Wiki FKKT - User contributions [en]

Magi.Coli: sinteza psilocibina s pomočjo E.coli

2020-04-13T18:48:10Z

Luka Lavrič:

Magi.Coli <ref> iGEM 2019 team Sydney. Magi.Coli. 21. 10. 2019. [citirano dne 11. 04. 2020] https://2019.igem.org/Team:Sydney_Australia </ref> je študentski projekt, ki ga je predstavila ekipa Sydney iz Avstralije na tekmovanju iGEM 2019. Želja in cilj ekipe je, da bi v prihodnosti bile raziskave in zdravljenje s pomočjo psilocibina stroškovno in tudi količinsko ugodne, kar bi lahko dosegli z ''in vivo'' sintezo v ''E. coli''.

== '''Zdravljenje duševnih motenj''' ==
Depresija je najpogostejša duševna bolezen, ki se lahko pojavi na različne načine in prizadane od 8-10 % populacije. Poleg depresije, sta pogosti duševni bolezni tudi anksioznost in obsesivno kompulzivna motnja. V eni izmed raziskav, kjer so v veliki meri pozdravili prisotnost duševnih motenj, so to dosegli z zdravilom, ki ima zelo velik potencial. Uporabili so psilocibin. Vsi bolniki so dobro prenašali psilocibin, hkrati pa ni prišlo do resnih ali nepričakovanih neželenih učinkov. Zmeren odmerek tega naravnega zdravila je pokazal, da je v 3 mesecih 8 od 12 udeležencev izpolnilo merila za popolno remisijo. Ugotovljeno je tudi, da ima psilocibin zelo nizek potencial za zlorabo in naj ne bi povzročal zasvojenosti <ref> R. L. Carhart-Harris, M. Bolstridge, J. Rucker, C. M. Day, D. Erritzoe, M. Kaelen, M. Bloomfield, J. A. Rickard, B. Forbes, A. Feilding, D. Taylor: Psilocybin with psychological support for treatment-resistant depression: an open-label feasibility study. The Lancet Psychiatry. '''2016''', ''3''(7), 619–627. </ref>.
=== Psilocibin ===
Psilocibin je psihedelična spojina, ki se sintetizira iz triptofana in je produkt v različnih gobah iz rodu ''Psilocybe''. Medsebojno gobe razlikujemo po velikosti, obliki in učinkovitosti. Večina jih raste na območju ZDA. Gobe so že od sedemdesetih let ilegalne v večini držav po svetu, posledica pa je pomanjkanje raziskav s to spojino. Vseeno so znanstveniki kalili ideje, kako bi sintetizirali psilocibin v namene zdravljenja duševnih motenj. Psilocibin so sintetizirali s pomočjo organske sinteze, vendar pa je naslednji problem predstavljala cena, saj je sinteza enega grama znašala 2000 dolarjev <ref> J. Fricke, F. Blei, D. Hoffmeister: Enzymatic synthesis of psilocybin. Angew. Chemi. Int. Ed. Engl. '''2017''', ''56''(40), 12352–12355. </ref> <ref> J. Fricke, C. Lenz, J. Wick, F. Blei, D. Hoffmeister: Production Options for Psilocybin: Making of the Magic. Chemistry. '''2019''', ''25''(4), 897–903.</ref>
.
== '''Magi.Coli''' ==
V naravi se psilocibin sintetizira po poti, kjer delujejo štirje različni encimi. Ekipa, ki se je lotila projekta je želela klonirati to pot v ''E. coli'', da bi zmanjšali stroške proizvodnje, hkrati pa sintetizirali večje količine psilocibina. Tako bi lažje omogočili raziskave in potrebe po zdravljenju duševnih motenj. Njihov cilj je bil oblikovati sistem, ki bo sposoben sintetizirati psilocibin z uporabo genov psiD, psiH, psiK, psiM, katerih produkte najdemo v biosintetski poti''Psilocybe cubensis''. To je vključevalo vnos genov psiD, psiK in psiM v en plazmid, pri čemer ima vsak svoj RBS, vse pa je pod nadzorom enega močnega promotorja. Gen psiH so vključili v drug plazmid, da bi ga sočasno izrazili. Pridobljen sistem Magi.Coli so želeli izboljšati, ter z njim povečati sintezo psilocibina. To bi dosegli s povečano sintezo funkcionalnih Psi proteinov v ''E. coli'' z optimizacijo kodonov, zlasti PsiH. Optimizacijo kodonov so želeli preizkusiti na fluorescenčnem proteinu VVD iz glive ''Neurospora crassa''.

=== Priprava na eksperimente ===
==== Geni psi ====
Zaporedja za vse psi gene divjega tipa so pregledali, da ne bi vsebovali neželenih restrikcijskih mest. Poleg teh mest so odstranili tudi kriptične promotorje in RBS mesta znotraj gena.
==== Konstrukti VVD ====
Vsi kontrukti VVD so temeljili na izvornem proteinu VVD iz ''Neurospora crassa''. VVD36 kodirajoče zaporedje je bilo ustvarjeno z odstranitvijo prvih 36 aminokislinskih ostankov in dodajanjem začetnega kodona. Cisteinski ostanek na položaju 73 (TGC) so spremenili v alanin s spremembo kodona v GCC, s tem se je VVD spremenil v fluoroprotein. Nastal je VVD36-C73A ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3140005 BBa_K3140005]).

=== Izbor plazmidov ===
==== Plazmid pCW ====
Protein PsiH je citokrom P450 monooksigenaza. Zapisi za encim PsiH so znani po tem, da so zelo zahtevni za funkcionalno izražanje v ''E. coli'' in pogosto zahtevajo posebne pogoje izražanja ali šaperone. Potrebujejo partnerski encim P450 reduktazo iz ''Psilocybe cubensis'', vendar P450 reduktaza ni dobro opisana in tudi ni bila izražena v ''E. coli''. Plazmid pCW je pogosto uporabljen plazmid, ki vsebuje človeški gen P450 in gen za citokrom P450 reduktazo. Upali so, da bo ta sistem optimiziran tako, da bodo izrezali obstoječi človeški P450 in ga nadomestili s citokrom P450 monooksigenazo. To bi omogočilo izražanje proteinov PsiH skupaj z obstoječim genom za P450 reduktazo.

==== Plazmid pET-28c ====
Plazmid pET-28c je strogo reguliran plazmid, namenjen močnemu in nadzorovanemu izražanju vseh treh psi genov. Na N-konec genov so vstavili polihistidinsko oznako (6x His-tag), ki jim je omogočila čiščenje proteinov z Ni-afinitetno kromatografijo.

==== Plazmid pUS250 ====
Plazmid pUS250 je primeren za vstavljanje vseh treh genov psiK, psiD in psiM v en plazmid s pomočjo Golden Gate molekulskega kloniranja.

=== Izvedba eksperimentov ===
==== Izražanje genov psiK, psiD in psiM ====
Prvi uspešen korak je bil kloniranje genov psiK ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3140002 BBa_K3140002]), psiD ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3140000 BBa_K3140000]) in psiM ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3140003 BBa_K31440003]) v plazmidu pET-28c. Z ustreznimi restriktazami so rezali plazmide pET-28c, da so vstavili posamezne gene in ligirali. Celice ''E. coli'' BL21[DE3] so transformirali s plazmidi. Celične lizate so nanesli na NaDS-PAGE, da so preverili ustrezno velikost sintetiziranih proteinov. Pokazalo se je, da so bili proteini ob določenih pogojih izražanja netopni. Idejo za optimizacijo so dobili s pomočjo drugega iGEM projekta. Odločili so se, da poleg plazmida pET-28c v celice vstavijo še dodaten plazmid pGro7, ki kodira kompleks groES-groEL. Proteine so očistili s pomočjo Ni-afinitetne kromatografije. Funkcionalnost proteinov so preverili s pomočjo kvalitativnega testa tekočinske kromatografije in masne spektrometrije (LCMS). Podatki so pokazali katalitično aktivnost PsiD in PsiK.

==== Sestavljanje genskega skupka ("gene cluster") ====
Cilj je bil vse tri gene psiK, psiD in psiM iz psilocibinske encimske poti vstaviti v plazmid pU250, kar so naredili s pomočjo Golden Gate. Celice ''E.coli'' DH5α so transformirali s plazmidom pUS250 in pGro7. Gojili so veliko kulture in inducirali sintezo proteinov s pomočjo kumata. Celice so centrifugirali in očistili supernatant. Produkte so identificirali s pomočjo LCMS. Čeprav so dokazali aktivnost encimov v poti, niso mogli dokazati proizvodnje psilocibina. Predpostavka je bila, da ni prišlo do zadostne sinteze baeocistina, intermediata v sintezni poti proteina PsiM. Zato so se osredotočili za optimizacijo pogojev za sintezo proteinov. Za optimizacijo je bilo več možnosti: optimizacija medija, PCR, ki je nagnjen k napakam, ter izboljšanje kodonov proizvedenih proteinov.

==== Izražanje in karakterizacija PsiH encima ====
V tem delu projekta so želeli izraziti in opisati aktivnost PsiH encima, ter encima P450 monooksigenaze, preden so ga vnesli v enocelični sistem. Človeški gen p450 so izrezali iz pCW plazmida, katerega so nato ponovno združili skupaj. Tako so dobili na novo skonstruiran plazmid pUS381. Prav tako so na novo skonstruirali plazmid pUS382 ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3140001 BBa_K3140001]), ki je vseboval psiH divjega tipa iz Psilocybe cubensis in plazmid pUS383 ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3140004 BBa_K3140004]), ki vsebuje IDT kodon. S pomočjo sekvenciranja po Sangerju so ugotovili, da je pri plazmidu pUS383 prišlo do izbrisa posameznega nukleotida na začetku gena, ki je optimiziran za kodon psiH, posledica tega je mutacija in premik bralnega okvirja. Da so potrdili, če se protein lahko izrazi v ''E.coli'' so gojili kulture celic, ki so vsebovale plazmide pUS381, pUS382 in pUS383. S pomočjo SDS-PAGE so ugotovili, da je encim PsiH prisoten v pUS382, pUS383. Izvedli so testiranje ali lahko PsiH katalizira reakcijo oksidacijo triptamina do 4-hidroksitriptamina, ki poteka tudi v biosintezni poti psilocibina. Rezultate LCMS je bilo težko analizirati. Ugotovili so, da je možno spodbuditi celice ''E.coli'' za izražanje PsiH. Predvidevajo, da bi prihodnje usmeritve PsiH mogle biti usmerjene v prilagoditev zaporedja gena za boljšo ekspresijo v ''E. coli''. To bi se lahko doseglo s spremembo N-terminala gena in poskusi različnih načinov usklajevanja in optimizacije.

==== Nastanek dvoplazmidnega sistema ====
S tem, ko so vstavili dva plazmida v isto celico, je bila ustvarjena celotna biosintetska pot psilocibina v ''E. coli''. Transformirali so celice ''E. coli'' DH5α s pGro7, s pUS382 in s pUS387. To so imenovali Magi.Coli – sistem z vsemi divjimi tipi psi genov. Gojili so kulture dvoplazmidnih celic v TB mediju, inducirali proizvodnjo proteinov GROES in GROEL iz pGro7 z arabinozo. Proizvodnjo proteinov iz pUS382 so inducirali z IPTG in iz pUS387 s kumatom. Sledili so protokolu in vzorce supernatanta analizirali z LCMS analizo.

==== Gojenje ====
Namen tega dela je bil raziskati in primerjati pogoje rasti celic v fermentorju in v laboratorijski kulturi. V fermentorju so bili rezultati veliko boljši, saj je bilo število celic na liter gojene kulture v fermentorju večje, kot v laboratorijski kulturi. V nadaljevanju so si zato želeli optimizirati Magi.Coli za gojenje v fermentorju.

=== Optimizacija ===
==== Optimizacija kodonov ====
Želeli so določiti katera vrsta optimizacije kodona bo izboljšala izražanje proteina VVD v primerjavi z divjim tipom kodona ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3140006 BBa_K3140006], [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3140007 BBa_K3140007],[http://parts.igem.org/Part:BBa_K3140008 BBa_K3140008], [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3140009 BBa_K3140009]). Rezultate optimizacije bi uporabili za optimizacijo kodonov genov psi in prišli do izboljšanega izražanja. Ugotovili so, da optimizacija kodonov morda ni najučinkovitejša metoda za izboljšanje aktivnosti teh fluorescenčnih proteinov.

==== PCR nagnjen k napakam ====
S pomočjo PCR, ki je nagnjen k napakam, so želeli ustvariti bolj fluorescenčno različico šibko fluorescirajočega proteina VVD. Rezultati določanja zaporedja genov VVD iz svetlih kolonij so pokazali, da je bila pri večini genov skupna mutacija. Mutacija določenega mesta v kodonu za metioninski ostanek 130 je povzročila spremembo v izolevcin, treonin ali levcin, ter izboljšala fluorescenco proteina ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3140010 BBa_K31440010]).

== '''Zaključek''' ==
Ekipa iz Sydneya je dokazala, da dve od štirih komponent njihovega sistema delujeta po pričakovanjih v ''in vivo'' pogojih. Ko so klonirali gene psiD, psiK, psiM in psiH v ''E.coli'' so ugotovili, da pride do ustrezne pretvorbe substrata v 3 od 5 korakov v biosintetski poti. Rezultati kažejo, da je sistem Magi.Coli obetaven, ekipa pa še naprej dela na izboljšavah tega sistema.

== '''Viri''' ==

<references/>

Seminarji SB 2019/20

2020-04-13T18:27:45Z

Luka Lavrič:

V študijskem letu 2019/20 študentje 1. letnika predstavljajo naslednje teme:

RAZISKOVALNI ČLANKI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) 

Primer: 
1 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/MoClo:_modularni_klonirni_sistem_za_standardizirano_sestavljanje_ve%C4%8Dgenskih_konstruktov MoClo: modularni klonirni sistem za standardizirano sestavljanje večgenskih konstruktov] (Valentina Levak)

NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.) 
Primer: 
1 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Phactory:_proizvodnja_bakteriofagov_za_precizno_zdravljenje Phactory: proizvodnja bakteriofagov za precizno zdravljenje] (Rok Miklavčič)

Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Povzetek je treba objaviti dva dni pred predstavitvijo do polnoči (za seminarje v sredo torej v ponedeljek). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo razprava, ki praviloma ne bo daljša od 5 minut.

----

Razpored po datumih predstavitev (pri vsakem terminu so možni največ 4 seminarji; vpišite ime in priimek pri dnevu, ko želite predstaviti seminar):

15.4. 
1 [[Robustno večcelično računanje z uporabo gensko kodiranih vrat NE-ALI in kemičnih 'žic']] (Tanja Zupan) 
2 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/PETEXE_-_sistem_za_filtracijo_mikroplastike_v_pralnih_strojih PETEXE - sistem za filtracijo mikroplastike v pralnih strojih]
(Lana Vogrinec) 
3 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Magi.Coli:_sinteza_psilocibina_s_pomo%C4%8Djo_E.coli Magi.Coli: sinteza psilocibina s pomočjo ''E.coli''] (Luka Lavrič) 
4 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/SONOBE_-_proteinski_sistem_za_agregacijo_mikroplastike SONOBE - proteinski sistem za agregacijo mikroplastike] (Vesna Podgrajšek) 

21.4. 
1 Žiga Vičič 
2 Tina Turel 
3 Anže Jenko 
4 Dunia Sahir 

22.4. 
1 Milica Janković 
2 Nika Testen 
3 Ana Obaha 
4 Ana Maklin 

5.5. 
1 Ajda Lenardič 
2 Jelena Štrbac 
3 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Programabilni_enocelični_sesalski_bioračunalniki Programabilni enocelični sesalski bioračunalniki] (Andreja Habič) 
4 Uroš Prešern 

6.5. 
1 Sara Korošec 
2 Peter Škrinjar 
3 Luka Gregorič 
4 Urban Hribar 

12.5. 
1 Jerneja Nimac 
2 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Orodje_za_modularno_sestavljanje_večgenskih_konstruktov_v_kvasovki: Orodje za modularno sestavljanje večgenskih konstruktov v kvasovki] (Katja Doberšek) 
3 Daria Latysheva 
4 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Modularni_klonirni_sistem_MoClo_za_biološko_sintezo_v_mikroalgi_C._reinhardtii Modularni klonirni sistem MoClo za biološko sintezo v mikroalgi ''C. reinhardtii''] (Veronika Razpotnik) 

13.5. 
1 Ines Medved 
2 Željka Erić 
3 Patricija Miklavc 
4 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/In%C5%BEenirsko_pripravljeni_promotorji%2C_ki_omogo%C4%8Dajo_izra%C5%BEanje_ne_glede_na_%C5%A1tevilo_kopij Inženirsko pripravljeni promotorji, ki omogočajo izražanje ne glede na število kopij] (Benjamin Malovrh) 

19.5. 
1 Samo Purič 
2 Sara Jereb 
3 Primož Bembič 
4 Andrej Race 

20.5. 
1 Katja Malenšek 
2 Vid Modic 
3 Andrej Ivanovski 
4 Maja Globočnik 

26.5. 
1 Nika Zaveršek 
2 Janina Gea Cvikl 
3 
4 

27.5. Rezervni termin 
1 
2 
3 
4

Magi.Coli: sinteza psilocibina s pomočjo E.coli

2020-04-13T17:40:49Z

Luka Lavrič:

Magi.Coli <ref> iGEM 2019 team Sydney. Magi.Coli. 21. 10. 2019. [citirano dne 11. 04. 2020] https://2019.igem.org/Team:Sydney_Australia </ref> je študentski projekt, ki ga je predstavila ekipa Sydney iz Avstralije na tekmovanju iGEM 2019. Želja in cilj ekipe je, da bi v prihodnosti bile raziskave in zdravljenje s pomočjo psilocibina stroškovno in tudi količinsko ugodne, kar bi lahko dosegli z ''in vivo'' sintezo v ''E. coli''.

== '''Zdravljenje duševnih motenj''' ==
Depresija je najpogostejša duševna bolezen, ki se lahko pojavi na različne načine in prizadane od 8-10 % populacije. Poleg depresije, sta pogosti duševni bolezni tudi anksioznost in obsesivno kompulzivna motnja. V eni izmed raziskav, kjer so v veliki meri pozdravili prisotnost duševnih motenj, so to dosegli z zdravilom, ki ima zelo velik potencial. Uporabili so psilocibin. Vsi bolniki so dobro prenašali psilocibin, hkrati pa ni prišlo do resnih ali nepričakovanih neželenih učinkov. Zmeren odmerek tega naravnega zdravila je pokazal, da je v 3 mesecih 8 od 12 udeležencev izpolnilo merila za popolno remisijo. Ugotovljeno je tudi, da ima psilocibin zelo nizek potencial za zlorabo in naj ne bi povzročal zasvojenosti <ref> R. L. Carhart-Harris, M. Bolstridge, J. Rucker, C. M. Day, D. Erritzoe, M. Kaelen, M. Bloomfield, J. A. Rickard, B. Forbes, A. Feilding, D. Taylor: Psilocybin with psychological support for treatment-resistant depression: an open-label feasibility study. The Lancet Psychiatry. '''2016''', 3(7), 619–627. </ref>.
=== Psilocibin ===
Psilocibin je psihedelična spojina, ki se sintetizira iz triptofana in je produkt v različnih gobah iz rodu ''Psilocybe''. Medsebojno gobe razlikujemo po velikosti, obliki in učinkovitosti. Večina jih raste na območju ZDA. Gobe so že od sedemdesetih let ilegalne v večini držav po svetu, posledica pa je pomanjkanje raziskav s to spojino. Vseeno so znanstveniki kalili ideje, kako bi sintetizirali psilocibin v namene zdravljenja duševnih motenj. Psilocibin so sintetizirali s pomočjo organske sinteze, vendar pa je naslednji problem predstavljala cena, saj je sinteza enega grama znašala 2000 dolarjev <ref> J. Fricke, F. Blei, D. Hoffmeister: Enzymatic synthesis of psilocybin. Angew. Chemi. Int. Ed. Engl. '''2017''', 56(40), 12352–12355. </ref> <ref> J. Fricke, C. Lenz, J. Wick, F. Blei, D. Hoffmeister: Production Options for Psilocybin: Making of the Magic. Chemistry. '''2019''', 25(4), 897–903.</ref>
.
== '''Magi.Coli''' ==
V naravi se psilocibin sintetizira po poti, kjer delujejo štirje različni encimi. Ekipa, ki se je lotila projekta je želela klonirati to pot v ''E. coli'', da bi zmanjšali stroške proizvodnje, hkrati pa sintetizirali večje količine psilocibina. Tako bi lažje omogočili raziskave in potrebe po zdravljenju duševnih motenj. Njihov cilj je bil oblikovati sistem, ki bo sposoben sintetizirati psilocibin z uporabo genov psiD, psiH, psiK, psiM, katerih produkte najdemo v biosintetski poti''Psilocybe cubensis''. To je vključevalo vnos genov psiD, psiK in psiM v en plazmid, pri čemer ima vsak svoj RBS, vse pa je pod nadzorom enega močnega promotorja. Gen psiH so vključili v drug plazmid, da bi ga sočasno izrazili. Pridobljen sistem Magi.Coli so želeli izboljšati, ter z njim povečati sintezo psilocibina. To bi dosegli s povečano sintezo funkcionalnih Psi proteinov v ''E. coli'' z optimizacijo kodonov, zlasti PsiH. Optimizacijo kodonov so želeli preizkusiti na fluorescenčnem proteinu VVD iz glive ''Neurospora crassa''.

=== Priprava na eksperimente ===
==== Geni psi ====
Zaporedja za vse psi gene divjega tipa so pregledali, da ne bi vsebovali neželenih restrikcijskih mest. Poleg teh mest so odstranili tudi kriptične promotorje in RBS mesta znotraj gena.
==== Konstrukti VVD ====
Vsi kontrukti VVD so temeljili na izvornem proteinu VVD iz ''Neurospora crassa''. VVD36 kodirajoče zaporedje je bilo ustvarjeno z odstranitvijo prvih 36 aminokislinskih ostankov in dodajanjem začetnega kodona. Cisteinski ostanek na položaju 73 (TGC) so spremenili v alanin s spremembo kodona v GCC, s tem se je VVD spremenil v fluoroprotein. Nastal je VVD36-C73A ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3140005 BBa_K3140005]).

=== Izbor plazmidov ===
==== Plazmid pCW ====
Protein PsiH je citokrom P450 monooksigenaza. Zapisi za encim PsiH so znani po tem, da so zelo zahtevni za funkcionalno izražanje v ''E. coli'' in pogosto zahtevajo posebne pogoje izražanja ali šaperone. Potrebujejo partnerski encim P450 reduktazo iz ''Psilocybe cubensis'', vendar P450 reduktaza ni dobro opisana in tudi ni bila izražena v ''E. coli''. Plazmid pCW je pogosto uporabljen plazmid, ki vsebuje človeški gen P450 in gen za citokrom P450 reduktazo. Upali so, da bo ta sistem optimiziran tako, da bodo izrezali obstoječi človeški P450 in ga nadomestili s citokrom P450 monooksigenazo. To bi omogočilo izražanje proteinov PsiH skupaj z obstoječim genom za P450 reduktazo.

==== Plazmid pET-28c ====
Plazmid pET-28c je strogo reguliran plazmid, namenjen močnemu in nadzorovanemu izražanju vseh treh psi genov. Na N-konec genov so vstavili polihistidinsko oznako (6x His-tag), ki jim je omogočila čiščenje proteinov z Ni-afinitetno kromatografijo.

==== Plazmid pUS250 ====
Plazmid pUS250 je primeren za vstavljanje vseh treh genov psiK, psiD in psiM v en plazmid s pomočjo Golden Gate molekulskega kloniranja.

=== Izvedba eksperimentov ===
==== Izražanje genov psiK, psiD in psiM ====
Prvi uspešen korak je bil kloniranje genov psiK ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3140002 BBa_K3140002]), psiD ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3140000 BBa_K3140000]) in psiM ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3140003 BBa_K31440003]) v plazmidu pET-28c. Z ustreznimi restriktazami so rezali plazmide pET-28c, da so vstavili posamezne gene in ligirali. Celice ''E. coli'' BL21[DE3] so transformirali s plazmidi. Celične lizate so nanesli na NaDS-PAGE, da so preverili ustrezno velikost sintetiziranih proteinov. Pokazalo se je, da so bili proteini ob določenih pogojih izražanja netopni. Idejo za optimizacijo so dobili s pomočjo drugega iGEM projekta. Odločili so se, da poleg plazmida pET-28c v celice vstavijo še dodaten plazmid pGro7, ki kodira kompleks groES-groEL. Proteine so očistili s pomočjo Ni-afinitetne kromatografije. Funkcionalnost proteinov so preverili s pomočjo kvalitativnega testa tekočinske kromatografije in masne spektrometrije (LCMS). Podatki so pokazali katalitično aktivnost PsiD in PsiK.

==== Sestavljanje genskega skupka ("gene cluster") ====
Cilj je bil vse tri gene psiK, psiD in psiM iz psilocibinske encimske poti vstaviti v plazmid pU250, kar so naredili s pomočjo Golden Gate. Celice ''E.coli'' DH5α so transformirali s plazmidom pUS250 in pGro7. Gojili so veliko kulture in inducirali sintezo proteinov s pomočjo kumata. Celice so centrifugirali in očistili supernatant. Produkte so identificirali s pomočjo LCMS. Čeprav so dokazali aktivnost encimov v poti, niso mogli dokazati proizvodnje psilocibina. Predpostavka je bila, da ni prišlo do zadostne sinteze baeocistina, intermediata v sintezni poti proteina PsiM. Zato so se osredotočili za optimizacijo pogojev za sintezo proteinov. Za optimizacijo je bilo več možnosti: optimizacija medija, PCR, ki je nagnjen k napakam, ter izboljšanje kodonov proizvedenih proteinov.

==== Izražanje in karakterizacija PsiH encima ====
V tem delu projekta so želeli izraziti in opisati aktivnost PsiH encima, ter encima P450 monooksigenaze, preden so ga vnesli v enocelični sistem. Človeški gen p450 so izrezali iz pCW plazmida, katerega so nato ponovno združili skupaj. Tako so dobili na novo skonstruiran plazmid pUS381. Prav tako so na novo skonstruirali plazmid pUS382 ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3140001 BBa_K3140001]), ki je vseboval psiH divjega tipa iz Psilocybe cubensis in plazmid pUS383 ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3140004 BBa_K3140004]), ki vsebuje IDT kodon. S pomočjo sekvenciranja po Sangerju so ugotovili, da je pri plazmidu pUS383 prišlo do izbrisa posameznega nukleotida na začetku gena, ki je optimiziran za kodon psiH, posledica tega je mutacija in premik bralnega okvirja. Da so potrdili, če se protein lahko izrazi v ''E.coli'' so gojili kulture celic, ki so vsebovale plazmide pUS381, pUS382 in pUS383. S pomočjo SDS-PAGE so ugotovili, da je encim PsiH prisoten v pUS382, pUS383. Izvedli so testiranje ali lahko PsiH katalizira reakcijo oksidacijo triptamina do 4-hidroksitriptamina, ki poteka tudi v biosintezni poti psilocibina. Rezultate LCMS je bilo težko analizirati. Ugotovili so, da je možno spodbuditi celice ''E.coli'' za izražanje PsiH. Predvidevajo, da bi prihodnje usmeritve PsiH mogle biti usmerjene v prilagoditev zaporedja gena za boljšo ekspresijo v ''E. coli''. To bi se lahko doseglo s spremembo N-terminala gena in poskusi različnih načinov usklajevanja in optimizacije.

==== Nastanek dvoplazmidnega sistema ====
S tem, ko so vstavili dva plazmida v isto celico, je bila ustvarjena celotna biosintetska pot psilocibina v ''E. coli''. Transformirali so celice ''E. coli'' DH5α s pGro7, s pUS382 in s pUS387. To so imenovali Magi.Coli – sistem z vsemi divjimi tipi psi genov. Gojili so kulture dvoplazmidnih celic v TB mediju, inducirali proizvodnjo proteinov GROES in GROEL iz pGro7 z arabinozo. Proizvodnjo proteinov iz pUS382 so inducirali z IPTG in iz pUS387 s kumatom. Sledili so protokolu in vzorce supernatanta analizirali z LCMS analizo.

==== Gojenje ====
Namen tega dela je bil raziskati in primerjati pogoje rasti celic v fermentorju in v laboratorijski kulturi. V fermentorju so bili rezultati veliko boljši, saj je bilo število celic na liter gojene kulture v fermentorju večje, kot v laboratorijski kulturi. V nadaljevanju so si zato želeli optimizirati Magi.Coli za gojenje v fermentorju.

=== Optimizacija ===
==== Optimizacija kodonov ====
Želeli so določiti katera vrsta optimizacije kodona bo izboljšala izražanje proteina VVD v primerjavi z divjim tipom kodona ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3140006 BBa_K3140006], [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3140007 BBa_K3140007],[http://parts.igem.org/Part:BBa_K3140008 BBa_K3140008], [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3140009 BBa_K3140009]). Rezultate optimizacije bi uporabili za optimizacijo kodonov genov psi in prišli do izboljšanega izražanja. Ugotovili so, da optimizacija kodonov morda ni najučinkovitejša metoda za izboljšanje aktivnosti teh fluorescenčnih proteinov.

==== PCR nagnjen k napakam ====
S pomočjo PCR, ki je nagnjen k napakam, so želeli ustvariti bolj fluorescenčno različico šibko fluorescirajočega proteina VVD. Rezultati določanja zaporedja genov VVD iz svetlih kolonij so pokazali, da je bila pri večini genov skupna mutacija. Mutacija določenega mesta v kodonu za metioninski ostanek 130 je povzročila spremembo v izolevcin, treonin ali levcin, ter izboljšala fluorescenco proteina ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3140010 BBa_K31440010]).

== '''Zaključek''' ==
Ekipa iz Sydneya je dokazala, da dve od štirih komponent njihovega sistema delujeta po pričakovanjih v ''in vivo'' pogojih. Ko so klonirali gene psiD, psiK, psiM in psiH v ''E.coli'' so ugotovili, da pride do ustrezne pretvorbe substrata v 3 od 5 korakov v biosintetski poti. Rezultati kažejo, da je sistem Magi.Coli obetaven, ekipa pa še naprej dela na izboljšavah tega sistema.

== '''Viri''' ==

<references/>

Magi.Coli: sinteza psilocibina s pomočjo E.coli

2020-04-13T13:23:31Z

Luka Lavrič:

Magi.Coli <ref> iGEM 2019 team Sydney. Magi.Coli. 21. 10. 2019. [citirano dne 11. 04. 2020] https://2019.igem.org/Team:Sydney_Australia </ref> je študentski projekt, ki ga je predstavila ekipa Sydney iz Avstralije na tekmovanju iGEM 2019. Želja in cilj ekipe je, da bi v prihodnosti bile raziskave in zdravljenje s pomočjo psilocibina stroškovno in tudi količinsko ugodne, kar bi lahko dosegli z in vivo sintezo v ''E.coli''.

== '''Zdravljenje duševnih motenj''' ==
Depresija je najpogostejša duševna bolezen, ki se lahko pojavi na različne načine in prizadane od 8-10 % populacije. Poleg depresije, sta pogosti duševni bolezni tudi anksioznost in obsesivno kompulzivna motnja. V eni izmed raziskav, kjer so v veliki meri pozdravili prisotnost duševnih motenj, so to dosegli z zdravilom, ki ima zelo velik potencial. Uporabili so psilocibin. Vsi bolniki so dobro prenašali psilocibin, hkrati pa ni prišlo do resnih ali nepričakovanih neželenih učinkov. Zmeren odmerek tega naravnega zdravila je pokazal, da je v 3 mesecih 8 od 12 udeležencev izpolnilo merila za popolno remisijo. Ugotovljeno je tudi, da ima psilocibin zelo nizek potencial za zlorabo in naj ne bi povzročal zasvojenosti <ref> R. L. Carhart-Harris, M. Bolstridge, J. Rucker, C. M. Day, D. Erritzoe, M. Kaelen, M. Bloomfield, J. A. Rickard, B. Forbes, A. Feilding, D. Taylor: Psilocybin with psychological support for treatment-resistant depression: an open-label feasibility study. The Lancet Psychiatry. '''2016''', 3(7), 619–627. </ref>.
=== Psilocibin ===
Psilocibin je psihedelična spojina, ki je sintetizirana iz triptofana in je produkt različnih gob iz rodu ''Psilocybe''. Medsebojno gobe razlikujemo po velikosti, obliki in učinkovitosti. Večina jih raste na območju ZDA. Gobe so že od sedemdesetih let ilegalne v večini držav po svetu, posledica pa je pomanjkanje raziskav s to spojino. Vseeno so znanstveniki kalili ideje, kako bi sintetizirali psilocibin v namene zdravljenja duševnih motenj. Psilocibin so sintetizirali s pomočjo organske sinteze, vendar pa je naslednji problem predstavljala cena, saj je sinteza enega grama znašala 2000 dolarjev <ref> J. Fricke, F. Blei, D. Hoffmeister: Enzymatic synthesis of psilocybin. Angew. Chemi. Int. Ed. Engl. '''2017''', 56(40), 12352–12355. </ref> <ref> J. Fricke, C. Lenz, J. Wick, F. Blei, D. Hoffmeister: Production Options for Psilocybin: Making of the Magic. Chemistry. '''2019''', 25(4), 897–903.</ref>
.
== '''Magi. Coli''' ==
V naravi se psilocibin sintetizira po poti, kjer delujejo štirje različni encimi. Ekipa, ki se je lotila projekta je želela klonirati to pot v ''E.coli'', da bi zmanjšali stroške proizvodnje, hkrati pa sintetizirali večje količine psilocibina. Tako bi lažje omogočili raziskave in potrebe po zdravljenju duševnih motenj. Njihov cilj je bil oblikovati sistem, ki bo sposoben sintetizirati psilocibin z uporabo genov psiD, psiH, psiK, psiM, ki jih najdemo v biosintetski poti ''Psilocybe cubensis''. To je vključevalo vnos genov psiD, psiK in psiM v en plazmid, pri čemer ima vsak svoj RBS, vse pa je pod nadzorom enega močnega promotorja. Gen psiH je bil vključen v drug plazmid, da bi bil sočasno izražen z drugimi geni. Po pridobljenem sistemu Magi.Coli so ga želeli še izboljšati, ter z njim povečati sintezo psilocibina. To bi dosegli s povečano sintezo funkcionalnih Psi proteinov v E.coli. Želeli so optimizirati kodone, da bi izboljšali sintezo funkcionalnih proteinov zlasti PsiH. To so poskušali na fluorescenčnem proteinu VVD iz glive ''Neurospora crassa''.

=== Priprava za eksperimente ===
==== Deli psi ====
Sekvence za vse psi gene divjega tipa so pregledali, da ne bi vsebovali neželenih restrikcijskih mest. Poleg teh mest so odstranili tudi kriptične promotorje in RBS mesta znotraj gena.
==== Deli VVD ====
Vsi deli VVD so temeljili na izvornem proteinu VVD iz ''Neurospora crassa''. VVD36 kodirajoče zaporedje je bilo ustvarjeno z odstranitvijo prvih 36 aminokislinskih ostankov in dodajanjem začetnega kodona. Ostanek cisteina na položaju 73 (TGC) so spremenili v alanin s spremembo kodona v GCC, s tem se je VVD spremenil v fluoroprotein. Nastal je VVD36-C73A ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3140005 BBa_K3140005]).

=== Izbor plazmidov ===
==== PsiH ekspresijski plazmid ====
Protein PsiH, ki so ga želeli izraziti iz ''Psilocybe cubensis'' je citokrom P450 monooksigenaza. Ti encimi so znani po tem, da so zelo zahtevni za funkcionalno izražanje v ''E.coli'' in pogosto zahtevajo posebne pogoje izražanja ali molekularne šaperone. Potrebujejo partnerski encim P450 reduktazo iz ''Psilocybe cubensis'', vendar P450 reduktaza ni dobro opisana in tudi ni bila izražena v E.coli. Plazmid pCW je pogosto uporabljen plazmid, ki vsebuje človeški gen P450 in gen za citokrom p450 reduktazo. Upali so, da bo ta sistem optimiziran tako, da bodo izrezali obstoječi P450 in ga nadomestili s svojim. To bi omogočilo ekspresijo proteinov PsiH skupaj z obstoječim P450 reduktaznim genom.

==== Pet28 plazmid ====
Plazmid pET-28c je strogo reguliran plazmid, namenjen močnemu in nadzorovanemu izražanju vseh treh psi genov. Gene so vstavili z N-terminalno 6x His oznako, ki jim je omogočila čiščenje proteinov, ter karakterizacijo ''in vitro''.

==== Inducibilni plazmid pUS250 ====
Primeren za vstavljanje vseh treh genov psiK, psiD in psiM v en plazmid s pomočjo Golden Gate molekularnega kloniranja.

=== Izvedba eksperimentov ===
==== Izražanje genov psiK, psiD in psiM ====
Prvi uspešen korak je bil kloniranje psiK ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3140002 BBa_K3140002]), psiD ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3140000 BBa_K3140000]) in psiM ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3140003 BBa_K31440003]) genov v plazmidu pET28. Z ustreznimi restriktazami so rezali pET28 plazmide, da so vstavili posamezen gen in ligirali. Celice ''E.coli'' BL21 [DE3] so transformirali s plazmidom. Celične lizate so nanesli na SDS-PAGE, da so preverili ustrezno velikost sintetiziranih proteinov. Pokazalo se je, da so bili proteini ob določenih pogojih izražanja netopni. Idejo za optimizacijo so dobili s pomočjo drugega iGEM projekta. Odločili so se, da oblikujejo plazmid pET28 z dodatnim plazmidom pGro7, ki kodira kompleks groES-groEL. Proteine so očistili s pomočjo afinitetne kromatografije z nikljem. Funkcionalnosti vzorcev so preverili s pomočjo kvalitativnega testa LCMS. Podatki so pokazali katalitično aktivnost PsiD in PsiK.

==== Sestavljanje genskega grozda ("gene cluster") ====
Cilj je bil vse tri gene psiK, psiD in psiM iz psilocibinske encimske poti vstaviti v plazmid pU250, kar so naredili s pomočjo Golden Gate. Vse skupaj so transformirali v celice ''E.coli'' DH5α s pGro7. Gojili so veliko kulture in inducirali sintezo proteinov s pomočjo kumata. Sledila je suspenzija celic ter inkubacija s stresanjem. Supernatant so očistili in identificirali produkte presnove z LCMS. Čeprav so dokazali aktivnost encimov v poti, niso mogli dokazati proizvodnje psilocibina. Predpostavka je bila, da ni prišlo do zadostne sinteze Baeocistina. Zato so se osredotočili za optimizacijo pogojev za sintezo proteinov. Za optimizacijo je bilo več možnosti: optimizacija medija, pogojev in uporabe proteina, uporaba PCR, ki je nagnjen k napakam, ter izboljšanje fenotipa proizvedenih proteinov.

==== Izražanje in karakterizacija PsiH encima ====
V tem delu projekta so želeli izraziti in opisati aktivnost PsiH encima, ter encima P450 monooksigenaze, preden so ga vnesli v enocelični sistem. Človeški gen p450 so izrezali iz pCW plazmida, katerega so nato ponovno združili skupaj. Tako so dobili na novo skonstruiran plazmid pUS381. Prav tako so na novo skonstruirali plazmid pUS382 ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3140001 BBa_K3140001]), ki je vseboval psiH divjega tipa iz Psilocybe cubensis in plazmid pUS383 ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3140004 BBa_K3140004]), ki vsebuje IDT kodon. S pomočjo sekvenciranja po Sangerju so ugotovili, da je pri plazmidu pUS383 prišlo do izbrisa posameznega nukleotida na začetku gena, ki je optimiziran za kodon psiH, posledica tega je mutacija in premik bralnega okvirja. Da so potrdili, če se protein lahko izrazi v ''E.coli'' so gojili kulture celic, ki so vsebovale plazmide pUS381, pUS382 in pUS383. S pomočjo SDS-PAGE so ugotovili, da je encim PsiH prisoten v pUS382, pUS383. Izvedli so testiranje ali lahko PsiH katalizira reakcijo oksidacijo triptamina do 4-hidroksitriptamina, ki poteka tudi v biosintezni poti psilocibina. Rezultate LCMS je bilo težko analizirati. Ugotovili so, da je možno spodbuditi celice ''E.coli'' za izražanje PsiH. Predvidevajo, da bi prihodnje usmeritve PsiH mogle biti usmerjene v prilagoditev zaporedja gena za boljšo ekspresijo v ''E. coli''. To bi se lahko doseglo s spremembo N-terminala gena in poskusi različnih načinov usklajevanja in optimizacije.

==== Nastanek dvoplazmidnega sistema ====
S tem, ko so vstavili dva plazmida v iste celice, je bila ustvarjena celotna pot iz gob v ''E.coli''. Transformirali so celice ''E.coli'' DH5α s pGro7 s pUS382 in pUS387, to so imenovali Magi.coli – sistem z vsemi divjimi tipi psi genov. Gojili so kulture dvoplazmidnih celic v TB mediju, inducirali proizvodnjo proteinov GROES in GROEL iz pGro7 z arabinozo do srednje dolge faze. PUS382 so inducirali z IPTG in pUS387 s kumatom. Sledili so protokolu in vzorce supernatanta analizirali z LCMS analizo, da so preverili prisotnost intermediatov na poti.

==== Gojenje ====
Namen tega dela je bil raziskati in primerjati rast v dveh ločenih sistemih. V fermentorju so bili rezultati veliko boljši, saj je bilo število celic na liter gojene kulture v fermentorju večje, kot v laboratorijski kulturi. V nadaljevanju so si zato želeli optimizirati Magi.Coli za izražanje v fermentorju.

=== Optimizacija ===
==== Optimizacija kodonov ====
Želeli so določiti katera vrsta optimizacije kodona bo izboljšala izražanje proteina VVD v primerjavi z divjim tipom kodona ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3140006 BBa_K3140006], [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3140007 BBa_K3140007],[http://parts.igem.org/Part:BBa_K3140008 BBa_K3140008], [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3140009 BBa_K3140009]). Optimizacijo bi uporabili za usklajevanje kodonov psi genov za izboljšanje izražanja. Ugotovili so, da optimizacija kodona morda ni najučinkovitejša metoda za izboljšanje aktivnosti teh fluorescenčnih proteinov.

==== PCR nagnjen k napakam ====
S pomočjo PCR, ki je nagnjen k napakam, so želeli ustvariti bolj fluorescenčno različico šibko fluorescenčnega proteina VVD. Rezultati sekvenciranja teh VVD genov iz svetlih kolonij so pokazali, da je bila pri večini genov skupna mutacija. Ta mutacija je metionin v ostanku 130 spremenila v izolevcin, treonin ali levcin, izboljšala se je fluorescenca proteina ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3140010 BBa_K31440010]).

== '''Zaključek''' ==
Ekipa iz Sydneya je dokazala, da dve od štirih komponent njihovega sistema delujeta po pričakovanjih v in vivo pogojih. Ko so klonirali gene psiD, psiK, psiM in psiH v ''E.coli'' so ugotovili, da pride do ustrezne pretvorbe substrata v 3 od 5 korakov v biosintetski poti. Rezultati kažejo, da je sistem Magi.Coli obetaven, ekipa pa še naprej dela na izboljšavah tega sistema.

== '''Viri''' ==

<references/>

Magi.Coli: sinteza psilocibina s pomočjo E.coli

2020-04-13T13:22:44Z

Luka Lavrič:

Magi.Coli <ref> iGEM 2019 team Sydney. Magi.Coli. 21. 10. 2019. [citirano dne 11. 04. 2020] https://2019.igem.org/Team:Sydney_Australia </ref> je študentski projekt, ki ga je predstavila ekipa Sydney iz Avstralije na tekmovanju iGEM 2019. Želja in cilj ekipe je, da bi v prihodnosti bile raziskave in zdravljenje s pomočjo psilocibina stroškovno in tudi količinsko ugodne, kar bi lahko dosegli z in vivo sintezo v ''E.coli''.

== '''Zdravljenje duševnih motenj''' ==
Depresija je najpogostejša duševna bolezen, ki se lahko pojavi na različne načine in prizadane od 8-10 % populacije. Poleg depresije, sta pogosti duševni bolezni tudi anksioznost in obsesivno kompulzivna motnja. V eni izmed raziskav, kjer so v veliki meri pozdravili prisotnost duševnih motenj, so to dosegli z zdravilom, ki ima zelo velik potencial. Uporabili so psilocibin. Vsi bolniki so dobro prenašali psilocibin, hkrati pa ni prišlo do resnih ali nepričakovanih neželenih učinkov. Zmeren odmerek tega naravnega zdravila je pokazal, da je v 3 mesecih 8 od 12 udeležencev izpolnilo merila za popolno remisijo. Ugotovljeno je tudi, da ima psilocibin zelo nizek potencial za zlorabo in naj ne bi povzročal zasvojenosti <ref> R. L. Carhart-Harris, M. Bolstridge, J. Rucker, C. M. Day, D. Erritzoe, M. Kaelen, M. Bloomfield, J. A. Rickard, B. Forbes, A. Feilding, D. Taylor: Psilocybin with psychological support for treatment-resistant depression: an open-label feasibility study. The Lancet Psychiatry. '''2016''', 3(7), 619–627. </ref>.
=== Psilocibin ===
Psilocibin je psihedelična spojina, ki je sintetizirana iz triptofana in je produkt različnih gob iz rodu ''Psilocybe''. Medsebojno gobe razlikujemo po velikosti, obliki in učinkovitosti. Večina jih raste na območju ZDA. Gobe so že od sedemdesetih let ilegalne v večini držav po svetu, posledica pa je pomanjkanje raziskav s to spojino. Vseeno so znanstveniki kalili ideje, kako bi sintetizirali psilocibin v namene zdravljenja duševnih motenj. Psilocibin so sintetizirali s pomočjo organske sinteze, vendar pa je naslednji problem predstavljala cena, saj je sinteza enega grama znašala 2000 dolarjev <ref> J. Fricke, F. Blei, D. Hoffmeister: Enzymatic synthesis of psilocybin. Angew. Chemi. Int. Ed. Engl. '''2017''', 56(40), 12352–12355. </ref> <ref> J. Fricke, C. Lenz, J. Wick, F. Blei, D. Hoffmeister: Production Options for Psilocybin: Making of the Magic. Chemistry. '''2019''', 25(4), 897–903.</ref>
.
== '''Magi. Coli''' ==
V naravi se psilocibin sintetizira po poti, kjer delujejo štirje različni encimi. Ekipa, ki se je lotila projekta je želela klonirati to pot v ''E.coli'', da bi zmanjšali stroške proizvodnje, hkrati pa sintetizirali večje količine psilocibina. Tako bi lažje omogočili raziskave in potrebe po zdravljenju duševnih motenj. Njihov cilj je bil oblikovati sistem, ki bo sposoben sintetizirati psilocibin z uporabo genov psiD, psiH, psiK, psiM, ki jih najdemo v biosintetski poti ''Psilocybe cubensis''. To je vključevalo vnos genov psiD, psiK in psiM v en plazmid, pri čemer ima vsak svoj RBS, vse pa je pod nadzorom enega močnega promotorja. Gen psiH je bil vključen v drug plazmid, da bi bil sočasno izražen z drugimi geni. Po pridobljenem sistemu Magi.Coli so ga želeli še izboljšati, ter z njim povečati sintezo psilocibina. To bi dosegli s povečano sintezo funkcionalnih Psi proteinov v E.coli. Želeli so optimizirati kodone, da bi izboljšali sintezo funkcionalnih proteinov zlasti PsiH. To so poskušali na fluorescenčnem proteinu VVD iz glive ''Neurospora crassa''.

=== Priprava za eksperimente ===
==== Deli psi ====
Sekvence za vse psi gene divjega tipa so pregledali, da ne bi vsebovali neželenih restrikcijskih mest. Poleg teh mest so odstranili tudi kriptične promotorje in RBS mesta znotraj gena.
==== Deli VVD ====
Vsi deli VVD so temeljili na izvornem proteinu VVD iz ''Neurospora crassa''. VVD36 kodirajoče zaporedje je bilo ustvarjeno z odstranitvijo prvih 36 aminokislinskih ostankov in dodajanjem začetnega kodona. Ostanek cisteina na položaju 73 (TGC) so spremenili v alanin s spremembo kodona v GCC, s tem se je VVD spremenil v fluoroprotein. Nastal je VVD36-C73A ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3140005 BBa_K3140005]).

=== Izbor plazmidov ===
==== PsiH ekspresijski plazmid ====
Protein PsiH, ki so ga želeli izraziti iz ''Psilocybe cubensis'' je citokrom P450 monooksigenaza. Ti encimi so znani po tem, da so zelo zahtevni za funkcionalno izražanje v ''E.coli'' in pogosto zahtevajo posebne pogoje izražanja ali molekularne šaperone. Potrebujejo partnerski encim P450 reduktazo iz ''Psilocybe cubensis'', vendar P450 reduktaza ni dobro opisana in tudi ni bila izražena v E.coli. Plazmid pCW je pogosto uporabljen plazmid, ki vsebuje človeški gen P450 in gen za citokrom p450 reduktazo. Upali so, da bo ta sistem optimiziran tako, da bodo izrezali obstoječi P450 in ga nadomestili s svojim. To bi omogočilo ekspresijo proteinov PsiH skupaj z obstoječim P450 reduktaznim genom.

==== Pet28 plazmid ====
Plazmid pET-28c je strogo reguliran plazmid, namenjen močnemu in nadzorovanemu izražanju vseh treh psi genov. Gene so vstavili z N-terminalno 6x His oznako, ki jim je omogočila čiščenje proteinov, ter karakterizacijo ''in vitro''.

==== Inducibilni plazmid pUS250 ====
Primeren za vstavljanje vseh treh genov psiK, psiD in psiM v en plazmid s pomočjo Golden Gate molekularnega kloniranja.

=== Izvedba eksperimentov ===
==== Izražanje genov psiK, psiD in psiM v posameznih konstruktih ====
Prvi uspešen korak je bil kloniranje psiK ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3140002 BBa_K3140002]), psiD ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3140000 BBa_K3140000]) in psiM ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3140003 BBa_K31440003]) genov v plazmidu pET28. Z ustreznimi restriktazami so rezali pET28 plazmide, da so vstavili posamezen gen in ligirali. Celice ''E.coli'' BL21 [DE3] so transformirali s plazmidom. Celične lizate so nanesli na SDS-PAGE, da so preverili ustrezno velikost sintetiziranih proteinov. Pokazalo se je, da so bili proteini ob določenih pogojih izražanja netopni. Idejo za optimizacijo so dobili s pomočjo drugega iGEM projekta. Odločili so se, da oblikujejo plazmid pET28 z dodatnim plazmidom pGro7, ki kodira kompleks groES-groEL. Proteine so očistili s pomočjo afinitetne kromatografije z nikljem. Funkcionalnosti vzorcev so preverili s pomočjo kvalitativnega testa LCMS. Podatki so pokazali katalitično aktivnost PsiD in PsiK.

==== Sestavljanje genskega grozda ("gene cluster") ====
Cilj je bil vse tri gene psiK, psiD in psiM iz psilocibinske encimske poti vstaviti v plazmid pU250, kar so naredili s pomočjo Golden Gate. Vse skupaj so transformirali v celice ''E.coli'' DH5α s pGro7. Gojili so veliko kulture in inducirali sintezo proteinov s pomočjo kumata. Sledila je suspenzija celic ter inkubacija s stresanjem. Supernatant so očistili in identificirali produkte presnove z LCMS. Čeprav so dokazali aktivnost encimov v poti, niso mogli dokazati proizvodnje psilocibina. Predpostavka je bila, da ni prišlo do zadostne sinteze Baeocistina. Zato so se osredotočili za optimizacijo pogojev za sintezo proteinov. Za optimizacijo je bilo več možnosti: optimizacija medija, pogojev in uporabe proteina, uporaba PCR, ki je nagnjen k napakam, ter izboljšanje fenotipa proizvedenih proteinov.

==== Izražanje in karakterizacija PsiH encima ====
V tem delu projekta so želeli izraziti in opisati aktivnost PsiH encima, ter encima P450 monooksigenaze, preden so ga vnesli v enocelični sistem. Človeški gen p450 so izrezali iz pCW plazmida, katerega so nato ponovno združili skupaj. Tako so dobili na novo skonstruiran plazmid pUS381. Prav tako so na novo skonstruirali plazmid pUS382 ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3140001 BBa_K3140001]), ki je vseboval psiH divjega tipa iz Psilocybe cubensis in plazmid pUS383 ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3140004 BBa_K3140004]), ki vsebuje IDT kodon. S pomočjo sekvenciranja po Sangerju so ugotovili, da je pri plazmidu pUS383 prišlo do izbrisa posameznega nukleotida na začetku gena, ki je optimiziran za kodon psiH, posledica tega je mutacija in premik bralnega okvirja. Da so potrdili, če se protein lahko izrazi v ''E.coli'' so gojili kulture celic, ki so vsebovale plazmide pUS381, pUS382 in pUS383. S pomočjo SDS-PAGE so ugotovili, da je encim PsiH prisoten v pUS382, pUS383. Izvedli so testiranje ali lahko PsiH katalizira reakcijo oksidacijo triptamina do 4-hidroksitriptamina, ki poteka tudi v biosintezni poti psilocibina. Rezultate LCMS je bilo težko analizirati. Ugotovili so, da je možno spodbuditi celice ''E.coli'' za izražanje PsiH. Predvidevajo, da bi prihodnje usmeritve PsiH mogle biti usmerjene v prilagoditev zaporedja gena za boljšo ekspresijo v ''E. coli''. To bi se lahko doseglo s spremembo N-terminala gena in poskusi različnih načinov usklajevanja in optimizacije.

==== Nastanek dvoplazmidnega sistema ====
S tem, ko so vstavili dva plazmida v iste celice, je bila ustvarjena celotna pot iz gob v ''E.coli''. Transformirali so celice ''E.coli'' DH5α s pGro7 s pUS382 in pUS387, to so imenovali Magi.coli – sistem z vsemi divjimi tipi psi genov. Gojili so kulture dvoplazmidnih celic v TB mediju, inducirali proizvodnjo proteinov GROES in GROEL iz pGro7 z arabinozo do srednje dolge faze. PUS382 so inducirali z IPTG in pUS387 s kumatom. Sledili so protokolu in vzorce supernatanta analizirali z LCMS analizo, da so preverili prisotnost intermediatov na poti.

==== Gojenje ====
Namen tega dela je bil raziskati in primerjati rast v dveh ločenih sistemih. V fermentorju so bili rezultati veliko boljši, saj je bilo število celic na liter gojene kulture v fermentorju večje, kot v laboratorijski kulturi. V nadaljevanju so si zato želeli optimizirati Magi.Coli za izražanje v fermentorju.

=== Optimizacija ===
==== Optimizacija kodonov ====
Želeli so določiti katera vrsta optimizacije kodona bo izboljšala izražanje proteina VVD v primerjavi z divjim tipom kodona ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3140006 BBa_K3140006], [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3140007 BBa_K3140007],[http://parts.igem.org/Part:BBa_K3140008 BBa_K3140008], [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3140009 BBa_K3140009]). Optimizacijo bi uporabili za usklajevanje kodonov psi genov za izboljšanje izražanja. Ugotovili so, da optimizacija kodona morda ni najučinkovitejša metoda za izboljšanje aktivnosti teh fluorescenčnih proteinov.

==== PCR nagnjen k napakam ====
S pomočjo PCR, ki je nagnjen k napakam, so želeli ustvariti bolj fluorescenčno različico šibko fluorescenčnega proteina VVD. Rezultati sekvenciranja teh VVD genov iz svetlih kolonij so pokazali, da je bila pri večini genov skupna mutacija. Ta mutacija je metionin v ostanku 130 spremenila v izolevcin, treonin ali levcin, izboljšala se je fluorescenca proteina ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3140010 BBa_K31440010]).

== '''Zaključek''' ==
Ekipa iz Sydneya je dokazala, da dve od štirih komponent njihovega sistema delujeta po pričakovanjih v in vivo pogojih. Ko so klonirali gene psiD, psiK, psiM in psiH v ''E.coli'' so ugotovili, da pride do ustrezne pretvorbe substrata v 3 od 5 korakov v biosintetski poti. Rezultati kažejo, da je sistem Magi.Coli obetaven, ekipa pa še naprej dela na izboljšavah tega sistema.

== '''Viri''' ==

<references/>

Magi.Coli: sinteza psilocibina s pomočjo E.coli

2020-04-13T13:20:21Z

Luka Lavrič:

Magi.Coli <ref> iGEM 2019 team Sydney. Magi.Coli. 21. 10. 2019. [citirano dne 11. 04. 2020] https://2019.igem.org/Team:Sydney_Australia </ref> je študentski projekt, ki ga je predstavila ekipa Sydney iz Avstralije na tekmovanju iGEM 2019. Želja in cilj ekipe je, da bi v prihodnosti bile raziskave in zdravljenje s pomočjo psilocibina stroškovno in tudi količinsko ugodne, kar bi lahko dosegli z in vivo sintezo v ''E.coli''.

== '''Zdravljenje duševnih motenj''' ==
Depresija je najpogostejša duševna bolezen, ki se lahko pojavi na različne načine in prizadane od 8-10 % populacije. Poleg depresije, sta pogosti duševni bolezni tudi anksioznost in obsesivno kompulzivna motnja. V eni izmed raziskav, kjer so v veliki meri pozdravili prisotnost duševnih motenj, so to dosegli z zdravilom, ki ima zelo velik potencial. Uporabili so psilocibin. Vsi bolniki so dobro prenašali psilocibin, hkrati pa ni prišlo do resnih ali nepričakovanih neželenih učinkov. Zmeren odmerek tega naravnega zdravila je pokazal, da je v 3 mesecih 8 od 12 udeležencev izpolnilo merila za popolno remisijo. Ugotovljeno je tudi, da ima psilocibin zelo nizek potencial za zlorabo in naj ne bi povzročal zasvojenosti <ref> R. L. Carhart-Harris, M. Bolstridge, J. Rucker, C. M. Day, D. Erritzoe, M. Kaelen, M. Bloomfield, J. A. Rickard, B. Forbes, A. Feilding, D. Taylor: Psilocybin with psychological support for treatment-resistant depression: an open-label feasibility study. The Lancet Psychiatry. '''2016''', 3(7), 619–627. </ref>.
=== Psilocibin ===
Psilocibin je psihedelična spojina, ki je sintetizirana iz triptofana in je produkt različnih gob iz rodu ''Psilocybe''. Medsebojno gobe razlikujemo po velikosti, obliki in učinkovitosti. Večina jih raste na območju ZDA. Gobe so že od sedemdesetih let ilegalne v večini držav po svetu, posledica pa je pomanjkanje raziskav s to spojino. Vseeno so znanstveniki kalili ideje, kako bi sintetizirali psilocibin v namene zdravljenja duševnih motenj. Psilocibin so sintetizirali s pomočjo organske sinteze, vendar pa je naslednji problem predstavljala cena, saj je sinteza enega grama znašala 2000 dolarjev <ref> J. Fricke, F. Blei, D. Hoffmeister: Enzymatic synthesis of psilocybin. Angew. Chemi. Int. Ed. Engl. '''2017''', 56(40), 12352–12355. </ref> <ref> J. Fricke, C. Lenz, J. Wick, F. Blei, D. Hoffmeister: Production Options for Psilocybin: Making of the Magic. Chemistry. '''2019''', 25(4), 897–903.</ref>
.
== '''Magi. Coli''' ==
V naravi se psilocibin sintetizira po poti, kjer delujejo štirje različni encimi. Ekipa, ki se je lotila projekta je želela klonirati to pot v ''E.coli'', da bi zmanjšali stroške proizvodnje, hkrati pa sintetizirali večje količine psilocibina. Tako bi lažje omogočili raziskave in potrebe po zdravljenju duševnih motenj. Njihov cilj je bil oblikovati sistem, ki bo sposoben sintetizirati psilocibin z uporabo genov psiD, psiH, psiK, psiM, ki jih najdemo v biosintetski poti ''Psilocybe cubensis''. To je vključevalo vnos genov psiD, psiK in psiM v en plazmid, pri čemer ima vsak svoj RBS, vse pa je pod nadzorom enega močnega promotorja. Gen psiH je bil vključen v drug plazmid, da bi bil sočasno izražen z drugimi geni. Po pridobljenem sistemu Magi.Coli so ga želeli še izboljšati, ter z njim povečati sintezo psilocibina. To bi dosegli s povečano sintezo funkcionalnih Psi proteinov v E.coli. Želeli so optimizirati kodone, da bi izboljšali sintezo funkcionalnih proteinov zlasti PsiH. To so poskušali na fluorescenčnem proteinu VVD iz glive ''Neurospora crassa''.

=== Priprava za eksperimente ===
==== Deli psi ====
Sekvence za vse psi gene divjega tipa so pregledali, da ne bi vsebovali neželenih restrikcijskih mest. Poleg teh mest so odstranili tudi kriptične promotorje in RBS mesta znotraj gena.
==== Deli VVD ====
Vsi deli VVD so temeljili na izvornem proteinu VVD iz ''Neurospora crassa''. VVD36 kodirajoče zaporedje je bilo ustvarjeno z odstranitvijo prvih 36 aminokislinskih ostankov in dodajanjem začetnega kodona. Ostanek cisteina na položaju 73 (TGC) so spremenili v alanin s spremembo kodona v GCC, s tem se je VVD spremenil v fluoroprotein. Nastal je VVD36-C73A ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3140005 BBa_K3140005]).

=== Izbor plazmidov ===
==== PsiH ekspresijski plazmid ====
Protein PsiH, ki so ga želeli izraziti iz ''Psilocybe cubensis'' je citokrom P450 monooksigenaza. Ti encimi so znani po tem, da so zelo zahtevni za funkcionalno izražanje v ''E.coli'' in pogosto zahtevajo posebne pogoje izražanja ali molekularne šaperone. Potrebujejo partnerski encim P450 reduktazo iz ''Psilocybe cubensis'', vendar P450 reduktaza ni dobro opisana in tudi ni bila izražena v E.coli. Plazmid pCW je pogosto uporabljen plazmid, ki vsebuje človeški gen P450 in gen za citokrom p450 reduktazo. Upali so, da bo ta sistem optimiziran tako, da bodo izrezali obstoječi P450 in ga nadomestili s svojim. To bi omogočilo ekspresijo proteinov PsiH skupaj z obstoječim P450 reduktaznim genom.

==== Pet28 plazmid za izražanje posameznega gena ====
Plazmid pET-28c je strogo reguliran plazmid, namenjen močnemu in nadzorovanemu izražanju vseh treh psi genov. Gene so vstavili z N-terminalno 6x His oznako, ki jim je omogočila čiščenje proteinov, ter karakterizacijo ''in vitro''.

==== Inducibilni plazmid pUS250 za »golden gate« kloniranje ====
Primeren za vstavljanje vseh treh genov psiK, psiD in psiM v en plazmid s pomočjo Golden Gate molekularnega kloniranja.

=== Izvedba eksperimentov ===
==== Izražanje genov psiK, psiD in psiM v posameznih konstruktih ====
Prvi uspešen korak je bil kloniranje psiK ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3140002 BBa_K3140002]), psiD ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3140000 BBa_K3140000]) in psiM ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3140003 BBa_K31440003]) genov v plazmidu pET28. Z ustreznimi restriktazami so rezali pET28 plazmide, da so vstavili posamezen gen in ligirali. Celice ''E.coli'' BL21 [DE3] so transformirali s plazmidom. Celične lizate so nanesli na SDS-PAGE, da so preverili ustrezno velikost sintetiziranih proteinov. Pokazalo se je, da so bili proteini ob določenih pogojih izražanja netopni. Idejo za optimizacijo so dobili s pomočjo drugega iGEM projekta. Odločili so se, da oblikujejo plazmid pET28 z dodatnim plazmidom pGro7, ki kodira kompleks groES-groEL. Proteine so očistili s pomočjo afinitetne kromatografije z nikljem. Funkcionalnosti vzorcev so preverili s pomočjo kvalitativnega testa LCMS. Podatki so pokazali katalitično aktivnost PsiD in PsiK.

==== Sestavljanje genskega grozda (gene cluster) psiK, psiD, psiM ====
Cilj je bil vse tri gene psiK, psiD in psiM iz psilocibinske encimske poti vstaviti v plazmid pU250, kar so naredili s pomočjo Golden Gate. Vse skupaj so transformirali v celice ''E.coli'' DH5α s pGro7. Gojili so veliko kulture in inducirali sintezo proteinov s pomočjo kumata. Sledila je suspenzija celic ter inkubacija s stresanjem. Supernatant so očistili in identificirali produkte presnove z LCMS. Čeprav so dokazali aktivnost encimov v poti, niso mogli dokazati proizvodnje psilocibina. Predpostavka je bila, da ni prišlo do zadostne sinteze Baeocistina. Zato so se osredotočili za optimizacijo pogojev za sintezo proteinov. Za optimizacijo je bilo več možnosti: optimizacija medija, pogojev in uporabe proteina, uporaba PCR, ki je nagnjen k napakam, ter izboljšanje fenotipa proizvedenih proteinov.

==== Izražanje in karakterizacija PsiH encima ====
V tem delu projekta so želeli izraziti in opisati aktivnost PsiH encima, ter encima P450 monooksigenaze, preden so ga vnesli v enocelični sistem. Človeški gen p450 so izrezali iz pCW plazmida, katerega so nato ponovno združili skupaj. Tako so dobili na novo skonstruiran plazmid pUS381. Prav tako so na novo skonstruirali plazmid pUS382 ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3140001 BBa_K3140001]), ki je vseboval psiH divjega tipa iz Psilocybe cubensis in plazmid pUS383 ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3140004 BBa_K3140004]), ki vsebuje IDT kodon. S pomočjo sekvenciranja po Sangerju so ugotovili, da je pri plazmidu pUS383 prišlo do izbrisa posameznega nukleotida na začetku gena, ki je optimiziran za kodon psiH, posledica tega je mutacija in premik bralnega okvirja. Da so potrdili, če se protein lahko izrazi v ''E.coli'' so gojili kulture celic, ki so vsebovale plazmide pUS381, pUS382 in pUS383. S pomočjo SDS-PAGE so ugotovili, da je encim PsiH prisoten v pUS382, pUS383. Izvedli so testiranje ali lahko PsiH katalizira reakcijo oksidacijo triptamina do 4-hidroksitriptamina, ki poteka tudi v biosintezni poti psilocibina. Rezultate LCMS je bilo težko analizirati. Ugotovili so, da je možno spodbuditi celice ''E.coli'' za izražanje PsiH. Predvidevajo, da bi prihodnje usmeritve PsiH mogle biti usmerjene v prilagoditev zaporedja gena za boljšo ekspresijo v ''E. coli''. To bi se lahko doseglo s spremembo N-terminala gena in poskusi različnih načinov usklajevanja in optimizacije.

==== Nastanek dvoplazmidnega sistema ====
S tem, ko so vstavili dva plazmida v iste celice, je bila ustvarjena celotna pot iz gob v ''E.coli''. Transformirali so celice ''E.coli'' DH5α s pGro7 s pUS382 in pUS387, to so imenovali Magi.coli – sistem z vsemi divjimi tipi psi genov. Gojili so kulture dvoplazmidnih celic v TB mediju, inducirali proizvodnjo proteinov GROES in GROEL iz pGro7 z arabinozo do srednje dolge faze. PUS382 so inducirali z IPTG in pUS387 s kumatom. Sledili so protokolu in vzorce supernatanta analizirali z LCMS analizo, da so preverili prisotnost intermediatov na poti.

==== Gojenje ====
Namen tega dela je bil raziskati in primerjati rast v dveh ločenih sistemih. V fermentorju so bili rezultati veliko boljši, saj je bilo število celic na liter gojene kulture v fermentorju večje, kot v laboratorijski kulturi. V nadaljevanju so si zato želeli optimizirati Magi.Coli za izražanje v fermentorju.

=== Optimizacija ===
==== Optimizacija kodonov ====
Želeli so določiti katera vrsta optimizacije kodona bo izboljšala izražanje proteina VVD v primerjavi z divjim tipom kodona ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3140006 BBa_K3140006], [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3140007 BBa_K3140007],[http://parts.igem.org/Part:BBa_K3140008 BBa_K3140008], [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3140009 BBa_K3140009]). Optimizacijo bi uporabili za usklajevanje kodonov psi genov za izboljšanje izražanja. Ugotovili so, da optimizacija kodona morda ni najučinkovitejša metoda za izboljšanje aktivnosti teh fluorescenčnih proteinov.

==== PCR nagnjen k napakam ====
S pomočjo PCR, ki je nagnjen k napakam, so želeli ustvariti bolj fluorescenčno različico šibko fluorescenčnega proteina VVD. Rezultati sekvenciranja teh VVD genov iz svetlih kolonij so pokazali, da je bila pri večini genov skupna mutacija. Ta mutacija je metionin v ostanku 130 spremenila v izolevcin, treonin ali levcin, izboljšala se je fluorescenca proteina ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3140010 BBa_K31440010]).

== '''Zaključek''' ==
Ekipa iz Sydneya je dokazala, da dve od štirih komponent njihovega sistema delujeta po pričakovanjih v in vivo pogojih. Ko so klonirali gene psiD, psiK, psiM in psiH v ''E.coli'' so ugotovili, da pride do ustrezne pretvorbe substrata v 3 od 5 korakov v biosintetski poti. Rezultati kažejo, da je sistem Magi.Coli obetaven, ekipa pa še naprej dela na izboljšavah tega sistema.

== '''Viri''' ==

<references/>

Magi.Coli: sinteza psilocibina s pomočjo E.coli

2020-04-13T13:15:40Z

Luka Lavrič:

Magi.Coli <ref> iGEM 2019 team Sydney. Magi.Coli. 21. 10. 2019. [citirano dne 11. 04. 2020] https://2019.igem.org/Team:Sydney_Australia </ref> je študentski projekt, ki ga je predstavila ekipa Sydney iz Avstralije na tekmovanju iGEM 2019. Želja in cilj ekipe je, da bi v prihodnosti bile raziskave in zdravljenje s pomočjo psilocibina stroškovno in tudi količinsko ugodne, kar bi lahko dosegli z in vivo sintezo v ''E.coli''.

== '''Zdravljenje duševnih motenj''' ==
Depresija je najpogostejša duševna bolezen, ki se lahko pojavi na različne načine in prizadane od 8-10 % populacije. Poleg depresije, sta pogosti duševni bolezni tudi anksioznost in obsesivno kompulzivna motnja. V eni izmed raziskav, kjer so v veliki meri pozdravili prisotnost duševnih motenj, so to dosegli z zdravilom, ki ima zelo velik potencial. Uporabili so psilocibin. Vsi bolniki so dobro prenašali psilocibin, hkrati pa ni prišlo do resnih ali nepričakovanih neželenih učinkov. Zmeren odmerek tega naravnega zdravila je pokazal, da je v 3 mesecih 8 od 12 udeležencev izpolnilo merila za popolno remisijo. Ugotovljeno je tudi, da ima psilocibin zelo nizek potencial za zlorabo in naj ne bi povzročal zasvojenosti <ref> R. L. Carhart-Harris, M. Bolstridge, J. Rucker, C. M. Day, D. Erritzoe, M. Kaelen, M. Bloomfield, J. A. Rickard, B. Forbes, A. Feilding, D. Taylor: Psilocybin with psychological support for treatment-resistant depression: an open-label feasibility study. The Lancet Psychiatry. '''2016''', 3(7), 619–627. </ref>.
=== Psilocibin ===
Psilocibin je psihedelična spojina, ki je sintetizirana iz triptofana in je produkt različnih gob iz rodu ''Psilocybe''. Medsebojno gobe razlikujemo po velikosti, obliki in učinkovitosti. Večina jih raste na območju ZDA. Gobe so že od sedemdesetih let ilegalne v večini držav po svetu, posledica pa je pomanjkanje raziskav s to spojino. Vseeno so znanstveniki kalili ideje, kako bi sintetizirali psilocibin v namene zdravljenja duševnih motenj. Psilocibin so sintetizirali s pomočjo organske sinteze, vendar pa je naslednji problem predstavljala cena, saj je sinteza enega grama znašala 2000 dolarjev <ref> J. Fricke, F. Blei, D. Hoffmeister: Enzymatic synthesis of psilocybin. Angew. Chemi. Int. Ed. Engl. '''2017''', 56(40), 12352–12355. </ref> <ref> J. Fricke, C. Lenz, J. Wick, F. Blei, D. Hoffmeister: Production Options for Psilocybin: Making of the Magic. Chemistry. '''2019''', 25(4), 897–903.</ref>
.
== '''Magi. Coli''' ==
V naravi se psilocibin sintetizira po poti, kjer delujejo štirje različni encimi. Ekipa, ki se je lotila projekta je želela klonirati to pot v ''E.coli'', da bi zmanjšali stroške proizvodnje, hkrati pa sintetizirali večje količine psilocibina. Tako bi lažje omogočili raziskave in potrebe po zdravljenju duševnih motenj. Njihov cilj je bil oblikovati sistem, ki bo sposoben sintetizirati psilocibin z uporabo genov psiD, psiH, psiK, psiM, ki jih najdemo v biosintetski poti ''Psilocybe cubensis''. To je vključevalo vnos genov psiD, psiK in psiM v en plazmid, pri čemer ima vsak svoj RBS, vse pa je pod nadzorom enega močnega promotorja. Gen psiH je bil vključen v drug plazmid, da bi bil sočasno izražen z drugimi geni. Po pridobljenem sistemu Magi.Coli so ga želeli še izboljšati, ter z njim povečati sintezo psilocibina. To bi dosegli s povečano sintezo funkcionalnih Psi proteinov v E.coli. Želeli so optimizirati kodone, da bi izboljšali sintezo funkcionalnih proteinov zlasti PsiH. To so poskušali na fluorescenčnem proteinu VVD iz glive ''Neurospora crassa''.

=== Izvedba eksperimentov ===
==== Izražanje genov psiK, psiD in psiM v posameznih konstruktih ====
Prvi uspešen korak je bil kloniranje psiK ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3140002 BBa_K3140002]), psiD ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3140000 BBa_K3140000]) in psiM ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3140003 BBa_K31440003]) genov v plazmidu pET28. Z ustreznimi restriktazami so rezali pET28 plazmide, da so vstavili posamezen gen in ligirali. Celice ''E.coli'' BL21 [DE3] so transformirali s plazmidom. Celične lizate so nanesli na SDS-PAGE, da so preverili ustrezno velikost sintetiziranih proteinov. Pokazalo se je, da so bili proteini ob določenih pogojih izražanja netopni. Idejo za optimizacijo so dobili s pomočjo drugega iGEM projekta. Odločili so se, da oblikujejo plazmid pET28 z dodatnim plazmidom pGro7, ki kodira kompleks groES-groEL. Proteine so očistili s pomočjo afinitetne kromatografije z nikljem. Funkcionalnosti vzorcev so preverili s pomočjo kvalitativnega testa LCMS. Podatki so pokazali katalitično aktivnost PsiD in PsiK.

==== Sestavljanje genskega grozda (gene cluster) psiK, psiD, psiM ====
Cilj je bil vse tri gene psiK, psiD in psiM iz psilocibinske encimske poti vstaviti v plazmid pU250, kar so naredili s pomočjo Golden Gate. Vse skupaj so transformirali v celice ''E.coli'' DH5α s pGro7. Gojili so veliko kulture in inducirali sintezo proteinov s pomočjo kumata. Sledila je suspenzija celic ter inkubacija s stresanjem. Supernatant so očistili in identificirali produkte presnove z LCMS. Čeprav so dokazali aktivnost encimov v poti, niso mogli dokazati proizvodnje psilocibina. Predpostavka je bila, da ni prišlo do zadostne sinteze Baeocistina. Zato so se osredotočili za optimizacijo pogojev za sintezo proteinov. Za optimizacijo je bilo več možnosti: optimizacija medija, pogojev in uporabe proteina, uporaba PCR, ki je nagnjen k napakam, ter izboljšanje fenotipa proizvedenih proteinov.

==== Izražanje in karakterizacija PsiH encima ====
V tem delu projekta so želeli izraziti in opisati aktivnost PsiH encima, ter encima P450 monooksigenaze, preden so ga vnesli v enocelični sistem. Človeški gen p450 so izrezali iz pCW plazmida, katerega so nato ponovno združili skupaj. Tako so dobili na novo skonstruiran plazmid pUS381. Prav tako so na novo skonstruirali plazmid pUS382 ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3140001 BBa_K3140001]), ki je vseboval psiH divjega tipa iz Psilocybe cubensis in plazmid pUS383 ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3140004 BBa_K3140004]), ki vsebuje IDT kodon. S pomočjo sekvenciranja po Sangerju so ugotovili, da je pri plazmidu pUS383 prišlo do izbrisa posameznega nukleotida na začetku gena, ki je optimiziran za kodon psiH, posledica tega je mutacija in premik bralnega okvirja. Da so potrdili, če se protein lahko izrazi v ''E.coli'' so gojili kulture celic, ki so vsebovale plazmide pUS381, pUS382 in pUS383. S pomočjo SDS-PAGE so ugotovili, da je encim PsiH prisoten v pUS382, pUS383. Izvedli so testiranje ali lahko PsiH katalizira reakcijo oksidacijo triptamina do 4-hidroksitriptamina, ki poteka tudi v biosintezni poti psilocibina. Rezultate LCMS je bilo težko analizirati. Ugotovili so, da je možno spodbuditi celice ''E.coli'' za izražanje PsiH. Predvidevajo, da bi prihodnje usmeritve PsiH mogle biti usmerjene v prilagoditev zaporedja gena za boljšo ekspresijo v ''E. coli''. To bi se lahko doseglo s spremembo N-terminala gena in poskusi različnih načinov usklajevanja in optimizacije.

==== Nastanek dvoplazmidnega sistema ====
S tem, ko so vstavili dva plazmida v iste celice, je bila ustvarjena celotna pot iz gob v ''E.coli''. Transformirali so celice ''E.coli'' DH5α s pGro7 s pUS382 in pUS387, to so imenovali Magi.coli – sistem z vsemi divjimi tipi psi genov. Gojili so kulture dvoplazmidnih celic v TB mediju, inducirali proizvodnjo proteinov GROES in GROEL iz pGro7 z arabinozo do srednje dolge faze. PUS382 so inducirali z IPTG in pUS387 s kumatom. Sledili so protokolu in vzorce supernatanta analizirali z LCMS analizo, da so preverili prisotnost intermediatov na poti.

==== Gojenje ====
Namen tega dela je bil raziskati in primerjati rast v dveh ločenih sistemih. V fermentorju so bili rezultati veliko boljši, saj je bilo število celic na liter gojene kulture v fermentorju večje, kot v laboratorijski kulturi. V nadaljevanju so si zato želeli optimizirati Magi.Coli za izražanje v fermentorju.

=== Optimizacija ===
==== Optimizacija kodonov ====
Želeli so določiti katera vrsta optimizacije kodona bo izboljšala izražanje proteina VVD v primerjavi z divjim tipom kodona ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3140006 BBa_K3140006], [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3140007 BBa_K3140007],[http://parts.igem.org/Part:BBa_K3140008 BBa_K3140008], [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3140009 BBa_K3140009]). Optimizacijo bi uporabili za usklajevanje kodonov psi genov za izboljšanje izražanja. Ugotovili so, da optimizacija kodona morda ni najučinkovitejša metoda za izboljšanje aktivnosti teh fluorescenčnih proteinov.

==== PCR nagnjen k napakam ====
S pomočjo PCR, ki je nagnjen k napakam, so želeli ustvariti bolj fluorescenčno različico šibko fluorescenčnega proteina VVD. Rezultati sekvenciranja teh VVD genov iz svetlih kolonij so pokazali, da je bila pri večini genov skupna mutacija. Ta mutacija je metionin v ostanku 130 spremenila v izolevcin, treonin ali levcin, izboljšala se je fluorescenca proteina ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3140010 BBa_K31440010]).

== '''Zaključek''' ==
Ekipa iz Sydneya je dokazala, da dve od štirih komponent njihovega sistema delujeta po pričakovanjih v in vivo pogojih. Ko so klonirali gene psiD, psiK, psiM in psiH v ''E.coli'' so ugotovili, da pride do ustrezne pretvorbe substrata v 3 od 5 korakov v biosintetski poti. Rezultati kažejo, da je sistem Magi.Coli obetaven, ekipa pa še naprej dela na izboljšavah tega sistema.

== '''Viri''' ==

<references/>

Magi.Coli: sinteza psilocibina s pomočjo E.coli

2020-04-13T13:14:33Z

Luka Lavrič:

Magi.Coli <ref> iGEM 2019 team Sydney. Magi.Coli. 21. 10. 2019. [citirano dne 11. 04. 2020] https://2019.igem.org/Team:Sydney_Australia </ref> je študentski projekt, ki ga je predstavila ekipa Sydney iz Avstralije na tekmovanju iGEM 2019. Želja in cilj ekipe je, da bi v prihodnosti bile raziskave in zdravljenje s pomočjo psilocibina stroškovno in tudi količinsko ugodne, kar bi lahko dosegli z in vivo sintezo v ''E.coli''.

== '''Zdravljenje duševnih motenj''' ==
Depresija je najpogostejša duševna bolezen, ki se lahko pojavi na različne načine in prizadane od 8-10 % populacije. Poleg depresije, sta pogosti duševni bolezni tudi anksioznost in obsesivno kompulzivna motnja. V eni izmed raziskav, kjer so v veliki meri pozdravili prisotnost duševnih motenj, so to dosegli z zdravilom, ki ima zelo velik potencial. Uporabili so psilocibin. Vsi bolniki so dobro prenašali psilocibin, hkrati pa ni prišlo do resnih ali nepričakovanih neželenih učinkov. Zmeren odmerek tega naravnega zdravila je pokazal, da je v 3 mesecih 8 od 12 udeležencev izpolnilo merila za popolno remisijo. Ugotovljeno je tudi, da ima psilocibin zelo nizek potencial za zlorabo in naj ne bi povzročal zasvojenosti <ref> R. L. Carhart-Harris, M. Bolstridge, J. Rucker, C. M. Day, D. Erritzoe, M. Kaelen, M. Bloomfield, J. A. Rickard, B. Forbes, A. Feilding, D. Taylor: Psilocybin with psychological support for treatment-resistant depression: an open-label feasibility study. The Lancet Psychiatry. 2016, 3(7), 619–627. </ref>.
=== Psilocibin ===
Psilocibin je psihedelična spojina, ki je sintetizirana iz triptofana in je produkt različnih gob iz rodu ''Psilocybe''. Medsebojno gobe razlikujemo po velikosti, obliki in učinkovitosti. Večina jih raste na območju ZDA. Gobe so že od sedemdesetih let ilegalne v večini držav po svetu, posledica pa je pomanjkanje raziskav s to spojino. Vseeno so znanstveniki kalili ideje, kako bi sintetizirali psilocibin v namene zdravljenja duševnih motenj. Psilocibin so sintetizirali s pomočjo organske sinteze, vendar pa je naslednji problem predstavljala cena, saj je sinteza enega grama znašala 2000 dolarjev <ref> J. Fricke, F. Blei, D. Hoffmeister: Enzymatic synthesis of psilocybin. Angew. Chemi. Int. Ed. Engl. 2017, 56(40), 12352–12355. </ref> <ref> J. Fricke, C. Lenz, J. Wick, F. Blei, D. Hoffmeister: Production Options for Psilocybin: Making of the Magic. Chemistry. 2019, 25(4), 897–903.</ref>
.
== '''Magi. Coli''' ==
V naravi se psilocibin sintetizira po poti, kjer delujejo štirje različni encimi. Ekipa, ki se je lotila projekta je želela klonirati to pot v ''E.coli'', da bi zmanjšali stroške proizvodnje, hkrati pa sintetizirali večje količine psilocibina. Tako bi lažje omogočili raziskave in potrebe po zdravljenju duševnih motenj. Njihov cilj je bil oblikovati sistem, ki bo sposoben sintetizirati psilocibin z uporabo genov psiD, psiH, psiK, psiM, ki jih najdemo v biosintetski poti ''Psilocybe cubensis''. To je vključevalo vnos genov psiD, psiK in psiM v en plazmid, pri čemer ima vsak svoj RBS, vse pa je pod nadzorom enega močnega promotorja. Gen psiH je bil vključen v drug plazmid, da bi bil sočasno izražen z drugimi geni. Po pridobljenem sistemu Magi.Coli so ga želeli še izboljšati, ter z njim povečati sintezo psilocibina. To bi dosegli s povečano sintezo funkcionalnih Psi proteinov v E.coli. Želeli so optimizirati kodone, da bi izboljšali sintezo funkcionalnih proteinov zlasti PsiH. To so poskušali na fluorescenčnem proteinu VVD iz glive ''Neurospora crassa''.

=== Izvedba eksperimentov ===
==== Izražanje genov psiK, psiD in psiM v posameznih konstruktih ====
Prvi uspešen korak je bil kloniranje psiK ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3140002 BBa_K3140002]), psiD ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3140000 BBa_K3140000]) in psiM ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3140003 BBa_K31440003]) genov v plazmidu pET28. Z ustreznimi restriktazami so rezali pET28 plazmide, da so vstavili posamezen gen in ligirali. Celice ''E.coli'' BL21 [DE3] so transformirali s plazmidom. Celične lizate so nanesli na SDS-PAGE, da so preverili ustrezno velikost sintetiziranih proteinov. Pokazalo se je, da so bili proteini ob določenih pogojih izražanja netopni. Idejo za optimizacijo so dobili s pomočjo drugega iGEM projekta. Odločili so se, da oblikujejo plazmid pET28 z dodatnim plazmidom pGro7, ki kodira kompleks groES-groEL. Proteine so očistili s pomočjo afinitetne kromatografije z nikljem. Funkcionalnosti vzorcev so preverili s pomočjo kvalitativnega testa LCMS. Podatki so pokazali katalitično aktivnost PsiD in PsiK.

==== Sestavljanje genskega grozda (gene cluster) psiK, psiD, psiM ====
Cilj je bil vse tri gene psiK, psiD in psiM iz psilocibinske encimske poti vstaviti v plazmid pU250, kar so naredili s pomočjo Golden Gate. Vse skupaj so transformirali v celice ''E.coli'' DH5α s pGro7. Gojili so veliko kulture in inducirali sintezo proteinov s pomočjo kumata. Sledila je suspenzija celic ter inkubacija s stresanjem. Supernatant so očistili in identificirali produkte presnove z LCMS. Čeprav so dokazali aktivnost encimov v poti, niso mogli dokazati proizvodnje psilocibina. Predpostavka je bila, da ni prišlo do zadostne sinteze Baeocistina. Zato so se osredotočili za optimizacijo pogojev za sintezo proteinov. Za optimizacijo je bilo več možnosti: optimizacija medija, pogojev in uporabe proteina, uporaba PCR, ki je nagnjen k napakam, ter izboljšanje fenotipa proizvedenih proteinov.

==== Izražanje in karakterizacija PsiH encima ====
V tem delu projekta so želeli izraziti in opisati aktivnost PsiH encima, ter encima P450 monooksigenaze, preden so ga vnesli v enocelični sistem. Človeški gen p450 so izrezali iz pCW plazmida, katerega so nato ponovno združili skupaj. Tako so dobili na novo skonstruiran plazmid pUS381. Prav tako so na novo skonstruirali plazmid pUS382 ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3140001 BBa_K3140001]), ki je vseboval psiH divjega tipa iz Psilocybe cubensis in plazmid pUS383 ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3140004 BBa_K3140004]), ki vsebuje IDT kodon. S pomočjo sekvenciranja po Sangerju so ugotovili, da je pri plazmidu pUS383 prišlo do izbrisa posameznega nukleotida na začetku gena, ki je optimiziran za kodon psiH, posledica tega je mutacija in premik bralnega okvirja. Da so potrdili, če se protein lahko izrazi v ''E.coli'' so gojili kulture celic, ki so vsebovale plazmide pUS381, pUS382 in pUS383. S pomočjo SDS-PAGE so ugotovili, da je encim PsiH prisoten v pUS382, pUS383. Izvedli so testiranje ali lahko PsiH katalizira reakcijo oksidacijo triptamina do 4-hidroksitriptamina, ki poteka tudi v biosintezni poti psilocibina. Rezultate LCMS je bilo težko analizirati. Ugotovili so, da je možno spodbuditi celice ''E.coli'' za izražanje PsiH. Predvidevajo, da bi prihodnje usmeritve PsiH mogle biti usmerjene v prilagoditev zaporedja gena za boljšo ekspresijo v ''E. coli''. To bi se lahko doseglo s spremembo N-terminala gena in poskusi različnih načinov usklajevanja in optimizacije.

==== Nastanek dvoplazmidnega sistema ====
S tem, ko so vstavili dva plazmida v iste celice, je bila ustvarjena celotna pot iz gob v ''E.coli''. Transformirali so celice ''E.coli'' DH5α s pGro7 s pUS382 in pUS387, to so imenovali Magi.coli – sistem z vsemi divjimi tipi psi genov. Gojili so kulture dvoplazmidnih celic v TB mediju, inducirali proizvodnjo proteinov GROES in GROEL iz pGro7 z arabinozo do srednje dolge faze. PUS382 so inducirali z IPTG in pUS387 s kumatom. Sledili so protokolu in vzorce supernatanta analizirali z LCMS analizo, da so preverili prisotnost intermediatov na poti.

==== Gojenje ====
Namen tega dela je bil raziskati in primerjati rast v dveh ločenih sistemih. V fermentorju so bili rezultati veliko boljši, saj je bilo število celic na liter gojene kulture v fermentorju večje, kot v laboratorijski kulturi. V nadaljevanju so si zato želeli optimizirati Magi.Coli za izražanje v fermentorju.

=== Optimizacija ===
==== Optimizacija kodonov ====
Želeli so določiti katera vrsta optimizacije kodona bo izboljšala izražanje proteina VVD v primerjavi z divjim tipom kodona ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3140006 BBa_K3140006], [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3140007 BBa_K3140007],[http://parts.igem.org/Part:BBa_K3140008 BBa_K3140008], [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3140009 BBa_K3140009]). Optimizacijo bi uporabili za usklajevanje kodonov psi genov za izboljšanje izražanja. Ugotovili so, da optimizacija kodona morda ni najučinkovitejša metoda za izboljšanje aktivnosti teh fluorescenčnih proteinov.

==== PCR nagnjen k napakam ====
S pomočjo PCR, ki je nagnjen k napakam, so želeli ustvariti bolj fluorescenčno različico šibko fluorescenčnega proteina VVD. Rezultati sekvenciranja teh VVD genov iz svetlih kolonij so pokazali, da je bila pri večini genov skupna mutacija. Ta mutacija je metionin v ostanku 130 spremenila v izolevcin, treonin ali levcin, izboljšala se je fluorescenca proteina ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3140010 BBa_K31440010]).

== '''Zaključek''' ==
Ekipa iz Sydneya je dokazala, da dve od štirih komponent njihovega sistema delujeta po pričakovanjih v in vivo pogojih. Ko so klonirali gene psiD, psiK, psiM in psiH v ''E.coli'' so ugotovili, da pride do ustrezne pretvorbe substrata v 3 od 5 korakov v biosintetski poti. Rezultati kažejo, da je sistem Magi.Coli obetaven, ekipa pa še naprej dela na izboljšavah tega sistema.

== '''Viri''' ==

<references/>

Magi.Coli: sinteza psilocibina s pomočjo E.coli

2020-04-13T13:12:01Z

Luka Lavrič:

Magi.Coli <ref> iGEM 2019 team Sydney. Magi.Coli. 21. 10. 2019. [citirano dne 11. 04. 2020] https://2019.igem.org/Team:Sydney_Australia </ref> je študentski projekt, ki ga je predstavila ekipa Sydney iz Avstralije na tekmovanju iGEM 2019. Želja in cilj ekipe je, da bi v prihodnosti bile raziskave in zdravljenje s pomočjo psilocibina stroškovno in tudi količinsko ugodne, kar bi lahko dosegli z in vivo sintezo v ''E.coli''.

== '''Zdravljenje duševnih motenj''' ==
Depresija je najpogostejša duševna bolezen, ki se lahko pojavi na različne načine in prizadane od 8-10 % populacije. Poleg depresije, sta pogosti duševni bolezni tudi anksioznost in obsesivno kompulzivna motnja. V eni izmed raziskav, kjer so v veliki meri pozdravili prisotnost duševnih motenj, so to dosegli z zdravilom, ki ima zelo velik potencial. Uporabili so psilocibin. Vsi bolniki so dobro prenašali psilocibin, hkrati pa ni prišlo do resnih ali nepričakovanih neželenih učinkov. Zmeren odmerek tega naravnega zdravila je pokazal, da je v 3 mesecih 8 od 12 udeležencev izpolnilo merila za popolno remisijo. Ugotovljeno je tudi, da ima psilocibin zelo nizek potencial za zlorabo in naj ne bi povzročal zasvojenosti <ref> R. L. Carhart-Harris, M. Bolstridge, J. Rucker, C. M. Day, D. Erritzoe, M. Kaelen, M. Bloomfield, J. A. Rickard, B. Forbes, A. Feilding, D. Taylor: Psilocybin with psychological support for treatment-resistant depression: an open-label feasibility study. The Lancet Psychiatry. 2016, 3(7), 619–627. </ref>.
=== Psilocibin ===
Psilocibin je psihedelična spojina, ki je sintetizirana iz triptofana in je produkt različnih gob iz rodu ''Psilocybe''. Medsebojno gobe razlikujemo po velikosti, obliki in učinkovitosti. Večina jih raste na območju ZDA. Gobe so že od sedemdesetih let ilegalne v večini držav po svetu, posledica pa je pomanjkanje raziskav s to spojino. Vseeno so znanstveniki kalili ideje, kako bi sintetizirali psilocibin v namene zdravljenja duševnih motenj. Psilocibin so sintetizirali s pomočjo organske sinteze, vendar pa je naslednji problem predstavljala cena, saj je sinteza enega grama znašala 2000 dolarjev <ref> J. Fricke, F. Blei, D. Hoffmeister: Enzymatic synthesis of psilocybin. Angew. Chemi. Int. Ed. Engl. 2017, 56(40), 12352–12355. </ref> <ref> J. Fricke, C. Lenz, J. Wick, F. Blei, D. Hoffmeister: Production Options for Psilocybin: Making of the Magic. Chemistry. 2019, 25(4), 897–903.</ref>
.
== '''Magi. Coli''' ==
V naravi se psilocibin sintetizira po poti, kjer delujejo štirje različni encimi. Ekipa, ki se je lotila projekta je želela klonirati to pot v ''E.coli'', da bi zmanjšali stroške proizvodnje, hkrati pa sintetizirali večje količine psilocibina. Tako bi lažje omogočili raziskave in potrebe po zdravljenju duševnih motenj. Njihov cilj je bil oblikovati sistem, ki bo sposoben sintetizirati psilocibin z uporabo genov psiD, psiH, psiK, psiM, ki jih najdemo v biosintetski poti ''Psilocybe cubensis''. To je vključevalo vnos genov psiD, psiK in psiM v en plazmid, pri čemer ima vsak svoj RBS, vse pa je pod nadzorom enega močnega promotorja. Gen psiH je bil vključen v drug plazmid, da bi bil sočasno izražen z drugimi geni. Po pridobljenem sistemu Magi.Coli so ga želeli še izboljšati, ter z njim povečati sintezo psilocibina. To bi dosegli s povečano sintezo funkcionalnih Psi proteinov v E.coli. Želeli so optimizirati kodone, da bi izboljšali sintezo funkcionalnih proteinov zlasti PsiH. To so poskušali na fluorescenčnem proteinu VVD iz glive ''Neurospora crassa''.

=== Izvedba eksperimentov ===
==== Izražanje genov psiK, psiD in psiM v posameznih konstruktih ====
Prvi uspešen korak je bil kloniranje psiK ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3140002 BBa_K3140002]), psiD ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3140000 BBa_K3140000]) in psiM ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3140003 BBa_K31440003]) genov v plazmidu pET28. Z ustreznimi restriktazami so rezali pET28 plazmide, da so vstavili posamezen gen in ligirali. Celice ''E.coli'' BL21 [DE3] so transformirali s plazmidom. Celične lizate so nanesli na SDS-PAGE, da so preverili ustrezno velikost sintetiziranih proteinov. Pokazalo se je, da so bili proteini ob določenih pogojih izražanja netopni. Idejo za optimizacijo so dobili s pomočjo drugega iGEM projekta. Odločili so se, da oblikujejo plazmid pET28 z dodatnim plazmidom pGro7, ki kodira kompleks groES-groEL. Proteine so očistili s pomočjo afinitetne kromatografije z nikljem. Funkcionalnosti vzorcev so preverili s pomočjo kvalitativnega testa LCMS. Podatki so pokazali katalitično aktivnost PsiD in PsiK.

==== Sestavljanje genskega grozda (gene cluster) psiK, psiD, psiM ====
Cilj je bil vse tri gene psiK, psiD in psiM iz psilocibinske encimske poti vstaviti v plazmid pU250, kar so naredili s pomočjo Golden Gate. Vse skupaj so transformirali v celice ''E.coli'' DH5α s pGro7. Gojili so veliko kulture in inducirali sintezo proteinov s pomočjo kumata. Sledila je suspenzija celic ter inkubacija s stresanjem. Supernatant so očistili in identificirali produkte presnove z LCMS. Čeprav so dokazali aktivnost encimov v poti, niso mogli dokazati proizvodnje psilocibina. Predpostavka je bila, da ni prišlo do zadostne sinteze Baeocistina. Zato so se osredotočili za optimizacijo pogojev za sintezo proteinov. Za optimizacijo je bilo več možnosti: optimizacija medija, pogojev in uporabe proteina, uporaba PCR, ki je nagnjen k napakam, ter izboljšanje fenotipa proizvedenih proteinov.

==== Izražanje in karakterizacija PsiH encima ====
V tem delu projekta so želeli izraziti in opisati aktivnost PsiH encima, ter encima P450 monooksigenaze, preden so ga vnesli v enocelični sistem. Človeški gen p450 so izrezali iz pCW plazmida, katerega so nato ponovno združili skupaj. Tako so dobili na novo skonstruiran plazmid pUS381. Prav tako so na novo skonstruirali plazmid pUS382 ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3140001 BBa_K3140001]), ki je vseboval psiH divjega tipa iz Psilocybe cubensis in plazmid pUS383 ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3140004 BBa_K3140004]), ki vsebuje IDT kodon. S pomočjo sekvenciranja po Sangerju so ugotovili, da je pri plazmidu pUS383 prišlo do izbrisa posameznega nukleotida na začetku gena, ki je optimiziran za kodon psiH, posledica tega je mutacija in premik bralnega okvirja. Da so potrdili, če se protein lahko izrazi v ''E.coli'' so gojili kulture celic, ki so vsebovale plazmide pUS381, pUS382 in pUS383. S pomočjo SDS-PAGE so ugotovili, da je encim PsiH prisoten v pUS382, pUS383. Izvedli so testiranje ali lahko PsiH katalizira reakcijo oksidacijo triptamina do 4-hidroksitriptamina, ki poteka tudi v biosintezni poti psilocibina. Rezultate LCMS je bilo težko analizirati. Ugotovili so, da je možno spodbuditi celice ''E.coli'' za izražanje PsiH. Predvidevajo, da bi prihodnje usmeritve PsiH mogle biti usmerjene v prilagoditev zaporedja gena za boljšo ekspresijo v ''E. coli''. To bi se lahko doseglo s spremembo N-terminala gena in poskusi različnih načinov usklajevanja in optimizacije.

==== Nastanek dvoplazmidnega sistema ====
S tem, ko so vstavili dva plazmida v iste celice, je bila ustvarjena celotna pot iz gob v ''E.coli''. Transformirali so celice ''E.coli'' DH5α s pGro7 s pUS382 in pUS387, to so imenovali Magi.coli – sistem z vsemi divjimi tipi psi genov. Gojili so kulture dvoplazmidnih celic v TB mediju, inducirali proizvodnjo proteinov GROES in GROEL iz pGro7 z arabinozo do srednje dolge faze. PUS382 so inducirali z IPTG in pUS387 s kumatom. Sledili so protokolu in vzorce supernatanta analizirali z LCMS analizo, da so preverili prisotnost intermediatov na poti.

==== Gojenje ====
Namen tega dela je bil raziskati in primerjati rast v dveh ločenih sistemih. V fermentorju so bili rezultati veliko boljši, saj je bilo število celic na liter gojene kulture v fermentorju večje, kot v laboratorijski kulturi. V nadaljevanju so si zato želeli optimizirati Magi.Coli za izražanje v fermentorju.

=== Optimizacija ===
==== Optimizacija kodonov ====
Želeli so določiti katera vrsta optimizacije kodona bo izboljšala izražanje proteina VVD v primerjavi z divjim tipom kodona ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3140006 BBa_K3140006], [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3140007 BBa_K3140007],[http://parts.igem.org/Part:BBa_K3140008 BBa_K3140008], [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3140009 BBa_K3140009]). Optimizacijo bi uporabili za usklajevanje kodonov psi genov za izboljšanje izražanja. Ugotovili so, da optimizacija kodona morda ni najučinkovitejša metoda za izboljšanje aktivnosti teh fluorescenčnih proteinov.

==== PCR nagnjen k napakam ====
S pomočjo PCR, ki je nagnjen k napakam, so želeli ustvariti bolj fluorescenčno različico šibko fluorescenčnega proteina VVD. Rezultati sekvenciranja teh VVD genov iz svetlih kolonij so pokazali, da je bila pri večini genov skupna mutacija. Ta mutacija je metionin v ostanku 130 spremenila v izolevcin, treonin ali levcin, izboljšala se je fluorescenca proteina ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3140010 BBa_K31440010]).

== '''Zaključek''' ==
Ekipa iz Sydneya je dokazala, da dve od štirih komponent njihovega sistema delujeta po pričakovanjih v in vivo pogojih. Ko so klonirali gene psiD, psiK, psiM in psiH v ''E.coli'' so ugotovili, da pride do ustrezne pretvorbe substrata v 3 od 5 korakov v biosintetski poti. Rezultati kažejo, da je sistem Magi.Coli obetaven, ekipa pa še naprej dela na izboljšavah tega sistema.

Magi.Coli: sinteza psilocibina s pomočjo E.coli

2020-04-13T13:07:05Z

Luka Lavrič: New page: Magi.Coli <ref> iGEM 2019 team Sydney. Magi.Coli. 21. 10. 2019. [citirano dne 11. 04. 2020] https://2019.igem.org/Team:Sydney_Australia </ref> je študentski projekt, ki ga je predstavila ...

Magi.Coli <ref> iGEM 2019 team Sydney. Magi.Coli. 21. 10. 2019. [citirano dne 11. 04. 2020] https://2019.igem.org/Team:Sydney_Australia </ref> je študentski projekt, ki ga je predstavila ekipa Sydney iz Avstralije na tekmovanju iGEM 2019. Želja in cilj ekipe je, da bi v prihodnosti bile raziskave in zdravljenje s pomočjo psilocibina stroškovno in tudi količinsko ugodne, kar bi lahko dosegli z in vivo sintezo v ''E.coli''.

== '''Zdravljenje duševnih motenj''' ==
Depresija je najpogostejša duševna bolezen, ki se lahko pojavi na različne načine in prizadane od 8-10 % populacije. Poleg depresije, sta pogosti duševni bolezni tudi anksioznost in obsesivno kompulzivna motnja. V eni izmed raziskav, kjer so v veliki meri pozdravili prisotnost duševnih motenj, so to dosegli z zdravilom, ki ima zelo velik potencial. Uporabili so psilocibin. Vsi bolniki so dobro prenašali psilocibin, hkrati pa ni prišlo do resnih ali nepričakovanih neželenih učinkov. Zmeren odmerek tega naravnega zdravila je pokazal, da je v 3 mesecih 8 od 12 udeležencev izpolnilo merila za popolno remisijo. Ugotovljeno je tudi, da ima psilocibin zelo nizek potencial za zlorabo in naj ne bi povzročal zasvojenosti <ref> R. L. Carhart-Harris, M. Bolstridge, J. Rucker, C. M. Day, D. Erritzoe, M. Kaelen, M. Bloomfield, J. A. Rickard, B. Forbes, A. Feilding, D. Taylor: Psilocybin with psychological support for treatment-resistant depression: an open-label feasibility study. The Lancet Psychiatry. 2016, 3(7), 619–627. </ref>.
=== Psilocibin ===
Psilocibin je psihedelična spojina, ki je sintetizirana iz triptofana in je produkt različnih gob iz rodu ''Psilocybe''. Medsebojno gobe razlikujemo po velikosti, obliki in učinkovitosti. Večina jih raste na območju ZDA. Gobe so že od sedemdesetih let ilegalne v večini držav po svetu, posledica pa je pomanjkanje raziskav s to spojino. Vseeno so znanstveniki kalili ideje, kako bi sintetizirali psilocibin v namene zdravljenja duševnih motenj. Psilocibin so sintetizirali s pomočjo organske sinteze, vendar pa je naslednji problem predstavljala cena, saj je sinteza enega grama znašala 2000 dolarjev <ref> J. Fricke, F. Blei, D. Hoffmeister: Enzymatic synthesis of psilocybin. Angew. Chemi. Int. Ed. Engl. 2017, 56(40), 12352–12355. </ref> <ref> J. Fricke, C. Lenz, J. Wick, F. Blei, D. Hoffmeister: Production Options for Psilocybin: Making of the Magic. Chemistry. 2019, 25(4), 897–903.</ref>
.
== '''Magi. Coli''' ==
V naravi se psilocibin sintetizira po poti, kjer delujejo štirje različni encimi. Ekipa, ki se je lotila projekta je želela klonirati to pot v ''E.coli'', da bi zmanjšali stroške proizvodnje, hkrati pa sintetizirali večje količine psilocibina. Tako bi lažje omogočili raziskave in potrebe po zdravljenju duševnih motenj. Njihov cilj je bil oblikovati sistem, ki bo sposoben sintetizirati psilocibin z uporabo genov psiD, psiH, psiK, psiM, ki jih najdemo v biosintetski poti ''Psilocybe cubensis''. To je vključevalo vnos genov psiD, psiK in psiM v en plazmid, pri čemer ima vsak svoj RBS, vse pa je pod nadzorom enega močnega promotorja. Gen psiH je bil vključen v drug plazmid, da bi bil sočasno izražen z drugimi geni. Po pridobljenem sistemu Magi.Coli so ga želeli še izboljšati, ter z njim povečati sintezo psilocibina. To bi dosegli s povečano sintezo funkcionalnih Psi proteinov v E.coli. Želeli so optimizirati kodone, da bi izboljšali sintezo funkcionalnih proteinov zlasti PsiH. To so poskušali na fluorescenčnem proteinu VVD iz glive ''Neurospora crassa''.
=== Priprava za eksperimente ===
==== Deli psi ====
Sekvence za vse psi gene divjega tipa so pregledali, da ne bi vsebovali neželenih restrikcijskih mest. Poleg teh mest so odstranili tudi kriptične promotorje in RBS mesta znotraj gena.
==== Deli VVD ====
Vsi deli VVD so temeljili na izvornem proteinu VVD iz ''Neurospora crassa''. VVD36 kodirajoče zaporedje je bilo ustvarjeno z odstranitvijo prvih 36 aminokislinskih ostankov in dodajanjem začetnega kodona. Ostanek cisteina na položaju 73 (TGC) so spremenili v alanin s spremembo kodona v GCC, s tem se je VVD spremenil v fluoroprotein. Nastal je VVD36-C73A ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3140005 BBa_K3140005]).

=== Izbor plazmidov ===

==== PsiH ekspresijski plazmid ====
Protein PsiH, ki so ga želeli izraziti iz ''Psilocybe cubensis'' je citokrom P450 monooksigenaza. Ti encimi so znani po tem, da so zelo zahtevni za funkcionalno izražanje v ''E.coli'' in pogosto zahtevajo posebne pogoje izražanja ali molekularne šaperone. Potrebujejo partnerski encim P450 reduktazo iz ''Psilocybe cubensis'', vendar P450 reduktaza ni dobro opisana in tudi ni bila izražena v E.coli. Plazmid pCW je pogosto uporabljen plazmid, ki vsebuje človeški gen P450 in gen za citokrom p450 reduktazo. Upali so, da bo ta sistem optimiziran tako, da bodo izrezali obstoječi P450 in ga nadomestili s svojim. To bi omogočilo ekspresijo proteinov PsiH skupaj z obstoječim P450 reduktaznim genom.

==== Pet28 plazmid za izražanje posameznega gena ====
Plazmid pET-28c je strogo reguliran plazmid, namenjen močnemu in nadzorovanemu izražanju vseh treh psi genov. Gene so vstavili z N-terminalno 6x His oznako, ki jim je omogočila čiščenje proteinov, ter karakterizacijo ''in vitro''.

==== Inducibilni plazmid pUS250 za »golden gate« kloniranje ====
Primeren za vstavljanje vseh treh genov psiK, psiD in psiM v en plazmid s pomočjo Golden Gate molekularnega kloniranja.
=== Izvedba eksperimentov ===
==== Izražanje genov psiK, psiD in psiM v posameznih konstruktih ====
Prvi uspešen korak je bil kloniranje psiK ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3140002 BBa_K3140002]), psiD ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3140000 BBa_K3140000]) in psiM ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3140003 BBa_K31440003]) genov v plazmidu pET28. Z ustreznimi restriktazami so rezali pET28 plazmide, da so vstavili posamezen gen in ligirali. Celice ''E.coli'' BL21 [DE3] so transformirali s plazmidom. Celične lizate so nanesli na SDS-PAGE, da so preverili ustrezno velikost sintetiziranih proteinov. Pokazalo se je, da so bili proteini ob določenih pogojih izražanja netopni. Idejo za optimizacijo so dobili s pomočjo drugega iGEM projekta. Odločili so se, da oblikujejo plazmid pET28 z dodatnim plazmidom pGro7, ki kodira kompleks groES-groEL. Proteine so očistili s pomočjo afinitetne kromatografije z nikljem. Funkcionalnosti vzorcev so preverili s pomočjo kvalitativnega testa LCMS. Podatki so pokazali katalitično aktivnost PsiD in PsiK.

==== Sestavljanje genskega grozda (gene cluster) psiK, psiD, psiM ====
Cilj je bil vse tri gene psiK, psiD in psiM iz psilocibinske encimske poti vstaviti v plazmid pU250, kar so naredili s pomočjo Golden Gate. Vse skupaj so transformirali v celice ''E.coli'' DH5α s pGro7. Gojili so veliko kulture in inducirali sintezo proteinov s pomočjo kumata. Sledila je suspenzija celic ter inkubacija s stresanjem. Supernatant so očistili in identificirali produkte presnove z LCMS. Čeprav so dokazali aktivnost encimov v poti, niso mogli dokazati proizvodnje psilocibina. Predpostavka je bila, da ni prišlo do zadostne sinteze Baeocistina. Zato so se osredotočili za optimizacijo pogojev za sintezo proteinov. Za optimizacijo je bilo več možnosti: optimizacija medija, pogojev in uporabe proteina, uporaba PCR, ki je nagnjen k napakam, ter izboljšanje fenotipa proizvedenih proteinov.

==== Izražanje in karakterizacija PsiH encima ====
V tem delu projekta so želeli izraziti in opisati aktivnost PsiH encima, ter encima P450 monooksigenaze, preden so ga vnesli v enocelični sistem. Človeški gen p450 so izrezali iz pCW plazmida, katerega so nato ponovno združili skupaj. Tako so dobili na novo skonstruiran plazmid pUS381. Prav tako so na novo skonstruirali plazmid pUS382 ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3140001 BBa_K3140001]), ki je vseboval psiH divjega tipa iz Psilocybe cubensis in plazmid pUS383 ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3140004 BBa_K3140004]), ki vsebuje IDT kodon. S pomočjo sekvenciranja po Sangerju so ugotovili, da je pri plazmidu pUS383 prišlo do izbrisa posameznega nukleotida na začetku gena, ki je optimiziran za kodon psiH, posledica tega je mutacija in premik bralnega okvirja. Da so potrdili, če se protein lahko izrazi v ''E.coli'' so gojili kulture celic, ki so vsebovale plazmide pUS381, pUS382 in pUS383. S pomočjo SDS-PAGE so ugotovili, da je encim PsiH prisoten v pUS382, pUS383. Izvedli so testiranje ali lahko PsiH katalizira reakcijo oksidacijo triptamina do 4-hidroksitriptamina, ki poteka tudi v biosintezni poti psilocibina. Rezultate LCMS je bilo težko analizirati. Ugotovili so, da je možno spodbuditi celice ''E.coli'' za izražanje PsiH. Predvidevajo, da bi prihodnje usmeritve PsiH mogle biti usmerjene v prilagoditev zaporedja gena za boljšo ekspresijo v ''E. coli''. To bi se lahko doseglo s spremembo N-terminala gena in poskusi različnih načinov usklajevanja in optimizacije.

==== Nastanek dvoplazmidnega sistema ====
S tem, ko so vstavili dva plazmida v iste celice, je bila ustvarjena celotna pot iz gob v ''E.coli''. Transformirali so celice ''E.coli'' DH5α s pGro7 s pUS382 in pUS387, to so imenovali Magi.coli – sistem z vsemi divjimi tipi psi genov. Gojili so kulture dvoplazmidnih celic v TB mediju, inducirali proizvodnjo proteinov GROES in GROEL iz pGro7 z arabinozo do srednje dolge faze. PUS382 so inducirali z IPTG in pUS387 s kumatom. Sledili so protokolu in vzorce supernatanta analizirali z LCMS analizo, da so preverili prisotnost intermediatov na poti.

==== Gojenje ====
Namen tega dela je bil raziskati in primerjati rast v dveh ločenih sistemih. V fermentorju so bili rezultati veliko boljši, saj je bilo število celic na liter gojene kulture v fermentorju večje, kot v laboratorijski kulturi. V nadaljevanju so si zato želeli optimizirati Magi.Coli za izražanje v fermentorju.

=== Optimizacija ===
==== Optimizacija kodonov ====
Želeli so določiti katera vrsta optimizacije kodona bo izboljšala izražanje proteina VVD v primerjavi z divjim tipom kodona ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3140006 BBa_K3140006], [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3140007 BBa_K3140007],[http://parts.igem.org/Part:BBa_K3140008 BBa_K3140008], [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3140009 BBa_K3140009]). Optimizacijo bi uporabili za usklajevanje kodonov psi genov za izboljšanje izražanja. Ugotovili so, da optimizacija kodona morda ni najučinkovitejša metoda za izboljšanje aktivnosti teh fluorescenčnih proteinov.

==== PCR nagnjen k napakam ====
S pomočjo PCR, ki je nagnjen k napakam, so želeli ustvariti bolj fluorescenčno različico šibko fluorescenčnega proteina VVD. Rezultati sekvenciranja teh VVD genov iz svetlih kolonij so pokazali, da je bila pri večini genov skupna mutacija. Ta mutacija je metionin v ostanku 130 spremenila v izolevcin, treonin ali levcin, izboljšala se je fluorescenca proteina ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3140010 BBa_K31440010]).

== '''Zaključek''' ==
Ekipa iz Sydneya je dokazala, da dve od štirih komponent njihovega sistema delujeta po pričakovanjih v in vivo pogojih. Ko so klonirali gene psiD, psiK, psiM in psiH v ''E.coli'' so ugotovili, da pride do ustrezne pretvorbe substrata v 3 od 5 korakov v biosintetski poti. Rezultati kažejo, da je sistem Magi.Coli obetaven, ekipa pa še naprej dela na izboljšavah tega sistema.

Seminarji SB 2019/20

2020-03-30T14:32:49Z

Luka Lavrič:

V študijskem letu 2019/20 študentje 1. letnika predstavljajo naslednje teme:

RAZISKOVALNI ČLANKI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) 

Primer: 
1 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/MoClo:_modularni_klonirni_sistem_za_standardizirano_sestavljanje_ve%C4%8Dgenskih_konstruktov MoClo: modularni klonirni sistem za standardizirano sestavljanje večgenskih konstruktov] (Valentina Levak)

NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.) 
Primer: 
1 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Phactory:_proizvodnja_bakteriofagov_za_precizno_zdravljenje Phactory: proizvodnja bakteriofagov za precizno zdravljenje] (Rok Miklavčič)

Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Povzetek je treba objaviti dva dni pred predstavitvijo do polnoči (za seminarje v sredo torej v ponedeljek). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo razprava, ki praviloma ne bo daljša od 5 minut.

----

Razpored po datumih predstavitev (pri vsakem terminu so možni največ 4 seminarji; vpišite ime in priimek pri dnevu, ko želite predstaviti seminar):

18.3. 
1 Veronika Razpotnik 
2 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Programabilni_enocelični_sesalski_bioračunalniki Programabilni enocelični sesalski bioračunalniki] (Andreja Habič) 
3 Samo Purič 
4 Jerneja Nimac 

25.3. 
1 Lana Vogrinec 
2 Peter Škrinjar 
3 Tanja Zupan 
4 Nika Testen 

1.4. 
1 Ana Obaha 
2 Benjamin Malovrh 
3 Dunia Sahir 
4 

7.4. 
1 Vesna Podgrajšek 
2 Luka Lavrič 
3 
4 

8.4. 
1 Nika Zaveršek 
2 Željka Erić 
3 Žiga Vičič 
4 

14.4. 
1 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Orodje_za_modularno_sestavljanje_večgenskih_konstruktov_v_kvasovki: Orodje za modularno sestavljanje večgenskih konstruktov v kvasovki] (Katja Doberšek) 
2 Ana Maklin 
3 Anže Jenko 
4 Patricija Miklavc 

15.4. 
1 Daria Latysheva 
2 Milica Janković 
3 Ines Medved 
4 Sara Jereb 

22.4. 
1 Jelena Štrbac 
2 Ajda Lenardič 
3 Andrej Ivanovski 
4 

6.5. 
1 Uroš Prešern 
2 Sara Korošec 
3 
4 Luka Gregorič 

13.5. 
1 Urban Hribar 
2 Tina Turel 
3 
4 Vid Modic 

20.5. 
1 Katja Malenšek 
2 Janina Gea Cvikl 
3 Maja Globočnik 
4 Primož Bembič 

27.5. Rezervni termin 
1 
2 
3 
4

BIO2 Povzetki seminarjev 2014

2015-01-23T22:02:00Z

Luka Lavrič: /* Luka Lavrič: Glikoliza - Metabolizem v možganih */

== Biokemija- Povzetki seminarjev 2014/2015 ==
Nazaj na osnovno [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Seminar_2014 stran]

=== Tadej Ulčnik: Različna dinamika in aktivnost dveh steroidnih receptorjev na istem promotorju ===

Transkripcijski faktorji so proteini, ki se specifično vežejo na DNA ter s tem omogočijo vezavo RNA polimeraze. Delujejo kot regulatorji izražanja genov. Primer transkripcijskih faktorjev so jedrni steroidni receptorji. Steroidni receptorji se nahajajo v citosolu in se aktivirajo ob vezavi steroidnih hormonov. Določeni vsebujejo med sabo podobno domeno, s katero se lahko več različnih receptorjev veže na isto zaporedje na promotorju. Še vedno ni znano kaj vse vpliva na potek translacije, tudi sami mehanizmi delovanja ostajajo še skrivnost. Primerjava aktivnosti in dinamike dveh podobnih steroidnih receptorjev, androgenega in glukokortikoidnega, ki imata v celici vlogo transkripcijskih faktorjev, je pokazala, da čeprav sta si receptorja podobna, to ne velja za njuno delovanje. Na promotorju nista bila ves čas prisotna v enaki količini, tudi količina prepisanega gena je bila različna. Ob dodatku inhibitorjev sta ta različno uspešno preprečevala transkripcijo, kar se je poznalo pri številu vezanih polimeraz in pri količini prepisanih mRNA. Za ta konkretni primer je bilo dokazano, da čeprav sta oba receptorja vplivala na izražanje gena, nista delovala na enak način in v enaki meri. Kaj vse je vplivalo na to je težko določiti, tako da to ostaja predmet nadaljnjih raziskav.

=== Dominik Dekleva: Aktivacija GPCR-jev v povezavi z vodo ===

Pomanjkljivosti do sedaj znanih metod za preučevanje proteinov, kot sta NMR- spektroskopija in rentgenska difrakcija, se kažejo, med drugim, pri preučevanju različnih proteinov in receptorjev, udeleženih v biosignalnih poti na atomarnem nivoju. Statične strukture nam ne povedo veliko o reorganizaciji vezi in dinamiki spreminjajočih se interakcij v proteinih, ki so ključne pri signalizacijskih poteh v celicah. Z uporabo nove metode, molekularnih dinamičnih (MD) simulacij, za katero stoji precej statistične matematike, lahko modele makromolekul opazujemo na atomarnem nivoju ter v mikrosekundnem časovnem oknu. Uporabnost omenjene metode se je dobro obnesla tudi v primeru švicarskih znanstvenikov iz Ecole Polytechnique Federale de Lausanne, ki so preiskovali vlogo vode pri aktivaciji treh prototipskih GPCR-jev: adenozin A2A R, β2-adrenergični receptor in rodopsin, kar bom povzel v nadaljevanju. Dokazali so, da se z vezavo liganda znotraj sedmih α-vijačnic GPCR vzpostavi urejen vodni tunel, ki močno vpliva na spremembo konformacije proteina GPCR-ja, ki se zgodi zaradi reorganizacije številnih vodikovih vezi v notranjosti proteina GPCR. Ob vezavi liganda na molekulo GPCR se torej ustvari vodni tunel v molekuli, kar omogoča nadaljnjo signalizacijo in ustrezen odziv celice na primarni sporočevalec.

=== Nuša Kelhar: Soodvisnost oblike membrane in medceličnega sporočanja ===
Celična membrana ali plazmalema je nekakšen ovoj celice, ki služi predvsem kot selektivna pregrada med celično zunanjostjo in notranjostjo. Sestavljena je iz lipidnega dvosloja in številnih proteinov, ki so povezani z membrano ali so vezani nanjo. Celične membrane se stalno spreminjajo zaradi odcepljanja in zlivanja veziklov ter zaradi interakcij z dinamičnim citoskeletom. Površina in oblika membrane močno vplivata na učinkovitost njene signalne aktivnosti. Ker reakcije pri prenosu signalov vključujejo tudi membranske komponente in vplivajo na citoskeletsko dinamiko, se s tem spreminja oblika membrane in oblika celice. Če poznamo odvisnost signalizacije od teh mehanizmov lahko že iz oblike celice napovemo, kakšne signale je prenesla ali prejela pred kratkim in prepoznamo nekatere znake nepravilnega delovanja signalnih poti, kar je pomembno pri identifikaciji rakavih celic in zdravljenju. Pomembni mehanizmi, s katerimi membrana sodeluje pri sporočanju so redukcija dimenzij, kjer se spremeni prostor gibanja delcev, ukrivljanje zaradi prostorskih gradientov receptorjev, kjer se receptorji združujejo na membranskih izboklinah in nato lateralno prehajajo, in sodelovanje s citoskeletom, ki izbokline stabilizira in omogoča, da delujejo kot nekakšna tipala. Pogledali si bomo tudi primere delovanja nekaterih načinov sporočanja med celicami in reakcije na določene signale, nekaj pa bomo povedali še o tem, kako njihovo nepravilno delovanje vpliva na razvoj rakavih celic.

=== Luka Lavrič: Glikoliza - Metabolizem v možganih ===
Da dejansko glukoza sploh pride v celico potrebujemo glukozne transporterje. Poznamo pet glukoznih transporterjev in sicer GLUT1, GLUT2, GLUT3, GLUT4 in GLUT5. Po vstopu glukoze v celico, lahko poteče glikoliza oz. metabolizem v možganih. V možganih se nahajata dve vrsti možganskih celic in sicer astrociti in nevroni. Ob prisotnosti dušikovega oksida v nevronih in astrocitih, pri miših pride do zaviranja mitohondrijskega dihanja. Pri nevronih zato pride do celične smrti, medtem ko astrociti izkoriščajo z glikolizo generiran ATP za povečanje svoje potencialne mitohondrijske membrane, s čimer so bolj odporni na pro-apoptotične dražljaje. Nevroni ne morejo povečati glikolize zaradi pomanjkanja aktivnosti encima 6-fosfofrukto-2-kinaza / fruktozo 2,6-bisfosfatno izoobliko 3 (PFKFB3). V nevronih, se PFKFB3 neprestano razgrajuje preko E3 ubikvitin ligaze, ki spodbuja kompleks/ciklosom (APC/ C) - CDH1. Do ubikvitin ligaze pridemo v treh korakih, najprej se karboksil ubikvitina veže na sulfhidrilno skupino cisteina encima E1. V drugi fazi se postopek ponovi na konjugiran encim E2. V zadnji fazi pa pride do nastanka ubivkitin ligaze E3. Proteine, namenjene za razgradnjo razgraja ubikvitin ligaza E3. Aktivnost E3 ubikvitin ligaze je v astrocitih precej nižja kot v nevronih. Metabolizem glukoze v nevronih je zato usmerjen predvsem na poti pentoza fosfatni poti, ki vodi do nastanka glutationa, ta pa je zelo pomemben za človeka.

=== Primož Tič: Primanjkljaj encima piruvat karboksilaze ===
Citratni cikel je pomemben člen metabolizma, saj njegovi intermediati vstopajo v mnoge anabolne poti. Zato so vsakršne napake v njegovem delovanju lahko usodne za organizem. Zelo pomemben encim citratnega cikla je piruvat karboksilaza, ki spremeni piruvat v oksaloacetat. Oksaloacetat je pomemben intermediat, saj lahko vstopi npr. v cikel glukoneogeneze in tako prepreči laktatno acidozo, ki je skupni simptom te metabolne okvare. Ker je cilj metabolizma proizvodnja energije v obliki molekul ATP, se celica na moteno delovanje metabolizma odzove s senzornimi proteini AMPK (''AMP-activated protein kinase''). Proteini spodbudijo katabolne procese, kjer nastajajo molekule ATP in zavirajo neesencialne anabolne procese, kjer se ATP porablja. Obratno deluje protein mTOR (''mammalian target of rapamycin''), ki spodbuja sintezo maščobnih kislin, proteinov in ogljikovih hidratov. Poznamo tri tipe bolezni: tip A, tip B in tip C. Najhujša oblika je tip B, kjer oseba umre v roku treh mesecev po rojstvu. Zaenkrat se bolezen še ne da zdraviti, jo pa lahko blažimo npr. z anaplerotično dieto. Anaplerotične reackije nadomeščajo intermediate npr. v citratnem ciklu, ko jih je malo. Anaplerotična dieta izkorišča alternativne intermediate, ki lahko zaobidejo nedelujoče encime in poteka metabolizem normalno. Tako se vsaj približno vzpostavi homeostaza celice. Primer takšnega intermediata je triglicerid triheptanoin, ki se lahko vključi v citratni cikel. V prihodnosti bi lahko takšne in podobne okvare zdravili z gensko terapijo.

=== Naida Hajdarević: Skrivnost metformina končno odkrita? ===
Metformin je eno najučinkovitejših zdravil za zdravljenje diabetesa tipa 2, saj zmanjša hepatično glukoneogenezo brez povečanja izločanja inzulina, povečanja telesne teže ali tveganja za razvoj hipoglikemije. Kljub temu, da se pacientom z diabetesom tipa 2 predpisuje že več kot pol stoletja, je njegov mehanizem delovanja prava uganka.
Raziskav na to temo je malo morje, z vsako so bili znanstveniki korak bližje odkritju skrivnosti metformina. Tako so leta 2000 v eni izmed raziskav prišli do prvega pravega zaključka: terapija z metforminom pri diabetikih zniža stopnjo proizvodnje glukoze preko inhibicije glukoneogeneze. Odgovoru, kako metformin inhibira glukoneogenezo, je bila bližje naslednja skupina raziskovalcev, ki je ugotovila, da je primarno mesto njegovega delovanja preko direktne inhibicije kompleksa I dihalne verige. Tako smo korak za korakom prišli do zadnjih raziskav, ki so mehanizem delovanja metformina razložile še natančneje – pokazale so, da metformin nekompetativno inhibira encim glicerol-3-fosfat dehidrogenazo, kar zmanjša pretvorbo laktata in glicerola ter zmanjša hepatično glukoneogenezo.

=== Marija Srnko: Fosfofruktokinaza: Posrednik med glikolitičnim pretokom in razvojem tumorja ===

Rak-bolezen sodobne družbe. V večini primerov se njegova rast prične iz neznanih vzrokov. Neznan dražljaj v telesu sproži spremembe v genih in kot posledica se pojavi nenadzorovana in hitra rast spremenjenih celic. Določen delež obolenj pa je tudi dedno pogojen. Torej se mutacija genov prenaša iz generacije v generacijo. Že samo zdrav življenjski slog pa lahko pripomore k manjšemu tveganju za njegov razvoj. S hitrejšo rastjo oziroma poliferacijo celic pa pride do sprememba v metabolizmu. Bistvena razlika v primerjavi z metabolizmom normalnih celic je povečana potreba po glukozi. Kar bi lahko povezali s povečano potrebo makromolekul, potrebnih za pospešeno rast celic. Dosedanje najučinkovitejše zdravljenje temelji na kemoterapiji. Vendar si znanstveniki prizadevajo odkritje za organizem manj škodljivih snovi in procesov zdravljenja. V dani nalogi sem se posvetila zbiranju podatkov iz raziskav, ki temeljijo na inhibiranju glikoliznih reakcij. Izpostaviti sem žele encime oz reakcija na katerih je bilo do sedaj izvedenih največ poskusov in dejansko pomujajo možnosti za razvoj pacientu prijaznejšega zdravljenja. Zanimalo me je kakšen vpliv bi imela redukcija določenih reakcij na druga tkiva. Nekaj pozornosti pa sem namenila tudi razvoju nanotehnologije, ki bo kljub odkritju mehanizma inhibicije igrala pomembno vlogo pri transportu substratov do prizadetega tkiva.

=== Vesna Podgrajšek: Mitohondrijski metabolizem je potreben za znotrajcelično rast toxoplasme gondii ===
Toxoplasma gondii je znotrajcelična pražival in povzroča bolezen toksoplazmozo. Toxoplasma gondii pospešeno raste znotraj gostiteljevih vakuol, kjer se za svojo rast in replikacijo zanaša na gostiteljev ogljik in hranila. Ena izmed oblik parazita je tahizoit, kateri so se sposobni razmnoževati in napadati v vsakršni gostiteljski celici z jedrom. Proučevali in primerjali so metabolno pot ogljika v znotrajcelični in sproščeni oz. zunajcelični stopnji parazita. Ugotovili so, da toxoplasma gondii v znotrajcelični stopnji, aktivno katabolizira gostiteljevo glukozo preko cikla citronske kisline (TCA). Te stopnje tudi katabolizirajo glutamin preko TCA cikla in poti γ-aminobuturične kisline (GABA), ki generira molekule, ki vstopijo v TCA cikel. Mehanizem preoblikovanja piruvata v acetil-CoA še obstaja nepojasnjen, saj jim manjka PDH kompleks, ki povezuje glikolizo s TCA ciklom. Kemiča inhibicija (NaFAc) TCA cikla popolnoma prepreči znotrajcelično replikacijo parazita, kar pomeni da je potrebna popolna aktivnost TCA cikla. Paraziti, ki jim manjka GABA pot, imajo zavrto rast in niso sposobni ohraniti drsno motiliteto pod razmerami, kjer so hranila omejena (npr. zunaj celice), kar nakazuje, da ima GABA funkcijo kratkotrajne rezerve energije. Zatorej ima toxoplasma gondii tahizoiti metabolno fleksebilnost, ki najverjetneje dovoljuje zajedalcem inficiranje različnih tipov celic.

=== Ernest Šprager: Vloga nekaterih proteinov tankega črevesa pri tvorbi hilomikronov ===
Z razgradnjo maščob, ki predstavljajo estre glicerola in treh maščobnih kislin, pridobimo do 40 % vse energije. Maščobne kisline se, preden vstopijo v celice tankega črevesa, protonirajo in s tem postanejo nepolarne. Kljub temu, da se jih večina absorbira kar s pasivno difuzijo, membrane celic tankega črevesa vsebuje ogromno proteinov, ki imajo zelo različne funkcije. Nekateri med njimi olajšajo pasivno difuzijo preko ohranjanja kontracijskega gradienta maščobnih kislin, spet drugi uravnavajo število in velikost hilomikronov, s katerimi se maščobe prenesejo iz tankega črevesa v kri. Za nastanek hilomikrona se morajo v lumnu endoplazemskega retikuluma s pomočjo mikrosomalnega triglicerid transfer proteina okoli apolipoproteinskega jedra povezati triacilgliceridi skupaj z fosfolipidi. Celotna pot maščob od njihove absorbcije v tankem črevesu do sprostitve iz hilomikronov je natančno regulirana. Pomembno vlogo ima protein CD36, ki med drugim deluje kot nekakšen senzor, ki sporoča celicam količino maščob v tankem črevesu. Signalizacija deluje tako, da lahko CD36, kadar je povezan k maščobno kislino, fosforilira ostale encime, ti pa nato lahko vplivajo število hilomikronov, njihovo velikost in s tem tudi količino triacilgliceridov. Prav povišana količina triacilgliceridov v krvi je povezana z kardiovaskularnimi boleznimi, odpornostjo na inzulin in debelost, zato je boljše razumevanje sprejema maščob in njihovo pakiranje v hilomikrone pomembno.

=== Katja Malovrh: Zmanjšanje aktivnosti encimov citratnega cikla s staranjem ===
Citratni cikel je niz kemijskih reakcij, ki v aerobnih organizmih potekajo v mitohondrijih. Cikel je na prvem mestu reguliran s količino piruvata, pretvorjenega v Acetil-CoA, ki vanj lahko vstopi. V nadaljevanju procesa pa pri regulaciji sodelujejo tudi številni encimi, ki pretvarjajo intermediate iz ene oblike v drugo. Tako striktna regulacija procesa je izrednega pomena, saj bi brez nje lahko prišlo do prekomerne sinteze ATP, kar bi povzročilo velike izgube energije in mnoge zdravju škodljive spremembe. Kako pa se encimi citratnega cikla spreminjajo s staranjem? Raziskovalci so ugotovili, da se škoda, povzročena s strani prostih radikalov, ki nastajajo kot stranski produkti številnih reakcij, s staranjem močno povečuje. Škodljivi radikali povzročajo poškodbe vsepovsod v celici, najobičajnejša tarča pa so mitohondriji. Mitohondrijska DNA, ki prosto plava po matriksu je zaradi nezaščitenosti dovzetna za številne napade radikalov, ki povzročajo mutacije. Pri translaciji tako dobimo napačno zaporedje na mRNA, posledično nastajajo neaktivni oziroma predrugačeni proteini, ki ne opravljajo svojih nalog. V raziskavi, so znanstveniki ugotavljali če se kateri od encimov, vključenih v citratni cikel s staranjem spremeni, kako se spremeni in kakšne škodljive posledice imajo take spremembe za živi organizem. Ugotovili so, da se encimi spremenijo, da to povzroči nepopolno delovanje citratnega cikla in posledično slabšo proizvodnjo intermediatov, ki so za celice vitalnega pomena.

=== Urška Kašnik: Transport maščobnih kislin skozi človeško placento ===
Esencialne maščobne kisline (EFA) in njihovi derivati dolgih večkrat nenasičenih verig maščobnih kislin (LCPUFA), kot sta dokosaheksaenoična kislina (DHA) in arahidonska kislina (ARA), so bistvenega pomena za pravilno rast in razvoj ploda. Vnos s hrano in presnova teh maščobnih kislin ter njihov nadaljnji prenos iz matere na plod, so zato pomembni dejavniki za razvoj plodu. Posteljica je ključni organ, prek katerega hranilne snovi, kot so prej omenjene esencialne maščobne kisline, odtekajo iz matere na plod. Celični privzem (cellular uptake) in translokacija dolgih verig maščobnih kislin (LCFAs) v različnih tkivih se doseže s povezavo soobstoječih mehanizmov. Čeprav lahko LCFA vstopi v celico s pasivno difuzijo, raziskave kažejo, da je vnos LCFA v številnih tkivih, vključno s človeško posteljico, nadzorovan z membranskimi transportnimi/vezavnimi proteini kot so maščobnokislinska translokaza (FAT/CD36), membranski protein, ki veže maščobne kisline (FABPpm), maščobnokislinski transportni protein (FATP) in znotrajcelični FABPs. Za transkripcijske faktorje, aktivirane z maščobnimi kislinami (PPARs, LXR, RXR in SREBP-1) je bilo dokazano, da regulirajo te maščobnokislinske transportne/povezovalne proteine in funkcije posteljice oz. placente. Materine maščobne kisline morda same uravnavajo svoj transport skozi posteljico, kakor tudi funkcije posteljice preko transkripcijskih faktorjev, ki jih aktivirajo maščobne kisline. V tem seminarju sem skušala opisati nedavni razvoj na področju transporta in metabolizma maščobnih kislin placente in vlogo regulacije proteinov, vključenih v te procese.

=== Tjaša Sorčan: Ketonska dopolnila zmanjšujejo preživetje tumorskih celic ===
Tumorske celice imajo zaradi genetskih mutacij in mitohondrijske disfunkcije povečano porabo glukoze. Rakave celice se zanašajo na presežek glukoze za uspešno proliferacijo in rast, a je to hkrati njihova največja pomanjkljivost, kar nam pokaže tudI Warburgov učinek. Otto Warburg, po katerem se ta učinek tudi imenuje, predvideva, da naj bi bil glavni vzrok za nastanek rakastih obolenj preklop pri nastajanja energije v obliki ATP iz aerobne kemiosmotske sklopitve v anaerobno glikolizo. Tumorske celice so nezmožne uporabiti ketonska telesa za proizvodnjo energije, zato obstaja hipoteza, da naj bi ketonska telesa zavirala rast tumorskih celic. To so skušali ugotoviti s poskusi na miših, ki so jim vbrizgali VM-M3 kulture, ki so močno metastatske ob dodatku oziroma odsotnosti beta-hidroksibutirata (ketonsko telo). Podoben poskus izvedejo tudi s štirimi mišmi, katerim so bile v hrano dodna različna ketonska dopolnila – 1,3-butadiol (BD) ali keton ester (KE). Rast tumorja so spremljali z bioluminiscenco in vivo. Merili so čas preživetja, rast tumorja, glukozo v krvi, beta-hidroksibutirat v krvi in telesno težo. Ketonska dopolnila so znižala proliferacijo in življenjsko dobo rakavih celic tudi v prisotnosti visoke koncentracije glukoze. BD in KE sta povišala življenjsko dobo miši za 51% oziroma celo 69% v miših z metastatskim rakom. Ketonska dopolnila torej zavirajo rast rakavih celic, neodvisno od koncentracije glukoze ali omejitve kalorij.

=== Bine Tršavec: Odkritja o zgradbi in delovanju glutamat dehidrogenaze ===
Glutamat dehidrogenaza (GDH) je eden izmed encimov potrebnih pri metabolizmu aminokislin. Kot nam pove ime, je njegova naloga, da dehidrogenira glutamat, kar vodi do oksidativne deaminacije glutamata v α-ketoglutarat. Brez encima ta reakcija ne bi potekala, ker je sprememba gibbsonove proste energije za reakcijo pozitivna. α-ketoglutarat se potem prenese v Krebsov cikel, kjer se na koncu pretvori v energijo v obliki ATP. Encim je prisoten pri vseh živih bitjih, saj omogoča povezavo med razgradnjo aminokislin in energijskimi potrebami celice. Zaradi različnih potreb po regulaciji obstaja več vrst tega encima. Zaradi njene naloge se glutamat dehidrogenaza pri evkariontih nahaja v mitohondrijih (kjer poteka tudi Krebsov cikel), v manjši količini pa tudi v endoplazmatskem retiklu (kjer se sintetizira). Lokacija v celici je bila dokazana z vezavo GFP-ja. V nekaterih primerih lahko predstavlja kar 10% vseh mitohondrijskih proteinov. Regulacija encima je zelo kompleksna. Nanj delujejo številni alostreični regulatorji, ki z vezavo naredijo mehanske ovire in zmanjšajo njegovo aktivnost. Najnovejše raziskave dokazujejo, da pri tem pomagajo tudi sirtuini. Dolga leta so znanstveniki preučevali natančno zgradbo in delovanje GDH, ter pri tem naleteli na kar nekaj težav. Po 50 letih raziskav tako boljše razumemo pomen in evolucijski razvoj tega pomembnega encima. V mojem seminarju sem se osredotočil na zgradbo in reguliranje encima.

=== Nina Mavec: Katabolizem triptofana in rak ===
Ker je rak v sodobnem svetu ena izmed bolezni, ki povzročijo največ smrti, se v zadnjem času izvaja vse več raziskav o samih vzrokih in mehanizmih za nastanek te nevarne bolezni v upanju, da bi s pomočjo ugotovitev lahko razvili, nove, boljše metode zdravljenja. Že nekaj časa je znano, da metabolizem triptofana vpliva na rast in maligni razvoj tumorjev, tako da oslabi imunski odziv celice. Pri katabolizmu te esencialne aminokisline je pomembna kinureninska pot, preko katere se katalizira večina triptofana, nastajajo pa razni metaboliti, med katerimi je tudi kinurenin. Obstajajo trije encimi, ki katalizirajo prvo stopnjo te reakcije, to so indolamin 2,3-dioksigenaza (IDO), triptofan 2,3-dioksigenaza (TDO) in indolamin 2,3-dioksigenaza 2 (IDO2). Ob povečanem katabolizmu triptofana v tumorskem tkivu se vzpostavi imunosupresivno okolje, ki tumorjem omogoča, da se izognejo imunskemu odzivu organizma. To se zgodi preko dveh mehanizmov, ki pa oba prispevata k vzpostavitvi take imunosupresije. Zmanjšana količina triptofana preko protein-kinaze GCN2 povzroči apoptozo limfocitov T. Več kinurenina, ki pri katabolizmu triptofana nastaja, pa preko transkripcijskega faktorja AhR povzroči diferenciacijo regulatornih limfocitov T, ki tumorju omogočajo imunsko toleranco. Inhibitorji teh treh encimov, ki omogočajo katabolizem triptofana, so torej privlačno potencialno zdravilo in raziskave v tej smeri že potekajo.

=== Enja Kokalj: Toksičnost amonijaka za možgane ===
Amonijak nastane v metabolizmu aminokislin. V serumu je v fizioloških pogojih večinoma prisoten v obliki amonijevega iona NH4+. Cikel sečnine, ki se odvija v jetrih, služi pretvorbi NH4+ v sečnino, ki se nato izloči iz organizma, saj je koncentracija NH4+ v krvi regulirana. Kljub temu, da možgani ne morejo sintetizirati uree iz NH4+, je njegova koncentracija v centralnem živčnem sistemu prav tako regulirana. Presežek NH4+ je za centralni živčni sistem toksičen. Pri odraslih ponavadi pride do hiperamonemije zaradi odpovedi jeter, pri otrocih pa zaradi motenj v ciklusu sečnine, ta pa vodi do hepatične encefalopatije, ki povzroči motje zavesti, v skrajnih primerih pa tudi komo. Stopnja ireverzibilne škode, ki jo možgani utrpijo, je odvisna od stopnje razvitosti možganov ter tudi intenzivnosti in dolžine izpostavitve visokim koncentracijam NH4+. Ker se vsa bolezenska stanja, ki nastopijo, odražajo na možganih, ti tudi predstavljajo osrednji predmet vseh spekulacij o mehanizmih toksičnosti amonijaka. Večja količina NH4+ v krvi vpliva na koncentracije številnih aminokislin, še posebej glutamina, glutamata in arginina, ovira normalno delovanje nevronov in s tem tudi prenos živčnih signalov ter onemogoča optimalno sintezo dušikovega oksida. Vse te motnje vzdrževanja celične homeostaze imajo lahko ireverzibilen vpliv na naše možganske celice, v primeru, da stanja ne zdravimo, pa lahko pride celo do smrti.

=== Inge Sotlar: Sinteza celuloze in druge komponente rastlinske celične stene ===
Rastlinsko tkivo gradijo rastlinske celice, ki se od živalskih razlikujejo po tem, da poleg tipičnih organelov vsebujejo še plastide, vakuolo in celično steno. Debelejša in dokaj trdna celična stena je zelo dinamičen del celice. Njene osnovne naloge so, da vzdržuje osmotski tlak in obliko celice ter jo ščiti pred vplivi okolja. Glavni gradnik celične stene rastlin je celuloza, polisaharid iz več sto ali tisoč enot glukoze, ki se nahaja v obliki kristaliničnih mikrofibril. Vsako posamezno celulozno mikrofibrilo sintetizira transmembranski proteinski kompleks na plazmalemi, sintaza celuloze. Pod mikroskopom so sintaze vidne kot strukture, podobne rozeti, ki se vzdolž plazmaleme premikajo s pomočjo obodnih mikrotubulov in tudi aktinskih filamentov. Rozeta je heksamer, sestavljen iz 36 proteinov, ki sintetizirajo celulozo (CesA proteinov). Dva sosednja CesA proteina se povežeta preko cinkovega prsta in tvorita kompleks, kateri izgradi posamezno verigo celuloze. Na katalitsko domeno encima se veže substrat UDP-glukoza, ki se sintetizira s pomočjo sintaze sukroze ali pirofosforilaze UDP-glukoze. V naslednjem koraku se UDP-glukoza, donor glikozilne skupine, prenese na rastočo verigo. Zaradi steričnih ovir se na glavno verigo ne dodajajo monomeri glukoze, temveč celobioza – disaharid glukoze. Drugi polisaharid, ki tvori steno, je hemiceluloza. Verige hemiceluloze so krajše in za razliko od celuloze ne kristalizirajo. S celulozo se prepletajo v t.i. matriksu pektina, ki je tretja glavna sestavina celične stene. Če se razvije sekundarna celična stena, se v matriks vgradi še lignin in poveča trdnost.

=== Peter Pečan: Vpliv maščob na komplekse oksidativne fosforilacije ===
Nealkoholna maščobna bolezen jeter (NAFLD) je izraz, ki predstavlja širok spekter bolezni jeter. Spada med najpogostejše kronične bolezni jeter v razvitem svetu, pojavlja pa se predvsem pri ljudeh s prekomerno telesno težo, ki ne uživajo prevelikih količin alkohola (ta lahko namreč povzroči enake oz. zelo podobne okvare). Najverjetnejši model razvoja bolezni predpostavlja delovanje v dveh stopnjah. V prvi stopnji pride do zvišane odpornosti na insulin, hiperglikemije, hiperlipidemije in nabiranja trigliceridov v jetrih, v drugi pa do oksidativnega stresa. V obeh stopnjah lahko pride do okvare mitohondrijev. Do napak naj bi prišlo, ker so mitohondriji ključni pri procesu β-oksidacije prostih maščobnih kislin (FFA). Te reakcije so namreč največji vir reaktivnih kisikovih spojin (ang. reactive oxygen species, ROS), ki sicer niso vedno škodljive, vendar lahko v povečanih količinah pripeljejo do močnega oksidativnega stresa. V predhodnjih raziskavah so dokazali, da ROS negativno vplivajo na procese oksidativne fosforilacije. Tako je pri osebah, ki imajo povečan vnos maščob, njihova oksidacija povečana, koncentracija ATP molekul pa posledično manjša kot običajno. Antioksidanti in antiperoksinitriti preprečijo takšne spremembe v oksidativni fosforilaciji, iz česar lahko z veliko gotovostjo sklepamo, da oksidativni stres res igra ključno vlogo pri patogenezi teh sprememb. Uporaba teh antioksidantov bi zato morda lahko bila uporabljena tudi za zdravljenje NAFLD pri ljudeh.

=== Jernej Vidmar: Oksidatvina fosforilacija v rakavih celicah ===
Mitohondriji so ključni celični organeli, ki sodelujejo v metabolizmu, igrajo ključno vlogo pri celični smrti in signalnih poteh. Za sintezo ATP preko oksidativne fosforilacije mitohondriji porabijo večino kisika, ki ga celica prejme, pri tem pa kot stranski produkt proizvede večino reaktivnih kisikovih spojin. Reaktivne kisikove spojine igrajo pomembno vlogo pri karcinogenezi, saj zaradi svoje oksidativnosti povzročajo poškodbe na celičnih makromolekulah. Povezanost mitohondrijskih funkcij z rakom še ni razvozlana, vendar je potrjena velika vpletenost, saj mitohondriji, poleg tega da igrajo ključno vlogo pri proizvodnji energije in regulirajo reaktivne kisikove spojine, nadzirajo celično življenje in smrt. To je zelo pomembno, saj lahko tumorske celice razvijejo odpornost na apoptozo na številne načine, med drugim preko mitohondrijskih nepravilnosti, izražanju protiapoptotskih proteinov ali negativni regulaciji ali mutaciji proapoptotskih proteinov. Rakave celice morajo svoj metabolizem prilagoditi, tako da proizvedejo molekule in energijo potrebno za rast tumorja in za morebitno spremembo okolja kjer preživijo. V rakavih celicah je veliko posebnosti, ki se tičejo oksidativne fosforilacije-nepravilnosti v kompleksih dihalne verige, posebna regulacija memebranskega potenciala, mutacije mitohondrijske DNA in mutacije genov v jedru, ki vplivajo na oksidativno fosforilacijo. Odkrivanje mehanizmov delovanja nekaterih molekul, katerih nepravilnosti v izražanju povzročajo rakave celice, bo v prihodnje pripomoglo k diagnostriciranju in zdravljenju raka.

=== Luka Dejanović: Sistemi za ohranjanje funkcionalnosti mitohondrijev ===
Mitohondrij je eden od organelov v evkariontski celici. Ima dve membrani zunanjo in notranjo. Notranja membrana je močno nagubana, saj tako omogoča povečanje površine za potek dihalne verige (RC). Njegova glavna naloga je proizvodnja ATP. V mitohondriju poteka ogromno število reakcij. Včasih se zgodi, da se kakšna tudi zalomi. Tako lahko npr. iz enega od citokromov (RC) uide elektron, ki pa lahko reagira s kisikom v bližini. Nastanejo reaktivni oksidativni intermediati (ROS). Te lahko reagirajo z bližnjimi biomolekulami in jih poškoduje. Prav zaradi takih situacij so celice razvile sistem ki stalno nadzoruje delovanje mitohondrija in ga ohranja funkcionalnega. Prav te sistemi so osnova za to seminarsko nalogo. Delijo se v 3 večje skupine glede na nivo delovanja: molekularni, na nivoju organelov in celični. Najbolj raziskan je sistem za lovljenje ROS, v mitohondriju imamo encime, ki so sposobni ROS spremeniti v vodikov peroksid, ta se kasneje razgradi na vodo in kisik. Naprej poznamo še sistem, ki lahko popravlja mitohondrijsko DNA. Več sistemov, ki popravljajo proteine in jih zvijajo nazaj v nativne konformacije. Poznamo pa tudi take mehanizme, ki mitohondrij vodijo v mitofagijo. Najbolj skrajni sistem deluje na celičnem nivoju in lahko sproži apoptozo. Toda tudi te mehanizmi niso vsemogočni, torej se naši mitohondriji vseeno kvarijo in jih je potrebno obnavljati.

=== Gašper Marinšek: Eikozanoidi citokrom P450 poti in rak ===
Eikozanoidi so družina zelo pomembnih bioloških molekul, ki igrajo v našem telesu osrednjo vlogo pri nastanku vnetij in ohranjanju homeostaze tkiv. Uvrščamo jih med lipide in so produkt metabolizma arahidonske kisline. Mednje spadajo tudi metaboliti citokrom P450 poti. Te so v preteklosti sicer že raziskovali in pri tem tudi ugotovili, da imajo sposobnost širjenja oz. krčenja žil-na ta način lahko uravnavajo krvni pritisk v našem telesu, a so do nedavnega ostali v senci drugih eikozanoidov, predvsem »razvpitih« vnetnih prostaglandinov. Šele pred kratkim pa so nekatere raziskave nakazale možnost povezave med eikozanoidi citokrom P450 poti in rakom. Predlaganih je bilo več možnosti povezave: spodbujanje rasti tumorskih celic, vnetne reakcije in pospeševanje angiogeneze, ki je ključna za normalno prehranjenost tumorskih celic in njihovo preživetje. Žal je bilo do tega trenutka izvedenih premalo raziskav, da bi lahko z gotovostjo govorili o eikozanoidih citokrom P450 poti kot o nedvomnih spodbujevalcih raka. Težava je tudi v tem, da so določeni poskusi dali nasprotujoče si rezultate. V prihodnosti bo tako potrebno izvesti še veliko poskusov in ugotoviti, ali so eikozanoidi citokrom P450 poti res primerne tarčne molekule za zdravljenje raka.

=== Urška Černe: Kontrola homeostaze holesterola preko ubikvitin-proteasomskega sistema ===
Ob nenehnem opozarjanju kako škodljiv je holesterol za naše telo, včasih pozabimo, da je to ena izmed bolj pomembnih molekul v našem organizmu. Je sestavni del bioloških membran in prekurzor steroidnih hormonov, žolčnih kislin ter vitamina D. Zaradi vseh teh nalog holesterola mora biti njegova koncentracija v celicah in na splošno v organizmu dobro uravnana. Pomembno vlogo pri regulaciji homeostaze holesterola ima UPS - ubikvitin-proteasomski sistem. Ta nadzira poti, ki primarno vplivajo na koncentracijo holesterola. Tako nadzira sintezo holesterola preko transkripcijskih faktorjev (npr. SREBP) in preko encimov, ki sodelujejo v sintezi holesterola (HMG-CoA reduktaza); udeležen je pri uravnavanju absorpcije holesterola preko receptorjev za LDL (LDLR) in izločanja holesterola iz celic preko membranskih transporterjev (npr. ABCA1). Poleg lizosomske razgradnje predstavlja UPS glavno pot v razgradnji znotraj celičnih proteinov. Ob pomanjkanju ali preveliki količini holesterola lahko pride do številnih bolezni, na celični ravni pa nakopičenje holesterola lahko privede do apoptoze mitohondrijev. Ateroskleroza je v tem kontekstu najbolj znana bolezen, takrat je koncentracija LDL holesterola znatno prevelika; poznamo pa tudi sindrom pomanjkanja »dobrega holesterola« HDL in družinsko hiperholesterolemijo. V seminarju sem na kratko razložila metabolizem holesterola in se osredotočila na to kako UPS vpliva na samo homeostazo ter nakazala morebitne načine za zdravljenje bolezni, ki so povezane z nenormalnimi koncentracijami holesterola.

=== Jerneja Ovčar: Metabolizem saharoze in njen pomen pri signalizaciji v rastlinah ===
Saharoza je vrsta ogljikov hidratov in spada med nereducirajoče disaharide. Je spojina fruktoze in glukoze. Sinteza ogljikovih hidratov pri rastlinah poteka s fotosintezo v listih. V listih se shranjujejo kot škrob, v druge dele rastline pa potujejo v obliki saharoze, ki je glavna transportna oblika ogljikovih hidratov v rastlini. Saharoza ima v rastlini več vlog. Vloga saharoze kot signalizacijske molekule v rastlinah je bila predstavljena že pred desetletji. Saharozni signali lahko nadzirajo veliko število razvojnih procesov v življenjskem ciklu rastline. Med drugim je saharozno signaliziranje povezano z ogljikovo in dušikovo asimilacijo ter transportom v rastlini. Ugotovili so, da je v naravi verjetno saharoza tista molekula, ki sproži signalne kaskade, ki vodijo do indukcije fruktanskih sinteznih proteinov, ki nato sprožijo sintezo fruktana v rastlinah (polimer fruktoze). Kot saharozni senzor v rastlinah je znan protein SUT2. Transporterji SUT2 so energijsko odvisni saharozni/H+ transporterji, ki so lahko spremljevalci drugih celic ali pa se nahajajo direktno v sitastih celicah floema v rastlini. Tip transporterjev SUT2 je poseben, ker vsebuje N-terminalne in centralne razširitvene zanke, ki so sestavljene iz 40-60 aminokislin. Takšne zanke v drugih saharoznih transporterjih niso prisotne in to je vzrok, da imajo ti proteini v rastlinah tudi senzorno vlogo.

=== Valentina Levak: Sinteza škroba in regulacija slednje ===
Škrob je rezervni rastlinski polisaharid in tako kot saharoza nastaja iz intermediata Calvinovega cikla - gliceraldehid 3-fosfata. V času fotosinteze nastaja v granulah v kloroplastih, v času, ko fotosinteze ni, pa se granule izpraznijo, škrob se porabi za rast rastline, celično dihanje ali pa se nalaga v skladiščnih heterotrofnih tkivih. V večini tkiv je glavna kontrola sinteze škroba usmerjena na zadnjo reakcijo pred dejansko sintezo, in sicer na reakcijo z ADP-glukoza pirofosforilazo (AGP-azo), ki aktivira glukozo 1-fosfat, da lahko vstopi v reakcijo polimerizacije na škrob sintazi. Kontrolo izvajajo alosterični efektorji, ki so metabolni intermediati, oksidoreduktaze (npr. tioredoksin) ter transkripcijski regulatorji glede na jakost fotosinteze in koncentracijo sladkorjev. Podenote heterotetramera AGP-aze so kodirane na več mestih v DNA, kar kaže na specifične izooblike encima glede na tkivo, v katerem deluje, in različno občutljivost na posamezne efektorje.
V heterotrofnih tkivih se škrob skladišči v amiloplastih, ki imajo genetsko določeno število granul, ki lahko zrastejo v njih. Tudi velikosti granul se močno razlikujejo od rastline do rastline. 3D-struktura granul kaže, kako sta organizirana amilopektin in amiloza ter vzrok za semikristalinsko strukturo. Tu je še posebej pomembna navzočnost ne le AGP-aze, temveč tudi različnih škrob sintaz, razvejilnih in klestilnih encimov, saj mora biti prostor za dolgoročnejše skladiščenje škroba (gomolji, endoderm semen) čim bolje izkoriščen.

=== Monika Pepelnjak: Biosinteza serina in njegov vpliv ===
Serin je neesencialna aminokislina, ki jo lahko naše telo dobi na štiri različne načine: vnos z hrano, z razgradnjo proteinov in lipidov, iz glicina z reverzibilno reakcijo ali pa preko biosintetske poti iz metabolita glikolize – 3-fosfoglicerata. Serin ni pomemben samo za izgradnjo proteinov ampak je tudi prekurzor za druge pomembne molekule. Iz glicina nastaneta aminokislini glicin in cistein. Ob pretvorbi serina v glicin, serin odcepi eno ogljikovo skupino, ki se prenese na tetrahidrofolat. Tetrahidrofolat služi kot pomemben prenašalec te metilne skupine. V ciklu enega ogljika se pretvarja ter omogoča izgradnjo purinskih in pirimidinskih obročev. Odcepljena oglikova skupina se porabi tudi za metilacijo DNA, RNA in proteinov. Zaradi vsega tega je ključnega pomena, da je biosinteza serina natančno uravnana. Biosintetska pot je v začetku razvoja bolj aktivna, potem pa se zmanjša in ostane aktivna samo v tkivih, ki se hitro delijo. Aktivnost te poti je izrednega pomena pri razvoju možganskih celic, saj je serin prekurzor tudi za nevromodulatorja glicin in D-serin ter za gradnike mielinske ovojnice. Povišano koncentracijo encimov biosinteze serina so zasledili v rakavih tkivih, kjer povečana sinteza serina prispeva višjo količino a-ketoglutarata v citratni cikel. Tako omogoča povečanje anabolnih poti v celici. Zaradi tega raziskujejo nove možnosti zdravljenja, ki bi vplivale na biosintezo serina.

=== Liza Otorepec: Asparagin sintetaza in akutna limfoblastna levkemija ===
Asparagin sintetaza je encim, ki katalizira sintezo asparagina in glutamata. Pri reakciji se aspartat in glutamin pretvorita v asparagin in glutamat, pri tem nastaja tudi ATP. Asparagin je neesencialna aminokislina, kar pomeni, da jo telo samo sintetizira. Poznani sta dve vrsti asparagin sintetaze: prva uporablja za donor dušika amonijak (AS-A), pri drugi pa je donor dušika glutamin (AS-B). Prekomerno izražanje proteina asparagin sintetaze vpliva na odpornost do terapije, ki temelji na uporabi asparagina za zdravljenje akutne limfoblastne levkemije. Prav tako pa lahko prekomerno izražanje napove tudi občutljivost na zdravila za zdravljenje tumorjev. Otroci z akutno limfoblastno levkemijo so zdravljeni s kombinacijo večih zdravil, ki vsebujejo encim L-asparaginazo. Terapija z asparagin sintetazo temelji na izčrpavanju asparagina, takoj ko pride asparagin sintetaza v krvno plazmo. Prav tako je uničen tudi celični asparagin, zato se asparagin izčrpa iz vseh celic v telesu. Celice akutne limfoblastne levkemije izražajo zelo nizek nivo asparagin sintetaze, zato je zdravljenje z asparagin sintetazo zelo učnkovito, saj le ta zavira rast malignih celic pri levkemiji. Kljub temu da novejši načini zdravljenja pripomorejo k 80-odstotnem izboljšanju, sta ponovljivost bolezni in odpornost proti zdravilom še vedno velik problem. Znanstveniki zato zdaj odkrivajo inhibitorje asparagin sintetaze, s katerimi bi lahko razložili nastanek teh stranskih učinkov.

=== Anja Tanšek: Zaščita nitrogenaznega kompleksa ===
Za življenje je nujno potreben dušik, saj ga vsak živeč organizem potrebuje. Največje količine dušika lahko najdemo v zraku, vendar se pojavi problem, saj se nahaja v zelo nereaktivni obliki. Dva atoma dušika sta povezana s tremi močnimi kovalentnimi vezmi, ki jih ne gre tako zlahka pretrgati. Večina živih bitij porablja dušik v obliki nitritov, nitratov ali amonijevega iona. Poraja se vprašanje kako se atmosferski dušik pretvori v uporabno obliko, ki jo večina organizmov potrebuje. Znanstveniki že dolgo vedo, da to počnejo nekatere bakterije in cianobakterije, vendar popolnoma natančen mehanizem še ni poznan. Bakterije, ki se naselijo na koreninah rastlin, predvsem stročnic, fiksirajo dušik iz zraka. Odgovorni encimski kompleks za te reakcije je nitrogenazni kompleks. Ta je sestavljen iz dveh komponent: dinitrogenaze-reduktaze in dinitrogenaze. Aktivnost encima je močno odvisna od pogojev. Najbolj problematična je prisotnost kisika, saj povzroči trajno deformacijo encima. Ta problem so rešile rastline, saj so bakterije, ki živijo v njihovih koreninah zaščitile z leghemoglobinom. Ta protein ima zelo veliko afiniteto do kisika in tako veže ves kisik preden bi sploh prišel do bakterij. Fiksacijo dušika opravljajo tudi cianobakterije, ki živijo v vodi. Pri njih se pojavi še dodatna težave, saj so same fotosintetski organizmi in kot vemo je stranski produkt fotosinteze kisik. Potrebna je še učinkovitejša zaščita pred kisikom. Razvile so se posebne celice heterociste, kjer se nahajajo nitrogenazni kompleksi.

=== Živa Moravec: mTOR in njegova vloga pri sintezi lipidov ===
Rast celice je odvisna od količine energije in hranilnih snovi, ki jih ima na voljo. Za ohranitev homeostaze so se zato že zelo zgodaj v evoluciji pojavile signalne poti, ki odločajo ali bo celica rasla, ker so razmere za to ugodne, ali pa se bo preusmerila v recikliranje proteinov in organelov, ki so v njej že prisotni. Ena od takih poti je signalna pot (m)TORa. TOR (tarča rapamicina, poimenovan po svojem inhibitorju) je serin/treoninska kinaza, ki skupaj z določenimi proteini tvori komplekse, od katerih sta najpomembnejša mTORC1 in mTORC2. mTORC2 nadzoruje celično preživetje in organizacijo citoskeleta , mTORC1 pa kontrolira rast celice, metabolizem in celični cikel. Po aktivaciji teh kompleksov se med drugim sproži mitohondrijska biosinteza in sinteza proteinov ter lipidov. Pri slednji mTOR deluje preko različnih efektorjev, med katerimi so najbolj, čeprav še vedno premalo, raziskani SREBP-1, PPAR-y in lipin1. Raziskave, opravljene na kvasovkah, so pokazale, da je sinteza keramidov (vrsta sfingolipidov) odvisna od aktivnosti mTORC2. Ker so začetni koraki de novo sinteze sfingolipidov evolucijsko dobro ohranjeni, bi bilo logično, da lahko mTORC2 kontrolira to signalno pot tudi pri sesalcih. Ker imajo sfingolipidi pomembno vlogo pri veliko boleznih (rak, diabetes, napake imunskega sistema, nevrološke motnje), bi lahko dodatne raziskave na tem področju pomagale pri izboljšanju načina zdravljenja teh bolezni.

=== Amadeja Lapornik: Vpliv analogov vitamina D na bolezni ledvic in ostale pogoste bolezni ===
Vitamin D je pravzaprav hormon, saj je edini vitamin, ki ga telo samo sintetizira, ko smo izpostavljeni sončnim žarkom. Njegova struktura je zelo podobna steroidom. Je eden najpomembnejših regulatorjev presnove kalcija in fosfata. Že 10- do 15-minutno izpostavljanje soncu 2- do 3-krat na teden zadovolji človeške potrebe po vitaminu D. Lahko pa ga pridobimo tudi s hrano. Vitamin D se nahaja v mesu mastnih rib, v kravjih jetrih, siru in jajčnemu rumenjaku ter v gobah, ki so posušene na soncu. Poznamo več analogov vitamina D: kalciol (vitamin D3), ergokalciferol (vitamin D2), kalcidiol, kalcitriol,… Vitamin D postane biološko aktiven po dveh hidroksilacijah. Prva poteka v jetrih kjer je mesto presnove kalciola v kalcidiol, druga pa v ledvicah, kjer iz kalcidiola nastaja kalcitriol. Vitamin D ključno vpliva na nastanek in razvoj različnih bolezni, kot so multipla skleroza, osteoporoza, kronična ledvična bolezen, alergijska obolenja, prekomerna telesna teža, več vrst rakavih obolenj, astma,… Mednarodna raziskava po Evropi (2011) je pokazala, da bi z reševanjem pomanjkanja vitamina D pri ljudeh, v zdravstvu lahko privarčevali več milijard evrov. S preprostim sporočilom ljudem, naj povečajo vnos vitamina D, bi lahko neverjetno izboljšali njihovo zdravje in kvaliteto življenja ter z zmanjšanjem kar lepega števila bolezni potencialno razbremenili zdravstveni sistem po vsem svetu.

=== Jerneja Kocutar: Uporaba rjavega maščobnega tkiva za zdravljenje debelosti ===
Vse odkar so znanstveniki odkrili, da tudi odrasli imamo rjavo maščobno tkivo (BAT) se ta predstavlja kot potenciala terapija za zdravljenje debelosti. BAT je ena od oblik maščobnega tkiva v našem telesu. Od belega maščobnega tkiva (WAT) se razlikuje predvsem po funkciji saj energije ne shranjuje ampak jo ob stimulaciji aktivno porablja. Razlike lahko opazimo tudi pri adipocitih, let ti so pri BAT manjši, vsebujejo manjše maščobne kapljice ter mnogo več mitohondrijev. Najbolj pomembni so ravno mitohondriji saj v njihovi notranji membrani najdemo protein UCP1. Ta lahko razklopi reakcijo oksidativne fosforilacije, protonom omogoči, da se v matriks vrnejo preko njega in zaobidejo ATP sintazo. Energija protonskega gradienta se v tem primeru ne porabi za sintezo ATP ampak se v procesu termogeneze sprosti v obliki toplote. Najbolj znan aktivator termogeneze je mraz v zadnjem času pa se raziskuje tudi oblika, ki jo aktivira prevelik vnos hranil. Izpeljanih je bilo veliko poskusov, ki so neizpodbitno dokazali, da nam aktiviran BAT lahko pomoga porabiti več kalorij kot običajno. Pri zdravljenju debelosti s pomočjo BAT so se osredotočili na štiri poti: aktivacija termogeneze v mišicah, povečanje BAT (povečanje diferenciacije), aktivacija termogeneze in povečanje stopnje razklopa v mitohondrijih. Vse raziskave so se v povojih vendar kažejo pozitivne rezultate in nam dajejo upanje, da bomo našli zdravilo za debelost in spremljajoče bolezni.

=== Tomaž Žagar: Vloga melatonina pri zaznavanju dneva in noči in njegovi fiziološki učinki ===
Melatonin je hormon, ki se sintetizira v češeriki, majhni endokrini žlezi v možganih. Zanj je značilno, da se sintetizira le ponoči oziroma v odsotnosti svetlobe. Posebne celice na mrežnici zaznajo svetlobo in preko več struktur ta signal posredujejo češeriki. Ker je njegova sinteza točno določena s količino svetlobe, pri živalih (v glavnem sesalcih) služi za uravnavanje cirkadianega cikla oziroma ''biološke ure''. Ta uravnava cikel spanja in budnosti, izločanje različnih hormonov, metabolizem ter deloma še telesno temperaturo in srčni utrip. Z ravnijo melatonina pa nekatere živali, katerih način življenja je odvisen od letnih časov, določajo letni čas. Ker je vsako leto istega datuma dan enako dolg, živali z merjenjem dolžine dneva (za kar je odgovoren melatonin), spremljajo ali bo prišla pomlad ali poletje in se na to ustrezno pripravijo. Pri tem ima ključno vlogo melatonin, ki posredno ali pa neposredno povzroči določene fiziološke odzive kot so: rast dlake, hibernacija, uravnavanje reprodukcije. Za vse te odzive sta ključna dva melatoninska receptorja MT1 in MT2, ki sta oba z G proteinom sklopljena receptorja. Njuna glavna vloga je regulacija transkripcije, ki poteka po dveh glavnih mehanizmih, in sicer preko aktivacije kaskade MAPK ali pa z zavrtjem transkripcijskega faktorja CREB preko inhibicije adenilat ciklaze. Poleg tega je melatonin še zelo močan antioksidant, ki varuje telo pred reaktivnimi kisikovimi in dušikovimi reaktivnimi spojinami.

BIO2 Povzetki seminarjev 2014

2014-10-28T18:49:52Z

Luka Lavrič: /* Biokemija- Povzetki seminarjev 2014/2015 */

BIO2 Seminar 2014

2014-10-23T13:28:56Z

Luka Lavrič: /* Seznam seminarjev */

= Biokemijski seminar =
doc. dr. Gregor Gunčar, K2.022

== Seznam seminarjev ==
{| {{table}}
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Ime Priimek'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Tema*'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Naslov seminarja'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 1'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 2'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 3'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Datum oddaje'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Datum recenzije'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Datum predstavitve'''
|-
| Dominik Dekleva||12||[http://bit.ly/1xURyBR Aktivacija Gpcr-jev v povezavi z vodo]||Anja Tanšek||Inge Sotlar||Bine Tršavec||14.10.2014||21.10.2014||28.10.2014
|-
| Nuša Kelhar||12||[http://www.cell.com/cell/abstract/S0092-8674%2814%2900198-6 Soodvisnost oblike membrane in medceličnega sporočanja]||Monika Pepelnjak||Jerneja Ovčar||Enja Kokalj||14.10.2014||21.10.2014||28.10.2014
|-
| Tadej Ulčnik||12||[http://www.plosone.org/article/info%3Adoi%2F10.1371%2Fjournal.pone.0105204 Različna dinamika in aktivnost dveh steroidnih receptorjev na istem promotorju]||Liza Otorepec ||Valentina Levak||Peter Pečan||14.10.2014||21.10.2014||28.10.2014
|-
| Marija Srnko||14-15||[http://www.croh-online.com/article/S1040-8428(14)00086-9/abstract Fosfofruktokinaza: Posrednik med glikolitičnim pretokom in razvojem raka]||Tomaž Žagar||Gašper Marinšek||Luka Dejanović||28.10.2014||2.11.2014||04.11.2014
|-
| Luka Lavrič||14-15||[http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0968000409002072 Glikoliza - Metabolizem v možganih]||Jerneja Kocutar||Urška Černe||Jernej Vidmar||28.10.2014||2.11.2014||04.11.2014
|-
| Naida Hajdarević||14-15||Moj izbrani naslov||Amadeja Lapornik||Živa Moravec||Inge Sotlar||28.10.2014||2.11.2014||04.11.2014
|-
| Vesna Podgrajšek||16||[http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1931312812003551 Mitohondrijski metabolizem glukoze in glutamina je potreben za znotrajcelično rast toxoplasme gondii ]||Dominik Dekleva||Anja Tanšek||Jerneja Ovčar||28.10.2014||2.11.2014||04.11.2014
|-
| Katja Malovrh||16||[http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0047637405002460 Zmanjšanje aktivnosti encimov citratnega cikla s staranjem]||Nuša Kelhar||Monika Pepelnjak||Valentina Levak||28.10.2014||04.11.2014||11.11.2014
|-
| Primož Tič||16||Moj izbrani naslov||Tadej Ulčnik||Liza Otorepec ||Gašper Marinšek||28.10.2014||04.11.2014||11.11.2014
|-
| Urška Kašnik||17||Moj izbrani naslov||Marija Srnko||Tomaž Žagar||Urška Černe||28.10.2014||04.11.2014||11.11.2014
|-
| Ernest Šprager||17||[http://www.nature.com/jcbfm/journal/v33/n10/full/jcbfm2013128a.html Moj izbrani naslov]||Luka Lavrič||Jerneja Kocutar||Živa Moravec||28.10.2014||04.11.2014||11.11.2014
|-
| Tjaša Sorčan||17||Moj izbrani naslov||Naida Hajdarević||Amadeja Lapornik||Anja Tanšek||04.11.2014||11.11.2014||18.11.2014
|-
| Nina Mavec||18||Moj izbrani naslov||Vesna Podgrajšek||Dominik Dekleva||Monika Pepelnjak||04.11.2014||11.11.2014||18.11.2014
|-
| Bine Tršavec||18||Moj izbrani naslov||Katja Malovrh||Nuša Kelhar||Liza Otorepec ||04.11.2014||11.11.2014||18.11.2014
|-
| Enja Kokalj||18||Moj izbrani naslov||Primož Tič||Tadej Ulčnik||Tomaž Žagar||04.11.2014||11.11.2014||18.11.2014
|-
| Peter Pečan||19||Moj izbrani naslov||Urška Kašnik||Marija Srnko||Jerneja Kocutar||11.11.2014||18.11.2014||25.11.2014
|-
| Luka Dejanović||19||Moj izbrani naslov||Ernest Šprager||Luka Lavrič||Amadeja Lapornik||11.11.2014||18.11.2014||25.11.2014
|-
| Jernej Vidmar||19||Moj izbrani naslov||Tjaša Sorčan||Naida Hajdarević||Dominik Dekleva||11.11.2014||18.11.2014||25.11.2014
|-
| Inge Sotlar||20||Moj izbrani naslov||Nina Mavec||Vesna Podgrajšek||Nuša Kelhar||11.11.2014||18.11.2014||25.11.2014
|-
| Jerneja Ovčar||20||Moj izbrani naslov||Bine Tršavec||Katja Malovrh||Tadej Ulčnik||25.11.2014||02.12.2014||09.12.2014
|-
| Valentina Levak||20||Moj izbrani naslov||Enja Kokalj||Primož Tič||Marija Srnko||25.11.2014||02.12.2014||09.12.2014
|-
| Gašper Marinšek||21||Moj izbrani naslov||Peter Pečan||Urška Kašnik||Luka Lavrič||25.11.2014||02.12.2014||09.12.2014
|-
| Urška Černe||21||Moj izbrani naslov||Luka Dejanović||Ernest Šprager||Naida Hajdarević||25.11.2014||02.12.2014||09.12.2014
|-
| Živa Moravec||21||Moj izbrani naslov||Jernej Vidmar||Tjaša Sorčan||Vesna Podgrajšek||02.12.2014||09.12.2014||16.12.2014
|-
| Anja Tanšek||22||Moj izbrani naslov||Inge Sotlar||Nina Mavec||Katja Malovrh||02.12.2014||09.12.2014||16.12.2014
|-
| Monika Pepelnjak||22||Moj izbrani naslov||Jerneja Ovčar||Bine Tršavec||Primož Tič||02.12.2014||09.12.2014||16.12.2014
|-
| Liza Otorepec ||22||Moj izbrani naslov||Valentina Levak||Enja Kokalj||Urška Kašnik||02.12.2014||09.12.2014||16.12.2014
|-
| Tomaž Žagar||23||Moj izbrani naslov||Gašper Marinšek||Peter Pečan||Ernest Šprager||23.12.2014||03.01.2015||06.01.2015
|-
| Jerneja Kocutar||23||Moj izbrani naslov||Urška Černe||Luka Dejanović||Tjaša Sorčan||23.12.2014||03.01.2015||06.01.2015
|-
| Amadeja Lapornik||23||Moj izbrani naslov||Živa Moravec||Jernej Vidmar||Nina Mavec||23.12.2014||03.01.2015||06.01.2015
|-
| ||||||||||||03.01.2014||06.01.2014||13.01.2015
|}

*številka v okencu za temo pomeni poglavje v Lehningerju, v katerega naj izbrana tema spada

== Gradivo za predavanja ==
Gradivo za predavanja in seminarje najdete na http://bio.ijs.si/~zajec/bio2/
username: bio2
password: samozame

==Naloga==
'''Vaša naloga za seminar je: '''
Samostojno pripraviti seminar o seminarski temi, ki vam je bila dodeljena. Za osnovo morate vzeti pregledni članek iz revije, ki ima faktor vpliva nad 5 (npr. [http://www.sciencedirect.com/science/journal/09680004/ TIBS]. Poiskati morate še vsaj tri znanstvene članke, ki se nanašajo na opisano temo in jih uporabiti kot podlago za seminarsko nalogo!

Za pripravo seminarja velja naslednje: 
* [[BIO2 Povzetki seminarjev 2014|Povzetek seminarja]] opišete na wikiju v približno 200 besedah - najkasneje do dne ko morate oddati seminar recenzentom.
* Povezavo do povzetka vnesete v tabelo seminarjev tekočega letnika.
* Seminar pripravite v obliki seminarske naloge na ~5-9 straneh A4 (pisava 12, enojni razmak, 2,5 cm robovi; važno je, da je obseg od 2700 do 3000 besed), vsebovati mora najmanj tri slike. Slika mora imeti legendo in v besedilu mora biti na ustreznem mestu sklic na sliko. 
* Seminar oddajte do datuma oddaje, ki je naveden v tabeli v elektronski obliki z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/ tega obrazca].
* vsi seminarji so v elektronski obliki dostopni [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/bioseminar/ tukaj].
* Recenzenti do dneva določenega v tabeli določijo popravke (v elektronski obliki) in podajo oceno pisnega dela. Popravljen seminar oddajte z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/ tega obrazca].
* Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Za predstavitev je na voljo 25 minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni.
* Predstavitvi sledi razprava. Recenzenti podajo oceno predstavitve in postavijo najmanj dve vprašanji.Vsi ostali morajo postaviti še dve dodatni vprašanji v toku celega seminarskega obdobja.
* Na dan predstavitve morate docentu še pred predstavitvijo oddati končno (popravljeno) in natisnjeno verzijo seminarja v enem izvodu, elektronsko verzijo seminarja in predstavitev pa oddati na strežnik na dan predstavitve do polnoči.
* Seminarska naloga in povzetek morajo biti v slovenskem jeziku.

==Imena datotek==
Prosim vas, da vse datoteke, ki mi jih pošiljate poimenujete po naslednjem receptu:
* 312_BIO_Priimek_Ime.doc(x) za seminar, npr. 312_BIO_Guncar_Gregor.docx
* 312_BIO_Priimek_ime_final.doc(x) za končno verzijo seminarja
* 312_BIO_Priimek_Ime_rec_Priimek2.doc(x) za recenzijo, kjer je Priimek2 priimek recenzenta, npr. 312_BIO_Guncar_Gregor_rec_Scott.docx (če se pišete Scott in odajate recenzijo za seminar, ki ga je napisal Gunčar)
* 312_BIO_Priimek_Ime.ppt(x) za prezentacijo, npr 312_BIO_Guncar_Gregor.pptx

==Ocenjevanje seminarjev==
Recenzenti ocenijo seminar tako, da izpolnijo [https://docs.google.com/forms/d/1EQDYwFO-DEzZ2R7jf8DhLqIeV4FFxRd3-ScceEASpt4/viewform recenzentsko poročilo] na spletu. Recenzentsko poročilo morate oddati najkasneje do 21:00, en dan pred predstavitvijo seminarja.

== Mnenje o predstavitvi ==
Vsak posameznik '''mora''' oceniti seminar, tako da odda svoje [https://docs.google.com/forms/d/19bnx0Yh4RIuC2Kzkdaa8t8WqRTBgXYNTV_IWfjrO0W4/viewform?usp=send_form mnenje] najkasneje v sedmih dneh po predstavitvi. Kdor na seminarju ni bil prisoten, mnenja '''ne sme''' oddati.

==Urejanje spletnih strani na wikiju==
Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''

==Citiranje virov==
Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se v seminarju držite ene same.
Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati.
Za citate v naravoslovju je najpogostejše citiranje po pravilniku ISO 690. [http://www.zveza-zotks.si/gzm/dokumenti/literatura.html Pravila], ki upoštevajo omenjeni standard, so pripravili pri ZTKS. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati. 
'''Citiranje knjig:''' 
Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica. 
Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN. 

Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005. 
Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4. 
Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.).

'''Citiranje člankov:''' 
Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani. 
Lartigue C. ''et al''. Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, letn. 317, str. 632-638.

Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole: 
Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani. 
Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.

Revija Science uporablja skrajšani zapis: 
C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007) 

V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne).

'''Citiranje spletnih virov:''' 
Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov 
strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life 
Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.