Wiki FKKT - User contributions [en]

Genetsko kodiranje in izražanje RNA origami citoskeleta v sintetičnih celicah

2025-05-25T13:22:40Z

Maša Karčovnik:

Izhodiščni članek: [https://doi.org/10.1038/s41565-025-01879-3 Genetic encoding and expression of RNA origami cytoskeletons in synthetic cells]

== Uvod ==
Temeljni cilj sintezne biologije je zgraditi nekaj novega. Pri tem se uporabljata dva pristopa; od zgoraj navzdol in od spodaj navzgor. Cilj pristopa od spodaj navzgor je, iz neživih molekularnih komponent ustvari celico, ki je minimalna enota življenja. Osrednji del teh prizadevanj je reševanje specifičnih inženirskih težav, kot so kompartmentalizacija, oskrba z energijo, metabolizem, replikacija in biosinteza, da bi bile sintetične celice sposobne zgraditi svoje lastne komponente z uporabo intrinzičnega genoma in okoljskih hranil. S tem bi lahko izpolnile zahteve osrednje dogme molekularne biologije, ki pravi, da informacije tečejo od DNA (informacija) do RNA (ojačenje in regulacija) in končno do proteinov (funkcija). Vendar pa osrednja dogma zahteva razvoj relativno zapletenega sistema [1, 2].

Za izdelavo sintetičnih celic se najpogosteje uporabljajo veliki unilamelarni vezikli (ang. Giant unilamellar vesicles, GUV), ki dobro posnemajo celične membrane, so združljivi z membranskimi proteini in omogočajo natančno sintezo z visoko ponovljivostjo. Vendar izražanje proteinov znotraj GUV predstavlja velik izziv zaradi omejenega števila prisotnih proteinov znotraj veziklov in njihovih medsebojnih interakcij, omejenih postranslacijskih modifikacij ter omejene življenjske dobe proteinov. Sintetična celica, ki deluje v skladu s centralno dogmo, zahtevala več kot 150 genov samo za transkripcijsko-translacijski mehanizem. Ena od možnih rešitev je sistema z le enim korakom med genotipom in fenotipom. Nanotehnologija DNA je olajšala ustvarjanje strukturnih in funkcionalnih analogov celičnih proteinov na osnovi nukleinskih kislin, kar predstavlja začetne korake k razvoju sintetičnih celic brez proteinov. Z uporabo nanotehnologije DNA so znanstveniki ustvarili DNA citoskelet, vendar ga sintetične celice zaradi potrebnih temperaturnih sprememb ne morejo same sintetizirati. Poleg tega obstajajo druge omejitve, kot so uporaba DNA kot genetskega in funkcionalnega materiala hkrati in zahteve po kemično funkcionalizirani DNA (na primer s holesterolom za sidranje na membrano), kar dodatno otežuje kodiranje in proizvodnjo teh struktur znotraj veziklov. Možna je sicer enkapsulacija sintetiziranih struktur, kar pa ne izpolnjuje zahteve po avtonomnosti. Rešitev teh težav je citoskelet na osnovi RNA origamija, ki se lahko izraža izotermno neposredno znotraj GUV, ki vsebujejo matrično DNA in RNA-polimerazo. RNA strukture so genetsko kodirane, kar pomeni, da lahko sintetične celice same proizvajajo lastne gradnike v aktivnem, neravnovesnem procesu. S tem pridobimo ločena dva tipa nukleinskih kislin; dvoverižna DNA kot informacijska komponenta in enoverižno RNA kot funkcionalna komponenta [1].

Zasnovali so takšne RNA origami ploščice, ki se same povežejo v mikrometrske, tridimenzionalne RNA origami nanocevke. Mehanizem zlaganja RNA origamija spominja na mehanizem prokariontske ekspresije proteinov; ena sama polimerna veriga, ki jo prepisuje RNA polimeraza, se kotranskripcijsko zloži v lokalne terciarne strukture preko notranjih zank, sledi tvorba kvartarnih struktur med posameznimi molekulami preko robnih zank in nadaljnjo povezovanje v daljše strukture nanocevk. Sorodno kot na proteine je z mutacijami DNA mogoče vplivati na strukturo in delovanje nanocevk [1].

== Eksperiment ==

=== Načrtovanje RNA origamija ===
Osnovna zaporedja za RNA origami so prevzeli od Geary C. in sod., 2021, in jih modificirali z uporabo programske opreme RNA Origami Automated Design (ROAD), ki je namenjena 3D-modeliranju RNA struktur, analizi poti zlaganja ter načrtovanju zaporedij in povezovalnih zank, kar omogoča povezovanje v stabilne terciarne strukture. ROAD omogoča hitro izdelavo prototipov več različnih ogrodij in raziskovanje učinkov različnih parametrov načrtovanja s kratkim ciklom načrtovanja ter identificira potencialne ovire za zlaganje in oblikuje optimizirana zaporedja [1, 3].

=== Izražanje RNA origamija v raztopini ===
S poskusi izražanja RNA so začeli v raztopni. Da so ugotovili, kako je učinkovitost transkripcije odvisna od koncentracije Mg ionov, so poskus izvedli z različnimi koncentracijami Mg(OAc)2. S poskusi so začeli z dvodimenzionalnim RNA origamijem, ki ima dobro definirano strukturo; posamezna RNA molekula se zloži v tri vijačnice, ki se nato sestavijo v petkotnik. Na 3' konec so dodali iSpinach aptamer (iSpi), ki je odgovoren za aktivacijo barvila DFHBI-1T ob vezavi, kar je omogočilo kvantifikacijo uspešnosti procesa sestavljanja. Poskusi so pokazali, da v 1 mM raztopina Mg2+ ionov niso nastale predvidene strukture, medtem ko so jih v 6 mM raztopini Mg2+ ionov dobili [1].

=== Izražanje RNA origamija znotraj GUV ===
Poleg enkapsulacije metrične DNA in RNA-polimeraze znotraj GUV je bilo potrebno zagotoviti, da se transkripcija začne šele znotraj GUV, zato je potreben sprožilec procesa. Zaradi omejenega reakcijskega volumna GUV bi izčrpavanje hranil in kopičenje odpadkov ustavilo transkripcijo, zato so uvedli dva različna kontrolna sistema: omejitev esencialnega kofaktorja Mg2+ in omejitev ribonukleotidov (rNTP). Izbrali so magnezijev ionofor, ki omogoča zaprt membranski sitem brez proteinov in je sposoben prenašati Mg2+ čez membrano z visoko specifičnostjo. Težava so odpadki transkripcijskega procesa, ki ne morejo zapustiti vezikla. Za kombiniran uvoz Mg2+, rNTP-jev in odstranjevanje odpadkov so v membrano vključili bakterijsko transmembransko poro α-hemolizin. S premerom 1,4 nm ta pora omogoča nemoten prehod omenjenih snovi, hkrati pa preprečuje uhajanje večjih struktur, kot so matrična DNA, RNA-polimeraze in RNA origami. V tem primeru so transkripcijo kontrolirali z rNTP-ji, ki so jih dodali v raztopino, ko so želeli, da se transkripcija začne [1].

Nastajanje RNA origamija so spremljali z merjenjem fluorescence iSpi znotraj posameznih GUV s konfokalno mikroskopijo. Intenziteta fluorescence znotraj GUV se je kot pričakovano povečevala v primerjavi z raztopino, kar potrjuje uspešno nastajanje RNA origamija tako znotraj veziklov z magnezijevimi ionoforji kot z α-hemolizinom. Kljub uspešnosti obeh sistemov, se je kontrolni sistem z α-hemolizinom izkazal za uspešnejšega, ker omogoča prehajanje vseh potrebnih ionov in so jih lahko dodali po tem, ko so vezikli že nastali. Ker je tvorba veziklov občutljiva na ione, so s tem dosegli večjo učinkovitost njihove tvorbe [1].

=== Ko-transkripcijsko zlaganje RNA origami nanocevk ===
Nato so želeli iz majhnega števila genov ustvariti mikrotubulom podobne strukture velikosti celice, ki se zlagajo kotranskripcijsko. Zasnovali so RNA nanocevke divjega tipa (WT). Nastajanje ploščic WT, skladnih z in silico zasnovanimi, so eksperimentalno potrdili z mikroskopijo na atomsko silo (AFM). Ko-transkripcijsko zložene ploščice so se sestavile v votle nanocevke dolžine do nekaj mikrometrov, ki zaradi močnih interakcij končnih zank RNA nanocevk prenesejo temperature do 50 °C . Nato so zasnovali še ploščice z iSpi, ki so jih dodali na 3' konce monomernih enot, da so lahko nanocevke opazovali s konfokalno mikroskopijo. Potrdili so, da so dobili mreže, podobne citoskeletu, s premerom več deset mikrometrov [1].

Ker je modifikacija posameznih ploščic ključna za ustvarjanje funkcionalnih citoskeletov, so preverili še vpliv dodatka dvoverižne zanke na 3' koncu (dsOV). Izkazalo se je, da dodatek relativno obsežnih zaporedij iSpi in dsOV ne vpliva na dolžino samih ploščic oziroma nanocevk, ampak poveča njihovo fleksibilnost, kar povzroči hitrejši prelom nanocevk [1].

=== Fenotipska plastičnost sistema ===
Pri pregledu struktur so v redkih primerih opazili nastanek obročev namesto nanocevk. To so povezali z mutacijami, kar dokazuje fenotipsko plastičnost sistema. S skoraj istim zaporedjem RNA so dobili dva izrazito različna fenotipa, kar nakazuje na številne možnosti za usmerjeno evolucijo [1].

=== Izražanje RNA origami citoskeletov v sintetičnih celicah ===
Citoskelet igra ključno vlogo pri uravnavanju oblike in trdnosti celic. Potem ko so zgradili citoskeletu podobne RNA nanocevke, ki se ko-transkripcijsko zlagajo, je bil naslednji korak njihovo izražanje znotraj GUV. Transkripcijo ploščic iSpi znotraj GUV so sprožili z dodajanjem rNTP-jev preko por α-hemolizina. Proces so spremljali s konfokalno mikroskopijo, ki je po šestih urah pokazala pojav mreže RNA origami nanocevk [1].

Na koncu so želeli doseči, da bi se citoskelet vezal na membrano, zato so dodali še biotinski aptamer. Te ploščice so izrazili v GUV s 5 % biotiniliranih lipidov. RNA nanocevke, ki so vsebovale iSpi in biotinske aptamere, so se kot predvideno povezale v mrežo na notranji strani membrane GUV, medtem ko so se nanocevke brez biotinskega aptamera koncentrirale v središču GUV [1].

== Zaključek ==
Sintetične celice imajo pomembno vlogo pri razumevanju delovanja živih sistemov. Imajo pa tudi aplikacije v vsakdanjem življenju. V primerjavi z bioinženirskimi celičnimi sistemi jih je mnogo lažje prilagajati in spreminjati na molekularni ravni, zato imajo potencial uporabe kot odzivna zdravila, ki sproščajo spojine, ko prejmejo signal iz bioloških sistemov. Biomedicinske aplikacije vključujejo zdravljenje raka in nadomestne terapije z encimi. Številni izzivi dela z živimi sistemi, zanje ne veljajo. Pomembna je predvsem njihova robustnost, saj so sposobne prenašati nenaravne in za celico toksične pogoje [4].

Sinteza RNA origami citoskeleta znotraj veziklov predstavlja velik korak k strukturiranju sintetičnih celic. Z nadaljnjimi študijami bi lahko z vključitvijo ribocimov dosegli tudi sintezo molekularnih strojev, ki izvajajo kompleksne celične naloge, znotraj veziklov. Polimerazni ribocimi, bi lahko v tem sistemu nadomestili potrebo po vključitvi proteinske RNA polimeraze v celice. Genetsko kodirana strojna oprema, izdelana iz RNA origamija, bi lahko vodila do novih biofizikalnih orodij za manipulacijo celic in reševanje vprašanj v celični biologiji [1].

== Literatura ==
[1] M. P. Tran, T. Chakraborty, E. Poppleton, L. Monari, M. Illig, F. Giessler, K. Göpfrich: Genetic encoding and expression of RNA origami cytoskeletons in synthetic cells. Nat. Nanotechnol. 2025, 20, 664–671.

[2] C. Guindani, L. C. Da Silva, S. Cao, T. Ivanov, K. Landfester: Synthetic Cells: From Simple Bio‐Inspired Modules to Sophisticated Integrated Systems. Angew Chem Int Ed 2022, 61, e202110855.

[3] C. Geary, G. Grossi, E. K. S. McRae, P. W. K. Rothemund, E. S. Andersen: RNA origami design tools enable cotranscriptional folding of kilobase-sized nanoscaffolds. Nat. Chem. 2021, 13, 549–558.

[4] K. P. Adamala, M. Dogterom, Y. Elani, P. Schwille, M. Takinoue, T.-Y. D. Tang: Present and future of synthetic cell development. Nat Rev Mol Cell Biol 2024, 25, 162–167.

Genetsko kodiranje in izražanje RNA origami citoskeleta v sintetičnih celicah

2025-05-25T13:20:45Z

Maša Karčovnik:

Izhodiščni članek: [https://doi.org/10.1038/s41565-025-01879-3 Genetic encoding and expression of RNA origami cytoskeletons in synthetic cells]

== Uvod ==
Temeljni cilj sintezne biologije je zgraditi nekaj novega. Pri tem se uporabljata dva pristopa; od zgoraj navzdol in od spodaj navzgor. Cilj pristopa od spodaj navzgor je, iz neživih molekularnih komponent ustvari celico, ki je minimalna enota življenja. Osrednji del teh prizadevanj je reševanje specifičnih inženirskih težav, kot so kompartmentalizacija, oskrba z energijo, metabolizem, replikacija in biosinteza, da bi bile sintetične celice sposobne zgraditi svoje lastne komponente z uporabo intrinzičnega genoma in okoljskih hranil. S tem bi lahko izpolnile zahteve osrednje dogme molekularne biologije, ki pravi, da informacije tečejo od DNA (informacija) do RNA (ojačenje in regulacija) in končno do proteinov (funkcija). Vendar pa osrednja dogma zahteva razvoj relativno zapletenega sistema [1, 2].
Za izdelavo sintetičnih celic se najpogosteje uporabljajo veliki unilamelarni vezikli (ang. Giant unilamellar vesicles, GUV), ki dobro posnemajo celične membrane, so združljivi z membranskimi proteini in omogočajo natančno sintezo z visoko ponovljivostjo. Vendar izražanje proteinov znotraj GUV predstavlja velik izziv zaradi omejenega števila prisotnih proteinov znotraj veziklov in njihovih medsebojnih interakcij, omejenih postranslacijskih modifikacij ter omejene življenjske dobe proteinov. Sintetična celica, ki deluje v skladu s centralno dogmo, zahtevala več kot 150 genov samo za transkripcijsko-translacijski mehanizem. Ena od možnih rešitev je sistema z le enim korakom med genotipom in fenotipom. Nanotehnologija DNA je olajšala ustvarjanje strukturnih in funkcionalnih analogov celičnih proteinov na osnovi nukleinskih kislin, kar predstavlja začetne korake k razvoju sintetičnih celic brez proteinov. Z uporabo nanotehnologije DNA so znanstveniki ustvarili DNA citoskelet, vendar ga sintetične celice zaradi potrebnih temperaturnih sprememb ne morejo same sintetizirati. Poleg tega obstajajo druge omejitve, kot so uporaba DNA kot genetskega in funkcionalnega materiala hkrati in zahteve po kemično funkcionalizirani DNA (na primer s holesterolom za sidranje na membrano), kar dodatno otežuje kodiranje in proizvodnjo teh struktur znotraj veziklov. Možna je sicer enkapsulacija sintetiziranih struktur, kar pa ne izpolnjuje zahteve po avtonomnosti. Rešitev teh težav je citoskelet na osnovi RNA origamija, ki se lahko izraža izotermno neposredno znotraj GUV, ki vsebujejo matrično DNA in RNA-polimerazo. RNA strukture so genetsko kodirane, kar pomeni, da lahko sintetične celice same proizvajajo lastne gradnike v aktivnem, neravnovesnem procesu. S tem pridobimo ločena dva tipa nukleinskih kislin; dvoverižna DNA kot informacijska komponenta in enoverižno RNA kot funkcionalna komponenta [1].
Zasnovali so takšne RNA origami ploščice, ki se same povežejo v mikrometrske, tridimenzionalne RNA origami nanocevke. Mehanizem zlaganja RNA origamija spominja na mehanizem prokariontske ekspresije proteinov; ena sama polimerna veriga, ki jo prepisuje RNA polimeraza, se kotranskripcijsko zloži v lokalne terciarne strukture preko notranjih zank, sledi tvorba kvartarnih struktur med posameznimi molekulami preko robnih zank in nadaljnjo povezovanje v daljše strukture nanocevk. Sorodno kot na proteine je z mutacijami DNA mogoče vplivati na strukturo in delovanje nanocevk [1].

== Eksperiment ==

=== Načrtovanje RNA origamija ===
Osnovna zaporedja za RNA origami so prevzeli od Geary C. in sod., 2021, in jih modificirali z uporabo programske opreme RNA Origami Automated Design (ROAD), ki je namenjena 3D-modeliranju RNA struktur, analizi poti zlaganja ter načrtovanju zaporedij in povezovalnih zank, kar omogoča povezovanje v stabilne terciarne strukture. ROAD omogoča hitro izdelavo prototipov več različnih ogrodij in raziskovanje učinkov različnih parametrov načrtovanja s kratkim ciklom načrtovanja ter identificira potencialne ovire za zlaganje in oblikuje optimizirana zaporedja [1, 3].

=== Izražanje RNA origamija v raztopini ===
S poskusi izražanja RNA so začeli v raztopni. Da so ugotovili, kako je učinkovitost transkripcije odvisna od koncentracije Mg ionov, so poskus izvedli z različnimi koncentracijami Mg(OAc)2. S poskusi so začeli z dvodimenzionalnim RNA origamijem, ki ima dobro definirano strukturo; posamezna RNA molekula se zloži v tri vijačnice, ki se nato sestavijo v petkotnik. Na 3' konec so dodali iSpinach aptamer (iSpi), ki je odgovoren za aktivacijo barvila DFHBI-1T ob vezavi, kar je omogočilo kvantifikacijo uspešnosti procesa sestavljanja. Poskusi so pokazali, da v 1 mM raztopina Mg2+ ionov niso nastale predvidene strukture, medtem ko so jih v 6 mM raztopini Mg2+ ionov dobili [1].

=== Izražanje RNA origamija znotraj GUV ===
Poleg enkapsulacije metrične DNA in RNA-polimeraze znotraj GUV je bilo potrebno zagotoviti, da se transkripcija začne šele znotraj GUV, zato je potreben sprožilec procesa. Zaradi omejenega reakcijskega volumna GUV bi izčrpavanje hranil in kopičenje odpadkov ustavilo transkripcijo, zato so uvedli dva različna kontrolna sistema: omejitev esencialnega kofaktorja Mg2+ in omejitev ribonukleotidov (rNTP). Izbrali so magnezijev ionofor, ki omogoča zaprt membranski sitem brez proteinov in je sposoben prenašati Mg2+ čez membrano z visoko specifičnostjo. Težava so odpadki transkripcijskega procesa, ki ne morejo zapustiti vezikla. Za kombiniran uvoz Mg2+, rNTP-jev in odstranjevanje odpadkov so v membrano vključili bakterijsko transmembransko poro α-hemolizin. S premerom 1,4 nm ta pora omogoča nemoten prehod omenjenih snovi, hkrati pa preprečuje uhajanje večjih struktur, kot so matrična DNA, RNA-polimeraze in RNA origami. V tem primeru so transkripcijo kontrolirali z rNTP-ji, ki so jih dodali v raztopino, ko so želeli, da se transkripcija začne [1].
Nastajanje RNA origamija so spremljali z merjenjem fluorescence iSpi znotraj posameznih GUV s konfokalno mikroskopijo. Intenziteta fluorescence znotraj GUV se je kot pričakovano povečevala v primerjavi z raztopino, kar potrjuje uspešno nastajanje RNA origamija tako znotraj veziklov z magnezijevimi ionoforji kot z α-hemolizinom. Kljub uspešnosti obeh sistemov, se je kontrolni sistem z α-hemolizinom izkazal za uspešnejšega, ker omogoča prehajanje vseh potrebnih ionov in so jih lahko dodali po tem, ko so vezikli že nastali. Ker je tvorba veziklov občutljiva na ione, so s tem dosegli večjo učinkovitost njihove tvorbe [1].

=== Ko-transkripcijsko zlaganje RNA origami nanocevk ===
Nato so želeli iz majhnega števila genov ustvariti mikrotubulom podobne strukture velikosti celice, ki se zlagajo kotranskripcijsko. Zasnovali so RNA nanocevke divjega tipa (WT). Nastajanje ploščic WT, skladnih z in silico zasnovanimi, so eksperimentalno potrdili z mikroskopijo na atomsko silo (AFM). Ko-transkripcijsko zložene ploščice so se sestavile v votle nanocevke dolžine do nekaj mikrometrov, ki zaradi močnih interakcij končnih zank RNA nanocevk prenesejo temperature do 50 °C . Nato so zasnovali še ploščice z iSpi, ki so jih dodali na 3' konce monomernih enot, da so lahko nanocevke opazovali s konfokalno mikroskopijo. Potrdili so, da so dobili mreže, podobne citoskeletu, s premerom več deset mikrometrov [1].
Ker je modifikacija posameznih ploščic ključna za ustvarjanje funkcionalnih citoskeletov, so preverili še vpliv dodatka dvoverižne zanke na 3' koncu (dsOV). Izkazalo se je, da dodatek relativno obsežnih zaporedij iSpi in dsOV ne vpliva na dolžino samih ploščic oziroma nanocevk, ampak poveča njihovo fleksibilnost, kar povzroči hitrejši prelom nanocevk [1].

=== Fenotipska plastičnost sistema ===
Pri pregledu struktur so v redkih primerih opazili nastanek obročev namesto nanocevk. To so povezali z mutacijami, kar dokazuje fenotipsko plastičnost sistema. S skoraj istim zaporedjem RNA so dobili dva izrazito različna fenotipa, kar nakazuje na številne možnosti za usmerjeno evolucijo [1].

=== Izražanje RNA origami citoskeletov v sintetičnih celicah ===
Citoskelet igra ključno vlogo pri uravnavanju oblike in trdnosti celic. Potem ko so zgradili citoskeletu podobne RNA nanocevke, ki se ko-transkripcijsko zlagajo, je bil naslednji korak njihovo izražanje znotraj GUV. Transkripcijo ploščic iSpi znotraj GUV so sprožili z dodajanjem rNTP-jev preko por α-hemolizina. Proces so spremljali s konfokalno mikroskopijo, ki je po šestih urah pokazala pojav mreže RNA origami nanocevk [1].
Na koncu so želeli doseči, da bi se citoskelet vezal na membrano, zato so dodali še biotinski aptamer. Te ploščice so izrazili v GUV s 5 % biotiniliranih lipidov. RNA nanocevke, ki so vsebovale iSpi in biotinske aptamere, so se kot predvideno povezale v mrežo na notranji strani membrane GUV, medtem ko so se nanocevke brez biotinskega aptamera koncentrirale v središču GUV [1].

== Zaključek ==
Sintetične celice imajo pomembno vlogo pri razumevanju delovanja živih sistemov. Imajo pa tudi aplikacije v vsakdanjem življenju. V primerjavi z bioinženirskimi celičnimi sistemi jih je mnogo lažje prilagajati in spreminjati na molekularni ravni, zato imajo potencial uporabe kot odzivna zdravila, ki sproščajo spojine, ko prejmejo signal iz bioloških sistemov. Biomedicinske aplikacije vključujejo zdravljenje raka in nadomestne terapije z encimi. Številni izzivi dela z živimi sistemi, zanje ne veljajo. Pomembna je predvsem njihova robustnost, saj so sposobne prenašati nenaravne in za celico toksične pogoje [4].
Sinteza RNA origami citoskeleta znotraj veziklov predstavlja velik korak k strukturiranju sintetičnih celic. Z nadaljnjimi študijami bi lahko z vključitvijo ribocimov dosegli tudi sintezo molekularnih strojev, ki izvajajo kompleksne celične naloge, znotraj veziklov. Polimerazni ribocimi, bi lahko v tem sistemu nadomestili potrebo po vključitvi proteinske RNA polimeraze v celice. Genetsko kodirana strojna oprema, izdelana iz RNA origamija, bi lahko vodila do novih biofizikalnih orodij za manipulacijo celic in reševanje vprašanj v celični biologiji [1].

== Literatura ==
[1] M. P. Tran, T. Chakraborty, E. Poppleton, L. Monari, M. Illig, F. Giessler, K. Göpfrich: Genetic encoding and expression of RNA origami cytoskeletons in synthetic cells. Nat. Nanotechnol. 2025, 20, 664–671.

[2] C. Guindani, L. C. Da Silva, S. Cao, T. Ivanov, K. Landfester: Synthetic Cells: From Simple Bio‐Inspired Modules to Sophisticated Integrated Systems. Angew Chem Int Ed 2022, 61, e202110855.

[3] C. Geary, G. Grossi, E. K. S. McRae, P. W. K. Rothemund, E. S. Andersen: RNA origami design tools enable cotranscriptional folding of kilobase-sized nanoscaffolds. Nat. Chem. 2021, 13, 549–558.

[4] K. P. Adamala, M. Dogterom, Y. Elani, P. Schwille, M. Takinoue, T.-Y. D. Tang: Present and future of synthetic cell development. Nat Rev Mol Cell Biol 2024, 25, 162–167.

Genetsko kodiranje in izražanje RNA origami citoskeleta v sintetičnih celicah

2025-05-25T13:18:31Z

Maša Karčovnik:

Izhodiščni članek: [https://doi.org/10.1038/s41565-025-01879-3 Genetic encoding and expression of RNA origami cytoskeletons in synthetic cells]

=== Uvod ===
Temeljni cilj sintezne biologije je zgraditi nekaj novega. Pri tem se uporabljata dva pristopa; od zgoraj navzdol in od spodaj navzgor. Cilj pristopa od spodaj navzgor je, iz neživih molekularnih komponent ustvari celico, ki je minimalna enota življenja. Osrednji del teh prizadevanj je reševanje specifičnih inženirskih težav, kot so kompartmentalizacija, oskrba z energijo, metabolizem, replikacija in biosinteza, da bi bile sintetične celice sposobne zgraditi svoje lastne komponente z uporabo intrinzičnega genoma in okoljskih hranil. S tem bi lahko izpolnile zahteve osrednje dogme molekularne biologije, ki pravi, da informacije tečejo od DNA (informacija) do RNA (ojačenje in regulacija) in končno do proteinov (funkcija). Vendar pa osrednja dogma zahteva razvoj relativno zapletenega sistema [1, 2].
Za izdelavo sintetičnih celic se najpogosteje uporabljajo veliki unilamelarni vezikli (ang. Giant unilamellar vesicles, GUV), ki dobro posnemajo celične membrane, so združljivi z membranskimi proteini in omogočajo natančno sintezo z visoko ponovljivostjo. Vendar izražanje proteinov znotraj GUV predstavlja velik izziv zaradi omejenega števila prisotnih proteinov znotraj veziklov in njihovih medsebojnih interakcij, omejenih postranslacijskih modifikacij ter omejene življenjske dobe proteinov. Sintetična celica, ki deluje v skladu s centralno dogmo, zahtevala več kot 150 genov samo za transkripcijsko-translacijski mehanizem. Ena od možnih rešitev je sistema z le enim korakom med genotipom in fenotipom. Nanotehnologija DNA je olajšala ustvarjanje strukturnih in funkcionalnih analogov celičnih proteinov na osnovi nukleinskih kislin, kar predstavlja začetne korake k razvoju sintetičnih celic brez proteinov. Z uporabo nanotehnologije DNA so znanstveniki ustvarili DNA citoskelet, vendar ga sintetične celice zaradi potrebnih temperaturnih sprememb ne morejo same sintetizirati. Poleg tega obstajajo druge omejitve, kot so uporaba DNA kot genetskega in funkcionalnega materiala hkrati in zahteve po kemično funkcionalizirani DNA (na primer s holesterolom za sidranje na membrano), kar dodatno otežuje kodiranje in proizvodnjo teh struktur znotraj veziklov. Možna je sicer enkapsulacija sintetiziranih struktur, kar pa ne izpolnjuje zahteve po avtonomnosti. Rešitev teh težav je citoskelet na osnovi RNA origamija, ki se lahko izraža izotermno neposredno znotraj GUV, ki vsebujejo matrično DNA in RNA-polimerazo. RNA strukture so genetsko kodirane, kar pomeni, da lahko sintetične celice same proizvajajo lastne gradnike v aktivnem, neravnovesnem procesu. S tem pridobimo ločena dva tipa nukleinskih kislin; dvoverižna DNA kot informacijska komponenta in enoverižno RNA kot funkcionalna komponenta [1].
Zasnovali so takšne RNA origami ploščice, ki se same povežejo v mikrometrske, tridimenzionalne RNA origami nanocevke. Mehanizem zlaganja RNA origamija spominja na mehanizem prokariontske ekspresije proteinov; ena sama polimerna veriga, ki jo prepisuje RNA polimeraza, se kotranskripcijsko zloži v lokalne terciarne strukture preko notranjih zank, sledi tvorba kvartarnih struktur med posameznimi molekulami preko robnih zank in nadaljnjo povezovanje v daljše strukture nanocevk. Sorodno kot na proteine je z mutacijami DNA mogoče vplivati na strukturo in delovanje nanocevk [1].

== Eksperiment ==

== Načrtovanje RNA origamija ==
Osnovna zaporedja za RNA origami so prevzeli od Geary C. in sod., 2021, in jih modificirali z uporabo programske opreme RNA Origami Automated Design (ROAD), ki je namenjena 3D-modeliranju RNA struktur, analizi poti zlaganja ter načrtovanju zaporedij in povezovalnih zank, kar omogoča povezovanje v stabilne terciarne strukture. ROAD omogoča hitro izdelavo prototipov več različnih ogrodij in raziskovanje učinkov različnih parametrov načrtovanja s kratkim ciklom načrtovanja ter identificira potencialne ovire za zlaganje in oblikuje optimizirana zaporedja [1, 3].

== Izražanje RNA origamija v raztopini ==
S poskusi izražanja RNA so začeli v raztopni. Da so ugotovili, kako je učinkovitost transkripcije odvisna od koncentracije Mg ionov, so poskus izvedli z različnimi koncentracijami Mg(OAc)2. S poskusi so začeli z dvodimenzionalnim RNA origamijem, ki ima dobro definirano strukturo; posamezna RNA molekula se zloži v tri vijačnice, ki se nato sestavijo v petkotnik. Na 3' konec so dodali iSpinach aptamer (iSpi), ki je odgovoren za aktivacijo barvila DFHBI-1T ob vezavi, kar je omogočilo kvantifikacijo uspešnosti procesa sestavljanja. Poskusi so pokazali, da v 1 mM raztopina Mg2+ ionov niso nastale predvidene strukture, medtem ko so jih v 6 mM raztopini Mg2+ ionov dobili [1].

== Izražanje RNA origamija znotraj GUV ==
Poleg enkapsulacije metrične DNA in RNA-polimeraze znotraj GUV je bilo potrebno zagotoviti, da se transkripcija začne šele znotraj GUV, zato je potreben sprožilec procesa. Zaradi omejenega reakcijskega volumna GUV bi izčrpavanje hranil in kopičenje odpadkov ustavilo transkripcijo, zato so uvedli dva različna kontrolna sistema: omejitev esencialnega kofaktorja Mg2+ in omejitev ribonukleotidov (rNTP). Izbrali so magnezijev ionofor, ki omogoča zaprt membranski sitem brez proteinov in je sposoben prenašati Mg2+ čez membrano z visoko specifičnostjo. Težava so odpadki transkripcijskega procesa, ki ne morejo zapustiti vezikla. Za kombiniran uvoz Mg2+, rNTP-jev in odstranjevanje odpadkov so v membrano vključili bakterijsko transmembransko poro α-hemolizin. S premerom 1,4 nm ta pora omogoča nemoten prehod omenjenih snovi, hkrati pa preprečuje uhajanje večjih struktur, kot so matrična DNA, RNA-polimeraze in RNA origami. V tem primeru so transkripcijo kontrolirali z rNTP-ji, ki so jih dodali v raztopino, ko so želeli, da se transkripcija začne [1].
Nastajanje RNA origamija so spremljali z merjenjem fluorescence iSpi znotraj posameznih GUV s konfokalno mikroskopijo. Intenziteta fluorescence znotraj GUV se je kot pričakovano povečevala v primerjavi z raztopino, kar potrjuje uspešno nastajanje RNA origamija tako znotraj veziklov z magnezijevimi ionoforji kot z α-hemolizinom. Kljub uspešnosti obeh sistemov, se je kontrolni sistem z α-hemolizinom izkazal za uspešnejšega, ker omogoča prehajanje vseh potrebnih ionov in so jih lahko dodali po tem, ko so vezikli že nastali. Ker je tvorba veziklov občutljiva na ione, so s tem dosegli večjo učinkovitost njihove tvorbe [1].

== Ko-transkripcijsko zlaganje RNA origami nanocevk ==
Nato so želeli iz majhnega števila genov ustvariti mikrotubulom podobne strukture velikosti celice, ki se zlagajo kotranskripcijsko. Zasnovali so RNA nanocevke divjega tipa (WT). Nastajanje ploščic WT, skladnih z in silico zasnovanimi, so eksperimentalno potrdili z mikroskopijo na atomsko silo (AFM). Ko-transkripcijsko zložene ploščice so se sestavile v votle nanocevke dolžine do nekaj mikrometrov, ki zaradi močnih interakcij končnih zank RNA nanocevk prenesejo temperature do 50 °C . Nato so zasnovali še ploščice z iSpi, ki so jih dodali na 3' konce monomernih enot, da so lahko nanocevke opazovali s konfokalno mikroskopijo. Potrdili so, da so dobili mreže, podobne citoskeletu, s premerom več deset mikrometrov [1].
Ker je modifikacija posameznih ploščic ključna za ustvarjanje funkcionalnih citoskeletov, so preverili še vpliv dodatka dvoverižne zanke na 3' koncu (dsOV). Izkazalo se je, da dodatek relativno obsežnih zaporedij iSpi in dsOV ne vpliva na dolžino samih ploščic oziroma nanocevk, ampak poveča njihovo fleksibilnost, kar povzroči hitrejši prelom nanocevk [1].

== Fenotipska plastičnost sistema ==
Pri pregledu struktur so v redkih primerih opazili nastanek obročev namesto nanocevk. To so povezali z mutacijami, kar dokazuje fenotipsko plastičnost sistema. S skoraj istim zaporedjem RNA so dobili dva izrazito različna fenotipa, kar nakazuje na številne možnosti za usmerjeno evolucijo [1].

== Izražanje RNA origami citoskeletov v sintetičnih celicah ==
Citoskelet igra ključno vlogo pri uravnavanju oblike in trdnosti celic. Potem ko so zgradili citoskeletu podobne RNA nanocevke, ki se ko-transkripcijsko zlagajo, je bil naslednji korak njihovo izražanje znotraj GUV. Transkripcijo ploščic iSpi znotraj GUV so sprožili z dodajanjem rNTP-jev preko por α-hemolizina. Proces so spremljali s konfokalno mikroskopijo, ki je po šestih urah pokazala pojav mreže RNA origami nanocevk [1].
Na koncu so želeli doseči, da bi se citoskelet vezal na membrano, zato so dodali še biotinski aptamer. Te ploščice so izrazili v GUV s 5 % biotiniliranih lipidov. RNA nanocevke, ki so vsebovale iSpi in biotinske aptamere, so se kot predvideno povezale v mrežo na notranji strani membrane GUV, medtem ko so se nanocevke brez biotinskega aptamera koncentrirale v središču GUV [1].

== Zaključek ==
Sintetične celice imajo pomembno vlogo pri razumevanju delovanja živih sistemov. Imajo pa tudi aplikacije v vsakdanjem življenju. V primerjavi z bioinženirskimi celičnimi sistemi jih je mnogo lažje prilagajati in spreminjati na molekularni ravni, zato imajo potencial uporabe kot odzivna zdravila, ki sproščajo spojine, ko prejmejo signal iz bioloških sistemov. Biomedicinske aplikacije vključujejo zdravljenje raka in nadomestne terapije z encimi. Številni izzivi dela z živimi sistemi, zanje ne veljajo. Pomembna je predvsem njihova robustnost, saj so sposobne prenašati nenaravne in za celico toksične pogoje [4].
Sinteza RNA origami citoskeleta znotraj veziklov predstavlja velik korak k strukturiranju sintetičnih celic. Z nadaljnjimi študijami bi lahko z vključitvijo ribocimov dosegli tudi sintezo molekularnih strojev, ki izvajajo kompleksne celične naloge, znotraj veziklov. Polimerazni ribocimi, bi lahko v tem sistemu nadomestili potrebo po vključitvi proteinske RNA polimeraze v celice. Genetsko kodirana strojna oprema, izdelana iz RNA origamija, bi lahko vodila do novih biofizikalnih orodij za manipulacijo celic in reševanje vprašanj v celični biologiji [1].

== Literatura ==
[1] M. P. Tran, T. Chakraborty, E. Poppleton, L. Monari, M. Illig, F. Giessler, K. Göpfrich: Genetic encoding and expression of RNA origami cytoskeletons in synthetic cells. Nat. Nanotechnol. 2025, 20, 664–671.

[2] C. Guindani, L. C. Da Silva, S. Cao, T. Ivanov, K. Landfester: Synthetic Cells: From Simple Bio‐Inspired Modules to Sophisticated Integrated Systems. Angew Chem Int Ed 2022, 61, e202110855.

[3] C. Geary, G. Grossi, E. K. S. McRae, P. W. K. Rothemund, E. S. Andersen: RNA origami design tools enable cotranscriptional folding of kilobase-sized nanoscaffolds. Nat. Chem. 2021, 13, 549–558.

[4] K. P. Adamala, M. Dogterom, Y. Elani, P. Schwille, M. Takinoue, T.-Y. D. Tang: Present and future of synthetic cell development. Nat Rev Mol Cell Biol 2024, 25, 162–167.

Genetsko kodiranje in izražanje RNA origami citoskeleta v sintetičnih celicah

2025-05-25T13:16:12Z

Maša Karčovnik: Created page with "Izhodiščni članek: [https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/39322757/ Combining systems and synthetic biology for in vivo enzymology] == Uvod == Temeljni cilj sintezne biologije je zgraditi nekaj novega. Pri tem se uporabljata dva pristopa; od zgoraj navzdol in od spodaj navzgor. Cilj pristopa od spodaj navzgor je, iz neživih molekularnih komponent ustvari celico, ki je minimalna enota življenja. Osrednji del teh prizadevanj je reševanje specifičnih inženirskih težav,..."

Izhodiščni članek: [https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/39322757/ Combining systems and synthetic biology for in vivo enzymology]

== Uvod ==
Temeljni cilj sintezne biologije je zgraditi nekaj novega. Pri tem se uporabljata dva pristopa; od zgoraj navzdol in od spodaj navzgor. Cilj pristopa od spodaj navzgor je, iz neživih molekularnih komponent ustvari celico, ki je minimalna enota življenja. Osrednji del teh prizadevanj je reševanje specifičnih inženirskih težav, kot so kompartmentalizacija, oskrba z energijo, metabolizem, replikacija in biosinteza, da bi bile sintetične celice sposobne zgraditi svoje lastne komponente z uporabo intrinzičnega genoma in okoljskih hranil. S tem bi lahko izpolnile zahteve osrednje dogme molekularne biologije, ki pravi, da informacije tečejo od DNA (informacija) do RNA (ojačenje in regulacija) in končno do proteinov (funkcija). Vendar pa osrednja dogma zahteva razvoj relativno zapletenega sistema [1, 2].
Za izdelavo sintetičnih celic se najpogosteje uporabljajo veliki unilamelarni vezikli (ang. Giant unilamellar vesicles, GUV), ki dobro posnemajo celične membrane, so združljivi z membranskimi proteini in omogočajo natančno sintezo z visoko ponovljivostjo. Vendar izražanje proteinov znotraj GUV predstavlja velik izziv zaradi omejenega števila prisotnih proteinov znotraj veziklov in njihovih medsebojnih interakcij, omejenih postranslacijskih modifikacij ter omejene življenjske dobe proteinov. Sintetična celica, ki deluje v skladu s centralno dogmo, zahtevala več kot 150 genov samo za transkripcijsko-translacijski mehanizem. Ena od možnih rešitev je sistema z le enim korakom med genotipom in fenotipom. Nanotehnologija DNA je olajšala ustvarjanje strukturnih in funkcionalnih analogov celičnih proteinov na osnovi nukleinskih kislin, kar predstavlja začetne korake k razvoju sintetičnih celic brez proteinov. Z uporabo nanotehnologije DNA so znanstveniki ustvarili DNA citoskelet, vendar ga sintetične celice zaradi potrebnih temperaturnih sprememb ne morejo same sintetizirati. Poleg tega obstajajo druge omejitve, kot so uporaba DNA kot genetskega in funkcionalnega materiala hkrati in zahteve po kemično funkcionalizirani DNA (na primer s holesterolom za sidranje na membrano), kar dodatno otežuje kodiranje in proizvodnjo teh struktur znotraj veziklov. Možna je sicer enkapsulacija sintetiziranih struktur, kar pa ne izpolnjuje zahteve po avtonomnosti. Rešitev teh težav je citoskelet na osnovi RNA origamija, ki se lahko izraža izotermno neposredno znotraj GUV, ki vsebujejo matrično DNA in RNA-polimerazo. RNA strukture so genetsko kodirane, kar pomeni, da lahko sintetične celice same proizvajajo lastne gradnike v aktivnem, neravnovesnem procesu. S tem pridobimo ločena dva tipa nukleinskih kislin; dvoverižna DNA kot informacijska komponenta in enoverižno RNA kot funkcionalna komponenta [1].
Zasnovali so takšne RNA origami ploščice, ki se same povežejo v mikrometrske, tridimenzionalne RNA origami nanocevke. Mehanizem zlaganja RNA origamija spominja na mehanizem prokariontske ekspresije proteinov; ena sama polimerna veriga, ki jo prepisuje RNA polimeraza, se kotranskripcijsko zloži v lokalne terciarne strukture preko notranjih zank, sledi tvorba kvartarnih struktur med posameznimi molekulami preko robnih zank in nadaljnjo povezovanje v daljše strukture nanocevk. Sorodno kot na proteine je z mutacijami DNA mogoče vplivati na strukturo in delovanje nanocevk [1].

== Eksperiment ==

== Načrtovanje RNA origamija ==
Osnovna zaporedja za RNA origami so prevzeli od Geary C. in sod., 2021, in jih modificirali z uporabo programske opreme RNA Origami Automated Design (ROAD), ki je namenjena 3D-modeliranju RNA struktur, analizi poti zlaganja ter načrtovanju zaporedij in povezovalnih zank, kar omogoča povezovanje v stabilne terciarne strukture. ROAD omogoča hitro izdelavo prototipov več različnih ogrodij in raziskovanje učinkov različnih parametrov načrtovanja s kratkim ciklom načrtovanja ter identificira potencialne ovire za zlaganje in oblikuje optimizirana zaporedja [1, 3].

== Izražanje RNA origamija v raztopini ==
S poskusi izražanja RNA so začeli v raztopni. Da so ugotovili, kako je učinkovitost transkripcije odvisna od koncentracije Mg ionov, so poskus izvedli z različnimi koncentracijami Mg(OAc)2. S poskusi so začeli z dvodimenzionalnim RNA origamijem, ki ima dobro definirano strukturo; posamezna RNA molekula se zloži v tri vijačnice, ki se nato sestavijo v petkotnik. Na 3' konec so dodali iSpinach aptamer (iSpi), ki je odgovoren za aktivacijo barvila DFHBI-1T ob vezavi, kar je omogočilo kvantifikacijo uspešnosti procesa sestavljanja. Poskusi so pokazali, da v 1 mM raztopina Mg2+ ionov niso nastale predvidene strukture, medtem ko so jih v 6 mM raztopini Mg2+ ionov dobili [1].

== Izražanje RNA origamija znotraj GUV ==
Poleg enkapsulacije metrične DNA in RNA-polimeraze znotraj GUV je bilo potrebno zagotoviti, da se transkripcija začne šele znotraj GUV, zato je potreben sprožilec procesa. Zaradi omejenega reakcijskega volumna GUV bi izčrpavanje hranil in kopičenje odpadkov ustavilo transkripcijo, zato so uvedli dva različna kontrolna sistema: omejitev esencialnega kofaktorja Mg2+ in omejitev ribonukleotidov (rNTP). Izbrali so magnezijev ionofor, ki omogoča zaprt membranski sitem brez proteinov in je sposoben prenašati Mg2+ čez membrano z visoko specifičnostjo. Težava so odpadki transkripcijskega procesa, ki ne morejo zapustiti vezikla. Za kombiniran uvoz Mg2+, rNTP-jev in odstranjevanje odpadkov so v membrano vključili bakterijsko transmembransko poro α-hemolizin. S premerom 1,4 nm ta pora omogoča nemoten prehod omenjenih snovi, hkrati pa preprečuje uhajanje večjih struktur, kot so matrična DNA, RNA-polimeraze in RNA origami. V tem primeru so transkripcijo kontrolirali z rNTP-ji, ki so jih dodali v raztopino, ko so želeli, da se transkripcija začne [1].
Nastajanje RNA origamija so spremljali z merjenjem fluorescence iSpi znotraj posameznih GUV s konfokalno mikroskopijo. Intenziteta fluorescence znotraj GUV se je kot pričakovano povečevala v primerjavi z raztopino, kar potrjuje uspešno nastajanje RNA origamija tako znotraj veziklov z magnezijevimi ionoforji kot z α-hemolizinom. Kljub uspešnosti obeh sistemov, se je kontrolni sistem z α-hemolizinom izkazal za uspešnejšega, ker omogoča prehajanje vseh potrebnih ionov in so jih lahko dodali po tem, ko so vezikli že nastali. Ker je tvorba veziklov občutljiva na ione, so s tem dosegli večjo učinkovitost njihove tvorbe [1].

== Ko-transkripcijsko zlaganje RNA origami nanocevk ==
Nato so želeli iz majhnega števila genov ustvariti mikrotubulom podobne strukture velikosti celice, ki se zlagajo kotranskripcijsko. Zasnovali so RNA nanocevke divjega tipa (WT). Nastajanje ploščic WT, skladnih z in silico zasnovanimi, so eksperimentalno potrdili z mikroskopijo na atomsko silo (AFM). Ko-transkripcijsko zložene ploščice so se sestavile v votle nanocevke dolžine do nekaj mikrometrov, ki zaradi močnih interakcij končnih zank RNA nanocevk prenesejo temperature do 50 °C . Nato so zasnovali še ploščice z iSpi, ki so jih dodali na 3' konce monomernih enot, da so lahko nanocevke opazovali s konfokalno mikroskopijo. Potrdili so, da so dobili mreže, podobne citoskeletu, s premerom več deset mikrometrov [1].
Ker je modifikacija posameznih ploščic ključna za ustvarjanje funkcionalnih citoskeletov, so preverili še vpliv dodatka dvoverižne zanke na 3' koncu (dsOV). Izkazalo se je, da dodatek relativno obsežnih zaporedij iSpi in dsOV ne vpliva na dolžino samih ploščic oziroma nanocevk, ampak poveča njihovo fleksibilnost, kar povzroči hitrejši prelom nanocevk [1].

== Fenotipska plastičnost sistema ==
Pri pregledu struktur so v redkih primerih opazili nastanek obročev namesto nanocevk. To so povezali z mutacijami, kar dokazuje fenotipsko plastičnost sistema. S skoraj istim zaporedjem RNA so dobili dva izrazito različna fenotipa, kar nakazuje na številne možnosti za usmerjeno evolucijo [1].

== Izražanje RNA origami citoskeletov v sintetičnih celicah ==
Citoskelet igra ključno vlogo pri uravnavanju oblike in trdnosti celic. Potem ko so zgradili citoskeletu podobne RNA nanocevke, ki se ko-transkripcijsko zlagajo, je bil naslednji korak njihovo izražanje znotraj GUV. Transkripcijo ploščic iSpi znotraj GUV so sprožili z dodajanjem rNTP-jev preko por α-hemolizina. Proces so spremljali s konfokalno mikroskopijo, ki je po šestih urah pokazala pojav mreže RNA origami nanocevk [1].
Na koncu so želeli doseči, da bi se citoskelet vezal na membrano, zato so dodali še biotinski aptamer. Te ploščice so izrazili v GUV s 5 % biotiniliranih lipidov. RNA nanocevke, ki so vsebovale iSpi in biotinske aptamere, so se kot predvideno povezale v mrežo na notranji strani membrane GUV, medtem ko so se nanocevke brez biotinskega aptamera koncentrirale v središču GUV [1].

== Zaključek ==
Sintetične celice imajo pomembno vlogo pri razumevanju delovanja živih sistemov. Imajo pa tudi aplikacije v vsakdanjem življenju. V primerjavi z bioinženirskimi celičnimi sistemi jih je mnogo lažje prilagajati in spreminjati na molekularni ravni, zato imajo potencial uporabe kot odzivna zdravila, ki sproščajo spojine, ko prejmejo signal iz bioloških sistemov. Biomedicinske aplikacije vključujejo zdravljenje raka in nadomestne terapije z encimi. Številni izzivi dela z živimi sistemi, zanje ne veljajo. Pomembna je predvsem njihova robustnost, saj so sposobne prenašati nenaravne in za celico toksične pogoje [4].
Sinteza RNA origami citoskeleta znotraj veziklov predstavlja velik korak k strukturiranju sintetičnih celic. Z nadaljnjimi študijami bi lahko z vključitvijo ribocimov dosegli tudi sintezo molekularnih strojev, ki izvajajo kompleksne celične naloge, znotraj veziklov. Polimerazni ribocimi, bi lahko v tem sistemu nadomestili potrebo po vključitvi proteinske RNA polimeraze v celice. Genetsko kodirana strojna oprema, izdelana iz RNA origamija, bi lahko vodila do novih biofizikalnih orodij za manipulacijo celic in reševanje vprašanj v celični biologiji [1].

== Literatura ==
[1] M. P. Tran, T. Chakraborty, E. Poppleton, L. Monari, M. Illig, F. Giessler, K. Göpfrich: Genetic encoding and expression of RNA origami cytoskeletons in synthetic cells. Nat. Nanotechnol. 2025, 20, 664–671.

[2] C. Guindani, L. C. Da Silva, S. Cao, T. Ivanov, K. Landfester: Synthetic Cells: From Simple Bio‐Inspired Modules to Sophisticated Integrated Systems. Angew Chem Int Ed 2022, 61, e202110855.

[3] C. Geary, G. Grossi, E. K. S. McRae, P. W. K. Rothemund, E. S. Andersen: RNA origami design tools enable cotranscriptional folding of kilobase-sized nanoscaffolds. Nat. Chem. 2021, 13, 549–558.

[4] K. P. Adamala, M. Dogterom, Y. Elani, P. Schwille, M. Takinoue, T.-Y. D. Tang: Present and future of synthetic cell development. Nat Rev Mol Cell Biol 2024, 25, 162–167.

Seminarji SB 2024/25

2025-05-25T13:08:32Z

Maša Karčovnik:

V študijskem letu 2024/25 študenti in študentke pri Sintezni biologiji predstavljajo naslednje teme:

RAZISKOVALNI ČLANKI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) <br>
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Inženiring_umetnih_medvrstnih_promotorjev_z_različnimi_transkripcijskimi_močmi Inženiring umetnih medvrstnih promotorjev z različnimi transkripcijskimi močmi] (Miljan Trajković)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Preprečevanje_nastanka_multimerov_pogosto_uporabljenih_plazmidov_v_sintezni_biologiji Preprečevanje nastanka multimerov pogosto uporabljenih plazmidov v sintezni biologiji] (Lev Jošt)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Priprava_Nicotiane_benthamiane_za_proizvodnjo_krisoeriola_z_uporabo_tehnik_sintezne_biologije Priprava ''Nicotiane benthamiane'' za proizvodnjo krisoeriola z uporabo tehnik sintezne biologije] (Nika Frelih)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Gensko_spremenjeni_receptorji_za_komunikacijo_med_celicami_preko_topnih_signalov_in_zaznavanje_bolezni Gensko spremenjeni receptorji za komunikacijo med celicami preko topnih signalov in zaznavanje bolezni] (Zara Bunc)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Nadzor_nad_izražanjem_heterolognih_genov_pri_Bdellovibrio_bacteriovorus_z_uporabo_sintezne_biologije Nadzor nad izražanjem heterolognih genov pri Bdellovibrio bacteriovorus z uporabo sintezne biologije] (Živa Flego)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Uporaba_konzorcija_kvasovk_za_de_novo_biosintezo_rastlinskih_lignanov Uporaba konzorcija kvasovk za de novo biosintezo rastlinskih lignanov] (Urša Lah)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sonogenetsko_nadzorovane_gensko_spremenjene_celice_za_zdravljenje_raka_v_mišjih_tumorskih_modelih Sonogenetsko nadzorovane gensko spremenjene celice za zdravljenje raka v mišjih tumorskih modelih] (Pia Mencin)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Združitev_difuzijskega_modela_in_transformerja_za_sintezo_izboljšanih_promotorjev_ter_napoved_moči_sintetičnih_promotorjev_z_uporabo_globokega_učenja Združitev difuzijskega modela in transformerja za sintezo izboljšanih promotorjev ter napoved moči sintetičnih promotorjev z uporabo globokega učenja] (Tinkara Korošec)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Z_dvojno_svetlobo_nadzirani_kokulturni_sistem_omogoča_uravnavanje_sestave_populacije Z dvojno svetlobo nadzirani sistem omogoča uravnavanje sestave populacije] (Ula Mikoš)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Načrtovanje_močnih_inducibilnih_sinteznih_promotorjev_v_kvasovkah Načrtovanje močnih inducibilnih sinteznih promotorjev v kvasovkah] (Bor Kunstelj)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Metabolni_inženiring_E._coli_za_izboljšano_produkcijo_diolov_iz_acetata Metabolni inženiring ''E. coli'' za izboljšano produkcijo diolov iz acetata] (Teo Trost)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Inkorporacija_fotosintetsko_aktivnih_kloroplastov_iz_alg_v_kultivirane_celice_sesalcev_kot_pot_k_fotosintezi_pri_Živalih Inkorporacija fotosintetsko aktivnih kloroplastov iz alg v kultivirane celice sesalcev kot pot k fotosintezi pri živalih] (Peter Gričar Vintar)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Izgradnja_metabolične_poti_za_biosintezo_treonina_iz_etilen_glikola Izgradnja metabolične poti za biosintezo treonina iz etilen glikola] (Tinkara Butara)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Povezava_sintezne_in_sistemske_biologije_za_in_vivo_encimatiko Povezava sintezne in sistemske biologije za ''in vivo'' encimatiko] (Gaja Starc)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Nanotelo_proti_Pdc1p_kot_gensko_kodiran_inhibitor_proizvodnje_etanola_omogoča_dvojni_transkripcijski_in_posttranslacijski_nadzor_fermentacije_v_kvasovkah Nanotelo proti Pdc1p kot gensko kodiran inhibitor proizvodnje etanola omogoča dvojni transkripcijski in posttranslacijski nadzor fermentacije v kvasovkah] (Lara Zupanc)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/S_fazno_separacijo_posredovano_sestavljanje_ve%C4%8Dencimskih_kompleksov_in_vivo S fazno separacijo posredovano sestavljanje večencimskih kompleksov ''in vivo''] (Lana Kores)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Umetna_nevronska_mreža_na_proteinski_ravni_v_sesalskih_celicah Umetna nevronska mreža na proteinski ravni v sesalskih celicah] (Gal Kastelic)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Uporaba_sintezne_virologije_za_hitro_inženirstvo_virusa_vezikularnega_stomatitisa_VSV Uporaba sintezne virologije za hitro inženirstvo virusa vezikularnega stomatitisa (VSV)] (Bine Brunec)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Molekularni_inženiring_funkcionalnih_siRNA Molekularni inženiring funkcionalnih siRNA] (Nataša Vujović)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Konstruirane_bakterije_za_z_bli%C5%BEnjo_infrarde%C4%8Do_svetlobo_inducirano_izra%C5%BEanje_protirakavih_terapevtikov Konstruirane bakterije za z bližnjo infrardečo svetlobo inducirano izražanje protirakavih terapevtikov] (Suzana Kučuk)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Genetsko_kodiranje_in_izražanje_RNA_origami_citoskeleta_v_sintetičnih_celicah Genetsko kodiranje in izražanje RNA origami citoskeleta v sintetičnih celicah] (Maša Karčovnik)
NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/SynPlode SynPlode] (Leila Bohorč)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/PETal:_izdelovanje_eteričnega_olja_sandalovine_iz_PET_plastike PETal: izdelovanje eteričnega olja sandalovine iz PET plastike] (Lara Krampač)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/PET_TWINS:_Praktična_uporaba_PETaze_za_učinkovitejše_recikliranje_plastike PET TWINS: Praktična uporaba PETaze za učinkovitejše recikliranje plastike] (Tina Urh)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/CAU-China:_Nodulska_tovarna_DHA_in_EPA CAU-China: Nodulska tovarna DHA in EPA] (Luka Fink)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/nuCloud:_Nov_oblak_za_shranjevanje_podatkov_na_osnovi_nukleotidov nuCloud: Nov oblak za shranjevanje podatkov na osnovi nukleotidov] (Aleš Poljanšek)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Nova_metoda_diagnosticiranja_multiple_skleroze_-_miRADAR Nova metoda diagnosticiranja multiple skleroze - miRADAR] (Petja Premrl)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Biostimulant_za_rast_rastlin_na_Luni_–_BioMoon Biostimulant za rast rastlin na Luni – BioMoon] (Žan Žnidar)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=CAPTURE:_Boj_proti_oku%C5%BEbam_s_Pseudomonas_aeruginosa_z_nosilci_protimikrobnih_peptidov&action=edit&redlink=1 Boj proti okužbam s Pseudomonas aeruginosa z nosilci protimikrobnih peptidov - CAPTURE] (Metka Rus)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/REPARO REPARO] (Lina Kopač)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Tarakate Tarakate] (Pia Špehar)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Heartecho:_presejalni_test_za_raka_pri_pacientih_po_miokardnem_infarktu Heartecho: presejalni test za raka pri pacientih po miokardnem infarktu] (Zarja Doberšek)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Synhesion Synhesion] (Janja Bohte)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Rebolutionaries Rebolutionaries] (Mia Kobal)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/PrymDetect PrymDetect] (Pia Trošt)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/PICasSO: Uporaba CRISPR/Cas v 3D genetskem inženirstvu preko programabilnih interakcij DNA-DNA] (Zarja Weingerl)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/NeoMineX NeoMineX] (Vanja Ivošević)

Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Povzetek je treba objaviti dva dni pred predstavitvijo do polnoči (za seminarje v torek torej najkasneje v ponedeljek). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo približno 5-minutna razprava.

Terminski razpored bo razviden iz preglednice na strežniku Google Drive.

Kako je videti končni seznam seminarjev, lahko preverite pri lanskem letniku: [[Seminarji_SB_2023/24]].

Replikacija DNA pri arhejah

2023-05-13T08:06:43Z

Maša Karčovnik: /* DNA polimeraza */

== Uvod ==

Kot vemo so arhejo bolj sorodne evkariontom kot bakterijam. To se kaže, izmed drugih podobnih lastnosti, ki jih imajo arheje z evkarionti, tudi v njihovi replikacijski mašineriji. Veliko različnih študij pri arhejah, je raziskovalo mesta ori, iniciatorje, markomolekulske komplekse, katere so ključnega pomena za razvitje DNA in sintezo nascentne verige. Rezultati na podlagi različnih organizmov domene arhej, kažejo veliko mero diverzitete. Vse od organizacije celičnega cikla, do ploidnosti kromosomov in replikativne narave polimeraz.

== Regulacija replikacije ==

'''Celični cikelj'''

Regulacija celičnega cikla v arhejah je ključna za natančno podvojevane DNA. Podobno kot pri evkariontih in bakterijah, se tudi v arhejah replikacija DNK usklajeno izvaja z drugimi celičnimi procesi. Aktivacija replikacijskih proteinov in natančen čas replikacije sta ključna za pravilno podvojevane DNA. Celični cikel arhej se lahko razlikuje glede na vrsto. Na splošno vključuje podobne faze kot pri evkariontih in bakterijah. Cikel je razdeljen na predreplikacijsko G1 fazo, S-fazo (kjer se zgodi replikacija genoma), postreplikacijsko G2 fazo ter M in D fazi, ko pride do segregacije genoma in delitve celic. Najdaljša faza je G2, ki traja več kot polovico celičnega cikla. To je v nasprotju z evkarionti, kjer je faza G2 kratka.

'''Regulacija podvojejvanja DNA'''

Regulacija iniciacije podvojevana DNA in vzorec izražanja genov je raznolik tudi med tesno sorodnimi vrstami Arhej, obstaja namreč velika variabilnost v genomu. Večina vrst arhej ima poliploiden zapis DNA, vendar pa nekatere vrste kot je ''Crenarchaeal phylum'' vsebujejo samo en zapis genoma. Pri arheji ''Sulfolobus solfataricus'' je številčnost proteinov Cdc6 specifična glede na celični cikel. Ekspresija Cdc6 se poveča v fazi G1 ali tik pred njo, zmanjša pa se v fazi S in se znatno zmanjša v celicah, ki se ne podvajajo. Pri arheji ''Sulfolobus acidocaldarius'' izražanje Cdc6-1 in Cdc6-3, kot tudi njuna vezava na izvoru, ostaja konstantno v celotnem celičnem ciklu, tudi v fazi, ko se ne delijo.

Med vrstami arhej prihaja tudi do velike raznolikosti v številu mest začetka replikacije. Več izvorov replikacije na kromosom poveča kompleksnost regulacije iniciacije replikacije. Pri ''Sulfolobus acidocaldarius'', vrsti s tremi izvori replikacije na kromosom, obstaja tesna koordinacija začetkov dveh izvorov replikacije (oriC1 in oriC3) na začetku S-faze, medtem ko se tretji izvor, oriC2, aktivira nekoliko kasneje. Mehanizmi, ki zagotavljajo sočasen pričetek replikacije, niso znani.

== Luka ==

Za vse, do sedaj opisane bakterije, velja da imajo en ori na kromosom. Veliko arhejskih genomov je sestavljenih podobno kot pri bakterijah, tj. iz glavnega kromosoma, lahko pa tudi vsebuje nekaj megaplazmidov. Prva opisana iniciacija replikacije pri arhejah je bila pri Pyrococcus abyssi. Odkrili so, da ima en ori. Kljub temu prvemu odkritju, je v bistvu ta arheja je neke vrste anomalija, saj v resnici imajo lahko arheje več ori mest na kromosom. Npr. Haloferax ima tri in Pyrobaculum calidifontis ima štiri ori mesta na kromosom. Pomemben testen sev je Sulfolobus, ki ima tri ori mesta. Dokazano je bilo, da divje celice tega seva uporabljajo vse tri ori-je in da noben ori ni individualno potreben za normalno podvojevanje.

Veliko arhej si deli podoben tip ori. Pri sevu Sulfolobus imamo Orc1-1, ki se veže na oriC1. Bolj natančno se veže na elemente znotraj ori-ja, ki se imenujejo origin recognition box (ORB) elements. (Slika 1). Elementi ORB imajo diadno simetrijo z asimetričnim zaporedjem, bogatim z G na eni strani diadnega elementa. Na vsak element ORB se veže en monomer Orc1-1 z določeno polarnostjo. Proteini Orc1/Cdc6 imajo N-končno AAA+ zvitje in C-končno domeno imenovano winged helix (wH). AAA+ je velika družina NTPaz, torej vsebujejo NTP vezavno domeno in katalitičen modul. Domeno wH najdemo pri transkripcijskih sistemih in predstavlja podrazred motiva helix-turn-helix. Domena wH prepoznava diadni element ORB-ja in domeno AAA+, ki je bogata z α-vijačnicami, imenovana iniciator specifičen motiv (ISM). ISM prepozna asimetričen z G bogat motiv. Število elementov ORB se med vrstami razlikuje. Skupna značilnost je, da se dva elementa ORB pojavljata v obrnjeni konformaciji glede eden na drugega in sta ločena minimalno 75 bp. To so običajno z AT bogate regije, torej so kandidat za DNA unwinding element (DUE). In vitro rekonstrukcijski eksperimenti so pokazali, da Orc1-1 rekrutira helikazo na oriC1 in le ta je odvisna od površine, ki je izpostavljena α-vijačni regiji (MCM recruitment motif, MRM) blizu wH Orc1-1 AAA+ domene. Na to interakcijo je pomembno vplival nukleotidni kofaktor, ki se veže na Orc1-1 AAA+ domeno. Bolj specifično, stabilizirali so ATP v aktivnem mestu, npr. z mutacijo domene AAA+, motiv Walker B, ak ostanek glutamat (E147), ostanka udeleženega pri hidrolizi ATP. Ugotovili so, da bi lahko Orc1-1 E147 pomagal pri vezavi MCM in vitro in pomagal pri oriC1 replikaciji in vivo. Po drugi strani, ko je bilo aktivno mesto zasedeno z ADP, je zmožnost interakcije MRM z MCM opuščena. Ta opažanja kažejo na to, da je aktivacija ori mesta odvisna od vezanega ATP na Orc1-1.

Pri evkariontih je ključni korak iniciacije DNA replikacije asociacija kompleksa Cds45, MCM GINS. Podobno je pri arhejah. Pri Sulfolobus acidocaldarius so rekonstruirali kompleks iz Gins23, Gins15 in Cdc45, ki so ortologi evkariontskih, in ugotovili da so v razmerju 2:2:2. (Slika 2). Bistvo je, da so ugotovili, da GINS tvori pomembno povezavo med MCM in Cdc45.

== Arhejska primaza ==

'''Delovanje primaze'''

Arhejska primaza je nizko procesivna RNA polimeraza, ki za model sinteze uporabi enojno vijačnico znotraj replikacijskega mehurčka in je zadolžena za sintezo oligoribonukleotidnega primerja. Oligoribonukleotidni primer običajno vsebuje 10 do 12 nukleotidov, ki so komplementarni nukleotidom na matični verigi DNK in služi kot začetna točka podaljševanja nove verige za DNA polimerazo. Pri sintezi vodilne verige je primazna aktivnost potrebna le enkrat. Na zastajajoči verigi pa je primazna aktivnost konstanta, saj se Okazakijev fragment začne na vsakih 100-200 nukleotidov, kar zahteva ponavljajočo se primazno aktivnost. V arhejah ''Sulfolobusu'', je bilo dokazano, da primaza interagira s kompleksom GINS, kar ponuja mehanizem za koordinirano aktivnost sinteze primerjev z potekom replikacije v replikacijskih vilicah. Kompleks GINS pomaga pri odvijanju dvojne vijačnice DNK in s tem ustvarja smerno napredujočo replikacijsko vilico, ki omogoča, da primaza sintetizira prajmerje na pravem mestu.

'''Zgradba primaze'''

Arhejska primaza ima dve podenoti, katalitična podenote PriS in regulatorne podenote PriL, ki sta skupna vsem vrstam arhej. PriS in PriL v arhejah sta ortologna primaznemu kompleksu DNA-polimeraze α primaze v evkariotskih celicah, zato se PriSL imenuje tudi arhejska evkariontska primaza (AEP). Proteini sorodni AEP so bili najdeni v izvenkromosomskih proteinih tako evkariontih kot tudi v bakterijskih celicah. PriSL je bil biokemično opisani pri številnih vrstah arhej in je pokazal sposobnost začetne sinteze tako RNA kot tudi DNA. Študije na primzah arhejah ''Archaeoglobus'' in ''Pyrococcus'' so pokazale, da ima primaza vlogo tudi pri popravilu DNA. Pri proučevanju arheje ''Sulfolobus'' so ugotovili, da poleg PriS in PriL ima primaza še tretjo podenoto PriX. PriX naj bi signifikantno povečala procesivnosti encima in stabilizirala celoten kompleks. Kompleks bi tako tvoril heterotrimer. Študije so pokazale, da sta podenoti PriX in PriL v arhejah skupaj strukturno enaki podenoti PriL v evkariontih. Na človeškem PriL je bilo dokazano, da interagira z 5' koncem RNA primerjem v na modelni verigi. Pri arhejah pa s 5' koncem interagira PriX in tako služi kot vezavno mesto za začetni nukleotid pri sintezi primerja.

== DNA polimeraza ==

V poznih devetdesetih so ugotovili, da imajo prave arheje DNA polimerazo (DNAP), ki se filogenetsko razlikuje od vseh do takrat znanih celičnih DNA polimeraz, zato so jo umestili v novo družino, imenovano družina polimeraz D (PolD). PolD je heterodimerni protein, sestavljen iz dveh podenot (proteinov DP1 in DP2) z vsemi funkcijskimi značilnostmi replikacijske DNAP, vendar s katalitskim jedrom RNA polimeraze (RNAP). Kasneje so potrdili, da so polimeraze iz te družine v vseh vrstah arhej razen v krenarhejah. Številne arheje vsebujejo tudi DNAP, ki pripada družini polimeraz B (PolB). Izkazalo se je, da je PolD replikacijska polimeraza, ki je ključna komponenta arhealnega riplosoma, saj je odgovorna za iniciacijo replikacije DNA tako na vodilni kot tudi zastajajojoči verigi. Sestavljena je iz velike katalitske podenote DP2 in majhne podenote DP1 s 3′ → 5′ eksonukleazno aktivnostjo, ki služi kontrolnemu branju. PolB večinoma niso nepogrešljive za preživetje arheje, vendar se njihova vloga v celicah razlikuje, na primer: PolB1 ima pomembno vlogo pri povečanje učinkovitosti zorenja Okazakijevih fragmentov, saj preprečuje nepotrebno ponovno sintezo DNA med samim procesom.

'''Podenota DP1'''

Ugotovili so, da podenota DP1 pripada družini fosfodiestraz, njeno aktivno mesto pa je edinstveno za družino PolD. Analize aminokislinskega zaporedja so pokazale, da je podenota DP1 podobna majhni podenoti evkariontske DNA polimeraze δ (iz družine polimeraz B), ki je esencialna za replikacijo evkariontskih celic. Hkrati je tudi struktura DP1 tesno povezana s podenoto B evkariontskih PolB, ki je sicer izgubila katalitsko mesto, povezano z eksonukleazno aktivnostjo, kar nakazuje, da bi se lahko polimeraze B razvile iz polimeraz D.
DP1 je sestavljena iz dveh domen: oligonukleotid vezavne domene (OB) in N-končne nukleazne fosfodiestrske domene (PDE), ki jo sicer najdemo v številnih hidrolazah, vendar je funkcija, povezana s kontrolnim branjem DNAP, specifična samo za PolD. Njeno aktivno mest je obrnjeno proti 3' koncu nastajajoče verige DNA.

'''Podenota DP2'''

Katalitska podenota DP2 je edinstvena za družino encimov PolD, saj pri analizah poravnav zaporedij in struktur niso našli dobrega ujemanja z ostalimi proteini. Vsebuje le posamezne motive, ki so značilni za katalitske podenote RNA polimeraz (RNAP). Od ostalih polimeraz se razlikuje tudi v katalitskem središču, ki je običajno v tako imenovani domeni dlani in jo delimo na dva podtipa glede na topologijo strukture aktivnega mesta. Lahko so tipa Klenow ali Polβ-podobno, medtem ko imajo PolD specifično dvojno psi β-sodčasto zvitje, ki je značilno za RNAP. Torej PolD spada v novo družino polimeraz, ki lahko vršijo od DNA odvisno sintezo RNA ali DNA oziroma od RNA odvisno sintezo RNA, kar prvič združi DNA replikacijo in transkripcijo znotraj iste družine proteinov. Drsna vponka je sestavljena iz dveh polipeptidnih, in sicer drsne vponke 1 in drsne vponke 2, ki tvorita osrednjo votlino s premerom 30 Å, in popolnoma obdata DNA. Drsna vponka 1, ki je sestavljen iz petih alfa-vijačnic in domene Zn-III, je z ene strani obrnjen proti katalitskemu centru polimeraze, z druge strani pa proti katalitskemu centru nukleaze. DP2 se z DP1 poveže na C-končni strani preko Zn-povezovalne domene. Ta povezave je potrebna za konformacijsko spremembo DP2 katalitske domene, ki sicer ne bi bila aktivna. Drsna vponka 2 je večinoma sestavljen iz štirih alfa-vijačnic, ki tvorijo elektro pozitivno območje, potrebno za interakcijo z novonastalo DNA. Domeni Zn-I in Zn-II prispevata predvsem k stabilizaciji drsne vponke 2. Afiniteta PolD za dvoverižno DNA je šibkejša kot za enoverižno DNA, kar nakazuje, da se PolD prednostno veže na matrično DNA, zato predvidevajo, da se PolD vključi hitro za iniciacijo primaze, v kasnejši stopnji pa se zgodi zamenjava, tako da PolB postane odgovorna za replikacijo vodilne verige, medtem ko PolD nadaljuje z replikacijo zastajajoče verige.

== Viri ==

1. AUSIANNIKAVA, Darya in ALLERS, Thorsten, 2017. Diversity of DNA Replication in the Archaea. Genes. 31 januar 2017. Vol. 8, no. 2, pp. 56. DOI 10.3390/genes8020056.

2. GRECI, Mark D. in BELL, Stephen D., 2020a. Archaeal DNA Replication. Annual review of microbiology. 8 september 2020. Vol. 74, pp. 65–80. DOI 10.1146/annurev-micro-020518-115443.

3. LINDÅS, Ann-Christin in BERNANDER, Rolf, 2013. The cell cycle of archaea. Nature Reviews Microbiology. september 2013. Vol. 11, no. 9, pp. 627–638. DOI 10.1038/nrmicro3077.

4. RAIA, Pierre, CARRONI, Marta, HENRY, Etienne, PEHAU-ARNAUDET, Gérard, BRÛLÉ, Sébastien, BÉGUIN, Pierre, HENNEKE, Ghislaine, LINDAHL, Erik, DELARUE, Marc in SAUGUET, Ludovic, 2019. Structure of the DP1–DP2 PolD complex bound with DNA and its implications for the evolutionary history of DNA and RNA polymerases. PLoS Biology. 18 januar 2019. Vol. 17, no. 1, pp. e3000122. DOI 10.1371/journal.pbio.3000122.

5. Shared active site architecture between archaeal PolD and multi-subunit RNA polymerases revealed by X-ray crystallography - PMC, brez datuma. na spletu. [Pridobljeno 10 maj 2023]. Pridobljeno s: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4996933/#S1

Talk:Replikacija DNA pri arhejah

2023-05-13T07:59:42Z

Maša Karčovnik:

Primož Šenica Pavletič (Regulacija replikacije, Arhejska primaza)

Maša Karčovnik (DNA polimeraza)

Talk:Replikacija DNA pri arhejah

2023-05-13T07:59:17Z

Maša Karčovnik:

Primož Šenica Pavletič (Regulacija replikacije, Arhejska primaza)
Maša Karčovnik (DNA polimeraza)

Replikacija DNA pri arhejah

2023-05-13T07:57:10Z

Maša Karčovnik: /* DNA polimeraza */

== Uvod ==

Kot vemo so arhejo bolj sorodne evkariontom kot bakterijam. To se kaže, izmed drugih podobnih lastnosti, ki jih imajo arheje z evkarionti, tudi v njihovi replikacijski mašineriji. Veliko različnih študij pri arhejah, je raziskovalo mesta ori, iniciatorje, markomolekulske komplekse, katere so ključnega pomena za razvitje DNA in sintezo nascentne verige. Rezultati na podlagi različnih organizmov domene arhej, kažejo veliko mero diverzitete. Vse od organizacije celičnega cikla, do ploidnosti kromosomov in replikativne narave polimeraz.

== Regulacija replikacije ==

'''Celični cikelj'''

Regulacija celičnega cikla v arhejah je ključna za natančno podvojevane DNA. Podobno kot pri evkariontih in bakterijah, se tudi v arhejah replikacija DNK usklajeno izvaja z drugimi celičnimi procesi. Aktivacija replikacijskih proteinov in natančen čas replikacije sta ključna za pravilno podvojevane DNA. Celični cikel arhej se lahko razlikuje glede na vrsto. Na splošno vključuje podobne faze kot pri evkariontih in bakterijah. Cikel je razdeljen na predreplikacijsko G1 fazo, S-fazo (kjer se zgodi replikacija genoma), postreplikacijsko G2 fazo ter M in D fazi, ko pride do segregacije genoma in delitve celic. Najdaljša faza je G2, ki traja več kot polovico celičnega cikla. To je v nasprotju z evkarionti, kjer je faza G2 kratka.

'''Regulacija podvojejvanja DNA'''

Regulacija iniciacije podvojevana DNA in vzorec izražanja genov je raznolik tudi med tesno sorodnimi vrstami Arhej, obstaja namreč velika variabilnost v genomu. Večina vrst arhej ima poliploiden zapis DNA, vendar pa nekatere vrste kot je ''Crenarchaeal phylum'' vsebujejo samo en zapis genoma. Pri arheji ''Sulfolobus solfataricus'' je številčnost proteinov Cdc6 specifična glede na celični cikel. Ekspresija Cdc6 se poveča v fazi G1 ali tik pred njo, zmanjša pa se v fazi S in se znatno zmanjša v celicah, ki se ne podvajajo. Pri arheji ''Sulfolobus acidocaldarius'' izražanje Cdc6-1 in Cdc6-3, kot tudi njuna vezava na izvoru, ostaja konstantno v celotnem celičnem ciklu, tudi v fazi, ko se ne delijo.

Med vrstami arhej prihaja tudi do velike raznolikosti v številu mest začetka replikacije. Več izvorov replikacije na kromosom poveča kompleksnost regulacije iniciacije replikacije. Pri ''Sulfolobus acidocaldarius'', vrsti s tremi izvori replikacije na kromosom, obstaja tesna koordinacija začetkov dveh izvorov replikacije (oriC1 in oriC3) na začetku S-faze, medtem ko se tretji izvor, oriC2, aktivira nekoliko kasneje. Mehanizmi, ki zagotavljajo sočasen pričetek replikacije, niso znani.

== Luka ==

Za vse, do sedaj opisane bakterije, velja da imajo en ori na kromosom. Veliko arhejskih genomov je sestavljenih podobno kot pri bakterijah, tj. iz glavnega kromosoma, lahko pa tudi vsebuje nekaj megaplazmidov. Prva opisana iniciacija replikacije pri arhejah je bila pri Pyrococcus abyssi. Odkrili so, da ima en ori. Kljub temu prvemu odkritju, je v bistvu ta arheja je neke vrste anomalija, saj v resnici imajo lahko arheje več ori mest na kromosom. Npr. Haloferax ima tri in Pyrobaculum calidifontis ima štiri ori mesta na kromosom. Pomemben testen sev je Sulfolobus, ki ima tri ori mesta. Dokazano je bilo, da divje celice tega seva uporabljajo vse tri ori-je in da noben ori ni individualno potreben za normalno podvojevanje.

Veliko arhej si deli podoben tip ori. Pri sevu Sulfolobus imamo Orc1-1, ki se veže na oriC1. Bolj natančno se veže na elemente znotraj ori-ja, ki se imenujejo origin recognition box (ORB) elements. (Slika 1). Elementi ORB imajo diadno simetrijo z asimetričnim zaporedjem, bogatim z G na eni strani diadnega elementa. Na vsak element ORB se veže en monomer Orc1-1 z določeno polarnostjo. Proteini Orc1/Cdc6 imajo N-končno AAA+ zvitje in C-končno domeno imenovano winged helix (wH). AAA+ je velika družina NTPaz, torej vsebujejo NTP vezavno domeno in katalitičen modul. Domeno wH najdemo pri transkripcijskih sistemih in predstavlja podrazred motiva helix-turn-helix. Domena wH prepoznava diadni element ORB-ja in domeno AAA+, ki je bogata z α-vijačnicami, imenovana iniciator specifičen motiv (ISM). ISM prepozna asimetričen z G bogat motiv. Število elementov ORB se med vrstami razlikuje. Skupna značilnost je, da se dva elementa ORB pojavljata v obrnjeni konformaciji glede eden na drugega in sta ločena minimalno 75 bp. To so običajno z AT bogate regije, torej so kandidat za DNA unwinding element (DUE). In vitro rekonstrukcijski eksperimenti so pokazali, da Orc1-1 rekrutira helikazo na oriC1 in le ta je odvisna od površine, ki je izpostavljena α-vijačni regiji (MCM recruitment motif, MRM) blizu wH Orc1-1 AAA+ domene. Na to interakcijo je pomembno vplival nukleotidni kofaktor, ki se veže na Orc1-1 AAA+ domeno. Bolj specifično, stabilizirali so ATP v aktivnem mestu, npr. z mutacijo domene AAA+, motiv Walker B, ak ostanek glutamat (E147), ostanka udeleženega pri hidrolizi ATP. Ugotovili so, da bi lahko Orc1-1 E147 pomagal pri vezavi MCM in vitro in pomagal pri oriC1 replikaciji in vivo. Po drugi strani, ko je bilo aktivno mesto zasedeno z ADP, je zmožnost interakcije MRM z MCM opuščena. Ta opažanja kažejo na to, da je aktivacija ori mesta odvisna od vezanega ATP na Orc1-1.

Pri evkariontih je ključni korak iniciacije DNA replikacije asociacija kompleksa Cds45, MCM GINS. Podobno je pri arhejah. Pri Sulfolobus acidocaldarius so rekonstruirali kompleks iz Gins23, Gins15 in Cdc45, ki so ortologi evkariontskih, in ugotovili da so v razmerju 2:2:2. (Slika 2). Bistvo je, da so ugotovili, da GINS tvori pomembno povezavo med MCM in Cdc45.

== Arhejska primaza ==

'''Delovanje primaze'''

Arhejska primaza je nizko procesivna RNA polimeraza, ki za model sinteze uporabi enojno vijačnico znotraj replikacijskega mehurčka in je zadolžena za sintezo oligoribonukleotidnega primerja. Oligoribonukleotidni primer običajno vsebuje 10 do 12 nukleotidov, ki so komplementarni nukleotidom na matični verigi DNK in služi kot začetna točka podaljševanja nove verige za DNA polimerazo. Pri sintezi vodilne verige je primazna aktivnost potrebna le enkrat. Na zastajajoči verigi pa je primazna aktivnost konstanta, saj se Okazakijev fragment začne na vsakih 100-200 nukleotidov, kar zahteva ponavljajočo se primazno aktivnost. V arhejah ''Sulfolobusu'', je bilo dokazano, da primaza interagira s kompleksom GINS, kar ponuja mehanizem za koordinirano aktivnost sinteze primerjev z potekom replikacije v replikacijskih vilicah. Kompleks GINS pomaga pri odvijanju dvojne vijačnice DNK in s tem ustvarja smerno napredujočo replikacijsko vilico, ki omogoča, da primaza sintetizira prajmerje na pravem mestu.

'''Zgradba primaze'''

Arhejska primaza ima dve podenoti, katalitična podenote PriS in regulatorne podenote PriL, ki sta skupna vsem vrstam arhej. PriS in PriL v arhejah sta ortologna primaznemu kompleksu DNA-polimeraze α primaze v evkariotskih celicah, zato se PriSL imenuje tudi arhejska evkariontska primaza (AEP). Proteini sorodni AEP so bili najdeni v izvenkromosomskih proteinih tako evkariontih kot tudi v bakterijskih celicah. PriSL je bil biokemično opisani pri številnih vrstah arhej in je pokazal sposobnost začetne sinteze tako RNA kot tudi DNA. Študije na primzah arhejah ''Archaeoglobus'' in ''Pyrococcus'' so pokazale, da ima primaza vlogo tudi pri popravilu DNA. Pri proučevanju arheje ''Sulfolobus'' so ugotovili, da poleg PriS in PriL ima primaza še tretjo podenoto PriX. PriX naj bi signifikantno povečala procesivnosti encima in stabilizirala celoten kompleks. Kompleks bi tako tvoril heterotrimer. Študije so pokazale, da sta podenoti PriX in PriL v arhejah skupaj strukturno enaki podenoti PriL v evkariontih. Na človeškem PriL je bilo dokazano, da interagira z 5' koncem RNA primerjem v na modelni verigi. Pri arhejah pa s 5' koncem interagira PriX in tako služi kot vezavno mesto za začetni nukleotid pri sintezi primerja.

== DNA polimeraza ==

V poznih devetdesetih so ugotovili, da imajo prave arheje DNA polimerazo (DNAP), ki se filogenetsko razlikuje od vseh do takrat znanih celičnih DNA polimeraz, zato so jo umestili v novo družino, imenovano družina polimeraz D (PolD). PolD je heterodimerni protein, sestavljen iz dveh podenot (proteinov DP1 in DP2) z vsemi funkcijskimi značilnostmi replikacijske DNAP, vendar s katalitskim jedrom RNA polimeraze (RNAP). Kasneje so potrdili, da so polimeraze iz te družine v vseh vrstah arhej razen v krenarhejah. Številne arheje vsebujejo tudi DNAP, ki pripada družini polimeraz B (PolB). Izkazalo se je, da je PolD replikacijska polimeraza, ki je ključna komponenta arhealnega riplosoma, saj je odgovorna za iniciacijo replikacije DNA tako na vodilni kot tudi zastajajojoči verigi. Sestavljena je iz velike katalitske podenote DP2 in majhne podenote DP1 s 3′ → 5′ eksonukleazno aktivnostjo, ki služi kontrolnemu branju. PolB večinoma niso nepogrešljive za preživetje arheje, vendar se njihova vloga v celicah razlikuje, na primer: PolB1 ima pomembno vlogo pri povečanje učinkovitosti zorenja Okazakijevih fragmentov, saj preprečuje nepotrebno ponovno sintezo DNA med samim procesom.

'''Podenota DP1'''

Ugotovili so, da podenota DP1 pripada družini fosfodiestraz, njeno aktivno mesto pa je edinstveno za družino PolD. Analize aminokislinskega zaporedja so pokazale, da je podenota DP1 podobna majhni podenoti evkariontske DNA polimeraze δ (iz družine polimeraz B), ki je esencialna za replikacijo evkariontskih celic. Hkrati je tudi struktura DP1 tesno povezana s podenoto B evkariontskih PolB, ki je sicer izgubila katalitsko mesto, povezano z eksonukleazno aktivnostjo, kar nakazuje, da bi se lahko polimeraze B razvile iz polimeraz D.
DP1 je sestavljena iz dveh domen: oligonukleotid vezavne domene (OB) in N-končne nukleazne fosfodiestrske domene (PDE), ki jo sicer najdemo v številnih hidrolazah, vendar je funkcija, povezana s kontrolnim branjem DNAP, specifična samo za PolD. Njeno aktivno mest je obrnjeno proti 3' koncu nastajajoče verige DNA.

'''Podenota DP2'''

Katalitska podenota DP2 je edinstvena za družino encimov PolD, saj pri analizah poravnav zaporedij in struktur niso našli dobrega ujemanja z ostalimi proteini. Vsebuje le posamezne motive, ki so značilni za katalitske podenote RNA polimeraz (RNAP). Od ostalih polimeraz se razlikuje tudi v katalitskem središču, ki je običajno v tako imenovani domeni dlani in jo delimo na dva podtipa glede na topologijo strukture aktivnega mesta. Lahko so tipa Klenow ali Polβ-podobno, medtem ko imajo PolD specifično dvojno psi β-sodčasto zvitje, ki je značilno za RNAP. Torej PolD spada v novo družino polimeraz, ki lahko vršijo od DNA odvisno sintezo RNA ali DNA oziroma od RNA odvisno sintezo RNA, kar prvič združi DNA replikacijo in transkripcijo znotraj iste družine proteinov. Drsna vponka je sestavljena iz dveh polipeptidnih, in sicer drsne vponke 1 in drsne vponke 2, ki tvorita osrednjo votlino s premerom 30 Å, in popolnoma obdata DNA. Drsna vponka 1, ki je sestavljen iz petih alfa-vijačnic in domene Zn-III, je z ene strani obrnjen proti katalitskemu centru polimeraze, z druge strani pa proti katalitskemu centru nukleaze. Domena Zn-III in beta-list, ki povezujejo domeno Zn-III z alfa vijačnicami, imata popolno obliko za interakcijo z majhnim žlebom nastajajoče DNA. DP2 se z DP1 poveže na C-končni strani preko Zn-povezovalne domene. Ta povezave je potrebna za konformacijsko spremembo DP2 katalitske domene, ki sicer ne bi bila aktivna. Drsna vponka 2 je večinoma sestavljen iz štirih alfa-vijačnic, ki tvorijo elektro pozitivno območje, potrebno za interakcijo z novonastalo DNA. Domeni Zn-I in Zn-II prispevata predvsem k stabilizaciji drsne vponke 2. Afiniteta PolD za dvoverižno DNA je šibkejša kot za enoverižno DNA, kar nakazuje, da se PolD prednostno veže na matrično DNA, zato predvidevajo, da se PolD vključi hitro za iniciacijo primaze, v kasnejši stopnji pa se zgodi zamenjava, tako da PolB postane odgovorna za replikacijo vodilne verige, medtem ko PolD nadaljuje z replikacijo zastajajoče verige.

== Viri ==

1. AUSIANNIKAVA, Darya in ALLERS, Thorsten, 2017. Diversity of DNA Replication in the Archaea. Genes. 31 januar 2017. Vol. 8, no. 2, pp. 56. DOI 10.3390/genes8020056.

2. GRECI, Mark D. in BELL, Stephen D., 2020a. Archaeal DNA Replication. Annual review of microbiology. 8 september 2020. Vol. 74, pp. 65–80. DOI 10.1146/annurev-micro-020518-115443.

3. LINDÅS, Ann-Christin in BERNANDER, Rolf, 2013. The cell cycle of archaea. Nature Reviews Microbiology. september 2013. Vol. 11, no. 9, pp. 627–638. DOI 10.1038/nrmicro3077.

4. RAIA, Pierre, CARRONI, Marta, HENRY, Etienne, PEHAU-ARNAUDET, Gérard, BRÛLÉ, Sébastien, BÉGUIN, Pierre, HENNEKE, Ghislaine, LINDAHL, Erik, DELARUE, Marc in SAUGUET, Ludovic, 2019. Structure of the DP1–DP2 PolD complex bound with DNA and its implications for the evolutionary history of DNA and RNA polymerases. PLoS Biology. 18 januar 2019. Vol. 17, no. 1, pp. e3000122. DOI 10.1371/journal.pbio.3000122.

5. Shared active site architecture between archaeal PolD and multi-subunit RNA polymerases revealed by X-ray crystallography - PMC, brez datuma. na spletu. [Pridobljeno 10 maj 2023]. Pridobljeno s: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4996933/#S1

Replikacija DNA pri arhejah

2023-05-11T15:58:27Z

Maša Karčovnik:

== Uvod ==

Kot vemo so arhejo bolj sorodne evkariontom kot bakterijam. To se kaže, izmed drugih podobnih lastnosti, ki jih imajo arheje z evkarionti, tudi v njihovi replikacijski mašineriji. Veliko različnih študij pri arhejah, je raziskovalo mesta ori, iniciatorje, markomolekulske komplekse, katere so ključnega pomena za razvitje DNA in sintezo nascentne verige. Rezultati na podlagi različnih organizmov domene arhej, kažejo veliko mero diverzitete. Vse od organizacije celičnega cikla, do ploidnosti kromosomov in replikativne narave polimeraz.

== Regulacija replikacije ==

Regulacija celičnega cikla v arhejah je ključna za natančno podvojevane DNA. Podobno kot pri evkariontih in bakterijah, se tudi v arhejah replikacija DNK usklajeno izvaja z drugimi celičnimi procesi. Aktivacija replikacijskih proteinov in natančen čas replikacije sta ključna za pravilno podvojevane DNK. Celični cikel arhej se lahko razlikuje glede na vrsto. Na splošno vključuje podobne faze kot pri evkariontih in bakterijah. Cikel je razdeljen na predreplikacijsko G1 fazo, S-fazo (kjer se zgodi replikacija genoma), postreplikacijsko G2 fazo ter M in D fazi, ko pride do segregacije genoma in delitve celic. Najdaljša faza je G2, ki traja več kot polovico celičnega cikla. To je v nasprotju z evkarionti, kjer je faza G2 kratka.

Regulacija iniciacije podvojevana DNA in vzorec izražanja genov je raznolik tudi med tesno sorodnimi vrstami Arhej, obstaja namreč velika variabilnost v genomu. Večina vrst arhej ima poliploiden zapis DNA, vendar pa nekatere vrste kot je ''Crenarchaeal phylum'' vsebujejo samo en zapis genoma. Pri arheji ''Sulfolobus solfataricus'' je številčnost proteinov Cdc6 specifična glede na celični cikel. Ekspresija Cdc6 se poveča v fazi G1 ali tik pred njo, zmanjša pa se v fazi S in se znatno zmanjša v celicah, ki se ne podvajajo. Pri arheji ''Sulfolobus acidocaldarius'' izražanje Cdc6-1 in Cdc6-3, kot tudi njuna vezava na izvoru, ostaja konstantno v celotnem celičnem ciklu, tudi v fazi, ko se ne delijo.

Med vrstami arhej prihaja tudi do velike raznolikosti v številu mest začetka replikacije. Več izvorov replikacije na kromosom poveča kompleksnost regulacije iniciacije replikacije. Pri ''Sulfolobus acidocaldarius'', vrsti s tremi izvori replikacije na kromosom, obstaja tesna koordinacija začetkov dveh izvorov replikacije (oriC1 in oriC3) na začetku S-faze, medtem ko se tretji izvor, oriC2, aktivira nekoliko kasneje. Mehanizmi, ki zagotavljajo sočasen pričetek replikacije, niso znani.

== Luka ==

Za vse, do sedaj opisane bakterije, velja da imajo en ori na kromosom. Veliko arhejskih genomov je sestavljenih podobno kot pri bakterijah, tj. iz glavnega kromosoma, lahko pa tudi vsebuje nekaj megaplazmidov. Prva opisana iniciacija replikacije pri arhejah je bila pri Pyrococcus abyssi. Odkrili so, da ima en ori. Kljub temu prvemu odkritju, je v bistvu ta arheja je neke vrste anomalija, saj v resnici imajo lahko arheje več ori mest na kromosom. Npr. Haloferax ima tri in Pyrobaculum calidifontis ima štiri ori mesta na kromosom. Pomemben testen sev je Sulfolobus, ki ima tri ori mesta. Dokazano je bilo, da divje celice tega seva uporabljajo vse tri ori-je in da noben ori ni individualno potreben za normalno podvojevanje.

Veliko arhej si deli podoben tip ori. Pri sevu Sulfolobus imamo Orc1-1, ki se veže na oriC1. Bolj natančno se veže na elemente znotraj ori-ja, ki se imenujejo origin recognition box (ORB) elements. (Slika 1). Elementi ORB imajo diadno simetrijo z asimetričnim zaporedjem, bogatim z G na eni strani diadnega elementa. Na vsak element ORB se veže en monomer Orc1-1 z določeno polarnostjo. Proteini Orc1/Cdc6 imajo N-končno AAA+ zvitje in C-končno domeno imenovano winged helix (wH). AAA+ je velika družina NTPaz, torej vsebujejo NTP vezavno domeno in katalitičen modul. Domeno wH najdemo pri transkripcijskih sistemih in predstavlja podrazred motiva helix-turn-helix. Domena wH prepoznava diadni element ORB-ja in domeno AAA+, ki je bogata z α-vijačnicami, imenovana iniciator specifičen motiv (ISM). ISM prepozna asimetričen z G bogat motiv. Število elementov ORB se med vrstami razlikuje. Skupna značilnost je, da se dva elementa ORB pojavljata v obrnjeni konformaciji glede eden na drugega in sta ločena minimalno 75 bp. To so običajno z AT bogate regije, torej so kandidat za DNA unwinding element (DUE). In vitro rekonstrukcijski eksperimenti so pokazali, da Orc1-1 rekrutira helikazo na oriC1 in le ta je odvisna od površine, ki je izpostavljena α-vijačni regiji (MCM recruitment motif, MRM) blizu wH Orc1-1 AAA+ domene. Na to interakcijo je pomembno vplival nukleotidni kofaktor, ki se veže na Orc1-1 AAA+ domeno. Bolj specifično, stabilizirali so ATP v aktivnem mestu, npr. z mutacijo domene AAA+, motiv Walker B, ak ostanek glutamat (E147), ostanka udeleženega pri hidrolizi ATP. Ugotovili so, da bi lahko Orc1-1 E147 pomagal pri vezavi MCM in vitro in pomagal pri oriC1 replikaciji in vivo. Po drugi strani, ko je bilo aktivno mesto zasedeno z ADP, je zmožnost interakcije MRM z MCM opuščena. Ta opažanja kažejo na to, da je aktivacija ori mesta odvisna od vezanega ATP na Orc1-1.

Pri evkariontih je ključni korak iniciacije DNA replikacije asociacija kompleksa Cds45, MCM GINS. Podobno je pri arhejah. Pri Sulfolobus acidocaldarius so rekonstruirali kompleks iz Gins23, Gins15 in Cdc45, ki so ortologi evkariontskih, in ugotovili da so v razmerju 2:2:2. (Slika 2). Bistvo je, da so ugotovili, da GINS tvori pomembno povezavo med MCM in Cdc45.

== Arhejska primaza ==

Arhejska primaza je nizko procesivna RNA polimeraza, ki za model sinteze uporabi enojno vijačnico znotraj replikacijskega mehurčka in je zadolžena za sintezo oligoribonukleotidnega primerja. Oligoribonukleotidni primer običajno vsebuje 10 do 12 nukleotidov, ki so komplementarni nukleotidom na matični verigi DNK in služi kot začetna točka podaljševanja nove verige za DNA polimerazo. Pri sintezi vodilne verige je primazna aktivnost potrebna le enkrat. Na zastajajoči verigi pa je primazna aktivnost konstanta, saj se Okazakijev fragment začne na vsakih 100-200 nukleotidov, kar zahteva ponavljajočo se primazno aktivnost.

V arhejah ''Sulfolobusu'', je bilo dokazano, da primaza interagira s kompleksom GINS, kar ponuja mehanizem za koordinirano aktivnost sinteze primerjev z potekom replikacije v replikacijskih vilicah. Kompleks GINS pomaga pri odvijanju dvojne vijačnice DNK in s tem ustvarja smerno napredujočo replikacijsko vilico, ki omogoča, da primaza sintetizira prajmerje na pravem mestu.

Arhejska primaza ima dve podenoti, katalitična podenote PriS in regulatorne podenote PriL, ki sta skupna vsem vrstam arhej. PriS in PriL v arhejah sta ortologna primaznemu kompleksu DNA-polimeraze α primaze v evkariotskih celicah, zato se PriSL imenuje tudi arhejska evkariontska primaza (AEP). Proteini sorodni AEP so bili najdeni v izvenkromosomskih proteinih tako evkariontih kot tudi v bakterijskih celicah. PriSL je bil biokemično opisani pri številnih vrstah arhej in je pokazal sposobnost začetne sinteze tako RNA kot tudi DNA. Študije na primzah arhejah ''Archaeoglobus'' in ''Pyrococcus'' so pokazale, da ima primaza vlogo tudi pri popravilu DNA.

Pri proučevanju arheje ''Sulfolobus'' so ugotovili, da poleg PriS in PriL ima primaza še tretjo podenoto PriX. PriX naj bi signifikantno povečala procesivnosti encima in stabilizirala celoten kompleks. Kompleks bi tako tvoril heterotrimer. Študije so pokazale, da sta podenoti PriX in PriL v arhejah skupaj strukturno enaki podenoti PriL v evkariontih. Na človeškem PriL je bilo dokazano, da interagira z 5' koncem RNA primerjem v na modelni verigi. Pri arhejah pa s 5' koncem interagira PriX in tako služi kot vezavno mesto za začetni nukleotid pri sintezi primerja.

== DNA polimeraza ==

V poznih devetdesetih so ugotovili, da imajo prave arheje DNA polimerazo (DNAP), ki se filogenetsko razlikuje od vseh do sedaj znanih celičnih DNA polimeraz, zato so jo umestili v novo družino, imenovano družina polimeraz D (PolD). PolD je heterodimerni protein, sestavljen iz dveh podenot (proteinov DP1 in DP2) z vsemi funkcijskimi značilnostmi replikacijske DNAP, vendar s katalitičnim jedrom RNA polimeraze (RNAP). Kasneje so potrdili, da so polimeraze iz te družine v vseh vrstah arhej razen v krenarhejah. Številne arheje vsebujejo tudi DNAP, ki pripada družini polimeraz B (PolB). Izkazalo se je, da je PolD ključna komponenta arhealnega riplosoma, medtem ko ima PolB večinoma pomožno vlogo, vendar vse PolB v celicah niso enako pomembne. PolB1 ima pomembno vlogo pri povečanje učinkovitosti zorenja Okazakijevih fragmentov, saj preprečuje nepotrebno ponovno sintezo DNA med procesom obdelave Okazakijevih fragmentov. PolD je replikacijska polimeraza, odgovorna za iniciacijo replikacije DNA tako na vodilni kot tudi zastajajojoči verigi. Sestavljena je iz velike katalitske podenote DP2 in majhne podenote DP1 s 3′ → 5′ eksonukleazno aktivnostjo, ki služi kontrolnemu branju. Obe podenoti lahko odcepita napačno sparjene baze in razširita začetni oligonukleotid.

'''Podenota DP1'''

Ugotovili so, da podenota DP1 pripada družini fosfodiestraz, njeno aktivno mesto pa je edinstveno za družino PolD. Analize aminokislinskega zaporedja so pokazale, da je podenota DP1 podobna majhni podenoti evkariontske DNA polimeraze δ (iz družine polimeraz B), ki je esencialna za replikacijo evkariontskih celic. Hkrati je struktura DP1 tesno povezana s podenoto B evkariontskih PolB, ki so sicer izgubile katalitični ostanek. DP1 je sestavljena iz dveh domen: oligonukleotid vezavne domene (OB) in N-končne nukleazne fosfodiestrske domene (PDE), ki jo sicer najdemo v številnih hidrolazah, vendar je funkcija, povezana s kontrolnim branjem DNAP, specifična samo za PolD. Njeno aktivno mest je obrnjeno proti 3' koncu nastajajoče verige DNA.

'''Podenota DP2'''

Katalitska podenota DP2 je edinstvena za družino encimov PolD, saj pri analizah poravnav zaporedij in struktur niso našli dobrega ujemanja z ostalimi proteini. Vsebuje le posamezne motive, ki so značilni za katalitske podenote RNA polimeraz (RNAP). Od ostalih polimeraz se razlikuje tudi v katalitskem središču, ki je običajno v tako imenovani domeni dlani in jo delimo na dva podtipa glede na topologijo strukture aktivnega mesta. Lahko so tipa Klenow ali Polβ-podobno, medtem ko imajo PolD specifično dvojno psi β-sodčasto zvitje, ki je značilno za RNAP. Torej PolD spada v novo družino polimeraz, ki lahko vršijo od DNA odvisno sintezo RNA ali DNA oziroma od RNA odvisno sintezo RNA, kar prvič združi DNA replikacijo in transkripcijo znotraj iste družine proteinov. Dvodelna vpenjalna domena, sestavljena iz domen clamp-1 in clamp-2, ki tvorita osrednjo votlino s premerom 30 Å, popolnoma obda DNA. Clamp-1, ki je sestavljen iz 5-vijačnic in domene Zn-III, je z ene strani obrnjen proti katalitskemu centru polimeraze, z druge strani pa proti katalitskemu centru nukleaze. Domena Zn-III in β list, ki povezujejo domeno Zn-III z domeno clamp-1, sta idealno nameščena za interakcijo z majhnim žlebom nastajajoče DNA. Zn-I domena prispeva k stabilizaciji clamp-2, ki obsega območje med C-koncem C zadnje verige β DP1 in prvo verigo β DP2. DP2 se z DP1 poveže na C-končni strani preko cink-povezovalne domene. Ta povezave je potrebna za konformacijsko spremembo DP2 katalitične domene. Domena clamp-2 je večinoma sestavljen iz štirih zank, ki tvorijo elektro pozitivno območje, ki obdaja novonastalo DNA. Afiniteta PolD za dsDNA je šibkejša kot za ssDNA, kar kaže, da se PolD prednostno veže na matrično DNA, zato predvidevajo, da se PolD vključi hitro za iniciacijo primaze in nato se v kasnejši stopnji zgodi zamenjava, tako da PolB postane odgovorna za replikacijo vodilne verige, medtem ko PolD nadaljuje z replikacijo zastajajoče verige.

== Viri ==

1. AUSIANNIKAVA, Darya in ALLERS, Thorsten, 2017. Diversity of DNA Replication in the Archaea. Genes. 31 januar 2017. Vol. 8, no. 2, pp. 56. DOI 10.3390/genes8020056.

2. GRECI, Mark D. in BELL, Stephen D., 2020a. Archaeal DNA Replication. Annual review of microbiology. 8 september 2020. Vol. 74, pp. 65–80. DOI 10.1146/annurev-micro-020518-115443.

3. LINDÅS, Ann-Christin in BERNANDER, Rolf, 2013. The cell cycle of archaea. Nature Reviews Microbiology. september 2013. Vol. 11, no. 9, pp. 627–638. DOI 10.1038/nrmicro3077.

4. RAIA, Pierre, CARRONI, Marta, HENRY, Etienne, PEHAU-ARNAUDET, Gérard, BRÛLÉ, Sébastien, BÉGUIN, Pierre, HENNEKE, Ghislaine, LINDAHL, Erik, DELARUE, Marc in SAUGUET, Ludovic, 2019. Structure of the DP1–DP2 PolD complex bound with DNA and its implications for the evolutionary history of DNA and RNA polymerases. PLoS Biology. 18 januar 2019. Vol. 17, no. 1, pp. e3000122. DOI 10.1371/journal.pbio.3000122.

5. Shared active site architecture between archaeal PolD and multi-subunit RNA polymerases revealed by X-ray crystallography - PMC, brez datuma. na spletu. [Pridobljeno 10 maj 2023]. Pridobljeno s: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4996933/#S1