Wiki FKKT - User contributions [en]

Seminarji SB 2021/22

2022-05-24T22:17:59Z

Maks Kumek:

V študijskem letu 2021/22 študentje pri Sintezni biologiji predstavljajo naslednje teme:

RAZISKOVALNI ČLANKI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) 

# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Kombinatori%C4%8Dni_pristopi_pri_na%C4%8Drtovanju_medproteinskih_interakcij%2C_uravnavanih_s_svetlobnimi_stikali Kombinatorični pristopi pri načrtovanju medproteinskih interakcij, uravnavanih s svetlobnimi stikali] (Neža Žerjav)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/De_novo_na%C4%8Drtovanje_transkripcijskega_faktorja_za_uporabo_v_progesteronskem_biosenzorju ''De novo'' načrtovanje transkripcijskega faktorja za uporabo v progesteronskem biosenzorju] (Polona Skrt)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Prozdravila_na_osnovi_siRNA%2C_ki_aktivirajo_RNA-interferenco_kot_odziv_na_prisotnost_specifi%C4%8Dnega_RNA-biomarkerja Prozdravila na osnovi siRNA, ki aktivirajo RNA-interferenco kot odziv na prisotnost specifičnega RNA-biomarkerja] (Tina Zavodnik)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Bifunkcionalno_optogenetsko_stikalo_za_izboljšanje_proizvodnje_šikimske_kisline_v_E._coli Bifunkcionalno optogenetsko stikalo za izboljšanje proizvodnje šikimske kisline v ''E. coli''] (Meta Kodrič)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Inžiniring_in_izkoriščanje_sintetične_alosterije_luciferaze_NanoLuc Inžiniring in izkoriščanje sintetične alosterije luciferaze NanoLuc] (Rebeka Dajčman)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Modularen_RNA_interferenčni_sistem_za_regulacijo_multipleksnih_genov Modularen RNA interferenčni sistem za regulacijo multipleksnih genov] (Marko Pavleković)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Označevanje_bioloških_celic_za_zanesljivo_celično_inženirstvo Označevanje bioloških celic za zanesljivo celično inženirstvo] (Neža Blaznik)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Z_biosenzorjem_usmerjen_inžiniring_Cupriavidus_necator_H16_za_avtotrofno_proizvodnjo_manitola Z biosenzorjem usmerjen inženiring ''Cupriavidus necator'' H16 za avtotrofno proizvodnjo manitola] (Teo Nograšek)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/CelloSelect_%E2%80%93_sinteti%C4%8Dna_celobiozna_presnovna_pot_za_izbor_stabilnih_transgenih_celi%C4%8Dnih_linij_CHO CelloSelect – sintetična celobiozna presnovna pot za izbor stabilnih transgenih celičnih linij CHO] (Nika Vegelj)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Hipersensitiven_genetsko_kodiran_fluorescen%C4%8Dni_indikator_%28roGFP2-Prx1%29_za_kontinuirno_merjenje_znotrajceli%C4%8Dnega_H2O2_med_mikro-kultivacijo_celic#Literatura Hipersensitiven genetsko kodiran fluorescenčni indikator (roGFP2-Prx1) za kontinuirno merjenje znotrajceličnega H2O2 med mikro-kultivacijo celic] (Eva Kanalec)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Zasnova_in_karakterizacija_s_salicilno_kislino_induciranega_genskega_ekspresijskega_sistema_za_celice_Jurkat Zasnova in karakterizacija s salicilno kislino induciranega genskega ekspresijskega sistema za celice Jurkat] (Tina Arnšek)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Modularni_sinteti%C4%8Dni_kromosomi_kot_novo_orodje_za_in%C5%BEenirstvo_metabolizma Modularni sintetični kromosomi kot novo orodje za inženirstvo metabolizma] (Špela Kladnik)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sinteti%C4%8Dni_mikrobni_konzorcij_za_biosintezo_2-keto-L-glukonske_kisline_%282-KLG%29 Sintetični mikrobni konzorcij za biosintezo 2-keto-L-glukonske kisline (2-KLG)] (Anastasija Nechevska)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Računalništvo_znotraj_bakterij:_Programiranje_bakterijskega_obnašanja_s_pomočjo_plazmida,_ki_kodira_perceptronsko_nevronsko_mrežo Računalništvo znotraj bakterij: Programiranje bakterijskega obnašanja s pomočjo plazmida, ki kodira perceptronsko nevronsko mrežo] (Tevž Levstek)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Genetsko_vezje_na_osnovi_rekombinaze_za_spremljanje_težkih_kovin Genetsko vezje na osnovi rekombinaze za spremljanje težkih kovin] (Mija Šulin)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Molekularni_biosenzor_za_zaznavanje_kaspaze-3_in_detekcijo_apoptoze Molekularni biosenzor za zaznavanje kaspaze-3 in detekcijo apoptoze] (Evgen Kozole)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Neodvisno_uravnavanje_jakosti_in_periode_v_sinteti%C4%8Dnem_oscilatorskem_vezju_preko_modificiranega_represilatorja Neodvisno uravnavanje jakosti in periode v sintetičnem oscilatorskem vezju preko modificiranega represilatorja] (Maks Kumek

NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.) 

# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/MIBOM_-_biokompatibilni_material_iz_školjk MIBOM - biokompatibilni material iz školjk] (Manca Osolin) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BOOM_V_-_bakterijski_membranski_vezikli_za_zaščito_rastlin_pred_patogeni BOOM V - bakterijski membranski vezikli za zaščito rastlin pred patogeni] (Eva Gartner) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/LET.IT.BEE_-_paradižnik,_katerega_cvetovi_razgradijo_insekticid LET.IT.BEE - paradižnik, katerega cvetovi razgradijo insekticid] (Barbara Jaklič) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Kissed_by_light_-_sistem_proti_oku%C5%BEbi_opeklin Kissed by light - sistem proti okužbi opeklin] (Nina Varda)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Gutail_Floractory_-_probiotične_bakterije_za_zaščito_črevesja_pred_vnetji Gutail Floractory - probiotične bakterije za zaščito črevesja pred vnetji] (Karmen Mlinar)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/AptaVita_-_diagnostika_pomanjkanja_vitaminov_z_aptacimi AptaVita - diagnostika pomanjkanja vitaminov z aptacimi] (Valeriya Musina)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/P.L.A.N.T._-_rastlinski_detekcijski_sistem_za_bojne_strupe P.L.A.N.T. - rastlinski detekcijski sistem za bojne strupe] (Tina Logonder)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Kolorimetrični_sistem_za_zaznavanje_virusov_na_podlagi_G_-_kvadrupleksov Kolorimetrični sistem za zaznavanje virusov na podlagi G-kvadrupleksov] (Nastja Feguš)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Aprifreeze Aprifreeze - zaščita marelic pred spomladanskimi pozebami] (Laura Gašperšič) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/OpenPlast_-_kloroplastni_brezcelični_sistemi_za_hitrejšo_karakterizacijo_genetskih_delov OpenPlast - kloroplastni brezcelični sistemi za hitrejšo karakterizacijo genetskih delov] (Kim Glavič) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/PHEAST_-_P._pastoris_za_odstranjevanje_metana PHEAST - ''P. pastoris'' za odstranjevanje metana] (Ana Potočnik) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/ELIXIO_-Mikrobni_konzorcij_za_vonj_po_vijolicah ELIXIO Mikrobni konzorcij za vonj po vijolicah] (Ajda Godec) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Agrobactory_593_-_Modularna_bakterijska_platforma_za_pripravo_biopesticidov Agrobactory 593 - Modularna bakterijska platforma za pripravo biopesticidev] (Tim Nograšek) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=CyaSalt_-_metoda_za_razsoljevanje_morskih_voda] (Michelle Oletič) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/PRYSM_-_s svetlobo regulirane kvasovke PRYSM_-_s svetlobo regulirane kvasovke] (Nika Malečkar)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Remi,_du_et!_-_bioremediacija_razlitij_nafte Remi, du et! - bioremediacija razlitij nafte] (Jošt Hren)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Minicelice_kot_proizvodna_platforma Minicelice kot proizvodna platforma] (Mladen Davidovikj)
----

Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Povzetek je treba objaviti dva dni pred predstavitvijo do polnoči (za seminarje v sredo torej v ponedeljek). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo razprava, ki praviloma ne bo daljša od 5 minut.

Neodvisno uravnavanje jakosti in periode v sintetičnem oscilatorskem vezju preko modificiranega represilatorja

2022-05-24T22:14:58Z

Maks Kumek:

Izhodiščni članek: Zhang, F., Sun, Y., Zhang, Y. et al. Independent control of amplitude and period in a synthetic oscillator circuit with modified repressilator. Commun Biol 5, 23 (2022). https://doi.org/10.1038/s42003-021-02987-1

== Uvod ==

Oscilatorska vezja so v naravi vsestransko prisotna. Genetski oscilatorji kot so p53 oscilator, NF-κB sunkovni oscilator, cirkadiani ritmi in mehanizem celičnega cikla so ključnega pomena v regulaciji procesov celic in večceličnih sistemov [1]. Značilnosti naravnih oscilatorjev so njihova stabilnost in sposobnost spreminjanja faze, periode in jakosti izhodnega signala. Sintetična vezja, ki se dan danes razvijajo strmijo k posnemanju le teh lastnosti in nakazujejo na možno praktično uporabo v pulznem dostavljanju zdravilnih učinkovin v medicini [2], [3]. Ustvarjanje minimaliziranih modularnih vodljivih oscilatorjev odpira možnosti njihove integracije v mnogo kompleksnejša vezja, kjer se lahko dinamično usklajuje končne produkte glede na željene rezultate [4].

Dva tipa oscilatorjev se izrazito preučujeta v poprej omenjene namene: dvojno povratni oscilator (DFO) in represilator (RLT). Prvi temelji na dveh povratnih zankah, npr. izražanje ''lacI'' (negativna povratna zanka) in ''araC'' (pozitivna povratna zanka). Stičišče teh dveh zank je promotor s pozitivno-negativno regulacijo, ki regulira izražanje obeh genov [5]. Po drugi strani represilator temelji na treh zaporednih represorskih genih, ki se vežejo na operatorske regije naslednjega gena v zaporedju. Prvi opisani represilator je bil Elowitzov represilator, ki je združil repressorje: TetR (Tn10 transpozon), LacI (laktozni opreon) in cI (bakteriofag λ)[3]. V nasprotju z DFO so vodljivi RLT ostajali predmet teoretičnih modelov [6].

Ideja raziskovalne skupine je bila zasnovati represilatorsko vezje, ki se poslužuje dveh induktorjev: enega, ki spreminja periodo izhodnega signala in drugega, ki omogoča reguliranje jakosti signala. Prvi naj bi deloval neposredno na osrednje oscilatorski vezje, medtem ko bi drugega vključili v vezje preko uporabe promotorja z »dvojnim vnosom« (s pozitivno-negativno regulacijo). Spremljanje izhodnega signala reporterskega dela vezja so izvajali s pomočjo mikrofluidnidnega sistema. V nadaljevanju so razvili še kvantitativni model za napovedovanje odziva glede na dodane koncentracije induktorjev. Delo je praktična nadgradnja teoretičnih osnov, ki so jih začrtali ''Tomazou et al'' [6].

== Rezultati ==

'''Genetsko vezje'''

Izhajali so iz plazmidov pLPT119 in pLPT41. pLPT119 je bil plazmid z že vstavljenim vezjem za izvedenko Elowitzovega represilatorja z reporterskim genom ''mVenus''(zapis za rumen fluorescenčen protein –YFP) pod regulacijo promotorja P(LTetO-1). Srž dela je bila uvedba vozlišča, ki bi povezoval regulacijo amplitude in faze s končnim izhodnim signalom. Zato so se odločili nadomestiti obstoječ promotor P(LTetO-1) z ''de novo'' sestavljenim promotorjem z »dvojnim vnosom«. V osnovi je šlo za promotor P(ECF11), ki ga aktivira σECF11. Preko saturacijske mutageneze so promotorju določali jederne promotorske regije. Izkazalo se je, da so le te dovolj izolirane, da mutacije izven regij ne vplivajo na funkcijo celotnega promotorja. Tako so lahko v bližino jedrnih regij promotorjev dodali vezavno mesto za TetR. Pridobljeni promotor P(DUAL) so vstavili pred mVenus z metodo sestavljanja po Gibsonu [3], [7].

Drug plazmid je vseboval vezje, ki je nadzorovalo izražanje ''σECF11''. S sistemom ''NahR-PSal'' so dosegli, da se je konstitutivno izražal protein NahR, ki je zaviral izražanje σECF11. Ob dodatku salicilne kisline (I1) pa se je negativna regulacija σECF11 zmanjšala in induciral se je lahko ''mVenus''. Sklepali so, da se bo z večanjem koncentracije salicilne kisline večala amplituda izhodnega signala.

Za induktor, ki bi nadzoroval periodo, so si izbrali IPTG (I1). Ker zavira represijo z LacI, bi na samo represilatorsko vezje vplival tako, da bi podaljšal čas preklapljanja med posameznimi represorji [3].

'''Spremljanje sistema'''

Oscilacije na celični ravni so spremljali preko mikrofluidnega sistema. Sestavljen je bil iz 8 glavnih kanalov za polnjenje in dovajanje gojišča. Vsak kanal je imel po 120 stranskih kanalčkov, v katere so s centrifugiranjem vstavili transformirane celice E. coli K-12 DH10B. Ob konstantnem pretoku 40 µl/h so spremljali fluorescenco posameznih kanalčkov pod fluorescenčnim mikroskopom [3].

'''Umerjanje in karakterizacija sistema'''

V začetku so delovanje vezja preverili s testi prižiga in vklopa regulacije amplitude in periode. Ob neprisotnosti IPTG so spremljali spreminjanje fluorescence v odvisnosti od časa za koncentracije salicilne kisline 0 µM in 200 µM. Povprečna intenziteta vrhov je bila pri odsotnosti salicilne kisline le 17,9 a.u., medtem ko je ob dodatku narasla vse do 2963 a.u., kar je potrdilo delovanje vezja za regulacijo amplitude. Podobno so preverili delovanje regulacije periode z koncentracijama IPTG: 0 µM in 10 µM. Izkazalo se je, da se je število vrhov v poskusu zmanjšalo za 1, kar je nakazovalo, da je dodatek IPTG povzročil podaljšanje periode oscilacije [3].
V nadaljevanju so izvajali poizkuse z variacijo kombiniranih koncentracij obeh induktorjev. To so storili v obliki matrike 4x4, kjer so imeli gradient štirih koncentracij IPTG: 0 µM, 2,5 µM, 5 µM in 10 µM ter gradient salicilne kisline: 0 µM, 50 µM, 100 µM, 200 µM. Dobljeni rezultati so bili podobni tistim, ki so jih pridobili s testi vklopa in izklopa vezja. Pri konstantnih koncentracijah IPTG se je ob višanju salicilne kisline višala amplituda, pri enakih koncentracijah salicilne kisline in različnih koncentracijah IPTG pa se je večala perioda oscilacij [3].

Opazili so tudi, da ima vezje fizične omejitve. Nad 200 µM salicilne kisline in 10 µM IPTG se amplituda vezja in perioda nista več spreminjali. Domnevali so, da je bil razlog zasičenje z induktorji. Iz zbranih podatkov so zaključili, da lahko amplitudo vezja spreminjajo med 48,0 ± 9,4 a.u. in variirajo periodo med 323,9 ±1,9 min [3].

'''Kvantitativni model'''

Delovanje vezja so nato želeli kvantitativno opisati z modelom, ki bi lahko iz izhodiščnih parametrov napovedal odstopanja v oscilaciji. Model so razdelili na tri komponente: regulacija periode, regulacija amplitude in izhodni signal [3].

Najprej so definirali diferencialne enačbe, ki so opisovale translacijo proteinov vezja. Ločevali so med zvitimi in nezvitimi proteini. Spremembo koncentracije danega nezvitega proteina v kratkem časovnem intervalu so opisali kot produkt koncentracije prisotne mRNA in faktorja hitrosti translacije. Produktu so odšteli zmnožek konstante zvitja in koncentracije nezvitih proteinov (proteini, ki se zvijejo), in odšteli še izgube zaradi razredčitve proteinov med delitvijo celic (faktor razredčitve pomnožen s koncentracijo nezvitih proteinov). Podobno so naredili tudi za zvit protein, le da so celotni pozitivni prispevek predstavljali proteini, pridobljeni z zvitjem (člen, ki smo ga prej odšteli) in od tega je bil odštet zmnožek faktorja razredčitve ter koncentracije zvitih proteinov [3], [6].

Temu je sledil opis diferencialnih enačb za transkripcijo. Vključevale so spremenljivke: število kopij genov, konstanto bazalne hitrosti transkripcije, konstanto največje hitrosti transkripcije, značajno koncentracijo, ki opisuje količino potrebnega represorja za polovično maksimalne stopnje represije in stopnjo razpadanja mRNA [3], [6].

Efekt induktorja IPTG so vključili v diferencialno enačbo koncentracijo prepisane mRNA za TetR, saj ga je neposredno nadzorovala inhibicija LacI z IPTG. Efekt salicilne kisline so vključili enačbo od koncentracije prepisane mRNA za σECF11. Končna diferencialna enačba je opisovala spremembo koncentracije mRNA reporterskega proteina mVenus v majhnem časovnem intervalu. V tej enačbi so se poleg poprej omenjenih vpeljale še koncentracije TetR in σECF11. Preko iterativnega računanja ekspresije na podlagi vseh omenjenih enačb so lahko simulirali osciliranje fluorescence v modelu [3].

Napovedno moč modela so ocenili z računanjem korena povprečne kvadratne napake (RMSE) iz modelnih in eksperimentalno določenih podatkov. RMSE za amplitudo signala je znašal 97,0 a.u., RMSE za periodo pa 4, 3 minute. Iz tega so sklepali, da je model sprejemljiv [3].

Zanimala jih je tudi ortogonalnost modela in eksperimentalnega vezja. To so preverili z računanjem skupne informacije (angl. mutual information) za vsak par izhodnih informacij (amplituda, perioda) in vhodnih signalov (I1, I2). Tudi tu se je pokazalo, da sta tako model kot eksperiment primerno ortogonalna [3].

== Zaključek ==

Zasnova vodljivega represilatorskega vezja je temeljila na principih: izbire robustnega vezja, reduciranja števila komponent vezja, izbire komponent, ki omogočajo kvantifikacijo vezja in končno poenostavljenja delovanja vezja brez izgube funkcije. Slednji princip je bil uporabljen pri izbiri reporterskega gena pod kontrolo promotorja z dvojim vnosom, saj se je s tem zaobšlo oviro nadzorovanja amplitude na represilatorskem delu. Zagotovljena je bila tudi ortogonalnost učinkov obeh induktorjev [3].

Razvoj kvantitativnega modela omogoča modularno uporabo RLT. Modularen RLT bi sprejemal dva vhodna signala in imel en izhodni oscilatorski signal, ki pa ga ne smemo razumeti kot končni cilj uporabe modularnega vezja. Prav nasprotno bi lahko z analizo amplitude in periode izhodnega signala izračunali vrednosti vhodnih signalov in s tem lahko spremljali informacije o delovanju večjih biološko sinteznih naprav, v katere bi vključili modularen RLT [3], [6].

Med druge možne načine uporabe novega vezja sodijo pulzni dostavljalni sistemi za zdravila. Potreba po razvoju teh sistemov je velika, saj v telesu pogosto konstantno sproščanje zdravilnih učinkovin nima vseh zaželenih efektov. Velikokrat so že obstoječi pulzni sistemi omejeni s časom trajanja oz. časom oddajanja učinkovin, ki sicer ne bi bili problem z opisanimi sintezno biološkimi pristopi [3], [8].

== Viri: ==

[1] Z. Li in Q. Yang, „Systems and synthetic biology approaches in understanding biological oscillators“, Quant Biol, let. 6, št. 1, str. 1–14, mar. 2018, doi: 10.1007/s40484-017-0120-7.

[2] D. Jain, R. Raturi, V. Jain, P. Bansal, in R. Singh, „Recent technologies in pulsatile drug delivery systems“, Biomatter, let. 1, št. 1, str. 57–65, jul. 2011, doi: 10.4161/biom.1.1.17717.

[3] F. Zhang idr., „Independent control of amplitude and period in a synthetic oscillator circuit with modified repressilator“, Commun Biol, let. 5, št. 1, Art. št. 1, jan. 2022, doi: 10.1038/s42003-021-02987-1.

[4] E. J. Olson, L. A. Hartsough, B. P. Landry, R. Shroff, in J. J. Tabor, „Characterizing bacterial gene circuit dynamics with optically programmed gene expression signals“, Nat Methods, let. 11, št. 4, str. 449–455, apr. 2014, doi: 10.1038/nmeth.2884.

[5] Y. J. Joshi, Y. K. Jawale, in C. A. Athale, „Modeling the tunability of the dual-feedback genetic oscillator“, Phys Rev E, let. 101, št. 1–1, str. 012417, jan. 2020, doi: 10.1103/PhysRevE.101.012417.

[6] M. Tomazou, M. Barahona, K. M. Polizzi, in G.-B. Stan, „Computational Re-design of Synthetic Genetic Oscillators for Independent Amplitude and Frequency Modulation“, Cell Syst, let. 6, št. 4, str. 508-520.e5, apr. 2018, doi: 10.1016/j.cels.2018.03.013.

[7] Y. Zong idr., „Insulated transcriptional elements enable precise design of genetic circuits“, Nat Commun, let. 8, št. 1, Art. št. 1, jul. 2017, doi: 10.1038/s41467-017-00063-z.

[8] V. N. L. Sirisha, M. Namrata, in B. Sruthi, „Pulsatile Drug Delivery System-A Review“, str. 11.

Neodvisno uravnavanje jakosti in periode v sintetičnem oscilatorskem vezju preko modificiranega represilatorja

2022-05-24T22:08:59Z

Maks Kumek: New page: Izhodiščni članek: Zhang, F., Sun, Y., Zhang, Y. et al. Independent control of amplitude and period in a synthetic oscillator circuit with modified repressilator. Commun Biol 5, 23 (202...

Izhodiščni članek: Zhang, F., Sun, Y., Zhang, Y. et al. Independent control of amplitude and period in a synthetic oscillator circuit with modified repressilator. Commun Biol 5, 23 (2022). https://doi.org/10.1038/s42003-021-02987-1

== Uvod ==

Oscilatorska vezja so v naravi vsestransko prisotna. Genetski oscilatorji kot so p53 oscilator, NF-κB sunkovni oscilator, cirkadiani ritmi in mehanizem celičnega cikla so ključnega pomena v regulaciji procesov celic in večceličnih sistemov [1]. Značilnosti naravnih oscilatorjev so njihova stabilnost in sposobnost spreminjanja faze, periode in jakosti izhodnega signala. Sintetična vezja, ki se dan danes razvijajo strmijo k posnemanju le teh lastnosti in nakazujejo na možno praktično uporabo v pulznem dostavljanju zdravilnih učinkovin v medicini [2], [3]. Ustvarjanje minimaliziranih modularnih vodljivih oscilatorjev odpira možnosti njihove integracije v mnogo kompleksnejša vezja, kjer se lahko dinamično usklajuje končne produkte glede na željene rezultate [4].

Dva tipa oscilatorjev se izrazito preučujeta v poprej omenjene namene: dvojno povratni oscilator (DFO) in represilator (RLT). Prvi temelji na dveh povratnih zankah, npr. izražanje lacI (negativna povratna zanka) in araC (pozitivna povratna zanka). Stičišče teh dveh zank je promotor s pozitivno-negativno regulacijo, ki regulira izražanje obeh genov [5]. Po drugi strani represilator temelji na treh zaporednih represorskih genih, ki se vežejo na operatorske regije naslednjega gena v zaporedju. Prvi opisani represilator je bil Elowitzov represilator, ki je združil repressorje: TetR (Tn10 transpozon), LacI (laktozni opreon) in cI (bakteriofag λ)[3]. V nasprotju z DFO so vodljivi RLT ostajali predmet teoretičnih modelov [6].

Ideja raziskovalne skupine je bila zasnovati represilatorsko vezje, ki se poslužuje dveh induktorjev: enega, ki spreminja periodo izhodnega signala in drugega, ki omogoča reguliranje jakosti signala. Prvi naj bi deloval neposredno na osrednje oscilatorski vezje, medtem ko bi drugega vključili v vezje preko uporabe promotorja z »dvojnim vnosom« (s pozitivno-negativno regulacijo). Spremljanje izhodnega signala reporterskega dela vezja so izvajali s pomočjo mikrofluidnidnega sistema. V nadaljevanju so razvili še kvantitativni model za napovedovanje odziva glede na dodane koncentracije induktorjev. Delo je praktična nadgradnja teoretičnih osnov, ki so jih začrtali ''Tomazou et al'' [6].

== Rezultati ==

'''Genetsko vezje'''

Izhajali so iz plazmidov pLPT119 in pLPT41. pLPT119 je bil plazmid z že vstavljenim vezjem za izvedenko Elowitzovega represilatorja z reporterskim genom ''mVenus''(zapis za rumen fluorescenčen protein –YFP) pod regulacijo promotorja pLTetO-1. Srž dela je bila uvedba vozlišča, ki bi povezoval regulacijo amplitude in faze s končnim izhodnim signalom. Zato so se odločili nadomestiti obstoječ promotor pLTetO-1 z ''de novo'' sestavljenim promotorjem z »dvojnim vnosom«. V osnovi je šlo za promotor PECF11, ki ga aktivira σECF11. Preko saturacijske mutageneze so promotorju določali jederne promotorske regije. Izkazalo se je, da so le te dovolj izolirane, da mutacije izven regij ne vplivajo na funkcijo celotnega promotorja. Tako so lahko v bližino jedrnih regij promotorjev dodali vezavno mesto za TetR. Pridobljeni promotor PDUAL so vstavili pred mVenus z metodo sestavljanja po Gibsonu [3], [7].

Drug plazmid je vseboval vezje, ki je nadzorovalo izražanje σECF11. S sistemom NahR-PSal so dosegli, da se je konstitutivno izražal protein NahR, ki je zaviral izražanje σECF11. Ob dodatku salicilne kisline (I1) pa se je negativna regulacija σECF11 zmanjšala in induciral se je lahko mVenus. Sklepali so, da se bo z večanjem koncentracije salicilne kisline večala amplituda izhodnega signala.

Za induktor, ki bi nadzoroval periodo, so si izbrali IPTG (I1). Ker zavira represijo LacI, bi na samo represilatorsko vezje vplival tako, da bi podaljšal čas preklapljanja med posameznimi represorji [3].

'''Spremljanje sistema'''

Oscilacije na celični ravni so spremljali preko mikrofluidnega sistema. Sestavljen je bil iz 8 glavnih kanalov za polnjenje in dovajanje gojišča. Vsak kanal je imel po 120 stranskih kanalčkov, v katere so s centrifugiranjem vstavili transformirane celice E. coli K-12 DH10B. Ob konstantnem pretoku 40 µl/h so spremljali fluorescenco posameznih kanalčkov pod fluorescenčnim mikroskopom [3].

'''Umerjanje in karakterizacija sistema'''

V začetku so delovanje vezja preverili s testi prižiga in vklopa regulacije amplitude in periode. Ob neprisotnosti IPTG so spremljali spreminjanje fluorescence v odvisnosti od časa za koncentracije salicilne kisline 0 µM in 200 µM. Povprečna intenziteta vrhov je bila pri odsotnosti salicilne kisline le 17,9 a.u., medtem ko je ob dodatku narasla vse do 2963 a.u., kar je potrdilo delovanje vezja za regulacijo amplitude. Podobno so preverili delovanje regulacije periode z koncentracijama IPTG: 0 µM in 10 µM. Izkazalo se je, da se je število vrhov v poskusu zmanjšalo za 1, kar je nakazovalo, da je dodatek IPTG povzročil podaljšanje periode oscilacije [3].
V nadaljevanju so izvajali poizkuse z variacijo kombiniranih koncentracij obeh induktorjev. To so storili v obliki matrike 4x4, kjer so imeli gradient štirih koncentracij IPTG: 0 µM, 2,5 µM, 5 µM in 10 µM ter gradient salicilne kisline: 0 µM, 50 µM, 100 µM, 200 µM. Dobljeni rezultati so bili podobni tistim, ki so jih pridobili s testi vklopa in izklopa vezja. Pri konstantnih koncentracijah IPTG se je ob višanju salicilne kisline višala amplituda, pri enakih koncentracijah salicilne kisline in različnih koncentracijah IPTG pa se je večala perioda oscilacij [3].

Opazili so tudi, da ima vezje fizične omejitve. Nad 200 µM salicilne kisline in 10 µM IPTG se amplituda vezja in perioda nista več spreminjali. Domnevali so, da je bil razlog zasičenje z induktorji. Iz zbranih podatkov so zaključili, da lahko amplitudo vezja spreminjajo med 48,0 ± 9,4 a.u. in variirajo periodo med 323,9 ±1,9 min [3].

'''Kvantitativni model'''

Delovanje vezja so nato želeli kvantitativno opisati z modelom, ki bi lahko iz izhodiščnih parametrov napovedal odstopanja v oscilaciji. Model so razdelili na tri komponente: regulacija periode, regulacija amplitude in izhodni signal [3].

Najprej so definirali diferencialne enačbe, ki so opisovale translacijo proteinov vezja. Ločevali so med zvitimi in nezvitimi proteini. Spremembo koncentracije danega nezvitega proteina v kratkem časovnem intervalu so opisali kot produkt koncentracije prisotne mRNA in faktorja hitrosti translacije. Produktu so odšteli zmnožek konstante zvitja in koncentracije nezvitih proteinov (proteini, ki se zvijejo), in odšteli še izgube zaradi razredčitve proteinov med delitvijo celic (faktor razredčitve pomnožen s koncentracijo nezvitih proteinov). Podobno so naredili tudi za zvit protein, le da so celotni pozitivni prispevek predstavljali proteini, pridobljeni z zvitjem (člen, ki smo ga prej odšteli) in od tega je bil odštet zmnožek faktorja razredčitve ter koncentracije zvitih proteinov [3], [6].

Temu je sledil opis diferencialnih enačb za transkripcijo. Vključevale so spremenljivke: število kopij genov, konstanto bazalne hitrosti transkripcije, konstanto največje hitrosti transkripcije, značajno koncentracijo, ki opisuje količino potrebnega represorja za polovično maksimalne stopnje represije in stopnjo razpadanja mRNA [3], [6].

Efekt induktorja IPTG so vključili v diferencialno enačbo koncentracijo prepisane mRNA za TetR, saj ga je neposredno nadzorovala inhibicija LacI z IPTG. Efekt salicilne kisline so vključili enačbo od koncentracije prepisane mRNA za σECF11. Končna diferencialna enačba je opisovala spremembo koncentracije mRNA reporterskega proteina mVenus v majhnem časovnem intervalu. V tej enačbi so se poleg poprej omenjenih vpeljale še koncentracije TetR in σECF11. Preko iterativnega računanja ekspresije na podlagi vseh omenjenih enačb so lahko simulirali osciliranje fluorescence v modelu [3].

Napovedno moč modela so ocenili z računanjem korena povprečne kvadratne napake (RMSE) iz modelnih in eksperimentalno določenih podatkov. RMSE za amplitudo signala je znašal 97,0 a.u., RMSE za periodo pa 4, 3 minute. Iz tega so sklepali, da je model sprejemljiv [3].

Zanimala jih je tudi ortogonalnost modela in eksperimentalnega vezja. To so preverili z računanjem skupne informacije (angl. mutual information) za vsak par izhodnih informacij (amplituda, perioda) in vhodnih signalov (I1, I2). Tudi tu se je pokazalo, da sta tako model kot eksperiment primerno ortogonalna [3].

== Zaključek ==

Zasnova vodljivega represilatorskega vezja je temeljila na principih: izbire robustnega vezja, reduciranja števila komponent vezja, izbire komponent, ki omogočajo kvantifikacijo vezja in končno poenostavljenja delovanja vezja brez izgube funkcije. Slednji princip je bil uporabljen pri izbiri reporterskega gena pod kontrolo promotorja z dvojim vnosom, saj se je s tem zaobšlo oviro nadzorovanja amplitude na represilatorskem delu. Zagotovljena je bila tudi ortogonalnost učinkov obeh induktorjev [3].

Razvoj kvantitativnega modela omogoča modularno uporabo RLT. Modularen RLT bi sprejemal dva vhodna signala in imel en izhodni oscilatorski signal, ki pa ga ne smemo razumeti kot končni cilj uporabe modularnega vezja. Prav nasprotno bi lahko z analizo amplitude in periode izhodnega signala izračunali vrednosti vhodnih signalov in s tem lahko spremljali informacije o delovanju večjih biološko sinteznih naprav, v katere bi vključili modularen RLT [3], [6].

Med druge možne načine uporabe novega vezja sodijo pulzni dostavljalni sistemi za zdravila. Potreba po razvoju teh sistemov je velika, saj v telesu pogosto konstantno sproščanje zdravilnih učinkovin nima vseh zaželenih efektov. Velikokrat so že obstoječi pulzni sistemi omejeni s časom trajanja oz. časom oddajanja učinkovin, ki sicer ne bi bili problem z opisanimi sintezno biološkimi pristopi [3], [8].

== Viri: ==

[1] Z. Li in Q. Yang, „Systems and synthetic biology approaches in understanding biological oscillators“, Quant Biol, let. 6, št. 1, str. 1–14, mar. 2018, doi: 10.1007/s40484-017-0120-7.

[2] D. Jain, R. Raturi, V. Jain, P. Bansal, in R. Singh, „Recent technologies in pulsatile drug delivery systems“, Biomatter, let. 1, št. 1, str. 57–65, jul. 2011, doi: 10.4161/biom.1.1.17717.

[3] F. Zhang idr., „Independent control of amplitude and period in a synthetic oscillator circuit with modified repressilator“, Commun Biol, let. 5, št. 1, Art. št. 1, jan. 2022, doi: 10.1038/s42003-021-02987-1.

[4] E. J. Olson, L. A. Hartsough, B. P. Landry, R. Shroff, in J. J. Tabor, „Characterizing bacterial gene circuit dynamics with optically programmed gene expression signals“, Nat Methods, let. 11, št. 4, str. 449–455, apr. 2014, doi: 10.1038/nmeth.2884.

[5] Y. J. Joshi, Y. K. Jawale, in C. A. Athale, „Modeling the tunability of the dual-feedback genetic oscillator“, Phys Rev E, let. 101, št. 1–1, str. 012417, jan. 2020, doi: 10.1103/PhysRevE.101.012417.

[6] M. Tomazou, M. Barahona, K. M. Polizzi, in G.-B. Stan, „Computational Re-design of Synthetic Genetic Oscillators for Independent Amplitude and Frequency Modulation“, Cell Syst, let. 6, št. 4, str. 508-520.e5, apr. 2018, doi: 10.1016/j.cels.2018.03.013.

[7] Y. Zong idr., „Insulated transcriptional elements enable precise design of genetic circuits“, Nat Commun, let. 8, št. 1, Art. št. 1, jul. 2017, doi: 10.1038/s41467-017-00063-z.

[8] V. N. L. Sirisha, M. Namrata, in B. Sruthi, „Pulsatile Drug Delivery System-A Review“, str. 11.

Metilacijski sistem pri bakterijah

2019-04-09T19:14:33Z

Maks Kumek: /* Obračanje baz */

== Uvod ==

Metilacija DNA je eden izmed najpomembnejših načinov modifikacije DNA in je prisotna v genomih različnih organizmov. Metilacija DNA pri bakterijah vpliva na različne procese, kot so: genska regulacija, kromosomsko podvojevanje/popravljanje, prepoznavanje tuje DNA v gostiteljski celici in posledično rezanje tuje DNA ter v posebnem primeru preživetje virusne DNA v gostiteljski celici. Pri bakterijah do metilacije DNA prihaja na bazah v nukleotidih adenina in citozina. Metiltransferaze (MTaz) katalizirajo ta postopek, pri čemer je S-adenozil-L-metionin ([https://file.medchemexpress.com/product_pic/hy-b0617.gif AdoMet]) univerzalni donor metilne skupine. Po reakciji nastane metilirana DNA in AdoHcy (S-adendozil-L-homocistein) [1].

Na osnovi znanih funkcij bakterijskih metiltransferaz, jih delimo v tri velike skupine:

• MTaze, ki niso del restrikcijo-modifikacijskih sistemov, vendar lahko sodelujejo pri celični regulaciji,

• MTaze, ki spadajo v restrikcijsko-modifikacijske sisteme,

• virusne MTaze, ki jih prenašajo fagi in jih uporabljajo za povečanje obstoja svoje DNA v gostiteljskih celicah.

Bakterije imajo ti. restrikcijsko-modifikacijske sisteme. DNA MTaze imajo v njih vlogo zaščite lastne DNA pred restrikcijskimi encimi. R/M sistemi delujejo namreč tako, da metilirajo na določenem zaporedju DNA, ki ga prepoznavajo tudi restrikcijski encimi. Preprečena je vezava restrikaz in cepljenje lastne dvojne vijačnice. S tem bakterija prepreči zase usoden dogodek [1].

== Delovanje metiltransferaz, ki niso del restrikcijsko-metilacijskega sistema ==

DNA adenin MTaza (Dam) je eden izmed encimov velike skupine metiltransferaz, ki niso del R/M sistema. Dam metilira na adeninu in igra vlogo pri metiliranju hemimetilirane DNA, ki nastane pri replikaciji.

Na hemimetilirano DNA se na promotorski regiji vežejo DNA vezavni proteini SeqA. Ko je SeqA vezan, preprečuje vezavo Dam na promotorsko regijo in posledično metilacijo samega promotorja. Slednje ima posledico inhibicije ali indukcije transkripcije genov za različne proteine. Spontana disocijacija SeqA dovoli dostop in vezavo Dam na DNA. Ko veže promotor, začne drseti po vijačnici dokler ne pride do specifičnega nukleotidnega zaporedja 5' – GATC – 3' in metilira adenin. Stabilnost adenina v aktivnem mestu omogoči DPPY motiv na proteinu. Po [http://mol-biol4masters.masters.grkraj.org/html/Prokaryotic_DNA_Replication3-E_coli_DNA_Replication_files/image003.jpg metiliranju promotorja] se lahko veže bakterijska dnaA, ki je transkripcijski aktivator [2].

== Zgradba metiltransferaz ==

Naj si bodo nekatere DNA MTaze monomerne, dimerne ali celo oligomerne, so v njih vedno relativno ohranjene domene. Na osnovi funkcije teh domen jih delimo na tri skupine: AdoMet vezavne domene, TRD (target recognition domain) in katalitične domene [2].

Še bolj pa so ohranjeni gradniki teh domen, motivi, ki si sledijo po številčenju od I-X. Čeprav se lahko domene v zaporedju izmenjujejo ali pa se dodajo še druge domene, imajo motivi znotraj domen fiksna zaporedja, kar kaže na vloge teh motivov pri katalitskem procesu.

Katalitična domena objema večinoma motiv IV, ki ima tudi ohranjeno skupno zaporedje. Večinoma se imenuje DPPY, pri čemer se D spreminja glede na različni sev [2,3].

TRD domena prepozna, stabilizira in veže DNA, vendar njeno aminokislinsko zaporedje ni ohranjeno. Pač pa je eno najbolj diverznih zaporedji aminokislinskih ostankov v encimu. Velikokrat so na robu teh zaporedji ponavljajoča se dokaj ohranjena zaporedja. Pomembno je poudariti, da ni direktne povezave med enim aminokislinskim ostankom in enim nukleotidom, marveč so interakcije med TRD in DNA kompleksne narave.

AdoMet vezavna domena se veže na kofaktor. Sestavljena je iz dveh poddomen: ena za vezavo AdoMet in druga za vezavo na prejemnika metilne skupine. AdoMet ima najpomembnejši motiv I. Na osnovi aktivnosti AdoMet vezavne in katalitične domene delimo metiltransferaze R/M sistemov na: eksociklične amino MTaze (N6-adenin MTaza in N4-citozin MTaza) in endociklične MTaze (C5-citozin MTaze) [3].

== C5 metilacija ==

Mehanizem C5 je bil raziskan med prvimi. Posebej dobro preučen je na primeru endonukleaze/metiltransferaze HhaI. Začne se z nukleofilnim napadom C6 atoma v citozinu s tiolno skupino cisteina v Motivu IV. Tvori se kovalentna vez in poveže encim in substrat v kompleks. N3 (na citozinu) se protonira s pomočjo protona, ki ga donira nek kisli aminokislinski ostanek, v primeru HhaI je to glutaminsko kislinski ostanek (E119). To olajša nukleofilni napad. Podre se klasična vezava vodikovih vezi med baznim parom, v katerega je citozin vključen. Hkrati pa se tvorijo vodikove vezi med sedaj glutamatnim ostankom in vodikovim atomom na N4 ter argininom (R165) in kisikom na 2. mestu baznega obroča. Te stabilizirajo položaj baze v katalitičnem mestu. Po potečenem nukleoilnem napadu se sedaj zgodi elektrofilen napad na meso C5, kjer AdoMed svojo metilno skupino, nastane pa AdoHyc. Za zaključek se z napadom baze (najverjetneje vode) odstrani odvečni proton na C5. Prekine pa se tudi C6-S vez preko β eliminacije [1].

Posebnost tega mehanizma je dejstvo, da se zaradi vezave tiolne skupine in C6 atoma celotna baza deformira iz ravnine in zato nima prostora v dvojni vijačnici. To nakazuje na lokacijo katalize reakcije izven dvojne vijačnice [1].

== Eksociklične metiltransferaze ==

[https://www.ncbi.nlm.nih.gov/core/lw/2.0/html/tileshop_pmc/tileshop_pmc_inline.html?title=Click%20on%20image%20to%20zoom&p=PMC3&id=1609917_bic804i003.jpg Mehanizem], s katerim se prenese metilna skupina na enega od dušikov, vezanih na cikle baz, je dosti manj raziskan, vendar obstaja dokaj verjetna teorija o poteku reakcije.

Nekatere študije so dokazale, da se prenos metilne skupine dogodi neposredno na N6 atomu (M.EcoRI), kar potrjuje, da ni vmesnih intermediatov, kjer bi se prenašala metilna skupina iz enega dušika na drugega. Tako je najbolj splošna razlaga mehanizma, da se dogodi direkten prenos metilne skupine po SN2 reakcijskem mehanizmu z inverzijo simetrije. Podrobnejši vpogled nam pokaže, da se vseeno ustvari intermediat ob prenosu skupine, preden se lahko odcepi proton. Nastane torej N6-metilamonij adeninski kation, ki ga mora katalitsko mesto stabilizirati, da lahko reakcija steče do konca. S pomočjo reševanja M.TaqI struktur v kompleksu z AdoMet je bilo dognano, da v napadu dušika na 6. mestu sodeluje sam dušik najprej kot donor vodikove vezi na aspargin v motivu IV in tudi na kisik skeleta verige med dvema prolinoma v motivu IV. Dušik se delno negativno nabije in ima tako možnost napasti metilno skupino na AdoMet. Nastali N6- metil amonijev intermediat se na koncu deprotonira. To pa privede do končnega produkta N6 -metiliranega adenina [3,4].

Nekaj je tudi predpostavljenih modelov za N4 metiltransferaze. Predvsem za M.PvuII. Domneva je, da se vzpostavijo vodikove vezi med N4 atomom in Ser53 ter Pro54. Hkrati pa je možnost tvorbe van der Waalsovih vezi s Phe56 ostankom (vsi se nahajajo v motivu IV). Aktivacija takega dušika bi lahko potekala po slednjem modelu.
Asp96 se poveže z vodikovo vezjo na Ser53. Aktivira se hidroksilna skupina Ser 53 in proton se prenese s citozina preko serina na aspartatno kislinski ostanek. Prenos metilne skupine se dogodi istočasno z deprotonacijo N4. Končno protoniran asp96 tvori vez z N3 na citozinu [3].

== Obračanje baz ==

Pri vseh metiltransferazah je potreba po premestitvi baze, ki se metilira, velika. Razlogi so predvsem sterične narave. Pri C5 metilaciji npr. je to nastanek intermediatov, ki nimajo prostora v klasični B-obliki DNA vijačnice. Tako je bila že prav pri modelu kompleksa HhaI z AdoMet odkrita oblika, kjer je baza, ki je namenjena metilaciji, rotirana iz osi dvojne vijačnice za 180°. Ta baza je tako segala iz malega žleba DNA v katalitično domeno encima. Ista potreba po rotaciji baz se je pokazala pri vseh ostalih vrstah metilaz.

Osrednjo vlogo v sprostitvi baze iz DNA ima TRD. [https://media.nature.com/m685/nature-assets/nsmb/journal/v8/n2/images/nsb0201_121_F1.jpg M.TaqI] modeli so pokazali, da se ob vezavi struktura vijačnice močno deformira. Razmakne se mali žleb za približno 3 °A, stisne se ogrodje in timidin se pomakne bolj proti centru vijačnice. To je posledica interakcij med skoraj vsemi baznimi pari [https://media.nature.com/m685/nature-assets/nsmb/journal/v8/n2/images/nsb0201_121_F2.gif prepoznavnega zaporedja DNA], razen timidina, ki je par metiliranemu adenozinu. Vse to pripomore prekinitvi van der Waalsovih vezi med tem parom in izpostavitvi adenozina [4].

== Metiltransferaze restrikcijsko-modifikacijskih sistemov (R/M sistemi) ==

Večina bakterijskih DNA metiltransferaz (MTaz) je sklopljenih z restrikcijskim encimom. Skupaj tvorita R/M sisteme, ki ščitijo bakterije pred tujo DNA. MTaza modificira bakterijsko DNA in jo s tem zaščiti pred vezavo restriktaze. Ob vstopu virusne DNA v celico restriktaza nanjo lahko deluje, saj ni modificirana z metilnimi skupinami [1].

R/M sistemi se razdelijo v 4 skupine. Sistem IV dejansko ni pravi RM sistem, saj ne vsebuje MTaze.

Najenostavnejši in tudi najštevilčnejši je '''sistem II''', zanj je značilno, da sta MTaza in restriktaza ločena encima, ki delujeta neodvisno eden od drugega. Prepoznata enako signalno zaporedje na DNA. Večina MTaz sistema II je monomernih proteinov, sestavljenih iz katalitične domene z vezanim AdoMet in TRD domeno. Večinoma prepoznajo kratka palindromska zaporedja na DNA, v dolžini nekje med 2 in 8 nukleotidov. Včasih je prepoznavno zaporedje prekinjeno z nekaj vmesnimi nukleotidi, tako da encim prepozna kratek palindromski odsek, sledi nekaj nesimetričnih nukleotidov in nato spet kratek prepoznavni palindromski odsek. MTaze podsistema IIs prepoznajo nesimetrično zaporedje, zato sta za modifikacijo obeh verig DNA potrebni dve MTazi.

'''Sistem I''' je najbolj kompleksen. MTaza in restriktaza sta skupaj s še eno podenoto povezani v heterotrimer. M podenota je odgovorna za metilacijo, R podenota je restriktaza, S podenota pa omogoča vezavo na DNA (vsebuje TRD domeno). Načeloma so vse tri podenote povezane v kompleks, ampak M in S podenota skupaj lahko delujeta neodvisno od R podenote. Vsako podenoto zapisuje svoj gen. Gena za podenoti S in M regulira skupni promotor, medtem ima gen za restriktazo svoj promotor, kar omogoča ločeno regulacijo izražanja. Prepoznavno mesto na DNA je sestavljeno iz dveh krajših asimetričnih zaporedij (3-5 nukleotidov), ki sta ločeni z nekaj vmesnimi nukleotidi. Na vsaki verigi DNA se metilira po en adenin.

'''R/M sistem III''' je najmanj raziskana skupina. Podenoti MTaze in restriktaza sestavljata heterodimerni kompleks, za razliko od sistema I pa zraven nimata podenote S. TRD domena se nahaja na obeh ostalih podenotah. Prepoznavno zaporedje je sestavljeno iz 5-6 asimetričnih nukleotidov. Za razliko od preostalih skupin, se metilacija pojavi le na eni verigi DNA, kar pa še vedno omogoča zaščito pred restriktazo.

Hemimetilirana DNA je v vseh primerih zaščitena pred restriktazami, a se v večini primerov metilira tudi na drugi verigi. To je ključnega pomena pri podvojevanju DNA, ko nastaneta 2 hčerinski DNA, ki vsebujeta po eno na novo nastalo verigo in eno verigo iz starševske DNA. Le slednja je metilirana. Če modifikacija na eni sami verigi ne bi bila zadostna zaščita, bi restriktaze prej ali slej razrezale lastne kromosome [1,5].

== Regulacija R/M sistemov ==

1. MTaza se lahko veže na promotor gena za MTazo. S tem prepreči vezavo RNA-polimeraze in prepreči prepisovanje genov.

2. Nekatere MTaze prepoznajo zaporedje, ki je del promotorja za gen MTaze. Metilacija deluje kot represor in gen za MTazo se ne more prepisovati. 1. in 2. način omogočata, da se izražanje MTaze zmanjša, ko je te v celici dovolj. S tem se prepreči, da v primeru pojava virusne DNA restriktaza deluje prej kot MTaza.

3. V primeru prenosa genov za R/M sistem med bakterijami, se mora v bakteriji, ki je prejela gen, najprej izraziti gen za MTazo, šele nato gen za restriktazo. To omogačajo C-proteini (kontrolni proteini). V celici se najprej začne izražati gen za MTazo. Hkrati se začne prepisovati tudi gen za protein C, ki nato aktivira gen za restriktazo. Zamik v nastanku enega in drugega encima je ravno pravšnji, da lahko MTaza modificira kromosome in jih zaščiti. C-protein je homodimerni protein, ki se na palindromsko zaporedje na DNA veže z motivom vijačnica-zavoj-vijačnica [5].

== Viri ==

[1] M. Noyer-Weidner and T. A. Trautner, “Methylation of DNA in Prokaryotes,” in DNA Methylation, Basel: Birkhäuser Basel, 1993, pp. 39–108.

[2] J. Casadesús and D. Low, “Epigenetic gene regulation in the bacterial world.,” Microbiol. Mol. Biol. Rev., vol. 70, no. 3, pp. 830–56, Sep. 2006.

[3] S. Bheemanaik, Y. V. R. Reddy, and D. N. Rao, “Structure, function and mechanism of exocyclic DNA methyltransferases.,” Biochem. J., vol. 399, no. 2, pp. 177–90, Oct. 2006.

[4] W. Gong, M. O’gara, R. M. Blumenthal, X. Cheng, and W. M. Keck, “Structure of PvuII DNA-(cytosine N4) methyltransferase, an example of domain permutation and protein fold assignment,” Oxford University Press, 1997.

[5] G. G. Wilson and N. E. Murray, “Restriction and Modification Systems,” Annu. Rev. Genet., vol. 25, no. 1, pp. 585–627, Dec. 1991.

Metilacijski sistem pri bakterijah

2019-04-09T18:35:16Z

Maks Kumek: /* Obračanje baz */

== Uvod ==

Metilacija DNA je eden najpomembnejših načinov modifikacije DNA in je prisotna v genomih različnih organizmov. Metilacija DNA pri bakterijah vpliva na različne proces, kot so: genska regulacija, kromosomsko podvojevanje /popravljanje, prepoznavanje tuje DNA v gostiteljski celici in posledično rezanje tuje DNA ter v posebnem primeru preživetje virusne DNA v gostiteljski celici. Pri bakterijah do metilacije DNA prihaja na bazah v nukleotidih adenina in citozina. Metiltransferaze(MTaz) katalizirajo ta postopek, pri čemer je S-adenozil-L-metionin ([https://file.medchemexpress.com/product_pic/hy-b0617.gif AdoMet]) univerzalni donor metilne skupine. Po reakciji nastane metilirana DNA in AdoHcy (S-adendozil-L-homocistein) [1].

Na osnovi znanih funkcij bakterijskih metiltransferaz, jih delimo v tri velike skupine:

• MTaze, ki niso del restrikcijo-metilacijskih sistemov, vendar lahko sodelujejo pri celični regulaciji,

• MTaze, ki spadajo v restrikcijsko-metilacijski sistem,

• virusne MTaze, ki jih prenašajo fagi in jih upoabljajo za povečanje obstoja svoje DNA v gostiteljskih celicah.

Bakterije imajo ti. restrikcijsko-modifikacijske sisteme. DNA MTaze imajo v njih vlogo zaščite lastne DNA pred restrikcijskimi encimi. R/M sistemi delujejo namreč tako, da metilirajo na določenem zaporedju DNA, ki ga prepoznavajo tudi restrikcijski encimi. Preprečena je vezava restrikaz in cepljenje lastne dvojne vijačnice. S tem bakterija prepreči zase usoden dogodek [1].

== Delovanje metiltransferaz, ki niso del restrikcijsko-metilacijskega sistema ==

DNA adenin MTaza (Dam) je eden izmed encimov velike skupine metiltransferaz, ki niso del R/M sistema. Dam metilira na adeninu in igra vlogo pri metiliranju hemimetilirane DNA, ki nastane pri replikaciji.

Na hemimetilirano DNA se na promotorski regiji vežejo DNA vezavni proteini SeqA. Ko je SeqA vezan, preprečuje vezavo Dam na promotorsko regijo in posledično metilacijo samega promotorja. Slednje ima posledico inhibicije ali indukcije transkripcije genov za različne proteine. Spontana disocijacija SeqA dovoli dostop in vezavo Dam na DNA. Ko veže promotor, začne drseti po vijačnici dokler ne pride do specifičnega nukleotidnega zaporedja 5' – GATC – 3' in metilira adenin. Stabilnost adenina v aktivnem mestu omogoči DPPY motiv na proteinu. Po [http://mol-biol4masters.masters.grkraj.org/html/Prokaryotic_DNA_Replication3-E_coli_DNA_Replication_files/image003.jpg metiliranju promotorja] se lahko veže bakterijska dnaA, ki je transkripcijski aktivator.

== Zgradba metiltransferaz ==

Naj si bodo nekatere DNA MTaze monomerne, dimerne ali celo oligomerne, so v njih vedno relativno ohranjene domene. Na osnovi funkcije teh domen jih delimo na tri skupine: AdoMet vezavne domene, TRD (target recognition domain) in katalitične domene [2].

Še bolj pa so ohranjeni gradniki teh domen, motivi, ki si sledijo po številčenju od I-X. Čeprav se lahko domene v zaporedju izmenjujejo ali pa se dodajo še druge domene, imajo motivi znotraj domen fiksna zaporedja, kar kaže na vloge teh motivov pri katalitskem procesu.

Katalitična domena objema večinoma motiv IV, ki ima tudi ohranjeno skupno zaporedje. Večinoma se imenuje DPPY, pri čemer se D spreminja glede na različni sev [2,3].

TRD domena prepozna, stabilizira in veže DNA, vendar njeno aminokislinsko zaporedje ni ohranjeno. Pač pa je eno najbolj diverznih zaporedji aminokislinskih ostankov v encimu. Velikokrat so na robu teh zaporedji ponavljajoča se dokaj ohranjena zaporedja. Pomembno je poudariti, da ni direktne povezave med enim aminokislinskim ostankom in enim nukleotidom, marveč so interakcije med TRD in DNA kompleksne narave.

AdoMet vezavna domena veže na kofaktor. Sestavljena je iz dveh poddomen: ena za vezavo AdoMet in druga za vezavo na prejemnika metilne skupine. AdoMet ima najpomembnejši motiv I. Na osnovi aktivnosti AdoMet vezavne in katalitične domene delimo metiltransferaze R/M sistema na: eksociklične amino MTaze (N6 adenin MTaza in N4 citozin MTaza) in endociklične MTaze (N5 citozin MTaze) [3].

== C5 metilacija ==

Mehanizem C5 je bil raziskan med prvimi. Posebej dobro preučen je na primeru endonukleaze/metiltransferaze HhaI. Začne se z nukleofilnim napadom C6 atoma v citozinu s tiolno skupino cisteina v Motivu IV. Tvori se kovalentna vez in poveže encim in substrat v kompleks. N3 (na citozinu) se protonira s pomočjo protona, ki ga donira nek kisli aminokislinski ostanek, v primeru HhaI je to glutaminsko kislinski ostanek (E119). To olajša nukleofilni napad. Podre se klasična vezava vodikovih vezi med baznim parom, v katerega je citozin vključen. Hkrati pa se tvorijo vodikove vezi med sedaj glutamatnim ostankom in vodikovim atomom na N4 ter argininom (R165) in kisikom na 2. mestu baznega obroča. Te stabilizirajo položaj baze v katalitičnem mestu. Po potečenem nukleoilnem napadu se sedaj zgodi elektrofilen napad na meso C5, kjer AdoMed svojo metilno skupino, nastane pa AdoHyc. Za zaključek se z napadom baze (najverjetneje vode) odstrani odvečni proton na C5. Prekine pa se tudi C6-S vez preko β eliminacije [1].

Posebnost tega mehanizma je dejstvo, da se zaradi vezave tiolne skupine in C6 atoma celotna baza deformira iz ravnine in zato nima prostora v dvojni vijačnici. To nakazuje na lokacijo katalize reakcije izven dvojne vijačnice [1].

== Eksociklične metiltransferaze ==

[https://www.ncbi.nlm.nih.gov/core/lw/2.0/html/tileshop_pmc/tileshop_pmc_inline.html?title=Click%20on%20image%20to%20zoom&p=PMC3&id=1609917_bic804i003.jpg Mehanizem], s katerim se prenese metilna skupina na enega od dušikov, vezanih na cikle baz, je dosti manj raziskan, vendar obstaja dokaj verjetna teorija o poteku reakcije.

Nekatere študije so dokazale, da se prenos metilne skupine dogodi neposredno na N6 atomu (M.EcoRI), kar potrjuje, da ni vmesnih intermediatov, kjer bi se prenašala metilna skupina iz enega dušika na drugega. Tako je najbolj splošna razlaga mehanizma, da se dogodi direkten prenos metilne skupine po SN2 reakcijskem mehanizmu z inverzijo simetrije. Podrobnejši vpogled nam pokaže, da se vseeno ustvari intermediat ob prenosu skupine, preden se lahko odcepi proton. Nastane torej N6-metilamonij adeninski kation, ki ga mora katalitsko mesto stabilizirati, da lahko reakcija steče do konca. S pomočjo reševanja M.TaqI struktur v kompleksu z AdoMet je bilo dognano, da v napadu dušika na 6. mestu sodeluje sam dušik najprej kot donor vodikove vezi na aspargin v motivu IV in tudi na kisik skeleta verige med dvema prolinoma v motivu IV. Dušik se delno negativno nabije in ima tako možnost napasti metilno skupino na AdoMet. Nastali N6- metil amonijev intermediat se na koncu deprotonira. To pa privede do končnega produkta N6 -metiliranega adenina [3,4].

Nekaj je tudi predpostavljenih modelov za N4 metiltransferaze. Predvsem za M.PvuII. Domneva je, da se vzpostavijo vodikove vezi med N4 atomom in Ser53 ter Pro54. Hkrati pa je možnost tvorbe van der Waalsovih vezi s Phe56 ostankom (vsi se nahajajo v motivu IV). Aktivacija takega dušika bi lahko potekala po slednjem modelu.
Asp96 se poveže z vodikovo vezjo na Ser53. Aktivira se hidroksilna skupina Ser 53 in proton se prenese s citozina preko serina na aspartatno kislinski ostanek. Prenos metilne skupine se dogodi istočasno z deprotonacijo N4. Končno protoniran asp96 tvori vez z N3 na citozinu [3].

== Obračanje baz ==

Pri vseh metiltransferazah je potreba po premestitvi baze, ki se metilira, velika. Razlogi so predvsem sterične narave. Pri C5 metilaciji npr. je to nastanek intermediatov, ki nimajo prostora v klasični B-obliki DNA vijačnice. Tako je bila že prav pri modelu kompleksa HhaI z AdoMet odkrita oblika, kjer je baza, ki je namenjena metilaciji, rotirana iz osi dvojne vijačnice za 180°. Ta baza je tako segala iz malega žleba DNA v katalitično domeno encima. Ista potreba po rotaciji baz se je pokazala pri vseh ostalih vrstah metilaz.

Osrednjo vlogo v sprostitvi baze iz DNA ima TRD. [https://media.nature.com/m685/nature-assets/nsmb/journal/v8/n2/images/nsb0201_121_F1.jpg M.TaqI] modeli so pokazali, da se ob vezavi struktura vijačnice močno deformira. Razmakne se mali žleb za približno 3 °A, stisne se ogrodje in timin se pomakne bolj proti centru vijačnice. To je posledica interakcij med skoraj vsemi baznimi pari [https://media.nature.com/m685/nature-assets/nsmb/journal/v8/n2/images/nsb0201_121_F2.gif prepoznavnega zaporedja DNA], razen timidina, ki je par metiliranemu adeninu. Vse to pripomore prekinitvi van der Waalsovih vezi med tem parom in izpostavitvi adenina [4].

== Metiltransferaze restrikcijsko-modifikacijskih sistemov (R/M sistemi) ==

Večina bakterijskih DNA metiltransferaz (MTaz) je sklopljenih z restrikcijskim encimom. Skupaj tvorita R/M sisteme, ki ščitijo bakterije pred tujo DNA. MTaza modificira bakterijsko DNA in jo s tem zaščiti pred vezavo restriktaze. Ob vstopu virusne DNA v celico restriktaza nanjo lahko deluje, saj ni modificirana z metilnimi skupinami [1].

R/M sistemi se razdelijo v 4 skupine. Sistem IV dejansko ni pravi RM sistem, saj ne vsebuje MTaze.

Najenostavnejši in tudi najštevilčnejši je '''sistem II''', zanj je značilno, da sta MTaza in restriktaza ločena encima, ki delujeta neodvisno eden od drugega. Prepoznata enako signalno zaporedje na DNA. Večina MTaz sistema II je monomernih proteinov, sestavljenih iz katalitične domene z vezanim AdoMet in TRD domeno. Večinoma prepoznajo kratka palindromska zaporedja na DNA, v dolžini nekje med 2 in 8 nukleotidov. Včasih je prepoznavno zaporedje prekinjeno z nekaj vmesnimi nukleotidi, tako da encim prepozna kratek palindromski odsek, sledi nekaj nesimetričnih nukleotidov in nato spet kratek prepoznavni palindromski odsek. MTaze podsistema IIs prepoznajo nesimetrično zaporedje, zato sta za modifikacijo obeh verig DNA potrebni dve MTazi.

'''Sistem I''' je najbolj kompleksen. MTaza in restriktaza sta skupaj s še eno podenoto povezani v heterotrimer. M podenota je odgovorna za metilacijo, R podenota je restriktaza, S podenota pa omogoča vezavo na DNA (vsebuje TRD domeno). Načeloma so vse tri podenote povezane v kompleks, ampak M in S podenota skupaj lahko delujeta neodvisno od R podenote. Vsako podenoto zapisuje svoj gen. Gena za podenoti S in M regulira skupni promotor, medtem ima gen za restriktazo svoj promotor, kar omogoča ločeno regulacijo izražanja. Prepoznavno mesto na DNA je sestavljeno iz dveh krajših asimetričnih zaporedij (3-5 nukleotidov), ki sta ločeni z nekaj vmesnimi nukleotidi. Na vsaki verigi DNA se metilira po en adenin.

'''R/M sistem III''' je najmanj raziskana skupina. Podenoti MTaze in restriktaza sestavljata heterodimerni kompleks, za razliko od sistema I pa zraven nimata podenote S. TRD domena se nahaja na obeh ostalih podenotah. Prepoznavno zaporedje je sestavljeno iz 5-6 asimetričnih nukleotidov. Za razliko od preostalih skupin, se metilacija pojavi le na eni verigi DNA, kar pa še vedno omogoča zaščito pred restriktazo.

Hemimetilirana DNA je v vseh primerih zaščitena pred restriktazami, a se v večini primerov metilira tudi na drugi verigi. To je ključnega pomena pri podvojevanju DNA, ko nastaneta 2 hčerinski DNA, ki vsebujeta po eno na novo nastalo verigo in eno verigo iz starševske DNA. Le slednja je metilirana. Če modifikacija na eni sami verigi ne bi bila zadostna zaščita, bi restriktaze prej ali slej razrezale lastne kromosome [1,5].

== Regulacija R/M sistemov ==

1. MTaza se lahko veže na promotor gena za MTazo. S tem prepreči vezavo RNA-polimeraze in prepreči prepisovanje genov.

2. Nekatere MTaze prepoznajo zaporedje, ki je del promotorja za gen MTaze. Metilacija deluje kot represor in gen za MTazo se ne more prepisovati. 1. in 2. način omogočata, da se izražanje MTaze zmanjša, ko je te v celici dovolj. S tem se prepreči, da v primeru pojava virusne DNA restriktaza deluje prej kot MTaza.

3. V primeru prenosa genov za R/M sistem med bakterijami, se mora v bakteriji, ki je prejela gen, najprej izraziti gen za MTazo, šele nato gen za restriktazo. To omogačajo C-proteini (kontrolni proteini). V celici se najprej začne izražati gen za MTazo. Hkrati se začne prepisovati tudi gen za protein C, ki nato aktivira gen za restriktazo. Zamik v nastanku enega in drugega encima je ravno pravšnji, da lahko MTaza modificira kromosome in jih zaščiti. C-protein je homodimerni protein, ki se na palindromsko zaporedje na DNA veže z motivom vijačnica-zavoj-vijačnica [5].

== Viri ==

[1] M. Noyer-Weidner and T. A. Trautner, “Methylation of DNA in Prokaryotes,” in DNA Methylation, Basel: Birkhäuser Basel, 1993, pp. 39–108.

[2] J. Casadesús and D. Low, “Epigenetic gene regulation in the bacterial world.,” Microbiol. Mol. Biol. Rev., vol. 70, no. 3, pp. 830–56, Sep. 2006.

[3] S. Bheemanaik, Y. V. R. Reddy, and D. N. Rao, “Structure, function and mechanism of exocyclic DNA methyltransferases.,” Biochem. J., vol. 399, no. 2, pp. 177–90, Oct. 2006.

[4] W. Gong, M. O’gara, R. M. Blumenthal, X. Cheng, and W. M. Keck, “Structure of PvuII DNA-(cytosine N4) methyltransferase, an example of domain permutation and protein fold assignment,” Oxford University Press, 1997.

[5] G. G. Wilson and N. E. Murray, “Restriction and Modification Systems,” Annu. Rev. Genet., vol. 25, no. 1, pp. 585–627, Dec. 1991.

Metilacijski sistem pri bakterijah

2019-04-09T18:34:03Z

Maks Kumek: /* Eksociklične metiltransferaze */

== Uvod ==

Metilacija DNA je eden najpomembnejših načinov modifikacije DNA in je prisotna v genomih različnih organizmov. Metilacija DNA pri bakterijah vpliva na različne proces, kot so: genska regulacija, kromosomsko podvojevanje /popravljanje, prepoznavanje tuje DNA v gostiteljski celici in posledično rezanje tuje DNA ter v posebnem primeru preživetje virusne DNA v gostiteljski celici. Pri bakterijah do metilacije DNA prihaja na bazah v nukleotidih adenina in citozina. Metiltransferaze(MTaz) katalizirajo ta postopek, pri čemer je S-adenozil-L-metionin ([https://file.medchemexpress.com/product_pic/hy-b0617.gif AdoMet]) univerzalni donor metilne skupine. Po reakciji nastane metilirana DNA in AdoHcy (S-adendozil-L-homocistein) [1].

Na osnovi znanih funkcij bakterijskih metiltransferaz, jih delimo v tri velike skupine:

• MTaze, ki niso del restrikcijo-metilacijskih sistemov, vendar lahko sodelujejo pri celični regulaciji,

• MTaze, ki spadajo v restrikcijsko-metilacijski sistem,

• virusne MTaze, ki jih prenašajo fagi in jih upoabljajo za povečanje obstoja svoje DNA v gostiteljskih celicah.

Bakterije imajo ti. restrikcijsko-modifikacijske sisteme. DNA MTaze imajo v njih vlogo zaščite lastne DNA pred restrikcijskimi encimi. R/M sistemi delujejo namreč tako, da metilirajo na določenem zaporedju DNA, ki ga prepoznavajo tudi restrikcijski encimi. Preprečena je vezava restrikaz in cepljenje lastne dvojne vijačnice. S tem bakterija prepreči zase usoden dogodek [1].

== Delovanje metiltransferaz, ki niso del restrikcijsko-metilacijskega sistema ==

DNA adenin MTaza (Dam) je eden izmed encimov velike skupine metiltransferaz, ki niso del R/M sistema. Dam metilira na adeninu in igra vlogo pri metiliranju hemimetilirane DNA, ki nastane pri replikaciji.

Na hemimetilirano DNA se na promotorski regiji vežejo DNA vezavni proteini SeqA. Ko je SeqA vezan, preprečuje vezavo Dam na promotorsko regijo in posledično metilacijo samega promotorja. Slednje ima posledico inhibicije ali indukcije transkripcije genov za različne proteine. Spontana disocijacija SeqA dovoli dostop in vezavo Dam na DNA. Ko veže promotor, začne drseti po vijačnici dokler ne pride do specifičnega nukleotidnega zaporedja 5' – GATC – 3' in metilira adenin. Stabilnost adenina v aktivnem mestu omogoči DPPY motiv na proteinu. Po [http://mol-biol4masters.masters.grkraj.org/html/Prokaryotic_DNA_Replication3-E_coli_DNA_Replication_files/image003.jpg metiliranju promotorja] se lahko veže bakterijska dnaA, ki je transkripcijski aktivator.

== Zgradba metiltransferaz ==

Naj si bodo nekatere DNA MTaze monomerne, dimerne ali celo oligomerne, so v njih vedno relativno ohranjene domene. Na osnovi funkcije teh domen jih delimo na tri skupine: AdoMet vezavne domene, TRD (target recognition domain) in katalitične domene [2].

Še bolj pa so ohranjeni gradniki teh domen, motivi, ki si sledijo po številčenju od I-X. Čeprav se lahko domene v zaporedju izmenjujejo ali pa se dodajo še druge domene, imajo motivi znotraj domen fiksna zaporedja, kar kaže na vloge teh motivov pri katalitskem procesu.

Katalitična domena objema večinoma motiv IV, ki ima tudi ohranjeno skupno zaporedje. Večinoma se imenuje DPPY, pri čemer se D spreminja glede na različni sev [2,3].

TRD domena prepozna, stabilizira in veže DNA, vendar njeno aminokislinsko zaporedje ni ohranjeno. Pač pa je eno najbolj diverznih zaporedji aminokislinskih ostankov v encimu. Velikokrat so na robu teh zaporedji ponavljajoča se dokaj ohranjena zaporedja. Pomembno je poudariti, da ni direktne povezave med enim aminokislinskim ostankom in enim nukleotidom, marveč so interakcije med TRD in DNA kompleksne narave.

AdoMet vezavna domena veže na kofaktor. Sestavljena je iz dveh poddomen: ena za vezavo AdoMet in druga za vezavo na prejemnika metilne skupine. AdoMet ima najpomembnejši motiv I. Na osnovi aktivnosti AdoMet vezavne in katalitične domene delimo metiltransferaze R/M sistema na: eksociklične amino MTaze (N6 adenin MTaza in N4 citozin MTaza) in endociklične MTaze (N5 citozin MTaze) [3].

== C5 metilacija ==

Mehanizem C5 je bil raziskan med prvimi. Posebej dobro preučen je na primeru endonukleaze/metiltransferaze HhaI. Začne se z nukleofilnim napadom C6 atoma v citozinu s tiolno skupino cisteina v Motivu IV. Tvori se kovalentna vez in poveže encim in substrat v kompleks. N3 (na citozinu) se protonira s pomočjo protona, ki ga donira nek kisli aminokislinski ostanek, v primeru HhaI je to glutaminsko kislinski ostanek (E119). To olajša nukleofilni napad. Podre se klasična vezava vodikovih vezi med baznim parom, v katerega je citozin vključen. Hkrati pa se tvorijo vodikove vezi med sedaj glutamatnim ostankom in vodikovim atomom na N4 ter argininom (R165) in kisikom na 2. mestu baznega obroča. Te stabilizirajo položaj baze v katalitičnem mestu. Po potečenem nukleoilnem napadu se sedaj zgodi elektrofilen napad na meso C5, kjer AdoMed svojo metilno skupino, nastane pa AdoHyc. Za zaključek se z napadom baze (najverjetneje vode) odstrani odvečni proton na C5. Prekine pa se tudi C6-S vez preko β eliminacije [1].

Posebnost tega mehanizma je dejstvo, da se zaradi vezave tiolne skupine in C6 atoma celotna baza deformira iz ravnine in zato nima prostora v dvojni vijačnici. To nakazuje na lokacijo katalize reakcije izven dvojne vijačnice [1].

== Eksociklične metiltransferaze ==

[https://www.ncbi.nlm.nih.gov/core/lw/2.0/html/tileshop_pmc/tileshop_pmc_inline.html?title=Click%20on%20image%20to%20zoom&p=PMC3&id=1609917_bic804i003.jpg Mehanizem], s katerim se prenese metilna skupina na enega od dušikov, vezanih na cikle baz, je dosti manj raziskan, vendar obstaja dokaj verjetna teorija o poteku reakcije.

Nekatere študije so dokazale, da se prenos metilne skupine dogodi neposredno na N6 atomu (M.EcoRI), kar potrjuje, da ni vmesnih intermediatov, kjer bi se prenašala metilna skupina iz enega dušika na drugega. Tako je najbolj splošna razlaga mehanizma, da se dogodi direkten prenos metilne skupine po SN2 reakcijskem mehanizmu z inverzijo simetrije. Podrobnejši vpogled nam pokaže, da se vseeno ustvari intermediat ob prenosu skupine, preden se lahko odcepi proton. Nastane torej N6-metilamonij adeninski kation, ki ga mora katalitsko mesto stabilizirati, da lahko reakcija steče do konca. S pomočjo reševanja M.TaqI struktur v kompleksu z AdoMet je bilo dognano, da v napadu dušika na 6. mestu sodeluje sam dušik najprej kot donor vodikove vezi na aspargin v motivu IV in tudi na kisik skeleta verige med dvema prolinoma v motivu IV. Dušik se delno negativno nabije in ima tako možnost napasti metilno skupino na AdoMet. Nastali N6- metil amonijev intermediat se na koncu deprotonira. To pa privede do končnega produkta N6 -metiliranega adenina [3,4].

Nekaj je tudi predpostavljenih modelov za N4 metiltransferaze. Predvsem za M.PvuII. Domneva je, da se vzpostavijo vodikove vezi med N4 atomom in Ser53 ter Pro54. Hkrati pa je možnost tvorbe van der Waalsovih vezi s Phe56 ostankom (vsi se nahajajo v motivu IV). Aktivacija takega dušika bi lahko potekala po slednjem modelu.
Asp96 se poveže z vodikovo vezjo na Ser53. Aktivira se hidroksilna skupina Ser 53 in proton se prenese s citozina preko serina na aspartatno kislinski ostanek. Prenos metilne skupine se dogodi istočasno z deprotonacijo N4. Končno protoniran asp96 tvori vez z N3 na citozinu [3].

== Obračanje baz ==

Pri vseh metiltransferazah, je potreba po premestitvi baze, ki se metilira, velika. Razlogi so predvsem sterične narave. Pri C5 metilaciji npr. je to nastanek intermediatov, ki nimajo prostora v klasični B-obliki DNA vijačnice. Tako je bila že prav pri modelu kompleksa HhaI z AdoMet odkrita oblika, kjer je baza, ki je namenjena metilaciji, rotirana iz osi dvojne vijačnice za 180°. Ta baza je tako segala iz malega žleba DNA v katalitično domeno encima. Ista potreba po rotaciji baz se je pokazala pri vseh ostalih vrstah metilaz.

Osrednjo vlogo v sprostitvi baze iz DNA ima TRD. [https://media.nature.com/m685/nature-assets/nsmb/journal/v8/n2/images/nsb0201_121_F1.jpg M.TaqI] modeli so pokazali, da se ob vezavi struktura vijačnice močno deformira. Razmakne se mali žleb za približno 3 °A, stisne se ogrodje in timin se pomakne bolj proti centru vijačnice. To je posledica interakcij med skoraj vsemi baznimi pari [https://media.nature.com/m685/nature-assets/nsmb/journal/v8/n2/images/nsb0201_121_F2.gif prepoznavnega zaporedja DNA], razen timidina, ki je par metiliranemu adeninu. Vse to pripomore prekinitvi van der Waalsovih vezi med tem parom in izpostavitvi adenina [4].

== Metiltransferaze restrikcijsko-modifikacijskih sistemov (R/M sistemi) ==

Večina bakterijskih DNA metiltransferaz (MTaz) je sklopljenih z restrikcijskim encimom. Skupaj tvorita R/M sisteme, ki ščitijo bakterije pred tujo DNA. MTaza modificira bakterijsko DNA in jo s tem zaščiti pred vezavo restriktaze. Ob vstopu virusne DNA v celico restriktaza nanjo lahko deluje, saj ni modificirana z metilnimi skupinami [1].

R/M sistemi se razdelijo v 4 skupine. Sistem IV dejansko ni pravi RM sistem, saj ne vsebuje MTaze.

Najenostavnejši in tudi najštevilčnejši je '''sistem II''', zanj je značilno, da sta MTaza in restriktaza ločena encima, ki delujeta neodvisno eden od drugega. Prepoznata enako signalno zaporedje na DNA. Večina MTaz sistema II je monomernih proteinov, sestavljenih iz katalitične domene z vezanim AdoMet in TRD domeno. Večinoma prepoznajo kratka palindromska zaporedja na DNA, v dolžini nekje med 2 in 8 nukleotidov. Včasih je prepoznavno zaporedje prekinjeno z nekaj vmesnimi nukleotidi, tako da encim prepozna kratek palindromski odsek, sledi nekaj nesimetričnih nukleotidov in nato spet kratek prepoznavni palindromski odsek. MTaze podsistema IIs prepoznajo nesimetrično zaporedje, zato sta za modifikacijo obeh verig DNA potrebni dve MTazi.

'''Sistem I''' je najbolj kompleksen. MTaza in restriktaza sta skupaj s še eno podenoto povezani v heterotrimer. M podenota je odgovorna za metilacijo, R podenota je restriktaza, S podenota pa omogoča vezavo na DNA (vsebuje TRD domeno). Načeloma so vse tri podenote povezane v kompleks, ampak M in S podenota skupaj lahko delujeta neodvisno od R podenote. Vsako podenoto zapisuje svoj gen. Gena za podenoti S in M regulira skupni promotor, medtem ima gen za restriktazo svoj promotor, kar omogoča ločeno regulacijo izražanja. Prepoznavno mesto na DNA je sestavljeno iz dveh krajših asimetričnih zaporedij (3-5 nukleotidov), ki sta ločeni z nekaj vmesnimi nukleotidi. Na vsaki verigi DNA se metilira po en adenin.

'''R/M sistem III''' je najmanj raziskana skupina. Podenoti MTaze in restriktaza sestavljata heterodimerni kompleks, za razliko od sistema I pa zraven nimata podenote S. TRD domena se nahaja na obeh ostalih podenotah. Prepoznavno zaporedje je sestavljeno iz 5-6 asimetričnih nukleotidov. Za razliko od preostalih skupin, se metilacija pojavi le na eni verigi DNA, kar pa še vedno omogoča zaščito pred restriktazo.

Hemimetilirana DNA je v vseh primerih zaščitena pred restriktazami, a se v večini primerov metilira tudi na drugi verigi. To je ključnega pomena pri podvojevanju DNA, ko nastaneta 2 hčerinski DNA, ki vsebujeta po eno na novo nastalo verigo in eno verigo iz starševske DNA. Le slednja je metilirana. Če modifikacija na eni sami verigi ne bi bila zadostna zaščita, bi restriktaze prej ali slej razrezale lastne kromosome [1,5].

== Regulacija R/M sistemov ==

1. MTaza se lahko veže na promotor gena za MTazo. S tem prepreči vezavo RNA-polimeraze in prepreči prepisovanje genov.

2. Nekatere MTaze prepoznajo zaporedje, ki je del promotorja za gen MTaze. Metilacija deluje kot represor in gen za MTazo se ne more prepisovati. 1. in 2. način omogočata, da se izražanje MTaze zmanjša, ko je te v celici dovolj. S tem se prepreči, da v primeru pojava virusne DNA restriktaza deluje prej kot MTaza.

3. V primeru prenosa genov za R/M sistem med bakterijami, se mora v bakteriji, ki je prejela gen, najprej izraziti gen za MTazo, šele nato gen za restriktazo. To omogačajo C-proteini (kontrolni proteini). V celici se najprej začne izražati gen za MTazo. Hkrati se začne prepisovati tudi gen za protein C, ki nato aktivira gen za restriktazo. Zamik v nastanku enega in drugega encima je ravno pravšnji, da lahko MTaza modificira kromosome in jih zaščiti. C-protein je homodimerni protein, ki se na palindromsko zaporedje na DNA veže z motivom vijačnica-zavoj-vijačnica [5].

== Viri ==

[1] M. Noyer-Weidner and T. A. Trautner, “Methylation of DNA in Prokaryotes,” in DNA Methylation, Basel: Birkhäuser Basel, 1993, pp. 39–108.

[2] J. Casadesús and D. Low, “Epigenetic gene regulation in the bacterial world.,” Microbiol. Mol. Biol. Rev., vol. 70, no. 3, pp. 830–56, Sep. 2006.

[3] S. Bheemanaik, Y. V. R. Reddy, and D. N. Rao, “Structure, function and mechanism of exocyclic DNA methyltransferases.,” Biochem. J., vol. 399, no. 2, pp. 177–90, Oct. 2006.

[4] W. Gong, M. O’gara, R. M. Blumenthal, X. Cheng, and W. M. Keck, “Structure of PvuII DNA-(cytosine N4) methyltransferase, an example of domain permutation and protein fold assignment,” Oxford University Press, 1997.

[5] G. G. Wilson and N. E. Murray, “Restriction and Modification Systems,” Annu. Rev. Genet., vol. 25, no. 1, pp. 585–627, Dec. 1991.

Metilacijski sistem pri bakterijah

2019-04-09T18:28:05Z

Maks Kumek: /* Eksociklične metiltransferaze */

== Uvod ==

Metilacija DNA je eden najpomembnejših načinov modifikacije DNA in je prisotna v genomih različnih organizmov. Metilacija DNA pri bakterijah vpliva na različne proces, kot so: genska regulacija, kromosomsko podvojevanje /popravljanje, prepoznavanje tuje DNA v gostiteljski celici in posledično rezanje tuje DNA ter v posebnem primeru preživetje virusne DNA v gostiteljski celici. Pri bakterijah do metilacije DNA prihaja na bazah v nukleotidih adenina in citozina. Metiltransferaze(MTaz) katalizirajo ta postopek, pri čemer je S-adenozil-L-metionin ([https://file.medchemexpress.com/product_pic/hy-b0617.gif AdoMet]) univerzalni donor metilne skupine. Po reakciji nastane metilirana DNA in AdoHcy (S-adendozil-L-homocistein) [1].

Na osnovi znanih funkcij bakterijskih metiltransferaz, jih delimo v tri velike skupine:

• MTaze, ki niso del restrikcijo-metilacijskih sistemov, vendar lahko sodelujejo pri celični regulaciji,

• MTaze, ki spadajo v restrikcijsko-metilacijski sistem,

• virusne MTaze, ki jih prenašajo fagi in jih upoabljajo za povečanje obstoja svoje DNA v gostiteljskih celicah.

Bakterije imajo ti. restrikcijsko-modifikacijske sisteme. DNA MTaze imajo v njih vlogo zaščite lastne DNA pred restrikcijskimi encimi. R/M sistemi delujejo namreč tako, da metilirajo na določenem zaporedju DNA, ki ga prepoznavajo tudi restrikcijski encimi. Preprečena je vezava restrikaz in cepljenje lastne dvojne vijačnice. S tem bakterija prepreči zase usoden dogodek [1].

== Delovanje metiltransferaz, ki niso del restrikcijsko-metilacijskega sistema ==

DNA adenin MTaza (Dam) je eden izmed encimov velike skupine metiltransferaz, ki niso del R/M sistema. Dam metilira na adeninu in igra vlogo pri metiliranju hemimetilirane DNA, ki nastane pri replikaciji.

Na hemimetilirano DNA se na promotorski regiji vežejo DNA vezavni proteini SeqA. Ko je SeqA vezan, preprečuje vezavo Dam na promotorsko regijo in posledično metilacijo samega promotorja. Slednje ima posledico inhibicije ali indukcije transkripcije genov za različne proteine. Spontana disocijacija SeqA dovoli dostop in vezavo Dam na DNA. Ko veže promotor, začne drseti po vijačnici dokler ne pride do specifičnega nukleotidnega zaporedja 5' – GATC – 3' in metilira adenin. Stabilnost adenina v aktivnem mestu omogoči DPPY motiv na proteinu. Po [http://mol-biol4masters.masters.grkraj.org/html/Prokaryotic_DNA_Replication3-E_coli_DNA_Replication_files/image003.jpg metiliranju promotorja] se lahko veže bakterijska dnaA, ki je transkripcijski aktivator.

== Zgradba metiltransferaz ==

Naj si bodo nekatere DNA MTaze monomerne, dimerne ali celo oligomerne, so v njih vedno relativno ohranjene domene. Na osnovi funkcije teh domen jih delimo na tri skupine: AdoMet vezavne domene, TRD (target recognition domain) in katalitične domene [2].

Še bolj pa so ohranjeni gradniki teh domen, motivi, ki si sledijo po številčenju od I-X. Čeprav se lahko domene v zaporedju izmenjujejo ali pa se dodajo še druge domene, imajo motivi znotraj domen fiksna zaporedja, kar kaže na vloge teh motivov pri katalitskem procesu.

Katalitična domena objema večinoma motiv IV, ki ima tudi ohranjeno skupno zaporedje. Večinoma se imenuje DPPY, pri čemer se D spreminja glede na različni sev [2,3].

TRD domena prepozna, stabilizira in veže DNA, vendar njeno aminokislinsko zaporedje ni ohranjeno. Pač pa je eno najbolj diverznih zaporedji aminokislinskih ostankov v encimu. Velikokrat so na robu teh zaporedji ponavljajoča se dokaj ohranjena zaporedja. Pomembno je poudariti, da ni direktne povezave med enim aminokislinskim ostankom in enim nukleotidom, marveč so interakcije med TRD in DNA kompleksne narave.

AdoMet vezavna domena veže na kofaktor. Sestavljena je iz dveh poddomen: ena za vezavo AdoMet in druga za vezavo na prejemnika metilne skupine. AdoMet ima najpomembnejši motiv I. Na osnovi aktivnosti AdoMet vezavne in katalitične domene delimo metiltransferaze R/M sistema na: eksociklične amino MTaze (N6 adenin MTaza in N4 citozin MTaza) in endociklične MTaze (N5 citozin MTaze) [3].

== C5 metilacija ==

Mehanizem C5 je bil raziskan med prvimi. Posebej dobro preučen je na primeru endonukleaze/metiltransferaze HhaI. Začne se z nukleofilnim napadom C6 atoma v citozinu s tiolno skupino cisteina v Motivu IV. Tvori se kovalentna vez in poveže encim in substrat v kompleks. N3 (na citozinu) se protonira s pomočjo protona, ki ga donira nek kisli aminokislinski ostanek, v primeru HhaI je to glutaminsko kislinski ostanek (E119). To olajša nukleofilni napad. Podre se klasična vezava vodikovih vezi med baznim parom, v katerega je citozin vključen. Hkrati pa se tvorijo vodikove vezi med sedaj glutamatnim ostankom in vodikovim atomom na N4 ter argininom (R165) in kisikom na 2. mestu baznega obroča. Te stabilizirajo položaj baze v katalitičnem mestu. Po potečenem nukleoilnem napadu se sedaj zgodi elektrofilen napad na meso C5, kjer AdoMed svojo metilno skupino, nastane pa AdoHyc. Za zaključek se z napadom baze (najverjetneje vode) odstrani odvečni proton na C5. Prekine pa se tudi C6-S vez preko β eliminacije [1].

Posebnost tega mehanizma je dejstvo, da se zaradi vezave tiolne skupine in C6 atoma celotna baza deformira iz ravnine in zato nima prostora v dvojni vijačnici. To nakazuje na lokacijo katalize reakcije izven dvojne vijačnice [1].

== Eksociklične metiltransferaze ==

[https://www.ncbi.nlm.nih.gov/core/lw/2.0/html/tileshop_pmc/tileshop_pmc_inline.html?title=Click%20on%20image%20to%20zoom&p=PMC3&id=1609917_bic804i003.jpg Mehanizem], s katerim se prenese metilna skupina na enega od dušikov, vezanih na cikle baz, je dosti manj raziskan, vendar obstaja dokaj verjetna teorija o poteku reakcije.

Nekatere študije so dokazale, da se prenos metilne skupine dogodi neposredno na N6 atomu (M.EcoRI), kar potrjuje, da ni vmesnih intermediatov, kjer bi se prenašala metilna skupina iz enega dušika na drugega. Tako je najbolj splošna razlaga mehanizma, da se dogodi direkten prenos metilne skupine po SN2 reakcijskem mehanizmu z inverzijo simetrije. Podrobnejši vpogled nam pokaže, da se vseeno ustvari intermediat ob prenosu skupine, preden se lahko odcepi proton. Nastane torej N6-metilamonij adeninski kation, ki ga mora katalitsko mesto stabilizirati, da lahko reakcija steče do konca. S pomočjo reševanja M.TaqI struktur v kompleksu z AdoMet, je bilo dognano, da v napadu dušika na 6. mestu sodeluje dušik, kot donor vodikove vezi na aspargin v motivu IV in tudi na kisik skeleta verige med dvema prolinoma v motivu IV. Dušik se delno negativno nabije in ima tako možnost napasti metilno skupino na AdoMet. Nastali N6- metil amonijev intermediat se na koncu deprotonira. To pa privede do končnega produkta N6 -metiliranega adenina [3,4].

Nekaj je tudi predpostavljenih modelov za N4 metiltransferaze. Predvsem za M.PvuII. Domneva je, da se vzpostavijo vodikove vezi med N4 atomom in Ser53 ter Pro54. Hkrati pa je možnost tvorbe van der Waalsovih vezi s Phe56 ostankom (vsi se nahajajo v motivu IV). Aktivacija takega dušika bi lahko potekala po slednjem modelu.
Asp96 se poveže z vodikovo vezjo na Ser53. Aktivira se hidroksilna skupina Ser 53 in prenese se proton s citozina preko serina na aspartatno kislinski ostanek. Prenos metilne skupine se dogodi istočasno z deprotonacijo N4. Končno protoniran asp96 tvori vez z N3 na citozinu [3].

== Obračanje baz ==

Pri vseh metiltransferazah, je potreba po premestitvi baze, ki se metilira, velika. Razlogi so predvsem sterične narave. Pri C5 metilaciji npr. je to nastanek intermediatov, ki nimajo prostora v klasični B-obliki DNA vijačnice. Tako je bila že prav pri modelu kompleksa HhaI z AdoMet odkrita oblika, kjer je baza, ki je namenjena metilaciji, rotirana iz osi dvojne vijačnice za 180°. Ta baza je tako segala iz malega žleba DNA v katalitično domeno encima. Ista potreba po rotaciji baz se je pokazala pri vseh ostalih vrstah metilaz.

Osrednjo vlogo v sprostitvi baze iz DNA ima TRD. [https://media.nature.com/m685/nature-assets/nsmb/journal/v8/n2/images/nsb0201_121_F1.jpg M.TaqI] modeli so pokazali, da se ob vezavi struktura vijačnice močno deformira. Razmakne se mali žleb za približno 3 °A, stisne se ogrodje in timin se pomakne bolj proti centru vijačnice. To je posledica interakcij med skoraj vsemi baznimi pari [https://media.nature.com/m685/nature-assets/nsmb/journal/v8/n2/images/nsb0201_121_F2.gif prepoznavnega zaporedja DNA], razen timidina, ki je par metiliranemu adeninu. Vse to pripomore prekinitvi van der Waalsovih vezi med tem parom in izpostavitvi adenina [4].

== Metiltransferaze restrikcijsko-modifikacijskih sistemov (R/M sistemi) ==

Večina bakterijskih DNA metiltransferaz (MTaz) je sklopljenih z restrikcijskim encimom. Skupaj tvorita R/M sisteme, ki ščitijo bakterije pred tujo DNA. MTaza modificira bakterijsko DNA in jo s tem zaščiti pred vezavo restriktaze. Ob vstopu virusne DNA v celico restriktaza nanjo lahko deluje, saj ni modificirana z metilnimi skupinami [1].

R/M sistemi se razdelijo v 4 skupine. Sistem IV dejansko ni pravi RM sistem, saj ne vsebuje MTaze.

Najenostavnejši in tudi najštevilčnejši je '''sistem II''', zanj je značilno, da sta MTaza in restriktaza ločena encima, ki delujeta neodvisno eden od drugega. Prepoznata enako signalno zaporedje na DNA. Večina MTaz sistema II je monomernih proteinov, sestavljenih iz katalitične domene z vezanim AdoMet in TRD domeno. Večinoma prepoznajo kratka palindromska zaporedja na DNA, v dolžini nekje med 2 in 8 nukleotidov. Včasih je prepoznavno zaporedje prekinjeno z nekaj vmesnimi nukleotidi, tako da encim prepozna kratek palindromski odsek, sledi nekaj nesimetričnih nukleotidov in nato spet kratek prepoznavni palindromski odsek. MTaze podsistema IIs prepoznajo nesimetrično zaporedje, zato sta za modifikacijo obeh verig DNA potrebni dve MTazi.

'''Sistem I''' je najbolj kompleksen. MTaza in restriktaza sta skupaj s še eno podenoto povezani v heterotrimer. M podenota je odgovorna za metilacijo, R podenota je restriktaza, S podenota pa omogoča vezavo na DNA (vsebuje TRD domeno). Načeloma so vse tri podenote povezane v kompleks, ampak M in S podenota skupaj lahko delujeta neodvisno od R podenote. Vsako podenoto zapisuje svoj gen. Gena za podenoti S in M regulira skupni promotor, medtem ima gen za restriktazo svoj promotor, kar omogoča ločeno regulacijo izražanja. Prepoznavno mesto na DNA je sestavljeno iz dveh krajših asimetričnih zaporedij (3-5 nukleotidov), ki sta ločeni z nekaj vmesnimi nukleotidi. Na vsaki verigi DNA se metilira po en adenin.

'''R/M sistem III''' je najmanj raziskana skupina. Podenoti MTaze in restriktaza sestavljata heterodimerni kompleks, za razliko od sistema I pa zraven nimata podenote S. TRD domena se nahaja na obeh ostalih podenotah. Prepoznavno zaporedje je sestavljeno iz 5-6 asimetričnih nukleotidov. Za razliko od preostalih skupin, se metilacija pojavi le na eni verigi DNA, kar pa še vedno omogoča zaščito pred restriktazo.

Hemimetilirana DNA je v vseh primerih zaščitena pred restriktazami, a se v večini primerov metilira tudi na drugi verigi. To je ključnega pomena pri podvojevanju DNA, ko nastaneta 2 hčerinski DNA, ki vsebujeta po eno na novo nastalo verigo in eno verigo iz starševske DNA. Le slednja je metilirana. Če modifikacija na eni sami verigi ne bi bila zadostna zaščita, bi restriktaze prej ali slej razrezale lastne kromosome [1,5].

== Regulacija R/M sistemov ==

1. MTaza se lahko veže na promotor gena za MTazo. S tem prepreči vezavo RNA-polimeraze in prepreči prepisovanje genov.

2. Nekatere MTaze prepoznajo zaporedje, ki je del promotorja za gen MTaze. Metilacija deluje kot represor in gen za MTazo se ne more prepisovati. 1. in 2. način omogočata, da se izražanje MTaze zmanjša, ko je te v celici dovolj. S tem se prepreči, da v primeru pojava virusne DNA restriktaza deluje prej kot MTaza.

3. V primeru prenosa genov za R/M sistem med bakterijami, se mora v bakteriji, ki je prejela gen, najprej izraziti gen za MTazo, šele nato gen za restriktazo. To omogačajo C-proteini (kontrolni proteini). V celici se najprej začne izražati gen za MTazo. Hkrati se začne prepisovati tudi gen za protein C, ki nato aktivira gen za restriktazo. Zamik v nastanku enega in drugega encima je ravno pravšnji, da lahko MTaza modificira kromosome in jih zaščiti. C-protein je homodimerni protein, ki se na palindromsko zaporedje na DNA veže z motivom vijačnica-zavoj-vijačnica [5].

== Viri ==

[1] M. Noyer-Weidner and T. A. Trautner, “Methylation of DNA in Prokaryotes,” in DNA Methylation, Basel: Birkhäuser Basel, 1993, pp. 39–108.

[2] J. Casadesús and D. Low, “Epigenetic gene regulation in the bacterial world.,” Microbiol. Mol. Biol. Rev., vol. 70, no. 3, pp. 830–56, Sep. 2006.

[3] S. Bheemanaik, Y. V. R. Reddy, and D. N. Rao, “Structure, function and mechanism of exocyclic DNA methyltransferases.,” Biochem. J., vol. 399, no. 2, pp. 177–90, Oct. 2006.

[4] W. Gong, M. O’gara, R. M. Blumenthal, X. Cheng, and W. M. Keck, “Structure of PvuII DNA-(cytosine N4) methyltransferase, an example of domain permutation and protein fold assignment,” Oxford University Press, 1997.

[5] G. G. Wilson and N. E. Murray, “Restriction and Modification Systems,” Annu. Rev. Genet., vol. 25, no. 1, pp. 585–627, Dec. 1991.

Metilacijski sistem pri bakterijah

2019-04-09T18:15:14Z

Maks Kumek: /* Eksociklične metiltransferaze */

== Uvod ==

Metilacija DNA je eden najpomembnejših načinov modifikacije DNA in je prisotna v genomih različnih organizmov. Metilacija DNA pri bakterijah vpliva na različne proces, kot so: genska regulacija, kromosomsko podvojevanje /popravljanje, prepoznavanje tuje DNA v gostiteljski celici in posledično rezanje tuje DNA ter v posebnem primeru preživetje virusne DNA v gostiteljski celici. Pri bakterijah do metilacije DNA prihaja na bazah v nukleotidih adenina in citozina. Metiltransferaze(MTaz) katalizirajo ta postopek, pri čemer je S-adenozil-L-metionin ([https://file.medchemexpress.com/product_pic/hy-b0617.gif AdoMet]) univerzalni donor metilne skupine. Po reakciji nastane metilirana DNA in AdoHcy (S-adendozil-L-homocistein) [1].

Na osnovi znanih funkcij bakterijskih metiltransferaz, jih delimo v tri velike skupine:

• MTaze, ki niso del restrikcijo-metilacijskih sistemov, vendar lahko sodelujejo pri celični regulaciji,

• MTaze, ki spadajo v restrikcijsko-metilacijski sistem,

• virusne MTaze, ki jih prenašajo fagi in jih upoabljajo za povečanje obstoja svoje DNA v gostiteljskih celicah.

Bakterije imajo ti. restrikcijsko-modifikacijske sisteme. DNA MTaze imajo v njih vlogo zaščite lastne DNA pred restrikcijskimi encimi. R/M sistemi delujejo namreč tako, da metilirajo na določenem zaporedju DNA, ki ga prepoznavajo tudi restrikcijski encimi. Preprečena je vezava restrikaz in cepljenje lastne dvojne vijačnice. S tem bakterija prepreči zase usoden dogodek [1].

== Delovanje metiltransferaz, ki niso del restrikcijsko-metilacijskega sistema ==

DNA adenin MTaza (Dam) je eden izmed encimov velike skupine metiltransferaz, ki niso del R/M sistema. Dam metilira na adeninu in igra vlogo pri metiliranju hemimetilirane DNA, ki nastane pri replikaciji.

Na hemimetilirano DNA se na promotorski regiji vežejo DNA vezavni proteini SeqA. Ko je SeqA vezan, preprečuje vezavo Dam na promotorsko regijo in posledično metilacijo samega promotorja. Slednje ima posledico inhibicije ali indukcije transkripcije genov za različne proteine. Spontana disocijacija SeqA dovoli dostop in vezavo Dam na DNA. Ko veže promotor, začne drseti po vijačnici dokler ne pride do specifičnega nukleotidnega zaporedja 5' – GATC – 3' in metilira adenin. Stabilnost adenina v aktivnem mestu omogoči DPPY motiv na proteinu. Po [http://mol-biol4masters.masters.grkraj.org/html/Prokaryotic_DNA_Replication3-E_coli_DNA_Replication_files/image003.jpg metiliranju promotorja] se lahko veže bakterijska dnaA, ki je transkripcijski aktivator.

== Zgradba metiltransferaz ==

Naj si bodo nekatere DNA MTaze monomerne, dimerne ali celo oligomerne, so v njih vedno relativno ohranjene domene. Na osnovi funkcije teh domen jih delimo na tri skupine: AdoMet vezavne domene, TRD (target recognition domain) in katalitične domene [2].

Še bolj pa so ohranjeni gradniki teh domen, motivi, ki si sledijo po številčenju od I-X. Čeprav se lahko domene v zaporedju izmenjujejo ali pa se dodajo še druge domene, imajo motivi znotraj domen fiksna zaporedja, kar kaže na vloge teh motivov pri katalitskem procesu.

Katalitična domena objema večinoma motiv IV, ki ima tudi ohranjeno skupno zaporedje. Večinoma se imenuje DPPY, pri čemer se D spreminja glede na različni sev [2,3].

TRD domena prepozna, stabilizira in veže DNA, vendar njeno aminokislinsko zaporedje ni ohranjeno. Pač pa je eno najbolj diverznih zaporedji aminokislinskih ostankov v encimu. Velikokrat so na robu teh zaporedji ponavljajoča se dokaj ohranjena zaporedja. Pomembno je poudariti, da ni direktne povezave med enim aminokislinskim ostankom in enim nukleotidom, marveč so interakcije med TRD in DNA kompleksne narave.

AdoMet vezavna domena veže na kofaktor. Sestavljena je iz dveh poddomen: ena za vezavo AdoMet in druga za vezavo na prejemnika metilne skupine. AdoMet ima najpomembnejši motiv I. Na osnovi aktivnosti AdoMet vezavne in katalitične domene delimo metiltransferaze R/M sistema na: eksociklične amino MTaze (N6 adenin MTaza in N4 citozin MTaza) in endociklične MTaze (N5 citozin MTaze) [3].

== C5 metilacija ==

Mehanizem C5 je bil raziskan med prvimi. Posebej dobro preučen je na primeru endonukleaze/metiltransferaze HhaI. Začne se z nukleofilnim napadom C6 atoma v citozinu s tiolno skupino cisteina v Motivu IV. Tvori se kovalentna vez in poveže encim in substrat v kompleks. N3 (na citozinu) se protonira s pomočjo protona, ki ga donira nek kisli aminokislinski ostanek, v primeru HhaI je to glutaminsko kislinski ostanek (E119). To olajša nukleofilni napad. Podre se klasična vezava vodikovih vezi med baznim parom, v katerega je citozin vključen. Hkrati pa se tvorijo vodikove vezi med sedaj glutamatnim ostankom in vodikovim atomom na N4 ter argininom (R165) in kisikom na 2. mestu baznega obroča. Te stabilizirajo položaj baze v katalitičnem mestu. Po potečenem nukleoilnem napadu se sedaj zgodi elektrofilen napad na meso C5, kjer AdoMed svojo metilno skupino, nastane pa AdoHyc. Za zaključek se z napadom baze (najverjetneje vode) odstrani odvečni proton na C5. Prekine pa se tudi C6-S vez preko β eliminacije [1].

Posebnost tega mehanizma je dejstvo, da se zaradi vezave tiolne skupine in C6 atoma celotna baza deformira iz ravnine in zato nima prostora v dvojni vijačnici. To nakazuje na lokacijo katalize reakcije izven dvojne vijačnice [1].

== Eksociklične metiltransferaze ==

[https://www.ncbi.nlm.nih.gov/core/lw/2.0/html/tileshop_pmc/tileshop_pmc_inline.html?title=Click%20on%20image%20to%20zoom&p=PMC3&id=1609917_bic804i003.jpg Mehanizem], s katerim se prenese metilna skupina na enega od dušikov, vezanih na cikle baz,je dosti manj raziskan, vendar obstaja dokaj verjetna teorija o poteku reakcije.

Nekatere študije so dokazale, da se prenos metilne skupine dogodi neposredno na N6 atomu (M.EcoRI), kar potrjuje, da ne mora obstajati nikakršnih intermediatov, kjer bi se prenašala metilna skupina iz enega dušika na drugega. Tako je najbolj splošna razlaga mehanizma, da se dogodi direkten prenos metilne skupine po SN2 reakcijskem mehanizmu z inverzijo simetrije. Podrobnejši vpogled nam pokaže, da se vseeno ustvari intermediat ob prenosu skupine, preden se lahko odcepi proton. Nastane torej N6-metilamonij adeninski kation, ki ga mora katalitsko mesto stabilizirati, da lahko reakcija steče do konca. S pomočjo reševanja M.TaqI struktur v kompleksu z AdoMet, je bilo dognano, da v napadu dušika na 6. mestu sodeluje dušik, kot donor vodikove vezi na aspargin v motivu IV in tudi na kisik skeleta verige med dvema prolinoma v motivu IV. Dušik se delno negativno nabije in ima tako možnost napasti metilno skupino na AdoMet. Nastali N6- metil amonijev intermediat se na koncu deprotonira. To pa privede do končnega produkta N6 -metiliranega adenina [3,4].

Nekaj je tudi predpostavljenih modelov za N4 metiltransferaze. Predvsem za M.PvuII. Domneva je, da se vzpostavijo vodikove vezi med N4 atomom in Ser53 ter Pro54. Hkrati pa je možnost tvorbe van der Waalsovih vezi s Phe56 ostankom (vsi se nahajajo v motivu IV). Aktivacija takega dušika bi lahko potekala po slednjem modelu.
Asp96 se poveže z vodikovo vezjo na Ser53. Aktivira se hidroksilna skupina Ser 53 in prenese se proton s citozina preko serina na aspartatno kislinski ostanek. Prenos metilne skupine se dogodi istočasno z deprotonacijo N4. Končno protoniran asp96 tvori vez z N3 na citozinu [3].

== Obračanje baz ==

Pri vseh metiltransferazah, je potreba po premestitvi baze, ki se metilira, velika. Razlogi so predvsem sterične narave. Pri C5 metilaciji npr. je to nastanek intermediatov, ki nimajo prostora v klasični B-obliki DNA vijačnice. Tako je bila že prav pri modelu kompleksa HhaI z AdoMet odkrita oblika, kjer je baza, ki je namenjena metilaciji, rotirana iz osi dvojne vijačnice za 180°. Ta baza je tako segala iz malega žleba DNA v katalitično domeno encima. Ista potreba po rotaciji baz se je pokazala pri vseh ostalih vrstah metilaz.

Osrednjo vlogo v sprostitvi baze iz DNA ima TRD. [https://media.nature.com/m685/nature-assets/nsmb/journal/v8/n2/images/nsb0201_121_F1.jpg M.TaqI] modeli so pokazali, da se ob vezavi struktura vijačnice močno deformira. Razmakne se mali žleb za približno 3 °A, stisne se ogrodje in timin se pomakne bolj proti centru vijačnice. To je posledica interakcij med skoraj vsemi baznimi pari [https://media.nature.com/m685/nature-assets/nsmb/journal/v8/n2/images/nsb0201_121_F2.gif prepoznavnega zaporedja DNA], razen timidina, ki je par metiliranemu adeninu. Vse to pripomore prekinitvi van der Waalsovih vezi med tem parom in izpostavitvi adenina [4].

== Metiltransferaze restrikcijsko-modifikacijskih sistemov (R/M sistemi) ==

Večina bakterijskih DNA metiltransferaz (MTaz) je sklopljenih z restrikcijskim encimom. Skupaj tvorita R/M sisteme, ki ščitijo bakterije pred tujo DNA. MTaza modificira bakterijsko DNA in jo s tem zaščiti pred vezavo restriktaze. Ob vstopu virusne DNA v celico restriktaza nanjo lahko deluje, saj ni modificirana z metilnimi skupinami [1].

R/M sistemi se razdelijo v 4 skupine. Sistem IV dejansko ni pravi RM sistem, saj ne vsebuje MTaze.

Najenostavnejši in tudi najštevilčnejši je '''sistem II''', zanj je značilno, da sta MTaza in restriktaza ločena encima, ki delujeta neodvisno eden od drugega. Prepoznata enako signalno zaporedje na DNA. Večina MTaz sistema II je monomernih proteinov, sestavljenih iz katalitične domene z vezanim AdoMet in TRD domeno. Večinoma prepoznajo kratka palindromska zaporedja na DNA, v dolžini nekje med 2 in 8 nukleotidov. Včasih je prepoznavno zaporedje prekinjeno z nekaj vmesnimi nukleotidi, tako da encim prepozna kratek palindromski odsek, sledi nekaj nesimetričnih nukleotidov in nato spet kratek prepoznavni palindromski odsek. MTaze podsistema IIs prepoznajo nesimetrično zaporedje, zato sta za modifikacijo obeh verig DNA potrebni dve MTazi.

'''Sistem I''' je najbolj kompleksen. MTaza in restriktaza sta skupaj s še eno podenoto povezani v heterotrimer. M podenota je odgovorna za metilacijo, R podenota je restriktaza, S podenota pa omogoča vezavo na DNA (vsebuje TRD domeno). Načeloma so vse tri podenote povezane v kompleks, ampak M in S podenota skupaj lahko delujeta neodvisno od R podenote. Vsako podenoto zapisuje svoj gen. Gena za podenoti S in M regulira skupni promotor, medtem ima gen za restriktazo svoj promotor, kar omogoča ločeno regulacijo izražanja. Prepoznavno mesto na DNA je sestavljeno iz dveh krajših asimetričnih zaporedij (3-5 nukleotidov), ki sta ločeni z nekaj vmesnimi nukleotidi. Na vsaki verigi DNA se metilira po en adenin.

'''R/M sistem III''' je najmanj raziskana skupina. Podenoti MTaze in restriktaza sestavljata heterodimerni kompleks, za razliko od sistema I pa zraven nimata podenote S. TRD domena se nahaja na obeh ostalih podenotah. Prepoznavno zaporedje je sestavljeno iz 5-6 asimetričnih nukleotidov. Za razliko od preostalih skupin, se metilacija pojavi le na eni verigi DNA, kar pa še vedno omogoča zaščito pred restriktazo.

Hemimetilirana DNA je v vseh primerih zaščitena pred restriktazami, a se v večini primerov metilira tudi na drugi verigi. To je ključnega pomena pri podvojevanju DNA, ko nastaneta 2 hčerinski DNA, ki vsebujeta po eno na novo nastalo verigo in eno verigo iz starševske DNA. Le slednja je metilirana. Če modifikacija na eni sami verigi ne bi bila zadostna zaščita, bi restriktaze prej ali slej razrezale lastne kromosome [1,5].

== Regulacija R/M sistemov ==

1. MTaza se lahko veže na promotor gena za MTazo. S tem prepreči vezavo RNA-polimeraze in prepreči prepisovanje genov.

2. Nekatere MTaze prepoznajo zaporedje, ki je del promotorja za gen MTaze. Metilacija deluje kot represor in gen za MTazo se ne more prepisovati. 1. in 2. način omogočata, da se izražanje MTaze zmanjša, ko je te v celici dovolj. S tem se prepreči, da v primeru pojava virusne DNA restriktaza deluje prej kot MTaza.

3. V primeru prenosa genov za R/M sistem med bakterijami, se mora v bakteriji, ki je prejela gen, najprej izraziti gen za MTazo, šele nato gen za restriktazo. To omogačajo C-proteini (kontrolni proteini). V celici se najprej začne izražati gen za MTazo. Hkrati se začne prepisovati tudi gen za protein C, ki nato aktivira gen za restriktazo. Zamik v nastanku enega in drugega encima je ravno pravšnji, da lahko MTaza modificira kromosome in jih zaščiti. C-protein je homodimerni protein, ki se na palindromsko zaporedje na DNA veže z motivom vijačnica-zavoj-vijačnica [5].

== Viri ==

[1] M. Noyer-Weidner and T. A. Trautner, “Methylation of DNA in Prokaryotes,” in DNA Methylation, Basel: Birkhäuser Basel, 1993, pp. 39–108.

[2] J. Casadesús and D. Low, “Epigenetic gene regulation in the bacterial world.,” Microbiol. Mol. Biol. Rev., vol. 70, no. 3, pp. 830–56, Sep. 2006.

[3] S. Bheemanaik, Y. V. R. Reddy, and D. N. Rao, “Structure, function and mechanism of exocyclic DNA methyltransferases.,” Biochem. J., vol. 399, no. 2, pp. 177–90, Oct. 2006.

[4] W. Gong, M. O’gara, R. M. Blumenthal, X. Cheng, and W. M. Keck, “Structure of PvuII DNA-(cytosine N4) methyltransferase, an example of domain permutation and protein fold assignment,” Oxford University Press, 1997.

[5] G. G. Wilson and N. E. Murray, “Restriction and Modification Systems,” Annu. Rev. Genet., vol. 25, no. 1, pp. 585–627, Dec. 1991.

Odgovor bakterij na tujo DNA

2019-04-09T00:54:16Z

Maks Kumek:

Seminarji pri Molekularni biologiji v študijskem letu 2018/19 obravnavajo odziv bakterijskih celic na tujo DNA, ki vstopi vanje, oziroma na okužbo z bakteriofagi. Okvirni naslovi oz. teme so navedeni na prvem seznamu. Za orientacijo in splošno poznavanje tematike si preberite [https://www.nature.com/articles/nrmicro2315 pregledni članek] v Nature Rev. Microbiol. iz leta 2010. V okviru posameznih poglavij znotraj osnovne teme lahko predlagate še kakšen seminar po lastni presoji (pošljite predlog po e-pošti!).

Vsako temo obdelajo praviloma trije študenti. Vsaka skupina mora pripraviti povzetek seminarja z vsaj 1200 besedami in ne več kot 1800 besedami in ga objaviti na tem wikiju. Povzetek ne vsebuje slikovnega gradiva, lahko pa vključuje povezave do slik in videov na spletu. Navedite do 5 ključnih virov (ti ne štejejo v vsoto 1200 besed), ki ste jih uporabili.

Vsaka skupina mora objaviti povzetek seminarja na wikiju najkasneje 24 h pred predstavitvijo svojega seminarja. Kateri del povzetka je napisal kdo, navedite v zavihku 'discussion'.
Predstavitev naj bo dolga pribl. 20 minut (tolerančni okvir je 18-23 min.), temu pa bo sledila razprava, dolga 5-10 min. Vsak član skupine mora predstaviti en del seminarja, pri čemer mora biti delo enakomerno razdeljeno med vse. Osredotočite se na osnovno temo, ki ste si jo izbrali in vključite čim manj splošnega uvoda.

Razpored seminarjev po datumih bo razviden iz spletne učilnice. Začetek seminarjev bo 8. aprila, na dve uri (ponedeljek, četrtek) pa so predvideni po trije seminarji.

Vsebina seminarjev je izpitna snov. Iz teme seminarjev so 2-3 vprašanja od ~30, kolikor jih ima celoten izpit.

Poglavja za seminarje so:

'''Preprečevanje adsorpcije fagov na celično površino''' 
1. Blokiranje receptorjev za fage 
2. Proizvodnja zunajceličnega matriksa 
3. Proizvodnja kompetitivnih inhibitorjev 

'''Preprečevanje ponovne okužbe z istim fagom s preprečitvijo vstopa fagne DNA''' 
4. Sistem Sie pri gramnegativnih bakterijah 
5. Sistem Sie pri grampozitivnih bakterijah 

'''Bakterijski restrikcijsko-modifikacijski sistem''' 
6. Odkritje prvih restrikcijskih endonukleaz ''(npr. Nobelovo predavanje Hamiltona Smitha 1978 in njegov članek iz 1970)'' 
7. Metilacijski sistem pri bakterijah 
8. Struktura in mehanizem restriktaz tipa II 
9. Prilagoditve fagov na bakterijske restrikcijsko-modifikacijske sisteme 

'''Sistem CRISP/Cas proti fagom in plazmidom''' 
10. Odkritje in opis regij CRISPR in Cas (do leta ~2002) 
11. Odkritje izvora ponavljajočih se zaporedij (Mojica et al., 2005) 
12. Odkritje vloge CRISPR/Cas pri omejevanju vnosa plazmidov (Marraffini&Sontheimer, 2008) 
13. Mehanizem delovanja kompleksa Cascade in sistem CRISPR/Cas pri ''E. coli'' (Brouns et al., 2008) 
14. Struktura in delovanje sistema CRISPR/Cas pri bakteriji ''Streptococcus pyogenes'' 

'''Sistemi abortivne infekcije (Abi)''' 
15. Sistem Rex pri bakteriji ''Escherichia coli'' 
16. Bakterijski sistemi toksin-antitoksin, usmerjeni proti fagom 

''Kjer so ob temi navedeni članki, naj ti služijo kot osnova za iskanje dodatnih virov.''

----

Za seminar se prijavite tako, da se vpišete v oklepaj za naslovom seminarja:

1. [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Blokiranje_receptorjev_za_fage Blokiranje receptorjev za fage] (Martina Lokar, Tina Kolenc Milavec, Urša Štrancar) 
2. [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Proizvodnja_zunajceli%C4%8Dnega_matriksa Proizvodnja zunajceličnega matriksa] (Patricija Miklavc, Benjamin Malovrh, Vid Modic) 
3. [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Proizvodnja_kompetitivnih_inhibitorjev Proizvodnja kompetitivnih inhibitorjev] (Ajda Godec,Liza Ulčakar,Luka Gnidovec) 
4. Sistem Sie pri gramnegativnih bakterijah (Anamarija Agnič, Aljaž Bratina, Anže Šumah) 
5. Sistem Sie pri grampozitivnih bakterijah 
6. [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Odkritje_prvih_restrikcijskih_endonukleaz Odkritje prvih restrikcijskih endonukleaz] (Alen Šadl, Bor Klančnik, Andrej Špenko) 
7. [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Metilacijski_sistem_pri_bakterijah Metilacijski sistem pri bakterijah] (Sumeja Kudelić, Maja Škof, Maks Kumek) 
8. Struktura in mehanizem restriktaz tipa II (Meta Kodrič, Barbara Jaklič, Laura Gašperšič) 
9. Prilagoditve fagov na bakterijske restrikcijsko-modifikacijske sisteme (Nika Boštic, Tadej Medved, Sonja Gabrijelčič) 
10. Odkritje in opis regij CRISPR in Cas (do leta ~2002) (Eva Gartner, Neža Blaznik, Tina Zavodnik ) 
11. Odkritje izvora ponavljajočih se zaporedij (Mateja Špegel, Špela Friškovec Vončina, Anja Truden) 
12. Odkritje vloge CRISPR/Cas pri omejevanju vnosa plazmidov (Urška Zagorc, Nika Mikulič Vernik, Anja Tavčar) 
13. Mehanizem delovanja kompleksa Cascade in sistem CRISPR/Cas pri ''E. coli'' (Jernej Imperl, Klementina Polanec, Gašper Anton Komatar) 
14. Struktura in delovanje sistema CRISPR/Cas pri bakteriji ''Streptococcus pyogenes'' (Lara Hrvatin, Doroteja Armič, Matija Ruparčič) 
15. Sistem Rex pri bakteriji ''Escherichia coli'' (Karmen Mlinar, Marko Pavleković, Valeriya Musina) 
16. Bakterijski sistemi toksin-antitoksin, usmerjeni proti fagom (Sanja Stanković, Karin Dobravc Škof, Neža Žerjav ) 

Ko boste pripravljali povzetek, naslov teme na spodnjem seznamu povežite z novo wiki stranjo, ki bo vsebovala povzetek. Na koncu besedila (pod viri) v novo vrstico dodajte oznaki: <nowiki>[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]</nowiki> 

Primer, kako so bili urejeni seminarji v prejšnjih letih, si lahko ogledate na primer na strani [[Struktura kromatina]] (2013/14).

#[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Herpesvirusi_in_sorodni_dsDNA_virusi Herpesvirusi in sorodni dsDNA virusi] (Veronika Razpotnik, Ines Medved, Andrej Ivanovski)

Talk:Metilacijski sistem pri bakterijah

2019-04-09T00:52:46Z

Maks Kumek:

'''Sumeja Kudelič''': ''Uvod, Zgrdba metiltransferaz, Delovanje metiltransferaz, ki niso del restrikcijsko-metilacijskega sistema
''

'''Maks Kumek''': ''C5 metilacija, Eksociklične metiltransferaze, Obračanje baz''

'''Maja Škof''': ''Metiltransferaze restrikcijsko-modifikacijskih sistemov (R/M sistemi), Regulacija R/M sistemov
''

Talk:Metilacijski sistem pri bakterijah

2019-04-09T00:52:20Z

Maks Kumek:

Talk:Metilacijski sistem pri bakterijah

2019-04-09T00:51:11Z

Maks Kumek:

Talk:Metilacijski sistem pri bakterijah

2019-04-09T00:51:02Z

Maks Kumek:

'''Sumeja Kudelič''': ''Uvod, Zgrdba metiltransferaz, Delovanje metiltransferaz, ki niso del restrikcijsko-metilacijskega sistema
''
'''Maks Kumek''': ''C5 metilacija, Eksociklične metiltransferaze, Obračanje baz''

'''Maja Škof''': ''Metiltransferaze restrikcijsko-modifikacijskih sistemov (R/M sistemi), Regulacija R/M sistemov
''

Talk:Metilacijski sistem pri bakterijah

2019-04-09T00:49:26Z

Maks Kumek:

-Sumeja Kudelič: Uvod, Zgrdba metiltransferaz, Delovanje metiltransferaz, ki niso del restrikcijsko-metilacijskega sistema

-Maks Kumek: C5 metilacija, Eksociklične metiltransferaze

-Maja Škof: Metiltransferaze restrikcijsko-modifikacijskih sistemov (R/M sistemi), Regulacija R/M sistemov

Talk:Metilacijski sistem pri bakterijah

2019-04-09T00:47:54Z

Maks Kumek: New page: -Sumeja Kudelič: Uvod, Zgrdba metiltransferaz, Delovanje metiltransferaz, ki niso del restrikcijsko-metilacijskega sistema -Maks Kumek: C5 metilacija, Eksociklične metiltransferaze

-Sumeja Kudelič: Uvod, Zgrdba metiltransferaz, Delovanje metiltransferaz, ki niso del restrikcijsko-metilacijskega sistema

-Maks Kumek: C5 metilacija, Eksociklične metiltransferaze

Metilacijski sistem pri bakterijah

2019-04-09T00:42:48Z

Maks Kumek:

== Uvod ==

Metilacija DNA je eden najpomembnejših načinov modifikacije DNA in je prisotna v genomih različnih organizmov. Metilacija DNA pri bakterijah vpliva na različne proces, kot so: genska regulacija, kromosomsko podvojevanje /popravljanje, prepoznavanje tuje DNA v gostiteljski celici in posledično rezanje tuje DNA ter v posebnem primeru preživetje virusne DNA v gostiteljski celici. Pri bakterijah do metilacije DNA prihaja na bazah v nukleotidih adenina in citozina. Metiltransferaze(MTaz) katalizirajo ta postopek, pri čemer je S-adenozil-L-metionin ([https://file.medchemexpress.com/product_pic/hy-b0617.gif AdoMet]) univerzalni donor metilne skupine. Po reakciji nastane metilirana DNA in AdoHcy (S-adendozil-L-homocistein) [1].

Na osnovi znanih funkcij bakterijskih metiltransferaz, jih delimo v tri velike skupine:

• MTaze, ki niso del restrikcijo-metilacijskih sistemov, vendar lahko sodelujejo pri celični regulaciji,

• MTaze, ki so spadajo v restrikcijsko-metilacijski sistem,

• virusne MTaze, ki jih prenašajo fagi in jih upoabljajo za povečanje obstoja svoje DNA v gostiteljskih celicah.

Bakterije imajo ti. restrikcijsko-modifikacijske sisteme. DNA MTaze imajo v njih vlogo zaščite lastne DNA pred restrikcijskimi encimi. R/M sistemi delujejo namreč tako, da metilirajo na določenem zaporedju DNA, ki ga prepoznavajo tudi restrikcijski encimi. Preprečena je vezava restrikaz in cepljenje lastne dvojne vijačnice. S tem bakterija prepreči zase usoden dogodek [1].

== Delovanje metiltransferaz, ki niso del restrikcijsko-metilacijskega sistema ==

DNA adenin MTaza (Dam) je eden izmed encimov velike skupine metiltransferaz, ki niso del R/M sistema. Dam metilira na adeninu in igra vlogo pri metiliranju hemimetilirane DNA, ki nastane pri replikaciji.

Na hemimetilirano DNA se na promotorski regiji vežejo DNA vezavni proteini SeqA. Ko je SeqA vezan, preprečuje vezavo Dam na promotorsko regijo in posledično metilacijo samega promotorja. Slednje ima posledico inhibicije ali indukcije transkripcije genov za različne proteine. Spontana disocijacija SeqA dovoli dostop in vezavo Dam na DNA. Ko veže promotor, začne drseti po vijačnici dokler ne pride do specifičnega nukleotidnega zaporedja 5' – GATC – 3' in metilira adenin. Stabilnost adenina v aktivnem mestu omogoči DPPY motiv na proteinu. Po [http://mol-biol4masters.masters.grkraj.org/html/Prokaryotic_DNA_Replication3-E_coli_DNA_Replication_files/image003.jpg metiliranju promotorja] se lahko veže bakterijska dnaA, ki je transkripcijski aktivator.

== Zgradba metiltransferaz ==

Naj si bodo nekatere DNA MTaze monomerne, dimerne ali celo oligomerne, so v njih vedno relativno ohranjene domene. Na osnovi funkcije teh domen jih delimo na tri skupine: AdoMet vezavne domene, TRD (target recognition domain) in katalitične domene [2].

Še bolj pa so ohranjeni gradniki teh domen, motivi, ki si sledijo po številčenju od I-X. Čeprav se lahko domene v zaporedju izmenjujejo ali pa se dodajo še druge domene, imajo motivi znotraj domen fiksna zaporedja, kar kaže na vloge teh motivov pri katalitskem procesu.

Katalitična domena objema večinoma motiv IV, ki ima tudi ohranjeno skupno zaporedje. Večinoma se imenuje DPPY, pri čemer se D spreminja glede na različni sev [2,3].

TRD domena prepozna, stabilizira in veže DNA, vendar njeno aminokislinsko zaporedje ni ohranjeno. Pač pa je eno najbolj diverznih zaporedji aminokislinskih ostankov v encimu. Velikokrat so na robu teh zaporedji ponavljajoča se dokaj ohranjena zaporedja. Pomembno je poudariti, da ni direktne povezave med enim aminokislinskim ostankom in enim nukleotidom, marveč so interakcije med TRD in DNA kompleksne narave.

AdoMet vezavna domena veže na kofaktor. Sestavljena je iz dveh poddomen: ena za vezavo AdoMet in druga za vezavo na prejemnika metilne skupine. AdoMet ima najpomembnejši motiv I. Na osnovi aktivnosti AdoMet vezavne in katalitične domene delimo metiltransferaze R/M sistema na: eksociklične amino MTaze (N6 adenin MTaza in N4 citozin MTaza) in endociklične MTaze (N5 citozin MTaze) [3].

== C5 metilacija ==

Mehanizem C5 je bil raziskan med prvimi. Posebej dobro preučen je na primeru endonukleaze/metiltransferaze HhaI. Začne se z nukleofilnim napadom C6 atoma v citozinu s tiolno skupino cisteina v Motivu IV. Tvori se kovalentna vez in poveže encim in substrat v kompleks. N3 (na citozinu) se protonira s pomočjo protona, ki ga donira nek kisli aminokislinski ostanek, v primeru HhaI je to glutaminsko kislinski ostanek (E119). To olajša nukleofilni napad. Podre se klasična vezava vodikovih vezi med baznim parom, v katerega je citozin vključen. Hkrati pa se tvorijo vodikove vezi med sedaj glutamatnim ostankom in vodikovim atomom na N4 ter argininom (R165) in kisikom na 2. mestu baznega obroča. Te stabilizirajo položaj baze v katalitičnem mestu. Po potečenem nukleoilnem napadu se sedaj zgodi elektrofilen napad na meso C5, kjer AdoMed svojo metilno skupino, nastane pa AdoHyc. Za zaključek se z napadom baze (najverjetneje vode) odstrani odvečni proton na C5. Prekine pa se tudi C6-S vez preko β eliminacije [1].

Posebnost tega mehanizma je dejstvo, da se zaradi vezave tiolne skupine in C6 atoma celotna baza deformira iz ravnine in zato nima prostora v dvojni vijačnici. To nakazuje na lokacijo katalize reakcije izven dvojne vijačnice [1].

== Eksociklične metiltransferaze ==

[https://www.ncbi.nlm.nih.gov/core/lw/2.0/html/tileshop_pmc/tileshop_pmc_inline.html?title=Click%20on%20image%20to%20zoom&p=PMC3&id=1609917_bic804i003.jpg Mehanizem] s katerim se prenese metilna skupina na enega od dušikov vezanih na cikle baz dosti manj raziskana, vendar obstaja dokaj verjetna teorija o poteku reakcije.
Nekatere študije so dokazale, da se prenos metilne skupine dogodi neposredno na N6 atomu (M.EcoRI), kar potrjuje, da ne mora obstajati nikakršnih intermediatov, kjer bi se prenašala metilna skupina iz enega dušika na drugega. Tako je najbolj splošna razlaga mehanizma, da se dogodi direkten prenos metilne skupine po SN2 reakcijskem mehanizmu z inverzijo simetrije. Podrobnejši vpogled nam pokaže, da pa se vseeno ustvari intermediat ob prenosu skupine, preden se lahko odcepi proton. Nastane torej N6-metilamonij adeninski kation, ki ga mora katalitsko mesto stabilizirati, da lahko reakcija steče do konca. S pomočjo reševanja M.TaqI struktur v kompleksu z AdoMet, je bilo dognano, da v napadu dušika na 6. mestu sodeluje dušik, kot donor vodikove vezi na aspargin v motivu IV in tudi na kisik skeleta verige med dvema prolinoma v motivu IV. Dušik se delno negativno nabije in ima tako možnost napasti metilno skupino na AdoMet. Nastali N6- metil amonijev intermediat se na koncu deprotonira. To pa privede do končnega produkta N6 -metiliranega adenina [3,4].

Nekaj je tudi predpostavljenih modelov za N4 metiltransferaze. Predvsem za M.PvuII. Domneva je da se vzpostavijo vodikove vezi med N4 atomom in Ser53 ter Pro54. Hkrati pa je možnost tvorbe van der Waalsovih vezi s Phe56 ostankom (vsi se nahajajo v motivu IV). Aktivacija takega dušika bi lahko potekala po slednjem modelu.
Asp96 se poveže z vodikovo vezjo na Ser53. Aktivira se hidroksilna skupina Ser 53 in prenese se proton s citozina preko serina na aspartatno kislinski ostanek. Prenos metilne skupine se dogodi istočasno z deprotonacijo N4. Končno protoniran asp96 tvori vez z N3 na citozinu [3].

== Obračanje baz ==

Pri vseh metiltransferazah, je potreba po premestitvi baze, ki se metilira, velika. Razlogi so predvsem sterične narave. Pri C5 metilaciji npr. je to nastanek intermediatov, ki nimajo prostora v klasični B-obliki DNA vijačnice. Tako je bila že prav pri modelu kompleksa HhaI z AdoMet odkrita oblika, kjer je baza, ki je namenjena metilaciji, rotirana iz osi dvojne vijačnice za 180°. Ta baza je tako segala iz malega žleba DNA v katalitično domeno encima. Ista potreba po rotaciji baz se je pokazala pri vseh ostalih vrstah metilaz.

Osrednjo vlogo v sprostitvi baze iz DNA ima TRD. [https://media.nature.com/m685/nature-assets/nsmb/journal/v8/n2/images/nsb0201_121_F1.jpg M.TaqI] modeli so pokazali, da se ob vezavi struktura vijačnice močno deformira. Razmakne se mali žleb za približno 3 °A, stisne se ogrodje in timin se pomakne bolj proti centru vijačnice. To je posledica interakcij med skoraj vsemi baznimi pari [https://media.nature.com/m685/nature-assets/nsmb/journal/v8/n2/images/nsb0201_121_F2.gif prepoznavnega zaporedja DNA], razen timidina, ki je par metiliranemu adeninu. Vse to pripomore prekinitvi van der Waalsovih vezi med tem parom in izpostavitvi adenina [4].

== Metiltransferaze restrikcijsko-modifikacijskih sistemov (R/M sistemi) ==

Večina bakterijskih DNA metiltransferaz (MTaz) je sklopljenih z restrikcijskim encimom. Skupaj tvorita R/M sisteme, ki ščitijo bakterije pred tujo DNA. MTaza modificira bakterijsko DNA in jo s tem zaščiti pred vezavo restriktaze. Ob vstopu virusne DNA v celico restriktaza nanjo lahko deluje, saj ni modificirana z metilnimi skupinami [1].

R/M sistemi se razdelijo v 4 skupine. Sistem IV dejansko ni pravi RM sistem, saj ne vsebuje MTaze.

Najenostavnejši in tudi najštevilčnejši je '''sistem II''', zanj je značilno, da sta MTaza in restriktaza ločena encima, ki delujeta neodvisno eden od drugega. Prepoznata enako signalno zaporedje na DNA. Večina MTaz sistema II je monomernih proteinov, sestavljenih iz katalitične domene z vezanim AdoMet in TRD domeno. Večinoma prepoznajo kratka palindromska zaporedja na DNA, v dolžini nekje med 2 in 8 nukleotidov. Včasih je prepoznavno zaporedje prekinjeno z nekaj vmesnimi nukleotidi, tako da encim prepozna kratek palindromski odsek, sledi nekaj nesimetričnih nukleotidov in nato spet kratek prepoznavni palindromski odsek. MTaze podsistema IIs prepoznajo nesimetrično zaporedje, zato sta za modifikacijo obeh verig DNA potrebni dve MTazi.

'''Sistem I''' je najbolj kompleksen. MTaza in restriktaza sta skupaj s še eno podenoto povezani v heterotrimer. M podenota je odgovorna za metilacijo, R podenota je restriktaza, S podenota pa omogoča vezavo na DNA (vsebuje TRD domeno). Načeloma so vse tri podenote povezane v kompleks, ampak M in S podenota skupaj lahko delujeta neodvisno od R podenote. Vsako podenoto zapisuje svoj gen. Gena za podenoti S in M regulira skupni promotor, medtem ima gen za restriktazo svoj promotor, kar omogoča ločeno regulacijo izražanja. Prepoznavno mesto na DNA je sestavljeno iz dveh krajših asimetričnih zaporedij (3-5 nukleotidov), ki sta ločeni z nekaj vmesnimi nukleotidi. Na vsaki verigi DNA se metilira po en adenin.

'''R/M sistem III''' je najmanj raziskana skupina. Podenoti MTaze in restriktaza sestavljata heterodimerni kompleks, za razliko od sistema I pa zraven nimata podenote S. TRD domena se nahaja na obeh ostalih podenotah. Prepoznavno zaporedje je sestavljeno iz 5-6 asimetričnih nukleotidov. Za razliko od preostalih skupin, se metilacija pojavi le na eni verigi DNA, kar pa še vedno omogoča zaščito pred restriktazo.

Hemimetilirana DNA je v vseh primerih zaščitena pred restriktazami, a se v večini primerov metilira tudi na drugi verigi. To je ključnega pomena pri podvojevanju DNA, ko nastaneta 2 hčerinski DNA, ki vsebujeta po eno na novo nastalo verigo in eno verigo iz starševske DNA. Le slednja je metilirana. Če modifikacija na eni sami verigi ne bi bila zadostna zaščita, bi restriktaze prej ali slej razrezale lastne kromosome [1,5].

== Regulacija R/M sistemov ==

1. MTaza se lahko veže na promotor gena za MTazo. S tem prepreči vezavo RNA-polimeraze in prepreči prepisovanje genov.

2. Nekatere MTaze prepoznajo zaporedje, ki je del promotorja za gen MTaze. Metilacija deluje kot represor in gen za MTazo se ne more prepisovati. 1. in 2. način omogočata, da se izražanje MTaze zmanjša, ko je te v celici dovolj. S tem se prepreči, da v primeru pojava virusne DNA restriktaza deluje prej kot MTaza.

3. V primeru prenosa genov za R/M sistem med bakterijami, se mora v bakteriji, ki je prejela gen, najprej izraziti gen za MTazo, šele nato gen za restriktazo. To omogačajo C-proteini (kontrolni proteini). V celici se najprej začne izražati gen za MTazo. Hkrati se začne prepisovati tudi gen za protein C, ki nato aktivira gen za restriktazo. Zamik v nastanku enega in drugega encima je ravno pravšnji, da lahko MTaza modificira kromosome in jih zaščiti. C-protein je homodimerni protein, ki se na palindromsko zaporedje na DNA veže z motivom vijačnica-zavoj-vijačnica [5].

== Viri ==

[1] M. Noyer-Weidner and T. A. Trautner, “Methylation of DNA in Prokaryotes,” in DNA Methylation, Basel: Birkhäuser Basel, 1993, pp. 39–108.

[2] J. Casadesús and D. Low, “Epigenetic gene regulation in the bacterial world.,” Microbiol. Mol. Biol. Rev., vol. 70, no. 3, pp. 830–56, Sep. 2006.

[3] S. Bheemanaik, Y. V. R. Reddy, and D. N. Rao, “Structure, function and mechanism of exocyclic DNA methyltransferases.,” Biochem. J., vol. 399, no. 2, pp. 177–90, Oct. 2006.

[4] W. Gong, M. O’gara, R. M. Blumenthal, X. Cheng, and W. M. Keck, “Structure of PvuII DNA-(cytosine N4) methyltransferase, an example of domain permutation and protein fold assignment,” Oxford University Press, 1997.

[5] G. G. Wilson and N. E. Murray, “Restriction and Modification Systems,” Annu. Rev. Genet., vol. 25, no. 1, pp. 585–627, Dec. 1991.

Metilacijski sistem pri bakterijah

2019-04-09T00:36:17Z

Maks Kumek:

== Uvod ==

Metilacija DNA je eden najpomembnejših načinov modifikacije DNA in je prisotna v genomih različnih organizmov. Metilacija DNA pri bakterijah vpliva na različne proces, kot so: genska regulacija, kromosomsko podvojevanje /popravljanje, prepoznavanje tuje DNA v gostiteljski celici in posledično rezanje tuje DNA ter v posebnem primeru preživetje virusne DNA v gostiteljski celici. Pri bakterijah do metilacije DNA prihaja na bazah v nukleotidih adenina in citozina. Metiltransferaze(MTaz) katalizirajo ta postopek, pri čemer je S-adenozil-L-metionin ([https://file.medchemexpress.com/product_pic/hy-b0617.gif AdoMet]) univerzalni donor metilne skupine. Po reakciji nastane metilirana DNA in AdoHcy (S-adendozil-L-homocistein) [1].

Na osnovi znanih funkcij bakterijskih metiltransferaz, jih delimo v tri velike skupine:

• MTaze, ki niso del restrikcijo-metilacijskih sistemov, vendar lahko sodelujejo pri celični regulaciji,

• MTaze, ki so spadajo v restrikcijsko-metilacijski sistem,

• virusne MTaze, ki jih prenašajo fagi in jih upoabljajo za povečanje obstoja svoje DNA v gostiteljskih celicah.

Bakterije imajo ti. restrikcijsko-modifikacijske sisteme. DNA MTaze imajo v njih vlogo zaščite lastne DNA pred restrikcijskimi encimi. R/M sistemi delujejo namreč tako, da metilirajo na določenem zaporedju DNA, ki ga prepoznavajo tudi restrikcijski encimi. Preprečena je vezava restrikaz in cepljenje lastne dvojne vijačnice. S tem bakterija prepreči zase usoden dogodek [1].

== Delovanje metiltransferaz, ki niso del restrikcijsko-metilacijskega sistema ==

DNA adenin MTaza (Dam) je eden izmed encimov velike skupine metiltransferaz, ki niso del R/M sistema. Dam metilira na adeninu in igra vlogo pri metiliranju hemimetilirane DNA, ki nastane pri replikaciji.

Na hemimetilirano DNA se na promotorski regiji vežejo DNA vezavni proteini SeqA. Ko je SeqA vezan, preprečuje vezavo Dam na promotorsko regijo in posledično metilacijo samega promotorja. Slednje ima posledico inhibicije ali indukcije transkripcije genov za različne proteine. Spontana disocijacija SeqA dovoli dostop in vezavo Dam na DNA. Ko veže promotor, začne drseti po vijačnici dokler ne pride do specifičnega nukleotidnega zaporedja 5' – GATC – 3' in metilira adenin. Stabilnost adenina v aktivnem mestu omogoči DPPY motiv na proteinu. Po [http://mol-biol4masters.masters.grkraj.org/html/Prokaryotic_DNA_Replication3-E_coli_DNA_Replication_files/image003.jpg metiliranju promotorja] se lahko veže bakterijska dnaA, ki je transkripcijski aktivator.

Naj si bodo nekatere DNA MTaze monomerne, dimerne ali celo oligomerne, se v njih vedno relativno ohranjene domene. Na osnovi funkcije teh domen jih delimo na tri skupine: AdoMet vezavne domene, TRD (target recognition domain) in katalitične domene [2].

Še bolj pa so ohranjeni gradniki teh domen, motivi, ki si sledijo po številčenju od I-X. Čeprav se lahko domene v zaporedju izmenjujejo ali pa se dodajo še druge domene, imajo motivi znotraj domen fiksna zaporedja, kar kaže na vloge teh motivov pri katalitskem procesu.

Katalitična domena objema večinoma motiv IV, ki ima tudi ohranjeno skupno zaporedje. Večinoma se imenuje DPPY, pri čemer se D spreminja glede na različni sev [2,3].

TRD domena prepozna, stabilizira in veže DNA, vendar njeno aminokislinsko zaporedje ni ohranjeno. Pač pa je eno najbolj diverznih zaporedji aminokislinskih ostankov v encimu. Velikokrat so na robu teh zaporedji ponavljajoča se dokaj ohranjena zaporedja. Pomembno je poudariti, da ni direktne povezave med enim aminokislinskim ostankom in enim nukleotidom, marveč so interakcije med TRD in DNA kompleksne narave.

AdoMet vezavna domena veže na kofaktor. Sestavljena je iz dveh poddomen: ena za vezavo AdoMet in druga za vezavo na prejemnika metilne skupine. AdoMet ima najpomembnejši motiv I. Na osnovi aktivnosti AdoMet vezavne in katalitične domene delimo metiltransferaze R/M sistema na: eksociklične amino MTaze (N6 adenin MTaza in N4 citozin MTaza) in endociklične MTaze (N5 citozin MTaze) [3].

== C5 metilacija ==

Mehanizem C5 je bil raziskan med prvimi. Posebej dobro preučen je na primeru endonukleaze/metiltransferaze HhaI. Začne se z nukleofilnim napadom C6 atoma v citozinu s tiolno skupino cisteina v Motivu IV. Tvori se kovalentna vez in poveže encim in substrat v kompleks. N3 (na citozinu) se protonira s pomočjo protona, ki ga donira nek kisli aminokislinski ostanek, v primeru HhaI je to glutaminsko kislinski ostanek (E119). To olajša nukleofilni napad. Podre se klasična vezava vodikovih vezi med baznim parom, v katerega je citozin vključen. Hkrati pa se tvorijo vodikove vezi med sedaj glutamatnim ostankom in vodikovim atomom na N4 ter argininom (R165) in kisikom na 2. mestu baznega obroča. Te stabilizirajo položaj baze v katalitičnem mestu. Po potečenem nukleoilnem napadu se sedaj zgodi elektrofilen napad na meso C5, kjer AdoMed svojo metilno skupino, nastane pa AdoHyc. Za zaključek se z napadom baze (najverjetneje vode) odstrani odvečni proton na C5. Prekine pa se tudi C6-S vez preko β eliminacije [1].

Posebnost tega mehanizma je dejstvo, da se zaradi vezave tiolne skupine in C6 atoma celotna baza deformira iz ravnine in zato nima prostora v dvojni vijačnici. To nakazuje na lokacijo katalize reakcije izven dvojne vijačnice [1].

== Eksociklične metil transferaze ==

[https://www.ncbi.nlm.nih.gov/core/lw/2.0/html/tileshop_pmc/tileshop_pmc_inline.html?title=Click%20on%20image%20to%20zoom&p=PMC3&id=1609917_bic804i003.jpg Mehanizem] s katerim se prenese metilna skupina na enega od dušikov vezanih na cikle baz dosti manj raziskana, vendar obstaja dokaj verjetna teorija o poteku reakcije.
Nekatere študije so dokazale, da se prenos metilne skupine dogodi neposredno na N6 atomu (M.EcoRI), kar potrjuje, da ne mora obstajati nikakršnih intermediatov, kjer bi se prenašala metilna skupina iz enega dušika na drugega. Tako je najbolj splošna razlaga mehanizma, da se dogodi direkten prenos metilne skupine po SN2 reakcijskem mehanizmu z inverzijo simetrije. Podrobnejši vpogled nam pokaže, da pa se vseeno ustvari intermediat ob prenosu skupine, preden se lahko odcepi proton. Nastane torej N6-metilamonij adeninski kation, ki ga mora katalitsko mesto stabilizirati, da lahko reakcija steče do konca. S pomočjo reševanja M.TaqI struktur v kompleksu z AdoMet, je bilo dognano, da v napadu dušika na 6. mestu sodeluje dušik, kot donor vodikove vezi na aspargin v motivu IV in tudi na kisik skeleta verige med dvema prolinoma v motivu IV. Dušik se delno negativno nabije in ima tako možnost napasti metilno skupino na AdoMet. Nastali N6- metil amonijev intermediat se na koncu deprotonira. To pa privede do končnega produkta N6 -metiliranega adenina [3,4].

Nekaj je tudi predpostavljenih modelov za N4 metil transferaze. Predvsem za M.PvuII. Domneva je da se vzpostavijo vodikove vezi med N4 atomom in Ser53 ter Pro54. Hkrati pa je možnost tvorbe van der Waalsovih vezi s Phe56 ostankom (vsi se nahajajo v motivu IV). Aktivacija takega dušika bi lahko potekala po slednjem modelu.
Asp96 se poveže z vodikovo vezjo na Ser53. Aktivira se hidroksilna skupina Ser 53 in prenese se proton s citozina preko serina na aspartatno kislinski ostanek. Prenos metilne skupine se dogodi istočasno z deprotonacijo N4. Končno protoniran asp96 tvori vez z N3 na citozinu [3].

== Obračanje baz ==

Pri vseh metil transferazah, je potreba po premestitvi baze, ki se metilira, velika. Razlogi so predvsem sterične narave. Pri C5 metilaciji npr. je to nastanek intermediatov, ki nimajo prostora v klasični B-obliki DNA vijačnice. Tako je bila že prav pri modelu kompleksa HhaI z AdoMet odkrita oblika, kjer je baza, ki je namenjena metilaciji, rotirana iz osi dvojne vijačnice za 180°. Ta baza je tako segala iz malega žleba DNA v katalitično domeno encima. Ista potreba po rotaciji baz se je pokazala pri vseh ostalih vrstah metilaz.

Osrednjo vlogo v sprostitvi baze iz DNA ima TRD. [https://media.nature.com/m685/nature-assets/nsmb/journal/v8/n2/images/nsb0201_121_F1.jpg M.TaqI] modeli so pokazali, da se ob vezavi struktura vijačnice močno deformira. Razmakne se mali žleb za približno 3 °A, stisne se ogrodje in timin se pomakne bolj proti centru vijačnice. To je posledica interakcij med skoraj vsemi baznimi pari [https://media.nature.com/m685/nature-assets/nsmb/journal/v8/n2/images/nsb0201_121_F2.gif prepoznavnega zaporedja DNA], razen timidina, ki je par metiliranemu adeninu. Vse to pripomore prekinitvi van der Waalsovih vezi med tem parom in izpostavitvi adenina [4].

== Metiltransferaze restrikcijsko-modifikacijskih sistemov (R/M sistemi) ==

Večina bakterijskih DNA metiltransferaz (MTaz) je sklopljenih z restrikcijskim encimom. Skupaj tvorita R/M sisteme, ki ščitijo bakterije pred tujo DNA. MTaza modificira bakterijsko DNA in jo s tem zaščiti pred vezavo restriktaze. Ob vstopu virusne DNA v celico restriktaza nanjo lahko deluje, saj ni modificirana z metilnimi skupinami [1].

R/M sistemi se razdelijo v 4 skupine. Sistem IV dejansko ni pravi RM sistem, saj ne vsebuje MTaze.

Najenostavnejši in tudi najštevilčnejši je '''sistem II''', zanj je značilno, da sta MTaza in restriktaza ločena encima, ki delujeta neodvisno eden od drugega. Prepoznata enako signalno zaporedje na DNA. Večina MTaz sistema II je monomernih proteinov, sestavljenih iz katalitične domene z vezanim AdoMet in TRD domeno. Večinoma prepoznajo kratka palindromska zaporedja na DNA, v dolžini nekje med 2 in 8 nukleotidov. Včasih je prepoznavno zaporedje prekinjeno z nekaj vmesnimi nukleotidi, tako da encim prepozna kratek palindromski odsek, sledi nekaj nesimetričnih nukleotidov in nato spet kratek prepoznavni palindromski odsek. MTaze podsistema IIs prepoznajo nesimetrično zaporedje, zato sta za modifikacijo obeh verig DNA potrebni dve MTazi.

'''Sistem I''' je najbolj kompleksen. MTaza in restriktaza sta skupaj s še eno podenoto povezani v heterotrimer. M podenota je odgovorna za metilacijo, R podenota je restriktaza, S podenota pa omogoča vezavo na DNA (vsebuje TRD domeno). Načeloma so vse tri podenote povezane v kompleks, ampak M in S podenota skupaj lahko delujeta neodvisno od R podenote. Vsako podenoto zapisuje svoj gen. Gena za podenoti S in M regulira skupni promotor, medtem ima gen za restriktazo svoj promotor, kar omogoča ločeno regulacijo izražanja. Prepoznavno mesto na DNA je sestavljeno iz dveh krajših asimetričnih zaporedij (3-5 nukleotidov), ki sta ločeni z nekaj vmesnimi nukleotidi. Na vsaki verigi DNA se metilira po en adenin.

'''R/M sistem III''' je najmanj raziskana skupina. Podenoti MTaze in restriktaza sestavljata heterodimerni kompleks, za razliko od sistema I pa zraven nimata podenote S. TRD domena se nahaja na obeh ostalih podenotah. Prepoznavno zaporedje je sestavljeno iz 5-6 asimetričnih nukleotidov. Za razliko od preostalih skupin, se metilacija pojavi le na eni verigi DNA, kar pa še vedno omogoča zaščito pred restriktazo.

Hemimetilirana DNA je v vseh primerih zaščitena pred restriktazami, a se v večini primerov metilira tudi na drugi verigi. To je ključnega pomena pri podvojevanju DNA, ko nastaneta 2 hčerinski DNA, ki vsebujeta po eno na novo nastalo verigo in eno verigo iz starševske DNA. Le slednja je metilirana. Če modifikacija na eni sami verigi ne bi bila zadostna zaščita, bi restriktaze prej ali slej razrezale lastne kromosome [1,5].

== Regulacija R/M sistemov ==

1. MTaza se lahko veže na promotor gena za MTazo. S tem prepreči vezavo RNA-polimeraze in prepreči prepisovanje genov.

2. Nekatere MTaze prepoznajo zaporedje, ki je del promotorja za gen MTaze. Metilacija deluje kot represor in gen za MTazo se ne more prepisovati. 1. in 2. način omogočata, da se izražanje MTaze zmanjša, ko je te v celici dovolj. S tem se prepreči, da v primeru pojava virusne DNA restriktaza deluje prej kot MTaza.

3. V primeru prenosa genov za R/M sistem med bakterijami, se mora v bakteriji, ki je prejela gen, najprej izraziti gen za MTazo, šele nato gen za restriktazo. To omogačajo C-proteini (kontrolni proteini). V celici se najprej začne izražati gen za MTazo. Hkrati se začne prepisovati tudi gen za protein C, ki nato aktivira gen za restriktazo. Zamik v nastanku enega in drugega encima je ravno pravšnji, da lahko MTaza modificira kromosome in jih zaščiti. C-protein je homodimerni protein, ki se na palindromsko zaporedje na DNA veže z motivom vijačnica-zavoj-vijačnica [5].

== Viri ==

[1] M. Noyer-Weidner and T. A. Trautner, “Methylation of DNA in Prokaryotes,” in DNA Methylation, Basel: Birkhäuser Basel, 1993, pp. 39–108.

[2] J. Casadesús and D. Low, “Epigenetic gene regulation in the bacterial world.,” Microbiol. Mol. Biol. Rev., vol. 70, no. 3, pp. 830–56, Sep. 2006.

[3] S. Bheemanaik, Y. V. R. Reddy, and D. N. Rao, “Structure, function and mechanism of exocyclic DNA methyltransferases.,” Biochem. J., vol. 399, no. 2, pp. 177–90, Oct. 2006.

[4] W. Gong, M. O’gara, R. M. Blumenthal, X. Cheng, and W. M. Keck, “Structure of PvuII DNA-(cytosine N4) methyltransferase, an example of domain permutation and protein fold assignment,” Oxford University Press, 1997.

[5] G. G. Wilson and N. E. Murray, “Restriction and Modification Systems,” Annu. Rev. Genet., vol. 25, no. 1, pp. 585–627, Dec. 1991.

Metilacijski sistem pri bakterijah

2019-04-09T00:21:55Z

Maks Kumek:

== Uvod ==

Metilacija DNA je eden najpomembnejših načinov modifikacije DNA in je prisotna v genomih različnih organizmov. Metilacija DNA pri bakterijah vpliva na različne proces, kot so: genska regulacija, kromosomsko podvojevanje /popravljanje, prepoznavanje tuje DNA v gostiteljski celici in posledično rezanje tuje DNA ter v posebnem primeru preživetje virusne DNA v gostiteljski celici. Pri bakterijah do metilacije DNA prihaja na bazah v nukleotidih adenina in citozina. Metiltransferaze(MTaz) katalizirajo ta postopek, pri čemer je S-adenozil-metionin (AdoMet) univerzalni donor metilne skupine. Po reakciji nastane metilirana DNA in AdoHcy (S-adendozil-L-homocistein) [1].

Na osnovi znanih funkcij bakterijskih metiltransferaz, jih delimo v tri velike skupine:

• MTaze, ki niso del restrikcijo-metilacijskih sistemov, vendar lahko sodelujejo pri celični regulaciji,

• MTaze, ki so spadajo v restrikcijsko-metilacijski sistem,

• virusne MTaze, ki jih prenašajo fagi in jih upoabljajo za povečanje obstoja svoje DNA v gostiteljskih celicah.

Bakterije imajo ti. restrikcijsko-modifikacijske sisteme. DNA MTaze imajo v njih vlogo zaščite lastne DNA pred restrikcijskimi encimi. R/M sistemi delujejo namreč tako, da metilirajo na določenem zaporedju DNA, ki ga prepoznavajo tudi restrikcijski encimi. Preprečena je vezava restrikaz in cepljenje lastne dvojne vijačnice. S tem bakterija prepreči zase usoden dogodek [1].

== Delovanje metiltransferaz, ki niso del restrikcijsko-metilacijskega sistema ==

DNA adenin MTaza (Dam) je eden izmed encimov velike skupine metiltransferaz, ki niso del R/M sistema. Dam metilira na adeninu in igra vlogo pri metiliranju hemimetilirane DNA, ki nastane pri replikaciji.

Na hemimetilirano DNA se na promotorski regiji vežejo DNA vezavni proteini SeqA. Ko je SeqA vezan, preprečuje vezavo Dam na promotorsko regijo in posledično metilacijo samega promotorja. Slednje ima posledico inhibicije ali indukcije transkripcije genov za različne proteine. Spontana disocijacija SeqA dovoli dostop in vezavo Dam na DNA. Ko veže promotor, začne drseti po vijačnici dokler ne pride do specifičnega nukleotidnega zaporedja 5' – GATC – 3' in metilira adenin. Stabilnost adenina v aktivnem mestu omogoči DPPY motiv na proteinu. Po metiliranju promotorja se lahko veže bakterijska dnaA, ki je transkripcijski aktivator.
Naj si bodo nekatere DNA MTaze monomerne, dimerne ali celo oligomerne, se v njih vedno relativno ohranjene domene. Na osnovi funkcije teh domen jih delimo na tri skupine: AdoMet vezavne domene, TRD (target recognition domain) in katalitične domene [2].

Še bolj pa so ohranjeni gradniki teh domen, motivi, ki si sledijo po številčenju od I-X. Čeprav se lahko domene v zaporedju izmenjujejo ali pa se dodajo še druge domene, imajo motivi znotraj domen fiksna zaporedja, kar kaže na vloge teh motivov pri katalitskem procesu.

Katalitična domena objema večinoma motiv IV, ki ima tudi ohranjeno skupno zaporedje. Večinoma se imenuje DPPY, pri čemer se D spreminja glede na različni sev [2,3].

TRD domena prepozna, stabilizira in veže DNA, vendar njeno aminokislinsko zaporedje ni ohranjeno. Pač pa je eno najbolj diverznih zaporedji aminokislinskih ostankov v encimu. Velikokrat so na robu teh zaporedji ponavljajoča se dokaj ohranjena zaporedja. Pomembno je poudariti, da ni direktne povezave med enim aminokislinskim ostankom in enim nukleotidom, marveč so interakcije med TRD in DNA kompleksne narave.

AdoMet vezavna domena veže na kofaktor. Sestavljena je iz dveh poddomen: ena za vezavo AdoMet in druga za vezavo na prejemnika metilne skupine. AdoMet ima najpomembnejši motiv I. Na osnovi aktivnosti AdoMet vezavne in katalitične domene delimo metiltransferaze R/M sistema na: eksociklične amino MTaze (N6 adenin MTaza in N4 citozin MTaza) in endociklične MTaze (N5 citozin MTaze) [3].

== C5 metilacija ==

Mehanizem C5 je bil raziskan med prvimi. Posebej dobro preučen je na primeru endonukleaze/metiltransferaze HhaI. Začne se z nukleofilnim napadom C6 atoma v citozinu s tiolno skupino cisteina v Motivu IV. Tvori se kovalentna vez in poveže encim in substrat v kompleks. N3 (na citozinu) se protonira s pomočjo protona, ki ga donira nek kisli aminokislinski ostanek, v primeru HhaI je to glutaminsko kislinski ostanek (E119). To olajša nukleofilni napad. Podre se klasična vezava vodikovih vezi med baznim parom, v katerega je citozin vključen. Hkrati pa se tvorijo vodikove vezi med sedaj glutamatnim ostankom in vodikovim atomom na N4 ter argininom (R165) in kisikom na 2. mestu baznega obroča. Te stabilizirajo položaj baze v katalitičnem mestu. Po potečenem nukleoilnem napadu se sedaj zgodi elektrofilen napad na meso C5, kjer AdoMed svojo metilno skupino, nastane pa AdoHyc. Za zaključek se z napadom baze (najverjetneje vode) odstrani odvečni proton na C5. Prekine pa se tudi C6-S vez preko β eliminacije [1].

Posebnost tega mehanizma je dejstvo, da se zaradi vezave tiolne skupine in C6 atoma celotna baza deformira iz ravnine in zato nima prostora v dvojni vijačnici. To nakazuje na lokacijo katalize reakcije izven dvojne vijačnice [1].

== Eksociklične metil transferaze ==

[https://www.ncbi.nlm.nih.gov/core/lw/2.0/html/tileshop_pmc/tileshop_pmc_inline.html?title=Click%20on%20image%20to%20zoom&p=PMC3&id=1609917_bic804i003.jpg Mehanizem] s katerim se prenese metilna skupina na enega od dušikov vezanih na cikle baz dosti manj raziskana, vendar obstaja dokaj verjetna teorija o poteku reakcije.
Nekatere študije so dokazale, da se prenos metilne skupine dogodi neposredno na N6 atomu (M.EcoRI), kar potrjuje, da ne mora obstajati nikakršnih intermediatov, kjer bi se prenašala metilna skupina iz enega dušika na drugega. Tako je najbolj splošna razlaga mehanizma, da se dogodi direkten prenos metilne skupine po SN2 reakcijskem mehanizmu z inverzijo simetrije. Podrobnejši vpogled nam pokaže, da pa se vseeno ustvari intermediat ob prenosu skupine, preden se lahko odcepi proton. Nastane torej N6-metilamonij adeninski kation, ki ga mora katalitsko mesto stabilizirati, da lahko reakcija steče do konca. S pomočjo reševanja M.TaqI struktur v kompleksu z AdoMet, je bilo dognano, da v napadu dušika na 6. mestu sodeluje dušik, kot donor vodikove vezi na aspargin v motivu IV in tudi na kisik skeleta verige med dvema prolinoma v motivu IV. Dušik se delno negativno nabije in ima tako možnost napasti metilno skupino na AdoMet. Nastali N6- metil amonijev intermediat se na koncu deprotonira. To pa privede do končnega produkta N6 -metiliranega adenina [3,4].

Nekaj je tudi predpostavljenih modelov za N4 metil transferaze. Predvsem za M.PvuII. Domneva je da se vzpostavijo vodikove vezi med N4 atomom in Ser53 ter Pro54. Hkrati pa je možnost tvorbe van der Waalsovih vezi s Phe56 ostankom (vsi se nahajajo v motivu IV). Aktivacija takega dušika bi lahko potekala po slednjem modelu.
Asp96 se poveže z vodikovo vezjo na Ser53. Aktivira se hidroksilna skupina Ser 53 in prenese se proton s citozina preko serina na aspartatno kislinski ostanek. Prenos metilne skupine se dogodi istočasno z deprotonacijo N4. Končno protoniran asp96 tvori vez z N3 na citozinu [3].

== Obračanje baz ==

Pri vseh metil transferazah, je potreba po premestitvi baze, ki se metilira, velika. Razlogi so predvsem sterične narave. Pri C5 metilaciji npr. je to nastanek intermediatov, ki nimajo prostora v klasični B-obliki DNA vijačnice. Tako je bila že prav pri modelu kompleksa HhaI z AdoMet odkrita oblika, kjer je baza, ki je namenjena metilaciji, rotirana iz osi dvojne vijačnice za 180°. Ta baza je tako segala iz malega žleba DNA v katalitično domeno encima. Ista potreba po rotaciji baz se je pokazala pri vseh ostalih vrstah metilaz.

Osrednjo vlogo v sprostitvi baze iz DNA ima TRD. [https://media.nature.com/m685/nature-assets/nsmb/journal/v8/n2/images/nsb0201_121_F1.jpg M.TaqI] modeli so pokazali, da se ob vezavi struktura vijačnice močno deformira. Razmakne se mali žleb za približno 3 °A, stisne se ogrodje in timin se pomakne bolj proti centru vijačnice. To je posledica interakcij med skoraj vsemi baznimi pari prepoznavne sekvence DNA, razen timidina, ki je par metiliranemu adeninu. Vse to pripomore prekinitvi van der Waalsovih vezi med tem parom in izpostavitvi adenina [4].

== Metiltransferaze restrikcijsko-modifikacijskih sistemov (R/M sistemi) ==

Večina bakterijskih DNA metiltransferaz (MTaz) je sklopljenih z restrikcijskim encimom. Skupaj tvorita R/M sisteme, ki ščitijo bakterije pred tujo DNA. MTaza modificira bakterijsko DNA in jo s tem zaščiti pred vezavo restriktaze. Ob vstopu virusne DNA v celico restriktaza nanjo lahko deluje, saj ni modificirana z metilnimi skupinami [1].

R/M sistemi se razdelijo v 4 skupine. Sistem IV dejansko ni pravi RM sistem, saj ne vsebuje MTaze.

Najenostavnejši in tudi najštevilčnejši je '''sistem II''', zanj je značilno, da sta MTaza in restriktaza ločena encima, ki delujeta neodvisno eden od drugega. Prepoznata enako signalno zaporedje na DNA. Večina MTaz sistema II je monomernih proteinov, sestavljenih iz katalitične domene z vezanim AdoMet in TRD domeno. Večinoma prepoznajo kratka palindromska zaporedja na DNA, v dolžini nekje med 2 in 8 nukleotidov. Včasih je prepoznavno zaporedje prekinjeno z nekaj vmesnimi nukleotidi, tako da encim prepozna kratek palindromski odsek, sledi nekaj nesimetričnih nukleotidov in nato spet kratek prepoznavni palindromski odsek. MTaze podsistema IIs prepoznajo nesimetrično zaporedje, zato sta za modifikacijo obeh verig DNA potrebni dve MTazi.

'''Sistem I''' je najbolj kompleksen. MTaza in restriktaza sta skupaj s še eno podenoto povezani v heterotrimer. M podenota je odgovorna za metilacijo, R podenota je restriktaza, S podenota pa omogoča vezavo na DNA (vsebuje TRD domeno). Načeloma so vse tri podenote povezane v kompleks, ampak M in S podenota skupaj lahko delujeta neodvisno od R podenote. Vsako podenoto zapisuje svoj gen. Gena za podenoti S in M regulira skupni promotor, medtem ima gen za restriktazo svoj promotor, kar omogoča ločeno regulacijo izražanja. Prepoznavno mesto na DNA je sestavljeno iz dveh krajših asimetričnih zaporedij (3-5 nukleotidov), ki sta ločeni z nekaj vmesnimi nukleotidi. Na vsaki verigi DNA se metilira po en adenin.

'''R/M sistem III''' je najmanj raziskana skupina. Podenoti MTaze in restriktaza sestavljata heterodimerni kompleks, za razliko od sistema I pa zraven nimata podenote S. TRD domena se nahaja na obeh ostalih podenotah. Prepoznavno zaporedje je sestavljeno iz 5-6 asimetričnih nukleotidov. Za razliko od preostalih skupin, se metilacija pojavi le na eni verigi DNA, kar pa še vedno omogoča zaščito pred restriktazo.

Hemimetilirana DNA je v vseh primerih zaščitena pred restriktazami, a se v večini primerov metilira tudi na drugi verigi. To je ključnega pomena pri podvojevanju DNA, ko nastaneta 2 hčerinski DNA, ki vsebujeta po eno na novo nastalo verigo in eno verigo iz starševske DNA. Le slednja je metilirana. Če modifikacija na eni sami verigi ne bi bila zadostna zaščita, bi restriktaze prej ali slej razrezale lastne kromosome [1,5].

== Regulacija R/M sistemov ==

1. MTaza se lahko veže na promotor gena za MTazo. S tem prepreči vezavo RNA-polimeraze in prepreči prepisovanje genov.

2. Nekatere MTaze prepoznajo zaporedje, ki je del promotorja za gen MTaze. Metilacija deluje kot represor in gen za MTazo se ne more prepisovati. 1. in 2. način omogočata, da se izražanje MTaze zmanjša, ko je te v celici dovolj. S tem se prepreči, da v primeru pojava virusne DNA restriktaza deluje prej kot MTaza.

3. V primeru prenosa genov za R/M sistem med bakterijami, se mora v bakteriji, ki je prejela gen, najprej izraziti gen za MTazo, šele nato gen za restriktazo. To omogačajo C-proteini (kontrolni proteini). V celici se najprej začne izražati gen za MTazo. Hkrati se začne prepisovati tudi gen za protein C, ki nato aktivira gen za restriktazo. Zamik v nastanku enega in drugega encima je ravno pravšnji, da lahko MTaza modificira kromosome in jih zaščiti. C-protein je homodimerni protein, ki se na palindromsko zaporedje na DNA veže z motivom vijačnica-zavoj-vijačnica [5].

== Viri ==

[1] M. Noyer-Weidner and T. A. Trautner, “Methylation of DNA in Prokaryotes,” in DNA Methylation, Basel: Birkhäuser Basel, 1993, pp. 39–108.

[2] J. Casadesús and D. Low, “Epigenetic gene regulation in the bacterial world.,” Microbiol. Mol. Biol. Rev., vol. 70, no. 3, pp. 830–56, Sep. 2006.

[3] S. Bheemanaik, Y. V. R. Reddy, and D. N. Rao, “Structure, function and mechanism of exocyclic DNA methyltransferases.,” Biochem. J., vol. 399, no. 2, pp. 177–90, Oct. 2006.

[4] W. Gong, M. O’gara, R. M. Blumenthal, X. Cheng, and W. M. Keck, “Structure of PvuII DNA-(cytosine N4) methyltransferase, an example of domain permutation and protein fold assignment,” Oxford University Press, 1997.

[5] G. G. Wilson and N. E. Murray, “Restriction and Modification Systems,” Annu. Rev. Genet., vol. 25, no. 1, pp. 585–627, Dec. 1991.

Metilacijski sistem pri bakterijah

2019-04-08T23:43:40Z

Maks Kumek: New page: == Uvod == Metilacija DNA je eden najpomembnejših načinov modifikacije DNA in je prisotna v genomih različnih organizmov. Metilacija DNA pri bakterijah vpliva na različne proces, kot ...

== Uvod ==

Metilacija DNA je eden najpomembnejših načinov modifikacije DNA in je prisotna v genomih različnih organizmov. Metilacija DNA pri bakterijah vpliva na različne proces, kot so: genska regulacija, kromosomsko podvojevanje /popravljanje, prepoznavanje tuje DNA v gostiteljski celici in posledično rezanje tuje DNA ter v posebnem primeru preživetje virusne DNA v gostiteljski celici. Pri bakterijah do metilacije DNA prihaja na bazah v nukleotidih adenina in citozina. Metiltransferaze(MTaz) katalizirajo ta postopek, pri čemer je S-adenozil-metionin (AdoMet) univerzalni donor metilne skupine. Po reakciji nastane metilirana DNA in AdoHcy (S-adendozil-L-homocistein).

Na osnovi znanih funkcij bakterijskih metiltransferaz, jih delimo v tri velike skupine:

• MTaze, ki niso del restrikcijo-metilacijskih sistemov, vendar lahko sodelujejo pri celični regulaciji,

• MTaze, ki so spadajo v restrikcijsko-metilacijski sistem,

• virusne MTaze, ki jih prenašajo fagi in jih upoabljajo za povečanje obstoja svoje DNA v gostiteljskih celicah.

Bakterije imajo ti. restrikcijsko-modifikacijske sisteme. DNA MTaze imajo v njih vlogo zaščite lastne DNA pred restrikcijskimi encimi. R/M sistemi delujejo namreč tako, da metilirajo na določenem zaporedju DNA, ki ga prepoznavajo tudi restrikcijski encimi. Preprečena je vezava restrikaz in cepljenje lastne dvojne vijačnice. S tem bakterija prepreči zase usoden dogodek.

== Delovanje metiltransferaz, ki niso del restrikcijsko-metilacijskega sistema ==

DNA adenin MTaza (Dam) je eden izmed encimov velike skupine metiltransferaz, ki niso del R/M sistema. Dam metilira na adeninu in igra vlogo pri metiliranju hemimetilirane DNA, ki nastane pri replikaciji.

Na hemimetilirano DNA se na promotorski regiji vežejo DNA vezavni proteini SeqA. Ko je SeqA vezan, preprečuje vezavo Dam na promotorsko regijo in posledično metilacijo samega promotorja. Slednje ima posledico inhibicije ali indukcije transkripcije genov za različne proteine. Spontana disocijacija SeqA dovoli dostop in vezavo Dam na DNA. Ko veže promotor, začne drseti po vijačnici dokler ne pride do specifičnega nukleotidnega zaporedja 5' – GATC – 3' in metilira adenin. Stabilnost adenina v aktivnem mestu omogoči DPPY motiv na proteinu. Po metiliranju promotorja se lahko veže bakterijska dnaA, ki je transkripcijski aktivator.
Naj si bodo nekatere DNA MTaze monomerne, dimerne ali celo oligomerne, se v njih vedno relativno ohranjene domene. Na osnovi funkcije teh domen jih delimo na tri skupine: AdoMet vezavne domene, TRD (target recognition domain) in katalitične domene.

Še bolj pa so ohranjeni gradniki teh domen, motivi, ki si sledijo po številčenju od I-X. Čeprav se lahko domene v zaporedju izmenjujejo ali pa se dodajo še druge domene, imajo motivi znotraj domen fiksna zaporedja, kar kaže na vloge teh motivov pri katalitskem procesu.

Katalitična domena objema večinoma motiv IV, ki ima tudi ohranjeno skupno zaporedje. Večinoma se imenuje DPPY, pri čemer se D spreminja glede na različni sev.

TRD domena prepozna, stabilizira in veže DNA, vendar njeno aminokislinsko zaporedje ni ohranjeno. Pač pa je eno najbolj diverznih zaporedji aminokislinskih ostankov v encimu. Velikokrat so na robu teh zaporedji ponavljajoča se dokaj ohranjena zaporedja. Pomembno je poudariti, da ni direktne povezave med enim aminokislinskim ostankom in enim nukleotidom, marveč so interakcije med TRD in DNA kompleksne narave.

AdoMet vezavna domena veže na kofaktor. Sestavljena je iz dveh poddomen: ena za vezavo AdoMet in druga za vezavo na prejemnika metilne skupine. AdoMet ima najpomembnejši motiv I. Na osnovi aktivnosti AdoMet vezavne in katalitične domene delimo metiltransferaze R/M sistema na: eksociklične amino MTaze (N6 adenin MTaza in N4 citozin MTaza) in endociklične MTaze (N5 citozin MTaze).

== C5 metilacija ==

Mehanizem C5 je bil raziskan med prvimi. Posebej dobro preučen je na primeru endonukleaze/metiltransferaze HhaI. Začne se z nukleofilnim napadom C6 atoma v citozinu s tiolno skupino cisteina v Motivu IV. Tvori se kovalentna vez in poveže encim in substrat v kompleks. N3 (na citozinu) se protonira s pomočjo protona, ki ga donira nek kisli aminokislinski ostanek, v primeru HhaI je to glutaminsko kislinski ostanek (E119). To olajša nukleofilni napad. Podre se klasična vezava vodikovih vezi med baznim parom, v katerega je citozin vključen. Hkrati pa se tvorijo vodikove vezi med sedaj glutamatnim ostankom in vodikovim atomom na N4 ter argininom (R165) in kisikom na 2. mestu baznega obroča. Te stabilizirajo položaj baze v katalitičnem mestu. Po potečenem nukleoilnem napadu se sedaj zgodi elektrofilen napad na meso C5, kjer AdoMed svojo metilno skupino, nastane pa AdoHyc. Za zaključek se z napadom baze (najverjetneje vode) odstrani odvečni proton na C5. Prekine pa se tudi C6-S vez preko β eliminacije.

Posebnost tega mehanizma je dejstvo, da se zaradi vezave tiolne skupine in C6 atoma celotna baza deformira iz ravnine in zato nima prostora v dvojni vijačnici. To nakazuje na lokacijo katalize reakcije izven dvojne vijačnice.

== Eksociklične metil transferaze ==

Mehanizem s katerim se prenese metilna skupina na enega od dušikov vezanih na cikle baz dosti manj raziskana, vendar obstaja dokaj verjetna teorija o poteku reakcije.
Nekatere študije so dokazale, da se prenos metilne skupine dogodi direkno na N6 atomu (M.EcoRI), kar potrjuje, da ne mora obstajati nikakršnih intermediatov, kjer bi se prenašala metilna skupina iz enega dušika na drugega. Tako je najbolj splošna razlaga mehanizma, da se dogodi direkten prenos metilne skupine po SN2 reakcijskem mehanizmu z inverzijo simetrije. Podrobnejši vpogled nam pokaže, da pa se vseeno ustvari intermediat ob prenosu skupine, preden se lahko odcepi proton. Nastane torej N6-metilamonij adeninski kation, ki ga mora katalitsko mesto stabilizirati, da lahko reakcija steče do konca. S pomočjo reševanja M.TaqI struktur v kompleksu z AdoMet, je bilo dognano, da v napadu dušika na 6. mestu sodeluje dušik, kot donor vodikove vezi na aspargin v motivu IV in tudi na kisik skeleta verige med dvema prolinoma v motivu IV. Dušik se delno negativno nabije in ima tako možnost napasti metilno skupino na AdoMet. Nastali N6- metil amonijev intermediat se na koncu deprotonira. To pa privede do končnega produkta N6 -metiliranega adenina.

Nekaj je tudi predpostavljenih modelov za N4 metil transferaze. Predvsem za M.PvuII. Domneva je da se vzpostavijo vodikove vezi med N4 atomom in Ser53 ter Pro54. Hkrati pa je možnost tvorbe van der Waalsovih vezi s Phe56 ostankom (vsi se nahajajo v motivu IV). Aktivacija takega dušika bi lahko potekala po slednjem modelu.
Asp96 se poveže z vodikovo vezjo na Ser53. Aktivira se hidroksilna skupina Ser 53 in prenese se proton s citozina preko serina na aspartatno kislinski ostanek. Prenos metilne skupine se dogodi istočasno z deprotonacijo N4. Končno protoniran asp96 tvori vez z N3 na citozinu.

== Obračanje baz ==

Pri vseh metil transferazah, je potreba po premestitvi baze, ki se metilira, velika. Razlogi so predvsem sterične narave. Pri C5 metilaciji npr. je to nastanek intermediatov, ki nimajo prostora v klasični B-obliki DNA vijačnice. Tako je bila že prav pri modelu kompleksa HhaI z AdoMet odkrita oblika, kjer je baza, ki je namenjena metilaciji, rotirana iz osi dvojne vijačnice za 180°. Ta baza je tako segala iz malega žleba DNA v katalitično domeno encima. Ista potreba po rotaciji baz se je pokazala pri vseh ostalih vrstah metilaz.

Osrednjo vlogo v sprostitvi baze iz DNA ima TRD. M.TaqI modeli so pokazali, da se ob vezavi struktura vijačnice močno deformira. Razmakne se mali žleb za približno 3 °A, stisne se ogrodje in timin se pomakne bolj proti centru vijačnice. To je posledica interakcij med skoraj vsemi baznimi pari prepoznavne sekvence DNA, razen timidina, ki je par metiliranemu adeninu. Vse to pripomore prekinitvi van der Waalsovih vezi med tem parom in izpostavitvi adenina.

== Metiltransferaze restrikcijsko-modifikacijskih sistemov (R/M sistemi) ==

Večina bakterijskih DNA metiltransferaz (MTaz) je sklopljenih z restrikcijskim encimom. Skupaj tvorita R/M sisteme, ki ščitijo bakterije pred tujo DNA. MTaza modificira bakterijsko DNA in jo s tem zaščiti pred vezavo restriktaze. Ob vstopu virusne DNA v celico restriktaza nanjo lahko deluje, saj ni modificirana z metilnimi skupinami.

R/M sistemi se razdelijo v 4 skupine. Sistem IV dejansko ni pravi RM sistem, saj ne vsebuje MTaze.

Najenostavnejši in tudi najštevilčnejši je '''sistem II''', zanj je značilno, da sta MTaza in restriktaza ločena encima, ki delujeta neodvisno eden od drugega. Prepoznata enako signalno zaporedje na DNA. Večina MTaz sistema II je monomernih proteinov, sestavljenih iz katalitične domene z vezanim AdoMet in TRD domeno. Večinoma prepoznajo kratka palindromska zaporedja na DNA, v dolžini nekje med 2 in 8 nukleotidov. Včasih je prepoznavno zaporedje prekinjeno z nekaj vmesnimi nukleotidi, tako da encim prepozna kratek palindromski odsek, sledi nekaj nesimetričnih nukleotidov in nato spet kratek prepoznavni palindromski odsek. MTaze podsistema IIs prepoznajo nesimetrično zaporedje, zato sta za modifikacijo obeh verig DNA potrebni dve MTazi.

'''Sistem I''' je najbolj kompleksen. MTaza in restriktaza sta skupaj s še eno podenoto povezani v heterotrimer. M podenota je odgovorna za metilacijo, R podenota je restriktaza, S podenota pa omogoča vezavo na DNA (vsebuje TRD domeno). Načeloma so vse tri podenote povezane v kompleks, ampak M in S podenota skupaj lahko delujeta neodvisno od R podenote. Vsako podenoto zapisuje svoj gen. Gena za podenoti S in M regulira skupni promotor, medtem ima gen za restriktazo svoj promotor, kar omogoča ločeno regulacijo izražanja. Prepoznavno mesto na DNA je sestavljeno iz dveh krajših asimetričnih zaporedij (3-5 nukleotidov), ki sta ločeni z nekaj vmesnimi nukleotidi. Na vsaki verigi DNA se metilira po en adenin.

'''R/M sistem III''' je najmanj raziskana skupina. Podenoti MTaze in restriktaza sestavljata heterodimerni kompleks, za razliko od sistema I pa zraven nimata podenote S. TRD domena se nahaja na obeh ostalih podenotah. Prepoznavno zaporedje je sestavljeno iz 5-6 asimetričnih nukleotidov. Za razliko od preostalih skupin, se metilacija pojavi le na eni verigi DNA, kar pa še vedno omogoča zaščito pred restriktazo.

Hemimetilirana DNA je v vseh primerih zaščitena pred restriktazami, a se v večini primerov metilira tudi na drugi verigi. To je ključnega pomena pri podvojevanju DNA, ko nastaneta 2 hčerinski DNA, ki vsebujeta po eno na novo nastalo verigo in eno verigo iz starševske DNA. Le slednja je metilirana. Če modifikacija na eni sami verigi ne bi bila zadostna zaščita, bi restriktaze prej ali slej razrezale lastne kromosome.

== Regulacija R/M sistemov ==

1. MTaza se lahko veže na promotor gena za MTazo. S tem prepreči vezavo RNA-polimeraze in prepreči prepisovanje genov.

2. Nekatere MTaze prepoznajo zaporedje, ki je del promotorja za gen MTaze. Metilacija deluje kot represor in gen za MTazo se ne more prepisovati. 1. in 2. način omogočata, da se izražanje MTaze zmanjša, ko je te v celici dovolj. S tem se prepreči, da v primeru pojava virusne DNA restriktaza deluje prej kot MTaza.

3. V primeru prenosa genov za R/M sistem med bakterijami, se mora v bakteriji, ki je prejela gen, najprej izraziti gen za MTazo, šele nato gen za restriktazo. To omogačajo C-proteini (kontrolni proteini). V celici se najprej začne izražati gen za MTazo. Hkrati se začne prepisovati tudi gen za protein C, ki nato aktivira gen za restriktazo. Zamik v nastanku enega in drugega encima je ravno pravšnji, da lahko MTaza modificira kromosome in jih zaščiti. C-protein je homodimerni protein, ki se na palindromsko zaporedje na DNA veže z motivom vijačnica-zavoj-vijačnica.

BIO2 Povzetki seminarjev 2018

2018-11-24T07:29:40Z

Maks Kumek: /* Maks Kumek: Vloga metabolizma arginina v celični regulaciji in erekcija */

== Biokemija- Povzetki seminarjev 2018/2019 ==
Nazaj na osnovno [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Seminar_2018 stran]

===Karmen Mlinar: Signalizacija in odzivi na abiotski stres pri rastlinah===
Rastline živijo v stalno spreminjajočem se okolju, ki je pogosto neugodno in stresno za njihovo rast in razvoj. Primer abiotskega stresa so suša, ekstremne temperature, slanost tal, pomanjkanje hranil v prsti ipd. Rastline lahko stres preživijo tako, da se mu prilagodijo ali pa izognejo. V nasprotnem primeru so obsojene na smrt. Identificiranih je le malo senzorjev, ki zaznavajo stres. Pri signalizaciji odzivov na stresna okolja pogosto sodeluje družina kinaz SnRK, ki zaznajo spremembe v energijskem statusu rastline, ki jih povzroči stres. Znane so tri poddružine SnRKs: SnRK1s, SnRK2s, ki sodelujejo pri osmotskem stresu in ABA signalizaciji, in SnRK3s, ki so ključni regulatorji ionske homeostaze pri spopadanju s solnim stresom. Pri ionskem stresu pogosto problem predstavlja Na+. Pri njegovi signalizaciji je ključna SOS signalna pot. Signalizacija temperaturnega stresa se začne s spremembami v fluidnosti membrane, kar zaznajo integralni membranski proteini. Pri signalizaciji pogosto sodelujejo tudi MAPKs, CPKs in stresni hormon ABA, pomembno vlogo pa nosijo sekundarni sporočevalci kot sta kalcij in ROS. Vse to stremi k vzpostavitvi ionske in vodne homeostaze ter celične stabilnosti v stresnem okolju. Z razumevanjem signalizacije stresa in odzivov, ki sledijo, bomo lahko izboljšali odpornost pridelkov na stres in s tem zagotovili kmetijsko stabilnost in preskrbo s hrano za rastoče svetovno prebivalstvo.

===Aljaž Bratina: Pomen različnih signalnih poti pri staranju===
Staranje je postopna izguba fiziološke integritete in vodi v prizadeto funkcionalnost ter povečano možnost za smrt. Hitremu staranju nasprotna je dolgoživost, to je stanje, v katerem organizem ne izgublja funkcionalnosti ali jo izgublja počasneje. Staranje lahko opredelimo z devetimi splošnimi lastnostmi, ki jih opazimo v večini organizmov. Pri preučevanju staranja opazujemo organizem C. elegans, ki lahko med razvojem v primeru neugodnih razmer razvije stanje dauer, v katerem je razvoj ustavljen in je tako organizem sposoben preživeti dalj časa. Pri regulaciji staranja in dolgoživosti so pomembne mnoge celične signalne poti, kot del njih pa predvsem jedrni receptorji, ki uravnavajo prepisovanje genov, ki imajo vpliv na hitrost staranja oz. vzdrževanje dolgoživosti. V seminarski nalogi so opisane štiri pomembne signalne poti in njihov vpliv na staranje. Pri prvi je pomemben jedrni receptor DAF-12, ki za svoje delovanje potrebuje steroid DA. Neugodne razmere ga deaktivirajo, kar vodi v razvoj stanja dauer. Na dolgoživost pozitivno vpliva tudi aktiviran kompleks NSBP-1 in jedrnega receptorja DAF-16, ki sta del signalne poti IIS. To pot regulira tudi količina holesterola v celici. Dolgoživost povzročajo tudi prekinitveni post, pri katerem se aktivira jedrni receptor AP-1, pa tudi odstranitev zarodnih celic, ki poleg prej omenjene DAF-12 in DAF-16 aktivira tudi nekatere druge receptorje, npr. NHR-80 in NH3-49.

===Eva Gartner: Wnt signalizacija in njena vloga pri srčni fibrozi===
Wnt signalizacija zajema skupino signalnih poti, ki jih regulirajo wnt proteini. Ti se vežejo na posebne receptorje v membrani celice, preko katerih se signal prenese v notranjost. Wnt signalizacijo sestavljajo tri glavne signalizacijske poti: kanonična wnt pot, ki vključuje protein β-katenin, nekanonična (PCP) pot in nekanonična pot, ki sodeluje pri regulaciji kalcija. Vse poti se začnejo z vezavo wnt-liganda na transmembranske Fz receptorje in prenosom signala do znotrajceličnega proteina Dsh. Od tu naprej se poti razcepijo vsaka v svojo smer. Wnt signalizacija sodeluje v mnogih procesih, potrebnih za normalen razvoj organizma, kot so npr. razmnoževanje, specializacija in migracije celic. Prisotnost regulacije z wnt signalizacijo so odkrili tudi pri srčni fibrozi in z njo povezanih boleznih in poškodbah srca. V zdravih celicah wnt signalizacija navadno ni prisotna. Izraz fibroza se nanaša na povečanje količine zunajceličnega matriksa, zaradi česar postane srčna mišica otrdela in krčenje manj intenzivno. Pride do prekomerne namnožitve fibroblastov in diferenciacije v miofibroblaste, ki so fenotipsko med fibroblasti in mišičnimi celicami. Kljub številnim raziskavam, ki dokazujejo vpletenost wnt signalizacije v razvoju fibroze, natančni mehanizmi vseh signalnih poti še vedno niso znani. Potrebne so še nadaljnje raziskave za razumevanje zapletene celične komunikacije in odkritje novih terapevtskih možnosti.

===Neža Žerjav: Vloga kaspaz pri celični smrti===
Kaspaze so cisteinske peptidaze, ki sodelujejo v signalnih poteh celične smrti. Poznamo več vrst celične smrti, med njii tudi apoptozo, nekrozo, nekroptozo in piroptozo. Vloga kaspaz pri apoptozi je dobro znana, so adapterski proteini ali pa aktivno sodelujejo pri postopni razgradnji celice, saj sprožijo nastajanje apoptotskih veziklov in fagocitozo celice. Nekrozo označujemo kot neprogramirano celično smrt, vendar to za nekroptozo, ki ji pravimo tudi programirana nekroza, ne drži. Slednja je namreč v celici konkurenčna apoptozi, preko kaspaz sta recipročno regulirani. Nekroptozo kaspaze zavirajo, saj inhibirajo kompleks RIPK1/RIPK3, ki z aktivacijo proteina MLKL povzroči razlitje celične vsebine, značilno za nekrozo. Kaspaze sodelujejo tudi pri piroptozi, ki je posledica stresnih dejavnikov iz okolice – poškodb, patogenih organizmov ali njihovih toksinov. Kaspaze pri piroptozi povzročijo aktivacijo gasdermina D, ki sproži celično lizo, in vnetni odziv. Poznavanje delovanja kaspaz nam omogoča tako vpogled v razvoj in mehanizem vzdrževanja homeostaze organizmov, kakor tudi razumevanje patoloških procesov, na primer multiple in amiotrofične lateralne skleroze, ishemične bolezni srca ter vnetnih odzivov zaradi okužb.

===Meta Kodrič: Svetlobne signalne poti za uravnavanje fotomorfogeneze===
Svetloba je za rastline eden od najpomembnejših okoljskih signalov, ki vplivajo na rast in razvoj. V odvisnosti od intenzitete in valovne dolžine svetlobe se pri rastlinah pojavljata dva kontrastna razvojna procesa. Fotomorfogeneza je osnovna oblika rasti, saj rastlinam omogoča razvoj v avtotrofne organizme, sposobne opravljati fotosintezo, skotomorfogeneza pa je le zavrta oblika fotomorfogeneze, ki se odvija v temi. Potek teh dveh procesov rastline uravnavajo pod vplivom svetlobnega signala v svetlobni signalni poti. V njej sodelujejo fotoreceptorji ter pozitivni in negativni regulatorji fotomorfogeneze. V temi se fotoreceptor fitokrom nahaja v biološko neaktivni obliki v citosolu rastlinske celice. Negativni regulatorji se tako lahko v jedru prosto vežejo na druge molekule. Transkripcijski faktorji PIF se v obliki dimerov vežejo na promotorske regije na molekuli DNA in s tem preprečijo prepisovanje genov za fotomorfogenezo. Proteini COP/DET/FUS delujejo kot E3 ligaze pozitivnih regulatorjev HY5, HFR1, LAF1 in tako sodelujejo pri njihovi razgradnji. Z vzajemnim delovanjem tako negativni regulatorji zatirajo potek fotomorfogeneze. Na svetlobi se fitokrom konformacijsko spremeni in preide v jedro. Tam v sodelovanju z drugimi molekulami inhibira negativne regulatorje, bodisi s preprečitvijo njihovega encimskega delovanja, bodisi s sodelovanjem pri njihovi razgradnji. Posledično lahko postanejo aktivni pozitivni regulatorji, ki se vežejo poleg promotorskih regij na DNA in tako aktivirajo prepisovanje genov za fotomorfogenezo.

===Tina Zavodnik: Mehanična transdukcija in proteini Piezo===
Praktično vsi organizmi so občutljivi na mehanske dražljaje. Fizične sile regulirajo številne fiziološke procese, nezadostni oz. napačni odzivi nanje pa lahko vodijo do številnih okvar ali bolezni. Naše zaznavanje teh dražljajev in njihova pretvorba v biokemijske informacije, imenovana tudi mehanotransdukcija, sta torej ključna za dojemanje sveta okoli nas in odzivanje nanj. To nam omogočajo čutila, navadno sestavljena iz čutilne celice ali receptorja in senzoričnega nevrona. Zaradi obstoja mnogo različnih vrst in intenzitet dražljajev so se tudi čutnice in senzorični nevroni specializirali v zaznavanje vsakega od stimulusov. Merklovi živčni končiči so mehanski receptorji, sposobni zaznavati nežen pritisk na koži. To pa jim omogočajo posebni ionski kanalčki, imenovani proteini Piezo. Nežen dotik na površini kože sproži prenos mehaničnega dražljaja do Merklovih živčnih končičev, kjer se aktivira kanalček Piezo2 v Merklovi celici. Aktivacija kanalčka omogoči prehod kalcijevih in natrijevih ionov v notranjost celice. Merklova celica se depolarizira in sproži akcijski potencial v pripadajočem aferentnem nevronu. Mehanični dražljaj pa aktivira tudi kanalčke Piezo2 v membrani SA1 aferentnega nevrona in s tem sproži dodatno vzpostavitev akcijskega potenciala. Pred kratkim je bila odkrita struktura proteina Piezo, kar pa še vedno ne razkriva natančnega mehanizma aktivacije ionskega kanalčka zaradi mehanskega dražljaja. Najverjetneje se zaradi mehanskega dražljaja spremeni konformacija proteina Piezo. Kanalček se odpre in ioni lahko pod vplivom koncentracijskega gradienta prehajajo skozi membrano.

===Doroteja Armič: Bifunkcionalen encim PFK-2/FBPaza-2 in njegova vloga v metabolizmu glukoze===
PFK-2/FBPaza-2 (fosfofruktokinaza-2/fruktoza-2,6-bisfosfataza) je eden izmed encimov, ki sodelujejo pri regulaciji metabolizma glukoze v evkariontih. Je bifunkcionalen encim, ki uravnava, ali bo v celici potekala glikoliza ali glukoneogeneza. Za to je odgovoren posredno, saj regulira količino alosteričnega efektorja encimov PFK-1 in FBPaza-1 – fruktoze-2,6-bisfosfata. En encim ima dve katalitični domeni. Kinazna domena katalizira sintezo, bisfosfatazna domena pa razgradnjo fruktoze-2,6-bisfosfata. Delovanje encima je regulirano na nivoju posttranslacijske modifikacije, in sicer s fosforilacijo/defosforilacijo. Pri sesalcih obstajajo štirje različni izocimi, vsakega kodira drug gen. Ti izocimi so jetrni, srčni, možganski in izocim testisov. Vsak izocim pa ima več izooblik, ki nastanejo z alternativnim spajanjem eksonov. Izooblike se razlikujejo v regulatornih regijah. Fosforilirajo in defosforilirajo jih drugačne kinaze, nekatere izooblike pa fosforilacijskih mest sploh nimajo. Encim PFK-2/FBPaza-2 je nastal s fuzijo dveh genov. Encim se je razvil tako, da je funkcionalen samo, če sta prisotni obe domeni. Tudi pri tripanosomatidih in kvasovkah, kjer je encim monofunkcionalen, je zato še vedno zapis za obe domeni. V razvoju je prišlo do različnih izooblik v različnih tkivih oziroma organizmih zaradi drugačnih potreb za metabolizem glukoze. Ker PFK-2/FBPaza uravnava glikolizo in glukoneogenezo, bi lahko tarčno reguliranje encima postalo nov način zdravljenja diabetesa.

===Martina Lokar: Biotinilacija proteinov ===
Biotin je pomemben encimski kofaktor, saj olajša prenos karboksilne skupine med metaboliti pri karboksilaciji, dekarboksilaciji in transkarboksilaciji. Biotin protein ligaza (BPL) ga v procesu biotinilacije veže na tarčni biotin-odvisen encim. Biotinilacija je dvostopenjski proces, pri katerem pride v prvem koraku do ligacije biotina in ATP ter nastanka intermediata biotinil-AMP. V drugem koraku se biotin iz biotinil-AMP veže na tarčni encim in pride do sprostitve molekule AMP. Ker je biotin v naravi redek, organizmi natančno uravnavajo njegovo porabo. Evkarionti so nezmožni sami sintetizirati biotin, zato ga pridobivajo iz okolja. Zadostno količino ohranjajo v biotinskem ciklu z reciklacijo biotina iz biotin-odvisnih encimov. Pri metaboličnih procesih sesalcev sodeluje pet biotin-odvisnih karboksilaz, ki so v splošnem zgrajene iz treh domen: domene BC, domene CT in domene BCCD. Biotin je kovalentno vezan na lizinski ostanek v domeni BCCD in se preko modela zibajoče roke ali modela zibajoče domene med katalizo translocira iz domene BC v domeno CT. Karboksilaze katalizirajo reakcijo prenosa karboksilne skupine na substrat v dveh korakih. Najprej se v domeni BC karboksilna skupina veže na biotin. Slednji se nato premakne v domeno CT, kjer se karboksilna skupina iz biotina prenese na substrat. Če telo ni sposobno uravnavati in izkoriščati zaloge biotina, človek oboli za boleznijo MCD.

===Lara Drinovec: AMPK in avtofagija pri glukoznem/glikogenem metabolizmu===
Glukozni/glikogeni metabolizem je primarna metabolična pot, ki je uravnavana na najrazličnejših nivojih, glede na potrebe celice. Znano je, da raven glukoze v krvi uravnavata dva hormona: inzulin, ki omogoča prevzem glukoze v celico in glukagon z nasprotno učinkovitostjo. Metabolni regulator, ki deluje od inzulina neodvisno in se odziva na krčenje mišic, je AMPK (AMP-aktivirana protein kinaza). Aktivira jo lahko AMP, tako da se veže na vezavno mesto na eni izmed treh podenot AMPK. Spremembo koncentracije AMP lahko AMPK zazna hitreje kot spremembo koncentracije ATP. Aktivirana AMPK inhibira anabolne poti in aktivira katabolne procese, ter tako vzdržuje energijsko homoestazo v aktivnih celicah. Pomembno vlogo pri vzdrževanju nivoja glukoze v celici igra tudi avtofagija, ki povzroči razgradnjo hranilnih snovi, kot so glikogen in lipidne kapljice, s tem zagotovi celici zadostno količino glukoze, in tako deluje kot nadomesten proces za glukoneogenezo. Tudi ta proces je v celicah uravnavan, in sicer z različnimi signalnimi molekulami. Mnogo bolezni, kot sta na primer diabetes in rak, sta tesno povezani z nefunkcionalnostjo nekaterih metaboličnih senzorjev ali avtofagije, zato je razumevanje njihovih funkcionalnih interakcij osnova za nove terapevtske možnosti.

=== Tina Kolenc Milavec: Intermediati Krebsovega cikla kot signalne molekule pri vnetnem in protivnetnem odgovoru===
Intermediati Krebsovega cikla imajo v celici pomembno vlogo, saj ne služijo le kot vmesni produkti v procesu nastanka molekul ATP, temveč tudi kot prekurzorji za sintezo drugih biološko pomembnih molekul ter kot signalne molekule v številnih metaboličnih poteh. Ko se na tolične receptorje (TLR4) na površini makrofaga vežejo s patogeni povezani molekulski vzorci, pride v celici do preklopa metabolizma z oksidativne fosforilacije na glikolizo za namene pridobivanja energije v obliki ATP, kar neposredno vpliva na vnetno stanje v celici. Krebsov cikel, ki sedaj nima več vloge zagotavljanja energije celici, se prekine na dveh mestih: za sukcinatom ter pri izocitrat dehidrogenazi, kar omogoči, da intermediati citratnega cikla delujejo kot signalne molekule. Pri vnetnem odzivu organizma na patogene sta zelo pomembna sukcinat in citrat. Prvi povzroči povišanje koncentracije Hif1α v celici ter nastanek reaktivnih kisikovih spojin (ROS) zaradi vzvratnega elektronskega transporta, citrat pa deluje kot substrat za verigo reakcij, ki prav tako vodijo do nastanka ROS. Pri ponovni vzpostavitvi normalnih razmer v celici po uspešni odstranitvi patogenov pa ima pomembno vlogo itakonat - molekula, ki nastane iz cis-akonitata. Ta vpliva na tri pomembne molekule (sukcinat dehidrogenazo, Nrf2 ter ATF3), ki sprožijo vsaka svojo kaskado reakcij protivnetnega odgovora.

===Valeriya Musina: Vpliv intermediatov Krebsovega cikla na celične procese===
Krebsov cikel je bil oblikovan osedemdeset let nazaj, vloge njegovih inermediatov, zlasti sukcinata in fumarata, pa so bile odkrite nedavno. V zadnjem času so bile narejene številne raziskave človeških bolezni, zlasti niza specifičnih vrst raka, ki so razkrile pomembne vloge intermediatov Krebsovega cikla pri metilaciji genov in s tem pri preoblikovanju celic. Intermediati Krebsovega cikla lahko delujejo kot primarni substrati, signalne molekule ali sodelujejo pri posttranslacijskih modifikacijah. Vedno več dokazov kaže, da ima epigenetika pomembno vlogo pri regulaciji dobe zdravja, in je vključena v proces staranja. 2-oksoglutarat (α-ketoglutarat) je ključni metabolit v Krebsovem ciklu, vendar je tudi obvezen substrat za 2-oksoglutarat odvisne dioksigenaze (2-OGDO). Družina encimov 2-OGDO vključuje glavne encime za demetilacijo DNA in histonov, encime Ten-Eleven translocation (TETs) in encime z domeno Jumonji C (JmjC). Poleg tega lahko člani družine 2-OGDO regulirajo sintezo kolagena in odzive na hipoksično okolje tudi na neepigenetski način. 2-oksoglutarat je substrat 2-oksoglutarat dehidrogenaz (2-OGDH), zato lahko motnje v funkciji 2-OGDH v Krebsovem ciklu povzročijo globalne degenerativne spremembe v strukturi kromatina. Sukcinat in fumarat močna inhibitorja 2-OGDO encimov, zato ravnotežje reakcij v Krebsovem ciklu lahko vpliva na raven metilacije DNA in histonov ter tako nadzira izražanje genov.

===Marko Pavleković: Vloga sukcinata kot ligand z G proteini vezanega receptorja GPR91===
Znano je, da je cikel citronske kisline osrednjega pomena za presnovo celic in energetsko homeostazo. Vendar marsikateri intermediat cikla igra vlogo tudi v drugih procesih v telesu. Na primer sukcinat deluje kot ekstracelularni ligand z vezavo na z G proteinom vezan receptor, znan kot GPR91, izražen v ledvicah, jetrih, srcu, retinalnih celicah in morda v številnih drugih tkivih, kar vodi do širokega nabora fizioloških in patoloških učinkov. V normalnih pogojih se sukcinata ne sintetizira dovolj, da bi lahko aktiviral GPR91, šele v pogojih kot so ishemija, diabetes in hipoksija, sukcinata nastane dovolj. Ker pa sukcinat nastaja v matriksu mitohondrija mora na poti do receptorja, ki se nahaja na zunanji strani celic, prečkati še tri membrane. Skozi GPR91 je sukcinat vključen v funkcije, kot so uravnavanje krvnega tlaka, zaviranje lipolize v belem maščobnem tkivu, razvoj vaskularizacije mrežnice, srčna hipertrofija in aktivacija zvezdastih jetrnih celic z ishemičnimi hepatociti. Zaradi tega je sukcinatni receptor obetajoč cilj za zdravila za preprečevanje teh neželenih patoloških učinkov. Nedavni razvoj antagonistov, specifičnih za SUCNR1, odpira nove možnosti za raziskave v modelih za te motnje in lahko sčasoma zagotovi nove možnosti za zdravljenje bolnikov.

===Klementina Polanec: Sirtuini kot regulatorji oksidacije maščobnih kislin===
Sirtuini so družina visoko ohranjenih proteinov (SIRT1-SIRT7 pri sesalcih), ki imajo regulatorno vlogo v metabolizmu in staranju. Delujejo kot regulatorji oksidacije maščobnih kislin v odgovor na številne strese za celico, kot so omejitev kalorij, postenje, mraz. Ker se zniža nivo ATP v celici in je glukoze premalo, se poveča razgradnja glikogena, hkrati pa se pospeši oksidacija maščobnih kislin v mišicah in jetrih. Do nedavnega je veljajo prepričanje, da je aktivnost sirtuinov odvisna le od koncentracije NAD+ v celici. Raziskovalci so pred kratkim dokazali, da se lahko SIRT1 aktivira tudi s fosforilacijo, ki jo izvede protein kinaza A (PKA). Ko so sirtuini aktivirani, delujejo v glavnem kot deacetilaze številnih encimov, s čimer jih aktivirajo. SIRT1 tako deacetilira PGC1α, ki pospeši izražanje tarčnih genov, ki so povezani z oksidacijo maščobnih kislin. SIRT3 pa odvisno od koncentracije NAD+ deacetilira in s tem aktivira LCAD (long-chain acyl-CoA dehydrogenase). To je pri miših ključen encim, ki sodeluje v oksidaciji dolgoverižnih maščobnih kislin. S pospešeno oksidacijo celica dvigne nivo ATP in ponovno vzpostavi homeostazo. Sirtuini so zato lahko potencialna tarča za zdravljenje motenj v oksidaciji maščobnih kislin ter tudi za preprečevanje prekomerne teže oziroma debelosti.

===Tadej Medved: Vpliv oksidacije maščobnih kislin na usodo celic===
Usodo celic, tj. končne lastnosti, ki jih bo celica izražala po razvoju in diferenciaciji, določajo številni procesi. Mednje spada tudi metabolična β-oksidacija maščobnih kislin. Izkaže se, da je količina acetil-CoA, pridobljena preko oksidacije maščobnih kislin, pogosto odločilni dejavnik za izražanje lastnosti določenih tipov celic; do sedaj je bil ta vpliv raziskan v endotelijskih celicah limfnih žil in srca ter v limfocitih T. Ključna regulacija oksidacije MK se prične pri izražanju encima CPT1, ki omogoča transport maščobnih kislin v mitohondrij. V srčnem endoteliju vpliva ta proces na pretvorbo endotelijskih celic v mezenhimske, in sicer zaradi TGF-β signalizacije, ki z inhibicijo metabolizma MK sproži spremembe celičnih lastnosti v mezenhimske. V endoteliju limfnih žil je oksidacija MK pomembna za vršenje limfangiogeneze, tj. tvorbe novih limfnih žil s proliferacijo in diferenciacijo obstoječih limfnih endotelijskih celic. Ta proces je odvisen od signalov VEGF-C in PROX1; slednji poveča izražanje CPT1 in pripravi celico do migracije in proliferacije. Količina acetil-CoA je relevanten dejavnik za diferenciacijo in dolgoživost spominskih T celic, povezana pa je preko aktivacije AMPK s signalno molekulo TRAF6. V T celicah na sploh pa močno učinkuje PD-1, ki pospeši tako hidrolizo MK kot tudi njihovo oksidacijo in omogoča preživetje teh celic v pogojih, kjer niso sposobne sprejemanja drugih hranilnih snovi, kot je glukoza.

===Rebeka Dajčman: Metabolizen, signalizacija in farmakološka funkcija ketonskih teles===
ketonska telesa nastanejo kot stranski produk pri presnovi maščobnih kislin. mednje sodijo acetoacetat, aceton in najobstojnejši beta hidroksibutirat. njihova sinteza se poveča, ko telesu primanjkuje ogljikovih hidratov. to je med stradanjem, po športni aktivnosti, med nosečnostjo ali med ketonsko dieto. v seminarski nalogi bom predstavila metabolično bot ketonskih teles. od sinteze v jetrih do njihovega transporta v ostala tkiva. to so predvsem skeletne mišice, srce in možgani ter njihovo oksidacijo nazaj v acetil-CoA. sinteza ketonskih teles je regulirana s transkripcijsko in post-translacijsko regulacijo. pri tem gre predvsem za regulacijo encimov, ki sodelujejo v sintezi in razgradnji teles. ketonska telesa pa imajo vlogo regulacije dveh membranskih receptorje ali histonske deacetilaze. ketonska telesa se že desetletja uporabljajo v zdravljenju nevrodegenerativnih bolezni in v tej smeri tudi tečejo prihodnje raziskave

===Sumeja Kudelić: Transsulfuracijska pot kot obrambni mehanizem celic pri oksidativnem stresu===
Transsulfuracijska pot, kot novo raziskovalno področje nam podarja veliko pozitivnih načinov v boju proti oksidativnemu stresu. Oksidativni stres, kot negativni dejavnik celic s svojimi reaktivnimi kisikovim zvrsti, poškoduje različne celične organele, kar vodi do celične smrti. Pri transsulfuraciji poti je ugotovljeno, da bistveni pomen ima cistein y-liaza, ki je biosintetični encim cisteina. Pri razgradnji cisteina lahko pridobimo vodikov sulfid (H2S), ki je v zelo majhnih koncentracijah pomemben signalizator celice. Več mehanizmov pozitivnega delovanja transsulfuracije poti (posredne ali neposredne) je raziskano, te so prišli do rezultatov, ki bi lahko pomagali pri izboljšanem terapevtskem zdravljenju nevrodegenerativnih bolezni, ki so povezane z metabolizmom aminokislin. Važno je iztakniti, da s pomočjo tega mehanizma ali z njeno inhibicijo bi tudi vplivali na bakterijsko smrt. Saj se pri bakterijah razvila obrambna stimulacija transsulfuracijske poti, pri čemer so bakterije postale 'imune' na antibiotike. Vodikov sulfid kot pomemben dejavnik transsulfuracijske poti vpliva na to, da veže proste ione, ki bi lahko v oksidativnih pogojih (H2O2) reagirali s to spojino. Kot posledica reakcije nastanejo prosti kisikovi radikali, ki poškodujejo celične organele. Nevrodegenerativne bolezni uporabljajo transsulfuracijsko pot kod pomemben vir aminokislin in tudi s tem preprečujejo, da so njihove celice izpostavljene oksidativnemu stresu.

===Matija Ruparčič: Ureaze in njihova vloga v živih bitjih===
Ureaze so metaloencimi, ki katalizirajo hidrolizo uree oziroma sečnine. Pri tem nastaneta dve molekuli amoniaka ter ena molekula ogljikovega dioksida. Najdemo jih v veliko organizmih kot so rastline, glive in bakterije. Le živali jih nimajo, saj se pri njih sečnina tvori kot odpadni produkt. Strukturno se razlikujejo glede na vrsto organizma, zapis za njihove sestavne dele pa se skriva v velikem številu genov. Za organizme, ki jih vsebujejo, predstavljajo ključen faktor za življenje. S pomočjo njih lahko bakterije ''Helicobacter pylori'' preživijo v ekstremno kislih razmerah želodca, bakterijam ''Proteus mirabilis'' omogočajo tvorbo zaščitnih biofilmov, rastlinam pa zagotavljajo bogat vir dušika in jim pomagajo pri katabolizmu arginina. Pred kratkim pa so odkrili, da imajo poleg tega ureaze še druge naloge, ki niso povezane z njihovo katalitično sposobnostjo. Med te štejemo vlogo medcelične komunikacije pri lišajih, obramba pred oksidativnim stresom kot odgovor imunskega sistema in še veliko več. Poznamo jih sicer že skoraj 150 let, vendar o njih vemo še vedno relativno malo. Motivacija za njihovo preučevanje pa je velika, saj nam lahko pomagajo k napredkom na raznih področjih kot sta medicina in agronomija.
===Maks Kumek: Vloga metabolizma arginina v celični regulaciji in erekcija===
Izmed vseh intermediatov ureinega ciklusa je pravzagotovo arginin najbolj prepleten v razne regulacijske sisteme celice. Metabolične poti arginina so kompleksne in se mnogokrat prepletajo med seboj. Sinteza arginina poteka v različnih predelih telesa v ti. črevesno renalni osi. Pretvorba glutamina vse do citrulina poteka v celicah tankega črevesja. Citrulin se izloči v krvni obtok in potuje do ledvic, kjer se nadaljnjo sintetizira do argenina. Regulacija nastajanja produktov je tesno povezana z transportnimi regulatorji družine SLC7 ( CAT 1, CAT-2A, y+LAT, b0,+, CAT-2B) . Regulacija transporterjev ne poteka le na transkripcijskem nivoju temveč tudi na posttranslacijskem nivoju (npr. spermin). Kompleksnost s poglabljanjem le narašča.Vrste encimov, pri katerih igra arginin vlogo substrata so: arginaza, NOS (ang. nitric oxide synthase), arginin dekarboksilaza (ADC), arginin:glicil amidinotransferaza. Posebno pomembnost ima NOS,ki so trije izocimi: iNOS, nNOS, eNOS. Ti trije encimi so prostorsko in regulacijsko ločeni med seboj, vendar pa je moč tudi pri njih zapaziti prepletanje delovanja v procesu, kot je erekcija.Razumevanje vloge metaboličnih produktov arginina v celic pomaga razumeti širšo sliko imunološkega odziva, preprečevanje bolezenskih stanj (npr. impotence) in konec koncev pomaga tudi pri razumevanju lastnega telesa.

BIO2 Povzetki seminarjev 2018

2018-11-24T07:28:57Z

Maks Kumek: /* Maks Kumek: Vloga metabolizma arginina v celični regulaciji in erekcija */

== Biokemija- Povzetki seminarjev 2018/2019 ==
Nazaj na osnovno [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Seminar_2018 stran]

===Karmen Mlinar: Signalizacija in odzivi na abiotski stres pri rastlinah===
Rastline živijo v stalno spreminjajočem se okolju, ki je pogosto neugodno in stresno za njihovo rast in razvoj. Primer abiotskega stresa so suša, ekstremne temperature, slanost tal, pomanjkanje hranil v prsti ipd. Rastline lahko stres preživijo tako, da se mu prilagodijo ali pa izognejo. V nasprotnem primeru so obsojene na smrt. Identificiranih je le malo senzorjev, ki zaznavajo stres. Pri signalizaciji odzivov na stresna okolja pogosto sodeluje družina kinaz SnRK, ki zaznajo spremembe v energijskem statusu rastline, ki jih povzroči stres. Znane so tri poddružine SnRKs: SnRK1s, SnRK2s, ki sodelujejo pri osmotskem stresu in ABA signalizaciji, in SnRK3s, ki so ključni regulatorji ionske homeostaze pri spopadanju s solnim stresom. Pri ionskem stresu pogosto problem predstavlja Na+. Pri njegovi signalizaciji je ključna SOS signalna pot. Signalizacija temperaturnega stresa se začne s spremembami v fluidnosti membrane, kar zaznajo integralni membranski proteini. Pri signalizaciji pogosto sodelujejo tudi MAPKs, CPKs in stresni hormon ABA, pomembno vlogo pa nosijo sekundarni sporočevalci kot sta kalcij in ROS. Vse to stremi k vzpostavitvi ionske in vodne homeostaze ter celične stabilnosti v stresnem okolju. Z razumevanjem signalizacije stresa in odzivov, ki sledijo, bomo lahko izboljšali odpornost pridelkov na stres in s tem zagotovili kmetijsko stabilnost in preskrbo s hrano za rastoče svetovno prebivalstvo.

===Aljaž Bratina: Pomen različnih signalnih poti pri staranju===
Staranje je postopna izguba fiziološke integritete in vodi v prizadeto funkcionalnost ter povečano možnost za smrt. Hitremu staranju nasprotna je dolgoživost, to je stanje, v katerem organizem ne izgublja funkcionalnosti ali jo izgublja počasneje. Staranje lahko opredelimo z devetimi splošnimi lastnostmi, ki jih opazimo v večini organizmov. Pri preučevanju staranja opazujemo organizem C. elegans, ki lahko med razvojem v primeru neugodnih razmer razvije stanje dauer, v katerem je razvoj ustavljen in je tako organizem sposoben preživeti dalj časa. Pri regulaciji staranja in dolgoživosti so pomembne mnoge celične signalne poti, kot del njih pa predvsem jedrni receptorji, ki uravnavajo prepisovanje genov, ki imajo vpliv na hitrost staranja oz. vzdrževanje dolgoživosti. V seminarski nalogi so opisane štiri pomembne signalne poti in njihov vpliv na staranje. Pri prvi je pomemben jedrni receptor DAF-12, ki za svoje delovanje potrebuje steroid DA. Neugodne razmere ga deaktivirajo, kar vodi v razvoj stanja dauer. Na dolgoživost pozitivno vpliva tudi aktiviran kompleks NSBP-1 in jedrnega receptorja DAF-16, ki sta del signalne poti IIS. To pot regulira tudi količina holesterola v celici. Dolgoživost povzročajo tudi prekinitveni post, pri katerem se aktivira jedrni receptor AP-1, pa tudi odstranitev zarodnih celic, ki poleg prej omenjene DAF-12 in DAF-16 aktivira tudi nekatere druge receptorje, npr. NHR-80 in NH3-49.

===Eva Gartner: Wnt signalizacija in njena vloga pri srčni fibrozi===
Wnt signalizacija zajema skupino signalnih poti, ki jih regulirajo wnt proteini. Ti se vežejo na posebne receptorje v membrani celice, preko katerih se signal prenese v notranjost. Wnt signalizacijo sestavljajo tri glavne signalizacijske poti: kanonična wnt pot, ki vključuje protein β-katenin, nekanonična (PCP) pot in nekanonična pot, ki sodeluje pri regulaciji kalcija. Vse poti se začnejo z vezavo wnt-liganda na transmembranske Fz receptorje in prenosom signala do znotrajceličnega proteina Dsh. Od tu naprej se poti razcepijo vsaka v svojo smer. Wnt signalizacija sodeluje v mnogih procesih, potrebnih za normalen razvoj organizma, kot so npr. razmnoževanje, specializacija in migracije celic. Prisotnost regulacije z wnt signalizacijo so odkrili tudi pri srčni fibrozi in z njo povezanih boleznih in poškodbah srca. V zdravih celicah wnt signalizacija navadno ni prisotna. Izraz fibroza se nanaša na povečanje količine zunajceličnega matriksa, zaradi česar postane srčna mišica otrdela in krčenje manj intenzivno. Pride do prekomerne namnožitve fibroblastov in diferenciacije v miofibroblaste, ki so fenotipsko med fibroblasti in mišičnimi celicami. Kljub številnim raziskavam, ki dokazujejo vpletenost wnt signalizacije v razvoju fibroze, natančni mehanizmi vseh signalnih poti še vedno niso znani. Potrebne so še nadaljnje raziskave za razumevanje zapletene celične komunikacije in odkritje novih terapevtskih možnosti.

===Neža Žerjav: Vloga kaspaz pri celični smrti===
Kaspaze so cisteinske peptidaze, ki sodelujejo v signalnih poteh celične smrti. Poznamo več vrst celične smrti, med njii tudi apoptozo, nekrozo, nekroptozo in piroptozo. Vloga kaspaz pri apoptozi je dobro znana, so adapterski proteini ali pa aktivno sodelujejo pri postopni razgradnji celice, saj sprožijo nastajanje apoptotskih veziklov in fagocitozo celice. Nekrozo označujemo kot neprogramirano celično smrt, vendar to za nekroptozo, ki ji pravimo tudi programirana nekroza, ne drži. Slednja je namreč v celici konkurenčna apoptozi, preko kaspaz sta recipročno regulirani. Nekroptozo kaspaze zavirajo, saj inhibirajo kompleks RIPK1/RIPK3, ki z aktivacijo proteina MLKL povzroči razlitje celične vsebine, značilno za nekrozo. Kaspaze sodelujejo tudi pri piroptozi, ki je posledica stresnih dejavnikov iz okolice – poškodb, patogenih organizmov ali njihovih toksinov. Kaspaze pri piroptozi povzročijo aktivacijo gasdermina D, ki sproži celično lizo, in vnetni odziv. Poznavanje delovanja kaspaz nam omogoča tako vpogled v razvoj in mehanizem vzdrževanja homeostaze organizmov, kakor tudi razumevanje patoloških procesov, na primer multiple in amiotrofične lateralne skleroze, ishemične bolezni srca ter vnetnih odzivov zaradi okužb.

===Meta Kodrič: Svetlobne signalne poti za uravnavanje fotomorfogeneze===
Svetloba je za rastline eden od najpomembnejših okoljskih signalov, ki vplivajo na rast in razvoj. V odvisnosti od intenzitete in valovne dolžine svetlobe se pri rastlinah pojavljata dva kontrastna razvojna procesa. Fotomorfogeneza je osnovna oblika rasti, saj rastlinam omogoča razvoj v avtotrofne organizme, sposobne opravljati fotosintezo, skotomorfogeneza pa je le zavrta oblika fotomorfogeneze, ki se odvija v temi. Potek teh dveh procesov rastline uravnavajo pod vplivom svetlobnega signala v svetlobni signalni poti. V njej sodelujejo fotoreceptorji ter pozitivni in negativni regulatorji fotomorfogeneze. V temi se fotoreceptor fitokrom nahaja v biološko neaktivni obliki v citosolu rastlinske celice. Negativni regulatorji se tako lahko v jedru prosto vežejo na druge molekule. Transkripcijski faktorji PIF se v obliki dimerov vežejo na promotorske regije na molekuli DNA in s tem preprečijo prepisovanje genov za fotomorfogenezo. Proteini COP/DET/FUS delujejo kot E3 ligaze pozitivnih regulatorjev HY5, HFR1, LAF1 in tako sodelujejo pri njihovi razgradnji. Z vzajemnim delovanjem tako negativni regulatorji zatirajo potek fotomorfogeneze. Na svetlobi se fitokrom konformacijsko spremeni in preide v jedro. Tam v sodelovanju z drugimi molekulami inhibira negativne regulatorje, bodisi s preprečitvijo njihovega encimskega delovanja, bodisi s sodelovanjem pri njihovi razgradnji. Posledično lahko postanejo aktivni pozitivni regulatorji, ki se vežejo poleg promotorskih regij na DNA in tako aktivirajo prepisovanje genov za fotomorfogenezo.

===Tina Zavodnik: Mehanična transdukcija in proteini Piezo===
Praktično vsi organizmi so občutljivi na mehanske dražljaje. Fizične sile regulirajo številne fiziološke procese, nezadostni oz. napačni odzivi nanje pa lahko vodijo do številnih okvar ali bolezni. Naše zaznavanje teh dražljajev in njihova pretvorba v biokemijske informacije, imenovana tudi mehanotransdukcija, sta torej ključna za dojemanje sveta okoli nas in odzivanje nanj. To nam omogočajo čutila, navadno sestavljena iz čutilne celice ali receptorja in senzoričnega nevrona. Zaradi obstoja mnogo različnih vrst in intenzitet dražljajev so se tudi čutnice in senzorični nevroni specializirali v zaznavanje vsakega od stimulusov. Merklovi živčni končiči so mehanski receptorji, sposobni zaznavati nežen pritisk na koži. To pa jim omogočajo posebni ionski kanalčki, imenovani proteini Piezo. Nežen dotik na površini kože sproži prenos mehaničnega dražljaja do Merklovih živčnih končičev, kjer se aktivira kanalček Piezo2 v Merklovi celici. Aktivacija kanalčka omogoči prehod kalcijevih in natrijevih ionov v notranjost celice. Merklova celica se depolarizira in sproži akcijski potencial v pripadajočem aferentnem nevronu. Mehanični dražljaj pa aktivira tudi kanalčke Piezo2 v membrani SA1 aferentnega nevrona in s tem sproži dodatno vzpostavitev akcijskega potenciala. Pred kratkim je bila odkrita struktura proteina Piezo, kar pa še vedno ne razkriva natančnega mehanizma aktivacije ionskega kanalčka zaradi mehanskega dražljaja. Najverjetneje se zaradi mehanskega dražljaja spremeni konformacija proteina Piezo. Kanalček se odpre in ioni lahko pod vplivom koncentracijskega gradienta prehajajo skozi membrano.

===Doroteja Armič: Bifunkcionalen encim PFK-2/FBPaza-2 in njegova vloga v metabolizmu glukoze===
PFK-2/FBPaza-2 (fosfofruktokinaza-2/fruktoza-2,6-bisfosfataza) je eden izmed encimov, ki sodelujejo pri regulaciji metabolizma glukoze v evkariontih. Je bifunkcionalen encim, ki uravnava, ali bo v celici potekala glikoliza ali glukoneogeneza. Za to je odgovoren posredno, saj regulira količino alosteričnega efektorja encimov PFK-1 in FBPaza-1 – fruktoze-2,6-bisfosfata. En encim ima dve katalitični domeni. Kinazna domena katalizira sintezo, bisfosfatazna domena pa razgradnjo fruktoze-2,6-bisfosfata. Delovanje encima je regulirano na nivoju posttranslacijske modifikacije, in sicer s fosforilacijo/defosforilacijo. Pri sesalcih obstajajo štirje različni izocimi, vsakega kodira drug gen. Ti izocimi so jetrni, srčni, možganski in izocim testisov. Vsak izocim pa ima več izooblik, ki nastanejo z alternativnim spajanjem eksonov. Izooblike se razlikujejo v regulatornih regijah. Fosforilirajo in defosforilirajo jih drugačne kinaze, nekatere izooblike pa fosforilacijskih mest sploh nimajo. Encim PFK-2/FBPaza-2 je nastal s fuzijo dveh genov. Encim se je razvil tako, da je funkcionalen samo, če sta prisotni obe domeni. Tudi pri tripanosomatidih in kvasovkah, kjer je encim monofunkcionalen, je zato še vedno zapis za obe domeni. V razvoju je prišlo do različnih izooblik v različnih tkivih oziroma organizmih zaradi drugačnih potreb za metabolizem glukoze. Ker PFK-2/FBPaza uravnava glikolizo in glukoneogenezo, bi lahko tarčno reguliranje encima postalo nov način zdravljenja diabetesa.

===Martina Lokar: Biotinilacija proteinov ===
Biotin je pomemben encimski kofaktor, saj olajša prenos karboksilne skupine med metaboliti pri karboksilaciji, dekarboksilaciji in transkarboksilaciji. Biotin protein ligaza (BPL) ga v procesu biotinilacije veže na tarčni biotin-odvisen encim. Biotinilacija je dvostopenjski proces, pri katerem pride v prvem koraku do ligacije biotina in ATP ter nastanka intermediata biotinil-AMP. V drugem koraku se biotin iz biotinil-AMP veže na tarčni encim in pride do sprostitve molekule AMP. Ker je biotin v naravi redek, organizmi natančno uravnavajo njegovo porabo. Evkarionti so nezmožni sami sintetizirati biotin, zato ga pridobivajo iz okolja. Zadostno količino ohranjajo v biotinskem ciklu z reciklacijo biotina iz biotin-odvisnih encimov. Pri metaboličnih procesih sesalcev sodeluje pet biotin-odvisnih karboksilaz, ki so v splošnem zgrajene iz treh domen: domene BC, domene CT in domene BCCD. Biotin je kovalentno vezan na lizinski ostanek v domeni BCCD in se preko modela zibajoče roke ali modela zibajoče domene med katalizo translocira iz domene BC v domeno CT. Karboksilaze katalizirajo reakcijo prenosa karboksilne skupine na substrat v dveh korakih. Najprej se v domeni BC karboksilna skupina veže na biotin. Slednji se nato premakne v domeno CT, kjer se karboksilna skupina iz biotina prenese na substrat. Če telo ni sposobno uravnavati in izkoriščati zaloge biotina, človek oboli za boleznijo MCD.

===Lara Drinovec: AMPK in avtofagija pri glukoznem/glikogenem metabolizmu===
Glukozni/glikogeni metabolizem je primarna metabolična pot, ki je uravnavana na najrazličnejših nivojih, glede na potrebe celice. Znano je, da raven glukoze v krvi uravnavata dva hormona: inzulin, ki omogoča prevzem glukoze v celico in glukagon z nasprotno učinkovitostjo. Metabolni regulator, ki deluje od inzulina neodvisno in se odziva na krčenje mišic, je AMPK (AMP-aktivirana protein kinaza). Aktivira jo lahko AMP, tako da se veže na vezavno mesto na eni izmed treh podenot AMPK. Spremembo koncentracije AMP lahko AMPK zazna hitreje kot spremembo koncentracije ATP. Aktivirana AMPK inhibira anabolne poti in aktivira katabolne procese, ter tako vzdržuje energijsko homoestazo v aktivnih celicah. Pomembno vlogo pri vzdrževanju nivoja glukoze v celici igra tudi avtofagija, ki povzroči razgradnjo hranilnih snovi, kot so glikogen in lipidne kapljice, s tem zagotovi celici zadostno količino glukoze, in tako deluje kot nadomesten proces za glukoneogenezo. Tudi ta proces je v celicah uravnavan, in sicer z različnimi signalnimi molekulami. Mnogo bolezni, kot sta na primer diabetes in rak, sta tesno povezani z nefunkcionalnostjo nekaterih metaboličnih senzorjev ali avtofagije, zato je razumevanje njihovih funkcionalnih interakcij osnova za nove terapevtske možnosti.

=== Tina Kolenc Milavec: Intermediati Krebsovega cikla kot signalne molekule pri vnetnem in protivnetnem odgovoru===
Intermediati Krebsovega cikla imajo v celici pomembno vlogo, saj ne služijo le kot vmesni produkti v procesu nastanka molekul ATP, temveč tudi kot prekurzorji za sintezo drugih biološko pomembnih molekul ter kot signalne molekule v številnih metaboličnih poteh. Ko se na tolične receptorje (TLR4) na površini makrofaga vežejo s patogeni povezani molekulski vzorci, pride v celici do preklopa metabolizma z oksidativne fosforilacije na glikolizo za namene pridobivanja energije v obliki ATP, kar neposredno vpliva na vnetno stanje v celici. Krebsov cikel, ki sedaj nima več vloge zagotavljanja energije celici, se prekine na dveh mestih: za sukcinatom ter pri izocitrat dehidrogenazi, kar omogoči, da intermediati citratnega cikla delujejo kot signalne molekule. Pri vnetnem odzivu organizma na patogene sta zelo pomembna sukcinat in citrat. Prvi povzroči povišanje koncentracije Hif1α v celici ter nastanek reaktivnih kisikovih spojin (ROS) zaradi vzvratnega elektronskega transporta, citrat pa deluje kot substrat za verigo reakcij, ki prav tako vodijo do nastanka ROS. Pri ponovni vzpostavitvi normalnih razmer v celici po uspešni odstranitvi patogenov pa ima pomembno vlogo itakonat - molekula, ki nastane iz cis-akonitata. Ta vpliva na tri pomembne molekule (sukcinat dehidrogenazo, Nrf2 ter ATF3), ki sprožijo vsaka svojo kaskado reakcij protivnetnega odgovora.

===Valeriya Musina: Vpliv intermediatov Krebsovega cikla na celične procese===
Krebsov cikel je bil oblikovan osedemdeset let nazaj, vloge njegovih inermediatov, zlasti sukcinata in fumarata, pa so bile odkrite nedavno. V zadnjem času so bile narejene številne raziskave človeških bolezni, zlasti niza specifičnih vrst raka, ki so razkrile pomembne vloge intermediatov Krebsovega cikla pri metilaciji genov in s tem pri preoblikovanju celic. Intermediati Krebsovega cikla lahko delujejo kot primarni substrati, signalne molekule ali sodelujejo pri posttranslacijskih modifikacijah. Vedno več dokazov kaže, da ima epigenetika pomembno vlogo pri regulaciji dobe zdravja, in je vključena v proces staranja. 2-oksoglutarat (α-ketoglutarat) je ključni metabolit v Krebsovem ciklu, vendar je tudi obvezen substrat za 2-oksoglutarat odvisne dioksigenaze (2-OGDO). Družina encimov 2-OGDO vključuje glavne encime za demetilacijo DNA in histonov, encime Ten-Eleven translocation (TETs) in encime z domeno Jumonji C (JmjC). Poleg tega lahko člani družine 2-OGDO regulirajo sintezo kolagena in odzive na hipoksično okolje tudi na neepigenetski način. 2-oksoglutarat je substrat 2-oksoglutarat dehidrogenaz (2-OGDH), zato lahko motnje v funkciji 2-OGDH v Krebsovem ciklu povzročijo globalne degenerativne spremembe v strukturi kromatina. Sukcinat in fumarat močna inhibitorja 2-OGDO encimov, zato ravnotežje reakcij v Krebsovem ciklu lahko vpliva na raven metilacije DNA in histonov ter tako nadzira izražanje genov.

===Marko Pavleković: Vloga sukcinata kot ligand z G proteini vezanega receptorja GPR91===
Znano je, da je cikel citronske kisline osrednjega pomena za presnovo celic in energetsko homeostazo. Vendar marsikateri intermediat cikla igra vlogo tudi v drugih procesih v telesu. Na primer sukcinat deluje kot ekstracelularni ligand z vezavo na z G proteinom vezan receptor, znan kot GPR91, izražen v ledvicah, jetrih, srcu, retinalnih celicah in morda v številnih drugih tkivih, kar vodi do širokega nabora fizioloških in patoloških učinkov. V normalnih pogojih se sukcinata ne sintetizira dovolj, da bi lahko aktiviral GPR91, šele v pogojih kot so ishemija, diabetes in hipoksija, sukcinata nastane dovolj. Ker pa sukcinat nastaja v matriksu mitohondrija mora na poti do receptorja, ki se nahaja na zunanji strani celic, prečkati še tri membrane. Skozi GPR91 je sukcinat vključen v funkcije, kot so uravnavanje krvnega tlaka, zaviranje lipolize v belem maščobnem tkivu, razvoj vaskularizacije mrežnice, srčna hipertrofija in aktivacija zvezdastih jetrnih celic z ishemičnimi hepatociti. Zaradi tega je sukcinatni receptor obetajoč cilj za zdravila za preprečevanje teh neželenih patoloških učinkov. Nedavni razvoj antagonistov, specifičnih za SUCNR1, odpira nove možnosti za raziskave v modelih za te motnje in lahko sčasoma zagotovi nove možnosti za zdravljenje bolnikov.

===Klementina Polanec: Sirtuini kot regulatorji oksidacije maščobnih kislin===
Sirtuini so družina visoko ohranjenih proteinov (SIRT1-SIRT7 pri sesalcih), ki imajo regulatorno vlogo v metabolizmu in staranju. Delujejo kot regulatorji oksidacije maščobnih kislin v odgovor na številne strese za celico, kot so omejitev kalorij, postenje, mraz. Ker se zniža nivo ATP v celici in je glukoze premalo, se poveča razgradnja glikogena, hkrati pa se pospeši oksidacija maščobnih kislin v mišicah in jetrih. Do nedavnega je veljajo prepričanje, da je aktivnost sirtuinov odvisna le od koncentracije NAD+ v celici. Raziskovalci so pred kratkim dokazali, da se lahko SIRT1 aktivira tudi s fosforilacijo, ki jo izvede protein kinaza A (PKA). Ko so sirtuini aktivirani, delujejo v glavnem kot deacetilaze številnih encimov, s čimer jih aktivirajo. SIRT1 tako deacetilira PGC1α, ki pospeši izražanje tarčnih genov, ki so povezani z oksidacijo maščobnih kislin. SIRT3 pa odvisno od koncentracije NAD+ deacetilira in s tem aktivira LCAD (long-chain acyl-CoA dehydrogenase). To je pri miših ključen encim, ki sodeluje v oksidaciji dolgoverižnih maščobnih kislin. S pospešeno oksidacijo celica dvigne nivo ATP in ponovno vzpostavi homeostazo. Sirtuini so zato lahko potencialna tarča za zdravljenje motenj v oksidaciji maščobnih kislin ter tudi za preprečevanje prekomerne teže oziroma debelosti.

===Tadej Medved: Vpliv oksidacije maščobnih kislin na usodo celic===
Usodo celic, tj. končne lastnosti, ki jih bo celica izražala po razvoju in diferenciaciji, določajo številni procesi. Mednje spada tudi metabolična β-oksidacija maščobnih kislin. Izkaže se, da je količina acetil-CoA, pridobljena preko oksidacije maščobnih kislin, pogosto odločilni dejavnik za izražanje lastnosti določenih tipov celic; do sedaj je bil ta vpliv raziskan v endotelijskih celicah limfnih žil in srca ter v limfocitih T. Ključna regulacija oksidacije MK se prične pri izražanju encima CPT1, ki omogoča transport maščobnih kislin v mitohondrij. V srčnem endoteliju vpliva ta proces na pretvorbo endotelijskih celic v mezenhimske, in sicer zaradi TGF-β signalizacije, ki z inhibicijo metabolizma MK sproži spremembe celičnih lastnosti v mezenhimske. V endoteliju limfnih žil je oksidacija MK pomembna za vršenje limfangiogeneze, tj. tvorbe novih limfnih žil s proliferacijo in diferenciacijo obstoječih limfnih endotelijskih celic. Ta proces je odvisen od signalov VEGF-C in PROX1; slednji poveča izražanje CPT1 in pripravi celico do migracije in proliferacije. Količina acetil-CoA je relevanten dejavnik za diferenciacijo in dolgoživost spominskih T celic, povezana pa je preko aktivacije AMPK s signalno molekulo TRAF6. V T celicah na sploh pa močno učinkuje PD-1, ki pospeši tako hidrolizo MK kot tudi njihovo oksidacijo in omogoča preživetje teh celic v pogojih, kjer niso sposobne sprejemanja drugih hranilnih snovi, kot je glukoza.

===Rebeka Dajčman: Metabolizen, signalizacija in farmakološka funkcija ketonskih teles===
ketonska telesa nastanejo kot stranski produk pri presnovi maščobnih kislin. mednje sodijo acetoacetat, aceton in najobstojnejši beta hidroksibutirat. njihova sinteza se poveča, ko telesu primanjkuje ogljikovih hidratov. to je med stradanjem, po športni aktivnosti, med nosečnostjo ali med ketonsko dieto. v seminarski nalogi bom predstavila metabolično bot ketonskih teles. od sinteze v jetrih do njihovega transporta v ostala tkiva. to so predvsem skeletne mišice, srce in možgani ter njihovo oksidacijo nazaj v acetil-CoA. sinteza ketonskih teles je regulirana s transkripcijsko in post-translacijsko regulacijo. pri tem gre predvsem za regulacijo encimov, ki sodelujejo v sintezi in razgradnji teles. ketonska telesa pa imajo vlogo regulacije dveh membranskih receptorje ali histonske deacetilaze. ketonska telesa se že desetletja uporabljajo v zdravljenju nevrodegenerativnih bolezni in v tej smeri tudi tečejo prihodnje raziskave

===Sumeja Kudelić: Transsulfuracijska pot kot obrambni mehanizem celic pri oksidativnem stresu===
Transsulfuracijska pot, kot novo raziskovalno področje nam podarja veliko pozitivnih načinov v boju proti oksidativnemu stresu. Oksidativni stres, kot negativni dejavnik celic s svojimi reaktivnimi kisikovim zvrsti, poškoduje različne celične organele, kar vodi do celične smrti. Pri transsulfuraciji poti je ugotovljeno, da bistveni pomen ima cistein y-liaza, ki je biosintetični encim cisteina. Pri razgradnji cisteina lahko pridobimo vodikov sulfid (H2S), ki je v zelo majhnih koncentracijah pomemben signalizator celice. Več mehanizmov pozitivnega delovanja transsulfuracije poti (posredne ali neposredne) je raziskano, te so prišli do rezultatov, ki bi lahko pomagali pri izboljšanem terapevtskem zdravljenju nevrodegenerativnih bolezni, ki so povezane z metabolizmom aminokislin. Važno je iztakniti, da s pomočjo tega mehanizma ali z njeno inhibicijo bi tudi vplivali na bakterijsko smrt. Saj se pri bakterijah razvila obrambna stimulacija transsulfuracijske poti, pri čemer so bakterije postale 'imune' na antibiotike. Vodikov sulfid kot pomemben dejavnik transsulfuracijske poti vpliva na to, da veže proste ione, ki bi lahko v oksidativnih pogojih (H2O2) reagirali s to spojino. Kot posledica reakcije nastanejo prosti kisikovi radikali, ki poškodujejo celične organele. Nevrodegenerativne bolezni uporabljajo transsulfuracijsko pot kod pomemben vir aminokislin in tudi s tem preprečujejo, da so njihove celice izpostavljene oksidativnemu stresu.

===Matija Ruparčič: Ureaze in njihova vloga v živih bitjih===
Ureaze so metaloencimi, ki katalizirajo hidrolizo uree oziroma sečnine. Pri tem nastaneta dve molekuli amoniaka ter ena molekula ogljikovega dioksida. Najdemo jih v veliko organizmih kot so rastline, glive in bakterije. Le živali jih nimajo, saj se pri njih sečnina tvori kot odpadni produkt. Strukturno se razlikujejo glede na vrsto organizma, zapis za njihove sestavne dele pa se skriva v velikem številu genov. Za organizme, ki jih vsebujejo, predstavljajo ključen faktor za življenje. S pomočjo njih lahko bakterije ''Helicobacter pylori'' preživijo v ekstremno kislih razmerah želodca, bakterijam ''Proteus mirabilis'' omogočajo tvorbo zaščitnih biofilmov, rastlinam pa zagotavljajo bogat vir dušika in jim pomagajo pri katabolizmu arginina. Pred kratkim pa so odkrili, da imajo poleg tega ureaze še druge naloge, ki niso povezane z njihovo katalitično sposobnostjo. Med te štejemo vlogo medcelične komunikacije pri lišajih, obramba pred oksidativnim stresom kot odgovor imunskega sistema in še veliko več. Poznamo jih sicer že skoraj 150 let, vendar o njih vemo še vedno relativno malo. Motivacija za njihovo preučevanje pa je velika, saj nam lahko pomagajo k napredkom na raznih področjih kot sta medicina in agronomija.
===Maks Kumek: Vloga metabolizma arginina v celični regulaciji in erekcija===
Izmed vseh intermediatov ureinega ciklusa je pravzagotovo arginin najbolj prepleten v razne regulacijske sisteme celice. Metabolične poti arginina so kompleksne in se mnogokrat prepletajo med seboj. Sinteza arginina poteka v različnih predelih telesa v ti. črevesno renalni osi. Pretvorba glutamina vse do citrulina poteka v celicah tankega črevesja. Citrulin se izloči v krvni obtok in potuje do ledvic, kjer se nadaljnjo sintetizira do argenina. Regulacija nastajanja produktov je tesno povezana z transportnimi regulatorji družine SLC7 ( CAT 1, CAT-2A, y+LAT, b0,+, CAT-2B) . Regulacija transporterjev ne poteka le na transkripcijskem nivoju temveč tudi na posttranslacijskem nivoju (npr. spermin). Kompleksnost s poglabljanjem le narašča.Vrste encimov, pri katerih igra arginin vlogo substrata so: arginaza, NOS (ang. nitric oxide synthase), arginin dekarboksilaza (ADC), arginin:glicil amidinotransferaza. Posebno pomembnost ima NOS,ki so trije izocimi: iNOS, nNOS, eNOS. Ti trije encimi so prostorsko in regulacijsko ločeni med seboj, vendar pa je moč tudi pri njih zapaziti prepletanje delovanja v procesu kot je erekcija.Razumevanje vloge metaboličnih produktov arginina v celic pomaga razumeti širšo sliko imunološkega odziva, preprečevanje bolezenskih stanj (npr. impotence) in konec koncev pomaga tudi pri razumevanju lastnega telesa.

BIO2 Povzetki seminarjev 2018

2018-11-24T07:26:20Z

Maks Kumek: /* Biokemija- Povzetki seminarjev 2018/2019 */

== Biokemija- Povzetki seminarjev 2018/2019 ==
Nazaj na osnovno [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Seminar_2018 stran]

===Karmen Mlinar: Signalizacija in odzivi na abiotski stres pri rastlinah===
Rastline živijo v stalno spreminjajočem se okolju, ki je pogosto neugodno in stresno za njihovo rast in razvoj. Primer abiotskega stresa so suša, ekstremne temperature, slanost tal, pomanjkanje hranil v prsti ipd. Rastline lahko stres preživijo tako, da se mu prilagodijo ali pa izognejo. V nasprotnem primeru so obsojene na smrt. Identificiranih je le malo senzorjev, ki zaznavajo stres. Pri signalizaciji odzivov na stresna okolja pogosto sodeluje družina kinaz SnRK, ki zaznajo spremembe v energijskem statusu rastline, ki jih povzroči stres. Znane so tri poddružine SnRKs: SnRK1s, SnRK2s, ki sodelujejo pri osmotskem stresu in ABA signalizaciji, in SnRK3s, ki so ključni regulatorji ionske homeostaze pri spopadanju s solnim stresom. Pri ionskem stresu pogosto problem predstavlja Na+. Pri njegovi signalizaciji je ključna SOS signalna pot. Signalizacija temperaturnega stresa se začne s spremembami v fluidnosti membrane, kar zaznajo integralni membranski proteini. Pri signalizaciji pogosto sodelujejo tudi MAPKs, CPKs in stresni hormon ABA, pomembno vlogo pa nosijo sekundarni sporočevalci kot sta kalcij in ROS. Vse to stremi k vzpostavitvi ionske in vodne homeostaze ter celične stabilnosti v stresnem okolju. Z razumevanjem signalizacije stresa in odzivov, ki sledijo, bomo lahko izboljšali odpornost pridelkov na stres in s tem zagotovili kmetijsko stabilnost in preskrbo s hrano za rastoče svetovno prebivalstvo.

===Aljaž Bratina: Pomen različnih signalnih poti pri staranju===
Staranje je postopna izguba fiziološke integritete in vodi v prizadeto funkcionalnost ter povečano možnost za smrt. Hitremu staranju nasprotna je dolgoživost, to je stanje, v katerem organizem ne izgublja funkcionalnosti ali jo izgublja počasneje. Staranje lahko opredelimo z devetimi splošnimi lastnostmi, ki jih opazimo v večini organizmov. Pri preučevanju staranja opazujemo organizem C. elegans, ki lahko med razvojem v primeru neugodnih razmer razvije stanje dauer, v katerem je razvoj ustavljen in je tako organizem sposoben preživeti dalj časa. Pri regulaciji staranja in dolgoživosti so pomembne mnoge celične signalne poti, kot del njih pa predvsem jedrni receptorji, ki uravnavajo prepisovanje genov, ki imajo vpliv na hitrost staranja oz. vzdrževanje dolgoživosti. V seminarski nalogi so opisane štiri pomembne signalne poti in njihov vpliv na staranje. Pri prvi je pomemben jedrni receptor DAF-12, ki za svoje delovanje potrebuje steroid DA. Neugodne razmere ga deaktivirajo, kar vodi v razvoj stanja dauer. Na dolgoživost pozitivno vpliva tudi aktiviran kompleks NSBP-1 in jedrnega receptorja DAF-16, ki sta del signalne poti IIS. To pot regulira tudi količina holesterola v celici. Dolgoživost povzročajo tudi prekinitveni post, pri katerem se aktivira jedrni receptor AP-1, pa tudi odstranitev zarodnih celic, ki poleg prej omenjene DAF-12 in DAF-16 aktivira tudi nekatere druge receptorje, npr. NHR-80 in NH3-49.

===Eva Gartner: Wnt signalizacija in njena vloga pri srčni fibrozi===
Wnt signalizacija zajema skupino signalnih poti, ki jih regulirajo wnt proteini. Ti se vežejo na posebne receptorje v membrani celice, preko katerih se signal prenese v notranjost. Wnt signalizacijo sestavljajo tri glavne signalizacijske poti: kanonična wnt pot, ki vključuje protein β-katenin, nekanonična (PCP) pot in nekanonična pot, ki sodeluje pri regulaciji kalcija. Vse poti se začnejo z vezavo wnt-liganda na transmembranske Fz receptorje in prenosom signala do znotrajceličnega proteina Dsh. Od tu naprej se poti razcepijo vsaka v svojo smer. Wnt signalizacija sodeluje v mnogih procesih, potrebnih za normalen razvoj organizma, kot so npr. razmnoževanje, specializacija in migracije celic. Prisotnost regulacije z wnt signalizacijo so odkrili tudi pri srčni fibrozi in z njo povezanih boleznih in poškodbah srca. V zdravih celicah wnt signalizacija navadno ni prisotna. Izraz fibroza se nanaša na povečanje količine zunajceličnega matriksa, zaradi česar postane srčna mišica otrdela in krčenje manj intenzivno. Pride do prekomerne namnožitve fibroblastov in diferenciacije v miofibroblaste, ki so fenotipsko med fibroblasti in mišičnimi celicami. Kljub številnim raziskavam, ki dokazujejo vpletenost wnt signalizacije v razvoju fibroze, natančni mehanizmi vseh signalnih poti še vedno niso znani. Potrebne so še nadaljnje raziskave za razumevanje zapletene celične komunikacije in odkritje novih terapevtskih možnosti.

===Neža Žerjav: Vloga kaspaz pri celični smrti===
Kaspaze so cisteinske peptidaze, ki sodelujejo v signalnih poteh celične smrti. Poznamo več vrst celične smrti, med njii tudi apoptozo, nekrozo, nekroptozo in piroptozo. Vloga kaspaz pri apoptozi je dobro znana, so adapterski proteini ali pa aktivno sodelujejo pri postopni razgradnji celice, saj sprožijo nastajanje apoptotskih veziklov in fagocitozo celice. Nekrozo označujemo kot neprogramirano celično smrt, vendar to za nekroptozo, ki ji pravimo tudi programirana nekroza, ne drži. Slednja je namreč v celici konkurenčna apoptozi, preko kaspaz sta recipročno regulirani. Nekroptozo kaspaze zavirajo, saj inhibirajo kompleks RIPK1/RIPK3, ki z aktivacijo proteina MLKL povzroči razlitje celične vsebine, značilno za nekrozo. Kaspaze sodelujejo tudi pri piroptozi, ki je posledica stresnih dejavnikov iz okolice – poškodb, patogenih organizmov ali njihovih toksinov. Kaspaze pri piroptozi povzročijo aktivacijo gasdermina D, ki sproži celično lizo, in vnetni odziv. Poznavanje delovanja kaspaz nam omogoča tako vpogled v razvoj in mehanizem vzdrževanja homeostaze organizmov, kakor tudi razumevanje patoloških procesov, na primer multiple in amiotrofične lateralne skleroze, ishemične bolezni srca ter vnetnih odzivov zaradi okužb.

===Meta Kodrič: Svetlobne signalne poti za uravnavanje fotomorfogeneze===
Svetloba je za rastline eden od najpomembnejših okoljskih signalov, ki vplivajo na rast in razvoj. V odvisnosti od intenzitete in valovne dolžine svetlobe se pri rastlinah pojavljata dva kontrastna razvojna procesa. Fotomorfogeneza je osnovna oblika rasti, saj rastlinam omogoča razvoj v avtotrofne organizme, sposobne opravljati fotosintezo, skotomorfogeneza pa je le zavrta oblika fotomorfogeneze, ki se odvija v temi. Potek teh dveh procesov rastline uravnavajo pod vplivom svetlobnega signala v svetlobni signalni poti. V njej sodelujejo fotoreceptorji ter pozitivni in negativni regulatorji fotomorfogeneze. V temi se fotoreceptor fitokrom nahaja v biološko neaktivni obliki v citosolu rastlinske celice. Negativni regulatorji se tako lahko v jedru prosto vežejo na druge molekule. Transkripcijski faktorji PIF se v obliki dimerov vežejo na promotorske regije na molekuli DNA in s tem preprečijo prepisovanje genov za fotomorfogenezo. Proteini COP/DET/FUS delujejo kot E3 ligaze pozitivnih regulatorjev HY5, HFR1, LAF1 in tako sodelujejo pri njihovi razgradnji. Z vzajemnim delovanjem tako negativni regulatorji zatirajo potek fotomorfogeneze. Na svetlobi se fitokrom konformacijsko spremeni in preide v jedro. Tam v sodelovanju z drugimi molekulami inhibira negativne regulatorje, bodisi s preprečitvijo njihovega encimskega delovanja, bodisi s sodelovanjem pri njihovi razgradnji. Posledično lahko postanejo aktivni pozitivni regulatorji, ki se vežejo poleg promotorskih regij na DNA in tako aktivirajo prepisovanje genov za fotomorfogenezo.

===Tina Zavodnik: Mehanična transdukcija in proteini Piezo===
Praktično vsi organizmi so občutljivi na mehanske dražljaje. Fizične sile regulirajo številne fiziološke procese, nezadostni oz. napačni odzivi nanje pa lahko vodijo do številnih okvar ali bolezni. Naše zaznavanje teh dražljajev in njihova pretvorba v biokemijske informacije, imenovana tudi mehanotransdukcija, sta torej ključna za dojemanje sveta okoli nas in odzivanje nanj. To nam omogočajo čutila, navadno sestavljena iz čutilne celice ali receptorja in senzoričnega nevrona. Zaradi obstoja mnogo različnih vrst in intenzitet dražljajev so se tudi čutnice in senzorični nevroni specializirali v zaznavanje vsakega od stimulusov. Merklovi živčni končiči so mehanski receptorji, sposobni zaznavati nežen pritisk na koži. To pa jim omogočajo posebni ionski kanalčki, imenovani proteini Piezo. Nežen dotik na površini kože sproži prenos mehaničnega dražljaja do Merklovih živčnih končičev, kjer se aktivira kanalček Piezo2 v Merklovi celici. Aktivacija kanalčka omogoči prehod kalcijevih in natrijevih ionov v notranjost celice. Merklova celica se depolarizira in sproži akcijski potencial v pripadajočem aferentnem nevronu. Mehanični dražljaj pa aktivira tudi kanalčke Piezo2 v membrani SA1 aferentnega nevrona in s tem sproži dodatno vzpostavitev akcijskega potenciala. Pred kratkim je bila odkrita struktura proteina Piezo, kar pa še vedno ne razkriva natančnega mehanizma aktivacije ionskega kanalčka zaradi mehanskega dražljaja. Najverjetneje se zaradi mehanskega dražljaja spremeni konformacija proteina Piezo. Kanalček se odpre in ioni lahko pod vplivom koncentracijskega gradienta prehajajo skozi membrano.

===Doroteja Armič: Bifunkcionalen encim PFK-2/FBPaza-2 in njegova vloga v metabolizmu glukoze===
PFK-2/FBPaza-2 (fosfofruktokinaza-2/fruktoza-2,6-bisfosfataza) je eden izmed encimov, ki sodelujejo pri regulaciji metabolizma glukoze v evkariontih. Je bifunkcionalen encim, ki uravnava, ali bo v celici potekala glikoliza ali glukoneogeneza. Za to je odgovoren posredno, saj regulira količino alosteričnega efektorja encimov PFK-1 in FBPaza-1 – fruktoze-2,6-bisfosfata. En encim ima dve katalitični domeni. Kinazna domena katalizira sintezo, bisfosfatazna domena pa razgradnjo fruktoze-2,6-bisfosfata. Delovanje encima je regulirano na nivoju posttranslacijske modifikacije, in sicer s fosforilacijo/defosforilacijo. Pri sesalcih obstajajo štirje različni izocimi, vsakega kodira drug gen. Ti izocimi so jetrni, srčni, možganski in izocim testisov. Vsak izocim pa ima več izooblik, ki nastanejo z alternativnim spajanjem eksonov. Izooblike se razlikujejo v regulatornih regijah. Fosforilirajo in defosforilirajo jih drugačne kinaze, nekatere izooblike pa fosforilacijskih mest sploh nimajo. Encim PFK-2/FBPaza-2 je nastal s fuzijo dveh genov. Encim se je razvil tako, da je funkcionalen samo, če sta prisotni obe domeni. Tudi pri tripanosomatidih in kvasovkah, kjer je encim monofunkcionalen, je zato še vedno zapis za obe domeni. V razvoju je prišlo do različnih izooblik v različnih tkivih oziroma organizmih zaradi drugačnih potreb za metabolizem glukoze. Ker PFK-2/FBPaza uravnava glikolizo in glukoneogenezo, bi lahko tarčno reguliranje encima postalo nov način zdravljenja diabetesa.

===Martina Lokar: Biotinilacija proteinov ===
Biotin je pomemben encimski kofaktor, saj olajša prenos karboksilne skupine med metaboliti pri karboksilaciji, dekarboksilaciji in transkarboksilaciji. Biotin protein ligaza (BPL) ga v procesu biotinilacije veže na tarčni biotin-odvisen encim. Biotinilacija je dvostopenjski proces, pri katerem pride v prvem koraku do ligacije biotina in ATP ter nastanka intermediata biotinil-AMP. V drugem koraku se biotin iz biotinil-AMP veže na tarčni encim in pride do sprostitve molekule AMP. Ker je biotin v naravi redek, organizmi natančno uravnavajo njegovo porabo. Evkarionti so nezmožni sami sintetizirati biotin, zato ga pridobivajo iz okolja. Zadostno količino ohranjajo v biotinskem ciklu z reciklacijo biotina iz biotin-odvisnih encimov. Pri metaboličnih procesih sesalcev sodeluje pet biotin-odvisnih karboksilaz, ki so v splošnem zgrajene iz treh domen: domene BC, domene CT in domene BCCD. Biotin je kovalentno vezan na lizinski ostanek v domeni BCCD in se preko modela zibajoče roke ali modela zibajoče domene med katalizo translocira iz domene BC v domeno CT. Karboksilaze katalizirajo reakcijo prenosa karboksilne skupine na substrat v dveh korakih. Najprej se v domeni BC karboksilna skupina veže na biotin. Slednji se nato premakne v domeno CT, kjer se karboksilna skupina iz biotina prenese na substrat. Če telo ni sposobno uravnavati in izkoriščati zaloge biotina, človek oboli za boleznijo MCD.

===Lara Drinovec: AMPK in avtofagija pri glukoznem/glikogenem metabolizmu===
Glukozni/glikogeni metabolizem je primarna metabolična pot, ki je uravnavana na najrazličnejših nivojih, glede na potrebe celice. Znano je, da raven glukoze v krvi uravnavata dva hormona: inzulin, ki omogoča prevzem glukoze v celico in glukagon z nasprotno učinkovitostjo. Metabolni regulator, ki deluje od inzulina neodvisno in se odziva na krčenje mišic, je AMPK (AMP-aktivirana protein kinaza). Aktivira jo lahko AMP, tako da se veže na vezavno mesto na eni izmed treh podenot AMPK. Spremembo koncentracije AMP lahko AMPK zazna hitreje kot spremembo koncentracije ATP. Aktivirana AMPK inhibira anabolne poti in aktivira katabolne procese, ter tako vzdržuje energijsko homoestazo v aktivnih celicah. Pomembno vlogo pri vzdrževanju nivoja glukoze v celici igra tudi avtofagija, ki povzroči razgradnjo hranilnih snovi, kot so glikogen in lipidne kapljice, s tem zagotovi celici zadostno količino glukoze, in tako deluje kot nadomesten proces za glukoneogenezo. Tudi ta proces je v celicah uravnavan, in sicer z različnimi signalnimi molekulami. Mnogo bolezni, kot sta na primer diabetes in rak, sta tesno povezani z nefunkcionalnostjo nekaterih metaboličnih senzorjev ali avtofagije, zato je razumevanje njihovih funkcionalnih interakcij osnova za nove terapevtske možnosti.

=== Tina Kolenc Milavec: Intermediati Krebsovega cikla kot signalne molekule pri vnetnem in protivnetnem odgovoru===
Intermediati Krebsovega cikla imajo v celici pomembno vlogo, saj ne služijo le kot vmesni produkti v procesu nastanka molekul ATP, temveč tudi kot prekurzorji za sintezo drugih biološko pomembnih molekul ter kot signalne molekule v številnih metaboličnih poteh. Ko se na tolične receptorje (TLR4) na površini makrofaga vežejo s patogeni povezani molekulski vzorci, pride v celici do preklopa metabolizma z oksidativne fosforilacije na glikolizo za namene pridobivanja energije v obliki ATP, kar neposredno vpliva na vnetno stanje v celici. Krebsov cikel, ki sedaj nima več vloge zagotavljanja energije celici, se prekine na dveh mestih: za sukcinatom ter pri izocitrat dehidrogenazi, kar omogoči, da intermediati citratnega cikla delujejo kot signalne molekule. Pri vnetnem odzivu organizma na patogene sta zelo pomembna sukcinat in citrat. Prvi povzroči povišanje koncentracije Hif1α v celici ter nastanek reaktivnih kisikovih spojin (ROS) zaradi vzvratnega elektronskega transporta, citrat pa deluje kot substrat za verigo reakcij, ki prav tako vodijo do nastanka ROS. Pri ponovni vzpostavitvi normalnih razmer v celici po uspešni odstranitvi patogenov pa ima pomembno vlogo itakonat - molekula, ki nastane iz cis-akonitata. Ta vpliva na tri pomembne molekule (sukcinat dehidrogenazo, Nrf2 ter ATF3), ki sprožijo vsaka svojo kaskado reakcij protivnetnega odgovora.

===Valeriya Musina: Vpliv intermediatov Krebsovega cikla na celične procese===
Krebsov cikel je bil oblikovan osedemdeset let nazaj, vloge njegovih inermediatov, zlasti sukcinata in fumarata, pa so bile odkrite nedavno. V zadnjem času so bile narejene številne raziskave človeških bolezni, zlasti niza specifičnih vrst raka, ki so razkrile pomembne vloge intermediatov Krebsovega cikla pri metilaciji genov in s tem pri preoblikovanju celic. Intermediati Krebsovega cikla lahko delujejo kot primarni substrati, signalne molekule ali sodelujejo pri posttranslacijskih modifikacijah. Vedno več dokazov kaže, da ima epigenetika pomembno vlogo pri regulaciji dobe zdravja, in je vključena v proces staranja. 2-oksoglutarat (α-ketoglutarat) je ključni metabolit v Krebsovem ciklu, vendar je tudi obvezen substrat za 2-oksoglutarat odvisne dioksigenaze (2-OGDO). Družina encimov 2-OGDO vključuje glavne encime za demetilacijo DNA in histonov, encime Ten-Eleven translocation (TETs) in encime z domeno Jumonji C (JmjC). Poleg tega lahko člani družine 2-OGDO regulirajo sintezo kolagena in odzive na hipoksično okolje tudi na neepigenetski način. 2-oksoglutarat je substrat 2-oksoglutarat dehidrogenaz (2-OGDH), zato lahko motnje v funkciji 2-OGDH v Krebsovem ciklu povzročijo globalne degenerativne spremembe v strukturi kromatina. Sukcinat in fumarat močna inhibitorja 2-OGDO encimov, zato ravnotežje reakcij v Krebsovem ciklu lahko vpliva na raven metilacije DNA in histonov ter tako nadzira izražanje genov.

===Marko Pavleković: Vloga sukcinata kot ligand z G proteini vezanega receptorja GPR91===
Znano je, da je cikel citronske kisline osrednjega pomena za presnovo celic in energetsko homeostazo. Vendar marsikateri intermediat cikla igra vlogo tudi v drugih procesih v telesu. Na primer sukcinat deluje kot ekstracelularni ligand z vezavo na z G proteinom vezan receptor, znan kot GPR91, izražen v ledvicah, jetrih, srcu, retinalnih celicah in morda v številnih drugih tkivih, kar vodi do širokega nabora fizioloških in patoloških učinkov. V normalnih pogojih se sukcinata ne sintetizira dovolj, da bi lahko aktiviral GPR91, šele v pogojih kot so ishemija, diabetes in hipoksija, sukcinata nastane dovolj. Ker pa sukcinat nastaja v matriksu mitohondrija mora na poti do receptorja, ki se nahaja na zunanji strani celic, prečkati še tri membrane. Skozi GPR91 je sukcinat vključen v funkcije, kot so uravnavanje krvnega tlaka, zaviranje lipolize v belem maščobnem tkivu, razvoj vaskularizacije mrežnice, srčna hipertrofija in aktivacija zvezdastih jetrnih celic z ishemičnimi hepatociti. Zaradi tega je sukcinatni receptor obetajoč cilj za zdravila za preprečevanje teh neželenih patoloških učinkov. Nedavni razvoj antagonistov, specifičnih za SUCNR1, odpira nove možnosti za raziskave v modelih za te motnje in lahko sčasoma zagotovi nove možnosti za zdravljenje bolnikov.

===Klementina Polanec: Sirtuini kot regulatorji oksidacije maščobnih kislin===
Sirtuini so družina visoko ohranjenih proteinov (SIRT1-SIRT7 pri sesalcih), ki imajo regulatorno vlogo v metabolizmu in staranju. Delujejo kot regulatorji oksidacije maščobnih kislin v odgovor na številne strese za celico, kot so omejitev kalorij, postenje, mraz. Ker se zniža nivo ATP v celici in je glukoze premalo, se poveča razgradnja glikogena, hkrati pa se pospeši oksidacija maščobnih kislin v mišicah in jetrih. Do nedavnega je veljajo prepričanje, da je aktivnost sirtuinov odvisna le od koncentracije NAD+ v celici. Raziskovalci so pred kratkim dokazali, da se lahko SIRT1 aktivira tudi s fosforilacijo, ki jo izvede protein kinaza A (PKA). Ko so sirtuini aktivirani, delujejo v glavnem kot deacetilaze številnih encimov, s čimer jih aktivirajo. SIRT1 tako deacetilira PGC1α, ki pospeši izražanje tarčnih genov, ki so povezani z oksidacijo maščobnih kislin. SIRT3 pa odvisno od koncentracije NAD+ deacetilira in s tem aktivira LCAD (long-chain acyl-CoA dehydrogenase). To je pri miših ključen encim, ki sodeluje v oksidaciji dolgoverižnih maščobnih kislin. S pospešeno oksidacijo celica dvigne nivo ATP in ponovno vzpostavi homeostazo. Sirtuini so zato lahko potencialna tarča za zdravljenje motenj v oksidaciji maščobnih kislin ter tudi za preprečevanje prekomerne teže oziroma debelosti.

===Tadej Medved: Vpliv oksidacije maščobnih kislin na usodo celic===
Usodo celic, tj. končne lastnosti, ki jih bo celica izražala po razvoju in diferenciaciji, določajo številni procesi. Mednje spada tudi metabolična β-oksidacija maščobnih kislin. Izkaže se, da je količina acetil-CoA, pridobljena preko oksidacije maščobnih kislin, pogosto odločilni dejavnik za izražanje lastnosti določenih tipov celic; do sedaj je bil ta vpliv raziskan v endotelijskih celicah limfnih žil in srca ter v limfocitih T. Ključna regulacija oksidacije MK se prične pri izražanju encima CPT1, ki omogoča transport maščobnih kislin v mitohondrij. V srčnem endoteliju vpliva ta proces na pretvorbo endotelijskih celic v mezenhimske, in sicer zaradi TGF-β signalizacije, ki z inhibicijo metabolizma MK sproži spremembe celičnih lastnosti v mezenhimske. V endoteliju limfnih žil je oksidacija MK pomembna za vršenje limfangiogeneze, tj. tvorbe novih limfnih žil s proliferacijo in diferenciacijo obstoječih limfnih endotelijskih celic. Ta proces je odvisen od signalov VEGF-C in PROX1; slednji poveča izražanje CPT1 in pripravi celico do migracije in proliferacije. Količina acetil-CoA je relevanten dejavnik za diferenciacijo in dolgoživost spominskih T celic, povezana pa je preko aktivacije AMPK s signalno molekulo TRAF6. V T celicah na sploh pa močno učinkuje PD-1, ki pospeši tako hidrolizo MK kot tudi njihovo oksidacijo in omogoča preživetje teh celic v pogojih, kjer niso sposobne sprejemanja drugih hranilnih snovi, kot je glukoza.

===Rebeka Dajčman: Metabolizen, signalizacija in farmakološka funkcija ketonskih teles===
ketonska telesa nastanejo kot stranski produk pri presnovi maščobnih kislin. mednje sodijo acetoacetat, aceton in najobstojnejši beta hidroksibutirat. njihova sinteza se poveča, ko telesu primanjkuje ogljikovih hidratov. to je med stradanjem, po športni aktivnosti, med nosečnostjo ali med ketonsko dieto. v seminarski nalogi bom predstavila metabolično bot ketonskih teles. od sinteze v jetrih do njihovega transporta v ostala tkiva. to so predvsem skeletne mišice, srce in možgani ter njihovo oksidacijo nazaj v acetil-CoA. sinteza ketonskih teles je regulirana s transkripcijsko in post-translacijsko regulacijo. pri tem gre predvsem za regulacijo encimov, ki sodelujejo v sintezi in razgradnji teles. ketonska telesa pa imajo vlogo regulacije dveh membranskih receptorje ali histonske deacetilaze. ketonska telesa se že desetletja uporabljajo v zdravljenju nevrodegenerativnih bolezni in v tej smeri tudi tečejo prihodnje raziskave

===Sumeja Kudelić: Transsulfuracijska pot kot obrambni mehanizem celic pri oksidativnem stresu===
Transsulfuracijska pot, kot novo raziskovalno področje nam podarja veliko pozitivnih načinov v boju proti oksidativnemu stresu. Oksidativni stres, kot negativni dejavnik celic s svojimi reaktivnimi kisikovim zvrsti, poškoduje različne celične organele, kar vodi do celične smrti. Pri transsulfuraciji poti je ugotovljeno, da bistveni pomen ima cistein y-liaza, ki je biosintetični encim cisteina. Pri razgradnji cisteina lahko pridobimo vodikov sulfid (H2S), ki je v zelo majhnih koncentracijah pomemben signalizator celice. Več mehanizmov pozitivnega delovanja transsulfuracije poti (posredne ali neposredne) je raziskano, te so prišli do rezultatov, ki bi lahko pomagali pri izboljšanem terapevtskem zdravljenju nevrodegenerativnih bolezni, ki so povezane z metabolizmom aminokislin. Važno je iztakniti, da s pomočjo tega mehanizma ali z njeno inhibicijo bi tudi vplivali na bakterijsko smrt. Saj se pri bakterijah razvila obrambna stimulacija transsulfuracijske poti, pri čemer so bakterije postale 'imune' na antibiotike. Vodikov sulfid kot pomemben dejavnik transsulfuracijske poti vpliva na to, da veže proste ione, ki bi lahko v oksidativnih pogojih (H2O2) reagirali s to spojino. Kot posledica reakcije nastanejo prosti kisikovi radikali, ki poškodujejo celične organele. Nevrodegenerativne bolezni uporabljajo transsulfuracijsko pot kod pomemben vir aminokislin in tudi s tem preprečujejo, da so njihove celice izpostavljene oksidativnemu stresu.

===Matija Ruparčič: Ureaze in njihova vloga v živih bitjih===
Ureaze so metaloencimi, ki katalizirajo hidrolizo uree oziroma sečnine. Pri tem nastaneta dve molekuli amoniaka ter ena molekula ogljikovega dioksida. Najdemo jih v veliko organizmih kot so rastline, glive in bakterije. Le živali jih nimajo, saj se pri njih sečnina tvori kot odpadni produkt. Strukturno se razlikujejo glede na vrsto organizma, zapis za njihove sestavne dele pa se skriva v velikem številu genov. Za organizme, ki jih vsebujejo, predstavljajo ključen faktor za življenje. S pomočjo njih lahko bakterije ''Helicobacter pylori'' preživijo v ekstremno kislih razmerah želodca, bakterijam ''Proteus mirabilis'' omogočajo tvorbo zaščitnih biofilmov, rastlinam pa zagotavljajo bogat vir dušika in jim pomagajo pri katabolizmu arginina. Pred kratkim pa so odkrili, da imajo poleg tega ureaze še druge naloge, ki niso povezane z njihovo katalitično sposobnostjo. Med te štejemo vlogo medcelične komunikacije pri lišajih, obramba pred oksidativnim stresom kot odgovor imunskega sistema in še veliko več. Poznamo jih sicer že skoraj 150 let, vendar o njih vemo še vedno relativno malo. Motivacija za njihovo preučevanje pa je velika, saj nam lahko pomagajo k napredkom na raznih področjih kot sta medicina in agronomija.
===Maks Kumek: Vloga metabolizma arginina v celični regulaciji in erekcija===
Izmed vseh intermediatov ureinega ciklusa je pravzagotovo arginin najbolj prepleten v razne regulacijske sisteme celiceMetabolične poti arginina so kompleksne in se mnogokrat prepletajo med seboj. Sinteza arginina poteka v različnih predelih telesa v ti. črevesno renalni osi. Pretvorba glutamina vse do citrulina poteka v celicah tankega črevesja. Citrulin se izloči v krvni obtok in potuje do ledvic, kjer se nadaljnjo sintetizira do argenina. Regulacija nastajanja produktov je tesno povezana z transportnimi regulatorji družine SLC7 ( CAT 1, CAT-2A, y+LAT, b0,+, CAT-2B) . Regulacija transporterjev ne poteka le na transkripcijskem nivoju temveč tudi na posttranslacijskem nivoju (npr. spermin). Kompleksnost s poglabljanjem le narašča.Vrste encimov, pri katerih igra arginin vlogo substrata so: arginaza, NOS (ang. nitric oxide synthase), arginin dekarboksilaza (ADC), arginin:glicil amidinotransferaza. NOS so trije izocimi: iNOS, nNOS, eNOS. Ti trije encimi so prostorsko in regulacijsko ločeni med seboj, vendar pa je moč tudi pri njih zapaziti prepletanje delovanja v procesu kot je erekcija.Razumevanje vloge metaboličnih produktov arginina v celic pomaga razumeti širšo sliko imunološkega odziva, preprečevanje bolezenskih stanj (npr. impotence) in konec koncev tudi razumevanje lastnega telesa.

BIO2 Seminar 2018

2018-11-23T18:14:32Z

Maks Kumek: /* Seznam seminarjev */

= Biokemijski seminar =
doc. dr. Gregor Gunčar, K2.022

== Seznam seminarjev ==
{| {{table}}
| align="left" style="background:#f0f0f0;"|'''ime in priimek'''
| align="left" style="background:#f0f0f0;"|'''poglavje'''
| align="left" style="background:#f0f0f0;"|'''naslov seminarja'''
| align="left" style="background:#f0f0f0;"|'''recenzent 1'''
| align="left" style="background:#f0f0f0;"|'''recenzent 2'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''datum oddaje'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''datum recenzije'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''datum predstavitve'''
|-
| Eva Gartner || 12 || [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2018#Eva_Gartner:_Wnt_signalizacija_in_njena_vloga_pri_sr.C4.8Dni_fibrozi Wnt signalizacija in njena vloga pri srčni fibrozi] || Anamarija Agnič || Anastasija Nechevska || 15/10/2018 || 16/10/2018 || 17/10/2018
|-
| Aljaž Bratina || 12 || [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2018#Alja.C5.BE_Bratina:_Pomen_razli.C4.8Dnih_signalnih_poti_pri_staranju Pomen različnih signalnih poti pri staranju]|| Lara Drinovec || Liza Ulčakar || 15/10/2018 || 16/10/2018 || 17/10/2018
|-
| Karmen Mlinar || 12 || [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2018#Karmen_Mlinar:_Signalizacija_in_odzivi_na_abiotski_stres_pri_rastlinah Signalizacija in odzivi na abiotski stres v rastlinah] || Luka Gnidovec || Maja Škof || 15/10/2018 || 16/10/2018 || 17/10/2018
|-
| Tina Zavodnik || 12 || [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2018#Tina_Zavodnik:_Mehani.C4.8Dna_transdukcija_in_proteini_Piezo Mehanična transdukcija in proteini Piezo] || Jernej Imperl || Ajda Godec || 19/10/2018 || 22/10/2018 || 24/10/2018
|-
| Meta Kodrič || 12 || [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2018#Meta_Kodri.C4.8D:_Svetlobne_signalne_poti_za_uravnavanje_fotomorfogeneze Svetlobne signalne poti za uravnavanje fotomorfogeneze] || Laura Gašperšič || Neža Blaznik || 19/10/2018 || 22/10/2018 || 24/10/2018
|-
| Neža Žerjav || 12 || [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2018#Ne.C5.BEa_.C5.BDerjav:_Vloga_kaspaz_pri_celi.C4.8Dni_smrti Vloga kaspaz pri celični smrti] || Nika Boštic || Urša Štrancar || 19/10/2018 || 22/10/2018 || 24/10/2018
|-
| Doroteja Armič || 14-15 || [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2018#Doroteja_Armi.C4.8D:_Bifunkcionalen_encim_PFK-2.2FFBPaza-2_in_njegova_vloga_v_metabolizmu_glukoze Bifunkcionalen encim PFK-2/FBPaza-2 in njegova vloga v metabolizmu glukoze] || Eva Gartner || Anamarija Agnič || 02/11/2018 || 05/11/2018 || 07/11/2018
|-
| Lara Drinovec || 14-15 || AMPK in avtofagija pri glukoznem/glikogenem metabolizmu || Aljaž Bratina || Barbara Jaklič || 02/11/2018 || 05/11/2018 || 07/11/2018
|-
| Martina Lokar || 14-15 || [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2018#Martina_Lokar:_Biotinilacija_proteinov Biotinilacija proteinov]|| Karmen Mlinar || Luka Gnidovec || 02/11/2018 || 05/11/2018 || 07/11/2018
|-
| Marko Pavleković || 16 || Vloga sukcinata kot ligand z G proteini vezanega receptorja GPR91 || Tina Zavodnik || Jernej Imperl || 09/11/2018 || 12/11/2018 || 14/11/2018
|-
| Valeriya Musina || 16 || Vpliv intermediatov Krebsovega cikla na celične procese || Meta Kodrič || Laura Gašperšič || 09/11/2018 || 12/11/2018 || 14/11/2018
|-
| Tina Kolenc Milavec || 16 || [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2018#Tina_Kolenc_Milavec:_Intermediati_Krebsovega_cikla_kot_signalne_molekule_pri_vnetnem_in_protivnetnem_odgovoru Intermediati Krebsovega cikla kot signalne molekule pri vnetnem in protivnetnem odgovoru]|| Neža Žerjav || Nika Boštic || 09/11/2018 || 12/11/2018 || 14/11/2018
|-
| Andrej Špenko || 17 || Regulacija oksidacije maščobnih kislin v skeletnih mišicah || Doroteja Armič || Eva Gartner || 16/11/2018 || 19/11/2018 || 21/11/2018
|-
| Tadej Medved || 17 || [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2018#Tadej_Medved:_Vpliv_oksidacije_ma.C5.A1.C4.8Dobnih_kislin_na_usodo_celic Vpliv oksidacije maščobnih kislin na usodo celic] || Sanja Stanković || Aljaž Bratina || 16/11/2018 || 19/11/2018 || 21/11/2018
|-
| Klementina Polanec || 17 || Sirtuini kot regulatorji oksidacije maščobnih kislin || Martina Lokar || Karmen Mlinar || 16/11/2018 || 19/11/2018 || 21/11/2018
|-
| Rebeka Dajčman || 17 || Ketonska telesa kot signalni metaboliti || Marko Pavleković || Tina Zavodnik || 16/11/2018 || 19/11/2018 || 21/11/2018
|-
| Sumeja Kudelić || 18 || Transsulfuracijska pot kot obrambni mehanizem celic pri oksidativnem stresu || Valeriya Musina || Meta Kodrič || 23/11/2018 || 26/11/2018 || 28/11/2018
|-
| Matija Ruparčič || 18 || Encimi ureaze in njihova vloga v živih bitjih || Tina Kolenc Milavec || Neža Žerjav || 23/11/2018 || 26/11/2018 || 28/11/2018
|-
| Maks Kumek || 18 || Vloga metabolizma arginina v celični regulaciji in erekcija || Andrej Špenko || Doroteja Armič || 23/11/2018 || 26/11/2018 || 28/11/2018
|-
| Anže Šumah || 19 || Termogeneza in termogenin || Tadej Medved || Sanja Stanković || 30/11/2018 || 03/12/2018 || 05/12/2018
|-
| Barbara Jaklič || 19 || moj naslov || Klementina Polanec || Martina Lokar || 30/11/2018 || 03/12/2018 || 05/12/2018
|-
| Gašper Anton Komatar || 19 || Kako športna vadba pospeši biosintezo mitohondrijev in vpliva na zdravje || Rebeka Dajčman || Marko Pavleković || 30/11/2018 || 03/12/2018 || 05/12/2018
|-
| Praznik Liza || 19 || moj naslov || Sumeja Kudelić || Valeriya Musina || 30/11/2018 || 03/12/2018 || 05/12/2018
|-
| Lara Hrvatin || 20 || Mehanizmi koncentriranja ogljika || Matija Ruparčič || Tina Kolenc Milavec || 07/12/2018 || 10/12/2018 || 12/12/2018
|-
| Sonja Gabrijelčič || 20 || moj naslov || Maks Kumek || Andrej Špenko || 07/12/2018 || 10/12/2018 || 12/12/2018
|-
| Anastasija Nechevska || 20 || moj naslov || Anže Šumah || Tadej Medved || 07/12/2018 || 10/12/2018 || 12/12/2018
|-
| Liza Ulčakar || 21 || Vloga interakcij med lipidnimi kapljicami in organeli pri homeostazi lipidov|| Barbara Jaklič || Klementina Polanec || 14/12/2018 || 17/12/2018 || 19/12/2018
|-
| Maja Škof || 21 || Sinteza sfingolipidov in njihova vloga v celicah || Gašper Anton Komatar || Rebeka Dajčman || 14/12/2018 || 17/12/2018 || 19/12/2018
|-
| Ajda Godec || 21 || Biosinteza leukotriena B4 || Praznik Liza || Sumeja Kudelić || 14/12/2018 || 17/12/2018 || 19/12/2018
|-
| Neža Blaznik || 22 || moj naslov || Lara Hrvatin || Matija Ruparčič || 04/01/2019 || 07/01/2019 || 09/01/2019
|-
| Urša Štrancar || 22 || moj naslov || Sonja Gabrijelčič || Maks Kumek || 04/01/2019 || 07/01/2019 || 09/01/2019
|-
| Anamarija Agnič || 22 || moj naslov || Anastasija Nechevska || Anže Šumah || 04/01/2019 || 07/01/2019 || 09/01/2019
|-
| Sanja Stanković || 23 || moj naslov || Liza Ulčakar || Lara Drinovec|| 04/01/2019 || 07/01/2019 || 09/01/2019
|-
| Luka Gnidovec || 23 || moj naslov || Maja Škof || Gašper Anton Komatar || 11/01/2019 || 14/01/2019 || 16/01/2019
|-
| Jernej Imperl || 23 || moj naslov || Ajda Godec || Praznik Liza || 11/01/2019 || 14/01/2019 || 16/01/2019
|-
| Laura Gašperšič || 23 || moj naslov || Neža Blaznik || Lara Hrvatin || 11/01/2019 || 14/01/2019 || 16/01/2019
|-
| Nika Boštic || 23 || moj naslov || Urša Štrancar || Sonja Gabrijelčič || 11/01/2019 || 14/01/2019 || 16/01/2019
|}

*številka v okencu za temo pomeni poglavje v Lehningerju, v katerega naj izbrana tema spada
Sporočite mi morebitne napake ali če vas nisem razporedil.

== Gradivo za predavanja ==
Gradivo za predavanja in seminarje najdete na http://bio.ijs.si/~zajec/bio2/
username: bio2
password: samozame

==Naloga==
'''Vaša naloga za seminar je: '''
Samostojno pripraviti seminar o seminarski temi, ki vam je bila dodeljena. Za osnovo morate vzeti pregledni članek iz revije, ki ima faktor vpliva nad 5 (npr. [http://www.sciencedirect.com/science/journal/09680004/ TIBS]. Poiskati morate še vsaj tri znanstvene članke, ki se nanašajo na opisano temo in jih uporabiti kot podlago za seminarsko nalogo! Članki so dostopni [http://93.174.95.27/scimag/ tukaj].

Za pripravo seminarja velja naslednje: 
* [[BIO2 Povzetki seminarjev 2018|Povzetek seminarja]] opišete na wikiju '''v 200 besedah''' (+- dvajset besed) - najkasneje do dne ko morate oddati seminar recenzentom.
* Povezavo do povzetka vnesete v tabelo seminarjev tekočega letnika.
* Seminar pripravite v obliki seminarske naloge na ~5-12 straneh A4 (pisava 12, enojni razmak, 2,5 cm robovi). Zelo pomembno je, da je obseg od 2700 do 3000 besed , a ne več kot 3500 besed. Seminarska naloga mora vsebovati najmanj tri slike. Eno sliko morate narisati sami in to pod sliko posebej označiti. Slika mora imeti legendo in v besedilu mora biti na ustreznem mestu sklic na sliko. 
* Seminar oddajte do datuma oddaje, ki je naveden v tabeli v elektronski obliki z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/ tega obrazca].
* Vsi seminarji so v elektronski obliki dostopni [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/bioseminar/ tukaj].
* Recenzenti do dneva določenega v tabeli določijo popravke (v elektronski obliki) in podajo oceno pisnega dela. Popravljen seminar oddajte z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/ tega obrazca].
* Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Za predstavitev je na voljo 20 minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni.
* Predstavitvi sledi razprava. Recenzenti podajo oceno predstavitve in postavijo najmanj dve vprašanji.Vsi ostali morajo postaviti še dve dodatni vprašanji v toku celega seminarskega obdobja. Vprašanja, ki ste jih postavili vpišite na [https://docs.google.com/forms/d/e/1FAIpQLSdV9OFlNzI3XyS8FRGnuIbG89gwH_36uwz29ocigV--2CXSbQ/viewform tukaj].
* Na dan predstavitve morate docentu še pred predstavitvijo oddati končno (popravljeno) in natisnjeno verzijo seminarja v enem izvodu, elektronsko verzijo seminarja in predstavitev pa oddati na strežnik na dan predstavitve do polnoči.
* Seminarska naloga in povzetek morajo biti v slovenskem jeziku, razen za študente, katerih materni jezik ni slovenščina. Ti lahko oddajo seminar v angleškem jeziku.

==Imena datotek==
Prosim vas, da vse datoteke, ki mi jih pošiljate poimenujete po naslednjem receptu:
* 312_BIO_Priimek_Ime.doc(x) za seminar, npr. 312_BIO_Guncar_Gregor.docx
* 312_BIO_Priimek_ime_final.doc(x) za končno verzijo seminarja
* 312_BIO_Priimek_Ime_rec_Priimek2.doc(x) za recenzijo, kjer je Priimek2 priimek recenzenta, npr. 312_BIO_Guncar_Gregor_rec_Scott.docx (če se pišete Scott in odajate recenzijo za seminar, ki ga je napisal Gunčar)
* 312_BIO_Priimek_Ime.ppt(x) za prezentacijo, npr 312_BIO_Guncar_Gregor.pptx
* 312_BIO_Priimek_ime_poprava.doc(x) za popravljeno končno verzijo seminarja, če so popravki manjši

==Ocenjevanje seminarjev==
Recenzenti ocenijo seminar tako, da izpolnijo [https://docs.google.com/forms/d/1EQDYwFO-DEzZ2R7jf8DhLqIeV4FFxRd3-ScceEASpt4/viewform recenzentsko poročilo] na spletu. Recenzentsko poročilo morate oddati najkasneje do 21:00, en dan pred predstavitvijo seminarja.

== Mnenje o predstavitvi ==
Vsak posameznik odda svoje mnenje o predstavitvi takoj po predstavitvi z online glasovanjem.

==Urejanje spletnih strani na wikiju==
Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''

==Citiranje virov==
Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se držite ene same. V seminarskih nalogah in diplomskih nalogah FKKT uprabljajte shemo citiranja, ki je pobarvana zeleno.
Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati.
Za citate v naravoslovju je najpogostejše citiranje po pravilniku ISO 690. [http://www.zveza-zotks.si/gzm/dokumenti/literatura.html Pravila], ki upoštevajo omenjeni standard, so pripravili pri ZTKS. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati. 
'''Citiranje knjig:''' 
Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica. 
Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN. 

Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005. 
Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4. 
Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.).

'''Citiranje člankov:''' 
Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani. 
Lartigue, C., Glass, J. I., Alperovich, N., Pieper, R., Parmar, P. P., Hutchison III, C. A., Smith, H. O. in Venter, J. C.
Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, 317, str. 632-638.

Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole: 
Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani. 
Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.

Revija Science uporablja skrajšani zapis: 
C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007) 

V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne). Navesti morate tudi vse avtorje dela, razen v primeru, ko jih je 10 ali več. Takrat navedite le prvih devet, za ostale pa uporabite okrajšavo in sod. (in sodelavci). Pred zadnjim avtorjem naj bo vedno besedica "in".

'''Citiranje spletnih virov:''' 
Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov 
strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life 
Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.

TBK2018-seminar

2018-04-17T19:20:04Z

Maks Kumek: /* Seznam seminarjev */

= Temelji biokemije- seminar =

Seminarje vodi prof. dr. Brigita Lenarčič. Seminarji so obvezni.

Ocena seminarjev (6-10) predstavlja enako število odstotkov, ki se prišteje h končni pisni oceni izpita.
Stran na strežniku s seminarskimi nalogami je zaščitena.
Uporabniško ime je: tbk, password pa: samozame## "##" sta dve številki, ki ju izveste na predavanjih.
Tudi za urejanje Wiki strani potrebujete geslo, ki se od zgornjega razlikuje. Postopek pridobitve Wiki uporabniškega imena in gesla je opisan [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Main_Page tukaj].

== Seznam seminarjev ==

{| border="1" cellpadding="4" cellspacing="0" style="border:#c9c9c9 1px solid; margin: 1em 1em 1em 0; border-collapse: collapse;"
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Ime in priimek'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Naslov seminarja'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Povezava'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Rok za oddajo'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Rok za recenzijo'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Datum predstavitve'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 1'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 2'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 3'''
|-
| Anna Scott||Moj naslov v slovenščini||http://www.bioscirep.org/content/36/1/e00291.long||28.10.||05.11.||07.11.||r1||r2||r3
|-
| Doroteja Armič || Pretvorba mišjih fibroblastov v pluripotentne matične celice s pomočjo tehnologije CRISPR || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/01/180118162449.htm || 27.02. || 02.03. || 05.03. || Martina Lokar || Liza Ulčakar || Zoja Siter
|-
| Valeriya Musina || Metalopeptid bakrov(II) fenantrolin tarčno onemogoči delovanje mitohondrijev v matičnih celicah raka dojke || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/12/171213124751.htm || 27.02. || 02.03. || 05.03. || Nika Boštic || Tiana Karmen Kokalj || Aljaž Bratina
|-
| Dea Simonič || Sprožilci avtoimunskih bolezni in vzroki za nekontrolirano širjenje le-teh po telesu ||https://www.sciencedaily.com/releases/2017/08/170824141207.htm|| 27.02. || 02.03. || 05.03. || Sumeja Kudelić || Jernej Imperl || Anamarija Agnič
|-
| Neža Štremfelj ||Delovanje inzulinskih receptorjev||https://www.sciencedaily.com/releases/2018/02/180219103256.htm|| 27.02. || 02.03. || 05.03. || Luka Gnidovec || Matija Ruparčič || Simona Gorgievska
|-
| Gašper Komatar || Tvorba kompleksa receptorjev ApoER2, ephirinB2 in AMPAR, ki jih povezuje GRIP1, sodeluje pri tvorbi spomina || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/10/171009093207.htm || 06.03. || 09.03. || 12.03. || Lara Hrvatin || Tiana Karmen Kokalj || Matej Jereb
|-
| Marko Pavleković || Prehajanje imunskih celic, povzročiteljic multiple skleroze, skozi krvno-možgansko pregrado || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/11/171121155811.htm || 06.03. || 09.03. || 12.03. || Klementina Polanec || Meta Kodrič || Lara Drinovec
|-
| Laura Gašperšič || Alzheimerjeva bolezen: povrnitev zmožnosti pomnjenja z inhibicijo interakcije med Sp3 in HDAC2 || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/08/170808150001.htm || 06.03. || 09.03. || 12.03. || Karmen Mlinar || Ana Menegalija || Maks Kumek
|-
| Rebeka Dajčman || Več mehanizmov poganja dinamiko kalcijevega signala okoli lasersko povzročene rane epitelija || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/10/171003124646.htm || 06.03. || 09.03. || 12.03. || Ula Nikolaja Ratajec || Andreja Marija Belič || Neža Blaznik
|-
| Maja Škof || Pomen S-proteinov pri prilagajanju koronavirusov na okolje. || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/11/171127105937.htm || 13.03. || 16.03. || 19.03. || Doroteja Armič || Barbara Jaklič || Liza Ulčakar
|-
| Tina Kolenc Milavec || Vezava kalcija na karboksilni konec α-sinukleina uravnava interakcije med sinaptičnimi vezikli || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/02/180219071758.htm || 13.03. || 16.03. || 19.03. || Valeriya Musina || Eva Gartner || Jana Rajchevska
|-
| Tina Zavodnik || Disfunkcionalni mitohondriji s pomočjo ROS zavirajo translacijsko aktivnost || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/02/180202112629.htm || 13.03. || 16.03. || 19.03. || Dea Simonič || Martina Lokar || Jernej Imperl
|-
| Tadej Medved || Identifikacija vezavnih mest proteinov WASP na aktinski ojedritveni kompleks Arp2/3 || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/03/180305130632.htm || 13.03. || 16.03. || 19.03. || Neža Štremfelj || Nika Boštic || Matija Ruparčič
|-
| Bogdan Jovićević || || || 20.03. || 23.03. || 26.03. || Laura Gašperšič || Lara Hrvatin || Ana Menegalija
|-
| Polona Kalan || || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/02/180214111055.htm || 20.03. || 23.03. || 26.03. || Rebeka Dajčman || Klementina Polanec || Andreja Marija Belič
|-
| Liza Praznik ||Vpliv šaperono Skp in SurA na zvijanje proteinov FhuA v terciarno strukturo ||https://www.sciencedaily.com/releases/2015/09/150907113757.htm || 20.03. || 23.03. || 26.03. || Maja Škof || Karmen Mlinar || Barbara Jaklič
|-
| Anže Šumah || Razvoj genskega senzorja za uničevanje celic s pomanjkanjem proteina p53 || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/11/171114104201.htm || 20.03. || 23.03. || 26.03. || Tina Kolenc Milavec || Ula Nikolaja Ratajec || Eva Gartner
|-
| Neža Žerjav|| Dodajanje enega samega nukleotida omejuje aktivnost človeške telomeraze ||https://www.sciencedaily.com/releases/2018/02/180227142114.htm || 03.04. || 06.04. || 09.04. || Tina Zavodnik || Doroteja Armič || Martina Lokar
|-
| Urša Štrancar || Predstavitev združitve avtofagosoma in lizosoma s pomočjo supermolekularnega para FRET || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/02/180219103254.htm || 03.04. || 06.04. || 09.04. || Tadej Medved || Valeriya Musina || Nika Boštic
|-
| Zoja Siter || || || 03.04. || 06.04. || 09.04. || Neža Žerjav || Dea Simonič || Sumeja Kudelić
|-
| Aljaž Bratina || Intrinzična destabilizacija ribosoma || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/11/171120101314.htm || 03.04. || 06.04. || 09.04. || Anastasija Nechevska || Neža Štremfelj || Luka Gnidovec
|-
| Anamarija Agnič || ATP-aza P4 s premeščanjem fosfolipidov uravnava uvihanost membrane || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/03/180329141014.htm || 10.04. || 13.04. || 16.04. || Bogdan Jovićević || Sumeja Kudelić || Lara Hrvatin
|-
| Simona Gorgievska || Optical tools to detect metabolic changes linked to disease || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/03/180307161351.htm|| 10.04. || 13.04. || 16.04. || Polona Kalan || Marko Pavleković || Klementina Polanec
|-
| Matej Jereb || Gradnja človeške pluripotentne matične celice v funkcionalno skeletno mišično tkivo|| https://www.sciencedaily.com/releases/2018/01/180109104707.htm || 10.04. || 13.04. || 16.04. || Liza Praznik || Laura Gašperšič || Karmen Mlinar
|-
| Lara Drinovec || Tavrin pomaga obnoviti zaradi multiple skleroze poškodovane celice || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/12/171208143024.htm || 10.04. || 13.04. || 16.04. || Anže Šumah || Rebeka Dajčman || Ula Nikolaja Ratajec
|-
| Maks Kumek || Dinamični izvor sprememb specifčne toplote v encimsko kataliziranih reakcijah || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/03/180321090854.htm || 17.04. || 20.04. || 23.04. || Marko Pavleković || Maja Škof || Doroteja Armič
|-
| Neža Blaznik || Glikozilirana sialična kislina na protitelesu IgA inhibira virus influence tipa A || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/04/180403111203.htm || 17.04. || 20.04. || 23.04. || Urša Štrancar || Tina Kolenc Milavec || Valeriya Musina
|-
| Liza Ulčakar || ||https://www.sciencedaily.com/releases/2017/11/171129163851.htm || 17.04. || 20.04. || 23.04. || Zoja Siter || Tina Zavodnik || Dea Simonič
|-
| Anastasija Nechevska || || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/03/180319155730.htm || 17.04. || 20.04. || 23.04. || Aljaž Bratina || Tadej Medved || Neža Štremfelj
|-
| Jernej Imperl || Optimizacija antimikrobnih peptidov s pomočjo virtualnih metod || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/04/180416085922.htm || 23.04. || 26.04. || 07.05. || Anamarija Agnič || Neža Žerjav || Luka Gnidovec
|-
| Matija Ruparčič || || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/01/180131095453.htm || 23.04. || 26.04. || 07.05. || Simona Gorgievska || Anastasija Nechevska || Marko Pavleković
|-
| Tiana Karmen Kokalj || B-1a limfociti spodbujajo oligodendrogenezo med razvojem možganov || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/03/180313091702.htm || 23.04. || 26.04. || 07.05. || Matej Jereb || Bogdan Jovićević || Laura Gašperšič
|-
| Meta Kodrič || || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/01/180125101321.htm || 23.04. || 26.04. || 07.05. || Lara Drinovec || Polona Kalan || Rebeka Dajčman
|-
| Ana Menegalija || || || 08.05. || 11.05. || 14.05. || Maks Kumek || Liza Praznik || Maja Škof
|-
| Andreja Marija Belič || || || 08.05. || 11.05. || 14.05. || Neža Blaznik || Anže Šumah || Tina Kolenc Milavec
|-
| Barbara Jaklič || || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/02/180220161201.htm || 08.05. || 11.05. || 14.05. || Liza Ulčakar || Meta Kodrič || Tina Zavodnik
|-
| Eva Gartner || || || 08.05. || 11.05. || 14.05. || Gašper Komatar || Urša Štrancar || Tadej Medved
|-
| Martina Lokar || || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/03/180301144138.htm || 15.05. || 18.05. || 21.05. || Jernej Imperl || Zoja Siter || Neža Žerjav
|-
| Nika Boštic || || || 15.05. || 18.05. || 21.05. || Matija Ruparčič || Aljaž Bratina || Anastasija Nechevska
|-
| Sumeja Kudelić || ||https://www.sciencedaily.com/releases/2017/12/171221122927.htm || 15.05. || 18.05. || 21.05. || Tiana Karmen Kokalj || Anamarija Agnič || Bogdan Jovićević
|-
| Luka Gnidovec || || || 15.05. || 18.05. || 21.05. || Meta Kodrič || Simona Gorgievska || Polona Kalan
|-
| Lara Hrvatin || Mg2+ ioni omogočajo kondenzacijo kromosomov || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/02/180201104559.htm || 22.05. || 25.05. || 28.05. || Ana Menegalija || Matej Jereb || Liza Praznik
|-
| Klementina Polanec || || || 22.05. || 25.05. || 28.05. || Andreja Marija Belič || Lara Drinovec || Anže Šumah
|-
| Karmen Mlinar || || || 22.05. || 25.05. || 28.05. || Barbara Jaklič || Maks Kumek || Gašper Komatar
|-
| Ula Nikolaja Ratajec || || || 22.05. || 25.05. || 28.05. || Eva Gartner || Neža Blaznik || Urša Štrancar
|-
| rezerva || || || 29.05. || 01.06. || 04.06. || || ||
|}

==Naloga==
* samostojno pripraviti seminar, katerega tema je novica iz področja biokemije na portalu [http://www.sciencedaily.com ScienceDaily], ki je bila objavljena kasneje kot 1. avgusta 2016. Osnova za seminar naj bo znanstveni članek, ki je podlaga za to novico. Poleg tega članka za seminar uporabite še najmanj pet drugih virov, od teh vsaj še dva druga znanstvena članka, ki se navezujeta na to vsebino.
* članke na temo lahko iščete [https://scholar.google.com/ z Google učenjakom].
* naslov izbrane teme in povezavo do novice vpišite v tabelo seminarjev takoj ko ste si izbrali temo, najkasneje pa en teden pred rokom za oddajo
* [[TBK2017 Povzetki seminarjev|Povzetek seminarja]] opišete na wikiju v približno 200 besedah - najkasneje do dne, ko morate oddati seminar recenzentom.
* Povezavo do povzetka vnesete v tabelo seminarjev tekočega letnika.
* Seminar pripravite v obliki seminarske naloge (pisava Cambria, font 11, enojni razmak, 2,5 cm robovi; tekst naj obsega okoli 1000 besed), vsebuje naj 1-2 sliki. Slika mora imeti legendo in v besedilu mora biti na ustreznem mestu sklic na sliko. Vse uporabljene vire citirajte v tekstu, kot npr. (Nobel, 2010), na koncu pa navedite točen seznam literature, kot je opisano spodaj!
*Celotni seminar naj obsega 2 strani A4 formata (po možnosti dvostransko tiskanje).
* Seminar oddajte do datuma oddaje, ki je naveden v tabeli v elektronski obliki z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/tbk/poslji/ tega obrazca].
* vsi seminarji so v elektronski obliki dostopni [http://bio.ijs.si/~zajec/tbk/poslji//bioseminar/ tukaj].
* Recenzenti do dneva določenega v tabeli določijo popravke in podajo oceno pisnega dela, v predpisanem formatu elektronskega obrazca na internetu.
* Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Za predstavitev je na voljo 12 minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni. Prvi recenzent vodi predstavitve in razpravo ter skrbi za to, da vse poteka v zastavljenih časovnih okvirih.
* Predstavitvi sledi razprava do 8 minut. Sledijo vprašanja prisotnih, recenzenti postavijo vsak vsaj dve vprašanji in na koncu podajo oceno predstavitve.
* En dan pred predstavitvijo na strežnik oddajte tudi končno verzijo. Na dan predstavitve morate oddati tudi končno (popravljeno) in natisnjeno verzijo seminarja v enem izvodu.
* Seminarska naloga in povzetek na wikiju morajo biti v slovenskem jeziku!

==Imena datotek==
Prosim vas, da vse datoteke, ki jih pošiljate poimenujete po spodnjih pravilih. Ne uporabljajte ČŽŠčžš!
Poslati morate naslednje datoteke:
* TBK_2018_Priimek_Ime.doc(x) za seminar, npr. TBK_2017_Guncar_Gregor.docx
* TBK_2018_Priimek_ime_final.doc(x) za končno verzijo seminarja
* TBK_2018_Priimek_Ime_rec_Priimek2.doc(x) za recenzijo, kjer je Priimek2 priimek recenzenta, npr. TBK_2017_Guncar_Gregor_rec_Scott.docx (če se pišete Scott in odajate recenzijo za seminar, ki ga je napisal Gunčar)
* TBK_2018_Priimek_Ime.ppt(x) za prezentacijo, npr TBK_2017_Guncar_Gregor.pptx
* TBK_2018_Priimek_Ime_clanek.pdf za datoteko PDF, ki vsebuje izvirni članek, npr. TBK_2017_Guncar_Gregor_clanek.pdf

==Ocenjevanje seminarjev==
Recenzenti ocenijo seminar tako, da izpolnijo [[https://docs.google.com/forms/d/1Hdg2OHCyG24qwLTnFt09yZTng46RIwaIiUqnKOdsJxQ/viewform recenzentsko poročilo]] na spletu.

== Mnenje o predstavitvi ==
Vsak posameznik '''mora''' oceniti seminar tako, da odda svoje [https://docs.google.com/forms/d/1VvE-jaKikfiDO5Gdybqgp9mf_0uJZfBbIK8PLXKDaS0/viewform mnenje] najkasneje v enem tednu po predstavitvi. Kdor na seminarju ni bil prisoten, mnenja '''ne sme''' oddati.

==Urejanje spletnih strani na wikiju==
Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''

==Faktor vpliva==
Faktor vpliva (angl. impact factor) neke revije pove, kolikokrat so bili v poprečju citirani članki v tej reviji v dveh letih skupaj pred objavo tega faktorja. Faktorje vpliva za posamezno revijo lahko najdete v [http://www.cobiss.si/scripts/cobiss?command=CONNECT&base=JCR COBISS-u]. V polje "Naslov revije" vnesite ime revije za katero želite izvedeti faktor vpliva in pritisnite na gumb POIŠČI. V skrajnem desnem stolpcu se bodo izpisali faktorji vpliva za revije, ki ustrezajo vašim iskalnim kriterijem. Zadetkov za posamezno revijo je več zato, ker so navedeni faktorji vpliva za posamezno leto. Za tekoče leto faktorji vpliva še niso objavljeni, zato se orientirajte po faktorjih vpliva zadnjih par let. Če faktorja vpliva za vašo izbrano revijo ne najdete v bazi COBISS, potem izberite članek iz kakšne druge revije.

==Citiranje virov==Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se v seminarju držite ene same. Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati. '''Citiranje knjig:''' Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica. Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN. Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005. Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4. Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.). '''Citiranje člankov:''' Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani. Lartigue C. ''et al''. Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, letn. 317, str. 632-638.Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole: Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani. Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.Revija Science uporablja skrajšani zapis: C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007) V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne). '''Citiranje spletnih virov:''' Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.