Wiki FKKT - User contributions [en]

Seminarji SB 2024/25

2025-05-28T23:04:39Z

Luka Fink:

V študijskem letu 2024/25 študenti in študentke pri Sintezni biologiji predstavljajo naslednje teme:

RAZISKOVALNI ČLANKI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sintetični Sintetični nastavljivi promotorji za prilagodljivo uravnavanje večgenskega izražanja v sesalskih celicah] (Marjeta Milostnik)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Inženiring_umetnih_medvrstnih_promotorjev_z_različnimi_transkripcijskimi_močmi Inženiring umetnih medvrstnih promotorjev z različnimi transkripcijskimi močmi] (Miljan Trajković)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Preprečevanje_nastanka_multimerov_pogosto_uporabljenih_plazmidov_v_sintezni_biologiji Preprečevanje nastanka multimerov pogosto uporabljenih plazmidov v sintezni biologiji] (Lev Jošt)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Priprava_Nicotiane_benthamiane_za_proizvodnjo_krisoeriola_z_uporabo_tehnik_sintezne_biologije Priprava ''Nicotiane benthamiane'' za proizvodnjo krisoeriola z uporabo tehnik sintezne biologije] (Nika Frelih)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Gensko_spremenjeni_receptorji_za_komunikacijo_med_celicami_preko_topnih_signalov_in_zaznavanje_bolezni Gensko spremenjeni receptorji za komunikacijo med celicami preko topnih signalov in zaznavanje bolezni] (Zara Bunc)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Nadzor_nad_izražanjem_heterolognih_genov_pri_Bdellovibrio_bacteriovorus_z_uporabo_sintezne_biologije Nadzor nad izražanjem heterolognih genov pri Bdellovibrio bacteriovorus z uporabo sintezne biologije] (Živa Flego)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Uporaba_konzorcija_kvasovk_za_de_novo_biosintezo_rastlinskih_lignanov Uporaba konzorcija kvasovk za de novo biosintezo rastlinskih lignanov] (Urša Lah)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sonogenetsko_nadzorovane_gensko_spremenjene_celice_za_zdravljenje_raka_v_mišjih_tumorskih_modelih Sonogenetsko nadzorovane gensko spremenjene celice za zdravljenje raka v mišjih tumorskih modelih] (Pia Mencin)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Združitev_difuzijskega_modela_in_transformerja_za_sintezo_izboljšanih_promotorjev_ter_napoved_moči_sintetičnih_promotorjev_z_uporabo_globokega_učenja Združitev difuzijskega modela in transformerja za sintezo izboljšanih promotorjev ter napoved moči sintetičnih promotorjev z uporabo globokega učenja] (Tinkara Korošec)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Z_dvojno_svetlobo_nadzirani_kokulturni_sistem_omogoča_uravnavanje_sestave_populacije Z dvojno svetlobo nadzirani sistem omogoča uravnavanje sestave populacije] (Ula Mikoš)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Načrtovanje_močnih_inducibilnih_sinteznih_promotorjev_v_kvasovkah Načrtovanje močnih inducibilnih sinteznih promotorjev v kvasovkah] (Bor Kunstelj)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Metabolni_inženiring_E._coli_za_izboljšano_produkcijo_diolov_iz_acetata Metabolni inženiring ''E. coli'' za izboljšano produkcijo diolov iz acetata] (Teo Trost)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Inkorporacija_fotosintetsko_aktivnih_kloroplastov_iz_alg_v_kultivirane_celice_sesalcev_kot_pot_k_fotosintezi_pri_Živalih Inkorporacija fotosintetsko aktivnih kloroplastov iz alg v kultivirane celice sesalcev kot pot k fotosintezi pri živalih] (Peter Gričar Vintar)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Izgradnja_metabolične_poti_za_biosintezo_treonina_iz_etilen_glikola Izgradnja metabolične poti za biosintezo treonina iz etilen glikola] (Tinkara Butara)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Povezava_sintezne_in_sistemske_biologije_za_in_vivo_encimatiko Povezava sintezne in sistemske biologije za ''in vivo'' encimatiko] (Gaja Starc)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Nanotelo_proti_Pdc1p_kot_gensko_kodiran_inhibitor_proizvodnje_etanola_omogoča_dvojni_transkripcijski_in_posttranslacijski_nadzor_fermentacije_v_kvasovkah Nanotelo proti Pdc1p kot gensko kodiran inhibitor proizvodnje etanola omogoča dvojni transkripcijski in posttranslacijski nadzor fermentacije v kvasovkah] (Lara Zupanc)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/S_fazno_separacijo_posredovano_sestavljanje_ve%C4%8Dencimskih_kompleksov_in_vivo S fazno separacijo posredovano sestavljanje večencimskih kompleksov ''in vivo''] (Lana Kores)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Umetna_nevronska_mreža_na_proteinski_ravni_v_sesalskih_celicah Umetna nevronska mreža na proteinski ravni v sesalskih celicah] (Gal Kastelic)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Uporaba_sintezne_virologije_za_hitro_inženirstvo_virusa_vezikularnega_stomatitisa_VSV Uporaba sintezne virologije za hitro inženirstvo virusa vezikularnega stomatitisa (VSV)] (Bine Brunec)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Molekularni_inženiring_funkcionalnih_siRNA Molekularni inženiring funkcionalnih siRNA] (Nataša Vujović)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Konstruirane_bakterije_za_z_bli%C5%BEnjo_infrarde%C4%8Do_svetlobo_inducirano_izra%C5%BEanje_protirakavih_terapevtikov Konstruirane bakterije za z bližnjo infrardečo svetlobo inducirano izražanje protirakavih terapevtikov] (Suzana Kučuk)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Genetsko_kodiranje_in_izražanje_RNA_origami_citoskeleta_v_sintetičnih_celicah Genetsko kodiranje in izražanje RNA origami citoskeleta v sintetičnih celicah] (Maša Karčovnik)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Evolucija_samoreplikativne_DNA_v_sintetični_protocelici Evolucija samoreplikativne DNA v sintetični protocelici] (Teo Stupar)
NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/SynPlode SynPlode] (Leila Bohorč)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/PETal:_izdelovanje_eteričnega_olja_sandalovine_iz_PET_plastike PETal: izdelovanje eteričnega olja sandalovine iz PET plastike] (Lara Krampač)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/PET_TWINS:_Praktična_uporaba_PETaze_za_učinkovitejše_recikliranje_plastike PET TWINS: Praktična uporaba PETaze za učinkovitejše recikliranje plastike] (Tina Urh)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/CAU-China:_Nodulska_tovarna_DHA_in_EPA CAU-China: Nodulska tovarna DHA in EPA] (Luka Fink)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/nuCloud:_Nov_oblak_za_shranjevanje_podatkov_na_osnovi_nukleotidov nuCloud: Nov oblak za shranjevanje podatkov na osnovi nukleotidov] (Aleš Poljanšek)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Nova_metoda_diagnosticiranja_multiple_skleroze_-_miRADAR Nova metoda diagnosticiranja multiple skleroze - miRADAR] (Petja Premrl)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Biostimulant_za_rast_rastlin_na_Luni_–_BioMoon Biostimulant za rast rastlin na Luni – BioMoon] (Žan Žnidar)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=CAPTURE:_Boj_proti_oku%C5%BEbam_s_Pseudomonas_aeruginosa_z_nosilci_protimikrobnih_peptidov&action=edit&redlink=1 Boj proti okužbam s Pseudomonas aeruginosa z nosilci protimikrobnih peptidov - CAPTURE] (Metka Rus)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/REPARO REPARO] (Lina Kopač)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Tarakate Tarakate] (Pia Špehar)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Heartecho:_presejalni_test_za_raka_pri_pacientih_po_miokardnem_infarktu Heartecho: presejalni test za raka pri pacientih po miokardnem infarktu] (Zarja Doberšek)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Synhesion Synhesion] (Janja Bohte)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Rebolutionaries Rebolutionaries] (Mia Kobal)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/PrymDetect PrymDetect] (Pia Trošt)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/PICasSO: Uporaba CRISPR/Cas v 3D genetskem inženirstvu preko programabilnih interakcij DNA-DNA] (Zarja Weingerl)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/NeoMineX NeoMineX] (Vanja Ivošević)

Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Povzetek je treba objaviti dva dni pred predstavitvijo do polnoči (za seminarje v torek torej najkasneje v ponedeljek). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo približno 5-minutna razprava.

Terminski razpored bo razviden iz preglednice na strežniku Google Drive.

Kako je videti končni seznam seminarjev, lahko preverite pri lanskem letniku: [[Seminarji_SB_2023/24]].

Evolucija samoreplikativne DNA v sintetični protocelici

2025-05-28T23:03:13Z

Luka Fink: Created page with "Izhodiščni članek: [https://www.nature.com/articles/s41467-024-53226-0] == Uvod == Ena izmed osrednjih ambicij sodobne sintezne biologije je konstrukcija umetnega sistema, ki bi imel temeljne lastnosti žive celice. Čeprav je bilo že več osnovnih življenjskih funkcij uspešno rekonstruiranih v umetnem okolju, funkcionalna sintetična celica, sposobna samostojnega obstoja in evolucije, še vedno presega naše trenutne zmožnosti. Evolucija je temeljna značilnos..."

Izhodiščni članek: [https://www.nature.com/articles/s41467-024-53226-0]

== Uvod ==
Ena izmed osrednjih ambicij sodobne sintezne biologije je konstrukcija umetnega sistema, ki bi imel temeljne lastnosti žive celice. Čeprav je bilo že več osnovnih življenjskih funkcij uspešno rekonstruiranih v umetnem okolju, funkcionalna sintetična celica, sposobna samostojnega obstoja in evolucije, še vedno presega naše trenutne zmožnosti. Evolucija je temeljna značilnost življenja, saj organizmom omogoča prilagajanje na spreminjajoče se okolje. Ključni pogoj za evolucijo je dednost – prenos informacij iz generacije v generacijo, ki ga omogoča molekularni mehanizem replikacije. Zato je vzpostavitev zanesljive in vitro replikacije eden ključnih korakov pri gradnji umetnega življenja. Prvi replikatorji v zgodovini so morda temeljili na RNA ali enostavnih avtokatalitskih sistemih. Danes poznamo več laboratorijsko rekonstruiranih samoreplikatorskih sistemov, ki ne temeljijo na DNA – med njimi RNA replikatorje in neencimatske reakcije. Ločitev genotipa in fenotipa, ki jo omogoča DNA, pa predstavlja prelomno točko v razvoju življenja, saj je odprla pot za bolj kompleksne evolucijske procese. Sprva so raziskovalci poskušali z replikacijo krožne DNA, vendar se je ta izkazala za nepraktično, saj so se pri replikaciji tvorili konkatemeri. Zato so pozornost preusmerili na linearne DNA genome, kot jih najdemo pri bakteriofagu Φ29. Ta sistem vsebuje začetke replikacije na obeh koncih in uporablja svojo lastno DNA polimerazo ter terminalni protein kot začetni primer, kar omogoča učinkovito replikacijo z malo dodatnih pomožnih proteinov. [1]

== Načrtovanje DNK replikatorja in eksperimentalna vzpostavitev evolucijskega sistema ==
Avtorji članka so pri zasnovi sintetičnega DNA replikatorja izhajali iz bakteriofaga Φ29, ki okužuje bakterijo Bacillus subtilis. Na osnovi tega sistema so sintetizirali linearno DNA zaporedje, imenovano ori-p2p3, ki vključuje dva ključna gena, vstavljena pod močan T7 promotor: p2, ki kodira Φ29 DNA polimerazo, in p3, ki kodira terminalni protein TP, pomemben za iniciacijo replikacije. DNA zaporedje so kodonsko optimizirali za izražanje v E. coli. Pri eksperimentu so za izražanje genov uporabili sistem PURE, umetno sestavljen celični ekstrakt za transkripcijo in translacijo brez uporabe živih celic. Vse sestavine so enkapsulirali v liposome, katerih lipidna sestava posnema notranjo membrano E. coli, s čimer so ustvarili umetno, zaprto okolje za replikacijo in selekcijo. Ob prvih testih pomnoževanja so pri analizi vzorcev na agaroznem gelu poleg pričakovane, 3,2 kb dolge DNA, opazili tudi krajše fragmente dolžine 1,4 kb. Ti parazitski fragmenti bi lahko motili selekcijski proces, zato so pomnožke sekvencirali in ugotovili, da so posledica spajanja homolognih vodilnih sekvenc pred genoma p2 in p3. Sistem so nato optimizirali z uvedbo umetne T7 leader sekvence pred genom p3, kar je preprečilo nastanek parazitskih produktov. Za povečanje mutacijske raznolikosti so vključili tudi mutirano različico Φ29 DNA polimeraze brez popravljalne (eksonukleazne) aktivnosti. [1]

== Evolucija DNA replikatorjev s prekinitvami ==
Da bi razvili sintetično protocelico, so najprej poskušali vzpostaviti standardni protokol za evolucijo DNA replikatorjev znotraj liposomov. DNA so enkapsulirali v liposome, joh inkubirali 24 ur pri 30 °C, izolirali, jo PCR-pomnožili, analizirali dolžino fragmentov na agaroznem gelu in jo znova enkapsulirali za naslednji cikel. Po dvanajstih ciklih evolucije so opazili petkratno povečanje koncentracije DNA. V ločenem poskusu, brez analize dolžine pomnožkov na agaroznem gelu, se količina DNA ni bistveno spreminjala. V nadaljevanju so testirali mutacijo F62Y v Φ29 DNA polimerazi. Izvedli so enajst ciklov evolucije, po osmem ciklu pa so inkubacijski čas skrajšali na štiri ure, s čimer so povečali selekcijski pritisk. Posledično se je učinkovitost DNA replikacije zmanjšala, zato so eksperiment zaključili. Analiza z NGS je pokazala kontaminacijo iz drugega eksperimenta (Int-WT1), vendar so rezultati kljub temu potrdili, da kompartmentalizirana IVTTR replikacija omogoča preživetje DNA replikatorjev. [1]

== Polkontinuirana evolucija in pomen kompartmentalizacije ==
Pri polkontinuirani evoluciji so DNA, pomnoženo v liposomih, s pomočjo freeze-thaw (FT) metode prenesli v nove liposome. Pri tem postopku se približno polovica DNA izgubi v okolico, preostanek pa ostane v liposomih. Eksperimente so izvajali z 16-urno inkubacijo pri 30 °C in 100-kratnim redčenjem med posameznimi cikli. Dodali so DSB proteine, ki omogočajo replikacijo tudi zunaj liposomov, da se pri spiranju med cikli ne bi izgubil nabor mutacij, prav tako tudi niso dodali DNAze I, saj bi ta encim lahko vstopil v liposome in razgradil znotrajcelično DNA. PCR analiza je pokazala, da se celotna 3,2 kb DNA ohranja skozi vsaj pet evolucijskih ciklov. Kvantitativna PCR je potrdila, da koncentracija p2 gena v liposomih sledi skupni količini DNA, medtem ko v bulk pogojih hitro upade zaradi prevlade parazitskih transkriptov. [1]

== Pojav DNK mutacij ter njihova evolucija ==
Raziskovalci so s pomočjo sekvenciranja naslednje generacije (NGS) spremljali DNK mutacije med evolucijo v različnih eksperimentalnih pogojih (Int-WT1, Int-WT2, Int-Mut, Con-WT). Na podlagi dobljenih podatkov so izračunali frekvence posameznih mutacij ter analizirali, katere so postale prevladujoče v populaciji. V eksperimentu Int-WT1 so se nekatere mutacije pojavile že v zgodnjih ciklih, a kasneje izginile, medtem ko sta mutaciji S79G in A80T v genu za DNK polimerazo postali prevladujoči v poznejših krogih. Mutacija S79G se je pogosto pojavljala skupaj s tiho mutacijo V247V, ki lahko vpliva na stabilnost mRNA ali hitrost translacije. V Int-WT2 sta se prav tako pojavili S79G in A80T, vendar z nižjo frekvenco, kar članek pojasnuje kot zametek konvergentne evolucije. V Int-Mut so že zgodaj nastale številne mutacije, ki so hitro postale dominantne. Ključne spremembe so bile prisotne v genu p2 (npr. F62Y, A80T, E158G) in p3 (S189G, L263P). Posebej zanimivi sta bili dve tihi mutaciji v homopolimernih regijah (AAAAAA), ki lahko zmanjšata pogostost napak DNK polimeraze pri podvajanju in ribosomske zdrse. V Con-WT so zaznali bistveno manj mutacij v primerjavi z Int-WT1 in Int-WT2, kar potrjuje, da PCR pomnoževanje med cikli poveča kopičenje mutacij. Nižja stopnja mutacij v Con-WT je obenem tudi posledica mešanja vsebine med liposomi, zaradi česar koristni encimi (fenotipi) niso nujno več povezani z lastno DNK (genotipom). To oslabi selektivni pritisk, saj evolucija ne more učinkovito "nagraditi" mutacij, ki izboljšajo funkcijo. [1]

== Karakterizacija mutacij ==
Da bi razumeli, kako posamezne mutacije vplivajo na učinkovitost replikacije, so raziskovalci podrobno preučili dve najpogostejši mutaciji – S79G in A80T – v genu p2, ki kodira DNK polimerazo (DNAP). Pripravili so vse možne kombinacije teh mutacij (posamične in dvojno mutirane proteine), jih izražali ter testirali v liposomskem IVTTR sistemu in tudi v raztopini zunaj liposomov, da bi ocenili, ali imajo mutacije splošen ali okoljsko specifičen učinek.Rezultati so pokazali, da sta obe mutaciji povzročili statistično značilno povečanje količine podvojene DNK znotraj liposomov. Zanimivo pa je, da kombinacija obeh mutacij na istem proteinu ni prinesla dodatne izboljšave – v nekaterih primerih je bila celo manj učinkovita od posameznih mutacij. Ta ugotovitev jasno kaže, da gre za funkcionalne mutacije, ki neposredno prispevajo k izboljšani replikaciji v določenem okolju in niso zgolj spremljevalke naključne evolucije. Z nadaljnjo analizo kinetike replikacije so ugotovili, da mutacija S79G pospeši hitrost podvajanja DNK. Vendar pa enake mutacije, testirane v raztopini brez liposomov, niso pokazale nobenega vpliva na učinkovitost replikacije, kar kaže, da je njihova evolucijska prednost specifična za liposomsko mikrookolje. Da bi razjasnili mehanizem delovanja mutacij – ali vplivajo na stabilnost DNK ali neposredno na aktivnost DNAP – so raziskovalci encim izolirali, očistili in testirali v odsotnosti DNK matrice. Rezultati so pokazali, da nobena od mutacij ni izboljšala aktivnosti encima samega, kar pomeni, da so njihovi učinki odvisni od interakcije z DNK matrico znotraj liposoma. Zamenjave aminokislin torej ne povečajo splošne encimske aktivnosti, temveč učinkujejo le v specifičnem kontekstu. Dodatno so preučili tudi vpliv tihih mutacij, ki ne spreminjajo aminokislinskega zaporedja, a lahko vplivajo na stabilnost DNK, odpravo homopolimerov, učinkovitost translacije ali sekundarno strukturo mRNA. Vse testirane tihe mutacije so dosegle enako raven replikacije kot izvorna DNK, kar nakazuje, da njihov vpliv ni neposreden in deluje v kombinaciji z drugimi mutacijami. [1]

== Zaključek ==
Raziskava dokazuje, da je mogoče ustvariti sintetični sistem, ki omogoča replikacijo in evolucijo DNA brez prisotnosti živih celic. Znotraj liposomov se DNA ne le pomnožuje, temveč tudi mutira. Ključni element tega procesa je povezava med genotipom in fenotipom, saj le tako mutacije lahko vplivajo na funkcionalnost in preživetje. Kompartmentalizacija znotraj liposomov ima osrednjo vlogo, saj omogoča selekcijo in preprečuje tvorbo parazitskih pomnožkov. Rezultati potrjujejo, da se lahko sintetični DNA replikatorji neodvisno replicirajo in se spreminjajo ter prilagajajo selekcijskemu pritisku v okolju. [1]

== Literatura ==
[1] Abil, Z., Restrepo Sierra, A. M., Stan, A. R., & others. (2024). Darwinian evolution of self-replicating DNA in a synthetic protocell. Nature Communications, 15, 9091. https://doi.org/10.1038/s41467-024-53226-0

Seminarji SB 2024/25

2025-05-28T23:02:43Z

Luka Fink:

V študijskem letu 2024/25 študenti in študentke pri Sintezni biologiji predstavljajo naslednje teme:

RAZISKOVALNI ČLANKI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sintetični Sintetični nastavljivi promotorji za prilagodljivo uravnavanje večgenskega izražanja v sesalskih celicah] (Marjeta Milostnik)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Inženiring_umetnih_medvrstnih_promotorjev_z_različnimi_transkripcijskimi_močmi Inženiring umetnih medvrstnih promotorjev z različnimi transkripcijskimi močmi] (Miljan Trajković)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Preprečevanje_nastanka_multimerov_pogosto_uporabljenih_plazmidov_v_sintezni_biologiji Preprečevanje nastanka multimerov pogosto uporabljenih plazmidov v sintezni biologiji] (Lev Jošt)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Priprava_Nicotiane_benthamiane_za_proizvodnjo_krisoeriola_z_uporabo_tehnik_sintezne_biologije Priprava ''Nicotiane benthamiane'' za proizvodnjo krisoeriola z uporabo tehnik sintezne biologije] (Nika Frelih)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Gensko_spremenjeni_receptorji_za_komunikacijo_med_celicami_preko_topnih_signalov_in_zaznavanje_bolezni Gensko spremenjeni receptorji za komunikacijo med celicami preko topnih signalov in zaznavanje bolezni] (Zara Bunc)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Nadzor_nad_izražanjem_heterolognih_genov_pri_Bdellovibrio_bacteriovorus_z_uporabo_sintezne_biologije Nadzor nad izražanjem heterolognih genov pri Bdellovibrio bacteriovorus z uporabo sintezne biologije] (Živa Flego)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Uporaba_konzorcija_kvasovk_za_de_novo_biosintezo_rastlinskih_lignanov Uporaba konzorcija kvasovk za de novo biosintezo rastlinskih lignanov] (Urša Lah)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sonogenetsko_nadzorovane_gensko_spremenjene_celice_za_zdravljenje_raka_v_mišjih_tumorskih_modelih Sonogenetsko nadzorovane gensko spremenjene celice za zdravljenje raka v mišjih tumorskih modelih] (Pia Mencin)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Združitev_difuzijskega_modela_in_transformerja_za_sintezo_izboljšanih_promotorjev_ter_napoved_moči_sintetičnih_promotorjev_z_uporabo_globokega_učenja Združitev difuzijskega modela in transformerja za sintezo izboljšanih promotorjev ter napoved moči sintetičnih promotorjev z uporabo globokega učenja] (Tinkara Korošec)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Z_dvojno_svetlobo_nadzirani_kokulturni_sistem_omogoča_uravnavanje_sestave_populacije Z dvojno svetlobo nadzirani sistem omogoča uravnavanje sestave populacije] (Ula Mikoš)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Načrtovanje_močnih_inducibilnih_sinteznih_promotorjev_v_kvasovkah Načrtovanje močnih inducibilnih sinteznih promotorjev v kvasovkah] (Bor Kunstelj)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Metabolni_inženiring_E._coli_za_izboljšano_produkcijo_diolov_iz_acetata Metabolni inženiring ''E. coli'' za izboljšano produkcijo diolov iz acetata] (Teo Trost)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Inkorporacija_fotosintetsko_aktivnih_kloroplastov_iz_alg_v_kultivirane_celice_sesalcev_kot_pot_k_fotosintezi_pri_Živalih Inkorporacija fotosintetsko aktivnih kloroplastov iz alg v kultivirane celice sesalcev kot pot k fotosintezi pri živalih] (Peter Gričar Vintar)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Izgradnja_metabolične_poti_za_biosintezo_treonina_iz_etilen_glikola Izgradnja metabolične poti za biosintezo treonina iz etilen glikola] (Tinkara Butara)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Povezava_sintezne_in_sistemske_biologije_za_in_vivo_encimatiko Povezava sintezne in sistemske biologije za ''in vivo'' encimatiko] (Gaja Starc)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Nanotelo_proti_Pdc1p_kot_gensko_kodiran_inhibitor_proizvodnje_etanola_omogoča_dvojni_transkripcijski_in_posttranslacijski_nadzor_fermentacije_v_kvasovkah Nanotelo proti Pdc1p kot gensko kodiran inhibitor proizvodnje etanola omogoča dvojni transkripcijski in posttranslacijski nadzor fermentacije v kvasovkah] (Lara Zupanc)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/S_fazno_separacijo_posredovano_sestavljanje_ve%C4%8Dencimskih_kompleksov_in_vivo S fazno separacijo posredovano sestavljanje večencimskih kompleksov ''in vivo''] (Lana Kores)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Umetna_nevronska_mreža_na_proteinski_ravni_v_sesalskih_celicah Umetna nevronska mreža na proteinski ravni v sesalskih celicah] (Gal Kastelic)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Uporaba_sintezne_virologije_za_hitro_inženirstvo_virusa_vezikularnega_stomatitisa_VSV Uporaba sintezne virologije za hitro inženirstvo virusa vezikularnega stomatitisa (VSV)] (Bine Brunec)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Molekularni_inženiring_funkcionalnih_siRNA Molekularni inženiring funkcionalnih siRNA] (Nataša Vujović)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Konstruirane_bakterije_za_z_bli%C5%BEnjo_infrarde%C4%8Do_svetlobo_inducirano_izra%C5%BEanje_protirakavih_terapevtikov Konstruirane bakterije za z bližnjo infrardečo svetlobo inducirano izražanje protirakavih terapevtikov] (Suzana Kučuk)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Genetsko_kodiranje_in_izražanje_RNA_origami_citoskeleta_v_sintetičnih_celicah Genetsko kodiranje in izražanje RNA origami citoskeleta v sintetičnih celicah] (Maša Karčovnik)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Evolucija_samoreplikativne_DNA_v_sintetični_protocelici Evolucija samoreplikativne DNA v sintetični protocelici] (Teo Stupar)
NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/SynPlode SynPlode] (Leila Bohorč)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/PETal:_izdelovanje_eteričnega_olja_sandalovine_iz_PET_plastike PETal: izdelovanje eteričnega olja sandalovine iz PET plastike] (Lara Krampač)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/PET_TWINS:_Praktična_uporaba_PETaze_za_učinkovitejše_recikliranje_plastike PET TWINS: Praktična uporaba PETaze za učinkovitejše recikliranje plastike] (Tina Urh)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/CAU-China:_Nodulska_tovarna_DHA_in_EPA CAU-China: Nodulska tovarna DHA in EPA] (Luka Fink)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/nuCloud:_Nov_oblak_za_shranjevanje_podatkov_na_osnovi_nukleotidov nuCloud: Nov oblak za shranjevanje podatkov na osnovi nukleotidov] (Aleš Poljanšek)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Nova_metoda_diagnosticiranja_multiple_skleroze_-_miRADAR Nova metoda diagnosticiranja multiple skleroze - miRADAR] (Petja Premrl)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Biostimulant_za_rast_rastlin_na_Luni_–_BioMoon Biostimulant za rast rastlin na Luni – BioMoon] (Žan Žnidar)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=CAPTURE:_Boj_proti_oku%C5%BEbam_s_Pseudomonas_aeruginosa_z_nosilci_protimikrobnih_peptidov&action=edit&redlink=1 Boj proti okužbam s Pseudomonas aeruginosa z nosilci protimikrobnih peptidov - CAPTURE] (Metka Rus)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/REPARO REPARO] (Lina Kopač)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Tarakate Tarakate] (Pia Špehar)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Heartecho:_presejalni_test_za_raka_pri_pacientih_po_miokardnem_infarktu Heartecho: presejalni test za raka pri pacientih po miokardnem infarktu] (Zarja Doberšek)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Synhesion Synhesion] (Janja Bohte)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Rebolutionaries Rebolutionaries] (Mia Kobal)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/PrymDetect PrymDetect] (Pia Trošt)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/PICasSO: Uporaba CRISPR/Cas v 3D genetskem inženirstvu preko programabilnih interakcij DNA-DNA] (Zarja Weingerl)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/NeoMineX NeoMineX] (Vanja Ivošević)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Evolucija samoreplikativne DNA v sintetični protocelici] (Teo Stupar)

Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Povzetek je treba objaviti dva dni pred predstavitvijo do polnoči (za seminarje v torek torej najkasneje v ponedeljek). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo približno 5-minutna razprava.

Terminski razpored bo razviden iz preglednice na strežniku Google Drive.

Kako je videti končni seznam seminarjev, lahko preverite pri lanskem letniku: [[Seminarji_SB_2023/24]].

Seminarji SB 2024/25

2025-05-28T23:00:46Z

Luka Fink:

V študijskem letu 2024/25 študenti in študentke pri Sintezni biologiji predstavljajo naslednje teme:

RAZISKOVALNI ČLANKI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sintetični Sintetični nastavljivi promotorji za prilagodljivo uravnavanje večgenskega izražanja v sesalskih celicah] (Marjeta Milostnik)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Inženiring_umetnih_medvrstnih_promotorjev_z_različnimi_transkripcijskimi_močmi Inženiring umetnih medvrstnih promotorjev z različnimi transkripcijskimi močmi] (Miljan Trajković)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Preprečevanje_nastanka_multimerov_pogosto_uporabljenih_plazmidov_v_sintezni_biologiji Preprečevanje nastanka multimerov pogosto uporabljenih plazmidov v sintezni biologiji] (Lev Jošt)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Priprava_Nicotiane_benthamiane_za_proizvodnjo_krisoeriola_z_uporabo_tehnik_sintezne_biologije Priprava ''Nicotiane benthamiane'' za proizvodnjo krisoeriola z uporabo tehnik sintezne biologije] (Nika Frelih)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Gensko_spremenjeni_receptorji_za_komunikacijo_med_celicami_preko_topnih_signalov_in_zaznavanje_bolezni Gensko spremenjeni receptorji za komunikacijo med celicami preko topnih signalov in zaznavanje bolezni] (Zara Bunc)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Nadzor_nad_izražanjem_heterolognih_genov_pri_Bdellovibrio_bacteriovorus_z_uporabo_sintezne_biologije Nadzor nad izražanjem heterolognih genov pri Bdellovibrio bacteriovorus z uporabo sintezne biologije] (Živa Flego)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Uporaba_konzorcija_kvasovk_za_de_novo_biosintezo_rastlinskih_lignanov Uporaba konzorcija kvasovk za de novo biosintezo rastlinskih lignanov] (Urša Lah)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sonogenetsko_nadzorovane_gensko_spremenjene_celice_za_zdravljenje_raka_v_mišjih_tumorskih_modelih Sonogenetsko nadzorovane gensko spremenjene celice za zdravljenje raka v mišjih tumorskih modelih] (Pia Mencin)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Združitev_difuzijskega_modela_in_transformerja_za_sintezo_izboljšanih_promotorjev_ter_napoved_moči_sintetičnih_promotorjev_z_uporabo_globokega_učenja Združitev difuzijskega modela in transformerja za sintezo izboljšanih promotorjev ter napoved moči sintetičnih promotorjev z uporabo globokega učenja] (Tinkara Korošec)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Z_dvojno_svetlobo_nadzirani_kokulturni_sistem_omogoča_uravnavanje_sestave_populacije Z dvojno svetlobo nadzirani sistem omogoča uravnavanje sestave populacije] (Ula Mikoš)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Načrtovanje_močnih_inducibilnih_sinteznih_promotorjev_v_kvasovkah Načrtovanje močnih inducibilnih sinteznih promotorjev v kvasovkah] (Bor Kunstelj)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Metabolni_inženiring_E._coli_za_izboljšano_produkcijo_diolov_iz_acetata Metabolni inženiring ''E. coli'' za izboljšano produkcijo diolov iz acetata] (Teo Trost)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Inkorporacija_fotosintetsko_aktivnih_kloroplastov_iz_alg_v_kultivirane_celice_sesalcev_kot_pot_k_fotosintezi_pri_Živalih Inkorporacija fotosintetsko aktivnih kloroplastov iz alg v kultivirane celice sesalcev kot pot k fotosintezi pri živalih] (Peter Gričar Vintar)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Izgradnja_metabolične_poti_za_biosintezo_treonina_iz_etilen_glikola Izgradnja metabolične poti za biosintezo treonina iz etilen glikola] (Tinkara Butara)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Povezava_sintezne_in_sistemske_biologije_za_in_vivo_encimatiko Povezava sintezne in sistemske biologije za ''in vivo'' encimatiko] (Gaja Starc)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Nanotelo_proti_Pdc1p_kot_gensko_kodiran_inhibitor_proizvodnje_etanola_omogoča_dvojni_transkripcijski_in_posttranslacijski_nadzor_fermentacije_v_kvasovkah Nanotelo proti Pdc1p kot gensko kodiran inhibitor proizvodnje etanola omogoča dvojni transkripcijski in posttranslacijski nadzor fermentacije v kvasovkah] (Lara Zupanc)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/S_fazno_separacijo_posredovano_sestavljanje_ve%C4%8Dencimskih_kompleksov_in_vivo S fazno separacijo posredovano sestavljanje večencimskih kompleksov ''in vivo''] (Lana Kores)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Umetna_nevronska_mreža_na_proteinski_ravni_v_sesalskih_celicah Umetna nevronska mreža na proteinski ravni v sesalskih celicah] (Gal Kastelic)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Uporaba_sintezne_virologije_za_hitro_inženirstvo_virusa_vezikularnega_stomatitisa_VSV Uporaba sintezne virologije za hitro inženirstvo virusa vezikularnega stomatitisa (VSV)] (Bine Brunec)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Molekularni_inženiring_funkcionalnih_siRNA Molekularni inženiring funkcionalnih siRNA] (Nataša Vujović)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Konstruirane_bakterije_za_z_bli%C5%BEnjo_infrarde%C4%8Do_svetlobo_inducirano_izra%C5%BEanje_protirakavih_terapevtikov Konstruirane bakterije za z bližnjo infrardečo svetlobo inducirano izražanje protirakavih terapevtikov] (Suzana Kučuk)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Genetsko_kodiranje_in_izražanje_RNA_origami_citoskeleta_v_sintetičnih_celicah Genetsko kodiranje in izražanje RNA origami citoskeleta v sintetičnih celicah] (Maša Karčovnik)
NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/SynPlode SynPlode] (Leila Bohorč)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/PETal:_izdelovanje_eteričnega_olja_sandalovine_iz_PET_plastike PETal: izdelovanje eteričnega olja sandalovine iz PET plastike] (Lara Krampač)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/PET_TWINS:_Praktična_uporaba_PETaze_za_učinkovitejše_recikliranje_plastike PET TWINS: Praktična uporaba PETaze za učinkovitejše recikliranje plastike] (Tina Urh)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/CAU-China:_Nodulska_tovarna_DHA_in_EPA CAU-China: Nodulska tovarna DHA in EPA] (Luka Fink)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/nuCloud:_Nov_oblak_za_shranjevanje_podatkov_na_osnovi_nukleotidov nuCloud: Nov oblak za shranjevanje podatkov na osnovi nukleotidov] (Aleš Poljanšek)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Nova_metoda_diagnosticiranja_multiple_skleroze_-_miRADAR Nova metoda diagnosticiranja multiple skleroze - miRADAR] (Petja Premrl)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Biostimulant_za_rast_rastlin_na_Luni_–_BioMoon Biostimulant za rast rastlin na Luni – BioMoon] (Žan Žnidar)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=CAPTURE:_Boj_proti_oku%C5%BEbam_s_Pseudomonas_aeruginosa_z_nosilci_protimikrobnih_peptidov&action=edit&redlink=1 Boj proti okužbam s Pseudomonas aeruginosa z nosilci protimikrobnih peptidov - CAPTURE] (Metka Rus)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/REPARO REPARO] (Lina Kopač)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Tarakate Tarakate] (Pia Špehar)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Heartecho:_presejalni_test_za_raka_pri_pacientih_po_miokardnem_infarktu Heartecho: presejalni test za raka pri pacientih po miokardnem infarktu] (Zarja Doberšek)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Synhesion Synhesion] (Janja Bohte)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Rebolutionaries Rebolutionaries] (Mia Kobal)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/PrymDetect PrymDetect] (Pia Trošt)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/PICasSO: Uporaba CRISPR/Cas v 3D genetskem inženirstvu preko programabilnih interakcij DNA-DNA] (Zarja Weingerl)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/NeoMineX NeoMineX] (Vanja Ivošević)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Evolucija samoreplikativne DNA v sintetični protocelici] (Teo Stupar)

Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Povzetek je treba objaviti dva dni pred predstavitvijo do polnoči (za seminarje v torek torej najkasneje v ponedeljek). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo približno 5-minutna razprava.

Terminski razpored bo razviden iz preglednice na strežniku Google Drive.

Kako je videti končni seznam seminarjev, lahko preverite pri lanskem letniku: [[Seminarji_SB_2023/24]].

Seminarji SB 2024/25

2025-05-28T22:58:58Z

Luka Fink:

V študijskem letu 2024/25 študenti in študentke pri Sintezni biologiji predstavljajo naslednje teme:

RAZISKOVALNI ČLANKI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sintetični Sintetični nastavljivi promotorji za prilagodljivo uravnavanje večgenskega izražanja v sesalskih celicah] (Marjeta Milostnik)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Inženiring_umetnih_medvrstnih_promotorjev_z_različnimi_transkripcijskimi_močmi Inženiring umetnih medvrstnih promotorjev z različnimi transkripcijskimi močmi] (Miljan Trajković)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Preprečevanje_nastanka_multimerov_pogosto_uporabljenih_plazmidov_v_sintezni_biologiji Preprečevanje nastanka multimerov pogosto uporabljenih plazmidov v sintezni biologiji] (Lev Jošt)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Priprava_Nicotiane_benthamiane_za_proizvodnjo_krisoeriola_z_uporabo_tehnik_sintezne_biologije Priprava ''Nicotiane benthamiane'' za proizvodnjo krisoeriola z uporabo tehnik sintezne biologije] (Nika Frelih)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Gensko_spremenjeni_receptorji_za_komunikacijo_med_celicami_preko_topnih_signalov_in_zaznavanje_bolezni Gensko spremenjeni receptorji za komunikacijo med celicami preko topnih signalov in zaznavanje bolezni] (Zara Bunc)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Nadzor_nad_izražanjem_heterolognih_genov_pri_Bdellovibrio_bacteriovorus_z_uporabo_sintezne_biologije Nadzor nad izražanjem heterolognih genov pri Bdellovibrio bacteriovorus z uporabo sintezne biologije] (Živa Flego)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Uporaba_konzorcija_kvasovk_za_de_novo_biosintezo_rastlinskih_lignanov Uporaba konzorcija kvasovk za de novo biosintezo rastlinskih lignanov] (Urša Lah)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sonogenetsko_nadzorovane_gensko_spremenjene_celice_za_zdravljenje_raka_v_mišjih_tumorskih_modelih Sonogenetsko nadzorovane gensko spremenjene celice za zdravljenje raka v mišjih tumorskih modelih] (Pia Mencin)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Združitev_difuzijskega_modela_in_transformerja_za_sintezo_izboljšanih_promotorjev_ter_napoved_moči_sintetičnih_promotorjev_z_uporabo_globokega_učenja Združitev difuzijskega modela in transformerja za sintezo izboljšanih promotorjev ter napoved moči sintetičnih promotorjev z uporabo globokega učenja] (Tinkara Korošec)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Z_dvojno_svetlobo_nadzirani_kokulturni_sistem_omogoča_uravnavanje_sestave_populacije Z dvojno svetlobo nadzirani sistem omogoča uravnavanje sestave populacije] (Ula Mikoš)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Načrtovanje_močnih_inducibilnih_sinteznih_promotorjev_v_kvasovkah Načrtovanje močnih inducibilnih sinteznih promotorjev v kvasovkah] (Bor Kunstelj)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Metabolni_inženiring_E._coli_za_izboljšano_produkcijo_diolov_iz_acetata Metabolni inženiring ''E. coli'' za izboljšano produkcijo diolov iz acetata] (Teo Trost)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Inkorporacija_fotosintetsko_aktivnih_kloroplastov_iz_alg_v_kultivirane_celice_sesalcev_kot_pot_k_fotosintezi_pri_Živalih Inkorporacija fotosintetsko aktivnih kloroplastov iz alg v kultivirane celice sesalcev kot pot k fotosintezi pri živalih] (Peter Gričar Vintar)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Izgradnja_metabolične_poti_za_biosintezo_treonina_iz_etilen_glikola Izgradnja metabolične poti za biosintezo treonina iz etilen glikola] (Tinkara Butara)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Povezava_sintezne_in_sistemske_biologije_za_in_vivo_encimatiko Povezava sintezne in sistemske biologije za ''in vivo'' encimatiko] (Gaja Starc)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Nanotelo_proti_Pdc1p_kot_gensko_kodiran_inhibitor_proizvodnje_etanola_omogoča_dvojni_transkripcijski_in_posttranslacijski_nadzor_fermentacije_v_kvasovkah Nanotelo proti Pdc1p kot gensko kodiran inhibitor proizvodnje etanola omogoča dvojni transkripcijski in posttranslacijski nadzor fermentacije v kvasovkah] (Lara Zupanc)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/S_fazno_separacijo_posredovano_sestavljanje_ve%C4%8Dencimskih_kompleksov_in_vivo S fazno separacijo posredovano sestavljanje večencimskih kompleksov ''in vivo''] (Lana Kores)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Umetna_nevronska_mreža_na_proteinski_ravni_v_sesalskih_celicah Umetna nevronska mreža na proteinski ravni v sesalskih celicah] (Gal Kastelic)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Uporaba_sintezne_virologije_za_hitro_inženirstvo_virusa_vezikularnega_stomatitisa_VSV Uporaba sintezne virologije za hitro inženirstvo virusa vezikularnega stomatitisa (VSV)] (Bine Brunec)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Molekularni_inženiring_funkcionalnih_siRNA Molekularni inženiring funkcionalnih siRNA] (Nataša Vujović)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Konstruirane_bakterije_za_z_bli%C5%BEnjo_infrarde%C4%8Do_svetlobo_inducirano_izra%C5%BEanje_protirakavih_terapevtikov Konstruirane bakterije za z bližnjo infrardečo svetlobo inducirano izražanje protirakavih terapevtikov] (Suzana Kučuk)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Genetsko_kodiranje_in_izražanje_RNA_origami_citoskeleta_v_sintetičnih_celicah Genetsko kodiranje in izražanje RNA origami citoskeleta v sintetičnih celicah] (Maša Karčovnik)
NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/SynPlode SynPlode] (Leila Bohorč)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/PETal:_izdelovanje_eteričnega_olja_sandalovine_iz_PET_plastike PETal: izdelovanje eteričnega olja sandalovine iz PET plastike] (Lara Krampač)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/PET_TWINS:_Praktična_uporaba_PETaze_za_učinkovitejše_recikliranje_plastike PET TWINS: Praktična uporaba PETaze za učinkovitejše recikliranje plastike] (Tina Urh)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/CAU-China:_Nodulska_tovarna_DHA_in_EPA CAU-China: Nodulska tovarna DHA in EPA] (Luka Fink)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/nuCloud:_Nov_oblak_za_shranjevanje_podatkov_na_osnovi_nukleotidov nuCloud: Nov oblak za shranjevanje podatkov na osnovi nukleotidov] (Aleš Poljanšek)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Nova_metoda_diagnosticiranja_multiple_skleroze_-_miRADAR Nova metoda diagnosticiranja multiple skleroze - miRADAR] (Petja Premrl)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Biostimulant_za_rast_rastlin_na_Luni_–_BioMoon Biostimulant za rast rastlin na Luni – BioMoon] (Žan Žnidar)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=CAPTURE:_Boj_proti_oku%C5%BEbam_s_Pseudomonas_aeruginosa_z_nosilci_protimikrobnih_peptidov&action=edit&redlink=1 Boj proti okužbam s Pseudomonas aeruginosa z nosilci protimikrobnih peptidov - CAPTURE] (Metka Rus)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/REPARO REPARO] (Lina Kopač)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Tarakate Tarakate] (Pia Špehar)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Heartecho:_presejalni_test_za_raka_pri_pacientih_po_miokardnem_infarktu Heartecho: presejalni test za raka pri pacientih po miokardnem infarktu] (Zarja Doberšek)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Synhesion Synhesion] (Janja Bohte)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Rebolutionaries Rebolutionaries] (Mia Kobal)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/PrymDetect PrymDetect] (Pia Trošt)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/PICasSO: Uporaba CRISPR/Cas v 3D genetskem inženirstvu preko programabilnih interakcij DNA-DNA] (Zarja Weingerl)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/NeoMineX NeoMineX] (Vanja Ivošević)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/ Evolucija samoreplikativne DNA v sintetični protocelici ] (Teo Stupar)

Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Povzetek je treba objaviti dva dni pred predstavitvijo do polnoči (za seminarje v torek torej najkasneje v ponedeljek). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo približno 5-minutna razprava.

Terminski razpored bo razviden iz preglednice na strežniku Google Drive.

Kako je videti končni seznam seminarjev, lahko preverite pri lanskem letniku: [[Seminarji_SB_2023/24]].

Evolucija

2025-05-28T22:57:33Z

Luka Fink:

Evolucija

2025-05-28T22:52:24Z

Izhodiščni članek: [https://www.nature.com/articles/s41467-024-53226-0]

== Uvod ==
Ena izmed osrednjih ambicij sodobne sintezne biologije je konstrukcija umetnega sistema, ki bi imel temeljne lastnosti žive celice. Čeprav je bilo že več osnovnih življenjskih funkcij uspešno rekonstruiranih v umetnem okolju, funkcionalna sintetična celica, sposobna samostojnega obstoja in evolucije, še vedno presega naše trenutne zmožnosti. Evolucija je temeljna značilnost življenja, saj organizmom omogoča prilagajanje na spreminjajoče se okolje. Ključni pogoj za evolucijo je dednost – prenos informacij iz generacije v generacijo, ki ga omogoča molekularni mehanizem replikacije. Zato je vzpostavitev zanesljive in vitro replikacije eden ključnih korakov pri gradnji umetnega življenja. Prvi replikatorji v zgodovini so morda temeljili na RNA ali enostavnih avtokatalitskih sistemih. Danes poznamo več laboratorijsko rekonstruiranih samoreplikatorskih sistemov, ki ne temeljijo na DNA – med njimi RNA replikatorje in neencimatske reakcije. Ločitev genotipa in fenotipa, ki jo omogoča DNA, pa predstavlja prelomno točko v razvoju življenja, saj je odprla pot za bolj kompleksne evolucijske procese. Sprva so raziskovalci poskušali z replikacijo krožne DNA, vendar se je ta izkazala za nepraktično, saj so se pri replikaciji tvorili konkatemeri. Zato so pozornost preusmerili na linearne DNA genome, kot jih najdemo pri bakteriofagu Φ29. Ta sistem vsebuje začetke replikacije na obeh koncih in uporablja svojo lastno DNA polimerazo ter terminalni protein kot začetni primer, kar omogoča učinkovito replikacijo z malo dodatnih pomožnih proteinov. [1]

== Načrtovanje DNK replikatorja in eksperimentalna vzpostavitev evolucijskega sistema ==
Avtorji članka so pri zasnovi sintetičnega DNA replikatorja izhajali iz bakteriofaga Φ29, ki okužuje bakterijo Bacillus subtilis. Na osnovi tega sistema so sintetizirali linearno DNA zaporedje, imenovano ori-p2p3, ki vključuje dva ključna gena, vstavljena pod močan T7 promotor: p2, ki kodira Φ29 DNA polimerazo, in p3, ki kodira terminalni protein TP, pomemben za iniciacijo replikacije. DNA zaporedje so kodonsko optimizirali za izražanje v E. coli. Pri eksperimentu so za izražanje genov uporabili sistem PURE, umetno sestavljen celični ekstrakt za transkripcijo in translacijo brez uporabe živih celic. Vse sestavine so enkapsulirali v liposome, katerih lipidna sestava posnema notranjo membrano E. coli, s čimer so ustvarili umetno, zaprto okolje za replikacijo in selekcijo. Ob prvih testih pomnoževanja so pri analizi vzorcev na agaroznem gelu poleg pričakovane, 3,2 kb dolge DNA, opazili tudi krajše fragmente dolžine 1,4 kb. Ti parazitski fragmenti bi lahko motili selekcijski proces, zato so pomnožke sekvencirali in ugotovili, da so posledica spajanja homolognih vodilnih sekvenc pred genoma p2 in p3. Sistem so nato optimizirali z uvedbo umetne T7 leader sekvence pred genom p3, kar je preprečilo nastanek parazitskih produktov. Za povečanje mutacijske raznolikosti so vključili tudi mutirano različico Φ29 DNA polimeraze brez popravljalne (eksonukleazne) aktivnosti. [1]

== Evolucija DNA replikatorjev s prekinitvami ==
Da bi razvili sintetično protocelico, so najprej poskušali vzpostaviti standardni protokol za evolucijo DNA replikatorjev znotraj liposomov. DNA so enkapsulirali v liposome, joh inkubirali 24 ur pri 30 °C, izolirali, jo PCR-pomnožili, analizirali dolžino fragmentov na agaroznem gelu in jo znova enkapsulirali za naslednji cikel. Po dvanajstih ciklih evolucije so opazili petkratno povečanje koncentracije DNA. V ločenem poskusu, brez analize dolžine pomnožkov na agaroznem gelu, se količina DNA ni bistveno spreminjala. V nadaljevanju so testirali mutacijo F62Y v Φ29 DNA polimerazi. Izvedli so enajst ciklov evolucije, po osmem ciklu pa so inkubacijski čas skrajšali na štiri ure, s čimer so povečali selekcijski pritisk. Posledično se je učinkovitost DNA replikacije zmanjšala, zato so eksperiment zaključili. Analiza z NGS je pokazala kontaminacijo iz drugega eksperimenta (Int-WT1), vendar so rezultati kljub temu potrdili, da kompartmentalizirana IVTTR replikacija omogoča preživetje DNA replikatorjev. [1]

== Polkontinuirana evolucija in pomen kompartmentalizacije ==
Pri polkontinuirani evoluciji so DNA, pomnoženo v liposomih, s pomočjo freeze-thaw (FT) metode prenesli v nove liposome. Pri tem postopku se približno polovica DNA izgubi v okolico, preostanek pa ostane v liposomih. Eksperimente so izvajali z 16-urno inkubacijo pri 30 °C in 100-kratnim redčenjem med posameznimi cikli. Dodali so DSB proteine, ki omogočajo replikacijo tudi zunaj liposomov, da se pri spiranju med cikli ne bi izgubil nabor mutacij, prav tako tudi niso dodali DNAze I, saj bi ta encim lahko vstopil v liposome in razgradil znotrajcelično DNA. PCR analiza je pokazala, da se celotna 3,2 kb DNA ohranja skozi vsaj pet evolucijskih ciklov. Kvantitativna PCR je potrdila, da koncentracija p2 gena v liposomih sledi skupni količini DNA, medtem ko v bulk pogojih hitro upade zaradi prevlade parazitskih transkriptov. [1]

== Pojav DNK mutacij ter njihova evolucija ==
Raziskovalci so s pomočjo sekvenciranja naslednje generacije (NGS) spremljali DNK mutacije med evolucijo v različnih eksperimentalnih pogojih (Int-WT1, Int-WT2, Int-Mut, Con-WT). Na podlagi dobljenih podatkov so izračunali frekvence posameznih mutacij ter analizirali, katere so postale prevladujoče v populaciji. V eksperimentu Int-WT1 so se nekatere mutacije pojavile že v zgodnjih ciklih, a kasneje izginile, medtem ko sta mutaciji S79G in A80T v genu za DNK polimerazo postali prevladujoči v poznejših krogih. Mutacija S79G se je pogosto pojavljala skupaj s tiho mutacijo V247V, ki lahko vpliva na stabilnost mRNA ali hitrost translacije. V Int-WT2 sta se prav tako pojavili S79G in A80T, vendar z nižjo frekvenco, kar članek pojasnuje kot zametek konvergentne evolucije. V Int-Mut so že zgodaj nastale številne mutacije, ki so hitro postale dominantne. Ključne spremembe so bile prisotne v genu p2 (npr. F62Y, A80T, E158G) in p3 (S189G, L263P). Posebej zanimivi sta bili dve tihi mutaciji v homopolimernih regijah (AAAAAA), ki lahko zmanjšata pogostost napak DNK polimeraze pri podvajanju in ribosomske zdrse. V Con-WT so zaznali bistveno manj mutacij v primerjavi z Int-WT1 in Int-WT2, kar potrjuje, da PCR pomnoževanje med cikli poveča kopičenje mutacij. Nižja stopnja mutacij v Con-WT je obenem tudi posledica mešanja vsebine med liposomi, zaradi česar koristni encimi (fenotipi) niso nujno več povezani z lastno DNK (genotipom). To oslabi selektivni pritisk, saj evolucija ne more učinkovito "nagraditi" mutacij, ki izboljšajo funkcijo. [1]

== Karakterizacija mutacij ==
Da bi razumeli, kako posamezne mutacije vplivajo na učinkovitost replikacije, so raziskovalci podrobno preučili dve najpogostejši mutaciji – S79G in A80T – v genu p2, ki kodira DNK polimerazo (DNAP). Pripravili so vse možne kombinacije teh mutacij (posamične in dvojno mutirane proteine), jih izražali ter testirali v liposomskem IVTTR sistemu in tudi v raztopini zunaj liposomov, da bi ocenili, ali imajo mutacije splošen ali okoljsko specifičen učinek.Rezultati so pokazali, da sta obe mutaciji povzročili statistično značilno povečanje količine podvojene DNK znotraj liposomov. Zanimivo pa je, da kombinacija obeh mutacij na istem proteinu ni prinesla dodatne izboljšave – v nekaterih primerih je bila celo manj učinkovita od posameznih mutacij. Ta ugotovitev jasno kaže, da gre za funkcionalne mutacije, ki neposredno prispevajo k izboljšani replikaciji v določenem okolju in niso zgolj spremljevalke naključne evolucije. Z nadaljnjo analizo kinetike replikacije so ugotovili, da mutacija S79G pospeši hitrost podvajanja DNK. Vendar pa enake mutacije, testirane v raztopini brez liposomov, niso pokazale nobenega vpliva na učinkovitost replikacije, kar kaže, da je njihova evolucijska prednost specifična za liposomsko mikrookolje. Da bi razjasnili mehanizem delovanja mutacij – ali vplivajo na stabilnost DNK ali neposredno na aktivnost DNAP – so raziskovalci encim izolirali, očistili in testirali v odsotnosti DNK matrice. Rezultati so pokazali, da nobena od mutacij ni izboljšala aktivnosti encima samega, kar pomeni, da so njihovi učinki odvisni od interakcije z DNK matrico znotraj liposoma. Zamenjave aminokislin torej ne povečajo splošne encimske aktivnosti, temveč učinkujejo le v specifičnem kontekstu. Dodatno so preučili tudi vpliv tihih mutacij, ki ne spreminjajo aminokislinskega zaporedja, a lahko vplivajo na stabilnost DNK, odpravo homopolimerov, učinkovitost translacije ali sekundarno strukturo mRNA. Vse testirane tihe mutacije so dosegle enako raven replikacije kot izvorna DNK, kar nakazuje, da njihov vpliv ni neposreden in deluje v kombinaciji z drugimi mutacijami. [1]

== Zaključek ==
V tej študiji so avtorji predstavili de novo pristop za sestavo virusa VSV, ki pomeni pomemben tehnični napredek glede hitrosti, prilagodljivosti in učinkovitosti pri ustvarjanju VSV-vektorjev. Medtem ko so modularna sestava DNA in reverzna genetika dobro uveljavljene pri pozitivno orientiranih RNA virusih (npr. SARS-CoV-2), so tovrstne metode redko uporabljene pri negativno orientiranih virusih, kot je VSV. V raziskavi so izpostavili tudi ključne prednosti sintezne virologije in sicer, da ni potrebe po obstoječem plazmidu, saj se virusi lahko načrtujejo in sestavijo zgolj na podlagi digitalne sekvence. Pri sintezni virologiji imamo tudi popoln nadzor nad genetsko zasnovo, ki omogoča natančne mutacije, bolj čisto sestavo in daljše sekvence brez PCR napak, ter manj napak v splošnem kontekstu v primerjavi s tradicionalnimi metodami, saj je manj možnosti za kontaminacijo ali delne produkte. Kljub vsem prednostim pa ima ta sintezni pristop tudi razne omejitve kot je predvsem odvisnost od točne referenčne sekvence, saj se tudi v javnih bazah podatkov lahko pojavijo določene napake, enako kot se jim je v tem poskusu, saj so ugotovili 14 nukleotidnih razlik, ki so vplivale na več virusnih genov. Vendar kljub tem izzivom pa ta platforma omogoča hitro spreminjanje genomov in tako imajo raziskovalci orodje za razvoj novih cepiv, terapevtskih vektorjev ter onkolitičnih virusov in tako predstavlja sintezna virologija izjemen potencial za pospešitev razvoja novih biomedicinskih rešitev. [1]

== Literatura ==
[1] Abil, Z., Restrepo Sierra, A. M., Stan, A. R., & others. (2024). Darwinian evolution of self-replicating DNA in a synthetic protocell. Nature Communications, 15, 9091. https://doi.org/10.1038/s41467-024-53226-0

Seminarji SB 2024/25

2025-05-28T21:06:35Z

Luka Fink:

V študijskem letu 2024/25 študenti in študentke pri Sintezni biologiji predstavljajo naslednje teme:

RAZISKOVALNI ČLANKI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sintetični Sintetični nastavljivi promotorji za prilagodljivo uravnavanje večgenskega izražanja v sesalskih celicah] (Marjeta Milostnik)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Inženiring_umetnih_medvrstnih_promotorjev_z_različnimi_transkripcijskimi_močmi Inženiring umetnih medvrstnih promotorjev z različnimi transkripcijskimi močmi] (Miljan Trajković)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Preprečevanje_nastanka_multimerov_pogosto_uporabljenih_plazmidov_v_sintezni_biologiji Preprečevanje nastanka multimerov pogosto uporabljenih plazmidov v sintezni biologiji] (Lev Jošt)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Priprava_Nicotiane_benthamiane_za_proizvodnjo_krisoeriola_z_uporabo_tehnik_sintezne_biologije Priprava ''Nicotiane benthamiane'' za proizvodnjo krisoeriola z uporabo tehnik sintezne biologije] (Nika Frelih)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Gensko_spremenjeni_receptorji_za_komunikacijo_med_celicami_preko_topnih_signalov_in_zaznavanje_bolezni Gensko spremenjeni receptorji za komunikacijo med celicami preko topnih signalov in zaznavanje bolezni] (Zara Bunc)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Nadzor_nad_izražanjem_heterolognih_genov_pri_Bdellovibrio_bacteriovorus_z_uporabo_sintezne_biologije Nadzor nad izražanjem heterolognih genov pri Bdellovibrio bacteriovorus z uporabo sintezne biologije] (Živa Flego)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Uporaba_konzorcija_kvasovk_za_de_novo_biosintezo_rastlinskih_lignanov Uporaba konzorcija kvasovk za de novo biosintezo rastlinskih lignanov] (Urša Lah)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sonogenetsko_nadzorovane_gensko_spremenjene_celice_za_zdravljenje_raka_v_mišjih_tumorskih_modelih Sonogenetsko nadzorovane gensko spremenjene celice za zdravljenje raka v mišjih tumorskih modelih] (Pia Mencin)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Združitev_difuzijskega_modela_in_transformerja_za_sintezo_izboljšanih_promotorjev_ter_napoved_moči_sintetičnih_promotorjev_z_uporabo_globokega_učenja Združitev difuzijskega modela in transformerja za sintezo izboljšanih promotorjev ter napoved moči sintetičnih promotorjev z uporabo globokega učenja] (Tinkara Korošec)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Z_dvojno_svetlobo_nadzirani_kokulturni_sistem_omogoča_uravnavanje_sestave_populacije Z dvojno svetlobo nadzirani sistem omogoča uravnavanje sestave populacije] (Ula Mikoš)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Načrtovanje_močnih_inducibilnih_sinteznih_promotorjev_v_kvasovkah Načrtovanje močnih inducibilnih sinteznih promotorjev v kvasovkah] (Bor Kunstelj)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Metabolni_inženiring_E._coli_za_izboljšano_produkcijo_diolov_iz_acetata Metabolni inženiring ''E. coli'' za izboljšano produkcijo diolov iz acetata] (Teo Trost)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Inkorporacija_fotosintetsko_aktivnih_kloroplastov_iz_alg_v_kultivirane_celice_sesalcev_kot_pot_k_fotosintezi_pri_Živalih Inkorporacija fotosintetsko aktivnih kloroplastov iz alg v kultivirane celice sesalcev kot pot k fotosintezi pri živalih] (Peter Gričar Vintar)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Izgradnja_metabolične_poti_za_biosintezo_treonina_iz_etilen_glikola Izgradnja metabolične poti za biosintezo treonina iz etilen glikola] (Tinkara Butara)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Povezava_sintezne_in_sistemske_biologije_za_in_vivo_encimatiko Povezava sintezne in sistemske biologije za ''in vivo'' encimatiko] (Gaja Starc)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Nanotelo_proti_Pdc1p_kot_gensko_kodiran_inhibitor_proizvodnje_etanola_omogoča_dvojni_transkripcijski_in_posttranslacijski_nadzor_fermentacije_v_kvasovkah Nanotelo proti Pdc1p kot gensko kodiran inhibitor proizvodnje etanola omogoča dvojni transkripcijski in posttranslacijski nadzor fermentacije v kvasovkah] (Lara Zupanc)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/S_fazno_separacijo_posredovano_sestavljanje_ve%C4%8Dencimskih_kompleksov_in_vivo S fazno separacijo posredovano sestavljanje večencimskih kompleksov ''in vivo''] (Lana Kores)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Umetna_nevronska_mreža_na_proteinski_ravni_v_sesalskih_celicah Umetna nevronska mreža na proteinski ravni v sesalskih celicah] (Gal Kastelic)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Uporaba_sintezne_virologije_za_hitro_inženirstvo_virusa_vezikularnega_stomatitisa_VSV Uporaba sintezne virologije za hitro inženirstvo virusa vezikularnega stomatitisa (VSV)] (Bine Brunec)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Molekularni_inženiring_funkcionalnih_siRNA Molekularni inženiring funkcionalnih siRNA] (Nataša Vujović)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Konstruirane_bakterije_za_z_bli%C5%BEnjo_infrarde%C4%8Do_svetlobo_inducirano_izra%C5%BEanje_protirakavih_terapevtikov Konstruirane bakterije za z bližnjo infrardečo svetlobo inducirano izražanje protirakavih terapevtikov] (Suzana Kučuk)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Genetsko_kodiranje_in_izražanje_RNA_origami_citoskeleta_v_sintetičnih_celicah Genetsko kodiranje in izražanje RNA origami citoskeleta v sintetičnih celicah] (Maša Karčovnik)
NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/SynPlode SynPlode] (Leila Bohorč)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/PETal:_izdelovanje_eteričnega_olja_sandalovine_iz_PET_plastike PETal: izdelovanje eteričnega olja sandalovine iz PET plastike] (Lara Krampač)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/PET_TWINS:_Praktična_uporaba_PETaze_za_učinkovitejše_recikliranje_plastike PET TWINS: Praktična uporaba PETaze za učinkovitejše recikliranje plastike] (Tina Urh)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/CAU-China:_Nodulska_tovarna_DHA_in_EPA CAU-China: Nodulska tovarna DHA in EPA] (Luka Fink)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/nuCloud:_Nov_oblak_za_shranjevanje_podatkov_na_osnovi_nukleotidov nuCloud: Nov oblak za shranjevanje podatkov na osnovi nukleotidov] (Aleš Poljanšek)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Nova_metoda_diagnosticiranja_multiple_skleroze_-_miRADAR Nova metoda diagnosticiranja multiple skleroze - miRADAR] (Petja Premrl)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Biostimulant_za_rast_rastlin_na_Luni_–_BioMoon Biostimulant za rast rastlin na Luni – BioMoon] (Žan Žnidar)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=CAPTURE:_Boj_proti_oku%C5%BEbam_s_Pseudomonas_aeruginosa_z_nosilci_protimikrobnih_peptidov&action=edit&redlink=1 Boj proti okužbam s Pseudomonas aeruginosa z nosilci protimikrobnih peptidov - CAPTURE] (Metka Rus)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/REPARO REPARO] (Lina Kopač)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Tarakate Tarakate] (Pia Špehar)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Heartecho:_presejalni_test_za_raka_pri_pacientih_po_miokardnem_infarktu Heartecho: presejalni test za raka pri pacientih po miokardnem infarktu] (Zarja Doberšek)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Synhesion Synhesion] (Janja Bohte)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Rebolutionaries Rebolutionaries] (Mia Kobal)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/PrymDetect PrymDetect] (Pia Trošt)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/PICasSO: Uporaba CRISPR/Cas v 3D genetskem inženirstvu preko programabilnih interakcij DNA-DNA] (Zarja Weingerl)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/NeoMineX NeoMineX] (Vanja Ivošević)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Evolucija samoreplikativne DNA v sintetični protocelici] (Teo Stupar)

Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Povzetek je treba objaviti dva dni pred predstavitvijo do polnoči (za seminarje v torek torej najkasneje v ponedeljek). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo približno 5-minutna razprava.

Terminski razpored bo razviden iz preglednice na strežniku Google Drive.

Kako je videti končni seznam seminarjev, lahko preverite pri lanskem letniku: [[Seminarji_SB_2023/24]].

Nadzor nad izražanjem heterolognih genov pri Bdellovibrio bacteriovorus z uporabo sintezne biologije

2025-04-20T21:59:51Z

Luka Fink:

Izhodiščni članek: [https://enviromicro-journals.onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/1751-7915.14517 Controlling the expression of heterologous genes in Bdellovibrio bacteriovorus using synthetic biology strategies]
=UVOD=
''Bdellovibrio bacteriovorus'' je obligativna aerobna gramnegativna bakterija, ki ima zaradi svojega posebnega življenjskega cikla in številnih hidrolitičnih encimov, kot že sam vrstni pridevek ''bacteriovorus'' pove, zmožnost prehranjevanja z drugimi gramnegativnimi bakterijami. Ideja o uporabi ''B. bacteriovorus'' kot živega antibiotika sega že več kot desetletje nazaj in predstavlja eno izmed možnih rešitev za vse večji globalni problem odpornosti bakterij na antibiotike. Življenjski cikel te majhne plenilske bakterije je razdeljen v dve funkcionalno ločeni fazi: faza napada (ang. ''attack phase''), v kateri bakterija kot prosto gibajoča se celica išče plen in faza rasti (ang. ''growth phase''), v kateri se nahaja znotraj periplazme plena, kjer oblikuje bdeloplast. Pri tvorbi bdeloplasta spremeni celično steno plena v okroglo obliko. Med rastjo (oz. elongacijo) in delitvijo (oz. septacijo) na 4 do 6 hčerinskih celic si zagotavlja hranila iz gostiteljske celice. Nove bakterije povzročijo lizo celične stene. ''B. bacteriovorus'' pa ponovno preide v fazo napada, kjer se lahko prosto premika in je neodvisna od gostitelja.
Zlasti omejena razpoložljivost genetskih orodij za regulacijo izražanja genov, saj ne gre za klasično modelno bakterijo, kot je npr. ''E. coli'', je doslej predstavljala veliko oviro pri njeni biotehnološki uporabi. Zato se je Salgado s sodelavci odločil razviti in prilagoditi orodja sintezne biologije za široko uporabnost te bakterije. Cilj te študije je vzpostaviti robusten sistem za kontrolirano izražanje heterolognih genov v ''B. bacteriovorus'' HD100.

=UPORABA KLONIRNE TEHNIKE GOLDEN STANDARD (GS) IN KROMOSOMSKE INSERCIJE Z UPORABO TRANSPOZONSKEGA SISTEMA Tn7 NA BAKTERIJAH B. BACTERIOVORUS=
Najprej je bila razvita Golden standard (GS) tehnika, ki temelji na hierarhičnem kloniranju po principu Golden Gate, tako da omogoča izražanje heterolognih genov z uporabo replikativnih plazmidov. Tipično se pri GS uporabi plazmide SEVA. Za ogrodje sta bila izbrana dva plazmida SEVA s širokospektralnim ''ori'' RSF1010 (pSEVAX5X), in sicer pSEVA251 in pSEVA651, ki posamično vsebujeta gena za odpornost proti kanamicinu (Km) oziroma gentamicinu (Gm). Omenjena plazmida so najprej »domesticirali« z odstranitvijo dveh restrikcijskih mest za ''BpiI'', tako da so nastali plazmidi pSEVAX51-dom. Nato so konstruktom na nivoju 1 dodali še proteinski tovor ''lacZα'' ter dobili končna prilagojena plazmida pSEVA2519[g2] in pSEVA6519[g2], katerim je bilo možno z modularnostjo zamenjati posamezne osnovne dele - za namene karakterizacije promotorjev so zamenjali različne promotorje. Dobljeni replikativni plazmidi pa so brez selekcijskega pritiska nestabilni (tj. v tem primeru brez prisotnosti antibiotika), zato so uvedli še dodaten pristop. Z uporabo transpozonskega sistema Tn7, ki omogoča integracijo ene same kopije v specifično, nekodirajoče zaporedje (ang. ''attTn7 site''), ki se nahaja za genom ''glmS'', so dosegli stabilno izražanje. Za to so kot osnovno ogrodje uporabili drug plazmid pTn7-M. Izvedli so še restrikcijo s ''PacI'' in ''SpeI'' ter ligacijo in s tem ustvarili končne plazmide pTn7-19[g2] in pTn7-19[gE] na nivoju 1 oziroma 2.
Uporabljeni so bili različni selekcijski markerji: streptomicin (Sp) za nivo 0, kanamicin (Km) za nivo 1 in gentamicin (Gm) za nivo 2, Km in Gr sta bila uporabljena tudi za Tn7 konstrukte. Pristop je omogočil natančno kontrolo nad mestom in številom integracijskih dogodkov, kar je ključnega pomena pri nemodelnih organizmih z nepredvidljivim odzivom na selekcijo. V prekonočni kulturi so s modro-belim testom izbrali bele kolonije za čiščenje plazmidov. Za kontrolo so izvedli še sekvenciranje.

=KONSTRUKCIJA SEVOV Z IZRAŽENIM mRFP1=
Predhodno so bili izvedeni eksperimenti, pri katerih so pod vplivom nativnih promotorjev izražali heterologne proteine, med drugim tudi monomerni rdeči fluorescenčni protein mRFP1. Uporaba heterolognih promotorjev pa zahteva večjo pozornost, saj je močno odvisna od združljivosti transkripcijskega mehanizma, pri čemer so eni izmed pomembnejših faktorjev faktorji σ. ''In silico'' analize so pokazale, da sta poddomeni 2.4 in 4.2 faktorja RpoD, ki sta odgovorni za vezavo na DNA tako pri ''B. bacteriovorus'' HD100 in ''E. coli'' K-12 visoko homologni (100 % in 96,6 % identičnosti). Postavljena je bila hipoteza, da so promotorji, odvisni od σ70 za ''E. coli'' prepoznavni tudi za RpoD pri ''B. bacteriovorus''.
=KARAKTERIZACIJA KONSTITUTIVNIH IN INDUCIBILNIH PROMOTORJEV=
Salgado in sodelavci so se odločili za karakterizacijo šestih sintetičnih konstitutivnih promotorjev (PJ102, PJ106,PJ116, PBG25, PBG37, PBG42) različnih moči (trije so bili iz Andersonove zbirke, preostali trije pa iz Zobelove zbirke) na podlagi izražanja monomernega rdečega fluorescenčnega proteina mRFP1. Vsi ti promotorji so bili znani kot konstitutivni promotorji pri pogostih bakterijskih modelih, kot sta ''E. coli'' in/ali ''P. putida''. Prav tako so želeli karakterizirati pet inducibilnih promotorjev na podlagi izražanja msfGFP – monomernega zelenega fluorescenčnega proteina z izboljšanim zlaganjem. Uporabljeni so bili sledeči inducibilni promotorski sistemi: PJExD/EliR, Pb/ChnR, PBAD/AraC, PrhaBAD/RhaSR in Pm/XylS. V vseh primerih se RBS (uporabljen BCD2) in terminatorja (uporabljen rnpB_T1) ni spreminjalo. Kot negativni kontroli so dizajnirali nefunkcionalno promotorsko zaporedje (pL0-P0-AB), ki je nadomestilo promotor ter še ‘prazen vektor’, ki ni imel kodirajočega zaporedja (pL0-ncTU-AI).
Pri transfekciji so uporabili triparentalno razmnoževanje za replikativne plazmide in štiriparentalno razmnoževanje za integrativne plazmide. Ker še nikoli doslej ni bila izvedena konjugacija na tak način pri tej bakterijski vrsti, so pregledali učinkovitost transfekcije za vsak konstrukt posebej.
===REZULTATI===
Uspešnost transfekcije je bila izmerjena v plakotvorni enoti (ang. ''plaque-forming unit'', PFU). Pri transfekciji replikativnih plazmidov so ugotovili, da se uspešnost giblje med 10−7 in 10−3, medtem ko je bila frekvenca pri kromosomski inserciji s Tn7 dosledno uspešna z učinkovitostjo 10−6 za vsak konstrukt. Enako je bilo opaženo tudi vizualno, z oceno fenotipa pod mikroskopom.
Za potrditev stabilnosti so izvedli še dve serijski kokulturi brez selekcijskega pritiska, ki sta pokazali, da je po devetih generacijah prišlo do signifikantno znižane vrednosti GmR celic pri sevu HD100 [pSEVA6519[g2]-ncTU, medtem ko ni prišlo do razlik pri sevih z integriranimi konstrukti. Dodatno so stabilnost preverili še s pretočno citometrijo, kjer so opazili dva ločena vrhova, ki se nanašata na dve populaciji z različno izraženim mRFP1. Pri celicah z integriranim konstruktom je bil opažen en sam vrh (homogena populacija).
Ker je bilo potrebno uporabiti kokulturo večih različnih bakterij (plena in plenilca) se na podatke OD600 niso mogli zanašati. OD600 je v tem primeru padal, zaradi vedno manjše količina plena. Za interpretacijo so zato vzeli le absolutno vrednost fluorescenčnega signala, ki je koreliral s rastjo in delitvijo ''B. bacteriovorus''.
Za karakterizacijo promotorjev so vzeli absolutno metodo merjenja fluorescence zgolj v sevih z integriranim konstruktom, saj so želeli delati z homogeno populacijo. Rezultati so pokazali, da je moč konstitutivnih promotorjev pri treh primerljiva z referenčnimi organizmi, pri ostali polovici pa je bila moč različna - PBG37, ki sicer velja za srednje močen promotor, je pri ''B. bacteriovorus'' močen promotor, ravno obratno pa je PJ106 deloval kot šibek promotor. PJ116, ki je v ''E. coli'' šibek promotor, je tukaj bil srednje močen.
Pri sevih z vgrajenimi inducibilnimi promotorji je bil fluorescenčni signal opažen le pri PJExD in Pb. Oba sta odvisna od koncentracije dodanega induktorja, kar je bilo potrjeno tudi s pretočno citometrijo. Analiza Hillove krivulje je pokazala, da je močnejši promotor PJExD, s višjo inducibilnostjo in nižjo bazalno aktivnostjo. Dodatne analize so potrdile, da je ta promotor primeren za nadaljnje aplikacije v ''B. bacteriovorus''. Glede na to, da konstrukti z ostalimi testiranimi inducibilnimi sistemi niso izrazili msfGFP, to potrjuje le na pomen testiranja združljivosti v vsakem posameznem gostitelju zaradi specifičnih mehanizmov znotraj posamezne vrste. Možni vzroki za konkretne promotorje so različni.

=ZAKLJUČEK=
Študija je uspešno razširila in validirala repertoar genetskih orodij za spreminjanje genoma ''B. bacteriovorus'' in dokazala, da so promotorji odvisni tudi od faze, v kateri se bakterija nahaja. Nov sistem nudi možnosti uporabe v številne različne namene, vse od medicine pa do akvarike.

Nadzor nad izražanjem heterolognih genov pri Bdellovibrio bacteriovorus z uporabo sintezne biologije

2025-04-20T07:52:06Z

Luka Fink: Created page with "Izhodiščni članek: [https://enviromicro-journals.onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/1751-7915.14517 Controlling the expression of heterologous genes in Bdellovibrio bacteriovorus using synthetic biology strategies]"

Seminarji SB 2024/25

2025-04-20T07:44:37Z

Luka Fink:

CAU-China: Nodulska tovarna DHA in EPA

2025-04-15T13:33:48Z

Luka Fink: /* Samomorilski mehanizem razlaga */

[https://2024.igem.wiki/cau-china/ N. Factory (Nodulska tovarna DHA in EPA)] je iGEM projekt skupine CAU-China iz Kitajske iz leta 2024.
== UVOD ==
Človeštvo že dolgo časa poizkuša izboljšati hranilno vrednost hrane na raznorazne načine, da bi se spopadli s problemi kot so podhranjenost v nerazvitih državah in omejenost določenih virov hrane. Cilj te skupine je bil proizvajati DHA in EPA v nodulih z genetsko spremenjenimi simbiontskimi bakterijami, z namenom povečati hranilno vrednost gojenih rastlin, še posebej soje.

Noduli so majhne kroglaste tvorbe, ki se razvijejo na rastlinskih koreninah ali steblih. V nodulih živijo simbiontske bakterije, ki iz zraka vežejo dušik. Različne rastline razvijejo simbiozo z različnimi bakterijami. Rastilne iz družine metuljnic (soja, fižol, grah, leča) živijo v simbiozi z bakterijami iz rodu ''Rhizobium''.

Potencilna vcepitev ''Rhizobium'' kot mikrobnega gnolija, prinaša še druge prednosti poleg proizvodnje DHA in EPA in to je obogatitev zemlje z dušikovimi spojinami, ki jih rastline lahko uporabljajo. Dolgoročna uporaba kemičnih gnojil lahko privede do nabiranja določenih kemikalij v zemlji, kar vodi do zmanjšanja števila koristnih bakterij. Namesto kemičnih gnojil bi lahko uporabljali mikrobna gnolija, ki vsebujejo ''Rhizobium'', in bi tako izboljšali kakovost zemlje in zmanjšali negativne učinke kemičnih gnojil.

== Izvedba projekta ==
Izbrali so si bakterijo ''Sinorhizobium fredii'' CCBAU45436. V njej so vzpostavili niz regulacijskih modulov, ki se odzivajo na spremembe v koncentraciji dušika in kisika. Hkrati so izbrali gene, ki kodirajo za PUFA sintazo, ki bi proizvajala željena produkta DHA in EPA, nastajali pa bi še ostali stranski produkti. Za izboljšanje učinkovitosti so reprogramirali metabolizem z uravnavanjem izražanja določenih genov. Zasnovali so samomorilski mehanizem, če ''S. fredii'' pobegne. Regulacijski moduli so odgovorni za kontrolo izražanja genov za sintezo PUFA (poly-unsaturated fatty acid) in kontrolo samomorilskega mehanizma.

== Delecija ''phaC2'' ==
PHB (poli-β-hidroksibutirat) je produkt metabolizma, ki lahko služi kot zaloga energije, in nastaja v ''S. fredii'' v veliki meri. Odločili so se, da bodo izbrisali gen ''phaC2'', ki kodira ključni encim za sintezo PHB. Delecijo so naredili s homologno rekombinacijo z dvojno zamenjavo. V odsotnosti gena ''phaC2'' naj bi se v celici povečala koncentracija acetil-CoA, ki naj bi služil kot prekurzor za sintezo PUFA.

Delecijo so potrdili s PCR na osnovi kolonije. Opazili so, da je ''S. fredii'' spremenil fenotip, ko so ga gojili na trdem gojišču. In sicer pri ''∆phaC2'' so kolonije rumene, pri wt pa bele. Testirali so še ali ima ''∆phaC2'' vpliv na sposobnost fiksiranja dušika, ko so mutanto vcepili v rastlino Jidou 17. Inkubacija je potekala 15 dni. Analizirali so nodule, ki so zrasli na rastlini, ki je bila vcepljena z wt in nodule, ki so zrasli na rastlini, ki je bila vcepljena z mutanto ter ugotovili, da ni vidne razlike med wt in mutanto. Analizirali so še vsebnost klorofila in suhe teže nadzemeljskih delov rastline in niso našli nobene statistično signifikantne razlike. Torej ''∆phaC2'' ne vpliva na rast rastline.

== Regulacija in sinteza modula ==
Problem pri sintezi PUFA je ta, da mora potekati v anaerobnem okolju, drugače lahko prihaja do oksidacije PUFA. Zato ''S. fredii'' predstavlja idealno okolje za sintezo. Za sintezo PUFA so si izbrali gručo genov iz ''Aetherobacter fasciculatus'', katera je bila že predhodno testirana v ''E. coli'' za sintezo PUFA. Da bi zagotovili učinkovito izražanje genov PUFA, so optimizirali rabo kodonov, ki bi ustrezala ''S. fredii'', in hkrati so gruči genov dodali PPTazo, ki bi omogočala posttranslacijske modifikacije.

Sintetizirali so modul, ki se odziva na različne koncentracije dušika in kisika v okolju. Izbrali so si promotorja '''''glnK''''' in '''''nifH''''', ki sta endogena inducibilna promotorja ''S. fredii''. Promotor ''glnK'' se odziva na nizke koncentracije dušika, promotor ''nifH'' pa se odziva na nizke koncentracije kisika. Regulacijski modul za sintezo PUFA je sestavljen tako, da sta pod promotorjem ''glnK'' zapisa za sgRNA-GFP in tracrRNA, pod promotorjem ''nifH'' pa zapisa za GFP in gruča genov za sintezo PUFA. Na drugi lokaciji na plazmidu je prisoten tudi konstitutivni promotor ''nuoA''. Navzdol od promotorja ''nuoA'' se nahaja zapis za Cas12k. Posebnost Cas12k je, da nima katalitske aktivnosti in da inhibira transkripcijo samo s fizično vezavo na tarčno DNA. Ko v celici nastaja tako Cas12k kot tudi sgRNA za tarčno zaporedje, se ta povežeta in blokirata prepisovanje navzdol od vezave. Ko se v celici zniža koncentacija sgRNA, Cas12k oddisociira in s tem je prepisovanje navzdol spet omogočeno.

Cilj regulacije je, da pride do prepisavanja sinteznih genov za PUFA samo ob visokih koncentracijah dušika in nizki koncentraciji kisika. Ob nizki koncentaciji dušika pride do prepisovanja navzdol od promotorja ''glnK'', to sta sgRNA-GFP (njegova tarča je omenjeno zaporedje GFP zavzdol od ''nifH'' promotorja) in tracrRNA. Ta konstrukt se potem poveže s Cas12k. Ta se veže na zapis za GFP in s tem blokira prepisovanje genov za sintezo PUFA. Torej tudi ko je koncentracija kisika nizka in se s tem aktivira promotor ''nifH'', do prepisovanja genov za sintezo PUFA ne pride. Ob visoki koncentraciji kisika in nizki koncentraciji dušika (to predstavlja okolje preden ''S. fredii'' tvori simbiozo z rastlino) do prepisa sinteznih genov PUFA ne pride. Ob visoki koncentraciji dušika in kisika do prepisovanja navzdol od promotorjev ''glnK'' in ''nifH'' ne pride. Ob visoki koncentaciji dušika (ko dodamo gnojilo bogato z dušikom) in nizki koncentraciji kisika pride do prepisovanje genov za sintezo PUFA, saj ne pride do prepisovanja sgRNA-GFP in tracrRNA, tako da Cas12k ne more blokirati prepisovanja genov za sintezo PUFA. Prav tako je koncentracija kisika nizka, zato je ''nifH'' promotor sploh aktiven.

== Samomorilski mehanizem razlaga ==
Samomorilski mehanizem za ''S. fredii'' je zasnovan tako, da ko ''S. fredii'' pobegne ven iz modula v okolje s povišano koncentracijo dušika in kisika, naredi samomor. Mehanizem je zasnovan na sistemu toksin-antitoksin (''vapC-vapB'') in promotorjih ''nuoA'', ''nifH'' in ''glnK''. Na enem delu konstrukta ''nuoA'' kontrolira izražanje Cas12k, na drugem pa izražanje ''vapC''. ''nifH'' kontrolira izražanje ''vapB''. ''glnK'' pa kontrolira izražanje sgRNA za gen ''mCherry'' in ''tracrRNA''. Različne kombinacije koncentracij dušika in kisika omogočajo preživetje, samo ob povišani koncentraciji dušika in hkrati kisika vodijo v samomor. Pri nizki koncentraciji dušika in kisika nastaja VapB ter sgRNA-mCherry in tracrRNA. Hkrati se izraža Cas12k, ki se poveže z sgRNA-mCherry in tracrRNA, se veže na gen za mCherry in s tem blokira izražanje ''vapC''. Pri nizki koncentracij dušika in povišani koncentracij kisika ''vapB'' ne nastaja, izraža se sgRNA-mCherry in tracrRNA ter Cas12k, zato VapC ne nastaja. Pri povišani koncentraciji dušika in nizki koncentracij kisika VapB in VapC ne nastajata. Pri povišani koncentraciji dušika in povišani koncentracij kisika VapB ne nastaja, nastaja pa VapC, saj Cas12k ne more blokirati transkripcije ''vapC'', saj sgRNA-mCherry in tracrRNA ne nastajata. Posledično se koncentracija VapB v celici poviša, kar vodi v smrt pobegle celice, to je izven okolja modula.

Eden izmed testov, ki so ga naredili, da bi potrdili uspešnost samomorilskega mehanizma, je bil merjenje spremembe OD600 bakterij v suspenziji pri hiperoksičnih pogojih in spremenljivi koncentraciji amonijevega klorida, kot virom dušika. Po desetih urah so opazili padajoč trend v gojiščih z amonijevim kloridom. Padajoč trend je še bolj očiten, ko se poveča koncentracija amonijevega klorida. Zaključili so, da je samomorilski mehanizem pod temi testnimi pogoji reguliran s koncentracijo dušika in da deluje.

== Transport DHA in EPA v sojo ==
Njihov končni cilj je bil tudi transportirati DHA in EPA izven koreninskih nodulov v sojo. Za transport PUFA je bil že pred tem odkrit eksportni sistem, ki bi to omogočal, za gram negativne bakterije. ''S. fredii'' je tudi gram negativna bakterija. Ena študija se je ukvarjala z fiziološkim odzivom gram negativne bakterije ''Acinetobacter baumannii'' na PUFA in odkrili so povečano ekspresijo gena adeJ, ki je komponenta črpalke ''adeIJK'', ki lahko transportira več različnih učinkovin ven iz celice. Ugotovili so da delecija gena ''adeJ'' poveča dovzetnost za PUFA. Podobno vlogo kot ima črpalka ''adeIJK'', ima črpalka ''emhABC'' iz ''Pseudomonas fluorescens'', ki kontrolira homeostazo lipidov, tako da izčrpava dolgo-verižne maščobne kisline. Razultata kažeta na to, da obstajajo v gram negativnih bakterijah določeni transportni proteini, ki bi omogočali transport DHA in EPA iz celice. Torej če bi povečali njihovo izražanje, bi lahko transportirali tudi DHA in EPA v sojo.
== Viri in literatura ==
[1] CAU-China: N. Factory https://2024.igem.wiki/cau-china/ (pridobljeno 13. 4. 2025)

CAU-China: Nodulska tovarna DHA in EPA

2025-04-15T13:05:50Z

Luka Fink: /* Delecija phaC2 */

[https://2024.igem.wiki/cau-china/ N. Factory (Nodulska tovarna DHA in EPA)] je iGEM projekt skupine CAU-China iz Kitajske iz leta 2024.
== UVOD ==
Človeštvo že dolgo časa poizkuša izboljšati hranilno vrednost hrane na raznorazne načine, da bi se spopadli s problemi kot so podhranjenost v nerazvitih državah in omejenost določenih virov hrane. Cilj te skupine je bil proizvajati DHA in EPA v nodulih z genetsko spremenjenimi simbiontskimi bakterijami, z namenom povečati hranilno vrednost gojenih rastlin, še posebej soje.

Noduli so majhne kroglaste tvorbe, ki se razvijejo na rastlinskih koreninah ali steblih. V nodulih živijo simbiontske bakterije, ki iz zraka vežejo dušik. Različne rastline razvijejo simbiozo z različnimi bakterijami. Rastilne iz družine metuljnic (soja, fižol, grah, leča) živijo v simbiozi z bakterijami iz rodu ''Rhizobium''.

Potencilna vcepitev ''Rhizobium'' kot mikrobnega gnolija, prinaša še druge prednosti poleg proizvodnje DHA in EPA in to je obogatitev zemlje z dušikovimi spojinami, ki jih rastline lahko uporabljajo. Dolgoročna uporaba kemičnih gnojil lahko privede do nabiranja določenih kemikalij v zemlji, kar vodi do zmanjšanja števila koristnih bakterij. Namesto kemičnih gnojil bi lahko uporabljali mikrobna gnolija, ki vsebujejo ''Rhizobium'', in bi tako izboljšali kakovost zemlje in zmanjšali negativne učinke kemičnih gnojil.

== Izvedba projekta ==
Izbrali so si bakterijo ''Sinorhizobium fredii'' CCBAU45436. V njej so vzpostavili niz regulacijskih modulov, ki se odzivajo na spremembe v koncentraciji dušika in kisika. Hkrati so izbrali gene, ki kodirajo za PUFA sintazo, ki bi proizvajala željena produkta DHA in EPA, nastajali pa bi še ostali stranski produkti. Za izboljšanje učinkovitosti so reprogramirali metabolizem z uravnavanjem izražanja določenih genov. Zasnovali so samomorilski mehanizem, če ''S. fredii'' pobegne. Regulacijski moduli so odgovorni za kontrolo izražanja genov za sintezo PUFA (poly-unsaturated fatty acid) in kontrolo samomorilskega mehanizma.

== Delecija ''phaC2'' ==
PHB (poli-β-hidroksibutirat) je produkt metabolizma, ki lahko služi kot zaloga energije, in nastaja v ''S. fredii'' v veliki meri. Odločili so se, da bodo izbrisali gen ''phaC2'', ki kodira ključni encim za sintezo PHB. Delecijo so naredili s homologno rekombinacijo z dvojno zamenjavo. V odsotnosti gena ''phaC2'' naj bi se v celici povečala koncentracija acetil-CoA, ki naj bi služil kot prekurzor za sintezo PUFA.

Delecijo so potrdili s PCR na osnovi kolonije. Opazili so, da je ''S. fredii'' spremenil fenotip, ko so ga gojili na trdem gojišču. In sicer pri ''∆phaC2'' so kolonije rumene, pri wt pa bele. Testirali so še ali ima ''∆phaC2'' vpliv na sposobnost fiksiranja dušika, ko so mutanto vcepili v rastlino Jidou 17. Inkubacija je potekala 15 dni. Analizirali so nodule, ki so zrasli na rastlini, ki je bila vcepljena z wt in nodule, ki so zrasli na rastlini, ki je bila vcepljena z mutanto ter ugotovili, da ni vidne razlike med wt in mutanto. Analizirali so še vsebnost klorofila in suhe teže nadzemeljskih delov rastline in niso našli nobene statistično signifikantne razlike. Torej ''∆phaC2'' ne vpliva na rast rastline.

== Regulacija in sinteza modula ==
Problem pri sintezi PUFA je ta, da mora potekati v anaerobnem okolju, drugače lahko prihaja do oksidacije PUFA. Zato ''S. fredii'' predstavlja idealno okolje za sintezo. Za sintezo PUFA so si izbrali gručo genov iz ''Aetherobacter fasciculatus'', katera je bila že predhodno testirana v ''E. coli'' za sintezo PUFA. Da bi zagotovili učinkovito izražanje genov PUFA, so optimizirali rabo kodonov, ki bi ustrezala ''S. fredii'', in hkrati so gruči genov dodali PPTazo, ki bi omogočala posttranslacijske modifikacije.

Sintetizirali so modul, ki se odziva na različne koncentracije dušika in kisika v okolju. Izbrali so si promotorja '''''glnK''''' in '''''nifH''''', ki sta endogena inducibilna promotorja ''S. fredii''. Promotor ''glnK'' se odziva na nizke koncentracije dušika, promotor ''nifH'' pa se odziva na nizke koncentracije kisika. Regulacijski modul za sintezo PUFA je sestavljen tako, da sta pod promotorjem ''glnK'' zapisa za sgRNA-GFP in tracrRNA, pod promotorjem ''nifH'' pa zapisa za GFP in gruča genov za sintezo PUFA. Na drugi lokaciji na plazmidu je prisoten tudi konstitutivni promotor ''nuoA''. Navzdol od promotorja ''nuoA'' se nahaja zapis za Cas12k. Posebnost Cas12k je, da nima katalitske aktivnosti in da inhibira transkripcijo samo s fizično vezavo na tarčno DNA. Ko v celici nastaja tako Cas12k kot tudi sgRNA za tarčno zaporedje, se ta povežeta in blokirata prepisovanje navzdol od vezave. Ko se v celici zniža koncentacija sgRNA, Cas12k oddisociira in s tem je prepisovanje navzdol spet omogočeno.

Cilj regulacije je, da pride do prepisavanja sinteznih genov za PUFA samo ob visokih koncentracijah dušika in nizki koncentraciji kisika. Ob nizki koncentaciji dušika pride do prepisovanja navzdol od promotorja ''glnK'', to sta sgRNA-GFP (njegova tarča je omenjeno zaporedje GFP zavzdol od ''nifH'' promotorja) in tracrRNA. Ta konstrukt se potem poveže s Cas12k. Ta se veže na zapis za GFP in s tem blokira prepisovanje genov za sintezo PUFA. Torej tudi ko je koncentracija kisika nizka in se s tem aktivira promotor ''nifH'', do prepisovanja genov za sintezo PUFA ne pride. Ob visoki koncentraciji kisika in nizki koncentraciji dušika (to predstavlja okolje preden ''S. fredii'' tvori simbiozo z rastlino) do prepisa sinteznih genov PUFA ne pride. Ob visoki koncentraciji dušika in kisika do prepisovanja navzdol od promotorjev ''glnK'' in ''nifH'' ne pride. Ob visoki koncentaciji dušika (ko dodamo gnojilo bogato z dušikom) in nizki koncentraciji kisika pride do prepisovanje genov za sintezo PUFA, saj ne pride do prepisovanja sgRNA-GFP in tracrRNA, tako da Cas12k ne more blokirati prepisovanja genov za sintezo PUFA. Prav tako je koncentracija kisika nizka, zato je ''nifH'' promotor sploh aktiven.

== Samomorilski mehanizem razlaga ==
Samomorilski mehanizem za ''S. fredii'' je zasnovan tako, da ko ''S. fredii'' pobegne ven iz modula v okolje s povišano koncentracijo dušika in kisika, naredi samomor. Mehanizem je zasnovan na sistemu toksin-antitoksin (''vapC-vapB'') in promotorjih ''nuoA'', ''nifH'' in ''glnK''. Na enem delu konstrukta ''nuoA'' kontrolira izražanje Cas12k, na drugem pa izražanje ''vapC''. ''nifH'' kontrolira izražanje ''vapB''. ''glnK'' pa kontrolira izražanje sgRNA za gen ''mCherry'' in ''tracrRNA''. Različne kombinacije koncentracij dušika in kisika omogočajo preživetje, samo ob povišani koncentraciji dušika in hkrati kisika vodijo v samomor. Pri nizki koncentraciji dušika in kisika nastaja VapB ter sgRNA-mCherry in tracrRNA. Hkrati se izraža Cas12k, ki se poveže z sgRNA-mCherry in tracrRNA, se veže na gen za mCherry in s tem blokira izražanje ''vapC''. Pri nizki koncentracij dušika in povišani koncentracij kisika ''vapB'' ne nastaja, izraža se sgRNA-mCherry in tracrRNA ter Cas12k, zato VapC ne nastaja. Pri povišani koncentraciji dušika in nizki koncentracij kisika VapB in VapC ne nastajata. Pri povišani koncentraciji dušika in povišani koncentracij kisika VapB ne nastaja, nastaja pa VapC, saj Cas12k ne more blokirati transkripcije ''vapC'', saj sgRNA-mCherrz in tracrRNA ne nastajata. Posledično se koncentracija VapB v celici poviša, kar vodi v smrt pobegle celice, to je izven okolja modula.

Eden izmed testov, ki so ga naredili, da bi potrdili uspešnost samomorilskega mehanizma, je bil merjenje spremembe OD600 bakterij v suspenziji pri hiperoksičnih pogojih in spremenljivi koncentraciji amonijevega klorida, kot virom dušika. Po desetih urah so opazili padajoč trend v gojiščih z amonijevim kloridom. Padajoč trend je še bolj očiten, ko se poveča koncentracija amonijevega klorida. Zaključili so, da je samomorilski mehanizem pod temi testnimi pogoji reguliran s koncentracijo dušika in da deluje.

== Transport DHA in EPA v sojo ==
Njihov končni cilj je bil tudi transportirati DHA in EPA izven koreninskih nodulov v sojo. Za transport PUFA je bil že pred tem odkrit eksportni sistem, ki bi to omogočal, za gram negativne bakterije. ''S. fredii'' je tudi gram negativna bakterija. Ena študija se je ukvarjala z fiziološkim odzivom gram negativne bakterije ''Acinetobacter baumannii'' na PUFA in odkrili so povečano ekspresijo gena adeJ, ki je komponenta črpalke ''adeIJK'', ki lahko transportira več različnih učinkovin ven iz celice. Ugotovili so da delecija gena ''adeJ'' poveča dovzetnost za PUFA. Podobno vlogo kot ima črpalka ''adeIJK'', ima črpalka ''emhABC'' iz ''Pseudomonas fluorescens'', ki kontrolira homeostazo lipidov, tako da izčrpava dolgo-verižne maščobne kisline. Razultata kažeta na to, da obstajajo v gram negativnih bakterijah določeni transportni proteini, ki bi omogočali transport DHA in EPA iz celice. Torej če bi povečali njihovo izražanje, bi lahko transportirali tudi DHA in EPA v sojo.
== Viri in literatura ==
[1] CAU-China: N. Factory https://2024.igem.wiki/cau-china/ (pridobljeno 13. 4. 2025)

CAU-China: Nodulska tovarna DHA in EPA

2025-04-15T13:05:38Z

Luka Fink: /* Delecija PHB */

[https://2024.igem.wiki/cau-china/ N. Factory (Nodulska tovarna DHA in EPA)] je iGEM projekt skupine CAU-China iz Kitajske iz leta 2024.
== UVOD ==
Človeštvo že dolgo časa poizkuša izboljšati hranilno vrednost hrane na raznorazne načine, da bi se spopadli s problemi kot so podhranjenost v nerazvitih državah in omejenost določenih virov hrane. Cilj te skupine je bil proizvajati DHA in EPA v nodulih z genetsko spremenjenimi simbiontskimi bakterijami, z namenom povečati hranilno vrednost gojenih rastlin, še posebej soje.

Noduli so majhne kroglaste tvorbe, ki se razvijejo na rastlinskih koreninah ali steblih. V nodulih živijo simbiontske bakterije, ki iz zraka vežejo dušik. Različne rastline razvijejo simbiozo z različnimi bakterijami. Rastilne iz družine metuljnic (soja, fižol, grah, leča) živijo v simbiozi z bakterijami iz rodu ''Rhizobium''.

Potencilna vcepitev ''Rhizobium'' kot mikrobnega gnolija, prinaša še druge prednosti poleg proizvodnje DHA in EPA in to je obogatitev zemlje z dušikovimi spojinami, ki jih rastline lahko uporabljajo. Dolgoročna uporaba kemičnih gnojil lahko privede do nabiranja določenih kemikalij v zemlji, kar vodi do zmanjšanja števila koristnih bakterij. Namesto kemičnih gnojil bi lahko uporabljali mikrobna gnolija, ki vsebujejo ''Rhizobium'', in bi tako izboljšali kakovost zemlje in zmanjšali negativne učinke kemičnih gnojil.

== Izvedba projekta ==
Izbrali so si bakterijo ''Sinorhizobium fredii'' CCBAU45436. V njej so vzpostavili niz regulacijskih modulov, ki se odzivajo na spremembe v koncentraciji dušika in kisika. Hkrati so izbrali gene, ki kodirajo za PUFA sintazo, ki bi proizvajala željena produkta DHA in EPA, nastajali pa bi še ostali stranski produkti. Za izboljšanje učinkovitosti so reprogramirali metabolizem z uravnavanjem izražanja določenih genov. Zasnovali so samomorilski mehanizem, če ''S. fredii'' pobegne. Regulacijski moduli so odgovorni za kontrolo izražanja genov za sintezo PUFA (poly-unsaturated fatty acid) in kontrolo samomorilskega mehanizma.

== Delecija phaC2 ==
PHB (poli-β-hidroksibutirat) je produkt metabolizma, ki lahko služi kot zaloga energije, in nastaja v ''S. fredii'' v veliki meri. Odločili so se, da bodo izbrisali gen ''phaC2'', ki kodira ključni encim za sintezo PHB. Delecijo so naredili s homologno rekombinacijo z dvojno zamenjavo. V odsotnosti gena ''phaC2'' naj bi se v celici povečala koncentracija acetil-CoA, ki naj bi služil kot prekurzor za sintezo PUFA.

Delecijo so potrdili s PCR na osnovi kolonije. Opazili so, da je ''S. fredii'' spremenil fenotip, ko so ga gojili na trdem gojišču. In sicer pri ''∆phaC2'' so kolonije rumene, pri wt pa bele. Testirali so še ali ima ''∆phaC2'' vpliv na sposobnost fiksiranja dušika, ko so mutanto vcepili v rastlino Jidou 17. Inkubacija je potekala 15 dni. Analizirali so nodule, ki so zrasli na rastlini, ki je bila vcepljena z wt in nodule, ki so zrasli na rastlini, ki je bila vcepljena z mutanto ter ugotovili, da ni vidne razlike med wt in mutanto. Analizirali so še vsebnost klorofila in suhe teže nadzemeljskih delov rastline in niso našli nobene statistično signifikantne razlike. Torej ''∆phaC2'' ne vpliva na rast rastline.

== Regulacija in sinteza modula ==
Problem pri sintezi PUFA je ta, da mora potekati v anaerobnem okolju, drugače lahko prihaja do oksidacije PUFA. Zato ''S. fredii'' predstavlja idealno okolje za sintezo. Za sintezo PUFA so si izbrali gručo genov iz ''Aetherobacter fasciculatus'', katera je bila že predhodno testirana v ''E. coli'' za sintezo PUFA. Da bi zagotovili učinkovito izražanje genov PUFA, so optimizirali rabo kodonov, ki bi ustrezala ''S. fredii'', in hkrati so gruči genov dodali PPTazo, ki bi omogočala posttranslacijske modifikacije.

Sintetizirali so modul, ki se odziva na različne koncentracije dušika in kisika v okolju. Izbrali so si promotorja '''''glnK''''' in '''''nifH''''', ki sta endogena inducibilna promotorja ''S. fredii''. Promotor ''glnK'' se odziva na nizke koncentracije dušika, promotor ''nifH'' pa se odziva na nizke koncentracije kisika. Regulacijski modul za sintezo PUFA je sestavljen tako, da sta pod promotorjem ''glnK'' zapisa za sgRNA-GFP in tracrRNA, pod promotorjem ''nifH'' pa zapisa za GFP in gruča genov za sintezo PUFA. Na drugi lokaciji na plazmidu je prisoten tudi konstitutivni promotor ''nuoA''. Navzdol od promotorja ''nuoA'' se nahaja zapis za Cas12k. Posebnost Cas12k je, da nima katalitske aktivnosti in da inhibira transkripcijo samo s fizično vezavo na tarčno DNA. Ko v celici nastaja tako Cas12k kot tudi sgRNA za tarčno zaporedje, se ta povežeta in blokirata prepisovanje navzdol od vezave. Ko se v celici zniža koncentacija sgRNA, Cas12k oddisociira in s tem je prepisovanje navzdol spet omogočeno.

Cilj regulacije je, da pride do prepisavanja sinteznih genov za PUFA samo ob visokih koncentracijah dušika in nizki koncentraciji kisika. Ob nizki koncentaciji dušika pride do prepisovanja navzdol od promotorja ''glnK'', to sta sgRNA-GFP (njegova tarča je omenjeno zaporedje GFP zavzdol od ''nifH'' promotorja) in tracrRNA. Ta konstrukt se potem poveže s Cas12k. Ta se veže na zapis za GFP in s tem blokira prepisovanje genov za sintezo PUFA. Torej tudi ko je koncentracija kisika nizka in se s tem aktivira promotor ''nifH'', do prepisovanja genov za sintezo PUFA ne pride. Ob visoki koncentraciji kisika in nizki koncentraciji dušika (to predstavlja okolje preden ''S. fredii'' tvori simbiozo z rastlino) do prepisa sinteznih genov PUFA ne pride. Ob visoki koncentraciji dušika in kisika do prepisovanja navzdol od promotorjev ''glnK'' in ''nifH'' ne pride. Ob visoki koncentaciji dušika (ko dodamo gnojilo bogato z dušikom) in nizki koncentraciji kisika pride do prepisovanje genov za sintezo PUFA, saj ne pride do prepisovanja sgRNA-GFP in tracrRNA, tako da Cas12k ne more blokirati prepisovanja genov za sintezo PUFA. Prav tako je koncentracija kisika nizka, zato je ''nifH'' promotor sploh aktiven.

== Samomorilski mehanizem razlaga ==
Samomorilski mehanizem za ''S. fredii'' je zasnovan tako, da ko ''S. fredii'' pobegne ven iz modula v okolje s povišano koncentracijo dušika in kisika, naredi samomor. Mehanizem je zasnovan na sistemu toksin-antitoksin (''vapC-vapB'') in promotorjih ''nuoA'', ''nifH'' in ''glnK''. Na enem delu konstrukta ''nuoA'' kontrolira izražanje Cas12k, na drugem pa izražanje ''vapC''. ''nifH'' kontrolira izražanje ''vapB''. ''glnK'' pa kontrolira izražanje sgRNA za gen ''mCherry'' in ''tracrRNA''. Različne kombinacije koncentracij dušika in kisika omogočajo preživetje, samo ob povišani koncentraciji dušika in hkrati kisika vodijo v samomor. Pri nizki koncentraciji dušika in kisika nastaja VapB ter sgRNA-mCherry in tracrRNA. Hkrati se izraža Cas12k, ki se poveže z sgRNA-mCherry in tracrRNA, se veže na gen za mCherry in s tem blokira izražanje ''vapC''. Pri nizki koncentracij dušika in povišani koncentracij kisika ''vapB'' ne nastaja, izraža se sgRNA-mCherry in tracrRNA ter Cas12k, zato VapC ne nastaja. Pri povišani koncentraciji dušika in nizki koncentracij kisika VapB in VapC ne nastajata. Pri povišani koncentraciji dušika in povišani koncentracij kisika VapB ne nastaja, nastaja pa VapC, saj Cas12k ne more blokirati transkripcije ''vapC'', saj sgRNA-mCherrz in tracrRNA ne nastajata. Posledično se koncentracija VapB v celici poviša, kar vodi v smrt pobegle celice, to je izven okolja modula.

Eden izmed testov, ki so ga naredili, da bi potrdili uspešnost samomorilskega mehanizma, je bil merjenje spremembe OD600 bakterij v suspenziji pri hiperoksičnih pogojih in spremenljivi koncentraciji amonijevega klorida, kot virom dušika. Po desetih urah so opazili padajoč trend v gojiščih z amonijevim kloridom. Padajoč trend je še bolj očiten, ko se poveča koncentracija amonijevega klorida. Zaključili so, da je samomorilski mehanizem pod temi testnimi pogoji reguliran s koncentracijo dušika in da deluje.

== Transport DHA in EPA v sojo ==
Njihov končni cilj je bil tudi transportirati DHA in EPA izven koreninskih nodulov v sojo. Za transport PUFA je bil že pred tem odkrit eksportni sistem, ki bi to omogočal, za gram negativne bakterije. ''S. fredii'' je tudi gram negativna bakterija. Ena študija se je ukvarjala z fiziološkim odzivom gram negativne bakterije ''Acinetobacter baumannii'' na PUFA in odkrili so povečano ekspresijo gena adeJ, ki je komponenta črpalke ''adeIJK'', ki lahko transportira več različnih učinkovin ven iz celice. Ugotovili so da delecija gena ''adeJ'' poveča dovzetnost za PUFA. Podobno vlogo kot ima črpalka ''adeIJK'', ima črpalka ''emhABC'' iz ''Pseudomonas fluorescens'', ki kontrolira homeostazo lipidov, tako da izčrpava dolgo-verižne maščobne kisline. Razultata kažeta na to, da obstajajo v gram negativnih bakterijah določeni transportni proteini, ki bi omogočali transport DHA in EPA iz celice. Torej če bi povečali njihovo izražanje, bi lahko transportirali tudi DHA in EPA v sojo.
== Viri in literatura ==
[1] CAU-China: N. Factory https://2024.igem.wiki/cau-china/ (pridobljeno 13. 4. 2025)

CAU-China: Nodulska tovarna DHA in EPA

2025-04-15T09:53:30Z

Luka Fink: /* Samomorilski mehanizem razlaga */

[https://2024.igem.wiki/cau-china/ N. Factory (Nodulska tovarna DHA in EPA)] je iGEM projekt skupine CAU-China iz Kitajske iz leta 2024.
== UVOD ==
Človeštvo že dolgo časa poizkuša izboljšati hranilno vrednost hrane na raznorazne načine, da bi se spopadli s problemi kot so podhranjenost v nerazvitih državah in omejenost določenih virov hrane. Cilj te skupine je bil proizvajati DHA in EPA v nodulih z genetsko spremenjenimi simbiontskimi bakterijami, z namenom povečati hranilno vrednost gojenih rastlin, še posebej soje.

Noduli so majhne kroglaste tvorbe, ki se razvijejo na rastlinskih koreninah ali steblih. V nodulih živijo simbiontske bakterije, ki iz zraka vežejo dušik. Različne rastline razvijejo simbiozo z različnimi bakterijami. Rastilne iz družine metuljnic (soja, fižol, grah, leča) živijo v simbiozi z bakterijami iz rodu ''Rhizobium''.

Potencilna vcepitev ''Rhizobium'' kot mikrobnega gnolija, prinaša še druge prednosti poleg proizvodnje DHA in EPA in to je obogatitev zemlje z dušikovimi spojinami, ki jih rastline lahko uporabljajo. Dolgoročna uporaba kemičnih gnojil lahko privede do nabiranja določenih kemikalij v zemlji, kar vodi do zmanjšanja števila koristnih bakterij. Namesto kemičnih gnojil bi lahko uporabljali mikrobna gnolija, ki vsebujejo ''Rhizobium'', in bi tako izboljšali kakovost zemlje in zmanjšali negativne učinke kemičnih gnojil.

== Izvedba projekta ==
Izbrali so si bakterijo ''Sinorhizobium fredii'' CCBAU45436. V njej so vzpostavili niz regulacijskih modulov, ki se odzivajo na spremembe v koncentraciji dušika in kisika. Hkrati so izbrali gene, ki kodirajo za PUFA sintazo, ki bi proizvajala željena produkta DHA in EPA, nastajali pa bi še ostali stranski produkti. Za izboljšanje učinkovitosti so reprogramirali metabolizem z uravnavanjem izražanja določenih genov. Zasnovali so samomorilski mehanizem, če ''S. fredii'' pobegne. Regulacijski moduli so odgovorni za kontrolo izražanja genov za sintezo PUFA (poly-unsaturated fatty acid) in kontrolo samomorilskega mehanizma.

== Delecija PHB ==
PHB (poli-β-hidroksibutirat) je produkt metabolizma, ki lahko služi kot zaloga energije, in nastaja v ''S. fredii'' v veliki meri. Odločili so se, da bodo izbrisali gen ''phaC2'', ki kodira ključni encim za sintezo PHB. Delecijo so naredili s homologno rekombinacijo z dvojno zamenjavo. V odsotnosti gena ''phaC2'' naj bi se v celici povečala koncentracija acetil-CoA, ki naj bi služil kot prekurzor za sintezo PUFA.

Delecijo so potrdili s PCR na osnovi kolonije. Opazili so, da je ''S. fredii'' spremenil fenotip, ko so ga gojili na trdem gojišču. In sicer pri ''∆phaC2'' so kolonije rumene, pri wt pa bele. Testirali so še ali ima ''∆phaC2'' vpliv na sposobnost fiksiranja dušika, ko so mutanto vcepili v rastlino Jidou 17. Inkubacija je potekala 15 dni. Analizirali so nodule, ki so zrasli na rastlini, ki je bila vcepljena z wt in nodule, ki so zrasli na rastlini, ki je bila vcepljena z mutanto ter ugotovili, da ni vidne razlike med wt in mutanto. Analizirali so še vsebnost klorofila in suhe teže nadzemeljskih delov rastline in niso našli nobene statistično signifikantne razlike. Torej ''∆phaC2'' ne vpliva na rast rastline.

== Regulacija in sinteza modula ==
Problem pri sintezi PUFA je ta, da mora potekati v anaerobnem okolju, drugače lahko prihaja do oksidacije PUFA. Zato ''S. fredii'' predstavlja idealno okolje za sintezo. Za sintezo PUFA so si izbrali gručo genov iz ''Aetherobacter fasciculatus'', katera je bila že predhodno testirana v ''E. coli'' za sintezo PUFA. Da bi zagotovili učinkovito izražanje genov PUFA, so optimizirali rabo kodonov, ki bi ustrezala ''S. fredii'', in hkrati so gruči genov dodali PPTazo, ki bi omogočala posttranslacijske modifikacije.

Sintetizirali so modul, ki se odziva na različne koncentracije dušika in kisika v okolju. Izbrali so si promotorja '''''glnK''''' in '''''nifH''''', ki sta endogena inducibilna promotorja ''S. fredii''. Promotor ''glnK'' se odziva na nizke koncentracije dušika, promotor ''nifH'' pa se odziva na nizke koncentracije kisika. Regulacijski modul za sintezo PUFA je sestavljen tako, da sta pod promotorjem ''glnK'' zapisa za sgRNA-GFP in tracrRNA, pod promotorjem ''nifH'' pa zapisa za GFP in gruča genov za sintezo PUFA. Na drugi lokaciji na plazmidu je prisoten tudi konstitutivni promotor ''nuoA''. Navzdol od promotorja ''nuoA'' se nahaja zapis za Cas12k. Posebnost Cas12k je, da nima katalitske aktivnosti in da inhibira transkripcijo samo s fizično vezavo na tarčno DNA. Ko v celici nastaja tako Cas12k kot tudi sgRNA za tarčno zaporedje, se ta povežeta in blokirata prepisovanje navzdol od vezave. Ko se v celici zniža koncentacija sgRNA, Cas12k oddisociira in s tem je prepisovanje navzdol spet omogočeno.

Cilj regulacije je, da pride do prepisavanja sinteznih genov za PUFA samo ob visokih koncentracijah dušika in nizki koncentraciji kisika. Ob nizki koncentaciji dušika pride do prepisovanja navzdol od promotorja ''glnK'', to sta sgRNA-GFP (njegova tarča je omenjeno zaporedje GFP zavzdol od ''nifH'' promotorja) in tracrRNA. Ta konstrukt se potem poveže s Cas12k. Ta se veže na zapis za GFP in s tem blokira prepisovanje genov za sintezo PUFA. Torej tudi ko je koncentracija kisika nizka in se s tem aktivira promotor ''nifH'', do prepisovanja genov za sintezo PUFA ne pride. Ob visoki koncentraciji kisika in nizki koncentraciji dušika (to predstavlja okolje preden ''S. fredii'' tvori simbiozo z rastlino) do prepisa sinteznih genov PUFA ne pride. Ob visoki koncentraciji dušika in kisika do prepisovanja navzdol od promotorjev ''glnK'' in ''nifH'' ne pride. Ob visoki koncentaciji dušika (ko dodamo gnojilo bogato z dušikom) in nizki koncentraciji kisika pride do prepisovanje genov za sintezo PUFA, saj ne pride do prepisovanja sgRNA-GFP in tracrRNA, tako da Cas12k ne more blokirati prepisovanja genov za sintezo PUFA. Prav tako je koncentracija kisika nizka, zato je ''nifH'' promotor sploh aktiven.

== Samomorilski mehanizem razlaga ==
Samomorilski mehanizem za ''S. fredii'' je zasnovan tako, da ko ''S. fredii'' pobegne ven iz modula v okolje s povišano koncentracijo dušika in kisika, naredi samomor. Mehanizem je zasnovan na sistemu toksin-antitoksin (''vapC-vapB'') in promotorjih ''nuoA'', ''nifH'' in ''glnK''. Na enem delu konstrukta ''nuoA'' kontrolira izražanje Cas12k, na drugem pa izražanje ''vapC''. ''nifH'' kontrolira izražanje ''vapB''. ''glnK'' pa kontrolira izražanje sgRNA za gen ''mCherry'' in ''tracrRNA''. Različne kombinacije koncentracij dušika in kisika omogočajo preživetje, samo ob povišani koncentraciji dušika in hkrati kisika vodijo v samomor. Pri nizki koncentraciji dušika in kisika nastaja VapB ter sgRNA-mCherry in tracrRNA. Hkrati se izraža Cas12k, ki se poveže z sgRNA-mCherry in tracrRNA, se veže na gen za mCherry in s tem blokira izražanje ''vapC''. Pri nizki koncentracij dušika in povišani koncentracij kisika ''vapB'' ne nastaja, izraža se sgRNA-mCherry in tracrRNA ter Cas12k, zato VapC ne nastaja. Pri povišani koncentraciji dušika in nizki koncentracij kisika VapB in VapC ne nastajata. Pri povišani koncentraciji dušika in povišani koncentracij kisika VapB ne nastaja, nastaja pa VapC, saj Cas12k ne more blokirati transkripcije ''vapC'', saj sgRNA-mCherrz in tracrRNA ne nastajata. Posledično se koncentracija VapB v celici poviša, kar vodi v smrt pobegle celice, to je izven okolja modula.

Eden izmed testov, ki so ga naredili, da bi potrdili uspešnost samomorilskega mehanizma, je bil merjenje spremembe OD600 bakterij v suspenziji pri hiperoksičnih pogojih in spremenljivi koncentraciji amonijevega klorida, kot virom dušika. Po desetih urah so opazili padajoč trend v gojiščih z amonijevim kloridom. Padajoč trend je še bolj očiten, ko se poveča koncentracija amonijevega klorida. Zaključili so, da je samomorilski mehanizem pod temi testnimi pogoji reguliran s koncentracijo dušika in da deluje.

== Transport DHA in EPA v sojo ==
Njihov končni cilj je bil tudi transportirati DHA in EPA izven koreninskih nodulov v sojo. Za transport PUFA je bil že pred tem odkrit eksportni sistem, ki bi to omogočal, za gram negativne bakterije. ''S. fredii'' je tudi gram negativna bakterija. Ena študija se je ukvarjala z fiziološkim odzivom gram negativne bakterije ''Acinetobacter baumannii'' na PUFA in odkrili so povečano ekspresijo gena adeJ, ki je komponenta črpalke ''adeIJK'', ki lahko transportira več različnih učinkovin ven iz celice. Ugotovili so da delecija gena ''adeJ'' poveča dovzetnost za PUFA. Podobno vlogo kot ima črpalka ''adeIJK'', ima črpalka ''emhABC'' iz ''Pseudomonas fluorescens'', ki kontrolira homeostazo lipidov, tako da izčrpava dolgo-verižne maščobne kisline. Razultata kažeta na to, da obstajajo v gram negativnih bakterijah določeni transportni proteini, ki bi omogočali transport DHA in EPA iz celice. Torej če bi povečali njihovo izražanje, bi lahko transportirali tudi DHA in EPA v sojo.
== Viri in literatura ==
[1] CAU-China: N. Factory https://2024.igem.wiki/cau-china/ (pridobljeno 13. 4. 2025)

CAU-China: Nodulska tovarna DHA in EPA

2025-04-15T09:50:22Z

Luka Fink: /* Regulacija in sinteza modula */

[https://2024.igem.wiki/cau-china/ N. Factory (Nodulska tovarna DHA in EPA)] je iGEM projekt skupine CAU-China iz Kitajske iz leta 2024.
== UVOD ==
Človeštvo že dolgo časa poizkuša izboljšati hranilno vrednost hrane na raznorazne načine, da bi se spopadli s problemi kot so podhranjenost v nerazvitih državah in omejenost določenih virov hrane. Cilj te skupine je bil proizvajati DHA in EPA v nodulih z genetsko spremenjenimi simbiontskimi bakterijami, z namenom povečati hranilno vrednost gojenih rastlin, še posebej soje.

Noduli so majhne kroglaste tvorbe, ki se razvijejo na rastlinskih koreninah ali steblih. V nodulih živijo simbiontske bakterije, ki iz zraka vežejo dušik. Različne rastline razvijejo simbiozo z različnimi bakterijami. Rastilne iz družine metuljnic (soja, fižol, grah, leča) živijo v simbiozi z bakterijami iz rodu ''Rhizobium''.

Potencilna vcepitev ''Rhizobium'' kot mikrobnega gnolija, prinaša še druge prednosti poleg proizvodnje DHA in EPA in to je obogatitev zemlje z dušikovimi spojinami, ki jih rastline lahko uporabljajo. Dolgoročna uporaba kemičnih gnojil lahko privede do nabiranja določenih kemikalij v zemlji, kar vodi do zmanjšanja števila koristnih bakterij. Namesto kemičnih gnojil bi lahko uporabljali mikrobna gnolija, ki vsebujejo ''Rhizobium'', in bi tako izboljšali kakovost zemlje in zmanjšali negativne učinke kemičnih gnojil.

== Izvedba projekta ==
Izbrali so si bakterijo ''Sinorhizobium fredii'' CCBAU45436. V njej so vzpostavili niz regulacijskih modulov, ki se odzivajo na spremembe v koncentraciji dušika in kisika. Hkrati so izbrali gene, ki kodirajo za PUFA sintazo, ki bi proizvajala željena produkta DHA in EPA, nastajali pa bi še ostali stranski produkti. Za izboljšanje učinkovitosti so reprogramirali metabolizem z uravnavanjem izražanja določenih genov. Zasnovali so samomorilski mehanizem, če ''S. fredii'' pobegne. Regulacijski moduli so odgovorni za kontrolo izražanja genov za sintezo PUFA (poly-unsaturated fatty acid) in kontrolo samomorilskega mehanizma.

== Delecija PHB ==
PHB (poli-β-hidroksibutirat) je produkt metabolizma, ki lahko služi kot zaloga energije, in nastaja v ''S. fredii'' v veliki meri. Odločili so se, da bodo izbrisali gen ''phaC2'', ki kodira ključni encim za sintezo PHB. Delecijo so naredili s homologno rekombinacijo z dvojno zamenjavo. V odsotnosti gena ''phaC2'' naj bi se v celici povečala koncentracija acetil-CoA, ki naj bi služil kot prekurzor za sintezo PUFA.

Delecijo so potrdili s PCR na osnovi kolonije. Opazili so, da je ''S. fredii'' spremenil fenotip, ko so ga gojili na trdem gojišču. In sicer pri ''∆phaC2'' so kolonije rumene, pri wt pa bele. Testirali so še ali ima ''∆phaC2'' vpliv na sposobnost fiksiranja dušika, ko so mutanto vcepili v rastlino Jidou 17. Inkubacija je potekala 15 dni. Analizirali so nodule, ki so zrasli na rastlini, ki je bila vcepljena z wt in nodule, ki so zrasli na rastlini, ki je bila vcepljena z mutanto ter ugotovili, da ni vidne razlike med wt in mutanto. Analizirali so še vsebnost klorofila in suhe teže nadzemeljskih delov rastline in niso našli nobene statistično signifikantne razlike. Torej ''∆phaC2'' ne vpliva na rast rastline.

== Regulacija in sinteza modula ==
Problem pri sintezi PUFA je ta, da mora potekati v anaerobnem okolju, drugače lahko prihaja do oksidacije PUFA. Zato ''S. fredii'' predstavlja idealno okolje za sintezo. Za sintezo PUFA so si izbrali gručo genov iz ''Aetherobacter fasciculatus'', katera je bila že predhodno testirana v ''E. coli'' za sintezo PUFA. Da bi zagotovili učinkovito izražanje genov PUFA, so optimizirali rabo kodonov, ki bi ustrezala ''S. fredii'', in hkrati so gruči genov dodali PPTazo, ki bi omogočala posttranslacijske modifikacije.

Sintetizirali so modul, ki se odziva na različne koncentracije dušika in kisika v okolju. Izbrali so si promotorja '''''glnK''''' in '''''nifH''''', ki sta endogena inducibilna promotorja ''S. fredii''. Promotor ''glnK'' se odziva na nizke koncentracije dušika, promotor ''nifH'' pa se odziva na nizke koncentracije kisika. Regulacijski modul za sintezo PUFA je sestavljen tako, da sta pod promotorjem ''glnK'' zapisa za sgRNA-GFP in tracrRNA, pod promotorjem ''nifH'' pa zapisa za GFP in gruča genov za sintezo PUFA. Na drugi lokaciji na plazmidu je prisoten tudi konstitutivni promotor ''nuoA''. Navzdol od promotorja ''nuoA'' se nahaja zapis za Cas12k. Posebnost Cas12k je, da nima katalitske aktivnosti in da inhibira transkripcijo samo s fizično vezavo na tarčno DNA. Ko v celici nastaja tako Cas12k kot tudi sgRNA za tarčno zaporedje, se ta povežeta in blokirata prepisovanje navzdol od vezave. Ko se v celici zniža koncentacija sgRNA, Cas12k oddisociira in s tem je prepisovanje navzdol spet omogočeno.

Cilj regulacije je, da pride do prepisavanja sinteznih genov za PUFA samo ob visokih koncentracijah dušika in nizki koncentraciji kisika. Ob nizki koncentaciji dušika pride do prepisovanja navzdol od promotorja ''glnK'', to sta sgRNA-GFP (njegova tarča je omenjeno zaporedje GFP zavzdol od ''nifH'' promotorja) in tracrRNA. Ta konstrukt se potem poveže s Cas12k. Ta se veže na zapis za GFP in s tem blokira prepisovanje genov za sintezo PUFA. Torej tudi ko je koncentracija kisika nizka in se s tem aktivira promotor ''nifH'', do prepisovanja genov za sintezo PUFA ne pride. Ob visoki koncentraciji kisika in nizki koncentraciji dušika (to predstavlja okolje preden ''S. fredii'' tvori simbiozo z rastlino) do prepisa sinteznih genov PUFA ne pride. Ob visoki koncentraciji dušika in kisika do prepisovanja navzdol od promotorjev ''glnK'' in ''nifH'' ne pride. Ob visoki koncentaciji dušika (ko dodamo gnojilo bogato z dušikom) in nizki koncentraciji kisika pride do prepisovanje genov za sintezo PUFA, saj ne pride do prepisovanja sgRNA-GFP in tracrRNA, tako da Cas12k ne more blokirati prepisovanja genov za sintezo PUFA. Prav tako je koncentracija kisika nizka, zato je ''nifH'' promotor sploh aktiven.

== Samomorilski mehanizem razlaga ==
Samomorilski mehanizem za ''S. fredii'' je zasnovan tako, da ko ''S. fredii'' pobegne ven iz modula v okolje s povišno koncentracijo dušika in kisika, naredi samomor. Mehanizem je zasnovan na sistemu toksin-antitoksin (''vapC-vapB'') in promotorjih ''nuoA'', ''nifH'' in ''glnK''. Na enem delu konstrukta ''nuoA'' kontrolira izražanje Cas12k, na drugem pa izražanje ''vapC''. ''nifH'' kontrolira izražanje ''vapB''. ''glnK'' pa kontrolira izražanje sgRNA za gen mCherry in tracrRNA. Različne kombinacije koncentracij dušika in kisika omogočajo preživetje, samo ob povišani koncentraciji dušika in hkrati kisika vodijo v samomor. Pri nizki koncentraciji dušika in kisika, nastaja VapB ter sgRNA-mCherry in tracrRNA. Hkrati se izraža Cas12k, ki se poveže z sgRNA-mCherry in tracrRNA, se veže na gen za mCherry in s tem blokira izražanje ''vapC''. Pri nizki koncentracij dušika in povišani koncentracij kisika, ''vapB'' ne nastaja, izraža se sgRNA-mCherry in tracrRNA ter Cas12k, zato VapC ne nastaja. Pri povišani koncentracij dušika in nizki koncentracij kisika VapB in VapC ne nastajata. Pri povišani koncentracij dušika in povišani koncentracij kisika VapB ne nastaja, nastaja pa VapC, saj Cas12k ne more blokirati transkripcije ''vapC'', saj sgRNA-mCherrz in tracrRNA ne nastajata. Posledično se koncentracija VapB v celici poviša, kar vodi v smrt pobegle celice, to je izven okolja modula.

Eden izmed testov, ki so ga naredili, da bi potrdili uspešnost samomorilskega mehanizma je bil merjenje spremembe OD600 bakterij v suspenziji pri hiperoksičnih pogojih in spremenljivo koncentracijo amonijevega klorida, kot vira dušika. Po desetih urah so opazili padajoč trend v gojiščih z amonijevim kloridom. Padajoč trend je še bolj očiten, ko se poveča koncentracija amonijevega klorida. Zaključili so da je samomorilski mehanizem pod temi testnimi pogoji, reguliran s koncentracijo dušika in da deluje.
== Transport DHA in EPA v sojo ==
Njihov končni cilj je bil tudi transportirati DHA in EPA izven koreninskih nodulov v sojo. Za transport PUFA je bil že pred tem odkrit eksportni sistem, ki bi to omogočal, za gram negativne bakterije. ''S. fredii'' je tudi gram negativna bakterija. Ena študija se je ukvarjala z fiziološkim odzivom gram negativne bakterije ''Acinetobacter baumannii'' na PUFA in odkrili so povečano ekspresijo gena adeJ, ki je komponenta črpalke ''adeIJK'', ki lahko transportira več različnih učinkovin ven iz celice. Ugotovili so da delecija gena ''adeJ'' poveča dovzetnost za PUFA. Podobno vlogo kot ima črpalka ''adeIJK'', ima črpalka ''emhABC'' iz ''Pseudomonas fluorescens'', ki kontrolira homeostazo lipidov, tako da izčrpava dolgo-verižne maščobne kisline. Razultata kažeta na to, da obstajajo v gram negativnih bakterijah določeni transportni proteini, ki bi omogočali transport DHA in EPA iz celice. Torej če bi povečali njihovo izražanje, bi lahko transportirali tudi DHA in EPA v sojo.
== Viri in literatura ==
[1] CAU-China: N. Factory https://2024.igem.wiki/cau-china/ (pridobljeno 13. 4. 2025)

CAU-China: Nodulska tovarna DHA in EPA

2025-04-15T09:46:35Z

Luka Fink: /* Delecija PHB */

[https://2024.igem.wiki/cau-china/ N. Factory (Nodulska tovarna DHA in EPA)] je iGEM projekt skupine CAU-China iz Kitajske iz leta 2024.
== UVOD ==
Človeštvo že dolgo časa poizkuša izboljšati hranilno vrednost hrane na raznorazne načine, da bi se spopadli s problemi kot so podhranjenost v nerazvitih državah in omejenost določenih virov hrane. Cilj te skupine je bil proizvajati DHA in EPA v nodulih z genetsko spremenjenimi simbiontskimi bakterijami, z namenom povečati hranilno vrednost gojenih rastlin, še posebej soje.

Noduli so majhne kroglaste tvorbe, ki se razvijejo na rastlinskih koreninah ali steblih. V nodulih živijo simbiontske bakterije, ki iz zraka vežejo dušik. Različne rastline razvijejo simbiozo z različnimi bakterijami. Rastilne iz družine metuljnic (soja, fižol, grah, leča) živijo v simbiozi z bakterijami iz rodu ''Rhizobium''.

Potencilna vcepitev ''Rhizobium'' kot mikrobnega gnolija, prinaša še druge prednosti poleg proizvodnje DHA in EPA in to je obogatitev zemlje z dušikovimi spojinami, ki jih rastline lahko uporabljajo. Dolgoročna uporaba kemičnih gnojil lahko privede do nabiranja določenih kemikalij v zemlji, kar vodi do zmanjšanja števila koristnih bakterij. Namesto kemičnih gnojil bi lahko uporabljali mikrobna gnolija, ki vsebujejo ''Rhizobium'', in bi tako izboljšali kakovost zemlje in zmanjšali negativne učinke kemičnih gnojil.

== Izvedba projekta ==
Izbrali so si bakterijo ''Sinorhizobium fredii'' CCBAU45436. V njej so vzpostavili niz regulacijskih modulov, ki se odzivajo na spremembe v koncentraciji dušika in kisika. Hkrati so izbrali gene, ki kodirajo za PUFA sintazo, ki bi proizvajala željena produkta DHA in EPA, nastajali pa bi še ostali stranski produkti. Za izboljšanje učinkovitosti so reprogramirali metabolizem z uravnavanjem izražanja določenih genov. Zasnovali so samomorilski mehanizem, če ''S. fredii'' pobegne. Regulacijski moduli so odgovorni za kontrolo izražanja genov za sintezo PUFA (poly-unsaturated fatty acid) in kontrolo samomorilskega mehanizma.

== Delecija PHB ==
PHB (poli-β-hidroksibutirat) je produkt metabolizma, ki lahko služi kot zaloga energije, in nastaja v ''S. fredii'' v veliki meri. Odločili so se, da bodo izbrisali gen ''phaC2'', ki kodira ključni encim za sintezo PHB. Delecijo so naredili s homologno rekombinacijo z dvojno zamenjavo. V odsotnosti gena ''phaC2'' naj bi se v celici povečala koncentracija acetil-CoA, ki naj bi služil kot prekurzor za sintezo PUFA.

Delecijo so potrdili s PCR na osnovi kolonije. Opazili so, da je ''S. fredii'' spremenil fenotip, ko so ga gojili na trdem gojišču. In sicer pri ''∆phaC2'' so kolonije rumene, pri wt pa bele. Testirali so še ali ima ''∆phaC2'' vpliv na sposobnost fiksiranja dušika, ko so mutanto vcepili v rastlino Jidou 17. Inkubacija je potekala 15 dni. Analizirali so nodule, ki so zrasli na rastlini, ki je bila vcepljena z wt in nodule, ki so zrasli na rastlini, ki je bila vcepljena z mutanto ter ugotovili, da ni vidne razlike med wt in mutanto. Analizirali so še vsebnost klorofila in suhe teže nadzemeljskih delov rastline in niso našli nobene statistično signifikantne razlike. Torej ''∆phaC2'' ne vpliva na rast rastline.

== Regulacija in sinteza modula ==
Problem pri sintezi PUFA je ta, da mora potekati v anaerobnem okolju, drugače lahko prihaja do oksidacije PUFA. Zato ''S. fredii'' predstavlja idealno okolje za sintezo. Za sintezo PUFA so si izbrali gručo genov iz ''Aetherobacter fasciculatus'', katera je bila že predhodno testirana v ''E. coli'' za sintezo PUFA. Da bi zagotovili učinkovito izražanje genov PUFA, so optimizirali rabo kodonov, ki bi ustrezala ''S. fredii'', in hkrati so gruči genov dodali PPTazo, ki bi omogočala posttranslacijske modifikacije.

Sintetizirali so modul, ki se odziva na različne koncentracije dušika in kisika v okolju. Izbrali so si promotorja '''''glnK''''' in '''''nifH''''', ki sta endogena inducibilna promotorja ''S. fredii''. Promotor ''glnK'' se odziva na nizke koncentracije dušika, promotor ''nifH'' pa se odziva na nizke koncentracije kisika. Regulacijski modul za sintezo PUFA je sestavljen tako, da sta pod promotorjem ''glnK'' zapisa za sgRNA-GFP in tracrRNA, pod promotorjem ''nifH'' pa zapisa za GFP in gruča genov za sintezo PUFA. Na drugi lokaciji na plazmidu je prisoten tudi konstitutivni promotor ''nuoA''. Navzdol od promotorja ''nuoA'' se nahaj zapis za Cas12k. Posebnost Cas12k je da nima katalitske aktivnosti in da inhibira transkripcijo samo s fizično vezavo na tarčno DNA. Ko se v celici nastaja tako Cas12k kot tudi sgRNA za tarčno zaporedje, se ta povežeta in blokirata prepisovanje navzdol od vezave. Ko se v celici zniža koncentacija sgRNA, Cas12k oddisocira in s tem je prepisovanje navzdol spet omogočeno.

Cilj regulacije je da pride do prepisavanja sinteznih genov za PUFA samo ob visokih koncentracijah dušika in nizki koncentraciji kisika. Ob nizki koncentaciji dušika pride do prepisovanja nazdol od promotorja ''glnK'', to sta sgRNA-GFP (njegova tarča je omenjeno zaporedje GFP zavzdol od ''nifH'' promotorja) in tracrRNA. Ta konstrukt se potem poveže s Cas12k. Ta se veže na zapis za GFP in s tem blokira prepisovanje genov za sintezo PUFA. Torej tudi ko je koncentracija kisika nizka in se s tem aktivira promotor ''nifH'' do prepisovanja genov za sintezo PUFA ne pride. Ob visoki koncentraciji kisika in nizki koncentraciji dušika (to predstavlja okolje preden ''S. fredii'' tvori simbiozo z rastlino) do prepisa sinteznih genov PUFA ne pride. Ob visoki koncentaciji dušika in kisika do prepisovanja navzdol od promotorjev ''glnK'' in ''nifH'' ne pride. Ob visoki koncentaciji dušika (ko dodamo gnojilo bogato z dušikom) in nizki koncentraciji kisika pride do prepisovanje genov za sintezo PUFA, saj ne pride do prepisovanja sgRNA-GFP in tracrRNA, tako da Cas12k ne more blokirati prepisovanja genov za sintezo PUFA. Prav tako je koncentracija kisika nizka, zato je nifH promotor sploh aktiven.
== Samomorilski mehanizem razlaga ==
Samomorilski mehanizem za ''S. fredii'' je zasnovan tako, da ko ''S. fredii'' pobegne ven iz modula v okolje s povišno koncentracijo dušika in kisika, naredi samomor. Mehanizem je zasnovan na sistemu toksin-antitoksin (''vapC-vapB'') in promotorjih ''nuoA'', ''nifH'' in ''glnK''. Na enem delu konstrukta ''nuoA'' kontrolira izražanje Cas12k, na drugem pa izražanje ''vapC''. ''nifH'' kontrolira izražanje ''vapB''. ''glnK'' pa kontrolira izražanje sgRNA za gen mCherry in tracrRNA. Različne kombinacije koncentracij dušika in kisika omogočajo preživetje, samo ob povišani koncentraciji dušika in hkrati kisika vodijo v samomor. Pri nizki koncentraciji dušika in kisika, nastaja VapB ter sgRNA-mCherry in tracrRNA. Hkrati se izraža Cas12k, ki se poveže z sgRNA-mCherry in tracrRNA, se veže na gen za mCherry in s tem blokira izražanje ''vapC''. Pri nizki koncentracij dušika in povišani koncentracij kisika, ''vapB'' ne nastaja, izraža se sgRNA-mCherry in tracrRNA ter Cas12k, zato VapC ne nastaja. Pri povišani koncentracij dušika in nizki koncentracij kisika VapB in VapC ne nastajata. Pri povišani koncentracij dušika in povišani koncentracij kisika VapB ne nastaja, nastaja pa VapC, saj Cas12k ne more blokirati transkripcije ''vapC'', saj sgRNA-mCherrz in tracrRNA ne nastajata. Posledično se koncentracija VapB v celici poviša, kar vodi v smrt pobegle celice, to je izven okolja modula.

Eden izmed testov, ki so ga naredili, da bi potrdili uspešnost samomorilskega mehanizma je bil merjenje spremembe OD600 bakterij v suspenziji pri hiperoksičnih pogojih in spremenljivo koncentracijo amonijevega klorida, kot vira dušika. Po desetih urah so opazili padajoč trend v gojiščih z amonijevim kloridom. Padajoč trend je še bolj očiten, ko se poveča koncentracija amonijevega klorida. Zaključili so da je samomorilski mehanizem pod temi testnimi pogoji, reguliran s koncentracijo dušika in da deluje.
== Transport DHA in EPA v sojo ==
Njihov končni cilj je bil tudi transportirati DHA in EPA izven koreninskih nodulov v sojo. Za transport PUFA je bil že pred tem odkrit eksportni sistem, ki bi to omogočal, za gram negativne bakterije. ''S. fredii'' je tudi gram negativna bakterija. Ena študija se je ukvarjala z fiziološkim odzivom gram negativne bakterije ''Acinetobacter baumannii'' na PUFA in odkrili so povečano ekspresijo gena adeJ, ki je komponenta črpalke ''adeIJK'', ki lahko transportira več različnih učinkovin ven iz celice. Ugotovili so da delecija gena ''adeJ'' poveča dovzetnost za PUFA. Podobno vlogo kot ima črpalka ''adeIJK'', ima črpalka ''emhABC'' iz ''Pseudomonas fluorescens'', ki kontrolira homeostazo lipidov, tako da izčrpava dolgo-verižne maščobne kisline. Razultata kažeta na to, da obstajajo v gram negativnih bakterijah določeni transportni proteini, ki bi omogočali transport DHA in EPA iz celice. Torej če bi povečali njihovo izražanje, bi lahko transportirali tudi DHA in EPA v sojo.
== Viri in literatura ==
[1] CAU-China: N. Factory https://2024.igem.wiki/cau-china/ (pridobljeno 13. 4. 2025)

CAU-China: Nodulska tovarna DHA in EPA

2025-04-15T09:44:55Z

Luka Fink: /* Izvedba projekta */

[https://2024.igem.wiki/cau-china/ N. Factory (Nodulska tovarna DHA in EPA)] je iGEM projekt skupine CAU-China iz Kitajske iz leta 2024.
== UVOD ==
Človeštvo že dolgo časa poizkuša izboljšati hranilno vrednost hrane na raznorazne načine, da bi se spopadli s problemi kot so podhranjenost v nerazvitih državah in omejenost določenih virov hrane. Cilj te skupine je bil proizvajati DHA in EPA v nodulih z genetsko spremenjenimi simbiontskimi bakterijami, z namenom povečati hranilno vrednost gojenih rastlin, še posebej soje.

Noduli so majhne kroglaste tvorbe, ki se razvijejo na rastlinskih koreninah ali steblih. V nodulih živijo simbiontske bakterije, ki iz zraka vežejo dušik. Različne rastline razvijejo simbiozo z različnimi bakterijami. Rastilne iz družine metuljnic (soja, fižol, grah, leča) živijo v simbiozi z bakterijami iz rodu ''Rhizobium''.

Potencilna vcepitev ''Rhizobium'' kot mikrobnega gnolija, prinaša še druge prednosti poleg proizvodnje DHA in EPA in to je obogatitev zemlje z dušikovimi spojinami, ki jih rastline lahko uporabljajo. Dolgoročna uporaba kemičnih gnojil lahko privede do nabiranja določenih kemikalij v zemlji, kar vodi do zmanjšanja števila koristnih bakterij. Namesto kemičnih gnojil bi lahko uporabljali mikrobna gnolija, ki vsebujejo ''Rhizobium'', in bi tako izboljšali kakovost zemlje in zmanjšali negativne učinke kemičnih gnojil.

== Izvedba projekta ==
Izbrali so si bakterijo ''Sinorhizobium fredii'' CCBAU45436. V njej so vzpostavili niz regulacijskih modulov, ki se odzivajo na spremembe v koncentraciji dušika in kisika. Hkrati so izbrali gene, ki kodirajo za PUFA sintazo, ki bi proizvajala željena produkta DHA in EPA, nastajali pa bi še ostali stranski produkti. Za izboljšanje učinkovitosti so reprogramirali metabolizem z uravnavanjem izražanja določenih genov. Zasnovali so samomorilski mehanizem, če ''S. fredii'' pobegne. Regulacijski moduli so odgovorni za kontrolo izražanja genov za sintezo PUFA (poly-unsaturated fatty acid) in kontrolo samomorilskega mehanizma.

== Delecija PHB ==
PHB (poli-β-hidroksibutirat) je produkt metabolizma, ki lahko služi kot zaloga energije, in nastaja v ''S. fredii'' v veliki meri. Odločili so se da bodo izbrisali gen ''phaC2'', ki kodira ključni encim za sintezo PHB. Delecijo so naredili s homologno rekombinacijo z dvojno zamenjavo. V odsotnosti gena ''phaC2'' naj bi se v celici povečala koncentracija acetil-CoA, ki naj bi služil kot prekursor za sintezo PUFA.

Delecijo so potrdili s PCR na osnovi kolonije. Opazili so da je ''S. fredii'' spremenil fenotip, ko so ga gojili na trdem gojišču. In sicer pri ''∆phaC2'' so kolonije rumene, pri wt pa bele. Testirali so še ali ima ''∆phaC2'' vpliv na sposobnost fiksiranja dušika, ko so mutanto vcepili v rastlino Jidou 17. Inkubacija je potekala 15 dni. Analizirali so nodule, ki so zrasli na rastlini, ki je bila vcepljena z wt in nodule, ki so zrasli na rastlini, ki je bila vcepljena z mutanto ter ugotovili da ni vidne razlike med wt in mutanto. Analizirali so še vsebnost klorofila in suhe teže nadzemeljskih delov rastline in niso našli nobene statistično signifikantne razlike. Torej ''∆phaC2'' ne vpliva na rast rastline.
== Regulacija in sinteza modula ==
Problem pri sintezi PUFA je ta, da mora potekati v anaerobnem okolju, drugače lahko prihaja do oksidacije PUFA. Zato ''S. fredii'' predstavlja idealno okolje za sintezo. Za sintezo PUFA so si izbrali gručo genov iz ''Aetherobacter fasciculatus'', katera je bila že predhodno testirana v ''E. coli'' za sintezo PUFA. Da bi zagotovili učinkovito izražanje genov PUFA, so optimizirali rabo kodonov, ki bi ustrezala ''S. fredii'', in hkrati so gruči genov dodali PPTazo, ki bi omogočala posttranslacijske modifikacije.

Sintetizirali so modul, ki se odziva na različne koncentracije dušika in kisika v okolju. Izbrali so si promotorja '''''glnK''''' in '''''nifH''''', ki sta endogena inducibilna promotorja ''S. fredii''. Promotor ''glnK'' se odziva na nizke koncentracije dušika, promotor ''nifH'' pa se odziva na nizke koncentracije kisika. Regulacijski modul za sintezo PUFA je sestavljen tako, da sta pod promotorjem ''glnK'' zapisa za sgRNA-GFP in tracrRNA, pod promotorjem ''nifH'' pa zapisa za GFP in gruča genov za sintezo PUFA. Na drugi lokaciji na plazmidu je prisoten tudi konstitutivni promotor ''nuoA''. Navzdol od promotorja ''nuoA'' se nahaj zapis za Cas12k. Posebnost Cas12k je da nima katalitske aktivnosti in da inhibira transkripcijo samo s fizično vezavo na tarčno DNA. Ko se v celici nastaja tako Cas12k kot tudi sgRNA za tarčno zaporedje, se ta povežeta in blokirata prepisovanje navzdol od vezave. Ko se v celici zniža koncentacija sgRNA, Cas12k oddisocira in s tem je prepisovanje navzdol spet omogočeno.

Cilj regulacije je da pride do prepisavanja sinteznih genov za PUFA samo ob visokih koncentracijah dušika in nizki koncentraciji kisika. Ob nizki koncentaciji dušika pride do prepisovanja nazdol od promotorja ''glnK'', to sta sgRNA-GFP (njegova tarča je omenjeno zaporedje GFP zavzdol od ''nifH'' promotorja) in tracrRNA. Ta konstrukt se potem poveže s Cas12k. Ta se veže na zapis za GFP in s tem blokira prepisovanje genov za sintezo PUFA. Torej tudi ko je koncentracija kisika nizka in se s tem aktivira promotor ''nifH'' do prepisovanja genov za sintezo PUFA ne pride. Ob visoki koncentraciji kisika in nizki koncentraciji dušika (to predstavlja okolje preden ''S. fredii'' tvori simbiozo z rastlino) do prepisa sinteznih genov PUFA ne pride. Ob visoki koncentaciji dušika in kisika do prepisovanja navzdol od promotorjev ''glnK'' in ''nifH'' ne pride. Ob visoki koncentaciji dušika (ko dodamo gnojilo bogato z dušikom) in nizki koncentraciji kisika pride do prepisovanje genov za sintezo PUFA, saj ne pride do prepisovanja sgRNA-GFP in tracrRNA, tako da Cas12k ne more blokirati prepisovanja genov za sintezo PUFA. Prav tako je koncentracija kisika nizka, zato je nifH promotor sploh aktiven.
== Samomorilski mehanizem razlaga ==
Samomorilski mehanizem za ''S. fredii'' je zasnovan tako, da ko ''S. fredii'' pobegne ven iz modula v okolje s povišno koncentracijo dušika in kisika, naredi samomor. Mehanizem je zasnovan na sistemu toksin-antitoksin (''vapC-vapB'') in promotorjih ''nuoA'', ''nifH'' in ''glnK''. Na enem delu konstrukta ''nuoA'' kontrolira izražanje Cas12k, na drugem pa izražanje ''vapC''. ''nifH'' kontrolira izražanje ''vapB''. ''glnK'' pa kontrolira izražanje sgRNA za gen mCherry in tracrRNA. Različne kombinacije koncentracij dušika in kisika omogočajo preživetje, samo ob povišani koncentraciji dušika in hkrati kisika vodijo v samomor. Pri nizki koncentraciji dušika in kisika, nastaja VapB ter sgRNA-mCherry in tracrRNA. Hkrati se izraža Cas12k, ki se poveže z sgRNA-mCherry in tracrRNA, se veže na gen za mCherry in s tem blokira izražanje ''vapC''. Pri nizki koncentracij dušika in povišani koncentracij kisika, ''vapB'' ne nastaja, izraža se sgRNA-mCherry in tracrRNA ter Cas12k, zato VapC ne nastaja. Pri povišani koncentracij dušika in nizki koncentracij kisika VapB in VapC ne nastajata. Pri povišani koncentracij dušika in povišani koncentracij kisika VapB ne nastaja, nastaja pa VapC, saj Cas12k ne more blokirati transkripcije ''vapC'', saj sgRNA-mCherrz in tracrRNA ne nastajata. Posledično se koncentracija VapB v celici poviša, kar vodi v smrt pobegle celice, to je izven okolja modula.

Eden izmed testov, ki so ga naredili, da bi potrdili uspešnost samomorilskega mehanizma je bil merjenje spremembe OD600 bakterij v suspenziji pri hiperoksičnih pogojih in spremenljivo koncentracijo amonijevega klorida, kot vira dušika. Po desetih urah so opazili padajoč trend v gojiščih z amonijevim kloridom. Padajoč trend je še bolj očiten, ko se poveča koncentracija amonijevega klorida. Zaključili so da je samomorilski mehanizem pod temi testnimi pogoji, reguliran s koncentracijo dušika in da deluje.
== Transport DHA in EPA v sojo ==
Njihov končni cilj je bil tudi transportirati DHA in EPA izven koreninskih nodulov v sojo. Za transport PUFA je bil že pred tem odkrit eksportni sistem, ki bi to omogočal, za gram negativne bakterije. ''S. fredii'' je tudi gram negativna bakterija. Ena študija se je ukvarjala z fiziološkim odzivom gram negativne bakterije ''Acinetobacter baumannii'' na PUFA in odkrili so povečano ekspresijo gena adeJ, ki je komponenta črpalke ''adeIJK'', ki lahko transportira več različnih učinkovin ven iz celice. Ugotovili so da delecija gena ''adeJ'' poveča dovzetnost za PUFA. Podobno vlogo kot ima črpalka ''adeIJK'', ima črpalka ''emhABC'' iz ''Pseudomonas fluorescens'', ki kontrolira homeostazo lipidov, tako da izčrpava dolgo-verižne maščobne kisline. Razultata kažeta na to, da obstajajo v gram negativnih bakterijah določeni transportni proteini, ki bi omogočali transport DHA in EPA iz celice. Torej če bi povečali njihovo izražanje, bi lahko transportirali tudi DHA in EPA v sojo.
== Viri in literatura ==
[1] CAU-China: N. Factory https://2024.igem.wiki/cau-china/ (pridobljeno 13. 4. 2025)

CAU-China: Nodulska tovarna DHA in EPA

2025-04-15T09:43:36Z

Luka Fink: /* Izvedba projekta */

[https://2024.igem.wiki/cau-china/ N. Factory (Nodulska tovarna DHA in EPA)] je iGEM projekt skupine CAU-China iz Kitajske iz leta 2024.
== UVOD ==
Človeštvo že dolgo časa poizkuša izboljšati hranilno vrednost hrane na raznorazne načine, da bi se spopadli s problemi kot so podhranjenost v nerazvitih državah in omejenost določenih virov hrane. Cilj te skupine je bil proizvajati DHA in EPA v nodulih z genetsko spremenjenimi simbiontskimi bakterijami, z namenom povečati hranilno vrednost gojenih rastlin, še posebej soje.

Noduli so majhne kroglaste tvorbe, ki se razvijejo na rastlinskih koreninah ali steblih. V nodulih živijo simbiontske bakterije, ki iz zraka vežejo dušik. Različne rastline razvijejo simbiozo z različnimi bakterijami. Rastilne iz družine metuljnic (soja, fižol, grah, leča) živijo v simbiozi z bakterijami iz rodu ''Rhizobium''.

Potencilna vcepitev ''Rhizobium'' kot mikrobnega gnolija, prinaša še druge prednosti poleg proizvodnje DHA in EPA in to je obogatitev zemlje z dušikovimi spojinami, ki jih rastline lahko uporabljajo. Dolgoročna uporaba kemičnih gnojil lahko privede do nabiranja določenih kemikalij v zemlji, kar vodi do zmanjšanja števila koristnih bakterij. Namesto kemičnih gnojil bi lahko uporabljali mikrobna gnolija, ki vsebujejo ''Rhizobium'', in bi tako izboljšali kakovost zemlje in zmanjšali negativne učinke kemičnih gnojil.

== Izvedba projekta ==
Izbrali so si bakterijo ''Sinorhizobium fredii'' CCBAU45436. V njej so vzpostavili niz regulacijskih modulov, ki se odzivajo na spremembe v koncentraciji dušika in kisika. Hkrati so izbrali gene, ki kodirajo za PUFA sintazo, ki bi proizvajala željena produkta DHA in EPA ter hkrati bi nastajali še ostali stranski produkti). Za izboljšanje učinkovitosti so reprogramirali metabolizem z uravnavanjem izražanja določenih genov. Zasnovali so samomorilski mehanizem, če ''S. fredii'' pobegne. Regulacijski moduli so odgovorni za kontrolo izražanja genov za sintezo PUFA (poly-unsaturated fatty acid) in kontrolo samomorilskega mehanizma.

== Delecija PHB ==
PHB (poli-β-hidroksibutirat) je produkt metabolizma, ki lahko služi kot zaloga energije, in nastaja v ''S. fredii'' v veliki meri. Odločili so se da bodo izbrisali gen ''phaC2'', ki kodira ključni encim za sintezo PHB. Delecijo so naredili s homologno rekombinacijo z dvojno zamenjavo. V odsotnosti gena ''phaC2'' naj bi se v celici povečala koncentracija acetil-CoA, ki naj bi služil kot prekursor za sintezo PUFA.

Delecijo so potrdili s PCR na osnovi kolonije. Opazili so da je ''S. fredii'' spremenil fenotip, ko so ga gojili na trdem gojišču. In sicer pri ''∆phaC2'' so kolonije rumene, pri wt pa bele. Testirali so še ali ima ''∆phaC2'' vpliv na sposobnost fiksiranja dušika, ko so mutanto vcepili v rastlino Jidou 17. Inkubacija je potekala 15 dni. Analizirali so nodule, ki so zrasli na rastlini, ki je bila vcepljena z wt in nodule, ki so zrasli na rastlini, ki je bila vcepljena z mutanto ter ugotovili da ni vidne razlike med wt in mutanto. Analizirali so še vsebnost klorofila in suhe teže nadzemeljskih delov rastline in niso našli nobene statistično signifikantne razlike. Torej ''∆phaC2'' ne vpliva na rast rastline.
== Regulacija in sinteza modula ==
Problem pri sintezi PUFA je ta, da mora potekati v anaerobnem okolju, drugače lahko prihaja do oksidacije PUFA. Zato ''S. fredii'' predstavlja idealno okolje za sintezo. Za sintezo PUFA so si izbrali gručo genov iz ''Aetherobacter fasciculatus'', katera je bila že predhodno testirana v ''E. coli'' za sintezo PUFA. Da bi zagotovili učinkovito izražanje genov PUFA, so optimizirali rabo kodonov, ki bi ustrezala ''S. fredii'', in hkrati so gruči genov dodali PPTazo, ki bi omogočala posttranslacijske modifikacije.

Sintetizirali so modul, ki se odziva na različne koncentracije dušika in kisika v okolju. Izbrali so si promotorja '''''glnK''''' in '''''nifH''''', ki sta endogena inducibilna promotorja ''S. fredii''. Promotor ''glnK'' se odziva na nizke koncentracije dušika, promotor ''nifH'' pa se odziva na nizke koncentracije kisika. Regulacijski modul za sintezo PUFA je sestavljen tako, da sta pod promotorjem ''glnK'' zapisa za sgRNA-GFP in tracrRNA, pod promotorjem ''nifH'' pa zapisa za GFP in gruča genov za sintezo PUFA. Na drugi lokaciji na plazmidu je prisoten tudi konstitutivni promotor ''nuoA''. Navzdol od promotorja ''nuoA'' se nahaj zapis za Cas12k. Posebnost Cas12k je da nima katalitske aktivnosti in da inhibira transkripcijo samo s fizično vezavo na tarčno DNA. Ko se v celici nastaja tako Cas12k kot tudi sgRNA za tarčno zaporedje, se ta povežeta in blokirata prepisovanje navzdol od vezave. Ko se v celici zniža koncentacija sgRNA, Cas12k oddisocira in s tem je prepisovanje navzdol spet omogočeno.

Cilj regulacije je da pride do prepisavanja sinteznih genov za PUFA samo ob visokih koncentracijah dušika in nizki koncentraciji kisika. Ob nizki koncentaciji dušika pride do prepisovanja nazdol od promotorja ''glnK'', to sta sgRNA-GFP (njegova tarča je omenjeno zaporedje GFP zavzdol od ''nifH'' promotorja) in tracrRNA. Ta konstrukt se potem poveže s Cas12k. Ta se veže na zapis za GFP in s tem blokira prepisovanje genov za sintezo PUFA. Torej tudi ko je koncentracija kisika nizka in se s tem aktivira promotor ''nifH'' do prepisovanja genov za sintezo PUFA ne pride. Ob visoki koncentraciji kisika in nizki koncentraciji dušika (to predstavlja okolje preden ''S. fredii'' tvori simbiozo z rastlino) do prepisa sinteznih genov PUFA ne pride. Ob visoki koncentaciji dušika in kisika do prepisovanja navzdol od promotorjev ''glnK'' in ''nifH'' ne pride. Ob visoki koncentaciji dušika (ko dodamo gnojilo bogato z dušikom) in nizki koncentraciji kisika pride do prepisovanje genov za sintezo PUFA, saj ne pride do prepisovanja sgRNA-GFP in tracrRNA, tako da Cas12k ne more blokirati prepisovanja genov za sintezo PUFA. Prav tako je koncentracija kisika nizka, zato je nifH promotor sploh aktiven.
== Samomorilski mehanizem razlaga ==
Samomorilski mehanizem za ''S. fredii'' je zasnovan tako, da ko ''S. fredii'' pobegne ven iz modula v okolje s povišno koncentracijo dušika in kisika, naredi samomor. Mehanizem je zasnovan na sistemu toksin-antitoksin (''vapC-vapB'') in promotorjih ''nuoA'', ''nifH'' in ''glnK''. Na enem delu konstrukta ''nuoA'' kontrolira izražanje Cas12k, na drugem pa izražanje ''vapC''. ''nifH'' kontrolira izražanje ''vapB''. ''glnK'' pa kontrolira izražanje sgRNA za gen mCherry in tracrRNA. Različne kombinacije koncentracij dušika in kisika omogočajo preživetje, samo ob povišani koncentraciji dušika in hkrati kisika vodijo v samomor. Pri nizki koncentraciji dušika in kisika, nastaja VapB ter sgRNA-mCherry in tracrRNA. Hkrati se izraža Cas12k, ki se poveže z sgRNA-mCherry in tracrRNA, se veže na gen za mCherry in s tem blokira izražanje ''vapC''. Pri nizki koncentracij dušika in povišani koncentracij kisika, ''vapB'' ne nastaja, izraža se sgRNA-mCherry in tracrRNA ter Cas12k, zato VapC ne nastaja. Pri povišani koncentracij dušika in nizki koncentracij kisika VapB in VapC ne nastajata. Pri povišani koncentracij dušika in povišani koncentracij kisika VapB ne nastaja, nastaja pa VapC, saj Cas12k ne more blokirati transkripcije ''vapC'', saj sgRNA-mCherrz in tracrRNA ne nastajata. Posledično se koncentracija VapB v celici poviša, kar vodi v smrt pobegle celice, to je izven okolja modula.

Eden izmed testov, ki so ga naredili, da bi potrdili uspešnost samomorilskega mehanizma je bil merjenje spremembe OD600 bakterij v suspenziji pri hiperoksičnih pogojih in spremenljivo koncentracijo amonijevega klorida, kot vira dušika. Po desetih urah so opazili padajoč trend v gojiščih z amonijevim kloridom. Padajoč trend je še bolj očiten, ko se poveča koncentracija amonijevega klorida. Zaključili so da je samomorilski mehanizem pod temi testnimi pogoji, reguliran s koncentracijo dušika in da deluje.
== Transport DHA in EPA v sojo ==
Njihov končni cilj je bil tudi transportirati DHA in EPA izven koreninskih nodulov v sojo. Za transport PUFA je bil že pred tem odkrit eksportni sistem, ki bi to omogočal, za gram negativne bakterije. ''S. fredii'' je tudi gram negativna bakterija. Ena študija se je ukvarjala z fiziološkim odzivom gram negativne bakterije ''Acinetobacter baumannii'' na PUFA in odkrili so povečano ekspresijo gena adeJ, ki je komponenta črpalke ''adeIJK'', ki lahko transportira več različnih učinkovin ven iz celice. Ugotovili so da delecija gena ''adeJ'' poveča dovzetnost za PUFA. Podobno vlogo kot ima črpalka ''adeIJK'', ima črpalka ''emhABC'' iz ''Pseudomonas fluorescens'', ki kontrolira homeostazo lipidov, tako da izčrpava dolgo-verižne maščobne kisline. Razultata kažeta na to, da obstajajo v gram negativnih bakterijah določeni transportni proteini, ki bi omogočali transport DHA in EPA iz celice. Torej če bi povečali njihovo izražanje, bi lahko transportirali tudi DHA in EPA v sojo.
== Viri in literatura ==
[1] CAU-China: N. Factory https://2024.igem.wiki/cau-china/ (pridobljeno 13. 4. 2025)

CAU-China: Nodulska tovarna DHA in EPA

2025-04-15T09:43:09Z

Luka Fink: /* UVOD */

[https://2024.igem.wiki/cau-china/ N. Factory (Nodulska tovarna DHA in EPA)] je iGEM projekt skupine CAU-China iz Kitajske iz leta 2024.
== UVOD ==
Človeštvo že dolgo časa poizkuša izboljšati hranilno vrednost hrane na raznorazne načine, da bi se spopadli s problemi kot so podhranjenost v nerazvitih državah in omejenost določenih virov hrane. Cilj te skupine je bil proizvajati DHA in EPA v nodulih z genetsko spremenjenimi simbiontskimi bakterijami, z namenom povečati hranilno vrednost gojenih rastlin, še posebej soje.

Noduli so majhne kroglaste tvorbe, ki se razvijejo na rastlinskih koreninah ali steblih. V nodulih živijo simbiontske bakterije, ki iz zraka vežejo dušik. Različne rastline razvijejo simbiozo z različnimi bakterijami. Rastilne iz družine metuljnic (soja, fižol, grah, leča) živijo v simbiozi z bakterijami iz rodu ''Rhizobium''.

Potencilna vcepitev ''Rhizobium'' kot mikrobnega gnolija, prinaša še druge prednosti poleg proizvodnje DHA in EPA in to je obogatitev zemlje z dušikovimi spojinami, ki jih rastline lahko uporabljajo. Dolgoročna uporaba kemičnih gnojil lahko privede do nabiranja določenih kemikalij v zemlji, kar vodi do zmanjšanja števila koristnih bakterij. Namesto kemičnih gnojil bi lahko uporabljali mikrobna gnolija, ki vsebujejo ''Rhizobium'', in bi tako izboljšali kakovost zemlje in zmanjšali negativne učinke kemičnih gnojil.

== Izvedba projekta ==
Izbrali so si bakterijo ''Sinorhizobium fredii'' CCBAU45436. V njej so vzpostavili niz regulacijskih modulov, ki se odzivajo na spremembne v koncentraciji dušika in kisika. Hkrati so izbrali gene, ki kodirajo za PUFA sintazo, ki bi proizvajala željena produkta DHA in EPA ter hkrati bi nastajali še ostali stranski produkti). Za izboljšanje učinkovitosti so reprogramirali metabolizem z uravnavanjem izražanja določenih genov. Zasnovali so samomorilski mehanizem, če ''S. fredii'' pobegne. Regulacijski moduli so odgovorni za kontrolo izražanja genov za sintezo PUFA (poly-unsaturated fatty acid) in kontrolo samomorilskega mehanizma.
== Delecija PHB ==
PHB (poli-β-hidroksibutirat) je produkt metabolizma, ki lahko služi kot zaloga energije, in nastaja v ''S. fredii'' v veliki meri. Odločili so se da bodo izbrisali gen ''phaC2'', ki kodira ključni encim za sintezo PHB. Delecijo so naredili s homologno rekombinacijo z dvojno zamenjavo. V odsotnosti gena ''phaC2'' naj bi se v celici povečala koncentracija acetil-CoA, ki naj bi služil kot prekursor za sintezo PUFA.

Delecijo so potrdili s PCR na osnovi kolonije. Opazili so da je ''S. fredii'' spremenil fenotip, ko so ga gojili na trdem gojišču. In sicer pri ''∆phaC2'' so kolonije rumene, pri wt pa bele. Testirali so še ali ima ''∆phaC2'' vpliv na sposobnost fiksiranja dušika, ko so mutanto vcepili v rastlino Jidou 17. Inkubacija je potekala 15 dni. Analizirali so nodule, ki so zrasli na rastlini, ki je bila vcepljena z wt in nodule, ki so zrasli na rastlini, ki je bila vcepljena z mutanto ter ugotovili da ni vidne razlike med wt in mutanto. Analizirali so še vsebnost klorofila in suhe teže nadzemeljskih delov rastline in niso našli nobene statistično signifikantne razlike. Torej ''∆phaC2'' ne vpliva na rast rastline.
== Regulacija in sinteza modula ==
Problem pri sintezi PUFA je ta, da mora potekati v anaerobnem okolju, drugače lahko prihaja do oksidacije PUFA. Zato ''S. fredii'' predstavlja idealno okolje za sintezo. Za sintezo PUFA so si izbrali gručo genov iz ''Aetherobacter fasciculatus'', katera je bila že predhodno testirana v ''E. coli'' za sintezo PUFA. Da bi zagotovili učinkovito izražanje genov PUFA, so optimizirali rabo kodonov, ki bi ustrezala ''S. fredii'', in hkrati so gruči genov dodali PPTazo, ki bi omogočala posttranslacijske modifikacije.

Sintetizirali so modul, ki se odziva na različne koncentracije dušika in kisika v okolju. Izbrali so si promotorja '''''glnK''''' in '''''nifH''''', ki sta endogena inducibilna promotorja ''S. fredii''. Promotor ''glnK'' se odziva na nizke koncentracije dušika, promotor ''nifH'' pa se odziva na nizke koncentracije kisika. Regulacijski modul za sintezo PUFA je sestavljen tako, da sta pod promotorjem ''glnK'' zapisa za sgRNA-GFP in tracrRNA, pod promotorjem ''nifH'' pa zapisa za GFP in gruča genov za sintezo PUFA. Na drugi lokaciji na plazmidu je prisoten tudi konstitutivni promotor ''nuoA''. Navzdol od promotorja ''nuoA'' se nahaj zapis za Cas12k. Posebnost Cas12k je da nima katalitske aktivnosti in da inhibira transkripcijo samo s fizično vezavo na tarčno DNA. Ko se v celici nastaja tako Cas12k kot tudi sgRNA za tarčno zaporedje, se ta povežeta in blokirata prepisovanje navzdol od vezave. Ko se v celici zniža koncentacija sgRNA, Cas12k oddisocira in s tem je prepisovanje navzdol spet omogočeno.

Cilj regulacije je da pride do prepisavanja sinteznih genov za PUFA samo ob visokih koncentracijah dušika in nizki koncentraciji kisika. Ob nizki koncentaciji dušika pride do prepisovanja nazdol od promotorja ''glnK'', to sta sgRNA-GFP (njegova tarča je omenjeno zaporedje GFP zavzdol od ''nifH'' promotorja) in tracrRNA. Ta konstrukt se potem poveže s Cas12k. Ta se veže na zapis za GFP in s tem blokira prepisovanje genov za sintezo PUFA. Torej tudi ko je koncentracija kisika nizka in se s tem aktivira promotor ''nifH'' do prepisovanja genov za sintezo PUFA ne pride. Ob visoki koncentraciji kisika in nizki koncentraciji dušika (to predstavlja okolje preden ''S. fredii'' tvori simbiozo z rastlino) do prepisa sinteznih genov PUFA ne pride. Ob visoki koncentaciji dušika in kisika do prepisovanja navzdol od promotorjev ''glnK'' in ''nifH'' ne pride. Ob visoki koncentaciji dušika (ko dodamo gnojilo bogato z dušikom) in nizki koncentraciji kisika pride do prepisovanje genov za sintezo PUFA, saj ne pride do prepisovanja sgRNA-GFP in tracrRNA, tako da Cas12k ne more blokirati prepisovanja genov za sintezo PUFA. Prav tako je koncentracija kisika nizka, zato je nifH promotor sploh aktiven.
== Samomorilski mehanizem razlaga ==
Samomorilski mehanizem za ''S. fredii'' je zasnovan tako, da ko ''S. fredii'' pobegne ven iz modula v okolje s povišno koncentracijo dušika in kisika, naredi samomor. Mehanizem je zasnovan na sistemu toksin-antitoksin (''vapC-vapB'') in promotorjih ''nuoA'', ''nifH'' in ''glnK''. Na enem delu konstrukta ''nuoA'' kontrolira izražanje Cas12k, na drugem pa izražanje ''vapC''. ''nifH'' kontrolira izražanje ''vapB''. ''glnK'' pa kontrolira izražanje sgRNA za gen mCherry in tracrRNA. Različne kombinacije koncentracij dušika in kisika omogočajo preživetje, samo ob povišani koncentraciji dušika in hkrati kisika vodijo v samomor. Pri nizki koncentraciji dušika in kisika, nastaja VapB ter sgRNA-mCherry in tracrRNA. Hkrati se izraža Cas12k, ki se poveže z sgRNA-mCherry in tracrRNA, se veže na gen za mCherry in s tem blokira izražanje ''vapC''. Pri nizki koncentracij dušika in povišani koncentracij kisika, ''vapB'' ne nastaja, izraža se sgRNA-mCherry in tracrRNA ter Cas12k, zato VapC ne nastaja. Pri povišani koncentracij dušika in nizki koncentracij kisika VapB in VapC ne nastajata. Pri povišani koncentracij dušika in povišani koncentracij kisika VapB ne nastaja, nastaja pa VapC, saj Cas12k ne more blokirati transkripcije ''vapC'', saj sgRNA-mCherrz in tracrRNA ne nastajata. Posledično se koncentracija VapB v celici poviša, kar vodi v smrt pobegle celice, to je izven okolja modula.

Eden izmed testov, ki so ga naredili, da bi potrdili uspešnost samomorilskega mehanizma je bil merjenje spremembe OD600 bakterij v suspenziji pri hiperoksičnih pogojih in spremenljivo koncentracijo amonijevega klorida, kot vira dušika. Po desetih urah so opazili padajoč trend v gojiščih z amonijevim kloridom. Padajoč trend je še bolj očiten, ko se poveča koncentracija amonijevega klorida. Zaključili so da je samomorilski mehanizem pod temi testnimi pogoji, reguliran s koncentracijo dušika in da deluje.
== Transport DHA in EPA v sojo ==
Njihov končni cilj je bil tudi transportirati DHA in EPA izven koreninskih nodulov v sojo. Za transport PUFA je bil že pred tem odkrit eksportni sistem, ki bi to omogočal, za gram negativne bakterije. ''S. fredii'' je tudi gram negativna bakterija. Ena študija se je ukvarjala z fiziološkim odzivom gram negativne bakterije ''Acinetobacter baumannii'' na PUFA in odkrili so povečano ekspresijo gena adeJ, ki je komponenta črpalke ''adeIJK'', ki lahko transportira več različnih učinkovin ven iz celice. Ugotovili so da delecija gena ''adeJ'' poveča dovzetnost za PUFA. Podobno vlogo kot ima črpalka ''adeIJK'', ima črpalka ''emhABC'' iz ''Pseudomonas fluorescens'', ki kontrolira homeostazo lipidov, tako da izčrpava dolgo-verižne maščobne kisline. Razultata kažeta na to, da obstajajo v gram negativnih bakterijah določeni transportni proteini, ki bi omogočali transport DHA in EPA iz celice. Torej če bi povečali njihovo izražanje, bi lahko transportirali tudi DHA in EPA v sojo.
== Viri in literatura ==
[1] CAU-China: N. Factory https://2024.igem.wiki/cau-china/ (pridobljeno 13. 4. 2025)

CAU-China: Nodulska tovarna DHA in EPA

2025-04-15T09:42:07Z

Luka Fink: /* UVOD */

[https://2024.igem.wiki/cau-china/ N. Factory (Nodulska tovarna DHA in EPA)] je iGEM projekt skupine CAU-China iz Kitajske iz leta 2024.
== UVOD ==
Človeštvo že dolgo časa poizkuša izboljšati hranilno vrednost hrane na raznorazne načine, da bi se spopadli s problemi kot so podhranjenost v nerazvitih državah in omejenost določenih virov hrane. Cilj te skupine je bil proizvajati DHA in EPA v nodulih z genetsko spremenjenimi simbiontskimi bakterijami, z namenom povečati hranilno vrednost gojenih rastlin, še posebej soje.

Noduli so majhne kroglaste tvorbe, ki se razvijejo na rastlinskih koreninah ali steblih. V nodulih živijo simbiontske bakterije, ki iz zraka vežejo dušik. Različne rastline razvijejo simbiozo z različnimi bakterijami. Rastilne iz družine metuljnic (soja, fižol, grah, leča) živijo v simbiozi z bakterijami iz rodu ''Rhizobium''.

Potencilna vcepitev ''Rhizobium'' kot mikrobnega gnolija, prinaša še druge prednosti poleg proizvodnje DHA in EPA in to je obogatitev zemlje z dušikovimi spojinami, ki jih rastline lahko uporaljajo. Dolgoročna uporaba kemičnih gnojil, lahko privede do nabiranja določenih kemikalij v zemlji, kar vodi v zmanjšanje število koristnih bakterij. Namesto kemičnih gnojil, bi lahko uporabljali mikrobna gnolija, ki vsebujejo ''Rhizobium'', in bi tako izboljšali kakovost zemlje in zmanjšali negativne učinke kemičnih gnojil.

== Izvedba projekta ==
Izbrali so si bakterijo ''Sinorhizobium fredii'' CCBAU45436. V njej so vzpostavili niz regulacijskih modulov, ki se odzivajo na spremembne v koncentraciji dušika in kisika. Hkrati so izbrali gene, ki kodirajo za PUFA sintazo, ki bi proizvajala željena produkta DHA in EPA ter hkrati bi nastajali še ostali stranski produkti). Za izboljšanje učinkovitosti so reprogramirali metabolizem z uravnavanjem izražanja določenih genov. Zasnovali so samomorilski mehanizem, če ''S. fredii'' pobegne. Regulacijski moduli so odgovorni za kontrolo izražanja genov za sintezo PUFA (poly-unsaturated fatty acid) in kontrolo samomorilskega mehanizma.
== Delecija PHB ==
PHB (poli-β-hidroksibutirat) je produkt metabolizma, ki lahko služi kot zaloga energije, in nastaja v ''S. fredii'' v veliki meri. Odločili so se da bodo izbrisali gen ''phaC2'', ki kodira ključni encim za sintezo PHB. Delecijo so naredili s homologno rekombinacijo z dvojno zamenjavo. V odsotnosti gena ''phaC2'' naj bi se v celici povečala koncentracija acetil-CoA, ki naj bi služil kot prekursor za sintezo PUFA.

Delecijo so potrdili s PCR na osnovi kolonije. Opazili so da je ''S. fredii'' spremenil fenotip, ko so ga gojili na trdem gojišču. In sicer pri ''∆phaC2'' so kolonije rumene, pri wt pa bele. Testirali so še ali ima ''∆phaC2'' vpliv na sposobnost fiksiranja dušika, ko so mutanto vcepili v rastlino Jidou 17. Inkubacija je potekala 15 dni. Analizirali so nodule, ki so zrasli na rastlini, ki je bila vcepljena z wt in nodule, ki so zrasli na rastlini, ki je bila vcepljena z mutanto ter ugotovili da ni vidne razlike med wt in mutanto. Analizirali so še vsebnost klorofila in suhe teže nadzemeljskih delov rastline in niso našli nobene statistično signifikantne razlike. Torej ''∆phaC2'' ne vpliva na rast rastline.
== Regulacija in sinteza modula ==
Problem pri sintezi PUFA je ta, da mora potekati v anaerobnem okolju, drugače lahko prihaja do oksidacije PUFA. Zato ''S. fredii'' predstavlja idealno okolje za sintezo. Za sintezo PUFA so si izbrali gručo genov iz ''Aetherobacter fasciculatus'', katera je bila že predhodno testirana v ''E. coli'' za sintezo PUFA. Da bi zagotovili učinkovito izražanje genov PUFA, so optimizirali rabo kodonov, ki bi ustrezala ''S. fredii'', in hkrati so gruči genov dodali PPTazo, ki bi omogočala posttranslacijske modifikacije.

Sintetizirali so modul, ki se odziva na različne koncentracije dušika in kisika v okolju. Izbrali so si promotorja '''''glnK''''' in '''''nifH''''', ki sta endogena inducibilna promotorja ''S. fredii''. Promotor ''glnK'' se odziva na nizke koncentracije dušika, promotor ''nifH'' pa se odziva na nizke koncentracije kisika. Regulacijski modul za sintezo PUFA je sestavljen tako, da sta pod promotorjem ''glnK'' zapisa za sgRNA-GFP in tracrRNA, pod promotorjem ''nifH'' pa zapisa za GFP in gruča genov za sintezo PUFA. Na drugi lokaciji na plazmidu je prisoten tudi konstitutivni promotor ''nuoA''. Navzdol od promotorja ''nuoA'' se nahaj zapis za Cas12k. Posebnost Cas12k je da nima katalitske aktivnosti in da inhibira transkripcijo samo s fizično vezavo na tarčno DNA. Ko se v celici nastaja tako Cas12k kot tudi sgRNA za tarčno zaporedje, se ta povežeta in blokirata prepisovanje navzdol od vezave. Ko se v celici zniža koncentacija sgRNA, Cas12k oddisocira in s tem je prepisovanje navzdol spet omogočeno.

Cilj regulacije je da pride do prepisavanja sinteznih genov za PUFA samo ob visokih koncentracijah dušika in nizki koncentraciji kisika. Ob nizki koncentaciji dušika pride do prepisovanja nazdol od promotorja ''glnK'', to sta sgRNA-GFP (njegova tarča je omenjeno zaporedje GFP zavzdol od ''nifH'' promotorja) in tracrRNA. Ta konstrukt se potem poveže s Cas12k. Ta se veže na zapis za GFP in s tem blokira prepisovanje genov za sintezo PUFA. Torej tudi ko je koncentracija kisika nizka in se s tem aktivira promotor ''nifH'' do prepisovanja genov za sintezo PUFA ne pride. Ob visoki koncentraciji kisika in nizki koncentraciji dušika (to predstavlja okolje preden ''S. fredii'' tvori simbiozo z rastlino) do prepisa sinteznih genov PUFA ne pride. Ob visoki koncentaciji dušika in kisika do prepisovanja navzdol od promotorjev ''glnK'' in ''nifH'' ne pride. Ob visoki koncentaciji dušika (ko dodamo gnojilo bogato z dušikom) in nizki koncentraciji kisika pride do prepisovanje genov za sintezo PUFA, saj ne pride do prepisovanja sgRNA-GFP in tracrRNA, tako da Cas12k ne more blokirati prepisovanja genov za sintezo PUFA. Prav tako je koncentracija kisika nizka, zato je nifH promotor sploh aktiven.
== Samomorilski mehanizem razlaga ==
Samomorilski mehanizem za ''S. fredii'' je zasnovan tako, da ko ''S. fredii'' pobegne ven iz modula v okolje s povišno koncentracijo dušika in kisika, naredi samomor. Mehanizem je zasnovan na sistemu toksin-antitoksin (''vapC-vapB'') in promotorjih ''nuoA'', ''nifH'' in ''glnK''. Na enem delu konstrukta ''nuoA'' kontrolira izražanje Cas12k, na drugem pa izražanje ''vapC''. ''nifH'' kontrolira izražanje ''vapB''. ''glnK'' pa kontrolira izražanje sgRNA za gen mCherry in tracrRNA. Različne kombinacije koncentracij dušika in kisika omogočajo preživetje, samo ob povišani koncentraciji dušika in hkrati kisika vodijo v samomor. Pri nizki koncentraciji dušika in kisika, nastaja VapB ter sgRNA-mCherry in tracrRNA. Hkrati se izraža Cas12k, ki se poveže z sgRNA-mCherry in tracrRNA, se veže na gen za mCherry in s tem blokira izražanje ''vapC''. Pri nizki koncentracij dušika in povišani koncentracij kisika, ''vapB'' ne nastaja, izraža se sgRNA-mCherry in tracrRNA ter Cas12k, zato VapC ne nastaja. Pri povišani koncentracij dušika in nizki koncentracij kisika VapB in VapC ne nastajata. Pri povišani koncentracij dušika in povišani koncentracij kisika VapB ne nastaja, nastaja pa VapC, saj Cas12k ne more blokirati transkripcije ''vapC'', saj sgRNA-mCherrz in tracrRNA ne nastajata. Posledično se koncentracija VapB v celici poviša, kar vodi v smrt pobegle celice, to je izven okolja modula.

Eden izmed testov, ki so ga naredili, da bi potrdili uspešnost samomorilskega mehanizma je bil merjenje spremembe OD600 bakterij v suspenziji pri hiperoksičnih pogojih in spremenljivo koncentracijo amonijevega klorida, kot vira dušika. Po desetih urah so opazili padajoč trend v gojiščih z amonijevim kloridom. Padajoč trend je še bolj očiten, ko se poveča koncentracija amonijevega klorida. Zaključili so da je samomorilski mehanizem pod temi testnimi pogoji, reguliran s koncentracijo dušika in da deluje.
== Transport DHA in EPA v sojo ==
Njihov končni cilj je bil tudi transportirati DHA in EPA izven koreninskih nodulov v sojo. Za transport PUFA je bil že pred tem odkrit eksportni sistem, ki bi to omogočal, za gram negativne bakterije. ''S. fredii'' je tudi gram negativna bakterija. Ena študija se je ukvarjala z fiziološkim odzivom gram negativne bakterije ''Acinetobacter baumannii'' na PUFA in odkrili so povečano ekspresijo gena adeJ, ki je komponenta črpalke ''adeIJK'', ki lahko transportira več različnih učinkovin ven iz celice. Ugotovili so da delecija gena ''adeJ'' poveča dovzetnost za PUFA. Podobno vlogo kot ima črpalka ''adeIJK'', ima črpalka ''emhABC'' iz ''Pseudomonas fluorescens'', ki kontrolira homeostazo lipidov, tako da izčrpava dolgo-verižne maščobne kisline. Razultata kažeta na to, da obstajajo v gram negativnih bakterijah določeni transportni proteini, ki bi omogočali transport DHA in EPA iz celice. Torej če bi povečali njihovo izražanje, bi lahko transportirali tudi DHA in EPA v sojo.
== Viri in literatura ==
[1] CAU-China: N. Factory https://2024.igem.wiki/cau-china/ (pridobljeno 13. 4. 2025)

CAU-China: Nodulska tovarna DHA in EPA

2025-04-15T09:41:30Z

Luka Fink: /* UVOD */

[https://2024.igem.wiki/cau-china/ N. Factory (Nodulska tovarna DHA in EPA)] je iGEM projekt skupine CAU-China iz Kitajske iz leta 2024.
== UVOD ==
Človeštvo že dolgo časa poizkuša izboljšati hranilno vrednost hrane na raznorazne načine, da bi se spopadli s problemi kot so podhranjenost v nerazvitih državah in omejenost določenih virov hrane. Cilj te skupine je bil proizvajati DHA in EPA v nodulih z genetsko spremenjenimi simbiontskimi bakterijami, z namenom povečati hranilno vrednost gojenih rastlin, še posebej soje.

Noduli so majhne kroglaste tvorbe, ki se razvijejo na rastlinskih koreninah ali steblih. V nodulih živijo simbionstske bakterije, ki iz zraka vežejo dušik. Različne rastline razvijejo simbiozo z različnimi bakterijami. Rastilne iz družine metuljnic (soja, fižol, grah, leča) živijo v simbiozi z bakterijami iz rodu ''Rhizobium''.

Potencilna vcepitev ''Rhizobium'' kot mikrobnega gnolija, prinaša še druge prednosti poleg proizvodnje DHA in EPA in to je obogatitev zemlje z dušikovimi spojinami, ki jih rastline lahko uporaljajo. Dolgoročna uporaba kemičnih gnojil, lahko privede do nabiranja določenih kemikalij v zemlji, kar vodi v zmanjšanje število koristnih bakterij. Namesto kemičnih gnojil, bi lahko uporabljali mikrobna gnolija, ki vsebujejo ''Rhizobium'', in bi tako izboljšali kakovost zemlje in zmanjšali negativne učinke kemičnih gnojil.

== Izvedba projekta ==
Izbrali so si bakterijo ''Sinorhizobium fredii'' CCBAU45436. V njej so vzpostavili niz regulacijskih modulov, ki se odzivajo na spremembne v koncentraciji dušika in kisika. Hkrati so izbrali gene, ki kodirajo za PUFA sintazo, ki bi proizvajala željena produkta DHA in EPA ter hkrati bi nastajali še ostali stranski produkti). Za izboljšanje učinkovitosti so reprogramirali metabolizem z uravnavanjem izražanja določenih genov. Zasnovali so samomorilski mehanizem, če ''S. fredii'' pobegne. Regulacijski moduli so odgovorni za kontrolo izražanja genov za sintezo PUFA (poly-unsaturated fatty acid) in kontrolo samomorilskega mehanizma.
== Delecija PHB ==
PHB (poli-β-hidroksibutirat) je produkt metabolizma, ki lahko služi kot zaloga energije, in nastaja v ''S. fredii'' v veliki meri. Odločili so se da bodo izbrisali gen ''phaC2'', ki kodira ključni encim za sintezo PHB. Delecijo so naredili s homologno rekombinacijo z dvojno zamenjavo. V odsotnosti gena ''phaC2'' naj bi se v celici povečala koncentracija acetil-CoA, ki naj bi služil kot prekursor za sintezo PUFA.

Delecijo so potrdili s PCR na osnovi kolonije. Opazili so da je ''S. fredii'' spremenil fenotip, ko so ga gojili na trdem gojišču. In sicer pri ''∆phaC2'' so kolonije rumene, pri wt pa bele. Testirali so še ali ima ''∆phaC2'' vpliv na sposobnost fiksiranja dušika, ko so mutanto vcepili v rastlino Jidou 17. Inkubacija je potekala 15 dni. Analizirali so nodule, ki so zrasli na rastlini, ki je bila vcepljena z wt in nodule, ki so zrasli na rastlini, ki je bila vcepljena z mutanto ter ugotovili da ni vidne razlike med wt in mutanto. Analizirali so še vsebnost klorofila in suhe teže nadzemeljskih delov rastline in niso našli nobene statistično signifikantne razlike. Torej ''∆phaC2'' ne vpliva na rast rastline.
== Regulacija in sinteza modula ==
Problem pri sintezi PUFA je ta, da mora potekati v anaerobnem okolju, drugače lahko prihaja do oksidacije PUFA. Zato ''S. fredii'' predstavlja idealno okolje za sintezo. Za sintezo PUFA so si izbrali gručo genov iz ''Aetherobacter fasciculatus'', katera je bila že predhodno testirana v ''E. coli'' za sintezo PUFA. Da bi zagotovili učinkovito izražanje genov PUFA, so optimizirali rabo kodonov, ki bi ustrezala ''S. fredii'', in hkrati so gruči genov dodali PPTazo, ki bi omogočala posttranslacijske modifikacije.

Sintetizirali so modul, ki se odziva na različne koncentracije dušika in kisika v okolju. Izbrali so si promotorja '''''glnK''''' in '''''nifH''''', ki sta endogena inducibilna promotorja ''S. fredii''. Promotor ''glnK'' se odziva na nizke koncentracije dušika, promotor ''nifH'' pa se odziva na nizke koncentracije kisika. Regulacijski modul za sintezo PUFA je sestavljen tako, da sta pod promotorjem ''glnK'' zapisa za sgRNA-GFP in tracrRNA, pod promotorjem ''nifH'' pa zapisa za GFP in gruča genov za sintezo PUFA. Na drugi lokaciji na plazmidu je prisoten tudi konstitutivni promotor ''nuoA''. Navzdol od promotorja ''nuoA'' se nahaj zapis za Cas12k. Posebnost Cas12k je da nima katalitske aktivnosti in da inhibira transkripcijo samo s fizično vezavo na tarčno DNA. Ko se v celici nastaja tako Cas12k kot tudi sgRNA za tarčno zaporedje, se ta povežeta in blokirata prepisovanje navzdol od vezave. Ko se v celici zniža koncentacija sgRNA, Cas12k oddisocira in s tem je prepisovanje navzdol spet omogočeno.

Cilj regulacije je da pride do prepisavanja sinteznih genov za PUFA samo ob visokih koncentracijah dušika in nizki koncentraciji kisika. Ob nizki koncentaciji dušika pride do prepisovanja nazdol od promotorja ''glnK'', to sta sgRNA-GFP (njegova tarča je omenjeno zaporedje GFP zavzdol od ''nifH'' promotorja) in tracrRNA. Ta konstrukt se potem poveže s Cas12k. Ta se veže na zapis za GFP in s tem blokira prepisovanje genov za sintezo PUFA. Torej tudi ko je koncentracija kisika nizka in se s tem aktivira promotor ''nifH'' do prepisovanja genov za sintezo PUFA ne pride. Ob visoki koncentraciji kisika in nizki koncentraciji dušika (to predstavlja okolje preden ''S. fredii'' tvori simbiozo z rastlino) do prepisa sinteznih genov PUFA ne pride. Ob visoki koncentaciji dušika in kisika do prepisovanja navzdol od promotorjev ''glnK'' in ''nifH'' ne pride. Ob visoki koncentaciji dušika (ko dodamo gnojilo bogato z dušikom) in nizki koncentraciji kisika pride do prepisovanje genov za sintezo PUFA, saj ne pride do prepisovanja sgRNA-GFP in tracrRNA, tako da Cas12k ne more blokirati prepisovanja genov za sintezo PUFA. Prav tako je koncentracija kisika nizka, zato je nifH promotor sploh aktiven.
== Samomorilski mehanizem razlaga ==
Samomorilski mehanizem za ''S. fredii'' je zasnovan tako, da ko ''S. fredii'' pobegne ven iz modula v okolje s povišno koncentracijo dušika in kisika, naredi samomor. Mehanizem je zasnovan na sistemu toksin-antitoksin (''vapC-vapB'') in promotorjih ''nuoA'', ''nifH'' in ''glnK''. Na enem delu konstrukta ''nuoA'' kontrolira izražanje Cas12k, na drugem pa izražanje ''vapC''. ''nifH'' kontrolira izražanje ''vapB''. ''glnK'' pa kontrolira izražanje sgRNA za gen mCherry in tracrRNA. Različne kombinacije koncentracij dušika in kisika omogočajo preživetje, samo ob povišani koncentraciji dušika in hkrati kisika vodijo v samomor. Pri nizki koncentraciji dušika in kisika, nastaja VapB ter sgRNA-mCherry in tracrRNA. Hkrati se izraža Cas12k, ki se poveže z sgRNA-mCherry in tracrRNA, se veže na gen za mCherry in s tem blokira izražanje ''vapC''. Pri nizki koncentracij dušika in povišani koncentracij kisika, ''vapB'' ne nastaja, izraža se sgRNA-mCherry in tracrRNA ter Cas12k, zato VapC ne nastaja. Pri povišani koncentracij dušika in nizki koncentracij kisika VapB in VapC ne nastajata. Pri povišani koncentracij dušika in povišani koncentracij kisika VapB ne nastaja, nastaja pa VapC, saj Cas12k ne more blokirati transkripcije ''vapC'', saj sgRNA-mCherrz in tracrRNA ne nastajata. Posledično se koncentracija VapB v celici poviša, kar vodi v smrt pobegle celice, to je izven okolja modula.

Eden izmed testov, ki so ga naredili, da bi potrdili uspešnost samomorilskega mehanizma je bil merjenje spremembe OD600 bakterij v suspenziji pri hiperoksičnih pogojih in spremenljivo koncentracijo amonijevega klorida, kot vira dušika. Po desetih urah so opazili padajoč trend v gojiščih z amonijevim kloridom. Padajoč trend je še bolj očiten, ko se poveča koncentracija amonijevega klorida. Zaključili so da je samomorilski mehanizem pod temi testnimi pogoji, reguliran s koncentracijo dušika in da deluje.
== Transport DHA in EPA v sojo ==
Njihov končni cilj je bil tudi transportirati DHA in EPA izven koreninskih nodulov v sojo. Za transport PUFA je bil že pred tem odkrit eksportni sistem, ki bi to omogočal, za gram negativne bakterije. ''S. fredii'' je tudi gram negativna bakterija. Ena študija se je ukvarjala z fiziološkim odzivom gram negativne bakterije ''Acinetobacter baumannii'' na PUFA in odkrili so povečano ekspresijo gena adeJ, ki je komponenta črpalke ''adeIJK'', ki lahko transportira več različnih učinkovin ven iz celice. Ugotovili so da delecija gena ''adeJ'' poveča dovzetnost za PUFA. Podobno vlogo kot ima črpalka ''adeIJK'', ima črpalka ''emhABC'' iz ''Pseudomonas fluorescens'', ki kontrolira homeostazo lipidov, tako da izčrpava dolgo-verižne maščobne kisline. Razultata kažeta na to, da obstajajo v gram negativnih bakterijah določeni transportni proteini, ki bi omogočali transport DHA in EPA iz celice. Torej če bi povečali njihovo izražanje, bi lahko transportirali tudi DHA in EPA v sojo.
== Viri in literatura ==
[1] CAU-China: N. Factory https://2024.igem.wiki/cau-china/ (pridobljeno 13. 4. 2025)

CAU-China: Nodulska tovarna DHA in EPA

2025-04-15T09:40:47Z

Luka Fink: /* UVOD */

[https://2024.igem.wiki/cau-china/ N. Factory (Nodulska tovarna DHA in EPA)] je iGEM projekt skupine CAU-China iz Kitajske iz leta 2024.
== UVOD ==
Človeštvo že dolgo časa poizkuša izboljšati hranilno vrednost hrane na raznorazne načine, da bi se spopadli s problemi kot so podhranjenost v nerazvitih državah in omejenost določenih virov hrane. Cilj te skupine je bil proizvajati DHA in EPA v nodulih z genetsko spremenjenimi simbiontskimi bakterijami, z namenom povečati hranilno vrednost gojenih rastlin, še posebaj soje.

Noduli so majhne kroglaste tvorbe, ki se razvijejo na rastlinskih koreninah ali steblih. V nodulih živijo simbionstske bakterije, ki iz zraka vežejo dušik. Različne rastline razvijejo simbiozo z različnimi bakterijami. Rastilne iz družine metuljnic (soja, fižol, grah, leča) živijo v simbiozi z bakterijami iz rodu ''Rhizobium''.

Potencilna vcepitev ''Rhizobium'' kot mikrobnega gnolija, prinaša še druge prednosti poleg proizvodnje DHA in EPA in to je obogatitev zemlje z dušikovimi spojinami, ki jih rastline lahko uporaljajo. Dolgoročna uporaba kemičnih gnojil, lahko privede do nabiranja določenih kemikalij v zemlji, kar vodi v zmanjšanje število koristnih bakterij. Namesto kemičnih gnojil, bi lahko uporabljali mikrobna gnolija, ki vsebujejo ''Rhizobium'', in bi tako izboljšali kakovost zemlje in zmanjšali negativne učinke kemičnih gnojil.

== Izvedba projekta ==
Izbrali so si bakterijo ''Sinorhizobium fredii'' CCBAU45436. V njej so vzpostavili niz regulacijskih modulov, ki se odzivajo na spremembne v koncentraciji dušika in kisika. Hkrati so izbrali gene, ki kodirajo za PUFA sintazo, ki bi proizvajala željena produkta DHA in EPA ter hkrati bi nastajali še ostali stranski produkti). Za izboljšanje učinkovitosti so reprogramirali metabolizem z uravnavanjem izražanja določenih genov. Zasnovali so samomorilski mehanizem, če ''S. fredii'' pobegne. Regulacijski moduli so odgovorni za kontrolo izražanja genov za sintezo PUFA (poly-unsaturated fatty acid) in kontrolo samomorilskega mehanizma.
== Delecija PHB ==
PHB (poli-β-hidroksibutirat) je produkt metabolizma, ki lahko služi kot zaloga energije, in nastaja v ''S. fredii'' v veliki meri. Odločili so se da bodo izbrisali gen ''phaC2'', ki kodira ključni encim za sintezo PHB. Delecijo so naredili s homologno rekombinacijo z dvojno zamenjavo. V odsotnosti gena ''phaC2'' naj bi se v celici povečala koncentracija acetil-CoA, ki naj bi služil kot prekursor za sintezo PUFA.

Delecijo so potrdili s PCR na osnovi kolonije. Opazili so da je ''S. fredii'' spremenil fenotip, ko so ga gojili na trdem gojišču. In sicer pri ''∆phaC2'' so kolonije rumene, pri wt pa bele. Testirali so še ali ima ''∆phaC2'' vpliv na sposobnost fiksiranja dušika, ko so mutanto vcepili v rastlino Jidou 17. Inkubacija je potekala 15 dni. Analizirali so nodule, ki so zrasli na rastlini, ki je bila vcepljena z wt in nodule, ki so zrasli na rastlini, ki je bila vcepljena z mutanto ter ugotovili da ni vidne razlike med wt in mutanto. Analizirali so še vsebnost klorofila in suhe teže nadzemeljskih delov rastline in niso našli nobene statistično signifikantne razlike. Torej ''∆phaC2'' ne vpliva na rast rastline.
== Regulacija in sinteza modula ==
Problem pri sintezi PUFA je ta, da mora potekati v anaerobnem okolju, drugače lahko prihaja do oksidacije PUFA. Zato ''S. fredii'' predstavlja idealno okolje za sintezo. Za sintezo PUFA so si izbrali gručo genov iz ''Aetherobacter fasciculatus'', katera je bila že predhodno testirana v ''E. coli'' za sintezo PUFA. Da bi zagotovili učinkovito izražanje genov PUFA, so optimizirali rabo kodonov, ki bi ustrezala ''S. fredii'', in hkrati so gruči genov dodali PPTazo, ki bi omogočala posttranslacijske modifikacije.

Sintetizirali so modul, ki se odziva na različne koncentracije dušika in kisika v okolju. Izbrali so si promotorja '''''glnK''''' in '''''nifH''''', ki sta endogena inducibilna promotorja ''S. fredii''. Promotor ''glnK'' se odziva na nizke koncentracije dušika, promotor ''nifH'' pa se odziva na nizke koncentracije kisika. Regulacijski modul za sintezo PUFA je sestavljen tako, da sta pod promotorjem ''glnK'' zapisa za sgRNA-GFP in tracrRNA, pod promotorjem ''nifH'' pa zapisa za GFP in gruča genov za sintezo PUFA. Na drugi lokaciji na plazmidu je prisoten tudi konstitutivni promotor ''nuoA''. Navzdol od promotorja ''nuoA'' se nahaj zapis za Cas12k. Posebnost Cas12k je da nima katalitske aktivnosti in da inhibira transkripcijo samo s fizično vezavo na tarčno DNA. Ko se v celici nastaja tako Cas12k kot tudi sgRNA za tarčno zaporedje, se ta povežeta in blokirata prepisovanje navzdol od vezave. Ko se v celici zniža koncentacija sgRNA, Cas12k oddisocira in s tem je prepisovanje navzdol spet omogočeno.

Cilj regulacije je da pride do prepisavanja sinteznih genov za PUFA samo ob visokih koncentracijah dušika in nizki koncentraciji kisika. Ob nizki koncentaciji dušika pride do prepisovanja nazdol od promotorja ''glnK'', to sta sgRNA-GFP (njegova tarča je omenjeno zaporedje GFP zavzdol od ''nifH'' promotorja) in tracrRNA. Ta konstrukt se potem poveže s Cas12k. Ta se veže na zapis za GFP in s tem blokira prepisovanje genov za sintezo PUFA. Torej tudi ko je koncentracija kisika nizka in se s tem aktivira promotor ''nifH'' do prepisovanja genov za sintezo PUFA ne pride. Ob visoki koncentraciji kisika in nizki koncentraciji dušika (to predstavlja okolje preden ''S. fredii'' tvori simbiozo z rastlino) do prepisa sinteznih genov PUFA ne pride. Ob visoki koncentaciji dušika in kisika do prepisovanja navzdol od promotorjev ''glnK'' in ''nifH'' ne pride. Ob visoki koncentaciji dušika (ko dodamo gnojilo bogato z dušikom) in nizki koncentraciji kisika pride do prepisovanje genov za sintezo PUFA, saj ne pride do prepisovanja sgRNA-GFP in tracrRNA, tako da Cas12k ne more blokirati prepisovanja genov za sintezo PUFA. Prav tako je koncentracija kisika nizka, zato je nifH promotor sploh aktiven.
== Samomorilski mehanizem razlaga ==
Samomorilski mehanizem za ''S. fredii'' je zasnovan tako, da ko ''S. fredii'' pobegne ven iz modula v okolje s povišno koncentracijo dušika in kisika, naredi samomor. Mehanizem je zasnovan na sistemu toksin-antitoksin (''vapC-vapB'') in promotorjih ''nuoA'', ''nifH'' in ''glnK''. Na enem delu konstrukta ''nuoA'' kontrolira izražanje Cas12k, na drugem pa izražanje ''vapC''. ''nifH'' kontrolira izražanje ''vapB''. ''glnK'' pa kontrolira izražanje sgRNA za gen mCherry in tracrRNA. Različne kombinacije koncentracij dušika in kisika omogočajo preživetje, samo ob povišani koncentraciji dušika in hkrati kisika vodijo v samomor. Pri nizki koncentraciji dušika in kisika, nastaja VapB ter sgRNA-mCherry in tracrRNA. Hkrati se izraža Cas12k, ki se poveže z sgRNA-mCherry in tracrRNA, se veže na gen za mCherry in s tem blokira izražanje ''vapC''. Pri nizki koncentracij dušika in povišani koncentracij kisika, ''vapB'' ne nastaja, izraža se sgRNA-mCherry in tracrRNA ter Cas12k, zato VapC ne nastaja. Pri povišani koncentracij dušika in nizki koncentracij kisika VapB in VapC ne nastajata. Pri povišani koncentracij dušika in povišani koncentracij kisika VapB ne nastaja, nastaja pa VapC, saj Cas12k ne more blokirati transkripcije ''vapC'', saj sgRNA-mCherrz in tracrRNA ne nastajata. Posledično se koncentracija VapB v celici poviša, kar vodi v smrt pobegle celice, to je izven okolja modula.

Eden izmed testov, ki so ga naredili, da bi potrdili uspešnost samomorilskega mehanizma je bil merjenje spremembe OD600 bakterij v suspenziji pri hiperoksičnih pogojih in spremenljivo koncentracijo amonijevega klorida, kot vira dušika. Po desetih urah so opazili padajoč trend v gojiščih z amonijevim kloridom. Padajoč trend je še bolj očiten, ko se poveča koncentracija amonijevega klorida. Zaključili so da je samomorilski mehanizem pod temi testnimi pogoji, reguliran s koncentracijo dušika in da deluje.
== Transport DHA in EPA v sojo ==
Njihov končni cilj je bil tudi transportirati DHA in EPA izven koreninskih nodulov v sojo. Za transport PUFA je bil že pred tem odkrit eksportni sistem, ki bi to omogočal, za gram negativne bakterije. ''S. fredii'' je tudi gram negativna bakterija. Ena študija se je ukvarjala z fiziološkim odzivom gram negativne bakterije ''Acinetobacter baumannii'' na PUFA in odkrili so povečano ekspresijo gena adeJ, ki je komponenta črpalke ''adeIJK'', ki lahko transportira več različnih učinkovin ven iz celice. Ugotovili so da delecija gena ''adeJ'' poveča dovzetnost za PUFA. Podobno vlogo kot ima črpalka ''adeIJK'', ima črpalka ''emhABC'' iz ''Pseudomonas fluorescens'', ki kontrolira homeostazo lipidov, tako da izčrpava dolgo-verižne maščobne kisline. Razultata kažeta na to, da obstajajo v gram negativnih bakterijah določeni transportni proteini, ki bi omogočali transport DHA in EPA iz celice. Torej če bi povečali njihovo izražanje, bi lahko transportirali tudi DHA in EPA v sojo.
== Viri in literatura ==
[1] CAU-China: N. Factory https://2024.igem.wiki/cau-china/ (pridobljeno 13. 4. 2025)

CAU-China: Nodulska tovarna DHA in EPA

2025-04-15T09:40:23Z

Luka Fink:

[https://2024.igem.wiki/cau-china/ N. Factory (Nodulska tovarna DHA in EPA)] je iGEM projekt skupine CAU-China iz Kitajske iz leta 2024.
== UVOD ==
Človeštvo že dolgo časa poizkuša izboljšati hranilno vrednost hrane na razno razne načine, da bi se spopadli s problemi kot so podhranjenost v nerazvitih državah in omejenost določenih virov hrane. Cilj te skupine je bil proizvajati DHA in EPA v nodulih z genetsko spremenjenimi simbiontskimi bakterijami, z namenom povečati hranilno vrednost gojenih rastlin, še posebaj soje.

Noduli so majhne kroglaste tvorbe, ki se razvijejo na rastlinskih koreninah ali steblih. V nodulih živijo simbionstske bakterije, ki iz zraka vežejo dušik. Različne rastline razvijejo simbiozo z različnimi bakterijami. Rastilne iz družine metuljnic (soja, fižol, grah, leča) živijo v simbiozi z bakterijami iz rodu ''Rhizobium''.

Potencilna vcepitev ''Rhizobium'' kot mikrobnega gnolija, prinaša še druge prednosti poleg proizvodnje DHA in EPA in to je obogatitev zemlje z dušikovimi spojinami, ki jih rastline lahko uporaljajo. Dolgoročna uporaba kemičnih gnojil, lahko privede do nabiranja določenih kemikalij v zemlji, kar vodi v zmanjšanje število koristnih bakterij. Namesto kemičnih gnojil, bi lahko uporabljali mikrobna gnolija, ki vsebujejo ''Rhizobium'', in bi tako izboljšali kakovost zemlje in zmanjšali negativne učinke kemičnih gnojil.
== Izvedba projekta ==
Izbrali so si bakterijo ''Sinorhizobium fredii'' CCBAU45436. V njej so vzpostavili niz regulacijskih modulov, ki se odzivajo na spremembne v koncentraciji dušika in kisika. Hkrati so izbrali gene, ki kodirajo za PUFA sintazo, ki bi proizvajala željena produkta DHA in EPA ter hkrati bi nastajali še ostali stranski produkti). Za izboljšanje učinkovitosti so reprogramirali metabolizem z uravnavanjem izražanja določenih genov. Zasnovali so samomorilski mehanizem, če ''S. fredii'' pobegne. Regulacijski moduli so odgovorni za kontrolo izražanja genov za sintezo PUFA (poly-unsaturated fatty acid) in kontrolo samomorilskega mehanizma.
== Delecija PHB ==
PHB (poli-β-hidroksibutirat) je produkt metabolizma, ki lahko služi kot zaloga energije, in nastaja v ''S. fredii'' v veliki meri. Odločili so se da bodo izbrisali gen ''phaC2'', ki kodira ključni encim za sintezo PHB. Delecijo so naredili s homologno rekombinacijo z dvojno zamenjavo. V odsotnosti gena ''phaC2'' naj bi se v celici povečala koncentracija acetil-CoA, ki naj bi služil kot prekursor za sintezo PUFA.

Delecijo so potrdili s PCR na osnovi kolonije. Opazili so da je ''S. fredii'' spremenil fenotip, ko so ga gojili na trdem gojišču. In sicer pri ''∆phaC2'' so kolonije rumene, pri wt pa bele. Testirali so še ali ima ''∆phaC2'' vpliv na sposobnost fiksiranja dušika, ko so mutanto vcepili v rastlino Jidou 17. Inkubacija je potekala 15 dni. Analizirali so nodule, ki so zrasli na rastlini, ki je bila vcepljena z wt in nodule, ki so zrasli na rastlini, ki je bila vcepljena z mutanto ter ugotovili da ni vidne razlike med wt in mutanto. Analizirali so še vsebnost klorofila in suhe teže nadzemeljskih delov rastline in niso našli nobene statistično signifikantne razlike. Torej ''∆phaC2'' ne vpliva na rast rastline.
== Regulacija in sinteza modula ==
Problem pri sintezi PUFA je ta, da mora potekati v anaerobnem okolju, drugače lahko prihaja do oksidacije PUFA. Zato ''S. fredii'' predstavlja idealno okolje za sintezo. Za sintezo PUFA so si izbrali gručo genov iz ''Aetherobacter fasciculatus'', katera je bila že predhodno testirana v ''E. coli'' za sintezo PUFA. Da bi zagotovili učinkovito izražanje genov PUFA, so optimizirali rabo kodonov, ki bi ustrezala ''S. fredii'', in hkrati so gruči genov dodali PPTazo, ki bi omogočala posttranslacijske modifikacije.

Sintetizirali so modul, ki se odziva na različne koncentracije dušika in kisika v okolju. Izbrali so si promotorja '''''glnK''''' in '''''nifH''''', ki sta endogena inducibilna promotorja ''S. fredii''. Promotor ''glnK'' se odziva na nizke koncentracije dušika, promotor ''nifH'' pa se odziva na nizke koncentracije kisika. Regulacijski modul za sintezo PUFA je sestavljen tako, da sta pod promotorjem ''glnK'' zapisa za sgRNA-GFP in tracrRNA, pod promotorjem ''nifH'' pa zapisa za GFP in gruča genov za sintezo PUFA. Na drugi lokaciji na plazmidu je prisoten tudi konstitutivni promotor ''nuoA''. Navzdol od promotorja ''nuoA'' se nahaj zapis za Cas12k. Posebnost Cas12k je da nima katalitske aktivnosti in da inhibira transkripcijo samo s fizično vezavo na tarčno DNA. Ko se v celici nastaja tako Cas12k kot tudi sgRNA za tarčno zaporedje, se ta povežeta in blokirata prepisovanje navzdol od vezave. Ko se v celici zniža koncentacija sgRNA, Cas12k oddisocira in s tem je prepisovanje navzdol spet omogočeno.

Cilj regulacije je da pride do prepisavanja sinteznih genov za PUFA samo ob visokih koncentracijah dušika in nizki koncentraciji kisika. Ob nizki koncentaciji dušika pride do prepisovanja nazdol od promotorja ''glnK'', to sta sgRNA-GFP (njegova tarča je omenjeno zaporedje GFP zavzdol od ''nifH'' promotorja) in tracrRNA. Ta konstrukt se potem poveže s Cas12k. Ta se veže na zapis za GFP in s tem blokira prepisovanje genov za sintezo PUFA. Torej tudi ko je koncentracija kisika nizka in se s tem aktivira promotor ''nifH'' do prepisovanja genov za sintezo PUFA ne pride. Ob visoki koncentraciji kisika in nizki koncentraciji dušika (to predstavlja okolje preden ''S. fredii'' tvori simbiozo z rastlino) do prepisa sinteznih genov PUFA ne pride. Ob visoki koncentaciji dušika in kisika do prepisovanja navzdol od promotorjev ''glnK'' in ''nifH'' ne pride. Ob visoki koncentaciji dušika (ko dodamo gnojilo bogato z dušikom) in nizki koncentraciji kisika pride do prepisovanje genov za sintezo PUFA, saj ne pride do prepisovanja sgRNA-GFP in tracrRNA, tako da Cas12k ne more blokirati prepisovanja genov za sintezo PUFA. Prav tako je koncentracija kisika nizka, zato je nifH promotor sploh aktiven.
== Samomorilski mehanizem razlaga ==
Samomorilski mehanizem za ''S. fredii'' je zasnovan tako, da ko ''S. fredii'' pobegne ven iz modula v okolje s povišno koncentracijo dušika in kisika, naredi samomor. Mehanizem je zasnovan na sistemu toksin-antitoksin (''vapC-vapB'') in promotorjih ''nuoA'', ''nifH'' in ''glnK''. Na enem delu konstrukta ''nuoA'' kontrolira izražanje Cas12k, na drugem pa izražanje ''vapC''. ''nifH'' kontrolira izražanje ''vapB''. ''glnK'' pa kontrolira izražanje sgRNA za gen mCherry in tracrRNA. Različne kombinacije koncentracij dušika in kisika omogočajo preživetje, samo ob povišani koncentraciji dušika in hkrati kisika vodijo v samomor. Pri nizki koncentraciji dušika in kisika, nastaja VapB ter sgRNA-mCherry in tracrRNA. Hkrati se izraža Cas12k, ki se poveže z sgRNA-mCherry in tracrRNA, se veže na gen za mCherry in s tem blokira izražanje ''vapC''. Pri nizki koncentracij dušika in povišani koncentracij kisika, ''vapB'' ne nastaja, izraža se sgRNA-mCherry in tracrRNA ter Cas12k, zato VapC ne nastaja. Pri povišani koncentracij dušika in nizki koncentracij kisika VapB in VapC ne nastajata. Pri povišani koncentracij dušika in povišani koncentracij kisika VapB ne nastaja, nastaja pa VapC, saj Cas12k ne more blokirati transkripcije ''vapC'', saj sgRNA-mCherrz in tracrRNA ne nastajata. Posledično se koncentracija VapB v celici poviša, kar vodi v smrt pobegle celice, to je izven okolja modula.

Eden izmed testov, ki so ga naredili, da bi potrdili uspešnost samomorilskega mehanizma je bil merjenje spremembe OD600 bakterij v suspenziji pri hiperoksičnih pogojih in spremenljivo koncentracijo amonijevega klorida, kot vira dušika. Po desetih urah so opazili padajoč trend v gojiščih z amonijevim kloridom. Padajoč trend je še bolj očiten, ko se poveča koncentracija amonijevega klorida. Zaključili so da je samomorilski mehanizem pod temi testnimi pogoji, reguliran s koncentracijo dušika in da deluje.
== Transport DHA in EPA v sojo ==
Njihov končni cilj je bil tudi transportirati DHA in EPA izven koreninskih nodulov v sojo. Za transport PUFA je bil že pred tem odkrit eksportni sistem, ki bi to omogočal, za gram negativne bakterije. ''S. fredii'' je tudi gram negativna bakterija. Ena študija se je ukvarjala z fiziološkim odzivom gram negativne bakterije ''Acinetobacter baumannii'' na PUFA in odkrili so povečano ekspresijo gena adeJ, ki je komponenta črpalke ''adeIJK'', ki lahko transportira več različnih učinkovin ven iz celice. Ugotovili so da delecija gena ''adeJ'' poveča dovzetnost za PUFA. Podobno vlogo kot ima črpalka ''adeIJK'', ima črpalka ''emhABC'' iz ''Pseudomonas fluorescens'', ki kontrolira homeostazo lipidov, tako da izčrpava dolgo-verižne maščobne kisline. Razultata kažeta na to, da obstajajo v gram negativnih bakterijah določeni transportni proteini, ki bi omogočali transport DHA in EPA iz celice. Torej če bi povečali njihovo izražanje, bi lahko transportirali tudi DHA in EPA v sojo.
== Viri in literatura ==
[1] CAU-China: N. Factory https://2024.igem.wiki/cau-china/ (pridobljeno 13. 4. 2025)

CAU-China: Nodulska tovarna DHA in EPA

2025-04-14T09:42:07Z

Luka Fink:

[https://2024.igem.wiki/cau-china/ N. Factory (Nodulska tovarna DHA in EPA)] je iGEM projekt skupine CAU-China iz Kitajske iz leta 2024.
== UVOD ==
Človeštvo že dolga časa poizkuša izboljšati hranilno vrednost hrane na razno razne načine, da bi se spopadli s problemi kot so podhranjenost v nerazvitih državah in omejenost določenih virov hrane. Cilj te skupine je bil proizvajati DHA in EPA v nodulih z genetsko spremenjenimi simbiontskimi bakterijami, z namenom povečati hranilno vrednost gojenih rastlin, še posebaj soje.

Noduli so majhne kroglaste tvorbe, ki se razvijejo na rastlinskih koreninah ali steblih. V nodulih živijo simbionstske bakterije, ki iz zraka vežejo dušik. Različne rastline razvijejo simbiozo z različnimi bakterijami. Rastilne iz družine metuljnic (soja, fižol, grah, leča) živijo v simbiozi z bakterijami iz rodu ''Rhizobium''.

Potencilna vcepitev ''Rhizobium'' kot mikrobnega gnolija, prinaša še druge prednosti poleg proizvodnje DHA in EPA in to je obogatitev zemlje z dušikovimi spojinami, ki jih rastline lahko uporaljajo. Dolgoročna uporaba kemičnih gnojil, lahko privede do nabiranja določenih kemikalij v zemlji, kar vodi v zmanjšanje število koristnih bakterij. Namesto kemičnih gnojil, bi lahko uporabljali mikrobna gnolija, ki vsebujejo ''Rhizobium'', in bi tako izboljšali kakovost zemlje in zmanjšali negativne učinke kemičnih gnojil.
== Izvedba projekta ==
Izbrali so si bakterijo ''Sinorhizobium fredii'' CCBAU45436. V njej so vzpostavili niz regulacijskih modulov, ki se odzivajo na spremembne v koncentraciji dušika in kisika. Hkrati so izbrali gene, ki kodirajo za PUFA sintazo, ki bi proizvajala željena produkta DHA in EPA ter hkrati bi nastajali še ostali stranski produkti). Za izboljšanje učinkovitosti so reprogramirali metabolizem z uravnavanjem izražanja določenih genov. Zasnovali so samomorilski mehanizem, če ''S. fredii'' pobegne. Regulacijski moduli so odgovorni za kontrolo izražanja genov za sintezo PUFA (poly-unsaturated fatty acid) in kontrolo samomorilskega mehanizma.
== Delecija PHB ==
PHB (poli-β-hidroksibutirat) je produkt metabolizma, ki lahko služi kot zaloga energije, in nastaja v ''S. fredii'' v veliki meri. Odločili so se da bodo izbrisali gen ''phaC2'', ki kodira ključni encim za sintezo PHB. Delecijo so naredili s homologno rekombinacijo z dvojno zamenjavo. V odsotnosti gena ''phaC2'' naj bi se v celici povečala koncentracija acetil-CoA, ki naj bi služil kot prekursor za sintezo PUFA.

Delecijo so potrdili s PCR na osnovi kolonije. Opazili so da je ''S. fredii'' spremenil fenotip, ko so ga gojili na trdem gojišču. In sicer pri ''∆phaC2'' so kolonije rumene, pri wt pa bele. Testirali so še ali ima ''∆phaC2'' vpliv na sposobnost fiksiranja dušika, ko so mutanto vcepili v rastlino Jidou 17. Inkubacija je potekala 15 dni. Analizirali so nodule, ki so zrasli na rastlini, ki je bila vcepljena z wt in nodule, ki so zrasli na rastlini, ki je bila vcepljena z mutanto ter ugotovili da ni vidne razlike med wt in mutanto. Analizirali so še vsebnost klorofila in suhe teže nadzemeljskih delov rastline in niso našli nobene statistično signifikantne razlike. Torej ''∆phaC2'' ne vpliva na rast rastline.
== Regulacija in sinteza modula ==
Problem pri sintezi PUFA je ta, da mora potekati v anaerobnem okolju, drugače lahko prihaja do oksidacije PUFA. Zato ''S. fredii'' predstavlja idealno okolje za sintezo. Za sintezo PUFA so si izbrali gručo genov iz ''Aetherobacter fasciculatus'', katera je bila že predhodno testirana v ''E. coli'' za sintezo PUFA. Da bi zagotovili učinkovito izražanje genov PUFA, so optimizirali rabo kodonov, ki bi ustrezala ''S. fredii'', in hkrati so gruči genov dodali PPTazo, ki bi omogočala posttranslacijske modifikacije.

Sintetizirali so modul, ki se odziva na različne koncentracije dušika in kisika v okolju. Izbrali so si promotorja '''''glnK''''' in '''''nifH''''', ki sta endogena inducibilna promotorja ''S. fredii''. Promotor ''glnK'' se odziva na nizke koncentracije dušika, promotor ''nifH'' pa se odziva na nizke koncentracije kisika. Regulacijski modul za sintezo PUFA je sestavljen tako, da sta pod promotorjem ''glnK'' zapisa za sgRNA-GFP in tracrRNA, pod promotorjem ''nifH'' pa zapisa za GFP in gruča genov za sintezo PUFA. Na drugi lokaciji na plazmidu je prisoten tudi konstitutivni promotor ''nuoA''. Navzdol od promotorja ''nuoA'' se nahaj zapis za Cas12k. Posebnost Cas12k je da nima katalitske aktivnosti in da inhibira transkripcijo samo s fizično vezavo na tarčno DNA. Ko se v celici nastaja tako Cas12k kot tudi sgRNA za tarčno zaporedje, se ta povežeta in blokirata prepisovanje navzdol od vezave. Ko se v celici zniža koncentacija sgRNA, Cas12k oddisocira in s tem je prepisovanje navzdol spet omogočeno.

Cilj regulacije je da pride do prepisavanja sinteznih genov za PUFA samo ob visokih koncentracijah dušika in nizki koncentraciji kisika. Ob nizki koncentaciji dušika pride do prepisovanja nazdol od promotorja ''glnK'', to sta sgRNA-GFP (njegova tarča je omenjeno zaporedje GFP zavzdol od ''nifH'' promotorja) in tracrRNA. Ta konstrukt se potem poveže s Cas12k. Ta se veže na zapis za GFP in s tem blokira prepisovanje genov za sintezo PUFA. Torej tudi ko je koncentracija kisika nizka in se s tem aktivira promotor ''nifH'' do prepisovanja genov za sintezo PUFA ne pride. Ob visoki koncentraciji kisika in nizki koncentraciji dušika (to predstavlja okolje preden ''S. fredii'' tvori simbiozo z rastlino) do prepisa sinteznih genov PUFA ne pride. Ob visoki koncentaciji dušika in kisika do prepisovanja navzdol od promotorjev ''glnK'' in ''nifH'' ne pride. Ob visoki koncentaciji dušika (ko dodamo gnojilo bogato z dušikom) in nizki koncentraciji kisika pride do prepisovanje genov za sintezo PUFA, saj ne pride do prepisovanja sgRNA-GFP in tracrRNA, tako da Cas12k ne more blokirati prepisovanja genov za sintezo PUFA. Prav tako je koncentracija kisika nizka, zato je nifH promotor sploh aktiven.
== Samomorilski mehanizem razlaga ==
Samomorilski mehanizem za ''S. fredii'' je zasnovan tako, da ko ''S. fredii'' pobegne ven iz modula v okolje s povišno koncentracijo dušika in kisika, naredi samomor. Mehanizem je zasnovan na sistemu toksin-antitoksin (''vapC-vapB'') in promotorjih ''nuoA'', ''nifH'' in ''glnK''. Na enem delu konstrukta ''nuoA'' kontrolira izražanje Cas12k, na drugem pa izražanje ''vapC''. ''nifH'' kontrolira izražanje ''vapB''. ''glnK'' pa kontrolira izražanje sgRNA za gen mCherry in tracrRNA. Različne kombinacije koncentracij dušika in kisika omogočajo preživetje, samo ob povišani koncentraciji dušika in hkrati kisika vodijo v samomor. Pri nizki koncentraciji dušika in kisika, nastaja VapB ter sgRNA-mCherry in tracrRNA. Hkrati se izraža Cas12k, ki se poveže z sgRNA-mCherry in tracrRNA, se veže na gen za mCherry in s tem blokira izražanje ''vapC''. Pri nizki koncentracij dušika in povišani koncentracij kisika, ''vapB'' ne nastaja, izraža se sgRNA-mCherry in tracrRNA ter Cas12k, zato VapC ne nastaja. Pri povišani koncentracij dušika in nizki koncentracij kisika VapB in VapC ne nastajata. Pri povišani koncentracij dušika in povišani koncentracij kisika VapB ne nastaja, nastaja pa VapC, saj Cas12k ne more blokirati transkripcije ''vapC'', saj sgRNA-mCherrz in tracrRNA ne nastajata. Posledično se koncentracija VapB v celici poviša, kar vodi v smrt pobegle celice, to je izven okolja modula.

Eden izmed testov, ki so ga naredili, da bi potrdili uspešnost samomorilskega mehanizma je bil merjenje spremembe OD600 bakterij v suspenziji pri hiperoksičnih pogojih in spremenljivo koncentracijo amonijevega klorida, kot vira dušika. Po desetih urah so opazili padajoč trend v gojiščih z amonijevim kloridom. Padajoč trend je še bolj očiten, ko se poveča koncentracija amonijevega klorida. Zaključili so da je samomorilski mehanizem pod temi testnimi pogoji, reguliran s koncentracijo dušika in da deluje.
== Transport DHA in EPA v sojo ==
Njihov končni cilj je bil tudi transportirati DHA in EPA izven koreninskih nodulov v sojo. Za transport PUFA je bil že pred tem odkrit eksportni sistem, ki bi to omogočal, za gram negativne bakterije. ''S. fredii'' je tudi gram negativna bakterija. Ena študija se je ukvarjala z fiziološkim odzivom gram negativne bakterije ''Acinetobacter baumannii'' na PUFA in odkrili so povečano ekspresijo gena adeJ, ki je komponenta črpalke ''adeIJK'', ki lahko transportira več različnih učinkovin ven iz celice. Ugotovili so da delecija gena ''adeJ'' poveča dovzetnost za PUFA. Podobno vlogo kot ima črpalka ''adeIJK'', ima črpalka ''emhABC'' iz ''Pseudomonas fluorescens'', ki kontrolira homeostazo lipidov, tako da izčrpava dolgo-verižne maščobne kisline. Razultata kažeta na to, da obstajajo v gram negativnih bakterijah določeni transportni proteini, ki bi omogočali transport DHA in EPA iz celice. Torej če bi povečali njihovo izražanje, bi lahko transportirali tudi DHA in EPA v sojo.
== Viri in literatura ==
[1] CAU-China: N. Factory https://2024.igem.wiki/cau-china/ (pridobljeno 13. 4. 2025)

CAU-China: Nodulska tovarna DHA in EPA

2025-04-14T09:41:28Z

Luka Fink:

[https://2024.igem.wiki/cau-china/ N. Factory (Nodulska tovarna DHA in EPA)] je iGEM projekt skupine CAU-China iz Kitajske iz leta 2024.
== UVOD ==
Človeštvo že dolga časa poizkuša izboljšati hranilno vrednost hrane na razno razne načine, da bi se spopadli s problemi kot so podhranjenost v nerazvitih državah in omejenost določenih virov hrane. Cilj te skupine je bil proizvajati DHA in EPA v nodulih z genetsko spremenjenimi simbiontskimi bakterijami, z namenom povečati hranilno vrednost gojenih rastlin, še posebaj soje.

Noduli so majhne kroglaste tvorbe, ki se razvijejo na rastlinskih koreninah ali steblih. V nodulih živijo simbionstske bakterije, ki iz zraka vežejo dušik. Različne rastline razvijejo simbiozo z različnimi bakterijami. Rastilne iz družine metuljnic (soja, fižol, grah, leča) živijo v simbiozi z bakterijami iz rodu ''Rhizobium''.

Potencilna vcepitev ''Rhizobium'' kot mikrobnega gnolija, prinaša še druge prednosti poleg proizvodnje DHA in EPA in to je obogatitev zemlje z dušikovimi spojinami, ki jih rastline lahko uporaljajo. Dolgoročna uporaba kemičnih gnojil, lahko privede do nabiranja določenih kemikalij v zemlji, kar vodi v zmanjšanje število koristnih bakterij. Namesto kemičnih gnojil, bi lahko uporabljali mikrobna gnolija, ki vsebujejo ''Rhizobium'', in bi tako izboljšali kakost zemlje in zmanjšali negativne učinke kemičnih gnojil.
== Izvedba projekta ==
Izbrali so si bakterijo ''Sinorhizobium fredii'' CCBAU45436. V njej so vzpostavili niz regulacijskih modulov, ki se odzivajo na spremembne v koncentraciji dušika in kisika. Hkrati so izbrali gene, ki kodirajo za PUFA sintazo, ki bi proizvajala željena produkta DHA in EPA ter hkrati bi nastajali še ostali stranski produkti). Za izboljšanje učinkovitosti so reprogramirali metabolizem z uravnavanjem izražanja določenih genov. Zasnovali so samomorilski mehanizem, če ''S. fredii'' pobegne. Regulacijski moduli so odgovorni za kontrolo izražanja genov za sintezo PUFA (poly-unsaturated fatty acid) in kontrolo samomorilskega mehanizma.
== Delecija PHB ==
PHB (poli-β-hidroksibutirat) je produkt metabolizma, ki lahko služi kot zaloga energije, in nastaja v ''S. fredii'' v veliki meri. Odločili so se da bodo izbrisali gen ''phaC2'', ki kodira ključni encim za sintezo PHB. Delecijo so naredili s homologno rekombinacijo z dvojno zamenjavo. V odsotnosti gena ''phaC2'' naj bi se v celici povečala koncentracija acetil-CoA, ki naj bi služil kot prekursor za sintezo PUFA.

Delecijo so potrdili s PCR na osnovi kolonije. Opazili so da je ''S. fredii'' spremenil fenotip, ko so ga gojili na trdem gojišču. In sicer pri ''∆phaC2'' so kolonije rumene, pri wt pa bele. Testirali so še ali ima ''∆phaC2'' vpliv na sposobnost fiksiranja dušika, ko so mutanto vcepili v rastlino Jidou 17. Inkubacija je potekala 15 dni. Analizirali so nodule, ki so zrasli na rastlini, ki je bila vcepljena z wt in nodule, ki so zrasli na rastlini, ki je bila vcepljena z mutanto ter ugotovili da ni vidne razlike med wt in mutanto. Analizirali so še vsebnost klorofila in suhe teže nadzemeljskih delov rastline in niso našli nobene statistično signifikantne razlike. Torej ''∆phaC2'' ne vpliva na rast rastline.
== Regulacija in sinteza modula ==
Problem pri sintezi PUFA je ta, da mora potekati v anaerobnem okolju, drugače lahko prihaja do oksidacije PUFA. Zato ''S. fredii'' predstavlja idealno okolje za sintezo. Za sintezo PUFA so si izbrali gručo genov iz ''Aetherobacter fasciculatus'', katera je bila že predhodno testirana v ''E. coli'' za sintezo PUFA. Da bi zagotovili učinkovito izražanje genov PUFA, so optimizirali rabo kodonov, ki bi ustrezala ''S. fredii'', in hkrati so gruči genov dodali PPTazo, ki bi omogočala posttranslacijske modifikacije.

Sintetizirali so modul, ki se odziva na različne koncentracije dušika in kisika v okolju. Izbrali so si promotorja '''''glnK''''' in '''''nifH''''', ki sta endogena inducibilna promotorja ''S. fredii''. Promotor ''glnK'' se odziva na nizke koncentracije dušika, promotor ''nifH'' pa se odziva na nizke koncentracije kisika. Regulacijski modul za sintezo PUFA je sestavljen tako, da sta pod promotorjem ''glnK'' zapisa za sgRNA-GFP in tracrRNA, pod promotorjem ''nifH'' pa zapisa za GFP in gruča genov za sintezo PUFA. Na drugi lokaciji na plazmidu je prisoten tudi konstitutivni promotor ''nuoA''. Navzdol od promotorja ''nuoA'' se nahaj zapis za Cas12k. Posebnost Cas12k je da nima katalitske aktivnosti in da inhibira transkripcijo samo s fizično vezavo na tarčno DNA. Ko se v celici nastaja tako Cas12k kot tudi sgRNA za tarčno zaporedje, se ta povežeta in blokirata prepisovanje navzdol od vezave. Ko se v celici zniža koncentacija sgRNA, Cas12k oddisocira in s tem je prepisovanje navzdol spet omogočeno.

Cilj regulacije je da pride do prepisavanja sinteznih genov za PUFA samo ob visokih koncentracijah dušika in nizki koncentraciji kisika. Ob nizki koncentaciji dušika pride do prepisovanja nazdol od promotorja ''glnK'', to sta sgRNA-GFP (njegova tarča je omenjeno zaporedje GFP zavzdol od ''nifH'' promotorja) in tracrRNA. Ta konstrukt se potem poveže s Cas12k. Ta se veže na zapis za GFP in s tem blokira prepisovanje genov za sintezo PUFA. Torej tudi ko je koncentracija kisika nizka in se s tem aktivira promotor ''nifH'' do prepisovanja genov za sintezo PUFA ne pride. Ob visoki koncentraciji kisika in nizki koncentraciji dušika (to predstavlja okolje preden ''S. fredii'' tvori simbiozo z rastlino) do prepisa sinteznih genov PUFA ne pride. Ob visoki koncentaciji dušika in kisika do prepisovanja navzdol od promotorjev ''glnK'' in ''nifH'' ne pride. Ob visoki koncentaciji dušika (ko dodamo gnojilo bogato z dušikom) in nizki koncentraciji kisika pride do prepisovanje genov za sintezo PUFA, saj ne pride do prepisovanja sgRNA-GFP in tracrRNA, tako da Cas12k ne more blokirati prepisovanja genov za sintezo PUFA. Prav tako je koncentracija kisika nizka, zato je nifH promotor sploh aktiven.
== Samomorilski mehanizem razlaga ==
Samomorilski mehanizem za ''S. fredii'' je zasnovan tako, da ko ''S. fredii'' pobegne ven iz modula v okolje s povišno koncentracijo dušika in kisika, naredi samomor. Mehanizem je zasnovan na sistemu toksin-antitoksin (''vapC-vapB'') in promotorjih ''nuoA'', ''nifH'' in ''glnK''. Na enem delu konstrukta ''nuoA'' kontrolira izražanje Cas12k, na drugem pa izražanje ''vapC''. ''nifH'' kontrolira izražanje ''vapB''. ''glnK'' pa kontrolira izražanje sgRNA za gen mCherry in tracrRNA. Različne kombinacije koncentracij dušika in kisika omogočajo preživetje, samo ob povišani koncentraciji dušika in hkrati kisika vodijo v samomor. Pri nizki koncentraciji dušika in kisika, nastaja VapB ter sgRNA-mCherry in tracrRNA. Hkrati se izraža Cas12k, ki se poveže z sgRNA-mCherry in tracrRNA, se veže na gen za mCherry in s tem blokira izražanje ''vapC''. Pri nizki koncentracij dušika in povišani koncentracij kisika, ''vapB'' ne nastaja, izraža se sgRNA-mCherry in tracrRNA ter Cas12k, zato VapC ne nastaja. Pri povišani koncentracij dušika in nizki koncentracij kisika VapB in VapC ne nastajata. Pri povišani koncentracij dušika in povišani koncentracij kisika VapB ne nastaja, nastaja pa VapC, saj Cas12k ne more blokirati transkripcije ''vapC'', saj sgRNA-mCherrz in tracrRNA ne nastajata. Posledično se koncentracija VapB v celici poviša, kar vodi v smrt pobegle celice, to je izven okolja modula.

Eden izmed testov, ki so ga naredili, da bi potrdili uspešnost samomorilskega mehanizma je bil merjenje spremembe OD600 bakterij v suspenziji pri hiperoksičnih pogojih in spremenljivo koncentracijo amonijevega klorida, kot vira dušika. Po desetih urah so opazili padajoč trend v gojiščih z amonijevim kloridom. Padajoč trend je še bolj očiten, ko se poveča koncentracija amonijevega klorida. Zaključili so da je samomorilski mehanizem pod temi testnimi pogoji, reguliran s koncentracijo dušika in da deluje.
== Transport DHA in EPA v sojo ==
Njihov končni cilj je bil tudi transportirati DHA in EPA izven koreninskih nodulov v sojo. Za transport PUFA je bil že pred tem odkrit eksportni sistem, ki bi to omogočal, za gram negativne bakterije. ''S. fredii'' je tudi gram negativna bakterija. Ena študija se je ukvarjala z fiziološkim odzivom gram negativne bakterije ''Acinetobacter baumannii'' na PUFA in odkrili so povečano ekspresijo gena adeJ, ki je komponenta črpalke ''adeIJK'', ki lahko transportira več različnih učinkovin ven iz celice. Ugotovili so da delecija gena ''adeJ'' poveča dovzetnost za PUFA. Podobno vlogo kot ima črpalka ''adeIJK'', ima črpalka ''emhABC'' iz ''Pseudomonas fluorescens'', ki kontrolira homeostazo lipidov, tako da izčrpava dolgo-verižne maščobne kisline. Razultata kažeta na to, da obstajajo v gram negativnih bakterijah določeni transportni proteini, ki bi omogočali transport DHA in EPA iz celice. Torej če bi povečali njihovo izražanje, bi lahko transportirali tudi DHA in EPA v sojo.
== Viri in literatura ==
[1] CAU-China: N. Factory https://2024.igem.wiki/cau-china/ (pridobljeno 13. 4. 2025)

CAU-China: Nodulska tovarna DHA in EPA

2025-04-14T09:40:51Z

Luka Fink:

[https://2024.igem.wiki/cau-china/ N. Factory (Nodulska tovarna DHA in EPA)] je iGEM projekt skupine CAU-China iz Kitajske iz leta 2024.
== UVOD ==
Človeštvo že dolga časa poizkuša izboljšati hranilno vrednost hrane na razno razne načine, da bi se spopadli s problemi kot so podhranjenost v nerazvitih državah in omejenost določenih virov hrane. Cilj te skupine je bil proizvajati DHA in EPA v nodulih z genetsko spremenjenimi simbiontskimi bakterijami, z namenom povečati hranilno vrednost gojenih rastlin, še posebaj soje.

Noduli so majhne kroglaste tvorbe, ki se razvijejo na rastlinskih koreninah ali steblih. V nodulih živijo simbionstske bakterije, ki iz zraka vežejo dušik. Različne rastline razvijejo simbiozo z različnimi bakterijami. Rastilne iz družine metuljnic (soja, fižol, grah, leča) živijo v simbiozi z bakterijami iz rodu ''Rhizobium''.

Potencilna vcepitev ''Rhizobium'' kot mikrobnega gnolija, prinaša še druge prednosti poleg proizvodnje DHA in EPA in to je obogatitev zemlje z dušikovimi spojinami, ki jih rastline lahko uporaljajo. Dolgoročna uporaba kemičnih gnojil, lahko privede do nabiranja določenih kemikalij v zemlji, kar vodi v zmanjšanje števila koristnih bakterij. Namesto kemičnih gnojil, bi lahko uporabljali mikrobna gnolija, ki vsebujejo ''Rhizobium'', in bi tako izboljšali kakost zemlje in zmanjšali negativne učinke kemičnih gnojil.
== Izvedba projekta ==
Izbrali so si bakterijo ''Sinorhizobium fredii'' CCBAU45436. V njej so vzpostavili niz regulacijskih modulov, ki se odzivajo na spremembne v koncentraciji dušika in kisika. Hkrati so izbrali gene, ki kodirajo za PUFA sintazo, ki bi proizvajala željena produkta DHA in EPA ter hkrati bi nastajali še ostali stranski produkti). Za izboljšanje učinkovitosti so reprogramirali metabolizem z uravnavanjem izražanja določenih genov. Zasnovali so samomorilski mehanizem, če ''S. fredii'' pobegne. Regulacijski moduli so odgovorni za kontrolo izražanja genov za sintezo PUFA (poly-unsaturated fatty acid) in kontrolo samomorilskega mehanizma.
== Delecija PHB ==
PHB (poli-β-hidroksibutirat) je produkt metabolizma, ki lahko služi kot zaloga energije, in nastaja v ''S. fredii'' v veliki meri. Odločili so se da bodo izbrisali gen ''phaC2'', ki kodira ključni encim za sintezo PHB. Delecijo so naredili s homologno rekombinacijo z dvojno zamenjavo. V odsotnosti gena ''phaC2'' naj bi se v celici povečala koncentracija acetil-CoA, ki naj bi služil kot prekursor za sintezo PUFA.

Delecijo so potrdili s PCR na osnovi kolonije. Opazili so da je ''S. fredii'' spremenil fenotip, ko so ga gojili na trdem gojišču. In sicer pri ''∆phaC2'' so kolonije rumene, pri wt pa bele. Testirali so še ali ima ''∆phaC2'' vpliv na sposobnost fiksiranja dušika, ko so mutanto vcepili v rastlino Jidou 17. Inkubacija je potekala 15 dni. Analizirali so nodule, ki so zrasli na rastlini, ki je bila vcepljena z wt in nodule, ki so zrasli na rastlini, ki je bila vcepljena z mutanto ter ugotovili da ni vidne razlike med wt in mutanto. Analizirali so še vsebnost klorofila in suhe teže nadzemeljskih delov rastline in niso našli nobene statistično signifikantne razlike. Torej ''∆phaC2'' ne vpliva na rast rastline.
== Regulacija in sinteza modula ==
Problem pri sintezi PUFA je ta, da mora potekati v anaerobnem okolju, drugače lahko prihaja do oksidacije PUFA. Zato ''S. fredii'' predstavlja idealno okolje za sintezo. Za sintezo PUFA so si izbrali gručo genov iz ''Aetherobacter fasciculatus'', katera je bila že predhodno testirana v ''E. coli'' za sintezo PUFA. Da bi zagotovili učinkovito izražanje genov PUFA, so optimizirali rabo kodonov, ki bi ustrezala ''S. fredii'', in hkrati so gruči genov dodali PPTazo, ki bi omogočala posttranslacijske modifikacije.

Sintetizirali so modul, ki se odziva na različne koncentracije dušika in kisika v okolju. Izbrali so si promotorja '''''glnK''''' in '''''nifH''''', ki sta endogena inducibilna promotorja ''S. fredii''. Promotor ''glnK'' se odziva na nizke koncentracije dušika, promotor ''nifH'' pa se odziva na nizke koncentracije kisika. Regulacijski modul za sintezo PUFA je sestavljen tako, da sta pod promotorjem ''glnK'' zapisa za sgRNA-GFP in tracrRNA, pod promotorjem ''nifH'' pa zapisa za GFP in gruča genov za sintezo PUFA. Na drugi lokaciji na plazmidu je prisoten tudi konstitutivni promotor ''nuoA''. Navzdol od promotorja ''nuoA'' se nahaj zapis za Cas12k. Posebnost Cas12k je da nima katalitske aktivnosti in da inhibira transkripcijo samo s fizično vezavo na tarčno DNA. Ko se v celici nastaja tako Cas12k kot tudi sgRNA za tarčno zaporedje, se ta povežeta in blokirata prepisovanje navzdol od vezave. Ko se v celici zniža koncentacija sgRNA, Cas12k oddisocira in s tem je prepisovanje navzdol spet omogočeno.

Cilj regulacije je da pride do prepisavanja sinteznih genov za PUFA samo ob visokih koncentracijah dušika in nizki koncentraciji kisika. Ob nizki koncentaciji dušika pride do prepisovanja nazdol od promotorja ''glnK'', to sta sgRNA-GFP (njegova tarča je omenjeno zaporedje GFP zavzdol od ''nifH'' promotorja) in tracrRNA. Ta konstrukt se potem poveže s Cas12k. Ta se veže na zapis za GFP in s tem blokira prepisovanje genov za sintezo PUFA. Torej tudi ko je koncentracija kisika nizka in se s tem aktivira promotor ''nifH'' do prepisovanja genov za sintezo PUFA ne pride. Ob visoki koncentraciji kisika in nizki koncentraciji dušika (to predstavlja okolje preden ''S. fredii'' tvori simbiozo z rastlino) do prepisa sinteznih genov PUFA ne pride. Ob visoki koncentaciji dušika in kisika do prepisovanja navzdol od promotorjev ''glnK'' in ''nifH'' ne pride. Ob visoki koncentaciji dušika (ko dodamo gnojilo bogato z dušikom) in nizki koncentraciji kisika pride do prepisovanje genov za sintezo PUFA, saj ne pride do prepisovanja sgRNA-GFP in tracrRNA, tako da Cas12k ne more blokirati prepisovanja genov za sintezo PUFA. Prav tako je koncentracija kisika nizka, zato je nifH promotor sploh aktiven.
== Samomorilski mehanizem razlaga ==
Samomorilski mehanizem za ''S. fredii'' je zasnovan tako, da ko ''S. fredii'' pobegne ven iz modula v okolje s povišno koncentracijo dušika in kisika, naredi samomor. Mehanizem je zasnovan na sistemu toksin-antitoksin (''vapC-vapB'') in promotorjih ''nuoA'', ''nifH'' in ''glnK''. Na enem delu konstrukta ''nuoA'' kontrolira izražanje Cas12k, na drugem pa izražanje ''vapC''. ''nifH'' kontrolira izražanje ''vapB''. ''glnK'' pa kontrolira izražanje sgRNA za gen mCherry in tracrRNA. Različne kombinacije koncentracij dušika in kisika omogočajo preživetje, samo ob povišani koncentraciji dušika in hkrati kisika vodijo v samomor. Pri nizki koncentraciji dušika in kisika, nastaja VapB ter sgRNA-mCherry in tracrRNA. Hkrati se izraža Cas12k, ki se poveže z sgRNA-mCherry in tracrRNA, se veže na gen za mCherry in s tem blokira izražanje ''vapC''. Pri nizki koncentracij dušika in povišani koncentracij kisika, ''vapB'' ne nastaja, izraža se sgRNA-mCherry in tracrRNA ter Cas12k, zato VapC ne nastaja. Pri povišani koncentracij dušika in nizki koncentracij kisika VapB in VapC ne nastajata. Pri povišani koncentracij dušika in povišani koncentracij kisika VapB ne nastaja, nastaja pa VapC, saj Cas12k ne more blokirati transkripcije ''vapC'', saj sgRNA-mCherrz in tracrRNA ne nastajata. Posledično se koncentracija VapB v celici poviša, kar vodi v smrt pobegle celice, to je izven okolja modula.

Eden izmed testov, ki so ga naredili, da bi potrdili uspešnost samomorilskega mehanizma je bil merjenje spremembe OD600 bakterij v suspenziji pri hiperoksičnih pogojih in spremenljivo koncentracijo amonijevega klorida, kot vira dušika. Po desetih urah so opazili padajoč trend v gojiščih z amonijevim kloridom. Padajoč trend je še bolj očiten, ko se poveča koncentracija amonijevega klorida. Zaključili so da je samomorilski mehanizem pod temi testnimi pogoji, reguliran s koncentracijo dušika in da deluje.
== Transport DHA in EPA v sojo ==
Njihov končni cilj je bil tudi transportirati DHA in EPA izven koreninskih nodulov v sojo. Za transport PUFA je bil že pred tem odkrit eksportni sistem, ki bi to omogočal, za gram negativne bakterije. ''S. fredii'' je tudi gram negativna bakterija. Ena študija se je ukvarjala z fiziološkim odzivom gram negativne bakterije ''Acinetobacter baumannii'' na PUFA in odkrili so povečano ekspresijo gena adeJ, ki je komponenta črpalke ''adeIJK'', ki lahko transportira več različnih učinkovin ven iz celice. Ugotovili so da delecija gena ''adeJ'' poveča dovzetnost za PUFA. Podobno vlogo kot ima črpalka ''adeIJK'', ima črpalka ''emhABC'' iz ''Pseudomonas fluorescens'', ki kontrolira homeostazo lipidov, tako da izčrpava dolgo-verižne maščobne kisline. Razultata kažeta na to, da obstajajo v gram negativnih bakterijah določeni transportni proteini, ki bi omogočali transport DHA in EPA iz celice. Torej če bi povečali njihovo izražanje, bi lahko transportirali tudi DHA in EPA v sojo.
== Viri in literatura ==
[1] CAU-China: N. Factory https://2024.igem.wiki/cau-china/ (pridobljeno 13. 4. 2025)

CAU-China: Nodulska tovarna DHA in EPA

2025-04-13T16:00:48Z

Luka Fink:

[https://2024.igem.wiki/cau-china/ N. Factory (Nodulska tovarna DHA in EPA)] je iGEM projekt skupine CAU-China iz Kitajske iz leta 2024.
== UVOD ==
Človeštvo že dolga časa poizkuša izboljšati hranilno vrednost hrane na razno razne načine, da bi se spopadli s problemi kot so podhranjenost v nerazvitih državah in omejenost določenih virov hrane. Cilj te skupine je bil proizvajati DHA in EPA v nodulih z genetsko spremenjenimi simbiontskimi bakterijami, z namenom povečati hranilno vrednost gojenih rastlin, še posebaj soje.

Noduli so majhne kroglaste tvorbe, ki se razvijejo na rastlinskih koreninah ali steblih. V nodulih živijo simbionstske bakterije, ki iz zraka vežejo dušik. Različne rastline razvijejo simbiozo z različnimi bakterijami. Rastilne iz družine metuljnic (soja, fižol, grah, leča) živijo v simbiozi z bakterijami iz rodu ''Rhizobium''.

Vcepitev ''Rhizobium'' prinaša še eno prednost in to je obogatitev zemlje z dušikovimi spojinami, ki jih rastline lahko uporaljajo. Dolgoročna uporaba kemičnih gnojil, lahko privede do nabiranja določenih kemikalij v zemlji, kar vodi v zmanjšanje števila koristnih bakterij. Namesto kemičnih gnojil, bi lahko uporabljali mikrobna gnolija, ki vsebujejo ''Rhizobium'', in bi tako izboljšali kakost zemlje in zmanjšali negativne učinke kemičnih gnojil.
== Izvedba projekta ==
Izbrali so si bakterijo ''Sinorhizobium fredii'' CCBAU45436. V njej so vzpostavili niz regulacijskih modulov, ki se odzivajo na spremembne v koncentraciji dušika in kisika. Hkrati so izbrali gene, ki kodirajo za PUFA sintazo, ki bi proizvajala željena produkta DHA in EPA ter hkrati bi nastajali še ostali stranski produkti). Za izboljšanje učinkovitosti so reprogramirali metabolizem z uravnavanjem izražanja določenih genov. Zasnovali so samomorilski mehanizem, če ''S. fredii'' pobegne. Regulacijski moduli so odgovorni za kontrolo izražanja genov za sintezo PUFA (poly-unsaturated fatty acid) in kontrolo samomorilskega mehanizma.
== Delecija PHB ==
PHB (poli-β-hidroksibutirat) je produkt metabolizma, ki lahko služi kot zaloga energije, in nastaja v ''S. fredii'' v veliki meri. Odločili so se da bodo izbrisali gen ''phaC2'', ki kodira ključni encim za sintezo PHB. Delecijo so naredili s homologno rekombinacijo z dvojno zamenjavo. V odsotnosti gena ''phaC2'' naj bi se v celici povečala koncentracija acetil-CoA, ki naj bi služil kot prekursor za sintezo PUFA.

Delecijo so potrdili s PCR na osnovi kolonije. Opazili so da je ''S. fredii'' spremenil fenotip, ko so ga gojili na trdem gojišču. In sicer pri ''∆phaC2'' so kolonije rumene, pri wt pa bele. Testirali so še ali ima ''∆phaC2'' vpliv na sposobnost fiksiranja dušika, ko so mutanto vcepili v rastlino Jidou 17. Inkubacija je potekala 15 dni. Analizirali so nodule, ki so zrasli na rastlini, ki je bila vcepljena z wt in nodule, ki so zrasli na rastlini, ki je bila vcepljena z mutanto ter ugotovili da ni vidne razlike med wt in mutanto. Analizirali so še vsebnost klorofila in suhe teže nadzemeljskih delov rastline in niso našli nobene statistično signifikantne razlike. Torej ''∆phaC2'' ne vpliva na rast rastline.
== Regulacija in sinteza modula ==
Problem pri sintezi PUFA je ta, da mora potekati v anaerobnem okolju, drugače lahko prihaja do oksidacije PUFA. Zato ''S. fredii'' predstavlja idealno okolje za sintezo. Za sintezo PUFA so si izbrali gručo genov iz ''Aetherobacter fasciculatus'', katera je bila že predhodno testirana v ''E. coli'' za sintezo PUFA. Da bi zagotovili učinkovito izražanje genov PUFA, so optimizirali rabo kodonov, ki bi ustrezala ''S. fredii'', in hkrati so gruči genov dodali PPTazo, ki bi omogočala posttranslacijske modifikacije.

Sintetizirali so modul, ki se odziva na različne koncentracije dušika in kisika v okolju. Izbrali so si promotorja '''''glnK''''' in '''''nifH''''', ki sta endogena inducibilna promotorja ''S. fredii''. Promotor ''glnK'' se odziva na nizke koncentracije dušika, promotor ''nifH'' pa se odziva na nizke koncentracije kisika. Regulacijski modul za sintezo PUFA je sestavljen tako, da sta pod promotorjem ''glnK'' zapisa za sgRNA-GFP in tracrRNA, pod promotorjem ''nifH'' pa zapisa za GFP in gruča genov za sintezo PUFA. Na drugi lokaciji na plazmidu je prisoten tudi konstitutivni promotor ''nuoA''. Navzdol od promotorja ''nuoA'' se nahaj zapis za Cas12k. Posebnost Cas12k je da nima katalitske aktivnosti in da inhibira transkripcijo samo s fizično vezavo na tarčno DNA. Ko se v celici nastaja tako Cas12k kot tudi sgRNA za tarčno zaporedje, se ta povežeta in blokirata prepisovanje navzdol od vezave. Ko se v celici zniža koncentacija sgRNA, Cas12k oddisocira in s tem je prepisovanje navzdol spet omogočeno.

Cilj regulacije je da pride do prepisavanja sinteznih genov za PUFA samo ob visokih koncentracijah dušika in nizki koncentraciji kisika. Ob nizki koncentaciji dušika pride do prepisovanja nazdol od promotorja ''glnK'', to sta sgRNA-GFP (njegova tarča je omenjeno zaporedje GFP zavzdol od ''nifH'' promotorja) in tracrRNA. Ta konstrukt se potem poveže s Cas12k. Ta se veže na zapis za GFP in s tem blokira prepisovanje genov za sintezo PUFA. Torej tudi ko je koncentracija kisika nizka in se s tem aktivira promotor ''nifH'' do prepisovanja genov za sintezo PUFA ne pride. Ob visoki koncentraciji kisika in nizki koncentraciji dušika (to predstavlja okolje preden ''S. fredii'' tvori simbiozo z rastlino) do prepisa sinteznih genov PUFA ne pride. Ob visoki koncentaciji dušika in kisika do prepisovanja navzdol od promotorjev ''glnK'' in ''nifH'' ne pride. Ob visoki koncentaciji dušika (ko dodamo gnojilo bogato z dušikom) in nizki koncentraciji kisika pride do prepisovanje genov za sintezo PUFA, saj ne pride do prepisovanja sgRNA-GFP in tracrRNA, tako da Cas12k ne more blokirati prepisovanja genov za sintezo PUFA. Prav tako je koncentracija kisika nizka, zato je nifH promotor sploh aktiven.
== Samomorilski mehanizem razlaga ==
Samomorilski mehanizem za ''S. fredii'' je zasnovan tako, da ko ''S. fredii'' pobegne ven iz modula v okolje s povišno koncentracijo dušika in kisika, naredi samomor. Mehanizem je zasnovan na sistemu toksin-antitoksin (''vapC-vapB'') in promotorjih ''nuoA'', ''nifH'' in ''glnK''. Na enem delu konstrukta ''nuoA'' kontrolira izražanje Cas12k, na drugem pa izražanje ''vapC''. ''nifH'' kontrolira izražanje ''vapB''. ''glnK'' pa kontrolira izražanje sgRNA za gen mCherry in tracrRNA. Različne kombinacije koncentracij dušika in kisika omogočajo preživetje, samo ob povišani koncentraciji dušika in hkrati kisika vodijo v samomor. Pri nizki koncentraciji dušika in kisika, nastaja VapB ter sgRNA-mCherry in tracrRNA. Hkrati se izraža Cas12k, ki se poveže z sgRNA-mCherry in tracrRNA, se veže na gen za mCherry in s tem blokira izražanje ''vapC''. Pri nizki koncentracij dušika in povišani koncentracij kisika, ''vapB'' ne nastaja, izraža se sgRNA-mCherry in tracrRNA ter Cas12k, zato VapC ne nastaja. Pri povišani koncentracij dušika in nizki koncentracij kisika VapB in VapC ne nastajata. Pri povišani koncentracij dušika in povišani koncentracij kisika VapB ne nastaja, nastaja pa VapC, saj Cas12k ne more blokirati transkripcije ''vapC'', saj sgRNA-mCherrz in tracrRNA ne nastajata. Posledično se koncentracija VapB v celici poviša, kar vodi v smrt pobegle celice, to je izven okolja modula.

Eden izmed testov, ki so ga naredili, da bi potrdili uspešnost samomorilskega mehanizma je bil merjenje spremembe OD600 bakterij v suspenziji pri hiperoksičnih pogojih in spremenljivo koncentracijo amonijevega klorida, kot vira dušika. Po desetih urah so opazili padajoč trend v gojiščih z amonijevim kloridom. Padajoč trend je še bolj očiten, ko se poveča koncentracija amonijevega klorida. Zaključili so da je samomorilski mehanizem pod temi testnimi pogoji, reguliran s koncentracijo dušika in da deluje.
== Transport DHA in EPA v sojo ==
Njihov končni cilj je bil tudi transportirati DHA in EPA izven koreninskih nodulov v sojo. Za transport PUFA je bil že pred tem odkrit eksportni sistem, ki bi to omogočal, za gram negativne bakterije. ''S. fredii'' je tudi gram negativna bakterija. Ena študija se je ukvarjala z fiziološkim odzivom gram negativne bakterije ''Acinetobacter baumannii'' na PUFA in odkrili so povečano ekspresijo gena adeJ, ki je komponenta črpalke ''adeIJK'', ki lahko transportira več različnih učinkovin ven iz celice. Ugotovili so da delecija gena ''adeJ'' poveča dovzetnost za PUFA. Podobno vlogo kot ima črpalka ''adeIJK'', ima črpalka ''emhABC'' iz ''Pseudomonas fluorescens'', ki kontrolira homeostazo lipidov, tako da izčrpava dolgo-verižne maščobne kisline. Razultata kažeta na to, da obstajajo v gram negativnih bakterijah določeni transportni proteini, ki bi omogočali transport DHA in EPA iz celice. Torej če bi povečali njihovo izražanje, bi lahko transportirali tudi DHA in EPA v sojo.
== Viri in literatura ==
[1] CAU-China: N. Factory https://2024.igem.wiki/cau-china/ (pridobljeno 13. 4. 2025)

CAU-China: Nodulska tovarna DHA in EPA

2025-04-13T15:55:24Z

Luka Fink:

[https://2024.igem.wiki/cau-china/ N. Factory (Nodulska tovarna DHA in EPA)] je iGEM projekt skupine CAU-China iz Kitajske iz leta 2024.
== UVOD ==
Človeštvo že dolga časa poizkuša izboljšati hranilno vrednost hrane na razno razne načine, da bi se spopadli s problemi kot so podhranjenost v nerazvitih državah in omejenost določenih virov hrane. Cilj te skupine je bil proizvajati DHA in EPA v nodulih z genetsko spremenjenimi simbiontskimi bakterijami, z namenom povečati hranilno vrednost gojenih rastlin, še posebaj soje.

Noduli so majhne kroglaste tvorbe, ki se razvijejo na rastlinskih koreninah ali steblih. V nodulih živijo simbionstske bakterije, ki iz zraka vežejo dušik. Različne rastline razvijejo simbiozo z različnimi bakterijami. Rastilne iz družine metuljnic (soja, fižol, grah, leča) živijo v simbiozi z bakterijami iz rodu ''Rhizobium''.

Vcepitev ''Rhizobium'' prinaša še eno prednost in to je obogatitev zemlje z dušikovimi spojinami, ki jih rastline lahko uporaljajo. Dolgoročna uporaba kemičnih gnojil, lahko privede do nabiranja določenih kemikalij v zemlji, kar vodi v zmanjšanje števila koristnih bakterij. Namesto kemičnih gnojil, bi lahko uporabljali mikrobna gnolija, ki vsebujejo ''Rhizobium'', in bi tako izboljšali kakost zemlje in zmanjšali negativne učinke kemičnih gnojil.
== Izvedba projekta ==
Izbrali so si bakterijo ''Sinorhizobium fredii'' CCBAU45436. V njej so vzpostavili niz regulacijskih modulov, ki se odzivajo na spremembne v koncentraciji dušika in kisika. Hkrati so izbrali gene, ki kodirajo za PUFA sintazo, ki bi proizvajala željena produkta DHA in EPA ter hkrati bi nastajali še ostali stranski produkti). Za izboljšanje učinkovitosti so reprogramirali metabolizem z uravnavanjem izražanja določenih genov. Zasnovali so samomorilski mehanizem, če ''S. fredii'' pobegne. Regulacijski moduli so odgovorni za kontrolo izražanja genov za sintezo PUFA (poly-unsaturated fatty acid) in kontrolo samomorilskega mehanizma.
== Delecija PHB ==
PHB (poli-β-hidroksibutirat) je produkt metabolizma, ki lahko služi kot zaloga energije, in nastaja v ''S. fredii'' v veliki meri. Odločili so se da bodo izbrisali gen ''phaC2'', ki kodira ključni encim za sintezo PHB. Delecijo so naredili s homologno rekombinacijo z dvojno zamenjavo. V odsotnosti gena ''phaC2'' naj bi se v celici povečala koncentracija acetil-CoA, ki naj bi služil kot prekursor za sintezo PUFA.

Delecijo so potrdili s PCR na osnovi kolonije. Opazili so da je ''S. fredii'' spremenil fenotip, ko so ga gojili na trdem gojišču. In sicer pri ''∆phaC2'' so kolonije rumene, pri wt pa bele. Testirali so še ali ima ''∆phaC2'' vpliv na sposobnost fiksiranja dušika, ko so mutanto vcepili v rastlino Jidou 17. Inkubacija je potekala 15 dni. Analizirali so nodule, ki so zrasli na rastlini, ki je bila vcepljena z wt in nodule, ki so zrasli na rastlini, ki je bila vcepljena z mutanto ter ugotovili da ni vidne razlike med wt in mutanto. Analizirali so še vsebnost klorofila in suhe teže nadzemeljskih delov rastline in niso našli nobene statistično signifikantne razlike. Torej ''∆phaC2'' ne vpliva na rast rastline.
== Regulacija in sinteza modula ==
Problem pri sintezi PUFA je ta, da mora potekati v anaerobnem okolju, drugače lahko prihaja do oksidacije PUFA. Zato ''S. fredii'' predstavlja idealno okolje za sintezo. Za sintezo PUFA so si izbrali gručo genov iz ''Aetherobacter fasciculatus'', katera je bila že predhodno testirana v ''E. coli'' za sintezo PUFA. Da bi zagotovili učinkovito izražanje genov PUFA, so optimizirali rabo kodonov, ki bi ustrezala ''S. fredii'', in hkrati so gruči genov dodali PPTazo, ki bi omogočala posttranslacijske modifikacije.

Sintetizirali so modul, ki se odziva na različne koncentracije dušika in kisika v okolju. Izbrali so si promotorja '''''glnK''''' in '''nifH''', ki sta endogena inducibilna promotorja S. fredii. Promotor glnK se odziva na nizke koncentracije dušika, promotor nifH pa se odziva na nizke koncentracije kisika. Regulacijski modul za sintezo PUFA je sestavljen tako, da sta pod promotorjem glnK zapisa za sgRNA-GFP in tracrRNA, pod promotorjem nifH pa zapisa za GFP in gruča genov za sintezo PUFA. Na drugi lokaciji na plazmidu je prisoten tudi konstitutivni promotor nuoA. Navzdol od promotorja nuoA se nahaj zapis za Cas12k. Posebnost Cas12k je da nima katalitske aktivnosti in da inhibira transkripcijo samo s fizično vezavo na tarčno DNA. Ko se v celici nastaja tako Cas12k kot tudi sgRNA za tarčno zaporedje, se ta povežeta in blokirata prepisovanje navzdol od vezave. Ko se v celici zniža koncentacija sgRNA, Cas12k oddisocira in s tem je prepisovanje navzdol spet omogočeno.

Cilj regulacije je da pride do prepisavanja sinteznih genov za PUFA samo ob visokih koncentracijah dušika in nizki koncentraciji kisika. Ob nizki koncentaciji dušika pride do prepisovanja nazdol od promotorja glnK, to sta sgRNA-GFP (njegova tarča je omenjeno zaporedje GFP zavzdol od nifH promotorja) in tracrRNA. Ta konstrukt se potem poveže s Cas12k. Ta se veže na zapis za GFP in s tem blokira prepisovanje genov za sintezo PUFA. Torej tudi ko je koncentracija kisika nizka in se s tem aktivira promotor nifH do prepisovanja genov za sintezo PUFA ne pride. Ob visoki koncentraciji kisika in nizki koncentraciji dušika (to predstavlja okolje preden S. fredii tvori simbiozo z rastlino) do prepisa sinteznih genov PUFA ne pride. Ob visoki koncentaciji dušika in kisika do prepisovanja navzdol od promotorjev glnK in nifH ne pride. Ob visoki koncentaciji dušika (ko dodamo gnojilo bogato z dušikom) in nizki koncentraciji kisika pride do prepisovanje genov za sintezo PUFA, saj ne pride do prepisovanja sgRNA-GFP in tracrRNA, tako da Cas12k ne more blokirati prepisovanja genov za sintezo PUFA. Prav tako je koncentracija kisika nizka, zato je nifH promotor sploh aktiven.
== Samomorilski mehanizem razlaga ==
Samomorilski mehanizem za S. fredii je zasnovan tako, da ko S. fredii pobegne ven iz modula v okolje s povišno koncentracijo dušika in kisika, naredi samomor. Mehanizem je zasnovan na sistemu toksin-antitoksin (vapC-vapB) in promotorjih nuoA, nifH in glnK. Na enem delu konstrukta nuoA kontrolira izražanje Cas12k, na drugem pa izražanje vapC. nifH kontrolira izražanje vapB. glnK pa kontrolira izražanje sgRNA za gen mCherry in tracrRNA. Različne kombinacije koncentracij dušika in kisika omogočajo preživetje, samo ob povišani koncentraciji dušika in hkrati kisika vodijo v samomor. Pri nizki koncentraciji dušika in kisika, nastaja VapB ter sgRNA-mCherry in tracrRNA. Hkrati se izraža Cas12k, ki se poveže z sgRNA-mCherry in tracrRNA, se veže na gen za mCherry in s tem blokira izražanje vapC. Pri nizki koncentracij dušika in povišani koncentracij kisika, vapB ne nastaja, izraža se sgRNA-mCherry in tracrRNA ter Cas12k, zato VapC ne nastaja. Pri povišani koncentracij dušika in nizki koncentracij kisika VapB in VapC ne nastajata. Pri povišani koncentracij dušika in povišani koncentracij kisika VapB ne nastaja, nastaja pa VapC, saj Cas12k ne more blokirati transkripcije vapC, saj sgRNA-mCherrz in tracrRNA ne nastajata. Posledično se koncentracija VapB v celici poviša, kar vodi v smrt pobegle celice, to je izven okolja modula.

Eden izmed testov, ki so ga naredili, da bi potrdili uspešnost samomorilskega mehanizma je bil merjenje spremembe OD600 bakterij v suspenziji pri hiperoksičnih pogojih in spremenljivo koncentracijo amonijevega klorida, kot vira dušika. Po desetih urah so opazili padajoč trend v gojiščih z amonijevim kloridom. Padajoč trend je še bolj očiten, ko se poveča koncentracija amonijevega klorida. Zaključili so da je samomorilski mehanizem pod temi testnimi pogoji, reguliran s koncentracijo dušika in da deluje.
== Transport DHA in EPA v sojo ==
Njihov končni cilj je bil tudi transportirati DHA in EPA izven koreninskih nodulov v sojo. Za transport PUFA je bil že pred tem odkrit eksportni sistem, ki bi to omogočal, za gram negativne bakterije. S. fredii je tudi gram negativna bakterija. Ena študija se je ukvarjala z fiziološkim odzivom gram negativne bakterije Acinetobacter baumannii na PUFA in odkrili so povečano ekspresijo gena adeJ, ki je komponenta črpalke adeIJK, ki lahko transportira več različnih učinkovin ven iz celice. Ugotovili so da delecija gena adeJ poveča dovzetnost za PUFA. Podobno vlogo kot ima črpalka adeIJK, ima črpalka emhABC iz Pseudomonas fluorescens, ki kontrolira homeostazo lipidov, tako da izčrpava dolgo-verižne maščobne kisline. Razultata kažeta na to, da obstajajo v gram negativnih bakterijah določeni transportni proteini, ki bi omogočali transport DHA in EPA iz celice. Torej če bi povečali njihovo izražanje, bi lahko transportirali tudi DHA in EPA v sojo.
== Viri in literatura ==
[1] CAU-China: N. Factory https://2024.igem.wiki/cau-china/ (pridobljeno 13. 4. 2025)

CAU-China: Nodulska tovarna DHA in EPA

2025-04-13T15:54:56Z

Luka Fink:

[https://2024.igem.wiki/cau-china/ N. Factory (Nodulska tovarna DHA in EPA)] je iGEM projekt skupine CAU-China iz Kitajske iz leta 2024.
== UVOD ==
Človeštvo že dolga časa poizkuša izboljšati hranilno vrednost hrane na razno razne načine, da bi se spopadli s problemi kot so podhranjenost v nerazvitih državah in omejenost določenih virov hrane. Cilj te skupine je bil proizvajati DHA in EPA v nodulih z genetsko spremenjenimi simbiontskimi bakterijami, z namenom povečati hranilno vrednost gojenih rastlin, še posebaj soje.

Noduli so majhne kroglaste tvorbe, ki se razvijejo na rastlinskih koreninah ali steblih. V nodulih živijo simbionstske bakterije, ki iz zraka vežejo dušik. Različne rastline razvijejo simbiozo z različnimi bakterijami. Rastilne iz družine metuljnic (soja, fižol, grah, leča) živijo v simbiozi z bakterijami iz rodu ''Rhizobium''.

Vcepitev ''Rhizobium'' prinaša še eno prednost in to je obogatitev zemlje z dušikovimi spojinami, ki jih rastline lahko uporaljajo. Dolgoročna uporaba kemičnih gnojil, lahko privede do nabiranja določenih kemikalij v zemlji, kar vodi v zmanjšanje števila koristnih bakterij. Namesto kemičnih gnojil, bi lahko uporabljali mikrobna gnolija, ki vsebujejo ''Rhizobium'', in bi tako izboljšali kakost zemlje in zmanjšali negativne učinke kemičnih gnojil.
== Izvedba projekta ==
Izbrali so si bakterijo ''Sinorhizobium fredii'' CCBAU45436. V njej so vzpostavili niz regulacijskih modulov, ki se odzivajo na spremembne v koncentraciji dušika in kisika. Hkrati so izbrali gene, ki kodirajo za PUFA sintazo, ki bi proizvajala željena produkta DHA in EPA ter hkrati bi nastajali še ostali stranski produkti). Za izboljšanje učinkovitosti so reprogramirali metabolizem z uravnavanjem izražanja določenih genov. Zasnovali so samomorilski mehanizem, če ''S. fredii'' pobegne. Regulacijski moduli so odgovorni za kontrolo izražanja genov za sintezo PUFA (poly-unsaturated fatty acid) in kontrolo samomorilskega mehanizma.
== Delecija PHB ==
PHB (poli-β-hidroksibutirat) je produkt metabolizma, ki lahko služi kot zaloga energije, in nastaja v ''S. fredii'' v veliki meri. Odločili so se da bodo izbrisali gen ''phaC2'', ki kodira ključni encim za sintezo PHB. Delecijo so naredili s homologno rekombinacijo z dvojno zamenjavo. V odsotnosti gena ''phaC2'' naj bi se v celici povečala koncentracija acetil-CoA, ki naj bi služil kot prekursor za sintezo PUFA.

Delecijo so potrdili s PCR na osnovi kolonije. Opazili so da je ''S. fredii'' spremenil fenotip, ko so ga gojili na trdem gojišču. In sicer pri ''∆phaC2'' so kolonije rumene, pri wt pa bele. Testirali so še ali ima ''∆phaC2'' vpliv na sposobnost fiksiranja dušika, ko so mutanto vcepili v rastlino Jidou 17. Inkubacija je potekala 15 dni. Analizirali so nodule, ki so zrasli na rastlini, ki je bila vcepljena z wt in nodule, ki so zrasli na rastlini, ki je bila vcepljena z mutanto ter ugotovili da ni vidne razlike med wt in mutanto. Analizirali so še vsebnost klorofila in suhe teže nadzemeljskih delov rastline in niso našli nobene statistično signifikantne razlike. Torej ''∆phaC2'' ne vpliva na rast rastline.
== Regulacija in sinteza modula ==
Problem pri sintezi PUFA je ta, da mora potekati v anaerobnem okolju, drugače lahko prihaja do oksidacije PUFA. Zato ''S. fredii'' predstavlja idealno okolje za sintezo. Za sintezo PUFA so si izbrali gručo genov iz ''Aetherobacter fasciculatus'', katera je bila že predhodno testirana v ''E. coli'' za sintezo PUFA. Da bi zagotovili učinkovito izražanje genov PUFA, so optimizirali rabo kodonov, ki bi ustrezala ''S. fredii'', in hkrati so gruči genov dodali PPTazo, ki bi omogočala posttranslacijske modifikacije.

Sintetizirali so modul, ki se odziva na različne koncentracije dušika in kisika v okolju. Izbrali so si promotorja ''''glnK'''' in '''nifH''', ki sta endogena inducibilna promotorja S. fredii. Promotor glnK se odziva na nizke koncentracije dušika, promotor nifH pa se odziva na nizke koncentracije kisika. Regulacijski modul za sintezo PUFA je sestavljen tako, da sta pod promotorjem glnK zapisa za sgRNA-GFP in tracrRNA, pod promotorjem nifH pa zapisa za GFP in gruča genov za sintezo PUFA. Na drugi lokaciji na plazmidu je prisoten tudi konstitutivni promotor nuoA. Navzdol od promotorja nuoA se nahaj zapis za Cas12k. Posebnost Cas12k je da nima katalitske aktivnosti in da inhibira transkripcijo samo s fizično vezavo na tarčno DNA. Ko se v celici nastaja tako Cas12k kot tudi sgRNA za tarčno zaporedje, se ta povežeta in blokirata prepisovanje navzdol od vezave. Ko se v celici zniža koncentacija sgRNA, Cas12k oddisocira in s tem je prepisovanje navzdol spet omogočeno.

Cilj regulacije je da pride do prepisavanja sinteznih genov za PUFA samo ob visokih koncentracijah dušika in nizki koncentraciji kisika. Ob nizki koncentaciji dušika pride do prepisovanja nazdol od promotorja glnK, to sta sgRNA-GFP (njegova tarča je omenjeno zaporedje GFP zavzdol od nifH promotorja) in tracrRNA. Ta konstrukt se potem poveže s Cas12k. Ta se veže na zapis za GFP in s tem blokira prepisovanje genov za sintezo PUFA. Torej tudi ko je koncentracija kisika nizka in se s tem aktivira promotor nifH do prepisovanja genov za sintezo PUFA ne pride. Ob visoki koncentraciji kisika in nizki koncentraciji dušika (to predstavlja okolje preden S. fredii tvori simbiozo z rastlino) do prepisa sinteznih genov PUFA ne pride. Ob visoki koncentaciji dušika in kisika do prepisovanja navzdol od promotorjev glnK in nifH ne pride. Ob visoki koncentaciji dušika (ko dodamo gnojilo bogato z dušikom) in nizki koncentraciji kisika pride do prepisovanje genov za sintezo PUFA, saj ne pride do prepisovanja sgRNA-GFP in tracrRNA, tako da Cas12k ne more blokirati prepisovanja genov za sintezo PUFA. Prav tako je koncentracija kisika nizka, zato je nifH promotor sploh aktiven.
== Samomorilski mehanizem razlaga ==
Samomorilski mehanizem za S. fredii je zasnovan tako, da ko S. fredii pobegne ven iz modula v okolje s povišno koncentracijo dušika in kisika, naredi samomor. Mehanizem je zasnovan na sistemu toksin-antitoksin (vapC-vapB) in promotorjih nuoA, nifH in glnK. Na enem delu konstrukta nuoA kontrolira izražanje Cas12k, na drugem pa izražanje vapC. nifH kontrolira izražanje vapB. glnK pa kontrolira izražanje sgRNA za gen mCherry in tracrRNA. Različne kombinacije koncentracij dušika in kisika omogočajo preživetje, samo ob povišani koncentraciji dušika in hkrati kisika vodijo v samomor. Pri nizki koncentraciji dušika in kisika, nastaja VapB ter sgRNA-mCherry in tracrRNA. Hkrati se izraža Cas12k, ki se poveže z sgRNA-mCherry in tracrRNA, se veže na gen za mCherry in s tem blokira izražanje vapC. Pri nizki koncentracij dušika in povišani koncentracij kisika, vapB ne nastaja, izraža se sgRNA-mCherry in tracrRNA ter Cas12k, zato VapC ne nastaja. Pri povišani koncentracij dušika in nizki koncentracij kisika VapB in VapC ne nastajata. Pri povišani koncentracij dušika in povišani koncentracij kisika VapB ne nastaja, nastaja pa VapC, saj Cas12k ne more blokirati transkripcije vapC, saj sgRNA-mCherrz in tracrRNA ne nastajata. Posledično se koncentracija VapB v celici poviša, kar vodi v smrt pobegle celice, to je izven okolja modula.

Eden izmed testov, ki so ga naredili, da bi potrdili uspešnost samomorilskega mehanizma je bil merjenje spremembe OD600 bakterij v suspenziji pri hiperoksičnih pogojih in spremenljivo koncentracijo amonijevega klorida, kot vira dušika. Po desetih urah so opazili padajoč trend v gojiščih z amonijevim kloridom. Padajoč trend je še bolj očiten, ko se poveča koncentracija amonijevega klorida. Zaključili so da je samomorilski mehanizem pod temi testnimi pogoji, reguliran s koncentracijo dušika in da deluje.
== Transport DHA in EPA v sojo ==
Njihov končni cilj je bil tudi transportirati DHA in EPA izven koreninskih nodulov v sojo. Za transport PUFA je bil že pred tem odkrit eksportni sistem, ki bi to omogočal, za gram negativne bakterije. S. fredii je tudi gram negativna bakterija. Ena študija se je ukvarjala z fiziološkim odzivom gram negativne bakterije Acinetobacter baumannii na PUFA in odkrili so povečano ekspresijo gena adeJ, ki je komponenta črpalke adeIJK, ki lahko transportira več različnih učinkovin ven iz celice. Ugotovili so da delecija gena adeJ poveča dovzetnost za PUFA. Podobno vlogo kot ima črpalka adeIJK, ima črpalka emhABC iz Pseudomonas fluorescens, ki kontrolira homeostazo lipidov, tako da izčrpava dolgo-verižne maščobne kisline. Razultata kažeta na to, da obstajajo v gram negativnih bakterijah določeni transportni proteini, ki bi omogočali transport DHA in EPA iz celice. Torej če bi povečali njihovo izražanje, bi lahko transportirali tudi DHA in EPA v sojo.
== Viri in literatura ==
[1] CAU-China: N. Factory https://2024.igem.wiki/cau-china/ (pridobljeno 13. 4. 2025)

CAU-China: Nodulska tovarna DHA in EPA

2025-04-13T15:54:23Z

Luka Fink:

[https://2024.igem.wiki/cau-china/ N. Factory (Nodulska tovarna DHA in EPA)] je iGEM projekt skupine CAU-China iz Kitajske iz leta 2024.
== UVOD ==
Človeštvo že dolga časa poizkuša izboljšati hranilno vrednost hrane na razno razne načine, da bi se spopadli s problemi kot so podhranjenost v nerazvitih državah in omejenost določenih virov hrane. Cilj te skupine je bil proizvajati DHA in EPA v nodulih z genetsko spremenjenimi simbiontskimi bakterijami, z namenom povečati hranilno vrednost gojenih rastlin, še posebaj soje.

Noduli so majhne kroglaste tvorbe, ki se razvijejo na rastlinskih koreninah ali steblih. V nodulih živijo simbionstske bakterije, ki iz zraka vežejo dušik. Različne rastline razvijejo simbiozo z različnimi bakterijami. Rastilne iz družine metuljnic (soja, fižol, grah, leča) živijo v simbiozi z bakterijami iz rodu ''Rhizobium''.

Vcepitev ''Rhizobium'' prinaša še eno prednost in to je obogatitev zemlje z dušikovimi spojinami, ki jih rastline lahko uporaljajo. Dolgoročna uporaba kemičnih gnojil, lahko privede do nabiranja določenih kemikalij v zemlji, kar vodi v zmanjšanje števila koristnih bakterij. Namesto kemičnih gnojil, bi lahko uporabljali mikrobna gnolija, ki vsebujejo ''Rhizobium'', in bi tako izboljšali kakost zemlje in zmanjšali negativne učinke kemičnih gnojil.
== Izvedba projekta ==
Izbrali so si bakterijo ''Sinorhizobium fredii'' CCBAU45436. V njej so vzpostavili niz regulacijskih modulov, ki se odzivajo na spremembne v koncentraciji dušika in kisika. Hkrati so izbrali gene, ki kodirajo za PUFA sintazo, ki bi proizvajala željena produkta DHA in EPA ter hkrati bi nastajali še ostali stranski produkti). Za izboljšanje učinkovitosti so reprogramirali metabolizem z uravnavanjem izražanja določenih genov. Zasnovali so samomorilski mehanizem, če ''S. fredii'' pobegne. Regulacijski moduli so odgovorni za kontrolo izražanja genov za sintezo PUFA (poly-unsaturated fatty acid) in kontrolo samomorilskega mehanizma.
== Delecija PHB ==
PHB (poli-β-hidroksibutirat) je produkt metabolizma, ki lahko služi kot zaloga energije, in nastaja v ''S. fredii'' v veliki meri. Odločili so se da bodo izbrisali gen ''phaC2'', ki kodira ključni encim za sintezo PHB. Delecijo so naredili s homologno rekombinacijo z dvojno zamenjavo. V odsotnosti gena ''phaC2'' naj bi se v celici povečala koncentracija acetil-CoA, ki naj bi služil kot prekursor za sintezo PUFA.

Delecijo so potrdili s PCR na osnovi kolonije. Opazili so da je ''S. fredii'' spremenil fenotip, ko so ga gojili na trdem gojišču. In sicer pri ''∆phaC2'' so kolonije rumene, pri wt pa bele. Testirali so še ali ima ''∆phaC2'' vpliv na sposobnost fiksiranja dušika, ko so mutanto vcepili v rastlino Jidou 17. Inkubacija je potekala 15 dni. Analizirali so nodule, ki so zrasli na rastlini, ki je bila vcepljena z wt in nodule, ki so zrasli na rastlini, ki je bila vcepljena z mutanto ter ugotovili da ni vidne razlike med wt in mutanto. Analizirali so še vsebnost klorofila in suhe teže nadzemeljskih delov rastline in niso našli nobene statistično signifikantne razlike. Torej ''∆phaC2'' ne vpliva na rast rastline.
== Regulacija in sinteza modula ==
Problem pri sintezi PUFA je ta, da mora potekati v anaerobnem okolju, drugače lahko prihaja do oksidacije PUFA. Zato ''S. fredii'' predstavlja idealno okolje za sintezo. Za sintezo PUFA so si izbrali gručo genov iz ''Aetherobacter fasciculatus'', katera je bila že predhodno testirana v ''E. coli'' za sintezo PUFA. Da bi zagotovili učinkovito izražanje genov PUFA, so optimizirali rabo kodonov, ki bi ustrezala ''S. fredii'', in hkrati so gruči genov dodali PPTazo, ki bi omogočala posttranslacijske modifikacije.

Sintetizirali so modul, ki se odziva na različne koncentracije dušika in kisika v okolju. Izbrali so si promotorja '''glnK''' in '''nifH''', ki sta endogena inducibilna promotorja S. fredii. Promotor glnK se odziva na nizke koncentracije dušika, promotor nifH pa se odziva na nizke koncentracije kisika. Regulacijski modul za sintezo PUFA je sestavljen tako, da sta pod promotorjem glnK zapisa za sgRNA-GFP in tracrRNA, pod promotorjem nifH pa zapisa za GFP in gruča genov za sintezo PUFA. Na drugi lokaciji na plazmidu je prisoten tudi konstitutivni promotor nuoA. Navzdol od promotorja nuoA se nahaj zapis za Cas12k. Posebnost Cas12k je da nima katalitske aktivnosti in da inhibira transkripcijo samo s fizično vezavo na tarčno DNA. Ko se v celici nastaja tako Cas12k kot tudi sgRNA za tarčno zaporedje, se ta povežeta in blokirata prepisovanje navzdol od vezave. Ko se v celici zniža koncentacija sgRNA, Cas12k oddisocira in s tem je prepisovanje navzdol spet omogočeno.

Cilj regulacije je da pride do prepisavanja sinteznih genov za PUFA samo ob visokih koncentracijah dušika in nizki koncentraciji kisika. Ob nizki koncentaciji dušika pride do prepisovanja nazdol od promotorja glnK, to sta sgRNA-GFP (njegova tarča je omenjeno zaporedje GFP zavzdol od nifH promotorja) in tracrRNA. Ta konstrukt se potem poveže s Cas12k. Ta se veže na zapis za GFP in s tem blokira prepisovanje genov za sintezo PUFA. Torej tudi ko je koncentracija kisika nizka in se s tem aktivira promotor nifH do prepisovanja genov za sintezo PUFA ne pride. Ob visoki koncentraciji kisika in nizki koncentraciji dušika (to predstavlja okolje preden S. fredii tvori simbiozo z rastlino) do prepisa sinteznih genov PUFA ne pride. Ob visoki koncentaciji dušika in kisika do prepisovanja navzdol od promotorjev glnK in nifH ne pride. Ob visoki koncentaciji dušika (ko dodamo gnojilo bogato z dušikom) in nizki koncentraciji kisika pride do prepisovanje genov za sintezo PUFA, saj ne pride do prepisovanja sgRNA-GFP in tracrRNA, tako da Cas12k ne more blokirati prepisovanja genov za sintezo PUFA. Prav tako je koncentracija kisika nizka, zato je nifH promotor sploh aktiven.
== Samomorilski mehanizem razlaga ==
Samomorilski mehanizem za S. fredii je zasnovan tako, da ko S. fredii pobegne ven iz modula v okolje s povišno koncentracijo dušika in kisika, naredi samomor. Mehanizem je zasnovan na sistemu toksin-antitoksin (vapC-vapB) in promotorjih nuoA, nifH in glnK. Na enem delu konstrukta nuoA kontrolira izražanje Cas12k, na drugem pa izražanje vapC. nifH kontrolira izražanje vapB. glnK pa kontrolira izražanje sgRNA za gen mCherry in tracrRNA. Različne kombinacije koncentracij dušika in kisika omogočajo preživetje, samo ob povišani koncentraciji dušika in hkrati kisika vodijo v samomor. Pri nizki koncentraciji dušika in kisika, nastaja VapB ter sgRNA-mCherry in tracrRNA. Hkrati se izraža Cas12k, ki se poveže z sgRNA-mCherry in tracrRNA, se veže na gen za mCherry in s tem blokira izražanje vapC. Pri nizki koncentracij dušika in povišani koncentracij kisika, vapB ne nastaja, izraža se sgRNA-mCherry in tracrRNA ter Cas12k, zato VapC ne nastaja. Pri povišani koncentracij dušika in nizki koncentracij kisika VapB in VapC ne nastajata. Pri povišani koncentracij dušika in povišani koncentracij kisika VapB ne nastaja, nastaja pa VapC, saj Cas12k ne more blokirati transkripcije vapC, saj sgRNA-mCherrz in tracrRNA ne nastajata. Posledično se koncentracija VapB v celici poviša, kar vodi v smrt pobegle celice, to je izven okolja modula.

Eden izmed testov, ki so ga naredili, da bi potrdili uspešnost samomorilskega mehanizma je bil merjenje spremembe OD600 bakterij v suspenziji pri hiperoksičnih pogojih in spremenljivo koncentracijo amonijevega klorida, kot vira dušika. Po desetih urah so opazili padajoč trend v gojiščih z amonijevim kloridom. Padajoč trend je še bolj očiten, ko se poveča koncentracija amonijevega klorida. Zaključili so da je samomorilski mehanizem pod temi testnimi pogoji, reguliran s koncentracijo dušika in da deluje.
== Transport DHA in EPA v sojo ==
Njihov končni cilj je bil tudi transportirati DHA in EPA izven koreninskih nodulov v sojo. Za transport PUFA je bil že pred tem odkrit eksportni sistem, ki bi to omogočal, za gram negativne bakterije. S. fredii je tudi gram negativna bakterija. Ena študija se je ukvarjala z fiziološkim odzivom gram negativne bakterije Acinetobacter baumannii na PUFA in odkrili so povečano ekspresijo gena adeJ, ki je komponenta črpalke adeIJK, ki lahko transportira več različnih učinkovin ven iz celice. Ugotovili so da delecija gena adeJ poveča dovzetnost za PUFA. Podobno vlogo kot ima črpalka adeIJK, ima črpalka emhABC iz Pseudomonas fluorescens, ki kontrolira homeostazo lipidov, tako da izčrpava dolgo-verižne maščobne kisline. Razultata kažeta na to, da obstajajo v gram negativnih bakterijah določeni transportni proteini, ki bi omogočali transport DHA in EPA iz celice. Torej če bi povečali njihovo izražanje, bi lahko transportirali tudi DHA in EPA v sojo.
== Viri in literatura ==
[1] CAU-China: N. Factory https://2024.igem.wiki/cau-china/ (pridobljeno 13. 4. 2025)

CAU-China: Nodulska tovarna DHA in EPA

2025-04-13T15:46:55Z

Luka Fink:

[https://2024.igem.wiki/cau-china/ N. Factory (Nodulska tovarna DHA in EPA)] je iGEM projekt skupine CAU-China iz Kitajske iz leta 2024.
== UVOD ==
Človeštvo že dolga časa poizkuša izboljšati hranilno vrednost hrane na razno razne načine, da bi se spopadli s problemi kot so podhranjenost v nerazvitih državah in omejenost določenih virov hrane. Cilj te skupine je bil proizvajati DHA in EPA v nodulih z genetsko spremenjenimi simbiontskimi bakterijami, z namenom povečati hranilno vrednost gojenih rastlin, še posebaj soje.

Noduli so majhne kroglaste tvorbe, ki se razvijejo na rastlinskih koreninah ali steblih. V nodulih živijo simbionstske bakterije, ki iz zraka vežejo dušik. Različne rastline razvijejo simbiozo z različnimi bakterijami. Rastilne iz družine metuljnic (soja, fižol, grah, leča) živijo v simbiozi z bakterijami iz rodu Rhizobium.

Vcepitev Rhizobium prinaša še eno prednost in to je obogatitev zemlje z dušikovimi spojinami, ki jih rastline lahko uporaljajo. Dolgoročna uporaba kemičnih gnojil, lahko privede do nabiranja določenih kemikalij v zemlji, kar vodi v zmanjšanje števila koristnih bakterij. Namesto kemičnih gnojil, bi lahko uporabljali mikrobna gnolija, ki vsebujejo Rhizobium, in bi tako izboljšali kakost zemlje in zmanjšali negativne učinke kemičnih gnojil.
== Izvedba projekta ==
Izbrali so si bakterijo Sinorhizobium fredii CCBAU45436. V njej so vzpostavili niz regulacijskih modulov, ki se odzivajo na spremembne v koncentraciji dušika in kisika. Hkrati so izbrali gene, ki kodirajo za PUFA sintazo in dipeptidil aldehid, ki bi proizvajala željena produkta DHA in EPA (ter ostale stranske produkte). Za izboljšanje učinkovitosti so reprogramirali metabolizem z uravnavanjem izražanja določenih genov. Zasnovali so samomorilski mehanizem, če S. fredii pobegne. Regulacijski moduli so odgovorni za kontrolo izražanja genov za sintezo PUFA (poly-unsaturated fatty acid) in kontrolo samomorilskega mehanizma.
== Delecija PHB ==
PHB (poli-β-hidroksibutirat) je produkt metabolizma, ki lahko služi kot zaloga energije, in nastaja v S. fredii v veliki meri. Odločili so se da bodo izbrisali gen phaC2, ki kodira ključni encim za sintezo PHB. Delecijo so naredili s homologno rekombinacijo z dvojno zamenjavo. V odsotnosti gena phaC2 naj bi se v celici povečala koncentracija acetil-CoA, ki naj bi služil kot prekursor za sintezo PUFA.

Delecijo so potrdili s PCR na osnovi kolonije. Opazili so da se je S. fredii spremenil fenotip, ko so ga gojili na trdem gojišču. In sicer pri ∆phaC2 so kolonije rumene, pri wt pa bele. Testirali so še ali ima ∆phaC2 vpliv na sposobnost fiksiranja dušika, ko so mutanto vcepili v rastlino Jidou 17. Inkubacija je potekala 15 dni. Analizirali so nodule, ki so zrasli na rastlini, ki je bila vcepljena z wt in nodule, ki so zrasli na rastlini, ki je bila vcepljena z mutanto ter ugotovili da ni vidne razlike med wt in mutanto. Analizirali so še vsebnost klorofila in suhe teže nadzemeljskih delov rastline in niso našli nobene statistično signifikantne razlike. Torej ∆phaC2 ne vpliva na rast rastline.
== Regulacija in sinteza modula ==
Problem pri sintezi PUFA je ta, da mora potekati v anaerobnem okolju, drugače lahko prihaja do oksidacije PUFA. Zato bi lahko S. fredii predstavljal idealno okolje za sintezo. Za sintezo PUFA so si izbrali gručo genov iz Aetherobacter fasciculatus, katera je bila že predhodno testirana v E. coli za sintezo PUFA. Da bi zagotovili učinkovito izražanje genov PUFA, so optimizirali rabo kodonov, ki bi ustrezala S. fredii, in hkrati so gruči genov dodali PPTazo, ki bi omogočala posttranslacijske modifikacije.

Sintetizirali so modul, ki se odziva na različne koncentracije dušika in kisika v okolju. Izbrali so si promotorja '''glnK''' in '''nifH''', ki sta endogena inducibilna promotorja S. fredii. Promotor glnK se odziva na nizke koncentracije dušika, promotor nifH pa se odziva na nizke koncentracije kisika. Regulacijski modul za sintezo PUFA je sestavljen tako, da sta pod promotorjem glnK zapisa za sgRNA-GFP in tracrRNA, pod promotorjem nifH pa zapisa za GFP in gruča genov za sintezo PUFA. Na drugi lokaciji na plazmidu je prisoten tudi konstitutivni promotor nuoA. Navzdol od promotorja nuoA se nahaj zapis za Cas12k. Posebnost Cas12k je da nima katalitske aktivnosti in da inhibira transkripcijo samo s fizično vezavo na tarčno DNA. Ko se v celici nastaja tako Cas12k kot tudi sgRNA za tarčno zaporedje, se ta povežeta in blokirata prepisovanje navzdol od vezave. Ko se v celici zniža koncentacija sgRNA, Cas12k oddisocira in s tem je prepisovanje navzdol spet omogočeno.

Cilj regulacije je da pride do prepisavanja sinteznih genov za PUFA samo ob visokih koncentracijah dušika in nizki koncentraciji kisika. Ob nizki koncentaciji dušika pride do prepisovanja nazdol od promotorja glnK, to sta sgRNA-GFP (njegova tarča je omenjeno zaporedje GFP zavzdol od nifH promotorja) in tracrRNA. Ta konstrukt se potem poveže s Cas12k. Ta se veže na zapis za GFP in s tem blokira prepisovanje genov za sintezo PUFA. Torej tudi ko je koncentracija kisika nizka in se s tem aktivira promotor nifH do prepisovanja genov za sintezo PUFA ne pride. Ob visoki koncentraciji kisika in nizki koncentraciji dušika (to predstavlja okolje preden S. fredii tvori simbiozo z rastlino) do prepisa sinteznih genov PUFA ne pride. Ob visoki koncentaciji dušika in kisika do prepisovanja navzdol od promotorjev glnK in nifH ne pride. Ob visoki koncentaciji dušika (ko dodamo gnojilo bogato z dušikom) in nizki koncentraciji kisika pride do prepisovanje genov za sintezo PUFA, saj ne pride do prepisovanja sgRNA-GFP in tracrRNA, tako da Cas12k ne more blokirati prepisovanja genov za sintezo PUFA. Prav tako je koncentracija kisika nizka, zato je nifH promotor sploh aktiven.
== Samomorilski mehanizem razlaga ==
Samomorilski mehanizem za S. fredii je zasnovan tako, da ko S. fredii pobegne ven iz modula v okolje s povišno koncentracijo dušika in kisika, naredi samomor. Mehanizem je zasnovan na sistemu toksin-antitoksin (vapC-vapB) in promotorjih nuoA, nifH in glnK. Na enem delu konstrukta nuoA kontrolira izražanje Cas12k, na drugem pa izražanje vapC. nifH kontrolira izražanje vapB. glnK pa kontrolira izražanje sgRNA za gen mCherry in tracrRNA. Različne kombinacije koncentracij dušika in kisika omogočajo preživetje, samo ob povišani koncentraciji dušika in hkrati kisika vodijo v samomor. Pri nizki koncentraciji dušika in kisika, nastaja VapB ter sgRNA-mCherry in tracrRNA. Hkrati se izraža Cas12k, ki se poveže z sgRNA-mCherry in tracrRNA, se veže na gen za mCherry in s tem blokira izražanje vapC. Pri nizki koncentracij dušika in povišani koncentracij kisika, vapB ne nastaja, izraža se sgRNA-mCherry in tracrRNA ter Cas12k, zato VapC ne nastaja. Pri povišani koncentracij dušika in nizki koncentracij kisika VapB in VapC ne nastajata. Pri povišani koncentracij dušika in povišani koncentracij kisika VapB ne nastaja, nastaja pa VapC, saj Cas12k ne more blokirati transkripcije vapC, saj sgRNA-mCherrz in tracrRNA ne nastajata. Posledično se koncentracija VapB v celici poviša, kar vodi v smrt pobegle celice, to je izven okolja modula.

Eden izmed testov, ki so ga naredili, da bi potrdili uspešnost samomorilskega mehanizma je bil merjenje spremembe OD600 bakterij v suspenziji pri hiperoksičnih pogojih in spremenljivo koncentracijo amonijevega klorida, kot vira dušika. Po desetih urah so opazili padajoč trend v gojiščih z amonijevim kloridom. Padajoč trend je še bolj očiten, ko se poveča koncentracija amonijevega klorida. Zaključili so da je samomorilski mehanizem pod temi testnimi pogoji, reguliran s koncentracijo dušika in da deluje.
== Transport DHA in EPA v sojo ==
Njihov končni cilj je bil tudi transportirati DHA in EPA izven koreninskih nodulov v sojo. Za transport PUFA je bil že pred tem odkrit eksportni sistem, ki bi to omogočal, za gram negativne bakterije. S. fredii je tudi gram negativna bakterija. Ena študija se je ukvarjala z fiziološkim odzivom gram negativne bakterije Acinetobacter baumannii na PUFA in odkrili so povečano ekspresijo gena adeJ, ki je komponenta črpalke adeIJK, ki lahko transportira več različnih učinkovin ven iz celice. Ugotovili so da delecija gena adeJ poveča dovzetnost za PUFA. Podobno vlogo kot ima črpalka adeIJK, ima črpalka emhABC iz Pseudomonas fluorescens, ki kontrolira homeostazo lipidov, tako da izčrpava dolgo-verižne maščobne kisline. Razultata kažeta na to, da obstajajo v gram negativnih bakterijah določeni transportni proteini, ki bi omogočali transport DHA in EPA iz celice. Torej če bi povečali njihovo izražanje, bi lahko transportirali tudi DHA in EPA v sojo.
== Viri in literatura ==
[1] CAU-China: N. Factory https://2024.igem.wiki/cau-china/ (pridobljeno 13. 4. 2025)

CAU-China: Nodulska tovarna DHA in EPA

2025-04-13T15:46:35Z

Luka Fink:

[https://2024.igem.wiki/cau-china/ N. Factory (Nodulska tovarna DHA in EPA] je iGEM projekt skupine CAU-China iz Kitajske iz leta 2024.
== UVOD ==
Človeštvo že dolga časa poizkuša izboljšati hranilno vrednost hrane na razno razne načine, da bi se spopadli s problemi kot so podhranjenost v nerazvitih državah in omejenost določenih virov hrane. Cilj te skupine je bil proizvajati DHA in EPA v nodulih z genetsko spremenjenimi simbiontskimi bakterijami, z namenom povečati hranilno vrednost gojenih rastlin, še posebaj soje.

Noduli so majhne kroglaste tvorbe, ki se razvijejo na rastlinskih koreninah ali steblih. V nodulih živijo simbionstske bakterije, ki iz zraka vežejo dušik. Različne rastline razvijejo simbiozo z različnimi bakterijami. Rastilne iz družine metuljnic (soja, fižol, grah, leča) živijo v simbiozi z bakterijami iz rodu Rhizobium.

Vcepitev Rhizobium prinaša še eno prednost in to je obogatitev zemlje z dušikovimi spojinami, ki jih rastline lahko uporaljajo. Dolgoročna uporaba kemičnih gnojil, lahko privede do nabiranja določenih kemikalij v zemlji, kar vodi v zmanjšanje števila koristnih bakterij. Namesto kemičnih gnojil, bi lahko uporabljali mikrobna gnolija, ki vsebujejo Rhizobium, in bi tako izboljšali kakost zemlje in zmanjšali negativne učinke kemičnih gnojil.
== Izvedba projekta ==
Izbrali so si bakterijo Sinorhizobium fredii CCBAU45436. V njej so vzpostavili niz regulacijskih modulov, ki se odzivajo na spremembne v koncentraciji dušika in kisika. Hkrati so izbrali gene, ki kodirajo za PUFA sintazo in dipeptidil aldehid, ki bi proizvajala željena produkta DHA in EPA (ter ostale stranske produkte). Za izboljšanje učinkovitosti so reprogramirali metabolizem z uravnavanjem izražanja določenih genov. Zasnovali so samomorilski mehanizem, če S. fredii pobegne. Regulacijski moduli so odgovorni za kontrolo izražanja genov za sintezo PUFA (poly-unsaturated fatty acid) in kontrolo samomorilskega mehanizma.
== Delecija PHB ==
PHB (poli-β-hidroksibutirat) je produkt metabolizma, ki lahko služi kot zaloga energije, in nastaja v S. fredii v veliki meri. Odločili so se da bodo izbrisali gen phaC2, ki kodira ključni encim za sintezo PHB. Delecijo so naredili s homologno rekombinacijo z dvojno zamenjavo. V odsotnosti gena phaC2 naj bi se v celici povečala koncentracija acetil-CoA, ki naj bi služil kot prekursor za sintezo PUFA.

Delecijo so potrdili s PCR na osnovi kolonije. Opazili so da se je S. fredii spremenil fenotip, ko so ga gojili na trdem gojišču. In sicer pri ∆phaC2 so kolonije rumene, pri wt pa bele. Testirali so še ali ima ∆phaC2 vpliv na sposobnost fiksiranja dušika, ko so mutanto vcepili v rastlino Jidou 17. Inkubacija je potekala 15 dni. Analizirali so nodule, ki so zrasli na rastlini, ki je bila vcepljena z wt in nodule, ki so zrasli na rastlini, ki je bila vcepljena z mutanto ter ugotovili da ni vidne razlike med wt in mutanto. Analizirali so še vsebnost klorofila in suhe teže nadzemeljskih delov rastline in niso našli nobene statistično signifikantne razlike. Torej ∆phaC2 ne vpliva na rast rastline.
== Regulacija in sinteza modula ==
Problem pri sintezi PUFA je ta, da mora potekati v anaerobnem okolju, drugače lahko prihaja do oksidacije PUFA. Zato bi lahko S. fredii predstavljal idealno okolje za sintezo. Za sintezo PUFA so si izbrali gručo genov iz Aetherobacter fasciculatus, katera je bila že predhodno testirana v E. coli za sintezo PUFA. Da bi zagotovili učinkovito izražanje genov PUFA, so optimizirali rabo kodonov, ki bi ustrezala S. fredii, in hkrati so gruči genov dodali PPTazo, ki bi omogočala posttranslacijske modifikacije.

Sintetizirali so modul, ki se odziva na različne koncentracije dušika in kisika v okolju. Izbrali so si promotorja '''glnK''' in '''nifH''', ki sta endogena inducibilna promotorja S. fredii. Promotor glnK se odziva na nizke koncentracije dušika, promotor nifH pa se odziva na nizke koncentracije kisika. Regulacijski modul za sintezo PUFA je sestavljen tako, da sta pod promotorjem glnK zapisa za sgRNA-GFP in tracrRNA, pod promotorjem nifH pa zapisa za GFP in gruča genov za sintezo PUFA. Na drugi lokaciji na plazmidu je prisoten tudi konstitutivni promotor nuoA. Navzdol od promotorja nuoA se nahaj zapis za Cas12k. Posebnost Cas12k je da nima katalitske aktivnosti in da inhibira transkripcijo samo s fizično vezavo na tarčno DNA. Ko se v celici nastaja tako Cas12k kot tudi sgRNA za tarčno zaporedje, se ta povežeta in blokirata prepisovanje navzdol od vezave. Ko se v celici zniža koncentacija sgRNA, Cas12k oddisocira in s tem je prepisovanje navzdol spet omogočeno.

Cilj regulacije je da pride do prepisavanja sinteznih genov za PUFA samo ob visokih koncentracijah dušika in nizki koncentraciji kisika. Ob nizki koncentaciji dušika pride do prepisovanja nazdol od promotorja glnK, to sta sgRNA-GFP (njegova tarča je omenjeno zaporedje GFP zavzdol od nifH promotorja) in tracrRNA. Ta konstrukt se potem poveže s Cas12k. Ta se veže na zapis za GFP in s tem blokira prepisovanje genov za sintezo PUFA. Torej tudi ko je koncentracija kisika nizka in se s tem aktivira promotor nifH do prepisovanja genov za sintezo PUFA ne pride. Ob visoki koncentraciji kisika in nizki koncentraciji dušika (to predstavlja okolje preden S. fredii tvori simbiozo z rastlino) do prepisa sinteznih genov PUFA ne pride. Ob visoki koncentaciji dušika in kisika do prepisovanja navzdol od promotorjev glnK in nifH ne pride. Ob visoki koncentaciji dušika (ko dodamo gnojilo bogato z dušikom) in nizki koncentraciji kisika pride do prepisovanje genov za sintezo PUFA, saj ne pride do prepisovanja sgRNA-GFP in tracrRNA, tako da Cas12k ne more blokirati prepisovanja genov za sintezo PUFA. Prav tako je koncentracija kisika nizka, zato je nifH promotor sploh aktiven.
== Samomorilski mehanizem razlaga ==
Samomorilski mehanizem za S. fredii je zasnovan tako, da ko S. fredii pobegne ven iz modula v okolje s povišno koncentracijo dušika in kisika, naredi samomor. Mehanizem je zasnovan na sistemu toksin-antitoksin (vapC-vapB) in promotorjih nuoA, nifH in glnK. Na enem delu konstrukta nuoA kontrolira izražanje Cas12k, na drugem pa izražanje vapC. nifH kontrolira izražanje vapB. glnK pa kontrolira izražanje sgRNA za gen mCherry in tracrRNA. Različne kombinacije koncentracij dušika in kisika omogočajo preživetje, samo ob povišani koncentraciji dušika in hkrati kisika vodijo v samomor. Pri nizki koncentraciji dušika in kisika, nastaja VapB ter sgRNA-mCherry in tracrRNA. Hkrati se izraža Cas12k, ki se poveže z sgRNA-mCherry in tracrRNA, se veže na gen za mCherry in s tem blokira izražanje vapC. Pri nizki koncentracij dušika in povišani koncentracij kisika, vapB ne nastaja, izraža se sgRNA-mCherry in tracrRNA ter Cas12k, zato VapC ne nastaja. Pri povišani koncentracij dušika in nizki koncentracij kisika VapB in VapC ne nastajata. Pri povišani koncentracij dušika in povišani koncentracij kisika VapB ne nastaja, nastaja pa VapC, saj Cas12k ne more blokirati transkripcije vapC, saj sgRNA-mCherrz in tracrRNA ne nastajata. Posledično se koncentracija VapB v celici poviša, kar vodi v smrt pobegle celice, to je izven okolja modula.

Eden izmed testov, ki so ga naredili, da bi potrdili uspešnost samomorilskega mehanizma je bil merjenje spremembe OD600 bakterij v suspenziji pri hiperoksičnih pogojih in spremenljivo koncentracijo amonijevega klorida, kot vira dušika. Po desetih urah so opazili padajoč trend v gojiščih z amonijevim kloridom. Padajoč trend je še bolj očiten, ko se poveča koncentracija amonijevega klorida. Zaključili so da je samomorilski mehanizem pod temi testnimi pogoji, reguliran s koncentracijo dušika in da deluje.
== Transport DHA in EPA v sojo ==
Njihov končni cilj je bil tudi transportirati DHA in EPA izven koreninskih nodulov v sojo. Za transport PUFA je bil že pred tem odkrit eksportni sistem, ki bi to omogočal, za gram negativne bakterije. S. fredii je tudi gram negativna bakterija. Ena študija se je ukvarjala z fiziološkim odzivom gram negativne bakterije Acinetobacter baumannii na PUFA in odkrili so povečano ekspresijo gena adeJ, ki je komponenta črpalke adeIJK, ki lahko transportira več različnih učinkovin ven iz celice. Ugotovili so da delecija gena adeJ poveča dovzetnost za PUFA. Podobno vlogo kot ima črpalka adeIJK, ima črpalka emhABC iz Pseudomonas fluorescens, ki kontrolira homeostazo lipidov, tako da izčrpava dolgo-verižne maščobne kisline. Razultata kažeta na to, da obstajajo v gram negativnih bakterijah določeni transportni proteini, ki bi omogočali transport DHA in EPA iz celice. Torej če bi povečali njihovo izražanje, bi lahko transportirali tudi DHA in EPA v sojo.
== Viri in literatura ==
[1] CAU-China: N. Factory https://2024.igem.wiki/cau-china/ (pridobljeno 13. 4. 2025)

CAU-China: Nodulska tovarna DHA in EPA

2025-04-13T15:45:14Z

Luka Fink:

[https://2024.igem.wiki/cau-china/] je iGEM projekt skupine CAU-China iz Kitajske iz leta 2024.
== UVOD ==
Človeštvo že dolga časa poizkuša izboljšati hranilno vrednost hrane na razno razne načine, da bi se spopadli s problemi kot so podhranjenost v nerazvitih državah in omejenost določenih virov hrane. Cilj te skupine je bil proizvajati DHA in EPA v nodulih z genetsko spremenjenimi simbiontskimi bakterijami, z namenom povečati hranilno vrednost gojenih rastlin, še posebaj soje.

Noduli so majhne kroglaste tvorbe, ki se razvijejo na rastlinskih koreninah ali steblih. V nodulih živijo simbionstske bakterije, ki iz zraka vežejo dušik. Različne rastline razvijejo simbiozo z različnimi bakterijami. Rastilne iz družine metuljnic (soja, fižol, grah, leča) živijo v simbiozi z bakterijami iz rodu Rhizobium.

Vcepitev Rhizobium prinaša še eno prednost in to je obogatitev zemlje z dušikovimi spojinami, ki jih rastline lahko uporaljajo. Dolgoročna uporaba kemičnih gnojil, lahko privede do nabiranja določenih kemikalij v zemlji, kar vodi v zmanjšanje števila koristnih bakterij. Namesto kemičnih gnojil, bi lahko uporabljali mikrobna gnolija, ki vsebujejo Rhizobium, in bi tako izboljšali kakost zemlje in zmanjšali negativne učinke kemičnih gnojil.
== Izvedba projekta ==
Izbrali so si bakterijo Sinorhizobium fredii CCBAU45436. V njej so vzpostavili niz regulacijskih modulov, ki se odzivajo na spremembne v koncentraciji dušika in kisika. Hkrati so izbrali gene, ki kodirajo za PUFA sintazo in dipeptidil aldehid, ki bi proizvajala željena produkta DHA in EPA (ter ostale stranske produkte). Za izboljšanje učinkovitosti so reprogramirali metabolizem z uravnavanjem izražanja določenih genov. Zasnovali so samomorilski mehanizem, če S. fredii pobegne. Regulacijski moduli so odgovorni za kontrolo izražanja genov za sintezo PUFA (poly-unsaturated fatty acid) in kontrolo samomorilskega mehanizma.
== Delecija PHB ==
PHB (poli-β-hidroksibutirat) je produkt metabolizma, ki lahko služi kot zaloga energije, in nastaja v S. fredii v veliki meri. Odločili so se da bodo izbrisali gen phaC2, ki kodira ključni encim za sintezo PHB. Delecijo so naredili s homologno rekombinacijo z dvojno zamenjavo. V odsotnosti gena phaC2 naj bi se v celici povečala koncentracija acetil-CoA, ki naj bi služil kot prekursor za sintezo PUFA.

Delecijo so potrdili s PCR na osnovi kolonije. Opazili so da se je S. fredii spremenil fenotip, ko so ga gojili na trdem gojišču. In sicer pri ∆phaC2 so kolonije rumene, pri wt pa bele. Testirali so še ali ima ∆phaC2 vpliv na sposobnost fiksiranja dušika, ko so mutanto vcepili v rastlino Jidou 17. Inkubacija je potekala 15 dni. Analizirali so nodule, ki so zrasli na rastlini, ki je bila vcepljena z wt in nodule, ki so zrasli na rastlini, ki je bila vcepljena z mutanto ter ugotovili da ni vidne razlike med wt in mutanto. Analizirali so še vsebnost klorofila in suhe teže nadzemeljskih delov rastline in niso našli nobene statistično signifikantne razlike. Torej ∆phaC2 ne vpliva na rast rastline.
== Regulacija in sinteza modula ==
Problem pri sintezi PUFA je ta, da mora potekati v anaerobnem okolju, drugače lahko prihaja do oksidacije PUFA. Zato bi lahko S. fredii predstavljal idealno okolje za sintezo. Za sintezo PUFA so si izbrali gručo genov iz Aetherobacter fasciculatus, katera je bila že predhodno testirana v E. coli za sintezo PUFA. Da bi zagotovili učinkovito izražanje genov PUFA, so optimizirali rabo kodonov, ki bi ustrezala S. fredii, in hkrati so gruči genov dodali PPTazo, ki bi omogočala posttranslacijske modifikacije.

Sintetizirali so modul, ki se odziva na različne koncentracije dušika in kisika v okolju. Izbrali so si promotorja '''glnK''' in '''nifH''', ki sta endogena inducibilna promotorja S. fredii. Promotor glnK se odziva na nizke koncentracije dušika, promotor nifH pa se odziva na nizke koncentracije kisika. Regulacijski modul za sintezo PUFA je sestavljen tako, da sta pod promotorjem glnK zapisa za sgRNA-GFP in tracrRNA, pod promotorjem nifH pa zapisa za GFP in gruča genov za sintezo PUFA. Na drugi lokaciji na plazmidu je prisoten tudi konstitutivni promotor nuoA. Navzdol od promotorja nuoA se nahaj zapis za Cas12k. Posebnost Cas12k je da nima katalitske aktivnosti in da inhibira transkripcijo samo s fizično vezavo na tarčno DNA. Ko se v celici nastaja tako Cas12k kot tudi sgRNA za tarčno zaporedje, se ta povežeta in blokirata prepisovanje navzdol od vezave. Ko se v celici zniža koncentacija sgRNA, Cas12k oddisocira in s tem je prepisovanje navzdol spet omogočeno.

Cilj regulacije je da pride do prepisavanja sinteznih genov za PUFA samo ob visokih koncentracijah dušika in nizki koncentraciji kisika. Ob nizki koncentaciji dušika pride do prepisovanja nazdol od promotorja glnK, to sta sgRNA-GFP (njegova tarča je omenjeno zaporedje GFP zavzdol od nifH promotorja) in tracrRNA. Ta konstrukt se potem poveže s Cas12k. Ta se veže na zapis za GFP in s tem blokira prepisovanje genov za sintezo PUFA. Torej tudi ko je koncentracija kisika nizka in se s tem aktivira promotor nifH do prepisovanja genov za sintezo PUFA ne pride. Ob visoki koncentraciji kisika in nizki koncentraciji dušika (to predstavlja okolje preden S. fredii tvori simbiozo z rastlino) do prepisa sinteznih genov PUFA ne pride. Ob visoki koncentaciji dušika in kisika do prepisovanja navzdol od promotorjev glnK in nifH ne pride. Ob visoki koncentaciji dušika (ko dodamo gnojilo bogato z dušikom) in nizki koncentraciji kisika pride do prepisovanje genov za sintezo PUFA, saj ne pride do prepisovanja sgRNA-GFP in tracrRNA, tako da Cas12k ne more blokirati prepisovanja genov za sintezo PUFA. Prav tako je koncentracija kisika nizka, zato je nifH promotor sploh aktiven.
== Samomorilski mehanizem razlaga ==
Samomorilski mehanizem za S. fredii je zasnovan tako, da ko S. fredii pobegne ven iz modula v okolje s povišno koncentracijo dušika in kisika, naredi samomor. Mehanizem je zasnovan na sistemu toksin-antitoksin (vapC-vapB) in promotorjih nuoA, nifH in glnK. Na enem delu konstrukta nuoA kontrolira izražanje Cas12k, na drugem pa izražanje vapC. nifH kontrolira izražanje vapB. glnK pa kontrolira izražanje sgRNA za gen mCherry in tracrRNA. Različne kombinacije koncentracij dušika in kisika omogočajo preživetje, samo ob povišani koncentraciji dušika in hkrati kisika vodijo v samomor. Pri nizki koncentraciji dušika in kisika, nastaja VapB ter sgRNA-mCherry in tracrRNA. Hkrati se izraža Cas12k, ki se poveže z sgRNA-mCherry in tracrRNA, se veže na gen za mCherry in s tem blokira izražanje vapC. Pri nizki koncentracij dušika in povišani koncentracij kisika, vapB ne nastaja, izraža se sgRNA-mCherry in tracrRNA ter Cas12k, zato VapC ne nastaja. Pri povišani koncentracij dušika in nizki koncentracij kisika VapB in VapC ne nastajata. Pri povišani koncentracij dušika in povišani koncentracij kisika VapB ne nastaja, nastaja pa VapC, saj Cas12k ne more blokirati transkripcije vapC, saj sgRNA-mCherrz in tracrRNA ne nastajata. Posledično se koncentracija VapB v celici poviša, kar vodi v smrt pobegle celice, to je izven okolja modula.

Eden izmed testov, ki so ga naredili, da bi potrdili uspešnost samomorilskega mehanizma je bil merjenje spremembe OD600 bakterij v suspenziji pri hiperoksičnih pogojih in spremenljivo koncentracijo amonijevega klorida, kot vira dušika. Po desetih urah so opazili padajoč trend v gojiščih z amonijevim kloridom. Padajoč trend je še bolj očiten, ko se poveča koncentracija amonijevega klorida. Zaključili so da je samomorilski mehanizem pod temi testnimi pogoji, reguliran s koncentracijo dušika in da deluje.
== Transport DHA in EPA v sojo ==
Njihov končni cilj je bil tudi transportirati DHA in EPA izven koreninskih nodulov v sojo. Za transport PUFA je bil že pred tem odkrit eksportni sistem, ki bi to omogočal, za gram negativne bakterije. S. fredii je tudi gram negativna bakterija. Ena študija se je ukvarjala z fiziološkim odzivom gram negativne bakterije Acinetobacter baumannii na PUFA in odkrili so povečano ekspresijo gena adeJ, ki je komponenta črpalke adeIJK, ki lahko transportira več različnih učinkovin ven iz celice. Ugotovili so da delecija gena adeJ poveča dovzetnost za PUFA. Podobno vlogo kot ima črpalka adeIJK, ima črpalka emhABC iz Pseudomonas fluorescens, ki kontrolira homeostazo lipidov, tako da izčrpava dolgo-verižne maščobne kisline. Razultata kažeta na to, da obstajajo v gram negativnih bakterijah določeni transportni proteini, ki bi omogočali transport DHA in EPA iz celice. Torej če bi povečali njihovo izražanje, bi lahko transportirali tudi DHA in EPA v sojo.
== Viri in literatura ==
[1] CAU-China: N. Factory https://2024.igem.wiki/cau-china/ (pridobljeno 13. 4. 2025)

CAU-China: Nodulska tovarna DHA in EPA

2025-04-13T15:44:08Z

Luka Fink:

https://2024.igem.wiki/cau-china/ je iGEM projekt skupine CAU-China iz Kitajske iz leta 2024.
== UVOD ==
Človeštvo že dolga časa poizkuša izboljšati hranilno vrednost hrane na razno razne načine, da bi se spopadli s problemi kot so podhranjenost v nerazvitih državah in omejenost določenih virov hrane. Cilj te skupine je bil proizvajati DHA in EPA v nodulih z genetsko spremenjenimi simbiontskimi bakterijami, z namenom povečati hranilno vrednost gojenih rastlin, še posebaj soje.

Noduli so majhne kroglaste tvorbe, ki se razvijejo na rastlinskih koreninah ali steblih. V nodulih živijo simbionstske bakterije, ki iz zraka vežejo dušik. Različne rastline razvijejo simbiozo z različnimi bakterijami. Rastilne iz družine metuljnic (soja, fižol, grah, leča) živijo v simbiozi z bakterijami iz rodu Rhizobium.

Vcepitev Rhizobium prinaša še eno prednost in to je obogatitev zemlje z dušikovimi spojinami, ki jih rastline lahko uporaljajo. Dolgoročna uporaba kemičnih gnojil, lahko privede do nabiranja določenih kemikalij v zemlji, kar vodi v zmanjšanje števila koristnih bakterij. Namesto kemičnih gnojil, bi lahko uporabljali mikrobna gnolija, ki vsebujejo Rhizobium, in bi tako izboljšali kakost zemlje in zmanjšali negativne učinke kemičnih gnojil.
== Izvedba projekta ==
Izbrali so si bakterijo Sinorhizobium fredii CCBAU45436. V njej so vzpostavili niz regulacijskih modulov, ki se odzivajo na spremembne v koncentraciji dušika in kisika. Hkrati so izbrali gene, ki kodirajo za PUFA sintazo in dipeptidil aldehid, ki bi proizvajala željena produkta DHA in EPA (ter ostale stranske produkte). Za izboljšanje učinkovitosti so reprogramirali metabolizem z uravnavanjem izražanja določenih genov. Zasnovali so samomorilski mehanizem, če S. fredii pobegne. Regulacijski moduli so odgovorni za kontrolo izražanja genov za sintezo PUFA (poly-unsaturated fatty acid) in kontrolo samomorilskega mehanizma.
== Delecija PHB ==
PHB (poli-β-hidroksibutirat) je produkt metabolizma, ki lahko služi kot zaloga energije, in nastaja v S. fredii v veliki meri. Odločili so se da bodo izbrisali gen phaC2, ki kodira ključni encim za sintezo PHB. Delecijo so naredili s homologno rekombinacijo z dvojno zamenjavo. V odsotnosti gena phaC2 naj bi se v celici povečala koncentracija acetil-CoA, ki naj bi služil kot prekursor za sintezo PUFA.

Delecijo so potrdili s PCR na osnovi kolonije. Opazili so da se je S. fredii spremenil fenotip, ko so ga gojili na trdem gojišču. In sicer pri ∆phaC2 so kolonije rumene, pri wt pa bele. Testirali so še ali ima ∆phaC2 vpliv na sposobnost fiksiranja dušika, ko so mutanto vcepili v rastlino Jidou 17. Inkubacija je potekala 15 dni. Analizirali so nodule, ki so zrasli na rastlini, ki je bila vcepljena z wt in nodule, ki so zrasli na rastlini, ki je bila vcepljena z mutanto ter ugotovili da ni vidne razlike med wt in mutanto. Analizirali so še vsebnost klorofila in suhe teže nadzemeljskih delov rastline in niso našli nobene statistično signifikantne razlike. Torej ∆phaC2 ne vpliva na rast rastline.
== Regulacija in sinteza modula ==
Problem pri sintezi PUFA je ta, da mora potekati v anaerobnem okolju, drugače lahko prihaja do oksidacije PUFA. Zato bi lahko S. fredii predstavljal idealno okolje za sintezo. Za sintezo PUFA so si izbrali gručo genov iz Aetherobacter fasciculatus, katera je bila že predhodno testirana v E. coli za sintezo PUFA. Da bi zagotovili učinkovito izražanje genov PUFA, so optimizirali rabo kodonov, ki bi ustrezala S. fredii, in hkrati so gruči genov dodali PPTazo, ki bi omogočala posttranslacijske modifikacije.

Sintetizirali so modul, ki se odziva na različne koncentracije dušika in kisika v okolju. Izbrali so si promotorja '''glnK''' in '''nifH''', ki sta endogena inducibilna promotorja S. fredii. Promotor glnK se odziva na nizke koncentracije dušika, promotor nifH pa se odziva na nizke koncentracije kisika. Regulacijski modul za sintezo PUFA je sestavljen tako, da sta pod promotorjem glnK zapisa za sgRNA-GFP in tracrRNA, pod promotorjem nifH pa zapisa za GFP in gruča genov za sintezo PUFA. Na drugi lokaciji na plazmidu je prisoten tudi konstitutivni promotor nuoA. Navzdol od promotorja nuoA se nahaj zapis za Cas12k. Posebnost Cas12k je da nima katalitske aktivnosti in da inhibira transkripcijo samo s fizično vezavo na tarčno DNA. Ko se v celici nastaja tako Cas12k kot tudi sgRNA za tarčno zaporedje, se ta povežeta in blokirata prepisovanje navzdol od vezave. Ko se v celici zniža koncentacija sgRNA, Cas12k oddisocira in s tem je prepisovanje navzdol spet omogočeno.

Cilj regulacije je da pride do prepisavanja sinteznih genov za PUFA samo ob visokih koncentracijah dušika in nizki koncentraciji kisika. Ob nizki koncentaciji dušika pride do prepisovanja nazdol od promotorja glnK, to sta sgRNA-GFP (njegova tarča je omenjeno zaporedje GFP zavzdol od nifH promotorja) in tracrRNA. Ta konstrukt se potem poveže s Cas12k. Ta se veže na zapis za GFP in s tem blokira prepisovanje genov za sintezo PUFA. Torej tudi ko je koncentracija kisika nizka in se s tem aktivira promotor nifH do prepisovanja genov za sintezo PUFA ne pride. Ob visoki koncentraciji kisika in nizki koncentraciji dušika (to predstavlja okolje preden S. fredii tvori simbiozo z rastlino) do prepisa sinteznih genov PUFA ne pride. Ob visoki koncentaciji dušika in kisika do prepisovanja navzdol od promotorjev glnK in nifH ne pride. Ob visoki koncentaciji dušika (ko dodamo gnojilo bogato z dušikom) in nizki koncentraciji kisika pride do prepisovanje genov za sintezo PUFA, saj ne pride do prepisovanja sgRNA-GFP in tracrRNA, tako da Cas12k ne more blokirati prepisovanja genov za sintezo PUFA. Prav tako je koncentracija kisika nizka, zato je nifH promotor sploh aktiven.
== Samomorilski mehanizem razlaga ==
Samomorilski mehanizem za S. fredii je zasnovan tako, da ko S. fredii pobegne ven iz modula v okolje s povišno koncentracijo dušika in kisika, naredi samomor. Mehanizem je zasnovan na sistemu toksin-antitoksin (vapC-vapB) in promotorjih nuoA, nifH in glnK. Na enem delu konstrukta nuoA kontrolira izražanje Cas12k, na drugem pa izražanje vapC. nifH kontrolira izražanje vapB. glnK pa kontrolira izražanje sgRNA za gen mCherry in tracrRNA. Različne kombinacije koncentracij dušika in kisika omogočajo preživetje, samo ob povišani koncentraciji dušika in hkrati kisika vodijo v samomor. Pri nizki koncentraciji dušika in kisika, nastaja VapB ter sgRNA-mCherry in tracrRNA. Hkrati se izraža Cas12k, ki se poveže z sgRNA-mCherry in tracrRNA, se veže na gen za mCherry in s tem blokira izražanje vapC. Pri nizki koncentracij dušika in povišani koncentracij kisika, vapB ne nastaja, izraža se sgRNA-mCherry in tracrRNA ter Cas12k, zato VapC ne nastaja. Pri povišani koncentracij dušika in nizki koncentracij kisika VapB in VapC ne nastajata. Pri povišani koncentracij dušika in povišani koncentracij kisika VapB ne nastaja, nastaja pa VapC, saj Cas12k ne more blokirati transkripcije vapC, saj sgRNA-mCherrz in tracrRNA ne nastajata. Posledično se koncentracija VapB v celici poviša, kar vodi v smrt pobegle celice, to je izven okolja modula.

Eden izmed testov, ki so ga naredili, da bi potrdili uspešnost samomorilskega mehanizma je bil merjenje spremembe OD600 bakterij v suspenziji pri hiperoksičnih pogojih in spremenljivo koncentracijo amonijevega klorida, kot vira dušika. Po desetih urah so opazili padajoč trend v gojiščih z amonijevim kloridom. Padajoč trend je še bolj očiten, ko se poveča koncentracija amonijevega klorida. Zaključili so da je samomorilski mehanizem pod temi testnimi pogoji, reguliran s koncentracijo dušika in da deluje.
== Transport DHA in EPA v sojo ==
Njihov končni cilj je bil tudi transportirati DHA in EPA izven koreninskih nodulov v sojo. Za transport PUFA je bil že pred tem odkrit eksportni sistem, ki bi to omogočal, za gram negativne bakterije. S. fredii je tudi gram negativna bakterija. Ena študija se je ukvarjala z fiziološkim odzivom gram negativne bakterije Acinetobacter baumannii na PUFA in odkrili so povečano ekspresijo gena adeJ, ki je komponenta črpalke adeIJK, ki lahko transportira več različnih učinkovin ven iz celice. Ugotovili so da delecija gena adeJ poveča dovzetnost za PUFA. Podobno vlogo kot ima črpalka adeIJK, ima črpalka emhABC iz Pseudomonas fluorescens, ki kontrolira homeostazo lipidov, tako da izčrpava dolgo-verižne maščobne kisline. Razultata kažeta na to, da obstajajo v gram negativnih bakterijah določeni transportni proteini, ki bi omogočali transport DHA in EPA iz celice. Torej če bi povečali njihovo izražanje, bi lahko transportirali tudi DHA in EPA v sojo.
== Viri in literatura ==
[1] CAU-China: N. Factory https://2024.igem.wiki/cau-china/ (pridobljeno 13. 4. 2025)

CAU-China: Nodulska tovarna DHA in EPA

2025-04-13T15:42:09Z

Luka Fink:

== UVOD ==
Človeštvo že dolga časa poizkuša izboljšati hranilno vrednost hrane na razno razne načine, da bi se spopadli s problemi kot so podhranjenost v nerazvitih državah in omejenost določenih virov hrane. Cilj te skupine je bil proizvajati DHA in EPA v nodulih z genetsko spremenjenimi simbiontskimi bakterijami, z namenom povečati hranilno vrednost gojenih rastlin, še posebaj soje.

Noduli so majhne kroglaste tvorbe, ki se razvijejo na rastlinskih koreninah ali steblih. V nodulih živijo simbionstske bakterije, ki iz zraka vežejo dušik. Različne rastline razvijejo simbiozo z različnimi bakterijami. Rastilne iz družine metuljnic (soja, fižol, grah, leča) živijo v simbiozi z bakterijami iz rodu Rhizobium.

Vcepitev Rhizobium prinaša še eno prednost in to je obogatitev zemlje z dušikovimi spojinami, ki jih rastline lahko uporaljajo. Dolgoročna uporaba kemičnih gnojil, lahko privede do nabiranja določenih kemikalij v zemlji, kar vodi v zmanjšanje števila koristnih bakterij. Namesto kemičnih gnojil, bi lahko uporabljali mikrobna gnolija, ki vsebujejo Rhizobium, in bi tako izboljšali kakost zemlje in zmanjšali negativne učinke kemičnih gnojil.
== Izvedba projekta ==
Izbrali so si bakterijo Sinorhizobium fredii CCBAU45436. V njej so vzpostavili niz regulacijskih modulov, ki se odzivajo na spremembne v koncentraciji dušika in kisika. Hkrati so izbrali gene, ki kodirajo za PUFA sintazo in dipeptidil aldehid, ki bi proizvajala željena produkta DHA in EPA (ter ostale stranske produkte). Za izboljšanje učinkovitosti so reprogramirali metabolizem z uravnavanjem izražanja določenih genov. Zasnovali so samomorilski mehanizem, če S. fredii pobegne. Regulacijski moduli so odgovorni za kontrolo izražanja genov za sintezo PUFA (poly-unsaturated fatty acid) in kontrolo samomorilskega mehanizma.
== Delecija PHB ==
PHB (poli-β-hidroksibutirat) je produkt metabolizma, ki lahko služi kot zaloga energije, in nastaja v S. fredii v veliki meri. Odločili so se da bodo izbrisali gen phaC2, ki kodira ključni encim za sintezo PHB. Delecijo so naredili s homologno rekombinacijo z dvojno zamenjavo. V odsotnosti gena phaC2 naj bi se v celici povečala koncentracija acetil-CoA, ki naj bi služil kot prekursor za sintezo PUFA.

Delecijo so potrdili s PCR na osnovi kolonije. Opazili so da se je S. fredii spremenil fenotip, ko so ga gojili na trdem gojišču. In sicer pri ∆phaC2 so kolonije rumene, pri wt pa bele. Testirali so še ali ima ∆phaC2 vpliv na sposobnost fiksiranja dušika, ko so mutanto vcepili v rastlino Jidou 17. Inkubacija je potekala 15 dni. Analizirali so nodule, ki so zrasli na rastlini, ki je bila vcepljena z wt in nodule, ki so zrasli na rastlini, ki je bila vcepljena z mutanto ter ugotovili da ni vidne razlike med wt in mutanto. Analizirali so še vsebnost klorofila in suhe teže nadzemeljskih delov rastline in niso našli nobene statistično signifikantne razlike. Torej ∆phaC2 ne vpliva na rast rastline.
== Regulacija in sinteza modula ==
Problem pri sintezi PUFA je ta, da mora potekati v anaerobnem okolju, drugače lahko prihaja do oksidacije PUFA. Zato bi lahko S. fredii predstavljal idealno okolje za sintezo. Za sintezo PUFA so si izbrali gručo genov iz Aetherobacter fasciculatus, katera je bila že predhodno testirana v E. coli za sintezo PUFA. Da bi zagotovili učinkovito izražanje genov PUFA, so optimizirali rabo kodonov, ki bi ustrezala S. fredii, in hkrati so gruči genov dodali PPTazo, ki bi omogočala posttranslacijske modifikacije.

Sintetizirali so modul, ki se odziva na različne koncentracije dušika in kisika v okolju. Izbrali so si promotorja '''glnK''' in '''nifH''', ki sta endogena inducibilna promotorja S. fredii. Promotor glnK se odziva na nizke koncentracije dušika, promotor nifH pa se odziva na nizke koncentracije kisika. Regulacijski modul za sintezo PUFA je sestavljen tako, da sta pod promotorjem glnK zapisa za sgRNA-GFP in tracrRNA, pod promotorjem nifH pa zapisa za GFP in gruča genov za sintezo PUFA. Na drugi lokaciji na plazmidu je prisoten tudi konstitutivni promotor nuoA. Navzdol od promotorja nuoA se nahaj zapis za Cas12k. Posebnost Cas12k je da nima katalitske aktivnosti in da inhibira transkripcijo samo s fizično vezavo na tarčno DNA. Ko se v celici nastaja tako Cas12k kot tudi sgRNA za tarčno zaporedje, se ta povežeta in blokirata prepisovanje navzdol od vezave. Ko se v celici zniža koncentacija sgRNA, Cas12k oddisocira in s tem je prepisovanje navzdol spet omogočeno.

Cilj regulacije je da pride do prepisavanja sinteznih genov za PUFA samo ob visokih koncentracijah dušika in nizki koncentraciji kisika. Ob nizki koncentaciji dušika pride do prepisovanja nazdol od promotorja glnK, to sta sgRNA-GFP (njegova tarča je omenjeno zaporedje GFP zavzdol od nifH promotorja) in tracrRNA. Ta konstrukt se potem poveže s Cas12k. Ta se veže na zapis za GFP in s tem blokira prepisovanje genov za sintezo PUFA. Torej tudi ko je koncentracija kisika nizka in se s tem aktivira promotor nifH do prepisovanja genov za sintezo PUFA ne pride. Ob visoki koncentraciji kisika in nizki koncentraciji dušika (to predstavlja okolje preden S. fredii tvori simbiozo z rastlino) do prepisa sinteznih genov PUFA ne pride. Ob visoki koncentaciji dušika in kisika do prepisovanja navzdol od promotorjev glnK in nifH ne pride. Ob visoki koncentaciji dušika (ko dodamo gnojilo bogato z dušikom) in nizki koncentraciji kisika pride do prepisovanje genov za sintezo PUFA, saj ne pride do prepisovanja sgRNA-GFP in tracrRNA, tako da Cas12k ne more blokirati prepisovanja genov za sintezo PUFA. Prav tako je koncentracija kisika nizka, zato je nifH promotor sploh aktiven.
== Samomorilski mehanizem razlaga ==
Samomorilski mehanizem za S. fredii je zasnovan tako, da ko S. fredii pobegne ven iz modula v okolje s povišno koncentracijo dušika in kisika, naredi samomor. Mehanizem je zasnovan na sistemu toksin-antitoksin (vapC-vapB) in promotorjih nuoA, nifH in glnK. Na enem delu konstrukta nuoA kontrolira izražanje Cas12k, na drugem pa izražanje vapC. nifH kontrolira izražanje vapB. glnK pa kontrolira izražanje sgRNA za gen mCherry in tracrRNA. Različne kombinacije koncentracij dušika in kisika omogočajo preživetje, samo ob povišani koncentraciji dušika in hkrati kisika vodijo v samomor. Pri nizki koncentraciji dušika in kisika, nastaja VapB ter sgRNA-mCherry in tracrRNA. Hkrati se izraža Cas12k, ki se poveže z sgRNA-mCherry in tracrRNA, se veže na gen za mCherry in s tem blokira izražanje vapC. Pri nizki koncentracij dušika in povišani koncentracij kisika, vapB ne nastaja, izraža se sgRNA-mCherry in tracrRNA ter Cas12k, zato VapC ne nastaja. Pri povišani koncentracij dušika in nizki koncentracij kisika VapB in VapC ne nastajata. Pri povišani koncentracij dušika in povišani koncentracij kisika VapB ne nastaja, nastaja pa VapC, saj Cas12k ne more blokirati transkripcije vapC, saj sgRNA-mCherrz in tracrRNA ne nastajata. Posledično se koncentracija VapB v celici poviša, kar vodi v smrt pobegle celice, to je izven okolja modula.

Eden izmed testov, ki so ga naredili, da bi potrdili uspešnost samomorilskega mehanizma je bil merjenje spremembe OD600 bakterij v suspenziji pri hiperoksičnih pogojih in spremenljivo koncentracijo amonijevega klorida, kot vira dušika. Po desetih urah so opazili padajoč trend v gojiščih z amonijevim kloridom. Padajoč trend je še bolj očiten, ko se poveča koncentracija amonijevega klorida. Zaključili so da je samomorilski mehanizem pod temi testnimi pogoji, reguliran s koncentracijo dušika in da deluje.
== Transport DHA in EPA v sojo ==
Njihov končni cilj je bil tudi transportirati DHA in EPA izven koreninskih nodulov v sojo. Za transport PUFA je bil že pred tem odkrit eksportni sistem, ki bi to omogočal, za gram negativne bakterije. S. fredii je tudi gram negativna bakterija. Ena študija se je ukvarjala z fiziološkim odzivom gram negativne bakterije Acinetobacter baumannii na PUFA in odkrili so povečano ekspresijo gena adeJ, ki je komponenta črpalke adeIJK, ki lahko transportira več različnih učinkovin ven iz celice. Ugotovili so da delecija gena adeJ poveča dovzetnost za PUFA. Podobno vlogo kot ima črpalka adeIJK, ima črpalka emhABC iz Pseudomonas fluorescens, ki kontrolira homeostazo lipidov, tako da izčrpava dolgo-verižne maščobne kisline. Razultata kažeta na to, da obstajajo v gram negativnih bakterijah določeni transportni proteini, ki bi omogočali transport DHA in EPA iz celice. Torej če bi povečali njihovo izražanje, bi lahko transportirali tudi DHA in EPA v sojo.
== Viri in literatura ==
[1] CAU-China: N. Factory https://https://2024.igem.wiki/cau-china/ (pridobljeno 13. 4. 2025)

CAU-China: Nodulska tovarna DHA in EPA

2025-04-13T15:41:34Z

Luka Fink:

[https://teams.igem.org/5300]
CAU-China: Nodulska tovarna DHA in EPA
== UVOD ==
Človeštvo že dolga časa poizkuša izboljšati hranilno vrednost hrane na razno razne načine, da bi se spopadli s problemi kot so podhranjenost v nerazvitih državah in omejenost določenih virov hrane. Cilj te skupine je bil proizvajati DHA in EPA v nodulih z genetsko spremenjenimi simbiontskimi bakterijami, z namenom povečati hranilno vrednost gojenih rastlin, še posebaj soje.

Noduli so majhne kroglaste tvorbe, ki se razvijejo na rastlinskih koreninah ali steblih. V nodulih živijo simbionstske bakterije, ki iz zraka vežejo dušik. Različne rastline razvijejo simbiozo z različnimi bakterijami. Rastilne iz družine metuljnic (soja, fižol, grah, leča) živijo v simbiozi z bakterijami iz rodu Rhizobium.

Vcepitev Rhizobium prinaša še eno prednost in to je obogatitev zemlje z dušikovimi spojinami, ki jih rastline lahko uporaljajo. Dolgoročna uporaba kemičnih gnojil, lahko privede do nabiranja določenih kemikalij v zemlji, kar vodi v zmanjšanje števila koristnih bakterij. Namesto kemičnih gnojil, bi lahko uporabljali mikrobna gnolija, ki vsebujejo Rhizobium, in bi tako izboljšali kakost zemlje in zmanjšali negativne učinke kemičnih gnojil.
== Izvedba projekta ==
Izbrali so si bakterijo Sinorhizobium fredii CCBAU45436. V njej so vzpostavili niz regulacijskih modulov, ki se odzivajo na spremembne v koncentraciji dušika in kisika. Hkrati so izbrali gene, ki kodirajo za PUFA sintazo in dipeptidil aldehid, ki bi proizvajala željena produkta DHA in EPA (ter ostale stranske produkte). Za izboljšanje učinkovitosti so reprogramirali metabolizem z uravnavanjem izražanja določenih genov. Zasnovali so samomorilski mehanizem, če S. fredii pobegne. Regulacijski moduli so odgovorni za kontrolo izražanja genov za sintezo PUFA (poly-unsaturated fatty acid) in kontrolo samomorilskega mehanizma.
== Delecija PHB ==
PHB (poli-β-hidroksibutirat) je produkt metabolizma, ki lahko služi kot zaloga energije, in nastaja v S. fredii v veliki meri. Odločili so se da bodo izbrisali gen phaC2, ki kodira ključni encim za sintezo PHB. Delecijo so naredili s homologno rekombinacijo z dvojno zamenjavo. V odsotnosti gena phaC2 naj bi se v celici povečala koncentracija acetil-CoA, ki naj bi služil kot prekursor za sintezo PUFA.

Delecijo so potrdili s PCR na osnovi kolonije. Opazili so da se je S. fredii spremenil fenotip, ko so ga gojili na trdem gojišču. In sicer pri ∆phaC2 so kolonije rumene, pri wt pa bele. Testirali so še ali ima ∆phaC2 vpliv na sposobnost fiksiranja dušika, ko so mutanto vcepili v rastlino Jidou 17. Inkubacija je potekala 15 dni. Analizirali so nodule, ki so zrasli na rastlini, ki je bila vcepljena z wt in nodule, ki so zrasli na rastlini, ki je bila vcepljena z mutanto ter ugotovili da ni vidne razlike med wt in mutanto. Analizirali so še vsebnost klorofila in suhe teže nadzemeljskih delov rastline in niso našli nobene statistično signifikantne razlike. Torej ∆phaC2 ne vpliva na rast rastline.
== Regulacija in sinteza modula ==
Problem pri sintezi PUFA je ta, da mora potekati v anaerobnem okolju, drugače lahko prihaja do oksidacije PUFA. Zato bi lahko S. fredii predstavljal idealno okolje za sintezo. Za sintezo PUFA so si izbrali gručo genov iz Aetherobacter fasciculatus, katera je bila že predhodno testirana v E. coli za sintezo PUFA. Da bi zagotovili učinkovito izražanje genov PUFA, so optimizirali rabo kodonov, ki bi ustrezala S. fredii, in hkrati so gruči genov dodali PPTazo, ki bi omogočala posttranslacijske modifikacije.

Sintetizirali so modul, ki se odziva na različne koncentracije dušika in kisika v okolju. Izbrali so si promotorja '''glnK''' in '''nifH''', ki sta endogena inducibilna promotorja S. fredii. Promotor glnK se odziva na nizke koncentracije dušika, promotor nifH pa se odziva na nizke koncentracije kisika. Regulacijski modul za sintezo PUFA je sestavljen tako, da sta pod promotorjem glnK zapisa za sgRNA-GFP in tracrRNA, pod promotorjem nifH pa zapisa za GFP in gruča genov za sintezo PUFA. Na drugi lokaciji na plazmidu je prisoten tudi konstitutivni promotor nuoA. Navzdol od promotorja nuoA se nahaj zapis za Cas12k. Posebnost Cas12k je da nima katalitske aktivnosti in da inhibira transkripcijo samo s fizično vezavo na tarčno DNA. Ko se v celici nastaja tako Cas12k kot tudi sgRNA za tarčno zaporedje, se ta povežeta in blokirata prepisovanje navzdol od vezave. Ko se v celici zniža koncentacija sgRNA, Cas12k oddisocira in s tem je prepisovanje navzdol spet omogočeno.

Cilj regulacije je da pride do prepisavanja sinteznih genov za PUFA samo ob visokih koncentracijah dušika in nizki koncentraciji kisika. Ob nizki koncentaciji dušika pride do prepisovanja nazdol od promotorja glnK, to sta sgRNA-GFP (njegova tarča je omenjeno zaporedje GFP zavzdol od nifH promotorja) in tracrRNA. Ta konstrukt se potem poveže s Cas12k. Ta se veže na zapis za GFP in s tem blokira prepisovanje genov za sintezo PUFA. Torej tudi ko je koncentracija kisika nizka in se s tem aktivira promotor nifH do prepisovanja genov za sintezo PUFA ne pride. Ob visoki koncentraciji kisika in nizki koncentraciji dušika (to predstavlja okolje preden S. fredii tvori simbiozo z rastlino) do prepisa sinteznih genov PUFA ne pride. Ob visoki koncentaciji dušika in kisika do prepisovanja navzdol od promotorjev glnK in nifH ne pride. Ob visoki koncentaciji dušika (ko dodamo gnojilo bogato z dušikom) in nizki koncentraciji kisika pride do prepisovanje genov za sintezo PUFA, saj ne pride do prepisovanja sgRNA-GFP in tracrRNA, tako da Cas12k ne more blokirati prepisovanja genov za sintezo PUFA. Prav tako je koncentracija kisika nizka, zato je nifH promotor sploh aktiven.
== Samomorilski mehanizem razlaga ==
Samomorilski mehanizem za S. fredii je zasnovan tako, da ko S. fredii pobegne ven iz modula v okolje s povišno koncentracijo dušika in kisika, naredi samomor. Mehanizem je zasnovan na sistemu toksin-antitoksin (vapC-vapB) in promotorjih nuoA, nifH in glnK. Na enem delu konstrukta nuoA kontrolira izražanje Cas12k, na drugem pa izražanje vapC. nifH kontrolira izražanje vapB. glnK pa kontrolira izražanje sgRNA za gen mCherry in tracrRNA. Različne kombinacije koncentracij dušika in kisika omogočajo preživetje, samo ob povišani koncentraciji dušika in hkrati kisika vodijo v samomor. Pri nizki koncentraciji dušika in kisika, nastaja VapB ter sgRNA-mCherry in tracrRNA. Hkrati se izraža Cas12k, ki se poveže z sgRNA-mCherry in tracrRNA, se veže na gen za mCherry in s tem blokira izražanje vapC. Pri nizki koncentracij dušika in povišani koncentracij kisika, vapB ne nastaja, izraža se sgRNA-mCherry in tracrRNA ter Cas12k, zato VapC ne nastaja. Pri povišani koncentracij dušika in nizki koncentracij kisika VapB in VapC ne nastajata. Pri povišani koncentracij dušika in povišani koncentracij kisika VapB ne nastaja, nastaja pa VapC, saj Cas12k ne more blokirati transkripcije vapC, saj sgRNA-mCherrz in tracrRNA ne nastajata. Posledično se koncentracija VapB v celici poviša, kar vodi v smrt pobegle celice, to je izven okolja modula.

Eden izmed testov, ki so ga naredili, da bi potrdili uspešnost samomorilskega mehanizma je bil merjenje spremembe OD600 bakterij v suspenziji pri hiperoksičnih pogojih in spremenljivo koncentracijo amonijevega klorida, kot vira dušika. Po desetih urah so opazili padajoč trend v gojiščih z amonijevim kloridom. Padajoč trend je še bolj očiten, ko se poveča koncentracija amonijevega klorida. Zaključili so da je samomorilski mehanizem pod temi testnimi pogoji, reguliran s koncentracijo dušika in da deluje.
== Transport DHA in EPA v sojo ==
Njihov končni cilj je bil tudi transportirati DHA in EPA izven koreninskih nodulov v sojo. Za transport PUFA je bil že pred tem odkrit eksportni sistem, ki bi to omogočal, za gram negativne bakterije. S. fredii je tudi gram negativna bakterija. Ena študija se je ukvarjala z fiziološkim odzivom gram negativne bakterije Acinetobacter baumannii na PUFA in odkrili so povečano ekspresijo gena adeJ, ki je komponenta črpalke adeIJK, ki lahko transportira več različnih učinkovin ven iz celice. Ugotovili so da delecija gena adeJ poveča dovzetnost za PUFA. Podobno vlogo kot ima črpalka adeIJK, ima črpalka emhABC iz Pseudomonas fluorescens, ki kontrolira homeostazo lipidov, tako da izčrpava dolgo-verižne maščobne kisline. Razultata kažeta na to, da obstajajo v gram negativnih bakterijah določeni transportni proteini, ki bi omogočali transport DHA in EPA iz celice. Torej če bi povečali njihovo izražanje, bi lahko transportirali tudi DHA in EPA v sojo.
== Viri in literatura ==
[1] CAU-China: N. Factory https://https://2024.igem.wiki/cau-china/ (pridobljeno 13. 4. 2025)

CAU-China: Nodulska tovarna DHA in EPA

2025-04-13T15:38:16Z

Luka Fink:

CAU-China: Nodulska tovarna DHA in EPA

2025-04-13T15:35:34Z

Luka Fink:

[https://teams.igem.org/5300]
CAU-China: Nodulska tovarna DHA in EPA
== UVOD ==
Človeštvo že dolga časa poizkuša izboljšati hranilno vrednost hrane na razno razne načine, da bi se spopadli s problemi kot so podhranjenost v nerazvitih državah in omejenost določenih virov hrane. Cilj te skupine je bil proizvajati DHA in EPA v nodulih z genetsko spremenjenimi simbiontskimi bakterijami, z namenom povečati hranilno vrednost gojenih rastlin, še posebaj soje.

Noduli so majhne kroglaste tvorbe, ki se razvijejo na rastlinskih koreninah ali steblih. V nodulih živijo simbionstske bakterije, ki iz zraka vežejo dušik. Različne rastline razvijejo simbiozo z različnimi bakterijami. Rastilne iz družine metuljnic (soja, fižol, grah, leča) živijo v simbiozi z bakterijami iz rodu Rhizobium.

Vcepitev Rhizobium prinaša še eno prednost in to je obogatitev zemlje z dušikovimi spojinami, ki jih rastline lahko uporaljajo. Dolgoročna uporaba kemičnih gnojil, lahko privede do nabiranja določenih kemikalij v zemlji, kar vodi v zmanjšanje števila koristnih bakterij. Namesto kemičnih gnojil, bi lahko uporabljali mikrobna gnolija, ki vsebujejo Rhizobium, in bi tako izboljšali kakost zemlje in zmanjšali negativne učinke kemičnih gnojil.
== Izvedba projekta ==
Izbrali so si bakterijo Sinorhizobium fredii CCBAU45436. V njej so vzpostavili niz regulacijskih modulov, ki se odzivajo na spremembne v koncentraciji dušika in kisika. Hkrati so izbrali gene, ki kodirajo za PUFA sintazo in dipeptidil aldehid, ki bi proizvajala željena produkta DHA in EPA (ter ostale stranske produkte). Za izboljšanje učinkovitosti so reprogramirali metabolizem z uravnavanjem izražanja določenih genov. Zasnovali so samomorilski mehanizem, če S. fredii pobegne. Regulacijski moduli so odgovorni za kontrolo izražanja genov za sintezo PUFA (poly-unsaturated fatty acid) in kontrolo samomorilskega mehanizma.
== Delecija PHB ==
PHB (poli-β-hidroksibutirat) je produkt metabolizma, ki lahko služi kot zaloga energije, in nastaja v S. fredii v veliki meri. Odločili so se da bodo izbrisali gen phaC2, ki kodira ključni encim za sintezo PHB. Delecijo so naredili s homologno rekombinacijo z dvojno zamenjavo. V odsotnosti gena phaC2 naj bi se v celici povečala koncentracija acetil-CoA, ki naj bi služil kot prekursor za sintezo PUFA.

Delecijo so potrdili s PCR na osnovi kolonije. Opazili so da se je S. fredii spremenil fenotip, ko so ga gojili na trdem gojišču. In sicer pri ∆phaC2 so kolonije rumene, pri wt pa bele. Testirali so še ali ima ∆phaC2 vpliv na sposobnost fiksiranja dušika, ko so mutanto vcepili v rastlino Jidou 17. Inkubacija je potekala 15 dni. Analizirali so nodule, ki so zrasli na rastlini, ki je bila vcepljena z wt in nodule, ki so zrasli na rastlini, ki je bila vcepljena z mutanto ter ugotovili da ni vidne razlike med wt in mutanto. Analizirali so še vsebnost klorofila in suhe teže nadzemeljskih delov rastline in niso našli nobene statistično signifikantne razlike. Torej ∆phaC2 ne vpliva na rast rastline.
== Regulacija in sinteza modula ==
Problem pri sintezi PUFA je ta, da mora potekati v anaerobnem okolju, drugače lahko prihaja do oksidacije PUFA. Zato bi lahko S. fredii predstavljal idealno okolje za sintezo. Za sintezo PUFA so si izbrali gručo genov iz Aetherobacter fasciculatus, katera je bila že predhodno testirana v E. coli za sintezo PUFA. Da bi zagotovili učinkovito izražanje genov PUFA, so optimizirali rabo kodonov, ki bi ustrezala S. fredii, in hkrati so gruči genov dodali PPTazo, ki bi omogočala posttranslacijske modifikacije.

Sintetizirali so modul, ki se odziva na različne koncentracije dušika in kisika v okolju. Izbrali so si promotorja glnK in nifH, ki sta endogena inducibilna promotorja S. fredii. Promotor glnK se odziva na nizke koncentracije dušika, promotor nifH pa se odziva na nizke koncentracije kisika. Regulacijski modul za sintezo PUFA je sestavljen tako, da sta pod promotorjem glnK zapisa za sgRNA-GFP in tracrRNA, pod promotorjem nifH pa zapisa za GFP in gruča genov za sintezo PUFA. Na drugi lokaciji na plazmidu je prisoten tudi konstitutivni promotor nuoA. Navzdol od promotorja nuoA se nahaj zapis za Cas12k. Posebnost Cas12k je da nima katalitske aktivnosti in da inhibira transkripcijo samo s fizično vezavo na tarčno DNA. Ko se v celici nastaja tako Cas12k kot tudi sgRNA za tarčno zaporedje, se ta povežeta in blokirata prepisovanje navzdol od vezave. Ko se v celici zniža koncentacija sgRNA, Cas12k oddisocira in s tem je prepisovanje navzdol spet omogočeno.

Cilj regulacije je da pride do prepisavanja sinteznih genov za PUFA samo ob visokih koncentracijah dušika in nizki koncentraciji kisika. Ob nizki koncentaciji dušika pride do prepisovanja nazdol od promotorja glnK, to sta sgRNA-GFP (njegova tarča je omenjeno zaporedje GFP zavzdol od nifH promotorja) in tracrRNA. Ta konstrukt se potem poveže s Cas12k. Ta se veže na zapis za GFP in s tem blokira prepisovanje genov za sintezo PUFA. Torej tudi ko je koncentracija kisika nizka in se s tem aktivira promotor nifH do prepisovanja genov za sintezo PUFA ne pride. Ob visoki koncentraciji kisika in nizki koncentraciji dušika (to predstavlja okolje preden S. fredii tvori simbiozo z rastlino) do prepisa sinteznih genov PUFA ne pride. Ob visoki koncentaciji dušika in kisika do prepisovanja navzdol od promotorjev glnK in nifH ne pride. Ob visoki koncentaciji dušika (ko dodamo gnojilo bogato z dušikom) in nizki koncentraciji kisika pride do prepisovanje genov za sintezo PUFA, saj ne pride do prepisovanja sgRNA-GFP in tracrRNA, tako da Cas12k ne more blokirati prepisovanja genov za sintezo PUFA. Prav tako je koncentracija kisika nizka, zato je nifH promotor sploh aktiven.
== Samomorilski mehanizem razlaga ==
Samomorilski mehanizem za S. fredii je zasnovan tako, da ko S. fredii pobegne ven iz modula v okolje s povišno koncentracijo dušika in kisika, naredi samomor. Mehanizem je zasnovan na sistemu toksin-antitoksin (vapC-vapB) in promotorjih nuoA, nifH in glnK. Na enem delu konstrukta nuoA kontrolira izražanje Cas12k, na drugem pa izražanje vapC. nifH kontrolira izražanje vapB. glnK pa kontrolira izražanje sgRNA za gen mCherry in tracrRNA. Različne kombinacije koncentracij dušika in kisika omogočajo preživetje, samo ob povišani koncentraciji dušika in hkrati kisika vodijo v samomor. Pri nizki koncentraciji dušika in kisika, nastaja VapB ter sgRNA-mCherry in tracrRNA. Hkrati se izraža Cas12k, ki se poveže z sgRNA-mCherry in tracrRNA, se veže na gen za mCherry in s tem blokira izražanje vapC. Pri nizki koncentracij dušika in povišani koncentracij kisika, vapB ne nastaja, izraža se sgRNA-mCherry in tracrRNA ter Cas12k, zato VapC ne nastaja. Pri povišani koncentracij dušika in nizki koncentracij kisika VapB in VapC ne nastajata. Pri povišani koncentracij dušika in povišani koncentracij kisika VapB ne nastaja, nastaja pa VapC, saj Cas12k ne more blokirati transkripcije vapC, saj sgRNA-mCherrz in tracrRNA ne nastajata. Posledično se koncentracija VapB v celici poviša, kar vodi v smrt pobegle celice, to je izven okolja modula.

Eden izmed testov, ki so ga naredili, da bi potrdili uspešnost samomorilskega mehanizma je bil merjenje spremembe OD600 bakterij v suspenziji pri hiperoksičnih pogojih in spremenljivo koncentracijo amonijevega klorida, kot vira dušika. Po desetih urah so opazili padajoč trend v gojiščih z amonijevim kloridom. Padajoč trend je še bolj očiten, ko se poveča koncentracija amonijevega klorida. Zaključili so da je samomorilski mehanizem pod temi testnimi pogoji, reguliran s koncentracijo dušika in da deluje.
== Transport DHA in EPA v sojo ==
Njihov končni cilj je bil tudi transportirati DHA in EPA izven koreninskih nodulov v sojo. Za transport PUFA je bil že pred tem odkrit eksportni sistem, ki bi to omogočal, za gram negativne bakterije. S. fredii je tudi gram negativna bakterija. Ena študija se je ukvarjala z fiziološkim odzivom gram negativne bakterije Acinetobacter baumannii na PUFA in odkrili so povečano ekspresijo gena adeJ, ki je komponenta črpalke adeIJK, ki lahko transportira več različnih učinkovin ven iz celice. Ugotovili so da delecija gena adeJ poveča dovzetnost za PUFA. Podobno vlogo kot ima črpalka adeIJK, ima črpalka emhABC iz Pseudomonas fluorescens, ki kontrolira homeostazo lipidov, tako da izčrpava dolgo-verižne maščobne kisline. Razultata kažeta na to, da obstajajo v gram negativnih bakterijah določeni transportni proteini, ki bi omogočali transport DHA in EPA iz celice. Torej če bi povečali njihovo izražanje, bi lahko transportirali tudi DHA in EPA v sojo.

CAU-China: Nodulska tovarna DHA in EPA

2025-04-13T15:33:53Z

Luka Fink:

[https://teams.igem.org/5300]
CAU-China: Nodulska tovarna DHA in EPA
== UVOD ==
Človeštvo že dolga časa poizkuša izboljšati hranilno vrednost hrane na razno razne načine, da bi se spopadli s problemi kot so podhranjenost v nerazvitih državah in omejenost določenih virov hrane. Cilj te skupine je bil proizvajati DHA in EPA v nodulih z genetsko spremenjenimi simbiontskimi bakterijami, z namenom povečati hranilno vrednost gojenih rastlin, še posebaj soje.

Noduli so majhne kroglaste tvorbe, ki se razvijejo na rastlinskih koreninah ali steblih. V nodulih živijo simbionstske bakterije, ki iz zraka vežejo dušik. Različne rastline razvijejo simbiozo z različnimi bakterijami. Rastilne iz družine metuljnic (soja, fižol, grah, leča) živijo v simbiozi z bakterijami iz rodu Rhizobium.
Vcepitev Rhizobium prinaša še eno prednost in to je obogatitev zemlje z dušikovimi spojinami, ki jih rastline lahko uporaljajo. Dolgoročna uporaba kemičnih gnojil, lahko privede do nabiranja določenih kemikalij v zemlji, kar vodi v zmanjšanje števila koristnih bakterij. Namesto kemičnih gnojil, bi lahko uporabljali mikrobna gnolija, ki vsebujejo Rhizobium, in bi tako izboljšali kakost zemlje in zmanjšali negativne učinke kemičnih gnojil.
== Izvedba projekta ==
Izbrali so si bakterijo Sinorhizobium fredii CCBAU45436. V njej so vzpostavili niz regulacijskih modulov, ki se odzivajo na spremembne v koncentraciji dušika in kisika. Hkrati so izbrali gene, ki kodirajo za PUFA sintazo in dipeptidil aldehid, ki bi proizvajala željena produkta DHA in EPA (ter ostale stranske produkte). Za izboljšanje učinkovitosti so reprogramirali metabolizem z uravnavanjem izražanja določenih genov. Zasnovali so samomorilski mehanizem, če S. fredii pobegne. Regulacijski moduli so odgovorni za kontrolo izražanja genov za sintezo PUFA (poly-unsaturated fatty acid) in kontrolo samomorilskega mehanizma.
== Delecija PHB ==
PHB (poli-β-hidroksibutirat) je produkt metabolizma, ki lahko služi kot zaloga energije, in nastaja v S. fredii v veliki meri. Odločili so se da bodo izbrisali gen phaC2, ki kodira ključni encim za sintezo PHB. Delecijo so naredili s homologno rekombinacijo z dvojno zamenjavo. V odsotnosti gena phaC2 naj bi se v celici povečala koncentracija acetil-CoA, ki naj bi služil kot prekursor za sintezo PUFA.
Delecijo so potrdili s PCR na osnovi kolonije. Opazili so da se je S. fredii spremenil fenotip, ko so ga gojili na trdem gojišču. In sicer pri ∆phaC2 so kolonije rumene, pri wt pa bele. Testirali so še ali ima ∆phaC2 vpliv na sposobnost fiksiranja dušika, ko so mutanto vcepili v rastlino Jidou 17. Inkubacija je potekala 15 dni. Analizirali so nodule, ki so zrasli na rastlini, ki je bila vcepljena z wt in nodule, ki so zrasli na rastlini, ki je bila vcepljena z mutanto ter ugotovili da ni vidne razlike med wt in mutanto. Analizirali so še vsebnost klorofila in suhe teže nadzemeljskih delov rastline in niso našli nobene statistično signifikantne razlike. Torej ∆phaC2 ne vpliva na rast rastline.
== Regulacija in sinteza modula ==
Problem pri sintezi PUFA je ta, da mora potekati v anaerobnem okolju, drugače lahko prihaja do oksidacije PUFA. Zato bi lahko S. fredii predstavljal idealno okolje za sintezo. Za sintezo PUFA so si izbrali gručo genov iz Aetherobacter fasciculatus, katera je bila že predhodno testirana v E. coli za sintezo PUFA. Da bi zagotovili učinkovito izražanje genov PUFA, so optimizirali rabo kodonov, ki bi ustrezala S. fredii, in hkrati so gruči genov dodali PPTazo, ki bi omogočala posttranslacijske modifikacije.
Sintetizirali so modul, ki se odziva na različne koncentracije dušika in kisika v okolju. Izbrali so si promotorja glnK in nifH, ki sta endogena inducibilna promotorja S. fredii. Promotor glnK se odziva na nizke koncentracije dušika, promotor nifH pa se odziva na nizke koncentracije kisika. Regulacijski modul za sintezo PUFA je sestavljen tako, da sta pod promotorjem glnK zapisa za sgRNA-GFP in tracrRNA, pod promotorjem nifH pa zapisa za GFP in gruča genov za sintezo PUFA. Na drugi lokaciji na plazmidu je prisoten tudi konstitutivni promotor nuoA. Navzdol od promotorja nuoA se nahaj zapis za Cas12k. Posebnost Cas12k je da nima katalitske aktivnosti in da inhibira transkripcijo samo s fizično vezavo na tarčno DNA. Ko se v celici nastaja tako Cas12k kot tudi sgRNA za tarčno zaporedje, se ta povežeta in blokirata prepisovanje navzdol od vezave. Ko se v celici zniža koncentacija sgRNA, Cas12k oddisocira in s tem je prepisovanje navzdol spet omogočeno.
Cilj regulacije je da pride do prepisavanja sinteznih genov za PUFA samo ob visokih koncentracijah dušika in nizki koncentraciji kisika. Ob nizki koncentaciji dušika pride do prepisovanja nazdol od promotorja glnK, to sta sgRNA-GFP (njegova tarča je omenjeno zaporedje GFP zavzdol od nifH promotorja) in tracrRNA. Ta konstrukt se potem poveže s Cas12k. Ta se veže na zapis za GFP in s tem blokira prepisovanje genov za sintezo PUFA. Torej tudi ko je koncentracija kisika nizka in se s tem aktivira promotor nifH do prepisovanja genov za sintezo PUFA ne pride. Ob visoki koncentraciji kisika in nizki koncentraciji dušika (to predstavlja okolje preden S. fredii tvori simbiozo z rastlino) do prepisa sinteznih genov PUFA ne pride. Ob visoki koncentaciji dušika in kisika do prepisovanja navzdol od promotorjev glnK in nifH ne pride. Ob visoki koncentaciji dušika (ko dodamo gnojilo bogato z dušikom) in nizki koncentraciji kisika pride do prepisovanje genov za sintezo PUFA, saj ne pride do prepisovanja sgRNA-GFP in tracrRNA, tako da Cas12k ne more blokirati prepisovanja genov za sintezo PUFA. Prav tako je koncentracija kisika nizka, zato je nifH promotor sploh aktiven.
== Samomorilski mehanizem razlaga ==
Samomorilski mehanizem za S. fredii je zasnovan tako, da ko S. fredii pobegne ven iz modula v okolje s povišno koncentracijo dušika in kisika, naredi samomor. Mehanizem je zasnovan na sistemu toksin-antitoksin (vapC-vapB) in promotorjih nuoA, nifH in glnK. Na enem delu konstrukta nuoA kontrolira izražanje Cas12k, na drugem pa izražanje vapC. nifH kontrolira izražanje vapB. glnK pa kontrolira izražanje sgRNA za gen mCherry in tracrRNA. Različne kombinacije koncentracij dušika in kisika omogočajo preživetje, samo ob povišani koncentraciji dušika in hkrati kisika vodijo v samomor. Pri nizki koncentraciji dušika in kisika, nastaja VapB ter sgRNA-mCherry in tracrRNA. Hkrati se izraža Cas12k, ki se poveže z sgRNA-mCherry in tracrRNA, se veže na gen za mCherry in s tem blokira izražanje vapC. Pri nizki koncentracij dušika in povišani koncentracij kisika, vapB ne nastaja, izraža se sgRNA-mCherry in tracrRNA ter Cas12k, zato VapC ne nastaja. Pri povišani koncentracij dušika in nizki koncentracij kisika VapB in VapC ne nastajata. Pri povišani koncentracij dušika in povišani koncentracij kisika VapB ne nastaja, nastaja pa VapC, saj Cas12k ne more blokirati transkripcije vapC, saj sgRNA-mCherrz in tracrRNA ne nastajata. Posledično se koncentracija VapB v celici poviša, kar vodi v smrt pobegle celice, to je izven okolja modula.
Eden izmed testov, ki so ga naredili, da bi potrdili uspešnost samomorilskega mehanizma je bil merjenje spremembe OD600 bakterij v suspenziji pri hiperoksičnih pogojih in spremenljivo koncentracijo amonijevega klorida, kot vira dušika. Po desetih urah so opazili padajoč trend v gojiščih z amonijevim kloridom. Padajoč trend je še bolj očiten, ko se poveča koncentracija amonijevega klorida. Zaključili so da je samomorilski mehanizem pod temi testnimi pogoji, reguliran s koncentracijo dušika in da deluje.
== Transport DHA in EPA v sojo ==
Njihov končni cilj je bil tudi transportirati DHA in EPA izven koreninskih nodulov v sojo. Za transport PUFA je bil že pred tem odkrit eksportni sistem, ki bi to omogočal, za gram negativne bakterije. S. fredii je tudi gram negativna bakterija. Ena študija se je ukvarjala z fiziološkim odzivom gram negativne bakterije Acinetobacter baumannii na PUFA in odkrili so povečano ekspresijo gena adeJ, ki je komponenta črpalke adeIJK, ki lahko transportira več različnih učinkovin ven iz celice. Ugotovili so da delecija gena adeJ poveča dovzetnost za PUFA. Podobno vlogo kot ima črpalka adeIJK, ima črpalka emhABC iz Pseudomonas fluorescens, ki kontrolira homeostazo lipidov, tako da izčrpava dolgo-verižne maščobne kisline. Razultata kažeta na to, da obstajajo v gram negativnih bakterijah določeni transportni proteini, ki bi omogočali transport DHA in EPA iz celice. Torej če bi povečali njihovo izražanje, bi lahko transportirali tudi DHA in EPA v sojo.

CAU-China: Nodulska tovarna DHA in EPA

2025-04-13T15:32:26Z

Luka Fink:

[https://teams.igem.org/5300]
CAU-China: Nodulska tovarna DHA in EPA
== UVOD ==
Človeštvo že dolga časa poizkuša izboljšati hranilno vrednost hrane na razno razne načine, da bi se spopadli s problemi kot so podhranjenost v nerazvitih državah in omejenost določenih virov hrane. Cilj te skupine je bil proizvajati DHA in EPA v nodulih z genetsko spremenjenimi simbiontskimi bakterijami, z namenom povečati hranilno vrednost gojenih rastlin, še posebaj soje.
Noduli so majhne kroglaste tvorbe, ki se razvijejo na rastlinskih koreninah ali steblih. V nodulih živijo simbionstske bakterije, ki iz zraka vežejo dušik. Različne rastline razvijejo simbiozo z različnimi bakterijami. Rastilne iz družine metuljnic (soja, fižol, grah, leča) živijo v simbiozi z bakterijami iz rodu Rhizobium.
Vcepitev Rhizobium prinaša še eno prednost in to je obogatitev zemlje z dušikovimi spojinami, ki jih rastline lahko uporaljajo. Dolgoročna uporaba kemičnih gnojil, lahko privede do nabiranja določenih kemikalij v zemlji, kar vodi v zmanjšanje števila koristnih bakterij. Namesto kemičnih gnojil, bi lahko uporabljali mikrobna gnolija, ki vsebujejo Rhizobium, in bi tako izboljšali kakost zemlje in zmanjšali negativne učinke kemičnih gnojil.
== Izvedba projekta ==
Izbrali so si bakterijo Sinorhizobium fredii CCBAU45436. V njej so vzpostavili niz regulacijskih modulov, ki se odzivajo na spremembne v koncentraciji dušika in kisika. Hkrati so izbrali gene, ki kodirajo za PUFA sintazo in dipeptidil aldehid, ki bi proizvajala željena produkta DHA in EPA (ter ostale stranske produkte). Za izboljšanje učinkovitosti so reprogramirali metabolizem z uravnavanjem izražanja določenih genov. Zasnovali so samomorilski mehanizem, če S. fredii pobegne. Regulacijski moduli so odgovorni za kontrolo izražanja genov za sintezo PUFA (poly-unsaturated fatty acid) in kontrolo samomorilskega mehanizma.
== Delecija PHB ==
PHB (poli-β-hidroksibutirat) je produkt metabolizma, ki lahko služi kot zaloga energije, in nastaja v S. fredii v veliki meri. Odločili so se da bodo izbrisali gen phaC2, ki kodira ključni encim za sintezo PHB. Delecijo so naredili s homologno rekombinacijo z dvojno zamenjavo. V odsotnosti gena phaC2 naj bi se v celici povečala koncentracija acetil-CoA, ki naj bi služil kot prekursor za sintezo PUFA.
Delecijo so potrdili s PCR na osnovi kolonije. Opazili so da se je S. fredii spremenil fenotip, ko so ga gojili na trdem gojišču. In sicer pri ∆phaC2 so kolonije rumene, pri wt pa bele. Testirali so še ali ima ∆phaC2 vpliv na sposobnost fiksiranja dušika, ko so mutanto vcepili v rastlino Jidou 17. Inkubacija je potekala 15 dni. Analizirali so nodule, ki so zrasli na rastlini, ki je bila vcepljena z wt in nodule, ki so zrasli na rastlini, ki je bila vcepljena z mutanto ter ugotovili da ni vidne razlike med wt in mutanto. Analizirali so še vsebnost klorofila in suhe teže nadzemeljskih delov rastline in niso našli nobene statistično signifikantne razlike. Torej ∆phaC2 ne vpliva na rast rastline.
== Regulacija in sinteza modula ==
Problem pri sintezi PUFA je ta, da mora potekati v anaerobnem okolju, drugače lahko prihaja do oksidacije PUFA. Zato bi lahko S. fredii predstavljal idealno okolje za sintezo. Za sintezo PUFA so si izbrali gručo genov iz Aetherobacter fasciculatus, katera je bila že predhodno testirana v E. coli za sintezo PUFA. Da bi zagotovili učinkovito izražanje genov PUFA, so optimizirali rabo kodonov, ki bi ustrezala S. fredii, in hkrati so gruči genov dodali PPTazo, ki bi omogočala posttranslacijske modifikacije.
Sintetizirali so modul, ki se odziva na različne koncentracije dušika in kisika v okolju. Izbrali so si promotorja glnK in nifH, ki sta endogena inducibilna promotorja S. fredii. Promotor glnK se odziva na nizke koncentracije dušika, promotor nifH pa se odziva na nizke koncentracije kisika. Regulacijski modul za sintezo PUFA je sestavljen tako, da sta pod promotorjem glnK zapisa za sgRNA-GFP in tracrRNA, pod promotorjem nifH pa zapisa za GFP in gruča genov za sintezo PUFA. Na drugi lokaciji na plazmidu je prisoten tudi konstitutivni promotor nuoA. Navzdol od promotorja nuoA se nahaj zapis za Cas12k. Posebnost Cas12k je da nima katalitske aktivnosti in da inhibira transkripcijo samo s fizično vezavo na tarčno DNA. Ko se v celici nastaja tako Cas12k kot tudi sgRNA za tarčno zaporedje, se ta povežeta in blokirata prepisovanje navzdol od vezave. Ko se v celici zniža koncentacija sgRNA, Cas12k oddisocira in s tem je prepisovanje navzdol spet omogočeno.
Cilj regulacije je da pride do prepisavanja sinteznih genov za PUFA samo ob visokih koncentracijah dušika in nizki koncentraciji kisika. Ob nizki koncentaciji dušika pride do prepisovanja nazdol od promotorja glnK, to sta sgRNA-GFP (njegova tarča je omenjeno zaporedje GFP zavzdol od nifH promotorja) in tracrRNA. Ta konstrukt se potem poveže s Cas12k. Ta se veže na zapis za GFP in s tem blokira prepisovanje genov za sintezo PUFA. Torej tudi ko je koncentracija kisika nizka in se s tem aktivira promotor nifH do prepisovanja genov za sintezo PUFA ne pride. Ob visoki koncentraciji kisika in nizki koncentraciji dušika (to predstavlja okolje preden S. fredii tvori simbiozo z rastlino) do prepisa sinteznih genov PUFA ne pride. Ob visoki koncentaciji dušika in kisika do prepisovanja navzdol od promotorjev glnK in nifH ne pride. Ob visoki koncentaciji dušika (ko dodamo gnojilo bogato z dušikom) in nizki koncentraciji kisika pride do prepisovanje genov za sintezo PUFA, saj ne pride do prepisovanja sgRNA-GFP in tracrRNA, tako da Cas12k ne more blokirati prepisovanja genov za sintezo PUFA. Prav tako je koncentracija kisika nizka, zato je nifH promotor sploh aktiven.
== Samomorilski mehanizem razlaga ==
Samomorilski mehanizem za S. fredii je zasnovan tako, da ko S. fredii pobegne ven iz modula v okolje s povišno koncentracijo dušika in kisika, naredi samomor. Mehanizem je zasnovan na sistemu toksin-antitoksin (vapC-vapB) in promotorjih nuoA, nifH in glnK. Na enem delu konstrukta nuoA kontrolira izražanje Cas12k, na drugem pa izražanje vapC. nifH kontrolira izražanje vapB. glnK pa kontrolira izražanje sgRNA za gen mCherry in tracrRNA. Različne kombinacije koncentracij dušika in kisika omogočajo preživetje, samo ob povišani koncentraciji dušika in hkrati kisika vodijo v samomor. Pri nizki koncentraciji dušika in kisika, nastaja VapB ter sgRNA-mCherry in tracrRNA. Hkrati se izraža Cas12k, ki se poveže z sgRNA-mCherry in tracrRNA, se veže na gen za mCherry in s tem blokira izražanje vapC. Pri nizki koncentracij dušika in povišani koncentracij kisika, vapB ne nastaja, izraža se sgRNA-mCherry in tracrRNA ter Cas12k, zato VapC ne nastaja. Pri povišani koncentracij dušika in nizki koncentracij kisika VapB in VapC ne nastajata. Pri povišani koncentracij dušika in povišani koncentracij kisika VapB ne nastaja, nastaja pa VapC, saj Cas12k ne more blokirati transkripcije vapC, saj sgRNA-mCherrz in tracrRNA ne nastajata. Posledično se koncentracija VapB v celici poviša, kar vodi v smrt pobegle celice, to je izven okolja modula.
Eden izmed testov, ki so ga naredili, da bi potrdili uspešnost samomorilskega mehanizma je bil merjenje spremembe OD600 bakterij v suspenziji pri hiperoksičnih pogojih in spremenljivo koncentracijo amonijevega klorida, kot vira dušika. Po desetih urah so opazili padajoč trend v gojiščih z amonijevim kloridom. Padajoč trend je še bolj očiten, ko se poveča koncentracija amonijevega klorida. Zaključili so da je samomorilski mehanizem pod temi testnimi pogoji, reguliran s koncentracijo dušika in da deluje.
== Transport DHA in EPA v sojo ==
Njihov končni cilj je bil tudi transportirati DHA in EPA izven koreninskih nodulov v sojo. Za transport PUFA je bil že pred tem odkrit eksportni sistem, ki bi to omogočal, za gram negativne bakterije. S. fredii je tudi gram negativna bakterija. Ena študija se je ukvarjala z fiziološkim odzivom gram negativne bakterije Acinetobacter baumannii na PUFA in odkrili so povečano ekspresijo gena adeJ, ki je komponenta črpalke adeIJK, ki lahko transportira več različnih učinkovin ven iz celice. Ugotovili so da delecija gena adeJ poveča dovzetnost za PUFA. Podobno vlogo kot ima črpalka adeIJK, ima črpalka emhABC iz Pseudomonas fluorescens, ki kontrolira homeostazo lipidov, tako da izčrpava dolgo-verižne maščobne kisline. Razultata kažeta na to, da obstajajo v gram negativnih bakterijah določeni transportni proteini, ki bi omogočali transport DHA in EPA iz celice. Torej če bi povečali njihovo izražanje, bi lahko transportirali tudi DHA in EPA v sojo.

CAU-China: Nodulska tovarna DHA in EPA

2025-04-13T15:28:07Z

Luka Fink: Created page with "[https://teams.igem.org/5300]"

[https://teams.igem.org/5300]

Seminarji SB 2024/25

2025-04-13T15:25:00Z

Luka Fink:

PETal: izdelovanje eteričnega olja sandalovine iz PET plastike

2025-04-07T19:14:16Z

Luka Fink:

[https://2024.igem.wiki/iiser-tvm/home PETal] je iGEM projekt ekipe IISER-TVM iz Indije iz leta 2024. Z njim so osvojili nagradi ''najboljši projekt v kategoriji moda in kozmetika'' ter ''najboljši promocijski video''.
== UVOD ==
Indijsko olje sandalovine je ena izmed najbolj iskanih surovin v kozmetični industriji. PETal ponuja inovativno rešitev za njegovo proizvodnjo, ki združuje reciklažno plastičnih odpadkov in proizvodnjo tega dišavnega olja s pomočjo sintezne biologije. Z uporabo gensko spremenjene bakterije ''Pseudomonas putida'', ki lahko presnavlja monomere polietilen tereftalata (PET), torej tereftalno kislino (TPA) in etilen glikol (EG), so želeli sintetizirati santalen in santalol, ki sta glavni sestavini olja sandalovine.
== Olje sandalovine ==
Sandalovina je vrsta lesa iz dreves iz rodu ''Santalum''. Les ima značilen vonj, ki ga, za razliko od drugih aromatičnih lesov, lahko ohrani več desetletij. Iz tega lesa pridobivajo tudi olje sandalovine, ki s svojim vonjem dopolnjuje mnoge dišave, mila in kozmetiko po vsem svetu. Najbolj cenjena vrsta, ''Santalum album'' (indijska sandalovina), raste izključno na polotoku Indije in velja za eno izmed najdragocenejših vrst lesa na svetu.
Molekulska struktura komponent olja sandalovine je edinstvena med lesenimi notami v parfumeriji. Seskviterpena '''α-santalol''' in '''β-santalol''' sta glavna nosilca vonja, ki ju pridobivajo iz sredice drevesa s parno destilacijo. Pridobivanje olja sandalovine pa je zelo dolgotrajen in drag proces. Drevesa za svojo rast potrebujejo 15-20 let, za 600 mL olja pa je potrebnih kar 20 kg lesa. Povpraševanje po sandalovini in olju sandalovine iz leta v leto narašča, ponudba pa je, glede na potrebe trga, premajhna.
== PET plastika ==
Polietilen tereftalat (PET) je tretji najbolj razširjen polimer v embalažni industriji in prevladuje na trgu plastenk za pijače. Hkrati je tudi najpogostejša oblika plastičnih odpadkov v okolju. Čeprav ga je mogoče reciklirati mehansko ali kemijsko, pa so ti postopki predragi, da bi z njimi ponovno pridobivali osnovne surovine, zato se reciklira manj kot 30 % letne proizvodnje. V zadnjem času se kot obetavna alternativa uveljavlja biološka nadpredelava (angl. ''upcycling''), ki bi lahko rešila ekonomske izzive klasičnih metod reciklaže PET.
== Izdelovanje eteričnega olja sandalovine iz PET plastike ==
Da bi učinkovito naslovili pomanjkanje olja sandalovine in hkrati vzpostavili trajnostno zanko z uporabo PET odpadkov, je skupina iz Indije zasnovala modularni sistem PETal, ki omogoča krožno rabo surovin in valorizacijo plastičnih odpadkov.
Polietilen tereftalat (PET) je sestavljen iz monomerov tereftalne kisline (TPA) in etilenglikola (EG). Z uporabo že prilagojenega seva bakterije ''Pseudomonas putida'', ki lahko presnavlja TPA in EG, so prvič v ta organizem vnesli biosintetsko pot za proizvodnjo santalola, s čimer so iz PET odpadkov želeli proizvajati santalen in santalol.

== Izvedba projekta ==
=== Izbira organizma in reševanje težav pri gojenju s pristopom ALE ===
Za organizem je skupina izbrala bakterijo ''Pseudomonas putida'' KT2440, zaradi njenega prilagodljivega metabolizma, robustnosti in sposobnosti rasti na različnih substratih. Šlo je za sev TA7-EG, ki je bil genetsko prilagojen za presnavljanje prej omenjenih monomerov TPA in EG pri 'nevtralnem pH.
Skupina je imela na začetku nekaj težav pri gojenju seva 'P. putida TA7-EG na monomerih PET, saj so bakterije znatno rast dosegle šele po 24-36 urah. Reševanja težave so se lotili s pristopom adaptivne evolucije. Začeli so z medijem, ki je poleg TPA in EG vseboval še 5 % glukoze, nato pa so njen delež postopoma zniževali, dokler ni v mediju ostala le še kombinacija TPA in EG oz. posamezen monomer. Namen tega je bil postopoma privaditi sev na rast zgolj na monomerih PET.
Po tem postopku so opazovali rast prilagojenega seva v različnih medijih (TPA, EG in TPA+EG) z merjenjem optične gostote (OD). Rezultati so pokazali, da je prilagojeni sev prešel v logaritemsko fazo hitreje kot izvorni TA7-EG, ki je za to potreboval več kot 2 dneva. Najhitrejša rast je bila opažena v mediju s kombinacijo TPA in EG, medtem ko je bil EG sam po sebi manj učinkovit.
=== Inženiring presnovne poti ===
Njihova strategija je vključevala preusmeritev toka ogljika iz monomerov PET proti naravni metabolni poti MEP za sintezo terpenoidov ter vnos biosintetske poti za santalol. Ta vključuje izražanje treh ključnih encimov iz ''Santalum album'':
*'''farnezil pirofosfat sintaza''' ('''FPPS'''),
*'''santalen sintaza''' ('''SaSSy'''),
*'''citokrom P450 monooksigenaza''' ('''CYP736A167''') s svojim '''reduktaznim partnerjem''' ('''CPR1''').
Vsi sestavljeni encimski deli so bili zasnovani modularno, z uporabo zamenljivih promotorjev in mest za vezavo ribosomov, kar bi omogočalo prihodnjim ekipam in raziskovalcem nadaljnje testiranje.

=== Metabolna pot MEP ===
Metil eritritol fosfatna pot ('''MEP''') je odgovorna za biosintezo izoprenoidnih prekurzorjev v bakterijah in plastidih. Predstavlja presnovno alternativo bolj znani mevalonatni poti (MEV) za sintezo izoprenoidov, ki se pojavlja pri arhejah in evkariontih [2].
''P. putida'' naravno vsebuje MEP pot, ki zagotavlja izoprenoidna prekurzorja IPP (izopentenil difosfat) in DMAPP (dimetilalil difosfat) iz centralnih metabolitov piruvata in gliceraldehid-3-fosfata. Ta naravna pot je dobro prilagojena gostitelju in lahko zagotovi zadostno količino prekurzorjev za proizvodnjo terpenoidov brez obsežnih gensko-inženirskih posegov.
S pomočjo modeliranja je skupina predlagala presnovno pot, ki se začne s pretvorbo TPA in EG v piruvat in gliceraldehid-3-fosfat, ki ju encima DXS in DXR pretvorita v MEP. Nadalje se MEP preko encimov IspD, IspE, IspF, IspG in IspH pretvori v spojine '''IPP''' in '''DMAPP''', ki vsebujejo 5 ogljikov. IPP molekule se nato združijo v spojino s 15 ogljiki, imenovano farnezil pirofosfat ('''FPP'''), pri čemer sodeluje encim '''FPPS''' (FPP sintaza). Čeprav je FPPS že prisoten v ''P. putida'', so vnesli tudi gen za FPPS iz ''Santalum album'', da bi zagotovili zadostno količino encima in nadzorovano izražanje pod inducibilnim promotorjem.
FPP je končni produkt MEP poti in prekurzor za santalen. Santalen sintaza ('''SaSSy''') deluje na FPP in sintetizira različne izomere, kot so endo-bergamoten, beta-santalen, (Z)-farnezen, epi-santalen in alfa-santalen. Izražanje FPPS in SaSSy je bilo že uspešno demonstrirano v ''E. coli'', zato se je ekipa odločila uporabiti enak plazmid.
=== Testiranje izražanja FPPS in SaSSY ===
Uporabili so torej ekspresijski vektor pCDFDuet, ki je vseboval zapisa za encima FPPS in SaSSy iz ''Santalum album''. Bakterije so transformirali z elektroporacijo in inducirali izražanje encima SaSSy z IPTG. Sledila je analiza izražanja proteina z barvanjem s Coomassie Blue in kemijska analiza z GC/MS. Izražanje encima SaSSy in sintezo santalena so sicer potrdili, vendar pa je bila koncentracija spojine v vzorcu razmeroma nizka. Za reševanje tega izziva so zasnovali konstrukt iz štirih osnovnih delov:
*promotor araBAD z RBS (BBa_K5181006),
*SaSSy (BBa_K5181004),
*IRES (BBa_K5181013),
*FPPS(BBa_K5181005).
Iz teh so sestavili svojo biokocko '''araBAD_SaSSy-FPPS''' (BBa_K5181014), ki so jo nato pomnožili s PCR. Biokocka je zasnovana tako, da se lahko uporablja skupaj z ogrodjem pSEVA, ki ima restrikcijski mesti ''EcoR''I in ''Hind''III. Uporabili so ogrodje '''pSEVA531''' in plazmid ter insert rezali z restrikcijskima encimoma EcoRI-HF in HindIII. Ligacijo so izvedli z NEB T4 DNA ligazo uspešnost pa preverili z rezanjem z omenjenima restrikcijskima encimoma in gelsko elektroforezo. Nato so transformirali bakterije s plazmidom in potrdili sposobnost encimov za tvorbo santalena z GC/MS.

=== Načrtovanje konstrukta za izražanje P450-CPR ===
Zadnji cilj skupine IISER-TVM je bil zasnovati najustreznejši konstrukt za izražanje encimov P450 in CPR. Encima katalizirata pretvorbo santalena v santalol, ki je še zadnja od glavnih komponent olja sandalovine. Izražanje teh encimov v prokariontskih sistemih je velik izziv, s katerim se trenutno soočajo številni znanstveniki po svetu. Med glavnimi težavami pri izražanju rastlinskega, v membrano vezanega, citokroma P450 v prokariontih, so razlike v sestavi membran, nepravilno sidranje encimov in pomanjkanje optimalnih pogojev za izražanje v bakterijskih gostiteljih.
Njihova rešitev je vključevala kombinacijo eksperimentalnega in računalniškega pristopa. S pregledom literature so ugotovili, da ima tudi ''P. putida'' svoj P450 encim, ki je dobro preučen. Njegovo strukturo so primerjali s tisto od rastlinega encima in zaznali precejšnjo strukturno podobnost, čeprav si sekvenci med seboj nista bili zelo podobni.
Za tem so začeli s spreminjanjem uporabljenih rastlinskih encimov, s tem da so odstranili njuni transmembranski domeni. Kmalu pa so naleteli na novo težavo in sicer, da morata biti encima za pravilno delovanje blizu drug drugega. Pri reševanje tega izziva so si pomagali s strukturo še enega encima P450, tokrat iz bakterije ''Bacillus cereus''. Ta encim je imel že vključeni obe domeni, oksidazno in reduktazno, strukturno pa je bil zelo podoben rastlinskima encimoma brez njunih transmembranskih domen. Člen, ki je povezoval oksidazno in reduktazno domeno v encimu iz bakterije ''B. cereus'', so uporabili kot povezovalni člen pri svojem proteinu in z njim povezali rastlinska encima P450 in CPR1. Tako dobljen encim so poimenovali '''pP450'''.
Za izražanje tega encima, so iz osnovnih delov sestavili novo biokocko '''tet-P450-CPR_fusion protein''' (BBa_K5181015). Zgrajena je bila iz:
*tet_RBS (BBa_K5181009),
*P450-CPR_fusion protein (BC_linker) (BBa_K5181008).
Kljub večim poskusom so imeli težave pri uspešni ligaciji vektorja in inserta tako z uporabo konvencionalne metode kot tudi z Gibsonovo metodo. Ligacijske poskuse so izvedli z različnimi vektorskimi ogrodji, vendar transformacije vseeno niso privedle do nastanka kolonij po elektroporaciji ali pa so transformirane kolonije, ki so jih izbrali in jim izolirali plazmide, na gelu pokazale le zabrisane lise.
Da bi prišli do vzroka težav, so sekvencirali fragmente inserta, ki sodelujo pri povezavi z vektorjem. Na podlagi rezultatov so domnevali, da se fragment med PCR-jem sicer pravilno pomnoži, vendar ligacija ne uspe zaradi strukturnih težav ali pa težav s sekvencami.

=== Računalniško modeliranje ===
Kljub neuspelemu izražanju je skupina želela razumeti, kako bi dizajniran encim deloval. Z modeliranjem so raziskali vezavo santalena in njegovih derivatov na načrtovane P450-CPR encime ter analizirali učinkovitost te vezave preko energij vezave. Rezultati računalniških simulacij so pokazali ugodne interakcije med santalenom in P450-CPR kompleksom, kar nakazuje na potencialno učinkovito pretvorbo santalena v želen produkt santalol.
== Viri in literatura ==
[1] PETal: Valorizing PET plastic to sandalwood oil https://2024.igem.wiki/iiser-tvm/home (pridobljeno 6. 4. 2025)

[2] J. Perez-Gil, J. Behrendorff, A. Douw, C. E. Vickers: The methylerythritol phosphate pathway as an oxidative stress sense and response system. ''Nat Commun'' 2024, ''15'', 5303.

PETal: izdelovanje eteričnega olja sandalovine iz PET plastike

2025-04-06T22:20:38Z

Luka Fink:

[https://2024.igem.wiki/iiser-tvm/home PETal] je iGEM projekt ekipe IISER-TVM iz Indije iz leta 2024. Z njim so osvojili nagradi ''najboljši projekt v kategoriji moda in kozmetika'' ter ''najboljši promocijski video''.
== UVOD ==
Indijsko olje sandalovine je ena izmed najbolj iskanih surovin v kozmetični industriji. PETal ponuja inovativno rešitev za njegovo proizvodnjo, ki združuje reciklažno plastičnih odpadkov in proizvodnjo tega dišavnega olja s pomočjo sintezne biologije. Z uporabo gensko spremenjene bakterije ''Pseudomonas putida'', ki lahko presnavlja monomere polietilen tereftalata (PET), torej tereftalno kislino (TPA) in etilen glikol (EG), so želeli sintetizirati santalen in santalol, ki sta glavni sestavini olja sandalovine.
== Olje sandalovine ==
Sandalovina je vrsta lesa iz dreves iz rodu ''Santalum''. Les ima značilen vonj, ki ga, za razliko od drugih aromatičnih lesov, lahko ohrani več desetletij. Iz tega lesa pridobivajo tudi olje sandalovine, ki s svojim vonjem dopolnjuje mnoge dišave, mila in kozmetiko po vsem svetu. Najbolj cenjena vrsta, ''Santalum album'' (indijska sandalovina), raste izključno na polotoku Indije in velja za eno izmed najdragocenejših vrst lesa na svetu.
Molekulska struktura komponent olja sandalovine je edinstvena med lesenimi notami v parfumeriji. Seskviterpena '''α-santalol''' in '''β-santalol''' sta glavna nosilca vonja, ki ju pridobivajo iz sredice drevesa s parno destilacijo. Pridobivanje olja sandalovine pa je zelo dolgotrajen in drag proces. Drevesa za svojo rast potrebujejo 15-20 let, za 600 mL olja pa je potrebnih kar 20 kg lesa. Povpraševanje po sandalovini in olju sandalovine iz leta v leto narašča, ponudba pa je, glede na potrebe trga, premajhna.
== PET plastika ==
Polietilen tereftalat (PET) je tretji najbolj razširjen polimer v embalažni industriji in prevladuje na trgu plastenk za pijače. Hkrati je tudi najpogostejša oblika plastičnih odpadkov v okolju. Čeprav ga je mogoče reciklirati mehansko ali kemijsko, pa so ti postopki predragi, da bi z njimi ponovno pridobivali osnovne surovine, zato se reciklira manj kot 30 % letne proizvodnje. V zadnjem času se kot obetavna alternativa uveljavlja biološka nadpredelava (angl. ''upcycling''), ki bi lahko rešila ekonomske izzive klasičnih metod reciklaže PET.
== Izdelovanje eteričnega olja sandalovine iz PET plastike ==
Da bi učinkovito naslovili pomanjkanje olja sandalovine in hkrati vzpostavili trajnostno zanko z uporabo PET odpadkov, je skupina iz Indije zasnovala modularni sistem PETal, ki omogoča krožno rabo surovin in valorizacijo plastičnih odpadkov.
Polietilen tereftalat (PET) je sestavljen iz monomerov tereftalne kisline (TPA) in etilenglikola (EG). Z uporabo že prilagojenega seva bakterije ''Pseudomonas putida'', ki lahko presnavlja TPA in EG, so prvič v ta organizem vnesli biosintetsko pot za proizvodnjo santalola, s čimer so iz PET odpadkov želeli proizvajati santalen in santalol.

== Izvedba projekta ==
=== Izbira organizma in reševanje težav pri gojenju s pristopom ALE ===
Za organizem je skupina izbrala bakterijo ''Pseudomonas putida'' KT2440, zaradi njenega prilagodljivega metabolizma, robustnosti in sposobnosti rasti na različnih substratih. Šlo je za sev TA7-EG, ki je bil genetsko prilagojen za presnavljanje prej omenjenih monomerov TPA in EG pri 'nevtralnem pH.
Skupina je imela na začetku nekaj težav pri gojenju seva 'P. putida TA7-EG na monomerih PET, saj so bakterije znatno rast dosegle šele po 24-36 urah. Reševanja težave so se lotili s pristopom adaptivne evolucije. Začeli so z medijem, ki je poleg TPA in EG vseboval še 5 % glukoze, nato pa so njen delež postopoma zniževali, dokler ni v mediju ostala le še kombinacija TPA in EG oz. posamezen monomer. Namen tega je bil postopoma privaditi sev na rast zgolj na monomerih PET.
Po tem postopku so opazovali rast prilagojenega seva v različnih medijih (TPA, EG in TPA+EG) z merjenjem optične gostote (OD). Rezultati so pokazali, da je prilagojeni sev prešel v logaritemsko fazo hitreje kot izvorni TA7-EG, ki je za to potreboval več kot 2 dneva. Najhitrejša rast je bila opažena v mediju s kombinacijo TPA in EG, medtem ko je bil EG sam po sebi manj učinkovit.
=== Inženiring presnovne poti ===
Njihova strategija je vključevala preusmeritev toka ogljika iz monomerov PET proti naravni metabolni poti MEP za sintezo terpenoidov ter vnos biosintetske poti za santalol. Ta vključuje izražanje treh ključnih encimov iz ''Santalum album'':
*'''farnezil pirofosfat sintaza''' ('''FPPS'''),
*'''santalen sintaza''' ('''SaSSy'''),
*'''citokrom P450 monooksigenaza''' ('''CYP736A167''') s svojim '''reduktaznim partnerjem''' ('''CPR1''').
Vsi sestavljeni encimski deli so bili zasnovani modularno, z uporabo zamenljivih promotorjev in mest za vezavo ribosomov, kar bi omogočalo prihodnjim ekipam in raziskovalcem nadaljnje testiranje.

=== Metabolna pot MEP ===
Metil eritritol fosfatna pot ('''MEP''')je odgovorna za biosintezo izoprenoidnih prekurzorjev v bakterijah in plastidih. Predstavlja presnovno alternativo bolj znani mevalonatni poti (MEV) za sintezo izoprenoidov, ki se pojavlja pri arhejah in evkariontih [2].
''P. putida'' naravno vsebuje MEP pot, ki zagotavlja izoprenoidna prekurzorja IPP (izopentenil difosfat) in DMAPP (dimetilalil difosfat) iz centralnih metabolitov piruvata in gliceraldehid-3-fosfata. Ta naravna pot je dobro prilagojena gostitelju in lahko zagotovi zadostno količino prekurzorjev za proizvodnjo terpenoidov brez obsežnih gensko-inženirskih posegov.
S pomočjo modeliranja je skupina predlagala presnovno pot, ki se začne s pretvorbo TPA in EG v piruvat in gliceraldehid-3-fosfat, ki ju encima DXS in DXR pretvorita v MEP. Nadalje se MEP preko encimov IspD, IspE, IspF, IspG in IspH pretvori v spojine '''IPP''' in '''DMAPP''', ki vsebujejo 5 ogljikov. IPP molekule se nato združijo v spojino s 15 ogljiki, imenovano farnezil pirofosfat ('''FPP'''), pri čemer sodeluje encim '''FPPS''' (FPP sintaza). Čeprav je FPPS že prisoten v ''P. putida'', so vnesli tudi gen za FPPS iz ''Santalum album'', da bi zagotovili zadostno količino encima in nadzorovano izražanje pod inducibilnim promotorjem.
FPP je končni produkt MEP poti in prekurzor za santalen. Santalen sintaza ('''SaSSy''') deluje na FPP in sintetizira različne izomere, kot so endo-bergamoten, beta-santalen, (Z)-farnezen, epi-santalen in alfa-santalen. Izražanje FPPS in SaSSy je bilo že uspešno demonstrirano v ''E. coli'', zato se je ekipa odločila uporabiti enak plazmid.
=== Testiranje izražanja FPPS in SaSSY ===
Uporabili so torej ekspresijski vektor pCDFDuet, ki je vseboval zapisa za encima FPPS in SaSSy iz ''Santalum album''. Bakterije so transformirali z elektroporacijo in inducirali izražanje encima SaSSy z IPTG. Sledila je analiza izražanja proteina z barvanjem s Coomassie Blue in kemijska analiza z GC/MS. Izražanje encima SaSSy in sintezo santalena so sicer potrdili, vendar pa je bila koncentracija spojine v vzorcu razmeroma nizka. Za reševanje tega izziva so zasnovali konstrukt iz štirih osnovnih delov:
*promotor araBAD z RBS (BBa_K5181006),
*SaSSy (BBa_K5181004),
*IRES (BBa_K5181013),
*FPPS(BBa_K5181005).
Iz teh so sestavili svojo biokocko '''araBAD_SaSSy-FPPS''' (BBa_K5181014), ki so jo nato pomnožili s PCR. Biokocka je zasnovana tako, da se lahko uporablja skupaj z ogrodjem pSEVA, ki ima restrikcijski mesti ''EcoR''I in ''Hind''III. Uporabili so ogrodje '''pSEVA531''' in plazmid ter insert rezali z restrikcijskima encimoma EcoRI-HF in HindIII. Ligacijo so izvedli z NEB T4 DNA ligazo uspešnost pa preverili z rezanjem z omenjenima restrikcijskima encimoma in gelsko elektroforezo. Nato so transformirali bakterije s plazmidom in potrdili sposobnost encimov za tvorbo santalena z GC/MS.

=== Načrtovanje konstrukta za izražanje P450-CPR ===
Zadnji cilj skupine IISER-TVM je bil zasnovati najustreznejši konstrukt za izražanje encimov P450 in CPR. Encima katalizirata pretvorbo santalena v santalol, ki je še zadnja od glavnih komponent olja sandalovine. Izražanje teh encimov v prokariontskih sistemih je velik izziv, s katerim se trenutno soočajo številni znanstveniki po svetu. Med glavnimi težavami pri izražanju rastlinskega, v membrano vezanega, citokroma P450 v prokariontih, so razlike v sestavi membran, nepravilno sidranje encimov in pomanjkanje optimalnih pogojev za izražanje v bakterijskih gostiteljih.
Njihova rešitev je vključevala kombinacijo eksperimentalnega in računalniškega pristopa. S pregledom literature so ugotovili, da ima tudi ''P. putida'' svoj P450 encim, ki je dobro preučen. Njegovo strukturo so primerjali s tisto od rastlinega encima in zaznali precejšnjo strukturno podobnost, čeprav si sekvenci med seboj nista bili zelo podobni.
Za tem so začeli s spreminjanjem uporabljenih rastlinskih encimov, s tem da so odstranili njuni transmembranski domeni. Kmalu pa so naleteli na novo težavo in sicer, da morata biti encima za pravilno delovanje blizu drug drugega. Pri reševanje tega izziva so si pomagali s strukturo še enega encima P450, tokrat iz bakterije ''Bacillus cereus''. Ta encim je imel že vključeni obe domeni, oksidazno in reduktazno, strukturno pa je bil zelo podoben rastlinskima encimoma brez njunih transmembranskih domen. Člen, ki je povezoval oksidazno in reduktazno domeno v encimu iz bakterije ''B. cereus'', so uporabili kot povezovalni člen pri svojem proteinu in z njim povezali rastlinska encima P450 in CPR1. Tako dobljen encim so poimenovali '''pP450'''.
Za izražanje tega encima, so iz osnovnih delov sestavili novo biokocko '''tet-P450-CPR_fusion protein''' (BBa_K5181015). Zgrajena je bila iz:
*tet_RBS (BBa_K5181009),
*P450-CPR_fusion protein (BC_linker) (BBa_K5181008).
Kljub večim poskusom so imeli težave pri uspešni ligaciji vektorja in inserta tako z uporabo konvencionalne metode kot tudi z Gibsonovo metodo. Ligacijske poskuse so izvedli z različnimi vektorskimi ogrodji, vendar transformacije vseeno niso privedle do nastanka kolonij po elektroporaciji ali pa so transformirane kolonije, ki so jih izbrali in jim izolirali plazmide, na gelu pokazale le zabrisane lise.
Da bi prišli do vzroka težav, so sekvencirali fragmente inserta, ki sodelujo pri povezavi z vektorjem. Na podlagi rezultatov so domnevali, da se fragment med PCR-jem sicer pravilno pomnoži, vendar ligacija ne uspe zaradi strukturnih težav ali pa težav s sekvencami.

=== Računalniško modeliranje ===
Kljub neuspelemu izražanju je skupina želela razumeti, kako bi dizajniran encim deloval. Z modeliranjem so raziskali vezavo santalena in njegovih derivatov na načrtovane P450-CPR encime ter analizirali učinkovitost te vezave preko energij vezave. Rezultati računalniških simulacij so pokazali ugodne interakcije med santalenom in P450-CPR kompleksom, kar nakazuje na potencialno učinkovito pretvorbo santalena v želen produkt santalol.
== Viri in literatura ==
[1] PETal: Valorizing PET plastic to sandalwood oil https://2024.igem.wiki/iiser-tvm/home (pridobljeno 6. 4. 2025)

[2] J. Perez-Gil, J. Behrendorff, A. Douw, C. E. Vickers: The methylerythritol phosphate pathway as an oxidative stress sense and response system. ''Nat Commun'' 2024, ''15'', 5303.

PETal: izdelovanje eteričnega olja sandalovine iz PET plastike

2025-04-06T22:18:51Z

Luka Fink: /* Viri in literatura */

[https://2024.igem.wiki/iiser-tvm/home PETal] je iGEM projekt ekipe IISER-TVM iz Indije iz leta 2024.
== UVOD ==
Indijsko olje sandalovine je ena izmed najbolj iskanih surovin v kozmetični industriji. PETal ponuja inovativno rešitev za njegovo proizvodnjo, ki združuje reciklažno plastičnih odpadkov in proizvodnjo tega dišavnega olja s pomočjo sintezne biologije. Z uporabo gensko spremenjene bakterije ''Pseudomonas putida'', ki lahko presnavlja monomere polietilen tereftalata (PET), torej tereftalno kislino (TPA) in etilen glikol (EG), so želeli sintetizirati santalen in santalol, ki sta glavni sestavini olja sandalovine.
== Olje sandalovine ==
Sandalovina je vrsta lesa iz dreves iz rodu ''Santalum''. Les ima značilen vonj, ki ga, za razliko od drugih aromatičnih lesov, lahko ohrani več desetletij. Iz tega lesa pridobivajo tudi olje sandalovine, ki s svojim vonjem dopolnjuje mnoge dišave, mila in kozmetiko po vsem svetu. Najbolj cenjena vrsta, ''Santalum album'' (indijska sandalovina), raste izključno na polotoku Indije in velja za eno izmed najdragocenejših vrst lesa na svetu.
Molekulska struktura komponent olja sandalovine je edinstvena med lesenimi notami v parfumeriji. Seskviterpena '''α-santalol''' in '''β-santalol''' sta glavna nosilca vonja, ki ju pridobivajo iz sredice drevesa s parno destilacijo. Pridobivanje olja sandalovine pa je zelo dolgotrajen in drag proces. Drevesa za svojo rast potrebujejo 15-20 let, za 600 mL olja pa je potrebnih kar 20 kg lesa. Povpraševanje po sandalovini in olju sandalovine iz leta v leto narašča, ponudba pa je, glede na potrebe trga, premajhna.
== PET plastika ==
Polietilen tereftalat (PET) je tretji najbolj razširjen polimer v embalažni industriji in prevladuje na trgu plastenk za pijače. Hkrati je tudi najpogostejša oblika plastičnih odpadkov v okolju. Čeprav ga je mogoče reciklirati mehansko ali kemijsko, pa so ti postopki predragi, da bi z njimi ponovno pridobivali osnovne surovine, zato se reciklira manj kot 30 % letne proizvodnje. V zadnjem času se kot obetavna alternativa uveljavlja biološka nadpredelava (angl. ''upcycling''), ki bi lahko rešila ekonomske izzive klasičnih metod reciklaže PET.
== Izdelovanje eteričnega olja sandalovine iz PET plastike ==
Da bi učinkovito naslovili pomanjkanje olja sandalovine in hkrati vzpostavili trajnostno zanko z uporabo PET odpadkov, je skupina iz Indije zasnovala modularni sistem PETal, ki omogoča krožno rabo surovin in valorizacijo plastičnih odpadkov.
Polietilen tereftalat (PET) je sestavljen iz monomerov tereftalne kisline (TPA) in etilenglikola (EG). Z uporabo že prilagojenega seva bakterije ''Pseudomonas putida'', ki lahko presnavlja TPA in EG, so prvič v ta organizem vnesli biosintetsko pot za proizvodnjo santalola, s čimer so iz PET odpadkov želeli proizvajati santalen in santalol.

== Izvedba projekta ==
=== Izbira organizma in reševanje težav pri gojenju s pristopom ALE ===
Za organizem je skupina izbrala bakterijo ''Pseudomonas putida'' KT2440, zaradi njenega prilagodljivega metabolizma, robustnosti in sposobnosti rasti na različnih substratih. Šlo je za sev TA7-EG, ki je bil genetsko prilagojen za presnavljanje prej omenjenih monomerov TPA in EG pri 'nevtralnem pH.
Skupina je imela na začetku nekaj težav pri gojenju seva 'P. putida TA7-EG na monomerih PET, saj so bakterije znatno rast dosegle šele po 24-36 urah. Reševanja težave so se lotili s pristopom adaptivne evolucije. Začeli so z medijem, ki je poleg TPA in EG vseboval še 5 % glukoze, nato pa so njen delež postopoma zniževali, dokler ni v mediju ostala le še kombinacija TPA in EG oz. posamezen monomer. Namen tega je bil postopoma privaditi sev na rast zgolj na monomerih PET.
Po tem postopku so opazovali rast prilagojenega seva v različnih medijih (TPA, EG in TPA+EG) z merjenjem optične gostote (OD). Rezultati so pokazali, da je prilagojeni sev prešel v logaritemsko fazo hitreje kot izvorni TA7-EG, ki je za to potreboval več kot 2 dneva. Najhitrejša rast je bila opažena v mediju s kombinacijo TPA in EG, medtem ko je bil EG sam po sebi manj učinkovit.
=== Inženiring presnovne poti ===
Njihova strategija je vključevala preusmeritev toka ogljika iz monomerov PET proti naravni metabolni poti MEP za sintezo terpenoidov ter vnos biosintetske poti za santalol. Ta vključuje izražanje treh ključnih encimov iz ''Santalum album'':
*'''farnezil pirofosfat sintaza''' ('''FPPS'''),
*'''santalen sintaza''' ('''SaSSy'''),
*'''citokrom P450 monooksigenaza''' ('''CYP736A167''') s svojim '''reduktaznim partnerjem''' ('''CPR1''').
Vsi sestavljeni encimski deli so bili zasnovani modularno, z uporabo zamenljivih promotorjev in mest za vezavo ribosomov, kar bi omogočalo prihodnjim ekipam in raziskovalcem nadaljnje testiranje.

=== Metabolna pot MEP ===
Metil eritritol fosfatna pot ('''MEP''')je odgovorna za biosintezo izoprenoidnih prekurzorjev v bakterijah in plastidih. Predstavlja presnovno alternativo bolj znani mevalonatni poti (MEV) za sintezo izoprenoidov, ki se pojavlja pri arhejah in evkariontih [2].
''P. putida'' naravno vsebuje MEP pot, ki zagotavlja izoprenoidna prekurzorja IPP (izopentenil difosfat) in DMAPP (dimetilalil difosfat) iz centralnih metabolitov piruvata in gliceraldehid-3-fosfata. Ta naravna pot je dobro prilagojena gostitelju in lahko zagotovi zadostno količino prekurzorjev za proizvodnjo terpenoidov brez obsežnih gensko-inženirskih posegov.
S pomočjo modeliranja je skupina predlagala presnovno pot, ki se začne s pretvorbo TPA in EG v piruvat in gliceraldehid-3-fosfat, ki ju encima DXS in DXR pretvorita v MEP. Nadalje se MEP preko encimov IspD, IspE, IspF, IspG in IspH pretvori v spojine '''IPP''' in '''DMAPP''', ki vsebujejo 5 ogljikov. IPP molekule se nato združijo v spojino s 15 ogljiki, imenovano farnezil pirofosfat ('''FPP'''), pri čemer sodeluje encim '''FPPS''' (FPP sintaza). Čeprav je FPPS že prisoten v ''P. putida'', so vnesli tudi gen za FPPS iz ''Santalum album'', da bi zagotovili zadostno količino encima in nadzorovano izražanje pod inducibilnim promotorjem.
FPP je končni produkt MEP poti in prekurzor za santalen. Santalen sintaza ('''SaSSy''') deluje na FPP in sintetizira različne izomere, kot so endo-bergamoten, beta-santalen, (Z)-farnezen, epi-santalen in alfa-santalen. Izražanje FPPS in SaSSy je bilo že uspešno demonstrirano v ''E. coli'', zato se je ekipa odločila uporabiti enak plazmid.
=== Testiranje izražanja FPPS in SaSSY ===
Uporabili so torej ekspresijski vektor pCDFDuet, ki je vseboval zapisa za encima FPPS in SaSSy iz ''Santalum album''. Bakterije so transformirali z elektroporacijo in inducirali izražanje encima SaSSy z IPTG. Sledila je analiza izražanja proteina z barvanjem s Coomassie Blue in kemijska analiza z GC/MS. Izražanje encima SaSSy in sintezo santalena so sicer potrdili, vendar pa je bila koncentracija spojine v vzorcu razmeroma nizka. Za reševanje tega izziva so zasnovali konstrukt iz štirih osnovnih delov:
*promotor araBAD z RBS (BBa_K5181006),
*SaSSy (BBa_K5181004),
*IRES (BBa_K5181013),
*FPPS(BBa_K5181005).
Iz teh so sestavili svojo biokocko '''araBAD_SaSSy-FPPS''' (BBa_K5181014), ki so jo nato pomnožili s PCR. Biokocka je zasnovana tako, da se lahko uporablja skupaj z ogrodjem pSEVA, ki ima restrikcijski mesti ''EcoR''I in ''Hind''III. Uporabili so ogrodje '''pSEVA531''' in plazmid ter insert rezali z restrikcijskima encimoma EcoRI-HF in HindIII. Ligacijo so izvedli z NEB T4 DNA ligazo uspešnost pa preverili z rezanjem z omenjenima restrikcijskima encimoma in gelsko elektroforezo. Nato so transformirali bakterije s plazmidom in potrdili sposobnost encimov za tvorbo santalena z GC/MS.

=== Načrtovanje konstrukta za izražanje P450-CPR ===
Zadnji cilj skupine IISER-TVM je bil zasnovati najustreznejši konstrukt za izražanje encimov P450 in CPR. Encima katalizirata pretvorbo santalena v santalol, ki je še zadnja od glavnih komponent olja sandalovine. Izražanje teh encimov v prokariontskih sistemih je velik izziv, s katerim se trenutno soočajo številni znanstveniki po svetu. Med glavnimi težavami pri izražanju rastlinskega, v membrano vezanega, citokroma P450 v prokariontih, so razlike v sestavi membran, nepravilno sidranje encimov in pomanjkanje optimalnih pogojev za izražanje v bakterijskih gostiteljih.
Njihova rešitev je vključevala kombinacijo eksperimentalnega in računalniškega pristopa. S pregledom literature so ugotovili, da ima tudi ''P. putida'' svoj P450 encim, ki je dobro preučen. Njegovo strukturo so primerjali s tisto od rastlinega encima in zaznali precejšnjo strukturno podobnost, čeprav si sekvenci med seboj nista bili zelo podobni.
Za tem so začeli s spreminjanjem uporabljenih rastlinskih encimov, s tem da so odstranili njuni transmembranski domeni. Kmalu pa so naleteli na novo težavo in sicer, da morata biti encima za pravilno delovanje blizu drug drugega. Pri reševanje tega izziva so si pomagali s strukturo še enega encima P450, tokrat iz bakterije ''Bacillus cereus''. Ta encim je imel že vključeni obe domeni, oksidazno in reduktazno, strukturno pa je bil zelo podoben rastlinskima encimoma brez njunih transmembranskih domen. Člen, ki je povezoval oksidazno in reduktazno domeno v encimu iz bakterije ''B. cereus'', so uporabili kot povezovalni člen pri svojem proteinu in z njim povezali rastlinska encima P450 in CPR1. Tako dobljen encim so poimenovali '''pP450'''.
Za izražanje tega encima, so iz osnovnih delov sestavili novo biokocko '''tet-P450-CPR_fusion protein''' (BBa_K5181015). Zgrajena je bila iz:
*tet_RBS (BBa_K5181009),
*P450-CPR_fusion protein (BC_linker) (BBa_K5181008).
Kljub večim poskusom so imeli težave pri uspešni ligaciji vektorja in inserta tako z uporabo konvencionalne metode kot tudi z Gibsonovo metodo. Ligacijske poskuse so izvedli z različnimi vektorskimi ogrodji, vendar transformacije vseeno niso privedle do nastanka kolonij po elektroporaciji ali pa so transformirane kolonije, ki so jih izbrali in jim izolirali plazmide, na gelu pokazale le zabrisane lise.
Da bi prišli do vzroka težav, so sekvencirali fragmente inserta, ki sodelujo pri povezavi z vektorjem. Na podlagi rezultatov so domnevali, da se fragment med PCR-jem sicer pravilno pomnoži, vendar ligacija ne uspe zaradi strukturnih težav ali pa težav s sekvencami.

=== Računalniško modeliranje ===
Kljub neuspelemu izražanju je skupina želela razumeti, kako bi dizajniran encim deloval. Z modeliranjem so raziskali vezavo santalena in njegovih derivatov na načrtovane P450-CPR encime ter analizirali učinkovitost te vezave preko energij vezave. Rezultati računalniških simulacij so pokazali ugodne interakcije med santalenom in P450-CPR kompleksom, kar nakazuje na potencialno učinkovito pretvorbo santalena v želen produkt santalol.
== Viri in literatura ==
[1] PETal: Valorizing PET plastic to sandalwood oil https://2024.igem.wiki/iiser-tvm/home (pridobljeno 6. 4. 2025)

[2] J. Perez-Gil, J. Behrendorff, A. Douw, C. E. Vickers: The methylerythritol phosphate pathway as an oxidative stress sense and response system. ''Nat Commun'' 2024, ''15'', 5303.

PETal: izdelovanje eteričnega olja sandalovine iz PET plastike

2025-04-06T22:17:09Z

Luka Fink: /* Viri in literatura */

PETal: izdelovanje eteričnega olja sandalovine iz PET plastike

2025-04-06T22:16:32Z

Luka Fink:

[https://2024.igem.wiki/iiser-tvm/home PETal] je iGEM projekt ekipe IISER-TVM iz Indije iz leta 2024.
== UVOD ==
Indijsko olje sandalovine je ena izmed najbolj iskanih surovin v kozmetični industriji. PETal ponuja inovativno rešitev za njegovo proizvodnjo, ki združuje reciklažno plastičnih odpadkov in proizvodnjo tega dišavnega olja s pomočjo sintezne biologije. Z uporabo gensko spremenjene bakterije ''Pseudomonas putida'', ki lahko presnavlja monomere polietilen tereftalata (PET), torej tereftalno kislino (TPA) in etilen glikol (EG), so želeli sintetizirati santalen in santalol, ki sta glavni sestavini olja sandalovine.
== Olje sandalovine ==
Sandalovina je vrsta lesa iz dreves iz rodu ''Santalum''. Les ima značilen vonj, ki ga, za razliko od drugih aromatičnih lesov, lahko ohrani več desetletij. Iz tega lesa pridobivajo tudi olje sandalovine, ki s svojim vonjem dopolnjuje mnoge dišave, mila in kozmetiko po vsem svetu. Najbolj cenjena vrsta, ''Santalum album'' (indijska sandalovina), raste izključno na polotoku Indije in velja za eno izmed najdragocenejših vrst lesa na svetu.
Molekulska struktura komponent olja sandalovine je edinstvena med lesenimi notami v parfumeriji. Seskviterpena '''α-santalol''' in '''β-santalol''' sta glavna nosilca vonja, ki ju pridobivajo iz sredice drevesa s parno destilacijo. Pridobivanje olja sandalovine pa je zelo dolgotrajen in drag proces. Drevesa za svojo rast potrebujejo 15-20 let, za 600 mL olja pa je potrebnih kar 20 kg lesa. Povpraševanje po sandalovini in olju sandalovine iz leta v leto narašča, ponudba pa je, glede na potrebe trga, premajhna.
== PET plastika ==
Polietilen tereftalat (PET) je tretji najbolj razširjen polimer v embalažni industriji in prevladuje na trgu plastenk za pijače. Hkrati je tudi najpogostejša oblika plastičnih odpadkov v okolju. Čeprav ga je mogoče reciklirati mehansko ali kemijsko, pa so ti postopki predragi, da bi z njimi ponovno pridobivali osnovne surovine, zato se reciklira manj kot 30 % letne proizvodnje. V zadnjem času se kot obetavna alternativa uveljavlja biološka nadpredelava (angl. ''upcycling''), ki bi lahko rešila ekonomske izzive klasičnih metod reciklaže PET.
== Izdelovanje eteričnega olja sandalovine iz PET plastike ==
Da bi učinkovito naslovili pomanjkanje olja sandalovine in hkrati vzpostavili trajnostno zanko z uporabo PET odpadkov, je skupina iz Indije zasnovala modularni sistem PETal, ki omogoča krožno rabo surovin in valorizacijo plastičnih odpadkov.
Polietilen tereftalat (PET) je sestavljen iz monomerov tereftalne kisline (TPA) in etilenglikola (EG). Z uporabo že prilagojenega seva bakterije ''Pseudomonas putida'', ki lahko presnavlja TPA in EG, so prvič v ta organizem vnesli biosintetsko pot za proizvodnjo santalola, s čimer so iz PET odpadkov želeli proizvajati santalen in santalol.

== Izvedba projekta ==
=== Izbira organizma in reševanje težav pri gojenju s pristopom ALE ===
Za organizem je skupina izbrala bakterijo ''Pseudomonas putida'' KT2440, zaradi njenega prilagodljivega metabolizma, robustnosti in sposobnosti rasti na različnih substratih. Šlo je za sev TA7-EG, ki je bil genetsko prilagojen za presnavljanje prej omenjenih monomerov TPA in EG pri 'nevtralnem pH.
Skupina je imela na začetku nekaj težav pri gojenju seva 'P. putida TA7-EG na monomerih PET, saj so bakterije znatno rast dosegle šele po 24-36 urah. Reševanja težave so se lotili s pristopom adaptivne evolucije. Začeli so z medijem, ki je poleg TPA in EG vseboval še 5 % glukoze, nato pa so njen delež postopoma zniževali, dokler ni v mediju ostala le še kombinacija TPA in EG oz. posamezen monomer. Namen tega je bil postopoma privaditi sev na rast zgolj na monomerih PET.
Po tem postopku so opazovali rast prilagojenega seva v različnih medijih (TPA, EG in TPA+EG) z merjenjem optične gostote (OD). Rezultati so pokazali, da je prilagojeni sev prešel v logaritemsko fazo hitreje kot izvorni TA7-EG, ki je za to potreboval več kot 2 dneva. Najhitrejša rast je bila opažena v mediju s kombinacijo TPA in EG, medtem ko je bil EG sam po sebi manj učinkovit.
=== Inženiring presnovne poti ===
Njihova strategija je vključevala preusmeritev toka ogljika iz monomerov PET proti naravni metabolni poti MEP za sintezo terpenoidov ter vnos biosintetske poti za santalol. Ta vključuje izražanje treh ključnih encimov iz ''Santalum album'':
*'''farnezil pirofosfat sintaza''' ('''FPPS'''),
*'''santalen sintaza''' ('''SaSSy'''),
*'''citokrom P450 monooksigenaza''' ('''CYP736A167''') s svojim '''reduktaznim partnerjem''' ('''CPR1''').
Vsi sestavljeni encimski deli so bili zasnovani modularno, z uporabo zamenljivih promotorjev in mest za vezavo ribosomov, kar bi omogočalo prihodnjim ekipam in raziskovalcem nadaljnje testiranje.

=== Metabolna pot MEP ===
Metil eritritol fosfatna pot ('''MEP''')je odgovorna za biosintezo izoprenoidnih prekurzorjev v bakterijah in plastidih. Predstavlja presnovno alternativo bolj znani mevalonatni poti (MEV) za sintezo izoprenoidov, ki se pojavlja pri arhejah in evkariontih [2].
''P. putida'' naravno vsebuje MEP pot, ki zagotavlja izoprenoidna prekurzorja IPP (izopentenil difosfat) in DMAPP (dimetilalil difosfat) iz centralnih metabolitov piruvata in gliceraldehid-3-fosfata. Ta naravna pot je dobro prilagojena gostitelju in lahko zagotovi zadostno količino prekurzorjev za proizvodnjo terpenoidov brez obsežnih gensko-inženirskih posegov.
S pomočjo modeliranja je skupina predlagala presnovno pot, ki se začne s pretvorbo TPA in EG v piruvat in gliceraldehid-3-fosfat, ki ju encima DXS in DXR pretvorita v MEP. Nadalje se MEP preko encimov IspD, IspE, IspF, IspG in IspH pretvori v spojine '''IPP''' in '''DMAPP''', ki vsebujejo 5 ogljikov. IPP molekule se nato združijo v spojino s 15 ogljiki, imenovano farnezil pirofosfat ('''FPP'''), pri čemer sodeluje encim '''FPPS''' (FPP sintaza). Čeprav je FPPS že prisoten v ''P. putida'', so vnesli tudi gen za FPPS iz ''Santalum album'', da bi zagotovili zadostno količino encima in nadzorovano izražanje pod inducibilnim promotorjem.
FPP je končni produkt MEP poti in prekurzor za santalen. Santalen sintaza ('''SaSSy''') deluje na FPP in sintetizira različne izomere, kot so endo-bergamoten, beta-santalen, (Z)-farnezen, epi-santalen in alfa-santalen. Izražanje FPPS in SaSSy je bilo že uspešno demonstrirano v ''E. coli'', zato se je ekipa odločila uporabiti enak plazmid.
=== Testiranje izražanja FPPS in SaSSY ===
Uporabili so torej ekspresijski vektor pCDFDuet, ki je vseboval zapisa za encima FPPS in SaSSy iz ''Santalum album''. Bakterije so transformirali z elektroporacijo in inducirali izražanje encima SaSSy z IPTG. Sledila je analiza izražanja proteina z barvanjem s Coomassie Blue in kemijska analiza z GC/MS. Izražanje encima SaSSy in sintezo santalena so sicer potrdili, vendar pa je bila koncentracija spojine v vzorcu razmeroma nizka. Za reševanje tega izziva so zasnovali konstrukt iz štirih osnovnih delov:
*promotor araBAD z RBS (BBa_K5181006),
*SaSSy (BBa_K5181004),
*IRES (BBa_K5181013),
*FPPS(BBa_K5181005).
Iz teh so sestavili svojo biokocko '''araBAD_SaSSy-FPPS''' (BBa_K5181014), ki so jo nato pomnožili s PCR. Biokocka je zasnovana tako, da se lahko uporablja skupaj z ogrodjem pSEVA, ki ima restrikcijski mesti ''EcoR''I in ''Hind''III. Uporabili so ogrodje '''pSEVA531''' in plazmid ter insert rezali z restrikcijskima encimoma EcoRI-HF in HindIII. Ligacijo so izvedli z NEB T4 DNA ligazo uspešnost pa preverili z rezanjem z omenjenima restrikcijskima encimoma in gelsko elektroforezo. Nato so transformirali bakterije s plazmidom in potrdili sposobnost encimov za tvorbo santalena z GC/MS.

=== Načrtovanje konstrukta za izražanje P450-CPR ===
Zadnji cilj skupine IISER-TVM je bil zasnovati najustreznejši konstrukt za izražanje encimov P450 in CPR. Encima katalizirata pretvorbo santalena v santalol, ki je še zadnja od glavnih komponent olja sandalovine. Izražanje teh encimov v prokariontskih sistemih je velik izziv, s katerim se trenutno soočajo številni znanstveniki po svetu. Med glavnimi težavami pri izražanju rastlinskega, v membrano vezanega, citokroma P450 v prokariontih, so razlike v sestavi membran, nepravilno sidranje encimov in pomanjkanje optimalnih pogojev za izražanje v bakterijskih gostiteljih.
Njihova rešitev je vključevala kombinacijo eksperimentalnega in računalniškega pristopa. S pregledom literature so ugotovili, da ima tudi ''P. putida'' svoj P450 encim, ki je dobro preučen. Njegovo strukturo so primerjali s tisto od rastlinega encima in zaznali precejšnjo strukturno podobnost, čeprav si sekvenci med seboj nista bili zelo podobni.
Za tem so začeli s spreminjanjem uporabljenih rastlinskih encimov, s tem da so odstranili njuni transmembranski domeni. Kmalu pa so naleteli na novo težavo in sicer, da morata biti encima za pravilno delovanje blizu drug drugega. Pri reševanje tega izziva so si pomagali s strukturo še enega encima P450, tokrat iz bakterije ''Bacillus cereus''. Ta encim je imel že vključeni obe domeni, oksidazno in reduktazno, strukturno pa je bil zelo podoben rastlinskima encimoma brez njunih transmembranskih domen. Člen, ki je povezoval oksidazno in reduktazno domeno v encimu iz bakterije ''B. cereus'', so uporabili kot povezovalni člen pri svojem proteinu in z njim povezali rastlinska encima P450 in CPR1. Tako dobljen encim so poimenovali '''pP450'''.
Za izražanje tega encima, so iz osnovnih delov sestavili novo biokocko '''tet-P450-CPR_fusion protein''' (BBa_K5181015). Zgrajena je bila iz:
*tet_RBS (BBa_K5181009),
*P450-CPR_fusion protein (BC_linker) (BBa_K5181008).
Kljub večim poskusom so imeli težave pri uspešni ligaciji vektorja in inserta tako z uporabo konvencionalne metode kot tudi z Gibsonovo metodo. Ligacijske poskuse so izvedli z različnimi vektorskimi ogrodji, vendar transformacije vseeno niso privedle do nastanka kolonij po elektroporaciji ali pa so transformirane kolonije, ki so jih izbrali in jim izolirali plazmide, na gelu pokazale le zabrisane lise.
Da bi prišli do vzroka težav, so sekvencirali fragmente inserta, ki sodelujo pri povezavi z vektorjem. Na podlagi rezultatov so domnevali, da se fragment med PCR-jem sicer pravilno pomnoži, vendar ligacija ne uspe zaradi strukturnih težav ali pa težav s sekvencami.

=== Računalniško modeliranje ===
Kljub neuspelemu izražanju je skupina želela razumeti, kako bi dizajniran encim deloval. Z modeliranjem so raziskali vezavo santalena in njegovih derivatov na načrtovane P450-CPR encime ter analizirali učinkovitost te vezave preko energij vezave. Rezultati računalniških simulacij so pokazali ugodne interakcije med santalenom in P450-CPR kompleksom, kar nakazuje na potencialno učinkovito pretvorbo santalena v želen produkt santalol.
== Viri in literatura ==
[1] PETal: Valorizing PET plastic to sandalwood oil https://2024.igem.wiki/iiser-tvm/home (pridobljeno 6. 4. 2025)
[2] J. Perez-Gil, J. Behrendorff, A. Douw, C. E. Vickers: The methylerythritol phosphate pathway as an oxidative stress sense and response system. Nat Commun 2024, 15, 5303.

PETal: izdelovanje eteričnega olja sandalovine iz PET plastike

2025-04-06T22:09:32Z

Luka Fink: /* Načrtovanje konstrukta za izražanje P450-CPR */

[https://2024.igem.wiki/iiser-tvm/home PETal] je iGEM projekt ekipe IISER-TVM iz Indije iz leta 2024.
== UVOD ==
Indijsko olje sandalovine je ena izmed najbolj iskanih surovin v kozmetični industriji. PETal ponuja inovativno rešitev za njegovo proizvodnjo, ki združuje reciklažno plastičnih odpadkov in proizvodnjo tega dišavnega olja s pomočjo sintezne biologije. Z uporabo gensko spremenjene bakterije ''Pseudomonas putida'', ki lahko presnavlja monomere polietilen tereftalata (PET), torej tereftalno kislino (TPA) in etilen glikol (EG), so želeli sintetizirati santalen in santalol, ki sta glavni sestavini olja sandalovine.
== Olje sandalovine ==
Sandalovina je vrsta lesa iz dreves iz rodu ''Santalum''. Les ima značilen vonj, ki ga, za razliko od drugih aromatičnih lesov, lahko ohrani več desetletij. Iz tega lesa pridobivajo tudi olje sandalovine, ki s svojim vonjem dopolnjuje mnoge dišave, mila in kozmetiko po vsem svetu. Najbolj cenjena vrsta, ''Santalum album'' (indijska sandalovina), raste izključno na polotoku Indije in velja za eno izmed najdragocenejših vrst lesa na svetu.
Molekulska struktura komponent olja sandalovine je edinstvena med lesenimi notami v parfumeriji. Seskviterpena '''α-santalol''' in '''β-santalol''' sta glavna nosilca vonja, ki ju pridobivajo iz sredice drevesa s parno destilacijo. Pridobivanje olja sandalovine pa je zelo dolgotrajen in drag proces. Drevesa za svojo rast potrebujejo 15-20 let, za 600 mL olja pa je potrebnih kar 20 kg lesa. Povpraševanje po sandalovini in olju sandalovine iz leta v leto narašča, ponudba pa je, glede na potrebe trga, premajhna.
== PET plastika ==
Polietilen tereftalat (PET) je tretji najbolj razširjen polimer v embalažni industriji in prevladuje na trgu plastenk za pijače. Hkrati je tudi najpogostejša oblika plastičnih odpadkov v okolju. Čeprav ga je mogoče reciklirati mehansko ali kemijsko, pa so ti postopki predragi, da bi z njimi ponovno pridobivali osnovne surovine, zato se reciklira manj kot 30 % letne proizvodnje. V zadnjem času se kot obetavna alternativa uveljavlja biološka nadpredelava (angl. ''upcycling''), ki bi lahko rešila ekonomske izzive klasičnih metod reciklaže PET.
== Izdelovanje eteričnega olja sandalovine iz PET plastike ==
Da bi učinkovito naslovili pomanjkanje olja sandalovine in hkrati vzpostavili trajnostno zanko z uporabo PET odpadkov, je skupina iz Indije zasnovala modularni sistem PETal, ki omogoča krožno rabo surovin in valorizacijo plastičnih odpadkov.
Polietilen tereftalat (PET) je sestavljen iz monomerov tereftalne kisline (TPA) in etilenglikola (EG). Z uporabo že prilagojenega seva bakterije ''Pseudomonas putida'', ki lahko presnavlja TPA in EG, so prvič v ta organizem vnesli biosintetsko pot za proizvodnjo santalola, s čimer so iz PET odpadkov želeli proizvajati santalen in santalol.

== Izvedba projekta ==
=== Izbira organizma in reševanje težav pri gojenju s pristopom ALE ===
Za organizem je skupina izbrala bakterijo ''Pseudomonas putida'' KT2440, zaradi njenega prilagodljivega metabolizma, robustnosti in sposobnosti rasti na različnih substratih. Šlo je za sev TA7-EG, ki je bil genetsko prilagojen za presnavljanje prej omenjenih monomerov TPA in EG pri 'nevtralnem pH.
Skupina je imela na začetku nekaj težav pri gojenju seva 'P. putida TA7-EG na monomerih PET, saj so bakterije znatno rast dosegle šele po 24-36 urah. Reševanja težave so se lotili s pristopom adaptivne evolucije. Začeli so z medijem, ki je poleg TPA in EG vseboval še 5 % glukoze, nato pa so njen delež postopoma zniževali, dokler ni v mediju ostala le še kombinacija TPA in EG oz. posamezen monomer. Namen tega je bil postopoma privaditi sev na rast zgolj na monomerih PET.
Po tem postopku so opazovali rast prilagojenega seva v različnih medijih (TPA, EG in TPA+EG) z merjenjem optične gostote (OD). Rezultati so pokazali, da je prilagojeni sev prešel v logaritemsko fazo hitreje kot izvorni TA7-EG, ki je za to potreboval več kot 2 dneva. Najhitrejša rast je bila opažena v mediju s kombinacijo TPA in EG, medtem ko je bil EG sam po sebi manj učinkovit.
=== Inženiring presnovne poti ===
Njihova strategija je vključevala preusmeritev toka ogljika iz monomerov PET proti naravni metabolni poti MEP za sintezo terpenoidov ter vnos biosintetske poti za santalol. Ta vključuje izražanje treh ključnih encimov iz ''Santalum album'':
*'''farnezil pirofosfat sintaza''' ('''FPPS'''),
*'''santalen sintaza''' ('''SaSSy'''),
*'''citokrom P450 monooksigenaza''' ('''CYP736A167''') s svojim '''reduktaznim partnerjem''' ('''CPR1''').
Vsi sestavljeni encimski deli so bili zasnovani modularno, z uporabo zamenljivih promotorjev in mest za vezavo ribosomov, kar bi omogočalo prihodnjim ekipam in raziskovalcem nadaljnje testiranje.

=== Metabolna pot MEP ===
Metil eritritol fosfatna pot ('''MEP''')je odgovorna za biosintezo izoprenoidnih prekurzorjev v bakterijah in plastidih. Predstavlja presnovno alternativo bolj znani mevalonatni poti (MEV) za sintezo izoprenoidov, ki se pojavlja pri arhejah in evkariontih [1].
''P. putida'' naravno vsebuje MEP pot, ki zagotavlja izoprenoidna prekurzorja IPP (izopentenil difosfat) in DMAPP (dimetilalil difosfat) iz centralnih metabolitov piruvata in gliceraldehid-3-fosfata. Ta naravna pot je dobro prilagojena gostitelju in lahko zagotovi zadostno količino prekurzorjev za proizvodnjo terpenoidov brez obsežnih gensko-inženirskih posegov.
S pomočjo modeliranja je skupina predlagala presnovno pot, ki se začne s pretvorbo TPA in EG v piruvat in gliceraldehid-3-fosfat, ki ju encima DXS in DXR pretvorita v MEP. Nadalje se MEP preko encimov IspD, IspE, IspF, IspG in IspH pretvori v spojine '''IPP''' in '''DMAPP''', ki vsebujejo 5 ogljikov. IPP molekule se nato združijo v spojino s 15 ogljiki, imenovano farnezil pirofosfat ('''FPP'''), pri čemer sodeluje encim '''FPPS''' (FPP sintaza). Čeprav je FPPS že prisoten v ''P. putida'', so vnesli tudi gen za FPPS iz ''Santalum album'', da bi zagotovili zadostno količino encima in nadzorovano izražanje pod inducibilnim promotorjem.
FPP je končni produkt MEP poti in prekurzor za santalen. Santalen sintaza ('''SaSSy''') deluje na FPP in sintetizira različne izomere, kot so endo-bergamoten, beta-santalen, (Z)-farnezen, epi-santalen in alfa-santalen. Izražanje FPPS in SaSSy je bilo že uspešno demonstrirano v ''E. coli'', zato se je ekipa odločila uporabiti enak plazmid.
=== Testiranje izražanja FPPS in SaSSY ===
Uporabili so torej ekspresijski vektor pCDFDuet, ki je vseboval zapisa za encima FPPS in SaSSy iz ''Santalum album''. Bakterije so transformirali z elektroporacijo in inducirali izražanje encima SaSSy z IPTG. Sledila je analiza izražanja proteina z barvanjem s Coomassie Blue in kemijska analiza z GC/MS. Izražanje encima SaSSy in sintezo santalena so sicer potrdili, vendar pa je bila koncentracija spojine v vzorcu razmeroma nizka. Za reševanje tega izziva so zasnovali konstrukt iz štirih osnovnih delov:
*promotor araBAD z RBS (BBa_K5181006),
*SaSSy (BBa_K5181004),
*IRES (BBa_K5181013),
*FPPS(BBa_K5181005).
Iz teh so sestavili svojo biokocko '''araBAD_SaSSy-FPPS''' (BBa_K5181014), ki so jo nato pomnožili s PCR. Biokocka je zasnovana tako, da se lahko uporablja skupaj z ogrodjem pSEVA, ki ima restrikcijski mesti ''EcoR''I in ''Hind''III. Uporabili so ogrodje '''pSEVA531''' in plazmid ter insert rezali z restrikcijskima encimoma EcoRI-HF in HindIII. Ligacijo so izvedli z NEB T4 DNA ligazo uspešnost pa preverili z rezanjem z omenjenima restrikcijskima encimoma in gelsko elektroforezo. Nato so transformirali bakterije s plazmidom in potrdili sposobnost encimov za tvorbo santalena z GC/MS.

=== Načrtovanje konstrukta za izražanje P450-CPR ===
Zadnji cilj skupine IISER-TVM je bil zasnovati najustreznejši konstrukt za izražanje encimov P450 in CPR. Encima katalizirata pretvorbo santalena v santalol, ki je še zadnja od glavnih komponent olja sandalovine. Izražanje teh encimov v prokariontskih sistemih je velik izziv, s katerim se trenutno soočajo številni znanstveniki po svetu. Med glavnimi težavami pri izražanju rastlinskega, v membrano vezanega, citokroma P450 v prokariontih, so razlike v sestavi membran, nepravilno sidranje encimov in pomanjkanje optimalnih pogojev za izražanje v bakterijskih gostiteljih.
Njihova rešitev je vključevala kombinacijo eksperimentalnega in računalniškega pristopa. S pregledom literature so ugotovili, da ima tudi ''P. putida'' svoj P450 encim, ki je dobro preučen. Njegovo strukturo so primerjali s tisto od rastlinega encima in zaznali precejšnjo strukturno podobnost, čeprav si sekvenci med seboj nista bili zelo podobni.
Za tem so začeli s spreminjanjem uporabljenih rastlinskih encimov, s tem da so odstranili njuni transmembranski domeni. Kmalu pa so naleteli na novo težavo in sicer, da morata biti encima za pravilno delovanje blizu drug drugega. Pri reševanje tega izziva so si pomagali s strukturo še enega encima P450, tokrat iz bakterije ''Bacillus cereus''. Ta encim je imel že vključeni obe domeni, oksidazno in reduktazno, strukturno pa je bil zelo podoben rastlinskima encimoma brez njunih transmembranskih domen. Člen, ki je povezoval oksidazno in reduktazno domeno v encimu iz bakterije ''B. cereus'', so uporabili kot povezovalni člen pri svojem proteinu in z njim povezali rastlinska encima P450 in CPR1. Tako dobljen encim so poimenovali '''pP450'''.
Za izražanje tega encima, so iz osnovnih delov sestavili novo biokocko '''tet-P450-CPR_fusion protein''' (BBa_K5181015). Zgrajena je bila iz:
*tet_RBS (BBa_K5181009),
*P450-CPR_fusion protein (BC_linker) (BBa_K5181008).
Kljub večim poskusom so imeli težave pri uspešni ligaciji vektorja in inserta tako z uporabo konvencionalne metode kot tudi z Gibsonovo metodo. Ligacijske poskuse so izvedli z različnimi vektorskimi ogrodji, vendar transformacije vseeno niso privedle do nastanka kolonij po elektroporaciji ali pa so transformirane kolonije, ki so jih izbrali in jim izolirali plazmide, na gelu pokazale le zabrisane lise.
Da bi prišli do vzroka težav, so sekvencirali fragmente inserta, ki sodelujo pri povezavi z vektorjem. Na podlagi rezultatov so domnevali, da se fragment med PCR-jem sicer pravilno pomnoži, vendar ligacija ne uspe zaradi strukturnih težav ali pa težav s sekvencami.

=== Računalniško modeliranje ===
Kljub neuspelemu izražanju je skupina želela razumeti, kako bi dizajniran encim deloval. Z modeliranjem so raziskali vezavo santalena in njegovih derivatov na načrtovane P450-CPR encime ter analizirali učinkovitost te vezave preko energij vezave. Rezultati računalniških simulacij so pokazali ugodne interakcije med santalenom in P450-CPR kompleksom, kar nakazuje na potencialno učinkovito pretvorbo santalena v želen produkt santalol.

PETal: izdelovanje eteričnega olja sandalovine iz PET plastike

2025-04-06T22:07:19Z

Luka Fink: /* Načrtovanje konstrukta za izražanje P450-CPR */

[https://2024.igem.wiki/iiser-tvm/home PETal] je iGEM projekt ekipe IISER-TVM iz Indije iz leta 2024.
== UVOD ==
Indijsko olje sandalovine je ena izmed najbolj iskanih surovin v kozmetični industriji. PETal ponuja inovativno rešitev za njegovo proizvodnjo, ki združuje reciklažno plastičnih odpadkov in proizvodnjo tega dišavnega olja s pomočjo sintezne biologije. Z uporabo gensko spremenjene bakterije ''Pseudomonas putida'', ki lahko presnavlja monomere polietilen tereftalata (PET), torej tereftalno kislino (TPA) in etilen glikol (EG), so želeli sintetizirati santalen in santalol, ki sta glavni sestavini olja sandalovine.
== Olje sandalovine ==
Sandalovina je vrsta lesa iz dreves iz rodu ''Santalum''. Les ima značilen vonj, ki ga, za razliko od drugih aromatičnih lesov, lahko ohrani več desetletij. Iz tega lesa pridobivajo tudi olje sandalovine, ki s svojim vonjem dopolnjuje mnoge dišave, mila in kozmetiko po vsem svetu. Najbolj cenjena vrsta, ''Santalum album'' (indijska sandalovina), raste izključno na polotoku Indije in velja za eno izmed najdragocenejših vrst lesa na svetu.
Molekulska struktura komponent olja sandalovine je edinstvena med lesenimi notami v parfumeriji. Seskviterpena '''α-santalol''' in '''β-santalol''' sta glavna nosilca vonja, ki ju pridobivajo iz sredice drevesa s parno destilacijo. Pridobivanje olja sandalovine pa je zelo dolgotrajen in drag proces. Drevesa za svojo rast potrebujejo 15-20 let, za 600 mL olja pa je potrebnih kar 20 kg lesa. Povpraševanje po sandalovini in olju sandalovine iz leta v leto narašča, ponudba pa je, glede na potrebe trga, premajhna.
== PET plastika ==
Polietilen tereftalat (PET) je tretji najbolj razširjen polimer v embalažni industriji in prevladuje na trgu plastenk za pijače. Hkrati je tudi najpogostejša oblika plastičnih odpadkov v okolju. Čeprav ga je mogoče reciklirati mehansko ali kemijsko, pa so ti postopki predragi, da bi z njimi ponovno pridobivali osnovne surovine, zato se reciklira manj kot 30 % letne proizvodnje. V zadnjem času se kot obetavna alternativa uveljavlja biološka nadpredelava (angl. ''upcycling''), ki bi lahko rešila ekonomske izzive klasičnih metod reciklaže PET.
== Izdelovanje eteričnega olja sandalovine iz PET plastike ==
Da bi učinkovito naslovili pomanjkanje olja sandalovine in hkrati vzpostavili trajnostno zanko z uporabo PET odpadkov, je skupina iz Indije zasnovala modularni sistem PETal, ki omogoča krožno rabo surovin in valorizacijo plastičnih odpadkov.
Polietilen tereftalat (PET) je sestavljen iz monomerov tereftalne kisline (TPA) in etilenglikola (EG). Z uporabo že prilagojenega seva bakterije ''Pseudomonas putida'', ki lahko presnavlja TPA in EG, so prvič v ta organizem vnesli biosintetsko pot za proizvodnjo santalola, s čimer so iz PET odpadkov želeli proizvajati santalen in santalol.

== Izvedba projekta ==
=== Izbira organizma in reševanje težav pri gojenju s pristopom ALE ===
Za organizem je skupina izbrala bakterijo ''Pseudomonas putida'' KT2440, zaradi njenega prilagodljivega metabolizma, robustnosti in sposobnosti rasti na različnih substratih. Šlo je za sev TA7-EG, ki je bil genetsko prilagojen za presnavljanje prej omenjenih monomerov TPA in EG pri 'nevtralnem pH.
Skupina je imela na začetku nekaj težav pri gojenju seva 'P. putida TA7-EG na monomerih PET, saj so bakterije znatno rast dosegle šele po 24-36 urah. Reševanja težave so se lotili s pristopom adaptivne evolucije. Začeli so z medijem, ki je poleg TPA in EG vseboval še 5 % glukoze, nato pa so njen delež postopoma zniževali, dokler ni v mediju ostala le še kombinacija TPA in EG oz. posamezen monomer. Namen tega je bil postopoma privaditi sev na rast zgolj na monomerih PET.
Po tem postopku so opazovali rast prilagojenega seva v različnih medijih (TPA, EG in TPA+EG) z merjenjem optične gostote (OD). Rezultati so pokazali, da je prilagojeni sev prešel v logaritemsko fazo hitreje kot izvorni TA7-EG, ki je za to potreboval več kot 2 dneva. Najhitrejša rast je bila opažena v mediju s kombinacijo TPA in EG, medtem ko je bil EG sam po sebi manj učinkovit.
=== Inženiring presnovne poti ===
Njihova strategija je vključevala preusmeritev toka ogljika iz monomerov PET proti naravni metabolni poti MEP za sintezo terpenoidov ter vnos biosintetske poti za santalol. Ta vključuje izražanje treh ključnih encimov iz ''Santalum album'':
*'''farnezil pirofosfat sintaza''' ('''FPPS'''),
*'''santalen sintaza''' ('''SaSSy'''),
*'''citokrom P450 monooksigenaza''' ('''CYP736A167''') s svojim '''reduktaznim partnerjem''' ('''CPR1''').
Vsi sestavljeni encimski deli so bili zasnovani modularno, z uporabo zamenljivih promotorjev in mest za vezavo ribosomov, kar bi omogočalo prihodnjim ekipam in raziskovalcem nadaljnje testiranje.

=== Metabolna pot MEP ===
Metil eritritol fosfatna pot ('''MEP''')je odgovorna za biosintezo izoprenoidnih prekurzorjev v bakterijah in plastidih. Predstavlja presnovno alternativo bolj znani mevalonatni poti (MEV) za sintezo izoprenoidov, ki se pojavlja pri arhejah in evkariontih [1].
''P. putida'' naravno vsebuje MEP pot, ki zagotavlja izoprenoidna prekurzorja IPP (izopentenil difosfat) in DMAPP (dimetilalil difosfat) iz centralnih metabolitov piruvata in gliceraldehid-3-fosfata. Ta naravna pot je dobro prilagojena gostitelju in lahko zagotovi zadostno količino prekurzorjev za proizvodnjo terpenoidov brez obsežnih gensko-inženirskih posegov.
S pomočjo modeliranja je skupina predlagala presnovno pot, ki se začne s pretvorbo TPA in EG v piruvat in gliceraldehid-3-fosfat, ki ju encima DXS in DXR pretvorita v MEP. Nadalje se MEP preko encimov IspD, IspE, IspF, IspG in IspH pretvori v spojine '''IPP''' in '''DMAPP''', ki vsebujejo 5 ogljikov. IPP molekule se nato združijo v spojino s 15 ogljiki, imenovano farnezil pirofosfat ('''FPP'''), pri čemer sodeluje encim '''FPPS''' (FPP sintaza). Čeprav je FPPS že prisoten v ''P. putida'', so vnesli tudi gen za FPPS iz ''Santalum album'', da bi zagotovili zadostno količino encima in nadzorovano izražanje pod inducibilnim promotorjem.
FPP je končni produkt MEP poti in prekurzor za santalen. Santalen sintaza ('''SaSSy''') deluje na FPP in sintetizira različne izomere, kot so endo-bergamoten, beta-santalen, (Z)-farnezen, epi-santalen in alfa-santalen. Izražanje FPPS in SaSSy je bilo že uspešno demonstrirano v ''E. coli'', zato se je ekipa odločila uporabiti enak plazmid.
=== Testiranje izražanja FPPS in SaSSY ===
Uporabili so torej ekspresijski vektor pCDFDuet, ki je vseboval zapisa za encima FPPS in SaSSy iz ''Santalum album''. Bakterije so transformirali z elektroporacijo in inducirali izražanje encima SaSSy z IPTG. Sledila je analiza izražanja proteina z barvanjem s Coomassie Blue in kemijska analiza z GC/MS. Izražanje encima SaSSy in sintezo santalena so sicer potrdili, vendar pa je bila koncentracija spojine v vzorcu razmeroma nizka. Za reševanje tega izziva so zasnovali konstrukt iz štirih osnovnih delov:
*promotor araBAD z RBS (BBa_K5181006),
*SaSSy (BBa_K5181004),
*IRES (BBa_K5181013),
*FPPS(BBa_K5181005).
Iz teh so sestavili svojo biokocko '''araBAD_SaSSy-FPPS''' (BBa_K5181014), ki so jo nato pomnožili s PCR. Biokocka je zasnovana tako, da se lahko uporablja skupaj z ogrodjem pSEVA, ki ima restrikcijski mesti ''EcoR''I in ''Hind''III. Uporabili so ogrodje '''pSEVA531''' in plazmid ter insert rezali z restrikcijskima encimoma EcoRI-HF in HindIII. Ligacijo so izvedli z NEB T4 DNA ligazo uspešnost pa preverili z rezanjem z omenjenima restrikcijskima encimoma in gelsko elektroforezo. Nato so transformirali bakterije s plazmidom in potrdili sposobnost encimov za tvorbo santalena z GC/MS.

=== Načrtovanje konstrukta za izražanje P450-CPR ===
Zadnji cilj skupine IISER-TVM je bil zasnovati najustreznejši konstrukt za izražanje encimov P450 in CPR. Encima katalizirata pretvorbo santalena v santalol, ki je še zadnja od glavnih komponent olja sandalovine. Izražanje teh encimov v prokariontskih sistemih je velik izziv, s katerim se trenutno soočajo številni znanstveniki po svetu. Med glavnimi težavami pri izražanju rastlinskega, v membrano vezanega, citokroma P450 v prokariontih, so razlike v sestavi membran, nepravilno sidranje encimov in pomanjkanje optimalnih pogojev za izražanje v bakterijskih gostiteljih.
Njihova rešitev je vključevala kombinacijo eksperimentalnega in računalniškega pristopa. S pregledom literature so ugotovili, da ima tudi ''P. putida'' svoj P450 encim, ki je dobro preučen. Njegovo strukturo so primerjali s tisto od rastlinega encima in zaznali precejšnjo strukturno podobnost, čeprav si sekvenci med seboj nista bili zelo podobni.
Za tem so začeli s spreminjanjem uporabljenih rastlinskih encimov, s tem da so odstranili njuni transmembranski domeni. Kmalu pa so naleteli na novo težavo in sicer, da morata biti encima za pravilno delovanje blizu drug drugega. Pri reševanje tega izziva so si pomagali s strukturo še enega encima P450, tokrat iz bakterije ''Bacillus cereus''. Ta encim je imel že vključeni obe domeni, oksidazno in reduktazno, strukturno pa je bil zelo podoben rastlinskima encimoma brez njunih transmembranskih domen. Člen, ki je povezoval oksidazno in reduktazno domeno v encimu iz bakterije ''B. cereus'', so uporabili kot povezovalni člen pri svojem proteinu in z njim povezali rastlinska encima P450 in CPR1. Tako dobljen encim so poimenovali '''pP450'''.
Za izražanje tega encima, so iz osnovnih delov sestavili novo biokocko '''tet-P450-CPR_fusion protein''' (BBa_K5181015). Zgrajena je bila iz:
*tet_RBS (BBa_K5181009),
*P450-CPR_fusion protein (BC_linker) (BBa_K5181008).
Kljub večim poskusom, so imeli težave pri uspešni ligaciji vektorja in inserta tako z uporabo konvencionalne metode kot tudi z Gibsonovo metodo. Ligacijske poskuse so izvedli z različnimi vektorskimi ogrodji, kljub temu pa transformacije niso privedle do nastanka kolonij po elektroporaciji ali pa so transformirane kolonije, ki so jih izbrali in jim izolirali plazmide, na gelu pokazale le zabrisane lise.
Da bi prišli do vzroka težav, so sekvencirali fragmente inserta, ki sodelujo pri povezavi z vektorjem. Na podlagi rezultatov so domnevali, da se fragment med PCR-jem sicer pravilno pomnoži, vendar ligacija ne uspe zaradi strukturnih težav ali pa težav s sekvencami.

=== Računalniško modeliranje ===
Kljub neuspelemu izražanju je skupina želela razumeti, kako bi dizajniran encim deloval. Z modeliranjem so raziskali vezavo santalena in njegovih derivatov na načrtovane P450-CPR encime ter analizirali učinkovitost te vezave preko energij vezave. Rezultati računalniških simulacij so pokazali ugodne interakcije med santalenom in P450-CPR kompleksom, kar nakazuje na potencialno učinkovito pretvorbo santalena v želen produkt santalol.