https://wiki.fkkt.uni-lj.si/api.php?action=feedcontributions&feedformat=atom&user=Luka.gnidovec 2026-05-27T11:00:12Z User contributions MediaWiki 1.45.3 https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=PROSTATUS:_Diagnostika_raka_prostate&diff=19324 2021-05-19T09:48:32Z

<p>Luka.gnidovec: /* REZULTATI */</p> <hr /> <div>PROSTATUS je iGEM projekt iz leta 2020, ki je osvojil nominacijo v kategoriji Diagnostika med podiplomskimi študenti. Pripravili so ga študenti Univerze južne Danske. <br /> [https://2020.igem.org/Team:SDU-Denmark Spletna stran projekta:]<br /> <br /> ==UVOD==<br /> Rak prostate je eden najpogostejših rakov, ki se razvije pri enem izmed osmih moških. Število diagnosticiranih primerov se povečuje, k čemur verjetno pripomore povišan screening koncentracije PSA (prostate specific antigen) v krvi med moškimi. Ta test pa je precej nezanesljiv, z 31 % verjetnostjo lažnega pozitivnega rezultata in 42 % verjetnostjo lažnega negativnega rezultata. [1] Nivo PSA v krvi se lahko poviša iz številnih drugih razlogov (vnetje urinarnega trakta, ejakulacija, zdravila…). Poleg tega preverjanju krvne slike sledi še neprijeten in invaziven fizičen pregled. Vsekakor ima trenutni postopek screeninga raka prostate veliko potenciala za izboljšave.<br /> <br /> PROSTATUS je študentski projekt skupine iz Univerze južne Danske, s katerim so sodelovali na iGEM-u 2020 v kategoriji podiplomskih študentov. V projektu so razvili neinvazivno metodo, pri kateri zaznavamo tri RNA biomarkerje v urinu (TMPRSS2:ERG, AMACR, PCA3) in dva SNP-ja (rs6983267, rs16901979), ki povečata verjetnost razvoja raka prostate, v DNA v slini. Test deluje na podlagi sistema CRISPR-Cas13a v primeru zaznavanja RNA biomarkerjev in sistema CRISPR-Cas12a v primeru zaznavanja SNP-jev.<br /> <br /> ==OPIS PROJEKTA==<br /> ===PRINCIP DELOVANJA SISTEMA===<br /> Skupina je v projektu uporabila dve metodi, ki temeljita na delovanju proteinov družine Cas. <br /> ====SHERLOCK====<br /> SHERLOCK (Specific High-sensitivity Enzymatic Reporter unLOCKinkg) je metoda, ki s pomočjo encima Cas13a zaznava ssRNA v vzorcu. V Cas13a je vezana sgRNA (single guide RNA), ki zazna komplementarno tarčo v vzorcu. Ko pride do hibridizacije s tarčo, se Cas13a aktivira in cepi tudi netarčno RNA v vzorcu. Na ta način lahko pride do cepitve reporterske RNA. [2]<br /> <br /> ====DETECTR====<br /> DETECTR (The DNA Edonuclease Targeted CRISPR Trans Reporter system) je metoda, ki uporablja Cas12a in zaznava tarčno ssDNA v vzorcu, ob prepoznavi tarče pa pridobi nespecifično endonukleazno aktivnost in cepi reportersko ssDNA. [2]<br /> <br /> ===POTEK OBLIKOVANJA PROJEKTA===<br /> ====Kloniranje==== <br /> Za implementacijo teh dveh metod so morali najprej izraziti dva Cas encima ter pridobiti različne sgRNA, ki se vežejo v encima. <br /> Encime so izražali v ''E. coli''. Uporabili so gena cas13a iz bakterije ''Leptotrichia wadei'' in cas12a iz ''Acidaminococcus'' sp. Z orodjem podjetja IDT so optimizirali rabo kodonov ter nato v konstrukt dodali vse potrebne komponente za izražanje proteinov (IPTG inducibilni promotor, RBS, terminator ter oznaki SUMO in His na N-koncu). Naročili so sintetični gen za cas13a, ki so mu nato dodali še restrikcijska mesta za EcoRI in SpeI. Gen cas12a, vstavljen v plazmid, so pridobili od raziskovalne skupine iz Univerze južne Danske. S pomnoževanjem s PCR so temu genu dodali promotorsko regijo sintetičnega gena cas13a ter mu dodali restrikcijska mesta EcoRI, XbaI, SpeI in PstI. Oba konstrukta so nato klonirali v vektor pSB1C3 in transformirali kompetentne celice E. coli seva ER2256.<br /> <br /> ====Načrtovanje sgRNA====<br /> Nato so dizajnirali sgRNA, ki se veže v Cas proteina in je ključna za prepoznavanje tarče. Za aktivacijo Cas12a je v oddaljenosti največ 21 bp od tarče potreben PAM motiv (TTTV). Poleg tega je za specifično aktivacijo Cas12a pomembno 100 % ujemanje v začetnem delu t. i. prilegajoče regije sgRNA (ang. spacer sequence) medtem ko v bolj oddaljenem območju prilegajoče regije 100 % ujemanje za aktivacijo ni potrebno. Če želimo specifično prepoznati SNP, je torej pomembno, da se ta nahaja v začetni regiji tarče, sicer bi dobili nespecifično aktivacijo in signal, ki ne bi bil odvisen od SNP-ja. Optimalna dolžina prilegajoče regije naj bi bila 21 – 24 nukleotidov. Vse te omejitve je skupina upoštevala pri dizajnu sgRNA za Cas12a. Oblikovali so štiri sgRNA, ki se vežejo na Cas12a in prepoznajo posamezne možne alele (prevladujoč alel in alel, ki poviša možnost za razvoj raka prostate). [3]<br /> <br /> Pri oblikovanju sgRNA za Cas13a so upoštevali optimalno dolžino prilegajoče regije 28-31 nukleotidov, prav tako pa pri sgRNA encima Cas13a velja pravilo o 100 % prileganju začetnega dela prilegajoče regije. Cas13a sicer za prepoznavo tarče ne potrebuje PAM motiva. Skupina je oblikovala tri sgRNA za Cas13a, ki se vežejo na RNA biomarkerje v urinu. [4]<br /> <br /> ====Pomnoževanje z metodo RPA====<br /> Ker obstaja verjetnost, da ta sistem ne bi zaznal zelo nizkih koncentracij RNA biomarkerjev v vzorcu, bi pred detekcijo RNA biomarkerje še namnožili z uporabo metode pomnoževanja z rekombinazo in polimerazo (ang. recombinase polymerase amplification – RPA). Gre za proces, alternativen PCR, ki poteka izotermalno in je zato njegova izvedba precej bolj enostavna. Za pomnožitev RNA bi potrebovali štiri encime, in sicer rekombinazo, ssDNA vezavne proteine (SSB) reverzno transkriptazo in DNA polimerazo. Da bi pridobili še pomnoženo RNA in ne le cDNA, bi uporabili še T7 polimerazo. <br /> <br /> V reakciji reverzna transkriptaza najprej prepiše ssRNA v cDNA. V RNA/DNA hibrid rekombinaza vstavi začetne oligonukleotide, ki so komplementarni RNA tarči. Na smerne začetne oligonukleotide bi dodali še T7 promotor. SSB stabilizirajo odrinjeno ssDNA na mestu vezave oligonukleotida, reverzna transkriptaza pa nato spet prepiše RNA verigo v cDNA. Iz novonastale cDNA z dodanim T7 promotorjem nato nastane RNA transkript, ki je na koncu reakcije prisoten v visoki koncentraciji in ga zlahka zaznamo v vzorcu. V opisu projekta ne omenjajo DNA polimeraze, a vendar bi bila ta potrebna za sintezo druge verige cDNA. Lahko bi uporabili tudi encim, ki lahko deluje kot reverzna transkriptaza in DNA polimeraza. <br /> <br /> Podobno reakcijo bi lahko zasnovali tudi za pomnoževanje DNA fragmentov, ki vsebujejo SNP-je, le da bi v tem primeru potrebovali le DNA polimerazo, ne pa tudi reverzne transkriptaze.<br /> <br /> ====Inhibicija aktivnosti RNaz====<br /> Ker pri zaznavanju RNA uporabljamo RNaze, ki se aktivirajo ob specifičnem signalu, bi ostale RNaze v urinu lahko motile specifično cepitev reporterja. Zato je ključna inaktivacija RNaz v vzorcu. V projektu bi uporabili metodo cepitve RNaz s proteinazo K. Po obdelavi vzorca s proteinazo K bi slednjo inaktivirali s fenilmetilsulfonil fluoridom (PMSF), da ne bi razgradila encimov Cas. <br /> ====Detekcija cepitve reporterja====<br /> Za detekcijo cepitve reporterja s Cas12a in Cas13a bi v projektu uporabili hitri test z lateralnim tokom (ang. lateral flow strip). Ta metoda za vizualizacijo rezultatov uporablja anti-FAM-protitelesa s pripetimi zlatimi nanodelci v kombinaciji s posebnim reporterjem. Reporter prek ssRNA ali ssDNA verige povezuje biotin in fluorescein amidit (FAM). Cepitev reporterja se vizualizira na traku, na katerem sta prisotni dve liniji – testna in kontrolna. Če ne pride do cepitve reporterja, se ob potovanju po traku reporter zaradi vezave biotina ustavi na kontrolni liniji. Če pa pride do cepitve, reporter potuje prek kontrolne linije in rezultat detektiramo na testni liniji prek vezave anti-FAM protitelesa na sekundarno protitelo.<br /> <br /> ==REZULTATI==<br /> Skupina je z nikelj-afinitetno kromatografijo uspešno izolirala encima Cas12a in Cas13a ter z in vitro transkripcijo sintetizirala sgRNA. Skupaj so inkubirali izolirana encima in različne koncentracije sgRNA, nato pa preverili, ali prisotnost tarče v vzorcu vzbudi nespecifično endonukleazno aktivnost Cas12a in Cas13a. <br /> <br /> Pokazali so, da je ob daljših časih inkubacije, višjih koncentracijah sgRNA in prisotnosti tarčne sekvence reporter bolj razgrajen, kar kaže na aktivacijo nespecifične endonukleazne aktivnosti encimov Cas12a in Cas13a. V primeru Cas13a je bilo nekaj reporterske RNA razgrajene tudi v odsotnosti tarčne sekvence, kar bi lahko vodilo v lažno pozitivne rezultate. Zato bi bila v tem delu projekta potrebna optimizacija. <br /> <br /> Sledila je inhibicija RNaz, ki so jo zaznavali s kompletom reagenov podjetja Thermofisher, kjer je kot reporter delovala RNA z vezanim fluoroforom in dušilcem fluorescence. Vzorce sline in urina so inkubirali s proteinazo K in fluorescenco primerjali v vzorcu brez proteinaze. Rezultati so pokazali, da je bila inhibicija RNaz v urinu po triurni inkubaciji boljša kot inhibicija v slini. Po prekonočni inkubaciji je bila tudi inhibicija v slini popolna, torej je metoda uspešna. <br /> <br /> Nato so proteinazo K inhibirali z 1mM PMSF in k tem vzorcem dodali še nekaj nove sline in urina, kjer se nahajajo aktivne RNaze, ter izvedli enako detekcijo kot prej. Pokazali so, da so v vzorcih prisotne aktivne RNaze, torej je bila aktivnost proteinaze K inhibirana.<br /> <br /> Preverili so še možnost uporabe hitrega testa z lateralnim tokom (ang. lateral flow strip) kot metode detekcije. Ugotovili so, da negativni testi dajo signal tako v testni, kot tudi v kontrolni liniji, saj se nekaj reporterja verjetno spontano razgradi ali pa je prisotnega preveč reporterja in odvečna količina potuje prek vezavno zasedene kontrolne linije. V tem primeru je še vedno jasna razlika med pozitivnim in negativnim testom, saj pri pozitivnem dobimo signal le v testni liniji. Vendar bi bila optimizacija testa za bolj nedvoumne rezultate vseeno dobrodošla.<br /> <br /> ==ZAKLJUČEK==<br /> V okviru projekta je skupina razvila postopek za detekcijo poljubnega izbranega biomarkerja v urinu. Pri tem so oblikovali številne enostavne in sestavljene biokocke za proteine Cas in sgRNA, ki so dostopne [https://2020.igem.org/Team:SDU-Denmark/Parts tukaj]. Projekt ima velik potencial za izboljšanje zgodnje diagnostike raka prostate, vendar bi bile potrebne še številne optimizacije. Izboljšati bi bilo treba metodo detekcije (hitri test z lateralnim tokom), da bi bili rezultati bolj nedvoumni, optimizirala bi se lahko tudi izbira biomarkerjev, saj so izbrani v tem projektu primerni predvsem za belsko populacijo. Poleg tega bi bil potreben dizajn embalaže, kjer bi se reakcija izvajala, saj bi le na ta način zagotovili ponovljivost razmer in s tem zanesljivost rezultatov testov.<br /> <br /> ==VIRI==<br /> <br /> [1] Benecchi, L. PSA velocity and PSA slope. Prostate Cancer Prostatic Dis 9, 169–172 (2006). doi:10.1038/sj.pcan.4500866<br /> <br /> [2] Gootenberg JS, Abudayyeh OO, Kellner MJ, Joung J, Collins JJ, Zhang F. Multiplexed and portable nucleic acid detection platform with Cas13, Cas12a, and Csm6. Science. 2018;360(6387):439-44. doi:10.1126/science.aaq0179<br /> <br /> [3] Creutzburg, S. C. A., Wu, W. Y., Mohanraju, P., Swartjes, T., Alkan, F., Gorodkin, J., . . . van der Oost, J. (2020). Good guide, bad guide: spacer sequence-dependent cleavage efficiency of Cas12a. Nucleic Acids Res, 48(6), 3228-3243. doi:10.1093/nar/gkz1240<br /> <br /> [4] Gootenberg JS, Abudayyeh OO, Lee JW, et al. Nucleic acid detection with CRISPR-Cas13a/C2c2. Science. 2017;356(6336):438-442. doi:10.1126/science.aam9321</div>

Luka.gnidovec https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=PROSTATUS:_Diagnostika_raka_prostate&diff=19323 2021-05-19T09:46:01Z

<p>Luka.gnidovec: /* Detekcija cepitve reporterja */</p> <hr /> <div>PROSTATUS je iGEM projekt iz leta 2020, ki je osvojil nominacijo v kategoriji Diagnostika med podiplomskimi študenti. Pripravili so ga študenti Univerze južne Danske. <br /> [https://2020.igem.org/Team:SDU-Denmark Spletna stran projekta:]<br /> <br /> ==UVOD==<br /> Rak prostate je eden najpogostejših rakov, ki se razvije pri enem izmed osmih moških. Število diagnosticiranih primerov se povečuje, k čemur verjetno pripomore povišan screening koncentracije PSA (prostate specific antigen) v krvi med moškimi. Ta test pa je precej nezanesljiv, z 31 % verjetnostjo lažnega pozitivnega rezultata in 42 % verjetnostjo lažnega negativnega rezultata. [1] Nivo PSA v krvi se lahko poviša iz številnih drugih razlogov (vnetje urinarnega trakta, ejakulacija, zdravila…). Poleg tega preverjanju krvne slike sledi še neprijeten in invaziven fizičen pregled. Vsekakor ima trenutni postopek screeninga raka prostate veliko potenciala za izboljšave.<br /> <br /> PROSTATUS je študentski projekt skupine iz Univerze južne Danske, s katerim so sodelovali na iGEM-u 2020 v kategoriji podiplomskih študentov. V projektu so razvili neinvazivno metodo, pri kateri zaznavamo tri RNA biomarkerje v urinu (TMPRSS2:ERG, AMACR, PCA3) in dva SNP-ja (rs6983267, rs16901979), ki povečata verjetnost razvoja raka prostate, v DNA v slini. Test deluje na podlagi sistema CRISPR-Cas13a v primeru zaznavanja RNA biomarkerjev in sistema CRISPR-Cas12a v primeru zaznavanja SNP-jev.<br /> <br /> ==OPIS PROJEKTA==<br /> ===PRINCIP DELOVANJA SISTEMA===<br /> Skupina je v projektu uporabila dve metodi, ki temeljita na delovanju proteinov družine Cas. <br /> ====SHERLOCK====<br /> SHERLOCK (Specific High-sensitivity Enzymatic Reporter unLOCKinkg) je metoda, ki s pomočjo encima Cas13a zaznava ssRNA v vzorcu. V Cas13a je vezana sgRNA (single guide RNA), ki zazna komplementarno tarčo v vzorcu. Ko pride do hibridizacije s tarčo, se Cas13a aktivira in cepi tudi netarčno RNA v vzorcu. Na ta način lahko pride do cepitve reporterske RNA. [2]<br /> <br /> ====DETECTR====<br /> DETECTR (The DNA Edonuclease Targeted CRISPR Trans Reporter system) je metoda, ki uporablja Cas12a in zaznava tarčno ssDNA v vzorcu, ob prepoznavi tarče pa pridobi nespecifično endonukleazno aktivnost in cepi reportersko ssDNA. [2]<br /> <br /> ===POTEK OBLIKOVANJA PROJEKTA===<br /> ====Kloniranje==== <br /> Za implementacijo teh dveh metod so morali najprej izraziti dva Cas encima ter pridobiti različne sgRNA, ki se vežejo v encima. <br /> Encime so izražali v ''E. coli''. Uporabili so gena cas13a iz bakterije ''Leptotrichia wadei'' in cas12a iz ''Acidaminococcus'' sp. Z orodjem podjetja IDT so optimizirali rabo kodonov ter nato v konstrukt dodali vse potrebne komponente za izražanje proteinov (IPTG inducibilni promotor, RBS, terminator ter oznaki SUMO in His na N-koncu). Naročili so sintetični gen za cas13a, ki so mu nato dodali še restrikcijska mesta za EcoRI in SpeI. Gen cas12a, vstavljen v plazmid, so pridobili od raziskovalne skupine iz Univerze južne Danske. S pomnoževanjem s PCR so temu genu dodali promotorsko regijo sintetičnega gena cas13a ter mu dodali restrikcijska mesta EcoRI, XbaI, SpeI in PstI. Oba konstrukta so nato klonirali v vektor pSB1C3 in transformirali kompetentne celice E. coli seva ER2256.<br /> <br /> ====Načrtovanje sgRNA====<br /> Nato so dizajnirali sgRNA, ki se veže v Cas proteina in je ključna za prepoznavanje tarče. Za aktivacijo Cas12a je v oddaljenosti največ 21 bp od tarče potreben PAM motiv (TTTV). Poleg tega je za specifično aktivacijo Cas12a pomembno 100 % ujemanje v začetnem delu t. i. prilegajoče regije sgRNA (ang. spacer sequence) medtem ko v bolj oddaljenem območju prilegajoče regije 100 % ujemanje za aktivacijo ni potrebno. Če želimo specifično prepoznati SNP, je torej pomembno, da se ta nahaja v začetni regiji tarče, sicer bi dobili nespecifično aktivacijo in signal, ki ne bi bil odvisen od SNP-ja. Optimalna dolžina prilegajoče regije naj bi bila 21 – 24 nukleotidov. Vse te omejitve je skupina upoštevala pri dizajnu sgRNA za Cas12a. Oblikovali so štiri sgRNA, ki se vežejo na Cas12a in prepoznajo posamezne možne alele (prevladujoč alel in alel, ki poviša možnost za razvoj raka prostate). [3]<br /> <br /> Pri oblikovanju sgRNA za Cas13a so upoštevali optimalno dolžino prilegajoče regije 28-31 nukleotidov, prav tako pa pri sgRNA encima Cas13a velja pravilo o 100 % prileganju začetnega dela prilegajoče regije. Cas13a sicer za prepoznavo tarče ne potrebuje PAM motiva. Skupina je oblikovala tri sgRNA za Cas13a, ki se vežejo na RNA biomarkerje v urinu. [4]<br /> <br /> ====Pomnoževanje z metodo RPA====<br /> Ker obstaja verjetnost, da ta sistem ne bi zaznal zelo nizkih koncentracij RNA biomarkerjev v vzorcu, bi pred detekcijo RNA biomarkerje še namnožili z uporabo metode pomnoževanja z rekombinazo in polimerazo (ang. recombinase polymerase amplification – RPA). Gre za proces, alternativen PCR, ki poteka izotermalno in je zato njegova izvedba precej bolj enostavna. Za pomnožitev RNA bi potrebovali štiri encime, in sicer rekombinazo, ssDNA vezavne proteine (SSB) reverzno transkriptazo in DNA polimerazo. Da bi pridobili še pomnoženo RNA in ne le cDNA, bi uporabili še T7 polimerazo. <br /> <br /> V reakciji reverzna transkriptaza najprej prepiše ssRNA v cDNA. V RNA/DNA hibrid rekombinaza vstavi začetne oligonukleotide, ki so komplementarni RNA tarči. Na smerne začetne oligonukleotide bi dodali še T7 promotor. SSB stabilizirajo odrinjeno ssDNA na mestu vezave oligonukleotida, reverzna transkriptaza pa nato spet prepiše RNA verigo v cDNA. Iz novonastale cDNA z dodanim T7 promotorjem nato nastane RNA transkript, ki je na koncu reakcije prisoten v visoki koncentraciji in ga zlahka zaznamo v vzorcu. V opisu projekta ne omenjajo DNA polimeraze, a vendar bi bila ta potrebna za sintezo druge verige cDNA. Lahko bi uporabili tudi encim, ki lahko deluje kot reverzna transkriptaza in DNA polimeraza. <br /> <br /> Podobno reakcijo bi lahko zasnovali tudi za pomnoževanje DNA fragmentov, ki vsebujejo SNP-je, le da bi v tem primeru potrebovali le DNA polimerazo, ne pa tudi reverzne transkriptaze.<br /> <br /> ====Inhibicija aktivnosti RNaz====<br /> Ker pri zaznavanju RNA uporabljamo RNaze, ki se aktivirajo ob specifičnem signalu, bi ostale RNaze v urinu lahko motile specifično cepitev reporterja. Zato je ključna inaktivacija RNaz v vzorcu. V projektu bi uporabili metodo cepitve RNaz s proteinazo K. Po obdelavi vzorca s proteinazo K bi slednjo inaktivirali s fenilmetilsulfonil fluoridom (PMSF), da ne bi razgradila encimov Cas. <br /> ====Detekcija cepitve reporterja====<br /> Za detekcijo cepitve reporterja s Cas12a in Cas13a bi v projektu uporabili hitri test z lateralnim tokom (ang. lateral flow strip). Ta metoda za vizualizacijo rezultatov uporablja anti-FAM-protitelesa s pripetimi zlatimi nanodelci v kombinaciji s posebnim reporterjem. Reporter prek ssRNA ali ssDNA verige povezuje biotin in fluorescein amidit (FAM). Cepitev reporterja se vizualizira na traku, na katerem sta prisotni dve liniji – testna in kontrolna. Če ne pride do cepitve reporterja, se ob potovanju po traku reporter zaradi vezave biotina ustavi na kontrolni liniji. Če pa pride do cepitve, reporter potuje prek kontrolne linije in rezultat detektiramo na testni liniji prek vezave anti-FAM protitelesa na sekundarno protitelo.<br /> <br /> ==REZULTATI==<br /> Skupina je z nikelj-afinitetno kromatografijo uspešno izolirala encima Cas12a in Cas13a ter z in vitro transkripcijo sintetizirala sgRNA. Skupaj so inkubirali izolirana encima in različne koncentracije sgRNA, nato pa preverili, ali prisotnost tarče v vzorcu vzbudi nespecifično endonukleazno aktivnost Cas12a in Cas13a. <br /> <br /> Pokazali so, da je ob daljših časih inkubacije, višjih koncentracijah sgRNA in prisotnosti tarčne sekvence reporter bolj razgrajen, kar kaže na aktivacijo nespecifične endonukleazne aktivnosti encimov Cas12a in Cas13a. V primeru Cas13a je bilo nekaj reporterske RNA razgrajene tudi v odsotnosti tarčne sekvence, kar bi lahko vodilo v lažno pozitivne rezultate. Zato bi bila v tem delu projekta potrebna optimizacija. <br /> <br /> Sledila je inhibicija RNaz, ki so jo zaznavali s kompletom reagenov podjetja Thermofisher, kjer je kot reporter delovala RNA z vezanim fluoroforom in dušilcem fluorescence. Vzorce sline in urina so inkubirali s proteinazo K in fluorescenco primerjali v vzorcu brez proteinaze. Rezultati so pokazali, da je bila inhibicija RNaz v urinu po triurni inkubaciji boljša kot inhibicija v slini. Po prekonočni inkubaciji je bila tudi inhibicija v slini popolna, torej je metoda uspešna. <br /> <br /> Nato so proteinazo K inhibirali z 1mM PMSF in k tem vzorcem dodali še nekaj nove sline in urina, kjer se nahajajo aktivne RNaze, ter izvedli enako detekcijo kot prej. Pokazali so, da so v vzorcih prisotne aktivne RNaze, torej je bila aktivnost proteinaze K inhibirana.<br /> <br /> Preverili so še možnost uporabe hitrega testa z lateralnim tokom (ang. lateral flow strip) kot metode detekcije. Ugotovili so, da negativni testi dajo signal tako v testni, kot tudi v kontrolni liniji, saj se nekaj reporterja verjetno spontano razgradi. V tem primeru je še vedno jasna razlika med pozitivnim in negativnim testom, saj pri pozitivnem dobimo signal le v testni liniji. Vendar bi bila optimizacija testa za bolj nedvoumne rezultate vseeno dobrodošla.<br /> <br /> ==ZAKLJUČEK==<br /> V okviru projekta je skupina razvila postopek za detekcijo poljubnega izbranega biomarkerja v urinu. Pri tem so oblikovali številne enostavne in sestavljene biokocke za proteine Cas in sgRNA, ki so dostopne [https://2020.igem.org/Team:SDU-Denmark/Parts tukaj]. Projekt ima velik potencial za izboljšanje zgodnje diagnostike raka prostate, vendar bi bile potrebne še številne optimizacije. Izboljšati bi bilo treba metodo detekcije (hitri test z lateralnim tokom), da bi bili rezultati bolj nedvoumni, optimizirala bi se lahko tudi izbira biomarkerjev, saj so izbrani v tem projektu primerni predvsem za belsko populacijo. Poleg tega bi bil potreben dizajn embalaže, kjer bi se reakcija izvajala, saj bi le na ta način zagotovili ponovljivost razmer in s tem zanesljivost rezultatov testov.<br /> <br /> ==VIRI==<br /> <br /> [1] Benecchi, L. PSA velocity and PSA slope. Prostate Cancer Prostatic Dis 9, 169–172 (2006). doi:10.1038/sj.pcan.4500866<br /> <br /> [2] Gootenberg JS, Abudayyeh OO, Kellner MJ, Joung J, Collins JJ, Zhang F. Multiplexed and portable nucleic acid detection platform with Cas13, Cas12a, and Csm6. Science. 2018;360(6387):439-44. doi:10.1126/science.aaq0179<br /> <br /> [3] Creutzburg, S. C. A., Wu, W. Y., Mohanraju, P., Swartjes, T., Alkan, F., Gorodkin, J., . . . van der Oost, J. (2020). Good guide, bad guide: spacer sequence-dependent cleavage efficiency of Cas12a. Nucleic Acids Res, 48(6), 3228-3243. doi:10.1093/nar/gkz1240<br /> <br /> [4] Gootenberg JS, Abudayyeh OO, Lee JW, et al. Nucleic acid detection with CRISPR-Cas13a/C2c2. Science. 2017;356(6336):438-442. doi:10.1126/science.aam9321</div>

Luka.gnidovec https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=PROSTATUS:_Diagnostika_raka_prostate&diff=19321 2021-05-19T07:59:20Z

<p>Luka.gnidovec: /* Kloniranje */</p> <hr /> <div>PROSTATUS je iGEM projekt iz leta 2020, ki je osvojil nominacijo v kategoriji Diagnostika med podiplomskimi študenti. Pripravili so ga študenti Univerze južne Danske. <br /> [https://2020.igem.org/Team:SDU-Denmark Spletna stran projekta:]<br /> <br /> ==UVOD==<br /> Rak prostate je eden najpogostejših rakov, ki se razvije pri enem izmed osmih moških. Število diagnosticiranih primerov se povečuje, k čemur verjetno pripomore povišan screening koncentracije PSA (prostate specific antigen) v krvi med moškimi. Ta test pa je precej nezanesljiv, z 31 % verjetnostjo lažnega pozitivnega rezultata in 42 % verjetnostjo lažnega negativnega rezultata. [1] Nivo PSA v krvi se lahko poviša iz številnih drugih razlogov (vnetje urinarnega trakta, ejakulacija, zdravila…). Poleg tega preverjanju krvne slike sledi še neprijeten in invaziven fizičen pregled. Vsekakor ima trenutni postopek screeninga raka prostate veliko potenciala za izboljšave.<br /> <br /> PROSTATUS je študentski projekt skupine iz Univerze južne Danske, s katerim so sodelovali na iGEM-u 2020 v kategoriji podiplomskih študentov. V projektu so razvili neinvazivno metodo, pri kateri zaznavamo tri RNA biomarkerje v urinu (TMPRSS2:ERG, AMACR, PCA3) in dva SNP-ja (rs6983267, rs16901979), ki povečata verjetnost razvoja raka prostate, v DNA v slini. Test deluje na podlagi sistema CRISPR-Cas13a v primeru zaznavanja RNA biomarkerjev in sistema CRISPR-Cas12a v primeru zaznavanja SNP-jev.<br /> <br /> ==OPIS PROJEKTA==<br /> ===PRINCIP DELOVANJA SISTEMA===<br /> Skupina je v projektu uporabila dve metodi, ki temeljita na delovanju proteinov družine Cas. <br /> ====SHERLOCK====<br /> SHERLOCK (Specific High-sensitivity Enzymatic Reporter unLOCKinkg) je metoda, ki s pomočjo encima Cas13a zaznava ssRNA v vzorcu. V Cas13a je vezana sgRNA (single guide RNA), ki zazna komplementarno tarčo v vzorcu. Ko pride do hibridizacije s tarčo, se Cas13a aktivira in cepi tudi netarčno RNA v vzorcu. Na ta način lahko pride do cepitve reporterske RNA. [2]<br /> <br /> ====DETECTR====<br /> DETECTR (The DNA Edonuclease Targeted CRISPR Trans Reporter system) je metoda, ki uporablja Cas12a in zaznava tarčno ssDNA v vzorcu, ob prepoznavi tarče pa pridobi nespecifično endonukleazno aktivnost in cepi reportersko ssDNA. [2]<br /> <br /> ===POTEK OBLIKOVANJA PROJEKTA===<br /> ====Kloniranje==== <br /> Za implementacijo teh dveh metod so morali najprej izraziti dva Cas encima ter pridobiti različne sgRNA, ki se vežejo v encima. <br /> Encime so izražali v ''E. coli''. Uporabili so gena cas13a iz bakterije ''Leptotrichia wadei'' in cas12a iz ''Acidaminococcus'' sp. Z orodjem podjetja IDT so optimizirali rabo kodonov ter nato v konstrukt dodali vse potrebne komponente za izražanje proteinov (IPTG inducibilni promotor, RBS, terminator ter oznaki SUMO in His na N-koncu). Naročili so sintetični gen za cas13a, ki so mu nato dodali še restrikcijska mesta za EcoRI in SpeI. Gen cas12a, vstavljen v plazmid, so pridobili od raziskovalne skupine iz Univerze južne Danske. S pomnoževanjem s PCR so temu genu dodali promotorsko regijo sintetičnega gena cas13a ter mu dodali restrikcijska mesta EcoRI, XbaI, SpeI in PstI. Oba konstrukta so nato klonirali v vektor pSB1C3 in transformirali kompetentne celice E. coli seva ER2256.<br /> <br /> ====Načrtovanje sgRNA====<br /> Nato so dizajnirali sgRNA, ki se veže v Cas proteina in je ključna za prepoznavanje tarče. Za aktivacijo Cas12a je v oddaljenosti največ 21 bp od tarče potreben PAM motiv (TTTV). Poleg tega je za specifično aktivacijo Cas12a pomembno 100 % ujemanje v začetnem delu t. i. prilegajoče regije sgRNA (ang. spacer sequence) medtem ko v bolj oddaljenem območju prilegajoče regije 100 % ujemanje za aktivacijo ni potrebno. Če želimo specifično prepoznati SNP, je torej pomembno, da se ta nahaja v začetni regiji tarče, sicer bi dobili nespecifično aktivacijo in signal, ki ne bi bil odvisen od SNP-ja. Optimalna dolžina prilegajoče regije naj bi bila 21 – 24 nukleotidov. Vse te omejitve je skupina upoštevala pri dizajnu sgRNA za Cas12a. Oblikovali so štiri sgRNA, ki se vežejo na Cas12a in prepoznajo posamezne možne alele (prevladujoč alel in alel, ki poviša možnost za razvoj raka prostate). [3]<br /> <br /> Pri oblikovanju sgRNA za Cas13a so upoštevali optimalno dolžino prilegajoče regije 28-31 nukleotidov, prav tako pa pri sgRNA encima Cas13a velja pravilo o 100 % prileganju začetnega dela prilegajoče regije. Cas13a sicer za prepoznavo tarče ne potrebuje PAM motiva. Skupina je oblikovala tri sgRNA za Cas13a, ki se vežejo na RNA biomarkerje v urinu. [4]<br /> <br /> ====Pomnoževanje z metodo RPA====<br /> Ker obstaja verjetnost, da ta sistem ne bi zaznal zelo nizkih koncentracij RNA biomarkerjev v vzorcu, bi pred detekcijo RNA biomarkerje še namnožili z uporabo metode pomnoževanja z rekombinazo in polimerazo (ang. recombinase polymerase amplification – RPA). Gre za proces, alternativen PCR, ki poteka izotermalno in je zato njegova izvedba precej bolj enostavna. Za pomnožitev RNA bi potrebovali štiri encime, in sicer rekombinazo, ssDNA vezavne proteine (SSB) reverzno transkriptazo in DNA polimerazo. Da bi pridobili še pomnoženo RNA in ne le cDNA, bi uporabili še T7 polimerazo. <br /> <br /> V reakciji reverzna transkriptaza najprej prepiše ssRNA v cDNA. V RNA/DNA hibrid rekombinaza vstavi začetne oligonukleotide, ki so komplementarni RNA tarči. Na smerne začetne oligonukleotide bi dodali še T7 promotor. SSB stabilizirajo odrinjeno ssDNA na mestu vezave oligonukleotida, reverzna transkriptaza pa nato spet prepiše RNA verigo v cDNA. Iz novonastale cDNA z dodanim T7 promotorjem nato nastane RNA transkript, ki je na koncu reakcije prisoten v visoki koncentraciji in ga zlahka zaznamo v vzorcu. V opisu projekta ne omenjajo DNA polimeraze, a vendar bi bila ta potrebna za sintezo druge verige cDNA. Lahko bi uporabili tudi encim, ki lahko deluje kot reverzna transkriptaza in DNA polimeraza. <br /> <br /> Podobno reakcijo bi lahko zasnovali tudi za pomnoževanje DNA fragmentov, ki vsebujejo SNP-je, le da bi v tem primeru potrebovali le DNA polimerazo, ne pa tudi reverzne transkriptaze.<br /> <br /> ====Inhibicija aktivnosti RNaz====<br /> Ker pri zaznavanju RNA uporabljamo RNaze, ki se aktivirajo ob specifičnem signalu, bi ostale RNaze v urinu lahko motile specifično cepitev reporterja. Zato je ključna inaktivacija RNaz v vzorcu. V projektu bi uporabili metodo cepitve RNaz s proteinazo K. Po obdelavi vzorca s proteinazo K bi slednjo inaktivirali s fenilmetilsulfonil fluoridom (PMSF), da ne bi razgradila encimov Cas. <br /> ====Detekcija cepitve reporterja====<br /> Za detekcijo cepitve reporterja s Cas12a in Cas13a bi v projektu uporabili hitri test z lateralnim tokom (ang. lateral flow strip). Ta metoda za vizualizacijo rezultatov uporablja anti-FAM-protitelesa s pripetimi zlatimi nanodelci v kombinaciji s posebnim reporterjem. Reporter prek ssRNA ali ssDNA verige povezuje biotin in fluorescein amidit (FAM). Cepitev reporterja se vizualizira na traku, na katerem sta prisotni dve liniji – testna in kontrolna. Če pride do cepitve verige reporterja, se na FAM na cepljenem reporterju lahko veže anti-FAM-protitelo z zlatimi nanodelci na način, ki omogoča vezavo na sekundarna protitelesa, imobilizirana na testni liniji na traku za detekcijo. V primeru, da se reporter ne cepi, pa se protitelesa vežejo na FAM na način, ki ne omogoča vezave na sekundarna protitelesa in se zato reporter prek biotina veže na kontrolno linijo na traku za detekcijo.<br /> <br /> ==REZULTATI==<br /> Skupina je z nikelj-afinitetno kromatografijo uspešno izolirala encima Cas12a in Cas13a ter z in vitro transkripcijo sintetizirala sgRNA. Skupaj so inkubirali izolirana encima in različne koncentracije sgRNA, nato pa preverili, ali prisotnost tarče v vzorcu vzbudi nespecifično endonukleazno aktivnost Cas12a in Cas13a. <br /> <br /> Pokazali so, da je ob daljših časih inkubacije, višjih koncentracijah sgRNA in prisotnosti tarčne sekvence reporter bolj razgrajen, kar kaže na aktivacijo nespecifične endonukleazne aktivnosti encimov Cas12a in Cas13a. V primeru Cas13a je bilo nekaj reporterske RNA razgrajene tudi v odsotnosti tarčne sekvence, kar bi lahko vodilo v lažno pozitivne rezultate. Zato bi bila v tem delu projekta potrebna optimizacija. <br /> <br /> Sledila je inhibicija RNaz, ki so jo zaznavali s kompletom reagenov podjetja Thermofisher, kjer je kot reporter delovala RNA z vezanim fluoroforom in dušilcem fluorescence. Vzorce sline in urina so inkubirali s proteinazo K in fluorescenco primerjali v vzorcu brez proteinaze. Rezultati so pokazali, da je bila inhibicija RNaz v urinu po triurni inkubaciji boljša kot inhibicija v slini. Po prekonočni inkubaciji je bila tudi inhibicija v slini popolna, torej je metoda uspešna. <br /> <br /> Nato so proteinazo K inhibirali z 1mM PMSF in k tem vzorcem dodali še nekaj nove sline in urina, kjer se nahajajo aktivne RNaze, ter izvedli enako detekcijo kot prej. Pokazali so, da so v vzorcih prisotne aktivne RNaze, torej je bila aktivnost proteinaze K inhibirana.<br /> <br /> Preverili so še možnost uporabe hitrega testa z lateralnim tokom (ang. lateral flow strip) kot metode detekcije. Ugotovili so, da negativni testi dajo signal tako v testni, kot tudi v kontrolni liniji, saj se nekaj reporterja verjetno spontano razgradi. V tem primeru je še vedno jasna razlika med pozitivnim in negativnim testom, saj pri pozitivnem dobimo signal le v testni liniji. Vendar bi bila optimizacija testa za bolj nedvoumne rezultate vseeno dobrodošla.<br /> <br /> ==ZAKLJUČEK==<br /> V okviru projekta je skupina razvila postopek za detekcijo poljubnega izbranega biomarkerja v urinu. Pri tem so oblikovali številne enostavne in sestavljene biokocke za proteine Cas in sgRNA, ki so dostopne [https://2020.igem.org/Team:SDU-Denmark/Parts tukaj]. Projekt ima velik potencial za izboljšanje zgodnje diagnostike raka prostate, vendar bi bile potrebne še številne optimizacije. Izboljšati bi bilo treba metodo detekcije (hitri test z lateralnim tokom), da bi bili rezultati bolj nedvoumni, optimizirala bi se lahko tudi izbira biomarkerjev, saj so izbrani v tem projektu primerni predvsem za belsko populacijo. Poleg tega bi bil potreben dizajn embalaže, kjer bi se reakcija izvajala, saj bi le na ta način zagotovili ponovljivost razmer in s tem zanesljivost rezultatov testov.<br /> <br /> ==VIRI==<br /> <br /> [1] Benecchi, L. PSA velocity and PSA slope. Prostate Cancer Prostatic Dis 9, 169–172 (2006). doi:10.1038/sj.pcan.4500866<br /> <br /> [2] Gootenberg JS, Abudayyeh OO, Kellner MJ, Joung J, Collins JJ, Zhang F. Multiplexed and portable nucleic acid detection platform with Cas13, Cas12a, and Csm6. Science. 2018;360(6387):439-44. doi:10.1126/science.aaq0179<br /> <br /> [3] Creutzburg, S. C. A., Wu, W. Y., Mohanraju, P., Swartjes, T., Alkan, F., Gorodkin, J., . . . van der Oost, J. (2020). Good guide, bad guide: spacer sequence-dependent cleavage efficiency of Cas12a. Nucleic Acids Res, 48(6), 3228-3243. doi:10.1093/nar/gkz1240<br /> <br /> [4] Gootenberg JS, Abudayyeh OO, Lee JW, et al. Nucleic acid detection with CRISPR-Cas13a/C2c2. Science. 2017;356(6336):438-442. doi:10.1126/science.aam9321</div>

Luka.gnidovec https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=PROSTATUS:_Diagnostika_raka_prostate&diff=19306 2021-05-18T08:40:16Z

<p>Luka.gnidovec: /* Kloniranje */</p> <hr /> <div>PROSTATUS je iGEM projekt iz leta 2020, ki je osvojil nominacijo v kategoriji Diagnostika med podiplomskimi študenti. Pripravili so ga študenti Univerze južne Danske. <br /> [https://2020.igem.org/Team:SDU-Denmark Spletna stran projekta:]<br /> <br /> ==UVOD==<br /> Rak prostate je eden najpogostejših rakov, ki se razvije pri enem izmed osmih moških. Število diagnosticiranih primerov se povečuje, k čemur verjetno pripomore povišan screening koncentracije PSA (prostate specific antigen) v krvi med moškimi. Ta test pa je precej nezanesljiv, z 31 % verjetnostjo lažnega pozitivnega rezultata in 42 % verjetnostjo lažnega negativnega rezultata. [1] Nivo PSA v krvi se lahko poviša iz številnih drugih razlogov (vnetje urinarnega trakta, ejakulacija, zdravila…). Poleg tega preverjanju krvne slike sledi še neprijeten in invaziven fizičen pregled. Vsekakor ima trenutni postopek screeninga raka prostate veliko potenciala za izboljšave.<br /> <br /> PROSTATUS je študentski projekt skupine iz Univerze južne Danske, s katerim so sodelovali na iGEM-u 2020 v kategoriji podiplomskih študentov. V projektu so razvili neinvazivno metodo, pri kateri zaznavamo tri RNA biomarkerje v urinu (TMPRSS2:ERG, AMACR, PCA3) in dva SNP-ja (rs6983267, rs16901979), ki povečata verjetnost razvoja raka prostate, v DNA v slini. Test deluje na podlagi sistema CRISPR-Cas13a v primeru zaznavanja RNA biomarkerjev in sistema CRISPR-Cas12a v primeru zaznavanja SNP-jev.<br /> <br /> ==OPIS PROJEKTA==<br /> ===PRINCIP DELOVANJA SISTEMA===<br /> Skupina je v projektu uporabila dve metodi, ki temeljita na delovanju proteinov družine Cas. <br /> ====SHERLOCK====<br /> SHERLOCK (Specific High-sensitivity Enzymatic Reporter unLOCKinkg) je metoda, ki s pomočjo encima Cas13a zaznava ssRNA v vzorcu. V Cas13a je vezana sgRNA (single guide RNA), ki zazna komplementarno tarčo v vzorcu. Ko pride do hibridizacije s tarčo, se Cas13a aktivira in cepi tudi netarčno RNA v vzorcu. Na ta način lahko pride do cepitve reporterske RNA. [2]<br /> <br /> ====DETECTR====<br /> DETECTR (The DNA Edonuclease Targeted CRISPR Trans Reporter system) je metoda, ki uporablja Cas12a in zaznava tarčno ssDNA v vzorcu, ob prepoznavi tarče pa pridobi nespecifično endonukleazno aktivnost in cepi reportersko ssDNA. [2]<br /> <br /> ===POTEK OBLIKOVANJA PROJEKTA===<br /> ====Kloniranje==== <br /> Za implementacijo teh dveh metod so morali najprej izraziti dva Cas encima ter pridobiti različne sgRNA, ki se vežejo v encima. <br /> Encime so izražali v ''E. coli''. Uporabili so gena cas13a iz bakterije ''Leptotrichia wadei'' in cas12a iz ''Acidaminococcus'' sp. Z orodjem podjetja IDT so optimizirali rabo kodonov ter nato v konstrukt dodali vse potrebne komponente za izražanje proteinov (IPTG inducibilni promotor, RBS, terminator ter oznaki SUMO in His na N-koncu). Naročili so sintetični gen za cas13a, ki so mu nato dodali še restrikcijska mesta za EcoRI in SpeI. Gen cas12a, vstavljen v plazmid, so pridobili od raziskovalne skupine iz Univerze južne Danske. S pomnoževanjem s PCR so temu genu dodali promotorsko regijo sintetičnega gena cas13a ter mu dodali restrikcijska mesta EcoRI in SpeI. Oba konstrukta so nato klonirali v vektor pSB1C3 in transformirali kompetentne celice E. coli seva ER2256.<br /> <br /> ====Načrtovanje sgRNA====<br /> Nato so dizajnirali sgRNA, ki se veže v Cas proteina in je ključna za prepoznavanje tarče. Za aktivacijo Cas12a je v oddaljenosti največ 21 bp od tarče potreben PAM motiv (TTTV). Poleg tega je za specifično aktivacijo Cas12a pomembno 100 % ujemanje v začetnem delu t. i. prilegajoče regije sgRNA (ang. spacer sequence) medtem ko v bolj oddaljenem območju prilegajoče regije 100 % ujemanje za aktivacijo ni potrebno. Če želimo specifično prepoznati SNP, je torej pomembno, da se ta nahaja v začetni regiji tarče, sicer bi dobili nespecifično aktivacijo in signal, ki ne bi bil odvisen od SNP-ja. Optimalna dolžina prilegajoče regije naj bi bila 21 – 24 nukleotidov. Vse te omejitve je skupina upoštevala pri dizajnu sgRNA za Cas12a. Oblikovali so štiri sgRNA, ki se vežejo na Cas12a in prepoznajo posamezne možne alele (prevladujoč alel in alel, ki poviša možnost za razvoj raka prostate). [3]<br /> <br /> Pri oblikovanju sgRNA za Cas13a so upoštevali optimalno dolžino prilegajoče regije 28-31 nukleotidov, prav tako pa pri sgRNA encima Cas13a velja pravilo o 100 % prileganju začetnega dela prilegajoče regije. Cas13a sicer za prepoznavo tarče ne potrebuje PAM motiva. Skupina je oblikovala tri sgRNA za Cas13a, ki se vežejo na RNA biomarkerje v urinu. [4]<br /> <br /> ====Pomnoževanje z metodo RPA====<br /> Ker obstaja verjetnost, da ta sistem ne bi zaznal zelo nizkih koncentracij RNA biomarkerjev v vzorcu, bi pred detekcijo RNA biomarkerje še namnožili z uporabo metode pomnoževanja z rekombinazo in polimerazo (ang. recombinase polymerase amplification – RPA). Gre za proces, alternativen PCR, ki poteka izotermalno in je zato njegova izvedba precej bolj enostavna. Za pomnožitev RNA bi potrebovali štiri encime, in sicer rekombinazo, ssDNA vezavne proteine (SSB) reverzno transkriptazo in DNA polimerazo. Da bi pridobili še pomnoženo RNA in ne le cDNA, bi uporabili še T7 polimerazo. <br /> <br /> V reakciji reverzna transkriptaza najprej prepiše ssRNA v cDNA. V RNA/DNA hibrid rekombinaza vstavi začetne oligonukleotide, ki so komplementarni RNA tarči. Na smerne začetne oligonukleotide bi dodali še T7 promotor. SSB stabilizirajo odrinjeno ssDNA na mestu vezave oligonukleotida, reverzna transkriptaza pa nato spet prepiše RNA verigo v cDNA. Iz novonastale cDNA z dodanim T7 promotorjem nato nastane RNA transkript, ki je na koncu reakcije prisoten v visoki koncentraciji in ga zlahka zaznamo v vzorcu. V opisu projekta ne omenjajo DNA polimeraze, a vendar bi bila ta potrebna za sintezo druge verige cDNA. Lahko bi uporabili tudi encim, ki lahko deluje kot reverzna transkriptaza in DNA polimeraza. <br /> <br /> Podobno reakcijo bi lahko zasnovali tudi za pomnoževanje DNA fragmentov, ki vsebujejo SNP-je, le da bi v tem primeru potrebovali le DNA polimerazo, ne pa tudi reverzne transkriptaze.<br /> <br /> ====Inhibicija aktivnosti RNaz====<br /> Ker pri zaznavanju RNA uporabljamo RNaze, ki se aktivirajo ob specifičnem signalu, bi ostale RNaze v urinu lahko motile specifično cepitev reporterja. Zato je ključna inaktivacija RNaz v vzorcu. V projektu bi uporabili metodo cepitve RNaz s proteinazo K. Po obdelavi vzorca s proteinazo K bi slednjo inaktivirali s fenilmetilsulfonil fluoridom (PMSF), da ne bi razgradila encimov Cas. <br /> ====Detekcija cepitve reporterja====<br /> Za detekcijo cepitve reporterja s Cas12a in Cas13a bi v projektu uporabili hitri test z lateralnim tokom (ang. lateral flow strip). Ta metoda za vizualizacijo rezultatov uporablja anti-FAM-protitelesa s pripetimi zlatimi nanodelci v kombinaciji s posebnim reporterjem. Reporter prek ssRNA ali ssDNA verige povezuje biotin in fluorescein amidit (FAM). Cepitev reporterja se vizualizira na traku, na katerem sta prisotni dve liniji – testna in kontrolna. Če pride do cepitve verige reporterja, se na FAM na cepljenem reporterju lahko veže anti-FAM-protitelo z zlatimi nanodelci na način, ki omogoča vezavo na sekundarna protitelesa, imobilizirana na testni liniji na traku za detekcijo. V primeru, da se reporter ne cepi, pa se protitelesa vežejo na FAM na način, ki ne omogoča vezave na sekundarna protitelesa in se zato reporter prek biotina veže na kontrolno linijo na traku za detekcijo.<br /> <br /> ==REZULTATI==<br /> Skupina je z nikelj-afinitetno kromatografijo uspešno izolirala encima Cas12a in Cas13a ter z in vitro transkripcijo sintetizirala sgRNA. Skupaj so inkubirali izolirana encima in različne koncentracije sgRNA, nato pa preverili, ali prisotnost tarče v vzorcu vzbudi nespecifično endonukleazno aktivnost Cas12a in Cas13a. <br /> <br /> Pokazali so, da je ob daljših časih inkubacije, višjih koncentracijah sgRNA in prisotnosti tarčne sekvence reporter bolj razgrajen, kar kaže na aktivacijo nespecifične endonukleazne aktivnosti encimov Cas12a in Cas13a. V primeru Cas13a je bilo nekaj reporterske RNA razgrajene tudi v odsotnosti tarčne sekvence, kar bi lahko vodilo v lažno pozitivne rezultate. Zato bi bila v tem delu projekta potrebna optimizacija. <br /> <br /> Sledila je inhibicija RNaz, ki so jo zaznavali s kompletom reagenov podjetja Thermofisher, kjer je kot reporter delovala RNA z vezanim fluoroforom in dušilcem fluorescence. Vzorce sline in urina so inkubirali s proteinazo K in fluorescenco primerjali v vzorcu brez proteinaze. Rezultati so pokazali, da je bila inhibicija RNaz v urinu po triurni inkubaciji boljša kot inhibicija v slini. Po prekonočni inkubaciji je bila tudi inhibicija v slini popolna, torej je metoda uspešna. <br /> <br /> Nato so proteinazo K inhibirali z 1mM PMSF in k tem vzorcem dodali še nekaj nove sline in urina, kjer se nahajajo aktivne RNaze, ter izvedli enako detekcijo kot prej. Pokazali so, da so v vzorcih prisotne aktivne RNaze, torej je bila aktivnost proteinaze K inhibirana.<br /> <br /> Preverili so še možnost uporabe hitrega testa z lateralnim tokom (ang. lateral flow strip) kot metode detekcije. Ugotovili so, da negativni testi dajo signal tako v testni, kot tudi v kontrolni liniji, saj se nekaj reporterja verjetno spontano razgradi. V tem primeru je še vedno jasna razlika med pozitivnim in negativnim testom, saj pri pozitivnem dobimo signal le v testni liniji. Vendar bi bila optimizacija testa za bolj nedvoumne rezultate vseeno dobrodošla.<br /> <br /> ==ZAKLJUČEK==<br /> V okviru projekta je skupina razvila postopek za detekcijo poljubnega izbranega biomarkerja v urinu. Pri tem so oblikovali številne enostavne in sestavljene biokocke za proteine Cas in sgRNA, ki so dostopne [https://2020.igem.org/Team:SDU-Denmark/Parts tukaj]. Projekt ima velik potencial za izboljšanje zgodnje diagnostike raka prostate, vendar bi bile potrebne še številne optimizacije. Izboljšati bi bilo treba metodo detekcije (hitri test z lateralnim tokom), da bi bili rezultati bolj nedvoumni, optimizirala bi se lahko tudi izbira biomarkerjev, saj so izbrani v tem projektu primerni predvsem za belsko populacijo. Poleg tega bi bil potreben dizajn embalaže, kjer bi se reakcija izvajala, saj bi le na ta način zagotovili ponovljivost razmer in s tem zanesljivost rezultatov testov.<br /> <br /> ==VIRI==<br /> <br /> [1] Benecchi, L. PSA velocity and PSA slope. Prostate Cancer Prostatic Dis 9, 169–172 (2006). doi:10.1038/sj.pcan.4500866<br /> <br /> [2] Gootenberg JS, Abudayyeh OO, Kellner MJ, Joung J, Collins JJ, Zhang F. Multiplexed and portable nucleic acid detection platform with Cas13, Cas12a, and Csm6. Science. 2018;360(6387):439-44. doi:10.1126/science.aaq0179<br /> <br /> [3] Creutzburg, S. C. A., Wu, W. Y., Mohanraju, P., Swartjes, T., Alkan, F., Gorodkin, J., . . . van der Oost, J. (2020). Good guide, bad guide: spacer sequence-dependent cleavage efficiency of Cas12a. Nucleic Acids Res, 48(6), 3228-3243. doi:10.1093/nar/gkz1240<br /> <br /> [4] Gootenberg JS, Abudayyeh OO, Lee JW, et al. Nucleic acid detection with CRISPR-Cas13a/C2c2. Science. 2017;356(6336):438-442. doi:10.1126/science.aam9321</div>

Luka.gnidovec https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=PROSTATUS:_Diagnostika_raka_prostate&diff=19305 2021-05-18T08:37:54Z

<p>Luka.gnidovec: </p> <hr /> <div>PROSTATUS je iGEM projekt iz leta 2020, ki je osvojil nominacijo v kategoriji Diagnostika med podiplomskimi študenti. Pripravili so ga študenti Univerze južne Danske. <br /> [https://2020.igem.org/Team:SDU-Denmark Spletna stran projekta:]<br /> <br /> ==UVOD==<br /> Rak prostate je eden najpogostejših rakov, ki se razvije pri enem izmed osmih moških. Število diagnosticiranih primerov se povečuje, k čemur verjetno pripomore povišan screening koncentracije PSA (prostate specific antigen) v krvi med moškimi. Ta test pa je precej nezanesljiv, z 31 % verjetnostjo lažnega pozitivnega rezultata in 42 % verjetnostjo lažnega negativnega rezultata. [1] Nivo PSA v krvi se lahko poviša iz številnih drugih razlogov (vnetje urinarnega trakta, ejakulacija, zdravila…). Poleg tega preverjanju krvne slike sledi še neprijeten in invaziven fizičen pregled. Vsekakor ima trenutni postopek screeninga raka prostate veliko potenciala za izboljšave.<br /> <br /> PROSTATUS je študentski projekt skupine iz Univerze južne Danske, s katerim so sodelovali na iGEM-u 2020 v kategoriji podiplomskih študentov. V projektu so razvili neinvazivno metodo, pri kateri zaznavamo tri RNA biomarkerje v urinu (TMPRSS2:ERG, AMACR, PCA3) in dva SNP-ja (rs6983267, rs16901979), ki povečata verjetnost razvoja raka prostate, v DNA v slini. Test deluje na podlagi sistema CRISPR-Cas13a v primeru zaznavanja RNA biomarkerjev in sistema CRISPR-Cas12a v primeru zaznavanja SNP-jev.<br /> <br /> ==OPIS PROJEKTA==<br /> ===PRINCIP DELOVANJA SISTEMA===<br /> Skupina je v projektu uporabila dve metodi, ki temeljita na delovanju proteinov družine Cas. <br /> ====SHERLOCK====<br /> SHERLOCK (Specific High-sensitivity Enzymatic Reporter unLOCKinkg) je metoda, ki s pomočjo encima Cas13a zaznava ssRNA v vzorcu. V Cas13a je vezana sgRNA (single guide RNA), ki zazna komplementarno tarčo v vzorcu. Ko pride do hibridizacije s tarčo, se Cas13a aktivira in cepi tudi netarčno RNA v vzorcu. Na ta način lahko pride do cepitve reporterske RNA. [2]<br /> <br /> ====DETECTR====<br /> DETECTR (The DNA Edonuclease Targeted CRISPR Trans Reporter system) je metoda, ki uporablja Cas12a in zaznava tarčno ssDNA v vzorcu, ob prepoznavi tarče pa pridobi nespecifično endonukleazno aktivnost in cepi reportersko ssDNA. [2]<br /> <br /> ===POTEK OBLIKOVANJA PROJEKTA===<br /> ====Kloniranje==== <br /> Za implementacijo teh dveh metod so morali najprej izraziti dva Cas encima ter pridobiti različne sgRNA, ki se vežejo v encima. <br /> Encime so izražali v ''E. coli''. Uporabili so gena cas13a iz bakterije ''Leptotrichia wadei'' in cas12a iz ''Acidaminococcus'' sp. Z orodjem podjetja IDT so optimizirali rabo kodonov ter nato v konstrukt dodali vse potrebne komponente za izražanje proteinov (IPTG inducibilni promotor, RBS, terminator ter oznaki SUMO in His na N-koncu) ter naročili sintetični gen, ki so mu nato dodali še restrikcijska mesta za EcoRI in SpeI. <br /> Gen cas12a, vstavljen v plazmid, so pridobili od raziskovalne skupine iz Univerze južne Danske. S pomnoževanjem s PCR so genu dodali promotorsko regijo sintetičnega gena cas13a. Oba konstrukta so nato klonirali v vektor pSB1C3 in transformirali kompetentne celice E. coli seva ER2256. <br /> ====Načrtovanje sgRNA====<br /> Nato so dizajnirali sgRNA, ki se veže v Cas proteina in je ključna za prepoznavanje tarče. Za aktivacijo Cas12a je v oddaljenosti največ 21 bp od tarče potreben PAM motiv (TTTV). Poleg tega je za specifično aktivacijo Cas12a pomembno 100 % ujemanje v začetnem delu t. i. prilegajoče regije sgRNA (ang. spacer sequence) medtem ko v bolj oddaljenem območju prilegajoče regije 100 % ujemanje za aktivacijo ni potrebno. Če želimo specifično prepoznati SNP, je torej pomembno, da se ta nahaja v začetni regiji tarče, sicer bi dobili nespecifično aktivacijo in signal, ki ne bi bil odvisen od SNP-ja. Optimalna dolžina prilegajoče regije naj bi bila 21 – 24 nukleotidov. Vse te omejitve je skupina upoštevala pri dizajnu sgRNA za Cas12a. Oblikovali so štiri sgRNA, ki se vežejo na Cas12a in prepoznajo posamezne možne alele (prevladujoč alel in alel, ki poviša možnost za razvoj raka prostate). [3]<br /> <br /> Pri oblikovanju sgRNA za Cas13a so upoštevali optimalno dolžino prilegajoče regije 28-31 nukleotidov, prav tako pa pri sgRNA encima Cas13a velja pravilo o 100 % prileganju začetnega dela prilegajoče regije. Cas13a sicer za prepoznavo tarče ne potrebuje PAM motiva. Skupina je oblikovala tri sgRNA za Cas13a, ki se vežejo na RNA biomarkerje v urinu. [4]<br /> <br /> ====Pomnoževanje z metodo RPA====<br /> Ker obstaja verjetnost, da ta sistem ne bi zaznal zelo nizkih koncentracij RNA biomarkerjev v vzorcu, bi pred detekcijo RNA biomarkerje še namnožili z uporabo metode pomnoževanja z rekombinazo in polimerazo (ang. recombinase polymerase amplification – RPA). Gre za proces, alternativen PCR, ki poteka izotermalno in je zato njegova izvedba precej bolj enostavna. Za pomnožitev RNA bi potrebovali štiri encime, in sicer rekombinazo, ssDNA vezavne proteine (SSB) reverzno transkriptazo in DNA polimerazo. Da bi pridobili še pomnoženo RNA in ne le cDNA, bi uporabili še T7 polimerazo. <br /> <br /> V reakciji reverzna transkriptaza najprej prepiše ssRNA v cDNA. V RNA/DNA hibrid rekombinaza vstavi začetne oligonukleotide, ki so komplementarni RNA tarči. Na smerne začetne oligonukleotide bi dodali še T7 promotor. SSB stabilizirajo odrinjeno ssDNA na mestu vezave oligonukleotida, reverzna transkriptaza pa nato spet prepiše RNA verigo v cDNA. Iz novonastale cDNA z dodanim T7 promotorjem nato nastane RNA transkript, ki je na koncu reakcije prisoten v visoki koncentraciji in ga zlahka zaznamo v vzorcu. V opisu projekta ne omenjajo DNA polimeraze, a vendar bi bila ta potrebna za sintezo druge verige cDNA. Lahko bi uporabili tudi encim, ki lahko deluje kot reverzna transkriptaza in DNA polimeraza. <br /> <br /> Podobno reakcijo bi lahko zasnovali tudi za pomnoževanje DNA fragmentov, ki vsebujejo SNP-je, le da bi v tem primeru potrebovali le DNA polimerazo, ne pa tudi reverzne transkriptaze.<br /> <br /> ====Inhibicija aktivnosti RNaz====<br /> Ker pri zaznavanju RNA uporabljamo RNaze, ki se aktivirajo ob specifičnem signalu, bi ostale RNaze v urinu lahko motile specifično cepitev reporterja. Zato je ključna inaktivacija RNaz v vzorcu. V projektu bi uporabili metodo cepitve RNaz s proteinazo K. Po obdelavi vzorca s proteinazo K bi slednjo inaktivirali s fenilmetilsulfonil fluoridom (PMSF), da ne bi razgradila encimov Cas. <br /> ====Detekcija cepitve reporterja====<br /> Za detekcijo cepitve reporterja s Cas12a in Cas13a bi v projektu uporabili hitri test z lateralnim tokom (ang. lateral flow strip). Ta metoda za vizualizacijo rezultatov uporablja anti-FAM-protitelesa s pripetimi zlatimi nanodelci v kombinaciji s posebnim reporterjem. Reporter prek ssRNA ali ssDNA verige povezuje biotin in fluorescein amidit (FAM). Cepitev reporterja se vizualizira na traku, na katerem sta prisotni dve liniji – testna in kontrolna. Če pride do cepitve verige reporterja, se na FAM na cepljenem reporterju lahko veže anti-FAM-protitelo z zlatimi nanodelci na način, ki omogoča vezavo na sekundarna protitelesa, imobilizirana na testni liniji na traku za detekcijo. V primeru, da se reporter ne cepi, pa se protitelesa vežejo na FAM na način, ki ne omogoča vezave na sekundarna protitelesa in se zato reporter prek biotina veže na kontrolno linijo na traku za detekcijo.<br /> <br /> ==REZULTATI==<br /> Skupina je z nikelj-afinitetno kromatografijo uspešno izolirala encima Cas12a in Cas13a ter z in vitro transkripcijo sintetizirala sgRNA. Skupaj so inkubirali izolirana encima in različne koncentracije sgRNA, nato pa preverili, ali prisotnost tarče v vzorcu vzbudi nespecifično endonukleazno aktivnost Cas12a in Cas13a. <br /> <br /> Pokazali so, da je ob daljših časih inkubacije, višjih koncentracijah sgRNA in prisotnosti tarčne sekvence reporter bolj razgrajen, kar kaže na aktivacijo nespecifične endonukleazne aktivnosti encimov Cas12a in Cas13a. V primeru Cas13a je bilo nekaj reporterske RNA razgrajene tudi v odsotnosti tarčne sekvence, kar bi lahko vodilo v lažno pozitivne rezultate. Zato bi bila v tem delu projekta potrebna optimizacija. <br /> <br /> Sledila je inhibicija RNaz, ki so jo zaznavali s kompletom reagenov podjetja Thermofisher, kjer je kot reporter delovala RNA z vezanim fluoroforom in dušilcem fluorescence. Vzorce sline in urina so inkubirali s proteinazo K in fluorescenco primerjali v vzorcu brez proteinaze. Rezultati so pokazali, da je bila inhibicija RNaz v urinu po triurni inkubaciji boljša kot inhibicija v slini. Po prekonočni inkubaciji je bila tudi inhibicija v slini popolna, torej je metoda uspešna. <br /> <br /> Nato so proteinazo K inhibirali z 1mM PMSF in k tem vzorcem dodali še nekaj nove sline in urina, kjer se nahajajo aktivne RNaze, ter izvedli enako detekcijo kot prej. Pokazali so, da so v vzorcih prisotne aktivne RNaze, torej je bila aktivnost proteinaze K inhibirana.<br /> <br /> Preverili so še možnost uporabe hitrega testa z lateralnim tokom (ang. lateral flow strip) kot metode detekcije. Ugotovili so, da negativni testi dajo signal tako v testni, kot tudi v kontrolni liniji, saj se nekaj reporterja verjetno spontano razgradi. V tem primeru je še vedno jasna razlika med pozitivnim in negativnim testom, saj pri pozitivnem dobimo signal le v testni liniji. Vendar bi bila optimizacija testa za bolj nedvoumne rezultate vseeno dobrodošla.<br /> <br /> ==ZAKLJUČEK==<br /> V okviru projekta je skupina razvila postopek za detekcijo poljubnega izbranega biomarkerja v urinu. Pri tem so oblikovali številne enostavne in sestavljene biokocke za proteine Cas in sgRNA, ki so dostopne [https://2020.igem.org/Team:SDU-Denmark/Parts tukaj]. Projekt ima velik potencial za izboljšanje zgodnje diagnostike raka prostate, vendar bi bile potrebne še številne optimizacije. Izboljšati bi bilo treba metodo detekcije (hitri test z lateralnim tokom), da bi bili rezultati bolj nedvoumni, optimizirala bi se lahko tudi izbira biomarkerjev, saj so izbrani v tem projektu primerni predvsem za belsko populacijo. Poleg tega bi bil potreben dizajn embalaže, kjer bi se reakcija izvajala, saj bi le na ta način zagotovili ponovljivost razmer in s tem zanesljivost rezultatov testov.<br /> <br /> ==VIRI==<br /> <br /> [1] Benecchi, L. PSA velocity and PSA slope. Prostate Cancer Prostatic Dis 9, 169–172 (2006). doi:10.1038/sj.pcan.4500866<br /> <br /> [2] Gootenberg JS, Abudayyeh OO, Kellner MJ, Joung J, Collins JJ, Zhang F. Multiplexed and portable nucleic acid detection platform with Cas13, Cas12a, and Csm6. Science. 2018;360(6387):439-44. doi:10.1126/science.aaq0179<br /> <br /> [3] Creutzburg, S. C. A., Wu, W. Y., Mohanraju, P., Swartjes, T., Alkan, F., Gorodkin, J., . . . van der Oost, J. (2020). Good guide, bad guide: spacer sequence-dependent cleavage efficiency of Cas12a. Nucleic Acids Res, 48(6), 3228-3243. doi:10.1093/nar/gkz1240<br /> <br /> [4] Gootenberg JS, Abudayyeh OO, Lee JW, et al. Nucleic acid detection with CRISPR-Cas13a/C2c2. Science. 2017;356(6336):438-442. doi:10.1126/science.aam9321</div>

Luka.gnidovec https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=PROSTATUS:_Diagnostika_raka_prostate&diff=19304 2021-05-18T08:34:38Z

<p>Luka.gnidovec: </p> <hr /> <div>PROSTATUS je iGEM projekt iz leta 2020, ki je osvojil nominacijo v kategoriji Diagnostika med podiplomskimi študenti. Pripravili so ga študenti Univerze južne Danske. <br /> [https://2020.igem.org/Team:SDU-Denmark Spletna stran projekta:]<br /> <br /> ==UVOD==<br /> Rak prostate je eden najpogostejših rakov, ki se razvije pri enem izmed osmih moških. Število diagnosticiranih primerov se povečuje, k čemur verjetno pripomore povišan screening koncentracije PSA (prostate specific antigen) v krvi med moškimi. Ta test pa je precej nezanesljiv, z 31 % verjetnostjo lažnega pozitivnega rezultata in 42 % verjetnostjo lažnega negativnega rezultata. [1] Nivo PSA v krvi se lahko poviša iz številnih drugih razlogov (vnetje urinarnega trakta, ejakulacija, zdravila…). Poleg tega preverjanju krvne slike sledi še neprijeten in invaziven fizičen pregled. Vsekakor ima trenutni postopek screeninga raka prostate veliko potenciala za izboljšave.<br /> <br /> PROSTATUS je študentski projekt skupine iz Univerze južne Danske, s katerim so sodelovali na iGEM-u 2020 v kategoriji podiplomskih študentov. V projektu so razvili neinvazivno metodo, pri kateri zaznavamo tri RNA biomarkerje v urinu (TMPRSS2:ERG, AMACR, PCA3) in dva SNP-ja (rs6983267, rs16901979), ki povečata verjetnost razvoja raka prostate, v DNA v slini. Test deluje na podlagi sistema CRISPR-Cas13a v primeru zaznavanja RNA biomarkerjev in sistema CRISPR-Cas12a v primeru zaznavanja SNP-jev.<br /> <br /> ==OPIS PROJEKTA==<br /> ===PRINCIP DELOVANJA SISTEMA===<br /> Skupina je v projektu uporabila dve metodi, ki temeljita na delovanju proteinov družine Cas. <br /> ====SHERLOCK====<br /> SHERLOCK (Specific High-sensitivity Enzymatic Reporter unLOCKinkg) je metoda, ki s pomočjo encima Cas13a zaznava ssRNA v vzorcu. V Cas13a je vezana sgRNA (single guide RNA), ki zazna komplementarno tarčo v vzorcu. Ko pride do hibridizacije s tarčo, se Cas13a aktivira in cepi tudi netarčno RNA v vzorcu. Na ta način lahko pride do cepitve reporterske RNA. [2]<br /> <br /> ====DETECTR====<br /> DETECTR (The DNA Edonuclease Targeted CRISPR Trans Reporter system) je metoda, ki uporablja Cas12a in zaznava tarčno ssDNA v vzorcu, ob prepoznavi tarče pa pridobi nespecifično endonukleazno aktivnost in cepi reportersko ssDNA. [2]<br /> <br /> ===POTEK OBLIKOVANJA PROJEKTA===<br /> ====Kloniranje==== <br /> Za implementacijo teh dveh metod so morali najprej izraziti dva Cas encima ter pridobiti različne sgRNA, ki se vežejo v encima. <br /> Encime so izražali v E. ''coli''. Uporabili so gena cas13a iz bakterije Leptotrichia wadei in cas12a iz Acidaminococcus sp. Z orodjem podjetja IDT so optimizirali rabo kodonov ter nato v konstrukt dodali vse potrebne komponente za izražanje proteinov (IPTG inducibilni promotor, RBS, terminator ter oznaki SUMO in His na N-koncu) ter naročili sintetični gen, ki so mu nato dodali še restrikcijska mesta za EcoRI in SpeI. <br /> Gen cas12a, vstavljen v plazmid, so pridobili od raziskovalne skupine iz Univerze južne Danske. S pomnoževanjem s PCR so genu dodali promotorsko regijo sintetičnega gena cas13a. Oba konstrukta so nato klonirali v vektor pSB1C3 in transformirali kompetentne celice E. coli seva ER2256. <br /> ====Načrtovanje sgRNA====<br /> Nato so dizajnirali sgRNA, ki se veže v Cas proteina in je ključna za prepoznavanje tarče. Za aktivacijo Cas12a je v oddaljenosti največ 21 bp od tarče potreben PAM motiv (TTTV). Poleg tega je za specifično aktivacijo Cas12a pomembno 100 % ujemanje v začetnem delu t. i. prilegajoče regije sgRNA (ang. spacer sequence) medtem ko v bolj oddaljenem območju prilegajoče regije 100 % ujemanje za aktivacijo ni potrebno. Če želimo specifično prepoznati SNP, je torej pomembno, da se ta nahaja v začetni regiji tarče, sicer bi dobili nespecifično aktivacijo in signal, ki ne bi bil odvisen od SNP-ja. Optimalna dolžina prilegajoče regije naj bi bila 21 – 24 nukleotidov. Vse te omejitve je skupina upoštevala pri dizajnu sgRNA za Cas12a. Oblikovali so štiri sgRNA, ki se vežejo na Cas12a in prepoznajo posamezne možne alele (prevladujoč alel in alel, ki poviša možnost za razvoj raka prostate). [3]<br /> <br /> Pri oblikovanju sgRNA za Cas13a so upoštevali optimalno dolžino prilegajoče regije 28-31 nukleotidov, prav tako pa pri sgRNA encima Cas13a velja pravilo o 100 % prileganju začetnega dela prilegajoče regije. Cas13a sicer za prepoznavo tarče ne potrebuje PAM motiva. Skupina je oblikovala tri sgRNA za Cas13a, ki se vežejo na RNA biomarkerje v urinu. [4]<br /> <br /> ====Pomnoževanje z metodo RPA====<br /> Ker obstaja verjetnost, da ta sistem ne bi zaznal zelo nizkih koncentracij RNA biomarkerjev v vzorcu, bi pred detekcijo RNA biomarkerje še namnožili z uporabo metode pomnoževanja z rekombinazo in polimerazo (ang. recombinase polymerase amplification – RPA). Gre za proces, alternativen PCR, ki poteka izotermalno in je zato njegova izvedba precej bolj enostavna. Za pomnožitev RNA bi potrebovali štiri encime, in sicer rekombinazo, ssDNA vezavne proteine (SSB) reverzno transkriptazo in DNA polimerazo. Da bi pridobili še pomnoženo RNA in ne le cDNA, bi uporabili še T7 polimerazo. <br /> <br /> V reakciji reverzna transkriptaza najprej prepiše ssRNA v cDNA. V RNA/DNA hibrid rekombinaza vstavi začetne oligonukleotide, ki so komplementarni RNA tarči. Na smerne začetne oligonukleotide bi dodali še T7 promotor. SSB stabilizirajo odrinjeno ssDNA na mestu vezave oligonukleotida, reverzna transkriptaza pa nato spet prepiše RNA verigo v cDNA. Iz novonastale cDNA z dodanim T7 promotorjem nato nastane RNA transkript, ki je na koncu reakcije prisoten v visoki koncentraciji in ga zlahka zaznamo v vzorcu. V opisu projekta ne omenjajo DNA polimeraze, a vendar bi bila ta potrebna za sintezo druge verige cDNA. Lahko bi uporabili tudi encim, ki lahko deluje kot reverzna transkriptaza in DNA polimeraza. <br /> <br /> Podobno reakcijo bi lahko zasnovali tudi za pomnoževanje DNA fragmentov, ki vsebujejo SNP-je, le da bi v tem primeru potrebovali le DNA polimerazo, ne pa tudi reverzne transkriptaze.<br /> <br /> ====Inhibicija aktivnosti RNaz====<br /> Ker pri zaznavanju RNA uporabljamo RNaze, ki se aktivirajo ob specifičnem signalu, bi ostale RNaze v urinu lahko motile specifično cepitev reporterja. Zato je ključna inaktivacija RNaz v vzorcu. V projektu bi uporabili metodo cepitve RNaz s proteinazo K. Po obdelavi vzorca s proteinazo K bi slednjo inaktivirali s fenilmetilsulfonil fluoridom (PMSF), da ne bi razgradila encimov Cas. <br /> ====Detekcija cepitve reporterja====<br /> Za detekcijo cepitve reporterja s Cas12a in Cas13a bi v projektu uporabili hitri test z lateralnim tokom (ang. lateral flow strip). Ta metoda za vizualizacijo rezultatov uporablja anti-FAM-protitelesa s pripetimi zlatimi nanodelci v kombinaciji s posebnim reporterjem. Reporter prek ssRNA ali ssDNA verige povezuje biotin in fluorescein amidit (FAM). Cepitev reporterja se vizualizira na traku, na katerem sta prisotni dve liniji – testna in kontrolna. Če pride do cepitve verige reporterja, se na FAM na cepljenem reporterju lahko veže anti-FAM-protitelo z zlatimi nanodelci na način, ki omogoča vezavo na sekundarna protitelesa, imobilizirana na testni liniji na traku za detekcijo. V primeru, da se reporter ne cepi, pa se protitelesa vežejo na FAM na način, ki ne omogoča vezave na sekundarna protitelesa in se zato reporter prek biotina veže na kontrolno linijo na traku za detekcijo.<br /> <br /> ==REZULTATI==<br /> Skupina je z nikelj-afinitetno kromatografijo uspešno izolirala encima Cas12a in Cas13a ter z in vitro transkripcijo sintetizirala sgRNA. Skupaj so inkubirali izolirana encima in različne koncentracije sgRNA, nato pa preverili, ali prisotnost tarče v vzorcu vzbudi nespecifično endonukleazno aktivnost Cas12a in Cas13a. <br /> <br /> Pokazali so, da je ob daljših časih inkubacije, višjih koncentracijah sgRNA in prisotnosti tarčne sekvence reporter bolj razgrajen, kar kaže na aktivacijo nespecifične endonukleazne aktivnosti encimov Cas12a in Cas13a. V primeru Cas13a je bilo nekaj reporterske RNA razgrajene tudi v odsotnosti tarčne sekvence, kar bi lahko vodilo v lažno pozitivne rezultate. Zato bi bila v tem delu projekta potrebna optimizacija. <br /> <br /> Sledila je inhibicija RNaz, ki so jo zaznavali s kompletom reagenov podjetja Thermofisher, kjer je kot reporter delovala RNA z vezanim fluoroforom in dušilcem fluorescence. Vzorce sline in urina so inkubirali s proteinazo K in fluorescenco primerjali v vzorcu brez proteinaze. Rezultati so pokazali, da je bila inhibicija RNaz v urinu po triurni inkubaciji boljša kot inhibicija v slini. Po prekonočni inkubaciji je bila tudi inhibicija v slini popolna, torej je metoda uspešna. <br /> <br /> Nato so proteinazo K inhibirali z 1mM PMSF in k tem vzorcem dodali še nekaj nove sline in urina, kjer se nahajajo aktivne RNaze, ter izvedli enako detekcijo kot prej. Pokazali so, da so v vzorcih prisotne aktivne RNaze, torej je bila aktivnost proteinaze K inhibirana.<br /> <br /> Preverili so še možnost uporabe hitrega testa z lateralnim tokom (ang. lateral flow strip) kot metode detekcije. Ugotovili so, da negativni testi dajo signal tako v testni, kot tudi v kontrolni liniji, saj se nekaj reporterja verjetno spontano razgradi. V tem primeru je še vedno jasna razlika med pozitivnim in negativnim testom, saj pri pozitivnem dobimo signal le v testni liniji. Vendar bi bila optimizacija testa za bolj nedvoumne rezultate vseeno dobrodošla.<br /> <br /> ==ZAKLJUČEK==<br /> V okviru projekta je skupina razvila postopek za detekcijo poljubnega izbranega biomarkerja v urinu. Pri tem so oblikovali številne enostavne in sestavljene biokocke za proteine Cas in sgRNA, ki so dostopne [https://2020.igem.org/Team:SDU-Denmark/Parts tukaj]. Projekt ima velik potencial za izboljšanje zgodnje diagnostike raka prostate, vendar bi bile potrebne še številne optimizacije. Izboljšati bi bilo treba metodo detekcije (hitri test z lateralnim tokom), da bi bili rezultati bolj nedvoumni, optimizirala bi se lahko tudi izbira biomarkerjev, saj so izbrani v tem projektu primerni predvsem za belsko populacijo. Poleg tega bi bil potreben dizajn embalaže, kjer bi se reakcija izvajala, saj bi le na ta način zagotovili ponovljivost razmer in s tem zanesljivost rezultatov testov.<br /> <br /> ==VIRI==<br /> <br /> [1] Benecchi, L. PSA velocity and PSA slope. Prostate Cancer Prostatic Dis 9, 169–172 (2006). doi:10.1038/sj.pcan.4500866<br /> <br /> [2] Gootenberg JS, Abudayyeh OO, Kellner MJ, Joung J, Collins JJ, Zhang F. Multiplexed and portable nucleic acid detection platform with Cas13, Cas12a, and Csm6. Science. 2018;360(6387):439-44. doi:10.1126/science.aaq0179<br /> <br /> [3] Creutzburg, S. C. A., Wu, W. Y., Mohanraju, P., Swartjes, T., Alkan, F., Gorodkin, J., . . . van der Oost, J. (2020). Good guide, bad guide: spacer sequence-dependent cleavage efficiency of Cas12a. Nucleic Acids Res, 48(6), 3228-3243. doi:10.1093/nar/gkz1240<br /> <br /> [4] Gootenberg JS, Abudayyeh OO, Lee JW, et al. Nucleic acid detection with CRISPR-Cas13a/C2c2. Science. 2017;356(6336):438-442. doi:10.1126/science.aam9321</div>

Luka.gnidovec https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=PROSTATUS:_Diagnostika_raka_prostate&diff=19303 2021-05-18T06:47:51Z

<p>Luka.gnidovec: /* UVOD */</p> <hr /> <div>PROSTATUS je iGEM projekt iz leta 2020, ki je osvojil nominacijo v kategoriji Diagnostika med podiplomskimi študenti. Pripravili so ga študenti Univerze južne Danske. <br /> [https://2020.igem.org/Team:SDU-Denmark Spletna stran projekta:]<br /> <br /> ==UVOD==<br /> Rak prostate je eden najpogostejših rakov, ki se razvije pri enem izmed osmih moških. Število diagnosticiranih primerov se povečuje, k čemur verjetno pripomore povišan screening koncentracije PSA (prostate specific antigen) v krvi med moškimi. Ta test pa je precej nezanesljiv, z 31 % verjetnostjo lažnega pozitivnega rezultata in 42 % verjetnostjo lažnega negativnega rezultata. [1] Nivo PSA v krvi se lahko poviša iz številnih drugih razlogov (vnetje urinarnega trakta, ejakulacija, zdravila…). Poleg tega preverjanju krvne slike sledi še neprijeten in invaziven fizičen pregled. Vsekakor ima trenutni postopek screeninga raka prostate veliko potenciala za izboljšave.<br /> <br /> PROSTATUS je študentski projekt skupine iz Univerze južne Danske, s katerim so sodelovali na iGEM-u 2020 v kategoriji podiplomskih študentov. V projektu so razvili neinvazivno metodo, pri kateri zaznavamo tri RNA biomarkerje v urinu (TMPRSS2:ERG, AMACR, PCA3) in dva SNP-ja (rs6983267, rs16901979), ki povečata verjetnost razvoja raka prostate, v DNA v slini. Test deluje na podlagi sistema CRISPR-Cas13a v primeru zaznavanja RNA biomarkerjev in sistema CRISPR-Cas12a v primeru zaznavanja SNP-jev.<br /> <br /> ==OPIS PROJEKTA==<br /> ===PRINCIP DELOVANJA SISTEMA===<br /> Skupina je v projektu uporabila dve metodi, ki temeljita na delovanju proteinov družine Cas. <br /> ====SHERLOCK====<br /> SHERLOCK (Specific High-sensitivity Enzymatic Reporter unLOCKinkg) je metoda, ki s pomočjo encima Cas13a zaznava ssRNA v vzorcu. V Cas13a je vezana sgRNA (single guide RNA), ki zazna komplementarno tarčo v vzorcu. Ko pride do hibridizacije s tarčo, se Cas13a aktivira in cepi tudi netarčno RNA v vzorcu. Na ta način lahko pride do cepitve reporterske RNA. [2]<br /> <br /> ====DETECTR====<br /> DETECTR (The DNA Edonuclease Targeted CRISPR Trans Reporter system) je metoda, ki uporablja Cas12a in zaznava tarčno ssDNA v vzorcu, ob prepoznavi tarče pa pridobi nespecifično endonukleazno aktivnost in cepi reportersko ssDNA. [2]<br /> <br /> ===POTEK OBLIKOVANJA PROJEKTA===<br /> ====Kloniranje==== <br /> Za implementacijo teh dveh metod so morali najprej izraziti dva Cas encima ter pridobiti različne sgRNA, ki se vežejo v encima. <br /> Encime so izražali v E. coli. Uporabili so gena cas13a iz bakterije Leptotrichia wadei in cas12a iz Acidaminococcus sp. Z orodjem podjetja IDT so optimizirali rabo kodonov ter nato v konstrukt dodali vse potrebne komponente za izražanje proteinov (IPTG inducibilni promotor, RBS, terminator ter oznaki SUMO in His na N-koncu) ter naročili sintetični gen, ki so mu nato dodali še restrikcijska mesta za EcoRI in SpeI. <br /> Gen cas12a, vstavljen v plazmid, so pridobili od raziskovalne skupine iz Univerze južne Danske. S pomnoževanjem s PCR so genu dodali promotorsko regijo sintetičnega gena cas13a. Oba konstrukta so nato klonirali v vektor pSB1C3 in transformirali kompetentne celice E. coli seva ER2256. <br /> ====Načrtovanje sgRNA====<br /> Nato so dizajnirali sgRNA, ki se veže v Cas proteina in je ključna za prepoznavanje tarče. Za aktivacijo Cas12a je v oddaljenosti največ 21 bp od tarče potreben PAM motiv (TTTV). Poleg tega je za specifično aktivacijo Cas12a pomembno 100 % ujemanje v začetnem delu t. i. prilegajoče regije sgRNA (ang. spacer sequence) medtem ko v bolj oddaljenem območju prilegajoče regije 100 % ujemanje za aktivacijo ni potrebno. Če želimo specifično prepoznati SNP, je torej pomembno, da se ta nahaja v začetni regiji tarče, sicer bi dobili nespecifično aktivacijo in signal, ki ne bi bil odvisen od SNP-ja. Optimalna dolžina prilegajoče regije naj bi bila 21 – 24 nukleotidov. Vse te omejitve je skupina upoštevala pri dizajnu sgRNA za Cas12a. Oblikovali so štiri sgRNA, ki se vežejo na Cas12a in prepoznajo posamezne možne alele (prevladujoč alel in alel, ki poviša možnost za razvoj raka prostate). [3]<br /> <br /> Pri oblikovanju sgRNA za Cas13a so upoštevali optimalno dolžino prilegajoče regije 28-31 nukleotidov, prav tako pa pri sgRNA encima Cas13a velja pravilo o 100 % prileganju začetnega dela prilegajoče regije. Cas13a sicer za prepoznavo tarče ne potrebuje PAM motiva. Skupina je oblikovala tri sgRNA za Cas13a, ki se vežejo na RNA biomarkerje v urinu. [4]<br /> <br /> ====Pomnoževanje z metodo RPA====<br /> Ker obstaja verjetnost, da ta sistem ne bi zaznal zelo nizkih koncentracij RNA biomarkerjev v vzorcu, bi pred detekcijo RNA biomarkerje še namnožili z uporabo metode pomnoževanja z rekombinazo in polimerazo (ang. recombinase polymerase amplification – RPA). Gre za proces, alternativen PCR, ki poteka izotermalno in je zato njegova izvedba precej bolj enostavna. Za pomnožitev RNA bi potrebovali štiri encime, in sicer rekombinazo, ssDNA vezavne proteine (SSB) reverzno transkriptazo in DNA polimerazo. Da bi pridobili še pomnoženo RNA in ne le cDNA, bi uporabili še T7 polimerazo. <br /> <br /> V reakciji reverzna transkriptaza najprej prepiše ssRNA v cDNA. V RNA/DNA hibrid rekombinaza vstavi začetne oligonukleotide, ki so komplementarni RNA tarči. Na smerne začetne oligonukleotide bi dodali še T7 promotor. SSB stabilizirajo odrinjeno ssDNA na mestu vezave oligonukleotida, reverzna transkriptaza pa nato spet prepiše RNA verigo v cDNA. Iz novonastale cDNA z dodanim T7 promotorjem nato nastane RNA transkript, ki je na koncu reakcije prisoten v visoki koncentraciji in ga zlahka zaznamo v vzorcu. V opisu projekta ne omenjajo DNA polimeraze, a vendar bi bila ta potrebna za sintezo druge verige cDNA. Lahko bi uporabili tudi encim, ki lahko deluje kot reverzna transkriptaza in DNA polimeraza. <br /> <br /> Podobno reakcijo bi lahko zasnovali tudi za pomnoževanje DNA fragmentov, ki vsebujejo SNP-je, le da bi v tem primeru potrebovali le DNA polimerazo, ne pa tudi reverzne transkriptaze.<br /> <br /> ====Inhibicija aktivnosti RNaz====<br /> Ker pri zaznavanju RNA uporabljamo RNaze, ki se aktivirajo ob specifičnem signalu, bi ostale RNaze v urinu lahko motile specifično cepitev reporterja. Zato je ključna inaktivacija RNaz v vzorcu. V projektu bi uporabili metodo cepitve RNaz s proteinazo K. Po obdelavi vzorca s proteinazo K bi slednjo inaktivirali s fenilmetilsulfonil fluoridom (PMSF), da ne bi razgradila encimov Cas. <br /> ====Detekcija cepitve reporterja====<br /> Za detekcijo cepitve reporterja s Cas12a in Cas13a bi v projektu uporabili hitri test z lateralnim tokom (ang. lateral flow strip). Ta metoda za vizualizacijo rezultatov uporablja anti-FAM-protitelesa s pripetimi zlatimi nanodelci v kombinaciji s posebnim reporterjem. Reporter prek ssRNA ali ssDNA verige povezuje biotin in fluorescein amidit (FAM). Cepitev reporterja se vizualizira na traku, na katerem sta prisotni dve liniji – testna in kontrolna. Če pride do cepitve verige reporterja, se na FAM na cepljenem reporterju lahko veže anti-FAM-protitelo z zlatimi nanodelci na način, ki omogoča vezavo na sekundarna protitelesa, imobilizirana na testni liniji na traku za detekcijo. V primeru, da se reporter ne cepi, pa se protitelesa vežejo na FAM na način, ki ne omogoča vezave na sekundarna protitelesa in se zato reporter prek biotina veže na kontrolno linijo na traku za detekcijo.<br /> <br /> ==REZULTATI==<br /> Skupina je uspešno izolirala encima Cas12a in Cas13a ter z in vitro transkripcijo sintetizirala sgRNA. Skupaj so inkubirali izolirana encima in različne koncentracije sgRNA, nato pa preverili, ali prisotnost tarče v vzorcu vzbudi nespecifično endonukleazno aktivnost Cas12a in Cas13a. <br /> <br /> Pokazali so, da je ob daljših časih inkubacije, višjih koncentracijah sgRNA in prisotnosti tarčne sekvence reporter bolj razgrajen, kar kaže na aktivacijo nespecifične endonukleazne aktivnosti encimov Cas12a in Cas13a. V primeru Cas13a je bilo nekaj reporterske RNA razgrajene tudi v odsotnosti tarčne sekvence, kar bi lahko vodilo v lažno pozitivne rezultate. Zato bi bila v tem delu projekta potrebna optimizacija. <br /> <br /> Sledila je inhibicija RNaz, ki so jo zaznavali s kompletom reagenov podjetja Thermofisher, kjer je kot reporter delovala RNA z vezanim fluoroforom in dušilcem fluorescence. Vzorce sline in urina so inkubirali s proteinazo K in fluorescenco primerjali v vzorcu brez proteinaze. Rezultati so pokazali, da je bila inhibicija RNaz v urinu po triurni inkubaciji boljša kot inhibicija v slini. Po prekonočni inkubaciji je bila tudi inhibicija v slini popolna, torej je metoda uspešna. <br /> <br /> Nato so proteinazo K inhibirali z 1mM PMSF in k tem vzorcem dodali še nekaj nove sline in urina, kjer se nahajajo aktivne RNaze, ter izvedli enako detekcijo kot prej. Pokazali so, da so v vzorcih prisotne aktivne RNaze, torej je bila aktivnost proteinaze K inhibirana.<br /> <br /> Preverili so še možnost uporabe hitrega testa z lateralnim tokom (ang. lateral flow strip) kot metode detekcije. Ugotovili so, da negativni testi dajo signal tako v testni, kot tudi v kontrolni liniji, saj se nekaj reporterja verjetno spontano razgradi. V tem primeru je še vedno jasna razlika med pozitivnim in negativnim testom, saj pri pozitivnem dobimo signal le v testni liniji. Vendar bi bila optimizacija testa za bolj nedvoumne rezultate vseeno dobrodošla.<br /> <br /> ==ZAKLJUČEK==<br /> V okviru projekta je skupina razvila postopek za detekcijo poljubnega izbranega biomarkerja v urinu. Pri tem so oblikovali številne enostavne in sestavljene biokocke za proteine Cas in sgRNA, ki so dostopne [https://2020.igem.org/Team:SDU-Denmark/Parts tukaj]. Projekt ima velik potencial za izboljšanje zgodnje diagnostike raka prostate, vendar bi bile potrebne še številne optimizacije. Izboljšati bi bilo treba metodo detekcije (hitri test z lateralnim tokom), da bi bili rezultati bolj nedvoumni, optimizirala bi se lahko tudi izbira biomarkerjev, saj so izbrani v tem projektu primerni predvsem za belsko populacijo. Poleg tega bi bil potreben dizajn embalaže, kjer bi se reakcija izvajala, saj bi le na ta način zagotovili ponovljivost razmer in s tem zanesljivost rezultatov testov.<br /> <br /> ==VIRI==<br /> <br /> [1] Benecchi, L. PSA velocity and PSA slope. Prostate Cancer Prostatic Dis 9, 169–172 (2006). doi:10.1038/sj.pcan.4500866<br /> <br /> [2] Gootenberg JS, Abudayyeh OO, Kellner MJ, Joung J, Collins JJ, Zhang F. Multiplexed and portable nucleic acid detection platform with Cas13, Cas12a, and Csm6. Science. 2018;360(6387):439-44. doi:10.1126/science.aaq0179<br /> <br /> [3] Creutzburg, S. C. A., Wu, W. Y., Mohanraju, P., Swartjes, T., Alkan, F., Gorodkin, J., . . . van der Oost, J. (2020). Good guide, bad guide: spacer sequence-dependent cleavage efficiency of Cas12a. Nucleic Acids Res, 48(6), 3228-3243. doi:10.1093/nar/gkz1240<br /> <br /> [4] Gootenberg JS, Abudayyeh OO, Lee JW, et al. Nucleic acid detection with CRISPR-Cas13a/C2c2. Science. 2017;356(6336):438-442. doi:10.1126/science.aam9321</div>

Luka.gnidovec https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=PROSTATUS:_Diagnostika_raka_prostate&diff=19300 2021-05-18T06:13:00Z

<p>Luka.gnidovec: /* ZAKLJUČEK */</p> <hr /> <div>PROSTATUS je iGEM projekt iz leta 2020, ki je osvojil nominacijo v kategoriji Diagnostika med podiplomskimi študenti. Pripravili so ga študenti Univerze južne Danske. <br /> [https://2020.igem.org/Team:SDU-Denmark Spletna stran projekta:]<br /> <br /> ==UVOD==<br /> Rak prostate je eden najpogostejših rakov, ki se razvije pri enem izmed osmih moških. Število diagnosticiranih primerov se povečuje, k čemur verjetno pripomore povišan screening koncentracije PSA (prostate specific antigen) v krvi med moškimi. Ta test pa je precej nezanesljiv, z 31 % verjetnostjo lažnega pozitivnega rezultata in 42 % verjetnostjo lažnega negativnega rezultata.[1] PSA nivo v krvi se lahko poviša iz številnih drugih razlogov (vnetje urinarnega trakta, ejakulacija, zdravila…). Poleg tega preverjanju krvne slike sledi še neprijeten in invaziven fizičen pregled. Vsekakor ima trenutni postopek screeninga raka prostate veliko potenciala za izboljšave.<br /> <br /> PROSTATUS je študentski projekt skupine iz Univerze južne Danske, s katerim so sodelovali na iGEM-u 2020 v kategoriji podiplomskih študentov. V projektu so razvili neinvazivno metodo, pri kateri zaznavamo tri RNA biomarkerje v urinu (TMPRSS2:ERG, AMACR, PCA3) in dva SNP-ja (rs6983267, rs16901979), ki povečata verjetnost razvoja raka prostate, v DNA v slini. Test deluje na podlagi sistema CRISPR-Cas13a v primeru zaznavanja RNA biomarkerjev in sistema CRISPR-Cas12a v primeru zaznavanja SNP-jev.<br /> <br /> ==OPIS PROJEKTA==<br /> ===PRINCIP DELOVANJA SISTEMA===<br /> Skupina je v projektu uporabila dve metodi, ki temeljita na delovanju proteinov družine Cas. <br /> ====SHERLOCK====<br /> SHERLOCK (Specific High-sensitivity Enzymatic Reporter unLOCKinkg) je metoda, ki s pomočjo encima Cas13a zaznava ssRNA v vzorcu. V Cas13a je vezana sgRNA (single guide RNA), ki zazna komplementarno tarčo v vzorcu. Ko pride do hibridizacije s tarčo, se Cas13a aktivira in cepi tudi netarčno RNA v vzorcu. Na ta način lahko pride do cepitve reporterske RNA. [2]<br /> <br /> ====DETECTR====<br /> DETECTR (The DNA Edonuclease Targeted CRISPR Trans Reporter system) je metoda, ki uporablja Cas12a in zaznava tarčno ssDNA v vzorcu, ob prepoznavi tarče pa pridobi nespecifično endonukleazno aktivnost in cepi reportersko ssDNA. [2]<br /> <br /> ===POTEK OBLIKOVANJA PROJEKTA===<br /> ====Kloniranje==== <br /> Za implementacijo teh dveh metod so morali najprej izraziti dva Cas encima ter pridobiti različne sgRNA, ki se vežejo v encima. <br /> Encime so izražali v E. coli. Uporabili so gena cas13a iz bakterije Leptotrichia wadei in cas12a iz Acidaminococcus sp. Z orodjem podjetja IDT so optimizirali rabo kodonov ter nato v konstrukt dodali vse potrebne komponente za izražanje proteinov (IPTG inducibilni promotor, RBS, terminator ter oznaki SUMO in His na N-koncu) ter naročili sintetični gen, ki so mu nato dodali še restrikcijska mesta za EcoRI in SpeI. <br /> Gen cas12a, vstavljen v plazmid, so pridobili od raziskovalne skupine iz Univerze južne Danske. S pomnoževanjem s PCR so genu dodali promotorsko regijo sintetičnega gena cas13a. Oba konstrukta so nato klonirali v vektor pSB1C3 in transformirali kompetentne celice E. coli seva ER2256. <br /> ====Načrtovanje sgRNA====<br /> Nato so dizajnirali sgRNA, ki se veže v Cas proteina in je ključna za prepoznavanje tarče. Za aktivacijo Cas12a je v oddaljenosti največ 21 bp od tarče potreben PAM motiv (TTTV). Poleg tega je za specifično aktivacijo Cas12a pomembno 100 % ujemanje v začetnem delu t. i. prilegajoče regije sgRNA (ang. spacer sequence) medtem ko v bolj oddaljenem območju prilegajoče regije 100 % ujemanje za aktivacijo ni potrebno. Če želimo specifično prepoznati SNP, je torej pomembno, da se ta nahaja v začetni regiji tarče, sicer bi dobili nespecifično aktivacijo in signal, ki ne bi bil odvisen od SNP-ja. Optimalna dolžina prilegajoče regije naj bi bila 21 – 24 nukleotidov. Vse te omejitve je skupina upoštevala pri dizajnu sgRNA za Cas12a. Oblikovali so štiri sgRNA, ki se vežejo na Cas12a in prepoznajo posamezne možne alele (prevladujoč alel in alel, ki poviša možnost za razvoj raka prostate). [3]<br /> <br /> Pri oblikovanju sgRNA za Cas13a so upoštevali optimalno dolžino prilegajoče regije 28-31 nukleotidov, prav tako pa pri sgRNA encima Cas13a velja pravilo o 100 % prileganju začetnega dela prilegajoče regije. Cas13a sicer za prepoznavo tarče ne potrebuje PAM motiva. Skupina je oblikovala tri sgRNA za Cas13a, ki se vežejo na RNA biomarkerje v urinu. [4]<br /> <br /> ====Pomnoževanje z metodo RPA====<br /> Ker obstaja verjetnost, da ta sistem ne bi zaznal zelo nizkih koncentracij RNA biomarkerjev v vzorcu, bi pred detekcijo RNA biomarkerje še namnožili z uporabo metode pomnoževanja z rekombinazo in polimerazo (ang. recombinase polymerase amplification – RPA). Gre za proces, alternativen PCR, ki poteka izotermalno in je zato njegova izvedba precej bolj enostavna. Za pomnožitev RNA bi potrebovali štiri encime, in sicer rekombinazo, ssDNA vezavne proteine (SSB) reverzno transkriptazo in DNA polimerazo. Da bi pridobili še pomnoženo RNA in ne le cDNA, bi uporabili še T7 polimerazo. <br /> <br /> V reakciji reverzna transkriptaza najprej prepiše ssRNA v cDNA. V RNA/DNA hibrid rekombinaza vstavi začetne oligonukleotide, ki so komplementarni RNA tarči. Na smerne začetne oligonukleotide bi dodali še T7 promotor. SSB stabilizirajo odrinjeno ssDNA na mestu vezave oligonukleotida, reverzna transkriptaza pa nato spet prepiše RNA verigo v cDNA. Iz novonastale cDNA z dodanim T7 promotorjem nato nastane RNA transkript, ki je na koncu reakcije prisoten v visoki koncentraciji in ga zlahka zaznamo v vzorcu. V opisu projekta ne omenjajo DNA polimeraze, a vendar bi bila ta potrebna za sintezo druge verige cDNA. Lahko bi uporabili tudi encim, ki lahko deluje kot reverzna transkriptaza in DNA polimeraza. <br /> <br /> Podobno reakcijo bi lahko zasnovali tudi za pomnoževanje DNA fragmentov, ki vsebujejo SNP-je, le da bi v tem primeru potrebovali le DNA polimerazo, ne pa tudi reverzne transkriptaze.<br /> <br /> ====Inhibicija aktivnosti RNaz====<br /> Ker pri zaznavanju RNA uporabljamo RNaze, ki se aktivirajo ob specifičnem signalu, bi ostale RNaze v urinu lahko motile specifično cepitev reporterja. Zato je ključna inaktivacija RNaz v vzorcu. V projektu bi uporabili metodo cepitve RNaz s proteinazo K. Po obdelavi vzorca s proteinazo K bi slednjo inaktivirali s fenilmetilsulfonil fluoridom (PMSF), da ne bi razgradila encimov Cas. <br /> ====Detekcija cepitve reporterja====<br /> Za detekcijo cepitve reporterja s Cas12a in Cas13a bi v projektu uporabili hitri test z lateralnim tokom (ang. lateral flow strip). Ta metoda za vizualizacijo rezultatov uporablja anti-FAM-protitelesa s pripetimi zlatimi nanodelci v kombinaciji s posebnim reporterjem. Reporter prek ssRNA ali ssDNA verige povezuje biotin in fluorescein amidit (FAM). Cepitev reporterja se vizualizira na traku, na katerem sta prisotni dve liniji – testna in kontrolna. Če pride do cepitve verige reporterja, se na FAM na cepljenem reporterju lahko veže anti-FAM-protitelo z zlatimi nanodelci na način, ki omogoča vezavo na sekundarna protitelesa, imobilizirana na testni liniji na traku za detekcijo. V primeru, da se reporter ne cepi, pa se protitelesa vežejo na FAM na način, ki ne omogoča vezave na sekundarna protitelesa in se zato reporter prek biotina veže na kontrolno linijo na traku za detekcijo.<br /> <br /> ==REZULTATI==<br /> Skupina je uspešno izolirala encima Cas12a in Cas13a ter z in vitro transkripcijo sintetizirala sgRNA. Skupaj so inkubirali izolirana encima in različne koncentracije sgRNA, nato pa preverili, ali prisotnost tarče v vzorcu vzbudi nespecifično endonukleazno aktivnost Cas12a in Cas13a. <br /> <br /> Pokazali so, da je ob daljših časih inkubacije, višjih koncentracijah sgRNA in prisotnosti tarčne sekvence reporter bolj razgrajen, kar kaže na aktivacijo nespecifične endonukleazne aktivnosti encimov Cas12a in Cas13a. V primeru Cas13a je bilo nekaj reporterske RNA razgrajene tudi v odsotnosti tarčne sekvence, kar bi lahko vodilo v lažno pozitivne rezultate. Zato bi bila v tem delu projekta potrebna optimizacija. <br /> <br /> Sledila je inhibicija RNaz, ki so jo zaznavali s kompletom reagenov podjetja Thermofisher, kjer je kot reporter delovala RNA z vezanim fluoroforom in dušilcem fluorescence. Vzorce sline in urina so inkubirali s proteinazo K in fluorescenco primerjali v vzorcu brez proteinaze. Rezultati so pokazali, da je bila inhibicija RNaz v urinu po triurni inkubaciji boljša kot inhibicija v slini. Po prekonočni inkubaciji je bila tudi inhibicija v slini popolna, torej je metoda uspešna. <br /> <br /> Nato so proteinazo K inhibirali z 1mM PMSF in k tem vzorcem dodali še nekaj nove sline in urina, kjer se nahajajo aktivne RNaze, ter izvedli enako detekcijo kot prej. Pokazali so, da so v vzorcih prisotne aktivne RNaze, torej je bila aktivnost proteinaze K inhibirana.<br /> <br /> Preverili so še možnost uporabe hitrega testa z lateralnim tokom (ang. lateral flow strip) kot metode detekcije. Ugotovili so, da negativni testi dajo signal tako v testni, kot tudi v kontrolni liniji, saj se nekaj reporterja verjetno spontano razgradi. V tem primeru je še vedno jasna razlika med pozitivnim in negativnim testom, saj pri pozitivnem dobimo signal le v testni liniji. Vendar bi bila optimizacija testa za bolj nedvoumne rezultate vseeno dobrodošla.<br /> <br /> ==ZAKLJUČEK==<br /> V okviru projekta je skupina razvila postopek za detekcijo poljubnega izbranega biomarkerja v urinu. Pri tem so oblikovali številne enostavne in sestavljene biokocke za proteine Cas in sgRNA, ki so dostopne [https://2020.igem.org/Team:SDU-Denmark/Parts tukaj]. Projekt ima velik potencial za izboljšanje zgodnje diagnostike raka prostate, vendar bi bile potrebne še številne optimizacije. Izboljšati bi bilo treba metodo detekcije (hitri test z lateralnim tokom), da bi bili rezultati bolj nedvoumni, optimizirala bi se lahko tudi izbira biomarkerjev, saj so izbrani v tem projektu primerni predvsem za belsko populacijo. Poleg tega bi bil potreben dizajn embalaže, kjer bi se reakcija izvajala, saj bi le na ta način zagotovili ponovljivost razmer in s tem zanesljivost rezultatov testov.<br /> <br /> ==VIRI==<br /> <br /> [1] Benecchi, L. PSA velocity and PSA slope. Prostate Cancer Prostatic Dis 9, 169–172 (2006). doi:10.1038/sj.pcan.4500866<br /> <br /> [2] Gootenberg JS, Abudayyeh OO, Kellner MJ, Joung J, Collins JJ, Zhang F. Multiplexed and portable nucleic acid detection platform with Cas13, Cas12a, and Csm6. Science. 2018;360(6387):439-44. doi:10.1126/science.aaq0179<br /> <br /> [3] Creutzburg, S. C. A., Wu, W. Y., Mohanraju, P., Swartjes, T., Alkan, F., Gorodkin, J., . . . van der Oost, J. (2020). Good guide, bad guide: spacer sequence-dependent cleavage efficiency of Cas12a. Nucleic Acids Res, 48(6), 3228-3243. doi:10.1093/nar/gkz1240<br /> <br /> [4] Gootenberg JS, Abudayyeh OO, Lee JW, et al. Nucleic acid detection with CRISPR-Cas13a/C2c2. Science. 2017;356(6336):438-442. doi:10.1126/science.aam9321</div>

Luka.gnidovec https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=PROSTATUS:_Diagnostika_raka_prostate&diff=19285 2021-05-17T20:54:54Z

<p>Luka.gnidovec: /* Načrtovanje sgRNA */</p> <hr /> <div>PROSTATUS je iGEM projekt iz leta 2020, ki je osvojil nominacijo v kategoriji Diagnostika med podiplomskimi študenti. Pripravili so ga študenti Univerze južne Danske. <br /> [https://2020.igem.org/Team:SDU-Denmark Spletna stran projekta:]<br /> <br /> ==UVOD==<br /> Rak prostate je eden najpogostejših rakov, ki se razvije pri enem izmed osmih moških. Število diagnosticiranih primerov se povečuje, k čemur verjetno pripomore povišan screening koncentracije PSA (prostate specific antigen) v krvi med moškimi. Ta test pa je precej nezanesljiv, z 31 % verjetnostjo lažnega pozitivnega rezultata in 42 % verjetnostjo lažnega negativnega rezultata.[1] PSA nivo v krvi se lahko poviša iz številnih drugih razlogov (vnetje urinarnega trakta, ejakulacija, zdravila…). Poleg tega preverjanju krvne slike sledi še neprijeten in invaziven fizičen pregled. Vsekakor ima trenutni postopek screeninga raka prostate veliko potenciala za izboljšave.<br /> <br /> PROSTATUS je študentski projekt skupine iz Univerze južne Danske, s katerim so sodelovali na iGEM-u 2020 v kategoriji podiplomskih študentov. V projektu so razvili neinvazivno metodo, pri kateri zaznavamo tri RNA biomarkerje v urinu (TMPRSS2:ERG, AMACR, PCA3) in dva SNP-ja (rs6983267, rs16901979), ki povečata verjetnost razvoja raka prostate, v DNA v slini. Test deluje na podlagi sistema CRISPR-Cas13a v primeru zaznavanja RNA biomarkerjev in sistema CRISPR-Cas12a v primeru zaznavanja SNP-jev.<br /> <br /> ==OPIS PROJEKTA==<br /> ===PRINCIP DELOVANJA SISTEMA===<br /> Skupina je v projektu uporabila dve metodi, ki temeljita na delovanju proteinov družine Cas. <br /> ====SHERLOCK====<br /> SHERLOCK (Specific High-sensitivity Enzymatic Reporter unLOCKinkg) je metoda, ki s pomočjo encima Cas13a zaznava ssRNA v vzorcu. V Cas13a je vezana sgRNA (single guide RNA), ki zazna komplementarno tarčo v vzorcu. Ko pride do hibridizacije s tarčo, se Cas13a aktivira in cepi tudi netarčno RNA v vzorcu. Na ta način lahko pride do cepitve reporterske RNA. [2]<br /> <br /> ====DETECTR====<br /> DETECTR (The DNA Edonuclease Targeted CRISPR Trans Reporter system) je metoda, ki uporablja Cas12a in zaznava tarčno ssDNA v vzorcu, ob prepoznavi tarče pa pridobi nespecifično endonukleazno aktivnost in cepi reportersko ssDNA. [2]<br /> <br /> ===POTEK OBLIKOVANJA PROJEKTA===<br /> ====Kloniranje==== <br /> Za implementacijo teh dveh metod so morali najprej izraziti dva Cas encima ter pridobiti različne sgRNA, ki se vežejo v encima. <br /> Encime so izražali v E. coli. Uporabili so gena cas13a iz bakterije Leptotrichia wadei in cas12a iz Acidaminococcus sp. Z orodjem podjetja IDT so optimizirali rabo kodonov ter nato v konstrukt dodali vse potrebne komponente za izražanje proteinov (IPTG inducibilni promotor, RBS, terminator ter oznaki SUMO in His na N-koncu) ter naročili sintetični gen, ki so mu nato dodali še restrikcijska mesta za EcoRI in SpeI. <br /> Gen cas12a, vstavljen v plazmid, so pridobili od raziskovalne skupine iz Univerze južne Danske. S pomnoževanjem s PCR so genu dodali promotorsko regijo sintetičnega gena cas13a. Oba konstrukta so nato klonirali v vektor pSB1C3 in transformirali kompetentne celice E. coli seva ER2256. <br /> ====Načrtovanje sgRNA====<br /> Nato so dizajnirali sgRNA, ki se veže v Cas proteina in je ključna za prepoznavanje tarče. Za aktivacijo Cas12a je v oddaljenosti največ 21 bp od tarče potreben PAM motiv (TTTV). Poleg tega je za specifično aktivacijo Cas12a pomembno 100 % ujemanje v začetnem delu t. i. prilegajoče regije sgRNA (ang. spacer sequence) medtem ko v bolj oddaljenem območju prilegajoče regije 100 % ujemanje za aktivacijo ni potrebno. Če želimo specifično prepoznati SNP, je torej pomembno, da se ta nahaja v začetni regiji tarče, sicer bi dobili nespecifično aktivacijo in signal, ki ne bi bil odvisen od SNP-ja. Optimalna dolžina prilegajoče regije naj bi bila 21 – 24 nukleotidov. Vse te omejitve je skupina upoštevala pri dizajnu sgRNA za Cas12a. Oblikovali so štiri sgRNA, ki se vežejo na Cas12a in prepoznajo posamezne možne alele (prevladujoč alel in alel, ki poviša možnost za razvoj raka prostate). [3]<br /> <br /> Pri oblikovanju sgRNA za Cas13a so upoštevali optimalno dolžino prilegajoče regije 28-31 nukleotidov, prav tako pa pri sgRNA encima Cas13a velja pravilo o 100 % prileganju začetnega dela prilegajoče regije. Cas13a sicer za prepoznavo tarče ne potrebuje PAM motiva. Skupina je oblikovala tri sgRNA za Cas13a, ki se vežejo na RNA biomarkerje v urinu. [4]<br /> <br /> ====Pomnoževanje z metodo RPA====<br /> Ker obstaja verjetnost, da ta sistem ne bi zaznal zelo nizkih koncentracij RNA biomarkerjev v vzorcu, bi pred detekcijo RNA biomarkerje še namnožili z uporabo metode pomnoževanja z rekombinazo in polimerazo (ang. recombinase polymerase amplification – RPA). Gre za proces, alternativen PCR, ki poteka izotermalno in je zato njegova izvedba precej bolj enostavna. Za pomnožitev RNA bi potrebovali štiri encime, in sicer rekombinazo, ssDNA vezavne proteine (SSB) reverzno transkriptazo in DNA polimerazo. Da bi pridobili še pomnoženo RNA in ne le cDNA, bi uporabili še T7 polimerazo. <br /> <br /> V reakciji reverzna transkriptaza najprej prepiše ssRNA v cDNA. V RNA/DNA hibrid rekombinaza vstavi začetne oligonukleotide, ki so komplementarni RNA tarči. Na smerne začetne oligonukleotide bi dodali še T7 promotor. SSB stabilizirajo odrinjeno ssDNA na mestu vezave oligonukleotida, reverzna transkriptaza pa nato spet prepiše RNA verigo v cDNA. Iz novonastale cDNA z dodanim T7 promotorjem nato nastane RNA transkript, ki je na koncu reakcije prisoten v visoki koncentraciji in ga zlahka zaznamo v vzorcu. V opisu projekta ne omenjajo DNA polimeraze, a vendar bi bila ta potrebna za sintezo druge verige cDNA. Lahko bi uporabili tudi encim, ki lahko deluje kot reverzna transkriptaza in DNA polimeraza. <br /> <br /> Podobno reakcijo bi lahko zasnovali tudi za pomnoževanje DNA fragmentov, ki vsebujejo SNP-je, le da bi v tem primeru potrebovali le DNA polimerazo, ne pa tudi reverzne transkriptaze.<br /> <br /> ====Inhibicija aktivnosti RNaz====<br /> Ker pri zaznavanju RNA uporabljamo RNaze, ki se aktivirajo ob specifičnem signalu, bi ostale RNaze v urinu lahko motile specifično cepitev reporterja. Zato je ključna inaktivacija RNaz v vzorcu. V projektu bi uporabili metodo cepitve RNaz s proteinazo K. Po obdelavi vzorca s proteinazo K bi slednjo inaktivirali s fenilmetilsulfonil fluoridom (PMSF), da ne bi razgradila encimov Cas. <br /> ====Detekcija cepitve reporterja====<br /> Za detekcijo cepitve reporterja s Cas12a in Cas13a bi v projektu uporabili hitri test z lateralnim tokom (ang. lateral flow strip). Ta metoda za vizualizacijo rezultatov uporablja anti-FAM-protitelesa s pripetimi zlatimi nanodelci v kombinaciji s posebnim reporterjem. Reporter prek ssRNA ali ssDNA verige povezuje biotin in fluorescein amidit (FAM). Cepitev reporterja se vizualizira na traku, na katerem sta prisotni dve liniji – testna in kontrolna. Če pride do cepitve verige reporterja, se na FAM na cepljenem reporterju lahko veže anti-FAM-protitelo z zlatimi nanodelci na način, ki omogoča vezavo na sekundarna protitelesa, imobilizirana na testni liniji na traku za detekcijo. V primeru, da se reporter ne cepi, pa se protitelesa vežejo na FAM na način, ki ne omogoča vezave na sekundarna protitelesa in se zato reporter prek biotina veže na kontrolno linijo na traku za detekcijo.<br /> <br /> ==REZULTATI==<br /> Skupina je uspešno izolirala encima Cas12a in Cas13a ter z in vitro transkripcijo sintetizirala sgRNA. Skupaj so inkubirali izolirana encima in različne koncentracije sgRNA, nato pa preverili, ali prisotnost tarče v vzorcu vzbudi nespecifično endonukleazno aktivnost Cas12a in Cas13a. <br /> <br /> Pokazali so, da je ob daljših časih inkubacije, višjih koncentracijah sgRNA in prisotnosti tarčne sekvence reporter bolj razgrajen, kar kaže na aktivacijo nespecifične endonukleazne aktivnosti encimov Cas12a in Cas13a. V primeru Cas13a je bilo nekaj reporterske RNA razgrajene tudi v odsotnosti tarčne sekvence, kar bi lahko vodilo v lažno pozitivne rezultate. Zato bi bila v tem delu projekta potrebna optimizacija. <br /> <br /> Sledila je inhibicija RNaz, ki so jo zaznavali s kompletom reagenov podjetja Thermofisher, kjer je kot reporter delovala RNA z vezanim fluoroforom in dušilcem fluorescence. Vzorce sline in urina so inkubirali s proteinazo K in fluorescenco primerjali v vzorcu brez proteinaze. Rezultati so pokazali, da je bila inhibicija RNaz v urinu po triurni inkubaciji boljša kot inhibicija v slini. Po prekonočni inkubaciji je bila tudi inhibicija v slini popolna, torej je metoda uspešna. <br /> <br /> Nato so proteinazo K inhibirali z 1mM PMSF in k tem vzorcem dodali še nekaj nove sline in urina, kjer se nahajajo aktivne RNaze, ter izvedli enako detekcijo kot prej. Pokazali so, da so v vzorcih prisotne aktivne RNaze, torej je bila aktivnost proteinaze K inhibirana.<br /> <br /> Preverili so še možnost uporabe hitrega testa z lateralnim tokom (ang. lateral flow strip) kot metode detekcije. Ugotovili so, da negativni testi dajo signal tako v testni, kot tudi v kontrolni liniji, saj se nekaj reporterja verjetno spontano razgradi. V tem primeru je še vedno jasna razlika med pozitivnim in negativnim testom, saj pri pozitivnem dobimo signal le v testni liniji. Vendar bi bila optimizacija testa za bolj nedvoumne rezultate vseeno dobrodošla.<br /> <br /> ==ZAKLJUČEK==<br /> V okviru projekta je skupina razvila postopek za detekcijo poljubnega izbranega biomarkerja v urinu. Pri tem so oblikovali številne enostavne in sestavljene biokocke, ki so dostopne [https://2020.igem.org/Team:SDU-Denmark/Parts tukaj]. Projekt ima velik potencial za izboljšanje zgodnje diagnostike raka prostate, vendar bi bile potrebne še številne optimizacije. Izboljšati bi bilo treba metodo detekcije (hitri test z lateralnim tokom), da bi bili rezultati bolj nedvoumni, optimizirala bi se lahko tudi izbira biomarkerjev, saj so izbrani v tem projektu primerni predvsem za belsko populacijo. Poleg tega bi bil potreben dizajn embalaže, kjer bi se reakcija izvajala, saj bi le na ta način zagotovili ponovljivost razmer in s tem zanesljivost rezultatov testov.<br /> <br /> ==VIRI==<br /> <br /> [1] Benecchi, L. PSA velocity and PSA slope. Prostate Cancer Prostatic Dis 9, 169–172 (2006). doi:10.1038/sj.pcan.4500866<br /> <br /> [2] Gootenberg JS, Abudayyeh OO, Kellner MJ, Joung J, Collins JJ, Zhang F. Multiplexed and portable nucleic acid detection platform with Cas13, Cas12a, and Csm6. Science. 2018;360(6387):439-44. doi:10.1126/science.aaq0179<br /> <br /> [3] Creutzburg, S. C. A., Wu, W. Y., Mohanraju, P., Swartjes, T., Alkan, F., Gorodkin, J., . . . van der Oost, J. (2020). Good guide, bad guide: spacer sequence-dependent cleavage efficiency of Cas12a. Nucleic Acids Res, 48(6), 3228-3243. doi:10.1093/nar/gkz1240<br /> <br /> [4] Gootenberg JS, Abudayyeh OO, Lee JW, et al. Nucleic acid detection with CRISPR-Cas13a/C2c2. Science. 2017;356(6336):438-442. doi:10.1126/science.aam9321</div>

Luka.gnidovec https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=PROSTATUS:_Diagnostika_raka_prostate&diff=19284 2021-05-17T20:54:36Z

<p>Luka.gnidovec: /* PRINCIP DELOVANJA SISTEMA */</p> <hr /> <div>PROSTATUS je iGEM projekt iz leta 2020, ki je osvojil nominacijo v kategoriji Diagnostika med podiplomskimi študenti. Pripravili so ga študenti Univerze južne Danske. <br /> [https://2020.igem.org/Team:SDU-Denmark Spletna stran projekta:]<br /> <br /> ==UVOD==<br /> Rak prostate je eden najpogostejših rakov, ki se razvije pri enem izmed osmih moških. Število diagnosticiranih primerov se povečuje, k čemur verjetno pripomore povišan screening koncentracije PSA (prostate specific antigen) v krvi med moškimi. Ta test pa je precej nezanesljiv, z 31 % verjetnostjo lažnega pozitivnega rezultata in 42 % verjetnostjo lažnega negativnega rezultata.[1] PSA nivo v krvi se lahko poviša iz številnih drugih razlogov (vnetje urinarnega trakta, ejakulacija, zdravila…). Poleg tega preverjanju krvne slike sledi še neprijeten in invaziven fizičen pregled. Vsekakor ima trenutni postopek screeninga raka prostate veliko potenciala za izboljšave.<br /> <br /> PROSTATUS je študentski projekt skupine iz Univerze južne Danske, s katerim so sodelovali na iGEM-u 2020 v kategoriji podiplomskih študentov. V projektu so razvili neinvazivno metodo, pri kateri zaznavamo tri RNA biomarkerje v urinu (TMPRSS2:ERG, AMACR, PCA3) in dva SNP-ja (rs6983267, rs16901979), ki povečata verjetnost razvoja raka prostate, v DNA v slini. Test deluje na podlagi sistema CRISPR-Cas13a v primeru zaznavanja RNA biomarkerjev in sistema CRISPR-Cas12a v primeru zaznavanja SNP-jev.<br /> <br /> ==OPIS PROJEKTA==<br /> ===PRINCIP DELOVANJA SISTEMA===<br /> Skupina je v projektu uporabila dve metodi, ki temeljita na delovanju proteinov družine Cas. <br /> ====SHERLOCK====<br /> SHERLOCK (Specific High-sensitivity Enzymatic Reporter unLOCKinkg) je metoda, ki s pomočjo encima Cas13a zaznava ssRNA v vzorcu. V Cas13a je vezana sgRNA (single guide RNA), ki zazna komplementarno tarčo v vzorcu. Ko pride do hibridizacije s tarčo, se Cas13a aktivira in cepi tudi netarčno RNA v vzorcu. Na ta način lahko pride do cepitve reporterske RNA. [2]<br /> <br /> ====DETECTR====<br /> DETECTR (The DNA Edonuclease Targeted CRISPR Trans Reporter system) je metoda, ki uporablja Cas12a in zaznava tarčno ssDNA v vzorcu, ob prepoznavi tarče pa pridobi nespecifično endonukleazno aktivnost in cepi reportersko ssDNA. [2]<br /> <br /> ===POTEK OBLIKOVANJA PROJEKTA===<br /> ====Kloniranje==== <br /> Za implementacijo teh dveh metod so morali najprej izraziti dva Cas encima ter pridobiti različne sgRNA, ki se vežejo v encima. <br /> Encime so izražali v E. coli. Uporabili so gena cas13a iz bakterije Leptotrichia wadei in cas12a iz Acidaminococcus sp. Z orodjem podjetja IDT so optimizirali rabo kodonov ter nato v konstrukt dodali vse potrebne komponente za izražanje proteinov (IPTG inducibilni promotor, RBS, terminator ter oznaki SUMO in His na N-koncu) ter naročili sintetični gen, ki so mu nato dodali še restrikcijska mesta za EcoRI in SpeI. <br /> Gen cas12a, vstavljen v plazmid, so pridobili od raziskovalne skupine iz Univerze južne Danske. S pomnoževanjem s PCR so genu dodali promotorsko regijo sintetičnega gena cas13a. Oba konstrukta so nato klonirali v vektor pSB1C3 in transformirali kompetentne celice E. coli seva ER2256. <br /> ====Načrtovanje sgRNA====<br /> Nato so dizajnirali sgRNA, ki se veže v Cas proteina in je ključna za prepoznavanje tarče. Za aktivacijo Cas12a je v oddaljenosti največ 21 bp od tarče potreben PAM motiv (TTTV). Poleg tega je za specifično aktivacijo Cas12a pomembno 100 % ujemanje v začetnem delu t. i. prilegajoče regije sgRNA (ang. spacer sequence) medtem ko v bolj oddaljenem območju prilegajoče regije 100 % ujemanje za aktivacijo ni potrebno. Če želimo specifično prepoznati SNP, je torej pomembno, da se ta nahaja v začetni regiji tarče, sicer bi dobili nespecifično aktivacijo in signal, ki ne bi bil odvisen od SNP-ja. Optimalna dolžina prilegajoče regije naj bi bila 21 – 24 nukleotidov. Vse te omejitve je skupina upoštevala pri dizajnu sgRNA za Cas12a. Oblikovali so štiri sgRNA, ki se vežejo na Cas12a in prepoznajo posamezne možne alele (prevladujoč alel in alel, ki poviša možnost za razvoj raka prostate). [4]<br /> <br /> Pri oblikovanju sgRNA za Cas13a so upoštevali optimalno dolžino prilegajoče regije 28-31 nukleotidov, prav tako pa pri sgRNA encima Cas13a velja pravilo o 100 % prileganju začetnega dela prilegajoče regije. Cas13a sicer za prepoznavo tarče ne potrebuje PAM motiva. Skupina je oblikovala tri sgRNA za Cas13a, ki se vežejo na RNA biomarkerje v urinu. [5]<br /> <br /> ====Pomnoževanje z metodo RPA====<br /> Ker obstaja verjetnost, da ta sistem ne bi zaznal zelo nizkih koncentracij RNA biomarkerjev v vzorcu, bi pred detekcijo RNA biomarkerje še namnožili z uporabo metode pomnoževanja z rekombinazo in polimerazo (ang. recombinase polymerase amplification – RPA). Gre za proces, alternativen PCR, ki poteka izotermalno in je zato njegova izvedba precej bolj enostavna. Za pomnožitev RNA bi potrebovali štiri encime, in sicer rekombinazo, ssDNA vezavne proteine (SSB) reverzno transkriptazo in DNA polimerazo. Da bi pridobili še pomnoženo RNA in ne le cDNA, bi uporabili še T7 polimerazo. <br /> <br /> V reakciji reverzna transkriptaza najprej prepiše ssRNA v cDNA. V RNA/DNA hibrid rekombinaza vstavi začetne oligonukleotide, ki so komplementarni RNA tarči. Na smerne začetne oligonukleotide bi dodali še T7 promotor. SSB stabilizirajo odrinjeno ssDNA na mestu vezave oligonukleotida, reverzna transkriptaza pa nato spet prepiše RNA verigo v cDNA. Iz novonastale cDNA z dodanim T7 promotorjem nato nastane RNA transkript, ki je na koncu reakcije prisoten v visoki koncentraciji in ga zlahka zaznamo v vzorcu. V opisu projekta ne omenjajo DNA polimeraze, a vendar bi bila ta potrebna za sintezo druge verige cDNA. Lahko bi uporabili tudi encim, ki lahko deluje kot reverzna transkriptaza in DNA polimeraza. <br /> <br /> Podobno reakcijo bi lahko zasnovali tudi za pomnoževanje DNA fragmentov, ki vsebujejo SNP-je, le da bi v tem primeru potrebovali le DNA polimerazo, ne pa tudi reverzne transkriptaze.<br /> <br /> ====Inhibicija aktivnosti RNaz====<br /> Ker pri zaznavanju RNA uporabljamo RNaze, ki se aktivirajo ob specifičnem signalu, bi ostale RNaze v urinu lahko motile specifično cepitev reporterja. Zato je ključna inaktivacija RNaz v vzorcu. V projektu bi uporabili metodo cepitve RNaz s proteinazo K. Po obdelavi vzorca s proteinazo K bi slednjo inaktivirali s fenilmetilsulfonil fluoridom (PMSF), da ne bi razgradila encimov Cas. <br /> ====Detekcija cepitve reporterja====<br /> Za detekcijo cepitve reporterja s Cas12a in Cas13a bi v projektu uporabili hitri test z lateralnim tokom (ang. lateral flow strip). Ta metoda za vizualizacijo rezultatov uporablja anti-FAM-protitelesa s pripetimi zlatimi nanodelci v kombinaciji s posebnim reporterjem. Reporter prek ssRNA ali ssDNA verige povezuje biotin in fluorescein amidit (FAM). Cepitev reporterja se vizualizira na traku, na katerem sta prisotni dve liniji – testna in kontrolna. Če pride do cepitve verige reporterja, se na FAM na cepljenem reporterju lahko veže anti-FAM-protitelo z zlatimi nanodelci na način, ki omogoča vezavo na sekundarna protitelesa, imobilizirana na testni liniji na traku za detekcijo. V primeru, da se reporter ne cepi, pa se protitelesa vežejo na FAM na način, ki ne omogoča vezave na sekundarna protitelesa in se zato reporter prek biotina veže na kontrolno linijo na traku za detekcijo.<br /> <br /> ==REZULTATI==<br /> Skupina je uspešno izolirala encima Cas12a in Cas13a ter z in vitro transkripcijo sintetizirala sgRNA. Skupaj so inkubirali izolirana encima in različne koncentracije sgRNA, nato pa preverili, ali prisotnost tarče v vzorcu vzbudi nespecifično endonukleazno aktivnost Cas12a in Cas13a. <br /> <br /> Pokazali so, da je ob daljših časih inkubacije, višjih koncentracijah sgRNA in prisotnosti tarčne sekvence reporter bolj razgrajen, kar kaže na aktivacijo nespecifične endonukleazne aktivnosti encimov Cas12a in Cas13a. V primeru Cas13a je bilo nekaj reporterske RNA razgrajene tudi v odsotnosti tarčne sekvence, kar bi lahko vodilo v lažno pozitivne rezultate. Zato bi bila v tem delu projekta potrebna optimizacija. <br /> <br /> Sledila je inhibicija RNaz, ki so jo zaznavali s kompletom reagenov podjetja Thermofisher, kjer je kot reporter delovala RNA z vezanim fluoroforom in dušilcem fluorescence. Vzorce sline in urina so inkubirali s proteinazo K in fluorescenco primerjali v vzorcu brez proteinaze. Rezultati so pokazali, da je bila inhibicija RNaz v urinu po triurni inkubaciji boljša kot inhibicija v slini. Po prekonočni inkubaciji je bila tudi inhibicija v slini popolna, torej je metoda uspešna. <br /> <br /> Nato so proteinazo K inhibirali z 1mM PMSF in k tem vzorcem dodali še nekaj nove sline in urina, kjer se nahajajo aktivne RNaze, ter izvedli enako detekcijo kot prej. Pokazali so, da so v vzorcih prisotne aktivne RNaze, torej je bila aktivnost proteinaze K inhibirana.<br /> <br /> Preverili so še možnost uporabe hitrega testa z lateralnim tokom (ang. lateral flow strip) kot metode detekcije. Ugotovili so, da negativni testi dajo signal tako v testni, kot tudi v kontrolni liniji, saj se nekaj reporterja verjetno spontano razgradi. V tem primeru je še vedno jasna razlika med pozitivnim in negativnim testom, saj pri pozitivnem dobimo signal le v testni liniji. Vendar bi bila optimizacija testa za bolj nedvoumne rezultate vseeno dobrodošla.<br /> <br /> ==ZAKLJUČEK==<br /> V okviru projekta je skupina razvila postopek za detekcijo poljubnega izbranega biomarkerja v urinu. Pri tem so oblikovali številne enostavne in sestavljene biokocke, ki so dostopne [https://2020.igem.org/Team:SDU-Denmark/Parts tukaj]. Projekt ima velik potencial za izboljšanje zgodnje diagnostike raka prostate, vendar bi bile potrebne še številne optimizacije. Izboljšati bi bilo treba metodo detekcije (hitri test z lateralnim tokom), da bi bili rezultati bolj nedvoumni, optimizirala bi se lahko tudi izbira biomarkerjev, saj so izbrani v tem projektu primerni predvsem za belsko populacijo. Poleg tega bi bil potreben dizajn embalaže, kjer bi se reakcija izvajala, saj bi le na ta način zagotovili ponovljivost razmer in s tem zanesljivost rezultatov testov.<br /> <br /> ==VIRI==<br /> <br /> [1] Benecchi, L. PSA velocity and PSA slope. Prostate Cancer Prostatic Dis 9, 169–172 (2006). doi:10.1038/sj.pcan.4500866<br /> <br /> [2] Gootenberg JS, Abudayyeh OO, Kellner MJ, Joung J, Collins JJ, Zhang F. Multiplexed and portable nucleic acid detection platform with Cas13, Cas12a, and Csm6. Science. 2018;360(6387):439-44. doi:10.1126/science.aaq0179<br /> <br /> [3] Creutzburg, S. C. A., Wu, W. Y., Mohanraju, P., Swartjes, T., Alkan, F., Gorodkin, J., . . . van der Oost, J. (2020). Good guide, bad guide: spacer sequence-dependent cleavage efficiency of Cas12a. Nucleic Acids Res, 48(6), 3228-3243. doi:10.1093/nar/gkz1240<br /> <br /> [4] Gootenberg JS, Abudayyeh OO, Lee JW, et al. Nucleic acid detection with CRISPR-Cas13a/C2c2. Science. 2017;356(6336):438-442. doi:10.1126/science.aam9321</div>

Luka.gnidovec https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=PROSTATUS:_Diagnostika_raka_prostate&diff=19283 2021-05-17T20:54:26Z

<p>Luka.gnidovec: /* UVOD */</p> <hr /> <div>PROSTATUS je iGEM projekt iz leta 2020, ki je osvojil nominacijo v kategoriji Diagnostika med podiplomskimi študenti. Pripravili so ga študenti Univerze južne Danske. <br /> [https://2020.igem.org/Team:SDU-Denmark Spletna stran projekta:]<br /> <br /> ==UVOD==<br /> Rak prostate je eden najpogostejših rakov, ki se razvije pri enem izmed osmih moških. Število diagnosticiranih primerov se povečuje, k čemur verjetno pripomore povišan screening koncentracije PSA (prostate specific antigen) v krvi med moškimi. Ta test pa je precej nezanesljiv, z 31 % verjetnostjo lažnega pozitivnega rezultata in 42 % verjetnostjo lažnega negativnega rezultata.[1] PSA nivo v krvi se lahko poviša iz številnih drugih razlogov (vnetje urinarnega trakta, ejakulacija, zdravila…). Poleg tega preverjanju krvne slike sledi še neprijeten in invaziven fizičen pregled. Vsekakor ima trenutni postopek screeninga raka prostate veliko potenciala za izboljšave.<br /> <br /> PROSTATUS je študentski projekt skupine iz Univerze južne Danske, s katerim so sodelovali na iGEM-u 2020 v kategoriji podiplomskih študentov. V projektu so razvili neinvazivno metodo, pri kateri zaznavamo tri RNA biomarkerje v urinu (TMPRSS2:ERG, AMACR, PCA3) in dva SNP-ja (rs6983267, rs16901979), ki povečata verjetnost razvoja raka prostate, v DNA v slini. Test deluje na podlagi sistema CRISPR-Cas13a v primeru zaznavanja RNA biomarkerjev in sistema CRISPR-Cas12a v primeru zaznavanja SNP-jev.<br /> <br /> ==OPIS PROJEKTA==<br /> ===PRINCIP DELOVANJA SISTEMA===<br /> Skupina je v projektu uporabila dve metodi, ki temeljita na delovanju proteinov družine Cas. <br /> ====SHERLOCK====<br /> SHERLOCK (Specific High-sensitivity Enzymatic Reporter unLOCKinkg) je metoda, ki s pomočjo encima Cas13a zaznava ssRNA v vzorcu. V Cas13a je vezana sgRNA (single guide RNA), ki zazna komplementarno tarčo v vzorcu. Ko pride do hibridizacije s tarčo, se Cas13a aktivira in cepi tudi netarčno RNA v vzorcu. Na ta način lahko pride do cepitve reporterske RNA. [3]<br /> <br /> ====DETECTR====<br /> DETECTR (The DNA Edonuclease Targeted CRISPR Trans Reporter system) je metoda, ki uporablja Cas12a in zaznava tarčno ssDNA v vzorcu, ob prepoznavi tarče pa pridobi nespecifično endonukleazno aktivnost in cepi reportersko ssDNA. [3]<br /> <br /> ===POTEK OBLIKOVANJA PROJEKTA===<br /> ====Kloniranje==== <br /> Za implementacijo teh dveh metod so morali najprej izraziti dva Cas encima ter pridobiti različne sgRNA, ki se vežejo v encima. <br /> Encime so izražali v E. coli. Uporabili so gena cas13a iz bakterije Leptotrichia wadei in cas12a iz Acidaminococcus sp. Z orodjem podjetja IDT so optimizirali rabo kodonov ter nato v konstrukt dodali vse potrebne komponente za izražanje proteinov (IPTG inducibilni promotor, RBS, terminator ter oznaki SUMO in His na N-koncu) ter naročili sintetični gen, ki so mu nato dodali še restrikcijska mesta za EcoRI in SpeI. <br /> Gen cas12a, vstavljen v plazmid, so pridobili od raziskovalne skupine iz Univerze južne Danske. S pomnoževanjem s PCR so genu dodali promotorsko regijo sintetičnega gena cas13a. Oba konstrukta so nato klonirali v vektor pSB1C3 in transformirali kompetentne celice E. coli seva ER2256. <br /> ====Načrtovanje sgRNA====<br /> Nato so dizajnirali sgRNA, ki se veže v Cas proteina in je ključna za prepoznavanje tarče. Za aktivacijo Cas12a je v oddaljenosti največ 21 bp od tarče potreben PAM motiv (TTTV). Poleg tega je za specifično aktivacijo Cas12a pomembno 100 % ujemanje v začetnem delu t. i. prilegajoče regije sgRNA (ang. spacer sequence) medtem ko v bolj oddaljenem območju prilegajoče regije 100 % ujemanje za aktivacijo ni potrebno. Če želimo specifično prepoznati SNP, je torej pomembno, da se ta nahaja v začetni regiji tarče, sicer bi dobili nespecifično aktivacijo in signal, ki ne bi bil odvisen od SNP-ja. Optimalna dolžina prilegajoče regije naj bi bila 21 – 24 nukleotidov. Vse te omejitve je skupina upoštevala pri dizajnu sgRNA za Cas12a. Oblikovali so štiri sgRNA, ki se vežejo na Cas12a in prepoznajo posamezne možne alele (prevladujoč alel in alel, ki poviša možnost za razvoj raka prostate). [4]<br /> <br /> Pri oblikovanju sgRNA za Cas13a so upoštevali optimalno dolžino prilegajoče regije 28-31 nukleotidov, prav tako pa pri sgRNA encima Cas13a velja pravilo o 100 % prileganju začetnega dela prilegajoče regije. Cas13a sicer za prepoznavo tarče ne potrebuje PAM motiva. Skupina je oblikovala tri sgRNA za Cas13a, ki se vežejo na RNA biomarkerje v urinu. [5]<br /> <br /> ====Pomnoževanje z metodo RPA====<br /> Ker obstaja verjetnost, da ta sistem ne bi zaznal zelo nizkih koncentracij RNA biomarkerjev v vzorcu, bi pred detekcijo RNA biomarkerje še namnožili z uporabo metode pomnoževanja z rekombinazo in polimerazo (ang. recombinase polymerase amplification – RPA). Gre za proces, alternativen PCR, ki poteka izotermalno in je zato njegova izvedba precej bolj enostavna. Za pomnožitev RNA bi potrebovali štiri encime, in sicer rekombinazo, ssDNA vezavne proteine (SSB) reverzno transkriptazo in DNA polimerazo. Da bi pridobili še pomnoženo RNA in ne le cDNA, bi uporabili še T7 polimerazo. <br /> <br /> V reakciji reverzna transkriptaza najprej prepiše ssRNA v cDNA. V RNA/DNA hibrid rekombinaza vstavi začetne oligonukleotide, ki so komplementarni RNA tarči. Na smerne začetne oligonukleotide bi dodali še T7 promotor. SSB stabilizirajo odrinjeno ssDNA na mestu vezave oligonukleotida, reverzna transkriptaza pa nato spet prepiše RNA verigo v cDNA. Iz novonastale cDNA z dodanim T7 promotorjem nato nastane RNA transkript, ki je na koncu reakcije prisoten v visoki koncentraciji in ga zlahka zaznamo v vzorcu. V opisu projekta ne omenjajo DNA polimeraze, a vendar bi bila ta potrebna za sintezo druge verige cDNA. Lahko bi uporabili tudi encim, ki lahko deluje kot reverzna transkriptaza in DNA polimeraza. <br /> <br /> Podobno reakcijo bi lahko zasnovali tudi za pomnoževanje DNA fragmentov, ki vsebujejo SNP-je, le da bi v tem primeru potrebovali le DNA polimerazo, ne pa tudi reverzne transkriptaze.<br /> <br /> ====Inhibicija aktivnosti RNaz====<br /> Ker pri zaznavanju RNA uporabljamo RNaze, ki se aktivirajo ob specifičnem signalu, bi ostale RNaze v urinu lahko motile specifično cepitev reporterja. Zato je ključna inaktivacija RNaz v vzorcu. V projektu bi uporabili metodo cepitve RNaz s proteinazo K. Po obdelavi vzorca s proteinazo K bi slednjo inaktivirali s fenilmetilsulfonil fluoridom (PMSF), da ne bi razgradila encimov Cas. <br /> ====Detekcija cepitve reporterja====<br /> Za detekcijo cepitve reporterja s Cas12a in Cas13a bi v projektu uporabili hitri test z lateralnim tokom (ang. lateral flow strip). Ta metoda za vizualizacijo rezultatov uporablja anti-FAM-protitelesa s pripetimi zlatimi nanodelci v kombinaciji s posebnim reporterjem. Reporter prek ssRNA ali ssDNA verige povezuje biotin in fluorescein amidit (FAM). Cepitev reporterja se vizualizira na traku, na katerem sta prisotni dve liniji – testna in kontrolna. Če pride do cepitve verige reporterja, se na FAM na cepljenem reporterju lahko veže anti-FAM-protitelo z zlatimi nanodelci na način, ki omogoča vezavo na sekundarna protitelesa, imobilizirana na testni liniji na traku za detekcijo. V primeru, da se reporter ne cepi, pa se protitelesa vežejo na FAM na način, ki ne omogoča vezave na sekundarna protitelesa in se zato reporter prek biotina veže na kontrolno linijo na traku za detekcijo.<br /> <br /> ==REZULTATI==<br /> Skupina je uspešno izolirala encima Cas12a in Cas13a ter z in vitro transkripcijo sintetizirala sgRNA. Skupaj so inkubirali izolirana encima in različne koncentracije sgRNA, nato pa preverili, ali prisotnost tarče v vzorcu vzbudi nespecifično endonukleazno aktivnost Cas12a in Cas13a. <br /> <br /> Pokazali so, da je ob daljših časih inkubacije, višjih koncentracijah sgRNA in prisotnosti tarčne sekvence reporter bolj razgrajen, kar kaže na aktivacijo nespecifične endonukleazne aktivnosti encimov Cas12a in Cas13a. V primeru Cas13a je bilo nekaj reporterske RNA razgrajene tudi v odsotnosti tarčne sekvence, kar bi lahko vodilo v lažno pozitivne rezultate. Zato bi bila v tem delu projekta potrebna optimizacija. <br /> <br /> Sledila je inhibicija RNaz, ki so jo zaznavali s kompletom reagenov podjetja Thermofisher, kjer je kot reporter delovala RNA z vezanim fluoroforom in dušilcem fluorescence. Vzorce sline in urina so inkubirali s proteinazo K in fluorescenco primerjali v vzorcu brez proteinaze. Rezultati so pokazali, da je bila inhibicija RNaz v urinu po triurni inkubaciji boljša kot inhibicija v slini. Po prekonočni inkubaciji je bila tudi inhibicija v slini popolna, torej je metoda uspešna. <br /> <br /> Nato so proteinazo K inhibirali z 1mM PMSF in k tem vzorcem dodali še nekaj nove sline in urina, kjer se nahajajo aktivne RNaze, ter izvedli enako detekcijo kot prej. Pokazali so, da so v vzorcih prisotne aktivne RNaze, torej je bila aktivnost proteinaze K inhibirana.<br /> <br /> Preverili so še možnost uporabe hitrega testa z lateralnim tokom (ang. lateral flow strip) kot metode detekcije. Ugotovili so, da negativni testi dajo signal tako v testni, kot tudi v kontrolni liniji, saj se nekaj reporterja verjetno spontano razgradi. V tem primeru je še vedno jasna razlika med pozitivnim in negativnim testom, saj pri pozitivnem dobimo signal le v testni liniji. Vendar bi bila optimizacija testa za bolj nedvoumne rezultate vseeno dobrodošla.<br /> <br /> ==ZAKLJUČEK==<br /> V okviru projekta je skupina razvila postopek za detekcijo poljubnega izbranega biomarkerja v urinu. Pri tem so oblikovali številne enostavne in sestavljene biokocke, ki so dostopne [https://2020.igem.org/Team:SDU-Denmark/Parts tukaj]. Projekt ima velik potencial za izboljšanje zgodnje diagnostike raka prostate, vendar bi bile potrebne še številne optimizacije. Izboljšati bi bilo treba metodo detekcije (hitri test z lateralnim tokom), da bi bili rezultati bolj nedvoumni, optimizirala bi se lahko tudi izbira biomarkerjev, saj so izbrani v tem projektu primerni predvsem za belsko populacijo. Poleg tega bi bil potreben dizajn embalaže, kjer bi se reakcija izvajala, saj bi le na ta način zagotovili ponovljivost razmer in s tem zanesljivost rezultatov testov.<br /> <br /> ==VIRI==<br /> <br /> [1] Benecchi, L. PSA velocity and PSA slope. Prostate Cancer Prostatic Dis 9, 169–172 (2006). doi:10.1038/sj.pcan.4500866<br /> <br /> [2] Gootenberg JS, Abudayyeh OO, Kellner MJ, Joung J, Collins JJ, Zhang F. Multiplexed and portable nucleic acid detection platform with Cas13, Cas12a, and Csm6. Science. 2018;360(6387):439-44. doi:10.1126/science.aaq0179<br /> <br /> [3] Creutzburg, S. C. A., Wu, W. Y., Mohanraju, P., Swartjes, T., Alkan, F., Gorodkin, J., . . . van der Oost, J. (2020). Good guide, bad guide: spacer sequence-dependent cleavage efficiency of Cas12a. Nucleic Acids Res, 48(6), 3228-3243. doi:10.1093/nar/gkz1240<br /> <br /> [4] Gootenberg JS, Abudayyeh OO, Lee JW, et al. Nucleic acid detection with CRISPR-Cas13a/C2c2. Science. 2017;356(6336):438-442. doi:10.1126/science.aam9321</div>

Luka.gnidovec https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=PROSTATUS:_Diagnostika_raka_prostate&diff=19282 2021-05-17T20:53:59Z

<p>Luka.gnidovec: </p> <hr /> <div>PROSTATUS je iGEM projekt iz leta 2020, ki je osvojil nominacijo v kategoriji Diagnostika med podiplomskimi študenti. Pripravili so ga študenti Univerze južne Danske. <br /> [https://2020.igem.org/Team:SDU-Denmark Spletna stran projekta:]<br /> <br /> ==UVOD==<br /> Rak prostate je eden najpogostejših rakov, ki se razvije pri enem izmed osmih moških. Število diagnosticiranih primerov se povečuje, k čemur verjetno pripomore povišan screening koncentracije PSA (prostate specific antigen) v krvi med moškimi. Ta test pa je precej nezanesljiv, z 31 % verjetnostjo lažnega pozitivnega rezultata in 42 % verjetnostjo lažnega negativnega rezultata.[1,2] PSA nivo v krvi se lahko poviša iz številnih drugih razlogov (vnetje urinarnega trakta, ejakulacija, zdravila…). Poleg tega preverjanju krvne slike sledi še neprijeten in invaziven fizičen pregled. Vsekakor ima trenutni postopek screeninga raka prostate veliko potenciala za izboljšave. [1] <br /> <br /> PROSTATUS je študentski projekt skupine iz Univerze južne Danske, s katerim so sodelovali na iGEM-u 2020 v kategoriji podiplomskih študentov. V projektu so razvili neinvazivno metodo, pri kateri zaznavamo tri RNA biomarkerje v urinu (TMPRSS2:ERG, AMACR, PCA3) in dva SNP-ja (rs6983267, rs16901979), ki povečata verjetnost razvoja raka prostate, v DNA v slini. Test deluje na podlagi sistema CRISPR-Cas13a v primeru zaznavanja RNA biomarkerjev in sistema CRISPR-Cas12a v primeru zaznavanja SNP-jev. [1]<br /> <br /> ==OPIS PROJEKTA==<br /> ===PRINCIP DELOVANJA SISTEMA===<br /> Skupina je v projektu uporabila dve metodi, ki temeljita na delovanju proteinov družine Cas. <br /> ====SHERLOCK====<br /> SHERLOCK (Specific High-sensitivity Enzymatic Reporter unLOCKinkg) je metoda, ki s pomočjo encima Cas13a zaznava ssRNA v vzorcu. V Cas13a je vezana sgRNA (single guide RNA), ki zazna komplementarno tarčo v vzorcu. Ko pride do hibridizacije s tarčo, se Cas13a aktivira in cepi tudi netarčno RNA v vzorcu. Na ta način lahko pride do cepitve reporterske RNA. [3]<br /> <br /> ====DETECTR====<br /> DETECTR (The DNA Edonuclease Targeted CRISPR Trans Reporter system) je metoda, ki uporablja Cas12a in zaznava tarčno ssDNA v vzorcu, ob prepoznavi tarče pa pridobi nespecifično endonukleazno aktivnost in cepi reportersko ssDNA. [3]<br /> <br /> ===POTEK OBLIKOVANJA PROJEKTA===<br /> ====Kloniranje==== <br /> Za implementacijo teh dveh metod so morali najprej izraziti dva Cas encima ter pridobiti različne sgRNA, ki se vežejo v encima. <br /> Encime so izražali v E. coli. Uporabili so gena cas13a iz bakterije Leptotrichia wadei in cas12a iz Acidaminococcus sp. Z orodjem podjetja IDT so optimizirali rabo kodonov ter nato v konstrukt dodali vse potrebne komponente za izražanje proteinov (IPTG inducibilni promotor, RBS, terminator ter oznaki SUMO in His na N-koncu) ter naročili sintetični gen, ki so mu nato dodali še restrikcijska mesta za EcoRI in SpeI. <br /> Gen cas12a, vstavljen v plazmid, so pridobili od raziskovalne skupine iz Univerze južne Danske. S pomnoževanjem s PCR so genu dodali promotorsko regijo sintetičnega gena cas13a. Oba konstrukta so nato klonirali v vektor pSB1C3 in transformirali kompetentne celice E. coli seva ER2256. <br /> ====Načrtovanje sgRNA====<br /> Nato so dizajnirali sgRNA, ki se veže v Cas proteina in je ključna za prepoznavanje tarče. Za aktivacijo Cas12a je v oddaljenosti največ 21 bp od tarče potreben PAM motiv (TTTV). Poleg tega je za specifično aktivacijo Cas12a pomembno 100 % ujemanje v začetnem delu t. i. prilegajoče regije sgRNA (ang. spacer sequence) medtem ko v bolj oddaljenem območju prilegajoče regije 100 % ujemanje za aktivacijo ni potrebno. Če želimo specifično prepoznati SNP, je torej pomembno, da se ta nahaja v začetni regiji tarče, sicer bi dobili nespecifično aktivacijo in signal, ki ne bi bil odvisen od SNP-ja. Optimalna dolžina prilegajoče regije naj bi bila 21 – 24 nukleotidov. Vse te omejitve je skupina upoštevala pri dizajnu sgRNA za Cas12a. Oblikovali so štiri sgRNA, ki se vežejo na Cas12a in prepoznajo posamezne možne alele (prevladujoč alel in alel, ki poviša možnost za razvoj raka prostate). [4]<br /> <br /> Pri oblikovanju sgRNA za Cas13a so upoštevali optimalno dolžino prilegajoče regije 28-31 nukleotidov, prav tako pa pri sgRNA encima Cas13a velja pravilo o 100 % prileganju začetnega dela prilegajoče regije. Cas13a sicer za prepoznavo tarče ne potrebuje PAM motiva. Skupina je oblikovala tri sgRNA za Cas13a, ki se vežejo na RNA biomarkerje v urinu. [5]<br /> <br /> ====Pomnoževanje z metodo RPA====<br /> Ker obstaja verjetnost, da ta sistem ne bi zaznal zelo nizkih koncentracij RNA biomarkerjev v vzorcu, bi pred detekcijo RNA biomarkerje še namnožili z uporabo metode pomnoževanja z rekombinazo in polimerazo (ang. recombinase polymerase amplification – RPA). Gre za proces, alternativen PCR, ki poteka izotermalno in je zato njegova izvedba precej bolj enostavna. Za pomnožitev RNA bi potrebovali štiri encime, in sicer rekombinazo, ssDNA vezavne proteine (SSB) reverzno transkriptazo in DNA polimerazo. Da bi pridobili še pomnoženo RNA in ne le cDNA, bi uporabili še T7 polimerazo. <br /> <br /> V reakciji reverzna transkriptaza najprej prepiše ssRNA v cDNA. V RNA/DNA hibrid rekombinaza vstavi začetne oligonukleotide, ki so komplementarni RNA tarči. Na smerne začetne oligonukleotide bi dodali še T7 promotor. SSB stabilizirajo odrinjeno ssDNA na mestu vezave oligonukleotida, reverzna transkriptaza pa nato spet prepiše RNA verigo v cDNA. Iz novonastale cDNA z dodanim T7 promotorjem nato nastane RNA transkript, ki je na koncu reakcije prisoten v visoki koncentraciji in ga zlahka zaznamo v vzorcu. V opisu projekta ne omenjajo DNA polimeraze, a vendar bi bila ta potrebna za sintezo druge verige cDNA. Lahko bi uporabili tudi encim, ki lahko deluje kot reverzna transkriptaza in DNA polimeraza. <br /> <br /> Podobno reakcijo bi lahko zasnovali tudi za pomnoževanje DNA fragmentov, ki vsebujejo SNP-je, le da bi v tem primeru potrebovali le DNA polimerazo, ne pa tudi reverzne transkriptaze.<br /> <br /> ====Inhibicija aktivnosti RNaz====<br /> Ker pri zaznavanju RNA uporabljamo RNaze, ki se aktivirajo ob specifičnem signalu, bi ostale RNaze v urinu lahko motile specifično cepitev reporterja. Zato je ključna inaktivacija RNaz v vzorcu. V projektu bi uporabili metodo cepitve RNaz s proteinazo K. Po obdelavi vzorca s proteinazo K bi slednjo inaktivirali s fenilmetilsulfonil fluoridom (PMSF), da ne bi razgradila encimov Cas. <br /> ====Detekcija cepitve reporterja====<br /> Za detekcijo cepitve reporterja s Cas12a in Cas13a bi v projektu uporabili hitri test z lateralnim tokom (ang. lateral flow strip). Ta metoda za vizualizacijo rezultatov uporablja anti-FAM-protitelesa s pripetimi zlatimi nanodelci v kombinaciji s posebnim reporterjem. Reporter prek ssRNA ali ssDNA verige povezuje biotin in fluorescein amidit (FAM). Cepitev reporterja se vizualizira na traku, na katerem sta prisotni dve liniji – testna in kontrolna. Če pride do cepitve verige reporterja, se na FAM na cepljenem reporterju lahko veže anti-FAM-protitelo z zlatimi nanodelci na način, ki omogoča vezavo na sekundarna protitelesa, imobilizirana na testni liniji na traku za detekcijo. V primeru, da se reporter ne cepi, pa se protitelesa vežejo na FAM na način, ki ne omogoča vezave na sekundarna protitelesa in se zato reporter prek biotina veže na kontrolno linijo na traku za detekcijo.<br /> <br /> ==REZULTATI==<br /> Skupina je uspešno izolirala encima Cas12a in Cas13a ter z in vitro transkripcijo sintetizirala sgRNA. Skupaj so inkubirali izolirana encima in različne koncentracije sgRNA, nato pa preverili, ali prisotnost tarče v vzorcu vzbudi nespecifično endonukleazno aktivnost Cas12a in Cas13a. <br /> <br /> Pokazali so, da je ob daljših časih inkubacije, višjih koncentracijah sgRNA in prisotnosti tarčne sekvence reporter bolj razgrajen, kar kaže na aktivacijo nespecifične endonukleazne aktivnosti encimov Cas12a in Cas13a. V primeru Cas13a je bilo nekaj reporterske RNA razgrajene tudi v odsotnosti tarčne sekvence, kar bi lahko vodilo v lažno pozitivne rezultate. Zato bi bila v tem delu projekta potrebna optimizacija. <br /> <br /> Sledila je inhibicija RNaz, ki so jo zaznavali s kompletom reagenov podjetja Thermofisher, kjer je kot reporter delovala RNA z vezanim fluoroforom in dušilcem fluorescence. Vzorce sline in urina so inkubirali s proteinazo K in fluorescenco primerjali v vzorcu brez proteinaze. Rezultati so pokazali, da je bila inhibicija RNaz v urinu po triurni inkubaciji boljša kot inhibicija v slini. Po prekonočni inkubaciji je bila tudi inhibicija v slini popolna, torej je metoda uspešna. <br /> <br /> Nato so proteinazo K inhibirali z 1mM PMSF in k tem vzorcem dodali še nekaj nove sline in urina, kjer se nahajajo aktivne RNaze, ter izvedli enako detekcijo kot prej. Pokazali so, da so v vzorcih prisotne aktivne RNaze, torej je bila aktivnost proteinaze K inhibirana.<br /> <br /> Preverili so še možnost uporabe hitrega testa z lateralnim tokom (ang. lateral flow strip) kot metode detekcije. Ugotovili so, da negativni testi dajo signal tako v testni, kot tudi v kontrolni liniji, saj se nekaj reporterja verjetno spontano razgradi. V tem primeru je še vedno jasna razlika med pozitivnim in negativnim testom, saj pri pozitivnem dobimo signal le v testni liniji. Vendar bi bila optimizacija testa za bolj nedvoumne rezultate vseeno dobrodošla.<br /> <br /> ==ZAKLJUČEK==<br /> V okviru projekta je skupina razvila postopek za detekcijo poljubnega izbranega biomarkerja v urinu. Pri tem so oblikovali številne enostavne in sestavljene biokocke, ki so dostopne [https://2020.igem.org/Team:SDU-Denmark/Parts tukaj]. Projekt ima velik potencial za izboljšanje zgodnje diagnostike raka prostate, vendar bi bile potrebne še številne optimizacije. Izboljšati bi bilo treba metodo detekcije (hitri test z lateralnim tokom), da bi bili rezultati bolj nedvoumni, optimizirala bi se lahko tudi izbira biomarkerjev, saj so izbrani v tem projektu primerni predvsem za belsko populacijo. Poleg tega bi bil potreben dizajn embalaže, kjer bi se reakcija izvajala, saj bi le na ta način zagotovili ponovljivost razmer in s tem zanesljivost rezultatov testov.<br /> <br /> ==VIRI==<br /> <br /> [1] Benecchi, L. PSA velocity and PSA slope. Prostate Cancer Prostatic Dis 9, 169–172 (2006). doi:10.1038/sj.pcan.4500866<br /> <br /> [2] Gootenberg JS, Abudayyeh OO, Kellner MJ, Joung J, Collins JJ, Zhang F. Multiplexed and portable nucleic acid detection platform with Cas13, Cas12a, and Csm6. Science. 2018;360(6387):439-44. doi:10.1126/science.aaq0179<br /> <br /> [3] Creutzburg, S. C. A., Wu, W. Y., Mohanraju, P., Swartjes, T., Alkan, F., Gorodkin, J., . . . van der Oost, J. (2020). Good guide, bad guide: spacer sequence-dependent cleavage efficiency of Cas12a. Nucleic Acids Res, 48(6), 3228-3243. doi:10.1093/nar/gkz1240<br /> <br /> [4] Gootenberg JS, Abudayyeh OO, Lee JW, et al. Nucleic acid detection with CRISPR-Cas13a/C2c2. Science. 2017;356(6336):438-442. doi:10.1126/science.aam9321</div>

Luka.gnidovec https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=PROSTATUS:_Diagnostika_raka_prostate&diff=19281 2021-05-17T20:52:45Z

<p>Luka.gnidovec: /* VIRI */</p> <hr /> <div>PROSTATUS je iGEM projekt iz leta 2020, ki je osvojil nominacijo v kategoriji Diagnostika med podiplomskimi študenti. Pripravili so ga študenti Univerze južne Danske. <br /> Spletna stran projekta: [https://2020.igem.org/Team:SDU-Denmark]<br /> <br /> ==UVOD==<br /> Rak prostate je eden najpogostejših rakov, ki se razvije pri enem izmed osmih moških. Število diagnosticiranih primerov se povečuje, k čemur verjetno pripomore povišan screening koncentracije PSA (prostate specific antigen) v krvi med moškimi. Ta test pa je precej nezanesljiv, z 31 % verjetnostjo lažnega pozitivnega rezultata in 42 % verjetnostjo lažnega negativnega rezultata.[1,2] PSA nivo v krvi se lahko poviša iz številnih drugih razlogov (vnetje urinarnega trakta, ejakulacija, zdravila…). Poleg tega preverjanju krvne slike sledi še neprijeten in invaziven fizičen pregled. Vsekakor ima trenutni postopek screeninga raka prostate veliko potenciala za izboljšave. [1] <br /> <br /> PROSTATUS je študentski projekt skupine iz Univerze južne Danske, s katerim so sodelovali na iGEM-u 2020 v kategoriji podiplomskih študentov. V projektu so razvili neinvazivno metodo, pri kateri zaznavamo tri RNA biomarkerje v urinu (TMPRSS2:ERG, AMACR, PCA3) in dva SNP-ja (rs6983267, rs16901979), ki povečata verjetnost razvoja raka prostate, v DNA v slini. Test deluje na podlagi sistema CRISPR-Cas13a v primeru zaznavanja RNA biomarkerjev in sistema CRISPR-Cas12a v primeru zaznavanja SNP-jev. [1]<br /> <br /> ==OPIS PROJEKTA==<br /> ===PRINCIP DELOVANJA SISTEMA===<br /> Skupina je v projektu uporabila dve metodi, ki temeljita na delovanju proteinov družine Cas. <br /> ====SHERLOCK====<br /> SHERLOCK (Specific High-sensitivity Enzymatic Reporter unLOCKinkg) je metoda, ki s pomočjo encima Cas13a zaznava ssRNA v vzorcu. V Cas13a je vezana sgRNA (single guide RNA), ki zazna komplementarno tarčo v vzorcu. Ko pride do hibridizacije s tarčo, se Cas13a aktivira in cepi tudi netarčno RNA v vzorcu. Na ta način lahko pride do cepitve reporterske RNA. [3]<br /> <br /> ====DETECTR====<br /> DETECTR (The DNA Edonuclease Targeted CRISPR Trans Reporter system) je metoda, ki uporablja Cas12a in zaznava tarčno ssDNA v vzorcu, ob prepoznavi tarče pa pridobi nespecifično endonukleazno aktivnost in cepi reportersko ssDNA. [3]<br /> <br /> ===POTEK OBLIKOVANJA PROJEKTA===<br /> ====Kloniranje==== <br /> Za implementacijo teh dveh metod so morali najprej izraziti dva Cas encima ter pridobiti različne sgRNA, ki se vežejo v encima. <br /> Encime so izražali v E. coli. Uporabili so gena cas13a iz bakterije Leptotrichia wadei in cas12a iz Acidaminococcus sp. Z orodjem podjetja IDT so optimizirali rabo kodonov ter nato v konstrukt dodali vse potrebne komponente za izražanje proteinov (IPTG inducibilni promotor, RBS, terminator ter oznaki SUMO in His na N-koncu) ter naročili sintetični gen, ki so mu nato dodali še restrikcijska mesta za EcoRI in SpeI. <br /> Gen cas12a, vstavljen v plazmid, so pridobili od raziskovalne skupine iz Univerze južne Danske. S pomnoževanjem s PCR so genu dodali promotorsko regijo sintetičnega gena cas13a. Oba konstrukta so nato klonirali v vektor pSB1C3 in transformirali kompetentne celice E. coli seva ER2256. <br /> ====Načrtovanje sgRNA====<br /> Nato so dizajnirali sgRNA, ki se veže v Cas proteina in je ključna za prepoznavanje tarče. Za aktivacijo Cas12a je v oddaljenosti največ 21 bp od tarče potreben PAM motiv (TTTV). Poleg tega je za specifično aktivacijo Cas12a pomembno 100 % ujemanje v začetnem delu t. i. prilegajoče regije sgRNA (ang. spacer sequence) medtem ko v bolj oddaljenem območju prilegajoče regije 100 % ujemanje za aktivacijo ni potrebno. Če želimo specifično prepoznati SNP, je torej pomembno, da se ta nahaja v začetni regiji tarče, sicer bi dobili nespecifično aktivacijo in signal, ki ne bi bil odvisen od SNP-ja. Optimalna dolžina prilegajoče regije naj bi bila 21 – 24 nukleotidov. Vse te omejitve je skupina upoštevala pri dizajnu sgRNA za Cas12a. Oblikovali so štiri sgRNA, ki se vežejo na Cas12a in prepoznajo posamezne možne alele (prevladujoč alel in alel, ki poviša možnost za razvoj raka prostate). [4]<br /> <br /> Pri oblikovanju sgRNA za Cas13a so upoštevali optimalno dolžino prilegajoče regije 28-31 nukleotidov, prav tako pa pri sgRNA encima Cas13a velja pravilo o 100 % prileganju začetnega dela prilegajoče regije. Cas13a sicer za prepoznavo tarče ne potrebuje PAM motiva. Skupina je oblikovala tri sgRNA za Cas13a, ki se vežejo na RNA biomarkerje v urinu. [5]<br /> <br /> ====Pomnoževanje z metodo RPA====<br /> Ker obstaja verjetnost, da ta sistem ne bi zaznal zelo nizkih koncentracij RNA biomarkerjev v vzorcu, bi pred detekcijo RNA biomarkerje še namnožili z uporabo metode pomnoževanja z rekombinazo in polimerazo (ang. recombinase polymerase amplification – RPA). Gre za proces, alternativen PCR, ki poteka izotermalno in je zato njegova izvedba precej bolj enostavna. Za pomnožitev RNA bi potrebovali štiri encime, in sicer rekombinazo, ssDNA vezavne proteine (SSB) reverzno transkriptazo in DNA polimerazo. Da bi pridobili še pomnoženo RNA in ne le cDNA, bi uporabili še T7 polimerazo. <br /> <br /> V reakciji reverzna transkriptaza najprej prepiše ssRNA v cDNA. V RNA/DNA hibrid rekombinaza vstavi začetne oligonukleotide, ki so komplementarni RNA tarči. Na smerne začetne oligonukleotide bi dodali še T7 promotor. SSB stabilizirajo odrinjeno ssDNA na mestu vezave oligonukleotida, reverzna transkriptaza pa nato spet prepiše RNA verigo v cDNA. Iz novonastale cDNA z dodanim T7 promotorjem nato nastane RNA transkript, ki je na koncu reakcije prisoten v visoki koncentraciji in ga zlahka zaznamo v vzorcu. V opisu projekta ne omenjajo DNA polimeraze, a vendar bi bila ta potrebna za sintezo druge verige cDNA. Lahko bi uporabili tudi encim, ki lahko deluje kot reverzna transkriptaza in DNA polimeraza. <br /> <br /> Podobno reakcijo bi lahko zasnovali tudi za pomnoževanje DNA fragmentov, ki vsebujejo SNP-je, le da bi v tem primeru potrebovali le DNA polimerazo, ne pa tudi reverzne transkriptaze.<br /> <br /> ====Inhibicija aktivnosti RNaz====<br /> Ker pri zaznavanju RNA uporabljamo RNaze, ki se aktivirajo ob specifičnem signalu, bi ostale RNaze v urinu lahko motile specifično cepitev reporterja. Zato je ključna inaktivacija RNaz v vzorcu. V projektu bi uporabili metodo cepitve RNaz s proteinazo K. Po obdelavi vzorca s proteinazo K bi slednjo inaktivirali s fenilmetilsulfonil fluoridom (PMSF), da ne bi razgradila encimov Cas. <br /> ====Detekcija cepitve reporterja====<br /> Za detekcijo cepitve reporterja s Cas12a in Cas13a bi v projektu uporabili hitri test z lateralnim tokom (ang. lateral flow strip). Ta metoda za vizualizacijo rezultatov uporablja anti-FAM-protitelesa s pripetimi zlatimi nanodelci v kombinaciji s posebnim reporterjem. Reporter prek ssRNA ali ssDNA verige povezuje biotin in fluorescein amidit (FAM). Cepitev reporterja se vizualizira na traku, na katerem sta prisotni dve liniji – testna in kontrolna. Če pride do cepitve verige reporterja, se na FAM na cepljenem reporterju lahko veže anti-FAM-protitelo z zlatimi nanodelci na način, ki omogoča vezavo na sekundarna protitelesa, imobilizirana na testni liniji na traku za detekcijo. V primeru, da se reporter ne cepi, pa se protitelesa vežejo na FAM na način, ki ne omogoča vezave na sekundarna protitelesa in se zato reporter prek biotina veže na kontrolno linijo na traku za detekcijo.<br /> <br /> ==REZULTATI==<br /> Skupina je uspešno izolirala encima Cas12a in Cas13a ter z in vitro transkripcijo sintetizirala sgRNA. Skupaj so inkubirali izolirana encima in različne koncentracije sgRNA, nato pa preverili, ali prisotnost tarče v vzorcu vzbudi nespecifično endonukleazno aktivnost Cas12a in Cas13a. <br /> <br /> Pokazali so, da je ob daljših časih inkubacije, višjih koncentracijah sgRNA in prisotnosti tarčne sekvence reporter bolj razgrajen, kar kaže na aktivacijo nespecifične endonukleazne aktivnosti encimov Cas12a in Cas13a. V primeru Cas13a je bilo nekaj reporterske RNA razgrajene tudi v odsotnosti tarčne sekvence, kar bi lahko vodilo v lažno pozitivne rezultate. Zato bi bila v tem delu projekta potrebna optimizacija. <br /> <br /> Sledila je inhibicija RNaz, ki so jo zaznavali s kompletom reagenov podjetja Thermofisher, kjer je kot reporter delovala RNA z vezanim fluoroforom in dušilcem fluorescence. Vzorce sline in urina so inkubirali s proteinazo K in fluorescenco primerjali v vzorcu brez proteinaze. Rezultati so pokazali, da je bila inhibicija RNaz v urinu po triurni inkubaciji boljša kot inhibicija v slini. Po prekonočni inkubaciji je bila tudi inhibicija v slini popolna, torej je metoda uspešna. <br /> <br /> Nato so proteinazo K inhibirali z 1mM PMSF in k tem vzorcem dodali še nekaj nove sline in urina, kjer se nahajajo aktivne RNaze, ter izvedli enako detekcijo kot prej. Pokazali so, da so v vzorcih prisotne aktivne RNaze, torej je bila aktivnost proteinaze K inhibirana.<br /> <br /> Preverili so še možnost uporabe hitrega testa z lateralnim tokom (ang. lateral flow strip) kot metode detekcije. Ugotovili so, da negativni testi dajo signal tako v testni, kot tudi v kontrolni liniji, saj se nekaj reporterja verjetno spontano razgradi. V tem primeru je še vedno jasna razlika med pozitivnim in negativnim testom, saj pri pozitivnem dobimo signal le v testni liniji. Vendar bi bila optimizacija testa za bolj nedvoumne rezultate vseeno dobrodošla.<br /> <br /> ==ZAKLJUČEK==<br /> V okviru projekta je skupina razvila postopek za detekcijo poljubnega izbranega biomarkerja v urinu. Pri tem so oblikovali številne enostavne in sestavljene biokocke, ki so dostopne [https://2020.igem.org/Team:SDU-Denmark/Parts tukaj]. Projekt ima velik potencial za izboljšanje zgodnje diagnostike raka prostate, vendar bi bile potrebne še številne optimizacije. Izboljšati bi bilo treba metodo detekcije (hitri test z lateralnim tokom), da bi bili rezultati bolj nedvoumni, optimizirala bi se lahko tudi izbira biomarkerjev, saj so izbrani v tem projektu primerni predvsem za belsko populacijo. Poleg tega bi bil potreben dizajn embalaže, kjer bi se reakcija izvajala, saj bi le na ta način zagotovili ponovljivost razmer in s tem zanesljivost rezultatov testov.<br /> <br /> ==VIRI==<br /> <br /> [1] Benecchi, L. PSA velocity and PSA slope. Prostate Cancer Prostatic Dis 9, 169–172 (2006). doi:10.1038/sj.pcan.4500866<br /> <br /> [2] Gootenberg JS, Abudayyeh OO, Kellner MJ, Joung J, Collins JJ, Zhang F. Multiplexed and portable nucleic acid detection platform with Cas13, Cas12a, and Csm6. Science. 2018;360(6387):439-44. doi:10.1126/science.aaq0179<br /> <br /> [3] Creutzburg, S. C. A., Wu, W. Y., Mohanraju, P., Swartjes, T., Alkan, F., Gorodkin, J., . . . van der Oost, J. (2020). Good guide, bad guide: spacer sequence-dependent cleavage efficiency of Cas12a. Nucleic Acids Res, 48(6), 3228-3243. doi:10.1093/nar/gkz1240<br /> <br /> [4] Gootenberg JS, Abudayyeh OO, Lee JW, et al. Nucleic acid detection with CRISPR-Cas13a/C2c2. Science. 2017;356(6336):438-442. doi:10.1126/science.aam9321</div>

Luka.gnidovec https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=PROSTATUS:_Diagnostika_raka_prostate&diff=19280 2021-05-17T20:51:35Z

<p>Luka.gnidovec: /* INŽENIRING */</p> <hr /> <div>PROSTATUS je iGEM projekt iz leta 2020, ki je osvojil nominacijo v kategoriji Diagnostika med podiplomskimi študenti. Pripravili so ga študenti Univerze južne Danske. <br /> Spletna stran projekta: [https://2020.igem.org/Team:SDU-Denmark]<br /> <br /> ==UVOD==<br /> Rak prostate je eden najpogostejših rakov, ki se razvije pri enem izmed osmih moških. Število diagnosticiranih primerov se povečuje, k čemur verjetno pripomore povišan screening koncentracije PSA (prostate specific antigen) v krvi med moškimi. Ta test pa je precej nezanesljiv, z 31 % verjetnostjo lažnega pozitivnega rezultata in 42 % verjetnostjo lažnega negativnega rezultata.[1,2] PSA nivo v krvi se lahko poviša iz številnih drugih razlogov (vnetje urinarnega trakta, ejakulacija, zdravila…). Poleg tega preverjanju krvne slike sledi še neprijeten in invaziven fizičen pregled. Vsekakor ima trenutni postopek screeninga raka prostate veliko potenciala za izboljšave. [1] <br /> <br /> PROSTATUS je študentski projekt skupine iz Univerze južne Danske, s katerim so sodelovali na iGEM-u 2020 v kategoriji podiplomskih študentov. V projektu so razvili neinvazivno metodo, pri kateri zaznavamo tri RNA biomarkerje v urinu (TMPRSS2:ERG, AMACR, PCA3) in dva SNP-ja (rs6983267, rs16901979), ki povečata verjetnost razvoja raka prostate, v DNA v slini. Test deluje na podlagi sistema CRISPR-Cas13a v primeru zaznavanja RNA biomarkerjev in sistema CRISPR-Cas12a v primeru zaznavanja SNP-jev. [1]<br /> <br /> ==OPIS PROJEKTA==<br /> ===PRINCIP DELOVANJA SISTEMA===<br /> Skupina je v projektu uporabila dve metodi, ki temeljita na delovanju proteinov družine Cas. <br /> ====SHERLOCK====<br /> SHERLOCK (Specific High-sensitivity Enzymatic Reporter unLOCKinkg) je metoda, ki s pomočjo encima Cas13a zaznava ssRNA v vzorcu. V Cas13a je vezana sgRNA (single guide RNA), ki zazna komplementarno tarčo v vzorcu. Ko pride do hibridizacije s tarčo, se Cas13a aktivira in cepi tudi netarčno RNA v vzorcu. Na ta način lahko pride do cepitve reporterske RNA. [3]<br /> <br /> ====DETECTR====<br /> DETECTR (The DNA Edonuclease Targeted CRISPR Trans Reporter system) je metoda, ki uporablja Cas12a in zaznava tarčno ssDNA v vzorcu, ob prepoznavi tarče pa pridobi nespecifično endonukleazno aktivnost in cepi reportersko ssDNA. [3]<br /> <br /> ===POTEK OBLIKOVANJA PROJEKTA===<br /> ====Kloniranje==== <br /> Za implementacijo teh dveh metod so morali najprej izraziti dva Cas encima ter pridobiti različne sgRNA, ki se vežejo v encima. <br /> Encime so izražali v E. coli. Uporabili so gena cas13a iz bakterije Leptotrichia wadei in cas12a iz Acidaminococcus sp. Z orodjem podjetja IDT so optimizirali rabo kodonov ter nato v konstrukt dodali vse potrebne komponente za izražanje proteinov (IPTG inducibilni promotor, RBS, terminator ter oznaki SUMO in His na N-koncu) ter naročili sintetični gen, ki so mu nato dodali še restrikcijska mesta za EcoRI in SpeI. <br /> Gen cas12a, vstavljen v plazmid, so pridobili od raziskovalne skupine iz Univerze južne Danske. S pomnoževanjem s PCR so genu dodali promotorsko regijo sintetičnega gena cas13a. Oba konstrukta so nato klonirali v vektor pSB1C3 in transformirali kompetentne celice E. coli seva ER2256. <br /> ====Načrtovanje sgRNA====<br /> Nato so dizajnirali sgRNA, ki se veže v Cas proteina in je ključna za prepoznavanje tarče. Za aktivacijo Cas12a je v oddaljenosti največ 21 bp od tarče potreben PAM motiv (TTTV). Poleg tega je za specifično aktivacijo Cas12a pomembno 100 % ujemanje v začetnem delu t. i. prilegajoče regije sgRNA (ang. spacer sequence) medtem ko v bolj oddaljenem območju prilegajoče regije 100 % ujemanje za aktivacijo ni potrebno. Če želimo specifično prepoznati SNP, je torej pomembno, da se ta nahaja v začetni regiji tarče, sicer bi dobili nespecifično aktivacijo in signal, ki ne bi bil odvisen od SNP-ja. Optimalna dolžina prilegajoče regije naj bi bila 21 – 24 nukleotidov. Vse te omejitve je skupina upoštevala pri dizajnu sgRNA za Cas12a. Oblikovali so štiri sgRNA, ki se vežejo na Cas12a in prepoznajo posamezne možne alele (prevladujoč alel in alel, ki poviša možnost za razvoj raka prostate). [4]<br /> <br /> Pri oblikovanju sgRNA za Cas13a so upoštevali optimalno dolžino prilegajoče regije 28-31 nukleotidov, prav tako pa pri sgRNA encima Cas13a velja pravilo o 100 % prileganju začetnega dela prilegajoče regije. Cas13a sicer za prepoznavo tarče ne potrebuje PAM motiva. Skupina je oblikovala tri sgRNA za Cas13a, ki se vežejo na RNA biomarkerje v urinu. [5]<br /> <br /> ====Pomnoževanje z metodo RPA====<br /> Ker obstaja verjetnost, da ta sistem ne bi zaznal zelo nizkih koncentracij RNA biomarkerjev v vzorcu, bi pred detekcijo RNA biomarkerje še namnožili z uporabo metode pomnoževanja z rekombinazo in polimerazo (ang. recombinase polymerase amplification – RPA). Gre za proces, alternativen PCR, ki poteka izotermalno in je zato njegova izvedba precej bolj enostavna. Za pomnožitev RNA bi potrebovali štiri encime, in sicer rekombinazo, ssDNA vezavne proteine (SSB) reverzno transkriptazo in DNA polimerazo. Da bi pridobili še pomnoženo RNA in ne le cDNA, bi uporabili še T7 polimerazo. <br /> <br /> V reakciji reverzna transkriptaza najprej prepiše ssRNA v cDNA. V RNA/DNA hibrid rekombinaza vstavi začetne oligonukleotide, ki so komplementarni RNA tarči. Na smerne začetne oligonukleotide bi dodali še T7 promotor. SSB stabilizirajo odrinjeno ssDNA na mestu vezave oligonukleotida, reverzna transkriptaza pa nato spet prepiše RNA verigo v cDNA. Iz novonastale cDNA z dodanim T7 promotorjem nato nastane RNA transkript, ki je na koncu reakcije prisoten v visoki koncentraciji in ga zlahka zaznamo v vzorcu. V opisu projekta ne omenjajo DNA polimeraze, a vendar bi bila ta potrebna za sintezo druge verige cDNA. Lahko bi uporabili tudi encim, ki lahko deluje kot reverzna transkriptaza in DNA polimeraza. <br /> <br /> Podobno reakcijo bi lahko zasnovali tudi za pomnoževanje DNA fragmentov, ki vsebujejo SNP-je, le da bi v tem primeru potrebovali le DNA polimerazo, ne pa tudi reverzne transkriptaze.<br /> <br /> ====Inhibicija aktivnosti RNaz====<br /> Ker pri zaznavanju RNA uporabljamo RNaze, ki se aktivirajo ob specifičnem signalu, bi ostale RNaze v urinu lahko motile specifično cepitev reporterja. Zato je ključna inaktivacija RNaz v vzorcu. V projektu bi uporabili metodo cepitve RNaz s proteinazo K. Po obdelavi vzorca s proteinazo K bi slednjo inaktivirali s fenilmetilsulfonil fluoridom (PMSF), da ne bi razgradila encimov Cas. <br /> ====Detekcija cepitve reporterja====<br /> Za detekcijo cepitve reporterja s Cas12a in Cas13a bi v projektu uporabili hitri test z lateralnim tokom (ang. lateral flow strip). Ta metoda za vizualizacijo rezultatov uporablja anti-FAM-protitelesa s pripetimi zlatimi nanodelci v kombinaciji s posebnim reporterjem. Reporter prek ssRNA ali ssDNA verige povezuje biotin in fluorescein amidit (FAM). Cepitev reporterja se vizualizira na traku, na katerem sta prisotni dve liniji – testna in kontrolna. Če pride do cepitve verige reporterja, se na FAM na cepljenem reporterju lahko veže anti-FAM-protitelo z zlatimi nanodelci na način, ki omogoča vezavo na sekundarna protitelesa, imobilizirana na testni liniji na traku za detekcijo. V primeru, da se reporter ne cepi, pa se protitelesa vežejo na FAM na način, ki ne omogoča vezave na sekundarna protitelesa in se zato reporter prek biotina veže na kontrolno linijo na traku za detekcijo.<br /> <br /> ==REZULTATI==<br /> Skupina je uspešno izolirala encima Cas12a in Cas13a ter z in vitro transkripcijo sintetizirala sgRNA. Skupaj so inkubirali izolirana encima in različne koncentracije sgRNA, nato pa preverili, ali prisotnost tarče v vzorcu vzbudi nespecifično endonukleazno aktivnost Cas12a in Cas13a. <br /> <br /> Pokazali so, da je ob daljših časih inkubacije, višjih koncentracijah sgRNA in prisotnosti tarčne sekvence reporter bolj razgrajen, kar kaže na aktivacijo nespecifične endonukleazne aktivnosti encimov Cas12a in Cas13a. V primeru Cas13a je bilo nekaj reporterske RNA razgrajene tudi v odsotnosti tarčne sekvence, kar bi lahko vodilo v lažno pozitivne rezultate. Zato bi bila v tem delu projekta potrebna optimizacija. <br /> <br /> Sledila je inhibicija RNaz, ki so jo zaznavali s kompletom reagenov podjetja Thermofisher, kjer je kot reporter delovala RNA z vezanim fluoroforom in dušilcem fluorescence. Vzorce sline in urina so inkubirali s proteinazo K in fluorescenco primerjali v vzorcu brez proteinaze. Rezultati so pokazali, da je bila inhibicija RNaz v urinu po triurni inkubaciji boljša kot inhibicija v slini. Po prekonočni inkubaciji je bila tudi inhibicija v slini popolna, torej je metoda uspešna. <br /> <br /> Nato so proteinazo K inhibirali z 1mM PMSF in k tem vzorcem dodali še nekaj nove sline in urina, kjer se nahajajo aktivne RNaze, ter izvedli enako detekcijo kot prej. Pokazali so, da so v vzorcih prisotne aktivne RNaze, torej je bila aktivnost proteinaze K inhibirana.<br /> <br /> Preverili so še možnost uporabe hitrega testa z lateralnim tokom (ang. lateral flow strip) kot metode detekcije. Ugotovili so, da negativni testi dajo signal tako v testni, kot tudi v kontrolni liniji, saj se nekaj reporterja verjetno spontano razgradi. V tem primeru je še vedno jasna razlika med pozitivnim in negativnim testom, saj pri pozitivnem dobimo signal le v testni liniji. Vendar bi bila optimizacija testa za bolj nedvoumne rezultate vseeno dobrodošla.<br /> <br /> ==ZAKLJUČEK==<br /> V okviru projekta je skupina razvila postopek za detekcijo poljubnega izbranega biomarkerja v urinu. Pri tem so oblikovali številne enostavne in sestavljene biokocke, ki so dostopne [https://2020.igem.org/Team:SDU-Denmark/Parts tukaj]. Projekt ima velik potencial za izboljšanje zgodnje diagnostike raka prostate, vendar bi bile potrebne še številne optimizacije. Izboljšati bi bilo treba metodo detekcije (hitri test z lateralnim tokom), da bi bili rezultati bolj nedvoumni, optimizirala bi se lahko tudi izbira biomarkerjev, saj so izbrani v tem projektu primerni predvsem za belsko populacijo. Poleg tega bi bil potreben dizajn embalaže, kjer bi se reakcija izvajala, saj bi le na ta način zagotovili ponovljivost razmer in s tem zanesljivost rezultatov testov.<br /> <br /> ==VIRI==<br /> <br /> [1] https://2020.igem.org/Team:SDU-Denmark<br /> <br /> [2] Benecchi, L. PSA velocity and PSA slope. Prostate Cancer Prostatic Dis 9, 169–172 (2006). doi:10.1038/sj.pcan.4500866<br /> <br /> [3] Gootenberg JS, Abudayyeh OO, Kellner MJ, Joung J, Collins JJ, Zhang F. Multiplexed and portable nucleic acid detection platform with Cas13, Cas12a, and Csm6. Science. 2018;360(6387):439-44. doi:10.1126/science.aaq0179<br /> <br /> [4] Creutzburg, S. C. A., Wu, W. Y., Mohanraju, P., Swartjes, T., Alkan, F., Gorodkin, J., . . . van der Oost, J. (2020). Good guide, bad guide: spacer sequence-dependent cleavage efficiency of Cas12a. Nucleic Acids Res, 48(6), 3228-3243. doi:10.1093/nar/gkz1240<br /> <br /> [5] Gootenberg JS, Abudayyeh OO, Lee JW, et al. Nucleic acid detection with CRISPR-Cas13a/C2c2. Science. 2017;356(6336):438-442. doi:10.1126/science.aam9321</div>

Luka.gnidovec https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=PROSTATUS:_Diagnostika_raka_prostate&diff=19279 2021-05-17T20:50:15Z

<p>Luka.gnidovec: /* ZAKLJUČEK */</p> <hr /> <div>PROSTATUS je iGEM projekt iz leta 2020, ki je osvojil nominacijo v kategoriji Diagnostika med podiplomskimi študenti. Pripravili so ga študenti Univerze južne Danske. <br /> Spletna stran projekta: [https://2020.igem.org/Team:SDU-Denmark]<br /> <br /> ==UVOD==<br /> Rak prostate je eden najpogostejših rakov, ki se razvije pri enem izmed osmih moških. Število diagnosticiranih primerov se povečuje, k čemur verjetno pripomore povišan screening koncentracije PSA (prostate specific antigen) v krvi med moškimi. Ta test pa je precej nezanesljiv, z 31 % verjetnostjo lažnega pozitivnega rezultata in 42 % verjetnostjo lažnega negativnega rezultata.[1,2] PSA nivo v krvi se lahko poviša iz številnih drugih razlogov (vnetje urinarnega trakta, ejakulacija, zdravila…). Poleg tega preverjanju krvne slike sledi še neprijeten in invaziven fizičen pregled. Vsekakor ima trenutni postopek screeninga raka prostate veliko potenciala za izboljšave. [1] <br /> <br /> PROSTATUS je študentski projekt skupine iz Univerze južne Danske, s katerim so sodelovali na iGEM-u 2020 v kategoriji podiplomskih študentov. V projektu so razvili neinvazivno metodo, pri kateri zaznavamo tri RNA biomarkerje v urinu (TMPRSS2:ERG, AMACR, PCA3) in dva SNP-ja (rs6983267, rs16901979), ki povečata verjetnost razvoja raka prostate, v DNA v slini. Test deluje na podlagi sistema CRISPR-Cas13a v primeru zaznavanja RNA biomarkerjev in sistema CRISPR-Cas12a v primeru zaznavanja SNP-jev. [1]<br /> <br /> ==OPIS PROJEKTA==<br /> ===PRINCIP DELOVANJA SISTEMA===<br /> Skupina je v projektu uporabila dve metodi, ki temeljita na delovanju proteinov družine Cas. <br /> ====SHERLOCK====<br /> SHERLOCK (Specific High-sensitivity Enzymatic Reporter unLOCKinkg) je metoda, ki s pomočjo encima Cas13a zaznava ssRNA v vzorcu. V Cas13a je vezana sgRNA (single guide RNA), ki zazna komplementarno tarčo v vzorcu. Ko pride do hibridizacije s tarčo, se Cas13a aktivira in cepi tudi netarčno RNA v vzorcu. Na ta način lahko pride do cepitve reporterske RNA. [3]<br /> <br /> ====DETECTR====<br /> DETECTR (The DNA Edonuclease Targeted CRISPR Trans Reporter system) je metoda, ki uporablja Cas12a in zaznava tarčno ssDNA v vzorcu, ob prepoznavi tarče pa pridobi nespecifično endonukleazno aktivnost in cepi reportersko ssDNA. [3]<br /> <br /> ===INŽENIRING===<br /> ====Kloniranje==== <br /> Za implementacijo teh dveh metod so morali najprej izraziti dva Cas encima ter pridobiti različne sgRNA, ki se vežejo v encima. <br /> Encime so izražali v E. coli. Uporabili so gena cas13a iz bakterije Leptotrichia wadei in cas12a iz Acidaminococcus sp. Z orodjem podjetja IDT so optimizirali rabo kodonov ter nato v konstrukt dodali vse potrebne komponente za izražanje proteinov (IPTG inducibilni promotor, RBS, terminator ter oznaki SUMO in His na N-koncu) ter naročili sintetični gen, ki so mu nato dodali še restrikcijska mesta za EcoRI in SpeI. <br /> Gen cas12a, vstavljen v plazmid, so pridobili od raziskovalne skupine iz Univerze južne Danske. S pomnoževanjem s PCR so genu dodali promotorsko regijo sintetičnega gena cas13a. Oba konstrukta so nato klonirali v vektor pSB1C3 in transformirali kompetentne celice E. coli seva ER2256. <br /> ====Načrtovanje sgRNA====<br /> Nato so dizajnirali sgRNA, ki se veže v Cas proteina in je ključna za prepoznavanje tarče. Za aktivacijo Cas12a je v oddaljenosti največ 21 bp od tarče potreben PAM motiv (TTTV). Poleg tega je za specifično aktivacijo Cas12a pomembno 100 % ujemanje v začetnem delu t. i. prilegajoče regije sgRNA (ang. spacer sequence) medtem ko v bolj oddaljenem območju prilegajoče regije 100 % ujemanje za aktivacijo ni potrebno. Če želimo specifično prepoznati SNP, je torej pomembno, da se ta nahaja v začetni regiji tarče, sicer bi dobili nespecifično aktivacijo in signal, ki ne bi bil odvisen od SNP-ja. Optimalna dolžina prilegajoče regije naj bi bila 21 – 24 nukleotidov. Vse te omejitve je skupina upoštevala pri dizajnu sgRNA za Cas12a. Oblikovali so štiri sgRNA, ki se vežejo na Cas12a in prepoznajo posamezne možne alele (prevladujoč alel in alel, ki poviša možnost za razvoj raka prostate). [4]<br /> <br /> Pri oblikovanju sgRNA za Cas13a so upoštevali optimalno dolžino prilegajoče regije 28-31 nukleotidov, prav tako pa pri sgRNA encima Cas13a velja pravilo o 100 % prileganju začetnega dela prilegajoče regije. Cas13a sicer za prepoznavo tarče ne potrebuje PAM motiva. Skupina je oblikovala tri sgRNA za Cas13a, ki se vežejo na RNA biomarkerje v urinu. [5]<br /> <br /> ====Pomnoževanje z metodo RPA====<br /> Ker obstaja verjetnost, da ta sistem ne bi zaznal zelo nizkih koncentracij RNA biomarkerjev v vzorcu, bi pred detekcijo RNA biomarkerje še namnožili z uporabo metode pomnoževanja z rekombinazo in polimerazo (ang. recombinase polymerase amplification – RPA). Gre za proces, alternativen PCR, ki poteka izotermalno in je zato njegova izvedba precej bolj enostavna. Za pomnožitev RNA bi potrebovali štiri encime, in sicer rekombinazo, ssDNA vezavne proteine (SSB) reverzno transkriptazo in DNA polimerazo. Da bi pridobili še pomnoženo RNA in ne le cDNA, bi uporabili še T7 polimerazo. <br /> <br /> V reakciji reverzna transkriptaza najprej prepiše ssRNA v cDNA. V RNA/DNA hibrid rekombinaza vstavi začetne oligonukleotide, ki so komplementarni RNA tarči. Na smerne začetne oligonukleotide bi dodali še T7 promotor. SSB stabilizirajo odrinjeno ssDNA na mestu vezave oligonukleotida, reverzna transkriptaza pa nato spet prepiše RNA verigo v cDNA. Iz novonastale cDNA z dodanim T7 promotorjem nato nastane RNA transkript, ki je na koncu reakcije prisoten v visoki koncentraciji in ga zlahka zaznamo v vzorcu. V opisu projekta ne omenjajo DNA polimeraze, a vendar bi bila ta potrebna za sintezo druge verige cDNA. Lahko bi uporabili tudi encim, ki lahko deluje kot reverzna transkriptaza in DNA polimeraza. <br /> <br /> Podobno reakcijo bi lahko zasnovali tudi za pomnoževanje DNA fragmentov, ki vsebujejo SNP-je, le da bi v tem primeru potrebovali le DNA polimerazo, ne pa tudi reverzne transkriptaze.<br /> <br /> ====Inhibicija aktivnosti RNaz====<br /> Ker pri zaznavanju RNA uporabljamo RNaze, ki se aktivirajo ob specifičnem signalu, bi ostale RNaze v urinu lahko motile specifično cepitev reporterja. Zato je ključna inaktivacija RNaz v vzorcu. V projektu bi uporabili metodo cepitve RNaz s proteinazo K. Po obdelavi vzorca s proteinazo K bi slednjo inaktivirali s fenilmetilsulfonil fluoridom (PMSF), da ne bi razgradila encimov Cas. <br /> ====Detekcija cepitve reporterja====<br /> Za detekcijo cepitve reporterja s Cas12a in Cas13a bi v projektu uporabili hitri test z lateralnim tokom (ang. lateral flow strip). Ta metoda za vizualizacijo rezultatov uporablja anti-FAM-protitelesa s pripetimi zlatimi nanodelci v kombinaciji s posebnim reporterjem. Reporter prek ssRNA ali ssDNA verige povezuje biotin in fluorescein amidit (FAM). Cepitev reporterja se vizualizira na traku, na katerem sta prisotni dve liniji – testna in kontrolna. Če pride do cepitve verige reporterja, se na FAM na cepljenem reporterju lahko veže anti-FAM-protitelo z zlatimi nanodelci na način, ki omogoča vezavo na sekundarna protitelesa, imobilizirana na testni liniji na traku za detekcijo. V primeru, da se reporter ne cepi, pa se protitelesa vežejo na FAM na način, ki ne omogoča vezave na sekundarna protitelesa in se zato reporter prek biotina veže na kontrolno linijo na traku za detekcijo.<br /> ==REZULTATI==<br /> Skupina je uspešno izolirala encima Cas12a in Cas13a ter z in vitro transkripcijo sintetizirala sgRNA. Skupaj so inkubirali izolirana encima in različne koncentracije sgRNA, nato pa preverili, ali prisotnost tarče v vzorcu vzbudi nespecifično endonukleazno aktivnost Cas12a in Cas13a. <br /> <br /> Pokazali so, da je ob daljših časih inkubacije, višjih koncentracijah sgRNA in prisotnosti tarčne sekvence reporter bolj razgrajen, kar kaže na aktivacijo nespecifične endonukleazne aktivnosti encimov Cas12a in Cas13a. V primeru Cas13a je bilo nekaj reporterske RNA razgrajene tudi v odsotnosti tarčne sekvence, kar bi lahko vodilo v lažno pozitivne rezultate. Zato bi bila v tem delu projekta potrebna optimizacija. <br /> <br /> Sledila je inhibicija RNaz, ki so jo zaznavali s kompletom reagenov podjetja Thermofisher, kjer je kot reporter delovala RNA z vezanim fluoroforom in dušilcem fluorescence. Vzorce sline in urina so inkubirali s proteinazo K in fluorescenco primerjali v vzorcu brez proteinaze. Rezultati so pokazali, da je bila inhibicija RNaz v urinu po triurni inkubaciji boljša kot inhibicija v slini. Po prekonočni inkubaciji je bila tudi inhibicija v slini popolna, torej je metoda uspešna. <br /> <br /> Nato so proteinazo K inhibirali z 1mM PMSF in k tem vzorcem dodali še nekaj nove sline in urina, kjer se nahajajo aktivne RNaze, ter izvedli enako detekcijo kot prej. Pokazali so, da so v vzorcih prisotne aktivne RNaze, torej je bila aktivnost proteinaze K inhibirana.<br /> <br /> Preverili so še možnost uporabe hitrega testa z lateralnim tokom (ang. lateral flow strip) kot metode detekcije. Ugotovili so, da negativni testi dajo signal tako v testni, kot tudi v kontrolni liniji, saj se nekaj reporterja verjetno spontano razgradi. V tem primeru je še vedno jasna razlika med pozitivnim in negativnim testom, saj pri pozitivnem dobimo signal le v testni liniji. Vendar bi bila optimizacija testa za bolj nedvoumne rezultate vseeno dobrodošla.<br /> <br /> ==ZAKLJUČEK==<br /> V okviru projekta je skupina razvila postopek za detekcijo poljubnega izbranega biomarkerja v urinu. Pri tem so oblikovali številne enostavne in sestavljene biokocke, ki so dostopne [https://2020.igem.org/Team:SDU-Denmark/Parts tukaj]. Projekt ima velik potencial za izboljšanje zgodnje diagnostike raka prostate, vendar bi bile potrebne še številne optimizacije. Izboljšati bi bilo treba metodo detekcije (hitri test z lateralnim tokom), da bi bili rezultati bolj nedvoumni, optimizirala bi se lahko tudi izbira biomarkerjev, saj so izbrani v tem projektu primerni predvsem za belsko populacijo. Poleg tega bi bil potreben dizajn embalaže, kjer bi se reakcija izvajala, saj bi le na ta način zagotovili ponovljivost razmer in s tem zanesljivost rezultatov testov.<br /> <br /> ==VIRI==<br /> <br /> [1] https://2020.igem.org/Team:SDU-Denmark<br /> <br /> [2] Benecchi, L. PSA velocity and PSA slope. Prostate Cancer Prostatic Dis 9, 169–172 (2006). doi:10.1038/sj.pcan.4500866<br /> <br /> [3] Gootenberg JS, Abudayyeh OO, Kellner MJ, Joung J, Collins JJ, Zhang F. Multiplexed and portable nucleic acid detection platform with Cas13, Cas12a, and Csm6. Science. 2018;360(6387):439-44. doi:10.1126/science.aaq0179<br /> <br /> [4] Creutzburg, S. C. A., Wu, W. Y., Mohanraju, P., Swartjes, T., Alkan, F., Gorodkin, J., . . . van der Oost, J. (2020). Good guide, bad guide: spacer sequence-dependent cleavage efficiency of Cas12a. Nucleic Acids Res, 48(6), 3228-3243. doi:10.1093/nar/gkz1240<br /> <br /> [5] Gootenberg JS, Abudayyeh OO, Lee JW, et al. Nucleic acid detection with CRISPR-Cas13a/C2c2. Science. 2017;356(6336):438-442. doi:10.1126/science.aam9321</div>

Luka.gnidovec https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=PROSTATUS:_Diagnostika_raka_prostate&diff=19278 2021-05-17T20:49:49Z

<p>Luka.gnidovec: /* ZAKLJUČEK */</p> <hr /> <div>PROSTATUS je iGEM projekt iz leta 2020, ki je osvojil nominacijo v kategoriji Diagnostika med podiplomskimi študenti. Pripravili so ga študenti Univerze južne Danske. <br /> Spletna stran projekta: [https://2020.igem.org/Team:SDU-Denmark]<br /> <br /> ==UVOD==<br /> Rak prostate je eden najpogostejših rakov, ki se razvije pri enem izmed osmih moških. Število diagnosticiranih primerov se povečuje, k čemur verjetno pripomore povišan screening koncentracije PSA (prostate specific antigen) v krvi med moškimi. Ta test pa je precej nezanesljiv, z 31 % verjetnostjo lažnega pozitivnega rezultata in 42 % verjetnostjo lažnega negativnega rezultata.[1,2] PSA nivo v krvi se lahko poviša iz številnih drugih razlogov (vnetje urinarnega trakta, ejakulacija, zdravila…). Poleg tega preverjanju krvne slike sledi še neprijeten in invaziven fizičen pregled. Vsekakor ima trenutni postopek screeninga raka prostate veliko potenciala za izboljšave. [1] <br /> <br /> PROSTATUS je študentski projekt skupine iz Univerze južne Danske, s katerim so sodelovali na iGEM-u 2020 v kategoriji podiplomskih študentov. V projektu so razvili neinvazivno metodo, pri kateri zaznavamo tri RNA biomarkerje v urinu (TMPRSS2:ERG, AMACR, PCA3) in dva SNP-ja (rs6983267, rs16901979), ki povečata verjetnost razvoja raka prostate, v DNA v slini. Test deluje na podlagi sistema CRISPR-Cas13a v primeru zaznavanja RNA biomarkerjev in sistema CRISPR-Cas12a v primeru zaznavanja SNP-jev. [1]<br /> <br /> ==OPIS PROJEKTA==<br /> ===PRINCIP DELOVANJA SISTEMA===<br /> Skupina je v projektu uporabila dve metodi, ki temeljita na delovanju proteinov družine Cas. <br /> ====SHERLOCK====<br /> SHERLOCK (Specific High-sensitivity Enzymatic Reporter unLOCKinkg) je metoda, ki s pomočjo encima Cas13a zaznava ssRNA v vzorcu. V Cas13a je vezana sgRNA (single guide RNA), ki zazna komplementarno tarčo v vzorcu. Ko pride do hibridizacije s tarčo, se Cas13a aktivira in cepi tudi netarčno RNA v vzorcu. Na ta način lahko pride do cepitve reporterske RNA. [3]<br /> <br /> ====DETECTR====<br /> DETECTR (The DNA Edonuclease Targeted CRISPR Trans Reporter system) je metoda, ki uporablja Cas12a in zaznava tarčno ssDNA v vzorcu, ob prepoznavi tarče pa pridobi nespecifično endonukleazno aktivnost in cepi reportersko ssDNA. [3]<br /> <br /> ===INŽENIRING===<br /> ====Kloniranje==== <br /> Za implementacijo teh dveh metod so morali najprej izraziti dva Cas encima ter pridobiti različne sgRNA, ki se vežejo v encima. <br /> Encime so izražali v E. coli. Uporabili so gena cas13a iz bakterije Leptotrichia wadei in cas12a iz Acidaminococcus sp. Z orodjem podjetja IDT so optimizirali rabo kodonov ter nato v konstrukt dodali vse potrebne komponente za izražanje proteinov (IPTG inducibilni promotor, RBS, terminator ter oznaki SUMO in His na N-koncu) ter naročili sintetični gen, ki so mu nato dodali še restrikcijska mesta za EcoRI in SpeI. <br /> Gen cas12a, vstavljen v plazmid, so pridobili od raziskovalne skupine iz Univerze južne Danske. S pomnoževanjem s PCR so genu dodali promotorsko regijo sintetičnega gena cas13a. Oba konstrukta so nato klonirali v vektor pSB1C3 in transformirali kompetentne celice E. coli seva ER2256. <br /> ====Načrtovanje sgRNA====<br /> Nato so dizajnirali sgRNA, ki se veže v Cas proteina in je ključna za prepoznavanje tarče. Za aktivacijo Cas12a je v oddaljenosti največ 21 bp od tarče potreben PAM motiv (TTTV). Poleg tega je za specifično aktivacijo Cas12a pomembno 100 % ujemanje v začetnem delu t. i. prilegajoče regije sgRNA (ang. spacer sequence) medtem ko v bolj oddaljenem območju prilegajoče regije 100 % ujemanje za aktivacijo ni potrebno. Če želimo specifično prepoznati SNP, je torej pomembno, da se ta nahaja v začetni regiji tarče, sicer bi dobili nespecifično aktivacijo in signal, ki ne bi bil odvisen od SNP-ja. Optimalna dolžina prilegajoče regije naj bi bila 21 – 24 nukleotidov. Vse te omejitve je skupina upoštevala pri dizajnu sgRNA za Cas12a. Oblikovali so štiri sgRNA, ki se vežejo na Cas12a in prepoznajo posamezne možne alele (prevladujoč alel in alel, ki poviša možnost za razvoj raka prostate). [4]<br /> <br /> Pri oblikovanju sgRNA za Cas13a so upoštevali optimalno dolžino prilegajoče regije 28-31 nukleotidov, prav tako pa pri sgRNA encima Cas13a velja pravilo o 100 % prileganju začetnega dela prilegajoče regije. Cas13a sicer za prepoznavo tarče ne potrebuje PAM motiva. Skupina je oblikovala tri sgRNA za Cas13a, ki se vežejo na RNA biomarkerje v urinu. [5]<br /> <br /> ====Pomnoževanje z metodo RPA====<br /> Ker obstaja verjetnost, da ta sistem ne bi zaznal zelo nizkih koncentracij RNA biomarkerjev v vzorcu, bi pred detekcijo RNA biomarkerje še namnožili z uporabo metode pomnoževanja z rekombinazo in polimerazo (ang. recombinase polymerase amplification – RPA). Gre za proces, alternativen PCR, ki poteka izotermalno in je zato njegova izvedba precej bolj enostavna. Za pomnožitev RNA bi potrebovali štiri encime, in sicer rekombinazo, ssDNA vezavne proteine (SSB) reverzno transkriptazo in DNA polimerazo. Da bi pridobili še pomnoženo RNA in ne le cDNA, bi uporabili še T7 polimerazo. <br /> <br /> V reakciji reverzna transkriptaza najprej prepiše ssRNA v cDNA. V RNA/DNA hibrid rekombinaza vstavi začetne oligonukleotide, ki so komplementarni RNA tarči. Na smerne začetne oligonukleotide bi dodali še T7 promotor. SSB stabilizirajo odrinjeno ssDNA na mestu vezave oligonukleotida, reverzna transkriptaza pa nato spet prepiše RNA verigo v cDNA. Iz novonastale cDNA z dodanim T7 promotorjem nato nastane RNA transkript, ki je na koncu reakcije prisoten v visoki koncentraciji in ga zlahka zaznamo v vzorcu. V opisu projekta ne omenjajo DNA polimeraze, a vendar bi bila ta potrebna za sintezo druge verige cDNA. Lahko bi uporabili tudi encim, ki lahko deluje kot reverzna transkriptaza in DNA polimeraza. <br /> <br /> Podobno reakcijo bi lahko zasnovali tudi za pomnoževanje DNA fragmentov, ki vsebujejo SNP-je, le da bi v tem primeru potrebovali le DNA polimerazo, ne pa tudi reverzne transkriptaze.<br /> <br /> ====Inhibicija aktivnosti RNaz====<br /> Ker pri zaznavanju RNA uporabljamo RNaze, ki se aktivirajo ob specifičnem signalu, bi ostale RNaze v urinu lahko motile specifično cepitev reporterja. Zato je ključna inaktivacija RNaz v vzorcu. V projektu bi uporabili metodo cepitve RNaz s proteinazo K. Po obdelavi vzorca s proteinazo K bi slednjo inaktivirali s fenilmetilsulfonil fluoridom (PMSF), da ne bi razgradila encimov Cas. <br /> ====Detekcija cepitve reporterja====<br /> Za detekcijo cepitve reporterja s Cas12a in Cas13a bi v projektu uporabili hitri test z lateralnim tokom (ang. lateral flow strip). Ta metoda za vizualizacijo rezultatov uporablja anti-FAM-protitelesa s pripetimi zlatimi nanodelci v kombinaciji s posebnim reporterjem. Reporter prek ssRNA ali ssDNA verige povezuje biotin in fluorescein amidit (FAM). Cepitev reporterja se vizualizira na traku, na katerem sta prisotni dve liniji – testna in kontrolna. Če pride do cepitve verige reporterja, se na FAM na cepljenem reporterju lahko veže anti-FAM-protitelo z zlatimi nanodelci na način, ki omogoča vezavo na sekundarna protitelesa, imobilizirana na testni liniji na traku za detekcijo. V primeru, da se reporter ne cepi, pa se protitelesa vežejo na FAM na način, ki ne omogoča vezave na sekundarna protitelesa in se zato reporter prek biotina veže na kontrolno linijo na traku za detekcijo.<br /> ==REZULTATI==<br /> Skupina je uspešno izolirala encima Cas12a in Cas13a ter z in vitro transkripcijo sintetizirala sgRNA. Skupaj so inkubirali izolirana encima in različne koncentracije sgRNA, nato pa preverili, ali prisotnost tarče v vzorcu vzbudi nespecifično endonukleazno aktivnost Cas12a in Cas13a. <br /> <br /> Pokazali so, da je ob daljših časih inkubacije, višjih koncentracijah sgRNA in prisotnosti tarčne sekvence reporter bolj razgrajen, kar kaže na aktivacijo nespecifične endonukleazne aktivnosti encimov Cas12a in Cas13a. V primeru Cas13a je bilo nekaj reporterske RNA razgrajene tudi v odsotnosti tarčne sekvence, kar bi lahko vodilo v lažno pozitivne rezultate. Zato bi bila v tem delu projekta potrebna optimizacija. <br /> <br /> Sledila je inhibicija RNaz, ki so jo zaznavali s kompletom reagenov podjetja Thermofisher, kjer je kot reporter delovala RNA z vezanim fluoroforom in dušilcem fluorescence. Vzorce sline in urina so inkubirali s proteinazo K in fluorescenco primerjali v vzorcu brez proteinaze. Rezultati so pokazali, da je bila inhibicija RNaz v urinu po triurni inkubaciji boljša kot inhibicija v slini. Po prekonočni inkubaciji je bila tudi inhibicija v slini popolna, torej je metoda uspešna. <br /> <br /> Nato so proteinazo K inhibirali z 1mM PMSF in k tem vzorcem dodali še nekaj nove sline in urina, kjer se nahajajo aktivne RNaze, ter izvedli enako detekcijo kot prej. Pokazali so, da so v vzorcih prisotne aktivne RNaze, torej je bila aktivnost proteinaze K inhibirana.<br /> <br /> Preverili so še možnost uporabe hitrega testa z lateralnim tokom (ang. lateral flow strip) kot metode detekcije. Ugotovili so, da negativni testi dajo signal tako v testni, kot tudi v kontrolni liniji, saj se nekaj reporterja verjetno spontano razgradi. V tem primeru je še vedno jasna razlika med pozitivnim in negativnim testom, saj pri pozitivnem dobimo signal le v testni liniji. Vendar bi bila optimizacija testa za bolj nedvoumne rezultate vseeno dobrodošla.<br /> <br /> ==ZAKLJUČEK==<br /> V okviru projekta je skupina razvila postopek za detekcijo poljubnega izbranega biomarkerja v urinu. Pri tem so sestavili številne enostavne in sestavljene biokocke, ki so dostopne [https://2020.igem.org/Team:SDU-Denmark/Parts tukaj]. Projekt ima velik potencial za izboljšanje zgodnje diagnostike raka prostate, vendar bi bile potrebne še številne optimizacije. Izboljšati bi bilo treba metodo detekcije (hitri test z lateralnim tokom), da bi bili rezultati bolj nedvoumni, optimizirala bi se lahko tudi izbira biomarkerjev, saj so izbrani v tem projektu primerni predvsem za belsko populacijo. Poleg tega bi bil potreben dizajn embalaže, kjer bi se reakcija izvajala, saj bi le na ta način zagotovili ponovljivost razmer in s tem zanesljivost rezultatov testov.<br /> <br /> ==VIRI==<br /> <br /> [1] https://2020.igem.org/Team:SDU-Denmark<br /> <br /> [2] Benecchi, L. PSA velocity and PSA slope. Prostate Cancer Prostatic Dis 9, 169–172 (2006). doi:10.1038/sj.pcan.4500866<br /> <br /> [3] Gootenberg JS, Abudayyeh OO, Kellner MJ, Joung J, Collins JJ, Zhang F. Multiplexed and portable nucleic acid detection platform with Cas13, Cas12a, and Csm6. Science. 2018;360(6387):439-44. doi:10.1126/science.aaq0179<br /> <br /> [4] Creutzburg, S. C. A., Wu, W. Y., Mohanraju, P., Swartjes, T., Alkan, F., Gorodkin, J., . . . van der Oost, J. (2020). Good guide, bad guide: spacer sequence-dependent cleavage efficiency of Cas12a. Nucleic Acids Res, 48(6), 3228-3243. doi:10.1093/nar/gkz1240<br /> <br /> [5] Gootenberg JS, Abudayyeh OO, Lee JW, et al. Nucleic acid detection with CRISPR-Cas13a/C2c2. Science. 2017;356(6336):438-442. doi:10.1126/science.aam9321</div>

Luka.gnidovec https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=PROSTATUS:_Diagnostika_raka_prostate&diff=19277 2021-05-17T20:47:10Z

<p>Luka.gnidovec: /* ZAKLJUČEK */</p> <hr /> <div>PROSTATUS je iGEM projekt iz leta 2020, ki je osvojil nominacijo v kategoriji Diagnostika med podiplomskimi študenti. Pripravili so ga študenti Univerze južne Danske. <br /> Spletna stran projekta: [https://2020.igem.org/Team:SDU-Denmark]<br /> <br /> ==UVOD==<br /> Rak prostate je eden najpogostejših rakov, ki se razvije pri enem izmed osmih moških. Število diagnosticiranih primerov se povečuje, k čemur verjetno pripomore povišan screening koncentracije PSA (prostate specific antigen) v krvi med moškimi. Ta test pa je precej nezanesljiv, z 31 % verjetnostjo lažnega pozitivnega rezultata in 42 % verjetnostjo lažnega negativnega rezultata.[1,2] PSA nivo v krvi se lahko poviša iz številnih drugih razlogov (vnetje urinarnega trakta, ejakulacija, zdravila…). Poleg tega preverjanju krvne slike sledi še neprijeten in invaziven fizičen pregled. Vsekakor ima trenutni postopek screeninga raka prostate veliko potenciala za izboljšave. [1] <br /> <br /> PROSTATUS je študentski projekt skupine iz Univerze južne Danske, s katerim so sodelovali na iGEM-u 2020 v kategoriji podiplomskih študentov. V projektu so razvili neinvazivno metodo, pri kateri zaznavamo tri RNA biomarkerje v urinu (TMPRSS2:ERG, AMACR, PCA3) in dva SNP-ja (rs6983267, rs16901979), ki povečata verjetnost razvoja raka prostate, v DNA v slini. Test deluje na podlagi sistema CRISPR-Cas13a v primeru zaznavanja RNA biomarkerjev in sistema CRISPR-Cas12a v primeru zaznavanja SNP-jev. [1]<br /> <br /> ==OPIS PROJEKTA==<br /> ===PRINCIP DELOVANJA SISTEMA===<br /> Skupina je v projektu uporabila dve metodi, ki temeljita na delovanju proteinov družine Cas. <br /> ====SHERLOCK====<br /> SHERLOCK (Specific High-sensitivity Enzymatic Reporter unLOCKinkg) je metoda, ki s pomočjo encima Cas13a zaznava ssRNA v vzorcu. V Cas13a je vezana sgRNA (single guide RNA), ki zazna komplementarno tarčo v vzorcu. Ko pride do hibridizacije s tarčo, se Cas13a aktivira in cepi tudi netarčno RNA v vzorcu. Na ta način lahko pride do cepitve reporterske RNA. [3]<br /> <br /> ====DETECTR====<br /> DETECTR (The DNA Edonuclease Targeted CRISPR Trans Reporter system) je metoda, ki uporablja Cas12a in zaznava tarčno ssDNA v vzorcu, ob prepoznavi tarče pa pridobi nespecifično endonukleazno aktivnost in cepi reportersko ssDNA. [3]<br /> <br /> ===INŽENIRING===<br /> ====Kloniranje==== <br /> Za implementacijo teh dveh metod so morali najprej izraziti dva Cas encima ter pridobiti različne sgRNA, ki se vežejo v encima. <br /> Encime so izražali v E. coli. Uporabili so gena cas13a iz bakterije Leptotrichia wadei in cas12a iz Acidaminococcus sp. Z orodjem podjetja IDT so optimizirali rabo kodonov ter nato v konstrukt dodali vse potrebne komponente za izražanje proteinov (IPTG inducibilni promotor, RBS, terminator ter oznaki SUMO in His na N-koncu) ter naročili sintetični gen, ki so mu nato dodali še restrikcijska mesta za EcoRI in SpeI. <br /> Gen cas12a, vstavljen v plazmid, so pridobili od raziskovalne skupine iz Univerze južne Danske. S pomnoževanjem s PCR so genu dodali promotorsko regijo sintetičnega gena cas13a. Oba konstrukta so nato klonirali v vektor pSB1C3 in transformirali kompetentne celice E. coli seva ER2256. <br /> ====Načrtovanje sgRNA====<br /> Nato so dizajnirali sgRNA, ki se veže v Cas proteina in je ključna za prepoznavanje tarče. Za aktivacijo Cas12a je v oddaljenosti največ 21 bp od tarče potreben PAM motiv (TTTV). Poleg tega je za specifično aktivacijo Cas12a pomembno 100 % ujemanje v začetnem delu t. i. prilegajoče regije sgRNA (ang. spacer sequence) medtem ko v bolj oddaljenem območju prilegajoče regije 100 % ujemanje za aktivacijo ni potrebno. Če želimo specifično prepoznati SNP, je torej pomembno, da se ta nahaja v začetni regiji tarče, sicer bi dobili nespecifično aktivacijo in signal, ki ne bi bil odvisen od SNP-ja. Optimalna dolžina prilegajoče regije naj bi bila 21 – 24 nukleotidov. Vse te omejitve je skupina upoštevala pri dizajnu sgRNA za Cas12a. Oblikovali so štiri sgRNA, ki se vežejo na Cas12a in prepoznajo posamezne možne alele (prevladujoč alel in alel, ki poviša možnost za razvoj raka prostate). [4]<br /> <br /> Pri oblikovanju sgRNA za Cas13a so upoštevali optimalno dolžino prilegajoče regije 28-31 nukleotidov, prav tako pa pri sgRNA encima Cas13a velja pravilo o 100 % prileganju začetnega dela prilegajoče regije. Cas13a sicer za prepoznavo tarče ne potrebuje PAM motiva. Skupina je oblikovala tri sgRNA za Cas13a, ki se vežejo na RNA biomarkerje v urinu. [5]<br /> <br /> ====Pomnoževanje z metodo RPA====<br /> Ker obstaja verjetnost, da ta sistem ne bi zaznal zelo nizkih koncentracij RNA biomarkerjev v vzorcu, bi pred detekcijo RNA biomarkerje še namnožili z uporabo metode pomnoževanja z rekombinazo in polimerazo (ang. recombinase polymerase amplification – RPA). Gre za proces, alternativen PCR, ki poteka izotermalno in je zato njegova izvedba precej bolj enostavna. Za pomnožitev RNA bi potrebovali štiri encime, in sicer rekombinazo, ssDNA vezavne proteine (SSB) reverzno transkriptazo in DNA polimerazo. Da bi pridobili še pomnoženo RNA in ne le cDNA, bi uporabili še T7 polimerazo. <br /> <br /> V reakciji reverzna transkriptaza najprej prepiše ssRNA v cDNA. V RNA/DNA hibrid rekombinaza vstavi začetne oligonukleotide, ki so komplementarni RNA tarči. Na smerne začetne oligonukleotide bi dodali še T7 promotor. SSB stabilizirajo odrinjeno ssDNA na mestu vezave oligonukleotida, reverzna transkriptaza pa nato spet prepiše RNA verigo v cDNA. Iz novonastale cDNA z dodanim T7 promotorjem nato nastane RNA transkript, ki je na koncu reakcije prisoten v visoki koncentraciji in ga zlahka zaznamo v vzorcu. V opisu projekta ne omenjajo DNA polimeraze, a vendar bi bila ta potrebna za sintezo druge verige cDNA. Lahko bi uporabili tudi encim, ki lahko deluje kot reverzna transkriptaza in DNA polimeraza. <br /> <br /> Podobno reakcijo bi lahko zasnovali tudi za pomnoževanje DNA fragmentov, ki vsebujejo SNP-je, le da bi v tem primeru potrebovali le DNA polimerazo, ne pa tudi reverzne transkriptaze.<br /> <br /> ====Inhibicija aktivnosti RNaz====<br /> Ker pri zaznavanju RNA uporabljamo RNaze, ki se aktivirajo ob specifičnem signalu, bi ostale RNaze v urinu lahko motile specifično cepitev reporterja. Zato je ključna inaktivacija RNaz v vzorcu. V projektu bi uporabili metodo cepitve RNaz s proteinazo K. Po obdelavi vzorca s proteinazo K bi slednjo inaktivirali s fenilmetilsulfonil fluoridom (PMSF), da ne bi razgradila encimov Cas. <br /> ====Detekcija cepitve reporterja====<br /> Za detekcijo cepitve reporterja s Cas12a in Cas13a bi v projektu uporabili hitri test z lateralnim tokom (ang. lateral flow strip). Ta metoda za vizualizacijo rezultatov uporablja anti-FAM-protitelesa s pripetimi zlatimi nanodelci v kombinaciji s posebnim reporterjem. Reporter prek ssRNA ali ssDNA verige povezuje biotin in fluorescein amidit (FAM). Cepitev reporterja se vizualizira na traku, na katerem sta prisotni dve liniji – testna in kontrolna. Če pride do cepitve verige reporterja, se na FAM na cepljenem reporterju lahko veže anti-FAM-protitelo z zlatimi nanodelci na način, ki omogoča vezavo na sekundarna protitelesa, imobilizirana na testni liniji na traku za detekcijo. V primeru, da se reporter ne cepi, pa se protitelesa vežejo na FAM na način, ki ne omogoča vezave na sekundarna protitelesa in se zato reporter prek biotina veže na kontrolno linijo na traku za detekcijo.<br /> ==REZULTATI==<br /> Skupina je uspešno izolirala encima Cas12a in Cas13a ter z in vitro transkripcijo sintetizirala sgRNA. Skupaj so inkubirali izolirana encima in različne koncentracije sgRNA, nato pa preverili, ali prisotnost tarče v vzorcu vzbudi nespecifično endonukleazno aktivnost Cas12a in Cas13a. <br /> <br /> Pokazali so, da je ob daljših časih inkubacije, višjih koncentracijah sgRNA in prisotnosti tarčne sekvence reporter bolj razgrajen, kar kaže na aktivacijo nespecifične endonukleazne aktivnosti encimov Cas12a in Cas13a. V primeru Cas13a je bilo nekaj reporterske RNA razgrajene tudi v odsotnosti tarčne sekvence, kar bi lahko vodilo v lažno pozitivne rezultate. Zato bi bila v tem delu projekta potrebna optimizacija. <br /> <br /> Sledila je inhibicija RNaz, ki so jo zaznavali s kompletom reagenov podjetja Thermofisher, kjer je kot reporter delovala RNA z vezanim fluoroforom in dušilcem fluorescence. Vzorce sline in urina so inkubirali s proteinazo K in fluorescenco primerjali v vzorcu brez proteinaze. Rezultati so pokazali, da je bila inhibicija RNaz v urinu po triurni inkubaciji boljša kot inhibicija v slini. Po prekonočni inkubaciji je bila tudi inhibicija v slini popolna, torej je metoda uspešna. <br /> <br /> Nato so proteinazo K inhibirali z 1mM PMSF in k tem vzorcem dodali še nekaj nove sline in urina, kjer se nahajajo aktivne RNaze, ter izvedli enako detekcijo kot prej. Pokazali so, da so v vzorcih prisotne aktivne RNaze, torej je bila aktivnost proteinaze K inhibirana.<br /> <br /> Preverili so še možnost uporabe hitrega testa z lateralnim tokom (ang. lateral flow strip) kot metode detekcije. Ugotovili so, da negativni testi dajo signal tako v testni, kot tudi v kontrolni liniji, saj se nekaj reporterja verjetno spontano razgradi. V tem primeru je še vedno jasna razlika med pozitivnim in negativnim testom, saj pri pozitivnem dobimo signal le v testni liniji. Vendar bi bila optimizacija testa za bolj nedvoumne rezultate vseeno dobrodošla.<br /> <br /> ==ZAKLJUČEK==<br /> V okviru projekta je skupina razvila postopek za detekcijo poljubnega izbranega biomarkerja v urinu. Pri tem so sestavili številne enostavne in sestavljene biokocke, ki so dostopne [[tukaj]]. Projekt ima velik potencial za izboljšanje zgodnje diagnostike raka prostate, vendar bi bile potrebne še številne optimizacije. Izboljšati bi bilo treba metodo detekcije (hitri test z lateralnim tokom), da bi bili rezultati bolj nedvoumni, optimizirala bi se lahko tudi izbira biomarkerjev, saj so izbrani v tem projektu primerni predvsem za belsko populacijo. Poleg tega bi bil potreben dizajn embalaže, kjer bi se reakcija izvajala, saj bi le na ta način zagotovili ponovljivost razmer in s tem zanesljivost rezultatov testov.<br /> <br /> ==VIRI==<br /> <br /> [1] https://2020.igem.org/Team:SDU-Denmark<br /> <br /> [2] Benecchi, L. PSA velocity and PSA slope. Prostate Cancer Prostatic Dis 9, 169–172 (2006). doi:10.1038/sj.pcan.4500866<br /> <br /> [3] Gootenberg JS, Abudayyeh OO, Kellner MJ, Joung J, Collins JJ, Zhang F. Multiplexed and portable nucleic acid detection platform with Cas13, Cas12a, and Csm6. Science. 2018;360(6387):439-44. doi:10.1126/science.aaq0179<br /> <br /> [4] Creutzburg, S. C. A., Wu, W. Y., Mohanraju, P., Swartjes, T., Alkan, F., Gorodkin, J., . . . van der Oost, J. (2020). Good guide, bad guide: spacer sequence-dependent cleavage efficiency of Cas12a. Nucleic Acids Res, 48(6), 3228-3243. doi:10.1093/nar/gkz1240<br /> <br /> [5] Gootenberg JS, Abudayyeh OO, Lee JW, et al. Nucleic acid detection with CRISPR-Cas13a/C2c2. Science. 2017;356(6336):438-442. doi:10.1126/science.aam9321</div>

Luka.gnidovec https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=PROSTATUS:_Diagnostika_raka_prostate&diff=19276 2021-05-17T20:46:08Z

<p>Luka.gnidovec: /* Načrtovanje sgRNA */</p> <hr /> <div>PROSTATUS je iGEM projekt iz leta 2020, ki je osvojil nominacijo v kategoriji Diagnostika med podiplomskimi študenti. Pripravili so ga študenti Univerze južne Danske. <br /> Spletna stran projekta: [https://2020.igem.org/Team:SDU-Denmark]<br /> <br /> ==UVOD==<br /> Rak prostate je eden najpogostejših rakov, ki se razvije pri enem izmed osmih moških. Število diagnosticiranih primerov se povečuje, k čemur verjetno pripomore povišan screening koncentracije PSA (prostate specific antigen) v krvi med moškimi. Ta test pa je precej nezanesljiv, z 31 % verjetnostjo lažnega pozitivnega rezultata in 42 % verjetnostjo lažnega negativnega rezultata.[1,2] PSA nivo v krvi se lahko poviša iz številnih drugih razlogov (vnetje urinarnega trakta, ejakulacija, zdravila…). Poleg tega preverjanju krvne slike sledi še neprijeten in invaziven fizičen pregled. Vsekakor ima trenutni postopek screeninga raka prostate veliko potenciala za izboljšave. [1] <br /> <br /> PROSTATUS je študentski projekt skupine iz Univerze južne Danske, s katerim so sodelovali na iGEM-u 2020 v kategoriji podiplomskih študentov. V projektu so razvili neinvazivno metodo, pri kateri zaznavamo tri RNA biomarkerje v urinu (TMPRSS2:ERG, AMACR, PCA3) in dva SNP-ja (rs6983267, rs16901979), ki povečata verjetnost razvoja raka prostate, v DNA v slini. Test deluje na podlagi sistema CRISPR-Cas13a v primeru zaznavanja RNA biomarkerjev in sistema CRISPR-Cas12a v primeru zaznavanja SNP-jev. [1]<br /> <br /> ==OPIS PROJEKTA==<br /> ===PRINCIP DELOVANJA SISTEMA===<br /> Skupina je v projektu uporabila dve metodi, ki temeljita na delovanju proteinov družine Cas. <br /> ====SHERLOCK====<br /> SHERLOCK (Specific High-sensitivity Enzymatic Reporter unLOCKinkg) je metoda, ki s pomočjo encima Cas13a zaznava ssRNA v vzorcu. V Cas13a je vezana sgRNA (single guide RNA), ki zazna komplementarno tarčo v vzorcu. Ko pride do hibridizacije s tarčo, se Cas13a aktivira in cepi tudi netarčno RNA v vzorcu. Na ta način lahko pride do cepitve reporterske RNA. [3]<br /> <br /> ====DETECTR====<br /> DETECTR (The DNA Edonuclease Targeted CRISPR Trans Reporter system) je metoda, ki uporablja Cas12a in zaznava tarčno ssDNA v vzorcu, ob prepoznavi tarče pa pridobi nespecifično endonukleazno aktivnost in cepi reportersko ssDNA. [3]<br /> <br /> ===INŽENIRING===<br /> ====Kloniranje==== <br /> Za implementacijo teh dveh metod so morali najprej izraziti dva Cas encima ter pridobiti različne sgRNA, ki se vežejo v encima. <br /> Encime so izražali v E. coli. Uporabili so gena cas13a iz bakterije Leptotrichia wadei in cas12a iz Acidaminococcus sp. Z orodjem podjetja IDT so optimizirali rabo kodonov ter nato v konstrukt dodali vse potrebne komponente za izražanje proteinov (IPTG inducibilni promotor, RBS, terminator ter oznaki SUMO in His na N-koncu) ter naročili sintetični gen, ki so mu nato dodali še restrikcijska mesta za EcoRI in SpeI. <br /> Gen cas12a, vstavljen v plazmid, so pridobili od raziskovalne skupine iz Univerze južne Danske. S pomnoževanjem s PCR so genu dodali promotorsko regijo sintetičnega gena cas13a. Oba konstrukta so nato klonirali v vektor pSB1C3 in transformirali kompetentne celice E. coli seva ER2256. <br /> ====Načrtovanje sgRNA====<br /> Nato so dizajnirali sgRNA, ki se veže v Cas proteina in je ključna za prepoznavanje tarče. Za aktivacijo Cas12a je v oddaljenosti največ 21 bp od tarče potreben PAM motiv (TTTV). Poleg tega je za specifično aktivacijo Cas12a pomembno 100 % ujemanje v začetnem delu t. i. prilegajoče regije sgRNA (ang. spacer sequence) medtem ko v bolj oddaljenem območju prilegajoče regije 100 % ujemanje za aktivacijo ni potrebno. Če želimo specifično prepoznati SNP, je torej pomembno, da se ta nahaja v začetni regiji tarče, sicer bi dobili nespecifično aktivacijo in signal, ki ne bi bil odvisen od SNP-ja. Optimalna dolžina prilegajoče regije naj bi bila 21 – 24 nukleotidov. Vse te omejitve je skupina upoštevala pri dizajnu sgRNA za Cas12a. Oblikovali so štiri sgRNA, ki se vežejo na Cas12a in prepoznajo posamezne možne alele (prevladujoč alel in alel, ki poviša možnost za razvoj raka prostate). [4]<br /> <br /> Pri oblikovanju sgRNA za Cas13a so upoštevali optimalno dolžino prilegajoče regije 28-31 nukleotidov, prav tako pa pri sgRNA encima Cas13a velja pravilo o 100 % prileganju začetnega dela prilegajoče regije. Cas13a sicer za prepoznavo tarče ne potrebuje PAM motiva. Skupina je oblikovala tri sgRNA za Cas13a, ki se vežejo na RNA biomarkerje v urinu. [5]<br /> <br /> ====Pomnoževanje z metodo RPA====<br /> Ker obstaja verjetnost, da ta sistem ne bi zaznal zelo nizkih koncentracij RNA biomarkerjev v vzorcu, bi pred detekcijo RNA biomarkerje še namnožili z uporabo metode pomnoževanja z rekombinazo in polimerazo (ang. recombinase polymerase amplification – RPA). Gre za proces, alternativen PCR, ki poteka izotermalno in je zato njegova izvedba precej bolj enostavna. Za pomnožitev RNA bi potrebovali štiri encime, in sicer rekombinazo, ssDNA vezavne proteine (SSB) reverzno transkriptazo in DNA polimerazo. Da bi pridobili še pomnoženo RNA in ne le cDNA, bi uporabili še T7 polimerazo. <br /> <br /> V reakciji reverzna transkriptaza najprej prepiše ssRNA v cDNA. V RNA/DNA hibrid rekombinaza vstavi začetne oligonukleotide, ki so komplementarni RNA tarči. Na smerne začetne oligonukleotide bi dodali še T7 promotor. SSB stabilizirajo odrinjeno ssDNA na mestu vezave oligonukleotida, reverzna transkriptaza pa nato spet prepiše RNA verigo v cDNA. Iz novonastale cDNA z dodanim T7 promotorjem nato nastane RNA transkript, ki je na koncu reakcije prisoten v visoki koncentraciji in ga zlahka zaznamo v vzorcu. V opisu projekta ne omenjajo DNA polimeraze, a vendar bi bila ta potrebna za sintezo druge verige cDNA. Lahko bi uporabili tudi encim, ki lahko deluje kot reverzna transkriptaza in DNA polimeraza. <br /> <br /> Podobno reakcijo bi lahko zasnovali tudi za pomnoževanje DNA fragmentov, ki vsebujejo SNP-je, le da bi v tem primeru potrebovali le DNA polimerazo, ne pa tudi reverzne transkriptaze.<br /> <br /> ====Inhibicija aktivnosti RNaz====<br /> Ker pri zaznavanju RNA uporabljamo RNaze, ki se aktivirajo ob specifičnem signalu, bi ostale RNaze v urinu lahko motile specifično cepitev reporterja. Zato je ključna inaktivacija RNaz v vzorcu. V projektu bi uporabili metodo cepitve RNaz s proteinazo K. Po obdelavi vzorca s proteinazo K bi slednjo inaktivirali s fenilmetilsulfonil fluoridom (PMSF), da ne bi razgradila encimov Cas. <br /> ====Detekcija cepitve reporterja====<br /> Za detekcijo cepitve reporterja s Cas12a in Cas13a bi v projektu uporabili hitri test z lateralnim tokom (ang. lateral flow strip). Ta metoda za vizualizacijo rezultatov uporablja anti-FAM-protitelesa s pripetimi zlatimi nanodelci v kombinaciji s posebnim reporterjem. Reporter prek ssRNA ali ssDNA verige povezuje biotin in fluorescein amidit (FAM). Cepitev reporterja se vizualizira na traku, na katerem sta prisotni dve liniji – testna in kontrolna. Če pride do cepitve verige reporterja, se na FAM na cepljenem reporterju lahko veže anti-FAM-protitelo z zlatimi nanodelci na način, ki omogoča vezavo na sekundarna protitelesa, imobilizirana na testni liniji na traku za detekcijo. V primeru, da se reporter ne cepi, pa se protitelesa vežejo na FAM na način, ki ne omogoča vezave na sekundarna protitelesa in se zato reporter prek biotina veže na kontrolno linijo na traku za detekcijo.<br /> ==REZULTATI==<br /> Skupina je uspešno izolirala encima Cas12a in Cas13a ter z in vitro transkripcijo sintetizirala sgRNA. Skupaj so inkubirali izolirana encima in različne koncentracije sgRNA, nato pa preverili, ali prisotnost tarče v vzorcu vzbudi nespecifično endonukleazno aktivnost Cas12a in Cas13a. <br /> <br /> Pokazali so, da je ob daljših časih inkubacije, višjih koncentracijah sgRNA in prisotnosti tarčne sekvence reporter bolj razgrajen, kar kaže na aktivacijo nespecifične endonukleazne aktivnosti encimov Cas12a in Cas13a. V primeru Cas13a je bilo nekaj reporterske RNA razgrajene tudi v odsotnosti tarčne sekvence, kar bi lahko vodilo v lažno pozitivne rezultate. Zato bi bila v tem delu projekta potrebna optimizacija. <br /> <br /> Sledila je inhibicija RNaz, ki so jo zaznavali s kompletom reagenov podjetja Thermofisher, kjer je kot reporter delovala RNA z vezanim fluoroforom in dušilcem fluorescence. Vzorce sline in urina so inkubirali s proteinazo K in fluorescenco primerjali v vzorcu brez proteinaze. Rezultati so pokazali, da je bila inhibicija RNaz v urinu po triurni inkubaciji boljša kot inhibicija v slini. Po prekonočni inkubaciji je bila tudi inhibicija v slini popolna, torej je metoda uspešna. <br /> <br /> Nato so proteinazo K inhibirali z 1mM PMSF in k tem vzorcem dodali še nekaj nove sline in urina, kjer se nahajajo aktivne RNaze, ter izvedli enako detekcijo kot prej. Pokazali so, da so v vzorcih prisotne aktivne RNaze, torej je bila aktivnost proteinaze K inhibirana.<br /> <br /> Preverili so še možnost uporabe hitrega testa z lateralnim tokom (ang. lateral flow strip) kot metode detekcije. Ugotovili so, da negativni testi dajo signal tako v testni, kot tudi v kontrolni liniji, saj se nekaj reporterja verjetno spontano razgradi. V tem primeru je še vedno jasna razlika med pozitivnim in negativnim testom, saj pri pozitivnem dobimo signal le v testni liniji. Vendar bi bila optimizacija testa za bolj nedvoumne rezultate vseeno dobrodošla.<br /> <br /> ==ZAKLJUČEK==<br /> V okviru projekta je skupina razvila postopek za detekcijo poljubnega izbranega biomarkerja v urinu. Pri tem so sestavili številne enostavne in sestavljene biokocke, ki so dostopne na povezavi. Projekt ima velik potencial za izboljšanje zgodnje diagnostike raka prostate, vendar bi bile potrebne še številne optimizacije. Izboljšati bi bilo treba metodo detekcije (hitri test z lateralnim tokom), da bi bili rezultati bolj nedvoumni, optimizirala bi se lahko tudi izbira biomarkerjev, saj so izbrani v tem projektu primerni predvsem za belsko populacijo. Poleg tega bi bil potreben dizajn embalaže, kjer bi se reakcija izvajala, saj bi le na ta način zagotovili ponovljivost razmer in s tem zanesljivost rezultatov testov.<br /> <br /> ==VIRI==<br /> <br /> [1] https://2020.igem.org/Team:SDU-Denmark<br /> <br /> [2] Benecchi, L. PSA velocity and PSA slope. Prostate Cancer Prostatic Dis 9, 169–172 (2006). doi:10.1038/sj.pcan.4500866<br /> <br /> [3] Gootenberg JS, Abudayyeh OO, Kellner MJ, Joung J, Collins JJ, Zhang F. Multiplexed and portable nucleic acid detection platform with Cas13, Cas12a, and Csm6. Science. 2018;360(6387):439-44. doi:10.1126/science.aaq0179<br /> <br /> [4] Creutzburg, S. C. A., Wu, W. Y., Mohanraju, P., Swartjes, T., Alkan, F., Gorodkin, J., . . . van der Oost, J. (2020). Good guide, bad guide: spacer sequence-dependent cleavage efficiency of Cas12a. Nucleic Acids Res, 48(6), 3228-3243. doi:10.1093/nar/gkz1240<br /> <br /> [5] Gootenberg JS, Abudayyeh OO, Lee JW, et al. Nucleic acid detection with CRISPR-Cas13a/C2c2. Science. 2017;356(6336):438-442. doi:10.1126/science.aam9321</div>

Luka.gnidovec https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=PROSTATUS:_Diagnostika_raka_prostate&diff=19275 2021-05-17T20:45:59Z

<p>Luka.gnidovec: /* Načrtovanje sgRNA */</p> <hr /> <div>PROSTATUS je iGEM projekt iz leta 2020, ki je osvojil nominacijo v kategoriji Diagnostika med podiplomskimi študenti. Pripravili so ga študenti Univerze južne Danske. <br /> Spletna stran projekta: [https://2020.igem.org/Team:SDU-Denmark]<br /> <br /> ==UVOD==<br /> Rak prostate je eden najpogostejših rakov, ki se razvije pri enem izmed osmih moških. Število diagnosticiranih primerov se povečuje, k čemur verjetno pripomore povišan screening koncentracije PSA (prostate specific antigen) v krvi med moškimi. Ta test pa je precej nezanesljiv, z 31 % verjetnostjo lažnega pozitivnega rezultata in 42 % verjetnostjo lažnega negativnega rezultata.[1,2] PSA nivo v krvi se lahko poviša iz številnih drugih razlogov (vnetje urinarnega trakta, ejakulacija, zdravila…). Poleg tega preverjanju krvne slike sledi še neprijeten in invaziven fizičen pregled. Vsekakor ima trenutni postopek screeninga raka prostate veliko potenciala za izboljšave. [1] <br /> <br /> PROSTATUS je študentski projekt skupine iz Univerze južne Danske, s katerim so sodelovali na iGEM-u 2020 v kategoriji podiplomskih študentov. V projektu so razvili neinvazivno metodo, pri kateri zaznavamo tri RNA biomarkerje v urinu (TMPRSS2:ERG, AMACR, PCA3) in dva SNP-ja (rs6983267, rs16901979), ki povečata verjetnost razvoja raka prostate, v DNA v slini. Test deluje na podlagi sistema CRISPR-Cas13a v primeru zaznavanja RNA biomarkerjev in sistema CRISPR-Cas12a v primeru zaznavanja SNP-jev. [1]<br /> <br /> ==OPIS PROJEKTA==<br /> ===PRINCIP DELOVANJA SISTEMA===<br /> Skupina je v projektu uporabila dve metodi, ki temeljita na delovanju proteinov družine Cas. <br /> ====SHERLOCK====<br /> SHERLOCK (Specific High-sensitivity Enzymatic Reporter unLOCKinkg) je metoda, ki s pomočjo encima Cas13a zaznava ssRNA v vzorcu. V Cas13a je vezana sgRNA (single guide RNA), ki zazna komplementarno tarčo v vzorcu. Ko pride do hibridizacije s tarčo, se Cas13a aktivira in cepi tudi netarčno RNA v vzorcu. Na ta način lahko pride do cepitve reporterske RNA. [3]<br /> <br /> ====DETECTR====<br /> DETECTR (The DNA Edonuclease Targeted CRISPR Trans Reporter system) je metoda, ki uporablja Cas12a in zaznava tarčno ssDNA v vzorcu, ob prepoznavi tarče pa pridobi nespecifično endonukleazno aktivnost in cepi reportersko ssDNA. [3]<br /> <br /> ===INŽENIRING===<br /> ====Kloniranje==== <br /> Za implementacijo teh dveh metod so morali najprej izraziti dva Cas encima ter pridobiti različne sgRNA, ki se vežejo v encima. <br /> Encime so izražali v E. coli. Uporabili so gena cas13a iz bakterije Leptotrichia wadei in cas12a iz Acidaminococcus sp. Z orodjem podjetja IDT so optimizirali rabo kodonov ter nato v konstrukt dodali vse potrebne komponente za izražanje proteinov (IPTG inducibilni promotor, RBS, terminator ter oznaki SUMO in His na N-koncu) ter naročili sintetični gen, ki so mu nato dodali še restrikcijska mesta za EcoRI in SpeI. <br /> Gen cas12a, vstavljen v plazmid, so pridobili od raziskovalne skupine iz Univerze južne Danske. S pomnoževanjem s PCR so genu dodali promotorsko regijo sintetičnega gena cas13a. Oba konstrukta so nato klonirali v vektor pSB1C3 in transformirali kompetentne celice E. coli seva ER2256. <br /> ====Načrtovanje sgRNA====<br /> Nato so dizajnirali sgRNA, ki se veže v Cas proteina in je ključna za prepoznavanje tarče. Za aktivacijo Cas12a je v oddaljenosti največ 21 bp od tarče potreben PAM motiv (TTTV). Poleg tega je za specifično aktivacijo Cas12a pomembno 100 % ujemanje v začetnem delu t. i. prilegajoče regije sgRNA (ang. spacer sequence) medtem ko v bolj oddaljenem območju prilegajoče regije 100 % ujemanje za aktivacijo ni potrebno. Če želimo specifično prepoznati SNP, je torej pomembno, da se ta nahaja v začetni regiji tarče, sicer bi dobili nespecifično aktivacijo in signal, ki ne bi bil odvisen od SNP-ja. Optimalna dolžina prilegajoče regije naj bi bila 21 – 24 nukleotidov. Vse te omejitve je skupina upoštevala pri dizajnu sgRNA za Cas12a. Oblikovali so štiri sgRNA, ki se vežejo na Cas12a in prepoznajo posamezne možne alele (prevladujoč alel in alel, ki poviša možnost za razvoj raka prostate). [4]<br /> <br /> Pri oblikovanju sgRNA za Cas13a so upoštevali optimalno dolžino prilegajoče regije 28-31 nukleotidov, prav tako pa pri sgRNA encima Cas13a velja pravilo o 100 % prileganju začetnega dela prilegajoče regije. Cas13a sicer za prepoznavo tarče ne potrebuje PAM motiva. Skupina je oblikovala tri sgRNA za Cas13a, ki se vežejo na RNA biomarkerje v urinu.[5]<br /> <br /> ====Pomnoževanje z metodo RPA====<br /> Ker obstaja verjetnost, da ta sistem ne bi zaznal zelo nizkih koncentracij RNA biomarkerjev v vzorcu, bi pred detekcijo RNA biomarkerje še namnožili z uporabo metode pomnoževanja z rekombinazo in polimerazo (ang. recombinase polymerase amplification – RPA). Gre za proces, alternativen PCR, ki poteka izotermalno in je zato njegova izvedba precej bolj enostavna. Za pomnožitev RNA bi potrebovali štiri encime, in sicer rekombinazo, ssDNA vezavne proteine (SSB) reverzno transkriptazo in DNA polimerazo. Da bi pridobili še pomnoženo RNA in ne le cDNA, bi uporabili še T7 polimerazo. <br /> <br /> V reakciji reverzna transkriptaza najprej prepiše ssRNA v cDNA. V RNA/DNA hibrid rekombinaza vstavi začetne oligonukleotide, ki so komplementarni RNA tarči. Na smerne začetne oligonukleotide bi dodali še T7 promotor. SSB stabilizirajo odrinjeno ssDNA na mestu vezave oligonukleotida, reverzna transkriptaza pa nato spet prepiše RNA verigo v cDNA. Iz novonastale cDNA z dodanim T7 promotorjem nato nastane RNA transkript, ki je na koncu reakcije prisoten v visoki koncentraciji in ga zlahka zaznamo v vzorcu. V opisu projekta ne omenjajo DNA polimeraze, a vendar bi bila ta potrebna za sintezo druge verige cDNA. Lahko bi uporabili tudi encim, ki lahko deluje kot reverzna transkriptaza in DNA polimeraza. <br /> <br /> Podobno reakcijo bi lahko zasnovali tudi za pomnoževanje DNA fragmentov, ki vsebujejo SNP-je, le da bi v tem primeru potrebovali le DNA polimerazo, ne pa tudi reverzne transkriptaze.<br /> <br /> ====Inhibicija aktivnosti RNaz====<br /> Ker pri zaznavanju RNA uporabljamo RNaze, ki se aktivirajo ob specifičnem signalu, bi ostale RNaze v urinu lahko motile specifično cepitev reporterja. Zato je ključna inaktivacija RNaz v vzorcu. V projektu bi uporabili metodo cepitve RNaz s proteinazo K. Po obdelavi vzorca s proteinazo K bi slednjo inaktivirali s fenilmetilsulfonil fluoridom (PMSF), da ne bi razgradila encimov Cas. <br /> ====Detekcija cepitve reporterja====<br /> Za detekcijo cepitve reporterja s Cas12a in Cas13a bi v projektu uporabili hitri test z lateralnim tokom (ang. lateral flow strip). Ta metoda za vizualizacijo rezultatov uporablja anti-FAM-protitelesa s pripetimi zlatimi nanodelci v kombinaciji s posebnim reporterjem. Reporter prek ssRNA ali ssDNA verige povezuje biotin in fluorescein amidit (FAM). Cepitev reporterja se vizualizira na traku, na katerem sta prisotni dve liniji – testna in kontrolna. Če pride do cepitve verige reporterja, se na FAM na cepljenem reporterju lahko veže anti-FAM-protitelo z zlatimi nanodelci na način, ki omogoča vezavo na sekundarna protitelesa, imobilizirana na testni liniji na traku za detekcijo. V primeru, da se reporter ne cepi, pa se protitelesa vežejo na FAM na način, ki ne omogoča vezave na sekundarna protitelesa in se zato reporter prek biotina veže na kontrolno linijo na traku za detekcijo.<br /> ==REZULTATI==<br /> Skupina je uspešno izolirala encima Cas12a in Cas13a ter z in vitro transkripcijo sintetizirala sgRNA. Skupaj so inkubirali izolirana encima in različne koncentracije sgRNA, nato pa preverili, ali prisotnost tarče v vzorcu vzbudi nespecifično endonukleazno aktivnost Cas12a in Cas13a. <br /> <br /> Pokazali so, da je ob daljših časih inkubacije, višjih koncentracijah sgRNA in prisotnosti tarčne sekvence reporter bolj razgrajen, kar kaže na aktivacijo nespecifične endonukleazne aktivnosti encimov Cas12a in Cas13a. V primeru Cas13a je bilo nekaj reporterske RNA razgrajene tudi v odsotnosti tarčne sekvence, kar bi lahko vodilo v lažno pozitivne rezultate. Zato bi bila v tem delu projekta potrebna optimizacija. <br /> <br /> Sledila je inhibicija RNaz, ki so jo zaznavali s kompletom reagenov podjetja Thermofisher, kjer je kot reporter delovala RNA z vezanim fluoroforom in dušilcem fluorescence. Vzorce sline in urina so inkubirali s proteinazo K in fluorescenco primerjali v vzorcu brez proteinaze. Rezultati so pokazali, da je bila inhibicija RNaz v urinu po triurni inkubaciji boljša kot inhibicija v slini. Po prekonočni inkubaciji je bila tudi inhibicija v slini popolna, torej je metoda uspešna. <br /> <br /> Nato so proteinazo K inhibirali z 1mM PMSF in k tem vzorcem dodali še nekaj nove sline in urina, kjer se nahajajo aktivne RNaze, ter izvedli enako detekcijo kot prej. Pokazali so, da so v vzorcih prisotne aktivne RNaze, torej je bila aktivnost proteinaze K inhibirana.<br /> <br /> Preverili so še možnost uporabe hitrega testa z lateralnim tokom (ang. lateral flow strip) kot metode detekcije. Ugotovili so, da negativni testi dajo signal tako v testni, kot tudi v kontrolni liniji, saj se nekaj reporterja verjetno spontano razgradi. V tem primeru je še vedno jasna razlika med pozitivnim in negativnim testom, saj pri pozitivnem dobimo signal le v testni liniji. Vendar bi bila optimizacija testa za bolj nedvoumne rezultate vseeno dobrodošla.<br /> <br /> ==ZAKLJUČEK==<br /> V okviru projekta je skupina razvila postopek za detekcijo poljubnega izbranega biomarkerja v urinu. Pri tem so sestavili številne enostavne in sestavljene biokocke, ki so dostopne na povezavi. Projekt ima velik potencial za izboljšanje zgodnje diagnostike raka prostate, vendar bi bile potrebne še številne optimizacije. Izboljšati bi bilo treba metodo detekcije (hitri test z lateralnim tokom), da bi bili rezultati bolj nedvoumni, optimizirala bi se lahko tudi izbira biomarkerjev, saj so izbrani v tem projektu primerni predvsem za belsko populacijo. Poleg tega bi bil potreben dizajn embalaže, kjer bi se reakcija izvajala, saj bi le na ta način zagotovili ponovljivost razmer in s tem zanesljivost rezultatov testov.<br /> <br /> ==VIRI==<br /> <br /> [1] https://2020.igem.org/Team:SDU-Denmark<br /> <br /> [2] Benecchi, L. PSA velocity and PSA slope. Prostate Cancer Prostatic Dis 9, 169–172 (2006). doi:10.1038/sj.pcan.4500866<br /> <br /> [3] Gootenberg JS, Abudayyeh OO, Kellner MJ, Joung J, Collins JJ, Zhang F. Multiplexed and portable nucleic acid detection platform with Cas13, Cas12a, and Csm6. Science. 2018;360(6387):439-44. doi:10.1126/science.aaq0179<br /> <br /> [4] Creutzburg, S. C. A., Wu, W. Y., Mohanraju, P., Swartjes, T., Alkan, F., Gorodkin, J., . . . van der Oost, J. (2020). Good guide, bad guide: spacer sequence-dependent cleavage efficiency of Cas12a. Nucleic Acids Res, 48(6), 3228-3243. doi:10.1093/nar/gkz1240<br /> <br /> [5] Gootenberg JS, Abudayyeh OO, Lee JW, et al. Nucleic acid detection with CRISPR-Cas13a/C2c2. Science. 2017;356(6336):438-442. doi:10.1126/science.aam9321</div>

Luka.gnidovec https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=PROSTATUS:_Diagnostika_raka_prostate&diff=19274 2021-05-17T20:45:31Z

<p>Luka.gnidovec: /* DETECTR */</p> <hr /> <div>PROSTATUS je iGEM projekt iz leta 2020, ki je osvojil nominacijo v kategoriji Diagnostika med podiplomskimi študenti. Pripravili so ga študenti Univerze južne Danske. <br /> Spletna stran projekta: [https://2020.igem.org/Team:SDU-Denmark]<br /> <br /> ==UVOD==<br /> Rak prostate je eden najpogostejših rakov, ki se razvije pri enem izmed osmih moških. Število diagnosticiranih primerov se povečuje, k čemur verjetno pripomore povišan screening koncentracije PSA (prostate specific antigen) v krvi med moškimi. Ta test pa je precej nezanesljiv, z 31 % verjetnostjo lažnega pozitivnega rezultata in 42 % verjetnostjo lažnega negativnega rezultata.[1,2] PSA nivo v krvi se lahko poviša iz številnih drugih razlogov (vnetje urinarnega trakta, ejakulacija, zdravila…). Poleg tega preverjanju krvne slike sledi še neprijeten in invaziven fizičen pregled. Vsekakor ima trenutni postopek screeninga raka prostate veliko potenciala za izboljšave. [1] <br /> <br /> PROSTATUS je študentski projekt skupine iz Univerze južne Danske, s katerim so sodelovali na iGEM-u 2020 v kategoriji podiplomskih študentov. V projektu so razvili neinvazivno metodo, pri kateri zaznavamo tri RNA biomarkerje v urinu (TMPRSS2:ERG, AMACR, PCA3) in dva SNP-ja (rs6983267, rs16901979), ki povečata verjetnost razvoja raka prostate, v DNA v slini. Test deluje na podlagi sistema CRISPR-Cas13a v primeru zaznavanja RNA biomarkerjev in sistema CRISPR-Cas12a v primeru zaznavanja SNP-jev. [1]<br /> <br /> ==OPIS PROJEKTA==<br /> ===PRINCIP DELOVANJA SISTEMA===<br /> Skupina je v projektu uporabila dve metodi, ki temeljita na delovanju proteinov družine Cas. <br /> ====SHERLOCK====<br /> SHERLOCK (Specific High-sensitivity Enzymatic Reporter unLOCKinkg) je metoda, ki s pomočjo encima Cas13a zaznava ssRNA v vzorcu. V Cas13a je vezana sgRNA (single guide RNA), ki zazna komplementarno tarčo v vzorcu. Ko pride do hibridizacije s tarčo, se Cas13a aktivira in cepi tudi netarčno RNA v vzorcu. Na ta način lahko pride do cepitve reporterske RNA. [3]<br /> <br /> ====DETECTR====<br /> DETECTR (The DNA Edonuclease Targeted CRISPR Trans Reporter system) je metoda, ki uporablja Cas12a in zaznava tarčno ssDNA v vzorcu, ob prepoznavi tarče pa pridobi nespecifično endonukleazno aktivnost in cepi reportersko ssDNA. [3]<br /> <br /> ===INŽENIRING===<br /> ====Kloniranje==== <br /> Za implementacijo teh dveh metod so morali najprej izraziti dva Cas encima ter pridobiti različne sgRNA, ki se vežejo v encima. <br /> Encime so izražali v E. coli. Uporabili so gena cas13a iz bakterije Leptotrichia wadei in cas12a iz Acidaminococcus sp. Z orodjem podjetja IDT so optimizirali rabo kodonov ter nato v konstrukt dodali vse potrebne komponente za izražanje proteinov (IPTG inducibilni promotor, RBS, terminator ter oznaki SUMO in His na N-koncu) ter naročili sintetični gen, ki so mu nato dodali še restrikcijska mesta za EcoRI in SpeI. <br /> Gen cas12a, vstavljen v plazmid, so pridobili od raziskovalne skupine iz Univerze južne Danske. S pomnoževanjem s PCR so genu dodali promotorsko regijo sintetičnega gena cas13a. Oba konstrukta so nato klonirali v vektor pSB1C3 in transformirali kompetentne celice E. coli seva ER2256. <br /> ====Načrtovanje sgRNA====<br /> Nato so dizajnirali sgRNA, ki se veže v Cas proteina in je ključna za prepoznavanje tarče. Za aktivacijo Cas12a je v oddaljenosti največ 21 bp od tarče potreben PAM motiv (TTTV). Poleg tega je za specifično aktivacijo Cas12a pomembno 100 % ujemanje v začetnem delu t. i. prilegajoče regije sgRNA (ang. spacer sequence) medtem ko v bolj oddaljenem območju prilegajoče regije 100 % ujemanje za aktivacijo ni potrebno. Če želimo specifično prepoznati SNP, je torej pomembno, da se ta nahaja v začetni regiji tarče, sicer bi dobili nespecifično aktivacijo in signal, ki ne bi bil odvisen od SNP-ja. Optimalna dolžina prilegajoče regije naj bi bila 21 – 24 nukleotidov. Vse te omejitve je skupina upoštevala pri dizajnu sgRNA za Cas12a. Oblikovali so štiri sgRNA, ki se vežejo na Cas12a in prepoznajo posamezne možne alele (prevladujoč alel in alel, ki poviša možnost za razvoj raka prostate).<br /> <br /> Pri oblikovanju sgRNA za Cas13a so upoštevali optimalno dolžino prilegajoče regije 28-31 nukleotidov, prav tako pa pri sgRNA encima Cas13a velja pravilo o 100 % prileganju začetnega dela prilegajoče regije. Cas13a sicer za prepoznavo tarče ne potrebuje PAM motiva. Skupina je oblikovala tri sgRNA za Cas13a, ki se vežejo na RNA biomarkerje v urinu.<br /> <br /> ====Pomnoževanje z metodo RPA====<br /> Ker obstaja verjetnost, da ta sistem ne bi zaznal zelo nizkih koncentracij RNA biomarkerjev v vzorcu, bi pred detekcijo RNA biomarkerje še namnožili z uporabo metode pomnoževanja z rekombinazo in polimerazo (ang. recombinase polymerase amplification – RPA). Gre za proces, alternativen PCR, ki poteka izotermalno in je zato njegova izvedba precej bolj enostavna. Za pomnožitev RNA bi potrebovali štiri encime, in sicer rekombinazo, ssDNA vezavne proteine (SSB) reverzno transkriptazo in DNA polimerazo. Da bi pridobili še pomnoženo RNA in ne le cDNA, bi uporabili še T7 polimerazo. <br /> <br /> V reakciji reverzna transkriptaza najprej prepiše ssRNA v cDNA. V RNA/DNA hibrid rekombinaza vstavi začetne oligonukleotide, ki so komplementarni RNA tarči. Na smerne začetne oligonukleotide bi dodali še T7 promotor. SSB stabilizirajo odrinjeno ssDNA na mestu vezave oligonukleotida, reverzna transkriptaza pa nato spet prepiše RNA verigo v cDNA. Iz novonastale cDNA z dodanim T7 promotorjem nato nastane RNA transkript, ki je na koncu reakcije prisoten v visoki koncentraciji in ga zlahka zaznamo v vzorcu. V opisu projekta ne omenjajo DNA polimeraze, a vendar bi bila ta potrebna za sintezo druge verige cDNA. Lahko bi uporabili tudi encim, ki lahko deluje kot reverzna transkriptaza in DNA polimeraza. <br /> <br /> Podobno reakcijo bi lahko zasnovali tudi za pomnoževanje DNA fragmentov, ki vsebujejo SNP-je, le da bi v tem primeru potrebovali le DNA polimerazo, ne pa tudi reverzne transkriptaze.<br /> <br /> ====Inhibicija aktivnosti RNaz====<br /> Ker pri zaznavanju RNA uporabljamo RNaze, ki se aktivirajo ob specifičnem signalu, bi ostale RNaze v urinu lahko motile specifično cepitev reporterja. Zato je ključna inaktivacija RNaz v vzorcu. V projektu bi uporabili metodo cepitve RNaz s proteinazo K. Po obdelavi vzorca s proteinazo K bi slednjo inaktivirali s fenilmetilsulfonil fluoridom (PMSF), da ne bi razgradila encimov Cas. <br /> ====Detekcija cepitve reporterja====<br /> Za detekcijo cepitve reporterja s Cas12a in Cas13a bi v projektu uporabili hitri test z lateralnim tokom (ang. lateral flow strip). Ta metoda za vizualizacijo rezultatov uporablja anti-FAM-protitelesa s pripetimi zlatimi nanodelci v kombinaciji s posebnim reporterjem. Reporter prek ssRNA ali ssDNA verige povezuje biotin in fluorescein amidit (FAM). Cepitev reporterja se vizualizira na traku, na katerem sta prisotni dve liniji – testna in kontrolna. Če pride do cepitve verige reporterja, se na FAM na cepljenem reporterju lahko veže anti-FAM-protitelo z zlatimi nanodelci na način, ki omogoča vezavo na sekundarna protitelesa, imobilizirana na testni liniji na traku za detekcijo. V primeru, da se reporter ne cepi, pa se protitelesa vežejo na FAM na način, ki ne omogoča vezave na sekundarna protitelesa in se zato reporter prek biotina veže na kontrolno linijo na traku za detekcijo.<br /> ==REZULTATI==<br /> Skupina je uspešno izolirala encima Cas12a in Cas13a ter z in vitro transkripcijo sintetizirala sgRNA. Skupaj so inkubirali izolirana encima in različne koncentracije sgRNA, nato pa preverili, ali prisotnost tarče v vzorcu vzbudi nespecifično endonukleazno aktivnost Cas12a in Cas13a. <br /> <br /> Pokazali so, da je ob daljših časih inkubacije, višjih koncentracijah sgRNA in prisotnosti tarčne sekvence reporter bolj razgrajen, kar kaže na aktivacijo nespecifične endonukleazne aktivnosti encimov Cas12a in Cas13a. V primeru Cas13a je bilo nekaj reporterske RNA razgrajene tudi v odsotnosti tarčne sekvence, kar bi lahko vodilo v lažno pozitivne rezultate. Zato bi bila v tem delu projekta potrebna optimizacija. <br /> <br /> Sledila je inhibicija RNaz, ki so jo zaznavali s kompletom reagenov podjetja Thermofisher, kjer je kot reporter delovala RNA z vezanim fluoroforom in dušilcem fluorescence. Vzorce sline in urina so inkubirali s proteinazo K in fluorescenco primerjali v vzorcu brez proteinaze. Rezultati so pokazali, da je bila inhibicija RNaz v urinu po triurni inkubaciji boljša kot inhibicija v slini. Po prekonočni inkubaciji je bila tudi inhibicija v slini popolna, torej je metoda uspešna. <br /> <br /> Nato so proteinazo K inhibirali z 1mM PMSF in k tem vzorcem dodali še nekaj nove sline in urina, kjer se nahajajo aktivne RNaze, ter izvedli enako detekcijo kot prej. Pokazali so, da so v vzorcih prisotne aktivne RNaze, torej je bila aktivnost proteinaze K inhibirana.<br /> <br /> Preverili so še možnost uporabe hitrega testa z lateralnim tokom (ang. lateral flow strip) kot metode detekcije. Ugotovili so, da negativni testi dajo signal tako v testni, kot tudi v kontrolni liniji, saj se nekaj reporterja verjetno spontano razgradi. V tem primeru je še vedno jasna razlika med pozitivnim in negativnim testom, saj pri pozitivnem dobimo signal le v testni liniji. Vendar bi bila optimizacija testa za bolj nedvoumne rezultate vseeno dobrodošla.<br /> <br /> ==ZAKLJUČEK==<br /> V okviru projekta je skupina razvila postopek za detekcijo poljubnega izbranega biomarkerja v urinu. Pri tem so sestavili številne enostavne in sestavljene biokocke, ki so dostopne na povezavi. Projekt ima velik potencial za izboljšanje zgodnje diagnostike raka prostate, vendar bi bile potrebne še številne optimizacije. Izboljšati bi bilo treba metodo detekcije (hitri test z lateralnim tokom), da bi bili rezultati bolj nedvoumni, optimizirala bi se lahko tudi izbira biomarkerjev, saj so izbrani v tem projektu primerni predvsem za belsko populacijo. Poleg tega bi bil potreben dizajn embalaže, kjer bi se reakcija izvajala, saj bi le na ta način zagotovili ponovljivost razmer in s tem zanesljivost rezultatov testov.<br /> <br /> ==VIRI==<br /> <br /> [1] https://2020.igem.org/Team:SDU-Denmark<br /> <br /> [2] Benecchi, L. PSA velocity and PSA slope. Prostate Cancer Prostatic Dis 9, 169–172 (2006). doi:10.1038/sj.pcan.4500866<br /> <br /> [3] Gootenberg JS, Abudayyeh OO, Kellner MJ, Joung J, Collins JJ, Zhang F. Multiplexed and portable nucleic acid detection platform with Cas13, Cas12a, and Csm6. Science. 2018;360(6387):439-44. doi:10.1126/science.aaq0179<br /> <br /> [4] Creutzburg, S. C. A., Wu, W. Y., Mohanraju, P., Swartjes, T., Alkan, F., Gorodkin, J., . . . van der Oost, J. (2020). Good guide, bad guide: spacer sequence-dependent cleavage efficiency of Cas12a. Nucleic Acids Res, 48(6), 3228-3243. doi:10.1093/nar/gkz1240<br /> <br /> [5] Gootenberg JS, Abudayyeh OO, Lee JW, et al. Nucleic acid detection with CRISPR-Cas13a/C2c2. Science. 2017;356(6336):438-442. doi:10.1126/science.aam9321</div>

Luka.gnidovec https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=PROSTATUS:_Diagnostika_raka_prostate&diff=19273 2021-05-17T20:45:20Z

<p>Luka.gnidovec: /* SHERLOCK */</p> <hr /> <div>PROSTATUS je iGEM projekt iz leta 2020, ki je osvojil nominacijo v kategoriji Diagnostika med podiplomskimi študenti. Pripravili so ga študenti Univerze južne Danske. <br /> Spletna stran projekta: [https://2020.igem.org/Team:SDU-Denmark]<br /> <br /> ==UVOD==<br /> Rak prostate je eden najpogostejših rakov, ki se razvije pri enem izmed osmih moških. Število diagnosticiranih primerov se povečuje, k čemur verjetno pripomore povišan screening koncentracije PSA (prostate specific antigen) v krvi med moškimi. Ta test pa je precej nezanesljiv, z 31 % verjetnostjo lažnega pozitivnega rezultata in 42 % verjetnostjo lažnega negativnega rezultata.[1,2] PSA nivo v krvi se lahko poviša iz številnih drugih razlogov (vnetje urinarnega trakta, ejakulacija, zdravila…). Poleg tega preverjanju krvne slike sledi še neprijeten in invaziven fizičen pregled. Vsekakor ima trenutni postopek screeninga raka prostate veliko potenciala za izboljšave. [1] <br /> <br /> PROSTATUS je študentski projekt skupine iz Univerze južne Danske, s katerim so sodelovali na iGEM-u 2020 v kategoriji podiplomskih študentov. V projektu so razvili neinvazivno metodo, pri kateri zaznavamo tri RNA biomarkerje v urinu (TMPRSS2:ERG, AMACR, PCA3) in dva SNP-ja (rs6983267, rs16901979), ki povečata verjetnost razvoja raka prostate, v DNA v slini. Test deluje na podlagi sistema CRISPR-Cas13a v primeru zaznavanja RNA biomarkerjev in sistema CRISPR-Cas12a v primeru zaznavanja SNP-jev. [1]<br /> <br /> ==OPIS PROJEKTA==<br /> ===PRINCIP DELOVANJA SISTEMA===<br /> Skupina je v projektu uporabila dve metodi, ki temeljita na delovanju proteinov družine Cas. <br /> ====SHERLOCK====<br /> SHERLOCK (Specific High-sensitivity Enzymatic Reporter unLOCKinkg) je metoda, ki s pomočjo encima Cas13a zaznava ssRNA v vzorcu. V Cas13a je vezana sgRNA (single guide RNA), ki zazna komplementarno tarčo v vzorcu. Ko pride do hibridizacije s tarčo, se Cas13a aktivira in cepi tudi netarčno RNA v vzorcu. Na ta način lahko pride do cepitve reporterske RNA. [3]<br /> <br /> ====DETECTR====<br /> DETECTR (The DNA Edonuclease Targeted CRISPR Trans Reporter system) je metoda, ki uporablja Cas12a in zaznava tarčno ssDNA v vzorcu, ob prepoznavi tarče pa pridobi nespecifično endonukleazno aktivnost in cepi reportersko ssDNA.<br /> <br /> ===INŽENIRING===<br /> ====Kloniranje==== <br /> Za implementacijo teh dveh metod so morali najprej izraziti dva Cas encima ter pridobiti različne sgRNA, ki se vežejo v encima. <br /> Encime so izražali v E. coli. Uporabili so gena cas13a iz bakterije Leptotrichia wadei in cas12a iz Acidaminococcus sp. Z orodjem podjetja IDT so optimizirali rabo kodonov ter nato v konstrukt dodali vse potrebne komponente za izražanje proteinov (IPTG inducibilni promotor, RBS, terminator ter oznaki SUMO in His na N-koncu) ter naročili sintetični gen, ki so mu nato dodali še restrikcijska mesta za EcoRI in SpeI. <br /> Gen cas12a, vstavljen v plazmid, so pridobili od raziskovalne skupine iz Univerze južne Danske. S pomnoževanjem s PCR so genu dodali promotorsko regijo sintetičnega gena cas13a. Oba konstrukta so nato klonirali v vektor pSB1C3 in transformirali kompetentne celice E. coli seva ER2256. <br /> ====Načrtovanje sgRNA====<br /> Nato so dizajnirali sgRNA, ki se veže v Cas proteina in je ključna za prepoznavanje tarče. Za aktivacijo Cas12a je v oddaljenosti največ 21 bp od tarče potreben PAM motiv (TTTV). Poleg tega je za specifično aktivacijo Cas12a pomembno 100 % ujemanje v začetnem delu t. i. prilegajoče regije sgRNA (ang. spacer sequence) medtem ko v bolj oddaljenem območju prilegajoče regije 100 % ujemanje za aktivacijo ni potrebno. Če želimo specifično prepoznati SNP, je torej pomembno, da se ta nahaja v začetni regiji tarče, sicer bi dobili nespecifično aktivacijo in signal, ki ne bi bil odvisen od SNP-ja. Optimalna dolžina prilegajoče regije naj bi bila 21 – 24 nukleotidov. Vse te omejitve je skupina upoštevala pri dizajnu sgRNA za Cas12a. Oblikovali so štiri sgRNA, ki se vežejo na Cas12a in prepoznajo posamezne možne alele (prevladujoč alel in alel, ki poviša možnost za razvoj raka prostate).<br /> <br /> Pri oblikovanju sgRNA za Cas13a so upoštevali optimalno dolžino prilegajoče regije 28-31 nukleotidov, prav tako pa pri sgRNA encima Cas13a velja pravilo o 100 % prileganju začetnega dela prilegajoče regije. Cas13a sicer za prepoznavo tarče ne potrebuje PAM motiva. Skupina je oblikovala tri sgRNA za Cas13a, ki se vežejo na RNA biomarkerje v urinu.<br /> <br /> ====Pomnoževanje z metodo RPA====<br /> Ker obstaja verjetnost, da ta sistem ne bi zaznal zelo nizkih koncentracij RNA biomarkerjev v vzorcu, bi pred detekcijo RNA biomarkerje še namnožili z uporabo metode pomnoževanja z rekombinazo in polimerazo (ang. recombinase polymerase amplification – RPA). Gre za proces, alternativen PCR, ki poteka izotermalno in je zato njegova izvedba precej bolj enostavna. Za pomnožitev RNA bi potrebovali štiri encime, in sicer rekombinazo, ssDNA vezavne proteine (SSB) reverzno transkriptazo in DNA polimerazo. Da bi pridobili še pomnoženo RNA in ne le cDNA, bi uporabili še T7 polimerazo. <br /> <br /> V reakciji reverzna transkriptaza najprej prepiše ssRNA v cDNA. V RNA/DNA hibrid rekombinaza vstavi začetne oligonukleotide, ki so komplementarni RNA tarči. Na smerne začetne oligonukleotide bi dodali še T7 promotor. SSB stabilizirajo odrinjeno ssDNA na mestu vezave oligonukleotida, reverzna transkriptaza pa nato spet prepiše RNA verigo v cDNA. Iz novonastale cDNA z dodanim T7 promotorjem nato nastane RNA transkript, ki je na koncu reakcije prisoten v visoki koncentraciji in ga zlahka zaznamo v vzorcu. V opisu projekta ne omenjajo DNA polimeraze, a vendar bi bila ta potrebna za sintezo druge verige cDNA. Lahko bi uporabili tudi encim, ki lahko deluje kot reverzna transkriptaza in DNA polimeraza. <br /> <br /> Podobno reakcijo bi lahko zasnovali tudi za pomnoževanje DNA fragmentov, ki vsebujejo SNP-je, le da bi v tem primeru potrebovali le DNA polimerazo, ne pa tudi reverzne transkriptaze.<br /> <br /> ====Inhibicija aktivnosti RNaz====<br /> Ker pri zaznavanju RNA uporabljamo RNaze, ki se aktivirajo ob specifičnem signalu, bi ostale RNaze v urinu lahko motile specifično cepitev reporterja. Zato je ključna inaktivacija RNaz v vzorcu. V projektu bi uporabili metodo cepitve RNaz s proteinazo K. Po obdelavi vzorca s proteinazo K bi slednjo inaktivirali s fenilmetilsulfonil fluoridom (PMSF), da ne bi razgradila encimov Cas. <br /> ====Detekcija cepitve reporterja====<br /> Za detekcijo cepitve reporterja s Cas12a in Cas13a bi v projektu uporabili hitri test z lateralnim tokom (ang. lateral flow strip). Ta metoda za vizualizacijo rezultatov uporablja anti-FAM-protitelesa s pripetimi zlatimi nanodelci v kombinaciji s posebnim reporterjem. Reporter prek ssRNA ali ssDNA verige povezuje biotin in fluorescein amidit (FAM). Cepitev reporterja se vizualizira na traku, na katerem sta prisotni dve liniji – testna in kontrolna. Če pride do cepitve verige reporterja, se na FAM na cepljenem reporterju lahko veže anti-FAM-protitelo z zlatimi nanodelci na način, ki omogoča vezavo na sekundarna protitelesa, imobilizirana na testni liniji na traku za detekcijo. V primeru, da se reporter ne cepi, pa se protitelesa vežejo na FAM na način, ki ne omogoča vezave na sekundarna protitelesa in se zato reporter prek biotina veže na kontrolno linijo na traku za detekcijo.<br /> ==REZULTATI==<br /> Skupina je uspešno izolirala encima Cas12a in Cas13a ter z in vitro transkripcijo sintetizirala sgRNA. Skupaj so inkubirali izolirana encima in različne koncentracije sgRNA, nato pa preverili, ali prisotnost tarče v vzorcu vzbudi nespecifično endonukleazno aktivnost Cas12a in Cas13a. <br /> <br /> Pokazali so, da je ob daljših časih inkubacije, višjih koncentracijah sgRNA in prisotnosti tarčne sekvence reporter bolj razgrajen, kar kaže na aktivacijo nespecifične endonukleazne aktivnosti encimov Cas12a in Cas13a. V primeru Cas13a je bilo nekaj reporterske RNA razgrajene tudi v odsotnosti tarčne sekvence, kar bi lahko vodilo v lažno pozitivne rezultate. Zato bi bila v tem delu projekta potrebna optimizacija. <br /> <br /> Sledila je inhibicija RNaz, ki so jo zaznavali s kompletom reagenov podjetja Thermofisher, kjer je kot reporter delovala RNA z vezanim fluoroforom in dušilcem fluorescence. Vzorce sline in urina so inkubirali s proteinazo K in fluorescenco primerjali v vzorcu brez proteinaze. Rezultati so pokazali, da je bila inhibicija RNaz v urinu po triurni inkubaciji boljša kot inhibicija v slini. Po prekonočni inkubaciji je bila tudi inhibicija v slini popolna, torej je metoda uspešna. <br /> <br /> Nato so proteinazo K inhibirali z 1mM PMSF in k tem vzorcem dodali še nekaj nove sline in urina, kjer se nahajajo aktivne RNaze, ter izvedli enako detekcijo kot prej. Pokazali so, da so v vzorcih prisotne aktivne RNaze, torej je bila aktivnost proteinaze K inhibirana.<br /> <br /> Preverili so še možnost uporabe hitrega testa z lateralnim tokom (ang. lateral flow strip) kot metode detekcije. Ugotovili so, da negativni testi dajo signal tako v testni, kot tudi v kontrolni liniji, saj se nekaj reporterja verjetno spontano razgradi. V tem primeru je še vedno jasna razlika med pozitivnim in negativnim testom, saj pri pozitivnem dobimo signal le v testni liniji. Vendar bi bila optimizacija testa za bolj nedvoumne rezultate vseeno dobrodošla.<br /> <br /> ==ZAKLJUČEK==<br /> V okviru projekta je skupina razvila postopek za detekcijo poljubnega izbranega biomarkerja v urinu. Pri tem so sestavili številne enostavne in sestavljene biokocke, ki so dostopne na povezavi. Projekt ima velik potencial za izboljšanje zgodnje diagnostike raka prostate, vendar bi bile potrebne še številne optimizacije. Izboljšati bi bilo treba metodo detekcije (hitri test z lateralnim tokom), da bi bili rezultati bolj nedvoumni, optimizirala bi se lahko tudi izbira biomarkerjev, saj so izbrani v tem projektu primerni predvsem za belsko populacijo. Poleg tega bi bil potreben dizajn embalaže, kjer bi se reakcija izvajala, saj bi le na ta način zagotovili ponovljivost razmer in s tem zanesljivost rezultatov testov.<br /> <br /> ==VIRI==<br /> <br /> [1] https://2020.igem.org/Team:SDU-Denmark<br /> <br /> [2] Benecchi, L. PSA velocity and PSA slope. Prostate Cancer Prostatic Dis 9, 169–172 (2006). doi:10.1038/sj.pcan.4500866<br /> <br /> [3] Gootenberg JS, Abudayyeh OO, Kellner MJ, Joung J, Collins JJ, Zhang F. Multiplexed and portable nucleic acid detection platform with Cas13, Cas12a, and Csm6. Science. 2018;360(6387):439-44. doi:10.1126/science.aaq0179<br /> <br /> [4] Creutzburg, S. C. A., Wu, W. Y., Mohanraju, P., Swartjes, T., Alkan, F., Gorodkin, J., . . . van der Oost, J. (2020). Good guide, bad guide: spacer sequence-dependent cleavage efficiency of Cas12a. Nucleic Acids Res, 48(6), 3228-3243. doi:10.1093/nar/gkz1240<br /> <br /> [5] Gootenberg JS, Abudayyeh OO, Lee JW, et al. Nucleic acid detection with CRISPR-Cas13a/C2c2. Science. 2017;356(6336):438-442. doi:10.1126/science.aam9321</div>

Luka.gnidovec https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=PROSTATUS:_Diagnostika_raka_prostate&diff=19272 2021-05-17T20:42:21Z

<p>Luka.gnidovec: /* VIRI */</p> <hr /> <div>PROSTATUS je iGEM projekt iz leta 2020, ki je osvojil nominacijo v kategoriji Diagnostika med podiplomskimi študenti. Pripravili so ga študenti Univerze južne Danske. <br /> Spletna stran projekta: [https://2020.igem.org/Team:SDU-Denmark]<br /> <br /> ==UVOD==<br /> Rak prostate je eden najpogostejših rakov, ki se razvije pri enem izmed osmih moških. Število diagnosticiranih primerov se povečuje, k čemur verjetno pripomore povišan screening koncentracije PSA (prostate specific antigen) v krvi med moškimi. Ta test pa je precej nezanesljiv, z 31 % verjetnostjo lažnega pozitivnega rezultata in 42 % verjetnostjo lažnega negativnega rezultata.[1,2] PSA nivo v krvi se lahko poviša iz številnih drugih razlogov (vnetje urinarnega trakta, ejakulacija, zdravila…). Poleg tega preverjanju krvne slike sledi še neprijeten in invaziven fizičen pregled. Vsekakor ima trenutni postopek screeninga raka prostate veliko potenciala za izboljšave. [1] <br /> <br /> PROSTATUS je študentski projekt skupine iz Univerze južne Danske, s katerim so sodelovali na iGEM-u 2020 v kategoriji podiplomskih študentov. V projektu so razvili neinvazivno metodo, pri kateri zaznavamo tri RNA biomarkerje v urinu (TMPRSS2:ERG, AMACR, PCA3) in dva SNP-ja (rs6983267, rs16901979), ki povečata verjetnost razvoja raka prostate, v DNA v slini. Test deluje na podlagi sistema CRISPR-Cas13a v primeru zaznavanja RNA biomarkerjev in sistema CRISPR-Cas12a v primeru zaznavanja SNP-jev. [1]<br /> <br /> ==OPIS PROJEKTA==<br /> ===PRINCIP DELOVANJA SISTEMA===<br /> Skupina je v projektu uporabila dve metodi, ki temeljita na delovanju proteinov družine Cas. <br /> ====SHERLOCK====<br /> SHERLOCK (Specific High-sensitivity Enzymatic Reporter unLOCKinkg) je metoda, ki s pomočjo encima Cas13a zaznava ssRNA v vzorcu. V Cas13a je vezana sgRNA (single guide RNA), ki zazna komplementarno tarčo v vzorcu. Ko pride do hibridizacije s tarčo, se Cas13a aktivira in cepi tudi netarčno RNA v vzorcu. Na ta način lahko pride do cepitve reporterske RNA.<br /> ====DETECTR====<br /> DETECTR (The DNA Edonuclease Targeted CRISPR Trans Reporter system) je metoda, ki uporablja Cas12a in zaznava tarčno ssDNA v vzorcu, ob prepoznavi tarče pa pridobi nespecifično endonukleazno aktivnost in cepi reportersko ssDNA.<br /> <br /> ===INŽENIRING===<br /> ====Kloniranje==== <br /> Za implementacijo teh dveh metod so morali najprej izraziti dva Cas encima ter pridobiti različne sgRNA, ki se vežejo v encima. <br /> Encime so izražali v E. coli. Uporabili so gena cas13a iz bakterije Leptotrichia wadei in cas12a iz Acidaminococcus sp. Z orodjem podjetja IDT so optimizirali rabo kodonov ter nato v konstrukt dodali vse potrebne komponente za izražanje proteinov (IPTG inducibilni promotor, RBS, terminator ter oznaki SUMO in His na N-koncu) ter naročili sintetični gen, ki so mu nato dodali še restrikcijska mesta za EcoRI in SpeI. <br /> Gen cas12a, vstavljen v plazmid, so pridobili od raziskovalne skupine iz Univerze južne Danske. S pomnoževanjem s PCR so genu dodali promotorsko regijo sintetičnega gena cas13a. Oba konstrukta so nato klonirali v vektor pSB1C3 in transformirali kompetentne celice E. coli seva ER2256. <br /> ====Načrtovanje sgRNA====<br /> Nato so dizajnirali sgRNA, ki se veže v Cas proteina in je ključna za prepoznavanje tarče. Za aktivacijo Cas12a je v oddaljenosti največ 21 bp od tarče potreben PAM motiv (TTTV). Poleg tega je za specifično aktivacijo Cas12a pomembno 100 % ujemanje v začetnem delu t. i. prilegajoče regije sgRNA (ang. spacer sequence) medtem ko v bolj oddaljenem območju prilegajoče regije 100 % ujemanje za aktivacijo ni potrebno. Če želimo specifično prepoznati SNP, je torej pomembno, da se ta nahaja v začetni regiji tarče, sicer bi dobili nespecifično aktivacijo in signal, ki ne bi bil odvisen od SNP-ja. Optimalna dolžina prilegajoče regije naj bi bila 21 – 24 nukleotidov. Vse te omejitve je skupina upoštevala pri dizajnu sgRNA za Cas12a. Oblikovali so štiri sgRNA, ki se vežejo na Cas12a in prepoznajo posamezne možne alele (prevladujoč alel in alel, ki poviša možnost za razvoj raka prostate).<br /> <br /> Pri oblikovanju sgRNA za Cas13a so upoštevali optimalno dolžino prilegajoče regije 28-31 nukleotidov, prav tako pa pri sgRNA encima Cas13a velja pravilo o 100 % prileganju začetnega dela prilegajoče regije. Cas13a sicer za prepoznavo tarče ne potrebuje PAM motiva. Skupina je oblikovala tri sgRNA za Cas13a, ki se vežejo na RNA biomarkerje v urinu.<br /> <br /> ====Pomnoževanje z metodo RPA====<br /> Ker obstaja verjetnost, da ta sistem ne bi zaznal zelo nizkih koncentracij RNA biomarkerjev v vzorcu, bi pred detekcijo RNA biomarkerje še namnožili z uporabo metode pomnoževanja z rekombinazo in polimerazo (ang. recombinase polymerase amplification – RPA). Gre za proces, alternativen PCR, ki poteka izotermalno in je zato njegova izvedba precej bolj enostavna. Za pomnožitev RNA bi potrebovali štiri encime, in sicer rekombinazo, ssDNA vezavne proteine (SSB) reverzno transkriptazo in DNA polimerazo. Da bi pridobili še pomnoženo RNA in ne le cDNA, bi uporabili še T7 polimerazo. <br /> <br /> V reakciji reverzna transkriptaza najprej prepiše ssRNA v cDNA. V RNA/DNA hibrid rekombinaza vstavi začetne oligonukleotide, ki so komplementarni RNA tarči. Na smerne začetne oligonukleotide bi dodali še T7 promotor. SSB stabilizirajo odrinjeno ssDNA na mestu vezave oligonukleotida, reverzna transkriptaza pa nato spet prepiše RNA verigo v cDNA. Iz novonastale cDNA z dodanim T7 promotorjem nato nastane RNA transkript, ki je na koncu reakcije prisoten v visoki koncentraciji in ga zlahka zaznamo v vzorcu. V opisu projekta ne omenjajo DNA polimeraze, a vendar bi bila ta potrebna za sintezo druge verige cDNA. Lahko bi uporabili tudi encim, ki lahko deluje kot reverzna transkriptaza in DNA polimeraza. <br /> <br /> Podobno reakcijo bi lahko zasnovali tudi za pomnoževanje DNA fragmentov, ki vsebujejo SNP-je, le da bi v tem primeru potrebovali le DNA polimerazo, ne pa tudi reverzne transkriptaze.<br /> <br /> ====Inhibicija aktivnosti RNaz====<br /> Ker pri zaznavanju RNA uporabljamo RNaze, ki se aktivirajo ob specifičnem signalu, bi ostale RNaze v urinu lahko motile specifično cepitev reporterja. Zato je ključna inaktivacija RNaz v vzorcu. V projektu bi uporabili metodo cepitve RNaz s proteinazo K. Po obdelavi vzorca s proteinazo K bi slednjo inaktivirali s fenilmetilsulfonil fluoridom (PMSF), da ne bi razgradila encimov Cas. <br /> ====Detekcija cepitve reporterja====<br /> Za detekcijo cepitve reporterja s Cas12a in Cas13a bi v projektu uporabili hitri test z lateralnim tokom (ang. lateral flow strip). Ta metoda za vizualizacijo rezultatov uporablja anti-FAM-protitelesa s pripetimi zlatimi nanodelci v kombinaciji s posebnim reporterjem. Reporter prek ssRNA ali ssDNA verige povezuje biotin in fluorescein amidit (FAM). Cepitev reporterja se vizualizira na traku, na katerem sta prisotni dve liniji – testna in kontrolna. Če pride do cepitve verige reporterja, se na FAM na cepljenem reporterju lahko veže anti-FAM-protitelo z zlatimi nanodelci na način, ki omogoča vezavo na sekundarna protitelesa, imobilizirana na testni liniji na traku za detekcijo. V primeru, da se reporter ne cepi, pa se protitelesa vežejo na FAM na način, ki ne omogoča vezave na sekundarna protitelesa in se zato reporter prek biotina veže na kontrolno linijo na traku za detekcijo.<br /> ==REZULTATI==<br /> Skupina je uspešno izolirala encima Cas12a in Cas13a ter z in vitro transkripcijo sintetizirala sgRNA. Skupaj so inkubirali izolirana encima in različne koncentracije sgRNA, nato pa preverili, ali prisotnost tarče v vzorcu vzbudi nespecifično endonukleazno aktivnost Cas12a in Cas13a. <br /> <br /> Pokazali so, da je ob daljših časih inkubacije, višjih koncentracijah sgRNA in prisotnosti tarčne sekvence reporter bolj razgrajen, kar kaže na aktivacijo nespecifične endonukleazne aktivnosti encimov Cas12a in Cas13a. V primeru Cas13a je bilo nekaj reporterske RNA razgrajene tudi v odsotnosti tarčne sekvence, kar bi lahko vodilo v lažno pozitivne rezultate. Zato bi bila v tem delu projekta potrebna optimizacija. <br /> <br /> Sledila je inhibicija RNaz, ki so jo zaznavali s kompletom reagenov podjetja Thermofisher, kjer je kot reporter delovala RNA z vezanim fluoroforom in dušilcem fluorescence. Vzorce sline in urina so inkubirali s proteinazo K in fluorescenco primerjali v vzorcu brez proteinaze. Rezultati so pokazali, da je bila inhibicija RNaz v urinu po triurni inkubaciji boljša kot inhibicija v slini. Po prekonočni inkubaciji je bila tudi inhibicija v slini popolna, torej je metoda uspešna. <br /> <br /> Nato so proteinazo K inhibirali z 1mM PMSF in k tem vzorcem dodali še nekaj nove sline in urina, kjer se nahajajo aktivne RNaze, ter izvedli enako detekcijo kot prej. Pokazali so, da so v vzorcih prisotne aktivne RNaze, torej je bila aktivnost proteinaze K inhibirana.<br /> <br /> Preverili so še možnost uporabe hitrega testa z lateralnim tokom (ang. lateral flow strip) kot metode detekcije. Ugotovili so, da negativni testi dajo signal tako v testni, kot tudi v kontrolni liniji, saj se nekaj reporterja verjetno spontano razgradi. V tem primeru je še vedno jasna razlika med pozitivnim in negativnim testom, saj pri pozitivnem dobimo signal le v testni liniji. Vendar bi bila optimizacija testa za bolj nedvoumne rezultate vseeno dobrodošla.<br /> <br /> ==ZAKLJUČEK==<br /> V okviru projekta je skupina razvila postopek za detekcijo poljubnega izbranega biomarkerja v urinu. Pri tem so sestavili številne enostavne in sestavljene biokocke, ki so dostopne na povezavi. Projekt ima velik potencial za izboljšanje zgodnje diagnostike raka prostate, vendar bi bile potrebne še številne optimizacije. Izboljšati bi bilo treba metodo detekcije (hitri test z lateralnim tokom), da bi bili rezultati bolj nedvoumni, optimizirala bi se lahko tudi izbira biomarkerjev, saj so izbrani v tem projektu primerni predvsem za belsko populacijo. Poleg tega bi bil potreben dizajn embalaže, kjer bi se reakcija izvajala, saj bi le na ta način zagotovili ponovljivost razmer in s tem zanesljivost rezultatov testov.<br /> <br /> ==VIRI==<br /> <br /> [1] https://2020.igem.org/Team:SDU-Denmark<br /> <br /> [2] Benecchi, L. PSA velocity and PSA slope. Prostate Cancer Prostatic Dis 9, 169–172 (2006). doi:10.1038/sj.pcan.4500866<br /> <br /> [3] Gootenberg JS, Abudayyeh OO, Kellner MJ, Joung J, Collins JJ, Zhang F. Multiplexed and portable nucleic acid detection platform with Cas13, Cas12a, and Csm6. Science. 2018;360(6387):439-44. doi:10.1126/science.aaq0179<br /> <br /> [4] Creutzburg, S. C. A., Wu, W. Y., Mohanraju, P., Swartjes, T., Alkan, F., Gorodkin, J., . . . van der Oost, J. (2020). Good guide, bad guide: spacer sequence-dependent cleavage efficiency of Cas12a. Nucleic Acids Res, 48(6), 3228-3243. doi:10.1093/nar/gkz1240<br /> <br /> [5] Gootenberg JS, Abudayyeh OO, Lee JW, et al. Nucleic acid detection with CRISPR-Cas13a/C2c2. Science. 2017;356(6336):438-442. doi:10.1126/science.aam9321</div>

Luka.gnidovec https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=PROSTATUS:_Diagnostika_raka_prostate&diff=19271 2021-05-17T20:41:09Z

<p>Luka.gnidovec: /* VIRI */</p> <hr /> <div>PROSTATUS je iGEM projekt iz leta 2020, ki je osvojil nominacijo v kategoriji Diagnostika med podiplomskimi študenti. Pripravili so ga študenti Univerze južne Danske. <br /> Spletna stran projekta: [https://2020.igem.org/Team:SDU-Denmark]<br /> <br /> ==UVOD==<br /> Rak prostate je eden najpogostejših rakov, ki se razvije pri enem izmed osmih moških. Število diagnosticiranih primerov se povečuje, k čemur verjetno pripomore povišan screening koncentracije PSA (prostate specific antigen) v krvi med moškimi. Ta test pa je precej nezanesljiv, z 31 % verjetnostjo lažnega pozitivnega rezultata in 42 % verjetnostjo lažnega negativnega rezultata.[1,2] PSA nivo v krvi se lahko poviša iz številnih drugih razlogov (vnetje urinarnega trakta, ejakulacija, zdravila…). Poleg tega preverjanju krvne slike sledi še neprijeten in invaziven fizičen pregled. Vsekakor ima trenutni postopek screeninga raka prostate veliko potenciala za izboljšave. [1] <br /> <br /> PROSTATUS je študentski projekt skupine iz Univerze južne Danske, s katerim so sodelovali na iGEM-u 2020 v kategoriji podiplomskih študentov. V projektu so razvili neinvazivno metodo, pri kateri zaznavamo tri RNA biomarkerje v urinu (TMPRSS2:ERG, AMACR, PCA3) in dva SNP-ja (rs6983267, rs16901979), ki povečata verjetnost razvoja raka prostate, v DNA v slini. Test deluje na podlagi sistema CRISPR-Cas13a v primeru zaznavanja RNA biomarkerjev in sistema CRISPR-Cas12a v primeru zaznavanja SNP-jev. [1]<br /> <br /> ==OPIS PROJEKTA==<br /> ===PRINCIP DELOVANJA SISTEMA===<br /> Skupina je v projektu uporabila dve metodi, ki temeljita na delovanju proteinov družine Cas. <br /> ====SHERLOCK====<br /> SHERLOCK (Specific High-sensitivity Enzymatic Reporter unLOCKinkg) je metoda, ki s pomočjo encima Cas13a zaznava ssRNA v vzorcu. V Cas13a je vezana sgRNA (single guide RNA), ki zazna komplementarno tarčo v vzorcu. Ko pride do hibridizacije s tarčo, se Cas13a aktivira in cepi tudi netarčno RNA v vzorcu. Na ta način lahko pride do cepitve reporterske RNA.<br /> ====DETECTR====<br /> DETECTR (The DNA Edonuclease Targeted CRISPR Trans Reporter system) je metoda, ki uporablja Cas12a in zaznava tarčno ssDNA v vzorcu, ob prepoznavi tarče pa pridobi nespecifično endonukleazno aktivnost in cepi reportersko ssDNA.<br /> <br /> ===INŽENIRING===<br /> ====Kloniranje==== <br /> Za implementacijo teh dveh metod so morali najprej izraziti dva Cas encima ter pridobiti različne sgRNA, ki se vežejo v encima. <br /> Encime so izražali v E. coli. Uporabili so gena cas13a iz bakterije Leptotrichia wadei in cas12a iz Acidaminococcus sp. Z orodjem podjetja IDT so optimizirali rabo kodonov ter nato v konstrukt dodali vse potrebne komponente za izražanje proteinov (IPTG inducibilni promotor, RBS, terminator ter oznaki SUMO in His na N-koncu) ter naročili sintetični gen, ki so mu nato dodali še restrikcijska mesta za EcoRI in SpeI. <br /> Gen cas12a, vstavljen v plazmid, so pridobili od raziskovalne skupine iz Univerze južne Danske. S pomnoževanjem s PCR so genu dodali promotorsko regijo sintetičnega gena cas13a. Oba konstrukta so nato klonirali v vektor pSB1C3 in transformirali kompetentne celice E. coli seva ER2256. <br /> ====Načrtovanje sgRNA====<br /> Nato so dizajnirali sgRNA, ki se veže v Cas proteina in je ključna za prepoznavanje tarče. Za aktivacijo Cas12a je v oddaljenosti največ 21 bp od tarče potreben PAM motiv (TTTV). Poleg tega je za specifično aktivacijo Cas12a pomembno 100 % ujemanje v začetnem delu t. i. prilegajoče regije sgRNA (ang. spacer sequence) medtem ko v bolj oddaljenem območju prilegajoče regije 100 % ujemanje za aktivacijo ni potrebno. Če želimo specifično prepoznati SNP, je torej pomembno, da se ta nahaja v začetni regiji tarče, sicer bi dobili nespecifično aktivacijo in signal, ki ne bi bil odvisen od SNP-ja. Optimalna dolžina prilegajoče regije naj bi bila 21 – 24 nukleotidov. Vse te omejitve je skupina upoštevala pri dizajnu sgRNA za Cas12a. Oblikovali so štiri sgRNA, ki se vežejo na Cas12a in prepoznajo posamezne možne alele (prevladujoč alel in alel, ki poviša možnost za razvoj raka prostate).<br /> <br /> Pri oblikovanju sgRNA za Cas13a so upoštevali optimalno dolžino prilegajoče regije 28-31 nukleotidov, prav tako pa pri sgRNA encima Cas13a velja pravilo o 100 % prileganju začetnega dela prilegajoče regije. Cas13a sicer za prepoznavo tarče ne potrebuje PAM motiva. Skupina je oblikovala tri sgRNA za Cas13a, ki se vežejo na RNA biomarkerje v urinu.<br /> <br /> ====Pomnoževanje z metodo RPA====<br /> Ker obstaja verjetnost, da ta sistem ne bi zaznal zelo nizkih koncentracij RNA biomarkerjev v vzorcu, bi pred detekcijo RNA biomarkerje še namnožili z uporabo metode pomnoževanja z rekombinazo in polimerazo (ang. recombinase polymerase amplification – RPA). Gre za proces, alternativen PCR, ki poteka izotermalno in je zato njegova izvedba precej bolj enostavna. Za pomnožitev RNA bi potrebovali štiri encime, in sicer rekombinazo, ssDNA vezavne proteine (SSB) reverzno transkriptazo in DNA polimerazo. Da bi pridobili še pomnoženo RNA in ne le cDNA, bi uporabili še T7 polimerazo. <br /> <br /> V reakciji reverzna transkriptaza najprej prepiše ssRNA v cDNA. V RNA/DNA hibrid rekombinaza vstavi začetne oligonukleotide, ki so komplementarni RNA tarči. Na smerne začetne oligonukleotide bi dodali še T7 promotor. SSB stabilizirajo odrinjeno ssDNA na mestu vezave oligonukleotida, reverzna transkriptaza pa nato spet prepiše RNA verigo v cDNA. Iz novonastale cDNA z dodanim T7 promotorjem nato nastane RNA transkript, ki je na koncu reakcije prisoten v visoki koncentraciji in ga zlahka zaznamo v vzorcu. V opisu projekta ne omenjajo DNA polimeraze, a vendar bi bila ta potrebna za sintezo druge verige cDNA. Lahko bi uporabili tudi encim, ki lahko deluje kot reverzna transkriptaza in DNA polimeraza. <br /> <br /> Podobno reakcijo bi lahko zasnovali tudi za pomnoževanje DNA fragmentov, ki vsebujejo SNP-je, le da bi v tem primeru potrebovali le DNA polimerazo, ne pa tudi reverzne transkriptaze.<br /> <br /> ====Inhibicija aktivnosti RNaz====<br /> Ker pri zaznavanju RNA uporabljamo RNaze, ki se aktivirajo ob specifičnem signalu, bi ostale RNaze v urinu lahko motile specifično cepitev reporterja. Zato je ključna inaktivacija RNaz v vzorcu. V projektu bi uporabili metodo cepitve RNaz s proteinazo K. Po obdelavi vzorca s proteinazo K bi slednjo inaktivirali s fenilmetilsulfonil fluoridom (PMSF), da ne bi razgradila encimov Cas. <br /> ====Detekcija cepitve reporterja====<br /> Za detekcijo cepitve reporterja s Cas12a in Cas13a bi v projektu uporabili hitri test z lateralnim tokom (ang. lateral flow strip). Ta metoda za vizualizacijo rezultatov uporablja anti-FAM-protitelesa s pripetimi zlatimi nanodelci v kombinaciji s posebnim reporterjem. Reporter prek ssRNA ali ssDNA verige povezuje biotin in fluorescein amidit (FAM). Cepitev reporterja se vizualizira na traku, na katerem sta prisotni dve liniji – testna in kontrolna. Če pride do cepitve verige reporterja, se na FAM na cepljenem reporterju lahko veže anti-FAM-protitelo z zlatimi nanodelci na način, ki omogoča vezavo na sekundarna protitelesa, imobilizirana na testni liniji na traku za detekcijo. V primeru, da se reporter ne cepi, pa se protitelesa vežejo na FAM na način, ki ne omogoča vezave na sekundarna protitelesa in se zato reporter prek biotina veže na kontrolno linijo na traku za detekcijo.<br /> ==REZULTATI==<br /> Skupina je uspešno izolirala encima Cas12a in Cas13a ter z in vitro transkripcijo sintetizirala sgRNA. Skupaj so inkubirali izolirana encima in različne koncentracije sgRNA, nato pa preverili, ali prisotnost tarče v vzorcu vzbudi nespecifično endonukleazno aktivnost Cas12a in Cas13a. <br /> <br /> Pokazali so, da je ob daljših časih inkubacije, višjih koncentracijah sgRNA in prisotnosti tarčne sekvence reporter bolj razgrajen, kar kaže na aktivacijo nespecifične endonukleazne aktivnosti encimov Cas12a in Cas13a. V primeru Cas13a je bilo nekaj reporterske RNA razgrajene tudi v odsotnosti tarčne sekvence, kar bi lahko vodilo v lažno pozitivne rezultate. Zato bi bila v tem delu projekta potrebna optimizacija. <br /> <br /> Sledila je inhibicija RNaz, ki so jo zaznavali s kompletom reagenov podjetja Thermofisher, kjer je kot reporter delovala RNA z vezanim fluoroforom in dušilcem fluorescence. Vzorce sline in urina so inkubirali s proteinazo K in fluorescenco primerjali v vzorcu brez proteinaze. Rezultati so pokazali, da je bila inhibicija RNaz v urinu po triurni inkubaciji boljša kot inhibicija v slini. Po prekonočni inkubaciji je bila tudi inhibicija v slini popolna, torej je metoda uspešna. <br /> <br /> Nato so proteinazo K inhibirali z 1mM PMSF in k tem vzorcem dodali še nekaj nove sline in urina, kjer se nahajajo aktivne RNaze, ter izvedli enako detekcijo kot prej. Pokazali so, da so v vzorcih prisotne aktivne RNaze, torej je bila aktivnost proteinaze K inhibirana.<br /> <br /> Preverili so še možnost uporabe hitrega testa z lateralnim tokom (ang. lateral flow strip) kot metode detekcije. Ugotovili so, da negativni testi dajo signal tako v testni, kot tudi v kontrolni liniji, saj se nekaj reporterja verjetno spontano razgradi. V tem primeru je še vedno jasna razlika med pozitivnim in negativnim testom, saj pri pozitivnem dobimo signal le v testni liniji. Vendar bi bila optimizacija testa za bolj nedvoumne rezultate vseeno dobrodošla.<br /> <br /> ==ZAKLJUČEK==<br /> V okviru projekta je skupina razvila postopek za detekcijo poljubnega izbranega biomarkerja v urinu. Pri tem so sestavili številne enostavne in sestavljene biokocke, ki so dostopne na povezavi. Projekt ima velik potencial za izboljšanje zgodnje diagnostike raka prostate, vendar bi bile potrebne še številne optimizacije. Izboljšati bi bilo treba metodo detekcije (hitri test z lateralnim tokom), da bi bili rezultati bolj nedvoumni, optimizirala bi se lahko tudi izbira biomarkerjev, saj so izbrani v tem projektu primerni predvsem za belsko populacijo. Poleg tega bi bil potreben dizajn embalaže, kjer bi se reakcija izvajala, saj bi le na ta način zagotovili ponovljivost razmer in s tem zanesljivost rezultatov testov.<br /> <br /> ==VIRI==<br /> <br /> [1] https://2020.igem.org/Team:SDU-Denmark<br /> <br /> [2] Benecchi, L. PSA velocity and PSA slope. Prostate Cancer Prostatic Dis 9, 169–172 (2006). doi:10.1038/sj.pcan.4500866<br /> <br /> [3] Gootenberg JS, Abudayyeh OO, Kellner MJ, Joung J, Collins JJ, Zhang F. Multiplexed and portable nucleic acid detection platform with Cas13, Cas12a, and Csm6. Science. 2018;360(6387):439-44.<br /> <br /> [4] Creutzburg, S. C. A., Wu, W. Y., Mohanraju, P., Swartjes, T., Alkan, F., Gorodkin, J., . . . van der Oost, J. (2020). Good guide, bad guide: spacer sequence-dependent cleavage efficiency of Cas12a. Nucleic Acids Res, 48(6), 3228-3243. doi:10.1093/nar/gkz1240<br /> <br /> [5] Gootenberg JS, Abudayyeh OO, Lee JW, et al. Nucleic acid detection with CRISPR-Cas13a/C2c2. Science. 2017;356(6336):438-442. doi:10.1126/science.aam9321</div>

Luka.gnidovec https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=PROSTATUS:_Diagnostika_raka_prostate&diff=19270 2021-05-17T20:38:26Z

<p>Luka.gnidovec: /* VIRI */</p> <hr /> <div>PROSTATUS je iGEM projekt iz leta 2020, ki je osvojil nominacijo v kategoriji Diagnostika med podiplomskimi študenti. Pripravili so ga študenti Univerze južne Danske. <br /> Spletna stran projekta: [https://2020.igem.org/Team:SDU-Denmark]<br /> <br /> ==UVOD==<br /> Rak prostate je eden najpogostejših rakov, ki se razvije pri enem izmed osmih moških. Število diagnosticiranih primerov se povečuje, k čemur verjetno pripomore povišan screening koncentracije PSA (prostate specific antigen) v krvi med moškimi. Ta test pa je precej nezanesljiv, z 31 % verjetnostjo lažnega pozitivnega rezultata in 42 % verjetnostjo lažnega negativnega rezultata.[1,2] PSA nivo v krvi se lahko poviša iz številnih drugih razlogov (vnetje urinarnega trakta, ejakulacija, zdravila…). Poleg tega preverjanju krvne slike sledi še neprijeten in invaziven fizičen pregled. Vsekakor ima trenutni postopek screeninga raka prostate veliko potenciala za izboljšave. [1] <br /> <br /> PROSTATUS je študentski projekt skupine iz Univerze južne Danske, s katerim so sodelovali na iGEM-u 2020 v kategoriji podiplomskih študentov. V projektu so razvili neinvazivno metodo, pri kateri zaznavamo tri RNA biomarkerje v urinu (TMPRSS2:ERG, AMACR, PCA3) in dva SNP-ja (rs6983267, rs16901979), ki povečata verjetnost razvoja raka prostate, v DNA v slini. Test deluje na podlagi sistema CRISPR-Cas13a v primeru zaznavanja RNA biomarkerjev in sistema CRISPR-Cas12a v primeru zaznavanja SNP-jev. [1]<br /> <br /> ==OPIS PROJEKTA==<br /> ===PRINCIP DELOVANJA SISTEMA===<br /> Skupina je v projektu uporabila dve metodi, ki temeljita na delovanju proteinov družine Cas. <br /> ====SHERLOCK====<br /> SHERLOCK (Specific High-sensitivity Enzymatic Reporter unLOCKinkg) je metoda, ki s pomočjo encima Cas13a zaznava ssRNA v vzorcu. V Cas13a je vezana sgRNA (single guide RNA), ki zazna komplementarno tarčo v vzorcu. Ko pride do hibridizacije s tarčo, se Cas13a aktivira in cepi tudi netarčno RNA v vzorcu. Na ta način lahko pride do cepitve reporterske RNA.<br /> ====DETECTR====<br /> DETECTR (The DNA Edonuclease Targeted CRISPR Trans Reporter system) je metoda, ki uporablja Cas12a in zaznava tarčno ssDNA v vzorcu, ob prepoznavi tarče pa pridobi nespecifično endonukleazno aktivnost in cepi reportersko ssDNA.<br /> <br /> ===INŽENIRING===<br /> ====Kloniranje==== <br /> Za implementacijo teh dveh metod so morali najprej izraziti dva Cas encima ter pridobiti različne sgRNA, ki se vežejo v encima. <br /> Encime so izražali v E. coli. Uporabili so gena cas13a iz bakterije Leptotrichia wadei in cas12a iz Acidaminococcus sp. Z orodjem podjetja IDT so optimizirali rabo kodonov ter nato v konstrukt dodali vse potrebne komponente za izražanje proteinov (IPTG inducibilni promotor, RBS, terminator ter oznaki SUMO in His na N-koncu) ter naročili sintetični gen, ki so mu nato dodali še restrikcijska mesta za EcoRI in SpeI. <br /> Gen cas12a, vstavljen v plazmid, so pridobili od raziskovalne skupine iz Univerze južne Danske. S pomnoževanjem s PCR so genu dodali promotorsko regijo sintetičnega gena cas13a. Oba konstrukta so nato klonirali v vektor pSB1C3 in transformirali kompetentne celice E. coli seva ER2256. <br /> ====Načrtovanje sgRNA====<br /> Nato so dizajnirali sgRNA, ki se veže v Cas proteina in je ključna za prepoznavanje tarče. Za aktivacijo Cas12a je v oddaljenosti največ 21 bp od tarče potreben PAM motiv (TTTV). Poleg tega je za specifično aktivacijo Cas12a pomembno 100 % ujemanje v začetnem delu t. i. prilegajoče regije sgRNA (ang. spacer sequence) medtem ko v bolj oddaljenem območju prilegajoče regije 100 % ujemanje za aktivacijo ni potrebno. Če želimo specifično prepoznati SNP, je torej pomembno, da se ta nahaja v začetni regiji tarče, sicer bi dobili nespecifično aktivacijo in signal, ki ne bi bil odvisen od SNP-ja. Optimalna dolžina prilegajoče regije naj bi bila 21 – 24 nukleotidov. Vse te omejitve je skupina upoštevala pri dizajnu sgRNA za Cas12a. Oblikovali so štiri sgRNA, ki se vežejo na Cas12a in prepoznajo posamezne možne alele (prevladujoč alel in alel, ki poviša možnost za razvoj raka prostate).<br /> <br /> Pri oblikovanju sgRNA za Cas13a so upoštevali optimalno dolžino prilegajoče regije 28-31 nukleotidov, prav tako pa pri sgRNA encima Cas13a velja pravilo o 100 % prileganju začetnega dela prilegajoče regije. Cas13a sicer za prepoznavo tarče ne potrebuje PAM motiva. Skupina je oblikovala tri sgRNA za Cas13a, ki se vežejo na RNA biomarkerje v urinu.<br /> <br /> ====Pomnoževanje z metodo RPA====<br /> Ker obstaja verjetnost, da ta sistem ne bi zaznal zelo nizkih koncentracij RNA biomarkerjev v vzorcu, bi pred detekcijo RNA biomarkerje še namnožili z uporabo metode pomnoževanja z rekombinazo in polimerazo (ang. recombinase polymerase amplification – RPA). Gre za proces, alternativen PCR, ki poteka izotermalno in je zato njegova izvedba precej bolj enostavna. Za pomnožitev RNA bi potrebovali štiri encime, in sicer rekombinazo, ssDNA vezavne proteine (SSB) reverzno transkriptazo in DNA polimerazo. Da bi pridobili še pomnoženo RNA in ne le cDNA, bi uporabili še T7 polimerazo. <br /> <br /> V reakciji reverzna transkriptaza najprej prepiše ssRNA v cDNA. V RNA/DNA hibrid rekombinaza vstavi začetne oligonukleotide, ki so komplementarni RNA tarči. Na smerne začetne oligonukleotide bi dodali še T7 promotor. SSB stabilizirajo odrinjeno ssDNA na mestu vezave oligonukleotida, reverzna transkriptaza pa nato spet prepiše RNA verigo v cDNA. Iz novonastale cDNA z dodanim T7 promotorjem nato nastane RNA transkript, ki je na koncu reakcije prisoten v visoki koncentraciji in ga zlahka zaznamo v vzorcu. V opisu projekta ne omenjajo DNA polimeraze, a vendar bi bila ta potrebna za sintezo druge verige cDNA. Lahko bi uporabili tudi encim, ki lahko deluje kot reverzna transkriptaza in DNA polimeraza. <br /> <br /> Podobno reakcijo bi lahko zasnovali tudi za pomnoževanje DNA fragmentov, ki vsebujejo SNP-je, le da bi v tem primeru potrebovali le DNA polimerazo, ne pa tudi reverzne transkriptaze.<br /> <br /> ====Inhibicija aktivnosti RNaz====<br /> Ker pri zaznavanju RNA uporabljamo RNaze, ki se aktivirajo ob specifičnem signalu, bi ostale RNaze v urinu lahko motile specifično cepitev reporterja. Zato je ključna inaktivacija RNaz v vzorcu. V projektu bi uporabili metodo cepitve RNaz s proteinazo K. Po obdelavi vzorca s proteinazo K bi slednjo inaktivirali s fenilmetilsulfonil fluoridom (PMSF), da ne bi razgradila encimov Cas. <br /> ====Detekcija cepitve reporterja====<br /> Za detekcijo cepitve reporterja s Cas12a in Cas13a bi v projektu uporabili hitri test z lateralnim tokom (ang. lateral flow strip). Ta metoda za vizualizacijo rezultatov uporablja anti-FAM-protitelesa s pripetimi zlatimi nanodelci v kombinaciji s posebnim reporterjem. Reporter prek ssRNA ali ssDNA verige povezuje biotin in fluorescein amidit (FAM). Cepitev reporterja se vizualizira na traku, na katerem sta prisotni dve liniji – testna in kontrolna. Če pride do cepitve verige reporterja, se na FAM na cepljenem reporterju lahko veže anti-FAM-protitelo z zlatimi nanodelci na način, ki omogoča vezavo na sekundarna protitelesa, imobilizirana na testni liniji na traku za detekcijo. V primeru, da se reporter ne cepi, pa se protitelesa vežejo na FAM na način, ki ne omogoča vezave na sekundarna protitelesa in se zato reporter prek biotina veže na kontrolno linijo na traku za detekcijo.<br /> ==REZULTATI==<br /> Skupina je uspešno izolirala encima Cas12a in Cas13a ter z in vitro transkripcijo sintetizirala sgRNA. Skupaj so inkubirali izolirana encima in različne koncentracije sgRNA, nato pa preverili, ali prisotnost tarče v vzorcu vzbudi nespecifično endonukleazno aktivnost Cas12a in Cas13a. <br /> <br /> Pokazali so, da je ob daljših časih inkubacije, višjih koncentracijah sgRNA in prisotnosti tarčne sekvence reporter bolj razgrajen, kar kaže na aktivacijo nespecifične endonukleazne aktivnosti encimov Cas12a in Cas13a. V primeru Cas13a je bilo nekaj reporterske RNA razgrajene tudi v odsotnosti tarčne sekvence, kar bi lahko vodilo v lažno pozitivne rezultate. Zato bi bila v tem delu projekta potrebna optimizacija. <br /> <br /> Sledila je inhibicija RNaz, ki so jo zaznavali s kompletom reagenov podjetja Thermofisher, kjer je kot reporter delovala RNA z vezanim fluoroforom in dušilcem fluorescence. Vzorce sline in urina so inkubirali s proteinazo K in fluorescenco primerjali v vzorcu brez proteinaze. Rezultati so pokazali, da je bila inhibicija RNaz v urinu po triurni inkubaciji boljša kot inhibicija v slini. Po prekonočni inkubaciji je bila tudi inhibicija v slini popolna, torej je metoda uspešna. <br /> <br /> Nato so proteinazo K inhibirali z 1mM PMSF in k tem vzorcem dodali še nekaj nove sline in urina, kjer se nahajajo aktivne RNaze, ter izvedli enako detekcijo kot prej. Pokazali so, da so v vzorcih prisotne aktivne RNaze, torej je bila aktivnost proteinaze K inhibirana.<br /> <br /> Preverili so še možnost uporabe hitrega testa z lateralnim tokom (ang. lateral flow strip) kot metode detekcije. Ugotovili so, da negativni testi dajo signal tako v testni, kot tudi v kontrolni liniji, saj se nekaj reporterja verjetno spontano razgradi. V tem primeru je še vedno jasna razlika med pozitivnim in negativnim testom, saj pri pozitivnem dobimo signal le v testni liniji. Vendar bi bila optimizacija testa za bolj nedvoumne rezultate vseeno dobrodošla.<br /> <br /> ==ZAKLJUČEK==<br /> V okviru projekta je skupina razvila postopek za detekcijo poljubnega izbranega biomarkerja v urinu. Pri tem so sestavili številne enostavne in sestavljene biokocke, ki so dostopne na povezavi. Projekt ima velik potencial za izboljšanje zgodnje diagnostike raka prostate, vendar bi bile potrebne še številne optimizacije. Izboljšati bi bilo treba metodo detekcije (hitri test z lateralnim tokom), da bi bili rezultati bolj nedvoumni, optimizirala bi se lahko tudi izbira biomarkerjev, saj so izbrani v tem projektu primerni predvsem za belsko populacijo. Poleg tega bi bil potreben dizajn embalaže, kjer bi se reakcija izvajala, saj bi le na ta način zagotovili ponovljivost razmer in s tem zanesljivost rezultatov testov.<br /> <br /> ==VIRI==<br /> <br /> [1] https://2020.igem.org/Team:SDU-Denmark<br /> <br /> [2] Benecchi, L. PSA velocity and PSA slope. Prostate Cancer Prostatic Dis 9, 169–172 (2006). https://doi.org/10.1038/sj.pcan.4500866<br /> <br /> [3] Gootenberg JS, Abudayyeh OO, Kellner MJ, Joung J, Collins JJ, Zhang F. Multiplexed and portable nucleic acid detection platform with Cas13, Cas12a, and Csm6. Science. 2018;360(6387):439-44.<br /> <br /> [4] Creutzburg, S. C. A., Wu, W. Y., Mohanraju, P., Swartjes, T., Alkan, F., Gorodkin, J., . . . van der Oost, J. (2020). Good guide, bad guide: spacer sequence-dependent cleavage efficiency of Cas12a. Nucleic Acids Res, 48(6), 3228-3243. doi:10.1093/nar/gkz1240<br /> <br /> [5] Gootenberg JS, Abudayyeh OO, Lee JW, et al. Nucleic acid detection with CRISPR-Cas13a/C2c2. Science. 2017;356(6336):438-442. doi:10.1126/science.aam9321</div>

Luka.gnidovec https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=PROSTATUS:_Diagnostika_raka_prostate&diff=19269 2021-05-17T20:33:14Z

<p>Luka.gnidovec: </p> <hr /> <div>PROSTATUS je iGEM projekt iz leta 2020, ki je osvojil nominacijo v kategoriji Diagnostika med podiplomskimi študenti. Pripravili so ga študenti Univerze južne Danske. <br /> Spletna stran projekta: [https://2020.igem.org/Team:SDU-Denmark]<br /> <br /> ==UVOD==<br /> Rak prostate je eden najpogostejših rakov, ki se razvije pri enem izmed osmih moških. Število diagnosticiranih primerov se povečuje, k čemur verjetno pripomore povišan screening koncentracije PSA (prostate specific antigen) v krvi med moškimi. Ta test pa je precej nezanesljiv, z 31 % verjetnostjo lažnega pozitivnega rezultata in 42 % verjetnostjo lažnega negativnega rezultata.[1,2] PSA nivo v krvi se lahko poviša iz številnih drugih razlogov (vnetje urinarnega trakta, ejakulacija, zdravila…). Poleg tega preverjanju krvne slike sledi še neprijeten in invaziven fizičen pregled. Vsekakor ima trenutni postopek screeninga raka prostate veliko potenciala za izboljšave. [1] <br /> <br /> PROSTATUS je študentski projekt skupine iz Univerze južne Danske, s katerim so sodelovali na iGEM-u 2020 v kategoriji podiplomskih študentov. V projektu so razvili neinvazivno metodo, pri kateri zaznavamo tri RNA biomarkerje v urinu (TMPRSS2:ERG, AMACR, PCA3) in dva SNP-ja (rs6983267, rs16901979), ki povečata verjetnost razvoja raka prostate, v DNA v slini. Test deluje na podlagi sistema CRISPR-Cas13a v primeru zaznavanja RNA biomarkerjev in sistema CRISPR-Cas12a v primeru zaznavanja SNP-jev. [1]<br /> <br /> ==OPIS PROJEKTA==<br /> ===PRINCIP DELOVANJA SISTEMA===<br /> Skupina je v projektu uporabila dve metodi, ki temeljita na delovanju proteinov družine Cas. <br /> ====SHERLOCK====<br /> SHERLOCK (Specific High-sensitivity Enzymatic Reporter unLOCKinkg) je metoda, ki s pomočjo encima Cas13a zaznava ssRNA v vzorcu. V Cas13a je vezana sgRNA (single guide RNA), ki zazna komplementarno tarčo v vzorcu. Ko pride do hibridizacije s tarčo, se Cas13a aktivira in cepi tudi netarčno RNA v vzorcu. Na ta način lahko pride do cepitve reporterske RNA.<br /> ====DETECTR====<br /> DETECTR (The DNA Edonuclease Targeted CRISPR Trans Reporter system) je metoda, ki uporablja Cas12a in zaznava tarčno ssDNA v vzorcu, ob prepoznavi tarče pa pridobi nespecifično endonukleazno aktivnost in cepi reportersko ssDNA.<br /> <br /> ===INŽENIRING===<br /> ====Kloniranje==== <br /> Za implementacijo teh dveh metod so morali najprej izraziti dva Cas encima ter pridobiti različne sgRNA, ki se vežejo v encima. <br /> Encime so izražali v E. coli. Uporabili so gena cas13a iz bakterije Leptotrichia wadei in cas12a iz Acidaminococcus sp. Z orodjem podjetja IDT so optimizirali rabo kodonov ter nato v konstrukt dodali vse potrebne komponente za izražanje proteinov (IPTG inducibilni promotor, RBS, terminator ter oznaki SUMO in His na N-koncu) ter naročili sintetični gen, ki so mu nato dodali še restrikcijska mesta za EcoRI in SpeI. <br /> Gen cas12a, vstavljen v plazmid, so pridobili od raziskovalne skupine iz Univerze južne Danske. S pomnoževanjem s PCR so genu dodali promotorsko regijo sintetičnega gena cas13a. Oba konstrukta so nato klonirali v vektor pSB1C3 in transformirali kompetentne celice E. coli seva ER2256. <br /> ====Načrtovanje sgRNA====<br /> Nato so dizajnirali sgRNA, ki se veže v Cas proteina in je ključna za prepoznavanje tarče. Za aktivacijo Cas12a je v oddaljenosti največ 21 bp od tarče potreben PAM motiv (TTTV). Poleg tega je za specifično aktivacijo Cas12a pomembno 100 % ujemanje v začetnem delu t. i. prilegajoče regije sgRNA (ang. spacer sequence) medtem ko v bolj oddaljenem območju prilegajoče regije 100 % ujemanje za aktivacijo ni potrebno. Če želimo specifično prepoznati SNP, je torej pomembno, da se ta nahaja v začetni regiji tarče, sicer bi dobili nespecifično aktivacijo in signal, ki ne bi bil odvisen od SNP-ja. Optimalna dolžina prilegajoče regije naj bi bila 21 – 24 nukleotidov. Vse te omejitve je skupina upoštevala pri dizajnu sgRNA za Cas12a. Oblikovali so štiri sgRNA, ki se vežejo na Cas12a in prepoznajo posamezne možne alele (prevladujoč alel in alel, ki poviša možnost za razvoj raka prostate).<br /> <br /> Pri oblikovanju sgRNA za Cas13a so upoštevali optimalno dolžino prilegajoče regije 28-31 nukleotidov, prav tako pa pri sgRNA encima Cas13a velja pravilo o 100 % prileganju začetnega dela prilegajoče regije. Cas13a sicer za prepoznavo tarče ne potrebuje PAM motiva. Skupina je oblikovala tri sgRNA za Cas13a, ki se vežejo na RNA biomarkerje v urinu.<br /> <br /> ====Pomnoževanje z metodo RPA====<br /> Ker obstaja verjetnost, da ta sistem ne bi zaznal zelo nizkih koncentracij RNA biomarkerjev v vzorcu, bi pred detekcijo RNA biomarkerje še namnožili z uporabo metode pomnoževanja z rekombinazo in polimerazo (ang. recombinase polymerase amplification – RPA). Gre za proces, alternativen PCR, ki poteka izotermalno in je zato njegova izvedba precej bolj enostavna. Za pomnožitev RNA bi potrebovali štiri encime, in sicer rekombinazo, ssDNA vezavne proteine (SSB) reverzno transkriptazo in DNA polimerazo. Da bi pridobili še pomnoženo RNA in ne le cDNA, bi uporabili še T7 polimerazo. <br /> <br /> V reakciji reverzna transkriptaza najprej prepiše ssRNA v cDNA. V RNA/DNA hibrid rekombinaza vstavi začetne oligonukleotide, ki so komplementarni RNA tarči. Na smerne začetne oligonukleotide bi dodali še T7 promotor. SSB stabilizirajo odrinjeno ssDNA na mestu vezave oligonukleotida, reverzna transkriptaza pa nato spet prepiše RNA verigo v cDNA. Iz novonastale cDNA z dodanim T7 promotorjem nato nastane RNA transkript, ki je na koncu reakcije prisoten v visoki koncentraciji in ga zlahka zaznamo v vzorcu. V opisu projekta ne omenjajo DNA polimeraze, a vendar bi bila ta potrebna za sintezo druge verige cDNA. Lahko bi uporabili tudi encim, ki lahko deluje kot reverzna transkriptaza in DNA polimeraza. <br /> <br /> Podobno reakcijo bi lahko zasnovali tudi za pomnoževanje DNA fragmentov, ki vsebujejo SNP-je, le da bi v tem primeru potrebovali le DNA polimerazo, ne pa tudi reverzne transkriptaze.<br /> <br /> ====Inhibicija aktivnosti RNaz====<br /> Ker pri zaznavanju RNA uporabljamo RNaze, ki se aktivirajo ob specifičnem signalu, bi ostale RNaze v urinu lahko motile specifično cepitev reporterja. Zato je ključna inaktivacija RNaz v vzorcu. V projektu bi uporabili metodo cepitve RNaz s proteinazo K. Po obdelavi vzorca s proteinazo K bi slednjo inaktivirali s fenilmetilsulfonil fluoridom (PMSF), da ne bi razgradila encimov Cas. <br /> ====Detekcija cepitve reporterja====<br /> Za detekcijo cepitve reporterja s Cas12a in Cas13a bi v projektu uporabili hitri test z lateralnim tokom (ang. lateral flow strip). Ta metoda za vizualizacijo rezultatov uporablja anti-FAM-protitelesa s pripetimi zlatimi nanodelci v kombinaciji s posebnim reporterjem. Reporter prek ssRNA ali ssDNA verige povezuje biotin in fluorescein amidit (FAM). Cepitev reporterja se vizualizira na traku, na katerem sta prisotni dve liniji – testna in kontrolna. Če pride do cepitve verige reporterja, se na FAM na cepljenem reporterju lahko veže anti-FAM-protitelo z zlatimi nanodelci na način, ki omogoča vezavo na sekundarna protitelesa, imobilizirana na testni liniji na traku za detekcijo. V primeru, da se reporter ne cepi, pa se protitelesa vežejo na FAM na način, ki ne omogoča vezave na sekundarna protitelesa in se zato reporter prek biotina veže na kontrolno linijo na traku za detekcijo.<br /> ==REZULTATI==<br /> Skupina je uspešno izolirala encima Cas12a in Cas13a ter z in vitro transkripcijo sintetizirala sgRNA. Skupaj so inkubirali izolirana encima in različne koncentracije sgRNA, nato pa preverili, ali prisotnost tarče v vzorcu vzbudi nespecifično endonukleazno aktivnost Cas12a in Cas13a. <br /> <br /> Pokazali so, da je ob daljših časih inkubacije, višjih koncentracijah sgRNA in prisotnosti tarčne sekvence reporter bolj razgrajen, kar kaže na aktivacijo nespecifične endonukleazne aktivnosti encimov Cas12a in Cas13a. V primeru Cas13a je bilo nekaj reporterske RNA razgrajene tudi v odsotnosti tarčne sekvence, kar bi lahko vodilo v lažno pozitivne rezultate. Zato bi bila v tem delu projekta potrebna optimizacija. <br /> <br /> Sledila je inhibicija RNaz, ki so jo zaznavali s kompletom reagenov podjetja Thermofisher, kjer je kot reporter delovala RNA z vezanim fluoroforom in dušilcem fluorescence. Vzorce sline in urina so inkubirali s proteinazo K in fluorescenco primerjali v vzorcu brez proteinaze. Rezultati so pokazali, da je bila inhibicija RNaz v urinu po triurni inkubaciji boljša kot inhibicija v slini. Po prekonočni inkubaciji je bila tudi inhibicija v slini popolna, torej je metoda uspešna. <br /> <br /> Nato so proteinazo K inhibirali z 1mM PMSF in k tem vzorcem dodali še nekaj nove sline in urina, kjer se nahajajo aktivne RNaze, ter izvedli enako detekcijo kot prej. Pokazali so, da so v vzorcih prisotne aktivne RNaze, torej je bila aktivnost proteinaze K inhibirana.<br /> <br /> Preverili so še možnost uporabe hitrega testa z lateralnim tokom (ang. lateral flow strip) kot metode detekcije. Ugotovili so, da negativni testi dajo signal tako v testni, kot tudi v kontrolni liniji, saj se nekaj reporterja verjetno spontano razgradi. V tem primeru je še vedno jasna razlika med pozitivnim in negativnim testom, saj pri pozitivnem dobimo signal le v testni liniji. Vendar bi bila optimizacija testa za bolj nedvoumne rezultate vseeno dobrodošla.<br /> <br /> ==ZAKLJUČEK==<br /> V okviru projekta je skupina razvila postopek za detekcijo poljubnega izbranega biomarkerja v urinu. Pri tem so sestavili številne enostavne in sestavljene biokocke, ki so dostopne na povezavi. Projekt ima velik potencial za izboljšanje zgodnje diagnostike raka prostate, vendar bi bile potrebne še številne optimizacije. Izboljšati bi bilo treba metodo detekcije (hitri test z lateralnim tokom), da bi bili rezultati bolj nedvoumni, optimizirala bi se lahko tudi izbira biomarkerjev, saj so izbrani v tem projektu primerni predvsem za belsko populacijo. Poleg tega bi bil potreben dizajn embalaže, kjer bi se reakcija izvajala, saj bi le na ta način zagotovili ponovljivost razmer in s tem zanesljivost rezultatov testov.<br /> <br /> ==VIRI==<br /> <br /> [1] https://2020.igem.org/Team:SDU-Denmark<br /> [2] Benecchi, L. PSA velocity and PSA slope. Prostate Cancer Prostatic Dis 9, 169–172 (2006). https://doi.org/10.1038/sj.pcan.4500866</div>

Luka.gnidovec https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=PROSTATUS:_Diagnostika_raka_prostate&diff=19268 2021-05-17T20:31:43Z

<p>Luka.gnidovec: /* UVOD */</p> <hr /> <div>PROSTATUS je iGEM projekt iz leta 2020, ki je osvojil nominacijo v kategoriji Diagnostika med podiplomskimi študenti. Pripravili so ga študenti Univerze južne Danske. <br /> Spletna stran projekta: [https://2020.igem.org/Team:SDU-Denmark]<br /> <br /> ==UVOD==<br /> Rak prostate je eden najpogostejših rakov, ki se razvije pri enem izmed osmih moških. Število diagnosticiranih primerov se povečuje, k čemur verjetno pripomore povišan screening koncentracije PSA (prostate specific antigen) v krvi med moškimi. Ta test pa je precej nezanesljiv, z 31 % verjetnostjo lažnega pozitivnega rezultata in 42 % verjetnostjo lažnega negativnega rezultata.[1,2] PSA nivo v krvi se lahko poviša iz številnih drugih razlogov (vnetje urinarnega trakta, ejakulacija, zdravila…). Poleg tega preverjanju krvne slike sledi še neprijeten in invaziven fizičen pregled. Vsekakor ima trenutni postopek screeninga raka prostate veliko potenciala za izboljšave. [1] <br /> <br /> PROSTATUS je študentski projekt skupine iz Univerze južne Danske, s katerim so sodelovali na iGEM-u 2020 v kategoriji podiplomskih študentov. V projektu so razvili neinvazivno metodo, pri kateri zaznavamo tri RNA biomarkerje v urinu (TMPRSS2:ERG, AMACR, PCA3) in dva SNP-ja (rs6983267, rs16901979), ki povečata verjetnost razvoja raka prostate, v DNA v slini. Test deluje na podlagi sistema CRISPR-Cas13a v primeru zaznavanja RNA biomarkerjev in sistema CRISPR-Cas12a v primeru zaznavanja SNP-jev. [1]<br /> <br /> ==OPIS PROJEKTA==<br /> ===PRINCIP DELOVANJA SISTEMA===<br /> Skupina je v projektu uporabila dve metodi, ki temeljita na delovanju proteinov družine Cas. <br /> ====SHERLOCK====<br /> SHERLOCK (Specific High-sensitivity Enzymatic Reporter unLOCKinkg) je metoda, ki s pomočjo encima Cas13a zaznava ssRNA v vzorcu. V Cas13a je vezana sgRNA (single guide RNA), ki zazna komplementarno tarčo v vzorcu. Ko pride do hibridizacije s tarčo, se Cas13a aktivira in cepi tudi netarčno RNA v vzorcu. Na ta način lahko pride do cepitve reporterske RNA.<br /> ====DETECTR====<br /> DETECTR (The DNA Edonuclease Targeted CRISPR Trans Reporter system) je metoda, ki uporablja Cas12a in zaznava tarčno ssDNA v vzorcu, ob prepoznavi tarče pa pridobi nespecifično endonukleazno aktivnost in cepi reportersko ssDNA.<br /> <br /> ===INŽENIRING===<br /> ====Kloniranje==== <br /> Za implementacijo teh dveh metod so morali najprej izraziti dva Cas encima ter pridobiti različne sgRNA, ki se vežejo v encima. <br /> Encime so izražali v E. coli. Uporabili so gena cas13a iz bakterije Leptotrichia wadei in cas12a iz Acidaminococcus sp. Z orodjem podjetja IDT so optimizirali rabo kodonov ter nato v konstrukt dodali vse potrebne komponente za izražanje proteinov (IPTG inducibilni promotor, RBS, terminator ter oznaki SUMO in His na N-koncu) ter naročili sintetični gen, ki so mu nato dodali še restrikcijska mesta za EcoRI in SpeI. <br /> Gen cas12a, vstavljen v plazmid, so pridobili od raziskovalne skupine iz Univerze južne Danske. S pomnoževanjem s PCR so genu dodali promotorsko regijo sintetičnega gena cas13a. Oba konstrukta so nato klonirali v vektor pSB1C3 in transformirali kompetentne celice E. coli seva ER2256. <br /> ====Načrtovanje sgRNA====<br /> Nato so dizajnirali sgRNA, ki se veže v Cas proteina in je ključna za prepoznavanje tarče. Za aktivacijo Cas12a je v oddaljenosti največ 21 bp od tarče potreben PAM motiv (TTTV). Poleg tega je za specifično aktivacijo Cas12a pomembno 100 % ujemanje v začetnem delu t. i. prilegajoče regije sgRNA (ang. spacer sequence) medtem ko v bolj oddaljenem območju prilegajoče regije 100 % ujemanje za aktivacijo ni potrebno. Če želimo specifično prepoznati SNP, je torej pomembno, da se ta nahaja v začetni regiji tarče, sicer bi dobili nespecifično aktivacijo in signal, ki ne bi bil odvisen od SNP-ja. Optimalna dolžina prilegajoče regije naj bi bila 21 – 24 nukleotidov. Vse te omejitve je skupina upoštevala pri dizajnu sgRNA za Cas12a. Oblikovali so štiri sgRNA, ki se vežejo na Cas12a in prepoznajo posamezne možne alele (prevladujoč alel in alel, ki poviša možnost za razvoj raka prostate).<br /> <br /> Pri oblikovanju sgRNA za Cas13a so upoštevali optimalno dolžino prilegajoče regije 28-31 nukleotidov, prav tako pa pri sgRNA encima Cas13a velja pravilo o 100 % prileganju začetnega dela prilegajoče regije. Cas13a sicer za prepoznavo tarče ne potrebuje PAM motiva. Skupina je oblikovala tri sgRNA za Cas13a, ki se vežejo na RNA biomarkerje v urinu.<br /> <br /> ====Pomnoževanje z metodo RPA====<br /> Ker obstaja verjetnost, da ta sistem ne bi zaznal zelo nizkih koncentracij RNA biomarkerjev v vzorcu, bi pred detekcijo RNA biomarkerje še namnožili z uporabo metode pomnoževanja z rekombinazo in polimerazo (ang. recombinase polymerase amplification – RPA). Gre za proces, alternativen PCR, ki poteka izotermalno in je zato njegova izvedba precej bolj enostavna. Za pomnožitev RNA bi potrebovali štiri encime, in sicer rekombinazo, ssDNA vezavne proteine (SSB) reverzno transkriptazo in DNA polimerazo. Da bi pridobili še pomnoženo RNA in ne le cDNA, bi uporabili še T7 polimerazo. <br /> <br /> V reakciji reverzna transkriptaza najprej prepiše ssRNA v cDNA. V RNA/DNA hibrid rekombinaza vstavi začetne oligonukleotide, ki so komplementarni RNA tarči. Na smerne začetne oligonukleotide bi dodali še T7 promotor. SSB stabilizirajo odrinjeno ssDNA na mestu vezave oligonukleotida, reverzna transkriptaza pa nato spet prepiše RNA verigo v cDNA. Iz novonastale cDNA z dodanim T7 promotorjem nato nastane RNA transkript, ki je na koncu reakcije prisoten v visoki koncentraciji in ga zlahka zaznamo v vzorcu. V opisu projekta ne omenjajo DNA polimeraze, a vendar bi bila ta potrebna za sintezo druge verige cDNA. Lahko bi uporabili tudi encim, ki lahko deluje kot reverzna transkriptaza in DNA polimeraza. <br /> <br /> Podobno reakcijo bi lahko zasnovali tudi za pomnoževanje DNA fragmentov, ki vsebujejo SNP-je, le da bi v tem primeru potrebovali le DNA polimerazo, ne pa tudi reverzne transkriptaze.<br /> <br /> ====Inhibicija aktivnosti RNaz====<br /> Ker pri zaznavanju RNA uporabljamo RNaze, ki se aktivirajo ob specifičnem signalu, bi ostale RNaze v urinu lahko motile specifično cepitev reporterja. Zato je ključna inaktivacija RNaz v vzorcu. V projektu bi uporabili metodo cepitve RNaz s proteinazo K. Po obdelavi vzorca s proteinazo K bi slednjo inaktivirali s fenilmetilsulfonil fluoridom (PMSF), da ne bi razgradila encimov Cas. <br /> ====Detekcija cepitve reporterja====<br /> Za detekcijo cepitve reporterja s Cas12a in Cas13a bi v projektu uporabili hitri test z lateralnim tokom (ang. lateral flow strip). Ta metoda za vizualizacijo rezultatov uporablja anti-FAM-protitelesa s pripetimi zlatimi nanodelci v kombinaciji s posebnim reporterjem. Reporter prek ssRNA ali ssDNA verige povezuje biotin in fluorescein amidit (FAM). Cepitev reporterja se vizualizira na traku, na katerem sta prisotni dve liniji – testna in kontrolna. Če pride do cepitve verige reporterja, se na FAM na cepljenem reporterju lahko veže anti-FAM-protitelo z zlatimi nanodelci na način, ki omogoča vezavo na sekundarna protitelesa, imobilizirana na testni liniji na traku za detekcijo. V primeru, da se reporter ne cepi, pa se protitelesa vežejo na FAM na način, ki ne omogoča vezave na sekundarna protitelesa in se zato reporter prek biotina veže na kontrolno linijo na traku za detekcijo.<br /> ==REZULTATI==<br /> Skupina je uspešno izolirala encima Cas12a in Cas13a ter z in vitro transkripcijo sintetizirala sgRNA. Skupaj so inkubirali izolirana encima in različne koncentracije sgRNA, nato pa preverili, ali prisotnost tarče v vzorcu vzbudi nespecifično endonukleazno aktivnost Cas12a in Cas13a. <br /> <br /> Pokazali so, da je ob daljših časih inkubacije, višjih koncentracijah sgRNA in prisotnosti tarčne sekvence reporter bolj razgrajen, kar kaže na aktivacijo nespecifične endonukleazne aktivnosti encimov Cas12a in Cas13a. V primeru Cas13a je bilo nekaj reporterske RNA razgrajene tudi v odsotnosti tarčne sekvence, kar bi lahko vodilo v lažno pozitivne rezultate. Zato bi bila v tem delu projekta potrebna optimizacija. <br /> <br /> Sledila je inhibicija RNaz, ki so jo zaznavali s kompletom reagenov podjetja Thermofisher, kjer je kot reporter delovala RNA z vezanim fluoroforom in dušilcem fluorescence. Vzorce sline in urina so inkubirali s proteinazo K in fluorescenco primerjali v vzorcu brez proteinaze. Rezultati so pokazali, da je bila inhibicija RNaz v urinu po triurni inkubaciji boljša kot inhibicija v slini. Po prekonočni inkubaciji je bila tudi inhibicija v slini popolna, torej je metoda uspešna. <br /> <br /> Nato so proteinazo K inhibirali z 1mM PMSF in k tem vzorcem dodali še nekaj nove sline in urina, kjer se nahajajo aktivne RNaze, ter izvedli enako detekcijo kot prej. Pokazali so, da so v vzorcih prisotne aktivne RNaze, torej je bila aktivnost proteinaze K inhibirana.<br /> <br /> Preverili so še možnost uporabe hitrega testa z lateralnim tokom (ang. lateral flow strip) kot metode detekcije. Ugotovili so, da negativni testi dajo signal tako v testni, kot tudi v kontrolni liniji, saj se nekaj reporterja verjetno spontano razgradi. V tem primeru je še vedno jasna razlika med pozitivnim in negativnim testom, saj pri pozitivnem dobimo signal le v testni liniji. Vendar bi bila optimizacija testa za bolj nedvoumne rezultate vseeno dobrodošla.<br /> <br /> ==ZAKLJUČEK==<br /> V okviru projekta je skupina razvila postopek za detekcijo poljubnega izbranega biomarkerja v urinu. Pri tem so sestavili številne enostavne in sestavljene biokocke, ki so dostopne na povezavi. Projekt ima velik potencial za izboljšanje zgodnje diagnostike raka prostate, vendar bi bile potrebne še številne optimizacije. Izboljšati bi bilo treba metodo detekcije (hitri test z lateralnim tokom), da bi bili rezultati bolj nedvoumni, optimizirala bi se lahko tudi izbira biomarkerjev, saj so izbrani v tem projektu primerni predvsem za belsko populacijo. Poleg tega bi bil potreben dizajn embalaže, kjer bi se reakcija izvajala, saj bi le na ta način zagotovili ponovljivost razmer in s tem zanesljivost rezultatov testov.</div>

Luka.gnidovec https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=PROSTATUS:_Diagnostika_raka_prostate&diff=19267 2021-05-17T20:22:55Z

<p>Luka.gnidovec: /* Pomnoževanje z metodo RPA */</p> <hr /> <div>PROSTATUS je iGEM projekt iz leta 2020, ki je osvojil nominacijo v kategoriji Diagnostika med podiplomskimi študenti. Pripravili so ga študenti Univerze južne Danske. <br /> Spletna stran projekta: [https://2020.igem.org/Team:SDU-Denmark]<br /> <br /> ==UVOD==<br /> Rak prostate je eden najpogostejših rakov, ki se razvije pri enem izmed osmih moških. Število diagnosticiranih primerov se povečuje, k čemur verjetno pripomore povišan screening koncentracije PSA (prostate specific antigen) v krvi med moškimi. Ta test pa je precej nezanesljiv, z 31 % verjetnostjo lažnega pozitivnega rezultata in 42 % verjetnostjo lažnega negativnega rezultata. PSA nivo v krvi se lahko poviša iz številnih drugih razlogov (vnetje urinarnega trakta, ejakulacija, zdravila…). Poleg tega preverjanju krvne slike sledi še neprijeten in invaziven fizičen pregled. Vsekakor ima trenutni postopek screeninga raka prostate veliko potenciala za izboljšave. <br /> <br /> PROSTATUS je študentski projekt skupine iz Univerze južne Danske, s katerim so sodelovali na iGEM-u 2020 v kategoriji podiplomskih študentov. V projektu so razvili neinvazivno metodo, pri kateri zaznavamo tri RNA biomarkerje v urinu in dva SNP-ja, ki povečata verjetnost razvoja raka prostate, v DNA v slini. Test deluje na podlagi sistema CRISPR-Cas13a v primeru zaznavanja RNA biomarkerjev in sistema CRISPR-Cas12a v primeru zaznavanja SNP-jev.<br /> <br /> ==OPIS PROJEKTA==<br /> ===PRINCIP DELOVANJA SISTEMA===<br /> Skupina je v projektu uporabila dve metodi, ki temeljita na delovanju proteinov družine Cas. <br /> ====SHERLOCK====<br /> SHERLOCK (Specific High-sensitivity Enzymatic Reporter unLOCKinkg) je metoda, ki s pomočjo encima Cas13a zaznava ssRNA v vzorcu. V Cas13a je vezana sgRNA (single guide RNA), ki zazna komplementarno tarčo v vzorcu. Ko pride do hibridizacije s tarčo, se Cas13a aktivira in cepi tudi netarčno RNA v vzorcu. Na ta način lahko pride do cepitve reporterske RNA.<br /> ====DETECTR====<br /> DETECTR (The DNA Edonuclease Targeted CRISPR Trans Reporter system) je metoda, ki uporablja Cas12a in zaznava tarčno ssDNA v vzorcu, ob prepoznavi tarče pa pridobi nespecifično endonukleazno aktivnost in cepi reportersko ssDNA.<br /> <br /> ===INŽENIRING===<br /> ====Kloniranje==== <br /> Za implementacijo teh dveh metod so morali najprej izraziti dva Cas encima ter pridobiti različne sgRNA, ki se vežejo v encima. <br /> Encime so izražali v E. coli. Uporabili so gena cas13a iz bakterije Leptotrichia wadei in cas12a iz Acidaminococcus sp. Z orodjem podjetja IDT so optimizirali rabo kodonov ter nato v konstrukt dodali vse potrebne komponente za izražanje proteinov (IPTG inducibilni promotor, RBS, terminator ter oznaki SUMO in His na N-koncu) ter naročili sintetični gen, ki so mu nato dodali še restrikcijska mesta za EcoRI in SpeI. <br /> Gen cas12a, vstavljen v plazmid, so pridobili od raziskovalne skupine iz Univerze južne Danske. S pomnoževanjem s PCR so genu dodali promotorsko regijo sintetičnega gena cas13a. Oba konstrukta so nato klonirali v vektor pSB1C3 in transformirali kompetentne celice E. coli seva ER2256. <br /> ====Načrtovanje sgRNA====<br /> Nato so dizajnirali sgRNA, ki se veže v Cas proteina in je ključna za prepoznavanje tarče. Za aktivacijo Cas12a je v oddaljenosti največ 21 bp od tarče potreben PAM motiv (TTTV). Poleg tega je za specifično aktivacijo Cas12a pomembno 100 % ujemanje v začetnem delu t. i. prilegajoče regije sgRNA (ang. spacer sequence) medtem ko v bolj oddaljenem območju prilegajoče regije 100 % ujemanje za aktivacijo ni potrebno. Če želimo specifično prepoznati SNP, je torej pomembno, da se ta nahaja v začetni regiji tarče, sicer bi dobili nespecifično aktivacijo in signal, ki ne bi bil odvisen od SNP-ja. Optimalna dolžina prilegajoče regije naj bi bila 21 – 24 nukleotidov. Vse te omejitve je skupina upoštevala pri dizajnu sgRNA za Cas12a. Oblikovali so štiri sgRNA, ki se vežejo na Cas12a in prepoznajo posamezne možne alele (prevladujoč alel in alel, ki poviša možnost za razvoj raka prostate).<br /> <br /> Pri oblikovanju sgRNA za Cas13a so upoštevali optimalno dolžino prilegajoče regije 28-31 nukleotidov, prav tako pa pri sgRNA encima Cas13a velja pravilo o 100 % prileganju začetnega dela prilegajoče regije. Cas13a sicer za prepoznavo tarče ne potrebuje PAM motiva. Skupina je oblikovala tri sgRNA za Cas13a, ki se vežejo na RNA biomarkerje v urinu.<br /> <br /> ====Pomnoževanje z metodo RPA====<br /> Ker obstaja verjetnost, da ta sistem ne bi zaznal zelo nizkih koncentracij RNA biomarkerjev v vzorcu, bi pred detekcijo RNA biomarkerje še namnožili z uporabo metode pomnoževanja z rekombinazo in polimerazo (ang. recombinase polymerase amplification – RPA). Gre za proces, alternativen PCR, ki poteka izotermalno in je zato njegova izvedba precej bolj enostavna. Za pomnožitev RNA bi potrebovali štiri encime, in sicer rekombinazo, ssDNA vezavne proteine (SSB) reverzno transkriptazo in DNA polimerazo. Da bi pridobili še pomnoženo RNA in ne le cDNA, bi uporabili še T7 polimerazo. <br /> <br /> V reakciji reverzna transkriptaza najprej prepiše ssRNA v cDNA. V RNA/DNA hibrid rekombinaza vstavi začetne oligonukleotide, ki so komplementarni RNA tarči. Na smerne začetne oligonukleotide bi dodali še T7 promotor. SSB stabilizirajo odrinjeno ssDNA na mestu vezave oligonukleotida, reverzna transkriptaza pa nato spet prepiše RNA verigo v cDNA. Iz novonastale cDNA z dodanim T7 promotorjem nato nastane RNA transkript, ki je na koncu reakcije prisoten v visoki koncentraciji in ga zlahka zaznamo v vzorcu. V opisu projekta ne omenjajo DNA polimeraze, a vendar bi bila ta potrebna za sintezo druge verige cDNA. Lahko bi uporabili tudi encim, ki lahko deluje kot reverzna transkriptaza in DNA polimeraza. <br /> <br /> Podobno reakcijo bi lahko zasnovali tudi za pomnoževanje DNA fragmentov, ki vsebujejo SNP-je, le da bi v tem primeru potrebovali le DNA polimerazo, ne pa tudi reverzne transkriptaze.<br /> <br /> ====Inhibicija aktivnosti RNaz====<br /> Ker pri zaznavanju RNA uporabljamo RNaze, ki se aktivirajo ob specifičnem signalu, bi ostale RNaze v urinu lahko motile specifično cepitev reporterja. Zato je ključna inaktivacija RNaz v vzorcu. V projektu bi uporabili metodo cepitve RNaz s proteinazo K. Po obdelavi vzorca s proteinazo K bi slednjo inaktivirali s fenilmetilsulfonil fluoridom (PMSF), da ne bi razgradila encimov Cas. <br /> ====Detekcija cepitve reporterja====<br /> Za detekcijo cepitve reporterja s Cas12a in Cas13a bi v projektu uporabili hitri test z lateralnim tokom (ang. lateral flow strip). Ta metoda za vizualizacijo rezultatov uporablja anti-FAM-protitelesa s pripetimi zlatimi nanodelci v kombinaciji s posebnim reporterjem. Reporter prek ssRNA ali ssDNA verige povezuje biotin in fluorescein amidit (FAM). Cepitev reporterja se vizualizira na traku, na katerem sta prisotni dve liniji – testna in kontrolna. Če pride do cepitve verige reporterja, se na FAM na cepljenem reporterju lahko veže anti-FAM-protitelo z zlatimi nanodelci na način, ki omogoča vezavo na sekundarna protitelesa, imobilizirana na testni liniji na traku za detekcijo. V primeru, da se reporter ne cepi, pa se protitelesa vežejo na FAM na način, ki ne omogoča vezave na sekundarna protitelesa in se zato reporter prek biotina veže na kontrolno linijo na traku za detekcijo.<br /> ==REZULTATI==<br /> Skupina je uspešno izolirala encima Cas12a in Cas13a ter z in vitro transkripcijo sintetizirala sgRNA. Skupaj so inkubirali izolirana encima in različne koncentracije sgRNA, nato pa preverili, ali prisotnost tarče v vzorcu vzbudi nespecifično endonukleazno aktivnost Cas12a in Cas13a. <br /> <br /> Pokazali so, da je ob daljših časih inkubacije, višjih koncentracijah sgRNA in prisotnosti tarčne sekvence reporter bolj razgrajen, kar kaže na aktivacijo nespecifične endonukleazne aktivnosti encimov Cas12a in Cas13a. V primeru Cas13a je bilo nekaj reporterske RNA razgrajene tudi v odsotnosti tarčne sekvence, kar bi lahko vodilo v lažno pozitivne rezultate. Zato bi bila v tem delu projekta potrebna optimizacija. <br /> <br /> Sledila je inhibicija RNaz, ki so jo zaznavali s kompletom reagenov podjetja Thermofisher, kjer je kot reporter delovala RNA z vezanim fluoroforom in dušilcem fluorescence. Vzorce sline in urina so inkubirali s proteinazo K in fluorescenco primerjali v vzorcu brez proteinaze. Rezultati so pokazali, da je bila inhibicija RNaz v urinu po triurni inkubaciji boljša kot inhibicija v slini. Po prekonočni inkubaciji je bila tudi inhibicija v slini popolna, torej je metoda uspešna. <br /> <br /> Nato so proteinazo K inhibirali z 1mM PMSF in k tem vzorcem dodali še nekaj nove sline in urina, kjer se nahajajo aktivne RNaze, ter izvedli enako detekcijo kot prej. Pokazali so, da so v vzorcih prisotne aktivne RNaze, torej je bila aktivnost proteinaze K inhibirana.<br /> <br /> Preverili so še možnost uporabe hitrega testa z lateralnim tokom (ang. lateral flow strip) kot metode detekcije. Ugotovili so, da negativni testi dajo signal tako v testni, kot tudi v kontrolni liniji, saj se nekaj reporterja verjetno spontano razgradi. V tem primeru je še vedno jasna razlika med pozitivnim in negativnim testom, saj pri pozitivnem dobimo signal le v testni liniji. Vendar bi bila optimizacija testa za bolj nedvoumne rezultate vseeno dobrodošla.<br /> <br /> ==ZAKLJUČEK==<br /> V okviru projekta je skupina razvila postopek za detekcijo poljubnega izbranega biomarkerja v urinu. Pri tem so sestavili številne enostavne in sestavljene biokocke, ki so dostopne na povezavi. Projekt ima velik potencial za izboljšanje zgodnje diagnostike raka prostate, vendar bi bile potrebne še številne optimizacije. Izboljšati bi bilo treba metodo detekcije (hitri test z lateralnim tokom), da bi bili rezultati bolj nedvoumni, optimizirala bi se lahko tudi izbira biomarkerjev, saj so izbrani v tem projektu primerni predvsem za belsko populacijo. Poleg tega bi bil potreben dizajn embalaže, kjer bi se reakcija izvajala, saj bi le na ta način zagotovili ponovljivost razmer in s tem zanesljivost rezultatov testov.</div>

Luka.gnidovec https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=PROSTATUS:_Diagnostika_raka_prostate&diff=19266 2021-05-17T20:22:33Z

<p>Luka.gnidovec: /* REZULTATI */</p> <hr /> <div>PROSTATUS je iGEM projekt iz leta 2020, ki je osvojil nominacijo v kategoriji Diagnostika med podiplomskimi študenti. Pripravili so ga študenti Univerze južne Danske. <br /> Spletna stran projekta: [https://2020.igem.org/Team:SDU-Denmark]<br /> <br /> ==UVOD==<br /> Rak prostate je eden najpogostejših rakov, ki se razvije pri enem izmed osmih moških. Število diagnosticiranih primerov se povečuje, k čemur verjetno pripomore povišan screening koncentracije PSA (prostate specific antigen) v krvi med moškimi. Ta test pa je precej nezanesljiv, z 31 % verjetnostjo lažnega pozitivnega rezultata in 42 % verjetnostjo lažnega negativnega rezultata. PSA nivo v krvi se lahko poviša iz številnih drugih razlogov (vnetje urinarnega trakta, ejakulacija, zdravila…). Poleg tega preverjanju krvne slike sledi še neprijeten in invaziven fizičen pregled. Vsekakor ima trenutni postopek screeninga raka prostate veliko potenciala za izboljšave. <br /> <br /> PROSTATUS je študentski projekt skupine iz Univerze južne Danske, s katerim so sodelovali na iGEM-u 2020 v kategoriji podiplomskih študentov. V projektu so razvili neinvazivno metodo, pri kateri zaznavamo tri RNA biomarkerje v urinu in dva SNP-ja, ki povečata verjetnost razvoja raka prostate, v DNA v slini. Test deluje na podlagi sistema CRISPR-Cas13a v primeru zaznavanja RNA biomarkerjev in sistema CRISPR-Cas12a v primeru zaznavanja SNP-jev.<br /> <br /> ==OPIS PROJEKTA==<br /> ===PRINCIP DELOVANJA SISTEMA===<br /> Skupina je v projektu uporabila dve metodi, ki temeljita na delovanju proteinov družine Cas. <br /> ====SHERLOCK====<br /> SHERLOCK (Specific High-sensitivity Enzymatic Reporter unLOCKinkg) je metoda, ki s pomočjo encima Cas13a zaznava ssRNA v vzorcu. V Cas13a je vezana sgRNA (single guide RNA), ki zazna komplementarno tarčo v vzorcu. Ko pride do hibridizacije s tarčo, se Cas13a aktivira in cepi tudi netarčno RNA v vzorcu. Na ta način lahko pride do cepitve reporterske RNA.<br /> ====DETECTR====<br /> DETECTR (The DNA Edonuclease Targeted CRISPR Trans Reporter system) je metoda, ki uporablja Cas12a in zaznava tarčno ssDNA v vzorcu, ob prepoznavi tarče pa pridobi nespecifično endonukleazno aktivnost in cepi reportersko ssDNA.<br /> <br /> ===INŽENIRING===<br /> ====Kloniranje==== <br /> Za implementacijo teh dveh metod so morali najprej izraziti dva Cas encima ter pridobiti različne sgRNA, ki se vežejo v encima. <br /> Encime so izražali v E. coli. Uporabili so gena cas13a iz bakterije Leptotrichia wadei in cas12a iz Acidaminococcus sp. Z orodjem podjetja IDT so optimizirali rabo kodonov ter nato v konstrukt dodali vse potrebne komponente za izražanje proteinov (IPTG inducibilni promotor, RBS, terminator ter oznaki SUMO in His na N-koncu) ter naročili sintetični gen, ki so mu nato dodali še restrikcijska mesta za EcoRI in SpeI. <br /> Gen cas12a, vstavljen v plazmid, so pridobili od raziskovalne skupine iz Univerze južne Danske. S pomnoževanjem s PCR so genu dodali promotorsko regijo sintetičnega gena cas13a. Oba konstrukta so nato klonirali v vektor pSB1C3 in transformirali kompetentne celice E. coli seva ER2256. <br /> ====Načrtovanje sgRNA====<br /> Nato so dizajnirali sgRNA, ki se veže v Cas proteina in je ključna za prepoznavanje tarče. Za aktivacijo Cas12a je v oddaljenosti največ 21 bp od tarče potreben PAM motiv (TTTV). Poleg tega je za specifično aktivacijo Cas12a pomembno 100 % ujemanje v začetnem delu t. i. prilegajoče regije sgRNA (ang. spacer sequence) medtem ko v bolj oddaljenem območju prilegajoče regije 100 % ujemanje za aktivacijo ni potrebno. Če želimo specifično prepoznati SNP, je torej pomembno, da se ta nahaja v začetni regiji tarče, sicer bi dobili nespecifično aktivacijo in signal, ki ne bi bil odvisen od SNP-ja. Optimalna dolžina prilegajoče regije naj bi bila 21 – 24 nukleotidov. Vse te omejitve je skupina upoštevala pri dizajnu sgRNA za Cas12a. Oblikovali so štiri sgRNA, ki se vežejo na Cas12a in prepoznajo posamezne možne alele (prevladujoč alel in alel, ki poviša možnost za razvoj raka prostate).<br /> <br /> Pri oblikovanju sgRNA za Cas13a so upoštevali optimalno dolžino prilegajoče regije 28-31 nukleotidov, prav tako pa pri sgRNA encima Cas13a velja pravilo o 100 % prileganju začetnega dela prilegajoče regije. Cas13a sicer za prepoznavo tarče ne potrebuje PAM motiva. Skupina je oblikovala tri sgRNA za Cas13a, ki se vežejo na RNA biomarkerje v urinu.<br /> <br /> ====Pomnoževanje z metodo RPA====<br /> Ker obstaja verjetnost, da ta sistem ne bi zaznal zelo nizkih koncentracij RNA biomarkerjev v vzorcu, bi pred detekcijo RNA biomarkerje še namnožili z uporabo metode pomnoževanja z rekombinazo in polimerazo (ang. recombinase polymerase amplification – RPA). Gre za proces, alternativen PCR, ki poteka izotermalno in je zato njegova izvedba precej bolj enostavna. Za pomnožitev RNA bi potrebovali štiri encime, in sicer rekombinazo, ssDNA vezavne proteine (SSB) reverzno transkriptazo in DNA polimerazo. Da bi pridobili še pomnoženo RNA in ne le cDNA, bi uporabili še T7 polimerazo. <br /> V reakciji reverzna transkriptaza najprej prepiše ssRNA v cDNA. V RNA/DNA hibrid rekombinaza vstavi začetne oligonukleotide, ki so komplementarni RNA tarči. Na smerne začetne oligonukleotide bi dodali še T7 promotor. SSB stabilizirajo odrinjeno ssDNA na mestu vezave oligonukleotida, reverzna transkriptaza pa nato spet prepiše RNA verigo v cDNA. Iz novonastale cDNA z dodanim T7 promotorjem nato nastane RNA transkript, ki je na koncu reakcije prisoten v visoki koncentraciji in ga zlahka zaznamo v vzorcu. V opisu projekta ne omenjajo DNA polimeraze, a vendar bi bila ta potrebna za sintezo druge verige cDNA. Lahko bi uporabili tudi encim, ki lahko deluje kot reverzna transkriptaza in DNA polimeraza. <br /> Podobno reakcijo bi lahko zasnovali tudi za pomnoževanje DNA fragmentov, ki vsebujejo SNP-je, le da bi v tem primeru potrebovali le DNA polimerazo, ne pa tudi reverzne transkriptaze. <br /> ====Inhibicija aktivnosti RNaz====<br /> Ker pri zaznavanju RNA uporabljamo RNaze, ki se aktivirajo ob specifičnem signalu, bi ostale RNaze v urinu lahko motile specifično cepitev reporterja. Zato je ključna inaktivacija RNaz v vzorcu. V projektu bi uporabili metodo cepitve RNaz s proteinazo K. Po obdelavi vzorca s proteinazo K bi slednjo inaktivirali s fenilmetilsulfonil fluoridom (PMSF), da ne bi razgradila encimov Cas. <br /> ====Detekcija cepitve reporterja====<br /> Za detekcijo cepitve reporterja s Cas12a in Cas13a bi v projektu uporabili hitri test z lateralnim tokom (ang. lateral flow strip). Ta metoda za vizualizacijo rezultatov uporablja anti-FAM-protitelesa s pripetimi zlatimi nanodelci v kombinaciji s posebnim reporterjem. Reporter prek ssRNA ali ssDNA verige povezuje biotin in fluorescein amidit (FAM). Cepitev reporterja se vizualizira na traku, na katerem sta prisotni dve liniji – testna in kontrolna. Če pride do cepitve verige reporterja, se na FAM na cepljenem reporterju lahko veže anti-FAM-protitelo z zlatimi nanodelci na način, ki omogoča vezavo na sekundarna protitelesa, imobilizirana na testni liniji na traku za detekcijo. V primeru, da se reporter ne cepi, pa se protitelesa vežejo na FAM na način, ki ne omogoča vezave na sekundarna protitelesa in se zato reporter prek biotina veže na kontrolno linijo na traku za detekcijo.<br /> ==REZULTATI==<br /> Skupina je uspešno izolirala encima Cas12a in Cas13a ter z in vitro transkripcijo sintetizirala sgRNA. Skupaj so inkubirali izolirana encima in različne koncentracije sgRNA, nato pa preverili, ali prisotnost tarče v vzorcu vzbudi nespecifično endonukleazno aktivnost Cas12a in Cas13a. <br /> <br /> Pokazali so, da je ob daljših časih inkubacije, višjih koncentracijah sgRNA in prisotnosti tarčne sekvence reporter bolj razgrajen, kar kaže na aktivacijo nespecifične endonukleazne aktivnosti encimov Cas12a in Cas13a. V primeru Cas13a je bilo nekaj reporterske RNA razgrajene tudi v odsotnosti tarčne sekvence, kar bi lahko vodilo v lažno pozitivne rezultate. Zato bi bila v tem delu projekta potrebna optimizacija. <br /> <br /> Sledila je inhibicija RNaz, ki so jo zaznavali s kompletom reagenov podjetja Thermofisher, kjer je kot reporter delovala RNA z vezanim fluoroforom in dušilcem fluorescence. Vzorce sline in urina so inkubirali s proteinazo K in fluorescenco primerjali v vzorcu brez proteinaze. Rezultati so pokazali, da je bila inhibicija RNaz v urinu po triurni inkubaciji boljša kot inhibicija v slini. Po prekonočni inkubaciji je bila tudi inhibicija v slini popolna, torej je metoda uspešna. <br /> <br /> Nato so proteinazo K inhibirali z 1mM PMSF in k tem vzorcem dodali še nekaj nove sline in urina, kjer se nahajajo aktivne RNaze, ter izvedli enako detekcijo kot prej. Pokazali so, da so v vzorcih prisotne aktivne RNaze, torej je bila aktivnost proteinaze K inhibirana.<br /> <br /> Preverili so še možnost uporabe hitrega testa z lateralnim tokom (ang. lateral flow strip) kot metode detekcije. Ugotovili so, da negativni testi dajo signal tako v testni, kot tudi v kontrolni liniji, saj se nekaj reporterja verjetno spontano razgradi. V tem primeru je še vedno jasna razlika med pozitivnim in negativnim testom, saj pri pozitivnem dobimo signal le v testni liniji. Vendar bi bila optimizacija testa za bolj nedvoumne rezultate vseeno dobrodošla.<br /> <br /> ==ZAKLJUČEK==<br /> V okviru projekta je skupina razvila postopek za detekcijo poljubnega izbranega biomarkerja v urinu. Pri tem so sestavili številne enostavne in sestavljene biokocke, ki so dostopne na povezavi. Projekt ima velik potencial za izboljšanje zgodnje diagnostike raka prostate, vendar bi bile potrebne še številne optimizacije. Izboljšati bi bilo treba metodo detekcije (hitri test z lateralnim tokom), da bi bili rezultati bolj nedvoumni, optimizirala bi se lahko tudi izbira biomarkerjev, saj so izbrani v tem projektu primerni predvsem za belsko populacijo. Poleg tega bi bil potreben dizajn embalaže, kjer bi se reakcija izvajala, saj bi le na ta način zagotovili ponovljivost razmer in s tem zanesljivost rezultatov testov.</div>

Luka.gnidovec https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=PROSTATUS:_Diagnostika_raka_prostate&diff=19265 2021-05-17T20:21:39Z

<p>Luka.gnidovec: /* Načrtovanje sgRNA */</p> <hr /> <div>PROSTATUS je iGEM projekt iz leta 2020, ki je osvojil nominacijo v kategoriji Diagnostika med podiplomskimi študenti. Pripravili so ga študenti Univerze južne Danske. <br /> Spletna stran projekta: [https://2020.igem.org/Team:SDU-Denmark]<br /> <br /> ==UVOD==<br /> Rak prostate je eden najpogostejših rakov, ki se razvije pri enem izmed osmih moških. Število diagnosticiranih primerov se povečuje, k čemur verjetno pripomore povišan screening koncentracije PSA (prostate specific antigen) v krvi med moškimi. Ta test pa je precej nezanesljiv, z 31 % verjetnostjo lažnega pozitivnega rezultata in 42 % verjetnostjo lažnega negativnega rezultata. PSA nivo v krvi se lahko poviša iz številnih drugih razlogov (vnetje urinarnega trakta, ejakulacija, zdravila…). Poleg tega preverjanju krvne slike sledi še neprijeten in invaziven fizičen pregled. Vsekakor ima trenutni postopek screeninga raka prostate veliko potenciala za izboljšave. <br /> <br /> PROSTATUS je študentski projekt skupine iz Univerze južne Danske, s katerim so sodelovali na iGEM-u 2020 v kategoriji podiplomskih študentov. V projektu so razvili neinvazivno metodo, pri kateri zaznavamo tri RNA biomarkerje v urinu in dva SNP-ja, ki povečata verjetnost razvoja raka prostate, v DNA v slini. Test deluje na podlagi sistema CRISPR-Cas13a v primeru zaznavanja RNA biomarkerjev in sistema CRISPR-Cas12a v primeru zaznavanja SNP-jev.<br /> <br /> ==OPIS PROJEKTA==<br /> ===PRINCIP DELOVANJA SISTEMA===<br /> Skupina je v projektu uporabila dve metodi, ki temeljita na delovanju proteinov družine Cas. <br /> ====SHERLOCK====<br /> SHERLOCK (Specific High-sensitivity Enzymatic Reporter unLOCKinkg) je metoda, ki s pomočjo encima Cas13a zaznava ssRNA v vzorcu. V Cas13a je vezana sgRNA (single guide RNA), ki zazna komplementarno tarčo v vzorcu. Ko pride do hibridizacije s tarčo, se Cas13a aktivira in cepi tudi netarčno RNA v vzorcu. Na ta način lahko pride do cepitve reporterske RNA.<br /> ====DETECTR====<br /> DETECTR (The DNA Edonuclease Targeted CRISPR Trans Reporter system) je metoda, ki uporablja Cas12a in zaznava tarčno ssDNA v vzorcu, ob prepoznavi tarče pa pridobi nespecifično endonukleazno aktivnost in cepi reportersko ssDNA.<br /> <br /> ===INŽENIRING===<br /> ====Kloniranje==== <br /> Za implementacijo teh dveh metod so morali najprej izraziti dva Cas encima ter pridobiti različne sgRNA, ki se vežejo v encima. <br /> Encime so izražali v E. coli. Uporabili so gena cas13a iz bakterije Leptotrichia wadei in cas12a iz Acidaminococcus sp. Z orodjem podjetja IDT so optimizirali rabo kodonov ter nato v konstrukt dodali vse potrebne komponente za izražanje proteinov (IPTG inducibilni promotor, RBS, terminator ter oznaki SUMO in His na N-koncu) ter naročili sintetični gen, ki so mu nato dodali še restrikcijska mesta za EcoRI in SpeI. <br /> Gen cas12a, vstavljen v plazmid, so pridobili od raziskovalne skupine iz Univerze južne Danske. S pomnoževanjem s PCR so genu dodali promotorsko regijo sintetičnega gena cas13a. Oba konstrukta so nato klonirali v vektor pSB1C3 in transformirali kompetentne celice E. coli seva ER2256. <br /> ====Načrtovanje sgRNA====<br /> Nato so dizajnirali sgRNA, ki se veže v Cas proteina in je ključna za prepoznavanje tarče. Za aktivacijo Cas12a je v oddaljenosti največ 21 bp od tarče potreben PAM motiv (TTTV). Poleg tega je za specifično aktivacijo Cas12a pomembno 100 % ujemanje v začetnem delu t. i. prilegajoče regije sgRNA (ang. spacer sequence) medtem ko v bolj oddaljenem območju prilegajoče regije 100 % ujemanje za aktivacijo ni potrebno. Če želimo specifično prepoznati SNP, je torej pomembno, da se ta nahaja v začetni regiji tarče, sicer bi dobili nespecifično aktivacijo in signal, ki ne bi bil odvisen od SNP-ja. Optimalna dolžina prilegajoče regije naj bi bila 21 – 24 nukleotidov. Vse te omejitve je skupina upoštevala pri dizajnu sgRNA za Cas12a. Oblikovali so štiri sgRNA, ki se vežejo na Cas12a in prepoznajo posamezne možne alele (prevladujoč alel in alel, ki poviša možnost za razvoj raka prostate).<br /> <br /> Pri oblikovanju sgRNA za Cas13a so upoštevali optimalno dolžino prilegajoče regije 28-31 nukleotidov, prav tako pa pri sgRNA encima Cas13a velja pravilo o 100 % prileganju začetnega dela prilegajoče regije. Cas13a sicer za prepoznavo tarče ne potrebuje PAM motiva. Skupina je oblikovala tri sgRNA za Cas13a, ki se vežejo na RNA biomarkerje v urinu.<br /> <br /> ====Pomnoževanje z metodo RPA====<br /> Ker obstaja verjetnost, da ta sistem ne bi zaznal zelo nizkih koncentracij RNA biomarkerjev v vzorcu, bi pred detekcijo RNA biomarkerje še namnožili z uporabo metode pomnoževanja z rekombinazo in polimerazo (ang. recombinase polymerase amplification – RPA). Gre za proces, alternativen PCR, ki poteka izotermalno in je zato njegova izvedba precej bolj enostavna. Za pomnožitev RNA bi potrebovali štiri encime, in sicer rekombinazo, ssDNA vezavne proteine (SSB) reverzno transkriptazo in DNA polimerazo. Da bi pridobili še pomnoženo RNA in ne le cDNA, bi uporabili še T7 polimerazo. <br /> V reakciji reverzna transkriptaza najprej prepiše ssRNA v cDNA. V RNA/DNA hibrid rekombinaza vstavi začetne oligonukleotide, ki so komplementarni RNA tarči. Na smerne začetne oligonukleotide bi dodali še T7 promotor. SSB stabilizirajo odrinjeno ssDNA na mestu vezave oligonukleotida, reverzna transkriptaza pa nato spet prepiše RNA verigo v cDNA. Iz novonastale cDNA z dodanim T7 promotorjem nato nastane RNA transkript, ki je na koncu reakcije prisoten v visoki koncentraciji in ga zlahka zaznamo v vzorcu. V opisu projekta ne omenjajo DNA polimeraze, a vendar bi bila ta potrebna za sintezo druge verige cDNA. Lahko bi uporabili tudi encim, ki lahko deluje kot reverzna transkriptaza in DNA polimeraza. <br /> Podobno reakcijo bi lahko zasnovali tudi za pomnoževanje DNA fragmentov, ki vsebujejo SNP-je, le da bi v tem primeru potrebovali le DNA polimerazo, ne pa tudi reverzne transkriptaze. <br /> ====Inhibicija aktivnosti RNaz====<br /> Ker pri zaznavanju RNA uporabljamo RNaze, ki se aktivirajo ob specifičnem signalu, bi ostale RNaze v urinu lahko motile specifično cepitev reporterja. Zato je ključna inaktivacija RNaz v vzorcu. V projektu bi uporabili metodo cepitve RNaz s proteinazo K. Po obdelavi vzorca s proteinazo K bi slednjo inaktivirali s fenilmetilsulfonil fluoridom (PMSF), da ne bi razgradila encimov Cas. <br /> ====Detekcija cepitve reporterja====<br /> Za detekcijo cepitve reporterja s Cas12a in Cas13a bi v projektu uporabili hitri test z lateralnim tokom (ang. lateral flow strip). Ta metoda za vizualizacijo rezultatov uporablja anti-FAM-protitelesa s pripetimi zlatimi nanodelci v kombinaciji s posebnim reporterjem. Reporter prek ssRNA ali ssDNA verige povezuje biotin in fluorescein amidit (FAM). Cepitev reporterja se vizualizira na traku, na katerem sta prisotni dve liniji – testna in kontrolna. Če pride do cepitve verige reporterja, se na FAM na cepljenem reporterju lahko veže anti-FAM-protitelo z zlatimi nanodelci na način, ki omogoča vezavo na sekundarna protitelesa, imobilizirana na testni liniji na traku za detekcijo. V primeru, da se reporter ne cepi, pa se protitelesa vežejo na FAM na način, ki ne omogoča vezave na sekundarna protitelesa in se zato reporter prek biotina veže na kontrolno linijo na traku za detekcijo.<br /> ==REZULTATI==<br /> Skupina je uspešno izolirala encima Cas12a in Cas13a ter z in vitro transkripcijo sintetizirala sgRNA. Skupaj so inkubirali izolirana encima in različne koncentracije sgRNA, nato pa preverili, ali prisotnost tarče v vzorcu vzbudi nespecifično endonukleazno aktivnost Cas12a in Cas13a. <br /> Pokazali so, da je ob daljših časih inkubacije, višjih koncentracijah sgRNA in prisotnosti tarčne sekvence reporter bolj razgrajen, kar kaže na aktivacijo nespecifične endonukleazne aktivnosti encimov Cas12a in Cas13a. V primeru Cas13a je bilo nekaj reporterske RNA razgrajene tudi v odsotnosti tarčne sekvence, kar bi lahko vodilo v lažno pozitivne rezultate. Zato bi bila v tem delu projekta potrebna optimizacija. <br /> Sledila je inhibicija RNaz, ki so jo zaznavali s kompletom reagenov podjetja Thermofisher, kjer je kot reporter delovala RNA z vezanim fluoroforom in dušilcem fluorescence. Vzorce sline in urina so inkubirali s proteinazo K in fluorescenco primerjali v vzorcu brez proteinaze. Rezultati so pokazali, da je bila inhibicija RNaz v urinu po triurni inkubaciji boljša kot inhibicija v slini. Po prekonočni inkubaciji je bila tudi inhibicija v slini popolna, torej je metoda uspešna. <br /> Nato so proteinazo K inhibirali z 1mM PMSF in k tem vzorcem dodali še nekaj nove sline in urina, kjer se nahajajo aktivne RNaze, ter izvedli enako detekcijo kot prej. Pokazali so, da so v vzorcih prisotne aktivne RNaze, torej je bila aktivnost proteinaze K inhibirana.<br /> Preverili so še možnost uporabe hitrega testa z lateralnim tokom (ang. lateral flow strip) kot metode detekcije. Ugotovili so, da negativni testi dajo signal tako v testni, kot tudi v kontrolni liniji, saj se nekaj reporterja verjetno spontano razgradi. V tem primeru je še vedno jasna razlika med pozitivnim in negativnim testom, saj pri pozitivnem dobimo signal le v testni liniji. Vendar bi bila optimizacija testa za bolj nedvoumne rezultate vseeno dobrodošla. <br /> ==ZAKLJUČEK==<br /> V okviru projekta je skupina razvila postopek za detekcijo poljubnega izbranega biomarkerja v urinu. Pri tem so sestavili številne enostavne in sestavljene biokocke, ki so dostopne na povezavi. Projekt ima velik potencial za izboljšanje zgodnje diagnostike raka prostate, vendar bi bile potrebne še številne optimizacije. Izboljšati bi bilo treba metodo detekcije (hitri test z lateralnim tokom), da bi bili rezultati bolj nedvoumni, optimizirala bi se lahko tudi izbira biomarkerjev, saj so izbrani v tem projektu primerni predvsem za belsko populacijo. Poleg tega bi bil potreben dizajn embalaže, kjer bi se reakcija izvajala, saj bi le na ta način zagotovili ponovljivost razmer in s tem zanesljivost rezultatov testov.</div>

Luka.gnidovec https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=PROSTATUS:_Diagnostika_raka_prostate&diff=19264 2021-05-17T20:21:19Z

<p>Luka.gnidovec: /* UVOD */</p> <hr /> <div>PROSTATUS je iGEM projekt iz leta 2020, ki je osvojil nominacijo v kategoriji Diagnostika med podiplomskimi študenti. Pripravili so ga študenti Univerze južne Danske. <br /> Spletna stran projekta: [https://2020.igem.org/Team:SDU-Denmark]<br /> <br /> ==UVOD==<br /> Rak prostate je eden najpogostejših rakov, ki se razvije pri enem izmed osmih moških. Število diagnosticiranih primerov se povečuje, k čemur verjetno pripomore povišan screening koncentracije PSA (prostate specific antigen) v krvi med moškimi. Ta test pa je precej nezanesljiv, z 31 % verjetnostjo lažnega pozitivnega rezultata in 42 % verjetnostjo lažnega negativnega rezultata. PSA nivo v krvi se lahko poviša iz številnih drugih razlogov (vnetje urinarnega trakta, ejakulacija, zdravila…). Poleg tega preverjanju krvne slike sledi še neprijeten in invaziven fizičen pregled. Vsekakor ima trenutni postopek screeninga raka prostate veliko potenciala za izboljšave. <br /> <br /> PROSTATUS je študentski projekt skupine iz Univerze južne Danske, s katerim so sodelovali na iGEM-u 2020 v kategoriji podiplomskih študentov. V projektu so razvili neinvazivno metodo, pri kateri zaznavamo tri RNA biomarkerje v urinu in dva SNP-ja, ki povečata verjetnost razvoja raka prostate, v DNA v slini. Test deluje na podlagi sistema CRISPR-Cas13a v primeru zaznavanja RNA biomarkerjev in sistema CRISPR-Cas12a v primeru zaznavanja SNP-jev.<br /> <br /> ==OPIS PROJEKTA==<br /> ===PRINCIP DELOVANJA SISTEMA===<br /> Skupina je v projektu uporabila dve metodi, ki temeljita na delovanju proteinov družine Cas. <br /> ====SHERLOCK====<br /> SHERLOCK (Specific High-sensitivity Enzymatic Reporter unLOCKinkg) je metoda, ki s pomočjo encima Cas13a zaznava ssRNA v vzorcu. V Cas13a je vezana sgRNA (single guide RNA), ki zazna komplementarno tarčo v vzorcu. Ko pride do hibridizacije s tarčo, se Cas13a aktivira in cepi tudi netarčno RNA v vzorcu. Na ta način lahko pride do cepitve reporterske RNA.<br /> ====DETECTR====<br /> DETECTR (The DNA Edonuclease Targeted CRISPR Trans Reporter system) je metoda, ki uporablja Cas12a in zaznava tarčno ssDNA v vzorcu, ob prepoznavi tarče pa pridobi nespecifično endonukleazno aktivnost in cepi reportersko ssDNA.<br /> <br /> ===INŽENIRING===<br /> ====Kloniranje==== <br /> Za implementacijo teh dveh metod so morali najprej izraziti dva Cas encima ter pridobiti različne sgRNA, ki se vežejo v encima. <br /> Encime so izražali v E. coli. Uporabili so gena cas13a iz bakterije Leptotrichia wadei in cas12a iz Acidaminococcus sp. Z orodjem podjetja IDT so optimizirali rabo kodonov ter nato v konstrukt dodali vse potrebne komponente za izražanje proteinov (IPTG inducibilni promotor, RBS, terminator ter oznaki SUMO in His na N-koncu) ter naročili sintetični gen, ki so mu nato dodali še restrikcijska mesta za EcoRI in SpeI. <br /> Gen cas12a, vstavljen v plazmid, so pridobili od raziskovalne skupine iz Univerze južne Danske. S pomnoževanjem s PCR so genu dodali promotorsko regijo sintetičnega gena cas13a. Oba konstrukta so nato klonirali v vektor pSB1C3 in transformirali kompetentne celice E. coli seva ER2256. <br /> ====Načrtovanje sgRNA====<br /> Nato so dizajnirali sgRNA, ki se veže v Cas proteina in je ključna za prepoznavanje tarče. Za aktivacijo Cas12a je v oddaljenosti največ 21 bp od tarče potreben PAM motiv (TTTV). Poleg tega je za specifično aktivacijo Cas12a pomembno 100 % ujemanje v začetnem delu t. i. prilegajoče regije sgRNA (ang. spacer sequence) medtem ko v bolj oddaljenem območju prilegajoče regije 100 % ujemanje za aktivacijo ni potrebno. Če želimo specifično prepoznati SNP, je torej pomembno, da se ta nahaja v začetni regiji tarče, sicer bi dobili nespecifično aktivacijo in signal, ki ne bi bil odvisen od SNP-ja. Optimalna dolžina prilegajoče regije naj bi bila 21 – 24 nukleotidov. Vse te omejitve je skupina upoštevala pri dizajnu sgRNA za Cas12a. Oblikovali so štiri sgRNA, ki se vežejo na Cas12a in prepoznajo posamezne možne alele (prevladujoč alel in alel, ki poviša možnost za razvoj raka prostate). <br /> Pri oblikovanju sgRNA za Cas13a so upoštevali optimalno dolžino prilegajoče regije 28-31 nukleotidov, prav tako pa pri sgRNA encima Cas13a velja pravilo o 100 % prileganju začetnega dela prilegajoče regije. Cas13a sicer za prepoznavo tarče ne potrebuje PAM motiva. Skupina je oblikovala tri sgRNA za Cas13a, ki se vežejo na RNA biomarkerje v urinu. <br /> ====Pomnoževanje z metodo RPA====<br /> Ker obstaja verjetnost, da ta sistem ne bi zaznal zelo nizkih koncentracij RNA biomarkerjev v vzorcu, bi pred detekcijo RNA biomarkerje še namnožili z uporabo metode pomnoževanja z rekombinazo in polimerazo (ang. recombinase polymerase amplification – RPA). Gre za proces, alternativen PCR, ki poteka izotermalno in je zato njegova izvedba precej bolj enostavna. Za pomnožitev RNA bi potrebovali štiri encime, in sicer rekombinazo, ssDNA vezavne proteine (SSB) reverzno transkriptazo in DNA polimerazo. Da bi pridobili še pomnoženo RNA in ne le cDNA, bi uporabili še T7 polimerazo. <br /> V reakciji reverzna transkriptaza najprej prepiše ssRNA v cDNA. V RNA/DNA hibrid rekombinaza vstavi začetne oligonukleotide, ki so komplementarni RNA tarči. Na smerne začetne oligonukleotide bi dodali še T7 promotor. SSB stabilizirajo odrinjeno ssDNA na mestu vezave oligonukleotida, reverzna transkriptaza pa nato spet prepiše RNA verigo v cDNA. Iz novonastale cDNA z dodanim T7 promotorjem nato nastane RNA transkript, ki je na koncu reakcije prisoten v visoki koncentraciji in ga zlahka zaznamo v vzorcu. V opisu projekta ne omenjajo DNA polimeraze, a vendar bi bila ta potrebna za sintezo druge verige cDNA. Lahko bi uporabili tudi encim, ki lahko deluje kot reverzna transkriptaza in DNA polimeraza. <br /> Podobno reakcijo bi lahko zasnovali tudi za pomnoževanje DNA fragmentov, ki vsebujejo SNP-je, le da bi v tem primeru potrebovali le DNA polimerazo, ne pa tudi reverzne transkriptaze. <br /> ====Inhibicija aktivnosti RNaz====<br /> Ker pri zaznavanju RNA uporabljamo RNaze, ki se aktivirajo ob specifičnem signalu, bi ostale RNaze v urinu lahko motile specifično cepitev reporterja. Zato je ključna inaktivacija RNaz v vzorcu. V projektu bi uporabili metodo cepitve RNaz s proteinazo K. Po obdelavi vzorca s proteinazo K bi slednjo inaktivirali s fenilmetilsulfonil fluoridom (PMSF), da ne bi razgradila encimov Cas. <br /> ====Detekcija cepitve reporterja====<br /> Za detekcijo cepitve reporterja s Cas12a in Cas13a bi v projektu uporabili hitri test z lateralnim tokom (ang. lateral flow strip). Ta metoda za vizualizacijo rezultatov uporablja anti-FAM-protitelesa s pripetimi zlatimi nanodelci v kombinaciji s posebnim reporterjem. Reporter prek ssRNA ali ssDNA verige povezuje biotin in fluorescein amidit (FAM). Cepitev reporterja se vizualizira na traku, na katerem sta prisotni dve liniji – testna in kontrolna. Če pride do cepitve verige reporterja, se na FAM na cepljenem reporterju lahko veže anti-FAM-protitelo z zlatimi nanodelci na način, ki omogoča vezavo na sekundarna protitelesa, imobilizirana na testni liniji na traku za detekcijo. V primeru, da se reporter ne cepi, pa se protitelesa vežejo na FAM na način, ki ne omogoča vezave na sekundarna protitelesa in se zato reporter prek biotina veže na kontrolno linijo na traku za detekcijo.<br /> ==REZULTATI==<br /> Skupina je uspešno izolirala encima Cas12a in Cas13a ter z in vitro transkripcijo sintetizirala sgRNA. Skupaj so inkubirali izolirana encima in različne koncentracije sgRNA, nato pa preverili, ali prisotnost tarče v vzorcu vzbudi nespecifično endonukleazno aktivnost Cas12a in Cas13a. <br /> Pokazali so, da je ob daljših časih inkubacije, višjih koncentracijah sgRNA in prisotnosti tarčne sekvence reporter bolj razgrajen, kar kaže na aktivacijo nespecifične endonukleazne aktivnosti encimov Cas12a in Cas13a. V primeru Cas13a je bilo nekaj reporterske RNA razgrajene tudi v odsotnosti tarčne sekvence, kar bi lahko vodilo v lažno pozitivne rezultate. Zato bi bila v tem delu projekta potrebna optimizacija. <br /> Sledila je inhibicija RNaz, ki so jo zaznavali s kompletom reagenov podjetja Thermofisher, kjer je kot reporter delovala RNA z vezanim fluoroforom in dušilcem fluorescence. Vzorce sline in urina so inkubirali s proteinazo K in fluorescenco primerjali v vzorcu brez proteinaze. Rezultati so pokazali, da je bila inhibicija RNaz v urinu po triurni inkubaciji boljša kot inhibicija v slini. Po prekonočni inkubaciji je bila tudi inhibicija v slini popolna, torej je metoda uspešna. <br /> Nato so proteinazo K inhibirali z 1mM PMSF in k tem vzorcem dodali še nekaj nove sline in urina, kjer se nahajajo aktivne RNaze, ter izvedli enako detekcijo kot prej. Pokazali so, da so v vzorcih prisotne aktivne RNaze, torej je bila aktivnost proteinaze K inhibirana.<br /> Preverili so še možnost uporabe hitrega testa z lateralnim tokom (ang. lateral flow strip) kot metode detekcije. Ugotovili so, da negativni testi dajo signal tako v testni, kot tudi v kontrolni liniji, saj se nekaj reporterja verjetno spontano razgradi. V tem primeru je še vedno jasna razlika med pozitivnim in negativnim testom, saj pri pozitivnem dobimo signal le v testni liniji. Vendar bi bila optimizacija testa za bolj nedvoumne rezultate vseeno dobrodošla. <br /> ==ZAKLJUČEK==<br /> V okviru projekta je skupina razvila postopek za detekcijo poljubnega izbranega biomarkerja v urinu. Pri tem so sestavili številne enostavne in sestavljene biokocke, ki so dostopne na povezavi. Projekt ima velik potencial za izboljšanje zgodnje diagnostike raka prostate, vendar bi bile potrebne še številne optimizacije. Izboljšati bi bilo treba metodo detekcije (hitri test z lateralnim tokom), da bi bili rezultati bolj nedvoumni, optimizirala bi se lahko tudi izbira biomarkerjev, saj so izbrani v tem projektu primerni predvsem za belsko populacijo. Poleg tega bi bil potreben dizajn embalaže, kjer bi se reakcija izvajala, saj bi le na ta način zagotovili ponovljivost razmer in s tem zanesljivost rezultatov testov.</div>

Luka.gnidovec https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=PROSTATUS:_Diagnostika_raka_prostate&diff=19263 2021-05-17T20:18:40Z

<p>Luka.gnidovec: </p> <hr /> <div>PROSTATUS je iGEM projekt iz leta 2020, ki je osvojil nominacijo v kategoriji Diagnostika med podiplomskimi študenti. Pripravili so ga študenti Univerze južne Danske. <br /> Spletna stran projekta: [https://2020.igem.org/Team:SDU-Denmark]<br /> <br /> ==UVOD==<br /> Rak prostate je eden najpogostejših rakov, ki se razvije pri enem izmed osmih moških. Število diagnosticiranih primerov se povečuje, k čemur verjetno pripomore povišan screening koncentracije PSA (prostate specific antigen) v krvi med moškimi. Ta test pa je precej nezanesljiv, z 31 % verjetnostjo lažnega pozitivnega rezultata in 42 % verjetnostjo lažnega negativnega rezultata. PSA nivo v krvi se lahko poviša iz številnih drugih razlogov (vnetje urinarnega trakta, ejakulacija, zdravila…). Poleg tega preverjanju krvne slike sledi še neprijeten in invaziven fizičen pregled. Vsekakor ima trenutni postopek screeninga raka prostate veliko potenciala za izboljšave. <br /> PROSTATUS je študentski projekt skupine iz Univerze južne Danske, s katerim so sodelovali na iGEM-u 2020 v kategoriji podiplomskih študentov. V projektu so razvili neinvazivno metodo, pri kateri zaznavamo tri RNA biomarkerje v urinu in dva SNP-ja, ki povečata verjetnost razvoja raka prostate, v DNA v slini. Test deluje na podlagi sistema CRISPR-Cas13a v primeru zaznavanja RNA biomarkerjev in sistema CRISPR-Cas12a v primeru zaznavanja SNP-jev. <br /> ==OPIS PROJEKTA==<br /> ===PRINCIP DELOVANJA SISTEMA===<br /> Skupina je v projektu uporabila dve metodi, ki temeljita na delovanju proteinov družine Cas. <br /> ====SHERLOCK====<br /> SHERLOCK (Specific High-sensitivity Enzymatic Reporter unLOCKinkg) je metoda, ki s pomočjo encima Cas13a zaznava ssRNA v vzorcu. V Cas13a je vezana sgRNA (single guide RNA), ki zazna komplementarno tarčo v vzorcu. Ko pride do hibridizacije s tarčo, se Cas13a aktivira in cepi tudi netarčno RNA v vzorcu. Na ta način lahko pride do cepitve reporterske RNA.<br /> ====DETECTR====<br /> DETECTR (The DNA Edonuclease Targeted CRISPR Trans Reporter system) je metoda, ki uporablja Cas12a in zaznava tarčno ssDNA v vzorcu, ob prepoznavi tarče pa pridobi nespecifično endonukleazno aktivnost in cepi reportersko ssDNA.<br /> <br /> ===INŽENIRING===<br /> ====Kloniranje==== <br /> Za implementacijo teh dveh metod so morali najprej izraziti dva Cas encima ter pridobiti različne sgRNA, ki se vežejo v encima. <br /> Encime so izražali v E. coli. Uporabili so gena cas13a iz bakterije Leptotrichia wadei in cas12a iz Acidaminococcus sp. Z orodjem podjetja IDT so optimizirali rabo kodonov ter nato v konstrukt dodali vse potrebne komponente za izražanje proteinov (IPTG inducibilni promotor, RBS, terminator ter oznaki SUMO in His na N-koncu) ter naročili sintetični gen, ki so mu nato dodali še restrikcijska mesta za EcoRI in SpeI. <br /> Gen cas12a, vstavljen v plazmid, so pridobili od raziskovalne skupine iz Univerze južne Danske. S pomnoževanjem s PCR so genu dodali promotorsko regijo sintetičnega gena cas13a. Oba konstrukta so nato klonirali v vektor pSB1C3 in transformirali kompetentne celice E. coli seva ER2256. <br /> ====Načrtovanje sgRNA====<br /> Nato so dizajnirali sgRNA, ki se veže v Cas proteina in je ključna za prepoznavanje tarče. Za aktivacijo Cas12a je v oddaljenosti največ 21 bp od tarče potreben PAM motiv (TTTV). Poleg tega je za specifično aktivacijo Cas12a pomembno 100 % ujemanje v začetnem delu t. i. prilegajoče regije sgRNA (ang. spacer sequence) medtem ko v bolj oddaljenem območju prilegajoče regije 100 % ujemanje za aktivacijo ni potrebno. Če želimo specifično prepoznati SNP, je torej pomembno, da se ta nahaja v začetni regiji tarče, sicer bi dobili nespecifično aktivacijo in signal, ki ne bi bil odvisen od SNP-ja. Optimalna dolžina prilegajoče regije naj bi bila 21 – 24 nukleotidov. Vse te omejitve je skupina upoštevala pri dizajnu sgRNA za Cas12a. Oblikovali so štiri sgRNA, ki se vežejo na Cas12a in prepoznajo posamezne možne alele (prevladujoč alel in alel, ki poviša možnost za razvoj raka prostate). <br /> Pri oblikovanju sgRNA za Cas13a so upoštevali optimalno dolžino prilegajoče regije 28-31 nukleotidov, prav tako pa pri sgRNA encima Cas13a velja pravilo o 100 % prileganju začetnega dela prilegajoče regije. Cas13a sicer za prepoznavo tarče ne potrebuje PAM motiva. Skupina je oblikovala tri sgRNA za Cas13a, ki se vežejo na RNA biomarkerje v urinu. <br /> ====Pomnoževanje z metodo RPA====<br /> Ker obstaja verjetnost, da ta sistem ne bi zaznal zelo nizkih koncentracij RNA biomarkerjev v vzorcu, bi pred detekcijo RNA biomarkerje še namnožili z uporabo metode pomnoževanja z rekombinazo in polimerazo (ang. recombinase polymerase amplification – RPA). Gre za proces, alternativen PCR, ki poteka izotermalno in je zato njegova izvedba precej bolj enostavna. Za pomnožitev RNA bi potrebovali štiri encime, in sicer rekombinazo, ssDNA vezavne proteine (SSB) reverzno transkriptazo in DNA polimerazo. Da bi pridobili še pomnoženo RNA in ne le cDNA, bi uporabili še T7 polimerazo. <br /> V reakciji reverzna transkriptaza najprej prepiše ssRNA v cDNA. V RNA/DNA hibrid rekombinaza vstavi začetne oligonukleotide, ki so komplementarni RNA tarči. Na smerne začetne oligonukleotide bi dodali še T7 promotor. SSB stabilizirajo odrinjeno ssDNA na mestu vezave oligonukleotida, reverzna transkriptaza pa nato spet prepiše RNA verigo v cDNA. Iz novonastale cDNA z dodanim T7 promotorjem nato nastane RNA transkript, ki je na koncu reakcije prisoten v visoki koncentraciji in ga zlahka zaznamo v vzorcu. V opisu projekta ne omenjajo DNA polimeraze, a vendar bi bila ta potrebna za sintezo druge verige cDNA. Lahko bi uporabili tudi encim, ki lahko deluje kot reverzna transkriptaza in DNA polimeraza. <br /> Podobno reakcijo bi lahko zasnovali tudi za pomnoževanje DNA fragmentov, ki vsebujejo SNP-je, le da bi v tem primeru potrebovali le DNA polimerazo, ne pa tudi reverzne transkriptaze. <br /> ====Inhibicija aktivnosti RNaz====<br /> Ker pri zaznavanju RNA uporabljamo RNaze, ki se aktivirajo ob specifičnem signalu, bi ostale RNaze v urinu lahko motile specifično cepitev reporterja. Zato je ključna inaktivacija RNaz v vzorcu. V projektu bi uporabili metodo cepitve RNaz s proteinazo K. Po obdelavi vzorca s proteinazo K bi slednjo inaktivirali s fenilmetilsulfonil fluoridom (PMSF), da ne bi razgradila encimov Cas. <br /> ====Detekcija cepitve reporterja====<br /> Za detekcijo cepitve reporterja s Cas12a in Cas13a bi v projektu uporabili hitri test z lateralnim tokom (ang. lateral flow strip). Ta metoda za vizualizacijo rezultatov uporablja anti-FAM-protitelesa s pripetimi zlatimi nanodelci v kombinaciji s posebnim reporterjem. Reporter prek ssRNA ali ssDNA verige povezuje biotin in fluorescein amidit (FAM). Cepitev reporterja se vizualizira na traku, na katerem sta prisotni dve liniji – testna in kontrolna. Če pride do cepitve verige reporterja, se na FAM na cepljenem reporterju lahko veže anti-FAM-protitelo z zlatimi nanodelci na način, ki omogoča vezavo na sekundarna protitelesa, imobilizirana na testni liniji na traku za detekcijo. V primeru, da se reporter ne cepi, pa se protitelesa vežejo na FAM na način, ki ne omogoča vezave na sekundarna protitelesa in se zato reporter prek biotina veže na kontrolno linijo na traku za detekcijo.<br /> ==REZULTATI==<br /> Skupina je uspešno izolirala encima Cas12a in Cas13a ter z in vitro transkripcijo sintetizirala sgRNA. Skupaj so inkubirali izolirana encima in različne koncentracije sgRNA, nato pa preverili, ali prisotnost tarče v vzorcu vzbudi nespecifično endonukleazno aktivnost Cas12a in Cas13a. <br /> Pokazali so, da je ob daljših časih inkubacije, višjih koncentracijah sgRNA in prisotnosti tarčne sekvence reporter bolj razgrajen, kar kaže na aktivacijo nespecifične endonukleazne aktivnosti encimov Cas12a in Cas13a. V primeru Cas13a je bilo nekaj reporterske RNA razgrajene tudi v odsotnosti tarčne sekvence, kar bi lahko vodilo v lažno pozitivne rezultate. Zato bi bila v tem delu projekta potrebna optimizacija. <br /> Sledila je inhibicija RNaz, ki so jo zaznavali s kompletom reagenov podjetja Thermofisher, kjer je kot reporter delovala RNA z vezanim fluoroforom in dušilcem fluorescence. Vzorce sline in urina so inkubirali s proteinazo K in fluorescenco primerjali v vzorcu brez proteinaze. Rezultati so pokazali, da je bila inhibicija RNaz v urinu po triurni inkubaciji boljša kot inhibicija v slini. Po prekonočni inkubaciji je bila tudi inhibicija v slini popolna, torej je metoda uspešna. <br /> Nato so proteinazo K inhibirali z 1mM PMSF in k tem vzorcem dodali še nekaj nove sline in urina, kjer se nahajajo aktivne RNaze, ter izvedli enako detekcijo kot prej. Pokazali so, da so v vzorcih prisotne aktivne RNaze, torej je bila aktivnost proteinaze K inhibirana.<br /> Preverili so še možnost uporabe hitrega testa z lateralnim tokom (ang. lateral flow strip) kot metode detekcije. Ugotovili so, da negativni testi dajo signal tako v testni, kot tudi v kontrolni liniji, saj se nekaj reporterja verjetno spontano razgradi. V tem primeru je še vedno jasna razlika med pozitivnim in negativnim testom, saj pri pozitivnem dobimo signal le v testni liniji. Vendar bi bila optimizacija testa za bolj nedvoumne rezultate vseeno dobrodošla. <br /> ==ZAKLJUČEK==<br /> V okviru projekta je skupina razvila postopek za detekcijo poljubnega izbranega biomarkerja v urinu. Pri tem so sestavili številne enostavne in sestavljene biokocke, ki so dostopne na povezavi. Projekt ima velik potencial za izboljšanje zgodnje diagnostike raka prostate, vendar bi bile potrebne še številne optimizacije. Izboljšati bi bilo treba metodo detekcije (hitri test z lateralnim tokom), da bi bili rezultati bolj nedvoumni, optimizirala bi se lahko tudi izbira biomarkerjev, saj so izbrani v tem projektu primerni predvsem za belsko populacijo. Poleg tega bi bil potreben dizajn embalaže, kjer bi se reakcija izvajala, saj bi le na ta način zagotovili ponovljivost razmer in s tem zanesljivost rezultatov testov.</div>

Luka.gnidovec https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=PROSTATUS:_Diagnostika_raka_prostate&diff=19262 2021-05-17T20:17:56Z

<p>Luka.gnidovec: </p> <hr /> <div>PROSTATUS je iGEM projekt iz leta 2020, ki je osvojil nominacijo v kategoriji Diagnostika med podiplomskimi študenti. Pripravili so ga študenti Univerze južne Danske. <br /> Spletna stran projekta: [https://2020.igem.org/Team:SDU-Denmark]<br /> <br /> ==UVOD==<br /> Rak prostate je eden najpogostejših rakov, ki se razvije pri enem izmed osmih moških. Število diagnosticiranih primerov se povečuje, k čemur verjetno pripomore povišan screening koncentracije PSA (prostate specific antigen) v krvi med moškimi. Ta test pa je precej nezanesljiv, z 31 % verjetnostjo lažnega pozitivnega rezultata in 42 % verjetnostjo lažnega negativnega rezultata. PSA nivo v krvi se lahko poviša iz številnih drugih razlogov (vnetje urinarnega trakta, ejakulacija, zdravila…). Poleg tega preverjanju krvne slike sledi še neprijeten in invaziven fizičen pregled. Vsekakor ima trenutni postopek screeninga raka prostate veliko potenciala za izboljšave. <br /> PROSTATUS je študentski projekt skupine iz Univerze južne Danske, s katerim so sodelovali na iGEM-u 2020 v kategoriji podiplomskih študentov. V projektu so razvili neinvazivno metodo, pri kateri zaznavamo tri RNA biomarkerje v urinu in dva SNP-ja, ki povečata verjetnost razvoja raka prostate, v DNA v slini. Test deluje na podlagi sistema CRISPR-Cas13a v primeru zaznavanja RNA biomarkerjev in sistema CRISPR-Cas12a v primeru zaznavanja SNP-jev. <br /> ==OPIS PROJEKTA==<br /> ===PRINCIP DELOVANJA SISTEMA===<br /> Skupina je v projektu uporabila dve metodi, ki temeljita na delovanju proteinov družine Cas. <br /> ====SHERLOCK====<br /> SHERLOCK (Specific High-sensitivity Enzymatic Reporter unLOCKinkg) je metoda, ki s pomočjo encima Cas13a zaznava ssRNA v vzorcu. V Cas13a je vezana sgRNA (single guide RNA), ki zazna komplementarno tarčo v vzorcu. Ko pride do hibridizacije s tarčo, se Cas13a aktivira in cepi tudi netarčno RNA v vzorcu. Na ta način lahko pride do cepitve reporterske RNA.<br /> ====DETECTR====<br /> DETECTR (The DNA Edonuclease Targeted CRISPR Trans Reporter system) je metoda, ki uporablja Cas12a in zaznava tarčno ssDNA v vzorcu, ob prepoznavi tarče pa pridobi nespecifično endonukleazno aktivnost in cepi reportersko ssDNA.<br /> <br /> ===INŽENIRING===<br /> ====Kloniranje==== <br /> Za implementacijo teh dveh metod so morali najprej izraziti dva Cas encima ter pridobiti različne sgRNA, ki se vežejo v encima. <br /> Encime so izražali v E. coli. Uporabili so gena cas13a iz bakterije Leptotrichia wadei in cas12a iz Acidaminococcus sp. Z orodjem podjetja IDT so optimizirali rabo kodonov ter nato v konstrukt dodali vse potrebne komponente za izražanje proteinov (IPTG inducibilni promotor, RBS, terminator ter oznaki SUMO in His na N-koncu) ter naročili sintetični gen, ki so mu nato dodali še restrikcijska mesta za EcoRI in SpeI. <br /> Gen cas12a, vstavljen v plazmid, so pridobili od raziskovalne skupine iz Univerze južne Danske. S pomnoževanjem s PCR so genu dodali promotorsko regijo sintetičnega gena cas13a. Oba konstrukta so nato klonirali v vektor pSB1C3 in transformirali kompetentne celice E. coli seva ER2256. <br /> ====Načrtovanje sgRNA====<br /> Nato so dizajnirali sgRNA, ki se veže v Cas proteina in je ključna za prepoznavanje tarče. Za aktivacijo Cas12a je v oddaljenosti največ 21 bp od tarče potreben PAM motiv (TTTV). Poleg tega je za specifično aktivacijo Cas12a pomembno 100 % ujemanje v začetnem delu t. i. prilegajoče regije sgRNA (ang. spacer sequence) medtem ko v bolj oddaljenem območju prilegajoče regije 100 % ujemanje za aktivacijo ni potrebno. Če želimo specifično prepoznati SNP, je torej pomembno, da se ta nahaja v začetni regiji tarče, sicer bi dobili nespecifično aktivacijo in signal, ki ne bi bil odvisen od SNP-ja. Optimalna dolžina prilegajoče regije naj bi bila 21 – 24 nukleotidov. Vse te omejitve je skupina upoštevala pri dizajnu sgRNA za Cas12a. Oblikovali so štiri sgRNA, ki se vežejo na Cas12a in prepoznajo posamezne možne alele (prevladujoč alel in alel, ki poviša možnost za razvoj raka prostate). <br /> Pri oblikovanju sgRNA za Cas13a so upoštevali optimalno dolžino prilegajoče regije 28-31 nukleotidov, prav tako pa pri sgRNA encima Cas13a velja pravilo o 100 % prileganju začetnega dela prilegajoče regije. Cas13a sicer za prepoznavo tarče ne potrebuje PAM motiva. Skupina je oblikovala tri sgRNA za Cas13a, ki se vežejo na RNA biomarkerje v urinu. <br /> ====Pomnoževanje z metodo RPA====<br /> Ker obstaja verjetnost, da ta sistem ne bi zaznal zelo nizkih koncentracij RNA biomarkerjev v vzorcu, bi pred detekcijo RNA biomarkerje še namnožili z uporabo metode pomnoževanja z rekombinazo in polimerazo (ang. recombinase polymerase amplification – RPA). Gre za proces, alternativen PCR, ki poteka izotermalno in je zato njegova izvedba precej bolj enostavna. Za pomnožitev RNA bi potrebovali štiri encime, in sicer rekombinazo, ssDNA vezavne proteine (SSB) reverzno transkriptazo in DNA polimerazo. Da bi pridobili še pomnoženo RNA in ne le cDNA, bi uporabili še T7 polimerazo. <br /> V reakciji reverzna transkriptaza najprej prepiše ssRNA v cDNA. V RNA/DNA hibrid rekombinaza vstavi začetne oligonukleotide, ki so komplementarni RNA tarči. Na smerne začetne oligonukleotide bi dodali še T7 promotor. SSB stabilizirajo odrinjeno ssDNA na mestu vezave oligonukleotida, reverzna transkriptaza pa nato spet prepiše RNA verigo v cDNA. Iz novonastale cDNA z dodanim T7 promotorjem nato nastane RNA transkript, ki je na koncu reakcije prisoten v visoki koncentraciji in ga zlahka zaznamo v vzorcu. V opisu projekta ne omenjajo DNA polimeraze, a vendar bi bila ta potrebna za sintezo druge verige cDNA. Lahko bi uporabili tudi encim, ki lahko deluje kot reverzna transkriptaza in DNA polimeraza. <br /> Podobno reakcijo bi lahko zasnovali tudi za pomnoževanje DNA fragmentov, ki vsebujejo SNP-je, le da bi v tem primeru potrebovali le DNA polimerazo, ne pa tudi reverzne transkriptaze. <br /> ====Inhibicija aktivnosti RNaz====<br /> Ker pri zaznavanju RNA uporabljamo RNaze, ki se aktivirajo ob specifičnem signalu, bi ostale RNaze v urinu lahko motile specifično cepitev reporterja. Zato je ključna inaktivacija RNaz v vzorcu. V projektu bi uporabili metodo cepitve RNaz s proteinazo K. Po obdelavi vzorca s proteinazo K bi slednjo inaktivirali s fenilmetilsulfonil fluoridom (PMSF), da ne bi razgradila encimov Cas. <br /> ====Detekcija cepitve reporterja====<br /> Za detekcijo cepitve reporterja s Cas12a in Cas13a bi v projektu uporabili hitri test z lateralnim tokom (ang. lateral flow strip). Ta metoda za vizualizacijo rezultatov uporablja anti-FAM-protitelesa s pripetimi zlatimi nanodelci v kombinaciji s posebnim reporterjem. Reporter prek ssRNA ali ssDNA verige povezuje biotin in fluorescein amidit (FAM). Cepitev reporterja se vizualizira na traku, na katerem sta prisotni dve liniji – testna in kontrolna. Če pride do cepitve verige reporterja, se na FAM na cepljenem reporterju lahko veže anti-FAM-protitelo z zlatimi nanodelci na način, ki omogoča vezavo na sekundarna protitelesa, imobilizirana na testni liniji na traku za detekcijo. V primeru, da se reporter ne cepi, pa se protitelesa vežejo na FAM na način, ki ne omogoča vezave na sekundarna protitelesa in se zato reporter prek biotina veže na kontrolno linijo na traku za detekcijo.<br /> ===REZULTATI===<br /> Skupina je uspešno izolirala encima Cas12a in Cas13a ter z in vitro transkripcijo sintetizirala sgRNA. Skupaj so inkubirali izolirana encima in različne koncentracije sgRNA, nato pa preverili, ali prisotnost tarče v vzorcu vzbudi nespecifično endonukleazno aktivnost Cas12a in Cas13a. <br /> Pokazali so, da je ob daljših časih inkubacije, višjih koncentracijah sgRNA in prisotnosti tarčne sekvence reporter bolj razgrajen, kar kaže na aktivacijo nespecifične endonukleazne aktivnosti encimov Cas12a in Cas13a. V primeru Cas13a je bilo nekaj reporterske RNA razgrajene tudi v odsotnosti tarčne sekvence, kar bi lahko vodilo v lažno pozitivne rezultate. Zato bi bila v tem delu projekta potrebna optimizacija. <br /> Sledila je inhibicija RNaz, ki so jo zaznavali s kompletom reagenov podjetja Thermofisher, kjer je kot reporter delovala RNA z vezanim fluoroforom in dušilcem fluorescence. Vzorce sline in urina so inkubirali s proteinazo K in fluorescenco primerjali v vzorcu brez proteinaze. Rezultati so pokazali, da je bila inhibicija RNaz v urinu po triurni inkubaciji boljša kot inhibicija v slini. Po prekonočni inkubaciji je bila tudi inhibicija v slini popolna, torej je metoda uspešna. <br /> Nato so proteinazo K inhibirali z 1mM PMSF in k tem vzorcem dodali še nekaj nove sline in urina, kjer se nahajajo aktivne RNaze, ter izvedli enako detekcijo kot prej. Pokazali so, da so v vzorcih prisotne aktivne RNaze, torej je bila aktivnost proteinaze K inhibirana.<br /> Preverili so še možnost uporabe hitrega testa z lateralnim tokom (ang. lateral flow strip) kot metode detekcije. Ugotovili so, da negativni testi dajo signal tako v testni, kot tudi v kontrolni liniji, saj se nekaj reporterja verjetno spontano razgradi. V tem primeru je še vedno jasna razlika med pozitivnim in negativnim testom, saj pri pozitivnem dobimo signal le v testni liniji. Vendar bi bila optimizacija testa za bolj nedvoumne rezultate vseeno dobrodošla. <br /> ===ZAKLJUČEK===<br /> V okviru projekta je skupina razvila postopek za detekcijo poljubnega izbranega biomarkerja v urinu. Pri tem so sestavili številne enostavne in sestavljene biokocke, ki so dostopne na povezavi. Projekt ima velik potencial za izboljšanje zgodnje diagnostike raka prostate, vendar bi bile potrebne še številne optimizacije. Izboljšati bi bilo treba metodo detekcije (hitri test z lateralnim tokom), da bi bili rezultati bolj nedvoumni, optimizirala bi se lahko tudi izbira biomarkerjev, saj so izbrani v tem projektu primerni predvsem za belsko populacijo. Poleg tega bi bil potreben dizajn embalaže, kjer bi se reakcija izvajala, saj bi le na ta način zagotovili ponovljivost razmer in s tem zanesljivost rezultatov testov.</div>

Luka.gnidovec https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=PROSTATUS:_Diagnostika_raka_prostate&diff=19261 2021-05-17T20:16:50Z

<p>Luka.gnidovec: </p> <hr /> <div>PROSTATUS je iGEM projekt iz leta 2020, ki je osvojil nominacijo v kategoriji Diagnostika med podiplomskimi študenti. Pripravili so ga študenti Univerze južne Danske. <br /> Spletna stran projekta: [https://2020.igem.org/Team:SDU-Denmark]<br /> <br /> ==UVOD==<br /> Rak prostate je eden najpogostejših rakov, ki se razvije pri enem izmed osmih moških. Število diagnosticiranih primerov se povečuje, k čemur verjetno pripomore povišan screening koncentracije PSA (prostate specific antigen) v krvi med moškimi. Ta test pa je precej nezanesljiv, z 31 % verjetnostjo lažnega pozitivnega rezultata in 42 % verjetnostjo lažnega negativnega rezultata. PSA nivo v krvi se lahko poviša iz številnih drugih razlogov (vnetje urinarnega trakta, ejakulacija, zdravila…). Poleg tega preverjanju krvne slike sledi še neprijeten in invaziven fizičen pregled. Vsekakor ima trenutni postopek screeninga raka prostate veliko potenciala za izboljšave. <br /> PROSTATUS je študentski projekt skupine iz Univerze južne Danske, s katerim so sodelovali na iGEM-u 2020 v kategoriji podiplomskih študentov. V projektu so razvili neinvazivno metodo, pri kateri zaznavamo tri RNA biomarkerje v urinu in dva SNP-ja, ki povečata verjetnost razvoja raka prostate, v DNA v slini. Test deluje na podlagi sistema CRISPR-Cas13a v primeru zaznavanja RNA biomarkerjev in sistema CRISPR-Cas12a v primeru zaznavanja SNP-jev. <br /> ==OPIS PROJEKTA==<br /> ===PRINCIP DELOVANJA SISTEMA===<br /> Skupina je v projektu uporabila dve metodi, ki temeljita na delovanju proteinov družine Cas. <br /> ====SHERLOCK====<br /> SHERLOCK (Specific High-sensitivity Enzymatic Reporter unLOCKinkg) je metoda, ki s pomočjo encima Cas13a zaznava ssRNA v vzorcu. V Cas13a je vezana sgRNA (single guide RNA), ki zazna komplementarno tarčo v vzorcu. Ko pride do hibridizacije s tarčo, se Cas13a aktivira in cepi tudi netarčno RNA v vzorcu. Na ta način lahko pride do cepitve reporterske RNA.<br /> ====DETECTR====<br /> DETECTR (The DNA Edonuclease Targeted CRISPR Trans Reporter system) je metoda, ki uporablja Cas12a in zaznava tarčno ssDNA v vzorcu, ob prepoznavi tarče pa pridobi nespecifično endonukleazno aktivnost in cepi reportersko ssDNA.<br /> <br /> ===INŽENIRING===<br /> ====Kloniranje==== <br /> Za implementacijo teh dveh metod so morali najprej izraziti dva Cas encima ter pridobiti različne sgRNA, ki se vežejo v encima. <br /> Encime so izražali v E. coli. Uporabili so gena cas13a iz bakterije Leptotrichia wadei in cas12a iz Acidaminococcus sp. Z orodjem podjetja IDT so optimizirali rabo kodonov ter nato v konstrukt dodali vse potrebne komponente za izražanje proteinov (IPTG inducibilni promotor, RBS, terminator ter oznaki SUMO in His na N-koncu) ter naročili sintetični gen, ki so mu nato dodali še restrikcijska mesta za EcoRI in SpeI. <br /> Gen cas12a, vstavljen v plazmid, so pridobili od raziskovalne skupine iz Univerze južne Danske. S pomnoževanjem s PCR so genu dodali promotorsko regijo sintetičnega gena cas13a. Oba konstrukta so nato klonirali v vektor pSB1C3 in transformirali kompetentne celice E. coli seva ER2256. <br /> ====Načrtovanje sgRNA====<br /> Nato so dizajnirali sgRNA, ki se veže v Cas proteina in je ključna za prepoznavanje tarče. Za aktivacijo Cas12a je v oddaljenosti največ 21 bp od tarče potreben PAM motiv (TTTV). Poleg tega je za specifično aktivacijo Cas12a pomembno 100 % ujemanje v začetnem delu t. i. prilegajoče regije sgRNA (ang. spacer sequence) medtem ko v bolj oddaljenem območju prilegajoče regije 100 % ujemanje za aktivacijo ni potrebno. Če želimo specifično prepoznati SNP, je torej pomembno, da se ta nahaja v začetni regiji tarče, sicer bi dobili nespecifično aktivacijo in signal, ki ne bi bil odvisen od SNP-ja. Optimalna dolžina prilegajoče regije naj bi bila 21 – 24 nukleotidov. Vse te omejitve je skupina upoštevala pri dizajnu sgRNA za Cas12a. Oblikovali so štiri sgRNA, ki se vežejo na Cas12a in prepoznajo posamezne možne alele (prevladujoč alel in alel, ki poviša možnost za razvoj raka prostate). <br /> Pri oblikovanju sgRNA za Cas13a so upoštevali optimalno dolžino prilegajoče regije 28-31 nukleotidov, prav tako pa pri sgRNA encima Cas13a velja pravilo o 100 % prileganju začetnega dela prilegajoče regije. Cas13a sicer za prepoznavo tarče ne potrebuje PAM motiva. Skupina je oblikovala tri sgRNA za Cas13a, ki se vežejo na RNA biomarkerje v urinu. <br /> ====Pomnoževanje z metodo RPA====<br /> Ker obstaja verjetnost, da ta sistem ne bi zaznal zelo nizkih koncentracij RNA biomarkerjev v vzorcu, bi pred detekcijo RNA biomarkerje še namnožili z uporabo metode pomnoževanja z rekombinazo in polimerazo (ang. recombinase polymerase amplification – RPA). Gre za proces, alternativen PCR, ki poteka izotermalno in je zato njegova izvedba precej bolj enostavna. Za pomnožitev RNA bi potrebovali štiri encime, in sicer rekombinazo, ssDNA vezavne proteine (SSB) reverzno transkriptazo in DNA polimerazo. Da bi pridobili še pomnoženo RNA in ne le cDNA, bi uporabili še T7 polimerazo. <br /> V reakciji reverzna transkriptaza najprej prepiše ssRNA v cDNA. V RNA/DNA hibrid rekombinaza vstavi začetne oligonukleotide, ki so komplementarni RNA tarči. Na smerne začetne oligonukleotide bi dodali še T7 promotor. SSB stabilizirajo odrinjeno ssDNA na mestu vezave oligonukleotida, reverzna transkriptaza pa nato spet prepiše RNA verigo v cDNA. Iz novonastale cDNA z dodanim T7 promotorjem nato nastane RNA transkript, ki je na koncu reakcije prisoten v visoki koncentraciji in ga zlahka zaznamo v vzorcu. V opisu projekta ne omenjajo DNA polimeraze, a vendar bi bila ta potrebna za sintezo druge verige cDNA. Lahko bi uporabili tudi encim, ki lahko deluje kot reverzna transkriptaza in DNA polimeraza. <br /> Podobno reakcijo bi lahko zasnovali tudi za pomnoževanje DNA fragmentov, ki vsebujejo SNP-je, le da bi v tem primeru potrebovali le DNA polimerazo, ne pa tudi reverzne transkriptaze. <br /> ====Inhibicija aktivnosti RNaz====<br /> Ker pri zaznavanju RNA uporabljamo RNaze, ki se aktivirajo ob specifičnem signalu, bi ostale RNaze v urinu lahko motile specifično cepitev reporterja. Zato je ključna inaktivacija RNaz v vzorcu. V projektu bi uporabili metodo cepitve RNaz s proteinazo K. Po obdelavi vzorca s proteinazo K bi slednjo inaktivirali s fenilmetilsulfonil fluoridom (PMSF), da ne bi razgradila encimov Cas. <br /> ====Detekcija cepitve reporterja====<br /> Za detekcijo cepitve reporterja s Cas12a in Cas13a bi v projektu uporabili hitri test z lateralnim tokom (ang. lateral flow strip). Ta metoda za vizualizacijo rezultatov uporablja anti-FAM-protitelesa s pripetimi zlatimi nanodelci v kombinaciji s posebnim reporterjem. Reporter prek ssRNA ali ssDNA verige povezuje biotin in fluorescein amidit (FAM). Cepitev reporterja se vizualizira na traku, na katerem sta prisotni dve liniji – testna in kontrolna. Če pride do cepitve verige reporterja, se na FAM na cepljenem reporterju lahko veže anti-FAM-protitelo z zlatimi nanodelci na način, ki omogoča vezavo na sekundarna protitelesa, imobilizirana na testni liniji na traku za detekcijo. V primeru, da se reporter ne cepi, pa se protitelesa vežejo na FAM na način, ki ne omogoča vezave na sekundarna protitelesa in se zato reporter prek biotina veže na kontrolno linijo na traku za detekcijo.</div>

Luka.gnidovec https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=PROSTATUS:_Diagnostika_raka_prostate&diff=19260 2021-05-17T20:16:22Z

<p>Luka.gnidovec: </p> <hr /> <div>PROSTATUS je iGEM projekt iz leta 2020, ki je osvojil nominacijo v kategoriji Diagnostika med podiplomskimi študenti. Pripravili so ga študenti Univerze južne Danske. <br /> Spletna stran projekta: [https://2020.igem.org/Team:SDU-Denmark]<br /> <br /> ==UVOD==<br /> <br /> Rak prostate je eden najpogostejših rakov, ki se razvije pri enem izmed osmih moških. Število diagnosticiranih primerov se povečuje, k čemur verjetno pripomore povišan screening koncentracije PSA (prostate specific antigen) v krvi med moškimi. Ta test pa je precej nezanesljiv, z 31 % verjetnostjo lažnega pozitivnega rezultata in 42 % verjetnostjo lažnega negativnega rezultata. PSA nivo v krvi se lahko poviša iz številnih drugih razlogov (vnetje urinarnega trakta, ejakulacija, zdravila…). Poleg tega preverjanju krvne slike sledi še neprijeten in invaziven fizičen pregled. Vsekakor ima trenutni postopek screeninga raka prostate veliko potenciala za izboljšave. <br /> PROSTATUS je študentski projekt skupine iz Univerze južne Danske, s katerim so sodelovali na iGEM-u 2020 v kategoriji podiplomskih študentov. V projektu so razvili neinvazivno metodo, pri kateri zaznavamo tri RNA biomarkerje v urinu in dva SNP-ja, ki povečata verjetnost razvoja raka prostate, v DNA v slini. Test deluje na podlagi sistema CRISPR-Cas13a v primeru zaznavanja RNA biomarkerjev in sistema CRISPR-Cas12a v primeru zaznavanja SNP-jev. <br /> <br /> ==OPIS PROJEKTA==<br /> <br /> ===PRINCIP DELOVANJA SISTEMA===<br /> Skupina je v projektu uporabila dve metodi, ki temeljita na delovanju proteinov družine Cas. <br /> ====SHERLOCK====<br /> SHERLOCK (Specific High-sensitivity Enzymatic Reporter unLOCKinkg) je metoda, ki s pomočjo encima Cas13a zaznava ssRNA v vzorcu. V Cas13a je vezana sgRNA (single guide RNA), ki zazna komplementarno tarčo v vzorcu. Ko pride do hibridizacije s tarčo, se Cas13a aktivira in cepi tudi netarčno RNA v vzorcu. Na ta način lahko pride do cepitve reporterske RNA.<br /> ====DETECTR====<br /> DETECTR (The DNA Edonuclease Targeted CRISPR Trans Reporter system) je metoda, ki uporablja Cas12a in zaznava tarčno ssDNA v vzorcu, ob prepoznavi tarče pa pridobi nespecifično endonukleazno aktivnost in cepi reportersko ssDNA.<br /> ===INŽENIRING===<br /> ====Kloniranje==== <br /> Za implementacijo teh dveh metod so morali najprej izraziti dva Cas encima ter pridobiti različne sgRNA, ki se vežejo v encima. <br /> Encime so izražali v E. coli. Uporabili so gena cas13a iz bakterije Leptotrichia wadei in cas12a iz Acidaminococcus sp. Z orodjem podjetja IDT so optimizirali rabo kodonov ter nato v konstrukt dodali vse potrebne komponente za izražanje proteinov (IPTG inducibilni promotor, RBS, terminator ter oznaki SUMO in His na N-koncu) ter naročili sintetični gen, ki so mu nato dodali še restrikcijska mesta za EcoRI in SpeI. <br /> Gen cas12a, vstavljen v plazmid, so pridobili od raziskovalne skupine iz Univerze južne Danske. S pomnoževanjem s PCR so genu dodali promotorsko regijo sintetičnega gena cas13a. Oba konstrukta so nato klonirali v vektor pSB1C3 in transformirali kompetentne celice E. coli seva ER2256. <br /> ====Načrtovanje sgRNA====<br /> Nato so dizajnirali sgRNA, ki se veže v Cas proteina in je ključna za prepoznavanje tarče. Za aktivacijo Cas12a je v oddaljenosti največ 21 bp od tarče potreben PAM motiv (TTTV). Poleg tega je za specifično aktivacijo Cas12a pomembno 100 % ujemanje v začetnem delu t. i. prilegajoče regije sgRNA (ang. spacer sequence) medtem ko v bolj oddaljenem območju prilegajoče regije 100 % ujemanje za aktivacijo ni potrebno. Če želimo specifično prepoznati SNP, je torej pomembno, da se ta nahaja v začetni regiji tarče, sicer bi dobili nespecifično aktivacijo in signal, ki ne bi bil odvisen od SNP-ja. Optimalna dolžina prilegajoče regije naj bi bila 21 – 24 nukleotidov. Vse te omejitve je skupina upoštevala pri dizajnu sgRNA za Cas12a. Oblikovali so štiri sgRNA, ki se vežejo na Cas12a in prepoznajo posamezne možne alele (prevladujoč alel in alel, ki poviša možnost za razvoj raka prostate). <br /> Pri oblikovanju sgRNA za Cas13a so upoštevali optimalno dolžino prilegajoče regije 28-31 nukleotidov, prav tako pa pri sgRNA encima Cas13a velja pravilo o 100 % prileganju začetnega dela prilegajoče regije. Cas13a sicer za prepoznavo tarče ne potrebuje PAM motiva. Skupina je oblikovala tri sgRNA za Cas13a, ki se vežejo na RNA biomarkerje v urinu. <br /> ====Pomnoževanje z metodo RPA====<br /> Ker obstaja verjetnost, da ta sistem ne bi zaznal zelo nizkih koncentracij RNA biomarkerjev v vzorcu, bi pred detekcijo RNA biomarkerje še namnožili z uporabo metode pomnoževanja z rekombinazo in polimerazo (ang. recombinase polymerase amplification – RPA). Gre za proces, alternativen PCR, ki poteka izotermalno in je zato njegova izvedba precej bolj enostavna. Za pomnožitev RNA bi potrebovali štiri encime, in sicer rekombinazo, ssDNA vezavne proteine (SSB) reverzno transkriptazo in DNA polimerazo. Da bi pridobili še pomnoženo RNA in ne le cDNA, bi uporabili še T7 polimerazo. <br /> V reakciji reverzna transkriptaza najprej prepiše ssRNA v cDNA. V RNA/DNA hibrid rekombinaza vstavi začetne oligonukleotide, ki so komplementarni RNA tarči. Na smerne začetne oligonukleotide bi dodali še T7 promotor. SSB stabilizirajo odrinjeno ssDNA na mestu vezave oligonukleotida, reverzna transkriptaza pa nato spet prepiše RNA verigo v cDNA. Iz novonastale cDNA z dodanim T7 promotorjem nato nastane RNA transkript, ki je na koncu reakcije prisoten v visoki koncentraciji in ga zlahka zaznamo v vzorcu. V opisu projekta ne omenjajo DNA polimeraze, a vendar bi bila ta potrebna za sintezo druge verige cDNA. Lahko bi uporabili tudi encim, ki lahko deluje kot reverzna transkriptaza in DNA polimeraza. <br /> Podobno reakcijo bi lahko zasnovali tudi za pomnoževanje DNA fragmentov, ki vsebujejo SNP-je, le da bi v tem primeru potrebovali le DNA polimerazo, ne pa tudi reverzne transkriptaze. <br /> ====Inhibicija aktivnosti RNaz====<br /> Ker pri zaznavanju RNA uporabljamo RNaze, ki se aktivirajo ob specifičnem signalu, bi ostale RNaze v urinu lahko motile specifično cepitev reporterja. Zato je ključna inaktivacija RNaz v vzorcu. V projektu bi uporabili metodo cepitve RNaz s proteinazo K. Po obdelavi vzorca s proteinazo K bi slednjo inaktivirali s fenilmetilsulfonil fluoridom (PMSF), da ne bi razgradila encimov Cas. <br /> ====Detekcija cepitve reporterja====<br /> Za detekcijo cepitve reporterja s Cas12a in Cas13a bi v projektu uporabili hitri test z lateralnim tokom (ang. lateral flow strip). Ta metoda za vizualizacijo rezultatov uporablja anti-FAM-protitelesa s pripetimi zlatimi nanodelci v kombinaciji s posebnim reporterjem. Reporter prek ssRNA ali ssDNA verige povezuje biotin in fluorescein amidit (FAM). Cepitev reporterja se vizualizira na traku, na katerem sta prisotni dve liniji – testna in kontrolna. Če pride do cepitve verige reporterja, se na FAM na cepljenem reporterju lahko veže anti-FAM-protitelo z zlatimi nanodelci na način, ki omogoča vezavo na sekundarna protitelesa, imobilizirana na testni liniji na traku za detekcijo. V primeru, da se reporter ne cepi, pa se protitelesa vežejo na FAM na način, ki ne omogoča vezave na sekundarna protitelesa in se zato reporter prek biotina veže na kontrolno linijo na traku za detekcijo.</div>

Luka.gnidovec https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=PROSTATUS:_Diagnostika_raka_prostate&diff=19259 2021-05-17T20:15:41Z

<p>Luka.gnidovec: </p> <hr /> <div>PROSTATUS je iGEM projekt iz leta 2020, ki je osvojil nominacijo v kategoriji Diagnostika med podiplomskimi študenti. Pripravili so ga študenti Univerze južne Danske. <br /> Spletna stran projekta: [https://2020.igem.org/Team:SDU-Denmark]<br /> <br /> ==UVOD==<br /> <br /> Rak prostate je eden najpogostejših rakov, ki se razvije pri enem izmed osmih moških. Število diagnosticiranih primerov se povečuje, k čemur verjetno pripomore povišan screening koncentracije PSA (prostate specific antigen) v krvi med moškimi. Ta test pa je precej nezanesljiv, z 31 % verjetnostjo lažnega pozitivnega rezultata in 42 % verjetnostjo lažnega negativnega rezultata. PSA nivo v krvi se lahko poviša iz številnih drugih razlogov (vnetje urinarnega trakta, ejakulacija, zdravila…). Poleg tega preverjanju krvne slike sledi še neprijeten in invaziven fizičen pregled. Vsekakor ima trenutni postopek screeninga raka prostate veliko potenciala za izboljšave. <br /> PROSTATUS je študentski projekt skupine iz Univerze južne Danske, s katerim so sodelovali na iGEM-u 2020 v kategoriji podiplomskih študentov. V projektu so razvili neinvazivno metodo, pri kateri zaznavamo tri RNA biomarkerje v urinu in dva SNP-ja, ki povečata verjetnost razvoja raka prostate, v DNA v slini. Test deluje na podlagi sistema CRISPR-Cas13a v primeru zaznavanja RNA biomarkerjev in sistema CRISPR-Cas12a v primeru zaznavanja SNP-jev. <br /> <br /> ==OPIS PROJEKTA==<br /> ===Princip delovanja sistema===<br /> Skupina je v projektu uporabila dve metodi, ki temeljita na delovanju proteinov družine Cas. <br /> ====SHERLOCK====<br /> SHERLOCK (Specific High-sensitivity Enzymatic Reporter unLOCKinkg) je metoda, ki s pomočjo encima Cas13a zaznava ssRNA v vzorcu. V Cas13a je vezana sgRNA (single guide RNA), ki zazna komplementarno tarčo v vzorcu. Ko pride do hibridizacije s tarčo, se Cas13a aktivira in cepi tudi netarčno RNA v vzorcu. Na ta način lahko pride do cepitve reporterske RNA.<br /> ====DETECTR====<br /> DETECTR (The DNA Edonuclease Targeted CRISPR Trans Reporter system) je metoda, ki uporablja Cas12a in zaznava tarčno ssDNA v vzorcu, ob prepoznavi tarče pa pridobi nespecifično endonukleazno aktivnost in cepi reportersko ssDNA.<br /> ===Inženiring===<br /> ====Kloniranje==== <br /> Za implementacijo teh dveh metod so morali najprej izraziti dva Cas encima ter pridobiti različne sgRNA, ki se vežejo v encima. <br /> Encime so izražali v E. coli. Uporabili so gena cas13a iz bakterije Leptotrichia wadei in cas12a iz Acidaminococcus sp. Z orodjem podjetja IDT so optimizirali rabo kodonov ter nato v konstrukt dodali vse potrebne komponente za izražanje proteinov (IPTG inducibilni promotor, RBS, terminator ter oznaki SUMO in His na N-koncu) ter naročili sintetični gen, ki so mu nato dodali še restrikcijska mesta za EcoRI in SpeI. <br /> Gen cas12a, vstavljen v plazmid, so pridobili od raziskovalne skupine iz Univerze južne Danske. S pomnoževanjem s PCR so genu dodali promotorsko regijo sintetičnega gena cas13a. Oba konstrukta so nato klonirali v vektor pSB1C3 in transformirali kompetentne celice E. coli seva ER2256. <br /> ====Načrtovanje sgRNA====<br /> Nato so dizajnirali sgRNA, ki se veže v Cas proteina in je ključna za prepoznavanje tarče. Za aktivacijo Cas12a je v oddaljenosti največ 21 bp od tarče potreben PAM motiv (TTTV). Poleg tega je za specifično aktivacijo Cas12a pomembno 100 % ujemanje v začetnem delu t. i. prilegajoče regije sgRNA (ang. spacer sequence) medtem ko v bolj oddaljenem območju prilegajoče regije 100 % ujemanje za aktivacijo ni potrebno. Če želimo specifično prepoznati SNP, je torej pomembno, da se ta nahaja v začetni regiji tarče, sicer bi dobili nespecifično aktivacijo in signal, ki ne bi bil odvisen od SNP-ja. Optimalna dolžina prilegajoče regije naj bi bila 21 – 24 nukleotidov. Vse te omejitve je skupina upoštevala pri dizajnu sgRNA za Cas12a. Oblikovali so štiri sgRNA, ki se vežejo na Cas12a in prepoznajo posamezne možne alele (prevladujoč alel in alel, ki poviša možnost za razvoj raka prostate). <br /> Pri oblikovanju sgRNA za Cas13a so upoštevali optimalno dolžino prilegajoče regije 28-31 nukleotidov, prav tako pa pri sgRNA encima Cas13a velja pravilo o 100 % prileganju začetnega dela prilegajoče regije. Cas13a sicer za prepoznavo tarče ne potrebuje PAM motiva. Skupina je oblikovala tri sgRNA za Cas13a, ki se vežejo na RNA biomarkerje v urinu. <br /> ====Pomnoževanje z metodo RPA====<br /> Ker obstaja verjetnost, da ta sistem ne bi zaznal zelo nizkih koncentracij RNA biomarkerjev v vzorcu, bi pred detekcijo RNA biomarkerje še namnožili z uporabo metode pomnoževanja z rekombinazo in polimerazo (ang. recombinase polymerase amplification – RPA). Gre za proces, alternativen PCR, ki poteka izotermalno in je zato njegova izvedba precej bolj enostavna. Za pomnožitev RNA bi potrebovali štiri encime, in sicer rekombinazo, ssDNA vezavne proteine (SSB) reverzno transkriptazo in DNA polimerazo. Da bi pridobili še pomnoženo RNA in ne le cDNA, bi uporabili še T7 polimerazo. <br /> V reakciji reverzna transkriptaza najprej prepiše ssRNA v cDNA. V RNA/DNA hibrid rekombinaza vstavi začetne oligonukleotide, ki so komplementarni RNA tarči. Na smerne začetne oligonukleotide bi dodali še T7 promotor. SSB stabilizirajo odrinjeno ssDNA na mestu vezave oligonukleotida, reverzna transkriptaza pa nato spet prepiše RNA verigo v cDNA. Iz novonastale cDNA z dodanim T7 promotorjem nato nastane RNA transkript, ki je na koncu reakcije prisoten v visoki koncentraciji in ga zlahka zaznamo v vzorcu. V opisu projekta ne omenjajo DNA polimeraze, a vendar bi bila ta potrebna za sintezo druge verige cDNA. Lahko bi uporabili tudi encim, ki lahko deluje kot reverzna transkriptaza in DNA polimeraza. <br /> Podobno reakcijo bi lahko zasnovali tudi za pomnoževanje DNA fragmentov, ki vsebujejo SNP-je, le da bi v tem primeru potrebovali le DNA polimerazo, ne pa tudi reverzne transkriptaze. <br /> ====Inhibicija aktivnosti RNaz====<br /> Ker pri zaznavanju RNA uporabljamo RNaze, ki se aktivirajo ob specifičnem signalu, bi ostale RNaze v urinu lahko motile specifično cepitev reporterja. Zato je ključna inaktivacija RNaz v vzorcu. V projektu bi uporabili metodo cepitve RNaz s proteinazo K. Po obdelavi vzorca s proteinazo K bi slednjo inaktivirali s fenilmetilsulfonil fluoridom (PMSF), da ne bi razgradila encimov Cas. <br /> ====Detekcija cepitve reporterja====<br /> Za detekcijo cepitve reporterja s Cas12a in Cas13a bi v projektu uporabili hitri test z lateralnim tokom (ang. lateral flow strip). Ta metoda za vizualizacijo rezultatov uporablja anti-FAM-protitelesa s pripetimi zlatimi nanodelci v kombinaciji s posebnim reporterjem. Reporter prek ssRNA ali ssDNA verige povezuje biotin in fluorescein amidit (FAM). Cepitev reporterja se vizualizira na traku, na katerem sta prisotni dve liniji – testna in kontrolna. Če pride do cepitve verige reporterja, se na FAM na cepljenem reporterju lahko veže anti-FAM-protitelo z zlatimi nanodelci na način, ki omogoča vezavo na sekundarna protitelesa, imobilizirana na testni liniji na traku za detekcijo. V primeru, da se reporter ne cepi, pa se protitelesa vežejo na FAM na način, ki ne omogoča vezave na sekundarna protitelesa in se zato reporter prek biotina veže na kontrolno linijo na traku za detekcijo.</div>

Luka.gnidovec https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=PROSTATUS:_Diagnostika_raka_prostate&diff=19258 2021-05-17T20:14:16Z

<p>Luka.gnidovec: </p> <hr /> <div>PROSTATUS je iGEM projekt iz leta 2020, ki je osvojil nominacijo v kategoriji Diagnostika med podiplomskimi študenti. Pripravili so ga študenti Univerze južne Danske. <br /> Spletna stran projekta: [https://2020.igem.org/Team:SDU-Denmark]<br /> <br /> ==UVOD==<br /> <br /> Rak prostate je eden najpogostejših rakov, ki se razvije pri enem izmed osmih moških. Število diagnosticiranih primerov se povečuje, k čemur verjetno pripomore povišan screening koncentracije PSA (prostate specific antigen) v krvi med moškimi. Ta test pa je precej nezanesljiv, z 31 % verjetnostjo lažnega pozitivnega rezultata in 42 % verjetnostjo lažnega negativnega rezultata. PSA nivo v krvi se lahko poviša iz številnih drugih razlogov (vnetje urinarnega trakta, ejakulacija, zdravila…). Poleg tega preverjanju krvne slike sledi še neprijeten in invaziven fizičen pregled. Vsekakor ima trenutni postopek screeninga raka prostate veliko potenciala za izboljšave. <br /> PROSTATUS je študentski projekt skupine iz Univerze južne Danske, s katerim so sodelovali na iGEM-u 2020 v kategoriji podiplomskih študentov. V projektu so razvili neinvazivno metodo, pri kateri zaznavamo tri RNA biomarkerje v urinu in dva SNP-ja, ki povečata verjetnost razvoja raka prostate, v DNA v slini. Test deluje na podlagi sistema CRISPR-Cas13a v primeru zaznavanja RNA biomarkerjev in sistema CRISPR-Cas12a v primeru zaznavanja SNP-jev. <br /> <br /> ==OPIS PROJEKTA==<br /> Skupina je v projektu uporabila dve metodi, ki temeljita na delovanju proteinov družine Cas. <br /> ===SHERLOCK===<br /> SHERLOCK (Specific High-sensitivity Enzymatic Reporter unLOCKinkg) je metoda, ki s pomočjo encima Cas13a zaznava ssRNA v vzorcu. V Cas13a je vezana sgRNA (single guide RNA), ki zazna komplementarno tarčo v vzorcu. Ko pride do hibridizacije s tarčo, se Cas13a aktivira in cepi tudi netarčno RNA v vzorcu. Na ta način lahko pride do cepitve reporterske RNA.<br /> ===DETECTR===<br /> DETECTR (The DNA Edonuclease Targeted CRISPR Trans Reporter system) je metoda, ki uporablja Cas12a in zaznava tarčno ssDNA v vzorcu, ob prepoznavi tarče pa pridobi nespecifično endonukleazno aktivnost in cepi reportersko ssDNA.<br /> ===Inženiring===<br /> ====Kloniranje==== <br /> Za implementacijo teh dveh metod so morali najprej izraziti dva Cas encima ter pridobiti različne sgRNA, ki se vežejo v encima. <br /> Encime so izražali v E. coli. Uporabili so gena cas13a iz bakterije Leptotrichia wadei in cas12a iz Acidaminococcus sp. Z orodjem podjetja IDT so optimizirali rabo kodonov ter nato v konstrukt dodali vse potrebne komponente za izražanje proteinov (IPTG inducibilni promotor, RBS, terminator ter oznaki SUMO in His na N-koncu) ter naročili sintetični gen, ki so mu nato dodali še restrikcijska mesta za EcoRI in SpeI. <br /> Gen cas12a, vstavljen v plazmid, so pridobili od raziskovalne skupine iz Univerze južne Danske. S pomnoževanjem s PCR so genu dodali promotorsko regijo sintetičnega gena cas13a. Oba konstrukta so nato klonirali v vektor pSB1C3 in transformirali kompetentne celice E. coli seva ER2256. <br /> ====Načrtovanje sgRNA====<br /> Nato so dizajnirali sgRNA, ki se veže v Cas proteina in je ključna za prepoznavanje tarče. Za aktivacijo Cas12a je v oddaljenosti največ 21 bp od tarče potreben PAM motiv (TTTV). Poleg tega je za specifično aktivacijo Cas12a pomembno 100 % ujemanje v začetnem delu t. i. prilegajoče regije sgRNA (ang. spacer sequence) medtem ko v bolj oddaljenem območju prilegajoče regije 100 % ujemanje za aktivacijo ni potrebno. Če želimo specifično prepoznati SNP, je torej pomembno, da se ta nahaja v začetni regiji tarče, sicer bi dobili nespecifično aktivacijo in signal, ki ne bi bil odvisen od SNP-ja. Optimalna dolžina prilegajoče regije naj bi bila 21 – 24 nukleotidov. Vse te omejitve je skupina upoštevala pri dizajnu sgRNA za Cas12a. Oblikovali so štiri sgRNA, ki se vežejo na Cas12a in prepoznajo posamezne možne alele (prevladujoč alel in alel, ki poviša možnost za razvoj raka prostate). <br /> Pri oblikovanju sgRNA za Cas13a so upoštevali optimalno dolžino prilegajoče regije 28-31 nukleotidov, prav tako pa pri sgRNA encima Cas13a velja pravilo o 100 % prileganju začetnega dela prilegajoče regije. Cas13a sicer za prepoznavo tarče ne potrebuje PAM motiva. Skupina je oblikovala tri sgRNA za Cas13a, ki se vežejo na RNA biomarkerje v urinu. <br /> ====Pomnoževanje z metodo RPA====<br /> Ker obstaja verjetnost, da ta sistem ne bi zaznal zelo nizkih koncentracij RNA biomarkerjev v vzorcu, bi pred detekcijo RNA biomarkerje še namnožili z uporabo metode pomnoževanja z rekombinazo in polimerazo (ang. recombinase polymerase amplification – RPA). Gre za proces, alternativen PCR, ki poteka izotermalno in je zato njegova izvedba precej bolj enostavna. Za pomnožitev RNA bi potrebovali štiri encime, in sicer rekombinazo, ssDNA vezavne proteine (SSB) reverzno transkriptazo in DNA polimerazo. Da bi pridobili še pomnoženo RNA in ne le cDNA, bi uporabili še T7 polimerazo. <br /> V reakciji reverzna transkriptaza najprej prepiše ssRNA v cDNA. V RNA/DNA hibrid rekombinaza vstavi začetne oligonukleotide, ki so komplementarni RNA tarči. Na smerne začetne oligonukleotide bi dodali še T7 promotor. SSB stabilizirajo odrinjeno ssDNA na mestu vezave oligonukleotida, reverzna transkriptaza pa nato spet prepiše RNA verigo v cDNA. Iz novonastale cDNA z dodanim T7 promotorjem nato nastane RNA transkript, ki je na koncu reakcije prisoten v visoki koncentraciji in ga zlahka zaznamo v vzorcu. V opisu projekta ne omenjajo DNA polimeraze, a vendar bi bila ta potrebna za sintezo druge verige cDNA. Lahko bi uporabili tudi encim, ki lahko deluje kot reverzna transkriptaza in DNA polimeraza. <br /> Podobno reakcijo bi lahko zasnovali tudi za pomnoževanje DNA fragmentov, ki vsebujejo SNP-je, le da bi v tem primeru potrebovali le DNA polimerazo, ne pa tudi reverzne transkriptaze. <br /> ====Inhibicija aktivnosti RNaz====<br /> Ker pri zaznavanju RNA uporabljamo RNaze, ki se aktivirajo ob specifičnem signalu, bi ostale RNaze v urinu lahko motile specifično cepitev reporterja. Zato je ključna inaktivacija RNaz v vzorcu. V projektu bi uporabili metodo cepitve RNaz s proteinazo K. Po obdelavi vzorca s proteinazo K bi slednjo inaktivirali s fenilmetilsulfonil fluoridom (PMSF), da ne bi razgradila encimov Cas. <br /> ====Detekcija cepitve reporterja====<br /> Za detekcijo cepitve reporterja s Cas12a in Cas13a bi v projektu uporabili hitri test z lateralnim tokom (ang. lateral flow strip). Ta metoda za vizualizacijo rezultatov uporablja anti-FAM-protitelesa s pripetimi zlatimi nanodelci v kombinaciji s posebnim reporterjem. Reporter prek ssRNA ali ssDNA verige povezuje biotin in fluorescein amidit (FAM). Cepitev reporterja se vizualizira na traku, na katerem sta prisotni dve liniji – testna in kontrolna. Če pride do cepitve verige reporterja, se na FAM na cepljenem reporterju lahko veže anti-FAM-protitelo z zlatimi nanodelci na način, ki omogoča vezavo na sekundarna protitelesa, imobilizirana na testni liniji na traku za detekcijo. V primeru, da se reporter ne cepi, pa se protitelesa vežejo na FAM na način, ki ne omogoča vezave na sekundarna protitelesa in se zato reporter prek biotina veže na kontrolno linijo na traku za detekcijo.</div>

Luka.gnidovec https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=PROSTATUS:_Diagnostika_raka_prostate&diff=19257 2021-05-17T20:10:31Z

<p>Luka.gnidovec: </p> <hr /> <div>PROSTATUS je iGEM projekt iz leta 2020, ki je osvojil nominacijo v kategoriji Diagnostika med podiplomskimi študenti. Pripravili so ga študenti Univerze južne Danske. <br /> Spletna stran projekta: [https://2020.igem.org/Team:SDU-Denmark]<br /> <br /> ==UVOD==<br /> <br /> Rak prostate je eden najpogostejših rakov, ki se razvije pri enem izmed osmih moških. Število diagnosticiranih primerov se povečuje, k čemur verjetno pripomore povišan screening koncentracije PSA (prostate specific antigen) v krvi med moškimi. Ta test pa je precej nezanesljiv, z 31 % verjetnostjo lažnega pozitivnega rezultata in 42 % verjetnostjo lažnega negativnega rezultata. PSA nivo v krvi se lahko poviša iz številnih drugih razlogov (vnetje urinarnega trakta, ejakulacija, zdravila…). Poleg tega preverjanju krvne slike sledi še neprijeten in invaziven fizičen pregled. Vsekakor ima trenutni postopek screeninga raka prostate veliko potenciala za izboljšave. <br /> PROSTATUS je študentski projekt skupine iz Univerze južne Danske, s katerim so sodelovali na iGEM-u 2020 v kategoriji podiplomskih študentov. V projektu so razvili neinvazivno metodo, pri kateri zaznavamo tri RNA biomarkerje v urinu in dva SNP-ja, ki povečata verjetnost razvoja raka prostate, v DNA v slini. Test deluje na podlagi sistema CRISPR-Cas13a v primeru zaznavanja RNA biomarkerjev in sistema CRISPR-Cas12a v primeru zaznavanja SNP-jev. <br /> <br /> ==NAČRTOVANJE PROJEKTA==<br /> Skupina je v projektu uporabila dve metodi, ki temeljita na delovanju proteinov družine Cas. <br /> ===SHERLOCK===<br /> SHERLOCK (Specific High-sensitivity Enzymatic Reporter unLOCKinkg) je metoda, ki s pomočjo encima Cas13a zaznava ssRNA v vzorcu. V Cas13a je vezana sgRNA (single guide RNA), ki zazna komplementarno tarčo v vzorcu. Ko pride do hibridizacije s tarčo, se Cas13a aktivira in cepi tudi netarčno RNA v vzorcu. Na ta način lahko pride do cepitve reporterske RNA.<br /> ===DETECTR===<br /> DETECTR (The DNA Edonuclease Targeted CRISPR Trans Reporter system) je metoda, ki uporablja Cas12a in zaznava tarčno ssDNA v vzorcu, ob prepoznavi tarče pa pridobi nespecifično endonukleazno aktivnost in cepi reportersko ssDNA.</div>

Luka.gnidovec https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=PROSTATUS:_Diagnostika_raka_prostate&diff=19256 2021-05-17T20:10:13Z

<p>Luka.gnidovec: </p> <hr /> <div>PROSTATUS je iGEM projekt iz leta 2020, ki je osvojil nominacijo v kategoriji Diagnostika med podiplomskimi študenti. Pripravili so ga študenti Univerze južne Danske. <br /> Spletna stran projekta: [https://2020.igem.org/Team:SDU-Denmark]<br /> <br /> ==UVOD==<br /> <br /> Rak prostate je eden najpogostejših rakov, ki se razvije pri enem izmed osmih moških. Število diagnosticiranih primerov se povečuje, k čemur verjetno pripomore povišan screening koncentracije PSA (prostate specific antigen) v krvi med moškimi. Ta test pa je precej nezanesljiv, z 31 % verjetnostjo lažnega pozitivnega rezultata in 42 % verjetnostjo lažnega negativnega rezultata. PSA nivo v krvi se lahko poviša iz številnih drugih razlogov (vnetje urinarnega trakta, ejakulacija, zdravila…). Poleg tega preverjanju krvne slike sledi še neprijeten in invaziven fizičen pregled. Vsekakor ima trenutni postopek screeninga raka prostate veliko potenciala za izboljšave. <br /> PROSTATUS je študentski projekt skupine iz Univerze južne Danske, s katerim so sodelovali na iGEM-u 2020 v kategoriji podiplomskih študentov. V projektu so razvili neinvazivno metodo, pri kateri zaznavamo tri RNA biomarkerje v urinu in dva SNP-ja, ki povečata verjetnost razvoja raka prostate, v DNA v slini. Test deluje na podlagi sistema CRISPR-Cas13a v primeru zaznavanja RNA biomarkerjev in sistema CRISPR-Cas12a v primeru zaznavanja SNP-jev. <br /> <br /> <br /> ==NAČRTOVANJE PROJEKTA==<br /> <br /> Skupina je v projektu uporabila dve metodi, ki temeljita na delovanju proteinov družine Cas. <br /> <br /> ===SHERLOCK===<br /> <br /> SHERLOCK (Specific High-sensitivity Enzymatic Reporter unLOCKinkg) je metoda, ki s pomočjo encima Cas13a zaznava ssRNA v vzorcu. V Cas13a je vezana sgRNA (single guide RNA), ki zazna komplementarno tarčo v vzorcu. Ko pride do hibridizacije s tarčo, se Cas13a aktivira in cepi tudi netarčno RNA v vzorcu. Na ta način lahko pride do cepitve reporterske RNA.<br /> ===DETECTR===<br /> DETECTR (The DNA Edonuclease Targeted CRISPR Trans Reporter system) je metoda, ki uporablja Cas12a in zaznava tarčno ssDNA v vzorcu, ob prepoznavi tarče pa pridobi nespecifično endonukleazno aktivnost in cepi reportersko ssDNA.</div>

Luka.gnidovec https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=PROSTATUS:_Diagnostika_raka_prostate&diff=19255 2021-05-17T20:08:59Z

<p>Luka.gnidovec: New page: PROSTATUS je iGEM projekt iz leta 2020, ki je osvojil nominacijo v kategoriji Diagnostika med podiplomskimi študenti. Pripravili so ga študenti Univerze južne Danske. Spletna stran pro...</p> <hr /> <div>PROSTATUS je iGEM projekt iz leta 2020, ki je osvojil nominacijo v kategoriji Diagnostika med podiplomskimi študenti. Pripravili so ga študenti Univerze južne Danske. <br /> Spletna stran projekta: [https://2020.igem.org/Team:SDU-Denmark]<br /> <br /> ==Uvod==<br /> <br /> Rak prostate je eden najpogostejših rakov, ki se razvije pri enem izmed osmih moških. Število diagnosticiranih primerov se povečuje, k čemur verjetno pripomore povišan screening koncentracije PSA (prostate specific antigen) v krvi med moškimi. Ta test pa je precej nezanesljiv, z 31 % verjetnostjo lažnega pozitivnega rezultata in 42 % verjetnostjo lažnega negativnega rezultata. PSA nivo v krvi se lahko poviša iz številnih drugih razlogov (vnetje urinarnega trakta, ejakulacija, zdravila…). Poleg tega preverjanju krvne slike sledi še neprijeten in invaziven fizičen pregled. Vsekakor ima trenutni postopek screeninga raka prostate veliko potenciala za izboljšave. <br /> PROSTATUS je študentski projekt skupine iz Univerze južne Danske, s katerim so sodelovali na iGEM-u 2020 v kategoriji podiplomskih študentov. V projektu so razvili neinvazivno metodo, pri kateri zaznavamo tri RNA biomarkerje v urinu in dva SNP-ja, ki povečata verjetnost razvoja raka prostate, v DNA v slini. Test deluje na podlagi sistema CRISPR-Cas13a v primeru zaznavanja RNA biomarkerjev in sistema CRISPR-Cas12a v primeru zaznavanja SNP-jev. <br /> <br /> <br /> ==Načrtovanje projekta==<br /> <br /> Skupina je v projektu uporabila dve metodi, ki temeljita na delovanju proteinov družine Cas. <br /> <br /> ===SHERLOCK===<br /> <br /> SHERLOCK (Specific High-sensitivity Enzymatic Reporter unLOCKinkg) je metoda, ki s pomočjo encima Cas13a zaznava ssRNA v vzorcu. V Cas13a je vezana sgRNA (single guide RNA), ki zazna komplementarno tarčo v vzorcu. Ko pride do hibridizacije s tarčo, se Cas13a aktivira in cepi tudi netarčno RNA v vzorcu. Na ta način lahko pride do cepitve reporterske RNA.<br /> <br /> ===DETECTR===<br /> <br /> DETECTR (The DNA Edonuclease Targeted CRISPR Trans Reporter system) je metoda, ki uporablja Cas12a in zaznava tarčno ssDNA v vzorcu, ob prepoznavi tarče pa pridobi nespecifično endonukleazno aktivnost in cepi reportersko ssDNA.</div>

Luka.gnidovec https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Seminarji_SB_2020/21&diff=19254 2021-05-17T20:04:20Z

<p>Luka.gnidovec: </p> <hr /> <div>[http://www.example.com link title]V študijskem letu 2020/21 študentje 1. letnika predstavljajo naslednje teme: <br /> <br /> RAZISKOVALNI ČLANKI<br /> <br /> (Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) &lt;br&gt;<br /> <br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Proizvodnja_1,3-propandiola_iz_različnih_ogljikovodikov_po_nenaravni_poti_preko_3-hidroksipropanojske_kisline Proizvodnja 1,3-propandiola iz različnih ogljikovodikov po nenaravni poti preko 3-hidroksipropanojske kisline] (Liza Ulčakar) &lt;br&gt;<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Doseganje_asimetri%C4%8Dnosti_in_asimetri%C4%8Dne_delitve_pri_E._coli Doseganje asimetričnosti in asimetrične delitve pri E. coli] (Aljaž Bratina) &lt;br&gt;<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Zmanj%C5%A1ana_procesivnost_ribosomov_v_sistemu_PURE Zmanjšana procesivnost ribosomov v sistemu PURE] (Tina Kolenc Milavec) &lt;br&gt;<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Na%C4%8Drtovana_pot_zvijanja_proteinskih_origamijev Načrtovana pot zvijanja proteinskih origamijev] (Anamarija Agnič) &lt;br&gt;<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/U%C4%8Dinkovita_svetlobno_inducibilna_Dre_rekombinaza_za_%C4%8Dasovno_in_prostorsko_celi%C4%8Dno_specifi%C4%8Dno_urejanje_genoma_v_mi%C5%A1jih_modelih#VIRI Učinkovita svetlobno inducibilna Dre rekombinaza za časovno in prostorsko celično specifično urejanje genoma v mišjih modelih] (Nika Mikulič Vernik) &lt;br&gt;<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Vzpostavitev_termometra_tRNA_za_dolo%C4%8Danje_temperature_optimalne_rasti_mikroorganizmov Vzpostavitev termometra tRNA za določanje temperature optimalne rasti mikroorganizmov] (Urša Štrancar) &lt;br&gt;<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Racionalna_zasnova_minimalnih_sinteti%C4%8Dnih_promotorjev_za_rastline#Construction_of_plasmids Racionalna zasnova minimalnih sintetičnih promotorjev za rastline] (Almina Tahirović) &lt;br&gt;<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Reverzibilna_toplotna_regulacija_za_bifunkcionalno_dinamično_uravnavanje_izražanja_genov_v_E._coli Reverzibilna toplotna regulacija za bifunkcionalno dinamično uravnavanje izražanja genov v E. coli] (Urška Fajdiga) &lt;br&gt;<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sinteti%C4%8Dna_optogenetska_naprava_na_osnovi_BRET_za_pulzirajo%C4%8Do_ekspresijo_transgena%2C_ki_omogo%C4%8Da_glukozno_homeostazo_pri_mi%C5%A1ih Sintetična optogenetska naprava na osnovi BRET za pulzirajočo ekspresijo transgena, ki omogoča glukozno homeostazo pri miših] (Paula Horvat) &lt;br&gt;<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Hkratna_karakterizacija_več_različnih_racionalno_načrtovanih_promotorskih_arhitektur Vpogled v kombinatorno logiko z IPTG induciranih sistemov] (Urška Zagorc) &lt;br&gt;<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Ponovno_določanje_specifičnosti_izven_citoplazme_aktivnih_sigma_faktorjev Ponovno določanje specifičnosti izven citoplazme aktivnih sigma faktorjev] (Eva Keber) &lt;br&gt;<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Hierarhi%C4%8Dno_sestavljanje_asimetri%C4%8Dnih_ikozaedri%C4%8Dnih_virusnih_kapsid Hierarhično sestavljanje asimetričnih ikozaedričnih virusnih kapsid] (Urška Pečarič Strnad) &lt;br&gt;<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Avtomatizirano_oblikovanje_sintezne_mikrobne_zdru%C5%BEbe Avtomatizirano oblikovanje sintezne mikrobne združbe] (Urša Lovše) &lt;br&gt;<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Regulacija_stopnje_izra%C5%BEanja_z_L-arabinozo_v_ekspresijskem_sistemu_T7_z_razklopljeno_rastjo Regulacija stopnje izražanja z L-arabinozo v ekspresijskem sistemu T7 z razklopljeno rastjo] (Maruša Mišmaš) &lt;br&gt;<br /> # [[Oblikovanje sintetičnega faga iz P. aeruginosa z reduciranim genomom|Oblikovanje sintetičnega faga iz ''P. aeruginosa'' z reduciranim genomom]] (Martina Lokar) &lt;br&gt;<br /> #[[Uravnavanje izražanja genov s pomočjo nanoteles in njihov vpliv na epigenetski spomin]] (Sara Laznik) &lt;br&gt;<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Priprava_humanih_CAR_imunskih_celic_z_napredno_logiko_in_porazdeljenim_računalništvom Priprava humanih CAR imunskih celic z napredno logiko in porazdeljenim računalništvom] (Tjaša Mlakar) &lt;br&gt;<br /> # [[Utišanje genov na osnovi majhnih protismernih DNA omogoča manipulacijo in replikacijo genoma bakteriofagov v brezceličnem sistemu]] (Anže Karlek) &lt;br&gt;<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Translacijski_nadzor_izražanja_encima_odstranjevalca_preko_s_toksinom_induciranega_miRNA_stikala Translacijski nadzor izražanja encima odstranjevalca preko s toksinom induciranega miRNA stikala] (Ernestina Lavrih) &lt;br&gt;<br /> # [[Sintetični promotorji za indukcijo imunskih celic v tumorskem mikrookolju]] (Saša Slabe) &lt;br&gt;<br /> <br /> NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI <br /> <br /> (Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.) &lt;br&gt;<br /> <br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/RESHAPE_-_spreminjanje_morfologije_nitastih_gliv RESHAPE - spreminjanje morfologije nitastih gliv] (Špela Supej) &lt;br&gt;<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/The_Chlamy_Cleaner:_razgradnja_pesticida_z_zeleno_algo The Chlamy Cleaner: razgradnja pesticida z zeleno algo] (Doroteja Armič) &lt;br&gt;<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/TheraPUFA:_nazalni_probiotik_proti_okužbam_in_vnetjem TheraPUFA- nazalni probiotik proti okužbam in vnetjem] (Barbara Slapnik) &lt;br&gt;<br /> # [[S-POP: Modularni biosenzor za zaznavanje obstojnih organskih onesnaževal v okoljskih vodah]] (Tadej Medved) &lt;br&gt;<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/MARS-magnetni_sistem_za_recikliranje_ATP MARS-magnetni sistem za recikliranje ATP] (David Miškić) &lt;br&gt;<br /> # [[B.O.T.: Bakterijska oscilacijska terapija za zdravljenje kolorektalnega raka]] (Neža Pavko) &lt;br&gt;<br /> # [[Rapidemic razvoj novega kompleta za hitro diagnostiko na mestu oskrbe]] (Mirsad Mešić) &lt;br&gt;<br /> # [[iGEMINI: Kvasovke kot prehransko dopolnilo v vesolju]] (Klementina Polanec) &lt;br&gt;<br /> # [[Antea-Glyphosate: Detekcija in razgradnja glifosata]] (Jernej Imperl) &lt;br&gt;<br /> # [[NANOFLEX: Standardiziran, prilagodljiv in priročen celični biosenzor]] (Martin Špendl) &lt;br&gt;<br /> # [[FlavoFlow: ribogojniška zaščita pred okužbami rib]] (Mateja Žvipelj) &lt;br&gt;<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/samoreplicirajoč_COVID-19_test Samoreplicirajoč COVID-19-test] (Irma Zeljković) &lt;br&gt;<br /> # [[Renervate: Polimer za zdravljenje poškodb hrbtenjače]] (Sabina Sladič Oblak) &lt;br&gt;<br /> # [[PROSTATUS: Diagnostika raka prostate]] (Luka Gnidovec)<br /> &lt;br&gt;<br /> ----<br /> <br /> Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Povzetek je treba objaviti dva dni pred predstavitvijo do polnoči (za seminarje v sredo torej v ponedeljek). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo razprava, ki praviloma ne bo daljša od 5 minut.</div>

Luka.gnidovec https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Seminarji_SB_2020/21&diff=19253 2021-05-17T20:03:37Z

<p>Luka.gnidovec: </p> <hr /> <div>[http://www.example.com link title]V študijskem letu 2020/21 študentje 1. letnika predstavljajo naslednje teme: <br /> <br /> RAZISKOVALNI ČLANKI<br /> <br /> (Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) &lt;br&gt;<br /> <br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Proizvodnja_1,3-propandiola_iz_različnih_ogljikovodikov_po_nenaravni_poti_preko_3-hidroksipropanojske_kisline Proizvodnja 1,3-propandiola iz različnih ogljikovodikov po nenaravni poti preko 3-hidroksipropanojske kisline] (Liza Ulčakar) &lt;br&gt;<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Doseganje_asimetri%C4%8Dnosti_in_asimetri%C4%8Dne_delitve_pri_E._coli Doseganje asimetričnosti in asimetrične delitve pri E. coli] (Aljaž Bratina) &lt;br&gt;<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Zmanj%C5%A1ana_procesivnost_ribosomov_v_sistemu_PURE Zmanjšana procesivnost ribosomov v sistemu PURE] (Tina Kolenc Milavec) &lt;br&gt;<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Na%C4%8Drtovana_pot_zvijanja_proteinskih_origamijev Načrtovana pot zvijanja proteinskih origamijev] (Anamarija Agnič) &lt;br&gt;<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/U%C4%8Dinkovita_svetlobno_inducibilna_Dre_rekombinaza_za_%C4%8Dasovno_in_prostorsko_celi%C4%8Dno_specifi%C4%8Dno_urejanje_genoma_v_mi%C5%A1jih_modelih#VIRI Učinkovita svetlobno inducibilna Dre rekombinaza za časovno in prostorsko celično specifično urejanje genoma v mišjih modelih] (Nika Mikulič Vernik) &lt;br&gt;<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Vzpostavitev_termometra_tRNA_za_dolo%C4%8Danje_temperature_optimalne_rasti_mikroorganizmov Vzpostavitev termometra tRNA za določanje temperature optimalne rasti mikroorganizmov] (Urša Štrancar) &lt;br&gt;<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Racionalna_zasnova_minimalnih_sinteti%C4%8Dnih_promotorjev_za_rastline#Construction_of_plasmids Racionalna zasnova minimalnih sintetičnih promotorjev za rastline] (Almina Tahirović) &lt;br&gt;<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Reverzibilna_toplotna_regulacija_za_bifunkcionalno_dinamično_uravnavanje_izražanja_genov_v_E._coli Reverzibilna toplotna regulacija za bifunkcionalno dinamično uravnavanje izražanja genov v E. coli] (Urška Fajdiga) &lt;br&gt;<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sinteti%C4%8Dna_optogenetska_naprava_na_osnovi_BRET_za_pulzirajo%C4%8Do_ekspresijo_transgena%2C_ki_omogo%C4%8Da_glukozno_homeostazo_pri_mi%C5%A1ih Sintetična optogenetska naprava na osnovi BRET za pulzirajočo ekspresijo transgena, ki omogoča glukozno homeostazo pri miših] (Paula Horvat) &lt;br&gt;<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Hkratna_karakterizacija_več_različnih_racionalno_načrtovanih_promotorskih_arhitektur Vpogled v kombinatorno logiko z IPTG induciranih sistemov] (Urška Zagorc) &lt;br&gt;<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Ponovno_določanje_specifičnosti_izven_citoplazme_aktivnih_sigma_faktorjev Ponovno določanje specifičnosti izven citoplazme aktivnih sigma faktorjev] (Eva Keber) &lt;br&gt;<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Hierarhi%C4%8Dno_sestavljanje_asimetri%C4%8Dnih_ikozaedri%C4%8Dnih_virusnih_kapsid Hierarhično sestavljanje asimetričnih ikozaedričnih virusnih kapsid] (Urška Pečarič Strnad) &lt;br&gt;<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Avtomatizirano_oblikovanje_sintezne_mikrobne_zdru%C5%BEbe Avtomatizirano oblikovanje sintezne mikrobne združbe] (Urša Lovše) &lt;br&gt;<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Regulacija_stopnje_izra%C5%BEanja_z_L-arabinozo_v_ekspresijskem_sistemu_T7_z_razklopljeno_rastjo Regulacija stopnje izražanja z L-arabinozo v ekspresijskem sistemu T7 z razklopljeno rastjo] (Maruša Mišmaš) &lt;br&gt;<br /> # [[Oblikovanje sintetičnega faga iz P. aeruginosa z reduciranim genomom|Oblikovanje sintetičnega faga iz ''P. aeruginosa'' z reduciranim genomom]] (Martina Lokar) &lt;br&gt;<br /> #[[Uravnavanje izražanja genov s pomočjo nanoteles in njihov vpliv na epigenetski spomin]] (Sara Laznik) &lt;br&gt;<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Priprava_humanih_CAR_imunskih_celic_z_napredno_logiko_in_porazdeljenim_računalništvom Priprava humanih CAR imunskih celic z napredno logiko in porazdeljenim računalništvom] (Tjaša Mlakar) &lt;br&gt;<br /> # [[Utišanje genov na osnovi majhnih protismernih DNA omogoča manipulacijo in replikacijo genoma bakteriofagov v brezceličnem sistemu]] (Anže Karlek) &lt;br&gt;<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Translacijski_nadzor_izražanja_encima_odstranjevalca_preko_s_toksinom_induciranega_miRNA_stikala Translacijski nadzor izražanja encima odstranjevalca preko s toksinom induciranega miRNA stikala] (Ernestina Lavrih) &lt;br&gt;<br /> # [[Sintetični promotorji za indukcijo imunskih celic v tumorskem mikrookolju]] (Saša Slabe) &lt;br&gt;<br /> <br /> NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI <br /> <br /> (Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.) &lt;br&gt;<br /> <br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/RESHAPE_-_spreminjanje_morfologije_nitastih_gliv RESHAPE - spreminjanje morfologije nitastih gliv] (Špela Supej) &lt;br&gt;<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/The_Chlamy_Cleaner:_razgradnja_pesticida_z_zeleno_algo The Chlamy Cleaner: razgradnja pesticida z zeleno algo] (Doroteja Armič) &lt;br&gt;<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/TheraPUFA:_nazalni_probiotik_proti_okužbam_in_vnetjem TheraPUFA- nazalni probiotik proti okužbam in vnetjem] (Barbara Slapnik) &lt;br&gt;<br /> # [[S-POP: Modularni biosenzor za zaznavanje obstojnih organskih onesnaževal v okoljskih vodah]] (Tadej Medved) &lt;br&gt;<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/MARS-magnetni_sistem_za_recikliranje_ATP MARS-magnetni sistem za recikliranje ATP] (David Miškić) &lt;br&gt;<br /> # [[B.O.T.: Bakterijska oscilacijska terapija za zdravljenje kolorektalnega raka]] (Neža Pavko) &lt;br&gt;<br /> # [[Rapidemic razvoj novega kompleta za hitro diagnostiko na mestu oskrbe]] (Mirsad Mešić) &lt;br&gt;<br /> # [[iGEMINI: Kvasovke kot prehransko dopolnilo v vesolju]] (Klementina Polanec) &lt;br&gt;<br /> # [[Antea-Glyphosate: Detekcija in razgradnja glifosata]] (Jernej Imperl) &lt;br&gt;<br /> # [[NANOFLEX: Standardiziran, prilagodljiv in priročen celični biosenzor]] (Martin Špendl) &lt;br&gt;<br /> # [[FlavoFlow: ribogojniška zaščita pred okužbami rib]] (Mateja Žvipelj) &lt;br&gt;<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/samoreplicirajoč_COVID-19_test Samoreplicirajoč COVID-19-test] (Irma Zeljković) &lt;br&gt;<br /> # [[Renervate: Polimer za zdravljenje poškodb hrbtenjače]] (Sabina Sladič Oblak) &lt;br&gt;<br /> # [[PROTEUS: Diagnostika raka prostate]] (Luka Gnidovec)<br /> &lt;br&gt;<br /> ----<br /> <br /> Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Povzetek je treba objaviti dva dni pred predstavitvijo do polnoči (za seminarje v sredo torej v ponedeljek). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo razprava, ki praviloma ne bo daljša od 5 minut.</div>

Luka.gnidovec https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=U%C4%8Dinkovita_biosinteza_vanilina_iz_izoevgenola_z_uporabo_rekombinantne_izoevgenol_monooksigenaze_Jin1_iz_bakterije_Pseudomonas_nitroreducens&diff=18409 2021-04-14T06:13:37Z

<p>Luka.gnidovec: </p> <hr /> <div>== UVOD ==<br /> <br /> Vanilin je organska spojina, ki se v naravi večinoma nahaja v strokih orhidej iz rodu Vanilla. Uporablja se kot aditiv v hrani, dodatek parfumom in drugim kozmetičnim izdelkom ter v farmacevtski industriji. V zadnjem času se vedno bolj raziskuje možnost biotehnološke pridelave vanilina iz različnih naravnih surovin, kot so lignin, izoevgenol, ferulična kislina in glukoza. [1,2]<br /> <br /> Izoevgenol je cenovno ugoden substrat, ki se nahaja v eteričnem olju nageljnovih žbic. Hkrati je njegova biotehnološka pretvorba v vanilin zelo enostavna, saj je potreben le en pretvorbeni korak, ki ga katalizirata izoevgenol monooksigenaza (IEM) ali lipoksigenaza. [1,3]<br /> <br /> Namen raziskave, ki so jo izvedli Wang in sodelavci, je bil vzpostaviti in optimizirati biotehnološki sistem proizvodnje vanilina iz izoevgenola. Uporabili so izoevgenol monooksigenazo iz seva Jin1 bakterije ''Pseudomonas nitroreducens''. Sintetični gen za IEM so vstavili v ekspresijski vektor in z njim transformirali ''E.coli'' sev BL21(DE3). Po indukciji izražanja IEM z IPTG so celice dodali v reakcijsko zmes z 10 mM izoevgenolom, kjer je v 10 minutah ob 30 °C potekla oksidacija substrata. Na ta način so preverili encimsko aktivnost. Ob optimizaciji so spreminjali posamezne pogoje reakcije. [1]<br /> <br /> == REZULTATI ==<br /> === Vpliv sestave gojišča, temperature in pH gojenja rekombinantnih bakterij===<br /> <br /> Najprej so raziskovalci preverili, kako na izražanje encima vpliva sestava gojišča. Transformirano bakterijsko kulturo so inokulirali v več različnih gojiščih, med drugim LB, M9, TB in YT gojišču. Najboljše rezultate je dalo gojišče M9. S spreminjanjem komponent tega gojišča so nato preverili še, kaj je optimalen vir ogljika in dušika. Kot najboljši vir ogljika se je izkazala glukoza (končna koncentracija v gojišču 14 g/L), kot vir dušika pa kvasni ekstrakt v obliki praška (končna koncentracija v gojišču 10 g/L). [1]<br /> <br /> Sledila je optimizacija temperature in pH gojenja po indukciji izražanja IEM, optimalni pogoji so bili doseženi pri 25 °C in pH = 7. V optimiziranih pogojih je encimska aktivnost dosegla svoj maksimum po 16h gojenja. Celična masa je bila 5-krat višja (5 g/L), specifična encimska aktivnost pa 4,5-krat višja (409,6 U/g) kot v LB gojišču, ki so ga uporabljali v prejšnjih raziskavah. [1]<br /> <br /> === Vpliv kotopila, temperature, pH in koncentracije produkta na stopnjo pretvorbe substrata v produkt===<br /> <br /> Gojenju celic v procesu biotehnološke proizvodnje vanilina sledi oksidacija izoevgenola v vanilin, ki jo katalizirajo rekombinantne bakterije E. coli. Raziskovalci so optimizirali pH in temperaturo reakcije, preverili pa so tudi, kako dodatek kotopil vpliva na topnost substrata in s tem na učinkovitost pretvorbe. Pri teh optimizacijah so uporabili 10 mM koncentracijo substrata. V nadaljevanju so preverili še, ali odstranjevanje produkta iz reakcijske zmesi vpliva na učinkovitost pretvorbe. [1]<br /> <br /> Izoevgenol je dokaj slabo topen v vodi, zato so raziskovalci k vodi dodali še organsko topilo, ki bi izboljšalo topnost substrata ter s tem stopnjo pretvorbe substrata v produkt. Preizkusili so štiri organske spojine, in sicer metanol, etanol, izopropanol in DMSO. Kot najboljši dodatek se je izkazal DMSO v 10 % končni koncentraciji, pri čemer se je stopnja pretvorbe izboljšala za 10 %. [1]<br /> <br /> Ker je bil encim najbolj stabilen pri pH = 9 (Gly-NaOH pufer) - po 12h je bila njegova preostala aktivnost še vedno nad 90% - je bil ta pH sprejet kot optimalen za izvedbo reakcije. Ob spremembi temperature od 15 °C do 20 °C se je stopnja pretvorba povečala iz 67 % na 84,1 %, pri temperaturi nad 20 °C pa je bila nižja, kar bi lahko bila posledica slabe temperaturne obstojnosti encima. [1]<br /> <br /> Ob 50 in 100mM koncentraciji substrata se je po 8 urah praktično ves izoevgenol pretvoril v vanilin. Ob višjih koncentracijah substrata pa je stopnja pretvorbe začela padati. Glede na prejšnje raziskave lahko sklepamo, da je prišlo do inhibicije s produktom. Če bi sproti iz reakcijske zmesi odvajali produkt, bi tako lahko povečali izkoristek reakcije. Raziskovalci so tako zasnovali magnetni hitozanski film iz hitozana in železovega tetroksida. -NH2 funkcionalne skupine na filmu reagirajo z aldehidno skupino vanilina, pri čemer nastane iminska skupina. Stopnja pretvorbe je po dodatku filma ob 300 mM koncentraciji substrata znašala 84 % oz. kar 36 % več kot pri istih pogojih brez hitozanskega filma. [1]<br /> <br /> ==ZAKLJUČEK==<br /> <br /> Ob primerjavi z rezultati iz literature so raziskovalci ugotovili, da sta končna koncentracija vanilina in stopnja pretvorbe izoevgenola ob koncu optimizacije procesa najvišji med do zdaj poročanimi. To lahko pripišemo visoki encimski aktivnosti ter in-situ izolaciji produkta. Čistost produkta so preverili s HPLC, znašala je 99 %. [1]<br /> <br /> ==VIRI==<br /> <br /> 1. Wang Q, Wu X, Lu X, He Y, Ma B, Xu Y. Efficient Biosynthesis of Vanillin from Isoeugenol by Recombinant Isoeugenol Monooxygenase from Pseudomonas nitroreducens Jin1. Appl Biochem Biotechnol. 2021:1116-1128. doi:10.1007/s12010-020-03478-5<br /> <br /> 2. Zhao L, Jiang Y, Fang H, et al. Biotransformation of Isoeugenol into Vanillin Using Immobilized Recombinant Cells Containing Isoeugenol Monooxygenase Active Aggregates. Appl Biochem Biotechnol. 2019;189(2):448-458. doi:10.1007/s12010-019-02996-1<br /> <br /> 3. Ryu JY, Seo J, Park S, et al. Characterization of an isoeugenol monooxygenase (Iem) from Pseudomonas nitroreducens Jin1 that transforms isoeugenol to vanillin. Biosci Biotechnol Biochem. 2013;77(2):289-294. doi:10.1271/bbb.120715</div>

Luka.gnidovec https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=U%C4%8Dinkovita_biosinteza_vanilina_iz_izoevgenola_z_uporabo_rekombinantne_izoevgenol_monooksigenaze_Jin1_iz_bakterije_Pseudomonas_nitroreducens&diff=18366 2021-04-13T18:07:06Z

<p>Luka.gnidovec: </p> <hr /> <div>== UVOD ==<br /> <br /> Vanilin je organska spojina, ki se v naravi večinoma nahaja v strokih orhidej iz rodu Vanilla. Uporablja se kot aditiv v hrani, dodatek parfumom in drugim kozmetičnim izdelkom ter v farmacevtski industriji. V zadnjem času se vedno bolj raziskuje možnost biotehnološke pridelave vanilina iz različnih naravnih surovin, kot so lignin, izoevgenol, ferulična kislina in glukoza. [1,2]<br /> <br /> Izoevgenol je cenovno ugoden substrat, ki se nahaja v eteričnem olju nageljnovih žbic. Hkrati je njegova biotehnološka pretvorba v vanilin zelo enostavna, saj je potreben le en pretvorbeni korak, ki ga katalizirata izoevgenol monooksigenaza (IEM) ali lipoksigenaza. [1,3]<br /> <br /> Namen raziskave, ki so jo izvedli Wang in sodelavci, je bil vzpostaviti in optimizirati biotehnološki sistem proizvodnje vanilina iz izoevgenola. Uporabili so izoevgenol monooksigenazo iz seva Jin1 bakterije ''Pseudomonas nitroreducens''. Sintetični gen za IEM so vstavili v ekspresijski vektor in z njim transformirali ''E.coli'' sev BL21(DE3). Po indukciji izražanja IEM z IPTG so celice dodali v reakcijsko zmes z 10 mM izoevgenolom, kjer je v 10 minutah ob 30 °C potekla oksidacija substrata. Na ta način so preverili encimsko aktivnost. Ob optimizaciji so spreminjali posamezne pogoje reakcije. [1]<br /> <br /> == REZULTATI ==<br /> === Vpliv sestave gojišča, temperature in pH gojenja rekombinantnih bakterij===<br /> <br /> Najprej so raziskovalci preverili, kako na izražanje encima vpliva sestava gojišča. Transformirano bakterijsko kulturo so inokulirali v več različnih gojiščih, med drugim LB, M9, TB in YT gojišču. Najboljše rezultate je dalo gojišče M9. S spreminjanjem komponent tega gojišča so nato preverili še, kaj je optimalen vir ogljika in dušika. Kot najboljši vir ogljika se je izkazala glukoza (končna koncentracija v gojišču 14 g/L), kot vir dušika pa kvasni ekstrakt v obliki praška (končna koncentracija v gojišču 10 g/L). [1]<br /> <br /> Sledila je optimizacija temperature in pH gojenja, optimalni pogoji so bili doseženi pri 25 °C in pH = 7. V optimiziranih pogojih je encimska aktivnost dosegla svoj maksimum po 16h gojenja. Celična masa je bila 5-krat višja (5 g/L), specifična encimska aktivnost pa 4,5-krat višja (409,6 U/g) kot v LB gojišču, ki so ga uporabljali v prejšnjih raziskavah. [1]<br /> <br /> === Vpliv kotopila, temperature, pH in koncentracije produkta na stopnjo pretvorbe substrata v produkt===<br /> <br /> Gojenju celic v procesu biotehnološke proizvodnje vanilina sledi oksidacija izoevgenola v vanilin, ki jo katalizirajo rekombinantne bakterije E. coli. Raziskovalci so optimizirali pH in temperaturo reakcije, preverili pa so tudi, kako dodatek kotopil vpliva na topnost substrata in s tem na učinkovitost pretvorbe. Pri teh optimizacijah so uporabili 10 mM koncentracijo substrata. V nadaljevanju so preverili še, ali odstranjevanje produkta iz reakcijske zmesi vpliva na učinkovitost pretvorbe. [1]<br /> <br /> Izoevgenol je dokaj slabo topen v vodi, zato so raziskovalci k vodi dodali še organsko topilo, ki bi izboljšalo topnost substrata ter s tem stopnjo pretvorbe substrata v produkt. Preizkusili so štiri organske spojine, in sicer metanol, etanol, izopropanol in DMSO. Kot najboljši dodatek se je izkazal DMSO v 10 % končni koncentraciji, pri čemer se je stopnja pretvorbe izboljšala za 10 %. [1]<br /> <br /> Ker je bil encim najbolj stabilen pri pH = 9 (Gly-NaOH pufer) - po 12h je bila njegova preostala aktivnost še vedno nad 90% - je bil ta pH sprejet kot optimalen za izvedbo reakcije. Ob spremembi temperature od 15 °C do 20 °C se je stopnja pretvorba povečala iz 67 % na 84,1 %, pri temperaturi nad 20 °C pa je bila nižja, kar bi lahko bila posledica slabe temperaturne obstojnosti encima. [1]<br /> <br /> Ob 50 in 100mM koncentraciji substrata se je po 8 urah praktično ves izoevgenol pretvoril v vanilin. Ob višjih koncentracijah substrata pa je stopnja pretvorbe začela padati. Glede na prejšnje raziskave lahko sklepamo, da je prišlo do inhibicije s produktom. Če bi sproti iz reakcijske zmesi odvajali produkt, bi tako lahko povečali izkoristek reakcije. Raziskovalci so tako zasnovali magnetni hitozanski film iz hitozana in železovega tetroksida. -NH2 funkcionalne skupine na filmu reagirajo z aldehidno skupino vanilina, pri čemer nastane iminska skupina. Stopnja pretvorbe je po dodatku filma ob 300 mM koncentraciji substrata znašala 84 % oz. kar 36 % več kot pri istih pogojih brez hitozanskega filma. [1]<br /> <br /> ==ZAKLJUČEK==<br /> <br /> Ob primerjavi z rezultati iz literature so raziskovalci ugotovili, da sta končna koncentracija vanilina in stopnja pretvorbe izoevgenola ob koncu optimizacije procesa najvišji med do zdaj poročanimi. To lahko pripišemo visoki encimski aktivnosti ter in-situ izolaciji produkta. Čistost produkta so preverili s HPLC, znašala je 99 %. [1]<br /> <br /> ==VIRI==<br /> <br /> 1. Wang Q, Wu X, Lu X, He Y, Ma B, Xu Y. Efficient Biosynthesis of Vanillin from Isoeugenol by Recombinant Isoeugenol Monooxygenase from Pseudomonas nitroreducens Jin1. Appl Biochem Biotechnol. 2021:1116-1128. doi:10.1007/s12010-020-03478-5<br /> <br /> 2. Zhao L, Jiang Y, Fang H, et al. Biotransformation of Isoeugenol into Vanillin Using Immobilized Recombinant Cells Containing Isoeugenol Monooxygenase Active Aggregates. Appl Biochem Biotechnol. 2019;189(2):448-458. doi:10.1007/s12010-019-02996-1<br /> <br /> 3. Ryu JY, Seo J, Park S, et al. Characterization of an isoeugenol monooxygenase (Iem) from Pseudomonas nitroreducens Jin1 that transforms isoeugenol to vanillin. Biosci Biotechnol Biochem. 2013;77(2):289-294. doi:10.1271/bbb.120715</div>

Luka.gnidovec https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=U%C4%8Dinkovita_biosinteza_vanilina_iz_izoevgenola_z_uporabo_rekombinantne_izoevgenol_monooksigenaze_Jin1_iz_bakterije_Pseudomonas_nitroreducens&diff=18365 2021-04-13T18:04:37Z

<p>Luka.gnidovec: </p> <hr /> <div>== UVOD ==<br /> <br /> Vanilin je organska spojina, ki se v naravi večinoma nahaja v strokih orhidej iz rodu Vanilla. Uporablja se kot aditiv v hrani, dodatek parfumom in drugim kozmetičnim izdelkom ter v farmacevtski industriji. V zadnjem času se vedno bolj raziskuje možnost biotehnološke pridelave vanilina iz različnih naravnih surovin, kot so lignin, izoevgenol, ferulična kislina in glukoza. [1,2]<br /> <br /> Izoevgenol je cenovno ugoden substrat, ki se nahaja v eteričnem olju nageljnovih žbic. Hkrati je njegova biotehnološka pretvorba v vanilin zelo enostavna, saj je potreben le en pretvorbeni korak, ki ga katalizirata izoevgenol monooksigenaza (IEM) ali lipoksigenaza. [1,3]<br /> <br /> Namen raziskave, ki so jo izvedli Wang in sodelavci, je bil vzpostaviti in optimizirati biotehnološki sistem proizvodnje vanilina iz izoevgenola. Uporabili so izoevgenol monooksigenazo iz seva Jin1 bakterije ''Pseudomonas nitroreducens''. Sintetični gen za IEM so vstavili v ekspresijski vektor in z njim transformirali ''E.coli'' sev BL21(DE3). Po indukciji izražanja IEM z IPTG so celice dodali v reakcijsko zmes z 10 mM izoevgenolom, kjer je v 10 minutah ob 30 °C potekla oksidacija substrata. Na ta način so preverili encimsko aktivnost. Ob optimizaciji so spreminjali posamezne pogoje reakcije. [1]<br /> <br /> == REZULTATI ==<br /> === Vpliv sestave gojišča, temperature in pH gojenja rekombinantnih bakterij===<br /> <br /> Najprej so raziskovalci preverili, kako na izražanje encima vpliva sestava gojišča. Transformirano bakterijsko kulturo so inokulirali v več različnih gojiščih, med drugim LB, M9, TB in YT gojišču. Najboljše rezultate je dalo gojišče M9. S spreminjanjem komponent tega gojišča so nato preverili še, kaj je optimalen vir ogljika in dušika. Kot najboljši vir ogljika se je izkazala glukoza (končna koncentracija v gojišču 14 g/L), kot vir dušika pa kvasni ekstrakt v obliki praška (končna koncentracija v gojišču 10 g/L). [1]<br /> <br /> Sledila je optimizacija temperature in pH gojenja, optimalni pogoji so bili doseženi pri 25 °C in pH = 7. V optimiziranih pogojih je encimska aktivnost dosegla svoj maksimum po 16h gojenja. Celična masa je bila 5-krat višja (5 g/L), specifična encimska aktivnost pa 4,5-krat višja (409,6 U/g) kot v LB gojišču, ki so ga uporabljali v prejšnjih raziskavah. [1]<br /> <br /> === Vpliv kotopila, temperature, pH in koncentracije produkta na stopnjo pretvorbe substrata v produkt===<br /> <br /> Gojenju celic v procesu biotehnološke proizvodnje vanilina sledi oksidacija izoevgenola v vanilin, ki jo katalizirajo rekombinantne bakterije E. coli. Raziskovalci so optimizirali pH in temperaturo reakcije, preverili pa so tudi, kako dodatek kotopil vpliva na topnost substrata in s tem na učinkovitost pretvorbe. Pri teh optimizacijah so uporabili 10 mM koncentracijo substrata. V nadaljevanju so preverili še, ali odstranjevanje produkta iz reakcijske zmesi vpliva na učinkovitost pretvorbe. [1]<br /> <br /> Izoevgenol je dokaj slabo topen v vodi, zato so raziskovalci k vodi dodali še organsko topilo, ki bi izboljšalo topnost substrata ter s tem stopnjo pretvorbe substrata v produkt. Preizkusili so štiri organske spojine, in sicer metanol, etanol, izopropanol in DMSO. Kot najboljši dodatek se je izkazal DMSO v 10 % končni koncentraciji, pri čemer se je stopnja pretvorbe izboljšala za 10 %. [1]<br /> <br /> Ker je bil encim najbolj stabilen pri pH = 9 (Gly-NaOH pufer) - po 12h je bila njegova preostala aktivnost še vedno nad 90% - je bil ta pH sprejet kot optimalen za izvedbo reakcije. Ob spremembi temperature od 15 °C do 20 °C se je stopnja pretvorba povečala iz 67 % na 84,1 %, pri temperaturi nad 20 °C pa je bila nižja, kar bi lahko bila posledica slabe temperaturne obstojnosti encima. [1]<br /> <br /> Ob 50 in 100mM koncentraciji substrata se je po 8 urah praktično ves izoevgenol pretvoril v vanilin. Ob višjih koncentracijah substrata pa je stopnja pretvorbe začela padati. Glede na prejšnje raziskave lahko sklepamo, da je prišlo do inhibicije s produktom. Če bi sproti iz reakcijske zmesi odvajali produkt, bi tako lahko povečali izkoristek reakcije. Raziskovalci so tako zasnovali magnetni hitozanski film iz hitozana in železovega tetroksida. -NH2 funkcionalne skupine na filmu reagirajo z aldehidno skupino vanilina, pri čemer nastane iminska skupina. Stopnja pretvorbe je po dodatku filma ob 300 mM koncentraciji substrata znašala 84 % oz. kar 36 % več kot pri istih pogojih brez hitozanskega filma. [1]<br /> <br /> ==ZAKLJUČEK==<br /> <br /> Ob primerjavi z rezultati iz literature so raziskovalci ugotovili, da sta končna koncentracija vanilina in stopnja pretvorbe izoevgenola ob koncu optimizacije procesa najvišji med do zdaj poročanimi. To lahko pripišemo visoki encimski aktivnosti ter in-situ izolaciji produkta. Čistost produkta so preverili s HPLC, znašala je 99 %. <br /> <br /> ==VIRI==<br /> <br /> 1. Wang Q, Wu X, Lu X, He Y, Ma B, Xu Y. Efficient Biosynthesis of Vanillin from Isoeugenol by Recombinant Isoeugenol Monooxygenase from Pseudomonas nitroreducens Jin1. Appl Biochem Biotechnol. 2021:1116-1128. doi:10.1007/s12010-020-03478-5<br /> <br /> 2. Zhao L, Jiang Y, Fang H, et al. Biotransformation of Isoeugenol into Vanillin Using Immobilized Recombinant Cells Containing Isoeugenol Monooxygenase Active Aggregates. Appl Biochem Biotechnol. 2019;189(2):448-458. doi:10.1007/s12010-019-02996-1<br /> <br /> 3. Ryu JY, Seo J, Park S, et al. Characterization of an isoeugenol monooxygenase (Iem) from Pseudomonas nitroreducens Jin1 that transforms isoeugenol to vanillin. Biosci Biotechnol Biochem. 2013;77(2):289-294. doi:10.1271/bbb.120715</div>

Luka.gnidovec https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=U%C4%8Dinkovita_biosinteza_vanilina_iz_izoevgenola_z_uporabo_rekombinantne_izoevgenol_monooksigenaze_Jin1_iz_bakterije_Pseudomonas_nitroreducens&diff=18364 2021-04-13T18:03:06Z

<p>Luka.gnidovec: </p> <hr /> <div>== UVOD ==<br /> <br /> Vanilin je organska spojina, ki se v naravi večinoma nahaja v strokih orhidej iz rodu Vanilla. Uporablja se kot aditiv v hrani, dodatek parfumom in drugim kozmetičnim izdelkom ter v farmacevtski industriji. V zadnjem času se vedno bolj raziskuje možnost biotehnološke pridelave vanilina iz različnih naravnih surovin, kot so lignin, izoevgenol, ferulična kislina in glukoza. [1,2]<br /> <br /> Izoevgenol je cenovno ugoden substrat, ki se nahaja v eteričnem olju nageljnovih žbic. Hkrati je njegova biotehnološka pretvorba v vanilin zelo enostavna, saj je potreben le en pretvorbeni korak, ki ga katalizirata izoevgenol monooksigenaza (IEM) ali lipoksigenaza. [1,3]<br /> <br /> Namen raziskave, ki so jo izvedli Wang in sodelavci, je bil vzpostaviti in optimizirati biotehnološki sistem proizvodnje vanilina iz izoevgenola. Uporabili so izoevgenol monooksigenazo iz seva Jin1 bakterije ''Pseudomonas nitroreducens''. Sintetični gen za IEM so vstavili v ekspresijski vektor in z njim transformirali ''E.coli'' sev BL21(DE3). Po indukciji izražanja IEM z IPTG so celice dodali v reakcijsko zmes z 10 mM izoevgenolom, kjer je v 10 minutah ob 30 °C potekla oksidacija substrata. Na ta način so preverili encimsko aktivnost. Ob optimizaciji so spreminjali posamezne pogoje reakcije. [1]<br /> <br /> == Rezultati ==<br /> === Vpliv sestave gojišča, temperature in pH gojenja rekombinantnih bakterij===<br /> <br /> Najprej so raziskovalci preverili, kako na izražanje encima vpliva sestava gojišča. Transformirano bakterijsko kulturo so inokulirali v več različnih gojiščih, med drugim LB, M9, TB in YT gojišču. Najboljše rezultate je dalo gojišče M9. S spreminjanjem komponent tega gojišča so nato preverili še, kaj je optimalen vir ogljika in dušika. Kot najboljši vir ogljika se je izkazala glukoza (končna koncentracija v gojišču 14 g/L), kot vir dušika pa kvasni ekstrakt v obliki praška (končna koncentracija v gojišču 10 g/L). [1]<br /> <br /> Sledila je optimizacija temperature in pH gojenja, optimalni pogoji so bili doseženi pri 25 °C in pH = 7. V optimiziranih pogojih je encimska aktivnost dosegla svoj maksimum po 16h gojenja. Celična masa je bila 5-krat višja (5 g/L), specifična encimska aktivnost pa 4,5-krat višja (409,6 U/g) kot v LB gojišču, ki so ga uporabljali v prejšnjih raziskavah. [1]<br /> <br /> === Vpliv pogojev ob oksidaciji izoevgenola v vanilin===<br /> <br /> Gojenju celic v procesu biotehnološke proizvodnje vanilina sledi oksidacija izoevgenola v vanilin, ki jo katalizirajo rekombinantne bakterije E. coli. Raziskovalci so optimizirali pH in temperaturo reakcije, preverili pa so tudi, kako dodatek kotopil vpliva na topnost substrata in s tem na učinkovitost pretvorbe. Pri teh optimizacijah so uporabili 10 mM koncentracijo substrata. V nadaljevanju so preverili še, ali odstranjevanje produkta iz reakcijske zmesi vpliva na učinkovitost pretvorbe. [1]<br /> <br /> Izoevgenol je dokaj slabo topen v vodi, zato so raziskovalci k vodi dodali še organsko topilo, ki bi izboljšalo topnost substrata ter s tem stopnjo pretvorbe substrata v produkt. Preizkusili so štiri organske spojine, in sicer metanol, etanol, izopropanol in DMSO. Kot najboljši dodatek se je izkazal DMSO v 10 % končni koncentraciji, pri čemer se je stopnja pretvorbe izboljšala za 10 %. [1]<br /> <br /> Ker je bil encim najbolj stabilen pri pH = 9 (Gly-NaOH pufer) - po 12h je bila njegova preostala aktivnost še vedno nad 90% - je bil ta pH sprejet kot optimalen za izvedbo reakcije. Ob spremembi temperature od 15 °C do 20 °C se je stopnja pretvorba povečala iz 67 % na 84,1 %, pri temperaturi nad 20 °C pa je bila nižja, kar bi lahko bila posledica slabe temperaturne obstojnosti encima. [1]<br /> <br /> Ob 50 in 100mM koncentraciji substrata se je po 8 urah praktično ves izoevgenol pretvoril v vanilin. Ob višjih koncentracijah substrata pa je stopnja pretvorbe začela padati. Glede na prejšnje raziskave lahko sklepamo, da je prišlo do inhibicije s produktom. Če bi sproti iz reakcijske zmesi odvajali produkt, bi tako lahko povečali izkoristek reakcije. Raziskovalci so tako zasnovali magnetni hitozanski film iz hitozana in železovega tetroksida. -NH2 funkcionalne skupine na filmu reagirajo z aldehidno skupino vanilina, pri čemer nastane iminska skupina. Stopnja pretvorbe je po dodatku filma ob 300 mM koncentraciji substrata znašala 84 % oz. kar 36 % več kot pri istih pogojih brez hitozanskega filma. [1]<br /> <br /> ==Zaključek==<br /> <br /> Ob primerjavi z rezultati iz literature so raziskovalci ugotovili, da sta končna koncentracija vanilina in stopnja pretvorbe izoevgenola ob koncu optimizacije procesa najvišji med do zdaj poročanimi. To lahko pripišemo visoki encimski aktivnosti ter in-situ izolaciji produkta. Čistost produkta so preverili s HPLC, znašala je 99 %. <br /> <br /> ==Viri==<br /> <br /> 1. Wang Q, Wu X, Lu X, He Y, Ma B, Xu Y. Efficient Biosynthesis of Vanillin from Isoeugenol by Recombinant Isoeugenol Monooxygenase from Pseudomonas nitroreducens Jin1. Appl Biochem Biotechnol. 2021:1116-1128. doi:10.1007/s12010-020-03478-5<br /> <br /> 2. Zhao L, Jiang Y, Fang H, et al. Biotransformation of Isoeugenol into Vanillin Using Immobilized Recombinant Cells Containing Isoeugenol Monooxygenase Active Aggregates. Appl Biochem Biotechnol. 2019;189(2):448-458. doi:10.1007/s12010-019-02996-1<br /> <br /> 3. Ryu JY, Seo J, Park S, et al. Characterization of an isoeugenol monooxygenase (Iem) from Pseudomonas nitroreducens Jin1 that transforms isoeugenol to vanillin. Biosci Biotechnol Biochem. 2013;77(2):289-294. doi:10.1271/bbb.120715</div>

Luka.gnidovec https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=U%C4%8Dinkovita_biosinteza_vanilina_iz_izoevgenola_z_uporabo_rekombinantne_izoevgenol_monooksigenaze_Jin1_iz_bakterije_Pseudomonas_nitroreducens&diff=18363 2021-04-13T17:52:03Z

<p>Luka.gnidovec: </p> <hr /> <div>== UVOD ==<br /> <br /> Vanilin je organska spojina, ki se v naravi večinoma nahaja v strokih orhidej iz rodu Vanilla. Uporablja se kot aditiv v hrani, dodatek parfumom in drugim kozmetičnim izdelkom ter v farmacevtski industriji. V zadnjem času se vedno bolj raziskuje možnost biotehnološke pridelave vanilina iz različnih naravnih surovin, kot so lignin, izoevgenol, ferulična kislina in glukoza. [1,2]<br /> <br /> Izoevgenol je cenovno ugoden substrat, ki se nahaja v eteričnem olju nageljnovih žbic. Hkrati je njegova biotehnološka pretvorba v vanilin zelo enostavna, saj je potreben le en pretvorbeni korak, ki ga katalizirata izoevgenol monooksigenaza (IEM) ali lipoksigenaza. [1,3]<br /> <br /> Namen raziskave, ki so jo izvedli Wang in sodelavci, je bil vzpostaviti in optimizirati biotehnološki sistem proizvodnje vanilina iz izoevgenola. Uporabili so izoevgenol monooksigenazo iz seva Jin1 bakterije ''Pseudomonas nitroreducens''. Sintetični gen za IEM so vstavili v ekspresijski vektor in z njim transformirali ''E.coli'' sev BL21(DE3). Po indukciji izražanja IEM z IPTG so celice dodali v reakcijsko zmes z 10 mM izoevgenolom, kjer je v 10 minutah ob 30 °C potekla oksidacija substrata. Na ta način so preverili encimsko aktivnost. Ob optimizaciji so spreminjali posamezne pogoje reakcije. [1]<br /> <br /> == Rezultati ==</div>

Luka.gnidovec https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=U%C4%8Dinkovita_biosinteza_vanilina_iz_izoevgenola_z_uporabo_rekombinantne_izoevgenol_monooksigenaze_Jin1_iz_bakterije_Pseudomonas_nitroreducens&diff=18362 2021-04-13T17:51:24Z

<p>Luka.gnidovec: </p> <hr /> <div>== UVOD ==<br /> <br /> Vanilin je organska spojina, ki se v naravi večinoma nahaja v strokih orhidej iz rodu Vanilla. Uporablja se kot aditiv v hrani, dodatek parfumom in drugim kozmetičnim izdelkom ter v farmacevtski industriji. V zadnjem času se vedno bolj raziskuje možnost biotehnološke pridelave vanilina iz različnih naravnih surovin, kot so lignin, izoevgenol, ferulična kislina in glukoza. [1,2]<br /> <br /> Izoevgenol je cenovno ugoden substrat, ki se nahaja v eteričnem olju nageljnovih žbic. Hkrati je njegova biotehnološka pretvorba v vanilin zelo enostavna, saj je potreben le en pretvorbeni korak, ki ga katalizirata izoevgenol monooksigenaza (IEM) ali lipoksigenaza. [1,3]<br /> <br /> Namen raziskave, ki so jo izvedli Wang in sodelavci, je bil vzpostaviti in optimizirati biotehnološki sistem proizvodnje vanilina iz izoevgenola. Uporabili so izoevgenol monooksigenazo iz seva Jin1 bakterije ''Pseudomonas nitroreducens''. Sintetični gen za IEM so vstavili v ekspresijski vektor in z njim transformirali ''E.coli'' sev BL21(DE3). Po indukciji izražanja IEM z IPTG so celice dodali v reakcijsko zmes z 10 mM izoevgenolom, kjer je v 10 minutah ob 30 °C potekla oksidacija substrata. Na ta način so preverili encimsko aktivnost. Ob optimizaciji so spreminjali posamezne pogoje reakcije. [1]</div>

Luka.gnidovec https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=U%C4%8Dinkovita_biosinteza_vanilina_iz_izoevgenola_z_uporabo_rekombinantne_izoevgenol_monooksigenaze_Jin1_iz_bakterije_Pseudomonas_nitroreducens&diff=18361 2021-04-13T17:51:06Z

<p>Luka.gnidovec: New page: == UVOD == Vanilin je organska spojina, ki se v naravi večinoma nahaja v strokih orhidej iz rodu Vanilla. Uporablja se kot aditiv v hrani, dodatek parfumom in drugim kozmetičnim izdelko...</p> <hr /> <div>== UVOD ==<br /> <br /> Vanilin je organska spojina, ki se v naravi večinoma nahaja v strokih orhidej iz rodu Vanilla. Uporablja se kot aditiv v hrani, dodatek parfumom in drugim kozmetičnim izdelkom ter v farmacevtski industriji. V zadnjem času se vedno bolj raziskuje možnost biotehnološke pridelave vanilina iz različnih naravnih surovin, kot so lignin, izoevgenol, ferulična kislina in glukoza. [1,2]<br /> Izoevgenol je cenovno ugoden substrat, ki se nahaja v eteričnem olju nageljnovih žbic. Hkrati je njegova biotehnološka pretvorba v vanilin zelo enostavna, saj je potreben le en pretvorbeni korak, ki ga katalizirata izoevgenol monooksigenaza (IEM) ali lipoksigenaza. [1,3]<br /> Namen raziskave, ki so jo izvedli Wang in sodelavci, je bil vzpostaviti in optimizirati biotehnološki sistem proizvodnje vanilina iz izoevgenola. Uporabili so izoevgenol monooksigenazo iz seva Jin1 bakterije ''Pseudomonas nitroreducens''. Sintetični gen za IEM so vstavili v ekspresijski vektor in z njim transformirali ''E.coli'' sev BL21(DE3). Po indukciji izražanja IEM z IPTG so celice dodali v reakcijsko zmes z 10 mM izoevgenolom, kjer je v 10 minutah ob 30 °C potekla oksidacija substrata. Na ta način so preverili encimsko aktivnost. Ob optimizaciji so spreminjali posamezne pogoje reakcije. [1]</div>

Luka.gnidovec https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=MBT_seminarji_2021&diff=18360 2021-04-13T17:49:14Z

<p>Luka.gnidovec: </p> <hr /> <div>Seminarji iz Molekularne biotehnologije so letos organizirani tako, da vsak študent (praviloma v paru, lahko pa tudi samostojno) obdela temo s področja cepiv proti virusu SARS-CoV-2 in o tem pripravi kratek poljudno napisan povzetek. Ta del seminarjev je predstavljen na [[protikovidna cepiva|ločeni strani]].<br /> V drugem delu vsak študent predstavi nek raziskovalni dosežek s širšega področja molekularne biotehnologije. Seznam tem in predstavitev za študijsko leto 2020/21 je predstavljen tu.<br /> <br /> Povzetke morate objaviti do torka do polnoči v tednu, ko imate seminar (v četrtek). Angleški naslov prevedite tudi v slovenščino - to bo naslov povzetka, ki ga objavite na posebni strani, tako kot so to naredili kolegi pred vami (oz. predlani).<br /> <br /> Način vnosa:<br /> <br /> The importance of ''Arabidopsis'' glutathione peroxidase 8 for protecting ''Arabidopsis'' plant and ''E. coli'' cells against oxidative stress (A. Gaber; GM Crops &amp; Food 5(1), 2014; http://dx.doi.org/10.4161/gmcr.26979) Pomen glutation peroksidaze 8 iz repnjakovca za zaščito rastline ''Arabidopsis thaliana'' in bakterije ''Escherichia coli'' pred oksidativnim stresom. Janez Novak (28.2.)&lt;br&gt;<br /> (slovenski naslov povežite z novo stranjo, na kateri bo povzetek)<br /> <br /> ----<br /> <br /> <br /> Naslovi odobrenih člankov po temah:<br /> <br /> '''Farmacevtsko pomembni proteini'''&lt;br&gt;<br /> # Development of Antibody-Fragment-Producing Rice for Neutralization of Human Norovirus (A. Sasou ''et. al''; Frontiers in Plant Science 12, 2021; https://doi.org/10.3389/fpls.2021.639953). [[Proizvodnja riža za sintezo fragmentov protiteles proti humanemu norovirusu.]] Mateja Žvipelj (11.3.)<br /> # A New Plant Expression System for Producing Pharmaceutical Proteins (N. Abd-Aziz ''et. al''; Molecular Biotechnology 62, 2020; https://doi.org/10.1007/s12033-020-00242-2). [[Razvoj ekspresijskega sistema za proizvodnjo farmacevtskih proteinov v rastlini Mucuna bracteata]]. Jernej Imperl (18.3.)<br /> # Development of a Recombinant Monospecific Anti-PLGF Bivalent Nanobody and Evaluation of it in Angiogenesis Modulation (A. Nikooharf &quot;et all&quot;; Molecular Biotechnology 62, 2020; https://link.springer.com/article/10.1007/s12033-020-00275-7#additional-information) [[Razvoj rekombinantnih monospecifičnih bivalentnih nanoteles proti PLGF-u]]. Nika Zaveršek (18.3.)<br /> <br /> '''Cepiva'''&lt;br&gt;<br /> # Development of a DNA Vaccine for Melanoma Metastasis by Inhalation Based on an Analysis of Transgene Expression Characteristics of Naked pDNA and a Ternary Complex in Mouse Lung Tissues (Kodama ''et.al'';Pharmaceutics 12,2020; https://www.mdpi.com/1999-4923/12/6/540#framed_div_cited_count) [[ Razvoj DNA cepiva proti metastazam melanoma z vdihavanjem na podlagi analize značilnosti transgene ekspresije gole pDNA in trojni kompleks v mišjem pljučnem tkivu]]. Paula Horvat (25.3.)&lt;br&gt;<br /> # An AMA1/MSP1&lt;sub&gt;19&lt;/sub&gt; Adjuvanted Malaria Transplastomic Plant‑Based Vaccine Induces Immune Responses in Test Animals (Evelia M. Milán‑Noris ''et. al''; Molecular Biotechnology 62, 2020; https://doi.org/10.1007/s12033-020-00271-x) [[V rastlinah proizvedeno transplastomsko antimalarijsko cepivo z AMA1/MSP119 in dodanim adjuvansom inducira imunski odziv v testnih živalih]]. Neža Pavko (25.3.)&lt;br&gt;<br /> <br /> '''Gensko spremenjene rastline'''&lt;br&gt;<br /> # A wheat cysteine-rich receptor-like kinase confers broad-spectrum resistance against Septoria tritici blotch (C. Saintenac ''et al.''; Nat. Commun. 12, 2021, https://doi.org/10.1038/s41467-020-20685-0). [[Receptorju podobna kinaza bogata s cisteini, pšenici daje odpornost proti širokemu spektru pegavosti Septoria tritici]]. Andrej Race (7.4.)<br /> # RNAi silenced ζ-carotene desaturase developed variegated tomato transformants with increased phytoene content (M. A. Babu ''et. al''; Plant Growth Regul. 93, 2021; https://doi.org/10.1007/s10725-020-00678-1). [[Vpliv utišanja ζ-karoten desaturaze na vsebnost karotenoidov v gensko spremenjenih paradižnikih]]. Peter Škrinjar (7.4.)<br /> <br /> '''Gensko spremenjene živali in celične linije'''&lt;br&gt;<br /> # Engineering carotenoid production in mammalian cells for nutritionally enhanced cell-cultured foods (A. J. Stout &quot;et. al&quot;; Metabolic Engineering 62, 2020; https://doi.org/10.1016/j.ymben.2020.07.011). [[Razvoj proizvodnje karotenoidov v sesalskih celicah za prehransko izboljšano celično pridobljeno meso]]. Urša Lovše (8.4.)<br /> # Efficient photoactivatable Dre recombinase for cell type-specific spatiotemporal control of genome engineering in the mouse (H. Li ''et. al''; Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 117(52), 2021; https://doi.org/10.1073/pnas.2003991117). [[Priprava fotoinducibilne rekombinaze Dre kot orodje za prostorsko in časovno odvisno urejanje genoma v specifičnih mišjih celicah.]] Matija Ruparčič (8.4.)<br /> <br /> '''Nizkomolekularni biotehnološki produkti'''&lt;br&gt;<br /> # Fermentative N-Methylanthranilate Production by Engineered ''Corynebacterium glutamicum''. (T. Walter ''et. al.''; Microorganisms 8(6), 2020; https://doi.org/10.3390/microorganisms8060866). [[Fermentativna proizvodnja N-metilantranilata z inženirsko spremenjeno Corynebacterium glutamicum]]. Saša Slabe (14.4.)<br /> # Efficient Biosynthesis of Vanillin from Isoeugenol by Recombinant Isoeugenol Monooxygenase from ''Pseudomonas nitroreducens'' Jin1. (Wang Q, Wu X, Lu X, He Y, Ma B, Xu Y. Efficient Biosynthesis of Vanillin from Isoeugenol by Recombinant Isoeugenol Monooxygenase from Pseudomonas nitroreducens Jin1. Appl Biochem Biotechnol. 2021:1116-1128. doi:10.1007/s12010-020-03478-5). [[Učinkovita biosinteza vanilina iz izoevgenola z uporabo rekombinantne izoevgenol monooksigenaze Jin1 iz bakterije Pseudomonas nitroreducens]]. Luka Gnidovec (15.4.)<br /> # One-pot production of butyl butyrate from glucose using a cognate “diamond-shaped” ''E. coli'' consortium (J. P. Sinumvayo &quot;et. al&quot;; Bioresources and Bioprocessing 8, 2021; https://bioresourcesbioprocessing.springeropen.com/articles/10.1186/s40643-021-00372-8#Sec9). [[Proizvodnja butil butirata iz glukoze z uporabo &quot;diamantnega&quot; konzorcija E. coli]] Liza Ulčakar (15.4.)<br /> <br /> '''Biotehnološki polimeri'''&lt;br&gt;<br /> # Anže Karlek (21.4.)<br /> # Ana Maklin (22.4.)<br /> # Urban Hribar (22.4.)<br /> <br /> '''Biotehnološko pridobljeni encimi'''&lt;br&gt;<br /> # Urška Fajdiga (5.5.)<br /> # Mirsad Mešić (6.5.)<br /> # Martina Lokar (6.5.)<br /> <br /> '''Metabolno inženirstvo v biotehnologiji'''&lt;br&gt;<br /> # Jerneja Nimac (12.5.)<br /> # Urška Pečarič Strnad (12.5.)<br /> # Klementina Polanec (13.5.)<br /> # Ernestina Lavrih (13.5.)<br /> <br /> '''Biomasa in biogoriva'''&lt;br&gt;<br /> # Željka Erić (19.5.)<br /> # Karin Dobravc Škof (20.5.)<br /> # Katja Doberšek (20.5.)<br /> <br /> '''Okoljski vidiki biotehnologije in bioremediacija'''&lt;br&gt;<br /> # Almina Tahirović (26.5.)<br /> # Eva Keber (27.5.)<br /> # Nina Lukančič (27.5.)</div>

Luka.gnidovec https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=MBT_seminarji_2021&diff=18359 2021-04-13T17:48:24Z

<p>Luka.gnidovec: </p> <hr /> <div>Seminarji iz Molekularne biotehnologije so letos organizirani tako, da vsak študent (praviloma v paru, lahko pa tudi samostojno) obdela temo s področja cepiv proti virusu SARS-CoV-2 in o tem pripravi kratek poljudno napisan povzetek. Ta del seminarjev je predstavljen na [[protikovidna cepiva|ločeni strani]].<br /> V drugem delu vsak študent predstavi nek raziskovalni dosežek s širšega področja molekularne biotehnologije. Seznam tem in predstavitev za študijsko leto 2020/21 je predstavljen tu.<br /> <br /> Povzetke morate objaviti do torka do polnoči v tednu, ko imate seminar (v četrtek). Angleški naslov prevedite tudi v slovenščino - to bo naslov povzetka, ki ga objavite na posebni strani, tako kot so to naredili kolegi pred vami (oz. predlani).<br /> <br /> Način vnosa:<br /> <br /> The importance of ''Arabidopsis'' glutathione peroxidase 8 for protecting ''Arabidopsis'' plant and ''E. coli'' cells against oxidative stress (A. Gaber; GM Crops &amp; Food 5(1), 2014; http://dx.doi.org/10.4161/gmcr.26979) Pomen glutation peroksidaze 8 iz repnjakovca za zaščito rastline ''Arabidopsis thaliana'' in bakterije ''Escherichia coli'' pred oksidativnim stresom. Janez Novak (28.2.)&lt;br&gt;<br /> (slovenski naslov povežite z novo stranjo, na kateri bo povzetek)<br /> <br /> ----<br /> <br /> <br /> Naslovi odobrenih člankov po temah:<br /> <br /> '''Farmacevtsko pomembni proteini'''&lt;br&gt;<br /> # Development of Antibody-Fragment-Producing Rice for Neutralization of Human Norovirus (A. Sasou ''et. al''; Frontiers in Plant Science 12, 2021; https://doi.org/10.3389/fpls.2021.639953). [[Proizvodnja riža za sintezo fragmentov protiteles proti humanemu norovirusu.]] Mateja Žvipelj (11.3.)<br /> # A New Plant Expression System for Producing Pharmaceutical Proteins (N. Abd-Aziz ''et. al''; Molecular Biotechnology 62, 2020; https://doi.org/10.1007/s12033-020-00242-2). [[Razvoj ekspresijskega sistema za proizvodnjo farmacevtskih proteinov v rastlini Mucuna bracteata]]. Jernej Imperl (18.3.)<br /> # Development of a Recombinant Monospecific Anti-PLGF Bivalent Nanobody and Evaluation of it in Angiogenesis Modulation (A. Nikooharf &quot;et all&quot;; Molecular Biotechnology 62, 2020; https://link.springer.com/article/10.1007/s12033-020-00275-7#additional-information) [[Razvoj rekombinantnih monospecifičnih bivalentnih nanoteles proti PLGF-u]]. Nika Zaveršek (18.3.)<br /> <br /> '''Cepiva'''&lt;br&gt;<br /> # Development of a DNA Vaccine for Melanoma Metastasis by Inhalation Based on an Analysis of Transgene Expression Characteristics of Naked pDNA and a Ternary Complex in Mouse Lung Tissues (Kodama ''et.al'';Pharmaceutics 12,2020; https://www.mdpi.com/1999-4923/12/6/540#framed_div_cited_count) [[ Razvoj DNA cepiva proti metastazam melanoma z vdihavanjem na podlagi analize značilnosti transgene ekspresije gole pDNA in trojni kompleks v mišjem pljučnem tkivu]]. Paula Horvat (25.3.)&lt;br&gt;<br /> # An AMA1/MSP1&lt;sub&gt;19&lt;/sub&gt; Adjuvanted Malaria Transplastomic Plant‑Based Vaccine Induces Immune Responses in Test Animals (Evelia M. Milán‑Noris ''et. al''; Molecular Biotechnology 62, 2020; https://doi.org/10.1007/s12033-020-00271-x) [[V rastlinah proizvedeno transplastomsko antimalarijsko cepivo z AMA1/MSP119 in dodanim adjuvansom inducira imunski odziv v testnih živalih]]. Neža Pavko (25.3.)&lt;br&gt;<br /> <br /> '''Gensko spremenjene rastline'''&lt;br&gt;<br /> # A wheat cysteine-rich receptor-like kinase confers broad-spectrum resistance against Septoria tritici blotch (C. Saintenac ''et al.''; Nat. Commun. 12, 2021, https://doi.org/10.1038/s41467-020-20685-0). [[Receptorju podobna kinaza bogata s cisteini, pšenici daje odpornost proti širokemu spektru pegavosti Septoria tritici]]. Andrej Race (7.4.)<br /> # RNAi silenced ζ-carotene desaturase developed variegated tomato transformants with increased phytoene content (M. A. Babu ''et. al''; Plant Growth Regul. 93, 2021; https://doi.org/10.1007/s10725-020-00678-1). [[Vpliv utišanja ζ-karoten desaturaze na vsebnost karotenoidov v gensko spremenjenih paradižnikih]]. Peter Škrinjar (7.4.)<br /> <br /> '''Gensko spremenjene živali in celične linije'''&lt;br&gt;<br /> # Engineering carotenoid production in mammalian cells for nutritionally enhanced cell-cultured foods (A. J. Stout &quot;et. al&quot;; Metabolic Engineering 62, 2020; https://doi.org/10.1016/j.ymben.2020.07.011). [[Razvoj proizvodnje karotenoidov v sesalskih celicah za prehransko izboljšano celično pridobljeno meso]]. Urša Lovše (8.4.)<br /> # Efficient photoactivatable Dre recombinase for cell type-specific spatiotemporal control of genome engineering in the mouse (H. Li ''et. al''; Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 117(52), 2021; https://doi.org/10.1073/pnas.2003991117). [[Priprava fotoinducibilne rekombinaze Dre kot orodje za prostorsko in časovno odvisno urejanje genoma v specifičnih mišjih celicah.]] Matija Ruparčič (8.4.)<br /> <br /> '''Nizkomolekularni biotehnološki produkti'''&lt;br&gt;<br /> # Fermentative N-Methylanthranilate Production by Engineered ''Corynebacterium glutamicum''. (T. Walter ''et. al.''; Microorganisms 8(6), 2020; https://doi.org/10.3390/microorganisms8060866). [[Fermentativna proizvodnja N-metilantranilata z inženirsko spremenjeno Corynebacterium glutamicum]]. Saša Slabe (14.4.)<br /> # Efficient Biosynthesis of Vanillin from Isoeugenol by Recombinant Isoeugenol Monooxygenase from ''Pseudomonas nitroreducens'' Jin1. (Wang Q, Wu X, Lu X, He Y, Ma B, Xu Y. Efficient Biosynthesis of Vanillin from Isoeugenol by Recombinant Isoeugenol Monooxygenase from Pseudomonas nitroreducens Jin1. Appl Biochem Biotechnol. 2021:1116-1128. doi:10.1007/s12010-020-03478-5). [[Učinkovita biosinteza vanilina iz izoevgenola z uporabo rekombinantne izoevgenol monooksigenaze Jin1 iz bakterije Pseudomonas nitroreducens]] Luka Gnidovec (15.4.)<br /> # One-pot production of butyl butyrate from glucose using a cognate “diamond-shaped” ''E. coli'' consortium (J. P. Sinumvayo &quot;et. al&quot;; Bioresources and Bioprocessing 8, 2021; https://bioresourcesbioprocessing.springeropen.com/articles/10.1186/s40643-021-00372-8#Sec9). [[Proizvodnja butil butirata iz glukoze z uporabo &quot;diamantnega&quot; konzorcija E. coli]] Liza Ulčakar (15.4.)<br /> <br /> '''Biotehnološki polimeri'''&lt;br&gt;<br /> # Anže Karlek (21.4.)<br /> # Ana Maklin (22.4.)<br /> # Urban Hribar (22.4.)<br /> <br /> '''Biotehnološko pridobljeni encimi'''&lt;br&gt;<br /> # Urška Fajdiga (5.5.)<br /> # Mirsad Mešić (6.5.)<br /> # Martina Lokar (6.5.)<br /> <br /> '''Metabolno inženirstvo v biotehnologiji'''&lt;br&gt;<br /> # Jerneja Nimac (12.5.)<br /> # Urška Pečarič Strnad (12.5.)<br /> # Klementina Polanec (13.5.)<br /> # Ernestina Lavrih (13.5.)<br /> <br /> '''Biomasa in biogoriva'''&lt;br&gt;<br /> # Željka Erić (19.5.)<br /> # Karin Dobravc Škof (20.5.)<br /> # Katja Doberšek (20.5.)<br /> <br /> '''Okoljski vidiki biotehnologije in bioremediacija'''&lt;br&gt;<br /> # Almina Tahirović (26.5.)<br /> # Eva Keber (27.5.)<br /> # Nina Lukančič (27.5.)</div>

Luka.gnidovec