Wiki FKKT - User contributions [en]

Razvoj in optimizacija modularnega dvofragmentnega LacI stikala za naprednejšo biodetekcijo

2024-05-27T22:56:32Z

Luka Stanković: /* 3.2. Testiranje delovanja sistema s komplementarnimi levcinskimi zadrgami */

Povezava do izhodiščnega članka: [https://link.springer.com/article/10.1007/s12257-024-00020-w Razvoj in optimizacija modularnega dvofragmentnega LacI stikala za naprednejšo biodetekcijo]

==1. Uvod==

Genska stikala (genetic switches) so ključni elementi za regulacijo izražanja specifičnih genov. Zaradi njihovega širokega spektra delovanja in modularnosti so v sintezni biologiji ključnega pomena. Eni najpogosteje uporabljenih genskih stikal so transkripcijski faktorji. Slednji premorejo veliko potenciala za optimizacijo različnih postopkov pri molekulskem inžinjiringu in različnih področjih diagnostike. [1]

V članku ''Development and optimization of a modular two-fragment LacI switch for enhanced biosensor applications'' je raziskovalna skupina predstavila potencialno uporabo represorja laktoznega operona LacI za detekcijo prisotnosti specifičnih proteinov ali interakcije med njimi. Predstavljen princip temelji na metodi z razcepljenimi proteini. LacI so razcepili na dva fragmenta. Na DNA vezavno domeno in regulatorno domeno. Na oba fragmenta so pripeli peptida, ki sta bila med seboj komplementarna. Komplementarna peptida omogočata spajanjenje obeh LacI fragmentov v funkcionalen LacI represor, ki se veže na operatorsko regijo Lac operona in zavre prepisovanje genov operona. Z izbiro ustreznega komplementarnega peptida, bi lahko detektirali prisotnost tarčnega proteina, ki bi z vezavo na komplementarno regijo fuzijskega proteina preprečil spajanje LacI fragmentov v aktivni encim. Posledično ne bi prišlo do represije reporterskih genov na operonu, kar bi zaznali z detekcijo signala. [1, 2]

==2. Metode za razvoj sistema==

Poglavitni problem pri razvoju metode je bilo ugotoviti, kako bi LacI razdelili na dve fuzijski podenoti (z poljubnima komplementarnima peptidoma), ki bi po ponovni združitvi povrnili prvotno vlogo proteina. V ta namen je bilo potrebno pripraviti knjižnico zaporedij za represor LacI z vstavljenim določenim zaporedjem na naključnih mestih. Za namen lažje selekcije v kasnejših stopnjah, so se odločili, da bodo znotraj ''LacI'' gena vstavili transpozonsko zaporedje za ojačan zeleni fluorescenčni protein z markerjem za odpornost proti kanamicinu (eGFPuv-KanR). Slednji bi omogočal selekcijo vseh kolonij, kjer je prišlo do uspešne združitve obeh podenot preko emisije zelene svetlobe, medtem ko bi povrjeno aktivnost lacI detektirali preko represije sekundarnega reporterskega sistema (zapis za RFP) lac operona na ločenem plazmidu. [1]

===2.1. Konstrukcija sevov===

Za namen selekcije so morali v začetni stopnji v genom izbranega seva (DH5α) uvesti okvarjen gen za lacI represor. Okvaro so dosegli z rekombinacijo s pomočjo rdečega lambda bakteriofaga. Z rekombinacijo so v kromosom ustavili kaseto, ki so jo vzeli iz seva BW25113''ΔlacI::KmR'', pomnožili z metodo PCR. Zaporedje so preverili s sekvenciranjem zaporedja ter izvedli rekombinacijo s pomočjo vektorja pKD46. Vstavljena kaseta je poleg okvarjenega lacI gena vsebovala tudi selekcijski marker za odpornost proti kanamicinu. Po selekciji v gojišču ob prisotnosti kanamicina so prenesli ustrezne kolonije in zaporedje preverili s ponovno metodo PCR. V nadaljevanju so selekcijski marker odstranili s flipazo. [1, 3]

===2.2. Konstrukcija plazmidov===

Za namen selekcije kolonij DH5α z delujočim sistemom je bilo potrebno konstruirati dva plazmida. Prvi (pUCBB-eGFP) je vseboval zapis za lacI represor z vstavljenjim zaporedjem za eGFP pod konstitutivnim lacO promotorjem in selekcijskim markerjem za kanamicin, ki je bil kasneje odstranjen z NheI z nadaljno ligacijo z T4 ligazo. Drugi (pACBB-mRFP) je vseboval trc promoter, lac operator in zaporedje za mRFP. Za združevanje segmentov DNA so uporabili In-Fusion Cloning Kit (Clontech). [1]

===2.3. konstrukcija in vstavljanje transpozonske regije Tn5[GFPuv]===

Transpozone z GFP zaporedjem in markerjem za odpornost proti kanamicinu so dobili z vstavljanjem ''gfpuv'' gena iz pGFPuv (Clontech) v transpozon EZ-Tn5 (Epicentre) pred zapisom za gen KmR. Transpozonsko regijo so očistili z gelsko ekstrakcijo (Qiagen kit). 87 fm očiščenega transpozona so z ekvivalentno molsko maso tarčnega plazmida pUCBB-LacI 2 uri inkubirali v 10 µL Tris acetatnega pufra z 1 enoto EZ::TN™ (In-Frame Linker Insertion Kit; Epicentre) in 25 % glicerolom pri 37 %. Transpozicijo so po 2 urah ustavili z dodatkom 0.1% SDS in 10-minutno inkubacijo pri 70 °C. V nadaljevanju so z plazmidom transformirali E. coli DH5α z elektroporacijo ter bakterije gojili na ploščah ob prisotnosti ampicilina in kanamicina. Plazmid so iz kolonij, kjer je prišlo do inscercije transpozona izolirali z izolacijskim setom (Qiagen). [1]

==3. Rezultati in diskusija==

===3.1. Identifikacija dostopnega cepitvenega mesta LacI represorja===

Po transformaciji DH5α z obema plazmidoma (pACBB-mRFP in pUCBB-eGFP) so celice gojili na ploščah. Pri kolonijah, kjer je ni bilo zelene fluorescence, ni prišlo do spajanja podenot LacI represorja. V primeru, ko sta bili prisotni obe fluorescenci, je sicer prišlo do spajanja obeh podenot, saj je bil GFP funkcionalen, a je bil tronspozon vstavljen na takem mestu, da tudi po združitvi fragmentov LacI ni prišlo do povratka prvotne funkcije proteina, saj ni prišlo do represije izražanja RFP genov. Ustreznih kolonij, ki so fluorescirale zgolj z zeleno barvo je bilo 34 (od skupno ~ 1.6 × 10^4). Od tega so v nadaljevanju izbrali in izolirali 13 proteinov, kasneje pa s strukturno analizo izbrali 4 kandidate, ki so imeli cepitvena mesta na P155, N157, L307 in G315. Vsi kandidati so kasneje pokazali vsaj 1,6-kratno povečanje fluorescence ob prisotnosti 1mM IPTG. Ko so testirali spremembo fluorescence v primerih, ko je bil prisoten zgolj en od obeh fragmentov, spremembe fluorescence kot pričakovani ni bilo. [1]

===3.2. Testiranje delovanja sistema s komplementarnimi levcinskimi zadrgami===

V nadaljevanju so izvedli dodaten poskus s pripenjanjem dveh fragmentov lizinske zadrge na kandidata P155 in G315. Pri obeh kandidatih je prišlo do znižanja fluorescence v primerjavi s kontrolnimi skupinami, ki so vsebovale zgolj eno od obeh peptidov na fragmentih razcepljenega LacI. Fluorescenco je bilo moč zaznati tako ob prisotnosti, kot tudi ob odsotnosti IPTG. Dodatno so preizkusili tudi obnašanje sistema in vitro v celicah E. Coli, ki so jih inkubirali pri različnih koncentracijah IPTG (od 0 do 100 µM). Pri obeh kandidatih je prišlo do precej visoke fluorescence v odsotnosti od IPTG, kar nakazuje, da po vsej verjetnosti ni prišlo do ustreznega sestavljanja podenot v funkcionalen encim, kar bi lahko brez ustrezne optimizacije v praksi povzročilo precej omejitev z vidika občutljivosti metode. [1]

===3.3. Brezcelični sistem===

Reporterski fluorescenčni gen so poskusili izraziti z uporabo kompleta za ''in vitro'' sintezo beljakovin PURExpress®. Izražanje je bilo doseženo z dodatkom fragmentov razcepljenega LacI in fuzijskimi peptidi ter induktorjem IPTG. Spremljali so spremembe v intenzivnosti fluorescence skozi čas v serijskih reakcijah za tri različice LacI (divji tip, P155 in G315). Kot pričakovano, je divji tip LacI pokazal od IPTG-odvisen odziv. Fluorescenčni signal se je s časom povečeval, z največjo spremembo za 1,6-krat po 3-urni reakciji. Ta sprememba je primerljiva z ''in vivo'' testom, kar kaže, da sistem deluje primerljivo tudi v ''in vitro'' okolju. V primeru razdeljenega LacI-155 in -315, s komplementarnimi proteini, se je IPTG-odvisen signal prav tako povečevala do 3 ure. Rezultati opredeljujejo uspešno delovanje modularnega dvodelnega sistema ob uporabi CFPE (cell free protein expression) tehnologije, kar ga naredi primernega za številne analitične aplikacije. [1]

===3.4. Optimizacija sistema===

Cilj optimizacije je bil čim bolj zmanjšati vplive ozadja (nespecifično fluorescenco). Problema so se avtorji članka lotili tako, da so signal dobljen z uporabo razcepljenega lacI primerjali z wild-type signalom pri različnih vrednostih IPTG ter DNA. Ugotovili so, da fluorescenca doseže plato pri 200 µM IPTG. Najboljše razmerje signal-ozadje pa je bilo doseženo pri 100 ng DNA (glede na standard seta PURExpress®). [1]

==4. Zaključek==

Predstavljen sistem na principu razcepljenih transkripcijskih faktorjev ponuja številne možnosti za napredek diagnostičnih metod in študij interakcij. Ko se tarčne molekule vežejo na eno od proteinskih oznak, te konkurenčno zavirajo ponovno sestavljanje fragmentov LacI, kar ima za posledico neprekinjeno aktivacijo izražanja reporterskega gena neodvisno od IPTG. Te fuzijske beljakovinske oznake ponujajo fleksibilnost in jih je mogoče zamenjati glede na interes tarče, kar je prednostno za razvoj različnih biosenzorjev. Dodatna prednost je možnost uporabe sistema v izvenceličnem okolju. Čeprav predstavljen sistem ne ponuja toliko potenciala z vidika identifikacij velikega števila interakcij, kot ga ponujajo tradicionalni sistemi, kot na primer dvohibridni sistem kvasovk, avtorji članka ob ponujenih možnostih za optimizacijo, navajajo prednosti sistema predvsem v enostavnosti, hitrosti in obstojnosti sistema zaradi možnosti izvedbe v izvenceličnem sistemu (CFPE), kar bi pomenilo precejšnjo prednost v medicinski diagnostiki, ki omogoča detekcijo že na samem mestu odvzema vzorca (point-of-care). [1]

==Viri==

[1] Lee, H., Rha, E. & Kim, H. Development and optimization of a modular two-fragment LacI switch for enhanced biosensor applications. Biotechnol Bioproc E 29, 109–117 (2024). https://doi.org/10.1007/s12257-024-00020-w

[2] Slomovic S, Pardee K, Collins JJ (2015) Synthetic biology devices for in vitro and in vivo diagnostics. Proc Natl Acad Sci USA 112:14429–14435. https://doi.org/10.1073/pnas.1508521112

[3] Datsenko KA, Wanner BL (2000) One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proc Natl Acad Sci USA 97:6640–6645. https://doi.org/10.1073/pnas.120163297

Razvoj in optimizacija modularnega dvofragmentnega LacI stikala za naprednejšo biodetekcijo

2024-05-27T21:47:14Z

Luka Stanković: /* 2.3. konstrukcija in vstavljanje transpozonske regije Tn5[GFPuv] */

Povezava do izhodiščnega članka: [https://link.springer.com/article/10.1007/s12257-024-00020-w Razvoj in optimizacija modularnega dvofragmentnega LacI stikala za naprednejšo biodetekcijo]

==1. Uvod==

Genska stikala (genetic switches) so ključni elementi za regulacijo izražanja specifičnih genov. Zaradi njihovega širokega spektra delovanja in modularnosti so v sintezni biologiji ključnega pomena. Eni najpogosteje uporabljenih genskih stikal so transkripcijski faktorji. Slednji premorejo veliko potenciala za optimizacijo različnih postopkov pri molekulskem inžinjiringu in različnih področjih diagnostike. [1]

V članku ''Development and optimization of a modular two-fragment LacI switch for enhanced biosensor applications'' je raziskovalna skupina predstavila potencialno uporabo represorja laktoznega operona LacI za detekcijo prisotnosti specifičnih proteinov ali interakcije med njimi. Predstavljen princip temelji na metodi z razcepljenimi proteini. LacI so razcepili na dva fragmenta. Na DNA vezavno domeno in regulatorno domeno. Na oba fragmenta so pripeli peptida, ki sta bila med seboj komplementarna. Komplementarna peptida omogočata spajanjenje obeh LacI fragmentov v funkcionalen LacI represor, ki se veže na operatorsko regijo Lac operona in zavre prepisovanje genov operona. Z izbiro ustreznega komplementarnega peptida, bi lahko detektirali prisotnost tarčnega proteina, ki bi z vezavo na komplementarno regijo fuzijskega proteina preprečil spajanje LacI fragmentov v aktivni encim. Posledično ne bi prišlo do represije reporterskih genov na operonu, kar bi zaznali z detekcijo signala. [1, 2]

==2. Metode za razvoj sistema==

Poglavitni problem pri razvoju metode je bilo ugotoviti, kako bi LacI razdelili na dve fuzijski podenoti (z poljubnima komplementarnima peptidoma), ki bi po ponovni združitvi povrnili prvotno vlogo proteina. V ta namen je bilo potrebno pripraviti knjižnico zaporedij za represor LacI z vstavljenim določenim zaporedjem na naključnih mestih. Za namen lažje selekcije v kasnejših stopnjah, so se odločili, da bodo znotraj ''LacI'' gena vstavili transpozonsko zaporedje za ojačan zeleni fluorescenčni protein z markerjem za odpornost proti kanamicinu (eGFPuv-KanR). Slednji bi omogočal selekcijo vseh kolonij, kjer je prišlo do uspešne združitve obeh podenot preko emisije zelene svetlobe, medtem ko bi povrjeno aktivnost lacI detektirali preko represije sekundarnega reporterskega sistema (zapis za RFP) lac operona na ločenem plazmidu. [1]

===2.1. Konstrukcija sevov===

Za namen selekcije so morali v začetni stopnji v genom izbranega seva (DH5α) uvesti okvarjen gen za lacI represor. Okvaro so dosegli z rekombinacijo s pomočjo rdečega lambda bakteriofaga. Z rekombinacijo so v kromosom ustavili kaseto, ki so jo vzeli iz seva BW25113''ΔlacI::KmR'', pomnožili z metodo PCR. Zaporedje so preverili s sekvenciranjem zaporedja ter izvedli rekombinacijo s pomočjo vektorja pKD46. Vstavljena kaseta je poleg okvarjenega lacI gena vsebovala tudi selekcijski marker za odpornost proti kanamicinu. Po selekciji v gojišču ob prisotnosti kanamicina so prenesli ustrezne kolonije in zaporedje preverili s ponovno metodo PCR. V nadaljevanju so selekcijski marker odstranili s flipazo. [1, 3]

===2.2. Konstrukcija plazmidov===

Za namen selekcije kolonij DH5α z delujočim sistemom je bilo potrebno konstruirati dva plazmida. Prvi (pUCBB-eGFP) je vseboval zapis za lacI represor z vstavljenjim zaporedjem za eGFP pod konstitutivnim lacO promotorjem in selekcijskim markerjem za kanamicin, ki je bil kasneje odstranjen z NheI z nadaljno ligacijo z T4 ligazo. Drugi (pACBB-mRFP) je vseboval trc promoter, lac operator in zaporedje za mRFP. Za združevanje segmentov DNA so uporabili In-Fusion Cloning Kit (Clontech). [1]

===2.3. konstrukcija in vstavljanje transpozonske regije Tn5[GFPuv]===

Transpozone z GFP zaporedjem in markerjem za odpornost proti kanamicinu so dobili z vstavljanjem ''gfpuv'' gena iz pGFPuv (Clontech) v transpozon EZ-Tn5 (Epicentre) pred zapisom za gen KmR. Transpozonsko regijo so očistili z gelsko ekstrakcijo (Qiagen kit). 87 fm očiščenega transpozona so z ekvivalentno molsko maso tarčnega plazmida pUCBB-LacI 2 uri inkubirali v 10 µL Tris acetatnega pufra z 1 enoto EZ::TN™ (In-Frame Linker Insertion Kit; Epicentre) in 25 % glicerolom pri 37 %. Transpozicijo so po 2 urah ustavili z dodatkom 0.1% SDS in 10-minutno inkubacijo pri 70 °C. V nadaljevanju so z plazmidom transformirali E. coli DH5α z elektroporacijo ter bakterije gojili na ploščah ob prisotnosti ampicilina in kanamicina. Plazmid so iz kolonij, kjer je prišlo do inscercije transpozona izolirali z izolacijskim setom (Qiagen). [1]

==3. Rezultati in diskusija==

===3.1. Identifikacija dostopnega cepitvenega mesta LacI represorja===

Po transformaciji DH5α z obema plazmidoma (pACBB-mRFP in pUCBB-eGFP) so celice gojili na ploščah. Pri kolonijah, kjer je ni bilo zelene fluorescence, ni prišlo do spajanja podenot LacI represorja. V primeru, ko sta bili prisotni obe fluorescenci, je sicer prišlo do spajanja obeh podenot, saj je bil GFP funkcionalen, a je bil tronspozon vstavljen na takem mestu, da tudi po združitvi fragmentov LacI ni prišlo do povratka prvotne funkcije proteina, saj ni prišlo do represije izražanja RFP genov. Ustreznih kolonij, ki so fluorescirale zgolj z zeleno barvo je bilo 34 (od skupno ~ 1.6 × 10^4). Od tega so v nadaljevanju izbrali in izolirali 13 proteinov, kasneje pa s strukturno analizo izbrali 4 kandidate, ki so imeli cepitvena mesta na P155, N157, L307 in G315. Vsi kandidati so kasneje pokazali vsaj 1,6-kratno povečanje fluorescence ob prisotnosti 1mM IPTG. Ko so testirali spremembo fluorescence v primerih, ko je bil prisoten zgolj en od obeh fragmentov, spremembe fluorescence kot pričakovani ni bilo. [1]

===3.2. Testiranje delovanja sistema s komplementarnimi levcinskimi zadrgami===

V nadaljevanju so izvedli dodaten poskus s pripenjanjem dveh fragmentov lizinske zadrge na kandidata P155 in G315. Pri obeh kandidatih je prišlo do znižanja fluorescence v primerjavi s kontrolnimi skupinami, ki so vsebovale zgolj eno od obeh peptidov na fragmentih razcepljenega LacI. Znižanje je bilo moč zaznati tako ob prisotnosti, kot tudi ob odsotnosti IPTG. Dodatno so preizkusili tudi obnašanje sistema in vitro v celicah E. Coli, ki so jih inkubirali pri različnih koncentracijah IPTG (od 0 do 100 µM). Pri obeh kandidatih je prišlo do precej visoke fluorescence v odsotnosti od IPTG, kar nakazuje, da po vsej verjetnosti ni prišlo do ustreznega sestavljanja podenot v funkcionalen encim, kar bi lahko brez ustrezne optimizacije v praksi povzročilo precej omejitev z vidika občutljivosti metode. [1]

===3.3. Brezcelični sistem===

Reporterski fluorescenčni gen so poskusili izraziti z uporabo kompleta za ''in vitro'' sintezo beljakovin PURExpress®. Izražanje je bilo doseženo z dodatkom fragmentov razcepljenega LacI in fuzijskimi peptidi ter induktorjem IPTG. Spremljali so spremembe v intenzivnosti fluorescence skozi čas v serijskih reakcijah za tri različice LacI (divji tip, P155 in G315). Kot pričakovano, je divji tip LacI pokazal od IPTG-odvisen odziv. Fluorescenčni signal se je s časom povečeval, z največjo spremembo za 1,6-krat po 3-urni reakciji. Ta sprememba je primerljiva z ''in vivo'' testom, kar kaže, da sistem deluje primerljivo tudi v ''in vitro'' okolju. V primeru razdeljenega LacI-155 in -315, s komplementarnimi proteini, se je IPTG-odvisen signal prav tako povečevala do 3 ure. Rezultati opredeljujejo uspešno delovanje modularnega dvodelnega sistema ob uporabi CFPE (cell free protein expression) tehnologije, kar ga naredi primernega za številne analitične aplikacije. [1]

===3.4. Optimizacija sistema===

Cilj optimizacije je bil čim bolj zmanjšati vplive ozadja (nespecifično fluorescenco). Problema so se avtorji članka lotili tako, da so signal dobljen z uporabo razcepljenega lacI primerjali z wild-type signalom pri različnih vrednostih IPTG ter DNA. Ugotovili so, da fluorescenca doseže plato pri 200 µM IPTG. Najboljše razmerje signal-ozadje pa je bilo doseženo pri 100 ng DNA (glede na standard seta PURExpress®). [1]

==4. Zaključek==

Predstavljen sistem na principu razcepljenih transkripcijskih faktorjev ponuja številne možnosti za napredek diagnostičnih metod in študij interakcij. Ko se tarčne molekule vežejo na eno od proteinskih oznak, te konkurenčno zavirajo ponovno sestavljanje fragmentov LacI, kar ima za posledico neprekinjeno aktivacijo izražanja reporterskega gena neodvisno od IPTG. Te fuzijske beljakovinske oznake ponujajo fleksibilnost in jih je mogoče zamenjati glede na interes tarče, kar je prednostno za razvoj različnih biosenzorjev. Dodatna prednost je možnost uporabe sistema v izvenceličnem okolju. Čeprav predstavljen sistem ne ponuja toliko potenciala z vidika identifikacij velikega števila interakcij, kot ga ponujajo tradicionalni sistemi, kot na primer dvohibridni sistem kvasovk, avtorji članka ob ponujenih možnostih za optimizacijo, navajajo prednosti sistema predvsem v enostavnosti, hitrosti in obstojnosti sistema zaradi možnosti izvedbe v izvenceličnem sistemu (CFPE), kar bi pomenilo precejšnjo prednost v medicinski diagnostiki, ki omogoča detekcijo že na samem mestu odvzema vzorca (point-of-care). [1]

==Viri==

[1] Lee, H., Rha, E. & Kim, H. Development and optimization of a modular two-fragment LacI switch for enhanced biosensor applications. Biotechnol Bioproc E 29, 109–117 (2024). https://doi.org/10.1007/s12257-024-00020-w

[2] Slomovic S, Pardee K, Collins JJ (2015) Synthetic biology devices for in vitro and in vivo diagnostics. Proc Natl Acad Sci USA 112:14429–14435. https://doi.org/10.1073/pnas.1508521112

[3] Datsenko KA, Wanner BL (2000) One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proc Natl Acad Sci USA 97:6640–6645. https://doi.org/10.1073/pnas.120163297

Razvoj in optimizacija modularnega dvofragmentnega LacI stikala za naprednejšo biodetekcijo

2024-05-27T21:09:06Z

Luka Stanković: /* 3.1. Identifikacija dostopnega cepitvenega mesta LacI represorja */

Povezava do izhodiščnega članka: [https://link.springer.com/article/10.1007/s12257-024-00020-w Razvoj in optimizacija modularnega dvofragmentnega LacI stikala za naprednejšo biodetekcijo]

==1. Uvod==

Genska stikala (genetic switches) so ključni elementi za regulacijo izražanja specifičnih genov. Zaradi njihovega širokega spektra delovanja in modularnosti so v sintezni biologiji ključnega pomena. Eni najpogosteje uporabljenih genskih stikal so transkripcijski faktorji. Slednji premorejo veliko potenciala za optimizacijo različnih postopkov pri molekulskem inžinjiringu in različnih področjih diagnostike. [1]

V članku ''Development and optimization of a modular two-fragment LacI switch for enhanced biosensor applications'' je raziskovalna skupina predstavila potencialno uporabo represorja laktoznega operona LacI za detekcijo prisotnosti specifičnih proteinov ali interakcije med njimi. Predstavljen princip temelji na metodi z razcepljenimi proteini. LacI so razcepili na dva fragmenta. Na DNA vezavno domeno in regulatorno domeno. Na oba fragmenta so pripeli peptida, ki sta bila med seboj komplementarna. Komplementarna peptida omogočata spajanjenje obeh LacI fragmentov v funkcionalen LacI represor, ki se veže na operatorsko regijo Lac operona in zavre prepisovanje genov operona. Z izbiro ustreznega komplementarnega peptida, bi lahko detektirali prisotnost tarčnega proteina, ki bi z vezavo na komplementarno regijo fuzijskega proteina preprečil spajanje LacI fragmentov v aktivni encim. Posledično ne bi prišlo do represije reporterskih genov na operonu, kar bi zaznali z detekcijo signala. [1, 2]

==2. Metode za razvoj sistema==

Poglavitni problem pri razvoju metode je bilo ugotoviti, kako bi LacI razdelili na dve fuzijski podenoti (z poljubnima komplementarnima peptidoma), ki bi po ponovni združitvi povrnili prvotno vlogo proteina. V ta namen je bilo potrebno pripraviti knjižnico zaporedij za represor LacI z vstavljenim določenim zaporedjem na naključnih mestih. Za namen lažje selekcije v kasnejših stopnjah, so se odločili, da bodo znotraj ''LacI'' gena vstavili transpozonsko zaporedje za ojačan zeleni fluorescenčni protein z markerjem za odpornost proti kanamicinu (eGFPuv-KanR). Slednji bi omogočal selekcijo vseh kolonij, kjer je prišlo do uspešne združitve obeh podenot preko emisije zelene svetlobe, medtem ko bi povrjeno aktivnost lacI detektirali preko represije sekundarnega reporterskega sistema (zapis za RFP) lac operona na ločenem plazmidu. [1]

===2.1. Konstrukcija sevov===

Za namen selekcije so morali v začetni stopnji v genom izbranega seva (DH5α) uvesti okvarjen gen za lacI represor. Okvaro so dosegli z rekombinacijo s pomočjo rdečega lambda bakteriofaga. Z rekombinacijo so v kromosom ustavili kaseto, ki so jo vzeli iz seva BW25113''ΔlacI::KmR'', pomnožili z metodo PCR. Zaporedje so preverili s sekvenciranjem zaporedja ter izvedli rekombinacijo s pomočjo vektorja pKD46. Vstavljena kaseta je poleg okvarjenega lacI gena vsebovala tudi selekcijski marker za odpornost proti kanamicinu. Po selekciji v gojišču ob prisotnosti kanamicina so prenesli ustrezne kolonije in zaporedje preverili s ponovno metodo PCR. V nadaljevanju so selekcijski marker odstranili s flipazo. [1, 3]

===2.2. Konstrukcija plazmidov===

Za namen selekcije kolonij DH5α z delujočim sistemom je bilo potrebno konstruirati dva plazmida. Prvi (pUCBB-eGFP) je vseboval zapis za lacI represor z vstavljenjim zaporedjem za eGFP pod konstitutivnim lacO promotorjem in selekcijskim markerjem za kanamicin, ki je bil kasneje odstranjen z NheI z nadaljno ligacijo z T4 ligazo. Drugi (pACBB-mRFP) je vseboval trc promoter, lac operator in zaporedje za mRFP. Za združevanje segmentov DNA so uporabili In-Fusion Cloning Kit (Clontech). [1]

===2.3. konstrukcija in vstavljanje transpozonske regije Tn5[GFPuv]===

Transpozone z GFP zaporedjem in markerjem za odpornost proti kanamicinu so dobili z vstavljanjem gfpuv gena iz pGFPuv (Clontech) v transpozon EZ-Tn5 (Epicentre) pred zapisom za gen KmR. Transpozonsko regijo so očistili z gelsko ekstrakcijo (Qiagen kit). 87 fm očiščenega transpozona so z ekvivalentno molsko maso tarčnega plazmida pUCBB-LacI 2 uri inkubirali v 10 µL Tris acetatnega pufra z 1 enoto EZ::TN™ (In-Frame Linker Insertion Kit; Epicentre) in 25 % glicerolom pri 37 %. Transpozicijo so po 2 urah ustavili z dodatkom 0.1% SDS in 10-minutno inkubacijo pri 70 °C. V nadaljevanju so z plazmidom transformirali E. coli DH5α z elektroporacijo ter bakterije gojili na ploščah ob prisotnosti ampicilina in kanamicina. Plazmid so iz kolonij, kjer je prišlo do inscercije transpozona izolirali z izolacijskim setom (Qiagen). [1]

==3. Rezultati in diskusija==

===3.1. Identifikacija dostopnega cepitvenega mesta LacI represorja===

Po transformaciji DH5α z obema plazmidoma (pACBB-mRFP in pUCBB-eGFP) so celice gojili na ploščah. Pri kolonijah, kjer je ni bilo zelene fluorescence, ni prišlo do spajanja podenot LacI represorja. V primeru, ko sta bili prisotni obe fluorescenci, je sicer prišlo do spajanja obeh podenot, saj je bil GFP funkcionalen, a je bil tronspozon vstavljen na takem mestu, da tudi po združitvi fragmentov LacI ni prišlo do povratka prvotne funkcije proteina, saj ni prišlo do represije izražanja RFP genov. Ustreznih kolonij, ki so fluorescirale zgolj z zeleno barvo je bilo 34 (od skupno ~ 1.6 × 10^4). Od tega so v nadaljevanju izbrali in izolirali 13 proteinov, kasneje pa s strukturno analizo izbrali 4 kandidate, ki so imeli cepitvena mesta na P155, N157, L307 in G315. Vsi kandidati so kasneje pokazali vsaj 1,6-kratno povečanje fluorescence ob prisotnosti 1mM IPTG. Ko so testirali spremembo fluorescence v primerih, ko je bil prisoten zgolj en od obeh fragmentov, spremembe fluorescence kot pričakovani ni bilo. [1]

===3.2. Testiranje delovanja sistema s komplementarnimi levcinskimi zadrgami===

V nadaljevanju so izvedli dodaten poskus s pripenjanjem dveh fragmentov lizinske zadrge na kandidata P155 in G315. Pri obeh kandidatih je prišlo do znižanja fluorescence v primerjavi s kontrolnimi skupinami, ki so vsebovale zgolj eno od obeh peptidov na fragmentih razcepljenega LacI. Znižanje je bilo moč zaznati tako ob prisotnosti, kot tudi ob odsotnosti IPTG. Dodatno so preizkusili tudi obnašanje sistema in vitro v celicah E. Coli, ki so jih inkubirali pri različnih koncentracijah IPTG (od 0 do 100 µM). Pri obeh kandidatih je prišlo do precej visoke fluorescence v odsotnosti od IPTG, kar nakazuje, da po vsej verjetnosti ni prišlo do ustreznega sestavljanja podenot v funkcionalen encim, kar bi lahko brez ustrezne optimizacije v praksi povzročilo precej omejitev z vidika občutljivosti metode. [1]

===3.3. Brezcelični sistem===

Reporterski fluorescenčni gen so poskusili izraziti z uporabo kompleta za ''in vitro'' sintezo beljakovin PURExpress®. Izražanje je bilo doseženo z dodatkom fragmentov razcepljenega LacI in fuzijskimi peptidi ter induktorjem IPTG. Spremljali so spremembe v intenzivnosti fluorescence skozi čas v serijskih reakcijah za tri različice LacI (divji tip, P155 in G315). Kot pričakovano, je divji tip LacI pokazal od IPTG-odvisen odziv. Fluorescenčni signal se je s časom povečeval, z največjo spremembo za 1,6-krat po 3-urni reakciji. Ta sprememba je primerljiva z ''in vivo'' testom, kar kaže, da sistem deluje primerljivo tudi v ''in vitro'' okolju. V primeru razdeljenega LacI-155 in -315, s komplementarnimi proteini, se je IPTG-odvisen signal prav tako povečevala do 3 ure. Rezultati opredeljujejo uspešno delovanje modularnega dvodelnega sistema ob uporabi CFPE (cell free protein expression) tehnologije, kar ga naredi primernega za številne analitične aplikacije. [1]

===3.4. Optimizacija sistema===

Cilj optimizacije je bil čim bolj zmanjšati vplive ozadja (nespecifično fluorescenco). Problema so se avtorji članka lotili tako, da so signal dobljen z uporabo razcepljenega lacI primerjali z wild-type signalom pri različnih vrednostih IPTG ter DNA. Ugotovili so, da fluorescenca doseže plato pri 200 µM IPTG. Najboljše razmerje signal-ozadje pa je bilo doseženo pri 100 ng DNA (glede na standard seta PURExpress®). [1]

==4. Zaključek==

Predstavljen sistem na principu razcepljenih transkripcijskih faktorjev ponuja številne možnosti za napredek diagnostičnih metod in študij interakcij. Ko se tarčne molekule vežejo na eno od proteinskih oznak, te konkurenčno zavirajo ponovno sestavljanje fragmentov LacI, kar ima za posledico neprekinjeno aktivacijo izražanja reporterskega gena neodvisno od IPTG. Te fuzijske beljakovinske oznake ponujajo fleksibilnost in jih je mogoče zamenjati glede na interes tarče, kar je prednostno za razvoj različnih biosenzorjev. Dodatna prednost je možnost uporabe sistema v izvenceličnem okolju. Čeprav predstavljen sistem ne ponuja toliko potenciala z vidika identifikacij velikega števila interakcij, kot ga ponujajo tradicionalni sistemi, kot na primer dvohibridni sistem kvasovk, avtorji članka ob ponujenih možnostih za optimizacijo, navajajo prednosti sistema predvsem v enostavnosti, hitrosti in obstojnosti sistema zaradi možnosti izvedbe v izvenceličnem sistemu (CFPE), kar bi pomenilo precejšnjo prednost v medicinski diagnostiki, ki omogoča detekcijo že na samem mestu odvzema vzorca (point-of-care). [1]

==Viri==

[1] Lee, H., Rha, E. & Kim, H. Development and optimization of a modular two-fragment LacI switch for enhanced biosensor applications. Biotechnol Bioproc E 29, 109–117 (2024). https://doi.org/10.1007/s12257-024-00020-w

[2] Slomovic S, Pardee K, Collins JJ (2015) Synthetic biology devices for in vitro and in vivo diagnostics. Proc Natl Acad Sci USA 112:14429–14435. https://doi.org/10.1073/pnas.1508521112

[3] Datsenko KA, Wanner BL (2000) One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proc Natl Acad Sci USA 97:6640–6645. https://doi.org/10.1073/pnas.120163297

Seminarji SB 2023/24

2024-05-27T19:15:20Z

Luka Stanković:

V študijskem letu 2023/24 študenti in študentke pri Sintezni biologiji predstavljajo naslednje teme:

RAZISKOVALNI ČLANKI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sinteznobiološki_pristop_k_sestavljanju_in_ponovnemu_zagonu_klinično_pomembnih_fagov_Pseudomonas_aeruginosa Sinteznobiološki pristop k sestavljanju in ponovnemu zagonu klinično pomembnih fagov ''Pseudomonas aeruginosa''] (Bor Krajnik)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Optogenetsko_prostorsko_vzorčenje_kooperacije_pri_glivah_kvasovkah Optogenetsko prostorsko vzorčenje kooperacije pri glivah kvasovkah] (Martin Stanonik)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sintetična_celična_linija_za_inducibilno_pakiranje_virusa_influence_A Sintetična celična linija za inducibilno pakiranje virusa influence A] (Klara Razboršek)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Uporaba_sesalskega_RNA-vezavnega_proteina_Musashi-1_kot_alosterično_reguliranega_translacijskega_represorja_v_E._coli Uporaba sesalskega RNA-vezavnega proteina Musashi-1 kot alosterično reguliranega translacijskega represorja v ''E. coli''] (Marko Kovačić)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Kaskadno_ojačano_genetsko_vezje_za_detekcijo_glivnih_patogenov Kaskadno ojačano genetsko vezje za detekcijo glivnih patogenov] (Jakob Tomšič)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sintetična_mRNA-stikala_s_povratno_zanko,_ki_omogočajo_zaznavanje_miRNA Sintetična mRNA-stikala s povratno zanko, ki omogočajo zaznavanje miRNA] (Ana Pervanja)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Molekularni_nabor_navzkrižno_hranjenih_sevov_za_pripravo_sintetičnih_skupnosti_kvasovk Molekularni nabor navzkrižno hranjenih sevov za pripravo sintetičnih skupnosti kvasovk] (Teja Spruk)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Inženiring_dinamike_rasti_sesalskih_celic_za_bioproizvodnjo Inženiring dinamike rasti sesalskih celic za bioproizvodnjo] (Zarja Rožanc)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Inženirane_mRNA-ribosomske_fuzije_za_lažjo_biosintezo_selenoproteinov Inženirane mRNA-ribosomske fuzije za lažjo biosintezo selenoproteinov] (Kostadin Mitkov)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Razvoj_novih_binarnih_ekspresijskih_sistemov_za_sintezno_biologijo_rastlin Razvoj novih binarnih ekspresijskih sistemov za sintezno biologijo rastlin] (Alliana Kolar)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Kombinatorična_biosinteza_terpenoidov_v_kvasovkah Kombinatorična biosinteza terpenoidov v kvasovkah] (Jan Kogovšek)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Identifikacija_genov,_ki_se_odzivajo_na_stres_kislega_okolja_in_inženiring_odpornosti_na_kislo_okolje_v_cianobakteriji_Synechococcus_elongatus_PCC_7942 Identifikacija genov, ki se odzivajo na stres kislega okolja in inženiring odpornosti na kislo okolje v cianobakteriji ''Synechococcus elongatus'' PCC 7942] (Ela Kovač)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Vse_v_enem-IQ_preklopna_stikala_z_veliko_vsestranskostjo_za_natančno_nastavitev_izražanja_transgenov_v_sesalskih_celicah_in_tkivih Vse v enem-IQ preklopna stikala z veliko vsestranskostjo za natančno nastavitev izražanja transgenov v sesalskih celicah in tkivih] (Ena Kartal)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Podenote_E3_ligaznega_kompleksa_kot_degroni_za_učinkovito_degradacijo_citosolnih,_jedrnih_in_membranskih_proteinov Podenote E3 ligaznega kompleksa kot degroni za učinkovito degradacijo citosolnih, jedrnih in membranskih proteinov] (David Valte)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Razvoj_robustnega_sistema_genetskega_biozadrževanja_kvasovk_s_stikalom_za_stabilnost_proteinov Razvoj robustnega sistema genetskega biozadrževanja kvasovk s stikalom za stabilnost proteinov] (Mark Loborec)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Reprogramiranje_z_doksiciklinom_inducibilnega_genskega_stikala_za_bakterijsko_posredovano_terapijo Reprogramiranje z doksiciklinom inducibilnega genskega stikala za bakterijsko posredovano terapijo] (Špela Sotlar)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/A_flexible_,_modular_and_versatile_part_assembly_toolkit_for_gene_cluster_engineering_in_Streptomyces A flexible, modular and versatile part assembly toolkit for gene cluster engineering in Streptomyces] (Damjan Pop Stefanija)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Metoda_TASER_za_detekijo_nukleinskih_kislin TASER: Metoda TASER za detekcijo nukleinskih kislin] (Srna Anastasovska)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Razvoj_in_optimizacija_modularnega_dvofragmentnega_LacI_stikala_za_naprednej%C5%A1o_biodetekcijo Razvoj in optimizacija modularnega dvofragmentnega LacI stikala za naprednejšo biodetekcijo] (Luka Stanković)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Razvoj_novih_genskih_orodij_v_metanotrofih Razvoj novih gensikih orodij v metanotrofih] (Jan Pistotnik)

NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/PhaseOut Biološka proizvodnja bioplastike] (Sašo Jakob)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BeeYeast Inženiring kvasovk za boj proti virusnim okužbam čebel] (Mateja Milošević)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Cellect Cellect - Fenotipsko stabilne celične linije] (Lucija Voga)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/oPHAelia oPHAelia - Inovativna rešitev za zmanjšanje onesnaževanja s plastiko] (Irina Kostadinoska)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/ReMixHD ReMixHD - Recikliranje mešanih plastičnih odpadkov] (Ema Kavčič)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/DARWINS DARWINS - Usmerjena posodobitev proteinov Ago z idealno proteinsko termično stabilnostjo] (Rahela Petrovčič)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/PET-2-Protein PET-2-Protein - Proizvodnja mikrobnih proteinov iz polietilen tereftalata] (Zala Perko)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/48C_Cadmium_catcher_LBP 48C Cadmium catcher LBP- Proizvodnja bioterapevtika za vezavo kadmija] (Maja Deutsch)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Proteus Proteus - Sistem za ciljanje onkogenov in induciranje piroptoze] (Gašper Struna)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Silinker Silinker] (Nuša Brdnik)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sublimestone Sublimestone - uporaba bakterij za ohranjanje kulturne dediščine] (Ana Maučec)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/LAMPS LAMPS - sistem svetlečih alg] (Rebeka Jerina)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/FluoroLoop#Problematika_PFAS FluoroLoop] (Eva Vene)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/OASYS OASYS - Diagnostični pripomoček za klinično depresijo] (Ajda Dedič)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/OTTER OTTER - Optimizirana tehnika za načrtovanje in karakterizacijo RNA-stikal] (Luka Hafner)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Li+on_Switch Li+on Switch] (Hana Glavnik)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/DRIP DRIP] (Klara Ažbe)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/B.HOME B.HOME] (Luša Karner)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Methanivore Methanivore] (Anja Moškrič)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/cELPro cELPro] (Jan Trebušak)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/AureoBos AureoBos] (Tina Javeršek)

Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Povzetek je treba objaviti dva dni pred predstavitvijo do polnoči (za seminarje v sredo torej v ponedeljek). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo približno 5-minutna razprava.

Terminski razpored je razviden iz preglednice na strežniku Google Drive.

Kako je videti seznam seminarjev, lahko preverite pri lanskem letniku: [[Seminarji_SB_2022/23]].

Razvoj in optimizacija modularnega dvofragmentnega LacI stikala za naprednejšo biodetekcijo

2024-05-27T15:47:01Z

Luka Stanković: /* 3.3. Brezcelični sistem */

Povezava do izhodiščnega članka: [https://link.springer.com/article/10.1007/s12257-024-00020-w Razvoj in optimizacija modularnega dvofragmentnega LacI stikala za naprednejšo biodetekcijo]

==1. Uvod==

Genska stikala (genetic switches) so ključni elementi za regulacijo izražanja specifičnih genov. Zaradi njihovega širokega spektra delovanja in modularnosti so v sintezni biologiji ključnega pomena. Eni najpogosteje uporabljenih genskih stikal so transkripcijski faktorji. Slednji premorejo veliko potenciala za optimizacijo različnih postopkov pri molekulskem inžinjiringu in različnih področjih diagnostike. [1]

V članku ''Development and optimization of a modular two-fragment LacI switch for enhanced biosensor applications'' je raziskovalna skupina predstavila potencialno uporabo represorja laktoznega operona LacI za detekcijo prisotnosti specifičnih proteinov ali interakcije med njimi. Predstavljen princip temelji na metodi z razcepljenimi proteini. LacI so razcepili na dva fragmenta. Na DNA vezavno domeno in regulatorno domeno. Na oba fragmenta so pripeli peptida, ki sta bila med seboj komplementarna. Komplementarna peptida omogočata spajanjenje obeh LacI fragmentov v funkcionalen LacI represor, ki se veže na operatorsko regijo Lac operona in zavre prepisovanje genov operona. Z izbiro ustreznega komplementarnega peptida, bi lahko detektirali prisotnost tarčnega proteina, ki bi z vezavo na komplementarno regijo fuzijskega proteina preprečil spajanje LacI fragmentov v aktivni encim. Posledično ne bi prišlo do represije reporterskih genov na operonu, kar bi zaznali z detekcijo signala. [1, 2]

==2. Metode za razvoj sistema==

Poglavitni problem pri razvoju metode je bilo ugotoviti, kako bi LacI razdelili na dve fuzijski podenoti (z poljubnima komplementarnima peptidoma), ki bi po ponovni združitvi povrnili prvotno vlogo proteina. V ta namen je bilo potrebno pripraviti knjižnico zaporedij za represor LacI z vstavljenim določenim zaporedjem na naključnih mestih. Za namen lažje selekcije v kasnejših stopnjah, so se odločili, da bodo znotraj ''LacI'' gena vstavili transpozonsko zaporedje za ojačan zeleni fluorescenčni protein z markerjem za odpornost proti kanamicinu (eGFPuv-KanR). Slednji bi omogočal selekcijo vseh kolonij, kjer je prišlo do uspešne združitve obeh podenot preko emisije zelene svetlobe, medtem ko bi povrjeno aktivnost lacI detektirali preko represije sekundarnega reporterskega sistema (zapis za RFP) lac operona na ločenem plazmidu. [1]

===2.1. Konstrukcija sevov===

Za namen selekcije so morali v začetni stopnji v genom izbranega seva (DH5α) uvesti okvarjen gen za lacI represor. Okvaro so dosegli z rekombinacijo s pomočjo rdečega lambda bakteriofaga. Z rekombinacijo so v kromosom ustavili kaseto, ki so jo vzeli iz seva BW25113''ΔlacI::KmR'', pomnožili z metodo PCR. Zaporedje so preverili s sekvenciranjem zaporedja ter izvedli rekombinacijo s pomočjo vektorja pKD46. Vstavljena kaseta je poleg okvarjenega lacI gena vsebovala tudi selekcijski marker za odpornost proti kanamicinu. Po selekciji v gojišču ob prisotnosti kanamicina so prenesli ustrezne kolonije in zaporedje preverili s ponovno metodo PCR. V nadaljevanju so selekcijski marker odstranili s flipazo. [1, 3]

===2.2. Konstrukcija plazmidov===

Za namen selekcije kolonij DH5α z delujočim sistemom je bilo potrebno konstruirati dva plazmida. Prvi (pUCBB-eGFP) je vseboval zapis za lacI represor z vstavljenjim zaporedjem za eGFP pod konstitutivnim lacO promotorjem in selekcijskim markerjem za kanamicin, ki je bil kasneje odstranjen z NheI z nadaljno ligacijo z T4 ligazo. Drugi (pACBB-mRFP) je vseboval trc promoter, lac operator in zaporedje za mRFP. Za združevanje segmentov DNA so uporabili In-Fusion Cloning Kit (Clontech). [1]

===2.3. konstrukcija in vstavljanje transpozonske regije Tn5[GFPuv]===

Transpozone z GFP zaporedjem in markerjem za odpornost proti kanamicinu so dobili z vstavljanjem gfpuv gena iz pGFPuv (Clontech) v transpozon EZ-Tn5 (Epicentre) pred zapisom za gen KmR. Transpozonsko regijo so očistili z gelsko ekstrakcijo (Qiagen kit). 87 fm očiščenega transpozona so z ekvivalentno molsko maso tarčnega plazmida pUCBB-LacI 2 uri inkubirali v 10 µL Tris acetatnega pufra z 1 enoto EZ::TN™ (In-Frame Linker Insertion Kit; Epicentre) in 25 % glicerolom pri 37 %. Transpozicijo so po 2 urah ustavili z dodatkom 0.1% SDS in 10-minutno inkubacijo pri 70 °C. V nadaljevanju so z plazmidom transformirali E. coli DH5α z elektroporacijo ter bakterije gojili na ploščah ob prisotnosti ampicilina in kanamicina. Plazmid so iz kolonij, kjer je prišlo do inscercije transpozona izolirali z izolacijskim setom (Qiagen). [1]

==3. Rezultati in diskusija==

===3.1. Identifikacija dostopnega cepitvenega mesta LacI represorja===

Po transformaciji DH5α z obema plazmidoma (pACBB-mRFP in pUCBB-eGFP) so celice gojili na ploščah. Pri kolonijah, kjer je ni bilo zelene fluorescence, ni prišlo do spajanja podenot LacI represorja. V primeru, ko sta bili prisotni obe fluorescenci, je sicer prišlo do spajanja obeh podenot, saj je bil GFP funkcionalen, a je bil tronspozon vstavljen na takem mestu, da tudi po združitvi fragmentov LacI ni prišlo do povratka prvotne funkcije proteina, saj ni prišlo do represije izražanja RFP genov. Ustreznih kolonij, ki so fluorescirale zgolj z zeleno barvo je bilo 34 (od skupno ~ 1.6 × 104). Od tega so v nadaljevanju izbrali in izolirali 13 proteinov, kasneje pa s strukturno analizo izbrali 4 kandidate, ki so imeli cepitvena mesta na P155, N157, L307 in G315. Vsi kandidati so kasneje pokazali vsaj 1,6-kratno povečanje fluorescence ob prisotnosti 1mM IPTG. Ko so testirali spremembo fluorescence v primerih, ko je bil prisoten zgolj en od obeh fragmentov, spremembe fluorescence kot pričakovani ni bilo. [1]

===3.2. Testiranje delovanja sistema s komplementarnimi levcinskimi zadrgami===

V nadaljevanju so izvedli dodaten poskus s pripenjanjem dveh fragmentov lizinske zadrge na kandidata P155 in G315. Pri obeh kandidatih je prišlo do znižanja fluorescence v primerjavi s kontrolnimi skupinami, ki so vsebovale zgolj eno od obeh peptidov na fragmentih razcepljenega LacI. Znižanje je bilo moč zaznati tako ob prisotnosti, kot tudi ob odsotnosti IPTG. Dodatno so preizkusili tudi obnašanje sistema in vitro v celicah E. Coli, ki so jih inkubirali pri različnih koncentracijah IPTG (od 0 do 100 µM). Pri obeh kandidatih je prišlo do precej visoke fluorescence v odsotnosti od IPTG, kar nakazuje, da po vsej verjetnosti ni prišlo do ustreznega sestavljanja podenot v funkcionalen encim, kar bi lahko brez ustrezne optimizacije v praksi povzročilo precej omejitev z vidika občutljivosti metode. [1]

===3.3. Brezcelični sistem===

Reporterski fluorescenčni gen so poskusili izraziti z uporabo kompleta za ''in vitro'' sintezo beljakovin PURExpress®. Izražanje je bilo doseženo z dodatkom fragmentov razcepljenega LacI in fuzijskimi peptidi ter induktorjem IPTG. Spremljali so spremembe v intenzivnosti fluorescence skozi čas v serijskih reakcijah za tri različice LacI (divji tip, P155 in G315). Kot pričakovano, je divji tip LacI pokazal od IPTG-odvisen odziv. Fluorescenčni signal se je s časom povečeval, z največjo spremembo za 1,6-krat po 3-urni reakciji. Ta sprememba je primerljiva z ''in vivo'' testom, kar kaže, da sistem deluje primerljivo tudi v ''in vitro'' okolju. V primeru razdeljenega LacI-155 in -315, s komplementarnimi proteini, se je IPTG-odvisen signal prav tako povečevala do 3 ure. Rezultati opredeljujejo uspešno delovanje modularnega dvodelnega sistema ob uporabi CFPE (cell free protein expression) tehnologije, kar ga naredi primernega za številne analitične aplikacije. [1]

===3.4. Optimizacija sistema===

Cilj optimizacije je bil čim bolj zmanjšati vplive ozadja (nespecifično fluorescenco). Problema so se avtorji članka lotili tako, da so signal dobljen z uporabo razcepljenega lacI primerjali z wild-type signalom pri različnih vrednostih IPTG ter DNA. Ugotovili so, da fluorescenca doseže plato pri 200 µM IPTG. Najboljše razmerje signal-ozadje pa je bilo doseženo pri 100 ng DNA (glede na standard seta PURExpress®). [1]

==4. Zaključek==

Predstavljen sistem na principu razcepljenih transkripcijskih faktorjev ponuja številne možnosti za napredek diagnostičnih metod in študij interakcij. Ko se tarčne molekule vežejo na eno od proteinskih oznak, te konkurenčno zavirajo ponovno sestavljanje fragmentov LacI, kar ima za posledico neprekinjeno aktivacijo izražanja reporterskega gena neodvisno od IPTG. Te fuzijske beljakovinske oznake ponujajo fleksibilnost in jih je mogoče zamenjati glede na interes tarče, kar je prednostno za razvoj različnih biosenzorjev. Dodatna prednost je možnost uporabe sistema v izvenceličnem okolju. Čeprav predstavljen sistem ne ponuja toliko potenciala z vidika identifikacij velikega števila interakcij, kot ga ponujajo tradicionalni sistemi, kot na primer dvohibridni sistem kvasovk, avtorji članka ob ponujenih možnostih za optimizacijo, navajajo prednosti sistema predvsem v enostavnosti, hitrosti in obstojnosti sistema zaradi možnosti izvedbe v izvenceličnem sistemu (CFPE), kar bi pomenilo precejšnjo prednost v medicinski diagnostiki, ki omogoča detekcijo že na samem mestu odvzema vzorca (point-of-care). [1]

==Viri==

[1] Lee, H., Rha, E. & Kim, H. Development and optimization of a modular two-fragment LacI switch for enhanced biosensor applications. Biotechnol Bioproc E 29, 109–117 (2024). https://doi.org/10.1007/s12257-024-00020-w

[2] Slomovic S, Pardee K, Collins JJ (2015) Synthetic biology devices for in vitro and in vivo diagnostics. Proc Natl Acad Sci USA 112:14429–14435. https://doi.org/10.1073/pnas.1508521112

[3] Datsenko KA, Wanner BL (2000) One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proc Natl Acad Sci USA 97:6640–6645. https://doi.org/10.1073/pnas.120163297

Razvoj in optimizacija modularnega dvofragmentnega LacI stikala za naprednejšo biodetekcijo

2024-05-27T02:26:24Z

Luka Stanković: /* Viri */

Povezava do izhodiščnega članka: [https://link.springer.com/article/10.1007/s12257-024-00020-w Razvoj in optimizacija modularnega dvofragmentnega LacI stikala za naprednejšo biodetekcijo]

==1. Uvod==

Genska stikala (genetic switches) so ključni elementi za regulacijo izražanja specifičnih genov. Zaradi njihovega širokega spektra delovanja in modularnosti so v sintezni biologiji ključnega pomena. Eni najpogosteje uporabljenih genskih stikal so transkripcijski faktorji. Slednji premorejo veliko potenciala za optimizacijo različnih postopkov pri molekulskem inžinjiringu in različnih področjih diagnostike. [1]

V članku ''Development and optimization of a modular two-fragment LacI switch for enhanced biosensor applications'' je raziskovalna skupina predstavila potencialno uporabo represorja laktoznega operona LacI za detekcijo prisotnosti specifičnih proteinov ali interakcije med njimi. Predstavljen princip temelji na metodi z razcepljenimi proteini. LacI so razcepili na dva fragmenta. Na DNA vezavno domeno in regulatorno domeno. Na oba fragmenta so pripeli peptida, ki sta bila med seboj komplementarna. Komplementarna peptida omogočata spajanjenje obeh LacI fragmentov v funkcionalen LacI represor, ki se veže na operatorsko regijo Lac operona in zavre prepisovanje genov operona. Z izbiro ustreznega komplementarnega peptida, bi lahko detektirali prisotnost tarčnega proteina, ki bi z vezavo na komplementarno regijo fuzijskega proteina preprečil spajanje LacI fragmentov v aktivni encim. Posledično ne bi prišlo do represije reporterskih genov na operonu, kar bi zaznali z detekcijo signala. [1, 2]

==2. Metode za razvoj sistema==

Poglavitni problem pri razvoju metode je bilo ugotoviti, kako bi LacI razdelili na dve fuzijski podenoti (z poljubnima komplementarnima peptidoma), ki bi po ponovni združitvi povrnili prvotno vlogo proteina. V ta namen je bilo potrebno pripraviti knjižnico zaporedij za represor LacI z vstavljenim določenim zaporedjem na naključnih mestih. Za namen lažje selekcije v kasnejših stopnjah, so se odločili, da bodo znotraj ''LacI'' gena vstavili transpozonsko zaporedje za ojačan zeleni fluorescenčni protein z markerjem za odpornost proti kanamicinu (eGFPuv-KanR). Slednji bi omogočal selekcijo vseh kolonij, kjer je prišlo do uspešne združitve obeh podenot preko emisije zelene svetlobe, medtem ko bi povrjeno aktivnost lacI detektirali preko represije sekundarnega reporterskega sistema (zapis za RFP) lac operona na ločenem plazmidu. [1]

===2.1. Konstrukcija sevov===

Za namen selekcije so morali v začetni stopnji v genom izbranega seva (DH5α) uvesti okvarjen gen za lacI represor. Okvaro so dosegli z rekombinacijo s pomočjo rdečega lambda bakteriofaga. Z rekombinacijo so v kromosom ustavili kaseto, ki so jo vzeli iz seva BW25113''ΔlacI::KmR'', pomnožili z metodo PCR. Zaporedje so preverili s sekvenciranjem zaporedja ter izvedli rekombinacijo s pomočjo vektorja pKD46. Vstavljena kaseta je poleg okvarjenega lacI gena vsebovala tudi selekcijski marker za odpornost proti kanamicinu. Po selekciji v gojišču ob prisotnosti kanamicina so prenesli ustrezne kolonije in zaporedje preverili s ponovno metodo PCR. V nadaljevanju so selekcijski marker odstranili s flipazo. [1, 3]

===2.2. Konstrukcija plazmidov===

Za namen selekcije kolonij DH5α z delujočim sistemom je bilo potrebno konstruirati dva plazmida. Prvi (pUCBB-eGFP) je vseboval zapis za lacI represor z vstavljenjim zaporedjem za eGFP pod konstitutivnim lacO promotorjem in selekcijskim markerjem za kanamicin, ki je bil kasneje odstranjen z NheI z nadaljno ligacijo z T4 ligazo. Drugi (pACBB-mRFP) je vseboval trc promoter, lac operator in zaporedje za mRFP. Za združevanje segmentov DNA so uporabili In-Fusion Cloning Kit (Clontech). [1]

===2.3. konstrukcija in vstavljanje transpozonske regije Tn5[GFPuv]===

Transpozone z GFP zaporedjem in markerjem za odpornost proti kanamicinu so dobili z vstavljanjem gfpuv gena iz pGFPuv (Clontech) v transpozon EZ-Tn5 (Epicentre) pred zapisom za gen KmR. Transpozonsko regijo so očistili z gelsko ekstrakcijo (Qiagen kit). 87 fm očiščenega transpozona so z ekvivalentno molsko maso tarčnega plazmida pUCBB-LacI 2 uri inkubirali v 10 µL Tris acetatnega pufra z 1 enoto EZ::TN™ (In-Frame Linker Insertion Kit; Epicentre) in 25 % glicerolom pri 37 %. Transpozicijo so po 2 urah ustavili z dodatkom 0.1% SDS in 10-minutno inkubacijo pri 70 °C. V nadaljevanju so z plazmidom transformirali E. coli DH5α z elektroporacijo ter bakterije gojili na ploščah ob prisotnosti ampicilina in kanamicina. Plazmid so iz kolonij, kjer je prišlo do inscercije transpozona izolirali z izolacijskim setom (Qiagen). [1]

==3. Rezultati in diskusija==

===3.1. Identifikacija dostopnega cepitvenega mesta LacI represorja===

Po transformaciji DH5α z obema plazmidoma (pACBB-mRFP in pUCBB-eGFP) so celice gojili na ploščah. Pri kolonijah, kjer je ni bilo zelene fluorescence, ni prišlo do spajanja podenot LacI represorja. V primeru, ko sta bili prisotni obe fluorescenci, je sicer prišlo do spajanja obeh podenot, saj je bil GFP funkcionalen, a je bil tronspozon vstavljen na takem mestu, da tudi po združitvi fragmentov LacI ni prišlo do povratka prvotne funkcije proteina, saj ni prišlo do represije izražanja RFP genov. Ustreznih kolonij, ki so fluorescirale zgolj z zeleno barvo je bilo 34 (od skupno ~ 1.6 × 104). Od tega so v nadaljevanju izbrali in izolirali 13 proteinov, kasneje pa s strukturno analizo izbrali 4 kandidate, ki so imeli cepitvena mesta na P155, N157, L307 in G315. Vsi kandidati so kasneje pokazali vsaj 1,6-kratno povečanje fluorescence ob prisotnosti 1mM IPTG. Ko so testirali spremembo fluorescence v primerih, ko je bil prisoten zgolj en od obeh fragmentov, spremembe fluorescence kot pričakovani ni bilo. [1]

===3.2. Testiranje delovanja sistema s komplementarnimi levcinskimi zadrgami===

V nadaljevanju so izvedli dodaten poskus s pripenjanjem dveh fragmentov lizinske zadrge na kandidata P155 in G315. Pri obeh kandidatih je prišlo do znižanja fluorescence v primerjavi s kontrolnimi skupinami, ki so vsebovale zgolj eno od obeh peptidov na fragmentih razcepljenega LacI. Znižanje je bilo moč zaznati tako ob prisotnosti, kot tudi ob odsotnosti IPTG. Dodatno so preizkusili tudi obnašanje sistema in vitro v celicah E. Coli, ki so jih inkubirali pri različnih koncentracijah IPTG (od 0 do 100 µM). Pri obeh kandidatih je prišlo do precej visoke fluorescence v odsotnosti od IPTG, kar nakazuje, da po vsej verjetnosti ni prišlo do ustreznega sestavljanja podenot v funkcionalen encim, kar bi lahko brez ustrezne optimizacije v praksi povzročilo precej omejitev z vidika občutljivosti metode. [1]

===3.3. Brezcelični sistem===

Reporterski fluorescenčni gen so poskusili izraziti z uporabo kompleta za in vitro sintezo beljakovin PURExpress®. Izražanje je bilo doseženo z dodatkom fragmentov razcepljenega LacI in fuzijskimi peptidi ter induktorjem IPTG. Spremljali so spremembe v intenzivnosti fluorescence skozi čas v serijskih reakcijah za tri različice LacI (divji tip, P155 in G315). Kot pričakovano, je divji tip LacI pokazal od IPTG-odvisen odziv. Fluorescenčni signal se je s časom povečeval, z največjo spremembo za 1,6-krat po 3-urni reakciji. Ta sprememba je primerljiva z in vivo testom, kar kaže, da sistem deluje primerljivo tudi v in vitro okolju. V primeru razdeljenega LacI-155 in -315, s komplementarnimi proteini, se je IPTG-odvisen signal prav tako povečevala do 3 ure. Rezultati opredeljujejo uspešno delovanje modularnega dvodelnega sistema ob uporabi CFPE (cell free protein expression) tehnologije, kar ga naredi primernega za številne analitične aplikacije. [1]

===3.4. Optimizacija sistema===

Cilj optimizacije je bil čim bolj zmanjšati vplive ozadja (nespecifično fluorescenco). Problema so se avtorji članka lotili tako, da so signal dobljen z uporabo razcepljenega lacI primerjali z wild-type signalom pri različnih vrednostih IPTG ter DNA. Ugotovili so, da fluorescenca doseže plato pri 200 µM IPTG. Najboljše razmerje signal-ozadje pa je bilo doseženo pri 100 ng DNA (glede na standard seta PURExpress®). [1]

==4. Zaključek==

Predstavljen sistem na principu razcepljenih transkripcijskih faktorjev ponuja številne možnosti za napredek diagnostičnih metod in študij interakcij. Ko se tarčne molekule vežejo na eno od proteinskih oznak, te konkurenčno zavirajo ponovno sestavljanje fragmentov LacI, kar ima za posledico neprekinjeno aktivacijo izražanja reporterskega gena neodvisno od IPTG. Te fuzijske beljakovinske oznake ponujajo fleksibilnost in jih je mogoče zamenjati glede na interes tarče, kar je prednostno za razvoj različnih biosenzorjev. Dodatna prednost je možnost uporabe sistema v izvenceličnem okolju. Čeprav predstavljen sistem ne ponuja toliko potenciala z vidika identifikacij velikega števila interakcij, kot ga ponujajo tradicionalni sistemi, kot na primer dvohibridni sistem kvasovk, avtorji članka ob ponujenih možnostih za optimizacijo, navajajo prednosti sistema predvsem v enostavnosti, hitrosti in obstojnosti sistema zaradi možnosti izvedbe v izvenceličnem sistemu (CFPE), kar bi pomenilo precejšnjo prednost v medicinski diagnostiki, ki omogoča detekcijo že na samem mestu odvzema vzorca (point-of-care). [1]

==Viri==

[1] Lee, H., Rha, E. & Kim, H. Development and optimization of a modular two-fragment LacI switch for enhanced biosensor applications. Biotechnol Bioproc E 29, 109–117 (2024). https://doi.org/10.1007/s12257-024-00020-w

[2] Slomovic S, Pardee K, Collins JJ (2015) Synthetic biology devices for in vitro and in vivo diagnostics. Proc Natl Acad Sci USA 112:14429–14435. https://doi.org/10.1073/pnas.1508521112

[3] Datsenko KA, Wanner BL (2000) One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proc Natl Acad Sci USA 97:6640–6645. https://doi.org/10.1073/pnas.120163297

Razvoj in optimizacija modularnega dvofragmentnega LacI stikala za naprednejšo biodetekcijo

2024-05-27T02:25:27Z

Luka Stanković:

Povezava do izhodiščnega članka: [https://link.springer.com/article/10.1007/s12257-024-00020-w Razvoj in optimizacija modularnega dvofragmentnega LacI stikala za naprednejšo biodetekcijo]

==1. Uvod==

Genska stikala (genetic switches) so ključni elementi za regulacijo izražanja specifičnih genov. Zaradi njihovega širokega spektra delovanja in modularnosti so v sintezni biologiji ključnega pomena. Eni najpogosteje uporabljenih genskih stikal so transkripcijski faktorji. Slednji premorejo veliko potenciala za optimizacijo različnih postopkov pri molekulskem inžinjiringu in različnih področjih diagnostike. [1]

V članku ''Development and optimization of a modular two-fragment LacI switch for enhanced biosensor applications'' je raziskovalna skupina predstavila potencialno uporabo represorja laktoznega operona LacI za detekcijo prisotnosti specifičnih proteinov ali interakcije med njimi. Predstavljen princip temelji na metodi z razcepljenimi proteini. LacI so razcepili na dva fragmenta. Na DNA vezavno domeno in regulatorno domeno. Na oba fragmenta so pripeli peptida, ki sta bila med seboj komplementarna. Komplementarna peptida omogočata spajanjenje obeh LacI fragmentov v funkcionalen LacI represor, ki se veže na operatorsko regijo Lac operona in zavre prepisovanje genov operona. Z izbiro ustreznega komplementarnega peptida, bi lahko detektirali prisotnost tarčnega proteina, ki bi z vezavo na komplementarno regijo fuzijskega proteina preprečil spajanje LacI fragmentov v aktivni encim. Posledično ne bi prišlo do represije reporterskih genov na operonu, kar bi zaznali z detekcijo signala. [1, 2]

==2. Metode za razvoj sistema==

Poglavitni problem pri razvoju metode je bilo ugotoviti, kako bi LacI razdelili na dve fuzijski podenoti (z poljubnima komplementarnima peptidoma), ki bi po ponovni združitvi povrnili prvotno vlogo proteina. V ta namen je bilo potrebno pripraviti knjižnico zaporedij za represor LacI z vstavljenim določenim zaporedjem na naključnih mestih. Za namen lažje selekcije v kasnejših stopnjah, so se odločili, da bodo znotraj ''LacI'' gena vstavili transpozonsko zaporedje za ojačan zeleni fluorescenčni protein z markerjem za odpornost proti kanamicinu (eGFPuv-KanR). Slednji bi omogočal selekcijo vseh kolonij, kjer je prišlo do uspešne združitve obeh podenot preko emisije zelene svetlobe, medtem ko bi povrjeno aktivnost lacI detektirali preko represije sekundarnega reporterskega sistema (zapis za RFP) lac operona na ločenem plazmidu. [1]

===2.1. Konstrukcija sevov===

Za namen selekcije so morali v začetni stopnji v genom izbranega seva (DH5α) uvesti okvarjen gen za lacI represor. Okvaro so dosegli z rekombinacijo s pomočjo rdečega lambda bakteriofaga. Z rekombinacijo so v kromosom ustavili kaseto, ki so jo vzeli iz seva BW25113''ΔlacI::KmR'', pomnožili z metodo PCR. Zaporedje so preverili s sekvenciranjem zaporedja ter izvedli rekombinacijo s pomočjo vektorja pKD46. Vstavljena kaseta je poleg okvarjenega lacI gena vsebovala tudi selekcijski marker za odpornost proti kanamicinu. Po selekciji v gojišču ob prisotnosti kanamicina so prenesli ustrezne kolonije in zaporedje preverili s ponovno metodo PCR. V nadaljevanju so selekcijski marker odstranili s flipazo. [1, 3]

===2.2. Konstrukcija plazmidov===

Za namen selekcije kolonij DH5α z delujočim sistemom je bilo potrebno konstruirati dva plazmida. Prvi (pUCBB-eGFP) je vseboval zapis za lacI represor z vstavljenjim zaporedjem za eGFP pod konstitutivnim lacO promotorjem in selekcijskim markerjem za kanamicin, ki je bil kasneje odstranjen z NheI z nadaljno ligacijo z T4 ligazo. Drugi (pACBB-mRFP) je vseboval trc promoter, lac operator in zaporedje za mRFP. Za združevanje segmentov DNA so uporabili In-Fusion Cloning Kit (Clontech). [1]

===2.3. konstrukcija in vstavljanje transpozonske regije Tn5[GFPuv]===

Transpozone z GFP zaporedjem in markerjem za odpornost proti kanamicinu so dobili z vstavljanjem gfpuv gena iz pGFPuv (Clontech) v transpozon EZ-Tn5 (Epicentre) pred zapisom za gen KmR. Transpozonsko regijo so očistili z gelsko ekstrakcijo (Qiagen kit). 87 fm očiščenega transpozona so z ekvivalentno molsko maso tarčnega plazmida pUCBB-LacI 2 uri inkubirali v 10 µL Tris acetatnega pufra z 1 enoto EZ::TN™ (In-Frame Linker Insertion Kit; Epicentre) in 25 % glicerolom pri 37 %. Transpozicijo so po 2 urah ustavili z dodatkom 0.1% SDS in 10-minutno inkubacijo pri 70 °C. V nadaljevanju so z plazmidom transformirali E. coli DH5α z elektroporacijo ter bakterije gojili na ploščah ob prisotnosti ampicilina in kanamicina. Plazmid so iz kolonij, kjer je prišlo do inscercije transpozona izolirali z izolacijskim setom (Qiagen). [1]

==3. Rezultati in diskusija==

===3.1. Identifikacija dostopnega cepitvenega mesta LacI represorja===

Po transformaciji DH5α z obema plazmidoma (pACBB-mRFP in pUCBB-eGFP) so celice gojili na ploščah. Pri kolonijah, kjer je ni bilo zelene fluorescence, ni prišlo do spajanja podenot LacI represorja. V primeru, ko sta bili prisotni obe fluorescenci, je sicer prišlo do spajanja obeh podenot, saj je bil GFP funkcionalen, a je bil tronspozon vstavljen na takem mestu, da tudi po združitvi fragmentov LacI ni prišlo do povratka prvotne funkcije proteina, saj ni prišlo do represije izražanja RFP genov. Ustreznih kolonij, ki so fluorescirale zgolj z zeleno barvo je bilo 34 (od skupno ~ 1.6 × 104). Od tega so v nadaljevanju izbrali in izolirali 13 proteinov, kasneje pa s strukturno analizo izbrali 4 kandidate, ki so imeli cepitvena mesta na P155, N157, L307 in G315. Vsi kandidati so kasneje pokazali vsaj 1,6-kratno povečanje fluorescence ob prisotnosti 1mM IPTG. Ko so testirali spremembo fluorescence v primerih, ko je bil prisoten zgolj en od obeh fragmentov, spremembe fluorescence kot pričakovani ni bilo. [1]

===3.2. Testiranje delovanja sistema s komplementarnimi levcinskimi zadrgami===

V nadaljevanju so izvedli dodaten poskus s pripenjanjem dveh fragmentov lizinske zadrge na kandidata P155 in G315. Pri obeh kandidatih je prišlo do znižanja fluorescence v primerjavi s kontrolnimi skupinami, ki so vsebovale zgolj eno od obeh peptidov na fragmentih razcepljenega LacI. Znižanje je bilo moč zaznati tako ob prisotnosti, kot tudi ob odsotnosti IPTG. Dodatno so preizkusili tudi obnašanje sistema in vitro v celicah E. Coli, ki so jih inkubirali pri različnih koncentracijah IPTG (od 0 do 100 µM). Pri obeh kandidatih je prišlo do precej visoke fluorescence v odsotnosti od IPTG, kar nakazuje, da po vsej verjetnosti ni prišlo do ustreznega sestavljanja podenot v funkcionalen encim, kar bi lahko brez ustrezne optimizacije v praksi povzročilo precej omejitev z vidika občutljivosti metode. [1]

===3.3. Brezcelični sistem===

Reporterski fluorescenčni gen so poskusili izraziti z uporabo kompleta za in vitro sintezo beljakovin PURExpress®. Izražanje je bilo doseženo z dodatkom fragmentov razcepljenega LacI in fuzijskimi peptidi ter induktorjem IPTG. Spremljali so spremembe v intenzivnosti fluorescence skozi čas v serijskih reakcijah za tri različice LacI (divji tip, P155 in G315). Kot pričakovano, je divji tip LacI pokazal od IPTG-odvisen odziv. Fluorescenčni signal se je s časom povečeval, z največjo spremembo za 1,6-krat po 3-urni reakciji. Ta sprememba je primerljiva z in vivo testom, kar kaže, da sistem deluje primerljivo tudi v in vitro okolju. V primeru razdeljenega LacI-155 in -315, s komplementarnimi proteini, se je IPTG-odvisen signal prav tako povečevala do 3 ure. Rezultati opredeljujejo uspešno delovanje modularnega dvodelnega sistema ob uporabi CFPE (cell free protein expression) tehnologije, kar ga naredi primernega za številne analitične aplikacije. [1]

===3.4. Optimizacija sistema===

Cilj optimizacije je bil čim bolj zmanjšati vplive ozadja (nespecifično fluorescenco). Problema so se avtorji članka lotili tako, da so signal dobljen z uporabo razcepljenega lacI primerjali z wild-type signalom pri različnih vrednostih IPTG ter DNA. Ugotovili so, da fluorescenca doseže plato pri 200 µM IPTG. Najboljše razmerje signal-ozadje pa je bilo doseženo pri 100 ng DNA (glede na standard seta PURExpress®). [1]

==4. Zaključek==

Predstavljen sistem na principu razcepljenih transkripcijskih faktorjev ponuja številne možnosti za napredek diagnostičnih metod in študij interakcij. Ko se tarčne molekule vežejo na eno od proteinskih oznak, te konkurenčno zavirajo ponovno sestavljanje fragmentov LacI, kar ima za posledico neprekinjeno aktivacijo izražanja reporterskega gena neodvisno od IPTG. Te fuzijske beljakovinske oznake ponujajo fleksibilnost in jih je mogoče zamenjati glede na interes tarče, kar je prednostno za razvoj različnih biosenzorjev. Dodatna prednost je možnost uporabe sistema v izvenceličnem okolju. Čeprav predstavljen sistem ne ponuja toliko potenciala z vidika identifikacij velikega števila interakcij, kot ga ponujajo tradicionalni sistemi, kot na primer dvohibridni sistem kvasovk, avtorji članka ob ponujenih možnostih za optimizacijo, navajajo prednosti sistema predvsem v enostavnosti, hitrosti in obstojnosti sistema zaradi možnosti izvedbe v izvenceličnem sistemu (CFPE), kar bi pomenilo precejšnjo prednost v medicinski diagnostiki, ki omogoča detekcijo že na samem mestu odvzema vzorca (point-of-care). [1]

==Viri==

[1] Lee, H., Rha, E. & Kim, H. Development and optimization of a modular two-fragment LacI switch for enhanced biosensor applications. Biotechnol Bioproc E 29, 109–117 (2024). https://doi.org/10.1007/s12257-024-00020-w
[2] Slomovic S, Pardee K, Collins JJ (2015) Synthetic biology devices for in vitro and in vivo diagnostics. Proc Natl Acad Sci USA 112:14429–14435. https://doi.org/10.1073/pnas.1508521112
[3] Datsenko KA, Wanner BL (2000) One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proc Natl Acad Sci USA 97:6640–6645. https://doi.org/10.1073/pnas.120163297

Razvoj in optimizacija modularnega dvofragmentnega LacI stikala za naprednejšo biodetekcijo

2024-05-27T02:17:18Z

Luka Stanković:

Povezava do izhodiščnega članka: [https://link.springer.com/article/10.1007/s12257-024-00020-w Razvoj in optimizacija modularnega dvofragmentnega LacI stikala za naprednejšo biodetekcijo]

==1. Uvod==

Genska stikala (genetic switches) so ključni elementi za regulacijo izražanja specifičnih genov. Zaradi njihovega širokega spektra delovanja in modularnosti so v sintezni biologiji ključnega pomena. Eni najpogosteje uporabljenih genskih stikal so transkripcijski faktorji. Slednji premorejo veliko potenciala za optimizacijo različnih postopkov pri molekulskem inžinjiringu in različnih področjih diagnostike. [1]

V članku Development and optimization of a modular two-fragment LacI switch for enhanced biosensor applications je raziskovalna skupina predstavila potencialno uporabo represorja laktoznega operona LacI za detekcijo prisotnosti specifičnih proteinov ali interakcije med njimi. Predstavljen princip temelji na metodi z razcepljenimi proteini. LacI so razcepili na dva fragmenta. Na DNA vezavno domeno in regulatorno domeno. Na oba fragmenta sta pripeta peptida, ki sta med seboj komplementarna. Komplementarna peptida omogočata spajanjenje obeh LacI fragmentov v funkcionalen LacI represor, ki se veže na operatorsko regijo Lac operona in zavre prepisovanje genov operona. Z izbiro ustreznega komplementarnega peptida, bi lahko detektirali prisotnost tarčnega proteina, ki bi z vezavo na komplementarno regijo fuzijskega proteina preprečil spajanje LacI fragmentov v aktivni encim. Posledično ne bi prišlo do represije reporterskih genov na operonu, kar bi zaznali z detekcijo signala. [1, 2]

==2. Metode za razvoj sistema==

Poglavitni problem pri razvoju metode je bilo ugotoviti, kako bi LacI razdelili na dve fuzijski podenoti, ki bi po ponovni združitvi povrnili prvotno vlogo proteina. V ta namen je bilo potrebno pripraviti knjižnico zaporedij LacI z vstavljenim določenim zaporedjem na naključnih različnih mestih. Za namen lažje selekcije v kasnejših stopnjah, so se odločili, da bodo znotraj LacI gena vstavili transpozonsko zaporedje za ojačan zeleni fluorescenčni protein z markerjem za odpornost proti kanamicinu (eGFPuv-KanR). Slednji bi omogočal selekcijo vseh kolonij, kjer je prišlo do uspešne združitve obeh podenot preko zelene emitirane svetlobe, medtem ko bi povrjeno aktivnost lacI detektirali preko represije sekundarnega reporterskega sistema (zapis za RFP) lac operona na ločenem plazmidu. [1]

===2.1. Konstrukcija sevov===

Za namen selekcije so morali v začetni stopnji v genom izbranega seva (DH5α) uvesti okvarjen gen za lacI represor. Okvaro so dosegli z rekombinacijo s pomočjo rdečega lambda bakteriofaga. Z rekombinacijo so v kromosom ustavili kaseto, ki so jo vzeli iz seva BW25113ΔlacI::KmR, pomnožili z metodo PCR. Zaporedje so preverili s sekvenciranjem zaporedja ter izvedli rekombinacijo s pomočjo vektorja pKD46. Vstavljena kaseta je poleg okvarjenega lacI gena vsebovala tudi selekcijski marker za odpornost proti kanamicinu. Po selekciji v gojišču ob prisotnosti kanamicina so prenesli ustrezne kolonije in zaporedje preverili s ponovno metodo PCR. V nadaljevanju so selekcijski marker odstranili s flipazo. [1, 3]

===2.2. Konstrukcija plazmidov===

Za namen selekcije kolonij DH5α z delujočim sistemom je bilo potrebno konstruirati dva plazmida. Prvi (pUCBB-eGFP) je vseboval zapis za lacI represor z vstavljenjim zaporedjem za eGFP pod konstitutivnim lacO promotorjem in selekcijskim markerjem za kanamicin, ki je bil kasneje odstranjen z NheI z nadaljno ligacijo z T4 ligazo. Drugi (pACBB-mRFP) je vseboval trc promoter, lac operator in zaporedje za mRFP. Za združevanje segmentov DNA so uporabili In-Fusion Cloning Kit (Clontech). [1]

===2.3. konstrukcija in vstavljanje transpozonske regije Tn5[GFPuv]===

Transpozone z GFP zaporedjem in markerjem za odpornost proti kanamicinu so dobili z vstavljanjem gfpuv gena iz pGFPuv (Clontech) v transpozon EZ-Tn5 (Epicentre) pred zapisom za gen KmR. Transpozonsko regijo so očistili z gelsko ekstrakcijo (Qiagen kit). 87 fm očiščenega transpozona so z ekvivalentno molsko maso tarčnega plazmida pUCBB-LacI 2 uri inkubirali v 10 µL Tris acetatnega pufra z 1 enoto EZ::TN™ (In-Frame Linker Insertion Kit; Epicentre) in 25 % glicerolom pri 37 %. Transpozicijo so po 2 urah ustavili z dodatkom 0.1% SDS in 10-minutno inkubacijo pri 70 °C. V nadaljevanju so z plazmidom transformirali E. coli DH5α z elektroporacijo ter bakterije gojili na ploščah ob prisotnosti ampicilina in kanamicina. Plazmid so iz kolonij, kjer je prišlo do inscercije transpozona izolirali z izolacijskim setom (Qiagen). [1]

==3. Rezultati in diskusija==

===3.1. Identifikacija dostopnega cepitvenega mesta LacI represorja===

Po transformaciji DH5α z obema plazmidoma (pACBB-mRFP in pUCBB-eGFP) so celice gojili na ploščah. Pri kolonijah, kjer je ni bilo zelene fluorescence, ni prišlo do spajanja podenot LacI represorja. V primeru, ko sta bili prisotni obe fluorescenci, je sicer prišlo do spajanja obeh podenot, saj je bil GFP funkcionalen, a je bil tronspozon vstavljen na takem mestu, da tudi po združitvi fragmentov LacI ni prišlo do povratka prvotne funkcije proteina, saj ni prišlo do represije izražanja RFP genov. Ustreznih kolonij, ki so fluorescirale zgolj z zeleno barvo je bilo 34 (od skupno ~ 1.6 × 104). Od tega so v nadaljevanju izbrali in izolirali 13 proteinov, kasneje pa s strukturno analizo izbrali 4 kandidate, ki so imeli cepitvena mesta na P155, N157, L307 in G315. Vsi kandidati so kasneje pokazali vsaj 1,6-kratno povečanje fluorescence ob prisotnosti 1mM IPTG. Ko so testirali spremembo fluorescence v primerih, ko je bil prisoten zgolj en od obeh fragmentov, spremembe fluorescence kot pričakovani ni bilo. [1]

===3.2. Testiranje delovanja sistema s komplementarnimi levcinskimi zadrgami===

V nadaljevanju so izvedli dodaten poskus s pripenjanjem dveh fragmentov lizinske zadrge na kandidata P155 in G315. Pri obeh kandidatih je prišlo do znižanja fluorescence v primerjavi s kontrolnimi skupinami, ki so vsebovale zgolj eno od obeh peptidov na fragmentih razcepljenega LacI. Znižanje je bilo moč zaznati tako ob prisotnosti, kot tudi ob odsotnosti IPTG. Dodatno so preizkusili tudi obnašanje sistema in vitro v celicah E. Coli, ki so jih inkubirali pri različnih koncentracijah IPTG (od 0 do 100 µM). Pri obeh kandidatih je prišlo do precej visoke fluorescence v odsotnosti od IPTG, kar nakazuje, da po vsej verjetnosti ni prišlo do ustreznega sestavljanja podenot v funkcionalen encim, kar bi lahko brez ustrezne optimizacije v praksi povzročilo precej omejitev z vidika občutljivosti metode. [1]

===3.3. Brezcelični sistem===

Reporterski fluorescenčni gen so poskusili izraziti z uporabo kompleta za in vitro sintezo beljakovin PURExpress®. Izražanje je bilo doseženo z dodatkom fragmentov razcepljenega LacI in fuzijskimi peptidi ter induktorjem IPTG. Spremljali so spremembe v intenzivnosti fluorescence skozi čas v serijskih reakcijah za tri različice LacI (divji tip, P155 in G315). Kot pričakovano, je divji tip LacI pokazal od IPTG-odvisen odziv. Fluorescenčni signal se je s časom povečeval, z največjo spremembo za 1,6-krat po 3-urni reakciji. Ta sprememba je primerljiva z in vivo testom, kar kaže, da sistem deluje primerljivo tudi v in vitro okolju. V primeru razdeljenega LacI-155 in -315, s komplementarnimi proteini, se je IPTG-odvisen signal prav tako povečevala do 3 ure. Rezultati opredeljujejo uspešno delovanje modularnega dvodelnega sistema ob uporabi CFPE (cell free protein expression) tehnologije, kar ga naredi primernega za številne analitične aplikacije. [1]

===3.4. Optimizacija sistema===

Cilj optimizacije je bil čim bolj zmanjšati vplive ozadja (nespecifično fluorescenco). Problema so se avtorji članka lotili tako, da so signal dobljen z uporabo razcepljenega lacI primerjali z wild-type signalom pri različnih vrednostih IPTG ter DNA. Ugotovili so, da fluorescenca doseže plato pri 200 µM IPTG. Najboljše razmerje signal-ozadje pa je bilo doseženo pri 100 ng DNA (glede na standard seta PURExpress®). [1]

==4. Zaključek==

Predstavljen sistem na principu razcepljenih transkripcijskih faktorjev ponuja številne možnosti za napredek diagnostičnih metod in študij interakcij. Ko se tarčne molekule vežejo na eno od proteinskih oznak, te konkurenčno zavirajo ponovno sestavljanje fragmentov LacI, kar ima za posledico neprekinjeno aktivacijo izražanja reporterskega gena neodvisno od IPTG. Te fuzijske beljakovinske oznake ponujajo fleksibilnost in jih je mogoče zamenjati glede na interes tarče, kar je prednostno za razvoj različnih biosenzorjev. Dodatna prednost je možnost uporabe sistema v izvenceličnem okolju. Čeprav predstavljen sistem ne ponuja toliko potenciala z vidika identifikacij velikega števila interakcij, kot ga ponujajo tradicionalni sistemi, kot na primer dvohibridni sistem kvasovk, avtorji članka ob ponujenih možnostih za optimizacijo, navajajo prednosti sistema predvsem v enostavnosti, hitrosti in obstojnosti sistema zaradi možnosti izvedbe v izvenceličnem sistemu (CFPE), kar bi pomenilo precejšnjo prednost v medicinski diagnostiki, ki omogoča detekcijo že na samem mestu odvzema vzorca (point-of-care). [1]

==Viri==

[1] Lee, H., Rha, E. & Kim, H. Development and optimization of a modular two-fragment LacI switch for enhanced biosensor applications. Biotechnol Bioproc E 29, 109–117 (2024). https://doi.org/10.1007/s12257-024-00020-w
[2] Slomovic S, Pardee K, Collins JJ (2015) Synthetic biology devices for in vitro and in vivo diagnostics. Proc Natl Acad Sci USA 112:14429–14435. https://doi.org/10.1073/pnas.1508521112
[3] Datsenko KA, Wanner BL (2000) One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proc Natl Acad Sci USA 97:6640–6645. https://doi.org/10.1073/pnas.120163297

Razvoj in optimizacija modularnega dvofragmentnega LacI stikala za naprednejšo biodetekcijo

2024-05-27T02:11:00Z

Luka Stanković:

Povezava do izhodiščnega članka: [https://link.springer.com/article/10.1007/s12257-024-00020-w Razvoj in optimizacija modularnega dvofragmentnega LacI stikala za naprednejšo biodetekcijo]

==1. Uvod==

Genska stikala (genetic switches) so ključni elementi za regulacijo izražanja specifičnih genov. Zaradi njihovega širokega spektra delovanja in modularnosti so v sintezni biologiji ključnega pomena. Eni najpogosteje uporabljenih genskih stikal so transkripcijski faktorji. Slednji premorejo veliko potenciala za optimizacijo različnih postopkov pri molekulskem inžinjiringu in različnih področjih diagnostike. [1]

V članku Development and optimization of a modular two-fragment LacI switch for enhanced biosensor applications je raziskovalna skupina predstavila potencialno uporabo represorja laktoznega operona LacI za detekcijo prisotnosti specifičnih proteinov ali interakcije med njimi. Predstavljen princip temelji na metodi z razcepljenimi proteini. LacI so razcepili na dva fragmenta. Na DNA vezavno domeno in regulatorno domeno. Na oba fragmenta sta pripeta peptida, ki sta med seboj komplementarna. Komplementarna peptida omogočata spajanjenje obeh LacI fragmentov v funkcionalen LacI represor, ki se veže na operatorsko regijo Lac operona in zavre prepisovanje genov operona. Z izbiro ustreznega komplementarnega peptida, bi lahko detektirali prisotnost tarčnega proteina, ki bi z vezavo na komplementarno regijo fuzijskega proteina preprečil spajanje LacI fragmentov v aktivni encim. Posledično ne bi prišlo do represije reporterskih genov na operonu, kar bi zaznali z detekcijo signala. [1, 2]

==2. Metode za razvoj sistema==

Poglavitni problem pri razvoju metode je bilo ugotoviti, kako bi LacI razdelili na dve fuzijski podenoti, ki bi po ponovni združitvi povrnili prvotno vlogo proteina. V ta namen je bilo potrebno pripraviti knjižnico zaporedij LacI z vstavljenim določenim zaporedjem na naključnih različnih mestih. Za namen lažje selekcije v kasnejših stopnjah, so se odločili, da bodo znotraj LacI gena vstavili transpozonsko zaporedje za ojačan zeleni fluorescenčni protein z markerjem za odpornost proti kanamicinu (eGFPuv-KanR). Slednji bi omogočal selekcijo vseh kolonij, kjer je prišlo do uspešne združitve obeh podenot preko zelene emitirane svetlobe, medtem ko bi povrjeno aktivnost lacI detektirali preko represije sekundarnega reporterskega sistema (zapis za RFP) lac operona na ločenem plazmidu. [1]

===2.1. Konstrukcija sevov===

Za namen selekcije so morali v začetni stopnji v genom izbranega seva (DH5α) uvesti okvarjen gen za lacI represor. Okvaro so dosegli z rekombinacijo s pomočjo rdečega lambda bakteriofaga. Z rekombinacijo so v kromosom ustavili kaseto, ki so jo vzeli iz seva BW25113ΔlacI::KmR, pomnožili z metodo PCR. Zaporedje so preverili s sekvenciranjem zaporedja ter izvedli rekombinacijo s pomočjo vektorja pKD46. Vstavljena kaseta je poleg okvarjenega lacI gena vsebovala tudi selekcijski marker za odpornost proti kanamicinu. Po selekciji v gojišču ob prisotnosti kanamicina so prenesli ustrezne kolonije in zaporedje preverili s ponovno metodo PCR. V nadaljevanju so selekcijski marker odstranili s flipazo. [35]

===2.2. Konstrukcija plazmidov===

Za namen selekcije kolonij DH5α z delujočim sistemom je bilo potrebno konstruirati dva plazmida. Prvi (pUCBB-eGFP) je vseboval zapis za lacI represor z vstavljenjim zaporedjem za eGFP pod konstitutivnim lacO promotorjem in selekcijskim markerjem za kanamicin, ki je bil kasneje odstranjen z NheI z nadaljno ligacijo z T4 ligazo. Drugi (pACBB-mRFP) je vseboval trc promoter, lac operator in zaporedje za mRFP. Za združevanje segmentov DNA so uporabili In-Fusion Cloning Kit (Clontech). [1]

===2.3. konstrukcija in vstavljanje transpozonske regije Tn5[GFPuv]===

Transpozone z GFP zaporedjem in markerjem za odpornost proti kanamicinu so dobili z vstavljanjem gfpuv gena iz pGFPuv (Clontech) v transpozon EZ-Tn5 (Epicentre) pred zapisom za gen KmR. Transpozonsko regijo so očistili z gelsko ekstrakcijo (Qiagen kit). 87 fm očiščenega transpozona so z ekvivalentno molsko maso tarčnega plazmida pUCBB-LacI 2 uri inkubirali v 10 µL Tris acetatnega pufra z 1 enoto EZ::TN™ (In-Frame Linker Insertion Kit; Epicentre) in 25 % glicerolom pri 37 %. Transpozicijo so po 2 urah ustavili z dodatkom 0.1% SDS in 10-minutno inkubacijo pri 70 °C. V nadaljevanju so z plazmidom transformirali E. coli DH5α z elektroporacijo ter bakterije gojili na ploščah ob prisotnosti ampicilina in kanamicina. Plazmid so iz kolonij, kjer je prišlo do inscercije transpozona izolirali z izolacijskim setom (Qiagen). [1]

==3. Rezultati in diskusija==

===3.1. Identifikacija dostopnega cepitvenega mesta LacI represorja===

Po transformaciji DH5α z obema plazmidoma (pACBB-mRFP in pUCBB-eGFP) so celice gojili na ploščah. Pri kolonijah, kjer je ni bilo zelene fluorescence, ni prišlo do spajanja podenot LacI represorja. V primeru, ko sta bili prisotni obe fluorescenci, je sicer prišlo do spajanja obeh podenot, saj je bil GFP funkcionalen, a je bil tronspozon vstavljen na takem mestu, da tudi po združitvi fragmentov LacI ni prišlo do povratka prvotne funkcije proteina, saj ni prišlo do represije izražanja RFP genov. Ustreznih kolonij, ki so fluorescirale zgolj z zeleno barvo je bilo 34 (od skupno ~ 1.6 × 104). Od tega so v nadaljevanju izbrali in izolirali 13 proteinov, kasneje pa s strukturno analizo izbrali 4 kandidate, ki so imeli cepitvena mesta na P155, N157, L307 in G315. Vsi kandidati so kasneje pokazali vsaj 1,6-kratno povečanje fluorescence ob prisotnosti 1mM IPTG. Ko so testirali spremembo fluorescence v primerih, ko je bil prisoten zgolj en od obeh fragmentov, spremembe fluorescence kot pričakovani ni bilo.

===3.2. Testiranje delovanja sistema s komplementarnimi levcinskimi zadrgami===

V nadaljevanju so izvedli dodaten poskus s pripenjanjem dveh fragmentov lizinske zadrge na kandidata P155 in G315. Pri obeh kandidatih je prišlo do znižanja fluorescence v primerjavi s kontrolnimi skupinami, ki so vsebovale zgolj eno od obeh peptidov na fragmentih razcepljenega LacI. Znižanje je bilo moč zaznati tako ob prisotnosti, kot tudi ob odsotnosti IPTG. Dodatno so preizkusili tudi obnašanje sistema in vitro v celicah E. Coli, ki so jih inkubirali pri različnih koncentracijah IPTG (od 0 do 100 µM). Pri obeh kandidatih je prišlo do precej visoke fluorescence v odsotnosti od IPTG, kar nakazuje, da po vsej verjetnosti ni prišlo do ustreznega sestavljanja podenot v funkcionalen encim, kar bi lahko brez ustrezne optimizacije v praksi povzročilo precej omejitev z vidika občutljivosti metode.

===3.3. Brezcelični sistem===

Reporterski fluorescenčni gen so poskusili izraziti z uporabo kompleta za in vitro sintezo beljakovin PURExpress®. Izražanje je bilo doseženo z dodatkom fragmentov razcepljenega LacI in fuzijskimi peptidi ter induktorjem IPTG. Spremljali so spremembe v intenzivnosti fluorescence skozi čas v serijskih reakcijah za tri različice LacI (divji tip, P155 in G315). Kot pričakovano, je divji tip LacI pokazal od IPTG-odvisen odziv. Fluorescenčni signal se je s časom povečeval, z največjo spremembo za 1,6-krat po 3-urni reakciji. Ta sprememba je primerljiva z in vivo testom, kar kaže, da sistem deluje primerljivo tudi v in vitro okolju. V primeru razdeljenega LacI-155 in -315, s komplementarnimi proteini, se je IPTG-odvisen signal prav tako povečevala do 3 ure. Rezultati opredeljujejo uspešno delovanje modularnega dvodelnega sistema ob uporabi CFPE (cell free protein expression) tehnologije, kar ga naredi primernega za številne analitične aplikacije.

===3.4. Optimizacija sistema===

Cilj optimizacije je bil čim bolj zmanjšati vplive ozadja (nespecifično fluorescenco). Problema so se avtorji članka lotili tako, da so signal dobljen z uporabo razcepljenega lacI primerjali z wild-type signalom pri različnih vrednostih IPTG ter DNA. Ugotovili so, da fluorescenca doseže plato pri 200 µM IPTG. Najboljše razmerje signal-ozadje pa je bilo doseženo pri 100 ng DNA (glede na standard seta PURExpress®).

==4. Zaključek==

Predstavljen sistem na principu razcepljenih transkripcijskih faktorjev ponuja številne možnosti za napredek diagnostičnih metod in študij interakcij. Ko se tarčne molekule vežejo na eno od proteinskih oznak, te konkurenčno zavirajo ponovno sestavljanje fragmentov LacI, kar ima za posledico neprekinjeno aktivacijo izražanja reporterskega gena neodvisno od IPTG. Te fuzijske beljakovinske oznake ponujajo fleksibilnost in jih je mogoče zamenjati glede na interes tarče, kar je prednostno za razvoj različnih biosenzorjev. Dodatna prednost je možnost uporabe sistema v izvenceličnem okolju. Čeprav predstavljen sistem ne ponuja toliko potenciala z vidika identifikacij velikega števila interakcij, kot ga ponujajo tradicionalni sistemi, kot na primer dvohibridni sistem kvasovk, avtorji članka ob ponujenih možnostih za optimizacijo, navajajo prednosti sistema predvsem v enostavnosti, hitrosti in obstojnosti sistema zaradi možnosti izvedbe v izvenceličnem sistemu (CFPE), kar bi pomenilo precejšnjo prednost v medicinski diagnostiki, ki omogoča detekcijo že na samem mestu odvzema vzorca (point-of-care). [1]

Razvoj in optimizacija modularnega dvofragmentnega LacI stikala za naprednejšo biodetekcijo

2024-05-27T02:10:49Z

Luka Stanković:

Povezava do izhodiščnega članka: #[https://link.springer.com/article/10.1007/s12257-024-00020-w Razvoj in optimizacija modularnega dvofragmentnega LacI stikala za naprednejšo biodetekcijo]

==1. Uvod==

Genska stikala (genetic switches) so ključni elementi za regulacijo izražanja specifičnih genov. Zaradi njihovega širokega spektra delovanja in modularnosti so v sintezni biologiji ključnega pomena. Eni najpogosteje uporabljenih genskih stikal so transkripcijski faktorji. Slednji premorejo veliko potenciala za optimizacijo različnih postopkov pri molekulskem inžinjiringu in različnih področjih diagnostike. [1]

V članku Development and optimization of a modular two-fragment LacI switch for enhanced biosensor applications je raziskovalna skupina predstavila potencialno uporabo represorja laktoznega operona LacI za detekcijo prisotnosti specifičnih proteinov ali interakcije med njimi. Predstavljen princip temelji na metodi z razcepljenimi proteini. LacI so razcepili na dva fragmenta. Na DNA vezavno domeno in regulatorno domeno. Na oba fragmenta sta pripeta peptida, ki sta med seboj komplementarna. Komplementarna peptida omogočata spajanjenje obeh LacI fragmentov v funkcionalen LacI represor, ki se veže na operatorsko regijo Lac operona in zavre prepisovanje genov operona. Z izbiro ustreznega komplementarnega peptida, bi lahko detektirali prisotnost tarčnega proteina, ki bi z vezavo na komplementarno regijo fuzijskega proteina preprečil spajanje LacI fragmentov v aktivni encim. Posledično ne bi prišlo do represije reporterskih genov na operonu, kar bi zaznali z detekcijo signala. [1, 2]

==2. Metode za razvoj sistema==

Poglavitni problem pri razvoju metode je bilo ugotoviti, kako bi LacI razdelili na dve fuzijski podenoti, ki bi po ponovni združitvi povrnili prvotno vlogo proteina. V ta namen je bilo potrebno pripraviti knjižnico zaporedij LacI z vstavljenim določenim zaporedjem na naključnih različnih mestih. Za namen lažje selekcije v kasnejših stopnjah, so se odločili, da bodo znotraj LacI gena vstavili transpozonsko zaporedje za ojačan zeleni fluorescenčni protein z markerjem za odpornost proti kanamicinu (eGFPuv-KanR). Slednji bi omogočal selekcijo vseh kolonij, kjer je prišlo do uspešne združitve obeh podenot preko zelene emitirane svetlobe, medtem ko bi povrjeno aktivnost lacI detektirali preko represije sekundarnega reporterskega sistema (zapis za RFP) lac operona na ločenem plazmidu. [1]

===2.1. Konstrukcija sevov===

Za namen selekcije so morali v začetni stopnji v genom izbranega seva (DH5α) uvesti okvarjen gen za lacI represor. Okvaro so dosegli z rekombinacijo s pomočjo rdečega lambda bakteriofaga. Z rekombinacijo so v kromosom ustavili kaseto, ki so jo vzeli iz seva BW25113ΔlacI::KmR, pomnožili z metodo PCR. Zaporedje so preverili s sekvenciranjem zaporedja ter izvedli rekombinacijo s pomočjo vektorja pKD46. Vstavljena kaseta je poleg okvarjenega lacI gena vsebovala tudi selekcijski marker za odpornost proti kanamicinu. Po selekciji v gojišču ob prisotnosti kanamicina so prenesli ustrezne kolonije in zaporedje preverili s ponovno metodo PCR. V nadaljevanju so selekcijski marker odstranili s flipazo. [35]

===2.2. Konstrukcija plazmidov===

Za namen selekcije kolonij DH5α z delujočim sistemom je bilo potrebno konstruirati dva plazmida. Prvi (pUCBB-eGFP) je vseboval zapis za lacI represor z vstavljenjim zaporedjem za eGFP pod konstitutivnim lacO promotorjem in selekcijskim markerjem za kanamicin, ki je bil kasneje odstranjen z NheI z nadaljno ligacijo z T4 ligazo. Drugi (pACBB-mRFP) je vseboval trc promoter, lac operator in zaporedje za mRFP. Za združevanje segmentov DNA so uporabili In-Fusion Cloning Kit (Clontech). [1]

===2.3. konstrukcija in vstavljanje transpozonske regije Tn5[GFPuv]===

Transpozone z GFP zaporedjem in markerjem za odpornost proti kanamicinu so dobili z vstavljanjem gfpuv gena iz pGFPuv (Clontech) v transpozon EZ-Tn5 (Epicentre) pred zapisom za gen KmR. Transpozonsko regijo so očistili z gelsko ekstrakcijo (Qiagen kit). 87 fm očiščenega transpozona so z ekvivalentno molsko maso tarčnega plazmida pUCBB-LacI 2 uri inkubirali v 10 µL Tris acetatnega pufra z 1 enoto EZ::TN™ (In-Frame Linker Insertion Kit; Epicentre) in 25 % glicerolom pri 37 %. Transpozicijo so po 2 urah ustavili z dodatkom 0.1% SDS in 10-minutno inkubacijo pri 70 °C. V nadaljevanju so z plazmidom transformirali E. coli DH5α z elektroporacijo ter bakterije gojili na ploščah ob prisotnosti ampicilina in kanamicina. Plazmid so iz kolonij, kjer je prišlo do inscercije transpozona izolirali z izolacijskim setom (Qiagen). [1]

==3. Rezultati in diskusija==

===3.1. Identifikacija dostopnega cepitvenega mesta LacI represorja===

Po transformaciji DH5α z obema plazmidoma (pACBB-mRFP in pUCBB-eGFP) so celice gojili na ploščah. Pri kolonijah, kjer je ni bilo zelene fluorescence, ni prišlo do spajanja podenot LacI represorja. V primeru, ko sta bili prisotni obe fluorescenci, je sicer prišlo do spajanja obeh podenot, saj je bil GFP funkcionalen, a je bil tronspozon vstavljen na takem mestu, da tudi po združitvi fragmentov LacI ni prišlo do povratka prvotne funkcije proteina, saj ni prišlo do represije izražanja RFP genov. Ustreznih kolonij, ki so fluorescirale zgolj z zeleno barvo je bilo 34 (od skupno ~ 1.6 × 104). Od tega so v nadaljevanju izbrali in izolirali 13 proteinov, kasneje pa s strukturno analizo izbrali 4 kandidate, ki so imeli cepitvena mesta na P155, N157, L307 in G315. Vsi kandidati so kasneje pokazali vsaj 1,6-kratno povečanje fluorescence ob prisotnosti 1mM IPTG. Ko so testirali spremembo fluorescence v primerih, ko je bil prisoten zgolj en od obeh fragmentov, spremembe fluorescence kot pričakovani ni bilo.

===3.2. Testiranje delovanja sistema s komplementarnimi levcinskimi zadrgami===

V nadaljevanju so izvedli dodaten poskus s pripenjanjem dveh fragmentov lizinske zadrge na kandidata P155 in G315. Pri obeh kandidatih je prišlo do znižanja fluorescence v primerjavi s kontrolnimi skupinami, ki so vsebovale zgolj eno od obeh peptidov na fragmentih razcepljenega LacI. Znižanje je bilo moč zaznati tako ob prisotnosti, kot tudi ob odsotnosti IPTG. Dodatno so preizkusili tudi obnašanje sistema in vitro v celicah E. Coli, ki so jih inkubirali pri različnih koncentracijah IPTG (od 0 do 100 µM). Pri obeh kandidatih je prišlo do precej visoke fluorescence v odsotnosti od IPTG, kar nakazuje, da po vsej verjetnosti ni prišlo do ustreznega sestavljanja podenot v funkcionalen encim, kar bi lahko brez ustrezne optimizacije v praksi povzročilo precej omejitev z vidika občutljivosti metode.

===3.3. Brezcelični sistem===

Reporterski fluorescenčni gen so poskusili izraziti z uporabo kompleta za in vitro sintezo beljakovin PURExpress®. Izražanje je bilo doseženo z dodatkom fragmentov razcepljenega LacI in fuzijskimi peptidi ter induktorjem IPTG. Spremljali so spremembe v intenzivnosti fluorescence skozi čas v serijskih reakcijah za tri različice LacI (divji tip, P155 in G315). Kot pričakovano, je divji tip LacI pokazal od IPTG-odvisen odziv. Fluorescenčni signal se je s časom povečeval, z največjo spremembo za 1,6-krat po 3-urni reakciji. Ta sprememba je primerljiva z in vivo testom, kar kaže, da sistem deluje primerljivo tudi v in vitro okolju. V primeru razdeljenega LacI-155 in -315, s komplementarnimi proteini, se je IPTG-odvisen signal prav tako povečevala do 3 ure. Rezultati opredeljujejo uspešno delovanje modularnega dvodelnega sistema ob uporabi CFPE (cell free protein expression) tehnologije, kar ga naredi primernega za številne analitične aplikacije.

===3.4. Optimizacija sistema===

Cilj optimizacije je bil čim bolj zmanjšati vplive ozadja (nespecifično fluorescenco). Problema so se avtorji članka lotili tako, da so signal dobljen z uporabo razcepljenega lacI primerjali z wild-type signalom pri različnih vrednostih IPTG ter DNA. Ugotovili so, da fluorescenca doseže plato pri 200 µM IPTG. Najboljše razmerje signal-ozadje pa je bilo doseženo pri 100 ng DNA (glede na standard seta PURExpress®).

==4. Zaključek==

Predstavljen sistem na principu razcepljenih transkripcijskih faktorjev ponuja številne možnosti za napredek diagnostičnih metod in študij interakcij. Ko se tarčne molekule vežejo na eno od proteinskih oznak, te konkurenčno zavirajo ponovno sestavljanje fragmentov LacI, kar ima za posledico neprekinjeno aktivacijo izražanja reporterskega gena neodvisno od IPTG. Te fuzijske beljakovinske oznake ponujajo fleksibilnost in jih je mogoče zamenjati glede na interes tarče, kar je prednostno za razvoj različnih biosenzorjev. Dodatna prednost je možnost uporabe sistema v izvenceličnem okolju. Čeprav predstavljen sistem ne ponuja toliko potenciala z vidika identifikacij velikega števila interakcij, kot ga ponujajo tradicionalni sistemi, kot na primer dvohibridni sistem kvasovk, avtorji članka ob ponujenih možnostih za optimizacijo, navajajo prednosti sistema predvsem v enostavnosti, hitrosti in obstojnosti sistema zaradi možnosti izvedbe v izvenceličnem sistemu (CFPE), kar bi pomenilo precejšnjo prednost v medicinski diagnostiki, ki omogoča detekcijo že na samem mestu odvzema vzorca (point-of-care). [1]

Razvoj in optimizacija modularnega dvofragmentnega LacI stikala za naprednejšo biodetekcijo

2024-05-27T02:09:41Z

Luka Stanković:

Povezava do izhodiščnega članka: https://link.springer.com/article/10.1007/s12257-024-00020-w

==1. Uvod==

Genska stikala (genetic switches) so ključni elementi za regulacijo izražanja specifičnih genov. Zaradi njihovega širokega spektra delovanja in modularnosti so v sintezni biologiji ključnega pomena. Eni najpogosteje uporabljenih genskih stikal so transkripcijski faktorji. Slednji premorejo veliko potenciala za optimizacijo različnih postopkov pri molekulskem inžinjiringu in različnih področjih diagnostike. [1]

V članku Development and optimization of a modular two-fragment LacI switch for enhanced biosensor applications je raziskovalna skupina predstavila potencialno uporabo represorja laktoznega operona LacI za detekcijo prisotnosti specifičnih proteinov ali interakcije med njimi. Predstavljen princip temelji na metodi z razcepljenimi proteini. LacI so razcepili na dva fragmenta. Na DNA vezavno domeno in regulatorno domeno. Na oba fragmenta sta pripeta peptida, ki sta med seboj komplementarna. Komplementarna peptida omogočata spajanjenje obeh LacI fragmentov v funkcionalen LacI represor, ki se veže na operatorsko regijo Lac operona in zavre prepisovanje genov operona. Z izbiro ustreznega komplementarnega peptida, bi lahko detektirali prisotnost tarčnega proteina, ki bi z vezavo na komplementarno regijo fuzijskega proteina preprečil spajanje LacI fragmentov v aktivni encim. Posledično ne bi prišlo do represije reporterskih genov na operonu, kar bi zaznali z detekcijo signala. [1, 2]

==2. Metode za razvoj sistema==

Poglavitni problem pri razvoju metode je bilo ugotoviti, kako bi LacI razdelili na dve fuzijski podenoti, ki bi po ponovni združitvi povrnili prvotno vlogo proteina. V ta namen je bilo potrebno pripraviti knjižnico zaporedij LacI z vstavljenim določenim zaporedjem na naključnih različnih mestih. Za namen lažje selekcije v kasnejših stopnjah, so se odločili, da bodo znotraj LacI gena vstavili transpozonsko zaporedje za ojačan zeleni fluorescenčni protein z markerjem za odpornost proti kanamicinu (eGFPuv-KanR). Slednji bi omogočal selekcijo vseh kolonij, kjer je prišlo do uspešne združitve obeh podenot preko zelene emitirane svetlobe, medtem ko bi povrjeno aktivnost lacI detektirali preko represije sekundarnega reporterskega sistema (zapis za RFP) lac operona na ločenem plazmidu. [1]

===2.1. Konstrukcija sevov===

Za namen selekcije so morali v začetni stopnji v genom izbranega seva (DH5α) uvesti okvarjen gen za lacI represor. Okvaro so dosegli z rekombinacijo s pomočjo rdečega lambda bakteriofaga. Z rekombinacijo so v kromosom ustavili kaseto, ki so jo vzeli iz seva BW25113ΔlacI::KmR, pomnožili z metodo PCR. Zaporedje so preverili s sekvenciranjem zaporedja ter izvedli rekombinacijo s pomočjo vektorja pKD46. Vstavljena kaseta je poleg okvarjenega lacI gena vsebovala tudi selekcijski marker za odpornost proti kanamicinu. Po selekciji v gojišču ob prisotnosti kanamicina so prenesli ustrezne kolonije in zaporedje preverili s ponovno metodo PCR. V nadaljevanju so selekcijski marker odstranili s flipazo. [35]

===2.2. Konstrukcija plazmidov===

Za namen selekcije kolonij DH5α z delujočim sistemom je bilo potrebno konstruirati dva plazmida. Prvi (pUCBB-eGFP) je vseboval zapis za lacI represor z vstavljenjim zaporedjem za eGFP pod konstitutivnim lacO promotorjem in selekcijskim markerjem za kanamicin, ki je bil kasneje odstranjen z NheI z nadaljno ligacijo z T4 ligazo. Drugi (pACBB-mRFP) je vseboval trc promoter, lac operator in zaporedje za mRFP. Za združevanje segmentov DNA so uporabili In-Fusion Cloning Kit (Clontech). [1]

===2.3. konstrukcija in vstavljanje transpozonske regije Tn5[GFPuv]===

Transpozone z GFP zaporedjem in markerjem za odpornost proti kanamicinu so dobili z vstavljanjem gfpuv gena iz pGFPuv (Clontech) v transpozon EZ-Tn5 (Epicentre) pred zapisom za gen KmR. Transpozonsko regijo so očistili z gelsko ekstrakcijo (Qiagen kit). 87 fm očiščenega transpozona so z ekvivalentno molsko maso tarčnega plazmida pUCBB-LacI 2 uri inkubirali v 10 µL Tris acetatnega pufra z 1 enoto EZ::TN™ (In-Frame Linker Insertion Kit; Epicentre) in 25 % glicerolom pri 37 %. Transpozicijo so po 2 urah ustavili z dodatkom 0.1% SDS in 10-minutno inkubacijo pri 70 °C. V nadaljevanju so z plazmidom transformirali E. coli DH5α z elektroporacijo ter bakterije gojili na ploščah ob prisotnosti ampicilina in kanamicina. Plazmid so iz kolonij, kjer je prišlo do inscercije transpozona izolirali z izolacijskim setom (Qiagen). [1]

==3. Rezultati in diskusija==

===3.1. Identifikacija dostopnega cepitvenega mesta LacI represorja===

Po transformaciji DH5α z obema plazmidoma (pACBB-mRFP in pUCBB-eGFP) so celice gojili na ploščah. Pri kolonijah, kjer je ni bilo zelene fluorescence, ni prišlo do spajanja podenot LacI represorja. V primeru, ko sta bili prisotni obe fluorescenci, je sicer prišlo do spajanja obeh podenot, saj je bil GFP funkcionalen, a je bil tronspozon vstavljen na takem mestu, da tudi po združitvi fragmentov LacI ni prišlo do povratka prvotne funkcije proteina, saj ni prišlo do represije izražanja RFP genov. Ustreznih kolonij, ki so fluorescirale zgolj z zeleno barvo je bilo 34 (od skupno ~ 1.6 × 104). Od tega so v nadaljevanju izbrali in izolirali 13 proteinov, kasneje pa s strukturno analizo izbrali 4 kandidate, ki so imeli cepitvena mesta na P155, N157, L307 in G315. Vsi kandidati so kasneje pokazali vsaj 1,6-kratno povečanje fluorescence ob prisotnosti 1mM IPTG. Ko so testirali spremembo fluorescence v primerih, ko je bil prisoten zgolj en od obeh fragmentov, spremembe fluorescence kot pričakovani ni bilo.

===3.2. Testiranje delovanja sistema s komplementarnimi levcinskimi zadrgami===

V nadaljevanju so izvedli dodaten poskus s pripenjanjem dveh fragmentov lizinske zadrge na kandidata P155 in G315. Pri obeh kandidatih je prišlo do znižanja fluorescence v primerjavi s kontrolnimi skupinami, ki so vsebovale zgolj eno od obeh peptidov na fragmentih razcepljenega LacI. Znižanje je bilo moč zaznati tako ob prisotnosti, kot tudi ob odsotnosti IPTG. Dodatno so preizkusili tudi obnašanje sistema in vitro v celicah E. Coli, ki so jih inkubirali pri različnih koncentracijah IPTG (od 0 do 100 µM). Pri obeh kandidatih je prišlo do precej visoke fluorescence v odsotnosti od IPTG, kar nakazuje, da po vsej verjetnosti ni prišlo do ustreznega sestavljanja podenot v funkcionalen encim, kar bi lahko brez ustrezne optimizacije v praksi povzročilo precej omejitev z vidika občutljivosti metode.

===3.3. Brezcelični sistem===

Reporterski fluorescenčni gen so poskusili izraziti z uporabo kompleta za in vitro sintezo beljakovin PURExpress®. Izražanje je bilo doseženo z dodatkom fragmentov razcepljenega LacI in fuzijskimi peptidi ter induktorjem IPTG. Spremljali so spremembe v intenzivnosti fluorescence skozi čas v serijskih reakcijah za tri različice LacI (divji tip, P155 in G315). Kot pričakovano, je divji tip LacI pokazal od IPTG-odvisen odziv. Fluorescenčni signal se je s časom povečeval, z največjo spremembo za 1,6-krat po 3-urni reakciji. Ta sprememba je primerljiva z in vivo testom, kar kaže, da sistem deluje primerljivo tudi v in vitro okolju. V primeru razdeljenega LacI-155 in -315, s komplementarnimi proteini, se je IPTG-odvisen signal prav tako povečevala do 3 ure. Rezultati opredeljujejo uspešno delovanje modularnega dvodelnega sistema ob uporabi CFPE (cell free protein expression) tehnologije, kar ga naredi primernega za številne analitične aplikacije.

===3.4. Optimizacija sistema===

Cilj optimizacije je bil čim bolj zmanjšati vplive ozadja (nespecifično fluorescenco). Problema so se avtorji članka lotili tako, da so signal dobljen z uporabo razcepljenega lacI primerjali z wild-type signalom pri različnih vrednostih IPTG ter DNA. Ugotovili so, da fluorescenca doseže plato pri 200 µM IPTG. Najboljše razmerje signal-ozadje pa je bilo doseženo pri 100 ng DNA (glede na standard seta PURExpress®).

==4. Zaključek==

Predstavljen sistem na principu razcepljenih transkripcijskih faktorjev ponuja številne možnosti za napredek diagnostičnih metod in študij interakcij. Ko se tarčne molekule vežejo na eno od proteinskih oznak, te konkurenčno zavirajo ponovno sestavljanje fragmentov LacI, kar ima za posledico neprekinjeno aktivacijo izražanja reporterskega gena neodvisno od IPTG. Te fuzijske beljakovinske oznake ponujajo fleksibilnost in jih je mogoče zamenjati glede na interes tarče, kar je prednostno za razvoj različnih biosenzorjev. Dodatna prednost je možnost uporabe sistema v izvenceličnem okolju. Čeprav predstavljen sistem ne ponuja toliko potenciala z vidika identifikacij velikega števila interakcij, kot ga ponujajo tradicionalni sistemi, kot na primer dvohibridni sistem kvasovk, avtorji članka ob ponujenih možnostih za optimizacijo, navajajo prednosti sistema predvsem v enostavnosti, hitrosti in obstojnosti sistema zaradi možnosti izvedbe v izvenceličnem sistemu (CFPE), kar bi pomenilo precejšnjo prednost v medicinski diagnostiki, ki omogoča detekcijo že na samem mestu odvzema vzorca (point-of-care). [1]

Seminarji SB 2023/24

2024-05-27T02:08:17Z

Luka Stanković:

V študijskem letu 2023/24 študenti in študentke pri Sintezni biologiji predstavljajo naslednje teme:

RAZISKOVALNI ČLANKI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sinteznobiološki_pristop_k_sestavljanju_in_ponovnemu_zagonu_klinično_pomembnih_fagov_Pseudomonas_aeruginosa Sinteznobiološki pristop k sestavljanju in ponovnemu zagonu klinično pomembnih fagov ''Pseudomonas aeruginosa''] (Bor Krajnik)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Optogenetsko_prostorsko_vzorčenje_kooperacije_pri_glivah_kvasovkah Optogenetsko prostorsko vzorčenje kooperacije pri glivah kvasovkah] (Martin Stanonik)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sintetična_celična_linija_za_inducibilno_pakiranje_virusa_influence_A Sintetična celična linija za inducibilno pakiranje virusa influence A] (Klara Razboršek)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Uporaba_sesalskega_RNA-vezavnega_proteina_Musashi-1_kot_alosterično_reguliranega_translacijskega_represorja_v_E._coli Uporaba sesalskega RNA-vezavnega proteina Musashi-1 kot alosterično reguliranega translacijskega represorja v ''E. coli''] (Marko Kovačić)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Kaskadno_ojačano_genetsko_vezje_za_detekcijo_glivnih_patogenov Kaskadno ojačano genetsko vezje za detekcijo glivnih patogenov] (Jakob Tomšič)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sintetična_mRNA-stikala_s_povratno_zanko,_ki_omogočajo_zaznavanje_miRNA Sintetična mRNA-stikala s povratno zanko, ki omogočajo zaznavanje miRNA] (Ana Pervanja)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Molekularni_nabor_navzkrižno_hranjenih_sevov_za_pripravo_sintetičnih_skupnosti_kvasovk Molekularni nabor navzkrižno hranjenih sevov za pripravo sintetičnih skupnosti kvasovk] (Teja Spruk)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Inženiring_dinamike_rasti_sesalskih_celic_za_bioproizvodnjo Inženiring dinamike rasti sesalskih celic za bioproizvodnjo] (Zarja Rožanc)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Inženirane_mRNA-ribosomske_fuzije_za_lažjo_biosintezo_selenoproteinov Inženirane mRNA-ribosomske fuzije za lažjo biosintezo selenoproteinov] (Kostadin Mitkov)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Razvoj_novih_binarnih_ekspresijskih_sistemov_za_sintezno_biologijo_rastlin Razvoj novih binarnih ekspresijskih sistemov za sintezno biologijo rastlin] (Alliana Kolar)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Kombinatorična_biosinteza_terpenoidov_v_kvasovkah Kombinatorična biosinteza terpenoidov v kvasovkah] (Jan Kogovšek)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Identifikacija_genov,_ki_se_odzivajo_na_stres_kislega_okolja_in_inženiring_odpornosti_na_kislo_okolje_v_cianobakteriji_Synechococcus_elongatus_PCC_7942 Identifikacija genov, ki se odzivajo na stres kislega okolja in inženiring odpornosti na kislo okolje v cianobakteriji ''Synechococcus elongatus'' PCC 7942] (Ela Kovač)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Vse_v_enem-IQ_preklopna_stikala_z_veliko_vsestranskostjo_za_natančno_nastavitev_izražanja_transgenov_v_sesalskih_celicah_in_tkivih Vse v enem-IQ preklopna stikala z veliko vsestranskostjo za natančno nastavitev izražanja transgenov v sesalskih celicah in tkivih] (Ena Kartal)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Podenote_E3_ligaznega_kompleksa_kot_degroni_za_učinkovito_degradacijo_citosolnih,_jedrnih_in_membranskih_proteinov Podenote E3 ligaznega kompleksa kot degroni za učinkovito degradacijo citosolnih, jedrnih in membranskih proteinov] (David Valte)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Razvoj_robustnega_sistema_genetskega_biozadrževanja_kvasovk_s_stikalom_za_stabilnost_proteinov Razvoj robustnega sistema genetskega biozadrževanja kvasovk s stikalom za stabilnost proteinov] (Mark Loborec)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Reprogramiranje_z_doksiciklinom_inducibilnega_genskega_stikala_za_bakterijsko_posredovano_terapijo Reprogramiranje z doksiciklinom inducibilnega genskega stikala za bakterijsko posredovano terapijo] (Špela Sotlar)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/A_flexible_,_modular_and_versatile_part_assembly_toolkit_for_gene_cluster_engineering_in_Streptomyces A flexible, modular and versatile part assembly toolkit for gene cluster engineering in Streptomyces] (Damjan Pop Stefanija)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Metoda_TASER_za_detekijo_nukleinskih_kislin TASER: A flexible approach for nucleic acid detection using a molecular converter] (Srna Anastasovska)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Razvoj_in_optimizacija_modularnega_dvofragmentnega_LacI_stikala_za_naprednej%C5%A1o_biodetekcijo Development and optimization of a modular two-fragment LacI switch for enhanced biosensor applications] (Luka Stanković)

NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/PhaseOut Biološka proizvodnja bioplastike] (Sašo Jakob)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BeeYeast Inženiring kvasovk za boj proti virusnim okužbam čebel] (Mateja Milošević)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Cellect Cellect - Fenotipsko stabilne celične linije] (Lucija Voga)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/oPHAelia oPHAelia - Inovativna rešitev za zmanjšanje onesnaževanja s plastiko] (Irina Kostadinoska)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/ReMixHD ReMixHD - Recikliranje mešanih plastičnih odpadkov] (Ema Kavčič)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/DARWINS DARWINS - Usmerjena posodobitev proteinov Ago z idealno proteinsko termično stabilnostjo] (Rahela Petrovčič)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/PET-2-Protein PET-2-Protein - Proizvodnja mikrobnih proteinov iz polietilen tereftalata] (Zala Perko)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/48C_Cadmium_catcher_LBP 48C Cadmium catcher LBP- Proizvodnja bioterapevtika za vezavo kadmija] (Maja Deutsch)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Proteus Proteus - Sistem za ciljanje onkogenov in induciranje piroptoze] (Gašper Struna)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Silinker Silinker] (Nuša Brdnik)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sublimestone Sublimestone - uporaba bakterij za ohranjanje kulturne dediščine] (Ana Maučec)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/LAMPS LAMPS - sistem svetlečih alg] (Rebeka Jerina)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/FluoroLoop#Problematika_PFAS FluoroLoop] (Eva Vene)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/OASYS OASYS - Diagnostični pripomoček za klinično depresijo] (Ajda Dedič)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/OTTER OTTER - Optimizirana tehnika za načrtovanje in karakterizacijo RNA-stikal] (Luka Hafner)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Li+on_Switch Li+on Switch] (Hana Glavnik)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/DRIP DRIP] (Klara Ažbe)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/B.HOME B.HOME] (Luša Karner)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Methanivore Methanivore] (Anja Moškrič)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/cELPro cELPro] (Jan Trebušak)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/AureoBos AureoBos] (Tina Javeršek)

Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Povzetek je treba objaviti dva dni pred predstavitvijo do polnoči (za seminarje v sredo torej v ponedeljek). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo približno 5-minutna razprava.

Terminski razpored je razviden iz preglednice na strežniku Google Drive.

Kako je videti seznam seminarjev, lahko preverite pri lanskem letniku: [[Seminarji_SB_2022/23]].

Razvoj in optimizacija modularnega dvofragmentnega LacI stikala za naprednejšo biodetekcijo

2024-05-27T02:05:41Z

Luka Stanković: Created page with "Povezava do izhodiščnega članka: https://link.springer.com/article/10.1007/s12257-024-00020-w ==1. Uvod== Genska stikala (genetic switches) so ključni elementi za regulacijo izražanja specifičnih genov. Zaradi njihovega širokega spektra delovanja in modularnosti so v sintezni biologiji ključnega pomena. Eni najpogosteje uporabljenih genskih stikal so transkripcijski faktorji. Slednji premorejo veliko potenciala za optimizacijo različnih postopkov pri molekulsk..."

Povezava do izhodiščnega članka: https://link.springer.com/article/10.1007/s12257-024-00020-w

==1. Uvod==

Genska stikala (genetic switches) so ključni elementi za regulacijo izražanja specifičnih genov. Zaradi njihovega širokega spektra delovanja in modularnosti so v sintezni biologiji ključnega pomena. Eni najpogosteje uporabljenih genskih stikal so transkripcijski faktorji. Slednji premorejo veliko potenciala za optimizacijo različnih postopkov pri molekulskem inžinjiringu in različnih področjih diagnostike. [1]

V članku Development and optimization of a modular two-fragment LacI switch for enhanced biosensor applications je raziskovalna skupina predstavila potencialno uporabo represorja laktoznega operona LacI za detekcijo prisotnosti specifičnih proteinov ali interakcije med njimi. Predstavljen princip temelji na metodi z razcepljenimi proteini. LacI so razcepili na dva fragmenta. Na DNA vezavno domeno in regulatorno domeno. Na oba fragmenta sta pripeta peptida, ki sta med seboj komplementarna. Komplementarna peptida omogočata spajanjenje obeh LacI fragmentov v funkcionalen LacI represor, ki se veže na operatorsko regijo Lac operona in zavre prepisovanje genov operona. Z izbiro ustreznega komplementarnega peptida, bi lahko detektirali prisotnost tarčnega proteina, ki bi z vezavo na komplementarno regijo fuzijskega proteina preprečil spajanje LacI fragmentov v aktivni encim. Posledično ne bi prišlo do represije reporterskih genov na operonu, kar bi zaznali z detekcijo signala. [1, 2]

==2. Metode za razvoj sistema==

Poglavitni problem pri razvoju metode je bilo ugotoviti, kako bi LacI razdelili na dve fuzijski podenoti, ki bi po ponovni združitvi povrnili prvotno vlogo proteina. V ta namen je bilo potrebno pripraviti knjižnico zaporedij LacI z vstavljenim določenim zaporedjem na naključnih različnih mestih. Za namen lažje selekcije v kasnejših stopnjah, so se odločili, da bodo znotraj LacI gena vstavili transpozonsko zaporedje za ojačan zeleni fluorescenčni protein z markerjem za odpornost proti kanamicinu (eGFPuv-KanR). Slednji bi omogočal selekcijo vseh kolonij, kjer je prišlo do uspešne združitve obeh podenot preko zelene emitirane svetlobe, medtem ko bi povrjeno aktivnost lacI detektirali preko represije sekundarnega reporterskega sistema (zapis za RFP) lac operona na ločenem plazmidu. [1]

2.1. Konstrukcija sevov

Za namen selekcije so morali v začetni stopnji v genom izbranega seva (DH5α) uvesti okvarjen gen za lacI represor. Okvaro so dosegli z rekombinacijo s pomočjo rdečega lambda bakteriofaga. Z rekombinacijo so v kromosom ustavili kaseto, ki so jo vzeli iz seva BW25113ΔlacI::KmR, pomnožili z metodo PCR. Zaporedje so preverili s sekvenciranjem zaporedja ter izvedli rekombinacijo s pomočjo vektorja pKD46. Vstavljena kaseta je poleg okvarjenega lacI gena vsebovala tudi selekcijski marker za odpornost proti kanamicinu. Po selekciji v gojišču ob prisotnosti kanamicina so prenesli ustrezne kolonije in zaporedje preverili s ponovno metodo PCR. V nadaljevanju so selekcijski marker odstranili s flipazo. [35]

2.2. Konstrukcija plazmidov

Za namen selekcije kolonij DH5α z delujočim sistemom je bilo potrebno konstruirati dva plazmida. Prvi (pUCBB-eGFP) je vseboval zapis za lacI represor z vstavljenjim zaporedjem za eGFP pod konstitutivnim lacO promotorjem in selekcijskim markerjem za kanamicin, ki je bil kasneje odstranjen z NheI z nadaljno ligacijo z T4 ligazo. Drugi (pACBB-mRFP) je vseboval trc promoter, lac operator in zaporedje za mRFP. Za združevanje segmentov DNA so uporabili In-Fusion Cloning Kit (Clontech). [1]

2.3. konstrukcija in vstavljanje transpozonske regije Tn5[GFPuv]

Transpozone z GFP zaporedjem in markerjem za odpornost proti kanamicinu so dobili z vstavljanjem gfpuv gena iz pGFPuv (Clontech) v transpozon EZ-Tn5 (Epicentre) pred zapisom za gen KmR. Transpozonsko regijo so očistili z gelsko ekstrakcijo (Qiagen kit). 87 fm očiščenega transpozona so z ekvivalentno molsko maso tarčnega plazmida pUCBB-LacI 2 uri inkubirali v 10 µL Tris acetatnega pufra z 1 enoto EZ::TN™ (In-Frame Linker Insertion Kit; Epicentre) in 25 % glicerolom pri 37 %. Transpozicijo so po 2 urah ustavili z dodatkom 0.1% SDS in 10-minutno inkubacijo pri 70 °C. V nadaljevanju so z plazmidom transformirali E. coli DH5α z elektroporacijo ter bakterije gojili na ploščah ob prisotnosti ampicilina in kanamicina. Plazmid so iz kolonij, kjer je prišlo do inscercije transpozona izolirali z izolacijskim setom (Qiagen). [1]

3. Rezultati in diskusija

3.1. Identifikacija dostopnega cepitvenega mesta LacI represorja

Po transformaciji DH5α z obema plazmidoma (pACBB-mRFP in pUCBB-eGFP) so celice gojili na ploščah. Pri kolonijah, kjer je ni bilo zelene fluorescence, ni prišlo do spajanja podenot LacI represorja. V primeru, ko sta bili prisotni obe fluorescenci, je sicer prišlo do spajanja obeh podenot, saj je bil GFP funkcionalen, a je bil tronspozon vstavljen na takem mestu, da tudi po združitvi fragmentov LacI ni prišlo do povratka prvotne funkcije proteina, saj ni prišlo do represije izražanja RFP genov. Ustreznih kolonij, ki so fluorescirale zgolj z zeleno barvo je bilo 34 (od skupno ~ 1.6 × 104). Od tega so v nadaljevanju izbrali in izolirali 13 proteinov, kasneje pa s strukturno analizo izbrali 4 kandidate, ki so imeli cepitvena mesta na P155, N157, L307 in G315. Vsi kandidati so kasneje pokazali vsaj 1,6-kratno povečanje fluorescence ob prisotnosti 1mM IPTG. Ko so testirali spremembo fluorescence v primerih, ko je bil prisoten zgolj en od obeh fragmentov, spremembe fluorescence kot pričakovani ni bilo.

3.2. Testiranje delovanja sistema s komplementarnimi levcinskimi zadrgami

V nadaljevanju so izvedli dodaten poskus s pripenjanjem dveh fragmentov lizinske zadrge na kandidata P155 in G315. Pri obeh kandidatih je prišlo do znižanja fluorescence v primerjavi s kontrolnimi skupinami, ki so vsebovale zgolj eno od obeh peptidov na fragmentih razcepljenega LacI. Znižanje je bilo moč zaznati tako ob prisotnosti, kot tudi ob odsotnosti IPTG. Dodatno so preizkusili tudi obnašanje sistema in vitro v celicah E. Coli, ki so jih inkubirali pri različnih koncentracijah IPTG (od 0 do 100 µM). Pri obeh kandidatih je prišlo do precej visoke fluorescence v odsotnosti od IPTG, kar nakazuje, da po vsej verjetnosti ni prišlo do ustreznega sestavljanja podenot v funkcionalen encim, kar bi lahko brez ustrezne optimizacije v praksi povzročilo precej omejitev z vidika občutljivosti metode.

3.3. Brezcelični sistem

Reporterski fluorescenčni gen so poskusili izraziti z uporabo kompleta za in vitro sintezo beljakovin PURExpress®. Izražanje je bilo doseženo z dodatkom fragmentov razcepljenega LacI in fuzijskimi peptidi ter induktorjem IPTG. Spremljali so spremembe v intenzivnosti fluorescence skozi čas v serijskih reakcijah za tri različice LacI (divji tip, P155 in G315). Kot pričakovano, je divji tip LacI pokazal od IPTG-odvisen odziv. Fluorescenčni signal se je s časom povečeval, z največjo spremembo za 1,6-krat po 3-urni reakciji. Ta sprememba je primerljiva z in vivo testom, kar kaže, da sistem deluje primerljivo tudi v in vitro okolju. V primeru razdeljenega LacI-155 in -315, s komplementarnimi proteini, se je IPTG-odvisen signal prav tako povečevala do 3 ure. Rezultati opredeljujejo uspešno delovanje modularnega dvodelnega sistema ob uporabi CFPE (cell free protein expression) tehnologije, kar ga naredi primernega za številne analitične aplikacije.

3.4. Optimizacija sistema

Cilj optimizacije je bil čim bolj zmanjšati vplive ozadja (nespecifično fluorescenco). Problema so se avtorji članka lotili tako, da so signal dobljen z uporabo razcepljenega lacI primerjali z wild-type signalom pri različnih vrednostih IPTG ter DNA. Ugotovili so, da fluorescenca doseže plato pri 200 µM IPTG. Najboljše razmerje signal-ozadje pa je bilo doseženo pri 100 ng DNA (glede na standard seta PURExpress®).

4. Zaključek

Predstavljen sistem na principu razcepljenih transkripcijskih faktorjev ponuja številne možnosti za napredek diagnostičnih metod in študij interakcij. Ko se tarčne molekule vežejo na eno od proteinskih oznak, te konkurenčno zavirajo ponovno sestavljanje fragmentov LacI, kar ima za posledico neprekinjeno aktivacijo izražanja reporterskega gena neodvisno od IPTG. Te fuzijske beljakovinske oznake ponujajo fleksibilnost in jih je mogoče zamenjati glede na interes tarče, kar je prednostno za razvoj različnih biosenzorjev. Dodatna prednost je možnost uporabe sistema v izvenceličnem okolju. Čeprav predstavljen sistem ne ponuja toliko potenciala z vidika identifikacij velikega števila interakcij, kot ga ponujajo tradicionalni sistemi, kot na primer dvohibridni sistem kvasovk, avtorji članka ob ponujenih možnostih za optimizacijo, navajajo prednosti sistema predvsem v enostavnosti, hitrosti in obstojnosti sistema zaradi možnosti izvedbe v izvenceličnem sistemu (CFPE), kar bi pomenilo precejšnjo prednost v medicinski diagnostiki, ki omogoča detekcijo že na samem mestu odvzema vzorca (point-of-care). [1]

Struktura genoma in replikacija RNA pri koronavirusih

2021-05-05T10:07:01Z

Luka Stanković:

== Uvod ==

Koronavirusi (Coronaviridae) so največja družina virusov iz roda Nidovirales. Vsi virusi družin rodu Nidovirales (Coronaviridae, Arteriviridae, Roniviridae in Mesoniviridae) so nesegmentirani RNA virusi obdani s fosfolipidnim ovojem in dobro ohranjeno organizacijo gnoma. Slednji je pri Nidovirales v primerjavi z RNA virusi drugih rodov mnogo daljši in specifičen v številnih pogledih.

==== Pomen poznavanja genoma ====

Poznavanje genoma virusa je ključnega pomena. S sekvenciranjem genoma virusa lahko izvemo več o njegovi strukturi, delovanju, življenjskem ciklu, hitrosti širjenja in njegovi smrtonostnosti, obenem pa nam razkriva njegove slabosti in možnosti za boj proti virusu.
Mutacije virusov

Virusi se ves čas spreminjajo in kljub relativno uspešnim popravljalnim mehanizmom pri velikemu številu replikacij prihaja do mutacij. Le-te se sicer v večini primerov ne ohranijo, če ne pripomorejo k povečanju možnosti preživetja virusa ali pa k povečanju njegove infektivnosti. SARS-CoV-2 je najbolj razširjen koronavirus in je do maja 2021 okužil več kot 150 milijonov ljudi, kar je virusu omogočilo zelo veliko število replikacij in posledično mutacij, ki vodijo do nastanka novih sevov virusa. Do maja 2021 je bilo sekvencioniranih že več kot 1,3 milijone genomov SARS-CoV-2. Pogost odvzem vzorcev in sekvenciranje genomov virusa širše populacije je ključen za sledenje razvoja virusa in identifikacijo novih sevov.

==== Primerjava genomov med koronavirusi ====

Primerjava genomov posameznih virusov nam pomaga razumeti njihovo evolucijo in potencialno sorodnost med njimi, kar nam omogoča hitrejšo identifikacijo sredstva za boj proti novim virusom na podlagi preteklih raziskav sorodnih primerov. Poravnava genomov koronavirusov je pokazala 58 % ujemanje na področju regije nestrukturnih proteinov in 43 % ujemanje na delu genoma, ki nosi zapis za strukturne proteine. Slednje nakazuje na dejstvu, da so zapisi za nestrukturni proteini veliko bolj ohranjeni, medtem ko je pri sami strukturi virusa skozi evolucijo prihajalo do večjega števila prilagoditev odvisnih od gostitelja. (Analiza genoma SARS-CoV-2 je pokazala večje ujemanje z SARS-CoV najdenega v netopirjih kakor tistega, ki je bil prisoten pri okužbi pri ljudeh.

== Genom Koronavirusov ==

Genom koronavirusa je pozitivna enoverižna RNA zgrajena iz približno 30 tisoč baznih parov, kar ga uvršča med RNA viruse z najdaljšim genomom. Na 5’ koncu je zaščiten s 5’ kapo. Začne se z vodilno verigo ter nekodirajočo regijo. Tu se nahajajo številne zankaste structure, ki imajo pomembno vlogo pri translaciji in transkripciji. V smeri proti 3’ koncu sledi področje z zapisi za nestrukturne proteine. To področje se razteza čez približno 2/3 genoma (okoli 20 tisoč baz). Primarna naloga nestrukturnih proteinov je tvorba replikacijsko transkripcijskega kompleksa (RTC), ki omogoča podvojevanje RNA. Nestrukturni proteini, ki ne sodelujejo pri replikaciji oziroma transkripciji, omogočajo virusu nadzor nad gostiteljem.

Zadnjih 10 tisoč baz nosi zapis za strukturne proteine, ki so del kasneje nastalega viriona. Štirje osrednji strukturni proteini, ki imajo kodirajoče regije v genomu nanizane v enakem zaporedju, kot so navedeni v besedilu, so S protein, ki sestavlja bodice (S-spike), protein M, sestavni del membrane (M-membrane), E protein ovojnice (E-envelope) in protein N (N-nucleocapsid). Genom poleg naštetih vsebuje tudi zapise za več drugih strukturnih proteinov, ki se nahajajo med ali pored zapisov za S, M, E, N proteine. V zadnji tretjini genoma na 3’ se nahajajo tudi zapisi za pomožne proteine. Slednji nimajo pomembne vloge pri transkripciji in translaciji, saj sta procesa potekala tudi po izbrisu le-the. Izkazalo pa se je, da imajo ponekod ključno vlogo pri oslabitvi obrambnega mehanizma gostiteljske celice.
Pred vsakim zaporedjem, ki kodira zapis za strukturne ali pomožne protein se nahajajo regulatorna zaporedja, ki regulirajo transkripcijo in s tem vplivajo na ekspresijo določenega proteina. Pri 3’ koncu se zopet pojavi nekodirajoča regija, ki ji na sledi poli-A rep.

==== Bralni okvirji ====

Večina koronavirusnih genomov in subgenomov vsebuje vsaj 6 odprtih bralnih okvirjev. Bralna okvirja ORF1a in b (imenovana tudi rep1a in rep1b) pokrivata območje zapisa za nestrukturne proteine, katerih je 16 pri vseh koronavirusih (z izjemo gamma-koronavirusov, ki so brez prvega). Translacija ORF1a podaja poliprotein velikosti 500 kDa, imenovan poliprotein 1a (pp1a). Pri translaciji ORF1a/b, kjer pride do zamika bralnega okvirja za -1, pa dobimo poliprotein velikosti 800 kDa, ki se imenuje poliprotein 1b (pp1ab). Da lahko pride do zamika bralnega okvirja in s tem do sinteze obeh poliproteinov, virus uporablja spolzko zaporedje in RNA psevdovozel, ki povzročata ribosomalni premik bralnega okvirja iz rep1a na odprti bralni okvir rep1b. V večini primerov ribosom odvija psevodvozel in nadaljuje s translacijo dokler ne naleti na rep 1a stop kodon. Občasno pa psevdovozel prepreči ribosomu nadaljevanje elongacije, kar povzroči zaustavitev translacije na spolzkem zaporedju. Temu sledi premik bralnega okvirja za eno mesto nazaj in kot rezultat dobimo poliprotein 1ab. Virusi verjetno uporabljajo premik bralnega okvirja za regulacijo razmerja med poliproteinoma 1a in 1ab. Slednja nista bila zaznana v času infekcije, kar nakazuje na dejstvo, da sta pocesirana v zrele proteine šele v kotranslacijskem oziroma posttranslacijskem procesu.

==== Nestrukturni proteini ====

Iz pp1a nastanejo nestrukturni proteini 1 – 11, medtem ko je pp1ab procesiran v vseh 16 nestrukturnih proteinov.
Poznamo dva načina cepitve poliproteinov:
V prvem primeru ena ali dve papain-like proteazi, ki se nahajata v nsp3 cepita za nestrukturne proteine 1, 2 in 3. Nekatere od teh proteaz imajo tudi deubikvitinazno aktivnost, ki nasprotuje celični antivirusni obrambi. Imajo tudi pomembno vlogo pri združevanju virusnih replikacijskih struktur. Glavna proteaza – nsp5 opravi ostalih 11 cepitev. Kot vidimo, imajo glavna in papain-like proteaze pomembno vlogo že na začetku replikacije, zato predstavljajo pomembno tarčo za napad zdravil, predvsem nsp5, saj ima zelo specifično zaporedje in je bistveno lažje izdelati molekule, ki se bodo vezale le nanjo in ne bodo poškodovale ostalih proteaz v celici.
Nestrukturni proteini 2 do 16 se povežejo v replikacijsko-transkripcijski kompleks, ki je ključen pri sintezi RNA. Nsp3, 4 in 6 imajo v svoji strukturi transmembranske vijačnice, ki zasidrajo replikacijsko-transkripcijski kompleks v membrano organelov, v katerih poteka sinteza virusne RNA. Ti organeli se imenujejo vezikli z dvojno membrano, za njihov nastanek pa so ključni prav ti trije nestrukturni proteini.
Nsp 7, 8, 9 in 10 sodelujejo pri subgenomski in genomski replikaciji (subgenomska oz. diskontinuirna replikacija je natančneje razložena v naslednjem seminarju). Nsp7 in 8 tvorita heksadekamerni strukturi in sta ključni za vezavo RNA. Nsp10 je neencimski protein, ki vpliva na pravilnost replikacije tako, da regulira aktivnost nsp14 in 16. Mutacije v nsp10 inhibirajo sintezo -RNA, vendar je ta efekt neposreden, saj so raziskave pokazale, da je nsp10 ključen za funkcioniranje glavne proteaze.
Nsp14 je eksonukleaza, ki cepi od 3' proti 5' koncu in skrbi za pravilno transkripcijo RNA, saj služi za kontrolno branje. Nsp15 vsebuje endoribonukleazno domeno, ki pa je značilna le za koronaviruse oz. za nidoviruse. Enako velja tudi za eksonukleazo, zato predstavljata ta dva proteina genetska markerja za to vrsto virusov. Nsp 16 je od S-adenozil-metionina odvisna RNA transferaza, ki pa sodeluje pri tvorbi kape na 5’ koncu.
Nsp12 je od RNA odvisna RNA-polimeraza, nsp13 pa RNA helikaza. Nsp8 najverjetneje deluje kot primaza in je skupaj z nsp7 kofaktor glavne polimeraze.

==== Strukturni N protein ====

S samo replikacijo je neposredno povezan tudi strukturni protein N, ki tvori z genomsko RNA ribonukleoprotein, torej sodeluje tudi pri replikaciji. V začetnih fazah infekcije N protein kolokalizira z replikacijsko-transkripcijskim kompleksom v veziklih z dvojno membrano. Sicer raziskave o sodelovanju N proteina še potekajo, nekateri znanstveniki trdijo, da je njegova prisotnost nujna za sintezo RNA, medtem ko mu drugi pri replikaciji ne pripisujejo pretirano velikega pomena. Nekatere analize so sicer pokazale 100 krat večjo aktivnost replikona ob prisotnosti cis oblike N proteina in kar 1000 krat povečano aktivnost, če je bila navzoča trans oblika. Ali je prisotnost samega proteina bolj ključna pri replikaciji ali transkripciji ali pri obema je potrebno še raziskati.

==Življenjsji cikel virusa v celici==

V času življenjskega cikla v celici koronavirus replicira svojo genomsko RNA, v namen tvorbe kopij celotne dolžine RNA, ki so nato vključene v novonastale virusne delce. Replikacija se začne takoj po okužbi. Koronavirus se veže na celico s pomočjo interakcij med S-proteinom virusa in receptorji na celicah (ACE-2 v primeru SARS-CoV-2) ter gostiteljski faktorji (TMPRSS2). Sledi fuzija virusa s celiično membrano. Sledi takojšnja translacija dveh velikih odprtih bralnih okvirjev, ORF1a in ORF1b. Sintetizirata se 2 velika poliproteina pp1a in pp1ab, ki se preko posttranslacijskih modifikacij preoblikujeta v več manjših nestrukturnih proteinov (nsps), ki se oblikujejo v replikacijsko-transkripcijski kompleks. Ustvari se zaščitno okolje za replikacijo virusnega dednega materiala, ki sestoji iz perinulklearnih dvomembranskih mehurčkov (DMV), zvitih membran (CM) in majhnih odprtih dvojno membranskih kroglic (DMS). Strukturni proteini se preselijo na membrane endoplazemskega retikuluma in prehajajo čez ER-to-Golgi intermediate compartment (ERGIC), kjer se združijo strukturni proteini z novo nastalo (+)RNA, ki kasneje služi kot podlaga za nastajanje novih mRNA molekul. Za tem se virioni iz celice izločijo z eksocitozo.

==Replikacija==

Koronavirusi se od ostalih virusov razlikujejo po unikatni strategiji replikacije. Replikacija virusnih RNA sledi za translacijo in oblikovanjem RTC kompleksa. Ko replikacijsko transkripcijski kompleks interagira z koronavirusno RNA(+) se začne replikacija RNA molekul. Nastane RNA(-), s katero se lahko zgodita 2 stvari; 1. lahko poteče replikacija in se zopet sintetizira RNA(+) molekula, ki je identična molekuli, ki je prišla v celico iz virusa. Ta se lahko porabi za translacijo in nastanek nestrukturnih proteinov ali pa se zapakira v nove virione in zapusti celico ali pa 2. diskontinuirna transkripcija. Nastajajo različne subgenomske RNA (sgRNA), s pomočjo od RNA odvisne RNA polimeraze. sgRNA služi tvorbi strukturnih in akcesornih proteinov.
Veliko replikonskih zaporedij je zelo pomembnih pri replikaciji RNA. V 5' UTR koncu genoma je 7 lasničnih zank, ki se razširijo v gen 1a. V 3' UTR koncu pa je izbočena lasnična zanka, psevdoknot in hipervariabilno območje. Lasnična zanka in psevdovozelj na 3' koncu se prekrivata in zato ne moreta nastajati enakočasno. Iz tu izhaja ideja, da določene strukture regulirajo različne stopnje RNA sinteze, čeprav podrobnejši mehanizmi delovanja še niso jasni. Bolj raziskan pa je mehanizem nadaljnje replikacije dednega materiala in sicer diskontinuirana transkripcija.
Sama replikacija v veziklih poteka v citosolu gostiteljske celice, sam virus pa kontrolira celoten potek tudi s pomočjo nekaterih virusnih proteinov, ki se prenesejo v jedro gostiteljske celice. Kot vemo, se geni v jedrcu celice izražajo bolj intenzivno, zato tudi položaj genov oz. delov kromosoma vpliva na njihovo prepisovanje. Virusni proteini interagirajo z jedrnimi antigeni in jih prerazporedijo, tako da se intenzivneje sintetizirajo proteini, ki so za virusni življenjski cikel najpomembnejši. Vplivanje na proliferacijo gostiteljske celice je skupna značilnost vseh nidovirusov.

====Tvorba replikacijsko-transkripcijskega kompleksa====

Replikacija virusa je direktno povezana z tvorbo replikacijsko transkripcijskega kompleksa (RTC), ki je tudi potencialna tarča za zdravila. Na RTC poteka sinteza tako genomske kot tudi subgenomske RNA, katera je potrebna tako za replikacijo virusnega genoma kot tudi za transkripcijo virusnih proteinsko kodiranih genov. Nekaj posameznih struktur je bolj natančno definiranih (glej strukture posameznih nestrukturnih proteinov). Replikacija in transkripcija potekata po modelu leader-to-body fusion.

====Zaščitno okolje za replikacijo genskega materiala====

Podrobnejši mehanizem replikacije RNA je žal neznanka, je pa znano kje poteka replikacija (in tudi transkripcija) RNA. Nekatere študije zatrjujejo, da vezikli z dvojno membrano izvirajo iz endoplazemskega retikuluma, spet druge trdijo, da ti vezikli nastanejo kot produkti makrofagov, katerim manjka ATG5 (ključna komponenta avtofagosomov). Vsekakor pa njihova formacija vključuje ukrivljanje membran, kar je lahko ključno za insercijo virusnih proteinov v membrano veziklov. Vloga veziklov ni le tvorba primernega okolja za replikacijo RNA in njene zaščite, temveč sodelujejo tudi pri translaciji in tvorbi kapside okrog viriona.
Proteini nsp3, 5 in 8 (vsi sodelujejo pri replikciji) so locirani zunaj membrane teh veziklov, ostali nestrukturni proteini, ki tvorijo RTC kompleks pa so razporejeni na notranji membrani. V notranjosti so opazili tudi dvoverižno RNA, ki verjetno predstavlja intermediat replikacije.

==Viri==

Struktura genoma in replikacija RNA pri koronavirusih

2021-05-05T10:01:40Z

Luka Stanković: /* Primerjava genomov med koronavirusi */

== Uvod ==

Koronavirusi (Coronaviridae) so največja družina virusov iz roda Nidovirales. Vsi virusi družin rodu Nidovirales (Coronaviridae, Arteriviridae, Roniviridae in Mesoniviridae) so nesegmentirani RNA virusi obdani s fosfolipidnim ovojem in dobro ohranjeno organizacijo gnoma. Slednji je pri Nidovirales v primerjavi z RNA virusi drugih rodov mnogo daljši in specifičen v številnih pogledih.

==== Pomen poznavanja genoma ====

Poznavanje genoma virusa je ključnega pomena. S sekvenciranjem genoma virusa lahko izvemo več o njegovi strukturi, delovanju, življenjskem ciklu, hitrosti širjenja in njegovi smrtonostnosti, obenem pa nam razkriva njegove slabosti in možnosti za boj proti virusu.
Mutacije virusov

Virusi se ves čas spreminjajo in kljub relativno uspešnim popravljalnim mehanizmom pri velikemu številu replikacij prihaja do mutacij. Le-te se sicer v večini primerov ne ohranijo, če ne pripomorejo k povečanju možnosti preživetja virusa ali pa k povečanju njegove infektivnosti. SARS-CoV-2 je najbolj razširjen koronavirus in je do maja 2021 okužil več kot 150 milijonov ljudi, kar je virusu omogočilo zelo veliko število replikacij in posledično mutacij, ki vodijo do nastanka novih sevov virusa. Do maja 2021 je bilo sekvencioniranih že več kot 1,3 milijone genomov SARS-CoV-2. Pogost odvzem vzorcev in sekvenciranje genomov virusa širše populacije je ključen za sledenje razvoja virusa in identifikacijo novih sevov.

==== Primerjava genomov med koronavirusi ====

Primerjava genomov posameznih virusov nam pomaga razumeti njihovo evolucijo in potencialno sorodnost med njimi, kar nam omogoča hitrejšo identifikacijo sredstva za boj proti novim virusom na podlagi preteklih raziskav sorodnih primerov. Poravnava genomov koronavirusov je pokazala 58 % ujemanje na področju regije nestrukturnih proteinov in 43 % ujemanje na delu genoma, ki nosi zapis za strukturne proteine. Slednje nakazuje na dejstvu, da so zapisi za nestrukturni proteini veliko bolj ohranjeni, medtem ko je pri sami strukturi virusa skozi evolucijo prihajalo do večjega števila prilagoditev odvisnih od gostitelja. (Analiza genoma SARS-CoV-2 je pokazala večje ujemanje z SARS-CoV najdenega v netopirjih kakor tistega, ki je bil prisoten pri okužbi pri ljudeh.

== Genom Koronavirusov ==

Genom koronavirusa je pozitivna enoverižna RNA zgrajena iz približno 30 tisoč baznih parov, kar ga uvršča med RNA viruse z najdaljšim genomom. Na 5’ koncu je zaščiten s 5’ kapo. Začne se z vodilno verigo ter nekodirajočo regijo. Tu se nahajajo številne zankaste structure, ki imajo pomembno vlogo pri translaciji in transkripciji. V smeri proti 3’ koncu sledi področje z zapisi za nestrukturne proteine. To področje se razteza čez približno 2/3 genoma (okoli 20 tisoč baz). Primarna naloga nestrukturnih proteinov je tvorba replikacijsko transkripcijskega kompleksa (RTC), ki omogoča podvojevanje RNA. Nestrukturni proteini, ki ne sodelujejo pri replikaciji oziroma transkripciji, omogočajo virusu nadzor nad gostiteljem.

Zadnjih 10 tisoč baz nosi zapis za strukturne proteine, ki so del kasneje nastalega viriona. Štirje osrednji strukturni proteini, ki imajo kodirajoče regije v genomu nanizane v enakem zaporedju, kot so navedeni v besedilu, so S protein, ki sestavlja bodice (S-spike), protein M, sestavni del membrane (M-membrane), E protein ovojnice (E-envelope) in protein N (N-nucleocapsid). Genom poleg naštetih vsebuje tudi zapise za več drugih strukturnih proteinov, ki se nahajajo med ali pored zapisov za S, M, E, N proteine. V zadnji tretjini genoma na 3’ se nahajajo tudi zapisi za pomožne proteine. Slednji nimajo pomembne vloge pri transkripciji in translaciji, saj sta procesa potekala tudi po izbrisu le-the. Izkazalo pa se je, da imajo ponekod ključno vlogo pri oslabitvi obrambnega mehanizma gostiteljske celice.
Pred vsakim zaporedjem, ki kodira zapis za strukturne ali pomožne protein se nahajajo regulatorna zaporedja, ki regulirajo transkripcijo in s tem vplivajo na ekspresijo določenega proteina. Pri 3’ koncu se zopet pojavi nekodirajoča regija, ki ji na sledi poli-A rep.

==== Bralni okvirji ====

Večina koronavirusnih genomov in subgenomov vsebuje vsaj 6 odprtih bralnih okvirjev. Bralna okvirja ORF1a in b (imenovana tudi rep1a in rep1b) pokrivata območje zapisa za nestrukturne proteine, katerih je 16 pri vseh koronavirusih (z izjemo gamma-koronavirusov, ki so brez prvega). Translacija ORF1a podaja poliprotein velikosti 500 kDa, imenovan poliprotein 1a (pp1a). Pri translaciji ORF1a/b, kjer pride do zamika bralnega okvirja za -1, pa dobimo poliprotein velikosti 800 kDa, ki se imenuje poliprotein 1b (pp1ab). Da lahko pride do zamika bralnega okvirja in s tem do sinteze obeh poliproteinov, virus uporablja spolzko zaporedje in RNA psevdovozel, ki povzročata ribosomalni premik bralnega okvirja iz rep1a na odprti bralni okvir rep1b. V večini primerov ribosom odvija psevodvozel in nadaljuje s translacijo dokler ne naleti na rep 1a stop kodon. Občasno pa psevdovozel prepreči ribosomu nadaljevanje elongacije, kar povzroči zaustavitev translacije na spolzkem zaporedju. Temu sledi premik bralnega okvirja za eno mesto nazaj in kot rezultat dobimo poliprotein 1ab. Virusi verjetno uporabljajo premik bralnega okvirja za regulacijo razmerja med poliproteinoma 1a in 1ab. Slednja nista bila zaznana v času infekcije, kar nakazuje na dejstvo, da sta pocesirana v zrele proteine šele v kotranslacijskem oziroma posttranslacijskem procesu.

==== Nestrukturni proteini ====

Iz pp1a nastanejo nestrukturni proteini 1 – 11, medtem ko je pp1ab procesiran v vseh 16 nestrukturnih proteinov.
Poznamo dva načina cepitve poliproteinov:
V prvem primeru ena ali dve papain-like proteazi, ki se nahajata v nsp3 cepita za nestrukturne proteine 1, 2 in 3. Nekatere od teh proteaz imajo tudi deubikvitinazno aktivnost, ki nasprotuje celični antivirusni obrambi. Imajo tudi pomembno vlogo pri združevanju virusnih replikacijskih struktur. Glavna proteaza – nsp5 opravi ostalih 11 cepitev. Kot vidimo, imajo glavna in papain-like proteaze pomembno vlogo že na začetku replikacije, zato predstavljajo pomembno tarčo za napad zdravil, predvsem nsp5, saj ima zelo specifično zaporedje in je bistveno lažje izdelati molekule, ki se bodo vezale le nanjo in ne bodo poškodovale ostalih proteaz v celici.
Nestrukturni proteini 2 do 16 se povežejo v replikacijsko-transkripcijski kompleks, ki je ključen pri sintezi RNA. Nsp3, 4 in 6 imajo v svoji strukturi transmembranske vijačnice, ki zasidrajo replikacijsko-transkripcijski kompleks v membrano organelov, v katerih poteka sinteza virusne RNA. Ti organeli se imenujejo vezikli z dvojno membrano, za njihov nastanek pa so ključni prav ti trije nestrukturni proteini.
Nsp 7, 8, 9 in 10 sodelujejo pri subgenomski in genomski replikaciji (subgenomska oz. diskontinuirna replikacija je natančneje razložena v naslednjem seminarju). Nsp7 in 8 tvorita heksadekamerni strukturi in sta ključni za vezavo RNA. Nsp10 je neencimski protein, ki vpliva na pravilnost replikacije tako, da regulira aktivnost nsp14 in 16. Mutacije v nsp10 inhibirajo sintezo -RNA, vendar je ta efekt neposreden, saj so raziskave pokazale, da je nsp10 ključen za funkcioniranje glavne proteaze.
Nsp14 je eksonukleaza, ki cepi od 3' proti 5' koncu in skrbi za pravilno transkripcijo RNA, saj služi za kontrolno branje. Nsp15 vsebuje endoribonukleazno domeno, ki pa je značilna le za koronaviruse oz. za nidoviruse. Enako velja tudi za eksonukleazo, zato predstavljata ta dva proteina genetska markerja za to vrsto virusov. Nsp 16 je od S-adenozil-metionina odvisna RNA transferaza, ki pa sodeluje pri tvorbi kape na 5’ koncu.
Nsp12 je od RNA odvisna RNA-polimeraza, nsp13 pa RNA helikaza. Nsp8 najverjetneje deluje kot primaza in je skupaj z nsp7 kofaktor glavne polimeraze.

====Tvorba replikacijsko-transkripcijskega kompleksa====

Replikacija virusa je direktno povezana z tvorbo replikacijsko transkripcijskega kompleksa (RTC), ki je tudi potencialna tarča za zdravila. Na RTC poteka sinteza tako genomske kot tudi subgenomske RNA, katera je potrebna tako za replikacijo virusnega genoma kot tudi za transkripcijo virusnih proteinsko kodiranih genov. Podrobna struktura kompleksa ostaja neznanka, vendar je nekaj lokalnih struktur že definiranih (glej strukture posameznih nestrukturnih proteinov). Replikacija in transkripcija potekata po modelu leader-to-body fusion.

==== Strukturni N protein ====

S samo replikacijo je neposredno povezan tudi strukturni protein N, ki tvori z genomsko RNA ribonukleoprotein, torej sodeluje tudi pri replikaciji. V začetnih fazah infekcije N protein kolokalizira z replikacijsko-transkripcijskim kompleksom v veziklih z dvojno membrano. Sicer raziskave o sodelovanju N proteina še potekajo, nekateri znanstveniki trdijo, da je njegova prisotnost nujna za sintezo RNA, medtem ko mu drugi pri replikaciji ne pripisujejo pretirano velikega pomena. Nekatere analize so sicer pokazale 100 krat večjo aktivnost replikona ob prisotnosti cis oblike N proteina in kar 1000 krat povečano aktivnost, če je bila navzoča trans oblika. Ali je prisotnost samega proteina bolj ključna pri replikaciji ali transkripciji ali pri obema je potrebno še raziskati.

==ŽIVLJENJSKI CIKEL VIRUSA V CELICI==

V času življenjskega cikla v celici koronavirus replicira svojo genomsko RNA, v namen tvorbe kopij celotne dolžine RNA, ki so nato vključene v novonastale virusne delce. Replikacija se začne takoj po okužbi. Koronavirus se veže na celico s pomočjo interakcij med S-proteinom virusa in receptorji na celicah (ACE-2 v primeru SARS-CoV-2) ter gostiteljski faktorji (TMPRSS2). Sledi fuzija virusa s celiično membrano. Sledi takojšnja translacija dveh velikih odprtih bralnih okvirjev, ORF1a in ORF1b. Sintetizirata se 2 velika poliproteina pp1a in pp1ab, ki se preko posttranslacijskih modifikacij preoblikujeta v več manjših nestrukturnih proteinov (nsps), ki se oblikujejo v replikacijsko-transkripcijski kompleks. Ustvari se zaščitno okolje za replikacijo virusnega dednega materiala, ki sestoji iz perinulklearnih dvomembranskih mehurčkov (DMV), zvitih membran (CM) in majhnih odprtih dvojno membranskih kroglic (DMS). Strukturni proteini se preselijo na membrane endoplazemskega retikuluma in prehajajo čez ER-to-Golgi intermediate compartment (ERGIC), kjer se združijo strukturni proteini z novo nastalo (+)RNA, ki kasneje služi kot podlaga za nastajanje novih mRNA molekul. Za tem se virioni iz celice izločijo z eksocitozo.

Struktura genoma in replikacija RNA pri koronavirusih

2021-05-05T10:00:13Z

Luka Stanković:

== Uvod ==

Koronavirusi (Coronaviridae) so največja družina virusov iz roda Nidovirales. Vsi virusi družin rodu Nidovirales (Coronaviridae, Arteriviridae, Roniviridae in Mesoniviridae) so nesegmentirani RNA virusi obdani s fosfolipidnim ovojem in dobro ohranjeno organizacijo gnoma. Slednji je pri Nidovirales v primerjavi z RNA virusi drugih rodov mnogo daljši in specifičen v številnih pogledih.

==== Pomen poznavanja genoma ====

Poznavanje genoma virusa je ključnega pomena. S sekvenciranjem genoma virusa lahko izvemo več o njegovi strukturi, delovanju, življenjskem ciklu, hitrosti širjenja in njegovi smrtonostnosti, obenem pa nam razkriva njegove slabosti in možnosti za boj proti virusu.
Mutacije virusov

Virusi se ves čas spreminjajo in kljub relativno uspešnim popravljalnim mehanizmom pri velikemu številu replikacij prihaja do mutacij. Le-te se sicer v večini primerov ne ohranijo, če ne pripomorejo k povečanju možnosti preživetja virusa ali pa k povečanju njegove infektivnosti. SARS-CoV-2 je najbolj razširjen koronavirus in je do maja 2021 okužil več kot 150 milijonov ljudi, kar je virusu omogočilo zelo veliko število replikacij in posledično mutacij, ki vodijo do nastanka novih sevov virusa. Do maja 2021 je bilo sekvencioniranih že več kot 1,3 milijone genomov SARS-CoV-2. Pogost odvzem vzorcev in sekvenciranje genomov virusa širše populacije je ključen za sledenje razvoja virusa in identifikacijo novih sevov.

==== Primerjava genomov med koronavirusi ====

Primerjava genomov posameznih virusov nam pomaga razumeti njihovo evolucijo in potencialno sorodnost med njimi, kar nam omogoča hitrejšo identifikacijo sredstva za boj proti novim virusom na podlagi preteklih raziskav sorodnih primerov. Poravnava genomov koronavirusov je pokazala 58 % ujemanje na področju regije nestrukturnih proteinov in 43 % ujemanje na delu genoma, ki nosi zapis za strukturne proteine. Slednje nakazuje na dejstvu, da so zapisi za nestrukturni proteini veliko bolj ohranjeni, medtem ko je pri sami strukturi virusa skozi evolucijo prihajalo do večjega števila prilagoditev odvisnih od gostitelja. (Analiza genoma SARS-CoV-2 je pokazala večje ujemanje z SARS-CoV najdenega v netopirjih kakor tistega, ki je bil prisoten pri okužbi pri ljudeh.)

== Genom Koronavirusov ==

Genom koronavirusa je pozitivna enoverižna RNA zgrajena iz približno 30 tisoč baznih parov, kar ga uvršča med RNA viruse z najdaljšim genomom. Na 5’ koncu je zaščiten s 5’ kapo. Začne se z vodilno verigo ter nekodirajočo regijo. Tu se nahajajo številne zankaste structure, ki imajo pomembno vlogo pri translaciji in transkripciji. V smeri proti 3’ koncu sledi področje z zapisi za nestrukturne proteine. To področje se razteza čez približno 2/3 genoma (okoli 20 tisoč baz). Primarna naloga nestrukturnih proteinov je tvorba replikacijsko transkripcijskega kompleksa (RTC), ki omogoča podvojevanje RNA. Nestrukturni proteini, ki ne sodelujejo pri replikaciji oziroma transkripciji, omogočajo virusu nadzor nad gostiteljem.

Zadnjih 10 tisoč baz nosi zapis za strukturne proteine, ki so del kasneje nastalega viriona. Štirje osrednji strukturni proteini, ki imajo kodirajoče regije v genomu nanizane v enakem zaporedju, kot so navedeni v besedilu, so S protein, ki sestavlja bodice (S-spike), protein M, sestavni del membrane (M-membrane), E protein ovojnice (E-envelope) in protein N (N-nucleocapsid). Genom poleg naštetih vsebuje tudi zapise za več drugih strukturnih proteinov, ki se nahajajo med ali pored zapisov za S, M, E, N proteine. V zadnji tretjini genoma na 3’ se nahajajo tudi zapisi za pomožne proteine. Slednji nimajo pomembne vloge pri transkripciji in translaciji, saj sta procesa potekala tudi po izbrisu le-the. Izkazalo pa se je, da imajo ponekod ključno vlogo pri oslabitvi obrambnega mehanizma gostiteljske celice.
Pred vsakim zaporedjem, ki kodira zapis za strukturne ali pomožne protein se nahajajo regulatorna zaporedja, ki regulirajo transkripcijo in s tem vplivajo na ekspresijo določenega proteina. Pri 3’ koncu se zopet pojavi nekodirajoča regija, ki ji na sledi poli-A rep.

==== Bralni okvirji ====

Večina koronavirusnih genomov in subgenomov vsebuje vsaj 6 odprtih bralnih okvirjev. Bralna okvirja ORF1a in b (imenovana tudi rep1a in rep1b) pokrivata območje zapisa za nestrukturne proteine, katerih je 16 pri vseh koronavirusih (z izjemo gamma-koronavirusov, ki so brez prvega). Translacija ORF1a podaja poliprotein velikosti 500 kDa, imenovan poliprotein 1a (pp1a). Pri translaciji ORF1a/b, kjer pride do zamika bralnega okvirja za -1, pa dobimo poliprotein velikosti 800 kDa, ki se imenuje poliprotein 1b (pp1ab). Da lahko pride do zamika bralnega okvirja in s tem do sinteze obeh poliproteinov, virus uporablja spolzko zaporedje in RNA psevdovozel, ki povzročata ribosomalni premik bralnega okvirja iz rep1a na odprti bralni okvir rep1b. V večini primerov ribosom odvija psevodvozel in nadaljuje s translacijo dokler ne naleti na rep 1a stop kodon. Občasno pa psevdovozel prepreči ribosomu nadaljevanje elongacije, kar povzroči zaustavitev translacije na spolzkem zaporedju. Temu sledi premik bralnega okvirja za eno mesto nazaj in kot rezultat dobimo poliprotein 1ab. Virusi verjetno uporabljajo premik bralnega okvirja za regulacijo razmerja med poliproteinoma 1a in 1ab. Slednja nista bila zaznana v času infekcije, kar nakazuje na dejstvo, da sta pocesirana v zrele proteine šele v kotranslacijskem oziroma posttranslacijskem procesu.

==== Nestrukturni proteini ====

Iz pp1a nastanejo nestrukturni proteini 1 – 11, medtem ko je pp1ab procesiran v vseh 16 nestrukturnih proteinov.
Poznamo dva načina cepitve poliproteinov:
V prvem primeru ena ali dve papain-like proteazi, ki se nahajata v nsp3 cepita za nestrukturne proteine 1, 2 in 3. Nekatere od teh proteaz imajo tudi deubikvitinazno aktivnost, ki nasprotuje celični antivirusni obrambi. Imajo tudi pomembno vlogo pri združevanju virusnih replikacijskih struktur. Glavna proteaza – nsp5 opravi ostalih 11 cepitev. Kot vidimo, imajo glavna in papain-like proteaze pomembno vlogo že na začetku replikacije, zato predstavljajo pomembno tarčo za napad zdravil, predvsem nsp5, saj ima zelo specifično zaporedje in je bistveno lažje izdelati molekule, ki se bodo vezale le nanjo in ne bodo poškodovale ostalih proteaz v celici.
Nestrukturni proteini 2 do 16 se povežejo v replikacijsko-transkripcijski kompleks, ki je ključen pri sintezi RNA. Nsp3, 4 in 6 imajo v svoji strukturi transmembranske vijačnice, ki zasidrajo replikacijsko-transkripcijski kompleks v membrano organelov, v katerih poteka sinteza virusne RNA. Ti organeli se imenujejo vezikli z dvojno membrano, za njihov nastanek pa so ključni prav ti trije nestrukturni proteini.
Nsp 7, 8, 9 in 10 sodelujejo pri subgenomski in genomski replikaciji (subgenomska oz. diskontinuirna replikacija je natančneje razložena v naslednjem seminarju). Nsp7 in 8 tvorita heksadekamerni strukturi in sta ključni za vezavo RNA. Nsp10 je neencimski protein, ki vpliva na pravilnost replikacije tako, da regulira aktivnost nsp14 in 16. Mutacije v nsp10 inhibirajo sintezo -RNA, vendar je ta efekt neposreden, saj so raziskave pokazale, da je nsp10 ključen za funkcioniranje glavne proteaze.
Nsp14 je eksonukleaza, ki cepi od 3' proti 5' koncu in skrbi za pravilno transkripcijo RNA, saj služi za kontrolno branje. Nsp15 vsebuje endoribonukleazno domeno, ki pa je značilna le za koronaviruse oz. za nidoviruse. Enako velja tudi za eksonukleazo, zato predstavljata ta dva proteina genetska markerja za to vrsto virusov. Nsp 16 je od S-adenozil-metionina odvisna RNA transferaza, ki pa sodeluje pri tvorbi kape na 5’ koncu.
Nsp12 je od RNA odvisna RNA-polimeraza, nsp13 pa RNA helikaza. Nsp8 najverjetneje deluje kot primaza in je skupaj z nsp7 kofaktor glavne polimeraze.

====Tvorba replikacijsko-transkripcijskega kompleksa====

Replikacija virusa je direktno povezana z tvorbo replikacijsko transkripcijskega kompleksa (RTC), ki je tudi potencialna tarča za zdravila. Na RTC poteka sinteza tako genomske kot tudi subgenomske RNA, katera je potrebna tako za replikacijo virusnega genoma kot tudi za transkripcijo virusnih proteinsko kodiranih genov. Podrobna struktura kompleksa ostaja neznanka, vendar je nekaj lokalnih struktur že definiranih (glej strukture posameznih nestrukturnih proteinov). Replikacija in transkripcija potekata po modelu leader-to-body fusion.

==== Strukturni N protein ====

S samo replikacijo je neposredno povezan tudi strukturni protein N, ki tvori z genomsko RNA ribonukleoprotein, torej sodeluje tudi pri replikaciji. V začetnih fazah infekcije N protein kolokalizira z replikacijsko-transkripcijskim kompleksom v veziklih z dvojno membrano. Sicer raziskave o sodelovanju N proteina še potekajo, nekateri znanstveniki trdijo, da je njegova prisotnost nujna za sintezo RNA, medtem ko mu drugi pri replikaciji ne pripisujejo pretirano velikega pomena. Nekatere analize so sicer pokazale 100 krat večjo aktivnost replikona ob prisotnosti cis oblike N proteina in kar 1000 krat povečano aktivnost, če je bila navzoča trans oblika. Ali je prisotnost samega proteina bolj ključna pri replikaciji ali transkripciji ali pri obema je potrebno še raziskati.

==ŽIVLJENJSKI CIKEL VIRUSA V CELICI==

V času življenjskega cikla v celici koronavirus replicira svojo genomsko RNA, v namen tvorbe kopij celotne dolžine RNA, ki so nato vključene v novonastale virusne delce. Replikacija se začne takoj po okužbi. Koronavirus se veže na celico s pomočjo interakcij med S-proteinom virusa in receptorji na celicah (ACE-2 v primeru SARS-CoV-2) ter gostiteljski faktorji (TMPRSS2). Sledi fuzija virusa s celiično membrano. Sledi takojšnja translacija dveh velikih odprtih bralnih okvirjev, ORF1a in ORF1b. Sintetizirata se 2 velika poliproteina pp1a in pp1ab, ki se preko posttranslacijskih modifikacij preoblikujeta v več manjših nestrukturnih proteinov (nsps), ki se oblikujejo v replikacijsko-transkripcijski kompleks. Ustvari se zaščitno okolje za replikacijo virusnega dednega materiala, ki sestoji iz perinulklearnih dvomembranskih mehurčkov (DMV), zvitih membran (CM) in majhnih odprtih dvojno membranskih kroglic (DMS). Strukturni proteini se preselijo na membrane endoplazemskega retikuluma in prehajajo čez ER-to-Golgi intermediate compartment (ERGIC), kjer se združijo strukturni proteini z novo nastalo (+)RNA, ki kasneje služi kot podlaga za nastajanje novih mRNA molekul. Za tem se virioni iz celice izločijo z eksocitozo.

Struktura genoma in replikacija RNA pri koronavirusih

2021-05-05T09:55:38Z

Luka Stanković: /* Genom Koronavirusov */

Struktura genoma in replikacija RNA pri koronavirusih

2021-05-05T09:55:19Z

Luka Stanković: /* Bralni okvirji */

Struktura genoma in replikacija RNA pri koronavirusih

2021-05-05T09:55:11Z

Luka Stanković: /* Bralni okvirji */

Struktura genoma in replikacija RNA pri koronavirusih

2021-05-05T09:54:47Z

Luka Stanković: /* Uvod */

Struktura genoma in replikacija RNA pri koronavirusih

2021-05-05T09:41:38Z

Luka Stanković: /* Uvod */

Struktura genoma in replikacija RNA pri koronavirusih

2021-05-05T09:40:46Z

Luka Stanković: New page: == Uvod == Koronavirusi (Coronaviridae) so največja družina virusov iz roda Nidovirales. Vsi virusi družin rodu Nidovirales (Coronaviridae, Arteriviridae, Roniviridae in Mesoniviridae)...

Molekularna biologija koronavirusov

2021-05-05T09:35:53Z

Luka Stanković:

Seminarji pri Molekularni biologiji v študijskem letu 2020/21 obravnavajo sorazmerno ozko področje koronavirusov, vendar je to glede na pandemijo virusa SARS-CoV-2 zelo aktualna tema in zato smiselna, da jo podrobneje obdelamo. Za seminarje sem določil 15 poglavij, ki temeljijo na vsaj enem preglednem članku, objavljenem od leta 2015 naprej. Ti članki naj vam bodo izhodišče za pripravo, dopolnite pa jih z novejšimi podatki, predvsem glede povzročitelja bolezni kovid-19.

Vsako poglavje obdelajo praviloma trije študenti. Vsaka skupina mora pripraviti povzetek seminarja v obsegu 1200-1500 besed in ga objaviti na tem wikiju. Povzetek ne vsebuje slikovnega gradiva, lahko pa vključuje povezave do slik in videov na spletu. Navedite do 5 ključnih virov (ti ne štejejo v vsoto 1200 besed), ki ste jih uporabili.

Vsaka skupina mora objaviti povzetek seminarja najkasneje 24 h pred začetkom seminarjev. Kateri del povzetka je napisal kdo, navedite v zavihku 'discussion'.

Pripravite tudi predstavitev, dolgo pribl. 20 minut (tolerančni okvir je 18-22 min.), temu pa bo sledila razprava, dolga 5-10 min. Vsak član skupine mora predstaviti en del seminarja, pri čemer mora biti delo enakomerno razdeljeno med vse. Osredotočite se na osnovno temo, ki ste si jo izbrali in vključite čim manj splošnega uvoda. Ne opisujte potekov bolezni, če to ni nujno zaradi povezave z biokemijskimi značilnostmi virusov! Glede vsebine predstavitve se posvetujte s kolegi, ki bodo predstavljali sorodna poglavja, tako da bo čim manj prekrivanj.

Seminarji se bodo začeli 4.5.2021 po razporedu, ki bo objavljen v spletni učilnici.

Vsebina seminarjev je izpitna snov. Odgovori na vprašanja iz snovi seminarjev predstavljajo ~10 % končnih točk izpita (2-3 vprašanja od ~30).

Poglavja za seminarje so:
# Patogeni koronavirusi: izvor in evolucija (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/30531947/)
# Molekularni vidiki koronavirusov (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/32661197/)
# Način pakiranja RNA pri koronavirusih (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/31505321/)
# Struktura in funkcija končnih zaporedij koronavirusne genomske RNA (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/25736566/)
# Struktura genoma in replikacija RNA pri koronavirusih (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/31967327/ in https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/32833200/)
# Kontinuirna in diskontinuirna sinteza RNA pri koronavirusih (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/26958916/)
# Vloga gostiteljskih faktorjev pri replikaciji koronavirusne RNA (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/28643204/)
# Natančnost replikacije koronavirusne RNA (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/21593585/)
# Mehanizmi dodajanja kape in metilacije koronavirusne RNA (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/26847650/)
# Translacijski procesi pri sintezi koronavirusnih proteinov (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/22535777/ in https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/27712623/)
# Odgovor na stres in uravnavanje translacije pri koronavirusih (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/27384577/)
# RNA-elementi s cis-regulacijsko aktivnostjo pri koronavirusih (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/27712622/)
# Vloga nestrukturnega proteina 1 pri izražanju genov ob okužbi s koronavirusom (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/25432065/
# Vloga koronavirusne endonukleaze pri izogibanju protivirusnemu odgovoru (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/29307596/)
# Mehanizem fuzije koronavirusne membrane kot tarča za protivirusna zdravila (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/32272173/)
----

Za seminar se prijavite tako, da se vpišete v oklepaj za naslovom seminarja, tako kot je prikazano pri izmišljenem ničtem seminarju.
Seminarje bomo izvedli v enakem vrstnem redu, kot so navedeni zgoraj.

0. Analiza koronavirusov v Gallusovi dvorani Cankarjevega doma (Jasna Briški, Timi Pegan, Sanja Todorović) 

# [[Patogeni koronavirusi: izvor in evolucija]] (Nikola Janakievski, Stefanija Ivanova) 
# [[Molekularni vidiki koronavirusov]] (Neža Leskovar, Iva Matić, Anja Moškrič) 
# [[Način pakiranja RNA pri koronavirusih]] (Timotej Sotosek, Erik Putar, Eva Vene) 
# [[Struktura in funkcija končnih zaporedij koronavirusne genomske RNA]] (Špela Kladnik, Nika Malečkar, Eva Kanalec)
# [[Struktura genoma in replikacija RNA pri koronavirusih]] (Luka Šegota, Maruša Sernc, Luka Stanković)
# Kontinuirna in diskontinuirna sinteza RNA pri koronavirusih (Jakob Tomšič, Ana Pervanja, Zala Perko)
# Vloga gostiteljskih faktorjev pri replikaciji koronavirusne RNA (Nika Bedrač, Tinkara Božič, Maja Kobal)
# Natančnost replikacije koronavirusne RNA (Evgen Kozole, David Verdel, Petra Sintič)
# Mehanizmi dodajanja kape in metilacije koronavirusne RNA (Nika Perko, Gregor Strniša, Nika Tomsič)
# Translacijski procesi pri sintezi koronavirusnih proteinov (Bor Krajnik, Aljaž Simonič, Luka Hafner)
# Odgovor na stres in uravnavanje translacije pri koronavirusih (Aleksandra Rauter, Nika Banovšek, Laura Unuk, Katharina Carola Pavlin)
# RNA-elementi s cis-regulacijsko aktivnostjo pri koronavirusih (Jan Bregar, Ajda Beltram)
# Vloga nestrukturnega proteina 1 pri izražanju genov ob okužbi s koronavirusom (Srna Anastasovska, Mateja Milosevic)
# Vloga koronavirusne endonukleaze pri izogibanju protivirusnemu odgovoru (Veronika Bračič, Ela Bizjak, Rebeka Jerina)
# Mehanizem fuzije koronavirusne membrane kot tarča za protivirusna zdravila (Manca Pirc, Vid Dobrovoljc, Rahela Repina)

Ko boste pripravljali povzetek, naslov teme na tem, drugem, seznamu povežite z novo wiki stranjo, ki bo vsebovala povzetek. Na koncu besedila povzetka (pod viri) v novo vrstico dodajte oznako: <nowiki>[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]</nowiki> . Zgornji seznam bo po zaključku seminarjev izbrisan. Vire boste navedli na koncu vsakega povzetka, zato za serijo seminarjev ne bodo več pomembni.

Primer, kako so bili urejeni seminarji v prejšnjih letih, si lahko ogledate na strani [[Struktura kromatina]] (2013/14).

#[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Herpesvirusi_in_sorodni_dsDNA_virusi Herpesvirusi in sorodni dsDNA virusi] (Veronika Razpotnik, Ines Medved, Andrej Ivanovski)

Talk:Molekularna biologija koronavirusov

2021-05-05T09:18:02Z

Luka Stanković: New page: ''' == Test ==http://wiki.fkkt.uni-lj.si/skins/common/images/button_math.png '''

'''
== Test ==http://wiki.fkkt.uni-lj.si/skins/common/images/button_math.png
'''

BIO2 Povzetki seminarjev 2020

2020-12-18T13:14:40Z

Luka Stanković:

= POVZETKI SEMINARJEV BIOKEMIJA 2020/21 =

==Jan Bregar - Protein retinoblastoma==

Protein retinoblastoma (pRb) je eden ključnih proteinov, ki regulirajo celični cikel in njegova inaktivacija lahko povzroči različna bolezenska stanja. Ta protein regulira ključni prehod iz G1 v S fazo celičnega cikla s pomočjo interakcij z družino E2F, ki je vrsta transkripcijskih faktorjev celičnega cikla. Retinoblastoma protein (pRb) nadzoruje tudi izstop celice iz celičnega cikla. Njeno aktivnost regulira več mehanizmov, ki zaznavajo znotraj- in zunajcelične signale, ki blokirajo ali dovoljujejo fosforilacijo. pRb fosforilirajo od ciklina odvisne kinaze (Cdk-ji) in s tem protein Rb bodisi inaktivirajo ali pa rahlo spremenijo njegove lastnosti, protein pa vseeno ohrani svojo funkcijo. Odkrili so tudi, da pRb regulira apoptozo s pomočjo enakih interakcij s transkripcijskimi faktorji E2F. To, da je pRb vpleten pri apoptozi, popolno dopolnjuje pRb kot pomemben določevalec usode celice. Med trajanjem celičenga cikla je pRb inaktiviran, kar povzroči, da je celica bolj občutljiva na apoptotske stimuluse. Regulacijo apoptoze lahko onesposobijo nekateri virusi, ki s svojimi onkoproteini povzročijo napake v delovanju proteina Rb, kar lahko predstavlja tveganje za organizem. pRb – E2F kompleksi imajo pomembno vlogo pri regulaciji transkripcije genov, ki so vključeni v diferenciaciji in razvoju.

==Ajda Beltram - Struktura in dinamika signalnih komplekov GPCR==

Receptorji sklopljeni z G-proteinom (GPCR) so transmembranski proteini, ki kot odgovor na ligande regulirajo veliko signalnih poti preko heterotrimernih G-proteinov ali pa preko fosforilacije receptorja s kinazo GRK in arestinov. Vendar ti proteini ne obstajajo le v aktivirani ali neaktivirani obliki, pač pa imajo veliko konformacijskih stanj, ki vsaka sproži svojo signalno pot. Mene je zanimala podrobna razlaga konformacijskih sprememb, ki se zgodijo med prenosom signala. Za aktivacijo G-proteinov je potrebna zamenjava GDP z GTP, kjer igra ključno vlogo razcep domen podenote α G-proteina in destabilizacija vezavnega mesta za nukleotid na Ras-domeni podenote α, kar so posledice konformacijskih sprememb, ki jih povzroči vezava na receptor. Različni ligandi, ki se vežejo na receptorje, pa lahko vplivajo tudi na afiniteto G-proteina do GDP. Kompleksi receptor-G-protein, ki nastanejo z vezavo popolnih agonistov, imajo manjšo afiniteto do GDP, kot tisti, ki so nastali z vezavo delnih agonistov. Pri arestinih pa so prav tako prišli do novega spoznanja. Aktivacija arestinov je večinoma prikazana kot proces iz dveh delov in sicer vezave na fosforiliran C-rep receptorja in nato vezave na jedro receptorja, vendar pa so odkrili, da lahko obe vezavi posebej aktivirata arestin. To nakazuje na to, da verjetno obstaja veliko različnih kompleksov arestina in receptorja, ki regulirajo vsak svojo signalno pot.

==Anja Moškrič - Presinaptični kalcijevi kanalčki kot specializiran nadzor za sproščanje nevrotransmitorjev==

Signalizacija živčnih celic med drugim poteka s prenosom nevrotransmitorjev preko sinaps. Pri kemični sinapsi gre za pretvarjanje električnih impulzov v eksocitotsko sprostitev nevrotransmitorja (npr. glutamat, GABA, epinefrin, norepinefrin). Pri pretvarjanju signala imajo ključno vlogo napetostno uravnavani kalcijevi ionski kanalčki (Cav), v presinaptičnem predelu. Ti, kot odgovor na depolarizacijo nevrona, usmerjajo kalcijeve ione v notranjost celice in posledično sprožijo fuzijo mešička (z nevrotransmitorjem) s presinaptično membrano. Zgrajeni so iz več podenot, od teh je glavna α1, ki tvori poro za pretok ionov. Podenoti α2δ in β pa regulirata lastnosti. Kanalčke glede na obliko glavne podenote klasificiramo v 3 večje skupine: Cav1, Cav2 in Cav3. V večini sinaps so prisotni kanalčki iz družine Cav2. Da eksocitoza lahko poteče hitro in učinkovito, morajo biti Cav locirani znotraj aktivne regije presinaptične membrane, v bližini mesta eksocitoze. Slednjo kalcijevi kanalčki regulirajo preko različnih proteinov. Pomembnejši predstavnik je družina proteinov RIM (z rab3 vezavne molekule). Ti se na kanalček vežejo z RIM vezavnimi proteini (RBP). Z njimi asociira tudi protein munc13, ki je v membrani vezikla in nevrona vezani s proteini SNARE. Ti so mediatorji pri fuziji membran. Delovanje kanalčka inaktivirajo procesi, kot sta od napetosti odvisni mehanizem in od kalcija odvisen mehanizem, ki je povezan s kalmodulinom.

==Gregor Strniša - Načini aktivacije GPCR==

GPCR, oziroma z G proteinom sklopljeni receptorji, so transmembranski proteini, ki s svojim delovanjem vplivajo na dogajanje v celici. Zaradi vezave liganda na njihovo zunajcelično stran se jim spremeni konformacija in omogoči prenos signala preko različnih signalnih molekul. Signal se preko različnih G proteinov in β-arrestinov prenaša do drugih proteinov v celici. Kmalu po odkritju GPCR se je izkazalo, da vsi ne delujejo po istem principu. Nove raziskovalne metode so omogočile napredek na področju vizualizacije molekul in njihovega sledenja v celici. Tako so znanstveniki prišli do odkritja petih novih metod aktivacije GPCR, ki lažje razložijo delovanje receptorjev. Med seboj so si različne, a se lahko pogosto prekrivajo in dopolnjujejo. GPCR omogočijo več možnosti odgovora na določen ligand in njegovo koncentracijo. Načini aktivacije, predstavljeni v moji seminarski nalogi, so pristranska aktivacija, znotrajcelična aktivacija, dimerizacijska aktivacija, transaktivacija in dvofazna aktivacija. Posamezen receptor navadno deluje na več načinov. Ob posameznem načinu so podani primeri receptorjev in njihovega delovanja. Z razumevanjem načinov njihove aktivacije se odprejo nove možnosti razvoja zdravil, ki bi delovale preko GPCR, ali vplivale na njihove signalne poti.

==Nikola Janakievski - Selective Androgen Receptor Modulators==

Selective Androgen Receptors Modulators or better known as SARMs, were discovered 30 years ago, as a potential replacement to steroid therapy. SARMs are a type of Selective Receptor Modulators (SRM), compounds which can act both as agonists and antagonists in androgen receptors (ARs) (as a non-steroid replacement), according to the tissue they are in. The main idea behind SARMs, is improving the hormone therapies we have currently, which use synthetic steroids. An ideal SARM could have all the benefits of steroid hormones, without the side effects. The potential benefits and safety of SARMs is yet to be determined, there are numerous ongoing studies for various applications. It is important to have a summary of all these potential application and past examples of studies. In this seminar, we aim to do just that, by comparing all past studies and future potential applications related to SARMs. We conclude that, SARMs are a viable alternative, possibly an improvement to synthetic steroids, although much more research and clinical trials are required for SARMs to become truly applicable.

==Vid Dobrovoljc - Medsebojni vpliv signalnih poti na primeru RTK in GPCR signalnih poti==

Preučevanje součinkovanja med signalnimi potmi v celici je zelo zanimivo področje, vendar dokaj težko za raziskovanje. S seminarjem sem poizkusil predstaviti sovplivanje inzulinske(RTK) in β-adrenergične (GCPR) poti v srcu. . Inzulin na β-adrenergične (βAR) poti vpliva s fosforilacijo receptorja z različnimi kinazami, na primer protein kinazo A (PKA) G-protein kinazo (GRK2) in celo sam inzulinskim receptorjem (INSR), kar vodi do desenzitacije in včasih tudi internalizacije receptorja z vezavo β-arestina. Drug način vplivanja je z delovanjem na nižje člene v signalni poti, na primer na koncentracijo cAMP s fosfodiesterazami (PDE). Inzulin lahko tudi s pomočjo fosforilacije uporabi β-adrenergično pot za krepitev svojega signala. Zelo pomembna točka obeh signalnih poti je GRK2, ki po naravi deluje inhibirajoče na obe signalni poti, po zadnjih rezultatih pa jo poleg tega inzulin uporablja za še dodatno inhibicijo GPCR poti. Vplivanje βAR poti na inzulinsko pot je manj jasno, vendar kaže, da lahko βAR na sprejem glukoze v odvisnosti od situacije vpliva tako pozitivno kot negativno, dokaj pomembno vlogo pri tem pa ima PKB. Domnevam, da bo v prihodnosti vedno več raziskav na temo povezav med signalnimi potmi, saj bodo razvite nove opazovalne tehnike, poleg tega pa je razumevanje povezav koristno tako pri razvoju novih tehnik zdravljenja, kot pri samem študiju razvoja celične signalizacije

==Rebeka Jerina - Kofein kot antagonist adenozinskih receptorjev==

Veliko ljudi po svetu pije kavo, čaj ali kokakolo. Vsem naštetim pijačam je skupen kofein, najpogosteje zaužit psihostimulant na svetu. Kofein povzroča veliko učinkov, med katerimi je najbolj znan vpliv na budnost. Zanima me ali vemo kako in zakaj jo povzroči. Kofein je antagonist adenozinskih receptorjev (ARs). Ima podobno strukturo kot adenozin, zato lahko zaseda njegova vezavna mesta. Adenozinski receptorji so izraženi v mnogih tkivih, veliko pa jih najdemo v centralnem živčnem sistemu (CNS). Raziskala sem, da kofein večinoma vpliva na adenozinska receptorja podtipa A1 in A2A. Te dva podtipa adenozinskih receptorjev (ARs) vplivata na regulacijo mnogih fizioloških funkcij kot so spanje, kognicija, motivacija in čustva. Kofein tako z antagonizmom adenozinskih receptorjev (ARs) prepreči signalno kaskado, ki bi spodbudila zaspanost in posledično ohranja budnost. Adenozinski receptorji (ARs) spadajo pod receptorje povezane z G-proteini. Zgradba A1AR in A2AAR se nekoliko razlikuje, zato je tudi mehanizem delovanja teh dveh podtipov nekoliko drugačen. Signalizacija adenozinskih receptorjev (ARs) lahko poteka po več različnih signalnih poteh. Kofein bi zaradi pozitivnih okrepitvenih učinkov, pojava različnih duševnih motenj in pojava negativnih simptomov po prenehanju uživanja lahko prištevali med droge. Raziskave so pokazale, da se z antagonizmom adenozinskih receptorjev da uspešno zdraviti tudi številne bolezni. Glede na učinke in uporabo kofeina bi lahko rekli, da velja za hranilo, zdravilo ali drogo.

==Zala Perko - Mehanizmi vezave ligandov in regeneracija fotoreceptorjev očesne mrežnice==

Fotoreceptorji v membrani celic očesne mrežnice so značilni predstavniki z G-proteinom sklopljenih receptorjev. Njihova naloga je absorpcija svetlobe določene valovne dolžine in prenos signala preko G-proteina na citoplazemsko stran, kjer poteče veriga encimsko kataliziranih reakcij. Aktiviran fotoreceptor mora v procesu regeneracije ponovno zavzeti neaktivno konformacijo in vezati naravni ligand 11-cis-retinal. Barvni fotoreceptorji jodopsini zahtevajo učinkovit regeneracijski mehanizem, ker morajo stalno procesirati veliko količino svetlobnih signalov. Aktivna konformacija jodopsina razpade veliko hitreje v primerjavi z rodopsinom in tudi sam potek regeneracije je pri jodopsinih hitrejši. Vzrok za to bi lahko bila različna usoda desenzibiliziranih receptorjev. Nedavno so odkrili možnost, da pri regeneraciji jodopsinov pride do preusmeritve signalne poti. Namesto, da se receptor deaktivira preko internalizacije z arestinom, ostane v membrani in veže ligand glede na prehodno konformacijsko stanje v katerem se nahaja. Na različen potek regeneracije jodopsinov bi lahko vplivala tudi vezava druge molekule retinala v alosterično mesto, ki je posledica konformacijskih sprememb. Povezava med interakcijo retinala in njegovih analogov z določenim konformacijskim intermediatom ima pomembno vlogo tudi s terapevtskega vidika, saj GPCR-ji v splošnem predstavljajo terapevtske tarče za zdravljenje mnogih obolenj. Uporaba analogov 11-cis-retinala, kot sta 9CR in 6mr, ki se vežeta v aktivno ali eno od alosteričnih mest, bi lahko predstavljala učinkovit pristop pri zdravljenju prirojenih mutacij v fotoreceptorjih.

==Eva Vene - Povezava bolečine z vezavo kapsaicina na TRPV1==

Družina TRP kanalčkov pri živalih združuje devet manjših skupin kationskih prenašalcev, ki odločilno vplivajo na pravilno delovanje organizma. Eden od tovrstnih kanalčkov je tudi TRPV1 z angleškim imenom »transient receptor potential vanilloid 1«. Tega najdemo v mnogih organih in organskih sistemih, natančneje pa se v tem seminarju osredotočamo na njegovo vlogo v perifernem živčevju. TRPV1 vsebuje okoli polovica vseh somatskih in visceralnih senzoričnih nevronov, zato je pomemben mediator pri nocicepciji oziroma zaznavanju možno nevarnih stimulov ter njihovim prevodom v akcijskih potencial. Njegovo delovanje, poleg nekaterih drugih dražljajev, lahko vzbudi organska molekula, imenovana kapsaicin. Slednjega najdemo v sadežih rastlin rodu Capsicum in ga pojmujemo kot eno odločilnih molekul za pekoč okus teh plodov. Ob vezavi kapsaicina na TRPV1 v celico vdrejo kationi, ki spodbudijo različne celične procese, ključne za oblikovanje in prenos živčnega signala do možganov ter pojav vnetja. Posebej zanimive so dvolične posledice vezave kapsaicina, ki sicer vodijo do bolečine, draženja in vnetja, a omogočijo tudi refrakcijsko dobo kanalčka, ki predstavlja čas, ko slednjega ne moremo aktivirati ter desenzitacijo in degradacijo živčnih vlaken, kar povezujemo z analgetičnim učinkom te molekule. Ob redni daljši izpostavitvi kapsaicinu, ki ga lahko administriramo transdermalno ali injiciramo, se tako uspešno uporablja pri lajšanju kroničnih bolečin.

==Erik Putar - AMPK: senzor glukoze ter celičnega energijskega stanja ==

Celica uporablja z AMP aktivirano protein kinazo (AMPK) kot senzor celičnega energijskega stanja in glukoze. Njen glavni aktivator je AMP, ki promovira fosforilacijo Thr172 na AMPK, inhibira defosforilacijo fosforiliranega Thr172 ter alosterično aktivira AMPK. Aktivacija AMPK poteče že ob majhem energijskem deficitu in sproži regulatorni odgovor, ki preusmeri celični metabolizem iz anabolizma v katabolizem. Fosforilacija Thr172 poteče preko kinaze LKB1, medtem ko sta glikogen sintaza in acetil koencim A karboksilaza (ACC) dve tarči izmed mnogih kinazne aktivnosti AMPK. AMPK je heterotrimer sestavljen iz podenot α, β in γ. V α podenoti je prisotno kinazno aktivno mesto ter Thr172, medtem ko so na γ podenoti prisotna vezavna mesta za adenin nukleotide. β podenota je miristilirana na svojem N koncu, kar je ključnega pomena za delovanje glukoznega senzorja. Ta mehanizem poteka na lizosomih in sicer s tvorbo velikega kompleksa, ki vsebuje aldolazo, v-ATPazo, Ragulator, AXIN, LKB1 ter AMPK. Aldolaza je sicer tista, ki čuti prisotnost glukoze in to preko fruktoze 1,6-bisfosfata (FBP): odsotnost FBP v njenem aktivnem mestu aktivira AMPK neodvisno od razmerja koncentracijah adenin nukleotidov in tako preusmeri celico iz glikolitične v alternativne oksidativne poti.

==Timotej Sotošek - Regulacija mišičnega glikogena: granule in njeni proteini ==

Glikogen je primarna oblika shranjevanja glukoze, ki je hitra in dostopna oblika energije. Kljub njegovi pomembnosti pa procesi regulacije glikogena še vedno niso popolnoma jasni. Metabolizem glikogena je zelo reguliran, hkrati pa dinamičen. Kako se bo metabolizem glikogena usmeril, je odvisno od mnogih dejavnikov. Zaloge glikogena v skeletnih mišicah so razdeljena na tri območja: podsarkomerno, intermiofibrilarno in intramiofibrilarno. Vsako od teh območij ima drugačno funkcijo v celici in temu primerno vsaka zase regulira sintezo in razgradnjo glikogenskih granul. Vsaka granula glikogena pa je sposobna tudi samostojnega izvajanja regulacije, pri kateri sodelujejo različni proteini. Eden pomembnejših je protein fosfataza 1 (PP1), ki nadzoruje aktivnost ključnih encimov, kot so glikogen sintaza (GS) in glikogen fosforilaza (GP), pri tem pa mu pomaga glikogen tarčni protein (PTG), ki deluje kot ogrodni protein med PP1 in drugimi proteini. Ta proces je reguliran preko kompleksa laforin-malin, ki prekine povezavo med PP1 in PTG. V seminarju so predstavljene naloge in lastnosti glikogena v treh oddelkih znotraj skeletnih mišic. Predstavljen bo vpliv, ki ga imajo našteti proteini na sintezo glikogena, podrobnejši opis naloge, zgradbe proteinov laforina in malina, kako kompleks laforin-malin inhibira glikogen sintezo ter kakšne so posledice nedelovanja tega proteinskega kompleksa.

==Nika Tomsič - Acetil-CoA: glavni metabolit in sekundarni obveščevalec ==

Acetil-CoA je eden glavnih metabolitov. Deluje kot mejna točka med glikolizo in Krebsovim ciklom. Poleg tega so pomembne tudi njegove naloge kot sekundarni obveščevalec. Nadzoruje ključne celične procese, vključno z energetsko presnovo, mitozo in avtofagijo, tako neposredno kot preko regulacije ekspresije genov. Acetil-CoA običajno nastane v mitohondrijskem matriksu iz piruvata ali kot posledica β-oksidacije dolge verige maščobnih kislin. Lahko pa nastane tudi v citosolu z oksidacijo aminokislin, etanola ali z delovanjem acetil-CoA sintetaze, ki združuje dve glavni komponenti: acetil in koencim A. Razmerje med koncentracijama v mitohondrijskem matriksu in v citosolu je vedno enako. Govorimo torej o nekem dinamičnem ravnotežju, ki ga omogočajo številni prenašalci. Mitohondrijska memebrana je sicer neprepustna za acetil-CoA, zato mora najprej zreagirati v drugo obliko, da lahko vstopa ali iztopa iz mitohondrija. V mitohondrij vstopa piruvat s pomočjo citrat – piruvatnih prenašalcev. Tu piruvat dehidrogenazni kompleks katalizira reakcijo v acetil-CoA. Ko pa je v mitohondriju preveč acetil-CoA, se lahko ta prenese v citosol ali jedro v obliki acetilkarnitina preko karnitinskega prenašalca. V citosolu se spet povrne v acetil-CoA in je lahko vir anabolizma maščobnih kislin ali aminokislin, v jedru pa je njegova funkcija acetiliranje histonov. To omogoči prepisovanje genskega materiala. Lahko pa tudi nadaljuje svojo pot v mitohondriju in vstopi v citratni cikel, kjer je prvi korak pretvorba v citrat preko citratnega sinteznega kompleksa.

==Aleksandra Rauter - Vloga intermediatov Krebsovega cikla v makrofagih==

Makrofagi so nepogrešljive komponente imunskega sistema, ki izhajajo iz matičnih celic kostnega mozga in nastajajo v procesu hematopoeze. Glavne funkcije, ki jih opravljajo so fagocitoza, izločanje citokinov in sodelovanje pri humoralnem imunskem odzivu skupaj z limfociti. Njihovo aktivacijo povzroči prisotnost različnih citokinov, ki se vežejo na specifične TLR receptorje. Najpogostejši ligand klasične aktivacije je lipopolisaharid (LPS), strukturna komponenta celičnih sten bakterij. Zaznava vezanega liganda preko adapterskih proteinov, signalne kaskade, transkripcijskih faktorjev vodi do razvoja enega od dveh fenotipov makrofagov. M1 fenotip ima baktericidno in fagocitno delovanje, M2 pa sodeluje predvsem pri reparaciji tkiv. Točni mehanizmi, ki to povzročijo, še niso poznani. M1 makrofag ima reprogramiran Krebsov cikel, kar povzroči akumulacijo različnih intermediatov v mitohondriju. Ti se lahko prenesejo v citosol preko specifičnih transporterjev in sodelujejo pri različnih regulatornih mehanizmih. Sukcinat povzroči povečano izločanje vnetnih citokinov preko stabilizacije transkripcijskega faktorja HIF-1α, povečanja količine mROS, posttranslacijskih modifikacij proteinov in signalizacije preko z GPCR. Spremenjen Krebsov cikel povzroči akumulacijo citrata, ki je perkurzor itakonata. Ta preko transkripcijske regulacije in inhibicije določenih encimov regulira protivnetni in protimikrobni odziv. Fumarat in α-ketoglutarat sodelujeta pri epigenetski regulaciji celičnih procesov.

==Jakob Tomšič - Funkcije ketonskih telesc v centralnem živčevju ==

Acetoacetat, β-hidroksibutirat in aceton, drugače imenovani tudi ketonska telesca, so produkti našega metabolizma, ki ob pomankanju hranil možgansko tkivo, srce in skeletne mišice oskrbujejo z energijo. Ketogeneze pa danes ne povezujemo le s stanjem pomankanja hranil, ampak jo lahko spodbudimo tudi s tako imenovano ketogeno dieto, ki ji pripisujejo mnoge pozitivne učinke. Vloga ketogene diete pri epilepsiji in drugih nevroloških boleznih je poznana že skoraj stoletje, vendar so bili mehanizmi za antiepileptično delovanje vedno uganka. Trenutno poznamo več funkcij ketonskih telesc, ki presegajo njihovo osnovno metabolno vlogo. Ketonska telesca imajo epigenetski vpliv in lahko spodbujajo izražanje antioksidativnih genov. Prav tako je viden vpliv na vezikularni transport glutamatata z VGLUT v nevronih in zaviranje prenosa signala z GABA nevrotransmiterji. Ketonska telesca izražajo nevrozaščitno in protivnetno vlogo z vplivom na imunski sistem, z vezavo na HCA2 receptor, ki spodbuja nastanek prostagladina D2, in inhibicijo NLRP3 inflamasoma. Nevrološke motnje, kot je epilepsija, imajo več vzrokov, med katerimi sta neizpodbitno prevelika vzburjenost nevronov ter vnetno stanje tkiva. Vedno več dokazov kaže na vlogo ketonskih telesc pri nadziranju in manjšanju števila epileptičnih napadov pri bolnikih. Kljub vsem dokazom in povezavam pa še vedno obstajajo dvomi, da so ravno ketonska telesca tista, ki imajo antiepileptične funkcijo.

==Laura Unuk - Motnje oksidacije dolgoverižnih maščobnih kislin in karnitinskega transporta ==

Motnje oksidacije dolgoverižnih maščobnih kislin (lcFAOD) so dedne avtosomske recesivne bolezni, ki onemogočajo metabolizem maščobnih kislin. Gre za mutacije genov, ki kodirajo encime oksidacije in karnitinskega transporta. Pri oksidaciji dolgoverižnih maščobnih kislin (12-18 C-atomov) sodeluje več kot 15 encimov, vendar le motnja enega lahko pripelje do kliničnih simptomov, kot so šibkost mišic, odpoved jeter, odpoved srca, itd. Glavni encimi, ki katalizirajo karnitinski transport so OCTN2 (organski-kationski-transporter-novel-2), CPT1 (karnitin-palmitoil-transferaza-tipa-1A), CPT2 (karnitin-palmitoil-transferaza-tipa-2) in CACT (karnitin-acilkarnitin-translokaza); encimi, ki pa katalizirajo oksidacijo so VLCAD (zelo-dolgoverižna-acil-CoA-dehidrogenaza), MTP (mitohondrijski-trifunkcijski-protein), LCHAD (dolgoverižna-3-hidroksiacil-CoA-dehidrogenaza) in LCKAT (dolgoverižna-3-ketoacil-CoA-tiolaza). Karnitin je pomembna molekula za prenos dolgoverižnih maščobnih kislin skozi membrano mitohondrija, saj dolgoverižna maščobna kislina lahko vstopi v mitohondrij le v obliki acil-karnitin estra. Najpogostejša motnja pri oksidaciji dolgoverižnih maščobnih kislin pa je motnja VLCAD encima, ki katalizira reakcije odcepa dveh ogljikovih atomov iz maščobne kisline na CoA. Nastali acil-CoA lahko nato vstopi v cikel citronske kisline, kjer nastane ATP. Ob nedelovanju VLCAD pride do pomanjkanja ATP v celici in posledično kliničnih simptomov. Zaznavanje napake enega od encimov je izvedena preko profila acilkarnitina v krvi, plazmi ali DBS. Z metodo NBS ('newborn screening') lahko kmalu po rojstvu že zaznajo motnjo in tako s hitrim zdravljenjem preprečijo neprijetno napredovanje bolezni. Poleg trenutnega zdravljenja so v razvoju različne terapije za zdravljenje motenj, ki pa imajo velik potencial.

==Stefanija Ivanova - Vpliv telovadbe na metabolizem ketonskih telesc ==

Ketonska telesca predstavljajo alternativno energijo za možgane, srce in skeletne mišice pod določenimi pogoji, kot so stradanje, intenzivna vadba, nenadzorovan diabetes ali po zaužitju ketonskih dodatkov. Zanimanje za delovanje ketonskih telesc se je povečalo predvsem pri športnikih. Ker ima uživanje eksogenih ketonov dramatične učinke na metabolizem skeletnih mišic med vadbo, imajo lahko športniki od tega koristi. Pomembna premisleka sta, kako športniki tolerirajo vnos ketonskih estrov med vadbo in ali dodatek ogroža ali vpliva na vnos ogljikovih hidratov. Zaužitje ketonskih dodatkov lahko hitro poveča koncentracijo ketonskih telesc, v primerjavi s ketogeno prehrano ali stradanjem, ki potrebujeta vsaj nekaj dni. Dodatek eksogenih ketonov predstavlja vir energije in ima lahko učinke pri varčevanju zalog ogljikovih hidratov med treningom v času nizke razpoložljivosti ogljikovih hidratov. Varčevanje zalog endogenih ogljikovih hidratov bi teoretično povzročilo večjo zmogljivost med ključnimi deli, med katerim so ogljikovi hidrati prevladujoči substrat. Dokler niso metabolne interakcije dodatkov ketonskih estrov s skeletnimi mišicami med vadbo popolnoma razjasnjene, vse predlagane ergogene lastnosti ostanejo teoretične. Glavni razlog za utemeljevanje eksogenih dodatkov ketonov morajo biti ugotovitve, da se ketoliza med vadbo poveča in pomembno prispeva k oskrbi z energijo. Čeprav obstajajo predlogi, da so dodatki ketonskih telesc koristni za športnike, je trenutno premalo informacij o učinkih dodatkov na metabolizem ketonskih telesc med vadbo. Na številna vprašanja je še treba odgovoriti.

==Nika Perko - Encim karbamoil fosfat sintetaza 1 ==

Karbamoil fosfat sintetaza 1 (CPS1) je limitni encim cikla uree, ker katalizira njeno prvo tristopenjsko reakcijo. Nahaja se v matriksu mitohondrija v celicah jeter, ledvic in tankega črevesa. Sestavljen je iz šestih domen: interakcijske, glutaminazne, integracijske, alosterične in dveh katalitskih. Encim je lahko v neaktivni ali aktivni obliki. Alosterično ga aktivira N-acetil-L-glutamat. Encim se lahko pozitivno regulira s proteinom Sirtuin 5 in glukagonom, negativno pa z mikro RNA miR-19b in od ATP odvisno kinazo (AMPK). Napačno delovanje kateregakoli od petih encimov ali transporterjev cikla uree vodi v zelo redko bolezen – motnje cikla sečnine. Prav motnja v delovanju encima CPS1 povzročajo najhujšo obliko te bolezni. Izrazi se lahko tako v neonatalni dobi kot tudi kasneje, določi pa se jo preko encimske ali genske analize. Simptomi so lahko letargija, bruhanje, encefalopatija in koma. Mutacije tega in tudi preostalih encimov ciklusa povzročijo hiperamoniemijo, ki se jo zdravi s hemodializo in raznimi zdravili, kot so L-arginin hidroklorid, natrijev benzoat in natrijev fenilbutirat. Bolniki se morajo držati stroge diete, bogate z ogljikovimi hidrati in maščobami. Poleg omenjenih zdravil lahko uživajo tudi N-karbamil-L-glutamat, ki deluje kot šaperon, stabilizator in aktivator. Trenutno je edina trajna in učinkovita rešitev transplantacija jeter, v prihodnosti pa bo morda učinkovita tudi genska terapija.

==Neža Leskovar - Urea transporterji in regulacija skoncentriranosti urina ==

Urea je vodotopna polarna molekula, ki lahko počasi prehaja čez celične membrane z difuzijo, hiter in učinkovit transport pa ji omogočajo urea transporterji UT-A in UT-B. Ti sodelujejo pri izločanju odvečnega dušika iz telesa, koncentriranju urina in s tem pri regulaciji tekočinskega ravnovesja ter ponovni uporabi dušika vezanega v urei s pomočjo črevesnih bakterij. Transporterji so v osnovi sestavljeni iz dveh hidrofobnih transmembranskih domen in velike ekstracelularne povezovalne zanke, razen UT-A1, ki je rezultat podvojene osnovne strukture. So N-glikozilirani in imajo znotrajcelični aminski in karboksilni konec. UT-A transporterji se večinoma nahajajo v ledvicah. UT-A1 najdemo v spodnjem predelu ledvičnega zbiralca, v apikalnih delih celic, kjer omogoča prehod uree iz zbiralca v epitelne celice. UT-A3 se prav tako nahaja v spodnjem predelu ledvičnega zbiralca, le da v bazalnih delih celic in omogoča prehod uree nazaj v telesni obtok. UT-A2 se nahaja v Henlejevi zanki in skrbi za prehod uree iz ledvične sredice nazaj v Henlejevo zanko. UT-A4 je bil najden v ledvicah podgan, UT-A5 so našli v testisih miši in UT-A6 v človeškem črevesju. UT-B transporterji se nahajajo v ledvičnih kapilarah, najdemo jih tudi v različnih tkivih. Transport uree je dobro reguliran z vazopresinom, hiperosmolarnostjo, ubikvinacijo in drugimi načini.

==Ela Bizjak - Mutacije mitohondrijske DNA, heterogenost in mitohondrijske bolezni==

Mutacije mitohondrijske DNA so del mitohondriju lastnega dednega zapisa. Mitohondrijska DNA je krožna molekula, ki je stabilizirana z zvitjem v nukleoide. Najpogosteje mutacije nastanejo med replikacijo, saj je po predvidenih mehanizmih takrat DNA dolgo izpostavljena in enoverižna, prav tako pa je podvajanje pogosto. Poleg tega, da ima mitohondrijska polimeraza šibko eksonukleazno aktivnost, se v bližini dednega materiala nahaja tudi respiratorna veriga, ki proizvaja reaktivne kisikove radikale. Mutacije se širijo glede na njihovo vrsto. Delecije imajo pri podvajanju prednost, ker so manjše kot nemutirane molekule, zato v organelu hitro prevladujejo, dedni prenos delecij pa je zelo redek. Točkovne mutacije se širijo s sproščeno replikacijo, delitvami in fisijami mitohondrijev. Če so prisotne v spolnih celicah matere, jih podedujejo vsi njeni potomci. Heteroplazmija se lahko med tkivi osebka razlikuje. Te razlike so opazne v nepravilnostih na proteinskih superkompleksih, oblikah krist, sestavi mitohondrijske membrane, napetostnem potencialu in okvarah respiratorne verige. S sledenjem mutacijam ali različnim haploskupinam lahko sledimo tudi migracijam populacij. Nekatere dedne mutacije so odgovorne tudi za bolezenska stanja, če je nosilka mutacij mati. Najpogosteje prizadenejo živčevje, pojavijo pa se lahko ob rojstvu ali kasneje med 20. in 40. letom.

==Bor Krajnik - Reaktivne kisikove zvrsti in njihova vloga pri regulaciji celične proliferacije ==

Kisikove reaktivne zvrsti ali krajše ROS so zelo reaktivne zvrsti, ki nastajajo pri redukciji molekularnega kisika, med seboj pa se pretvarjajo spontano ali s pomočjo encimov. V celici sta najpomembnejša predstavnika vodikov peroksid in superoksidni anion. Glaven vir ROS v celici so mitohondriji, kjer nastajajo kot produkt preobremenjenih elektronskih prenašalnih verig. Sprva se je njihova pristnost v organizmih smatrala za izključno škodljivo, ampak danes vemo, da imajo v človeškem organizmu več funkcij. V celici igrajo pomembno vlogo v določenih signalnih poteh, kar dosežejo z oksidacijo predvsem cisteinskih ostankov. Ob hipoksiji so ROS pomembne pri stabilizaciji ene od podenot hipoksija inducibilnih faktorjev (HIF), to so transkripcijski fakorji, ki regulirajo ekspresijo genov in so pomembni za angiogenezo in celično proliferacijo. Prav tako so pomemben člen signalne poti preko katere hormon angiotenzin II spodbuja delitev celic gladkih mišic v žilah. Regulirajo aktivacijo T-celic, kar privede do njihove proliferacije. ROS so vpletene tudi v proliferacijo rakastih celic, v katerih visoki nivoji ROS pomagajo pri angiogenezi, ki je potrebna zaradi hitre rasti tumorja kar vodi v hipoksijo. Zaradi tega so bile preizkušene kot potencialna tarča pri zdravljenju raka vendar so rezultati mešani.

==Maja Kobal - Od UCP1 odvisna in neodvisna termogeneza==

Termogeneza je proces nastajanja toplote in je eden od mehanizmov termoregulacije. Glavni regulator adaptivne nedrgetajoče termogeneze je protein UCP1, imenovan tudi termogenin. To je razklopitveni (ang. uncoupling) protein, ki se nahaja v notranji mitohondrijski membrani rjavih in bež adipocitov (maščobne celice), kjer razklaplja protonski gradient, ki se ustvari med procesom dihalne verige. Gradient protonov preusmeri nazaj v matriks mitohondrija, namesto da bi ta šel preko ATP-sintaze. Tako torej ne nastane ATP, ampak sprosti se toplota, ki segreje celico in pomaga ohranjati stalno telesno temperaturo. Glavni regulatorji delovanja UCP1 so maščobne kisline in purinski nukleotidi; prvi delujejo kot aktivatorji, slednji pa kot inhibitorji. Novejše raziskave pa so pokazale mehanizme in termogene regulatorje v adipocitih, ki so neodvisni od UCP1. Ti mehanizmi so kroženje kalcijevih ionov preko mehanizma SERCA, kreatin-substratni cikel, kroženje lipidov, transport glicerol-3-fosfata in razklop preko N-acil aminokislin. Natančno poznavanje mehanizmov termogeneze bi ponudilo številne nove možnosti za zdravljenje debelosti in sladkorne bolezni tipa 2. Znanje o UCP1 neodvisnih mehanizmih termogeneze bi bilo zelo uporabno za zdravljenje predebelih in starejših ljudi, ki nimajo UCP1-pozitivnih adipocitov. Čeprav že več desetletij potekajo raziskave o termogenezi, je znanje na tem področju pomanjkljivo, tako da bodo potrebne še številne raziskave.

==Martin Stanonik - Ekofiziologija obstoječih fototrofov in vplivi na evolucijo oksigene fotosinteze==

Oksigena fotosinteza je pomemben mikrobiološki proces, ki je omogočil dvig atmosferske koncentracije kisika in posledični razvoj večceličnih organizmov. Pred tem procesom so že obstajali mehanizmi, ki so proizvajali energijo. Za to so potrebovali molekule bogate z elektroni, kot H2S. Vendar ti procesi niso proizvajali kisika, kot stranskega produkta. Zato je sprememba kompozicije atmosfere, ali GOE (Great Oxidation Event) povzročila smrt mnogih organizmov kake 2.5 milijarde let nazaj. Tisti, ki pa so preživeli, so pa razvili obrambne mehanizme proti radikalnimi molekulami (ROS), ki so nastale iz kisika, ali pa so se umaknili v globje predele takratnih oceanov, kjer so še zmeraj prevladovali pogoji pred GOE. Kljub temu znanju natančen pojav in razvoj teh procesov še ni poznan. Danes še obstajajo organizmi, ki izvajajo te procese, nekateri lahko celo oba, vendar je to odvisno od okolja. To, vključno z fosili in filogenetskimi raziskavami, bi nam lahko pomagalo razumeti kako se je razvilo življenje na Zemlji. Organizmi z oskigeno fotosintezo so pomemben vir kisika v okoljih. Oksigena fotosinteza vključuje mnoge dele, kot reaktivne centre (RCI in RCII) in fotosisteme PSI in PSII ter OEC, ki je sistem ,ki tvori stranski produkt kisik. Pojav teh mehanizmov tudi še ni natančno poznan zato bodo potrebne še številne raziskave.

==Tinkara Božič - Pomen saharoze in njenega metabolizma za rastline==
Saharoza je pomemben disaharid, ki vpliva na rast rastlin, njihov razvoj, reprodukcijo in obrambne odgovore. Višek trioza fosfata, ki nastane iz ogljika med aktivno fotosintezo, se v citoplazmi pretvori v saharozo. Z delovanjem saharoze je tesno povezana še trehaloza, oligosaharid iz dveh molekul glukoze, ki ima v celicah regulatorno vlogo. Saharoza je pomembna predvsem zaradi cepitve na heksozi glukozo in fruktozo, kar poteka na dva načina – lahko jo cepi saharozna sintaza ali jo hidrolizirajo invertaze. Slednje encime inhibirajo posebni proteini, imenovani invertazni inhibitorji. Saharozna pot se v rastlinah začne v fotosintetskih tkivih, nadaljuje z nalaganjem v floem, zaključi pa se z odlaganjem iz floema v ponore oz. nefotosintetska tkiva. Invertaze so treh vrst in jih klasificiramo glede na njihov pH ter mesto v celici – poznamo invertaze celične stene, vakuolne invertaze in citoplazemske invertaze. Nastopijo v celicah ponora, ko je potrebna cepitev saharoze na njeni sestavni molekuli. Invertaze celične stene pa sodelujejo še pri obrambnih odgovorih celice na napad patogenih organizmov, ko jo ti izkoriščajo za sladkorje. Če pa patogeni v navezo s celicami prinašajo hranila, ki jih gostitelji potrebujejo, to povezavo imenujemo mikoriza. Ta hranila so v glavnem fosfati, sladkor, ki ga od rastlin prejemajo patogeni organizmi, pa je glukoza.

==Mateja Milošević - CAM tip fotosinteze: Crassulacean Acid Metabolism==
CAM tip fotosinteze je evolucijska prilagoditev določenih vrst rastlin na ekstremne okoljske razmere, kot je pomanjkanje vode in zelo visoke temperature – tipičen primer takih rastlin so kaktusi v puščavi, ali kot prilagoditev ko rastlina ne more privoščiti si dovolj CO₂ čez dan. Takšen tip fotosinteze se od običajnega C3 tipa razlikuje po tem, da vsebuje dodaten encim t. j. fosfoenolpiruvat karboksilaza (PEPC). Ta skupaj z encimom RuBisCO pomaga asimilirati zunanji CO₂. Delovanje teh dveh encimov je časovno ločeno, in prav po tem se CAM fotosinteza razlikuje od še enega tipa fotosinteze – tipa C4. Asimilacija zunanjega CO₂ je ločena po fazah. Da se rastlina izogne prekomerni izgubi vode, čez dan svoje posebne listne pore - stome - zapre, uporablja pa v sebi shranjene energijsko bogate molekule. Ko pride do spremembe v okolici, npr. nastopi noč, rastlina svoje stome odpre in tako sprejme zunanji CO₂. Pomemben intermediat je malat2-, ki nastaja z obdelavo zunanjega CO₂ in se shranjuje v vakuoli v obliki malatne kisline. Ko se malat dekarboksilira, iz njega nastaneta piruvat in CO₂. Ta dva v nadaljnih metabolnih procesih doprineseta energijo in pomembne intermediate..

==Nika Banovšek - Regulacija mlečnih lipidov preko hrane in transkripcijskih faktorjev ter vpliv mleka na novorojenčka==
Mleko je edina, in zato glavna prehrana novorojenčka, ki je v začetnih fazah svojega obstoja zelo ranljiv. V materinih mlečnih žlezah nastajajo primerne sestavine, ki so pomembne tako za periferni kot za centralni razvoj mladiča. Mlečni lipidi so glavna komponenta mleka. Nastajajo preko različnih substratov; med glavne štejemo maščobe kisline, glukozo in glicerol. V citosolu mlečnih epitelnih celic se iz slednjih tvorijo predvsem srednje dolge verige mašobnih kislin, ki igrajo pomembno vlogo v telesu novorojenčka, saj mu prinašajo tako hranilne vrednosti in energijo kakor tudi nekatere signalne molekule. Triacilgliceroli nastajajo v endoplazmatskem retikulumu, kjer se nato zapakirajo kot mehurčki in se iz mlečne epitelne celice izločajo v obliki mleka. Na sestavo mleka in regulacijo njegovih sestavin vplivajo številni dejavniki. Med ključne štejemo transkripcijske faktorje, kot sta, npr. SREBP-1 in PPARγ, in samo prehrano. Če imajo matere novorojenčkov genetske okvare ali slabe prehranske navade, se v celici zgodijo napačne regulacije v sintezi mlečnih lipidov ter pride do tvorbe in izločanja »toksičnega« mleka v alveolih mlečnih žlez. Takšno mleko lahko povzroči velike nepravilnosti v telesu novorojenčka, saj ta zaužije sebi škodljive snovi, ki vodijo do raznih notranjih vnetij. Zaužitje takšne vrste mleka se lahko odraža tudi v dolgoročnem razvoju otroka v obliki različnih bolezni.

==Luka Stanković - LIPIDNE KAPLJE: nastanek, struktura in zorenje lipidnih kapelj==
Lipidne kaplje so bile prvič odkrite pred več kot 100 leti. Kljub temu, se jim do nedavnega ni posvečalo večje pozornosti in pripisovalo znatnejše vloge v delovanju organizma. Danes odkrivamo, da ne gre le za celično strukturo, ki shranjuje lipide, temveč gre za nadvse pomemben organel, ki ga najdemo v vseh evkariontskih celicah. Ne le, da so kaplje nadvse pomembne za metabolne procese, temveč imajo tudi pomembno vlogo pri zaščiti pred lipotoksičnostjo, poškodbi mitohondrijev, obnavljanju homeostaze, zadnje čase pa se odkriva tudi njihov pomen v signalnih poteh. Kljub številnim funkcijam, med katerimi je še veliko neraziskanega, se v seminarju posvečamo predvsem nastanku kapelj, njihovi strukturi in njihovem zorenju. Nastanek lipidne kaplje začnemo z nastankom maščobnih kislin iz acetil CoA. Le-te se v ER skupaj z glicerolom s pomočjo kompleksa encimov pretežno pretvorijo v di- in triacilgliceride. Naraščanje njihove koncentracije znotraj membrane ER povzroči nastanek in odcep kaplje iz membrane. V večini primerov gre za reguliran odcep v citosol. Celoten proces in kasnejšo zorenje uravnava cela kopica proteinov, katerih natančni mehanizmi ali pa celo vloge v nekaterih primerih še niso popolnoma jasni. Napake v delovanju slednjih pa lahko povzročajo hujše zdravstvene zaplete kot so debelost, inzulinska odpornost in posledično diabetis.

BIO2 Seminar 2020

2020-12-08T19:28:21Z

Luka Stanković:

= Biokemijski seminar =
doc. dr. Gregor Gunčar, K2.022

== Seznam seminarjev ==
{| {{table}}
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''ime in priimek'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''poglavje'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''naslov seminarja'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''recenzent 1'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''recenzent 2'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''datum oddaje'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''datum recenzije'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''datum predstavitve'''
|-
| Ajda Beltram||12||Zgradba in dinamika signalnih kompleksov GPCR||Luka Hafner||Tinkara Božič||16/10/20||19/10/20||21/10/20
|-
| Jan Bregar||12||Protein retinoblastoma||Nika Bedrač||Martin Stanonik||16/10/20||19/10/20||21/10/20
|-
| Anja Moškrič||12|| Presinaptični kalcijevi kanalčki kot specializiran nadzor za sproščanje nevrotransmiterjev||Srna Anastasovska||Luka Stanković||16/10/20||19/10/20||21/10/20
|-
| Gregor Strniša||12||Načini aktivacije GPCR||Manca Pirc||Ana Pervanja||23/10/20||26/10/20||28/10/20
|-
| Vid Dobrovoljc||12||Medsebojni vpliv signalnih poti na primeru RTK in GPCR signalnih poti||Maruša Sernc||Nika Banovšek||23/10/20||26/10/20||28/10/20
|-
| Nikola Janakievski||12||Selective androgen receptor modulators||Ajda Beltram||Aljaž Simonič||23/10/20||26/10/20||28/10/20
|-
| Rebeka Jerina||12||Kofein kot antagonist adenozinskih receptorjev||Jan Bregar||Luka Hafner||30/10/20||02/11/20||04/11/20
|-
| Eva Vene||12||Povezava bolečine z vezavo kapsaicina na TRPV1||Anja Moškrič||Nika Bedrač||30/10/20||02/11/20||04/11/20
|-
| Zala Perko||12||Mehanizmi vezave ligandov in regeneracija fotoreceptorjev očesne mrežnice||Gregor Strniša||Srna Anastasovska||30/10/20||02/11/20||04/11/20
|-
| Erik Putar||14-15||AMPK: senzor glukoze in celičnega energijskega stanja||Nikola Janakievski||Manca Pirc||06/11/20||09/11/20||11/11/20
|-
| Iva Matić||14-15||||Rebeka Jerina||Maruša Sernc||06/11/20||09/11/20||13/01/21
|-
| Timotej Sotošek||14-15||Regulacija mišičnega glikogena: granula in njeni proteini||Eva Vene||Ajda Beltram||06/11/20||09/11/20||11/11/20
|-
| Nika Tomsič||16||Acetil-CoA: glavni metabolit in sekundarni obveščevalec||Zala Perko||Jan Bregar||13/11/20||16/11/20||18/11/20
|-
| Andrej Špenko||16||||Erik Putar||Anja Moškrič||13/11/20||16/11/20||18/11/20
|-
| Aleksandra Rauter||16||Vloga intermediatov Krebsovega cikla v makrofagih||Iva Matić||Gregor Strniša||13/11/20||16/11/20||18/11/20
|-
| Laura Unuk||17||Motnje oksidacije dolgoverižnih maščobnih kislin in karnitinskega transporta||Timotej Sotošek||Nikola Janakievski||20/11/20||23/11/20||25/11/20
|-
| Stefanija Ivanova||17||Vpliv telovadbe na metabolizem ketonskih telesc||Nika Tomsič||Rebeka Jerina||20/11/20||23/11/20||25/11/20
|-
| Jakob Tomšič||17||Funkcije ketonskih telesc v centralnem živčevju||Andrej Špenko||Eva Vene||20/11/20||23/11/20||25/11/20
|-
| Neža Leskovar||18||Urea transporterji in regulacija skoncentriranosti urina||Aleksandra Rauter||Zala Perko||27/11/20||30/11/20||02/12/20
|-
| Luka Šegota||18||||Laura Unuk||Erik Putar||27/11/20||30/11/20||02/12/20
|-
| Nika Perko||18||Encim karbamoil fosfat sintetaza 1||Stefanija Ivanova||Iva Matić||27/11/20||30/11/20||02/12/20
|-
| Ela Bizjak||19||Mutacije mitohondrijske DNA, heterogenost in mitohondrijske bolezni||Jakob Tomšič||Timotej Sotošek||04/12/20||07/12/20||09/12/20
|-
| Bor Krajnik||19||Reaktivne kisikove zvrsti in njihova vloga pri regulaciji celične proliferacije||Neža Leskovar||Nika Tomsič||04/12/20||07/12/20||09/12/20
|-
| Maja Kobal||19||Od UCP1 odvisna in neodvisna termogeneza||Luka Šegota||Vid Dobrovoljc||04/12/20||07/12/20||09/12/20
|-
| Mateja Milošević||20||CAM tip fotosinteze: Crassualacean Acid Metabolism||Nika Perko||Andrej Špenko||11/12/20||14/12/20||16/12/20
|-
| Tinkara Božič||20||Pomen saharoze in njenega metabolizma za rastline||Ela Bizjak||Aleksandra Rauter||11/12/20||14/12/20||16/12/20
|-
| Martin Stanonik||20||Ekofiziologija obstoječih fototrofov in vplivi na evolucijo oksigene fotosinteze||Bor Krajnik||Laura Unuk||11/12/20||14/12/20||16/12/20
|-
| Luka Stanković||21||Nastanek, struktura in zorenje lipidnih kapelj v organizmu||Maja Kobal||Stefanija Ivanova||18/12/20||21/12/20||23/12/20
|-
| Ana Pervanja||21||Vpliv cirkadianega ritma na metabolizem lipidov||Mateja Milošević||Jakob Tomšič||18/12/20||21/12/20||23/12/20
|-
| Nika Banovšek||21||||Tinkara Božič||Neža Leskovar||18/12/20||21/12/20||23/12/20
|-
| Aljaž Simonič||22||||Martin Stanonik||Luka Šegota||23/12/20||28/12/20||30/12/20
|-
| Luka Hafner||22||||Luka Stanković||Ana Žagar||23/12/20||28/12/20||30/12/20
|-
| Ana Žagar||22||||Vid Dobrovoljc||Nika Perko||23/12/20||28/12/20||30/12/20
|-
| Nika Bedrač||23||||Ana Pervanja||Ela Bizjak||30/12/20||04/01/21||06/01/21
|-
| Srna Anastasovska||23||||Nika Banovšek||Bor Krajnik||30/12/20||04/01/21||06/01/21
|-
| Manca Pirc||23||||Aljaž Simonič||Maja Kobal||30/12/20||04/01/21||06/01/21
|-
| Maruša Sernc||23||||Ana Žagar||Mateja Milošević||08/01/21||11/01/21||13/01/21
|-
| Lea Nicouleau||any chapter||||||||06/01/21||11/01/21||13/01/21
|-
| Marjorie Leaud||any chapter||||||||06/01/21||11/01/21||13/01/21
|}

*številka v okencu za temo pomeni poglavje v Lehningerju, v katerega naj izbrana tema spada
Razporeditev je začasna in se lahko še spremeni, načeloma pa se termini do vključno 18. poglavja ne bodo spreminjali.
Prosim,da mi sporočite morebitne napake ali če vas nisem razporedil.

== Gradivo za predavanja ==
Gradivo za predavanja in seminarje najdete na http://bio.ijs.si/~zajec/bio2/
username: bio2
password: samozame

==Naloga==
'''Vaša naloga za seminar je: '''
Samostojno pripraviti seminar o seminarski temi, ki vam je bila dodeljena. Za osnovo morate vzeti pregledni članek iz revije, ki ima faktor vpliva nad 5 (npr. [http://www.sciencedirect.com/science/journal/09680004/ TIBS]. Poiskati morate še vsaj tri znanstvene članke, ki se nanašajo na opisano temo in jih uporabiti kot podlago za seminarsko nalogo! Članki so dostopni [http://93.174.95.27/scimag/ tukaj].

Za pripravo seminarja velja naslednje: 
* [[BIO2 Povzetki seminarjev 2020|Povzetek seminarja]] opišete na wikiju '''v 200 besedah''' (+- dvajset besed) - najkasneje do dne ko morate oddati seminar recenzentom.
* Povezavo do povzetka vnesete v tabelo seminarjev tekočega letnika.
* Seminar pripravite v obliki seminarske naloge na ~5-12 straneh A4 (pisava 12, enojni razmak, 2,5 cm robovi). Obseg seminarja naj bo 2700 do 3000 besed , a ne več kot 3500 besed. Seminarska naloga mora vsebovati najmanj tri slike, bolje več. Eno sliko morate narisati sami in to pod sliko posebej označiti. Slika mora imeti legendo in v besedilu mora biti na ustreznem mestu sklic na sliko. 
* Seminar oddajte do datuma oddaje, ki je naveden v tabeli v elektronski obliki z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/ tega obrazca].
* Vsi seminarji so v elektronski obliki dostopni [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/bioseminar/ tukaj].
* Recenzenti do dneva določenega v tabeli določijo popravke (v elektronski obliki) in podajo oceno pisnega dela. Popravljen seminar oddajte z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/ tega obrazca].
* Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Za predstavitev je na voljo 20-25 minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni.
* Predstavitvi sledi razprava. Recenzenti podajo oceno predstavitve in postavijo najmanj dve vprašanji.Vsi ostali morajo postaviti še dve dodatni vprašanji v okviru celega seminarskega obdobja. Vprašanja, ki ste jih postavili vpišite na [https://docs.google.com/forms/d/e/1FAIpQLSdV9OFlNzI3XyS8FRGnuIbG89gwH_36uwz29ocigV--2CXSbQ/viewform tukaj].
* Na dan predstavitve morate docentu še pred predstavitvijo oddati končno (popravljeno) in natisnjeno verzijo seminarja v enem izvodu, elektronsko verzijo seminarja in predstavitev pa oddati na strežnik na dan predstavitve do polnoči.
* Seminarska naloga in povzetek morajo biti v slovenskem jeziku, razen za študente, katerih materni jezik ni slovenščina. Ti lahko oddajo seminar v angleškem jeziku.

==Imena datotek==
Prosim vas, da vse datoteke, ki mi jih pošiljate poimenujete po naslednjem receptu:
* 312_BIO_Priimek_Ime.doc(x) za seminar, npr. 312_BIO_Guncar_Gregor.docx
* 312_BIO_Priimek_ime_final.doc(x) za končno verzijo seminarja
* 312_BIO_Priimek_Ime_rec_Priimek2.doc(x) za recenzijo, kjer je Priimek2 priimek recenzenta, npr. 312_BIO_Guncar_Gregor_rec_Scott.docx (če se pišete Scott in odajate recenzijo za seminar, ki ga je napisal Gunčar)
* 312_BIO_Priimek_Ime.ppt(x) za prezentacijo, npr 312_BIO_Guncar_Gregor.pptx
* 312_BIO_Priimek_ime_poprava.doc(x) za popravljeno končno verzijo seminarja, če so popravki manjši

==Ocenjevanje seminarjev==
Recenzenti ocenijo seminar tako, da izpolnijo [https://docs.google.com/forms/d/1EQDYwFO-DEzZ2R7jf8DhLqIeV4FFxRd3-ScceEASpt4/viewform recenzentsko poročilo] na spletu. Recenzentsko poročilo morate oddati najkasneje do 21:00, en dan pred predstavitvijo seminarja.

== Mnenje o predstavitvi ==
Vsak posameznik odda svoje mnenje o predstavitvi takoj po predstavitvi z online glasovanjem.

==Urejanje spletnih strani na wikiju==
Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''

==Citiranje virov==
Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se držite ene same. V seminarskih nalogah in diplomskih nalogah FKKT uprabljajte shemo citiranja, ki je pobarvana zeleno.
Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati.
Za citate v naravoslovju je najpogostejše citiranje po pravilniku ISO 690. [http://www.zveza-zotks.si/gzm/dokumenti/literatura.html Pravila], ki upoštevajo omenjeni standard, so pripravili pri ZTKS. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati. 
'''Citiranje knjig:''' 
Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica. 
Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN. 

Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005. 
Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4. 
Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.).

'''Citiranje člankov:''' 
Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani. 
Lartigue, C., Glass, J. I., Alperovich, N., Pieper, R., Parmar, P. P., Hutchison III, C. A., Smith, H. O. in Venter, J. C.
Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, 317, str. 632-638.

Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole: 
Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani. 
Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.

Revija Science uporablja skrajšani zapis: 
C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007) 

V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne). Navesti morate tudi vse avtorje dela, razen v primeru, ko jih je 10 ali več. Takrat navedite le prvih devet, za ostale pa uporabite okrajšavo in sod. (in sodelavci). Pred zadnjim avtorjem naj bo vedno besedica "in".

'''Citiranje spletnih virov:''' 
Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov 
strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life 
Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.

BIO2 Seminar 2020

2020-12-07T11:33:51Z

Luka Stanković:

= Biokemijski seminar =
doc. dr. Gregor Gunčar, K2.022

== Seznam seminarjev ==
{| {{table}}
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''ime in priimek'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''poglavje'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''naslov seminarja'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''recenzent 1'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''recenzent 2'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''datum oddaje'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''datum recenzije'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''datum predstavitve'''
|-
| Ajda Beltram||12||Zgradba in dinamika signalnih kompleksov GPCR||Luka Hafner||Tinkara Božič||16/10/20||19/10/20||21/10/20
|-
| Jan Bregar||12||Protein retinoblastoma||Nika Bedrač||Martin Stanonik||16/10/20||19/10/20||21/10/20
|-
| Anja Moškrič||12|| Presinaptični kalcijevi kanalčki kot specializiran nadzor za sproščanje nevrotransmiterjev||Srna Anastasovska||Luka Stanković||16/10/20||19/10/20||21/10/20
|-
| Gregor Strniša||12||Načini aktivacije GPCR||Manca Pirc||Ana Pervanja||23/10/20||26/10/20||28/10/20
|-
| Vid Dobrovoljc||12||Medsebojni vpliv signalnih poti na primeru RTK in GPCR signalnih poti||Maruša Sernc||Nika Banovšek||23/10/20||26/10/20||28/10/20
|-
| Nikola Janakievski||12||Selective androgen receptor modulators||Ajda Beltram||Aljaž Simonič||23/10/20||26/10/20||28/10/20
|-
| Rebeka Jerina||12||Kofein kot antagonist adenozinskih receptorjev||Jan Bregar||Luka Hafner||30/10/20||02/11/20||04/11/20
|-
| Eva Vene||12||Povezava bolečine z vezavo kapsaicina na TRPV1||Anja Moškrič||Nika Bedrač||30/10/20||02/11/20||04/11/20
|-
| Zala Perko||12||Mehanizmi vezave ligandov in regeneracija fotoreceptorjev očesne mrežnice||Gregor Strniša||Srna Anastasovska||30/10/20||02/11/20||04/11/20
|-
| Erik Putar||14-15||AMPK: senzor glukoze in celičnega energijskega stanja||Nikola Janakievski||Manca Pirc||06/11/20||09/11/20||11/11/20
|-
| Iva Matić||14-15||||Rebeka Jerina||Maruša Sernc||06/11/20||09/11/20||13/01/21
|-
| Timotej Sotošek||14-15||Regulacija mišičnega glikogena: granula in njeni proteini||Eva Vene||Ajda Beltram||06/11/20||09/11/20||11/11/20
|-
| Nika Tomsič||16||Acetil-CoA: glavni metabolit in sekundarni obveščevalec||Zala Perko||Jan Bregar||13/11/20||16/11/20||18/11/20
|-
| Andrej Špenko||16||||Erik Putar||Anja Moškrič||13/11/20||16/11/20||18/11/20
|-
| Aleksandra Rauter||16||Vloga intermediatov Krebsovega cikla v makrofagih||Iva Matić||Gregor Strniša||13/11/20||16/11/20||18/11/20
|-
| Laura Unuk||17||Motnje oksidacije dolgoverižnih maščobnih kislin in karnitinskega transporta||Timotej Sotošek||Nikola Janakievski||20/11/20||23/11/20||25/11/20
|-
| Stefanija Ivanova||17||Vpliv telovadbe na metabolizem ketonskih telesc||Nika Tomsič||Rebeka Jerina||20/11/20||23/11/20||25/11/20
|-
| Jakob Tomšič||17||Funkcije ketonskih telesc v centralnem živčevju||Andrej Špenko||Eva Vene||20/11/20||23/11/20||25/11/20
|-
| Neža Leskovar||18||Urea transporterji in regulacija skoncentriranosti urina||Aleksandra Rauter||Zala Perko||27/11/20||30/11/20||02/12/20
|-
| Luka Šegota||18||||Laura Unuk||Erik Putar||27/11/20||30/11/20||02/12/20
|-
| Nika Perko||18||Encim karbamoil fosfat sintetaza 1||Stefanija Ivanova||Iva Matić||27/11/20||30/11/20||02/12/20
|-
| Ela Bizjak||19||Mutacije mitohondrijske DNA, heterogenost in mitohondrijske bolezni||Jakob Tomšič||Timotej Sotošek||04/12/20||07/12/20||09/12/20
|-
| Bor Krajnik||19||Reaktivne kisikove zvrsti in njihova vloga pri regulaciji celične proliferacije||Neža Leskovar||Nika Tomsič||04/12/20||07/12/20||09/12/20
|-
| Maja Kobal||19||Od UCP1 odvisna in neodvisna termogeneza||Luka Šegota||Vid Dobrovoljc||04/12/20||07/12/20||09/12/20
|-
| Mateja Milošević||20||CAM tip fotosinteze: Crassualacean Acid Metabolism||Nika Perko||Andrej Špenko||11/12/20||14/12/20||16/12/20
|-
| Tinkara Božič||20||Pomen saharoze in njenega metabolizma za rastline||Ela Bizjak||Aleksandra Rauter||11/12/20||14/12/20||16/12/20
|-
| Martin Stanonik||20||Ekofiziologija obstoječih fototrofov in vplivi na evolucijo oksigene fotosinteze||Bor Krajnik||Laura Unuk||11/12/20||14/12/20||16/12/20
|-
| Luka Stanković||21||Nastanek, struktura in funkcija lipidnih kapelj v organizmu||Maja Kobal||Stefanija Ivanova||18/12/20||21/12/20||23/12/20
|-
| Ana Pervanja||21||Vpliv cirkadianega ritma na metabolizem lipidov||Mateja Milošević||Jakob Tomšič||18/12/20||21/12/20||23/12/20
|-
| Nika Banovšek||21||||Tinkara Božič||Neža Leskovar||18/12/20||21/12/20||23/12/20
|-
| Aljaž Simonič||22||||Martin Stanonik||Luka Šegota||23/12/20||28/12/20||30/12/20
|-
| Luka Hafner||22||||Luka Stanković||Ana Žagar||23/12/20||28/12/20||30/12/20
|-
| Ana Žagar||22||||Vid Dobrovoljc||Nika Perko||23/12/20||28/12/20||30/12/20
|-
| Nika Bedrač||23||||Ana Pervanja||Ela Bizjak||30/12/20||04/01/21||06/01/21
|-
| Srna Anastasovska||23||||Nika Banovšek||Bor Krajnik||30/12/20||04/01/21||06/01/21
|-
| Manca Pirc||23||||Aljaž Simonič||Maja Kobal||30/12/20||04/01/21||06/01/21
|-
| Maruša Sernc||23||||Ana Žagar||Mateja Milošević||08/01/21||11/01/21||13/01/21
|-
| Lea Nicouleau||any chapter||||||||06/01/21||11/01/21||13/01/21
|-
| Marjorie Leaud||any chapter||||||||06/01/21||11/01/21||13/01/21
|}

*številka v okencu za temo pomeni poglavje v Lehningerju, v katerega naj izbrana tema spada
Razporeditev je začasna in se lahko še spremeni, načeloma pa se termini do vključno 18. poglavja ne bodo spreminjali.
Prosim,da mi sporočite morebitne napake ali če vas nisem razporedil.

== Gradivo za predavanja ==
Gradivo za predavanja in seminarje najdete na http://bio.ijs.si/~zajec/bio2/
username: bio2
password: samozame

==Naloga==
'''Vaša naloga za seminar je: '''
Samostojno pripraviti seminar o seminarski temi, ki vam je bila dodeljena. Za osnovo morate vzeti pregledni članek iz revije, ki ima faktor vpliva nad 5 (npr. [http://www.sciencedirect.com/science/journal/09680004/ TIBS]. Poiskati morate še vsaj tri znanstvene članke, ki se nanašajo na opisano temo in jih uporabiti kot podlago za seminarsko nalogo! Članki so dostopni [http://93.174.95.27/scimag/ tukaj].

Za pripravo seminarja velja naslednje: 
* [[BIO2 Povzetki seminarjev 2020|Povzetek seminarja]] opišete na wikiju '''v 200 besedah''' (+- dvajset besed) - najkasneje do dne ko morate oddati seminar recenzentom.
* Povezavo do povzetka vnesete v tabelo seminarjev tekočega letnika.
* Seminar pripravite v obliki seminarske naloge na ~5-12 straneh A4 (pisava 12, enojni razmak, 2,5 cm robovi). Obseg seminarja naj bo 2700 do 3000 besed , a ne več kot 3500 besed. Seminarska naloga mora vsebovati najmanj tri slike, bolje več. Eno sliko morate narisati sami in to pod sliko posebej označiti. Slika mora imeti legendo in v besedilu mora biti na ustreznem mestu sklic na sliko. 
* Seminar oddajte do datuma oddaje, ki je naveden v tabeli v elektronski obliki z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/ tega obrazca].
* Vsi seminarji so v elektronski obliki dostopni [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/bioseminar/ tukaj].
* Recenzenti do dneva določenega v tabeli določijo popravke (v elektronski obliki) in podajo oceno pisnega dela. Popravljen seminar oddajte z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/ tega obrazca].
* Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Za predstavitev je na voljo 20-25 minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni.
* Predstavitvi sledi razprava. Recenzenti podajo oceno predstavitve in postavijo najmanj dve vprašanji.Vsi ostali morajo postaviti še dve dodatni vprašanji v okviru celega seminarskega obdobja. Vprašanja, ki ste jih postavili vpišite na [https://docs.google.com/forms/d/e/1FAIpQLSdV9OFlNzI3XyS8FRGnuIbG89gwH_36uwz29ocigV--2CXSbQ/viewform tukaj].
* Na dan predstavitve morate docentu še pred predstavitvijo oddati končno (popravljeno) in natisnjeno verzijo seminarja v enem izvodu, elektronsko verzijo seminarja in predstavitev pa oddati na strežnik na dan predstavitve do polnoči.
* Seminarska naloga in povzetek morajo biti v slovenskem jeziku, razen za študente, katerih materni jezik ni slovenščina. Ti lahko oddajo seminar v angleškem jeziku.

==Imena datotek==
Prosim vas, da vse datoteke, ki mi jih pošiljate poimenujete po naslednjem receptu:
* 312_BIO_Priimek_Ime.doc(x) za seminar, npr. 312_BIO_Guncar_Gregor.docx
* 312_BIO_Priimek_ime_final.doc(x) za končno verzijo seminarja
* 312_BIO_Priimek_Ime_rec_Priimek2.doc(x) za recenzijo, kjer je Priimek2 priimek recenzenta, npr. 312_BIO_Guncar_Gregor_rec_Scott.docx (če se pišete Scott in odajate recenzijo za seminar, ki ga je napisal Gunčar)
* 312_BIO_Priimek_Ime.ppt(x) za prezentacijo, npr 312_BIO_Guncar_Gregor.pptx
* 312_BIO_Priimek_ime_poprava.doc(x) za popravljeno končno verzijo seminarja, če so popravki manjši

==Ocenjevanje seminarjev==
Recenzenti ocenijo seminar tako, da izpolnijo [https://docs.google.com/forms/d/1EQDYwFO-DEzZ2R7jf8DhLqIeV4FFxRd3-ScceEASpt4/viewform recenzentsko poročilo] na spletu. Recenzentsko poročilo morate oddati najkasneje do 21:00, en dan pred predstavitvijo seminarja.

== Mnenje o predstavitvi ==
Vsak posameznik odda svoje mnenje o predstavitvi takoj po predstavitvi z online glasovanjem.

==Urejanje spletnih strani na wikiju==
Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''

==Citiranje virov==
Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se držite ene same. V seminarskih nalogah in diplomskih nalogah FKKT uprabljajte shemo citiranja, ki je pobarvana zeleno.
Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati.
Za citate v naravoslovju je najpogostejše citiranje po pravilniku ISO 690. [http://www.zveza-zotks.si/gzm/dokumenti/literatura.html Pravila], ki upoštevajo omenjeni standard, so pripravili pri ZTKS. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati. 
'''Citiranje knjig:''' 
Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica. 
Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN. 

Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005. 
Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4. 
Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.).

'''Citiranje člankov:''' 
Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani. 
Lartigue, C., Glass, J. I., Alperovich, N., Pieper, R., Parmar, P. P., Hutchison III, C. A., Smith, H. O. in Venter, J. C.
Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, 317, str. 632-638.

Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole: 
Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani. 
Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.

Revija Science uporablja skrajšani zapis: 
C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007) 

V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne). Navesti morate tudi vse avtorje dela, razen v primeru, ko jih je 10 ali več. Takrat navedite le prvih devet, za ostale pa uporabite okrajšavo in sod. (in sodelavci). Pred zadnjim avtorjem naj bo vedno besedica "in".

'''Citiranje spletnih virov:''' 
Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov 
strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life 
Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.

TBK2020 Povzetki seminarjev

2020-04-19T22:46:51Z

Luka Stanković:

=== Gregor Strniša: Vpliv genoma okroglega gobija na njegovo invazivnost===

Invazivne vrste predstavljajo velik problem naši družbi, saj s svojim širjenjem spreminjajo ravnotežje v ekosistemih. Razumevanje njihovega genoma je ključnega pomena za prepoznavanje sposobnosti, ki jim omogočajo prilagajanje na življenje v drugačnih krajih. Okrogli gobi je ena najbolj uspešnih invazivnih vrst, ki se je razširila iz svojega nativnega območja ob Črnem morju vse do Velikih jezer v Ameriki. Znanstveniki so ob primerjavi genoma okroglega gobija z drugimi podobnimi vrstami odkrili nenavadne prilagoditve, zaradi katerih lažje preživi v novih okoljih. Razširjena področja genov za imunski sistem mu omogočajo boljšo obrambo pred drugačnimi mikroorganizmi, ki jih lahko sreča v novem okolju. Povečana so vsa območja genov za nastanek inflamosoma - celične strukture, ki inducira nadzorovano celično smrt preko piroptoze ob detekciji tujih mikroorganizmov. Ima razširjeno območje genov družine CYP (citokromi P450), ki sodelujejo pri razgradnji telesu tujih snovi. Odkrili so še nekaj mutacij genov na receptorjih za vid in voh, za katere pa se še ne ve, ali imajo vpliv na preživetje okroglega gobija v novih okoljih. Nadaljnje raziskave drugih invazivnih vrst bodo pokazale, kako lahko omejimo njihovo širjenje in ohranimo naše ekosisteme.

=== Jan Trebušak:Vbod klopa vrste Amblyomma americanum sproži proizvodnjo IgE in preobčutljivost preko celic T CD4+ in od MyD88 odvisnih poti.===
Alergije, ki jih pri ljudeh sproži vbod klopa so bile zaradi zakasnelih simptomov diagnosticirane šele pred kratkim, predstavljajo pa naraščujočo grožnjo javnemu zdravju. Sindrom alfa-gal je alergija, ki se lahko pojavi, ko gostitelj ob vbodu pride v stik z molekulami galaktoze-alfa-1,3-galaktoze iz klopove sline, to je krvni antigen, ki v klopa pride s pitjem krvi svojega gostitelja. V takih primerih postane oseba alergična na vse vrste mesa, ki vsebujejo omenjeni ogljikov hidrat t.j vse rdeče meso, razen meso višjih primatov in ljudi. Alergija na rdeče meso je ena izmed redkih alergij na hrano, ki lahko sproži hude kožne, gastrointestinalne in respiratorne reakcije, oziroma anafilakso, buren odziv telesa najverjetneje sprožijo specifična protitelesa IgE. Ker so mehanizmi po katerih pride do alergij na hrano slabo poznani, je bil cilj študije razviti mišji model alergijske senzitizacija ob dermalni izpostavitvi klopom, ki bi ga potencialno lahko uporabili za identifikacijo mehanizmov, ki nazdorujejo sprožitev IgE protiteles povezanih z boleznimi, ki jih prenašajo klop.

=== Sara Golob: Vpliv virusa Herpesa simpleksa tipa 1 na razvoj Alzheimerjeve bolezni ===

Pri Alzheimerjevi bolezni pride do padca kognitivnih funkcij, kot so spomin, govor, pozornost, učenje, itd. Razvije se zaradi različnih dejavnikov, ki so lahko dedni ali okoljski. Eden od okoljskih dejavnikov je okužba z virusom Herpes simpleks tip 1. Ta povzroči večje izražanje ε4 alela apolipoproteina E, ki povzroča nalaganje Tau proteina in amiloida beta, ki sestavljata senilne plake pri Alzheimerjevi bolezni. To povezavo so odkrili s protitelesi proti virusu Herpes simpleks tipa 1 ter preko lizosomske okvare, zaradi katere pride do nalaganja amiloida beta v možganih. Dokazana je bila tudi povezava med Alzheimerjevo boleznijo in drugimi boleznimi (epilepsija, demenca, shizofrenija, fibromialgija, demenca), pri katerih je opazna kognitivna disfunkcija. Pri bolnikih z epilepsijo so odkrili amiloidne plake, ki so značilni za Alzheimerjevo bolezen, zaradi česar je večja verjetnost, da oboleli za epilepsijo zbolijo še za Alzheimerjevo boleznijo in obratno. Herpes simpleks virus redko povzroča tudi akutni encefalitis, katerega posledica so epileptični napadi, izguba spomina in spremembe v vedenju. Zato znanstveniki menijo, da je povezava med epilepsijo in Alzheimerjevo boleznijo tudi v apolipoproteinu E.

=== Ena Kartal: Kako celično staranje vodi do nevrodegeneracije ===
Čeprav je bila vzpostavljena povezava med kroničnim vnetjem in nevrodegenerativnimi boleznimi, je bilo veliko odprtih vprašanj v zvezi s tem, kako celično staranje, proces, pri katerem celice, ki se nehajo deliti pod stresom, izločijo mešanico vnetnih beljakovin, vplivajo na te patologije. Raziskovalci poročajo, da staranje v astrocitih, ki je najbolj razširjena vrsta celic v možganih, vodi do škodljive '' ekscitotoksičnosti '' na kortikalnih nevronih, ki so vključeni v spomin.In pri tem pride do Alzheimerjeve bolezni,ki je najpogostejši vzrok demence pri starejših, je nepopravljiva, napredujoča možganska motnja, ki ubija možganske celice in postopoma uničuje spomin.

=== Lenka Stanković: Optimizirano antiangiogeno reprogramiranje tumorskega mikrookolja potencira imunoterapijo CD40 ===

Karakteristika raka je njegova sposobnost spodbujanja angiogeneze, oziroma tvorba novih krvnih žil. Angiogeneza prispeva k rasti in napredovanju tumorja z induciranjem in vzdrževanjem kislega / hipoksičnega in imunosupresivnega okolja. Krvne žile v rakih so pogosto nefunkcionalne in omejujejo promet s T-celicami. Odkritje angiogenih zaviralcev naj bi pripomoglo k zmanjšanju umrljivosti zaradi karcinomov. Tukaj prikazujemo, da imunoterapija proti CD40 poveča tumorsko infiltracijo CD8+T, vendar regresijo tumorja dosežemo močneje, če anti-CD40 kombinirano z dvojno blokado Ang2 in VEGFA. Kombinacija anti-VEGFA, anti-Ang2 in agonističkih protiteles proti anti-CD40 omogoča zavrnitev tumorjev pri sintetičnih modelih tumorjev. Proučevali so odzive tumorjev na anti-VEGFA, anti-Ang2 in agonistična protitelesa proti CD40 v različnih modelih mišjega raka. V raziskavi so pokazali, da kombinacija agonističnih protiteles CD40 z dvojno blokado VEGFA/Ang2 povečuje protitumorski odziv v modelnih raka miši s pomočjo sinergistične regulacije genov in indukcije imunskega permisivnega mikrookruženja tumorja, za katero je značilno provnetno (M1 podobno) aktivacijo makrofagov, vaskularno normalizacija ter izboljšanja infiltracije in prostorska lokalizacija efektorskih T-celic. T-celice pošljejo signale drugim vrstam imunskih celic, vključno s citotoksičnimi T celicami CD8+. Citotoksične T-celice, znane tudi kot CD8 + T-celice, izražajo svoje TCR, ki jih spremlja glikoprotein CD8. CD8 + T-celice so povezane z učinkovitim ubijanjem rakavih celic: med antigensko specifično aktivacijo afiniteta med CD8 glikoproteinom, izraženim s celico CD8 + T, in molekulo MHC razreda I, izraženo z rakavo celico, ohranja obe vrsti celic skupaj. Tesna vezava T celic in rakavih celic skozi kompleks CD8 / TCR in kompleks antigen / MHC-I povzroči, da celice CD8 + T izločajo perforin in grancime, kar vodi v lizo rakavih celic.

=== Nika Tomsič: Pomembnost in delovanje sladkornega prenašalca PfHT1 v parazitu malarije ===
Po oceni World Health Organisation- World malaria report 2019 je v letu 2018 bilo 228 milijonov primerov malarije. Sladkor je glavni vir energije parazita, zato je razumevanje presnove sladkorjev pomembna tema, ki bi lahko predstavljala pomoč pri sestavljanju zdravil in izrivanju tega parazita. Glavna razlika v presnovi sladkorjev med parazitom in drugimi organizmi je prenašalec, ki sladkorje prenaša v celico. Za to je odgovoren šeskotni prenašalec PfHT1, ki je sposoben transportirati bodisi glukozo kot fruktozo. Strukturno pa je zelo podoben prenašalcem človeške celice GLUT. Prenašalec obsega 12 transmembranskih vijačnic, ki tvorijo osrednjo pot za vstop glukoze. Ključni del proteina pa predstavljajo izrastki ki delujejo kot receptorji za sladkorje. Sladkorne prenašalce še nadaljnjo stabilizirajo solne medcelične povezave. Druga velika razlika med PfHT1 in drugimi prenašalci je brez dvoma način odpiranja in zapiranja prenašalca, saj ni sestavljenen samo iz treh običajnih stanj (odprto navznoter, zaprto, odprto navznoter), temveč ga zaznamujejo še dve vmesni stanji (zaprto navznoter in zaprto navzven, angl. inward–occluded in outward-occluded). Nadaljnjo raziskovanje bi torej lahko omogočilo razvoja novih antimalaričnih zdravil, ki blokirajo uvoz sladkorja in zastrašujejo parazita do smrti oz. razvoja novih zaviralcev, ki so bolj specifični za blokiranje funkcije PfHT1, ne da bi pri tem vplivali na transport sladkorja v človeških celicah.

=== Maša Mencigar: Vpliv apoptotskih celic na imunski sistem ===
Apoptotske celice v telesu lahko nadzorujejo imunski sistem in preprečijo nezaželene imunske odzive na telesu lastna tkiva oziroma celice. Avtoimune bolezni so kronične, neozdravljive in predstavlajo velik zdravstven problem, saj bolniki trpijo, hkrati pa povzročajo velike stroške. Znanstveniki iz nemškega centra za raziskave rakavih bolezni (DKFZ - Deutsches Krebsforschungszentrum; angl: German Cancer Research Center) so našli receptor na imunskih celicah miši, ki aktivira ta zaščitni mehanizem in prepreči nevarne avtoimunske reakcije. Ta receptor se imenuje dektin-1, ki ima dvojno vlogo, saj veže beta-glukane in aksin proteine. Pomankanje dektina-1 vodi do simptomov avtoimunih bolezni šele proti koncu življenske dobe. Ključna pa je povezava med encimom NAHPH oksidazo-2 in dektinom-1, zato imajo ljudje, ki nimajo tega encima avtoimune bolezni.

=== Ema Kovačič: Izpostavljenost ploda materini mikrobioti ===
Študija o prehodu materine mikrobiote skozi placento pri otrocih, ki so se rodili s carskim rezom prezgodaj in normalno. Mamam so vzeli brise iz različnih delov telesa, otrokom pa takoj po rojstvu vzorce iz ustne votline in mekonija. Imunski sistem pri otrocih se razvije že v prenatalnem obdobju. Našli so DNK nekaterih bakterij v posteljici, plodovnici in mekoniju, kar kaže, da se zarodek spopade z bakterijami že v prenatalnem obdobju. Odkritje bakterijskih zapisov v materničnem okolju nakazuje na koesistenco mehanizmov za kontorolo izpostavljenosti pri plodu in materini mikrobioti.

=== Zala Puklavec: Globoko učenje void do odkritja novih antibiotikov===
Zaradi naglega pojava bakterij, ki so odporne na antibiotike, raste potreba po odkritju novih antibiotikov. Zato so naučili globoko nevronsko mrežo napovedati molekule, ki imajo antibakterijske lastnosti. S tem računalniškim modelom so odkrili, da ima halicin (c-Jun N-terminal kinase inhibitor SU3327) zelo močne antibakterijske lastnosti. Nadaljni eksperimenti so pokazali, da deluje na drugačen način kot večina antibiotikov. Za razliko od ostalih je halicin proti E.coli bakteriociden, ne le bakteriostatski. Testirali so ga tudi na bakterijah, za katere po mnenju Svetovne zdravstvene organizacije najnujneje potrebujemo neko obliko zdravljenja, in proti veliki večini je deloval zelo uspešno. Z daljšo izpostavljenostjo E.coli halicinu so poskušali izolirati mutantske celice, ki so razvile odpornost nanj, vendar jim ni uspelo, kar kaže na to, da te odpornosti ni možno ali pa se vsaj veliko težje razvije. Z še nekaj eksperimenti pa so prišli do zaključka, da halicin disipatira transmembranski pH potencial in najverjetneje veže Fe3+ pred pH disipacijo in povezavo z membrano.

=== Martin Stanonik: De novo pojavitev adapterskih membranskih proteinov iz timinsko bogatih genskih sekvenc===
Odkrivamo vedno več proteinov, ki so nastali iz de novo genov. To pomeni, da so se kodirali iz nekodirajočih delov DNA, kar velja za redek proces. V laboratorijskih poskusih je preveliko izražanje teh nastajajočih genov omogočalo boljše delovanje celice v primerjavi z prevelikim izražanjem že vzpostavljenih genov in motenje tega procesa ni vplivalo na delovanje celice. za osebek so uporabili kvas, saj glive kvasovke vsebujejo najboljše lastnosti za izražanje genov.To prikazuje velik potencial, še posebej za timinsko bogate sekvence za izdelavo transmembranskih proteinov. Iz kombinacij različnih analiz je bil predlagan nov model genskega nastanka. Ta odkritja, bi lahko omogočala nov način izdelave polipeptidov, ki nastanejo iz teh, de novo, delov DNA.

=== Klara Kočman: Koronavirus: SARS-CoV in SARS-CoV-2 ===
Koronavirusi so veliki, pozitivni RNA virusi. Okuženost z virusom lahko opazimo z značilni simptomi kot so vročina, kašelj in pomanjkanje zraka. Najnovejši tip koronavirusa, SARS-CoV-2, tudi 2019-nCoV, se je prvič pojavil 31. decembra 2019 v mestu Wuhan na Kitajskem. Transport virusa s človeka na človeka je pogost pri telesnih stikih z bolnikom. SARS-CoV-2 primerjajo z virusama MERS-CoV in SARS-CoV. Na podlagi celotne analize genoma in proteinov je virus bližje SARS-CoV kot MERS-CoV, saj obstaja več kot 90% genetska podobnost s SARS-CoV, medtem kot je s MERS-CoV-jem neznatna. Genom virusa SARS-CoV-2 je sestavljen iz približno 30 kilobaz, ki jih kodira več strukturnih in nestrukturnih proteinov. S SARS-CoV si je podoben po dolžini genoma ter podobnem mehanizmu vstopa v celico ter uporabi celičnih receptorjev (ACE2). Glikoprotein ACE2 se nahaja na površini membrane in je pomemben za vezavo receptorjev gostiteljskih celic in gostitelja. Transmembranski proteini virusa se vežejo na človeško celico preko receptorjev ACE2 (encim za pretvorbo angiotenzina 2). Med 120 sekvencami virusa SARS-CoV-2 ni bila zanana niti ena mutacija, zato lahko s ciljenjem slednjih nudimo zaščito. Znanstveniki z opazovanjem odziva na protitelesa pri miših raziskujejo cepivo.

===Timotej Sotošek: Protivirusni remdesivir potentno inhibira RNA-odvisno RNA polimerazo od Srednje Vzhodni respiratorni sindrom koronavirusa===
Zdravilo remdesivir (bolj natančno Remdesivir trifosfat) je preiskovalna spojina, ki je bilo sprva ustvarjeno za zdravit Ebolo. Ima širok spektrum protivirusnih aktivnosti proti RNA virusih kot na primer koronavirusi , Filovirusi,… Njegova tarča je multi-podenotni RNA sintezni kompleks znan pod imenom RNA-odvisna RNA polimeraza na katerem s pomočjo drugih proteinov poteka sinteza virusne RNA verige. Remdesivir je nukleotidni analog ATP-ja s katerim tekmuje za vezavo v nastajajočo se virusno RNA verigo po tem, ko je virus že okuži celico. V primeru, da se Remdesivir uspe vezat v virusno RNA verigo bo ta prenehala rast in tako postala ne uporabna. To pomeni, da je Remdesivir le inhibitor, ki upočasnjuje oz. preprečuje nadaljno širjenje virusa. Raziskave so preiskovale mehanizem inhibicije na virusu Srednje Vzhodni respiratorni sindrom(MERS-CoV) in ga primerjali kako je učinkovit v primerjavi inhibicije virusa Ebola, ter na splošno kako zelo je njegov mehanizem učinkovit. Ker sta si MERS-CoV in SARS-CoV-2 sorodna virusa bi lahko zdravilo Remdesivir pomagal ozdravit obolele z SARS-CoV-2 koronavirusom.

===Nika Perko: Enkapsulacija eteričnega olja pomarančevca v celice gliv kvasovk===
Komarji vrste Aedes aegypti so eni glavnih povzročiteljev bolezni kot so denga, rumena mrzlica, zika in čikungunja. Najdemo jih v tropskem in subtropskem pasu ter celo v Evropi. Znanstveniki Univerze Nove Mehike so poiskali način, kako preprečiti širitev omenjenih bolezni. Ustvarili so naraven insekticid, ki prepreči razvoj komarjev, ko so ti še v stopnji ličinke. Larvicid je sestavljen iz enostavnih komponent: eteričnega olja pomarančevca Citrus sinensis in gliv kvasovk vrste Saccharomyces cervevisiae. Sintetiziran je bil s postopkom enkapsulacije eteričnega olja pomarančevca v celice gliv kvasovk. Med korake tega procesa so vpeljali še enega novega. Z njim so odstranili odvečno eterično olje, ki je ostalo na zunanji strani celic. To je bilo izredno pomembno, saj je odvečno olje delovalo kot repelent. Z različnimi analizami in primerjavami so ugotovili, da struktura celične stene, membrane in oljnih kapljic ostane po enkapsulaciji nespremenjena. Pomembna ugotovitev je bila tudi, da se kvasovke po enkapsulaciji niso mogle več razmnoževat. Testi efektivnosti so bili vzpodbudni, saj je bil larvicid učinkovit pri vseh ličinkah. Najbolj pa je bil učinkovit pri začetni razvojni stopnji ličink. Novi larvicid ima kar nekaj dobrih lastnosti: je naraven, ne more se nenadzorovano širit in tako škodit vodnemu okolju, izdelava je relativno poceni, je neškodljiv za ljudi, dolgo učinkuje…

=== Anja Moškrič: Povezava med infekcijo s temperiranimi bakteriofagi in izgubo sistema CRISPR-Cas tipa I ===
Sistem CRISPR-Cas je imunski mehanizem, ki je značilen za veliko prokariontov in arhej. Gre za gruče enakomerno prekinjenih palindromskih ponovitev, ki nosijo zapis za obrambo proti vdoru tujega dednega materiala (virusov in plazmidov). Kratica Cas pa predstavlja s CRISPR povezane gene, ki kodirajo zapis za nekatere encime, ki cepijo DNA. CRISPR lokus je sestavljen iz ponavljajočih CRISPR genov, med katerimi so vmesniki. Na teh pa je shranjena kopija dela zapisa virusa oz. plazmida. S študijo so želeli izvedeti vpliv infekcije bakterije Pseudomonas aeruginosa, s temperiranim oziroma lizogenim bakteriofagom (DMS3), ki se v obliki profaga vključi v dedni material gostiteljske celice. Izbrana bakterijska vrsta vrši sistem CRISPR-Cas tipa I-F. Za primerjavo so za eksperimente uporabljali tudi nekatere mutirane vrste bakterij,ki so imele napako v CRISPR lokusu. Eksperimenti so pokazali, da ob infekciji z nemutiranimi bakteriofagi bakterije niso sposobne uspešno odstranit le-teh. Iz zbranih rezultatov so ugotovili, da je v tem primeru imunski mehanizem slabo prilagojen celicam, saj povzroča imunopatološki efekt (avtoimunost). Do tega pride zaradi nepopolnega ujemanja zapisa na CRISPR vmesnikih s profagi. Če bakteriofagi ne kodirajo zapisa za acr gene (anti-CRISPR geni, ki zatirajo omenjen mehanizem), lahko to privede do izgube sistema CRISPR-Cas skozi evolucijo.

===Maja Deutsch: Globalni kemični učinki mikrobioma vključujejo nove konjugacije žolčne kisline===
Med vsemi mnogoceličarji in njihovimi mikrobiomi se pojavijo številne medsebojne kemične interakcije. Številne molekule, za katere je znano, da jih proizvaja mikrobiom, izrazito vplivajo na ravnovesje med zdravjem in boleznijo. Z uporabo masne spektrometrije in vizualizacije podatkov so bili ocenjeni učinki mikrobioma na celotno kemijo sesalca s primerjavo podatkov metabolomike pri aseptičnih miši in specifičnih-mikroorganizmov-prostih miši. Ugotovljeno je bilo, da mikrobiota vpliva na kemijo vseh organov. To je vključevalo aminokislinske konjugacije žolčnih kislin, ki so bile uporabljene za proizvodnjo fenilalanoholne kisline, tirozoholne kisline in levcoholne kisline, ki prej še niso bile identificirane, kljub obsežnim raziskavam kemije žolčnih kislin. Ti konjugati žolčne kisline so bili najdeni tudi pri ljudeh, vendar so bile bolj pogoste pri bolnikih z vnetnimi črevesnimi boleznmi, cistično fibrozo in pri dojenčkih. Te spojine so agonizirale farnezodini receptor X (FXR) in miši, ki so imele na novo odkrite kisline, so pokazale zmanjšano izražanje genov za sintezo žolčne kisline. Potrebne pa so nadaljnje raziskave, da se ugotovi, ali imajo te spojine fiziološko vlogo v sesalcih in ali prispevajo k črevesnim boleznim, ki so povezane z mikrobiomsko disbiozo.

=== Hana Glavnik: Kako paraziti malarije zaznajo imunske celice in se pred njimi zaščitijo ===
Pri raziskovanju malarije so znanstveniki odkrili pojav, ki so ga poimenovali rozeta. Rozeta je skupek neokuženih rdečih krvnih celic, ki s pomočjo proteinov, ki jih sintetizira parazit obkolijo okuženo rdečo krvno celico. Parazit se tako zaščiti pred gostiteljevim imunskim sistemom, saj ga monocite tako obkoljenega težje zaznajo. Raziskovali so tvorjenje rozet pri različnih pogojih. Izoliranim parazitom so dodali različne vrste monocitov in opazovali njihovo reakcijo. S tem so odkrili tudi protein IGFBP7, ki inducira tvorjenje rozet, vendar le ob prisotnosti dodatnih serumskih faktorjev. Odkritje proteina IGFBP7 je vodilo v odkritje novega načina tvorjenja rozet, tako imenovanega tipa II, saj za razliko od prvotnega tipa I, ta ne poteče spontano. Nato so pod drobnogled vzeli tvorjenje rozet s proteinom IGFBP7. Z namenom, da bi lahko razložili ta pojav, so eritrocite zdravili z encimom Heparinaza in jih nato izpostavili pogojem, ugodnim za nastanek rozet ter opazovali dobljene rezultate. IGFBP7 opozori parazite na prihod monocitov, nato parazit ta protein uporabi kot most, ki se poveže še z dvema človeškima proteinoma na zdravem eritrocitu in tako pomaga pri tvorjenju.

=== Eva Ratajc: Z-DNA vezavni protein 1 kot ključni dejavnik kontrolirane replikacije virusa Zahodnega Nila in virusa zika ===
Virus Zahodnega Nila (WNV) je glavni povzročitelj virusnega encefalitisa v Združenih državah Amerike. Tudi okužbe z virusom zika (ZIKV) povzročajo resne nevrološke bolezni in prirojene napake. Znano je, da ima pri sproženju imunskega odziva pomembno vlogo Z-DNA vezavni protein 1 (ZBP1). Z-DNA vezavni protein (ZBP1) je citoplazmatski DNA-senzor, ki služi kot receptor za prepoznavanje molekularnih vzorcev. Ob okužbi telesa z virusom zika in virusom Zahodnega Nila se poveča izražanje ZBP1 v mišjih možganih. Zaradi tega so raziskovalci želeli raziskati vlogo ZBP1 pri omejitvi patogeneze pri osebkih, okuženih z navedenima virusoma. Pri miših z izbitim genom za ZBP1 −/− so zaznali višjo stopnjo okužb in višjo smrtnost po okužbi tako s smrtonosno kot z nesmrtonosno obliko virusa Zahodnega Nila kot pri miših divjega tipa (WT). Raziskovalci so ugotovili, da ima ZBP1 ključno vlogo pri omejitvi patogeneze pri miših. ZBP1 prepreči širjenje okužbe WNV in ZIKV v primarnih mišjih celicah in je pomemben za preživetje osebkov z boleznimi, ki ju povzročata omenjena virusa. Pomanjkanje ZBP1 je povzročilo večje količine virusa v serumu in možganih pri ZBP1−/− miših v primerjavi z divjim tipom. Pri ZBP1−/− miših so zaznali tudi višje virusne titre, ki so jih povezali z znižanimi leveli protivirusnih citokinov in kemokinov.

=== Lana Kores: Preučevanje ionskega kanalčka TRPA1 in bolečine s toksinom avstralskega škorpijona ===
Ionski kanalček TRPA1 (znan tudi kot wasabi receptor) je receptor za dražilce, ki povzročajo akutno bolečino in nevrogeno vnetje. Toksin za wasabi receptor WaTx je toksin avstralskega škorpijona, ki s pasivno difuzijo preide čez membrano celice in se nato veže na TRPA1. WaTx deluje na podoben način kot elektofilni dražilci receptorja, le da v nasprotju z njimi kanalčka ne odpre direktno, ampak le stabilizira njegovo odprto stanje in tako zmanjša prepustnost za Ca2+ ione. Koncentracija Ca2+ ionov je zato zadostna, da povzroči akutno bolečino, ne pa dovolj velika, da bi prišlo do nevrogenega vnetja, kot npr. pri elektrofilnem dražilcu AITC.

=== Eva Vene: Nevtralizacija denge v komarjih, ki izražajo načrtovano protitelo ===
Neuspešnost cepiva ter dejstvo, da je, zaradi širjenja življenjskega prostora A. aegypti, ogroženih 50% svetovnega prebivalstva, je vodilo v nadaljnje raziskave, ki bi omogočile zaustavitev širjenja virusa z restrikcijo slednjega že v samih prenašalcih. Možnost za uspeh obetajo protitelesa s širokim spektrom nevtralizacije (ang. broadly neutralizing antibodies), saj so slednja uspešna proti antigensko različnim virusom. Zaenkrat tovrstna protitelesa kot možnost zatiranja širjenja bolezni še niso bila uporabljena proti katerikoli vrsti virusa, njihova upešnost pa se je pokazala pri drugi veji mikroorganizmov.
Za raziskave so uporabili človeško protitelo 1C19, katerega uspešnost proti serotipom DENV je bila znana že iz prejšnjih let. V genom transgenih komarjev je bil dodan modificiran gen za scFv 1C19 (človeško protitelo, ki deluje proti DENV) in fluorescenčni označevalec, ki se sintetizira za protitelesom, tipa tdTomato. V komarje je bil določen serotip virusa vnešen z okuženo krvjo. Določili so dva možna izida okužbe: ponekod je DENV prosto prehajal čez srednje črevo – komarji so postali prenašalci virusa; v drugem primeru pa so izražena protitelesa nevtralizirala serotip virusa in s tem preprečila prenos okužbe naprej.

=== Nina Žgajnar: In vitro samostojno podvojevanje in policistronsko izražanje večjih sintetičnih genomov ===
Konvencionalne metode genskega inženirstva za reševanje zapletenih problemov se običajno osredotočajo na prilagajanje enega ali več genov. Sintezna biologija pa k tem težavam pristopa z novega vidika: ukvarja se z večjimi spremembami obstoječih celičnih struktur in z izgradnjo bolj zapletenih sistemov. Sinteza kemičnega sistema, ki je sposoben razmnoževanja in razvoja, je glavni cilj sintezne biologije. To bi lahko dosegli z in vitro rekonstrukcijo minimalno samozadostne centralne dogme. Znanstveniki so ustvarili sistem in vitro translacije, ki omogoča samostojno podvajanje in izražanje večjih genomov. Demonstrirali so samostojno podvojevanje genoma iz več kot 116 kilobaz, ki zajema celoten niz translacijskih faktorjev E. coli, vse tri ribosomske RNA, sistem za obnavljanje energije ter RNA in DNA polimeraze. Vzporedno z replikacijo DNA sistem omogoča sintezo vsaj 30 kodiranih translacijskih faktorjev, od katerih je polovica izražena v enakih ali večjih količinah od njihovih vhodnih nivojev. Vprašanje, kaj vse lahko dosežemo s samosestavljanjem kemijskih spojin, velja za eno izmed pomembnejših vprašanj v znanosti. Sintezna biologija tukaj postavlja nov cilj: sestaviti organizem izključno iz majhnih molekul. Potencialno bi tako lahko ustvarili organizme, ki bi čistili nevarne odpadke na nedostopnih mestih, rastline, ki bi zaznavale določene kemikalije in se nanje ustrezno odzvale, proizvedli čisto gorivo na učinkovit in trajnosten način ali prepoznavali in uničevali tumorje.

=== Luka Šegota: Sulfolipid-1, kot sprožilec kašlja pri tuberkuloznih bakterijah ===
Tuberkuloza je pljučna bolezen, ki jo povzroča bakterija Mycobacterium tuberculosis (Mtb). Med sesalci se ta bakterija prenaša s kašljem. Kašelj je vzbujen zaradi nociceptorske inervacije pljuč (porazdelitve končičev nevronov po pljučih). Mycobacterium tuberculosis sintetizira molekule, ki interagirajo z nevroni v pljučih in pri tem se poveča intercelularna koncentracija kalcija. Na osnovi merjenja koncentracije kalcija v dorzalnem koreninskem gangliju mišjega zarodka po stiku s bakterijo so ugotovili, da Mtb ativira nevrone. Da bi odkrili vzbujevalno molekulo, so ganglije mišjih zarodkov izpostavili izvlečkom (Mtb) celične membrane, frakcijam citosola, proteinom iz celične stene in proteinom Triton X-114. Ugotovili so, da le deli celice, ki vsebujejo lipide, vzbujajo nevrone. Molekula, ki je za to »odgovorna« se imenuje sulfolipid-1. Gre za najbolj sulfatiran glikolipid, ki se nahaja v zunanji membrani celične stene Mtb, najden je le v patogenih bakterijah te vrste. Eksperimenti so pokazali, da živali kašljajo le zaradi sevov Mtb bakterij, ki so sposobne sintetizirati sulfolipid-1. Morebitna terapija, ki zavira kašelj, bi lahko znatno zmanjšala prenos tuberkuloze in drugih bolezni.

=== Jan Kogovšek: Inhibitor plazmepsina zmoti več stanj življenjskega cikla parazita malarije ===
Parazit Plasmodium falciparum je najpogostejši povzročitelj malarije pri ljudeh. S to boleznijo zboli več milijonov ljudi, umre pa jih približno 400 000 vsako leto. Antimalariki, ki so v uporabi, počasi izgubljajo svojo moč, kajti parazit je postal rezistenten na do sedaj najbolj učinkovito terapijo, imenovano artemisinin combination therapy (ATC). Znanstveniki so v ta namen odkrili tri nove zdravilne učinkovine, ki delujejo kot inhibitorji plazmepsina IX in plazmepsina X, ki ju izloča Plasmodium. Odkrili so, da inhibitorji zavrejo izločanje dodatnih proteinov iz celic, ki parazitu omogočajo vstop v eritrocite. S testi so ugotovili, da WM4 in WM5, ki sta prva na novo odkrita inhibitorja, delujeta na isti princip, vendar ne vplivata na dozorevanje in širjenje oocist parazita. WM382, naknadno odkrit inhibitor, pa poleg istih mehanizmov, kot jih imata WM4 in WM5, deluje tudi na dozorevanje oocist v fazi rasti parazita v jetrih. Za vse tri učinkovine so tudi dokazali specifično delovanje na oba plazmepsina. S tem ko WM382 zavira rast in zorenje oocist parazita, se tudi zmanjša prenašanje parazita na komarje in možnost prenosa rezistence na že obstoječe antimalarike.

=== Kostadin Mitkov: Heat shock factor 2 helps the cells to maintain cell adhesion and protect themselves against stress ===
Maintenance of protein homeostasis is essential for the cell viability and growth. The cells in the human body are constantly exposed to environmental stress factors, which tend to disturb that protein homeostasis maintenance. For the first time, research shows that the contacts between cells, known as cell adhesion, are essential for cells to survive stress and maintain protein homeostasis. Cell adhesion is relied on heat shock factors (HSFs). HSFs mediate their protective functions through diverse genetic programs, which are composed of genes encoding molecular chaperones and other genes crucial for cell survival. Scientists have found that HSF2 is critical for cell survival during prolonged proteotoxicity, and their RNA sequencing (RNA-seq) analyses revealed that cells that lack HSF2 have weakened viability which is not caused by inadequate induction of molecular chaperones but is due to marked downregulation of cadherin superfamily genes. They demonstrated that maintenance of cadherin-mediated cell-cell adhesion is dependent on HSF2 and it is also required for protection against stress induced by proteasome inhibition. This study identifies HSF2 as a key regulator of cadherin superfamily genes and defines cell-cell adhesion as a determinant of proteotoxic stress resistance.

=== Jan Bregar: Prehodno neintegrativno izražanje reprogramirnih faktorjev v jedru spodbuja večplastno izboljšanje starajočih se človeških celic ===
Za staranje je značilno postopno poslabševanje delovanja na nivoju molekul in posledicno tudi celic, tkiv in nenazadnje celotnega organizma. Na kromatinskem nivoju s starostjo povezujemo pogostejše pojavljanje epigenetskih napak, izčrpavanje matičnih celic, senescenco in deregulirano celično/tkivno homeostazo. Jedrno reprogramiranje, ki vodi k pluripotenci (zmožnost celice, da se diferencira v kateri koli zarodni sloj), lahko vrne celico, tako starostno kot tudi identitetsko, v stanje ekvivalentno embrionalni celici. Ta raziskava je dokazala, da lahko dosežemo celični preporod pri človeških celicah, ki smo jih izolirali iz naravno staranih posameznikov. Pokazali so, da lahko neintegrativno prehodno celično reprogramiranje na podlagi mRNA naglo spremeni širok spekter znakov staranja v začetni fazi, ko se epigenetski izbris celične identitete še ni zgodil. Pokazali so, da se proces preporoda pojavi pri naravno staranih človeških in mišjih celicah, s tem ko se povrne izgubljena funkcionalnost v obolelih celicah, brez da bi posegli v celično identiteto.

=== Ajda Beltram: Identifikacija potencialnih komponent cepiva proti SARS-CoV-2 na podlagi imunoloških raziskav SARS-CoV ===
Cilj te raziskave je pomoč pri izdelavi cepiva proti SARS-CoV-2 na podlagi imunoloških raziskav SARS-CoV, saj sta si virusa genetske zelo podobna. Dokazali so veliko podobnost med posameznimi strukturnimi proteini SARS-CoV-2 in SARS-CoV, ter nekoliko manjšo med SARS-CoV-2 in MERS-CoV. Primerjali so tudi eksperimentalno določene epitope celic T in B strukturnih proteinov (S in N) SARS-CoV s strukturnimi proteini SARS-CoV-2. Epitope celic T so dobili na podlagi pozitivnega odziva celic T na epitope ali pozitivne vezave MHC na epitope, epitope celic B pa s pozitivno vezavo celic B na epitope. Ugotovili so, da se 23 % epitopov celic T in 16 % epitopov celic B SARS-CoV popolnoma ujema s SARS-CoV-2 in so tudi brez mutacij. Velik potencial predstavljajo predvsem epitopi celic T, saj je bilo dokazano pri SARS-CoV, da omogočajo dolgotrajno zaščito. Pri celicah B pa imajo za sprožitev imunskega odziva s protitelesi za SARS-CoV-2 več potenciala linearni epitopi celic B podenote S2 proteina S, saj se jih veliko popolnoma ujema s SARS-CoV-2. Zaradi vsega tega so najverjetneje cepiva, ki spodbudijo odziv celic T, in cepiva, ki poskušajo izzvati protitelesa, ki se vežejo na linearne epitope podenote S2, efektivna in bi morala biti v prihodnje še bolj raziskana.

=== Nadja Dolničar: Interferonsko spodbujeno izločanje živega patogena Cryptococcus neoformans iz makrofagov kot posledica virusne okužbe ===
V življenju so ljudje pogosto izpostavljeni več okužbam hkrati. Ker so le-te pogosto proučevane posamično, ostaja njihovo vzajemno delovanje dokaj nepoznano. Zato so se znanstveniki odločili raziskati, kako na odziv prirojenega imunskega sistema na glivo Cryptococcus neoformans vpliva sočasna virusna okužba. Kljub temu da makrofagi ohranijo normalno sposobnost fagocitoze in onesposobljanja mikroba, vseeno izražajo izjemno povečano nagnjenost k vomocitozi. To je mehanizem pri katerem makrofag izloči glivo, ji pri tem ne škodi, sam pa tudi ne razpade (non-lytic extrusion). Aktivacija vomocitoze je sprožena s strani interferonov tipa 1, protivirusnih molekul, ki predstavljajo eno od družin citokinov, majhno molekulskih proteinov, ki skrbijo za komunikacijo med celicami in njihovo aktivacijo ob odzivu prirojenega imunskega sistema na patogeni mikrob oz. virus. Interferoni z vezavo na interferonske receptorje na makrofagu signalno sprožijo izločitev glive iz makrofaga. Tako lahko sklepamo, da ta do sedaj neopazovan pojav predstavlja nekakšno hierarhijo, ki ji celice imunskega sistema sledijo oz. »reprioritizacijo«, pri kateri lahko celice imunskega sistem spreminjajo frekvenco izločanja prvotnega patogena glede na stopnjo ogroženosti s strani sekundarne okužbe. Tako makrofage na nek način sprostijo in jim omogočijo boj proti sekundarni virusni okužbi. Ta pojav pa je lahko za organizem tako ugoden kot tudi usoden, odvisno od okoliščin.

=== Tinkara Božič: Atomske zgradbe zaprtih in odprtih protonskih kanalčkov BM2 razkrivajo transportni mehanizem gripe tipa B ===
Poznamo tri različne viruse, ki povzročajo gripo (influenco) – to so virusi A, B in C; vsak od njih pa vsebuje drugačno verzijo proteina M2 (AM2, BM2, CM2). M2 je ionsko reguliran kanalček, ki prenaša protone skozi zunanjo virusno membrano (ali lipidno ovojnico). Kisel pH aktivira protonski kanalček BM2 gipe tipa B, da se sproži odvijanje virusa. Za razliko od proteina AM2, ki povzroča gipo tipa A in usmerja protone samo v notranjost kanalčka, sprošča BM2 protone navznoter in navzven. Z uporabo jedrske magnetne resonančne (NMR) spektroskopije v trdnem stanju so znanstveniki pokazali strukture transmembranske domene odprtega in zaprtega kanalčka BM2 v fosfolipidnem okolju. Pri aktivaciji transmembranske vijačnice povečajo kot nagnjenosti za 6 ° in svoj povprečen premer za 2,1 Å. Ob tem pridobi BM2 gibanje za aktivacijo, podobno škarjam, ki je zelo drugačno od gibanja AM2 – ta se izmenično odpira in zapira in tako protonom omogoči vstop. Prav zaradi simetričnega gibanja, podobnega škarjam, se lahko protoni skozi kanalček BM2 premikajo v obe smeri, skozi AM2 pa samo v eno smer. Protonskoselektiven histidin in obramben triptofan v odprtem kanalčku BM2 se reorientirata podobno kot v AM2, ob čemer so znanstveniki ugotovili, da je dinamika stranskih verig ključna za prenos protonov po kanalčku.

=== Tina Javeršek: Vpliv trans maščobnih kislin na potek apoptoze preko mitohondrijske pozitivne povratne zanke JNK-Sab-ROS ===
Trans maščobne kisline sodijo v skupino nenasičenih maščobnih kislin, ki imajo v svoji strukturi eno ali več dvojnih vezi. Linolelaidinska in elaidinska kislina, ki sta najbolj pogosti trans maščobni kislini v prehrani, nastajata med industrijsko delno hidrogenacijo rastlinskih in ribjih olj. Pri raziskovanju vpliva elaidinske kisline na potek apoptoze so uporabili sredstvo doksorubicin, ki povzroča okvare DNK. Zdravljenje celic z doksorubicinim, ki so bila pred tem izpostavljena elaidinski kislini, je zmanjšalo njihovo sposobnost preživetja, medtem ko cis-izomera elaidinske kisline (oleinska kislina) ni imela takšnega učinka. Elaidinska kislina torej služi kot spodbujevalni faktor pri apoptozi tako, da olajša vzajemno povečanje mitohondrijske generacije ROS in aktivacijo JNK, ki jo posreduje Sab (mitohondrijska pozitivna povratna zanka JNK-Sab-ROS). ROS (reactive oxygen species) so mitohondrijske reaktivne kisikove zvrsti, nastanejo pa kot stranski produkti mitohondrijske presnove. Kopičenje ter zvrsti je potencialno škodljivo, saj visoke ravni le teh povzročajo okvare DNK. Doksorubicin sproži generacijo ROS in poznejšo aktivacijo ASK1-p38/ JNK, kar vodi v celično smrt. Zmanjšanje mitohondrijske ROS je zaviral potek apoptoze ter nastanek generacije ROS samo v prisotnosti elaidinske kisline, vendar ne, ko te ni bilo. To je bil dokaz, da imajo trans maščobne kisline potencial, da sprožijo aktivacijo pozitivne povratne zanke JNK-Sab-ROS, ki pa se ne aktivira v pogojih brez trans maščob. Te maščobne kisline, predvsem industrijske, povečajo tveganje za razvoj in napredovanje različnih obolenj, kot so vnetja, metabolični sindrom, nevrodegenerativne motnje in tudi kardiovaskularne bolezni.

=== Vid Dobrovoljc: Povratni vsadek za dolgotrajno inkapsulacijo in preživetje terapevtskih celic v njem ===
Celična terapija je način zdravljenja, pri katerem bolniku presadijo terapevtske celice, ki bodisi nadomeščajo ali pa zdravijo bolne celice. Glavni problem celičnih terapij je imunski odziv. V tej raziskavi se posvečajo obrambi terapevtskih celic z uporabo polimernih makroinkapsulacijskih naprav. Napravo za makroinkapsulacijo, ki so jo uporabili, v grobem sestavlja celični rezervoar, pritrjen na porozno polimerno membrano PCTE. Naloga naprave je zaščita terapevtskih celic pred imunskim odzivom. Ta se kaže na dva načina. Prvi je direkten s citokini, drugi pa je posreden z nastankom fibrotične kapsule. Za zavrtje prvega potrebujemo membrano s porami ustrezne velikosti, ki morajo preprečevati prehod določenim komponentam imunskega sistema, po drugi strani pa morajo omogočati prehod hranilom. V raziskavi so določili, da so najustreznejše pore velikosti med 0,8 µm in 0,4 µm. Za zmanjšanje drugega načina pa je pomembno, da je naprava čim bolj biokompatibilna. To so dosegli z razvojem nove prevleke THPT. Uporabnost novih naprav so preizkusili še na več načinov. Naprave so se na preizkusih dobro obnesle, saj so terapevtske celice v napravah funkcionirale čez celoten 130-dnevni test. Diabetične miši, ki so jim z uporabo naprav presadili langerhansove otočke, pa so skozi daljša obdobja kazale glikemično sliko zdravih miši.

=== Polona Leban: Zakaj so motnje avtističnega spektra (ASD) pogostejše pri dečkih kot pri deklicah? ===
Vzrok za to še ni čisto jasen. Vsaka celica našega telesa vsebuje dva spolna kromosoma, pri ženski populaciji XX, pri moški pa XY kromosoma. Primerjali so dva gena NLGN4, enega na X in enega na Y kromosomu, ki sta ključna za vzpostavitev in delovanje sinaps. Do nedavnega so domnevali, da sta gena NLGN4X in NLGN4Y, ki kodirata proteine, delovala v enaki meri v nevronih. Izkazalo se je, da je dinamika proteina NLGN4Y v možganskih celicah manjša, zato ni sposoben vzdrževati sinapse, kar oslabi prehajanje signalov med nevroni. Mutacije na NLGN4X lahko vodijo do hudih učinkov na delovanje možganov, medtem ko vloga NLGN4Y še ni čisto jasna, a naj bi bile težave s slednjim posledica ene same aminokisline. Med drugim so odkrili, da je regija, ki obdaja to aminokislino v NLGN4X občutljiva na mutacije. Ko se na enem od genov NLGN4X pojavi mutacija, lahko drugi gen pri ženskah temu kompenzira. NLGN4Y pri moških pa ne more prevzeti funkcije mutiranega gena, ker se že sam funkcionalno razlikuje. Nezmožnost kompenzacije nam pomaga razložiti, zakaj je ASD pri moških, ki imajo samo en X kromosom, pogostejša. Podrobnejše znanje teh proteinov bi zdravnikom, ki zdravijo bolnike z mutacijami na NLGN4X, pomagalo bolje razumeti njihove simptome.

=== Stefanija Ivanova: Perceived healthiness of food items and the trafﬁc light front of pack nutrition labelling: choice-based conjoint analysis and cross-sectional survey ===
Perceptions of healthy eating are thought to be an important determinant, where food items are often categorised as healthy or unhealthy.Traffic light labelling was introduced to aid the selection of healthier choices with a simple red, amber green colour coding system. In this study, the goal was to find out whether it was fat, saturated fat, sugar or salt people most wanted to avoid and see whether the traffic light labelling was influencing this decision. Foods with a high sugar content and products flagged with a red label were by far perceived to be the worst for health . These behaviours highlight possible unintended consequences of the effect of the single-nutrient approach on perceptions of health. Focusing on reducing the intake of one nutrient might drive people to neglect the overall quality of the food, which gives the food industry the chance to modify other ingredients, regardless of their healthiness, at the same time as keeping the level of the focused nutrient in the recommended quantities. Despite a lack of knowledge about the daily intake recommendations, decisions made by participants concerning the healthfulness of food products were signiﬁcantly inﬂuenced by sugar content. TLL appears to guide consumer beliefs in the absence of deep knowledge. Taking all of the factors that would affect the process of reading nutrition labelling into consideration would increase the effectiveness of the use of TLL. This includes individual motivation and interest in health, educational level, socioeconomic status and other critical factors.

=== Sara Jerič:Plenitev morskih virusov s strani negostiteljskih organizmov ===
Morski virusi so najštevilčnejša oblika življenja v morjih in oceanih. S svojimi okužbami močno vplivajo na ravnotežje v morskih ekosistemih in na dinamiko populacij gostiteljskih organizmov. Da bi torej lahko razumeli, kako se to ravnotežje ohranja, je pomembno poznati tudi kako se v naravi zmanjša številčnost virusov. Eden izmed bioloških načinov so negostiteljski organizmi. Virusom namreč predstavljajo oviro oz. nevarnost. V raziskavi so se odločili pogledati, kako negostiteljski organizmi z vmešavanjem v prenos parazita v sistem parazit – gostitelj vplivajo na zmanjšanje številčnosti virusov. Za model virusnega sistema so uporabili fitoplanktonski virus PgV-07T. S prvim eksperimentom so testirali 10 morskih negostiteljskih organizmov. Najslabše so številčnost virusa zmanjšali vitičnjaki, ceponožci in školjke, najboljše pa krpaste spužve. Slednje so zato raziskovali še naprej v drugem eksperimentu, kjer so gledali spužvino odstranjevanje virusov v daljšem časovnem obdobju. Spužve so se izkazale kot izredno učinkovit odstranjevalec virusov. Rezultati so pokazali, da so negostiteljski organizmi učinkoviti v zmanjševanju številčnosti virusov z vmešavanjem v prenos. Pri tem so najverjetje pomembni tudi drugi okoljski faktorji, katerih učinke še ne poznamo. Na ohranjanje morske biodiverzitete imajo torej poleg virusov, velik vpliv tudi negostiteljski organizmi.

=== Ana Pervanja: Biološki material za sintezo umetnih žilnih struktur ===
Kompleks ELK1-GO je sestavljen iz proteina ELK1, ki je eden od potencialnih proteinov za sintezo bioloških materialov, ker je zaradi kratkih, ponavljajočih se zaporedij aminokislin neurejen in ker se mu ob spreminjanju temperature reverzibilno spreminja tudi struktura. Sestavljajo ga štiri ponovitve motiva VPGIG in ena VPGKG (pozitivno nabita). Druga komponenta biološkega materiala je grafenov oksid (GO), ki ima hidrofobno površino in negativno nabite karboksilne skupine na robovih. Skupaj sestavljata stabilno in temperaturno odporno membrano, ki se je sposobna preurediti v cevaste strukture s premerom do 10 µm. Močne interakcije med molekulama so posledica elektrostatičnih sil in vodikovih vezi med stransko skupino lizina in glavno verigo peptida. Podpira celično rast, ki je primerljiva z rastjo celic na TCP-ju. Membrane ELK1-GO so zaradi stabilnosti, sposobnosti upiranja vodnim tokovom, odpornosti in bioaktivnosti odličen biološki material, ki bi se lahko v prihodnosti uporabljal za sintezo kompleksnega biološkega tkiva, ki bi simuliral delovanje organov (organ-on-a-chip device). Tako bi lahko testirali npr. zdravila in dobili bolj realne podatke kot s testiranjem živali ali testiranjem na celicah.

=== Luka Stanković: Gen cirkadianega ritma oslabi imunsko obrambo pred pljučnico z inhibicijo gibljivosti in fagocitoške funkcije makrofagov ===
Kot posledica rotacije zemlje okoli osi in kroženja okoli sonca so organizmi skozi evolucijo razvili cirkadialne cikle, ki jih uravnavajo kompleksni mehanizmi znotraj vsake celice. To omogoča organizmom opravljanje različnih procesov glede na del dneva, ne da bi prejeli kakršnokoli informacijo iz zunanjega okolja. Te endogene procese v večini nadzoruje proteinski kompleks kodiran z genom '''Bmal1''' . Skozi raziskave je bilo ugotovljeno, da deluje gen v makrofagih kot zavora, saj jih ohranja bolj rigidne. V organizmih, kjer je bil gen v makrogfagih odstranjen so zabeležili drastično povečanje hitrosti in fagocitoze makrofagov na račun spremenjene aktinske strukture. Miši brez gena Bmal1 so se z bakterijsko okužbo s ''S. Pneumoniae'' bistveno bolje spopadale kakor skupina z genom. Vsi te ugotovitve odpirajo možnosti za številne nove raziskave v smeri zdravljenja bakterijskih okužb na podlagi zmanjšanja funkcije gena Bmal1 v celicah imunskega sistema.

Konec klepeta
Napiši sporočilo ...

TBK2020-seminar

2020-04-16T11:26:20Z

Luka Stanković: /* Seznam seminarjev */

= Temelji biokemije- seminar =

Seminarje vodi prof. dr. Brigita Lenarčič. Seminarji so obvezni.

Ocena seminarjev (6-10) predstavlja enako število odstotkov, ki se prišteje h končni pisni oceni izpita.
Stran na strežniku s seminarskimi nalogami je zaščitena.
Uporabniško ime je: tbk, password pa: samozame## "##" sta dve številki, ki ju izveste na predavanjih.
Tudi za urejanje Wiki strani potrebujete geslo, ki se od zgornjega razlikuje. Postopek pridobitve Wiki uporabniškega imena in gesla je opisan [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Main_Page tukaj].

== Seznam seminarjev ==

{| {{table}}
{| border="1" cellspacing="0" style="border:#c9c9c9 1px solid; margin: 1em 1em 1em 0; border-collapse: collapse;"
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Ime in priimek'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Naslov seminarja'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Povezava'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Rok za oddajo'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Rok za recenzijo'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Datum predstavitve'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 1'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 2'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 3'''
|-
| Anna Scott ||[[TBK2020_Povzetki_seminarjev#Anna_Scott:_Notting_Hill|Moj naslov v slovenščini, link pa kaže na povzetek]]||[https://www.sciencedaily.com/releases/2019/02/190214100038.htm povezava] || 28.10. || 05.11. || 07.11. || r1 || r2 || r3
|-
| Lenka Stanković || Optimizirano antiangiogeno reprogramiranje tumorskega mikrookolja potencira imunoterapijo CD40 || https://www.pnas.org/content/117/1/541 || 24.02. || 27.02. || 03.03. || Špela Došler || Zala Perko || Marija Dujaković
|-
| Ena Kartal || Kako celično staranje vodi do nevrodegeneracije || https://www.sciencedaily.com/releases/2020/01/200129174540.htm || 24.02. || 27.02. || 03.03. || Jasmina Bešić || Ana Žagar || Neža Leskovar
|-
| Ema Kovačič ||Izpostavljenost ploda materinski mikrobioti || https://insight.jci.org/articles/view/127806 || 24.02. || 27.02. || 03.03. || Nikola Janakievski || Karin Rak || Luka Hafner
|-
| Nika Tomsič || Pomembnost in delovanje sladkornega prenašalca PfHT1 v parazitu malarije || 24.02. || 27.02. || 03.03. || Maja Deutsch || Jakob Tomšič || Marigona Beqiraj
|-
| Sara Golob ||Vpliv virusa Herpesa simpleksa tipa 1 na razvoj Alzheimerjeve bolezni || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/10/181019100702.htm || 24.02. || 27.02. || 03.03. || Manca Pirc || Maja Kobal || Rebeka Jerina
|-
| Zala Puklavec ||Globoko učenje vodi do odkritja novih antibiotikov || https://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-8674(20)30102-1?_returnURL=https%3A%2F%2Flinkinghub.elsevier.com%2Fretrieve%2Fpii%2FS0092867420301021%3Fshowall%3Dtrue || 04.03. || 07.03. || 10.03. || Nika Bedrač || Špela Došler || Zala Perko
|-
| Martin Stanonik || De novo pojavitev adapterskih membranskih proteinov iz timinsko bogatih genskih sekvenc || https://www.sciencedaily.com/releases/2020/02/200218104740.htm || 04.03. || 07.03. || 10.03. || Ivana Trifunovska || Jasmina Bešić || Ana Žagar
|-
| Klara Kočman || Novi koronavirus SARS-CoV-2 in SARS-CoV || https://www.sciencedaily.com/releases/2020/01/200131114755.htm || 04.03. || 07.03. || 10.03. || Bor Krajnik || Nikola Janakievski || Karin Rak
|-
| Maša Mencigar || Vpliv apoptotskih celic na imunski sistem || https://www.sciencedaily.com/releases/2020/01/200108123137.htm || 04.03. || 07.03. || 10.03. || Erik Putar || Maja Deutsch || Jakob Tomšič
|-
| Nevena Ješić || Nepravilne komunikacije med celicami vodijo v levkemijo || https://www.sciencedaily.com/releases/2020/02/200206144824.htm || 04.03. || 07.03. || 10.03. || Ela Bizjak || Manca Pirc || Maja Kobal
|-
| Nika Perko ||Enkapsulacija eteričnega olja pomarančevca v celice gliv kvasovk ||https://parasitesandvectors.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13071-019-3870-4 || 10.03. || 13.03. || 24.03. || Lenka Stanković || Nika Bedrač || Špela Došler
|-
| Timotej Sotošek || Protivirusni remdesivir potentno inhibira RNA-odvisno RNA polimerazo od Srednje vzhodni respiratorni sindrome koronavirusa|| || 10.03. || 13.03. || 24.03. || Ena Kartal || Ivana Trifunovska || Jasmina Bešić
|-
| Hana Glavnik || Kako paraziti malarije zaznajo imunske celice in se pred njimi zaščitijo || https://www.sciencedaily.com/releases/2020/02/200218124346.htm || 10.03. || 13.03. || 24.03. || Ema Kovačič || Bor Krajnik || Nikola Janakievski
|-
| Maja Deutsch || Globalni kemični učinki mikrobioma vključujejo nove konjugacije žolčne kisline || https://www.nature.com/articles/s41586-020-2047-9 || 17.03. || 20.03. || 24.03. || Martin Stanonik || Ena Kartal || Ivana Trifunovska
|-
| Eva Ratajc || Z-DNA vezavni protein 1 kot ključni dejavnik kontrolirane replikacije virusa Zahodnega Nila in virusa zika || https://www.readcube.com/articles/10.3389/fmicb.2019.02089 || 17.03. || 20.03. || 24.03. || Anja Moškrič || Ema Kovačič || Bor Krajnik
|-
| Lana Kores || Preučevanje ionskega kanalčka TRPA1 in bolečine s toksinom avstralskega škorpijona || https://www.sciencedaily.com/releases/2019/08/190822113400.htm || 17.03. || 20.03. || 24.03. || Maša Mencigar || Nika Tomsič || Erik Putar
|-
| Jan Kogovšek || Inhibitor plazmepsina zmoti več stanj življenjskega cikla parazita malarije || https://www.sciencedaily.com/releases/2020/03/200304141514.htm || 24.03. || 27.03. || 31.03. || Nika Perko || Zala Puklavec || Lenka Stanković
|-
| Nina Žgajnar || In vitro samostojno podvojevanje in policistronsko izražanje večjih sintetičnih genomov || https://www.sciencedaily.com/releases/2020/02/200218130501.htm || 24.03. || 27.03. || 31.03. || Timotej Sotošek || Martin Stanonik || Ena Kartal
|-
| Erika Rihter || Mikrobiomska analiza krvi in tkiv kot pristop k diagnosticiranju rakavih obolenj || https://www.sciencedaily.com/releases/2020/03/200311123302.htm || 24.03. || 27.03. || 31.03. || Hana Glavnik || Anja Moškrič || Ema Kovačič
|-
| Luka Šegota || Sulfolipid-1 je sprožilec kašlja, ki prenaša tuberkulozo ||https://www.sciencedaily.com/releases/2020/03/200306183349.htm || 24.03. || 27.03. || 31.03. || Klara Kočman || Maša Mencigar || Nika Tomsič
|-
| Eva Vene ||Nevtralizacija denge v komarjih, ki izražajo načrtovano protitelo || https://www.sciencedaily.com/releases/2020/01/200116141710.htm || 24.03. || 27.03. || 31.03. || Gaja Osojnik || Nevena Ješić || Sara Golob
|-
| Ajda Beltram || Identifikacija potencialnih komponent cepiva proti SARS-CoV-2 na podlagi imunoloških raziskav SARS-CoV || https://www.sciencedaily.com/releases/2020/02/200226091227.htm|| 31.03. || 03.04. || 07.04. || Aleksandra Pajović || Nika Perko || Zala Puklavec
|-
| Jan Trebušak ||Vbod klopa vrste Amblyomma americanum sproži proizvodnjo IgE in preobčutljivost preko celic T CD4+ in od MyD88 odvisnih poti||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/08/190820130938.htm|| 31.03. || 03.04. || 07.04. || Aljaž Simonič || Timotej Sotošek || Martin Stanonik
|-
| Jan Bregar || Prehodno neintegrativno izražanje reprogramirnih faktorjev v jedru spodbuja večplastno izboljšanje starih človeških celic || https://www.sciencedaily.com/releases/2020/03/200324090007.htm || 31.03. || 03.04. || 07.04. || Eva Ratajc || Hana Glavnik || Anja Moškrič
|-
| Gregor Strniša || Vpliv genoma okroglega gobija na njegovo invazivnost || https://www.sciencedaily.com/releases/2020/02/200211103721.htm || 31.03. || 03.04. || 07.04. || Lana Kores || Klara Kočman || Maša Mencigar
|-
| Petra Pahor || || || 31.03. || 03.04. || 07.04. || Sara Borišek || Gaja Osojnik || Nevena Ješić
|-
| Nadja Dolničar ||Interferonsko spodbujeno izločanje živega patogena Cryptococcus neoformans iz makrofagov kot posledica virusne okužbe ||https://journals.plos.org/plospathogens/article?id=10.1371/journal.ppat.1008240 || 08.04. || 11.04. || 14.04. || Jan Kogovšek || Aleksandra Pajović || Nika Perko
|-
| Tina Javeršek ||Vpliv trans maščobnih kislin na potek apoptoze preko mitohondrijske pozitivne povratne zanke JNK-Sab-ROS || https://www.nature.com/articles/s41598-020-59636-6 || 08.04. || 11.04. || 14.04. || Nina Žgajnar || Aljaž Simonič || Timotej Sotošek
|-
| Vid Dobrovoljc ||Povratni vsadek za dolgotrajno inkapsulacijo in preživetje terapevtskih celic v njem||https://www.sciencedaily.com/releases/2020/03/200330152124.htm || 08.04. || 11.04. || 14.04. || Erika Rihter || Eva Ratajc || Hana Glavnik
|-
| Tinkara Božič ||Atomske strukture zaprtega in odprtega protonskega kanalčka M2 razkrivajo transportni mehanizem gripe tipa B ||https://www.sciencedaily.com/releases/2020/02/200203141435.htm || 08.04. || 11.04. || 14.04. || Luka Šegota || Lana Kores || Klara Kočman
|-
| Kostadin Mitkov ||Heat shock factor 2 helps the cells to maintain cell adhesion and protect themselves against stress ||https://www.sciencedaily.com/releases/2020/01/200116112548.htm || 08.04. || 11.04. || 14.04. || Eva Vene || Sara Borišek || Gaja Osojnik
|-
| Sara Jerič ||Plenitev morskih virusov s strani negostiteljskih organizmov || https://www.sciencedaily.com/releases/2020/03/200327113658.htm || 15.04. || 18.04. || 21.04. || Ajda Beltram || Jan Kogovšek || Aleksandra Pajović
|-
| Polona Leban ||Zakaj so motnje avtističnega spektra (ASD) pogostejše pri dečkih kot pri deklicah? ||https://www.sciencedaily.com/releases/2020/04/200402134622.htm || 15.04. || 18.04. || 21.04. || Jan Trebušak || Nina Žgajnar || Aljaž Simonič
|-
| Stefanija Ivanova || Perceived healthiness of food items and the traffic light front of pack nutrition labelling: choice-based conjoint analysis and cross-sectional survey|| https://www.sciencedaily.com/releases/2020/02/200228102257.htm || 15.04. || 18.04. || 21.04. || Jan Bregar || Erika Rihter || Eva Ratajc
|-
| Luka Stanković || Odstranitev gena cirkadianega cikla ščiti miši pred pljučnico || https://www.sciencedaily.com/releases/2020/01/200106123428.htm || 15.04. || 18.04. || 21.04. || Gregor Strniša || Luka Šegota || Lana Kores
|-
| Ana Pervanja || Biomaterial za sintezo umetnih žilnih struktur || https://www.sciencedaily.com/releases/2020/03/200304141557.htm || 15.04. || 18.04. || 21.04. || Petra Pahor || Eva Vene || Sara Borišek
|-
| Marija Dujaković || Beljakovine v krvi ščitijo pred poškodbami nevronov po možganski krvavitvi || https://www.sciencedaily.com/releases/2019/10/191022174405.htm || 29.04. || 02.05. || 05.05. || Nadja Dolničar || Ajda Beltram || Jan Kogovšek
|-
| Neža Leskovar || || || 29.04. || 02.05. || 05.05. || Tina Javeršek || Jan Trebušak || Nina Žgajnar
|-
| Luka Hafner || || || 29.04. || 02.05. || 05.05. || Vid Dobrovoljc || Jan Bregar || Erika Rihter
|-
| Anja Moškrič || Povezava med infekcijo s temperiranimi bakteriofagi in izgubo sistema CRISPR - Cas tipa I|| https://www.nature.com/articles/s41586-020-1936-2 || 29.04. || 02.05. || 05.05. || Tinkara Božič || Gregor Strniša || Luka Šegota
|-
| Rebeka Jerina || || || 29.04. || 02.05. || 05.05. || Kostadin Mitkov || Petra Pahor || Eva Vene
|-
| Zala Perko || Regulacija s staranjem povezanih patoloških stanj z acetilacijo proteina NLRP3 || https://www.sciencedaily.com/releases/2020/02/200206144837.htm || 06.05. || 09.05. || 12.05. || Sara Jerič || Nadja Dolničar || Ajda Beltram
|-
| Ana Žagar || || || 06.05. || 09.05. || 12.05. || Polona Leban || Tina Javeršek || Jan Trebušak
|-
| Karin Rak || || || 06.05. || 09.05. || 12.05. || Stefanija Ivanova || Vid Dobrovoljc || Jan Bregar
|-
| Jakob Tomšič || Vpliv BPA in njegovega analoga BPS na placento in razvijajoče se možgane ||https://www.sciencedaily.com/releases/2020/02/200218182202.htm || 06.05. || 09.05. || 12.05. || Luka Stanković || Tinkara Božič || Gregor Strniša
|-
| Maja Kobal || || || 06.05. || 09.05. || 12.05. || Ana Pervanja || Kostadin Mitkov || Petra Pahor
|-
|Erika Rihter || || || 13.05. || 16.05. || 19.05. || Marija Dujaković || Sara Jerič || Nadja Dolničar
|-
| Jasmina Bešić || Kako matične celice popravijo škodo zaradi srčnih napadov || https://www.sciencedaily.com/releases/2020/03/200313112144.htm || 13.05. || 16.05. || 19.05. || Neža Leskovar || Polona Leban || Tina Javeršek
|-
| Nikola Janakievski || || || 13.05. || 16.05. || 19.05. || Luka Hafner || Stefanija Ivanova || Vid Dobrovoljc
|-
| Aljaž Simonič || || || 13.05. || 16.05. || 19.05. || Marigona Beqiraj || Luka Stanković || Tinkara Božič
|-
| Manca Pirc || || || 13.05. || 16.05. || 19.05. || Rebeka Jerina || Ana Pervanja || Kostadin Mitkov
|-
| Nika Bedrač || Nižji vnos žveplo vsebujočih amino kislin niža tveganje za razvoj kardiometaboličnih bolezni || https://www.sciencedaily.com/releases/2020/02/200203141501.htm || 20.05. || 23.05. || 26.05. || Zala Perko || Marija Dujaković || Sara Jerič
|-
| Ivana Trifunovska || || || 20.05. || 23.05. || 26.05. || Ana Žagar || Neža Leskovar || Polona Leban
|-
| Bor Krajnik || || || 20.05. || 23.05. || 26.05. || Karin Rak || Luka Hafner || Stefanija Ivanova
|-
| Erik Putar || || || 20.05. || 23.05. || 26.05. || Jakob Tomšič || Marigona Beqiraj || Luka Stanković
|-
| Ela Bizjak || || || 20.05. || 23.05. || 26.05. || Maja Kobal || Rebeka Jerina || Ana Pervanja
|}

==Naloga==
* samostojno pripraviti seminar, katerega tema je novica iz področja biokemije na portalu [http://www.sciencedaily.com ScienceDaily], ki je bila objavljena kasneje kot 1. avgusta 2018. Osnova za seminar naj bo znanstveni članek, ki je podlaga za to novico. Poleg tega članka za seminar uporabite še najmanj pet drugih virov, od teh vsaj še dva druga znanstvena članka, ki se navezujeta na to vsebino.
* članke na temo lahko iščete [https://scholar.google.com/ z Google učenjakom].
* naslov izbrane teme in povezavo do novice vpišite v tabelo seminarjev takoj ko ste si izbrali temo, najkasneje pa en teden pred rokom za oddajo
* [[TBK2020 Povzetki seminarjev|Povzetek seminarja]] opišete na wikiju v približno 200 besedah - najkasneje do dne, ko morate oddati seminar recenzentom.
* Povezavo do povzetka vnesete v tabelo seminarjev tekočega letnika.
* Seminar pripravite v obliki seminarske naloge (pisava Cambria, font 11, enojni razmak, 2,5 cm robovi; tekst naj obsega okoli 1000 besed), vsebuje naj 1-2 sliki. Slika mora imeti legendo in v besedilu mora biti na ustreznem mestu sklic na sliko. Vse uporabljene vire citirajte v tekstu, kot npr. (Nobel, 2010), na koncu pa navedite točen seznam literature, kot je opisano spodaj!
*Celotni seminar naj obsega 2 strani A4 formata (po možnosti dvostransko tiskanje).
* Seminar oddajte do datuma oddaje, ki je naveden v tabeli v elektronski obliki z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/tbk/poslji/ tega obrazca].
* vsi seminarji so v elektronski obliki dostopni [http://bio.ijs.si/~zajec/tbk/poslji//bioseminar/ tukaj].
* Recenzenti do dneva določenega v tabeli določijo popravke in podajo oceno pisnega dela, v predpisanem formatu elektronskega obrazca na internetu.
* Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Za predstavitev je na voljo 10 minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni. Prvi recenzent vodi predstavitve in razpravo ter skrbi za to, da vse poteka v zastavljenih časovnih okvirih.
* Predstavitvi sledi razprava do 5 minut. Sledijo vprašanja prisotnih, recenzenti postavijo vsak vsaj dve vprašanji in na koncu podajo oceno predstavitve.
* En dan pred predstavitvijo na strežnik oddajte tudi končno verzijo. Na dan predstavitve morate oddati tudi končno (popravljeno) in natisnjeno verzijo seminarja v enem izvodu.
* Seminarska naloga in povzetek na wikiju morajo biti v slovenskem jeziku!

==Imena datotek==
Prosim vas, da vse datoteke, ki jih pošiljate poimenujete po spodnjih pravilih. Ne uporabljajte ČŽŠčžš!
Poslati morate naslednje datoteke:
* TBK_2020_Priimek_Ime.doc(x) za seminar, npr. TBK_2020_Guncar_Gregor.docx
* TBK_2020_Priimek_ime_final.doc(x) za končno verzijo seminarja
* TBK_2020_Priimek_Ime_rec_Priimek2.doc(x) za recenzijo, kjer je Priimek2 priimek recenzenta, npr. TBK_2020_Guncar_Gregor_rec_Scott.docx (če se pišete Scott in odajate recenzijo za seminar, ki ga je napisal Gunčar)
* TBK_2020_Priimek_Ime.ppt(x) za prezentacijo, npr TBK_2020_Guncar_Gregor.pptx
* TBK_2020_Priimek_Ime_clanek.pdf za datoteko PDF, ki vsebuje izvirni članek, npr. TBK_2020_Guncar_Gregor_clanek.pdf

==Ocenjevanje seminarjev==
Recenzenti ocenijo seminar tako, da izpolnijo [[https://docs.google.com/forms/d/1Hdg2OHCyG24qwLTnFt09yZTng46RIwaIiUqnKOdsJxQ/viewform recenzentsko poročilo]] na spletu.

== Mnenje o predstavitvi ==
Vsak posameznik '''mora''' oceniti seminar tako, da odda svoje [https://docs.google.com/forms/d/1VvE-jaKikfiDO5Gdybqgp9mf_0uJZfBbIK8PLXKDaS0/viewform mnenje] najkasneje v enem tednu po predstavitvi. Kdor na seminarju ni bil prisoten, mnenja '''ne sme''' oddati.

==Urejanje spletnih strani na wikiju==
Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''

==Faktor vpliva==
Faktor vpliva (angl. impact factor) neke revije pove, kolikokrat so bili v poprečju citirani članki v tej reviji v dveh letih skupaj pred objavo tega faktorja. Faktorje vpliva za posamezno revijo lahko najdete v [http://www.cobiss.si/scripts/cobiss?command=CONNECT&base=JCR COBISS-u]. V polje "Naslov revije" vnesite ime revije za katero želite izvedeti faktor vpliva in pritisnite na gumb POIŠČI. V skrajnem desnem stolpcu se bodo izpisali faktorji vpliva za revije, ki ustrezajo vašim iskalnim kriterijem. Zadetkov za posamezno revijo je več zato, ker so navedeni faktorji vpliva za posamezno leto. Za tekoče leto faktorji vpliva še niso objavljeni, zato se orientirajte po faktorjih vpliva zadnjih par let. Če faktorja vpliva za vašo izbrano revijo ne najdete v bazi COBISS, potem izberite članek iz kakšne druge revije.

==Citiranje virov==Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se v seminarju držite ene same. Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati. '''Citiranje knjig:''' Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica. Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN. Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005. Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4. Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.). '''Citiranje člankov:''' Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani. Lartigue C. ''et al''. Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, letn. 317, str. 632-638.Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole: Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani. Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.Revija Science uporablja skrajšani zapis: C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007) V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne). '''Citiranje spletnih virov:''' Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.