Wiki FKKT - User contributions [en]

Razvoj temperaturno inducibilnega transkripcijskega reostata pri Neurospori crassi

2023-04-11T12:39:31Z

Lsegota: /* Funkcijska analiza promotorjev hsp */

Izhodiščni članek: [https://journals.asm.org/doi/10.1128/mbio.03291-22 Developing a Temperature-Inducible Transcriptional Rheostat in Neurospora crassa]

== Uvod ==
''Neurospora crassa'' je rdeča plesen, ki spada v deblo askomicet. Zaradi svoje majhnosti, enostavnosti vzgoje in opravljanja genskih analiz, je ''N. crassa'' pomemben modelni organizem za raziskovanje številnih bioloških procesov, vključno s celičnim ciklom, fotosintezo, biološkimi ritmi, staranjem in razvojem. Prav tako proizvaja encime, ki razgrajujejo celulozo, kar je koristno pri proizvodnji etanola iz celuloznih virov [1].

Proteini toplotnega šoka (HSP) sodelujejo pri odzivu celice na stresne pogoje, kot so visoke ali nizke temperature, oksidativni stres in izpostavljenost strupenim snovem. Delujejo kot šaperoni, njihova naloga pa je zaščititi celice pred poškodbami s preprečevanjem nepravilnega zvitja proteinov. Vendar pa področje uravnavanja izražanja genov, ki kodirajo proteine HSP, še vedno ostaja delno neraziskano, zlasti v kontekstu modelnih glivnih organizmov, kot je ''N. crassa''. Faktorji toplotnega šoka (HSF) so pri stresnih pogojih aktivatorji transkripcije za proteine HSP. Po oligomerizaciji se faktorji HSF vežejo na DNA, in sicer na elemente toplotnega šoka (''hse''), ki so pri evkariontih relativno ohranjeni. V ''N. crassi'' so opisani trije geni hsp (''hsp30'', ''hsp70'' in ''hsp80''), ki se vsi izražajo pri visokih temperaturah, prav tako pa so pri vsakem odkrili domnevne ''cis'' regulatorne elemente [1].

V ''N. crassa'' so načrtali že mnogo promotorjev, ki se odzivajo na kemične signale (kot so glukoza, kininska kislina in baker), od fizično induciranih sistemov pa so razvili le takšnega, ki se odziva na svetlobo. Temperaturno induciran sistem, bi medtem omogočil zelo enostavno uravnavanje izražanja genov brez potrebe po dodajanju eksogenih kemikalij [1].

== Funkcijska analiza promotorjev ''hsp'' ==
V preteklih študijah so pri promotorju gena ''hsp30'' definirali štiri regije ''hse'', medtem ko so v promotorju ''hsp70'' našli dve. ''hsp70'' ne vsebuje regulatornih elementov ''hse'', vendar so opisane nekoliko različne ''cis'' regije, poimenovane kot temperaturno odzivni elementi (''tre'').
Da bi bolj okarakterizirali regulacijo genov so pripravili paleto konstruktov, ki so poleg bližnjega promotorja vsebovali različno dolge 5' regije. Različni konstrukti enakega gena pa so pri tem vsebovali raznoliko število regulatornih ''cis'' elementov. Za analizo so uporabili luciferazo iz kresničke z dodanim zaporedjem PEST (ki poveča razgradnjo proteina), kar skupaj tvori reporterski sistem za zaznavo transkripcije v realnem času. Pri sobni temperaturi so nagojili reporterske seve plesni in jih v temi izpostavili enournemu toplotnemu šoku pri treh različnih temperaturah: dveh visokih (35 °C in 45 °C) in eni, ki je bila bližja laboratorijskim rastnim pogojem ''N. crasse'' (30 °C), in merili luminiscenco s CCD kamero [1].

Vsi polno dolgi konstrukti so izkazali podobno hiter in močen odziv na toplotni šok pri 45 °C, medtem ko je bil odziv pri 35 °C neprimerno nižji, pri 30 °C pa odziva sploh ni bilo. Skrajšani konstrukti so se pri ''hsp30'' in ''hsp70'' odzivali v skladu s številom domnevnih regij ''hse'', ki so jih vsebovali. Medtem je konstrukt s polovičnim promotorjem ''hsp80'' (ki je vseboval 5 od 7 domnevnih regij ''tre''), pokazal kar 9-krat nižji odziv od konstrukta s polnim promotorjem, kar kaže na pomanjkljivo poznavanje regulacije promotorja ''hse80''. Izmed treh genov so pri ''hsp30'' opazili mnogo najnižje puščanje promotorja (pri 25 °C), zaradi česa so pri omenjenem genu opazili več kot 1000-kratno povečanje izražanja (razmerje med bazalnim vrhom in induciranim vrhom) [1].

HSP30 ima nižjo molekularno maso od ostalih dveh sorodnih proteinov (30 kDa proti 70 kDa / 80 kDa) na račun odsotnosti ATP-hidrolizne domene. Zaradi tega so pri stresnih pogojih manjši HSP-ji prvi, ki posredujejo proti proteinski denaturaciji, kar korelira tudi z opaženo visoko stopnjo povečanja izražanja pri ''hsp30''.
Avtorji so ''hsp30'' primerjali z drugimi znanimi inducibilnimi sistemi v ''N. crassa'', kot sta promotor ''qa-2'', ki se odziva na naraščajoče koncentracije kininske kisline in promotor ''vvd'', ki se aktivira s svetlobo. Promotor ''hsp30'' je imel najnižjo bazalno aktivnost in pa najvišjo aktivnost v induciranem stanju, potreboval pa je dlje časa za regeneracijo do minimuma aktivnosti po dražljaju (7 h) od promotorja ''vvd'' (4 h) [1].

== Odziv promotorja ''hsp30'' na toplotne dražljaje ==
Zaradi najbolj robustnega odziva na toplotne dražljaje so avtorji za nadaljnje delo izbrali promotor ''hsp30''. Zanimalo jih je promotorjev odziv na različno dolge toplotne dražljaje pri različnih temperaturah, zato so skonstruirali pristop, ki omogoča hitro in enostavno analizo.
Eksperiment so opravili v formatu mikrotitrske plošče za PCR in testirali 3 različne promotorje ''hsp30'' (en celoten in dva skrajšana). Pripravili so paleto različnih pogojev in ocenjevali odziv promotorja z merjenjem luminiscence. Vzorci so bili izpostavljeni šestim različnim temperaturam (v rangu od 34 °C do 46 °C), pri čem so toplotni dražljaji trajali 60, 30, 15, 5, in 1 min. V obzir pa je treba vzeti, da je zaradi relativno majhnega volumna gojišča (PCR mikrocentrifugirka), bila omejena količina dodanega medija in zato omejena rast plesni [1].

Konstrukti s promotorji ''hsp30'' so se izkazali za izjemno nastavljive sisteme, saj se je stopnja odziva povečevala, ko se je zviševala temperatura, prav tako pa so opazili večji odziv, kjer je temperaturni dražljaj trajal dlje časa. Vendar pa je maksimalni odziv bil opažen pri 15 min, pri daljših izpostavljenostih višji temperaturi pa je izražanje bilo nižje, kar so avtorji pripisovali upadu celične funkcije zaradi visokih temperatur. Že pri najkrajši izpostavljenosti (1 min) višji temperaturi je sistem podal robustni odziv.
Kot najbolj optimalna sistema sta se izkazala oba daljša promotorja (vsebujeta vse domnevne elemente ''hse''), saj so pri njima opazili močnejšo indukcijo in manjše puščanje promotorja v primerjavi s krajšim konstruktom [1].

== Temperaturno pogojena rast ''N. crasse'' ==
Celulozni regulator 2 (CLR-2) je transkripcijski faktor, ki je ključen pri regulaciji celulazne aktivnosti ''N. crasse'', saj je potreben za indukcijo ekspresije celulolitičnih genov. V industriji je pomembno nadzorovano izražanje CLR-2, s tem se na primer poveča proizvodnja bioetanola. Avtorji so pripravili sev ''N. crasse'', pri katerem so zapis za CLR-2 postavili pod promotor ''hsp30'' in opazovali rast celic pri različnih pogojih.
Najkrajši promotor ''hse30'' vsebuje le dve od štirih domnevnih regij ''hse'' in se je zato izkazal kot najmanj optimalen sistem za uravnavanje transkripcije (glej Odziv promotorja ''hsp30'' na toplotne dražljaje). Vseeno pa so ga avtorji pri tem eksperimentu uporabili zaradi njegove kratke dolžine (500 baznih parov). V ''N. crassi'' so namreč prisotne ponavljajoče se inducirane točkovne mutacije (RIP), kot obrambni mehanizem za zmanjšanje aktivnosti in širjenja mobilnih genetskih elementov, ki pa je manj pogosta v krajših segmentih DNA [1].

Rezultati so pokazali, da se sev ''hsp30:clr-2'' ne razvija v tekočih gojiščih z Avicelom (kristalinična celuloza) pri normalni temperaturi (25 °C). Vendar pa se po vsakodnevnih impulzih toplote (45 °C) rast povrne in celo preseže WT sev plesni [1].

== Načrtovanje sintetičnega promotorja iz domnevnih ''cis'' regij ''hsp30'' ==
Da bi uporabili vse domnevne regije ''hse'', in hkrati znižali pogostost RIP-induciranih mutacij so avtorji načrtali 2 sintetična promotorja. Ocenili so minimalno dolžino bližnjega promotorja (okoli 250 bp) in mu dodali domnevne regije ''hse''. S primerjavo promotorja ''hse30'' s promotorji ''hse30'' iz sorodnih organizmov ''N. crasse'' so identificirali še peto regijo ''hse'', ki je prav tako ohranjena, in tudi njo vključili v konstrukt. Razlika med sintetičnima promoterjema je bila zgolj v dolžini vmesnikov med domnevnimi regulatornimi regijami ''hse'' [1].

Tudi oba sintetična promotorja sta izkazala dobro nastavljivost pri različnih toplotnih tretmajih, vendar sta oba prikazala relativno močno bazalno aktivnost. Je pa tovrstno puščanje promotorja velikokrat prisotno ob načrtovanju umetnih promotorjev. Vseeno pa sta se oba nova promotorja izkazala za bolj uporaben sistem nastavljivega izražanja od promotorjev ''hsp70'' in ''hsp80'', prav tako so opazili višje stopnje izražanja od najkrajše verzije promotorja ''hsp30''. Zaradi velike ohranjenosti promotorja ''hsp30'' bi podobni promotorji najverjetneje delovali tudi v ostalih askomicetah, kot na primer v biotehnološko pomembnih ''Aspergillus niger'' ali ''Trichoderma reesei'' [1, 2].

== Zaključek ==
Sistem s finim uravnavanjem transkripcije preko toplotne indukcije predstavlja obetavno orodje za raziskave funkcije genov, pa tudi za biotehnološke aplikacije, kot so proizvodnja encimov, metabolitov ali drugih biološko pomembnih snovi. V primerjavi s kemično induciranimi sistemi se izkaže za lažje reverzibilen sistem, saj ni treba dodajati eksogenih sredstev, ki jih je težko odstraniti iz gojišča. Hkrati pa je enostaven za uporabo, sploh v primerjavi s svetlobno indukcijo, kjer je potreba po dobro definiranih laboratorijskih nastavitvah (temna soba). Vendar pa se pri toplotni indukciji pojavljajo potencialne težave oziroma omejitve, kot sta stres za organizem in neselektivna aktivacija genov [1, 3].

Ko so zapis za CLR-2 postavili pod promotor ''hse30'', so avtorji (kljub izbiri neoptimalnega promotorja) prikazali možnost uporabe toplotno inducibilnega sistema za regulacijo izražanja pri želenih fenotipih. Ob nadaljnji optimizaciji procesa bi se celulazna aktivnost plesni dodatno povečala, kar odpira priložnost uporabe tovrstnih sistemov v industriji. Glavna ovira pri industrijski uporabi razgradnje celuloze so namreč visoki stroški proizvodnje encimov, kar tudi preprečuje nižje cene bioetanola [1, 4].

== Literatura ==

[1] C. Tabilo-Agurto, V. Del Rio-Pinilla, V. Eltit-Villarroel, A. Goity, F. Muñoz-Guzmán, in L. F. Larrondo, „Developing a Temperature-Inducible Transcriptional Rheostat in Neurospora crassa“, mBio, let. 14, št. 1, str. e03291-22, feb. 2023, doi: 10.1128/mbio.03291-22.

[2] J. Han, B. McLane, E.-H. Kim, J.-W. Yoon, in H.-S. Jun, „Remission of diabetes by insulin gene therapy using a hepatocyte-specific and glucose-responsive synthetic promoter“, Mol. Ther. J. Am. Soc. Gene Ther., let. 19, št. 3, str. 470–478, mar. 2011, doi: 10.1038/mt.2010.255.

[3] J. Hearn, I. Ssinabulya, J. I. Schwartz, A. R. Akiteng, H. J. Ross, in J. A. Cafazzo, „Self-management of non-communicable diseases in low- and middle-income countries: A scoping review“, PLOS ONE, let. 14, št. 7, str. e0219141, jul. 2019, doi: 10.1371/journal.pone.0219141.

[4] A. K. Chandel, C. Es, R. Rudravaram, M. L. Narasu, V. Rao, in P. Ravindra, „Economics and environmental impact of bioethanol production technologies: an appraisal“.

Razvoj temperaturno inducibilnega transkripcijskega reostata pri Neurospori crassi

2023-04-11T11:46:08Z

Lsegota:

Izhodiščni članek: [https://journals.asm.org/doi/10.1128/mbio.03291-22 Developing a Temperature-Inducible Transcriptional Rheostat in Neurospora crassa]

== Uvod ==
''Neurospora crassa'' je rdeča plesen, ki spada v deblo askomicet. Zaradi svoje majhnosti, enostavnosti vzgoje in opravljanja genskih analiz, je ''N. crassa'' pomemben modelni organizem za raziskovanje številnih bioloških procesov, vključno s celičnim ciklom, fotosintezo, biološkimi ritmi, staranjem in razvojem. Prav tako proizvaja encime, ki razgrajujejo celulozo, kar je koristno pri proizvodnji etanola iz celuloznih virov [1].

Proteini toplotnega šoka (HSP) sodelujejo pri odzivu celice na stresne pogoje, kot so visoke ali nizke temperature, oksidativni stres in izpostavljenost strupenim snovem. Delujejo kot šaperoni, njihova naloga pa je zaščititi celice pred poškodbami s preprečevanjem nepravilnega zvitja proteinov. Vendar pa področje uravnavanja izražanja genov, ki kodirajo proteine HSP, še vedno ostaja delno neraziskano, zlasti v kontekstu modelnih glivnih organizmov, kot je ''N. crassa''. Faktorji toplotnega šoka (HSF) so pri stresnih pogojih aktivatorji transkripcije za proteine HSP. Po oligomerizaciji se faktorji HSF vežejo na DNA, in sicer na elemente toplotnega šoka (''hse''), ki so pri evkariontih relativno ohranjeni. V ''N. crassi'' so opisani trije geni hsp (''hsp30'', ''hsp70'' in ''hsp80''), ki se vsi izražajo pri visokih temperaturah, prav tako pa so pri vsakem odkrili domnevne ''cis'' regulatorne elemente [1].

V ''N. crassa'' so načrtali že mnogo promotorjev, ki se odzivajo na kemične signale (kot so glukoza, kininska kislina in baker), od fizično induciranih sistemov pa so razvili le takšnega, ki se odziva na svetlobo. Temperaturno induciran sistem, bi medtem omogočil zelo enostavno uravnavanje izražanja genov brez potrebe po dodajanju eksogenih kemikalij [1].

== Funkcijska analiza promotorjev ''hsp'' ==
V preteklih študijah so pri promotorju gena ''hsp30'' definirali štiri regije ''hse'', medtem ko so v promotorju ''hsp70'' našli dve. ''hsp70'' ne vsebuje regulatornih elementov ''hse'', vendar so opisane nekoliko različne ''cis'' regije, poimenovane kot elementi odziva na temperaturo (''tre'').
Da bi bolj okarakterizirali regulacijo genov so pripravili paleto konstruktov, ki so poleg bližnjega promotorja vsebovali različno dolge 5' regije. Različni konstrukti enakega gena pa so pri tem vsebovali raznoliko število regulatornih ''cis'' elementov. Za analizo so uporabili luciferazo iz kresničke z dodanim zaporedjem PEST (ki poveča razgradnjo proteina), kar skupaj tvori reporterski sistem za zaznavo transkripcije v realnem času. Pri sobni temperaturi so nagojili reporterske seve plesni in jih v temi izpostavili enournemu toplotnemu šoku pri treh različnih temperaturah: dveh visokih (35 °C in 45 °C) in eni, ki je bila bližja laboratorijskim rastnim pogojem ''N. crasse'' (30 °C), in merili luminiscenco s CCD kamero [1].

Vsi polno dolgi konstrukti so izkazali podobno hiter in močen odziv na toplotni šok pri 45 °C, medtem ko je bil odziv pri 35 °C neprimerno nižji, pri 30 °C pa odziva sploh ni bilo. Skrajšani konstrukti so se pri ''hsp30'' in ''hsp70'' odzivali v skladu s številom domnevnih regij ''hse'', ki so jih vsebovali. Medtem je konstrukt s polovičnim promotorjem ''hsp80'' (ki je vseboval 5 od 7 domnevnih regij ''tre''), pokazal kar 9-krat nižji odziv od konstrukta s polnim promotorjem, kar kaže na pomanjkljivo poznavanje regulacije promotorja ''hse80''. Izmed treh genov so pri ''hsp30'' opazili mnogo najnižje puščanje promotorja (pri 25 °C), zaradi česa so pri omenjenem genu opazili več kot 1000-kratno povečanje izražanja (razmerje med bazalnim vrhom in induciranim vrhom) [1].

HSP30 ima nižjo molekularno maso od ostalih dveh sorodnih proteinov (30 kDa proti 70 kDa / 80 kDa) na račun odsotnosti ATP-hidrolizne domene. Zaradi tega so pri stresnih pogojih manjši HSP-ji prvi, ki posredujejo proti proteinski denaturaciji, kar korelira tudi z opaženo visoko stopnjo povečanja izražanja pri ''hsp30''.
Avtorji so ''hsp30'' primerjali z drugimi znanimi inducibilnimi sistemi v ''N. crassa'', kot sta promotor ''qa-2'', ki se odziva na naraščajoče koncentracije kininske kisline in promotor ''vvd'', ki se aktivira s svetlobo. Promotor ''hsp30'' je imel najnižjo bazalno aktivnost in pa najvišjo aktivnost v induciranem stanju, potreboval pa je dlje časa za regeneracijo do minimuma aktivnosti po dražljaju (7 h) od promotorja ''vvd'' (4 h) [1].

== Odziv promotorja ''hsp30'' na toplotne dražljaje ==
Zaradi najbolj robustnega odziva na toplotne dražljaje so avtorji za nadaljnje delo izbrali promotor ''hsp30''. Zanimalo jih je promotorjev odziv na različno dolge toplotne dražljaje pri različnih temperaturah, zato so skonstruirali pristop, ki omogoča hitro in enostavno analizo.
Eksperiment so opravili v formatu mikrotitrske plošče za PCR in testirali 3 različne promotorje ''hsp30'' (en celoten in dva skrajšana). Pripravili so paleto različnih pogojev in ocenjevali odziv promotorja z merjenjem luminiscence. Vzorci so bili izpostavljeni šestim različnim temperaturam (v rangu od 34 °C do 46 °C), pri čem so toplotni dražljaji trajali 60, 30, 15, 5, in 1 min. V obzir pa je treba vzeti, da je zaradi relativno majhnega volumna gojišča (PCR mikrocentrifugirka), bila omejena količina dodanega medija in zato omejena rast plesni [1].

Konstrukti s promotorji ''hsp30'' so se izkazali za izjemno nastavljive sisteme, saj se je stopnja odziva povečevala, ko se je zviševala temperatura, prav tako pa so opazili večji odziv, kjer je temperaturni dražljaj trajal dlje časa. Vendar pa je maksimalni odziv bil opažen pri 15 min, pri daljših izpostavljenostih višji temperaturi pa je izražanje bilo nižje, kar so avtorji pripisovali upadu celične funkcije zaradi visokih temperatur. Že pri najkrajši izpostavljenosti (1 min) višji temperaturi je sistem podal robustni odziv.
Kot najbolj optimalna sistema sta se izkazala oba daljša promotorja (vsebujeta vse domnevne elemente ''hse''), saj so pri njima opazili močnejšo indukcijo in manjše puščanje promotorja v primerjavi s krajšim konstruktom [1].

== Temperaturno pogojena rast ''N. crasse'' ==
Celulozni regulator 2 (CLR-2) je transkripcijski faktor, ki je ključen pri regulaciji celulazne aktivnosti ''N. crasse'', saj je potreben za indukcijo ekspresije celulolitičnih genov. V industriji je pomembno nadzorovano izražanje CLR-2, s tem se na primer poveča proizvodnja bioetanola. Avtorji so pripravili sev ''N. crasse'', pri katerem so zapis za CLR-2 postavili pod promotor ''hsp30'' in opazovali rast celic pri različnih pogojih.
Najkrajši promotor ''hse30'' vsebuje le dve od štirih domnevnih regij ''hse'' in se je zato izkazal kot najmanj optimalen sistem za uravnavanje transkripcije (glej Odziv promotorja ''hsp30'' na toplotne dražljaje). Vseeno pa so ga avtorji pri tem eksperimentu uporabili zaradi njegove kratke dolžine (500 baznih parov). V ''N. crassi'' so namreč prisotne ponavljajoče se inducirane točkovne mutacije (RIP), kot obrambni mehanizem za zmanjšanje aktivnosti in širjenja mobilnih genetskih elementov, ki pa je manj pogosta v krajših segmentih DNA [1].

Rezultati so pokazali, da se sev ''hsp30:clr-2'' ne razvija v tekočih gojiščih z Avicelom (kristalinična celuloza) pri normalni temperaturi (25 °C). Vendar pa se po vsakodnevnih impulzih toplote (45 °C) rast povrne in celo preseže WT sev plesni [1].

== Načrtovanje sintetičnega promotorja iz domnevnih ''cis'' regij ''hsp30'' ==
Da bi uporabili vse domnevne regije ''hse'', in hkrati znižali pogostost RIP-induciranih mutacij so avtorji načrtali 2 sintetična promotorja. Ocenili so minimalno dolžino bližnjega promotorja (okoli 250 bp) in mu dodali domnevne regije ''hse''. S primerjavo promotorja ''hse30'' s promotorji ''hse30'' iz sorodnih organizmov ''N. crasse'' so identificirali še peto regijo ''hse'', ki je prav tako ohranjena, in tudi njo vključili v konstrukt. Razlika med sintetičnima promoterjema je bila zgolj v dolžini vmesnikov med domnevnimi regulatornimi regijami ''hse'' [1].

Tudi oba sintetična promotorja sta izkazala dobro nastavljivost pri različnih toplotnih tretmajih, vendar sta oba prikazala relativno močno bazalno aktivnost. Je pa tovrstno puščanje promotorja velikokrat prisotno ob načrtovanju umetnih promotorjev. Vseeno pa sta se oba nova promotorja izkazala za bolj uporaben sistem nastavljivega izražanja od promotorjev ''hsp70'' in ''hsp80'', prav tako so opazili višje stopnje izražanja od najkrajše verzije promotorja ''hsp30''. Zaradi velike ohranjenosti promotorja ''hsp30'' bi podobni promotorji najverjetneje delovali tudi v ostalih askomicetah, kot na primer v biotehnološko pomembnih ''Aspergillus niger'' ali ''Trichoderma reesei'' [1, 2].

== Zaključek ==
Sistem s finim uravnavanjem transkripcije preko toplotne indukcije predstavlja obetavno orodje za raziskave funkcije genov, pa tudi za biotehnološke aplikacije, kot so proizvodnja encimov, metabolitov ali drugih biološko pomembnih snovi. V primerjavi s kemično induciranimi sistemi se izkaže za lažje reverzibilen sistem, saj ni treba dodajati eksogenih sredstev, ki jih je težko odstraniti iz gojišča. Hkrati pa je enostaven za uporabo, sploh v primerjavi s svetlobno indukcijo, kjer je potreba po dobro definiranih laboratorijskih nastavitvah (temna soba). Vendar pa se pri toplotni indukciji pojavljajo potencialne težave oziroma omejitve, kot sta stres za organizem in neselektivna aktivacija genov [1, 3].

Ko so zapis za CLR-2 postavili pod promotor ''hse30'', so avtorji (kljub izbiri neoptimalnega promotorja) prikazali možnost uporabe toplotno inducibilnega sistema za regulacijo izražanja pri želenih fenotipih. Ob nadaljnji optimizaciji procesa bi se celulazna aktivnost plesni dodatno povečala, kar odpira priložnost uporabe tovrstnih sistemov v industriji. Glavna ovira pri industrijski uporabi razgradnje celuloze so namreč visoki stroški proizvodnje encimov, kar tudi preprečuje nižje cene bioetanola [1, 4].

== Literatura ==

[1] C. Tabilo-Agurto, V. Del Rio-Pinilla, V. Eltit-Villarroel, A. Goity, F. Muñoz-Guzmán, in L. F. Larrondo, „Developing a Temperature-Inducible Transcriptional Rheostat in Neurospora crassa“, mBio, let. 14, št. 1, str. e03291-22, feb. 2023, doi: 10.1128/mbio.03291-22.

[2] J. Han, B. McLane, E.-H. Kim, J.-W. Yoon, in H.-S. Jun, „Remission of diabetes by insulin gene therapy using a hepatocyte-specific and glucose-responsive synthetic promoter“, Mol. Ther. J. Am. Soc. Gene Ther., let. 19, št. 3, str. 470–478, mar. 2011, doi: 10.1038/mt.2010.255.

[3] J. Hearn, I. Ssinabulya, J. I. Schwartz, A. R. Akiteng, H. J. Ross, in J. A. Cafazzo, „Self-management of non-communicable diseases in low- and middle-income countries: A scoping review“, PLOS ONE, let. 14, št. 7, str. e0219141, jul. 2019, doi: 10.1371/journal.pone.0219141.

[4] A. K. Chandel, C. Es, R. Rudravaram, M. L. Narasu, V. Rao, in P. Ravindra, „Economics and environmental impact of bioethanol production technologies: an appraisal“.

Razvoj temperaturno inducibilnega transkripcijskega reostata pri Neurospori crassi

2023-04-11T11:45:48Z

Lsegota:

Izhodiščni članek :[https://journals.asm.org/doi/10.1128/mbio.03291-22 Developing a Temperature-Inducible Transcriptional Rheostat in Neurospora crassa]

== Uvod ==
''Neurospora crassa'' je rdeča plesen, ki spada v deblo askomicet. Zaradi svoje majhnosti, enostavnosti vzgoje in opravljanja genskih analiz, je ''N. crassa'' pomemben modelni organizem za raziskovanje številnih bioloških procesov, vključno s celičnim ciklom, fotosintezo, biološkimi ritmi, staranjem in razvojem. Prav tako proizvaja encime, ki razgrajujejo celulozo, kar je koristno pri proizvodnji etanola iz celuloznih virov [1].

Proteini toplotnega šoka (HSP) sodelujejo pri odzivu celice na stresne pogoje, kot so visoke ali nizke temperature, oksidativni stres in izpostavljenost strupenim snovem. Delujejo kot šaperoni, njihova naloga pa je zaščititi celice pred poškodbami s preprečevanjem nepravilnega zvitja proteinov. Vendar pa področje uravnavanja izražanja genov, ki kodirajo proteine HSP, še vedno ostaja delno neraziskano, zlasti v kontekstu modelnih glivnih organizmov, kot je ''N. crassa''. Faktorji toplotnega šoka (HSF) so pri stresnih pogojih aktivatorji transkripcije za proteine HSP. Po oligomerizaciji se faktorji HSF vežejo na DNA, in sicer na elemente toplotnega šoka (''hse''), ki so pri evkariontih relativno ohranjeni. V ''N. crassi'' so opisani trije geni hsp (''hsp30'', ''hsp70'' in ''hsp80''), ki se vsi izražajo pri visokih temperaturah, prav tako pa so pri vsakem odkrili domnevne ''cis'' regulatorne elemente [1].

V ''N. crassa'' so načrtali že mnogo promotorjev, ki se odzivajo na kemične signale (kot so glukoza, kininska kislina in baker), od fizično induciranih sistemov pa so razvili le takšnega, ki se odziva na svetlobo. Temperaturno induciran sistem, bi medtem omogočil zelo enostavno uravnavanje izražanja genov brez potrebe po dodajanju eksogenih kemikalij [1].

== Funkcijska analiza promotorjev ''hsp'' ==
V preteklih študijah so pri promotorju gena ''hsp30'' definirali štiri regije ''hse'', medtem ko so v promotorju ''hsp70'' našli dve. ''hsp70'' ne vsebuje regulatornih elementov ''hse'', vendar so opisane nekoliko različne ''cis'' regije, poimenovane kot elementi odziva na temperaturo (''tre'').
Da bi bolj okarakterizirali regulacijo genov so pripravili paleto konstruktov, ki so poleg bližnjega promotorja vsebovali različno dolge 5' regije. Različni konstrukti enakega gena pa so pri tem vsebovali raznoliko število regulatornih ''cis'' elementov. Za analizo so uporabili luciferazo iz kresničke z dodanim zaporedjem PEST (ki poveča razgradnjo proteina), kar skupaj tvori reporterski sistem za zaznavo transkripcije v realnem času. Pri sobni temperaturi so nagojili reporterske seve plesni in jih v temi izpostavili enournemu toplotnemu šoku pri treh različnih temperaturah: dveh visokih (35 °C in 45 °C) in eni, ki je bila bližja laboratorijskim rastnim pogojem ''N. crasse'' (30 °C), in merili luminiscenco s CCD kamero [1].

Vsi polno dolgi konstrukti so izkazali podobno hiter in močen odziv na toplotni šok pri 45 °C, medtem ko je bil odziv pri 35 °C neprimerno nižji, pri 30 °C pa odziva sploh ni bilo. Skrajšani konstrukti so se pri ''hsp30'' in ''hsp70'' odzivali v skladu s številom domnevnih regij ''hse'', ki so jih vsebovali. Medtem je konstrukt s polovičnim promotorjem ''hsp80'' (ki je vseboval 5 od 7 domnevnih regij ''tre''), pokazal kar 9-krat nižji odziv od konstrukta s polnim promotorjem, kar kaže na pomanjkljivo poznavanje regulacije promotorja ''hse80''. Izmed treh genov so pri ''hsp30'' opazili mnogo najnižje puščanje promotorja (pri 25 °C), zaradi česa so pri omenjenem genu opazili več kot 1000-kratno povečanje izražanja (razmerje med bazalnim vrhom in induciranim vrhom) [1].

HSP30 ima nižjo molekularno maso od ostalih dveh sorodnih proteinov (30 kDa proti 70 kDa / 80 kDa) na račun odsotnosti ATP-hidrolizne domene. Zaradi tega so pri stresnih pogojih manjši HSP-ji prvi, ki posredujejo proti proteinski denaturaciji, kar korelira tudi z opaženo visoko stopnjo povečanja izražanja pri ''hsp30''.
Avtorji so ''hsp30'' primerjali z drugimi znanimi inducibilnimi sistemi v ''N. crassa'', kot sta promotor ''qa-2'', ki se odziva na naraščajoče koncentracije kininske kisline in promotor ''vvd'', ki se aktivira s svetlobo. Promotor ''hsp30'' je imel najnižjo bazalno aktivnost in pa najvišjo aktivnost v induciranem stanju, potreboval pa je dlje časa za regeneracijo do minimuma aktivnosti po dražljaju (7 h) od promotorja ''vvd'' (4 h) [1].

== Odziv promotorja ''hsp30'' na toplotne dražljaje ==
Zaradi najbolj robustnega odziva na toplotne dražljaje so avtorji za nadaljnje delo izbrali promotor ''hsp30''. Zanimalo jih je promotorjev odziv na različno dolge toplotne dražljaje pri različnih temperaturah, zato so skonstruirali pristop, ki omogoča hitro in enostavno analizo.
Eksperiment so opravili v formatu mikrotitrske plošče za PCR in testirali 3 različne promotorje ''hsp30'' (en celoten in dva skrajšana). Pripravili so paleto različnih pogojev in ocenjevali odziv promotorja z merjenjem luminiscence. Vzorci so bili izpostavljeni šestim različnim temperaturam (v rangu od 34 °C do 46 °C), pri čem so toplotni dražljaji trajali 60, 30, 15, 5, in 1 min. V obzir pa je treba vzeti, da je zaradi relativno majhnega volumna gojišča (PCR mikrocentrifugirka), bila omejena količina dodanega medija in zato omejena rast plesni [1].

Konstrukti s promotorji ''hsp30'' so se izkazali za izjemno nastavljive sisteme, saj se je stopnja odziva povečevala, ko se je zviševala temperatura, prav tako pa so opazili večji odziv, kjer je temperaturni dražljaj trajal dlje časa. Vendar pa je maksimalni odziv bil opažen pri 15 min, pri daljših izpostavljenostih višji temperaturi pa je izražanje bilo nižje, kar so avtorji pripisovali upadu celične funkcije zaradi visokih temperatur. Že pri najkrajši izpostavljenosti (1 min) višji temperaturi je sistem podal robustni odziv.
Kot najbolj optimalna sistema sta se izkazala oba daljša promotorja (vsebujeta vse domnevne elemente ''hse''), saj so pri njima opazili močnejšo indukcijo in manjše puščanje promotorja v primerjavi s krajšim konstruktom [1].

== Temperaturno pogojena rast ''N. crasse'' ==
Celulozni regulator 2 (CLR-2) je transkripcijski faktor, ki je ključen pri regulaciji celulazne aktivnosti ''N. crasse'', saj je potreben za indukcijo ekspresije celulolitičnih genov. V industriji je pomembno nadzorovano izražanje CLR-2, s tem se na primer poveča proizvodnja bioetanola. Avtorji so pripravili sev ''N. crasse'', pri katerem so zapis za CLR-2 postavili pod promotor ''hsp30'' in opazovali rast celic pri različnih pogojih.
Najkrajši promotor ''hse30'' vsebuje le dve od štirih domnevnih regij ''hse'' in se je zato izkazal kot najmanj optimalen sistem za uravnavanje transkripcije (glej Odziv promotorja ''hsp30'' na toplotne dražljaje). Vseeno pa so ga avtorji pri tem eksperimentu uporabili zaradi njegove kratke dolžine (500 baznih parov). V ''N. crassi'' so namreč prisotne ponavljajoče se inducirane točkovne mutacije (RIP), kot obrambni mehanizem za zmanjšanje aktivnosti in širjenja mobilnih genetskih elementov, ki pa je manj pogosta v krajših segmentih DNA [1].

Rezultati so pokazali, da se sev ''hsp30:clr-2'' ne razvija v tekočih gojiščih z Avicelom (kristalinična celuloza) pri normalni temperaturi (25 °C). Vendar pa se po vsakodnevnih impulzih toplote (45 °C) rast povrne in celo preseže WT sev plesni [1].

== Načrtovanje sintetičnega promotorja iz domnevnih ''cis'' regij ''hsp30'' ==
Da bi uporabili vse domnevne regije ''hse'', in hkrati znižali pogostost RIP-induciranih mutacij so avtorji načrtali 2 sintetična promotorja. Ocenili so minimalno dolžino bližnjega promotorja (okoli 250 bp) in mu dodali domnevne regije ''hse''. S primerjavo promotorja ''hse30'' s promotorji ''hse30'' iz sorodnih organizmov ''N. crasse'' so identificirali še peto regijo ''hse'', ki je prav tako ohranjena, in tudi njo vključili v konstrukt. Razlika med sintetičnima promoterjema je bila zgolj v dolžini vmesnikov med domnevnimi regulatornimi regijami ''hse'' [1].

Tudi oba sintetična promotorja sta izkazala dobro nastavljivost pri različnih toplotnih tretmajih, vendar sta oba prikazala relativno močno bazalno aktivnost. Je pa tovrstno puščanje promotorja velikokrat prisotno ob načrtovanju umetnih promotorjev. Vseeno pa sta se oba nova promotorja izkazala za bolj uporaben sistem nastavljivega izražanja od promotorjev ''hsp70'' in ''hsp80'', prav tako so opazili višje stopnje izražanja od najkrajše verzije promotorja ''hsp30''. Zaradi velike ohranjenosti promotorja ''hsp30'' bi podobni promotorji najverjetneje delovali tudi v ostalih askomicetah, kot na primer v biotehnološko pomembnih ''Aspergillus niger'' ali ''Trichoderma reesei'' [1, 2].

== Zaključek ==
Sistem s finim uravnavanjem transkripcije preko toplotne indukcije predstavlja obetavno orodje za raziskave funkcije genov, pa tudi za biotehnološke aplikacije, kot so proizvodnja encimov, metabolitov ali drugih biološko pomembnih snovi. V primerjavi s kemično induciranimi sistemi se izkaže za lažje reverzibilen sistem, saj ni treba dodajati eksogenih sredstev, ki jih je težko odstraniti iz gojišča. Hkrati pa je enostaven za uporabo, sploh v primerjavi s svetlobno indukcijo, kjer je potreba po dobro definiranih laboratorijskih nastavitvah (temna soba). Vendar pa se pri toplotni indukciji pojavljajo potencialne težave oziroma omejitve, kot sta stres za organizem in neselektivna aktivacija genov [1, 3].

Ko so zapis za CLR-2 postavili pod promotor ''hse30'', so avtorji (kljub izbiri neoptimalnega promotorja) prikazali možnost uporabe toplotno inducibilnega sistema za regulacijo izražanja pri želenih fenotipih. Ob nadaljnji optimizaciji procesa bi se celulazna aktivnost plesni dodatno povečala, kar odpira priložnost uporabe tovrstnih sistemov v industriji. Glavna ovira pri industrijski uporabi razgradnje celuloze so namreč visoki stroški proizvodnje encimov, kar tudi preprečuje nižje cene bioetanola [1, 4].

== Literatura ==

[1] C. Tabilo-Agurto, V. Del Rio-Pinilla, V. Eltit-Villarroel, A. Goity, F. Muñoz-Guzmán, in L. F. Larrondo, „Developing a Temperature-Inducible Transcriptional Rheostat in Neurospora crassa“, mBio, let. 14, št. 1, str. e03291-22, feb. 2023, doi: 10.1128/mbio.03291-22.

[2] J. Han, B. McLane, E.-H. Kim, J.-W. Yoon, in H.-S. Jun, „Remission of diabetes by insulin gene therapy using a hepatocyte-specific and glucose-responsive synthetic promoter“, Mol. Ther. J. Am. Soc. Gene Ther., let. 19, št. 3, str. 470–478, mar. 2011, doi: 10.1038/mt.2010.255.

[3] J. Hearn, I. Ssinabulya, J. I. Schwartz, A. R. Akiteng, H. J. Ross, in J. A. Cafazzo, „Self-management of non-communicable diseases in low- and middle-income countries: A scoping review“, PLOS ONE, let. 14, št. 7, str. e0219141, jul. 2019, doi: 10.1371/journal.pone.0219141.

[4] A. K. Chandel, C. Es, R. Rudravaram, M. L. Narasu, V. Rao, in P. Ravindra, „Economics and environmental impact of bioethanol production technologies: an appraisal“.

Razvoj temperaturno inducibilnega transkripcijskega reostata pri Neurospori crassi

2023-04-11T11:45:09Z

Lsegota:

Izhodiščni članek : [https://journals.asm.org/doi/10.1128/mbio.03291-22 :Developing a Temperature-Inducible Transcriptional Rheostat in Neurospora crassa]

== Uvod ==
''Neurospora crassa'' je rdeča plesen, ki spada v deblo askomicet. Zaradi svoje majhnosti, enostavnosti vzgoje in opravljanja genskih analiz, je ''N. crassa'' pomemben modelni organizem za raziskovanje številnih bioloških procesov, vključno s celičnim ciklom, fotosintezo, biološkimi ritmi, staranjem in razvojem. Prav tako proizvaja encime, ki razgrajujejo celulozo, kar je koristno pri proizvodnji etanola iz celuloznih virov [1].

Proteini toplotnega šoka (HSP) sodelujejo pri odzivu celice na stresne pogoje, kot so visoke ali nizke temperature, oksidativni stres in izpostavljenost strupenim snovem. Delujejo kot šaperoni, njihova naloga pa je zaščititi celice pred poškodbami s preprečevanjem nepravilnega zvitja proteinov. Vendar pa področje uravnavanja izražanja genov, ki kodirajo proteine HSP, še vedno ostaja delno neraziskano, zlasti v kontekstu modelnih glivnih organizmov, kot je ''N. crassa''. Faktorji toplotnega šoka (HSF) so pri stresnih pogojih aktivatorji transkripcije za proteine HSP. Po oligomerizaciji se faktorji HSF vežejo na DNA, in sicer na elemente toplotnega šoka (''hse''), ki so pri evkariontih relativno ohranjeni. V ''N. crassi'' so opisani trije geni hsp (''hsp30'', ''hsp70'' in ''hsp80''), ki se vsi izražajo pri visokih temperaturah, prav tako pa so pri vsakem odkrili domnevne ''cis'' regulatorne elemente [1].

V ''N. crassa'' so načrtali že mnogo promotorjev, ki se odzivajo na kemične signale (kot so glukoza, kininska kislina in baker), od fizično induciranih sistemov pa so razvili le takšnega, ki se odziva na svetlobo. Temperaturno induciran sistem, bi medtem omogočil zelo enostavno uravnavanje izražanja genov brez potrebe po dodajanju eksogenih kemikalij [1].

== Funkcijska analiza promotorjev ''hsp'' ==
V preteklih študijah so pri promotorju gena ''hsp30'' definirali štiri regije ''hse'', medtem ko so v promotorju ''hsp70'' našli dve. ''hsp70'' ne vsebuje regulatornih elementov ''hse'', vendar so opisane nekoliko različne ''cis'' regije, poimenovane kot elementi odziva na temperaturo (''tre'').
Da bi bolj okarakterizirali regulacijo genov so pripravili paleto konstruktov, ki so poleg bližnjega promotorja vsebovali različno dolge 5' regije. Različni konstrukti enakega gena pa so pri tem vsebovali raznoliko število regulatornih ''cis'' elementov. Za analizo so uporabili luciferazo iz kresničke z dodanim zaporedjem PEST (ki poveča razgradnjo proteina), kar skupaj tvori reporterski sistem za zaznavo transkripcije v realnem času. Pri sobni temperaturi so nagojili reporterske seve plesni in jih v temi izpostavili enournemu toplotnemu šoku pri treh različnih temperaturah: dveh visokih (35 °C in 45 °C) in eni, ki je bila bližja laboratorijskim rastnim pogojem ''N. crasse'' (30 °C), in merili luminiscenco s CCD kamero [1].

Vsi polno dolgi konstrukti so izkazali podobno hiter in močen odziv na toplotni šok pri 45 °C, medtem ko je bil odziv pri 35 °C neprimerno nižji, pri 30 °C pa odziva sploh ni bilo. Skrajšani konstrukti so se pri ''hsp30'' in ''hsp70'' odzivali v skladu s številom domnevnih regij ''hse'', ki so jih vsebovali. Medtem je konstrukt s polovičnim promotorjem ''hsp80'' (ki je vseboval 5 od 7 domnevnih regij ''tre''), pokazal kar 9-krat nižji odziv od konstrukta s polnim promotorjem, kar kaže na pomanjkljivo poznavanje regulacije promotorja ''hse80''. Izmed treh genov so pri ''hsp30'' opazili mnogo najnižje puščanje promotorja (pri 25 °C), zaradi česa so pri omenjenem genu opazili več kot 1000-kratno povečanje izražanja (razmerje med bazalnim vrhom in induciranim vrhom) [1].

HSP30 ima nižjo molekularno maso od ostalih dveh sorodnih proteinov (30 kDa proti 70 kDa / 80 kDa) na račun odsotnosti ATP-hidrolizne domene. Zaradi tega so pri stresnih pogojih manjši HSP-ji prvi, ki posredujejo proti proteinski denaturaciji, kar korelira tudi z opaženo visoko stopnjo povečanja izražanja pri ''hsp30''.
Avtorji so ''hsp30'' primerjali z drugimi znanimi inducibilnimi sistemi v ''N. crassa'', kot sta promotor ''qa-2'', ki se odziva na naraščajoče koncentracije kininske kisline in promotor ''vvd'', ki se aktivira s svetlobo. Promotor ''hsp30'' je imel najnižjo bazalno aktivnost in pa najvišjo aktivnost v induciranem stanju, potreboval pa je dlje časa za regeneracijo do minimuma aktivnosti po dražljaju (7 h) od promotorja ''vvd'' (4 h) [1].

== Odziv promotorja ''hsp30'' na toplotne dražljaje ==
Zaradi najbolj robustnega odziva na toplotne dražljaje so avtorji za nadaljnje delo izbrali promotor ''hsp30''. Zanimalo jih je promotorjev odziv na različno dolge toplotne dražljaje pri različnih temperaturah, zato so skonstruirali pristop, ki omogoča hitro in enostavno analizo.
Eksperiment so opravili v formatu mikrotitrske plošče za PCR in testirali 3 različne promotorje ''hsp30'' (en celoten in dva skrajšana). Pripravili so paleto različnih pogojev in ocenjevali odziv promotorja z merjenjem luminiscence. Vzorci so bili izpostavljeni šestim različnim temperaturam (v rangu od 34 °C do 46 °C), pri čem so toplotni dražljaji trajali 60, 30, 15, 5, in 1 min. V obzir pa je treba vzeti, da je zaradi relativno majhnega volumna gojišča (PCR mikrocentrifugirka), bila omejena količina dodanega medija in zato omejena rast plesni [1].

Konstrukti s promotorji ''hsp30'' so se izkazali za izjemno nastavljive sisteme, saj se je stopnja odziva povečevala, ko se je zviševala temperatura, prav tako pa so opazili večji odziv, kjer je temperaturni dražljaj trajal dlje časa. Vendar pa je maksimalni odziv bil opažen pri 15 min, pri daljših izpostavljenostih višji temperaturi pa je izražanje bilo nižje, kar so avtorji pripisovali upadu celične funkcije zaradi visokih temperatur. Že pri najkrajši izpostavljenosti (1 min) višji temperaturi je sistem podal robustni odziv.
Kot najbolj optimalna sistema sta se izkazala oba daljša promotorja (vsebujeta vse domnevne elemente ''hse''), saj so pri njima opazili močnejšo indukcijo in manjše puščanje promotorja v primerjavi s krajšim konstruktom [1].

== Temperaturno pogojena rast ''N. crasse'' ==
Celulozni regulator 2 (CLR-2) je transkripcijski faktor, ki je ključen pri regulaciji celulazne aktivnosti ''N. crasse'', saj je potreben za indukcijo ekspresije celulolitičnih genov. V industriji je pomembno nadzorovano izražanje CLR-2, s tem se na primer poveča proizvodnja bioetanola. Avtorji so pripravili sev ''N. crasse'', pri katerem so zapis za CLR-2 postavili pod promotor ''hsp30'' in opazovali rast celic pri različnih pogojih.
Najkrajši promotor ''hse30'' vsebuje le dve od štirih domnevnih regij ''hse'' in se je zato izkazal kot najmanj optimalen sistem za uravnavanje transkripcije (glej Odziv promotorja ''hsp30'' na toplotne dražljaje). Vseeno pa so ga avtorji pri tem eksperimentu uporabili zaradi njegove kratke dolžine (500 baznih parov). V ''N. crassi'' so namreč prisotne ponavljajoče se inducirane točkovne mutacije (RIP), kot obrambni mehanizem za zmanjšanje aktivnosti in širjenja mobilnih genetskih elementov, ki pa je manj pogosta v krajših segmentih DNA [1].

Rezultati so pokazali, da se sev ''hsp30:clr-2'' ne razvija v tekočih gojiščih z Avicelom (kristalinična celuloza) pri normalni temperaturi (25 °C). Vendar pa se po vsakodnevnih impulzih toplote (45 °C) rast povrne in celo preseže WT sev plesni [1].

== Načrtovanje sintetičnega promotorja iz domnevnih ''cis'' regij ''hsp30'' ==
Da bi uporabili vse domnevne regije ''hse'', in hkrati znižali pogostost RIP-induciranih mutacij so avtorji načrtali 2 sintetična promotorja. Ocenili so minimalno dolžino bližnjega promotorja (okoli 250 bp) in mu dodali domnevne regije ''hse''. S primerjavo promotorja ''hse30'' s promotorji ''hse30'' iz sorodnih organizmov ''N. crasse'' so identificirali še peto regijo ''hse'', ki je prav tako ohranjena, in tudi njo vključili v konstrukt. Razlika med sintetičnima promoterjema je bila zgolj v dolžini vmesnikov med domnevnimi regulatornimi regijami ''hse'' [1].

Tudi oba sintetična promotorja sta izkazala dobro nastavljivost pri različnih toplotnih tretmajih, vendar sta oba prikazala relativno močno bazalno aktivnost. Je pa tovrstno puščanje promotorja velikokrat prisotno ob načrtovanju umetnih promotorjev. Vseeno pa sta se oba nova promotorja izkazala za bolj uporaben sistem nastavljivega izražanja od promotorjev ''hsp70'' in ''hsp80'', prav tako so opazili višje stopnje izražanja od najkrajše verzije promotorja ''hsp30''. Zaradi velike ohranjenosti promotorja ''hsp30'' bi podobni promotorji najverjetneje delovali tudi v ostalih askomicetah, kot na primer v biotehnološko pomembnih ''Aspergillus niger'' ali ''Trichoderma reesei'' [1, 2].

== Zaključek ==
Sistem s finim uravnavanjem transkripcije preko toplotne indukcije predstavlja obetavno orodje za raziskave funkcije genov, pa tudi za biotehnološke aplikacije, kot so proizvodnja encimov, metabolitov ali drugih biološko pomembnih snovi. V primerjavi s kemično induciranimi sistemi se izkaže za lažje reverzibilen sistem, saj ni treba dodajati eksogenih sredstev, ki jih je težko odstraniti iz gojišča. Hkrati pa je enostaven za uporabo, sploh v primerjavi s svetlobno indukcijo, kjer je potreba po dobro definiranih laboratorijskih nastavitvah (temna soba). Vendar pa se pri toplotni indukciji pojavljajo potencialne težave oziroma omejitve, kot sta stres za organizem in neselektivna aktivacija genov [1, 3].

Ko so zapis za CLR-2 postavili pod promotor ''hse30'', so avtorji (kljub izbiri neoptimalnega promotorja) prikazali možnost uporabe toplotno inducibilnega sistema za regulacijo izražanja pri želenih fenotipih. Ob nadaljnji optimizaciji procesa bi se celulazna aktivnost plesni dodatno povečala, kar odpira priložnost uporabe tovrstnih sistemov v industriji. Glavna ovira pri industrijski uporabi razgradnje celuloze so namreč visoki stroški proizvodnje encimov, kar tudi preprečuje nižje cene bioetanola [1, 4].

== Literatura ==

[1] C. Tabilo-Agurto, V. Del Rio-Pinilla, V. Eltit-Villarroel, A. Goity, F. Muñoz-Guzmán, in L. F. Larrondo, „Developing a Temperature-Inducible Transcriptional Rheostat in Neurospora crassa“, mBio, let. 14, št. 1, str. e03291-22, feb. 2023, doi: 10.1128/mbio.03291-22.

[2] J. Han, B. McLane, E.-H. Kim, J.-W. Yoon, in H.-S. Jun, „Remission of diabetes by insulin gene therapy using a hepatocyte-specific and glucose-responsive synthetic promoter“, Mol. Ther. J. Am. Soc. Gene Ther., let. 19, št. 3, str. 470–478, mar. 2011, doi: 10.1038/mt.2010.255.

[3] J. Hearn, I. Ssinabulya, J. I. Schwartz, A. R. Akiteng, H. J. Ross, in J. A. Cafazzo, „Self-management of non-communicable diseases in low- and middle-income countries: A scoping review“, PLOS ONE, let. 14, št. 7, str. e0219141, jul. 2019, doi: 10.1371/journal.pone.0219141.

[4] A. K. Chandel, C. Es, R. Rudravaram, M. L. Narasu, V. Rao, in P. Ravindra, „Economics and environmental impact of bioethanol production technologies: an appraisal“.

Razvoj temperaturno inducibilnega transkripcijskega reostata pri Neurospori crassi

2023-04-11T08:05:08Z

Lsegota: /* Zaključek */

Izhodiščni članek : [https://journals.asm.org/doi/10.1128/mbio.03291-22: Developing a Temperature-Inducible Transcriptional Rheostat in Neurospora crassa]

== Uvod ==
''Neurospora crassa'' je rdeča plesen, ki spada v deblo askomicet. Zaradi svoje majhnosti, enostavnosti vzgoje in opravljanja genskih analiz, je ''N. crassa'' pomemben modelni organizem za raziskovanje številnih bioloških procesov, vključno s celičnim ciklom, fotosintezo, biološkimi ritmi, staranjem in razvojem. Prav tako proizvaja encime, ki razgrajujejo celulozo, kar je koristno pri proizvodnji etanola iz celuloznih virov [1].

Proteini toplotnega šoka (HSP) sodelujejo pri odzivu celice na stresne pogoje, kot so visoke ali nizke temperature, oksidativni stres in izpostavljenost strupenim snovem. Delujejo kot šaperoni, njihova naloga pa je zaščititi celice pred poškodbami s preprečevanjem nepravilnega zvitja proteinov. Vendar pa področje uravnavanja izražanja genov, ki kodirajo proteine HSP, še vedno ostaja delno neraziskano, zlasti v kontekstu modelnih glivnih organizmov, kot je ''N. crassa''. Faktorji toplotnega šoka (HSF) so pri stresnih pogojih aktivatorji transkripcije za proteine HSP. Po oligomerizaciji se faktorji HSF vežejo na DNA, in sicer na elemente toplotnega šoka (''hse''), ki so pri evkariontih relativno ohranjeni. V ''N. crassi'' so opisani trije geni hsp (''hsp30'', ''hsp70'' in ''hsp80''), ki se vsi izražajo pri visokih temperaturah, prav tako pa so pri vsakem odkrili domnevne ''cis'' regulatorne elemente [1].

V ''N. crassa'' so načrtali že mnogo promotorjev, ki se odzivajo na kemične signale (kot so glukoza, kininska kislina in baker), od fizično induciranih sistemov pa so razvili le takšnega, ki se odziva na svetlobo. Temperaturno induciran sistem, bi medtem omogočil zelo enostavno uravnavanje izražanja genov brez potrebe po dodajanju eksogenih kemikalij [1].

== Funkcijska analiza promotorjev ''hsp'' ==
V preteklih študijah so pri promotorju gena ''hsp30'' definirali štiri regije ''hse'', medtem ko so v promotorju ''hsp70'' našli dve. ''hsp70'' ne vsebuje regulatornih elementov ''hse'', vendar so opisane nekoliko različne ''cis'' regije, poimenovane kot elementi odziva na temperaturo (''tre'').
Da bi bolj okarakterizirali regulacijo genov so pripravili paleto konstruktov, ki so poleg bližnjega promotorja vsebovali različno dolge 5' regije. Različni konstrukti enakega gena pa so pri tem vsebovali raznoliko število regulatornih ''cis'' elementov. Za analizo so uporabili luciferazo iz kresničke z dodanim zaporedjem PEST (ki poveča razgradnjo proteina), kar skupaj tvori reporterski sistem za zaznavo transkripcije v realnem času. Pri sobni temperaturi so nagojili reporterske seve plesni in jih v temi izpostavili enournemu toplotnemu šoku pri treh različnih temperaturah: dveh visokih (35 °C in 45 °C) in eni, ki je bila bližja laboratorijskim rastnim pogojem ''N. crasse'' (30 °C), in merili luminiscenco s CCD kamero [1].

Vsi polno dolgi konstrukti so izkazali podobno hiter in močen odziv na toplotni šok pri 45 °C, medtem ko je bil odziv pri 35 °C neprimerno nižji, pri 30 °C pa odziva sploh ni bilo. Skrajšani konstrukti so se pri ''hsp30'' in ''hsp70'' odzivali v skladu s številom domnevnih regij ''hse'', ki so jih vsebovali. Medtem je konstrukt s polovičnim promotorjem ''hsp80'' (ki je vseboval 5 od 7 domnevnih regij ''tre''), pokazal kar 9-krat nižji odziv od konstrukta s polnim promotorjem, kar kaže na pomanjkljivo poznavanje regulacije promotorja ''hse80''. Izmed treh genov so pri ''hsp30'' opazili mnogo najnižje puščanje promotorja (pri 25 °C), zaradi česa so pri omenjenem genu opazili več kot 1000-kratno povečanje izražanja (razmerje med bazalnim vrhom in induciranim vrhom) [1].

HSP30 ima nižjo molekularno maso od ostalih dveh sorodnih proteinov (30 kDa proti 70 kDa / 80 kDa) na račun odsotnosti ATP-hidrolizne domene. Zaradi tega so pri stresnih pogojih manjši HSP-ji prvi, ki posredujejo proti proteinski denaturaciji, kar korelira tudi z opaženo visoko stopnjo povečanja izražanja pri ''hsp30''.
Avtorji so ''hsp30'' primerjali z drugimi znanimi inducibilnimi sistemi v ''N. crassa'', kot sta promotor ''qa-2'', ki se odziva na naraščajoče koncentracije kininske kisline in promotor ''vvd'', ki se aktivira s svetlobo. Promotor ''hsp30'' je imel najnižjo bazalno aktivnost in pa najvišjo aktivnost v induciranem stanju, potreboval pa je dlje časa za regeneracijo do minimuma aktivnosti po dražljaju (7 h) od promotorja ''vvd'' (4 h) [1].

== Odziv promotorja ''hsp30'' na toplotne dražljaje ==
Zaradi najbolj robustnega odziva na toplotne dražljaje so avtorji za nadaljnje delo izbrali promotor ''hsp30''. Zanimalo jih je promotorjev odziv na različno dolge toplotne dražljaje pri različnih temperaturah, zato so skonstruirali pristop, ki omogoča hitro in enostavno analizo.
Eksperiment so opravili v formatu mikrotitrske plošče za PCR in testirali 3 različne promotorje ''hsp30'' (en celoten in dva skrajšana). Pripravili so paleto različnih pogojev in ocenjevali odziv promotorja z merjenjem luminiscence. Vzorci so bili izpostavljeni šestim različnim temperaturam (v rangu od 34 °C do 46 °C), pri čem so toplotni dražljaji trajali 60, 30, 15, 5, in 1 min. V obzir pa je treba vzeti, da je zaradi relativno majhnega volumna gojišča (PCR mikrocentrifugirka), bila omejena količina dodanega medija in zato omejena rast plesni [1].

Konstrukti s promotorji ''hsp30'' so se izkazali za izjemno nastavljive sisteme, saj se je stopnja odziva povečevala, ko se je zviševala temperatura, prav tako pa so opazili večji odziv, kjer je temperaturni dražljaj trajal dlje časa. Vendar pa je maksimalni odziv bil opažen pri 15 min, pri daljših izpostavljenostih višji temperaturi pa je izražanje bilo nižje, kar so avtorji pripisovali upadu celične funkcije zaradi visokih temperatur. Že pri najkrajši izpostavljenosti (1 min) višji temperaturi je sistem podal robustni odziv.
Kot najbolj optimalna sistema sta se izkazala oba daljša promotorja (vsebujeta vse domnevne elemente ''hse''), saj so pri njima opazili močnejšo indukcijo in manjše puščanje promotorja v primerjavi s krajšim konstruktom [1].

== Temperaturno pogojena rast ''N. crasse'' ==
Celulozni regulator 2 (CLR-2) je transkripcijski faktor, ki je ključen pri regulaciji celulazne aktivnosti ''N. crasse'', saj je potreben za indukcijo ekspresije celulolitičnih genov. V industriji je pomembno nadzorovano izražanje CLR-2, s tem se na primer poveča proizvodnja bioetanola. Avtorji so pripravili sev ''N. crasse'', pri katerem so zapis za CLR-2 postavili pod promotor ''hsp30'' in opazovali rast celic pri različnih pogojih.
Najkrajši promotor ''hse30'' vsebuje le dve od štirih domnevnih regij ''hse'' in se je zato izkazal kot najmanj optimalen sistem za uravnavanje transkripcije (glej Odziv promotorja ''hsp30'' na toplotne dražljaje). Vseeno pa so ga avtorji pri tem eksperimentu uporabili zaradi njegove kratke dolžine (500 baznih parov). V ''N. crassi'' so namreč prisotne ponavljajoče se inducirane točkovne mutacije (RIP), kot obrambni mehanizem za zmanjšanje aktivnosti in širjenja mobilnih genetskih elementov, ki pa je manj pogosta v krajših segmentih DNA [1].

Rezultati so pokazali, da se sev ''hsp30:clr-2'' ne razvija v tekočih gojiščih z Avicelom (kristalinična celuloza) pri normalni temperaturi (25 °C). Vendar pa se po vsakodnevnih impulzih toplote (45 °C) rast povrne in celo preseže WT sev plesni [1].

== Načrtovanje sintetičnega promotorja iz domnevnih ''cis'' regij ''hsp30'' ==
Da bi uporabili vse domnevne regije ''hse'', in hkrati znižali pogostost RIP-induciranih mutacij so avtorji načrtali 2 sintetična promotorja. Ocenili so minimalno dolžino bližnjega promotorja (okoli 250 bp) in mu dodali domnevne regije ''hse''. S primerjavo promotorja ''hse30'' s promotorji ''hse30'' iz sorodnih organizmov ''N. crasse'' so identificirali še peto regijo ''hse'', ki je prav tako ohranjena, in tudi njo vključili v konstrukt. Razlika med sintetičnima promoterjema je bila zgolj v dolžini vmesnikov med domnevnimi regulatornimi regijami ''hse'' [1].

Tudi oba sintetična promotorja sta izkazala dobro nastavljivost pri različnih toplotnih tretmajih, vendar sta oba prikazala relativno močno bazalno aktivnost. Je pa tovrstno puščanje promotorja velikokrat prisotno ob načrtovanju umetnih promotorjev. Vseeno pa sta se oba nova promotorja izkazala za bolj uporaben sistem nastavljivega izražanja od promotorjev ''hsp70'' in ''hsp80'', prav tako so opazili višje stopnje izražanja od najkrajše verzije promotorja ''hsp30''. Zaradi velike ohranjenosti promotorja ''hsp30'' bi podobni promotorji najverjetneje delovali tudi v ostalih askomicetah, kot na primer v biotehnološko pomembnih ''Aspergillus niger'' ali ''Trichoderma reesei'' [1, 2].

== Zaključek ==
Sistem s finim uravnavanjem transkripcije preko toplotne indukcije predstavlja obetavno orodje za raziskave funkcije genov, pa tudi za biotehnološke aplikacije, kot so proizvodnja encimov, metabolitov ali drugih biološko pomembnih snovi. V primerjavi s kemično induciranimi sistemi se izkaže za lažje reverzibilen sistem, saj ni treba dodajati eksogenih sredstev, ki jih je težko odstraniti iz gojišča. Hkrati pa je enostaven za uporabo, sploh v primerjavi s svetlobno indukcijo, kjer je potreba po dobro definiranih laboratorijskih nastavitvah (temna soba). Vendar pa se pri toplotni indukciji pojavljajo potencialne težave oziroma omejitve, kot sta stres za organizem in neselektivna aktivacija genov [1, 3].

Ko so zapis za CLR-2 postavili pod promotor ''hse30'', so avtorji (kljub izbiri neoptimalnega promotorja) prikazali možnost uporabe toplotno inducibilnega sistema za regulacijo izražanja pri želenih fenotipih. Ob nadaljnji optimizaciji procesa bi se celulazna aktivnost plesni dodatno povečala, kar odpira priložnost uporabe tovrstnih sistemov v industriji. Glavna ovira pri industrijski uporabi razgradnje celuloze so namreč visoki stroški proizvodnje encimov, kar tudi preprečuje nižje cene bioetanola [1, 4].

== Literatura ==

[1] C. Tabilo-Agurto, V. Del Rio-Pinilla, V. Eltit-Villarroel, A. Goity, F. Muñoz-Guzmán, in L. F. Larrondo, „Developing a Temperature-Inducible Transcriptional Rheostat in Neurospora crassa“, mBio, let. 14, št. 1, str. e03291-22, feb. 2023, doi: 10.1128/mbio.03291-22.

[2] J. Han, B. McLane, E.-H. Kim, J.-W. Yoon, in H.-S. Jun, „Remission of diabetes by insulin gene therapy using a hepatocyte-specific and glucose-responsive synthetic promoter“, Mol. Ther. J. Am. Soc. Gene Ther., let. 19, št. 3, str. 470–478, mar. 2011, doi: 10.1038/mt.2010.255.

[3] J. Hearn, I. Ssinabulya, J. I. Schwartz, A. R. Akiteng, H. J. Ross, in J. A. Cafazzo, „Self-management of non-communicable diseases in low- and middle-income countries: A scoping review“, PLOS ONE, let. 14, št. 7, str. e0219141, jul. 2019, doi: 10.1371/journal.pone.0219141.

[4] A. K. Chandel, C. Es, R. Rudravaram, M. L. Narasu, V. Rao, in P. Ravindra, „Economics and environmental impact of bioethanol production technologies: an appraisal“.

Razvoj temperaturno inducibilnega transkripcijskega reostata pri Neurospori crassi

2023-04-11T08:04:20Z

Lsegota: /* Zaključek */

Izhodiščni članek : [https://journals.asm.org/doi/10.1128/mbio.03291-22: Developing a Temperature-Inducible Transcriptional Rheostat in Neurospora crassa]

== Uvod ==
''Neurospora crassa'' je rdeča plesen, ki spada v deblo askomicet. Zaradi svoje majhnosti, enostavnosti vzgoje in opravljanja genskih analiz, je ''N. crassa'' pomemben modelni organizem za raziskovanje številnih bioloških procesov, vključno s celičnim ciklom, fotosintezo, biološkimi ritmi, staranjem in razvojem. Prav tako proizvaja encime, ki razgrajujejo celulozo, kar je koristno pri proizvodnji etanola iz celuloznih virov [1].

Proteini toplotnega šoka (HSP) sodelujejo pri odzivu celice na stresne pogoje, kot so visoke ali nizke temperature, oksidativni stres in izpostavljenost strupenim snovem. Delujejo kot šaperoni, njihova naloga pa je zaščititi celice pred poškodbami s preprečevanjem nepravilnega zvitja proteinov. Vendar pa področje uravnavanja izražanja genov, ki kodirajo proteine HSP, še vedno ostaja delno neraziskano, zlasti v kontekstu modelnih glivnih organizmov, kot je ''N. crassa''. Faktorji toplotnega šoka (HSF) so pri stresnih pogojih aktivatorji transkripcije za proteine HSP. Po oligomerizaciji se faktorji HSF vežejo na DNA, in sicer na elemente toplotnega šoka (''hse''), ki so pri evkariontih relativno ohranjeni. V ''N. crassi'' so opisani trije geni hsp (''hsp30'', ''hsp70'' in ''hsp80''), ki se vsi izražajo pri visokih temperaturah, prav tako pa so pri vsakem odkrili domnevne ''cis'' regulatorne elemente [1].

V ''N. crassa'' so načrtali že mnogo promotorjev, ki se odzivajo na kemične signale (kot so glukoza, kininska kislina in baker), od fizično induciranih sistemov pa so razvili le takšnega, ki se odziva na svetlobo. Temperaturno induciran sistem, bi medtem omogočil zelo enostavno uravnavanje izražanja genov brez potrebe po dodajanju eksogenih kemikalij [1].

== Funkcijska analiza promotorjev ''hsp'' ==
V preteklih študijah so pri promotorju gena ''hsp30'' definirali štiri regije ''hse'', medtem ko so v promotorju ''hsp70'' našli dve. ''hsp70'' ne vsebuje regulatornih elementov ''hse'', vendar so opisane nekoliko različne ''cis'' regije, poimenovane kot elementi odziva na temperaturo (''tre'').
Da bi bolj okarakterizirali regulacijo genov so pripravili paleto konstruktov, ki so poleg bližnjega promotorja vsebovali različno dolge 5' regije. Različni konstrukti enakega gena pa so pri tem vsebovali raznoliko število regulatornih ''cis'' elementov. Za analizo so uporabili luciferazo iz kresničke z dodanim zaporedjem PEST (ki poveča razgradnjo proteina), kar skupaj tvori reporterski sistem za zaznavo transkripcije v realnem času. Pri sobni temperaturi so nagojili reporterske seve plesni in jih v temi izpostavili enournemu toplotnemu šoku pri treh različnih temperaturah: dveh visokih (35 °C in 45 °C) in eni, ki je bila bližja laboratorijskim rastnim pogojem ''N. crasse'' (30 °C), in merili luminiscenco s CCD kamero [1].

Vsi polno dolgi konstrukti so izkazali podobno hiter in močen odziv na toplotni šok pri 45 °C, medtem ko je bil odziv pri 35 °C neprimerno nižji, pri 30 °C pa odziva sploh ni bilo. Skrajšani konstrukti so se pri ''hsp30'' in ''hsp70'' odzivali v skladu s številom domnevnih regij ''hse'', ki so jih vsebovali. Medtem je konstrukt s polovičnim promotorjem ''hsp80'' (ki je vseboval 5 od 7 domnevnih regij ''tre''), pokazal kar 9-krat nižji odziv od konstrukta s polnim promotorjem, kar kaže na pomanjkljivo poznavanje regulacije promotorja ''hse80''. Izmed treh genov so pri ''hsp30'' opazili mnogo najnižje puščanje promotorja (pri 25 °C), zaradi česa so pri omenjenem genu opazili več kot 1000-kratno povečanje izražanja (razmerje med bazalnim vrhom in induciranim vrhom) [1].

HSP30 ima nižjo molekularno maso od ostalih dveh sorodnih proteinov (30 kDa proti 70 kDa / 80 kDa) na račun odsotnosti ATP-hidrolizne domene. Zaradi tega so pri stresnih pogojih manjši HSP-ji prvi, ki posredujejo proti proteinski denaturaciji, kar korelira tudi z opaženo visoko stopnjo povečanja izražanja pri ''hsp30''.
Avtorji so ''hsp30'' primerjali z drugimi znanimi inducibilnimi sistemi v ''N. crassa'', kot sta promotor ''qa-2'', ki se odziva na naraščajoče koncentracije kininske kisline in promotor ''vvd'', ki se aktivira s svetlobo. Promotor ''hsp30'' je imel najnižjo bazalno aktivnost in pa najvišjo aktivnost v induciranem stanju, potreboval pa je dlje časa za regeneracijo do minimuma aktivnosti po dražljaju (7 h) od promotorja ''vvd'' (4 h) [1].

== Odziv promotorja ''hsp30'' na toplotne dražljaje ==
Zaradi najbolj robustnega odziva na toplotne dražljaje so avtorji za nadaljnje delo izbrali promotor ''hsp30''. Zanimalo jih je promotorjev odziv na različno dolge toplotne dražljaje pri različnih temperaturah, zato so skonstruirali pristop, ki omogoča hitro in enostavno analizo.
Eksperiment so opravili v formatu mikrotitrske plošče za PCR in testirali 3 različne promotorje ''hsp30'' (en celoten in dva skrajšana). Pripravili so paleto različnih pogojev in ocenjevali odziv promotorja z merjenjem luminiscence. Vzorci so bili izpostavljeni šestim različnim temperaturam (v rangu od 34 °C do 46 °C), pri čem so toplotni dražljaji trajali 60, 30, 15, 5, in 1 min. V obzir pa je treba vzeti, da je zaradi relativno majhnega volumna gojišča (PCR mikrocentrifugirka), bila omejena količina dodanega medija in zato omejena rast plesni [1].

Konstrukti s promotorji ''hsp30'' so se izkazali za izjemno nastavljive sisteme, saj se je stopnja odziva povečevala, ko se je zviševala temperatura, prav tako pa so opazili večji odziv, kjer je temperaturni dražljaj trajal dlje časa. Vendar pa je maksimalni odziv bil opažen pri 15 min, pri daljših izpostavljenostih višji temperaturi pa je izražanje bilo nižje, kar so avtorji pripisovali upadu celične funkcije zaradi visokih temperatur. Že pri najkrajši izpostavljenosti (1 min) višji temperaturi je sistem podal robustni odziv.
Kot najbolj optimalna sistema sta se izkazala oba daljša promotorja (vsebujeta vse domnevne elemente ''hse''), saj so pri njima opazili močnejšo indukcijo in manjše puščanje promotorja v primerjavi s krajšim konstruktom [1].

== Temperaturno pogojena rast ''N. crasse'' ==
Celulozni regulator 2 (CLR-2) je transkripcijski faktor, ki je ključen pri regulaciji celulazne aktivnosti ''N. crasse'', saj je potreben za indukcijo ekspresije celulolitičnih genov. V industriji je pomembno nadzorovano izražanje CLR-2, s tem se na primer poveča proizvodnja bioetanola. Avtorji so pripravili sev ''N. crasse'', pri katerem so zapis za CLR-2 postavili pod promotor ''hsp30'' in opazovali rast celic pri različnih pogojih.
Najkrajši promotor ''hse30'' vsebuje le dve od štirih domnevnih regij ''hse'' in se je zato izkazal kot najmanj optimalen sistem za uravnavanje transkripcije (glej Odziv promotorja ''hsp30'' na toplotne dražljaje). Vseeno pa so ga avtorji pri tem eksperimentu uporabili zaradi njegove kratke dolžine (500 baznih parov). V ''N. crassi'' so namreč prisotne ponavljajoče se inducirane točkovne mutacije (RIP), kot obrambni mehanizem za zmanjšanje aktivnosti in širjenja mobilnih genetskih elementov, ki pa je manj pogosta v krajših segmentih DNA [1].

Rezultati so pokazali, da se sev ''hsp30:clr-2'' ne razvija v tekočih gojiščih z Avicelom (kristalinična celuloza) pri normalni temperaturi (25 °C). Vendar pa se po vsakodnevnih impulzih toplote (45 °C) rast povrne in celo preseže WT sev plesni [1].

== Načrtovanje sintetičnega promotorja iz domnevnih ''cis'' regij ''hsp30'' ==
Da bi uporabili vse domnevne regije ''hse'', in hkrati znižali pogostost RIP-induciranih mutacij so avtorji načrtali 2 sintetična promotorja. Ocenili so minimalno dolžino bližnjega promotorja (okoli 250 bp) in mu dodali domnevne regije ''hse''. S primerjavo promotorja ''hse30'' s promotorji ''hse30'' iz sorodnih organizmov ''N. crasse'' so identificirali še peto regijo ''hse'', ki je prav tako ohranjena, in tudi njo vključili v konstrukt. Razlika med sintetičnima promoterjema je bila zgolj v dolžini vmesnikov med domnevnimi regulatornimi regijami ''hse'' [1].

Tudi oba sintetična promotorja sta izkazala dobro nastavljivost pri različnih toplotnih tretmajih, vendar sta oba prikazala relativno močno bazalno aktivnost. Je pa tovrstno puščanje promotorja velikokrat prisotno ob načrtovanju umetnih promotorjev. Vseeno pa sta se oba nova promotorja izkazala za bolj uporaben sistem nastavljivega izražanja od promotorjev ''hsp70'' in ''hsp80'', prav tako so opazili višje stopnje izražanja od najkrajše verzije promotorja ''hsp30''. Zaradi velike ohranjenosti promotorja ''hsp30'' bi podobni promotorji najverjetneje delovali tudi v ostalih askomicetah, kot na primer v biotehnološko pomembnih ''Aspergillus niger'' ali ''Trichoderma reesei'' [1, 2].

== Zaključek ==
Sistem s finim uravnavanjem transkripcije preko toplotne indukcije predstavlja obetavno orodje za raziskave funkcije genov, pa tudi za biotehnološke aplikacije, kot so proizvodnja encimov, metabolitov ali drugih biološko pomembnih snovi. V primerjavi s kemično induciranimi sistemi se izkaže za lažje reverzibilen sistem, saj ni treba dodajati eksogenih sredstev, ki jih je težko odstraniti iz gojišča. Hkrati pa je enostaven za uporabo, sploh v primerjavi s svetlobno indukcijo, kjer je potreba po dobro definiranih laboratorijskih nastavitvah (temna soba). Vendar pa se pri toplotni indukciji pojavljajo potencialne težave oziroma omejitve, kot sta stres za organizem in neselektivna aktivacija genov [1, 3].

Ko so zapis za CLR-2 postavili pod promotor ''hse30'' , so avtorji (kljub izbiri neoptimalnega promotorja) prikazali možnost uporabe toplotno inducibilnega sistema za regulacijo izražanja pri želenih fenotipih. Ob nadaljnji optimizaciji procesa bi se celulazna aktivnost plesni dodatno povečala, kar odpira priložnost uporabe tovrstnih sistemov v industriji. Glavna ovira pri industrijski uporabi razgradnje celuloze so namreč visoki stroški proizvodnje encimov, kar tudi preprečuje nižje cene bioetanola [1, 4].

== Literatura ==

[1] C. Tabilo-Agurto, V. Del Rio-Pinilla, V. Eltit-Villarroel, A. Goity, F. Muñoz-Guzmán, in L. F. Larrondo, „Developing a Temperature-Inducible Transcriptional Rheostat in Neurospora crassa“, mBio, let. 14, št. 1, str. e03291-22, feb. 2023, doi: 10.1128/mbio.03291-22.

[2] J. Han, B. McLane, E.-H. Kim, J.-W. Yoon, in H.-S. Jun, „Remission of diabetes by insulin gene therapy using a hepatocyte-specific and glucose-responsive synthetic promoter“, Mol. Ther. J. Am. Soc. Gene Ther., let. 19, št. 3, str. 470–478, mar. 2011, doi: 10.1038/mt.2010.255.

[3] J. Hearn, I. Ssinabulya, J. I. Schwartz, A. R. Akiteng, H. J. Ross, in J. A. Cafazzo, „Self-management of non-communicable diseases in low- and middle-income countries: A scoping review“, PLOS ONE, let. 14, št. 7, str. e0219141, jul. 2019, doi: 10.1371/journal.pone.0219141.

[4] A. K. Chandel, C. Es, R. Rudravaram, M. L. Narasu, V. Rao, in P. Ravindra, „Economics and environmental impact of bioethanol production technologies: an appraisal“.

Razvoj temperaturno inducibilnega transkripcijskega reostata pri Neurospori crassi

2023-04-11T07:59:47Z

Lsegota: /* Temperaturno pogojena rast N. crasse */

Izhodiščni članek : [https://journals.asm.org/doi/10.1128/mbio.03291-22: Developing a Temperature-Inducible Transcriptional Rheostat in Neurospora crassa]

== Uvod ==
''Neurospora crassa'' je rdeča plesen, ki spada v deblo askomicet. Zaradi svoje majhnosti, enostavnosti vzgoje in opravljanja genskih analiz, je ''N. crassa'' pomemben modelni organizem za raziskovanje številnih bioloških procesov, vključno s celičnim ciklom, fotosintezo, biološkimi ritmi, staranjem in razvojem. Prav tako proizvaja encime, ki razgrajujejo celulozo, kar je koristno pri proizvodnji etanola iz celuloznih virov [1].

Proteini toplotnega šoka (HSP) sodelujejo pri odzivu celice na stresne pogoje, kot so visoke ali nizke temperature, oksidativni stres in izpostavljenost strupenim snovem. Delujejo kot šaperoni, njihova naloga pa je zaščititi celice pred poškodbami s preprečevanjem nepravilnega zvitja proteinov. Vendar pa področje uravnavanja izražanja genov, ki kodirajo proteine HSP, še vedno ostaja delno neraziskano, zlasti v kontekstu modelnih glivnih organizmov, kot je ''N. crassa''. Faktorji toplotnega šoka (HSF) so pri stresnih pogojih aktivatorji transkripcije za proteine HSP. Po oligomerizaciji se faktorji HSF vežejo na DNA, in sicer na elemente toplotnega šoka (''hse''), ki so pri evkariontih relativno ohranjeni. V ''N. crassi'' so opisani trije geni hsp (''hsp30'', ''hsp70'' in ''hsp80''), ki se vsi izražajo pri visokih temperaturah, prav tako pa so pri vsakem odkrili domnevne ''cis'' regulatorne elemente [1].

V ''N. crassa'' so načrtali že mnogo promotorjev, ki se odzivajo na kemične signale (kot so glukoza, kininska kislina in baker), od fizično induciranih sistemov pa so razvili le takšnega, ki se odziva na svetlobo. Temperaturno induciran sistem, bi medtem omogočil zelo enostavno uravnavanje izražanja genov brez potrebe po dodajanju eksogenih kemikalij [1].

== Funkcijska analiza promotorjev ''hsp'' ==
V preteklih študijah so pri promotorju gena ''hsp30'' definirali štiri regije ''hse'', medtem ko so v promotorju ''hsp70'' našli dve. ''hsp70'' ne vsebuje regulatornih elementov ''hse'', vendar so opisane nekoliko različne ''cis'' regije, poimenovane kot elementi odziva na temperaturo (''tre'').
Da bi bolj okarakterizirali regulacijo genov so pripravili paleto konstruktov, ki so poleg bližnjega promotorja vsebovali različno dolge 5' regije. Različni konstrukti enakega gena pa so pri tem vsebovali raznoliko število regulatornih ''cis'' elementov. Za analizo so uporabili luciferazo iz kresničke z dodanim zaporedjem PEST (ki poveča razgradnjo proteina), kar skupaj tvori reporterski sistem za zaznavo transkripcije v realnem času. Pri sobni temperaturi so nagojili reporterske seve plesni in jih v temi izpostavili enournemu toplotnemu šoku pri treh različnih temperaturah: dveh visokih (35 °C in 45 °C) in eni, ki je bila bližja laboratorijskim rastnim pogojem ''N. crasse'' (30 °C), in merili luminiscenco s CCD kamero [1].

Vsi polno dolgi konstrukti so izkazali podobno hiter in močen odziv na toplotni šok pri 45 °C, medtem ko je bil odziv pri 35 °C neprimerno nižji, pri 30 °C pa odziva sploh ni bilo. Skrajšani konstrukti so se pri ''hsp30'' in ''hsp70'' odzivali v skladu s številom domnevnih regij ''hse'', ki so jih vsebovali. Medtem je konstrukt s polovičnim promotorjem ''hsp80'' (ki je vseboval 5 od 7 domnevnih regij ''tre''), pokazal kar 9-krat nižji odziv od konstrukta s polnim promotorjem, kar kaže na pomanjkljivo poznavanje regulacije promotorja ''hse80''. Izmed treh genov so pri ''hsp30'' opazili mnogo najnižje puščanje promotorja (pri 25 °C), zaradi česa so pri omenjenem genu opazili več kot 1000-kratno povečanje izražanja (razmerje med bazalnim vrhom in induciranim vrhom) [1].

HSP30 ima nižjo molekularno maso od ostalih dveh sorodnih proteinov (30 kDa proti 70 kDa / 80 kDa) na račun odsotnosti ATP-hidrolizne domene. Zaradi tega so pri stresnih pogojih manjši HSP-ji prvi, ki posredujejo proti proteinski denaturaciji, kar korelira tudi z opaženo visoko stopnjo povečanja izražanja pri ''hsp30''.
Avtorji so ''hsp30'' primerjali z drugimi znanimi inducibilnimi sistemi v ''N. crassa'', kot sta promotor ''qa-2'', ki se odziva na naraščajoče koncentracije kininske kisline in promotor ''vvd'', ki se aktivira s svetlobo. Promotor ''hsp30'' je imel najnižjo bazalno aktivnost in pa najvišjo aktivnost v induciranem stanju, potreboval pa je dlje časa za regeneracijo do minimuma aktivnosti po dražljaju (7 h) od promotorja ''vvd'' (4 h) [1].

== Odziv promotorja ''hsp30'' na toplotne dražljaje ==
Zaradi najbolj robustnega odziva na toplotne dražljaje so avtorji za nadaljnje delo izbrali promotor ''hsp30''. Zanimalo jih je promotorjev odziv na različno dolge toplotne dražljaje pri različnih temperaturah, zato so skonstruirali pristop, ki omogoča hitro in enostavno analizo.
Eksperiment so opravili v formatu mikrotitrske plošče za PCR in testirali 3 različne promotorje ''hsp30'' (en celoten in dva skrajšana). Pripravili so paleto različnih pogojev in ocenjevali odziv promotorja z merjenjem luminiscence. Vzorci so bili izpostavljeni šestim različnim temperaturam (v rangu od 34 °C do 46 °C), pri čem so toplotni dražljaji trajali 60, 30, 15, 5, in 1 min. V obzir pa je treba vzeti, da je zaradi relativno majhnega volumna gojišča (PCR mikrocentrifugirka), bila omejena količina dodanega medija in zato omejena rast plesni [1].

Konstrukti s promotorji ''hsp30'' so se izkazali za izjemno nastavljive sisteme, saj se je stopnja odziva povečevala, ko se je zviševala temperatura, prav tako pa so opazili večji odziv, kjer je temperaturni dražljaj trajal dlje časa. Vendar pa je maksimalni odziv bil opažen pri 15 min, pri daljših izpostavljenostih višji temperaturi pa je izražanje bilo nižje, kar so avtorji pripisovali upadu celične funkcije zaradi visokih temperatur. Že pri najkrajši izpostavljenosti (1 min) višji temperaturi je sistem podal robustni odziv.
Kot najbolj optimalna sistema sta se izkazala oba daljša promotorja (vsebujeta vse domnevne elemente ''hse''), saj so pri njima opazili močnejšo indukcijo in manjše puščanje promotorja v primerjavi s krajšim konstruktom [1].

== Temperaturno pogojena rast ''N. crasse'' ==
Celulozni regulator 2 (CLR-2) je transkripcijski faktor, ki je ključen pri regulaciji celulazne aktivnosti ''N. crasse'', saj je potreben za indukcijo ekspresije celulolitičnih genov. V industriji je pomembno nadzorovano izražanje CLR-2, s tem se na primer poveča proizvodnja bioetanola. Avtorji so pripravili sev ''N. crasse'', pri katerem so zapis za CLR-2 postavili pod promotor ''hsp30'' in opazovali rast celic pri različnih pogojih.
Najkrajši promotor ''hse30'' vsebuje le dve od štirih domnevnih regij ''hse'' in se je zato izkazal kot najmanj optimalen sistem za uravnavanje transkripcije (glej Odziv promotorja ''hsp30'' na toplotne dražljaje). Vseeno pa so ga avtorji pri tem eksperimentu uporabili zaradi njegove kratke dolžine (500 baznih parov). V ''N. crassi'' so namreč prisotne ponavljajoče se inducirane točkovne mutacije (RIP), kot obrambni mehanizem za zmanjšanje aktivnosti in širjenja mobilnih genetskih elementov, ki pa je manj pogosta v krajših segmentih DNA [1].

Rezultati so pokazali, da se sev ''hsp30:clr-2'' ne razvija v tekočih gojiščih z Avicelom (kristalinična celuloza) pri normalni temperaturi (25 °C). Vendar pa se po vsakodnevnih impulzih toplote (45 °C) rast povrne in celo preseže WT sev plesni [1].

== Načrtovanje sintetičnega promotorja iz domnevnih ''cis'' regij ''hsp30'' ==
Da bi uporabili vse domnevne regije ''hse'', in hkrati znižali pogostost RIP-induciranih mutacij so avtorji načrtali 2 sintetična promotorja. Ocenili so minimalno dolžino bližnjega promotorja (okoli 250 bp) in mu dodali domnevne regije ''hse''. S primerjavo promotorja ''hse30'' s promotorji ''hse30'' iz sorodnih organizmov ''N. crasse'' so identificirali še peto regijo ''hse'', ki je prav tako ohranjena, in tudi njo vključili v konstrukt. Razlika med sintetičnima promoterjema je bila zgolj v dolžini vmesnikov med domnevnimi regulatornimi regijami ''hse'' [1].

Tudi oba sintetična promotorja sta izkazala dobro nastavljivost pri različnih toplotnih tretmajih, vendar sta oba prikazala relativno močno bazalno aktivnost. Je pa tovrstno puščanje promotorja velikokrat prisotno ob načrtovanju umetnih promotorjev. Vseeno pa sta se oba nova promotorja izkazala za bolj uporaben sistem nastavljivega izražanja od promotorjev ''hsp70'' in ''hsp80'', prav tako so opazili višje stopnje izražanja od najkrajše verzije promotorja ''hsp30''. Zaradi velike ohranjenosti promotorja ''hsp30'' bi podobni promotorji najverjetneje delovali tudi v ostalih askomicetah, kot na primer v biotehnološko pomembnih ''Aspergillus niger'' ali ''Trichoderma reesei'' [1, 2].

== Zaključek ==
Sistem s finim uravnavanjem transkripcije preko toplotne indukcije predstavlja obetavno orodje za raziskave funkcije genov, pa tudi za biotehnološke aplikacije, kot so proizvodnja encimov, metabolitov ali drugih biološko pomembnih snovi. V primerjavi s kemično induciranimi sistemi se izkaže za lažje reverzibilen sistem, saj ni treba dodajati eksogenih sredstev, ki jih je težko odstraniti iz gojišča. Hkrati pa je enostaven za uporabo, sploh v primerjavi s svetlobno indukcijo, kjer je potreba po dobro definiranih laboratorijskih nastavitvah (temna soba). Vendar pa se pri toplotni indukciji pojavljajo potencialne težave oziroma omejitve, kot so stres za organizem ali neselektivna aktivacija genov [1, 3].

Ko so zapis za CLR-2 postavili pod promotor ''hse30'' , so avtorji (kljub izbiri neoptimalnega promotorja) prikazali možnost uporabe toplotno inducibilnega sistema za regulacijo izražanja pri želenih fenotipih. Ob nadaljnji optimizaciji procesa bi se celulazna aktivnost plesni dodatno povečala, kar odpira priložnost uporabe tovrstnih sistemov v industriji. Glavna ovira pri industrijski uporabi razgradnje celuloze so namreč visoki stroški proizvodnje encimov, kar tudi preprečuje nižje cene bioetanola [1, 4].

== Literatura ==

[1] C. Tabilo-Agurto, V. Del Rio-Pinilla, V. Eltit-Villarroel, A. Goity, F. Muñoz-Guzmán, in L. F. Larrondo, „Developing a Temperature-Inducible Transcriptional Rheostat in Neurospora crassa“, mBio, let. 14, št. 1, str. e03291-22, feb. 2023, doi: 10.1128/mbio.03291-22.

[2] J. Han, B. McLane, E.-H. Kim, J.-W. Yoon, in H.-S. Jun, „Remission of diabetes by insulin gene therapy using a hepatocyte-specific and glucose-responsive synthetic promoter“, Mol. Ther. J. Am. Soc. Gene Ther., let. 19, št. 3, str. 470–478, mar. 2011, doi: 10.1038/mt.2010.255.

[3] J. Hearn, I. Ssinabulya, J. I. Schwartz, A. R. Akiteng, H. J. Ross, in J. A. Cafazzo, „Self-management of non-communicable diseases in low- and middle-income countries: A scoping review“, PLOS ONE, let. 14, št. 7, str. e0219141, jul. 2019, doi: 10.1371/journal.pone.0219141.

[4] A. K. Chandel, C. Es, R. Rudravaram, M. L. Narasu, V. Rao, in P. Ravindra, „Economics and environmental impact of bioethanol production technologies: an appraisal“.

Razvoj temperaturno inducibilnega transkripcijskega reostata pri Neurospori crassi

2023-04-11T07:58:01Z

Lsegota: /* Odziv promotorja hsp30 na toplotne dražljaje */

Izhodiščni članek : [https://journals.asm.org/doi/10.1128/mbio.03291-22: Developing a Temperature-Inducible Transcriptional Rheostat in Neurospora crassa]

== Uvod ==
''Neurospora crassa'' je rdeča plesen, ki spada v deblo askomicet. Zaradi svoje majhnosti, enostavnosti vzgoje in opravljanja genskih analiz, je ''N. crassa'' pomemben modelni organizem za raziskovanje številnih bioloških procesov, vključno s celičnim ciklom, fotosintezo, biološkimi ritmi, staranjem in razvojem. Prav tako proizvaja encime, ki razgrajujejo celulozo, kar je koristno pri proizvodnji etanola iz celuloznih virov [1].

Proteini toplotnega šoka (HSP) sodelujejo pri odzivu celice na stresne pogoje, kot so visoke ali nizke temperature, oksidativni stres in izpostavljenost strupenim snovem. Delujejo kot šaperoni, njihova naloga pa je zaščititi celice pred poškodbami s preprečevanjem nepravilnega zvitja proteinov. Vendar pa področje uravnavanja izražanja genov, ki kodirajo proteine HSP, še vedno ostaja delno neraziskano, zlasti v kontekstu modelnih glivnih organizmov, kot je ''N. crassa''. Faktorji toplotnega šoka (HSF) so pri stresnih pogojih aktivatorji transkripcije za proteine HSP. Po oligomerizaciji se faktorji HSF vežejo na DNA, in sicer na elemente toplotnega šoka (''hse''), ki so pri evkariontih relativno ohranjeni. V ''N. crassi'' so opisani trije geni hsp (''hsp30'', ''hsp70'' in ''hsp80''), ki se vsi izražajo pri visokih temperaturah, prav tako pa so pri vsakem odkrili domnevne ''cis'' regulatorne elemente [1].

V ''N. crassa'' so načrtali že mnogo promotorjev, ki se odzivajo na kemične signale (kot so glukoza, kininska kislina in baker), od fizično induciranih sistemov pa so razvili le takšnega, ki se odziva na svetlobo. Temperaturno induciran sistem, bi medtem omogočil zelo enostavno uravnavanje izražanja genov brez potrebe po dodajanju eksogenih kemikalij [1].

== Funkcijska analiza promotorjev ''hsp'' ==
V preteklih študijah so pri promotorju gena ''hsp30'' definirali štiri regije ''hse'', medtem ko so v promotorju ''hsp70'' našli dve. ''hsp70'' ne vsebuje regulatornih elementov ''hse'', vendar so opisane nekoliko različne ''cis'' regije, poimenovane kot elementi odziva na temperaturo (''tre'').
Da bi bolj okarakterizirali regulacijo genov so pripravili paleto konstruktov, ki so poleg bližnjega promotorja vsebovali različno dolge 5' regije. Različni konstrukti enakega gena pa so pri tem vsebovali raznoliko število regulatornih ''cis'' elementov. Za analizo so uporabili luciferazo iz kresničke z dodanim zaporedjem PEST (ki poveča razgradnjo proteina), kar skupaj tvori reporterski sistem za zaznavo transkripcije v realnem času. Pri sobni temperaturi so nagojili reporterske seve plesni in jih v temi izpostavili enournemu toplotnemu šoku pri treh različnih temperaturah: dveh visokih (35 °C in 45 °C) in eni, ki je bila bližja laboratorijskim rastnim pogojem ''N. crasse'' (30 °C), in merili luminiscenco s CCD kamero [1].

Vsi polno dolgi konstrukti so izkazali podobno hiter in močen odziv na toplotni šok pri 45 °C, medtem ko je bil odziv pri 35 °C neprimerno nižji, pri 30 °C pa odziva sploh ni bilo. Skrajšani konstrukti so se pri ''hsp30'' in ''hsp70'' odzivali v skladu s številom domnevnih regij ''hse'', ki so jih vsebovali. Medtem je konstrukt s polovičnim promotorjem ''hsp80'' (ki je vseboval 5 od 7 domnevnih regij ''tre''), pokazal kar 9-krat nižji odziv od konstrukta s polnim promotorjem, kar kaže na pomanjkljivo poznavanje regulacije promotorja ''hse80''. Izmed treh genov so pri ''hsp30'' opazili mnogo najnižje puščanje promotorja (pri 25 °C), zaradi česa so pri omenjenem genu opazili več kot 1000-kratno povečanje izražanja (razmerje med bazalnim vrhom in induciranim vrhom) [1].

HSP30 ima nižjo molekularno maso od ostalih dveh sorodnih proteinov (30 kDa proti 70 kDa / 80 kDa) na račun odsotnosti ATP-hidrolizne domene. Zaradi tega so pri stresnih pogojih manjši HSP-ji prvi, ki posredujejo proti proteinski denaturaciji, kar korelira tudi z opaženo visoko stopnjo povečanja izražanja pri ''hsp30''.
Avtorji so ''hsp30'' primerjali z drugimi znanimi inducibilnimi sistemi v ''N. crassa'', kot sta promotor ''qa-2'', ki se odziva na naraščajoče koncentracije kininske kisline in promotor ''vvd'', ki se aktivira s svetlobo. Promotor ''hsp30'' je imel najnižjo bazalno aktivnost in pa najvišjo aktivnost v induciranem stanju, potreboval pa je dlje časa za regeneracijo do minimuma aktivnosti po dražljaju (7 h) od promotorja ''vvd'' (4 h) [1].

== Odziv promotorja ''hsp30'' na toplotne dražljaje ==
Zaradi najbolj robustnega odziva na toplotne dražljaje so avtorji za nadaljnje delo izbrali promotor ''hsp30''. Zanimalo jih je promotorjev odziv na različno dolge toplotne dražljaje pri različnih temperaturah, zato so skonstruirali pristop, ki omogoča hitro in enostavno analizo.
Eksperiment so opravili v formatu mikrotitrske plošče za PCR in testirali 3 različne promotorje ''hsp30'' (en celoten in dva skrajšana). Pripravili so paleto različnih pogojev in ocenjevali odziv promotorja z merjenjem luminiscence. Vzorci so bili izpostavljeni šestim različnim temperaturam (v rangu od 34 °C do 46 °C), pri čem so toplotni dražljaji trajali 60, 30, 15, 5, in 1 min. V obzir pa je treba vzeti, da je zaradi relativno majhnega volumna gojišča (PCR mikrocentrifugirka), bila omejena količina dodanega medija in zato omejena rast plesni [1].

Konstrukti s promotorji ''hsp30'' so se izkazali za izjemno nastavljive sisteme, saj se je stopnja odziva povečevala, ko se je zviševala temperatura, prav tako pa so opazili večji odziv, kjer je temperaturni dražljaj trajal dlje časa. Vendar pa je maksimalni odziv bil opažen pri 15 min, pri daljših izpostavljenostih višji temperaturi pa je izražanje bilo nižje, kar so avtorji pripisovali upadu celične funkcije zaradi visokih temperatur. Že pri najkrajši izpostavljenosti (1 min) višji temperaturi je sistem podal robustni odziv.
Kot najbolj optimalna sistema sta se izkazala oba daljša promotorja (vsebujeta vse domnevne elemente ''hse''), saj so pri njima opazili močnejšo indukcijo in manjše puščanje promotorja v primerjavi s krajšim konstruktom [1].

== Temperaturno pogojena rast ''N. crasse'' ==
Celulozni regulator 2 (CLR-2) je transkripcijski faktor, ki je ključen pri regulaciji celulazne aktivnosti ''N. crasse'', saj je potreben za indukcijo ekspresije celulolitičnih genov. V industriji je pomembno nadzorovano izražanje CLR-2, s tem se na primer poveča proizvodnja bioetanola. Avtorji so pripravili sev ''N. crasse'', pri katerem so zapis za CLR-2 postavili pod promotor ''hsp30'' in opazovali rast celic pri različnih pogojih.
Najkrajši promotor ''hse30'' vsebuje le dve od štirih domnevnih regij ''hse'' in se je zato izkazal kot najmanj optimalen sistem za uravnavanje transkripcije (glej Odziv promotorja ''hsp30'' na toplotne dražljaje). Vseeno pa so ga avtorji pri tem eksperimentu uporabili zaradi njegove kratke dolžine (500 baznih parov). V ''N. crassi'' so namreč prisotne ponavljajoče se inducirane točkovne mutacije (RIP), kot obrambni mehanizem za zmanjšanje aktivnosti in širjenja mobilnih genetskih elementov, ki pa je manj pogosta v krajših segmentih DNA [1].

Rezultati so pokazali, da se sev ''hsp300:clr-2'' ne razvija v tekočih gojiščih z Avicelom (kristalinična celuloza) pri normalni temperaturi (25 °C). Vendar pa se po vsakodnevnih impulzih toplote (45 °C) rast povrne in celo preseže WT sev plesni [1].

== Načrtovanje sintetičnega promotorja iz domnevnih ''cis'' regij ''hsp30'' ==
Da bi uporabili vse domnevne regije ''hse'', in hkrati znižali pogostost RIP-induciranih mutacij so avtorji načrtali 2 sintetična promotorja. Ocenili so minimalno dolžino bližnjega promotorja (okoli 250 bp) in mu dodali domnevne regije ''hse''. S primerjavo promotorja ''hse30'' s promotorji ''hse30'' iz sorodnih organizmov ''N. crasse'' so identificirali še peto regijo ''hse'', ki je prav tako ohranjena, in tudi njo vključili v konstrukt. Razlika med sintetičnima promoterjema je bila zgolj v dolžini vmesnikov med domnevnimi regulatornimi regijami ''hse'' [1].

Tudi oba sintetična promotorja sta izkazala dobro nastavljivost pri različnih toplotnih tretmajih, vendar sta oba prikazala relativno močno bazalno aktivnost. Je pa tovrstno puščanje promotorja velikokrat prisotno ob načrtovanju umetnih promotorjev. Vseeno pa sta se oba nova promotorja izkazala za bolj uporaben sistem nastavljivega izražanja od promotorjev ''hsp70'' in ''hsp80'', prav tako so opazili višje stopnje izražanja od najkrajše verzije promotorja ''hsp30''. Zaradi velike ohranjenosti promotorja ''hsp30'' bi podobni promotorji najverjetneje delovali tudi v ostalih askomicetah, kot na primer v biotehnološko pomembnih ''Aspergillus niger'' ali ''Trichoderma reesei'' [1, 2].

== Zaključek ==
Sistem s finim uravnavanjem transkripcije preko toplotne indukcije predstavlja obetavno orodje za raziskave funkcije genov, pa tudi za biotehnološke aplikacije, kot so proizvodnja encimov, metabolitov ali drugih biološko pomembnih snovi. V primerjavi s kemično induciranimi sistemi se izkaže za lažje reverzibilen sistem, saj ni treba dodajati eksogenih sredstev, ki jih je težko odstraniti iz gojišča. Hkrati pa je enostaven za uporabo, sploh v primerjavi s svetlobno indukcijo, kjer je potreba po dobro definiranih laboratorijskih nastavitvah (temna soba). Vendar pa se pri toplotni indukciji pojavljajo potencialne težave oziroma omejitve, kot so stres za organizem ali neselektivna aktivacija genov [1, 3].

Ko so zapis za CLR-2 postavili pod promotor ''hse30'' , so avtorji (kljub izbiri neoptimalnega promotorja) prikazali možnost uporabe toplotno inducibilnega sistema za regulacijo izražanja pri želenih fenotipih. Ob nadaljnji optimizaciji procesa bi se celulazna aktivnost plesni dodatno povečala, kar odpira priložnost uporabe tovrstnih sistemov v industriji. Glavna ovira pri industrijski uporabi razgradnje celuloze so namreč visoki stroški proizvodnje encimov, kar tudi preprečuje nižje cene bioetanola [1, 4].

== Literatura ==

[1] C. Tabilo-Agurto, V. Del Rio-Pinilla, V. Eltit-Villarroel, A. Goity, F. Muñoz-Guzmán, in L. F. Larrondo, „Developing a Temperature-Inducible Transcriptional Rheostat in Neurospora crassa“, mBio, let. 14, št. 1, str. e03291-22, feb. 2023, doi: 10.1128/mbio.03291-22.

[2] J. Han, B. McLane, E.-H. Kim, J.-W. Yoon, in H.-S. Jun, „Remission of diabetes by insulin gene therapy using a hepatocyte-specific and glucose-responsive synthetic promoter“, Mol. Ther. J. Am. Soc. Gene Ther., let. 19, št. 3, str. 470–478, mar. 2011, doi: 10.1038/mt.2010.255.

[3] J. Hearn, I. Ssinabulya, J. I. Schwartz, A. R. Akiteng, H. J. Ross, in J. A. Cafazzo, „Self-management of non-communicable diseases in low- and middle-income countries: A scoping review“, PLOS ONE, let. 14, št. 7, str. e0219141, jul. 2019, doi: 10.1371/journal.pone.0219141.

[4] A. K. Chandel, C. Es, R. Rudravaram, M. L. Narasu, V. Rao, in P. Ravindra, „Economics and environmental impact of bioethanol production technologies: an appraisal“.

Razvoj temperaturno inducibilnega transkripcijskega reostata pri Neurospori crassi

2023-04-11T07:53:39Z

Lsegota: /* Funkcijska analiza promotorjev hsp */

Izhodiščni članek : [https://journals.asm.org/doi/10.1128/mbio.03291-22: Developing a Temperature-Inducible Transcriptional Rheostat in Neurospora crassa]

== Uvod ==
''Neurospora crassa'' je rdeča plesen, ki spada v deblo askomicet. Zaradi svoje majhnosti, enostavnosti vzgoje in opravljanja genskih analiz, je ''N. crassa'' pomemben modelni organizem za raziskovanje številnih bioloških procesov, vključno s celičnim ciklom, fotosintezo, biološkimi ritmi, staranjem in razvojem. Prav tako proizvaja encime, ki razgrajujejo celulozo, kar je koristno pri proizvodnji etanola iz celuloznih virov [1].

Proteini toplotnega šoka (HSP) sodelujejo pri odzivu celice na stresne pogoje, kot so visoke ali nizke temperature, oksidativni stres in izpostavljenost strupenim snovem. Delujejo kot šaperoni, njihova naloga pa je zaščititi celice pred poškodbami s preprečevanjem nepravilnega zvitja proteinov. Vendar pa področje uravnavanja izražanja genov, ki kodirajo proteine HSP, še vedno ostaja delno neraziskano, zlasti v kontekstu modelnih glivnih organizmov, kot je ''N. crassa''. Faktorji toplotnega šoka (HSF) so pri stresnih pogojih aktivatorji transkripcije za proteine HSP. Po oligomerizaciji se faktorji HSF vežejo na DNA, in sicer na elemente toplotnega šoka (''hse''), ki so pri evkariontih relativno ohranjeni. V ''N. crassi'' so opisani trije geni hsp (''hsp30'', ''hsp70'' in ''hsp80''), ki se vsi izražajo pri visokih temperaturah, prav tako pa so pri vsakem odkrili domnevne ''cis'' regulatorne elemente [1].

V ''N. crassa'' so načrtali že mnogo promotorjev, ki se odzivajo na kemične signale (kot so glukoza, kininska kislina in baker), od fizično induciranih sistemov pa so razvili le takšnega, ki se odziva na svetlobo. Temperaturno induciran sistem, bi medtem omogočil zelo enostavno uravnavanje izražanja genov brez potrebe po dodajanju eksogenih kemikalij [1].

== Funkcijska analiza promotorjev ''hsp'' ==
V preteklih študijah so pri promotorju gena ''hsp30'' definirali štiri regije ''hse'', medtem ko so v promotorju ''hsp70'' našli dve. ''hsp70'' ne vsebuje regulatornih elementov ''hse'', vendar so opisane nekoliko različne ''cis'' regije, poimenovane kot elementi odziva na temperaturo (''tre'').
Da bi bolj okarakterizirali regulacijo genov so pripravili paleto konstruktov, ki so poleg bližnjega promotorja vsebovali različno dolge 5' regije. Različni konstrukti enakega gena pa so pri tem vsebovali raznoliko število regulatornih ''cis'' elementov. Za analizo so uporabili luciferazo iz kresničke z dodanim zaporedjem PEST (ki poveča razgradnjo proteina), kar skupaj tvori reporterski sistem za zaznavo transkripcije v realnem času. Pri sobni temperaturi so nagojili reporterske seve plesni in jih v temi izpostavili enournemu toplotnemu šoku pri treh različnih temperaturah: dveh visokih (35 °C in 45 °C) in eni, ki je bila bližja laboratorijskim rastnim pogojem ''N. crasse'' (30 °C), in merili luminiscenco s CCD kamero [1].

Vsi polno dolgi konstrukti so izkazali podobno hiter in močen odziv na toplotni šok pri 45 °C, medtem ko je bil odziv pri 35 °C neprimerno nižji, pri 30 °C pa odziva sploh ni bilo. Skrajšani konstrukti so se pri ''hsp30'' in ''hsp70'' odzivali v skladu s številom domnevnih regij ''hse'', ki so jih vsebovali. Medtem je konstrukt s polovičnim promotorjem ''hsp80'' (ki je vseboval 5 od 7 domnevnih regij ''tre''), pokazal kar 9-krat nižji odziv od konstrukta s polnim promotorjem, kar kaže na pomanjkljivo poznavanje regulacije promotorja ''hse80''. Izmed treh genov so pri ''hsp30'' opazili mnogo najnižje puščanje promotorja (pri 25 °C), zaradi česa so pri omenjenem genu opazili več kot 1000-kratno povečanje izražanja (razmerje med bazalnim vrhom in induciranim vrhom) [1].

HSP30 ima nižjo molekularno maso od ostalih dveh sorodnih proteinov (30 kDa proti 70 kDa / 80 kDa) na račun odsotnosti ATP-hidrolizne domene. Zaradi tega so pri stresnih pogojih manjši HSP-ji prvi, ki posredujejo proti proteinski denaturaciji, kar korelira tudi z opaženo visoko stopnjo povečanja izražanja pri ''hsp30''.
Avtorji so ''hsp30'' primerjali z drugimi znanimi inducibilnimi sistemi v ''N. crassa'', kot sta promotor ''qa-2'', ki se odziva na naraščajoče koncentracije kininske kisline in promotor ''vvd'', ki se aktivira s svetlobo. Promotor ''hsp30'' je imel najnižjo bazalno aktivnost in pa najvišjo aktivnost v induciranem stanju, potreboval pa je dlje časa za regeneracijo do minimuma aktivnosti po dražljaju (7 h) od promotorja ''vvd'' (4 h) [1].

== Odziv promotorja ''hsp30'' na toplotne dražljaje ==
Zaradi najbolj robustnega odziva na toplotne dražljaje so avtorji za nadaljnje delo izbrali promotor ''hsp30''. Zanimalo jih je promotorjev odziv na različno dolge toplotne dražljaje pri različnih temperaturah, zato so skonstruirali pristop, ki omogoča hitro in enostavno analizo.
Eksperiment so opravili v formatu mikrotitrske plošče za PCR in testirali 3 različne promotorje ''hsp30'' (en celoten in dva skrajšana). Pripravili so paleto različnih pogojev in ocenjevali odziv promotorja z merjenjem luminiscence. Vzorci so bili izpostavljeni šestim različnim temperaturam (v rangu od 34 °C do 46 °C), pri čem so toplotni dražljaji trajali 60, 30, 15, 5, in 1 min. V obzir pa je treba vzeti, da je zaradi relativno majhnega volumna gojišča (PCR mikrocentrifugirka), bila omejena količina dodanega medija in zato omejena rast plesni [1].

Konstrukti s promotorji ''hsp30'' so se izkazali za izjemno nastavljive sisteme, saj se je stopnja odziva povečevala, ko se je zviševala temperatura, prav tako pa so opazili večji odziv, kjer je temperaturni dražljaj trajal dlje časa. Vendar pa je maksimalni odziv bil opažen pri 15 min, pri daljših izpostavljenostih višji temperaturi pa je izražanje bilo nižje, kar so avtorji pripisovali upadu celične funkcije zaradi visokih temperatur. Že pri najkrajši izpostavljenosti (1 min) višji temperaturi je sistem podal robustni odziv.
Kot najbolj optimalna sistema sta se izkazala oba daljša konstrukta (vsebujeta vse domnevne elemente ''hse''), saj so pri njima opazili močnejšo indukcijo in manjše puščanje promotorja v primerjavi s krajšim konstruktom [1].

== Temperaturno pogojena rast ''N. crasse'' ==
Celulozni regulator 2 (CLR-2) je transkripcijski faktor, ki je ključen pri regulaciji celulazne aktivnosti ''N. crasse'', saj je potreben za indukcijo ekspresije celulolitičnih genov. V industriji je pomembno nadzorovano izražanje CLR-2, s tem se na primer poveča proizvodnja bioetanola. Avtorji so pripravili sev ''N. crasse'', pri katerem so zapis za CLR-2 postavili pod promotor ''hsp30'' in opazovali rast celic pri različnih pogojih.
Najkrajši promotor ''hse30'' vsebuje le dve od štirih domnevnih regij ''hse'' in se je zato izkazal kot najmanj optimalen sistem za uravnavanje transkripcije (glej Odziv promotorja ''hsp30'' na toplotne dražljaje). Vseeno pa so ga avtorji pri tem eksperimentu uporabili zaradi njegove kratke dolžine (500 baznih parov). V ''N. crassi'' so namreč prisotne ponavljajoče se inducirane točkovne mutacije (RIP), kot obrambni mehanizem za zmanjšanje aktivnosti in širjenja mobilnih genetskih elementov, ki pa je manj pogosta v krajših segmentih DNA [1].

Rezultati so pokazali, da se sev ''hsp300:clr-2'' ne razvija v tekočih gojiščih z Avicelom (kristalinična celuloza) pri normalni temperaturi (25 °C). Vendar pa se po vsakodnevnih impulzih toplote (45 °C) rast povrne in celo preseže WT sev plesni [1].

== Načrtovanje sintetičnega promotorja iz domnevnih ''cis'' regij ''hsp30'' ==
Da bi uporabili vse domnevne regije ''hse'', in hkrati znižali pogostost RIP-induciranih mutacij so avtorji načrtali 2 sintetična promotorja. Ocenili so minimalno dolžino bližnjega promotorja (okoli 250 bp) in mu dodali domnevne regije ''hse''. S primerjavo promotorja ''hse30'' s promotorji ''hse30'' iz sorodnih organizmov ''N. crasse'' so identificirali še peto regijo ''hse'', ki je prav tako ohranjena, in tudi njo vključili v konstrukt. Razlika med sintetičnima promoterjema je bila zgolj v dolžini vmesnikov med domnevnimi regulatornimi regijami ''hse'' [1].

Tudi oba sintetična promotorja sta izkazala dobro nastavljivost pri različnih toplotnih tretmajih, vendar sta oba prikazala relativno močno bazalno aktivnost. Je pa tovrstno puščanje promotorja velikokrat prisotno ob načrtovanju umetnih promotorjev. Vseeno pa sta se oba nova promotorja izkazala za bolj uporaben sistem nastavljivega izražanja od promotorjev ''hsp70'' in ''hsp80'', prav tako so opazili višje stopnje izražanja od najkrajše verzije promotorja ''hsp30''. Zaradi velike ohranjenosti promotorja ''hsp30'' bi podobni promotorji najverjetneje delovali tudi v ostalih askomicetah, kot na primer v biotehnološko pomembnih ''Aspergillus niger'' ali ''Trichoderma reesei'' [1, 2].

== Zaključek ==
Sistem s finim uravnavanjem transkripcije preko toplotne indukcije predstavlja obetavno orodje za raziskave funkcije genov, pa tudi za biotehnološke aplikacije, kot so proizvodnja encimov, metabolitov ali drugih biološko pomembnih snovi. V primerjavi s kemično induciranimi sistemi se izkaže za lažje reverzibilen sistem, saj ni treba dodajati eksogenih sredstev, ki jih je težko odstraniti iz gojišča. Hkrati pa je enostaven za uporabo, sploh v primerjavi s svetlobno indukcijo, kjer je potreba po dobro definiranih laboratorijskih nastavitvah (temna soba). Vendar pa se pri toplotni indukciji pojavljajo potencialne težave oziroma omejitve, kot so stres za organizem ali neselektivna aktivacija genov [1, 3].

Ko so zapis za CLR-2 postavili pod promotor ''hse30'' , so avtorji (kljub izbiri neoptimalnega promotorja) prikazali možnost uporabe toplotno inducibilnega sistema za regulacijo izražanja pri želenih fenotipih. Ob nadaljnji optimizaciji procesa bi se celulazna aktivnost plesni dodatno povečala, kar odpira priložnost uporabe tovrstnih sistemov v industriji. Glavna ovira pri industrijski uporabi razgradnje celuloze so namreč visoki stroški proizvodnje encimov, kar tudi preprečuje nižje cene bioetanola [1, 4].

== Literatura ==

[1] C. Tabilo-Agurto, V. Del Rio-Pinilla, V. Eltit-Villarroel, A. Goity, F. Muñoz-Guzmán, in L. F. Larrondo, „Developing a Temperature-Inducible Transcriptional Rheostat in Neurospora crassa“, mBio, let. 14, št. 1, str. e03291-22, feb. 2023, doi: 10.1128/mbio.03291-22.

[2] J. Han, B. McLane, E.-H. Kim, J.-W. Yoon, in H.-S. Jun, „Remission of diabetes by insulin gene therapy using a hepatocyte-specific and glucose-responsive synthetic promoter“, Mol. Ther. J. Am. Soc. Gene Ther., let. 19, št. 3, str. 470–478, mar. 2011, doi: 10.1038/mt.2010.255.

[3] J. Hearn, I. Ssinabulya, J. I. Schwartz, A. R. Akiteng, H. J. Ross, in J. A. Cafazzo, „Self-management of non-communicable diseases in low- and middle-income countries: A scoping review“, PLOS ONE, let. 14, št. 7, str. e0219141, jul. 2019, doi: 10.1371/journal.pone.0219141.

[4] A. K. Chandel, C. Es, R. Rudravaram, M. L. Narasu, V. Rao, in P. Ravindra, „Economics and environmental impact of bioethanol production technologies: an appraisal“.

Razvoj temperaturno inducibilnega transkripcijskega reostata pri Neurospori crassi

2023-04-11T07:52:05Z

Lsegota: /* Funkcijska analiza promotorjev hsp */

Izhodiščni članek : [https://journals.asm.org/doi/10.1128/mbio.03291-22: Developing a Temperature-Inducible Transcriptional Rheostat in Neurospora crassa]

== Uvod ==
''Neurospora crassa'' je rdeča plesen, ki spada v deblo askomicet. Zaradi svoje majhnosti, enostavnosti vzgoje in opravljanja genskih analiz, je ''N. crassa'' pomemben modelni organizem za raziskovanje številnih bioloških procesov, vključno s celičnim ciklom, fotosintezo, biološkimi ritmi, staranjem in razvojem. Prav tako proizvaja encime, ki razgrajujejo celulozo, kar je koristno pri proizvodnji etanola iz celuloznih virov [1].

Proteini toplotnega šoka (HSP) sodelujejo pri odzivu celice na stresne pogoje, kot so visoke ali nizke temperature, oksidativni stres in izpostavljenost strupenim snovem. Delujejo kot šaperoni, njihova naloga pa je zaščititi celice pred poškodbami s preprečevanjem nepravilnega zvitja proteinov. Vendar pa področje uravnavanja izražanja genov, ki kodirajo proteine HSP, še vedno ostaja delno neraziskano, zlasti v kontekstu modelnih glivnih organizmov, kot je ''N. crassa''. Faktorji toplotnega šoka (HSF) so pri stresnih pogojih aktivatorji transkripcije za proteine HSP. Po oligomerizaciji se faktorji HSF vežejo na DNA, in sicer na elemente toplotnega šoka (''hse''), ki so pri evkariontih relativno ohranjeni. V ''N. crassi'' so opisani trije geni hsp (''hsp30'', ''hsp70'' in ''hsp80''), ki se vsi izražajo pri visokih temperaturah, prav tako pa so pri vsakem odkrili domnevne ''cis'' regulatorne elemente [1].

V ''N. crassa'' so načrtali že mnogo promotorjev, ki se odzivajo na kemične signale (kot so glukoza, kininska kislina in baker), od fizično induciranih sistemov pa so razvili le takšnega, ki se odziva na svetlobo. Temperaturno induciran sistem, bi medtem omogočil zelo enostavno uravnavanje izražanja genov brez potrebe po dodajanju eksogenih kemikalij [1].

== Funkcijska analiza promotorjev ''hsp'' ==
V preteklih študijah so pri promotorju gena ''hsp30'' definirali štiri regije ''hse'', medtem ko so v promotorju ''hsp70'' našli dve. ''hsp70'' ne vsebuje regulatornih elementov ''hse'', vendar so opisane nekoliko različne ''cis'' regije, poimenovane kot elementi odziva na temperaturo (''tre'').
Da bi bolj okarakterizirali regulacijo genov so pripravili paleto konstruktov, ki so poleg bližnjega promotorja vsebovali različno dolge 5' regije. Različni konstrukti enakega gena pa so pri tem vsebovali raznoliko število regulatornih ''cis'' elementov. Za analizo so uporabili luciferazo iz kresničke z dodanim zaporedjem PEST (ki poveča razgradnjo proteina), kar skupaj tvori reporterski sistem za zaznavo transkripcije v realnem času. Pri sobni temperaturi so nagojili reporterske seve plesni in jih v temi izpostavili enournemu toplotnemu šoku pri treh različnih temperaturah: dveh visokih (35 °C in 45 °C) in eni, ki je bila bližja laboratorijskim rastnim pogojem ''N. crasse'' (30 °C), in merili luminiscenco s CCD kamero [1].

Vsi polno dolgi konstrukti so izkazali podobno hiter in močen odziv na toplotni šok pri 45 °C, medtem ko je bil odziv pri 35 °C neprimerno nižji, pri 30 °C pa odziva sploh ni bilo. Skrajšani konstrukti so se pri ''hsp30'' in ''hsp70'' odzivali v skladu s številom domnevnih regij ''hse'', ki so jih vsebovali. Medtem je konstrukt s polovičnim promotorjem ''hsp80'' (ki je vseboval 5 od 7 domnevnih regij ''tre''), pokazal kar 9-krat nižji odziv od konstrukta s polnim promotorjem, kar kaže na pomanjkljivo poznavanje regulacije promotorja ''hse80''. Izmed treh genov so pri ''hsp30'' opazili mnogo najnižje puščanje promotorja (pri 25 °C), zaradi česa so pri omenjenem genu opazili več kot 1000-kratno povečanje izražanja (razmerje med bazalnim vrhom in induciranim vrhom) [1].

HSP30 ima nižjo molekularno maso od ostalih dveh sorodnih proteinov (30 kDa proti 70 kDa / 80 kDa) na račun odsotnosti ATP-hidrolizne domene. Zaradi tega so pri stresnih pogojih manjši HSP-ji prvi, ki posredujejo proti proteinski denaturaciji, kar korelira tudi z opaženo visoko stopnjo povečanja izražanja pri ''hsp30''.
Avtorji so ''hsp30'' primerjali z drugimi znanimi inducibilnimi sistemi v ''N. crassa'', kot sta promotor ''qa-2'', ki se odziva na naraščajoče koncentracije kininske kisline in promotor ''vvd'', ki se aktivira s svetlobo. Promotor ''hsp30'' je imel najnižjo bazalno aktivnost in pa najvišjo aktivnost v induciranem stanjupotreboval pa je dlje časa za regeneracijo do minimuma aktivnosti po dražljaju (7 h) od promotorja ''vvd'' (4 h) [1].

== Odziv promotorja ''hsp30'' na toplotne dražljaje ==
Zaradi najbolj robustnega odziva na toplotne dražljaje so avtorji za nadaljnje delo izbrali promotor ''hsp30''. Zanimalo jih je promotorjev odziv na različno dolge toplotne dražljaje pri različnih temperaturah, zato so skonstruirali pristop, ki omogoča hitro in enostavno analizo.
Eksperiment so opravili v formatu mikrotitrske plošče za PCR in testirali 3 različne promotorje ''hsp30'' (en celoten in dva skrajšana). Pripravili so paleto različnih pogojev in ocenjevali odziv promotorja z merjenjem luminiscence. Vzorci so bili izpostavljeni šestim različnim temperaturam (v rangu od 34 °C do 46 °C), pri čem so toplotni dražljaji trajali 60, 30, 15, 5, in 1 min. V obzir pa je treba vzeti, da je zaradi relativno majhnega volumna gojišča (PCR mikrocentrifugirka), bila omejena količina dodanega medija in zato omejena rast plesni [1].

Konstrukti s promotorji ''hsp30'' so se izkazali za izjemno nastavljive sisteme, saj se je stopnja odziva povečevala, ko se je zviševala temperatura, prav tako pa so opazili večji odziv, kjer je temperaturni dražljaj trajal dlje časa. Vendar pa je maksimalni odziv bil opažen pri 15 min, pri daljših izpostavljenostih višji temperaturi pa je izražanje bilo nižje, kar so avtorji pripisovali upadu celične funkcije zaradi visokih temperatur. Že pri najkrajši izpostavljenosti (1 min) višji temperaturi je sistem podal robustni odziv.
Kot najbolj optimalna sistema sta se izkazala oba daljša konstrukta (vsebujeta vse domnevne elemente ''hse''), saj so pri njima opazili močnejšo indukcijo in manjše puščanje promotorja v primerjavi s krajšim konstruktom [1].

== Temperaturno pogojena rast ''N. crasse'' ==
Celulozni regulator 2 (CLR-2) je transkripcijski faktor, ki je ključen pri regulaciji celulazne aktivnosti ''N. crasse'', saj je potreben za indukcijo ekspresije celulolitičnih genov. V industriji je pomembno nadzorovano izražanje CLR-2, s tem se na primer poveča proizvodnja bioetanola. Avtorji so pripravili sev ''N. crasse'', pri katerem so zapis za CLR-2 postavili pod promotor ''hsp30'' in opazovali rast celic pri različnih pogojih.
Najkrajši promotor ''hse30'' vsebuje le dve od štirih domnevnih regij ''hse'' in se je zato izkazal kot najmanj optimalen sistem za uravnavanje transkripcije (glej Odziv promotorja ''hsp30'' na toplotne dražljaje). Vseeno pa so ga avtorji pri tem eksperimentu uporabili zaradi njegove kratke dolžine (500 baznih parov). V ''N. crassi'' so namreč prisotne ponavljajoče se inducirane točkovne mutacije (RIP), kot obrambni mehanizem za zmanjšanje aktivnosti in širjenja mobilnih genetskih elementov, ki pa je manj pogosta v krajših segmentih DNA [1].

Rezultati so pokazali, da se sev ''hsp300:clr-2'' ne razvija v tekočih gojiščih z Avicelom (kristalinična celuloza) pri normalni temperaturi (25 °C). Vendar pa se po vsakodnevnih impulzih toplote (45 °C) rast povrne in celo preseže WT sev plesni [1].

== Načrtovanje sintetičnega promotorja iz domnevnih ''cis'' regij ''hsp30'' ==
Da bi uporabili vse domnevne regije ''hse'', in hkrati znižali pogostost RIP-induciranih mutacij so avtorji načrtali 2 sintetična promotorja. Ocenili so minimalno dolžino bližnjega promotorja (okoli 250 bp) in mu dodali domnevne regije ''hse''. S primerjavo promotorja ''hse30'' s promotorji ''hse30'' iz sorodnih organizmov ''N. crasse'' so identificirali še peto regijo ''hse'', ki je prav tako ohranjena, in tudi njo vključili v konstrukt. Razlika med sintetičnima promoterjema je bila zgolj v dolžini vmesnikov med domnevnimi regulatornimi regijami ''hse'' [1].

Tudi oba sintetična promotorja sta izkazala dobro nastavljivost pri različnih toplotnih tretmajih, vendar sta oba prikazala relativno močno bazalno aktivnost. Je pa tovrstno puščanje promotorja velikokrat prisotno ob načrtovanju umetnih promotorjev. Vseeno pa sta se oba nova promotorja izkazala za bolj uporaben sistem nastavljivega izražanja od promotorjev ''hsp70'' in ''hsp80'', prav tako so opazili višje stopnje izražanja od najkrajše verzije promotorja ''hsp30''. Zaradi velike ohranjenosti promotorja ''hsp30'' bi podobni promotorji najverjetneje delovali tudi v ostalih askomicetah, kot na primer v biotehnološko pomembnih ''Aspergillus niger'' ali ''Trichoderma reesei'' [1, 2].

== Zaključek ==
Sistem s finim uravnavanjem transkripcije preko toplotne indukcije predstavlja obetavno orodje za raziskave funkcije genov, pa tudi za biotehnološke aplikacije, kot so proizvodnja encimov, metabolitov ali drugih biološko pomembnih snovi. V primerjavi s kemično induciranimi sistemi se izkaže za lažje reverzibilen sistem, saj ni treba dodajati eksogenih sredstev, ki jih je težko odstraniti iz gojišča. Hkrati pa je enostaven za uporabo, sploh v primerjavi s svetlobno indukcijo, kjer je potreba po dobro definiranih laboratorijskih nastavitvah (temna soba). Vendar pa se pri toplotni indukciji pojavljajo potencialne težave oziroma omejitve, kot so stres za organizem ali neselektivna aktivacija genov [1, 3].

Ko so zapis za CLR-2 postavili pod promotor ''hse30'' , so avtorji (kljub izbiri neoptimalnega promotorja) prikazali možnost uporabe toplotno inducibilnega sistema za regulacijo izražanja pri želenih fenotipih. Ob nadaljnji optimizaciji procesa bi se celulazna aktivnost plesni dodatno povečala, kar odpira priložnost uporabe tovrstnih sistemov v industriji. Glavna ovira pri industrijski uporabi razgradnje celuloze so namreč visoki stroški proizvodnje encimov, kar tudi preprečuje nižje cene bioetanola [1, 4].

== Literatura ==

[1] C. Tabilo-Agurto, V. Del Rio-Pinilla, V. Eltit-Villarroel, A. Goity, F. Muñoz-Guzmán, in L. F. Larrondo, „Developing a Temperature-Inducible Transcriptional Rheostat in Neurospora crassa“, mBio, let. 14, št. 1, str. e03291-22, feb. 2023, doi: 10.1128/mbio.03291-22.

[2] J. Han, B. McLane, E.-H. Kim, J.-W. Yoon, in H.-S. Jun, „Remission of diabetes by insulin gene therapy using a hepatocyte-specific and glucose-responsive synthetic promoter“, Mol. Ther. J. Am. Soc. Gene Ther., let. 19, št. 3, str. 470–478, mar. 2011, doi: 10.1038/mt.2010.255.

[3] J. Hearn, I. Ssinabulya, J. I. Schwartz, A. R. Akiteng, H. J. Ross, in J. A. Cafazzo, „Self-management of non-communicable diseases in low- and middle-income countries: A scoping review“, PLOS ONE, let. 14, št. 7, str. e0219141, jul. 2019, doi: 10.1371/journal.pone.0219141.

[4] A. K. Chandel, C. Es, R. Rudravaram, M. L. Narasu, V. Rao, in P. Ravindra, „Economics and environmental impact of bioethanol production technologies: an appraisal“.

Razvoj temperaturno inducibilnega transkripcijskega reostata pri Neurospori crassi

2023-04-11T07:49:08Z

Lsegota: /* Funkcijska analiza promotorjev hsp */

Izhodiščni članek : [https://journals.asm.org/doi/10.1128/mbio.03291-22: Developing a Temperature-Inducible Transcriptional Rheostat in Neurospora crassa]

== Uvod ==
''Neurospora crassa'' je rdeča plesen, ki spada v deblo askomicet. Zaradi svoje majhnosti, enostavnosti vzgoje in opravljanja genskih analiz, je ''N. crassa'' pomemben modelni organizem za raziskovanje številnih bioloških procesov, vključno s celičnim ciklom, fotosintezo, biološkimi ritmi, staranjem in razvojem. Prav tako proizvaja encime, ki razgrajujejo celulozo, kar je koristno pri proizvodnji etanola iz celuloznih virov [1].

Proteini toplotnega šoka (HSP) sodelujejo pri odzivu celice na stresne pogoje, kot so visoke ali nizke temperature, oksidativni stres in izpostavljenost strupenim snovem. Delujejo kot šaperoni, njihova naloga pa je zaščititi celice pred poškodbami s preprečevanjem nepravilnega zvitja proteinov. Vendar pa področje uravnavanja izražanja genov, ki kodirajo proteine HSP, še vedno ostaja delno neraziskano, zlasti v kontekstu modelnih glivnih organizmov, kot je ''N. crassa''. Faktorji toplotnega šoka (HSF) so pri stresnih pogojih aktivatorji transkripcije za proteine HSP. Po oligomerizaciji se faktorji HSF vežejo na DNA, in sicer na elemente toplotnega šoka (''hse''), ki so pri evkariontih relativno ohranjeni. V ''N. crassi'' so opisani trije geni hsp (''hsp30'', ''hsp70'' in ''hsp80''), ki se vsi izražajo pri visokih temperaturah, prav tako pa so pri vsakem odkrili domnevne ''cis'' regulatorne elemente [1].

V ''N. crassa'' so načrtali že mnogo promotorjev, ki se odzivajo na kemične signale (kot so glukoza, kininska kislina in baker), od fizično induciranih sistemov pa so razvili le takšnega, ki se odziva na svetlobo. Temperaturno induciran sistem, bi medtem omogočil zelo enostavno uravnavanje izražanja genov brez potrebe po dodajanju eksogenih kemikalij [1].

== Funkcijska analiza promotorjev ''hsp'' ==
V preteklih študijah so pri promotorju gena ''hsp30'' definirali štiri regije ''hse'', medtem ko so v promotorju ''hsp70'' našli dve. ''hsp70'' ne vsebuje regulatornih elementov ''hse'', vendar so opisane nekoliko različne ''cis'' regije, poimenovane kot elementi odziva na temperaturo (''tre'').
Da bi bolj okarakterizirali regulacijo genov so pripravili paleto konstruktov, ki so poleg bližnjega promotorja vsebovali različno dolge 5' regije. Različni konstrukti enakega gena pa so pri tem vsebovali raznoliko število regulatornih ''cis'' elementov. Za analizo so uporabili luciferazo iz kresničke z dodanim zaporedjem PEST (ki poveča razgradnjo proteina), kar skupaj tvori reporterski sistem za zaznavo transkripcije v realnem času. Pri sobni temperaturi so nagojili reporterske seve plesni in jih v temi izpostavili enournemu toplotnemu šoku pri treh različnih temperaturah: dveh visokih (35 °C in 45 °C) in eni, ki je bila bližja laboratorijskim rastnim pogojem ''N. crasse'' (30 °C), in merili luminiscenco s CCD kamero [1].

Vsi polno dolgi konstrukti so izkazali podobno hiter in močen odziv na toplotni šok pri 45 °C, medtem ko je bil odziv pri 35 °C neprimerno nižji, pri 30 °C pa odziva sploh ni bilo. Skrajšani konstrukti so se pri ''hsp30'' in ''hsp70'' odzivali v skladu s številom domnevnih regij ''hse'', ki so jih vsebovali. Medtem je konstrukt s polovičnim promotorjem ''hsp80'' (ki je vseboval 5 od 7 domnevnih regij ''tre''), pokazal kar 9-krat nižji odziv od konstrukta s polnim promotorjem, kar kaže na pomanjkljivo poznavanje regulacije promotorja ''hse80''. Izmed treh genov so pri ''hsp30'' opazili mnogo najnižje puščanje promotorja (pri 25 °C), zaradi česa so pri omenjenem genu opazili več kot 1000-kratno povečanje izražanja (razmerje med bazalnim vrhom in induciranim vrhom) [1].

''Hsp30'' ima nižjo molekularno maso od ostalih dveh sorodnih proteinov (30 kDa proti 70 kDa / 80 kDa) na račun odsotnosti ATP-hidrolizne domene. Zaradi tega so pri stresnih pogojih manjši HSP-ji prvi, ki posredujejo proti proteinski denaturaciji, kar korelira tudi z opaženo visoko stopnjo povečanja izražanja pri ''hsp30''.
Avtorji so ''hsp30'' primerjali z drugimi znanimi inducibilnimi sistemi v ''N. crassa'', kot sta promotor ''qa-2'', ki se odziva na naraščajoče koncentracije kininske kisline in promotor ''vvd'', ki se aktivira s svetlobo. Promotor ''hsp30'' je imel najnižjo bazalno aktivnost in pa najvišjo aktivnost v induciranem stanjupotreboval pa je dlje časa za regeneracijo do minimuma aktivnosti po dražljaju (7 h) od promotorja ''vvd'' (4 h) [1].

== Odziv promotorja ''hsp30'' na toplotne dražljaje ==
Zaradi najbolj robustnega odziva na toplotne dražljaje so avtorji za nadaljnje delo izbrali promotor ''hsp30''. Zanimalo jih je promotorjev odziv na različno dolge toplotne dražljaje pri različnih temperaturah, zato so skonstruirali pristop, ki omogoča hitro in enostavno analizo.
Eksperiment so opravili v formatu mikrotitrske plošče za PCR in testirali 3 različne promotorje ''hsp30'' (en celoten in dva skrajšana). Pripravili so paleto različnih pogojev in ocenjevali odziv promotorja z merjenjem luminiscence. Vzorci so bili izpostavljeni šestim različnim temperaturam (v rangu od 34 °C do 46 °C), pri čem so toplotni dražljaji trajali 60, 30, 15, 5, in 1 min. V obzir pa je treba vzeti, da je zaradi relativno majhnega volumna gojišča (PCR mikrocentrifugirka), bila omejena količina dodanega medija in zato omejena rast plesni [1].

Konstrukti s promotorji ''hsp30'' so se izkazali za izjemno nastavljive sisteme, saj se je stopnja odziva povečevala, ko se je zviševala temperatura, prav tako pa so opazili večji odziv, kjer je temperaturni dražljaj trajal dlje časa. Vendar pa je maksimalni odziv bil opažen pri 15 min, pri daljših izpostavljenostih višji temperaturi pa je izražanje bilo nižje, kar so avtorji pripisovali upadu celične funkcije zaradi visokih temperatur. Že pri najkrajši izpostavljenosti (1 min) višji temperaturi je sistem podal robustni odziv.
Kot najbolj optimalna sistema sta se izkazala oba daljša konstrukta (vsebujeta vse domnevne elemente ''hse''), saj so pri njima opazili močnejšo indukcijo in manjše puščanje promotorja v primerjavi s krajšim konstruktom [1].

== Temperaturno pogojena rast ''N. crasse'' ==
Celulozni regulator 2 (CLR-2) je transkripcijski faktor, ki je ključen pri regulaciji celulazne aktivnosti ''N. crasse'', saj je potreben za indukcijo ekspresije celulolitičnih genov. V industriji je pomembno nadzorovano izražanje CLR-2, s tem se na primer poveča proizvodnja bioetanola. Avtorji so pripravili sev ''N. crasse'', pri katerem so zapis za CLR-2 postavili pod promotor ''hsp30'' in opazovali rast celic pri različnih pogojih.
Najkrajši promotor ''hse30'' vsebuje le dve od štirih domnevnih regij ''hse'' in se je zato izkazal kot najmanj optimalen sistem za uravnavanje transkripcije (glej Odziv promotorja ''hsp30'' na toplotne dražljaje). Vseeno pa so ga avtorji pri tem eksperimentu uporabili zaradi njegove kratke dolžine (500 baznih parov). V ''N. crassi'' so namreč prisotne ponavljajoče se inducirane točkovne mutacije (RIP), kot obrambni mehanizem za zmanjšanje aktivnosti in širjenja mobilnih genetskih elementov, ki pa je manj pogosta v krajših segmentih DNA [1].

Rezultati so pokazali, da se sev ''hsp300:clr-2'' ne razvija v tekočih gojiščih z Avicelom (kristalinična celuloza) pri normalni temperaturi (25 °C). Vendar pa se po vsakodnevnih impulzih toplote (45 °C) rast povrne in celo preseže WT sev plesni [1].

== Načrtovanje sintetičnega promotorja iz domnevnih ''cis'' regij ''hsp30'' ==
Da bi uporabili vse domnevne regije ''hse'', in hkrati znižali pogostost RIP-induciranih mutacij so avtorji načrtali 2 sintetična promotorja. Ocenili so minimalno dolžino bližnjega promotorja (okoli 250 bp) in mu dodali domnevne regije ''hse''. S primerjavo promotorja ''hse30'' s promotorji ''hse30'' iz sorodnih organizmov ''N. crasse'' so identificirali še peto regijo ''hse'', ki je prav tako ohranjena, in tudi njo vključili v konstrukt. Razlika med sintetičnima promoterjema je bila zgolj v dolžini vmesnikov med domnevnimi regulatornimi regijami ''hse'' [1].

Tudi oba sintetična promotorja sta izkazala dobro nastavljivost pri različnih toplotnih tretmajih, vendar sta oba prikazala relativno močno bazalno aktivnost. Je pa tovrstno puščanje promotorja velikokrat prisotno ob načrtovanju umetnih promotorjev. Vseeno pa sta se oba nova promotorja izkazala za bolj uporaben sistem nastavljivega izražanja od promotorjev ''hsp70'' in ''hsp80'', prav tako so opazili višje stopnje izražanja od najkrajše verzije promotorja ''hsp30''. Zaradi velike ohranjenosti promotorja ''hsp30'' bi podobni promotorji najverjetneje delovali tudi v ostalih askomicetah, kot na primer v biotehnološko pomembnih ''Aspergillus niger'' ali ''Trichoderma reesei'' [1, 2].

== Zaključek ==
Sistem s finim uravnavanjem transkripcije preko toplotne indukcije predstavlja obetavno orodje za raziskave funkcije genov, pa tudi za biotehnološke aplikacije, kot so proizvodnja encimov, metabolitov ali drugih biološko pomembnih snovi. V primerjavi s kemično induciranimi sistemi se izkaže za lažje reverzibilen sistem, saj ni treba dodajati eksogenih sredstev, ki jih je težko odstraniti iz gojišča. Hkrati pa je enostaven za uporabo, sploh v primerjavi s svetlobno indukcijo, kjer je potreba po dobro definiranih laboratorijskih nastavitvah (temna soba). Vendar pa se pri toplotni indukciji pojavljajo potencialne težave oziroma omejitve, kot so stres za organizem ali neselektivna aktivacija genov [1, 3].

Ko so zapis za CLR-2 postavili pod promotor ''hse30'' , so avtorji (kljub izbiri neoptimalnega promotorja) prikazali možnost uporabe toplotno inducibilnega sistema za regulacijo izražanja pri želenih fenotipih. Ob nadaljnji optimizaciji procesa bi se celulazna aktivnost plesni dodatno povečala, kar odpira priložnost uporabe tovrstnih sistemov v industriji. Glavna ovira pri industrijski uporabi razgradnje celuloze so namreč visoki stroški proizvodnje encimov, kar tudi preprečuje nižje cene bioetanola [1, 4].

== Literatura ==

[1] C. Tabilo-Agurto, V. Del Rio-Pinilla, V. Eltit-Villarroel, A. Goity, F. Muñoz-Guzmán, in L. F. Larrondo, „Developing a Temperature-Inducible Transcriptional Rheostat in Neurospora crassa“, mBio, let. 14, št. 1, str. e03291-22, feb. 2023, doi: 10.1128/mbio.03291-22.

[2] J. Han, B. McLane, E.-H. Kim, J.-W. Yoon, in H.-S. Jun, „Remission of diabetes by insulin gene therapy using a hepatocyte-specific and glucose-responsive synthetic promoter“, Mol. Ther. J. Am. Soc. Gene Ther., let. 19, št. 3, str. 470–478, mar. 2011, doi: 10.1038/mt.2010.255.

[3] J. Hearn, I. Ssinabulya, J. I. Schwartz, A. R. Akiteng, H. J. Ross, in J. A. Cafazzo, „Self-management of non-communicable diseases in low- and middle-income countries: A scoping review“, PLOS ONE, let. 14, št. 7, str. e0219141, jul. 2019, doi: 10.1371/journal.pone.0219141.

[4] A. K. Chandel, C. Es, R. Rudravaram, M. L. Narasu, V. Rao, in P. Ravindra, „Economics and environmental impact of bioethanol production technologies: an appraisal“.

Razvoj temperaturno inducibilnega transkripcijskega reostata pri Neurospori crassi

2023-04-11T07:30:12Z

Lsegota: /* Funkcijska analiza promotorjev hsp */

Izhodiščni članek : [https://journals.asm.org/doi/10.1128/mbio.03291-22: Developing a Temperature-Inducible Transcriptional Rheostat in Neurospora crassa]

== Uvod ==
''Neurospora crassa'' je rdeča plesen, ki spada v deblo askomicet. Zaradi svoje majhnosti, enostavnosti vzgoje in opravljanja genskih analiz, je ''N. crassa'' pomemben modelni organizem za raziskovanje številnih bioloških procesov, vključno s celičnim ciklom, fotosintezo, biološkimi ritmi, staranjem in razvojem. Prav tako proizvaja encime, ki razgrajujejo celulozo, kar je koristno pri proizvodnji etanola iz celuloznih virov [1].

Proteini toplotnega šoka (HSP) sodelujejo pri odzivu celice na stresne pogoje, kot so visoke ali nizke temperature, oksidativni stres in izpostavljenost strupenim snovem. Delujejo kot šaperoni, njihova naloga pa je zaščititi celice pred poškodbami s preprečevanjem nepravilnega zvitja proteinov. Vendar pa področje uravnavanja izražanja genov, ki kodirajo proteine HSP, še vedno ostaja delno neraziskano, zlasti v kontekstu modelnih glivnih organizmov, kot je ''N. crassa''. Faktorji toplotnega šoka (HSF) so pri stresnih pogojih aktivatorji transkripcije za proteine HSP. Po oligomerizaciji se faktorji HSF vežejo na DNA, in sicer na elemente toplotnega šoka (''hse''), ki so pri evkariontih relativno ohranjeni. V ''N. crassi'' so opisani trije geni hsp (''hsp30'', ''hsp70'' in ''hsp80''), ki se vsi izražajo pri visokih temperaturah, prav tako pa so pri vsakem odkrili domnevne ''cis'' regulatorne elemente [1].

V ''N. crassa'' so načrtali že mnogo promotorjev, ki se odzivajo na kemične signale (kot so glukoza, kininska kislina in baker), od fizično induciranih sistemov pa so razvili le takšnega, ki se odziva na svetlobo. Temperaturno induciran sistem, bi medtem omogočil zelo enostavno uravnavanje izražanja genov brez potrebe po dodajanju eksogenih kemikalij [1].

== Funkcijska analiza promotorjev ''hsp'' ==
V preteklih študijah so pri promotorju gena ''hsp30'' definirali štiri regije ''hse'', medtem ko so v promotorju ''hsp70'' našli dve. ''hsp70'' ne vsebuje regulatornih elementov ''hse'', vendar so opisane nekoliko različne ''cis'' regije, poimenovane kot elementi odziva na temperaturo (''tre'').
Da bi bolj okarakterizirali regulacijo genov so pripravili paleto konstruktov, ki so poleg bližnjega promotorja vsebovali različno dolge 5' regije. Različni konstrukti enakega gena pa so pri tem vsebovali raznoliko število regulatornih ''cis'' elementov. Za analizo so uporabili luciferazo iz kresničke z dodanim zaporedjem PEST (ki poveča razgradnjo proteina), kar skupaj tvori reporterski sistem za zaznavo transkripcije v realnem času. Pri sobni temperaturi so nagojili reporterske seve plesni in jih v temi izpostavili enournemu toplotnemu šoku pri treh različnih temperaturah: dveh visokih (35 °C in 45 °C) in eni, ki je bila bližja laboratorijskim rastnim pogojem ''N. crasse'' (30 °C), in merili luminiscenco s CCD kamero [1].

Vsi polno dolgi konstrukti so izkazali podobno hiter in močen odziv na toplotni šok pri 45 °C, medtem ko je bil odziv pri 35 °C neprimerno nižji, pri 30 °C pa odziva sploh ni bilo. Skrajšani konstrukti so se pri ''hsp30'' in ''hsp70'' odzivali v skladu s številom domnevnih regij ''hse'', ki so jih vsebovali. Medtem je konstrukt s polovičnim promotorjem ''hsp80'' (ki je vseboval 5 od 7 domnevnih regij ''tre''), pokazal kar 9-krat nižji odziv od konstrukta s polnim promotorjem, kar kaže na pomanjkljivo poznavanje regulacije promotorja ''hse80''. Izmed treh genov so pri ''hsp30'' opazili mnogo najnižje puščanje promotorja (pri 25 °C), zaradi česa so pri omenjenem genu opazili več kot 1000-kratno povečanje izražanja (razmerje med bazalnim vrhom in induciranim vrhom) [1].

''Hsp30'' ima nižjo molekularno maso od ostalih dveh sorodnih proteinov (30 kDa proti 70 kDa / 80 kDa) na račun odsotnosti ATP-hidrolizne domene. Zaradi tega so pri stresnih pogojih manjši HSP-ji prvi, ki posredujejo proti proteinski denaturaciji, kar korelira z opaženo visoko stopnjo povečanja izražanja pri ''hsp30''.
Avtorji so ''hsp30'' primerjali z drugimi znanimi inducibilnimi sistemi v ''N. crassa'', kot sta promotor ''qa-2'', ki se odziva na naraščajoče koncentracije kininske kisline in promotor ''vvd'', ki se aktivira s svetlobo. Promotor ''hsp30'' je imel najnižjo bazalno aktivnost in pa najvišjo aktivnost v induciranem stanjupotreboval pa je dlje časa za regeneracijo do minimuma aktivnosti po dražljaju (7 h) od promotorja ''vvd'' (4 h) [1].

== Odziv promotorja ''hsp30'' na toplotne dražljaje ==
Zaradi najbolj robustnega odziva na toplotne dražljaje so avtorji za nadaljnje delo izbrali promotor ''hsp30''. Zanimalo jih je promotorjev odziv na različno dolge toplotne dražljaje pri različnih temperaturah, zato so skonstruirali pristop, ki omogoča hitro in enostavno analizo.
Eksperiment so opravili v formatu mikrotitrske plošče za PCR in testirali 3 različne promotorje ''hsp30'' (en celoten in dva skrajšana). Pripravili so paleto različnih pogojev in ocenjevali odziv promotorja z merjenjem luminiscence. Vzorci so bili izpostavljeni šestim različnim temperaturam (v rangu od 34 °C do 46 °C), pri čem so toplotni dražljaji trajali 60, 30, 15, 5, in 1 min. V obzir pa je treba vzeti, da je zaradi relativno majhnega volumna gojišča (PCR mikrocentrifugirka), bila omejena količina dodanega medija in zato omejena rast plesni [1].

Konstrukti s promotorji ''hsp30'' so se izkazali za izjemno nastavljive sisteme, saj se je stopnja odziva povečevala, ko se je zviševala temperatura, prav tako pa so opazili večji odziv, kjer je temperaturni dražljaj trajal dlje časa. Vendar pa je maksimalni odziv bil opažen pri 15 min, pri daljših izpostavljenostih višji temperaturi pa je izražanje bilo nižje, kar so avtorji pripisovali upadu celične funkcije zaradi visokih temperatur. Že pri najkrajši izpostavljenosti (1 min) višji temperaturi je sistem podal robustni odziv.
Kot najbolj optimalna sistema sta se izkazala oba daljša konstrukta (vsebujeta vse domnevne elemente ''hse''), saj so pri njima opazili močnejšo indukcijo in manjše puščanje promotorja v primerjavi s krajšim konstruktom [1].

== Temperaturno pogojena rast ''N. crasse'' ==
Celulozni regulator 2 (CLR-2) je transkripcijski faktor, ki je ključen pri regulaciji celulazne aktivnosti ''N. crasse'', saj je potreben za indukcijo ekspresije celulolitičnih genov. V industriji je pomembno nadzorovano izražanje CLR-2, s tem se na primer poveča proizvodnja bioetanola. Avtorji so pripravili sev ''N. crasse'', pri katerem so zapis za CLR-2 postavili pod promotor ''hsp30'' in opazovali rast celic pri različnih pogojih.
Najkrajši promotor ''hse30'' vsebuje le dve od štirih domnevnih regij ''hse'' in se je zato izkazal kot najmanj optimalen sistem za uravnavanje transkripcije (glej Odziv promotorja ''hsp30'' na toplotne dražljaje). Vseeno pa so ga avtorji pri tem eksperimentu uporabili zaradi njegove kratke dolžine (500 baznih parov). V ''N. crassi'' so namreč prisotne ponavljajoče se inducirane točkovne mutacije (RIP), kot obrambni mehanizem za zmanjšanje aktivnosti in širjenja mobilnih genetskih elementov, ki pa je manj pogosta v krajših segmentih DNA [1].

Rezultati so pokazali, da se sev ''hsp300:clr-2'' ne razvija v tekočih gojiščih z Avicelom (kristalinična celuloza) pri normalni temperaturi (25 °C). Vendar pa se po vsakodnevnih impulzih toplote (45 °C) rast povrne in celo preseže WT sev plesni [1].

== Načrtovanje sintetičnega promotorja iz domnevnih ''cis'' regij ''hsp30'' ==
Da bi uporabili vse domnevne regije ''hse'', in hkrati znižali pogostost RIP-induciranih mutacij so avtorji načrtali 2 sintetična promotorja. Ocenili so minimalno dolžino bližnjega promotorja (okoli 250 bp) in mu dodali domnevne regije ''hse''. S primerjavo promotorja ''hse30'' s promotorji ''hse30'' iz sorodnih organizmov ''N. crasse'' so identificirali še peto regijo ''hse'', ki je prav tako ohranjena, in tudi njo vključili v konstrukt. Razlika med sintetičnima promoterjema je bila zgolj v dolžini vmesnikov med domnevnimi regulatornimi regijami ''hse'' [1].

Tudi oba sintetična promotorja sta izkazala dobro nastavljivost pri različnih toplotnih tretmajih, vendar sta oba prikazala relativno močno bazalno aktivnost. Je pa tovrstno puščanje promotorja velikokrat prisotno ob načrtovanju umetnih promotorjev. Vseeno pa sta se oba nova promotorja izkazala za bolj uporaben sistem nastavljivega izražanja od promotorjev ''hsp70'' in ''hsp80'', prav tako so opazili višje stopnje izražanja od najkrajše verzije promotorja ''hsp30''. Zaradi velike ohranjenosti promotorja ''hsp30'' bi podobni promotorji najverjetneje delovali tudi v ostalih askomicetah, kot na primer v biotehnološko pomembnih ''Aspergillus niger'' ali ''Trichoderma reesei'' [1, 2].

== Zaključek ==
Sistem s finim uravnavanjem transkripcije preko toplotne indukcije predstavlja obetavno orodje za raziskave funkcije genov, pa tudi za biotehnološke aplikacije, kot so proizvodnja encimov, metabolitov ali drugih biološko pomembnih snovi. V primerjavi s kemično induciranimi sistemi se izkaže za lažje reverzibilen sistem, saj ni treba dodajati eksogenih sredstev, ki jih je težko odstraniti iz gojišča. Hkrati pa je enostaven za uporabo, sploh v primerjavi s svetlobno indukcijo, kjer je potreba po dobro definiranih laboratorijskih nastavitvah (temna soba). Vendar pa se pri toplotni indukciji pojavljajo potencialne težave oziroma omejitve, kot so stres za organizem ali neselektivna aktivacija genov [1, 3].

Ko so zapis za CLR-2 postavili pod promotor ''hse30'' , so avtorji (kljub izbiri neoptimalnega promotorja) prikazali možnost uporabe toplotno inducibilnega sistema za regulacijo izražanja pri želenih fenotipih. Ob nadaljnji optimizaciji procesa bi se celulazna aktivnost plesni dodatno povečala, kar odpira priložnost uporabe tovrstnih sistemov v industriji. Glavna ovira pri industrijski uporabi razgradnje celuloze so namreč visoki stroški proizvodnje encimov, kar tudi preprečuje nižje cene bioetanola [1, 4].

== Literatura ==

[1] C. Tabilo-Agurto, V. Del Rio-Pinilla, V. Eltit-Villarroel, A. Goity, F. Muñoz-Guzmán, in L. F. Larrondo, „Developing a Temperature-Inducible Transcriptional Rheostat in Neurospora crassa“, mBio, let. 14, št. 1, str. e03291-22, feb. 2023, doi: 10.1128/mbio.03291-22.

[2] J. Han, B. McLane, E.-H. Kim, J.-W. Yoon, in H.-S. Jun, „Remission of diabetes by insulin gene therapy using a hepatocyte-specific and glucose-responsive synthetic promoter“, Mol. Ther. J. Am. Soc. Gene Ther., let. 19, št. 3, str. 470–478, mar. 2011, doi: 10.1038/mt.2010.255.

[3] J. Hearn, I. Ssinabulya, J. I. Schwartz, A. R. Akiteng, H. J. Ross, in J. A. Cafazzo, „Self-management of non-communicable diseases in low- and middle-income countries: A scoping review“, PLOS ONE, let. 14, št. 7, str. e0219141, jul. 2019, doi: 10.1371/journal.pone.0219141.

[4] A. K. Chandel, C. Es, R. Rudravaram, M. L. Narasu, V. Rao, in P. Ravindra, „Economics and environmental impact of bioethanol production technologies: an appraisal“.

Razvoj temperaturno inducibilnega transkripcijskega reostata pri Neurospori crassi

2023-04-11T07:29:57Z

Lsegota: /* Funkcijska analiza promotorjev hsp */

Izhodiščni članek : [https://journals.asm.org/doi/10.1128/mbio.03291-22: Developing a Temperature-Inducible Transcriptional Rheostat in Neurospora crassa]

== Uvod ==
''Neurospora crassa'' je rdeča plesen, ki spada v deblo askomicet. Zaradi svoje majhnosti, enostavnosti vzgoje in opravljanja genskih analiz, je ''N. crassa'' pomemben modelni organizem za raziskovanje številnih bioloških procesov, vključno s celičnim ciklom, fotosintezo, biološkimi ritmi, staranjem in razvojem. Prav tako proizvaja encime, ki razgrajujejo celulozo, kar je koristno pri proizvodnji etanola iz celuloznih virov [1].

Proteini toplotnega šoka (HSP) sodelujejo pri odzivu celice na stresne pogoje, kot so visoke ali nizke temperature, oksidativni stres in izpostavljenost strupenim snovem. Delujejo kot šaperoni, njihova naloga pa je zaščititi celice pred poškodbami s preprečevanjem nepravilnega zvitja proteinov. Vendar pa področje uravnavanja izražanja genov, ki kodirajo proteine HSP, še vedno ostaja delno neraziskano, zlasti v kontekstu modelnih glivnih organizmov, kot je ''N. crassa''. Faktorji toplotnega šoka (HSF) so pri stresnih pogojih aktivatorji transkripcije za proteine HSP. Po oligomerizaciji se faktorji HSF vežejo na DNA, in sicer na elemente toplotnega šoka (''hse''), ki so pri evkariontih relativno ohranjeni. V ''N. crassi'' so opisani trije geni hsp (''hsp30'', ''hsp70'' in ''hsp80''), ki se vsi izražajo pri visokih temperaturah, prav tako pa so pri vsakem odkrili domnevne ''cis'' regulatorne elemente [1].

V ''N. crassa'' so načrtali že mnogo promotorjev, ki se odzivajo na kemične signale (kot so glukoza, kininska kislina in baker), od fizično induciranih sistemov pa so razvili le takšnega, ki se odziva na svetlobo. Temperaturno induciran sistem, bi medtem omogočil zelo enostavno uravnavanje izražanja genov brez potrebe po dodajanju eksogenih kemikalij [1].

== Funkcijska analiza promotorjev ''hsp'' ==
V preteklih študijah so pri promotorju gena ''hsp30'' definirali štiri regije ''hse'', medtem ko so v promotorju ''hsp70'' našli dve. ''hsp70'' ne vsebuje regulatornih elementov ''hse'', vendar so opisane nekoliko različne ''cis'' regije, poimenovane kot elementi odziva na temperaturo (''tre'').
Da bi bolj okarakterizirali regulacijo genov so pripravili paleto konstruktov, ki so poleg bližnjega promotorja vsebovali različno dolge 5' regije. Različni konstrukti enakega gena pa so pri tem vsebovali raznoliko število regulatornih ''cis'' elementov. Za analizo so uporabili luciferazo iz kresničke z dodanim zaporedjem PEST (ki poveča razgradnjo proteina), kar skupaj tvori reporterski sistem za zaznavo transkripcije v realnem času. Pri sobni temperaturi so nagojili reporterske seve plesni in jih v temi izpostavili enournemu toplotnemu šoku pri treh različnih temperaturah: dveh visokih (35 °C in 45 °C) in eni, ki je bila bližja laboratorijskim rastnim pogojem ''N. crasse'' (30 °C), in merili luminiscenco s CCD kamero [1].

Vsi polno dolgi konstrukti so izkazali podobno hiter in močen odziv na toplotni šok pri 45 °C, medtem ko je bil odziv pri 35 °C neprimerno nižji, pri 30 °C pa odziva sploh ni bilo. Skrajšani konstrukti so se pri ''hsp30'' in ''hsp70'' odzivali v skladu s številom domnevnih regij ''hse'' , ki so jih vsebovali. Medtem je konstrukt s polovičnim promotorjem ''hsp80'' (ki je vseboval 5 od 7 domnevnih regij ''tre''), pokazal kar 9-krat nižji odziv od konstrukta s polnim promotorjem, kar kaže na pomanjkljivo poznavanje regulacije promotorja ''hse80''. Izmed treh genov so pri ''hsp30'' opazili mnogo najnižje puščanje promotorja (pri 25 °C), zaradi česa so pri omenjenem genu opazili več kot 1000-kratno povečanje izražanja (razmerje med bazalnim vrhom in induciranim vrhom) [1].

''Hsp30'' ima nižjo molekularno maso od ostalih dveh sorodnih proteinov (30 kDa proti 70 kDa / 80 kDa) na račun odsotnosti ATP-hidrolizne domene. Zaradi tega so pri stresnih pogojih manjši HSP-ji prvi, ki posredujejo proti proteinski denaturaciji, kar korelira z opaženo visoko stopnjo povečanja izražanja pri ''hsp30''.
Avtorji so ''hsp30'' primerjali z drugimi znanimi inducibilnimi sistemi v ''N. crassa'', kot sta promotor ''qa-2'', ki se odziva na naraščajoče koncentracije kininske kisline in promotor ''vvd'', ki se aktivira s svetlobo. Promotor ''hsp30'' je imel najnižjo bazalno aktivnost in pa najvišjo aktivnost v induciranem stanjupotreboval pa je dlje časa za regeneracijo do minimuma aktivnosti po dražljaju (7 h) od promotorja ''vvd'' (4 h) [1].

== Odziv promotorja ''hsp30'' na toplotne dražljaje ==
Zaradi najbolj robustnega odziva na toplotne dražljaje so avtorji za nadaljnje delo izbrali promotor ''hsp30''. Zanimalo jih je promotorjev odziv na različno dolge toplotne dražljaje pri različnih temperaturah, zato so skonstruirali pristop, ki omogoča hitro in enostavno analizo.
Eksperiment so opravili v formatu mikrotitrske plošče za PCR in testirali 3 različne promotorje ''hsp30'' (en celoten in dva skrajšana). Pripravili so paleto različnih pogojev in ocenjevali odziv promotorja z merjenjem luminiscence. Vzorci so bili izpostavljeni šestim različnim temperaturam (v rangu od 34 °C do 46 °C), pri čem so toplotni dražljaji trajali 60, 30, 15, 5, in 1 min. V obzir pa je treba vzeti, da je zaradi relativno majhnega volumna gojišča (PCR mikrocentrifugirka), bila omejena količina dodanega medija in zato omejena rast plesni [1].

Konstrukti s promotorji ''hsp30'' so se izkazali za izjemno nastavljive sisteme, saj se je stopnja odziva povečevala, ko se je zviševala temperatura, prav tako pa so opazili večji odziv, kjer je temperaturni dražljaj trajal dlje časa. Vendar pa je maksimalni odziv bil opažen pri 15 min, pri daljših izpostavljenostih višji temperaturi pa je izražanje bilo nižje, kar so avtorji pripisovali upadu celične funkcije zaradi visokih temperatur. Že pri najkrajši izpostavljenosti (1 min) višji temperaturi je sistem podal robustni odziv.
Kot najbolj optimalna sistema sta se izkazala oba daljša konstrukta (vsebujeta vse domnevne elemente ''hse''), saj so pri njima opazili močnejšo indukcijo in manjše puščanje promotorja v primerjavi s krajšim konstruktom [1].

== Temperaturno pogojena rast ''N. crasse'' ==
Celulozni regulator 2 (CLR-2) je transkripcijski faktor, ki je ključen pri regulaciji celulazne aktivnosti ''N. crasse'', saj je potreben za indukcijo ekspresije celulolitičnih genov. V industriji je pomembno nadzorovano izražanje CLR-2, s tem se na primer poveča proizvodnja bioetanola. Avtorji so pripravili sev ''N. crasse'', pri katerem so zapis za CLR-2 postavili pod promotor ''hsp30'' in opazovali rast celic pri različnih pogojih.
Najkrajši promotor ''hse30'' vsebuje le dve od štirih domnevnih regij ''hse'' in se je zato izkazal kot najmanj optimalen sistem za uravnavanje transkripcije (glej Odziv promotorja ''hsp30'' na toplotne dražljaje). Vseeno pa so ga avtorji pri tem eksperimentu uporabili zaradi njegove kratke dolžine (500 baznih parov). V ''N. crassi'' so namreč prisotne ponavljajoče se inducirane točkovne mutacije (RIP), kot obrambni mehanizem za zmanjšanje aktivnosti in širjenja mobilnih genetskih elementov, ki pa je manj pogosta v krajših segmentih DNA [1].

Rezultati so pokazali, da se sev ''hsp300:clr-2'' ne razvija v tekočih gojiščih z Avicelom (kristalinična celuloza) pri normalni temperaturi (25 °C). Vendar pa se po vsakodnevnih impulzih toplote (45 °C) rast povrne in celo preseže WT sev plesni [1].

== Načrtovanje sintetičnega promotorja iz domnevnih ''cis'' regij ''hsp30'' ==
Da bi uporabili vse domnevne regije ''hse'', in hkrati znižali pogostost RIP-induciranih mutacij so avtorji načrtali 2 sintetična promotorja. Ocenili so minimalno dolžino bližnjega promotorja (okoli 250 bp) in mu dodali domnevne regije ''hse''. S primerjavo promotorja ''hse30'' s promotorji ''hse30'' iz sorodnih organizmov ''N. crasse'' so identificirali še peto regijo ''hse'', ki je prav tako ohranjena, in tudi njo vključili v konstrukt. Razlika med sintetičnima promoterjema je bila zgolj v dolžini vmesnikov med domnevnimi regulatornimi regijami ''hse'' [1].

Tudi oba sintetična promotorja sta izkazala dobro nastavljivost pri različnih toplotnih tretmajih, vendar sta oba prikazala relativno močno bazalno aktivnost. Je pa tovrstno puščanje promotorja velikokrat prisotno ob načrtovanju umetnih promotorjev. Vseeno pa sta se oba nova promotorja izkazala za bolj uporaben sistem nastavljivega izražanja od promotorjev ''hsp70'' in ''hsp80'', prav tako so opazili višje stopnje izražanja od najkrajše verzije promotorja ''hsp30''. Zaradi velike ohranjenosti promotorja ''hsp30'' bi podobni promotorji najverjetneje delovali tudi v ostalih askomicetah, kot na primer v biotehnološko pomembnih ''Aspergillus niger'' ali ''Trichoderma reesei'' [1, 2].

== Zaključek ==
Sistem s finim uravnavanjem transkripcije preko toplotne indukcije predstavlja obetavno orodje za raziskave funkcije genov, pa tudi za biotehnološke aplikacije, kot so proizvodnja encimov, metabolitov ali drugih biološko pomembnih snovi. V primerjavi s kemično induciranimi sistemi se izkaže za lažje reverzibilen sistem, saj ni treba dodajati eksogenih sredstev, ki jih je težko odstraniti iz gojišča. Hkrati pa je enostaven za uporabo, sploh v primerjavi s svetlobno indukcijo, kjer je potreba po dobro definiranih laboratorijskih nastavitvah (temna soba). Vendar pa se pri toplotni indukciji pojavljajo potencialne težave oziroma omejitve, kot so stres za organizem ali neselektivna aktivacija genov [1, 3].

Ko so zapis za CLR-2 postavili pod promotor ''hse30'' , so avtorji (kljub izbiri neoptimalnega promotorja) prikazali možnost uporabe toplotno inducibilnega sistema za regulacijo izražanja pri želenih fenotipih. Ob nadaljnji optimizaciji procesa bi se celulazna aktivnost plesni dodatno povečala, kar odpira priložnost uporabe tovrstnih sistemov v industriji. Glavna ovira pri industrijski uporabi razgradnje celuloze so namreč visoki stroški proizvodnje encimov, kar tudi preprečuje nižje cene bioetanola [1, 4].

== Literatura ==

[1] C. Tabilo-Agurto, V. Del Rio-Pinilla, V. Eltit-Villarroel, A. Goity, F. Muñoz-Guzmán, in L. F. Larrondo, „Developing a Temperature-Inducible Transcriptional Rheostat in Neurospora crassa“, mBio, let. 14, št. 1, str. e03291-22, feb. 2023, doi: 10.1128/mbio.03291-22.

[2] J. Han, B. McLane, E.-H. Kim, J.-W. Yoon, in H.-S. Jun, „Remission of diabetes by insulin gene therapy using a hepatocyte-specific and glucose-responsive synthetic promoter“, Mol. Ther. J. Am. Soc. Gene Ther., let. 19, št. 3, str. 470–478, mar. 2011, doi: 10.1038/mt.2010.255.

[3] J. Hearn, I. Ssinabulya, J. I. Schwartz, A. R. Akiteng, H. J. Ross, in J. A. Cafazzo, „Self-management of non-communicable diseases in low- and middle-income countries: A scoping review“, PLOS ONE, let. 14, št. 7, str. e0219141, jul. 2019, doi: 10.1371/journal.pone.0219141.

[4] A. K. Chandel, C. Es, R. Rudravaram, M. L. Narasu, V. Rao, in P. Ravindra, „Economics and environmental impact of bioethanol production technologies: an appraisal“.

Razvoj temperaturno inducibilnega transkripcijskega reostata pri Neurospori crassi

2023-04-11T07:22:00Z

Lsegota: /* Uvod */

Izhodiščni članek : [https://journals.asm.org/doi/10.1128/mbio.03291-22: Developing a Temperature-Inducible Transcriptional Rheostat in Neurospora crassa]

== Uvod ==
''Neurospora crassa'' je rdeča plesen, ki spada v deblo askomicet. Zaradi svoje majhnosti, enostavnosti vzgoje in opravljanja genskih analiz, je ''N. crassa'' pomemben modelni organizem za raziskovanje številnih bioloških procesov, vključno s celičnim ciklom, fotosintezo, biološkimi ritmi, staranjem in razvojem. Prav tako proizvaja encime, ki razgrajujejo celulozo, kar je koristno pri proizvodnji etanola iz celuloznih virov [1].

Proteini toplotnega šoka (HSP) sodelujejo pri odzivu celice na stresne pogoje, kot so visoke ali nizke temperature, oksidativni stres in izpostavljenost strupenim snovem. Delujejo kot šaperoni, njihova naloga pa je zaščititi celice pred poškodbami s preprečevanjem nepravilnega zvitja proteinov. Vendar pa področje uravnavanja izražanja genov, ki kodirajo proteine HSP, še vedno ostaja delno neraziskano, zlasti v kontekstu modelnih glivnih organizmov, kot je ''N. crassa''. Faktorji toplotnega šoka (HSF) so pri stresnih pogojih aktivatorji transkripcije za proteine HSP. Po oligomerizaciji se faktorji HSF vežejo na DNA, in sicer na elemente toplotnega šoka (''hse''), ki so pri evkariontih relativno ohranjeni. V ''N. crassi'' so opisani trije geni hsp (''hsp30'', ''hsp70'' in ''hsp80''), ki se vsi izražajo pri visokih temperaturah, prav tako pa so pri vsakem odkrili domnevne ''cis'' regulatorne elemente [1].

V ''N. crassa'' so načrtali že mnogo promotorjev, ki se odzivajo na kemične signale (kot so glukoza, kininska kislina in baker), od fizično induciranih sistemov pa so razvili le takšnega, ki se odziva na svetlobo. Temperaturno induciran sistem, bi medtem omogočil zelo enostavno uravnavanje izražanja genov brez potrebe po dodajanju eksogenih kemikalij [1].

== Funkcijska analiza promotorjev ''hsp'' ==
V preteklih študijah so pri promotorju gena ''hsp30'' definirali štiri regije ''hse'', medtem ko so v promotorju ''hsp70'' našli dve. ''hsp70'' ne vsebuje regulatornih elementov ''hse'', vendar so opisane nekoliko različne ''cis'' regije, poimenovane kot elementi odziva na temperaturo (''tre'').
Da bi bolj okarakterizirali regulacijo genov so pripravili paleto konstruktov, ki so poleg bližnjega promotorja vsebovali različno dolge 5' regije. Različni konstrukti enakega gena pa so pri tem vsebovali raznoliko število regulatornih ''cis'' elementov. Za analizo so uporabili luciferazo iz kresničke z dodanim zaporedjem PEST (ki poveča razgradnjo proteina), kar skupaj tvori reporterski sistem za zaznavo transkripcije v realnem času. Pri sobni temperaturi so nagojili reporterske seve plesni in jih v temi izpostavili enournemu toplotnemu šoku pri treh različnih temperaturah: dveh visokih (35 °C in 45 °C) in eni, ki je bila bližja laboratorijskim rastnim pogojem ''N. crasse'' (30 °C), in merili luminiscenco s CCD kamero [1].

Vsi polno dolgi konstrukti so izkazali podobno hiter in močen odziv na toplotni šok pri 45 °C, medtem ko je bil odziv pri 35 °C neprimerno nižji, pri 30 °C pa odziva sploh ni bilo. Skrajšani konstrukti so se pri ''hsp30'' in ''hsp70'' odzivali v skladu s številom domnevnih ''hse'' regij, ki so jih vsebovali. Medtem je konstrukt s polovičnim promotorjem ''hsp80'' (ki je vseboval 5 od 7 domnevnih regij ''tre''), pokazal kar 9-krat nižji odziv od konstrukta s polnim promotorjem, kar kaže na pomanjkljivo poznavanje regulacije promotorja ''hse80''. Izmed treh genov so pri ''hsp30'' opazili mnogo najnižje puščanje promotorja (pri 25 °C), zaradi česa so pri omenjenem genu opazili več kot 1000-kratno povečanje izražanja (razmerje med bazalnim vrhom in induciranim vrhom) [1].

''Hsp30'' ima nižjo molekularno maso od ostalih dveh sorodnih proteinov (30 kDa proti 70 kDa / 80 kDa) na račun odsotnosti ATP-hidrolizne domene. Zaradi tega so pri stresnih pogojih manjši HSP-ji prvi, ki posredujejo proti proteinski denaturaciji, kar korelira z opaženo visoko stopnjo povečanja izražanja pri ''hsp30''.
Avtorji so ''hsp30'' primerjali z drugimi znanimi inducibilnimi sistemi v ''N. crassa'', kot sta promotor ''qa-2'', ki se odziva na naraščajoče koncentracije kininske kisline in promotor ''vvd'', ki se aktivira s svetlobo. Promotor ''hsp30'' je imel najnižjo bazalno aktivnost in pa najvišjo aktivnost v induciranem stanjupotreboval pa je dlje časa za regeneracijo do minimuma aktivnosti po dražljaju (7 h) od promotorja ''vvd'' (4 h) [1].

== Odziv promotorja ''hsp30'' na toplotne dražljaje ==
Zaradi najbolj robustnega odziva na toplotne dražljaje so avtorji za nadaljnje delo izbrali promotor ''hsp30''. Zanimalo jih je promotorjev odziv na različno dolge toplotne dražljaje pri različnih temperaturah, zato so skonstruirali pristop, ki omogoča hitro in enostavno analizo.
Eksperiment so opravili v formatu mikrotitrske plošče za PCR in testirali 3 različne promotorje ''hsp30'' (en celoten in dva skrajšana). Pripravili so paleto različnih pogojev in ocenjevali odziv promotorja z merjenjem luminiscence. Vzorci so bili izpostavljeni šestim različnim temperaturam (v rangu od 34 °C do 46 °C), pri čem so toplotni dražljaji trajali 60, 30, 15, 5, in 1 min. V obzir pa je treba vzeti, da je zaradi relativno majhnega volumna gojišča (PCR mikrocentrifugirka), bila omejena količina dodanega medija in zato omejena rast plesni [1].

Konstrukti s promotorji ''hsp30'' so se izkazali za izjemno nastavljive sisteme, saj se je stopnja odziva povečevala, ko se je zviševala temperatura, prav tako pa so opazili večji odziv, kjer je temperaturni dražljaj trajal dlje časa. Vendar pa je maksimalni odziv bil opažen pri 15 min, pri daljših izpostavljenostih višji temperaturi pa je izražanje bilo nižje, kar so avtorji pripisovali upadu celične funkcije zaradi visokih temperatur. Že pri najkrajši izpostavljenosti (1 min) višji temperaturi je sistem podal robustni odziv.
Kot najbolj optimalna sistema sta se izkazala oba daljša konstrukta (vsebujeta vse domnevne elemente ''hse''), saj so pri njima opazili močnejšo indukcijo in manjše puščanje promotorja v primerjavi s krajšim konstruktom [1].

== Temperaturno pogojena rast ''N. crasse'' ==
Celulozni regulator 2 (CLR-2) je transkripcijski faktor, ki je ključen pri regulaciji celulazne aktivnosti ''N. crasse'', saj je potreben za indukcijo ekspresije celulolitičnih genov. V industriji je pomembno nadzorovano izražanje CLR-2, s tem se na primer poveča proizvodnja bioetanola. Avtorji so pripravili sev ''N. crasse'', pri katerem so zapis za CLR-2 postavili pod promotor ''hsp30'' in opazovali rast celic pri različnih pogojih.
Najkrajši promotor ''hse30'' vsebuje le dve od štirih domnevnih regij ''hse'' in se je zato izkazal kot najmanj optimalen sistem za uravnavanje transkripcije (glej Odziv promotorja ''hsp30'' na toplotne dražljaje). Vseeno pa so ga avtorji pri tem eksperimentu uporabili zaradi njegove kratke dolžine (500 baznih parov). V ''N. crassi'' so namreč prisotne ponavljajoče se inducirane točkovne mutacije (RIP), kot obrambni mehanizem za zmanjšanje aktivnosti in širjenja mobilnih genetskih elementov, ki pa je manj pogosta v krajših segmentih DNA [1].

Rezultati so pokazali, da se sev ''hsp300:clr-2'' ne razvija v tekočih gojiščih z Avicelom (kristalinična celuloza) pri normalni temperaturi (25 °C). Vendar pa se po vsakodnevnih impulzih toplote (45 °C) rast povrne in celo preseže WT sev plesni [1].

== Načrtovanje sintetičnega promotorja iz domnevnih ''cis'' regij ''hsp30'' ==
Da bi uporabili vse domnevne regije ''hse'', in hkrati znižali pogostost RIP-induciranih mutacij so avtorji načrtali 2 sintetična promotorja. Ocenili so minimalno dolžino bližnjega promotorja (okoli 250 bp) in mu dodali domnevne regije ''hse''. S primerjavo promotorja ''hse30'' s promotorji ''hse30'' iz sorodnih organizmov ''N. crasse'' so identificirali še peto regijo ''hse'', ki je prav tako ohranjena, in tudi njo vključili v konstrukt. Razlika med sintetičnima promoterjema je bila zgolj v dolžini vmesnikov med domnevnimi regulatornimi regijami ''hse'' [1].

Tudi oba sintetična promotorja sta izkazala dobro nastavljivost pri različnih toplotnih tretmajih, vendar sta oba prikazala relativno močno bazalno aktivnost. Je pa tovrstno puščanje promotorja velikokrat prisotno ob načrtovanju umetnih promotorjev. Vseeno pa sta se oba nova promotorja izkazala za bolj uporaben sistem nastavljivega izražanja od promotorjev ''hsp70'' in ''hsp80'', prav tako so opazili višje stopnje izražanja od najkrajše verzije promotorja ''hsp30''. Zaradi velike ohranjenosti promotorja ''hsp30'' bi podobni promotorji najverjetneje delovali tudi v ostalih askomicetah, kot na primer v biotehnološko pomembnih ''Aspergillus niger'' ali ''Trichoderma reesei'' [1, 2].

== Zaključek ==
Sistem s finim uravnavanjem transkripcije preko toplotne indukcije predstavlja obetavno orodje za raziskave funkcije genov, pa tudi za biotehnološke aplikacije, kot so proizvodnja encimov, metabolitov ali drugih biološko pomembnih snovi. V primerjavi s kemično induciranimi sistemi se izkaže za lažje reverzibilen sistem, saj ni treba dodajati eksogenih sredstev, ki jih je težko odstraniti iz gojišča. Hkrati pa je enostaven za uporabo, sploh v primerjavi s svetlobno indukcijo, kjer je potreba po dobro definiranih laboratorijskih nastavitvah (temna soba). Vendar pa se pri toplotni indukciji pojavljajo potencialne težave oziroma omejitve, kot so stres za organizem ali neselektivna aktivacija genov [1, 3].

Ko so zapis za CLR-2 postavili pod promotor ''hse30'' , so avtorji (kljub izbiri neoptimalnega promotorja) prikazali možnost uporabe toplotno inducibilnega sistema za regulacijo izražanja pri želenih fenotipih. Ob nadaljnji optimizaciji procesa bi se celulazna aktivnost plesni dodatno povečala, kar odpira priložnost uporabe tovrstnih sistemov v industriji. Glavna ovira pri industrijski uporabi razgradnje celuloze so namreč visoki stroški proizvodnje encimov, kar tudi preprečuje nižje cene bioetanola [1, 4].

== Literatura ==

[1] C. Tabilo-Agurto, V. Del Rio-Pinilla, V. Eltit-Villarroel, A. Goity, F. Muñoz-Guzmán, in L. F. Larrondo, „Developing a Temperature-Inducible Transcriptional Rheostat in Neurospora crassa“, mBio, let. 14, št. 1, str. e03291-22, feb. 2023, doi: 10.1128/mbio.03291-22.

[2] J. Han, B. McLane, E.-H. Kim, J.-W. Yoon, in H.-S. Jun, „Remission of diabetes by insulin gene therapy using a hepatocyte-specific and glucose-responsive synthetic promoter“, Mol. Ther. J. Am. Soc. Gene Ther., let. 19, št. 3, str. 470–478, mar. 2011, doi: 10.1038/mt.2010.255.

[3] J. Hearn, I. Ssinabulya, J. I. Schwartz, A. R. Akiteng, H. J. Ross, in J. A. Cafazzo, „Self-management of non-communicable diseases in low- and middle-income countries: A scoping review“, PLOS ONE, let. 14, št. 7, str. e0219141, jul. 2019, doi: 10.1371/journal.pone.0219141.

[4] A. K. Chandel, C. Es, R. Rudravaram, M. L. Narasu, V. Rao, in P. Ravindra, „Economics and environmental impact of bioethanol production technologies: an appraisal“.

Razvoj temperaturno inducibilnega transkripcijskega reostata pri Neurospori crassi

2023-04-11T06:25:14Z

Lsegota:

Izhodiščni članek : [https://journals.asm.org/doi/10.1128/mbio.03291-22: Developing a Temperature-Inducible Transcriptional Rheostat in Neurospora crassa]

== Uvod ==
''Neurospora crassa'' je rdeča plesen, ki spada v deblo askomicet. Zaradi svoje majhnosti, enostavnosti vzgoje in opravljanja genskih analiz, je ''N. crassa'' pomemben modelni organizem za raziskovanje številnih bioloških procesov, vključno s celičnim ciklom, fotosintezo, biološkimi ritmi, staranjem in razvojem. Prav tako proizvaja encime, ki razgrajujejo celulozo, kar je koristno pri proizvodnji etanola iz celuloznih virov [1].

Proteini toplotnega šoka (HSP) sodelujejo pri odzivu celice na stresne pogoje, kot so visoke ali nizke temperature, oksidativni stres in izpostavljenost strupenim snovem. Delujejo kot šaperoni, njihova naloga pa je zaščititi celice pred poškodbami s preprečevanjem nepravilnega zvitja proteinov. Vendar pa področje uravnavanja izražanja genov, ki kodirajo ''hsp'', še vedno ostaja delno neraziskano, zlasti v kontekstu modelnih glivnih organizmov, kot je ''N. crassa''. Faktorji toplotnega šoka (HSF) so pri stresnih pogojih aktivatorji transkripcije za proteine HSP. Po oligomerizaciji se faktorji HSF vežejo na DNA, in sicer na elemente toplotnega šoka (''hse''), ki so pri evkariontih relativno ohranjeni. V ''N. crassi'' so opisani trije geni hsp (''hsp30'', ''hsp70'' in ''hsp80''), ki se vsi izražajo pri visokih temperaturah, prav tako pa so pri vsakem odkrili domnevne ''cis'' regulatorne elemente [1].

V ''N. crassa'' so načrtali že mnogo promotorjev, ki se odzivajo na kemične signale (kot so glukoza, kininska kislina in baker), od fizično induciranih sistemov pa so razvili le takšnega, ki se odziva na svetlobo. Temperaturno induciran sistem, bi medtem omogočil zelo enostavno uravnavanje izražanja genov brez potrebe po dodajanju eksogenih kemikalij [1].

== Funkcijska analiza promotorjev ''hsp'' ==
V preteklih študijah so pri promotorju gena ''hsp30'' definirali štiri regije ''hse'', medtem ko so v promotorju ''hsp70'' našli dve. ''hsp70'' ne vsebuje regulatornih elementov ''hse'', vendar so opisane nekoliko različne ''cis'' regije, poimenovane kot elementi odziva na temperaturo (''tre'').
Da bi bolj okarakterizirali regulacijo genov so pripravili paleto konstruktov, ki so poleg bližnjega promotorja vsebovali različno dolge 5' regije. Različni konstrukti enakega gena pa so pri tem vsebovali raznoliko število regulatornih ''cis'' elementov. Za analizo so uporabili luciferazo iz kresničke z dodanim zaporedjem PEST (ki poveča razgradnjo proteina), kar skupaj tvori reporterski sistem za zaznavo transkripcije v realnem času. Pri sobni temperaturi so nagojili reporterske seve plesni in jih v temi izpostavili enournemu toplotnemu šoku pri treh različnih temperaturah: dveh visokih (35 °C in 45 °C) in eni, ki je bila bližja laboratorijskim rastnim pogojem ''N. crasse'' (30 °C), in merili luminiscenco s CCD kamero [1].

Vsi polno dolgi konstrukti so izkazali podobno hiter in močen odziv na toplotni šok pri 45 °C, medtem ko je bil odziv pri 35 °C neprimerno nižji, pri 30 °C pa odziva sploh ni bilo. Skrajšani konstrukti so se pri ''hsp30'' in ''hsp70'' odzivali v skladu s številom domnevnih ''hse'' regij, ki so jih vsebovali. Medtem je konstrukt s polovičnim promotorjem ''hsp80'' (ki je vseboval 5 od 7 domnevnih regij ''tre''), pokazal kar 9-krat nižji odziv od konstrukta s polnim promotorjem, kar kaže na pomanjkljivo poznavanje regulacije promotorja ''hse80''. Izmed treh genov so pri ''hsp30'' opazili mnogo najnižje puščanje promotorja (pri 25 °C), zaradi česa so pri omenjenem genu opazili več kot 1000-kratno povečanje izražanja (razmerje med bazalnim vrhom in induciranim vrhom) [1].

''Hsp30'' ima nižjo molekularno maso od ostalih dveh sorodnih proteinov (30 kDa proti 70 kDa / 80 kDa) na račun odsotnosti ATP-hidrolizne domene. Zaradi tega so pri stresnih pogojih manjši HSP-ji prvi, ki posredujejo proti proteinski denaturaciji, kar korelira z opaženo visoko stopnjo povečanja izražanja pri ''hsp30''.
Avtorji so ''hsp30'' primerjali z drugimi znanimi inducibilnimi sistemi v ''N. crassa'', kot sta promotor ''qa-2'', ki se odziva na naraščajoče koncentracije kininske kisline in promotor ''vvd'', ki se aktivira s svetlobo. Promotor ''hsp30'' je imel najnižjo bazalno aktivnost in pa najvišjo aktivnost v induciranem stanjupotreboval pa je dlje časa za regeneracijo do minimuma aktivnosti po dražljaju (7 h) od promotorja ''vvd'' (4 h) [1].

== Odziv promotorja ''hsp30'' na toplotne dražljaje ==
Zaradi najbolj robustnega odziva na toplotne dražljaje so avtorji za nadaljnje delo izbrali promotor ''hsp30''. Zanimalo jih je promotorjev odziv na različno dolge toplotne dražljaje pri različnih temperaturah, zato so skonstruirali pristop, ki omogoča hitro in enostavno analizo.
Eksperiment so opravili v formatu mikrotitrske plošče za PCR in testirali 3 različne promotorje ''hsp30'' (en celoten in dva skrajšana). Pripravili so paleto različnih pogojev in ocenjevali odziv promotorja z merjenjem luminiscence. Vzorci so bili izpostavljeni šestim različnim temperaturam (v rangu od 34 °C do 46 °C), pri čem so toplotni dražljaji trajali 60, 30, 15, 5, in 1 min. V obzir pa je treba vzeti, da je zaradi relativno majhnega volumna gojišča (PCR mikrocentrifugirka), bila omejena količina dodanega medija in zato omejena rast plesni [1].

Konstrukti s promotorji ''hsp30'' so se izkazali za izjemno nastavljive sisteme, saj se je stopnja odziva povečevala, ko se je zviševala temperatura, prav tako pa so opazili večji odziv, kjer je temperaturni dražljaj trajal dlje časa. Vendar pa je maksimalni odziv bil opažen pri 15 min, pri daljših izpostavljenostih višji temperaturi pa je izražanje bilo nižje, kar so avtorji pripisovali upadu celične funkcije zaradi visokih temperatur. Že pri najkrajši izpostavljenosti (1 min) višji temperaturi je sistem podal robustni odziv.
Kot najbolj optimalna sistema sta se izkazala oba daljša konstrukta (vsebujeta vse domnevne elemente ''hse''), saj so pri njima opazili močnejšo indukcijo in manjše puščanje promotorja v primerjavi s krajšim konstruktom [1].

== Temperaturno pogojena rast ''N. crasse'' ==
Celulozni regulator 2 (CLR-2) je transkripcijski faktor, ki je ključen pri regulaciji celulazne aktivnosti ''N. crasse'', saj je potreben za indukcijo ekspresije celulolitičnih genov. V industriji je pomembno nadzorovano izražanje CLR-2, s tem se na primer poveča proizvodnja bioetanola. Avtorji so pripravili sev ''N. crasse'', pri katerem so zapis za CLR-2 postavili pod promotor ''hsp30'' in opazovali rast celic pri različnih pogojih.
Najkrajši promotor ''hse30'' vsebuje le dve od štirih domnevnih regij ''hse'' in se je zato izkazal kot najmanj optimalen sistem za uravnavanje transkripcije (glej Odziv promotorja ''hsp30'' na toplotne dražljaje). Vseeno pa so ga avtorji pri tem eksperimentu uporabili zaradi njegove kratke dolžine (500 baznih parov). V ''N. crassi'' so namreč prisotne ponavljajoče se inducirane točkovne mutacije (RIP), kot obrambni mehanizem za zmanjšanje aktivnosti in širjenja mobilnih genetskih elementov, ki pa je manj pogosta v krajših segmentih DNA [1].

Rezultati so pokazali, da se sev ''hsp300:clr-2'' ne razvija v tekočih gojiščih z Avicelom (kristalinična celuloza) pri normalni temperaturi (25 °C). Vendar pa se po vsakodnevnih impulzih toplote (45 °C) rast povrne in celo preseže WT sev plesni [1].

== Načrtovanje sintetičnega promotorja iz domnevnih ''cis'' regij ''hsp30'' ==
Da bi uporabili vse domnevne regije ''hse'', in hkrati znižali pogostost RIP-induciranih mutacij so avtorji načrtali 2 sintetična promotorja. Ocenili so minimalno dolžino bližnjega promotorja (okoli 250 bp) in mu dodali domnevne regije ''hse''. S primerjavo promotorja ''hse30'' s promotorji ''hse30'' iz sorodnih organizmov ''N. crasse'' so identificirali še peto regijo ''hse'', ki je prav tako ohranjena, in tudi njo vključili v konstrukt. Razlika med sintetičnima promoterjema je bila zgolj v dolžini vmesnikov med domnevnimi regulatornimi regijami ''hse'' [1].

Tudi oba sintetična promotorja sta izkazala dobro nastavljivost pri različnih toplotnih tretmajih, vendar sta oba prikazala relativno močno bazalno aktivnost. Je pa tovrstno puščanje promotorja velikokrat prisotno ob načrtovanju umetnih promotorjev. Vseeno pa sta se oba nova promotorja izkazala za bolj uporaben sistem nastavljivega izražanja od promotorjev ''hsp70'' in ''hsp80'', prav tako so opazili višje stopnje izražanja od najkrajše verzije promotorja ''hsp30''. Zaradi velike ohranjenosti promotorja ''hsp30'' bi podobni promotorji najverjetneje delovali tudi v ostalih askomicetah, kot na primer v biotehnološko pomembnih ''Aspergillus niger'' ali ''Trichoderma reesei'' [1, 2].

== Zaključek ==
Sistem s finim uravnavanjem transkripcije preko toplotne indukcije predstavlja obetavno orodje za raziskave funkcije genov, pa tudi za biotehnološke aplikacije, kot so proizvodnja encimov, metabolitov ali drugih biološko pomembnih snovi. V primerjavi s kemično induciranimi sistemi se izkaže za lažje reverzibilen sistem, saj ni treba dodajati eksogenih sredstev, ki jih je težko odstraniti iz gojišča. Hkrati pa je enostaven za uporabo, sploh v primerjavi s svetlobno indukcijo, kjer je potreba po dobro definiranih laboratorijskih nastavitvah (temna soba). Vendar pa se pri toplotni indukciji pojavljajo potencialne težave oziroma omejitve, kot so stres za organizem ali neselektivna aktivacija genov [1, 3].

Ko so zapis za CLR-2 postavili pod promotor ''hse30'' , so avtorji (kljub izbiri neoptimalnega promotorja) prikazali možnost uporabe toplotno inducibilnega sistema za regulacijo izražanja pri želenih fenotipih. Ob nadaljnji optimizaciji procesa bi se celulazna aktivnost plesni dodatno povečala, kar odpira priložnost uporabe tovrstnih sistemov v industriji. Glavna ovira pri industrijski uporabi razgradnje celuloze so namreč visoki stroški proizvodnje encimov, kar tudi preprečuje nižje cene bioetanola [1, 4].

== Literatura ==

[1] C. Tabilo-Agurto, V. Del Rio-Pinilla, V. Eltit-Villarroel, A. Goity, F. Muñoz-Guzmán, in L. F. Larrondo, „Developing a Temperature-Inducible Transcriptional Rheostat in Neurospora crassa“, mBio, let. 14, št. 1, str. e03291-22, feb. 2023, doi: 10.1128/mbio.03291-22.

[2] J. Han, B. McLane, E.-H. Kim, J.-W. Yoon, in H.-S. Jun, „Remission of diabetes by insulin gene therapy using a hepatocyte-specific and glucose-responsive synthetic promoter“, Mol. Ther. J. Am. Soc. Gene Ther., let. 19, št. 3, str. 470–478, mar. 2011, doi: 10.1038/mt.2010.255.

[3] J. Hearn, I. Ssinabulya, J. I. Schwartz, A. R. Akiteng, H. J. Ross, in J. A. Cafazzo, „Self-management of non-communicable diseases in low- and middle-income countries: A scoping review“, PLOS ONE, let. 14, št. 7, str. e0219141, jul. 2019, doi: 10.1371/journal.pone.0219141.

[4] A. K. Chandel, C. Es, R. Rudravaram, M. L. Narasu, V. Rao, in P. Ravindra, „Economics and environmental impact of bioethanol production technologies: an appraisal“.

Razvoj temperaturno inducibilnega transkripcijskega reostata pri Neurospori crassi

2023-04-11T06:24:20Z

Lsegota:

Izhodiščni članek : [https://journals.asm.org/doi/10.1128/mbio.03291-22: Developing a Temperature-Inducible Transcriptional Rheostat in Neurospora crassa]

== Uvod ==
''Neurospora crassa'' je rdeča plesen, ki spada v deblo askomicet. Zaradi svoje majhnosti, enostavnosti vzgoje in opravljanja genskih analiz, je ''N. crassa'' pomemben modelni organizem za raziskovanje številnih bioloških procesov, vključno s celičnim ciklom, fotosintezo, biološkimi ritmi, staranjem in razvojem. Prav tako proizvaja encime, ki razgrajujejo celulozo, kar je koristno pri proizvodnji etanola iz celuloznih virov [1].

Proteini toplotnega šoka (HSP) sodelujejo pri odzivu celice na stresne pogoje, kot so visoke ali nizke temperature, oksidativni stres in izpostavljenost strupenim snovem. Delujejo kot šaperoni, njihova naloga pa je zaščititi celice pred poškodbami s preprečevanjem nepravilnega zvitja proteinov. Vendar pa področje uravnavanja izražanja genov, ki kodirajo ''hsp'', še vedno ostaja delno neraziskano, zlasti v kontekstu modelnih glivnih organizmov, kot je ''N. crassa''. Faktorji toplotnega šoka (HSF) so pri stresnih pogojih aktivatorji transkripcije za proteine HSP. Po oligomerizaciji se faktorji HSF vežejo na DNA, in sicer na elemente toplotnega šoka (''hse''), ki so pri evkariontih relativno ohranjeni. V ''N. crassi'' so opisani trije geni hsp (''hsp30'', ''hsp70'' in ''hsp80''), ki se vsi izražajo pri visokih temperaturah, prav tako pa so pri vsakem odkrili domnevne ''cis'' regulatorne elemente [1].

V ''N. crassa'' so načrtali že mnogo promotorjev, ki se odzivajo na kemične signale (kot so glukoza, kininska kislina in baker), od fizično induciranih sistemov pa so razvili le takšnega, ki se odziva na svetlobo. Temperaturno induciran sistem, bi medtem omogočil zelo enostavno uravnavanje izražanja genov brez potrebe po dodajanju eksogenih kemikalij [1].

== Funkcijska analiza promotorjev ''hsp'' ==
V preteklih študijah so pri promotorju gena ''hsp30'' definirali štiri regije ''hse'', medtem ko so v promotorju ''hsp70'' našli dve. ''Hsp70'' ne vsebuje regulatornih elementov ''hse'', vendar so opisane nekoliko različne ''cis'' regije, poimenovane kot elementi odziva na temperaturo (''tre'').
Da bi bolj okarakterizirali regulacijo genov so pripravili paleto konstruktov, ki so poleg bližnjega promotorja vsebovali različno dolge 5' regije. Različni konstrukti enakega gena pa so pri tem vsebovali raznoliko število regulatornih ''cis'' elementov. Za analizo so uporabili luciferazo iz kresničke z dodanim zaporedjem PEST (ki poveča razgradnjo proteina), kar skupaj tvori reporterski sistem za zaznavo transkripcije v realnem času. Pri sobni temperaturi so nagojili reporterske seve plesni in jih v temi izpostavili enournemu toplotnemu šoku pri treh različnih temperaturah: dveh visokih (35 °C in 45 °C) in eni, ki je bila bližja laboratorijskim rastnim pogojem ''N. crasse'' (30 °C), in merili luminiscenco s CCD kamero [1].

Vsi polno dolgi konstrukti so izkazali podobno hiter in močen odziv na toplotni šok pri 45 °C, medtem ko je bil odziv pri 35 °C neprimerno nižji, pri 30 °C pa odziva sploh ni bilo. Skrajšani konstrukti so se pri ''hsp30'' in ''hsp70'' odzivali v skladu s številom domnevnih ''hse'' regij, ki so jih vsebovali. Medtem je konstrukt s polovičnim promotorjem ''hsp80'' (ki je vseboval 5 od 7 domnevnih regij ''tre''), pokazal kar 9-krat nižji odziv od konstrukta s polnim promotorjem, kar kaže na pomanjkljivo poznavanje regulacije promotorja ''hse80''. Izmed treh genov so pri ''hsp30'' opazili mnogo najnižje puščanje promotorja (pri 25 °C), zaradi česa so pri omenjenem genu opazili več kot 1000-kratno povečanje izražanja (razmerje med bazalnim vrhom in induciranim vrhom) [1].

''Hsp30'' ima nižjo molekularno maso od ostalih dveh sorodnih proteinov (30 kDa proti 70 kDa / 80 kDa) na račun odsotnosti ATP-hidrolizne domene. Zaradi tega so pri stresnih pogojih manjši HSP-ji prvi, ki posredujejo proti proteinski denaturaciji, kar korelira z opaženo visoko stopnjo povečanja izražanja pri ''hsp30''.
Avtorji so ''hsp30'' primerjali z drugimi znanimi inducibilnimi sistemi v ''N. crassa'', kot sta promotor ''qa-2'', ki se odziva na naraščajoče koncentracije kininske kisline in promotor ''vvd'', ki se aktivira s svetlobo. Promotor ''hsp30'' je imel najnižjo bazalno aktivnost in pa najvišjo aktivnost v induciranem stanjupotreboval pa je dlje časa za regeneracijo do minimuma aktivnosti po dražljaju (7 h) od promotorja ''vvd'' (4 h) [1].

== Odziv promotorja ''hsp30'' na toplotne dražljaje ==
Zaradi najbolj robustnega odziva na toplotne dražljaje so avtorji za nadaljnje delo izbrali promotor ''hsp30''. Zanimalo jih je promotorjev odziv na različno dolge toplotne dražljaje pri različnih temperaturah, zato so skonstruirali pristop, ki omogoča hitro in enostavno analizo.
Eksperiment so opravili v formatu mikrotitrske plošče za PCR in testirali 3 različne promotorje ''hsp30'' (en celoten in dva skrajšana). Pripravili so paleto različnih pogojev in ocenjevali odziv promotorja z merjenjem luminiscence. Vzorci so bili izpostavljeni šestim različnim temperaturam (v rangu od 34 °C do 46 °C), pri čem so toplotni dražljaji trajali 60, 30, 15, 5, in 1 min. V obzir pa je treba vzeti, da je zaradi relativno majhnega volumna gojišča (PCR mikrocentrifugirka), bila omejena količina dodanega medija in zato omejena rast plesni [1].

Konstrukti s promotorji ''hsp30'' so se izkazali za izjemno nastavljive sisteme, saj se je stopnja odziva povečevala, ko se je zviševala temperatura, prav tako pa so opazili večji odziv, kjer je temperaturni dražljaj trajal dlje časa. Vendar pa je maksimalni odziv bil opažen pri 15 min, pri daljših izpostavljenostih višji temperaturi pa je izražanje bilo nižje, kar so avtorji pripisovali upadu celične funkcije zaradi visokih temperatur. Že pri najkrajši izpostavljenosti (1 min) višji temperaturi je sistem podal robustni odziv.
Kot najbolj optimalna sistema sta se izkazala oba daljša konstrukta (vsebujeta vse domnevne elemente ''hse''), saj so pri njima opazili močnejšo indukcijo in manjše puščanje promotorja v primerjavi s krajšim konstruktom [1].

== Temperaturno pogojena rast ''N. crasse'' ==
Celulozni regulator 2 (CLR-2) je transkripcijski faktor, ki je ključen pri regulaciji celulazne aktivnosti ''N. crasse'', saj je potreben za indukcijo ekspresije celulolitičnih genov. V industriji je pomembno nadzorovano izražanje CLR-2, s tem se na primer poveča proizvodnja bioetanola. Avtorji so pripravili sev ''N. crasse'', pri katerem so zapis za CLR-2 postavili pod promotor ''hsp30'' in opazovali rast celic pri različnih pogojih.
Najkrajši promotor ''hse30'' vsebuje le dve od štirih domnevnih regij ''hse'' in se je zato izkazal kot najmanj optimalen sistem za uravnavanje transkripcije (glej Odziv promotorja ''hsp30'' na toplotne dražljaje). Vseeno pa so ga avtorji pri tem eksperimentu uporabili zaradi njegove kratke dolžine (500 baznih parov). V ''N. crassi'' so namreč prisotne ponavljajoče se inducirane točkovne mutacije (RIP), kot obrambni mehanizem za zmanjšanje aktivnosti in širjenja mobilnih genetskih elementov, ki pa je manj pogosta v krajših segmentih DNA [1].

Rezultati so pokazali, da se sev ''hsp300:clr-2'' ne razvija v tekočih gojiščih z Avicelom (kristalinična celuloza) pri normalni temperaturi (25 °C). Vendar pa se po vsakodnevnih impulzih toplote (45 °C) rast povrne in celo preseže ''WT'' sev plesni [1].

== Načrtovanje sintetičnega promotorja iz domnevnih ''cis'' regij ''hsp30'' ==
Da bi uporabili vse domnevne regije ''hse'', in hkrati znižali pogostost RIP-induciranih mutacij so avtorji načrtali 2 sintetična promotorja. Ocenili so minimalno dolžino bližnjega promotorja (okoli 250 bp) in mu dodali domnevne regije ''hse''. S primerjavo promotorja ''hse30'' s promotorji ''hse30'' iz sorodnih organizmov ''N. crasse'' so identificirali še peto regijo ''hse'', ki je prav tako ohranjena, in tudi njo vključili v konstrukt. Razlika med sintetičnima promoterjema je bila zgolj v dolžini vmesnikov med domnevnimi regulatornimi regijami ''hse'' [1].

Tudi oba sintetična promotorja sta izkazala dobro nastavljivost pri različnih toplotnih tretmajih, vendar sta oba prikazala relativno močno bazalno aktivnost. Je pa tovrstno puščanje promotorja velikokrat prisotno ob načrtovanju umetnih promotorjev. Vseeno pa sta se oba nova promotorja izkazala za bolj uporaben sistem nastavljivega izražanja od promotorjev ''hsp70'' in ''hsp80'', prav tako so opazili višje stopnje izražanja od najkrajše verzije promotorja ''hsp30''. Zaradi velike ohranjenosti promotorja ''hsp30'' bi podobni promotorji najverjetneje delovali tudi v ostalih askomicetah, kot na primer v biotehnološko pomembnih ''Aspergillus niger'' ali ''Trichoderma reesei'' [1, 2].

== Zaključek ==
Sistem s finim uravnavanjem transkripcije preko toplotne indukcije predstavlja obetavno orodje za raziskave funkcije genov, pa tudi za biotehnološke aplikacije, kot so proizvodnja encimov, metabolitov ali drugih biološko pomembnih snovi. V primerjavi s kemično induciranimi sistemi se izkaže za lažje reverzibilen sistem, saj ni treba dodajati eksogenih sredstev, ki jih je težko odstraniti iz gojišča. Hkrati pa je enostaven za uporabo, sploh v primerjavi s svetlobno indukcijo, kjer je potreba po dobro definiranih laboratorijskih nastavitvah (temna soba). Vendar pa se pri toplotni indukciji pojavljajo potencialne težave oziroma omejitve, kot so stres za organizem ali neselektivna aktivacija genov [1, 3].

Ko so zapis za CLR-2 postavili pod promotor ''hse30'' , so avtorji (kljub izbiri neoptimalnega promotorja) prikazali možnost uporabe toplotno inducibilnega sistema za regulacijo izražanja pri želenih fenotipih. Ob nadaljnji optimizaciji procesa bi se celulazna aktivnost plesni dodatno povečala, kar odpira priložnost uporabe tovrstnih sistemov v industriji. Glavna ovira pri industrijski uporabi razgradnje celuloze so namreč visoki stroški proizvodnje encimov, kar tudi preprečuje nižje cene bioetanola [1, 4].

== Literatura ==

[1] C. Tabilo-Agurto, V. Del Rio-Pinilla, V. Eltit-Villarroel, A. Goity, F. Muñoz-Guzmán, in L. F. Larrondo, „Developing a Temperature-Inducible Transcriptional Rheostat in Neurospora crassa“, mBio, let. 14, št. 1, str. e03291-22, feb. 2023, doi: 10.1128/mbio.03291-22.

[2] J. Han, B. McLane, E.-H. Kim, J.-W. Yoon, in H.-S. Jun, „Remission of diabetes by insulin gene therapy using a hepatocyte-specific and glucose-responsive synthetic promoter“, Mol. Ther. J. Am. Soc. Gene Ther., let. 19, št. 3, str. 470–478, mar. 2011, doi: 10.1038/mt.2010.255.

[3] J. Hearn, I. Ssinabulya, J. I. Schwartz, A. R. Akiteng, H. J. Ross, in J. A. Cafazzo, „Self-management of non-communicable diseases in low- and middle-income countries: A scoping review“, PLOS ONE, let. 14, št. 7, str. e0219141, jul. 2019, doi: 10.1371/journal.pone.0219141.

[4] A. K. Chandel, C. Es, R. Rudravaram, M. L. Narasu, V. Rao, in P. Ravindra, „Economics and environmental impact of bioethanol production technologies: an appraisal“.

Razvoj temperaturno inducibilnega transkripcijskega reostata pri Neurospori crassi

2023-04-10T22:39:02Z

Lsegota:

Izhodiščni članek : [https://journals.asm.org/doi/10.1128/mbio.03291-22: Developing a Temperature-Inducible Transcriptional Rheostat in Neurospora crassa]

== Uvod ==
Neurospora crassa je rdeča plesen, ki spada v deblo askomicet. Zaradi svoje majhnosti, enostavnosti vzgoje in opravljanja genskih analiz, je N. crassa pomemben modelni organizem za raziskovanje številnih bioloških procesov, vključno s celičnim ciklom, fotosintezo, biološkimi ritmi, staranjem in razvojem. Prav tako proizvaja encime, ki razgrajujejo celulozo, kar je koristno pri proizvodnji etanola iz celuloznih virov [1].

Proteini toplotnega šoka (hsp) sodelujejo pri odzivu celice na stresne pogoje, kot so visoke ali nizke temperature, oksidativni stres in izpostavljenost strupenim snovem. Delujejo kot šaperoni, njihova naloga pa je zaščititi celice pred poškodbami s preprečevanjem nepravilnega zvitja proteinov. Vendar pa področje uravnavanja izražanja genov, ki kodirajo hsp, še vedno ostaja delno neraziskano, zlasti v kontekstu modelnih glivnih organizmov, kot je N. crassa. Faktorji toplotnega šoka (hsf) so pri stresnih pogojih aktivatorji transkripcije za proteine hsp. Po oligomerizaciji se faktorji hsf vežejo na DNA, in sicer na elemente toplotnega šoka (hse), ki so pri evkariontih relativno ohranjeni. V N. crassi so opisani trije geni hsp (hsp30, hsp70 in hsp80), ki se vsi izražajo pri visokih temperaturah, prav tako pa so pri vsakem odkrili domnevne cis regulatorne elemente [1].

V N. crassa so načrtali že mnogo promotorjev, ki se odzivajo na kemične signale (kot so glukoza, kininska kislina in baker), od fizično induciranih sistemov pa so razvili le takšnega, ki se odziva na svetlobo. Temperaturno induciran sistem, bi medtem omogočil zelo enostavno uravnavanje izražanja genov brez potrebe po dodajanju eksogenih kemikalij [1].

== Funkcijska analiza promotorjev hsp ==
V preteklih študijah so pri promotorju gena hsp30 definirali štiri regije hse, medtem ko so v promotorju hsp70 našli dve. Hsp70 ne vsebuje regulatornih elementov hse, vendar so opisane nekoliko različne cis regije, poimenovane kot elementi odziva na temperaturo (tre).
Da bi bolj okarakterizirali regulacijo genov so pripravili paleto konstruktov, ki so poleg bližnjega promotorja vsebovali različno dolge 5' regije. Različni konstrukti enakega gena pa so pri tem vsebovali raznoliko število regulatornih cis elementov. Za analizo so uporabili luciferazo iz kresničke z dodanim zaporedjem PEST (ki poveča razgradnjo proteina) kar skupaj tvori reporterski sistem za zaznavo transkripcije v realnem času. Pri sobni temperaturi so nagojili reporterske seve glive in jih v temi izpostavili enournemu toplotnemu šoku pri treh različnih temperaturah: dveh visokih (35 °C in 45 °C) in eni, ki je bila bližja laboratorijskim rastnim pogojem N. crasse (30 °C), in merili luminiscenco s CCD kamero [1].

Vsi polno dolgi konstrukti so izkazali podobno hiter in močen odziv na toplotni šok pri 45 °C, medtem ko je bil odziv pri 35 °C neprimerno nižji, pri 30 °C pa odziva sploh ni bilo. Skrajšani konstrukti so se pri hsp30 in hsp70 odzivali v skladu s številom domnevnih hse regij, ki so jih vsebovali. Medtem je konstrukt s polovičnim promotorjem hsp80 (ki je vseboval 5 od 7 domnevnih tre regij), pokazal kar 9-krat nižji odziv od konstrukta s polnim promotorjem, kar kaže na pomanjkljivo poznavanje regulacije promotorja hse80. Izmed treh genov so pri hsp30 opazili mnogo najnižje puščanje promotorja (pri 25 °C), zaradi česa so pri omenjenem genu opazili več kot 1000-kratno povečanje izražanja (razmerje med bazalnim vrhom in induciranim vrhom) [1].

Hsp30 ima nižjo molekularno maso od ostalih dveh sorodnih proteinov (30 kDa proti 70 kDa / 80 kDa) na račun odsotnosti ATP hidrolazne domene. Zaradi tega so pri stresnih pogojih manjši hsp-ji prvi, ki posredujejo proti proteinski denaturaciji, kar korelira z opaženo visoko stopnjo povečanja izražanja pri hsp30.
Avtorji so hsp30 primerjali z drugimi znanimi inducibilnimi sistemi v N. crassa, kot sta promotor qa-2, ki se odziva na naraščajoče koncentracije kininske kisline in promotor vvd, ki se aktivira s svetlobo. Promotor hsp30 je imel najnižjo bazalno aktivnost in pa najvišjo aktivnost v induciranem stanjupotreboval pa je dlje časa za regeneracijo do minimuma aktivnosti po dražljaju (7 h) od vvd promotorja (4 h) [1].

== Odziv promotorja hsp30 na toplotne dražljaje ==
Zaradi najbolj robustnega odziva na toplotne dražljaje so avtorji za nadaljnje delo izbrali promotor hsp30. Zanimalo jih je promotorjev odziv na različno dolge toplotne šoke pri različnih temperaturah, zato so skonstruirali pristop, ki omogoča hitro in enostavno analizo.
Eksperiment so opravili v formatu mikrotitrske plošče za pcr in testirali 3 različne promotorje hsp30 (en celoten in dva skrajšana). Pripravili so paleto različnih pogojev in ocenjevali odziv promotorja z merjenjem luminiscence. Vzorci so bili izpostavljeni šestim različnim temperaturam (v rangu od 34 °C do 46 °C), pri čem so toplotni dražljaji trajali 60, 30, 15, 5, in 1 min. V obzir pa je treba vzeti, da je zaradi relativno majhnega volumna gojišča (pcr mikrocentrifugirka), bila omejena količina dodanega medija in zato omejena rast plesni [1].

Konstrukti s promotorji hsp30 so se izkazali za izjemno nastavljive sisteme, saj se je stopnja odziva povečevala, ko se je zviševala temperatura, prav tako pa so opazili večji odziv, kjer je temperaturni dražljaj trajal dlje časa. Vendar pa je maksimalni odziv bil opažen pri 15 min, pri daljših izpostavljenostih višji temperaturi pa je izražanje bilo nižje, kar so avtorji pripisovali upadu celične funkcije zaradi visokih temperatur. Že pri najkrajši izpostavljenosti (1 min) višji temperaturi je sistem podal robustni odziv.
Kot najbolj optimalna sistema sta se izkazala oba daljša konstrukta (vsebujeta vse domnevne elemente hse), saj so pri njima opazili močnejšo indukcijo in manjše puščanje promotorja v primerjavi s krajšim konstruktom [1].

== Temperaturno pogojena rast N. crasse ==
Celulozni regulator 2 (CLR-2) je transkripcijski faktor, ki je ključen pri regulaciji celulazne aktivnosti N. crasse, saj je potreben za indukcijo ekspresije celulolitičnih genov. V industriji je pomembno nadzorovano izražanje CLR-2, s tem se na primer poveča proizvodnja bioetanola. Avtorji so pripravili sev N. crasse, pri katerem so zapis za CLR-2 postavili pod promotor hsp30 in opazovali rast celic pri različnih pogojih.
Najkrajši promotor hse30 vsebuje le dve od štirih domnevnih regij hse in se je zato izkazal kot najmanj optimalen sistem za uravnavanje transkripcije (glej Odziv promotorja hsp30 na toplotne dražljaje). Vseeno pa so ga avtorji pri tem eksperimentu uporabili zaradi njegove kratke dolžine (500 baznih parov). V N. crassi so namreč prisotne ponavljajoče se inducirane točkovne mutacije (RIP), kot obrambni mehanizem za zmanjšanje aktivnosti in širjenja mobilnih genetskih elementov, ki pa je manj pogosta v krajših segmentih DNA [1].

Rezultati so pokazali, da se sev hsp300.5 kb:clr-2 ne razvija v tekočih gojiščih z Avicelom (kristalinična celuloza) pri normalni temperaturi (25°C). Vendar pa se po vsakodnevnih impulzih toplote (45°C) rast povrne in celo preseže WT sev plesni [1].

== Načrtovanje sintetičnega promotorja iz domnevnih cis regij hsp30 ==
Da bi uporabili vse domnevne hse regije, in hkrati znižali pogostost RIP-induciranih mutacij so avtorji načrtali 2 sintetična promotorja. Ocenili so minimalno dolžino bližnjega promotorja (okoli 250 bp) in mu dodali domnevne regije hse. S primerjavo promotorja hse30 s promotorji hse30 iz sorodnih organizmov N. crasse so identificirali še peto regijo hse, ki je prav tako ohranjena, in tudi njo vključili v konstrukt. Razlika med sintetičnima promoterjema je bila zgolj v dolžini vmesnikov med domnevnimi regulatornimi regijami hse [1].

Tudi oba sintetična promotorja sta izkazala dobro nastavljivost pri različnih toplotnih tretmajih, vendar sta oba prikazala relativno močno bazalno aktivnost. Je pa tovrstno puščanje promotorja velikokrat prisotno ob načrtovanju umetnih promotorjev. Vseeno pa sta se oba nova promotorja izkazala za bolj uporaben sistem nastavljivega izražanja od promotorjev hsp70 in hsp80, prav tako so opazili višje stopnje izražanja od najkrajše verzije promotorja hsp30. Zaradi velike ohranjenosti promotorja hsp30 bi podobni promotorji najverjetneje delovali tudi v ostalih askomicetah, kot na primer v biotehnološko pomembnih Aspergillus niger ali Trichoderma reesei [1, 2].

== Zaključek ==
Sistem s finim uravnavanjem transkripcije preko toplotne indukcije predstavlja obetavno orodje za raziskave funkcije genov, pa tudi za biotehnološke aplikacije, kot so proizvodnja encimov, metabolitov ali drugih biološko pomembnih snovi. V primerjavi s kemično induciranimi sistemi se izkaže za lažje reverzibilen sistem, saj ni treba dodajati eksogenih sredstev, ki jih je težko odstraniti iz gojišča. Hkrati pa je enostaven za uporabo, sploh v primerjavi s svetlobno indukcijo, kjer je potreba po dobro definiranih laboratorijskih nastavitvah (temna soba). Vendar pa se pri toplotni indukciji pojavljajo potencialne težave oziroma omejitve, kot so stres za organizem ali neselektivna aktivacija genov [1, 3].

Ko so zapis za clr-2 postavili pod hse30 promotor, so avtorji (kljub izbiri neoptimalnega promotorja) prikazali možnost uporabe toplotno inducibilnega sistema za regulacijo izražanja pri želenih fenotipih. Ob nadaljnji optimizaciji procesa bi se celulazna aktivnost plesni dodatno povečala, kar odpira priložnost uporabe tovrstnih sistemov v industriji. Glavna ovira pri industrijski uporabi razgradnje celuloze so namreč visoki stroški proizvodnje encimov, kar tudi preprečuje nižje cene bioetanola [1, 4].

== Literatura ==

[1] C. Tabilo-Agurto, V. Del Rio-Pinilla, V. Eltit-Villarroel, A. Goity, F. Muñoz-Guzmán, in L. F. Larrondo, „Developing a Temperature-Inducible Transcriptional Rheostat in Neurospora crassa“, mBio, let. 14, št. 1, str. e03291-22, feb. 2023, doi: 10.1128/mbio.03291-22.

[2] J. Han, B. McLane, E.-H. Kim, J.-W. Yoon, in H.-S. Jun, „Remission of diabetes by insulin gene therapy using a hepatocyte-specific and glucose-responsive synthetic promoter“, Mol. Ther. J. Am. Soc. Gene Ther., let. 19, št. 3, str. 470–478, mar. 2011, doi: 10.1038/mt.2010.255.

[3] J. Hearn, I. Ssinabulya, J. I. Schwartz, A. R. Akiteng, H. J. Ross, in J. A. Cafazzo, „Self-management of non-communicable diseases in low- and middle-income countries: A scoping review“, PLOS ONE, let. 14, št. 7, str. e0219141, jul. 2019, doi: 10.1371/journal.pone.0219141.

[4] A. K. Chandel, C. Es, R. Rudravaram, M. L. Narasu, V. Rao, in P. Ravindra, „Economics and environmental impact of bioethanol production technologies: an appraisal“.

Razvoj temperaturno inducibilnega transkripcijskega reostata pri Neurospori crassi

2023-04-10T22:36:31Z

Lsegota:

Razvijanje temperaturno inducibilnega transkripcijskega reostata pri Neurospori crassi

== Uvod ==
Neurospora crassa je rdeča plesen, ki spada v deblo askomicet. Zaradi svoje majhnosti, enostavnosti vzgoje in opravljanja genskih analiz, je N. crassa pomemben modelni organizem za raziskovanje številnih bioloških procesov, vključno s celičnim ciklom, fotosintezo, biološkimi ritmi, staranjem in razvojem. Prav tako proizvaja encime, ki razgrajujejo celulozo, kar je koristno pri proizvodnji etanola iz celuloznih virov [1].

Proteini toplotnega šoka (hsp) sodelujejo pri odzivu celice na stresne pogoje, kot so visoke ali nizke temperature, oksidativni stres in izpostavljenost strupenim snovem. Delujejo kot šaperoni, njihova naloga pa je zaščititi celice pred poškodbami s preprečevanjem nepravilnega zvitja proteinov. Vendar pa področje uravnavanja izražanja genov, ki kodirajo hsp, še vedno ostaja delno neraziskano, zlasti v kontekstu modelnih glivnih organizmov, kot je N. crassa. Faktorji toplotnega šoka (hsf) so pri stresnih pogojih aktivatorji transkripcije za proteine hsp. Po oligomerizaciji se faktorji hsf vežejo na DNA, in sicer na elemente toplotnega šoka (hse), ki so pri evkariontih relativno ohranjeni. V N. crassi so opisani trije geni hsp (hsp30, hsp70 in hsp80), ki se vsi izražajo pri visokih temperaturah, prav tako pa so pri vsakem odkrili domnevne cis regulatorne elemente [1].

V N. crassa so načrtali že mnogo promotorjev, ki se odzivajo na kemične signale (kot so glukoza, kininska kislina in baker), od fizično induciranih sistemov pa so razvili le takšnega, ki se odziva na svetlobo. Temperaturno induciran sistem, bi medtem omogočil zelo enostavno uravnavanje izražanja genov brez potrebe po dodajanju eksogenih kemikalij [1].

== Funkcijska analiza promotorjev hsp ==
V preteklih študijah so pri promotorju gena hsp30 definirali štiri regije hse, medtem ko so v promotorju hsp70 našli dve. Hsp70 ne vsebuje regulatornih elementov hse, vendar so opisane nekoliko različne cis regije, poimenovane kot elementi odziva na temperaturo (tre).
Da bi bolj okarakterizirali regulacijo genov so pripravili paleto konstruktov, ki so poleg bližnjega promotorja vsebovali različno dolge 5' regije. Različni konstrukti enakega gena pa so pri tem vsebovali raznoliko število regulatornih cis elementov. Za analizo so uporabili luciferazo iz kresničke z dodanim zaporedjem PEST (ki poveča razgradnjo proteina) kar skupaj tvori reporterski sistem za zaznavo transkripcije v realnem času. Pri sobni temperaturi so nagojili reporterske seve glive in jih v temi izpostavili enournemu toplotnemu šoku pri treh različnih temperaturah: dveh visokih (35 °C in 45 °C) in eni, ki je bila bližja laboratorijskim rastnim pogojem N. crasse (30 °C), in merili luminiscenco s CCD kamero [1].

Vsi polno dolgi konstrukti so izkazali podobno hiter in močen odziv na toplotni šok pri 45 °C, medtem ko je bil odziv pri 35 °C neprimerno nižji, pri 30 °C pa odziva sploh ni bilo. Skrajšani konstrukti so se pri hsp30 in hsp70 odzivali v skladu s številom domnevnih hse regij, ki so jih vsebovali. Medtem je konstrukt s polovičnim promotorjem hsp80 (ki je vseboval 5 od 7 domnevnih tre regij), pokazal kar 9-krat nižji odziv od konstrukta s polnim promotorjem, kar kaže na pomanjkljivo poznavanje regulacije promotorja hse80. Izmed treh genov so pri hsp30 opazili mnogo najnižje puščanje promotorja (pri 25 °C), zaradi česa so pri omenjenem genu opazili več kot 1000-kratno povečanje izražanja (razmerje med bazalnim vrhom in induciranim vrhom) [1].

Hsp30 ima nižjo molekularno maso od ostalih dveh sorodnih proteinov (30 kDa proti 70 kDa / 80 kDa) na račun odsotnosti ATP hidrolazne domene. Zaradi tega so pri stresnih pogojih manjši hsp-ji prvi, ki posredujejo proti proteinski denaturaciji, kar korelira z opaženo visoko stopnjo povečanja izražanja pri hsp30.
Avtorji so hsp30 primerjali z drugimi znanimi inducibilnimi sistemi v N. crassa, kot sta promotor qa-2, ki se odziva na naraščajoče koncentracije kininske kisline in promotor vvd, ki se aktivira s svetlobo. Promotor hsp30 je imel najnižjo bazalno aktivnost in pa najvišjo aktivnost v induciranem stanjupotreboval pa je dlje časa za regeneracijo do minimuma aktivnosti po dražljaju (7 h) od vvd promotorja (4 h) [1].

== Odziv promotorja hsp30 na toplotne dražljaje ==
Zaradi najbolj robustnega odziva na toplotne dražljaje so avtorji za nadaljnje delo izbrali promotor hsp30. Zanimalo jih je promotorjev odziv na različno dolge toplotne šoke pri različnih temperaturah, zato so skonstruirali pristop, ki omogoča hitro in enostavno analizo.
Eksperiment so opravili v formatu mikrotitrske plošče za pcr in testirali 3 različne promotorje hsp30 (en celoten in dva skrajšana). Pripravili so paleto različnih pogojev in ocenjevali odziv promotorja z merjenjem luminiscence. Vzorci so bili izpostavljeni šestim različnim temperaturam (v rangu od 34 °C do 46 °C), pri čem so toplotni dražljaji trajali 60, 30, 15, 5, in 1 min. V obzir pa je treba vzeti, da je zaradi relativno majhnega volumna gojišča (pcr mikrocentrifugirka), bila omejena količina dodanega medija in zato omejena rast plesni [1].

Konstrukti s promotorji hsp30 so se izkazali za izjemno nastavljive sisteme, saj se je stopnja odziva povečevala, ko se je zviševala temperatura, prav tako pa so opazili večji odziv, kjer je temperaturni dražljaj trajal dlje časa. Vendar pa je maksimalni odziv bil opažen pri 15 min, pri daljših izpostavljenostih višji temperaturi pa je izražanje bilo nižje, kar so avtorji pripisovali upadu celične funkcije zaradi visokih temperatur. Že pri najkrajši izpostavljenosti (1 min) višji temperaturi je sistem podal robustni odziv.
Kot najbolj optimalna sistema sta se izkazala oba daljša konstrukta (vsebujeta vse domnevne elemente hse), saj so pri njima opazili močnejšo indukcijo in manjše puščanje promotorja v primerjavi s krajšim konstruktom [1].

== Temperaturno pogojena rast N. crasse ==
Celulozni regulator 2 (CLR-2) je transkripcijski faktor, ki je ključen pri regulaciji celulazne aktivnosti N. crasse, saj je potreben za indukcijo ekspresije celulolitičnih genov. V industriji je pomembno nadzorovano izražanje CLR-2, s tem se na primer poveča proizvodnja bioetanola. Avtorji so pripravili sev N. crasse, pri katerem so zapis za CLR-2 postavili pod promotor hsp30 in opazovali rast celic pri različnih pogojih.
Najkrajši promotor hse30 vsebuje le dve od štirih domnevnih regij hse in se je zato izkazal kot najmanj optimalen sistem za uravnavanje transkripcije (glej Odziv promotorja hsp30 na toplotne dražljaje). Vseeno pa so ga avtorji pri tem eksperimentu uporabili zaradi njegove kratke dolžine (500 baznih parov). V N. crassi so namreč prisotne ponavljajoče se inducirane točkovne mutacije (RIP), kot obrambni mehanizem za zmanjšanje aktivnosti in širjenja mobilnih genetskih elementov, ki pa je manj pogosta v krajših segmentih DNA [1].

Rezultati so pokazali, da se sev hsp300.5 kb:clr-2 ne razvija v tekočih gojiščih z Avicelom (kristalinična celuloza) pri normalni temperaturi (25°C). Vendar pa se po vsakodnevnih impulzih toplote (45°C) rast povrne in celo preseže WT sev plesni [1].

== Načrtovanje sintetičnega promotorja iz domnevnih cis regij hsp30 ==
Da bi uporabili vse domnevne hse regije, in hkrati znižali pogostost RIP-induciranih mutacij so avtorji načrtali 2 sintetična promotorja. Ocenili so minimalno dolžino bližnjega promotorja (okoli 250 bp) in mu dodali domnevne regije hse. S primerjavo promotorja hse30 s promotorji hse30 iz sorodnih organizmov N. crasse so identificirali še peto regijo hse, ki je prav tako ohranjena, in tudi njo vključili v konstrukt. Razlika med sintetičnima promoterjema je bila zgolj v dolžini vmesnikov med domnevnimi regulatornimi regijami hse [1].

Tudi oba sintetična promotorja sta izkazala dobro nastavljivost pri različnih toplotnih tretmajih, vendar sta oba prikazala relativno močno bazalno aktivnost. Je pa tovrstno puščanje promotorja velikokrat prisotno ob načrtovanju umetnih promotorjev. Vseeno pa sta se oba nova promotorja izkazala za bolj uporaben sistem nastavljivega izražanja od promotorjev hsp70 in hsp80, prav tako so opazili višje stopnje izražanja od najkrajše verzije promotorja hsp30. Zaradi velike ohranjenosti promotorja hsp30 bi podobni promotorji najverjetneje delovali tudi v ostalih askomicetah, kot na primer v biotehnološko pomembnih Aspergillus niger ali Trichoderma reesei [1, 2].

== Zaključek ==
Sistem s finim uravnavanjem transkripcije preko toplotne indukcije predstavlja obetavno orodje za raziskave funkcije genov, pa tudi za biotehnološke aplikacije, kot so proizvodnja encimov, metabolitov ali drugih biološko pomembnih snovi. V primerjavi s kemično induciranimi sistemi se izkaže za lažje reverzibilen sistem, saj ni treba dodajati eksogenih sredstev, ki jih je težko odstraniti iz gojišča. Hkrati pa je enostaven za uporabo, sploh v primerjavi s svetlobno indukcijo, kjer je potreba po dobro definiranih laboratorijskih nastavitvah (temna soba). Vendar pa se pri toplotni indukciji pojavljajo potencialne težave oziroma omejitve, kot so stres za organizem ali neselektivna aktivacija genov [1, 3].

Ko so zapis za clr-2 postavili pod hse30 promotor, so avtorji (kljub izbiri neoptimalnega promotorja) prikazali možnost uporabe toplotno inducibilnega sistema za regulacijo izražanja pri želenih fenotipih. Ob nadaljnji optimizaciji procesa bi se celulazna aktivnost plesni dodatno povečala, kar odpira priložnost uporabe tovrstnih sistemov v industriji. Glavna ovira pri industrijski uporabi razgradnje celuloze so namreč visoki stroški proizvodnje encimov, kar tudi preprečuje nižje cene bioetanola [1, 4].

== Literatura ==

[1] C. Tabilo-Agurto, V. Del Rio-Pinilla, V. Eltit-Villarroel, A. Goity, F. Muñoz-Guzmán, in L. F. Larrondo, „Developing a Temperature-Inducible Transcriptional Rheostat in Neurospora crassa“, mBio, let. 14, št. 1, str. e03291-22, feb. 2023, doi: 10.1128/mbio.03291-22.

[2] J. Han, B. McLane, E.-H. Kim, J.-W. Yoon, in H.-S. Jun, „Remission of diabetes by insulin gene therapy using a hepatocyte-specific and glucose-responsive synthetic promoter“, Mol. Ther. J. Am. Soc. Gene Ther., let. 19, št. 3, str. 470–478, mar. 2011, doi: 10.1038/mt.2010.255.

[3] J. Hearn, I. Ssinabulya, J. I. Schwartz, A. R. Akiteng, H. J. Ross, in J. A. Cafazzo, „Self-management of non-communicable diseases in low- and middle-income countries: A scoping review“, PLOS ONE, let. 14, št. 7, str. e0219141, jul. 2019, doi: 10.1371/journal.pone.0219141.

[4] A. K. Chandel, C. Es, R. Rudravaram, M. L. Narasu, V. Rao, in P. Ravindra, „Economics and environmental impact of bioethanol production technologies: an appraisal“.

Razvoj temperaturno inducibilnega transkripcijskega reostata pri Neurospori crassi

2023-04-10T22:31:10Z

Lsegota:

Razvijanje temperaturno inducibilnega transkripcijskega reostata pri Neurospori crassi

== Uvod ==
Neurospora crassa je rdeča plesen, ki spada v deblo askomicet. Zaradi svoje majhnosti, enostavnosti vzgoje in opravljanja genskih analiz, je N. crassa pomemben modelni organizem za raziskovanje številnih bioloških procesov, vključno s celičnim ciklom, fotosintezo, biološkimi ritmi, staranjem in razvojem. Prav tako proizvaja encime, ki razgrajujejo celulozo, kar je koristno pri proizvodnji etanola iz celuloznih virov [1].

Proteini toplotnega šoka (hsp) sodelujejo pri odzivu celice na stresne pogoje, kot so visoke ali nizke temperature, oksidativni stres in izpostavljenost strupenim snovem. Delujejo kot šaperoni, njihova naloga pa je zaščititi celice pred poškodbami s preprečevanjem nepravilnega zvitja proteinov. Vendar pa področje uravnavanja izražanja genov, ki kodirajo hsp, še vedno ostaja delno neraziskano, zlasti v kontekstu modelnih glivnih organizmov, kot je N. crassa. Faktorji toplotnega šoka (hsf) so pri stresnih pogojih aktivatorji transkripcije za proteine hsp. Po oligomerizaciji se faktorji hsf vežejo na DNA, in sicer na elemente toplotnega šoka (hse), ki so pri evkariontih relativno ohranjeni. V N. crassi so opisani trije geni hsp (hsp30, hsp70 in hsp80), ki se vsi izražajo pri visokih temperaturah, prav tako pa so pri vsakem odkrili domnevne cis regulatorne elemente [1].

V N. crassa so načrtali že mnogo promotorjev, ki se odzivajo na kemične signale (kot so glukoza, kininska kislina in baker), od fizično induciranih sistemov pa so razvili le takšnega, ki se odziva na svetlobo. Temperaturno induciran sistem, bi medtem omogočil zelo enostavno uravnavanje izražanja genov brez potrebe po dodajanju eksogenih kemikalij [1].

== Funkcijska analiza promotorjev hsp ==
V preteklih študijah so pri promotorju gena hsp30 definirali štiri regije hse, medtem ko so v promotorju hsp70 našli dve. Hsp70 ne vsebuje regulatornih elementov hse, vendar so opisane nekoliko različne cis regije, poimenovane kot elementi odziva na temperaturo (tre).
Da bi bolj okarakterizirali regulacijo genov so pripravili paleto konstruktov, ki so poleg bližnjega promotorja vsebovali različno dolge 5' regije. Različni konstrukti enakega gena pa so pri tem vsebovali raznoliko število regulatornih cis elementov. Za analizo so uporabili luciferazo iz kresničke z dodanim zaporedjem PEST (ki poveča razgradnjo proteina) kar skupaj tvori reporterski sistem za zaznavo transkripcije v realnem času. Pri sobni temperaturi so nagojili reporterske seve glive in jih v temi izpostavili enournemu toplotnemu šoku pri treh različnih temperaturah: dveh visokih (35 °C in 45 °C) in eni, ki je bila bližja laboratorijskim rastnim pogojem N. crasse (30 °C), in merili luminiscenco s CCD kamero [1].

Vsi polno dolgi konstrukti so izkazali podobno hiter in močen odziv na toplotni šok pri 45 °C, medtem ko je bil odziv pri 35 °C neprimerno nižji, pri 30 °C pa odziva sploh ni bilo. Skrajšani konstrukti so se pri hsp30 in hsp70 odzivali v skladu s številom domnevnih hse regij, ki so jih vsebovali. Medtem je konstrukt s polovičnim promotorjem hsp80 (ki je vseboval 5 od 7 domnevnih tre regij), pokazal kar 9-krat nižji odziv od konstrukta s polnim promotorjem, kar kaže na pomanjkljivo poznavanje regulacije promotorja hse80. Izmed treh genov so pri hsp30 opazili mnogo najnižje puščanje promotorja (pri 25 °C), zaradi česa so pri omenjenem genu opazili več kot 1000-kratno povečanje izražanja (razmerje med bazalnim vrhom in induciranim vrhom) [1].

Hsp30 ima nižjo molekularno maso od ostalih dveh sorodnih proteinov (30 kDa proti 70 kDa / 80 kDa) na račun odsotnosti ATP hidrolazne domene. Zaradi tega so pri stresnih pogojih manjši hsp-ji prvi, ki posredujejo proti proteinski denaturaciji, kar korelira z opaženo visoko stopnjo povečanja izražanja pri hsp30.
Avtorji so hsp30 primerjali z drugimi znanimi inducibilnimi sistemi v N. crassa, kot sta promotor qa-2, ki se odziva na naraščajoče koncentracije kininske kisline in promotor vvd, ki se aktivira s svetlobo. Promotor hsp30 je imel najnižjo bazalno aktivnost in pa najvišjo aktivnost v induciranem stanjupotreboval pa je dlje časa za regeneracijo do minimuma aktivnosti po dražljaju (7 h) od vvd promotorja (4 h) [1].

== Odziv promotorja hsp30 na toplotne dražljaje ==
Zaradi najbolj robustnega odziva na toplotne dražljaje so avtorji za nadaljnje delo izbrali promotor hsp30. Zanimalo jih je promotorjev odziv na različno dolge toplotne šoke pri različnih temperaturah, zato so skonstruirali pristop, ki omogoča hitro in enostavno analizo.
Eksperiment so opravili v formatu mikrotitrske plošče za pcr in testirali 3 različne promotorje hsp30 (en celoten in dva skrajšana). Pripravili so paleto različnih pogojev in ocenjevali odziv promotorja z merjenjem luminiscence. Vzorci so bili izpostavljeni šestim različnim temperaturam (v rangu od 34 °C do 46 °C), pri čem so toplotni dražljaji trajali 60, 30, 15, 5, in 1 min. V obzir pa je treba vzeti, da je zaradi relativno majhnega volumna gojišča (pcr mikrocentrifugirka), bila omejena količina dodanega medija in zato omejena rast plesni [1].

Konstrukti s promotorji hsp30 so se izkazali za izjemno nastavljive sisteme, saj se je stopnja odziva povečevala, ko se je zviševala temperatura, prav tako pa so opazili večji odziv, kjer je temperaturni dražljaj trajal dlje časa. Vendar pa je maksimalni odziv bil opažen pri 15 min, pri daljših izpostavljenostih višji temperaturi pa je izražanje bilo nižje, kar so avtorji pripisovali upadu celične funkcije zaradi visokih temperatur. Že pri najkrajši izpostavljenosti (1 min) višji temperaturi je sistem podal robustni odziv.
Kot najbolj optimalna sistema sta se izkazala oba daljša konstrukta (vsebujeta vse domnevne elemente hse), saj so pri njima opazili močnejšo indukcijo in manjše puščanje promotorja v primerjavi s krajšim konstruktom [1].

== Temperaturno pogojena rast N. crasse ==
Celulozni regulator 2 (CLR-2) je transkripcijski faktor, ki je ključen pri regulaciji celulazne aktivnosti N. crasse, saj je potreben za indukcijo ekspresije celulolitičnih genov. V industriji je pomembno nadzorovano izražanje CLR-2, s tem se na primer poveča proizvodnja bioetanola. Avtorji so pripravili sev N. crasse, pri katerem so zapis za CLR-2 postavili pod promotor hsp30 in opazovali rast celic pri različnih pogojih.
Najkrajši promotor hse30 vsebuje le dve od štirih domnevnih regij hse in se je zato izkazal kot najmanj optimalen sistem za uravnavanje transkripcije (glej Odziv hsp30 promotorja na toplotne dražljaje). Vseeno pa so ga avtorji pri tem eksperimentu uporabili zaradi njegove kratke dolžine (500 baznih parov). V N. crassi je namreč prisotna ponavljajoča inducirana mutacija (RIP), kot obrambni mehanizem za zmanjšanje aktivnosti in širjenja mobilnih genetskih elementov, ki pa je manj pogosta v krajših segmentih DNA [1].

Rezultati so pokazali, da se sev hsp300.5 kb:clr-2 ne razvija v tekočih gojiščih z Avicelom (kristalinična celuloza) pri normalni temperaturi (25°C). Vendar pa se po vsakodnevnih impulzih toplote (45°C) rast povrne in celo preseže WT sev plesni [1].

== Načrtovanje sintetičnega promotorja iz domnevnih cis regij hsp30 ==
Da bi uporabili vse domnevne hse regije, in hkrati znižali pogostost RIP-induciranih mutacij so avtorji načrtali 2 sintetična promotorja. Ocenili so minimalno dolžino bližnjega promotorja (okoli 250 bp) in mu dodali domnevne regije hse. S primerjavo promotorja hse30 s promotorji hse30 iz sorodnih organizmov N. crasse so identificirali še peto regijo hse, ki je prav tako ohranjena, in tudi njo vključili v konstrukt. Razlika med sintetičnima promoterjema je bila zgolj v dolžini vmesnikov med domnevnimi regulatornimi regijami hse [1].

Tudi oba sintetična promotorja sta izkazala dobro nastavljivost pri različnih toplotnih tretmajih, vendar sta oba prikazala relativno močno bazalno aktivnost. Je pa tovrstno puščanje promotorja velikokrat prisotno ob načrtovanju umetnih promotorjev. Vseeno pa sta se oba nova promotorja izkazala za bolj uporaben sistem nastavljivega izražanja od promotorjev hsp70 in hsp80, prav tako so opazili višje stopnje izražanja od najkrajše verzije promotorja hsp30. Zaradi velike ohranjenosti promotorja hsp30 bi podobni promotorji najverjetneje delovali tudi v ostalih askomicetah, kot na primer v biotehnološko pomembnih Aspergillus niger ali Trichoderma reesei [1, 2].

== Zaključek ==
Sistem s finim uravnavanjem transkripcije preko toplotne indukcije predstavlja obetavno orodje za raziskave funkcije genov, pa tudi za biotehnološke aplikacije, kot so proizvodnja encimov, metabolitov ali drugih biološko pomembnih snovi. V primerjavi s kemično induciranimi sistemi se izkaže za lažje reverzibilen sistem, saj ni treba dodajati eksogenih sredstev, ki jih je težko odstraniti iz gojišča. Hkrati pa je enostaven za uporabo, sploh v primerjavi s svetlobno indukcijo, kjer je potreba po dobro definiranih laboratorijskih nastavitvah (temna soba). Vendar pa se pri toplotni indukciji pojavljajo potencialne težave oziroma omejitve, kot so stres za organizem ali neselektivna aktivacija genov [1, 3].

Ko so zapis za clr-2 postavili pod hse30 promotor, so avtorji (kljub izbiri neoptimalnega promotorja) prikazali možnost uporabe toplotno inducibilnega sistema za regulacijo izražanja pri želenih fenotipih. Ob nadaljnji optimizaciji procesa bi se celulazna aktivnost plesni dodatno povečala, kar odpira priložnost uporabe tovrstnih sistemov v industriji. Glavna ovira pri industrijski uporabi razgradnje celuloze so namreč visoki stroški proizvodnje encimov, kar tudi preprečuje nižje cene bioetanola [1, 4].

== Literatura ==

[1] C. Tabilo-Agurto, V. Del Rio-Pinilla, V. Eltit-Villarroel, A. Goity, F. Muñoz-Guzmán, in L. F. Larrondo, „Developing a Temperature-Inducible Transcriptional Rheostat in Neurospora crassa“, mBio, let. 14, št. 1, str. e03291-22, feb. 2023, doi: 10.1128/mbio.03291-22.

[2] J. Han, B. McLane, E.-H. Kim, J.-W. Yoon, in H.-S. Jun, „Remission of diabetes by insulin gene therapy using a hepatocyte-specific and glucose-responsive synthetic promoter“, Mol. Ther. J. Am. Soc. Gene Ther., let. 19, št. 3, str. 470–478, mar. 2011, doi: 10.1038/mt.2010.255.

[3] J. Hearn, I. Ssinabulya, J. I. Schwartz, A. R. Akiteng, H. J. Ross, in J. A. Cafazzo, „Self-management of non-communicable diseases in low- and middle-income countries: A scoping review“, PLOS ONE, let. 14, št. 7, str. e0219141, jul. 2019, doi: 10.1371/journal.pone.0219141.

[4] A. K. Chandel, C. Es, R. Rudravaram, M. L. Narasu, V. Rao, in P. Ravindra, „Economics and environmental impact of bioethanol production technologies: an appraisal“.

Razvoj temperaturno inducibilnega transkripcijskega reostata pri Neurospori crassi

2023-04-10T22:27:43Z

Lsegota:

Razvijanje temperaturno inducibilnega transkripcijskega reostata pri Neurospori crassi

== Uvod ==
Neurospora crassa je rdeča plesen, ki spada v deblo askomicet. Zaradi svoje majhnosti, enostavnosti vzgoje in opravljanja genskih analiz, je N. crassa pomemben modelni organizem za raziskovanje številnih bioloških procesov, vključno s celičnim ciklom, fotosintezo, biološkimi ritmi, staranjem in razvojem. Prav tako proizvaja encime, ki razgrajujejo celulozo, kar je koristno pri proizvodnji etanola iz celuloznih virov [1].

Proteini toplotnega šoka (hsp) sodelujejo pri odzivu celice na stresne pogoje, kot so visoke ali nizke temperature, oksidativni stres in izpostavljenost strupenim snovem. Delujejo kot šaperoni, njihova naloga pa je zaščititi celice pred poškodbami s preprečevanjem nepravilnega zvitja proteinov. Vendar pa področje uravnavanja izražanja genov, ki kodirajo hsp, še vedno ostaja delno neraziskano, zlasti v kontekstu modelnih glivnih organizmov, kot je N. crassa. Faktorji toplotnega šoka (hsf) so pri stresnih pogojih aktivatorji transkripcije za proteine hsp. Po oligomerizaciji se faktorji hsf vežejo na DNA, in sicer na elemente toplotnega šoka (hse), ki so pri evkariontih relativno ohranjeni. V N. crassi so opisani trije geni hsp (hsp30, hsp70 in hsp80), ki se vsi izražajo pri visokih temperaturah, prav tako pa so pri vsakem odkrili domnevne cis regulatorne elemente [1].

V N. crassa so načrtali že mnogo promotorjev, ki se odzivajo na kemične signale (kot so glukoza, kininska kislina in baker), od fizično induciranih sistemov pa so razvili le takšnega, ki se odziva na svetlobo. Temperaturno induciran sistem, bi medtem omogočil zelo enostavno uravnavanje izražanja genov brez potrebe po dodajanju eksogenih kemikalij [1].

== Funkcijska analiza promotorjev hsp ==
V preteklih študijah so pri promotorju gena hsp30 definirali štiri regije hse, medtem ko so v promotorju hsp70 našli dve. Hsp70 ne vsebuje regulatornih elementov hse, vendar so opisane nekoliko različne cis regije, poimenovane kot elementi odziva na temperaturo (tre).
Da bi bolj okarakterizirali regulacijo genov so pripravili paleto konstruktov, ki so poleg bližnjega promotorja vsebovali različno dolge 5' regije. Različni konstrukti enakega gena pa so pri tem vsebovali raznoliko število regulatornih cis elementov. Za analizo so uporabili luciferazo iz kresničke z dodanim zaporedjem PEST (ki poveča razgradnjo proteina) kar skupaj tvori reporterski sistem za zaznavo transkripcije v realnem času. Pri sobni temperaturi so nagojili reporterske seve glive in jih v temi izpostavili enournemu toplotnemu šoku pri treh različnih temperaturah: dveh visokih (35 °C in 45 °C) in eni, ki je bila bližja laboratorijskim rastnim pogojem N. crasse (30 °C), in merili luminiscenco s CCD kamero [1].

Vsi polno dolgi konstrukti so izkazali podobno hiter in močen odziv na toplotni šok pri 45 °C, medtem ko je bil odziv pri 35 °C neprimerno nižji, pri 30 °C pa odziva sploh ni bilo. Skrajšani konstrukti so se pri hsp30 in hsp70 odzivali v skladu s številom domnevnih hse regij, ki so jih vsebovali. Medtem je konstrukt s polovičnim promotorjem hsp80 (ki je vseboval 5 od 7 domnevnih tre regij), pokazal kar 9-krat nižji odziv od konstrukta s polnim promotorjem, kar kaže na pomanjkljivo poznavanje regulacije promotorja hse80. Izmed treh genov so pri hsp30 opazili mnogo najnižje puščanje promotorja (pri 25 °C), zaradi česa so pri omenjenem genu opazili več kot 1000-kratno povečanje izražanja (razmerje med bazalnim vrhom in induciranim vrhom) [1].

Hsp30 ima nižjo molekularno maso od ostalih dveh sorodnih proteinov (30 kDa proti 70 kDa / 80 kDa) na račun odsotnosti ATP hidrolazne domene. Zaradi tega so pri stresnih pogojih manjši hsp-ji prvi, ki posredujejo proti proteinski denaturaciji, kar korelira z opaženo visoko stopnjo povečanja izražanja pri hsp30.
Avtorji so hsp30 primerjali z drugimi znanimi inducibilnimi sistemi v N. crassa, kot sta promotor qa-2, ki se odziva na naraščajoče koncentracije kininske kisline in promotor vvd, ki se aktivira s svetlobo. Promotor hsp30 je imel najnižjo bazalno aktivnost in pa najvišjo aktivnost v induciranem stanjupotreboval pa je dlje časa za regeneracijo do minimuma aktivnosti po dražljaju (7 h) od vvd promotorja (4 h) [1].

== Odziv promotorja hsp30 na toplotne dražljaje ==
Zaradi najbolj robustnega odziva na toplotne dražljaje so avtorji za nadaljnje delo izbrali promotor hsp30. Zanimalo jih je promotorjev odziv na različno dolge toplotne šoke pri različnih temperaturah, zato so skonstruirali pristop, ki omogoča hitro in enostavno analizo.
Eksperiment so opravili v formatu pcr mikrotitrske plošče in testirali 3 različne promotorje hsp30 (en celoten in dva skrajšana). Pripravili so paleto različnih pogojev in ocenjevali odziv promotorja z merjenjem luminiscence. Vzorci so bili izpostavljeni šestim različnim temperaturam (v rangu od 34 °C do 46 °C), pri čem so toplotni dražljaji trajali 60, 30, 15, 5, in 1 min. V obzir pa je treba vzeti, da je zaradi relativno majhnega volumna gojišča (pcr mikrocentrifugirka), bila omejena količina dodanega medija in zato omejena rast plesni [1].

Konstrukti s promotorji hsp30 so se izkazali za izjemno nastavljive sisteme, saj se je stopnja odziva povečevala, ko se je zviševala temperatura, prav tako pa so opazili večji odziv, kjer je temperaturni dražljaj trajal dlje časa. Vendar pa je maksimalni odziv bil opažen pri 15 min, pri daljših izpostavljenostih višji temperaturi pa je izražanje bilo nižje, kar so avtorji pripisovali upadu celične funkcije zaradi visokih temperatur. Že pri najkrajši izpostavljenosti (1 min) višji temperaturi je sistem podal robustni odziv.
Kot najbolj optimalna sistema sta se izkazala oba daljša konstrukta (vsebujeta vse domnevne elemente hse), saj so pri njima opazili močnejšo indukcijo in manjše puščanje promotorja v primerjavi s krajšim konstruktom [1].

== Temperaturno pogojena rast N. crasse ==
Celulozni regulator 2 (CLR-2) je transkripcijski faktor, ki je ključen pri regulaciji celulazne aktivnosti N. crasse, saj je potreben za indukcijo ekspresije celulolitičnih genov. V industriji je pomembno nadzorovano izražanje CLR-2, s tem se na primer poveča proizvodnja bioetanola. Avtorji so pripravili sev N. crasse, pri katerem so zapis za CLR-2 postavili pod promotor hsp30 in opazovali rast celic pri različnih pogojih.
Najkrajši promotor hse30 vsebuje le dve od štirih domnevnih regij hse in se je zato izkazal kot najmanj optimalen sistem za uravnavanje transkripcije (glej Odziv hsp30 promotorja na toplotne dražljaje). Vseeno pa so ga avtorji pri tem eksperimentu uporabili zaradi njegove kratke dolžine (500 baznih parov). V N. crassi je namreč prisotna ponavljajoča inducirana mutacija (RIP), kot obrambni mehanizem za zmanjšanje aktivnosti in širjenja mobilnih genetskih elementov, ki pa je manj pogosta v krajših segmentih DNA [1].

Rezultati so pokazali, da se sev hsp300.5 kb:clr-2 ne razvija v tekočih gojiščih z Avicelom (kristalinična celuloza) pri normalni temperaturi (25°C). Vendar pa se po vsakodnevnih impulzih toplote (45°C) rast povrne in celo preseže WT sev plesni [1].

== Načrtovanje sintetičnega promotorja iz domnevnih cis regij hsp30 ==
Da bi uporabili vse domnevne hse regije, in hkrati znižali pogostost RIP-induciranih mutacij so avtorji načrtali 2 sintetična promotorja. Ocenili so minimalno dolžino bližnjega promotorja (okoli 250 bp) in mu dodali domnevne regije hse. S primerjavo promotorja hse30 s promotorji hse30 iz sorodnih organizmov N. crasse so identificirali še peto regijo hse, ki je prav tako ohranjena, in tudi njo vključili v konstrukt. Razlika med sintetičnima promoterjema je bila zgolj v dolžini vmesnikov med domnevnimi regulatornimi regijami hse [1].

Tudi oba sintetična promotorja sta izkazala dobro nastavljivost pri različnih toplotnih tretmajih, vendar sta oba prikazala relativno močno bazalno aktivnost. Je pa tovrstno puščanje promotorja velikokrat prisotno ob načrtovanju umetnih promotorjev. Vseeno pa sta se oba nova promotorja izkazala za bolj uporaben sistem nastavljivega izražanja od promotorjev hsp70 in hsp80, prav tako so opazili višje stopnje izražanja od najkrajše verzije promotorja hsp30. Zaradi velike ohranjenosti promotorja hsp30 bi podobni promotorji najverjetneje delovali tudi v ostalih askomicetah, kot na primer v biotehnološko pomembnih Aspergillus niger ali Trichoderma reesei [1, 2].

== Zaključek ==
Sistem s finim uravnavanjem transkripcije preko toplotne indukcije predstavlja obetavno orodje za raziskave funkcije genov, pa tudi za biotehnološke aplikacije, kot so proizvodnja encimov, metabolitov ali drugih biološko pomembnih snovi. V primerjavi s kemično induciranimi sistemi se izkaže za lažje reverzibilen sistem, saj ni treba dodajati eksogenih sredstev, ki jih je težko odstraniti iz gojišča. Hkrati pa je enostaven za uporabo, sploh v primerjavi s svetlobno indukcijo, kjer je potreba po dobro definiranih laboratorijskih nastavitvah (temna soba). Vendar pa se pri toplotni indukciji pojavljajo potencialne težave oziroma omejitve, kot so stres za organizem ali neselektivna aktivacija genov [1, 3].

Ko so zapis za clr-2 postavili pod hse30 promotor, so avtorji (kljub izbiri neoptimalnega promotorja) prikazali možnost uporabe toplotno inducibilnega sistema za regulacijo izražanja pri želenih fenotipih. Ob nadaljnji optimizaciji procesa bi se celulazna aktivnost plesni dodatno povečala, kar odpira priložnost uporabe tovrstnih sistemov v industriji. Glavna ovira pri industrijski uporabi razgradnje celuloze so namreč visoki stroški proizvodnje encimov, kar tudi preprečuje nižje cene bioetanola [1, 4].

== Literatura ==

[1] C. Tabilo-Agurto, V. Del Rio-Pinilla, V. Eltit-Villarroel, A. Goity, F. Muñoz-Guzmán, in L. F. Larrondo, „Developing a Temperature-Inducible Transcriptional Rheostat in Neurospora crassa“, mBio, let. 14, št. 1, str. e03291-22, feb. 2023, doi: 10.1128/mbio.03291-22.

[2] J. Han, B. McLane, E.-H. Kim, J.-W. Yoon, in H.-S. Jun, „Remission of diabetes by insulin gene therapy using a hepatocyte-specific and glucose-responsive synthetic promoter“, Mol. Ther. J. Am. Soc. Gene Ther., let. 19, št. 3, str. 470–478, mar. 2011, doi: 10.1038/mt.2010.255.

[3] J. Hearn, I. Ssinabulya, J. I. Schwartz, A. R. Akiteng, H. J. Ross, in J. A. Cafazzo, „Self-management of non-communicable diseases in low- and middle-income countries: A scoping review“, PLOS ONE, let. 14, št. 7, str. e0219141, jul. 2019, doi: 10.1371/journal.pone.0219141.

[4] A. K. Chandel, C. Es, R. Rudravaram, M. L. Narasu, V. Rao, in P. Ravindra, „Economics and environmental impact of bioethanol production technologies: an appraisal“.

Razvoj temperaturno inducibilnega transkripcijskega reostata pri Neurospori crassi

2023-04-10T22:24:07Z

Lsegota:

Razvijanje temperaturno inducibilnega transkripcijskega reostata pri Neurospori crassi

== Uvod ==
Neurospora crassa je rdeča plesen, ki spada v deblo askomicet. Zaradi svoje majhnosti, enostavnosti vzgoje in opravljanja genskih analiz, je N. crassa pomemben modelni organizem za raziskovanje številnih bioloških procesov, vključno s celičnim ciklom, fotosintezo, biološkimi ritmi, staranjem in razvojem. Prav tako proizvaja encime, ki razgrajujejo celulozo, kar je koristno pri proizvodnji etanola iz celuloznih virov [1].

Proteini toplotnega šoka (hsp) sodelujejo pri odzivu celice na stresne pogoje, kot so visoke ali nizke temperature, oksidativni stres in izpostavljenost strupenim snovem. Delujejo kot šaperoni, njihova naloga pa je zaščititi celice pred poškodbami s preprečevanjem nepravilnega zvitja proteinov. Vendar pa področje uravnavanja izražanja genov, ki kodirajo hsp, še vedno ostaja delno neraziskano, zlasti v kontekstu modelnih glivnih organizmov, kot je N. crassa. Faktorji toplotnega šoka (hsf) so pri stresnih pogojih aktivatorji transkripcije za proteine hsp. Po oligomerizaciji se faktorji hsf vežejo na DNA, in sicer na elemente toplotnega šoka (hse), ki so pri evkariontih relativno ohranjeni. V N. crassi so opisali tri gene hsp (hsp30, hsp70 in hsp80), ki se vsi izražajo pri visokih temperaturah, prav tako pa so pri vsakem odkrili domnevne cis regulatorne elemente [1].

V N. crassa so načrtali že mnogo promotorjev, ki se odzivajo na kemične signale (kot so glukoza, kininska kislina in baker), od fizično induciranih sistemov pa so razvili le takšnega, ki se odziva na svetlobo. Temperaturno induciran sistem, bi medtem omogočil zelo enostavno uravnavanje izražanja genov brez potrebe po dodajanju eksogenih kemikalij [1].

== Funkcijska analiza promotorjev hsp ==
V preteklih študijah so pri promotorju gena hsp30 definirali štiri regije hse, medtem ko so v promotorju hsp70 našli dve. Hsp70 ne vsebuje regulatornih elementov hse, vendar so opisane nekoliko različne cis regije, poimenovane kot elementi odziva na temperaturo (tre).
Da bi bolj okarakterizirali regulacijo genov so pripravili paleto konstruktov, ki so poleg bližnjega promotorja vsebovali različno dolge 5' regije. Različni konstrukti enakega gena pa so pri tem vsebovali raznoliko število regulatornih cis elementov. Za analizo so uporabili luciferazo iz kresničke z dodanim zaporedjem PEST (ki poveča razgradnjo proteina) kar skupaj tvori reporterski sistem za zaznavo transkripcije v realnem času. Pri sobni temperaturi so nagojili reporterske seve glive in jih v temi izpostavili enournemu toplotnemu šoku pri treh različnih temperaturah: dveh visokih (35 °C in 45 °C) in eni, ki je bila bližja laboratorijskim rastnim pogojem N. crasse (30 °C), in merili luminiscenco s CCD kamero [1].

Vsi polno dolgi konstrukti so izkazali podobno hiter in močen odziv na toplotni šok pri 45 °C, medtem ko je bil odziv pri 35 °C neprimerno nižji, pri 30 °C pa odziva sploh ni bilo. Skrajšani konstrukti so se pri hsp30 in hsp70 odzivali v skladu s številom domnevnih hse regij, ki so jih vsebovali. Medtem je konstrukt s polovičnim promotorjem hsp80 (ki je vseboval 5 od 7 domnevnih tre regij), pokazal kar 9-krat nižji odziv od konstrukta s polnim promotorjem, kar kaže na pomanjkljivo poznavanje regulacije promotorja hse80. Izmed treh genov so pri hsp30 opazili mnogo najnižje puščanje promotorja (pri 25 °C), zaradi česa so pri omenjenem genu opazili več kot 1000-kratno povečanje izražanja (razmerje med bazalnim vrhom in induciranim vrhom) [1].

Hsp30 ima nižjo molekularno maso od ostalih dveh sorodnih proteinov (30 kDa proti 70 kDa / 80 kDa) na račun odsotnosti ATP hidrolazne domene. Zaradi tega so pri stresnih pogojih manjši hsp-ji prvi, ki posredujejo proti proteinski denaturaciji, kar korelira z opaženo visoko stopnjo povečanja izražanja pri hsp30.
Avtorji so hsp30 primerjali z drugimi znanimi inducibilnimi sistemi v N. crassa, kot sta promotor qa-2, ki se odziva na naraščajoče koncentracije kininske kisline in promotor vvd, ki se aktivira s svetlobo. Promotor hsp30 je imel najnižjo bazalno aktivnost in pa najvišjo aktivnost v induciranem stanjupotreboval pa je dlje časa za regeneracijo do minimuma aktivnosti po dražljaju (7 h) od vvd promotorja (4 h) [1].

== Odziv promotorja hsp30 na toplotne dražljaje ==
Zaradi najbolj robustnega odziva na toplotne dražljaje so avtorji za nadaljnje delo izbrali promotor hsp30. Zanimalo jih je promotorjev odziv na različno dolge toplotne šoke pri različnih temperaturah, zato so skonstruirali pristop, ki omogoča hitro in enostavno analizo.
Eksperiment so opravili v formatu pcr mikrotitrske plošče in testirali 3 različne promotorje hsp30 (en celoten in dva skrajšana). Pripravili so paleto različnih pogojev in ocenjevali odziv promotorja z merjenjem luminiscence. Vzorci so bili izpostavljeni šestim različnim temperaturam (v rangu od 34 °C do 46 °C), pri čem so toplotni dražljaji trajali 60, 30, 15, 5, in 1 min. V obzir pa je treba vzeti, da je zaradi relativno majhnega volumna gojišča (pcr mikrocentrifugirka), bila omejena količina dodanega medija in zato omejena rast plesni [1].

Konstrukti s promotorji hsp30 so se izkazali za izjemno nastavljive sisteme, saj se je stopnja odziva povečevala, ko se je zviševala temperatura, prav tako pa so opazili večji odziv, kjer je temperaturni dražljaj trajal dlje časa. Vendar pa je maksimalni odziv bil opažen pri 15 min, pri daljših izpostavljenostih višji temperaturi pa je izražanje bilo nižje, kar so avtorji pripisovali upadu celične funkcije zaradi visokih temperatur. Že pri najkrajši izpostavljenosti (1 min) višji temperaturi je sistem podal robustni odziv.
Kot najbolj optimalna sistema sta se izkazala oba daljša konstrukta (vsebujeta vse domnevne elemente hse), saj so pri njima opazili močnejšo indukcijo in manjše puščanje promotorja v primerjavi s krajšim konstruktom [1].

== Temperaturno pogojena rast N. crasse ==
Celulozni regulator 2 (CLR-2) je transkripcijski faktor, ki je ključen pri regulaciji celulazne aktivnosti N. crasse, saj je potreben za indukcijo ekspresije celulolitičnih genov. V industriji je pomembno nadzorovano izražanje CLR-2, s tem se na primer poveča proizvodnja bioetanola. Avtorji so pripravili sev N. crasse, pri katerem so zapis za CLR-2 postavili pod promotor hsp30 in opazovali rast celic pri različnih pogojih.
Najkrajši promotor hse30 vsebuje le dve od štirih domnevnih regij hse in se je zato izkazal kot najmanj optimalen sistem za uravnavanje transkripcije (glej Odziv hsp30 promotorja na toplotne dražljaje). Vseeno pa so ga avtorji pri tem eksperimentu uporabili zaradi njegove kratke dolžine (500 baznih parov). V N. crassi je namreč prisotna ponavljajoča inducirana mutacija (RIP), kot obrambni mehanizem za zmanjšanje aktivnosti in širjenja mobilnih genetskih elementov, ki pa je manj pogosta v krajših segmentih DNA [1].

Rezultati so pokazali, da se sev hsp300.5 kb:clr-2 ne razvija v tekočih gojiščih z Avicelom (kristalinična celuloza) pri normalni temperaturi (25°C). Vendar pa se po vsakodnevnih impulzih toplote (45°C) rast povrne in celo preseže WT sev plesni [1].

== Načrtovanje sintetičnega promotorja iz domnevnih cis regij hsp30 ==
Da bi uporabili vse domnevne hse regije, in hkrati znižali pogostost RIP-induciranih mutacij so avtorji načrtali 2 sintetična promotorja. Ocenili so minimalno dolžino bližnjega promotorja (okoli 250 bp) in mu dodali domnevne regije hse. S primerjavo promotorja hse30 s promotorji hse30 iz sorodnih organizmov N. crasse so identificirali še peto regijo hse, ki je prav tako ohranjena, in tudi njo vključili v konstrukt. Razlika med sintetičnima promoterjema je bila zgolj v dolžini vmesnikov med domnevnimi regulatornimi regijami hse [1].

Tudi oba sintetična promotorja sta izkazala dobro nastavljivost pri različnih toplotnih tretmajih, vendar sta oba prikazala relativno močno bazalno aktivnost. Je pa tovrstno puščanje promotorja velikokrat prisotno ob načrtovanju umetnih promotorjev. Vseeno pa sta se oba nova promotorja izkazala za bolj uporaben sistem nastavljivega izražanja od promotorjev hsp70 in hsp80, prav tako so opazili višje stopnje izražanja od najkrajše verzije promotorja hsp30. Zaradi velike ohranjenosti promotorja hsp30 bi podobni promotorji najverjetneje delovali tudi v ostalih askomicetah, kot na primer v biotehnološko pomembnih Aspergillus niger ali Trichoderma reesei [1, 2].

== Zaključek ==
Sistem s finim uravnavanjem transkripcije preko toplotne indukcije predstavlja obetavno orodje za raziskave funkcije genov, pa tudi za biotehnološke aplikacije, kot so proizvodnja encimov, metabolitov ali drugih biološko pomembnih snovi. V primerjavi s kemično induciranimi sistemi se izkaže za lažje reverzibilen sistem, saj ni treba dodajati eksogenih sredstev, ki jih je težko odstraniti iz gojišča. Hkrati pa je enostaven za uporabo, sploh v primerjavi s svetlobno indukcijo, kjer je potreba po dobro definiranih laboratorijskih nastavitvah (temna soba). Vendar pa se pri toplotni indukciji pojavljajo potencialne težave oziroma omejitve, kot so stres za organizem ali neselektivna aktivacija genov [1, 3].

Ko so zapis za clr-2 postavili pod hse30 promotor, so avtorji (kljub izbiri neoptimalnega promotorja) prikazali možnost uporabe toplotno inducibilnega sistema za regulacijo izražanja pri želenih fenotipih. Ob nadaljnji optimizaciji procesa bi se celulazna aktivnost plesni dodatno povečala, kar odpira priložnost uporabe tovrstnih sistemov v industriji. Glavna ovira pri industrijski uporabi razgradnje celuloze so namreč visoki stroški proizvodnje encimov, kar tudi preprečuje nižje cene bioetanola [1, 4].

== Literatura ==

[1] C. Tabilo-Agurto, V. Del Rio-Pinilla, V. Eltit-Villarroel, A. Goity, F. Muñoz-Guzmán, in L. F. Larrondo, „Developing a Temperature-Inducible Transcriptional Rheostat in Neurospora crassa“, mBio, let. 14, št. 1, str. e03291-22, feb. 2023, doi: 10.1128/mbio.03291-22.

[2] J. Han, B. McLane, E.-H. Kim, J.-W. Yoon, in H.-S. Jun, „Remission of diabetes by insulin gene therapy using a hepatocyte-specific and glucose-responsive synthetic promoter“, Mol. Ther. J. Am. Soc. Gene Ther., let. 19, št. 3, str. 470–478, mar. 2011, doi: 10.1038/mt.2010.255.

[3] J. Hearn, I. Ssinabulya, J. I. Schwartz, A. R. Akiteng, H. J. Ross, in J. A. Cafazzo, „Self-management of non-communicable diseases in low- and middle-income countries: A scoping review“, PLOS ONE, let. 14, št. 7, str. e0219141, jul. 2019, doi: 10.1371/journal.pone.0219141.

[4] A. K. Chandel, C. Es, R. Rudravaram, M. L. Narasu, V. Rao, in P. Ravindra, „Economics and environmental impact of bioethanol production technologies: an appraisal“.

Razvoj temperaturno inducibilnega transkripcijskega reostata pri Neurospori crassi

2023-04-10T22:21:55Z

Lsegota:

Razvijanje temperaturno inducibilnega transkripcijskega reostata pri Neurospori crassi

== Uvod ==
Neurospora crassa je rdeča plesen, ki spada v deblo askomicet. Zaradi svoje majhnosti, enostavnosti vzgoje in opravljanja genskih analiz, je N. crassa pomemben modelni organizem za raziskovanje številnih bioloških procesov, vključno s celičnim ciklom, fotosintezo, biološkimi ritmi, staranjem in razvojem. Prav tako proizvaja encime, ki razgrajujejo celulozo, kar je koristno pri proizvodnji etanola iz celuloznih virov.

Proteini toplotnega šoka (hsp) sodelujejo pri odzivu celice na stresne pogoje, kot so visoke ali nizke temperature, oksidativni stres in izpostavljenost strupenim snovem. Delujejo kot šaperoni, njihova naloga pa je zaščititi celice pred poškodbami s preprečevanjem nepravilnega zvitja proteinov. Vendar pa področje uravnavanja izražanja genov, ki kodirajo hsp, še vedno ostaja delno neraziskano, zlasti v kontekstu modelnih glivnih organizmov, kot je N. crassa. Faktorji toplotnega šoka (hsf) so pri stresnih pogojih aktivatorji transkripcije za proteine hsp. Po oligomerizaciji se faktorji hsf vežejo na DNA, in sicer na elemente toplotnega šoka (hse), ki so pri evkariontih relativno ohranjeni. V N. crassi so opisali tri gene hsp (hsp30, hsp70 in hsp80), ki se vsi izražajo pri visokih temperaturah, prav tako pa so pri vsakem odkrili domnevne cis regulatorne elemente.

V N. crassa so načrtali že mnogo promotorjev, ki se odzivajo na kemične signale (kot so glukoza, kininska kislina in baker), od fizično induciranih sistemov pa so razvili le takšnega, ki se odziva na svetlobo. Temperaturno induciran sistem, bi medtem omogočil zelo enostavno uravnavanje izražanja genov brez potrebe po dodajanju eksogenih kemikalij.

== Funkcijska analiza promotorjev hsp ==
V preteklih študijah so pri promotorju gena hsp30 definirali štiri regije hse, medtem ko so v promotorju hsp70 našli dve. Hsp70 ne vsebuje regulatornih elementov hse, vendar so opisane nekoliko različne cis regije, poimenovane kot elementi odziva na temperaturo (tre).
Da bi bolj okarakterizirali regulacijo genov so pripravili paleto konstruktov, ki so poleg bližnjega promotorja vsebovali različno dolge 5' regije. Različni konstrukti enakega gena pa so pri tem vsebovali raznoliko število regulatornih cis elementov. Za analizo so uporabili luciferazo iz kresničke z dodanim zaporedjem PEST (ki poveča razgradnjo proteina) kar skupaj tvori reporterski sistem za zaznavo transkripcije v realnem času. Pri sobni temperaturi so nagojili reporterske seve glive in jih v temi izpostavili enournemu toplotnemu šoku pri treh različnih temperaturah: dveh visokih (35 °C in 45 °C) in eni, ki je bila bližja laboratorijskim rastnim pogojem N. crasse (30 °C), in merili luminiscenco s CCD kamero.

Vsi polno dolgi konstrukti so izkazali podobno hiter in močen odziv na toplotni šok pri 45 °C, medtem ko je bil odziv pri 35 °C neprimerno nižji, pri 30 °C pa odziva sploh ni bilo. Skrajšani konstrukti so se pri hsp30 in hsp70 odzivali v skladu s številom domnevnih hse regij, ki so jih vsebovali. Medtem je konstrukt s polovičnim promotorjem hsp80 (ki je vseboval 5 od 7 domnevnih tre regij), pokazal kar 9-krat nižji odziv od konstrukta s polnim promotorjem, kar kaže na pomanjkljivo poznavanje regulacije promotorja hse80. Izmed treh genov so pri hsp30 opazili mnogo najnižje puščanje promotorja (pri 25 °C), zaradi česa so pri omenjenem genu opazili več kot 1000-kratno povečanje izražanja (razmerje med bazalnim vrhom in induciranim vrhom).

Hsp30 ima nižjo molekularno maso od ostalih dveh sorodnih proteinov (30 kDa proti 70 kDa / 80 kDa) na račun odsotnosti ATP hidrolazne domene. Zaradi tega so pri stresnih pogojih manjši hsp-ji prvi, ki posredujejo proti proteinski denaturaciji, kar korelira z opaženo visoko stopnjo povečanja izražanja pri hsp30.
Avtorji so hsp30 primerjali z drugimi znanimi inducibilnimi sistemi v N. crassa, kot sta promotor qa-2, ki se odziva na naraščajoče koncentracije kininske kisline in promotor vvd, ki se aktivira s svetlobo. Promotor hsp30 je imel najnižjo bazalno aktivnost in pa najvišjo aktivnost v induciranem stanjupotreboval pa je dlje časa za regeneracijo do minimuma aktivnosti po dražljaju (7 h) od vvd promotorja (4 h).

== Odziv promotorja hsp30 na toplotne dražljaje ==
Zaradi najbolj robustnega odziva na toplotne dražljaje so avtorji za nadaljnje delo izbrali promotor hsp30. Zanimalo jih je promotorjev odziv na različno dolge toplotne šoke pri različnih temperaturah, zato so skonstruirali pristop, ki omogoča hitro in enostavno analizo.
Eksperiment so opravili v formatu pcr mikrotitrske plošče in testirali 3 različne promotorje hsp30 (en celoten in dva skrajšana). Pripravili so paleto različnih pogojev in ocenjevali odziv promotorja z merjenjem luminiscence. Vzorci so bili izpostavljeni šestim različnim temperaturam (v rangu od 34 °C do 46 °C), pri čem so toplotni dražljaji trajali 60, 30, 15, 5, in 1 min. V obzir pa je treba vzeti, da je zaradi relativno majhnega volumna gojišča (pcr mikrocentrifugirka), bila omejena količina dodanega medija in zato omejena rast plesni.

Konstrukti s promotorji hsp30 so se izkazali za izjemno nastavljive sisteme, saj se je stopnja odziva povečevala, ko se je zviševala temperatura, prav tako pa so opazili večji odziv, kjer je temperaturni dražljaj trajal dlje časa. Vendar pa je maksimalni odziv bil opažen pri 15 min, pri daljših izpostavljenostih višji temperaturi pa je izražanje bilo nižje, kar so avtorji pripisovali upadu celične funkcije zaradi visokih temperatur. Že pri najkrajši izpostavljenosti (1 min) višji temperaturi je sistem podal robustni odziv.
Kot najbolj optimalna sistema sta se izkazala oba daljša konstrukta (vsebujeta vse domnevne elemente hse), saj so pri njima opazili močnejšo indukcijo in manjše puščanje promotorja v primerjavi s krajšim konstruktom.

== Temperaturno pogojena rast N. crasse ==
Celulozni regulator 2 (CLR-2) je transkripcijski faktor, ki je ključen pri regulaciji celulazne aktivnosti N. crasse, saj je potreben za indukcijo ekspresije celulolitičnih genov. V industriji je pomembno nadzorovano izražanje CLR-2, s tem se na primer poveča proizvodnja bioetanola. Avtorji so pripravili sev N. crasse, pri katerem so zapis za CLR-2 postavili pod promotor hsp30 in opazovali rast celic pri različnih pogojih.
Najkrajši promotor hse30 vsebuje le dve od štirih domnevnih regij hse in se je zato izkazal kot najmanj optimalen sistem za uravnavanje transkripcije (glej Odziv hsp30 promotorja na toplotne dražljaje). Vseeno pa so ga avtorji pri tem eksperimentu uporabili zaradi njegove kratke dolžine (500 baznih parov). V N. crassi je namreč prisotna ponavljajoča inducirana mutacija (RIP), kot obrambni mehanizem za zmanjšanje aktivnosti in širjenja mobilnih genetskih elementov, ki pa je manj pogosta v krajših segmentih DNA.

Rezultati so pokazali, da se sev hsp300.5 kb:clr-2 ne razvija v tekočih gojiščih z Avicelom (kristalinična celuloza) pri normalni temperaturi (25°C). Vendar pa se po vsakodnevnih impulzih toplote (45°C) rast povrne in celo preseže WT sev plesni.

== Načrtovanje sintetičnega promotorja iz domnevnih cis regij hsp30 ==
Da bi uporabili vse domnevne hse regije, in hkrati znižali pogostost RIP-induciranih mutacij so avtorji načrtali 2 sintetična promotorja. Ocenili so minimalno dolžino bližnjega promotorja (okoli 250 bp) in mu dodali domnevne regije hse. S primerjavo promotorja hse30 s promotorji hse30 iz sorodnih organizmov N. crasse so identificirali še peto regijo hse, ki je prav tako ohranjena, in tudi njo vključili v konstrukt. Razlika med sintetičnima promoterjema je bila zgolj v dolžini vmesnikov med domnevnimi regulatornimi regijami hse.

Tudi oba sintetična promotorja sta izkazala dobro nastavljivost pri različnih toplotnih tretmajih, vendar sta oba prikazala relativno močno bazalno aktivnost. Je pa tovrstno puščanje promotorja velikokrat prisotno ob načrtovanju umetnih promotorjev [2]. Vseeno pa sta se oba nova promotorja izkazala za bolj uporaben sistem nastavljivega izražanja od promotorjev hsp70 in hsp80, prav tako so opazili višje stopnje izražanja od najkrajše verzije promotorja hsp30. Zaradi velike ohranjenosti promotorja hsp30 bi podobni promotorji najverjetneje delovali tudi v ostalih askomicetah, kot na primer v biotehnološko pomembnih Aspergillus niger ali Trichoderma reesei.

== Zaključek ==
Sistem s finim uravnavanjem transkripcije preko toplotne indukcije predstavlja obetavno orodje za raziskave funkcije genov, pa tudi za biotehnološke aplikacije, kot so proizvodnja encimov, metabolitov ali drugih biološko pomembnih snovi. V primerjavi s kemično induciranimi sistemi se izkaže za lažje reverzibilen sistem, saj ni treba dodajati eksogenih sredstev, ki jih je težko odstraniti iz gojišča. Hkrati pa je enostaven za uporabo, sploh v primerjavi s svetlobno indukcijo, kjer je potreba po dobro definiranih laboratorijskih nastavitvah (temna soba). Vendar pa se pri toplotni indukciji pojavljajo potencialne težave oziroma omejitve, kot so stres za organizem ali neselektivna aktivacija genov [1,3].

Ko so zapis za clr-2 postavili pod hse30 promotor, so avtorji (kljub izbiri neoptimalnega promotorja) prikazali možnost uporabe toplotno inducibilnega sistema za regulacijo izražanja pri želenih fenotipih. Ob nadaljnji optimizaciji procesa bi se celulazna aktivnost plesni dodatno povečala, kar odpira priložnost uporabe tovrstnih sistemov v industriji. Glavna ovira pri industrijski uporabi razgradnje celuloze so namreč visoki stroški proizvodnje encimov, kar tudi preprečuje nižje cene bioetanola [1,4].

== Literatura ==

[1] C. Tabilo-Agurto, V. Del Rio-Pinilla, V. Eltit-Villarroel, A. Goity, F. Muñoz-Guzmán, in L. F. Larrondo, „Developing a Temperature-Inducible Transcriptional Rheostat in Neurospora crassa“, mBio, let. 14, št. 1, str. e03291-22, feb. 2023, doi: 10.1128/mbio.03291-22.

[2] J. Han, B. McLane, E.-H. Kim, J.-W. Yoon, in H.-S. Jun, „Remission of diabetes by insulin gene therapy using a hepatocyte-specific and glucose-responsive synthetic promoter“, Mol. Ther. J. Am. Soc. Gene Ther., let. 19, št. 3, str. 470–478, mar. 2011, doi: 10.1038/mt.2010.255.

[3] J. Hearn, I. Ssinabulya, J. I. Schwartz, A. R. Akiteng, H. J. Ross, in J. A. Cafazzo, „Self-management of non-communicable diseases in low- and middle-income countries: A scoping review“, PLOS ONE, let. 14, št. 7, str. e0219141, jul. 2019, doi: 10.1371/journal.pone.0219141.

[4] A. K. Chandel, C. Es, R. Rudravaram, M. L. Narasu, V. Rao, in P. Ravindra, „Economics and environmental impact of bioethanol production technologies: an appraisal“.

Razvoj temperaturno inducibilnega transkripcijskega reostata pri Neurospori crassi

2023-04-10T22:21:03Z

Lsegota:

Razvijanje temperaturno inducibilnega transkripcijskega reostata pri Neurospori crassi

== Uvod ==
Neurospora crassa je rdeča plesen, ki spada v deblo askomicet. Zaradi svoje majhnosti, enostavnosti vzgoje in opravljanja genskih analiz, je N. crassa pomemben modelni organizem za raziskovanje številnih bioloških procesov, vključno s celičnim ciklom, fotosintezo, biološkimi ritmi, staranjem in razvojem. Prav tako proizvaja encime, ki razgrajujejo celulozo, kar je koristno pri proizvodnji etanola iz celuloznih virov.

Proteini toplotnega šoka (hsp) sodelujejo pri odzivu celice na stresne pogoje, kot so visoke ali nizke temperature, oksidativni stres in izpostavljenost strupenim snovem. Delujejo kot šaperoni, njihova naloga pa je zaščititi celice pred poškodbami s preprečevanjem nepravilnega zvitja proteinov. Vendar pa področje uravnavanja izražanja genov, ki kodirajo hsp, še vedno ostaja delno neraziskano, zlasti v kontekstu modelnih glivnih organizmov, kot je N. crassa. Faktorji toplotnega šoka (hsf) so pri stresnih pogojih aktivatorji transkripcije za proteine hsp. Po oligomerizaciji se faktorji hsf vežejo na DNA, in sicer na elemente toplotnega šoka (hse), ki so pri evkariontih relativno ohranjeni. V N. crassi so opisali tri gene hsp (hsp30, hsp70 in hsp80), ki se vsi izražajo pri visokih temperaturah, prav tako pa so pri vsakem odkrili domnevne cis regulatorne elemente.

V N. crassa so načrtali že mnogo promotorjev, ki se odzivajo na kemične signale (kot so glukoza, kininska kislina in baker), od fizično induciranih sistemov pa so razvili le takšnega, ki se odziva na svetlobo. Temperaturno induciran sistem, bi medtem omogočil zelo enostavno uravnavanje izražanja genov brez potrebe po dodajanju eksogenih kemikalij.

== Funkcijska analiza promotorjev hsp ==
V preteklih študijah so pri promotorju gena hsp30 definirali štiri regije hse, medtem ko so v promotorju hsp70 našli dve. Hsp70 ne vsebuje regulatornih elementov hse, vendar so opisane nekoliko različne cis regije, poimenovane kot elementi odziva na temperaturo (tre).
Da bi bolj okarakterizirali regulacijo genov so pripravili paleto konstruktov, ki so poleg bližnjega promotorja vsebovali različno dolge 5' regije. Različni konstrukti enakega gena pa so pri tem vsebovali raznoliko število regulatornih cis elementov. Za analizo so uporabili luciferazo iz kresničke z dodanim zaporedjem PEST (ki poveča razgradnjo proteina) kar skupaj tvori reporterski sistem za zaznavo transkripcije v realnem času. Pri sobni temperaturi so nagojili reporterske seve glive in jih v temi izpostavili enournemu toplotnemu šoku pri treh različnih temperaturah: dveh visokih (35 °C in 45 °C) in eni, ki je bila bližja laboratorijskim rastnim pogojem N. crasse (30 °C), in merili luminiscenco s CCD kamero.

Vsi polno dolgi konstrukti so izkazali podobno hiter in močen odziv na toplotni šok pri 45 °C, medtem ko je bil odziv pri 35 °C neprimerno nižji, pri 30 °C pa odziva sploh ni bilo. Skrajšani konstrukti so se pri hsp30 in hsp70 odzivali v skladu s številom domnevnih hse regij, ki so jih vsebovali. Medtem je konstrukt s polovičnim promotorjem hsp80 (ki je vseboval 5 od 7 domnevnih tre regij), pokazal kar 9-krat nižji odziv od konstrukta s polnim promotorjem, kar kaže na pomanjkljivo poznavanje regulacije promotorja hse80. Izmed treh genov so pri hsp30 opazili mnogo najnižje puščanje promotorja (pri 25 °C), zaradi česa so pri omenjenem genu opazili več kot 1000-kratno povečanje izražanja (razmerje med bazalnim vrhom in induciranim vrhom).

Hsp30 ima nižjo molekularno maso od ostalih dveh sorodnih proteinov (30 kDa proti 70 kDa / 80 kDa) na račun odsotnosti ATP hidrolazne domene. Zaradi tega so pri stresnih pogojih manjši hsp-ji prvi, ki posredujejo proti proteinski denaturaciji, kar korelira z opaženo visoko stopnjo povečanja izražanja pri hsp30.
Avtorji so hsp30 primerjali z drugimi znanimi inducibilnimi sistemi v N. crassa, kot sta promotor qa-2, ki se odziva na naraščajoče koncentracije kininske kisline in promotor vvd, ki se aktivira s svetlobo. Promotor hsp30 je imel najnižjo bazalno aktivnost in pa najvišjo aktivnost v induciranem stanjupotreboval pa je dlje časa za regeneracijo do minimuma aktivnosti po dražljaju (7 h) od vvd promotorja (4 h).

== Odziv promotorja hsp30 na toplotne dražljaje ==
Zaradi najbolj robustnega odziva na toplotne dražljaje so avtorji za nadaljnje delo izbrali promotor hsp30. Zanimalo jih je promotorjev odziv na različno dolge toplotne šoke pri različnih temperaturah, zato so skonstruirali pristop, ki omogoča hitro in enostavno analizo.
Eksperiment so opravili v formatu pcr mikrotitrske plošče in testirali 3 različne promotorje hsp30 (en celoten in dva skrajšana). Pripravili so paleto različnih pogojev in ocenjevali odziv promotorja z merjenjem luminiscence. Vzorci so bili izpostavljeni šestim različnim temperaturam (v rangu od 34 °C do 46 °C), pri čem so toplotni dražljaji trajali 60, 30, 15, 5, in 1 min. V obzir pa je treba vzeti, da je zaradi relativno majhnega volumna gojišča (pcr mikrocentrifugirka), bila omejena količina dodanega medija in zato omejena rast plesni.

Konstrukti s promotorji hsp30 so se izkazali za izjemno nastavljive sisteme, saj se je stopnja odziva povečevala, ko se je zviševala temperatura, prav tako pa so opazili večji odziv, kjer je temperaturni dražljaj trajal dlje časa. Vendar pa je maksimalni odziv bil opažen pri 15 min, pri daljših izpostavljenostih višji temperaturi pa je izražanje bilo nižje, kar so avtorji pripisovali upadu celične funkcije zaradi visokih temperatur. Že pri najkrajši izpostavljenosti (1 min) višji temperaturi je sistem podal robustni odziv.
Kot najbolj optimalna sistema sta se izkazala oba daljša konstrukta (vsebujeta vse domnevne elemente hse), saj so pri njima opazili močnejšo indukcijo in manjše puščanje promotorja v primerjavi s krajšim konstruktom.

== Temperaturno pogojena rast N. crasse ==
Celulozni regulator 2 (CLR-2) je transkripcijski faktor, ki je ključen pri regulaciji celulazne aktivnosti N. crasse, saj je potreben za indukcijo ekspresije celulolitičnih genov. V industriji je pomembno nadzorovano izražanje CLR-2, s tem se na primer poveča proizvodnja bioetanola. Avtorji so pripravili sev N. crasse, pri katerem so zapis za CLR-2 postavili pod promotor hsp30 in opazovali rast celic pri različnih pogojih.
Najkrajši promotor hse30 vsebuje le dve od štirih domnevnih regij hse in se je zato izkazal kot najmanj optimalen sistem za uravnavanje transkripcije (glej Odziv hsp30 promotorja na toplotne dražljaje). Vseeno pa so ga avtorji pri tem eksperimentu uporabili zaradi njegove kratke dolžine (500 baznih parov). V N. crassi je namreč prisotna ponavljajoča inducirana mutacija (RIP), kot obrambni mehanizem za zmanjšanje aktivnosti in širjenja mobilnih genetskih elementov, ki pa je manj pogosta v krajših segmentih DNA.

Rezultati so pokazali, da se sev hsp300.5 kb:clr-2 ne razvija v tekočih gojiščih z Avicelom (kristalinična celuloza) pri normalni temperaturi (25°C). Vendar pa se po vsakodnevnih impulzih toplote (45°C) rast povrne in celo preseže WT sev plesni.

== Načrtovanje sintetičnega promotorja iz domnevnih cis regij hsp30 ==
Da bi uporabili vse domnevne hse regije, in hkrati znižali pogostost RIP-induciranih mutacij so avtorji načrtali 2 sintetična promotorja. Ocenili so minimalno dolžino bližnjega promotorja (okoli 250 bp) in mu dodali domnevne regije hse. S primerjavo promotorja hse30 s promotorji hse30 iz sorodnih organizmov N. crasse so identificirali še peto regijo hse, ki je prav tako ohranjena, in tudi njo vključili v konstrukt. Razlika med sintetičnima promoterjema je bila zgolj v dolžini vmesnikov med domnevnimi regulatornimi regijami hse.

Tudi oba sintetična promotorja sta izkazala dobro nastavljivost pri različnih toplotnih tretmajih, vendar sta oba prikazala relativno močno bazalno aktivnost. Je pa tovrstno puščanje promotorja velikokrat prisotno ob načrtovanju umetnih promotorjev [vir]. Vseeno pa sta se oba nova promotorja izkazala za bolj uporaben sistem nastavljivega izražanja od promotorjev hsp70 in hsp80, prav tako so opazili višje stopnje izražanja od najkrajše verzije promotorja hsp30. Zaradi velike ohranjenosti promotorja hsp30 bi podobni promotorji najverjetneje delovali tudi v ostalih askomicetah, kot na primer v biotehnološko pomembnih Aspergillus niger ali Trichoderma reesei.

== Zaključek ==
Sistem s finim uravnavanjem transkripcije preko toplotne indukcije predstavlja obetavno orodje za raziskave funkcije genov, pa tudi za biotehnološke aplikacije, kot so proizvodnja encimov, metabolitov ali drugih biološko pomembnih snovi. V primerjavi s kemično induciranimi sistemi se izkaže za lažje reverzibilen sistem, saj ni treba dodajati eksogenih sredstev, ki jih je težko odstraniti iz gojišča. Hkrati pa je enostaven za uporabo, sploh v primerjavi s svetlobno indukcijo, kjer je potreba po dobro definiranih laboratorijskih nastavitvah (temna soba). Vendar pa se pri toplotni indukciji pojavljajo potencialne težave oziroma omejitve, kot so stres za organizem ali neselektivna aktivacija genov [vir].

Ko so zapis za clr-2 postavili pod hse30 promotor, so avtorji (kljub izbiri neoptimalnega promotorja) prikazali možnost uporabe toplotno inducibilnega sistema za regulacijo izražanja pri želenih fenotipih. Ob nadaljnji optimizaciji procesa bi se celulazna aktivnost plesni dodatno povečala, kar odpira priložnost uporabe tovrstnih sistemov v industriji. Glavna ovira pri industrijski uporabi razgradnje celuloze so namreč visoki stroški proizvodnje encimov, kar tudi preprečuje nižje cene bioetanola [vir].

== Literatura ==

[1] C. Tabilo-Agurto, V. Del Rio-Pinilla, V. Eltit-Villarroel, A. Goity, F. Muñoz-Guzmán, in L. F. Larrondo, „Developing a Temperature-Inducible Transcriptional Rheostat in Neurospora crassa“, mBio, let. 14, št. 1, str. e03291-22, feb. 2023, doi: 10.1128/mbio.03291-22.

[2] J. Han, B. McLane, E.-H. Kim, J.-W. Yoon, in H.-S. Jun, „Remission of diabetes by insulin gene therapy using a hepatocyte-specific and glucose-responsive synthetic promoter“, Mol. Ther. J. Am. Soc. Gene Ther., let. 19, št. 3, str. 470–478, mar. 2011, doi: 10.1038/mt.2010.255.

[3] J. Hearn, I. Ssinabulya, J. I. Schwartz, A. R. Akiteng, H. J. Ross, in J. A. Cafazzo, „Self-management of non-communicable diseases in low- and middle-income countries: A scoping review“, PLOS ONE, let. 14, št. 7, str. e0219141, jul. 2019, doi: 10.1371/journal.pone.0219141.

[4] A. K. Chandel, C. Es, R. Rudravaram, M. L. Narasu, V. Rao, in P. Ravindra, „Economics and environmental impact of bioethanol production technologies: an appraisal“.

Razvoj temperaturno inducibilnega transkripcijskega reostata pri Neurospori crassi

2023-04-10T22:08:57Z

Lsegota:

Razvijanje temperaturno inducibilnega transkripcijskega reostata pri Neurospori crassi

== Uvod ==
Neurospora crassa je rdeča plesen, ki spada v deblo askomicet. Zaradi svoje majhnosti, enostavnosti vzgoje in opravljanja genskih analiz, je N. crassa pomemben modelni organizem za raziskovanje številnih bioloških procesov, vključno s celičnim ciklom, fotosintezo, biološkimi ritmi, staranjem in razvojem. Prav tako proizvaja encime, ki razgrajujejo celulozo, kar je koristno pri proizvodnji etanola iz celuloznih virov.

Proteini toplotnega šoka (hsp) sodelujejo pri odzivu celice na stresne pogoje, kot so visoke ali nizke temperature, oksidativni stres in izpostavljenost strupenim snovem. Delujejo kot šaperoni, njihova naloga pa je zaščititi celice pred poškodbami s preprečevanjem nepravilnega zvitja proteinov. Vendar pa področje uravnavanja izražanja genov, ki kodirajo hsp, še vedno ostaja delno neraziskano, zlasti v kontekstu modelnih glivnih organizmov, kot je N. crassa. Faktorji toplotnega šoka (hsf) so pri stresnih pogojih aktivatorji transkripcije za proteine hsp. Po oligomerizaciji se faktorji hsf vežejo na DNA, in sicer na elemente toplotnega šoka (hse), ki so pri evkariontih relativno ohranjeni. V N. crassi so opisali tri gene hsp (hsp30, hsp70 in hsp80), ki se vsi izražajo pri visokih temperaturah, prav tako pa so pri vsakem odkrili domnevne cis regulatorne elemente.

V N. crassa so načrtali že mnogo promotorjev, ki se odzivajo na kemične signale (kot so glukoza, kininska kislina in baker), od fizično induciranih sistemov pa so razvili le takšnega, ki se odziva na svetlobo. Temperaturno induciran sistem, bi medtem omogočil zelo enostavno uravnavanje izražanja genov brez potrebe po dodajanju eksogenih kemikalij.

== Funkcijska analiza promotorjev hsp ==
V preteklih študijah so pri promotorju gena hsp30 definirali štiri regije hse, medtem ko so v promotorju hsp70 našli dve. Hsp70 ne vsebuje regulatornih elementov hse, vendar so opisane nekoliko različne cis regije, poimenovane kot elementi odziva na temperaturo (tre).
Da bi bolj okarakterizirali regulacijo genov so pripravili paleto konstruktov, ki so poleg bližnjega promotorja vsebovali različno dolge 5' regije. Različni konstrukti enakega gena pa so pri tem vsebovali raznoliko število regulatornih cis elementov. Za analizo so uporabili luciferazo iz kresničke z dodanim zaporedjem PEST (ki poveča razgradnjo proteina) kar skupaj tvori reporterski sistem za zaznavo transkripcije v realnem času. Pri sobni temperaturi so nagojili reporterske seve glive in jih v temi izpostavili enournemu toplotnemu šoku pri treh različnih temperaturah: dveh visokih (35 °C in 45 °C) in eni, ki je bila bližja laboratorijskim rastnim pogojem N. crasse (30 °C), in merili luminiscenco s CCD kamero.

Vsi polno dolgi konstrukti so izkazali podobno hiter in močen odziv na toplotni šok pri 45 °C, medtem ko je bil odziv pri 35 °C neprimerno nižji, pri 30 °C pa odziva sploh ni bilo. Skrajšani konstrukti so se pri hsp30 in hsp70 odzivali v skladu s številom domnevnih hse regij, ki so jih vsebovali. Medtem je konstrukt s polovičnim promotorjem hsp80 (ki je vseboval 5 od 7 domnevnih tre regij), pokazal kar 9-krat nižji odziv od konstrukta s polnim promotorjem, kar kaže na pomanjkljivo poznavanje regulacije promotorja hse80. Izmed treh genov so pri hsp30 opazili mnogo najnižje puščanje promotorja (pri 25 °C), zaradi česa so pri omenjenem genu opazili več kot 1000-kratno povečanje izražanja (razmerje med bazalnim vrhom in induciranim vrhom).

Hsp30 ima nižjo molekularno maso od ostalih dveh sorodnih proteinov (30 kDa proti 70 kDa / 80 kDa) na račun odsotnosti ATP hidrolazne domene. Zaradi tega so pri stresnih pogojih manjši hsp-ji prvi, ki posredujejo proti proteinski denaturaciji, kar korelira z opaženo visoko stopnjo povečanja izražanja pri hsp30.
Avtorji so hsp30 primerjali z drugimi znanimi inducibilnimi sistemi v N. crassa, kot sta promotor qa-2, ki se odziva na naraščajoče koncentracije kininske kisline in promotor vvd, ki se aktivira s svetlobo. Promotor hsp30 je imel najnižjo bazalno aktivnost in pa najvišjo aktivnost v induciranem stanjupotreboval pa je dlje časa za regeneracijo do minimuma aktivnosti po dražljaju (7 h) od vvd promotorja (4 h).

== Odziv promotorja hsp30 na toplotne dražljaje ==
Zaradi najbolj robustnega odziva na toplotne dražljaje so avtorji za nadaljnje delo izbrali promotor hsp30. Zanimalo jih je promotorjev odziv na različno dolge toplotne šoke pri različnih temperaturah, zato so skonstruirali pristop, ki omogoča hitro in enostavno analizo.
Eksperiment so opravili v formatu pcr mikrotitrske plošče in testirali 3 različne promotorje hsp30 (en celoten in dva skrajšana). Pripravili so paleto različnih pogojev in ocenjevali odziv promotorja z merjenjem luminiscence. Vzorci so bili izpostavljeni šestim različnim temperaturam (v rangu od 34 °C do 46 °C), pri čem so toplotni dražljaji trajali 60, 30, 15, 5, in 1 min. V obzir pa je treba vzeti, da je zaradi relativno majhnega volumna gojišča (pcr mikrocentrifugirka), bila omejena količina dodanega medija in zato omejena rast plesni.

Konstrukti s promotorji hsp30 so se izkazali za izjemno nastavljive sisteme, saj se je stopnja odziva povečevala, ko se je zviševala temperatura, prav tako pa so opazili večji odziv, kjer je temperaturni dražljaj trajal dlje časa. Vendar pa je maksimalni odziv bil opažen pri 15 min, pri daljših izpostavljenostih višji temperaturi pa je izražanje bilo nižje, kar so avtorji pripisovali upadu celične funkcije zaradi visokih temperatur. Že pri najkrajši izpostavljenosti (1 min) višji temperaturi je sistem podal robustni odziv.
Kot najbolj optimalna sistema sta se izkazala oba daljša konstrukta (vsebujeta vse domnevne elemente hse), saj so pri njima opazili močnejšo indukcijo in manjše puščanje promotorja v primerjavi s krajšim konstruktom.

== Temperaturno pogojena rast N. crasse ==
Celulozni regulator 2 (CLR-2) je transkripcijski faktor, ki je ključen pri regulaciji celulazne aktivnosti N. crasse, saj je potreben za indukcijo ekspresije celulolitičnih genov. V industriji je pomembno nadzorovano izražanje CLR-2, s tem se na primer poveča proizvodnja bioetanola. Avtorji so pripravili sev N. crasse, pri katerem so zapis za CLR-2 postavili pod promotor hsp30 in opazovali rast celic pri različnih pogojih.
Najkrajši promotor hse30 vsebuje le dve od štirih domnevnih regij hse in se je zato izkazal kot najmanj optimalen sistem za uravnavanje transkripcije (glej Odziv hsp30 promotorja na toplotne dražljaje). Vseeno pa so ga avtorji pri tem eksperimentu uporabili zaradi njegove kratke dolžine (500 baznih parov). V N. crassi je namreč prisotna ponavljajoča inducirana mutacija (RIP), kot obrambni mehanizem za zmanjšanje aktivnosti in širjenja mobilnih genetskih elementov, ki pa je manj pogosta v krajših segmentih DNA.

Rezultati so pokazali, da se sev hsp300.5 kb:clr-2 ne razvija v tekočih gojiščih z Avicelom (kristalinična celuloza) pri normalni temperaturi (25°C). Vendar pa se po vsakodnevnih impulzih toplote (45°C) rast povrne in celo preseže WT sev plesni.

== Načrtovanje sintetičnega promotorja iz domnevnih cis regij hsp30 ==
Da bi uporabili vse domnevne hse regije, in hkrati znižali pogostost RIP-induciranih mutacij so avtorji načrtali 2 sintetična promotorja. Ocenili so minimalno dolžino bližnjega promotorja (okoli 250 bp) in mu dodali domnevne regije hse. S primerjavo promotorja hse30 s promotorji hse30 iz sorodnih organizmov N. crasse so identificirali še peto regijo hse, ki je prav tako ohranjena, in tudi njo vključili v konstrukt. Razlika med sintetičnima promoterjema je bila zgolj v dolžini vmesnikov med domnevnimi regulatornimi regijami hse.

Tudi oba sintetična promotorja sta izkazala dobro nastavljivost pri različnih toplotnih tretmajih, vendar sta oba prikazala relativno močno bazalno aktivnost. Je pa tovrstno puščanje promotorja velikokrat prisotno ob načrtovanju umetnih promotorjev [vir]. Vseeno pa sta se oba nova promotorja izkazala za bolj uporaben sistem nastavljivega izražanja od promotorjev hsp70 in hsp80, prav tako so opazili višje stopnje izražanja od najkrajše verzije promotorja hsp30. Zaradi velike ohranjenosti promotorja hsp30 bi podobni promotorji najverjetneje delovali tudi v ostalih askomicetah, kot na primer v biotehnološko pomembnih Aspergillus niger ali Trichoderma reesei.

== Zaključek ==
Sistem s finim uravnavanjem transkripcije preko toplotne indukcije predstavlja obetavno orodje za raziskave funkcije genov, pa tudi za biotehnološke aplikacije, kot so proizvodnja encimov, metabolitov ali drugih biološko pomembnih snovi. V primerjavi s kemično induciranimi sistemi se izkaže za lažje reverzibilen sistem, saj ni treba dodajati eksogenih sredstev, ki jih je težko odstraniti iz gojišča. Hkrati pa je enostaven za uporabo, sploh v primerjavi s svetlobno indukcijo, kjer je potreba po dobro definiranih laboratorijskih nastavitvah (temna soba). Vendar pa se pri toplotni indukciji pojavljajo potencialne težave oziroma omejitve, kot so stres za organizem ali neselektivna aktivacija genov [vir].

Ko so zapis za clr-2 postavili pod hse30 promotor, so avtorji (kljub izbiri neoptimalnega promotorja) prikazali možnost uporabe toplotno inducibilnega sistema za regulacijo izražanja pri želenih fenotipih. Ob nadaljnji optimizaciji procesa bi se celulazna aktivnost plesni dodatno povečala, kar odpira priložnost uporabe tovrstnih sistemov v industriji. Glavna ovira pri industrijski uporabi razgradnje celuloze so namreč visoki stroški proizvodnje encimov, kar tudi preprečuje nižje cene bioetanola [vir].

Razvoj temperaturno inducibilnega transkripcijskega reostata pri Neurospori crassi

2023-04-10T22:08:28Z

Lsegota:

Razvijanje temperaturno inducibilnega transkripcijskega reostata pri Neurospori crassi

== Uvod ==
Neurospora crassa je rdeča plesen, ki spada v deblo askomicet. Zaradi svoje majhnosti, enostavnosti vzgoje in opravljanja genskih analiz, je N. crassa pomemben modelni organizem za raziskovanje številnih bioloških procesov, vključno s celičnim ciklom, fotosintezo, biološkimi ritmi, staranjem in razvojem. Prav tako proizvaja encime, ki razgrajujejo celulozo, kar je koristno pri proizvodnji etanola iz celuloznih virov.

Proteini toplotnega šoka (hsp) sodelujejo pri odzivu celice na stresne pogoje, kot so visoke ali nizke temperature, oksidativni stres in izpostavljenost strupenim snovem. Delujejo kot šaperoni, njihova naloga pa je zaščititi celice pred poškodbami s preprečevanjem nepravilnega zvitja proteinov. Vendar pa področje uravnavanja izražanja genov, ki kodirajo hsp, še vedno ostaja delno neraziskano, zlasti v kontekstu modelnih glivnih organizmov, kot je N. crassa. Faktorji toplotnega šoka (hsf) so pri stresnih pogojih aktivatorji transkripcije za proteine hsp. Po oligomerizaciji se faktorji hsf vežejo na DNA, in sicer na elemente toplotnega šoka (hse), ki so pri evkariontih relativno ohranjeni. V N. crassi so opisali tri gene hsp (hsp30, hsp70 in hsp80), ki se vsi izražajo pri visokih temperaturah, prav tako pa so pri vsakem odkrili domnevne cis regulatorne elemente.

V N. crassa so načrtali že mnogo promotorjev, ki se odzivajo na kemične signale (kot so glukoza, kininska kislina in baker), od fizično induciranih sistemov pa so razvili le takšnega, ki se odziva na svetlobo. Temperaturno induciran sistem, bi medtem omogočil zelo enostavno uravnavanje izražanja genov brez potrebe po dodajanju eksogenih kemikalij.

== Funkcijska analiza promotorjev hsp ==
V preteklih študijah so pri promotorju gena hsp30 definirali štiri regije hse, medtem ko so v promotorju hsp70 našli dve. Hsp70 ne vsebuje regulatornih elementov hse, vendar so opisane nekoliko različne cis regije, poimenovane kot elementi odziva na temperaturo (tre).
Da bi bolj okarakterizirali regulacijo genov so pripravili paleto konstruktov, ki so poleg bližnjega promotorja vsebovali različno dolge 5' regije. Različni konstrukti enakega gena pa so pri tem vsebovali raznoliko število regulatornih cis elementov. Za analizo so uporabili luciferazo iz kresničke z dodanim zaporedjem PEST (ki poveča razgradnjo proteina) kar skupaj tvori reporterski sistem za zaznavo transkripcije v realnem času. Pri sobni temperaturi so nagojili reporterske seve glive in jih v temi izpostavili enournemu toplotnemu šoku pri treh različnih temperaturah: dveh visokih (35 °C in 45 °C) in eni, ki je bila bližja laboratorijskim rastnim pogojem N. crasse (30 °C), in merili luminiscenco s CCD kamero.

Vsi polno dolgi konstrukti so izkazali podobno hiter in močen odziv na toplotni šok pri 45 °C, medtem ko je bil odziv pri 35 °C neprimerno nižji, pri 30 °C pa odziva sploh ni bilo. Skrajšani konstrukti so se pri hsp30 in hsp70 odzivali v skladu s številom domnevnih hse regij, ki so jih vsebovali. Medtem je konstrukt s polovičnim promotorjem hsp80 (ki je vseboval 5 od 7 domnevnih tre regij), pokazal kar 9-krat nižji odziv od konstrukta s polnim promotorjem, kar kaže na pomanjkljivo poznavanje regulacije promotorja hse80. Izmed treh genov so pri hsp30 opazili mnogo najnižje puščanje promotorja (pri 25 °C), zaradi česa so pri omenjenem genu opazili več kot 1000-kratno povečanje izražanja (razmerje med bazalnim vrhom in induciranim vrhom).

Hsp30 ima nižjo molekularno maso od ostalih dveh sorodnih proteinov (30 kDa proti 70 kDa / 80 kDa) na račun odsotnosti ATP hidrolazne domene. Zaradi tega so pri stresnih pogojih manjši hsp-ji prvi, ki posredujejo proti proteinski denaturaciji, kar korelira z opaženo visoko stopnjo povečanja izražanja pri hsp30.
Avtorji so hsp30 primerjali z drugimi znanimi inducibilnimi sistemi v N. crassa, kot sta promotor qa-2, ki se odziva na naraščajoče koncentracije kininske kisline in promotor vvd, ki se aktivira s svetlobo. Promotor hsp30 je imel najnižjo bazalno aktivnost in pa najvišjo aktivnost v induciranem stanjupotreboval pa je dlje časa za regeneracijo do minimuma aktivnosti po dražljaju (7 h) od vvd promotorja (4 h).

== Odziv promotorja hsp30 na toplotne dražljaje ==
Zaradi najbolj robustnega odziva na toplotne dražljaje so avtorji za nadaljnje delo izbrali promotor hsp30. Zanimalo jih je promotorjev odziv na različno dolge toplotne šoke pri različnih temperaturah, zato so skonstruirali pristop, ki omogoča hitro in enostavno analizo.
Eksperiment so opravili v formatu pcr mikrotitrske plošče in testirali 3 različne promotorje hsp30 (en celoten in dva skrajšana). Pripravili so paleto različnih pogojev in ocenjevali odziv promotorja z merjenjem luminiscence. Vzorci so bili izpostavljeni šestim različnim temperaturam (v rangu od 34 °C do 46 °C), pri čem so toplotni dražljaji trajali 60, 30, 15, 5, in 1 min. V obzir pa je treba vzeti, da je zaradi relativno majhnega volumna gojišča (pcr mikrocentrifugirka), bila omejena količina dodanega medija in zato omejena rast plesni.

Konstrukti s promotorji hsp30 so se izkazali za izjemno nastavljive sisteme, saj se je stopnja odziva povečevala, ko se je zviševala temperatura, prav tako pa so opazili večji odziv, kjer je temperaturni dražljaj trajal dlje časa. Vendar pa je maksimalni odziv bil opažen pri 15 min, pri daljših izpostavljenostih višji temperaturi pa je izražanje bilo nižje, kar so avtorji pripisovali upadu celične funkcije zaradi visokih temperatur. Že pri najkrajši izpostavljenosti (1 min) višji temperaturi je sistem podal robustni odziv.
Kot najbolj optimalna sistema sta se izkazala oba daljša konstrukta (vsebujeta vse domnevne elemente hse), saj so pri njima opazili močnejšo indukcijo in manjše puščanje promotorja v primerjavi s krajšim konstruktom.

== Temperaturno pogojena rast N crasse ==
Celulozni regulator 2 (CLR-2) je transkripcijski faktor, ki je ključen pri regulaciji celulazne aktivnosti N. crasse, saj je potreben za indukcijo ekspresije celulolitičnih genov. V industriji je pomembno nadzorovano izražanje CLR-2, s tem se na primer poveča proizvodnja bioetanola. Avtorji so pripravili sev N. crasse, pri katerem so zapis za CLR-2 postavili pod promotor hsp30 in opazovali rast celic pri različnih pogojih.
Najkrajši promotor hse30 vsebuje le dve od štirih domnevnih regij hse in se je zato izkazal kot najmanj optimalen sistem za uravnavanje transkripcije (glej Odziv hsp30 promotorja na toplotne dražljaje). Vseeno pa so ga avtorji pri tem eksperimentu uporabili zaradi njegove kratke dolžine (500 baznih parov). V N. crassi je namreč prisotna ponavljajoča inducirana mutacija (RIP), kot obrambni mehanizem za zmanjšanje aktivnosti in širjenja mobilnih genetskih elementov, ki pa je manj pogosta v krajših segmentih DNA.

Rezultati so pokazali, da se sev hsp300.5 kb:clr-2 ne razvija v tekočih gojiščih z Avicelom (kristalinična celuloza) pri normalni temperaturi (25°C). Vendar pa se po vsakodnevnih impulzih toplote (45°C) rast povrne in celo preseže WT sev plesni.

== Načrtovanje sintetičnega promotorja iz domnevnih cis regij hsp30 ==
Da bi uporabili vse domnevne hse regije, in hkrati znižali pogostost RIP-induciranih mutacij so avtorji načrtali 2 sintetična promotorja. Ocenili so minimalno dolžino bližnjega promotorja (okoli 250 bp) in mu dodali domnevne regije hse. S primerjavo promotorja hse30 s promotorji hse30 iz sorodnih organizmov N. crasse so identificirali še peto regijo hse, ki je prav tako ohranjena, in tudi njo vključili v konstrukt. Razlika med sintetičnima promoterjema je bila zgolj v dolžini vmesnikov med domnevnimi regulatornimi regijami hse.

Tudi oba sintetična promotorja sta izkazala dobro nastavljivost pri različnih toplotnih tretmajih, vendar sta oba prikazala relativno močno bazalno aktivnost. Je pa tovrstno puščanje promotorja velikokrat prisotno ob načrtovanju umetnih promotorjev [vir]. Vseeno pa sta se oba nova promotorja izkazala za bolj uporaben sistem nastavljivega izražanja od promotorjev hsp70 in hsp80, prav tako so opazili višje stopnje izražanja od najkrajše verzije promotorja hsp30. Zaradi velike ohranjenosti promotorja hsp30 bi podobni promotorji najverjetneje delovali tudi v ostalih askomicetah, kot na primer v biotehnološko pomembnih Aspergillus niger ali Trichoderma reesei.

== Zaključek ==
Sistem s finim uravnavanjem transkripcije preko toplotne indukcije predstavlja obetavno orodje za raziskave funkcije genov, pa tudi za biotehnološke aplikacije, kot so proizvodnja encimov, metabolitov ali drugih biološko pomembnih snovi. V primerjavi s kemično induciranimi sistemi se izkaže za lažje reverzibilen sistem, saj ni treba dodajati eksogenih sredstev, ki jih je težko odstraniti iz gojišča. Hkrati pa je enostaven za uporabo, sploh v primerjavi s svetlobno indukcijo, kjer je potreba po dobro definiranih laboratorijskih nastavitvah (temna soba). Vendar pa se pri toplotni indukciji pojavljajo potencialne težave oziroma omejitve, kot so stres za organizem ali neselektivna aktivacija genov [vir].

Ko so zapis za clr-2 postavili pod hse30 promotor, so avtorji (kljub izbiri neoptimalnega promotorja) prikazali možnost uporabe toplotno inducibilnega sistema za regulacijo izražanja pri želenih fenotipih. Ob nadaljnji optimizaciji procesa bi se celulazna aktivnost plesni dodatno povečala, kar odpira priložnost uporabe tovrstnih sistemov v industriji. Glavna ovira pri industrijski uporabi razgradnje celuloze so namreč visoki stroški proizvodnje encimov, kar tudi preprečuje nižje cene bioetanola [vir].

Razvoj temperaturno inducibilnega transkripcijskega reostata pri Neurospori crassi

2023-04-10T22:07:39Z

Lsegota:

Razvijanje temperaturno inducibilnega transkripcijskega reostata pri Neurospori crassi

== Uvod ==
Neurospora crassa je rdeča plesen, ki spada v deblo askomicet. Zaradi svoje majhnosti, enostavnosti vzgoje in opravljanja genskih analiz, je N. crassa pomemben modelni organizem za raziskovanje številnih bioloških procesov, vključno s celičnim ciklom, fotosintezo, biološkimi ritmi, staranjem in razvojem. Prav tako proizvaja encime, ki razgrajujejo celulozo, kar je koristno pri proizvodnji etanola iz celuloznih virov.

Proteini toplotnega šoka (hsp) sodelujejo pri odzivu celice na stresne pogoje, kot so visoke ali nizke temperature, oksidativni stres in izpostavljenost strupenim snovem. Delujejo kot šaperoni, njihova naloga pa je zaščititi celice pred poškodbami s preprečevanjem nepravilnega zvitja proteinov. Vendar pa področje uravnavanja izražanja genov, ki kodirajo hsp, še vedno ostaja delno neraziskano, zlasti v kontekstu modelnih glivnih organizmov, kot je N. crassa. Faktorji toplotnega šoka (hsf) so pri stresnih pogojih aktivatorji transkripcije za proteine hsp. Po oligomerizaciji se faktorji hsf vežejo na DNA, in sicer na elemente toplotnega šoka (hse), ki so pri evkariontih relativno ohranjeni. V N. crassi so opisali tri gene hsp (hsp30, hsp70 in hsp80), ki se vsi izražajo pri visokih temperaturah, prav tako pa so pri vsakem odkrili domnevne cis regulatorne elemente.

V N. crassa so načrtali že mnogo promotorjev, ki se odzivajo na kemične signale (kot so glukoza, kininska kislina in baker), od fizično induciranih sistemov pa so razvili le takšnega, ki se odziva na svetlobo. Temperaturno induciran sistem, bi medtem omogočil zelo enostavno uravnavanje izražanja genov brez potrebe po dodajanju eksogenih kemikalij.

== Funkcijska analiza HSP promotorjev ==
V preteklih študijah so pri promotorju gena hsp30 definirali štiri regije hse, medtem ko so v promotorju hsp70 našli dve. Hsp70 ne vsebuje regulatornih elementov hse, vendar so opisane nekoliko različne cis regije, poimenovane kot elementi odziva na temperaturo (tre).
Da bi bolj okarakterizirali regulacijo genov so pripravili paleto konstruktov, ki so poleg bližnjega promotorja vsebovali različno dolge 5' regije. Različni konstrukti enakega gena pa so pri tem vsebovali raznoliko število regulatornih cis elementov. Za analizo so uporabili luciferazo iz kresničke z dodanim zaporedjem PEST (ki poveča razgradnjo proteina) kar skupaj tvori reporterski sistem za zaznavo transkripcije v realnem času. Pri sobni temperaturi so nagojili reporterske seve glive in jih v temi izpostavili enournemu toplotnemu šoku pri treh različnih temperaturah: dveh visokih (35 °C in 45 °C) in eni, ki je bila bližja laboratorijskim rastnim pogojem N. crasse (30 °C), in merili luminiscenco s CCD kamero.

Vsi polno dolgi konstrukti so izkazali podobno hiter in močen odziv na toplotni šok pri 45 °C, medtem ko je bil odziv pri 35 °C neprimerno nižji, pri 30 °C pa odziva sploh ni bilo. Skrajšani konstrukti so se pri hsp30 in hsp70 odzivali v skladu s številom domnevnih hse regij, ki so jih vsebovali. Medtem je konstrukt s polovičnim promotorjem hsp80 (ki je vseboval 5 od 7 domnevnih tre regij), pokazal kar 9-krat nižji odziv od konstrukta s polnim promotorjem, kar kaže na pomanjkljivo poznavanje regulacije promotorja hse80. Izmed treh genov so pri hsp30 opazili mnogo najnižje puščanje promotorja (pri 25 °C), zaradi česa so pri omenjenem genu opazili več kot 1000-kratno povečanje izražanja (razmerje med bazalnim vrhom in induciranim vrhom).

Hsp30 ima nižjo molekularno maso od ostalih dveh sorodnih proteinov (30 kDa proti 70 kDa / 80 kDa) na račun odsotnosti ATP hidrolazne domene. Zaradi tega so pri stresnih pogojih manjši hsp-ji prvi, ki posredujejo proti proteinski denaturaciji, kar korelira z opaženo visoko stopnjo povečanja izražanja pri hsp30.
Avtorji so hsp30 primerjali z drugimi znanimi inducibilnimi sistemi v N. crassa, kot sta promotor qa-2, ki se odziva na naraščajoče koncentracije kininske kisline in promotor vvd, ki se aktivira s svetlobo. Promotor hsp30 je imel najnižjo bazalno aktivnost in pa najvišjo aktivnost v induciranem stanjupotreboval pa je dlje časa za regeneracijo do minimuma aktivnosti po dražljaju (7 h) od vvd promotorja (4 h).

== Odziv HSP30 promotorja na toplotne dražljaje ==
Zaradi najbolj robustnega odziva na toplotne dražljaje so avtorji za nadaljnje delo izbrali promotor hsp30. Zanimalo jih je promotorjev odziv na različno dolge toplotne šoke pri različnih temperaturah, zato so skonstruirali pristop, ki omogoča hitro in enostavno analizo.
Eksperiment so opravili v formatu pcr mikrotitrske plošče in testirali 3 različne promotorje hsp30 (en celoten in dva skrajšana). Pripravili so paleto različnih pogojev in ocenjevali odziv promotorja z merjenjem luminiscence. Vzorci so bili izpostavljeni šestim različnim temperaturam (v rangu od 34 °C do 46 °C), pri čem so toplotni dražljaji trajali 60, 30, 15, 5, in 1 min. V obzir pa je treba vzeti, da je zaradi relativno majhnega volumna gojišča (pcr mikrocentrifugirka), bila omejena količina dodanega medija in zato omejena rast plesni.

Konstrukti s promotorji hsp30 so se izkazali za izjemno nastavljive sisteme, saj se je stopnja odziva povečevala, ko se je zviševala temperatura, prav tako pa so opazili večji odziv, kjer je temperaturni dražljaj trajal dlje časa. Vendar pa je maksimalni odziv bil opažen pri 15 min, pri daljših izpostavljenostih višji temperaturi pa je izražanje bilo nižje, kar so avtorji pripisovali upadu celične funkcije zaradi visokih temperatur. Že pri najkrajši izpostavljenosti (1 min) višji temperaturi je sistem podal robustni odziv.
Kot najbolj optimalna sistema sta se izkazala oba daljša konstrukta (vsebujeta vse domnevne elemente hse), saj so pri njima opazili močnejšo indukcijo in manjše puščanje promotorja v primerjavi s krajšim konstruktom.

== Temperaturno pogojena rast N crasse ==
Celulozni regulator 2 (CLR-2) je transkripcijski faktor, ki je ključen pri regulaciji celulazne aktivnosti N. crasse, saj je potreben za indukcijo ekspresije celulolitičnih genov. V industriji je pomembno nadzorovano izražanje CLR-2, s tem se na primer poveča proizvodnja bioetanola. Avtorji so pripravili sev N. crasse, pri katerem so zapis za CLR-2 postavili pod promotor hsp30 in opazovali rast celic pri različnih pogojih.
Najkrajši promotor hse30 vsebuje le dve od štirih domnevnih regij hse in se je zato izkazal kot najmanj optimalen sistem za uravnavanje transkripcije (glej Odziv hsp30 promotorja na toplotne dražljaje). Vseeno pa so ga avtorji pri tem eksperimentu uporabili zaradi njegove kratke dolžine (500 baznih parov). V N. crassi je namreč prisotna ponavljajoča inducirana mutacija (RIP), kot obrambni mehanizem za zmanjšanje aktivnosti in širjenja mobilnih genetskih elementov, ki pa je manj pogosta v krajših segmentih DNA.

Rezultati so pokazali, da se sev hsp300.5 kb:clr-2 ne razvija v tekočih gojiščih z Avicelom (kristalinična celuloza) pri normalni temperaturi (25°C). Vendar pa se po vsakodnevnih impulzih toplote (45°C) rast povrne in celo preseže WT sev plesni.

== Načrtovanje sintetičnega promotorja iz domnevnih cis regij hsp30 ==
Da bi uporabili vse domnevne hse regije, in hkrati znižali pogostost RIP-induciranih mutacij so avtorji načrtali 2 sintetična promotorja. Ocenili so minimalno dolžino bližnjega promotorja (okoli 250 bp) in mu dodali domnevne regije hse. S primerjavo promotorja hse30 s promotorji hse30 iz sorodnih organizmov N. crasse so identificirali še peto regijo hse, ki je prav tako ohranjena, in tudi njo vključili v konstrukt. Razlika med sintetičnima promoterjema je bila zgolj v dolžini vmesnikov med domnevnimi regulatornimi regijami hse.

Tudi oba sintetična promotorja sta izkazala dobro nastavljivost pri različnih toplotnih tretmajih, vendar sta oba prikazala relativno močno bazalno aktivnost. Je pa tovrstno puščanje promotorja velikokrat prisotno ob načrtovanju umetnih promotorjev [vir]. Vseeno pa sta se oba nova promotorja izkazala za bolj uporaben sistem nastavljivega izražanja od promotorjev hsp70 in hsp80, prav tako so opazili višje stopnje izražanja od najkrajše verzije promotorja hsp30. Zaradi velike ohranjenosti promotorja hsp30 bi podobni promotorji najverjetneje delovali tudi v ostalih askomicetah, kot na primer v biotehnološko pomembnih Aspergillus niger ali Trichoderma reesei.

== Zaključek ==
Sistem s finim uravnavanjem transkripcije preko toplotne indukcije predstavlja obetavno orodje za raziskave funkcije genov, pa tudi za biotehnološke aplikacije, kot so proizvodnja encimov, metabolitov ali drugih biološko pomembnih snovi. V primerjavi s kemično induciranimi sistemi se izkaže za lažje reverzibilen sistem, saj ni treba dodajati eksogenih sredstev, ki jih je težko odstraniti iz gojišča. Hkrati pa je enostaven za uporabo, sploh v primerjavi s svetlobno indukcijo, kjer je potreba po dobro definiranih laboratorijskih nastavitvah (temna soba). Vendar pa se pri toplotni indukciji pojavljajo potencialne težave oziroma omejitve, kot so stres za organizem ali neselektivna aktivacija genov [vir].

Ko so zapis za clr-2 postavili pod hse30 promotor, so avtorji (kljub izbiri neoptimalnega promotorja) prikazali možnost uporabe toplotno inducibilnega sistema za regulacijo izražanja pri želenih fenotipih. Ob nadaljnji optimizaciji procesa bi se celulazna aktivnost plesni dodatno povečala, kar odpira priložnost uporabe tovrstnih sistemov v industriji. Glavna ovira pri industrijski uporabi razgradnje celuloze so namreč visoki stroški proizvodnje encimov, kar tudi preprečuje nižje cene bioetanola [vir].

Razvoj temperaturno inducibilnega transkripcijskega reostata pri Neurospori crassi

2023-04-10T22:04:38Z

Lsegota:

Razvijanje temperaturno inducibilnega transkripcijskega reostata pri Neurospori crassi

== Uvod ==
Neurospora crassa je rdeča plesen, ki spada v deblo askomicet. Zaradi svoje majhnosti, enostavnosti vzgoje in opravljanja genskih analiz, je N. crassa pomemben modelni organizem za raziskovanje številnih bioloških procesov, vključno s celičnim ciklom, fotosintezo, biološkimi ritmi, staranjem in razvojem. Prav tako proizvaja encime, ki razgrajujejo celulozo, kar je koristno pri proizvodnji etanola iz celuloznih virov.

Proteini toplotnega šoka (hsp) sodelujejo pri odzivu celice na stresne pogoje, kot so visoke ali nizke temperature, oksidativni stres in izpostavljenost strupenim snovem. Delujejo kot šaperoni, njihova naloga pa je zaščititi celice pred poškodbami s preprečevanjem nepravilnega zvitja proteinov. Vendar pa področje uravnavanja izražanja genov, ki kodirajo hsp, še vedno ostaja delno neraziskano, zlasti v kontekstu modelnih glivnih organizmov, kot je N. crassa. Faktorji toplotnega šoka (hsf) so pri stresnih pogojih aktivatorji transkripcije za proteine hsp. Po oligomerizaciji se faktorji hsf vežejo na DNA, in sicer na elemente toplotnega šoka (hse), ki so pri evkariontih relativno ohranjeni. V N. crassi so opisali tri gene hsp (hsp30, hsp70 in hsp80), ki se vsi izražajo pri visokih temperaturah, prav tako pa so pri vsakem odkrili domnevne cis regulatorne elemente.

V N. crassa so načrtali že mnogo promotorjev, ki se odzivajo na kemične signale (kot so glukoza, kininska kislina in baker), od fizično induciranih sistemov pa so razvili le takšnega, ki se odziva na svetlobo. Temperaturno induciran sistem, bi medtem omogočil zelo enostavno uravnavanje izražanja genov brez potrebe po dodajanju eksogenih kemikalij.

== Funkcijska analiza HSP promotorjev ==
V preteklih študijah so pri promotorju gena hsp30 definirali štiri regije hse, medtem ko so v promotorju hsp70 našli dve. Hsp70 ne vsebuje regulatornih elementov hse, vendar so opisane nekoliko različne cis regije, poimenovane kot elementi odziva na temperaturo (tre).
Da bi bolj okarakterizirali regulacijo genov so pripravili paleto konstruktov, ki so poleg bližnjega promotorja vsebovali različno dolge 5' regije. Različni konstrukti enakega gena pa so pri tem vsebovali raznoliko število regulatornih cis elementov. Za analizo so uporabili luciferazo iz kresničke z dodanim zaporedjem PEST (ki poveča razgradnjo proteina) kar skupaj tvori reporterski sistem za zaznavo transkripcije v realnem času. Pri sobni temperaturi so nagojili reporterske seve glive in jih v temi izpostavili enournemu toplotnemu šoku pri treh različnih temperaturah: dveh visokih (35 °C in 45 °C) in eni, ki je bila bližja laboratorijskim rastnim pogojem N. crasse (30 °C), in merili luminiscenco s CCD kamero.
Vsi polno dolgi konstrukti so izkazali podobno hiter in močen odziv na toplotni šok pri 45 °C, medtem ko je bil odziv pri 35 °C neprimerno nižji, pri 30 °C pa odziva sploh ni bilo. Skrajšani konstrukti so se pri hsp30 in hsp70 odzivali v skladu s številom domnevnih hse regij, ki so jih vsebovali. Medtem je konstrukt s polovičnim promotorjem hsp80 (ki je vseboval 5 od 7 domnevnih tre regij), pokazal kar 9-krat nižji odziv od konstrukta s polnim promotorjem, kar kaže na pomanjkljivo poznavanje regulacije promotorja hse80. Izmed treh genov so pri hsp30 opazili mnogo najnižje puščanje promotorja (pri 25 °C), zaradi česa so pri omenjenem genu opazili več kot 1000-kratno povečanje izražanja (razmerje med bazalnim vrhom in induciranim vrhom).
Hsp30 ima nižjo molekularno maso od ostalih dveh sorodnih proteinov (30 kDa proti 70 kDa / 80 kDa) na račun odsotnosti ATP hidrolazne domene. Zaradi tega so pri stresnih pogojih manjši hsp-ji prvi, ki posredujejo proti proteinski denaturaciji, kar korelira z opaženo visoko stopnjo povečanja izražanja pri hsp30.
Avtorji so hsp30 primerjali z drugimi znanimi inducibilnimi sistemi v N. crassa, kot sta promotor qa-2, ki se odziva na naraščajoče koncentracije kininske kisline in promotor vvd, ki se aktivira s svetlobo. Promotor hsp30 je imel najnižjo bazalno aktivnost in pa najvišjo aktivnost v induciranem stanjupotreboval pa je dlje časa za regeneracijo do minimuma aktivnosti po dražljaju (7 h) od vvd promotorja (4 h ).

== Odziv HSP30 promotorja na toplotne dražljaje ==
Zaradi najbolj robustnega odziva na toplotne dražljaje so avtorji za nadaljnje delo izbrali promotor hsp30. Zanimalo jih je promotorjev odziv na različno dolge toplotne šoke pri različnih temperaturah, zato so skonstruirali pristop, ki omogoča hitro in enostavno analizo.
Eksperiment so opravili v formatu pcr mikrotitrske plošče in testirali 3 različne promotorje hsp30 (en celoten in dva skrajšana). Pripravili so paleto različnih pogojev in ocenjevali odziv promotorja z merjenjem luminiscence. Vzorci so bili izpostavljeni šestim različnim temperaturam (v rangu od 34 °C do 46 °C), pri čem so toplotni dražljaji trajali 60, 30, 15, 5, in 1 min. V obzir pa je treba vzeti, da je zaradi relativno majhnega volumna gojišča (pcr mikrocentrifugirka), bila omejena količina dodanega medija in zato omejena rast plesni.
Konstrukti s promotorji hsp30 so se izkazali za izjemno nastavljive sisteme, saj se je stopnja odziva povečevala, ko se je zviševala temperatura, prav tako pa so opazili večji odziv, kjer je temperaturni dražljaj trajal dlje časa. Vendar pa je maksimalni odziv bil opažen pri 15 min, pri daljših izpostavljenostih višji temperaturi pa je izražanje bilo nižje, kar so avtorji pripisovali upadu celične funkcije zaradi visokih temperatur. Že pri najkrajši izpostavljenosti (1 min) višji temperaturi je sistem podal robustni odziv.
Kot najbolj optimalna sistema sta se izkazala oba daljša konstrukta (vsebujeta vse domnevne elemente hse), saj so pri njima opazili močnejšo indukcijo in manjše puščanje promotorja v primerjavi s krajšim konstruktom.

== Temperaturno pogojena rast N crasse ==
Celulozni regulator 2 (CLR-2) je transkripcijski faktor, ki je ključen pri regulaciji celulazne aktivnosti N. crasse, saj je potreben za indukcijo ekspresije celulolitičnih genov. V industriji je pomembno nadzorovano izražanje CLR-2, s tem se na primer poveča proizvodnja bioetanola. Avtorji so pripravili sev N. crasse, pri katerem so zapis za CLR-2 postavili pod promotor hsp30 in opazovali rast celic pri različnih pogojih.
Najkrajši promotor hse30 vsebuje le dve od štirih domnevnih regij hse in se je zato izkazal kot najmanj optimalen sistem za uravnavanje transkripcije (glej Odziv hsp30 promotorja na toplotne dražljaje). Vseeno pa so ga avtorji pri tem eksperimentu uporabili zaradi njegove kratke dolžine (500 baznih parov). V N. crassi je namreč prisotna ponavljajoča inducirana mutacija (RIP), kot obrambni mehanizem za zmanjšanje aktivnosti in širjenja mobilnih genetskih elementov, ki pa je manj pogosta v krajših segmentih DNA.
Rezultati so pokazali, da se sev hsp300.5 kb:clr-2 ne razvija v tekočih gojiščih z Avicelom (kristalinična celuloza) pri normalni temperaturi (25°C). Vendar pa se po vsakodnevnih impulzih toplote (45°C) rast povrne in celo preseže WT sev plesni.

== Načrtovanje sintetičnega promotorja iz domnevnih cis regij hsp30 ==
Da bi uporabili vse domnevne hse regije, in hkrati znižali pogostost RIP-induciranih mutacij so avtorji načrtali 2 sintetična promotorja. Ocenili so minimalno dolžino bližnjega promotorja (okoli 250 bp) in mu dodali domnevne regije hse. S primerjavo promotorja hse30 s promotorji hse30 iz sorodnih organizmov N. crasse so identificirali še peto regijo hse, ki je prav tako ohranjena, in tudi njo vključili v konstrukt. Razlika med sintetičnima promoterjema je bila zgolj v dolžini vmesnikov med domnevnimi regulatornimi regijami hse.
Tudi oba sintetična promotorja sta izkazala dobro nastavljivost pri različnih toplotnih tretmajih, vendar sta oba prikazala relativno močno bazalno aktivnost. Je pa tovrstno puščanje promotorja velikokrat prisotno ob načrtovanju umetnih promotorjev [vir]. Vseeno pa sta se oba nova promotorja izkazala za bolj uporaben sistem nastavljivega izražanja od promotorjev hsp70 in hsp80, prav tako so opazili višje stopnje izražanja od najkrajše verzije promotorja hsp30. Zaradi velike ohranjenosti promotorja hsp30 bi podobni promotorji najverjetneje delovali tudi v ostalih askomicetah, kot na primer v biotehnološko pomembnih Aspergillus niger ali Trichoderma reesei.

== Zaključek ==
Sistem s finim uravnavanjem transkripcije preko toplotne indukcije predstavlja obetavno orodje za raziskave funkcije genov, pa tudi za biotehnološke aplikacije, kot so proizvodnja encimov, metabolitov ali drugih biološko pomembnih snovi. V primerjavi s kemično induciranimi sistemi se izkaže za lažje reverzibilen sistem, saj ni treba dodajati eksogenih sredstev, ki jih je težko odstraniti iz gojišča. Hkrati pa je enostaven za uporabo, sploh v primerjavi s svetlobno indukcijo, kjer je potreba po dobro definiranih laboratorijskih nastavitvah (temna soba). Vendar pa se pri toplotni indukciji pojavljajo potencialne težave oziroma omejitve, kot so stres za organizem ali neselektivna aktivacija genov [vir].
Ko so zapis za clr-2 postavili pod hse30 promotor, so avtorji (kljub izbiri neoptimalnega promotorja) prikazali možnost uporabe toplotno inducibilnega sistema za regulacijo izražanja pri želenih fenotipih. Ob nadaljnji optimizaciji procesa bi se celulazna aktivnost plesni dodatno povečala, kar odpira priložnost uporabe tovrstnih sistemov v industriji. Glavna ovira pri industrijski uporabi razgradnje celuloze so namreč visoki stroški proizvodnje encimov, kar tudi preprečuje nižje cene bioetanola [vir].

Seminarji SB 2022/23

2023-04-10T22:02:38Z

Lsegota:

V študijskem letu 2022/23 študentje pri Sintezni biologiji predstavljajo naslednje teme:

RAZISKOVALNI ČLANKI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Rudarjenje_in_uporaba_konstitutivnih_promotorjev_iz_Rhodosporidium_toruloides Rudarjenje in uporaba konstitutivnih promotorjev iz ''Rhodosporidium toruloides''] (Ana Babnik)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Biomolekularni_aktuatorji_za_gensko_selektivno_akusti%C4%8Dno_manipulacijo_celic Biomolekularni aktuatorji za gensko selektivno akustično manipulacijo celic] (Greta Junger)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/IN_VIVO_SAMOSESTAVLJENA_siRNA_KOT_NA%C4%8CIN_KOMBINIRANEGA_ZDRAVLJENJA_ULCEROZNEGA_KOLITISA#ZAKLJU.C4.8CEK In vivo samosestavljena siRNA kot način kombiniranega zdravljenja ulceroznega kolitisa] (Tjaša Kos)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Priprava_kompleta_orodij_za_zaznavanje_kvoruma_pri_cianobakterijah:_Razvoj_medceli%C4%8Dne_koordinacije_v_me%C5%A1anih_avtotrofno-heterotrofnih_skupnostih Priprava kompleta orodij za zaznavanje kvoruma pri cianobakterijah: Razvoj medcelične koordinacije v mešanih avtotrofno-heterotrofnih skupnostih] (Nuša Tkalec)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Razvoj_temperaturno_inducibilnega_transkripcijskega_reostata_pri_Neurospori_crassi Razvoj temperaturno inducibilnega transkripcijskega reostata pri ''Neurospori crassi''] (Luka Šegota)
NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/MonChassis MonChassis] (Nika Tomsič)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/FIAT_LUX FIAT LUX] (Neža Lanišek)

----

Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Povzetek je treba objaviti dva dni pred predstavitvijo do polnoči (za seminarje v sredo torej v ponedeljek). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo približno 5-minutna razprava.

Terminski razpored je razviden iz preglednice na strežniku Google Drive.

Kako je videti seznam seminarjev, lahko preverite pri lanskem letniku: [[Seminarji_SB_2021/22]].

Seminarji SB 2022/23

2023-04-10T22:01:32Z

Lsegota:

V študijskem letu 2022/23 študentje pri Sintezni biologiji predstavljajo naslednje teme:

RAZISKOVALNI ČLANKI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Rudarjenje_in_uporaba_konstitutivnih_promotorjev_iz_Rhodosporidium_toruloides Rudarjenje in uporaba konstitutivnih promotorjev iz ''Rhodosporidium toruloides''] (Ana Babnik)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Biomolekularni_aktuatorji_za_gensko_selektivno_akusti%C4%8Dno_manipulacijo_celic Biomolekularni aktuatorji za gensko selektivno akustično manipulacijo celic] (Greta Junger)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/IN_VIVO_SAMOSESTAVLJENA_siRNA_KOT_NA%C4%8CIN_KOMBINIRANEGA_ZDRAVLJENJA_ULCEROZNEGA_KOLITISA#ZAKLJU.C4.8CEK In vivo samosestavljena siRNA kot način kombiniranega zdravljenja ulceroznega kolitisa] (Tjaša Kos)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Priprava_kompleta_orodij_za_zaznavanje_kvoruma_pri_cianobakterijah:_Razvoj_medceli%C4%8Dne_koordinacije_v_me%C5%A1anih_avtotrofno-heterotrofnih_skupnostih Priprava kompleta orodij za zaznavanje kvoruma pri cianobakterijah: Razvoj medcelične koordinacije v mešanih avtotrofno-heterotrofnih skupnostih] (Nuša Tkalec)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Razvoj_temperaturno_inducibilnega_transkripcijskega_reostata_pri_Neurospori_crassi]
NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/MonChassis MonChassis] (Nika Tomsič)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/FIAT_LUX FIAT LUX] (Neža Lanišek)

----

Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Povzetek je treba objaviti dva dni pred predstavitvijo do polnoči (za seminarje v sredo torej v ponedeljek). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo približno 5-minutna razprava.

Terminski razpored je razviden iz preglednice na strežniku Google Drive.

Kako je videti seznam seminarjev, lahko preverite pri lanskem letniku: [[Seminarji_SB_2021/22]].

Razvoj temperaturno inducibilnega transkripcijskega reostata pri Neurospori crassi

2023-04-10T21:59:17Z

Lsegota: New page: Razvijanje temperaturno inducibilnega transkripcijskega reostata pri Neurospori crassi == Uvod == Neurospora crassa je rdeča plesen, ki spada v deblo askomicet. Zaradi svoje majhnosti, ...

Razvijanje temperaturno inducibilnega transkripcijskega reostata pri Neurospori crassi

== Uvod ==
Neurospora crassa je rdeča plesen, ki spada v deblo askomicet. Zaradi svoje majhnosti, enostavnosti vzgoje in opravljanja genskih analiz, je N. crassa pomemben modelni organizem za raziskovanje številnih bioloških procesov, vključno s celičnim ciklom, fotosintezo, biološkimi ritmi, staranjem in razvojem. Prav tako proizvaja encime, ki razgrajujejo celulozo, kar je koristno pri proizvodnji etanola iz celuloznih virov.
Proteini toplotnega šoka (hsp) sodelujejo pri odzivu celice na stresne pogoje, kot so visoke ali nizke temperature, oksidativni stres in izpostavljenost strupenim snovem. Delujejo kot šaperoni, njihova naloga pa je zaščititi celice pred poškodbami s preprečevanjem nepravilnega zvitja proteinov. Vendar pa področje uravnavanja izražanja genov, ki kodirajo hsp, še vedno ostaja delno neraziskano, zlasti v kontekstu modelnih glivnih organizmov, kot je N. crassa.
Faktorji toplotnega šoka (hsf) so pri stresnih pogojih aktivatorji transkripcije za proteine hsp. Po oligomerizaciji se faktorji hsf vežejo na DNA, in sicer na elemente toplotnega šoka (hse), ki so pri evkariontih relativno ohranjeni. V N. crassi so opisali tri gene hsp (hsp30, hsp70 in hsp80), ki se vsi izražajo pri visokih temperaturah, prav tako pa so pri vsakem odkrili domnevne cis regulatorne elemente.
V N. crassa so načrtali že mnogo promotorjev, ki se odzivajo na kemične signale (kot so glukoza, kininska kislina in baker), od fizično induciranih sistemov pa so razvili le takšnega, ki se odziva na svetlobo. Temperaturno induciran sistem, bi medtem omogočil zelo enostavno uravnavanje izražanja genov brez potrebe po dodajanju eksogenih kemikalij.

== Funkcijska analiza HSP promotorjev ==
V preteklih študijah so pri promotorju gena hsp30 definirali štiri regije hse, medtem ko so v promotorju hsp70 našli dve. Hsp70 ne vsebuje regulatornih elementov hse, vendar so opisane nekoliko različne cis regije, poimenovane kot elementi odziva na temperaturo (tre).
Da bi bolj okarakterizirali regulacijo genov so pripravili paleto konstruktov, ki so poleg bližnjega promotorja vsebovali različno dolge 5' regije. Različni konstrukti enakega gena pa so pri tem vsebovali raznoliko število regulatornih cis elementov. Za analizo so uporabili luciferazo iz kresničke z dodanim zaporedjem PEST (ki poveča razgradnjo proteina) kar skupaj tvori reporterski sistem za zaznavo transkripcije v realnem času. Pri sobni temperaturi so nagojili reporterske seve glive in jih v temi izpostavili enournemu toplotnemu šoku pri treh različnih temperaturah: dveh visokih (35 °C in 45 °C) in eni, ki je bila bližja laboratorijskim rastnim pogojem N. crasse (30 °C), in merili luminiscenco s CCD kamero.
Vsi polno dolgi konstrukti so izkazali podobno hiter in močen odziv na toplotni šok pri 45 °C, medtem ko je bil odziv pri 35 °C neprimerno nižji, pri 30 °C pa odziva sploh ni bilo. Skrajšani konstrukti so se pri hsp30 in hsp70 odzivali v skladu s številom domnevnih hse regij, ki so jih vsebovali. Medtem je konstrukt s polovičnim promotorjem hsp80 (ki je vseboval 5 od 7 domnevnih tre regij), pokazal kar 9-krat nižji odziv od konstrukta s polnim promotorjem, kar kaže na pomanjkljivo poznavanje regulacije promotorja hse80. Izmed treh genov so pri hsp30 opazili mnogo najnižje puščanje promotorja (pri 25 °C), zaradi česa so pri omenjenem genu opazili več kot 1000-kratno povečanje izražanja (razmerje med bazalnim vrhom in induciranim vrhom).
Hsp30 ima nižjo molekularno maso od ostalih dveh sorodnih proteinov (30 kDa proti 70 kDa / 80 kDa) na račun odsotnosti ATP hidrolazne domene. Zaradi tega so pri stresnih pogojih manjši hsp-ji prvi, ki posredujejo proti proteinski denaturaciji, kar korelira z opaženo visoko stopnjo povečanja izražanja pri hsp30.
Avtorji so hsp30 primerjali z drugimi znanimi inducibilnimi sistemi v N. crassa, kot sta promotor qa-2, ki se odziva na naraščajoče koncentracije kininske kisline in promotor vvd, ki se aktivira s svetlobo. Promotor hsp30 je imel najnižjo bazalno aktivnost in pa najvišjo aktivnost v induciranem stanjupotreboval pa je dlje časa za regeneracijo do minimuma aktivnosti po dražljaju (7 h) od vvd promotorja (4 h ).

== Odziv HSP30 promotorja na toplotne dražljaje ==
Zaradi najbolj robustnega odziva na toplotne dražljaje so avtorji za nadaljnje delo izbrali promotor hsp30. Zanimalo jih je promotorjev odziv na različno dolge toplotne šoke pri različnih temperaturah, zato so skonstruirali pristop, ki omogoča hitro in enostavno analizo.
Eksperiment so opravili v formatu pcr mikrotitrske plošče in testirali 3 različne promotorje hsp30 (en celoten in dva skrajšana). Pripravili so paleto različnih pogojev in ocenjevali odziv promotorja z merjenjem luminiscence. Vzorci so bili izpostavljeni šestim različnim temperaturam (v rangu od 34 °C do 46 °C), pri čem so toplotni dražljaji trajali 60, 30, 15, 5, in 1 min. V obzir pa je treba vzeti, da je zaradi relativno majhnega volumna gojišča (pcr mikrocentrifugirka), bila omejena količina dodanega medija in zato omejena rast plesni.
Konstrukti s promotorji hsp30 so se izkazali za izjemno nastavljive sisteme, saj se je stopnja odziva povečevala, ko se je zviševala temperatura, prav tako pa so opazili večji odziv, kjer je temperaturni dražljaj trajal dlje časa. Vendar pa je maksimalni odziv bil opažen pri 15 min, pri daljših izpostavljenostih višji temperaturi pa je izražanje bilo nižje, kar so avtorji pripisovali upadu celične funkcije zaradi visokih temperatur. Že pri najkrajši izpostavljenosti (1 min) višji temperaturi je sistem podal robustni odziv.
Kot najbolj optimalna sistema sta se izkazala oba daljša konstrukta (vsebujeta vse domnevne elemente hse), saj so pri njima opazili močnejšo indukcijo in manjše puščanje promotorja v primerjavi s krajšim konstruktom.

== Temperaturno pogojena rast N crasse ==
Celulozni regulator 2 (CLR-2) je transkripcijski faktor, ki je ključen pri regulaciji celulazne aktivnosti N. crasse, saj je potreben za indukcijo ekspresije celulolitičnih genov. V industriji je pomembno nadzorovano izražanje CLR-2, s tem se na primer poveča proizvodnja bioetanola. Avtorji so pripravili sev N. crasse, pri katerem so zapis za CLR-2 postavili pod promotor hsp30 in opazovali rast celic pri različnih pogojih.
Najkrajši promotor hse30 vsebuje le dve od štirih domnevnih regij hse in se je zato izkazal kot najmanj optimalen sistem za uravnavanje transkripcije (glej Odziv hsp30 promotorja na toplotne dražljaje). Vseeno pa so ga avtorji pri tem eksperimentu uporabili zaradi njegove kratke dolžine (500 baznih parov). V N. crassi je namreč prisotna ponavljajoča inducirana mutacija (RIP), kot obrambni mehanizem za zmanjšanje aktivnosti in širjenja mobilnih genetskih elementov, ki pa je manj pogosta v krajših segmentih DNA.
Rezultati so pokazali, da se sev hsp300.5 kb:clr-2 ne razvija v tekočih gojiščih z Avicelom (kristalinična celuloza) pri normalni temperaturi (25°C). Vendar pa se po vsakodnevnih impulzih toplote (45°C) rast povrne in celo preseže WT sev plesni.

== Načrtovanje sintetičnega promotorja iz domnevnih cis regij hsp30 ==
Da bi uporabili vse domnevne hse regije, in hkrati znižali pogostost RIP-induciranih mutacij so avtorji načrtali 2 sintetična promotorja. Ocenili so minimalno dolžino bližnjega promotorja (okoli 250 bp) in mu dodali domnevne regije hse. S primerjavo promotorja hse30 s promotorji hse30 iz sorodnih organizmov N. crasse so identificirali še peto regijo hse, ki je prav tako ohranjena, in tudi njo vključili v konstrukt. Razlika med sintetičnima promoterjema je bila zgolj v dolžini vmesnikov med domnevnimi regulatornimi regijami hse.
Tudi oba sintetična promotorja sta izkazala dobro nastavljivost pri različnih toplotnih tretmajih, vendar sta oba prikazala relativno močno bazalno aktivnost. Je pa tovrstno puščanje promotorja velikokrat prisotno ob načrtovanju umetnih promotorjev [vir]. Vseeno pa sta se oba nova promotorja izkazala za bolj uporaben sistem nastavljivega izražanja od promotorjev hsp70 in hsp80, prav tako so opazili višje stopnje izražanja od najkrajše verzije promotorja hsp30. Zaradi velike ohranjenosti promotorja hsp30 bi podobni promotorji najverjetneje delovali tudi v ostalih askomicetah, kot na primer v biotehnološko pomembnih Aspergillus niger ali Trichoderma reesei.

== Zaključek ==
Sistem s finim uravnavanjem transkripcije preko toplotne indukcije predstavlja obetavno orodje za raziskave funkcije genov, pa tudi za biotehnološke aplikacije, kot so proizvodnja encimov, metabolitov ali drugih biološko pomembnih snovi. V primerjavi s kemično induciranimi sistemi se izkaže za lažje reverzibilen sistem, saj ni treba dodajati eksogenih sredstev, ki jih je težko odstraniti iz gojišča. Hkrati pa je enostaven za uporabo, sploh v primerjavi s svetlobno indukcijo, kjer je potreba po dobro definiranih laboratorijskih nastavitvah (temna soba). Vendar pa se pri toplotni indukciji pojavljajo potencialne težave oziroma omejitve, kot so stres za organizem ali neselektivna aktivacija genov [vir].
Ko so zapis za clr-2 postavili pod hse30 promotor, so avtorji (kljub izbiri neoptimalnega promotorja) prikazali možnost uporabe toplotno inducibilnega sistema za regulacijo izražanja pri želenih fenotipih. Ob nadaljnji optimizaciji procesa bi se celulazna aktivnost plesni dodatno povečala, kar odpira priložnost uporabe tovrstnih sistemov v industriji. Glavna ovira pri industrijski uporabi razgradnje celuloze so namreč visoki stroški proizvodnje encimov, kar tudi preprečuje nižje cene bioetanola [vir].

Razvijanje temperaturno inducibilnega transkripcijskega reostata pri Neurospori crassi

2023-04-10T21:54:49Z

Lsegota:

Razvijanje temperaturno inducibilnega transkripcijskega reostata pri Neurospori crassi

== Uvod ==
Neurospora crassa je rdeča plesen, ki spada v deblo askomicet. Zaradi svoje majhnosti, enostavnosti vzgoje in opravljanja genskih analiz, je N. crassa pomemben modelni organizem za raziskovanje številnih bioloških procesov, vključno s celičnim ciklom, fotosintezo, biološkimi ritmi, staranjem in razvojem. Prav tako proizvaja encime, ki razgrajujejo celulozo, kar je koristno pri proizvodnji etanola iz celuloznih virov.
Proteini toplotnega šoka (hsp) sodelujejo pri odzivu celice na stresne pogoje, kot so visoke ali nizke temperature, oksidativni stres in izpostavljenost strupenim snovem. Delujejo kot šaperoni, njihova naloga pa je zaščititi celice pred poškodbami s preprečevanjem nepravilnega zvitja proteinov. Vendar pa področje uravnavanja izražanja genov, ki kodirajo hsp, še vedno ostaja delno neraziskano, zlasti v kontekstu modelnih glivnih organizmov, kot je N. crassa.
Faktorji toplotnega šoka (hsf) so pri stresnih pogojih aktivatorji transkripcije za proteine hsp. Po oligomerizaciji se faktorji hsf vežejo na DNA, in sicer na elemente toplotnega šoka (hse), ki so pri evkariontih relativno ohranjeni. V N. crassi so opisali tri gene hsp (hsp30, hsp70 in hsp80), ki se vsi izražajo pri visokih temperaturah, prav tako pa so pri vsakem odkrili domnevne cis regulatorne elemente.
V N. crassa so načrtali že mnogo promotorjev, ki se odzivajo na kemične signale (kot so glukoza, kininska kislina in baker), od fizično induciranih sistemov pa so razvili le takšnega, ki se odziva na svetlobo. Temperaturno induciran sistem, bi medtem omogočil zelo enostavno uravnavanje izražanja genov brez potrebe po dodajanju eksogenih kemikalij.

== Funkcijska analiza HSP promotorjev ==
V preteklih študijah so pri promotorju gena hsp30 definirali štiri regije hse, medtem ko so v promotorju hsp70 našli dve. Hsp70 ne vsebuje regulatornih elementov hse, vendar so opisane nekoliko različne cis regije, poimenovane kot elementi odziva na temperaturo (tre).
Da bi bolj okarakterizirali regulacijo genov so pripravili paleto konstruktov, ki so poleg bližnjega promotorja vsebovali različno dolge 5' regije. Različni konstrukti enakega gena pa so pri tem vsebovali raznoliko število regulatornih cis elementov. Za analizo so uporabili luciferazo iz kresničke z dodanim zaporedjem PEST (ki poveča razgradnjo proteina) kar skupaj tvori reporterski sistem za zaznavo transkripcije v realnem času. Pri sobni temperaturi so nagojili reporterske seve glive in jih v temi izpostavili enournemu toplotnemu šoku pri treh različnih temperaturah: dveh visokih (35 °C in 45 °C) in eni, ki je bila bližja laboratorijskim rastnim pogojem N. crasse (30 °C), in merili luminiscenco s CCD kamero.
Vsi polno dolgi konstrukti so izkazali podobno hiter in močen odziv na toplotni šok pri 45 °C, medtem ko je bil odziv pri 35 °C neprimerno nižji, pri 30 °C pa odziva sploh ni bilo. Skrajšani konstrukti so se pri hsp30 in hsp70 odzivali v skladu s številom domnevnih hse regij, ki so jih vsebovali. Medtem je konstrukt s polovičnim promotorjem hsp80 (ki je vseboval 5 od 7 domnevnih tre regij), pokazal kar 9-krat nižji odziv od konstrukta s polnim promotorjem, kar kaže na pomanjkljivo poznavanje regulacije promotorja hse80. Izmed treh genov so pri hsp30 opazili mnogo najnižje puščanje promotorja (pri 25 °C), zaradi česa so pri omenjenem genu opazili več kot 1000-kratno povečanje izražanja (razmerje med bazalnim vrhom in induciranim vrhom).
Hsp30 ima nižjo molekularno maso od ostalih dveh sorodnih proteinov (30 kDa proti 70 kDa / 80 kDa) na račun odsotnosti ATP hidrolazne domene. Zaradi tega so pri stresnih pogojih manjši hsp-ji prvi, ki posredujejo proti proteinski denaturaciji, kar korelira z opaženo visoko stopnjo povečanja izražanja pri hsp30.
Avtorji so hsp30 primerjali z drugimi znanimi inducibilnimi sistemi v N. crassa, kot sta promotor qa-2, ki se odziva na naraščajoče koncentracije kininske kisline in promotor vvd, ki se aktivira s svetlobo. Promotor hsp30 je imel najnižjo bazalno aktivnost in pa najvišjo aktivnost v induciranem stanjupotreboval pa je dlje časa za regeneracijo do minimuma aktivnosti po dražljaju (7 h) od vvd promotorja (4 h ).

== Odziv HSP30 promotorja na toplotne dražljaje ==
Zaradi najbolj robustnega odziva na toplotne dražljaje so avtorji za nadaljnje delo izbrali promotor hsp30. Zanimalo jih je promotorjev odziv na različno dolge toplotne šoke pri različnih temperaturah, zato so skonstruirali pristop, ki omogoča hitro in enostavno analizo.
Eksperiment so opravili v formatu pcr mikrotitrske plošče in testirali 3 različne promotorje hsp30 (en celoten in dva skrajšana). Pripravili so paleto različnih pogojev in ocenjevali odziv promotorja z merjenjem luminiscence. Vzorci so bili izpostavljeni šestim različnim temperaturam (v rangu od 34 °C do 46 °C), pri čem so toplotni dražljaji trajali 60, 30, 15, 5, in 1 min. V obzir pa je treba vzeti, da je zaradi relativno majhnega volumna gojišča (pcr mikrocentrifugirka), bila omejena količina dodanega medija in zato omejena rast plesni.
Konstrukti s promotorji hsp30 so se izkazali za izjemno nastavljive sisteme, saj se je stopnja odziva povečevala, ko se je zviševala temperatura, prav tako pa so opazili večji odziv, kjer je temperaturni dražljaj trajal dlje časa. Vendar pa je maksimalni odziv bil opažen pri 15 min, pri daljših izpostavljenostih višji temperaturi pa je izražanje bilo nižje, kar so avtorji pripisovali upadu celične funkcije zaradi visokih temperatur. Že pri najkrajši izpostavljenosti (1 min) višji temperaturi je sistem podal robustni odziv.
Kot najbolj optimalna sistema sta se izkazala oba daljša konstrukta (vsebujeta vse domnevne elemente hse), saj so pri njima opazili močnejšo indukcijo in manjše puščanje promotorja v primerjavi s krajšim konstruktom.

== Temperaturno pogojena rast N crasse ==
Celulozni regulator 2 (CLR-2) je transkripcijski faktor, ki je ključen pri regulaciji celulazne aktivnosti N. crasse, saj je potreben za indukcijo ekspresije celulolitičnih genov. V industriji je pomembno nadzorovano izražanje CLR-2, s tem se na primer poveča proizvodnja bioetanola. Avtorji so pripravili sev N. crasse, pri katerem so zapis za CLR-2 postavili pod promotor hsp30 in opazovali rast celic pri različnih pogojih.
Najkrajši promotor hse30 vsebuje le dve od štirih domnevnih regij hse in se je zato izkazal kot najmanj optimalen sistem za uravnavanje transkripcije (glej Odziv hsp30 promotorja na toplotne dražljaje). Vseeno pa so ga avtorji pri tem eksperimentu uporabili zaradi njegove kratke dolžine (500 baznih parov). V N. crassi je namreč prisotna ponavljajoča inducirana mutacija (RIP), kot obrambni mehanizem za zmanjšanje aktivnosti in širjenja mobilnih genetskih elementov, ki pa je manj pogosta v krajših segmentih DNA.
Rezultati so pokazali, da se sev hsp300.5 kb:clr-2 ne razvija v tekočih gojiščih z Avicelom (kristalinična celuloza) pri normalni temperaturi (25°C). Vendar pa se po vsakodnevnih impulzih toplote (45°C) rast povrne in celo preseže WT sev plesni.

== Načrtovanje sintetičnega promotorja iz domnevnih cis regij hsp30 ==
Da bi uporabili vse domnevne hse regije, in hkrati znižali pogostost RIP-induciranih mutacij so avtorji načrtali 2 sintetična promotorja. Ocenili so minimalno dolžino bližnjega promotorja (okoli 250 bp) in mu dodali domnevne regije hse. S primerjavo promotorja hse30 s promotorji hse30 iz sorodnih organizmov N. crasse so identificirali še peto regijo hse, ki je prav tako ohranjena, in tudi njo vključili v konstrukt. Razlika med sintetičnima promoterjema je bila zgolj v dolžini vmesnikov med domnevnimi regulatornimi regijami hse.
Tudi oba sintetična promotorja sta izkazala dobro nastavljivost pri različnih toplotnih tretmajih, vendar sta oba prikazala relativno močno bazalno aktivnost. Je pa tovrstno puščanje promotorja velikokrat prisotno ob načrtovanju umetnih promotorjev [vir]. Vseeno pa sta se oba nova promotorja izkazala za bolj uporaben sistem nastavljivega izražanja od promotorjev hsp70 in hsp80, prav tako so opazili višje stopnje izražanja od najkrajše verzije promotorja hsp30. Zaradi velike ohranjenosti promotorja hsp30 bi podobni promotorji najverjetneje delovali tudi v ostalih askomicetah, kot na primer v biotehnološko pomembnih Aspergillus niger ali Trichoderma reesei.

== Zaključek ==
Sistem s finim uravnavanjem transkripcije preko toplotne indukcije predstavlja obetavno orodje za raziskave funkcije genov, pa tudi za biotehnološke aplikacije, kot so proizvodnja encimov, metabolitov ali drugih biološko pomembnih snovi. V primerjavi s kemično induciranimi sistemi se izkaže za lažje reverzibilen sistem, saj ni treba dodajati eksogenih sredstev, ki jih je težko odstraniti iz gojišča. Hkrati pa je enostaven za uporabo, sploh v primerjavi s svetlobno indukcijo, kjer je potreba po dobro definiranih laboratorijskih nastavitvah (temna soba). Vendar pa se pri toplotni indukciji pojavljajo potencialne težave oziroma omejitve, kot so stres za organizem ali neselektivna aktivacija genov [vir].
Ko so zapis za clr-2 postavili pod hse30 promotor, so avtorji (kljub izbiri neoptimalnega promotorja) prikazali možnost uporabe toplotno inducibilnega sistema za regulacijo izražanja pri želenih fenotipih. Ob nadaljnji optimizaciji procesa bi se celulazna aktivnost plesni dodatno povečala, kar odpira priložnost uporabe tovrstnih sistemov v industriji. Glavna ovira pri industrijski uporabi razgradnje celuloze so namreč visoki stroški proizvodnje encimov, kar tudi preprečuje nižje cene bioetanola [vir].

Razvijanje temperaturno inducibilnega transkripcijskega reostata pri Neurospori crassi

2023-04-10T21:53:02Z

Lsegota:

Razvijanje temperaturno inducibilnega transkripcijskega reostata pri Neurospori crassi

== Uvod ==

Neurospora crassa je rdeča plesen, ki spada v deblo askomicet. Zaradi svoje majhnosti, enostavnosti vzgoje in opravljanja genskih analiz, je N. crassa pomemben modelni organizem za raziskovanje številnih bioloških procesov, vključno s celičnim ciklom, fotosintezo, biološkimi ritmi, staranjem in razvojem. Prav tako proizvaja encime, ki razgrajujejo celulozo, kar je koristno pri proizvodnji etanola iz celuloznih virov.
Proteini toplotnega šoka (hsp) sodelujejo pri odzivu celice na stresne pogoje, kot so visoke ali nizke temperature, oksidativni stres in izpostavljenost strupenim snovem. Delujejo kot šaperoni, njihova naloga pa je zaščititi celice pred poškodbami s preprečevanjem nepravilnega zvitja proteinov. Vendar pa področje uravnavanja izražanja genov, ki kodirajo hsp, še vedno ostaja delno neraziskano, zlasti v kontekstu modelnih glivnih organizmov, kot je N. crassa.
Faktorji toplotnega šoka (hsf) so pri stresnih pogojih aktivatorji transkripcije za proteine hsp. Po oligomerizaciji se faktorji hsf vežejo na DNA, in sicer na elemente toplotnega šoka (hse), ki so pri evkariontih relativno ohranjeni. V N. crassi so opisali tri gene hsp (hsp30, hsp70 in hsp80), ki se vsi izražajo pri visokih temperaturah, prav tako pa so pri vsakem odkrili domnevne cis regulatorne elemente.
V N. crassa so načrtali že mnogo promotorjev, ki se odzivajo na kemične signale (kot so glukoza, kininska kislina in baker), od fizično induciranih sistemov pa so razvili le takšnega, ki se odziva na svetlobo. Temperaturno induciran sistem, bi medtem omogočil zelo enostavno uravnavanje izražanja genov brez potrebe po dodajanju eksogenih kemikalij.

== Funkcijska analiza HSP promotorjev ==

V preteklih študijah so pri promotorju gena hsp30 definirali štiri regije hse, medtem ko so v promotorju hsp70 našli dve. Hsp70 ne vsebuje regulatornih elementov hse, vendar so opisane nekoliko različne cis regije, poimenovane kot elementi odziva na temperaturo (tre).
Da bi bolj okarakterizirali regulacijo genov so pripravili paleto konstruktov, ki so poleg bližnjega promotorja vsebovali različno dolge 5' regije. Različni konstrukti enakega gena pa so pri tem vsebovali raznoliko število regulatornih cis elementov. Za analizo so uporabili luciferazo iz kresničke z dodanim zaporedjem PEST (ki poveča razgradnjo proteina) kar skupaj tvori reporterski sistem za zaznavo transkripcije v realnem času. Pri sobni temperaturi so nagojili reporterske seve glive in jih v temi izpostavili enournemu toplotnemu šoku pri treh različnih temperaturah: dveh visokih (35 °C in 45 °C) in eni, ki je bila bližja laboratorijskim rastnim pogojem N. crasse (30 °C), in merili luminiscenco s CCD kamero.
Vsi polno dolgi konstrukti so izkazali podobno hiter in močen odziv na toplotni šok pri 45 °C, medtem ko je bil odziv pri 35 °C neprimerno nižji, pri 30 °C pa odziva sploh ni bilo. Skrajšani konstrukti so se pri hsp30 in hsp70 odzivali v skladu s številom domnevnih hse regij, ki so jih vsebovali. Medtem je konstrukt s polovičnim promotorjem hsp80 (ki je vseboval 5 od 7 domnevnih tre regij), pokazal kar 9-krat nižji odziv od konstrukta s polnim promotorjem, kar kaže na pomanjkljivo poznavanje regulacije promotorja hse80. Izmed treh genov so pri hsp30 opazili mnogo najnižje puščanje promotorja (pri 25 °C), zaradi česa so pri omenjenem genu opazili več kot 1000-kratno povečanje izražanja (razmerje med bazalnim vrhom in induciranim vrhom).
Hsp30 ima nižjo molekularno maso od ostalih dveh sorodnih proteinov (30 kDa proti 70 kDa / 80 kDa) na račun odsotnosti ATP hidrolazne domene. Zaradi tega so pri stresnih pogojih manjši hsp-ji prvi, ki posredujejo proti proteinski denaturaciji, kar korelira z opaženo visoko stopnjo povečanja izražanja pri hsp30.
Avtorji so hsp30 primerjali z drugimi znanimi inducibilnimi sistemi v N. crassa, kot sta promotor qa-2, ki se odziva na naraščajoče koncentracije kininske kisline in promotor vvd, ki se aktivira s svetlobo. Promotor hsp30 je imel najnižjo bazalno aktivnost in pa najvišjo aktivnost v induciranem stanjupotreboval pa je dlje časa za regeneracijo do minimuma aktivnosti po dražljaju (7 h) od vvd promotorja (4 h ).

== Odziv HSP30 promotorja na toplotne dražljaje ==

Zaradi najbolj robustnega odziva na toplotne dražljaje so avtorji za nadaljnje delo izbrali promotor hsp30. Zanimalo jih je promotorjev odziv na različno dolge toplotne šoke pri različnih temperaturah, zato so skonstruirali pristop, ki omogoča hitro in enostavno analizo.
Eksperiment so opravili v formatu pcr mikrotitrske plošče in testirali 3 različne promotorje hsp30 (en celoten in dva skrajšana). Pripravili so paleto različnih pogojev in ocenjevali odziv promotorja z merjenjem luminiscence. Vzorci so bili izpostavljeni šestim različnim temperaturam (v rangu od 34 °C do 46 °C), pri čem so toplotni dražljaji trajali 60, 30, 15, 5, in 1 min. V obzir pa je treba vzeti, da je zaradi relativno majhnega volumna gojišča (pcr mikrocentrifugirka), bila omejena količina dodanega medija in zato omejena rast plesni.
Konstrukti s promotorji hsp30 so se izkazali za izjemno nastavljive sisteme, saj se je stopnja odziva povečevala, ko se je zviševala temperatura, prav tako pa so opazili večji odziv, kjer je temperaturni dražljaj trajal dlje časa. Vendar pa je maksimalni odziv bil opažen pri 15 min, pri daljših izpostavljenostih višji temperaturi pa je izražanje bilo nižje, kar so avtorji pripisovali upadu celične funkcije zaradi visokih temperatur. Že pri najkrajši izpostavljenosti (1 min) višji temperaturi je sistem podal robustni odziv.
Kot najbolj optimalna sistema sta se izkazala oba daljša konstrukta (vsebujeta vse domnevne elemente hse), saj so pri njima opazili močnejšo indukcijo in manjše puščanje promotorja v primerjavi s krajšim konstruktom.

== Temperaturno pogojena rast N crasse ==

Celulozni regulator 2 (CLR-2) je transkripcijski faktor, ki je ključen pri regulaciji celulazne aktivnosti N. crasse, saj je potreben za indukcijo ekspresije celulolitičnih genov. V industriji je pomembno nadzorovano izražanje CLR-2, s tem se na primer poveča proizvodnja bioetanola. Avtorji so pripravili sev N. crasse, pri katerem so zapis za CLR-2 postavili pod promotor hsp30 in opazovali rast celic pri različnih pogojih.
Najkrajši promotor hse30 vsebuje le dve od štirih domnevnih regij hse in se je zato izkazal kot najmanj optimalen sistem za uravnavanje transkripcije (glej Odziv hsp30 promotorja na toplotne dražljaje). Vseeno pa so ga avtorji pri tem eksperimentu uporabili zaradi njegove kratke dolžine (500 baznih parov). V N. crassi je namreč prisotna ponavljajoča inducirana mutacija (RIP), kot obrambni mehanizem za zmanjšanje aktivnosti in širjenja mobilnih genetskih elementov, ki pa je manj pogosta v krajših segmentih DNA.
Rezultati so pokazali, da se sev hsp300.5 kb:clr-2 ne razvija v tekočih gojiščih z Avicelom (kristalinična celuloza) pri normalni temperaturi (25°C). Vendar pa se po vsakodnevnih impulzih toplote (45°C) rast povrne in celo preseže WT sev plesni.

== Načrtovanje sintetičnega promotorja iz domnevnih cis regij hsp30 ==

Da bi uporabili vse domnevne hse regije, in hkrati znižali pogostost RIP-induciranih mutacij so avtorji načrtali 2 sintetična promotorja. Ocenili so minimalno dolžino bližnjega promotorja (okoli 250 bp) in mu dodali domnevne regije hse. S primerjavo promotorja hse30 s promotorji hse30 iz sorodnih organizmov N. crasse so identificirali še peto regijo hse, ki je prav tako ohranjena, in tudi njo vključili v konstrukt. Razlika med sintetičnima promoterjema je bila zgolj v dolžini vmesnikov med domnevnimi regulatornimi regijami hse.
Tudi oba sintetična promotorja sta izkazala dobro nastavljivost pri različnih toplotnih tretmajih, vendar sta oba prikazala relativno močno bazalno aktivnost. Je pa tovrstno puščanje promotorja velikokrat prisotno ob načrtovanju umetnih promotorjev [vir]. Vseeno pa sta se oba nova promotorja izkazala za bolj uporaben sistem nastavljivega izražanja od promotorjev hsp70 in hsp80, prav tako so opazili višje stopnje izražanja od najkrajše verzije promotorja hsp30. Zaradi velike ohranjenosti promotorja hsp30 bi podobni promotorji najverjetneje delovali tudi v ostalih askomicetah, kot na primer v biotehnološko pomembnih Aspergillus niger ali Trichoderma reesei.

== Zaključek ==

Sistem s finim uravnavanjem transkripcije preko toplotne indukcije predstavlja obetavno orodje za raziskave funkcije genov, pa tudi za biotehnološke aplikacije, kot so proizvodnja encimov, metabolitov ali drugih biološko pomembnih snovi. V primerjavi s kemično induciranimi sistemi se izkaže za lažje reverzibilen sistem, saj ni treba dodajati eksogenih sredstev, ki jih je težko odstraniti iz gojišča. Hkrati pa je enostaven za uporabo, sploh v primerjavi s svetlobno indukcijo, kjer je potreba po dobro definiranih laboratorijskih nastavitvah (temna soba). Vendar pa se pri toplotni indukciji pojavljajo potencialne težave oziroma omejitve, kot so stres za organizem ali neselektivna aktivacija genov [vir].
Ko so zapis za clr-2 postavili pod hse30 promotor, so avtorji (kljub izbiri neoptimalnega promotorja) prikazali možnost uporabe toplotno inducibilnega sistema za regulacijo izražanja pri želenih fenotipih. Ob nadaljnji optimizaciji procesa bi se celulazna aktivnost plesni dodatno povečala, kar odpira priložnost uporabe tovrstnih sistemov v industriji. Glavna ovira pri industrijski uporabi razgradnje celuloze so namreč visoki stroški proizvodnje encimov, kar tudi preprečuje nižje cene bioetanola [vir].

Razvijanje temperaturno inducibilnega transkripcijskega reostata pri Neurospori crassi

2023-04-10T21:52:15Z

Lsegota:

Razvijanje temperaturno inducibilnega transkripcijskega reostata pri Neurospori crassi

== Uvod ==

Neurospora crassa je rdeča plesen, ki spada v deblo askomicet. Zaradi svoje majhnosti, enostavnosti vzgoje in opravljanja genskih analiz, je N. crassa pomemben modelni organizem za raziskovanje številnih bioloških procesov, vključno s celičnim ciklom, fotosintezo, biološkimi ritmi, staranjem in razvojem. Prav tako proizvaja encime, ki razgrajujejo celulozo, kar je koristno pri proizvodnji etanola iz celuloznih virov.
Proteini toplotnega šoka (hsp) sodelujejo pri odzivu celice na stresne pogoje, kot so visoke ali nizke temperature, oksidativni stres in izpostavljenost strupenim snovem. Delujejo kot šaperoni, njihova naloga pa je zaščititi celice pred poškodbami s preprečevanjem nepravilnega zvitja proteinov. Vendar pa področje uravnavanja izražanja genov, ki kodirajo hsp, še vedno ostaja delno neraziskano, zlasti v kontekstu modelnih glivnih organizmov, kot je N. crassa.
Faktorji toplotnega šoka (hsf) so pri stresnih pogojih aktivatorji transkripcije za proteine hsp. Po oligomerizaciji se faktorji hsf vežejo na DNA, in sicer na elemente toplotnega šoka (hse), ki so pri evkariontih relativno ohranjeni. V N. crassi so opisali tri gene hsp (hsp30, hsp70 in hsp80), ki se vsi izražajo pri visokih temperaturah, prav tako pa so pri vsakem odkrili domnevne cis regulatorne elemente.
V N. crassa so načrtali že mnogo promotorjev, ki se odzivajo na kemične signale (kot so glukoza, kininska kislina in baker), od fizično induciranih sistemov pa so razvili le takšnega, ki se odziva na svetlobo. Temperaturno induciran sistem, bi medtem omogočil zelo enostavno uravnavanje izražanja genov brez potrebe po dodajanju eksogenih kemikalij.

== Funkcijska analiza HSP promotorjev ==

V preteklih študijah so pri promotorju gena hsp30 definirali štiri regije hse, medtem ko so v promotorju hsp70 našli dve. Hsp70 ne vsebuje regulatornih elementov hse, vendar so opisane nekoliko različne cis regije, poimenovane kot elementi odziva na temperaturo (tre).
Da bi bolj okarakterizirali regulacijo genov so pripravili paleto konstruktov, ki so poleg bližnjega promotorja vsebovali različno dolge 5' regije. Različni konstrukti enakega gena pa so pri tem vsebovali raznoliko število regulatornih cis elementov. Za analizo so uporabili luciferazo iz kresničke z dodanim zaporedjem PEST (ki poveča razgradnjo proteina) kar skupaj tvori reporterski sistem za zaznavo transkripcije v realnem času. Pri sobni temperaturi so nagojili reporterske seve glive in jih v temi izpostavili enournemu toplotnemu šoku pri treh različnih temperaturah: dveh visokih (35 °C in 45 °C) in eni, ki je bila bližja laboratorijskim rastnim pogojem N. crasse (30 °C), in merili luminiscenco s CCD kamero.
Vsi polno dolgi konstrukti so izkazali podobno hiter in močen odziv na toplotni šok pri 45 °C, medtem ko je bil odziv pri 35 °C neprimerno nižji, pri 30 °C pa odziva sploh ni bilo. Skrajšani konstrukti so se pri hsp30 in hsp70 odzivali v skladu s številom domnevnih hse regij, ki so jih vsebovali. Medtem je konstrukt s polovičnim promotorjem hsp80 (ki je vseboval 5 od 7 domnevnih tre regij), pokazal kar 9-krat nižji odziv od konstrukta s polnim promotorjem, kar kaže na pomanjkljivo poznavanje regulacije promotorja hse80. Izmed treh genov so pri hsp30 opazili mnogo najnižje puščanje promotorja (pri 25 °C), zaradi česa so pri omenjenem genu opazili več kot 1000-kratno povečanje izražanja (razmerje med bazalnim vrhom in induciranim vrhom).
Hsp30 ima nižjo molekularno maso od ostalih dveh sorodnih proteinov (30 kDa proti 70 kDa / 80 kDa) na račun odsotnosti ATP hidrolazne domene. Zaradi tega so pri stresnih pogojih manjši hsp-ji prvi, ki posredujejo proti proteinski denaturaciji, kar korelira z opaženo visoko stopnjo povečanja izražanja pri hsp30.
Avtorji so hsp30 primerjali z drugimi znanimi inducibilnimi sistemi v N. crassa, kot sta promotor qa-2, ki se odziva na naraščajoče koncentracije kininske kisline in promotor vvd, ki se aktivira s svetlobo. Promotor hsp30 je imel najnižjo bazalno aktivnost in pa najvišjo aktivnost v induciranem stanjupotreboval pa je dlje časa za regeneracijo do minimuma aktivnosti po dražljaju (7 h) od vvd promotorja (4 h ).

== Odziv HSP30 promotorja na toplotne dražljaje ==

Zaradi najbolj robustnega odziva na toplotne dražljaje so avtorji za nadaljnje delo izbrali promotor hsp30. Zanimalo jih je promotorjev odziv na različno dolge toplotne šoke pri različnih temperaturah, zato so skonstruirali pristop, ki omogoča hitro in enostavno analizo.
Eksperiment so opravili v formatu pcr mikrotitrske plošče in testirali 3 različne promotorje hsp30 (en celoten in dva skrajšana). Pripravili so paleto različnih pogojev in ocenjevali odziv promotorja z merjenjem luminiscence. Vzorci so bili izpostavljeni šestim različnim temperaturam (v rangu od 34 °C do 46 °C), pri čem so toplotni dražljaji trajali 60, 30, 15, 5, in 1 min. V obzir pa je treba vzeti, da je zaradi relativno majhnega volumna gojišča (pcr mikrocentrifugirka), bila omejena količina dodanega medija in zato omejena rast plesni.
Konstrukti s promotorji hsp30 so se izkazali za izjemno nastavljive sisteme, saj se je stopnja odziva povečevala, ko se je zviševala temperatura, prav tako pa so opazili večji odziv, kjer je temperaturni dražljaj trajal dlje časa. Vendar pa je maksimalni odziv bil opažen pri 15 min, pri daljših izpostavljenostih višji temperaturi pa je izražanje bilo nižje, kar so avtorji pripisovali upadu celične funkcije zaradi visokih temperatur. Že pri najkrajši izpostavljenosti (1 min) višji temperaturi je sistem podal robustni odziv.
Kot najbolj optimalna sistema sta se izkazala oba daljša konstrukta (vsebujeta vse domnevne elemente hse), saj so pri njima opazili močnejšo indukcijo in manjše puščanje promotorja v primerjavi s krajšim konstruktom.
Temperaturno pogojena rast N crasse
Celulozni regulator 2 (CLR-2) je transkripcijski faktor, ki je ključen pri regulaciji celulazne aktivnosti N. crasse, saj je potreben za indukcijo ekspresije celulolitičnih genov. V industriji je pomembno nadzorovano izražanje CLR-2, s tem se na primer poveča proizvodnja bioetanola. Avtorji so pripravili sev N. crasse, pri katerem so zapis za CLR-2 postavili pod promotor hsp30 in opazovali rast celic pri različnih pogojih.
Najkrajši promotor hse30 vsebuje le dve od štirih domnevnih regij hse in se je zato izkazal kot najmanj optimalen sistem za uravnavanje transkripcije (glej Odziv hsp30 promotorja na toplotne dražljaje). Vseeno pa so ga avtorji pri tem eksperimentu uporabili zaradi njegove kratke dolžine (500 baznih parov). V N. crassi je namreč prisotna ponavljajoča inducirana mutacija (RIP), kot obrambni mehanizem za zmanjšanje aktivnosti in širjenja mobilnih genetskih elementov, ki pa je manj pogosta v krajših segmentih DNA.
Rezultati so pokazali, da se sev hsp300.5 kb:clr-2 ne razvija v tekočih gojiščih z Avicelom (kristalinična celuloza) pri normalni temperaturi (25°C). Vendar pa se po vsakodnevnih impulzih toplote (45°C) rast povrne in celo preseže WT sev plesni.
Načrtovanje sintetičnega promotorja iz domnevnih cis regij hsp30
Da bi uporabili vse domnevne hse regije, in hkrati znižali pogostost RIP-induciranih mutacij so avtorji načrtali 2 sintetična promotorja. Ocenili so minimalno dolžino bližnjega promotorja (okoli 250 bp) in mu dodali domnevne regije hse. S primerjavo promotorja hse30 s promotorji hse30 iz sorodnih organizmov N. crasse so identificirali še peto regijo hse, ki je prav tako ohranjena, in tudi njo vključili v konstrukt. Razlika med sintetičnima promoterjema je bila zgolj v dolžini vmesnikov med domnevnimi regulatornimi regijami hse.
Tudi oba sintetična promotorja sta izkazala dobro nastavljivost pri različnih toplotnih tretmajih, vendar sta oba prikazala relativno močno bazalno aktivnost. Je pa tovrstno puščanje promotorja velikokrat prisotno ob načrtovanju umetnih promotorjev [vir]. Vseeno pa sta se oba nova promotorja izkazala za bolj uporaben sistem nastavljivega izražanja od promotorjev hsp70 in hsp80, prav tako so opazili višje stopnje izražanja od najkrajše verzije promotorja hsp30. Zaradi velike ohranjenosti promotorja hsp30 bi podobni promotorji najverjetneje delovali tudi v ostalih askomicetah, kot na primer v biotehnološko pomembnih Aspergillus niger ali Trichoderma reesei.

== Zaključek ==

Sistem s finim uravnavanjem transkripcije preko toplotne indukcije predstavlja obetavno orodje za raziskave funkcije genov, pa tudi za biotehnološke aplikacije, kot so proizvodnja encimov, metabolitov ali drugih biološko pomembnih snovi. V primerjavi s kemično induciranimi sistemi se izkaže za lažje reverzibilen sistem, saj ni treba dodajati eksogenih sredstev, ki jih je težko odstraniti iz gojišča. Hkrati pa je enostaven za uporabo, sploh v primerjavi s svetlobno indukcijo, kjer je potreba po dobro definiranih laboratorijskih nastavitvah (temna soba). Vendar pa se pri toplotni indukciji pojavljajo potencialne težave oziroma omejitve, kot so stres za organizem ali neselektivna aktivacija genov [vir].
Ko so zapis za clr-2 postavili pod hse30 promotor, so avtorji (kljub izbiri neoptimalnega promotorja) prikazali možnost uporabe toplotno inducibilnega sistema za regulacijo izražanja pri želenih fenotipih. Ob nadaljnji optimizaciji procesa bi se celulazna aktivnost plesni dodatno povečala, kar odpira priložnost uporabe tovrstnih sistemov v industriji. Glavna ovira pri industrijski uporabi razgradnje celuloze so namreč visoki stroški proizvodnje encimov, kar tudi preprečuje nižje cene bioetanola [vir].

Razvijanje temperaturno inducibilnega transkripcijskega reostata pri Neurospori crassi

2023-04-10T21:45:15Z

Lsegota: New page: Razvijanje temperaturno inducibilnega transkripcijskega reostata pri Neurospori crassi UVOD Neurospora crassa je rdeča plesen, ki spada v deblo askomicet. Zaradi svoje majhnosti, enosta...

Razvijanje temperaturno inducibilnega transkripcijskega reostata pri Neurospori crassi

UVOD

Neurospora crassa je rdeča plesen, ki spada v deblo askomicet. Zaradi svoje majhnosti, enostavnosti vzgoje in opravljanja genskih analiz, je N. crassa pomemben modelni organizem za raziskovanje številnih bioloških procesov, vključno s celičnim ciklom, fotosintezo, biološkimi ritmi, staranjem in razvojem. Prav tako proizvaja encime, ki razgrajujejo celulozo, kar je koristno pri proizvodnji etanola iz celuloznih virov.
Proteini toplotnega šoka (hsp) sodelujejo pri odzivu celice na stresne pogoje, kot so visoke ali nizke temperature, oksidativni stres in izpostavljenost strupenim snovem. Delujejo kot šaperoni, njihova naloga pa je zaščititi celice pred poškodbami s preprečevanjem nepravilnega zvitja proteinov. Vendar pa področje uravnavanja izražanja genov, ki kodirajo hsp, še vedno ostaja delno neraziskano, zlasti v kontekstu modelnih glivnih organizmov, kot je N. crassa.
Faktorji toplotnega šoka (hsf) so pri stresnih pogojih aktivatorji transkripcije za proteine hsp. Po oligomerizaciji se faktorji hsf vežejo na DNA, in sicer na elemente toplotnega šoka (hse), ki so pri evkariontih relativno ohranjeni. V N. crassi so opisali tri gene hsp (hsp30, hsp70 in hsp80), ki se vsi izražajo pri visokih temperaturah, prav tako pa so pri vsakem odkrili domnevne cis regulatorne elemente.
V N. crassa so načrtali že mnogo promotorjev, ki se odzivajo na kemične signale (kot so glukoza, kininska kislina in baker), od fizično induciranih sistemov pa so razvili le takšnega, ki se odziva na svetlobo. Temperaturno induciran sistem, bi medtem omogočil zelo enostavno uravnavanje izražanja genov brez potrebe po dodajanju eksogenih kemikalij.

Funkcijska analiza HSP promotorjev
V preteklih študijah so pri promotorju gena hsp30 definirali štiri regije hse, medtem ko so v promotorju hsp70 našli dve. Hsp70 ne vsebuje regulatornih elementov hse, vendar so opisane nekoliko različne cis regije, poimenovane kot elementi odziva na temperaturo (tre).
Da bi bolj okarakterizirali regulacijo genov so pripravili paleto konstruktov, ki so poleg bližnjega promotorja vsebovali različno dolge 5' regije. Različni konstrukti enakega gena pa so pri tem vsebovali raznoliko število regulatornih cis elementov. Za analizo so uporabili luciferazo iz kresničke z dodanim zaporedjem PEST (ki poveča razgradnjo proteina) kar skupaj tvori reporterski sistem za zaznavo transkripcije v realnem času. Pri sobni temperaturi so nagojili reporterske seve glive in jih v temi izpostavili enournemu toplotnemu šoku pri treh različnih temperaturah: dveh visokih (35 °C in 45 °C) in eni, ki je bila bližja laboratorijskim rastnim pogojem N. crasse (30 °C), in merili luminiscenco s CCD kamero.
Vsi polno dolgi konstrukti so izkazali podobno hiter in močen odziv na toplotni šok pri 45 °C, medtem ko je bil odziv pri 35 °C neprimerno nižji, pri 30 °C pa odziva sploh ni bilo. Skrajšani konstrukti so se pri hsp30 in hsp70 odzivali v skladu s številom domnevnih hse regij, ki so jih vsebovali. Medtem je konstrukt s polovičnim promotorjem hsp80 (ki je vseboval 5 od 7 domnevnih tre regij), pokazal kar 9-krat nižji odziv od konstrukta s polnim promotorjem, kar kaže na pomanjkljivo poznavanje regulacije promotorja hse80. Izmed treh genov so pri hsp30 opazili mnogo najnižje puščanje promotorja (pri 25 °C), zaradi česa so pri omenjenem genu opazili več kot 1000-kratno povečanje izražanja (razmerje med bazalnim vrhom in induciranim vrhom).
Hsp30 ima nižjo molekularno maso od ostalih dveh sorodnih proteinov (30 kDa proti 70 kDa / 80 kDa) na račun odsotnosti ATP hidrolazne domene. Zaradi tega so pri stresnih pogojih manjši hsp-ji prvi, ki posredujejo proti proteinski denaturaciji, kar korelira z opaženo visoko stopnjo povečanja izražanja pri hsp30.
Avtorji so hsp30 primerjali z drugimi znanimi inducibilnimi sistemi v N. crassa, kot sta promotor qa-2, ki se odziva na naraščajoče koncentracije kininske kisline in promotor vvd, ki se aktivira s svetlobo. Promotor hsp30 je imel najnižjo bazalno aktivnost in pa najvišjo aktivnost v induciranem stanjupotreboval pa je dlje časa za regeneracijo do minimuma aktivnosti po dražljaju (7 h) od vvd promotorja (4 h ).

Odziv HSP30 promotorja na toplotne dražljaje
Zaradi najbolj robustnega odziva na toplotne dražljaje so avtorji za nadaljnje delo izbrali promotor hsp30. Zanimalo jih je promotorjev odziv na različno dolge toplotne šoke pri različnih temperaturah, zato so skonstruirali pristop, ki omogoča hitro in enostavno analizo.
Eksperiment so opravili v formatu pcr mikrotitrske plošče in testirali 3 različne promotorje hsp30 (en celoten in dva skrajšana). Pripravili so paleto različnih pogojev in ocenjevali odziv promotorja z merjenjem luminiscence. Vzorci so bili izpostavljeni šestim različnim temperaturam (v rangu od 34 °C do 46 °C), pri čem so toplotni dražljaji trajali 60, 30, 15, 5, in 1 min. V obzir pa je treba vzeti, da je zaradi relativno majhnega volumna gojišča (pcr mikrocentrifugirka), bila omejena količina dodanega medija in zato omejena rast plesni.
Konstrukti s promotorji hsp30 so se izkazali za izjemno nastavljive sisteme, saj se je stopnja odziva povečevala, ko se je zviševala temperatura, prav tako pa so opazili večji odziv, kjer je temperaturni dražljaj trajal dlje časa. Vendar pa je maksimalni odziv bil opažen pri 15 min, pri daljših izpostavljenostih višji temperaturi pa je izražanje bilo nižje, kar so avtorji pripisovali upadu celične funkcije zaradi visokih temperatur. Že pri najkrajši izpostavljenosti (1 min) višji temperaturi je sistem podal robustni odziv.
Kot najbolj optimalna sistema sta se izkazala oba daljša konstrukta (vsebujeta vse domnevne elemente hse), saj so pri njima opazili močnejšo indukcijo in manjše puščanje promotorja v primerjavi s krajšim konstruktom.
Temperaturno pogojena rast N crasse
Celulozni regulator 2 (CLR-2) je transkripcijski faktor, ki je ključen pri regulaciji celulazne aktivnosti N. crasse, saj je potreben za indukcijo ekspresije celulolitičnih genov. V industriji je pomembno nadzorovano izražanje CLR-2, s tem se na primer poveča proizvodnja bioetanola. Avtorji so pripravili sev N. crasse, pri katerem so zapis za CLR-2 postavili pod promotor hsp30 in opazovali rast celic pri različnih pogojih.
Najkrajši promotor hse30 vsebuje le dve od štirih domnevnih regij hse in se je zato izkazal kot najmanj optimalen sistem za uravnavanje transkripcije (glej Odziv hsp30 promotorja na toplotne dražljaje). Vseeno pa so ga avtorji pri tem eksperimentu uporabili zaradi njegove kratke dolžine (500 baznih parov). V N. crassi je namreč prisotna ponavljajoča inducirana mutacija (RIP), kot obrambni mehanizem za zmanjšanje aktivnosti in širjenja mobilnih genetskih elementov, ki pa je manj pogosta v krajših segmentih DNA.
Rezultati so pokazali, da se sev hsp300.5 kb:clr-2 ne razvija v tekočih gojiščih z Avicelom (kristalinična celuloza) pri normalni temperaturi (25°C). Vendar pa se po vsakodnevnih impulzih toplote (45°C) rast povrne in celo preseže WT sev plesni.
Načrtovanje sintetičnega promotorja iz domnevnih cis regij hsp30
Da bi uporabili vse domnevne hse regije, in hkrati znižali pogostost RIP-induciranih mutacij so avtorji načrtali 2 sintetična promotorja. Ocenili so minimalno dolžino bližnjega promotorja (okoli 250 bp) in mu dodali domnevne regije hse. S primerjavo promotorja hse30 s promotorji hse30 iz sorodnih organizmov N. crasse so identificirali še peto regijo hse, ki je prav tako ohranjena, in tudi njo vključili v konstrukt. Razlika med sintetičnima promoterjema je bila zgolj v dolžini vmesnikov med domnevnimi regulatornimi regijami hse.
Tudi oba sintetična promotorja sta izkazala dobro nastavljivost pri različnih toplotnih tretmajih, vendar sta oba prikazala relativno močno bazalno aktivnost. Je pa tovrstno puščanje promotorja velikokrat prisotno ob načrtovanju umetnih promotorjev [vir]. Vseeno pa sta se oba nova promotorja izkazala za bolj uporaben sistem nastavljivega izražanja od promotorjev hsp70 in hsp80, prav tako so opazili višje stopnje izražanja od najkrajše verzije promotorja hsp30. Zaradi velike ohranjenosti promotorja hsp30 bi podobni promotorji najverjetneje delovali tudi v ostalih askomicetah, kot na primer v biotehnološko pomembnih Aspergillus niger ali Trichoderma reesei.

Zaključek
Sistem s finim uravnavanjem transkripcije preko toplotne indukcije predstavlja obetavno orodje za raziskave funkcije genov, pa tudi za biotehnološke aplikacije, kot so proizvodnja encimov, metabolitov ali drugih biološko pomembnih snovi. V primerjavi s kemično induciranimi sistemi se izkaže za lažje reverzibilen sistem, saj ni treba dodajati eksogenih sredstev, ki jih je težko odstraniti iz gojišča. Hkrati pa je enostaven za uporabo, sploh v primerjavi s svetlobno indukcijo, kjer je potreba po dobro definiranih laboratorijskih nastavitvah (temna soba). Vendar pa se pri toplotni indukciji pojavljajo potencialne težave oziroma omejitve, kot so stres za organizem ali neselektivna aktivacija genov [vir].
Ko so zapis za clr-2 postavili pod hse30 promotor, so avtorji (kljub izbiri neoptimalnega promotorja) prikazali možnost uporabe toplotno inducibilnega sistema za regulacijo izražanja pri želenih fenotipih. Ob nadaljnji optimizaciji procesa bi se celulazna aktivnost plesni dodatno povečala, kar odpira priložnost uporabe tovrstnih sistemov v industriji. Glavna ovira pri industrijski uporabi razgradnje celuloze so namreč visoki stroški proizvodnje encimov, kar tudi preprečuje nižje cene bioetanola [vir].

Molekularna biologija koronavirusov

2021-03-26T10:05:28Z

Lsegota:

Seminarji pri Molekularni biologiji v študijskem letu 2020/21 obravnavajo sorazmerno ozko področje koronavirusov, vendar je to glede na pandemijo virusa SARS-CoV-2 zelo aktualna tema in zato smiselna, da jo podrobneje obdelamo. Za seminarje sem določil 15 poglavij, ki temeljijo na vsaj enem preglednem članku, objavljenem od leta 2015 naprej. Ti članki naj vam bodo izhodišče za pripravo, dopolnite pa jih z novejšimi podatki, predvsem glede povzročitelja bolezni kovid-19.

Vsako poglavje obdelajo praviloma trije študenti. Vsaka skupina mora pripraviti povzetek seminarja v obsegu 1200-1500 besed in ga objaviti na tem wikiju. Povzetek ne vsebuje slikovnega gradiva, lahko pa vključuje povezave do slik in videov na spletu. Navedite do 5 ključnih virov (ti ne štejejo v vsoto 1200 besed), ki ste jih uporabili.

Vsaka skupina mora objaviti povzetek seminarja najkasneje 24 h pred začetkom seminarjev. Kateri del povzetka je napisal kdo, navedite v zavihku 'discussion'.

Pripravite tudi predstavitev, dolgo pribl. 20 minut (tolerančni okvir je 18-22 min.), temu pa bo sledila razprava, dolga 5-10 min. Vsak član skupine mora predstaviti en del seminarja, pri čemer mora biti delo enakomerno razdeljeno med vse. Osredotočite se na osnovno temo, ki ste si jo izbrali in vključite čim manj splošnega uvoda. Ne opisujte potekov bolezni, če to ni nujno zaradi povezave z biokemijskimi značilnostmi virusov! Glede vsebine predstavitve se posvetujte s kolegi, ki bodo predstavljali sorodna poglavja, tako da bo čim manj prekrivanj.

Seminarji se bodo začeli 4.5.2021 po razporedu, ki bo objavljen v spletni učilnici.

Vsebina seminarjev je izpitna snov. Odgovori na vprašanja iz snovi seminarjev predstavljajo ~10 % končnih točk izpita (2-3 vprašanja od ~30).

Poglavja za seminarje so:
# Patogeni koronavirusi: izvor in evolucija (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/30531947/)
# Molekularni vidiki koronavirusov (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/32661197/)
# Način pakiranja RNA pri koronavirusih (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/31505321/)
# Struktura in funkcija končnih zaporedij koronavirusne genomske RNA (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/25736566/)
# Struktura genoma in replikacija RNA pri koronavirusih (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/31967327/ in https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/32833200/)
# Kontinuirna in diskontinuirna sinteza RNA pri koronavirusih (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/26958916/)
# Vloga gostiteljskih faktorjev pri replikaciji koronavirusne RNA (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/28643204/)
# Natančnost replikacije koronavirusne RNA (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/21593585/)
# Mehanizmi dodajanja kape in metilacije koronavirusne RNA (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/26847650/)
# Translacijski procesi pri sintezi koronavirusnih proteinov (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/22535777/ in https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/27712623/)
# Odgovor na stres in uravnavanje translacije pri koronavirusih (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/27384577/)
# RNA-elementi s cis-regulacijsko aktivnostjo pri koronavirusih (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/27712622/)
# Vloga nestrukturnega proteina 1 pri izražanju genov ob okužbi s koronavirusom (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/25432065/
# Vloga koronavirusne endonukleaze pri izogibanju protivirusnemu odgovoru (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/29307596/)
# Mehanizem fuzije koronavirusne membrane kot tarča za protivirusna zdravila (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/32272173/)
----

Za seminar se prijavite tako, da se vpišete v oklepaj za naslovom seminarja, tako kot je prikazano pri izmišljenem ničtem seminarju.
Seminarje bomo izvedli v enakem vrstnem redu, kot so navedeni zgoraj.

0. Analiza koronavirusov v Gallusovi dvorani Cankarjevega doma (Jasna Briški, Timi Pegan, Sanja Todorović) 

# Patogeni koronavirusi: izvor in evolucija (Nikola Janakievski, Stefanija Ivanova, )
# Molekularni vidiki koronavirusov (Neža Leskovar)
# Način pakiranja RNA pri koronavirusih
# Struktura in funkcija končnih zaporedij koronavirusne genomske RNA
# Struktura genoma in replikacija RNA pri koronavirusih (Luka Šegota, Maruša Sernc, Luka Stanković)
# Kontinuirna in diskontinuirna sinteza RNA pri koronavirusih (Jakob Tomšič, Ana Pervanja, Zala Perko)
# Vloga gostiteljskih faktorjev pri replikaciji koronavirusne RNA (Nika Bedrač, Tinkara Božič, Maja Kobal)
# Natančnost replikacije koronavirusne RNA
# Mehanizmi dodajanja kape in metilacije koronavirusne RNA (Nika Perko, Gregor Strniša, Nika Tomsič)
# Translacijski procesi pri sintezi koronavirusnih proteinov (Bor Krajnik,)
# Odgovor na stres in uravnavanje translacije pri koronavirusih
# RNA-elementi s cis-regulacijsko aktivnostjo pri koronavirusih (Jan Bregar, Ajda Beltram)
# Vloga nestrukturnega proteina 1 pri izražanju genov ob okužbi s koronavirusom
# Vloga koronavirusne endonukleaze pri izogibanju protivirusnemu odgovoru (Veronika Bračič, Ela Bizjak)
# Mehanizem fuzije koronavirusne membrane kot tarča za protivirusna zdravila (Manca Pirc, Vid Dobrovoljc)

Ko boste pripravljali povzetek, naslov teme na tem, drugem, seznamu povežite z novo wiki stranjo, ki bo vsebovala povzetek. Na koncu besedila povzetka (pod viri) v novo vrstico dodajte oznako: <nowiki>[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]</nowiki> . Zgornji seznam bo po zaključku seminarjev izbrisan. Vire boste navedli na koncu vsakega povzetka, zato za serijo seminarjev ne bodo več pomembni.

Primer, kako so bili urejeni seminarji v prejšnjih letih, si lahko ogledate na strani [[Struktura kromatina]] (2013/14).

#[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Herpesvirusi_in_sorodni_dsDNA_virusi Herpesvirusi in sorodni dsDNA virusi] (Veronika Razpotnik, Ines Medved, Andrej Ivanovski)

Molekularna biologija koronavirusov

2021-03-26T10:03:39Z

Lsegota:

Seminarji pri Molekularni biologiji v študijskem letu 2020/21 obravnavajo sorazmerno ozko področje koronavirusov, vendar je to glede na pandemijo virusa SARS-CoV-2 zelo aktualna tema in zato smiselna, da jo podrobneje obdelamo. Za seminarje sem določil 15 poglavij, ki temeljijo na vsaj enem preglednem članku, objavljenem od leta 2015 naprej. Ti članki naj vam bodo izhodišče za pripravo, dopolnite pa jih z novejšimi podatki, predvsem glede povzročitelja bolezni kovid-19.

Vsako poglavje obdelajo praviloma trije študenti. Vsaka skupina mora pripraviti povzetek seminarja v obsegu 1200-1500 besed in ga objaviti na tem wikiju. Povzetek ne vsebuje slikovnega gradiva, lahko pa vključuje povezave do slik in videov na spletu. Navedite do 5 ključnih virov (ti ne štejejo v vsoto 1200 besed), ki ste jih uporabili.

Vsaka skupina mora objaviti povzetek seminarja najkasneje 24 h pred začetkom seminarjev. Kateri del povzetka je napisal kdo, navedite v zavihku 'discussion'.

Pripravite tudi predstavitev, dolgo pribl. 20 minut (tolerančni okvir je 18-22 min.), temu pa bo sledila razprava, dolga 5-10 min. Vsak član skupine mora predstaviti en del seminarja, pri čemer mora biti delo enakomerno razdeljeno med vse. Osredotočite se na osnovno temo, ki ste si jo izbrali in vključite čim manj splošnega uvoda. Ne opisujte potekov bolezni, če to ni nujno zaradi povezave z biokemijskimi značilnostmi virusov! Glede vsebine predstavitve se posvetujte s kolegi, ki bodo predstavljali sorodna poglavja, tako da bo čim manj prekrivanj.

Seminarji se bodo začeli 4.5.2021 po razporedu, ki bo objavljen v spletni učilnici.

Vsebina seminarjev je izpitna snov. Odgovori na vprašanja iz snovi seminarjev predstavljajo ~10 % končnih točk izpita (2-3 vprašanja od ~30).

Poglavja za seminarje so:
# Patogeni koronavirusi: izvor in evolucija (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/30531947/) (Nikola Janakievski, Stefanija Ivanova, )
# Molekularni vidiki koronavirusov (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/32661197/)
# Način pakiranja RNA pri koronavirusih (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/31505321/)
# Struktura in funkcija končnih zaporedij koronavirusne genomske RNA (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/25736566/)
# Struktura genoma in replikacija RNA pri koronavirusih (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/31967327/ in https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/32833200/)(Luka Šegota, Maruša Sernc, Luka Stanković)

# Kontinuirna in diskontinuirna sinteza RNA pri koronavirusih (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/26958916/)
# Vloga gostiteljskih faktorjev pri replikaciji koronavirusne RNA (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/28643204/)(Nika Bedrač, Tinkara Božič, Maja Kobal)
# Natančnost replikacije koronavirusne RNA (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/21593585/)
# Mehanizmi dodajanja kape in metilacije koronavirusne RNA (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/26847650/)
# Translacijski procesi pri sintezi koronavirusnih proteinov (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/22535777/ in https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/27712623/)
# Odgovor na stres in uravnavanje translacije pri koronavirusih (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/27384577/)
# RNA-elementi s cis-regulacijsko aktivnostjo pri koronavirusih (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/27712622/)
# Vloga nestrukturnega proteina 1 pri izražanju genov ob okužbi s koronavirusom (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/25432065/
# Vloga koronavirusne endonukleaze pri izogibanju protivirusnemu odgovoru (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/29307596/)
# Mehanizem fuzije koronavirusne membrane kot tarča za protivirusna zdravila (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/32272173/)
----

Za seminar se prijavite tako, da se vpišete v oklepaj za naslovom seminarja, tako kot je prikazano pri izmišljenem ničtem seminarju.
Seminarje bomo izvedli v enakem vrstnem redu, kot so navedeni zgoraj.

0. Analiza koronavirusov v Gallusovi dvorani Cankarjevega doma (Jasna Briški, Timi Pegan, Sanja Todorović) 

# Patogeni koronavirusi: izvor in evolucija (Nikola Janakievski, Stefanija Ivanova, )
# Molekularni vidiki koronavirusov
# Način pakiranja RNA pri koronavirusih
# Struktura in funkcija končnih zaporedij koronavirusne genomske RNA
# Struktura genoma in replikacija RNA pri koronavirusih (Luka Šegota, Maruša Sernc, Luka Stanković)
# Kontinuirna in diskontinuirna sinteza RNA pri koronavirusih (Jakob Tomšič, Ana Pervanja, Zala Perko)
# Vloga gostiteljskih faktorjev pri replikaciji koronavirusne RNA (Nika Bedrač, Tinkara Božič, Maja Kobal)
# Natančnost replikacije koronavirusne RNA
# Mehanizmi dodajanja kape in metilacije koronavirusne RNA (Nika Perko, Gregor Strniša, Nika Tomsič)
# Translacijski procesi pri sintezi koronavirusnih proteinov (Bor Krajnik,)
# Odgovor na stres in uravnavanje translacije pri koronavirusih
# RNA-elementi s cis-regulacijsko aktivnostjo pri koronavirusih (Jan Bregar, Ajda Beltram)
# Vloga nestrukturnega proteina 1 pri izražanju genov ob okužbi s koronavirusom
# Vloga koronavirusne endonukleaze pri izogibanju protivirusnemu odgovoru (Veronika Bračič, Ela Bizjak)
# Mehanizem fuzije koronavirusne membrane kot tarča za protivirusna zdravila (Manca Pirc)

Ko boste pripravljali povzetek, naslov teme na tem, drugem, seznamu povežite z novo wiki stranjo, ki bo vsebovala povzetek. Na koncu besedila povzetka (pod viri) v novo vrstico dodajte oznako: <nowiki>[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]</nowiki> . Zgornji seznam bo po zaključku seminarjev izbrisan. Vire boste navedli na koncu vsakega povzetka, zato za serijo seminarjev ne bodo več pomembni.

Primer, kako so bili urejeni seminarji v prejšnjih letih, si lahko ogledate na strani [[Struktura kromatina]] (2013/14).

#[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Herpesvirusi_in_sorodni_dsDNA_virusi Herpesvirusi in sorodni dsDNA virusi] (Veronika Razpotnik, Ines Medved, Andrej Ivanovski)

Molekularna biologija koronavirusov

2021-03-26T10:03:17Z

Lsegota:

Seminarji pri Molekularni biologiji v študijskem letu 2020/21 obravnavajo sorazmerno ozko področje koronavirusov, vendar je to glede na pandemijo virusa SARS-CoV-2 zelo aktualna tema in zato smiselna, da jo podrobneje obdelamo. Za seminarje sem določil 15 poglavij, ki temeljijo na vsaj enem preglednem članku, objavljenem od leta 2015 naprej. Ti članki naj vam bodo izhodišče za pripravo, dopolnite pa jih z novejšimi podatki, predvsem glede povzročitelja bolezni kovid-19.

Vsako poglavje obdelajo praviloma trije študenti. Vsaka skupina mora pripraviti povzetek seminarja v obsegu 1200-1500 besed in ga objaviti na tem wikiju. Povzetek ne vsebuje slikovnega gradiva, lahko pa vključuje povezave do slik in videov na spletu. Navedite do 5 ključnih virov (ti ne štejejo v vsoto 1200 besed), ki ste jih uporabili.

Vsaka skupina mora objaviti povzetek seminarja najkasneje 24 h pred začetkom seminarjev. Kateri del povzetka je napisal kdo, navedite v zavihku 'discussion'.

Pripravite tudi predstavitev, dolgo pribl. 20 minut (tolerančni okvir je 18-22 min.), temu pa bo sledila razprava, dolga 5-10 min. Vsak član skupine mora predstaviti en del seminarja, pri čemer mora biti delo enakomerno razdeljeno med vse. Osredotočite se na osnovno temo, ki ste si jo izbrali in vključite čim manj splošnega uvoda. Ne opisujte potekov bolezni, če to ni nujno zaradi povezave z biokemijskimi značilnostmi virusov! Glede vsebine predstavitve se posvetujte s kolegi, ki bodo predstavljali sorodna poglavja, tako da bo čim manj prekrivanj.

Seminarji se bodo začeli 4.5.2021 po razporedu, ki bo objavljen v spletni učilnici.

Vsebina seminarjev je izpitna snov. Odgovori na vprašanja iz snovi seminarjev predstavljajo ~10 % končnih točk izpita (2-3 vprašanja od ~30).

Poglavja za seminarje so:
# Patogeni koronavirusi: izvor in evolucija (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/30531947/) (Nikola Janakievski, Stefanija Ivanova, )
# Molekularni vidiki koronavirusov (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/32661197/)
# Način pakiranja RNA pri koronavirusih (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/31505321/)
# Struktura in funkcija končnih zaporedij koronavirusne genomske RNA (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/25736566/)
# Struktura genoma in replikacija RNA pri koronavirusih (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/31967327/ in https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/32833200/)(Luka Šegota, Maruša Sernc, Luka Stanković)

# Kontinuirna in diskontinuirna sinteza RNA pri koronavirusih (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/26958916/)
# Vloga gostiteljskih faktorjev pri replikaciji koronavirusne RNA (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/28643204/)(Nika Bedrač, Tinkara Božič, Maja Kobal)
# Natančnost replikacije koronavirusne RNA (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/21593585/)
# Mehanizmi dodajanja kape in metilacije koronavirusne RNA (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/26847650/)
# Translacijski procesi pri sintezi koronavirusnih proteinov (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/22535777/ in https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/27712623/)
# Odgovor na stres in uravnavanje translacije pri koronavirusih (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/27384577/)
# RNA-elementi s cis-regulacijsko aktivnostjo pri koronavirusih (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/27712622/)
# Vloga nestrukturnega proteina 1 pri izražanju genov ob okužbi s koronavirusom (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/25432065/
# Vloga koronavirusne endonukleaze pri izogibanju protivirusnemu odgovoru (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/29307596/)
# Mehanizem fuzije koronavirusne membrane kot tarča za protivirusna zdravila (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/32272173/)
----

Za seminar se prijavite tako, da se vpišete v oklepaj za naslovom seminarja, tako kot je prikazano pri izmišljenem ničtem seminarju.
Seminarje bomo izvedli v enakem vrstnem redu, kot so navedeni zgoraj.

0. Analiza koronavirusov v Gallusovi dvorani Cankarjevega doma (Jasna Briški, Timi Pegan, Sanja Todorović) 

# Patogeni koronavirusi: izvor in evolucija (Nikola Janakievski, Stefanija Ivanova, )
# Molekularni vidiki koronavirusov
# Način pakiranja RNA pri koronavirusih
# Struktura in funkcija končnih zaporedij koronavirusne genomske RNA
# Struktura genoma in replikacija RNA pri koronavirusih
# Kontinuirna in diskontinuirna sinteza RNA pri koronavirusih (Jakob Tomšič, Ana Pervanja, Zala Perko)
# Vloga gostiteljskih faktorjev pri replikaciji koronavirusne RNA (Nika Bedrač, Tinkara Božič, Maja Kobal)
# Natančnost replikacije koronavirusne RNA
# Mehanizmi dodajanja kape in metilacije koronavirusne RNA (Nika Perko, Gregor Strniša, Nika Tomsič)
# Translacijski procesi pri sintezi koronavirusnih proteinov (Bor Krajnik,)
# Odgovor na stres in uravnavanje translacije pri koronavirusih
# RNA-elementi s cis-regulacijsko aktivnostjo pri koronavirusih (Jan Bregar, Ajda Beltram)
# Vloga nestrukturnega proteina 1 pri izražanju genov ob okužbi s koronavirusom
# Vloga koronavirusne endonukleaze pri izogibanju protivirusnemu odgovoru (Veronika Bračič, Ela Bizjak)
# Mehanizem fuzije koronavirusne membrane kot tarča za protivirusna zdravila (Manca Pirc)

Ko boste pripravljali povzetek, naslov teme na tem, drugem, seznamu povežite z novo wiki stranjo, ki bo vsebovala povzetek. Na koncu besedila povzetka (pod viri) v novo vrstico dodajte oznako: <nowiki>[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]</nowiki> . Zgornji seznam bo po zaključku seminarjev izbrisan. Vire boste navedli na koncu vsakega povzetka, zato za serijo seminarjev ne bodo več pomembni.

Primer, kako so bili urejeni seminarji v prejšnjih letih, si lahko ogledate na strani [[Struktura kromatina]] (2013/14).

#[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Herpesvirusi_in_sorodni_dsDNA_virusi Herpesvirusi in sorodni dsDNA virusi] (Veronika Razpotnik, Ines Medved, Andrej Ivanovski)

Molekularna biologija koronavirusov

2021-03-26T10:01:51Z

Lsegota:

Seminarji pri Molekularni biologiji v študijskem letu 2020/21 obravnavajo sorazmerno ozko področje koronavirusov, vendar je to glede na pandemijo virusa SARS-CoV-2 zelo aktualna tema in zato smiselna, da jo podrobneje obdelamo. Za seminarje sem določil 15 poglavij, ki temeljijo na vsaj enem preglednem članku, objavljenem od leta 2015 naprej. Ti članki naj vam bodo izhodišče za pripravo, dopolnite pa jih z novejšimi podatki, predvsem glede povzročitelja bolezni kovid-19.

Vsako poglavje obdelajo praviloma trije študenti. Vsaka skupina mora pripraviti povzetek seminarja v obsegu 1200-1500 besed in ga objaviti na tem wikiju. Povzetek ne vsebuje slikovnega gradiva, lahko pa vključuje povezave do slik in videov na spletu. Navedite do 5 ključnih virov (ti ne štejejo v vsoto 1200 besed), ki ste jih uporabili.

Vsaka skupina mora objaviti povzetek seminarja najkasneje 24 h pred začetkom seminarjev. Kateri del povzetka je napisal kdo, navedite v zavihku 'discussion'.

Pripravite tudi predstavitev, dolgo pribl. 20 minut (tolerančni okvir je 18-22 min.), temu pa bo sledila razprava, dolga 5-10 min. Vsak član skupine mora predstaviti en del seminarja, pri čemer mora biti delo enakomerno razdeljeno med vse. Osredotočite se na osnovno temo, ki ste si jo izbrali in vključite čim manj splošnega uvoda. Ne opisujte potekov bolezni, če to ni nujno zaradi povezave z biokemijskimi značilnostmi virusov! Glede vsebine predstavitve se posvetujte s kolegi, ki bodo predstavljali sorodna poglavja, tako da bo čim manj prekrivanj.

Seminarji se bodo začeli 4.5.2021 po razporedu, ki bo objavljen v spletni učilnici.

Vsebina seminarjev je izpitna snov. Odgovori na vprašanja iz snovi seminarjev predstavljajo ~10 % končnih točk izpita (2-3 vprašanja od ~30).

Poglavja za seminarje so:
# Patogeni koronavirusi: izvor in evolucija (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/30531947/) (Nikola Janakievski, Stefanija Ivanova, )
# Molekularni vidiki koronavirusov (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/32661197/)
# Način pakiranja RNA pri koronavirusih (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/31505321/)
# Struktura in funkcija končnih zaporedij koronavirusne genomske RNA (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/25736566/)
# Struktura genoma in replikacija RNA pri koronavirusih (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/31967327/ in https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/32833200/)(Luka Šegota, Maruša Sernc, Luka Stanković)

# Kontinuirna in diskontinuirna sinteza RNA pri koronavirusih (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/26958916/)
# Vloga gostiteljskih faktorjev pri replikaciji koronavirusne RNA (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/28643204/)(Nika Bedrač, Tinkara Božič, Maja Kobal)
# Natančnost replikacije koronavirusne RNA (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/21593585/)
# Mehanizmi dodajanja kape in metilacije koronavirusne RNA (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/26847650/)
# Translacijski procesi pri sintezi koronavirusnih proteinov (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/22535777/ in https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/27712623/)
# Odgovor na stres in uravnavanje translacije pri koronavirusih (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/27384577/)
# RNA-elementi s cis-regulacijsko aktivnostjo pri koronavirusih (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/27712622/)
# Vloga nestrukturnega proteina 1 pri izražanju genov ob okužbi s koronavirusom (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/25432065/
# Vloga koronavirusne endonukleaze pri izogibanju protivirusnemu odgovoru (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/29307596/)
# Mehanizem fuzije koronavirusne membrane kot tarča za protivirusna zdravila (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/32272173/)
----

Za seminar se prijavite tako, da se vpišete v oklepaj za naslovom seminarja, tako kot je prikazano pri izmišljenem ničtem seminarju.
Seminarje bomo izvedli v enakem vrstnem redu, kot so navedeni zgoraj.

0. Analiza koronavirusov v Gallusovi dvorani Cankarjevega doma (Jasna Briški, Timi Pegan, Sanja Todorović) 

# Patogeni koronavirusi: izvor in evolucija (Nikola Janakievski, Stefanija Ivanova, )
# Molekularni vidiki koronavirusov
# Način pakiranja RNA pri koronavirusih
# Struktura in funkcija končnih zaporedij koronavirusne genomske RNA
# Struktura genoma in replikacija RNA pri koronavirusih
# Kontinuirna in diskontinuirna sinteza RNA pri koronavirusih
# Vloga gostiteljskih faktorjev pri replikaciji koronavirusne RNA
# Natančnost replikacije koronavirusne RNA
# Mehanizmi dodajanja kape in metilacije koronavirusne RNA
# Translacijski procesi pri sintezi koronavirusnih proteinov
# Odgovor na stres in uravnavanje translacije pri koronavirusih
# RNA-elementi s cis-regulacijsko aktivnostjo pri koronavirusih
# Vloga nestrukturnega proteina 1 pri izražanju genov ob okužbi s koronavirusom
# Vloga koronavirusne endonukleaze pri izogibanju protivirusnemu odgovoru (Veronika Bračič, Ela Bizjak)
# Mehanizem fuzije koronavirusne membrane kot tarča za protivirusna zdravila

Ko boste pripravljali povzetek, naslov teme na tem, drugem, seznamu povežite z novo wiki stranjo, ki bo vsebovala povzetek. Na koncu besedila povzetka (pod viri) v novo vrstico dodajte oznako: <nowiki>[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]</nowiki> . Zgornji seznam bo po zaključku seminarjev izbrisan. Vire boste navedli na koncu vsakega povzetka, zato za serijo seminarjev ne bodo več pomembni.

Primer, kako so bili urejeni seminarji v prejšnjih letih, si lahko ogledate na strani [[Struktura kromatina]] (2013/14).

#[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Herpesvirusi_in_sorodni_dsDNA_virusi Herpesvirusi in sorodni dsDNA virusi] (Veronika Razpotnik, Ines Medved, Andrej Ivanovski)

Molekularna biologija koronavirusov

2021-03-26T10:01:23Z

Lsegota:

Seminarji pri Molekularni biologiji v študijskem letu 2020/21 obravnavajo sorazmerno ozko področje koronavirusov, vendar je to glede na pandemijo virusa SARS-CoV-2 zelo aktualna tema in zato smiselna, da jo podrobneje obdelamo. Za seminarje sem določil 15 poglavij, ki temeljijo na vsaj enem preglednem članku, objavljenem od leta 2015 naprej. Ti članki naj vam bodo izhodišče za pripravo, dopolnite pa jih z novejšimi podatki, predvsem glede povzročitelja bolezni kovid-19.

Vsako poglavje obdelajo praviloma trije študenti. Vsaka skupina mora pripraviti povzetek seminarja v obsegu 1200-1500 besed in ga objaviti na tem wikiju. Povzetek ne vsebuje slikovnega gradiva, lahko pa vključuje povezave do slik in videov na spletu. Navedite do 5 ključnih virov (ti ne štejejo v vsoto 1200 besed), ki ste jih uporabili.

Vsaka skupina mora objaviti povzetek seminarja najkasneje 24 h pred začetkom seminarjev. Kateri del povzetka je napisal kdo, navedite v zavihku 'discussion'.

Pripravite tudi predstavitev, dolgo pribl. 20 minut (tolerančni okvir je 18-22 min.), temu pa bo sledila razprava, dolga 5-10 min. Vsak član skupine mora predstaviti en del seminarja, pri čemer mora biti delo enakomerno razdeljeno med vse. Osredotočite se na osnovno temo, ki ste si jo izbrali in vključite čim manj splošnega uvoda. Ne opisujte potekov bolezni, če to ni nujno zaradi povezave z biokemijskimi značilnostmi virusov! Glede vsebine predstavitve se posvetujte s kolegi, ki bodo predstavljali sorodna poglavja, tako da bo čim manj prekrivanj.

Seminarji se bodo začeli 4.5.2021 po razporedu, ki bo objavljen v spletni učilnici.

Vsebina seminarjev je izpitna snov. Odgovori na vprašanja iz snovi seminarjev predstavljajo ~10 % končnih točk izpita (2-3 vprašanja od ~30).

Poglavja za seminarje so:
# Patogeni koronavirusi: izvor in evolucija (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/30531947/) (Nikola Janakievski, Stefanija Ivanova, )
# Molekularni vidiki koronavirusov (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/32661197/)
# Način pakiranja RNA pri koronavirusih (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/31505321/)
# Struktura in funkcija končnih zaporedij koronavirusne genomske RNA (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/25736566/)
# Struktura genoma in replikacija RNA pri koronavirusih (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/31967327/ in https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/32833200/)(Luka Šegota, Maruša Sernc, Luka Stanković)

# Kontinuirna in diskontinuirna sinteza RNA pri koronavirusih (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/26958916/)
# Vloga gostiteljskih faktorjev pri replikaciji koronavirusne RNA (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/28643204/)
# Natančnost replikacije koronavirusne RNA (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/21593585/)
# Mehanizmi dodajanja kape in metilacije koronavirusne RNA (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/26847650/)
# Translacijski procesi pri sintezi koronavirusnih proteinov (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/22535777/ in https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/27712623/)
# Odgovor na stres in uravnavanje translacije pri koronavirusih (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/27384577/)
# RNA-elementi s cis-regulacijsko aktivnostjo pri koronavirusih (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/27712622/)
# Vloga nestrukturnega proteina 1 pri izražanju genov ob okužbi s koronavirusom (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/25432065/
# Vloga koronavirusne endonukleaze pri izogibanju protivirusnemu odgovoru (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/29307596/)
# Mehanizem fuzije koronavirusne membrane kot tarča za protivirusna zdravila (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/32272173/)
----

Za seminar se prijavite tako, da se vpišete v oklepaj za naslovom seminarja, tako kot je prikazano pri izmišljenem ničtem seminarju.
Seminarje bomo izvedli v enakem vrstnem redu, kot so navedeni zgoraj.

0. Analiza koronavirusov v Gallusovi dvorani Cankarjevega doma (Jasna Briški, Timi Pegan, Sanja Todorović) 

# Patogeni koronavirusi: izvor in evolucija
# Molekularni vidiki koronavirusov
# Način pakiranja RNA pri koronavirusih
# Struktura in funkcija končnih zaporedij koronavirusne genomske RNA
# Struktura genoma in replikacija RNA pri koronavirusih
# Kontinuirna in diskontinuirna sinteza RNA pri koronavirusih
# Vloga gostiteljskih faktorjev pri replikaciji koronavirusne RNA
# Natančnost replikacije koronavirusne RNA
# Mehanizmi dodajanja kape in metilacije koronavirusne RNA
# Translacijski procesi pri sintezi koronavirusnih proteinov
# Odgovor na stres in uravnavanje translacije pri koronavirusih
# RNA-elementi s cis-regulacijsko aktivnostjo pri koronavirusih
# Vloga nestrukturnega proteina 1 pri izražanju genov ob okužbi s koronavirusom
# Vloga koronavirusne endonukleaze pri izogibanju protivirusnemu odgovoru (Veronika Bračič, Ela Bizjak)
# Mehanizem fuzije koronavirusne membrane kot tarča za protivirusna zdravila

Ko boste pripravljali povzetek, naslov teme na tem, drugem, seznamu povežite z novo wiki stranjo, ki bo vsebovala povzetek. Na koncu besedila povzetka (pod viri) v novo vrstico dodajte oznako: <nowiki>[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]</nowiki> . Zgornji seznam bo po zaključku seminarjev izbrisan. Vire boste navedli na koncu vsakega povzetka, zato za serijo seminarjev ne bodo več pomembni.

Primer, kako so bili urejeni seminarji v prejšnjih letih, si lahko ogledate na strani [[Struktura kromatina]] (2013/14).

#[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Herpesvirusi_in_sorodni_dsDNA_virusi Herpesvirusi in sorodni dsDNA virusi] (Veronika Razpotnik, Ines Medved, Andrej Ivanovski)

Molekularna biologija koronavirusov

2021-03-26T09:39:36Z

Lsegota:

Seminarji pri Molekularni biologiji v študijskem letu 2020/21 obravnavajo sorazmerno ozko področje koronavirusov, kar je glede na pandemijo virusa SARS-CoV-2 zelo aktualna tema. Za seminarje sem določil 15 ožjih področij, ki temeljijo na vsaj enem preglednem članku, objavljenem od leta 2015 naprej. Ti članki naj vam bodo izhodišče za pripravo, dopolnite pa jih z novejšimi podatki, predvsem glede povzročitelja bolezni kovid-19.

Vsako poglavje obdelajo praviloma trije študenti. Vsaka skupina mora pripraviti povzetek seminarja v obsegu 1200-1500 besed in ga objaviti na tem wikiju. Povzetek ne vsebuje slikovnega gradiva, lahko pa vključuje povezave do slik in videov na spletu. Navedite do 5 ključnih virov (ti ne štejejo v vsoto 1200 besed), ki ste jih uporabili.

Vsaka skupina mora objaviti povzetek seminarja najkasneje 24 h pred začetkom seminarjev. Kateri del povzetka je napisal kdo, navedite v zavihku 'discussion'.

Pripravite tudi predstavitev, dolgo pribl. 20 minut (tolerančni okvir je 18-22 min.), temu pa bo sledila razprava, dolga 5-10 min. Vsak član skupine mora predstaviti en del seminarja, pri čemer mora biti delo enakomerno razdeljeno med vse. Osredotočite se na osnovno temo, ki ste si jo izbrali in vključite čim manj splošnega uvoda. Ne opisujte potekov bolezni, če to ni nujno zaradi povezave z biokemijskimi značilnostmi virusov! Glede vsebine predstavitve se posvetujte s kolegi, ki bodo predstavljali sorodna poglavja, tako da bo čim manj prekrivanj.

Seminarji se bodo začeli 4.5.2021 po razporedu, ki bo objavljen v spletni učilnici.

Vsebina seminarjev je izpitna snov. Odgovori na vprašanja iz snovi seminarjev predstavljajo ~10 % končnih točk izpita (2-3 vprašanja od ~30).

Poglavja za seminarje so:
# Patogeni koronavirusi: izvor in evolucija (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/30531947/) (Nikola Janakievski, Stefanija Ivanova, )
# Molekularni vidiki koronavirusov (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/32661197/) (Neža Leskovar)
# Način pakiranja RNA pri koronavirusih (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/31505321/) (Timotej Sotosek, Erik Putar, Eva Vene)
# Struktura in funkcija končnih zaporedij koronavirusne genomske RNA (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/25736566/)(Luka Šegota, Maruša Sernc, Luka StankoviĆ)
# Struktura genoma in replikacija RNA pri koronavirusih (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/31967327/ in https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/32833200/) (Špela Kladnik, Nika Malečkar, Eva Kanalec)
# Kontinuirna in diskontinuirna sinteza RNA pri koronavirusih (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/26958916/) (Jakob Tomšič, Ana Pervanja, Zala Perko)
# Vloga gostiteljskih faktorjev pri replikaciji koronavirusne RNA (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/28643204/) (Tinkara Božič, Nika Bedrač, Maja Kobal)
# Natančnost replikacije koronavirusne RNA (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/21593585/)
# Mehanizmi dodajanja kape in metilacije koronavirusne RNA (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/26847650/) (Nika Perko, Gregor Strniša, Nika Tomsič)
# Translacijski procesi pri sintezi koronavirusnih proteinov (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/22535777/ in https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/27712623/)
# Odgovor na stres in uravnavanje translacije pri koronavirusih (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/27384577/)
# RNA-elementi s cis-regulacijsko aktivnostjo pri koronavirusih (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/27712622/)
# Vloga nestrukturnega proteina 1 pri izražanju genov ob okužbi s koronavirusom (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/25432065/)
# Vloga koronavirusne endonukleaze pri izogibanju protivirusnemu odgovoru (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/29307596/)
# Mehanizem fuzije koronavirusne membrane kot tarča za protivirusna zdravila (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/32272173/) (Vid Dobrovoljc)

BIO2 Povzetki seminarjev 2020

2021-01-06T21:54:03Z

Lsegota:

= POVZETKI SEMINARJEV BIOKEMIJA 2020/21 =

==Jan Bregar - Protein retinoblastoma==

Protein retinoblastoma (pRb) je eden ključnih proteinov, ki regulirajo celični cikel in njegova inaktivacija lahko povzroči različna bolezenska stanja. Ta protein regulira ključni prehod iz G1 v S fazo celičnega cikla s pomočjo interakcij z družino E2F, ki je vrsta transkripcijskih faktorjev celičnega cikla. Retinoblastoma protein (pRb) nadzoruje tudi izstop celice iz celičnega cikla. Njeno aktivnost regulira več mehanizmov, ki zaznavajo znotraj- in zunajcelične signale, ki blokirajo ali dovoljujejo fosforilacijo. pRb fosforilirajo od ciklina odvisne kinaze (Cdk-ji) in s tem protein Rb bodisi inaktivirajo ali pa rahlo spremenijo njegove lastnosti, protein pa vseeno ohrani svojo funkcijo. Odkrili so tudi, da pRb regulira apoptozo s pomočjo enakih interakcij s transkripcijskimi faktorji E2F. To, da je pRb vpleten pri apoptozi, popolno dopolnjuje pRb kot pomemben določevalec usode celice. Med trajanjem celičenga cikla je pRb inaktiviran, kar povzroči, da je celica bolj občutljiva na apoptotske stimuluse. Regulacijo apoptoze lahko onesposobijo nekateri virusi, ki s svojimi onkoproteini povzročijo napake v delovanju proteina Rb, kar lahko predstavlja tveganje za organizem. pRb – E2F kompleksi imajo pomembno vlogo pri regulaciji transkripcije genov, ki so vključeni v diferenciaciji in razvoju.

==Ajda Beltram - Struktura in dinamika signalnih komplekov GPCR==

Receptorji sklopljeni z G-proteinom (GPCR) so transmembranski proteini, ki kot odgovor na ligande regulirajo veliko signalnih poti preko heterotrimernih G-proteinov ali pa preko fosforilacije receptorja s kinazo GRK in arestinov. Vendar ti proteini ne obstajajo le v aktivirani ali neaktivirani obliki, pač pa imajo veliko konformacijskih stanj, ki vsaka sproži svojo signalno pot. Mene je zanimala podrobna razlaga konformacijskih sprememb, ki se zgodijo med prenosom signala. Za aktivacijo G-proteinov je potrebna zamenjava GDP z GTP, kjer igra ključno vlogo razcep domen podenote α G-proteina in destabilizacija vezavnega mesta za nukleotid na Ras-domeni podenote α, kar so posledice konformacijskih sprememb, ki jih povzroči vezava na receptor. Različni ligandi, ki se vežejo na receptorje, pa lahko vplivajo tudi na afiniteto G-proteina do GDP. Kompleksi receptor-G-protein, ki nastanejo z vezavo popolnih agonistov, imajo manjšo afiniteto do GDP, kot tisti, ki so nastali z vezavo delnih agonistov. Pri arestinih pa so prav tako prišli do novega spoznanja. Aktivacija arestinov je večinoma prikazana kot proces iz dveh delov in sicer vezave na fosforiliran C-rep receptorja in nato vezave na jedro receptorja, vendar pa so odkrili, da lahko obe vezavi posebej aktivirata arestin. To nakazuje na to, da verjetno obstaja veliko različnih kompleksov arestina in receptorja, ki regulirajo vsak svojo signalno pot.

==Anja Moškrič - Presinaptični kalcijevi kanalčki kot specializiran nadzor za sproščanje nevrotransmitorjev==

Signalizacija živčnih celic med drugim poteka s prenosom nevrotransmitorjev preko sinaps. Pri kemični sinapsi gre za pretvarjanje električnih impulzov v eksocitotsko sprostitev nevrotransmitorja (npr. glutamat, GABA, epinefrin, norepinefrin). Pri pretvarjanju signala imajo ključno vlogo napetostno uravnavani kalcijevi ionski kanalčki (Cav), v presinaptičnem predelu. Ti, kot odgovor na depolarizacijo nevrona, usmerjajo kalcijeve ione v notranjost celice in posledično sprožijo fuzijo mešička (z nevrotransmitorjem) s presinaptično membrano. Zgrajeni so iz več podenot, od teh je glavna α1, ki tvori poro za pretok ionov. Podenoti α2δ in β pa regulirata lastnosti. Kanalčke glede na obliko glavne podenote klasificiramo v 3 večje skupine: Cav1, Cav2 in Cav3. V večini sinaps so prisotni kanalčki iz družine Cav2. Da eksocitoza lahko poteče hitro in učinkovito, morajo biti Cav locirani znotraj aktivne regije presinaptične membrane, v bližini mesta eksocitoze. Slednjo kalcijevi kanalčki regulirajo preko različnih proteinov. Pomembnejši predstavnik je družina proteinov RIM (z rab3 vezavne molekule). Ti se na kanalček vežejo z RIM vezavnimi proteini (RBP). Z njimi asociira tudi protein munc13, ki je v membrani vezikla in nevrona vezani s proteini SNARE. Ti so mediatorji pri fuziji membran. Delovanje kanalčka inaktivirajo procesi, kot sta od napetosti odvisni mehanizem in od kalcija odvisen mehanizem, ki je povezan s kalmodulinom.

==Gregor Strniša - Načini aktivacije GPCR==

GPCR, oziroma z G proteinom sklopljeni receptorji, so transmembranski proteini, ki s svojim delovanjem vplivajo na dogajanje v celici. Zaradi vezave liganda na njihovo zunajcelično stran se jim spremeni konformacija in omogoči prenos signala preko različnih signalnih molekul. Signal se preko različnih G proteinov in β-arrestinov prenaša do drugih proteinov v celici. Kmalu po odkritju GPCR se je izkazalo, da vsi ne delujejo po istem principu. Nove raziskovalne metode so omogočile napredek na področju vizualizacije molekul in njihovega sledenja v celici. Tako so znanstveniki prišli do odkritja petih novih metod aktivacije GPCR, ki lažje razložijo delovanje receptorjev. Med seboj so si različne, a se lahko pogosto prekrivajo in dopolnjujejo. GPCR omogočijo več možnosti odgovora na določen ligand in njegovo koncentracijo. Načini aktivacije, predstavljeni v moji seminarski nalogi, so pristranska aktivacija, znotrajcelična aktivacija, dimerizacijska aktivacija, transaktivacija in dvofazna aktivacija. Posamezen receptor navadno deluje na več načinov. Ob posameznem načinu so podani primeri receptorjev in njihovega delovanja. Z razumevanjem načinov njihove aktivacije se odprejo nove možnosti razvoja zdravil, ki bi delovale preko GPCR, ali vplivale na njihove signalne poti.

==Nikola Janakievski - Selective Androgen Receptor Modulators==

Selective Androgen Receptors Modulators or better known as SARMs, were discovered 30 years ago, as a potential replacement to steroid therapy. SARMs are a type of Selective Receptor Modulators (SRM), compounds which can act both as agonists and antagonists in androgen receptors (ARs) (as a non-steroid replacement), according to the tissue they are in. The main idea behind SARMs, is improving the hormone therapies we have currently, which use synthetic steroids. An ideal SARM could have all the benefits of steroid hormones, without the side effects. The potential benefits and safety of SARMs is yet to be determined, there are numerous ongoing studies for various applications. It is important to have a summary of all these potential application and past examples of studies. In this seminar, we aim to do just that, by comparing all past studies and future potential applications related to SARMs. We conclude that, SARMs are a viable alternative, possibly an improvement to synthetic steroids, although much more research and clinical trials are required for SARMs to become truly applicable.

==Vid Dobrovoljc - Medsebojni vpliv signalnih poti na primeru RTK in GPCR signalnih poti==

Preučevanje součinkovanja med signalnimi potmi v celici je zelo zanimivo področje, vendar dokaj težko za raziskovanje. S seminarjem sem poizkusil predstaviti sovplivanje inzulinske(RTK) in β-adrenergične (GCPR) poti v srcu. . Inzulin na β-adrenergične (βAR) poti vpliva s fosforilacijo receptorja z različnimi kinazami, na primer protein kinazo A (PKA) G-protein kinazo (GRK2) in celo sam inzulinskim receptorjem (INSR), kar vodi do desenzitacije in včasih tudi internalizacije receptorja z vezavo β-arestina. Drug način vplivanja je z delovanjem na nižje člene v signalni poti, na primer na koncentracijo cAMP s fosfodiesterazami (PDE). Inzulin lahko tudi s pomočjo fosforilacije uporabi β-adrenergično pot za krepitev svojega signala. Zelo pomembna točka obeh signalnih poti je GRK2, ki po naravi deluje inhibirajoče na obe signalni poti, po zadnjih rezultatih pa jo poleg tega inzulin uporablja za še dodatno inhibicijo GPCR poti. Vplivanje βAR poti na inzulinsko pot je manj jasno, vendar kaže, da lahko βAR na sprejem glukoze v odvisnosti od situacije vpliva tako pozitivno kot negativno, dokaj pomembno vlogo pri tem pa ima PKB. Domnevam, da bo v prihodnosti vedno več raziskav na temo povezav med signalnimi potmi, saj bodo razvite nove opazovalne tehnike, poleg tega pa je razumevanje povezav koristno tako pri razvoju novih tehnik zdravljenja, kot pri samem študiju razvoja celične signalizacije

==Rebeka Jerina - Kofein kot antagonist adenozinskih receptorjev==

Veliko ljudi po svetu pije kavo, čaj ali kokakolo. Vsem naštetim pijačam je skupen kofein, najpogosteje zaužit psihostimulant na svetu. Kofein povzroča veliko učinkov, med katerimi je najbolj znan vpliv na budnost. Zanima me ali vemo kako in zakaj jo povzroči. Kofein je antagonist adenozinskih receptorjev (ARs). Ima podobno strukturo kot adenozin, zato lahko zaseda njegova vezavna mesta. Adenozinski receptorji so izraženi v mnogih tkivih, veliko pa jih najdemo v centralnem živčnem sistemu (CNS). Raziskala sem, da kofein večinoma vpliva na adenozinska receptorja podtipa A1 in A2A. Te dva podtipa adenozinskih receptorjev (ARs) vplivata na regulacijo mnogih fizioloških funkcij kot so spanje, kognicija, motivacija in čustva. Kofein tako z antagonizmom adenozinskih receptorjev (ARs) prepreči signalno kaskado, ki bi spodbudila zaspanost in posledično ohranja budnost. Adenozinski receptorji (ARs) spadajo pod receptorje povezane z G-proteini. Zgradba A1AR in A2AAR se nekoliko razlikuje, zato je tudi mehanizem delovanja teh dveh podtipov nekoliko drugačen. Signalizacija adenozinskih receptorjev (ARs) lahko poteka po več različnih signalnih poteh. Kofein bi zaradi pozitivnih okrepitvenih učinkov, pojava različnih duševnih motenj in pojava negativnih simptomov po prenehanju uživanja lahko prištevali med droge. Raziskave so pokazale, da se z antagonizmom adenozinskih receptorjev da uspešno zdraviti tudi številne bolezni. Glede na učinke in uporabo kofeina bi lahko rekli, da velja za hranilo, zdravilo ali drogo.

==Zala Perko - Mehanizmi vezave ligandov in regeneracija fotoreceptorjev očesne mrežnice==

Fotoreceptorji v membrani celic očesne mrežnice so značilni predstavniki z G-proteinom sklopljenih receptorjev. Njihova naloga je absorpcija svetlobe določene valovne dolžine in prenos signala preko G-proteina na citoplazemsko stran, kjer poteče veriga encimsko kataliziranih reakcij. Aktiviran fotoreceptor mora v procesu regeneracije ponovno zavzeti neaktivno konformacijo in vezati naravni ligand 11-cis-retinal. Barvni fotoreceptorji jodopsini zahtevajo učinkovit regeneracijski mehanizem, ker morajo stalno procesirati veliko količino svetlobnih signalov. Aktivna konformacija jodopsina razpade veliko hitreje v primerjavi z rodopsinom in tudi sam potek regeneracije je pri jodopsinih hitrejši. Vzrok za to bi lahko bila različna usoda desenzibiliziranih receptorjev. Nedavno so odkrili možnost, da pri regeneraciji jodopsinov pride do preusmeritve signalne poti. Namesto, da se receptor deaktivira preko internalizacije z arestinom, ostane v membrani in veže ligand glede na prehodno konformacijsko stanje v katerem se nahaja. Na različen potek regeneracije jodopsinov bi lahko vplivala tudi vezava druge molekule retinala v alosterično mesto, ki je posledica konformacijskih sprememb. Povezava med interakcijo retinala in njegovih analogov z določenim konformacijskim intermediatom ima pomembno vlogo tudi s terapevtskega vidika, saj GPCR-ji v splošnem predstavljajo terapevtske tarče za zdravljenje mnogih obolenj. Uporaba analogov 11-cis-retinala, kot sta 9CR in 6mr, ki se vežeta v aktivno ali eno od alosteričnih mest, bi lahko predstavljala učinkovit pristop pri zdravljenju prirojenih mutacij v fotoreceptorjih.

==Eva Vene - Povezava bolečine z vezavo kapsaicina na TRPV1==

Družina TRP kanalčkov pri živalih združuje devet manjših skupin kationskih prenašalcev, ki odločilno vplivajo na pravilno delovanje organizma. Eden od tovrstnih kanalčkov je tudi TRPV1 z angleškim imenom »transient receptor potential vanilloid 1«. Tega najdemo v mnogih organih in organskih sistemih, natančneje pa se v tem seminarju osredotočamo na njegovo vlogo v perifernem živčevju. TRPV1 vsebuje okoli polovica vseh somatskih in visceralnih senzoričnih nevronov, zato je pomemben mediator pri nocicepciji oziroma zaznavanju možno nevarnih stimulov ter njihovim prevodom v akcijskih potencial. Njegovo delovanje, poleg nekaterih drugih dražljajev, lahko vzbudi organska molekula, imenovana kapsaicin. Slednjega najdemo v sadežih rastlin rodu Capsicum in ga pojmujemo kot eno odločilnih molekul za pekoč okus teh plodov. Ob vezavi kapsaicina na TRPV1 v celico vdrejo kationi, ki spodbudijo različne celične procese, ključne za oblikovanje in prenos živčnega signala do možganov ter pojav vnetja. Posebej zanimive so dvolične posledice vezave kapsaicina, ki sicer vodijo do bolečine, draženja in vnetja, a omogočijo tudi refrakcijsko dobo kanalčka, ki predstavlja čas, ko slednjega ne moremo aktivirati ter desenzitacijo in degradacijo živčnih vlaken, kar povezujemo z analgetičnim učinkom te molekule. Ob redni daljši izpostavitvi kapsaicinu, ki ga lahko administriramo transdermalno ali injiciramo, se tako uspešno uporablja pri lajšanju kroničnih bolečin.

==Erik Putar - AMPK: senzor glukoze ter celičnega energijskega stanja ==

Celica uporablja z AMP aktivirano protein kinazo (AMPK) kot senzor celičnega energijskega stanja in glukoze. Njen glavni aktivator je AMP, ki promovira fosforilacijo Thr172 na AMPK, inhibira defosforilacijo fosforiliranega Thr172 ter alosterično aktivira AMPK. Aktivacija AMPK poteče že ob majhem energijskem deficitu in sproži regulatorni odgovor, ki preusmeri celični metabolizem iz anabolizma v katabolizem. Fosforilacija Thr172 poteče preko kinaze LKB1, medtem ko sta glikogen sintaza in acetil koencim A karboksilaza (ACC) dve tarči izmed mnogih kinazne aktivnosti AMPK. AMPK je heterotrimer sestavljen iz podenot α, β in γ. V α podenoti je prisotno kinazno aktivno mesto ter Thr172, medtem ko so na γ podenoti prisotna vezavna mesta za adenin nukleotide. β podenota je miristilirana na svojem N koncu, kar je ključnega pomena za delovanje glukoznega senzorja. Ta mehanizem poteka na lizosomih in sicer s tvorbo velikega kompleksa, ki vsebuje aldolazo, v-ATPazo, Ragulator, AXIN, LKB1 ter AMPK. Aldolaza je sicer tista, ki čuti prisotnost glukoze in to preko fruktoze 1,6-bisfosfata (FBP): odsotnost FBP v njenem aktivnem mestu aktivira AMPK neodvisno od razmerja koncentracijah adenin nukleotidov in tako preusmeri celico iz glikolitične v alternativne oksidativne poti.

==Timotej Sotošek - Regulacija mišičnega glikogena: granule in njeni proteini ==

Glikogen je primarna oblika shranjevanja glukoze, ki je hitra in dostopna oblika energije. Kljub njegovi pomembnosti pa procesi regulacije glikogena še vedno niso popolnoma jasni. Metabolizem glikogena je zelo reguliran, hkrati pa dinamičen. Kako se bo metabolizem glikogena usmeril, je odvisno od mnogih dejavnikov. Zaloge glikogena v skeletnih mišicah so razdeljena na tri območja: podsarkomerno, intermiofibrilarno in intramiofibrilarno. Vsako od teh območij ima drugačno funkcijo v celici in temu primerno vsaka zase regulira sintezo in razgradnjo glikogenskih granul. Vsaka granula glikogena pa je sposobna tudi samostojnega izvajanja regulacije, pri kateri sodelujejo različni proteini. Eden pomembnejših je protein fosfataza 1 (PP1), ki nadzoruje aktivnost ključnih encimov, kot so glikogen sintaza (GS) in glikogen fosforilaza (GP), pri tem pa mu pomaga glikogen tarčni protein (PTG), ki deluje kot ogrodni protein med PP1 in drugimi proteini. Ta proces je reguliran preko kompleksa laforin-malin, ki prekine povezavo med PP1 in PTG. V seminarju so predstavljene naloge in lastnosti glikogena v treh oddelkih znotraj skeletnih mišic. Predstavljen bo vpliv, ki ga imajo našteti proteini na sintezo glikogena, podrobnejši opis naloge, zgradbe proteinov laforina in malina, kako kompleks laforin-malin inhibira glikogen sintezo ter kakšne so posledice nedelovanja tega proteinskega kompleksa.

==Nika Tomsič - Acetil-CoA: glavni metabolit in sekundarni obveščevalec ==

Acetil-CoA je eden glavnih metabolitov. Deluje kot mejna točka med glikolizo in Krebsovim ciklom. Poleg tega so pomembne tudi njegove naloge kot sekundarni obveščevalec. Nadzoruje ključne celične procese, vključno z energetsko presnovo, mitozo in avtofagijo, tako neposredno kot preko regulacije ekspresije genov. Acetil-CoA običajno nastane v mitohondrijskem matriksu iz piruvata ali kot posledica β-oksidacije dolge verige maščobnih kislin. Lahko pa nastane tudi v citosolu z oksidacijo aminokislin, etanola ali z delovanjem acetil-CoA sintetaze, ki združuje dve glavni komponenti: acetil in koencim A. Razmerje med koncentracijama v mitohondrijskem matriksu in v citosolu je vedno enako. Govorimo torej o nekem dinamičnem ravnotežju, ki ga omogočajo številni prenašalci. Mitohondrijska memebrana je sicer neprepustna za acetil-CoA, zato mora najprej zreagirati v drugo obliko, da lahko vstopa ali iztopa iz mitohondrija. V mitohondrij vstopa piruvat s pomočjo citrat – piruvatnih prenašalcev. Tu piruvat dehidrogenazni kompleks katalizira reakcijo v acetil-CoA. Ko pa je v mitohondriju preveč acetil-CoA, se lahko ta prenese v citosol ali jedro v obliki acetilkarnitina preko karnitinskega prenašalca. V citosolu se spet povrne v acetil-CoA in je lahko vir anabolizma maščobnih kislin ali aminokislin, v jedru pa je njegova funkcija acetiliranje histonov. To omogoči prepisovanje genskega materiala. Lahko pa tudi nadaljuje svojo pot v mitohondriju in vstopi v citratni cikel, kjer je prvi korak pretvorba v citrat preko citratnega sinteznega kompleksa.

==Aleksandra Rauter - Vloga intermediatov Krebsovega cikla v makrofagih==

Makrofagi so nepogrešljive komponente imunskega sistema, ki izhajajo iz matičnih celic kostnega mozga in nastajajo v procesu hematopoeze. Glavne funkcije, ki jih opravljajo so fagocitoza, izločanje citokinov in sodelovanje pri humoralnem imunskem odzivu skupaj z limfociti. Njihovo aktivacijo povzroči prisotnost različnih citokinov, ki se vežejo na specifične TLR receptorje. Najpogostejši ligand klasične aktivacije je lipopolisaharid (LPS), strukturna komponenta celičnih sten bakterij. Zaznava vezanega liganda preko adapterskih proteinov, signalne kaskade, transkripcijskih faktorjev vodi do razvoja enega od dveh fenotipov makrofagov. M1 fenotip ima baktericidno in fagocitno delovanje, M2 pa sodeluje predvsem pri reparaciji tkiv. Točni mehanizmi, ki to povzročijo, še niso poznani. M1 makrofag ima reprogramiran Krebsov cikel, kar povzroči akumulacijo različnih intermediatov v mitohondriju. Ti se lahko prenesejo v citosol preko specifičnih transporterjev in sodelujejo pri različnih regulatornih mehanizmih. Sukcinat povzroči povečano izločanje vnetnih citokinov preko stabilizacije transkripcijskega faktorja HIF-1α, povečanja količine mROS, posttranslacijskih modifikacij proteinov in signalizacije preko z GPCR. Spremenjen Krebsov cikel povzroči akumulacijo citrata, ki je perkurzor itakonata. Ta preko transkripcijske regulacije in inhibicije določenih encimov regulira protivnetni in protimikrobni odziv. Fumarat in α-ketoglutarat sodelujeta pri epigenetski regulaciji celičnih procesov.

==Jakob Tomšič - Funkcije ketonskih telesc v centralnem živčevju ==

Acetoacetat, β-hidroksibutirat in aceton, drugače imenovani tudi ketonska telesca, so produkti našega metabolizma, ki ob pomankanju hranil možgansko tkivo, srce in skeletne mišice oskrbujejo z energijo. Ketogeneze pa danes ne povezujemo le s stanjem pomankanja hranil, ampak jo lahko spodbudimo tudi s tako imenovano ketogeno dieto, ki ji pripisujejo mnoge pozitivne učinke. Vloga ketogene diete pri epilepsiji in drugih nevroloških boleznih je poznana že skoraj stoletje, vendar so bili mehanizmi za antiepileptično delovanje vedno uganka. Trenutno poznamo več funkcij ketonskih telesc, ki presegajo njihovo osnovno metabolno vlogo. Ketonska telesca imajo epigenetski vpliv in lahko spodbujajo izražanje antioksidativnih genov. Prav tako je viden vpliv na vezikularni transport glutamatata z VGLUT v nevronih in zaviranje prenosa signala z GABA nevrotransmiterji. Ketonska telesca izražajo nevrozaščitno in protivnetno vlogo z vplivom na imunski sistem, z vezavo na HCA2 receptor, ki spodbuja nastanek prostagladina D2, in inhibicijo NLRP3 inflamasoma. Nevrološke motnje, kot je epilepsija, imajo več vzrokov, med katerimi sta neizpodbitno prevelika vzburjenost nevronov ter vnetno stanje tkiva. Vedno več dokazov kaže na vlogo ketonskih telesc pri nadziranju in manjšanju števila epileptičnih napadov pri bolnikih. Kljub vsem dokazom in povezavam pa še vedno obstajajo dvomi, da so ravno ketonska telesca tista, ki imajo antiepileptične funkcijo.

==Laura Unuk - Motnje oksidacije dolgoverižnih maščobnih kislin in karnitinskega transporta ==

Motnje oksidacije dolgoverižnih maščobnih kislin (lcFAOD) so dedne avtosomske recesivne bolezni, ki onemogočajo metabolizem maščobnih kislin. Gre za mutacije genov, ki kodirajo encime oksidacije in karnitinskega transporta. Pri oksidaciji dolgoverižnih maščobnih kislin (12-18 C-atomov) sodeluje več kot 15 encimov, vendar le motnja enega lahko pripelje do kliničnih simptomov, kot so šibkost mišic, odpoved jeter, odpoved srca, itd. Glavni encimi, ki katalizirajo karnitinski transport so OCTN2 (organski-kationski-transporter-novel-2), CPT1 (karnitin-palmitoil-transferaza-tipa-1A), CPT2 (karnitin-palmitoil-transferaza-tipa-2) in CACT (karnitin-acilkarnitin-translokaza); encimi, ki pa katalizirajo oksidacijo so VLCAD (zelo-dolgoverižna-acil-CoA-dehidrogenaza), MTP (mitohondrijski-trifunkcijski-protein), LCHAD (dolgoverižna-3-hidroksiacil-CoA-dehidrogenaza) in LCKAT (dolgoverižna-3-ketoacil-CoA-tiolaza). Karnitin je pomembna molekula za prenos dolgoverižnih maščobnih kislin skozi membrano mitohondrija, saj dolgoverižna maščobna kislina lahko vstopi v mitohondrij le v obliki acil-karnitin estra. Najpogostejša motnja pri oksidaciji dolgoverižnih maščobnih kislin pa je motnja VLCAD encima, ki katalizira reakcije odcepa dveh ogljikovih atomov iz maščobne kisline na CoA. Nastali acil-CoA lahko nato vstopi v cikel citronske kisline, kjer nastane ATP. Ob nedelovanju VLCAD pride do pomanjkanja ATP v celici in posledično kliničnih simptomov. Zaznavanje napake enega od encimov je izvedena preko profila acilkarnitina v krvi, plazmi ali DBS. Z metodo NBS ('newborn screening') lahko kmalu po rojstvu že zaznajo motnjo in tako s hitrim zdravljenjem preprečijo neprijetno napredovanje bolezni. Poleg trenutnega zdravljenja so v razvoju različne terapije za zdravljenje motenj, ki pa imajo velik potencial.

==Stefanija Ivanova - Vpliv telovadbe na metabolizem ketonskih telesc ==

Ketonska telesca predstavljajo alternativno energijo za možgane, srce in skeletne mišice pod določenimi pogoji, kot so stradanje, intenzivna vadba, nenadzorovan diabetes ali po zaužitju ketonskih dodatkov. Zanimanje za delovanje ketonskih telesc se je povečalo predvsem pri športnikih. Ker ima uživanje eksogenih ketonov dramatične učinke na metabolizem skeletnih mišic med vadbo, imajo lahko športniki od tega koristi. Pomembna premisleka sta, kako športniki tolerirajo vnos ketonskih estrov med vadbo in ali dodatek ogroža ali vpliva na vnos ogljikovih hidratov. Zaužitje ketonskih dodatkov lahko hitro poveča koncentracijo ketonskih telesc, v primerjavi s ketogeno prehrano ali stradanjem, ki potrebujeta vsaj nekaj dni. Dodatek eksogenih ketonov predstavlja vir energije in ima lahko učinke pri varčevanju zalog ogljikovih hidratov med treningom v času nizke razpoložljivosti ogljikovih hidratov. Varčevanje zalog endogenih ogljikovih hidratov bi teoretično povzročilo večjo zmogljivost med ključnimi deli, med katerim so ogljikovi hidrati prevladujoči substrat. Dokler niso metabolne interakcije dodatkov ketonskih estrov s skeletnimi mišicami med vadbo popolnoma razjasnjene, vse predlagane ergogene lastnosti ostanejo teoretične. Glavni razlog za utemeljevanje eksogenih dodatkov ketonov morajo biti ugotovitve, da se ketoliza med vadbo poveča in pomembno prispeva k oskrbi z energijo. Čeprav obstajajo predlogi, da so dodatki ketonskih telesc koristni za športnike, je trenutno premalo informacij o učinkih dodatkov na metabolizem ketonskih telesc med vadbo. Na številna vprašanja je še treba odgovoriti.

==Nika Perko - Encim karbamoil fosfat sintetaza 1 ==

Karbamoil fosfat sintetaza 1 (CPS1) je limitni encim cikla uree, ker katalizira njeno prvo tristopenjsko reakcijo. Nahaja se v matriksu mitohondrija v celicah jeter, ledvic in tankega črevesa. Sestavljen je iz šestih domen: interakcijske, glutaminazne, integracijske, alosterične in dveh katalitskih. Encim je lahko v neaktivni ali aktivni obliki. Alosterično ga aktivira N-acetil-L-glutamat. Encim se lahko pozitivno regulira s proteinom Sirtuin 5 in glukagonom, negativno pa z mikro RNA miR-19b in od ATP odvisno kinazo (AMPK). Napačno delovanje kateregakoli od petih encimov ali transporterjev cikla uree vodi v zelo redko bolezen – motnje cikla sečnine. Prav motnja v delovanju encima CPS1 povzročajo najhujšo obliko te bolezni. Izrazi se lahko tako v neonatalni dobi kot tudi kasneje, določi pa se jo preko encimske ali genske analize. Simptomi so lahko letargija, bruhanje, encefalopatija in koma. Mutacije tega in tudi preostalih encimov ciklusa povzročijo hiperamoniemijo, ki se jo zdravi s hemodializo in raznimi zdravili, kot so L-arginin hidroklorid, natrijev benzoat in natrijev fenilbutirat. Bolniki se morajo držati stroge diete, bogate z ogljikovimi hidrati in maščobami. Poleg omenjenih zdravil lahko uživajo tudi N-karbamil-L-glutamat, ki deluje kot šaperon, stabilizator in aktivator. Trenutno je edina trajna in učinkovita rešitev transplantacija jeter, v prihodnosti pa bo morda učinkovita tudi genska terapija.

==Neža Leskovar - Urea transporterji in regulacija skoncentriranosti urina ==

Urea je vodotopna polarna molekula, ki lahko počasi prehaja čez celične membrane z difuzijo, hiter in učinkovit transport pa ji omogočajo urea transporterji UT-A in UT-B. Ti sodelujejo pri izločanju odvečnega dušika iz telesa, koncentriranju urina in s tem pri regulaciji tekočinskega ravnovesja ter ponovni uporabi dušika vezanega v urei s pomočjo črevesnih bakterij. Transporterji so v osnovi sestavljeni iz dveh hidrofobnih transmembranskih domen in velike ekstracelularne povezovalne zanke, razen UT-A1, ki je rezultat podvojene osnovne strukture. So N-glikozilirani in imajo znotrajcelični aminski in karboksilni konec. UT-A transporterji se večinoma nahajajo v ledvicah. UT-A1 najdemo v spodnjem predelu ledvičnega zbiralca, v apikalnih delih celic, kjer omogoča prehod uree iz zbiralca v epitelne celice. UT-A3 se prav tako nahaja v spodnjem predelu ledvičnega zbiralca, le da v bazalnih delih celic in omogoča prehod uree nazaj v telesni obtok. UT-A2 se nahaja v Henlejevi zanki in skrbi za prehod uree iz ledvične sredice nazaj v Henlejevo zanko. UT-A4 je bil najden v ledvicah podgan, UT-A5 so našli v testisih miši in UT-A6 v človeškem črevesju. UT-B transporterji se nahajajo v ledvičnih kapilarah, najdemo jih tudi v različnih tkivih. Transport uree je dobro reguliran z vazopresinom, hiperosmolarnostjo, ubikvinacijo in drugimi načini.

==Luka Šegota - Hiperamoniemija ==

Amonijak je pomemben vir dušika v telesu. Ima vlogo skrbnika ravnovesja aminokislin, sodeluje pri sintezi proteinov in zagotavlja pH vrednost okolja. Stanje ko je amonijaka v krvi preveč, imenujemo hiperamoniemija. Telo odstranjuje amonijak v jetrih in v manjšem obsegu tudi v ledvicah preko cikla uree. V možganih pa se amonijak odstrani s pomočjo glutamin sintetaze, ki iz glutamata in amonijaka tvori glutamin, ki je pomemben transporter dušika in s tem amonijaka. Glavni vzrok za hiperamoniemijo so motnje v ciklu uree. Poznamo primarno hiperamoniemijo, ki se razvije zaradi pomankanja encimov ali transporterjev v ciklu uree in pa sekundarno, ki izvira iz inhibicije cikla uree. Amonijak povzroča največje težave v možganih, saj lahko prosto prehaja krvno-možgansko bariero. Tam povzroča pojave kot so otekanje astrocitov, eksitotoksičnost in neravnovesja med aminokislinami, žal pa je večino teh procesov slabo raziskanih, zato je večina mehanizmov opisanih le s hipotezami. Zdravljenje hiperamoniemije poteka preko dveh možnih poti; 1) terapije, ki znižujejo nastanek in absorpcijo amonijaka, tako da zmanjšajo število bakterij, ki proizvajajo ureaze, ali zmanjšajo degradacijo glutamina, 2) terapije, ki izboljšujejo mehanizme izločanja amonijaka, preko aktivacije cikla uree ali sinteze glutamina.

==Ela Bizjak - Mutacije mitohondrijske DNA, heterogenost in mitohondrijske bolezni==

Mutacije mitohondrijske DNA so del mitohondriju lastnega dednega zapisa. Mitohondrijska DNA je krožna molekula, ki je stabilizirana z zvitjem v nukleoide. Najpogosteje mutacije nastanejo med replikacijo, saj je po predvidenih mehanizmih takrat DNA dolgo izpostavljena in enoverižna, prav tako pa je podvajanje pogosto. Poleg tega, da ima mitohondrijska polimeraza šibko eksonukleazno aktivnost, se v bližini dednega materiala nahaja tudi respiratorna veriga, ki proizvaja reaktivne kisikove radikale. Mutacije se širijo glede na njihovo vrsto. Delecije imajo pri podvajanju prednost, ker so manjše kot nemutirane molekule, zato v organelu hitro prevladujejo, dedni prenos delecij pa je zelo redek. Točkovne mutacije se širijo s sproščeno replikacijo, delitvami in fisijami mitohondrijev. Če so prisotne v spolnih celicah matere, jih podedujejo vsi njeni potomci. Heteroplazmija se lahko med tkivi osebka razlikuje. Te razlike so opazne v nepravilnostih na proteinskih superkompleksih, oblikah krist, sestavi mitohondrijske membrane, napetostnem potencialu in okvarah respiratorne verige. S sledenjem mutacijam ali različnim haploskupinam lahko sledimo tudi migracijam populacij. Nekatere dedne mutacije so odgovorne tudi za bolezenska stanja, če je nosilka mutacij mati. Najpogosteje prizadenejo živčevje, pojavijo pa se lahko ob rojstvu ali kasneje med 20. in 40. letom.

==Bor Krajnik - Reaktivne kisikove zvrsti in njihova vloga pri regulaciji celične proliferacije ==

Kisikove reaktivne zvrsti ali krajše ROS so zelo reaktivne zvrsti, ki nastajajo pri redukciji molekularnega kisika, med seboj pa se pretvarjajo spontano ali s pomočjo encimov. V celici sta najpomembnejša predstavnika vodikov peroksid in superoksidni anion. Glaven vir ROS v celici so mitohondriji, kjer nastajajo kot produkt preobremenjenih elektronskih prenašalnih verig. Sprva se je njihova pristnost v organizmih smatrala za izključno škodljivo, ampak danes vemo, da imajo v človeškem organizmu več funkcij. V celici igrajo pomembno vlogo v določenih signalnih poteh, kar dosežejo z oksidacijo predvsem cisteinskih ostankov. Ob hipoksiji so ROS pomembne pri stabilizaciji ene od podenot hipoksija inducibilnih faktorjev (HIF), to so transkripcijski fakorji, ki regulirajo ekspresijo genov in so pomembni za angiogenezo in celično proliferacijo. Prav tako so pomemben člen signalne poti preko katere hormon angiotenzin II spodbuja delitev celic gladkih mišic v žilah. Regulirajo aktivacijo T-celic, kar privede do njihove proliferacije. ROS so vpletene tudi v proliferacijo rakastih celic, v katerih visoki nivoji ROS pomagajo pri angiogenezi, ki je potrebna zaradi hitre rasti tumorja kar vodi v hipoksijo. Zaradi tega so bile preizkušene kot potencialna tarča pri zdravljenju raka vendar so rezultati mešani.

==Maja Kobal - Od UCP1 odvisna in neodvisna termogeneza==

Termogeneza je proces nastajanja toplote in je eden od mehanizmov termoregulacije. Glavni regulator adaptivne nedrgetajoče termogeneze je protein UCP1, imenovan tudi termogenin. To je razklopitveni (ang. uncoupling) protein, ki se nahaja v notranji mitohondrijski membrani rjavih in bež adipocitov (maščobne celice), kjer razklaplja protonski gradient, ki se ustvari med procesom dihalne verige. Gradient protonov preusmeri nazaj v matriks mitohondrija, namesto da bi ta šel preko ATP-sintaze. Tako torej ne nastane ATP, ampak sprosti se toplota, ki segreje celico in pomaga ohranjati stalno telesno temperaturo. Glavni regulatorji delovanja UCP1 so maščobne kisline in purinski nukleotidi; prvi delujejo kot aktivatorji, slednji pa kot inhibitorji. Novejše raziskave pa so pokazale mehanizme in termogene regulatorje v adipocitih, ki so neodvisni od UCP1. Ti mehanizmi so kroženje kalcijevih ionov preko mehanizma SERCA, kreatin-substratni cikel, kroženje lipidov, transport glicerol-3-fosfata in razklop preko N-acil aminokislin. Natančno poznavanje mehanizmov termogeneze bi ponudilo številne nove možnosti za zdravljenje debelosti in sladkorne bolezni tipa 2. Znanje o UCP1 neodvisnih mehanizmih termogeneze bi bilo zelo uporabno za zdravljenje predebelih in starejših ljudi, ki nimajo UCP1-pozitivnih adipocitov. Čeprav že več desetletij potekajo raziskave o termogenezi, je znanje na tem področju pomanjkljivo, tako da bodo potrebne še številne raziskave.

==Martin Stanonik - Ekofiziologija obstoječih fototrofov in vplivi na evolucijo oksigene fotosinteze==

Oksigena fotosinteza je pomemben mikrobiološki proces, ki je omogočil dvig atmosferske koncentracije kisika in posledični razvoj večceličnih organizmov. Pred tem procesom so že obstajali mehanizmi, ki so proizvajali energijo. Za to so potrebovali molekule bogate z elektroni, kot H2S. Vendar ti procesi niso proizvajali kisika, kot stranskega produkta. Zato je sprememba kompozicije atmosfere, ali GOE (Great Oxidation Event) povzročila smrt mnogih organizmov kake 2.5 milijarde let nazaj. Tisti, ki pa so preživeli, so pa razvili obrambne mehanizme proti radikalnimi molekulami (ROS), ki so nastale iz kisika, ali pa so se umaknili v globje predele takratnih oceanov, kjer so še zmeraj prevladovali pogoji pred GOE. Kljub temu znanju natančen pojav in razvoj teh procesov še ni poznan. Danes še obstajajo organizmi, ki izvajajo te procese, nekateri lahko celo oba, vendar je to odvisno od okolja. To, vključno z fosili in filogenetskimi raziskavami, bi nam lahko pomagalo razumeti kako se je razvilo življenje na Zemlji. Organizmi z oskigeno fotosintezo so pomemben vir kisika v okoljih. Oksigena fotosinteza vključuje mnoge dele, kot reaktivne centre (RCI in RCII) in fotosisteme PSI in PSII ter OEC, ki je sistem ,ki tvori stranski produkt kisik. Pojav teh mehanizmov tudi še ni natančno poznan zato bodo potrebne še številne raziskave.

==Tinkara Božič - Pomen saharoze in njenega metabolizma za rastline==
Saharoza je pomemben disaharid, ki vpliva na rast rastlin, njihov razvoj, reprodukcijo in obrambne odgovore. Višek trioza fosfata, ki nastane iz ogljika med aktivno fotosintezo, se v citoplazmi pretvori v saharozo. Z delovanjem saharoze je tesno povezana še trehaloza, oligosaharid iz dveh molekul glukoze, ki ima v celicah regulatorno vlogo. Saharoza je pomembna predvsem zaradi cepitve na heksozi glukozo in fruktozo, kar poteka na dva načina – lahko jo cepi saharozna sintaza ali jo hidrolizirajo invertaze. Slednje encime inhibirajo posebni proteini, imenovani invertazni inhibitorji. Saharozna pot se v rastlinah začne v fotosintetskih tkivih, nadaljuje z nalaganjem v floem, zaključi pa se z odlaganjem iz floema v ponore oz. nefotosintetska tkiva. Invertaze so treh vrst in jih klasificiramo glede na njihov pH ter mesto v celici – poznamo invertaze celične stene, vakuolne invertaze in citoplazemske invertaze. Nastopijo v celicah ponora, ko je potrebna cepitev saharoze na njeni sestavni molekuli. Invertaze celične stene pa sodelujejo še pri obrambnih odgovorih celice na napad patogenih organizmov, ko jo ti izkoriščajo za sladkorje. Če pa patogeni v navezo s celicami prinašajo hranila, ki jih gostitelji potrebujejo, to povezavo imenujemo mikoriza. Ta hranila so v glavnem fosfati, sladkor, ki ga od rastlin prejemajo patogeni organizmi, pa je glukoza.

==Mateja Milošević - CAM tip fotosinteze: Crassulacean Acid Metabolism==
CAM tip fotosinteze je evolucijska prilagoditev določenih vrst rastlin na ekstremne okoljske razmere, kot je pomanjkanje vode in zelo visoke temperature – tipičen primer takih rastlin so kaktusi v puščavi, ali kot prilagoditev ko rastlina ne more privoščiti si dovolj CO₂ čez dan. Takšen tip fotosinteze se od običajnega C3 tipa razlikuje po tem, da vsebuje dodaten encim t. j. fosfoenolpiruvat karboksilaza (PEPC). Ta skupaj z encimom RuBisCO pomaga asimilirati zunanji CO₂. Delovanje teh dveh encimov je časovno ločeno, in prav po tem se CAM fotosinteza razlikuje od še enega tipa fotosinteze – tipa C4. Asimilacija zunanjega CO₂ je ločena po fazah. Da se rastlina izogne prekomerni izgubi vode, čez dan svoje posebne listne pore - stome - zapre, uporablja pa v sebi shranjene energijsko bogate molekule. Ko pride do spremembe v okolici, npr. nastopi noč, rastlina svoje stome odpre in tako sprejme zunanji CO₂. Pomemben intermediat je malat2-, ki nastaja z obdelavo zunanjega CO₂ in se shranjuje v vakuoli v obliki malatne kisline. Ko se malat dekarboksilira, iz njega nastaneta piruvat in CO₂. Ta dva v nadaljnih metabolnih procesih doprineseta energijo in pomembne intermediate..

==Nika Banovšek - Regulacija mlečnih lipidov preko hrane in transkripcijskih faktorjev ter vpliv mleka na novorojenčka==
Mleko je edina, in zato glavna prehrana novorojenčka, ki je v začetnih fazah svojega obstoja zelo ranljiv. V materinih mlečnih žlezah nastajajo primerne sestavine, ki so pomembne tako za periferni kot za centralni razvoj mladiča. Mlečni lipidi so glavna komponenta mleka. Nastajajo preko različnih substratov; med glavne štejemo maščobe kisline, glukozo in glicerol. V citosolu mlečnih epitelnih celic se iz slednjih tvorijo predvsem srednje dolge verige mašobnih kislin, ki igrajo pomembno vlogo v telesu novorojenčka, saj mu prinašajo tako hranilne vrednosti in energijo kakor tudi nekatere signalne molekule. Triacilgliceroli nastajajo v endoplazmatskem retikulumu, kjer se nato zapakirajo kot mehurčki in se iz mlečne epitelne celice izločajo v obliki mleka. Na sestavo mleka in regulacijo njegovih sestavin vplivajo številni dejavniki. Med ključne štejemo transkripcijske faktorje, kot sta, npr. SREBP-1 in PPARγ, in samo prehrano. Če imajo matere novorojenčkov genetske okvare ali slabe prehranske navade, se v celici zgodijo napačne regulacije v sintezi mlečnih lipidov ter pride do tvorbe in izločanja »toksičnega« mleka v alveolih mlečnih žlez. Takšno mleko lahko povzroči velike nepravilnosti v telesu novorojenčka, saj ta zaužije sebi škodljive snovi, ki vodijo do raznih notranjih vnetij. Zaužitje takšne vrste mleka se lahko odraža tudi v dolgoročnem razvoju otroka v obliki različnih bolezni.

==Luka Stanković - LIPIDNE KAPLJE: nastanek, struktura in zorenje lipidnih kapelj==
Lipidne kaplje so bile prvič odkrite pred več kot 100 leti. Kljub temu, se jim do nedavnega ni posvečalo večje pozornosti in pripisovalo znatnejše vloge v delovanju organizma. Danes odkrivamo, da ne gre le za celično strukturo, ki shranjuje lipide, temveč gre za nadvse pomemben organel, ki ga najdemo v vseh evkariontskih celicah. Ne le, da so kaplje nadvse pomembne za metabolne procese, temveč imajo tudi pomembno vlogo pri zaščiti pred lipotoksičnostjo, poškodbi mitohondrijev, obnavljanju homeostaze, zadnje čase pa se odkriva tudi njihov pomen v signalnih poteh. Kljub številnim funkcijam, med katerimi je še veliko neraziskanega, se v seminarju posvečamo predvsem nastanku kapelj, njihovi strukturi in njihovem zorenju. Nastanek lipidne kaplje začnemo z nastankom maščobnih kislin iz acetil CoA. Le-te se v ER skupaj z glicerolom s pomočjo kompleksa encimov pretežno pretvorijo v di- in triacilgliceride. Naraščanje njihove koncentracije znotraj membrane ER povzroči nastanek in odcep kaplje iz membrane. V večini primerov gre za reguliran odcep v citosol. Celoten proces in kasnejšo zorenje uravnava cela kopica proteinov, katerih natančni mehanizmi ali pa celo vloge v nekaterih primerih še niso popolnoma jasni. Napake v delovanju slednjih pa lahko povzročajo hujše zdravstvene zaplete kot so debelost, inzulinska odpornost in posledično diabetis.

== Ana Pervanja - Vpliv cirkadianega cikla na biosintezo lipidov==
Cirkadiani ritem oz. cikel je mehanizem, ki na podlagi zunanjih dražljajev vpliva na delovanje organizma. Proces poteka na osnovi zaznave svetlobe v fotosenzitivnih ganglijskih celicah, ki pošljejo signal v hipotalamus, kjer se nahaja glavna »ura«. Ta nato uskladi ostale organe po telesu. Posledica tega je nihanje regulatornih molekul (oscilatorjev) v perifernih celicah, ki preko glavnih regulatornih encimov vplivajo na metabolizem. Na biosintezo lipidov vplivata dve od cirkadianega cikla odvisni molekuli: transkripcijski faktor SREPB, ki sodeluje pri sintezi maščobnih kislin in sterolov, in jedrni receptor PPARγ, ki vpliva na sintezo maščobnih kislin z zelo dolgimi verigami. V primeru motenj cirkadianega cikla, ki so lahko posledica nepravilnega delovanja regulatornih molekul ali neusklajenosti glavne in perifernih »ur«, pride do disregulacije metabolizma. To lahko vodi do razvoja debelosti, sladkorne bolezni tipa II, ateroskleroze, možganske in srčne kapi idr.

== Aljaž Simonič - Inhibitorji sinteze nukleotidov kot protivirusna zdravila širokega spektra ==
Virusi so parazitski biološki delci, ki v svojih gostiteljih povzročajo bolezni. Večina do sedaj uporabljanih protivirusnih zdravil deluje na virusne proteine, vendar ta pristop ne omogoča zdravljenja več virusov z enim zdravilom in je občutljiv na mutacije virusa. Različne na gostitelja delujoče učinkovine bi lahko kljub hujšim stranskim učinkom delovale kot širokospektralna protivirusna zdravila. Med takšnimi spojinami so obetavni tudi inhibitorji biosinteze nukleotidov, sistema kompleksnih metabolnih poti, ki tvorijo nove purinske in pirimidinske nukleotide ali reciklirajo delno razgrajene. Inhibicija teh poti virusom odvzame molekule, ki jih za replikacijo neizogibno potrebujejo v količinah, ki močno presegajo potrebe ter zaloge zdravih celic in v okuženih celicah zato tudi spodbujajo njihove sintezne poti ali alternativno zavirajo njihovo razgradnjo, ter jih tako prizadanejo bolj kot zdrave celice. V klinični rabi kot protivirusno zdravilo je ribavirin, inhibitor sinteze gvanozina, ki deluje tudi kot mutagen. Za različne druge bolezni se uporabljajo tudi inhibitorji de novo sinteze pirimidinov, vendar zaradi učinkovite reciklaže in visoke koncentracije uridina v krvni plazmi sami po sebi niso uspešni proti virusnim okužbam. To bi lahko popravilo dodajanje inhibitorja reciklažne poti.

== Luka Hafner - GABA in njeni receptorji v človeških možganih ==
GABA ali 4-aminobutanojska kislina je neproteinogena aminokislina, ki je prisotna v večini organizmov . Sprva je bilo mišljeno, da je le sekundarni metabolit v rastlinah in mikroorganizmih. Komaj leta 1950 je bila odkrita tudi v centralnem živčnem sistemu sesalcev in 1967 je bila prepoznana kot nevrotransmiter. Pri sesalcih je prisotna skoraj v vseh tkivih in deluje kot signalna molekula z vrsto vlog. Nastaja v kratki metabolni poti "GABA shunt", in sicer preko glutamat dekarboksilaze, v manjši meri pa pri razgradnji putrescina. V centralnem živčnem sistemu deluje kot inhibitorni nevrotransmiter. Veže se na GABAA in GABAB receptorje. GABAA receptorji so kloridni kanalčki, ki imajo poleg GABA vezavnega mesta številna alosterična vezavna mesta. GABAB receptorji so GPCR receptorji, ki posredno odpirajo kalijeve kanalčke in inhibirajo kalcijeve kanalčke in adenilil ciklazo. Z aktivacijo receptorjev se nevron hiperpolarizira in tako se prepreči prenos signala. GABA ima zelo pomembno vlogo pri prenatalnem razvoju živčnega sistema, kjer vpliva na proliferacijo, migracijo in diferenciacijo živčnih celic. Ker ima GABA tako pomembno vlogo pri uravnavanju delovanja centralnega živčnega sistema, lahko nepravilnosti pri GABA signalizaciji privedejo do številnih nevroloških in psiholoških obolenj.

== Nika Bedrač - Vpliv estrogena in njegovih receptorjev na skeletne mišice ==
Estrogeni so steroidni hormoni, glavni predstavniki pa so 17β -estradiol, estron in estriol. Pri ženskah uravnavajo funkcijo reproduktivnega sistema, rast in razvoj spolnih organov, ohranitev sekundarnih spolnih znakov, imajo pa tudi vpliv na kostno gostoto, delovanje skeletnih mišic, delovanje možganov itd. So male lipofilne molekule, ki lahko direktno prehajajo membrano in se na citosolni strani vežejo na estrogenske receptorje. Od tam se lahko translocirajo v jedro in interagirajo z jedrno DNA, ob enem pa lahko tudi regulirajo transkripcijo in replikacijo mitohondrijske DNA. Glavna estrogenska receptorja sta ER-α in ER-β , razlika med njima je v tem, kateri gen ju kodira in v katerih organih sta prisotna.
Koncentracije estrogena pomembno vplivajo na telesno vzdržljivost in na izbiro substrata, ki ga celica med samo aktivnostjo oksidira. Raziskave so pokazale, da so pri glodavcih samice bile bolj telesno vzdržljive in so kot primarni substrat porabljale maščobne kisline – do podobnih ugotovitev so prišli tudi pri ljudeh. Koncentracija estrogena v telesu pri ženskah bistveno fluktuira in je odvisne od obdobja menstrualnega cikla.
S starostjo se koncentracija estrogena (predvsem pri ženskah) zmanjša, kar pa se lahko odraža v upadu mišične mase in kostne gostote. Za zdravljenje se uporabljajo hormonske nadomestne terapije.

== Srna Anastasovska - Grelin in njegove funkcije v organizmu ==
Grelin je hormon ki je bil odkrit kot endogeni ligand ki se veže na GHS receptor in s tem stimulira sekrecijo GH hormona. Sestavljen je iz 28 aminokislin, kjer je Ser 3 oktaniliran, kar je bistveno za biološko aktivnost hormona. Ta reakcija oktaniliranja katalizira ghrelin O-acil transferaza (GOAT) in je med prvimi peptidni hormoni ki ima takšno modifikacijo. V telesu so prisotni več oblik grelina: acilirane, deacilirane itd. Hormon je identificiran pri mnogih sesalcih in ima podobno funkcijo pri vseh. Grelin ima več funkcij v organizmu: stimulira sproščanje rastnega hormona (GH), signalizira možganom kadar potrebuje vnos hrane tako da aktivira celice v hipotalamusu in hipofizi, vključno z NPY nevroni ki stimulirajo apetit, regulira metabolizem glukoze, poboljša učenje in spomin, regulira metabolizem energije. Ko je želodec prazen, v zgornji regiji sintetizira grelin ki potem po kri ali vagusnem sistemu signalizira in aktivira regije v hipotalamusu (arkuatno jedro) ki nato stimulirajo apetit. Številne funkcije grelina in njegova sposobnost širjenja v številna tkiva omogočajo široko uporabo v medicini pri zdravljenju različnih bolezni ali stanj kot so anemija, bulimija, deficit rastnega hormona, odpoved srca, postoperativnega ileusa, in ima tudi pozitiven učinek na kardiovaskularnem sistemu. Odkritje grelina je omogočilo znanstvenikom vpogled v nove mehanizme regulacije in razumevanje hranjenja.

== Manca Pirc - Galanin, spexin in kisspeptin ==
Hormoni in nevrotransmitorji so ene ključnih molekul za vzdrževanje homeostaze v telesu. Med njih uvrščamo tudi tri sorodne biološke aktivne peptide, in sicer galanin, kisspeptin in spexin. Galanin so odkrili leta 1978 v prašičjem prebavnem traktu, kisspeptin so odkrili leta 1996 v rakavih celicah, ki niso bile zmožne metastaze. Obstoj spexina so leta 2007 potrdili s pomočjo bioinformacijskih študij in tako potrdili njegov obstoj še pred samo izolacijo peptida. Galanin in spexin povzročita odziv v celici preko vezave na receptorje tipa 1 – 3 za galanin (GALR1-3), medtem ko se kisspeptin veže na receptor za kisspeptin (KISS1R ali GPR-54). Spexin specifičnega receptorja pa še niso prepoznali. Njihova biološka vloga še ni popolnoma raziskana, vseeno vemo, da so pomembni pri homeostazi glukoze, vzdrževanju telesne teže, izražanju spolnih hormonov. V nadaljevanju seminarja si bomo pogledali, kakšno vlogo imajo pri homeostazi glukoze, izražanju spolnih hormonov in kako vplivajo na razvoj rakavih obolenj. Spexin, galanin in kisspeptin imajo vsi pozitivne učinke na uravnavanje koncentracije glukoze v krvi, kisspeptin je izredno pomemben sporočevalec za izražanje gnRH (gonadotropin sproščujoči hormon), ki spodbudi izločanje ostalih spolnih hormonov; kisspeptin pa je bil sprva prepoznam kot supresor metastaze.

== Nika Malečkar - Reaktivne kisikove spojine, koencim Q in njuna vloga v glavkomu ==
Glavkom je nevrodegenerativna bolezen očesnega živca, kjer je poškodovan vidni živec na mestu izhoda iz očesa. V Evropi prizadene približno 2 na 100 ljudi, starejših od 40 let. Zaradi velikega odstotka ljudi, ki zaradi neuspešnega zdravljenja oslepi, so se strokovnjaki obrnili k iskanju vzrokov in preprečevanju razvoja bolezni. Kot rezultat velike porabe kisika mrežnih celic, so le-te ranljive na vpliv oksidativnega stresa, ki nastane kot posledica previsokih koncentracij reaktivnih kisikovih spojin. To so prosti radikali, ki vplivajo na nepravilno delovanje mitohondrijev, oksidacijo encimov, motnje prenosa signalov in posledično povzročajo apoptozo celic. Njihov škodljivi učinek preprečujejo antioksidanti, med njimi tudi koencim Q10, ki ima vitaminu podobne funkcije. Nahaja se v večjih ali manjših koncentracijah povsod po telesu, je ključen dejavnik prenosa elektronov v ATP sintezi ter pomemben zaradi svoje antioksidantske in obnovitvene sposobnosti. Uporabljamo ga lahko kot prehransko dopolnilo, kremo ali zdravilo pri nevrodegenerativnih boleznih, med drugim tudi v glavkomu. Koencim Q inhibira apoptozo, ohranja morfologijo mitohondrija in pravilno izražanje mitohondrijske DNA ter deluje kot pufer pri porušeni homeostazi kalcija. V tej seminarski nalogi bom bolj natančno predstavila delovanje in vpliv reaktivnih kisikovih spojin ter koencima Q in opisala njuno vlogo v glavkomu.

== Evgen Kozole - Sirtuini in njihova vloga v organizmu ==
Vsak posameznik bi si v današnjem času želel, da bi dočakal dolgo življenjsko dobo in bil pri tem tudi zdrav. V organizmu obstajajo molekule, ki s svojim delovanjem neposredno vplivajo na proces staranja in druge biološke procese, kot na primer transkripcijo genov, apoptozo, metabolizem in popravljanje DNA. Gre za tako imenovane sirtuine. Sirtuini so družina proteinov, ki imajo encimsko aktivnost, ki je v večini primerov odvisna od NAD+ deacetilaze, preko katere vplivajo na transkripcijo genov, nekateri pa imajo tudi ADP-ribozilazno aktivnost. V človeškem organizmu lahko najdemo sedem različnih sirtuinov (SirT1-7), ki se predvsem razlikujejo po tem, kje v celici se nahajajo in kakšne so njihove vloge. Lastnost, ki je skupna večini sirtuinov je uravnavanje metabolizma in transkripcija genov. Njihovo delovanje v organizmu je skrajno pomembno, saj regulirajo procese, ki so življenjskega pomena, kot na primer izločanje inzulina, glikolizo, uravnavanje reaktivnih kisikovih zvrti in še mnoge druge. Nekateri sirtuini vplivajo tudi na potek kroničnih bolezni in so zadolženi za odziv imunskega sistema. V določenih primerih lahko izboljšajo potek kroničnih bolezni in odziv imunskega sistema, lahko pa tudi poslabšajo situacijo v primeru, da pride do mutacije gena in organizem izloča preveliko količino določenega sirtuina.

== Petra Sintič - Triptofan in njegova vloga v telesu ==
Triptofan (simbol Trp) je ena od osmih esencialnih aminokislin, ki jih v človeškem telesu ni mogoče sintetizirati in jih je treba dovajati s hrano, predvsem iz živalskih ali rastlinskih virov. Čeprav ima nižjo koncentracijo v človeškem telesu glede na ostale primarne aminokisline, je triptofan ključna sestavina številnih presnovnih funkcij. Pomemben je za presnovo proteinov in je predhodnik nekaterih zelo pomembnih snovi v telesu, kot so nevrotransmitor serotonin, hormon melatonin in eden najbolj pomembnih B-kompleksov, niacin. Serotonin, ki ga imenujemo tudi hormon sreče nam daje občutek zadovoljstva in dobrega počutja. Melatonin ima pa glavno vlogo pri uravnavanju dnevno-nočnega cikla. Sposobnost spreminjanja hitrosti sinteze serotonina v možganih z manipulacijo koncentracije triptofana je temelj številnih raziskav, zlasti na temo pomanjkanja ali izčrpavanja L-triptofana in posledic le tega. Poleg tega so klinični testi zagotovili nekaj začetnih dokazov o učinkovitosti triptofana za zdravljenje psihiatričnih motenj, preprečevanje agresije, motenj spanca, sezonsko efektivnih motenj, zlasti kadar se uporablja v kombinaciji z drugimi terapevtskimi sredstvi. Vendar so rezultati teh raziskav za enkrat še vedno preveč neodločni in ne konsistentni in so na to temo potrebne še nadaljne raziskave in preskušnje.

== Eva Kanalec - Oksitocin in njegova vloga v telesu ==
Oksitocin je peptidni hormon, sestavljen iz devetih aminokislin. Prvih šest aminokislin ima ciklično strukturo, ki je posledica disulfidne vezi med cisteinoma, zadnje tri aminokisline pa imajo linearno strukturo. Njegova sinteza poteka v hipotalamusu, skladišči se v zadnjem režnju hipofize oziroma v nevrohipofizi, od koder se tudi sprošča v krvni obtok. V telesu se veže na oksitocinske receptorje, ki jih najdemo v maternici, hipofizi, ledvicah in v ventromedialnem nukleusu hipotalamusa. Receptor je sestavljen iz sedmih transmembranskih domen, ki so na notranji strani membrane sklopljeni z G-proteinom, ta poskrbi za prenos signala naprej po celici. Receptor je specifičen za vezavo oksitocina, saj bi se nanj lahko vezali oksitocinu podobni hormoni kot je na primer vazopresin. Oksitocin ima v telesu pomembno vlogo pri porodu, kjer skrbi za krčenje gladkih mišic maternice. Pomembno vlogo pa naj bi imel tudi pri vplivu na apetit in izbor hrane. Vlogo ima tudi pri navezovanju socialnih stikov, kot je stik med materjo in dojenčkom, ter stik med partnerjema. Dokazano je bilo, da imajo socialni stiki vpliv na povečano raven oksitocina v telesu. V zdravstvu se antagoniste oksitocinskih receptorjev uporablja za zaviranje prezgodnjih porodov, oksitocin pa se uporablja za sprožitev poroda. Potencial za razvoj novih terapij, ki bi temeljile na tarčenju oksitocinskega receptorja ali uporabljale oksitocin, je zelo velik.

== Špela Kladnik - Leptin in njegova potencialna vloga biomarkerja za debelost ==
Debelost je bolezen modernega časa. Statistični podatki nakazujejo, da je debelih vedno več ljudi, debelost pa se v veliko primerih začne pojavljati že v zgodnjih letih. Prekomerna telesna teža ni vedno posledica napačnega prehranjevanja in nezdravega načina življenja. Pojavi se lahko tudi zaradi morebitnih genskih napak in, kakor je bilo raziskano, tudi zaradi motenj v delovanju hormona leptina, ki je eden od hormonov za regulacijo hranjenja. Leptin nastaja v maščobnih celicah in z delovanjem na hipotalamus uravnava vnos hrane in apetit. Je polipeptid, sestavljen iz štirih antiparalelnih α-vijačnic, ki se veže na receptor preko signalne poti JAK-STAT. V telesu imamo več oblik leptinskih receptorjev, ki se razlikujejo v dolžini znotrajcelične domene. Najbolj sta raziskani obliki Ob-Rb, ki je glavna za prenos signala, in (s)Ob-Re, ki je topni leptinski receptor. Določanje koncentracije prostega, vezanega in celotnega leptina ter koncentracije topnih leptinskih receptorjev ima pomembno vlogo pri razumevanju pojava debelosti. Pri vitkih osebah se leptin večinoma nahaja vezan na receptor, medtem ko se pri debelih ljudeh večinoma nahaja v prosti obliki. Zmanjšanje koncentracije topnega leptinskega receptorja lahko nakazuje na manjše število delujočih receptorjev, zato se lahko leptin že v zgodnjih letih uporablja kot biomarker za napovedovanje in zdravljenje debelosti.

==David Verdel - Biosinteza in raznolikost presnove terpena v rastlinah ==
Terpeni al z drugo besedo terpenoidi so večkrat teme raziskav na področju kemije in biokemije kot tudi biologije. Uporabljamo jih v različnih panogah in imajo pomembno ekološko vlogo za rastline in ekosistem. Vse rastline sintetizirajo raznovrstne in edinstvene terpenoide. Nekatere najdemo v večini rastlinah in so skupni vsem, vendar se mnogi sintetizirajo le v določenih taksonih in se vključujejo v določene ekološke razmere. Osnovne biosintetske poti terpenoidov s pomočjo terpen sintaze (TPS), so pogoste pri vseh rastlinah. Nekatere sintetizirajo terpene po mevalonski poti (MVA) nekatere pa po nemevalonski poti (MEP) kjer s pomočjo izopentenil difosfata (IPP) in njegovega alilnega izomera dimetilalil difosfata (DMAPP) ter terpen sintaze (TPS) sintetizirajo od monoterpenov do tetraterpenov in nekateri celo tudi hemiterpene. Nedavne raziskave dokazujejo, da se pri sintezi terpenov uporablaja mnogo več substratov, ki jih lahko uporabljajo encimi terpen sintaze (TPS). Nekateri encimi lahko katalizirajo tvorbo terpenov, čeprav niso iz družine encimov terpen sintaze (TPS). Novo odkriti substrati v nekaterih rastlinah s pomočjo terpen sintaze (TPS) lahko sintetizirajo terpene po različnih poteh kot tudi nekatere povezane z mikrobno TPS. V nekaterih rastlinah pa se celo pojavlja novo odkrit medorganski način prenosa terpenov v rastlinah in nove mehanizmi sinteze terpenov.

BIO2 Seminar 2020

2021-01-06T21:46:01Z

Lsegota:

= Biokemijski seminar =
doc. dr. Gregor Gunčar, K2.022

== Seznam seminarjev ==
{| {{table}}
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''ime in priimek'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''poglavje'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''naslov seminarja'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''recenzent 1'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''recenzent 2'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''datum oddaje'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''datum recenzije'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''datum predstavitve'''
|-
| Ajda Beltram||12||Zgradba in dinamika signalnih kompleksov GPCR||Luka Hafner||Tinkara Božič||16/10/20||19/10/20||21/10/20
|-
| Jan Bregar||12||Protein retinoblastoma||Nika Bedrač||Martin Stanonik||16/10/20||19/10/20||21/10/20
|-
| Anja Moškrič||12|| Presinaptični kalcijevi kanalčki kot specializiran nadzor za sproščanje nevrotransmiterjev||Srna Anastasovska||Luka Stanković||16/10/20||19/10/20||21/10/20
|-
| Gregor Strniša||12||Načini aktivacije GPCR||Manca Pirc||Ana Pervanja||23/10/20||26/10/20||28/10/20
|-
| Vid Dobrovoljc||12||Medsebojni vpliv signalnih poti na primeru RTK in GPCR signalnih poti||Maruša Sernc||Nika Banovšek||23/10/20||26/10/20||28/10/20
|-
| Nikola Janakievski||12||Selective androgen receptor modulators||Ajda Beltram||Aljaž Simonič||23/10/20||26/10/20||28/10/20
|-
| Rebeka Jerina||12||Kofein kot antagonist adenozinskih receptorjev||Jan Bregar||Luka Hafner||30/10/20||02/11/20||04/11/20
|-
| Eva Vene||12||Povezava bolečine z vezavo kapsaicina na TRPV1||Anja Moškrič||Nika Bedrač||30/10/20||02/11/20||04/11/20
|-
| Zala Perko||12||Mehanizmi vezave ligandov in regeneracija fotoreceptorjev očesne mrežnice||Gregor Strniša||Srna Anastasovska||30/10/20||02/11/20||04/11/20
|-
| Erik Putar||14-15||AMPK: senzor glukoze in celičnega energijskega stanja||Nikola Janakievski||Manca Pirc||06/11/20||09/11/20||11/11/20
|-
| Iva Matić||14-15||||Rebeka Jerina||Maruša Sernc||06/11/20||09/11/20||13/01/21
|-
| Timotej Sotošek||14-15||Regulacija mišičnega glikogena: granula in njeni proteini||Eva Vene||Ajda Beltram||06/11/20||09/11/20||11/11/20
|-
| Nika Tomsič||16||Acetil-CoA: glavni metabolit in sekundarni obveščevalec||Zala Perko||Jan Bregar||13/11/20||16/11/20||18/11/20
|-
| Andrej Špenko||16||||Erik Putar||Anja Moškrič||13/11/20||16/11/20||18/11/20
|-
| Aleksandra Rauter||16||Vloga intermediatov Krebsovega cikla v makrofagih||Iva Matić||Gregor Strniša||13/11/20||16/11/20||18/11/20
|-
| Laura Unuk||17||Motnje oksidacije dolgoverižnih maščobnih kislin in karnitinskega transporta||Timotej Sotošek||Nikola Janakievski||20/11/20||23/11/20||25/11/20
|-
| Stefanija Ivanova||17||Vpliv telovadbe na metabolizem ketonskih telesc||Nika Tomsič||Rebeka Jerina||20/11/20||23/11/20||25/11/20
|-
| Jakob Tomšič||17||Funkcije ketonskih telesc v centralnem živčevju||Andrej Špenko||Eva Vene||20/11/20||23/11/20||25/11/20
|-
| Neža Leskovar||18||Urea transporterji in regulacija skoncentriranosti urina||Aleksandra Rauter||Zala Perko||27/11/20||30/11/20||02/12/20
|-
| Luka Šegota||18||Hiperamoniemija||Laura Unuk||Erik Putar||27/11/20||30/11/20||02/12/20
|-
| Nika Perko||18||Encim karbamoil fosfat sintetaza 1||Stefanija Ivanova||Iva Matić||27/11/20||30/11/20||02/12/20
|-
| Ela Bizjak||19||Mutacije mitohondrijske DNA, heterogenost in mitohondrijske bolezni||Jakob Tomšič||Timotej Sotošek||04/12/20||07/12/20||09/12/20
|-
| Bor Krajnik||19||Reaktivne kisikove zvrsti in njihova vloga pri regulaciji celične proliferacije||Neža Leskovar||Nika Tomsič||04/12/20||07/12/20||09/12/20
|-
| Maja Kobal||19||Od UCP1 odvisna in neodvisna termogeneza||Luka Šegota||Vid Dobrovoljc||04/12/20||07/12/20||09/12/20
|-
| Mateja Milošević||20||CAM tip fotosinteze: Crassualacean Acid Metabolism||Nika Perko||Andrej Špenko||11/12/20||14/12/20||16/12/20
|-
| Tinkara Božič||20||Pomen saharoze in njenega metabolizma za rastline||Ela Bizjak||Aleksandra Rauter||11/12/20||14/12/20||16/12/20
|-
| Martin Stanonik||20||Ekofiziologija obstoječih fototrofov in vplivi na evolucijo oksigene fotosinteze||Bor Krajnik||Laura Unuk||11/12/20||14/12/20||16/12/20
|-
| Luka Stanković||21||Nastanek, struktura in zorenje lipidnih kapelj v organizmu||Maja Kobal||Stefanija Ivanova||18/12/20||21/12/20||23/12/20
|-
| Ana Pervanja||21||Vpliv cirkadianega ritma na biosintezo lipidov||Mateja Milošević||Jakob Tomšič||18/12/20||21/12/20||23/12/20
|-
| Nika Banovšek||21||Regulacija mlečnih lipidov preko hrane in transkripcijskih faktorjev ter vpliv mleka na novorojenčka||Tinkara Božič||Neža Leskovar||18/12/20||21/12/20||23/12/20
|-
| Aljaž Simonič||22||Inhibitorji sinteze nukleotidov kot protivirusna zdravila širokega spektra||Martin Stanonik||Luka Šegota||23/12/20||28/12/20||30/12/20
|-
| Luka Hafner||22||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2020#Luka_Hafner_-_GABA_in_njeni_receptorji_v_.C4.8Dlove.C5.A1kih_mo.C5.BEganih GABA in njeni receptorji v človeških možganih]|||Luka Stanković||Ana Žagar||23/12/20||28/12/20||30/12/20
|-
| Ana Žagar||22||||Vid Dobrovoljc||Nika Perko||23/12/20||28/12/20||30/12/20
|-
| Nika Bedrač||23|||Vpliv estrogena in estrogenskih receptorjev na skeletne mišice ||Ana Pervanja||Ela Bizjak||30/12/20||04/01/21||06/01/21
|-
| Srna Anastasovska||23||Grelin in njegove funkcije v organizmu||Nika Banovšek||Bor Krajnik||30/12/20||04/01/21||06/01/21
|-
| Manca Pirc||23||Galanin, spexin in kisspeptin||Aljaž Simonič||Maja Kobal||30/12/20||04/01/21||06/01/21
|-
| Maruša Sernc||23||Učinki uporabe kreatina v športu in medicini||Ana Žagar||Mateja Milošević||08/01/21||11/01/21||13/01/21
|-
| Lea Nicouleau||any chapter||||||||06/01/21||11/01/21||13/01/21
|-
| Marjorie Leaud||any chapter||||||||06/01/21||11/01/21||13/01/21
|-
| Evgen Kozole||||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2020#Evgen_Kozole_-_Sirtuini_in_njihova_vloga_v_organizmu Sirtuini in njihova vloga v organizmu]||||||||||
|-
| Eva Kanalec||||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2020#Eva_Kanalec_-_Oksitocin_in_njegova_vloga_v_telesu Oksitocin in njegova vloga v telesu]||||||||||
|-
| Špela Kladnik||||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2020#.C5.A0pela_Kladnik_-_Leptin_in_njegova_potencialna_vloga_biomarkerja_za_debelost Leptin in njegova potencialna vloga biomarkerja]||||||||||
|}

*številka v okencu za temo pomeni poglavje v Lehningerju, v katerega naj izbrana tema spada
Razporeditev je začasna in se lahko še spremeni, načeloma pa se termini do vključno 18. poglavja ne bodo spreminjali.
Prosim,da mi sporočite morebitne napake ali če vas nisem razporedil.

== Gradivo za predavanja ==
Gradivo za predavanja in seminarje najdete na http://bio.ijs.si/~zajec/bio2/
username: bio2
password: samozame

==Naloga==
'''Vaša naloga za seminar je: '''
Samostojno pripraviti seminar o seminarski temi, ki vam je bila dodeljena. Za osnovo morate vzeti pregledni članek iz revije, ki ima faktor vpliva nad 5 (npr. [http://www.sciencedirect.com/science/journal/09680004/ TIBS]. Poiskati morate še vsaj tri znanstvene članke, ki se nanašajo na opisano temo in jih uporabiti kot podlago za seminarsko nalogo! Članki so dostopni [http://93.174.95.27/scimag/ tukaj].

Za pripravo seminarja velja naslednje: 
* [[BIO2 Povzetki seminarjev 2020|Povzetek seminarja]] opišete na wikiju '''v 200 besedah''' (+- dvajset besed) - najkasneje do dne ko morate oddati seminar recenzentom.
* Povezavo do povzetka vnesete v tabelo seminarjev tekočega letnika.
* Seminar pripravite v obliki seminarske naloge na ~5-12 straneh A4 (pisava 12, enojni razmak, 2,5 cm robovi). Obseg seminarja naj bo 2700 do 3000 besed , a ne več kot 3500 besed. Seminarska naloga mora vsebovati najmanj tri slike, bolje več. Eno sliko morate narisati sami in to pod sliko posebej označiti. Slika mora imeti legendo in v besedilu mora biti na ustreznem mestu sklic na sliko. 
* Seminar oddajte do datuma oddaje, ki je naveden v tabeli v elektronski obliki z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/ tega obrazca].
* Vsi seminarji so v elektronski obliki dostopni [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/bioseminar/ tukaj].
* Recenzenti do dneva določenega v tabeli določijo popravke (v elektronski obliki) in podajo oceno pisnega dela. Popravljen seminar oddajte z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/ tega obrazca].
* Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Za predstavitev je na voljo 20-25 minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni.
* Predstavitvi sledi razprava. Recenzenti podajo oceno predstavitve in postavijo najmanj dve vprašanji.Vsi ostali morajo postaviti še dve dodatni vprašanji v okviru celega seminarskega obdobja. Vprašanja, ki ste jih postavili vpišite na [https://docs.google.com/forms/d/e/1FAIpQLSdV9OFlNzI3XyS8FRGnuIbG89gwH_36uwz29ocigV--2CXSbQ/viewform tukaj].
* Na dan predstavitve morate docentu še pred predstavitvijo oddati končno (popravljeno) in natisnjeno verzijo seminarja v enem izvodu, elektronsko verzijo seminarja in predstavitev pa oddati na strežnik na dan predstavitve do polnoči.
* Seminarska naloga in povzetek morajo biti v slovenskem jeziku, razen za študente, katerih materni jezik ni slovenščina. Ti lahko oddajo seminar v angleškem jeziku.

==Imena datotek==
Prosim vas, da vse datoteke, ki mi jih pošiljate poimenujete po naslednjem receptu:
* 312_BIO_Priimek_Ime.doc(x) za seminar, npr. 312_BIO_Guncar_Gregor.docx
* 312_BIO_Priimek_ime_final.doc(x) za končno verzijo seminarja
* 312_BIO_Priimek_Ime_rec_Priimek2.doc(x) za recenzijo, kjer je Priimek2 priimek recenzenta, npr. 312_BIO_Guncar_Gregor_rec_Scott.docx (če se pišete Scott in odajate recenzijo za seminar, ki ga je napisal Gunčar)
* 312_BIO_Priimek_Ime.ppt(x) za prezentacijo, npr 312_BIO_Guncar_Gregor.pptx
* 312_BIO_Priimek_ime_poprava.doc(x) za popravljeno končno verzijo seminarja, če so popravki manjši

==Ocenjevanje seminarjev==
Recenzenti ocenijo seminar tako, da izpolnijo [https://docs.google.com/forms/d/1EQDYwFO-DEzZ2R7jf8DhLqIeV4FFxRd3-ScceEASpt4/viewform recenzentsko poročilo] na spletu. Recenzentsko poročilo morate oddati najkasneje do 21:00, en dan pred predstavitvijo seminarja.

== Mnenje o predstavitvi ==
Vsak posameznik odda svoje mnenje o predstavitvi takoj po predstavitvi z online glasovanjem.

==Urejanje spletnih strani na wikiju==
Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''

==Citiranje virov==
Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se držite ene same. V seminarskih nalogah in diplomskih nalogah FKKT uprabljajte shemo citiranja, ki je pobarvana zeleno.
Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati.
Za citate v naravoslovju je najpogostejše citiranje po pravilniku ISO 690. [http://www.zveza-zotks.si/gzm/dokumenti/literatura.html Pravila], ki upoštevajo omenjeni standard, so pripravili pri ZTKS. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati. 
'''Citiranje knjig:''' 
Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica. 
Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN. 

Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005. 
Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4. 
Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.).

'''Citiranje člankov:''' 
Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani. 
Lartigue, C., Glass, J. I., Alperovich, N., Pieper, R., Parmar, P. P., Hutchison III, C. A., Smith, H. O. in Venter, J. C.
Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, 317, str. 632-638.

Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole: 
Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani. 
Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.

Revija Science uporablja skrajšani zapis: 
C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007) 

V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne). Navesti morate tudi vse avtorje dela, razen v primeru, ko jih je 10 ali več. Takrat navedite le prvih devet, za ostale pa uporabite okrajšavo in sod. (in sodelavci). Pred zadnjim avtorjem naj bo vedno besedica "in".

'''Citiranje spletnih virov:''' 
Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov 
strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life 
Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.

TBK2020 Povzetki seminarjev

2020-04-07T08:36:56Z

Lsegota:

=== Gregor Strniša: Vpliv genoma okroglega gobija na njegovo invazivnost===

Invazivne vrste predstavljajo velik problem naši družbi, saj s svojim širjenjem spreminjajo ravnotežje v ekosistemih. Razumevanje njihovega genoma je ključnega pomena za prepoznavanje sposobnosti, ki jim omogočajo prilagajanje na življenje v drugačnih krajih. Okrogli gobi je ena najbolj uspešnih invazivnih vrst, ki se je razširila iz svojega nativnega območja ob Črnem morju vse do Velikih jezer v Ameriki. Znanstveniki so ob primerjavi genoma okroglega gobija z drugimi podobnimi vrstami odkrili nenavadne prilagoditve, zaradi katerih lažje preživi v novih okoljih. Razširjena področja genov za imunski sistem mu omogočajo boljšo obrambo pred drugačnimi mikroorganizmi, ki jih lahko sreča v novem okolju. Povečana so vsa območja genov za nastanek inflamosoma - celične strukture, ki inducira nadzorovano celično smrt preko piroptoze ob detekciji tujih mikroorganizmov. Ima razširjeno območje genov družine CYP (citokromi P450), ki sodelujejo pri razgradnji telesu tujih snovi. Odkrili so še nekaj mutacij genov na receptorjih za vid in voh, za katere pa se še ne ve, ali imajo vpliv na preživetje okroglega gobija v novih okoljih. Nadaljnje raziskave drugih invazivnih vrst bodo pokazale, kako lahko omejimo njihovo širjenje in ohranimo naše ekosisteme.

=== Jan Trebušak:Vbod klopa vrste Amblyomma americanum sproži proizvodnjo IgE in preobčutljivost preko celic T CD4+ in od MyD88 odvisnih poti.===
Alergije, ki jih pri ljudeh sproži vbod klopa so bile zaradi zakasnelih simptomov diagnosticirane šele pred kratkim, predstavljajo pa naraščujočo grožnjo javnemu zdravju. Sindrom alfa-gal je alergija, ki se lahko pojavi, ko gostitelj ob vbodu pride v stik z molekulami galaktoze-alfa-1,3-galaktoze iz klopove sline, to je krvni antigen, ki v klopa pride s pitjem krvi svojega gostitelja. V takih primerih postane oseba alergična na vse vrste mesa, ki vsebujejo omenjeni ogljikov hidrat t.j vse rdeče meso, razen meso višjih primatov in ljudi. Alergija na rdeče meso je ena izmed redkih alergij na hrano, ki lahko sproži hude kožne, gastrointestinalne in respiratorne reakcije, oziroma anafilakso, buren odziv telesa najverjetneje sprožijo specifična protitelesa IgE. Ker so mehanizmi po katerih pride do alergij na hrano slabo poznani, je bil cilj študije razviti mišji model alergijske senzitizacija ob dermalni izpostavitvi klopom, ki bi ga potencialno lahko uporabili za identifikacijo mehanizmov, ki nazdorujejo sprožitev IgE protiteles povezanih z boleznimi, ki jih prenašajo klop.

=== Sara Golob: Vpliv virusa Herpesa simpleksa tipa 1 na razvoj Alzheimerjeve bolezni ===

Pri Alzheimerjevi bolezni pride do padca kognitivnih funkcij, kot so spomin, govor, pozornost, učenje, itd. Razvije se zaradi različnih dejavnikov, ki so lahko dedni ali okoljski. Eden od okoljskih dejavnikov je okužba z virusom Herpes simpleks tip 1. Ta povzroči večje izražanje ε4 alela apolipoproteina E, ki povzroča nalaganje Tau proteina in amiloida beta, ki sestavljata senilne plake pri Alzheimerjevi bolezni. To povezavo so odkrili s protitelesi proti virusu Herpes simpleks tipa 1 ter preko lizosomske okvare, zaradi katere pride do nalaganja amiloida beta v možganih. Dokazana je bila tudi povezava med Alzheimerjevo boleznijo in drugimi boleznimi (epilepsija, demenca, shizofrenija, fibromialgija, demenca), pri katerih je opazna kognitivna disfunkcija. Pri bolnikih z epilepsijo so odkrili amiloidne plake, ki so značilni za Alzheimerjevo bolezen, zaradi česar je večja verjetnost, da oboleli za epilepsijo zbolijo še za Alzheimerjevo boleznijo in obratno. Herpes simpleks virus redko povzroča tudi akutni encefalitis, katerega posledica so epileptični napadi, izguba spomina in spremembe v vedenju. Zato znanstveniki menijo, da je povezava med epilepsijo in Alzheimerjevo boleznijo tudi v apolipoproteinu E.

=== Ena Kartal: Kako celično staranje vodi do nevrodegeneracije ===
Čeprav je bila vzpostavljena povezava med kroničnim vnetjem in nevrodegenerativnimi boleznimi, je bilo veliko odprtih vprašanj v zvezi s tem, kako celično staranje, proces, pri katerem celice, ki se nehajo deliti pod stresom, izločijo mešanico vnetnih beljakovin, vplivajo na te patologije. Raziskovalci poročajo, da staranje v astrocitih, ki je najbolj razširjena vrsta celic v možganih, vodi do škodljive '' ekscitotoksičnosti '' na kortikalnih nevronih, ki so vključeni v spomin.In pri tem pride do Alzheimerjeve bolezni,ki je najpogostejši vzrok demence pri starejših, je nepopravljiva, napredujoča možganska motnja, ki ubija možganske celice in postopoma uničuje spomin.

=== Lenka Stanković: Optimizirano antiangiogeno reprogramiranje tumorskega mikrookolja potencira imunoterapijo CD40 ===

Karakteristika raka je njegova sposobnost spodbujanja angiogeneze, oziroma tvorba novih krvnih žil. Angiogeneza prispeva k rasti in napredovanju tumorja z induciranjem in vzdrževanjem kislega / hipoksičnega in imunosupresivnega okolja. Krvne žile v rakih so pogosto nefunkcionalne in omejujejo promet s T-celicami. Odkritje angiogenih zaviralcev naj bi pripomoglo k zmanjšanju umrljivosti zaradi karcinomov. Tukaj prikazujemo, da imunoterapija proti CD40 poveča tumorsko infiltracijo CD8+T, vendar regresijo tumorja dosežemo močneje, če anti-CD40 kombinirano z dvojno blokado Ang2 in VEGFA. Kombinacija anti-VEGFA, anti-Ang2 in agonističkih protiteles proti anti-CD40 omogoča zavrnitev tumorjev pri sintetičnih modelih tumorjev. Proučevali so odzive tumorjev na anti-VEGFA, anti-Ang2 in agonistična protitelesa proti CD40 v različnih modelih mišjega raka. V raziskavi so pokazali, da kombinacija agonističnih protiteles CD40 z dvojno blokado VEGFA/Ang2 povečuje protitumorski odziv v modelnih raka miši s pomočjo sinergistične regulacije genov in indukcije imunskega permisivnega mikrookruženja tumorja, za katero je značilno provnetno (M1 podobno) aktivacijo makrofagov, vaskularno normalizacija ter izboljšanja infiltracije in prostorska lokalizacija efektorskih T-celic. T-celice pošljejo signale drugim vrstam imunskih celic, vključno s citotoksičnimi T celicami CD8+. Citotoksične T-celice, znane tudi kot CD8 + T-celice, izražajo svoje TCR, ki jih spremlja glikoprotein CD8. CD8 + T-celice so povezane z učinkovitim ubijanjem rakavih celic: med antigensko specifično aktivacijo afiniteta med CD8 glikoproteinom, izraženim s celico CD8 + T, in molekulo MHC razreda I, izraženo z rakavo celico, ohranja obe vrsti celic skupaj. Tesna vezava T celic in rakavih celic skozi kompleks CD8 / TCR in kompleks antigen / MHC-I povzroči, da celice CD8 + T izločajo perforin in grancime, kar vodi v lizo rakavih celic.

=== Nika Tomsič: Pomembnost in delovanje sladkornega prenašalca PfHT1 v parazitu malarije ===
Po oceni World Health Organisation- World malaria report 2019 je v letu 2018 bilo 228 milijonov primerov malarije. Sladkor je glavni vir energije parazita, zato je razumevanje presnove sladkorjev pomembna tema, ki bi lahko predstavljala pomoč pri sestavljanju zdravil in izrivanju tega parazita. Glavna razlika v presnovi sladkorjev med parazitom in drugimi organizmi je prenašalec, ki sladkorje prenaša v celico. Za to je odgovoren šeskotni prenašalec PfHT1, ki je sposoben transportirati bodisi glukozo kot fruktozo. Strukturno pa je zelo podoben prenašalcem človeške celice GLUT. Prenašalec obsega 12 transmembranskih vijačnic, ki tvorijo osrednjo pot za vstop glukoze. Ključni del proteina pa predstavljajo izrastki ki delujejo kot receptorji za sladkorje. Sladkorne prenašalce še nadaljnjo stabilizirajo solne medcelične povezave. Druga velika razlika med PfHT1 in drugimi prenašalci je brez dvoma način odpiranja in zapiranja prenašalca, saj ni sestavljenen samo iz treh običajnih stanj (odprto navznoter, zaprto, odprto navznoter), temveč ga zaznamujejo še dve vmesni stanji (zaprto navznoter in zaprto navzven, angl. inward–occluded in outward-occluded). Nadaljnjo raziskovanje bi torej lahko omogočilo razvoja novih antimalaričnih zdravil, ki blokirajo uvoz sladkorja in zastrašujejo parazita do smrti oz. razvoja novih zaviralcev, ki so bolj specifični za blokiranje funkcije PfHT1, ne da bi pri tem vplivali na transport sladkorja v človeških celicah.

=== Maša Mencigar: Vpliv apoptotskih celic na imunski sistem ===
Apoptotske celice v telesu lahko nadzorujejo imunski sistem in preprečijo nezaželene imunske odzive na telesu lastna tkiva oziroma celice. Avtoimune bolezni so kronične, neozdravljive in predstavlajo velik zdravstven problem, saj bolniki trpijo, hkrati pa povzročajo velike stroške. Znanstveniki iz nemškega centra za raziskave rakavih bolezni (DKFZ - Deutsches Krebsforschungszentrum; angl: German Cancer Research Center) so našli receptor na imunskih celicah miši, ki aktivira ta zaščitni mehanizem in prepreči nevarne avtoimunske reakcije. Ta receptor se imenuje dektin-1, ki ima dvojno vlogo, saj veže beta-glukane in aksin proteine. Pomankanje dektina-1 vodi do simptomov avtoimunih bolezni šele proti koncu življenske dobe. Ključna pa je povezava med encimom NAHPH oksidazo-2 in dektinom-1, zato imajo ljudje, ki nimajo tega encima avtoimune bolezni.

=== Ema Kovačič: Izpostavljenost ploda materini mikrobioti ===
Študija o prehodu materine mikrobiote skozi placento pri otrocih, ki so se rodili s carskim rezom prezgodaj in normalno. Mamam so vzeli brise iz različnih delov telesa, otrokom pa takoj po rojstvu vzorce iz ustne votline in mekonija. Imunski sistem pri otrocih se razvije že v prenatalnem obdobju. Našli so DNK nekaterih bakterij v posteljici, plodovnici in mekoniju, kar kaže, da se zarodek spopade z bakterijami že v prenatalnem obdobju. Odkritje bakterijskih zapisov v materničnem okolju nakazuje na koesistenco mehanizmov za kontorolo izpostavljenosti pri plodu in materini mikrobioti.

=== Zala Puklavec: Globoko učenje void do odkritja novih antibiotikov===
Zaradi naglega pojava bakterij, ki so odporne na antibiotike, raste potreba po odkritju novih antibiotikov. Zato so naučili globoko nevronsko mrežo napovedati molekule, ki imajo antibakterijske lastnosti. S tem računalniškim modelom so odkrili, da ima halicin (c-Jun N-terminal kinase inhibitor SU3327) zelo močne antibakterijske lastnosti. Nadaljni eksperimenti so pokazali, da deluje na drugačen način kot večina antibiotikov. Za razliko od ostalih je halicin proti E.coli bakteriociden, ne le bakteriostatski. Testirali so ga tudi na bakterijah, za katere po mnenju Svetovne zdravstvene organizacije najnujneje potrebujemo neko obliko zdravljenja, in proti veliki večini je deloval zelo uspešno. Z daljšo izpostavljenostjo E.coli halicinu so poskušali izolirati mutantske celice, ki so razvile odpornost nanj, vendar jim ni uspelo, kar kaže na to, da te odpornosti ni možno ali pa se vsaj veliko težje razvije. Z še nekaj eksperimenti pa so prišli do zaključka, da halicin disipatira transmembranski pH potencial in najverjetneje veže Fe3+ pred pH disipacijo in povezavo z membrano.

=== Martin Stanonik: De novo pojavitev adapterskih membranskih proteinov iz timinsko bogatih genskih sekvenc===
Odkrivamo vedno več proteinov, ki so nastali iz de novo genov. To pomeni, da so se kodirali iz nekodirajočih delov DNA, kar velja za redek proces. V laboratorijskih poskusih je preveliko izražanje teh nastajajočih genov omogočalo boljše delovanje celice v primerjavi z prevelikim izražanjem že vzpostavljenih genov in motenje tega procesa ni vplivalo na delovanje celice. za osebek so uporabili kvas, saj glive kvasovke vsebujejo najboljše lastnosti za izražanje genov.To prikazuje velik potencial, še posebej za timinsko bogate sekvence za izdelavo transmembranskih proteinov. Iz kombinacij različnih analiz je bil predlagan nov model genskega nastanka. Ta odkritja, bi lahko omogočala nov način izdelave polipeptidov, ki nastanejo iz teh, de novo, delov DNA.

=== Klara Kočman: Koronavirus: SARS-CoV in SARS-CoV-2 ===
Koronavirusi so veliki, pozitivni RNA virusi. Okuženost z virusom lahko opazimo z značilni simptomi kot so vročina, kašelj in pomanjkanje zraka. Najnovejši tip koronavirusa, SARS-CoV-2, tudi 2019-nCoV, se je prvič pojavil 31. decembra 2019 v mestu Wuhan na Kitajskem. Transport virusa s človeka na človeka je pogost pri telesnih stikih z bolnikom. SARS-CoV-2 primerjajo z virusama MERS-CoV in SARS-CoV. Na podlagi celotne analize genoma in proteinov je virus bližje SARS-CoV kot MERS-CoV, saj obstaja več kot 90% genetska podobnost s SARS-CoV, medtem kot je s MERS-CoV-jem neznatna. Genom virusa SARS-CoV-2 je sestavljen iz približno 30 kilobaz, ki jih kodira več strukturnih in nestrukturnih proteinov. S SARS-CoV si je podoben po dolžini genoma ter podobnem mehanizmu vstopa v celico ter uporabi celičnih receptorjev (ACE2). Glikoprotein ACE2 se nahaja na površini membrane in je pomemben za vezavo receptorjev gostiteljskih celic in gostitelja. Transmembranski proteini virusa se vežejo na človeško celico preko receptorjev ACE2 (encim za pretvorbo angiotenzina 2). Med 120 sekvencami virusa SARS-CoV-2 ni bila zanana niti ena mutacija, zato lahko s ciljenjem slednjih nudimo zaščito. Znanstveniki z opazovanjem odziva na protitelesa pri miših raziskujejo cepivo.

===Timotej Sotošek: Protivirusni remdesivir potentno inhibira RNA-odvisno RNA polimerazo od Srednje Vzhodni respiratorni sindrom koronavirusa===
Zdravilo remdesivir (bolj natančno Remdesivir trifosfat) je preiskovalna spojina, ki je bilo sprva ustvarjeno za zdravit Ebolo. Ima širok spektrum protivirusnih aktivnosti proti RNA virusih kot na primer koronavirusi , Filovirusi,… Njegova tarča je multi-podenotni RNA sintezni kompleks znan pod imenom RNA-odvisna RNA polimeraza na katerem s pomočjo drugih proteinov poteka sinteza virusne RNA verige. Remdesivir je nukleotidni analog ATP-ja s katerim tekmuje za vezavo v nastajajočo se virusno RNA verigo po tem, ko je virus že okuži celico. V primeru, da se Remdesivir uspe vezat v virusno RNA verigo bo ta prenehala rast in tako postala ne uporabna. To pomeni, da je Remdesivir le inhibitor, ki upočasnjuje oz. preprečuje nadaljno širjenje virusa. Raziskave so preiskovale mehanizem inhibicije na virusu Srednje Vzhodni respiratorni sindrom(MERS-CoV) in ga primerjali kako je učinkovit v primerjavi inhibicije virusa Ebola, ter na splošno kako zelo je njegov mehanizem učinkovit. Ker sta si MERS-CoV in SARS-CoV-2 sorodna virusa bi lahko zdravilo Remdesivir pomagal ozdravit obolele z SARS-CoV-2 koronavirusom.

===Nika Perko: Enkapsulacija eteričnega olja pomarančevca v celice gliv kvasovk===
Komarji vrste Aedes aegypti so eni glavnih povzročiteljev bolezni kot so denga, rumena mrzlica, zika in čikungunja. Najdemo jih v tropskem in subtropskem pasu ter celo v Evropi. Znanstveniki Univerze Nove Mehike so poiskali način, kako preprečiti širitev omenjenih bolezni. Ustvarili so naraven insekticid, ki prepreči razvoj komarjev, ko so ti še v stopnji ličinke. Larvicid je sestavljen iz enostavnih komponent: eteričnega olja pomarančevca Citrus sinensis in gliv kvasovk vrste Saccharomyces cervevisiae. Sintetiziran je bil s postopkom enkapsulacije eteričnega olja pomarančevca v celice gliv kvasovk. Med korake tega procesa so vpeljali še enega novega. Z njim so odstranili odvečno eterično olje, ki je ostalo na zunanji strani celic. To je bilo izredno pomembno, saj je odvečno olje delovalo kot repelent. Z različnimi analizami in primerjavami so ugotovili, da struktura celične stene, membrane in oljnih kapljic ostane po enkapsulaciji nespremenjena. Pomembna ugotovitev je bila tudi, da se kvasovke po enkapsulaciji niso mogle več razmnoževat. Testi efektivnosti so bili vzpodbudni, saj je bil larvicid učinkovit pri vseh ličinkah. Najbolj pa je bil učinkovit pri začetni razvojni stopnji ličink. Novi larvicid ima kar nekaj dobrih lastnosti: je naraven, ne more se nenadzorovano širit in tako škodit vodnemu okolju, izdelava je relativno poceni, je neškodljiv za ljudi, dolgo učinkuje…

=== Anja Moškrič: Povezava med infekcijo s temperiranimi bakteriofagi in izgubo sistema CRISPR-Cas tipa I ===
Sistem CRISPR-Cas je imunski mehanizem, ki je značilen za veliko prokariontov in arhej. Gre za gruče enakomerno prekinjenih palindromskih ponovitev, ki nosijo zapis za obrambo proti vdoru tujega dednega materiala (virusov in plazmidov). Kratica Cas pa predstavlja s CRISPR povezane gene, ki kodirajo zapis za nekatere encime, ki cepijo DNA. CRISPR lokus je sestavljen iz ponavljajočih CRISPR genov, med katerimi so vmesniki. Na teh pa je shranjena kopija dela zapisa virusa oz. plazmida. S študijo so želeli izvedeti vpliv infekcije bakterije Pseudomonas aeruginosa, s temperiranim oziroma lizogenim bakteriofagom (DMS3), ki se v obliki profaga vključi v dedni material gostiteljske celice. Izbrana bakterijska vrsta vrši sistem CRISPR-Cas tipa I-F. Za primerjavo so za eksperimente uporabljali tudi nekatere mutirane vrste bakterij,ki so imele napako v CRISPR lokusu. Eksperimenti so pokazali, da ob infekciji z nemutiranimi bakteriofagi bakterije niso sposobne uspešno odstranit le-teh. Iz zbranih rezultatov so ugotovili, da je v tem primeru imunski mehanizem slabo prilagojen celicam, saj povzroča imunopatološki efekt (avtoimunost). Do tega pride zaradi nepopolnega ujemanja zapisa na CRISPR vmesnikih s profagi. Če bakteriofagi ne kodirajo zapisa za acr gene (anti-CRISPR geni, ki zatirajo omenjen mehanizem), lahko to privede do izgube sistema CRISPR-Cas skozi evolucijo.

===Maja Deutsch: Globalni kemični učinki mikrobioma vključujejo nove konjugacije žolčne kisline===
Med vsemi mnogoceličarji in njihovimi mikrobiomi se pojavijo številne medsebojne kemične interakcije. Številne molekule, za katere je znano, da jih proizvaja mikrobiom, izrazito vplivajo na ravnovesje med zdravjem in boleznijo. Z uporabo masne spektrometrije in vizualizacije podatkov so bili ocenjeni učinki mikrobioma na celotno kemijo sesalca s primerjavo podatkov metabolomike pri aseptičnih miši in specifičnih-mikroorganizmov-prostih miši. Ugotovljeno je bilo, da mikrobiota vpliva na kemijo vseh organov. To je vključevalo aminokislinske konjugacije žolčnih kislin, ki so bile uporabljene za proizvodnjo fenilalanoholne kisline, tirozoholne kisline in levcoholne kisline, ki prej še niso bile identificirane, kljub obsežnim raziskavam kemije žolčnih kislin. Ti konjugati žolčne kisline so bili najdeni tudi pri ljudeh, vendar so bile bolj pogoste pri bolnikih z vnetnimi črevesnimi boleznmi, cistično fibrozo in pri dojenčkih. Te spojine so agonizirale farnezodini receptor X (FXR) in miši, ki so imele na novo odkrite kisline, so pokazale zmanjšano izražanje genov za sintezo žolčne kisline. Potrebne pa so nadaljnje raziskave, da se ugotovi, ali imajo te spojine fiziološko vlogo v sesalcih in ali prispevajo k črevesnim boleznim, ki so povezane z mikrobiomsko disbiozo.

=== Hana Glavnik: Kako paraziti malarije zaznajo imunske celice in se pred njimi zaščitijo ===
Pri raziskovanju malarije so znanstveniki odkrili pojav, ki so ga poimenovali rozeta. Rozeta je skupek neokuženih rdečih krvnih celic, ki s pomočjo proteinov, ki jih sintetizira parazit obkolijo okuženo rdečo krvno celico. Parazit se tako zaščiti pred gostiteljevim imunskim sistemom, saj ga monocite tako obkoljenega težje zaznajo. Raziskovali so tvorjenje rozet pri različnih pogojih. Izoliranim parazitom so dodali različne vrste monocitov in opazovali njihovo reakcijo. S tem so odkrili tudi protein IGFBP7, ki inducira tvorjenje rozet, vendar le ob prisotnosti dodatnih serumskih faktorjev. Odkritje proteina IGFBP7 je vodilo v odkritje novega načina tvorjenja rozet, tako imenovanega tipa II, saj za razliko od prvotnega tipa I, ta ne poteče spontano. Nato so pod drobnogled vzeli tvorjenje rozet s proteinom IGFBP7. Z namenom, da bi lahko razložili ta pojav, so eritrocite zdravili z encimom Heparinaza in jih nato izpostavili pogojem, ugodnim za nastanek rozet ter opazovali dobljene rezultate. IGFBP7 opozori parazite na prihod monocitov, nato parazit ta protein uporabi kot most, ki se poveže še z dvema človeškima proteinoma na zdravem eritrocitu in tako pomaga pri tvorjenju.

=== Eva Ratajc: Z-DNA vezavni protein 1 kot ključni dejavnik kontrolirane replikacije virusa Zahodnega Nila in virusa zika ===
Virus Zahodnega Nila (WNV) je glavni povzročitelj virusnega encefalitisa v Združenih državah Amerike. Tudi okužbe z virusom zika (ZIKV) povzročajo resne nevrološke bolezni in prirojene napake. Znano je, da ima pri sproženju imunskega odziva pomembno vlogo Z-DNA vezavni protein 1 (ZBP1). Z-DNA vezavni protein (ZBP1) je citoplazmatski DNA-senzor, ki služi kot receptor za prepoznavanje molekularnih vzorcev. Ob okužbi telesa z virusom zika in virusom Zahodnega Nila se poveča izražanje ZBP1 v mišjih možganih. Zaradi tega so raziskovalci želeli raziskati vlogo ZBP1 pri omejitvi patogeneze pri osebkih, okuženih z navedenima virusoma. Pri miših z izbitim genom za ZBP1 −/− so zaznali višjo stopnjo okužb in višjo smrtnost po okužbi tako s smrtonosno kot z nesmrtonosno obliko virusa Zahodnega Nila kot pri miših divjega tipa (WT). Raziskovalci so ugotovili, da ima ZBP1 ključno vlogo pri omejitvi patogeneze pri miših. ZBP1 prepreči širjenje okužbe WNV in ZIKV v primarnih mišjih celicah in je pomemben za preživetje osebkov z boleznimi, ki ju povzročata omenjena virusa. Pomanjkanje ZBP1 je povzročilo večje količine virusa v serumu in možganih pri ZBP1−/− miših v primerjavi z divjim tipom. Pri ZBP1−/− miših so zaznali tudi višje virusne titre, ki so jih povezali z znižanimi leveli protivirusnih citokinov in kemokinov.

=== Lana Kores: Preučevanje ionskega kanalčka TRPA1 in bolečine s toksinom avstralskega škorpijona ===
Ionski kanalček TRPA1 (znan tudi kot wasabi receptor) je receptor za dražilce, ki povzročajo akutno bolečino in nevrogeno vnetje. Toksin za wasabi receptor WaTx je toksin avstralskega škorpijona, ki s pasivno difuzijo preide čez membrano celice in se nato veže na TRPA1. WaTx deluje na podoben način kot elektofilni dražilci receptorja, le da v nasprotju z njimi kanalčka ne odpre direktno, ampak le stabilizira njegovo odprto stanje in tako zmanjša prepustnost za Ca2+ ione. Koncentracija Ca2+ ionov je zato zadostna, da povzroči akutno bolečino, ne pa dovolj velika, da bi prišlo do nevrogenega vnetja, kot npr. pri elektrofilnem dražilcu AITC.

=== Eva Vene: Nevtralizacija denge v komarjih, ki izražajo načrtovano protitelo ===
Neuspešnost cepiva ter dejstvo, da je, zaradi širjenja življenjskega prostora A. aegypti, ogroženih 50% svetovnega prebivalstva, je vodilo v nadaljnje raziskave, ki bi omogočile zaustavitev širjenja virusa z restrikcijo slednjega že v samih prenašalcih. Možnost za uspeh obetajo protitelesa s širokim spektrom nevtralizacije (ang. broadly neutralizing antibodies), saj so slednja uspešna proti antigensko različnim virusom. Zaenkrat tovrstna protitelesa kot možnost zatiranja širjenja bolezni še niso bila uporabljena proti katerikoli vrsti virusa, njihova upešnost pa se je pokazala pri drugi veji mikroorganizmov.
Za raziskave so uporabili človeško protitelo 1C19, katerega uspešnost proti serotipom DENV je bila znana že iz prejšnjih let. V genom transgenih komarjev je bil dodan modificiran gen za scFv 1C19 (človeško protitelo, ki deluje proti DENV) in fluorescenčni označevalec, ki se sintetizira za protitelesom, tipa tdTomato. V komarje je bil določen serotip virusa vnešen z okuženo krvjo. Določili so dva možna izida okužbe: ponekod je DENV prosto prehajal čez srednje črevo – komarji so postali prenašalci virusa; v drugem primeru pa so izražena protitelesa nevtralizirala serotip virusa in s tem preprečila prenos okužbe naprej.

=== Nina Žgajnar: In vitro samostojno podvojevanje in policistronsko izražanje večjih sintetičnih genomov ===
Konvencionalne metode genskega inženirstva za reševanje zapletenih problemov se običajno osredotočajo na prilagajanje enega ali več genov. Sintezna biologija pa k tem težavam pristopa z novega vidika: ukvarja se z večjimi spremembami obstoječih celičnih struktur in z izgradnjo bolj zapletenih sistemov. Sinteza kemičnega sistema, ki je sposoben razmnoževanja in razvoja, je glavni cilj sintezne biologije. To bi lahko dosegli z in vitro rekonstrukcijo minimalno samozadostne centralne dogme. Znanstveniki so ustvarili sistem in vitro translacije, ki omogoča samostojno podvajanje in izražanje večjih genomov. Demonstrirali so samostojno podvojevanje genoma iz več kot 116 kilobaz, ki zajema celoten niz translacijskih faktorjev E. coli, vse tri ribosomske RNA, sistem za obnavljanje energije ter RNA in DNA polimeraze. Vzporedno z replikacijo DNA sistem omogoča sintezo vsaj 30 kodiranih translacijskih faktorjev, od katerih je polovica izražena v enakih ali večjih količinah od njihovih vhodnih nivojev. Vprašanje, kaj vse lahko dosežemo s samosestavljanjem kemijskih spojin, velja za eno izmed pomembnejših vprašanj v znanosti. Sintezna biologija tukaj postavlja nov cilj: sestaviti organizem izključno iz majhnih molekul. Potencialno bi tako lahko ustvarili organizme, ki bi čistili nevarne odpadke na nedostopnih mestih, rastline, ki bi zaznavale določene kemikalije in se nanje ustrezno odzvale, proizvedli čisto gorivo na učinkovit in trajnosten način ali prepoznavali in uničevali tumorje.

=== Luka Šegota: Sulfolipid-1, kot sprožilec kašlja pri tuberkuloznih bakterijah ===
Tuberkuloza je pljučna bolezen, ki jo povzroča bakterija Mycobacterium tuberculosis (Mtb). Med sesalci se ta bakterija prenaša s kašljem. Kašelj je vzbujen zaradi nociceptorske inervacije pljuč (porazdelitve končičev nevronov po pljučih). Mycobacterium tuberculosis sintetizira molekule, ki interagirajo z nevroni v pljučih in pri tem se poveča intercelularna koncentracija kalcija. Na osnovi merjenja koncentracije kalcija v dorzalnem koreninskem gangliju mišjega zarodka po stiku s bakterijo so ugotovili, da Mtb ativira nevrone. Da bi odkrili vzbujevalno molekulo, so ganglije mišjih zarodkov izpostavili izvlečkom (Mtb) celične membrane, frakcijam citosola, proteinom iz celične stene in proteinom Triton X-114. Ugotovili so, da le deli celice, ki vsebujejo lipide, vzbujajo nevrone. Molekula, ki je za to »odgovorna« se imenuje sulfolipid-1. Gre za najbolj sulfatiran glikolipid, ki se nahaja v zunanji membrani celične stene Mtb, najden je le v patogenih bakterijah te vrste. Eksperimenti so pokazali, da živali kašljajo le zaradi sevov Mtb bakterij, ki so sposobne sintetizirati sulfolipid-1. Morebitna terapija, ki zavira kašelj, bi lahko znatno zmanjšala prenos tuberkuloze in drugih bolezni.

=== Jan Kogovšek: Inhibitor plazmepsina zmoti več stanj življenjskega cikla parazita malarije ===
Parazit Plasmodium falciparum je najpogostejši povzročitelj malarije pri ljudeh. S to boleznijo zboli več milijonov ljudi, umre pa jih približno 400 000 vsako leto. Antimalariki, ki so v uporabi, počasi izgubljajo svojo moč, kajti parazit je postal rezistenten na do sedaj najbolj učinkovito terapijo, imenovano artemisinin combination therapy (ATC). Znanstveniki so v ta namen odkrili tri nove zdravilne učinkovine, ki delujejo kot inhibitorji plazmepsina IX in plazmepsina X, ki ju izloča Plasmodium. Odkrili so, da inhibitorji zavrejo izločanje dodatnih proteinov iz celic, ki parazitu omogočajo vstop v eritrocite. S testi so ugotovili, da WM4 in WM5, ki sta prva na novo odkrita inhibitorja, delujeta na isti princip, vendar ne vplivata na dozorevanje in širjenje oocist parazita. WM382, naknadno odkrit inhibitor, pa poleg istih mehanizmov, kot jih imata WM4 in WM5, deluje tudi na dozorevanje oocist v fazi rasti parazita v jetrih. Za vse tri učinkovine so tudi dokazali specifično delovanje na oba plazmepsina. S tem ko WM382 zavira rast in zorenje oocist parazita, se tudi zmanjša prenašanje parazita na komarje in možnost prenosa rezistence na že obstoječe antimalarike.

=== Kostadin Mitkov: Heat shock factor 2 helps the cells to maintain cell adhesion and protect themselves against stress ===
Maintenance of protein homeostasis is essential for the cell viability and growth. The cells in the human body are constantly exposed to environmental stress factors, which tend to disturb that protein homeostasis maintenance. For the first time, research shows that the contacts between cells, known as cell adhesion, are essential for cells to survive stress and maintain protein homeostasis. Cell adhesion is relied on heat shock factors (HSFs). HSFs mediate their protective functions through diverse genetic programs, which are composed of genes encoding molecular chaperones and other genes crucial for cell survival. Scientists have found that HSF2 is critical for cell survival during prolonged proteotoxicity, and their RNA sequencing (RNA-seq) analyses revealed that cells that lack HSF2 have weakened viability which is not caused by inadequate induction of molecular chaperones but is due to marked downregulation of cadherin superfamily genes. They demonstrated that maintenance of cadherin-mediated cell-cell adhesion is dependent on HSF2 and it is also required for protection against stress induced by proteasome inhibition. This study identifies HSF2 as a key regulator of cadherin superfamily genes and defines cell-cell adhesion as a determinant of proteotoxic stress resistance.

=== Jan Bregar: Prehodno neintegrativno izražanje reprogramirnih faktorjev v jedru spodbuja večplastno izboljšanje starajočih se človeških celic ===
Za staranje je značilno postopno poslabševanje delovanja na nivoju molekul in posledicno tudi celic, tkiv in nenazadnje celotnega organizma. Na kromatinskem nivoju s starostjo povezujemo pogostejše pojavljanje epigenetskih napak, izčrpavanje matičnih celic, senescenco in deregulirano celično/tkivno homeostazo. Jedrno reprogramiranje, ki vodi k pluripotenci (zmožnost celice, da se diferencira v kateri koli zarodni sloj), lahko vrne celico, tako starostno kot tudi identitetsko, v stanje ekvivalentno embrionalni celici. Ta raziskava je dokazala, da lahko dosežemo celični preporod pri človeških celicah, ki smo jih izolirali iz naravno staranih posameznikov. Pokazali so, da lahko neintegrativno prehodno celično reprogramiranje na podlagi mRNA naglo spremeni širok spekter znakov staranja v začetni fazi, ko se epigenetski izbris celične identitete še ni zgodil. Pokazali so, da se proces preporoda pojavi pri naravno staranih človeških in mišjih celicah, s tem ko se povrne izgubljena funkcionalnost v obolelih celicah, brez da bi posegli v celično identiteto.

=== Ajda Beltram: Identifikacija potencialnih komponent cepiva proti SARS-CoV-2 na podlagi imunoloških raziskav SARS-CoV ===
Cilj te raziskave je pomoč pri izdelavi cepiva proti SARS-CoV-2 na podlagi imunoloških raziskav SARS-CoV, saj sta si virusa genetske zelo podobna. Dokazali so veliko podobnost med posameznimi strukturnimi proteini SARS-CoV-2 in SARS-CoV, ter nekoliko manjšo med SARS-CoV-2 in MERS-CoV. Primerjali so tudi eksperimentalno določene epitope celic T in B strukturnih proteinov (S in N) SARS-CoV s strukturnimi proteini SARS-CoV-2. Epitope celic T so dobili na podlagi pozitivnega odziva celic T na epitope ali pozitivne vezave MHC na epitope, epitope celic B pa s pozitivno vezavo celic B na epitope. Ugotovili so, da se 23 % epitopov celic T in 16 % epitopov celic B SARS-CoV popolnoma ujema s SARS-CoV-2 in so tudi brez mutacij. Velik potencial predstavljajo predvsem epitopi celic T, saj je bilo dokazano pri SARS-CoV, da omogočajo dolgotrajno zaščito. Pri celicah B pa imajo za sprožitev imunskega odziva s protitelesi za SARS-CoV-2 več potenciala linearni epitopi celic B podenote S2 proteina S, saj se jih veliko popolnoma ujema s SARS-CoV-2. Zaradi vsega tega so najverjetneje cepiva, ki spodbudijo odziv celic T, in cepiva, ki poskušajo izzvati protitelesa, ki se vežejo na linearne epitope podenote S2, efektivna in bi morala biti v prihodnje še bolj raziskana.

Konec klepeta
Napiši sporočilo ...

TBK2020 Povzetki seminarjev

2020-04-07T08:36:04Z

Lsegota: Luka Šegota: Sulfolipid-1, kot sprožilec kašlja pri tuberkuloznih bakterijah

TBK2020-seminar

2020-03-16T17:16:08Z

Lsegota: /* Seznam seminarjev */

= Temelji biokemije- seminar =

Seminarje vodi prof. dr. Brigita Lenarčič. Seminarji so obvezni.

Ocena seminarjev (6-10) predstavlja enako število odstotkov, ki se prišteje h končni pisni oceni izpita.
Stran na strežniku s seminarskimi nalogami je zaščitena.
Uporabniško ime je: tbk, password pa: samozame## "##" sta dve številki, ki ju izveste na predavanjih.
Tudi za urejanje Wiki strani potrebujete geslo, ki se od zgornjega razlikuje. Postopek pridobitve Wiki uporabniškega imena in gesla je opisan [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Main_Page tukaj].

== Seznam seminarjev ==

{| {{table}}
{| border="1" cellspacing="0" style="border:#c9c9c9 1px solid; margin: 1em 1em 1em 0; border-collapse: collapse;"
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Ime in priimek'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Naslov seminarja'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Povezava'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Rok za oddajo'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Rok za recenzijo'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Datum predstavitve'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 1'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 2'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 3'''
|-
| Anna Scott ||[[TBK2020_Povzetki_seminarjev#Anna_Scott:_Notting_Hill|Moj naslov v slovenščini, link pa kaže na povzetek]]||[https://www.sciencedaily.com/releases/2019/02/190214100038.htm povezava] || 28.10. || 05.11. || 07.11. || r1 || r2 || r3
|-
| Lenka Stanković || Optimizirano antiangiogeno reprogramiranje tumorskega mikrookolja potencira imunoterapijo CD40 || https://www.pnas.org/content/117/1/541 || 24.02. || 27.02. || 03.03. || Špela Došler || Zala Perko || Marija Dujaković
|-
| Ena Kartal || Kako celično staranje vodi do nevrodegeneracije || https://www.sciencedaily.com/releases/2020/01/200129174540.htm || 24.02. || 27.02. || 03.03. || Jasmina Bešić || Ana Žagar || Neža Leskovar
|-
| Ema Kovačič ||Izpostavljenost ploda materinski mikrobioti || https://insight.jci.org/articles/view/127806 || 24.02. || 27.02. || 03.03. || Nikola Janakievski || Karin Rak || Luka Hafner
|-
| Nika Tomsič || Pomembnost in delovanje sladkornega prenašalca PfHT1 v parazitu malarije || https://www.sciencedaily.com/releases/2020/01/200129131533.htm https://sci-hub.tw/10.1038/s41586-020-1963-z|| 24.02. || 27.02. || 03.03. || Maja Deutsch || Jakob Tomšič || Marigona Beqiraj
|-
| Sara Golob ||Vpliv virusa Herpesa simpleksa tipa 1 na razvoj Alzheimerjeve bolezni || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/10/181019100702.htm || 24.02. || 27.02. || 03.03. || Manca Pirc || Maja Kobal || Rebeka Jerina
|-
| Zala Puklavec ||Globoko učenje vodi do odkritja novih antibiotikov || https://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-8674(20)30102-1?_returnURL=https%3A%2F%2Flinkinghub.elsevier.com%2Fretrieve%2Fpii%2FS0092867420301021%3Fshowall%3Dtrue || 04.03. || 07.03. || 10.03. || Nika Bedrač || Špela Došler || Zala Perko
|-
| Martin Stanonik || De novo pojavitev adapterskih membranskih proteinov iz timinsko bogatih genskih sekvenc || https://www.sciencedaily.com/releases/2020/02/200218104740.htm || 04.03. || 07.03. || 10.03. || Ivana Trifunovska || Jasmina Bešić || Ana Žagar
|-
| Klara Kočman || Novi koronavirus SARS-CoV-2 in SARS-CoV || https://www.sciencedaily.com/releases/2020/01/200131114755.htm || 04.03. || 07.03. || 10.03. || Bor Krajnik || Nikola Janakievski || Karin Rak
|-
| Maša Mencigar || Vpliv apoptotskih celic na imunski sistem || https://www.sciencedaily.com/releases/2020/01/200108123137.htm || 04.03. || 07.03. || 10.03. || Erik Putar || Maja Deutsch || Jakob Tomšič
|-
| Nevena Ješić || Nepravilne komunikacije med celicami vodijo v levkemijo || https://www.sciencedaily.com/releases/2020/02/200206144824.htm || 04.03. || 07.03. || 10.03. || Ela Bizjak || Manca Pirc || Maja Kobal
|-
| Nika Perko ||Enkapsulacija eteričnega olja pomarančevca v celice gliv kvasovk ||https://parasitesandvectors.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13071-019-3870-4 || 10.03. || 13.03. || 17.03. || Lenka Stanković || Nika Bedrač || Špela Došler
|-
| Timotej Sotošek || Protivirusni remdesivir potentno inhibira RNA-odvisno RNA polimerazo od Srednje vzhodni respiratorni sindrome koronavirusa || https://www.jbc.org/content/early/2020/02/24/jbc.AC120.013056.full.pdf https://www.jbc.org/content/early/2020/02/24/jbc.AC120.013056|| 10.03. || 13.03. || 17.03. || Ena Kartal || Ivana Trifunovska || Jasmina Bešić
|-
| Hana Glavnik || Kako paraziti malarije zaznajo imunske celice in se pred njimi zaščitijo || https://www.sciencedaily.com/releases/2020/02/200218124346.htm || 10.03. || 13.03. || 17.03. || Ema Kovačič || Bor Krajnik || Nikola Janakievski
|-
| Anja Moškrič || Povezava med infekcijo s temperiranimi bakteriofagi in izgubo sistema CRISPR - Cas tipa I|| https://www.nature.com/articles/s41586-020-1936-2 || 10.03. || 13.03. || 17.03. || Nika Tomsič || Erik Putar || Maja Deutsch
|-
| Gaja Osojnik || || || 10.03. || 13.03. || 17.03. || Sara Golob || Ela Bizjak || Manca Pirc
|-
| Aleksandra Pajović || || || 17.03. || 20.03. || 24.03. || Zala Puklavec || Lenka Stanković || Nika Bedrač
|-
| Maja Deutsch || Globalni kemični učinki mikrobioma vsebujejo nove konjugacije žolčne kisline || https://www.nature.com/articles/s41586-020-2047-9 || 17.03. || 20.03. || 24.03. || Martin Stanonik || Ena Kartal || Ivana Trifunovska
|-
| Eva Ratajc || Z-DNA vezni protein 1 kot ključni dejavnik kontrolirane replikacije virusa Zahodnega Nila in virusa zika || https://www.readcube.com/articles/10.3389/fmicb.2019.02089 || 17.03. || 20.03. || 24.03. || Anja Moškrič || Ema Kovačič || Bor Krajnik
|-
| Lana Kores || || || 17.03. || 20.03. || 24.03. || Maša Mencigar || Nika Tomsič || Erik Putar
|-
| Sara Borišek || || || 17.03. || 20.03. || 24.03. || Nevena Ješić || Sara Golob || Ela Bizjak
|-
| Jan Kogovšek || Inhibitor plazmepsina zmoti več stanj življenjskega cikla parazita malarije || https://www.sciencedaily.com/releases/2020/03/200304141514.htm https://reader.elsevier.com/reader/sd/pii/S193131282030113X?token=D5C1CD010E9020244FE3ED5F5B36BD9C50958D0419B1E3CD7F8BDDAF847C55706EBACBF92B00F7B1D038D29371ADEA8F || 24.03. || 27.03. || 31.03. || Nika Perko || Zala Puklavec || Lenka Stanković
|-
| Nina Žgajnar || In vitro samostojno podvojevanje in policistronsko izražanje večjih sintetičnih genomov || https://www.sciencedaily.com/releases/2020/02/200218130501.htm || 24.03. || 27.03. || 31.03. || Timotej Sotošek || Martin Stanonik || Ena Kartal
|-
| Erika Rihter || || || 24.03. || 27.03. || 31.03. || Hana Glavnik || Anja Moškrič || Ema Kovačič
|-
| Luka Šegota || Sulfolipid-1 je sprožilec kašlja, ki prenaša tuberkulozo ||https://www.sciencedaily.com/releases/2020/03/200306183349.htm || 24.03. || 27.03. || 31.03. || Klara Kočman || Maša Mencigar || Nika Tomsič
|-
| Eva Vene ||Nevtralizacija denge pri komarjih, ki izražajo sintetično protitelo || https://www.sciencedaily.com/releases/2020/01/200116141710.htm || 24.03. || 27.03. || 31.03. || Gaja Osojnik || Nevena Ješić || Sara Golob
|-
| Ajda Beltram || || || 31.03. || 03.04. || 07.04. || Aleksandra Pajović || Nika Perko || Zala Puklavec
|-
| Jan Trebušak || || || 31.03. || 03.04. || 07.04. || Aljaž Simonič || Timotej Sotošek || Martin Stanonik
|-
| Jan Bregar || || || 31.03. || 03.04. || 07.04. || Eva Ratajc || Hana Glavnik || Anja Moškrič
|-
| Gregor Strniša || || || 31.03. || 03.04. || 07.04. || Lana Kores || Klara Kočman || Maša Mencigar
|-
| Petra Pahor || || || 31.03. || 03.04. || 07.04. || Sara Borišek || Gaja Osojnik || Nevena Ješić
|-
| Nadja Dolničar || || || 08.04. || 11.04. || 14.04. || Jan Kogovšek || Aleksandra Pajović || Nika Perko
|-
| Tina Javeršek || || || 08.04. || 11.04. || 14.04. || Nina Žgajnar || Aljaž Simonič || Timotej Sotošek
|-
| Vid Dobrovoljc || || || 08.04. || 11.04. || 14.04. || Erika Rihter || Eva Ratajc || Hana Glavnik
|-
| Tinkara Božič || || || 08.04. || 11.04. || 14.04. || Luka Šegota || Lana Kores || Klara Kočman
|-
| Kostadin Mitkov || || || 08.04. || 11.04. || 14.04. || Eva Vene || Sara Borišek || Gaja Osojnik
|-
| Sara Jerič || || || 15.04. || 18.04. || 21.04. || Ajda Beltram || Jan Kogovšek || Aleksandra Pajović
|-
| Polona Leban || || || 15.04. || 18.04. || 21.04. || Jan Trebušak || Nina Žgajnar || Aljaž Simonič
|-
| Stefanija Ivanova || || || 15.04. || 18.04. || 21.04. || Jan Bregar || Erika Rihter || Eva Ratajc
|-
| Luka Stanković || || || 15.04. || 18.04. || 21.04. || Gregor Strniša || Luka Šegota || Lana Kores
|-
| Ana Pervanja || || || 15.04. || 18.04. || 21.04. || Petra Pahor || Eva Vene || Sara Borišek
|-
| Marija Dujaković || || || 29.04. || 02.05. || 05.05. || Nadja Dolničar || Ajda Beltram || Jan Kogovšek
|-
| Neža Leskovar || || || 29.04. || 02.05. || 05.05. || Tina Javeršek || Jan Trebušak || Nina Žgajnar
|-
| Luka Hafner || || || 29.04. || 02.05. || 05.05. || Vid Dobrovoljc || Jan Bregar || Erika Rihter
|-
| Marigona Beqiraj || || || 29.04. || 02.05. || 05.05. || Tinkara Božič || Gregor Strniša || Luka Šegota
|-
| Rebeka Jerina || || || 29.04. || 02.05. || 05.05. || Kostadin Mitkov || Petra Pahor || Eva Vene
|-
| Zala Perko || Regulacija s staranjem povezanih patoloških stanj z acetilacijo proteina NLRP3 || https://www.sciencedaily.com/releases/2020/02/200206144837.htm || 06.05. || 09.05. || 12.05. || Sara Jerič || Nadja Dolničar || Ajda Beltram
|-
| Ana Žagar || || || 06.05. || 09.05. || 12.05. || Polona Leban || Tina Javeršek || Jan Trebušak
|-
| Karin Rak || || || 06.05. || 09.05. || 12.05. || Stefanija Ivanova || Vid Dobrovoljc || Jan Bregar
|-
| Jakob Tomšič || || || 06.05. || 09.05. || 12.05. || Luka Stanković || Tinkara Božič || Gregor Strniša
|-
| Maja Kobal || || || 06.05. || 09.05. || 12.05. || Ana Pervanja || Kostadin Mitkov || Petra Pahor
|-
| Špela Došler || || || 13.05. || 16.05. || 19.05. || Marija Dujaković || Sara Jerič || Nadja Dolničar
|-
| Jasmina Bešić || || || 13.05. || 16.05. || 19.05. || Neža Leskovar || Polona Leban || Tina Javeršek
|-
| Nikola Janakievski || || || 13.05. || 16.05. || 19.05. || Luka Hafner || Stefanija Ivanova || Vid Dobrovoljc
|-
| Aljaž Simonič || || || 13.05. || 16.05. || 19.05. || Marigona Beqiraj || Luka Stanković || Tinkara Božič
|-
| Manca Pirc || || || 13.05. || 16.05. || 19.05. || Rebeka Jerina || Ana Pervanja || Kostadin Mitkov
|-
| Nika Bedrač || Nižji vnos žveplo vsebujočih amino kislin niža tveganje za razvoj kardiometaboličnih bolezni || https://www.sciencedaily.com/releases/2020/02/200203141501.htm || 20.05. || 23.05. || 26.05. || Zala Perko || Marija Dujaković || Sara Jerič
|-
| Ivana Trifunovska || || || 20.05. || 23.05. || 26.05. || Ana Žagar || Neža Leskovar || Polona Leban
|-
| Bor Krajnik || || || 20.05. || 23.05. || 26.05. || Karin Rak || Luka Hafner || Stefanija Ivanova
|-
| Erik Putar || || || 20.05. || 23.05. || 26.05. || Jakob Tomšič || Marigona Beqiraj || Luka Stanković
|-
| Ela Bizjak || || || 20.05. || 23.05. || 26.05. || Maja Kobal || Rebeka Jerina || Ana Pervanja
|}

==Naloga==
* samostojno pripraviti seminar, katerega tema je novica iz področja biokemije na portalu [http://www.sciencedaily.com ScienceDaily], ki je bila objavljena kasneje kot 1. avgusta 2018. Osnova za seminar naj bo znanstveni članek, ki je podlaga za to novico. Poleg tega članka za seminar uporabite še najmanj pet drugih virov, od teh vsaj še dva druga znanstvena članka, ki se navezujeta na to vsebino.
* članke na temo lahko iščete [https://scholar.google.com/ z Google učenjakom].
* naslov izbrane teme in povezavo do novice vpišite v tabelo seminarjev takoj ko ste si izbrali temo, najkasneje pa en teden pred rokom za oddajo
* [[TBK2020 Povzetki seminarjev|Povzetek seminarja]] opišete na wikiju v približno 200 besedah - najkasneje do dne, ko morate oddati seminar recenzentom.
* Povezavo do povzetka vnesete v tabelo seminarjev tekočega letnika.
* Seminar pripravite v obliki seminarske naloge (pisava Cambria, font 11, enojni razmak, 2,5 cm robovi; tekst naj obsega okoli 1000 besed), vsebuje naj 1-2 sliki. Slika mora imeti legendo in v besedilu mora biti na ustreznem mestu sklic na sliko. Vse uporabljene vire citirajte v tekstu, kot npr. (Nobel, 2010), na koncu pa navedite točen seznam literature, kot je opisano spodaj!
*Celotni seminar naj obsega 2 strani A4 formata (po možnosti dvostransko tiskanje).
* Seminar oddajte do datuma oddaje, ki je naveden v tabeli v elektronski obliki z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/tbk/poslji/ tega obrazca].
* vsi seminarji so v elektronski obliki dostopni [http://bio.ijs.si/~zajec/tbk/poslji//bioseminar/ tukaj].
* Recenzenti do dneva določenega v tabeli določijo popravke in podajo oceno pisnega dela, v predpisanem formatu elektronskega obrazca na internetu.
* Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Za predstavitev je na voljo 10 minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni. Prvi recenzent vodi predstavitve in razpravo ter skrbi za to, da vse poteka v zastavljenih časovnih okvirih.
* Predstavitvi sledi razprava do 5 minut. Sledijo vprašanja prisotnih, recenzenti postavijo vsak vsaj dve vprašanji in na koncu podajo oceno predstavitve.
* En dan pred predstavitvijo na strežnik oddajte tudi končno verzijo. Na dan predstavitve morate oddati tudi končno (popravljeno) in natisnjeno verzijo seminarja v enem izvodu.
* Seminarska naloga in povzetek na wikiju morajo biti v slovenskem jeziku!

==Imena datotek==
Prosim vas, da vse datoteke, ki jih pošiljate poimenujete po spodnjih pravilih. Ne uporabljajte ČŽŠčžš!
Poslati morate naslednje datoteke:
* TBK_2020_Priimek_Ime.doc(x) za seminar, npr. TBK_2020_Guncar_Gregor.docx
* TBK_2020_Priimek_ime_final.doc(x) za končno verzijo seminarja
* TBK_2020_Priimek_Ime_rec_Priimek2.doc(x) za recenzijo, kjer je Priimek2 priimek recenzenta, npr. TBK_2020_Guncar_Gregor_rec_Scott.docx (če se pišete Scott in odajate recenzijo za seminar, ki ga je napisal Gunčar)
* TBK_2020_Priimek_Ime.ppt(x) za prezentacijo, npr TBK_2020_Guncar_Gregor.pptx
* TBK_2020_Priimek_Ime_clanek.pdf za datoteko PDF, ki vsebuje izvirni članek, npr. TBK_2020_Guncar_Gregor_clanek.pdf

==Ocenjevanje seminarjev==
Recenzenti ocenijo seminar tako, da izpolnijo [[https://docs.google.com/forms/d/1Hdg2OHCyG24qwLTnFt09yZTng46RIwaIiUqnKOdsJxQ/viewform recenzentsko poročilo]] na spletu.

== Mnenje o predstavitvi ==
Vsak posameznik '''mora''' oceniti seminar tako, da odda svoje [https://docs.google.com/forms/d/1VvE-jaKikfiDO5Gdybqgp9mf_0uJZfBbIK8PLXKDaS0/viewform mnenje] najkasneje v enem tednu po predstavitvi. Kdor na seminarju ni bil prisoten, mnenja '''ne sme''' oddati.

==Urejanje spletnih strani na wikiju==
Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''

==Faktor vpliva==
Faktor vpliva (angl. impact factor) neke revije pove, kolikokrat so bili v poprečju citirani članki v tej reviji v dveh letih skupaj pred objavo tega faktorja. Faktorje vpliva za posamezno revijo lahko najdete v [http://www.cobiss.si/scripts/cobiss?command=CONNECT&base=JCR COBISS-u]. V polje "Naslov revije" vnesite ime revije za katero želite izvedeti faktor vpliva in pritisnite na gumb POIŠČI. V skrajnem desnem stolpcu se bodo izpisali faktorji vpliva za revije, ki ustrezajo vašim iskalnim kriterijem. Zadetkov za posamezno revijo je več zato, ker so navedeni faktorji vpliva za posamezno leto. Za tekoče leto faktorji vpliva še niso objavljeni, zato se orientirajte po faktorjih vpliva zadnjih par let. Če faktorja vpliva za vašo izbrano revijo ne najdete v bazi COBISS, potem izberite članek iz kakšne druge revije.

==Citiranje virov==Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se v seminarju držite ene same. Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati. '''Citiranje knjig:''' Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica. Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN. Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005. Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4. Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.). '''Citiranje člankov:''' Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani. Lartigue C. ''et al''. Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, letn. 317, str. 632-638.Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole: Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani. Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.Revija Science uporablja skrajšani zapis: C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007) V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne). '''Citiranje spletnih virov:''' Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.

TBK2020-seminar

2020-03-16T16:55:55Z

Lsegota: /* Seznam seminarjev */

= Temelji biokemije- seminar =

Seminarje vodi prof. dr. Brigita Lenarčič. Seminarji so obvezni.

Ocena seminarjev (6-10) predstavlja enako število odstotkov, ki se prišteje h končni pisni oceni izpita.
Stran na strežniku s seminarskimi nalogami je zaščitena.
Uporabniško ime je: tbk, password pa: samozame## "##" sta dve številki, ki ju izveste na predavanjih.
Tudi za urejanje Wiki strani potrebujete geslo, ki se od zgornjega razlikuje. Postopek pridobitve Wiki uporabniškega imena in gesla je opisan [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Main_Page tukaj].

== Seznam seminarjev ==

{| {{table}}
{| border="1" cellspacing="0" style="border:#c9c9c9 1px solid; margin: 1em 1em 1em 0; border-collapse: collapse;"
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Ime in priimek'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Naslov seminarja'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Povezava'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Rok za oddajo'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Rok za recenzijo'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Datum predstavitve'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 1'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 2'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 3'''
|-
| Anna Scott ||[[TBK2020_Povzetki_seminarjev#Anna_Scott:_Notting_Hill|Moj naslov v slovenščini, link pa kaže na povzetek]]||[https://www.sciencedaily.com/releases/2019/02/190214100038.htm povezava] || 28.10. || 05.11. || 07.11. || r1 || r2 || r3
|-
| Lenka Stanković || Optimizirano antiangiogeno reprogramiranje tumorskega mikrookolja potencira imunoterapijo CD40 || https://www.pnas.org/content/117/1/541 || 24.02. || 27.02. || 03.03. || Špela Došler || Zala Perko || Marija Dujaković
|-
| Ena Kartal || Kako celično staranje vodi do nevrodegeneracije || https://www.sciencedaily.com/releases/2020/01/200129174540.htm || 24.02. || 27.02. || 03.03. || Jasmina Bešić || Ana Žagar || Neža Leskovar
|-
| Ema Kovačič ||Izpostavljenost ploda materinski mikrobioti || https://insight.jci.org/articles/view/127806 || 24.02. || 27.02. || 03.03. || Nikola Janakievski || Karin Rak || Luka Hafner
|-
| Nika Tomsič || Pomembnost in delovanje sladkornega prenašalca PfHT1 v parazitu malarije || https://www.sciencedaily.com/releases/2020/01/200129131533.htm https://sci-hub.tw/10.1038/s41586-020-1963-z|| 24.02. || 27.02. || 03.03. || Maja Deutsch || Jakob Tomšič || Marigona Beqiraj
|-
| Sara Golob ||Vpliv virusa Herpesa simpleksa tipa 1 na razvoj Alzheimerjeve bolezni || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/10/181019100702.htm || 24.02. || 27.02. || 03.03. || Manca Pirc || Maja Kobal || Rebeka Jerina
|-
| Zala Puklavec ||Globoko učenje vodi do odkritja novih antibiotikov || https://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-8674(20)30102-1?_returnURL=https%3A%2F%2Flinkinghub.elsevier.com%2Fretrieve%2Fpii%2FS0092867420301021%3Fshowall%3Dtrue || 04.03. || 07.03. || 10.03. || Nika Bedrač || Špela Došler || Zala Perko
|-
| Martin Stanonik || De novo pojavitev adapterskih membranskih proteinov iz timinsko bogatih genskih sekvenc || https://www.sciencedaily.com/releases/2020/02/200218104740.htm || 04.03. || 07.03. || 10.03. || Ivana Trifunovska || Jasmina Bešić || Ana Žagar
|-
| Klara Kočman || Novi koronavirus SARS-CoV-2 in SARS-CoV || https://www.sciencedaily.com/releases/2020/01/200131114755.htm || 04.03. || 07.03. || 10.03. || Bor Krajnik || Nikola Janakievski || Karin Rak
|-
| Maša Mencigar || Vpliv apoptotskih celic na imunski sistem || https://www.sciencedaily.com/releases/2020/01/200108123137.htm || 04.03. || 07.03. || 10.03. || Erik Putar || Maja Deutsch || Jakob Tomšič
|-
| Nevena Ješić || Nepravilne komunikacije med celicami vodijo v levkemijo || https://www.sciencedaily.com/releases/2020/02/200206144824.htm || 04.03. || 07.03. || 10.03. || Ela Bizjak || Manca Pirc || Maja Kobal
|-
| Nika Perko ||Enkapsulacija eteričnega olja pomarančevca v celice gliv kvasovk ||https://parasitesandvectors.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13071-019-3870-4 || 10.03. || 13.03. || 17.03. || Lenka Stanković || Nika Bedrač || Špela Došler
|-
| Timotej Sotošek || Protivirusni remdesivir potentno inhibira RNA-odvisno RNA polimerazo od Srednje vzhodni respiratorni sindrome koronavirusa || https://www.jbc.org/content/early/2020/02/24/jbc.AC120.013056.full.pdf https://www.jbc.org/content/early/2020/02/24/jbc.AC120.013056|| 10.03. || 13.03. || 17.03. || Ena Kartal || Ivana Trifunovska || Jasmina Bešić
|-
| Hana Glavnik || Kako paraziti malarije zaznajo imunske celice in se pred njimi zaščitijo || https://www.sciencedaily.com/releases/2020/02/200218124346.htm || 10.03. || 13.03. || 17.03. || Ema Kovačič || Bor Krajnik || Nikola Janakievski
|-
| Anja Moškrič || Povezava med infekcijo s temperiranimi bakteriofagi in izgubo sistema CRISPR - Cas tipa I|| https://www.nature.com/articles/s41586-020-1936-2 || 10.03. || 13.03. || 17.03. || Nika Tomsič || Erik Putar || Maja Deutsch
|-
| Gaja Osojnik || || || 10.03. || 13.03. || 17.03. || Sara Golob || Ela Bizjak || Manca Pirc
|-
| Aleksandra Pajović || || || 17.03. || 20.03. || 24.03. || Zala Puklavec || Lenka Stanković || Nika Bedrač
|-
| Maja Deutsch || Globalni kemični učinki mikrobioma vsebujejo nove konjugacije žolčne kisline || https://www.nature.com/articles/s41586-020-2047-9 || 17.03. || 20.03. || 24.03. || Martin Stanonik || Ena Kartal || Ivana Trifunovska
|-
| Eva Ratajc || Z-DNA vezni protein 1 kot ključni dejavnik kontrolirane replikacije virusa Zahodnega Nila in virusa zika || https://www.readcube.com/articles/10.3389/fmicb.2019.02089 || 17.03. || 20.03. || 24.03. || Anja Moškrič || Ema Kovačič || Bor Krajnik
|-
| Lana Kores || || || 17.03. || 20.03. || 24.03. || Maša Mencigar || Nika Tomsič || Erik Putar
|-
| Sara Borišek || || || 17.03. || 20.03. || 24.03. || Nevena Ješić || Sara Golob || Ela Bizjak
|-
| Jan Kogovšek || Inhibitor plazmepsina zmoti več stanj življenjskega cikla parazita malarije || https://www.sciencedaily.com/releases/2020/03/200304141514.htm https://reader.elsevier.com/reader/sd/pii/S193131282030113X?token=D5C1CD010E9020244FE3ED5F5B36BD9C50958D0419B1E3CD7F8BDDAF847C55706EBACBF92B00F7B1D038D29371ADEA8F || 24.03. || 27.03. || 31.03. || Nika Perko || Zala Puklavec || Lenka Stanković
|-
| Nina Žgajnar || In vitro samostojno podvojevanje in policistronsko izražanje večjih sintetičnih genomov || https://www.sciencedaily.com/releases/2020/02/200218130501.htm || 24.03. || 27.03. || 31.03. || Timotej Sotošek || Martin Stanonik || Ena Kartal
|-
| Erika Rihter || || || 24.03. || 27.03. || 31.03. || Hana Glavnik || Anja Moškrič || Ema Kovačič
|-
| Luka Šegota || ||https://www.sciencedaily.com/releases/2020/03/200306183349.htm || 24.03. || 27.03. || 31.03. || Klara Kočman || Maša Mencigar || Nika Tomsič
|-
| Eva Vene ||Nevtralizacija denge pri komarjih, ki izražajo sintetično protitelo || https://www.sciencedaily.com/releases/2020/01/200116141710.htm || 24.03. || 27.03. || 31.03. || Gaja Osojnik || Nevena Ješić || Sara Golob
|-
| Ajda Beltram || || || 31.03. || 03.04. || 07.04. || Aleksandra Pajović || Nika Perko || Zala Puklavec
|-
| Jan Trebušak || || || 31.03. || 03.04. || 07.04. || Aljaž Simonič || Timotej Sotošek || Martin Stanonik
|-
| Jan Bregar || || || 31.03. || 03.04. || 07.04. || Eva Ratajc || Hana Glavnik || Anja Moškrič
|-
| Gregor Strniša || || || 31.03. || 03.04. || 07.04. || Lana Kores || Klara Kočman || Maša Mencigar
|-
| Petra Pahor || || || 31.03. || 03.04. || 07.04. || Sara Borišek || Gaja Osojnik || Nevena Ješić
|-
| Nadja Dolničar || || || 08.04. || 11.04. || 14.04. || Jan Kogovšek || Aleksandra Pajović || Nika Perko
|-
| Tina Javeršek || || || 08.04. || 11.04. || 14.04. || Nina Žgajnar || Aljaž Simonič || Timotej Sotošek
|-
| Vid Dobrovoljc || || || 08.04. || 11.04. || 14.04. || Erika Rihter || Eva Ratajc || Hana Glavnik
|-
| Tinkara Božič || || || 08.04. || 11.04. || 14.04. || Luka Šegota || Lana Kores || Klara Kočman
|-
| Kostadin Mitkov || || || 08.04. || 11.04. || 14.04. || Eva Vene || Sara Borišek || Gaja Osojnik
|-
| Sara Jerič || || || 15.04. || 18.04. || 21.04. || Ajda Beltram || Jan Kogovšek || Aleksandra Pajović
|-
| Polona Leban || || || 15.04. || 18.04. || 21.04. || Jan Trebušak || Nina Žgajnar || Aljaž Simonič
|-
| Stefanija Ivanova || || || 15.04. || 18.04. || 21.04. || Jan Bregar || Erika Rihter || Eva Ratajc
|-
| Luka Stanković || || || 15.04. || 18.04. || 21.04. || Gregor Strniša || Luka Šegota || Lana Kores
|-
| Ana Pervanja || || || 15.04. || 18.04. || 21.04. || Petra Pahor || Eva Vene || Sara Borišek
|-
| Marija Dujaković || || || 29.04. || 02.05. || 05.05. || Nadja Dolničar || Ajda Beltram || Jan Kogovšek
|-
| Neža Leskovar || || || 29.04. || 02.05. || 05.05. || Tina Javeršek || Jan Trebušak || Nina Žgajnar
|-
| Luka Hafner || || || 29.04. || 02.05. || 05.05. || Vid Dobrovoljc || Jan Bregar || Erika Rihter
|-
| Marigona Beqiraj || || || 29.04. || 02.05. || 05.05. || Tinkara Božič || Gregor Strniša || Luka Šegota
|-
| Rebeka Jerina || || || 29.04. || 02.05. || 05.05. || Kostadin Mitkov || Petra Pahor || Eva Vene
|-
| Zala Perko || Regulacija s staranjem povezanih patoloških stanj z acetilacijo proteina NLRP3 || https://www.sciencedaily.com/releases/2020/02/200206144837.htm || 06.05. || 09.05. || 12.05. || Sara Jerič || Nadja Dolničar || Ajda Beltram
|-
| Ana Žagar || || || 06.05. || 09.05. || 12.05. || Polona Leban || Tina Javeršek || Jan Trebušak
|-
| Karin Rak || || || 06.05. || 09.05. || 12.05. || Stefanija Ivanova || Vid Dobrovoljc || Jan Bregar
|-
| Jakob Tomšič || || || 06.05. || 09.05. || 12.05. || Luka Stanković || Tinkara Božič || Gregor Strniša
|-
| Maja Kobal || || || 06.05. || 09.05. || 12.05. || Ana Pervanja || Kostadin Mitkov || Petra Pahor
|-
| Špela Došler || || || 13.05. || 16.05. || 19.05. || Marija Dujaković || Sara Jerič || Nadja Dolničar
|-
| Jasmina Bešić || || || 13.05. || 16.05. || 19.05. || Neža Leskovar || Polona Leban || Tina Javeršek
|-
| Nikola Janakievski || || || 13.05. || 16.05. || 19.05. || Luka Hafner || Stefanija Ivanova || Vid Dobrovoljc
|-
| Aljaž Simonič || || || 13.05. || 16.05. || 19.05. || Marigona Beqiraj || Luka Stanković || Tinkara Božič
|-
| Manca Pirc || || || 13.05. || 16.05. || 19.05. || Rebeka Jerina || Ana Pervanja || Kostadin Mitkov
|-
| Nika Bedrač || Nižji vnos žveplo vsebujočih amino kislin niža tveganje za razvoj kardiometaboličnih bolezni || https://www.sciencedaily.com/releases/2020/02/200203141501.htm || 20.05. || 23.05. || 26.05. || Zala Perko || Marija Dujaković || Sara Jerič
|-
| Ivana Trifunovska || || || 20.05. || 23.05. || 26.05. || Ana Žagar || Neža Leskovar || Polona Leban
|-
| Bor Krajnik || || || 20.05. || 23.05. || 26.05. || Karin Rak || Luka Hafner || Stefanija Ivanova
|-
| Erik Putar || || || 20.05. || 23.05. || 26.05. || Jakob Tomšič || Marigona Beqiraj || Luka Stanković
|-
| Ela Bizjak || || || 20.05. || 23.05. || 26.05. || Maja Kobal || Rebeka Jerina || Ana Pervanja
|}

==Naloga==
* samostojno pripraviti seminar, katerega tema je novica iz področja biokemije na portalu [http://www.sciencedaily.com ScienceDaily], ki je bila objavljena kasneje kot 1. avgusta 2018. Osnova za seminar naj bo znanstveni članek, ki je podlaga za to novico. Poleg tega članka za seminar uporabite še najmanj pet drugih virov, od teh vsaj še dva druga znanstvena članka, ki se navezujeta na to vsebino.
* članke na temo lahko iščete [https://scholar.google.com/ z Google učenjakom].
* naslov izbrane teme in povezavo do novice vpišite v tabelo seminarjev takoj ko ste si izbrali temo, najkasneje pa en teden pred rokom za oddajo
* [[TBK2020 Povzetki seminarjev|Povzetek seminarja]] opišete na wikiju v približno 200 besedah - najkasneje do dne, ko morate oddati seminar recenzentom.
* Povezavo do povzetka vnesete v tabelo seminarjev tekočega letnika.
* Seminar pripravite v obliki seminarske naloge (pisava Cambria, font 11, enojni razmak, 2,5 cm robovi; tekst naj obsega okoli 1000 besed), vsebuje naj 1-2 sliki. Slika mora imeti legendo in v besedilu mora biti na ustreznem mestu sklic na sliko. Vse uporabljene vire citirajte v tekstu, kot npr. (Nobel, 2010), na koncu pa navedite točen seznam literature, kot je opisano spodaj!
*Celotni seminar naj obsega 2 strani A4 formata (po možnosti dvostransko tiskanje).
* Seminar oddajte do datuma oddaje, ki je naveden v tabeli v elektronski obliki z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/tbk/poslji/ tega obrazca].
* vsi seminarji so v elektronski obliki dostopni [http://bio.ijs.si/~zajec/tbk/poslji//bioseminar/ tukaj].
* Recenzenti do dneva določenega v tabeli določijo popravke in podajo oceno pisnega dela, v predpisanem formatu elektronskega obrazca na internetu.
* Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Za predstavitev je na voljo 10 minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni. Prvi recenzent vodi predstavitve in razpravo ter skrbi za to, da vse poteka v zastavljenih časovnih okvirih.
* Predstavitvi sledi razprava do 5 minut. Sledijo vprašanja prisotnih, recenzenti postavijo vsak vsaj dve vprašanji in na koncu podajo oceno predstavitve.
* En dan pred predstavitvijo na strežnik oddajte tudi končno verzijo. Na dan predstavitve morate oddati tudi končno (popravljeno) in natisnjeno verzijo seminarja v enem izvodu.
* Seminarska naloga in povzetek na wikiju morajo biti v slovenskem jeziku!

==Imena datotek==
Prosim vas, da vse datoteke, ki jih pošiljate poimenujete po spodnjih pravilih. Ne uporabljajte ČŽŠčžš!
Poslati morate naslednje datoteke:
* TBK_2020_Priimek_Ime.doc(x) za seminar, npr. TBK_2020_Guncar_Gregor.docx
* TBK_2020_Priimek_ime_final.doc(x) za končno verzijo seminarja
* TBK_2020_Priimek_Ime_rec_Priimek2.doc(x) za recenzijo, kjer je Priimek2 priimek recenzenta, npr. TBK_2020_Guncar_Gregor_rec_Scott.docx (če se pišete Scott in odajate recenzijo za seminar, ki ga je napisal Gunčar)
* TBK_2020_Priimek_Ime.ppt(x) za prezentacijo, npr TBK_2020_Guncar_Gregor.pptx
* TBK_2020_Priimek_Ime_clanek.pdf za datoteko PDF, ki vsebuje izvirni članek, npr. TBK_2020_Guncar_Gregor_clanek.pdf

==Ocenjevanje seminarjev==
Recenzenti ocenijo seminar tako, da izpolnijo [[https://docs.google.com/forms/d/1Hdg2OHCyG24qwLTnFt09yZTng46RIwaIiUqnKOdsJxQ/viewform recenzentsko poročilo]] na spletu.

== Mnenje o predstavitvi ==
Vsak posameznik '''mora''' oceniti seminar tako, da odda svoje [https://docs.google.com/forms/d/1VvE-jaKikfiDO5Gdybqgp9mf_0uJZfBbIK8PLXKDaS0/viewform mnenje] najkasneje v enem tednu po predstavitvi. Kdor na seminarju ni bil prisoten, mnenja '''ne sme''' oddati.

==Urejanje spletnih strani na wikiju==
Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''

==Faktor vpliva==
Faktor vpliva (angl. impact factor) neke revije pove, kolikokrat so bili v poprečju citirani članki v tej reviji v dveh letih skupaj pred objavo tega faktorja. Faktorje vpliva za posamezno revijo lahko najdete v [http://www.cobiss.si/scripts/cobiss?command=CONNECT&base=JCR COBISS-u]. V polje "Naslov revije" vnesite ime revije za katero želite izvedeti faktor vpliva in pritisnite na gumb POIŠČI. V skrajnem desnem stolpcu se bodo izpisali faktorji vpliva za revije, ki ustrezajo vašim iskalnim kriterijem. Zadetkov za posamezno revijo je več zato, ker so navedeni faktorji vpliva za posamezno leto. Za tekoče leto faktorji vpliva še niso objavljeni, zato se orientirajte po faktorjih vpliva zadnjih par let. Če faktorja vpliva za vašo izbrano revijo ne najdete v bazi COBISS, potem izberite članek iz kakšne druge revije.

==Citiranje virov==Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se v seminarju držite ene same. Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati. '''Citiranje knjig:''' Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica. Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN. Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005. Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4. Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.). '''Citiranje člankov:''' Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani. Lartigue C. ''et al''. Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, letn. 317, str. 632-638.Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole: Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani. Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.Revija Science uporablja skrajšani zapis: C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007) V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne). '''Citiranje spletnih virov:''' Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.