Wiki FKKT - User contributions [en]

SINISENS: kvantifikacija makrolidnih antibiotikov v okolju

2021-05-24T14:38:26Z

Maja Globočnik: /* PRISPEVEK IN OBETI */

SINISENS je naslov projekta iz tekmovanja iGem 2020. Avtorji so študenti Univerze Aalto na Finskem.
[https://2020.igem.org/Team:Aalto-Helsinki Spletna stran projekta:]
Avtorica povzetka: Maja Globočnik

==OPIS PROBLEMA==
Onesnaženje z zdravili predstavlja vedno večji problem. Antibiotiki se predpisujejo ljudem in živalim za različne okužbe. Ker se v celoti ne prebavijo, ti prehajajo v odpadno vodo. Čeprav se v njej nahajajo v zelo majhnih koncentracijah, se akumulirajo. Poleg tega prisotnost antibiotikov v vodi lahko privede do tega, da mikroorganizmi postanejo nanje odporni. V Baltskem morju naj bi bilo v odpadnih vodah prisotno največ eritromicina, azitromicina in klaritomicina. Detekcija zdravil v vodi je zaradi majhnih koncentracij ne samo dolgotrajna ampak tudi zelo draga. Do sedaj sta se najpogosteje uporabljali tehniki LC-MS/MS in HPLC-MS/MS. Zato so si študentje zadali cilj razviti biosenzor za detekcijo in kvantifikacijo makrolidnih antibiotikov v vodi. Ta bi bil enostaven za uporabo, dovolj majhen, prenosen in cenovno učinkovit. Glavni namen je bil razvoj naprave, kjer se vzorec odpadne vode zlije v biosenzor, kar ob prisotnosti makrolidnih antibiotikov, mednje sodi tudi eritromicin, sproži zeleno fluorescenco bakterijskih celic. Razvoj biosenzorja so usmerjali za uporabo v čistilnih napravah, kjer bi lahko v prihodnosti s pomočjo razvitega biosenzorja optimizirali odstranjevanje zdravil in ostalih mikroonesnažil iz odpadne vode.

==SESTAVLJANJE==
Napravo so najprej razdelili na dva dela, prvo so poimenovali 'represorska kaseta', drugo pa 'izhodna kaseta', da bi v primeru težav lažje ugotovili, kateri del ne funkcionira. Represorska kaseta (MphR sistem) je vsebovala zapis za proteinphR in ''erm''C pod konstitutivnim promotorjem (BBa_J23106) in terminator (BBa_B0029). Izhodna kaseta pa je bila sestavljena iz gena egfp pod inducibilnim promotorjem pMphR, katerega negativni regulator je MphR, in terminator BBa_B0029. Vse sekvence za proteine so vsebovale tudi RBS BBa_B0015, razen egfp , ta je imel svoje zaporedje za RBS, BBa_K3386005. Vsako kaseto so ligirali v plazmidni skelet z zapisom za odpornosti proti kloramfenikolu, ogrodji sta imeli drugačni obrazili.
Celice ''E. coli'', seva TOP10, so transformirali s sistemom MphR v gojišču LB z različnimi koncentracijami eritromicina (10, 50 in 100 μg/L) in klaritromicina, ki je strukturno podoben eritromicinu. Želeli so preveriti, ali zapis za odpornost proti eritromicinu nudi odpornost tudi na ostale makrolidne antibiotike. Kot negativno kontrolo so celice gojili v mediju s prisotnim spektinomicinom, ker ta pripada drugi vrsti antibiotikov in ima drugačen mehanizem delovanja.
S PCR na osnovi kolonije so preverili uspešnost ligacije, da so nato sistem EGFP in MphR klonirali v plazmidni skelet z zapisom za odpornost proti kanamicinu. Nato so lahko pričeli z optimizacijo naprave.

===Genetsko vezje===
Sistem deluje na način, da se v odsotnosti makrolidov transkripcijski faktor MphR veže na operator v bližini promotorja, ki ga regulira, pMphR, kar preprečuje izražanje gena egfp in s tem seveda fluorescenco celic. Ko pa so v okolju prisotni makrolidi, se ti vežejo na transkripcijski faktor MphR, kar onemogoča njihovo vezavo na operatorsko mesto, hkrati pa je sedaj omogočeno izražanje gena egfp in lahko zaznamo zeleno fluorescenco celic.

==REZULTATI==
Uspešno transformirane celice so gojili v gojiščih z različnimi koncentracijami eritromicina. Količina eritromicina v mediju je bila sorazmerna s količino proizvedene fluorescence. Razlike med vrednostmi fluorescence pri različnih koncentracijah eritromicina so bile premajhne za učinkovito zaznavanje majhnih količin makrolidov Sklepali so, da je močpromotorja prevelika in da se še vedno nekaj transkripcijskega faktorja Mphr ostane vezanega na DNA ne glede na koncentracijo eritromicina. Zato so zamenjali konstitutivni promotor pMphR z inducibilnim promotorjem pBAD.
Poleg tega so zapis za eGFP zamenjali z zapisom za sfGFP, saj ker so celice v odsotnosti represorja dajale močnejšo fluorescenco - močnejši signal.

===Optimizacija časa indukcije in koncentracije arabinoze===
Po optimiziranju naprave so morali preveriti še, ali je pred izpostavitvijo biosenzorju potrebna indukcija celic in kakšna je optimalna koncentracija arabinoze v sistemu, da bo občutljivost naprave največja.
Zapis za rezistenco ermC in transkripcijski faktor MpHR sta pod istim promotorjem pBAD. Zato so želeli preveriti, ali bi celice preživele, če jih izpostavijo direktno eritromicinu, ali potrebujejo predhodno indukcijo. Rast celic v mediju z eritromicinom in različnimi koncentracijami arabinoze ni bila zelo različna v prisotnosti induktorja in brez, zato so sklepali, da indukcija celic preden jih izpostavimo eritromicinu ni potrebna.
Za določitev optimalne koncentracije arabinoze so gojili celice v treh medijih z različnokoncentracijo arabinoze 0,1 %, 0,5 % in 1 % on 0, 0,1, 1 in 100 μg/mL eritromicina. Največje razlike v fluorescenci glede na različne koncentracije eritromicina so zaznali v mediju z 0,1 % arabinoze.

===Določitev koncentracijskega območja biosenzorja in izboljšanje občutljivosti===

S podatki iz literature so s pomočjo Hillove enačbe (graf vezanega makrolida na MphR v odvisnosti od koncentracije makrolida) ugotovili, da maksimalna koncentracija makrolidov, ki jo po navadi določijo v odpadnih vodah, ni v koncentracijskem območju biosenzorja. Njihova naprava bi morala biti kar od 10 do 100-krat bolj občutljiva.
Na začetku so predvideli, da makrolidi vstopajo v celico z difuzijo, in se bo po nekem času vzpostavilo ravnotežje, zato bo koncentracija makrolidov v odpadni vodi enaka koncentraciji makrolidov v celici. Ker pa so morali zagotoviti boljšo občutljivost biosenzorja, so s programom Rosetta predvideli mutacije v vezavnem mestu proteina MphR, ki bi omogočila močnejšo in hitrejšo vezavo makrolidov na MphR.
Eksperimentalno so zato preverili pet različnih nukleotidnih zaporedij v zapisu za MphR, od katerih se je eden izkazal za najbolj obetavnega. Senzor je bil občutljivejši za vezavo eritromicina in tudi razlika v jakosti fluorescence pri različnih koncentracijah eritromicina je bila večja.
Dodatno so želeli občutljivost naprave povečati tako, da bi vplivali na transmembranski protein FhuA. V literaturi so zasledili predlagane modifikacije, ki bi omogočale prehod večih makrolidov skozi ta transmembranski protein. Za eksperimentalno potrditev tega so računalniško (SWISS-MODEL) analizirali sev ''E. coli'' GKCW104 z odstranjenim genom toiC (element črpalk za multiplo odpornost) in modificiranim FhuA proteinom, kar vodi v prisotnost večih por v membrani. V tem primeru so vstavili vključek s konstitutivnim promtorjem, ker te celice potrebujejo indukcijo z arabinozo za omenjene spremembe membrane, zato uporaba pBAD promotorja ni svetovana. Rezultati so pokazali večjo razliko v fluorescenci, ki so jo celice proizvedle pri različnih koncentracijah eritromicina, v primerjavi s sevom TOP10. Eksperiment so zaradi omejenega dostopa do laboratorija ponovili samo dvakrat. Rezultati pa nakazujejo, da bi uporaba tega seva v biosenzorju lahko izboljšala občutljivost senzorja.

==PRISPEVEK IN OBETI==
Razvit optični biosenzor ima potencial za uporabo v čistilnih napravah. Z njim bi lahko optimizirali odstranjevanje mikroonesnažil iz vode. Da bi se to lahko izvajalo v praksi in uresničili cilj skupine, pa bi bilo potrebne še nekaj optimizacije. Ustvariti bi bilo potrebno biosenzor za uporabo več makrolidnih antibiotikov in več onesnažil, kar bi bilo bolj ugodno za uporabo v čistilnih napravah. Optični biosenzor bi bilo treba nadgraditi v elektrokemijski, saj so ti bolj občutljivi. Potrebno bi bilo zagotoviti tudi večjo občutljivost naprave. Meja detekcije takšnega biosenzorja bi glede na podatke iz literature morala biti vsaj 100 ng/L. Čeprav so med postopkom projekta v literaturi že zasledili, da so elektrokemijski biosenzorji bolj občutljivi, so se zaradi pomanjkljivega znanja o elektrokemiji osredotočili na optimizacijo optičnega senzorja, katerega razvoj je bil tudi njihov prvotni načrt.
V sklopu projekta so študentje razvili tudi kampanjo za ozaveščanje ljudi o nepravilni rabi in neustreznem ravnanju z antibiotiki in kakšne probleme lahko predstavljajo antibiotiki, prisotni v okolju. Da bi s problematiko seznanili tudi mlajše, so razvili igrico 'Fix the Flow'. Namen igrice je zgraditi čistilno napravo in med postopkom približati sintezno biologijo, ravnanje z odpadno vodo in problem odpornosti mikroorganizmov na antibiotike.

==VIRI==

[1] iGEM 2020 Team Aalto-Helsinki. SINISENS. [dostop: 23.5.2021]. Dostopno na: https://2020.igem.org/Team:Aalto-Helsinki.

SINISENS: kvantifikacija makrolidnih antibiotikov v okolju

2021-05-24T14:37:34Z

Maja Globočnik: /* PRISPEVEK IN OBETI */

SINISENS je naslov projekta iz tekmovanja iGem 2020. Avtorji so študenti Univerze Aalto na Finskem.
[https://2020.igem.org/Team:Aalto-Helsinki Spletna stran projekta:]
Avtorica povzetka: Maja Globočnik

==OPIS PROBLEMA==
Onesnaženje z zdravili predstavlja vedno večji problem. Antibiotiki se predpisujejo ljudem in živalim za različne okužbe. Ker se v celoti ne prebavijo, ti prehajajo v odpadno vodo. Čeprav se v njej nahajajo v zelo majhnih koncentracijah, se akumulirajo. Poleg tega prisotnost antibiotikov v vodi lahko privede do tega, da mikroorganizmi postanejo nanje odporni. V Baltskem morju naj bi bilo v odpadnih vodah prisotno največ eritromicina, azitromicina in klaritomicina. Detekcija zdravil v vodi je zaradi majhnih koncentracij ne samo dolgotrajna ampak tudi zelo draga. Do sedaj sta se najpogosteje uporabljali tehniki LC-MS/MS in HPLC-MS/MS. Zato so si študentje zadali cilj razviti biosenzor za detekcijo in kvantifikacijo makrolidnih antibiotikov v vodi. Ta bi bil enostaven za uporabo, dovolj majhen, prenosen in cenovno učinkovit. Glavni namen je bil razvoj naprave, kjer se vzorec odpadne vode zlije v biosenzor, kar ob prisotnosti makrolidnih antibiotikov, mednje sodi tudi eritromicin, sproži zeleno fluorescenco bakterijskih celic. Razvoj biosenzorja so usmerjali za uporabo v čistilnih napravah, kjer bi lahko v prihodnosti s pomočjo razvitega biosenzorja optimizirali odstranjevanje zdravil in ostalih mikroonesnažil iz odpadne vode.

==SESTAVLJANJE==
Napravo so najprej razdelili na dva dela, prvo so poimenovali 'represorska kaseta', drugo pa 'izhodna kaseta', da bi v primeru težav lažje ugotovili, kateri del ne funkcionira. Represorska kaseta (MphR sistem) je vsebovala zapis za proteinphR in ''erm''C pod konstitutivnim promotorjem (BBa_J23106) in terminator (BBa_B0029). Izhodna kaseta pa je bila sestavljena iz gena egfp pod inducibilnim promotorjem pMphR, katerega negativni regulator je MphR, in terminator BBa_B0029. Vse sekvence za proteine so vsebovale tudi RBS BBa_B0015, razen egfp , ta je imel svoje zaporedje za RBS, BBa_K3386005. Vsako kaseto so ligirali v plazmidni skelet z zapisom za odpornosti proti kloramfenikolu, ogrodji sta imeli drugačni obrazili.
Celice ''E. coli'', seva TOP10, so transformirali s sistemom MphR v gojišču LB z različnimi koncentracijami eritromicina (10, 50 in 100 μg/L) in klaritromicina, ki je strukturno podoben eritromicinu. Želeli so preveriti, ali zapis za odpornost proti eritromicinu nudi odpornost tudi na ostale makrolidne antibiotike. Kot negativno kontrolo so celice gojili v mediju s prisotnim spektinomicinom, ker ta pripada drugi vrsti antibiotikov in ima drugačen mehanizem delovanja.
S PCR na osnovi kolonije so preverili uspešnost ligacije, da so nato sistem EGFP in MphR klonirali v plazmidni skelet z zapisom za odpornost proti kanamicinu. Nato so lahko pričeli z optimizacijo naprave.

===Genetsko vezje===
Sistem deluje na način, da se v odsotnosti makrolidov transkripcijski faktor MphR veže na operator v bližini promotorja, ki ga regulira, pMphR, kar preprečuje izražanje gena egfp in s tem seveda fluorescenco celic. Ko pa so v okolju prisotni makrolidi, se ti vežejo na transkripcijski faktor MphR, kar onemogoča njihovo vezavo na operatorsko mesto, hkrati pa je sedaj omogočeno izražanje gena egfp in lahko zaznamo zeleno fluorescenco celic.

==REZULTATI==
Uspešno transformirane celice so gojili v gojiščih z različnimi koncentracijami eritromicina. Količina eritromicina v mediju je bila sorazmerna s količino proizvedene fluorescence. Razlike med vrednostmi fluorescence pri različnih koncentracijah eritromicina so bile premajhne za učinkovito zaznavanje majhnih količin makrolidov Sklepali so, da je močpromotorja prevelika in da se še vedno nekaj transkripcijskega faktorja Mphr ostane vezanega na DNA ne glede na koncentracijo eritromicina. Zato so zamenjali konstitutivni promotor pMphR z inducibilnim promotorjem pBAD.
Poleg tega so zapis za eGFP zamenjali z zapisom za sfGFP, saj ker so celice v odsotnosti represorja dajale močnejšo fluorescenco - močnejši signal.

===Optimizacija časa indukcije in koncentracije arabinoze===
Po optimiziranju naprave so morali preveriti še, ali je pred izpostavitvijo biosenzorju potrebna indukcija celic in kakšna je optimalna koncentracija arabinoze v sistemu, da bo občutljivost naprave največja.
Zapis za rezistenco ermC in transkripcijski faktor MpHR sta pod istim promotorjem pBAD. Zato so želeli preveriti, ali bi celice preživele, če jih izpostavijo direktno eritromicinu, ali potrebujejo predhodno indukcijo. Rast celic v mediju z eritromicinom in različnimi koncentracijami arabinoze ni bila zelo različna v prisotnosti induktorja in brez, zato so sklepali, da indukcija celic preden jih izpostavimo eritromicinu ni potrebna.
Za določitev optimalne koncentracije arabinoze so gojili celice v treh medijih z različnokoncentracijo arabinoze 0,1 %, 0,5 % in 1 % on 0, 0,1, 1 in 100 μg/mL eritromicina. Največje razlike v fluorescenci glede na različne koncentracije eritromicina so zaznali v mediju z 0,1 % arabinoze.

===Določitev koncentracijskega območja biosenzorja in izboljšanje občutljivosti===

S podatki iz literature so s pomočjo Hillove enačbe (graf vezanega makrolida na MphR v odvisnosti od koncentracije makrolida) ugotovili, da maksimalna koncentracija makrolidov, ki jo po navadi določijo v odpadnih vodah, ni v koncentracijskem območju biosenzorja. Njihova naprava bi morala biti kar od 10 do 100-krat bolj občutljiva.
Na začetku so predvideli, da makrolidi vstopajo v celico z difuzijo, in se bo po nekem času vzpostavilo ravnotežje, zato bo koncentracija makrolidov v odpadni vodi enaka koncentraciji makrolidov v celici. Ker pa so morali zagotoviti boljšo občutljivost biosenzorja, so s programom Rosetta predvideli mutacije v vezavnem mestu proteina MphR, ki bi omogočila močnejšo in hitrejšo vezavo makrolidov na MphR.
Eksperimentalno so zato preverili pet različnih nukleotidnih zaporedij v zapisu za MphR, od katerih se je eden izkazal za najbolj obetavnega. Senzor je bil občutljivejši za vezavo eritromicina in tudi razlika v jakosti fluorescence pri različnih koncentracijah eritromicina je bila večja.
Dodatno so želeli občutljivost naprave povečati tako, da bi vplivali na transmembranski protein FhuA. V literaturi so zasledili predlagane modifikacije, ki bi omogočale prehod večih makrolidov skozi ta transmembranski protein. Za eksperimentalno potrditev tega so računalniško (SWISS-MODEL) analizirali sev ''E. coli'' GKCW104 z odstranjenim genom toiC (element črpalk za multiplo odpornost) in modificiranim FhuA proteinom, kar vodi v prisotnost večih por v membrani. V tem primeru so vstavili vključek s konstitutivnim promtorjem, ker te celice potrebujejo indukcijo z arabinozo za omenjene spremembe membrane, zato uporaba pBAD promotorja ni svetovana. Rezultati so pokazali večjo razliko v fluorescenci, ki so jo celice proizvedle pri različnih koncentracijah eritromicina, v primerjavi s sevom TOP10. Eksperiment so zaradi omejenega dostopa do laboratorija ponovili samo dvakrat. Rezultati pa nakazujejo, da bi uporaba tega seva v biosenzorju lahko izboljšala občutljivost senzorja.

==PRISPEVEK IN OBETI==
Razvit optični biosenzor ima potencial za uporabo v čistilnih napravah. Z njim bi lahko optimizirali odstranjevanje mikroonesnažil iz vode. Da bi se to lahko izvajalo v praksi in uresničili cilj skupine, pa bi bilo potrebne še nekaj optimizacije. Ustvariti bi bilo potrebno biosenzor za uporabo več makrolidnih antibiotikov in več onesnažil, kar bi bilo bolj ugodno za uporabo v čistilnih napravah. Optični biosenzor bi bilo treba nadgraditi v elektrokemijski, saj so ti bolj občutljivi. Potrebno bi bilo zagotoviti tudi večjo občutljivost naprave. Meja detekcije takšnega biosenzorja bi glede na podatke iz literature morala biti vsaj 100 ng/L. Čeprav so med postopkom projekta v literaturi že zasledili, da so elektrokemijski biosenzorji bolj občutljivi, so se zaradi pomanjkljivega znanja o elektrokemiji osredotočili na optimizacijo optičnega senzorja, katerega razvoj je bil tudi njihov prvotni načrt.
V sklopu projekta so študentje razvili tudi kampanjo za ozaveščanje ljudi o nepravilni rabi in neustreznem ravnanju z antibiotiki in kakšne probleme lahko predstavljajo antibiotiki, prisotni v okolju. Da bi s problematiko seznanili tudi mlajše, so razvili igrico 'Fix the Flow'. Namen igrice je zgraditi čistilno napravo in med postopkom približati sintezno biologijo, ravnanje z odpadno vodo in odpornost na antibiotike.

==VIRI==

[1] iGEM 2020 Team Aalto-Helsinki. SINISENS. [dostop: 23.5.2021]. Dostopno na: https://2020.igem.org/Team:Aalto-Helsinki.

SINISENS: kvantifikacija makrolidnih antibiotikov v okolju

2021-05-24T14:37:18Z

Maja Globočnik: /* Določitev koncentracijskega območja biosenzorja in izboljšanje občutljivosti */

SINISENS je naslov projekta iz tekmovanja iGem 2020. Avtorji so študenti Univerze Aalto na Finskem.
[https://2020.igem.org/Team:Aalto-Helsinki Spletna stran projekta:]
Avtorica povzetka: Maja Globočnik

==OPIS PROBLEMA==
Onesnaženje z zdravili predstavlja vedno večji problem. Antibiotiki se predpisujejo ljudem in živalim za različne okužbe. Ker se v celoti ne prebavijo, ti prehajajo v odpadno vodo. Čeprav se v njej nahajajo v zelo majhnih koncentracijah, se akumulirajo. Poleg tega prisotnost antibiotikov v vodi lahko privede do tega, da mikroorganizmi postanejo nanje odporni. V Baltskem morju naj bi bilo v odpadnih vodah prisotno največ eritromicina, azitromicina in klaritomicina. Detekcija zdravil v vodi je zaradi majhnih koncentracij ne samo dolgotrajna ampak tudi zelo draga. Do sedaj sta se najpogosteje uporabljali tehniki LC-MS/MS in HPLC-MS/MS. Zato so si študentje zadali cilj razviti biosenzor za detekcijo in kvantifikacijo makrolidnih antibiotikov v vodi. Ta bi bil enostaven za uporabo, dovolj majhen, prenosen in cenovno učinkovit. Glavni namen je bil razvoj naprave, kjer se vzorec odpadne vode zlije v biosenzor, kar ob prisotnosti makrolidnih antibiotikov, mednje sodi tudi eritromicin, sproži zeleno fluorescenco bakterijskih celic. Razvoj biosenzorja so usmerjali za uporabo v čistilnih napravah, kjer bi lahko v prihodnosti s pomočjo razvitega biosenzorja optimizirali odstranjevanje zdravil in ostalih mikroonesnažil iz odpadne vode.

==SESTAVLJANJE==
Napravo so najprej razdelili na dva dela, prvo so poimenovali 'represorska kaseta', drugo pa 'izhodna kaseta', da bi v primeru težav lažje ugotovili, kateri del ne funkcionira. Represorska kaseta (MphR sistem) je vsebovala zapis za proteinphR in ''erm''C pod konstitutivnim promotorjem (BBa_J23106) in terminator (BBa_B0029). Izhodna kaseta pa je bila sestavljena iz gena egfp pod inducibilnim promotorjem pMphR, katerega negativni regulator je MphR, in terminator BBa_B0029. Vse sekvence za proteine so vsebovale tudi RBS BBa_B0015, razen egfp , ta je imel svoje zaporedje za RBS, BBa_K3386005. Vsako kaseto so ligirali v plazmidni skelet z zapisom za odpornosti proti kloramfenikolu, ogrodji sta imeli drugačni obrazili.
Celice ''E. coli'', seva TOP10, so transformirali s sistemom MphR v gojišču LB z različnimi koncentracijami eritromicina (10, 50 in 100 μg/L) in klaritromicina, ki je strukturno podoben eritromicinu. Želeli so preveriti, ali zapis za odpornost proti eritromicinu nudi odpornost tudi na ostale makrolidne antibiotike. Kot negativno kontrolo so celice gojili v mediju s prisotnim spektinomicinom, ker ta pripada drugi vrsti antibiotikov in ima drugačen mehanizem delovanja.
S PCR na osnovi kolonije so preverili uspešnost ligacije, da so nato sistem EGFP in MphR klonirali v plazmidni skelet z zapisom za odpornost proti kanamicinu. Nato so lahko pričeli z optimizacijo naprave.

===Genetsko vezje===
Sistem deluje na način, da se v odsotnosti makrolidov transkripcijski faktor MphR veže na operator v bližini promotorja, ki ga regulira, pMphR, kar preprečuje izražanje gena egfp in s tem seveda fluorescenco celic. Ko pa so v okolju prisotni makrolidi, se ti vežejo na transkripcijski faktor MphR, kar onemogoča njihovo vezavo na operatorsko mesto, hkrati pa je sedaj omogočeno izražanje gena egfp in lahko zaznamo zeleno fluorescenco celic.

==REZULTATI==
Uspešno transformirane celice so gojili v gojiščih z različnimi koncentracijami eritromicina. Količina eritromicina v mediju je bila sorazmerna s količino proizvedene fluorescence. Razlike med vrednostmi fluorescence pri različnih koncentracijah eritromicina so bile premajhne za učinkovito zaznavanje majhnih količin makrolidov Sklepali so, da je močpromotorja prevelika in da se še vedno nekaj transkripcijskega faktorja Mphr ostane vezanega na DNA ne glede na koncentracijo eritromicina. Zato so zamenjali konstitutivni promotor pMphR z inducibilnim promotorjem pBAD.
Poleg tega so zapis za eGFP zamenjali z zapisom za sfGFP, saj ker so celice v odsotnosti represorja dajale močnejšo fluorescenco - močnejši signal.

===Optimizacija časa indukcije in koncentracije arabinoze===
Po optimiziranju naprave so morali preveriti še, ali je pred izpostavitvijo biosenzorju potrebna indukcija celic in kakšna je optimalna koncentracija arabinoze v sistemu, da bo občutljivost naprave največja.
Zapis za rezistenco ermC in transkripcijski faktor MpHR sta pod istim promotorjem pBAD. Zato so želeli preveriti, ali bi celice preživele, če jih izpostavijo direktno eritromicinu, ali potrebujejo predhodno indukcijo. Rast celic v mediju z eritromicinom in različnimi koncentracijami arabinoze ni bila zelo različna v prisotnosti induktorja in brez, zato so sklepali, da indukcija celic preden jih izpostavimo eritromicinu ni potrebna.
Za določitev optimalne koncentracije arabinoze so gojili celice v treh medijih z različnokoncentracijo arabinoze 0,1 %, 0,5 % in 1 % on 0, 0,1, 1 in 100 μg/mL eritromicina. Največje razlike v fluorescenci glede na različne koncentracije eritromicina so zaznali v mediju z 0,1 % arabinoze.

===Določitev koncentracijskega območja biosenzorja in izboljšanje občutljivosti===

S podatki iz literature so s pomočjo Hillove enačbe (graf vezanega makrolida na MphR v odvisnosti od koncentracije makrolida) ugotovili, da maksimalna koncentracija makrolidov, ki jo po navadi določijo v odpadnih vodah, ni v koncentracijskem območju biosenzorja. Njihova naprava bi morala biti kar od 10 do 100-krat bolj občutljiva.
Na začetku so predvideli, da makrolidi vstopajo v celico z difuzijo, in se bo po nekem času vzpostavilo ravnotežje, zato bo koncentracija makrolidov v odpadni vodi enaka koncentraciji makrolidov v celici. Ker pa so morali zagotoviti boljšo občutljivost biosenzorja, so s programom Rosetta predvideli mutacije v vezavnem mestu proteina MphR, ki bi omogočila močnejšo in hitrejšo vezavo makrolidov na MphR.
Eksperimentalno so zato preverili pet različnih nukleotidnih zaporedij v zapisu za MphR, od katerih se je eden izkazal za najbolj obetavnega. Senzor je bil občutljivejši za vezavo eritromicina in tudi razlika v jakosti fluorescence pri različnih koncentracijah eritromicina je bila večja.
Dodatno so želeli občutljivost naprave povečati tako, da bi vplivali na transmembranski protein FhuA. V literaturi so zasledili predlagane modifikacije, ki bi omogočale prehod večih makrolidov skozi ta transmembranski protein. Za eksperimentalno potrditev tega so računalniško (SWISS-MODEL) analizirali sev ''E. coli'' GKCW104 z odstranjenim genom toiC (element črpalk za multiplo odpornost) in modificiranim FhuA proteinom, kar vodi v prisotnost večih por v membrani. V tem primeru so vstavili vključek s konstitutivnim promtorjem, ker te celice potrebujejo indukcijo z arabinozo za omenjene spremembe membrane, zato uporaba pBAD promotorja ni svetovana. Rezultati so pokazali večjo razliko v fluorescenci, ki so jo celice proizvedle pri različnih koncentracijah eritromicina, v primerjavi s sevom TOP10. Eksperiment so zaradi omejenega dostopa do laboratorija ponovili samo dvakrat. Rezultati pa nakazujejo, da bi uporaba tega seva v biosenzorju lahko izboljšala občutljivost senzorja.

==PRISPEVEK IN OBETI==
Razvit optični biosenzor ima potencial za uporabo v čistilnih napravah. Z njim bi lahko optimizirali odstranjevanje mikroonesnažil iz vode. Da bi se to lahko izvajalo v praksi in uresničili cilj skupine, pa bi bilo potrebne še nekaj optimizacije. Ustvariti bi bilo potrebno biosenzor za uporabo več makrolidnih antibiotikov in več onesnažil, kar bi bilo bolj ugodno za uporabo v čistilnih napravah. Optični biosenzor bi bilo treba nadgraditi v elektrokemijski, saj so ti bolj občutljivi. Potrebno bi bilo zagotoviti tudi večjo občutljivost naprave. Meja detekcije takšnega biosenzorja bi glede na podatke iz literature morala biti vsaj 100 ng/L. Čeprav so med postopkom projekta v literaturi že zasledili, da so elektrokemijski biosenzorji bolj občutljivi, so se zaradi pomanjkljivega znanja o elektrokemiji osredotočili na optimizacijo optičnega senzorja, katerega razvoj je bil tudi njihov prvotni načrt.
V sklopu projekta so študentje razvili tudi kampanjo za ozaveščanje ljudi o nepravilni rabi in neustreznem ravnanju z antibiotiki in kakšne probleme lahko predstavljajo antibiotiki, prisotni v okolju. Da bi s problematiko seznanili tudi mlajše, so razvili igrico ''Fix the Flow''. Namen igrice je zgraditi čistilno napravo in med postopkom približati sintezno biologijo, ravnanje z odpadno vodo in odpornost na antibiotike.

==VIRI==

[1] iGEM 2020 Team Aalto-Helsinki. SINISENS. [dostop: 23.5.2021]. Dostopno na: https://2020.igem.org/Team:Aalto-Helsinki.

SINISENS: kvantifikacija makrolidnih antibiotikov v okolju

2021-05-24T14:26:25Z

Maja Globočnik: /* Genetsko vezje */

SINISENS je naslov projekta iz tekmovanja iGem 2020. Avtorji so študenti Univerze Aalto na Finskem.
[https://2020.igem.org/Team:Aalto-Helsinki Spletna stran projekta:]
Avtorica povzetka: Maja Globočnik

==OPIS PROBLEMA==
Onesnaženje z zdravili predstavlja vedno večji problem. Antibiotiki se predpisujejo ljudem in živalim za različne okužbe. Ker se v celoti ne prebavijo, ti prehajajo v odpadno vodo. Čeprav se v njej nahajajo v zelo majhnih koncentracijah, se akumulirajo. Poleg tega prisotnost antibiotikov v vodi lahko privede do tega, da mikroorganizmi postanejo nanje odporni. V Baltskem morju naj bi bilo v odpadnih vodah prisotno največ eritromicina, azitromicina in klaritomicina. Detekcija zdravil v vodi je zaradi majhnih koncentracij ne samo dolgotrajna ampak tudi zelo draga. Do sedaj sta se najpogosteje uporabljali tehniki LC-MS/MS in HPLC-MS/MS. Zato so si študentje zadali cilj razviti biosenzor za detekcijo in kvantifikacijo makrolidnih antibiotikov v vodi. Ta bi bil enostaven za uporabo, dovolj majhen, prenosen in cenovno učinkovit. Glavni namen je bil razvoj naprave, kjer se vzorec odpadne vode zlije v biosenzor, kar ob prisotnosti makrolidnih antibiotikov, mednje sodi tudi eritromicin, sproži zeleno fluorescenco bakterijskih celic. Razvoj biosenzorja so usmerjali za uporabo v čistilnih napravah, kjer bi lahko v prihodnosti s pomočjo razvitega biosenzorja optimizirali odstranjevanje zdravil in ostalih mikroonesnažil iz odpadne vode.

==SESTAVLJANJE==
Napravo so najprej razdelili na dva dela, prvo so poimenovali 'represorska kaseta', drugo pa 'izhodna kaseta', da bi v primeru težav lažje ugotovili, kateri del ne funkcionira. Represorska kaseta (MphR sistem) je vsebovala zapis za proteinphR in ''erm''C pod konstitutivnim promotorjem (BBa_J23106) in terminator (BBa_B0029). Izhodna kaseta pa je bila sestavljena iz gena egfp pod inducibilnim promotorjem pMphR, katerega negativni regulator je MphR, in terminator BBa_B0029. Vse sekvence za proteine so vsebovale tudi RBS BBa_B0015, razen egfp , ta je imel svoje zaporedje za RBS, BBa_K3386005. Vsako kaseto so ligirali v plazmidni skelet z zapisom za odpornosti proti kloramfenikolu, ogrodji sta imeli drugačni obrazili.
Celice ''E. coli'', seva TOP10, so transformirali s sistemom MphR v gojišču LB z različnimi koncentracijami eritromicina (10, 50 in 100 μg/L) in klaritromicina, ki je strukturno podoben eritromicinu. Želeli so preveriti, ali zapis za odpornost proti eritromicinu nudi odpornost tudi na ostale makrolidne antibiotike. Kot negativno kontrolo so celice gojili v mediju s prisotnim spektinomicinom, ker ta pripada drugi vrsti antibiotikov in ima drugačen mehanizem delovanja.
S PCR na osnovi kolonije so preverili uspešnost ligacije, da so nato sistem EGFP in MphR klonirali v plazmidni skelet z zapisom za odpornost proti kanamicinu. Nato so lahko pričeli z optimizacijo naprave.

===Genetsko vezje===
Sistem deluje na način, da se v odsotnosti makrolidov transkripcijski faktor MphR veže na operator v bližini promotorja, ki ga regulira, pMphR, kar preprečuje izražanje gena egfp in s tem seveda fluorescenco celic. Ko pa so v okolju prisotni makrolidi, se ti vežejo na transkripcijski faktor MphR, kar onemogoča njihovo vezavo na operatorsko mesto, hkrati pa je sedaj omogočeno izražanje gena egfp in lahko zaznamo zeleno fluorescenco celic.

==REZULTATI==
Uspešno transformirane celice so gojili v gojiščih z različnimi koncentracijami eritromicina. Količina eritromicina v mediju je bila sorazmerna s količino proizvedene fluorescence. Razlike med vrednostmi fluorescence pri različnih koncentracijah eritromicina so bile premajhne za učinkovito zaznavanje majhnih količin makrolidov Sklepali so, da je močpromotorja prevelika in da se še vedno nekaj transkripcijskega faktorja Mphr ostane vezanega na DNA ne glede na koncentracijo eritromicina. Zato so zamenjali konstitutivni promotor pMphR z inducibilnim promotorjem pBAD.
Poleg tega so zapis za eGFP zamenjali z zapisom za sfGFP, saj ker so celice v odsotnosti represorja dajale močnejšo fluorescenco - močnejši signal.

===Optimizacija časa indukcije in koncentracije arabinoze===
Po optimiziranju naprave so morali preveriti še, ali je pred izpostavitvijo biosenzorju potrebna indukcija celic in kakšna je optimalna koncentracija arabinoze v sistemu, da bo občutljivost naprave največja.
Zapis za rezistenco ermC in transkripcijski faktor MpHR sta pod istim promotorjem pBAD. Zato so želeli preveriti, ali bi celice preživele, če jih izpostavijo direktno eritromicinu, ali potrebujejo predhodno indukcijo. Rast celic v mediju z eritromicinom in različnimi koncentracijami arabinoze ni bila zelo različna v prisotnosti induktorja in brez, zato so sklepali, da indukcija celic preden jih izpostavimo eritromicinu ni potrebna.
Za določitev optimalne koncentracije arabinoze so gojili celice v treh medijih z različnokoncentracijo arabinoze 0,1 %, 0,5 % in 1 % on 0, 0,1, 1 in 100 μg/mL eritromicina. Največje razlike v fluorescenci glede na različne koncentracije eritromicina so zaznali v mediju z 0,1 % arabinoze.

===Določitev koncentracijskega območja biosenzorja in izboljšanje občutljivosti===

S podatki iz literature so s pomočjo Hillove enačbe (graf vezanega makrolida na MphR v odvisnosti od koncentracije makrolida) ugotovili, da maksimalna koncentracija makrolidov, ki jo po navadi določijo v odpadnih vodah, ni v koncentracijskem območju biosenzorja. Njihova naprava bi morala biti kar od 10 do 100-krat bolj občutljiva.
Na začetku so predvideli, da makrolidi vstopajo v celico z difuzijo, in se bo po nekem času vzpostavilo ravnotežje, zato bo koncentracija makrolidov v odpadni vodi enaka koncentraciji makrolidov v celici. Ker pa so morali zagotoviti boljšo občutljivost biosenzorja, so s programom Rosetta predvideli mutacije v vezavnem mestu proteina MphR, ki bi omogočila močnejšo in hitrejšo vezavo makrolidov na MphR.
Eksperimentalno so zato preverili pet različnih nukleotidnih zaporedij v zapisu za MphR, od katerih se je eden izkazal za najbolj obetavnega. Senzor je bil občutljivejši za vezavo eritromicina in tudi razlika v jakosti fluorescence pri različnih koncentracijah eritromicina je bila večja.
Dodatno so želeli občutljivost naprave povečati tako, da bi vplivali na transmembranski protein FhuA. V literaturi so zasledili predlagane modifikacije, ki bi omogočale prehod večih makrolidov skozi ta transmembranski protein. Za eksperimentalno potrditev tega so računalniško (SWISS-MODEL) analizirali sev E. coli GKCW104 z odstranjenim genom toiC (element črpalk za multiplo odpornost) in modificiranim proteinom FhuA proteinom, kar vodi v prisotnost večih por v membrani. V tem primeru so vstavili vključek s konstitutivnim promtorjem, ker te celice potrebujejo indukcijo z arabinozo, za omenjene spremembe membrane, zato uporaba pBAD promotorja ni svetovana. Rezultati so pokazali večjo razliko v fluorescenci, ki so jo celice proizvedle v različnih koncentracijah eritromicina, v primerjavi s sevom TOP10. Eksperiment so zaradi omejenega dostopa do laboratorija ponovili samo dvakrat. Rezultati pa nakazujejo, da bi uporaba tega seva v biosenzorju lahko izboljšala občutljivost senzorja.

==PRISPEVEK IN OBETI==
Razvit optični biosenzor ima potencial za uporabo v čistilnih napravah. Z njim bi lahko optimizirali odstranjevanje mikroonesnažil iz vode. Da bi se to lahko izvajalo v praksi in uresničili cilj skupine, pa bi bilo potrebne še nekaj optimizacije. Ustvariti bi bilo potrebno biosenzor za uporabo več makrolidnih antibiotikov in več onesnažil, kar bi bilo bolj ugodno za uporabo v čistilnih napravah. Optični biosenzor bi bilo treba nadgraditi v elektrokemijski, saj so ti bolj občutljivi. Potrebno bi bilo zagotoviti tudi večjo občutljivost naprave. Meja detekcije takšnega biosenzorja bi glede na podatke iz literature morala biti vsaj 100 ng/L. Čeprav so med postopkom projekta v literaturi že zasledili, da so elektrokemijski biosenzorji bolj občutljivi, so se zaradi pomanjkljivega znanja o elektrokemiji osredotočili na optimizacijo optičnega senzorja, katerega razvoj je bil tudi njihov prvotni načrt.
V sklopu projekta so študentje razvili tudi kampanjo za ozaveščanje ljudi o nepravilni rabi in neustreznem ravnanju z antibiotiki in kakšne probleme lahko predstavljajo antibiotiki, prisotni v okolju. Da bi s problematiko seznanili tudi mlajše, so razvili igrico ''Fix the Flow''. Namen igrice je zgraditi čistilno napravo in med postopkom približati sintezno biologijo, ravnanje z odpadno vodo in odpornost na antibiotike.

==VIRI==

[1] iGEM 2020 Team Aalto-Helsinki. SINISENS. [dostop: 23.5.2021]. Dostopno na: https://2020.igem.org/Team:Aalto-Helsinki.

SINISENS: kvantifikacija makrolidnih antibiotikov v okolju

2021-05-24T13:22:22Z

Maja Globočnik: /* PRISPEVEK IN OBETI */

SINISENS je naslov projekta iz tekmovanja iGem 2020. Avtorji so študenti Univerze Aalto na Finskem.
[https://2020.igem.org/Team:Aalto-Helsinki Spletna stran projekta:]
Avtorica povzetka: Maja Globočnik

==OPIS PROBLEMA==
Onesnaženje z zdravili predstavlja vedno večji problem. Antibiotiki se predpisujejo ljudem in živalim za različne okužbe. Ker se v celoti ne prebavijo, ti prehajajo v odpadno vodo. Čeprav se v njej nahajajo v zelo majhnih koncentracijah, se akumulirajo. Poleg tega prisotnost antibiotikov v vodi lahko privede do tega, da mikroorganizmi postanejo nanje odporni. V Baltskem morju naj bi bilo v odpadnih vodah prisotno največ eritromicina, azitromicina in klaritomicina. Detekcija zdravil v vodi je zaradi majhnih koncentracij ne samo dolgotrajna ampak tudi zelo draga. Do sedaj sta se najpogosteje uporabljali tehniki LC-MS/MS in HPLC-MS/MS. Zato so si študentje zadali cilj razviti biosenzor za detekcijo in kvantifikacijo makrolidnih antibiotikov v vodi. Ta bi bil enostaven za uporabo, dovolj majhen, prenosen in cenovno učinkovit. Glavni namen je bil razvoj naprave, kjer se vzorec odpadne vode zlije v biosenzor, kar ob prisotnosti makrolidnih antibiotikov, mednje sodi tudi eritromicin, sproži zeleno fluorescenco bakterijskih celic. Razvoj biosenzorja so usmerjali za uporabo v čistilnih napravah, kjer bi lahko v prihodnosti s pomočjo razvitega biosenzorja optimizirali odstranjevanje zdravil in ostalih mikroonesnažil iz odpadne vode.

==SESTAVLJANJE==
Napravo so najprej razdelili na dva dela, prvo so poimenovali 'represorska kaseta', drugo pa 'izhodna kaseta', da bi v primeru težav lažje ugotovili, kateri del ne funkcionira. Represorska kaseta (MphR sistem) je vsebovala zapis za proteinphR in ''erm''C pod konstitutivnim promotorjem (BBa_J23106) in terminator (BBa_B0029). Izhodna kaseta pa je bila sestavljena iz gena egfp pod inducibilnim promotorjem pMphR, katerega negativni regulator je MphR, in terminator BBa_B0029. Vse sekvence za proteine so vsebovale tudi RBS BBa_B0015, razen egfp , ta je imel svoje zaporedje za RBS, BBa_K3386005. Vsako kaseto so ligirali v plazmidni skelet z zapisom za odpornosti proti kloramfenikolu, ogrodji sta imeli drugačni obrazili.
Celice ''E. coli'', seva TOP10, so transformirali s sistemom MphR v gojišču LB z različnimi koncentracijami eritromicina (10, 50 in 100 μg/L) in klaritromicina, ki je strukturno podoben eritromicinu. Želeli so preveriti, ali zapis za odpornost proti eritromicinu nudi odpornost tudi na ostale makrolidne antibiotike. Kot negativno kontrolo so celice gojili v mediju s prisotnim spektinomicinom, ker ta pripada drugi vrsti antibiotikov in ima drugačen mehanizem delovanja.
S PCR na osnovi kolonije so preverili uspešnost ligacije, da so nato sistem EGFP in MphR klonirali v plazmidni skelet z zapisom za odpornost proti kanamicinu. Nato so lahko pričeli z optimizacijo naprave.

===Genetsko vezje===
Sistem deluje na način, da se v odsotnosti makrolidov transkripcijski faktor MphR veže na operatorsko mesto promotorja, ki ga regulira, pMphR, kar preprečuje izražanje gena egfp in s tem seveda fluorescenco celic. Ko pa so v okolju prisotni makrolidi, se ti vežejo na transkripcijski faktor MphR, kar onemogoča njihovo vezavo na operatorsko mesto, hkrati pa je sedaj omogočeno izražanje gena egfp in lahko zaznamo zeleno fluorescenco celic.

==REZULTATI==
Uspešno transformirane celice so gojili v gojiščih z različnimi koncentracijami eritromicina. Količina eritromicina v mediju je bila sorazmerna s količino proizvedene fluorescence. Razlike med vrednostmi fluorescence pri različnih koncentracijah eritromicina so bile premajhne za učinkovito zaznavanje majhnih količin makrolidov Sklepali so, da je močpromotorja prevelika in da se še vedno nekaj transkripcijskega faktorja Mphr ostane vezanega na DNA ne glede na koncentracijo eritromicina. Zato so zamenjali konstitutivni promotor pMphR z inducibilnim promotorjem pBAD.
Poleg tega so zapis za eGFP zamenjali z zapisom za sfGFP, saj ker so celice v odsotnosti represorja dajale močnejšo fluorescenco - močnejši signal.

===Optimizacija časa indukcije in koncentracije arabinoze===
Po optimiziranju naprave so morali preveriti še, ali je pred izpostavitvijo biosenzorju potrebna indukcija celic in kakšna je optimalna koncentracija arabinoze v sistemu, da bo občutljivost naprave največja.
Zapis za rezistenco ermC in transkripcijski faktor MpHR sta pod istim promotorjem pBAD. Zato so želeli preveriti, ali bi celice preživele, če jih izpostavijo direktno eritromicinu, ali potrebujejo predhodno indukcijo. Rast celic v mediju z eritromicinom in različnimi koncentracijami arabinoze ni bila zelo različna v prisotnosti induktorja in brez, zato so sklepali, da indukcija celic preden jih izpostavimo eritromicinu ni potrebna.
Za določitev optimalne koncentracije arabinoze so gojili celice v treh medijih z različnokoncentracijo arabinoze 0,1 %, 0,5 % in 1 % on 0, 0,1, 1 in 100 μg/mL eritromicina. Največje razlike v fluorescenci glede na različne koncentracije eritromicina so zaznali v mediju z 0,1 % arabinoze.

===Določitev koncentracijskega območja biosenzorja in izboljšanje občutljivosti===

S podatki iz literature so s pomočjo Hillove enačbe (graf vezanega makrolida na MphR v odvisnosti od koncentracije makrolida) ugotovili, da maksimalna koncentracija makrolidov, ki jo po navadi določijo v odpadnih vodah, ni v koncentracijskem območju biosenzorja. Njihova naprava bi morala biti kar od 10 do 100-krat bolj občutljiva.
Na začetku so predvideli, da makrolidi vstopajo v celico z difuzijo, in se bo po nekem času vzpostavilo ravnotežje, zato bo koncentracija makrolidov v odpadni vodi enaka koncentraciji makrolidov v celici. Ker pa so morali zagotoviti boljšo občutljivost biosenzorja, so s programom Rosetta predvideli mutacije v vezavnem mestu proteina MphR, ki bi omogočila močnejšo in hitrejšo vezavo makrolidov na MphR.
Eksperimentalno so zato preverili pet različnih nukleotidnih zaporedij v zapisu za MphR, od katerih se je eden izkazal za najbolj obetavnega. Senzor je bil občutljivejši za vezavo eritromicina in tudi razlika v jakosti fluorescence pri različnih koncentracijah eritromicina je bila večja.
Dodatno so želeli občutljivost naprave povečati tako, da bi vplivali na transmembranski protein FhuA. V literaturi so zasledili predlagane modifikacije, ki bi omogočale prehod večih makrolidov skozi ta transmembranski protein. Za eksperimentalno potrditev tega so računalniško (SWISS-MODEL) analizirali sev E. coli GKCW104 z odstranjenim genom toiC (element črpalk za multiplo odpornost) in modificiranim proteinom FhuA proteinom, kar vodi v prisotnost večih por v membrani. V tem primeru so vstavili vključek s konstitutivnim promtorjem, ker te celice potrebujejo indukcijo z arabinozo, za omenjene spremembe membrane, zato uporaba pBAD promotorja ni svetovana. Rezultati so pokazali večjo razliko v fluorescenci, ki so jo celice proizvedle v različnih koncentracijah eritromicina, v primerjavi s sevom TOP10. Eksperiment so zaradi omejenega dostopa do laboratorija ponovili samo dvakrat. Rezultati pa nakazujejo, da bi uporaba tega seva v biosenzorju lahko izboljšala občutljivost senzorja.

==PRISPEVEK IN OBETI==
Razvit optični biosenzor ima potencial za uporabo v čistilnih napravah. Z njim bi lahko optimizirali odstranjevanje mikroonesnažil iz vode. Da bi se to lahko izvajalo v praksi in uresničili cilj skupine, pa bi bilo potrebne še nekaj optimizacije. Ustvariti bi bilo potrebno biosenzor za uporabo več makrolidnih antibiotikov in več onesnažil, kar bi bilo bolj ugodno za uporabo v čistilnih napravah. Optični biosenzor bi bilo treba nadgraditi v elektrokemijski, saj so ti bolj občutljivi. Potrebno bi bilo zagotoviti tudi večjo občutljivost naprave. Meja detekcije takšnega biosenzorja bi glede na podatke iz literature morala biti vsaj 100 ng/L. Čeprav so med postopkom projekta v literaturi že zasledili, da so elektrokemijski biosenzorji bolj občutljivi, so se zaradi pomanjkljivega znanja o elektrokemiji osredotočili na optimizacijo optičnega senzorja, katerega razvoj je bil tudi njihov prvotni načrt.
V sklopu projekta so študentje razvili tudi kampanjo za ozaveščanje ljudi o nepravilni rabi in neustreznem ravnanju z antibiotiki in kakšne probleme lahko predstavljajo antibiotiki, prisotni v okolju. Da bi s problematiko seznanili tudi mlajše, so razvili igrico ''Fix the Flow''. Namen igrice je zgraditi čistilno napravo in med postopkom približati sintezno biologijo, ravnanje z odpadno vodo in odpornost na antibiotike.

==VIRI==

[1] iGEM 2020 Team Aalto-Helsinki. SINISENS. [dostop: 23.5.2021]. Dostopno na: https://2020.igem.org/Team:Aalto-Helsinki.

SINISENS: kvantifikacija makrolidnih antibiotikov v okolju

2021-05-23T19:05:42Z

Maja Globočnik: /* Sestavljanje */

SINISENS je naslov projekta iz tekmovanja iGem 2020. Avtorji so študenti Univerze Aalto na Finskem.
[https://2020.igem.org/Team:Aalto-Helsinki Spletna stran projekta:]
Avtorica povzetka: Maja Globočnik

==OPIS PROBLEMA==
Onesnaženje z zdravili predstavlja vedno večji problem. Antibiotiki se predpisujejo ljudem in živalim za različne okužbe. Ker se v celoti ne prebavijo, ti prehajajo v odpadno vodo. Čeprav se v njej nahajajo v zelo majhnih koncentracijah, se akumulirajo. Poleg tega prisotnost antibiotikov v vodi lahko privede do tega, da mikroorganizmi postanejo nanje odporni. V Baltskem morju naj bi bilo v odpadnih vodah prisotno največ eritromicina, azitromicina in klaritomicina. Detekcija zdravil v vodi je zaradi majhnih koncentracij ne samo dolgotrajna ampak tudi zelo draga. Do sedaj sta se najpogosteje uporabljali tehniki LC-MS/MS in HPLC-MS/MS. Zato so si študentje zadali cilj razviti biosenzor za detekcijo in kvantifikacijo makrolidnih antibiotikov v vodi. Ta bi bil enostaven za uporabo, dovolj majhen, prenosen in cenovno učinkovit. Glavni namen je bil razvoj naprave, kjer se vzorec odpadne vode zlije v biosenzor, kar ob prisotnosti makrolidnih antibiotikov, mednje sodi tudi eritromicin, sproži zeleno fluorescenco bakterijskih celic. Razvoj biosenzorja so usmerjali za uporabo v čistilnih napravah, kjer bi lahko v prihodnosti s pomočjo razvitega biosenzorja optimizirali odstranjevanje zdravil in ostalih mikroonesnažil iz odpadne vode.

==SESTAVLJANJE==
Napravo so najprej razdelili na dva dela, prvo so poimenovali 'represorska kaseta', drugo pa 'izhodna kaseta', da bi v primeru težav lažje ugotovili, kateri del ne funkcionira. Represorska kaseta (MphR sistem) je vsebovala zapis za proteinphR in ''erm''C pod konstitutivnim promotorjem (BBa_J23106) in terminator (BBa_B0029). Izhodna kaseta pa je bila sestavljena iz gena egfp pod inducibilnim promotorjem pMphR, katerega negativni regulator je MphR, in terminator BBa_B0029. Vse sekvence za proteine so vsebovale tudi RBS BBa_B0015, razen egfp , ta je imel svoje zaporedje za RBS, BBa_K3386005. Vsako kaseto so ligirali v plazmidni skelet z zapisom za odpornosti proti kloramfenikolu, ogrodji sta imeli drugačni obrazili.
Celice ''E. coli'', seva TOP10, so transformirali s sistemom MphR v gojišču LB z različnimi koncentracijami eritromicina (10, 50 in 100 μg/L) in klaritromicina, ki je strukturno podoben eritromicinu. Želeli so preveriti, ali zapis za odpornost proti eritromicinu nudi odpornost tudi na ostale makrolidne antibiotike. Kot negativno kontrolo so celice gojili v mediju s prisotnim spektinomicinom, ker ta pripada drugi vrsti antibiotikov in ima drugačen mehanizem delovanja.
S PCR na osnovi kolonije so preverili uspešnost ligacije, da so nato sistem EGFP in MphR klonirali v plazmidni skelet z zapisom za odpornost proti kanamicinu. Nato so lahko pričeli z optimizacijo naprave.

===Genetsko vezje===
Sistem deluje na način, da se v odsotnosti makrolidov transkripcijski faktor MphR veže na operatorsko mesto promotorja, ki ga regulira, pMphR, kar preprečuje izražanje gena egfp in s tem seveda fluorescenco celic. Ko pa so v okolju prisotni makrolidi, se ti vežejo na transkripcijski faktor MphR, kar onemogoča njihovo vezavo na operatorsko mesto, hkrati pa je sedaj omogočeno izražanje gena egfp in lahko zaznamo zeleno fluorescenco celic.

==REZULTATI==
Uspešno transformirane celice so gojili v gojiščih z različnimi koncentracijami eritromicina. Količina eritromicina v mediju je bila sorazmerna s količino proizvedene fluorescence. Razlike med vrednostmi fluorescence pri različnih koncentracijah eritromicina so bile premajhne za učinkovito zaznavanje majhnih količin makrolidov Sklepali so, da je močpromotorja prevelika in da se še vedno nekaj transkripcijskega faktorja Mphr ostane vezanega na DNA ne glede na koncentracijo eritromicina. Zato so zamenjali konstitutivni promotor pMphR z inducibilnim promotorjem pBAD.
Poleg tega so zapis za eGFP zamenjali z zapisom za sfGFP, saj ker so celice v odsotnosti represorja dajale močnejšo fluorescenco - močnejši signal.

===Optimizacija časa indukcije in koncentracije arabinoze===
Po optimiziranju naprave so morali preveriti še, ali je pred izpostavitvijo biosenzorju potrebna indukcija celic in kakšna je optimalna koncentracija arabinoze v sistemu, da bo občutljivost naprave največja.
Zapis za rezistenco ermC in transkripcijski faktor MpHR sta pod istim promotorjem pBAD. Zato so želeli preveriti, ali bi celice preživele, če jih izpostavijo direktno eritromicinu, ali potrebujejo predhodno indukcijo. Rast celic v mediju z eritromicinom in različnimi koncentracijami arabinoze ni bila zelo različna v prisotnosti induktorja in brez, zato so sklepali, da indukcija celic preden jih izpostavimo eritromicinu ni potrebna.
Za določitev optimalne koncentracije arabinoze so gojili celice v treh medijih z različnokoncentracijo arabinoze 0,1 %, 0,5 % in 1 % on 0, 0,1, 1 in 100 μg/mL eritromicina. Največje razlike v fluorescenci glede na različne koncentracije eritromicina so zaznali v mediju z 0,1 % arabinoze.

===Določitev koncentracijskega območja biosenzorja in izboljšanje občutljivosti===

S podatki iz literature so s pomočjo Hillove enačbe (graf vezanega makrolida na MphR v odvisnosti od koncentracije makrolida) ugotovili, da maksimalna koncentracija makrolidov, ki jo po navadi določijo v odpadnih vodah, ni v koncentracijskem območju biosenzorja. Njihova naprava bi morala biti kar od 10 do 100-krat bolj občutljiva.
Na začetku so predvideli, da makrolidi vstopajo v celico z difuzijo, in se bo po nekem času vzpostavilo ravnotežje, zato bo koncentracija makrolidov v odpadni vodi enaka koncentraciji makrolidov v celici. Ker pa so morali zagotoviti boljšo občutljivost biosenzorja, so s programom Rosetta predvideli mutacije v vezavnem mestu proteina MphR, ki bi omogočila močnejšo in hitrejšo vezavo makrolidov na MphR.
Eksperimentalno so zato preverili pet različnih nukleotidnih zaporedij v zapisu za MphR, od katerih se je eden izkazal za najbolj obetavnega. Senzor je bil občutljivejši za vezavo eritromicina in tudi razlika v jakosti fluorescence pri različnih koncentracijah eritromicina je bila večja.
Dodatno so želeli občutljivost naprave povečati tako, da bi vplivali na transmembranski protein FhuA. V literaturi so zasledili predlagane modifikacije, ki bi omogočale prehod večih makrolidov skozi ta transmembranski protein. Za eksperimentalno potrditev tega so računalniško (SWISS-MODEL) analizirali sev E. coli GKCW104 z odstranjenim genom toiC (element črpalk za multiplo odpornost) in modificiranim proteinom FhuA proteinom, kar vodi v prisotnost večih por v membrani. V tem primeru so vstavili vključek s konstitutivnim promtorjem, ker te celice potrebujejo indukcijo z arabinozo, za omenjene spremembe membrane, zato uporaba pBAD promotorja ni svetovana. Rezultati so pokazali večjo razliko v fluorescenci, ki so jo celice proizvedle v različnih koncentracijah eritromicina, v primerjavi s sevom TOP10. Eksperiment so zaradi omejenega dostopa do laboratorija ponovili samo dvakrat. Rezultati pa nakazujejo, da bi uporaba tega seva v biosenzorju lahko izboljšala občutljivost senzorja.

==PRISPEVEK IN OBETI==
Razvit optični biosenzor ima potencial za uporabo v čistilnih napravah. Z njim bi lahko optimizirali odstranjevanje mikroonesnažil iz vode. Da bi se to lahko izvajalo v praksi in uresničili cilj skupine, pa bi bilo potrebne še nekaj optimizacije. Ustvariti bi bilo potrebno biosenzor za uporabo več makrolidnih antibiotikov in več polutantov , kar bi bilo bolj ugodno za uporabo v čistilnih napravah. Optični biosenzor bi bilo treba nadgraditi v elektrokemijski, saj so ti bolj občutljivi. Potrebno bi bilo zagotoviti tudi večjo občutljivost naprave. Meja detekcije takšnega biosenzorja bi glede na podatke iz literature morala biti vsaj 100 ng/L. Čeprav so med postopkom projekta v literaturi že zasledili, da so elektrokemijski biosenzorji bolj občutljivi, so se zaradi pomanjkljivega znanja o elektrokemiji osredotočili na optimizacijo optičnega senzorja, katerega razvoj je bil tudi njihov prvotni načrt.
V sklopu projekta so študentje razvili tudi kampanjo za ozaveščanje ljudi o nepravilni rabi in neustreznem ravnanju z antibiotiki in kakšne probleme lahko predstavljajo antibiotiki, prisotni v okolju. Da bi s problematiko seznanili tudi mlajše, so razvili igrico ''Fix the Flow''. Namen igrice je zgraditi čistilno napravo in med postopkom približati sintezno biologijo, ravnanje z odpadno vodo in odpornost na antibiotike.

==VIRI==

[1] iGEM 2020 Team Aalto-Helsinki. SINISENS. [dostop: 23.5.2021]. Dostopno na: https://2020.igem.org/Team:Aalto-Helsinki.

SINISENS: kvantifikacija makrolidnih antibiotikov v okolju

2021-05-23T19:05:07Z

Maja Globočnik: /* Opis problema */

SINISENS je naslov projekta iz tekmovanja iGem 2020. Avtorji so študenti Univerze Aalto na Finskem.
[https://2020.igem.org/Team:Aalto-Helsinki Spletna stran projekta:]
Avtorica povzetka: Maja Globočnik

==OPIS PROBLEMA==
Onesnaženje z zdravili predstavlja vedno večji problem. Antibiotiki se predpisujejo ljudem in živalim za različne okužbe. Ker se v celoti ne prebavijo, ti prehajajo v odpadno vodo. Čeprav se v njej nahajajo v zelo majhnih koncentracijah, se akumulirajo. Poleg tega prisotnost antibiotikov v vodi lahko privede do tega, da mikroorganizmi postanejo nanje odporni. V Baltskem morju naj bi bilo v odpadnih vodah prisotno največ eritromicina, azitromicina in klaritomicina. Detekcija zdravil v vodi je zaradi majhnih koncentracij ne samo dolgotrajna ampak tudi zelo draga. Do sedaj sta se najpogosteje uporabljali tehniki LC-MS/MS in HPLC-MS/MS. Zato so si študentje zadali cilj razviti biosenzor za detekcijo in kvantifikacijo makrolidnih antibiotikov v vodi. Ta bi bil enostaven za uporabo, dovolj majhen, prenosen in cenovno učinkovit. Glavni namen je bil razvoj naprave, kjer se vzorec odpadne vode zlije v biosenzor, kar ob prisotnosti makrolidnih antibiotikov, mednje sodi tudi eritromicin, sproži zeleno fluorescenco bakterijskih celic. Razvoj biosenzorja so usmerjali za uporabo v čistilnih napravah, kjer bi lahko v prihodnosti s pomočjo razvitega biosenzorja optimizirali odstranjevanje zdravil in ostalih mikroonesnažil iz odpadne vode.

==Sestavljanje==
Napravo so najprej razdelili na dva dela, prvo so poimenovali 'represorska kaseta', drugo pa 'izhodna kaseta', da bi v primeru težav lažje ugotovili, kateri del ne funkcionira. Represorska kaseta (MphR sistem) je vsebovala zapis za proteinphR in ''erm''C pod konstitutivnim promotorjem (BBa_J23106) in terminator (BBa_B0029). Izhodna kaseta pa je bila sestavljena iz gena egfp pod inducibilnim promotorjem pMphR, katerega negativni regulator je MphR, in terminator BBa_B0029. Vse sekvence za proteine so vsebovale tudi RBS BBa_B0015, razen egfp , ta je imel svoje zaporedje za RBS, BBa_K3386005. Vsako kaseto so ligirali v plazmidni skelet z zapisom za odpornosti proti kloramfenikolu, ogrodji sta imeli drugačni obrazili.
Celice ''E. coli'', seva TOP10, so transformirali s sistemom MphR v gojišču LB z različnimi koncentracijami eritromicina (10, 50 in 100 μg/L) in klaritromicina, ki je strukturno podoben eritromicinu. Želeli so preveriti, ali zapis za odpornost proti eritromicinu nudi odpornost tudi na ostale makrolidne antibiotike. Kot negativno kontrolo so celice gojili v mediju s prisotnim spektinomicinom, ker ta pripada drugi vrsti antibiotikov in ima drugačen mehanizem delovanja.
S PCR na osnovi kolonije so preverili uspešnost ligacije, da so nato sistem EGFP in MphR klonirali v plazmidni skelet z zapisom za odpornost proti kanamicinu. Nato so lahko pričeli z optimizacijo naprave.

===Genetsko vezje===
Sistem deluje na način, da se v odsotnosti makrolidov transkripcijski faktor MphR veže na operatorsko mesto promotorja, ki ga regulira, pMphR, kar preprečuje izražanje gena egfp in s tem seveda fluorescenco celic. Ko pa so v okolju prisotni makrolidi, se ti vežejo na transkripcijski faktor MphR, kar onemogoča njihovo vezavo na operatorsko mesto, hkrati pa je sedaj omogočeno izražanje gena egfp in lahko zaznamo zeleno fluorescenco celic.

==REZULTATI==
Uspešno transformirane celice so gojili v gojiščih z različnimi koncentracijami eritromicina. Količina eritromicina v mediju je bila sorazmerna s količino proizvedene fluorescence. Razlike med vrednostmi fluorescence pri različnih koncentracijah eritromicina so bile premajhne za učinkovito zaznavanje majhnih količin makrolidov Sklepali so, da je močpromotorja prevelika in da se še vedno nekaj transkripcijskega faktorja Mphr ostane vezanega na DNA ne glede na koncentracijo eritromicina. Zato so zamenjali konstitutivni promotor pMphR z inducibilnim promotorjem pBAD.
Poleg tega so zapis za eGFP zamenjali z zapisom za sfGFP, saj ker so celice v odsotnosti represorja dajale močnejšo fluorescenco - močnejši signal.

===Optimizacija časa indukcije in koncentracije arabinoze===
Po optimiziranju naprave so morali preveriti še, ali je pred izpostavitvijo biosenzorju potrebna indukcija celic in kakšna je optimalna koncentracija arabinoze v sistemu, da bo občutljivost naprave največja.
Zapis za rezistenco ermC in transkripcijski faktor MpHR sta pod istim promotorjem pBAD. Zato so želeli preveriti, ali bi celice preživele, če jih izpostavijo direktno eritromicinu, ali potrebujejo predhodno indukcijo. Rast celic v mediju z eritromicinom in različnimi koncentracijami arabinoze ni bila zelo različna v prisotnosti induktorja in brez, zato so sklepali, da indukcija celic preden jih izpostavimo eritromicinu ni potrebna.
Za določitev optimalne koncentracije arabinoze so gojili celice v treh medijih z različnokoncentracijo arabinoze 0,1 %, 0,5 % in 1 % on 0, 0,1, 1 in 100 μg/mL eritromicina. Največje razlike v fluorescenci glede na različne koncentracije eritromicina so zaznali v mediju z 0,1 % arabinoze.

===Določitev koncentracijskega območja biosenzorja in izboljšanje občutljivosti===

S podatki iz literature so s pomočjo Hillove enačbe (graf vezanega makrolida na MphR v odvisnosti od koncentracije makrolida) ugotovili, da maksimalna koncentracija makrolidov, ki jo po navadi določijo v odpadnih vodah, ni v koncentracijskem območju biosenzorja. Njihova naprava bi morala biti kar od 10 do 100-krat bolj občutljiva.
Na začetku so predvideli, da makrolidi vstopajo v celico z difuzijo, in se bo po nekem času vzpostavilo ravnotežje, zato bo koncentracija makrolidov v odpadni vodi enaka koncentraciji makrolidov v celici. Ker pa so morali zagotoviti boljšo občutljivost biosenzorja, so s programom Rosetta predvideli mutacije v vezavnem mestu proteina MphR, ki bi omogočila močnejšo in hitrejšo vezavo makrolidov na MphR.
Eksperimentalno so zato preverili pet različnih nukleotidnih zaporedij v zapisu za MphR, od katerih se je eden izkazal za najbolj obetavnega. Senzor je bil občutljivejši za vezavo eritromicina in tudi razlika v jakosti fluorescence pri različnih koncentracijah eritromicina je bila večja.
Dodatno so želeli občutljivost naprave povečati tako, da bi vplivali na transmembranski protein FhuA. V literaturi so zasledili predlagane modifikacije, ki bi omogočale prehod večih makrolidov skozi ta transmembranski protein. Za eksperimentalno potrditev tega so računalniško (SWISS-MODEL) analizirali sev E. coli GKCW104 z odstranjenim genom toiC (element črpalk za multiplo odpornost) in modificiranim proteinom FhuA proteinom, kar vodi v prisotnost večih por v membrani. V tem primeru so vstavili vključek s konstitutivnim promtorjem, ker te celice potrebujejo indukcijo z arabinozo, za omenjene spremembe membrane, zato uporaba pBAD promotorja ni svetovana. Rezultati so pokazali večjo razliko v fluorescenci, ki so jo celice proizvedle v različnih koncentracijah eritromicina, v primerjavi s sevom TOP10. Eksperiment so zaradi omejenega dostopa do laboratorija ponovili samo dvakrat. Rezultati pa nakazujejo, da bi uporaba tega seva v biosenzorju lahko izboljšala občutljivost senzorja.

==PRISPEVEK IN OBETI==
Razvit optični biosenzor ima potencial za uporabo v čistilnih napravah. Z njim bi lahko optimizirali odstranjevanje mikroonesnažil iz vode. Da bi se to lahko izvajalo v praksi in uresničili cilj skupine, pa bi bilo potrebne še nekaj optimizacije. Ustvariti bi bilo potrebno biosenzor za uporabo več makrolidnih antibiotikov in več polutantov , kar bi bilo bolj ugodno za uporabo v čistilnih napravah. Optični biosenzor bi bilo treba nadgraditi v elektrokemijski, saj so ti bolj občutljivi. Potrebno bi bilo zagotoviti tudi večjo občutljivost naprave. Meja detekcije takšnega biosenzorja bi glede na podatke iz literature morala biti vsaj 100 ng/L. Čeprav so med postopkom projekta v literaturi že zasledili, da so elektrokemijski biosenzorji bolj občutljivi, so se zaradi pomanjkljivega znanja o elektrokemiji osredotočili na optimizacijo optičnega senzorja, katerega razvoj je bil tudi njihov prvotni načrt.
V sklopu projekta so študentje razvili tudi kampanjo za ozaveščanje ljudi o nepravilni rabi in neustreznem ravnanju z antibiotiki in kakšne probleme lahko predstavljajo antibiotiki, prisotni v okolju. Da bi s problematiko seznanili tudi mlajše, so razvili igrico ''Fix the Flow''. Namen igrice je zgraditi čistilno napravo in med postopkom približati sintezno biologijo, ravnanje z odpadno vodo in odpornost na antibiotike.

==VIRI==

[1] iGEM 2020 Team Aalto-Helsinki. SINISENS. [dostop: 23.5.2021]. Dostopno na: https://2020.igem.org/Team:Aalto-Helsinki.

SINISENS: kvantifikacija makrolidnih antibiotikov v okolju

2021-05-23T19:04:50Z

Maja Globočnik: /* Viri */

SINISENS je naslov projekta iz tekmovanja iGem 2020. Avtorji so študenti Univerze Aalto na Finskem.
[https://2020.igem.org/Team:Aalto-Helsinki Spletna stran projekta:]
Avtorica povzetka: Maja Globočnik

==Opis problema==
Onesnaženje z zdravili predstavlja vedno večji problem. Antibiotiki se predpisujejo ljudem in živalim za različne okužbe. Ker se v celoti ne prebavijo, ti prehajajo v odpadno vodo. Čeprav se v njej nahajajo v zelo majhnih koncentracijah, se akumulirajo. Poleg tega prisotnost antibiotikov v vodi lahko privede do tega, da mikroorganizmi postanejo nanje odporni. V Baltskem morju naj bi bilo v odpadnih vodah prisotno največ eritromicina, azitromicina in klaritomicina. Detekcija zdravil v vodi je zaradi majhnih koncentracij ne samo dolgotrajna ampak tudi zelo draga. Do sedaj sta se najpogosteje uporabljali tehniki LC-MS/MS in HPLC-MS/MS. Zato so si študentje zadali cilj razviti biosenzor za detekcijo in kvantifikacijo makrolidnih antibiotikov v vodi. Ta bi bil enostaven za uporabo, dovolj majhen, prenosen in cenovno učinkovit. Glavni namen je bil razvoj naprave, kjer se vzorec odpadne vode zlije v biosenzor, kar ob prisotnosti makrolidnih antibiotikov, mednje sodi tudi eritromicin, sproži zeleno fluorescenco bakterijskih celic. Razvoj biosenzorja so usmerjali za uporabo v čistilnih napravah, kjer bi lahko v prihodnosti s pomočjo razvitega biosenzorja optimizirali odstranjevanje zdravil in ostalih mikroonesnažil iz odpadne vode.

==Sestavljanje==
Napravo so najprej razdelili na dva dela, prvo so poimenovali 'represorska kaseta', drugo pa 'izhodna kaseta', da bi v primeru težav lažje ugotovili, kateri del ne funkcionira. Represorska kaseta (MphR sistem) je vsebovala zapis za proteinphR in ''erm''C pod konstitutivnim promotorjem (BBa_J23106) in terminator (BBa_B0029). Izhodna kaseta pa je bila sestavljena iz gena egfp pod inducibilnim promotorjem pMphR, katerega negativni regulator je MphR, in terminator BBa_B0029. Vse sekvence za proteine so vsebovale tudi RBS BBa_B0015, razen egfp , ta je imel svoje zaporedje za RBS, BBa_K3386005. Vsako kaseto so ligirali v plazmidni skelet z zapisom za odpornosti proti kloramfenikolu, ogrodji sta imeli drugačni obrazili.
Celice ''E. coli'', seva TOP10, so transformirali s sistemom MphR v gojišču LB z različnimi koncentracijami eritromicina (10, 50 in 100 μg/L) in klaritromicina, ki je strukturno podoben eritromicinu. Želeli so preveriti, ali zapis za odpornost proti eritromicinu nudi odpornost tudi na ostale makrolidne antibiotike. Kot negativno kontrolo so celice gojili v mediju s prisotnim spektinomicinom, ker ta pripada drugi vrsti antibiotikov in ima drugačen mehanizem delovanja.
S PCR na osnovi kolonije so preverili uspešnost ligacije, da so nato sistem EGFP in MphR klonirali v plazmidni skelet z zapisom za odpornost proti kanamicinu. Nato so lahko pričeli z optimizacijo naprave.

===Genetsko vezje===
Sistem deluje na način, da se v odsotnosti makrolidov transkripcijski faktor MphR veže na operatorsko mesto promotorja, ki ga regulira, pMphR, kar preprečuje izražanje gena egfp in s tem seveda fluorescenco celic. Ko pa so v okolju prisotni makrolidi, se ti vežejo na transkripcijski faktor MphR, kar onemogoča njihovo vezavo na operatorsko mesto, hkrati pa je sedaj omogočeno izražanje gena egfp in lahko zaznamo zeleno fluorescenco celic.

==REZULTATI==
Uspešno transformirane celice so gojili v gojiščih z različnimi koncentracijami eritromicina. Količina eritromicina v mediju je bila sorazmerna s količino proizvedene fluorescence. Razlike med vrednostmi fluorescence pri različnih koncentracijah eritromicina so bile premajhne za učinkovito zaznavanje majhnih količin makrolidov Sklepali so, da je močpromotorja prevelika in da se še vedno nekaj transkripcijskega faktorja Mphr ostane vezanega na DNA ne glede na koncentracijo eritromicina. Zato so zamenjali konstitutivni promotor pMphR z inducibilnim promotorjem pBAD.
Poleg tega so zapis za eGFP zamenjali z zapisom za sfGFP, saj ker so celice v odsotnosti represorja dajale močnejšo fluorescenco - močnejši signal.

===Optimizacija časa indukcije in koncentracije arabinoze===
Po optimiziranju naprave so morali preveriti še, ali je pred izpostavitvijo biosenzorju potrebna indukcija celic in kakšna je optimalna koncentracija arabinoze v sistemu, da bo občutljivost naprave največja.
Zapis za rezistenco ermC in transkripcijski faktor MpHR sta pod istim promotorjem pBAD. Zato so želeli preveriti, ali bi celice preživele, če jih izpostavijo direktno eritromicinu, ali potrebujejo predhodno indukcijo. Rast celic v mediju z eritromicinom in različnimi koncentracijami arabinoze ni bila zelo različna v prisotnosti induktorja in brez, zato so sklepali, da indukcija celic preden jih izpostavimo eritromicinu ni potrebna.
Za določitev optimalne koncentracije arabinoze so gojili celice v treh medijih z različnokoncentracijo arabinoze 0,1 %, 0,5 % in 1 % on 0, 0,1, 1 in 100 μg/mL eritromicina. Največje razlike v fluorescenci glede na različne koncentracije eritromicina so zaznali v mediju z 0,1 % arabinoze.

===Določitev koncentracijskega območja biosenzorja in izboljšanje občutljivosti===

S podatki iz literature so s pomočjo Hillove enačbe (graf vezanega makrolida na MphR v odvisnosti od koncentracije makrolida) ugotovili, da maksimalna koncentracija makrolidov, ki jo po navadi določijo v odpadnih vodah, ni v koncentracijskem območju biosenzorja. Njihova naprava bi morala biti kar od 10 do 100-krat bolj občutljiva.
Na začetku so predvideli, da makrolidi vstopajo v celico z difuzijo, in se bo po nekem času vzpostavilo ravnotežje, zato bo koncentracija makrolidov v odpadni vodi enaka koncentraciji makrolidov v celici. Ker pa so morali zagotoviti boljšo občutljivost biosenzorja, so s programom Rosetta predvideli mutacije v vezavnem mestu proteina MphR, ki bi omogočila močnejšo in hitrejšo vezavo makrolidov na MphR.
Eksperimentalno so zato preverili pet različnih nukleotidnih zaporedij v zapisu za MphR, od katerih se je eden izkazal za najbolj obetavnega. Senzor je bil občutljivejši za vezavo eritromicina in tudi razlika v jakosti fluorescence pri različnih koncentracijah eritromicina je bila večja.
Dodatno so želeli občutljivost naprave povečati tako, da bi vplivali na transmembranski protein FhuA. V literaturi so zasledili predlagane modifikacije, ki bi omogočale prehod večih makrolidov skozi ta transmembranski protein. Za eksperimentalno potrditev tega so računalniško (SWISS-MODEL) analizirali sev E. coli GKCW104 z odstranjenim genom toiC (element črpalk za multiplo odpornost) in modificiranim proteinom FhuA proteinom, kar vodi v prisotnost večih por v membrani. V tem primeru so vstavili vključek s konstitutivnim promtorjem, ker te celice potrebujejo indukcijo z arabinozo, za omenjene spremembe membrane, zato uporaba pBAD promotorja ni svetovana. Rezultati so pokazali večjo razliko v fluorescenci, ki so jo celice proizvedle v različnih koncentracijah eritromicina, v primerjavi s sevom TOP10. Eksperiment so zaradi omejenega dostopa do laboratorija ponovili samo dvakrat. Rezultati pa nakazujejo, da bi uporaba tega seva v biosenzorju lahko izboljšala občutljivost senzorja.

==PRISPEVEK IN OBETI==
Razvit optični biosenzor ima potencial za uporabo v čistilnih napravah. Z njim bi lahko optimizirali odstranjevanje mikroonesnažil iz vode. Da bi se to lahko izvajalo v praksi in uresničili cilj skupine, pa bi bilo potrebne še nekaj optimizacije. Ustvariti bi bilo potrebno biosenzor za uporabo več makrolidnih antibiotikov in več polutantov , kar bi bilo bolj ugodno za uporabo v čistilnih napravah. Optični biosenzor bi bilo treba nadgraditi v elektrokemijski, saj so ti bolj občutljivi. Potrebno bi bilo zagotoviti tudi večjo občutljivost naprave. Meja detekcije takšnega biosenzorja bi glede na podatke iz literature morala biti vsaj 100 ng/L. Čeprav so med postopkom projekta v literaturi že zasledili, da so elektrokemijski biosenzorji bolj občutljivi, so se zaradi pomanjkljivega znanja o elektrokemiji osredotočili na optimizacijo optičnega senzorja, katerega razvoj je bil tudi njihov prvotni načrt.
V sklopu projekta so študentje razvili tudi kampanjo za ozaveščanje ljudi o nepravilni rabi in neustreznem ravnanju z antibiotiki in kakšne probleme lahko predstavljajo antibiotiki, prisotni v okolju. Da bi s problematiko seznanili tudi mlajše, so razvili igrico ''Fix the Flow''. Namen igrice je zgraditi čistilno napravo in med postopkom približati sintezno biologijo, ravnanje z odpadno vodo in odpornost na antibiotike.

==VIRI==

[1] iGEM 2020 Team Aalto-Helsinki. SINISENS. [dostop: 23.5.2021]. Dostopno na: https://2020.igem.org/Team:Aalto-Helsinki.

SINISENS: kvantifikacija makrolidnih antibiotikov v okolju

2021-05-23T19:04:41Z

Maja Globočnik: /* Prispevek in obeti */

SINISENS je naslov projekta iz tekmovanja iGem 2020. Avtorji so študenti Univerze Aalto na Finskem.
[https://2020.igem.org/Team:Aalto-Helsinki Spletna stran projekta:]
Avtorica povzetka: Maja Globočnik

==Opis problema==
Onesnaženje z zdravili predstavlja vedno večji problem. Antibiotiki se predpisujejo ljudem in živalim za različne okužbe. Ker se v celoti ne prebavijo, ti prehajajo v odpadno vodo. Čeprav se v njej nahajajo v zelo majhnih koncentracijah, se akumulirajo. Poleg tega prisotnost antibiotikov v vodi lahko privede do tega, da mikroorganizmi postanejo nanje odporni. V Baltskem morju naj bi bilo v odpadnih vodah prisotno največ eritromicina, azitromicina in klaritomicina. Detekcija zdravil v vodi je zaradi majhnih koncentracij ne samo dolgotrajna ampak tudi zelo draga. Do sedaj sta se najpogosteje uporabljali tehniki LC-MS/MS in HPLC-MS/MS. Zato so si študentje zadali cilj razviti biosenzor za detekcijo in kvantifikacijo makrolidnih antibiotikov v vodi. Ta bi bil enostaven za uporabo, dovolj majhen, prenosen in cenovno učinkovit. Glavni namen je bil razvoj naprave, kjer se vzorec odpadne vode zlije v biosenzor, kar ob prisotnosti makrolidnih antibiotikov, mednje sodi tudi eritromicin, sproži zeleno fluorescenco bakterijskih celic. Razvoj biosenzorja so usmerjali za uporabo v čistilnih napravah, kjer bi lahko v prihodnosti s pomočjo razvitega biosenzorja optimizirali odstranjevanje zdravil in ostalih mikroonesnažil iz odpadne vode.

==Sestavljanje==
Napravo so najprej razdelili na dva dela, prvo so poimenovali 'represorska kaseta', drugo pa 'izhodna kaseta', da bi v primeru težav lažje ugotovili, kateri del ne funkcionira. Represorska kaseta (MphR sistem) je vsebovala zapis za proteinphR in ''erm''C pod konstitutivnim promotorjem (BBa_J23106) in terminator (BBa_B0029). Izhodna kaseta pa je bila sestavljena iz gena egfp pod inducibilnim promotorjem pMphR, katerega negativni regulator je MphR, in terminator BBa_B0029. Vse sekvence za proteine so vsebovale tudi RBS BBa_B0015, razen egfp , ta je imel svoje zaporedje za RBS, BBa_K3386005. Vsako kaseto so ligirali v plazmidni skelet z zapisom za odpornosti proti kloramfenikolu, ogrodji sta imeli drugačni obrazili.
Celice ''E. coli'', seva TOP10, so transformirali s sistemom MphR v gojišču LB z različnimi koncentracijami eritromicina (10, 50 in 100 μg/L) in klaritromicina, ki je strukturno podoben eritromicinu. Želeli so preveriti, ali zapis za odpornost proti eritromicinu nudi odpornost tudi na ostale makrolidne antibiotike. Kot negativno kontrolo so celice gojili v mediju s prisotnim spektinomicinom, ker ta pripada drugi vrsti antibiotikov in ima drugačen mehanizem delovanja.
S PCR na osnovi kolonije so preverili uspešnost ligacije, da so nato sistem EGFP in MphR klonirali v plazmidni skelet z zapisom za odpornost proti kanamicinu. Nato so lahko pričeli z optimizacijo naprave.

===Genetsko vezje===
Sistem deluje na način, da se v odsotnosti makrolidov transkripcijski faktor MphR veže na operatorsko mesto promotorja, ki ga regulira, pMphR, kar preprečuje izražanje gena egfp in s tem seveda fluorescenco celic. Ko pa so v okolju prisotni makrolidi, se ti vežejo na transkripcijski faktor MphR, kar onemogoča njihovo vezavo na operatorsko mesto, hkrati pa je sedaj omogočeno izražanje gena egfp in lahko zaznamo zeleno fluorescenco celic.

==REZULTATI==
Uspešno transformirane celice so gojili v gojiščih z različnimi koncentracijami eritromicina. Količina eritromicina v mediju je bila sorazmerna s količino proizvedene fluorescence. Razlike med vrednostmi fluorescence pri različnih koncentracijah eritromicina so bile premajhne za učinkovito zaznavanje majhnih količin makrolidov Sklepali so, da je močpromotorja prevelika in da se še vedno nekaj transkripcijskega faktorja Mphr ostane vezanega na DNA ne glede na koncentracijo eritromicina. Zato so zamenjali konstitutivni promotor pMphR z inducibilnim promotorjem pBAD.
Poleg tega so zapis za eGFP zamenjali z zapisom za sfGFP, saj ker so celice v odsotnosti represorja dajale močnejšo fluorescenco - močnejši signal.

===Optimizacija časa indukcije in koncentracije arabinoze===
Po optimiziranju naprave so morali preveriti še, ali je pred izpostavitvijo biosenzorju potrebna indukcija celic in kakšna je optimalna koncentracija arabinoze v sistemu, da bo občutljivost naprave največja.
Zapis za rezistenco ermC in transkripcijski faktor MpHR sta pod istim promotorjem pBAD. Zato so želeli preveriti, ali bi celice preživele, če jih izpostavijo direktno eritromicinu, ali potrebujejo predhodno indukcijo. Rast celic v mediju z eritromicinom in različnimi koncentracijami arabinoze ni bila zelo različna v prisotnosti induktorja in brez, zato so sklepali, da indukcija celic preden jih izpostavimo eritromicinu ni potrebna.
Za določitev optimalne koncentracije arabinoze so gojili celice v treh medijih z različnokoncentracijo arabinoze 0,1 %, 0,5 % in 1 % on 0, 0,1, 1 in 100 μg/mL eritromicina. Največje razlike v fluorescenci glede na različne koncentracije eritromicina so zaznali v mediju z 0,1 % arabinoze.

===Določitev koncentracijskega območja biosenzorja in izboljšanje občutljivosti===

S podatki iz literature so s pomočjo Hillove enačbe (graf vezanega makrolida na MphR v odvisnosti od koncentracije makrolida) ugotovili, da maksimalna koncentracija makrolidov, ki jo po navadi določijo v odpadnih vodah, ni v koncentracijskem območju biosenzorja. Njihova naprava bi morala biti kar od 10 do 100-krat bolj občutljiva.
Na začetku so predvideli, da makrolidi vstopajo v celico z difuzijo, in se bo po nekem času vzpostavilo ravnotežje, zato bo koncentracija makrolidov v odpadni vodi enaka koncentraciji makrolidov v celici. Ker pa so morali zagotoviti boljšo občutljivost biosenzorja, so s programom Rosetta predvideli mutacije v vezavnem mestu proteina MphR, ki bi omogočila močnejšo in hitrejšo vezavo makrolidov na MphR.
Eksperimentalno so zato preverili pet različnih nukleotidnih zaporedij v zapisu za MphR, od katerih se je eden izkazal za najbolj obetavnega. Senzor je bil občutljivejši za vezavo eritromicina in tudi razlika v jakosti fluorescence pri različnih koncentracijah eritromicina je bila večja.
Dodatno so želeli občutljivost naprave povečati tako, da bi vplivali na transmembranski protein FhuA. V literaturi so zasledili predlagane modifikacije, ki bi omogočale prehod večih makrolidov skozi ta transmembranski protein. Za eksperimentalno potrditev tega so računalniško (SWISS-MODEL) analizirali sev E. coli GKCW104 z odstranjenim genom toiC (element črpalk za multiplo odpornost) in modificiranim proteinom FhuA proteinom, kar vodi v prisotnost večih por v membrani. V tem primeru so vstavili vključek s konstitutivnim promtorjem, ker te celice potrebujejo indukcijo z arabinozo, za omenjene spremembe membrane, zato uporaba pBAD promotorja ni svetovana. Rezultati so pokazali večjo razliko v fluorescenci, ki so jo celice proizvedle v različnih koncentracijah eritromicina, v primerjavi s sevom TOP10. Eksperiment so zaradi omejenega dostopa do laboratorija ponovili samo dvakrat. Rezultati pa nakazujejo, da bi uporaba tega seva v biosenzorju lahko izboljšala občutljivost senzorja.

==PRISPEVEK IN OBETI==
Razvit optični biosenzor ima potencial za uporabo v čistilnih napravah. Z njim bi lahko optimizirali odstranjevanje mikroonesnažil iz vode. Da bi se to lahko izvajalo v praksi in uresničili cilj skupine, pa bi bilo potrebne še nekaj optimizacije. Ustvariti bi bilo potrebno biosenzor za uporabo več makrolidnih antibiotikov in več polutantov , kar bi bilo bolj ugodno za uporabo v čistilnih napravah. Optični biosenzor bi bilo treba nadgraditi v elektrokemijski, saj so ti bolj občutljivi. Potrebno bi bilo zagotoviti tudi večjo občutljivost naprave. Meja detekcije takšnega biosenzorja bi glede na podatke iz literature morala biti vsaj 100 ng/L. Čeprav so med postopkom projekta v literaturi že zasledili, da so elektrokemijski biosenzorji bolj občutljivi, so se zaradi pomanjkljivega znanja o elektrokemiji osredotočili na optimizacijo optičnega senzorja, katerega razvoj je bil tudi njihov prvotni načrt.
V sklopu projekta so študentje razvili tudi kampanjo za ozaveščanje ljudi o nepravilni rabi in neustreznem ravnanju z antibiotiki in kakšne probleme lahko predstavljajo antibiotiki, prisotni v okolju. Da bi s problematiko seznanili tudi mlajše, so razvili igrico ''Fix the Flow''. Namen igrice je zgraditi čistilno napravo in med postopkom približati sintezno biologijo, ravnanje z odpadno vodo in odpornost na antibiotike.

==Viri==

[1] iGEM 2020 Team Aalto-Helsinki. SINISENS. [dostop: 23.5.2021]. Dostopno na: https://2020.igem.org/Team:Aalto-Helsinki.

Seminarji SB 2020/21

2021-05-23T19:04:04Z

Maja Globočnik:

[http://www.example.com link title]V študijskem letu 2020/21 študentje 1. letnika predstavljajo naslednje teme:

RAZISKOVALNI ČLANKI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) 

# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Proizvodnja_1,3-propandiola_iz_različnih_ogljikovodikov_po_nenaravni_poti_preko_3-hidroksipropanojske_kisline Proizvodnja 1,3-propandiola iz različnih ogljikovodikov po nenaravni poti preko 3-hidroksipropanojske kisline] (Liza Ulčakar) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Doseganje_asimetri%C4%8Dnosti_in_asimetri%C4%8Dne_delitve_pri_E._coli Doseganje asimetričnosti in asimetrične delitve pri E. coli] (Aljaž Bratina) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Zmanj%C5%A1ana_procesivnost_ribosomov_v_sistemu_PURE Zmanjšana procesivnost ribosomov v sistemu PURE] (Tina Kolenc Milavec) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Na%C4%8Drtovana_pot_zvijanja_proteinskih_origamijev Načrtovana pot zvijanja proteinskih origamijev] (Anamarija Agnič) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/U%C4%8Dinkovita_svetlobno_inducibilna_Dre_rekombinaza_za_%C4%8Dasovno_in_prostorsko_celi%C4%8Dno_specifi%C4%8Dno_urejanje_genoma_v_mi%C5%A1jih_modelih#VIRI Učinkovita svetlobno inducibilna Dre rekombinaza za časovno in prostorsko celično specifično urejanje genoma v mišjih modelih] (Nika Mikulič Vernik) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Vzpostavitev_termometra_tRNA_za_dolo%C4%8Danje_temperature_optimalne_rasti_mikroorganizmov Vzpostavitev termometra tRNA za določanje temperature optimalne rasti mikroorganizmov] (Urša Štrancar) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Racionalna_zasnova_minimalnih_sinteti%C4%8Dnih_promotorjev_za_rastline#Construction_of_plasmids Racionalna zasnova minimalnih sintetičnih promotorjev za rastline] (Almina Tahirović) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Reverzibilna_toplotna_regulacija_za_bifunkcionalno_dinamično_uravnavanje_izražanja_genov_v_E._coli Reverzibilna toplotna regulacija za bifunkcionalno dinamično uravnavanje izražanja genov v E. coli] (Urška Fajdiga) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sinteti%C4%8Dna_optogenetska_naprava_na_osnovi_BRET_za_pulzirajo%C4%8Do_ekspresijo_transgena%2C_ki_omogo%C4%8Da_glukozno_homeostazo_pri_mi%C5%A1ih Sintetična optogenetska naprava na osnovi BRET za pulzirajočo ekspresijo transgena, ki omogoča glukozno homeostazo pri miših] (Paula Horvat) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Hkratna_karakterizacija_več_različnih_racionalno_načrtovanih_promotorskih_arhitektur Vpogled v kombinatorno logiko z IPTG induciranih sistemov] (Urška Zagorc) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Ponovno_določanje_specifičnosti_izven_citoplazme_aktivnih_sigma_faktorjev Ponovno določanje specifičnosti izven citoplazme aktivnih sigma faktorjev] (Eva Keber) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Hierarhi%C4%8Dno_sestavljanje_asimetri%C4%8Dnih_ikozaedri%C4%8Dnih_virusnih_kapsid Hierarhično sestavljanje asimetričnih ikozaedričnih virusnih kapsid] (Urška Pečarič Strnad) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Avtomatizirano_oblikovanje_sintezne_mikrobne_zdru%C5%BEbe Avtomatizirano oblikovanje sintezne mikrobne združbe] (Urša Lovše) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Regulacija_stopnje_izra%C5%BEanja_z_L-arabinozo_v_ekspresijskem_sistemu_T7_z_razklopljeno_rastjo Regulacija stopnje izražanja z L-arabinozo v ekspresijskem sistemu T7 z razklopljeno rastjo] (Maruša Mišmaš) 
# [[Oblikovanje sintetičnega faga iz P. aeruginosa z reduciranim genomom|Oblikovanje sintetičnega faga iz ''P. aeruginosa'' z reduciranim genomom]] (Martina Lokar) 
#[[Uravnavanje izražanja genov s pomočjo nanoteles in njihov vpliv na epigenetski spomin]] (Sara Laznik) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Priprava_humanih_CAR_imunskih_celic_z_napredno_logiko_in_porazdeljenim_računalništvom Priprava humanih CAR imunskih celic z napredno logiko in porazdeljenim računalništvom] (Tjaša Mlakar) 
# [[Utišanje genov na osnovi majhnih protismernih DNA omogoča manipulacijo in replikacijo genoma bakteriofagov v brezceličnem sistemu]] (Anže Karlek) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Translacijski_nadzor_izražanja_encima_odstranjevalca_preko_s_toksinom_induciranega_miRNA_stikala Translacijski nadzor izražanja encima odstranjevalca preko s toksinom induciranega miRNA stikala] (Ernestina Lavrih) 
# [[Sintetični promotorji za indukcijo imunskih celic v tumorskem mikrookolju]] (Saša Slabe) 

NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.) 

# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/RESHAPE_-_spreminjanje_morfologije_nitastih_gliv RESHAPE - spreminjanje morfologije nitastih gliv] (Špela Supej) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/The_Chlamy_Cleaner:_razgradnja_pesticida_z_zeleno_algo The Chlamy Cleaner: razgradnja pesticida z zeleno algo] (Doroteja Armič) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/TheraPUFA:_nazalni_probiotik_proti_okužbam_in_vnetjem TheraPUFA- nazalni probiotik proti okužbam in vnetjem] (Barbara Slapnik) 
# [[S-POP: Modularni biosenzor za zaznavanje obstojnih organskih onesnaževal v okoljskih vodah]] (Tadej Medved) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/MARS-magnetni_sistem_za_recikliranje_ATP MARS-magnetni sistem za recikliranje ATP] (David Miškić) 
# [[B.O.T.: Bakterijska oscilacijska terapija za zdravljenje kolorektalnega raka]] (Neža Pavko) 
# [[Rapidemic razvoj novega kompleta za hitro diagnostiko na mestu oskrbe]] (Mirsad Mešić) 
# [[iGEMINI: Kvasovke kot prehransko dopolnilo v vesolju]] (Klementina Polanec) 
# [[Antea-Glyphosate: Detekcija in razgradnja glifosata]] (Jernej Imperl) 
# [[NANOFLEX: Standardiziran, prilagodljiv in priročen celični biosenzor]] (Martin Špendl) 
# [[FlavoFlow: ribogojniška zaščita pred okužbami rib]] (Mateja Žvipelj) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/samoreplicirajoč_COVID-19_test Samoreplicirajoč COVID-19-test] (Irma Zeljković) 
# [[Renervate: Polimer za zdravljenje poškodb hrbtenjače]] (Sabina Sladič Oblak) 
# [[PROSTATUS: Diagnostika raka prostate]] (Luka Gnidovec) 
# [[RootPatch: Boj proti škodljivim nematodam v prsti]] (Nina Lukančič) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/SINISENS:_kvantifikacija_makrolidnih_antibiotikov_v_okolju SINISENS-kvantifikacija makrolidnih antibiotikov v okolju] (Maja Globočnik) 
 
----

Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Povzetek je treba objaviti dva dni pred predstavitvijo do polnoči (za seminarje v sredo torej v ponedeljek). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo razprava, ki praviloma ne bo daljša od 5 minut.

SINISENS: kvantifikacija makrolidnih antibiotikov v okolju

2021-05-23T19:01:23Z

Maja Globočnik: New page: SINISENS je naslov projekta iz tekmovanja iGem 2020. Avtorji so študenti Univerze Aalto na Finskem. [https://2020.igem.org/Team:Aalto-Helsinki Spletna stran projekta:] Avtorica povzetka: ...

SINISENS je naslov projekta iz tekmovanja iGem 2020. Avtorji so študenti Univerze Aalto na Finskem.
[https://2020.igem.org/Team:Aalto-Helsinki Spletna stran projekta:]
Avtorica povzetka: Maja Globočnik

==Opis problema==
Onesnaženje z zdravili predstavlja vedno večji problem. Antibiotiki se predpisujejo ljudem in živalim za različne okužbe. Ker se v celoti ne prebavijo, ti prehajajo v odpadno vodo. Čeprav se v njej nahajajo v zelo majhnih koncentracijah, se akumulirajo. Poleg tega prisotnost antibiotikov v vodi lahko privede do tega, da mikroorganizmi postanejo nanje odporni. V Baltskem morju naj bi bilo v odpadnih vodah prisotno največ eritromicina, azitromicina in klaritomicina. Detekcija zdravil v vodi je zaradi majhnih koncentracij ne samo dolgotrajna ampak tudi zelo draga. Do sedaj sta se najpogosteje uporabljali tehniki LC-MS/MS in HPLC-MS/MS. Zato so si študentje zadali cilj razviti biosenzor za detekcijo in kvantifikacijo makrolidnih antibiotikov v vodi. Ta bi bil enostaven za uporabo, dovolj majhen, prenosen in cenovno učinkovit. Glavni namen je bil razvoj naprave, kjer se vzorec odpadne vode zlije v biosenzor, kar ob prisotnosti makrolidnih antibiotikov, mednje sodi tudi eritromicin, sproži zeleno fluorescenco bakterijskih celic. Razvoj biosenzorja so usmerjali za uporabo v čistilnih napravah, kjer bi lahko v prihodnosti s pomočjo razvitega biosenzorja optimizirali odstranjevanje zdravil in ostalih mikroonesnažil iz odpadne vode.

==Sestavljanje==
Napravo so najprej razdelili na dva dela, prvo so poimenovali 'represorska kaseta', drugo pa 'izhodna kaseta', da bi v primeru težav lažje ugotovili, kateri del ne funkcionira. Represorska kaseta (MphR sistem) je vsebovala zapis za proteinphR in ''erm''C pod konstitutivnim promotorjem (BBa_J23106) in terminator (BBa_B0029). Izhodna kaseta pa je bila sestavljena iz gena egfp pod inducibilnim promotorjem pMphR, katerega negativni regulator je MphR, in terminator BBa_B0029. Vse sekvence za proteine so vsebovale tudi RBS BBa_B0015, razen egfp , ta je imel svoje zaporedje za RBS, BBa_K3386005. Vsako kaseto so ligirali v plazmidni skelet z zapisom za odpornosti proti kloramfenikolu, ogrodji sta imeli drugačni obrazili.
Celice ''E. coli'', seva TOP10, so transformirali s sistemom MphR v gojišču LB z različnimi koncentracijami eritromicina (10, 50 in 100 μg/L) in klaritromicina, ki je strukturno podoben eritromicinu. Želeli so preveriti, ali zapis za odpornost proti eritromicinu nudi odpornost tudi na ostale makrolidne antibiotike. Kot negativno kontrolo so celice gojili v mediju s prisotnim spektinomicinom, ker ta pripada drugi vrsti antibiotikov in ima drugačen mehanizem delovanja.
S PCR na osnovi kolonije so preverili uspešnost ligacije, da so nato sistem EGFP in MphR klonirali v plazmidni skelet z zapisom za odpornost proti kanamicinu. Nato so lahko pričeli z optimizacijo naprave.

===Genetsko vezje===
Sistem deluje na način, da se v odsotnosti makrolidov transkripcijski faktor MphR veže na operatorsko mesto promotorja, ki ga regulira, pMphR, kar preprečuje izražanje gena egfp in s tem seveda fluorescenco celic. Ko pa so v okolju prisotni makrolidi, se ti vežejo na transkripcijski faktor MphR, kar onemogoča njihovo vezavo na operatorsko mesto, hkrati pa je sedaj omogočeno izražanje gena egfp in lahko zaznamo zeleno fluorescenco celic.

==REZULTATI==
Uspešno transformirane celice so gojili v gojiščih z različnimi koncentracijami eritromicina. Količina eritromicina v mediju je bila sorazmerna s količino proizvedene fluorescence. Razlike med vrednostmi fluorescence pri različnih koncentracijah eritromicina so bile premajhne za učinkovito zaznavanje majhnih količin makrolidov Sklepali so, da je močpromotorja prevelika in da se še vedno nekaj transkripcijskega faktorja Mphr ostane vezanega na DNA ne glede na koncentracijo eritromicina. Zato so zamenjali konstitutivni promotor pMphR z inducibilnim promotorjem pBAD.
Poleg tega so zapis za eGFP zamenjali z zapisom za sfGFP, saj ker so celice v odsotnosti represorja dajale močnejšo fluorescenco - močnejši signal.

===Optimizacija časa indukcije in koncentracije arabinoze===
Po optimiziranju naprave so morali preveriti še, ali je pred izpostavitvijo biosenzorju potrebna indukcija celic in kakšna je optimalna koncentracija arabinoze v sistemu, da bo občutljivost naprave največja.
Zapis za rezistenco ermC in transkripcijski faktor MpHR sta pod istim promotorjem pBAD. Zato so želeli preveriti, ali bi celice preživele, če jih izpostavijo direktno eritromicinu, ali potrebujejo predhodno indukcijo. Rast celic v mediju z eritromicinom in različnimi koncentracijami arabinoze ni bila zelo različna v prisotnosti induktorja in brez, zato so sklepali, da indukcija celic preden jih izpostavimo eritromicinu ni potrebna.
Za določitev optimalne koncentracije arabinoze so gojili celice v treh medijih z različnokoncentracijo arabinoze 0,1 %, 0,5 % in 1 % on 0, 0,1, 1 in 100 μg/mL eritromicina. Največje razlike v fluorescenci glede na različne koncentracije eritromicina so zaznali v mediju z 0,1 % arabinoze.

===Določitev koncentracijskega območja biosenzorja in izboljšanje občutljivosti===

S podatki iz literature so s pomočjo Hillove enačbe (graf vezanega makrolida na MphR v odvisnosti od koncentracije makrolida) ugotovili, da maksimalna koncentracija makrolidov, ki jo po navadi določijo v odpadnih vodah, ni v koncentracijskem območju biosenzorja. Njihova naprava bi morala biti kar od 10 do 100-krat bolj občutljiva.
Na začetku so predvideli, da makrolidi vstopajo v celico z difuzijo, in se bo po nekem času vzpostavilo ravnotežje, zato bo koncentracija makrolidov v odpadni vodi enaka koncentraciji makrolidov v celici. Ker pa so morali zagotoviti boljšo občutljivost biosenzorja, so s programom Rosetta predvideli mutacije v vezavnem mestu proteina MphR, ki bi omogočila močnejšo in hitrejšo vezavo makrolidov na MphR.
Eksperimentalno so zato preverili pet različnih nukleotidnih zaporedij v zapisu za MphR, od katerih se je eden izkazal za najbolj obetavnega. Senzor je bil občutljivejši za vezavo eritromicina in tudi razlika v jakosti fluorescence pri različnih koncentracijah eritromicina je bila večja.
Dodatno so želeli občutljivost naprave povečati tako, da bi vplivali na transmembranski protein FhuA. V literaturi so zasledili predlagane modifikacije, ki bi omogočale prehod večih makrolidov skozi ta transmembranski protein. Za eksperimentalno potrditev tega so računalniško (SWISS-MODEL) analizirali sev E. coli GKCW104 z odstranjenim genom toiC (element črpalk za multiplo odpornost) in modificiranim proteinom FhuA proteinom, kar vodi v prisotnost večih por v membrani. V tem primeru so vstavili vključek s konstitutivnim promtorjem, ker te celice potrebujejo indukcijo z arabinozo, za omenjene spremembe membrane, zato uporaba pBAD promotorja ni svetovana. Rezultati so pokazali večjo razliko v fluorescenci, ki so jo celice proizvedle v različnih koncentracijah eritromicina, v primerjavi s sevom TOP10. Eksperiment so zaradi omejenega dostopa do laboratorija ponovili samo dvakrat. Rezultati pa nakazujejo, da bi uporaba tega seva v biosenzorju lahko izboljšala občutljivost senzorja.

==Prispevek in obeti==
Razvit optični biosenzor ima potencial za uporabo v čistilnih napravah. Z njim bi lahko optimizirali odstranjevanje mikroonesnažil iz vode. Da bi se to lahko izvajalo v praksi in uresničili cilj skupine, pa bi bilo potrebne še nekaj optimizacije. Ustvariti bi bilo potrebno biosenzor za uporabo več makrolidnih antibiotikov in več polutantov , kar bi bilo bolj ugodno za uporabo v čistilnih napravah. Optični biosenzor bi bilo treba nadgraditi v elektrokemijski, saj so ti bolj občutljivi. Potrebno bi bilo zagotoviti tudi večjo občutljivost naprave. Meja detekcije takšnega biosenzorja bi glede na podatke iz literature morala biti vsaj 100 ng/L. Čeprav so med postopkom projekta v literaturi že zasledili, da so elektrokemijski biosenzorji bolj občutljivi, so se zaradi pomanjkljivega znanja o elektrokemiji osredotočili na optimizacijo optičnega senzorja, katerega razvoj je bil tudi njihov prvotni načrt.
V sklopu projekta so študentje razvili tudi kampanjo za ozaveščanje ljudi o nepravilni rabi in neustreznem ravnanju z antibiotiki in kakšne probleme lahko predstavljajo antibiotiki, prisotni v okolju. Da bi s problematiko seznanili tudi mlajše, so razvili igrico ''Fix the Flow''. Namen igrice je zgraditi čistilno napravo in med postopkom približati sintezno biologijo, ravnanje z odpadno vodo in odpornost na antibiotike.

==Viri==

[1] iGEM 2020 Team Aalto-Helsinki. SINISENS. [dostop: 23.5.2021]. Dostopno na: https://2020.igem.org/Team:Aalto-Helsinki.

Vzajemna regulacija med fagom in bakterijo na posttranskripcijski ravni

2020-05-05T18:44:16Z

Maja Globočnik: /* Profagna sRNA regulira aktivnost sRNA bakterijskega kromosoma */

''Povzeto po:'' [https://www.asmscience.org/content/journal/microbiolspec/10.1128/microbiolspec.RWR-0027-2018 Altuvia, S., Storz, G., Papenfort, K. Cross‐Regulation between Bacteria and Phages at a Posttranscriptional Level. ''Microbiol Spectrum.'' '''6''', 1–6 (2018).]

Študija bakteriofagov in profagov je v preteklosti že privedla do odkritja mehanizmov kot sta sistem CRISPR in RNA vezavni plaščni protein bakteriofaga MS2, ki omogočata številne aplikacije v molekularni biologiji. Kljub temu tudi v tako raziskanih sistemih še danes odkrivajo neznane mehanizme. Eden takih je vzajemna regulacija med fagom in bakterijo na posttranskripcijski ravni, kjer pomembno vlogo igrajo majhne RNA (sRNA). Gre za molekule RNA velikosti do 200 nukleotidov in jih v grobem delimo v dve skupini: tiste, ki z vezavo na proteine vplivajo na njihovo aktivnost in ribosomska stikala, ki nadzirajo izražanje genov preko vezave na mRNA. Ribosomska stikala delimo na tista, kjer se sRNA veže na daljša in tista, kjer se veže na krajša komplementarna zaporedja. Nekatere sRNA se popolnoma prilegajo tarčni mRNA, druge pa vežejo le krajši mRNA zapis. Z vezavo na mRNA nadzirajo prepisovanje, pri čemer pogosto sodeluje RNA šaperon, protein Hfq, ki omogoča parjenje baz kompleksa sRNA-mRNA in stabilizira molekule sRNA. Nedavna odkritja kažejo, da so zapisi za regulatorne sRNA prisotni tako na bakterijskem kromosomu kot v genomu bakteriofagov kar privede do vzajemne regulacije.

==Uravnavanje virulenčnih faktorjev kodiranih v profagih z sRNA==

''Salmonella enterica'' je patogena bakterija, v kateri je prišlo do prenosa virulenčnih faktorjev iz faga in je eden bolje proučenih sistemov vzajemne regulacije. Ta bakterija uporablja specializiran sistem izločanja proteinov, ki je zapisan v ''S. enterica'' patogenih otokih 1 in 2 (SPI-1 in SPI-2). Sistem omogoča dostavo efektorskih proteinov v sesalske celice in z njimi vpliva na signalne kaskade gostitelja. Zapis za številne efektorske proteine, ki jih bakterija izloča, nosijo fagi ali njihovi ostanki. Pogost pojav je, da izvorni sRNA sistemi bakterije razširijo nabor regulatornih vlog in tako prispevajo k regulaciji virulenčnih faktorjev, ki jih zapisujejo profagi. RprA in SgrS sta primera sRNA zaporedij, ki vplivata tako na horizontalno prenesene kot v genomu zapisane virulenčne faktorje.

Primarna vloga RprA je sprožena s strani dvokomponentnega receptorskega sistema v odgovor na stres celične ovojnice. Navadno RprA spodbuja izražanje jedrnega zapisa za stacionarni sigma faktor σs. Ugotovljen je bil še dodatni mehanizem delovanja, kjer RprA s pomočjo σs faktorja aktivira prepisovanje membranskega proteina RicI, ki inhibira bakterijsko konjugacijo.<ref>Altuvia, S., Storz, G., Papenfort, K. Cross‐Regulation between Bacteria and Phages at a Posttranscriptional Level. ''Microbiol Spectrum.'' '''6''', 1–6 (2018).</ref>

PinT je sRNA, ki nadzira sintezo profagnih virulenčnih faktorjev, zapisana na horizontalno pridobljenih genih v ''S. enterici''. Prepisovanje te sRNA je močno inducirano s strani PhoPQ dvokomponentnega sistema, ki je ključen regulator virulence ''S. enterice'', ko so bakterije že v sesalskih celicah. Ko se PinT veže na mRNA, ustavi nadaljnjo sintezo profagnih SopE in SopE2 efektorjev. Ti so izraženi na začetku infekcije in spodbujajo bakterijsko naselitev celice, zato jih bakterija več ne potrebuje. Dodatno se veže na mRNA, ki kodira za Crp transkripcijski faktor, ki nadzoruje centralni metabolizem ogljika in aktivira transkripcijo genov za SPI-2 proteine. Z regulacijo tako SPI-1 kot SPI-2 virulenčnih genov PinT omogoča bakteriji prehod med invazivnim stanjem in stanjem znotrajceličnega razmnoževanja.

V ''E. coli'' in ''V. cholerae'' je več primerov, kjer sta tako zapis za sRNA kot njihovi tarčni geni pridobljeni znotraj ene same horizontalno prenesene enote iz faga v bakterijski genom. Primer take sRNA je AfaR iz ''E. coli'', katerega izražanje je odvisno od temperature in se dogaja na medgenski regiji med ''afaABCD'' in ''afaE'' transkripcijskimi enotami zraven profagnega lokusa, ki zapisuje za družino afimbrijskih adhezinov. S temi si bakterija pomaga pri oprijemanju na gostiteljske celice, kar je pomemben korak okužbe. AfaR se veže blizu mesta začetka prevajanja za ''afaD'' in tako promovira cepitev na tem mestu z RNazo E. Posledično se zmanjša izražanje proteinov, pomembnih pri adheziji in virulentnost bakterije. AfaR torej regulira bakterijsko kolonizacijo v odvisnosti od okoljskih dejavnikov.

==Uravnavanje toksinov kodiranih v profagih z sRNA==

Profagi zapisujejo tudi za toksine, ki so škodljivi za bakterijo če nastajajo v večjih količinah. Bakterije so razvile sRNA mehanizme za uravnavanje izražanja nekaterih izmed teh profagnih toksinov, kot na primer OxyS sRNA, katerega prepisovanje v ''E.coli'' je inducirano s strani transkripcijskega faktorja OxyR v odziv na oksidativni stres. Ta sRNA se veže na regijo za zapis antiterminatorskega faktorja ''nusG'' in prepreči njegovo sintezo. NusG je ključnega pomena za bakterijo, saj prepreči nastanek toksičnih produktov genov, zapisanih v horizontalno prenesenih genomskih elementih, vključno z genom ''kilR'' iz ''rac'' profaga. KilR protein blokira celično delitev in inducira celično smrt. Aktivacija OxyS vodi do začasnega znižanja ravni izražanja ''nusG'', kar posledično vodi do povečanja izražanja ''kilR'' in začasne ustavitve rasti celice. Taka začasna ustavitev, dopušča popravitev okvarjene DNA preden se spet vzpostavi normalna rast.<ref>Barshihat, S., Elgrably-Weiss, M., Edelstein, J., Georg, J., Govindarajan, S., Haviv, M., Wright, P. R., Hess, W. R., Altuvia, S. OxyS small RNA induces cell cycle arrest to allow DNA damage repair. ''EMBO J.'' '''37''', 413–426 (2018).</ref>

Bolj direkten nadzor proizvodnje toksinov se dogaja preko mehanizma tipa I sistema toksin-antitoksin s ''cis''-zapisanimi protismernimi RNA, ki se vežejo na prepisano mRNA toksina. Te vrste zapisov zasledimo tako na kromosomski in plazmidni DNA bakterije kot v genomih fagov.

==Profagne sRNA regulirajo transkripte zapisane na bakterijskem kromosomu==

Tako fagi kot profagi vsebujejo zapise preko katerih so zmožni ne le uravnavanja izražanja lastnih genov temveč tudi genov gostiteljske celice. Ena prvih odkritih sRNA v ''E. coli'' je bila DicF. DicF sRNA se v celici nahaja v izooblikah, dolgih 53 in 72 nt. Prehod iz paličaste v filamentno obliko, ko se bakterija znajde v anerobnem okolju naj bi bil pomemben za preživetje predvsem patogenih bakterij in ohranjanje virulence v gostiteljevem tkivu. V anaerobnih pogojih se v celici kopiči 53 nukleotidov dolga oblika DicF. Prisotnost enolaz v degradosomu v anerobnem okolju spodbudi filamentacijo ''E. coli'' preko stabilizacije sRNA DicF, ta pa preprečuje izražanje gena za protein FtsZ, zadolženega za delitev celic.<ref>Murashko, O. N., Lin-Chao, S. ''Escherichia coli'' responds to environmental changes using enolasic degradosomes and stabilized DicF sRNA to alter cellular morphology. ''Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.'' '''114''', 8025–8034 (2017)</ref>

Visoke ravni izražene DicF vplivajo tudi na metabolizem ogljika. Ta sRNA inhibira metabolne gene, ki kodirajo transkripcijski faktor, udeležen v razpadu ''D''-ksilose (XylR), ter transporterja piruvat kinaze A (PykA) in manoze (ManX).

Profagna sRNA Esr41, ki ravno tako deluje kot postranskripcijski regulator transkriptov bakterijskega kromosoma v enterohemoragični ''E. coli'', stimulira izražanje flagelina (FliC), glavnega strukturnega proteina bičkov bakterij. Trenutno še ni znano, če se Esr41 komplementarno veže na mRNA ''fliC'', ali je efekt indirekten in so potrebni še drugi faktorji.

sRNA Esr41 tudi zavira iniciacijo translacije z vezavo na mesto za ribosom na molekulah mRNA, ki kodirajo za proteine, ključne za metabolizem železa. Da Esr41 regulira privzem železa iz okolja so dokazali tako, da so mutanto ''E. coli'' EHEC, brez zapisa za Esr41, gojili v gojišču z manj dostopnega železa, te celice pa so pridobile boljši fitnes, kar nakazuje da Esr41 uravnava transport železa z zaviranjem delovanja določenih receptorjev za železo s pomočjo še nekaterih drugih proteinov.

==Profagna sRNA regulira aktivnost sRNA bakterijskega kromosoma==

Profagne sRNA lahko regulirajo sRNA bakterijskega kromosoma, imenujejo jih anti-sRNAs ali RNA spužve, ki se komplementarno vežejo na sRNA in blokirajo njeno aktivnost. Ena takšnih je AgvB.

Bakterijska sRNA GcvB je izredno ohranjena med enterobakterijami in kontrolira velik regulon (skupina genov pod istim regulatornim genom) genov, ki kodirajo za transporterje aminokislin in proteinov. Je glavni regulator transporta aminokislin in represor translacije številnih proteinov, vključno z dipeptidnim transporterjem DppA. 5'-konec AgvB je delno komplementaren ohranjeni sejalni regiji R1 (CACAACA), s katero GcvB prepozna večino tarč. Če se na GcvB veže profagna AgvB, ta ne bo več prepoznaval ''dppA'' mRNA in bo represija izražanja zmanjšana. Zanimivo tudi sRNA SroC, ki jo kodira bakterijski kromosom, deluje po istem principu in vpliva na funkcijo GcvB, le da se SroC veže na dve različni regiji in povzroči razpad GcvB.

==Fagne sRNA, ki uravnavajo izražanje genov zapisanih na gostiteljskem kromosomu==

Bakterije pri katerih je tekom lizogenega cikla prišlo do vključitve dednega materiala bakteriofaga so znane po spremembi lastnosti, ki med drugim tudi onemogočajo okužbo z drugimi fagi. Lambdoidni fag PA-2 ob okužbi celic ''E. coli'' spodbudi proizvodnjo membranskega proteina Lc in zavira sintezo OmpC, ki deluje kot receptor za vezavo PA-2. Inhibicija izražanja OmpC poteka preko prepisovanja 247 baznih parov, ki sledijo zapisu za ''lc'' in ki so mu pripisali ime IpeX. Potrdili so, da se IpeX RNA ne prevaja, tako ima zgolj regulatorno funkcijo. Način inhibicije prevajanja OmpC je neodvisen od prisotnosti Hfq.

V sevih ''E. coli'' okuženih z bakteriofagom Φ24B so opazili sRNA dolge 20 nukleotidov, imenovane 24B_1, ki so nastale s specifično cepitvijo daljšega zapisa, ki se nahaja med geni lom in ''vb_24B_43''. Tak nastanek nakazuje podobnost evkariontskim mikroRNA in bi tako lahko bil prvi odkrit primer te vrste v prokariontih. Testi, kjer so z delecijami zapisa za ta zapis preverjali biološko vlogo 24B_1, so pokazali, da je mutanta manj učinkovito vstopala v lizogeni cikel in hitreje prešla v lizni cikel. Kasneje so opažanja pripisali vlogi 24B_1 kot negativnega regulatorja izražanja gena ''d_ant''. V mutiranem sevu pomanjkanje tega negativnega regulatorja poveča izražanje antirepresorja, ki inhibira ''cI'' represor, pri čemer pride do povečanega izražanja genov.<ref>Nejman-Faleńczyk, B., Bloch, S., Licznerska, K., Dydecka, A., Felczykowska, A., Topka, G., Węgrzyn, A., Węgrzyn, G. A small, microRNA-size, ribonucleic acid regulating gene expression and development of Shiga toxin-converting bacteriophage Φ24Β. ''Sci. Rep.'' '''5''', (2015).</ref>

Bakteriofag PAK_P3 okuži bakterije ''Pseudomonas aeruginosa'', čemur sledi upad bakterijskih transkriptov in porast virusnih RNA ter sprememba metabolizma pirimidina, usmerjena v proizvodnjo nukleotidov za sintezo virusnih genomov. V začetni fazi okužbe regulacija poteka preko asRNA v končnih pa pride do porasti nekodirajočih sRNA. V pozni fazi okužbe se povečano izražata dve sRNA imenovani sRNA1, zapisana med genoma za dva fagna proteina, in sRNA2, zapisana med regijama za fagne tRNA. Študija vloge teh dveh sRNA je pokazala, da sodelujeta v utišanju prevajanja. sRNA2 ima 11 nukleotidov dolgo zaporedje, ki se na gostiteljskem genomu pojavi 8-krat znotraj zaporedja TψC-zanke tRNA, ki je povezana z vezavo na ribosom.<ref> Chevallereau, A., Blasdel, B. G., De Smet, J., Monot, M., Zimmermann, M., Kogadeeva, M., Sauer, U., Jorth, P., Whiteley, M., Debarbieux, L., Lavigne, R. Next-Generation “-omics” Approaches Reveal a Massive Alteration of Host RNA Metabolism during Bacteriophage Infection of ''Pseudomonas aeruginosa''. ''PLoS Genet.'' '''12''', 1–20 (2016).</ref>

==Fagni proteini, ki vplivajo na post-transkripcijsko regulacijo v gostiteljski celici==

Za promocijo lastne proliferacije so bakteriofagi razvili mehanizme, s katerimi lahko modificirajo bakterijske RNA polimeraze in mehanizem degradacije RNA, z namenom povečanja izražanja fagnih genov in zaviranja bakterijskih. Primer je okužba ''E. coli'' z bakteriofagom T4, kjer fagni protein Srd spodbudi katalitično aktivnost gostiteljske ribonukleaze E, kar povzroči hitro razgradnjo bakterijske mRNA, zaradi česar se začnejo povečano prepisovati in prevajati fagni geni.

V primeru okužbe ''E. coli'' z bakteriofagom T7, protein kinaza gp0.7 povzroči fosforilacijo gostiteljske ribonukleaze E in RNA helikaze RhlB, kar povzroči dodatno stabilizacijo mRNA, ki jo sintetizira T7 RNA polimeraza, hkrati pa ne stabilizira mRNA, ki jo sintetirzira RNA polimeraza gostiteljske celice. Poleg tega naj bi kinaza gp0.7 spodbudila aktivnost RNaze III.

Tretji mehanizem regulacije predstavlja okužba ''P. aeruginosa'' s fagom ΦKZ. V tem primeru fagni protein Dip inhibira RNA degradosom, pri čemer se Dip veže na RNA-vezavni mesti, kamor se sicer veže RNaza E in tako zavira degradacijo preko RNaze E.

==Viri==

<references/>

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Vzajemna regulacija med fagom in bakterijo na posttranskripcijski ravni

2020-05-05T18:43:35Z

Maja Globočnik: /* Profagne sRNA regulirajo transkripte zapisane na bakterijskem kromosomu */

''Povzeto po:'' [https://www.asmscience.org/content/journal/microbiolspec/10.1128/microbiolspec.RWR-0027-2018 Altuvia, S., Storz, G., Papenfort, K. Cross‐Regulation between Bacteria and Phages at a Posttranscriptional Level. ''Microbiol Spectrum.'' '''6''', 1–6 (2018).]

Študija bakteriofagov in profagov je v preteklosti že privedla do odkritja mehanizmov kot sta sistem CRISPR in RNA vezavni plaščni protein bakteriofaga MS2, ki omogočata številne aplikacije v molekularni biologiji. Kljub temu tudi v tako raziskanih sistemih še danes odkrivajo neznane mehanizme. Eden takih je vzajemna regulacija med fagom in bakterijo na posttranskripcijski ravni, kjer pomembno vlogo igrajo majhne RNA (sRNA). Gre za molekule RNA velikosti do 200 nukleotidov in jih v grobem delimo v dve skupini: tiste, ki z vezavo na proteine vplivajo na njihovo aktivnost in ribosomska stikala, ki nadzirajo izražanje genov preko vezave na mRNA. Ribosomska stikala delimo na tista, kjer se sRNA veže na daljša in tista, kjer se veže na krajša komplementarna zaporedja. Nekatere sRNA se popolnoma prilegajo tarčni mRNA, druge pa vežejo le krajši mRNA zapis. Z vezavo na mRNA nadzirajo prepisovanje, pri čemer pogosto sodeluje RNA šaperon, protein Hfq, ki omogoča parjenje baz kompleksa sRNA-mRNA in stabilizira molekule sRNA. Nedavna odkritja kažejo, da so zapisi za regulatorne sRNA prisotni tako na bakterijskem kromosomu kot v genomu bakteriofagov kar privede do vzajemne regulacije.

==Uravnavanje virulenčnih faktorjev kodiranih v profagih z sRNA==

''Salmonella enterica'' je patogena bakterija, v kateri je prišlo do prenosa virulenčnih faktorjev iz faga in je eden bolje proučenih sistemov vzajemne regulacije. Ta bakterija uporablja specializiran sistem izločanja proteinov, ki je zapisan v ''S. enterica'' patogenih otokih 1 in 2 (SPI-1 in SPI-2). Sistem omogoča dostavo efektorskih proteinov v sesalske celice in z njimi vpliva na signalne kaskade gostitelja. Zapis za številne efektorske proteine, ki jih bakterija izloča, nosijo fagi ali njihovi ostanki. Pogost pojav je, da izvorni sRNA sistemi bakterije razširijo nabor regulatornih vlog in tako prispevajo k regulaciji virulenčnih faktorjev, ki jih zapisujejo profagi. RprA in SgrS sta primera sRNA zaporedij, ki vplivata tako na horizontalno prenesene kot v genomu zapisane virulenčne faktorje.

Primarna vloga RprA je sprožena s strani dvokomponentnega receptorskega sistema v odgovor na stres celične ovojnice. Navadno RprA spodbuja izražanje jedrnega zapisa za stacionarni sigma faktor σs. Ugotovljen je bil še dodatni mehanizem delovanja, kjer RprA s pomočjo σs faktorja aktivira prepisovanje membranskega proteina RicI, ki inhibira bakterijsko konjugacijo.<ref>Altuvia, S., Storz, G., Papenfort, K. Cross‐Regulation between Bacteria and Phages at a Posttranscriptional Level. ''Microbiol Spectrum.'' '''6''', 1–6 (2018).</ref>

PinT je sRNA, ki nadzira sintezo profagnih virulenčnih faktorjev, zapisana na horizontalno pridobljenih genih v ''S. enterici''. Prepisovanje te sRNA je močno inducirano s strani PhoPQ dvokomponentnega sistema, ki je ključen regulator virulence ''S. enterice'', ko so bakterije že v sesalskih celicah. Ko se PinT veže na mRNA, ustavi nadaljnjo sintezo profagnih SopE in SopE2 efektorjev. Ti so izraženi na začetku infekcije in spodbujajo bakterijsko naselitev celice, zato jih bakterija več ne potrebuje. Dodatno se veže na mRNA, ki kodira za Crp transkripcijski faktor, ki nadzoruje centralni metabolizem ogljika in aktivira transkripcijo genov za SPI-2 proteine. Z regulacijo tako SPI-1 kot SPI-2 virulenčnih genov PinT omogoča bakteriji prehod med invazivnim stanjem in stanjem znotrajceličnega razmnoževanja.

V ''E. coli'' in ''V. cholerae'' je več primerov, kjer sta tako zapis za sRNA kot njihovi tarčni geni pridobljeni znotraj ene same horizontalno prenesene enote iz faga v bakterijski genom. Primer take sRNA je AfaR iz ''E. coli'', katerega izražanje je odvisno od temperature in se dogaja na medgenski regiji med ''afaABCD'' in ''afaE'' transkripcijskimi enotami zraven profagnega lokusa, ki zapisuje za družino afimbrijskih adhezinov. S temi si bakterija pomaga pri oprijemanju na gostiteljske celice, kar je pomemben korak okužbe. AfaR se veže blizu mesta začetka prevajanja za ''afaD'' in tako promovira cepitev na tem mestu z RNazo E. Posledično se zmanjša izražanje proteinov, pomembnih pri adheziji in virulentnost bakterije. AfaR torej regulira bakterijsko kolonizacijo v odvisnosti od okoljskih dejavnikov.

==Uravnavanje toksinov kodiranih v profagih z sRNA==

Profagi zapisujejo tudi za toksine, ki so škodljivi za bakterijo če nastajajo v večjih količinah. Bakterije so razvile sRNA mehanizme za uravnavanje izražanja nekaterih izmed teh profagnih toksinov, kot na primer OxyS sRNA, katerega prepisovanje v ''E.coli'' je inducirano s strani transkripcijskega faktorja OxyR v odziv na oksidativni stres. Ta sRNA se veže na regijo za zapis antiterminatorskega faktorja ''nusG'' in prepreči njegovo sintezo. NusG je ključnega pomena za bakterijo, saj prepreči nastanek toksičnih produktov genov, zapisanih v horizontalno prenesenih genomskih elementih, vključno z genom ''kilR'' iz ''rac'' profaga. KilR protein blokira celično delitev in inducira celično smrt. Aktivacija OxyS vodi do začasnega znižanja ravni izražanja ''nusG'', kar posledično vodi do povečanja izražanja ''kilR'' in začasne ustavitve rasti celice. Taka začasna ustavitev, dopušča popravitev okvarjene DNA preden se spet vzpostavi normalna rast.<ref>Barshihat, S., Elgrably-Weiss, M., Edelstein, J., Georg, J., Govindarajan, S., Haviv, M., Wright, P. R., Hess, W. R., Altuvia, S. OxyS small RNA induces cell cycle arrest to allow DNA damage repair. ''EMBO J.'' '''37''', 413–426 (2018).</ref>

Bolj direkten nadzor proizvodnje toksinov se dogaja preko mehanizma tipa I sistema toksin-antitoksin s ''cis''-zapisanimi protismernimi RNA, ki se vežejo na prepisano mRNA toksina. Te vrste zapisov zasledimo tako na kromosomski in plazmidni DNA bakterije kot v genomih fagov.

==Profagne sRNA regulirajo transkripte zapisane na bakterijskem kromosomu==

Tako fagi kot profagi vsebujejo zapise preko katerih so zmožni ne le uravnavanja izražanja lastnih genov temveč tudi genov gostiteljske celice. Ena prvih odkritih sRNA v ''E. coli'' je bila DicF. DicF sRNA se v celici nahaja v izooblikah, dolgih 53 in 72 nt. Prehod iz paličaste v filamentno obliko, ko se bakterija znajde v anerobnem okolju naj bi bil pomemben za preživetje predvsem patogenih bakterij in ohranjanje virulence v gostiteljevem tkivu. V anaerobnih pogojih se v celici kopiči 53 nukleotidov dolga oblika DicF. Prisotnost enolaz v degradosomu v anerobnem okolju spodbudi filamentacijo ''E. coli'' preko stabilizacije sRNA DicF, ta pa preprečuje izražanje gena za protein FtsZ, zadolženega za delitev celic.<ref>Murashko, O. N., Lin-Chao, S. ''Escherichia coli'' responds to environmental changes using enolasic degradosomes and stabilized DicF sRNA to alter cellular morphology. ''Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.'' '''114''', 8025–8034 (2017)</ref>

Visoke ravni izražene DicF vplivajo tudi na metabolizem ogljika. Ta sRNA inhibira metabolne gene, ki kodirajo transkripcijski faktor, udeležen v razpadu ''D''-ksilose (XylR), ter transporterja piruvat kinaze A (PykA) in manoze (ManX).

Profagna sRNA Esr41, ki ravno tako deluje kot postranskripcijski regulator transkriptov bakterijskega kromosoma v enterohemoragični ''E. coli'', stimulira izražanje flagelina (FliC), glavnega strukturnega proteina bičkov bakterij. Trenutno še ni znano, če se Esr41 komplementarno veže na mRNA ''fliC'', ali je efekt indirekten in so potrebni še drugi faktorji.

sRNA Esr41 tudi zavira iniciacijo translacije z vezavo na mesto za ribosom na molekulah mRNA, ki kodirajo za proteine, ključne za metabolizem železa. Da Esr41 regulira privzem železa iz okolja so dokazali tako, da so mutanto ''E. coli'' EHEC, brez zapisa za Esr41, gojili v gojišču z manj dostopnega železa, te celice pa so pridobile boljši fitnes, kar nakazuje da Esr41 uravnava transport železa z zaviranjem delovanja določenih receptorjev za železo s pomočjo še nekaterih drugih proteinov.

==Profagna sRNA regulira aktivnost sRNA bakterijskega kromosoma==

Profagne sRNA lahko regulirajo sRNA bakterijskega kromosoma, imenujejo jih anti-sRNAs ali RNA spužve, ki se komplementarno vežejo na sRNA in blokirajo njeno aktivnost. Ena takšnih je AgvB.

Bakterijska sRNA GcvB je izredno ohranjena med enterobakterijami in kontrolira velik regulon (skupina genov pod istim regulatornim genom) genov, ki kodirajo za transporterje aminokislin in proteinov. Je glavni regulator transporta aminokislin in represor translacije številnih proteinov, vključno z dipeptidnim transporterjem DppA. 5'-konec AgvB je delno komplementaren ohranjeni sejalni regiji R1 (CACAACA), s katero GcvB prepozna večino tarč. Če se na GcvB veže profagna AgvB, ta ne bo več prepoznaval ''dpp'' mRNA in bo represija izražanja zmanjšana. Zanimivo tudi sRNA SroC, ki jo kodira bakterijski kromosom, deluje po istem principu in vpliva na funkcijo GcvB, le da se SroC veže na dve različni regiji in povzroči razpad GcvB.

==Fagne sRNA, ki uravnavajo izražanje genov zapisanih na gostiteljskem kromosomu==

Bakterije pri katerih je tekom lizogenega cikla prišlo do vključitve dednega materiala bakteriofaga so znane po spremembi lastnosti, ki med drugim tudi onemogočajo okužbo z drugimi fagi. Lambdoidni fag PA-2 ob okužbi celic ''E. coli'' spodbudi proizvodnjo membranskega proteina Lc in zavira sintezo OmpC, ki deluje kot receptor za vezavo PA-2. Inhibicija izražanja OmpC poteka preko prepisovanja 247 baznih parov, ki sledijo zapisu za ''lc'' in ki so mu pripisali ime IpeX. Potrdili so, da se IpeX RNA ne prevaja, tako ima zgolj regulatorno funkcijo. Način inhibicije prevajanja OmpC je neodvisen od prisotnosti Hfq.

V sevih ''E. coli'' okuženih z bakteriofagom Φ24B so opazili sRNA dolge 20 nukleotidov, imenovane 24B_1, ki so nastale s specifično cepitvijo daljšega zapisa, ki se nahaja med geni lom in ''vb_24B_43''. Tak nastanek nakazuje podobnost evkariontskim mikroRNA in bi tako lahko bil prvi odkrit primer te vrste v prokariontih. Testi, kjer so z delecijami zapisa za ta zapis preverjali biološko vlogo 24B_1, so pokazali, da je mutanta manj učinkovito vstopala v lizogeni cikel in hitreje prešla v lizni cikel. Kasneje so opažanja pripisali vlogi 24B_1 kot negativnega regulatorja izražanja gena ''d_ant''. V mutiranem sevu pomanjkanje tega negativnega regulatorja poveča izražanje antirepresorja, ki inhibira ''cI'' represor, pri čemer pride do povečanega izražanja genov.<ref>Nejman-Faleńczyk, B., Bloch, S., Licznerska, K., Dydecka, A., Felczykowska, A., Topka, G., Węgrzyn, A., Węgrzyn, G. A small, microRNA-size, ribonucleic acid regulating gene expression and development of Shiga toxin-converting bacteriophage Φ24Β. ''Sci. Rep.'' '''5''', (2015).</ref>

Bakteriofag PAK_P3 okuži bakterije ''Pseudomonas aeruginosa'', čemur sledi upad bakterijskih transkriptov in porast virusnih RNA ter sprememba metabolizma pirimidina, usmerjena v proizvodnjo nukleotidov za sintezo virusnih genomov. V začetni fazi okužbe regulacija poteka preko asRNA v končnih pa pride do porasti nekodirajočih sRNA. V pozni fazi okužbe se povečano izražata dve sRNA imenovani sRNA1, zapisana med genoma za dva fagna proteina, in sRNA2, zapisana med regijama za fagne tRNA. Študija vloge teh dveh sRNA je pokazala, da sodelujeta v utišanju prevajanja. sRNA2 ima 11 nukleotidov dolgo zaporedje, ki se na gostiteljskem genomu pojavi 8-krat znotraj zaporedja TψC-zanke tRNA, ki je povezana z vezavo na ribosom.<ref> Chevallereau, A., Blasdel, B. G., De Smet, J., Monot, M., Zimmermann, M., Kogadeeva, M., Sauer, U., Jorth, P., Whiteley, M., Debarbieux, L., Lavigne, R. Next-Generation “-omics” Approaches Reveal a Massive Alteration of Host RNA Metabolism during Bacteriophage Infection of ''Pseudomonas aeruginosa''. ''PLoS Genet.'' '''12''', 1–20 (2016).</ref>

==Fagni proteini, ki vplivajo na post-transkripcijsko regulacijo v gostiteljski celici==

Za promocijo lastne proliferacije so bakteriofagi razvili mehanizme, s katerimi lahko modificirajo bakterijske RNA polimeraze in mehanizem degradacije RNA, z namenom povečanja izražanja fagnih genov in zaviranja bakterijskih. Primer je okužba ''E. coli'' z bakteriofagom T4, kjer fagni protein Srd spodbudi katalitično aktivnost gostiteljske ribonukleaze E, kar povzroči hitro razgradnjo bakterijske mRNA, zaradi česar se začnejo povečano prepisovati in prevajati fagni geni.

V primeru okužbe ''E. coli'' z bakteriofagom T7, protein kinaza gp0.7 povzroči fosforilacijo gostiteljske ribonukleaze E in RNA helikaze RhlB, kar povzroči dodatno stabilizacijo mRNA, ki jo sintetizira T7 RNA polimeraza, hkrati pa ne stabilizira mRNA, ki jo sintetirzira RNA polimeraza gostiteljske celice. Poleg tega naj bi kinaza gp0.7 spodbudila aktivnost RNaze III.

Tretji mehanizem regulacije predstavlja okužba ''P. aeruginosa'' s fagom ΦKZ. V tem primeru fagni protein Dip inhibira RNA degradosom, pri čemer se Dip veže na RNA-vezavni mesti, kamor se sicer veže RNaza E in tako zavira degradacijo preko RNaze E.

==Viri==

<references/>

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]