Wiki FKKT - User contributions [en]

Konjugacijski prenos plazmidov pri bakteriji Bacillus subtilis

2024-05-04T21:52:33Z

Mark Frantar:

==Uvod==
Konjugacija je najbolj pogost mehanizem za horizontalni prenos genov in kot taka tudi najbolj zaslužna za širjenje genov za virulenco, toksine in odpornost proti antibiotikom. Posledično je eden izmed ciljev sodobnih raziskav na področju molekularne biologije razumevanje mehanizmov, po katerih konjugacija poteka. Medtem ko so procesi njene regulacije pri Gramnegativnih bakterijah, katerih predstavnica je ''E. Coli'' in njen plazmid IncF, že dokaj dobro raziskani, pri Grampozitivnih bakterijah ni tako. Nova odkritja na področju konjugacijskega prenosa plazmidov pri G+ bakteriji ''Bacillus subtilis'' bi lahko pripomogla k zmanjšanju te vrzeli.

==Konjugacija pri ''Bacillus subtilis''==
Pri procesu konjugacije sodeluje ogromno število različnih proteinov, nastanek katerih mora celica skrbno regulirati. Genski zapis za te konjugacijske proteine je lahko bodisi integriran v bakterijski kromosom ali pa je ohranjen na plazmidu, kakršen je tudi plazmid pLS20, najden v bakteriji ''Bacillus subtilis''. Začetne raziskave pri tem bacilu so pokazale, da mora biti potek konjugacije pri njem strogo reguliran, saj je bila konjugacija ves čas blokirana razen v ozkem časovnem intervalu na koncu eksponentne rasti celic.

===RcopLS20 deluje kot represor konjugacijskega operona===
V plazmidu pLS20 so nekateri geni izkazovali podobnost z že znanimi konjugacijskimi geni. Izkazalo se je, da ti geni spadajo pod isti operon, ki zajema gene od 28 do 74. Sekvenciranje ter ''in silico'' analiza plazmida sta nakazali, da bi transkripcijo na tem operonu lahko reguliral protein RcopLS20, ki ga zapisuje gen 27c, saj se gen nahaja pred operonom in mu je nasprotno usmerjen, njegovo zaporedje pa je podobno zaporedju za transkripcijske regulatorje Xre, ki imajo heliks-zavoj-heliks domeno. Z eksperimenti, kjer so opazovali izražanje RNA konjugacijskih genov pri različnih koncentracijah domnevnega regulatorja, so potrdili represorsko funkcijo RcopLS20.

===Sestava operatorske regije konjugacijskega operona===
V regiji med genoma 27c (represor RcopLS20) in 28 (konjugacijski operon) se nahajata dva promotorja: močan promotor Pc za prepisovanje konjugacijskega operona in šibek promotor Pr za prepisovanje RcopLS20. Promotorja sta nasprotno usmerjena in se prekrivata, kar pomeni, da bi se brez drugih dejavnikov (beri: regulatorjev) RNA polimeraza vezala samo na močnejši Pc. V okolici promotorjev so našli 10 polj z 8 bp dolgim zaporedjem CAGTGAAA, na katera se lahko veže RcopLS20. Polja se nahajajo v dveh regijah, ki nosita funkcijo operatorjev. Prvi operator (O1), ki vsebuje 4 Rco vezavna mesta, se nahaja na območju med genom 28 in promotorjema. Drugi operator (O2) s 6 RcopLS20 vezavnimi mesti pa se nahaja 75 bp stran od O1 in se prekriva s promotorjema. Operatorja sta med sabo nasprotno usmerjena, medtem ko so Rco vezavna mesta v posameznem operatorju enako orientirana.

===Mehanizem RcopLS20 represije vključuje nastanek DNA zanke===
Položaj in usmerjenost operatorjev sta sprožila sum, da RcopLS20 z vezavo na operator povzroči nastanek DNA zanke in s tem inhibira promotor Pc. Čeprav je za nastanek zanke potrebnih najmanj 90 bp DNA, razdalja med operatorjema pa je 75 bp, bi bila zanka v tem primeru vseeno možna, saj je vijačnica med operatorjema predhodno upognjena. Raziskave so pokazale tudi, da protein RcopLS20 v raztopini tvori tetramere. To dejstvo je skupaj z rezultati testa zamika elektroforezne mobilnosti za regulatorno regijo z vezanim RcopLS20 omogočilo določitev modela vezave RcopLS20. Tetramer RcopLS20 se veže na posamezni operator. Dva tetramera se nato povežeta (tvorita oktamer) in tako ustvarita DNA zanko. V tej konformaciji regulatorne regije je promotor Pc blokiran, kar omogoča vezavo RNA polimeraze na promotor Pr.

===Prekinitev represije povzroči RappLS20===
====Kaseta ''rap-phr''====
Da konjugacija lahko poteče, mora priti do prekinitve represije, to pa se v tem primeru zgodi preko proteina RappLS20. Ta je del družine proteinov RRNPP, poimenovano po značilnih predstavnikih Rap, Rgg, NprR, PlcR in PrgX. Geni za proteine RRNPP, ''rap'', se običajno prepisujejo istočasno kot geni ''phr'', ki zapisujejo ustrezen signalen peptid Phr*pLS20, o katerem bomo izvedeli več kasneje, v obliki kasete ''rap-phr''. Kromosom ''B. subtilis'' (ali plazmid) lahko vsebuje več ''rap-phr'' kaset, ki služijo zaustavljanju določenih razvojnih procesov kot je sporulacija, kompetenca in proizvodnja razgradnih encimov. Umetno povečano izražanje teh kaset na plazmidu pLS20 v ''B. subtilis'' ni vplivalo na razvojne procese, je pa močno vplivalo na konjugacijski proces, povečala se je največja raven konjugacije, povečalo se je izražanje konjugacijskih genov in razširilo se je časovno obdobje, v katerem je lahko uspešno potekala konjugacija. Pri odsotnosti kaset ''rap-phr'' pa je raven konjugacij močno upadla. Ti rezultati nakazujejo, da so RcopLS20, RcopLS20 in Phr*pLS20 edini proteini zapisani na plazmidu pLS20, ki so vpleteni v regulacijo konjugacijskih genov.

====RRNPP proteini====
RRNPP proteini so sestavljeni večinoma iz alfa heliksov in vsebujejo veliko C-terminalno domeno, ki interagira z ustreznim signalnim peptidom ter povzroči konformacijske spremembe in N-terminalno domeno, ki vsebuje efektorsko domeno sestavljeno iz treh alfa vijačnic, ki interagira s tarčno molekulo, svojo regulatorno vlogo pa lahko opravlja na različne načine. Prvi način je že omenjeni motiv heliks-zavoj-heliks, drugi je fosfatazna aktivnost, po kateri se imenujejo proteini Rap (Response regulator Aspartate Phosphatase) in tretji način, vezava efektorske domene na ustrezajoči efektorski protein, s čimer posredno ali neposredno zavre aktivnost efektorskega proteina.

====Delovanje RappLS20====
Efektorska domena RappLS20 deluje na tak način, da se veže neposredno na tetramer RcopLS20, kar povzroči, da se le ta odcepi od operatorjev. To je bilo ugotovljeno z analizo SAXS in velikostno izključitvene kromatografijo, poskusi sedimentacijske hitrosti pa so pokazali na tvorbo strukture, ki je ustrezala molekularni teži kompleksa RappLS20 dimera in RappLS20 tetramera. Z EMSA analizo je bilo ugotovljeno tudi, da se dimer RappLS20 preferenčno veže na tetramere že vezane v DNA zanke. DNA-zanke se tako razdrejo in prepis konjugacijskih genov je mogoč.

===Vpliv peptida Phr*pLS20===
Bakterije uporabljajo kemične signale, imenovane feromoni, za usklajevanje izražanja genov in vedenja celic v skupnosti. Feromoni nekaterih grampozitivnih bakterij, kot je ''Bacillus subtilis'', so kratki linearni peptidi, ki jih celica izloča, nato pa jih zaznajo citoplazemski feromon receptorji iz družine RRNPP. Peptid Phr*pLS20 kodira majhen odprt bralni okvir (44 aminokislin), po sekreciji pa ga cepi serinska proteaza, da nastane zrela aktivna oblika peptida. Tako kot pri drugih RRNPP proteinih in signalnih peptidih, tudi Phr*pLS20 interagira direktno s C-končno domeno RappLS20. Analize kažejo, da RappLS20 v raztopini večinoma tvori dimere, pri višjih koncentracijah pa ima tudi sposobnost tvoriti tetramere. Medtem pa ob prisotnosti Phr*pLS20 RappLS20 skoraj izključno tvori tetramere. RappLS20 je sestavljen iz velike C-končne domene iz 14 α vijačnic ter manjše N-končne domene iz 3 α vijačnic. Struktura z vezanim peptidom je pokazala, da se Phr*pLS20 veže v votlino C-končne domene, kar povzroči, da se N-končna domena premakne navzven. Ta položaj bolj ustreza tvorbi tetramer, pri čemer se dva dimera medsebojno povežeta prek N-končne domene, kar vodi do nastanka tako imenovane stopalo-stopalo konfiguracije. Ker so N-končne domene RappLS20 zasedene, ta ne more interagirati z RcopLS20, torej Phr*pLS20 inhibira antirepresorsko aktivnost RappLS20 in s tem zavira izražanje konjugacijskih genov.
Skupno gledano aktivacijsko stanje pLS20 konjugacijskih genov regulira koncentracija peptida Phr*pLS20. Ko večina celic populacije vsebuje plazmid, bo koncentracija peptida visoka in konjugacija inhibirana. Konjugacijski geni bodo aktivni, ko bo koncentracija Phr*pLS20 nizka, kar se zgodi, če so donorske celice v manjšini in potencialne prejemne celice v večini. Veliko število celic, ki lahko sprejmejo peptid, zniža koncentracijo Phr*pLS20, saj se relativno število donorskih celic zmanjša, poleg tega pa prejemne celice aktivno adsorbirajo signalni peptid. [https://www.frontiersin.org/files/Articles/648468/fmolb-08-648468-HTML-r1/image_m/fmolb-08-648468-g005.jpg Slika1]. Kaj se zgodi s kompleksom Rap-Phr ni znano, najbrž so kompleksi hitro razgrajeni ali pa obstaja mehanizem za recikliranje, znano pa je, da je promotor Prap konstituiven, torej se Rap in Phr stalno sintetizirata.
===Konjugacija in kompetenca===
Kompetenca je začasno stanje celic, v katerem so celice sposobne sprejeti DNA iz okolja in jo integrirati v svoj genom s homologno rekombinacijo. Konjugacija in kompetenca sta si podobna v tem, da gre pri obeh procesih za prenos enoverižne DNA(ssDNA), le da v nasprotnih smereh. Sočasen vnos in iznos regij ssDNA je za celico lahko nekompatibilno, saj se lahko ta transportna mehanizma medsebojno tekmujeta in se motita. Prav tako lahko rekombinantni encimi sintetizirani med fazo kompetence delujejo na ssDNA konjugativnega elementa. Dokazano je bilo, da sta konjugacija in kompetenca nekompatibilna procesa in obstajata vsaj 2 mehanizma, ki z recipročno inhibicijo skrbita, da se poti konjugacije in kompetence ne aktivirata sočasno.
==Zaključek==
V primerjavi z G- bakterijami sta konjugacija in regulacija konjugacijskih genov pri G+ bakterijah slabše poznana. Pri ''Bacillus subtilis'' je razen regulacije plazmida pLS20 znan tudi mehanizem ICEBs1 (integrativni konjugativni elementi), imenovan tudi konjugativni transpozoni. Nahajajo se na kromosomih in se lahko izrežejo ter zvijejo, nato pa prenesejo v druge celice. Gene ICEBs1 inhibira ImmR , ki je analog RcopLS20, antirepresor pa je v tem primeru RRNPP protein RapI. Celoten mehanizem delovanja RapI znan, je pa za njegovo delovanje potrebna še proteaza, ki razgradi ImmR. Ker je ImmR razgrajen, je konjugacija ICEBs1 ireverzibilen proces, medtem ko pri pLS20 peptid Phr nudi fleksibilnost in reverzibilnost, saj se RcopLS20 po tem ko Phr*pLS20 inaktivira RappLS20 sprosti in spet opravlja vlogo represorja
Proces konjugacije je energijsko zahteven proces in ima velik vpliv na celice, zato mora biti proces pod strogo kontrolo, ki dovoli aktivacijo le pri optimalnih pogojih. V praksi je konjugacija plazmida pLS20 iz ''Bacillus subtilis'' omejena na čas med zgodnjo in pozno eksponentno rastjo. Eksperimenti izvedeni v preglednem članku so bili izvedeni na tekočih kulturah, ki so bile stresane, kar zagotavlja homogenizacijo signalnih peptidov. Ti pogoji so drugačni od naravnih, kjer se v različnih delih kulture ustvarijo koncentracijski gradienti, zato so potrebne še nadaljnje študije mehanizmov konjugacije.

==Viri==
Meijer, Wilfried J. J., idr. „Multiple Layered Control of the Conjugation Process of the Bacillus subtilis Plasmid pLS20“. Frontiers in Molecular Biosciences, let. 8, marec 2021, str. 648468. DOI.org (Crossref), https://doi.org/10.3389/fmolb.2021.648468.

Ramachandran, Gayetri, idr. „A Complex Genetic Switch Involving Overlapping Divergent Promoters and DNA Looping Regulates Expression of Conjugation Genes of a Gram-Positive Plasmid“. PLoS Genetics, uredil Danielle A. Garsin, let. 10, št. 10, oktober 2014, str. e1004733. DOI.org (Crossref), https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1004733.

Singh, Praveen K., idr. „Mobility of the Native Bacillus Subtilis Conjugative Plasmid pLS20 Is Regulated by Intercellular Signaling“. PLoS Genetics, uredil Josep Casadesús, let. 9, št. 10, oktober 2013, str. e1003892. DOI.org (Crossref), https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1003892.

Praveen K Singh, Ester Serrano, Gayetri Ramachandran, Andrés Miguel-Arribas, César Gago-Cordoba, Jorge Val-Calvo, Arancha López-Pérez, Carlos Alfonso, Ling Juan Wu, Juan R Luque-Ortega, Wilfried J J Meijer, Reversible regulation of conjugation of Bacillus subtilis plasmid pLS20 by the quorum sensing peptide responsive anti-repressor RappLS20, Nucleic Acids Research, Volume 48, Issue 19, 4 November 2020, Pages 10785–10801.
https://doi.org/10.1093/nar/gkaa797

Neiditch, Matthew B., Glenn C. Capodagli, Gerd Prehna, in Michael J. Federle. 2017. „Genetic and Structural Analyses of RRNPP Intercellular Peptide Signaling of Gram-Positive Bacteria“. Annual review of genetics 51:311–33. https://doi.org/10.1146/annurev-genet-120116-023507.

Konjugacijski prenos plazmidov pri bakteriji Bacillus subtilis

2024-05-04T21:45:38Z

Mark Frantar:

Talk:Konjugacijski prenos plazmidov pri bakteriji Bacillus subtilis

2024-05-04T17:55:27Z

Mark Frantar:

Snedec, Andraž: Uvod, Konjugacija pri ''Bacillus subtilis'', RcopLS20 deluje kot represor konjugacijskega operona, Sestava operatorske regije konjugacijskega operona, Mehanizem RcopLS20 represije vključuje nastanek DNA zanke.

Frantar, Mark: Vpliv peptida Phr*pLS20, Konjugacija in kompetenca, Zaključek

Talk:Konjugacijski prenos plazmidov pri bakteriji Bacillus subtilis

2024-05-04T17:55:10Z

Mark Frantar:

Snedec, Andraž: Uvod, Konjugacija pri ''Bacillus subtilis'', RcopLS20 deluje kot represor konjugacijskega operona, Sestava operatorske regije konjugacijskega operona, Mehanizem RcopLS20 represije vključuje nastanek DNA zanke.
Frantar, Mark: Vpliv peptida Phr*pLS20, Konjugacija in kompetenca, Zaključek

Talk:Konjugacijski prenos plazmidov pri bakteriji Bacillus subtilis

2024-05-04T17:53:50Z

Mark Frantar:

Snedec, Andraž: Uvod, Konjugacija pri ''Bacillus subtilis'', RcopLS20 deluje kot represor konjugacijskega operona, Sestava operatorske regije konjugacijskega operona, Mehanizem RcopLS20 represije vključuje nastanek DNA zanke.
Frantar, Mark: Vpliv peptida Phr*pLS20, Konjugacija in kompetenca, Zaključek

Konjugacijski prenos plazmidov pri bakteriji Bacillus subtilis

2024-05-04T14:35:57Z

Mark Frantar:

==Uvod==
Konjugacija je najbolj pogost mehanizem za horizontalni prenos genov in kot taka tudi najbolj zaslužna za širjenje genov za virulenco, toksine in odpornost proti antibiotikom. Posledično je eden izmed ciljev sodobnih raziskav na področju molekularne biologije razumevanje mehanizmov, po katerih konjugacija poteka. Medtem ko so procesi njene regulacije pri Gramnegativnih bakterijah, katerih predstavnica je ''E. Coli'' in njen plazmid IncF, že dokaj dobro raziskani, pri Grampozitivnih bakterijah ni tako. Nova odkritja na področju konjugacijskega prenosa plazmidov pri G+ bakteriji ''Bacillus subtilis'' bi lahko pripomogla k zmanjšanju te vrzeli.

==Konjugacija pri ''Bacillus subtilis''==
Pri procesu konjugacije sodeluje ogromno število različnih proteinov, nastanek katerih mora celica skrbno regulirati. Genski zapis za te konjugacijske proteine je lahko bodisi integriran v bakterijski kromosom ali pa je ohranjen na plazmidu, kakršen je tudi plazmid pLS20, najden v bakteriji ''Bacillus subtilis''. Začetne raziskave pri tem bacilu so pokazale, da mora biti potek konjugacije pri njem strogo reguliran, saj je bila konjugacija ves čas blokirana razen v ozkem časovnem intervalu na koncu eksponentne rasti celic.

===RcopLS20 deluje kot represor konjugacijskega operona===
V plazmidu pLS20 so nekateri geni izkazovali podobnost z že znanimi konjugacijskimi geni. Izkazalo se je, da ti geni spadajo pod isti operon, ki zajema gene od 28 do 74. Sekvenciranje ter ''in silico'' analiza plazmida sta nakazali, da bi transkripcijo na tem operonu lahko reguliral protein RcopLS20, ki ga zapisuje gen 27c, saj se gen nahaja pred operonom in mu je nasprotno usmerjen, njegovo zaporedje pa je podobno zaporedju za transkripcijske regulatorje Xre, ki imajo heliks-zavoj-heliks domeno. Z eksperimenti, kjer so opazovali izražanje RNA konjugacijskih genov pri različnih koncentracijah domnevnega regulatorja, so potrdili represorsko funkcijo RcopLS20.

===Sestava operatorske regije konjugacijskega operona===
V regiji med genoma 27c (represor RcopLS20) in 28 (konjugacijski operon) se nahajata dva promotorja: močan promotor Pc za prepisovanje konjugacijskega operona in šibek promotor Pr za prepisovanje RcopLS20. Promotorja sta nasprotno usmerjena in se prekrivata, kar pomeni, da bi se brez drugih dejavnikov (beri: regulatorjev) RNA polimeraza vezala samo na močnejši Pc. V okolici promotorjev so našli 10 polj z 8 bp dolgim zaporedjem CAGTGAAA, na katera se lahko veže RcopLS20. Polja se nahajajo v dveh regijah, ki nosita funkcijo operatorjev. Prvi operator (O1), ki vsebuje 4 Rco vezavna mesta, se nahaja na območju med genom 28 in promotorjema. Drugi operator (O2) s 6 RcopLS20 vezavnimi mesti pa se nahaja 75 bp stran od O1 in se prekriva s promotorjema. Operatorja sta med sabo nasprotno usmerjena, medtem ko so Rco vezavna mesta v posameznem operatorju enako orientirana.

===Mehanizem RcopLS20 represije vključuje nastanek DNA zanke===
Položaj in usmerjenost operatorjev sta sprožila sum, da RcopLS20 z vezavo na operator povzroči nastanek DNA zanke in s tem inhibira promotor Pc. Čeprav je za nastanek zanke potrebnih najmanj 90 bp DNA, razdalja med operatorjema pa je 75 bp, bi bila zanka v tem primeru vseeno možna, saj je vijačnica med operatorjema predhodno upognjena. Raziskave so pokazale tudi, da protein RcopLS20 v raztopini tvori tetramere. To dejstvo je skupaj z rezultati testa zamika elektroforezne mobilnosti za regulatorno regijo z vezanim RcopLS20 omogočilo določitev modela vezave RcopLS20. Tetramer RcopLS20 se veže na posamezni operator. Dva tetramera se nato povežeta (tvorita oktamer) in tako ustvarita DNA zanko. V tej konformaciji regulatorne regije je promotor Pc blokiran, kar omogoča vezavo RNA polimeraze na promotor Pr.
===Nadzor konjugacije plazmida pLS20===

===Vpliv peptida Phr*pLS20===
Bakterije uporabljajo kemične signale, imenovane feromoni, za usklajevanje izražanja genov in vedenja celic v skupnosti. Feromoni nekaterih grampozitivnih bakterij, kot je ''Bacillus subtilis'', so kratki linearni peptidi, ki jih celica izloča, nato pa jih zaznajo citoplazemski feromon receptorji iz družine RRNPP. Peptid Phr*pLS20 kodira majhen odprt bralni okvir (44 aminokislin), po sekreciji pa ga cepi serinska proteaza, da nastane zrela aktivna oblika peptida. Tako kot pri drugih RRNPP proteinih in signalnih peptidih, tudi Phr*pLS20 interagira direktno s C-končno domeno RappLS20. Analize kažejo, da RappLS20 v raztopini večinoma tvori dimere, pri višjih koncentracijah pa ima tudi sposobnost tvoriti tetramere. Medtem pa ob prisotnosti Phr*pLS20 RappLS20 skoraj izključno tvori tetramere. RappLS20 je sestavljen iz velike C-končne domene iz 14 α vijačnic ter manjše N-končne domene iz 3 α vijačnic. Struktura z vezanim peptidom je pokazala, da se Phr*pLS20 veže v votlino C-končne domene, kar povzroči, da se N-končna domena premakne navzven. Ta položaj bolj ustreza tvorbi tetramer, pri čemer se dva dimera medsebojno povežeta prek N-končne domene, kar vodi do nastanka tako imenovane stopalo-stopalo konfiguracije. Ker so N-končne domene RappLS20 zasedene, ta ne more interagirati z RcopLS20, torej Phr*pLS20 inhibira antirepresorsko aktivnost RappLS20 in s tem zavira izražanje konjugacijskih genov.
Skupno gledano aktivacijsko stanje pLS20 konjugacijskih genov regulira koncentracija peptida Phr*pLS20. Ko večina celic populacije vsebuje plazmid, bo koncentracija peptida visoka in konjugacija inhibirana. Konjugacijski geni bodo aktivni, ko bo koncentracija Phr*pLS20 nizka, kar se zgodi, če so donorske celice v manjšini in potencialne prejemne celice v večini. Veliko število celic, ki lahko sprejmejo peptid, zniža koncentracijo Phr*pLS20, saj se relativno število donorskih celic zmanjša, poleg tega pa prejemne celice aktivno adsorbirajo signalni peptid. [https://www.frontiersin.org/files/Articles/648468/fmolb-08-648468-HTML-r1/image_m/fmolb-08-648468-g005.jpg Slika1]. Kaj se zgodi s kompleksom Rap-Phr ni znano, najbrž so kompleksi hitro razgrajeni ali pa obstaja mehanizem za recikliranje, znano pa je, da je promotor Prap konstituiven, torej se Rap in Phr stalno sintetizirata.
===Konjugacija in kompetenca===
Kompetenca je začasno stanje celic, v katerem so celice sposobne sprejeti DNA iz okolja in jo integrirati v svoj genom s homologno rekombinacijo. Konjugacija in kompetenca sta si podobna v tem, da gre pri obeh procesih za prenos enoverižne DNA(ssDNA), le da v nasprotnih smereh. Sočasen vnos in iznos regij ssDNA je za celico lahko nekompatibilno, saj se lahko ta transportna mehanizma medsebojno tekmujeta in se motita. Prav tako lahko rekombinantni encimi sintetizirani med fazo kompetence delujejo na ssDNA konjugativnega elementa. Dokazano je bilo, da sta konjugacija in kompetenca nekompatibilna procesa in obstajata vsaj 2 mehanizma, ki z recipročno inhibicijo skrbita, da se poti konjugacije in kompetence ne aktivirata sočasno.
===Zaključek===
V primerjavi z G- bakterijami sta konjugacija in regulacija konjugacijskih genov pri G+ bakterijah slabše poznana. Pri ''Bacillus subtilis'' je razen regulacije plazmida pLS20 znan tudi mehanizem ICEBs1 (integrativni konjugativni elementi), imenovan tudi konjugativni transpozoni. Nahajajo se na kromosomih in se lahko izrežejo ter zvijejo, nato pa prenesejo v druge celice. Gene ICEBs1 inhibira ImmR , ki je analog RcopLS20, antirepresor pa je v tem primeru RRNPP protein RapI. Celoten mehanizem delovanja RapI znan, je pa za njegovo delovanje potrebna še proteaza, ki razgradi ImmR. Ker je ImmR razgrajen, je konjugacija ICEBs1 ireverzibilen proces, medtem ko pri pLS20 peptid Phr nudi fleksibilnost in reverzibilnost, saj se RcopLS20 po tem ko Phr*pLS20 inaktivira RappLS20 sprosti in spet opravlja vlogo represorja
Proces konjugacije je energijsko zahteven proces in ima velik vpliv na celice, zato mora biti proces pod strogo kontrolo, ki dovoli aktivacijo le pri optimalnih pogojih. V praksi je konjugacija plazmida pLS20 iz ''Bacillus subtilis'' omejena na čas med zgodnjo in pozno eksponentno rastjo. Eksperimenti izvedeni v preglednem članku so bili izvedeni na tekočih kulturah, ki so bile stresane, kar zagotavlja homogenizacijo signalnih peptidov. Ti pogoji so drugačni od naravnih, kjer se v različnih delih kulture ustvarijo koncentracijski gradienti, zato so potrebne še nadaljnje študije mehanizmov konjugacije.

==Viri==
Meijer, Wilfried J. J., idr. „Multiple Layered Control of the Conjugation Process of the Bacillus subtilis Plasmid pLS20“. Frontiers in Molecular Biosciences, let. 8, marec 2021, str. 648468. DOI.org (Crossref), https://doi.org/10.3389/fmolb.2021.648468.

Ramachandran, Gayetri, idr. „A Complex Genetic Switch Involving Overlapping Divergent Promoters and DNA Looping Regulates Expression of Conjugation Genes of a Gram-Positive Plasmid“. PLoS Genetics, uredil Danielle A. Garsin, let. 10, št. 10, oktober 2014, str. e1004733. DOI.org (Crossref), https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1004733.

Singh, Praveen K., idr. „Mobility of the Native Bacillus Subtilis Conjugative Plasmid pLS20 Is Regulated by Intercellular Signaling“. PLoS Genetics, uredil Josep Casadesús, let. 9, št. 10, oktober 2013, str. e1003892. DOI.org (Crossref), https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1003892.

Konjugacijski prenos plazmidov pri bakteriji Bacillus subtilis

2024-05-04T14:30:09Z

Mark Frantar:

==Uvod==
Konjugacija je najbolj pogost mehanizem za horizontalni prenos genov in kot taka tudi najbolj zaslužna za širjenje genov za virulenco, toksine in odpornost proti antibiotikom. Posledično je eden izmed ciljev sodobnih raziskav na področju molekularne biologije razumevanje mehanizmov, po katerih konjugacija poteka. Medtem ko so procesi njene regulacije pri Gramnegativnih bakterijah, katerih predstavnica je ''E. Coli'' in njen plazmid IncF, že dokaj dobro raziskani, pri Grampozitivnih bakterijah ni tako. Nova odkritja na področju konjugacijskega prenosa plazmidov pri G+ bakteriji ''Bacillus subtilis'' bi lahko pripomogla k zmanjšanju te vrzeli.

==Konjugacija pri ''Bacillus subtilis''==
Pri procesu konjugacije sodeluje ogromno število različnih proteinov, nastanek katerih mora celica skrbno regulirati. Genski zapis za te konjugacijske proteine je lahko bodisi integriran v bakterijski kromosom ali pa je ohranjen na plazmidu, kakršen je tudi plazmid pLS20, najden v bakteriji ''Bacillus subtilis''. Začetne raziskave pri tem bacilu so pokazale, da mora biti potek konjugacije pri njem strogo reguliran, saj je bila konjugacija ves čas blokirana razen v ozkem časovnem intervalu na koncu eksponentne rasti celic.

===RcopLS20 deluje kot represor konjugacijskega operona===
V plazmidu pLS20 so nekateri geni izkazovali podobnost z že znanimi konjugacijskimi geni. Izkazalo se je, da ti geni spadajo pod isti operon, ki zajema gene od 28 do 74. Sekvenciranje ter ''in silico'' analiza plazmida sta nakazali, da bi transkripcijo na tem operonu lahko reguliral protein RcopLS20, ki ga zapisuje gen 27c, saj se gen nahaja pred operonom in mu je nasprotno usmerjen, njegovo zaporedje pa je podobno zaporedju za transkripcijske regulatorje Xre, ki imajo heliks-zavoj-heliks domeno. Z eksperimenti, kjer so opazovali izražanje RNA konjugacijskih genov pri različnih koncentracijah domnevnega regulatorja, so potrdili represorsko funkcijo RcopLS20.

===Sestava operatorske regije konjugacijskega operona===
V regiji med genoma 27c (represor RcopLS20) in 28 (konjugacijski operon) se nahajata dva promotorja: močan promotor Pc za prepisovanje konjugacijskega operona in šibek promotor Pr za prepisovanje RcopLS20. Promotorja sta nasprotno usmerjena in se prekrivata, kar pomeni, da bi se brez drugih dejavnikov (beri: regulatorjev) RNA polimeraza vezala samo na močnejši Pc. V okolici promotorjev so našli 10 polj z 8 bp dolgim zaporedjem CAGTGAAA, na katera se lahko veže RcopLS20. Polja se nahajajo v dveh regijah, ki nosita funkcijo operatorjev. Prvi operator (O1), ki vsebuje 4 Rco vezavna mesta, se nahaja na območju med genom 28 in promotorjema. Drugi operator (O2) s 6 RcopLS20 vezavnimi mesti pa se nahaja 75 bp stran od O1 in se prekriva s promotorjema. Operatorja sta med sabo nasprotno usmerjena, medtem ko so Rco vezavna mesta v posameznem operatorju enako orientirana.

===Mehanizem RcopLS20 represije vključuje nastanek DNA zanke===
Položaj in usmerjenost operatorjev sta sprožila sum, da RcopLS20 z vezavo na operator povzroči nastanek DNA zanke in s tem inhibira promotor Pc. Čeprav je za nastanek zanke potrebnih najmanj 90 bp DNA, razdalja med operatorjema pa je 75 bp, bi bila zanka v tem primeru vseeno možna, saj je vijačnica med operatorjema predhodno upognjena. Raziskave so pokazale tudi, da protein RcopLS20 v raztopini tvori tetramere. To dejstvo je skupaj z rezultati testa zamika elektroforezne mobilnosti za regulatorno regijo z vezanim RcopLS20 omogočilo določitev modela vezave RcopLS20. Tetramer RcopLS20 se veže na posamezni operator. Dva tetramera se nato povežeta (tvorita oktamer) in tako ustvarita DNA zanko. V tej konformaciji regulatorne regije je promotor Pc blokiran, kar omogoča vezavo RNA polimeraze na promotor Pr.
===Nadzor konjugacije plazmida pLS20===

===Vpliv peptida Phr*pLS20===
Bakterije uporabljajo kemične signale, imenovane feromoni, za usklajevanje izražanja genov in vedenja celic v skupnosti. Feromoni nekaterih grampozitivnih bakterij, kot je ''Bacillus subtilis'', so kratki linearni peptidi, ki jih celica izloča, nato pa jih zaznajo citoplazemski feromon receptorji iz družine RRNPP. Peptid Phr*pLS20 kodira majhen odprt bralni okvir (44 aminokislin), po sekreciji pa ga cepi serinska proteaza, da nastane zrela aktivna oblika peptida. Tako kot pri drugih RRNPP proteinih in signalnih peptidih, tudi Phr*pLS20 interagira direktno s C-končno domeno RappLS20. Analize kažejo, da RappLS20 v raztopini večinoma tvori dimere, pri višjih koncentracijah pa ima tudi sposobnost tvoriti tetramere. Medtem pa ob prisotnosti Phr*pLS20 RappLS20 skoraj izključno tvori tetramere. RappLS20 je sestavljen iz velike C-končne domene iz 14 α vijačnic ter manjše N-končne domene iz 3 α vijačnic. Struktura z vezanim peptidom je pokazala, da se Phr*pLS20 veže v votlino C-končne domene, kar povzroči, da se N-končna domena premakne navzven. Ta položaj bolj ustreza tvorbi tetramer, pri čemer se dva dimera medsebojno povežeta prek N-končne domene, kar vodi do nastanka tako imenovane stopalo-stopalo konfiguracije. Ker so N-končne domene RappLS20 zasedene, ta ne more interagirati z RcopLS20, torej Phr*pLS20 inhibira antirepresorsko aktivnost RappLS20 in s tem zavira izražanje konjugacijskih genov.
Skupno gledano aktivacijsko stanje pLS20 konjugacijskih genov regulira koncentracija peptida Phr*pLS20. Ko večina celic populacije vsebuje plazmid, bo koncentracija peptida visoka in konjugacija inhibirana. Konjugacijski geni bodo aktivni, ko bo koncentracija Phr*pLS20 nizka, kar se zgodi, če so donorske celice v manjšini in potencialne prejemne celice v večini. Veliko število celic, ki lahko sprejmejo peptid, zniža koncentracijo Phr*pLS20, saj se relativno število donorskih celic zmanjša, poleg tega pa prejemne celice aktivno adsorbirajo signalni peptid. [https://www.frontiersin.org/files/Articles/648468/fmolb-08-648468-HTML-r1/image_m/fmolb-08-648468-g005.jpg]Slika. Kaj se zgodi s kompleksom Rap-Phr ni znano, najbrž so kompleksi hitro razgrajeni ali pa obstaja mehanizem za recikliranje, znano pa je, da je promotor Prap konstituiven, torej se Rap in Phr stalno sintetizirata.
===Konjugacija in kompetenca===
Kompetenca je začasno stanje celic, v katerem so celice sposobne sprejeti DNA iz okolja in jo integrirati v svoj genom s homologno rekombinacijo. Konjugacija in kompetenca sta si podobna v tem, da gre pri obeh procesih za prenos enoverižne DNA(ssDNA), le da v nasprotnih smereh. Sočasen vnos in iznos regij ssDNA je za celico lahko nekompatibilno, saj se lahko ta transportna mehanizma medsebojno tekmujeta in se motita. Prav tako lahko rekombinantni encimi sintetizirani med fazo kompetence delujejo na ssDNA konjugativnega elementa. Dokazano je bilo, da sta konjugacija in kompetenca nekompatibilna procesa in obstajata vsaj 2 mehanizma, ki z recipročno inhibicijo skrbita, da se poti konjugacije in kompetence ne aktivirata sočasno.
===Zaključek===
V primerjavi z G- bakterijami sta konjugacija in regulacija konjugacijskih genov pri G+ bakterijah slabše poznana. Pri ''Bacillus subtilis'' je razen regulacije plazmida pLS20 znan tudi mehanizem ICEBs1 (integrativni konjugativni elementi), imenovan tudi konjugativni transpozoni. Nahajajo se na kromosomih in se lahko izrežejo ter zvijejo, nato pa prenesejo v druge celice. Gene ICEBs1 inhibira ImmR , ki je analog RcopLS20, antirepresor pa je v tem primeru RRNPP protein RapI. Celoten mehanizem delovanja RapI znan, je pa za njegovo delovanje potrebna še proteaza, ki razgradi ImmR. Ker je ImmR razgrajen, je konjugacija ICEBs1 ireverzibilen proces, medtem ko pri pLS20 peptid Phr nudi fleksibilnost in reverzibilnost, saj se RcopLS20 po tem ko Phr*pLS20 inaktivira RappLS20 sprosti in spet opravlja vlogo represorja
Proces konjugacije je energijsko zahteven proces in ima velik vpliv na celice, zato mora biti proces pod strogo kontrolo, ki dovoli aktivacijo le pri optimalnih pogojih. V praksi je konjugacija plazmida pLS20 iz ''Bacillus subtilis'' omejena na čas med zgodnjo in pozno eksponentno rastjo. Eksperimenti izvedeni v preglednem članku so bili izvedeni na tekočih kulturah, ki so bile stresane, kar zagotavlja homogenizacijo signalnih peptidov. Ti pogoji so drugačni od naravnih, kjer se v različnih delih kulture ustvarijo koncentracijski gradienti, zato so potrebne še nadaljnje študije mehanizmov konjugacije.

==Viri==
Meijer, Wilfried J. J., idr. „Multiple Layered Control of the Conjugation Process of the Bacillus subtilis Plasmid pLS20“. Frontiers in Molecular Biosciences, let. 8, marec 2021, str. 648468. DOI.org (Crossref), https://doi.org/10.3389/fmolb.2021.648468.

Ramachandran, Gayetri, idr. „A Complex Genetic Switch Involving Overlapping Divergent Promoters and DNA Looping Regulates Expression of Conjugation Genes of a Gram-Positive Plasmid“. PLoS Genetics, uredil Danielle A. Garsin, let. 10, št. 10, oktober 2014, str. e1004733. DOI.org (Crossref), https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1004733.

Singh, Praveen K., idr. „Mobility of the Native Bacillus Subtilis Conjugative Plasmid pLS20 Is Regulated by Intercellular Signaling“. PLoS Genetics, uredil Josep Casadesús, let. 9, št. 10, oktober 2013, str. e1003892. DOI.org (Crossref), https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1003892.

Konjugacijski prenos plazmidov pri bakteriji Bacillus subtilis

2024-05-04T14:22:53Z

Mark Frantar:

==Uvod==
Konjugacija je najbolj pogost mehanizem za horizontalni prenos genov in kot taka tudi najbolj zaslužna za širjenje genov za virulenco, toksine in odpornost proti antibiotikom. Posledično je eden izmed ciljev sodobnih raziskav na področju molekularne biologije razumevanje mehanizmov, po katerih konjugacija poteka. Medtem ko so procesi njene regulacije pri Gramnegativnih bakterijah, katerih predstavnica je ''E. Coli'' in njen plazmid IncF, že dokaj dobro raziskani, pri Grampozitivnih bakterijah ni tako. Nova odkritja na področju konjugacijskega prenosa plazmidov pri G+ bakteriji ''Bacillus subtilis'' bi lahko pripomogla k zmanjšanju te vrzeli.

==Konjugacija pri ''Bacillus subtilis''==
Pri procesu konjugacije sodeluje ogromno število različnih proteinov, nastanek katerih mora celica skrbno regulirati. Genski zapis za te konjugacijske proteine je lahko bodisi integriran v bakterijski kromosom ali pa je ohranjen na plazmidu, kakršen je tudi plazmid pLS20, najden v bakteriji ''Bacillus subtilis''. Začetne raziskave pri tem bacilu so pokazale, da mora biti potek konjugacije pri njem strogo reguliran, saj je bila konjugacija ves čas blokirana razen v ozkem časovnem intervalu na koncu eksponentne rasti celic.

===RcopLS20 deluje kot represor konjugacijskega operona===
V plazmidu pLS20 so nekateri geni izkazovali podobnost z že znanimi konjugacijskimi geni. Izkazalo se je, da ti geni spadajo pod isti operon, ki zajema gene od 28 do 74. Sekvenciranje ter ''in silico'' analiza plazmida sta nakazali, da bi transkripcijo na tem operonu lahko reguliral protein RcopLS20, ki ga zapisuje gen 27c, saj se gen nahaja pred operonom in mu je nasprotno usmerjen, njegovo zaporedje pa je podobno zaporedju za transkripcijske regulatorje Xre, ki imajo heliks-zavoj-heliks domeno. Z eksperimenti, kjer so opazovali izražanje RNA konjugacijskih genov pri različnih koncentracijah domnevnega regulatorja, so potrdili represorsko funkcijo RcopLS20.

===Sestava operatorske regije konjugacijskega operona===
V regiji med genoma 27c (represor RcopLS20) in 28 (konjugacijski operon) se nahajata dva promotorja: močan promotor Pc za prepisovanje konjugacijskega operona in šibek promotor Pr za prepisovanje RcopLS20. Promotorja sta nasprotno usmerjena in se prekrivata, kar pomeni, da bi se brez drugih dejavnikov (beri: regulatorjev) RNA polimeraza vezala samo na močnejši Pc. V okolici promotorjev so našli 10 polj z 8 bp dolgim zaporedjem CAGTGAAA, na katera se lahko veže RcopLS20. Polja se nahajajo v dveh regijah, ki nosita funkcijo operatorjev. Prvi operator (O1), ki vsebuje 4 Rco vezavna mesta, se nahaja na območju med genom 28 in promotorjema. Drugi operator (O2) s 6 RcopLS20 vezavnimi mesti pa se nahaja 75 bp stran od O1 in se prekriva s promotorjema. Operatorja sta med sabo nasprotno usmerjena, medtem ko so Rco vezavna mesta v posameznem operatorju enako orientirana.

===Mehanizem RcopLS20 represije vključuje nastanek DNA zanke===
Položaj in usmerjenost operatorjev sta sprožila sum, da RcopLS20 z vezavo na operator povzroči nastanek DNA zanke in s tem inhibira promotor Pc. Čeprav je za nastanek zanke potrebnih najmanj 90 bp DNA, razdalja med operatorjema pa je 75 bp, bi bila zanka v tem primeru vseeno možna, saj je vijačnica med operatorjema predhodno upognjena. Raziskave so pokazale tudi, da protein RcopLS20 v raztopini tvori tetramere. To dejstvo je skupaj z rezultati testa zamika elektroforezne mobilnosti za regulatorno regijo z vezanim RcopLS20 omogočilo določitev modela vezave RcopLS20. Tetramer RcopLS20 se veže na posamezni operator. Dva tetramera se nato povežeta (tvorita oktamer) in tako ustvarita DNA zanko. V tej konformaciji regulatorne regije je promotor Pc blokiran, kar omogoča vezavo RNA polimeraze na promotor Pr.
===Nadzor konjugacije plazmida pLS20===

===Vpliv peptida Phr*pLS20===
Bakterije uporabljajo kemične signale, imenovane feromoni, za usklajevanje izražanja genov in vedenja celic v skupnosti. Feromoni nekaterih grampozitivnih bakterij, kot je ''Bacillus subtilis'', so kratki linearni peptidi, ki jih celica izloča, nato pa jih zaznajo citoplazemski feromon receptorji iz družine RRNPP. Peptid Phr*pLS20 kodira majhen odprt bralni okvir (44 aminokislin), po sekreciji pa ga cepi serinska proteaza, da nastane zrela aktivna oblika peptida. Tako kot pri drugih RRNPP proteinih in signalnih peptidih, tudi Phr*pLS20 interagira direktno s C-končno domeno Rap*pLS20. Analize kažejo, da RappLS20 v raztopini večinoma tvori dimere, pri višjih koncentracijah pa ima tudi sposobnost tvoriti tetramere. Medtem pa ob prisotnosti Phr*pLS20 Rap*pLS20 skoraj izključno tvori tetramere. Rap*pLS20 je sestavljen iz velike C-končne domene iz 14 α vijačnic ter manjše N-končne domene iz 3 α vijačnic. Struktura z vezanim peptidom je pokazala, da se Phr*pLS20 veže v votlino C-končne domene, kar povzroči, da se N-končna domena premakne navzven. Ta položaj bolj ustreza tvorbi tetramer, pri čemer se dva dimera medsebojno povežeta prek N-končne domene, kar vodi do nastanka tako imenovane stopalo-stopalo konfiguracije. Ker so N-končne domene Rap*pLS20 zasedene, ta ne more interagirati z Rco*pLS20, torej Phr*pLS20 inhibira antirepresorsko aktivnost Rap*pLS20 in s tem zavira izražanje konjugacijskih genov.
Skupno gledano aktivacijsko stanje pLS20 konjugacijskih genov regulira koncentracija peptida Phr*pLS20. Ko večina celic populacije vsebuje plazmid, bo koncentracija peptida visoka in konjugacija inhibirana. Konjugacijski geni bodo aktivni, ko bo koncentracija Phr*pLS20 nizka, kar se zgodi, če so donorske celice v manjšini in potencialne prejemne celice v večini. Veliko število celic, ki lahko sprejmejo peptid, zniža koncentracijo Phr*pLS20, saj se relativno število donorskih celic zmanjša, poleg tega pa prejemne celice aktivno adsorbirajo signalni peptid. Slika x. Kaj se zgodi s kompleksom Rap-Phr ni znano, najbrž so kompleksi hitro razgrajeni ali pa obstaja mehanizem za recikliranje, znano pa je, da je promotor Prap konstituiven, torej se Rap in Phr stalno sintetizirata.
===Konjugacija in kompetenca===
Kompetenca je začasno stanje celic, v katerem so celice sposobne sprejeti DNA iz okolja in jo integrirati v svoj genom s homologno rekombinacijo. Konjugacija in kompetenca sta si podobna v tem, da gre pri obeh procesih za prenos enoverižne DNA(ssDNA), le da v nasprotnih smereh. Sočasen vnos in iznos regij ssDNA je za celico lahko nekompatibilno, saj se lahko ta transportna mehanizma medsebojno tekmujeta in se motita. Prav tako lahko rekombinantni encimi sintetizirani med fazo kompetence delujejo na ssDNA konjugativnega elementa. Dokazano je bilo, da sta konjugacija in kompetenca nekompatibilna procesa in obstajata vsaj 2 mehanizma, ki z recipročno inhibicijo skrbita, da se poti konjugacije in kompetence ne aktivirata sočasno.
===Zaključek===
V primerjavi z G- bakterijami sta konjugacija in regulacija konjugacijskih genov pri G+ bakterijah slabše poznana. Pri ''Bacillus subtilis'' je razen regulacije plazmida pLS20 znan tudi mehanizem ICEBs1 (integrativni konjugativni elementi), imenovan tudi konjugativni transpozoni. Nahajajo se na kromosomih in se lahko izrežejo ter zvijejo, nato pa prenesejo v druge celice. Gene ICEBs1 inhibira ImmR , ki je analog Rco*pLS20, antirepresor pa je v tem primeru RRNPP protein RapI. Celoten mehanizem delovanja RapI znan, je pa za njegovo delovanje potrebna še proteaza, ki razgradi ImmR. Ker je ImmR razgrajen, je konjugacija ICEBs1 ireverzibilen proces, medtem ko pri pLS20 peptid Phr nudi fleksibilnost in reverzibilnost, saj se Rco po tem ko Phr inaktivira Rap sprosti in spet opravlja vlogo represorja
Proces konjugacije je energijsko zahteven proces in ima velik vpliv na celice, zato mora biti proces pod strogo kontrolo, ki dovoli aktivacijo le pri optimalnih pogojih. V praksi je konjugacija plazmida pLS20 iz ''Bacillus subtilis'' omejena na čas med zgodnjo in pozno eksponentno rastjo. Eksperimenti izvedeni v preglednem članku so bili izvedeni na tekočih kulturah, ki so bile stresane, kar zagotavlja homogenizacijo signalnih peptidov. Ti pogoji so drugačni od naravnih, kjer se v različnih delih kulture ustvarijo koncentracijski gradienti, zato so potrebne še nadaljnje študije mehanizmov konjugacije.

==Viri==
Meijer, Wilfried J. J., idr. „Multiple Layered Control of the Conjugation Process of the Bacillus subtilis Plasmid pLS20“. Frontiers in Molecular Biosciences, let. 8, marec 2021, str. 648468. DOI.org (Crossref), https://doi.org/10.3389/fmolb.2021.648468.

Ramachandran, Gayetri, idr. „A Complex Genetic Switch Involving Overlapping Divergent Promoters and DNA Looping Regulates Expression of Conjugation Genes of a Gram-Positive Plasmid“. PLoS Genetics, uredil Danielle A. Garsin, let. 10, št. 10, oktober 2014, str. e1004733. DOI.org (Crossref), https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1004733.

Singh, Praveen K., idr. „Mobility of the Native Bacillus Subtilis Conjugative Plasmid pLS20 Is Regulated by Intercellular Signaling“. PLoS Genetics, uredil Josep Casadesús, let. 9, št. 10, oktober 2013, str. e1003892. DOI.org (Crossref), https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1003892.

Konjugacijski prenos plazmidov pri bakteriji Bacillus subtilis

2024-05-04T14:07:39Z

Mark Frantar: /* Primerjava s podobnimi sistemi */

BIO2 Povzetki seminarjev 2023

2023-11-06T19:59:02Z

Mark Frantar: /* POVZETKI SEMINARJEV BIOKEMIJA 2023/24 */

= POVZETKI SEMINARJEV BIOKEMIJA 2023/24 =
==Anja Kokol - Pomen kompertmentalizirane signalizacije v membranskih raftih pri razvoju raka==
Raziskovanje lipidnih raftov, membranskih domen, bogatih s holesterolom in sfingolipidi, je izboljšalo razumevanje celične membrane pri signalni transdukciji. Te sortirne platforme igrajo ključno vlogo pri kompartmentalizaciji signalnih poti in s tem spodbujajo ali zavirajo preživetje, smrt in metastazo tumorskih celic. Transformirane celice vsebujejo višjo raven znotrajceličnega holesterola in s tem posledično več membranskih raftov. Rafti so, zraven prenosa signalov, pomembni za aktivacijo receptorjev, endocitozo, znotrajcelični promet in organizacijo z lipidi in proteini. V obliki lipidnih lupin zagotavljajo proteinom, ki so jih tako ločili od ostalih, primerno mikrookolje in s pomočjo takšnega mehanizma vklopijo ali izklopijo določene poti prenosa signala. Na celične procese pomembno vpliva asimetrija holesterola v plazemski membrani, ki se vzdržuje z aktivnim transportom holesterola iz notranjega v zunanji del. Zaradi prenosa signala po lipidnih raftih lahko pride do prekomerne ekspresije in aktivacije številnih poti in sistemov rastnih faktorjev, kar pripomore k razvoju tumorja. Eden od njih je tudi aktivator signalne poti PI3K/AKT, ki je pomemben udeleženec pri nastanku raka. Značilnost sesalskih celic je prisotnost receptorjev smrti na njihovi površini. Ti zagotavljajo sposobnost apoptoze. Ligandi receptorjev smrti sprožijo značilno signalizacijo preko oligomerizacije receptorjev, kar posledično povzroči rekrutiranje specializiranih adapterskih proteinov znotraj lipidnih raftov. S preučevanjem membranskih raftov se je rodil tudi koncept CASMER, s pomočjo katerega se je razvila nova ideja zdravljenja raka.

==Vid Kozel - Vloga onkogenov in tumor zavirajočih genov pri razvoju raka==
Onkogeni kodirajo okvarjene proteine ter s tem povzročajo tumorje. Nastanejo iz spremenjenih proto-onkogenov. Za naše zdravje so zelo nevarni, saj spodbujajo delovanje procesov, ki vodijo do raka. Aktivirajo se zaradi genetske spremembe proto-onkogenov, najpogosteje do tega pride zaradi točkovnih mutacij; mutacije z večjo funkcionalnostjo, kromosomske translokacije, virusna integracija, epigenetske spremembe, spremembe regulatornih proteinov. Tumor zavirajoči geni ali tumorski supresorji tvorijo regulatorne proteine, ki preprečujejo delitev rakavih celic ter spodbujajo popravljanje DNA. Aktivirajo se s transkripcijsko aktivacijo, posttranslacijskimi modifikacijami ali interakcijami med proteini. Njihova glavna naloga je vzdrževanje genoma, prav tako pa preprečujejo nenadzorovano rast celic.
Pot RAS-RAF-MEK-ERK je signalna pot onkogenov, ki ima vlogo pri rasti, delitvi, preživetju in diferenciaciji celic. Njena nenormalna aktivacija lahko povzroči nastanek tumorjev. Pot se začne z aktivacijo RAS, do katere pride zaradi zunajceličnih signalov. RAS potem aktivira še RAF in sproži kaskado fosforilacije. Nato se aktivira MEK, ki sproži dvojno fosforilacijo in aktivira ERK, aktivacija le-te pa vodi do razmnoževanja, preživetja ali diferenciacije celic.
TP53 je gen, ki kodira tumor supresorski protein p53, ta pa zatira tumorje. Na poškodbe DNA odgovarja tako, da ustavi celični cikel ter nato popravi DNA, sproži apoptozo ali pa senescenco. Njegovo delovanje inhibira MDM2, ki ga lahko dodatno stabilizira MDM4. Ob mutacijah na TP53, ter posledično na P53, ta izgubi sposobnost obrambe proti tumorjem.
Z ugotavljanjem mutacij onkogenov/tumorskih supresorjev, ali s tem da ti služijo kot biomarkerji, lahko zdravniki napovejo verjetno napredovanje raka ter izberejo ustrezno zdravljenje.

==Nina Majerle - Z G-proteini sklopljeni vzorčno prepoznavni receptorji izraženi v nevtrofilcih==
Nevtrofilci so najpogostejši levkociti v človeški krvi in so ključnega pomena za pravilno delovanje imunskega sistema. Na površini izražajo različne receptorje, ki prepoznavajo molekulske vzorce tipične za patogene organizme in za poškodovane gostiteljske celice. Ti receptorji so ključnega pomena za delovanje nevtrofilcev, saj jim omogočajo regulacijo vnetnega odziva, diferenciacijo, priklic drugih celic imunskega sistema in fagocitozo. Mnogi od teh receptorjev pripadajo družini z G-proteini sklopljenih receptorjev. GPCR-ji imajo značilno strukturo sedmih α-vijačnic, prenos signala prek GPCR-jev pa največkrat poteka preko heterotrimernih G-proteinov. Seminarska naloga obravnava tako splošne značilnosti GPCR-jev, kot tudi podrobneje opiše mehanizme delovanja in funkcije nekaterih bolj znanih GPCR-jev izraženih na membranah nevtrofilcev, ki delujejo po principu vzorčnega prepoznavanja: družina formil peptidnih receptorjev (FPRs), purinergični receptor P2Y2R in dva člana družine receptorjev prostih maščobnih kislin FFA2R in GPR84. Poleg tega prek relevantnih primerov razlaga nekatere ključne pojme in koncepte v biokemiji kot so ortosterično vezavno mesto, alosterični receptorski modulatorji, vzorčno prepoznavanje, homologna in heterologna desenzibilizacija, receptorska transaktivacija, funkcionalna selektivnost in pa tudi pojme, ki se nanašajo na same nevtrofilce kot sta kemotaksija in primiranje. Na koncu se seminarska naloga naveže še na uporabnost poznavanja strukture in delovanja GPCR-jev izraženih v nevtrofilcih pri zdravljenju različnih imunskih obolenj.

==Jakob Urh Veler - Gvanilil ciklaze kot ključni receptorji in encimi pri celični biosignalizaciji==
Družina proteinov gvanilat ciklaze/gvanilil ciklaze (GC) v svoji katalitični domeni ciklizirajo GTP v cGMP. Ciklični GMP je sekundarni sporočevalec. Z nadaljno kaskado vpliva na protein kinaze (cGK), fosfodiesteraze (PDE) in ionske kanalčke (CNG). So pomembne za pravilno delovanje več organskih sistemov. Glede na strukturne, funkcionalne in regulatorne značilnosti GC delimo na membranske (mGC/pGC) in topne (sGC) oblike. Poznamo tipične in atipične sGC. Po priporočeni nomenklaturi poznamo 7 tipov mGC: MG-A, MG-B, MG-C, MG-D, MG-E, MG-F in MG-G. Vlogo encima in receptorja opravljajo topne gvanilil ciklaze v citosolu in membranske na celični membrani. Aktivirane so lahko tudi z endogenim NO, O2, HCO3-, natriuretskimi hormoni in s Ca2+-vezanimi proteini. V nadaljevanju podrobneje opisana aktivacija sGC z NO ter aktivacija GC-A z atrijskim natriuretskim hormonom (ANF). Z manipulacijo genov za zapis gvanilil ciklaz so odkrili njihove vloge v celicah in pomen specifičnih domen. Z različno stopnjo izražanja izoencimov je v celicah visoka diverziteta GC, zato je to mrežo signalizacije brez in vivo opazovanja zahtevno raziskovati. Približno 60 let že raziskujejo gvanilil ciklaze. Razumevanje te signalne poti je ključnega pomena za zdravljenje določenih bolezenskih stanj, saj imajo zdravila več tarčnih mest za delovanje.

==Domen Trontelj - G protein sklopljeni receptorji v fiziologiji okusa in farmakologiji==
G protein sklopljeni receptorji (GPCR), predstavljajo največjo družino receptorjev pri sesalcih in so ključni za uravnavanje večine fizioloških funkcij. Poleg posredovanja pri zaznavi vonja in vida, so prav tako prenašalci signala treh osnovnih okusov- sladko, umami in grenko, prav tako pa so ključnega pomena pri zaznavanju okusa kokumi. Nahajajo se v specializiranih okuševalnih celicah (TRC) znotraj brbončic. Tip I okuševalnih GPCR-jev (TAS1R) so heterodimerni kompleksi, ki skužijo kot receptorji za sladko (TAS1R2/TAS1R3) ali umami (TAS1R1/TAS1R3) okus, medtem ko Tip II obsega monomerne receptorje za grenak okus ali pa kokumi/kalcijeve receptorje.
Receptorji za sladko, umami in kokumi delijo strukturne podobnosti, saj vsebujejo več mest za vezavo agonistov z izrazito selektivnostjo, medtem ko večina grenkih receptorjev vsebuje le eno vezavno mesto, ki neselektivno sprejme veliko različnih ligandov. Vezava agonistov na receptor aktivira sekundarnih prenašalce, kar privede do vdora kalcija, to vodi do depolarizacije celice in na koncu sprostitve nevrotransmiterja.
Kljub nedavnim napredkom na področju raziskav konformacijskih sprememb, potrebnih za aktivacijo receptorja, ostaja še veliko nerešenih. V zadnjih letih so različni pristopi, ki združujejo heterologno izražanje, mutagenezo, homologno modeliranje in knockout študije na miših, skupaj ponudili vpogled v strukturo in pozicijo vezavnih mest za ligande in mehanizme ortosterične in alosterične modulacije.

==Karin Kunstelj - Potencialne terapije zdravljenja akutne mielonične levkemije najdene prav v metabolizmu celic kostnega mozga in njegovega mikrookolja==
Izogibanje detekciji in odgovoru imunskega odziva sodi med glavne težave levkemije poleg neuspešne imunoterapije. Burne poti mikrookolja so v ozadju odgovora tako rakavih kot zdravil celic, problem pa se pojavi, ko rakave celice prevzamejo vodilno vlogo metabolizmov in nadzorujejo reakcije sebi v prid. Mednje spadata tudi produkcija energije in izogibanje detekciji in pa odgovoru imunskih celic. Novo možnost terapije bi potemtakem lahko predstavljalo ciljanje povezav med mikrookoljem kostnega mozga in levkemičnimi celicami. V seminarju je podrobno opisano mikrookolje kostnega mozga, pomembne metabolične poti ogljikovih hidratov, aminokislin in maščobnih kislin. Opisani so tudi procesi levkemičnih celic, ki zdravljenju povzročajo težave in neuspešnost. Prav tako opozori na nove potencialne terapije zdravljenja akutne mielonične levkemije. Svoj fokus orientirajo in najdejo prav v mikrookolju kostnega mozga in problematičnih levkemičnih celic. Metabolizem levkemičnih celic, ki povzroča obolenja in preglavice tako obrne v svoj prid. Na koncu pa še poudari na pomembnost dodatnih raziskav in študij zaradi nedovršenih, premalo eksaktnih in pa preveč nasprotujočih-si rezultatov.

==Tonja Oman Sušnik - Metabolizem glukoze, senescenca živčnih celic in Alzheimerjeva bolezen==
Alzheimerjeva bolezen je nevrodegenerativna bolezen z visoko pojavnostjo predvsem med starejšimi. Pri njej sčasoma pride do upada miselnih sposobnosti in razvoja drugih psiholoških motenj. Njen razvoj je sicer že precej dobro raziskan, a zdravila, ki bi v celoti odpravil škodo storjeno na možganih, še ne poznamo. Tekom same bolezni se prepleta mnogo simptomov, ki so odvisni eden od drugega. To so med drugimi inzulinska rezistenca, celična senescenca, nevroinflamacija, nalaganje proteinskih plakov in oslabljen metabolizem glukoze. Najpomembnejša pri tem je celična senescenca, ki je v močni povezavi s staranjem. Ta napade tako živčne celice kot tudi glialne celice in povzroči nalaganje proteinov ter oslabljeno energijsko proizvodnjo celice. Slabša energetska preskrbljenost, kar je za nevrone izredno nevarno in se odraža v njihovem slabšem delovanju ter zmanjšani sinaptični plastičnosti, pa je tudi posledica zmanjšanega prevzema glukoze. Z boleznijo se število glukoznih transporterjev zmanjšuje, veča pa se inzulinska rezistenca. Nevroni zato ne sprejmejo dovolj glukoze za proizvodnjo ATP. Kako bi samo znanje o teh fizioloških okvarah prenesli na zdravljenje, še ni znano, a na to temo poteka mnogo tekočih raziskav. Najbolj ugodno bi bilo odstranjevanje senescentih celic, neposredno targetiranje glukoznega metabolizma ali razbijanje proteinskih plakov. Pozitivne rezultate dajejo tudi raziskave, kjer so opazovali odzivnost metabolizma glukoze na srednje intenzivno vadbo. Ta se je že pri enkrat tedenski vadbi močno izboljšal, napredovanje bolezni pa skoraj popolnoma zaustavilo.

==Jan Hvalec - Uravnavanje metabolizma endotelijskih in imunskih celic==
Endotelijske celice gradijo notranjo površino žil. Njihova funkcija je tesno povezana z ohranjanjem homeostaze tkiv, regulacijo krvnega pretoka in angiogeneze. Za opravljanje svoje naloge imajo prilagojen metabolizem z znižano stopnjo oksidativne fosforilacije in pospešeno glikolizo. Angiogeneza temelji na kolektivni migraciji endotelijskih celic, pri čemer konične celice usmerjajo poganjek, medtem ko ga stebelne celice podaljšujejo s proliferacijo. Rast žil se začne z razgradnjo bazalne membrane in izbiro konične celice pod vplivom vaskularnega endotelijskega faktorja (VEGF) in inducibilnega faktorja hipoksije (HIF), ki ju sproščajo telesne celice v hipoksičnih pogojih. Vlogo konične celice prevzame celica s hitrejšo energetsko proizvodnjo. Ker VEGF in HIF pospešita izražanje encima PFKFB3, ki pospešuje glikolizo, so ravni PFKFB3 višje v konici kot v steblu poganjka. Druga vrsta celic, ki glede na diferenciacijo prilagodi svoj metabolizem, so celice imunskega sistema. T-celice pomagalke in citotoksične celice se zanašajo na glikolizo in presnovo glutamina za tvorbo potrebne količine energije. Medtem ko se M1 makrofagi tudi zanašajo na glikolizo, je vloga metabolne poti drugačna, saj jo prednostno uporabljajo za vzdrževanje polnega stanja delovanja (razgradnjo fagocitiranih delcev). Nasprotno se spominske in regulatorne T-celice zanašajo na oksidacijo maščobnih kislin za učinkovitejšo proizvodnjo ATP, oksidativno fosforilacijo pa uporabljajo za vzdrževanje učinkovitega dolgoročnega delovanja.

==Mark Frantar - Energetika možganov in nevrodegenerativne bolezni==
Možgani so zaradi številnih funkcij, kot so vzdrževanje membranskega potenciala, recikliranje živčnih prenašalcev ter prenašanje signalov, energijsko izjemno zahteven organ. Za delovanje stalno potrebujejo energijo v obliki ATP, ki jo večinoma dobijo iz glukoze z oksidativno fosforilacijo, nekaj pa iz aerobne glikolize v citoplazmi. Za dostavljanje virov energije do nevronov skrbi nevrovaskularna enota, sestavljena iz endotelijskih celic kapilar, astrocitov ter nevronov. Nevroni lahko za vir energije uporabijo tudi ketone ali laktat, ki se proizvede v astrocitih s pretvorbo piruvata z laktat dehidrogenazo, nato pa je transportiran v nevrone skozi monokarboksilatne transporterje (MCT). Pri nevrodegenerativnih boleznih (NDB) pride do okvare metabolizma v možganih, najpogosteje do hipometabolizma glukoze. To vodi v stalno pomanjkanje energije, ki povzroči propad nevronskih celic, nabiranje agregatov nevrotoksičnih proteinov in disfunkcijo mitohondrijev, to pa še nadaljnje okvari metabolizem. Za upočasnjevanje napredovanja NDB obstaha več terapij in zdravil, a jih večina še ni dovolj testirana. Zdravila podpirajo mitohondrijske funkcije, izboljšujejo inzulinsko senzitivnost, zmanjšujejo inflamacijo, ipd. Uporabljajo se tudi ketonski prehranski dodatki ali ketogena dieta, saj gre pri NDB lahko le za okvaro metabolizma glukoze, medtem ko je metabolizem ketonov normalen. Optimizacija energetike možganov je torej temeljnega pomena pri NDB in bi morala biti prvi korak pri poskusih zakasnitve pojava in napredovanja NDB.