA zaporedjem so spremenili tako, da so reporterski gen za EGFP zamenjali z LacZ, saj bi bilo v rutinskem testiranju lažje zaznati spremembo barve kot pa meriti fluorescenco. Da bi preverili, ali je uporaba testa v brezceličnem sistemu možna, so plazmid z zapisom za tarčno miRNA dodali v komercialni sistem za in-vitro prepisovanje in tako dobili tarčno miRNA. Nato so v komercialni sistem za in-vitro sintezo proteinov dodali plazmid LIRA5 z oziroma brez tarčne miRNA. Po dodatku kromogenega substrata CPRG so opazovali spremembo barve. Pri vzorcu, ki je vseboval samo plazmid z LIRA zaporedjem ni prišlo do spremembe barve. Prav tako se barva ni spremenila v vzorcih, ki sta vsebovala samo eno tarčno miRNA. V vzorcu, ki je vseboval tudi obe tarčni miRNA so opazili spremembo barve. Ta rezultat je pokazal, da hkratna prisotnost miR-210-3p in miR-142-3p aktivira LIRA5 v brezceličnem sistemu. <br /> <br /> = Zaključek =<br /> <br /> Ekipa s Kitajske je v sklopu projekta Heartecho razvila presejalni test za odkrivanje raka pri pacientih po srčnem infarktu. Test temelji na zaznavanju miRNA miR-142-3p in miR-210-3p, ki se povišano izražata tako po miokardne infarktu kot tudi pri različnih tipih raka. Študentje so načrtali zaporedja LIRA, ki zaznavajo eno od tarčnih miRNA ter zaporedje, ki ga aktivira hkratna prisotnost obeh tarčnih miRNA. Delovanje testa so preizkusili v laboratoriju – najprej v bakterijski kulturi nato pa še v brezceličnem sistemu. Uspešno so identificirali eno LIRA zaporedje, ki zaznava miR-210-3p, eno zaporedje, ki zaznava miR-142-3p ter zaporedje, ki zaznava hkratno prisotnost obeh miRNA. <br /> <br /> = Viri in literatura =<br /> <br /> 1. CJUH-JLU-China: Heartecho: A cancer screening kit for post-myocardial infarction... (2024) - Project Promotion [English] - iGEM Video Universe [Internet]. [cit 12. máj 2025]. Available at: https://video.igem.org/videos/embed/add193b9-cecd-4f9a-9eea-e6ef14ec437c<br /> <br /> 2. Li N, Huang Z, Zhang Y, Sun H, Wang J, Zhao J. Increased cancer risk after myocardial infarction: fact or fiction? A systemic review and meta-analysis. Cancer Manag Res. 01. marec 2019;11:1959–68.</div>

Lina Kopač https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Heartecho:_presejalni_test_za_raka_pri_pacientih_po_miokardnem_infarktu&diff=24927 2025-05-12T22:15:24Z

<p>Lina Kopač: </p> <hr /> <div>Projekt Heartecho [https://2024.igem.wiki/cjuh-jlu-china/home] je na iGEM-u leta 2024 predstavila ekipa s Kitajske. Projekt je bil nagrajen z zlato medaljo in nominiran za najboljšega na področju diagnostike. <br /> <br /> = Uvod =<br /> <br /> Miokardni (srčni) infarkt in rak sta glavna vzroka smrti na svetu. V zadnjih letih so študije pokazale, da imajo kardiovaskularne bolezni (tudi miokardni infarkt) in rakava obolenja nekatere skupne značilnosti. Med pomembne dejavnike tveganja za obe bolezni sadajo kronično vnetje, debelost in kajenje. Študije so pokazale, da pri pacientih po srčnem infarktu obstaja povišano tveganje za nastanek raka [2]. Incidenca raka je pri pacientih po srčnem infarktu za 13 % višja kot v splošni populaciji. <br /> <br /> = Cilj =<br /> <br /> Namen projekta Heartecho je bil izdelava presejalnega testa za raka pri pacientih po miokardnem infarktu. Želeli so izdelati diagnostični test, ki bi temeljil na zaznavanju specifičnih miRNA s tehnologijo LIRA (Loop-initiated RNA Activator). S testom so želeli detektirati tiste miRNA, ki so visoko izražene pri pacientih s kardiovaskularnimi boleznimi in lahko hkrati spodbujajo nastanek raka. Študije so namreč pokazale, da se eksosomi, ki se ob ishemiji izločijo iz srčnih mišičnih celic, lahko nato absorbirajo v rakave celice. Ti eksosomi vsebujejo miRNA, ki v rakavih celicah zavirajo apoptozo in tako pripomorejo k napredovanju bolezni. <br /> <br /> = Načrtovanje =<br /> <br /> == Izbira tarčnih miRNA ==<br /> <br /> Prvi korak v načrtovanju metode je bil ugotoviti, katere miRNA izbrati za tarčo. S primerjavo podatkovnih baz GEO (Gene Expression Omnibus) in TCGA (Cancer Genome Atlas Program) so identificirali 24 miRNA, ki so drugače izražene tako po srčnem infarktu kot tudi pri raznih rakavih obolenjih. Pri izbiri kandidatov za tarčno miRNA so upoštevali še dva kriterija: količina miRNA v krvi mora biti dovolj visoka, izražanje miRNA pa mora biti povišano pri čim več tipih raka. Na podlagi teh kriterijev so nato izbrali miR-210-3p, ki se povišano izraža pri trinajstih različnih tipih raka in miR-142-3p, ki se povišano izraža pri desetih različnih tipih raka. Z analizo literature so ugotovili, da obe miRNA spodbujata migracijo in invazivnost tumorskih celic in sta tako primerna potencialna biološka označevalca. To so tudi eksperimentalno potrdili s testi celične migracije in invazije. Naslednji korak je bil ovrednotiti diagnostično vrednost miR-210-3p in miR-142-3p. Z analizo podatkov pridobljenih iz podatkovnih baz so ugotovili, da sočasna uporaba obeh miRNA kot bioloških označevalcev daje boljše rezultate, kot njuna posamična raba, saj zmanjša verjetnost lažno pozitivnih rezultatov. <br /> <br /> == LIRA ==<br /> <br /> Za detekcijo izbranih miRNA so se odločili uporabiti tehnologijo LIRA (Loop-initiated RNA Activator). LIRA tvori sekundarno strukturo steblo-zanka, ki vsebuje prepoznavno regijo, mesto za vezavo na ribosom (RBS) in začetni kodon AUG. Prepoznavna regija je 31 nukleotidov dolgo zaporedje, ki je reverzno komplementarno tarčni RNA. 21 nukleotidov prepoznavne regije tvori zanko, medtem ko je ostalih 10 nukleotidov v steblu. V odsotnosti tarčne RNA sta RBS in začetni kodon tesno vezana v steblo in tako ne moreta sprožiti prevajanja reporterskega gena. Vezava tarčne RNA na prepoznavno regijo sproži destabilizacijo zanke, kar povzroči izpostavitev RBS-ja in začetnega kodona ter omogoči prepisovanje reporterskega gena. Za potrebe diagnostičnega testa, so LIRA zaporedje prilagodili tako, da so prepoznavno regijo zamenjali z revezno komplementarnim zapisom za miR-210-3p oziroma miR-142-3p. Ker sta bili tarčni miRNA v tem primeru krajši od 31 nukleotidov (22 in 23 nukleotidov), so morali skrajšati prepozvano regijo, pri čemer so morali upoštevati, da so izbrali pravo razmerje med številom nukleotidov prepoznavne regije v zanki in steblu. Predvidevali so namreč, da je pravo razmerje ključno za aktivnosti LIRA, saj vpliva na interakcijo s tarčno RNA. Ker so to želeli tudi eksperimentalno preveriti, so si izbrali tri različna LIRA zaporedja proti miR-210-3p z razmerji steblo/zanka 2/20, 7/15 in 10/12 ter tri zaporedja proti miR-142-3p z razmerji steblo/zanka 3/20, 8/15 in 11/12. Da bi lahko zaznali dve miRNA hkrati, so načrtali takšno strukturo LIRA, ki je vsebovala dve roki ter logična vrata IN. Vezavno mesto za eno miRNA je bilo na prvi roki, vezavno mesto za drugo miRNA pa na drugi, daljši roki, ki je bila povezana z RBS in začetnim kodonom. Pričakovali so, da se bosta slednja izpostavila zgolj ob hkratni vezavi obeh tarčnih miRNA. Z računalniškimi simulacijami so nato identificirali tri zaporedja za katere so predvidevali, da bodo imela najboljše lastnosti.<br /> <br /> = Eksperimentalno delo =<br /> <br /> == Testiranje LIRA zaporedij za detekcijo ene miRNA ==<br /> <br /> Šest izbranih LIRA zaporedij so klonirali v plazmid pCOLADuet-1. Za povečanje izražanja so uporabili promotor T7. Za LIRA zaporedje so dodali še zapis za izboljšan zeleni fluorescenčni protein EGFP (angl. enchanced green flourescent protein), ki je služil kot reporterski gen. Predvidevali so, da bo vezava tarčne miRNA na LIRA zaporedje sprožila izražanje EGFP. Da bi zagotovili tudi izražanje tarčnih miRNA, so zaporedji za miR-210-3p in miR-142-3p klonirali v plazmida pET-15b in pCDFDuet-1. Trije uporabljeni plazmidi imajo kompatibilna mesta začetka podvojevanja (ORI) in različne selekcijske označevalce. Tako so jih lahko hkrati transformirali v bakterijske celice ter na gojišču z določeno kombinacijo antibiotika izbrali želene kolonije.<br /> Plazmide so tansformirali v E. coli seva BL21-D3. Celice so transformirali bodisi samo s plazmidom z LIRA zaporedjem ali pa s plazmidom z LIRA zaporedjem in hkrati s plazmidom z zapisom za tarčno miRNA. Iz uspešno transformiranih kolonij so nato pripravili kulture in izolirali plazmidno DNA. Da so potrdili ustrezne velikosti plazmidov, so jih razrezali z endonukelazami in analizirali z agarozno gelsko elektroforezo. Tranformirane celice so 4 ure inkubirali z IPTG ter nato pripravili celične lizate, ki so jim izmerili fluorescenco. Značilno razliko v fluorescenci med celicami transformiranimi samo s plazmidom z LIRA zaporedjem in s celicami transformiranimi s plazmidom z LIRA zaporedjem ter plazmidom z zapisom za tarčno miRNA so opazili samo v dveh primerih. To sta bili LIRA zaporedje proti miR-210-3p z razmerjem steblo/zanka 2/20 in LIRA zaporedje proti miR-142-3p z razmerjem steblo/zanka 11/12. Rezultati kažejo, da razmerje steblo/zanka morda vendarle nima takšnega vpliva na funkcijo LIRA, kot so sprva predvidevali.<br /> <br /> == Testiranje LIRA zaporedij za hkratno detekcijo dveh miRNA ==<br /> <br /> Tudi tri izbrana LIRA zaporedja z dvema rokama ki lahko hkrati vežejo obe tarčni miRNA so klonirali v plazmid pCOLADuet-1. Tudi v tem primeru s uporabili promotor T7 in EGFP kot reporterski gen. Konstrukte so označili kot LIRA1, LIRA2 in LIRA5. Plazmide so tansformirali v E. coli seva BL21-D3. Pripravili so celice, ki so vsebovale samo plazmid z izbranim LIRA zaporedjem, plazmid z LIRA zaporedjem in plazmidom za eno od tarčnih miRNA ter celice s plazmidom za LIRA zaporedje in obema plazmidoma z zapisom za tarčno miRNA. Tudi v tem primeru so celice so gojili na gojišču z dodatkom IPTG in nato pripravili celične lizate, ki so jim izmerili fluorescenco. Plazmidno DNA so izolirali in ustrezno velikost plazmidov potrdili z agarozno gelsko elektroforezo. Pri celicah transfromiranih z LIRA1 niso zaznali značilne razlike v fluorescenci ne glede na prisotnost katerekoli od tarčnih miRNA. Pri celicah transformiranih z LIRA2 so sicer opazili značilno povišanje fluorescence v prisotnosti obeh miRNA, vendar pa je bila fluorescenca značilno povišana tudi, kadar je bila prisotna zgolj miR-124-3p. Pri celicah transformiranih z LIRA5 so zaznali značilno povišanje fluorescence samo kadar sta bili prisotni obe tarčni miRNA, kar nakazuje, da je za aktivacijo tega LIRA zaporedja potrebna hkratna prisotnost miR-210-3p in miR-142-3p. <br /> <br /> == Brezcelični sistem ==<br /> <br /> Cilj projekta je bil zasnovati presejalni test za rutinsko diagnostiko. Ker bi bila transformacija miRNA iz krvi pacienta v bakterije težavna, so morali test prilagoditi za uporabo v brezceličnem sistemu. Plazmid z LIRA zaporedjem so spremenili tako, da so reporterski gen za EGFP zamenjali z LacZ, saj bi bilo v rutinskem testiranju lažje zaznati spremembo barve kot pa meriti fluorescenco. Da bi preverili, ali je uporaba testa v brezceličnem sistemu možna, so plazmid z zapisom za tarčno miRNA dodali v komercialni sistem za in-vitro prepisovanje in tako dobili tarčno miRNA. Nato so v komercialni sistem za in-vitro sintezo proteinov dodali plazmid LIRA5 z oziroma brez tarčne miRNA. Po dodatku kromogenega substrata CPRG so opazovali spremembo barve. Pri vzorcu, ki je vseboval samo plazmid z LIRA zaporedjem ni prišlo do spremembe barve. Prav tako se barva ni spremenila v vzorcih, ki sta vsebovala samo eno tarčno miRNA. V vzorcu, ki je vseboval tudi obe tarčni miRNA so opazili spremembo barve. Ta rezultat je pokazal, da hkratna prisotnost miR-210-3p in miR-142-3p aktivira LIRA5 v brezceličnem sistemu. <br /> <br /> = Zaključek =<br /> <br /> Ekipa iz Kitajske je v sklopu projekta Heartecho razvila presejalni test za odkrivanje raka pri pacientih po srčnem infarktu. Test temelji na zaznavanju miRNA miR-142-3p in miR-210-3p, ki se povišano izražata tako po miokardne infarktu kot tudi pri različnih tipih raka. Študentje so načrtali zaporedja LIRA, ki zaznavajo eno od tarčnih miRNA ter zaporedje, ki ga aktivira hkratna prisotnost obeh tarčnih miRNA. Delovanje testa so preizkusili v laboratoriju – najprej v bakterijski kulturi nato pa še v brezceličnem sistemu. Uspešno so identificirali eno LIRA zaporedje, ki zaznava miR-210-3p, eno zaporedje, ki zaznava miR-142-3p ter zaporedje, ki zaznava hkratno prisotnost obeh miRNA. <br /> <br /> = Viri in literatura =<br /> <br /> 1. CJUH-JLU-China: Heartecho: A cancer screening kit for post-myocardial infarction... (2024) - Project Promotion [English] - iGEM Video Universe [Internet]. [cit 12. máj 2025]. Available at: https://video.igem.org/videos/embed/add193b9-cecd-4f9a-9eea-e6ef14ec437c<br /> <br /> 2. Li N, Huang Z, Zhang Y, Sun H, Wang J, Zhao J. Increased cancer risk after myocardial infarction: fact or fiction? A systemic review and meta-analysis. Cancer Manag Res. 01. marec 2019;11:1959–68.</div>

Lina Kopač https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Seminarji_SB_2024/25&diff=24926 2025-05-12T22:05:37Z

<p>Lina Kopač: </p> <hr /> <div>V študijskem letu 2024/25 študenti in študentke pri Sintezni biologiji predstavljajo naslednje teme: <br /> <br /> RAZISKOVALNI ČLANKI<br /> <br /> (Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) &lt;br&gt;<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Inženiring_umetnih_medvrstnih_promotorjev_z_različnimi_transkripcijskimi_močmi Inženiring umetnih medvrstnih promotorjev z različnimi transkripcijskimi močmi] (Miljan Trajković) <br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Preprečevanje_nastanka_multimerov_pogosto_uporabljenih_plazmidov_v_sintezni_biologiji Preprečevanje nastanka multimerov pogosto uporabljenih plazmidov v sintezni biologiji] (Lev Jošt)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Priprava_Nicotiane_benthamiane_za_proizvodnjo_krisoeriola_z_uporabo_tehnik_sintezne_biologije Priprava ''Nicotiane benthamiane'' za proizvodnjo krisoeriola z uporabo tehnik sintezne biologije] (Nika Frelih)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Gensko_spremenjeni_receptorji_za_komunikacijo_med_celicami_preko_topnih_signalov_in_zaznavanje_bolezni Gensko spremenjeni receptorji za komunikacijo med celicami preko topnih signalov in zaznavanje bolezni] (Zara Bunc)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Nadzor_nad_izražanjem_heterolognih_genov_pri_Bdellovibrio_bacteriovorus_z_uporabo_sintezne_biologije Nadzor nad izražanjem heterolognih genov pri Bdellovibrio bacteriovorus z uporabo sintezne biologije] (Živa Flego)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Uporaba_konzorcija_kvasovk_za_de_novo_biosintezo_rastlinskih_lignanov Uporaba konzorcija kvasovk za de novo biosintezo rastlinskih lignanov] (Urša Lah)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sonogenetsko_nadzorovane_gensko_spremenjene_celice_za_zdravljenje_raka_v_mišjih_tumorskih_modelih Sonogenetsko nadzorovane gensko spremenjene celice za zdravljenje raka v mišjih tumorskih modelih] (Pia Mencin) <br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Združitev_difuzijskega_modela_in_transformerja_za_sintezo_izboljšanih_promotorjev_ter_napoved_moči_sintetičnih_promotorjev_z_uporabo_globokega_učenja Združitev difuzijskega modela in transformerja za sintezo izboljšanih promotorjev ter napoved moči sintetičnih promotorjev z uporabo globokega učenja] (Tinkara Korošec) <br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Z_dvojno_svetlobo_nadzirani_kokulturni_sistem_omogoča_uravnavanje_sestave_populacije Z dvojno svetlobo nadzirani sistem omogoča uravnavanje sestave populacije] (Ula Mikoš)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Načrtovanje_močnih_inducibilnih_sinteznih_promotorjev_v_kvasovkah Načrtovanje močnih inducibilnih sinteznih promotorjev v kvasovkah] (Bor Kunstelj)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Metabolni_inženiring_E._coli_za_izboljšano_produkcijo_diolov_iz_acetata Metabolni inženiring ''E. coli'' za izboljšano produkcijo diolov iz acetata] (Teo Trost)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Inkorporacija_fotosintetsko_aktivnih_kloroplastov_iz_alg_v_kultivirane_celice_sesalcev_kot_pot_k_fotosintezi_pri_Živalih Inkorporacija fotosintetsko aktivnih kloroplastov iz alg v kultivirane celice sesalcev kot pot k fotosintezi pri živalih] (Peter Gričar Vintar)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Izgradnja_metabolične_poti_za_biosintezo_treonina_iz_etilen_glikola Izgradnja metabolične poti za biosintezo treonina iz etilen glikola] (Tinkara Butara) <br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Povezava_sintezne_in_sistemske_biologije_za_in_vivo_encimatiko Povezava sintezne in sistemske biologije za ''in vivo'' encimatiko] (Gaja Starc) <br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Nanotelo_proti_Pdc1p_kot_gensko_kodiran_inhibitor_proizvodnje_etanola_omogoča_dvojni_transkripcijski_in_posttranslacijski_nadzor_fermentacije_v_kvasovkah Nanotelo proti Pdc1p kot gensko kodiran inhibitor proizvodnje etanola omogoča dvojni transkripcijski in posttranslacijski nadzor fermentacije v kvasovkah] (Lara Zupanc)<br /> # [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/S_fazno_separacijo_posredovano_sestavljanje_ve%C4%8Dencimskih_kompleksov_in_vivo S fazno separacijo posredovano sestavljanje večencimskih kompleksov ''in vivo''] (Lana Kores)<br /> <br /> NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI<br /> <br /> (Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/SynPlode SynPlode] (Leila Bohorč)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/PETal:_izdelovanje_eteričnega_olja_sandalovine_iz_PET_plastike PETal: izdelovanje eteričnega olja sandalovine iz PET plastike] (Lara Krampač)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/PET_TWINS:_Praktična_uporaba_PETaze_za_učinkovitejše_recikliranje_plastike PET TWINS: Praktična uporaba PETaze za učinkovitejše recikliranje plastike] (Tina Urh)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/CAU-China:_Nodulska_tovarna_DHA_in_EPA CAU-China: Nodulska tovarna DHA in EPA] (Luka Fink)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/nuCloud:_Nov_oblak_za_shranjevanje_podatkov_na_osnovi_nukleotidov nuCloud: Nov oblak za shranjevanje podatkov na osnovi nukleotidov] (Aleš Poljanšek)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Nova_metoda_diagnosticiranja_multiple_skleroze_-_miRADAR Nova metoda diagnosticiranja multiple skleroze - miRADAR] (Petja Premrl)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Biostimulant_za_rast_rastlin_na_Luni_–_BioMoon Biostimulant za rast rastlin na Luni – BioMoon] (Žan Žnidar)<br /> # [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=CAPTURE:_Boj_proti_oku%C5%BEbam_s_Pseudomonas_aeruginosa_z_nosilci_protimikrobnih_peptidov&amp;action=edit&amp;redlink=1 Boj proti okužbam s Pseudomonas aeruginosa z nosilci protimikrobnih peptidov - CAPTURE] (Metka Rus)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/REPARO REPARO] (Lina Kopač)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Tarakate Tarakate] (Pia Špehar)<br /> # [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Heartecho:_presejalni_test_za_raka_pri_pacientih_po_miokardnem_infarktu Heartecho: presejalni test za raka pri pacientih po miokardnem infarktu] (Zarja Doberšek)<br /> <br /> Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Povzetek je treba objaviti dva dni pred predstavitvijo do polnoči (za seminarje v torek torej najkasneje v ponedeljek). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo približno 5-minutna razprava.<br /> <br /> Terminski razpored bo razviden iz preglednice na strežniku Google Drive.<br /> <br /> Kako je videti končni seznam seminarjev, lahko preverite pri lanskem letniku: [[Seminarji_SB_2023/24]].</div>

Lina Kopač https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Heartecho:_presejalni_test_za_raka_pri_pacientih_po_miokardnem_infarktu&diff=24925 2025-05-12T22:03:29Z

<p>Lina Kopač: </p> <hr /> <div>Projekt Heartecho [https://2024.igem.wiki/cjuh-jlu-china/home] je na iGEM-u leta 2024 predstavila ekipa s Kitajske. Projekt je bil nagrajen z zlato medaljo in nominiran za najboljšega na področju diagnostike. <br /> <br /> = Uvod =<br /> <br /> Miokardni (srčni) infarkt in rak sta glavna vzroka smrti na svetu. V zadnjih letih so študije pokazale, da imajo kardiovaskularne bolezni (tudi miokardni infarkt) in rakava obolenja nekatere skupne značilnosti. Med pomembne dejavnike tveganja za obe bolezni sadajo kronično vnetje, debelost in kajenje. Klinične in epidemiološke študije so pokazale, da pri pacientih po srčnem infarktu obstaja povišano tveganje za nastanek raka [2]. Incidenca raka je pri pacientih po srčnem infarktu za kar 13 % višja kot v splošni populaciji. <br /> <br /> = Cilj =<br /> <br /> Namen projekta Heartecho je bil izdelava presejalnega testa za raka pri pacientih po miokardnem infarktu. Želeli so izdelati diagnostični test, ki bi temeljil na zaznavanju specifičnih miRNA s tehnologijo LIRA (Loop-initiated RNA Activator). S testom so želeli detektirati tiste miRNA, ki so visoko izražene pri pacientih s kardiovaskularnimi boleznimi in lahko hkrati spodbujajo nastanek raka. Študije so namreč pokazale, da se eksosomi, ki se ob ishemiji izločijo iz srčnih mišičnih celic, lahko nato absorbirajo v rakave celici. Ti eksosomi vsebujejo miRNA, ki v rakavih celicah zavirajo apoptozo in tako pripomorejo k napredovanju bolezni. <br /> <br /> = Načrtovanje =<br /> <br /> == Izbira tarčnih miRNA ==<br /> <br /> Prvi korak v načrtovanju metode je bil ugotoviti, katere miRNA izbrati za tarčo. S primerjavo podatkovnih baz GEO (Gene Expression Omnibus) in TCGA (Cancer Genome Atlas Program) so identificirali 24 miRNA, ki so drugače izražene tako po srčnem infarktu kot tudi pri raznih rakavih obolenjih. Pri izbiri kandidatov za tarčno miRNA so upoštevali še dva kriterija: količina miRNA v krvi mora biti dovolj visoka, izražanje miRNA pa mora biti povišano pri čim več tipih raka. Na podlagi teh kriterijev so nato izbrali miR-210-3p, ki se povišano izraža pri trinajstih različnih tipih raka in miR-142-3p, ki se povišano izraža pri desetih različnih tipih raka. Z analizo literature so ugotovili, da obe miRNA spodbujata migracijo in invazivnost tumorskih celic in sta tako primerna potencialna biološka označevalca. To so tudi eksperimentalno potrdili s testi celične migracije in invazije.<br /> Ker so študije pokazale, da incidenca raka ni povišana samo pri bolnikih po miokardnem infarktu, ampak tudi pri bolnikih s srčno odpovedjo, so se odločili, da na enak način analizirajo tudi izražanje miRNA pri srčni odpovedi. Identificirali so 35 različnih miRNA, ki se povišano izražajo tako pri srčni odpovedi kot tudi pri raku. Vendar pa v tem primeru niso uspeli identificirati nobene miRNA, ki bi bila izražena v zadostni količini in pri dovolj velikem številu tipov raka. Naslednji korak je bil ovrednostiti diagnostično vrednost miR-210-3p in miR-142-3p. Z analizo podatkov pridobljenih iz podatkovnih baz so ugotovili, da sočasna uporaba obeh miRNA kot bioloških označevalcev daje boljše rezultate, kot njuna posamična raba, saj zmanjša verjetnost lažno pozitivnih rezultatov. <br /> <br /> == LIRA ==<br /> <br /> Za detekcijo izbranih miRNA so se odločili uporabiti tehnologijo LIRA (Loop-initiated RNA Activator). LIRA tvori sekundarno strukturo steblo-zanka, ki vsebuje prepoznavno regijo, mesto za vezavo na ribosom (RBS) in začetni kodon AUG. Prepoznavna regija je 31 nukleotidov dolgo zaporedje, ki je reverzno komplementarno tarčni RNA. 21 nukleotidov prepoznavne regije tvori zanko, medtem ko je ostalih 10 nukleotidov v steblu. V odsotnosti tarčne RNA sta RBS in začetni kodon tesno vezana v steblo in tako ne moreta sprožiti prevajanja reporterskega gena. Vezava tarčne RNA na prepoznavno regijo sproži destabilizacijo zanke, kar povzroči izpostavitev RBS-ja in začetnega kodona ter omogoči prepisovanje reporterskega gena. Za potrebe diagnostičnega testa, so LIRA zaporedje prilagodili tako, da so prepoznavno regijo zamenjali z revezno komplementarnim zapisom za miR-210-3p oziroma miR-142-3p. Ker sta bili tarčni miRNA v tem primeru krajši od 31 nukleotidov (22 in 23 nukleotidov), so morali skrajšati prepozvano regijo, pri čemer so morali upoštevati, da so izbrali pravo razmerje med številom nukleotidov prepoznavne regije v zanki in steblu. Predvidevali so namreč, da je pravo razmerje ključno za aktivnosti LIRA, saj vpliva na interakcijo s tarčno RNA. Ker so to želeli tudi eksperimentalno preveriti, so si izbrali tri različna LIRA zaporedja proti miR-210-3p z razmerji steblo/zanka 2/20, 7/15 in 10/12 ter tri zaporedja proti miR-142-3p z razmerji steblo/zanka 3/20, 8/15 in 11/12. Da bi lahko zaznali dve miRNA hkrati, so načrtali takšno strukturo LIRA, ki je vsebovala dve roki ter logična vrata IN. Vezavno mesto za eno miRNA je bilo na prvi roki, vezavno mesto za drugo miRNA pa na drugi, daljši roki, ki je bila povezana z RBS in začetnim kodonom. Pričakovali so, da se bosta slednja izpostavila zgolj ob hkratni vezavi obeh tarčnih miRNA. Z računalniškimi simulacijami so nato identificirali šest LIRA zaporedji z dvema rokama, ki so najbolje ustrezala pričakovanjem. Z analizo nekaterih značilnosti LIRA zaporedji so izmed teh identificirali tri zaporedja za katere so predvidevali, da bodo imela najboljše lastnosti.<br /> <br /> = Eksperimentalno delo =<br /> <br /> == Testiranje LIRA zaporedij za detekcijo ene miRNA ==<br /> <br /> Šest izbranih LIRA zaporedij so klonirali v plazmid pCOLADuet-1. Za povečanje izražanja so uporabili promotor T7 - tako so lahko z dodatkom IPTG nadzirali čas reakcije. Za LIRA zaporedje so dodali še zapis za izboljšan zeleni fluorescenčni protein EGFP (angl. enchanced green flourescent protein), ki je služil kot reporterski gen. Predvidevali so, da bo vezava tarčne miRNA na LIRA zaporedje sprožila izražanje EGFP. Da bi zagotovili tudi izražanje tarčnih miRNA, so zaporedji za miR-210-3p in miR-142-3p klonirali v plazmida pET-15b in pCDFDuet-1. Trije uporabljeni plazmidi imajo kompatibilna mesta začetka podvojevanja (ORI) in različne selekcijske označevalce. Tako so jih lahko hkrati transformirali v bakterijske celice ter na gojišču z določeno kombinacijo antibiotika izbrali želene kolonije.<br /> Plazmide so tansformirali v E. coli seva BL21-D3. Celice so transformirali bodisi samo s plazmidom z LIRA zaporedjem ali pa s plazmidom z LIRA zaporedjem hkrati in s plazmidom z zapisom za tarčno miRNA. Iz uspešno transformiranih kolonij so nato pripravili kulture in izolirali plazmidno DNA. Da so potrdili ustrezne velikosti plazmidov, so jih razrezali z endonukelazami in analizirali z agarozno gelsko elektroforezo. Tranformirane celice so 4 ure inkubirali z IPTG ter nato pripravili celične lizate, ki so jim izmerili fluorescenco. Značilno razliko v fluorescenci med celicami transformiranimi samo s plazmidom z LIRA zaporedjem in s celicami transformiranimi s plazmidom z LIRA zaporedjem ter plazmidom z zapisom za tarčno miRNA so opazili samo v dveh primerih. To sta bili LIRA zaporedje proti miR-210-3p z razmerjem steblo/zanka 2/20 in LIRA zaporedje proti miR-142-3p z razmerjem steblo/zanka 11/12. Rezultati kažejo, da razmerje steblo/zanka morda vendarle nima takšnega vpliva na funkcijo LIRA, kot so sprva predvidevali.<br /> <br /> == Testiranje LIRA zaporedij za hkratno detekcijo dveh miRNA ==<br /> <br /> Tudi tri izbrana LIRA zaporedja z dvema rokama ki lahko hkrati vežejo obe tarčni miRNA so klonirali v plazmid pCOLADuet-1. Tudi v tem primeru s uporabili promotor T7 in EGFP kot reporterski gen. Konstrukte so označili kot LIRA1, LIRA2 in LIRA5. Plazmide so tansformirali v E. coli seva BL21-D3. Pripravili so celice, ki so vsebovale samo plazmid z izbranim LIRA zaporedjem, plazmid z LIRA zaporedjem in plazmidom za eno od tarčnih miRNA ter celice s plazmidom za LIRA zaporedje in obema plazmidoma z zapisom za tarčno miRNA. Tudi v tem primeru so celice so gojili na gojišču z dodatkom IPTG in nato pripravili celične lizate fluorescenco. Plazmidno DNA so izolirali in ustrezno velikost plazmidov potrdili z agarozno gelsko elektroforezo. Pri celicah transfromiranih z LIRA1 niso zaznali značilne razlike v fluorescenci ne glede na prisotnost katerekoli od tarčnih miRNA. Pri celicah transformiranih z LIRA2 so sicer opazili značilno povišanje fluorescence v prisotnosti obeh miRNA, vendar pa je bila fluorescenca značilno povišana tudi, kadar je bila prisotna zgolj miR-124-3p. Pri celicah transformiranih z LIRA5 so zaznali značilno povišanje fluorescence samo kadar sta bili prisotni obe tarčni miRNA, kar nakazuje, da je za aktivacijo tega LIRA zaporedja potrebna hkratna prisotnost miR-210-3p in miR-142-3p. <br /> <br /> == Brezcelični sistem ==<br /> <br /> Cilj projekta je bil zasnovati presejalni test za rutinsko diagnostiko. Ker bi bila transformacija miRNA iz krvi pacienta v bakterije težavna, so morali test prilagoditi za uporabo v brezceličnem sistemu. Plazmid z LIRA zaporedjem so spremenili tako, da so reporterski gen za EGFP zamenjali z LacZ, saj bi bilo v rutinskem testiranju lažje zaznati spremembo barve kot pa meriti fluorescenco. Da bi preverili, ali je uporaba testa v brezceličnem sistemu možna, so plazmid z zapisom za tarčno miRNA dodali v komercialni sistem za in-vitro prepisovanje in tako dobili tarčno miRNA. Nato so v komercialni sistem za in-vitro sintezo proteinov dodali plazmid LIRA5 z oziroma brez tarčne miRNA. Po dodatku kromogenega substrata CPRG so opazovali spremembo barve. Pri vzorcu, ki je vseboval samo plazmid z LIRA zaporedjem ni prišlo do spremembe barve. Prav tako se barva ni spremenila v vzorcih, ki sta vsebovala samo eno tarčno miRNA. V vzorcu, ki je vseboval tudi obe tarčni miRNA so opazili spremembo barve. Ta rezultat je pokazal, da hkratna prisotnost miR-210-3p in miR-142-3p aktivira LIRA5 v brezceličnem sistemu. <br /> <br /> = Zaključek =<br /> <br /> Ekipa iz Kitajske je v sklopu projekta Heartecho razvila presejalni test za odkrivanje raka pri pacientih po srčnem infarktu. Test temelji na zaznavanju miRNA miR-142-3p in miR-210-3p, ki se povišano izražata tako po miokardne infarktu kot tudi pri različnih tipih raka. Študentje so načrtali zaporedja LIRA, ki zaznavajo eno od tarčnih miRNA ter zaporedje, ki ga ajtivira hkratna prisotnost obeh tarčnih miRNA. Delovanje testa so preizkusili v laboratoriju – najprej v bakterijski kulturi nato pa še v brezceličnem sistemu. Uspešno so identificirali eno LIRA zaporedje, ki zaznava miR-210-3p, eno zaporedje, ki zaznava miR-142-3p ter zaporedje, ki zaznava hkratno prisotnost obeh miRNA. <br /> <br /> = Viri in literatura =<br /> <br /> 1. CJUH-JLU-China: Heartecho: A cancer screening kit for post-myocardial infarction... (2024) - Project Promotion [English] - iGEM Video Universe [Internet]. [cit 12. máj 2025]. Available at: https://video.igem.org/videos/embed/add193b9-cecd-4f9a-9eea-e6ef14ec437c<br /> <br /> 2. Li N, Huang Z, Zhang Y, Sun H, Wang J, Zhao J. Increased cancer risk after myocardial infarction: fact or fiction? A systemic review and meta-analysis. Cancer Manag Res. 01. marec 2019;11:1959–68.</div>

Lina Kopač https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Heartecho:_presejalni_test_za_raka_pri_pacientih_po_miokardnem_infarktu&diff=24924 2025-05-12T22:03:11Z

<p>Lina Kopač: Created page with &quot;Projekt Heartecho [https://2024.igem.wiki/cjuh-jlu-china/home] je na iGEM-u leta 2024 predstavila ekipa s Kitajske. Projekt je bil nagrajen z zlato medaljo in nominiran za najboljšega na področju diagnostike. = Uvod = Miokardni (srčni) infarkt in infarkt sta glavna vzroka smrti na svetu. V zadnjih letih so študije pokazale, da imajo kardiovaskularne bolezni (tudi miokardni infarkt) in rakava obolenja nekatere skupne značilnosti. Med pomembne dejavnike tveganja...&quot;</p> <hr /> <div>Projekt Heartecho [https://2024.igem.wiki/cjuh-jlu-china/home] je na iGEM-u leta 2024 predstavila ekipa s Kitajske. Projekt je bil nagrajen z zlato medaljo in nominiran za najboljšega na področju diagnostike. <br /> <br /> = Uvod =<br /> <br /> Miokardni (srčni) infarkt in infarkt sta glavna vzroka smrti na svetu. V zadnjih letih so študije pokazale, da imajo kardiovaskularne bolezni (tudi miokardni infarkt) in rakava obolenja nekatere skupne značilnosti. Med pomembne dejavnike tveganja za obe bolezni sadajo kronično vnetje, debelost in kajenje. Klinične in epidemiološke študije so pokazale, da pri pacientih po srčnem infarktu obstaja povišano tveganje za nastanek raka [2]. Incidenca raka je pri pacientih po srčnem infarktu za kar 13 % višja kot v splošni populaciji. <br /> <br /> = Cilj =<br /> <br /> Namen projekta Heartecho je bil izdelava presejalnega testa za raka pri pacientih po miokardnem infarktu. Želeli so izdelati diagnostični test, ki bi temeljil na zaznavanju specifičnih miRNA s tehnologijo LIRA (Loop-initiated RNA Activator). S testom so želeli detektirati tiste miRNA, ki so visoko izražene pri pacientih s kardiovaskularnimi boleznimi in lahko hkrati spodbujajo nastanek raka. Študije so namreč pokazale, da se eksosomi, ki se ob ishemiji izločijo iz srčnih mišičnih celic, lahko nato absorbirajo v rakave celici. Ti eksosomi vsebujejo miRNA, ki v rakavih celicah zavirajo apoptozo in tako pripomorejo k napredovanju bolezni. <br /> <br /> = Načrtovanje =<br /> <br /> == Izbira tarčnih miRNA ==<br /> <br /> Prvi korak v načrtovanju metode je bil ugotoviti, katere miRNA izbrati za tarčo. S primerjavo podatkovnih baz GEO (Gene Expression Omnibus) in TCGA (Cancer Genome Atlas Program) so identificirali 24 miRNA, ki so drugače izražene tako po srčnem infarktu kot tudi pri raznih rakavih obolenjih. Pri izbiri kandidatov za tarčno miRNA so upoštevali še dva kriterija: količina miRNA v krvi mora biti dovolj visoka, izražanje miRNA pa mora biti povišano pri čim več tipih raka. Na podlagi teh kriterijev so nato izbrali miR-210-3p, ki se povišano izraža pri trinajstih različnih tipih raka in miR-142-3p, ki se povišano izraža pri desetih različnih tipih raka. Z analizo literature so ugotovili, da obe miRNA spodbujata migracijo in invazivnost tumorskih celic in sta tako primerna potencialna biološka označevalca. To so tudi eksperimentalno potrdili s testi celične migracije in invazije.<br /> Ker so študije pokazale, da incidenca raka ni povišana samo pri bolnikih po miokardnem infarktu, ampak tudi pri bolnikih s srčno odpovedjo, so se odločili, da na enak način analizirajo tudi izražanje miRNA pri srčni odpovedi. Identificirali so 35 različnih miRNA, ki se povišano izražajo tako pri srčni odpovedi kot tudi pri raku. Vendar pa v tem primeru niso uspeli identificirati nobene miRNA, ki bi bila izražena v zadostni količini in pri dovolj velikem številu tipov raka. Naslednji korak je bil ovrednostiti diagnostično vrednost miR-210-3p in miR-142-3p. Z analizo podatkov pridobljenih iz podatkovnih baz so ugotovili, da sočasna uporaba obeh miRNA kot bioloških označevalcev daje boljše rezultate, kot njuna posamična raba, saj zmanjša verjetnost lažno pozitivnih rezultatov. <br /> <br /> == LIRA ==<br /> <br /> Za detekcijo izbranih miRNA so se odločili uporabiti tehnologijo LIRA (Loop-initiated RNA Activator). LIRA tvori sekundarno strukturo steblo-zanka, ki vsebuje prepoznavno regijo, mesto za vezavo na ribosom (RBS) in začetni kodon AUG. Prepoznavna regija je 31 nukleotidov dolgo zaporedje, ki je reverzno komplementarno tarčni RNA. 21 nukleotidov prepoznavne regije tvori zanko, medtem ko je ostalih 10 nukleotidov v steblu. V odsotnosti tarčne RNA sta RBS in začetni kodon tesno vezana v steblo in tako ne moreta sprožiti prevajanja reporterskega gena. Vezava tarčne RNA na prepoznavno regijo sproži destabilizacijo zanke, kar povzroči izpostavitev RBS-ja in začetnega kodona ter omogoči prepisovanje reporterskega gena. Za potrebe diagnostičnega testa, so LIRA zaporedje prilagodili tako, da so prepoznavno regijo zamenjali z revezno komplementarnim zapisom za miR-210-3p oziroma miR-142-3p. Ker sta bili tarčni miRNA v tem primeru krajši od 31 nukleotidov (22 in 23 nukleotidov), so morali skrajšati prepozvano regijo, pri čemer so morali upoštevati, da so izbrali pravo razmerje med številom nukleotidov prepoznavne regije v zanki in steblu. Predvidevali so namreč, da je pravo razmerje ključno za aktivnosti LIRA, saj vpliva na interakcijo s tarčno RNA. Ker so to želeli tudi eksperimentalno preveriti, so si izbrali tri različna LIRA zaporedja proti miR-210-3p z razmerji steblo/zanka 2/20, 7/15 in 10/12 ter tri zaporedja proti miR-142-3p z razmerji steblo/zanka 3/20, 8/15 in 11/12. Da bi lahko zaznali dve miRNA hkrati, so načrtali takšno strukturo LIRA, ki je vsebovala dve roki ter logična vrata IN. Vezavno mesto za eno miRNA je bilo na prvi roki, vezavno mesto za drugo miRNA pa na drugi, daljši roki, ki je bila povezana z RBS in začetnim kodonom. Pričakovali so, da se bosta slednja izpostavila zgolj ob hkratni vezavi obeh tarčnih miRNA. Z računalniškimi simulacijami so nato identificirali šest LIRA zaporedji z dvema rokama, ki so najbolje ustrezala pričakovanjem. Z analizo nekaterih značilnosti LIRA zaporedji so izmed teh identificirali tri zaporedja za katere so predvidevali, da bodo imela najboljše lastnosti.<br /> <br /> = Eksperimentalno delo =<br /> <br /> == Testiranje LIRA zaporedij za detekcijo ene miRNA ==<br /> <br /> Šest izbranih LIRA zaporedij so klonirali v plazmid pCOLADuet-1. Za povečanje izražanja so uporabili promotor T7 - tako so lahko z dodatkom IPTG nadzirali čas reakcije. Za LIRA zaporedje so dodali še zapis za izboljšan zeleni fluorescenčni protein EGFP (angl. enchanced green flourescent protein), ki je služil kot reporterski gen. Predvidevali so, da bo vezava tarčne miRNA na LIRA zaporedje sprožila izražanje EGFP. Da bi zagotovili tudi izražanje tarčnih miRNA, so zaporedji za miR-210-3p in miR-142-3p klonirali v plazmida pET-15b in pCDFDuet-1. Trije uporabljeni plazmidi imajo kompatibilna mesta začetka podvojevanja (ORI) in različne selekcijske označevalce. Tako so jih lahko hkrati transformirali v bakterijske celice ter na gojišču z določeno kombinacijo antibiotika izbrali želene kolonije.<br /> Plazmide so tansformirali v E. coli seva BL21-D3. Celice so transformirali bodisi samo s plazmidom z LIRA zaporedjem ali pa s plazmidom z LIRA zaporedjem hkrati in s plazmidom z zapisom za tarčno miRNA. Iz uspešno transformiranih kolonij so nato pripravili kulture in izolirali plazmidno DNA. Da so potrdili ustrezne velikosti plazmidov, so jih razrezali z endonukelazami in analizirali z agarozno gelsko elektroforezo. Tranformirane celice so 4 ure inkubirali z IPTG ter nato pripravili celične lizate, ki so jim izmerili fluorescenco. Značilno razliko v fluorescenci med celicami transformiranimi samo s plazmidom z LIRA zaporedjem in s celicami transformiranimi s plazmidom z LIRA zaporedjem ter plazmidom z zapisom za tarčno miRNA so opazili samo v dveh primerih. To sta bili LIRA zaporedje proti miR-210-3p z razmerjem steblo/zanka 2/20 in LIRA zaporedje proti miR-142-3p z razmerjem steblo/zanka 11/12. Rezultati kažejo, da razmerje steblo/zanka morda vendarle nima takšnega vpliva na funkcijo LIRA, kot so sprva predvidevali.<br /> <br /> == Testiranje LIRA zaporedij za hkratno detekcijo dveh miRNA ==<br /> <br /> Tudi tri izbrana LIRA zaporedja z dvema rokama ki lahko hkrati vežejo obe tarčni miRNA so klonirali v plazmid pCOLADuet-1. Tudi v tem primeru s uporabili promotor T7 in EGFP kot reporterski gen. Konstrukte so označili kot LIRA1, LIRA2 in LIRA5. Plazmide so tansformirali v E. coli seva BL21-D3. Pripravili so celice, ki so vsebovale samo plazmid z izbranim LIRA zaporedjem, plazmid z LIRA zaporedjem in plazmidom za eno od tarčnih miRNA ter celice s plazmidom za LIRA zaporedje in obema plazmidoma z zapisom za tarčno miRNA. Tudi v tem primeru so celice so gojili na gojišču z dodatkom IPTG in nato pripravili celične lizate fluorescenco. Plazmidno DNA so izolirali in ustrezno velikost plazmidov potrdili z agarozno gelsko elektroforezo. Pri celicah transfromiranih z LIRA1 niso zaznali značilne razlike v fluorescenci ne glede na prisotnost katerekoli od tarčnih miRNA. Pri celicah transformiranih z LIRA2 so sicer opazili značilno povišanje fluorescence v prisotnosti obeh miRNA, vendar pa je bila fluorescenca značilno povišana tudi, kadar je bila prisotna zgolj miR-124-3p. Pri celicah transformiranih z LIRA5 so zaznali značilno povišanje fluorescence samo kadar sta bili prisotni obe tarčni miRNA, kar nakazuje, da je za aktivacijo tega LIRA zaporedja potrebna hkratna prisotnost miR-210-3p in miR-142-3p. <br /> <br /> == Brezcelični sistem ==<br /> <br /> Cilj projekta je bil zasnovati presejalni test za rutinsko diagnostiko. Ker bi bila transformacija miRNA iz krvi pacienta v bakterije težavna, so morali test prilagoditi za uporabo v brezceličnem sistemu. Plazmid z LIRA zaporedjem so spremenili tako, da so reporterski gen za EGFP zamenjali z LacZ, saj bi bilo v rutinskem testiranju lažje zaznati spremembo barve kot pa meriti fluorescenco. Da bi preverili, ali je uporaba testa v brezceličnem sistemu možna, so plazmid z zapisom za tarčno miRNA dodali v komercialni sistem za in-vitro prepisovanje in tako dobili tarčno miRNA. Nato so v komercialni sistem za in-vitro sintezo proteinov dodali plazmid LIRA5 z oziroma brez tarčne miRNA. Po dodatku kromogenega substrata CPRG so opazovali spremembo barve. Pri vzorcu, ki je vseboval samo plazmid z LIRA zaporedjem ni prišlo do spremembe barve. Prav tako se barva ni spremenila v vzorcih, ki sta vsebovala samo eno tarčno miRNA. V vzorcu, ki je vseboval tudi obe tarčni miRNA so opazili spremembo barve. Ta rezultat je pokazal, da hkratna prisotnost miR-210-3p in miR-142-3p aktivira LIRA5 v brezceličnem sistemu. <br /> <br /> = Zaključek =<br /> <br /> Ekipa iz Kitajske je v sklopu projekta Heartecho razvila presejalni test za odkrivanje raka pri pacientih po srčnem infarktu. Test temelji na zaznavanju miRNA miR-142-3p in miR-210-3p, ki se povišano izražata tako po miokardne infarktu kot tudi pri različnih tipih raka. Študentje so načrtali zaporedja LIRA, ki zaznavajo eno od tarčnih miRNA ter zaporedje, ki ga ajtivira hkratna prisotnost obeh tarčnih miRNA. Delovanje testa so preizkusili v laboratoriju – najprej v bakterijski kulturi nato pa še v brezceličnem sistemu. Uspešno so identificirali eno LIRA zaporedje, ki zaznava miR-210-3p, eno zaporedje, ki zaznava miR-142-3p ter zaporedje, ki zaznava hkratno prisotnost obeh miRNA. <br /> <br /> = Viri in literatura =<br /> <br /> 1. CJUH-JLU-China: Heartecho: A cancer screening kit for post-myocardial infarction... (2024) - Project Promotion [English] - iGEM Video Universe [Internet]. [cit 12. máj 2025]. Available at: https://video.igem.org/videos/embed/add193b9-cecd-4f9a-9eea-e6ef14ec437c<br /> <br /> 2. Li N, Huang Z, Zhang Y, Sun H, Wang J, Zhao J. Increased cancer risk after myocardial infarction: fact or fiction? A systemic review and meta-analysis. Cancer Manag Res. 01. marec 2019;11:1959–68.</div>

Lina Kopač https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=REPARO&diff=24887 2025-05-11T18:19:17Z

<p>Lina Kopač: </p> <hr /> <div>[https://2024.igem.wiki/xmu-china/ REPARO] je projekt, ki ga je leta 2024 pripravila ekipa kitajske Univerze Xiamen. Ekipa je za svoj projekt prejela zlato medaljo in nagrado za najboljši projekt v svoji kategoriji.<br /> <br /> = Uvod =<br /> <br /> Razlog za hitre podnebne premembe je med drugim tudi obsežno krčenje gozdov, k čemur pomembno prispeva poraba lesa za proizvodnjo papirja. Eden izmed ukrepov za zmanjšanje te porabe je recikliranje odpadnega papirja, vendar pa trenutni postopki recikliranja niso optimalni. Glavni izziv predstavlja odstranjevanje črnila. Ta postopek porabi velike količine vode in topil, zato je dražji, onesnažuje okolje in predstavlja nevarnost za zdravje delavcev v tej industriji. Poleg tega po odstranjevanju črnila v vodi ostane veliko težkih kovin, kar še dodatno onesnažuje okolje.<br /> <br /> = Cilj =<br /> <br /> Ekipa je s svojim projektom poskušala razviti postopek odstranjevanja črnila z odpadnega papirja, ki bi bil bolj varen in bolj ekonomičen, hkrati pa bolj učinkovit od trenutno uporabljenih metod. Črnilo so poskušali odstraniti s pomočjo encimov, težke kovine v vodi po odstranitvi črnila, pa z adsorpcijo z metalotioneini. Tekom projekta so razvili tudi test, s katerim so lahko preizkusili učinkovitost uporabljenih encimov. Ker gre pri čiščenju odpadne vode za gensko spremenjene organizme, ki adsorbirajo težke kovine, in bi se lahko sprostili v okolje, so dodali še stikalo za uničenje, odzivno na modro svetlobo.<br /> <br /> = Izvedba =<br /> <br /> == 1. Encimsko odstranjevanje črnila ==<br /> <br /> Recikliranje papirja se začne s pripravo papirne kaše, ki ji nato dodajo velike količine topil. Ker papir pri postopku zbledi, mešanici dodajo še različna belila, kar še poslabša kakovost končnega izdelka. Po obdelavi s kemikalijami, se črnilo iz mešanice odstrani s postopkom flotacije. Gre za postopek, pri katerem v flotacijsko celico vpihujejo zračne mehurčke, na katere se vežejo delci črnila. Te nato odnese na površino, kjer nastaja pena, ki se odstranjuje. Za večjo čistost se ta postopek ponovi v več zaporednih flotacijskih celicah, kar poveča izgubo vlaken in posledično zmanjša izkoristek. <br /> <br /> Skupina je velike količine topil poskusila nadomestiti z ustreznim encimom. Izbrali so si različne encime, in sicer celulazo EG5C ''Bacillus subtilis'', monooksigenazo CYP199A4 ''Rhodopseudomonas palistris'' in lakazo ''Rheinheimera'' sp. Postopek flotacije so nadomestili z uporabo hidrofobnega topila limonena, da bi izboljšali izkoristek. <br /> Z odstranjevanjem črnila iz papirja, na katerem je bil natisnjen enak članek, so primerjali učinkovitost kemične metode odstranjevanja, pri kateri so uporabili natrijev hidroksid (NaOH), in odstranjevanje z encimi. Iz papirja so najprej pripravili papirno kašo, ji dodali ustrezna topila ali encime, po inkubaciji pa dodali še limonen. Tekočino so po odstranitvi črnila ločili od papirja, ga posušili, nato pa z računalniškim programom ocenili kakšna je njegova barva. Med encimi je bila najbolj uspešna monooksigenaza, ki sicer ni dosega enake čistosti kot kemična metoda. <br /> <br /> S pomočjo literature so zato izbrali več monooksigenaz. Izbrane so bile monooksigenaze, pri katerih je lahko (namesto NADPH) donor elektronov vodikov peroksid (H2O2), ki je cenejši. Pri odstranjevanju encima so bile ponovno najbolj učinkovite monooksigenaze CYP199A4, zato so za odstranjevanje izbrali eno od mutant tega encima.<br /> <br /> <br /> == 2. Izločanje rekombinantnega encima ==<br /> <br /> Izolacija encima bi podaljšala in podražila celoten postopek, zato so izbrali dva pristopa, s katerimi bi se rekombinantni proteini izločili v okolico: avtolizo celic, ali pa uporabo signalnih peptidov.<br /> <br /> Za lizo celic so uporabili sistem FLSA (''ang.'' FhuD-T7-lysozyme-SsrA mediated autolytic system). FhuD je signalni peptid, ki omogoča, da lizocim T7 preide v periplazemski prostor, kjer razgradi peptidoglikan v celični steni, s tem pa povzroči lizo celic. Dodatno protein SsrA omogoča razgradnjo T7 lizocima, v primeru, da bi prišlo do puščanja promotorja. Učinkovitost sistema so preverili tako, da so v bakterijah najprej izrazili sfGFP, nato pa z arabinozo inducirali avtolizo celic. Merili so fluorescenco supernatanta in kulture. Ker je bila učinkovitost tega sistema prenizka, so ga poskušali prilagoditi z mutacijo lizocima T7, menjavo signalnega peptida in menjavo linkerja. <br /> <br /> Predvidevali so, da avtoliza zaradi porabe velikih količin induktorjev ne bi bila najbolj primerna za uporabo v industriji, zato so se raje odločili za uporabo signalnih peptidov. Za primerjavo so uporabili sfGFP z različnimi signalnimi peptidi. Po indukciji izražanja so tako kot pri avtolizi merili, kakšna je bila fluorescenca supernatanta, kulture in kakšna je rast kulture (OD600). Po primerjavi osmih različnih signalnih peptidov, so izbrali signalni peptid LMT, ki je zagotavljal zadostno izločanje in ni povzročil prevelikega bremena za delovanje celic. <br /> <br /> Primerjali so še učinkovitost predhodno izbranih monooksigenaz z izbranim signalnim peptidom, pri tem pa so izbrali encim CYP199A4 z mutacijo T253E.<br /> <br /> Z uporabo signalnega peptida so omogočili uporabo supernatanta bakterijske kulture za odstranjevanje črnila, brez postopkov izolacije proteina. Po proizvodnji recikliranega papirja, bi bil ta obdelan z visokimi temperaturami, s čimer bi preprečili kontaminacijo z bakterijami.<br /> <br /> <br /> == 3. Čiščenje odpadne vode ==<br /> <br /> Po odstranjevanju črnila v odpadni vodi ostane velika količina težkih kovin, kot so svinec, krom, kadmij in živo srebro. Skupina je težke kovine v vodi poskusila odstraniti s pomočjo bakterij, ki bi izražale metalotioneine. To so majhni proteini, bogati s cisteinskimi aminokislinskimi ostanki, ki so sposobni vezave težkih kovin. Preizkusili so dve možnosti: izražanje metalotioneinov na površini celic ali pa izražanje metalotioneinov znotraj celic skupaj s transporterji za kovinske ione. <br /> <br /> Za predstavitev metalotioneinov na površini ''E. coli'' BL21 (DE3), so uporabili INPNC sistem. Gre za skrajšano obliko INP (''ang.'' Ice nucleoprotein) bakterije ''Pseudomonas syringae'', ki vsebuje N- in C-končno domeno. Ta omogoča sidranje proteinov na površino bakterije. Za adsorpcijo težkih kovin so uporabili človeška metalotioneina MT3 in MT2A. Tako kot ostali metalotioneini vežeta dvovalentne ione težkih kovin, vendar pa za razliko od preostalih MT2A omogoča tudi adsorpcijo Cr2O72- ionov. Po podatkih iz literature naj bi bila predstavitev na površini bolj uspešna pri adsorpciji kovin, vendar pa je učinkovitost adsorpcije kadmija nizka. Kot rešitev za ta problem so predstavili možnost izražanja metalotioneinov znotraj celic, ki bi sočasno izražale tudi transportni sistem za te ione. Pri tem bi bil uporabljen MntA, ki je odgovoren za transport manganovih in kadmijevih ionov. <br /> <br /> == 4. Stikalo za uničenje ==<br /> <br /> Ker bi v postopku čiščenja odpadne vode uporabili gensko spremenjene bakterije, ki bi se lahko sprostile v okolje, so dodali še stikalo za uničenje. Odločili so se za uporabo stikala, odzivnega na modro svetlobo, s tem so se ponovno poskusili izogniti uporabi prevelikih količin induktorjev. Uporabili so sistem LexRO/pColE408, ki bi uravnaval izražanje toksina CcdB. Toksin CcdB tvori kompleks z DNA girazo in s tem prepreči njeno delovanje. Izražanje toksina CcdB v tem vezju uravnava promotor pColE408, ki je sestavljen iz ColE promotorja in LexA(408) operatorja, kamor se veže LexRO. LexRO je represor, ki v temi dimerizira, se veže na pColE408 promotor in s tem prepreči izražanje toksina CcdB. Ko celice osvetlimo s svetlobo točno določene valovne dolžine pa dimer razpade, začne se izražanje CcdB, kar povzroči smrt celice. Ker bi lahko prišlo do celične smrti zaradi puščanja promotorja pColE408, je bil antitoksin CcdA, ki nevtralizira toksin CcdB, pod nadzorom šibkega konstitutivnega promotorja.<br /> <br /> = Prihodnje usmeritve =<br /> <br /> Velike količine odpadnega papirja nastanejo tudi zaradi napak pri pisanju. Za popravke se pogosto uporabljajo izdelki, s katerimi lahko te napake popravimo, vendar pa imajo ti izdelki določene pomanjkljivosti. To so predvsem učinkovitost in vpliv na okolje, poleg tega puščajo vidne sledi, zaradi česar se listi pogosto zavržejo, kar poveča količine odpadnega papirja. Skupina je zato kot možnost za nadaljnje raziskovanje predstavila izdelek, ki bi omogočal vsakodnevno odstranjevanje črnila. Ker je črnilo sestavljeno iz hidrofobnih pigmentov, so predvidevali, da bi ga lahko z uporabo hidrofobnih topil uspešno odstranili s papirja. Pri tem bi uporabili mikroemulzijo limonena in ramnolipidov, surfaktantov, ki bi omogočali, da se črnilo odstrani iz papirja. Za ponovno uporabo mikroemulzije, pa bi raztopljeno črnilo odstranili z uporabo hitozana, na katerega bi se črnilo adsorbiralo.<br /> <br /> = Zaključek =<br /> <br /> Ekipa kitajske Univerze Xiamen je razvila postopek, s katerim bi lahko bistveno izboljšali odstranjevanje črnila iz odpadnega papirja pri recikliranju. Alternativa velikim količinam topil, ki onesnažujejo okolje in predstavljajo nevarnost za delavce v industriji, je uporaba rekombinantnih encimov, sintetiziranih v ''E. coli'' BL21 (DE3), ki bi se iz celice izločali s pomočjo signalnih peptidov. Po izdelavi papirja, bi bil ta obdelan z visoko temperaturo, s čimer bi preprečili kontaminacijo z bakterijami. Ker pri postopku odstranjevanja nastanejo velike količine odpadne vode, ki je onesnažena s težkimi kovinami, so dodali še stopnjo čiščenja. Za to so uporabili bakterije, ki so izražale metalotionine, na katere bi se težke kovine adsorbirale. Možnost uhajanja bakterij so preprečili z dodatkom stikala za uničenje. <br /> Na ta način bi ekipa povečala recikliranje odpadnega papirja na bolj ekološki način, zmanjšala uporabo lesa za pridelavo papirja, s tem pa zmanjšala vpliv na podnebne spremembe. <br /> <br /> = Viri in literatura =<br /> <br /> [1] https://2024.igem.wiki/xmu-china/</div>

Lina Kopač https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=REPARO&diff=24883 2025-05-11T16:37:49Z

<p>Lina Kopač: </p> <hr /> <div>[https://2024.igem.wiki/xmu-china/ REPARO] je projekt, ki ga je leta 2024 pripravila ekipa kitajske Univerze Xiamen. Ekipa je za svoj projekt prejela zlato medaljo in nagrado za najboljši projekt v svoji kategoriji.<br /> <br /> = Uvod =<br /> <br /> Razlog za hitre podnebne premembe je med drugim tudi obsežno krčenje gozdov, k čemur pomembno prispeva poraba lesa za proizvodnjo papirja. Eden izmed ukrepov za zmanjšanje te porabe je recikliranje odpadnega papirja, vendar pa trenutni postopki recikliranja niso optimalni. Glavni izziv predstavlja odstranjevanje črnila. Ta postopek porabi velike količine vode in topil, zato je dražji, onesnažuje okolje in predstavlja nevarnost za zdravje delavcev v tej industriji. Poleg tega po odstranjevanju črnila v vodi ostane veliko težkih kovin, kar še dodatno onesnažuje okolje.<br /> <br /> = Cilj =<br /> <br /> Ekipa je s svojim projektom poskušala razviti postopek odstranjevanja črnila z odpadnega papirja, ki bi bil bolj varen in bolj ekonomičen, hkrati pa bolj učinkovit od trenutno uporabljenih metod. Črnilo so poskušali odstraniti s pomočjo encimov, težke kovine v vodi po odstranitvi črnila, pa z adsorpcijo z metalotioneini. Tekom projekta so razvili tudi test, s katerim so lahko preizkusili učinkovitost uporabljenih encimov. Ker gre pri čiščenju odpadne vode za gensko spremenjene organizme, ki adsorbirajo težke kovine, in bi se lahko sprostili v okolje, so dodali še stikalo za uničenje, odzivno na modro svetlobo.<br /> <br /> = Izvedba =<br /> <br /> == 1. Encimsko odstranjevanje črnila ==<br /> <br /> Recikliranje papirja se začne s pripravo papirne kaše, ki ji nato dodajo velike količine topil. Ker papir pri postopku zbledi, mešanici dodajo še različna belila, kar še poslabša kakovost končnega izdelka. Po obdelavi s kemikalijami, se črnilo iz mešanice odstrani s postopkom flotacije. Gre za postopek, pri katerem v flotacijsko celico vpihujejo zračne mehurčke, na katere se vežejo delci črnila. Te nato odnese na površino, kjer nastaja pena, ki se odstranjuje. Za večjo čistost se ta postopek ponovi v več zaporednih flotacijskih celicah, kar poveča izgubo vlaken in posledično zmanjša izkoristek. <br /> Skupina je velike količine topil poskusila nadomestiti z ustreznim encimom. Izbrali so si različne encime, in sicer celulazo EG5C ''Bacillus subtilis'', monooksigenazo CYP199A4 ''Rhodopseudomonas palistris'' in lakazo ''Rheinheimera'' sp. Postopek flotacije so nadomestili z uporabo hidrofobnega topila limonena, da bi izboljšali izkoristek. <br /> Z odstranjevanjem črnila iz papirja, na katerem je bil natisnjen enak članek, so primerjali učinkovitost kemične metode odstranjevanja, pri kateri so uporabili natrijev hidroksid (NaOH), in odstranjevanje z encimi. Iz papirja so najprej pripravili papirno kašo, ji dodali ustrezna topila ali encime, po inkubaciji pa dodali še limonen. Tekočino so po odstranitvi črnila ločili od papirja, ga posušili, nato pa z računalniškim programom ocenili kakšna je njegova barva. Med encimi je bila najbolj uspešna monooksigenaza, ki sicer ni dosega enake čistosti kot kemična metoda. <br /> S pomočjo literature so zato izbrali več monooksigenaz. Izbrane so bile monooksigenaze, pri katerih je lahko (namesto NADPH) donor elektronov vodikov peroksid (H2O2), ki je cenejši. Pri odstranjevanju encima so bile ponovno najbolj učinkovite monooksigenaze CYP199A4, zato so za odstranjevanje izbrali eno od mutant tega encima.<br /> <br /> <br /> == 2. Izločanje rekombinantnega encima ==<br /> <br /> Izolacija encima bi podaljšala in podražila celoten postopek, zato so izbrali dva pristopa, s katerimi bi se rekombinantni proteini izločili v okolico: avtolizo celic, ali pa uporabo signalnih peptidov.<br /> Za lizo celic so uporabili sistem FLSA (''ang.'' FhuD-T7-lysozyme-SsrA mediated autolytic system). FhuD je signalni peptid, ki omogoča, da lizocim T7 preide v periplazemski prostor, kjer razgradi peptidoglikan v celični steni, s tem pa povzroči lizo celic. Dodatno protein SsrA omogoča razgradnjo T7 lizocima, v primeru, da bi prišlo do puščanja promotorja. Učinkovitost sistema so preverili tako, da so v bakterijah najprej izrazili sfGFP, nato pa z arabinozo inducirali avtolizo celic. Merili so fluorescenco supernatanta in kulture. Ker je bila učinkovitost tega sistema prenizka, so ga poskušali prilagoditi z mutacijo lizocima T7, menjavo signalnega peptida in menjavo linkerja. <br /> Predvidevali so, da avtoliza zaradi porabe velikih količin induktorjev ne bi bila najbolj primerna za uporabo v industriji, zato so se raje odločili za uporabo signalnih peptidov. Za primerjavo so uporabili sfGFP z različnimi signalnimi peptidi. Po indukciji izražanja so tako kot pri avtolizi merili, kakšna je bila fluorescenca supernatanta, kulture in kakšna je rast kulture (OD600). Po primerjavi osmih različnih signalnih peptidov, so izbrali signalni peptid LMT, ki je zagotavljal zadostno izločanje in ni povzročil prevelikega bremena za delovanje celic. <br /> Primerjali so še učinkovitost predhodno izbranih monooksigenaz z izbranim signalnim peptidom, pri tem pa so izbrali encim CYP199A4 z mutacijo T253E.<br /> Z uporabo signalnega peptida so omogočili uporabo supernatanta bakterijske kulture za odstranjevanje črnila, brez postopkov izolacije proteina. Po proizvodnji recikliranega papirja, bi bil ta obdelan z visokimi temperaturami, s čimer bi preprečili kontaminacijo z bakterijami.<br /> <br /> <br /> == 3. Čiščenje odpadne vode ==<br /> <br /> Po odstranjevanju črnila v odpadni vodi ostane velika količina težkih kovin, kot so svinec, krom, kadmij in živo srebro. Skupina je težke kovine v vodi poskusila odstraniti s pomočjo bakterij, ki bi izražale metalotioneine. To so majhni proteini, bogati s cisteinskimi aminokislinskimi ostanki, ki so sposobni vezave težkih kovin. Preizkusili so dve možnosti: izražanje metalotioneinov na površini celic ali pa izražanje metalotioneinov znotraj celic skupaj s transporterji za kovinske ione. <br /> Za predstavitev metalotioneinov na površini ''E. coli'' BL21 (DE3), so uporabili INPNC sistem. Gre za skrajšano obliko INP (''ang.'' Ice nucleoprotein) bakterije ''Pseudomonas syringae'', ki vsebuje N- in C-končno domeno. Ta omogoča sidranje proteinov na površino bakterije. Za adsorpcijo težkih kovin so uporabili človeška metalotioneina MT3 in MT2A. Tako kot ostali metalotioneini vežeta dvovalentne ione težkih kovin, vendar pa za razliko od preostalih MT2A omogoča tudi adsorpcijo Cr2O72- ionov. Po podatkih iz literature naj bi bila predstavitev na površini bolj uspešna pri adsorpciji kovin, vendar pa je učinkovitost adsorpcije kadmija nizka. Kot rešitev za ta problem so predstavili možnost izražanja metalotioneinov znotraj celic, ki bi sočasno izražale tudi transportni sistem za te ione. Pri tem bi bil uporabljen MntA, ki je odgovoren za transport manganovih in kadmijevih ionov. <br /> <br /> == 4. Stikalo za uničenje ==<br /> <br /> Ker bi v postopku čiščenja odpadne vode uporabili gensko spremenjene bakterije, ki bi se lahko sprostile v okolje, so dodali še stikalo za uničenje. Odločili so se za uporabo stikala, odzivnega na modro svetlobo, s tem so se ponovno poskusili izogniti uporabi prevelikih količin induktorjev. Uporabili so sistem LexRO/pColE408, ki bi uravnaval izražanje toksina CcdB. Toksin CcdB tvori kompleks z DNA girazo in s tem prepreči njeno delovanje. Izražanje toksina CcdB v tem vezju uravnava promotor pColE408, ki je sestavljen iz ColE promotorja in LexA(408) operatorja, kamor se veže LexRO. LexRO je represor, ki v temi dimerizira, se veže na pColE408 promotor in s tem prepreči izražanje toksina CcdB. Ko celice osvetlimo s svetlobo točno določene valovne dolžine pa dimer razpade, začne se izražanje CcdB, kar povzroči smrt celice. Ker bi lahko prišlo do celične smrti zaradi puščanja promotorja pColE408, je bil antitoksin CcdA, ki nevtralizira toksin CcdB, pod nadzorom šibkega konstitutivnega promotorja.<br /> <br /> = Prihodnje usmeritve =<br /> <br /> Velike količine odpadnega papirja nastanejo tudi zaradi napak pri pisanju. Za popravke se pogosto uporabljajo izdelki, s katerimi lahko te napake popravimo, vendar pa imajo ti izdelki določene pomanjkljivosti. To so predvsem učinkovitost in vpliv na okolje, poleg tega puščajo vidne sledi, zaradi česar se listi pogosto zavržejo, kar poveča količine odpadnega papirja. Skupina je zato kot možnost za nadaljnje raziskovanje predstavila izdelek, ki bi omogočal vsakodnevno odstranjevanje črnila. Ker je črnilo sestavljeno iz hidrofobnih pigmentov, so predvidevali, da bi ga lahko z uporabo hidrofobnih topil uspešno odstranili s papirja. Pri tem bi uporabili mikroemulzijo limonena in ramnolipidov, surfaktantov, ki bi omogočali, da se črnilo odstrani iz papirja. Za ponovno uporabo mikroemulzije, pa bi raztopljeno črnilo odstranili z uporabo hitozana, na katerega bi se črnilo adsorbiralo.<br /> <br /> = Zaključek =<br /> <br /> Ekipa kitajske Univerze Xiamen je razvila postopek, s katerim bi lahko bistveno izboljšali odstranjevanje črnila iz odpadnega papirja pri recikliranju. Alternativa velikim količinam topil, ki onesnažujejo okolje in predstavljajo nevarnost za delavce v industriji, je uporaba rekombinantnih encimov, sintetiziranih v ''E. coli'' BL21 (DE3), ki bi se iz celice izločali s pomočjo signalnih peptidov. Po izdelavi papirja, bi bil ta obdelan z visoko temperaturo, s čimer bi preprečili kontaminacijo z bakterijami. Ker pri postopku odstranjevanja nastanejo velike količine odpadne vode, ki je onesnažena s težkimi kovinami, so dodali še stopnjo čiščenja. Za to so uporabili bakterije, ki so izražale metalotionine, na katere bi se težke kovine adsorbirale. Možnost uhajanja bakterij so preprečili z dodatkom stikala za uničenje. <br /> Na ta način bi ekipa povečala recikliranje odpadnega papirja na bolj ekološki način, zmanjšala uporabo lesa za pridelavo papirja, s tem pa zmanjšala vpliv na podnebne spremembe. <br /> <br /> = Viri in literatura =<br /> <br /> [1] https://2024.igem.wiki/xmu-china/</div>

Lina Kopač https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=REPARO&diff=24882 2025-05-11T16:33:40Z

<p>Lina Kopač: </p> <hr /> <div>REPARO je projekt, ki ga je leta 2024 pripravila ekipa kitajske Univerze Xiamen. Ekipa je za svoj projekt prejela zlato medaljo in nagrado za najboljši projekt v svoji kategoriji.<br /> <br /> = Uvod =<br /> <br /> Razlog za hitre podnebne premembe je med drugim tudi obsežno krčenje gozdov, k čemur pomembno prispeva poraba lesa za proizvodnjo papirja. Eden izmed ukrepov za zmanjšanje te porabe je recikliranje odpadnega papirja, vendar pa trenutni postopki recikliranja niso optimalni. Glavni izziv predstavlja odstranjevanje črnila. Ta postopek porabi velike količine vode in topil, zato je dražji, onesnažuje okolje in predstavlja nevarnost za zdravje delavcev v tej industriji. Poleg tega po odstranjevanju črnila v vodi ostane veliko težkih kovin, kar še dodatno onesnažuje okolje.<br /> <br /> = Cilj =<br /> <br /> Ekipa je s svojim projektom poskušala razviti postopek odstranjevanja črnila z odpadnega papirja, ki bi bil bolj varen in bolj ekonomičen, hkrati pa bolj učinkovit od trenutno uporabljenih metod. Črnilo so poskušali odstraniti s pomočjo encimov, težke kovine v vodi po odstranitvi črnila, pa z adsorpcijo z metalotioneini. Tekom projekta so razvili tudi test, s katerim so lahko preizkusili učinkovitost uporabljenih encimov. Ker gre pri čiščenju odpadne vode za gensko spremenjene organizme, ki adsorbirajo težke kovine, in bi se lahko sprostili v okolje, so dodali še stikalo za uničenje, odzivno na modro svetlobo.<br /> <br /> = Izvedba =<br /> <br /> == 1. Encimsko odstranjevanje črnila ==<br /> <br /> Recikliranje papirja se začne s pripravo papirne kaše, ki ji nato dodajo velike količine topil. Ker papir pri postopku zbledi, mešanici dodajo še različna belila, kar še poslabša kakovost končnega izdelka. Po obdelavi s kemikalijami, se črnilo iz mešanice odstrani s postopkom flotacije. Gre za postopek, pri katerem v flotacijsko celico vpihujejo zračne mehurčke, na katere se vežejo delci črnila. Te nato odnese na površino, kjer nastaja pena, ki se odstranjuje. Za večjo čistost se ta postopek ponovi v več zaporednih flotacijskih celicah, kar poveča izgubo vlaken in posledično zmanjša izkoristek. <br /> Skupina je velike količine topil poskusila nadomestiti z ustreznim encimom. Izbrali so si različne encime, in sicer celulazo EG5C ''Bacillus subtilis'', monooksigenazo CYP199A4 ''Rhodopseudomonas palistris'' in lakazo ''Rheinheimera'' sp. Postopek flotacije so nadomestili z uporabo hidrofobnega topila limonena, da bi izboljšali izkoristek. <br /> Z odstranjevanjem črnila iz papirja, na katerem je bil natisnjen enak članek, so primerjali učinkovitost kemične metode odstranjevanja, pri kateri so uporabili natrijev hidroksid (NaOH), in odstranjevanje z encimi. Iz papirja so najprej pripravili papirno kašo, ji dodali ustrezna topila ali encime, po inkubaciji pa dodali še limonen. Tekočino so po odstranitvi črnila ločili od papirja, ga posušili, nato pa z računalniškim programom ocenili kakšna je njegova barva. Med encimi je bila najbolj uspešna monooksigenaza, ki sicer ni dosega enake čistosti kot kemična metoda. <br /> S pomočjo literature so zato izbrali več monooksigenaz. Izbrane so bile monooksigenaze, pri katerih je lahko (namesto NADPH) donor elektronov vodikov peroksid (H2O2), ki je cenejši. Pri odstranjevanju encima so bile ponovno najbolj učinkovite monooksigenaze CYP199A4, zato so za odstranjevanje izbrali eno od mutant tega encima.<br /> <br /> <br /> == 2. Izločanje rekombinantnega encima ==<br /> <br /> Izolacija encima bi podaljšala in podražila celoten postopek, zato so izbrali dva pristopa, s katerimi bi se rekombinantni proteini izločili v okolico: avtolizo celic, ali pa uporabo signalnih peptidov.<br /> Za lizo celic so uporabili sistem FLSA (''ang.'' FhuD-T7-lysozyme-SsrA mediated autolytic system). FhuD je signalni peptid, ki omogoča, da lizocim T7 preide v periplazemski prostor, kjer razgradi peptidoglikan v celični steni, s tem pa povzroči lizo celic. Dodatno protein SsrA omogoča razgradnjo T7 lizocima, v primeru, da bi prišlo do puščanja promotorja. Učinkovitost sistema so preverili tako, da so v bakterijah najprej izrazili sfGFP, nato pa z arabinozo inducirali avtolizo celic. Merili so fluorescenco supernatanta in kulture. Ker je bila učinkovitost tega sistema prenizka, so ga poskušali prilagoditi z mutacijo lizocima T7, menjavo signalnega peptida in menjavo linkerja. <br /> Predvidevali so, da avtoliza zaradi porabe velikih količin induktorjev ne bi bila najbolj primerna za uporabo v industriji, zato so se raje odločili za uporabo signalnih peptidov. Za primerjavo so uporabili sfGFP z različnimi signalnimi peptidi. Po indukciji izražanja so tako kot pri avtolizi merili, kakšna je bila fluorescenca supernatanta, kulture in kakšna je rast kulture (OD600). Po primerjavi osmih različnih signalnih peptidov, so izbrali signalni peptid LMT, ki je zagotavljal zadostno izločanje in ni povzročil prevelikega bremena za delovanje celic. <br /> Primerjali so še učinkovitost predhodno izbranih monooksigenaz z izbranim signalnim peptidom, pri tem pa so izbrali encim CYP199A4 z mutacijo T253E.<br /> Z uporabo signalnega peptida so omogočili uporabo supernatanta bakterijske kulture za odstranjevanje črnila, brez postopkov izolacije proteina. Po proizvodnji recikliranega papirja, bi bil ta obdelan z visokimi temperaturami, s čimer bi preprečili kontaminacijo z bakterijami.<br /> <br /> <br /> == 3. Čiščenje odpadne vode ==<br /> <br /> Po odstranjevanju črnila v odpadni vodi ostane velika količina težkih kovin, kot so svinec, krom, kadmij in živo srebro. Skupina je težke kovine v vodi poskusila odstraniti s pomočjo bakterij, ki bi izražale metalotioneine. To so majhni proteini, bogati s cisteinskimi aminokislinskimi ostanki, ki so sposobni vezave težkih kovin. Preizkusili so dve možnosti: izražanje metalotioneinov na površini celic ali pa izražanje metalotioneinov znotraj celic skupaj s transporterji za kovinske ione. <br /> Za predstavitev metalotioneinov na površini ''E. coli'' BL21 (DE3), so uporabili INPNC sistem. Gre za skrajšano obliko INP (''ang.'' Ice nucleoprotein) bakterije ''Pseudomonas syringae'', ki vsebuje N- in C-končno domeno. Ta omogoča sidranje proteinov na površino bakterije. Za adsorpcijo težkih kovin so uporabili človeška metalotioneina MT3 in MT2A. Tako kot ostali metalotioneini vežeta dvovalentne ione težkih kovin, vendar pa za razliko od preostalih MT2A omogoča tudi adsorpcijo Cr2O72- ionov. Po podatkih iz literature naj bi bila predstavitev na površini bolj uspešna pri adsorpciji kovin, vendar pa je učinkovitost adsorpcije kadmija nizka. Kot rešitev za ta problem so predstavili možnost izražanja metalotioneinov znotraj celic, ki bi sočasno izražale tudi transportni sistem za te ione. Pri tem bi bil uporabljen MntA, ki je odgovoren za transport manganovih in kadmijevih ionov. <br /> <br /> == 4. Stikalo za uničenje ==<br /> <br /> Ker bi v postopku čiščenja odpadne vode uporabili gensko spremenjene bakterije, ki bi se lahko sprostile v okolje, so dodali še stikalo za uničenje. Odločili so se za uporabo stikala, odzivnega na modro svetlobo, s tem so se ponovno poskusili izogniti uporabi prevelikih količin induktorjev. Uporabili so sistem LexRO/pColE408, ki bi uravnaval izražanje toksina CcdB. Toksin CcdB tvori kompleks z DNA girazo in s tem prepreči njeno delovanje. Izražanje toksina CcdB v tem vezju uravnava promotor pColE408, ki je sestavljen iz ColE promotorja in LexA(408) operatorja, kamor se veže LexRO. LexRO je represor, ki v temi dimerizira, se veže na pColE408 promotor in s tem prepreči izražanje toksina CcdB. Ko celice osvetlimo s svetlobo točno določene valovne dolžine pa dimer razpade, začne se izražanje CcdB, kar povzroči smrt celice. Ker bi lahko prišlo do celične smrti zaradi puščanja promotorja pColE408, je bil antitoksin CcdA, ki nevtralizira toksin CcdB, pod nadzorom šibkega konstitutivnega promotorja.<br /> <br /> = Prihodnje usmeritve =<br /> <br /> Velike količine odpadnega papirja nastanejo tudi zaradi napak pri pisanju. Za popravke se pogosto uporabljajo izdelki, s katerimi lahko te napake popravimo, vendar pa imajo ti izdelki določene pomanjkljivosti. To so predvsem učinkovitost in vpliv na okolje, poleg tega puščajo vidne sledi, zaradi česar se listi pogosto zavržejo, kar poveča količine odpadnega papirja. Skupina je zato kot možnost za nadaljnje raziskovanje predstavila izdelek, ki bi omogočal vsakodnevno odstranjevanje črnila. Ker je črnilo sestavljeno iz hidrofobnih pigmentov, so predvidevali, da bi ga lahko z uporabo hidrofobnih topil uspešno odstranili s papirja. Pri tem bi uporabili mikroemulzijo limonena in ramnolipidov, surfaktantov, ki bi omogočali, da se črnilo odstrani iz papirja. Za ponovno uporabo mikroemulzije, pa bi raztopljeno črnilo odstranili z uporabo hitozana, na katerega bi se črnilo adsorbiralo.<br /> <br /> = Zaključek =<br /> <br /> Ekipa kitajske Univerze Xiamen je razvila postopek, s katerim bi lahko bistveno izboljšali odstranjevanje črnila iz odpadnega papirja pri recikliranju. Alternativa velikim količinam topil, ki onesnažujejo okolje in predstavljajo nevarnost za delavce v industriji, je uporaba rekombinantnih encimov, sintetiziranih v ''E. coli'' BL21 (DE3), ki bi se iz celice izločali s pomočjo signalnih peptidov. Po izdelavi papirja, bi bil ta obdelan z visoko temperaturo, s čimer bi preprečili kontaminacijo z bakterijami. Ker pri postopku odstranjevanja nastanejo velike količine odpadne vode, ki je onesnažena s težkimi kovinami, so dodali še stopnjo čiščenja. Za to so uporabili bakterije, ki so izražale metalotionine, na katere bi se težke kovine adsorbirale. Možnost uhajanja bakterij so preprečili z dodatkom stikala za uničenje. <br /> Na ta način bi ekipa povečala recikliranje odpadnega papirja na bolj ekološki način, zmanjšala uporabo lesa za pridelavo papirja, s tem pa zmanjšala vpliv na podnebne spremembe. <br /> <br /> = Viri in literatura =<br /> <br /> [1] https://2024.igem.wiki/xmu-china/</div>

Lina Kopač https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=REPARO&diff=24881 2025-05-11T16:32:58Z

<p>Lina Kopač: </p> <hr /> <div>REPARO je projekt, ki ga je leta 2024 pripravila ekipa kitajske Univerze Xiamen. Ekipa je za svoj projekt prejela zlato medaljo in nagrado za najboljši projekt v svoji kategoriji.<br /> <br /> = Uvod =<br /> <br /> Razlog za hitre podnebne premembe je med drugim tudi obsežno krčenje gozdov, k čemur pomembno prispeva poraba lesa za proizvodnjo papirja. Eden izmed ukrepov za zmanjšanje te porabe je recikliranje odpadnega papirja, vendar pa trenutni postopki recikliranja niso optimalni. Glavni izziv predstavlja odstranjevanje črnila. Ta postopek porabi velike količine vode in topil, zato je dražji, onesnažuje okolje in predstavlja nevarnost za zdravje delavcev v tej industriji. Poleg tega po odstranjevanju črnila v vodi ostane veliko težkih kovin, kar še dodatno onesnažuje okolje.<br /> <br /> = CILJ =<br /> <br /> Ekipa je s svojim projektom poskušala razviti postopek odstranjevanja črnila z odpadnega papirja, ki bi bil bolj varen in bolj ekonomičen, hkrati pa bolj učinkovit od trenutno uporabljenih metod. Črnilo so poskušali odstraniti s pomočjo encimov, težke kovine v vodi po odstranitvi črnila, pa z adsorpcijo z metalotioneini. Tekom projekta so razvili tudi test, s katerim so lahko preizkusili učinkovitost uporabljenih encimov. Ker gre pri čiščenju odpadne vode za gensko spremenjene organizme, ki adsorbirajo težke kovine, in bi se lahko sprostili v okolje, so dodali še stikalo za uničenje, odzivno na modro svetlobo.<br /> <br /> = IZVEDBA =<br /> <br /> == 1. Encimsko odstranjevanje črnila ==<br /> <br /> Recikliranje papirja se začne s pripravo papirne kaše, ki ji nato dodajo velike količine topil. Ker papir pri postopku zbledi, mešanici dodajo še različna belila, kar še poslabša kakovost končnega izdelka. Po obdelavi s kemikalijami, se črnilo iz mešanice odstrani s postopkom flotacije. Gre za postopek, pri katerem v flotacijsko celico vpihujejo zračne mehurčke, na katere se vežejo delci črnila. Te nato odnese na površino, kjer nastaja pena, ki se odstranjuje. Za večjo čistost se ta postopek ponovi v več zaporednih flotacijskih celicah, kar poveča izgubo vlaken in posledično zmanjša izkoristek. <br /> Skupina je velike količine topil poskusila nadomestiti z ustreznim encimom. Izbrali so si različne encime, in sicer celulazo EG5C ''Bacillus subtilis'', monooksigenazo CYP199A4 ''Rhodopseudomonas palistris'' in lakazo ''Rheinheimera'' sp. Postopek flotacije so nadomestili z uporabo hidrofobnega topila limonena, da bi izboljšali izkoristek. <br /> Z odstranjevanjem črnila iz papirja, na katerem je bil natisnjen enak članek, so primerjali učinkovitost kemične metode odstranjevanja, pri kateri so uporabili natrijev hidroksid (NaOH), in odstranjevanje z encimi. Iz papirja so najprej pripravili papirno kašo, ji dodali ustrezna topila ali encime, po inkubaciji pa dodali še limonen. Tekočino so po odstranitvi črnila ločili od papirja, ga posušili, nato pa z računalniškim programom ocenili kakšna je njegova barva. Med encimi je bila najbolj uspešna monooksigenaza, ki sicer ni dosega enake čistosti kot kemična metoda. <br /> S pomočjo literature so zato izbrali več monooksigenaz. Izbrane so bile monooksigenaze, pri katerih je lahko (namesto NADPH) donor elektronov vodikov peroksid (H2O2), ki je cenejši. Pri odstranjevanju encima so bile ponovno najbolj učinkovite monooksigenaze CYP199A4, zato so za odstranjevanje izbrali eno od mutant tega encima.<br /> <br /> <br /> == 2. Izločanje rekombinantnega encima ==<br /> <br /> Izolacija encima bi podaljšala in podražila celoten postopek, zato so izbrali dva pristopa, s katerimi bi se rekombinantni proteini izločili v okolico: avtolizo celic, ali pa uporabo signalnih peptidov.<br /> Za lizo celic so uporabili sistem FLSA (''ang.'' FhuD-T7-lysozyme-SsrA mediated autolytic system). FhuD je signalni peptid, ki omogoča, da lizocim T7 preide v periplazemski prostor, kjer razgradi peptidoglikan v celični steni, s tem pa povzroči lizo celic. Dodatno protein SsrA omogoča razgradnjo T7 lizocima, v primeru, da bi prišlo do puščanja promotorja. Učinkovitost sistema so preverili tako, da so v bakterijah najprej izrazili sfGFP, nato pa z arabinozo inducirali avtolizo celic. Merili so fluorescenco supernatanta in kulture. Ker je bila učinkovitost tega sistema prenizka, so ga poskušali prilagoditi z mutacijo lizocima T7, menjavo signalnega peptida in menjavo linkerja. <br /> Predvidevali so, da avtoliza zaradi porabe velikih količin induktorjev ne bi bila najbolj primerna za uporabo v industriji, zato so se raje odločili za uporabo signalnih peptidov. Za primerjavo so uporabili sfGFP z različnimi signalnimi peptidi. Po indukciji izražanja so tako kot pri avtolizi merili, kakšna je bila fluorescenca supernatanta, kulture in kakšna je rast kulture (OD600). Po primerjavi osmih različnih signalnih peptidov, so izbrali signalni peptid LMT, ki je zagotavljal zadostno izločanje in ni povzročil prevelikega bremena za delovanje celic. <br /> Primerjali so še učinkovitost predhodno izbranih monooksigenaz z izbranim signalnim peptidom, pri tem pa so izbrali encim CYP199A4 z mutacijo T253E.<br /> Z uporabo signalnega peptida so omogočili uporabo supernatanta bakterijske kulture za odstranjevanje črnila, brez postopkov izolacije proteina. Po proizvodnji recikliranega papirja, bi bil ta obdelan z visokimi temperaturami, s čimer bi preprečili kontaminacijo z bakterijami.<br /> <br /> <br /> == 3. Čiščenje odpadne vode ==<br /> <br /> Po odstranjevanju črnila v odpadni vodi ostane velika količina težkih kovin, kot so svinec, krom, kadmij in živo srebro. Skupina je težke kovine v vodi poskusila odstraniti s pomočjo bakterij, ki bi izražale metalotioneine. To so majhni proteini, bogati s cisteinskimi aminokislinskimi ostanki, ki so sposobni vezave težkih kovin. Preizkusili so dve možnosti: izražanje metalotioneinov na površini celic ali pa izražanje metalotioneinov znotraj celic skupaj s transporterji za kovinske ione. <br /> Za predstavitev metalotioneinov na površini ''E. coli'' BL21 (DE3), so uporabili INPNC sistem. Gre za skrajšano obliko INP (''ang.'' Ice nucleoprotein) bakterije ''Pseudomonas syringae'', ki vsebuje N- in C-končno domeno. Ta omogoča sidranje proteinov na površino bakterije. Za adsorpcijo težkih kovin so uporabili človeška metalotioneina MT3 in MT2A. Tako kot ostali metalotioneini vežeta dvovalentne ione težkih kovin, vendar pa za razliko od preostalih MT2A omogoča tudi adsorpcijo Cr2O72- ionov. Po podatkih iz literature naj bi bila predstavitev na površini bolj uspešna pri adsorpciji kovin, vendar pa je učinkovitost adsorpcije kadmija nizka. Kot rešitev za ta problem so predstavili možnost izražanja metalotioneinov znotraj celic, ki bi sočasno izražale tudi transportni sistem za te ione. Pri tem bi bil uporabljen MntA, ki je odgovoren za transport manganovih in kadmijevih ionov. <br /> <br /> == 4. Stikalo za uničenje ==<br /> <br /> Ker bi v postopku čiščenja odpadne vode uporabili gensko spremenjene bakterije, ki bi se lahko sprostile v okolje, so dodali še stikalo za uničenje. Odločili so se za uporabo stikala, odzivnega na modro svetlobo, s tem so se ponovno poskusili izogniti uporabi prevelikih količin induktorjev. Uporabili so sistem LexRO/pColE408, ki bi uravnaval izražanje toksina CcdB. Toksin CcdB tvori kompleks z DNA girazo in s tem prepreči njeno delovanje. Izražanje toksina CcdB v tem vezju uravnava promotor pColE408, ki je sestavljen iz ColE promotorja in LexA(408) operatorja, kamor se veže LexRO. LexRO je represor, ki v temi dimerizira, se veže na pColE408 promotor in s tem prepreči izražanje toksina CcdB. Ko celice osvetlimo s svetlobo točno določene valovne dolžine pa dimer razpade, začne se izražanje CcdB, kar povzroči smrt celice. Ker bi lahko prišlo do celične smrti zaradi puščanja promotorja pColE408, je bil antitoksin CcdA, ki nevtralizira toksin CcdB, pod nadzorom šibkega konstitutivnega promotorja.<br /> <br /> = PRIHODNJE USMERITVE =<br /> <br /> Velike količine odpadnega papirja nastanejo tudi zaradi napak pri pisanju. Za popravke se pogosto uporabljajo izdelki, s katerimi lahko te napake popravimo, vendar pa imajo ti izdelki določene pomanjkljivosti. To so predvsem učinkovitost in vpliv na okolje, poleg tega puščajo vidne sledi, zaradi česar se listi pogosto zavržejo, kar poveča količine odpadnega papirja. Skupina je zato kot možnost za nadaljnje raziskovanje predstavila izdelek, ki bi omogočal vsakodnevno odstranjevanje črnila. Ker je črnilo sestavljeno iz hidrofobnih pigmentov, so predvidevali, da bi ga lahko z uporabo hidrofobnih topil uspešno odstranili s papirja. Pri tem bi uporabili mikroemulzijo limonena in ramnolipidov, surfaktantov, ki bi omogočali, da se črnilo odstrani iz papirja. Za ponovno uporabo mikroemulzije, pa bi raztopljeno črnilo odstranili z uporabo hitozana, na katerega bi se črnilo adsorbiralo.<br /> <br /> = ZAKLJUČEK =<br /> <br /> Ekipa kitajske Univerze Xiamen je razvila postopek, s katerim bi lahko bistveno izboljšali odstranjevanje črnila iz odpadnega papirja pri recikliranju. Alternativa velikim količinam topil, ki onesnažujejo okolje in predstavljajo nevarnost za delavce v industriji, je uporaba rekombinantnih encimov, sintetiziranih v ''E. coli'' BL21 (DE3), ki bi se iz celice izločali s pomočjo signalnih peptidov. Po izdelavi papirja, bi bil ta obdelan z visoko temperaturo, s čimer bi preprečili kontaminacijo z bakterijami. Ker pri postopku odstranjevanja nastanejo velike količine odpadne vode, ki je onesnažena s težkimi kovinami, so dodali še stopnjo čiščenja. Za to so uporabili bakterije, ki so izražale metalotionine, na katere bi se težke kovine adsorbirale. Možnost uhajanja bakterij so preprečili z dodatkom stikala za uničenje. <br /> Na ta način bi ekipa povečala recikliranje odpadnega papirja na bolj ekološki način, zmanjšala uporabo lesa za pridelavo papirja, s tem pa zmanjšala vpliv na podnebne spremembe. <br /> <br /> = VIRI IN LITERATURA =<br /> <br /> [1] https://2024.igem.wiki/xmu-china/</div>

Lina Kopač https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=REPARO&diff=24880 2025-05-11T16:32:37Z

<p>Lina Kopač: Created page with &quot;REPARO je projekt, ki ga je leta 2024 pripravila ekipa kitajske Univerze Xiamen. Ekipa je za svoj projekt prejela zlato medaljo in nagrado za najboljši projekt v svoji kategoriji. = UVOD = Razlog za hitre podnebne premembe je med drugim tudi obsežno krčenje gozdov, k čemur pomembno prispeva poraba lesa za proizvodnjo papirja. Eden izmed ukrepov za zmanjšanje te porabe je recikliranje odpadnega papirja, vendar pa trenutni postopki recikliranja niso optimalni. Glavn...&quot;</p> <hr /> <div>REPARO je projekt, ki ga je leta 2024 pripravila ekipa kitajske Univerze Xiamen. Ekipa je za svoj projekt prejela zlato medaljo in nagrado za najboljši projekt v svoji kategoriji.<br /> <br /> = UVOD =<br /> <br /> Razlog za hitre podnebne premembe je med drugim tudi obsežno krčenje gozdov, k čemur pomembno prispeva poraba lesa za proizvodnjo papirja. Eden izmed ukrepov za zmanjšanje te porabe je recikliranje odpadnega papirja, vendar pa trenutni postopki recikliranja niso optimalni. Glavni izziv predstavlja odstranjevanje črnila. Ta postopek porabi velike količine vode in topil, zato je dražji, onesnažuje okolje in predstavlja nevarnost za zdravje delavcev v tej industriji. Poleg tega po odstranjevanju črnila v vodi ostane veliko težkih kovin, kar še dodatno onesnažuje okolje.<br /> <br /> = CILJ =<br /> <br /> Ekipa je s svojim projektom poskušala razviti postopek odstranjevanja črnila z odpadnega papirja, ki bi bil bolj varen in bolj ekonomičen, hkrati pa bolj učinkovit od trenutno uporabljenih metod. Črnilo so poskušali odstraniti s pomočjo encimov, težke kovine v vodi po odstranitvi črnila, pa z adsorpcijo z metalotioneini. Tekom projekta so razvili tudi test, s katerim so lahko preizkusili učinkovitost uporabljenih encimov. Ker gre pri čiščenju odpadne vode za gensko spremenjene organizme, ki adsorbirajo težke kovine, in bi se lahko sprostili v okolje, so dodali še stikalo za uničenje, odzivno na modro svetlobo.<br /> <br /> = IZVEDBA =<br /> <br /> == 1. Encimsko odstranjevanje črnila ==<br /> <br /> Recikliranje papirja se začne s pripravo papirne kaše, ki ji nato dodajo velike količine topil. Ker papir pri postopku zbledi, mešanici dodajo še različna belila, kar še poslabša kakovost končnega izdelka. Po obdelavi s kemikalijami, se črnilo iz mešanice odstrani s postopkom flotacije. Gre za postopek, pri katerem v flotacijsko celico vpihujejo zračne mehurčke, na katere se vežejo delci črnila. Te nato odnese na površino, kjer nastaja pena, ki se odstranjuje. Za večjo čistost se ta postopek ponovi v več zaporednih flotacijskih celicah, kar poveča izgubo vlaken in posledično zmanjša izkoristek. <br /> Skupina je velike količine topil poskusila nadomestiti z ustreznim encimom. Izbrali so si različne encime, in sicer celulazo EG5C ''Bacillus subtilis'', monooksigenazo CYP199A4 ''Rhodopseudomonas palistris'' in lakazo ''Rheinheimera'' sp. Postopek flotacije so nadomestili z uporabo hidrofobnega topila limonena, da bi izboljšali izkoristek. <br /> Z odstranjevanjem črnila iz papirja, na katerem je bil natisnjen enak članek, so primerjali učinkovitost kemične metode odstranjevanja, pri kateri so uporabili natrijev hidroksid (NaOH), in odstranjevanje z encimi. Iz papirja so najprej pripravili papirno kašo, ji dodali ustrezna topila ali encime, po inkubaciji pa dodali še limonen. Tekočino so po odstranitvi črnila ločili od papirja, ga posušili, nato pa z računalniškim programom ocenili kakšna je njegova barva. Med encimi je bila najbolj uspešna monooksigenaza, ki sicer ni dosega enake čistosti kot kemična metoda. <br /> S pomočjo literature so zato izbrali več monooksigenaz. Izbrane so bile monooksigenaze, pri katerih je lahko (namesto NADPH) donor elektronov vodikov peroksid (H2O2), ki je cenejši. Pri odstranjevanju encima so bile ponovno najbolj učinkovite monooksigenaze CYP199A4, zato so za odstranjevanje izbrali eno od mutant tega encima.<br /> <br /> <br /> == 2. Izločanje rekombinantnega encima ==<br /> <br /> Izolacija encima bi podaljšala in podražila celoten postopek, zato so izbrali dva pristopa, s katerimi bi se rekombinantni proteini izločili v okolico: avtolizo celic, ali pa uporabo signalnih peptidov.<br /> Za lizo celic so uporabili sistem FLSA (''ang.'' FhuD-T7-lysozyme-SsrA mediated autolytic system). FhuD je signalni peptid, ki omogoča, da lizocim T7 preide v periplazemski prostor, kjer razgradi peptidoglikan v celični steni, s tem pa povzroči lizo celic. Dodatno protein SsrA omogoča razgradnjo T7 lizocima, v primeru, da bi prišlo do puščanja promotorja. Učinkovitost sistema so preverili tako, da so v bakterijah najprej izrazili sfGFP, nato pa z arabinozo inducirali avtolizo celic. Merili so fluorescenco supernatanta in kulture. Ker je bila učinkovitost tega sistema prenizka, so ga poskušali prilagoditi z mutacijo lizocima T7, menjavo signalnega peptida in menjavo linkerja. <br /> Predvidevali so, da avtoliza zaradi porabe velikih količin induktorjev ne bi bila najbolj primerna za uporabo v industriji, zato so se raje odločili za uporabo signalnih peptidov. Za primerjavo so uporabili sfGFP z različnimi signalnimi peptidi. Po indukciji izražanja so tako kot pri avtolizi merili, kakšna je bila fluorescenca supernatanta, kulture in kakšna je rast kulture (OD600). Po primerjavi osmih različnih signalnih peptidov, so izbrali signalni peptid LMT, ki je zagotavljal zadostno izločanje in ni povzročil prevelikega bremena za delovanje celic. <br /> Primerjali so še učinkovitost predhodno izbranih monooksigenaz z izbranim signalnim peptidom, pri tem pa so izbrali encim CYP199A4 z mutacijo T253E.<br /> Z uporabo signalnega peptida so omogočili uporabo supernatanta bakterijske kulture za odstranjevanje črnila, brez postopkov izolacije proteina. Po proizvodnji recikliranega papirja, bi bil ta obdelan z visokimi temperaturami, s čimer bi preprečili kontaminacijo z bakterijami.<br /> <br /> <br /> == 3. Čiščenje odpadne vode ==<br /> <br /> Po odstranjevanju črnila v odpadni vodi ostane velika količina težkih kovin, kot so svinec, krom, kadmij in živo srebro. Skupina je težke kovine v vodi poskusila odstraniti s pomočjo bakterij, ki bi izražale metalotioneine. To so majhni proteini, bogati s cisteinskimi aminokislinskimi ostanki, ki so sposobni vezave težkih kovin. Preizkusili so dve možnosti: izražanje metalotioneinov na površini celic ali pa izražanje metalotioneinov znotraj celic skupaj s transporterji za kovinske ione. <br /> Za predstavitev metalotioneinov na površini ''E. coli'' BL21 (DE3), so uporabili INPNC sistem. Gre za skrajšano obliko INP (''ang.'' Ice nucleoprotein) bakterije ''Pseudomonas syringae'', ki vsebuje N- in C-končno domeno. Ta omogoča sidranje proteinov na površino bakterije. Za adsorpcijo težkih kovin so uporabili človeška metalotioneina MT3 in MT2A. Tako kot ostali metalotioneini vežeta dvovalentne ione težkih kovin, vendar pa za razliko od preostalih MT2A omogoča tudi adsorpcijo Cr2O72- ionov. Po podatkih iz literature naj bi bila predstavitev na površini bolj uspešna pri adsorpciji kovin, vendar pa je učinkovitost adsorpcije kadmija nizka. Kot rešitev za ta problem so predstavili možnost izražanja metalotioneinov znotraj celic, ki bi sočasno izražale tudi transportni sistem za te ione. Pri tem bi bil uporabljen MntA, ki je odgovoren za transport manganovih in kadmijevih ionov. <br /> <br /> == 4. Stikalo za uničenje ==<br /> <br /> Ker bi v postopku čiščenja odpadne vode uporabili gensko spremenjene bakterije, ki bi se lahko sprostile v okolje, so dodali še stikalo za uničenje. Odločili so se za uporabo stikala, odzivnega na modro svetlobo, s tem so se ponovno poskusili izogniti uporabi prevelikih količin induktorjev. Uporabili so sistem LexRO/pColE408, ki bi uravnaval izražanje toksina CcdB. Toksin CcdB tvori kompleks z DNA girazo in s tem prepreči njeno delovanje. Izražanje toksina CcdB v tem vezju uravnava promotor pColE408, ki je sestavljen iz ColE promotorja in LexA(408) operatorja, kamor se veže LexRO. LexRO je represor, ki v temi dimerizira, se veže na pColE408 promotor in s tem prepreči izražanje toksina CcdB. Ko celice osvetlimo s svetlobo točno določene valovne dolžine pa dimer razpade, začne se izražanje CcdB, kar povzroči smrt celice. Ker bi lahko prišlo do celične smrti zaradi puščanja promotorja pColE408, je bil antitoksin CcdA, ki nevtralizira toksin CcdB, pod nadzorom šibkega konstitutivnega promotorja.<br /> <br /> = PRIHODNJE USMERITVE =<br /> <br /> Velike količine odpadnega papirja nastanejo tudi zaradi napak pri pisanju. Za popravke se pogosto uporabljajo izdelki, s katerimi lahko te napake popravimo, vendar pa imajo ti izdelki določene pomanjkljivosti. To so predvsem učinkovitost in vpliv na okolje, poleg tega puščajo vidne sledi, zaradi česar se listi pogosto zavržejo, kar poveča količine odpadnega papirja. Skupina je zato kot možnost za nadaljnje raziskovanje predstavila izdelek, ki bi omogočal vsakodnevno odstranjevanje črnila. Ker je črnilo sestavljeno iz hidrofobnih pigmentov, so predvidevali, da bi ga lahko z uporabo hidrofobnih topil uspešno odstranili s papirja. Pri tem bi uporabili mikroemulzijo limonena in ramnolipidov, surfaktantov, ki bi omogočali, da se črnilo odstrani iz papirja. Za ponovno uporabo mikroemulzije, pa bi raztopljeno črnilo odstranili z uporabo hitozana, na katerega bi se črnilo adsorbiralo.<br /> <br /> = ZAKLJUČEK =<br /> <br /> Ekipa kitajske Univerze Xiamen je razvila postopek, s katerim bi lahko bistveno izboljšali odstranjevanje črnila iz odpadnega papirja pri recikliranju. Alternativa velikim količinam topil, ki onesnažujejo okolje in predstavljajo nevarnost za delavce v industriji, je uporaba rekombinantnih encimov, sintetiziranih v ''E. coli'' BL21 (DE3), ki bi se iz celice izločali s pomočjo signalnih peptidov. Po izdelavi papirja, bi bil ta obdelan z visoko temperaturo, s čimer bi preprečili kontaminacijo z bakterijami. Ker pri postopku odstranjevanja nastanejo velike količine odpadne vode, ki je onesnažena s težkimi kovinami, so dodali še stopnjo čiščenja. Za to so uporabili bakterije, ki so izražale metalotionine, na katere bi se težke kovine adsorbirale. Možnost uhajanja bakterij so preprečili z dodatkom stikala za uničenje. <br /> Na ta način bi ekipa povečala recikliranje odpadnega papirja na bolj ekološki način, zmanjšala uporabo lesa za pridelavo papirja, s tem pa zmanjšala vpliv na podnebne spremembe. <br /> <br /> = VIRI IN LITERATURA =<br /> <br /> [1] https://2024.igem.wiki/xmu-china/</div>

Lina Kopač https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Seminarji_SB_2024/25&diff=24879 2025-05-11T16:17:08Z

<p>Lina Kopač: </p> <hr /> <div>V študijskem letu 2024/25 študenti in študentke pri Sintezni biologiji predstavljajo naslednje teme: <br /> <br /> RAZISKOVALNI ČLANKI<br /> <br /> (Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) &lt;br&gt;<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Inženiring_umetnih_medvrstnih_promotorjev_z_različnimi_transkripcijskimi_močmi Inženiring umetnih medvrstnih promotorjev z različnimi transkripcijskimi močmi] (Miljan Trajković) <br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Preprečevanje_nastanka_multimerov_pogosto_uporabljenih_plazmidov_v_sintezni_biologiji Preprečevanje nastanka multimerov pogosto uporabljenih plazmidov v sintezni biologiji] (Lev Jošt)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Priprava_Nicotiane_benthamiane_za_proizvodnjo_krisoeriola_z_uporabo_tehnik_sintezne_biologije Priprava ''Nicotiane benthamiane'' za proizvodnjo krisoeriola z uporabo tehnik sintezne biologije] (Nika Frelih)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Gensko_spremenjeni_receptorji_za_komunikacijo_med_celicami_preko_topnih_signalov_in_zaznavanje_bolezni Gensko spremenjeni receptorji za komunikacijo med celicami preko topnih signalov in zaznavanje bolezni] (Zara Bunc)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Nadzor_nad_izražanjem_heterolognih_genov_pri_Bdellovibrio_bacteriovorus_z_uporabo_sintezne_biologije Nadzor nad izražanjem heterolognih genov pri Bdellovibrio bacteriovorus z uporabo sintezne biologije] (Živa Flego)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Uporaba_konzorcija_kvasovk_za_de_novo_biosintezo_rastlinskih_lignanov Uporaba konzorcija kvasovk za de novo biosintezo rastlinskih lignanov] (Urša Lah)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sonogenetsko_nadzorovane_gensko_spremenjene_celice_za_zdravljenje_raka_v_mišjih_tumorskih_modelih Sonogenetsko nadzorovane gensko spremenjene celice za zdravljenje raka v mišjih tumorskih modelih] (Pia Mencin) <br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Združitev_difuzijskega_modela_in_transformerja_za_sintezo_izboljšanih_promotorjev_ter_napoved_moči_sintetičnih_promotorjev_z_uporabo_globokega_učenja Združitev difuzijskega modela in transformerja za sintezo izboljšanih promotorjev ter napoved moči sintetičnih promotorjev z uporabo globokega učenja] (Tinkara Korošec) <br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Z_dvojno_svetlobo_nadzirani_kokulturni_sistem_omogoča_uravnavanje_sestave_populacije Z dvojno svetlobo nadzirani sistem omogoča uravnavanje sestave populacije] (Ula Mikoš)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Načrtovanje_močnih_inducibilnih_sinteznih_promotorjev_v_kvasovkah Načrtovanje močnih inducibilnih sinteznih promotorjev v kvasovkah] (Bor Kunstelj)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Metabolni_inženiring_E._coli_za_izboljšano_produkcijo_diolov_iz_acetata Metabolni inženiring ''E. coli'' za izboljšano produkcijo diolov iz acetata] (Teo Trost)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Inkorporacija_fotosintetsko_aktivnih_kloroplastov_iz_alg_v_kultivirane_celice_sesalcev_kot_pot_k_fotosintezi_pri_Živalih Inkorporacija fotosintetsko aktivnih kloroplastov iz alg v kultivirane celice sesalcev kot pot k fotosintezi pri živalih] (Peter Gričar Vintar)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Izgradnja_metabolične_poti_za_biosintezo_treonina_iz_etilen_glikola Izgradnja metabolične poti za biosintezo treonina iz etilen glikola] (Tinkara Butara) <br /> <br /> <br /> <br /> NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI<br /> <br /> (Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/SynPlode SynPlode] (Leila Bohorč)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/PETal:_izdelovanje_eteričnega_olja_sandalovine_iz_PET_plastike PETal: izdelovanje eteričnega olja sandalovine iz PET plastike] (Lara Krampač)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/PET_TWINS:_Praktična_uporaba_PETaze_za_učinkovitejše_recikliranje_plastike PET TWINS: Praktična uporaba PETaze za učinkovitejše recikliranje plastike] (Tina Urh)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/CAU-China:_Nodulska_tovarna_DHA_in_EPA CAU-China: Nodulska tovarna DHA in EPA] (Luka Fink)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/nuCloud:_Nov_oblak_za_shranjevanje_podatkov_na_osnovi_nukleotidov nuCloud: Nov oblak za shranjevanje podatkov na osnovi nukleotidov] (Aleš Poljanšek)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Nova_metoda_diagnosticiranja_multiple_skleroze_-_miRADAR Nova metoda diagnosticiranja multiple skleroze - miRADAR] (Petja Premrl)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Biostimulant_za_rast_rastlin_na_Luni_–_BioMoon Biostimulant za rast rastlin na Luni – BioMoon] (Žan Žnidar)<br /> # [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=CAPTURE:_Boj_proti_oku%C5%BEbam_s_Pseudomonas_aeruginosa_z_nosilci_protimikrobnih_peptidov&amp;action=edit&amp;redlink=1 Boj proti okužbam s Pseudomonas aeruginosa z nosilci protimikrobnih peptidov - CAPTURE] (Metka Rus)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/REPARO REPARO] (Lina Kopač)<br /> <br /> Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Povzetek je treba objaviti dva dni pred predstavitvijo do polnoči (za seminarje v torek torej najkasneje v ponedeljek). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo približno 5-minutna razprava.<br /> <br /> Terminski razpored bo razviden iz preglednice na strežniku Google Drive.<br /> <br /> Kako je videti končni seznam seminarjev, lahko preverite pri lanskem letniku: [[Seminarji_SB_2023/24]].</div>

Lina Kopač https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Seminarji_SB_2024/25&diff=24878 2025-05-11T16:16:36Z

<p>Lina Kopač: </p> <hr /> <div>V študijskem letu 2024/25 študenti in študentke pri Sintezni biologiji predstavljajo naslednje teme: <br /> <br /> RAZISKOVALNI ČLANKI<br /> <br /> (Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) &lt;br&gt;<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Inženiring_umetnih_medvrstnih_promotorjev_z_različnimi_transkripcijskimi_močmi Inženiring umetnih medvrstnih promotorjev z različnimi transkripcijskimi močmi] (Miljan Trajković) <br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Preprečevanje_nastanka_multimerov_pogosto_uporabljenih_plazmidov_v_sintezni_biologiji Preprečevanje nastanka multimerov pogosto uporabljenih plazmidov v sintezni biologiji] (Lev Jošt)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Priprava_Nicotiane_benthamiane_za_proizvodnjo_krisoeriola_z_uporabo_tehnik_sintezne_biologije Priprava ''Nicotiane benthamiane'' za proizvodnjo krisoeriola z uporabo tehnik sintezne biologije] (Nika Frelih)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Gensko_spremenjeni_receptorji_za_komunikacijo_med_celicami_preko_topnih_signalov_in_zaznavanje_bolezni Gensko spremenjeni receptorji za komunikacijo med celicami preko topnih signalov in zaznavanje bolezni] (Zara Bunc)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Nadzor_nad_izražanjem_heterolognih_genov_pri_Bdellovibrio_bacteriovorus_z_uporabo_sintezne_biologije Nadzor nad izražanjem heterolognih genov pri Bdellovibrio bacteriovorus z uporabo sintezne biologije] (Živa Flego)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Uporaba_konzorcija_kvasovk_za_de_novo_biosintezo_rastlinskih_lignanov Uporaba konzorcija kvasovk za de novo biosintezo rastlinskih lignanov] (Urša Lah)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sonogenetsko_nadzorovane_gensko_spremenjene_celice_za_zdravljenje_raka_v_mišjih_tumorskih_modelih Sonogenetsko nadzorovane gensko spremenjene celice za zdravljenje raka v mišjih tumorskih modelih] (Pia Mencin) <br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Združitev_difuzijskega_modela_in_transformerja_za_sintezo_izboljšanih_promotorjev_ter_napoved_moči_sintetičnih_promotorjev_z_uporabo_globokega_učenja Združitev difuzijskega modela in transformerja za sintezo izboljšanih promotorjev ter napoved moči sintetičnih promotorjev z uporabo globokega učenja] (Tinkara Korošec) <br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Z_dvojno_svetlobo_nadzirani_kokulturni_sistem_omogoča_uravnavanje_sestave_populacije Z dvojno svetlobo nadzirani sistem omogoča uravnavanje sestave populacije] (Ula Mikoš)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Načrtovanje_močnih_inducibilnih_sinteznih_promotorjev_v_kvasovkah Načrtovanje močnih inducibilnih sinteznih promotorjev v kvasovkah] (Bor Kunstelj)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Metabolni_inženiring_E._coli_za_izboljšano_produkcijo_diolov_iz_acetata Metabolni inženiring ''E. coli'' za izboljšano produkcijo diolov iz acetata] (Teo Trost)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Inkorporacija_fotosintetsko_aktivnih_kloroplastov_iz_alg_v_kultivirane_celice_sesalcev_kot_pot_k_fotosintezi_pri_Živalih Inkorporacija fotosintetsko aktivnih kloroplastov iz alg v kultivirane celice sesalcev kot pot k fotosintezi pri živalih] (Peter Gričar Vintar)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Izgradnja_metabolične_poti_za_biosintezo_treonina_iz_etilen_glikola Izgradnja metabolične poti za biosintezo treonina iz etilen glikola] (Tinkara Butara) <br /> <br /> <br /> <br /> NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI<br /> <br /> (Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/SynPlode SynPlode] (Leila Bohorč)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/PETal:_izdelovanje_eteričnega_olja_sandalovine_iz_PET_plastike PETal: izdelovanje eteričnega olja sandalovine iz PET plastike] (Lara Krampač)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/PET_TWINS:_Praktična_uporaba_PETaze_za_učinkovitejše_recikliranje_plastike PET TWINS: Praktična uporaba PETaze za učinkovitejše recikliranje plastike] (Tina Urh)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/CAU-China:_Nodulska_tovarna_DHA_in_EPA CAU-China: Nodulska tovarna DHA in EPA] (Luka Fink)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/nuCloud:_Nov_oblak_za_shranjevanje_podatkov_na_osnovi_nukleotidov nuCloud: Nov oblak za shranjevanje podatkov na osnovi nukleotidov] (Aleš Poljanšek)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Nova_metoda_diagnosticiranja_multiple_skleroze_-_miRADAR Nova metoda diagnosticiranja multiple skleroze - miRADAR] (Petja Premrl)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Biostimulant_za_rast_rastlin_na_Luni_–_BioMoon Biostimulant za rast rastlin na Luni – BioMoon] (Žan Žnidar)<br /> # [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=CAPTURE:_Boj_proti_oku%C5%BEbam_s_Pseudomonas_aeruginosa_z_nosilci_protimikrobnih_peptidov&amp;action=edit&amp;redlink=1 Boj proti okužbam s Pseudomonas aeruginosa z nosilci protimikrobnih peptidov - CAPTURE] (Metka Rus)<br /> [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/REPARO REPARO] (Lina Kopač)<br /> <br /> Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Povzetek je treba objaviti dva dni pred predstavitvijo do polnoči (za seminarje v torek torej najkasneje v ponedeljek). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo približno 5-minutna razprava.<br /> <br /> Terminski razpored bo razviden iz preglednice na strežniku Google Drive.<br /> <br /> Kako je videti končni seznam seminarjev, lahko preverite pri lanskem letniku: [[Seminarji_SB_2023/24]].</div>

Lina Kopač