Wiki FKKT - User contributions [en]

Orodja in načela za inženiring genskih vezij mikroorganizmov

2016-01-19T08:41:11Z

MarkoRadojkovic: /* Nastavljivi elementi v genskih vezjih */

==UVOD==
Sintezni biologi skozi racionalno načrtovanje in napredno inženirstvo stremijo k ustvarjanju novih genskih vezij, ki bi imela široko uporabnost. Imajoči v mislih kompleksnost procesiranja signalov, ki se pojavljajo v naravnih bioloških sistemih, inženirski mikroorganizmi imajo potencial za opravljanje številnih koristnih nalog, ki zahtevajo sofisticirano računalniško vodenje in kontrolo.
Ta članek predstavlja pregled vsestranskih komponent in orodij, ki so trenutno dostopna za inženiring genskih vezij v mikroorganizmih, vključno z nedavno razvitimi RNA orodji, ki vsebujejo zelo široko dinamično območje in se lahko programirajo. Seznanili se bomo z oblikovalnimi načeli, ki omogočajo robustno in razširljivo delovanje vezij, prav tako pa bomo spoznali nekatere efikasne strategije za hitro identifikacijo in popravljanje napak ter fino nastavljanje lastnosti vezij.

==ORODJA ZA INŽENIRING IZRAŽANJA RNA==
Transkripcija je verjetno najpomembnejša kontrolna točka v genskih vezjih, ker zagotavlja celovito regulacijo izražanja vseh komponent. Kontrolni elementi se lažje sestavljajo na nivoju DNA, s čimer se izognemo težavam, ki lahko nastanejo kot posledica sekundarnih struktur molekul mRNA.

===Vezava RNA-polimeraze===
Nukleotidno zaporedje promotorja, na katero se veže RNA-polimeraza (RNAP), je temeljna determinanta hitrosti transkripcije. Do vezave pride preko σ70- tipa faktorjev na -10 in -35 mesto od začetka transkripcije, kar hkrati določa samo specifičnost iniciacijskega mesta, medtem ko se C-končna domena α podenote preferenčno veže na kratko zaporedje ponovitev A in T baz, 30 mest navzgor od -35 mesta (UP element) in s tem določa jakost promotorja. Raziskave vpliva UP elementov na jakost promotorja so pokazale, da se vpliv le-teh na jakost promotorja z višanjem koncentracije RNAP zmanjšuje in obratno. Zaporedje navzdol od začetka transkripcije prav tako lahko vpliva na potek transkripcije same, vendar se z uporabo standardnih 5'-neprevajajočih se regij (UTR), temu vplivu lahko izognemo. Knjižnice promotorjev s širokim razponom jakosti predstavljajo dragoceno zbirko, ki jih biološki inženirji s pridom izkoriščajo in jo bodo izkoriščali, dokler se ne pojavijo popolni napovedni modeli.

===Proteinski regulatorji transkripcije===

Aktivatorji

Klasični aktivatorji, ki jih uporabljamo pri oblikovanj genskih vezij, kot je LuxR, delujejo na ta način, da stabilizirajo vezavo RNAP na promotor. Rhodius in kolegi so izkoristili ekstracitoplazmične funkcijske σ faktorje (ECFs) za izgradnjo največje knjižnice ortogonalnih transkripcijskih regulatorjev za ''E. coli'', pri čemer so našli 20 parov ECFs in sorodnih promotorjev, ki imajo zelo nizko navzkrižno reaktivnost. Ti proteini se vežejo na regije -35 in -10 in s tem določajo specifičnost vezave RNAP na določen promotor. Ostali transkripcijski aktivatorji, ki so koristni za uporabo v ''E.coli'' vključujejo tri šaperon-aktivatorske pare (ki se lahko izkoristijo za AND logiko), fagne transkripcijske aktivatorje ter HrpRS bakterijske ojačevalne proteine.

Represorji

Represorji najpogosteje delujejo na ta način, da RNAP onemogočijo dostop do promotorja. Stanton in sodelavci so ustvarili knjižnico homologov TetR in njihovih naravnih operatorjev, ki vsebuje 16 ortogonalnih variant. Obstaja tudi manjša knjižnica variant represorja LacI. Zelo zanimivo družino represorskih proteinov predstavljajo transkripcijskim aktivatorjem podobni efektorji (TALEs). TALE represorji se lažje modelirajo v primerjavi s proteini s cinkovimi prsti in se lahko uporabljajo za kontrolo več kompleksnih genov. Pokazali so da z njimi lahko dosežemo do 100-kratno znižanje ravni izražanja v ''E.coli''.

===RNA kontrola transkripcije===
Lep primer kontrole transkripcije z RNA predstavlja pT181 transkripcijski atenuacijski sistem, katerega različice so razvite za kontrolo genskih vezij v ''E.coli''. Naravni pT181 mehanizem koristi 5'- UTR zanko, ki normalno omogoča elongacijo transkripcije; interakcija med zanko na taRNA z 5'-UTR zanko na mRNA promovira nastanek steblo-zanka strukture, ki povzroči terminacijo transkripcije.
Majhne RNA molekule, ki aktivirajo transkripcijo (STARs), so dizajnirane da porušijo strukturo terminatorja, bodisi preko vezave na zanko, ki se nahaja v zaporedju navzgor ali preko direktne vezave na terminator. Ta pozitivna regulacija sistema pT181 omogoča zelo visoko dinamično območje (94-kratno), v primerjavi s klasičnimi represorji in je prav tako uporabna za izgradnjo večplastnih logičnih vrat.

==ORODJA ZA INŽENIRING IZRAŽANJA PROTEINOV==

===Ortogonalni ribosomi===
Vezava ribosoma na molekulo mRNA je posledica prepoznavanja in baznega parjenja med RBS in anti-Shine-Dalgarno zaporedjem, ki je zapisano v 16S rRNA. To lastnost so izkoristili za ustvarjanje treh dodatnih ortogonalnih ribosomov z modificirano 16S rRNA, ki inicira traslacijo samo na mRNA s sorodnim RBS. Transkripcija obeh ortogonalnih rRNA ter mRNA je potrebna za izražanje tarčnega gena, s čimer dobimo AND logična vrata.

===RNA-stikala===
Z RNA-stikali lahko vplivamo na translacijo preko od liganda odvisne spremembe konformacije 5'-UTR regije mRNA, s čemer otežimo dostop do RBS. Sharma in sodelavci so pokazali da RNA-stikala lahko kombiniramo za izgradnjo AND in NAND logičnih vrat. Od temperature odvisni RNA regulatorji prav tako delujejo preko kontrole dostopnosti RBS za vezavo ribosoma.

===taRNA kontrola translacije===

taRNA-represija

Mehanizem inhibicije translacije z majhnimi RNA molekulami (sRNAs) je konceptualno preprost, zaradi česar je tudi izvajanje same metode relativno enostavno: sRNA vsebuje zaporedje komplementarno tarčni mRNA in se veže na RBS ali na zaporedje navzgor ter na ta način prepreči vezavo ribosoma. Jakost inhibicije je ko korelirana z vezavno energijo sRNA-mRNA.

taRNA-aktivacija

Green in sodelavci so pred kratkim opisali razvoj RNA-stikal tipa »toehold«, oziroma zank, ki onemogočajo normalen potek translacije. Aktivacija translacije poteka preko vezave »sprožilne« RNA, ki se veže na zaporedje navzgor od zanke in ji spremeni strukturo. Najbolj učinkovita tovrstna stikala zajemajo kar 600-kratno dinamično območje, kar je za red velikosti boljše od ostalih taRNA kontrolnih mehanizmov.

==MODULARNOST IN ORTOGONALNOST==
Modularnost predstavlja kvaliteto konzistentnosti funkcije v številnih pogojih in kontekstih in je en izmed temeljnih pogojev za napovedni dizajn genskih vezij. Ortogonalnost zagotavlja da elementi in moduli ne bodo izražali neželene interakcije z drugimi elementi v inženirskih bioloških sistemih, prav tako pa tudi ne z genskim ozadjem gostitelja. Zato sta ti dve lastnosti nepogrešljivi pri načrtovanju kompleksnih genskih vezij.

===Fizična kompozicija===
Sinteznobiološki elementi so lahko občutljivi na spremembe v robnih zaporedjih, ki jih obkrožajo. Iz analize 12,563 kombinacij promotorjev in RBS, Kosuri in sodelavci so odkrili, da se približno 17 % vseh variacij v ravni izražanja proteinov ne more napovedati iz jakosti promotorjev, oziroma RBS. Mutalik in sodelavci so ugotovili, da spoji promotor: UTR in UTR: tarčni gen (GOI) v znatni meri vplivajo na variabilnost v izražanju genov in so naredili operacijsko enoto izražanja (EOU). Uporaba EOU omogoča veliko konzistentnost v nivojih izražanja tarčnih genov, ko menjavamo različne promotorje in RBS, kar ima veliko napovedno moč pri oblikovanju novih genskih vezij in finem usklajevanju ravni izražanja proteinov.

===Vpliv gostitelja===
Cardinale in sodelavci so iz analize velikega števila sevov ''E.coli'' ugotovili, da sta dostopnost ribosomov in hitrost rasti ključne determinante za učinkovitost genskih vezij. Ugotovili so tudi, da specifične delecije gostiteljskih genov imajo lahko veliki vpliv na genska vezja. Te mutacije posredno vplivajo na učinkovitost vezja preko sprememb v fluksu ogljikovega in dušikovega metabolizma. Komplementarni pristop spreminjanja gostiteljskega genetskega (in metabolnega) ozadja preko dodajanja določenih genov, lahko pozitivno vpliva na učinkovitost vezja.

===Robustnost in genetska stabilnost===
Robustna genska vezja vzdržujejo svojo učinkovitost skozi čas in v različnih pogojih – prilagajajo se spremembam, kot je različna hitrost rasti ali dostopnost transkripcijskih faktorjev, in pogosto imajo zelo visoko razmerje signal-šum. Genska vezja, ki so prilagodljiva in ne predstavljajo preveliko breme za gostitelja, sta tudi bolj robustna s stališča genetske stabilnosti. Zaželeno je, da so vezja ortogonalna, in da ne interreagirajo z gostiteljem, s čimer se tudi povečuje robustnost. V primeru, da se medsebojni interakciji ne moremo izogniti, gensko vezje lahko preoblikujemo tako, da dinamično uravnava svojo ekspresijo kot odgovor na povečani stres, ki ga povzroča gostitelju.

==POPRAVLJANJE NAPAK IN FINA NASTAVITEV GENSKIH VEZIJ==
Brez popolnoma napovednih zmogljivosti, načrtovanje genskih vezij neizogibno zahteva stopnje popravljanja napak ter fine nastavitve. Razlogi za neuspeh se najprej morajo identificirati, da bi vezje lahko normalno funkcioniralo znotraj želenih parametrov.

===Nastavljivi elementi v genskih vezjih===
Enkrat, ko se ugotovi razlog za neuspeh, se morajo narediti spremembe v vezju. Komponente je mogoče treba zamenjati, zaradi toksičnih učinkov njihovega izražanja, ali mogoče zaradi neustreznega dinamičnega območja njihovega izhodnega signala. Če je komponenta del velike ortogonalne zbirke, jo lahko zamenjamo z bolj ustrezno varianto. Ojačevalce signala lahko uporabimo v primeru, da hočemo popraviti signal komponente navzgor. Drugače obnašanje posameznih komponent lahko popravimo s spremembo jakosti promotorjev ali RBS, hitrosti razgradnje genskih produktov ali števila posameznih komponent.

===Strategije za odpravljanje napak===
Ena izmed najbolj uporabljanih strategij za fino nastavljanje delovanja genskih vezij, je uporaba BioBrick standardov. Medtem, ko je uvajanje mutacij v komponente tekom začetnega sestavljanja enostavno, enkrat, ko so deli povezani v večje module, nadaljnje spreminjanje posameznih komponent ni več možno. Za ponovno uvajanje variacij se moramo vrniti na korak, ko smo dodajali posamezne komponente ali uporabimo nekatero izmed metod, ki temeljijo na PCR. SLIC, Gibsonovo sestavljanje, CPEC in SLiCE so metode zasnovane na PCR, ki predstavljajo dobro alternativo sestavljanju preko linkerjev, ker se z njimi izognemo nastanku »brazgotin«, ki lahko vplivajo na funkcionalnost vezja.
MAGE je zelo močno orodje za uvajanje variacij po predhodnem sestavljanju komponent. Metoda temelji na uporabi različnih ssDNA oligonukleotidov, s katerimi preko λ-Red rekombinaze uvedemo mutacije na ustreznih mestih.

==ZAKLJUČEK==
Po skoraj 15 letih pospešenega napredovanja, sintezna biologija je prišla do stopnje, kjer je na razpolago veliko orodij in osnovnih gradnikov za inženiring genskih vezij. Veliki napredek je ostvarjen tudi na polju ortogonalnosti in modularnosti gradnikov, kar omogoča bolj predvidljivo in robustno načrtovanje kompleksnih genskih vezij. Gradniki, ki temeljijo na RNA, bodo najverjetneje imeli glavno vlogo pri nadaljnji sofistikaciji genskih vezij, zaradi svoje enostavne programabilnosti in ker njihovi termodinamski modeli zelo dobro napovejo obnašanje v genskih vezjih.
Čeprav zelo dinamično in nedefinirano okolje gostitelja pogosto ovira normalno delovanje genskih vezij, strategije, ki temeljijo na uporabi izoliranih delov in racionalnem iskanju optimalnih parametrov bodo zmanjšale čas potreben za izgradnjo kompleksnih vezij. Variacije, ki so posledica interakcij z gostiteljskim metabolizmom, bi se še lahko dodatno znižale z uporabo sevov z reduciranimi genomi.

==VIR==
R. W. Bradley, ''et al''., Tools and Principles for Microbial Gene Circuit Engineering, J. Mol. Biol. (2015).

Orodja in načela za inženiring genskih vezij mikroorganizmov

2016-01-19T08:04:38Z

MarkoRadojkovic:

==UVOD==
Sintezni biologi skozi racionalno načrtovanje in napredno inženirstvo stremijo k ustvarjanju novih genskih vezij, ki bi imela široko uporabnost. Imajoči v mislih kompleksnost procesiranja signalov, ki se pojavljajo v naravnih bioloških sistemih, inženirski mikroorganizmi imajo potencial za opravljanje številnih koristnih nalog, ki zahtevajo sofisticirano računalniško vodenje in kontrolo.
Ta članek predstavlja pregled vsestranskih komponent in orodij, ki so trenutno dostopna za inženiring genskih vezij v mikroorganizmih, vključno z nedavno razvitimi RNA orodji, ki vsebujejo zelo široko dinamično območje in se lahko programirajo. Seznanili se bomo z oblikovalnimi načeli, ki omogočajo robustno in razširljivo delovanje vezij, prav tako pa bomo spoznali nekatere efikasne strategije za hitro identifikacijo in popravljanje napak ter fino nastavljanje lastnosti vezij.

==ORODJA ZA INŽENIRING IZRAŽANJA RNA==
Transkripcija je verjetno najpomembnejša kontrolna točka v genskih vezjih, ker zagotavlja celovito regulacijo izražanja vseh komponent. Kontrolni elementi se lažje sestavljajo na nivoju DNA, s čimer se izognemo težavam, ki lahko nastanejo kot posledica sekundarnih struktur molekul mRNA.

===Vezava RNA-polimeraze===
Nukleotidno zaporedje promotorja, na katero se veže RNA-polimeraza (RNAP), je temeljna determinanta hitrosti transkripcije. Do vezave pride preko σ70- tipa faktorjev na -10 in -35 mesto od začetka transkripcije, kar hkrati določa samo specifičnost iniciacijskega mesta, medtem ko se C-končna domena α podenote preferenčno veže na kratko zaporedje ponovitev A in T baz, 30 mest navzgor od -35 mesta (UP element) in s tem določa jakost promotorja. Raziskave vpliva UP elementov na jakost promotorja so pokazale, da se vpliv le-teh na jakost promotorja z višanjem koncentracije RNAP zmanjšuje in obratno. Zaporedje navzdol od začetka transkripcije prav tako lahko vpliva na potek transkripcije same, vendar se z uporabo standardnih 5'-neprevajajočih se regij (UTR), temu vplivu lahko izognemo. Knjižnice promotorjev s širokim razponom jakosti predstavljajo dragoceno zbirko, ki jih biološki inženirji s pridom izkoriščajo in jo bodo izkoriščali, dokler se ne pojavijo popolni napovedni modeli.

===Proteinski regulatorji transkripcije===

Aktivatorji

Klasični aktivatorji, ki jih uporabljamo pri oblikovanj genskih vezij, kot je LuxR, delujejo na ta način, da stabilizirajo vezavo RNAP na promotor. Rhodius in kolegi so izkoristili ekstracitoplazmične funkcijske σ faktorje (ECFs) za izgradnjo največje knjižnice ortogonalnih transkripcijskih regulatorjev za ''E. coli'', pri čemer so našli 20 parov ECFs in sorodnih promotorjev, ki imajo zelo nizko navzkrižno reaktivnost. Ti proteini se vežejo na regije -35 in -10 in s tem določajo specifičnost vezave RNAP na določen promotor. Ostali transkripcijski aktivatorji, ki so koristni za uporabo v ''E.coli'' vključujejo tri šaperon-aktivatorske pare (ki se lahko izkoristijo za AND logiko), fagne transkripcijske aktivatorje ter HrpRS bakterijske ojačevalne proteine.

Represorji

Represorji najpogosteje delujejo na ta način, da RNAP onemogočijo dostop do promotorja. Stanton in sodelavci so ustvarili knjižnico homologov TetR in njihovih naravnih operatorjev, ki vsebuje 16 ortogonalnih variant. Obstaja tudi manjša knjižnica variant represorja LacI. Zelo zanimivo družino represorskih proteinov predstavljajo transkripcijskim aktivatorjem podobni efektorji (TALEs). TALE represorji se lažje modelirajo v primerjavi s proteini s cinkovimi prsti in se lahko uporabljajo za kontrolo več kompleksnih genov. Pokazali so da z njimi lahko dosežemo do 100-kratno znižanje ravni izražanja v ''E.coli''.

===RNA kontrola transkripcije===
Lep primer kontrole transkripcije z RNA predstavlja pT181 transkripcijski atenuacijski sistem, katerega različice so razvite za kontrolo genskih vezij v ''E.coli''. Naravni pT181 mehanizem koristi 5'- UTR zanko, ki normalno omogoča elongacijo transkripcije; interakcija med zanko na taRNA z 5'-UTR zanko na mRNA promovira nastanek steblo-zanka strukture, ki povzroči terminacijo transkripcije.
Majhne RNA molekule, ki aktivirajo transkripcijo (STARs), so dizajnirane da porušijo strukturo terminatorja, bodisi preko vezave na zanko, ki se nahaja v zaporedju navzgor ali preko direktne vezave na terminator. Ta pozitivna regulacija sistema pT181 omogoča zelo visoko dinamično območje (94-kratno), v primerjavi s klasičnimi represorji in je prav tako uporabna za izgradnjo večplastnih logičnih vrat.

==ORODJA ZA INŽENIRING IZRAŽANJA PROTEINOV==

===Ortogonalni ribosomi===
Vezava ribosoma na molekulo mRNA je posledica prepoznavanja in baznega parjenja med RBS in anti-Shine-Dalgarno zaporedjem, ki je zapisano v 16S rRNA. To lastnost so izkoristili za ustvarjanje treh dodatnih ortogonalnih ribosomov z modificirano 16S rRNA, ki inicira traslacijo samo na mRNA s sorodnim RBS. Transkripcija obeh ortogonalnih rRNA ter mRNA je potrebna za izražanje tarčnega gena, s čimer dobimo AND logična vrata.

===RNA-stikala===
Z RNA-stikali lahko vplivamo na translacijo preko od liganda odvisne spremembe konformacije 5'-UTR regije mRNA, s čemer otežimo dostop do RBS. Sharma in sodelavci so pokazali da RNA-stikala lahko kombiniramo za izgradnjo AND in NAND logičnih vrat. Od temperature odvisni RNA regulatorji prav tako delujejo preko kontrole dostopnosti RBS za vezavo ribosoma.

===taRNA kontrola translacije===

taRNA-represija

Mehanizem inhibicije translacije z majhnimi RNA molekulami (sRNAs) je konceptualno preprost, zaradi česar je tudi izvajanje same metode relativno enostavno: sRNA vsebuje zaporedje komplementarno tarčni mRNA in se veže na RBS ali na zaporedje navzgor ter na ta način prepreči vezavo ribosoma. Jakost inhibicije je ko korelirana z vezavno energijo sRNA-mRNA.

taRNA-aktivacija

Green in sodelavci so pred kratkim opisali razvoj RNA-stikal tipa »toehold«, oziroma zank, ki onemogočajo normalen potek translacije. Aktivacija translacije poteka preko vezave »sprožilne« RNA, ki se veže na zaporedje navzgor od zanke in ji spremeni strukturo. Najbolj učinkovita tovrstna stikala zajemajo kar 600-kratno dinamično območje, kar je za red velikosti boljše od ostalih taRNA kontrolnih mehanizmov.

==MODULARNOST IN ORTOGONALNOST==
Modularnost predstavlja kvaliteto konzistentnosti funkcije v številnih pogojih in kontekstih in je en izmed temeljnih pogojev za napovedni dizajn genskih vezij. Ortogonalnost zagotavlja da elementi in moduli ne bodo izražali neželene interakcije z drugimi elementi v inženirskih bioloških sistemih, prav tako pa tudi ne z genskim ozadjem gostitelja. Zato sta ti dve lastnosti nepogrešljivi pri načrtovanju kompleksnih genskih vezij.

===Fizična kompozicija===
Sinteznobiološki elementi so lahko občutljivi na spremembe v robnih zaporedjih, ki jih obkrožajo. Iz analize 12,563 kombinacij promotorjev in RBS, Kosuri in sodelavci so odkrili, da se približno 17 % vseh variacij v ravni izražanja proteinov ne more napovedati iz jakosti promotorjev, oziroma RBS. Mutalik in sodelavci so ugotovili, da spoji promotor: UTR in UTR: tarčni gen (GOI) v znatni meri vplivajo na variabilnost v izražanju genov in so naredili operacijsko enoto izražanja (EOU). Uporaba EOU omogoča veliko konzistentnost v nivojih izražanja tarčnih genov, ko menjavamo različne promotorje in RBS, kar ima veliko napovedno moč pri oblikovanju novih genskih vezij in finem usklajevanju ravni izražanja proteinov.

===Vpliv gostitelja===
Cardinale in sodelavci so iz analize velikega števila sevov ''E.coli'' ugotovili, da sta dostopnost ribosomov in hitrost rasti ključne determinante za učinkovitost genskih vezij. Ugotovili so tudi, da specifične delecije gostiteljskih genov imajo lahko veliki vpliv na genska vezja. Te mutacije posredno vplivajo na učinkovitost vezja preko sprememb v fluksu ogljikovega in dušikovega metabolizma. Komplementarni pristop spreminjanja gostiteljskega genetskega (in metabolnega) ozadja preko dodajanja določenih genov, lahko pozitivno vpliva na učinkovitost vezja.

===Robustnost in genetska stabilnost===
Robustna genska vezja vzdržujejo svojo učinkovitost skozi čas in v različnih pogojih – prilagajajo se spremembam, kot je različna hitrost rasti ali dostopnost transkripcijskih faktorjev, in pogosto imajo zelo visoko razmerje signal-šum. Genska vezja, ki so prilagodljiva in ne predstavljajo preveliko breme za gostitelja, sta tudi bolj robustna s stališča genetske stabilnosti. Zaželeno je, da so vezja ortogonalna, in da ne interreagirajo z gostiteljem, s čimer se tudi povečuje robustnost. V primeru, da se medsebojni interakciji ne moremo izogniti, gensko vezje lahko preoblikujemo tako, da dinamično uravnava svojo ekspresijo kot odgovor na povečani stres, ki ga povzroča gostitelju.

==POPRAVLJANJE NAPAK IN FINA NASTAVITEV GENSKIH VEZIJ==
Brez popolnoma napovednih zmogljivosti, načrtovanje genskih vezij neizogibno zahteva stopnje popravljanja napak ter fine nastavitve. Razlogi za neuspeh se najprej morajo identificirati, da bi vezje lahko normalno funkcioniralo znotraj želenih parametrov.

===Nastavljivi elementi v genskih vezjih===
Enkrat, ko se ugotovi razlog za neuspeh, se morajo narediti spremembe v vezju. Komponente je mogoče treba zamenjati, zaradi toksičnih učinkov njihovega izražanja, ali mogoče zaradi neustreznega dinamičnega območja njihovega izhodnega signala. Če je komponenta del velike ortogonalne zbirke, jo lahko zamenjamo z bolj ustrezno varianto. Ojačevalce signala lahko uporabimo v primeru, da hočemo popraviti signal komponente navzgor. Drugače obnašanje posameznih komponent lahko popravimo s spremembo jakosti promotorjev ali RBS, stopnje razgradnje genskih produktov ali števila posameznih komponent.

===Strategije za odpravljanje napak===
Ena izmed najbolj uporabljanih strategij za fino nastavljanje delovanja genskih vezij, je uporaba BioBrick standardov. Medtem, ko je uvajanje mutacij v komponente tekom začetnega sestavljanja enostavno, enkrat, ko so deli povezani v večje module, nadaljnje spreminjanje posameznih komponent ni več možno. Za ponovno uvajanje variacij se moramo vrniti na korak, ko smo dodajali posamezne komponente ali uporabimo nekatero izmed metod, ki temeljijo na PCR. SLIC, Gibsonovo sestavljanje, CPEC in SLiCE so metode zasnovane na PCR, ki predstavljajo dobro alternativo sestavljanju preko linkerjev, ker se z njimi izognemo nastanku »brazgotin«, ki lahko vplivajo na funkcionalnost vezja.
MAGE je zelo močno orodje za uvajanje variacij po predhodnem sestavljanju komponent. Metoda temelji na uporabi različnih ssDNA oligonukleotidov, s katerimi preko λ-Red rekombinaze uvedemo mutacije na ustreznih mestih.

==ZAKLJUČEK==
Po skoraj 15 letih pospešenega napredovanja, sintezna biologija je prišla do stopnje, kjer je na razpolago veliko orodij in osnovnih gradnikov za inženiring genskih vezij. Veliki napredek je ostvarjen tudi na polju ortogonalnosti in modularnosti gradnikov, kar omogoča bolj predvidljivo in robustno načrtovanje kompleksnih genskih vezij. Gradniki, ki temeljijo na RNA, bodo najverjetneje imeli glavno vlogo pri nadaljnji sofistikaciji genskih vezij, zaradi svoje enostavne programabilnosti in ker njihovi termodinamski modeli zelo dobro napovejo obnašanje v genskih vezjih.
Čeprav zelo dinamično in nedefinirano okolje gostitelja pogosto ovira normalno delovanje genskih vezij, strategije, ki temeljijo na uporabi izoliranih delov in racionalnem iskanju optimalnih parametrov bodo zmanjšale čas potreben za izgradnjo kompleksnih vezij. Variacije, ki so posledica interakcij z gostiteljskim metabolizmom, bi se še lahko dodatno znižale z uporabo sevov z reduciranimi genomi.

==VIR==
R. W. Bradley, ''et al''., Tools and Principles for Microbial Gene Circuit Engineering, J. Mol. Biol. (2015).

Orodja in načela za inženiring genskih vezij mikroorganizmov

2016-01-18T20:38:12Z

MarkoRadojkovic:

==UVOD==
Sintezni biologi skozi racionalno načrtovanje in napredno inženirstvo stremijo k ustvarjanju novih genskih vezij, ki bi imela široko uporabnost. Imajoči v mislih kompleksnost procesiranja signalov, ki se pojavljajo v naravnih bioloških sistemih, inženirski mikroorganizmi imajo potencial za opravljanje številnih koristnih nalog, ki zahtevajo sofisticirano računalniško vodenje in kontrolo.
Ta članek predstavlja pregled vsestranskih komponent in orodij, ki so trenutno dostopna za inženiring genskih vezij v mikroorganizmih, vključno z nedavno razvitimi RNA orodji, ki vsebujejo zelo široko dinamično območje in se lahko programirajo. Seznanili se bomo z oblikovalnimi načeli, ki omogočajo robustno in razširljivo delovanje vezij, prav tako pa bomo spoznali nekatere efikasne strategije za hitro identifikacijo in popravljanje napak ter fino nastavljanje lastnosti vezij.

==ORODJA ZA INŽENIRING IZRAŽANJA RNA==
Transkripcija je verjetno najpomembnejša kontrolna točka v genskih vezjih, ker zagotavlja celovito regulacijo izražanja vseh komponent. Kontrolni elementi se lažje sestavljajo na nivoju DNA, s čimer se izognemo težavam, ki lahko nastanejo kot posledica sekundarnih struktur molekul mRNA.

===Vezava RNA-polimeraze===
Nukleotidno zaporedje promotorja, na katero se veže RNA-polimeraza (RNAP), je temeljna determinanta hitrosti transkripcije. Do vezave pride preko σ70- tipa faktorjev na -10 in -35 mesto od začetka transkripcije, kar hkrati določa samo specifičnost iniciacijskega mesta, medtem ko se C-končna domena α podenote preferenčno veže na kratko zaporedje ponovitev A in T baz, 30 mest navzgor od -35 mesta (UP element) in s tem določa jakost promotorja. Raziskave vpliva UP elementov na jakost promotorja so pokazale, da se vpliv le-teh na jakost promotorja z višanjem koncentracije RNAP zmanjšuje in obratno. Zaporedje navzdol od začetka transkripcije prav tako lahko vpliva na potek transkripcije same, vendar se z uporabo standardnih 5'-neprevajajočih se regij (UTR), temu vplivu lahko izognemo. Knjižnice promotorjev s širokim razponom jakosti predstavljajo dragoceno zbirko, ki jih biološki inženirji s pridom izkoriščajo in jo bodo izkoriščali, dokler se ne pojavijo popolni napovedni modeli.

===Proteinski regulatorji transkripcije===

Aktivatorji

Klasični aktivatorji, ki jih uporabljamo pri oblikovanj genskih vezij, kot je LuxR, delujejo na ta način, da stabilizirajo vezavo RNAP na promotor. Rhodius in kolegi so izkoristili ekstracitoplazmične funkcijske σ faktorje (ECFs) za izgradnjo največje knjižnice ortogonalnih transkripcijskih regulatorjev za ''E. coli'', pri čemer so našli 20 parov ECFs in sorodnih promotorjev, ki imajo zelo nizko navzkrižno reaktivnost. Ti proteini se vežejo na regije -35 in -10 in s tem določajo specifičnost vezave RNAP na določen promotor. Ostali transkripcijski aktivatorji, ki so koristni za uporabo v ''E.coli'' vključujejo tri šaperon-aktivatorske pare (ki se lahko izkoristijo za AND logiko), fagne transkripcijske aktivatorje ter HrpRS bakterijske ojačevalne proteine.

Represorji

Represorji najpogosteje delujejo na ta način, da RNAP onemogočijo dostop do promotorja. Stanton in sodelavci so ustvarili knjižnico homologov TetR in njihovih naravnih operatorjev, ki vsebuje 16 ortogonalnih variant. Obstaja tudi manjša knjižnica variant represorja LacI. Zelo zanimivo družino represorskih proteinov predstavljajo transkripcijskim aktivatorjem podobni efektorji (TALEs). TALE represorji se lažje modelirajo v primerjavi s proteini s cinkovimi prsti in se lahko uporabljajo za kontrolo več kompleksnih genov. Pokazali so da z njimi lahko dosežemo do 100-kratno znižanje ravni izražanja v ''E.coli''.

===RNA kontrola transkripcije===
Lep primer kontrole transkripcije z RNA predstavlja pT181 transkripcijski atenuacijski sistem, katerega različice so razvite za kontrolo genskih vezij v ''E.coli''. Naravni pT181 mehanizem koristi 5'- UTR zanko, ki normalno omogoča elongacijo transkripcije; interakcija med zanko na taRNA z 5'-UTR zanko na mRNA promovira nastanek steblo-zanka strukture, ki povzroči terminacijo transkripcije.
Majhne RNA molekule, ki aktivirajo transkripcijo (STARs), so dizajnirane da porušijo strukturo terminatorja, bodisi preko vezave na zanko, ki se nahaja v zaporedju navzgor ali preko direktne vezave na terminator. Ta pozitivna regulacija sistema pT181 omogoča zelo visoko dinamično območje (94-kratno), v primerjavi s klasičnimi represorji in je prav tako uporabna za izgradnjo večplastnih logičnih vrat.

==ORODJA ZA INŽENIRING IZRAŽANJA PROTEINOV==

===Ortogonalni ribosomi===
Vezava ribosoma na molekulo mRNA je posledica prepoznavanja in baznega parjenja med RBS in anti-Shine-Dalgarno zaporedjem, ki je zapisano v 16S rRNA. To lastnost so izkoristili za ustvarjanje treh dodatnih ortogonalnih ribosomov z modificirano 16S rRNA, ki inicira traslacijo samo na mRNA s sorodnim RBS. Transkripcija obeh ortogonalnih rRNA ter mRNA je potrebna za izražanje tarčnega gena, s čimer dobimo AND logična vrata.

===RNA-stikala===
Z RNA-stikali lahko vplivamo na translacijo preko od liganda odvisne spremembe konformacije 5'-UTR regije mRNA, s čemer otežimo dostop do RBS. Sharma in sodelavci so pokazali da RNA-stikala lahko kombiniramo za izgradnjo AND in NAND logičnih vrat. Od temperature odvisni RNA regulatorji prav tako delujejo preko kontrole dostopnosti RBS za vezavo ribosoma.

===taRNA kontrola translacije===

taRNA-represija

Mehanizem inhibicije translacije z majhnimi RNA molekulami (sRNAs) je konceptualno preprost, zaradi česar je tudi izvajanje same metode relativno enostavno: sRNA vsebuje zaporedje komplementarno tarčni mRNA in se veže na RBS ali na zaporedje navzdol ter na ta način prepreči vezavo ribosoma. Vezavna energija sRNA-mRNA je korelirana z jakostjo inhibicije.

taRNA-aktivacija

Green in sodelavci so pred kratkim opisali razvoj RNA-stikal tipa »toehold«, oziroma zank, ki onemogočajo normalen potek translacije. Aktivacija translacije poteka preko vezave »sprožilne« RNA, ki se veže na zaporedje navzgor od zanke in ji spremeni strukturo. Najbolj učinkovita tovrstna stikala zajemajo kar 600-kratno dinamično območje, kar je za red velikosti boljše od ostalih taRNA kontrolnih mehanizmov.

==MODULARNOST IN ORTOGONALNOST==
Modularnost predstavlja kvaliteto konzistentnosti funkcije v številnih pogojih in kontekstih in je en izmed temeljnih pogojev za napovedni dizajn genskih vezij. Ortogonalnost zagotavlja da elementi in moduli ne bodo izražali neželene interakcije z drugimi elementi v inženirskih bioloških sistemih, prav tako pa tudi ne z genskim ozadjem gostitelja. Zato sta ti dve lastnosti nepogrešljivi pri načrtovanju kompleksnih genskih vezij.

===Fizična kompozicija===
Sinteznobiološki elementi so lahko občutljivi na spremembe v robnih zaporedjih, ki jih obkrožajo. Iz analize 12,563 kombinacij promotorjev in RBS, Kosuri in sodelavci so odkrili, da se približno 17 % vseh variacij v ravni izražanja proteinov ne more napovedati iz jakosti promotorjev, oziroma RBS. Mutalik in sodelavci so ugotovili, da spoji promotor: UTR in UTR: tarčni gen (GOI) v znatni meri vplivajo na variabilnost v izražanju genov in so naredili operacijsko enoto izražanja (EOU). Uporaba EOU omogoča veliko konzistentnost v nivojih izražanja tarčnih genov, ko menjavamo različne promotorje in RBS, kar ima veliko napovedno moč pri oblikovanju novih genskih vezij in finem usklajevanju ravni izražanja proteinov.

===Vpliv gostitelja===
Cardinale in sodelavci so iz analize velikega števila sevov ''E.coli'' ugotovili, da sta dostopnost ribosomov in hitrost rasti ključne determinante za učinkovitost genskih vezij. Ugotovili so tudi, da specifične delecije gostiteljskih genov imajo lahko veliki vpliv na genska vezja. Te mutacije posredno vplivajo na učinkovitost vezja preko sprememb v fluksu ogljikovega in dušikovega metabolizma. Komplementarni pristop spreminjanja gostiteljskega genetskega (in metabolnega) ozadja preko dodajanja določenih genov, lahko pozitivno vpliva na učinkovitost vezja.

===Robustnost in genetska stabilnost===
Robustna genska vezja vzdržujejo svojo učinkovitost skozi čas in v različnih pogojih – prilagajajo se spremembam, kot je različna hitrost rasti ali dostopnost transkripcijskih faktorjev, in pogosto imajo zelo visoko razmerje signal-šum. Genska vezja, ki so prilagodljiva in ne predstavljajo preveliko breme za gostitelja, sta tudi bolj robustna s stališča genetske stabilnosti. Zaželeno je, da so vezja ortogonalna, in da ne interreagirajo z gostiteljem, s čimer se tudi povečuje robustnost. V primeru, da se medsebojni interakciji ne moremo izogniti, gensko vezje lahko preoblikujemo tako, da dinamično uravnava svojo ekspresijo kot odgovor na povečani stres, ki ga povzroča gostitelju.

==POPRAVLJANJE NAPAK IN FINA NASTAVITEV GENSKIH VEZIJ==
Brez popolnoma napovednih zmogljivosti, načrtovanje genskih vezij neizogibno zahteva stopnje popravljanja napak ter fine nastavitve. Razlogi za neuspeh se najprej morajo identificirati, da bi vezje lahko normalno funkcioniralo znotraj želenih parametrov.

===Nastavljivi elementi v genskih vezjih===
Enkrat, ko se ugotovi razlog za neuspeh, se morajo narediti spremembe v vezju. Komponente je mogoče treba zamenjati, zaradi toksičnih učinkov njihovega izražanja, ali mogoče zaradi neustreznega dinamičnega območja njihovega izhodnega signala. Če je komponenta del velike ortogonalne zbirke, jo lahko zamenjamo z bolj ustrezno varianto. Ojačevalce signala lahko uporabimo v primeru, da hočemo popraviti signal komponente navzgor. Drugače obnašanje posameznih komponent lahko popravimo s spremembo jakosti promotorjev ali RBS, stopnje razgradnje genskih produktov ali števila posameznih komponent.

===Strategije za odpravljanje napak===
Ena izmed najbolj uporabljanih strategij za fino nastavljanje delovanja genskih vezij, je uporaba BioBrick standardov. Medtem, ko je uvajanje mutacij v komponente tekom začetnega sestavljanja enostavno, enkrat, ko so deli povezani v večje module, nadaljnje spreminjanje posameznih komponent ni več možno. Za ponovno uvajanje variacij se moramo vrniti na korak, ko smo dodajali posamezne komponente ali uporabimo nekatero izmed metod, ki temeljijo na PCR. SLIC, Gibsonovo sestavljanje, CPEC in SLiCE so metode zasnovane na PCR, ki predstavljajo dobro alternativo sestavljanju preko linkerjev, ker se z njimi izognemo nastanku »brazgotin«, ki lahko vplivajo na funkcionalnost vezja.
MAGE je zelo močno orodje za uvajanje variacij po predhodnem sestavljanju komponent. Metoda temelji na uporabi različnih ssDNA oligonukleotidov, s katerimi preko λ-Red rekombinaze uvedemo mutacije na ustreznih mestih.

==ZAKLJUČEK==
Po skoraj 15 letih pospešenega napredovanja, sintezna biologija je prišla do stopnje, kjer je na razpolago veliko orodij in osnovnih gradnikov za inženiring genskih vezij. Veliki napredek je ostvarjen tudi na polju ortogonalnosti in modularnosti gradnikov, kar omogoča bolj predvidljivo in robustno načrtovanje kompleksnih genskih vezij. Gradniki, ki temeljijo na RNA, bodo najverjetneje imeli glavno vlogo pri nadaljnji sofistikaciji genskih vezij, zaradi svoje enostavne programabilnosti in ker njihovi termodinamski modeli zelo dobro napovejo obnašanje v genskih vezjih.
Čeprav zelo dinamično in nedefinirano okolje gostitelja pogosto ovira normalno delovanje genskih vezij, strategije, ki temeljijo na uporabi izoliranih delov in racionalnem iskanju optimalnih parametrov bodo zmanjšale čas potreben za izgradnjo kompleksnih vezij. Variacije, ki so posledica interakcij z gostiteljskim metabolizmom, bi se še lahko dodatno znižale z uporabo sevov z reduciranimi genomi.

==VIR==
R. W. Bradley, ''et al''., Tools and Principles for Microbial Gene Circuit Engineering, J. Mol. Biol. (2015).

Orodja in načela za inženiring genskih vezij mikroorganizmov

2016-01-18T19:47:00Z

MarkoRadojkovic:

==UVOD==
Sintezni biologi skozi racionalno načrtovanje in napredno inženirstvo stremijo k ustvarjanju novih genskih vezij, ki bi imela široko uporabnost. Imajoči v mislih kompleksnost procesiranja signalov, ki se pojavljajo v naravnih bioloških sistemih, inženirski mikroorganizmi imajo potencial za opravljanje številnih koristnih nalog, ki zahtevajo sofisticirano računalniško vodenje in kontrolo.
Ta članek predstavlja pregled vsestranskih komponent in orodij, ki so trenutno dostopna za inženiring genskih vezij v mikroorganizmih, vključno z nedavno razvitimi RNA orodji, ki vsebujejo zelo široko dinamično območje in se lahko programirajo. Seznanili se bomo z oblikovalnimi načeli, ki omogočajo robustno in razširljivo delovanje vezij, prav tako pa bomo spoznali nekatere efikasne strategije za hitro identifikacijo in popravljanje napak ter fino nastavljanje lastnosti vezij.

==ORODJA ZA INŽENIRING IZRAŽANJA RNA==
Transkripcija je verjetno najpomembnejša kontrolna točka v genskih vezjih, ker zagotavlja celovito regulacijo izražanja vseh komponent. Kontrolni elementi se lažje sestavljajo na nivoju DNA, s čimer se izognemo težavam, ki lahko nastanejo kot posledica sekundarnih struktur molekul mRNA.

===Vezava RNA-polimeraze===
Nukleotidno zaporedje promotorja, na katero se veže RNA-polimeraza (RNAP), je temeljna determinanta hitrosti transkripcije. Do vezave pride preko σ70- tipa faktorjev na -10 in -35 mesto od začetka transkripcije, kar hkrati določa samo specifičnost iniciacijskega mesta, medtem ko se C-končna domena α podenote preferenčno veže na kratko zaporedje ponovitev A in T baz, 30 mest navzgor od -35 mesta (UP element) in s tem določa jakost promotorja. Raziskave vpliva UP elementov na jakost promotorja so pokazale, da se vpliv le-teh na jakost promotorja z višanjem koncentracije RNAP zmanjšuje in obratno. Zaporedje navzdol od začetka transkripcije prav tako lahko vpliva na potek transkripcije same, vendar se z uporabo standardnih 5'-neprevajajočih se regij (UTR), temu vplivu lahko izognemo. Knjižnice promotorjev s širokim razponom jakosti predstavljajo dragoceno zbirko, ki jih biološki inženirji s pridom izkoriščajo in jo bodo izkoriščali, dokler se ne pojavijo popolni napovedni modeli.

===Proteinski regulatorji transkripcije===

Aktivatorji

Klasični aktivatorji, ki jih uporabljamo pri oblikovanj genskih vezij, kot je LuxR, delujejo na ta način, da stabilizirajo vezavo RNAP na promotor. Rhodius in kolegi so izkoristili ekstracitoplazmične funkcijske σ faktorje (ECFs) za izgradnjo največje knjižnice ortogonalnih transkripcijskih regulatorjev za ''E. coli'', pri čemer so našli 20 parov ECFs in sorodnih promotorjev, ki imajo zelo nizko navzkrižno reaktivnost. Ti proteini se vežejo na regije -35 in -10 in s tem določajo specifičnost vezave RNAP na določen promotor. Ostali transkripcijski aktivatorji, ki so koristni za uporabo v ''E.coli'' vključujejo tri šaperon-aktivatorske pare (ki se lahko izkoristijo za AND logiko), fagne transkripcijske aktivatorje ter HrpRS bakterijske ojačevalne proteine.

Represorji

Represorji najpogosteje delujejo na ta način, da RNAP onemogočijo dostop do promotorja. Stanton in sodelavci so ustvarili knjižnico homologov TetR in njihovih naravnih operatorjev, ki vsebuje 16 ortogonalnih variant. Obstaja tudi manjša knjižnica variant represorja LacI. Zelo zanimivo družino represorskih proteinov predstavljajo transkripcijskim aktivatorjem podobni efektorji (TALEs). TALE represorji se lažje modelirajo v primerjavi s proteini s cinkovimi prsti in se lahko uporabljajo za kontrolo več kompleksnih genov. Pokazali so da z njimi lahko dosežemo do 100-kratno znižanje ravni izražanja v ''E.coli''.

===RNA kontrola transkripcije===
Lep primer kontrole transkripcije z RNA predstavlja pT181 transkripcijski atenuacijski sistem, katerega različice so razvite za kontrolo genskih vezij v ''E.coli''. Naravni pT181 mehanizem koristi 5'- UTR zanko, ki normalno omogoča elongacijo transkripcije; interakcija med zanko na taRNA z 5'-UTR zanko na mRNA promovira nastanek steblo-zanka strukture, ki povzroči terminacijo transkripcije.
Majhne RNA molekule, ki aktivirajo transkripcijo (STARs), so dizajnirane da porušijo strukturo terminatorja, bodisi preko vezave na zanko, ki se nahaja v zaporedju navzgor ali preko direktne vezave na terminator. Ta pozitivna regulacija sistema pT181 omogoča zelo visoko dinamično območje (94-kratno), v primerjavi s klasičnimi represorji in je prav tako uporabna za izgradnjo večplastnih logičnih vrat.

==ORODJA ZA INŽENIRING IZRAŽANJA PROTEINOV==

===Ortogonalni ribosomi===
Vezava ribosoma na molekulo mRNA je posledica prepoznavanja in baznega parjenja med RBS in anti-Shine-Dalgarno zaporedjem, ki je zapisano v 16S rRNA. To lastnost so izkoristili za ustvarjanje treh dodatnih ortogonalnih ribosomov z modificirano 16S rRNA, ki inicira traslacijo samo na mRNA s sorodnim RBS. Transkripcija obeh ortogonalnih rRNA ter mRNA je potrebna za izražanje tarčnega gena, s čimer dobimo AND logična vrata.

===RNA stikala===
Z RNA stikali lahko vplivamo na translacijo preko od liganda odvisne spremembe konformacije 5'-UTR regije mRNA, s čemer otežimo dostop do RBS. Sharma in sodelavci so pokazali da RNA stikala lahko kombiniramo za izgradnjo AND in NAND logičnih vrat. Od temperature odvisni RNA regulatorji prav tako delujejo preko kontrole dostopnosti RBS za vezavo ribosoma.

===taRNA kontrola translacije===

taRNA-represija

Mehanizem inhibicije translacije z majhnimi RNA molekulami (sRNAs) je konceptualno preprost, zaradi česar je tudi izvajanje same metode relativno enostavno: sRNA vsebuje zaporedje komplementarno tarčni mRNA in se veže na RBS ali na zaporedje navzdol ter na ta način prepreči vezavo ribosoma. Vezavna energija sRNA-mRNA je korelirana z jakostjo inhibicije.

taRNA-aktivacija

Green in sodelavci so pred kratkim opisali razvoj RNA-stikal tipa »toehold«, oziroma zank, ki onemogočajo normalen potek translacije. Aktivacija translacije poteka preko vezave »sprožilne« RNA, ki se veže na zaporedje navzgor od zanke in ji spremeni strukturo. Najbolj učinkovita tovrstna stikala zajemajo kar 600-kratno dinamično območje, kar je za red velikosti boljše od ostalih taRNA kontrolnih mehanizmov.

==MODULARNOST IN ORTOGONALNOST==
Modularnost predstavlja kvaliteto konzistentnosti funkcije v številnih pogojih in kontekstih in je en izmed temeljnih pogojev za napovedni dizajn genskih vezij. Ortogonalnost zagotavlja da elementi in moduli ne bodo izražali neželene interakcije z drugimi elementi v inženirskih bioloških sistemih, prav tako pa tudi ne z genskim ozadjem gostitelja. Zato sta ti dve lastnosti nepogrešljivi pri načrtovanju kompleksnih genskih vezij.

===Fizična kompozicija===
Sinteznobiološki elementi so lahko občutljivi na spremembe v robnih zaporedjih, ki jih obkrožajo. Iz analize 12,563 kombinacij promotorjev in RBS, Kosuri in sodelavci so odkrili, da se približno 17 % vseh variacij v ravni izražanja proteinov ne more napovedati iz jakosti promotorjev, oziroma RBS. Mutalik in sodelavci so ugotovili, da spoji promotor: UTR in UTR: tarčni gen (GOI) v znatni meri vplivajo na variabilnost v izražanju genov in so naredili operacijsko enoto izražanja (EOU). Uporaba EOU omogoča veliko konzistentnost v nivojih izražanja tarčnih genov, ko menjavamo različne promotorje in RBS, kar ima veliko napovedno moč pri oblikovanju novih genskih vezij in finem usklajevanju ravni izražanja proteinov.

===Vpliv gostitelja===
Cardinale in sodelavci so iz analize velikega števila sevov ''E.coli'' ugotovili, da sta dostopnost ribosomov in hitrost rasti ključne determinante za učinkovitost genskih vezij. Ugotovili so tudi, da specifične delecije gostiteljskih genov imajo lahko veliki vpliv na genska vezja. Te mutacije posredno vplivajo na učinkovitost vezja preko sprememb v fluksu ogljikovega in dušikovega metabolizma. Komplementarni pristop spreminjanja gostiteljskega genetskega (in metabolnega) ozadja preko dodajanja določenih genov, lahko pozitivno vpliva na učinkovitost vezja.

===Robustnost in genetska stabilnost===
Robustna genska vezja vzdržujejo svojo učinkovitost skozi čas in v različnih pogojih – prilagajajo se spremembam, kot je različna hitrost rasti ali dostopnost transkripcijskih faktorjev, in pogosto imajo zelo visoko razmerje signal-šum. Genska vezja, ki so prilagodljiva in ne predstavljajo preveliko breme za gostitelja, sta tudi bolj robustna s stališča genetske stabilnosti. Zaželeno je, da so vezja ortogonalna, in da ne interreagirajo z gostiteljem, s čimer se tudi povečuje robustnost. V primeru, da se medsebojni interakciji ne moremo izogniti, gensko vezje lahko preoblikujemo tako, da dinamično uravnava svojo ekspresijo kot odgovor na povečani stres, ki ga povzroča gostitelju.

==POPRAVLJANJE NAPAK IN FINA NASTAVITEV GENSKIH VEZIJ==
Brez popolnoma napovednih zmogljivosti, načrtovanje genskih vezij neizogibno zahteva stopnje popravljanja napak ter fine nastavitve. Razlogi za neuspeh se najprej morajo identificirati, da bi vezje lahko normalno funkcioniralo znotraj želenih parametrov.

===Nastavljivi elementi v genskih vezjih===
Enkrat, ko se ugotovi razlog za neuspeh, se morajo narediti spremembe v vezju. Komponente je mogoče treba zamenjati, zaradi toksičnih učinkov njihovega izražanja, ali mogoče zaradi neustreznega dinamičnega območja njihovega izhodnega signala. Če je komponenta del velike ortogonalne zbirke, jo lahko zamenjamo z bolj ustrezno varianto. Ojačevalce signala lahko uporabimo v primeru, da hočemo popraviti signal komponente navzgor. Drugače obnašanje posameznih komponent lahko popravimo s spremembo jakosti promotorjev ali RBS, stopnje razgradnje genskih produktov ali števila posameznih komponent.

===Strategije za odpravljanje napak===
Ena izmed najbolj uporabljanih strategij za fino nastavljanje delovanja genskih vezij, je uporaba BioBrick standardov. Medtem, ko je uvajanje mutacij v komponente tekom začetnega sestavljanja enostavno, enkrat, ko so deli povezani v večje module, nadaljnje spreminjanje posameznih komponent ni več možno. Za ponovno uvajanje variacij se moramo vrniti na korak, ko smo dodajali posamezne komponente ali uporabimo nekatero izmed metod, ki temeljijo na PCR. SLIC, Gibsonovo sestavljanje, CPEC in SLiCE so metode zasnovane na PCR, ki predstavljajo dobro alternativo sestavljanju preko linkerjev, ker se z njimi izognemo nastanku »brazgotin«, ki lahko vplivajo na funkcionalnost vezja.
MAGE je zelo močno orodje za uvajanje variacij po predhodnem sestavljanju komponent. Metoda temelji na uporabi različnih ssDNA oligonukleotidov, s katerimi preko λ-Red rekombinaze uvedemo mutacije na ustreznih mestih.

==ZAKLJUČEK==
Po skoraj 15 letih pospešenega napredovanja, sintezna biologija je prišla do stopnje, kjer je na razpolago veliko orodij in osnovnih gradnikov za inženiring genskih vezij. Veliki napredek je ostvarjen tudi na polju ortogonalnosti in modularnosti gradnikov, kar omogoča bolj predvidljivo in robustno načrtovanje kompleksnih genskih vezij. Gradniki, ki temeljijo na RNA, bodo najverjetneje imeli glavno vlogo pri nadaljnji sofistikaciji genskih vezij, zaradi svoje enostavne programabilnosti in ker njihovi termodinamski modeli zelo dobro napovejo obnašanje v genskih vezjih.
Čeprav zelo dinamično in nedefinirano okolje gostitelja pogosto ovira normalno delovanje genskih vezij, strategije, ki temeljijo na uporabi izoliranih delov in racionalnem iskanju optimalnih parametrov bodo zmanjšale čas potreben za izgradnjo kompleksnih vezij. Variacije, ki so posledica interakcij z gostiteljskim metabolizmom, bi se še lahko dodatno znižale z uporabo sevov z reduciranimi genomi.

==VIR==
R. W. Bradley, ''et al''., Tools and Principles for Microbial Gene Circuit Engineering, J. Mol. Biol. (2015).

Orodja in načela za inženiring genskih vezij mikroorganizmov

2016-01-18T19:45:50Z

MarkoRadojkovic:

==UVOD==
Sintezni biologi skozi racionalno načrtovanje in napredno inženirstvo stremijo k ustvarjanju novih genskih vezij, ki bi imela široko uporabnost. Imajoči v mislih kompleksnost procesiranja signalov, ki se pojavljajo v naravnih bioloških sistemih, inženirski mikroorganizmi imajo potencial za opravljanje številnih koristnih nalog, ki zahtevajo sofisticirano računalniško vodenje in kontrolo.
Ta članek predstavlja pregled vsestranskih komponent in orodij, ki so trenutno dostopna za inženiring genskih vezij v mikroorganizmih, vključno z nedavno razvitimi RNA orodji, ki vsebujejo zelo široko dinamično območje in se lahko programirajo. Seznanili se bomo z oblikovalnimi načeli, ki omogočajo robustno in razširljivo delovanje vezij, prav tako pa bomo spoznali nekatere efikasne strategije za hitro identifikacijo in popravljanje napak ter fino nastavljanje lastnosti vezij.

==ORODJA ZA INŽENIRING IZRAŽANJA RNA==
Transkripcija je verjetno najpomembnejša kontrolna točka v genskih vezjih, ker zagotavlja celovito regulacijo izražanja vseh komponent. Kontrolni elementi se lažje sestavljajo na nivoju DNA, s čimer se izognemo težavam, ki lahko nastanejo kot posledica sekundarnih struktur molekul mRNA.

===Vezava RNA===
Nukleotidno zaporedje promotorja, na katero se veže RNA-polimeraza (RNAP), je temeljna determinanta hitrosti transkripcije. Do vezave pride preko σ70- tipa faktorjev na -10 in -35 mesto od začetka transkripcije, kar hkrati določa samo specifičnost iniciacijskega mesta, medtem ko se C-končna domena α podenote preferenčno veže na kratko zaporedje ponovitev A in T baz, 30 mest navzgor od -35 mesta (UP element) in s tem določa jakost promotorja. Raziskave vpliva UP elementov na jakost promotorja so pokazale, da se vpliv le-teh na jakost promotorja z višanjem koncentracije RNAP zmanjšuje in obratno. Zaporedje navzdol od začetka transkripcije prav tako lahko vpliva na potek transkripcije same, vendar se z uporabo standardnih 5'-neprevajajočih se regij (UTR), temu vplivu lahko izognemo. Knjižnice promotorjev s širokim razponom jakosti predstavljajo dragoceno zbirko, ki jih biološki inženirji s pridom izkoriščajo in jo bodo izkoriščali, dokler se ne pojavijo popolni napovedni modeli.

===Proteinski regulatorji transkripcije===

Aktivatorji

Klasični aktivatorji, ki jih uporabljamo pri oblikovanj genskih vezij, kot je LuxR, delujejo na ta način, da stabilizirajo vezavo RNAP na promotor. Rhodius in kolegi so izkoristili ekstracitoplazmične funkcijske σ faktorje (ECFs) za izgradnjo največje knjižnice ortogonalnih transkripcijskih regulatorjev za ''E. coli'', pri čemer so našli 20 parov ECFs in sorodnih promotorjev, ki imajo zelo nizko navzkrižno reaktivnost. Ti proteini se vežejo na regije -35 in -10 in s tem določajo specifičnost vezave RNAP na določen promotor. Ostali transkripcijski aktivatorji, ki so koristni za uporabo v ''E.coli'' vključujejo tri šaperon-aktivatorske pare (ki se lahko izkoristijo za AND logiko), fagne transkripcijske aktivatorje ter HrpRS bakterijske ojačevalne proteine.

Represorji

Represorji najpogosteje delujejo na ta način, da RNAP onemogočijo dostop do promotorja. Stanton in sodelavci so ustvarili knjižnico homologov TetR in njihovih naravnih operatorjev, ki vsebuje 16 ortogonalnih variant. Obstaja tudi manjša knjižnica variant represorja LacI. Zelo zanimivo družino represorskih proteinov predstavljajo transkripcijskim aktivatorjem podobni efektorji (TALEs). TALE represorji se lažje modelirajo v primerjavi s proteini s cinkovimi prsti in se lahko uporabljajo za kontrolo več kompleksnih genov. Pokazali so da z njimi lahko dosežemo do 100-kratno znižanje ravni izražanja v ''E.coli''.

===RNA kontrola transkripcije===
Lep primer kontrole transkripcije z RNA predstavlja pT181 transkripcijski atenuacijski sistem, katerega različice so razvite za kontrolo genskih vezij v ''E.coli''. Naravni pT181 mehanizem koristi 5'- UTR zanko, ki normalno omogoča elongacijo transkripcije; interakcija med zanko na taRNA z 5'-UTR zanko na mRNA promovira nastanek steblo-zanka strukture, ki povzroči terminacijo transkripcije.
Majhne RNA molekule, ki aktivirajo transkripcijo (STARs), so dizajnirane da porušijo strukturo terminatorja, bodisi preko vezave na zanko, ki se nahaja v zaporedju navzgor ali preko direktne vezave na terminator. Ta pozitivna regulacija sistema pT181 omogoča zelo visoko dinamično območje (94-kratno), v primerjavi s klasičnimi represorji in je prav tako uporabna za izgradnjo večplastnih logičnih vrat.

==ORODJA ZA INŽENIRING IZRAŽANJA PROTEINOV==

===Ortogonalni ribosomi===
Vezava ribosoma na molekulo mRNA je posledica prepoznavanja in baznega parjenja med RBS in anti-Shine-Dalgarno zaporedjem, ki je zapisano v 16S rRNA. To lastnost so izkoristili za ustvarjanje treh dodatnih ortogonalnih ribosomov z modificirano 16S rRNA, ki inicira traslacijo samo na mRNA s sorodnim RBS. Transkripcija obeh ortogonalnih rRNA ter mRNA je potrebna za izražanje tarčnega gena, s čimer dobimo AND logična vrata.

===RNA stikala===
Z RNA stikali lahko vplivamo na translacijo preko od liganda odvisne spremembe konformacije 5'-UTR regije mRNA, s čemer otežimo dostop do RBS. Sharma in sodelavci so pokazali da RNA stikala lahko kombiniramo za izgradnjo AND in NAND logičnih vrat. Od temperature odvisni RNA regulatorji prav tako delujejo preko kontrole dostopnosti RBS za vezavo ribosoma.

===taRNA kontrola translacije===

taRNA-represija

Mehanizem inhibicije translacije z majhnimi RNA molekulami (sRNAs) je konceptualno preprost, zaradi česar je tudi izvajanje same metode relativno enostavno: sRNA vsebuje zaporedje komplementarno tarčni mRNA in se veže na RBS ali na zaporedje navzdol ter na ta način prepreči vezavo ribosoma. Vezavna energija sRNA-mRNA je korelirana z jakostjo inhibicije.

taRNA-aktivacija

Green in sodelavci so pred kratkim opisali razvoj RNA-stikal tipa »toehold«, oziroma zank, ki onemogočajo normalen potek translacije. Aktivacija translacije poteka preko vezave »sprožilne« RNA, ki se veže na zaporedje navzgor od zanke in ji spremeni strukturo. Najbolj učinkovita tovrstna stikala zajemajo kar 600-kratno dinamično območje, kar je za red velikosti boljše od ostalih taRNA kontrolnih mehanizmov.

==MODULARNOST IN ORTOGONALNOST==
Modularnost predstavlja kvaliteto konzistentnosti funkcije v številnih pogojih in kontekstih in je en izmed temeljnih pogojev za napovedni dizajn genskih vezij. Ortogonalnost zagotavlja da elementi in moduli ne bodo izražali neželene interakcije z drugimi elementi v inženirskih bioloških sistemih, prav tako pa tudi ne z genskim ozadjem gostitelja. Zato sta ti dve lastnosti nepogrešljivi pri načrtovanju kompleksnih genskih vezij.

===Fizična kompozicija===
Sinteznobiološki elementi so lahko občutljivi na spremembe v robnih zaporedjih, ki jih obkrožajo. Iz analize 12,563 kombinacij promotorjev in RBS, Kosuri in sodelavci so odkrili, da se približno 17 % vseh variacij v ravni izražanja proteinov ne more napovedati iz jakosti promotorjev, oziroma RBS. Mutalik in sodelavci so ugotovili, da spoji promotor: UTR in UTR: tarčni gen (GOI) v znatni meri vplivajo na variabilnost v izražanju genov in so naredili operacijsko enoto izražanja (EOU). Uporaba EOU omogoča veliko konzistentnost v nivojih izražanja tarčnih genov, ko menjavamo različne promotorje in RBS, kar ima veliko napovedno moč pri oblikovanju novih genskih vezij in finem usklajevanju ravni izražanja proteinov.

===Vpliv gostitelja===
Cardinale in sodelavci so iz analize velikega števila sevov ''E.coli'' ugotovili, da sta dostopnost ribosomov in hitrost rasti ključne determinante za učinkovitost genskih vezij. Ugotovili so tudi, da specifične delecije gostiteljskih genov imajo lahko veliki vpliv na genska vezja. Te mutacije posredno vplivajo na učinkovitost vezja preko sprememb v fluksu ogljikovega in dušikovega metabolizma. Komplementarni pristop spreminjanja gostiteljskega genetskega (in metabolnega) ozadja preko dodajanja določenih genov, lahko pozitivno vpliva na učinkovitost vezja.

===Robustnost in genetska stabilnost===
Robustna genska vezja vzdržujejo svojo učinkovitost skozi čas in v različnih pogojih – prilagajajo se spremembam, kot je različna hitrost rasti ali dostopnost transkripcijskih faktorjev, in pogosto imajo zelo visoko razmerje signal-šum. Genska vezja, ki so prilagodljiva in ne predstavljajo preveliko breme za gostitelja, sta tudi bolj robustna s stališča genetske stabilnosti. Zaželeno je, da so vezja ortogonalna, in da ne interreagirajo z gostiteljem, s čimer se tudi povečuje robustnost. V primeru, da se medsebojni interakciji ne moremo izogniti, gensko vezje lahko preoblikujemo tako, da dinamično uravnava svojo ekspresijo kot odgovor na povečani stres, ki ga povzroča gostitelju.

==POPRAVLJANJE NAPAK IN FINA NASTAVITEV GENSKIH VEZIJ==
Brez popolnoma napovednih zmogljivosti, načrtovanje genskih vezij neizogibno zahteva stopnje popravljanja napak ter fine nastavitve. Razlogi za neuspeh se najprej morajo identificirati, da bi vezje lahko normalno funkcioniralo znotraj želenih parametrov.

===Nastavljivi elementi v genskih vezjih===
Enkrat, ko se ugotovi razlog za neuspeh, se morajo narediti spremembe v vezju. Komponente je mogoče treba zamenjati, zaradi toksičnih učinkov njihovega izražanja, ali mogoče zaradi neustreznega dinamičnega območja njihovega izhodnega signala. Če je komponenta del velike ortogonalne zbirke, jo lahko zamenjamo z bolj ustrezno varianto. Ojačevalce signala lahko uporabimo v primeru, da hočemo popraviti signal komponente navzgor. Drugače obnašanje posameznih komponent lahko popravimo s spremembo jakosti promotorjev ali RBS, stopnje razgradnje genskih produktov ali števila posameznih komponent.

===Strategije za odpravljanje napak===
Ena izmed najbolj uporabljanih strategij za fino nastavljanje delovanja genskih vezij, je uporaba BioBrick standardov. Medtem, ko je uvajanje mutacij v komponente tekom začetnega sestavljanja enostavno, enkrat, ko so deli povezani v večje module, nadaljnje spreminjanje posameznih komponent ni več možno. Za ponovno uvajanje variacij se moramo vrniti na korak, ko smo dodajali posamezne komponente ali uporabimo nekatero izmed metod, ki temeljijo na PCR. SLIC, Gibsonovo sestavljanje, CPEC in SLiCE so metode zasnovane na PCR, ki predstavljajo dobro alternativo sestavljanju preko linkerjev, ker se z njimi izognemo nastanku »brazgotin«, ki lahko vplivajo na funkcionalnost vezja.
MAGE je zelo močno orodje za uvajanje variacij po predhodnem sestavljanju komponent. Metoda temelji na uporabi različnih ssDNA oligonukleotidov, s katerimi preko λ-Red rekombinaze uvedemo mutacije na ustreznih mestih.

==ZAKLJUČEK==
Po skoraj 15 letih pospešenega napredovanja, sintezna biologija je prišla do stopnje, kjer je na razpolago veliko orodij in osnovnih gradnikov za inženiring genskih vezij. Veliki napredek je ostvarjen tudi na polju ortogonalnosti in modularnosti gradnikov, kar omogoča bolj predvidljivo in robustno načrtovanje kompleksnih genskih vezij. Gradniki, ki temeljijo na RNA, bodo najverjetneje imeli glavno vlogo pri nadaljnji sofistikaciji genskih vezij, zaradi svoje enostavne programabilnosti in ker njihovi termodinamski modeli zelo dobro napovejo obnašanje v genskih vezjih.
Čeprav zelo dinamično in nedefinirano okolje gostitelja pogosto ovira normalno delovanje genskih vezij, strategije, ki temeljijo na uporabi izoliranih delov in racionalnem iskanju optimalnih parametrov bodo zmanjšale čas potreben za izgradnjo kompleksnih vezij. Variacije, ki so posledica interakcij z gostiteljskim metabolizmom, bi se še lahko dodatno znižale z uporabo sevov z reduciranimi genomi.

==VIR==
R. W. Bradley, ''et al''., Tools and Principles for Microbial Gene Circuit Engineering, J. Mol. Biol. (2015).

Orodja in načela za inženiring genskih vezij mikroorganizmov

2016-01-18T19:05:21Z

MarkoRadojkovic:

==UVOD==
Sintezni biologi skozi racionalno načrtovanje in napredno inženirstvo stremijo k ustvarjanju novih genskih vezij, ki bi imela široko uporabnost. Imajoči v mislih kompleksnost procesiranja signalov, ki se pojavljajo v naravnih bioloških sistemih, inženirski mikroorganizmi imajo potencial za opravljanje številnih koristnih nalog, ki zahtevajo sofisticirano računalniško vodenje in kontrolo.
Ta članek predstavlja pregled vsestranskih komponent in orodij, ki so trenutno dostopna za inženiring genskih vezij v mikroorganizmih, vključno z nedavno razvitimi RNA orodji, ki vsebujejo zelo široko dinamično območje in se lahko programirajo. Seznanili se bomo z oblikovalnimi načeli, ki omogočajo robustno in razširljivo delovanje vezij, prav tako pa bomo spoznali nekatere efikasne strategije za hitro identifikacijo in popravljanje napak ter fino nastavljanje lastnosti vezij.

==ORODJA ZA INŽENIRING RNA==
Transkripcija je verjetno najpomembnejša kontrolna točka v genskih vezjih, ker zagotavlja celovito regulacijo izražanja vseh komponent. Kontrolni elementi se lažje sestavljajo na nivoju DNA, s čimer se izognemo težavam, ki lahko nastanejo kot posledica sekundarnih struktur molekul mRNA.

===Vezava RNA===
Nukleotidno zaporedje promotorja, na katero se veže RNA-polimeraza (RNAP), je temeljna determinanta hitrosti transkripcije. Do vezave pride preko σ70- tipa faktorjev na -10 in -35 mesto od začetka transkripcije, kar hkrati določa samo specifičnost iniciacijskega mesta, medtem ko se C-končna domena α podenote preferenčno veže na kratko zaporedje ponovitev A in T baz, 30 mest navzgor od -35 mesta (UP element) in s tem določa jakost promotorja. Raziskave vpliva UP elementov na jakost promotorja so pokazale, da se vpliv le-teh na jakost promotorja z višanjem koncentracije RNAP zmanjšuje in obratno. Zaporedje navzdol od začetka transkripcije prav tako lahko vpliva na potek transkripcije same, vendar se z uporabo standardnih 5'-neprevajajočih se regij (UTR), temu vplivu lahko izognemo. Knjižnice promotorjev s širokim razponom jakosti predstavljajo dragoceno zbirko, ki jih biološki inženirji s pridom izkoriščajo in jo bodo izkoriščali, dokler se ne pojavijo popolni napovedni modeli.

===Proteinski regulatorji transkripcije===

Aktivatorji

Klasični aktivatorji, ki jih uporabljamo pri oblikovanj genskih vezij, kot je LuxR, delujejo na ta način, da stabilizirajo vezavo RNAP na promotor. Rhodius in kolegi so izkoristili ekstracitoplazmične funkcijske σ faktorje (ECFs) za izgradnjo največje knjižnice ortogonalnih transkripcijskih regulatorjev za ''E. coli'', pri čemer so našli 20 parov ECFs in sorodnih promotorjev, ki imajo zelo nizko navzkrižno reaktivnost. Ti proteini se vežejo na regije -35 in -10 in s tem določajo specifičnost vezave RNAP na določen promotor. Ostali transkripcijski aktivatorji, ki so koristni za uporabo v ''E.coli'' vključujejo tri šaperon-aktivatorske pare (ki se lahko izkoristijo za AND logiko), fagne transkripcijske aktivatorje ter HrpRS bakterijske ojačevalne proteine.

Represorji

Represorji najpogosteje delujejo na ta način, da RNAP onemogočijo dostop do promotorja. Stanton in sodelavci so ustvarili knjižnico homologov TetR in njihovih naravnih operatorjev, ki vsebuje 16 ortogonalnih variant. Obstaja tudi manjša knjižnica variant represorja LacI. Zelo zanimivo družino represorskih proteinov predstavljajo transkripcijskim aktivatorjem podobni efektorji (TALEs). TALE represorji se lažje modelirajo v primerjavi s proteini s cinkovimi prsti in se lahko uporabljajo za kontrolo več kompleksnih genov. Pokazali so da z njimi lahko dosežemo do 100-kratno znižanje ravni izražanja v ''E.coli''.

===RNA kontrola transkripcije===
Lep primer kontrole transkripcije z RNA predstavlja pT181 transkripcijski atenuacijski sistem, katerega različice so razvite za kontrolo genskih vezij v ''E.coli''. Naravni pT181 mehanizem koristi 5'- UTR zanko, ki normalno omogoča elongacijo transkripcije; interakcija med zanko na taRNA z 5'-UTR zanko na mRNA promovira nastanek steblo-zanka strukture, ki povzroči terminacijo transkripcije.
Majhne RNA molekule, ki aktivirajo transkripcijo (STARs), so dizajnirane da porušijo strukturo terminatorja, bodisi preko vezave na zanko, ki se nahaja v zaporedju navzgor ali preko direktne vezave na terminator. Ta pozitivna regulacija sistema pT181 omogoča zelo visoko dinamično območje (94-kratno), v primerjavi s klasičnimi represorji in je prav tako uporabna za izgradnjo večplastnih logičnih vrat.

==ORODJA ZA INŽENIRING IZRAŽANJA PROTEINOV==

===Ortogonalni ribosomi===
Vezava ribosoma na molekulo mRNA je posledica prepoznavanja in baznega parjenja med RBS in anti-Shine-Dalgarno zaporedjem, ki je zapisano v 16S rRNA. To lastnost so izkoristili za ustvarjanje treh dodatnih ortogonalnih ribosomov z modificirano 16S rRNA, ki inicira traslacijo samo na mRNA s sorodnim RBS. Transkripcija obeh ortogonalnih rRNA ter mRNA je potrebna za izražanje tarčnega gena, s čimer dobimo AND logična vrata.

===RNA stikala===
Z RNA stikali lahko vplivamo na translacijo preko od liganda odvisne spremembe konformacije 5'-UTR regije mRNA, s čemer otežimo dostop do RBS. Sharma in sodelavci so pokazali da RNA stikala lahko kombiniramo za izgradnjo AND in NAND logičnih vrat. Od temperature odvisni RNA regulatorji prav tako delujejo preko kontrole dostopnosti RBS za vezavo ribosoma.

===taRNA kontrola translacije===

taRNA-represija

Mehanizem inhibicije translacije z majhnimi RNA molekulami (sRNAs) je konceptualno preprost, zaradi česar je tudi izvajanje same metode relativno enostavno: sRNA vsebuje zaporedje komplementarno tarčni mRNA in se veže na RBS ali na zaporedje navzdol ter na ta način prepreči vezavo ribosoma. Vezavna energija sRNA-mRNA je korelirana z jakostjo inhibicije.

taRNA-aktivacija

Green in sodelavci so pred kratkim opisali razvoj RNA-stikal tipa »toehold«, oziroma zank, ki onemogočajo normalen potek translacije. Aktivacija translacije poteka preko vezave »sprožilne« RNA, ki se veže na zaporedje navzgor od zanke in ji spremeni strukturo. Najbolj učinkovita tovrstna stikala zajemajo kar 600-kratno dinamično območje, kar je za red velikosti boljše od ostalih taRNA kontrolnih mehanizmov.

==MODULARNOST IN ORTOGONALNOST==
Modularnost predstavlja kvaliteto konzistentnosti funkcije v številnih pogojih in kontekstih in je en izmed temeljnih pogojev za napovedni dizajn genskih vezij. Ortogonalnost zagotavlja da elementi in moduli ne bodo izražali neželene interakcije z drugimi elementi v inženirskih bioloških sistemih, prav tako pa tudi ne z genskim ozadjem gostitelja. Zato sta ti dve lastnosti nepogrešljivi pri načrtovanju kompleksnih genskih vezij.

===Fizična kompozicija===
Sinteznobiološki elementi so lahko občutljivi na spremembe v robnih zaporedjih, ki jih obkrožajo. Iz analize 12,563 kombinacij promotorjev in RBS, Kosuri in sodelavci so odkrili, da se približno 17 % vseh variacij v ravni izražanja proteinov ne more napovedati iz jakosti promotorjev, oziroma RBS. Mutalik in sodelavci so ugotovili, da spoji promotor: UTR in UTR: tarčni gen (GOI) v znatni meri vplivajo na variabilnost v izražanju genov in so naredili operacijsko enoto izražanja (EOU). Uporaba EOU omogoča veliko konzistentnost v nivojih izražanja tarčnih genov, ko menjavamo različne promotorje in RBS, kar ima veliko napovedno moč pri oblikovanju novih genskih vezij in finem usklajevanju ravni izražanja proteinov.

===Vpliv gostitelja===
Cardinale in sodelavci so iz analize velikega števila sevov ''E.coli'' ugotovili, da sta dostopnost ribosomov in hitrost rasti ključne determinante za učinkovitost genskih vezij. Ugotovili so tudi, da specifične delecije gostiteljskih genov imajo lahko veliki vpliv na genska vezja. Te mutacije posredno vplivajo na učinkovitost vezja preko sprememb v fluksu ogljikovega in dušikovega metabolizma. Komplementarni pristop spreminjanja gostiteljskega genetskega (in metabolnega) ozadja preko dodajanja določenih genov, lahko pozitivno vpliva na učinkovitost vezja.

===Robustnost in genetska stabilnost===
Robustna genska vezja vzdržujejo svojo učinkovitost skozi čas in v različnih pogojih – prilagajajo se spremembam, kot je različna hitrost rasti ali dostopnost transkripcijskih faktorjev, in pogosto imajo zelo visoko razmerje signal-šum. Genska vezja, ki so prilagodljiva in ne predstavljajo preveliko breme za gostitelja, sta tudi bolj robustna s stališča genetske stabilnosti. Zaželeno je, da so vezja ortogonalna, in da ne interreagirajo z gostiteljem, s čimer se tudi povečuje robustnost. V primeru, da se medsebojni interakciji ne moremo izogniti, gensko vezje lahko preoblikujemo tako, da dinamično uravnava svojo ekspresijo kot odgovor na povečani stres, ki ga povzroča gostitelju.

==POPRAVLJANJE NAPAK IN FINA NASTAVITEV GENSKIH VEZIJ==
Brez popolnoma napovednih zmogljivosti, načrtovanje genskih vezij neizogibno zahteva stopnje popravljanja napak ter fine nastavitve. Razlogi za neuspeh se najprej morajo identificirati, da bi vezje lahko normalno funkcioniralo znotraj želenih parametrov.

===Nastavljivi elementi v genskih vezjih===
Enkrat, ko se ugotovi razlog za neuspeh, se morajo narediti spremembe v vezju. Komponente je mogoče treba zamenjati, zaradi toksičnih učinkov njihovega izražanja, ali mogoče zaradi neustreznega dinamičnega območja njihovega izhodnega signala. Če je komponenta del velike ortogonalne zbirke, jo lahko zamenjamo z bolj ustrezno varianto. Ojačevalce signala lahko uporabimo v primeru, da hočemo popraviti signal komponente navzgor. Drugače obnašanje posameznih komponent lahko popravimo s spremembo jakosti promotorjev ali RBS, stopnje razgradnje genskih produktov ali števila posameznih komponent.

===Strategije za odpravljanje napak===
Ena izmed najbolj uporabljanih strategij za fino nastavljanje delovanja genskih vezij, je uporaba BioBrick standardov. Medtem, ko je uvajanje mutacij v komponente tekom začetnega sestavljanja enostavno, enkrat, ko so deli povezani v večje module, nadaljnje spreminjanje posameznih komponent ni več možno. Za ponovno uvajanje variacij se moramo vrniti na korak, ko smo dodajali posamezne komponente ali uporabimo nekatero izmed metod, ki temeljijo na PCR. SLIC, Gibsonovo sestavljanje, CPEC in SLiCE so metode zasnovane na PCR, ki predstavljajo dobro alternativo sestavljanju preko linkerjev, ker se z njimi izognemo nastanku »brazgotin«, ki lahko vplivajo na funkcionalnost vezja.
MAGE je zelo močno orodje za uvajanje variacij po predhodnem sestavljanju komponent. Metoda temelji na uporabi različnih ssDNA oligonukleotidov, s katerimi preko λ-Red rekombinaze uvedemo mutacije na ustreznih mestih.

==ZAKLJUČEK==
Po skoraj 15 letih pospešenega napredovanja, sintezna biologija je prišla do stopnje, kjer je na razpolago veliko orodij in osnovnih gradnikov za inženiring genskih vezij. Veliki napredek je ostvarjen tudi na polju ortogonalnosti in modularnosti gradnikov, kar omogoča bolj predvidljivo in robustno načrtovanje kompleksnih genskih vezij. Gradniki, ki temeljijo na RNA, bodo najverjetneje imeli glavno vlogo pri nadaljnji sofistikaciji genskih vezij, zaradi svoje enostavne programabilnosti in ker njihovi termodinamski modeli zelo dobro napovejo obnašanje v genskih vezjih.
Čeprav zelo dinamično in nedefinirano okolje gostitelja pogosto ovira normalno delovanje genskih vezij, strategije, ki temeljijo na uporabi izoliranih delov in racionalnem iskanju optimalnih parametrov bodo zmanjšale čas potreben za izgradnjo kompleksnih vezij. Variacije, ki so posledica interakcij z gostiteljskim metabolizmom, bi se še lahko dodatno znižale z uporabo sevov z reduciranimi genomi.

==VIR==
R. W. Bradley, ''et al''., Tools and Principles for Microbial Gene Circuit Engineering, J. Mol. Biol. (2015).

Orodja in načela za inženiring genskih vezij mikroorganizmov

2016-01-18T08:56:28Z

MarkoRadojkovic:

==UVOD==
Sintezni biologi skozi racionalno načrtovanje in napredno inženirstvo stremijo k ustvarjanju novih genskih vezij, ki bi imela široko uporabnost. Imajoči v mislih kompleksnost procesiranja signalov, ki se pojavljajo v naravnih bioloških sistemih, inženirski mikroorganizmi imajo potencial za opravljanje številnih koristnih nalog, ki zahtevajo sofisticirano računalniško vodenje in kontrolo.
Ta članek predstavlja pregled vsestranskih komponent in orodij, ki so trenutno dostopna za inženiring genskih vezij v mikroorganizmih, vključno z nedavno razvitimi RNA orodji, ki vsebujejo zelo široko dinamično območje in se lahko programirajo. Seznanili se bomo z oblikovalnimi načeli, ki omogočajo robustno in razširljivo delovanje vezij, prav tako pa bomo spoznali nekatere efikasne strategije za hitro identifikacijo in popravljanje napak ter fino nastavljanje lastnosti vezij.

==ORODJA ZA INŽENIRING RNA==
Transkripcija je verjetno najpomembnejša kontrolna točka v genskih vezjih, ker zagotavlja celovito regulacijo izražanja vseh komponent. Kontrolni elementi se lažje sestavljajo na nivoju DNA, s čimer se izognemo težavam, ki lahko nastanejo kot posledica sekundarnih struktur molekul mRNA.

===Vezava RNA===
Nukleotidno zaporedje promotorja, na katero se veže RNA-pomieraza (RNAP), je temeljna determinanta hitrosti transkripcije. Do vezave pride preko σ70- tipa faktorjev na -10 in -35 mesto od začetka transkripcije, kar hkrati določa samo specifičnost iniciacijskega mesta, medtem ko se C-končna domena α podenote preferenčno veže na kratko zaporedje ponovitev A in T baz, 30 mest navzgor od -35 mesta (UP element) in s tem določa jakost promotorja. Raziskave vpliva UP elementov na jakost promotorja so pokazale, da se vpliv le-teh na jakost promotorja z višanjem koncentracije RNAP zmanjšuje in obratno. Zaporedje navzdol od začetka transkripcije prav tako lahko vpliva na potek transkripcije same, vendar se z uporabo standardnih 5'-neprevajajočih se regij (UTR), temu vplivu lahko izognemo. Knjižnice promotorjev s širokim razponom jakosti predstavljajo dragoceno zbirko, ki jih biološki inženirji s pridom izkoriščajo in jo bodo izkoriščali, dokler se ne pojavijo popolni napovedni modeli.

===Proteinski regulatorji transkripcije===

Aktivatorji

Klasični aktivatorji, ki jih uporabljamo pri oblikovanj genskih vezij, kot je LuxR, delujejo na ta način, da stabilizirajo vezavo RNAP na promotor. Rhodius in kolegi so izkoristili ekstracitoplazmične funkcijske σ faktorje (ECFs) za izgradnjo največje knjižnice ortogonalnih transkripcijskih regulatorjev za ''E. coli'', pri čemer so našli 20 parov ECFs in sorodnih promotorjev, ki imajo zelo nizko navzkrižno reaktivnost. Ti proteini se vežejo na regije -35 in -10 in s tem določajo specifičnost vezave RNAP na določen promotor. Ostali transkripcijski aktivatorji, ki so koristni za uporabo v ''E.coli'' vključujejo tri šaperon-aktivatorske pare (ki se lahko izkoristijo za AND logiko), fagne transkripcijske aktivatorje ter HrpRS bakterijske ojačevalne proteine.

Represorji

Represorji najpogosteje delujejo na ta način, da RNAP onemogočijo dostop do promotorja. Stanton in sodelavci so ustvarili knjižnico homologov TetR in njihovih naravnih operatorjev, ki vsebuje 16 ortogonalnih variant. Obstaja tudi manjša knjižnica variant represorja LacI. Zelo zanimivo družino represorskih proteinov predstavljajo transkripcijskim aktivatorjem podobni efektorji (TALEs). TALE represorji se lažje modelirajo v primerjavi s proteini s cinkovimi prsti in se lahko uporabljajo za kontrolo več kompleksnih genov. Pokazali so da z njimi lahko dosežemo do 100-kratno znižanje ravni izražanja v ''E.coli''.

===RNA kontrola transkripcije===
Lep primer kontrole transkripcije z RNA predstavlja pT181 transkripcijski atenuacijski sistem, katerega različice so razvite za kontrolo genskih vezij v ''E.coli''. Naravni pT181 mehanizem koristi 5'- UTR zanko, ki normalno omogoča elongacijo transkripcije; interakcija med zanko na taRNA z 5'-UTR zanko na mRNA promovira nastanek steblo-zanka strukture, ki povzroči terminacijo transkripcije.
Majhne RNA molekule, ki aktivirajo transkripcijo (STARs), so dizajnirane da porušijo strukturo terminatorja, bodisi preko vezave na zanko, ki se nahaja v zaporedju navzgor ali preko direktne vezave na terminator. Ta pozitivna regulacija sistema pT181 omogoča zelo visoko dinamično območje (94-kratno), v primerjavi s klasičnimi represorji in je prav tako uporabna za izgradnjo večplastnih logičnih vrat.

==ORODJA ZA INŽENIRING IZRAŽANJA PROTEINOV==

===Ortogonalni ribosomi===
Vezava ribosoma na molekulo mRNA je posledica prepoznavanja in baznega parjenja med RBS in anti-Shine-Dalgarno zaporedjem, ki je zapisano v 16S rRNA. To lastnost so izkoristili za ustvarjanje treh dodatnih ortogonalnih ribosomov z modificirano 16S rRNA, ki inicira traslacijo samo na mRNA s sorodnim RBS. Transkripcija obeh ortogonalnih rRNA ter mRNA je potrebna za izražanje tarčnega gena, s čimer dobimo AND logična vrata.

===RNA stikala===
Z RNA stikali lahko vplivamo na translacijo preko od liganda odvisne spremembe konformacije 5'-UTR regije mRNA, s čemer otežimo dostop do RBS. Sharma in sodelavci so pokazali da RNA stikala lahko kombiniramo za izgradnjo AND in NAND logičnih vrat. Od temperature odvisni RNA regulatorji prav tako delujejo preko kontrole dostopnosti RBS za vezavo ribosoma.

===taRNA kontrola translacije===

taRNA-represija

Mehanizem inhibicije translacije z majhnimi RNA molekulami (sRNAs) je konceptualno preprost, zaradi česar je tudi izvajanje same metode relativno enostavno: sRNA vsebuje zaporedje komplementarno tarčni mRNA in se veže na RBS ali na zaporedje navzdol ter na ta način prepreči vezavo ribosoma. Vezavna energija sRNA-mRNA je korelirana z jakostjo inhibicije.

taRNA-aktivacija

Green in sodelavci so pred kratkim opisali razvoj RNA-stikal tipa »toehold«, oziroma zank, ki onemogočajo normalen potek translacije. Aktivacija translacije poteka preko vezave »sprožilne« RNA, ki se veže na zaporedje navzgor od zanke in ji spremeni strukturo. Najbolj učinkovita tovrstna stikala zajemajo kar 600-kratno dinamično območje, kar je za red velikosti boljše od ostalih taRNA kontrolnih mehanizmov.

==MODULARNOST IN ORTOGONALNOST==
Modularnost predstavlja kvaliteto konzistentnosti funkcije v številnih pogojih in kontekstih in je en izmed temeljnih pogojev za napovedni dizajn genskih vezij. Ortogonalnost zagotavlja da elementi in moduli ne bodo izražali neželene interakcije z drugimi elementi v inženirskih bioloških sistemih, prav tako pa tudi ne z genskim ozadjem gostitelja. Zato sta ti dve lastnosti nepogrešljivi pri načrtovanju kompleksnih genskih vezij.

===Fizična kompozicija===
Sinteznobiološki elementi so lahko občutljivi na spremembe v robnih zaporedjih, ki jih obkrožajo. Iz analize 12,563 kombinacij promotorjev in RBS, Kosuri in sodelavci so odkrili, da se približno 17 % vseh variacij v ravni izražanja proteinov ne more napovedati iz jakosti promotorjev, oziroma RBS. Mutalik in sodelavci so ugotovili, da spoji promotor: UTR in UTR: tarčni gen (GOI) v znatni meri vplivajo na variabilnost v izražanju genov in so naredili operacijsko enoto izražanja (EOU). Uporaba EOU omogoča veliko konzistentnost v nivojih izražanja tarčnih genov, ko menjavamo različne promotorje in RBS, kar ima veliko napovedno moč pri oblikovanju novih genskih vezij in finem usklajevanju ravni izražanja proteinov.

===Vpliv gostitelja===
Cardinale in sodelavci so iz analize velikega števila sevov ''E.coli'' ugotovili, da sta dostopnost ribosomov in hitrost rasti ključne determinante za učinkovitost genskih vezij. Ugotovili so tudi, da specifične delecije gostiteljskih genov imajo lahko veliki vpliv na genska vezja. Te mutacije posredno vplivajo na učinkovitost vezja preko sprememb v fluksu ogljikovega in dušikovega metabolizma. Komplementarni pristop spreminjanja gostiteljskega genetskega (in metabolnega) ozadja preko dodajanja določenih genov, lahko pozitivno vpliva na učinkovitost vezja.

===Robustnost in genetska stabilnost===
Robustna genska vezja vzdržujejo svojo učinkovitost skozi čas in v različnih pogojih – prilagajajo se spremembam, kot je različna hitrost rasti ali dostopnost transkripcijskih faktorjev, in pogosto imajo zelo visoko razmerje signal-šum. Genska vezja, ki so prilagodljiva in ne predstavljajo preveliko breme za gostitelja, sta tudi bolj robustna s stališča genetske stabilnosti. Zaželeno je, da so vezja ortogonalna, in da ne interreagirajo z gostiteljem, s čimer se tudi povečuje robustnost. V primeru, da se medsebojni interakciji ne moremo izogniti, gensko vezje lahko preoblikujemo tako, da dinamično uravnava svojo ekspresijo kot odgovor na povečani stres, ki ga povzroča gostitelju.

==POPRAVLJANJE NAPAK IN FINA NASTAVITEV GENSKIH VEZIJ==
Brez popolnoma napovednih zmogljivosti, načrtovanje genskih vezij neizogibno zahteva stopnje popravljanja napak ter fine nastavitve. Razlogi za neuspeh se najprej morajo identificirati, da bi vezje lahko normalno funkcioniralo znotraj želenih parametrov.

===Nastavljivi elementi v genskih vezjih===
Enkrat, ko se ugotovi razlog za neuspeh, se morajo narediti spremembe v vezju. Komponente je mogoče treba zamenjati, zaradi toksičnih učinkov njihovega izražanja, ali mogoče zaradi neustreznega dinamičnega območja njihovega izhodnega signala. Če je komponenta del velike ortogonalne zbirke, jo lahko zamenjamo z bolj ustrezno varianto. Ojačevalce signala lahko uporabimo v primeru, da hočemo popraviti signal komponente navzgor. Drugače obnašanje posameznih komponent lahko popravimo s spremembo jakosti promotorjev ali RBS, stopnje razgradnje genskih produktov ali števila posameznih komponent.

===Strategije za odpravljanje napak===
Ena izmed najbolj uporabljanih strategij za fino nastavljanje delovanja genskih vezij, je uporaba BioBrick standardov. Medtem, ko je uvajanje mutacij v komponente tekom začetnega sestavljanja enostavno, enkrat, ko so deli povezani v večje module, nadaljnje spreminjanje posameznih komponent ni več možno. Za ponovno uvajanje variacij se moramo vrniti na korak, ko smo dodajali posamezne komponente ali uporabimo nekatero izmed metod, ki temeljijo na PCR. SLIC, Gibsonovo sestavljanje, CPEC in SLiCE so metode zasnovane na PCR, ki predstavljajo dobro alternativo sestavljanju preko linkerjev, ker se z njimi izognemo nastanku »brazgotin«, ki lahko vplivajo na funkcionalnost vezja.
MAGE je zelo močno orodje za uvajanje variacij po predhodnem sestavljanju komponent. Metoda temelji na uporabi različnih ssDNA oligonukleotidov, s katerimi preko λ-Red rekombinaze uvedemo mutacije na ustreznih mestih.

==ZAKLJUČEK==
Po skoraj 15 letih pospešenega napredovanja, sintezna biologija je prišla do stopnje, kjer je na razpolago veliko orodij in osnovnih gradnikov za inženiring genskih vezij. Veliki napredek je ostvarjen tudi na polju ortogonalnosti in modularnosti gradnikov, kar omogoča bolj predvidljivo in robustno načrtovanje kompleksnih genskih vezij. Gradniki, ki temeljijo na RNA, bodo najverjetneje imeli glavno vlogo pri nadaljnji sofistikaciji genskih vezij, zaradi svoje enostavne programabilnosti in ker njihovi termodinamski modeli zelo dobro napovejo obnašanje v genskih vezjih.
Čeprav zelo dinamično in nedefinirano okolje gostitelja pogosto ovira normalno delovanje genskih vezij, strategije, ki temeljijo na uporabi izoliranih delov in racionalnem iskanju optimalnih parametrov bodo zmanjšale čas potreben za izgradnjo kompleksnih vezij. Variacije, ki so posledica interakcij z gostiteljskim metabolizmom, bi se še lahko dodatno znižale z uporabo sevov z reduciranimi genomi.

==VIR==
R. W. Bradley, ''et al''., Tools and Principles for Microbial Gene Circuit Engineering, J. Mol. Biol. (2015).

Orodja in načela za inženiring genskih vezij mikroorganizmov

2016-01-18T08:54:16Z

MarkoRadojkovic:

=UVOD=
Sintezni biologi skozi racionalno načrtovanje in napredno inženirstvo stremijo k ustvarjanju novih genskih vezij, ki bi imela široko uporabnost. Imajoči v mislih kompleksnost procesiranja signalov, ki se pojavljajo v naravnih bioloških sistemih, inženirski mikroorganizmi imajo potencial za opravljanje številnih koristnih nalog, ki zahtevajo sofisticirano računalniško vodenje in kontrolo.
Ta članek predstavlja pregled vsestranskih komponent in orodij, ki so trenutno dostopna za inženiring genskih vezij v mikroorganizmih, vključno z nedavno razvitimi RNA orodji, ki vsebujejo zelo široko dinamično območje in se lahko programirajo. Seznanili se bomo z oblikovalnimi načeli, ki omogočajo robustno in razširljivo delovanje vezij, prav tako pa bomo spoznali nekatere efikasne strategije za hitro identifikacijo in popravljanje napak ter fino nastavljanje lastnosti vezij.

=ORODJA ZA INŽENIRING RNA=
Transkripcija je verjetno najpomembnejša kontrolna točka v genskih vezjih, ker zagotavlja celovito regulacijo izražanja vseh komponent. Kontrolni elementi se lažje sestavljajo na nivoju DNA, s čimer se izognemo težavam, ki lahko nastanejo kot posledica sekundarnih struktur molekul mRNA.

==Vezava RNA==
Nukleotidno zaporedje promotorja, na katero se veže RNA-pomieraza (RNAP), je temeljna determinanta hitrosti transkripcije. Do vezave pride preko σ70- tipa faktorjev na -10 in -35 mesto od začetka transkripcije, kar hkrati določa samo specifičnost iniciacijskega mesta, medtem ko se C-končna domena α podenote preferenčno veže na kratko zaporedje ponovitev A in T baz, 30 mest navzgor od -35 mesta (UP element) in s tem določa jakost promotorja. Raziskave vpliva UP elementov na jakost promotorja so pokazale, da se vpliv le-teh na jakost promotorja z višanjem koncentracije RNAP zmanjšuje in obratno. Zaporedje navzdol od začetka transkripcije prav tako lahko vpliva na potek transkripcije same, vendar se z uporabo standardnih 5'-neprevajajočih se regij (UTR), temu vplivu lahko izognemo. Knjižnice promotorjev s širokim razponom jakosti predstavljajo dragoceno zbirko, ki jih biološki inženirji s pridom izkoriščajo in jo bodo izkoriščali, dokler se ne pojavijo popolni napovedni modeli.

==Proteinski regulatorji transkripcije==

Aktivatorji

Klasični aktivatorji, ki jih uporabljamo pri oblikovanj genskih vezij, kot je LuxR, delujejo na ta način, da stabilizirajo vezavo RNAP na promotor. Rhodius in kolegi so izkoristili ekstracitoplazmične funkcijske σ faktorje (ECFs) za izgradnjo največje knjižnice ortogonalnih transkripcijskih regulatorjev za ''E. coli'', pri čemer so našli 20 parov ECFs in sorodnih promotorjev, ki imajo zelo nizko navzkrižno reaktivnost. Ti proteini se vežejo na regije -35 in -10 in s tem določajo specifičnost vezave RNAP na določen promotor. Ostali transkripcijski aktivatorji, ki so koristni za uporabo v ''E.coli'' vključujejo tri šaperon-aktivatorske pare (ki se lahko izkoristijo za AND logiko), fagne transkripcijske aktivatorje ter HrpRS bakterijske ojačevalne proteine.

Represorji

Represorji najpogosteje delujejo na ta način, da RNAP onemogočijo dostop do promotorja. Stanton in sodelavci so ustvarili knjižnico homologov TetR in njihovih naravnih operatorjev, ki vsebuje 16 ortogonalnih variant. Obstaja tudi manjša knjižnica variant represorja LacI. Zelo zanimivo družino represorskih proteinov predstavljajo transkripcijskim aktivatorjem podobni efektorji (TALEs). TALE represorji se lažje modelirajo v primerjavi s proteini s cinkovimi prsti in se lahko uporabljajo za kontrolo več kompleksnih genov. Pokazali so da z njimi lahko dosežemo do 100-kratno znižanje ravni izražanja v ''E.coli''.

==RNA kontrola transkripcije==
Lep primer kontrole transkripcije z RNA predstavlja pT181 transkripcijski atenuacijski sistem, katerega različice so razvite za kontrolo genskih vezij v ''E.coli''. Naravni pT181 mehanizem koristi 5'- UTR zanko, ki normalno omogoča elongacijo transkripcije; interakcija med zanko na taRNA z 5'-UTR zanko na mRNA promovira nastanek steblo-zanka strukture, ki povzroči terminacijo transkripcije.
Majhne RNA molekule, ki aktivirajo transkripcijo (STARs), so dizajnirane da porušijo strukturo terminatorja, bodisi preko vezave na zanko, ki se nahaja v zaporedju navzgor ali preko direktne vezave na terminator. Ta pozitivna regulacija sistema pT181 omogoča zelo visoko dinamično območje (94-kratno), v primerjavi s klasičnimi represorji in je prav tako uporabna za izgradnjo večplastnih logičnih vrat.

=ORODJA ZA INŽENIRING IZRAŽANJA PROTEINOV=

==Ortogonalni ribosomi==
Vezava ribosoma na molekulo mRNA je posledica prepoznavanja in baznega parjenja med RBS in anti-Shine-Dalgarno zaporedjem, ki je zapisano v 16S rRNA. To lastnost so izkoristili za ustvarjanje treh dodatnih ortogonalnih ribosomov z modificirano 16S rRNA, ki inicira traslacijo samo na mRNA s sorodnim RBS. Transkripcija obeh ortogonalnih rRNA ter mRNA je potrebna za izražanje tarčnega gena, s čimer dobimo AND logična vrata.

==RNA stikala==
Z RNA stikali lahko vplivamo na translacijo preko od liganda odvisne spremembe konformacije 5'-UTR regije mRNA, s čemer otežimo dostop do RBS. Sharma in sodelavci so pokazali da RNA stikala lahko kombiniramo za izgradnjo AND in NAND logičnih vrat. Od temperature odvisni RNA regulatorji prav tako delujejo preko kontrole dostopnosti RBS za vezavo ribosoma.

==taRNA kontrola translacije==

taRNA-represija

Mehanizem inhibicije translacije z majhnimi RNA molekulami (sRNAs) je konceptualno preprost, zaradi česar je tudi izvajanje same metode relativno enostavno: sRNA vsebuje zaporedje komplementarno tarčni mRNA in se veže na RBS ali na zaporedje navzdol ter na ta način prepreči vezavo ribosoma. Vezavna energija sRNA-mRNA je korelirana z jakostjo inhibicije.

taRNA-aktivacija

Green in sodelavci so pred kratkim opisali razvoj RNA-stikal tipa »toehold«, oziroma zank, ki onemogočajo normalen potek translacije. Aktivacija translacije poteka preko vezave »sprožilne« RNA, ki se veže na zaporedje navzgor od zanke in ji spremeni strukturo. Najbolj učinkovita tovrstna stikala zajemajo kar 600-kratno dinamično območje, kar je za red velikosti boljše od ostalih taRNA kontrolnih mehanizmov.

=MODULARNOST IN ORTOGONALNOST=
Modularnost predstavlja kvaliteto konzistentnosti funkcije v številnih pogojih in kontekstih in je en izmed temeljnih pogojev za napovedni dizajn genskih vezij. Ortogonalnost zagotavlja da elementi in moduli ne bodo izražali neželene interakcije z drugimi elementi v inženirskih bioloških sistemih, prav tako pa tudi ne z genskim ozadjem gostitelja. Zato sta ti dve lastnosti nepogrešljivi pri načrtovanju kompleksnih genskih vezij.

==Fizična kompozicija==
Sinteznobiološki elementi so lahko občutljivi na spremembe v robnih zaporedjih, ki jih obkrožajo. Iz analize 12,563 kombinacij promotorjev in RBS, Kosuri in sodelavci so odkrili, da se približno 17 % vseh variacij v ravni izražanja proteinov ne more napovedati iz jakosti promotorjev, oziroma RBS. Mutalik in sodelavci so ugotovili, da spoji promotor: UTR in UTR: tarčni gen (GOI) v znatni meri vplivajo na variabilnost v izražanju genov in so naredili operacijsko enoto izražanja (EOU). Uporaba EOU omogoča veliko konzistentnost v nivojih izražanja tarčnih genov, ko menjavamo različne promotorje in RBS, kar ima veliko napovedno moč pri oblikovanju novih genskih vezij in finem usklajevanju ravni izražanja proteinov.

==Vpliv gostitelja==
Cardinale in sodelavci so iz analize velikega števila sevov ''E.coli'' ugotovili, da sta dostopnost ribosomov in hitrost rasti ključne determinante za učinkovitost genskih vezij. Ugotovili so tudi, da specifične delecije gostiteljskih genov imajo lahko veliki vpliv na genska vezja. Te mutacije posredno vplivajo na učinkovitost vezja preko sprememb v fluksu ogljikovega in dušikovega metabolizma. Komplementarni pristop spreminjanja gostiteljskega genetskega (in metabolnega) ozadja preko dodajanja določenih genov, lahko pozitivno vpliva na učinkovitost vezja.

==Robustnost in genetska stabilnost==
Robustna genska vezja vzdržujejo svojo učinkovitost skozi čas in v različnih pogojih – prilagajajo se spremembam, kot je različna hitrost rasti ali dostopnost transkripcijskih faktorjev, in pogosto imajo zelo visoko razmerje signal-šum. Genska vezja, ki so prilagodljiva in ne predstavljajo preveliko breme za gostitelja, sta tudi bolj robustna s stališča genetske stabilnosti. Zaželeno je, da so vezja ortogonalna, in da ne interreagirajo z gostiteljem, s čimer se tudi povečuje robustnost. V primeru, da se medsebojni interakciji ne moremo izogniti, gensko vezje lahko preoblikujemo tako, da dinamično uravnava svojo ekspresijo kot odgovor na povečani stres, ki ga povzroča gostitelju.

=POPRAVLJANJE NAPAK IN FINA NASTAVITEV GENSKIH VEZIJ=
Brez popolnoma napovednih zmogljivosti, načrtovanje genskih vezij neizogibno zahteva stopnje popravljanja napak ter fine nastavitve. Razlogi za neuspeh se najprej morajo identificirati, da bi vezje lahko normalno funkcioniralo znotraj želenih parametrov.

==Nastavljivi elementi v genskih vezjih==
Enkrat, ko se ugotovi razlog za neuspeh, se morajo narediti spremembe v vezju. Komponente je mogoče treba zamenjati, zaradi toksičnih učinkov njihovega izražanja, ali mogoče zaradi neustreznega dinamičnega območja njihovega izhodnega signala. Če je komponenta del velike ortogonalne zbirke, jo lahko zamenjamo z bolj ustrezno varianto. Ojačevalce signala lahko uporabimo v primeru, da hočemo popraviti signal komponente navzgor. Drugače obnašanje posameznih komponent lahko popravimo s spremembo jakosti promotorjev ali RBS, stopnje razgradnje genskih produktov ali števila posameznih komponent.

==Strategije za odpravljanje napak==
Ena izmed najbolj uporabljanih strategij za fino nastavljanje delovanja genskih vezij, je uporaba BioBrick standardov. Medtem, ko je uvajanje mutacij v komponente tekom začetnega sestavljanja enostavno, enkrat, ko so deli povezani v večje module, nadaljnje spreminjanje posameznih komponent ni več možno. Za ponovno uvajanje variacij se moramo vrniti na korak, ko smo dodajali posamezne komponente ali uporabimo nekatero izmed metod, ki temeljijo na PCR. SLIC, Gibsonovo sestavljanje, CPEC in SLiCE so metode zasnovane na PCR, ki predstavljajo dobro alternativo sestavljanju preko linkerjev, ker se z njimi izognemo nastanku »brazgotin«, ki lahko vplivajo na funkcionalnost vezja.
MAGE je zelo močno orodje za uvajanje variacij po predhodnem sestavljanju komponent. Metoda temelji na uporabi različnih ssDNA oligonukleotidov, s katerimi preko λ-Red rekombinaze uvedemo mutacije na ustreznih mestih.

=ZAKLJUČEK=
Po skoraj 15 letih pospešenega napredovanja, sintezna biologija je prišla do stopnje, kjer je na razpolago veliko orodij in osnovnih gradnikov za inženiring genskih vezij. Veliki napredek je ostvarjen tudi na polju ortogonalnosti in modularnosti gradnikov, kar omogoča bolj predvidljivo in robustno načrtovanje kompleksnih genskih vezij. Gradniki, ki temeljijo na RNA, bodo najverjetneje imeli glavno vlogo pri nadaljnji sofistikaciji genskih vezij, zaradi svoje enostavne programabilnosti in ker njihovi termodinamski modeli zelo dobro napovejo obnašanje v genskih vezjih.
Čeprav zelo dinamično in nedefinirano okolje gostitelja pogosto ovira normalno delovanje genskih vezij, strategije, ki temeljijo na uporabi izoliranih delov in racionalnem iskanju optimalnih parametrov bodo zmanjšale čas potreben za izgradnjo kompleksnih vezij. Variacije, ki so posledica interakcij z gostiteljskim metabolizmom, bi se še lahko dodatno znižale z uporabo sevov z reduciranimi genomi.

=VIR=
R. W. Bradley, ''et al''., Tools and Principles for Microbial Gene Circuit Engineering, J. Mol. Biol. (2015).

Orodja in načela za inženiring genskih vezij mikroorganizmov

2016-01-18T08:49:33Z

MarkoRadojkovic: /* UVOD */

==UVOD==
Sintezni biologi skozi racionalno načrtovanje in napredno inženirstvo stremijo k ustvarjanju novih genskih vezij, ki bi imela široko uporabnost. Imajoči v mislih kompleksnost procesiranja signalov, ki se pojavljajo v naravnih bioloških sistemih, inženirski mikroorganizmi imajo potencial za opravljanje številnih koristnih nalog, ki zahtevajo sofisticirano računalniško vodenje in kontrolo.
Ta članek predstavlja pregled vsestranskih komponent in orodij, ki so trenutno dostopna za inženiring genskih vezij v mikroorganizmih, vključno z nedavno razvitimi RNA orodji, ki vsebujejo zelo široko dinamično območje in se lahko programirajo. Seznanili se bomo z oblikovalnimi načeli, ki omogočajo robustno in razširljivo delovanje vezij, prav tako pa bomo spoznali nekatere efikasne strategije za hitro identifikacijo in popravljanje napak ter fino nastavljanje lastnosti vezij.

==ORODJA ZA INŽENIRING RNA==
Transkripcija je verjetno najpomembnejša kontrolna točka v genskih vezjih, ker zagotavlja celovito regulacijo izražanja vseh komponent. Kontrolni elementi se lažje sestavljajo na nivoju DNA, s čimer se izognemo težavam, ki lahko nastanejo kot posledica sekundarnih struktur molekul mRNA.

===Vezava RNA===
Nukleotidno zaporedje promotorja, na katero se veže RNA-pomieraza (RNAP), je temeljna determinanta hitrosti transkripcije. Do vezave pride preko σ70- tipa faktorjev na -10 in -35 mesto od začetka transkripcije, kar hkrati določa samo specifičnost iniciacijskega mesta, medtem ko se C-končna domena α podenote preferenčno veže na kratko zaporedje ponovitev A in T baz, 30 mest navzgor od -35 mesta (UP element) in s tem določa jakost promotorja. Raziskave vpliva UP elementov na jakost promotorja so pokazale, da se vpliv le-teh na jakost promotorja z višanjem koncentracije RNAP zmanjšuje in obratno. Zaporedje navzdol od začetka transkripcije prav tako lahko vpliva na potek transkripcije same, vendar se z uporabo standardnih 5'-neprevajajočih se regij (UTR), temu vplivu lahko izognemo. Knjižnice promotorjev s širokim razponom jakosti predstavljajo dragoceno zbirko, ki jih biološki inženirji s pridom izkoriščajo in jo bodo izkoriščali, dokler se ne pojavijo popolni napovedni modeli.

===Proteinski regulatorji transkripcije===

Aktivatorji

Klasični aktivatorji, ki jih uporabljamo pri oblikovanj genskih vezij, kot je LuxR, delujejo na ta način, da stabilizirajo vezavo RNAP na promotor. Rhodius in kolegi so izkoristili ekstracitoplazmične funkcijske σ faktorje (ECFs) za izgradnjo največje knjižnice ortogonalnih transkripcijskih regulatorjev za ''E. coli'', pri čemer so našli 20 parov ECFs in sorodnih promotorjev, ki imajo zelo nizko navzkrižno reaktivnost. Ti proteini se vežejo na regije -35 in -10 in s tem določajo specifičnost vezave RNAP na določen promotor. Ostali transkripcijski aktivatorji, ki so koristni za uporabo v ''E.coli'' vključujejo tri šaperon-aktivatorske pare (ki se lahko izkoristijo za AND logiko), fagne transkripcijske aktivatorje ter HrpRS bakterijske ojačevalne proteine.

Represorji

Represorji najpogosteje delujejo na ta način, da RNAP onemogočijo dostop do promotorja. Stanton in sodelavci so ustvarili knjižnico homologov TetR in njihovih naravnih operatorjev, ki vsebuje 16 ortogonalnih variant. Obstaja tudi manjša knjižnica variant represorja LacI. Zelo zanimivo družino represorskih proteinov predstavljajo transkripcijskim aktivatorjem podobni efektorji (TALEs). TALE represorji se lažje modelirajo v primerjavi s proteini s cinkovimi prsti in se lahko uporabljajo za kontrolo več kompleksnih genov. Pokazali so da z njimi lahko dosežemo do 100-kratno znižanje ravni izražanja v ''E.coli''.

===RNA kontrola transkripcije===
Lep primer kontrole transkripcije z RNA predstavlja pT181 transkripcijski atenuacijski sistem, katerega različice so razvite za kontrolo genskih vezij v ''E.coli''. Naravni pT181 mehanizem koristi 5'- UTR zanko, ki normalno omogoča elongacijo transkripcije; interakcija med zanko na taRNA z 5'-UTR zanko na mRNA promovira nastanek steblo-zanka strukture, ki povzroči terminacijo transkripcije.
Majhne RNA molekule, ki aktivirajo transkripcijo (STARs), so dizajnirane da porušijo strukturo terminatorja, bodisi preko vezave na zanko, ki se nahaja v zaporedju navzgor ali preko direktne vezave na terminator. Ta pozitivna regulacija sistema pT181 omogoča zelo visoko dinamično območje (94-kratno), v primerjavi s klasičnimi represorji in je prav tako uporabna za izgradnjo večplastnih logičnih vrat.

==ORODJA ZA INŽENIRING IZRAŽANJA PROTEINOV==

===Ortogonalni ribosomi===
Vezava ribosoma na molekulo mRNA je posledica prepoznavanja in baznega parjenja med RBS in anti-Shine-Dalgarno zaporedjem, ki je zapisano v 16S rRNA. To lastnost so izkoristili za ustvarjanje treh dodatnih ortogonalnih ribosomov z modificirano 16S rRNA, ki inicira traslacijo samo na mRNA s sorodnim RBS. Transkripcija obeh ortogonalnih rRNA ter mRNA je potrebna za izražanje tarčnega gena, s čimer dobimo AND logična vrata.

===RNA stikala===
Z RNA stikali lahko vplivamo na translacijo preko od liganda odvisne spremembe konformacije 5'-UTR regije mRNA, s čemer otežimo dostop do RBS. Sharma in sodelavci so pokazali da RNA stikala lahko kombiniramo za izgradnjo AND in NAND logičnih vrat. Od temperature odvisni RNA regulatorji prav tako delujejo preko kontrole dostopnosti RBS za vezavo ribosoma.

===taRNA kontrola translacije===

taRNA-represija

Mehanizem inhibicije translacije z majhnimi RNA molekulami (sRNAs) je konceptualno preprost, zaradi česar je tudi izvajanje same metode relativno enostavno: sRNA vsebuje zaporedje komplementarno tarčni mRNA in se veže na RBS ali na zaporedje navzdol ter na ta način prepreči vezavo ribosoma. Vezavna energija sRNA-mRNA je korelirana z jakostjo inhibicije.

taRNA-aktivacija

Green in sodelavci so pred kratkim opisali razvoj RNA-stikal tipa »toehold«, oziroma zank, ki onemogočajo normalen potek translacije. Aktivacija translacije poteka preko vezave »sprožilne« RNA, ki se veže na zaporedje navzgor od zanke in ji spremeni strukturo. Najbolj učinkovita tovrstna stikala zajemajo kar 600-kratno dinamično območje, kar je za red velikosti boljše od ostalih taRNA kontrolnih mehanizmov.

==MODULARNOST IN ORTOGONALNOST==
Modularnost predstavlja kvaliteto konzistentnosti funkcije v številnih pogojih in kontekstih in je en izmed temeljnih pogojev za napovedni dizajn genskih vezij. Ortogonalnost zagotavlja da elementi in moduli ne bodo izražali neželene interakcije z drugimi elementi v inženirskih bioloških sistemih, prav tako pa tudi ne z genskim ozadjem gostitelja. Zato sta ti dve lastnosti nepogrešljivi pri načrtovanju kompleksnih genskih vezij.

===Fizična kompozicija===
Sinteznobiološki elementi so lahko občutljivi na spremembe v robnih zaporedjih, ki jih obkrožajo. Iz analize 12,563 kombinacij promotorjev in RBS, Kosuri in sodelavci so odkrili, da se približno 17 % vseh variacij v ravni izražanja proteinov ne more napovedati iz jakosti promotorjev, oziroma RBS. Mutalik in sodelavci so ugotovili, da spoji promotor: UTR in UTR: tarčni gen (GOI) v znatni meri vplivajo na variabilnost v izražanju genov in so naredili operacijsko enoto izražanja (EOU). Uporaba EOU omogoča veliko konzistentnost v nivojih izražanja tarčnih genov, ko menjavamo različne promotorje in RBS, kar ima veliko napovedno moč pri oblikovanju novih genskih vezij in finem usklajevanju ravni izražanja proteinov.

===Vpliv gostitelja===
Cardinale in sodelavci so iz analize velikega števila sevov ''E.coli'' ugotovili, da sta dostopnost ribosomov in hitrost rasti ključne determinante za učinkovitost genskih vezij. Ugotovili so tudi, da specifične delecije gostiteljskih genov imajo lahko veliki vpliv na genska vezja. Te mutacije posredno vplivajo na učinkovitost vezja preko sprememb v fluksu ogljikovega in dušikovega metabolizma. Komplementarni pristop spreminjanja gostiteljskega genetskega (in metabolnega) ozadja preko dodajanja določenih genov, lahko pozitivno vpliva na učinkovitost vezja.

===Robustnost in genetska stabilnost===
Robustna genska vezja vzdržujejo svojo učinkovitost skozi čas in v različnih pogojih – prilagajajo se spremembam, kot je različna hitrost rasti ali dostopnost transkripcijskih faktorjev, in pogosto imajo zelo visoko razmerje signal-šum. Genska vezja, ki so prilagodljiva in ne predstavljajo preveliko breme za gostitelja, sta tudi bolj robustna s stališča genetske stabilnosti. Zaželeno je, da so vezja ortogonalna, in da ne interreagirajo z gostiteljem, s čimer se tudi povečuje robustnost. V primeru, da se medsebojni interakciji ne moremo izogniti, gensko vezje lahko preoblikujemo tako, da dinamično uravnava svojo ekspresijo kot odgovor na povečani stres, ki ga povzroča gostitelju.

==POPRAVLJANJE NAPAK IN FINA NASTAVITEV GENSKIH VEZIJ==
Brez popolnoma napovednih zmogljivosti, načrtovanje genskih vezij neizogibno zahteva stopnje popravljanja napak ter fine nastavitve. Razlogi za neuspeh se najprej morajo identificirati, da bi vezje lahko normalno funkcioniralo znotraj želenih parametrov.

===Nastavljivi elementi v genskih vezjih===
Enkrat, ko se ugotovi razlog za neuspeh, se morajo narediti spremembe v vezju. Komponente je mogoče treba zamenjati, zaradi toksičnih učinkov njihovega izražanja, ali mogoče zaradi neustreznega dinamičnega območja njihovega izhodnega signala. Če je komponenta del velike ortogonalne zbirke, jo lahko zamenjamo z bolj ustrezno varianto. Ojačevalce signala lahko uporabimo v primeru, da hočemo popraviti signal komponente navzgor. Drugače obnašanje posameznih komponent lahko popravimo s spremembo jakosti promotorjev ali RBS, stopnje razgradnje genskih produktov ali števila posameznih komponent.

===Strategije za odpravljanje napak===
Ena izmed najbolj uporabljanih strategij za fino nastavljanje delovanja genskih vezij, je uporaba BioBrick standardov. Medtem, ko je uvajanje mutacij v komponente tekom začetnega sestavljanja enostavno, enkrat, ko so deli povezani v večje module, nadaljnje spreminjanje posameznih komponent ni več možno. Za ponovno uvajanje variacij se moramo vrniti na korak, ko smo dodajali posamezne komponente ali uporabimo nekatero izmed metod, ki temeljijo na PCR. SLIC, Gibsonovo sestavljanje, CPEC in SLiCE so metode zasnovane na PCR, ki predstavljajo dobro alternativo sestavljanju preko linkerjev, ker se z njimi izognemo nastanku »brazgotin«, ki lahko vplivajo na funkcionalnost vezja.
MAGE je zelo močno orodje za uvajanje variacij po predhodnem sestavljanju komponent. Metoda temelji na uporabi različnih ssDNA oligonukleotidov, s katerimi preko λ-Red rekombinaze uvedemo mutacije na ustreznih mestih.

==ZAKLJUČEK==
Po skoraj 15 letih pospešenega napredovanja, sintezna biologija je prišla do stopnje, kjer je na razpolago veliko orodij in osnovnih gradnikov za inženiring genskih vezij. Veliki napredek je ostvarjen tudi na polju ortogonalnosti in modularnosti gradnikov, kar omogoča bolj predvidljivo in robustno načrtovanje kompleksnih genskih vezij. Gradniki, ki temeljijo na RNA, bodo najverjetneje imeli glavno vlogo pri nadaljnji sofistikaciji genskih vezij, zaradi svoje enostavne programabilnosti in ker njihovi termodinamski modeli zelo dobro napovejo obnašanje v genskih vezjih.
Čeprav zelo dinamično in nedefinirano okolje gostitelja pogosto ovira normalno delovanje genskih vezij, strategije, ki temeljijo na uporabi izoliranih delov in racionalnem iskanju optimalnih parametrov bodo zmanjšale čas potreben za izgradnjo kompleksnih vezij. Variacije, ki so posledica interakcij z gostiteljskim metabolizmom, bi se še lahko dodatno znižale z uporabo sevov z reduciranimi genomi.

==VIR==
R. W. Bradley, ''et al''., Tools and Principles for Microbial Gene Circuit Engineering, J. Mol. Biol. (2015).

Orodja in načela za inženiring genskih vezij mikroorganizmov

2016-01-18T08:48:25Z

MarkoRadojkovic:

==UVOD==
Sintezni biologi skozi racionalno načrtovanje in napredno inženirstvo stremijo k ustvarjanju novih genskih vezij, ki bi imela široko uporabnost. Imajoči v mislih kompleksnost procesiranja signalov, ki se pojavljajo v naravnih bioloških sistemih, inženirski mikroorganizmi imajo potencial za opravljanje številnih koristnih nalog, ki zahtevajo sofisticirano računalniško vodenje in kontrolo.
Ta članek predstavlja pregled vsestranskih komponent in orodij, ki so trenutno dostopna za inženiring genskih vezij v mikroorganizmih, vključno z nedavno razvitimi RNA orodji, ki vsebujejo zelo široko dinamično območje in se lahko programirajo. Seznanili se bomo z oblikovalnimi načeli, ki omogočajo robustno in razširljivo delovanje vezij, prav tako pa bomo pogledali nekatere efikasne strategije za hitro identifikacijo in popravljanje napak ter fino nastavljanje lastnosti vezij.

==ORODJA ZA INŽENIRING RNA==
Transkripcija je verjetno najpomembnejša kontrolna točka v genskih vezjih, ker zagotavlja celovito regulacijo izražanja vseh komponent. Kontrolni elementi se lažje sestavljajo na nivoju DNA, s čimer se izognemo težavam, ki lahko nastanejo kot posledica sekundarnih struktur molekul mRNA.

===Vezava RNA===
Nukleotidno zaporedje promotorja, na katero se veže RNA-pomieraza (RNAP), je temeljna determinanta hitrosti transkripcije. Do vezave pride preko σ70- tipa faktorjev na -10 in -35 mesto od začetka transkripcije, kar hkrati določa samo specifičnost iniciacijskega mesta, medtem ko se C-končna domena α podenote preferenčno veže na kratko zaporedje ponovitev A in T baz, 30 mest navzgor od -35 mesta (UP element) in s tem določa jakost promotorja. Raziskave vpliva UP elementov na jakost promotorja so pokazale, da se vpliv le-teh na jakost promotorja z višanjem koncentracije RNAP zmanjšuje in obratno. Zaporedje navzdol od začetka transkripcije prav tako lahko vpliva na potek transkripcije same, vendar se z uporabo standardnih 5'-neprevajajočih se regij (UTR), temu vplivu lahko izognemo. Knjižnice promotorjev s širokim razponom jakosti predstavljajo dragoceno zbirko, ki jih biološki inženirji s pridom izkoriščajo in jo bodo izkoriščali, dokler se ne pojavijo popolni napovedni modeli.

===Proteinski regulatorji transkripcije===

Aktivatorji

Klasični aktivatorji, ki jih uporabljamo pri oblikovanj genskih vezij, kot je LuxR, delujejo na ta način, da stabilizirajo vezavo RNAP na promotor. Rhodius in kolegi so izkoristili ekstracitoplazmične funkcijske σ faktorje (ECFs) za izgradnjo največje knjižnice ortogonalnih transkripcijskih regulatorjev za ''E. coli'', pri čemer so našli 20 parov ECFs in sorodnih promotorjev, ki imajo zelo nizko navzkrižno reaktivnost. Ti proteini se vežejo na regije -35 in -10 in s tem določajo specifičnost vezave RNAP na določen promotor. Ostali transkripcijski aktivatorji, ki so koristni za uporabo v ''E.coli'' vključujejo tri šaperon-aktivatorske pare (ki se lahko izkoristijo za AND logiko), fagne transkripcijske aktivatorje ter HrpRS bakterijske ojačevalne proteine.

Represorji

Represorji najpogosteje delujejo na ta način, da RNAP onemogočijo dostop do promotorja. Stanton in sodelavci so ustvarili knjižnico homologov TetR in njihovih naravnih operatorjev, ki vsebuje 16 ortogonalnih variant. Obstaja tudi manjša knjižnica variant represorja LacI. Zelo zanimivo družino represorskih proteinov predstavljajo transkripcijskim aktivatorjem podobni efektorji (TALEs). TALE represorji se lažje modelirajo v primerjavi s proteini s cinkovimi prsti in se lahko uporabljajo za kontrolo več kompleksnih genov. Pokazali so da z njimi lahko dosežemo do 100-kratno znižanje ravni izražanja v ''E.coli''.

===RNA kontrola transkripcije===
Lep primer kontrole transkripcije z RNA predstavlja pT181 transkripcijski atenuacijski sistem, katerega različice so razvite za kontrolo genskih vezij v ''E.coli''. Naravni pT181 mehanizem koristi 5'- UTR zanko, ki normalno omogoča elongacijo transkripcije; interakcija med zanko na taRNA z 5'-UTR zanko na mRNA promovira nastanek steblo-zanka strukture, ki povzroči terminacijo transkripcije.
Majhne RNA molekule, ki aktivirajo transkripcijo (STARs), so dizajnirane da porušijo strukturo terminatorja, bodisi preko vezave na zanko, ki se nahaja v zaporedju navzgor ali preko direktne vezave na terminator. Ta pozitivna regulacija sistema pT181 omogoča zelo visoko dinamično območje (94-kratno), v primerjavi s klasičnimi represorji in je prav tako uporabna za izgradnjo večplastnih logičnih vrat.

==ORODJA ZA INŽENIRING IZRAŽANJA PROTEINOV==

===Ortogonalni ribosomi===
Vezava ribosoma na molekulo mRNA je posledica prepoznavanja in baznega parjenja med RBS in anti-Shine-Dalgarno zaporedjem, ki je zapisano v 16S rRNA. To lastnost so izkoristili za ustvarjanje treh dodatnih ortogonalnih ribosomov z modificirano 16S rRNA, ki inicira traslacijo samo na mRNA s sorodnim RBS. Transkripcija obeh ortogonalnih rRNA ter mRNA je potrebna za izražanje tarčnega gena, s čimer dobimo AND logična vrata.

===RNA stikala===
Z RNA stikali lahko vplivamo na translacijo preko od liganda odvisne spremembe konformacije 5'-UTR regije mRNA, s čemer otežimo dostop do RBS. Sharma in sodelavci so pokazali da RNA stikala lahko kombiniramo za izgradnjo AND in NAND logičnih vrat. Od temperature odvisni RNA regulatorji prav tako delujejo preko kontrole dostopnosti RBS za vezavo ribosoma.

===taRNA kontrola translacije===

taRNA-represija

Mehanizem inhibicije translacije z majhnimi RNA molekulami (sRNAs) je konceptualno preprost, zaradi česar je tudi izvajanje same metode relativno enostavno: sRNA vsebuje zaporedje komplementarno tarčni mRNA in se veže na RBS ali na zaporedje navzdol ter na ta način prepreči vezavo ribosoma. Vezavna energija sRNA-mRNA je korelirana z jakostjo inhibicije.

taRNA-aktivacija

Green in sodelavci so pred kratkim opisali razvoj RNA-stikal tipa »toehold«, oziroma zank, ki onemogočajo normalen potek translacije. Aktivacija translacije poteka preko vezave »sprožilne« RNA, ki se veže na zaporedje navzgor od zanke in ji spremeni strukturo. Najbolj učinkovita tovrstna stikala zajemajo kar 600-kratno dinamično območje, kar je za red velikosti boljše od ostalih taRNA kontrolnih mehanizmov.

==MODULARNOST IN ORTOGONALNOST==
Modularnost predstavlja kvaliteto konzistentnosti funkcije v številnih pogojih in kontekstih in je en izmed temeljnih pogojev za napovedni dizajn genskih vezij. Ortogonalnost zagotavlja da elementi in moduli ne bodo izražali neželene interakcije z drugimi elementi v inženirskih bioloških sistemih, prav tako pa tudi ne z genskim ozadjem gostitelja. Zato sta ti dve lastnosti nepogrešljivi pri načrtovanju kompleksnih genskih vezij.

===Fizična kompozicija===
Sinteznobiološki elementi so lahko občutljivi na spremembe v robnih zaporedjih, ki jih obkrožajo. Iz analize 12,563 kombinacij promotorjev in RBS, Kosuri in sodelavci so odkrili, da se približno 17 % vseh variacij v ravni izražanja proteinov ne more napovedati iz jakosti promotorjev, oziroma RBS. Mutalik in sodelavci so ugotovili, da spoji promotor: UTR in UTR: tarčni gen (GOI) v znatni meri vplivajo na variabilnost v izražanju genov in so naredili operacijsko enoto izražanja (EOU). Uporaba EOU omogoča veliko konzistentnost v nivojih izražanja tarčnih genov, ko menjavamo različne promotorje in RBS, kar ima veliko napovedno moč pri oblikovanju novih genskih vezij in finem usklajevanju ravni izražanja proteinov.

===Vpliv gostitelja===
Cardinale in sodelavci so iz analize velikega števila sevov ''E.coli'' ugotovili, da sta dostopnost ribosomov in hitrost rasti ključne determinante za učinkovitost genskih vezij. Ugotovili so tudi, da specifične delecije gostiteljskih genov imajo lahko veliki vpliv na genska vezja. Te mutacije posredno vplivajo na učinkovitost vezja preko sprememb v fluksu ogljikovega in dušikovega metabolizma. Komplementarni pristop spreminjanja gostiteljskega genetskega (in metabolnega) ozadja preko dodajanja določenih genov, lahko pozitivno vpliva na učinkovitost vezja.

===Robustnost in genetska stabilnost===
Robustna genska vezja vzdržujejo svojo učinkovitost skozi čas in v različnih pogojih – prilagajajo se spremembam, kot je različna hitrost rasti ali dostopnost transkripcijskih faktorjev, in pogosto imajo zelo visoko razmerje signal-šum. Genska vezja, ki so prilagodljiva in ne predstavljajo preveliko breme za gostitelja, sta tudi bolj robustna s stališča genetske stabilnosti. Zaželeno je, da so vezja ortogonalna, in da ne interreagirajo z gostiteljem, s čimer se tudi povečuje robustnost. V primeru, da se medsebojni interakciji ne moremo izogniti, gensko vezje lahko preoblikujemo tako, da dinamično uravnava svojo ekspresijo kot odgovor na povečani stres, ki ga povzroča gostitelju.

==POPRAVLJANJE NAPAK IN FINA NASTAVITEV GENSKIH VEZIJ==
Brez popolnoma napovednih zmogljivosti, načrtovanje genskih vezij neizogibno zahteva stopnje popravljanja napak ter fine nastavitve. Razlogi za neuspeh se najprej morajo identificirati, da bi vezje lahko normalno funkcioniralo znotraj želenih parametrov.

===Nastavljivi elementi v genskih vezjih===
Enkrat, ko se ugotovi razlog za neuspeh, se morajo narediti spremembe v vezju. Komponente je mogoče treba zamenjati, zaradi toksičnih učinkov njihovega izražanja, ali mogoče zaradi neustreznega dinamičnega območja njihovega izhodnega signala. Če je komponenta del velike ortogonalne zbirke, jo lahko zamenjamo z bolj ustrezno varianto. Ojačevalce signala lahko uporabimo v primeru, da hočemo popraviti signal komponente navzgor. Drugače obnašanje posameznih komponent lahko popravimo s spremembo jakosti promotorjev ali RBS, stopnje razgradnje genskih produktov ali števila posameznih komponent.

===Strategije za odpravljanje napak===
Ena izmed najbolj uporabljanih strategij za fino nastavljanje delovanja genskih vezij, je uporaba BioBrick standardov. Medtem, ko je uvajanje mutacij v komponente tekom začetnega sestavljanja enostavno, enkrat, ko so deli povezani v večje module, nadaljnje spreminjanje posameznih komponent ni več možno. Za ponovno uvajanje variacij se moramo vrniti na korak, ko smo dodajali posamezne komponente ali uporabimo nekatero izmed metod, ki temeljijo na PCR. SLIC, Gibsonovo sestavljanje, CPEC in SLiCE so metode zasnovane na PCR, ki predstavljajo dobro alternativo sestavljanju preko linkerjev, ker se z njimi izognemo nastanku »brazgotin«, ki lahko vplivajo na funkcionalnost vezja.
MAGE je zelo močno orodje za uvajanje variacij po predhodnem sestavljanju komponent. Metoda temelji na uporabi različnih ssDNA oligonukleotidov, s katerimi preko λ-Red rekombinaze uvedemo mutacije na ustreznih mestih.

==ZAKLJUČEK==
Po skoraj 15 letih pospešenega napredovanja, sintezna biologija je prišla do stopnje, kjer je na razpolago veliko orodij in osnovnih gradnikov za inženiring genskih vezij. Veliki napredek je ostvarjen tudi na polju ortogonalnosti in modularnosti gradnikov, kar omogoča bolj predvidljivo in robustno načrtovanje kompleksnih genskih vezij. Gradniki, ki temeljijo na RNA, bodo najverjetneje imeli glavno vlogo pri nadaljnji sofistikaciji genskih vezij, zaradi svoje enostavne programabilnosti in ker njihovi termodinamski modeli zelo dobro napovejo obnašanje v genskih vezjih.
Čeprav zelo dinamično in nedefinirano okolje gostitelja pogosto ovira normalno delovanje genskih vezij, strategije, ki temeljijo na uporabi izoliranih delov in racionalnem iskanju optimalnih parametrov bodo zmanjšale čas potreben za izgradnjo kompleksnih vezij. Variacije, ki so posledica interakcij z gostiteljskim metabolizmom, bi se še lahko dodatno znižale z uporabo sevov z reduciranimi genomi.

==VIR==
R. W. Bradley, ''et al''., Tools and Principles for Microbial Gene Circuit Engineering, J. Mol. Biol. (2015).

Seminarji SB 2015/16

2016-01-18T08:45:57Z

MarkoRadojkovic:

Seminarji iz Sintezne biologije v študijskem letu 2015/16 so:

Vir: knjiga [http://journal.frontiersin.org/researchtopic/2866/synthetic-biology-engineering-complexity-and-refactoring-cell-capabilities SYNTHETIC BIOLOGY: ENGINEERING COMPLEXITY AND REFACTORING CELL CAPABILITIES]

* Production of fatty acid-derived valuable chemicals in synthetic microbes ([[Proizvodnja kemikalij iz derivatov maščobnih kislin s pomočjo sintetičnih mikroorganizmov]]) (Maja Grdadolnik) 
* Optimization of the IPP precursor supply for the production of lycopene, decaprenoxanthin and astaxanthin by Corynebacterium glutamicum ([[Optimizacija sinteze IPP kot prekursorja za produkcijo likopena, dekaprenoksantina in astaksantina v Corynebacterium glutamicum]]) (Griša Prinčič) 
* Engineering sugar utilization and microbial tolerance toward lignocellulose conversion [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Konverzija_lignoceluloze_s_pomočjo_izkoriščanja_mikrobne_tolerance_in_inženiringa_sladkorjev] (Kim Potočnik) 
* Cofactor engineering for enhancing the flux of metabolic pathways [[INŽENIRING KOFAKTORJEV ZA IZBOLJŠANJE METABOLIČNIH POTI]] (Nastja Štemberger) 
* [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4354409/ Can the natural diversity of quorum-sensing advance synthetic biology?] ([[Ali lahko naravna diverziteta quorum sensinga pripomore k napredku v sintezni biologiji?]]) (Tina Snoj) 
* [http://journal.frontiersin.org/article/10.3389/fbioe.2015.00093/full Signal-to-noise ratio measures efficacy of biological computing devices and circuits] ([[Določanje učinkovitosti bioloških naprav in vezij z razmerjem signal-šum]]) (Jakob G. Lavrenčič) 
* A sense of balance: experimental investigation and modeling of a malonyl-CoA sensor in Escherichia coli ([[Senzor za malonil-CoA v bakteriji Escherichia coli]]) (Ajda Rojc) 
* [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4211546/ New transposon tools tailored for metabolic engineering of Gram-negative microbial cell factories] ([[Metabolični inženiring gram-negativnih bakterij s transpozonskim sistemom]]) (Rok Razpotnik) 

Vir: knjiga [http://journal.frontiersin.org/researchtopic/455/synthetic-biology-applications-in-industrial-microbiology SYNTHETIC BIOLOGY APPLICATIONS IN INDUSTRIAL MICROBIOLOGY]

* Recent Progress in Synthetic Biology for Microbial Production of C3–C10 Alcohols (Urška Rauter) ([[Napredki v sintezni biologiji pri proizvodnji C3-C10 alkoholov v mikroorganizmih]])
* Visualizing Evolution in Real-Time Method for Strain Engineering ([[Vizualizacija evolucije v realnem času – metoda za sevno inženirstvo]]) (Samo Zakotnik)
* [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3367458/ Engineering Microbial Consortia to Enhance Biomining and Bioremediation] ([[Načrtovanje mikrobnih konzorcijev za izboljšanje biorudarstva in bioremediacije]]) (Maja Kostanjevec)
* Engineering Microbial Chemical Factories to Produce Renewable “Biomonomers” ([[Mikrobiološka proizvodnja obnovljivih biomonomerov in bioplastike]])(Nastja Pirman)
* [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3446811/ Application of Synthetic Biology in Cyanobacteria and Algae] ([[Uporaba sintezne biologije v cianobakterijah in algah]]) (Špela Tomaž)
* Synthetic Feedback Loop Model for Increasing Microbial Biofuel Production Using a Biosensor ([[Model s povratno zanko za povečanje mikrobne produkcije biogoriva z uporabo biosenzorja]])(Jernej Pušnik)
* Balance of XYL1 and XYL2 Expression in Different Yeast Chassis for Improved xylose Fermentation ([[Ravnotežje med ekspresijo XYL1 in XYL2 v različnih šasijah kvasovk v povezavi s povečano fermentacijo ksiloze]]) (Monika Praznik)
* [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3630320/ Design and Development of Synthetic Microbial Platform Cells for Bioenergy] ([[Načrtovanje in razvijanje sintetičnih mikrobnih celičnih platform za pridobivanje bioenergije]])(Erik Mršnik)
* [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3616241/ Microbial Production of Isoprenoids Enabled by Synthetic Biology] ([[Mikrobna produkcija izoprenoidov s sintezno biologijo]]) (Dominik Kert)
* Chemical synthetic biology: a mini-review ([[Kratki pregled kemijske sintezne biologije]]) (Anka Hotko)

Seminarji iz preglednih člankov:

* [http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S002228361500618X Towards engineering biological systems in a broader context] ([[Inženiring bioloških sistemov v širšem kontekstu]]) (Aleksander Benčič)
* [http://revistes.iec.cat/index.php/IM/article/viewFile/139212/137876 Synthetic biology: Novel approaches for microbiology] ([[Sintezno biološki pristopi v mikrobiologiji]]) (Daša Janeš)
* [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26463592 Tools and principles for microbial gene circuit engineering] ([[Orodja in načela za inženiring genskih vezij mikroorganizmov]]) (Marko Radojković)
* Sensitive cells: enabling tools for static and dynamic control of microbial metabolic pathways ([[Dinamično uravnavanje (regulacija) metabolnih poti]]) (Katja Leben)
* Chassis optimization as a cornerstone for the application of synthetic biology based strategies in microbial secondary metabolism ([[Oprimizacija šasij kot osnovni korak pri uporabi sintezno biološkega pristopa pri karakterizaciji mikrobnega sekundarnega metabolizma]]) (Jure Zabret)
* [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4571725/ Recent advances and opportunities in synthetic logic gates engineering in living cells] ([[Napredki v načrtovanju bioloških logičnih vrat v živih celicah]]) (Monika Biasizzo)
* Programmable genetic circuits for pathway engineering ([[Genetska vezja v metabolnem inženiringu]])(Urban Javoršek)
* [http://web.media.mit.edu/~neri/MATTER.MEDIA/Publications/Better_together-_engineering_and_application_of_microbial_symbioses.pdf Better together: engineering and application of microbial symbioses] ([[V slogi je moč: načrtovanje in uporaba mikrobne simbioze]]) (Nejc Petrišič)
* Synthetic biology for microbial production of lipid-based biofuels ([[Produkcija lipidnih biogoriv s sintezno biologijo]]) (Urška Pevec)
* Engineering Biosynthesis Mechanisms for Diversifying Polyhydroxyalkanoates ([[Inženiring biosintetskih mehanizmov za raznolike polihidroksialkanoate]]) (Mojca Banič)
* [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4519758/pdf/fmicb-06-00775.pdf Synthetic biology of fungal natural products] ([[Sintezna biologija naravnih produktov (nitastih) gliv]]) (Estera Merljak)
* Synthetic biology and biomimetic chemistry as converging technologies fostering a new generation of smart biosensors ([[Sintezna biologija in biomimetika pri razvoju biosenzorjev]]) (Benjamin Bajželj)
* [http://splasho.com/blog/papers/Bioluminescence.pdf How Synthetic Biology Would Reconsider Natural Bioluminescence and its Application] ([[Uporaba naravne bioluminiscence v sintezni biologiji]]) (Ana Grom & Ana Unkovič) 
* Synthetic Biology-Toward Therapeutic Solutions ([[Uporaba sintezne biologije v terapevtske namene]]) (Tanja Korpar)
* [http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0006291X15306197 Synthetically modified mRNA for efficient and fast human iPS cell generation and direct transdifferentiation to myoblasts] ([[Učinkovita in hitra priprava človeških iPS celic in neposredna transdiferenciacija v mioblaste s sintetično modificirano mRNA]]) (Mirjana Malnar)
* Mammalian synthetic biology: emerging medical applications([[Sintezna biologija sesalcev in medicinske aplikacije]]) ( Maša Mirkoviić)
* Biology devices and circuits for RNA-based ‘smart vaccines’: a propositional review ([[Biološke naprave in vezja za pripravo pametnih cepiv na osnovi RNA]])(Monika Škrjanc)

Orodja in načela za inženiring genskih vezij mikroorganizmov

2016-01-18T08:43:36Z

MarkoRadojkovic:

==UVOD==
Sintezni biologi skozi racionalno načrtovanje in napredno inženirstvo stremijo k ustvarjanju novih genskih vezij, ki bi imela široko uporabnost. Imajoči v mislih kompleksnost procesiranja signalov, ki se pojavljajo v naravnih bioloških sistemih, inženirski mikroorganizmi imajo potencial za opravljanje številnih koristnih nalog, ki zahtevajo sofisticirano računalniško vodenje in kontrolo.
Ta članek predstavlja pregled vsestranskih komponent in orodij, ki so trenutno dostopna za inženiring genskih vezij v mikroorganizmih, vključno z nedavno razvitimi RNA orodji, ki vsebujejo zelo široko dinamično območje in se lahko programirajo. Seznanili se bomo z oblikovalnimi načeli, ki omogočajo robustno in razširljivo delovanje vezij, prav tako pa bomo pogledali nekatere efikasne strategije za hitro identifikacijo in popravljanje napak ter fino nastavljanje lastnosti vezij.

==ORODJA ZA INŽENIRING RNA==
Transkripcija je verjetno najpomembnejša kontrolna točka v genskih vezjih, ker zagotavlja celovito regulacijo izražanja vseh komponent. Kontrolni elementi se lažje sestavljajo na nivoju DNA, s čimer se izognemo težavam, ki lahko nastanejo kot posledica sekundarnih struktur molekul mRNA.

===Vezava RNA===
Nukleotidno zaporedje promotorja, na katero se veže RNA-pomieraza (RNAP), je temeljna determinanta hitrosti transkripcije. Do vezave pride preko σ70- tipa faktorjev na -10 in -35 mesto od začetka transkripcije, kar hkrati določa samo specifičnost iniciacijskega mesta, medtem ko se C-končna domena α podenote preferenčno veže na kratko zaporedje ponovitev A in T baz, 30 mest navzgor od -35 mesta (UP element) in s tem določa jakost promotorja. Raziskave vpliva UP elementov na jakost promotorja so pokazale, da se vpliv le-teh na jakost promotorja z višanjem koncentracije RNAP zmanjšuje in obratno. Zaporedje navzdol od začetka transkripcije prav tako lahko vpliva na potek transkripcije same, vendar se z uporabo standardnih 5'-neprevajajočih se regij (UTR), temu vplivu lahko izognemo. Knjižnice promotorjev s širokim razponom jakosti predstavljajo dragoceno zbirko, ki jih biološki inženirji s pridom izkoriščajo in jo bodo izkoriščali, dokler se ne pojavijo popolni napovedni modeli.

===Proteinski regulatorji transkripcije===

Aktivatorji

Klasični aktivatorji, ki jih uporabljamo pri oblikovanj genskih vezij, kot je LuxR, delujejo na ta način, da stabilizirajo vezavo RNAP na promotor. Rhodius in kolegi so izkoristili ekstracitoplazmične funkcijske σ faktorje (ECFs) za izgradnjo največje knjižnice ortogonalnih transkripcijskih regulatorjev za E. coli, pri čemer so našli 20 parov ECFs in sorodnih promotorjev, ki imajo zelo nizko navzkrižno reaktivnost. Ti proteini se vežejo na regije -35 in -10 in s tem določajo specifičnost vezave RNAP na določen promotor. Ostali transkripcijski aktivatorji, ki so koristni za uporabo v E.coli vključujejo tri šaperon-aktivatorske pare (ki se lahko izkoristijo za AND logiko), fagne transkripcijske aktivatorje ter HrpRS bakterijske ojačevalne proteine.

Represorji

Represorji najpogosteje delujejo na ta način, da RNAP onemogočijo dostop do promotorja. Stanton in sodelavci so ustvarili knjižnico homologov TetR in njihovih naravnih operatorjev, ki vsebuje 16 ortogonalnih variant. Obstaja tudi manjša knjižnica variant represorja LacI. Zelo zanimivo družino represorskih proteinov predstavljajo transkripcijskim aktivatorjem podobni efektorji (TALEs). TALE represorji se lažje modelirajo v primerjavi s proteini s cinkovimi prsti in se lahko uporabljajo za kontrolo več kompleksnih genov. Pokazali so da z njimi lahko dosežemo do 100-kratno znižanje ravni izražanja v E.coli.

===RNA kontrola transkripcije===
Lep primer kontrole transkripcije z RNA predstavlja pT181 transkripcijski atenuacijski sistem, katerega različice so razvite za kontrolo genskih vezij v E.coli. Naravni pT181 mehanizem koristi 5'- UTR zanko, ki normalno omogoča elongacijo transkripcije; interakcija med zanko na taRNA z 5'-UTR zanko na mRNA promovira nastanek steblo-zanka strukture, ki povzroči terminacijo transkripcije.
Majhne RNA molekule, ki aktivirajo transkripcijo (STARs), so dizajnirane da porušijo strukturo terminatorja, bodisi preko vezave na zanko, ki se nahaja v zaporedju navzgor ali preko direktne vezave na terminator. Ta pozitivna regulacija sistema pT181 omogoča zelo visoko dinamično območje (94-kratno), v primerjavi s klasičnimi represorji in je prav tako uporabna za izgradnjo večplastnih logičnih vrat.

==ORODJA ZA INŽENIRING IZRAŽANJA PROTEINOV==

===Ortogonalni ribosomi===
Vezava ribosoma na molekulo mRNA je posledica prepoznavanja in baznega parjenja med RBS in anti-Shine-Dalgarno zaporedjem, ki je zapisano v 16S rRNA. To lastnost so izkoristili za ustvarjanje treh dodatnih ortogonalnih ribosomov z modificirano 16S rRNA, ki inicira traslacijo samo na mRNA s sorodnim RBS. Transkripcija obeh ortogonalnih rRNA ter mRNA je potrebna za izražanje tarčnega gena, s čimer dobimo AND logična vrata.

===RNA stikala===
Z RNA stikali lahko vplivamo na translacijo preko od liganda odvisne spremembe konformacije 5'-UTR regije mRNA, s čemer otežimo dostop do RBS. Sharma in sodelavci so pokazali da RNA stikala lahko kombiniramo za izgradnjo AND in NAND logičnih vrat. Od temperature odvisni RNA regulatorji prav tako delujejo preko kontrole dostopnosti RBS za vezavo ribosoma.

===taRNA kontrola translacije===

taRNA-represija

Mehanizem inhibicije translacije z majhnimi RNA molekulami (sRNAs) je konceptualno preprost, zaradi česar je tudi izvajanje same metode relativno enostavno: sRNA vsebuje zaporedje komplementarno tarčni mRNA in se veže na RBS ali na zaporedje navzdol ter na ta način prepreči vezavo ribosoma. Vezavna energija sRNA-mRNA je korelirana z jakostjo inhibicije.

taRNA-aktivacija

Green in sodelavci so pred kratkim opisali razvoj RNA-stikal tipa »toehold«, oziroma zank, ki onemogočajo normalen potek translacije. Aktivacija translacije poteka preko vezave »sprožilne« RNA, ki se veže na zaporedje navzgor od zanke in ji spremeni strukturo. Najbolj učinkovita tovrstna stikala zajemajo kar 600-kratno dinamično območje, kar je za red velikosti boljše od ostalih taRNA kontrolnih mehanizmov.

==MODULARNOST IN ORTOGONALNOST==
Modularnost predstavlja kvaliteto konzistentnosti funkcije v številnih pogojih in kontekstih in je en izmed temeljnih pogojev za napovedni dizajn genskih vezij. Ortogonalnost zagotavlja da elementi in moduli ne bodo izražali neželene interakcije z drugimi elementi v inženirskih bioloških sistemih, prav tako pa tudi ne z genskim ozadjem gostitelja. Zato sta ti dve lastnosti nepogrešljivi pri načrtovanju kompleksnih genskih vezij.

===Fizična kompozicija===
Sinteznobiološki elementi so lahko občutljivi na spremembe v robnih zaporedjih, ki jih obkrožajo. Iz analize 12,563 kombinacij promotorjev in RBS, Kosuri in sodelavci so odkrili, da se približno 17 % vseh variacij v ravni izražanja proteinov ne more napovedati iz jakosti promotorjev, oziroma RBS. Mutalik in sodelavci so ugotovili, da spoji promotor: UTR in UTR: tarčni gen (GOI) v znatni meri vplivajo na variabilnost v izražanju genov in so naredili operacijsko enoto izražanja (EOU). Uporaba EOU omogoča veliko konzistentnost v nivojih izražanja tarčnih genov, ko menjavamo različne promotorje in RBS, kar ima veliko napovedno moč pri oblikovanju novih genskih vezij in finem usklajevanju ravni izražanja proteinov.

===Vpliv gostitelja===
Cardinale in sodelavci so iz analize velikega števila sevov E.coli ugotovili, da sta dostopnost ribosomov in hitrost rasti ključne determinante za učinkovitost genskih vezij. Ugotovili so tudi, da specifične delecije gostiteljskih genov imajo lahko veliki vpliv na genska vezja. Te mutacije posredno vplivajo na učinkovitost vezja preko sprememb v fluksu ogljikovega in dušikovega metabolizma. Komplementarni pristop spreminjanja gostiteljskega genetskega (in metabolnega) ozadja preko dodajanja določenih genov, lahko pozitivno vpliva na učinkovitost vezja.

===Robustnost in genetska stabilnost===
Robustna genska vezja vzdržujejo svojo učinkovitost skozi čas in v različnih pogojih – prilagajajo se spremembam, kot je različna hitrost rasti ali dostopnost transkripcijskih faktorjev, in pogosto imajo zelo visoko razmerje signal-šum. Genska vezja, ki so prilagodljiva in ne predstavljajo preveliko breme za gostitelja, sta tudi bolj robustna s stališča genetske stabilnosti. Zaželeno je, da so vezja ortogonalna, in da ne interreagirajo z gostiteljem, s čimer se tudi povečuje robustnost. V primeru, da se medsebojni interakciji ne moremo izogniti, gensko vezje lahko preoblikujemo tako, da dinamično uravnava svojo ekspresijo kot odgovor na povečani stres, ki ga povzroča gostitelju.

==POPRAVLJANJE NAPAK IN FINA NASTAVITEV GENSKIH VEZIJ==
Brez popolnoma napovednih zmogljivosti, načrtovanje genskih vezij neizogibno zahteva stopnje popravljanja napak ter fine nastavitve. Razlogi za neuspeh se najprej morajo identificirati, da bi vezje lahko normalno funkcioniralo znotraj želenih parametrov.

===Nastavljivi elementi v genskih vezjih===
Enkrat, ko se ugotovi razlog za neuspeh, se morajo narediti spremembe v vezju. Komponente je mogoče treba zamenjati, zaradi toksičnih učinkov njihovega izražanja, ali mogoče zaradi neustreznega dinamičnega območja njihovega izhodnega signala. Če je komponenta del velike ortogonalne zbirke, jo lahko zamenjamo z bolj ustrezno varianto. Ojačevalce signala lahko uporabimo v primeru, da hočemo popraviti signal komponente navzgor. Drugače obnašanje posameznih komponent lahko popravimo s spremembo jakosti promotorjev ali RBS, stopnje razgradnje genskih produktov ali števila posameznih komponent.

===Strategije za odpravljanje napak===
Ena izmed najbolj uporabljanih strategij za fino nastavljanje delovanja genskih vezij, je uporaba BioBrick standardov. Medtem, ko je uvajanje mutacij v komponente tekom začetnega sestavljanja enostavno, enkrat, ko so deli povezani v večje module, nadaljnje spreminjanje posameznih komponent ni več možno. Za ponovno uvajanje variacij se moramo vrniti na korak, ko smo dodajali posamezne komponente ali uporabimo nekatero izmed metod, ki temeljijo na PCR. SLIC, Gibsonovo sestavljanje, CPEC in SLiCE so metode zasnovane na PCR, ki predstavljajo dobro alternativo sestavljanju preko linkerjev, ker se z njimi izognemo nastanku »brazgotin«, ki lahko vplivajo na funkcionalnost vezja.
MAGE je zelo močno orodje za uvajanje variacij po predhodnem sestavljanju komponent. Metoda temelji na uporabi različnih ssDNA oligonukleotidov, s katerimi preko λ-Red rekombinaze uvedemo mutacije na ustreznih mestih.

==ZAKLJUČEK==
Po skoraj 15 letih pospešenega napredovanja, sintezna biologija je prišla do stopnje, kjer je na razpolago veliko orodij in osnovnih gradnikov za inženiring genskih vezij. Veliki napredek je ostvarjen tudi na polju ortogonalnosti in modularnosti gradnikov, kar omogoča bolj predvidljivo in robustno načrtovanje kompleksnih genskih vezij. Gradniki, ki temeljijo na RNA, bodo najverjetneje imeli glavno vlogo pri nadaljnji sofistikaciji genskih vezij, zaradi svoje enostavne programabilnosti in ker njihovi termodinamski modeli zelo dobro napovejo obnašanje v genskih vezjih.
Čeprav zelo dinamično in nedefinirano okolje gostitelja pogosto ovira normalno delovanje genskih vezij, strategije, ki temeljijo na uporabi izoliranih delov in racionalnem iskanju optimalnih parametrov bodo zmanjšale čas potreben za izgradnjo kompleksnih vezij. Variacije, ki so posledica interakcij z gostiteljskim metabolizmom, bi se še lahko dodatno znižale z uporabo sevov z reduciranimi genomi.

==VIR==
R. W. Bradley, ''et al''., Tools and Principles for Microbial Gene Circuit Engineering, J. Mol. Biol. (2015).

Orodja in načela za inženiring genskih vezij mikroorganizmov

2016-01-18T08:42:44Z

MarkoRadojkovic: /* taRNA kontrola translacije */

==UVOD==
Sintezni biologi skozi racionalno načrtovanje in napredno inženirstvo stremijo k ustvarjanju novih genskih vezij, ki bi imela široko uporabnost. Imajoči v mislih kompleksnost procesiranja signalov, ki se pojavljajo v naravnih bioloških sistemih, inženirski mikroorganizmi imajo potencial za opravljanje številnih koristnih nalog, ki zahtevajo sofisticirano računalniško vodenje in kontrolo.
Ta članek predstavlja pregled vsestranskih komponent in orodij, ki so trenutno dostopna za inženiring genskih vezij v mikroorganizmih, vključno z nedavno razvitimi RNA orodji, ki vsebujejo zelo široko dinamično območje in se lahko programirajo. Seznanili se bomo z oblikovalnimi načeli, ki omogočajo robustno in razširljivo delovanje vezij, prav tako pa bomo pogledali nekatere efikasne strategije za hitro identifikacijo in popravljanje napak ter fino nastavljanje lastnosti vezij.

==ORODJA ZA INŽENIRING RNA==
Transkripcija je verjetno najpomembnejša kontrolna točka v genskih vezjih, ker zagotavlja celovito regulacijo izražanja vseh komponent. Kontrolni elementi se lažje sestavljajo na nivoju DNA, s čimer se izognemo težavam, ki lahko nastanejo kot posledica sekundarnih struktur molekul mRNA.

===Vezava RNA===
Nukleotidno zaporedje promotorja, na katero se veže RNA-pomieraza (RNAP), je temeljna determinanta hitrosti transkripcije. Do vezave pride preko σ70- tipa faktorjev na -10 in -35 mesto od začetka transkripcije, kar hkrati določa samo specifičnost iniciacijskega mesta, medtem ko se C-končna domena α podenote preferenčno veže na kratko zaporedje ponovitev A in T baz, 30 mest navzgor od -35 mesta (UP element) in s tem določa jakost promotorja. Raziskave vpliva UP elementov na jakost promotorja so pokazale, da se vpliv le-teh na jakost promotorja z višanjem koncentracije RNAP zmanjšuje in obratno. Zaporedje navzdol od začetka transkripcije prav tako lahko vpliva na potek transkripcije same, vendar se z uporabo standardnih 5'-neprevajajočih se regij (UTR), temu vplivu lahko izognemo. Knjižnice promotorjev s širokim razponom jakosti predstavljajo dragoceno zbirko, ki jih biološki inženirji s pridom izkoriščajo in jo bodo izkoriščali, dokler se ne pojavijo popolni napovedni modeli.

===Proteinski regulatorji transkripcije===

Aktivatorji

Klasični aktivatorji, ki jih uporabljamo pri oblikovanj genskih vezij, kot je LuxR, delujejo na ta način, da stabilizirajo vezavo RNAP na promotor. Rhodius in kolegi so izkoristili ekstracitoplazmične funkcijske σ faktorje (ECFs) za izgradnjo največje knjižnice ortogonalnih transkripcijskih regulatorjev za E. coli, pri čemer so našli 20 parov ECFs in sorodnih promotorjev, ki imajo zelo nizko navzkrižno reaktivnost. Ti proteini se vežejo na regije -35 in -10 in s tem določajo specifičnost vezave RNAP na določen promotor. Ostali transkripcijski aktivatorji, ki so koristni za uporabo v E.coli vključujejo tri šaperon-aktivatorske pare (ki se lahko izkoristijo za AND logiko), fagne transkripcijske aktivatorje ter HrpRS bakterijske ojačevalne proteine.

Represorji

Represorji najpogosteje delujejo na ta način, da RNAP onemogočijo dostop do promotorja. Stanton in sodelavci so ustvarili knjižnico homologov TetR in njihovih naravnih operatorjev, ki vsebuje 16 ortogonalnih variant. Obstaja tudi manjša knjižnica variant represorja LacI. Zelo zanimivo družino represorskih proteinov predstavljajo transkripcijskim aktivatorjem podobni efektorji (TALEs). TALE represorji se lažje modelirajo v primerjavi s proteini s cinkovimi prsti in se lahko uporabljajo za kontrolo več kompleksnih genov. Pokazali so da z njimi lahko dosežemo do 100-kratno znižanje ravni izražanja v E.coli.

==='''RNA kontrola transkripcije'''===
Lep primer kontrole transkripcije z RNA predstavlja pT181 transkripcijski atenuacijski sistem, katerega različice so razvite za kontrolo genskih vezij v E.coli. Naravni pT181 mehanizem koristi 5'- UTR zanko, ki normalno omogoča elongacijo transkripcije; interakcija med zanko na taRNA z 5'-UTR zanko na mRNA promovira nastanek steblo-zanka strukture, ki povzroči terminacijo transkripcije.
Majhne RNA molekule, ki aktivirajo transkripcijo (STARs), so dizajnirane da porušijo strukturo terminatorja, bodisi preko vezave na zanko, ki se nahaja v zaporedju navzgor ali preko direktne vezave na terminator. Ta pozitivna regulacija sistema pT181 omogoča zelo visoko dinamično območje (94-kratno), v primerjavi s klasičnimi represorji in je prav tako uporabna za izgradnjo večplastnih logičnih vrat.

==ORODJA ZA INŽENIRING IZRAŽANJA PROTEINOV==

===Ortogonalni ribosomi===
Vezava ribosoma na molekulo mRNA je posledica prepoznavanja in baznega parjenja med RBS in anti-Shine-Dalgarno zaporedjem, ki je zapisano v 16S rRNA. To lastnost so izkoristili za ustvarjanje treh dodatnih ortogonalnih ribosomov z modificirano 16S rRNA, ki inicira traslacijo samo na mRNA s sorodnim RBS. Transkripcija obeh ortogonalnih rRNA ter mRNA je potrebna za izražanje tarčnega gena, s čimer dobimo AND logična vrata.

==='''RNA stikala'''===
Z RNA stikali lahko vplivamo na translacijo preko od liganda odvisne spremembe konformacije 5'-UTR regije mRNA, s čemer otežimo dostop do RBS. Sharma in sodelavci so pokazali da RNA stikala lahko kombiniramo za izgradnjo AND in NAND logičnih vrat. Od temperature odvisni RNA regulatorji prav tako delujejo preko kontrole dostopnosti RBS za vezavo ribosoma.

==='''taRNA kontrola translacije'''===

taRNA-represija

Mehanizem inhibicije translacije z majhnimi RNA molekulami (sRNAs) je konceptualno preprost, zaradi česar je tudi izvajanje same metode relativno enostavno: sRNA vsebuje zaporedje komplementarno tarčni mRNA in se veže na RBS ali na zaporedje navzdol ter na ta način prepreči vezavo ribosoma. Vezavna energija sRNA-mRNA je korelirana z jakostjo inhibicije.

taRNA-aktivacija

Green in sodelavci so pred kratkim opisali razvoj RNA-stikal tipa »toehold«, oziroma zank, ki onemogočajo normalen potek translacije. Aktivacija translacije poteka preko vezave »sprožilne« RNA, ki se veže na zaporedje navzgor od zanke in ji spremeni strukturo. Najbolj učinkovita tovrstna stikala zajemajo kar 600-kratno dinamično območje, kar je za red velikosti boljše od ostalih taRNA kontrolnih mehanizmov.

==MODULARNOST IN ORTOGONALNOST==
Modularnost predstavlja kvaliteto konzistentnosti funkcije v številnih pogojih in kontekstih in je en izmed temeljnih pogojev za napovedni dizajn genskih vezij. Ortogonalnost zagotavlja da elementi in moduli ne bodo izražali neželene interakcije z drugimi elementi v inženirskih bioloških sistemih, prav tako pa tudi ne z genskim ozadjem gostitelja. Zato sta ti dve lastnosti nepogrešljivi pri načrtovanju kompleksnih genskih vezij.

==='''Fizična kompozicija'''===
Sinteznobiološki elementi so lahko občutljivi na spremembe v robnih zaporedjih, ki jih obkrožajo. Iz analize 12,563 kombinacij promotorjev in RBS, Kosuri in sodelavci so odkrili, da se približno 17 % vseh variacij v ravni izražanja proteinov ne more napovedati iz jakosti promotorjev, oziroma RBS. Mutalik in sodelavci so ugotovili, da spoji promotor: UTR in UTR: tarčni gen (GOI) v znatni meri vplivajo na variabilnost v izražanju genov in so naredili operacijsko enoto izražanja (EOU). Uporaba EOU omogoča veliko konzistentnost v nivojih izražanja tarčnih genov, ko menjavamo različne promotorje in RBS, kar ima veliko napovedno moč pri oblikovanju novih genskih vezij in finem usklajevanju ravni izražanja proteinov.

==='''Vpliv gostitelja'''===
Cardinale in sodelavci so iz analize velikega števila sevov E.coli ugotovili, da sta dostopnost ribosomov in hitrost rasti ključne determinante za učinkovitost genskih vezij. Ugotovili so tudi, da specifične delecije gostiteljskih genov imajo lahko veliki vpliv na genska vezja. Te mutacije posredno vplivajo na učinkovitost vezja preko sprememb v fluksu ogljikovega in dušikovega metabolizma. Komplementarni pristop spreminjanja gostiteljskega genetskega (in metabolnega) ozadja preko dodajanja določenih genov, lahko pozitivno vpliva na učinkovitost vezja.

==='''Robustnost in genetska stabilnost'''===
Robustna genska vezja vzdržujejo svojo učinkovitost skozi čas in v različnih pogojih – prilagajajo se spremembam, kot je različna hitrost rasti ali dostopnost transkripcijskih faktorjev, in pogosto imajo zelo visoko razmerje signal-šum. Genska vezja, ki so prilagodljiva in ne predstavljajo preveliko breme za gostitelja, sta tudi bolj robustna s stališča genetske stabilnosti. Zaželeno je, da so vezja ortogonalna, in da ne interreagirajo z gostiteljem, s čimer se tudi povečuje robustnost. V primeru, da se medsebojni interakciji ne moremo izogniti, gensko vezje lahko preoblikujemo tako, da dinamično uravnava svojo ekspresijo kot odgovor na povečani stres, ki ga povzroča gostitelju.

==POPRAVLJANJE NAPAK IN FINA NASTAVITEV GENSKIH VEZIJ==
Brez popolnoma napovednih zmogljivosti, načrtovanje genskih vezij neizogibno zahteva stopnje popravljanja napak ter fine nastavitve. Razlogi za neuspeh se najprej morajo identificirati, da bi vezje lahko normalno funkcioniralo znotraj želenih parametrov.

==='''Nastavljivi elementi v genskih vezjih'''===
Enkrat, ko se ugotovi razlog za neuspeh, se morajo narediti spremembe v vezju. Komponente je mogoče treba zamenjati, zaradi toksičnih učinkov njihovega izražanja, ali mogoče zaradi neustreznega dinamičnega območja njihovega izhodnega signala. Če je komponenta del velike ortogonalne zbirke, jo lahko zamenjamo z bolj ustrezno varianto. Ojačevalce signala lahko uporabimo v primeru, da hočemo popraviti signal komponente navzgor. Drugače obnašanje posameznih komponent lahko popravimo s spremembo jakosti promotorjev ali RBS, stopnje razgradnje genskih produktov ali števila posameznih komponent.

==='''Strategije za odpravljanje napak'''===
Ena izmed najbolj uporabljanih strategij za fino nastavljanje delovanja genskih vezij, je uporaba BioBrick standardov. Medtem, ko je uvajanje mutacij v komponente tekom začetnega sestavljanja enostavno, enkrat, ko so deli povezani v večje module, nadaljnje spreminjanje posameznih komponent ni več možno. Za ponovno uvajanje variacij se moramo vrniti na korak, ko smo dodajali posamezne komponente ali uporabimo nekatero izmed metod, ki temeljijo na PCR. SLIC, Gibsonovo sestavljanje, CPEC in SLiCE so metode zasnovane na PCR, ki predstavljajo dobro alternativo sestavljanju preko linkerjev, ker se z njimi izognemo nastanku »brazgotin«, ki lahko vplivajo na funkcionalnost vezja.
MAGE je zelo močno orodje za uvajanje variacij po predhodnem sestavljanju komponent. Metoda temelji na uporabi različnih ssDNA oligonukleotidov, s katerimi preko λ-Red rekombinaze uvedemo mutacije na ustreznih mestih.

==ZAKLJUČEK==
Po skoraj 15 letih pospešenega napredovanja, sintezna biologija je prišla do stopnje, kjer je na razpolago veliko orodij in osnovnih gradnikov za inženiring genskih vezij. Veliki napredek je ostvarjen tudi na polju ortogonalnosti in modularnosti gradnikov, kar omogoča bolj predvidljivo in robustno načrtovanje kompleksnih genskih vezij. Gradniki, ki temeljijo na RNA, bodo najverjetneje imeli glavno vlogo pri nadaljnji sofistikaciji genskih vezij, zaradi svoje enostavne programabilnosti in ker njihovi termodinamski modeli zelo dobro napovejo obnašanje v genskih vezjih.
Čeprav zelo dinamično in nedefinirano okolje gostitelja pogosto ovira normalno delovanje genskih vezij, strategije, ki temeljijo na uporabi izoliranih delov in racionalnem iskanju optimalnih parametrov bodo zmanjšale čas potreben za izgradnjo kompleksnih vezij. Variacije, ki so posledica interakcij z gostiteljskim metabolizmom, bi se še lahko dodatno znižale z uporabo sevov z reduciranimi genomi.

==VIR==
R. W. Bradley, ''et al''., Tools and Principles for Microbial Gene Circuit Engineering, J. Mol. Biol. (2015).

Orodja in načela za inženiring genskih vezij mikroorganizmov

2016-01-18T08:42:06Z

MarkoRadojkovic:

==UVOD==
Sintezni biologi skozi racionalno načrtovanje in napredno inženirstvo stremijo k ustvarjanju novih genskih vezij, ki bi imela široko uporabnost. Imajoči v mislih kompleksnost procesiranja signalov, ki se pojavljajo v naravnih bioloških sistemih, inženirski mikroorganizmi imajo potencial za opravljanje številnih koristnih nalog, ki zahtevajo sofisticirano računalniško vodenje in kontrolo.
Ta članek predstavlja pregled vsestranskih komponent in orodij, ki so trenutno dostopna za inženiring genskih vezij v mikroorganizmih, vključno z nedavno razvitimi RNA orodji, ki vsebujejo zelo široko dinamično območje in se lahko programirajo. Seznanili se bomo z oblikovalnimi načeli, ki omogočajo robustno in razširljivo delovanje vezij, prav tako pa bomo pogledali nekatere efikasne strategije za hitro identifikacijo in popravljanje napak ter fino nastavljanje lastnosti vezij.

==ORODJA ZA INŽENIRING RNA==
Transkripcija je verjetno najpomembnejša kontrolna točka v genskih vezjih, ker zagotavlja celovito regulacijo izražanja vseh komponent. Kontrolni elementi se lažje sestavljajo na nivoju DNA, s čimer se izognemo težavam, ki lahko nastanejo kot posledica sekundarnih struktur molekul mRNA.

===Vezava RNA===
Nukleotidno zaporedje promotorja, na katero se veže RNA-pomieraza (RNAP), je temeljna determinanta hitrosti transkripcije. Do vezave pride preko σ70- tipa faktorjev na -10 in -35 mesto od začetka transkripcije, kar hkrati določa samo specifičnost iniciacijskega mesta, medtem ko se C-končna domena α podenote preferenčno veže na kratko zaporedje ponovitev A in T baz, 30 mest navzgor od -35 mesta (UP element) in s tem določa jakost promotorja. Raziskave vpliva UP elementov na jakost promotorja so pokazale, da se vpliv le-teh na jakost promotorja z višanjem koncentracije RNAP zmanjšuje in obratno. Zaporedje navzdol od začetka transkripcije prav tako lahko vpliva na potek transkripcije same, vendar se z uporabo standardnih 5'-neprevajajočih se regij (UTR), temu vplivu lahko izognemo. Knjižnice promotorjev s širokim razponom jakosti predstavljajo dragoceno zbirko, ki jih biološki inženirji s pridom izkoriščajo in jo bodo izkoriščali, dokler se ne pojavijo popolni napovedni modeli.

===Proteinski regulatorji transkripcije===

Aktivatorji

Klasični aktivatorji, ki jih uporabljamo pri oblikovanj genskih vezij, kot je LuxR, delujejo na ta način, da stabilizirajo vezavo RNAP na promotor. Rhodius in kolegi so izkoristili ekstracitoplazmične funkcijske σ faktorje (ECFs) za izgradnjo največje knjižnice ortogonalnih transkripcijskih regulatorjev za E. coli, pri čemer so našli 20 parov ECFs in sorodnih promotorjev, ki imajo zelo nizko navzkrižno reaktivnost. Ti proteini se vežejo na regije -35 in -10 in s tem določajo specifičnost vezave RNAP na določen promotor. Ostali transkripcijski aktivatorji, ki so koristni za uporabo v E.coli vključujejo tri šaperon-aktivatorske pare (ki se lahko izkoristijo za AND logiko), fagne transkripcijske aktivatorje ter HrpRS bakterijske ojačevalne proteine.

Represorji

Represorji najpogosteje delujejo na ta način, da RNAP onemogočijo dostop do promotorja. Stanton in sodelavci so ustvarili knjižnico homologov TetR in njihovih naravnih operatorjev, ki vsebuje 16 ortogonalnih variant. Obstaja tudi manjša knjižnica variant represorja LacI. Zelo zanimivo družino represorskih proteinov predstavljajo transkripcijskim aktivatorjem podobni efektorji (TALEs). TALE represorji se lažje modelirajo v primerjavi s proteini s cinkovimi prsti in se lahko uporabljajo za kontrolo več kompleksnih genov. Pokazali so da z njimi lahko dosežemo do 100-kratno znižanje ravni izražanja v E.coli.

==='''RNA kontrola transkripcije'''===
Lep primer kontrole transkripcije z RNA predstavlja pT181 transkripcijski atenuacijski sistem, katerega različice so razvite za kontrolo genskih vezij v E.coli. Naravni pT181 mehanizem koristi 5'- UTR zanko, ki normalno omogoča elongacijo transkripcije; interakcija med zanko na taRNA z 5'-UTR zanko na mRNA promovira nastanek steblo-zanka strukture, ki povzroči terminacijo transkripcije.
Majhne RNA molekule, ki aktivirajo transkripcijo (STARs), so dizajnirane da porušijo strukturo terminatorja, bodisi preko vezave na zanko, ki se nahaja v zaporedju navzgor ali preko direktne vezave na terminator. Ta pozitivna regulacija sistema pT181 omogoča zelo visoko dinamično območje (94-kratno), v primerjavi s klasičnimi represorji in je prav tako uporabna za izgradnjo večplastnih logičnih vrat.

==ORODJA ZA INŽENIRING IZRAŽANJA PROTEINOV==

===Ortogonalni ribosomi===
Vezava ribosoma na molekulo mRNA je posledica prepoznavanja in baznega parjenja med RBS in anti-Shine-Dalgarno zaporedjem, ki je zapisano v 16S rRNA. To lastnost so izkoristili za ustvarjanje treh dodatnih ortogonalnih ribosomov z modificirano 16S rRNA, ki inicira traslacijo samo na mRNA s sorodnim RBS. Transkripcija obeh ortogonalnih rRNA ter mRNA je potrebna za izražanje tarčnega gena, s čimer dobimo AND logična vrata.

==='''RNA stikala'''===
Z RNA stikali lahko vplivamo na translacijo preko od liganda odvisne spremembe konformacije 5'-UTR regije mRNA, s čemer otežimo dostop do RBS. Sharma in sodelavci so pokazali da RNA stikala lahko kombiniramo za izgradnjo AND in NAND logičnih vrat. Od temperature odvisni RNA regulatorji prav tako delujejo preko kontrole dostopnosti RBS za vezavo ribosoma.

==='''taRNA kontrola translacije'''===

taRNA-represija

Mehanizem inhibicije translacije z majhnimi RNA molekulami (sRNAs) je konceptualno preprost, zaradi česar je tudi izvajanje same metode relativno enostavno: sRNA vsebuje zaporedje komplementarno tarčni mRNA in se veže na RBS ali na zaporedje navzdol ter na ta način prepreči vezavo ribosoma. Vezavna energija sRNA-mRNA je korelirana z jakostjo inhibicije.

taRNA-aktivacija

Green in sodelavci so pred kratkim opisali razvoj RNA-stikal tipa »toehold«, oziroma zank, ki onemogočajo normalen potek translacije. Aktivacija translacije poteka preko vezave »sprožilne« RNA, ki se veže na zaporedje navzgor od zanke in ji spremeni strukturo. Najbolj učinkovita tovrstna stikala zajemajo kar 600-kratno dinamično območje, kar je za red velikosti bolje od ostalih taRNA kontrolnih mehanizmov.

==MODULARNOST IN ORTOGONALNOST==
Modularnost predstavlja kvaliteto konzistentnosti funkcije v številnih pogojih in kontekstih in je en izmed temeljnih pogojev za napovedni dizajn genskih vezij. Ortogonalnost zagotavlja da elementi in moduli ne bodo izražali neželene interakcije z drugimi elementi v inženirskih bioloških sistemih, prav tako pa tudi ne z genskim ozadjem gostitelja. Zato sta ti dve lastnosti nepogrešljivi pri načrtovanju kompleksnih genskih vezij.

==='''Fizična kompozicija'''===
Sinteznobiološki elementi so lahko občutljivi na spremembe v robnih zaporedjih, ki jih obkrožajo. Iz analize 12,563 kombinacij promotorjev in RBS, Kosuri in sodelavci so odkrili, da se približno 17 % vseh variacij v ravni izražanja proteinov ne more napovedati iz jakosti promotorjev, oziroma RBS. Mutalik in sodelavci so ugotovili, da spoji promotor: UTR in UTR: tarčni gen (GOI) v znatni meri vplivajo na variabilnost v izražanju genov in so naredili operacijsko enoto izražanja (EOU). Uporaba EOU omogoča veliko konzistentnost v nivojih izražanja tarčnih genov, ko menjavamo različne promotorje in RBS, kar ima veliko napovedno moč pri oblikovanju novih genskih vezij in finem usklajevanju ravni izražanja proteinov.

==='''Vpliv gostitelja'''===
Cardinale in sodelavci so iz analize velikega števila sevov E.coli ugotovili, da sta dostopnost ribosomov in hitrost rasti ključne determinante za učinkovitost genskih vezij. Ugotovili so tudi, da specifične delecije gostiteljskih genov imajo lahko veliki vpliv na genska vezja. Te mutacije posredno vplivajo na učinkovitost vezja preko sprememb v fluksu ogljikovega in dušikovega metabolizma. Komplementarni pristop spreminjanja gostiteljskega genetskega (in metabolnega) ozadja preko dodajanja določenih genov, lahko pozitivno vpliva na učinkovitost vezja.

==='''Robustnost in genetska stabilnost'''===
Robustna genska vezja vzdržujejo svojo učinkovitost skozi čas in v različnih pogojih – prilagajajo se spremembam, kot je različna hitrost rasti ali dostopnost transkripcijskih faktorjev, in pogosto imajo zelo visoko razmerje signal-šum. Genska vezja, ki so prilagodljiva in ne predstavljajo preveliko breme za gostitelja, sta tudi bolj robustna s stališča genetske stabilnosti. Zaželeno je, da so vezja ortogonalna, in da ne interreagirajo z gostiteljem, s čimer se tudi povečuje robustnost. V primeru, da se medsebojni interakciji ne moremo izogniti, gensko vezje lahko preoblikujemo tako, da dinamično uravnava svojo ekspresijo kot odgovor na povečani stres, ki ga povzroča gostitelju.

==POPRAVLJANJE NAPAK IN FINA NASTAVITEV GENSKIH VEZIJ==
Brez popolnoma napovednih zmogljivosti, načrtovanje genskih vezij neizogibno zahteva stopnje popravljanja napak ter fine nastavitve. Razlogi za neuspeh se najprej morajo identificirati, da bi vezje lahko normalno funkcioniralo znotraj želenih parametrov.

==='''Nastavljivi elementi v genskih vezjih'''===
Enkrat, ko se ugotovi razlog za neuspeh, se morajo narediti spremembe v vezju. Komponente je mogoče treba zamenjati, zaradi toksičnih učinkov njihovega izražanja, ali mogoče zaradi neustreznega dinamičnega območja njihovega izhodnega signala. Če je komponenta del velike ortogonalne zbirke, jo lahko zamenjamo z bolj ustrezno varianto. Ojačevalce signala lahko uporabimo v primeru, da hočemo popraviti signal komponente navzgor. Drugače obnašanje posameznih komponent lahko popravimo s spremembo jakosti promotorjev ali RBS, stopnje razgradnje genskih produktov ali števila posameznih komponent.

==='''Strategije za odpravljanje napak'''===
Ena izmed najbolj uporabljanih strategij za fino nastavljanje delovanja genskih vezij, je uporaba BioBrick standardov. Medtem, ko je uvajanje mutacij v komponente tekom začetnega sestavljanja enostavno, enkrat, ko so deli povezani v večje module, nadaljnje spreminjanje posameznih komponent ni več možno. Za ponovno uvajanje variacij se moramo vrniti na korak, ko smo dodajali posamezne komponente ali uporabimo nekatero izmed metod, ki temeljijo na PCR. SLIC, Gibsonovo sestavljanje, CPEC in SLiCE so metode zasnovane na PCR, ki predstavljajo dobro alternativo sestavljanju preko linkerjev, ker se z njimi izognemo nastanku »brazgotin«, ki lahko vplivajo na funkcionalnost vezja.
MAGE je zelo močno orodje za uvajanje variacij po predhodnem sestavljanju komponent. Metoda temelji na uporabi različnih ssDNA oligonukleotidov, s katerimi preko λ-Red rekombinaze uvedemo mutacije na ustreznih mestih.

==ZAKLJUČEK==
Po skoraj 15 letih pospešenega napredovanja, sintezna biologija je prišla do stopnje, kjer je na razpolago veliko orodij in osnovnih gradnikov za inženiring genskih vezij. Veliki napredek je ostvarjen tudi na polju ortogonalnosti in modularnosti gradnikov, kar omogoča bolj predvidljivo in robustno načrtovanje kompleksnih genskih vezij. Gradniki, ki temeljijo na RNA, bodo najverjetneje imeli glavno vlogo pri nadaljnji sofistikaciji genskih vezij, zaradi svoje enostavne programabilnosti in ker njihovi termodinamski modeli zelo dobro napovejo obnašanje v genskih vezjih.
Čeprav zelo dinamično in nedefinirano okolje gostitelja pogosto ovira normalno delovanje genskih vezij, strategije, ki temeljijo na uporabi izoliranih delov in racionalnem iskanju optimalnih parametrov bodo zmanjšale čas potreben za izgradnjo kompleksnih vezij. Variacije, ki so posledica interakcij z gostiteljskim metabolizmom, bi se še lahko dodatno znižale z uporabo sevov z reduciranimi genomi.

==VIR==
R. W. Bradley, ''et al''., Tools and Principles for Microbial Gene Circuit Engineering, J. Mol. Biol. (2015).

Orodja in načela za inženiring genskih vezij mikroorganizmov

2016-01-18T08:41:13Z

MarkoRadojkovic:

==UVOD==
Sintezni biologi skozi racionalno načrtovanje in napredno inženirstvo stremijo k ustvarjanju novih genskih vezij, ki bi imela široko uporabnost. Imajoči v mislih kompleksnost procesiranja signalov, ki se pojavljajo v naravnih bioloških sistemih, inženirski mikroorganizmi imajo potencial za opravljanje številnih koristnih nalog, ki zahtevajo sofisticirano računalniško vodenje in kontrolo.
Ta članek predstavlja pregled vsestranskih komponent in orodij, ki so trenutno dostopna za inženiring genskih vezij v mikroorganizmih, vključno z nedavno razvitimi RNA orodji, ki vsebujejo zelo široko dinamično območje in se lahko programirajo. Seznanili se bomo z oblikovalnimi načeli, ki omogočajo robustno in razširljivo delovanje vezij, prav tako pa bomo pogledali nekatere efikasne strategije za hitro identifikacijo in popravljanje napak ter fino nastavljanje lastnosti vezij.

==ORODJA ZA INŽENIRING RNA==
Transkripcija je verjetno najpomembnejša kontrolna točka v genskih vezjih, ker zagotavlja celovito regulacijo izražanja vseh komponent. Kontrolni elementi se lažje sestavljajo na nivoju DNA, s čimer se izognemo težavam, ki lahko nastanejo kot posledica sekundarnih struktur molekul mRNA.

===Vezava RNA===
Nukleotidno zaporedje promotorja, na katero se veže RNA-pomieraza (RNAP), je temeljna determinanta hitrosti transkripcije. Do vezave pride preko σ70- tipa faktorjev na -10 in -35 mesto od začetka transkripcije, kar hkrati določa samo specifičnost iniciacijskega mesta, medtem ko se C-končna domena α podenote preferenčno veže na kratko zaporedje ponovitev A in T baz, 30 mest navzgor od -35 mesta (UP element) in s tem določa jakost promotorja. Raziskave vpliva UP elementov na jakost promotorja so pokazale, da se vpliv le-teh na jakost promotorja z višanjem koncentracije RNAP zmanjšuje in obratno. Zaporedje navzdol od začetka transkripcije prav tako lahko vpliva na potek transkripcije same, vendar se z uporabo standardnih 5'-neprevajajočih se regij (UTR), temu vplivu lahko izognemo. Knjižnice promotorjev s širokim razponom jakosti predstavljajo dragoceno zbirko, ki jih biološki inženirji s pridom izkoriščajo in jo bodo izkoriščali, dokler se ne pojavijo popolni napovedni modeli.

===Proteinski regulatorji transkripcije===

Aktivatorji

Klasični aktivatorji, ki jih uporabljamo pri oblikovanj genskih vezij, kot je LuxR, delujejo na ta način, da stabilizirajo vezavo RNAP na promotor. Rhodius in kolegi so izkoristili ekstracitoplazmične funkcijske σ faktorje (ECFs) za izgradnjo največje knjižnice ortogonalnih transkripcijskih regulatorjev za E. coli, pri čemer so našli 20 parov ECFs in sorodnih promotorjev, ki imajo zelo nizko navzkrižno reaktivnost. Ti proteini se vežejo na regije -35 in -10 in s tem določajo specifičnost vezave RNAP na določen promotor. Ostali transkripcijski aktivatorji, ki so koristni za uporabo v E.coli vključujejo tri šaperon-aktivatorske pare (ki se lahko izkoristijo za AND logiko), fagne transkripcijske aktivatorje ter HrpRS bakterijske ojačevalne proteine.

Represorji

Represorji najpogosteje delujejo na ta način, da RNAP onemogočijo dostop do promotorja. Stanton in sodelavci so ustvarili knjižnico homologov TetR in njihovih naravnih operatorjev, ki vsebuje 16 ortogonalnih variant. Obstaja tudi manjša knjižnica variant represorja LacI. Zelo zanimivo družino represorskih proteinov predstavljajo transkripcijskim aktivatorjem podobni efektorji (TALEs). TALE represorji se lažje modelirajo v primerjavi s proteini s cinkovimi prsti in se lahko uporabljajo za kontrolo več kompleksnih genov. Pokazali so da z njimi lahko dosežemo do 100-kratno znižanje ravni izražanja v E.coli.

==='''RNA kontrola transkripcije'''===
Lep primer kontrole transkripcije z RNA predstavlja pT181 transkripcijski atenuacijski sistem, katerega različice so razvite za kontrolo genskih vezij v E.coli. Naravni pT181 mehanizem koristi 5'- UTR zanko, ki normalno omogoča elongacijo transkripcije; interakcija med zanko na taRNA z 5'-UTR zanko na mRNA promovira nastanek steblo-zanka strukture, ki povzroči terminacijo transkripcije.
Majhne RNA molekule, ki aktivirajo transkripcijo (STARs), so dizajnirane da porušijo strukturo terminatorja, bodisi preko vezave na zanko, ki se nahaja v zaporedju navzgor ali preko direktne vezave na terminator. Ta pozitivna regulacija sistema pT181 omogoča zelo visoko dinamično območje (94-kratno), v primerjavi s klasičnimi represorji in je prav tako uporabna za izgradnjo večplastnih logičnih vrat.

==ORODJA ZA INŽENIRING IZRAŽANJA PROTEINOV==

===Ortogonalni ribosomi===
Vezava ribosoma na molekulo mRNA je posledica prepoznavanja in baznega parjenja med RBS in anti-Shine-Dalgarno zaporedjem, ki je zapisano v 16S rRNA. To lastnost so izkoristili za ustvarjanje treh dodatnih ortogonalnih ribosomov z modificirano 16S rRNA, ki inicira traslacijo samo na mRNA s sorodnim RBS. Transkripcija obeh ortogonalnih rRNA ter mRNA je potrebna za izražanje tarčnega gena, s čimer dobimo AND logična vrata.

==='''RNA stikala'''===
Z RNA stikali lahko vplivamo na translacijo preko od liganda odvisne spremembe konformacije 5'-UTR regije mRNA, s čemer otežimo dostop do RBS. Sharma in sodelavci so pokazali da RNA stikala lahko kombiniramo za izgradnjo AND in NAND logičnih vrat. Od temperature odvisni RNA regulatorji prav tako delujejo preko kontrole dostopnosti RBS za vezavo ribosoma.

==='''taRNA kontrola translacije'''===

taRNA-represija

Mehanizem inhibicije translacije z majhnimi RNA molekulami (sRNAs) je konceptualno preprost, zaradi česar je tudi izvajanje same metode relativno enostavno: sRNA vsebuje zaporedje komplementarno tarčni mRNA in se veže na RBS ali na zaporedje navzdol ter na ta način prepreči vezavo ribosoma. Vezavna energija sRNA-mRNA je korelirana z jakostjo inhibicije.

taRNA-aktivacija

Green in sodelavci so pred kratkim opisali razvoj RNA-stikal tipa »toehold«, oziroma zank, ki onemogočajo normalen potek translacije. Aktivacija translacije poteka preko vezave »sprožilne« RNA, ki se veže na zaporedje navzgor od zanke in ji spremeni strukturo. Najbolj učinkovita tovrstna stikala zajemajo kar 600-kratno dinamično območje, kar je za red velikosti bolje od ostalih taRNA kontrolnih mehanizmov.

==MODULARNOST IN ORTOGONALNOST==
Modularnost predstavlja kvaliteto konzistentnosti funkcije v številnih pogojih in kontekstih in je en izmed temeljnih pogojev za napovedni dizajn genskih vezij. Ortogonalnost zagotavlja da elementi in moduli ne bodo izražali neželene interakcije z drugimi elementi v inženirskih bioloških sistemih, prav tako pa tudi ne z genskim ozadjem gostitelja. Zato sta ti dve lastnosti nepogrešljivi pri načrtovanju kompleksnih genskih vezij.

==='''Fizična kompozicija'''===
Sinteznobiološki elementi so lahko občutljivi na spremembe v robnih zaporedjih, ki jih obkrožajo. Iz analize 12,563 kombinacij promotorjev in RBS, Kosuri in sodelavci so odkrili, da se približno 17 % vseh variacij v ravni izražanja proteinov ne more napovedati iz jakosti promotorjev, oziroma RBS. Mutalik in sodelavci so ugotovili, da spoji promotor: UTR in UTR: tarčni gen (GOI) v znatni meri vplivajo na variabilnost v izražanju genov in so naredili operacijsko enoto izražanja (EOU). Uporaba EOU omogoča veliko konzistentnost v nivojih izražanja tarčnih genov, ko menjavamo različne promotorje in RBS, kar ima veliko napovedno moč pri oblikovanju novih genskih vezij in finem usklajevanju ravni izražanja proteinov.

==='''Vpliv gostitelja'''===
Cardinale in sodelavci so iz analize velikega števila sevov E.coli ugotovili, da sta dostopnost ribosomov in hitrost rasti ključne determinante za učinkovitost genskih vezij. Ugotovili so tudi, da specifične delecije gostiteljskih genov imajo lahko veliki vpliv na genska vezja. Te mutacije posredno vplivajo na učinkovitost vezja preko sprememb v fluksu ogljikovega in dušikovega metabolizma. Komplementarni pristop spreminjanja gostiteljskega genetskega (in metabolnega) ozadja preko dodajanja določenih genov, lahko pozitivno vpliva na učinkovitost vezja.

==='''Robustnost in genetska stabilnost'''===
Robustna genska vezja vzdržujejo svojo učinkovitost skozi čas in v različnih pogojih – prilagajajo se spremembam, kot je različna hitrost rasti ali dostopnost transkripcijskih faktorjev, in pogosto imajo zelo visoko razmerje signal-šum. Genska vezja, ki so prilagodljiva in ne predstavljajo preveliko breme za gostitelja, sta tudi bolj robustna s stališča genetske stabilnosti. Zaželeno je, da so vezja ortogonalna, in da ne interreagirajo z gostiteljem, s čimer se tudi povečuje robustnost. V primeru, da se medsebojni interakciji ne moremo izogniti, gensko vezje lahko preoblikujemo tako, da dinamično uravnava svojo ekspresijo kot odgovor na povečani stres, ki ga povzroča gostitelju.

==POPRAVLJANJE NAPAK IN FINA NASTAVITEV GENSKIH VEZIJ==
Brez popolnoma napovednih zmogljivosti, načrtovanje genskih vezij neizogibno zahteva stopnje popravljanja napak ter fine nastavitve. Razlogi za neuspeh se najprej morajo identificirati, da bi vezje lahko normalno funkcioniralo znotraj želenih parametrov.

==='''Nastavljivi elementi v genskih vezjih'''===
Enkrat, ko se ugotovi razlog za neuspeh, se morajo narediti spremembe v vezju. Komponente je mogoče treba zamenjati, zaradi toksičnih učinkov njihovega izražanja, ali mogoče zaradi neustreznega dinamičnega območja njihovega izhodnega signala. Če je komponenta del velike ortogonalne zbirke, jo lahko zamenjamo z bolj ustrezno varianto. Ojačevalce signala lahko uporabimo v primeru, da hočemo popraviti signal komponente navzgor. Drugače obnašanje posameznih komponent lahko popravimo s spremembo jakosti promotorjev ali RBS, stopnje razgradnje genskih produktov ali števila posameznih komponent.

==='''Strategije za odpravljanje napak'''===
Ena izmed najbolj uporabljanih strategij za fino nastavljanje delovanja genskih vezij, je uporaba BioBrick standardov. Medtem, ko je uvajanje mutacij v komponente tekom začetnega sestavljanja enostavno, enkrat, ko so deli povezani v večje module, nadaljnje spreminjanje posameznih komponent ni več možno. Za ponovno uvajanje variacij se moramo vrniti na korak, ko smo dodajali posamezne komponente ali uporabimo nekatero izmed metod, ki temeljijo na PCR. SLIC, Gibsonovo sestavljanje, CPEC in SLiCE so metode zasnovane na PCR, ki predstavljajo dobro alternativo sestavljanju preko linkerjev, ker se z njimi izognemo nastanku »brazgotin«, ki lahko vplivajo na funkcionalnost vezja.
MAGE je zelo močno orodje za uvajanje variacij po predhodnem sestavljanju komponent. Metoda temelji na uporabi različnih ssDNA oligonukleotidov, s katerimi preko λ-Red rekombinaze uvedemo mutacije na ustreznih mestih.

==ZAKLJUČEK==
Po skoraj 15 letih pospešenega napredovanja, sintezna biologija je prišla do stopnje, kjer je na razpolago veliko orodij in osnovnih gradnikov za inženiring genskih vezij. Veliki napredek je ostvarjen tudi na polju ortogonalnosti in modularnosti gradnikov, kar omogoča bolj predvidljivo in robustno načrtovanje kompleksnih genskih vezij. Gradniki, ki temeljijo na RNA, bodo najverjetneje imeli glavno vlogo pri nadaljnji sofistikaciji genskih vezij, zaradi svoje enostavne programabilnosti in ker njihovi termodinamski modeli zelo dobro napovejo obnašanje v genskih vezjih.
Čeprav zelo dinamično in nedefinirano okolje gostitelja pogosto ovira normalno delovanje genskih vezij, strategije, ki temeljijo na uporabi izoliranih delov in racionalnem iskanju optimalnih parametrov bodo zmanjšale čas potreben za izgradnjo kompleksnih vezij. Variacije, ki so posledica interakcij z gostiteljskim metabolizmom, bi se še lahko znižale z uporabo sevov z reduciranimi genomi.

==VIR==
R. W. Bradley, ''et al''., Tools and Principles for Microbial Gene Circuit Engineering, J. Mol. Biol. (2015).

Orodja in načela za inženiring genskih vezij mikroorganizmov

2016-01-18T08:38:16Z

MarkoRadojkovic:

==UVOD==
Sintezni biologi skozi racionalno načrtovanje in napredno inženirstvo stremijo k ustvarjanju novih genskih vezij, ki bi imela široko uporabnost. Imajoči v mislih kompleksnost procesiranja signalov, ki se pojavljajo v naravnih bioloških sistemih, inženirski mikroorganizmi imajo potencial za opravljanje številnih koristnih nalog, ki zahtevajo sofisticirano računalniško vodenje in kontrolo.
Ta članek predstavlja pregled vsestranskih komponent in orodij, ki so trenutno dostopna za inženiring genskih vezij v mikroorganizmih, vključno z nedavno razvitimi RNA orodji, ki vsebujejo zelo široko dinamično območje in se lahko programirajo. Seznanili se bomo z oblikovalnimi načeli, ki omogočajo robustno in razširljivo delovanje vezij, prav tako pa bomo pogledali nekatere efikasne strategije za hitro identifikacijo in popravljanje napak ter fino nastavljanje lastnosti vezij.

==ORODJA ZA INŽENIRING RNA==
Transkripcija je verjetno najpomembnejša kontrolna točka v genskih vezjih, ker zagotavlja celovito regulacijo izražanja vseh komponent. Kontrolni elementi se lažje sestavljajo na nivoju DNA, s čimer se izognemo težavam, ki lahko nastanejo kot posledica sekundarnih struktur molekul mRNA.

===Vezava RNA===
Nukleotidno zaporedje promotorja, na katero se veže RNA-pomieraza (RNAP), je temeljna determinanta hitrosti transkripcije. Do vezave pride preko σ70- tipa faktorjev na -10 in -35 mesto od začetka transkripcije, kar hkrati določa samo specifičnost iniciacijskega mesta, medtem ko se C-končna domena α podenote preferenčno veže na kratko zaporedje ponovitev A in T baz, 30 mest navzgor od -35 mesta (UP element) in s tem določa jakost promotorja. Raziskave vpliva UP elementov na jakost promotorja so pokazale, da se vpliv le-teh na jakost promotorja z višanjem koncentracije RNAP zmanjšuje in obratno. Zaporedje navzdol od začetka transkripcije prav tako lahko vpliva na potek transkripcije same, vendar se z uporabo standardnih 5'-neprevajajočih se regij (UTR), temu vplivu lahko izognemo. Knjižnice promotorjev s širokim razponom jakosti predstavljajo dragoceno zbirko, ki jih biološki inženirji s pridom izkoriščajo in jo bodo izkoriščali, dokler se ne pojavijo popolni napovedni modeli.

===Proteinski regulatorji transkripcije===

'''Aktivatorji'''

Klasični aktivatorji, ki jih uporabljamo pri oblikovanj genskih vezij, kot je LuxR, delujejo na ta način, da stabilizirajo vezavo RNAP na promotor. Rhodius in kolegi so izkoristili ekstracitoplazmične funkcijske σ faktorje (ECFs) za izgradnjo največje knjižnice ortogonalnih transkripcijskih regulatorjev za E. coli, pri čemer so našli 20 parov ECFs in sorodnih promotorjev, ki imajo zelo nizko navzkrižno reaktivnost. Ti proteini se vežejo na regije -35 in -10 in s tem določajo specifičnost vezave RNAP na določen promotor. Ostali transkripcijski aktivatorji, ki so koristni za uporabo v E.coli vključujejo tri šaperon-aktivatorske pare (ki se lahko izkoristijo za AND logiko), fagne transkripcijske aktivatorje ter HrpRS bakterijske ojačevalne proteine.

'''Represorji'''

Represorji najpogosteje delujejo na ta način, da RNAP onemogočijo dostop do promotorja. Stanton in sodelavci so ustvarili knjižnico homologov TetR in njihovih naravnih operatorjev, ki vsebuje 16 ortogonalnih variant. Obstaja tudi manjša knjižnica variant represorja LacI. Zelo zanimivo družino represorskih proteinov predstavljajo transkripcijskim aktivatorjem podobni efektorji (TALEs). TALE represorji se lažje modelirajo v primerjavi s proteini s cinkovimi prsti in se lahko uporabljajo za kontrolo več kompleksnih genov. Pokazali so da z njimi lahko dosežemo do 100-kratno znižanje ravni izražanja v E.coli.

==='''RNA kontrola transkripcije'''===
Lep primer kontrole transkripcije z RNA predstavlja pT181 transkripcijski atenuacijski sistem, katerega različice so razvite za kontrolo genskih vezij v E.coli. Naravni pT181 mehanizem koristi 5'- UTR zanko, ki normalno omogoča elongacijo transkripcije; interakcija med zanko na taRNA z 5'-UTR zanko na mRNA promovira nastanek steblo-zanka strukture, ki povzroči terminacijo transkripcije.
Majhne RNA molekule, ki aktivirajo transkripcijo (STARs), so dizajnirane da porušijo strukturo terminatorja, bodisi preko vezave na zanko, ki se nahaja v zaporedju navzgor ali preko direktne vezave na terminator. Ta pozitivna regulacija sistema pT181 omogoča zelo visoko dinamično območje (94-kratno), v primerjavi s klasičnimi represorji in je prav tako uporabna za izgradnjo večplastnih logičnih vrat.

==ORODJA ZA INŽENIRING IZRAŽANJA PROTEINOV==

==='''Ortogonalni ribosomi'''===
Vezava ribosoma na molekulo mRNA je posledica prepoznavanja in baznega parjenja med RBS in anti-Shine-Dalgarno zaporedjem, ki je zapisano v 16S rRNA. To lastnost so izkoristili za ustvarjanje treh dodatnih ortogonalnih ribosomov z modificirano 16S rRNA, ki inicira traslacijo samo na mRNA s sorodnim RBS. Transkripcija obeh ortogonalnih rRNA ter mRNA je potrebna za izražanje tarčnega gena, s čimer dobimo AND logična vrata.

==='''RNA stikala'''===
Z RNA stikali lahko vplivamo na translacijo preko od liganda odvisne spremembe konformacije 5'-UTR regije mRNA, s čemer otežimo dostop do RBS. Sharma in sodelavci so pokazali da RNA stikala lahko kombiniramo za izgradnjo AND in NAND logičnih vrat. Od temperature odvisni RNA regulatorji prav tako delujejo preko kontrole dostopnosti RBS za vezavo ribosoma.

==='''taRNA kontrola translacije'''===

'''taRNA-represija'''

Mehanizem inhibicije translacije z majhnimi RNA molekulami (sRNAs) je konceptualno preprost, zaradi česar je tudi izvajanje same metode relativno enostavno: sRNA vsebuje zaporedje komplementarno tarčni mRNA in se veže na RBS ali na zaporedje navzdol ter na ta način prepreči vezavo ribosoma. Vezavna energija sRNA-mRNA je korelirana z jakostjo inhibicije.

'''taRNA-aktivacija'''

Green in sodelavci so pred kratkim opisali razvoj RNA-stikal tipa »toehold«, oziroma zank, ki onemogočajo normalen potek translacije. Aktivacija translacije poteka preko vezave »sprožilne« RNA, ki se veže na zaporedje navzgor od zanke in ji spremeni strukturo. Najbolj učinkovita tovrstna stikala zajemajo kar 600-kratno dinamično območje, kar je za red velikosti bolje od ostalih taRNA kontrolnih mehanizmov.

==MODULARNOST IN ORTOGONALNOST==
Modularnost predstavlja kvaliteto konzistentnosti funkcije v številnih pogojih in kontekstih in je en izmed temeljnih pogojev za napovedni dizajn genskih vezij. Ortogonalnost zagotavlja da elementi in moduli ne bodo izražali neželene interakcije z drugimi elementi v inženirskih bioloških sistemih, prav tako pa tudi ne z genskim ozadjem gostitelja. Zato sta ti dve lastnosti nepogrešljivi pri načrtovanju kompleksnih genskih vezij.

==='''Fizična kompozicija'''===
Sinteznobiološki elementi so lahko občutljivi na spremembe v robnih zaporedjih, ki jih obkrožajo. Iz analize 12,563 kombinacij promotorjev in RBS, Kosuri in sodelavci so odkrili, da se približno 17 % vseh variacij v ravni izražanja proteinov ne more napovedati iz jakosti promotorjev, oziroma RBS. Mutalik in sodelavci so ugotovili, da spoji promotor: UTR in UTR: tarčni gen (GOI) v znatni meri vplivajo na variabilnost v izražanju genov in so naredili operacijsko enoto izražanja (EOU). Uporaba EOU omogoča veliko konzistentnost v nivojih izražanja tarčnih genov, ko menjavamo različne promotorje in RBS, kar ima veliko napovedno moč pri oblikovanju novih genskih vezij in finem usklajevanju ravni izražanja proteinov.

==='''Vpliv gostitelja'''===
Cardinale in sodelavci so iz analize velikega števila sevov E.coli ugotovili, da sta dostopnost ribosomov in hitrost rasti ključne determinante za učinkovitost genskih vezij. Ugotovili so tudi, da specifične delecije gostiteljskih genov imajo lahko veliki vpliv na genska vezja. Te mutacije posredno vplivajo na učinkovitost vezja preko sprememb v fluksu ogljikovega in dušikovega metabolizma. Komplementarni pristop spreminjanja gostiteljskega genetskega (in metabolnega) ozadja preko dodajanja določenih genov, lahko pozitivno vpliva na učinkovitost vezja.

==='''Robustnost in genetska stabilnost'''===
Robustna genska vezja vzdržujejo svojo učinkovitost skozi čas in v različnih pogojih – prilagajajo se spremembam, kot je različna hitrost rasti ali dostopnost transkripcijskih faktorjev, in pogosto imajo zelo visoko razmerje signal-šum. Genska vezja, ki so prilagodljiva in ne predstavljajo preveliko breme za gostitelja, sta tudi bolj robustna s stališča genetske stabilnosti. Zaželeno je, da so vezja ortogonalna, in da ne interreagirajo z gostiteljem, s čimer se tudi povečuje robustnost. V primeru, da se medsebojni interakciji ne moremo izogniti, gensko vezje lahko preoblikujemo tako, da dinamično uravnava svojo ekspresijo kot odgovor na povečani stres, ki ga povzroča gostitelju.

==POPRAVLJANJE NAPAK IN FINA NASTAVITEV GENSKIH VEZIJ==
Brez popolnoma napovednih zmogljivosti, načrtovanje genskih vezij neizogibno zahteva stopnje popravljanja napak ter fine nastavitve. Razlogi za neuspeh se najprej morajo identificirati, da bi vezje lahko normalno funkcioniralo znotraj želenih parametrov.

==='''Nastavljivi elementi v genskih vezjih'''===
Enkrat, ko se ugotovi razlog za neuspeh, se morajo narediti spremembe v vezju. Komponente je mogoče treba zamenjati, zaradi toksičnih učinkov njihovega izražanja, ali mogoče zaradi neustreznega dinamičnega območja njihovega izhodnega signala. Če je komponenta del velike ortogonalne zbirke, jo lahko zamenjamo z bolj ustrezno varianto. Ojačevalce signala lahko uporabimo v primeru, da hočemo popraviti signal komponente navzgor. Drugače obnašanje posameznih komponent lahko popravimo s spremembo jakosti promotorjev ali RBS, stopnje razgradnje genskih produktov ali števila posameznih komponent.

==='''Strategije za odpravljanje napak'''===
Ena izmed najbolj uporabljanih strategij za fino nastavljanje delovanja genskih vezij, je uporaba BioBrick standardov. Medtem, ko je uvajanje mutacij v komponente tekom začetnega sestavljanja enostavno, enkrat, ko so deli povezani v večje module, nadaljnje spreminjanje posameznih komponent ni več možno. Za ponovno uvajanje variacij se moramo vrniti na korak, ko smo dodajali posamezne komponente ali uporabimo nekatero izmed metod, ki temeljijo na PCR. SLIC, Gibsonovo sestavljanje, CPEC in SLiCE so metode zasnovane na PCR, ki predstavljajo dobro alternativo sestavljanju preko linkerjev, ker se z njimi izognemo nastanku »brazgotin«, ki lahko vplivajo na funkcionalnost vezja.
MAGE je zelo močno orodje za uvajanje variacij po predhodnem sestavljanju komponent. Metoda temelji na uporabi različnih ssDNA oligonukleotidov, s katerimi preko λ-Red rekombinaze uvedemo mutacije na ustreznih mestih.

==ZAKLJUČEK==
Po skoraj 15 letih pospešenega napredovanja, sintezna biologija je prišla do stopnje, kjer je na razpolago veliko orodij in osnovnih gradnikov za inženiring genskih vezij. Veliki napredek je ostvarjen tudi na polju ortogonalnosti in modularnosti gradnikov, kar omogoča bolj predvidljivo in robustno načrtovanje kompleksnih genskih vezij. Gradniki, ki temeljijo na RNA, bodo najverjetneje imeli glavno vlogo pri nadaljnji sofistikaciji genskih vezij, zaradi svoje enostavne programabilnosti in ker njihovi termodinamski modeli zelo dobro napovejo obnašanje v genskih vezjih.
Čeprav zelo dinamično in nedefinirano okolje gostitelja pogosto ovira normalno delovanje genskih vezij, strategije, ki temeljijo na uporabi izoliranih delov in racionalnem iskanju optimalnih parametrov bodo zmanjšale čas potreben za izgradnjo kompleksnih vezij. Variacije, ki so posledica interakcij z gostiteljskim metabolizmom, bi se še lahko znižale z uporabo sevov z reduciranimi genomi.

==VIR==
R. W. Bradley, ''et al''., Tools and Principles for Microbial Gene Circuit Engineering, J. Mol. Biol. (2015).

Orodja in načela za inženiring genskih vezij mikroorganizmov

2016-01-18T08:35:48Z

MarkoRadojkovic:

=='''UVOD'''==
Sintezni biologi skozi racionalno načrtovanje in napredno inženirstvo stremijo k ustvarjanju novih genskih vezij, ki bi imela široko uporabnost. Imajoči v mislih kompleksnost procesiranja signalov, ki se pojavljajo v naravnih bioloških sistemih, inženirski mikroorganizmi imajo potencial za opravljanje številnih koristnih nalog, ki zahtevajo sofisticirano računalniško vodenje in kontrolo.
Ta članek predstavlja pregled vsestranskih komponent in orodij, ki so trenutno dostopna za inženiring genskih vezij v mikroorganizmih, vključno z nedavno razvitimi RNA orodji, ki vsebujejo zelo široko dinamično območje in se lahko programirajo. Seznanili se bomo z oblikovalnimi načeli, ki omogočajo robustno in razširljivo delovanje vezij, prav tako pa bomo pogledali nekatere efikasne strategije za hitro identifikacijo in popravljanje napak ter fino nastavljanje lastnosti vezij.

=='''ORODJA ZA INŽENIRING RNA'''==
Transkripcija je verjetno najpomembnejša kontrolna točka v genskih vezjih, ker zagotavlja celovito regulacijo izražanja vseh komponent. Kontrolni elementi se lažje sestavljajo na nivoju DNA, s čimer se izognemo težavam, ki lahko nastanejo kot posledica sekundarnih struktur molekul mRNA.

===Vezava RNA===
Nukleotidno zaporedje promotorja, na katero se veže RNA-pomieraza (RNAP), je temeljna determinanta hitrosti transkripcije. Do vezave pride preko σ70- tipa faktorjev na -10 in -35 mesto od začetka transkripcije, kar hkrati določa samo specifičnost iniciacijskega mesta, medtem ko se C-končna domena α podenote preferenčno veže na kratko zaporedje ponovitev A in T baz, 30 mest navzgor od -35 mesta (UP element) in s tem določa jakost promotorja. Raziskave vpliva UP elementov na jakost promotorja so pokazale, da se vpliv le-teh na jakost promotorja z višanjem koncentracije RNAP zmanjšuje in obratno. Zaporedje navzdol od začetka transkripcije prav tako lahko vpliva na potek transkripcije same, vendar se z uporabo standardnih 5'-neprevajajočih se regij (UTR), temu vplivu lahko izognemo. Knjižnice promotorjev s širokim razponom jakosti predstavljajo dragoceno zbirko, ki jih biološki inženirji s pridom izkoriščajo in jo bodo izkoriščali, dokler se ne pojavijo popolni napovedni modeli.

===Proteinski regulatorji transkripcije===

'''Aktivatorji'''

Klasični aktivatorji, ki jih uporabljamo pri oblikovanj genskih vezij, kot je LuxR, delujejo na ta način, da stabilizirajo vezavo RNAP na promotor. Rhodius in kolegi so izkoristili ekstracitoplazmične funkcijske σ faktorje (ECFs) za izgradnjo največje knjižnice ortogonalnih transkripcijskih regulatorjev za E. coli, pri čemer so našli 20 parov ECFs in sorodnih promotorjev, ki imajo zelo nizko navzkrižno reaktivnost. Ti proteini se vežejo na regije -35 in -10 in s tem določajo specifičnost vezave RNAP na določen promotor. Ostali transkripcijski aktivatorji, ki so koristni za uporabo v E.coli vključujejo tri šaperon-aktivatorske pare (ki se lahko izkoristijo za AND logiko), fagne transkripcijske aktivatorje ter HrpRS bakterijske ojačevalne proteine.

'''Represorji'''

Represorji najpogosteje delujejo na ta način, da RNAP onemogočijo dostop do promotorja. Stanton in sodelavci so ustvarili knjižnico homologov TetR in njihovih naravnih operatorjev, ki vsebuje 16 ortogonalnih variant. Obstaja tudi manjša knjižnica variant represorja LacI. Zelo zanimivo družino represorskih proteinov predstavljajo transkripcijskim aktivatorjem podobni efektorji (TALEs). TALE represorji se lažje modelirajo v primerjavi s proteini s cinkovimi prsti in se lahko uporabljajo za kontrolo več kompleksnih genov. Pokazali so da z njimi lahko dosežemo do 100-kratno znižanje ravni izražanja v E.coli.

==='''RNA kontrola transkripcije'''===
Lep primer kontrole transkripcije z RNA predstavlja pT181 transkripcijski atenuacijski sistem, katerega različice so razvite za kontrolo genskih vezij v E.coli. Naravni pT181 mehanizem koristi 5'- UTR zanko, ki normalno omogoča elongacijo transkripcije; interakcija med zanko na taRNA z 5'-UTR zanko na mRNA promovira nastanek steblo-zanka strukture, ki povzroči terminacijo transkripcije.
Majhne RNA molekule, ki aktivirajo transkripcijo (STARs), so dizajnirane da porušijo strukturo terminatorja, bodisi preko vezave na zanko, ki se nahaja v zaporedju navzgor ali preko direktne vezave na terminator. Ta pozitivna regulacija sistema pT181 omogoča zelo visoko dinamično območje (94-kratno), v primerjavi s klasičnimi represorji in je prav tako uporabna za izgradnjo večplastnih logičnih vrat.

=='''ORODJA ZA INŽENIRING IZRAŽANJA PROTEINOV'''==

==='''Ortogonalni ribosomi'''===
Vezava ribosoma na molekulo mRNA je posledica prepoznavanja in baznega parjenja med RBS in anti-Shine-Dalgarno zaporedjem, ki je zapisano v 16S rRNA. To lastnost so izkoristili za ustvarjanje treh dodatnih ortogonalnih ribosomov z modificirano 16S rRNA, ki inicira traslacijo samo na mRNA s sorodnim RBS. Transkripcija obeh ortogonalnih rRNA ter mRNA je potrebna za izražanje tarčnega gena, s čimer dobimo AND logična vrata.

==='''RNA stikala'''===
Z RNA stikali lahko vplivamo na translacijo preko od liganda odvisne spremembe konformacije 5'-UTR regije mRNA, s čemer otežimo dostop do RBS. Sharma in sodelavci so pokazali da RNA stikala lahko kombiniramo za izgradnjo AND in NAND logičnih vrat. Od temperature odvisni RNA regulatorji prav tako delujejo preko kontrole dostopnosti RBS za vezavo ribosoma.

==='''taRNA kontrola translacije'''===

'''taRNA-represija'''

Mehanizem inhibicije translacije z majhnimi RNA molekulami (sRNAs) je konceptualno preprost, zaradi česar je tudi izvajanje same metode relativno enostavno: sRNA vsebuje zaporedje komplementarno tarčni mRNA in se veže na RBS ali na zaporedje navzdol ter na ta način prepreči vezavo ribosoma. Vezavna energija sRNA-mRNA je korelirana z jakostjo inhibicije.

'''taRNA-aktivacija'''

Green in sodelavci so pred kratkim opisali razvoj RNA-stikal tipa »toehold«, oziroma zank, ki onemogočajo normalen potek translacije. Aktivacija translacije poteka preko vezave »sprožilne« RNA, ki se veže na zaporedje navzgor od zanke in ji spremeni strukturo. Najbolj učinkovita tovrstna stikala zajemajo kar 600-kratno dinamično območje, kar je za red velikosti bolje od ostalih taRNA kontrolnih mehanizmov.

=='''MODULARNOST IN ORTOGONALNOST'''==
Modularnost predstavlja kvaliteto konzistentnosti funkcije v številnih pogojih in kontekstih in je en izmed temeljnih pogojev za napovedni dizajn genskih vezij. Ortogonalnost zagotavlja da elementi in moduli ne bodo izražali neželene interakcije z drugimi elementi v inženirskih bioloških sistemih, prav tako pa tudi ne z genskim ozadjem gostitelja. Zato sta ti dve lastnosti nepogrešljivi pri načrtovanju kompleksnih genskih vezij.

==='''Fizična kompozicija'''===
Sinteznobiološki elementi so lahko občutljivi na spremembe v robnih zaporedjih, ki jih obkrožajo. Iz analize 12,563 kombinacij promotorjev in RBS, Kosuri in sodelavci so odkrili, da se približno 17 % vseh variacij v ravni izražanja proteinov ne more napovedati iz jakosti promotorjev, oziroma RBS. Mutalik in sodelavci so ugotovili, da spoji promotor: UTR in UTR: tarčni gen (GOI) v znatni meri vplivajo na variabilnost v izražanju genov in so naredili operacijsko enoto izražanja (EOU). Uporaba EOU omogoča veliko konzistentnost v nivojih izražanja tarčnih genov, ko menjavamo različne promotorje in RBS, kar ima veliko napovedno moč pri oblikovanju novih genskih vezij in finem usklajevanju ravni izražanja proteinov.

==='''Vpliv gostitelja'''===
Cardinale in sodelavci so iz analize velikega števila sevov E.coli ugotovili, da sta dostopnost ribosomov in hitrost rasti ključne determinante za učinkovitost genskih vezij. Ugotovili so tudi, da specifične delecije gostiteljskih genov imajo lahko veliki vpliv na genska vezja. Te mutacije posredno vplivajo na učinkovitost vezja preko sprememb v fluksu ogljikovega in dušikovega metabolizma. Komplementarni pristop spreminjanja gostiteljskega genetskega (in metabolnega) ozadja preko dodajanja določenih genov, lahko pozitivno vpliva na učinkovitost vezja.

==='''Robustnost in genetska stabilnost'''===
Robustna genska vezja vzdržujejo svojo učinkovitost skozi čas in v različnih pogojih – prilagajajo se spremembam, kot je različna hitrost rasti ali dostopnost transkripcijskih faktorjev, in pogosto imajo zelo visoko razmerje signal-šum. Genska vezja, ki so prilagodljiva in ne predstavljajo preveliko breme za gostitelja, sta tudi bolj robustna s stališča genetske stabilnosti. Zaželeno je, da so vezja ortogonalna, in da ne interreagirajo z gostiteljem, s čimer se tudi povečuje robustnost. V primeru, da se medsebojni interakciji ne moremo izogniti, gensko vezje lahko preoblikujemo tako, da dinamično uravnava svojo ekspresijo kot odgovor na povečani stres, ki ga povzroča gostitelju.

=='''POPRAVLJANJE NAPAK IN FINA NASTAVITEV GENSKIH VEZIJ'''==
Brez popolnoma napovednih zmogljivosti, načrtovanje genskih vezij neizogibno zahteva stopnje popravljanja napak ter fine nastavitve. Razlogi za neuspeh se najprej morajo identificirati, da bi vezje lahko normalno funkcioniralo znotraj želenih parametrov.

==='''Nastavljivi elementi v genskih vezjih'''===
Enkrat, ko se ugotovi razlog za neuspeh, se morajo narediti spremembe v vezju. Komponente je mogoče treba zamenjati, zaradi toksičnih učinkov njihovega izražanja, ali mogoče zaradi neustreznega dinamičnega območja njihovega izhodnega signala. Če je komponenta del velike ortogonalne zbirke, jo lahko zamenjamo z bolj ustrezno varianto. Ojačevalce signala lahko uporabimo v primeru, da hočemo popraviti signal komponente navzgor. Drugače obnašanje posameznih komponent lahko popravimo s spremembo jakosti promotorjev ali RBS, stopnje razgradnje genskih produktov ali števila posameznih komponent.

==='''Strategije za odpravljanje napak'''===
Ena izmed najbolj uporabljanih strategij za fino nastavljanje delovanja genskih vezij, je uporaba BioBrick standardov. Medtem, ko je uvajanje mutacij v komponente tekom začetnega sestavljanja enostavno, enkrat, ko so deli povezani v večje module, nadaljnje spreminjanje posameznih komponent ni več možno. Za ponovno uvajanje variacij se moramo vrniti na korak, ko smo dodajali posamezne komponente ali uporabimo nekatero izmed metod, ki temeljijo na PCR. SLIC, Gibsonovo sestavljanje, CPEC in SLiCE so metode zasnovane na PCR, ki predstavljajo dobro alternativo sestavljanju preko linkerjev, ker se z njimi izognemo nastanku »brazgotin«, ki lahko vplivajo na funkcionalnost vezja.
MAGE je zelo močno orodje za uvajanje variacij po predhodnem sestavljanju komponent. Metoda temelji na uporabi različnih ssDNA oligonukleotidov, s katerimi preko λ-Red rekombinaze uvedemo mutacije na ustreznih mestih.

=='''ZAKLJUČEK'''==
Po skoraj 15 letih pospešenega napredovanja, sintezna biologija je prišla do stopnje, kjer je na razpolago veliko orodij in osnovnih gradnikov za inženiring genskih vezij. Veliki napredek je ostvarjen tudi na polju ortogonalnosti in modularnosti gradnikov, kar omogoča bolj predvidljivo in robustno načrtovanje kompleksnih genskih vezij. Gradniki, ki temeljijo na RNA, bodo najverjetneje imeli glavno vlogo pri nadaljnji sofistikaciji genskih vezij, zaradi svoje enostavne programabilnosti in ker njihovi termodinamski modeli zelo dobro napovejo obnašanje v genskih vezjih.
Čeprav zelo dinamično in nedefinirano okolje gostitelja pogosto ovira normalno delovanje genskih vezij, strategije, ki temeljijo na uporabi izoliranih delov in racionalnem iskanju optimalnih parametrov bodo zmanjšale čas potreben za izgradnjo kompleksnih vezij. Variacije, ki so posledica interakcij z gostiteljskim metabolizmom, bi se še lahko znižale z uporabo sevov z reduciranimi genomi.

=='''VIRI'''==
R. W. Bradley, ''et al''., Tools and Principles for Microbial Gene Circuit Engineering, J. Mol. Biol. (2015).

Orodja in načela za inženiring genskih vezij mikroorganizmov

2016-01-18T08:33:40Z

MarkoRadojkovic:

=='''UVOD'''==
Sintezni biologi skozi racionalno načrtovanje in napredno inženirstvo stremijo k ustvarjanju novih genskih vezij, ki bi imela široko uporabnost. Imajoči v mislih kompleksnost procesiranja signalov, ki se pojavljajo v naravnih bioloških sistemih, inženirski mikroorganizmi imajo potencial za opravljanje številnih koristnih nalog, ki zahtevajo sofisticirano računalniško vodenje in kontrolo.
Ta članek predstavlja pregled vsestranskih komponent in orodij, ki so trenutno dostopna za inženiring genskih vezij v mikroorganizmih, vključno z nedavno razvitimi RNA orodji, ki vsebujejo zelo široko dinamično območje in se lahko programirajo. Seznanili se bomo z oblikovalnimi načeli, ki omogočajo robustno in razširljivo delovanje vezij, prav tako pa bomo pogledali nekatere efikasne strategije za hitro identifikacijo in popravljanje napak ter fino nastavljanje lastnosti vezij.

=='''ORODJA ZA INŽENIRING RNA'''==
Transkripcija je verjetno najpomembnejša kontrolna točka v genskih vezjih, ker zagotavlja celovito regulacijo izražanja vseh komponent. Kontrolni elementi se lažje sestavljajo na nivoju DNA, s čimer se izognemo težavam, ki lahko nastanejo kot posledica sekundarnih struktur molekul mRNA.

==='''Vezava RNA'''===
Nukleotidno zaporedje promotorja, na katero se veže RNA-pomieraza (RNAP), je temeljna determinanta hitrosti transkripcije. Do vezave pride preko σ70- tipa faktorjev na -10 in -35 mesto od začetka transkripcije, kar hkrati določa samo specifičnost iniciacijskega mesta, medtem ko se C-končna domena α podenote preferenčno veže na kratko zaporedje ponovitev A in T baz, 30 mest navzgor od -35 mesta (UP element) in s tem določa jakost promotorja. Raziskave vpliva UP elementov na jakost promotorja so pokazale, da se vpliv le-teh na jakost promotorja z višanjem koncentracije RNAP zmanjšuje in obratno. Zaporedje navzdol od začetka transkripcije prav tako lahko vpliva na potek transkripcije same, vendar se z uporabo standardnih 5'-neprevajajočih se regij (UTR), temu vplivu lahko izognemo. Knjižnice promotorjev s širokim razponom jakosti predstavljajo dragoceno zbirko, ki jih biološki inženirji s pridom izkoriščajo in jo bodo izkoriščali, dokler se ne pojavijo popolni napovedni modeli.

==='''Proteinski regulatorji transkripcije'''===

'''Aktivatorji'''

Klasični aktivatorji, ki jih uporabljamo pri oblikovanj genskih vezij, kot je LuxR, delujejo na ta način, da stabilizirajo vezavo RNAP na promotor. Rhodius in kolegi so izkoristili ekstracitoplazmične funkcijske σ faktorje (ECFs) za izgradnjo največje knjižnice ortogonalnih transkripcijskih regulatorjev za E. coli, pri čemer so našli 20 parov ECFs in sorodnih promotorjev, ki imajo zelo nizko navzkrižno reaktivnost. Ti proteini se vežejo na regije -35 in -10 in s tem določajo specifičnost vezave RNAP na določen promotor. Ostali transkripcijski aktivatorji, ki so koristni za uporabo v E.coli vključujejo tri šaperon-aktivatorske pare (ki se lahko izkoristijo za AND logiko), fagne transkripcijske aktivatorje ter HrpRS bakterijske ojačevalne proteine.

'''Represorji'''

Represorji najpogosteje delujejo na ta način, da RNAP onemogočijo dostop do promotorja. Stanton in sodelavci so ustvarili knjižnico homologov TetR in njihovih naravnih operatorjev, ki vsebuje 16 ortogonalnih variant. Obstaja tudi manjša knjižnica variant represorja LacI. Zelo zanimivo družino represorskih proteinov predstavljajo transkripcijskim aktivatorjem podobni efektorji (TALEs). TALE represorji se lažje modelirajo v primerjavi s proteini s cinkovimi prsti in se lahko uporabljajo za kontrolo več kompleksnih genov. Pokazali so da z njimi lahko dosežemo do 100-kratno znižanje ravni izražanja v E.coli.

==='''RNA kontrola transkripcije'''===
Lep primer kontrole transkripcije z RNA predstavlja pT181 transkripcijski atenuacijski sistem, katerega različice so razvite za kontrolo genskih vezij v E.coli. Naravni pT181 mehanizem koristi 5'- UTR zanko, ki normalno omogoča elongacijo transkripcije; interakcija med zanko na taRNA z 5'-UTR zanko na mRNA promovira nastanek steblo-zanka strukture, ki povzroči terminacijo transkripcije.
Majhne RNA molekule, ki aktivirajo transkripcijo (STARs), so dizajnirane da porušijo strukturo terminatorja, bodisi preko vezave na zanko, ki se nahaja v zaporedju navzgor ali preko direktne vezave na terminator. Ta pozitivna regulacija sistema pT181 omogoča zelo visoko dinamično območje (94-kratno), v primerjavi s klasičnimi represorji in je prav tako uporabna za izgradnjo večplastnih logičnih vrat.

=='''ORODJA ZA INŽENIRING IZRAŽANJA PROTEINOV'''==

==='''Ortogonalni ribosomi'''===
Vezava ribosoma na molekulo mRNA je posledica prepoznavanja in baznega parjenja med RBS in anti-Shine-Dalgarno zaporedjem, ki je zapisano v 16S rRNA. To lastnost so izkoristili za ustvarjanje treh dodatnih ortogonalnih ribosomov z modificirano 16S rRNA, ki inicira traslacijo samo na mRNA s sorodnim RBS. Transkripcija obeh ortogonalnih rRNA ter mRNA je potrebna za izražanje tarčnega gena, s čimer dobimo AND logična vrata.

==='''RNA stikala'''===
Z RNA stikali lahko vplivamo na translacijo preko od liganda odvisne spremembe konformacije 5'-UTR regije mRNA, s čemer otežimo dostop do RBS. Sharma in sodelavci so pokazali da RNA stikala lahko kombiniramo za izgradnjo AND in NAND logičnih vrat. Od temperature odvisni RNA regulatorji prav tako delujejo preko kontrole dostopnosti RBS za vezavo ribosoma.

==='''taRNA kontrola translacije'''===

'''taRNA-represija'''

Mehanizem inhibicije translacije z majhnimi RNA molekulami (sRNAs) je konceptualno preprost, zaradi česar je tudi izvajanje same metode relativno enostavno: sRNA vsebuje zaporedje komplementarno tarčni mRNA in se veže na RBS ali na zaporedje navzdol ter na ta način prepreči vezavo ribosoma. Vezavna energija sRNA-mRNA je korelirana z jakostjo inhibicije.

'''taRNA-aktivacija'''

Green in sodelavci so pred kratkim opisali razvoj RNA-stikal tipa »toehold«, oziroma zank, ki onemogočajo normalen potek translacije. Aktivacija translacije poteka preko vezave »sprožilne« RNA, ki se veže na zaporedje navzgor od zanke in ji spremeni strukturo. Najbolj učinkovita tovrstna stikala zajemajo kar 600-kratno dinamično območje, kar je za red velikosti bolje od ostalih taRNA kontrolnih mehanizmov.

=='''MODULARNOST IN ORTOGONALNOST'''==
Modularnost predstavlja kvaliteto konzistentnosti funkcije v številnih pogojih in kontekstih in je en izmed temeljnih pogojev za napovedni dizajn genskih vezij. Ortogonalnost zagotavlja da elementi in moduli ne bodo izražali neželene interakcije z drugimi elementi v inženirskih bioloških sistemih, prav tako pa tudi ne z genskim ozadjem gostitelja. Zato sta ti dve lastnosti nepogrešljivi pri načrtovanju kompleksnih genskih vezij.

==='''Fizična kompozicija'''===
Sinteznobiološki elementi so lahko občutljivi na spremembe v robnih zaporedjih, ki jih obkrožajo. Iz analize 12,563 kombinacij promotorjev in RBS, Kosuri in sodelavci so odkrili, da se približno 17 % vseh variacij v ravni izražanja proteinov ne more napovedati iz jakosti promotorjev, oziroma RBS. Mutalik in sodelavci so ugotovili, da spoji promotor: UTR in UTR: tarčni gen (GOI) v znatni meri vplivajo na variabilnost v izražanju genov in so naredili operacijsko enoto izražanja (EOU). Uporaba EOU omogoča veliko konzistentnost v nivojih izražanja tarčnih genov, ko menjavamo različne promotorje in RBS, kar ima veliko napovedno moč pri oblikovanju novih genskih vezij in finem usklajevanju ravni izražanja proteinov.

==='''Vpliv gostitelja'''===
Cardinale in sodelavci so iz analize velikega števila sevov E.coli ugotovili, da sta dostopnost ribosomov in hitrost rasti ključne determinante za učinkovitost genskih vezij. Ugotovili so tudi, da specifične delecije gostiteljskih genov imajo lahko veliki vpliv na genska vezja. Te mutacije posredno vplivajo na učinkovitost vezja preko sprememb v fluksu ogljikovega in dušikovega metabolizma. Komplementarni pristop spreminjanja gostiteljskega genetskega (in metabolnega) ozadja preko dodajanja določenih genov, lahko pozitivno vpliva na učinkovitost vezja.

==='''Robustnost in genetska stabilnost'''===
Robustna genska vezja vzdržujejo svojo učinkovitost skozi čas in v različnih pogojih – prilagajajo se spremembam, kot je različna hitrost rasti ali dostopnost transkripcijskih faktorjev, in pogosto imajo zelo visoko razmerje signal-šum. Genska vezja, ki so prilagodljiva in ne predstavljajo preveliko breme za gostitelja, sta tudi bolj robustna s stališča genetske stabilnosti. Zaželeno je, da so vezja ortogonalna, in da ne interreagirajo z gostiteljem, s čimer se tudi povečuje robustnost. V primeru, da se medsebojni interakciji ne moremo izogniti, gensko vezje lahko preoblikujemo tako, da dinamično uravnava svojo ekspresijo kot odgovor na povečani stres, ki ga povzroča gostitelju.

=='''POPRAVLJANJE NAPAK IN FINA NASTAVITEV GENSKIH VEZIJ'''==
Brez popolnoma napovednih zmogljivosti, načrtovanje genskih vezij neizogibno zahteva stopnje popravljanja napak ter fine nastavitve. Razlogi za neuspeh se najprej morajo identificirati, da bi vezje lahko normalno funkcioniralo znotraj želenih parametrov.

==='''Nastavljivi elementi v genskih vezjih'''===
Enkrat, ko se ugotovi razlog za neuspeh, se morajo narediti spremembe v vezju. Komponente je mogoče treba zamenjati, zaradi toksičnih učinkov njihovega izražanja, ali mogoče zaradi neustreznega dinamičnega območja njihovega izhodnega signala. Če je komponenta del velike ortogonalne zbirke, jo lahko zamenjamo z bolj ustrezno varianto. Ojačevalce signala lahko uporabimo v primeru, da hočemo popraviti signal komponente navzgor. Drugače obnašanje posameznih komponent lahko popravimo s spremembo jakosti promotorjev ali RBS, stopnje razgradnje genskih produktov ali števila posameznih komponent.

==='''Strategije za odpravljanje napak'''===
Ena izmed najbolj uporabljanih strategij za fino nastavljanje delovanja genskih vezij, je uporaba BioBrick standardov. Medtem, ko je uvajanje mutacij v komponente tekom začetnega sestavljanja enostavno, enkrat, ko so deli povezani v večje module, nadaljnje spreminjanje posameznih komponent ni več možno. Za ponovno uvajanje variacij se moramo vrniti na korak, ko smo dodajali posamezne komponente ali uporabimo nekatero izmed metod, ki temeljijo na PCR. SLIC, Gibsonovo sestavljanje, CPEC in SLiCE so metode zasnovane na PCR, ki predstavljajo dobro alternativo sestavljanju preko linkerjev, ker se z njimi izognemo nastanku »brazgotin«, ki lahko vplivajo na funkcionalnost vezja.
MAGE je zelo močno orodje za uvajanje variacij po predhodnem sestavljanju komponent. Metoda temelji na uporabi različnih ssDNA oligonukleotidov, s katerimi preko λ-Red rekombinaze uvedemo mutacije na ustreznih mestih.

=='''ZAKLJUČEK'''==
Po skoraj 15 letih pospešenega napredovanja, sintezna biologija je prišla do stopnje, kjer je na razpolago veliko orodij in osnovnih gradnikov za inženiring genskih vezij. Veliki napredek je ostvarjen tudi na polju ortogonalnosti in modularnosti gradnikov, kar omogoča bolj predvidljivo in robustno načrtovanje kompleksnih genskih vezij. Gradniki, ki temeljijo na RNA, bodo najverjetneje imeli glavno vlogo pri nadaljnji sofistikaciji genskih vezij, zaradi svoje enostavne programabilnosti in ker njihovi termodinamski modeli zelo dobro napovejo obnašanje v genskih vezjih.
Čeprav zelo dinamično in nedefinirano okolje gostitelja pogosto ovira normalno delovanje genskih vezij, strategije, ki temeljijo na uporabi izoliranih delov in racionalnem iskanju optimalnih parametrov bodo zmanjšale čas potreben za izgradnjo kompleksnih vezij. Variacije, ki so posledica interakcij z gostiteljskim metabolizmom, bi se še lahko znižale z uporabo sevov z reduciranimi genomi.

=='''VIRI'''==
R. W. Bradley, ''et al''., Tools and Principles for Microbial Gene Circuit Engineering, J. Mol. Biol. (2015).

Orodja in načela za inženiring genskih vezij mikroorganizmov

2016-01-18T08:22:49Z

MarkoRadojkovic:

=='''UVOD'''==
Sintezni biologi skozi racionalno načrtovanje in napredno inženirstvo stremijo k ustvarjanju novih genskih vezij, ki bi imela široko uporabnost. Imajoči v mislih kompleksnost procesiranja signalov, ki se pojavljajo v naravnih bioloških sistemih, inženirski mikroorganizmi imajo potencial za opravljanje številnih koristnih nalog, ki zahtevajo sofisticirano računalniško vodenje in kontrolo.
Ta članek predstavlja pregled vsestranskih komponent in orodij, ki so trenutno dostopna za inženiring genskih vezij v mikroorganizmih, vključno z nedavno razvitimi RNA orodji, ki vsebujejo zelo široko dinamično območje in se lahko programirajo. Seznanili se bomo z oblikovalnimi načeli, ki omogočajo robustno in razširljivo delovanje vezij, prav tako pa bomo pogledali nekatere efikasne strategije za hitro identifikacijo in popravljanje napak ter fino nastavljanje lastnosti vezij.

=='''Orodja za RNA inženiring'''==
Transkripcija je verjetno najpomembnejša kontrolna točka v genskih vezjih, ker zagotavlja celovito regulacijo izražanja vseh komponent. Kontrolni elementi se lažje sestavljajo na nivoju DNA, s čimer se izognemo težavam, ki lahko nastanejo kot posledica sekundarnih struktur molekul mRNA.

==='''Vezava RNA'''===
Nukleotidno zaporedje promotorja, na katero se veže RNA-pomieraza (RNAP), je temeljna determinanta hitrosti transkripcije. Do vezave pride preko σ70- tipa faktorjev na -10 in -35 mesto od začetka transkripcije, kar hkrati določa samo specifičnost iniciacijskega mesta, medtem ko se C-končna domena α podenote preferenčno veže na kratko zaporedje ponovitev A in T baz, 30 mest navzgor od -35 mesta (UP element) in s tem določa jakost promotorja. Raziskave vpliva UP elementov na jakost promotorja so pokazale, da se vpliv le-teh na jakost promotorja z višanjem koncentracije RNAP zmanjšuje in obratno. Zaporedje navzdol od začetka transkripcije prav tako lahko vpliva na potek transkripcije same, vendar se z uporabo standardnih 5'-neprevajajočih se regij (UTR), temu vplivu lahko izognemo. Knjižnice promotorjev s širokim razponom jakosti predstavljajo dragoceno zbirko, ki jih biološki inženirji s pridom izkoriščajo in jo bodo izkoriščali, dokler se ne pojavijo popolni napovedni modeli.

==='''Proteinski regulatorji transkripcije'''===

'''''Aktivatorji'''''

Klasični aktivatorji, ki jih uporabljamo pri oblikovanj genskih vezij, kot je LuxR, delujejo na ta način, da stabilizirajo vezavo RNAP na promotor. Rhodius in kolegi so izkoristili ekstracitoplazmične funkcijske σ faktorje (ECFs) za izgradnjo največje knjižnice ortogonalnih transkripcijskih regulatorjev za E. coli, pri čemer so našli 20 parov ECFs in sorodnih promotorjev, ki imajo zelo nizko navzkrižno reaktivnost. Ti proteini se vežejo na regije -35 in -10 in s tem določajo specifičnost vezave RNAP na določen promotor. Ostali transkripcijski aktivatorji, ki so koristni za uporabo v E.coli vključujejo tri šaperon-aktivatorske pare (ki se lahko izkoristijo za AND logiko), fagne transkripcijske aktivatorje ter HrpRS bakterijske ojačevalne proteine.

'''''Represorji'''''

Represorji najpogosteje delujejo na ta način, da RNAP onemogočijo dostop do promotorja. Stanton in sodelavci so ustvarili knjižnico homologov TetR in njihovih naravnih operatorjev, ki vsebuje 16 ortogonalnih variant. Obstaja tudi manjša knjižnica variant represorja LacI. Zelo zanimivo družino represorskih proteinov predstavljajo transkripcijskim aktivatorjem podobni efektorji (TALEs). TALE represorji se lažje modelirajo v primerjavi s proteini s cinkovimi prsti in se lahko uporabljajo za kontrolo več kompleksnih genov. Pokazali so da z njimi lahko dosežemo do 100-kratno znižanje ravni izražanja v E.coli.

==='''RNA kontrola transkripcije'''===
Lep primer kontrole transkripcije z RNA predstavlja pT181 transkripcijski atenuacijski sistem, katerega različice so razvite za kontrolo genskih vezij v E.coli. Naravni pT181 mehanizem koristi 5'- UTR zanko, ki normalno omogoča elongacijo transkripcije; interakcija med zanko na taRNA z 5'-UTR zanko na mRNA promovira nastanek steblo-zanka strukture, ki povzroči terminacijo transkripcije.
Majhne RNA molekule, ki aktivirajo transkripcijo (STARs), so dizajnirane da porušijo strukturo terminatorja, bodisi preko vezave na zanko, ki se nahaja v zaporedju navzgor ali preko direktne vezave na terminator. Ta pozitivna regulacija sistema pT181 omogoča zelo visoko dinamično območje (94-kratno), v primerjavi s klasičnimi represorji in je prav tako uporabna za izgradnjo večplastnih logičnih vrat.

=='''Orodja za inženiring izražanja proteinov'''==

==='''Ortogonalni ribosomi'''===
Vezava ribosoma na molekulo mRNA je posledica prepoznavanja in baznega parjenja med RBS in anti-Shine-Dalgarno zaporedjem, ki je zapisano v 16S rRNA. To lastnost so izkoristili za ustvarjanje treh dodatnih ortogonalnih ribosomov z modificirano 16S rRNA, ki inicira traslacijo samo na mRNA s sorodnim RBS. Transkripcija obeh ortogonalnih rRNA ter mRNA je potrebna za izražanje tarčnega gena, s čimer dobimo AND logična vrata.

==='''RNA stikala'''===
Z RNA stikali lahko vplivamo na translacijo preko od liganda odvisne spremembe konformacije 5'-UTR regije mRNA, s čemer otežimo dostop do RBS. Sharma in sodelavci so pokazali da RNA stikala lahko kombiniramo za izgradnjo AND in NAND logičnih vrat. Od temperature odvisni RNA regulatorji prav tako delujejo preko kontrole dostopnosti RBS za vezavo ribosoma.

==='''taRNA kontrola translacije'''===

'''''taRNA-represija'''''
Mehanizem inhibicije translacije z majhnimi RNA molekulami (sRNAs) je konceptualno preprost, zaradi česar je tudi izvajanje same metode relativno enostavno: sRNA vsebuje zaporedje komplementarno tarčni mRNA in se veže na RBS ali na zaporedje navzdol ter na ta način prepreči vezavo ribosoma. Vezavna energija sRNA-mRNA je korelirana z jakostjo inhibicije.

'''''taRNA-aktivacija'''''
Green in sodelavci so pred kratkim opisali razvoj RNA-stikal tipa »toehold«, oziroma zank, ki onemogočajo normalen potek translacije. Aktivacija translacije poteka preko vezave »sprožilne« RNA, ki se veže na zaporedje navzgor od zanke in ji spremeni strukturo. Najbolj učinkovita tovrstna stikala zajemajo kar 600-kratno dinamično območje, kar je za red velikosti bolje od ostalih taRNA kontrolnih mehanizmov.

=='''Modularnost in ortogonalnost'''==
Modularnost predstavlja kvaliteto konzistentnosti funkcije v številnih pogojih in kontekstih in je en izmed temeljnih pogojev za napovedni dizajn genskih vezij. Ortogonalnost zagotavlja da elementi in moduli ne bodo izražali neželene interakcije z drugimi elementi v inženirskih bioloških sistemih, prav tako pa tudi ne z genskim ozadjem gostitelja. Zato sta ti dve lastnosti nepogrešljivi pri načrtovanju kompleksnih genskih vezij.

==='''Fizična kompozicija'''===
Sinteznobiološki elementi so lahko občutljivi na spremembe v robnih zaporedjih, ki jih obkrožajo. Iz analize 12,563 kombinacij promotorjev in RBS, Kosuri in sodelavci so odkrili, da se približno 17 % vseh variacij v ravni izražanja proteinov ne more napovedati iz jakosti promotorjev, oziroma RBS. Mutalik in sodelavci so ugotovili, da spoji promotor: UTR in UTR: tarčni gen (GOI) v znatni meri vplivajo na variabilnost v izražanju genov in so naredili operacijsko enoto izražanja (EOU). Uporaba EOU omogoča veliko konzistentnost v nivojih izražanja tarčnih genov, ko menjavamo različne promotorje in RBS, kar ima veliko napovedno moč pri oblikovanju novih genskih vezij in finem usklajevanju ravni izražanja proteinov.

==='''Vpliv gostitelja'''===
Cardinale in sodelavci so iz analize velikega števila sevov E.coli ugotovili, da sta dostopnost ribosomov in hitrost rasti ključne determinante za učinkovitost genskih vezij. Ugotovili so tudi, da specifične delecije gostiteljskih genov imajo lahko veliki vpliv na genska vezja. Te mutacije posredno vplivajo na učinkovitost vezja preko sprememb v fluksu ogljikovega in dušikovega metabolizma. Komplementarni pristop spreminjanja gostiteljskega genetskega (in metabolnega) ozadja preko dodajanja določenih genov, lahko pozitivno vpliva na učinkovitost vezja.

==='''Robustnost in genetska stabilnost'''===
Robustna genska vezja vzdržujejo svojo učinkovitost skozi čas in v različnih pogojih – prilagajajo se spremembam, kot je različna hitrost rasti ali dostopnost transkripcijskih faktorjev, in pogosto imajo zelo visoko razmerje signal-šum. Genska vezja, ki so prilagodljiva in ne predstavljajo preveliko breme za gostitelja, sta tudi bolj robustna s stališča genetske stabilnosti. Zaželeno je, da so vezja ortogonalna, in da ne interreagirajo z gostiteljem, s čimer se tudi povečuje robustnost. V primeru, da se medsebojni interakciji ne moremo izogniti, gensko vezje lahko preoblikujemo tako, da dinamično uravnava svojo ekspresijo kot odgovor na povečani stres, ki ga povzroča gostitelju.

=='''Popravljanje napak in fina nastavitev genskih vezij'''==
Brez popolnoma napovednih zmogljivosti, načrtovanje genskih vezij neizogibno zahteva stopnje popravljanja napak ter fine nastavitve. Razlogi za neuspeh se najprej morajo identificirati, da bi vezje lahko normalno funkcioniralo znotraj želenih parametrov.

==='''Nastavljivi elementi v genskih vezjih'''===
Enkrat, ko se ugotovi razlog za neuspeh, se morajo narediti spremembe v vezju. Komponente je mogoče treba zamenjati, zaradi toksičnih učinkov njihovega izražanja, ali mogoče zaradi neustreznega dinamičnega območja njihovega izhodnega signala. Če je komponenta del velike ortogonalne zbirke, jo lahko zamenjamo z bolj ustrezno varianto. Ojačevalce signala lahko uporabimo v primeru, da hočemo popraviti signal komponente navzgor. Drugače obnašanje posameznih komponent lahko popravimo s spremembo jakosti promotorjev ali RBS, stopnje razgradnje genskih produktov ali števila posameznih komponent.

==='''Strategije za odpravljanje napak'''===
Ena izmed najbolj uporabljanih strategij za fino nastavljanje delovanja genskih vezij, je uporaba BioBrick standardov. Medtem, ko je uvajanje mutacij v komponente tekom začetnega sestavljanja enostavno, enkrat, ko so deli povezani v večje module, nadaljnje spreminjanje posameznih komponent ni več možno. Za ponovno uvajanje variacij se moramo vrniti na korak, ko smo dodajali posamezne komponente ali uporabimo nekatero izmed metod, ki temeljijo na PCR. SLIC, Gibsonovo sestavljanje, CPEC in SLiCE so metode zasnovane na PCR, ki predstavljajo dobro alternativo sestavljanju preko linkerjev, ker se z njimi izognemo nastanku »brazgotin«, ki lahko vplivajo na funkcionalnost vezja.
MAGE je zelo močno orodje za uvajanje variacij po predhodnem sestavljanju komponent. Metoda temelji na uporabi različnih ssDNA oligonukleotidov, s katerimi preko λ-Red rekombinaze uvedemo mutacije na ustreznih mestih.

=='''Zaključek'''==
Po skoraj 15 letih pospešenega napredovanja, sintezna biologija je prišla do stopnje, kjer je na razpolago veliko orodij in osnovnih gradnikov za inženiring genskih vezij. Veliki napredek je ostvarjen tudi na polju ortogonalnosti in modularnosti gradnikov, kar omogoča bolj predvidljivo in robustno načrtovanje kompleksnih genskih vezij. Gradniki, ki temeljijo na RNA, bodo najverjetneje imeli glavno vlogo pri nadaljnji sofistikaciji genskih vezij, zaradi svoje enostavne programabilnosti in ker njihovi termodinamski modeli zelo dobro napovejo obnašanje v genskih vezjih.
Čeprav zelo dinamično in nedefinirano okolje gostitelja pogosto ovira normalno delovanje genskih vezij, strategije, ki temeljijo na uporabi izoliranih delov in racionalnem iskanju optimalnih parametrov bodo zmanjšale čas potreben za izgradnjo kompleksnih vezij. Variacije, ki so posledica interakcij z gostiteljskim metabolizmom, bi se še lahko znižale z uporabo sevov z reduciranimi genomi.

Orodja in načela za inženiring genskih vezij mikroorganizmov

2016-01-18T08:22:17Z

MarkoRadojkovic:

=='''Uvod'''==
Sintezni biologi skozi racionalno načrtovanje in napredno inženirstvo stremijo k ustvarjanju novih genskih vezij, ki bi imela široko uporabnost. Imajoči v mislih kompleksnost procesiranja signalov, ki se pojavljajo v naravnih bioloških sistemih, inženirski mikroorganizmi imajo potencial za opravljanje številnih koristnih nalog, ki zahtevajo sofisticirano računalniško vodenje in kontrolo.
Ta članek predstavlja pregled vsestranskih komponent in orodij, ki so trenutno dostopna za inženiring genskih vezij v mikroorganizmih, vključno z nedavno razvitimi RNA orodji, ki vsebujejo zelo široko dinamično območje in se lahko programirajo. Seznanili se bomo z oblikovalnimi načeli, ki omogočajo robustno in razširljivo delovanje vezij, prav tako pa bomo pogledali nekatere efikasne strategije za hitro identifikacijo in popravljanje napak ter fino nastavljanje lastnosti vezij.

=='''Orodja za RNA inženiring'''==
Transkripcija je verjetno najpomembnejša kontrolna točka v genskih vezjih, ker zagotavlja celovito regulacijo izražanja vseh komponent. Kontrolni elementi se lažje sestavljajo na nivoju DNA, s čimer se izognemo težavam, ki lahko nastanejo kot posledica sekundarnih struktur molekul mRNA.

==='''Vezava RNA'''===
Nukleotidno zaporedje promotorja, na katero se veže RNA-pomieraza (RNAP), je temeljna determinanta hitrosti transkripcije. Do vezave pride preko σ70- tipa faktorjev na -10 in -35 mesto od začetka transkripcije, kar hkrati določa samo specifičnost iniciacijskega mesta, medtem ko se C-končna domena α podenote preferenčno veže na kratko zaporedje ponovitev A in T baz, 30 mest navzgor od -35 mesta (UP element) in s tem določa jakost promotorja. Raziskave vpliva UP elementov na jakost promotorja so pokazale, da se vpliv le-teh na jakost promotorja z višanjem koncentracije RNAP zmanjšuje in obratno. Zaporedje navzdol od začetka transkripcije prav tako lahko vpliva na potek transkripcije same, vendar se z uporabo standardnih 5'-neprevajajočih se regij (UTR), temu vplivu lahko izognemo. Knjižnice promotorjev s širokim razponom jakosti predstavljajo dragoceno zbirko, ki jih biološki inženirji s pridom izkoriščajo in jo bodo izkoriščali, dokler se ne pojavijo popolni napovedni modeli.

==='''Proteinski regulatorji transkripcije'''===

'''''Aktivatorji'''''

Klasični aktivatorji, ki jih uporabljamo pri oblikovanj genskih vezij, kot je LuxR, delujejo na ta način, da stabilizirajo vezavo RNAP na promotor. Rhodius in kolegi so izkoristili ekstracitoplazmične funkcijske σ faktorje (ECFs) za izgradnjo največje knjižnice ortogonalnih transkripcijskih regulatorjev za E. coli, pri čemer so našli 20 parov ECFs in sorodnih promotorjev, ki imajo zelo nizko navzkrižno reaktivnost. Ti proteini se vežejo na regije -35 in -10 in s tem določajo specifičnost vezave RNAP na določen promotor. Ostali transkripcijski aktivatorji, ki so koristni za uporabo v E.coli vključujejo tri šaperon-aktivatorske pare (ki se lahko izkoristijo za AND logiko), fagne transkripcijske aktivatorje ter HrpRS bakterijske ojačevalne proteine.

'''''Represorji'''''

Represorji najpogosteje delujejo na ta način, da RNAP onemogočijo dostop do promotorja. Stanton in sodelavci so ustvarili knjižnico homologov TetR in njihovih naravnih operatorjev, ki vsebuje 16 ortogonalnih variant. Obstaja tudi manjša knjižnica variant represorja LacI. Zelo zanimivo družino represorskih proteinov predstavljajo transkripcijskim aktivatorjem podobni efektorji (TALEs). TALE represorji se lažje modelirajo v primerjavi s proteini s cinkovimi prsti in se lahko uporabljajo za kontrolo več kompleksnih genov. Pokazali so da z njimi lahko dosežemo do 100-kratno znižanje ravni izražanja v E.coli.

==='''RNA kontrola transkripcije'''===
Lep primer kontrole transkripcije z RNA predstavlja pT181 transkripcijski atenuacijski sistem, katerega različice so razvite za kontrolo genskih vezij v E.coli. Naravni pT181 mehanizem koristi 5'- UTR zanko, ki normalno omogoča elongacijo transkripcije; interakcija med zanko na taRNA z 5'-UTR zanko na mRNA promovira nastanek steblo-zanka strukture, ki povzroči terminacijo transkripcije.
Majhne RNA molekule, ki aktivirajo transkripcijo (STARs), so dizajnirane da porušijo strukturo terminatorja, bodisi preko vezave na zanko, ki se nahaja v zaporedju navzgor ali preko direktne vezave na terminator. Ta pozitivna regulacija sistema pT181 omogoča zelo visoko dinamično območje (94-kratno), v primerjavi s klasičnimi represorji in je prav tako uporabna za izgradnjo večplastnih logičnih vrat.

=='''Orodja za inženiring izražanja proteinov'''==

==='''Ortogonalni ribosomi'''===
Vezava ribosoma na molekulo mRNA je posledica prepoznavanja in baznega parjenja med RBS in anti-Shine-Dalgarno zaporedjem, ki je zapisano v 16S rRNA. To lastnost so izkoristili za ustvarjanje treh dodatnih ortogonalnih ribosomov z modificirano 16S rRNA, ki inicira traslacijo samo na mRNA s sorodnim RBS. Transkripcija obeh ortogonalnih rRNA ter mRNA je potrebna za izražanje tarčnega gena, s čimer dobimo AND logična vrata.

==='''RNA stikala'''===
Z RNA stikali lahko vplivamo na translacijo preko od liganda odvisne spremembe konformacije 5'-UTR regije mRNA, s čemer otežimo dostop do RBS. Sharma in sodelavci so pokazali da RNA stikala lahko kombiniramo za izgradnjo AND in NAND logičnih vrat. Od temperature odvisni RNA regulatorji prav tako delujejo preko kontrole dostopnosti RBS za vezavo ribosoma.

==='''taRNA kontrola translacije'''===

'''''taRNA-represija'''''
Mehanizem inhibicije translacije z majhnimi RNA molekulami (sRNAs) je konceptualno preprost, zaradi česar je tudi izvajanje same metode relativno enostavno: sRNA vsebuje zaporedje komplementarno tarčni mRNA in se veže na RBS ali na zaporedje navzdol ter na ta način prepreči vezavo ribosoma. Vezavna energija sRNA-mRNA je korelirana z jakostjo inhibicije.

'''''taRNA-aktivacija'''''
Green in sodelavci so pred kratkim opisali razvoj RNA-stikal tipa »toehold«, oziroma zank, ki onemogočajo normalen potek translacije. Aktivacija translacije poteka preko vezave »sprožilne« RNA, ki se veže na zaporedje navzgor od zanke in ji spremeni strukturo. Najbolj učinkovita tovrstna stikala zajemajo kar 600-kratno dinamično območje, kar je za red velikosti bolje od ostalih taRNA kontrolnih mehanizmov.

=='''Modularnost in ortogonalnost'''==
Modularnost predstavlja kvaliteto konzistentnosti funkcije v številnih pogojih in kontekstih in je en izmed temeljnih pogojev za napovedni dizajn genskih vezij. Ortogonalnost zagotavlja da elementi in moduli ne bodo izražali neželene interakcije z drugimi elementi v inženirskih bioloških sistemih, prav tako pa tudi ne z genskim ozadjem gostitelja. Zato sta ti dve lastnosti nepogrešljivi pri načrtovanju kompleksnih genskih vezij.

==='''Fizična kompozicija'''===
Sinteznobiološki elementi so lahko občutljivi na spremembe v robnih zaporedjih, ki jih obkrožajo. Iz analize 12,563 kombinacij promotorjev in RBS, Kosuri in sodelavci so odkrili, da se približno 17 % vseh variacij v ravni izražanja proteinov ne more napovedati iz jakosti promotorjev, oziroma RBS. Mutalik in sodelavci so ugotovili, da spoji promotor: UTR in UTR: tarčni gen (GOI) v znatni meri vplivajo na variabilnost v izražanju genov in so naredili operacijsko enoto izražanja (EOU). Uporaba EOU omogoča veliko konzistentnost v nivojih izražanja tarčnih genov, ko menjavamo različne promotorje in RBS, kar ima veliko napovedno moč pri oblikovanju novih genskih vezij in finem usklajevanju ravni izražanja proteinov.

==='''Vpliv gostitelja'''===
Cardinale in sodelavci so iz analize velikega števila sevov E.coli ugotovili, da sta dostopnost ribosomov in hitrost rasti ključne determinante za učinkovitost genskih vezij. Ugotovili so tudi, da specifične delecije gostiteljskih genov imajo lahko veliki vpliv na genska vezja. Te mutacije posredno vplivajo na učinkovitost vezja preko sprememb v fluksu ogljikovega in dušikovega metabolizma. Komplementarni pristop spreminjanja gostiteljskega genetskega (in metabolnega) ozadja preko dodajanja določenih genov, lahko pozitivno vpliva na učinkovitost vezja.

==='''Robustnost in genetska stabilnost'''===
Robustna genska vezja vzdržujejo svojo učinkovitost skozi čas in v različnih pogojih – prilagajajo se spremembam, kot je različna hitrost rasti ali dostopnost transkripcijskih faktorjev, in pogosto imajo zelo visoko razmerje signal-šum. Genska vezja, ki so prilagodljiva in ne predstavljajo preveliko breme za gostitelja, sta tudi bolj robustna s stališča genetske stabilnosti. Zaželeno je, da so vezja ortogonalna, in da ne interreagirajo z gostiteljem, s čimer se tudi povečuje robustnost. V primeru, da se medsebojni interakciji ne moremo izogniti, gensko vezje lahko preoblikujemo tako, da dinamično uravnava svojo ekspresijo kot odgovor na povečani stres, ki ga povzroča gostitelju.

=='''Popravljanje napak in fina nastavitev genskih vezij'''==
Brez popolnoma napovednih zmogljivosti, načrtovanje genskih vezij neizogibno zahteva stopnje popravljanja napak ter fine nastavitve. Razlogi za neuspeh se najprej morajo identificirati, da bi vezje lahko normalno funkcioniralo znotraj želenih parametrov.

==='''Nastavljivi elementi v genskih vezjih'''===
Enkrat, ko se ugotovi razlog za neuspeh, se morajo narediti spremembe v vezju. Komponente je mogoče treba zamenjati, zaradi toksičnih učinkov njihovega izražanja, ali mogoče zaradi neustreznega dinamičnega območja njihovega izhodnega signala. Če je komponenta del velike ortogonalne zbirke, jo lahko zamenjamo z bolj ustrezno varianto. Ojačevalce signala lahko uporabimo v primeru, da hočemo popraviti signal komponente navzgor. Drugače obnašanje posameznih komponent lahko popravimo s spremembo jakosti promotorjev ali RBS, stopnje razgradnje genskih produktov ali števila posameznih komponent.

==='''Strategije za odpravljanje napak'''===
Ena izmed najbolj uporabljanih strategij za fino nastavljanje delovanja genskih vezij, je uporaba BioBrick standardov. Medtem, ko je uvajanje mutacij v komponente tekom začetnega sestavljanja enostavno, enkrat, ko so deli povezani v večje module, nadaljnje spreminjanje posameznih komponent ni več možno. Za ponovno uvajanje variacij se moramo vrniti na korak, ko smo dodajali posamezne komponente ali uporabimo nekatero izmed metod, ki temeljijo na PCR. SLIC, Gibsonovo sestavljanje, CPEC in SLiCE so metode zasnovane na PCR, ki predstavljajo dobro alternativo sestavljanju preko linkerjev, ker se z njimi izognemo nastanku »brazgotin«, ki lahko vplivajo na funkcionalnost vezja.
MAGE je zelo močno orodje za uvajanje variacij po predhodnem sestavljanju komponent. Metoda temelji na uporabi različnih ssDNA oligonukleotidov, s katerimi preko λ-Red rekombinaze uvedemo mutacije na ustreznih mestih.

=='''Zaključek'''==
Po skoraj 15 letih pospešenega napredovanja, sintezna biologija je prišla do stopnje, kjer je na razpolago veliko orodij in osnovnih gradnikov za inženiring genskih vezij. Veliki napredek je ostvarjen tudi na polju ortogonalnosti in modularnosti gradnikov, kar omogoča bolj predvidljivo in robustno načrtovanje kompleksnih genskih vezij. Gradniki, ki temeljijo na RNA, bodo najverjetneje imeli glavno vlogo pri nadaljnji sofistikaciji genskih vezij, zaradi svoje enostavne programabilnosti in ker njihovi termodinamski modeli zelo dobro napovejo obnašanje v genskih vezjih.
Čeprav zelo dinamično in nedefinirano okolje gostitelja pogosto ovira normalno delovanje genskih vezij, strategije, ki temeljijo na uporabi izoliranih delov in racionalnem iskanju optimalnih parametrov bodo zmanjšale čas potreben za izgradnjo kompleksnih vezij. Variacije, ki so posledica interakcij z gostiteljskim metabolizmom, bi se še lahko znižale z uporabo sevov z reduciranimi genomi.

Orodja in načela za inženiring genskih vezij mikroorganizmov

2016-01-18T08:21:18Z

MarkoRadojkovic: New page: =='''Uvod'''== Sintezni biologi skozi racionalno načrtovanje in napredno inženirstvo stremijo k ustvarjanju novih genskih vezij, ki bi imela široko uporabnost. Imajoči v mislih komplek...

=='''Uvod'''==
Sintezni biologi skozi racionalno načrtovanje in napredno inženirstvo stremijo k ustvarjanju novih genskih vezij, ki bi imela široko uporabnost. Imajoči v mislih kompleksnost procesiranja signalov, ki se pojavljajo v naravnih bioloških sistemih, inženirski mikroorganizmi imajo potencial za opravljanje številnih koristnih nalog, ki zahtevajo sofisticirano računalniško vodenje in kontrolo.
Ta članek predstavlja pregled vsestranskih komponent in orodij, ki so trenutno dostopna za inženiring genskih vezij v mikroorganizmih, vključno z nedavno razvitimi RNA orodji, ki vsebujejo zelo široko dinamično območje in se lahko programirajo. Seznanili se bomo z oblikovalnimi načeli, ki omogočajo robustno in razširljivo delovanje vezij, prav tako pa bomo pogledali nekatere efikasne strategije za hitro identifikacijo in popravljanje napak ter fino nastavljanje lastnosti vezij.

=='''Orodja za RNA inženiring'''==
Transkripcija je verjetno najpomembnejša kontrolna točka v genskih vezjih, ker zagotavlja celovito regulacijo izražanja vseh komponent. Kontrolni elementi se lažje sestavljajo na nivoju DNA, s čimer se izognemo težavam, ki lahko nastanejo kot posledica sekundarnih struktur molekul mRNA.

==='''Vezava RNA'''===
Nukleotidno zaporedje promotorja, na katero se veže RNA-pomieraza (RNAP), je temeljna determinanta hitrosti transkripcije. Do vezave pride preko σ70- tipa faktorjev na -10 in -35 mesto od začetka transkripcije, kar hkrati določa samo specifičnost iniciacijskega mesta, medtem ko se C-končna domena α podenote preferenčno veže na kratko zaporedje ponovitev A in T baz, 30 mest navzgor od -35 mesta (UP element) in s tem določa jakost promotorja. Raziskave vpliva UP elementov na jakost promotorja so pokazale, da se vpliv le-teh na jakost promotorja z višanjem koncentracije RNAP zmanjšuje in obratno. Zaporedje navzdol od začetka transkripcije prav tako lahko vpliva na potek transkripcije same, vendar se z uporabo standardnih 5'-neprevajajočih se regij (UTR), temu vplivu lahko izognemo. Knjižnice promotorjev s širokim razponom jakosti predstavljajo dragoceno zbirko, ki jih biološki inženirji s pridom izkoriščajo in jo bodo izkoriščali, dokler se ne pojavijo popolni napovedni modeli.

==='''Proteinski regulatorji transkripcije'''===

'''''Aktivatorji'''''
Klasični aktivatorji, ki jih uporabljamo pri oblikovanj genskih vezij, kot je LuxR, delujejo na ta način, da stabilizirajo vezavo RNAP na promotor. Rhodius in kolegi so izkoristili ekstracitoplazmične funkcijske σ faktorje (ECFs) za izgradnjo največje knjižnice ortogonalnih transkripcijskih regulatorjev za E. coli, pri čemer so našli 20 parov ECFs in sorodnih promotorjev, ki imajo zelo nizko navzkrižno reaktivnost. Ti proteini se vežejo na regije -35 in -10 in s tem določajo specifičnost vezave RNAP na določen promotor. Ostali transkripcijski aktivatorji, ki so koristni za uporabo v E.coli vključujejo tri šaperon-aktivatorske pare (ki se lahko izkoristijo za AND logiko), fagne transkripcijske aktivatorje ter HrpRS bakterijske ojačevalne proteine.

'''''Represorji'''''
Represorji najpogosteje delujejo na ta način, da RNAP onemogočijo dostop do promotorja. Stanton in sodelavci so ustvarili knjižnico homologov TetR in njihovih naravnih operatorjev, ki vsebuje 16 ortogonalnih variant. Obstaja tudi manjša knjižnica variant represorja LacI. Zelo zanimivo družino represorskih proteinov predstavljajo transkripcijskim aktivatorjem podobni efektorji (TALEs). TALE represorji se lažje modelirajo v primerjavi s proteini s cinkovimi prsti in se lahko uporabljajo za kontrolo več kompleksnih genov. Pokazali so da z njimi lahko dosežemo do 100-kratno znižanje ravni izražanja v E.coli.

==='''RNA kontrola transkripcije'''===
Lep primer kontrole transkripcije z RNA predstavlja pT181 transkripcijski atenuacijski sistem, katerega različice so razvite za kontrolo genskih vezij v E.coli. Naravni pT181 mehanizem koristi 5'- UTR zanko, ki normalno omogoča elongacijo transkripcije; interakcija med zanko na taRNA z 5'-UTR zanko na mRNA promovira nastanek steblo-zanka strukture, ki povzroči terminacijo transkripcije.
Majhne RNA molekule, ki aktivirajo transkripcijo (STARs), so dizajnirane da porušijo strukturo terminatorja, bodisi preko vezave na zanko, ki se nahaja v zaporedju navzgor ali preko direktne vezave na terminator. Ta pozitivna regulacija sistema pT181 omogoča zelo visoko dinamično območje (94-kratno), v primerjavi s klasičnimi represorji in je prav tako uporabna za izgradnjo večplastnih logičnih vrat.

=='''Orodja za inženiring izražanja proteinov'''==

==='''Ortogonalni ribosomi'''===
Vezava ribosoma na molekulo mRNA je posledica prepoznavanja in baznega parjenja med RBS in anti-Shine-Dalgarno zaporedjem, ki je zapisano v 16S rRNA. To lastnost so izkoristili za ustvarjanje treh dodatnih ortogonalnih ribosomov z modificirano 16S rRNA, ki inicira traslacijo samo na mRNA s sorodnim RBS. Transkripcija obeh ortogonalnih rRNA ter mRNA je potrebna za izražanje tarčnega gena, s čimer dobimo AND logična vrata.

==='''RNA stikala'''===
Z RNA stikali lahko vplivamo na translacijo preko od liganda odvisne spremembe konformacije 5'-UTR regije mRNA, s čemer otežimo dostop do RBS. Sharma in sodelavci so pokazali da RNA stikala lahko kombiniramo za izgradnjo AND in NAND logičnih vrat. Od temperature odvisni RNA regulatorji prav tako delujejo preko kontrole dostopnosti RBS za vezavo ribosoma.

==='''taRNA kontrola translacije'''===

'''''taRNA-represija'''''
Mehanizem inhibicije translacije z majhnimi RNA molekulami (sRNAs) je konceptualno preprost, zaradi česar je tudi izvajanje same metode relativno enostavno: sRNA vsebuje zaporedje komplementarno tarčni mRNA in se veže na RBS ali na zaporedje navzdol ter na ta način prepreči vezavo ribosoma. Vezavna energija sRNA-mRNA je korelirana z jakostjo inhibicije.

'''''taRNA-aktivacija'''''
Green in sodelavci so pred kratkim opisali razvoj RNA-stikal tipa »toehold«, oziroma zank, ki onemogočajo normalen potek translacije. Aktivacija translacije poteka preko vezave »sprožilne« RNA, ki se veže na zaporedje navzgor od zanke in ji spremeni strukturo. Najbolj učinkovita tovrstna stikala zajemajo kar 600-kratno dinamično območje, kar je za red velikosti bolje od ostalih taRNA kontrolnih mehanizmov.

=='''Modularnost in ortogonalnost'''==
Modularnost predstavlja kvaliteto konzistentnosti funkcije v številnih pogojih in kontekstih in je en izmed temeljnih pogojev za napovedni dizajn genskih vezij. Ortogonalnost zagotavlja da elementi in moduli ne bodo izražali neželene interakcije z drugimi elementi v inženirskih bioloških sistemih, prav tako pa tudi ne z genskim ozadjem gostitelja. Zato sta ti dve lastnosti nepogrešljivi pri načrtovanju kompleksnih genskih vezij.

==='''Fizična kompozicija'''===
Sinteznobiološki elementi so lahko občutljivi na spremembe v robnih zaporedjih, ki jih obkrožajo. Iz analize 12,563 kombinacij promotorjev in RBS, Kosuri in sodelavci so odkrili, da se približno 17 % vseh variacij v ravni izražanja proteinov ne more napovedati iz jakosti promotorjev, oziroma RBS. Mutalik in sodelavci so ugotovili, da spoji promotor: UTR in UTR: tarčni gen (GOI) v znatni meri vplivajo na variabilnost v izražanju genov in so naredili operacijsko enoto izražanja (EOU). Uporaba EOU omogoča veliko konzistentnost v nivojih izražanja tarčnih genov, ko menjavamo različne promotorje in RBS, kar ima veliko napovedno moč pri oblikovanju novih genskih vezij in finem usklajevanju ravni izražanja proteinov.

==='''Vpliv gostitelja'''===
Cardinale in sodelavci so iz analize velikega števila sevov E.coli ugotovili, da sta dostopnost ribosomov in hitrost rasti ključne determinante za učinkovitost genskih vezij. Ugotovili so tudi, da specifične delecije gostiteljskih genov imajo lahko veliki vpliv na genska vezja. Te mutacije posredno vplivajo na učinkovitost vezja preko sprememb v fluksu ogljikovega in dušikovega metabolizma. Komplementarni pristop spreminjanja gostiteljskega genetskega (in metabolnega) ozadja preko dodajanja določenih genov, lahko pozitivno vpliva na učinkovitost vezja.

==='''Robustnost in genetska stabilnost'''===
Robustna genska vezja vzdržujejo svojo učinkovitost skozi čas in v različnih pogojih – prilagajajo se spremembam, kot je različna hitrost rasti ali dostopnost transkripcijskih faktorjev, in pogosto imajo zelo visoko razmerje signal-šum. Genska vezja, ki so prilagodljiva in ne predstavljajo preveliko breme za gostitelja, sta tudi bolj robustna s stališča genetske stabilnosti. Zaželeno je, da so vezja ortogonalna, in da ne interreagirajo z gostiteljem, s čimer se tudi povečuje robustnost. V primeru, da se medsebojni interakciji ne moremo izogniti, gensko vezje lahko preoblikujemo tako, da dinamično uravnava svojo ekspresijo kot odgovor na povečani stres, ki ga povzroča gostitelju.

=='''Popravljanje napak in fina nastavitev genskih vezij'''==
Brez popolnoma napovednih zmogljivosti, načrtovanje genskih vezij neizogibno zahteva stopnje popravljanja napak ter fine nastavitve. Razlogi za neuspeh se najprej morajo identificirati, da bi vezje lahko normalno funkcioniralo znotraj želenih parametrov.

==='''Nastavljivi elementi v genskih vezjih'''===
Enkrat, ko se ugotovi razlog za neuspeh, se morajo narediti spremembe v vezju. Komponente je mogoče treba zamenjati, zaradi toksičnih učinkov njihovega izražanja, ali mogoče zaradi neustreznega dinamičnega območja njihovega izhodnega signala. Če je komponenta del velike ortogonalne zbirke, jo lahko zamenjamo z bolj ustrezno varianto. Ojačevalce signala lahko uporabimo v primeru, da hočemo popraviti signal komponente navzgor. Drugače obnašanje posameznih komponent lahko popravimo s spremembo jakosti promotorjev ali RBS, stopnje razgradnje genskih produktov ali števila posameznih komponent.

==='''Strategije za odpravljanje napak'''===
Ena izmed najbolj uporabljanih strategij za fino nastavljanje delovanja genskih vezij, je uporaba BioBrick standardov. Medtem, ko je uvajanje mutacij v komponente tekom začetnega sestavljanja enostavno, enkrat, ko so deli povezani v večje module, nadaljnje spreminjanje posameznih komponent ni več možno. Za ponovno uvajanje variacij se moramo vrniti na korak, ko smo dodajali posamezne komponente ali uporabimo nekatero izmed metod, ki temeljijo na PCR. SLIC, Gibsonovo sestavljanje, CPEC in SLiCE so metode zasnovane na PCR, ki predstavljajo dobro alternativo sestavljanju preko linkerjev, ker se z njimi izognemo nastanku »brazgotin«, ki lahko vplivajo na funkcionalnost vezja.
MAGE je zelo močno orodje za uvajanje variacij po predhodnem sestavljanju komponent. Metoda temelji na uporabi različnih ssDNA oligonukleotidov, s katerimi preko λ-Red rekombinaze uvedemo mutacije na ustreznih mestih.

=='''Zaključek'''==
Po skoraj 15 letih pospešenega napredovanja, sintezna biologija je prišla do stopnje, kjer je na razpolago veliko orodij in osnovnih gradnikov za inženiring genskih vezij. Veliki napredek je ostvarjen tudi na polju ortogonalnosti in modularnosti gradnikov, kar omogoča bolj predvidljivo in robustno načrtovanje kompleksnih genskih vezij. Gradniki, ki temeljijo na RNA, bodo najverjetneje imeli glavno vlogo pri nadaljnji sofistikaciji genskih vezij, zaradi svoje enostavne programabilnosti in ker njihovi termodinamski modeli zelo dobro napovejo obnašanje v genskih vezjih.
Čeprav zelo dinamično in nedefinirano okolje gostitelja pogosto ovira normalno delovanje genskih vezij, strategije, ki temeljijo na uporabi izoliranih delov in racionalnem iskanju optimalnih parametrov bodo zmanjšale čas potreben za izgradnjo kompleksnih vezij. Variacije, ki so posledica interakcij z gostiteljskim metabolizmom, bi se še lahko znižale z uporabo sevov z reduciranimi genomi.

Seminarji SB 2015/16

2016-01-13T20:59:44Z

MarkoRadojkovic:

Seminarji iz Sintezne biologije v študijskem letu 2015/16 so:

Vir: knjiga [http://journal.frontiersin.org/researchtopic/2866/synthetic-biology-engineering-complexity-and-refactoring-cell-capabilities SYNTHETIC BIOLOGY: ENGINEERING COMPLEXITY AND REFACTORING CELL CAPABILITIES]

* Production of fatty acid-derived valuable chemicals in synthetic microbes ([[Proizvodnja kemikalij iz derivatov maščobnih kislin s pomočjo sintetičnih mikroorganizmov]]) (Maja Grdadolnik) 
* Optimization of the IPP precursor supply for the production of lycopene, decaprenoxanthin and astaxanthin by Corynebacterium glutamicum ([[Optimizacija sinteze IPP kot prekursorja za produkcijo likopena, dekaprenoksantina in astaksantina v Corynebacterium glutamicum]]) (Griša Prinčič) 
* Engineering sugar utilization and microbial tolerance toward lignocellulose conversion [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Konverzija_lignoceluloze_s_pomočjo_izkoriščanja_mikrobne_tolerance_in_inženiringa_sladkorjev] (Kim Potočnik) 
* Cofactor engineering for enhancing the flux of metabolic pathways [[INŽENIRING KOFAKTORJEV ZA IZBOLJŠANJE METABOLIČNIH POTI]] (Nastja Štemberger) 
* [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4354409/ Can the natural diversity of quorum-sensing advance synthetic biology?] ([[Ali lahko naravna diverziteta quorum sensinga pripomore k napredku v sintezni biologiji?]]) (Tina Snoj) 
* [http://journal.frontiersin.org/article/10.3389/fbioe.2015.00093/full Signal-to-noise ratio measures efficacy of biological computing devices and circuits] ([[Določanje učinkovitosti bioloških naprav in vezij z razmerjem signal-šum]]) (Jakob G. Lavrenčič) 
* A sense of balance: experimental investigation and modeling of a malonyl-CoA sensor in Escherichia coli ([[Senzor za malonil-CoA v bakteriji Escherichia coli]]) (Ajda Rojc) 
* [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4211546/ New transposon tools tailored for metabolic engineering of Gram-negative microbial cell factories] ([[Metabolični inženiring gram-negativnih bakterij s transpozonskim sistemom]]) (Rok Razpotnik) 

Vir: knjiga [http://journal.frontiersin.org/researchtopic/455/synthetic-biology-applications-in-industrial-microbiology SYNTHETIC BIOLOGY APPLICATIONS IN INDUSTRIAL MICROBIOLOGY]

* Recent Progress in Synthetic Biology for Microbial Production of C3–C10 Alcohols (Urška Rauter) ([[Napredki v sintezni biologiji pri proizvodnji C3-C10 alkoholov v mikroorganizmih]])
* Visualizing Evolution in Real-Time Method for Strain Engineering ([[Vizualizacija evolucije v realnem času – metoda za sevno inženirstvo]]) (Samo Zakotnik)
* [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3367458/ Engineering Microbial Consortia to Enhance Biomining and Bioremediation] ([[Načrtovanje mikrobnih konzorcijev za izboljšanje biorudarstva in bioremediacije]]) (Maja Kostanjevec)
* Engineering Microbial Chemical Factories to Produce Renewable “Biomonomers” ([[Mikrobiološka proizvodnja obnovljivih biomonomerov in bioplastike]])(Nastja Pirman)
* [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3446811/ Application of Synthetic Biology in Cyanobacteria and Algae] ([[Uporaba sintezne biologije v cianobakterijah in algah]]) (Špela Tomaž)
* Synthetic Feedback Loop Model for Increasing Microbial Biofuel Production Using a Biosensor (Jernej Pušnik)
* Balance of XYL1 and XYL2 Expression in Different Yeast Chassis for Improved xylose Fermentation ([[Ravnotežje med ekspresijo XYL1 in XYL2 v različnih šasijah kvasovk v povezavi s povečano fermentacijo ksiloze]]) (Monika Praznik)
* [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3630320/ Design and Development of Synthetic Microbial Platform Cells for Bioenergy] ([[Načrtovanje in razvijanje sintetičnih mikrobnih celičnih platform za pridobivanje bioenergije]])(Erik Mršnik)
* [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3616241/ Microbial Production of Isoprenoids Enabled by Synthetic Biology] ([[Mikrobna produkcija izoprenoidov s sintezno biologijo]]) (Dominik Kert)
* Chemical synthetic biology: a mini-review ([[Kratki pregled kemijske sintezne biologije]]) (Anka Hotko)

Seminarji iz preglednih člankov:

* [http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S002228361500618X Towards engineering biological systems in a broader context] ([[Inženiring bioloških sistemov v širšem kontekstu]]) (Aleksander Benčič)
* [http://revistes.iec.cat/index.php/IM/article/viewFile/139212/137876 Synthetic biology: Novel approaches for microbiology] ([[Sintezno biološki pristopi v mikrobiologiji]]) (Daša Janeš)
* [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26463592 Tools and principles for microbial gene circuit engineering] (Marko Radojković)
* Sensitive cells: enabling tools for static and dynamic control of microbial metabolic pathways ([[Dinamično uravnavanje (regulacija) metabolnih poti]]) (Katja Leben)
* Chassis optimization as a cornerstone for the application of synthetic biology based strategies in microbial secondary metabolism ([[Oprimizacija šasij kot osnovni korak pri uporabi sintezno biološkega pristopa pri karakterizaciji mikrobnega sekundarnega metabolizma]]) (Jure Zabret)
* [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4571725/ Recent advances and opportunities in synthetic logic gates engineering in living cells] ([[Napredki v načrtovanju bioloških logičnih vrat v živih celicah]]) (Monika Biasizzo)
* Programmable genetic circuits for pathway engineering (Urban Javoršek)
* [http://web.media.mit.edu/~neri/MATTER.MEDIA/Publications/Better_together-_engineering_and_application_of_microbial_symbioses.pdf Better together: engineering and application of microbial symbioses] ([[V slogi je moč: načrtovanje in uporaba mikrobne simbioze]]) (Nejc Petrišič)
* Synthetic biology for microbial production of lipid-based biofuels ([[Produkcija lipidnih biogoriv s sintezno biologijo]]) (Urška Pevec)
* Engineering Biosynthesis Mechanisms for Diversifying Polyhydroxyalkanoates ([[Inženiring biosintetskih mehanizmov za raznolike polihidroksialkanoate]]) (Mojca Banič)
* [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4519758/pdf/fmicb-06-00775.pdf Synthetic biology of fungal natural products] ([[Sintezna biologija naravnih produktov (nitastih) gliv]]) (Estera Merljak)
* Synthetic biology and biomimetic chemistry as converging technologies fostering a new generation of smart biosensors ([[Sintezna biologija in biomimetika pri razvoju biosenzorjev]]) (Benjamin Bajželj)
* [http://splasho.com/blog/papers/Bioluminescence.pdf How Synthetic Biology Would Reconsider Natural Bioluminescence and its Application] (Ana Grom & Ana Unkovič) 
* Synthetic Biology-Toward Therapeutic Solutions (Tanja Korpar)
* Synthetically modified mRNA for efficient and fast human iPS cell generation and direct transdifferentiation to myoblasts (Mirjana Malnar)
* Mammalian synthetic biology: emerging medical applications([[Sintezna biologija sesalcev in medicinske aplikacije]]) ( Maša Mirkoviić)
biology devices and circuits for RNA-based ‘smart vaccines’: a propositional review (Monika Škrjanc)

Funkcionalne mutacije in karakterizacija VHH proti ureazi Helicobacter pylori

2015-05-06T09:20:14Z

MarkoRadojkovic:

== UVOD ==

''Helicobacter pylori'' je vrsta mikroaerofilnih gramnegativnih bacilov iz rodu ''Helicobacter'', ki pri ljudeh povzroča vnetje želodčne sluznice in razjede v želodcu in dvanajstniku. Standardna oblika zdravljenja vključuje kombinacijo antibiotikov z zaviralci protonske črpalke. Vendar je tovrstno zdravljenje v zadnjih časih dosti oteženo, zaradi čedalje pogostejše rezistence na antibiotike. Eden izmed novih popularnih pristopov je razvoj specifičnih protiteles proti ''H. pylori''. Encim ureaza je pomemben virulenčni dejavnik bakterije, ki nevtralizira kislo okolje in je ključen za nastanitev bakterije v gastrični mukozi. Sestavljen je iz dveh podenot (UreA in UreC), pri čemer je večja podenota UreC prisotna v vseh kliničnih vzorcih in predstavlja idealno tarčo za protitelesa. Vendar tudi zdravljenje s protitelesi ima svoje pomanjkljivosti, ki se kažejo v njihovi kompleksni zgradbi, velikosti in slabi penetraciji v tarčna tkiva.

VHH ali nanotelesa, so najmanjši antigen vezavni fragmenti (~15 kDa), ki izvirajo iz variabilnih domen kameljih protiteles. Zaradi svojih izjemnih biofizikalnih lastnostih, dobre topnosti in majhne imunogenosti, predstavljajo idealno alternativo klasičnim protitelesom in njihovim izpeljankam.
Nanotelo proti UreC podenoti ureaze ''H. pylori'' je pridobljeno s pomočjo fagne predstavitvene knjižnice iz imuniziranih kamel. V raziskavi, ki ga obravnava članek, so z naključno mutagenezo pripravili fagno knjižnico mutantov s ciljem afinitetnega zorenja.

== POTEK RAZISKAVE ==

Metoda, ki so jo v raziskavi uporabili za naključno mutagenezo, je PCR podvržena napakam, ki temelji na nenatančnem pomnoževanju tarčne DNA. Je enostavna, hitra in po ceni metoda za pripravo genomskih knjižnic. Za pripravo knjižnice mutantov so uporabili matrično DNA, ki zapisuje za UreC specifično VHH, ki so predhodno pidobili iz knjižnice imuniziranih kamel. Izvedli so 2 PCR mutageni reakciji pod različnimi reakcijskimi pogoji. PCR produkti so ligirani v fagmidni vektor in z elektroporacijo vneseni v celice ''E. coli'' TG1. Za predstavitev na površini fagnih delcev, so slednje celice transformirali z pomožnim fagom M13K07. Selekcija pozitivnih klonov je potekala na mikrotitrskih ploščicah z imobiliziranim UreC antigenom. Po štirih rundah izpiranja in vmesno obogatitvijo fagnih delcev, so naključno izbrali 25 klonov za fagno monoklonsko ELISA reakcijo. Dva klona z največjo absorbanco, HMR13 in HMR23, sta izbrana za ekspresijo v celicah ''E. coli'' BL21 (DE3).

Po uspešnem izražanju obeh VHH mutantov so s pomočjo nekompetitivne ELISE izmerili afiniteto vezave na UreC ter preverili specifičnost vezave. Z encimskim testom so preverili inhibicijo aktivnosti ureaze.

== REZULTATI ==

Novonastala knjižnica mutantov v celicah ''E.coli'' je vsebovala 4.0 x 107 različnih klonov. Po štirih postopkih izpiranja, sta dva izmed 25 naključno izbranih klonov izbrana za izražanje rekombinantnih VHH. Analiza afinitete vezave topnih VHH na imobilizirano UreC je pokazala Kd z vrednostjo 2.63 x 10-8 M-1 za HMR23, kar predstavlja 1.5x višjo afiniteto vezave v primerjavi s starševskim VHH. HMR13 ni pokazal izboljšane afinitete.
Analiza specifičnosti je pokazala da se HMR23 veže na UreC z visoko specifičnostjo v primerjavi z ostalimi antigeni, kar kaže da mutacije niso vplivale na specifičnost VHH. Inkubacija HMR23 s ''H.pylori'' je pokazala 68 % inhibicijo aktivnosti ureaze, medtem ko je starševski VHH dosegel 60 % inhibicijo, pri čemer je koncentracija obeh bila 20 μg/mL. Minimalna konc. HMR23 potrebna za inhibicijo ureaze je 0.6 μg/mL. Z DNA sekvenciranjem HMR23 in primerjavo z DNA starševskega nanotelesa so identificirali mutirane aminokislinske ostanke. Do zamenjave je prišlo pri 13 aminokislinah, pri čemer ni prišlo do insercije nukleotidov niti spremembe bralnega okvirja.

== DISKUSIJA ==

Afinitetno zorenje protiteles s PCR podvrženo napakam in njihova predstavitev na fagih, bakterijah, kvasovkah ali ribosomih, se je že izkazalo za zelo uspešno metodo, ki je pripeljala od 4-1000x izboljšane afinitete vezave. V opisani raziskavi je mutirani VHH imel samo 1.5x večjo afiniteto od starševskega. Afiniteta bi lahko bila daleč višja, če ne bi bilo nekaj ovir. Kot prvo, večina mutacij se je zgodila v regijah, ki niso ključne za prepoznavanje antigena. CDR3 zanka, ki je najbolj variabilna v velikosti in aminokislinski sestavi in ima ključno vlogo pri prepoznavanju antigena in afiniteti vezave, je ostala nespremenjena. Kot drugo, o veliko izboljšanih afinitetah je do sedaj poročano samo za scFV fragmente, ki se po strukturi in mehanizmu vezave na antigen razlikujejo od nanoteles. Kot tretje, rezultati slednje raziskave predstavljajo analizo samo nekaj klonov. Več klonov je potrebno analizirati za pridobitev bolj specifičnih VHH in oceno učinka naključne mutageneze na afinitetno zorenje.

== VIR ==

R. Hoseinpoor ''et al''; Functional Mutations in and Characterization of VHH Against ''Helicobacter pylori'' Urease, Applied Biochemistry and Biotechnology 172, 3079-3091, 2014.

MBT seminarji 2015

2015-04-21T20:34:56Z

MarkoRadojkovic:

'''Seznam seminarjev iz Molekularne biotehnologije v študijskem letu 2014/15'''

Tabela za razpored po tednih bo objavljena v spletni učilnici, vanjo pa se vpišite tudi za kratke predstavitve novic (3 min, dvakrat v semestru). Na tej strani bo samo seznam odobrenih člankov za seminar in povezave do člankov in do povzetkov, ki jih morate objaviti najkasneje tri dni pred predstavitvijo (ponedeljek oz. torek). Angleški naslov prevedite tudi v slovenščino - to bo naslov povzetka, ki ga objavite na posebni strani, tako kot so to naredili kolegi pred vami (oz. lani).

Način vnosa:

# The importance of ''Arabidopsis'' glutathione peroxidase 8 for protecting ''Arabidopsis'' plant and ''E. coli'' cells against oxidative stress (A. Gaber; GM Crops & Food 5(1), 2014; http://dx.doi.org/10.4161/gmcr.26979) Pomen glutation peroksidaze 8 iz repnjakovca za zaščito rastline ''Arabidopsis thaliana'' in bakterije ''Escherichia coli'' pred oksidativnim stresom. Janez Novak, 15. marca 2014
(slovenski naslov povežite z novo stranjo, na kateri bo povzetek)

'''Naslovi odobrenih člankov po temah:'''

'''Gensko spremenjene rastline''' 
# Successful high-level accumulation of fish oil omega-3 long-chain polyunsaturated fatty acids in a transgenic oilseed crop (Ruiz-Lopez, N., et al; The plant journal 77, 198-208, 2014; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24308505). [[Uspešna priprava gensko spremenjene oljne rastline z visoko vsebnostjo omega-3 polinenasičenih maščobnih kislin.]] Petra Malavašič, 20. marca 2015
#A simpliﬁed and accurate detection of the genetically modiﬁed wheat MON71800 with one calibrator plasmid (Jae Juan, S.,et al; Food Chemistry 176, 1-6, ;http://www.sciencedirect.com.nukweb.nuk.uni-lj.si/science/article/pii/S03088146140196572015 [[Poenostavljena in točna detekcija gensko spemenjene pšenice MON71800 z enim kalibratorskim plazmidom]]. Matej Lesar, 20. marca 2015

'''Gensko spremenjene živali''' 
# [[A novel adenoviral vector carrying an all-in-one Tet-On system with an autoregulatory loop for tight, inducible transgene expresion]] (H. Chen; et all.; BMC Biotechnology 2015, 15:4, doi:10.1186/s12896-015-0121-4; http://www.biomedcentral.com/1472-6750/15/4). Edvinas Grauželis, 27. marca 2015 (in English)
# Production of functional active human growth factors in insects used as living biofactories (B. Dudognon, et al; Journal of Biotechnology 184, 229–239, 2014; http://dx.doi.org/10.1016/j.jbiotec.2014.05.030). [[Proizvodnja funkcionalno aktivnih človeških rastnih faktorjev v insektih uporabljenih kot žive biotovarne]] Maxi Sagmeister, 27. marca 2015

'''Okolje''' 
# Bioremediation of pesticide contaminated water using an organophosphate degrading enzyme immobilized on nonwoven polyester textiles (Yuan Gao ''et al.'', Enzyme and Microbial Technology, vol. 54, pages 38-44, 10.1.2014, http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0141022913002044). [[Bioremediacija s pesticidi okužene vode z uporabo encima, ki razgrajuje organofosfate in je vezan na netkan poliestrski tekstil]]. Mitja Crček, 3. aprila 2015
# Biodegradation of atrazine by three transgenic grasses and alfalfa expressing a modified bacterial atrazine chlorohydrolase gene (A. W. Vail ''et al.''; Transgenic Research, 29. 11. 2014; http://link.springer.com/article/10.1007/s11248-014-9851-7). [[Biorazgradnja atrazina s tremi transgenskimi travami in lucerno, ki izražajo gen za modificirano bakterijsko atrazin klorohidrolazo]]. Mirjam Kmetič, 3. aprila 2015

'''Terapevtiki''' 
# Glycosylated enfuvirtide: A long-lasting glycopeptide with potent anti-HIV activity; http://pubs.acs.org/doi/full/10.1021/jm5016582 [[Glikoliziran Enfuvirtid: glikopeptid z močno proti HIV aktivnostjo s podaljšanim delovanjem]]. Sebastian Pleško, 10. aprila
# Microbicidal effects of α- and θ-defensins against antibiotic-resistant Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa; http://ini.sagepub.com/content/21/1/17.long. [[Mikrobicidno delovanje α in θ defenzinov na antibiotik-odporne Staphylococcus aureus in Pseudomonas aeruginosa]]. Ana Kapraljević, 10. aprila

'''Encimi''' 
# Immobilization and controlled release of β-galactosidase from chitosan-grafted hydrogels; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0308814615001028. [[Imobilizacija in nadzorovano sproščanje β-galaktozidaze iz hitozanskega hidrogela]]. Mojca Banič, 16. aprila 2015
# Construction of efficient xylose utilizing ''Pichia pastoris'' for industrial enzyme production (Li ''et al''; Microbial Cell Factories 14:22, 1-10, 2015; http://www.microbialcellfactories.com/content/14/1/22). [[Priprava Pichie pastoris, ki učinkovito uporablja ksilozo, za industrijsko proizvodnjo encimov]]. Špela Tomaž, 17. aprila 2015
# Postharvest application of a novel chitinase cloned from ''Metschnikowia fructicola'' and overexpressed in ''Pichia pastoris'' to control brown rot of peaches; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0168160515000033. [[Uporaba hitinaze, klonirane iz Metschnikowie fructicola in prekomerno izražene v Pichii pastoris za nadzor rjave gnilobe breskev po obiranju]] Špela Pohleven, 17. aprila 2015

'''Protitelesa''' 
# Optimization of heavy chain and light chain signal peptides for high level expression of therapeutic antibodies in CHO cells; http://dx.plos.org/10.1371/journal.pone.0116878. Optimizacija signalnih peptidov težkih in lahkih verig za večjo ekspresijo terapevtskih protiteles v CHO celičnih linijah. [[Optimizacija signalnih peptidov težkih in lahkih verig za večjo ekspresijo terapevtskih protiteles v CHO celičnih linijah]] Tjaša Blatnik, 23. aprila 2015
# Ethanol precipitation for purification of recombinant antibodies (A. Tscheliessnig ''et al''; Journal of Biotechnology 188, 17-28, 2014; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0168165614007810). [[Čiščenje rekombinantnih protiteles z obarjanjem z etanolom]]. Urška Rauter, 24. aprila 2015
# Functional mutations in and characterization of VHH against ''Helicobacter pylori'' urease (R. Hoseinpoor ''et al''; Applied Biochemistry and Biotechnology 172, 3079-3091, 2014; http://link.springer.com/article/10.1007/s12010-014-0750-4). [[Funkcionalne mutacije in karakterizacija VHH proti ureazi Helicobacter pylori]]. Marko Radojković, 7. maja 2015

'''Cepiva''' 
# Development of anti-E6 pegylated lipoplexes for mucosal application in the context of cervical preneoplastic lesions; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0378517315001507. Tanja Korpar, 7. maja 2015
# A novel “priming-boosting” strategy for immune interventions in cervical cancer (S. Liao et al.; Molecular Immunology 64, 295-305, 2015, http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0161589014003460. Nova "priming-boosting" strategija za imunsko posredovanje pri raku materničnega vratu. Anita Kustec, 8. maja 2015
# Potentiation of anthrax vaccines using protective antigen-expressing viral replicon vectors (H.C. Wang et al.; Immunology letters 163, 206-213, 2015, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25102364 ) Izboljšava cepiv proti antraksu z uporabo iz virusnih replikonov izvedenih vektorjev, ki omogočajo izražanje zaščitnega antigena. Daša Pavc, 8. maja 2015

'''Male molekule in polimeri''' 
# Methanol-induced chain termination in poly(3-hydroxybutyrate) biopolymers: Molecular weight control; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0141813014008307. Gašper Lavrenčič, 14. maja 2015
# Purification and characterization of gamma poly glutamic acid from newly Bacillus licheniformis NRC20; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0141813014008216. Uroš Stupar, 14. maja 2015
# Iza Ogris, 15. maja 2015
# Chromosomal integration of hyaluronic acid synthesis (''has'') genes enhances the molecular weight of hyaluronan produced in ''Lactococcus lactis'' (R. V. Hmar et al; Biotechnol. J. 9 (12), 2014; http://dx.doi.org/10.1002/biot.201400215) Integracija genov za sintezo hialuronske kisline v kromosom bakterije ''Lactococcus lactis'' izboljša sintezo visokomolekularne hialuronske kisline. Maja Grdadolnik, 15. maja 2015

'''Pretvorba biomase''' 
# Effect of pretreatment methods on the synergism of cellulase and xylanase during the hydrolysis of bagasse; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0960852415002114. Eva Lucija Kozak, 21. maja 2015
# Third generation biohydrogen production by Clostridium butyricum and adapted mixed cultures from Scenedesmus obliquus microalga biomass; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0016236115002550?np=y. Nives Naraglav, 22. maja 2015
# Bio-catalytic action of twin-screw extruder enzymatic hydrolysis on the deconstruction of annual plant material: Case of sweet corn co-products; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0926669015000436. Griša Prinčič, 22. maja 2015

'''Metabolično inženirstvo''' 
# Engineering lipid overproduction in the oleaginous yeast Yarrowia lipolytica;http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1096717615000166. Andreja Bratovš, 28. maja 2015
# Metabolic engineering of Saccharomyces cerevisiae for production of fatty acid-derived biofuels and chemicals (Weerawat Runguphana, Jay D. Keasling; Metabolic Engineering, vol 21, January 2014, Pages 103–113; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1096717613000670). Metabolično inženirstvo ''Saccharomyces cerevisiae'' za proizvodnjo derivatov maščobnih kislin, ki so primerni za biogorivo in kemikalije. Dominik Kert, 29. maja 2015
# Metabolic engineering of Klebsiella pneumoniae for the production of cis,cis-muconic acid (Jung,H.-M. Jung,M.-Y. Oh, M.-K.;Applied Microbiology and Biotechnology, Published online: 14 February 2015; http://link.springer.com/article/10.1007/s00253-015-6442-3). Metabolno inženirstvo Klebsiella pneumoniae za produkcijo cis,cis-mukonične kisline. Jure Zabret, 29. maja 2015

'''Biološki viri energije''' 
# Anodic and cathodic microbial communities in single chamber microbial fuel cells; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1871678414021694. Tamara Marić, 4. junija 2015
# Combination of dry dark fermentation and mechanical pretreatment for lignocellulosic deconstruction: An innovative strategy for biofuels and volatile fatty acids recovery; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0306261915002196. Jernej Pušnik, 4. junija 2015
# Potential use of feedlot cattle manure for bioethanol production; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0960852415001960. Nastja Pirman, 5. junija 2015
# Cellulolytic enzymes produced by a newly isolated soil fungus Penicillium sp. TG2 with potential for use in cellulosic ethanol production; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0960148114007022. Jana Verbančič, 5. junija 2015

'''Novi pristopi v molekularni biotehnologiji''' 
# Exploring the potential of algae/bacteria interactions; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0958166915000269. Matja Zalar, 11. junija
# How close we are to achieving commercially viable large-scale photobiological hydrogen production by cyanobacteria: A review of the biological aspects; http://www.mdpi.com/2075-1729/5/1/997/htm. Monika Škrjanc, 11. junija
# Mind-controlled transgene expression by a wireless-powered optogenetic designer cell implant (M. Folcher; Nature Communications 5, 1–11, 2014; http://www.nature.com/ncomms/2014/141111/ncomms6392/full/ncomms6392.html) Z EEG nadzorovano izražanje transgena preko brezžično napajanega optogenetskega celičnega vsadka. Luka Smole, 11. junija 2015

MBT seminarji 2015

2015-04-21T20:32:57Z

MarkoRadojkovic:

'''Seznam seminarjev iz Molekularne biotehnologije v študijskem letu 2014/15'''

Tabela za razpored po tednih bo objavljena v spletni učilnici, vanjo pa se vpišite tudi za kratke predstavitve novic (3 min, dvakrat v semestru). Na tej strani bo samo seznam odobrenih člankov za seminar in povezave do člankov in do povzetkov, ki jih morate objaviti najkasneje tri dni pred predstavitvijo (ponedeljek oz. torek). Angleški naslov prevedite tudi v slovenščino - to bo naslov povzetka, ki ga objavite na posebni strani, tako kot so to naredili kolegi pred vami (oz. lani).

Način vnosa:

# The importance of ''Arabidopsis'' glutathione peroxidase 8 for protecting ''Arabidopsis'' plant and ''E. coli'' cells against oxidative stress (A. Gaber; GM Crops & Food 5(1), 2014; http://dx.doi.org/10.4161/gmcr.26979) Pomen glutation peroksidaze 8 iz repnjakovca za zaščito rastline ''Arabidopsis thaliana'' in bakterije ''Escherichia coli'' pred oksidativnim stresom. Janez Novak, 15. marca 2014
(slovenski naslov povežite z novo stranjo, na kateri bo povzetek)

'''Naslovi odobrenih člankov po temah:'''

'''Gensko spremenjene rastline''' 
# Successful high-level accumulation of fish oil omega-3 long-chain polyunsaturated fatty acids in a transgenic oilseed crop (Ruiz-Lopez, N., et al; The plant journal 77, 198-208, 2014; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24308505). [[Uspešna priprava gensko spremenjene oljne rastline z visoko vsebnostjo omega-3 polinenasičenih maščobnih kislin.]] Petra Malavašič, 20. marca 2015
#A simpliﬁed and accurate detection of the genetically modiﬁed wheat MON71800 with one calibrator plasmid (Jae Juan, S.,et al; Food Chemistry 176, 1-6, ;http://www.sciencedirect.com.nukweb.nuk.uni-lj.si/science/article/pii/S03088146140196572015 [[Poenostavljena in točna detekcija gensko spemenjene pšenice MON71800 z enim kalibratorskim plazmidom]]. Matej Lesar, 20. marca 2015

'''Gensko spremenjene živali''' 
# [[A novel adenoviral vector carrying an all-in-one Tet-On system with an autoregulatory loop for tight, inducible transgene expresion]] (H. Chen; et all.; BMC Biotechnology 2015, 15:4, doi:10.1186/s12896-015-0121-4; http://www.biomedcentral.com/1472-6750/15/4). Edvinas Grauželis, 27. marca 2015 (in English)
# Production of functional active human growth factors in insects used as living biofactories (B. Dudognon, et al; Journal of Biotechnology 184, 229–239, 2014; http://dx.doi.org/10.1016/j.jbiotec.2014.05.030). [[Proizvodnja funkcionalno aktivnih človeških rastnih faktorjev v insektih uporabljenih kot žive biotovarne]] Maxi Sagmeister, 27. marca 2015

'''Okolje''' 
# Bioremediation of pesticide contaminated water using an organophosphate degrading enzyme immobilized on nonwoven polyester textiles (Yuan Gao ''et al.'', Enzyme and Microbial Technology, vol. 54, pages 38-44, 10.1.2014, http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0141022913002044). [[Bioremediacija s pesticidi okužene vode z uporabo encima, ki razgrajuje organofosfate in je vezan na netkan poliestrski tekstil]]. Mitja Crček, 3. aprila 2015
# Biodegradation of atrazine by three transgenic grasses and alfalfa expressing a modified bacterial atrazine chlorohydrolase gene (A. W. Vail ''et al.''; Transgenic Research, 29. 11. 2014; http://link.springer.com/article/10.1007/s11248-014-9851-7). [[Biorazgradnja atrazina s tremi transgenskimi travami in lucerno, ki izražajo gen za modificirano bakterijsko atrazin klorohidrolazo]]. Mirjam Kmetič, 3. aprila 2015

'''Terapevtiki''' 
# Glycosylated enfuvirtide: A long-lasting glycopeptide with potent anti-HIV activity; http://pubs.acs.org/doi/full/10.1021/jm5016582 [[Glikoliziran Enfuvirtid: glikopeptid z močno proti HIV aktivnostjo s podaljšanim delovanjem]]. Sebastian Pleško, 10. aprila
# Microbicidal effects of α- and θ-defensins against antibiotic-resistant Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa; http://ini.sagepub.com/content/21/1/17.long. [[Mikrobicidno delovanje α in θ defenzinov na antibiotik-odporne Staphylococcus aureus in Pseudomonas aeruginosa]]. Ana Kapraljević, 10. aprila

'''Encimi''' 
# Immobilization and controlled release of β-galactosidase from chitosan-grafted hydrogels; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0308814615001028. [[Imobilizacija in nadzorovano sproščanje β-galaktozidaze iz hitozanskega hidrogela]]. Mojca Banič, 16. aprila 2015
# Construction of efficient xylose utilizing ''Pichia pastoris'' for industrial enzyme production (Li ''et al''; Microbial Cell Factories 14:22, 1-10, 2015; http://www.microbialcellfactories.com/content/14/1/22). [[Priprava Pichie pastoris, ki učinkovito uporablja ksilozo, za industrijsko proizvodnjo encimov]]. Špela Tomaž, 17. aprila 2015
# Postharvest application of a novel chitinase cloned from ''Metschnikowia fructicola'' and overexpressed in ''Pichia pastoris'' to control brown rot of peaches; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0168160515000033. [[Uporaba hitinaze, klonirane iz Metschnikowie fructicola in prekomerno izražene v Pichii pastoris za nadzor rjave gnilobe breskev po obiranju]] Špela Pohleven, 17. aprila 2015

'''Protitelesa''' 
# Optimization of heavy chain and light chain signal peptides for high level expression of therapeutic antibodies in CHO cells; http://dx.plos.org/10.1371/journal.pone.0116878. Optimizacija signalnih peptidov težkih in lahkih verig za večjo ekspresijo terapevtskih protiteles v CHO celičnih linijah. [[Optimizacija signalnih peptidov težkih in lahkih verig za večjo ekspresijo terapevtskih protiteles v CHO celičnih linijah]] Tjaša Blatnik, 23. aprila 2015
# Ethanol precipitation for purification of recombinant antibodies (A. Tscheliessnig ''et al''; Journal of Biotechnology 188, 17-28, 2014; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0168165614007810). [[Čiščenje rekombinantnih protiteles z obarjanjem z etanolom]]. Urška Rauter, 24. aprila 2015
# Functional mutations in and characterization of VHH against Helicobacter pylori urease (R. Hoseinpoor ''et al''; Applied Biochemistry and Biotechnology 172, 3079-3091, 2014; http://link.springer.com/article/10.1007/s12010-014-0750-4). [[Funkcionalne mutacije in karakterizacija VHH proti ureazi Helicobacter pylori]]. Marko Radojković, 7. maja 2015

'''Cepiva''' 
# Development of anti-E6 pegylated lipoplexes for mucosal application in the context of cervical preneoplastic lesions; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0378517315001507. Tanja Korpar, 7. maja 2015
# A novel “priming-boosting” strategy for immune interventions in cervical cancer (S. Liao et al.; Molecular Immunology 64, 295-305, 2015, http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0161589014003460. Nova "priming-boosting" strategija za imunsko posredovanje pri raku materničnega vratu. Anita Kustec, 8. maja 2015
# Potentiation of anthrax vaccines using protective antigen-expressing viral replicon vectors (H.C. Wang et al.; Immunology letters 163, 206-213, 2015, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25102364 ) Izboljšava cepiv proti antraksu z uporabo iz virusnih replikonov izvedenih vektorjev, ki omogočajo izražanje zaščitnega antigena. Daša Pavc, 8. maja 2015

'''Male molekule in polimeri''' 
# Methanol-induced chain termination in poly(3-hydroxybutyrate) biopolymers: Molecular weight control; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0141813014008307. Gašper Lavrenčič, 14. maja 2015
# Purification and characterization of gamma poly glutamic acid from newly Bacillus licheniformis NRC20; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0141813014008216. Uroš Stupar, 14. maja 2015
# Iza Ogris, 15. maja 2015
# Chromosomal integration of hyaluronic acid synthesis (''has'') genes enhances the molecular weight of hyaluronan produced in ''Lactococcus lactis'' (R. V. Hmar et al; Biotechnol. J. 9 (12), 2014; http://dx.doi.org/10.1002/biot.201400215) Integracija genov za sintezo hialuronske kisline v kromosom bakterije ''Lactococcus lactis'' izboljša sintezo visokomolekularne hialuronske kisline. Maja Grdadolnik, 15. maja 2015

'''Pretvorba biomase''' 
# Effect of pretreatment methods on the synergism of cellulase and xylanase during the hydrolysis of bagasse; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0960852415002114. Eva Lucija Kozak, 21. maja 2015
# Third generation biohydrogen production by Clostridium butyricum and adapted mixed cultures from Scenedesmus obliquus microalga biomass; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0016236115002550?np=y. Nives Naraglav, 22. maja 2015
# Bio-catalytic action of twin-screw extruder enzymatic hydrolysis on the deconstruction of annual plant material: Case of sweet corn co-products; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0926669015000436. Griša Prinčič, 22. maja 2015

'''Metabolično inženirstvo''' 
# Engineering lipid overproduction in the oleaginous yeast Yarrowia lipolytica;http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1096717615000166. Andreja Bratovš, 28. maja 2015
# Metabolic engineering of Saccharomyces cerevisiae for production of fatty acid-derived biofuels and chemicals (Weerawat Runguphana, Jay D. Keasling; Metabolic Engineering, vol 21, January 2014, Pages 103–113; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1096717613000670). Metabolično inženirstvo ''Saccharomyces cerevisiae'' za proizvodnjo derivatov maščobnih kislin, ki so primerni za biogorivo in kemikalije. Dominik Kert, 29. maja 2015
# Metabolic engineering of Klebsiella pneumoniae for the production of cis,cis-muconic acid (Jung,H.-M. Jung,M.-Y. Oh, M.-K.;Applied Microbiology and Biotechnology, Published online: 14 February 2015; http://link.springer.com/article/10.1007/s00253-015-6442-3). Metabolno inženirstvo Klebsiella pneumoniae za produkcijo cis,cis-mukonične kisline. Jure Zabret, 29. maja 2015

'''Biološki viri energije''' 
# Anodic and cathodic microbial communities in single chamber microbial fuel cells; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1871678414021694. Tamara Marić, 4. junija 2015
# Combination of dry dark fermentation and mechanical pretreatment for lignocellulosic deconstruction: An innovative strategy for biofuels and volatile fatty acids recovery; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0306261915002196. Jernej Pušnik, 4. junija 2015
# Potential use of feedlot cattle manure for bioethanol production; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0960852415001960. Nastja Pirman, 5. junija 2015
# Cellulolytic enzymes produced by a newly isolated soil fungus Penicillium sp. TG2 with potential for use in cellulosic ethanol production; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0960148114007022. Jana Verbančič, 5. junija 2015

'''Novi pristopi v molekularni biotehnologiji''' 
# Exploring the potential of algae/bacteria interactions; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0958166915000269. Matja Zalar, 11. junija
# How close we are to achieving commercially viable large-scale photobiological hydrogen production by cyanobacteria: A review of the biological aspects; http://www.mdpi.com/2075-1729/5/1/997/htm. Monika Škrjanc, 11. junija
# Mind-controlled transgene expression by a wireless-powered optogenetic designer cell implant (M. Folcher; Nature Communications 5, 1–11, 2014; http://www.nature.com/ncomms/2014/141111/ncomms6392/full/ncomms6392.html) Z EEG nadzorovano izražanje transgena preko brezžično napajanega optogenetskega celičnega vsadka. Luka Smole, 11. junija 2015

MBT seminarji 2015

2015-04-21T20:27:40Z

MarkoRadojkovic:

'''Seznam seminarjev iz Molekularne biotehnologije v študijskem letu 2014/15'''

Tabela za razpored po tednih bo objavljena v spletni učilnici, vanjo pa se vpišite tudi za kratke predstavitve novic (3 min, dvakrat v semestru). Na tej strani bo samo seznam odobrenih člankov za seminar in povezave do člankov in do povzetkov, ki jih morate objaviti najkasneje tri dni pred predstavitvijo (ponedeljek oz. torek). Angleški naslov prevedite tudi v slovenščino - to bo naslov povzetka, ki ga objavite na posebni strani, tako kot so to naredili kolegi pred vami (oz. lani).

Način vnosa:

# The importance of ''Arabidopsis'' glutathione peroxidase 8 for protecting ''Arabidopsis'' plant and ''E. coli'' cells against oxidative stress (A. Gaber; GM Crops & Food 5(1), 2014; http://dx.doi.org/10.4161/gmcr.26979) Pomen glutation peroksidaze 8 iz repnjakovca za zaščito rastline ''Arabidopsis thaliana'' in bakterije ''Escherichia coli'' pred oksidativnim stresom. Janez Novak, 15. marca 2014
(slovenski naslov povežite z novo stranjo, na kateri bo povzetek)

'''Naslovi odobrenih člankov po temah:'''

'''Gensko spremenjene rastline''' 
# Successful high-level accumulation of fish oil omega-3 long-chain polyunsaturated fatty acids in a transgenic oilseed crop (Ruiz-Lopez, N., et al; The plant journal 77, 198-208, 2014; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24308505). [[Uspešna priprava gensko spremenjene oljne rastline z visoko vsebnostjo omega-3 polinenasičenih maščobnih kislin.]] Petra Malavašič, 20. marca 2015
#A simpliﬁed and accurate detection of the genetically modiﬁed wheat MON71800 with one calibrator plasmid (Jae Juan, S.,et al; Food Chemistry 176, 1-6, ;http://www.sciencedirect.com.nukweb.nuk.uni-lj.si/science/article/pii/S03088146140196572015 [[Poenostavljena in točna detekcija gensko spemenjene pšenice MON71800 z enim kalibratorskim plazmidom]]. Matej Lesar, 20. marca 2015

'''Gensko spremenjene živali''' 
# [[A novel adenoviral vector carrying an all-in-one Tet-On system with an autoregulatory loop for tight, inducible transgene expresion]] (H. Chen; et all.; BMC Biotechnology 2015, 15:4, doi:10.1186/s12896-015-0121-4; http://www.biomedcentral.com/1472-6750/15/4). Edvinas Grauželis, 27. marca 2015 (in English)
# Production of functional active human growth factors in insects used as living biofactories (B. Dudognon, et al; Journal of Biotechnology 184, 229–239, 2014; http://dx.doi.org/10.1016/j.jbiotec.2014.05.030). [[Proizvodnja funkcionalno aktivnih človeških rastnih faktorjev v insektih uporabljenih kot žive biotovarne]] Maxi Sagmeister, 27. marca 2015

'''Okolje''' 
# Bioremediation of pesticide contaminated water using an organophosphate degrading enzyme immobilized on nonwoven polyester textiles (Yuan Gao ''et al.'', Enzyme and Microbial Technology, vol. 54, pages 38-44, 10.1.2014, http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0141022913002044). [[Bioremediacija s pesticidi okužene vode z uporabo encima, ki razgrajuje organofosfate in je vezan na netkan poliestrski tekstil]]. Mitja Crček, 3. aprila 2015
# Biodegradation of atrazine by three transgenic grasses and alfalfa expressing a modified bacterial atrazine chlorohydrolase gene (A. W. Vail ''et al.''; Transgenic Research, 29. 11. 2014; http://link.springer.com/article/10.1007/s11248-014-9851-7). [[Biorazgradnja atrazina s tremi transgenskimi travami in lucerno, ki izražajo gen za modificirano bakterijsko atrazin klorohidrolazo]]. Mirjam Kmetič, 3. aprila 2015

'''Terapevtiki''' 
# Glycosylated enfuvirtide: A long-lasting glycopeptide with potent anti-HIV activity; http://pubs.acs.org/doi/full/10.1021/jm5016582 [[Glikoliziran Enfuvirtid: glikopeptid z močno proti HIV aktivnostjo s podaljšanim delovanjem]]. Sebastian Pleško, 10. aprila
# Microbicidal effects of α- and θ-defensins against antibiotic-resistant Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa; http://ini.sagepub.com/content/21/1/17.long. [[Mikrobicidno delovanje α in θ defenzinov na antibiotik-odporne Staphylococcus aureus in Pseudomonas aeruginosa]]. Ana Kapraljević, 10. aprila

'''Encimi''' 
# Immobilization and controlled release of β-galactosidase from chitosan-grafted hydrogels; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0308814615001028. [[Imobilizacija in nadzorovano sproščanje β-galaktozidaze iz hitozanskega hidrogela]]. Mojca Banič, 16. aprila 2015
# Construction of efficient xylose utilizing ''Pichia pastoris'' for industrial enzyme production (Li ''et al''; Microbial Cell Factories 14:22, 1-10, 2015; http://www.microbialcellfactories.com/content/14/1/22). [[Priprava Pichie pastoris, ki učinkovito uporablja ksilozo, za industrijsko proizvodnjo encimov]]. Špela Tomaž, 17. aprila 2015
# Postharvest application of a novel chitinase cloned from ''Metschnikowia fructicola'' and overexpressed in ''Pichia pastoris'' to control brown rot of peaches; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0168160515000033. [[Uporaba hitinaze, klonirane iz Metschnikowie fructicola in prekomerno izražene v Pichii pastoris za nadzor rjave gnilobe breskev po obiranju]] Špela Pohleven, 17. aprila 2015

'''Protitelesa''' 
# Optimization of heavy chain and light chain signal peptides for high level expression of therapeutic antibodies in CHO cells; http://dx.plos.org/10.1371/journal.pone.0116878. Optimizacija signalnih peptidov težkih in lahkih verig za večjo ekspresijo terapevtskih protiteles v CHO celičnih linijah. [[Optimizacija signalnih peptidov težkih in lahkih verig za večjo ekspresijo terapevtskih protiteles v CHO celičnih linijah]] Tjaša Blatnik, 23. aprila 2015
# Ethanol precipitation for purification of recombinant antibodies (A. Tscheliessnig ''et al''; Journal of Biotechnology 188, 17-28, 2014; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0168165614007810). [[Čiščenje rekombinantnih protiteles z obarjanjem z etanolom]]. Urška Rauter, 24. aprila 2015
# Functional mutations in and characterization of VHH against Helicobacter pylori urease (R. Hoseinpoor ''et al''; Applied Biochemistry and Biotechnology 172, 3079-3091, 2014; http://link.springer.com/article/10.1007/s12010-014-0750-4). [[Funkcionalne mutacije in karakterizacija VHH proti ureazi ''Helicobacter pylori'']]. Marko Radojković, 7. maja 2015

'''Cepiva''' 
# Development of anti-E6 pegylated lipoplexes for mucosal application in the context of cervical preneoplastic lesions; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0378517315001507. Tanja Korpar, 7. maja 2015
# A novel “priming-boosting” strategy for immune interventions in cervical cancer (S. Liao et al.; Molecular Immunology 64, 295-305, 2015, http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0161589014003460. Nova "priming-boosting" strategija za imunsko posredovanje pri raku materničnega vratu. Anita Kustec, 8. maja 2015
# Potentiation of anthrax vaccines using protective antigen-expressing viral replicon vectors (H.C. Wang et al.; Immunology letters 163, 206-213, 2015, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25102364 ) Izboljšava cepiv proti antraksu z uporabo iz virusnih replikonov izvedenih vektorjev, ki omogočajo izražanje zaščitnega antigena. Daša Pavc, 8. maja 2015

'''Male molekule in polimeri''' 
# Methanol-induced chain termination in poly(3-hydroxybutyrate) biopolymers: Molecular weight control; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0141813014008307. Gašper Lavrenčič, 14. maja 2015
# Purification and characterization of gamma poly glutamic acid from newly Bacillus licheniformis NRC20; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0141813014008216. Uroš Stupar, 14. maja 2015
# Iza Ogris, 15. maja 2015
# Chromosomal integration of hyaluronic acid synthesis (''has'') genes enhances the molecular weight of hyaluronan produced in ''Lactococcus lactis'' (R. V. Hmar et al; Biotechnol. J. 9 (12), 2014; http://dx.doi.org/10.1002/biot.201400215) Integracija genov za sintezo hialuronske kisline v kromosom bakterije ''Lactococcus lactis'' izboljša sintezo visokomolekularne hialuronske kisline. Maja Grdadolnik, 15. maja 2015

'''Pretvorba biomase''' 
# Effect of pretreatment methods on the synergism of cellulase and xylanase during the hydrolysis of bagasse; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0960852415002114. Eva Lucija Kozak, 21. maja 2015
# Third generation biohydrogen production by Clostridium butyricum and adapted mixed cultures from Scenedesmus obliquus microalga biomass; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0016236115002550?np=y. Nives Naraglav, 22. maja 2015
# Bio-catalytic action of twin-screw extruder enzymatic hydrolysis on the deconstruction of annual plant material: Case of sweet corn co-products; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0926669015000436. Griša Prinčič, 22. maja 2015

'''Metabolično inženirstvo''' 
# Engineering lipid overproduction in the oleaginous yeast Yarrowia lipolytica;http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1096717615000166. Andreja Bratovš, 28. maja 2015
# Metabolic engineering of Saccharomyces cerevisiae for production of fatty acid-derived biofuels and chemicals (Weerawat Runguphana, Jay D. Keasling; Metabolic Engineering, vol 21, January 2014, Pages 103–113; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1096717613000670). Metabolično inženirstvo ''Saccharomyces cerevisiae'' za proizvodnjo derivatov maščobnih kislin, ki so primerni za biogorivo in kemikalije. Dominik Kert, 29. maja 2015
# Metabolic engineering of Klebsiella pneumoniae for the production of cis,cis-muconic acid (Jung,H.-M. Jung,M.-Y. Oh, M.-K.;Applied Microbiology and Biotechnology, Published online: 14 February 2015; http://link.springer.com/article/10.1007/s00253-015-6442-3). Metabolno inženirstvo Klebsiella pneumoniae za produkcijo cis,cis-mukonične kisline. Jure Zabret, 29. maja 2015

'''Biološki viri energije''' 
# Anodic and cathodic microbial communities in single chamber microbial fuel cells; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1871678414021694. Tamara Marić, 4. junija 2015
# Combination of dry dark fermentation and mechanical pretreatment for lignocellulosic deconstruction: An innovative strategy for biofuels and volatile fatty acids recovery; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0306261915002196. Jernej Pušnik, 4. junija 2015
# Potential use of feedlot cattle manure for bioethanol production; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0960852415001960. Nastja Pirman, 5. junija 2015
# Cellulolytic enzymes produced by a newly isolated soil fungus Penicillium sp. TG2 with potential for use in cellulosic ethanol production; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0960148114007022. Jana Verbančič, 5. junija 2015

'''Novi pristopi v molekularni biotehnologiji''' 
# Exploring the potential of algae/bacteria interactions; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0958166915000269. Matja Zalar, 11. junija
# How close we are to achieving commercially viable large-scale photobiological hydrogen production by cyanobacteria: A review of the biological aspects; http://www.mdpi.com/2075-1729/5/1/997/htm. Monika Škrjanc, 11. junija
# Mind-controlled transgene expression by a wireless-powered optogenetic designer cell implant (M. Folcher; Nature Communications 5, 1–11, 2014; http://www.nature.com/ncomms/2014/141111/ncomms6392/full/ncomms6392.html) Z EEG nadzorovano izražanje transgena preko brezžično napajanega optogenetskega celičnega vsadka. Luka Smole, 11. junija 2015

Funkcionalne mutacije in karakterizacija VHH proti ureazi Helicobacter pylori

2015-04-21T20:26:13Z

MarkoRadojkovic: /* REZULTATI */

== UVOD ==

''Helicobacter pylori'' je vrsta mikroaerofilnih gramnegativnih bacilov iz rodu ''Helicobacter'', ki pri ljudeh povzroča vnetje želodčne sluznice in razjede v želodcu in dvanajstniku. Standardna oblika zdravljenja vključuje kombinacijo antibiotikov z zaviralci protonske črpalke. Vendar je tovrstno zdravljenje v zadnjih časih dosti oteženo, zaradi čedalje pogostejše rezistence na antibiotike. Eden izmed novih popularnih pristopov je razvoj specifičnih protiteles proti H. pylori. Encim ureaza je pomemben virulenčni dejavnik bakterije, ki nevtralizira kislo okolje in je ključen za nastanitev bakterije v gastrični mukozi. Sestavljen je iz dveh podenot (UreA in UreC), pri čemer je večja podenota UreC prisotna v vseh kliničnih vzorcih in predstavlja idealno tarčo za protitelesa. Vendar tudi zdravljenje s protitelesi ima svoje pomanjkljivosti, ki se kažejo v njihovi kompleksni zgradbi, velikosti in slabi penetraciji v tarčna tkiva.

VHH ali nanotelesa, so najmanjši antigen vezavni fragmenti (~15 kDa), ki izvirajo iz variabilnih domen kameljih protiteles. Zaradi svojih izjemnih biofizikalnih lastnostih, dobre topnosti in majhne imunogenosti, predstavljajo idealno alternativo klasičnim protitelesom in njihovim izpeljankam.
Nanotelo proti UreC podenoti ureaze H. pylori je pridobljeno s pomočjo fagne predstavitvene knjižnice iz imuniziranih kamel. V raziskavi, ki ga obravnava članek, so z naključno mutagenezo pripravili fagno knjižnico mutantov s ciljem afinitetnega zorenja.

== POTEK RAZISKAVE ==

Metoda, ki so jo v raziskavi uporabili za naključno mutagenezo, je PCR podvržena napakam, ki temelji na nenatančnem pomnoževanju tarčne DNA. Je enostavna, hitra in po ceni metoda za pripravo genomskih knjižnic. Za pripravo knjižnice mutantov so uporabili matrično DNA, ki zapisuje za UreC specifično VHH, ki so predhodno pidobili iz knjižnice imuniziranih kamel. Izvedli so 2 PCR mutageni reakciji pod različnimi reakcijskimi pogoji. PCR produkti so ligirani v fagmidni vektor in z elektroporacijo vneseni v celice ''E. coli'' TG1. Za predstavitev na površini fagnih delcev, so slednje celice transformirali z pomožnim fagom M13K07. Selekcija pozitivnih klonov je potekala na mikrotitrskih ploščicah z imobiliziranim UreC antigenom. Po štirih rundah izpiranja in vmesno obogatitvijo fagnih delcev, so naključno izbrali 25 klonov za fagno monoklonsko ELISA reakcijo. Dva klona z največjo absorbanco, HMR13 in HMR23, sta izbrana za ekspresijo v celicah ''E. coli'' BL21 (DE3).

Po uspešnem izražanju obeh VHH mutantov so s pomočjo nekompetitivne ELISE izmerili afiniteto vezave na UreC ter preverili specifičnost vezave. Z encimskim testom so preverili inhibicijo aktivnosti ureaze.

== REZULTATI ==

Novonastala knjižnica mutantov v celicah ''E.coli'' je vsebovala 4.0 x 107 različnih klonov. Po štirih postopkih izpiranja, sta dva izmed 25 naključno izbranih klonov izbrana za izražanje rekombinantnih VHH. Analiza afinitete vezave topnih VHH na imobilizirano UreC je pokazala Kd z vrednostjo 2.63 x 10-8 M-1 za HMR23, kar predstavlja 1.5x višjo afiniteto vezave v primerjavi s starševskim VHH. HMR13 ni pokazal izboljšane afinitete.
Analiza specifičnosti je pokazala da se HMR23 veže na UreC z visoko specifičnostjo v primerjavi z ostalimi antigeni, kar kaže da mutacije niso vplivale na specifičnost VHH. Inkubacija HMR23 s ''H.pylori'' je pokazala 68 % inhibicijo aktivnosti ureaze, medtem ko je starševski VHH dosegel 60 % inhibicijo, pri čemer je koncentracija obeh bila 20 μg/mL. Minimalna konc. HMR23 potrebna za inhibicijo ureaze je 0.6 μg/mL. Z DNA sekvenciranjem HMR23 in primerjavo z DNA starševskega nanotelesa so identificirali mutirane aminokislinske ostanke. Do zamenjave je prišlo pri 13 aminokislinah, pri čemer ni prišlo do insercije nukleotidov niti spremembe bralnega okvirja.

== DISKUSIJA ==

Afinitetno zorenje protiteles s PCR podvrženo napakam in njihova predstavitev na fagih, bakterijah, kvasovkah ali ribosomih, se je že izkazalo za zelo uspešno metodo, ki je pripeljala od 4-1000x izboljšane afinitete vezave. V opisani raziskavi je mutirani VHH imel samo 1.5x večjo afiniteto od starševskega. Afiniteta bi lahko bila daleč višja, če ne bi bilo nekaj ovir. Kot prvo, večina mutacij se je zgodila v regijah, ki niso ključne za prepoznavanje antigena. CDR3 zanka, ki je najbolj variabilna v velikosti in aminokislinski sestavi in ima ključno vlogo pri prepoznavanju antigena in afiniteti vezave, je ostala nespremenjena. Kot drugo, o veliko izboljšanih afinitetah je do sedaj poročano samo za scFV fragmente, ki se po strukturi in mehanizmu vezave na antigen razlikujejo od nanoteles. Kot tretje, rezultati slednje raziskave predstavljajo analizo samo nekaj klonov. Več klonov je potrebno analizirati za pridobitev bolj specifičnih VHH in oceno učinka naključne mutageneze na afinitetno zorenje.

== VIR ==

R. Hoseinpoor ''et al''; Functional Mutations in and Characterization of VHH Against ''Helicobacter pylori'' Urease, Applied Biochemistry and Biotechnology 172, 3079-3091, 2014.

Funkcionalne mutacije in karakterizacija VHH proti ureazi Helicobacter pylori

2015-04-21T20:25:32Z

MarkoRadojkovic: /* VIR */

== UVOD ==

''Helicobacter pylori'' je vrsta mikroaerofilnih gramnegativnih bacilov iz rodu ''Helicobacter'', ki pri ljudeh povzroča vnetje želodčne sluznice in razjede v želodcu in dvanajstniku. Standardna oblika zdravljenja vključuje kombinacijo antibiotikov z zaviralci protonske črpalke. Vendar je tovrstno zdravljenje v zadnjih časih dosti oteženo, zaradi čedalje pogostejše rezistence na antibiotike. Eden izmed novih popularnih pristopov je razvoj specifičnih protiteles proti H. pylori. Encim ureaza je pomemben virulenčni dejavnik bakterije, ki nevtralizira kislo okolje in je ključen za nastanitev bakterije v gastrični mukozi. Sestavljen je iz dveh podenot (UreA in UreC), pri čemer je večja podenota UreC prisotna v vseh kliničnih vzorcih in predstavlja idealno tarčo za protitelesa. Vendar tudi zdravljenje s protitelesi ima svoje pomanjkljivosti, ki se kažejo v njihovi kompleksni zgradbi, velikosti in slabi penetraciji v tarčna tkiva.

VHH ali nanotelesa, so najmanjši antigen vezavni fragmenti (~15 kDa), ki izvirajo iz variabilnih domen kameljih protiteles. Zaradi svojih izjemnih biofizikalnih lastnostih, dobre topnosti in majhne imunogenosti, predstavljajo idealno alternativo klasičnim protitelesom in njihovim izpeljankam.
Nanotelo proti UreC podenoti ureaze H. pylori je pridobljeno s pomočjo fagne predstavitvene knjižnice iz imuniziranih kamel. V raziskavi, ki ga obravnava članek, so z naključno mutagenezo pripravili fagno knjižnico mutantov s ciljem afinitetnega zorenja.

== POTEK RAZISKAVE ==

Metoda, ki so jo v raziskavi uporabili za naključno mutagenezo, je PCR podvržena napakam, ki temelji na nenatančnem pomnoževanju tarčne DNA. Je enostavna, hitra in po ceni metoda za pripravo genomskih knjižnic. Za pripravo knjižnice mutantov so uporabili matrično DNA, ki zapisuje za UreC specifično VHH, ki so predhodno pidobili iz knjižnice imuniziranih kamel. Izvedli so 2 PCR mutageni reakciji pod različnimi reakcijskimi pogoji. PCR produkti so ligirani v fagmidni vektor in z elektroporacijo vneseni v celice ''E. coli'' TG1. Za predstavitev na površini fagnih delcev, so slednje celice transformirali z pomožnim fagom M13K07. Selekcija pozitivnih klonov je potekala na mikrotitrskih ploščicah z imobiliziranim UreC antigenom. Po štirih rundah izpiranja in vmesno obogatitvijo fagnih delcev, so naključno izbrali 25 klonov za fagno monoklonsko ELISA reakcijo. Dva klona z največjo absorbanco, HMR13 in HMR23, sta izbrana za ekspresijo v celicah ''E. coli'' BL21 (DE3).

Po uspešnem izražanju obeh VHH mutantov so s pomočjo nekompetitivne ELISE izmerili afiniteto vezave na UreC ter preverili specifičnost vezave. Z encimskim testom so preverili inhibicijo aktivnosti ureaze.

== REZULTATI ==

Novonastala knjižnica mutantov v celicah ''E.coli'' je vsebovala 4.0 x 107 različnih klonov. Po štirih postopkih izpiranja, sta dva izmed 25 naključno izbranih klonov izbrana za izražanje rekombinantnih VHH.
Analiza afinitete vezave topnih VHH na imobilizirano UreC je pokazala Kd z vrednostjo 2.63 x 10-8 M-1 za HMR23, kar predstavlja 1.5x višjo afiniteto vezave v primerjavi s starševskim VHH. HMR13 ni pokazal izboljšane afinitete.
Analiza specifičnosti je pokazala da se HMR23 veže na UreC z visoko specifičnostjo v primerjavi z ostalimi antigeni, kar kaže da mutacije niso vplivale na specifičnost VHH.
Inkubacija HMR23 s ''H.pylori'' je pokazala 68 % inhibicijo aktivnosti ureaze, medtem ko je starševski VHH dosegel 60 % inhibicijo, pri čemer je koncentracija obeh bila 20 μg/mL. Minimalna konc. HMR23 potrebna za inhibicijo ureaze je 0.6 μg/mL.
Z DNA sekvenciranjem HMR23 in primerjavo z DNA starševskega nanotelesa so identificirali mutirane aminokislinske ostanke. Do zamenjave je prišlo pri 13 aminokislinah, pri čemer ni prišlo do insercije nukleotidov niti spremembe bralnega okvirja.

== DISKUSIJA ==

Afinitetno zorenje protiteles s PCR podvrženo napakam in njihova predstavitev na fagih, bakterijah, kvasovkah ali ribosomih, se je že izkazalo za zelo uspešno metodo, ki je pripeljala od 4-1000x izboljšane afinitete vezave. V opisani raziskavi je mutirani VHH imel samo 1.5x večjo afiniteto od starševskega. Afiniteta bi lahko bila daleč višja, če ne bi bilo nekaj ovir. Kot prvo, večina mutacij se je zgodila v regijah, ki niso ključne za prepoznavanje antigena. CDR3 zanka, ki je najbolj variabilna v velikosti in aminokislinski sestavi in ima ključno vlogo pri prepoznavanju antigena in afiniteti vezave, je ostala nespremenjena. Kot drugo, o veliko izboljšanih afinitetah je do sedaj poročano samo za scFV fragmente, ki se po strukturi in mehanizmu vezave na antigen razlikujejo od nanoteles. Kot tretje, rezultati slednje raziskave predstavljajo analizo samo nekaj klonov. Več klonov je potrebno analizirati za pridobitev bolj specifičnih VHH in oceno učinka naključne mutageneze na afinitetno zorenje.

== VIR ==

R. Hoseinpoor ''et al''; Functional Mutations in and Characterization of VHH Against ''Helicobacter pylori'' Urease, Applied Biochemistry and Biotechnology 172, 3079-3091, 2014.

Funkcionalne mutacije in karakterizacija VHH proti ureazi Helicobacter pylori

2015-04-21T20:25:08Z

MarkoRadojkovic:

== UVOD ==

''Helicobacter pylori'' je vrsta mikroaerofilnih gramnegativnih bacilov iz rodu ''Helicobacter'', ki pri ljudeh povzroča vnetje želodčne sluznice in razjede v želodcu in dvanajstniku. Standardna oblika zdravljenja vključuje kombinacijo antibiotikov z zaviralci protonske črpalke. Vendar je tovrstno zdravljenje v zadnjih časih dosti oteženo, zaradi čedalje pogostejše rezistence na antibiotike. Eden izmed novih popularnih pristopov je razvoj specifičnih protiteles proti H. pylori. Encim ureaza je pomemben virulenčni dejavnik bakterije, ki nevtralizira kislo okolje in je ključen za nastanitev bakterije v gastrični mukozi. Sestavljen je iz dveh podenot (UreA in UreC), pri čemer je večja podenota UreC prisotna v vseh kliničnih vzorcih in predstavlja idealno tarčo za protitelesa. Vendar tudi zdravljenje s protitelesi ima svoje pomanjkljivosti, ki se kažejo v njihovi kompleksni zgradbi, velikosti in slabi penetraciji v tarčna tkiva.

VHH ali nanotelesa, so najmanjši antigen vezavni fragmenti (~15 kDa), ki izvirajo iz variabilnih domen kameljih protiteles. Zaradi svojih izjemnih biofizikalnih lastnostih, dobre topnosti in majhne imunogenosti, predstavljajo idealno alternativo klasičnim protitelesom in njihovim izpeljankam.
Nanotelo proti UreC podenoti ureaze H. pylori je pridobljeno s pomočjo fagne predstavitvene knjižnice iz imuniziranih kamel. V raziskavi, ki ga obravnava članek, so z naključno mutagenezo pripravili fagno knjižnico mutantov s ciljem afinitetnega zorenja.

== POTEK RAZISKAVE ==

Metoda, ki so jo v raziskavi uporabili za naključno mutagenezo, je PCR podvržena napakam, ki temelji na nenatančnem pomnoževanju tarčne DNA. Je enostavna, hitra in po ceni metoda za pripravo genomskih knjižnic. Za pripravo knjižnice mutantov so uporabili matrično DNA, ki zapisuje za UreC specifično VHH, ki so predhodno pidobili iz knjižnice imuniziranih kamel. Izvedli so 2 PCR mutageni reakciji pod različnimi reakcijskimi pogoji. PCR produkti so ligirani v fagmidni vektor in z elektroporacijo vneseni v celice ''E. coli'' TG1. Za predstavitev na površini fagnih delcev, so slednje celice transformirali z pomožnim fagom M13K07. Selekcija pozitivnih klonov je potekala na mikrotitrskih ploščicah z imobiliziranim UreC antigenom. Po štirih rundah izpiranja in vmesno obogatitvijo fagnih delcev, so naključno izbrali 25 klonov za fagno monoklonsko ELISA reakcijo. Dva klona z največjo absorbanco, HMR13 in HMR23, sta izbrana za ekspresijo v celicah ''E. coli'' BL21 (DE3).

Po uspešnem izražanju obeh VHH mutantov so s pomočjo nekompetitivne ELISE izmerili afiniteto vezave na UreC ter preverili specifičnost vezave. Z encimskim testom so preverili inhibicijo aktivnosti ureaze.

== REZULTATI ==

Novonastala knjižnica mutantov v celicah ''E.coli'' je vsebovala 4.0 x 107 različnih klonov. Po štirih postopkih izpiranja, sta dva izmed 25 naključno izbranih klonov izbrana za izražanje rekombinantnih VHH.
Analiza afinitete vezave topnih VHH na imobilizirano UreC je pokazala Kd z vrednostjo 2.63 x 10-8 M-1 za HMR23, kar predstavlja 1.5x višjo afiniteto vezave v primerjavi s starševskim VHH. HMR13 ni pokazal izboljšane afinitete.
Analiza specifičnosti je pokazala da se HMR23 veže na UreC z visoko specifičnostjo v primerjavi z ostalimi antigeni, kar kaže da mutacije niso vplivale na specifičnost VHH.
Inkubacija HMR23 s ''H.pylori'' je pokazala 68 % inhibicijo aktivnosti ureaze, medtem ko je starševski VHH dosegel 60 % inhibicijo, pri čemer je koncentracija obeh bila 20 μg/mL. Minimalna konc. HMR23 potrebna za inhibicijo ureaze je 0.6 μg/mL.
Z DNA sekvenciranjem HMR23 in primerjavo z DNA starševskega nanotelesa so identificirali mutirane aminokislinske ostanke. Do zamenjave je prišlo pri 13 aminokislinah, pri čemer ni prišlo do insercije nukleotidov niti spremembe bralnega okvirja.

== DISKUSIJA ==

Afinitetno zorenje protiteles s PCR podvrženo napakam in njihova predstavitev na fagih, bakterijah, kvasovkah ali ribosomih, se je že izkazalo za zelo uspešno metodo, ki je pripeljala od 4-1000x izboljšane afinitete vezave. V opisani raziskavi je mutirani VHH imel samo 1.5x večjo afiniteto od starševskega. Afiniteta bi lahko bila daleč višja, če ne bi bilo nekaj ovir. Kot prvo, večina mutacij se je zgodila v regijah, ki niso ključne za prepoznavanje antigena. CDR3 zanka, ki je najbolj variabilna v velikosti in aminokislinski sestavi in ima ključno vlogo pri prepoznavanju antigena in afiniteti vezave, je ostala nespremenjena. Kot drugo, o veliko izboljšanih afinitetah je do sedaj poročano samo za scFV fragmente, ki se po strukturi in mehanizmu vezave na antigen razlikujejo od nanoteles. Kot tretje, rezultati slednje raziskave predstavljajo analizo samo nekaj klonov. Več klonov je potrebno analizirati za pridobitev bolj specifičnih VHH in oceno učinka naključne mutageneze na afinitetno zorenje.

== VIR ==

R. Hoseinpoor et al; Functional Mutations in and Characterization of VHH Against ''Helicobacter pylori'' Urease, Applied Biochemistry and Biotechnology 172, 3079-3091, 2014.

Funkcionalne mutacije in karakterizacija VHH proti ureazi Helicobacter pylori

2015-04-21T20:19:01Z

MarkoRadojkovic:

== UVOD ==

''Helicobacter pylori'' je vrsta mikroaerofilnih gramnegativnih bacilov iz rodu ''Helicobacter'', ki pri ljudeh povzroča vnetje želodčne sluznice in razjede v želodcu in dvanajstniku. Standardna oblika zdravljenja vključuje kombinacijo antibiotikov z zaviralci protonske črpalke. Vendar je tovrstno zdravljenje v zadnjih časih dosti oteženo, zaradi čedalje pogostejše rezistence na antibiotike. Eden izmed novih popularnih pristopov je razvoj specifičnih protiteles proti H. pylori. Encim ureaza je pomemben virulenčni dejavnik bakterije, ki nevtralizira kislo okolje in je ključen za nastanitev bakterije v gastrični mukozi. Sestavljen je iz dveh podenot (UreA in UreC), pri čemer je večja podenota UreC prisotna v vseh kliničnih vzorcih in predstavlja idealno tarčo za protitelesa. Vendar tudi zdravljenje s protitelesi ima svoje pomanjkljivosti, ki se kažejo v njihovi kompleksni zgradbi, velikosti in slabi penetraciji v tarčna tkiva.

VHH ali nanotelesa, so najmanjši antigen vezavni fragmenti (~15 kDa), ki izvirajo iz variabilnih domen kameljih protiteles. Zaradi svojih izjemnih biofizikalnih lastnostih, dobre topnosti in majhne imunogenosti, predstavljajo idealno alternativo klasičnim protitelesom in njihovim izpeljankam.
Nanotelo proti UreC podenoti ureaze H. pylori je pridobljeno s pomočjo fagne predstavitvene knjižnice iz imuniziranih kamel. V raziskavi, ki ga obravnava članek, so z naključno mutagenezo pripravili fagno knjižnico mutantov s ciljem afinitetnega zorenja.

== POTEK RAZISKAVE ==

Metoda, ki so jo v raziskavi uporabili za naključno mutagenezo, je PCR podvržena napakam, ki temelji na nenatančnem pomnoževanju tarčne DNA. Je enostavna, hitra in po ceni metoda za pripravo genomskih knjižnic. Za pripravo knjižnice mutantov so uporabili matrično DNA, ki zapisuje za UreC specifično VHH, ki so predhodno pidobili iz knjižnice imuniziranih kamel. Izvedli so 2 PCR mutageni reakciji pod različnimi reakcijskimi pogoji. PCR produkti so ligirani v fagmidni vektor in z elektroporacijo vneseni v celice ''E. coli'' TG1. Za predstavitev na površini fagnih delcev, so slednje celice transformirali z pomožnim fagom M13K07. Selekcija pozitivnih klonov je potekala na mikrotitrskih ploščicah z imobiliziranim UreC antigenom. Po štirih rundah izpiranja in vmesno obogatitvijo fagnih delcev, so naključno izbrali 25 klonov za fagno monoklonsko ELISA reakcijo. Dva klona z največjo absorbanco, HMR13 in HMR23, sta izbrana za ekspresijo v celicah ''E. coli'' BL21 (DE3).

Po uspešnem izražanju obeh VHH mutantov so s pomočjo nekompetitivne ELISE izmerili afiniteto vezave na UreC ter preverili specifičnost vezave. Z encimskim testom so preverili inhibicijo aktivnosti ureaze.

== REZULTATI ==

Novonastala knjižnica mutantov v celicah ''E.coli'' je vsebovala 4.0 x 107 različnih klonov. Po štirih postopkih izpiranja, sta dva izmed 25 naključno izbranih klonov izbrana za izražanje rekombinantnih VHH.
Analiza afinitete vezave topnih VHH na imobilizirano UreC je pokazala Kd z vrednostjo 2.63 x 10-8 M-1 za HMR23, kar predstavlja 1.5x višjo afiniteto vezave v primerjavi s starševskim VHH. HMR13 ni pokazal izboljšane afinitete.
Analiza specifičnosti je pokazala da se HMR23 veže na UreC z visoko specifičnostjo v primerjavi z ostalimi antigeni, kar kaže da mutacije niso vplivale na specifičnost VHH.
Inkubacija HMR23 s ''H.pylori'' je pokazala 68 % inhibicijo aktivnosti ureaze, medtem ko je starševski VHH dosegel 60 % inhibicijo, pri čemer je koncentracija obeh bila 20 μg/mL. Minimalna konc. HMR23 potrebna za inhibicijo ureaze je 0.6 μg/mL.
Z DNA sekvenciranjem HMR23 in primerjavo z DNA starševskega nanotelesa so identificirali mutirane aminokislinske ostanke. Do zamenjave je prišlo pri 13 aminokislinah, pri čemer ni prišlo do insercije nukleotidov niti spremembe bralnega okvirja.

== DISKUSIJA ==

Afinitetno zorenje protiteles s PCR podvrženo napakam in njihova predstavitev na fagih, bakterijah, kvasovkah ali ribosomih, se je že izkazalo za zelo uspešno metodo, ki je pripeljala od 4-1000x izboljšane afinitete vezave. V opisani raziskavi je mutirani VHH imel samo 1.5x večjo afiniteto od starševskega. Afiniteta bi lahko bila daleč višja, če ne bi bilo nekaj ovir. Kot prvo, večina mutacij se je zgodila v regijah, ki niso ključne za prepoznavanje antigena. CDR3 zanka, ki je najbolj variabilna v velikosti in aminokislinski sestavi in ima ključno vlogo pri prepoznavanju antigena in afiniteti vezave, je ostala nespremenjena. Kot drugo, o veliko izboljšanih afinitetah je do sedaj poročano samo za scFV fragmente, ki se po strukturi in mehanizmu vezave na antigen razlikujejo od nanoteles. Kot tretje, rezultati slednje raziskave predstavljajo analizo samo nekaj klonov. Več klonov je potrebno analizirati za pridobitev bolj specifičnih VHH in oceno učinka naključne mutageneze na afinitetno zorenje.

Funkcionalne mutacije in karakterizacija VHH proti ureazi Helicobacter pylori

2015-04-21T20:08:45Z

MarkoRadojkovic:

== UVOD ==

''Helicobacter pylori'' je vrsta mikroaerofilnih gramnegativnih bacilov iz rodu ''Helicobacter'', ki pri ljudeh povzroča vnetje želodčne sluznice in razjede v želodcu in dvanajstniku. Standardna oblika zdravljenja vključuje kombinacijo antibiotikov z zaviralci protonske črpalke. Vendar je tovrstno zdravljenje v zadnjih časih dosti oteženo, zaradi čedalje pogostejše rezistence na antibiotike. Eden izmed novih popularnih pristopov je razvoj specifičnih protiteles proti H. pylori. Encim ureaza je pomemben virulenčni dejavnik bakterije, ki nevtralizira kislo okolje in je ključen za nastanitev bakterije v gastrični mukozi. Sestavljen je iz dveh podenot (UreA in UreC), pri čemer je večja podenota UreC prisotna v vseh kliničnih vzorcih in predstavlja idealno tarčo za protitelesa. Vendar tudi zdravljenje s protitelesi ima svoje pomanjkljivosti, ki se kažejo v njihovi kompleksni zgradbi, velikosti in slabi penetraciji v tarčna tkiva.

VHH ali nanotelesa, so najmanjši antigen vezavni fragmenti (~15 kDa), ki izvirajo iz variabilnih domen kameljih protiteles. Zaradi svojih izjemnih biofizikalnih lastnostih, dobre topnosti in majhne imunogenosti, predstavljajo idealno alternativo klasičnim protitelesom in njihovim izpeljankam.
Nanotelo proti UreC podenoti ureaze H. pylori je pridobljeno s pomočjo fagne predstavitvene knjižnice iz imuniziranih kamel. V raziskavi, ki ga obravnava članek, so z naključno mutagenezo pripravili fagno knjižnico mutantov s ciljem afinitetnega zorenja.

== POTEK RAZISKAVE ==

Metoda, ki so jo v raziskavi uporabili za naključno mutagenezo, je PCR podvržena napakam, ki temelji na nenatančnem pomnoževanju tarčne DNA. Je enostavna, hitra in po ceni metoda za pripravo genomskih knjižnic. Za pripravo knjižnice mutantov so uporabili matrično DNA, ki zapisuje za UreC specifično VHH, ki so predhodno pidobili iz knjižnice imuniziranih kamel. Izvedli so 2 PCR mutageni reakciji pod različnimi reakcijskimi pogoji. PCR produkti so ligirani v fagmidni vektor in z elektroporacijo vneseni v celice ''E. coli'' TG1. Za predstavitev na površini fagnih delcev, so slednje celice transformirali z pomožnim fagom M13K07. Selekcija pozitivnih klonov je potekala na mikrotitrskih ploščicah z imobiliziranim UreC antigenom. Po štirih rundah izpiranja in vmesno obogatitvijo fagnih delcev, so naključno izbrali 25 klonov za fagno monoklonsko ELISA reakcijo. Dva klona z največjo absorbanco, HMR13 in HMR23, sta izbrana za ekspresijo v celicah ''E. coli'' BL21 (DE3).

Po uspešnem izražanju obeh VHH mutantov so s pomočjo nekompetitivne ELISE izmerili afiniteto vezave na UreC ter preverili specifičnost vezave. Z encimskim testom so preverili inhibicijo aktivnosti ureaze.

== REZULTATI ==

Novonastala knjižnica mutantov v celicah ''E.coli'' je vsebovala 4.0 x 107 različnih klonov. Po štirih postopkih izpiranja, sta dva izmed 25 naključno izbranih klonov izbrana za izražanje rekombinantnih VHH.
Analiza afinitete vezave topnih VHH na imobilizirano UreC je pokazala Kd z vrednostjo 2.63 x 10-8 M-1 za HMR23, kar predstavlja 1.5x višjo afiniteto vezave v primerjavi s starševskim VHH. HMR13 ni pokazal izboljšane afinitete.
Analiza specifičnosti je pokazala da se HMR23 veže na UreC z visoko specifičnostjo v primerjavi z ostalimi antigeni, kar kaže da mutacije niso vplivale na specifičnost VHH.
Inkubacija HMR23 s ''H.pylori'' je pokazala 68 % inhibicijo aktivnosti ureaze, medtem ko je starševski VHH dosegel 60 % inhibicijo, pri čemer je koncentracija obeh bila 20 μg/mL. Minimalna konc. HMR23 potrebna za inhibicijo ureaze je 0.6 μg/mL.
Z DNA sekvenciranjem HMR23 in primerjavo z DNA starševskega nanotelesa so identificirali mutirane aminokislinske ostanke. Do zamenjave je prišlo pri 13 aminokislinah, pri čemer ni prišlo do insercije nukleotidov niti spremembe bralnega okvirja.

== DISKUSIJA ==

Afinitetno zorenje protiteles s PCR podvrženo napakam in njihova predstavitev na fagih, bakterijah, kvasovkah ali ribosomih, se je že izkazalo za zelo uspešno metodo, ki je pripeljala od 4-1000x izboljšane afinitete vezave. V opisani raziskavi je mutirani VHH imel samo 1.5x večjo afiniteto od starševskega. Afiniteta bi lahko bila daleč višja, če ne bi bilo nekaj ovir. Kot prvo, večina mutacij se je zgodila v regijah, ki niso ključne za prepoznavanje antigena. CDR3 zanka, ki je najbolj variabilna v velikosti in aminokislinski sestavi in ima ključno vlogo pri prepoznavanju antigena in afiniteti vezave, je ostala nespremenjena. Kot drugo, o veliko izboljšanih afinitetah je do sedaj poročano samo za scFV fragmente, ki se po strukturi in mehanizmu vezave na antigen razlikujejo od nanoteles. Kot tretje, rezultati slednje raziskave predstavljajo analizo samo nekaj klonov. Več klonov je potrebno analizirati za pridobitev bolj specifičnih VHH in oceno učinka naključne mutageneze na afinitetno zorenje.

Funkcionalne mutacije in karakterizacija VHH proti ureazi Helicobacter pylori

2015-04-21T20:03:50Z

MarkoRadojkovic:

== UVOD ==

Helicobacter pylori je vrsta mikroaerofilnih gramnegativnih bacilov iz rodu Helicobacter, ki pri ljudeh povzroča vnetje želodčne sluznice in razjede v želodcu in dvanajstniku. Standardna oblika zdravljenja vključuje kombinacijo antibiotikov z zaviralci protonske črpalke. Vendar je tovrstno zdravljenje v zadnjih časih dosti oteženo, zaradi čedalje pogostejše rezistence na antibiotike. Eden izmed novih popularnih pristopov je razvoj specifičnih protiteles proti H. pylori. Encim ureaza je pomemben virulenčni dejavnik bakterije, ki nevtralizira kislo okolje in je ključen za nastanitev bakterije v gastrični mukozi. Sestavljen je iz dveh podenot (UreA in UreC), pri čemer je večja podenota UreC prisotna v vseh kliničnih vzorcih in predstavlja idealno tarčo za protitelesa. Vendar tudi zdravljenje s protitelesi ima svoje pomanjkljivosti, ki se kažejo v njihovi kompleksni zgradbi, velikosti in slabi penetraciji v tarčna tkiva.

VHH ali nanotelesa, so najmanjši antigen vezavni fragmenti (~15 kDa), ki izvirajo iz variabilnih domen kameljih protiteles. Zaradi svojih izjemnih biofizikalnih lastnostih, dobre topnosti in majhne imunogenosti, predstavljajo idealno alternativo klasičnim protitelesom in njihovim izpeljankam.
Nanotelo proti UreC podenoti ureaze H. pylori je pridobljeno s pomočjo fagne predstavitvene knjižnice iz imuniziranih kamel. V raziskavi, ki ga obravnava članek, so z naključno mutagenezo pripravili fagno knjižnico mutantov s ciljem afinitetnega zorenja.

== POTEK RAZISKAVE ==

Metoda, ki so jo v raziskavi uporabili za naključno mutagenezo, je PCR podvržena napakam, ki temelji na nenatančnem pomnoževanju tarčne DNA. Je enostavna, hitra in po ceni metoda za pripravo genomskih knjižnic. Za pripravo knjižnice mutantov so uporabili matrično DNA, ki zapisuje za UreC specifično VHH, ki so predhodno pidobili iz knjižnice imuniziranih kamel. Izvedli so 2 PCR mutageni reakciji pod različnimi reakcijskimi pogoji. PCR produkti so ligirani v fagmidni vektor in z elektroporacijo vneseni v celice E. coli TG1. Za predstavitev na površini fagnih delcev, so slednje celice transformirali z pomožnim fagom M13K07. Selekcija pozitivnih klonov je potekala na mikrotitrskih ploščicah z imobiliziranim UreC antigenom. Po štirih rundah izpiranja in vmesno obogatitvijo fagnih delcev, so naključno izbrali 25 klonov za fagno monoklonsko ELISA reakcijo. Dva klona z največjo absorbanco, HMR13 in HMR23, sta izbrana za ekspresijo v celicah E. coli BL21 (DE3).

Po uspešnem izražanju obeh VHH mutantov so s pomočjo nekompetitivne ELISE izmerili afiniteto vezave na UreC ter preverili specifičnost vezave. Z encimskim testom so preverili inhibicijo aktivnosti ureaze.

== REZULTATI ==

Novonastala knjižnica mutantov v celicah E.coli je vsebovala 4.0 x 107 različnih klonov. Po štirih postopkih izpiranja, sta dva izmed 25 naključno izbranih klonov izbrana za izražanje rekombinantnih VHH.
Analiza afinitete vezave topnih VHH na imobilizirano UreC je pokazala Kd z vrednostjo 2.63 x 10-8 M-1 za HMR23, kar predstavlja 1.5x višjo afiniteto vezave v primerjavi s starševskim VHH. HMR13 ni pokazal izboljšane afinitete.
Analiza specifičnosti je pokazala da se HMR23 veže na UreC z visoko specifičnostjo v primerjavi z ostalimi antigeni, kar kaže da mutacije niso vplivale na specifičnost VHH.
Inkubacija HMR23 s H.pylori je pokazala 68 % inhibicijo aktivnosti ureaze, medtem ko je starševski VHH dosegel 60 % inhibicijo, pri čemer je koncentracija obeh bila 20 μg/mL. Minimalna konc. HMR23 potrebna za inhibicijo ureaze je 0.6 μg/mL.
Z DNA sekvenciranjem HMR23 in primerjavo z DNA starševskega nanotelesa so identificirali mutirane aminokislinske ostanke. Do zamenjave je prišlo pri 13 aminokislinah, pri čemer ni prišlo do insercije nukleotidov niti spremembe bralnega okvirja.

== DISKUSIJA ==

Afinitetno zorenje protiteles s PCR podvrženo napakam in njihova predstavitev na fagih, bakterijah, kvasovkah ali ribosomih, se je že izkazalo za zelo uspešno metodo, ki je pripeljala od 4-1000x izboljšane afinitete vezave. V opisani raziskavi je mutirani VHH imel samo 1.5x večjo afiniteto od starševskega. Afiniteta bi lahko bila daleč višja, če ne bi bilo nekaj ovir. Kot prvo, večina mutacij se je zgodila v regijah, ki niso ključne za prepoznavanje antigena. CDR3 zanka, ki je najbolj variabilna v velikosti in aminokislinski sestavi in ima ključno vlogo pri prepoznavanju antigena in afiniteti vezave, je ostala nespremenjena. Kot drugo, o veliko izboljšanih afinitetah je do sedaj poročano samo za scFV fragmente, ki se po strukturi in mehanizmu vezave na antigen razlikujejo od nanoteles. Kot tretje, rezultati slednje raziskave predstavljajo analizo samo nekaj klonov. Več klonov je potrebno analizirati za pridobitev bolj specifičnih VHH in oceno učinka naključne mutageneze na afinitetno zorenje.

Funkcionalne mutacije in karakterizacija VHH proti ureazi Helicobacter pylori

2015-04-21T20:01:04Z

MarkoRadojkovic: New page: == UVOD == Helicobacter pylori je vrsta mikroaerofilnih gramnegativnih bacilov iz rodu Helicobacter, ki pri ljudeh povzroča vnetje želodčne sluznice in razjede v želodcu in dvanajstni...

== UVOD ==

Helicobacter pylori je vrsta mikroaerofilnih gramnegativnih bacilov iz rodu Helicobacter, ki pri ljudeh povzroča vnetje želodčne sluznice in razjede v želodcu in dvanajstniku. Standardna oblika zdravljenja vključuje kombinacijo antibiotikov z zaviralci protonske črpalke. Vendar je tovrstno zdravljenje v zadnjih časih dosti oteženo, zaradi čedalje pogostejše rezistence na antibiotike. Eden izmed novih popularnih pristopov je razvoj specifičnih protiteles proti H. pylori. Encim ureaza je pomemben virulenčni dejavnik bakterije, ki nevtralizira kislo okolje in je ključen za nastanitev bakterije v gastrični mukozi. Sestavljen je iz dveh podenot (UreA in UreC), pri čemer je večja podenota UreC prisotna v vseh kliničnih vzorcih in predstavlja idealno tarčo za protitelesa. Vendar tudi zdravljenje s protitelesi ima svoje pomanjkljivosti, ki se kažejo v njihovi kompleksni zgradbi, velikosti in slabi penetraciji v tarčna tkiva.
VHH ali nanotelesa, so najmanjši antigen vezavni fragmenti (~15 kDa), ki izvirajo iz variabilnih domen kameljih protiteles. Zaradi svojih izjemnih biofizikalnih lastnostih, dobre topnosti in majhne imunogenosti, predstavljajo idealno alternativo klasičnim protitelesom in njihovim izpeljankam.
Nanotelo proti UreC podenoti ureaze H. pylori je pridobljeno s pomočjo fagne predstavitvene knjižnice iz imuniziranih kamel. V raziskavi, ki ga obravnava članek, so z naključno mutagenezo pripravili fagno knjižnico mutantov s ciljem afinitetnega zorenja.

== POTEK RAZISKAVE ==

Metoda, ki so jo v raziskavi uporabili za naključno mutagenezo, je PCR podvržena napakam, ki temelji na nenatančnem pomnoževanju tarčne DNA. Je enostavna, hitra in po ceni metoda za pripravo genomskih knjižnic.
Za pripravo knjižnice mutantov so uporabili matrično DNA, ki zapisuje za UreC specifično VHH, ki so predhodno pidobili iz knjižnice imuniziranih kamel. Izvedli so 2 PCR mutageni reakciji pod različnimi reakcijskimi pogoji.
PCR produkti so ligirani v fagmidni vektor in z elektroporacijo vneseni v celice E. coli TG1. Za predstavitev na površini fagnih delcev, so slednje celice transformirali z pomožnim fagom M13K07.
Selekcija pozitivnih klonov je potekala na mikrotitrskih ploščicah z imobiliziranim UreC antigenom. Po štirih rundah izpiranja in vmesno obogatitvijo fagnih delcev, so naključno izbrali 25 klonov za fagno monoklonsko ELISA reakcijo. Dva klona z največjo absorbanco, HMR13 in HMR23, sta izbrana za ekspresijo v celicah E. coli BL21 (DE3).
Po uspešnem izražanju obeh VHH mutantov so s pomočjo nekompetitivne ELISE izmerili afiniteto vezave na UreC ter preverili specifičnost vezave. Z encimskim testom so preverili inhibicijo aktivnosti ureaze.

== REZULTATI ==

Novonastala knjižnica mutantov v celicah E.coli je vsebovala 4.0 x 107 različnih klonov. Po štirih postopkih izpiranja, sta dva izmed 25 naključno izbranih klonov izbrana za izražanje rekombinantnih VHH.
Analiza afinitete vezave topnih VHH na imobilizirano UreC je pokazala Kd z vrednostjo 2.63 x 10-8 M-1 za HMR23, kar predstavlja 1.5x višjo afiniteto vezave v primerjavi s starševskim VHH. HMR13 ni pokazal izboljšane afinitete.
Analiza specifičnosti je pokazala da se HMR23 veže na UreC z visoko specifičnostjo v primerjavi z ostalimi antigeni, kar kaže da mutacije niso vplivale na specifičnost VHH.
Inkubacija HMR23 s H.pylori je pokazala 68 % inhibicijo aktivnosti ureaze, medtem ko je starševski VHH dosegel 60 % inhibicijo, pri čemer je koncentracija obeh bila 20 μg/mL. Minimalna konc. HMR23 potrebna za inhibicijo ureaze je 0.6 μg/mL.
Z DNA sekvenciranjem HMR23 in primerjavo z DNA starševskega nanotelesa so identificirali mutirane aminokislinske ostanke. Do zamenjave je prišlo pri 13 aminokislinah, pri čemer ni prišlo do insercije nukleotidov niti spremembe bralnega okvirja.

== DISKUSIJA ==

Afinitetno zorenje protiteles s PCR podvrženo napakam in njihova predstavitev na fagih, bakterijah, kvasovkah ali ribosomih, se je že izkazalo za zelo uspešno metodo, ki je pripeljala od 4-1000x izboljšane afinitete vezave. V opisani raziskavi je mutirani VHH imel samo 1.5x večjo afiniteto od starševskega. Afiniteta bi lahko bila daleč višja, če ne bi bilo nekaj ovir. Kot prvo, večina mutacij se je zgodila v regijah, ki niso ključne za prepoznavanje antigena. CDR3 zanka, ki je najbolj variabilna v velikosti in aminokislinski sestavi in ima ključno vlogo pri prepoznavanju antigena in afiniteti vezave, je ostala nespremenjena. Kot drugo, o veliko izboljšanih afinitetah je do sedaj poročano samo za scFV fragmente, ki se po strukturi in mehanizmu vezave na antigen razlikujejo od nanoteles. Kot tretje, rezultati slednje raziskave predstavljajo analizo samo nekaj klonov. Več klonov je potrebno analizirati za pridobitev bolj specifičnih VHH in oceno učinka naključne mutageneze na afinitetno zorenje.

MBT seminarji 2015

2015-04-21T15:16:54Z

MarkoRadojkovic:

'''Seznam seminarjev iz Molekularne biotehnologije v študijskem letu 2014/15'''

Tabela za razpored po tednih bo objavljena v spletni učilnici, vanjo pa se vpišite tudi za kratke predstavitve novic (3 min, dvakrat v semestru). Na tej strani bo samo seznam odobrenih člankov za seminar in povezave do člankov in do povzetkov, ki jih morate objaviti najkasneje tri dni pred predstavitvijo (ponedeljek oz. torek). Angleški naslov prevedite tudi v slovenščino - to bo naslov povzetka, ki ga objavite na posebni strani, tako kot so to naredili kolegi pred vami (oz. lani).

Način vnosa:

# The importance of ''Arabidopsis'' glutathione peroxidase 8 for protecting ''Arabidopsis'' plant and ''E. coli'' cells against oxidative stress (A. Gaber; GM Crops & Food 5(1), 2014; http://dx.doi.org/10.4161/gmcr.26979) Pomen glutation peroksidaze 8 iz repnjakovca za zaščito rastline ''Arabidopsis thaliana'' in bakterije ''Escherichia coli'' pred oksidativnim stresom. Janez Novak, 15. marca 2014
(slovenski naslov povežite z novo stranjo, na kateri bo povzetek)

'''Naslovi odobrenih člankov po temah:'''

'''Gensko spremenjene rastline''' 
# Successful high-level accumulation of fish oil omega-3 long-chain polyunsaturated fatty acids in a transgenic oilseed crop (Ruiz-Lopez, N., et al; The plant journal 77, 198-208, 2014; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24308505). [[Uspešna priprava gensko spremenjene oljne rastline z visoko vsebnostjo omega-3 polinenasičenih maščobnih kislin.]] Petra Malavašič, 20. marca 2015
#A simpliﬁed and accurate detection of the genetically modiﬁed wheat MON71800 with one calibrator plasmid (Jae Juan, S.,et al; Food Chemistry 176, 1-6, ;http://www.sciencedirect.com.nukweb.nuk.uni-lj.si/science/article/pii/S03088146140196572015 [[Poenostavljena in točna detekcija gensko spemenjene pšenice MON71800 z enim kalibratorskim plazmidom]]. Matej Lesar, 20. marca 2015

'''Gensko spremenjene živali''' 
# [[A novel adenoviral vector carrying an all-in-one Tet-On system with an autoregulatory loop for tight, inducible transgene expresion]] (H. Chen; et all.; BMC Biotechnology 2015, 15:4, doi:10.1186/s12896-015-0121-4; http://www.biomedcentral.com/1472-6750/15/4). Edvinas Grauželis, 27. marca 2015 (in English)
# Production of functional active human growth factors in insects used as living biofactories (B. Dudognon, et al; Journal of Biotechnology 184, 229–239, 2014; http://dx.doi.org/10.1016/j.jbiotec.2014.05.030). [[Proizvodnja funkcionalno aktivnih človeških rastnih faktorjev v insektih uporabljenih kot žive biotovarne]] Maxi Sagmeister, 27. marca 2015

'''Okolje''' 
# Bioremediation of pesticide contaminated water using an organophosphate degrading enzyme immobilized on nonwoven polyester textiles (Yuan Gao ''et al.'', Enzyme and Microbial Technology, vol. 54, pages 38-44, 10.1.2014, http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0141022913002044). [[Bioremediacija s pesticidi okužene vode z uporabo encima, ki razgrajuje organofosfate in je vezan na netkan poliestrski tekstil]]. Mitja Crček, 3. aprila 2015
# Biodegradation of atrazine by three transgenic grasses and alfalfa expressing a modified bacterial atrazine chlorohydrolase gene (A. W. Vail ''et al.''; Transgenic Research, 29. 11. 2014; http://link.springer.com/article/10.1007/s11248-014-9851-7). [[Biorazgradnja atrazina s tremi transgenskimi travami in lucerno, ki izražajo gen za modificirano bakterijsko atrazin klorohidrolazo]]. Mirjam Kmetič, 3. aprila 2015

'''Terapevtiki''' 
# Glycosylated enfuvirtide: A long-lasting glycopeptide with potent anti-HIV activity; http://pubs.acs.org/doi/full/10.1021/jm5016582 [[Glikoliziran Enfuvirtid: glikopeptid z močno proti HIV aktivnostjo s podaljšanim delovanjem]]. Sebastian Pleško, 10. aprila
# Microbicidal effects of α- and θ-defensins against antibiotic-resistant Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa; http://ini.sagepub.com/content/21/1/17.long. [[Mikrobicidno delovanje α in θ defenzinov na antibiotik-odporne Staphylococcus aureus in Pseudomonas aeruginosa]]. Ana Kapraljević, 10. aprila

'''Encimi''' 
# Immobilization and controlled release of β-galactosidase from chitosan-grafted hydrogels; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0308814615001028. [[Imobilizacija in nadzorovano sproščanje β-galaktozidaze iz hitozanskega hidrogela]]. Mojca Banič, 16. aprila 2015
# Construction of efficient xylose utilizing ''Pichia pastoris'' for industrial enzyme production (Li ''et al''; Microbial Cell Factories 14:22, 1-10, 2015; http://www.microbialcellfactories.com/content/14/1/22). [[Priprava Pichie pastoris, ki učinkovito uporablja ksilozo, za industrijsko proizvodnjo encimov]]. Špela Tomaž, 17. aprila 2015
# Postharvest application of a novel chitinase cloned from ''Metschnikowia fructicola'' and overexpressed in ''Pichia pastoris'' to control brown rot of peaches; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0168160515000033. [[Uporaba hitinaze, klonirane iz Metschnikowie fructicola in prekomerno izražene v Pichii pastoris za nadzor rjave gnilobe breskev po obiranju]] Špela Pohleven, 17. aprila 2015

'''Protitelesa''' 
# Optimization of heavy chain and light chain signal peptides for high level expression of therapeutic antibodies in CHO cells; http://dx.plos.org/10.1371/journal.pone.0116878. Tjaša Blatnik, 23. aprila 2015
# Ethanol precipitation for purification of recombinant antibodies (A. Tscheliessnig ''et al''; Journal of Biotechnology 188, 17-28, 2014; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0168165614007810). Čiščenje rekombinantnih protiteles z obarjanjem z etanolom. Urška Rauter, 24. aprila 2015
# Functional mutations in and characterization of VHH against Helicobacter pylori urease (R. Hoseinpoor ''et al''; Applied Biochemistry and Biotechnology 172, 3079-3091, 2014; http://link.springer.com/article/10.1007/s12010-014-0750-4). Funkcionalne mutacije in karakterizacija VHH proti ureazi ''Helicobacter pylori''. Marko Radojković, 7. maja 2015

'''Cepiva''' 
# Development of anti-E6 pegylated lipoplexes for mucosal application in the context of cervical preneoplastic lesions; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0378517315001507. Tanja Korpar, 7. maja 2015
# A novel “priming-boosting” strategy for immune interventions in cervical cancer (S. Liao et al.; Molecular Immunology 64, 295-305, 2015, http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0161589014003460. Nova "priming-boosting" strategija za imunsko posredovanje pri raku materničnega vratu. Anita Kustec, 8. maja 2015
# Potentiation of anthrax vaccines using protective antigen-expressing viral replicon vectors (H.C. Wang et al.; Immunology letters 163, 206-213, 2015, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25102364 ) Izboljšava cepiv proti antraksu z uporabo iz virusnih replikonov izvedenih vektorjev, ki omogočajo izražanje zaščitnega antigena. Daša Pavc, 8. maja 2015

'''Male molekule in polimeri''' 
# Methanol-induced chain termination in poly(3-hydroxybutyrate) biopolymers: Molecular weight control; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0141813014008307. Gašper Lavrenčič, 14. maja 2015
# Purification and characterization of gamma poly glutamic acid from newly Bacillus licheniformis NRC20; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0141813014008216. Uroš Stupar, 14. maja 2015
# Iza Ogris, 15. maja 2015
# Chromosomal integration of hyaluronic acid synthesis (''has'') genes enhances the molecular weight of hyaluronan produced in ''Lactococcus lactis'' (R. V. Hmar et al; Biotechnol. J. 9 (12), 2014; http://dx.doi.org/10.1002/biot.201400215) Integracija genov za sintezo hialuronske kisline v kromosom bakterije ''Lactococcus lactis'' izboljša sintezo visokomolekularne hialuronske kisline. Maja Grdadolnik, 15. maja 2015

'''Pretvorba biomase''' 
# Effect of pretreatment methods on the synergism of cellulase and xylanase during the hydrolysis of bagasse; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0960852415002114. Eva Lucija Kozak, 21. maja 2015
# Third generation biohydrogen production by Clostridium butyricum and adapted mixed cultures from Scenedesmus obliquus microalga biomass; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0016236115002550?np=y. Nives Naraglav, 22. maja 2015
# Bio-catalytic action of twin-screw extruder enzymatic hydrolysis on the deconstruction of annual plant material: Case of sweet corn co-products; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0926669015000436. Griša Prinčič, 22. maja 2015

'''Metabolično inženirstvo''' 
# Engineering lipid overproduction in the oleaginous yeast Yarrowia lipolytica;http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1096717615000166. Andreja Bratovš, 28. maja 2015
# Metabolic engineering of Saccharomyces cerevisiae for production of fatty acid-derived biofuels and chemicals (Weerawat Runguphana, Jay D. Keasling; Metabolic Engineering, vol 21, January 2014, Pages 103–113; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1096717613000670). Metabolično inženirstvo ''Saccharomyces cerevisiae'' za proizvodnjo derivatov maščobnih kislin, ki so primerni za biogorivo in kemikalije. Dominik Kert, 29. maja 2015
# Metabolic engineering of Klebsiella pneumoniae for the production of cis,cis-muconic acid (Jung,H.-M. Jung,M.-Y. Oh, M.-K.;Applied Microbiology and Biotechnology, Published online: 14 February 2015; http://link.springer.com/article/10.1007/s00253-015-6442-3). Metabolno inženirstvo Klebsiella pneumoniae za produkcijo cis,cis-mukonične kisline. Jure Zabret, 29. maja 2015

'''Biološki viri energije''' 
# Anodic and cathodic microbial communities in single chamber microbial fuel cells; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1871678414021694. Tamara Marić, 4. junija 2015
# Combination of dry dark fermentation and mechanical pretreatment for lignocellulosic deconstruction: An innovative strategy for biofuels and volatile fatty acids recovery; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0306261915002196. Jernej Pušnik, 4. junija 2015
# Potential use of feedlot cattle manure for bioethanol production; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0960852415001960. Nastja Pirman, 5. junija 2015
# Cellulolytic enzymes produced by a newly isolated soil fungus Penicillium sp. TG2 with potential for use in cellulosic ethanol production; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0960148114007022. Jana Verbančič, 5. junija 2015

'''Novi pristopi v molekularni biotehnologiji''' 
# Exploring the potential of algae/bacteria interactions; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0958166915000269. Matja Zalar, 11. junija
# How close we are to achieving commercially viable large-scale photobiological hydrogen production by cyanobacteria: A review of the biological aspects; http://www.mdpi.com/2075-1729/5/1/997/htm. Monika Škrjanc, 11. junija
# Mind-controlled transgene expression by a wireless-powered optogenetic designer cell implant (M. Folcher; Nature Communications 5, 1–11, 2014; http://www.nature.com/ncomms/2014/141111/ncomms6392/full/ncomms6392.html) Z EEG nadzorovano izražanje transgena preko brezžično napajanega optogenetskega celičnega vsadka. Luka Smole, 11. junija 2015

MBT seminarji 2015

2015-04-21T15:15:11Z

MarkoRadojkovic:

'''Seznam seminarjev iz Molekularne biotehnologije v študijskem letu 2014/15'''

Tabela za razpored po tednih bo objavljena v spletni učilnici, vanjo pa se vpišite tudi za kratke predstavitve novic (3 min, dvakrat v semestru). Na tej strani bo samo seznam odobrenih člankov za seminar in povezave do člankov in do povzetkov, ki jih morate objaviti najkasneje tri dni pred predstavitvijo (ponedeljek oz. torek). Angleški naslov prevedite tudi v slovenščino - to bo naslov povzetka, ki ga objavite na posebni strani, tako kot so to naredili kolegi pred vami (oz. lani).

Način vnosa:

# The importance of ''Arabidopsis'' glutathione peroxidase 8 for protecting ''Arabidopsis'' plant and ''E. coli'' cells against oxidative stress (A. Gaber; GM Crops & Food 5(1), 2014; http://dx.doi.org/10.4161/gmcr.26979) Pomen glutation peroksidaze 8 iz repnjakovca za zaščito rastline ''Arabidopsis thaliana'' in bakterije ''Escherichia coli'' pred oksidativnim stresom. Janez Novak, 15. marca 2014
(slovenski naslov povežite z novo stranjo, na kateri bo povzetek)

'''Naslovi odobrenih člankov po temah:'''

'''Gensko spremenjene rastline''' 
# Successful high-level accumulation of fish oil omega-3 long-chain polyunsaturated fatty acids in a transgenic oilseed crop (Ruiz-Lopez, N., et al; The plant journal 77, 198-208, 2014; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24308505). [[Uspešna priprava gensko spremenjene oljne rastline z visoko vsebnostjo omega-3 polinenasičenih maščobnih kislin.]] Petra Malavašič, 20. marca 2015
#A simpliﬁed and accurate detection of the genetically modiﬁed wheat MON71800 with one calibrator plasmid (Jae Juan, S.,et al; Food Chemistry 176, 1-6, ;http://www.sciencedirect.com.nukweb.nuk.uni-lj.si/science/article/pii/S03088146140196572015 [[Poenostavljena in točna detekcija gensko spemenjene pšenice MON71800 z enim kalibratorskim plazmidom]]. Matej Lesar, 20. marca 2015

'''Gensko spremenjene živali''' 
# [[A novel adenoviral vector carrying an all-in-one Tet-On system with an autoregulatory loop for tight, inducible transgene expresion]] (H. Chen; et all.; BMC Biotechnology 2015, 15:4, doi:10.1186/s12896-015-0121-4; http://www.biomedcentral.com/1472-6750/15/4). Edvinas Grauželis, 27. marca 2015 (in English)
# Production of functional active human growth factors in insects used as living biofactories (B. Dudognon, et al; Journal of Biotechnology 184, 229–239, 2014; http://dx.doi.org/10.1016/j.jbiotec.2014.05.030). [[Proizvodnja funkcionalno aktivnih človeških rastnih faktorjev v insektih uporabljenih kot žive biotovarne]] Maxi Sagmeister, 27. marca 2015

'''Okolje''' 
# Bioremediation of pesticide contaminated water using an organophosphate degrading enzyme immobilized on nonwoven polyester textiles (Yuan Gao ''et al.'', Enzyme and Microbial Technology, vol. 54, pages 38-44, 10.1.2014, http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0141022913002044). [[Bioremediacija s pesticidi okužene vode z uporabo encima, ki razgrajuje organofosfate in je vezan na netkan poliestrski tekstil]]. Mitja Crček, 3. aprila 2015
# Biodegradation of atrazine by three transgenic grasses and alfalfa expressing a modified bacterial atrazine chlorohydrolase gene (A. W. Vail ''et al.''; Transgenic Research, 29. 11. 2014; http://link.springer.com/article/10.1007/s11248-014-9851-7). [[Biorazgradnja atrazina s tremi transgenskimi travami in lucerno, ki izražajo gen za modificirano bakterijsko atrazin klorohidrolazo]]. Mirjam Kmetič, 3. aprila 2015

'''Terapevtiki''' 
# Glycosylated enfuvirtide: A long-lasting glycopeptide with potent anti-HIV activity; http://pubs.acs.org/doi/full/10.1021/jm5016582 [[Glikoliziran Enfuvirtid: glikopeptid z močno proti HIV aktivnostjo s podaljšanim delovanjem]]. Sebastian Pleško, 10. aprila
# Microbicidal effects of α- and θ-defensins against antibiotic-resistant Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa; http://ini.sagepub.com/content/21/1/17.long. [[Mikrobicidno delovanje α in θ defenzinov na antibiotik-odporne Staphylococcus aureus in Pseudomonas aeruginosa]]. Ana Kapraljević, 10. aprila

'''Encimi''' 
# Immobilization and controlled release of β-galactosidase from chitosan-grafted hydrogels; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0308814615001028. [[Imobilizacija in nadzorovano sproščanje β-galaktozidaze iz hitozanskega hidrogela]]. Mojca Banič, 16. aprila 2015
# Construction of efficient xylose utilizing ''Pichia pastoris'' for industrial enzyme production (Li ''et al''; Microbial Cell Factories 14:22, 1-10, 2015; http://www.microbialcellfactories.com/content/14/1/22). [[Priprava Pichie pastoris, ki učinkovito uporablja ksilozo, za industrijsko proizvodnjo encimov]]. Špela Tomaž, 17. aprila 2015
# Postharvest application of a novel chitinase cloned from ''Metschnikowia fructicola'' and overexpressed in ''Pichia pastoris'' to control brown rot of peaches; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0168160515000033. [[Uporaba hitinaze, klonirane iz Metschnikowie fructicola in prekomerno izražene v Pichii pastoris za nadzor rjave gnilobe breskev po obiranju]] Špela Pohleven, 17. aprila 2015

'''Protitelesa''' 
# Optimization of heavy chain and light chain signal peptides for high level expression of therapeutic antibodies in CHO cells; http://dx.plos.org/10.1371/journal.pone.0116878. Tjaša Blatnik, 23. aprila 2015
# Ethanol precipitation for purification of recombinant antibodies (A. Tscheliessnig ''et al''; Journal of Biotechnology 188, 17-28, 2014; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0168165614007810). Čiščenje rekombinantnih protiteles z obarjanjem z etanolom. Urška Rauter, 24. aprila 2015
# Functional mutations in and characterization of VHH against Helicobacter pylori urease (R. Hoseinpoor ''et al''; Applied Biochemistry and Biotechnology 172, 3079-3091, 2014; http://link.springer.com/article/10.1007/s12010-014-0750-4). [[Funkcionalne mutacije in karakterizacija VHH proti ureazi ''Helicobacter pylori'']]. Marko Radojković, 7. maja 2015

'''Cepiva''' 
# Development of anti-E6 pegylated lipoplexes for mucosal application in the context of cervical preneoplastic lesions; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0378517315001507. Tanja Korpar, 7. maja 2015
# A novel “priming-boosting” strategy for immune interventions in cervical cancer (S. Liao et al.; Molecular Immunology 64, 295-305, 2015, http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0161589014003460. Nova "priming-boosting" strategija za imunsko posredovanje pri raku materničnega vratu. Anita Kustec, 8. maja 2015
# Potentiation of anthrax vaccines using protective antigen-expressing viral replicon vectors (H.C. Wang et al.; Immunology letters 163, 206-213, 2015, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25102364 ) Izboljšava cepiv proti antraksu z uporabo iz virusnih replikonov izvedenih vektorjev, ki omogočajo izražanje zaščitnega antigena. Daša Pavc, 8. maja 2015

'''Male molekule in polimeri''' 
# Methanol-induced chain termination in poly(3-hydroxybutyrate) biopolymers: Molecular weight control; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0141813014008307. Gašper Lavrenčič, 14. maja 2015
# Purification and characterization of gamma poly glutamic acid from newly Bacillus licheniformis NRC20; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0141813014008216. Uroš Stupar, 14. maja 2015
# Iza Ogris, 15. maja 2015
# Chromosomal integration of hyaluronic acid synthesis (''has'') genes enhances the molecular weight of hyaluronan produced in ''Lactococcus lactis'' (R. V. Hmar et al; Biotechnol. J. 9 (12), 2014; http://dx.doi.org/10.1002/biot.201400215) Integracija genov za sintezo hialuronske kisline v kromosom bakterije ''Lactococcus lactis'' izboljša sintezo visokomolekularne hialuronske kisline. Maja Grdadolnik, 15. maja 2015

'''Pretvorba biomase''' 
# Effect of pretreatment methods on the synergism of cellulase and xylanase during the hydrolysis of bagasse; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0960852415002114. Eva Lucija Kozak, 21. maja 2015
# Third generation biohydrogen production by Clostridium butyricum and adapted mixed cultures from Scenedesmus obliquus microalga biomass; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0016236115002550?np=y. Nives Naraglav, 22. maja 2015
# Bio-catalytic action of twin-screw extruder enzymatic hydrolysis on the deconstruction of annual plant material: Case of sweet corn co-products; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0926669015000436. Griša Prinčič, 22. maja 2015

'''Metabolično inženirstvo''' 
# Engineering lipid overproduction in the oleaginous yeast Yarrowia lipolytica;http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1096717615000166. Andreja Bratovš, 28. maja 2015
# Metabolic engineering of Saccharomyces cerevisiae for production of fatty acid-derived biofuels and chemicals (Weerawat Runguphana, Jay D. Keasling; Metabolic Engineering, vol 21, January 2014, Pages 103–113; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1096717613000670). Metabolično inženirstvo ''Saccharomyces cerevisiae'' za proizvodnjo derivatov maščobnih kislin, ki so primerni za biogorivo in kemikalije. Dominik Kert, 29. maja 2015
# Metabolic engineering of Klebsiella pneumoniae for the production of cis,cis-muconic acid (Jung,H.-M. Jung,M.-Y. Oh, M.-K.;Applied Microbiology and Biotechnology, Published online: 14 February 2015; http://link.springer.com/article/10.1007/s00253-015-6442-3). Metabolno inženirstvo Klebsiella pneumoniae za produkcijo cis,cis-mukonične kisline. Jure Zabret, 29. maja 2015

'''Biološki viri energije''' 
# Anodic and cathodic microbial communities in single chamber microbial fuel cells; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1871678414021694. Tamara Marić, 4. junija 2015
# Combination of dry dark fermentation and mechanical pretreatment for lignocellulosic deconstruction: An innovative strategy for biofuels and volatile fatty acids recovery; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0306261915002196. Jernej Pušnik, 4. junija 2015
# Potential use of feedlot cattle manure for bioethanol production; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0960852415001960. Nastja Pirman, 5. junija 2015
# Cellulolytic enzymes produced by a newly isolated soil fungus Penicillium sp. TG2 with potential for use in cellulosic ethanol production; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0960148114007022. Jana Verbančič, 5. junija 2015

'''Novi pristopi v molekularni biotehnologiji''' 
# Exploring the potential of algae/bacteria interactions; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0958166915000269. Matja Zalar, 11. junija
# How close we are to achieving commercially viable large-scale photobiological hydrogen production by cyanobacteria: A review of the biological aspects; http://www.mdpi.com/2075-1729/5/1/997/htm. Monika Škrjanc, 11. junija
# Mind-controlled transgene expression by a wireless-powered optogenetic designer cell implant (M. Folcher; Nature Communications 5, 1–11, 2014; http://www.nature.com/ncomms/2014/141111/ncomms6392/full/ncomms6392.html) Z EEG nadzorovano izražanje transgena preko brezžično napajanega optogenetskega celičnega vsadka. Luka Smole, 11. junija 2015

MBT seminarji 2015

2015-04-02T18:08:40Z

MarkoRadojkovic:

'''Seznam seminarjev iz Molekularne biotehnologije v študijskem letu 2014/15'''

Tabela za razpored po tednih bo objavljena v spletni učilnici, vanjo pa se vpišite tudi za kratke predstavitve novic (3 min, dvakrat v semestru). Na tej strani bo samo seznam odobrenih člankov za seminar in povezave do člankov in do povzetkov, ki jih morate objaviti najkasneje tri dni pred predstavitvijo (ponedeljek oz. torek). Angleški naslov prevedite tudi v slovenščino - to bo naslov povzetka, ki ga objavite na posebni strani, tako kot so to naredili kolegi pred vami (oz. lani).

Način vnosa:

# The importance of ''Arabidopsis'' glutathione peroxidase 8 for protecting ''Arabidopsis'' plant and ''E. coli'' cells against oxidative stress (A. Gaber; GM Crops & Food 5(1), 2014; http://dx.doi.org/10.4161/gmcr.26979) Pomen glutation peroksidaze 8 iz repnjakovca za zaščito rastline ''Arabidopsis thaliana'' in bakterije ''Escherichia coli'' pred oksidativnim stresom. Janez Novak, 15. marca 2014
(slovenski naslov povežite z novo stranjo, na kateri bo povzetek)

'''Naslovi odobrenih člankov po temah:'''

'''Gensko spremenjene rastline''' 
# Successful high-level accumulation of fish oil omega-3 long-chain polyunsaturated fatty acids in a transgenic oilseed crop (Ruiz-Lopez, N., et al; The plant journal 77, 198-208, 2014; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24308505). [[Uspešna priprava gensko spremenjene oljne rastline z visoko vsebnostjo omega-3 polinenasičenih maščobnih kislin.]] Petra Malavašič, 20. marca 2015
#A simpliﬁed and accurate detection of the genetically modiﬁed wheat MON71800 with one calibrator plasmid (Jae Juan, S.,et al; Food Chemistry 176, 1-6, ;http://www.sciencedirect.com.nukweb.nuk.uni-lj.si/science/article/pii/S03088146140196572015 [[Poenostavljena in točna detekcija gensko spemenjene pšenice MON71800 z enim kalibratorskim plazmidom]]. Matej Lesar, 20. marca 2015

'''Gensko spremenjene živali''' 
# [[A novel adenoviral vector carrying an all-in-one Tet-On system with an autoregulatory loop for tight, inducible transgene expresion]] (H. Chen; et all.; BMC Biotechnology 2015, 15:4, doi:10.1186/s12896-015-0121-4; http://www.biomedcentral.com/1472-6750/15/4). Edvinas Grauželis, 27. marca 2015 (in English)
# Production of functional active human growth factors in insects used as living biofactories (B. Dudognon, et al; Journal of Biotechnology 184, 229–239, 2014; http://dx.doi.org/10.1016/j.jbiotec.2014.05.030). [[Proizvodnja funkcionalno aktivnih človeških rastnih faktorjev v insektih uporabljenih kot žive biotovarne]] Maxi Sagmeister, 27. marca 2015

'''Okolje''' 
# Bioremediation of pesticide contaminated water using an organophosphate degrading enzyme immobilized on nonwoven polyester textiles (Yuan Gao ''et al.'', Enzyme and Microbial Technology, vol. 54, pages 38-44, 10.1.2014, http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0141022913002044). [[Bioremediacija s pesticidi okužene vode z uporabo encima, ki razgrajuje organofosfate in je vezan na netkan poliestrski tekstil]]. Mitja Crček, 3. aprila 2015
# Biodegradation of atrazine by three transgenic grasses and alfalfa expressing a modified bacterial atrazine chlorohydrolase gene (A. W. Vail ''et al.''; Transgenic Research, 29. 11. 2014; http://link.springer.com/article/10.1007/s11248-014-9851-7). [[Biorazgradnja atrazina s tremi transgenskimi travami in lucerno, ki izražajo gen za modificirano bakterijsko atrazin klorohidrolazo]]. Mirjam Kmetič, 3. aprila 2015

'''Terapevtiki''' 
# Mind-controlled transgene expression by a wireless-powered optogenetic designer cell implant (M. Folcher; Nature Communications 5, 1–11, 2014; http://www.nature.com/ncomms/2014/141111/ncomms6392/full/ncomms6392.html) Z EEG nadzorovano izražanje transgena preko brezžično napajanega optogenetskega celičnega vsadka. Luka Smole, 10. aprila 2015
# Glycosylated enfuvirtide: A long-lasting glycopeptide with potent anti-HIV activity; http://pubs.acs.org/doi/full/10.1021/jm5016582 Sebastian Pleško, 10. aprila
# Microbicidal effects of α- and θ-defensins against antibiotic-resistant Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa; http://ini.sagepub.com/content/21/1/17.long. Ana Kapraljević, 10. aprila

'''Encimi''' 
# Immobilization and controlled release of β-galactosidase from chitosan-grafted hydrogels; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0308814615001028. Mojca Banič, 16. aprila 2015
# Construction of efficient xylose utilizing ''Pichia pastoris'' for industrial enzyme production (Li ''et al''; Microbial Cell Factories 14:22, 1-10, 2015; http://www.microbialcellfactories.com/content/14/1/22). Priprava ''Pichie pastoris'', ki učinkovito uporablja ksilozo, za industrijsko proizvodnjo encimov. Špela Tomaž, 17. aprila 2015
# Postharvest application of a novel chitinase cloned from Metschnikowia fructicola and overexpressed in Pichia pastoris to control brown rot of peaches; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0168160515000033. Špela Pohleven, 17. aprila 2015

'''Protitelesa''' 
# Optimization of heavy chain and light chain signal peptides for high level expression of therapeutic antibodies in CHO cells; http://dx.plos.org/10.1371/journal.pone.0116878. Tjaša Blatnik, 23. aprila 2015
# Ethanol precipitation for purification of recombinant antibodies (A. Tscheliessnig ''et al''; Journal of Biotechnology 188, 17-28, 2014; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0168165614007810). Čiščenje rekombinantnih protiteles z obarjanjem z etanolom. Urška Rauter, 24. aprila 2015
# Functional mutations in and characterization of VHH against Helicobacter pylori urease (R. Hoseinpoor ''et al''; Applied Biochemistry and Biotechnology 172, 3079-3091, 2014; http://link.springer.com/article/10.1007/s12010-014-0750-4). Funkcionalne mutacije in karakterizacija VHH proti ureazi ''Helicobacter pylori''. Marko Radojković, 7. maja 2015

'''Cepiva''' 
# Development of anti-E6 pegylated lipoplexes for mucosal application in the context of cervical preneoplastic lesions; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0378517315001507. Tanja Korpar, 7. maja 2015
# A novel “priming-boosting” strategy for immune interventions in cervical cancer (S. Liao et al.; Molecular Immunology 64, 295-305, 2015, http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0161589014003460. Nova "priming-boosting" strategija za imunsko posredovanje pri raku materničnega vratu. Anita Kustec, 8. maja 2015
# Potentiation of anthrax vaccines using protective antigen-expressing viral replicon vectors (H.C. Wang et al.; Immunology letters 163, 206-213, 2015, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25102364 ) Izboljšava cepiv proti antraksu z uporabo iz virusnih replikonov izvedenih vektorjev, ki omogočajo izražanje zaščitnega antigena. Daša Pavc, 8. maja 2015

'''Male molekule in polimeri''' 
# Methanol-induced chain termination in poly(3-hydroxybutyrate) biopolymers: Molecular weight control; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0141813014008307. Gašper Lavrenčič, 14. maja 2015
# Purification and characterization of gamma poly glutamic acid from newly Bacillus licheniformis NRC20; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0141813014008216. Uroš Stupar, 14. maja 2015
# Iza Ogris, 15. maja 2015
# Chromosomal integration of hyaluronic acid synthesis (''has'') genes enhances the molecular weight of hyaluronan produced in ''Lactococcus lactis'' (R. V. Hmar et al; Biotechnol. J. 9 (12), 2014; http://dx.doi.org/10.1002/biot.201400215) Integracija genov za sintezo hialuronske kisline v kromosom bakterije ''Lactococcus lactis'' izboljša sintezo visokomolekularne hialuronske kisline. Maja Grdadolnik, 15. maja 2015

'''Pretvorba biomase''' 
# Effect of pretreatment methods on the synergism of cellulase and xylanase during the hydrolysis of bagasse; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0960852415002114. Eva Lucija Kozak, 21. maja 2015
# Third generation biohydrogen production by Clostridium butyricum and adapted mixed cultures from Scenedesmus obliquus microalga biomass; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0016236115002550?np=y. Nives Naraglav, 22. maja 2015
# Bio-catalytic action of twin-screw extruder enzymatic hydrolysis on the deconstruction of annual plant material: Case of sweet corn co-products; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0926669015000436. Griša Prinčič, 22. maja 2015

'''Metabolično inženirstvo''' 
# Engineering lipid overproduction in the oleaginous yeast Yarrowia lipolytica;http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1096717615000166. Andreja Bratovš, 28. maja 2015
# Metabolic engineering of Saccharomyces cerevisiae for production of fatty acid-derived biofuels and chemicals (Weerawat Runguphana, Jay D. Keasling; Metabolic Engineering, vol 21, January 2014, Pages 103–113; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1096717613000670). Metabolično inženirstvo ''Saccharomyces cerevisiae'' za proizvodnjo derivatov maščobnih kislin, ki so primerni za biogorivo in kemikalije. Dominik Kert, 29. maja 2015
# Metabolic engineering of Klebsiella pneumoniae for the production of cis,cis-muconic acid (Jung,H.-M. Jung,M.-Y. Oh, M.-K.;Applied Microbiology and Biotechnology, Published online: 14 February 2015; http://link.springer.com/article/10.1007/s00253-015-6442-3). Metabolno inženirstvo Klebsiella pneumoniae za produkcijo cis,cis-mukonične kisline. Jure Zabret, 29. maja 2015

'''Biološki viri energije''' 
# Anodic and cathodic microbial communities in single chamber microbial fuel cells; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1871678414021694. Tamara Marić, 4. junija 2015
# Combination of dry dark fermentation and mechanical pretreatment for lignocellulosic deconstruction: An innovative strategy for biofuels and volatile fatty acids recovery; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0306261915002196. Jernej Pušnik, 4. junija 2015
# Potential use of feedlot cattle manure for bioethanol production; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0960852415001960. Nastja Pirman, 5. junija 2015
# Cellulolytic enzymes produced by a newly isolated soil fungus Penicillium sp. TG2 with potential for use in cellulosic ethanol production; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0960148114007022. Jana Verbančič, 5. junija 2015

'''Novi pristopi v molekularni biotehnologiji''' 
# Exploring the potential of algae/bacteria interactions; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0958166915000269. Matja Zalar, 11. junija
# How close we are to achieving commercially viable large-scale photobiological hydrogen production by cyanobacteria: A review of the biological aspects; http://www.mdpi.com/2075-1729/5/1/997/htm. Monika Škrjanc, 11. junija

MBT seminarji 2015

2015-03-14T19:05:58Z

MarkoRadojkovic:

MBT seminarji 2015

2015-03-09T09:50:41Z

MarkoRadojkovic:

BIO2 Povzetki seminarjev 2011

2011-12-01T22:39:08Z

MarkoRadojkovic: /* Marko Radojković: Fluoroscentni proteini in njihova uporaba v živčnem sistemu */

== Ula Štok: Neuregulin 1 ==

Neuregulin-1 je član proteinov iz družine neuregulinov in je kodiran s strani gena NRG1. Obstaja veliko tipov Neuregulina-1, ki se razlikujejo po funkcionalnosti ter mestu v telesu na katerem delujejo. Najpogosteje delujejo v živčnem sistemu, kjer lahko z nepravilnim delovanjem med drugimi povzročajo tudi zelo razširjeno bolezen - shizofrenijo. Delujejo pa tudi na ostalih tkivih in organih (na primer: srce, pljuča, oprsje in želodec). Generalno obstajata dve poti signaliziranja Neuregulina-1, in sicer: Običajna ter neobičajna pot. Pri običajni poti je ErbB receptor aktiviran direktno, v enem koraku z vezavo Neuregulina-1. To najpogosteje povzroči dimerizacijo ali heterodimerizacijo ErbB receptorja. Dimerizacija ali heterodimerizacija sicer nista nujno potrebni, a vendar do njiju pride na skoraj vseh receptorjih ErbB. Ta združitev povzroči avto- in trans-fosforilacijo intracelularnih domen tega receptorja, kar aktivira vse nadaljnje poti signaliziranja. V končni fazi pa NRG1/ErbB signaliziranje vpliva direktno na transkripcijo. Pri neobičajni poti je postopek podoben, a vendar poteka začetna stopnja malo drugače. Na začetku namreč sodeluje JMa oblika receptorja ErbB4, ki se pod vplivom TACE cepi. Del receptorja (ErbB4-CTF) se odcepi v notranjost celice. Ta peptid je velik približno 80 kD in ima specifično izoblikovano vezavno mesto za Neuregulin-1. Nadaljnji procesi pa potekajo zelo podobno kot pri običajni signalni poti. Neuregulin-1 lahko povzroča shizofrenijo na različne načine, saj sodeluje pri zelo pomembnih procesih, kot so: tvorba sinaps, mielinizacija aksonov, razvoj oligodendrocit itd. Shizofrenija je zelo razširjena bolezen in nihče še ni odkril direktnega postopka k popolni odpravi te bolezni. A vendar, v letu 2009 se je zgodila neke vrste prelomnica v študiju shizofrenije. Odkrili so namreč, da posamezniki, ki so imeli gen za shizofrenijo niso zboleli. Še več! Napaka se jim je odrazila kot zvišanje kreativnih sposobnosti na znanstvenem ali umetniškem področju, odvisno od posameznika. Ob tem se je pojavilo mnogo vprašanj, saj bi na ta način mogoče lahko poiskali pot, da bi shizofrenija postala popolnoma ozdravljiva. A vendar, je to področje še raziskano, saj znanstveniki ne vedo po kakšnih poteh pride do tega, da te mutacije na NRG1 genu ne izrazijo v bolezenskem stanju.

== Maša Mirković: Proteinski produkti genov za disleksijo in z disleksijo povezane motnje ==

Disleksija je motnja, ki se kaže v nesposobnosti branja oziroma razumevanja prebranega, ter napakah in težavah pri izgovarjanju besed. Disleksiki,kot imenujemo posameznike, ki trpijo za disleksijo, imajo kljub normalnim intelektualnim sposobnostim, znanjem in izobrazbo, moteni veščini pisanja in branja s tendenco, da pomešajo med seboj črke ali besede med branjem ali pisanjem. V zadnjih letih, so uspeli ugotoviti mesta na kromosomih, povezana z dovzetnostjo za disleksijo. DYX1C1,KIAA0319,DCDC2 in ROBO1, so bili označeni kot kandidati, z dovzetnostjo za disleksijo. Najbolj obetaven je protein KIAA0319. Je transmembranski protein iz desetih transmembranskih vijačnic, najden v plazemski membrani nevronov. Njegov C-terminalni konec gleda v ekstracelularni matriks, manjši N-terminalni konec pa prehaja v citoplazmo nevrona. C-terminalni konec je visoko glikoziliran in nosi 5 PKD(polycystyc kidney desease) domene in eno MANEC(motif at the N terminus with eight cysteines) domeno. KIAA0319 igra vlogo pri rasti možganov in njihovi migraciji med razvojem možganov-iz tega je razvidno, da je disleksija problem v razvoju nevronov že v zgodnjih letih. Posamezniki z disleksijo nosijo izoobliko tega proteina, ki povzroči nižjo izraženost le tega. Spremembe so v 5'-regiji, ki kodira izoobliko proteina. Najopaznejše povezave z disleksijo se kažejo v 2,3 kb regiji, ki zavzema promotor, prvi nepreveden ekson in del prvega introna – odprti kromatin. Te ugotovitve vodijo, da je 5'-regija KIAA0319 gena tista lokacija alelov, ki največ prispeva k motnji branja.

== Katra Koman: INZULIN ==

Inzulin je peptidni hormon, ki sodeluje v uravnavanju ravni glukoze v krvi. Sintetizira in skladišči se v β-celicah Langerhansovih otočkov trebušne slinavke. Sinteza poteka od prekurzorske molekule preproinzulina preko proinzulina do dokončne zrele molekule inzulina, ki se shrani v skladiščnih veziklih. Ob povišanju ravni glukoze v krvi, na primer po obroku, glukoza, ki je tudi glavni stimulator sekrecije inzulina, iz krvi preide v β-celice skozi GLUT2 transporter. Tam se fosforilira v glukozo-6-fosfat, saj tako fosforilirana ne more več iz celice, lahko pa vstopi v proces glikolize, ki mu sledita še Krebsov cikel in oksidativna fosforilacija, ki povzroči pretvorbo ADP v ATP molekule. ATP molekula stimulira zaprtje kalijevih kanalčkov, kar privede do depolarizacije celične membrane, to pa sproži na odprtje kalcijevih kanalčkov in vdor Ca2+ ionov. Povišana koncentracija kalcijevih Ca2+ ionov v celici stimulira prenos in zlitje skladiščnih veziklov z inzulinom z membrano. Inzulin se tako sprosti v krvni obtok in potuje do tarčnih celic, ki imajo na površini izražene inzulinske receptorje. Ko se veže nanj, prenese signal o povišanju ravni glukoze v krvi v celico. To povzroči kaskado reakcij znotraj celice, ki pa na koncu privedejo do translokacije veziklov z GLUT4 transporterjev na površino celice. Število teh transporterjev za glukozo se na površini celične membrane poveča in glukoza lahko prehaja v celico, posledično pa pade raven glukoze v krvi. Razgradnja inzulina poteka v jetrih in ledvicah. Okvare na katerikoli stopnji poti inzulina se odražajo v diabetesu ali drugih boleznih.

== Rok Štemberger: Protein GABAA (gama aminomaslena kislina A) - zgradba, vloga in zanimivosti ==

V svoji seminarski nalogi sem raziskoval vlogo, pomen in zanimivosti proteina GABAA (gama-aminomaslena kislina A). To je receptor, ki se nahaja predvsem v centralnem živčnem sistemu in je zadolžen zato, da opravlja funkcijo inhibitorja. Lociran je na površini nevrotičnih sinaps in prekinja elektrokemični signal, tako da omogoči prehod kloridnih ionov znotraj celice. To se zgodi takrat ko se ustrezen ligand Gama veže na aktivno mesto tega receptorja. Konformacija podenot se spremeni in to omogoči aktivacijo receptorja. Znanstveniki so ugotovili, da obstaja več vrst GABAA receptorjev, kar pa je odvisno od sestave podenot. Najbolj pogoste podenote so alfa beta in gama v razmerju 2:2:1. V primeru da do prekinitve ne pride se lahko pojavijo epileptični napadi, psihiatrične motnje itd. Stres lahko v dobi odraščanja močno vpliva na GABAA receptorje in jih tudi permanentno strukturno spremeni, kar pa lahko kasneje v našem življenju vpliva predvsem na naš spanec in njegovo kvaliteto. Absint je bila v preteklosti prepovedana pijača, saj je povzročala razna obolenja zaradi substance imenovane tujon. Le ta se je vezala na GABAA receptorje in tako onemogočila njegovo delovanje, zato ker je preprečevala prehod kloridnih ionov v membrano. Sedaj potekajo raziskave teh receptorjev, saj je ključnega pomena čim boljša ozdravitev bolezni, ki nastanejo zaradi nepravilnega delovanja GABAA receptorja.

== Veronika Jarc: Perforin ==

Perforin je protein, ki nastane iz citotoksičnih limfocitov T. S pomočjo grancimov napade tarčno celico in jo uniči. Rečemo lahko, da je pomemben člen pri imunskem odzivu in sodeluje s NK celicami. Sestavljen je iz 555 aminokislin, njegova molekulska masa pa je 62-67 kD. Sestavljen je iz dveh pomembnih domen, domene MACPF in domene C2. Za domeno C2 je značilno, da ima afiniteto do Ca2+ ionov. Saj se na lipidni dvosloj veže le ob prisotnosti kalcija. Drugače obstajata dva različna tipa C2 domene, ki sta bila izolirana iz različnih organizmov. Lahko rečemo, da sta oba tipa zelo podobna v tem, da sta pri tipu 1 N-konec in C-konec obrnjena na vrh domene, kar je nasprotno kot pri tipu 2. Poznamo tri MACPF domene: Plu-MACPF, C8a MACPF in lipokalin C8g. Vse te domene primerjamo z skupino proteinov citolizinov in ugotovimo nekaj podobnosti in nekaj razlik. Na splošno, pa lahko rečemo, da je evolucija poskrbela tako, da so sta si domena MACPF in citolizini raszlični le v nekaj aminokislinah. Poznamo tri mehanizme kako perforin preide v tarčno celico in pri tem pomaga gramcimom B uničit to celico. Prvi mehanizem je prehajanje preko perforinske pore in sicer s pomočjo veziklov preide v celico. Naslednji mehanizem je endosomolitični model, pri katerem je pomemben kompleks s pomočjo katerega prehaja v celico. Kot zadnji mehanizem pa je model prehodne perforinske pore, ki pove, da perforin tvori kanalčke s pomočjo katerih grancimi B preidejo direktno v celico. Grancimi B so serinske proteaze, ki se sintetizirajo v citotoksičnih limfocitih T in NK celicah.

== Taja Karner: Glavoboli in migrene ==

Zaradi stresnega in hitrega tempa življenja, vse več ljudi trpi za občasnimi glavoboli, ki so najpogosteje posledica utrujenosti. Prav tako je vedno več ljudi, ki trpijo za močnejšimi oblikami glavobolov imenovanih migrene. V hujših oblikah migrene lahko glavobol traja do dva dni, močno migreno lahko spremljajo še drugi simptomi kot so slabost, bruhanje, občutljivost na svetlobo in močan zvok, depresija ter nespečnost. Mutacija, ki je največji krivec za nastanek bolezni se pojavlja na kromosomu 10 na genu KCNK18. Ta zapisuje protein TRESK, ki se nahaja v hrbtenjači in deluje kot kalijev kanalček. Mutacija povzroči, da ne pride do izmenjavanja ionov, kar povzroči hude glavobole. V raziskavah so odkrili zanimivo povezavo z anestetikom. Ta namreč ne glede na mutacijo ponovno aktivira kanal. To bi lahko učinkovito pozdravilo migrene, če bi ga le uspeli spraviti v primerno obliko. Ugotovili so tudi, da zdravila, ki vsebujejo citosporin in takrolimus v večini primerov povzročajo migrene v zdravstvu pa jih še vseeno pogosto uporabljajo. Odkritje te mutacije predstavlja revolucijo v zdravstvu in verjamem, da bo kmalu vodilo do odkritja učinkovitega zdravila proti migrenam.

== Ana Dolinar: Univerzalna kri – prihodnost transfuzijske medicine? ==

α-galaktozidaza (AGAL_HUMAN) je glikozil-hidrolazni encim. Spada v GH27-D (klan D, 27. družina) in ima aktivno mesto v obliki (β/α)8 sodčka. Encim zapisuje gen GLA, ki se nahaja na kromosomu X.

Ideja o univerzalni krvi, ki bi bila primerna za transfuzijo, ne glede na krvno skupino pacienta, je med znanstveniki prisotna že približno trideset let.
Razvili so tri metode za pretvorbo različnih antigenov v antigen 0 (po sistemu AB0), ki je primeren za transfuzijo v vse krvne skupine.
:#Encimska razgradnja antigenov A in B do antigena 0. Za antigene A so uporabili α-N-acetilgalaktozaminidazo, vendar so antigeni preveč kompleksni in metoda ni bila uspešna. Pri antigenih B so dosegli popolno pretvorbo v antigen 0 z uporabo α-galaktozidaze iz bakterije ''Streptomyces griseoplanus''.
:#Prekrivanje površine eritrocitov z maleimidofenil-polietilen-glikolom (Mal-Phe-PEG). Prekrije vse antigene, ne samo A ali B, vendar metoda ni uspešna, ker polietilen-glikol povzroča imunski odziv.
:#Pridobivanje univerzalnih rdečih krvnih celic iz pluripotentnih matičnih celic. Uspeli so pridobiti zrele eritrocite, ki so popolnoma funkcionalni.
Uporaba univerzalne krvi bi zmanjšala ali celo izničila imunski odziv ob transfuziji, prav tako ne bi bilo možnosti za transfuzijo napačne krvne skupne zaradi človeške napake. Metode trenutno niso dovolj izpopolnjene, da bi bilo možno pričakovati njeno uporabo v bližnji prihodnosti.

== Maša Mohar: Moški ali ženska to je sedaj vprašanje?(SRY - faktor za določitev spola) ==

SRY gen kodira Sry protein ki je član družine Sox (Sry related HMG box) transkripcijskih faktorjev. Poznamo jih okoli 20 pri človeku in miškah ter še mnogo drugih. Sox proteini imajo zelo različne vloge v embriogenezi in pri razvoju mnogih drugih organov. Tipično delujejo tako kot nekakšna stikala v diferenciaciji celic- sprožijo razvoj določenih celic. Sry je prav tako kot ostali člani te družine karakteriziran po HMG( high mobility group). HMG je drugače skupina specifičnih transkripcijskih faktorjev, ki imajo ~ 80 AK dolge strukturalno podobne domene za vezavo na DNA. Te domene oz. domena če je samo ena se veže na zaporedje (A/T)ACAA(T/A) v majhni žleb DNA. S tem ustvari zvitje DNA za približno 60- 85 stopinj. S tem ko se DNA zvije se razkrijejo mesta za izražanje drugih genov, recimo Sox9, ki kodira Sox9 protein ki pomaga pri diferenciaciji Sertoli celic in tako pri oblikovanju testisov, s tem pa determinira moški spol. Ugotovili smo tudi da obstaja veliko genskih bolezni povezanih s Sry genom in da lahko obstaja tudi ženska z XY spolnima kromosomoma, ker se pri njej zaradi mutacij Sry protein ne izrazi, prav tako pa obstajajo tudi moški z XX spolnima koromosomoma, kjer se enem od X kromosomov lahko izrazi SRY gen ob nepravilnostih pri očetovem delu zapisa. V bistvu sem prišla do zaključka da je zelo tanka meja med moškim in ženskim oblikovanjem spola, ena majhna mutacija oz. ena majhna razlika lahko privede do nastanka ženske ali moškega.

== Urška Rauter: A Green Glow: zgradba in funkcija encima luciferaze ==
Luciferaza je encim odvisen od ATP in magnezijevih ionov. Proces bioluminiscence se začne z vezavo na substrat luciferin, tvori se adenilatni intermediat in ob prisotnosti molekularnega kisika izhaja svetloba. Luciferaza je zgrajena iz dveh ločenih domen, večja se nahaja na N-koncu in manjša na C-koncu molekule, večja domena pa ima tudi svoje poddomene. Domeni sta med seboj ločeni z razpoko, kjer naj bi se po domnevanjih nahajalo tudi aktivno mesto encima. Luciferaza predstavlja tudi nov način mehanizma tvorbe adenilatnega intermediata med encimi in ponuja razlago za marsikatero metabolično pot.
Velika dilema, ki me med znanstveniki ostaja pa je razlika v barvi svetlobe, ki jo proces oksidacije luciferina emitira. Najverjetneje je za to odločilna keto tavtomerna oblika oksiluciferina in tudi resnonančna stabilizacija njegovega fenolatnega aniona, čeprav so znanstveniki odkrili tudi veliko drugih možnih vzrokov za različne barve (različne aminokisline, polarnost okolja, pH, ...).
Luciferaza se veliko uporablja v medicini, kjer služi kot marker molekul v telesu in tako pripomore k boljšem razumevanju različnih bolezni in infekcij, kot tudi sami strukturi celic in njenih organelov.

== Mirjam Kmetič: Mint condition (limonen-3-hidroksilaza in limonen-6-hidroksilaza) ==

Klasasta meta vsebuje encim limonen-6-hidroksilazo, ki sodeluje pri pridobivanju karvona. Poprova meta pa vsebuje limonen-3-hidroksilazo, ki je udeležena pri proizvodnji mentola. Obe hidroksilazi pripadata družini citokromov P450, njeni predstavniki pomembno sodelujejo pri proizvajanju različnih oksidiranih monoterpenov, ki so vir arom eteričnih olj. Karvon in mentol sta končna produkta hidroksilacije limonena. Ta encima sta si zelo podobna in njuni vezavni mesti za substrat sta zelo omejeni. Velja pravilo, da za spremembo aktivnosti v družini citokromov P450 potrebujemo določeno število mutacij, vendar je za modifikacijo vezavne aktivnosti limonenovih hidroksilaz potrebna samo ena. Ta fenilalanin v izolevcin mutacija povzroči, da se limonen-6-hidroksilaza spremeni v limonen-3-hidroksilazo! Mutiran encim je tako sposoben sinteze mentola tako kot encim v poprovi meti! Taka mutacija kaže, da sta prav ti dve aminokislini ne le nujni, temveč tudi prav zagotovo vpleteni pri orientaciji limonena v aktivnem mestu tako, da se ta hidroksilizira na ali C3 ali C6 poziciji. Posamične mutacije, ki lahko drastično spremenijo funkcijo proteina, so znanstveno zanimive. Nakazujejo ne le na zelo specifične manjše regije v sekvenici proteina, temveč so tudi ključne za razumevanje področij, kot so vezava in orientacija substrata, funkcija encima, metabolična pot in struktura vezavnega mesta.

== Sandi Botonjić: Kokain esteraza ==

Znanstveniki so v rizosferi kokinih plantaž (Erythroxylum coca) našli sev MB1, gram pozitivne bakterije Rhodococcus sp.. Tej bakteriji kokain predstavlja glavni vir ogljika in dušika in zato so znanstveniki izolirali osrednji encim njenega metabolizma tj. kokain esterazo (v nadaljevanju cocE). Encim je sestavljen iz treh domen: DOM1, ki vsebuje nabor kanoničnih α-vijačnic in β-ploskev; DOM2 - domena le z α-vijačnicami; in DOM3 je roladi podobna struktura z β-ploskvami. CocE je serinska esteraza, katere aktivno mesto se nahaja na stičišču vseh treh domen. Ta hidrolizira kokain na ekgonil metil ester in benzojsko kislino, ki nimata psihoaktivnih učinkov. CocE je pravi Ferrari v primerjavi z drugimi esterazami, saj lahko razgradi enako količino kokaina 1000 krat hitreje. Tako lahko postane neprecenljiva pri nujnih intervencijah v primeru prevelikega odmerka, saj bi intravenozni vbrizg cocE močno zmanjšal razpolovni čas kokaina. CocE je predmet številnih raziskav, v katerih znanstveniki proučujejo njeno termostabilnost in njenih mutiranih oblik, saj njen razpolovni čas pri fiziološki temperaturi traja le nekaj minut. Znanstveniki pa na podlagi ugotovitev iz raziskav cocE razvijajo tudi učinkovita protitelesa z vsaj podobnimi katalitičnimi parametri, ki bi brez imunskega odziva odlično delovala v bioloških sistemih.

==Tjaša Flis: Parkinsonizem in Parkin protein==

Parkinsonova bolezen je vse pogostejša bolezen pri starostnikih, njeni simptomi pa so tresavica, mišična otrdelost in upočasnjena motorika. Vzrok se skriva v propadu dopamnergičnih nevronskih celic. Bolezen je lahko avtosomno dominantno dedovana, kar pomeni, da pacienti podedujejo eno normalno in eno mutirano kopijo gena. Slednja prevladuje in se deduje naprej. Pri Parkinsonovi bolezni se mutacija zgodi v Park2 genu, ki kodira Parkin protein ali E3 ubikvitin ligazo. Parkin na poškodovane ali na preveč izražene proteine pripne ubikvitin (označevalni protein), ki jih nato usmeri v proteasom, to je velik razgradni kompleks v celicah.
Če mutacija poškoduje Parkin, je pot razgradnje onemogočena, to pa pomeni, da se v celici akumulirajo odvečni proteini. Tvorijo se Lewy-eva telesca polna teh proteinov, ki nadomestijo celične organele v nevronskih celicah, kar vodi do prenehanja njihovega delovanja. Ker pa ima Parkin več kot samo en substrat ki ga ubikvitinira, je točen mehanizem bolezni še dandanes uganka.
Eden izmed najbolj poznanih substratov je transmembranski protein Pael-R. Zvitje tega proteina poteka ob prisotnosti šaperonov. Prevelika koncentracija tega receptorja lahko izzove stres v endoplazmatskem retikulumu situiranem v nevronskih celicah. V primeru da je Parkin neaktiven, Pael-R povzroči celično smrt. Vendar to je le ena izmed možnih rešitev, substratov je namreč vsaj še dvajset, raziskave pa se nadaljujejo.

== Matja Zalar: Vloga SRK in SCR proteinov pri preprečevanju incestnega razmnoževanja cvetočih rastlin ==

Rastline so za zaščito pred samooplojevanjem razvile več vrst mehanizmov prepoznavanja lastnega peloda na molekularni ravni. Pri cvetočih rastlinah je najpogostejši mehanizem tipa SSI ali sporofitične lastne inkompatibilnosti. Pri družini ''Brassicaceae'' je za aktivacijo SSI ključna interakcija med transmembranskim proteinom SRK, ki predstavlja žensko determinanto odziva, in njenim ligandom - proteinom SCR, drugače imenovanim tudi moška determinanta odziva na lastno inkompatibilnost. Specifičnost vezave je zagotovljena s polimorfizmom alel obeh determinant. V posameznih vrstah je možno najti tudi do 100 različnih S-haplotipov genov za determinanti.
Vezava liganda na receptor bo uspešna le, če oba izhajata iz istega S-haplotipa. Vezava SCR na zunajcelično, N-glikolizirano domeno SRK povzroči nastanek kompleksa treh proteinov, ki s svojo aktivnostjo sproži kaksado reakcij, kar v končni fazi pripelje do preprečitve samooploditve.
Na neugodne življenske pogoje, ki so onemogočali medsebojno opraševanje, so se nekatere rastline prilagodile s favorizacijo samooplojevanja. Pri njih so mutacije S-lokusa, ki nosi zapis za SRK in SCR, povzročile nepravilno delovanje SI ali njegovo popolno odpoved. To pa seveda vodi v neprepoznavanje lastnega peloda in rastlina se samooprašuje. Najbolj znan primer take rastline je ''Arabidopsis thaliana'', ki se zaradi svojih specifičnih lastnosti uporablja kot modelni organizem v številnih študijah lastne inkompatibilnosti.

== Matevž Ambrožič: BSX protein in debelost ==

Za primeren občutek sitosti ali lakote glede na stanje energetskih zalog v telesu in odgovarjajoč vnos hrane ter porabo energije je odgovorna zapletena pot sporočanja. Začne se s tremi hormoni: inzulin, leptin in grelin. Leptin in inzulin se sprostita, ko so maščobne in hidratne zaloge v telesu polne in morata do možganov prenesti signal za prenehanje hranjenja, grelin pa ravno nasprotno. Vsi po krvi potujejo do hipotalamusa, predela možganov, ki je odgovoren za energijsko ravnovesje. V hipotalamusu sta dva tipa živčnih celic: oreksigene in anoreksigene. Prve sproščajo NPY in AgRP, nevropeptida, ki spodbujata hranjenje in zmanjšata porabo energije, druge pa α-MSH in CART, katerih učinek je nasproten. Našteti nevropeptidi se iz nevronov sprostijo po vezavi ustreznega izmed treh hormonov in prenesejo signal naprej, do končne spremembe v vnosu ali porabi energije. Glavni protein seminarja, BSX (brain specific homeobox) protein je transkripcijski faktor, ki spodbudi ekspresijo genov za AgRP in NPY, hkrati pa je odgovoren za premik organizma v iskanju hrane. Če v opisanem sistemu pride do napake, so pojavi nepotreben občutek lakote, kar je vzrok mnogih primerov debelosti. V boju z bolezensko debelostjo so ključne raziskave na BSX proteinu, saj je osrednji člen poti, ki v možgane prenese (včasih lažen) občutek lakote.

== Kaja Javoršek: A grey matter ==

Mikrocefalin je protein, ki ga kodira enakoimenski gen. Mikrocefalin naj bi kontroliral poliferacijo in diferenciacijo nevroblastov med nevrogenezo. Odkritje, da je mikrocefalin odločilen regulator velikosti možganov, je sprožilo hipotezo, da je igral vlogo v evoluciji možganov.
Razen v možganih najdemo mikrocefalin tudi v ledvicah, srcu, pljučih, vranici in skeletnih mišicah. Vendar pomen mikrocefalina v teh organih še ni znan.
Mutacije na genu mikrocefalina vodijo do nastanka mikrocefalije. To je bolezen razvoja živčnega sistema in je definirana kot resno zmanjšana velikost možganov. Pri odraslih je normalen volumen možganov od 1200 cm3 do 1600 cm3, pri odraslih s primarno mikocefalijo pa okoli 400 cm3 . Poleg mirocefalina pa povzročajo mikrocefalijo še mutacije petih genih (ASPM, MCPH2, CDK5RAP2, MCPH4, CENPJ)
Mikrocefalin ima tri BRCT domene na C – koncu. BRCT domene so prisotne v veliko ključnih proteinih, ki kontrolirajo delitev celice. Zato predvidevajo da mikrocefalija nastane, ker je ovirana normalna regulacija delitve celic v možganih.
Ugotovili so, da je protein mikrocefalin dol 835 aminokislin. Zaradi mutacije na genu mikrocefalina se ta protein skrajša na 25 aminokislin.
Znanstveniki so izvedli raziskavo ali gena mikrocefalin in ASPM vplivata na inteligenco. Na podlagi treh raziskav so zaključili, da inteligenca ni povezana z dominantnimi aleli ASPM – ja ali mikrocefalina.

== Rok Vene: A mind astray ==

Alzheimerjeva bolezen postaja vedno bolj aktualna tematika. Trenutno je na svetu več kot 26 milijonov ljudi s to obliko demence. Zaradi daljše življenjske dobe pa pričakujemo, da bo število obolelih samo še naraščalo. Alzheimerjeva bolezen prizadene centralni živčni sistem, v možganih se nalagajo snovi, ki povzročijo propad živčnih celic. Ena izmed snovi, ki se nalagajo v možganih so nefunkcionalni Tau proteini. Tau proteini sodijo v družino proteinov imenovanih microtubule-associated proteins (MAP), njihova naloga pa je je stabilizacija mikrotubulov. To dosežejo tako, da se na mikrotubule vežejo. Poleg tega predvidevajo, da imajo Tau proteini še eno nalogo. Sodelovali naj bi v kompleksu za uravnavanje vzdražnosti živčnih celic. Nefunkcionalnost Tau proteinov povezujejo z različnimi boleznimi, ki jih poznamo pod skupnim imenom tauopatije. V primeru Alzheimerjeve bolezni je Tau protein nefunkcionalen, zato ker je hiperfosforiliran, kar mu onemogoča vezavo na mikrotubule. Tau proteini zato tvorijo netopne agregate – nevrofibrilarne pentlje, ki najbrž povzročijo odmiranje živčnih celic. Pri iskanju učinkovin proti hiperfosforilaciji in agregaciji Tau proteina, so znanstveniki raziskali protein FKBP52. Ta protein ima več funkcij. Osredotočili so se predvsem na njegove šaperonske lastnosti. Ugotovili so, da se FKBP52 veže na hiperfosforiliran Tau protein, in tako prepreči agregacijo Tau proteina, ki je odgovorna za odmiranje nevronov.

== Ines Šterbal: LTP1 ==

Protein LTP1, izoliran iz ječmenovega zrna, spada v družino lipidnih prenašalnih proteinov (lipid transfer protein –LTP). Je dobro topen protein, ki se nahaja v alevronski plasti ječmenovega semena. Sestavljen je iz štirih heliksov, ki so povezani z disulfidnimi mostički. Ima dobro definiran C-terminalni konec. V razmerah in vivo je globularni protein, s stožčastim hidrofobnim jedrom, ki se razteza od enega konca molekule do drugega. Sposoben je vezati različne lipide, kot so maščobne kisline ali acetil-koencim A. LTP1 proteini so na površini aktivni proteini, so stabilni, denaturirajo šele okrog 100 °C. Vloga LTP1 proteina in vivo še ni znana. In vitro je glavni protein pri penjenju piva. Opravlja pa še številne druge funkcije, odvisno od tega, kateri ligand ima vezan. LTP1 proteini so verjetno vključeni v prenos lipidov preko membrane in celo v nastanek membrane, lahko bi imeli vlogo v transportu monomera Cutin, vlogo naj bi igrali tudi v obrambnem mehanizmu rastlin. Lipidi, ki so vezani na LTP1 bi naj imeli antibakterijsko aktivnost za bakterije in glive.
Vsi podatki kažejo, da so povezave med sladkorji in proteini, ki nastanejo kot produkt Milardove reakcije, prvi korak do nastanka pivovske pene. Kaže, da je kontrola glikacije LTP1 proteinov med slajenjem in varjenjem piva, nujna za optimalno penjenje piva.

== Mitja Crček: DSIP in spanje ==

Pred 2000 leti so ljudje verjeli, da postanemo zaspani zaradi nekakšnih želodčnih hlapov, ki gredo v možgane, se tam kondenzirajo, zamašijo pore in posledično povzročajo zaspanost. Kasneje so seveda ugotovili da temu ni tako, leta 1977 pa so odkrili majhne peptide, ki naj bi nas uspavali in jih poimenovali Delta Sleep-Inducing peptide (DSIP). DSIP je majhen peptid, sestavljen iz devetih aminokislinskih ostankov in maso 850 daltonov, prvič pa so ga odkrili pri zajcih. Sodeloval naj bi tako pri endokrini regulaciji kot pri fizioloških procesih (poveča učinkovitost oksidativne fosforilacije), pomembno vlogo pa naj bi imel tudi v medicini in pri zdravljenju bolezni. Ker naj bi podaljševal REM fazo, bi ga lahko uporabljali tudi kot dodatek pri zdravljenju alkoholizma ali ga dodajali antidepresivom in pomirjevalom, ki skrajšujejo REM fazo. Raziskave so spremljale tudi vpliv DSIP-ja na nespečnost. Ugotovili so, da DSIP rahlo povečuje kvaliteto spanja in skrajšuje latenco uspavanja, na trajanje budnosti in druge parametre pa ne vpliva, zato so si strokovnjaki enotni, da ima DSIP le rahle terapevtske učinke na nespečnost. Delovanje peptida pa še vedno ni povsem razjasnjeno in le želimo si lahko, da bodo novejše raziskave prinesle nove informacije, saj ima DSIP vsekakor velik potencial v medicini.

== Dominik Kert: FOXP2, govoreči protein ==

Ljudje in živali se razlikujejo. Za znanstvenike 19. stoletja je bilo zelo fascinantno to, da mi lahko govorimo, se sporazumevamo in pomnimo besede, medtem ko živali ne morejo. Ko se je pojavila družina KE na koncu 90. let prejšnjega stoletja, so znanstveniki ugotovili, da obstaja gen, ki kodira FOXP2. Družina KE je slovi po tem, da ima polovica njenih članov težave z govorom. Tako so ugotovili, da se mutacija prenaša avtosomno in dominantno. In verjetno na to vpliva mutacija FOXP2, FOXP2 protein pa je po vsej verjetnosti odločilen faktor pri govoru.
FOXP2 protein je sestavljen iz 715 aminokislin in spada med družino transkripcijskih faktorjev, ki se imenuje FOX (zaradi 'forkhead box' domene). Zanimivo je, da se ta gen razlikuje od gena opic (šimpanz, gorila, makaki) le za dve in od miši le za tri aminokisline. To se znanstvenikom zdi zelo zanimivo, ker je verjetno zaradi teh dve sprememb v aminokislinskem zaporedju prišlo do sprememb pri sporazumevanju. Zaradi teh dejstev so se naprej usmerili na to, ali je bil gen res pod vplivom naravne selekcije in ugotovili so, da je bil res.
FOXP2 na te spremembe vpliva v možganih, je pa prisoten tudi v pljučih, drobovju in srcu. Vendar njegova funkcija tam še ni znana.

== Petra Malavašič: Ureaza bakterije Helicobacter pylori ==

Bakterija Helicobacter pylori spada med patogene mikrobe. Znanstvenika Warren in Marshall sta leta 1987 odkrila to bakterijo ter ugotovila, da je s to bakterijo povezana razjeda na želodcu. Leta 2005 sta prejela Nobelovo nagrado. Že vsak drugi človek je okužen s to bakterijo. Naseljena je na želodčni sluznici in povzroča kronično vnetje želodčne sluznice. Bakterija se lahko naseli in se razmnožuje v prisotnosti želodčne kisline, kjer je pH okoli 2. Posebni obrambni mehanizmi omogočajo bakteriji, da lahko preživi v kislem okolju. Encim ureaza je pri tem najpomembnejši. Ureaza je encim, ki katalizira hidrolizo uree, pri čemer nastane amoniak, ki se v končni fazi veže z molekulami vode v amonijev hidroksid, ki poveča pH v neposredni okolici bakterije. Encim ureaza se nahaja v citoplazmi bakterijske celice in na njeni površini. Sam encim je zgrajen zelo kompleksno in omogoča bakteriji preživetje. Posebna kompleksna zgradba encima onemogoči, da bi kislina želodčnega soka denaturirala encim. Encim sestavljata dva kompleksa (αβ) štirih prostorsko razporejenih (αβ)3 enot.

== Matevž Merljak: CEM15, VIF in infektivnost retrovirusov ==

Ena izmed komponent obrambnega mehanizma pred retrovirusi v nekaterih človeških celicah je citidinska deaminaza CEM15 (APOBEC3G). V celicah, ki jo izražajo, se retrovirusi brez posebnega proteina (VIF, “viral infectivity factor”) ne morejo uspešno množiti, zato takim celicam pravimo “nepermisivne” celice.

CEM15 deluje tako, da med procesom reverzne transkripcije v novonastali “minus” DNA verigi številne citidinske baze pretvori v uridinske, ter s tem povzroči tako zmanjšano obstojnost z uracilom bogate DNA verige, kot tudi zamenjave gvanozinskih baz z adenozinskimi v kodirajoči (“plus”) verigi DNA. Čeprav takšna hipermutacija za nadaljno infektivnost virusa ni vedno usodna (torej lahko tako mutirana DNA v nekaterih primerih še vedno tvori funkcionalne viruse), je običajno dovolj obsežna, da onemogoči uspešno reprodukcijo virusa.

Raziskave kažejo, da CEM15 ne napade nastajajoče DNA kot lasten celični odgovor na infekcijo, pač pa se med izgradnjo novih virusov vgradi v le-te ter po infekciji nove celice povzroči omenjene spremembe v nastajajoči DNA verigi.

Že omenjen faktor VIF izhaja iz virusa HIV-1, ki primarno napada sicer nepermisivne limfocite T. Naloga VIF je preprečitev vgradnje CEM15 v nastajajoče viruse, to pa doseže tako z oteževanjem njene translacije, kot tudi z indukcijo razgradnje CEM15 v proteasomu.

== Eva Knapič: TSH3 - Kaj novorojenčkom omogoča zadihati? ==

Kaj novorojenčkom omogoča zadihati? Raziskave so pokazale, da ima eno izmed vodilnih vlog pri začetku dihanja protein teashirt homolog 3 (TSH3). To je protein, ki ga uvrščamo med transkripcijske faktorje. Po strukturi spada v družino cinkovih prstov, kjer so sekundarne strukture koordinirane s cinkovim ionom. TSH3 ima pet tako urejenih struktur in vse spadajo v Cys2His2 skupino – cinkov ion koordinira dva cisteinska in dva histidinska ostanka ßßα podenote.
Organizem brez zapisa za teashirt 3 protein se v času embrionalnega razvoja navidezno ne razlikuje od organizmov, ki ta zapis imajo. Vendar so podrobnejše raziskave pokazale, da se brez prisotnosti proteina teashirt 3 dokončno ne oblikujejo pljučni mešički, ki so funkcionalna enota pljuč, saj tam poteka izmenjava plinov. Odsotnost proteina povzroča povečano apoptozo nevronov motoričnega jedra v možganskem deblu, s tem so proteinu pripisali zmožnost inhibicije apoptoze nevronov. Prav tako so nezmožnost odziva organizma na pH spremembe okolja pripisali pomanjkanju proteina TSH3.
Iz vseh teh pomanjkljivostih, ki jih povzroča TSH3 so raziskovalci prišli do zaključka, da novorojenček brez zapisa za protein ni zmožen zadihati, ker ni sposoben odziva na spremembo okolja, predvsem pH in tako ne more vzdrževati homeostaze, ki je potreba na preživetje.

== Tjaša Goričan: Vpliv Nogo proteina na regeneracijo živčnega sistema ==

Nevroni vsebujejo mielin, ki je sestavni del mielinske ovojnice aksona in ima nalogo zagotavljanja stalnega prenosa električnih signalov. Poleg tega pa mu je dodeljena tudi nenavadna lastnost. Vsebuje namreč proteine Nogo-A, ki delujejo kot inhibirotji za rast poškodovanih aksonov. Posledično se diferencirani nevroni niso sposobni deliti. Problem se pojavi pri poškodbi živčnega sistema, saj se ni sposoben regenerirati. Bolezni, ki so povezane s poškodbami živčevja so: Poškodbe hrbtenjače, Alzheimerjeva bolezen, možganska kap, shizofrenija itd.

Nogo-A protein spada v družino proteinov retikulonov in je ena od oblik Nogo proteinov. Je transmembranski protein, ki se z domeno Nogo-66 uspešno veže na receptor in povzroči razgradnjo mikrotubulov v aksonu, kar privede do preureditve citoskeleta in posledično zaustavitve rasti aksona. Največ Nogo-A se nahaja na oligodendrocitih. Oligodendrociti so celice, ki spadajo med nevroglio in tvorijo mielinski ovoj nevronov v centralnem živčnem sistemu. Veliko več ga najdemo v centralnem živčnem sistemu v primerjavi s perifernim.

Čeprav je še veliko neznanega na področju živčnega sistema, je znanost že dosegla uspehe glede boja proti boleznimi, povezanimi z regeneracijo živčnega sistema. S protitelesi se da inhibirati protein Nogo-A in s tem preprečiti inhibicijo rasti poškodovanih nevronov.

== Marko Radojković: Fluorescentni proteini in njihova uporaba v živčnem sistemu ==

Fluorescentni proteini so členi družine homologih proteinov, ki se delijo skupno lastnost da svetlijo zaradi formiranja kromoforma znotraj lastnega polipeptidnega zaporedja. Prvi odkrit takšen protein je bil zeleni fluorescentni protein ali GFP. Od tedaj do danes so kreirani različni mutanti, ki žarijo skoraj vse barve človeškega vidnega spektra. Izkazalo se je da so zelo uporabni v mnogih bioloških disciplinah, predvsem pa so popularni v spremljanju dinamike proteinov, genske ekspresije, in tudi posledično na viši ravni, dinamike organelov ter gibanja celic znotraj tkiva.

Ne tako dolgo nazaj, je tim znanstvenikov uspel skombinirati različne barvne variante GFP-ja s sofisticiranim Cre/Lox sistemom genske rekombinacije in tako omogočil njihovo izražanje v samih možganih. Tale tehnika omogoča da se vsaki posamezni nevron obarva drugače in tako loči od sosednjih, kar omogoča detajlno analizo živčnega vezja. Brainbow strategija, kakor so jo poimenovali, daje upanje znanstvenikom da z ustvarjanem celotnega ''zemljevida'' možganov, lahko izpeljejo pomembne informacije o nevronskih povezavah in njihov nadaljni vpliv na vedenje in delovanje organizma.

== Tamara Marić: MikroRNA ==
MikroRNA je mala molekula, ki je prepisana z DNA na tak način kot mRNA. Zapis za miRNA se lahko nahaja v intronskih regijah, kodirajočih ali nekodirajočih genov. Osnovna funkcija je utišanje genov na nivoju sinteze proteinov. Da pa lahko opravi svojo nalogo mora dozoreti. Biogeneza miRNA se začne v samem jedru, kjer se 1000 nukleotidov dolg transkript s pomočjo encimskega kompleksa (Drosha-DGCR8)skrajša na 60-70 nukleotidov dolg pre-miRNA.Z eksportinom-5 se prenese iz jedra v citoplazmo do naslednjega kompleksa. Dicer veže pre-miRNA in jo skrajša na 22 nukleotidov. Nastane miRNA dupleks. Ena izmed verig prevzame vodilno funkcijo in se vmesti v kompleks istega encima v povezavi z drugimi proteini. Kompleks pripelje do komplamentarne verige mRNA in povzroči translacijsko represijo. Znanstveniki se ukvarjajo predvsem z vprašanjem,kako se miRNA izraža v številnih boleznih. Natančneje sem si pogledala proces resorpcije in obnove kosti in kako miRNA vpliva na regulacijo teh dveh procesov.

== Maja Remškar: Okulokutani albinizem tipa II in P protein ==

Melanin je pigment, ki je nujno potreben za zaščito kože pred pripekajočim soncem ter za normalno delovanje oči. Glavna sestavina za njegovo sintezo je aminokislina tirozin, ki je osnova evmelanina (črni pigment), ob dodatku cisteina pa dobimo še feomelanin (rdeče-rumen). Za običajno delovanje biosinteze melanina je potrebno kislo okolje v melanosomih, kjer se sinteza izvaja. Za vzdrževanje kislosti sta potrebna dva proteina – anionski kanalček in ATP črpalka. Anioni tu delujejo kot vaba za protone, kjučne za kisel pH. P protein naj bi deloval kot anionski transporter. Torej v njegovi odsotnosti v melanosom ne morejo dostopati anioni in posledično se v celico ne prečrpavajo protoni, kar pomeni da ni kislega pH ugodnega za sintezo melanina.
Okulokutani albinizem tipa II ali OCA2 nastane zaradi pomanjkanja količine melanina v očeh, koži in laseh. Za kožo to pomeni večjo občutljivost na UV žarke in povečano možnost za kožnega raka. Zaradi nepigmentiranih optičnih vlaken pa se pojavijo še težave z očmi, kot so škiljenje, fotofobija, nistagmus, degeneracija rumene pege, pride pa tudi do izgube biokularnega vida. OCA2 je dedna bolezen, ki se deduje recesivno. Človek le z enim okvarjenim alelom je torej prenašalec gena. Ugotovili so, da OCA2 povzroča mutacija gena P, in sicer najpogostejša je delecija 7 eksona.

== Ana Remžgar: Bacillus subtilis ==

Bacillus subtilis je grampozitivna paličasta bakterija. Ko ima v okolju dovolj hranil, se simetrično deli in vegetativno raste. Ko pa v okolju začne hranil primanjkovati, B. subtilis uvede različne mehanizme, da lahko preživi. Del populacije postane kompetenten in sprejme tujo DNA. Del populacije pa s pomočjo zapletenega sistema aktivacije proteina Spo0A vstopi v proces sporulacije. Sporulacija je počasen in energijsko potraten postopek, ki traja v idelanih razmerah vsaj 7 ur. Na koncu nastane spora, ki lahko preživi tudi več desetletji v neugodnih življenjskih razmerah. Ko celica vstopi v cikel sporulacije, začne v okolje izločati razne toksične snovi, med njimi sta najbolj učinkovita Skf in Sdp. Ko celica izloči ti dva proteina v okolje, ubije sosednje bakterijske celice Bacillis subtilisa. Zaradi njunih lasnosti, ta dva proteina pogosto zato imenujemo kanibalistična faktorja. Vendar mora celica paziti, da pri tem ne ubije še sebe. Pri tem ji pomaga medmembranski protein SdpI.
Bakterija Bacillus subtilis si tako s kanibalizmom pomaga, da celice ki vstopajo v sporulacijo dobijo dovolj hranil za dokončanje spore.

== Tina Gregorič: Grelin - hormon lakote ==

Občutek lakote je odvisen od številnih dejavnikov, med katere spadajo telesna sestava in teža, vrsta hrane, ki jo vsak dan uživamo, količina spanja in psihološki dejavniki. Večina ljudi postane lačnih, ko je čas za obrok: zajtrk, kosilo, malica, večerja. Znanstveniki so leta 1999 odkrili hormon, ki sodeluje pri nastanku lakote in poveča apetit. Imenuje se grelin, ki je poznan tudi pod imenom hormon lakote. Gen, ki kodira transkripcijo grelina, je sestavljen iz 117 aminokislin in se ob aktivaciji razcepi na 5 manjših podenot, med katerimi sta najpomembnejša grelin in obestatin. Grelin je sprva neaktiven hormon, sestavljen iz 28 aminokislin. Po esterifikaciji na serinu (Ser3) postane aktiven. Sprosti se v kri in po krvi potuje do hipofize v možganih, kjer se nahajajo grelinski receptorji, imenovani GHRS-1a receptorji. Natančna vezava grelina na receptor zaenkrat še ni znana. Grelin ni edini hormon, ki vpliva na to, kdaj nas bo zajela želja po hranjenju in kdaj nas bo minila. V telesu imamo več kot 40 snovi, ki spodbujajo in zavirajo občutek lakote. Odkritje grelina in raziskovanje njegove vloge v človeškem metabolizmu je odprlo vrata številnim raziskavam in študijam na področju debelosti in motenj, ki so povezane s prehranjevanjem. Hormon grelin je povezan z različnimi obolenji kot so anoreksija, kahesija, SW sindrom in na koncu tudi prekomerna telesna teža, vendar se njegova funkcija od bolezni do bolezni spreminja.

== Andreja Bratovš: Bolečina in njen receptor - TRPA1 ==

Ko začutimo bolečino, je to ponavadi znak, da lahko pride ali pa je že prišlo do poškodbe na ali v našem telesu – opozorilo za nas, naj ukrepamo. V zaznavanje bolečine je vpletenih veliko zapletenih mehanizmov, eno zanimivejših odkritij pa je gotovo receptor TRPA1. TRPA1 je receptorski ionski kanalček, prepusten za različne katione. Aktivirajo ga različni dražljaji: nizka temperatura, oksidativni stres in različne dražilne snovi. Med kemijskimi aktivatorji so zanimivi predvsem: alil izotiocianat (snov, ki daje pekoč okus gorčici, hrenu in wasabiju), alicin (spojina iz česna) ter akrolein (sestavina solzivca). Zanimivo je, da aktivacija TRPA1 poteka preko kovalentne vezave liganda na receptor.
TRPA1 se nahaja v nociceptorjih – to so prosti živčni končiči, ki zaznavajo bolečino – njegova funkcija pa je zaznavanje bolečine, ki jo povzročijo prej navedeni dražljaji. Udeležen je tudi pri občutenju bolečine pri vnetju tkiva, kjer deluje v povezavi z bradikininom – mediatorjem vnetja.
TRPA1 in tudi drugi TRP kanalčki so zanimive tarče za nove vrste analgetikov. Cilj novih zdravil je delovanje le na začetek poti prenosa bolečine in ne centralno na ves živčni sistem, kot je značilno za dosedanja zdravila proti bolečinam. Tako delovanje bi namreč zmanjšalo stranske učinke pri jemanju analgetikov, kot so na primer omotičnost in zaspanost.

BIO2 Povzetki seminarjev 2011

2011-12-01T22:38:46Z

MarkoRadojkovic: /* Marko Radojković: Fluoroscentni proteini in njihova uporaba v živčnem sistemu */

== Ula Štok: Neuregulin 1 ==

Neuregulin-1 je član proteinov iz družine neuregulinov in je kodiran s strani gena NRG1. Obstaja veliko tipov Neuregulina-1, ki se razlikujejo po funkcionalnosti ter mestu v telesu na katerem delujejo. Najpogosteje delujejo v živčnem sistemu, kjer lahko z nepravilnim delovanjem med drugimi povzročajo tudi zelo razširjeno bolezen - shizofrenijo. Delujejo pa tudi na ostalih tkivih in organih (na primer: srce, pljuča, oprsje in želodec). Generalno obstajata dve poti signaliziranja Neuregulina-1, in sicer: Običajna ter neobičajna pot. Pri običajni poti je ErbB receptor aktiviran direktno, v enem koraku z vezavo Neuregulina-1. To najpogosteje povzroči dimerizacijo ali heterodimerizacijo ErbB receptorja. Dimerizacija ali heterodimerizacija sicer nista nujno potrebni, a vendar do njiju pride na skoraj vseh receptorjih ErbB. Ta združitev povzroči avto- in trans-fosforilacijo intracelularnih domen tega receptorja, kar aktivira vse nadaljnje poti signaliziranja. V končni fazi pa NRG1/ErbB signaliziranje vpliva direktno na transkripcijo. Pri neobičajni poti je postopek podoben, a vendar poteka začetna stopnja malo drugače. Na začetku namreč sodeluje JMa oblika receptorja ErbB4, ki se pod vplivom TACE cepi. Del receptorja (ErbB4-CTF) se odcepi v notranjost celice. Ta peptid je velik približno 80 kD in ima specifično izoblikovano vezavno mesto za Neuregulin-1. Nadaljnji procesi pa potekajo zelo podobno kot pri običajni signalni poti. Neuregulin-1 lahko povzroča shizofrenijo na različne načine, saj sodeluje pri zelo pomembnih procesih, kot so: tvorba sinaps, mielinizacija aksonov, razvoj oligodendrocit itd. Shizofrenija je zelo razširjena bolezen in nihče še ni odkril direktnega postopka k popolni odpravi te bolezni. A vendar, v letu 2009 se je zgodila neke vrste prelomnica v študiju shizofrenije. Odkrili so namreč, da posamezniki, ki so imeli gen za shizofrenijo niso zboleli. Še več! Napaka se jim je odrazila kot zvišanje kreativnih sposobnosti na znanstvenem ali umetniškem področju, odvisno od posameznika. Ob tem se je pojavilo mnogo vprašanj, saj bi na ta način mogoče lahko poiskali pot, da bi shizofrenija postala popolnoma ozdravljiva. A vendar, je to področje še raziskano, saj znanstveniki ne vedo po kakšnih poteh pride do tega, da te mutacije na NRG1 genu ne izrazijo v bolezenskem stanju.

== Maša Mirković: Proteinski produkti genov za disleksijo in z disleksijo povezane motnje ==

Disleksija je motnja, ki se kaže v nesposobnosti branja oziroma razumevanja prebranega, ter napakah in težavah pri izgovarjanju besed. Disleksiki,kot imenujemo posameznike, ki trpijo za disleksijo, imajo kljub normalnim intelektualnim sposobnostim, znanjem in izobrazbo, moteni veščini pisanja in branja s tendenco, da pomešajo med seboj črke ali besede med branjem ali pisanjem. V zadnjih letih, so uspeli ugotoviti mesta na kromosomih, povezana z dovzetnostjo za disleksijo. DYX1C1,KIAA0319,DCDC2 in ROBO1, so bili označeni kot kandidati, z dovzetnostjo za disleksijo. Najbolj obetaven je protein KIAA0319. Je transmembranski protein iz desetih transmembranskih vijačnic, najden v plazemski membrani nevronov. Njegov C-terminalni konec gleda v ekstracelularni matriks, manjši N-terminalni konec pa prehaja v citoplazmo nevrona. C-terminalni konec je visoko glikoziliran in nosi 5 PKD(polycystyc kidney desease) domene in eno MANEC(motif at the N terminus with eight cysteines) domeno. KIAA0319 igra vlogo pri rasti možganov in njihovi migraciji med razvojem možganov-iz tega je razvidno, da je disleksija problem v razvoju nevronov že v zgodnjih letih. Posamezniki z disleksijo nosijo izoobliko tega proteina, ki povzroči nižjo izraženost le tega. Spremembe so v 5'-regiji, ki kodira izoobliko proteina. Najopaznejše povezave z disleksijo se kažejo v 2,3 kb regiji, ki zavzema promotor, prvi nepreveden ekson in del prvega introna – odprti kromatin. Te ugotovitve vodijo, da je 5'-regija KIAA0319 gena tista lokacija alelov, ki največ prispeva k motnji branja.

== Katra Koman: INZULIN ==

Inzulin je peptidni hormon, ki sodeluje v uravnavanju ravni glukoze v krvi. Sintetizira in skladišči se v β-celicah Langerhansovih otočkov trebušne slinavke. Sinteza poteka od prekurzorske molekule preproinzulina preko proinzulina do dokončne zrele molekule inzulina, ki se shrani v skladiščnih veziklih. Ob povišanju ravni glukoze v krvi, na primer po obroku, glukoza, ki je tudi glavni stimulator sekrecije inzulina, iz krvi preide v β-celice skozi GLUT2 transporter. Tam se fosforilira v glukozo-6-fosfat, saj tako fosforilirana ne more več iz celice, lahko pa vstopi v proces glikolize, ki mu sledita še Krebsov cikel in oksidativna fosforilacija, ki povzroči pretvorbo ADP v ATP molekule. ATP molekula stimulira zaprtje kalijevih kanalčkov, kar privede do depolarizacije celične membrane, to pa sproži na odprtje kalcijevih kanalčkov in vdor Ca2+ ionov. Povišana koncentracija kalcijevih Ca2+ ionov v celici stimulira prenos in zlitje skladiščnih veziklov z inzulinom z membrano. Inzulin se tako sprosti v krvni obtok in potuje do tarčnih celic, ki imajo na površini izražene inzulinske receptorje. Ko se veže nanj, prenese signal o povišanju ravni glukoze v krvi v celico. To povzroči kaskado reakcij znotraj celice, ki pa na koncu privedejo do translokacije veziklov z GLUT4 transporterjev na površino celice. Število teh transporterjev za glukozo se na površini celične membrane poveča in glukoza lahko prehaja v celico, posledično pa pade raven glukoze v krvi. Razgradnja inzulina poteka v jetrih in ledvicah. Okvare na katerikoli stopnji poti inzulina se odražajo v diabetesu ali drugih boleznih.

== Rok Štemberger: Protein GABAA (gama aminomaslena kislina A) - zgradba, vloga in zanimivosti ==

V svoji seminarski nalogi sem raziskoval vlogo, pomen in zanimivosti proteina GABAA (gama-aminomaslena kislina A). To je receptor, ki se nahaja predvsem v centralnem živčnem sistemu in je zadolžen zato, da opravlja funkcijo inhibitorja. Lociran je na površini nevrotičnih sinaps in prekinja elektrokemični signal, tako da omogoči prehod kloridnih ionov znotraj celice. To se zgodi takrat ko se ustrezen ligand Gama veže na aktivno mesto tega receptorja. Konformacija podenot se spremeni in to omogoči aktivacijo receptorja. Znanstveniki so ugotovili, da obstaja več vrst GABAA receptorjev, kar pa je odvisno od sestave podenot. Najbolj pogoste podenote so alfa beta in gama v razmerju 2:2:1. V primeru da do prekinitve ne pride se lahko pojavijo epileptični napadi, psihiatrične motnje itd. Stres lahko v dobi odraščanja močno vpliva na GABAA receptorje in jih tudi permanentno strukturno spremeni, kar pa lahko kasneje v našem življenju vpliva predvsem na naš spanec in njegovo kvaliteto. Absint je bila v preteklosti prepovedana pijača, saj je povzročala razna obolenja zaradi substance imenovane tujon. Le ta se je vezala na GABAA receptorje in tako onemogočila njegovo delovanje, zato ker je preprečevala prehod kloridnih ionov v membrano. Sedaj potekajo raziskave teh receptorjev, saj je ključnega pomena čim boljša ozdravitev bolezni, ki nastanejo zaradi nepravilnega delovanja GABAA receptorja.

== Veronika Jarc: Perforin ==

Perforin je protein, ki nastane iz citotoksičnih limfocitov T. S pomočjo grancimov napade tarčno celico in jo uniči. Rečemo lahko, da je pomemben člen pri imunskem odzivu in sodeluje s NK celicami. Sestavljen je iz 555 aminokislin, njegova molekulska masa pa je 62-67 kD. Sestavljen je iz dveh pomembnih domen, domene MACPF in domene C2. Za domeno C2 je značilno, da ima afiniteto do Ca2+ ionov. Saj se na lipidni dvosloj veže le ob prisotnosti kalcija. Drugače obstajata dva različna tipa C2 domene, ki sta bila izolirana iz različnih organizmov. Lahko rečemo, da sta oba tipa zelo podobna v tem, da sta pri tipu 1 N-konec in C-konec obrnjena na vrh domene, kar je nasprotno kot pri tipu 2. Poznamo tri MACPF domene: Plu-MACPF, C8a MACPF in lipokalin C8g. Vse te domene primerjamo z skupino proteinov citolizinov in ugotovimo nekaj podobnosti in nekaj razlik. Na splošno, pa lahko rečemo, da je evolucija poskrbela tako, da so sta si domena MACPF in citolizini raszlični le v nekaj aminokislinah. Poznamo tri mehanizme kako perforin preide v tarčno celico in pri tem pomaga gramcimom B uničit to celico. Prvi mehanizem je prehajanje preko perforinske pore in sicer s pomočjo veziklov preide v celico. Naslednji mehanizem je endosomolitični model, pri katerem je pomemben kompleks s pomočjo katerega prehaja v celico. Kot zadnji mehanizem pa je model prehodne perforinske pore, ki pove, da perforin tvori kanalčke s pomočjo katerih grancimi B preidejo direktno v celico. Grancimi B so serinske proteaze, ki se sintetizirajo v citotoksičnih limfocitih T in NK celicah.

== Taja Karner: Glavoboli in migrene ==

Zaradi stresnega in hitrega tempa življenja, vse več ljudi trpi za občasnimi glavoboli, ki so najpogosteje posledica utrujenosti. Prav tako je vedno več ljudi, ki trpijo za močnejšimi oblikami glavobolov imenovanih migrene. V hujših oblikah migrene lahko glavobol traja do dva dni, močno migreno lahko spremljajo še drugi simptomi kot so slabost, bruhanje, občutljivost na svetlobo in močan zvok, depresija ter nespečnost. Mutacija, ki je največji krivec za nastanek bolezni se pojavlja na kromosomu 10 na genu KCNK18. Ta zapisuje protein TRESK, ki se nahaja v hrbtenjači in deluje kot kalijev kanalček. Mutacija povzroči, da ne pride do izmenjavanja ionov, kar povzroči hude glavobole. V raziskavah so odkrili zanimivo povezavo z anestetikom. Ta namreč ne glede na mutacijo ponovno aktivira kanal. To bi lahko učinkovito pozdravilo migrene, če bi ga le uspeli spraviti v primerno obliko. Ugotovili so tudi, da zdravila, ki vsebujejo citosporin in takrolimus v večini primerov povzročajo migrene v zdravstvu pa jih še vseeno pogosto uporabljajo. Odkritje te mutacije predstavlja revolucijo v zdravstvu in verjamem, da bo kmalu vodilo do odkritja učinkovitega zdravila proti migrenam.

== Ana Dolinar: Univerzalna kri – prihodnost transfuzijske medicine? ==

α-galaktozidaza (AGAL_HUMAN) je glikozil-hidrolazni encim. Spada v GH27-D (klan D, 27. družina) in ima aktivno mesto v obliki (β/α)8 sodčka. Encim zapisuje gen GLA, ki se nahaja na kromosomu X.

Ideja o univerzalni krvi, ki bi bila primerna za transfuzijo, ne glede na krvno skupino pacienta, je med znanstveniki prisotna že približno trideset let.
Razvili so tri metode za pretvorbo različnih antigenov v antigen 0 (po sistemu AB0), ki je primeren za transfuzijo v vse krvne skupine.
:#Encimska razgradnja antigenov A in B do antigena 0. Za antigene A so uporabili α-N-acetilgalaktozaminidazo, vendar so antigeni preveč kompleksni in metoda ni bila uspešna. Pri antigenih B so dosegli popolno pretvorbo v antigen 0 z uporabo α-galaktozidaze iz bakterije ''Streptomyces griseoplanus''.
:#Prekrivanje površine eritrocitov z maleimidofenil-polietilen-glikolom (Mal-Phe-PEG). Prekrije vse antigene, ne samo A ali B, vendar metoda ni uspešna, ker polietilen-glikol povzroča imunski odziv.
:#Pridobivanje univerzalnih rdečih krvnih celic iz pluripotentnih matičnih celic. Uspeli so pridobiti zrele eritrocite, ki so popolnoma funkcionalni.
Uporaba univerzalne krvi bi zmanjšala ali celo izničila imunski odziv ob transfuziji, prav tako ne bi bilo možnosti za transfuzijo napačne krvne skupne zaradi človeške napake. Metode trenutno niso dovolj izpopolnjene, da bi bilo možno pričakovati njeno uporabo v bližnji prihodnosti.

== Maša Mohar: Moški ali ženska to je sedaj vprašanje?(SRY - faktor za določitev spola) ==

SRY gen kodira Sry protein ki je član družine Sox (Sry related HMG box) transkripcijskih faktorjev. Poznamo jih okoli 20 pri človeku in miškah ter še mnogo drugih. Sox proteini imajo zelo različne vloge v embriogenezi in pri razvoju mnogih drugih organov. Tipično delujejo tako kot nekakšna stikala v diferenciaciji celic- sprožijo razvoj določenih celic. Sry je prav tako kot ostali člani te družine karakteriziran po HMG( high mobility group). HMG je drugače skupina specifičnih transkripcijskih faktorjev, ki imajo ~ 80 AK dolge strukturalno podobne domene za vezavo na DNA. Te domene oz. domena če je samo ena se veže na zaporedje (A/T)ACAA(T/A) v majhni žleb DNA. S tem ustvari zvitje DNA za približno 60- 85 stopinj. S tem ko se DNA zvije se razkrijejo mesta za izražanje drugih genov, recimo Sox9, ki kodira Sox9 protein ki pomaga pri diferenciaciji Sertoli celic in tako pri oblikovanju testisov, s tem pa determinira moški spol. Ugotovili smo tudi da obstaja veliko genskih bolezni povezanih s Sry genom in da lahko obstaja tudi ženska z XY spolnima kromosomoma, ker se pri njej zaradi mutacij Sry protein ne izrazi, prav tako pa obstajajo tudi moški z XX spolnima koromosomoma, kjer se enem od X kromosomov lahko izrazi SRY gen ob nepravilnostih pri očetovem delu zapisa. V bistvu sem prišla do zaključka da je zelo tanka meja med moškim in ženskim oblikovanjem spola, ena majhna mutacija oz. ena majhna razlika lahko privede do nastanka ženske ali moškega.

== Urška Rauter: A Green Glow: zgradba in funkcija encima luciferaze ==
Luciferaza je encim odvisen od ATP in magnezijevih ionov. Proces bioluminiscence se začne z vezavo na substrat luciferin, tvori se adenilatni intermediat in ob prisotnosti molekularnega kisika izhaja svetloba. Luciferaza je zgrajena iz dveh ločenih domen, večja se nahaja na N-koncu in manjša na C-koncu molekule, večja domena pa ima tudi svoje poddomene. Domeni sta med seboj ločeni z razpoko, kjer naj bi se po domnevanjih nahajalo tudi aktivno mesto encima. Luciferaza predstavlja tudi nov način mehanizma tvorbe adenilatnega intermediata med encimi in ponuja razlago za marsikatero metabolično pot.
Velika dilema, ki me med znanstveniki ostaja pa je razlika v barvi svetlobe, ki jo proces oksidacije luciferina emitira. Najverjetneje je za to odločilna keto tavtomerna oblika oksiluciferina in tudi resnonančna stabilizacija njegovega fenolatnega aniona, čeprav so znanstveniki odkrili tudi veliko drugih možnih vzrokov za različne barve (različne aminokisline, polarnost okolja, pH, ...).
Luciferaza se veliko uporablja v medicini, kjer služi kot marker molekul v telesu in tako pripomore k boljšem razumevanju različnih bolezni in infekcij, kot tudi sami strukturi celic in njenih organelov.

== Mirjam Kmetič: Mint condition (limonen-3-hidroksilaza in limonen-6-hidroksilaza) ==

Klasasta meta vsebuje encim limonen-6-hidroksilazo, ki sodeluje pri pridobivanju karvona. Poprova meta pa vsebuje limonen-3-hidroksilazo, ki je udeležena pri proizvodnji mentola. Obe hidroksilazi pripadata družini citokromov P450, njeni predstavniki pomembno sodelujejo pri proizvajanju različnih oksidiranih monoterpenov, ki so vir arom eteričnih olj. Karvon in mentol sta končna produkta hidroksilacije limonena. Ta encima sta si zelo podobna in njuni vezavni mesti za substrat sta zelo omejeni. Velja pravilo, da za spremembo aktivnosti v družini citokromov P450 potrebujemo določeno število mutacij, vendar je za modifikacijo vezavne aktivnosti limonenovih hidroksilaz potrebna samo ena. Ta fenilalanin v izolevcin mutacija povzroči, da se limonen-6-hidroksilaza spremeni v limonen-3-hidroksilazo! Mutiran encim je tako sposoben sinteze mentola tako kot encim v poprovi meti! Taka mutacija kaže, da sta prav ti dve aminokislini ne le nujni, temveč tudi prav zagotovo vpleteni pri orientaciji limonena v aktivnem mestu tako, da se ta hidroksilizira na ali C3 ali C6 poziciji. Posamične mutacije, ki lahko drastično spremenijo funkcijo proteina, so znanstveno zanimive. Nakazujejo ne le na zelo specifične manjše regije v sekvenici proteina, temveč so tudi ključne za razumevanje področij, kot so vezava in orientacija substrata, funkcija encima, metabolična pot in struktura vezavnega mesta.

== Sandi Botonjić: Kokain esteraza ==

Znanstveniki so v rizosferi kokinih plantaž (Erythroxylum coca) našli sev MB1, gram pozitivne bakterije Rhodococcus sp.. Tej bakteriji kokain predstavlja glavni vir ogljika in dušika in zato so znanstveniki izolirali osrednji encim njenega metabolizma tj. kokain esterazo (v nadaljevanju cocE). Encim je sestavljen iz treh domen: DOM1, ki vsebuje nabor kanoničnih α-vijačnic in β-ploskev; DOM2 - domena le z α-vijačnicami; in DOM3 je roladi podobna struktura z β-ploskvami. CocE je serinska esteraza, katere aktivno mesto se nahaja na stičišču vseh treh domen. Ta hidrolizira kokain na ekgonil metil ester in benzojsko kislino, ki nimata psihoaktivnih učinkov. CocE je pravi Ferrari v primerjavi z drugimi esterazami, saj lahko razgradi enako količino kokaina 1000 krat hitreje. Tako lahko postane neprecenljiva pri nujnih intervencijah v primeru prevelikega odmerka, saj bi intravenozni vbrizg cocE močno zmanjšal razpolovni čas kokaina. CocE je predmet številnih raziskav, v katerih znanstveniki proučujejo njeno termostabilnost in njenih mutiranih oblik, saj njen razpolovni čas pri fiziološki temperaturi traja le nekaj minut. Znanstveniki pa na podlagi ugotovitev iz raziskav cocE razvijajo tudi učinkovita protitelesa z vsaj podobnimi katalitičnimi parametri, ki bi brez imunskega odziva odlično delovala v bioloških sistemih.

==Tjaša Flis: Parkinsonizem in Parkin protein==

Parkinsonova bolezen je vse pogostejša bolezen pri starostnikih, njeni simptomi pa so tresavica, mišična otrdelost in upočasnjena motorika. Vzrok se skriva v propadu dopamnergičnih nevronskih celic. Bolezen je lahko avtosomno dominantno dedovana, kar pomeni, da pacienti podedujejo eno normalno in eno mutirano kopijo gena. Slednja prevladuje in se deduje naprej. Pri Parkinsonovi bolezni se mutacija zgodi v Park2 genu, ki kodira Parkin protein ali E3 ubikvitin ligazo. Parkin na poškodovane ali na preveč izražene proteine pripne ubikvitin (označevalni protein), ki jih nato usmeri v proteasom, to je velik razgradni kompleks v celicah.
Če mutacija poškoduje Parkin, je pot razgradnje onemogočena, to pa pomeni, da se v celici akumulirajo odvečni proteini. Tvorijo se Lewy-eva telesca polna teh proteinov, ki nadomestijo celične organele v nevronskih celicah, kar vodi do prenehanja njihovega delovanja. Ker pa ima Parkin več kot samo en substrat ki ga ubikvitinira, je točen mehanizem bolezni še dandanes uganka.
Eden izmed najbolj poznanih substratov je transmembranski protein Pael-R. Zvitje tega proteina poteka ob prisotnosti šaperonov. Prevelika koncentracija tega receptorja lahko izzove stres v endoplazmatskem retikulumu situiranem v nevronskih celicah. V primeru da je Parkin neaktiven, Pael-R povzroči celično smrt. Vendar to je le ena izmed možnih rešitev, substratov je namreč vsaj še dvajset, raziskave pa se nadaljujejo.

== Matja Zalar: Vloga SRK in SCR proteinov pri preprečevanju incestnega razmnoževanja cvetočih rastlin ==

Rastline so za zaščito pred samooplojevanjem razvile več vrst mehanizmov prepoznavanja lastnega peloda na molekularni ravni. Pri cvetočih rastlinah je najpogostejši mehanizem tipa SSI ali sporofitične lastne inkompatibilnosti. Pri družini ''Brassicaceae'' je za aktivacijo SSI ključna interakcija med transmembranskim proteinom SRK, ki predstavlja žensko determinanto odziva, in njenim ligandom - proteinom SCR, drugače imenovanim tudi moška determinanta odziva na lastno inkompatibilnost. Specifičnost vezave je zagotovljena s polimorfizmom alel obeh determinant. V posameznih vrstah je možno najti tudi do 100 različnih S-haplotipov genov za determinanti.
Vezava liganda na receptor bo uspešna le, če oba izhajata iz istega S-haplotipa. Vezava SCR na zunajcelično, N-glikolizirano domeno SRK povzroči nastanek kompleksa treh proteinov, ki s svojo aktivnostjo sproži kaksado reakcij, kar v končni fazi pripelje do preprečitve samooploditve.
Na neugodne življenske pogoje, ki so onemogočali medsebojno opraševanje, so se nekatere rastline prilagodile s favorizacijo samooplojevanja. Pri njih so mutacije S-lokusa, ki nosi zapis za SRK in SCR, povzročile nepravilno delovanje SI ali njegovo popolno odpoved. To pa seveda vodi v neprepoznavanje lastnega peloda in rastlina se samooprašuje. Najbolj znan primer take rastline je ''Arabidopsis thaliana'', ki se zaradi svojih specifičnih lastnosti uporablja kot modelni organizem v številnih študijah lastne inkompatibilnosti.

== Matevž Ambrožič: BSX protein in debelost ==

Za primeren občutek sitosti ali lakote glede na stanje energetskih zalog v telesu in odgovarjajoč vnos hrane ter porabo energije je odgovorna zapletena pot sporočanja. Začne se s tremi hormoni: inzulin, leptin in grelin. Leptin in inzulin se sprostita, ko so maščobne in hidratne zaloge v telesu polne in morata do možganov prenesti signal za prenehanje hranjenja, grelin pa ravno nasprotno. Vsi po krvi potujejo do hipotalamusa, predela možganov, ki je odgovoren za energijsko ravnovesje. V hipotalamusu sta dva tipa živčnih celic: oreksigene in anoreksigene. Prve sproščajo NPY in AgRP, nevropeptida, ki spodbujata hranjenje in zmanjšata porabo energije, druge pa α-MSH in CART, katerih učinek je nasproten. Našteti nevropeptidi se iz nevronov sprostijo po vezavi ustreznega izmed treh hormonov in prenesejo signal naprej, do končne spremembe v vnosu ali porabi energije. Glavni protein seminarja, BSX (brain specific homeobox) protein je transkripcijski faktor, ki spodbudi ekspresijo genov za AgRP in NPY, hkrati pa je odgovoren za premik organizma v iskanju hrane. Če v opisanem sistemu pride do napake, so pojavi nepotreben občutek lakote, kar je vzrok mnogih primerov debelosti. V boju z bolezensko debelostjo so ključne raziskave na BSX proteinu, saj je osrednji člen poti, ki v možgane prenese (včasih lažen) občutek lakote.

== Kaja Javoršek: A grey matter ==

Mikrocefalin je protein, ki ga kodira enakoimenski gen. Mikrocefalin naj bi kontroliral poliferacijo in diferenciacijo nevroblastov med nevrogenezo. Odkritje, da je mikrocefalin odločilen regulator velikosti možganov, je sprožilo hipotezo, da je igral vlogo v evoluciji možganov.
Razen v možganih najdemo mikrocefalin tudi v ledvicah, srcu, pljučih, vranici in skeletnih mišicah. Vendar pomen mikrocefalina v teh organih še ni znan.
Mutacije na genu mikrocefalina vodijo do nastanka mikrocefalije. To je bolezen razvoja živčnega sistema in je definirana kot resno zmanjšana velikost možganov. Pri odraslih je normalen volumen možganov od 1200 cm3 do 1600 cm3, pri odraslih s primarno mikocefalijo pa okoli 400 cm3 . Poleg mirocefalina pa povzročajo mikrocefalijo še mutacije petih genih (ASPM, MCPH2, CDK5RAP2, MCPH4, CENPJ)
Mikrocefalin ima tri BRCT domene na C – koncu. BRCT domene so prisotne v veliko ključnih proteinih, ki kontrolirajo delitev celice. Zato predvidevajo da mikrocefalija nastane, ker je ovirana normalna regulacija delitve celic v možganih.
Ugotovili so, da je protein mikrocefalin dol 835 aminokislin. Zaradi mutacije na genu mikrocefalina se ta protein skrajša na 25 aminokislin.
Znanstveniki so izvedli raziskavo ali gena mikrocefalin in ASPM vplivata na inteligenco. Na podlagi treh raziskav so zaključili, da inteligenca ni povezana z dominantnimi aleli ASPM – ja ali mikrocefalina.

== Rok Vene: A mind astray ==

Alzheimerjeva bolezen postaja vedno bolj aktualna tematika. Trenutno je na svetu več kot 26 milijonov ljudi s to obliko demence. Zaradi daljše življenjske dobe pa pričakujemo, da bo število obolelih samo še naraščalo. Alzheimerjeva bolezen prizadene centralni živčni sistem, v možganih se nalagajo snovi, ki povzročijo propad živčnih celic. Ena izmed snovi, ki se nalagajo v možganih so nefunkcionalni Tau proteini. Tau proteini sodijo v družino proteinov imenovanih microtubule-associated proteins (MAP), njihova naloga pa je je stabilizacija mikrotubulov. To dosežejo tako, da se na mikrotubule vežejo. Poleg tega predvidevajo, da imajo Tau proteini še eno nalogo. Sodelovali naj bi v kompleksu za uravnavanje vzdražnosti živčnih celic. Nefunkcionalnost Tau proteinov povezujejo z različnimi boleznimi, ki jih poznamo pod skupnim imenom tauopatije. V primeru Alzheimerjeve bolezni je Tau protein nefunkcionalen, zato ker je hiperfosforiliran, kar mu onemogoča vezavo na mikrotubule. Tau proteini zato tvorijo netopne agregate – nevrofibrilarne pentlje, ki najbrž povzročijo odmiranje živčnih celic. Pri iskanju učinkovin proti hiperfosforilaciji in agregaciji Tau proteina, so znanstveniki raziskali protein FKBP52. Ta protein ima več funkcij. Osredotočili so se predvsem na njegove šaperonske lastnosti. Ugotovili so, da se FKBP52 veže na hiperfosforiliran Tau protein, in tako prepreči agregacijo Tau proteina, ki je odgovorna za odmiranje nevronov.

== Ines Šterbal: LTP1 ==

Protein LTP1, izoliran iz ječmenovega zrna, spada v družino lipidnih prenašalnih proteinov (lipid transfer protein –LTP). Je dobro topen protein, ki se nahaja v alevronski plasti ječmenovega semena. Sestavljen je iz štirih heliksov, ki so povezani z disulfidnimi mostički. Ima dobro definiran C-terminalni konec. V razmerah in vivo je globularni protein, s stožčastim hidrofobnim jedrom, ki se razteza od enega konca molekule do drugega. Sposoben je vezati različne lipide, kot so maščobne kisline ali acetil-koencim A. LTP1 proteini so na površini aktivni proteini, so stabilni, denaturirajo šele okrog 100 °C. Vloga LTP1 proteina in vivo še ni znana. In vitro je glavni protein pri penjenju piva. Opravlja pa še številne druge funkcije, odvisno od tega, kateri ligand ima vezan. LTP1 proteini so verjetno vključeni v prenos lipidov preko membrane in celo v nastanek membrane, lahko bi imeli vlogo v transportu monomera Cutin, vlogo naj bi igrali tudi v obrambnem mehanizmu rastlin. Lipidi, ki so vezani na LTP1 bi naj imeli antibakterijsko aktivnost za bakterije in glive.
Vsi podatki kažejo, da so povezave med sladkorji in proteini, ki nastanejo kot produkt Milardove reakcije, prvi korak do nastanka pivovske pene. Kaže, da je kontrola glikacije LTP1 proteinov med slajenjem in varjenjem piva, nujna za optimalno penjenje piva.

== Mitja Crček: DSIP in spanje ==

Pred 2000 leti so ljudje verjeli, da postanemo zaspani zaradi nekakšnih želodčnih hlapov, ki gredo v možgane, se tam kondenzirajo, zamašijo pore in posledično povzročajo zaspanost. Kasneje so seveda ugotovili da temu ni tako, leta 1977 pa so odkrili majhne peptide, ki naj bi nas uspavali in jih poimenovali Delta Sleep-Inducing peptide (DSIP). DSIP je majhen peptid, sestavljen iz devetih aminokislinskih ostankov in maso 850 daltonov, prvič pa so ga odkrili pri zajcih. Sodeloval naj bi tako pri endokrini regulaciji kot pri fizioloških procesih (poveča učinkovitost oksidativne fosforilacije), pomembno vlogo pa naj bi imel tudi v medicini in pri zdravljenju bolezni. Ker naj bi podaljševal REM fazo, bi ga lahko uporabljali tudi kot dodatek pri zdravljenju alkoholizma ali ga dodajali antidepresivom in pomirjevalom, ki skrajšujejo REM fazo. Raziskave so spremljale tudi vpliv DSIP-ja na nespečnost. Ugotovili so, da DSIP rahlo povečuje kvaliteto spanja in skrajšuje latenco uspavanja, na trajanje budnosti in druge parametre pa ne vpliva, zato so si strokovnjaki enotni, da ima DSIP le rahle terapevtske učinke na nespečnost. Delovanje peptida pa še vedno ni povsem razjasnjeno in le želimo si lahko, da bodo novejše raziskave prinesle nove informacije, saj ima DSIP vsekakor velik potencial v medicini.

== Dominik Kert: FOXP2, govoreči protein ==

Ljudje in živali se razlikujejo. Za znanstvenike 19. stoletja je bilo zelo fascinantno to, da mi lahko govorimo, se sporazumevamo in pomnimo besede, medtem ko živali ne morejo. Ko se je pojavila družina KE na koncu 90. let prejšnjega stoletja, so znanstveniki ugotovili, da obstaja gen, ki kodira FOXP2. Družina KE je slovi po tem, da ima polovica njenih članov težave z govorom. Tako so ugotovili, da se mutacija prenaša avtosomno in dominantno. In verjetno na to vpliva mutacija FOXP2, FOXP2 protein pa je po vsej verjetnosti odločilen faktor pri govoru.
FOXP2 protein je sestavljen iz 715 aminokislin in spada med družino transkripcijskih faktorjev, ki se imenuje FOX (zaradi 'forkhead box' domene). Zanimivo je, da se ta gen razlikuje od gena opic (šimpanz, gorila, makaki) le za dve in od miši le za tri aminokisline. To se znanstvenikom zdi zelo zanimivo, ker je verjetno zaradi teh dve sprememb v aminokislinskem zaporedju prišlo do sprememb pri sporazumevanju. Zaradi teh dejstev so se naprej usmerili na to, ali je bil gen res pod vplivom naravne selekcije in ugotovili so, da je bil res.
FOXP2 na te spremembe vpliva v možganih, je pa prisoten tudi v pljučih, drobovju in srcu. Vendar njegova funkcija tam še ni znana.

== Petra Malavašič: Ureaza bakterije Helicobacter pylori ==

Bakterija Helicobacter pylori spada med patogene mikrobe. Znanstvenika Warren in Marshall sta leta 1987 odkrila to bakterijo ter ugotovila, da je s to bakterijo povezana razjeda na želodcu. Leta 2005 sta prejela Nobelovo nagrado. Že vsak drugi človek je okužen s to bakterijo. Naseljena je na želodčni sluznici in povzroča kronično vnetje želodčne sluznice. Bakterija se lahko naseli in se razmnožuje v prisotnosti želodčne kisline, kjer je pH okoli 2. Posebni obrambni mehanizmi omogočajo bakteriji, da lahko preživi v kislem okolju. Encim ureaza je pri tem najpomembnejši. Ureaza je encim, ki katalizira hidrolizo uree, pri čemer nastane amoniak, ki se v končni fazi veže z molekulami vode v amonijev hidroksid, ki poveča pH v neposredni okolici bakterije. Encim ureaza se nahaja v citoplazmi bakterijske celice in na njeni površini. Sam encim je zgrajen zelo kompleksno in omogoča bakteriji preživetje. Posebna kompleksna zgradba encima onemogoči, da bi kislina želodčnega soka denaturirala encim. Encim sestavljata dva kompleksa (αβ) štirih prostorsko razporejenih (αβ)3 enot.

== Matevž Merljak: CEM15, VIF in infektivnost retrovirusov ==

Ena izmed komponent obrambnega mehanizma pred retrovirusi v nekaterih človeških celicah je citidinska deaminaza CEM15 (APOBEC3G). V celicah, ki jo izražajo, se retrovirusi brez posebnega proteina (VIF, “viral infectivity factor”) ne morejo uspešno množiti, zato takim celicam pravimo “nepermisivne” celice.

CEM15 deluje tako, da med procesom reverzne transkripcije v novonastali “minus” DNA verigi številne citidinske baze pretvori v uridinske, ter s tem povzroči tako zmanjšano obstojnost z uracilom bogate DNA verige, kot tudi zamenjave gvanozinskih baz z adenozinskimi v kodirajoči (“plus”) verigi DNA. Čeprav takšna hipermutacija za nadaljno infektivnost virusa ni vedno usodna (torej lahko tako mutirana DNA v nekaterih primerih še vedno tvori funkcionalne viruse), je običajno dovolj obsežna, da onemogoči uspešno reprodukcijo virusa.

Raziskave kažejo, da CEM15 ne napade nastajajoče DNA kot lasten celični odgovor na infekcijo, pač pa se med izgradnjo novih virusov vgradi v le-te ter po infekciji nove celice povzroči omenjene spremembe v nastajajoči DNA verigi.

Že omenjen faktor VIF izhaja iz virusa HIV-1, ki primarno napada sicer nepermisivne limfocite T. Naloga VIF je preprečitev vgradnje CEM15 v nastajajoče viruse, to pa doseže tako z oteževanjem njene translacije, kot tudi z indukcijo razgradnje CEM15 v proteasomu.

== Eva Knapič: TSH3 - Kaj novorojenčkom omogoča zadihati? ==

Kaj novorojenčkom omogoča zadihati? Raziskave so pokazale, da ima eno izmed vodilnih vlog pri začetku dihanja protein teashirt homolog 3 (TSH3). To je protein, ki ga uvrščamo med transkripcijske faktorje. Po strukturi spada v družino cinkovih prstov, kjer so sekundarne strukture koordinirane s cinkovim ionom. TSH3 ima pet tako urejenih struktur in vse spadajo v Cys2His2 skupino – cinkov ion koordinira dva cisteinska in dva histidinska ostanka ßßα podenote.
Organizem brez zapisa za teashirt 3 protein se v času embrionalnega razvoja navidezno ne razlikuje od organizmov, ki ta zapis imajo. Vendar so podrobnejše raziskave pokazale, da se brez prisotnosti proteina teashirt 3 dokončno ne oblikujejo pljučni mešički, ki so funkcionalna enota pljuč, saj tam poteka izmenjava plinov. Odsotnost proteina povzroča povečano apoptozo nevronov motoričnega jedra v možganskem deblu, s tem so proteinu pripisali zmožnost inhibicije apoptoze nevronov. Prav tako so nezmožnost odziva organizma na pH spremembe okolja pripisali pomanjkanju proteina TSH3.
Iz vseh teh pomanjkljivostih, ki jih povzroča TSH3 so raziskovalci prišli do zaključka, da novorojenček brez zapisa za protein ni zmožen zadihati, ker ni sposoben odziva na spremembo okolja, predvsem pH in tako ne more vzdrževati homeostaze, ki je potreba na preživetje.

== Tjaša Goričan: Vpliv Nogo proteina na regeneracijo živčnega sistema ==

Nevroni vsebujejo mielin, ki je sestavni del mielinske ovojnice aksona in ima nalogo zagotavljanja stalnega prenosa električnih signalov. Poleg tega pa mu je dodeljena tudi nenavadna lastnost. Vsebuje namreč proteine Nogo-A, ki delujejo kot inhibirotji za rast poškodovanih aksonov. Posledično se diferencirani nevroni niso sposobni deliti. Problem se pojavi pri poškodbi živčnega sistema, saj se ni sposoben regenerirati. Bolezni, ki so povezane s poškodbami živčevja so: Poškodbe hrbtenjače, Alzheimerjeva bolezen, možganska kap, shizofrenija itd.

Nogo-A protein spada v družino proteinov retikulonov in je ena od oblik Nogo proteinov. Je transmembranski protein, ki se z domeno Nogo-66 uspešno veže na receptor in povzroči razgradnjo mikrotubulov v aksonu, kar privede do preureditve citoskeleta in posledično zaustavitve rasti aksona. Največ Nogo-A se nahaja na oligodendrocitih. Oligodendrociti so celice, ki spadajo med nevroglio in tvorijo mielinski ovoj nevronov v centralnem živčnem sistemu. Veliko več ga najdemo v centralnem živčnem sistemu v primerjavi s perifernim.

Čeprav je še veliko neznanega na področju živčnega sistema, je znanost že dosegla uspehe glede boja proti boleznimi, povezanimi z regeneracijo živčnega sistema. S protitelesi se da inhibirati protein Nogo-A in s tem preprečiti inhibicijo rasti poškodovanih nevronov.

== Marko Radojković: Fluoroscentni proteini in njihova uporaba v živčnem sistemu ==

Fluorescentni proteini so členi družine homologih proteinov, ki se delijo skupno lastnost da svetlijo zaradi formiranja kromoforma znotraj lastnega polipeptidnega zaporedja. Prvi odkrit takšen protein je bil zeleni fluorescentni protein ali GFP. Od tedaj do danes so kreirani različni mutanti, ki žarijo skoraj vse barve človeškega vidnega spektra. Izkazalo se je da so zelo uporabni v mnogih bioloških disciplinah, predvsem pa so popularni v spremljanju dinamike proteinov, genske ekspresije, in tudi posledično na viši ravni, dinamike organelov ter gibanja celic znotraj tkiva.

Ne tako dolgo nazaj, je tim znanstvenikov uspel skombinirati različne barvne variante GFP-ja s sofisticiranim Cre/Lox sistemom genske rekombinacije in tako omogočil njihovo izražanje v samih možganih. Tale tehnika omogoča da se vsaki posamezni nevron obarva drugače in tako loči od sosednjih, kar omogoča detajlno analizo živčnega vezja. Brainbow strategija, kakor so jo poimenovali, daje upanje znanstvenikom da z ustvarjanem celotnega ''zemljevida'' možganov, lahko izpeljejo pomembne informacije o nevronskih povezavah in njihov nadaljni vpliv na vedenje in delovanje organizma.

== Tamara Marić: MikroRNA ==
MikroRNA je mala molekula, ki je prepisana z DNA na tak način kot mRNA. Zapis za miRNA se lahko nahaja v intronskih regijah, kodirajočih ali nekodirajočih genov. Osnovna funkcija je utišanje genov na nivoju sinteze proteinov. Da pa lahko opravi svojo nalogo mora dozoreti. Biogeneza miRNA se začne v samem jedru, kjer se 1000 nukleotidov dolg transkript s pomočjo encimskega kompleksa (Drosha-DGCR8)skrajša na 60-70 nukleotidov dolg pre-miRNA.Z eksportinom-5 se prenese iz jedra v citoplazmo do naslednjega kompleksa. Dicer veže pre-miRNA in jo skrajša na 22 nukleotidov. Nastane miRNA dupleks. Ena izmed verig prevzame vodilno funkcijo in se vmesti v kompleks istega encima v povezavi z drugimi proteini. Kompleks pripelje do komplamentarne verige mRNA in povzroči translacijsko represijo. Znanstveniki se ukvarjajo predvsem z vprašanjem,kako se miRNA izraža v številnih boleznih. Natančneje sem si pogledala proces resorpcije in obnove kosti in kako miRNA vpliva na regulacijo teh dveh procesov.

== Maja Remškar: Okulokutani albinizem tipa II in P protein ==

Melanin je pigment, ki je nujno potreben za zaščito kože pred pripekajočim soncem ter za normalno delovanje oči. Glavna sestavina za njegovo sintezo je aminokislina tirozin, ki je osnova evmelanina (črni pigment), ob dodatku cisteina pa dobimo še feomelanin (rdeče-rumen). Za običajno delovanje biosinteze melanina je potrebno kislo okolje v melanosomih, kjer se sinteza izvaja. Za vzdrževanje kislosti sta potrebna dva proteina – anionski kanalček in ATP črpalka. Anioni tu delujejo kot vaba za protone, kjučne za kisel pH. P protein naj bi deloval kot anionski transporter. Torej v njegovi odsotnosti v melanosom ne morejo dostopati anioni in posledično se v celico ne prečrpavajo protoni, kar pomeni da ni kislega pH ugodnega za sintezo melanina.
Okulokutani albinizem tipa II ali OCA2 nastane zaradi pomanjkanja količine melanina v očeh, koži in laseh. Za kožo to pomeni večjo občutljivost na UV žarke in povečano možnost za kožnega raka. Zaradi nepigmentiranih optičnih vlaken pa se pojavijo še težave z očmi, kot so škiljenje, fotofobija, nistagmus, degeneracija rumene pege, pride pa tudi do izgube biokularnega vida. OCA2 je dedna bolezen, ki se deduje recesivno. Človek le z enim okvarjenim alelom je torej prenašalec gena. Ugotovili so, da OCA2 povzroča mutacija gena P, in sicer najpogostejša je delecija 7 eksona.

== Ana Remžgar: Bacillus subtilis ==

Bacillus subtilis je grampozitivna paličasta bakterija. Ko ima v okolju dovolj hranil, se simetrično deli in vegetativno raste. Ko pa v okolju začne hranil primanjkovati, B. subtilis uvede različne mehanizme, da lahko preživi. Del populacije postane kompetenten in sprejme tujo DNA. Del populacije pa s pomočjo zapletenega sistema aktivacije proteina Spo0A vstopi v proces sporulacije. Sporulacija je počasen in energijsko potraten postopek, ki traja v idelanih razmerah vsaj 7 ur. Na koncu nastane spora, ki lahko preživi tudi več desetletji v neugodnih življenjskih razmerah. Ko celica vstopi v cikel sporulacije, začne v okolje izločati razne toksične snovi, med njimi sta najbolj učinkovita Skf in Sdp. Ko celica izloči ti dva proteina v okolje, ubije sosednje bakterijske celice Bacillis subtilisa. Zaradi njunih lasnosti, ta dva proteina pogosto zato imenujemo kanibalistična faktorja. Vendar mora celica paziti, da pri tem ne ubije še sebe. Pri tem ji pomaga medmembranski protein SdpI.
Bakterija Bacillus subtilis si tako s kanibalizmom pomaga, da celice ki vstopajo v sporulacijo dobijo dovolj hranil za dokončanje spore.

== Tina Gregorič: Grelin - hormon lakote ==

Občutek lakote je odvisen od številnih dejavnikov, med katere spadajo telesna sestava in teža, vrsta hrane, ki jo vsak dan uživamo, količina spanja in psihološki dejavniki. Večina ljudi postane lačnih, ko je čas za obrok: zajtrk, kosilo, malica, večerja. Znanstveniki so leta 1999 odkrili hormon, ki sodeluje pri nastanku lakote in poveča apetit. Imenuje se grelin, ki je poznan tudi pod imenom hormon lakote. Gen, ki kodira transkripcijo grelina, je sestavljen iz 117 aminokislin in se ob aktivaciji razcepi na 5 manjših podenot, med katerimi sta najpomembnejša grelin in obestatin. Grelin je sprva neaktiven hormon, sestavljen iz 28 aminokislin. Po esterifikaciji na serinu (Ser3) postane aktiven. Sprosti se v kri in po krvi potuje do hipofize v možganih, kjer se nahajajo grelinski receptorji, imenovani GHRS-1a receptorji. Natančna vezava grelina na receptor zaenkrat še ni znana. Grelin ni edini hormon, ki vpliva na to, kdaj nas bo zajela želja po hranjenju in kdaj nas bo minila. V telesu imamo več kot 40 snovi, ki spodbujajo in zavirajo občutek lakote. Odkritje grelina in raziskovanje njegove vloge v človeškem metabolizmu je odprlo vrata številnim raziskavam in študijam na področju debelosti in motenj, ki so povezane s prehranjevanjem. Hormon grelin je povezan z različnimi obolenji kot so anoreksija, kahesija, SW sindrom in na koncu tudi prekomerna telesna teža, vendar se njegova funkcija od bolezni do bolezni spreminja.

== Andreja Bratovš: Bolečina in njen receptor - TRPA1 ==

Ko začutimo bolečino, je to ponavadi znak, da lahko pride ali pa je že prišlo do poškodbe na ali v našem telesu – opozorilo za nas, naj ukrepamo. V zaznavanje bolečine je vpletenih veliko zapletenih mehanizmov, eno zanimivejših odkritij pa je gotovo receptor TRPA1. TRPA1 je receptorski ionski kanalček, prepusten za različne katione. Aktivirajo ga različni dražljaji: nizka temperatura, oksidativni stres in različne dražilne snovi. Med kemijskimi aktivatorji so zanimivi predvsem: alil izotiocianat (snov, ki daje pekoč okus gorčici, hrenu in wasabiju), alicin (spojina iz česna) ter akrolein (sestavina solzivca). Zanimivo je, da aktivacija TRPA1 poteka preko kovalentne vezave liganda na receptor.
TRPA1 se nahaja v nociceptorjih – to so prosti živčni končiči, ki zaznavajo bolečino – njegova funkcija pa je zaznavanje bolečine, ki jo povzročijo prej navedeni dražljaji. Udeležen je tudi pri občutenju bolečine pri vnetju tkiva, kjer deluje v povezavi z bradikininom – mediatorjem vnetja.
TRPA1 in tudi drugi TRP kanalčki so zanimive tarče za nove vrste analgetikov. Cilj novih zdravil je delovanje le na začetek poti prenosa bolečine in ne centralno na ves živčni sistem, kot je značilno za dosedanja zdravila proti bolečinam. Tako delovanje bi namreč zmanjšalo stranske učinke pri jemanju analgetikov, kot so na primer omotičnost in zaspanost.

BIO2 Seminar 2011

2011-11-18T22:46:17Z

MarkoRadojkovic: /* Seznam seminarjev- datumi in seznam recenzentov še niso dokončni! */

= Biokemijski seminar =

Seminarje vodi doc. dr. Gregor Gunčar in so na urniku vsako sredo in petek po eni uri predavanj iz Biokemije.

Ocena seminarjev predstavlja 30% končne ocene in vsebuje vse točke, ki jih študent/ka lahko zbere pri seminarju in ostalih dejavnostih, ki niso del pisnega izpita.

== Seznam seminarjev- datumi in seznam recenzentov še niso dokončni! ==
Vpišite svoj izbrani naslov!!!
{| {{table}}
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Ime in priimek'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Naslov seminarja'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Rok za oddajo'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Rok za recenzijo'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Datum predstavitve'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent1'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent2'''
|-
| Ula Štok||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2011 Tipping the mind]||17.10.11||19.10.11||21.10.11||Maja Remškar||Mirjam Kmetič
|-
| Maša Mirković||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2011 The twisted way of things]||17.10.11||19.10.11||21.10.11||Eva Knapič||Marko Radojković
|-
| Sara Draščič||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2011 On the spur of a whim ]||17.10.11||19.10.11||21.10.11||Matevž Merljak||Monika Škrjanc
|-
| Katra Koman||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2011#Katra_Koman:_INZULIN Protein of the 20th century]||18.10.11||23.10.11||26.10.11||Ines Kerin||Veronika Jarc
|-
| Ana Dolinar||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2011#Ana_Dolinar:_Univerzalna_kri_.E2.80.93_prihodnost_transfuzijske_medicine.3F The juice of life]||21.10.11||25.10.11||28.10.11||Tjaša Goričan||Andreja Bratovš
|-
| Urška Rauter||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2011#Ur.C5.A1ka_Rauter:_A_Green_Glow:_zgradba_in_funkcija_encima_luciferaze A green glow]||21.10.11||25.10.11||28.10.11||Maša Mohar||Sandi Botonjić
|-
| Taja Karner||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2011#Taja_Karner:_Glavoboli_in_migrene Throb]||21.10.11||26.10.11||02.11.11||Karmen Hrovat||Tamara Marić
|-
| Rok Štemberger||Forbidden fruit||21.10.11||28.10.11||04.11.11||Špela Pohleven||Maja Grdadolnik
|-
| Maša Mohar||The tenuous nature of sex||21.10.11||28.10.11||04.11.11||Andreja Bratovš||Ines Kerin
|-
| Veronika Jarc||Our hollow architecture||21.10.11||28.10.11||04.11.11||Sabina Mavretič||Matevž Ambrožič
|-
| Mirjam Kmetič||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2011#Mirjam_Kmeti.C4.8D:_Mint_condition_.28limonen-3-hidroksilaza_in_limonen-6-hidroksilaza.29 Mint condition]||26.10.11||02.11.11||09.11.11||Sandi Botonjić||Tina Gregorič
|-
| Janez Meden||The Japanese Horseshoe Crab and Deafness||28.10.11||01.12.11||20.1.12||Veronika Jarc||Ana Dolinar
|-
| Tjaša Flis||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2011#Sandi_Botonji.C4.87:_Kokain_esteraza Life's tremors]||28.10.11||04.11.11||11.11.11||Ana Dolinar||Špela Pohleven
|-
| Sandi Botonjić||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2011#Sandi_Botonji.C4.87:_Kokain_esteraza Nature's junkie]||28.10.11||04.11.11||11.11.11||Maša Mirković||Alenka Mikuž
|-
| Kaja Javoršek||A grey matter||02.11.11||09.11.11||16.11.11||Dominik Kert||Tjaša Flis
|-
| Rok Vene||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2011#Rok_Vene:_A_mind_astray A mind astray]||04.11.11||11.11.11||18.11.11||Tamara Marić||Maja Remškar
|-
| Ines Šterbal||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2011 LTP1]||04.11.11||11.11.11||18.11.11||Ula Štok||Rok Vene
|-
| Matja Zalar||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2011#Matja_Zalar:_Vloga_SRK_in_SCR_proteinov_pri_prepre.C4.8Devanju_incestnega_razmno.C5.BEevanja_c Do it yourself]||04.11.11||11.11.11||18.11.11||Monika Škrjanc||Matevž Merljak
|-
| Matevž Ambrožič||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2011#Matev.C5.BE_Ambro.C5.BEi.C4.8D:_BSX_protein_in_debelost Of fidgets and food]||09.11.11||16.11.11||23.11.11||Kaja Javoršek||Petra Malavašič
|-
| Matevž Merljak||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2011#Matev.C5.BE_Merljak:_CEM15.2C_VIF_in_infektivnost_retrovirusov Protein wars]||11.11.11||18.11.11||25.11.11||Teja Banič||Urška Navodnik
|-
| Mitja Crček||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2011#Mijta_Cr.C4.8Dek:_DSIP_in_spanje When your day draws to an end]||11.11.11||18.11.11||25.11.11||Marko Radojković||Andrej Vrankar
|-
| Dominik Kert||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2011#Dominik_Kert:_FOXP2.2C_govore.C4.8Di_protein FOXP2, govoreči protein]||11.11.11||18.11.11||25.11.11||Alja Zottel||Kaja Javoršek
|-
| Petra Malavašič||Going unnoticed||16.11.11||23.11.11||30.11.11||Maja Grdadolnik||Mitja Crček
|-
| Eva Knapič||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2011#Eva_Knapi.C4.8D:_TSH3_-_Kaj_novorojen.C4.8Dkom_omogo.C4.8Da_zadihati? Life's first breath]||18.11.11||25.11.11||02.12.11||Mirjam Kmetič||Andrej Vrankar
|-
| Marko Radojković||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2011#Marko_Radojkovi.C4.87:_Fluoroscentni_proteini_in_njihova_uporaba_v_.C5.BEiv.C4.8Dnem_sistemu Paint my thoughts]||18.11.11||25.11.11||02.12.11||Sara Draščič||Urška Rode
|-
| Tjaša Goričan||Nerve regrowth: nipped by a no-go||18.11.11||25.11.11||02.12.11||Ana Remžgar||Ines Šterbal
|-
| Tina Gregorič||Gut feelings||23.11.11||30.11.11||07.12.11||Janez Meden||Urška Rauter
|-
| Tamara Marić||The dark side of RNA||25.11.11||02.12.11||09.12.11||Dominik Kert||Rok Štemberger
|-
| Ana Remžgar||I'll have you for supper||25.11.11||02.12.11||09.12.11||Jana Verbančič||Eva Knapič
|-
| Maja Remškar||Questioning Colour||25.11.11||02.12.11||09.12.11||Katra Koman||Karmen Belšak
|-
| Andreja Bratovš||The power behind pain||30.11.11||07.12.11||14.12.11||Matevž Ambrožič||Teja Banič
|-
| Urška Navodnik||Darwin\'s dessert||02.12.11||09.12.11||16.12.11||Taja Karner||Karmen Hrovat
|-
| Jernej Mustar||Silent pain||02.12.11||09.12.11||16.12.11||Petra Malavašič||Jana Verbančič
|-
| Ines Kerin||A queen\'s dinner||02.12.11||09.12.11||16.12.11||Tjaša Flis||Iza Ogris
|-
| Alja Zottel||Sleepless nights||07.12.11||14.12.11||21.12.11||Ines Šterbal||Katra Koman
|-
| Alenka Mikuž||Molecular chastity||09.12.11||16.12.11||23.12.11||Urška Rode||Janez Meden
|-
| Maja Grdadolnik||Ear of Stone||09.12.11||16.12.11||23.12.11||Tina Gregorič||Ana Potočnik
|-
| Jana Verbančič||A balanced mind||09.12.11||16.12.11||23.12.11||Alenka Mikuž||Ana Remžgar
|-
| Karmen Hrovat||The thread of life||14.12.11||21.12.11||04.01.12||Iza Ogris||Taja Karner
|-
| Andrej Vrankar||The things we forget||16.12.11||23.12.11||06.01.12||Jernej Mustar||Maša Mohar
|-
| Teja Banič||Cool news||16.12.11||23.12.11||06.01.12||Karmen Belšak||Jernej Mustar
|-
| Špela Pohleven||The making of crooked||16.12.11||23.12.11||06.01.12||Mitja Crček||Maša Mirković
|-
| Sabina Mavretič||A short story||21.12.11||04.01.12||11.01.12||Rok Vene||Sabina Mavretič
|-
| Karmen Belšak||Another dark horse||23.12.11||06.01.12||13.01.12||Urška Rauter||Sara Draščič
|-
| Iza Ogris||Love,love, love...||23.12.11||06.01.12||13.01.12||Ana Potočnik||Matja Zalar
|-
| Monika Škrjanc||The greenest of us all||23.12.11||06.01.12||13.01.12||Rok Štemberger||Tjaša Goričan
|-
| Ana Potočnik||Skin-deep||04.01.12||11.01.12||18.01.12||Matja Zalar||Ula Štok
|-
| Urška Rode||Smart sweat||06.01.12||13.01.12||20.01.12||Urška Navodnik||Alja Zottel
|-
| Ime in priimek||Naslov seminarja||06.01.12||13.01.12||20.01.12||||
|}

== Gradivo za seminarje ==
NOVO Gradivo za predavanja in seminarje najdete na http://bio.ijs.si/~zajec/bio2/
username: bio2
password: samozame

==Naloga==
'''Vaša naloga za seminar je: '''
Samostojno pripraviti seminar o enem od proteinov opisanih v [http://web.expasy.org/spotlight/back_issues/2011/ ProteinSpotlight] Poiskati morate vsaj še tri znanstvene članke, ki se nanašajo na opisano temo in jih uporabiti kot podlago za seminarsko nalogo!

V okviru seminarske naloge morate opraviti še naslednje naloge, katerih rešitve predložite na dodatni strani seminarske naloge, ki se ne šteje v kvoto obsega seminarja:

* sekvenca proteina in [http://www.uniprot.org/ UniProt] oznaka proteina
* slika strukture proteina (če je le-ta znana), ki jo naredite sami s programom Pymol. Če struktura še ni znana, vključite sliko proteina, ki je vašemu najbolj podoben po sekvenci in katerega struktura je znana
* poiskati morate, na katerem kromosomu se v človeškem genu nahaja ta protein in narisati shematsko sliko gena (eksonov in intronov) tega proteina. Če protein ni človeškega izvora, poiščite protein, ki je vašemu najbolj podoben in vse navedeno opišite za ta protein.

Za pripravo seminarja velja naslednje: 
* [[BIO2 Povzetki seminarjev 2011|Povzetek seminarja]] opišete na wikiju v približno 200 besedah - najkasneje do dne ko morate oddati seminar recenzentom.
* Povezavo do povzetka vnesete v tabelo seminarjev tekočega letnika.
* Seminar pripravite v obliki seminarske naloge na ~5-9 straneh A4 (pisava 12, enojni razmak, 2,5 cm robovi; važno je, da je obseg od 2700 do 3000 besed), vsebovati mora najmanj tri slike. Slika mora imeti legendo in v besedilu mora biti na ustreznem mestu sklic na sliko.
* Seminar oddajte do datuma oddaje, ki je naveden v tabeli vsakemu od recenzentov in docentu (docentu ga pošljite po e-pošti).
* Recenzenti do dneva določenega v tabeli določijo popravke in podajo oceno pisnega dela.
* Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Za predstavitev je na voljo 20-30 minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni.
* Predstavitvi sledi razprava. Recenzenti podajo oceno predstavitve in postavijo najmanj dve vprašanji.
* Na dan predstavitve morate docentu oddati končno (popravljeno) in natisnjeno verzijo seminarja v enem izvodu.
* Seminarska naloga in povzetek morajo biti v slovenskem jeziku!

==Ocenjevanje seminarjev==
Recenzenti ocenijo seminar tako, da izpolnijo [https://docs.google.com/spreadsheet/viewform?formkey=dG1Pa3p2NXE2Vm1zX3FpVTZCT2dHVnc6MA recenzentsko poročilo] na spletu.

== Mnenje o predstavitvi ==
Vsak posameznik '''mora''' oceniti seminar, tako da odda svoje [https://docs.google.com/spreadsheet/viewform?formkey=dFNXUDBCRVBaVExvOFVxakpJUHRnOEE6MA mnenje] najkasneje v šestih dneh po predstavitvi. Kdor na seminarju ni bil prisoten, mnenja '''ne sme''' oddati.

==Urejanje spletnih strani na wikiju==
Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''

==Citiranje virov==
Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se v seminarju držite ene same.
Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati.
Za citate v naravoslovju je najpogostejše citiranje po pravilniku ISO 690. [http://www.zveza-zotks.si/gzm/dokumenti/literatura.html Pravila], ki upoštevajo omenjeni standard, so pripravili pri ZTKS. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati. 
'''Citiranje knjig:''' 
Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica. 
Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN. 

Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005. 
Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4. 
Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.).

'''Citiranje člankov:''' 
Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani. 
Lartigue C. ''et al''. Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, letn. 317, str. 632-638.

Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole: 
Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani. 
Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.

Revija Science uporablja skrajšani zapis: 
C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007) 

V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne).

'''Citiranje spletnih virov:''' 
Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov 
strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life 
Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.

BIO2 Seminar 2011

2011-11-18T22:45:20Z

MarkoRadojkovic: /* Seznam seminarjev- datumi in seznam recenzentov še niso dokončni! */

= Biokemijski seminar =

Seminarje vodi doc. dr. Gregor Gunčar in so na urniku vsako sredo in petek po eni uri predavanj iz Biokemije.

Ocena seminarjev predstavlja 30% končne ocene in vsebuje vse točke, ki jih študent/ka lahko zbere pri seminarju in ostalih dejavnostih, ki niso del pisnega izpita.

== Seznam seminarjev- datumi in seznam recenzentov še niso dokončni! ==
Vpišite svoj izbrani naslov!!!
{| {{table}}
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Ime in priimek'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Naslov seminarja'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Rok za oddajo'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Rok za recenzijo'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Datum predstavitve'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent1'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent2'''
|-
| Ula Štok||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2011 Tipping the mind]||17.10.11||19.10.11||21.10.11||Maja Remškar||Mirjam Kmetič
|-
| Maša Mirković||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2011 The twisted way of things]||17.10.11||19.10.11||21.10.11||Eva Knapič||Marko Radojković
|-
| Sara Draščič||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2011 On the spur of a whim ]||17.10.11||19.10.11||21.10.11||Matevž Merljak||Monika Škrjanc
|-
| Katra Koman||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2011#Katra_Koman:_INZULIN Protein of the 20th century]||18.10.11||23.10.11||26.10.11||Ines Kerin||Veronika Jarc
|-
| Ana Dolinar||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2011#Ana_Dolinar:_Univerzalna_kri_.E2.80.93_prihodnost_transfuzijske_medicine.3F The juice of life]||21.10.11||25.10.11||28.10.11||Tjaša Goričan||Andreja Bratovš
|-
| Urška Rauter||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2011#Ur.C5.A1ka_Rauter:_A_Green_Glow:_zgradba_in_funkcija_encima_luciferaze A green glow]||21.10.11||25.10.11||28.10.11||Maša Mohar||Sandi Botonjić
|-
| Taja Karner||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2011#Taja_Karner:_Glavoboli_in_migrene Throb]||21.10.11||26.10.11||02.11.11||Karmen Hrovat||Tamara Marić
|-
| Rok Štemberger||Forbidden fruit||21.10.11||28.10.11||04.11.11||Špela Pohleven||Maja Grdadolnik
|-
| Maša Mohar||The tenuous nature of sex||21.10.11||28.10.11||04.11.11||Andreja Bratovš||Ines Kerin
|-
| Veronika Jarc||Our hollow architecture||21.10.11||28.10.11||04.11.11||Sabina Mavretič||Matevž Ambrožič
|-
| Mirjam Kmetič||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2011#Mirjam_Kmeti.C4.8D:_Mint_condition_.28limonen-3-hidroksilaza_in_limonen-6-hidroksilaza.29 Mint condition]||26.10.11||02.11.11||09.11.11||Sandi Botonjić||Tina Gregorič
|-
| Janez Meden||The Japanese Horseshoe Crab and Deafness||28.10.11||01.12.11||20.1.12||Veronika Jarc||Ana Dolinar
|-
| Tjaša Flis||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2011#Sandi_Botonji.C4.87:_Kokain_esteraza Life's tremors]||28.10.11||04.11.11||11.11.11||Ana Dolinar||Špela Pohleven
|-
| Sandi Botonjić||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2011#Sandi_Botonji.C4.87:_Kokain_esteraza Nature's junkie]||28.10.11||04.11.11||11.11.11||Maša Mirković||Alenka Mikuž
|-
| Kaja Javoršek||A grey matter||02.11.11||09.11.11||16.11.11||Dominik Kert||Tjaša Flis
|-
| Rok Vene||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2011#Rok_Vene:_A_mind_astray A mind astray]||04.11.11||11.11.11||18.11.11||Tamara Marić||Maja Remškar
|-
| Ines Šterbal||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2011 LTP1]||04.11.11||11.11.11||18.11.11||Ula Štok||Rok Vene
|-
| Matja Zalar||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2011#Matja_Zalar:_Vloga_SRK_in_SCR_proteinov_pri_prepre.C4.8Devanju_incestnega_razmno.C5.BEevanja_c Do it yourself]||04.11.11||11.11.11||18.11.11||Monika Škrjanc||Matevž Merljak
|-
| Matevž Ambrožič||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2011#Matev.C5.BE_Ambro.C5.BEi.C4.8D:_BSX_protein_in_debelost Of fidgets and food]||09.11.11||16.11.11||23.11.11||Kaja Javoršek||Petra Malavašič
|-
| Matevž Merljak||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2011#Matev.C5.BE_Merljak:_CEM15.2C_VIF_in_infektivnost_retrovirusov Protein wars]||11.11.11||18.11.11||25.11.11||Teja Banič||Urška Navodnik
|-
| Mitja Crček||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2011#Mijta_Cr.C4.8Dek:_DSIP_in_spanje When your day draws to an end]||11.11.11||18.11.11||25.11.11||Marko Radojković||Andrej Vrankar
|-
| Dominik Kert||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2011#Dominik_Kert:_FOXP2.2C_govore.C4.8Di_protein FOXP2, govoreči protein]||11.11.11||18.11.11||25.11.11||Alja Zottel||Kaja Javoršek
|-
| Petra Malavašič||Going unnoticed||16.11.11||23.11.11||30.11.11||Maja Grdadolnik||Mitja Crček
|-
| Eva Knapič||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2011#Eva_Knapi.C4.8D:_TSH3_-_Kaj_novorojen.C4.8Dkom_omogo.C4.8Da_zadihati? Life's first breath]||18.11.11||25.11.11||02.12.11||Mirjam Kmetič||Andrej Vrankar
|-
| Marko Radojković||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2011#Marko_Radojkovi.C4.87:_Fluoroscentni_proteini_in_njihova_uporaba_v_.C5.BEiv.C4.8Dnem_sistemu]||18.11.11||25.11.11||02.12.11||Sara Draščič||Urška Rode
|-
| Tjaša Goričan||Nerve regrowth: nipped by a no-go||18.11.11||25.11.11||02.12.11||Ana Remžgar||Ines Šterbal
|-
| Tina Gregorič||Gut feelings||23.11.11||30.11.11||07.12.11||Janez Meden||Urška Rauter
|-
| Tamara Marić||The dark side of RNA||25.11.11||02.12.11||09.12.11||Dominik Kert||Rok Štemberger
|-
| Ana Remžgar||I'll have you for supper||25.11.11||02.12.11||09.12.11||Jana Verbančič||Eva Knapič
|-
| Maja Remškar||Questioning Colour||25.11.11||02.12.11||09.12.11||Katra Koman||Karmen Belšak
|-
| Andreja Bratovš||The power behind pain||30.11.11||07.12.11||14.12.11||Matevž Ambrožič||Teja Banič
|-
| Urška Navodnik||Darwin\'s dessert||02.12.11||09.12.11||16.12.11||Taja Karner||Karmen Hrovat
|-
| Jernej Mustar||Silent pain||02.12.11||09.12.11||16.12.11||Petra Malavašič||Jana Verbančič
|-
| Ines Kerin||A queen\'s dinner||02.12.11||09.12.11||16.12.11||Tjaša Flis||Iza Ogris
|-
| Alja Zottel||Sleepless nights||07.12.11||14.12.11||21.12.11||Ines Šterbal||Katra Koman
|-
| Alenka Mikuž||Molecular chastity||09.12.11||16.12.11||23.12.11||Urška Rode||Janez Meden
|-
| Maja Grdadolnik||Ear of Stone||09.12.11||16.12.11||23.12.11||Tina Gregorič||Ana Potočnik
|-
| Jana Verbančič||A balanced mind||09.12.11||16.12.11||23.12.11||Alenka Mikuž||Ana Remžgar
|-
| Karmen Hrovat||The thread of life||14.12.11||21.12.11||04.01.12||Iza Ogris||Taja Karner
|-
| Andrej Vrankar||The things we forget||16.12.11||23.12.11||06.01.12||Jernej Mustar||Maša Mohar
|-
| Teja Banič||Cool news||16.12.11||23.12.11||06.01.12||Karmen Belšak||Jernej Mustar
|-
| Špela Pohleven||The making of crooked||16.12.11||23.12.11||06.01.12||Mitja Crček||Maša Mirković
|-
| Sabina Mavretič||A short story||21.12.11||04.01.12||11.01.12||Rok Vene||Sabina Mavretič
|-
| Karmen Belšak||Another dark horse||23.12.11||06.01.12||13.01.12||Urška Rauter||Sara Draščič
|-
| Iza Ogris||Love,love, love...||23.12.11||06.01.12||13.01.12||Ana Potočnik||Matja Zalar
|-
| Monika Škrjanc||The greenest of us all||23.12.11||06.01.12||13.01.12||Rok Štemberger||Tjaša Goričan
|-
| Ana Potočnik||Skin-deep||04.01.12||11.01.12||18.01.12||Matja Zalar||Ula Štok
|-
| Urška Rode||Smart sweat||06.01.12||13.01.12||20.01.12||Urška Navodnik||Alja Zottel
|-
| Ime in priimek||Naslov seminarja||06.01.12||13.01.12||20.01.12||||
|}

== Gradivo za seminarje ==
NOVO Gradivo za predavanja in seminarje najdete na http://bio.ijs.si/~zajec/bio2/
username: bio2
password: samozame

==Naloga==
'''Vaša naloga za seminar je: '''
Samostojno pripraviti seminar o enem od proteinov opisanih v [http://web.expasy.org/spotlight/back_issues/2011/ ProteinSpotlight] Poiskati morate vsaj še tri znanstvene članke, ki se nanašajo na opisano temo in jih uporabiti kot podlago za seminarsko nalogo!

V okviru seminarske naloge morate opraviti še naslednje naloge, katerih rešitve predložite na dodatni strani seminarske naloge, ki se ne šteje v kvoto obsega seminarja:

* sekvenca proteina in [http://www.uniprot.org/ UniProt] oznaka proteina
* slika strukture proteina (če je le-ta znana), ki jo naredite sami s programom Pymol. Če struktura še ni znana, vključite sliko proteina, ki je vašemu najbolj podoben po sekvenci in katerega struktura je znana
* poiskati morate, na katerem kromosomu se v človeškem genu nahaja ta protein in narisati shematsko sliko gena (eksonov in intronov) tega proteina. Če protein ni človeškega izvora, poiščite protein, ki je vašemu najbolj podoben in vse navedeno opišite za ta protein.

Za pripravo seminarja velja naslednje: 
* [[BIO2 Povzetki seminarjev 2011|Povzetek seminarja]] opišete na wikiju v približno 200 besedah - najkasneje do dne ko morate oddati seminar recenzentom.
* Povezavo do povzetka vnesete v tabelo seminarjev tekočega letnika.
* Seminar pripravite v obliki seminarske naloge na ~5-9 straneh A4 (pisava 12, enojni razmak, 2,5 cm robovi; važno je, da je obseg od 2700 do 3000 besed), vsebovati mora najmanj tri slike. Slika mora imeti legendo in v besedilu mora biti na ustreznem mestu sklic na sliko.
* Seminar oddajte do datuma oddaje, ki je naveden v tabeli vsakemu od recenzentov in docentu (docentu ga pošljite po e-pošti).
* Recenzenti do dneva določenega v tabeli določijo popravke in podajo oceno pisnega dela.
* Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Za predstavitev je na voljo 20-30 minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni.
* Predstavitvi sledi razprava. Recenzenti podajo oceno predstavitve in postavijo najmanj dve vprašanji.
* Na dan predstavitve morate docentu oddati končno (popravljeno) in natisnjeno verzijo seminarja v enem izvodu.
* Seminarska naloga in povzetek morajo biti v slovenskem jeziku!

==Ocenjevanje seminarjev==
Recenzenti ocenijo seminar tako, da izpolnijo [https://docs.google.com/spreadsheet/viewform?formkey=dG1Pa3p2NXE2Vm1zX3FpVTZCT2dHVnc6MA recenzentsko poročilo] na spletu.

== Mnenje o predstavitvi ==
Vsak posameznik '''mora''' oceniti seminar, tako da odda svoje [https://docs.google.com/spreadsheet/viewform?formkey=dFNXUDBCRVBaVExvOFVxakpJUHRnOEE6MA mnenje] najkasneje v šestih dneh po predstavitvi. Kdor na seminarju ni bil prisoten, mnenja '''ne sme''' oddati.

==Urejanje spletnih strani na wikiju==
Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''

==Citiranje virov==
Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se v seminarju držite ene same.
Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati.
Za citate v naravoslovju je najpogostejše citiranje po pravilniku ISO 690. [http://www.zveza-zotks.si/gzm/dokumenti/literatura.html Pravila], ki upoštevajo omenjeni standard, so pripravili pri ZTKS. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati. 
'''Citiranje knjig:''' 
Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica. 
Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN. 

Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005. 
Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4. 
Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.).

'''Citiranje člankov:''' 
Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani. 
Lartigue C. ''et al''. Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, letn. 317, str. 632-638.

Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole: 
Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani. 
Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.

Revija Science uporablja skrajšani zapis: 
C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007) 

V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne).

'''Citiranje spletnih virov:''' 
Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov 
strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life 
Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.

BIO2 Povzetki seminarjev 2011

2011-11-18T22:35:52Z

MarkoRadojkovic: /* Marko Radojković: Fluoroscentni proteini in njihova uporaba v živčnem sistemu */

== Sara Draščič: On the spur of a whim ==

Serotonin ali 5-hidroksitriptamin (5-HT) spada v skupino heterogenih biokemičnih snovi, ki prenašajo informacije po živčnem sistemu in ki jim rečemo nevrotransmiterji. Ima pomembno vlogo pri veliko najrazličnejših reakcijah v telesu. Njegovo nepravilno delovanje vpliva na počutje, apetit, slabost, spanje, telesno temperaturo, staranje, bolečino, anksioznost, agresijo, spomin, migrene in na številne druge procese v organizmu. Večina serotonina se sintetizira v prebavnem traktu, preostali del pa v centralnem živčnem sistemu in trombocitih. Kljub temu, da se sintetizira le v določenih delih telesa, je prisoten povsod. Dokaz za njegovo prisotnost pa so serotoninski receptorji. Serotonin ima veliko receptorjev, ki so jih organizirali v sedem skupin glede na njihove fiziološke in strukturne razlike. Ravno zaradi tako velikega števila raznoraznih receptorjev, je serotonin pomemben pri tolikih različnih procesih, saj je njegovo delovanje, v veliki meri, odvisno od tega, na kateri receptor se bo vezal. Veliki pomen pri delovanju serotonina ima tudi njegov transporter. To je protein, katerega struktura še ni znana, vendar vemo kje in na katerem kromosomu se nahaja. Transporter je tudi glavna tarča raznih antidepresivov in drog kot so ecstasy, kokain in LSD.

== Ula Štok: Neuregulin 1 ==

Neuregulin-1 je član proteinov iz družine neuregulinov in je kodiran s strani gena NRG1. Obstaja veliko tipov Neuregulina-1, ki se razlikujejo po funkcionalnosti ter mestu v telesu na katerem delujejo. Najpogosteje delujejo v živčnem sistemu, kjer lahko z nepravilnim delovanjem med drugimi povzročajo tudi zelo razširjeno bolezen - shizofrenijo. Delujejo pa tudi na ostalih tkivih in organih (na primer: srce, pljuča, oprsje in želodec). Generalno obstajata dve poti signaliziranja Neuregulina-1, in sicer: Običajna ter neobičajna pot. Pri običajni poti je ErbB receptor aktiviran direktno, v enem koraku z vezavo Neuregulina-1. To najpogosteje povzroči dimerizacijo ali heterodimerizacijo ErbB receptorja. Dimerizacija ali heterodimerizacija sicer nista nujno potrebni, a vendar do njiju pride na skoraj vseh receptorjih ErbB. Ta združitev povzroči avto- in trans-fosforilacijo intracelularnih domen tega receptorja, kar aktivira vse nadaljnje poti signaliziranja. V končni fazi pa NRG1/ErbB signaliziranje vpliva direktno na transkripcijo. Pri neobičajni poti je postopek podoben, a vendar poteka začetna stopnja malo drugače. Na začetku namreč sodeluje JMa oblika receptorja ErbB4, ki se pod vplivom TACE cepi. Del receptorja (ErbB4-CTF) se odcepi v notranjost celice. Ta peptid je velik približno 80 kD in ima specifično izoblikovano vezavno mesto za Neuregulin-1. Nadaljnji procesi pa potekajo zelo podobno kot pri običajni signalni poti. Neuregulin-1 lahko povzroča shizofrenijo na različne načine, saj sodeluje pri zelo pomembnih procesih, kot so: tvorba sinaps, mielinizacija aksonov, razvoj oligodendrocit itd. Shizofrenija je zelo razširjena bolezen in nihče še ni odkril direktnega postopka k popolni odpravi te bolezni. A vendar, v letu 2009 se je zgodila neke vrste prelomnica v študiju shizofrenije. Odkrili so namreč, da posamezniki, ki so imeli gen za shizofrenijo niso zboleli. Še več! Napaka se jim je odrazila kot zvišanje kreativnih sposobnosti na znanstvenem ali umetniškem področju, odvisno od posameznika. Ob tem se je pojavilo mnogo vprašanj, saj bi na ta način mogoče lahko poiskali pot, da bi shizofrenija postala popolnoma ozdravljiva. A vendar, je to področje še raziskano, saj znanstveniki ne vedo po kakšnih poteh pride do tega, da te mutacije na NRG1 genu ne izrazijo v bolezenskem stanju.

== Maša Mirković: Proteinski produkti genov za disleksijo in z disleksijo povezane motnje ==

Disleksija je motnja, ki se kaže v nesposobnosti branja oziroma razumevanja prebranega, ter napakah in težavah pri izgovarjanju besed. Disleksiki,kot imenujemo posameznike, ki trpijo za disleksijo, imajo kljub normalnim intelektualnim sposobnostim, znanjem in izobrazbo, moteni veščini pisanja in branja s tendenco, da pomešajo med seboj črke ali besede med branjem ali pisanjem. V zadnjih letih, so uspeli ugotoviti mesta na kromosomih, povezana z dovzetnostjo za disleksijo. DYX1C1,KIAA0319,DCDC2 in ROBO1, so bili označeni kot kandidati, z dovzetnostjo za disleksijo. Najbolj obetaven je protein KIAA0319. Je transmembranski protein iz desetih transmembranskih vijačnic, najden v plazemski membrani nevronov. Njegov C-terminalni konec gleda v ekstracelularni matriks, manjši N-terminalni konec pa prehaja v citoplazmo nevrona. C-terminalni konec je visoko glikoziliran in nosi 5 PKD(polycystyc kidney desease) domene in eno MANEC(motif at the N terminus with eight cysteines) domeno. KIAA0319 igra vlogo pri rasti možganov in njihovi migraciji med razvojem možganov-iz tega je razvidno, da je disleksija problem v razvoju nevronov že v zgodnjih letih. Posamezniki z disleksijo nosijo izoobliko tega proteina, ki povzroči nižjo izraženost le tega. Spremembe so v 5'-regiji, ki kodira izoobliko proteina. Najopaznejše povezave z disleksijo se kažejo v 2,3 kb regiji, ki zavzema promotor, prvi nepreveden ekson in del prvega introna – odprti kromatin. Te ugotovitve vodijo, da je 5'-regija KIAA0319 gena tista lokacija alelov, ki največ prispeva k motnji branja.

== Katra Koman: INZULIN ==

Inzulin je peptidni hormon, ki sodeluje v uravnavanju ravni glukoze v krvi. Sintetizira in skladišči se v β-celicah Langerhansovih otočkov trebušne slinavke. Sinteza poteka od prekurzorske molekule preproinzulina preko proinzulina do dokončne zrele molekule inzulina, ki se shrani v skladiščnih veziklih. Ob povišanju ravni glukoze v krvi, na primer po obroku, glukoza, ki je tudi glavni stimulator sekrecije inzulina, iz krvi preide v β-celice skozi GLUT2 transporter. Tam se fosforilira v glukozo-6-fosfat, saj tako fosforilirana ne more več iz celice, lahko pa vstopi v proces glikolize, ki mu sledita še Krebsov cikel in oksidativna fosforilacija, ki povzroči pretvorbo ADP v ATP molekule. ATP molekula stimulira zaprtje kalijevih kanalčkov, kar privede do depolarizacije celične membrane, to pa sproži na odprtje kalcijevih kanalčkov in vdor Ca2+ ionov. Povišana koncentracija kalcijevih Ca2+ ionov v celici stimulira prenos in zlitje skladiščnih veziklov z inzulinom z membrano. Inzulin se tako sprosti v krvni obtok in potuje do tarčnih celic, ki imajo na površini izražene inzulinske receptorje. Ko se veže nanj, prenese signal o povišanju ravni glukoze v krvi v celico. To povzroči kaskado reakcij znotraj celice, ki pa na koncu privedejo do translokacije veziklov z GLUT4 transporterjev na površino celice. Število teh transporterjev za glukozo se na površini celične membrane poveča in glukoza lahko prehaja v celico, posledično pa pade raven glukoze v krvi. Razgradnja inzulina poteka v jetrih in ledvicah. Okvare na katerikoli stopnji poti inzulina se odražajo v diabetesu ali drugih boleznih.

== Rok Štemberger: Protein GABAA (gama aminomaslena kislina A) - zgradba, vloga in zanimivosti ==

V svoji seminarski nalogi sem raziskoval vlogo, pomen in zanimivosti proteina GABAA (gama-aminomaslena kislina A). To je receptor, ki se nahaja predvsem v centralnem živčnem sistemu in je zadolžen zato, da opravlja funkcijo inhibitorja. Lociran je na površini nevrotičnih sinaps in prekinja elektrokemični signal, tako da omogoči prehod kloridnih ionov znotraj celice. To se zgodi takrat ko se ustrezen ligand Gama veže na aktivno mesto tega receptorja. Konformacija podenot se spremeni in to omogoči aktivacijo receptorja. Znanstveniki so ugotovili, da obstaja več vrst GABAA receptorjev, kar pa je odvisno od sestave podenot. Najbolj pogoste podenote so alfa beta in gama v razmerju 2:2:1. V primeru da do prekinitve ne pride se lahko pojavijo epileptični napadi, psihiatrične motnje itd. Stres lahko v dobi odraščanja močno vpliva na GABAA receptorje in jih tudi permanentno strukturno spremeni, kar pa lahko kasneje v našem življenju vpliva predvsem na naš spanec in njegovo kvaliteto. Absint je bila v preteklosti prepovedana pijača, saj je povzročala razna obolenja zaradi substance imenovane tujon. Le ta se je vezala na GABAA receptorje in tako onemogočila njegovo delovanje, zato ker je preprečevala prehod kloridnih ionov v membrano. Sedaj potekajo raziskave teh receptorjev, saj je ključnega pomena čim boljša ozdravitev bolezni, ki nastanejo zaradi nepravilnega delovanja GABAA receptorja.

== Veronika Jarc: Perforin ==

Perforin je protein, ki nastane iz citotoksičnih limfocitov T. S pomočjo grancimov napade tarčno celico in jo uniči. Rečemo lahko, da je pomemben člen pri imunskem odzivu in sodeluje s NK celicami. Sestavljen je iz 555 aminokislin, njegova molekulska masa pa je 62-67 kD. Sestavljen je iz dveh pomembnih domen, domene MACPF in domene C2. Za domeno C2 je značilno, da ima afiniteto do Ca2+ ionov. Saj se na lipidni dvosloj veže le ob prisotnosti kalcija. Drugače obstajata dva različna tipa C2 domene, ki sta bila izolirana iz različnih organizmov. Lahko rečemo, da sta oba tipa zelo podobna v tem, da sta pri tipu 1 N-konec in C-konec obrnjena na vrh domene, kar je nasprotno kot pri tipu 2. Poznamo tri MACPF domene: Plu-MACPF, C8a MACPF in lipokalin C8g. Vse te domene primerjamo z skupino proteinov citolizinov in ugotovimo nekaj podobnosti in nekaj razlik. Na splošno, pa lahko rečemo, da je evolucija poskrbela tako, da so sta si domena MACPF in citolizini raszlični le v nekaj aminokislinah. Poznamo tri mehanizme kako perforin preide v tarčno celico in pri tem pomaga gramcimom B uničit to celico. Prvi mehanizem je prehajanje preko perforinske pore in sicer s pomočjo veziklov preide v celico. Naslednji mehanizem je endosomolitični model, pri katerem je pomemben kompleks s pomočjo katerega prehaja v celico. Kot zadnji mehanizem pa je model prehodne perforinske pore, ki pove, da perforin tvori kanalčke s pomočjo katerih grancimi B preidejo direktno v celico. Grancimi B so serinske proteaze, ki se sintetizirajo v citotoksičnih limfocitih T in NK celicah.

== Taja Karner: Glavoboli in migrene ==

Zaradi stresnega in hitrega tempa življenja, vse več ljudi trpi za občasnimi glavoboli, ki so najpogosteje posledica utrujenosti. Prav tako je vedno več ljudi, ki trpijo za močnejšimi oblikami glavobolov imenovanih migrene. V hujših oblikah migrene lahko glavobol traja do dva dni, močno migreno lahko spremljajo še drugi simptomi kot so slabost, bruhanje, občutljivost na svetlobo in močan zvok, depresija ter nespečnost. Mutacija, ki je največji krivec za nastanek bolezni se pojavlja na kromosomu 10 na genu KCNK18. Ta zapisuje protein TRESK, ki se nahaja v hrbtenjači in deluje kot kalijev kanalček. Mutacija povzroči, da ne pride do izmenjavanja ionov, kar povzroči hude glavobole. V raziskavah so odkrili zanimivo povezavo z anestetikom. Ta namreč ne glede na mutacijo ponovno aktivira kanal. To bi lahko učinkovito pozdravilo migrene, če bi ga le uspeli spraviti v primerno obliko. Ugotovili so tudi, da zdravila, ki vsebujejo citosporin in takrolimus v večini primerov povzročajo migrene v zdravstvu pa jih še vseeno pogosto uporabljajo. Odkritje te mutacije predstavlja revolucijo v zdravstvu in verjamem, da bo kmalu vodilo do odkritja učinkovitega zdravila proti migrenam.

== Ana Dolinar: Univerzalna kri – prihodnost transfuzijske medicine? ==

α-galaktozidaza (AGAL_HUMAN) je glikozil-hidrolazni encim. Spada v GH27-D (klan D, 27. družina) in ima aktivno mesto v obliki (β/α)8 sodčka. Encim zapisuje gen GLA, ki se nahaja na kromosomu X.

Ideja o univerzalni krvi, ki bi bila primerna za transfuzijo, ne glede na krvno skupino pacienta, je med znanstveniki prisotna že približno trideset let.
Razvili so tri metode za pretvorbo različnih antigenov v antigen 0 (po sistemu AB0), ki je primeren za transfuzijo v vse krvne skupine.
:#Encimska razgradnja antigenov A in B do antigena 0. Za antigene A so uporabili α-N-acetilgalaktozaminidazo, vendar so antigeni preveč kompleksni in metoda ni bila uspešna. Pri antigenih B so dosegli popolno pretvorbo v antigen 0 z uporabo α-galaktozidaze iz bakterije ''Streptomyces griseoplanus''.
:#Prekrivanje površine eritrocitov z maleimidofenil-polietilen-glikolom (Mal-Phe-PEG). Prekrije vse antigene, ne samo A ali B, vendar metoda ni uspešna, ker polietilen-glikol povzroča imunski odziv.
:#Pridobivanje univerzalnih rdečih krvnih celic iz pluripotentnih matičnih celic. Uspeli so pridobiti zrele eritrocite, ki so popolnoma funkcionalni.
Uporaba univerzalne krvi bi zmanjšala ali celo izničila imunski odziv ob transfuziji, prav tako ne bi bilo možnosti za transfuzijo napačne krvne skupne zaradi človeške napake. Metode trenutno niso dovolj izpopolnjene, da bi bilo možno pričakovati njeno uporabo v bližnji prihodnosti.

== Maša Mohar: Moški ali ženska to je sedaj vprašanje?(SRY - faktor za določitev spola) ==

SRY gen kodira Sry protein ki je član družine Sox (Sry related HMG box) transkripcijskih faktorjev. Poznamo jih okoli 20 pri človeku in miškah ter še mnogo drugih. Sox proteini imajo zelo različne vloge v embriogenezi in pri razvoju mnogih drugih organov. Tipično delujejo tako kot nekakšna stikala v diferenciaciji celic- sprožijo razvoj določenih celic. Sry je prav tako kot ostali člani te družine karakteriziran po HMG( high mobility group). HMG je drugače skupina specifičnih transkripcijskih faktorjev, ki imajo ~ 80 AK dolge strukturalno podobne domene za vezavo na DNA. Te domene oz. domena če je samo ena se veže na zaporedje (A/T)ACAA(T/A) v majhni žleb DNA. S tem ustvari zvitje DNA za približno 60- 85 stopinj. S tem ko se DNA zvije se razkrijejo mesta za izražanje drugih genov, recimo Sox9, ki kodira Sox9 protein ki pomaga pri diferenciaciji Sertoli celic in tako pri oblikovanju testisov, s tem pa determinira moški spol. Ugotovili smo tudi da obstaja veliko genskih bolezni povezanih s Sry genom in da lahko obstaja tudi ženska z XY spolnima kromosomoma, ker se pri njej zaradi mutacij Sry protein ne izrazi, prav tako pa obstajajo tudi moški z XX spolnima koromosomoma, kjer se enem od X kromosomov lahko izrazi SRY gen ob nepravilnostih pri očetovem delu zapisa. V bistvu sem prišla do zaključka da je zelo tanka meja med moškim in ženskim oblikovanjem spola, ena majhna mutacija oz. ena majhna razlika lahko privede do nastanka ženske ali moškega.

== Urška Rauter: A Green Glow: zgradba in funkcija encima luciferaze ==
Luciferaza je encim odvisen od ATP in magnezijevih ionov. Proces bioluminiscence se začne z vezavo na substrat luciferin, tvori se adenilatni intermediat in ob prisotnosti molekularnega kisika izhaja svetloba. Luciferaza je zgrajena iz dveh ločenih domen, večja se nahaja na N-koncu in manjša na C-koncu molekule, večja domena pa ima tudi svoje poddomene. Domeni sta med seboj ločeni z razpoko, kjer naj bi se po domnevanjih nahajalo tudi aktivno mesto encima. Luciferaza predstavlja tudi nov način mehanizma tvorbe adenilatnega intermediata med encimi in ponuja razlago za marsikatero metabolično pot.
Velika dilema, ki me med znanstveniki ostaja pa je razlika v barvi svetlobe, ki jo proces oksidacije luciferina emitira. Najverjetneje je za to odločilna keto tavtomerna oblika oksiluciferina in tudi resnonančna stabilizacija njegovega fenolatnega aniona, čeprav so znanstveniki odkrili tudi veliko drugih možnih vzrokov za različne barve (različne aminokisline, polarnost okolja, pH, ...).
Luciferaza se veliko uporablja v medicini, kjer služi kot marker molekul v telesu in tako pripomore k boljšem razumevanju različnih bolezni in infekcij, kot tudi sami strukturi celic in njenih organelov.

== Mirjam Kmetič: Mint condition (limonen-3-hidroksilaza in limonen-6-hidroksilaza) ==

Klasasta meta vsebuje encim limonen-6-hidroksilazo, ki sodeluje pri pridobivanju karvona. Poprova meta pa vsebuje limonen-3-hidroksilazo, ki je udeležena pri proizvodnji mentola. Obe hidroksilazi pripadata družini citokromov P450, njeni predstavniki pomembno sodelujejo pri proizvajanju različnih oksidiranih monoterpenov, ki so vir arom eteričnih olj. Karvon in mentol sta končna produkta hidroksilacije limonena. Ta encima sta si zelo podobna in njuni vezavni mesti za substrat sta zelo omejeni. Velja pravilo, da za spremembo aktivnosti v družini citokromov P450 potrebujemo določeno število mutacij, vendar je za modifikacijo vezavne aktivnosti limonenovih hidroksilaz potrebna samo ena. Ta fenilalanin v izolevcin mutacija povzroči, da se limonen-6-hidroksilaza spremeni v limonen-3-hidroksilazo! Mutiran encim je tako sposoben sinteze mentola tako kot encim v poprovi meti! Taka mutacija kaže, da sta prav ti dve aminokislini ne le nujni, temveč tudi prav zagotovo vpleteni pri orientaciji limonena v aktivnem mestu tako, da se ta hidroksilizira na ali C3 ali C6 poziciji. Posamične mutacije, ki lahko drastično spremenijo funkcijo proteina, so znanstveno zanimive. Nakazujejo ne le na zelo specifične manjše regije v sekvenici proteina, temveč so tudi ključne za razumevanje področij, kot so vezava in orientacija substrata, funkcija encima, metabolična pot in struktura vezavnega mesta.

== Sandi Botonjić: Kokain esteraza ==

Znanstveniki so v rizosferi kokinih plantaž (Erythroxylum coca) našli sev MB1, gram pozitivne bakterije Rhodococcus sp.. Tej bakteriji kokain predstavlja glavni vir ogljika in dušika in zato so znanstveniki izolirali osrednji encim njenega metabolizma tj. kokain esterazo (v nadaljevanju cocE). Encim je sestavljen iz treh domen: DOM1, ki vsebuje nabor kanoničnih α-vijačnic in β-ploskev; DOM2 - domena le z α-vijačnicami; in DOM3 je roladi podobna struktura z β-ploskvami. CocE je serinska esteraza, katere aktivno mesto se nahaja na stičišču vseh treh domen. Ta hidrolizira kokain na ekgonil metil ester in benzojsko kislino, ki nimata psihoaktivnih učinkov. CocE je pravi Ferrari v primerjavi z drugimi esterazami, saj lahko razgradi enako količino kokaina 1000 krat hitreje. Tako lahko postane neprecenljiva pri nujnih intervencijah v primeru prevelikega odmerka, saj bi intravenozni vbrizg cocE močno zmanjšal razpolovni čas kokaina. CocE je predmet številnih raziskav, v katerih znanstveniki proučujejo njeno termostabilnost in njenih mutiranih oblik, saj njen razpolovni čas pri fiziološki temperaturi traja le nekaj minut. Znanstveniki pa na podlagi ugotovitev iz raziskav cocE razvijajo tudi učinkovita protitelesa z vsaj podobnimi katalitičnimi parametri, ki bi brez imunskega odziva odlično delovala v bioloških sistemih.

==Tjaša Flis: Parkinsonizem in Parkin protein==

Parkinsonova bolezen je vse pogostejša bolezen pri starostnikih, njeni simptomi pa so tresavica, mišična otrdelost in upočasnjena motorika. Vzrok se skriva v propadu dopamnergičnih nevronskih celic. Bolezen je lahko avtosomno dominantno dedovana, kar pomeni, da pacienti podedujejo eno normalno in eno mutirano kopijo gena. Slednja prevladuje in se deduje naprej. Pri Parkinsonovi bolezni se mutacija zgodi v Park2 genu, ki kodira Parkin protein ali E3 ubikvitin ligazo. Parkin na poškodovane ali na preveč izražene proteine pripne ubikvitin (označevalni protein), ki jih nato usmeri v proteasom, to je velik razgradni kompleks v celicah.
Če mutacija poškoduje Parkin, je pot razgradnje onemogočena, to pa pomeni, da se v celici akumulirajo odvečni proteini. Tvorijo se Lewy-eva telesca polna teh proteinov, ki nadomestijo celične organele v nevronskih celicah, kar vodi do prenehanja njihovega delovanja. Ker pa ima Parkin več kot samo en substrat ki ga ubikvitinira, je točen mehanizem bolezni še dandanes uganka.
Eden izmed najbolj poznanih substratov je transmembranski protein Pael-R. Zvitje tega proteina poteka ob prisotnosti šaperonov. Prevelika koncentracija tega receptorja lahko izzove stres v endoplazmatskem retikulumu situiranem v nevronskih celicah. V primeru da je Parkin neaktiven, Pael-R povzroči celično smrt. Vendar to je le ena izmed možnih rešitev, substratov je namreč vsaj še dvajset, raziskave pa se nadaljujejo.

== Matja Zalar: Vloga SRK in SCR proteinov pri preprečevanju incestnega razmnoževanja cvetočih rastlin ==

Rastline so za zaščito pred samooplojevanjem razvile več vrst mehanizmov prepoznavanja lastnega peloda na molekularni ravni. Pri cvetočih rastlinah je najpogostejši mehanizem tipa SSI ali sporofitične lastne inkompatibilnosti. Pri družini ''Brassicaceae'' je za aktivacijo SSI ključna interakcija med transmembranskim proteinom SRK, ki predstavlja žensko determinanto odziva, in njenim ligandom - proteinom SCR, drugače imenovanim tudi moška determinanta odziva na lastno inkompatibilnost. Specifičnost vezave je zagotovljena s polimorfizmom alel obeh determinant. V posameznih vrstah je možno najti tudi do 100 različnih S-haplotipov genov za determinanti.
Vezava liganda na receptor bo uspešna le, če oba izhajata iz istega S-haplotipa. Vezava SCR na zunajcelično, N-glikolizirano domeno SRK povzroči nastanek kompleksa treh proteinov, ki s svojo aktivnostjo sproži kaksado reakcij, kar v končni fazi pripelje do preprečitve samooploditve.
Na neugodne življenske pogoje, ki so onemogočali medsebojno opraševanje, so se nekatere rastline prilagodile s favorizacijo samooplojevanja. Pri njih so mutacije S-lokusa, ki nosi zapis za SRK in SCR, povzročile nepravilno delovanje SI ali njegovo popolno odpoved. To pa seveda vodi v neprepoznavanje lastnega peloda in rastlina se samooprašuje. Najbolj znan primer take rastline je ''Arabidopsis thaliana'', ki se zaradi svojih specifičnih lastnosti uporablja kot modelni organizem v številnih študijah lastne inkompatibilnosti.

== Matevž Ambrožič: BSX protein in debelost ==

Za primeren občutek sitosti ali lakote glede na stanje energetskih zalog v telesu in odgovarjajoč vnos hrane ter porabo energije je odgovorna zapletena pot sporočanja. Začne se s tremi hormoni: inzulin, leptin in grelin. Leptin in inzulin se sprostita, ko so maščobne in hidratne zaloge v telesu polne in morata do možganov prenesti signal za prenehanje hranjenja, grelin pa ravno nasprotno. Vsi po krvi potujejo do hipotalamusa, predela možganov, ki je odgovoren za energijsko ravnovesje. V hipotalamusu sta dva tipa živčnih celic: oreksigene in anoreksigene. Prve sproščajo NPY in AgRP, nevropeptida, ki spodbujata hranjenje in zmanjšata porabo energije, druge pa α-MSH in CART, katerih učinek je nasproten. Našteti nevropeptidi se iz nevronov sprostijo po vezavi ustreznega izmed treh hormonov in prenesejo signal naprej, do končne spremembe v vnosu ali porabi energije. Glavni protein seminarja, BSX (brain specific homeobox) protein je transkripcijski faktor, ki spodbudi ekspresijo genov za AgRP in NPY, hkrati pa je odgovoren za premik organizma v iskanju hrane. Če v opisanem sistemu pride do napake, so pojavi nepotreben občutek lakote, kar je vzrok mnogih primerov debelosti. V boju z bolezensko debelostjo so ključne raziskave na BSX proteinu, saj je osrednji člen poti, ki v možgane prenese (včasih lažen) občutek lakote.

== Kaja Javoršek: A grey matter ==

Mikrocefalin je protein, ki ga kodira enakoimenski gen. Mikrocefalin naj bi kontroliral poliferacijo in diferenciacijo nevroblastov med nevrogenezo. Odkritje, da je mikrocefalin odločilen regulator velikosti možganov, je sprožilo hipotezo, da je igral vlogo v evoluciji možganov.
Razen v možganih najdemo mikrocefalin tudi v ledvicah, srcu, pljučih, vranici in skeletnih mišicah. Vendar pomen mikrocefalina v teh organih še ni znan.
Mutacije na genu mikrocefalina vodijo do nastanka mikrocefalije. To je bolezen razvoja živčnega sistema in je definirana kot resno zmanjšana velikost možganov. Pri odraslih je normalen volumen možganov od 1200 cm3 do 1600 cm3, pri odraslih s primarno mikocefalijo pa okoli 400 cm3 . Poleg mirocefalina pa povzročajo mikrocefalijo še mutacije petih genih (ASPM, MCPH2, CDK5RAP2, MCPH4, CENPJ)
Mikrocefalin ima tri BRCT domene na C – koncu. BRCT domene so prisotne v veliko ključnih proteinih, ki kontrolirajo delitev celice. Zato predvidevajo da mikrocefalija nastane, ker je ovirana normalna regulacija delitve celic v možganih.
Ugotovili so, da je protein mikrocefalin dol 835 aminokislin. Zaradi mutacije na genu mikrocefalina se ta protein skrajša na 25 aminokislin.
Znanstveniki so izvedli raziskavo ali gena mikrocefalin in ASPM vplivata na inteligenco. Na podlagi treh raziskav so zaključili, da inteligenca ni povezana z dominantnimi aleli ASPM – ja ali mikrocefalina.

== Rok Vene: A mind astray ==

Alzheimerjeva bolezen postaja vedno bolj aktualna tematika. Trenutno je na svetu več kot 26 milijonov ljudi s to obliko demence. Zaradi daljše življenjske dobe pa pričakujemo, da bo število obolelih samo še naraščalo. Alzheimerjeva bolezen prizadene centralni živčni sistem, v možganih se nalagajo snovi, ki povzročijo propad živčnih celic. Ena izmed snovi, ki se nalagajo v možganih so nefunkcionalni Tau proteini. Tau proteini sodijo v družino proteinov imenovanih microtubule-associated proteins (MAP), njihova naloga pa je je stabilizacija mikrotubulov. To dosežejo tako, da se na mikrotubule vežejo. Poleg tega predvidevajo, da imajo Tau proteini še eno nalogo. Sodelovali naj bi v kompleksu za uravnavanje vzdražnosti živčnih celic. Nefunkcionalnost Tau proteinov povezujejo z različnimi boleznimi, ki jih poznamo pod skupnim imenom tauopatije. V primeru Alzheimerjeve bolezni je Tau protein nefunkcionalen, zato ker je hiperfosforiliran, kar mu onemogoča vezavo na mikrotubule. Tau proteini zato tvorijo netopne agregate – nevrofibrilarne pentlje, ki najbrž povzročijo odmiranje živčnih celic. Pri iskanju učinkovin proti hiperfosforilaciji in agregaciji Tau proteina, so znanstveniki raziskali protein FKBP52. Ta protein ima več funkcij. Osredotočili so se predvsem na njegove šaperonske lastnosti. Ugotovili so, da se FKBP52 veže na hiperfosforiliran Tau protein, in tako prepreči agregacijo Tau proteina, ki je odgovorna za odmiranje nevronov.

== Ines Šterbal: LTP1 ==

Protein LTP1, izoliran iz ječmenovega zrna, spada v družino lipidnih prenašalnih proteinov (lipid transfer protein –LTP). Je dobro topen protein, ki se nahaja v alevronski plasti ječmenovega semena. Sestavljen je iz štirih heliksov, ki so povezani z disulfidnimi mostički. Ima dobro definiran C-terminalni konec. V razmerah in vivo je globularni protein, s stožčastim hidrofobnim jedrom, ki se razteza od enega konca molekule do drugega. Sposoben je vezati različne lipide, kot so maščobne kisline ali acetil-koencim A. LTP1 proteini so na površini aktivni proteini, so stabilni, denaturirajo šele okrog 100 °C. Vloga LTP1 proteina in vivo še ni znana. In vitro je glavni protein pri penjenju piva. Opravlja pa še številne druge funkcije, odvisno od tega, kateri ligand ima vezan. LTP1 proteini so verjetno vključeni v prenos lipidov preko membrane in celo v nastanek membrane, lahko bi imeli vlogo v transportu monomera Cutin, vlogo naj bi igrali tudi v obrambnem mehanizmu rastlin. Lipidi, ki so vezani na LTP1 bi naj imeli antibakterijsko aktivnost za bakterije in glive.
Vsi podatki kažejo, da so povezave med sladkorji in proteini, ki nastanejo kot produkt Milardove reakcije, prvi korak do nastanka pivovske pene. Kaže, da je kontrola glikacije LTP1 proteinov med slajenjem in varjenjem piva, nujna za optimalno penjenje piva.

== Mitja Crček: DSIP in spanje ==

Pred 2000 leti so ljudje verjeli, da postanemo zaspani zaradi nekakšnih želodčnih hlapov, ki gredo v možgane, se tam kondenzirajo, zamašijo pore in posledično povzročajo zaspanost. Kasneje so seveda ugotovili da temu ni tako, leta 1977 pa so odkrili majhne peptide, ki naj bi nas uspavali in jih poimenovali Delta Sleep-Inducing peptide (DSIP). DSIP je majhen peptid, sestavljen iz devetih aminokislinskih ostankov in maso 850 daltonov, prvič pa so ga odkrili pri zajcih. Sodeloval naj bi tako pri endokrini regulaciji kot pri fizioloških procesih (poveča učinkovitost oksidativne fosforilacije), pomembno vlogo pa naj bi imel tudi v medicini in pri zdravljenju bolezni. Ker naj bi podaljševal REM fazo, bi ga lahko uporabljali tudi kot dodatek pri zdravljenju alkoholizma ali ga dodajali antidepresivom in pomirjevalom, ki skrajšujejo REM fazo. Raziskave so spremljale tudi vpliv DSIP-ja na nespečnost. Ugotovili so, da DSIP rahlo povečuje kvaliteto spanja in skrajšuje latenco uspavanja, na trajanje budnosti in druge parametre pa ne vpliva, zato so si strokovnjaki enotni, da ima DSIP le rahle terapevtske učinke na nespečnost. Delovanje peptida pa še vedno ni povsem razjasnjeno in le želimo si lahko, da bodo novejše raziskave prinesle nove informacije, saj ima DSIP vsekakor velik potencial v medicini.

== Dominik Kert: FOXP2, govoreči protein ==

Ljudje in živali se razlikujejo. Za znanstvenike 19. stoletja je bilo zelo fascinantno to, da mi lahko govorimo, se sporazumevamo in pomnimo besede, medtem ko živali ne morejo. Ko se je pojavila družina KE na koncu 90. let prejšnjega stoletja, so znanstveniki ugotovili, da obstaja gen, ki kodira FOXP2. Družina KE je slovi po tem, da ima polovica njenih članov težave z govorom. Tako so ugotovili, da se mutacija prenaša avtosomno in dominantno. In verjetno na to vpliva mutacija FOXP2, FOXP2 protein pa je po vsej verjetnosti odločilen faktor pri govoru.
FOXP2 protein je sestavljen iz 715 aminokislin in spada med družino transkripcijskih faktorjev, ki se imenuje FOX (zaradi 'forkhead box' domene). Zanimivo je, da se ta gen razlikuje od gena opic (šimpanz, gorila, makaki) le za dve in od miši le za tri aminokisline. To se znanstvenikom zdi zelo zanimivo, ker je verjetno zaradi teh dve sprememb v aminokislinskem zaporedju prišlo do sprememb pri sporazumevanju. Zaradi teh dejstev so se naprej usmerili na to, ali je bil gen res pod vplivom naravne selekcije in ugotovili so, da je bil res.
FOXP2 na te spremembe vpliva v možganih, je pa prisoten tudi v pljučih, drobovju in srcu. Vendar njegova funkcija tam še ni znana.

== Petra Malavašič: Ureaza bakterije Helicobacter pylori ==

Bakterija Helicobacter pylori spada med patogene mikrobe. Znanstvenika Warren in Marshall sta leta 1987 odkrila to bakterijo ter ugotovila, da je s to bakterijo povezana razjeda na želodcu. Leta 2005 sta prejela Nobelovo nagrado. Že vsak drugi človek je okužen s to bakterijo. Naseljena je na želodčni sluznici in povzroča kronično vnetje želodčne sluznice. Bakterija se lahko naseli in se razmnožuje v prisotnosti želodčne kisline, kjer je pH okoli 2. Posebni obrambni mehanizmi omogočajo bakteriji, da lahko preživi v kislem okolju. Encim ureaza je pri tem najpomembnejši. Ureaza je encim, ki katalizira hidrolizo uree, pri čemer nastane amoniak, ki se v končni fazi veže z molekulami vode v amonijev hidroksid, ki poveča pH v neposredni okolici bakterije. Encim ureaza se nahaja v citoplazmi bakterijske celice in na njeni površini. Sam encim je zgrajen zelo kompleksno in omogoča bakteriji preživetje. Posebna kompleksna zgradba encima onemogoči, da bi kislina želodčnega soka denaturirala encim. Encim sestavljata dva kompleksa (αβ) štirih prostorsko razporejenih (αβ)3 enot.

== Matevž Merljak: CEM15, VIF in infektivnost retrovirusov ==

Ena izmed komponent obrambnega mehanizma pred retrovirusi v nekaterih človeških celicah je citidinska deaminaza CEM15 (APOBEC3G). V celicah, ki jo izražajo, se retrovirusi brez posebnega proteina (VIF, “viral infectivity factor”) ne morejo uspešno množiti, zato takim celicam pravimo “nepermisivne” celice.

CEM15 deluje tako, da med procesom reverzne transkripcije v novonastali “minus” DNA verigi številne citidinske baze pretvori v uridinske, ter s tem povzroči tako zmanjšano obstojnost z uracilom bogate DNA verige, kot tudi zamenjave gvanozinskih baz z adenozinskimi v kodirajoči (“plus”) verigi DNA. Čeprav takšna hipermutacija za nadaljno infektivnost virusa ni vedno usodna (torej lahko tako mutirana DNA v nekaterih primerih še vedno tvori funkcionalne viruse), je običajno dovolj obsežna, da onemogoči uspešno reprodukcijo virusa.

Raziskave kažejo, da CEM15 ne napade nastajajoče DNA kot lasten celični odgovor na infekcijo, pač pa se med izgradnjo novih virusov vgradi v le-te ter po infekciji nove celice povzroči omenjene spremembe v nastajajoči DNA verigi.

Že omenjen faktor VIF izhaja iz virusa HIV-1, ki primarno napada sicer nepermisivne limfocite T. Naloga VIF je preprečitev vgradnje CEM15 v nastajajoče viruse, to pa doseže tako z oteževanjem njene translacije, kot tudi z indukcijo razgradnje CEM15 v proteasomu.

== Eva Knapič: TSH3 - Kaj novorojenčkom omogoča zadihati? ==

Kaj novorojenčkom omogoča zadihati? Raziskave so pokazale, da ima eno izmed vodilnih vlog pri začetku dihanja protein teashirt homolog 3 (TSH3). To je protein, ki ga uvrščamo med transkripcijske faktorje. Po strukturi spada v družino cinkovih prstov, kjer so sekundarne strukture koordinirane s cinkovim ionom. TSH3 ima pet tako urejenih struktur in vse spadajo v Cys2His2 skupino – cinkov ion koordinira dva cisteinska in dva histidinska ostanka ßßα podenote.
Organizem brez zapisa za teashirt 3 protein se v času embrionalnega razvoja navidezno ne razlikuje od organizmov, ki ta zapis imajo. Vendar so podrobnejše raziskave pokazale, da se brez prisotnosti proteina teashirt 3 dokončno ne oblikujejo pljučni mešički, ki so funkcionalna enota pljuč, saj tam poteka izmenjava plinov. Odsotnost proteina povzroča povečano apoptozo nevronov motoričnega jedra v možganskem deblu, s tem so proteinu pripisali zmožnost inhibicije apoptoze nevronov. Prav tako so nezmožnost odziva organizma na pH spremembe okolja pripisali pomanjkanju proteina TSH3.
Iz vseh teh pomanjkljivostih, ki jih povzroča TSH3 so raziskovalci prišli do zaključka, da novorojenček brez zapisa za protein ni zmožen zadihati, ker ni sposoben odziva na spremembo okolja, predvsem pH in tako ne more vzdrževati homeostaze, ki je potreba na preživetje.

== Tjaša Goričan: Vpliv Nogo proteina na regeneracijo živčnega sistema ==

Nevroni vsebujejo mielin, ki je sestavni del mielinske ovojnice aksona in ima nalogo zagotavljanja stalnega prenosa električnih signalov. Poleg tega pa mu je dodeljena tudi nenavadna lastnost. Vsebuje namreč proteine Nogo-A, ki delujejo kot inhibirotji za rast poškodovanih aksonov. Posledično se diferencirani nevroni niso sposobni deliti. Problem se pojavi pri poškodbi živčnega sistema, saj se ni sposoben regenerirati. Bolezni, ki so povezane s poškodbami živčevja so: Poškodbe hrbtenjače, Alzheimerjeva bolezen, možganska kap, shizofrenija itd.

Nogo-A protein spada v družino proteinov retikulonov in je ena od oblik Nogo proteinov. Je transmembranski protein, ki se z domeno Nogo-66 uspešno veže na receptor in povzroči razgradnjo mikrotubulov v aksonu, kar privede do preureditve citoskeleta in posledično zaustavitve rasti aksona. Največ Nogo-A se nahaja na oligodendrocitih. Oligodendrociti so celice, ki spadajo med nevroglio in tvorijo mielinski ovoj nevronov v centralnem živčnem sistemu. Veliko več ga najdemo v centralnem živčnem sistemu v primerjavi s perifernim.

Čeprav je še veliko neznanega na področju živčnega sistema, je znanost že dosegla uspehe glede boja proti boleznimi, povezanimi z regeneracijo živčnega sistema. S protitelesi se da inhibirati protein Nogo-A in s tem preprečiti inhibicijo rasti poškodovanih nevronov.

== Marko Radojković: Fluoroscentni proteini in njihova uporaba v živčnem sistemu ==

Fluoroscentni proteini so členi družine homologih proteinov, ki se delijo skupno lastnost da svetlijo zaradi formiranja kromoforma znotraj lastnega polipeptidnega zaporedja. Prvi odkrit takšen protein je bil zeleni fluoroscentni protein ali GFP. Od tedaj do danes so kreirani različni mutanti, ki žarijo skoraj vse barve človeškega vidnega spektra. Izkazalo se je da so zelo uporabni v mnogih bioloških disciplinah, predvsem pa so popularni v spremljanju dinamike proteinov, genske ekspresije, in tudi posledično na viši ravni, dinamike organelov ter gibanja celic znotraj tkiva.

Ne tako dolgo nazaj, tim znanstvenikov je uspel skombinirati različne barvne variante GFP-ja s sofisticiranim Cre/Lox sistemom genske rekombinacije in tako omogočil njihovo izražanje v samih možganih. Tale tehnika omogoča da se vsaki posamezni nevron obarva drugače in tako loči od sosednjih, kar omogoča detajlno analizo živčnega vezja. Brainbow strategija, kakor so jo poimenovali, daje upanje znanstvenikom da z ustvarjanem celotnega ''zemljevida'' možganov, lahko izpeljejo pomembne informacije o nevronskih povezavah in njihov nadaljni vpliv na vedenje in delovanje organizma.

BIO2 Povzetki seminarjev 2011

2011-11-18T22:35:24Z

MarkoRadojkovic: /* Marko Radojković: Fluoroscentni proteini in njihova uporaba v živčnem sistemu */

== Sara Draščič: On the spur of a whim ==

Serotonin ali 5-hidroksitriptamin (5-HT) spada v skupino heterogenih biokemičnih snovi, ki prenašajo informacije po živčnem sistemu in ki jim rečemo nevrotransmiterji. Ima pomembno vlogo pri veliko najrazličnejših reakcijah v telesu. Njegovo nepravilno delovanje vpliva na počutje, apetit, slabost, spanje, telesno temperaturo, staranje, bolečino, anksioznost, agresijo, spomin, migrene in na številne druge procese v organizmu. Večina serotonina se sintetizira v prebavnem traktu, preostali del pa v centralnem živčnem sistemu in trombocitih. Kljub temu, da se sintetizira le v določenih delih telesa, je prisoten povsod. Dokaz za njegovo prisotnost pa so serotoninski receptorji. Serotonin ima veliko receptorjev, ki so jih organizirali v sedem skupin glede na njihove fiziološke in strukturne razlike. Ravno zaradi tako velikega števila raznoraznih receptorjev, je serotonin pomemben pri tolikih različnih procesih, saj je njegovo delovanje, v veliki meri, odvisno od tega, na kateri receptor se bo vezal. Veliki pomen pri delovanju serotonina ima tudi njegov transporter. To je protein, katerega struktura še ni znana, vendar vemo kje in na katerem kromosomu se nahaja. Transporter je tudi glavna tarča raznih antidepresivov in drog kot so ecstasy, kokain in LSD.

== Ula Štok: Neuregulin 1 ==

Neuregulin-1 je član proteinov iz družine neuregulinov in je kodiran s strani gena NRG1. Obstaja veliko tipov Neuregulina-1, ki se razlikujejo po funkcionalnosti ter mestu v telesu na katerem delujejo. Najpogosteje delujejo v živčnem sistemu, kjer lahko z nepravilnim delovanjem med drugimi povzročajo tudi zelo razširjeno bolezen - shizofrenijo. Delujejo pa tudi na ostalih tkivih in organih (na primer: srce, pljuča, oprsje in želodec). Generalno obstajata dve poti signaliziranja Neuregulina-1, in sicer: Običajna ter neobičajna pot. Pri običajni poti je ErbB receptor aktiviran direktno, v enem koraku z vezavo Neuregulina-1. To najpogosteje povzroči dimerizacijo ali heterodimerizacijo ErbB receptorja. Dimerizacija ali heterodimerizacija sicer nista nujno potrebni, a vendar do njiju pride na skoraj vseh receptorjih ErbB. Ta združitev povzroči avto- in trans-fosforilacijo intracelularnih domen tega receptorja, kar aktivira vse nadaljnje poti signaliziranja. V končni fazi pa NRG1/ErbB signaliziranje vpliva direktno na transkripcijo. Pri neobičajni poti je postopek podoben, a vendar poteka začetna stopnja malo drugače. Na začetku namreč sodeluje JMa oblika receptorja ErbB4, ki se pod vplivom TACE cepi. Del receptorja (ErbB4-CTF) se odcepi v notranjost celice. Ta peptid je velik približno 80 kD in ima specifično izoblikovano vezavno mesto za Neuregulin-1. Nadaljnji procesi pa potekajo zelo podobno kot pri običajni signalni poti. Neuregulin-1 lahko povzroča shizofrenijo na različne načine, saj sodeluje pri zelo pomembnih procesih, kot so: tvorba sinaps, mielinizacija aksonov, razvoj oligodendrocit itd. Shizofrenija je zelo razširjena bolezen in nihče še ni odkril direktnega postopka k popolni odpravi te bolezni. A vendar, v letu 2009 se je zgodila neke vrste prelomnica v študiju shizofrenije. Odkrili so namreč, da posamezniki, ki so imeli gen za shizofrenijo niso zboleli. Še več! Napaka se jim je odrazila kot zvišanje kreativnih sposobnosti na znanstvenem ali umetniškem področju, odvisno od posameznika. Ob tem se je pojavilo mnogo vprašanj, saj bi na ta način mogoče lahko poiskali pot, da bi shizofrenija postala popolnoma ozdravljiva. A vendar, je to področje še raziskano, saj znanstveniki ne vedo po kakšnih poteh pride do tega, da te mutacije na NRG1 genu ne izrazijo v bolezenskem stanju.

== Maša Mirković: Proteinski produkti genov za disleksijo in z disleksijo povezane motnje ==

Disleksija je motnja, ki se kaže v nesposobnosti branja oziroma razumevanja prebranega, ter napakah in težavah pri izgovarjanju besed. Disleksiki,kot imenujemo posameznike, ki trpijo za disleksijo, imajo kljub normalnim intelektualnim sposobnostim, znanjem in izobrazbo, moteni veščini pisanja in branja s tendenco, da pomešajo med seboj črke ali besede med branjem ali pisanjem. V zadnjih letih, so uspeli ugotoviti mesta na kromosomih, povezana z dovzetnostjo za disleksijo. DYX1C1,KIAA0319,DCDC2 in ROBO1, so bili označeni kot kandidati, z dovzetnostjo za disleksijo. Najbolj obetaven je protein KIAA0319. Je transmembranski protein iz desetih transmembranskih vijačnic, najden v plazemski membrani nevronov. Njegov C-terminalni konec gleda v ekstracelularni matriks, manjši N-terminalni konec pa prehaja v citoplazmo nevrona. C-terminalni konec je visoko glikoziliran in nosi 5 PKD(polycystyc kidney desease) domene in eno MANEC(motif at the N terminus with eight cysteines) domeno. KIAA0319 igra vlogo pri rasti možganov in njihovi migraciji med razvojem možganov-iz tega je razvidno, da je disleksija problem v razvoju nevronov že v zgodnjih letih. Posamezniki z disleksijo nosijo izoobliko tega proteina, ki povzroči nižjo izraženost le tega. Spremembe so v 5'-regiji, ki kodira izoobliko proteina. Najopaznejše povezave z disleksijo se kažejo v 2,3 kb regiji, ki zavzema promotor, prvi nepreveden ekson in del prvega introna – odprti kromatin. Te ugotovitve vodijo, da je 5'-regija KIAA0319 gena tista lokacija alelov, ki največ prispeva k motnji branja.

== Katra Koman: INZULIN ==

Inzulin je peptidni hormon, ki sodeluje v uravnavanju ravni glukoze v krvi. Sintetizira in skladišči se v β-celicah Langerhansovih otočkov trebušne slinavke. Sinteza poteka od prekurzorske molekule preproinzulina preko proinzulina do dokončne zrele molekule inzulina, ki se shrani v skladiščnih veziklih. Ob povišanju ravni glukoze v krvi, na primer po obroku, glukoza, ki je tudi glavni stimulator sekrecije inzulina, iz krvi preide v β-celice skozi GLUT2 transporter. Tam se fosforilira v glukozo-6-fosfat, saj tako fosforilirana ne more več iz celice, lahko pa vstopi v proces glikolize, ki mu sledita še Krebsov cikel in oksidativna fosforilacija, ki povzroči pretvorbo ADP v ATP molekule. ATP molekula stimulira zaprtje kalijevih kanalčkov, kar privede do depolarizacije celične membrane, to pa sproži na odprtje kalcijevih kanalčkov in vdor Ca2+ ionov. Povišana koncentracija kalcijevih Ca2+ ionov v celici stimulira prenos in zlitje skladiščnih veziklov z inzulinom z membrano. Inzulin se tako sprosti v krvni obtok in potuje do tarčnih celic, ki imajo na površini izražene inzulinske receptorje. Ko se veže nanj, prenese signal o povišanju ravni glukoze v krvi v celico. To povzroči kaskado reakcij znotraj celice, ki pa na koncu privedejo do translokacije veziklov z GLUT4 transporterjev na površino celice. Število teh transporterjev za glukozo se na površini celične membrane poveča in glukoza lahko prehaja v celico, posledično pa pade raven glukoze v krvi. Razgradnja inzulina poteka v jetrih in ledvicah. Okvare na katerikoli stopnji poti inzulina se odražajo v diabetesu ali drugih boleznih.

== Rok Štemberger: Protein GABAA (gama aminomaslena kislina A) - zgradba, vloga in zanimivosti ==

V svoji seminarski nalogi sem raziskoval vlogo, pomen in zanimivosti proteina GABAA (gama-aminomaslena kislina A). To je receptor, ki se nahaja predvsem v centralnem živčnem sistemu in je zadolžen zato, da opravlja funkcijo inhibitorja. Lociran je na površini nevrotičnih sinaps in prekinja elektrokemični signal, tako da omogoči prehod kloridnih ionov znotraj celice. To se zgodi takrat ko se ustrezen ligand Gama veže na aktivno mesto tega receptorja. Konformacija podenot se spremeni in to omogoči aktivacijo receptorja. Znanstveniki so ugotovili, da obstaja več vrst GABAA receptorjev, kar pa je odvisno od sestave podenot. Najbolj pogoste podenote so alfa beta in gama v razmerju 2:2:1. V primeru da do prekinitve ne pride se lahko pojavijo epileptični napadi, psihiatrične motnje itd. Stres lahko v dobi odraščanja močno vpliva na GABAA receptorje in jih tudi permanentno strukturno spremeni, kar pa lahko kasneje v našem življenju vpliva predvsem na naš spanec in njegovo kvaliteto. Absint je bila v preteklosti prepovedana pijača, saj je povzročala razna obolenja zaradi substance imenovane tujon. Le ta se je vezala na GABAA receptorje in tako onemogočila njegovo delovanje, zato ker je preprečevala prehod kloridnih ionov v membrano. Sedaj potekajo raziskave teh receptorjev, saj je ključnega pomena čim boljša ozdravitev bolezni, ki nastanejo zaradi nepravilnega delovanja GABAA receptorja.

== Veronika Jarc: Perforin ==

Perforin je protein, ki nastane iz citotoksičnih limfocitov T. S pomočjo grancimov napade tarčno celico in jo uniči. Rečemo lahko, da je pomemben člen pri imunskem odzivu in sodeluje s NK celicami. Sestavljen je iz 555 aminokislin, njegova molekulska masa pa je 62-67 kD. Sestavljen je iz dveh pomembnih domen, domene MACPF in domene C2. Za domeno C2 je značilno, da ima afiniteto do Ca2+ ionov. Saj se na lipidni dvosloj veže le ob prisotnosti kalcija. Drugače obstajata dva različna tipa C2 domene, ki sta bila izolirana iz različnih organizmov. Lahko rečemo, da sta oba tipa zelo podobna v tem, da sta pri tipu 1 N-konec in C-konec obrnjena na vrh domene, kar je nasprotno kot pri tipu 2. Poznamo tri MACPF domene: Plu-MACPF, C8a MACPF in lipokalin C8g. Vse te domene primerjamo z skupino proteinov citolizinov in ugotovimo nekaj podobnosti in nekaj razlik. Na splošno, pa lahko rečemo, da je evolucija poskrbela tako, da so sta si domena MACPF in citolizini raszlični le v nekaj aminokislinah. Poznamo tri mehanizme kako perforin preide v tarčno celico in pri tem pomaga gramcimom B uničit to celico. Prvi mehanizem je prehajanje preko perforinske pore in sicer s pomočjo veziklov preide v celico. Naslednji mehanizem je endosomolitični model, pri katerem je pomemben kompleks s pomočjo katerega prehaja v celico. Kot zadnji mehanizem pa je model prehodne perforinske pore, ki pove, da perforin tvori kanalčke s pomočjo katerih grancimi B preidejo direktno v celico. Grancimi B so serinske proteaze, ki se sintetizirajo v citotoksičnih limfocitih T in NK celicah.

== Taja Karner: Glavoboli in migrene ==

Zaradi stresnega in hitrega tempa življenja, vse več ljudi trpi za občasnimi glavoboli, ki so najpogosteje posledica utrujenosti. Prav tako je vedno več ljudi, ki trpijo za močnejšimi oblikami glavobolov imenovanih migrene. V hujših oblikah migrene lahko glavobol traja do dva dni, močno migreno lahko spremljajo še drugi simptomi kot so slabost, bruhanje, občutljivost na svetlobo in močan zvok, depresija ter nespečnost. Mutacija, ki je največji krivec za nastanek bolezni se pojavlja na kromosomu 10 na genu KCNK18. Ta zapisuje protein TRESK, ki se nahaja v hrbtenjači in deluje kot kalijev kanalček. Mutacija povzroči, da ne pride do izmenjavanja ionov, kar povzroči hude glavobole. V raziskavah so odkrili zanimivo povezavo z anestetikom. Ta namreč ne glede na mutacijo ponovno aktivira kanal. To bi lahko učinkovito pozdravilo migrene, če bi ga le uspeli spraviti v primerno obliko. Ugotovili so tudi, da zdravila, ki vsebujejo citosporin in takrolimus v večini primerov povzročajo migrene v zdravstvu pa jih še vseeno pogosto uporabljajo. Odkritje te mutacije predstavlja revolucijo v zdravstvu in verjamem, da bo kmalu vodilo do odkritja učinkovitega zdravila proti migrenam.

== Ana Dolinar: Univerzalna kri – prihodnost transfuzijske medicine? ==

α-galaktozidaza (AGAL_HUMAN) je glikozil-hidrolazni encim. Spada v GH27-D (klan D, 27. družina) in ima aktivno mesto v obliki (β/α)8 sodčka. Encim zapisuje gen GLA, ki se nahaja na kromosomu X.

Ideja o univerzalni krvi, ki bi bila primerna za transfuzijo, ne glede na krvno skupino pacienta, je med znanstveniki prisotna že približno trideset let.
Razvili so tri metode za pretvorbo različnih antigenov v antigen 0 (po sistemu AB0), ki je primeren za transfuzijo v vse krvne skupine.
:#Encimska razgradnja antigenov A in B do antigena 0. Za antigene A so uporabili α-N-acetilgalaktozaminidazo, vendar so antigeni preveč kompleksni in metoda ni bila uspešna. Pri antigenih B so dosegli popolno pretvorbo v antigen 0 z uporabo α-galaktozidaze iz bakterije ''Streptomyces griseoplanus''.
:#Prekrivanje površine eritrocitov z maleimidofenil-polietilen-glikolom (Mal-Phe-PEG). Prekrije vse antigene, ne samo A ali B, vendar metoda ni uspešna, ker polietilen-glikol povzroča imunski odziv.
:#Pridobivanje univerzalnih rdečih krvnih celic iz pluripotentnih matičnih celic. Uspeli so pridobiti zrele eritrocite, ki so popolnoma funkcionalni.
Uporaba univerzalne krvi bi zmanjšala ali celo izničila imunski odziv ob transfuziji, prav tako ne bi bilo možnosti za transfuzijo napačne krvne skupne zaradi človeške napake. Metode trenutno niso dovolj izpopolnjene, da bi bilo možno pričakovati njeno uporabo v bližnji prihodnosti.

== Maša Mohar: Moški ali ženska to je sedaj vprašanje?(SRY - faktor za določitev spola) ==

SRY gen kodira Sry protein ki je član družine Sox (Sry related HMG box) transkripcijskih faktorjev. Poznamo jih okoli 20 pri človeku in miškah ter še mnogo drugih. Sox proteini imajo zelo različne vloge v embriogenezi in pri razvoju mnogih drugih organov. Tipično delujejo tako kot nekakšna stikala v diferenciaciji celic- sprožijo razvoj določenih celic. Sry je prav tako kot ostali člani te družine karakteriziran po HMG( high mobility group). HMG je drugače skupina specifičnih transkripcijskih faktorjev, ki imajo ~ 80 AK dolge strukturalno podobne domene za vezavo na DNA. Te domene oz. domena če je samo ena se veže na zaporedje (A/T)ACAA(T/A) v majhni žleb DNA. S tem ustvari zvitje DNA za približno 60- 85 stopinj. S tem ko se DNA zvije se razkrijejo mesta za izražanje drugih genov, recimo Sox9, ki kodira Sox9 protein ki pomaga pri diferenciaciji Sertoli celic in tako pri oblikovanju testisov, s tem pa determinira moški spol. Ugotovili smo tudi da obstaja veliko genskih bolezni povezanih s Sry genom in da lahko obstaja tudi ženska z XY spolnima kromosomoma, ker se pri njej zaradi mutacij Sry protein ne izrazi, prav tako pa obstajajo tudi moški z XX spolnima koromosomoma, kjer se enem od X kromosomov lahko izrazi SRY gen ob nepravilnostih pri očetovem delu zapisa. V bistvu sem prišla do zaključka da je zelo tanka meja med moškim in ženskim oblikovanjem spola, ena majhna mutacija oz. ena majhna razlika lahko privede do nastanka ženske ali moškega.

== Urška Rauter: A Green Glow: zgradba in funkcija encima luciferaze ==
Luciferaza je encim odvisen od ATP in magnezijevih ionov. Proces bioluminiscence se začne z vezavo na substrat luciferin, tvori se adenilatni intermediat in ob prisotnosti molekularnega kisika izhaja svetloba. Luciferaza je zgrajena iz dveh ločenih domen, večja se nahaja na N-koncu in manjša na C-koncu molekule, večja domena pa ima tudi svoje poddomene. Domeni sta med seboj ločeni z razpoko, kjer naj bi se po domnevanjih nahajalo tudi aktivno mesto encima. Luciferaza predstavlja tudi nov način mehanizma tvorbe adenilatnega intermediata med encimi in ponuja razlago za marsikatero metabolično pot.
Velika dilema, ki me med znanstveniki ostaja pa je razlika v barvi svetlobe, ki jo proces oksidacije luciferina emitira. Najverjetneje je za to odločilna keto tavtomerna oblika oksiluciferina in tudi resnonančna stabilizacija njegovega fenolatnega aniona, čeprav so znanstveniki odkrili tudi veliko drugih možnih vzrokov za različne barve (različne aminokisline, polarnost okolja, pH, ...).
Luciferaza se veliko uporablja v medicini, kjer služi kot marker molekul v telesu in tako pripomore k boljšem razumevanju različnih bolezni in infekcij, kot tudi sami strukturi celic in njenih organelov.

== Mirjam Kmetič: Mint condition (limonen-3-hidroksilaza in limonen-6-hidroksilaza) ==

Klasasta meta vsebuje encim limonen-6-hidroksilazo, ki sodeluje pri pridobivanju karvona. Poprova meta pa vsebuje limonen-3-hidroksilazo, ki je udeležena pri proizvodnji mentola. Obe hidroksilazi pripadata družini citokromov P450, njeni predstavniki pomembno sodelujejo pri proizvajanju različnih oksidiranih monoterpenov, ki so vir arom eteričnih olj. Karvon in mentol sta končna produkta hidroksilacije limonena. Ta encima sta si zelo podobna in njuni vezavni mesti za substrat sta zelo omejeni. Velja pravilo, da za spremembo aktivnosti v družini citokromov P450 potrebujemo določeno število mutacij, vendar je za modifikacijo vezavne aktivnosti limonenovih hidroksilaz potrebna samo ena. Ta fenilalanin v izolevcin mutacija povzroči, da se limonen-6-hidroksilaza spremeni v limonen-3-hidroksilazo! Mutiran encim je tako sposoben sinteze mentola tako kot encim v poprovi meti! Taka mutacija kaže, da sta prav ti dve aminokislini ne le nujni, temveč tudi prav zagotovo vpleteni pri orientaciji limonena v aktivnem mestu tako, da se ta hidroksilizira na ali C3 ali C6 poziciji. Posamične mutacije, ki lahko drastično spremenijo funkcijo proteina, so znanstveno zanimive. Nakazujejo ne le na zelo specifične manjše regije v sekvenici proteina, temveč so tudi ključne za razumevanje področij, kot so vezava in orientacija substrata, funkcija encima, metabolična pot in struktura vezavnega mesta.

== Sandi Botonjić: Kokain esteraza ==

Znanstveniki so v rizosferi kokinih plantaž (Erythroxylum coca) našli sev MB1, gram pozitivne bakterije Rhodococcus sp.. Tej bakteriji kokain predstavlja glavni vir ogljika in dušika in zato so znanstveniki izolirali osrednji encim njenega metabolizma tj. kokain esterazo (v nadaljevanju cocE). Encim je sestavljen iz treh domen: DOM1, ki vsebuje nabor kanoničnih α-vijačnic in β-ploskev; DOM2 - domena le z α-vijačnicami; in DOM3 je roladi podobna struktura z β-ploskvami. CocE je serinska esteraza, katere aktivno mesto se nahaja na stičišču vseh treh domen. Ta hidrolizira kokain na ekgonil metil ester in benzojsko kislino, ki nimata psihoaktivnih učinkov. CocE je pravi Ferrari v primerjavi z drugimi esterazami, saj lahko razgradi enako količino kokaina 1000 krat hitreje. Tako lahko postane neprecenljiva pri nujnih intervencijah v primeru prevelikega odmerka, saj bi intravenozni vbrizg cocE močno zmanjšal razpolovni čas kokaina. CocE je predmet številnih raziskav, v katerih znanstveniki proučujejo njeno termostabilnost in njenih mutiranih oblik, saj njen razpolovni čas pri fiziološki temperaturi traja le nekaj minut. Znanstveniki pa na podlagi ugotovitev iz raziskav cocE razvijajo tudi učinkovita protitelesa z vsaj podobnimi katalitičnimi parametri, ki bi brez imunskega odziva odlično delovala v bioloških sistemih.

==Tjaša Flis: Parkinsonizem in Parkin protein==

Parkinsonova bolezen je vse pogostejša bolezen pri starostnikih, njeni simptomi pa so tresavica, mišična otrdelost in upočasnjena motorika. Vzrok se skriva v propadu dopamnergičnih nevronskih celic. Bolezen je lahko avtosomno dominantno dedovana, kar pomeni, da pacienti podedujejo eno normalno in eno mutirano kopijo gena. Slednja prevladuje in se deduje naprej. Pri Parkinsonovi bolezni se mutacija zgodi v Park2 genu, ki kodira Parkin protein ali E3 ubikvitin ligazo. Parkin na poškodovane ali na preveč izražene proteine pripne ubikvitin (označevalni protein), ki jih nato usmeri v proteasom, to je velik razgradni kompleks v celicah.
Če mutacija poškoduje Parkin, je pot razgradnje onemogočena, to pa pomeni, da se v celici akumulirajo odvečni proteini. Tvorijo se Lewy-eva telesca polna teh proteinov, ki nadomestijo celične organele v nevronskih celicah, kar vodi do prenehanja njihovega delovanja. Ker pa ima Parkin več kot samo en substrat ki ga ubikvitinira, je točen mehanizem bolezni še dandanes uganka.
Eden izmed najbolj poznanih substratov je transmembranski protein Pael-R. Zvitje tega proteina poteka ob prisotnosti šaperonov. Prevelika koncentracija tega receptorja lahko izzove stres v endoplazmatskem retikulumu situiranem v nevronskih celicah. V primeru da je Parkin neaktiven, Pael-R povzroči celično smrt. Vendar to je le ena izmed možnih rešitev, substratov je namreč vsaj še dvajset, raziskave pa se nadaljujejo.

== Matja Zalar: Vloga SRK in SCR proteinov pri preprečevanju incestnega razmnoževanja cvetočih rastlin ==

Rastline so za zaščito pred samooplojevanjem razvile več vrst mehanizmov prepoznavanja lastnega peloda na molekularni ravni. Pri cvetočih rastlinah je najpogostejši mehanizem tipa SSI ali sporofitične lastne inkompatibilnosti. Pri družini ''Brassicaceae'' je za aktivacijo SSI ključna interakcija med transmembranskim proteinom SRK, ki predstavlja žensko determinanto odziva, in njenim ligandom - proteinom SCR, drugače imenovanim tudi moška determinanta odziva na lastno inkompatibilnost. Specifičnost vezave je zagotovljena s polimorfizmom alel obeh determinant. V posameznih vrstah je možno najti tudi do 100 različnih S-haplotipov genov za determinanti.
Vezava liganda na receptor bo uspešna le, če oba izhajata iz istega S-haplotipa. Vezava SCR na zunajcelično, N-glikolizirano domeno SRK povzroči nastanek kompleksa treh proteinov, ki s svojo aktivnostjo sproži kaksado reakcij, kar v končni fazi pripelje do preprečitve samooploditve.
Na neugodne življenske pogoje, ki so onemogočali medsebojno opraševanje, so se nekatere rastline prilagodile s favorizacijo samooplojevanja. Pri njih so mutacije S-lokusa, ki nosi zapis za SRK in SCR, povzročile nepravilno delovanje SI ali njegovo popolno odpoved. To pa seveda vodi v neprepoznavanje lastnega peloda in rastlina se samooprašuje. Najbolj znan primer take rastline je ''Arabidopsis thaliana'', ki se zaradi svojih specifičnih lastnosti uporablja kot modelni organizem v številnih študijah lastne inkompatibilnosti.

== Matevž Ambrožič: BSX protein in debelost ==

Za primeren občutek sitosti ali lakote glede na stanje energetskih zalog v telesu in odgovarjajoč vnos hrane ter porabo energije je odgovorna zapletena pot sporočanja. Začne se s tremi hormoni: inzulin, leptin in grelin. Leptin in inzulin se sprostita, ko so maščobne in hidratne zaloge v telesu polne in morata do možganov prenesti signal za prenehanje hranjenja, grelin pa ravno nasprotno. Vsi po krvi potujejo do hipotalamusa, predela možganov, ki je odgovoren za energijsko ravnovesje. V hipotalamusu sta dva tipa živčnih celic: oreksigene in anoreksigene. Prve sproščajo NPY in AgRP, nevropeptida, ki spodbujata hranjenje in zmanjšata porabo energije, druge pa α-MSH in CART, katerih učinek je nasproten. Našteti nevropeptidi se iz nevronov sprostijo po vezavi ustreznega izmed treh hormonov in prenesejo signal naprej, do končne spremembe v vnosu ali porabi energije. Glavni protein seminarja, BSX (brain specific homeobox) protein je transkripcijski faktor, ki spodbudi ekspresijo genov za AgRP in NPY, hkrati pa je odgovoren za premik organizma v iskanju hrane. Če v opisanem sistemu pride do napake, so pojavi nepotreben občutek lakote, kar je vzrok mnogih primerov debelosti. V boju z bolezensko debelostjo so ključne raziskave na BSX proteinu, saj je osrednji člen poti, ki v možgane prenese (včasih lažen) občutek lakote.

== Kaja Javoršek: A grey matter ==

Mikrocefalin je protein, ki ga kodira enakoimenski gen. Mikrocefalin naj bi kontroliral poliferacijo in diferenciacijo nevroblastov med nevrogenezo. Odkritje, da je mikrocefalin odločilen regulator velikosti možganov, je sprožilo hipotezo, da je igral vlogo v evoluciji možganov.
Razen v možganih najdemo mikrocefalin tudi v ledvicah, srcu, pljučih, vranici in skeletnih mišicah. Vendar pomen mikrocefalina v teh organih še ni znan.
Mutacije na genu mikrocefalina vodijo do nastanka mikrocefalije. To je bolezen razvoja živčnega sistema in je definirana kot resno zmanjšana velikost možganov. Pri odraslih je normalen volumen možganov od 1200 cm3 do 1600 cm3, pri odraslih s primarno mikocefalijo pa okoli 400 cm3 . Poleg mirocefalina pa povzročajo mikrocefalijo še mutacije petih genih (ASPM, MCPH2, CDK5RAP2, MCPH4, CENPJ)
Mikrocefalin ima tri BRCT domene na C – koncu. BRCT domene so prisotne v veliko ključnih proteinih, ki kontrolirajo delitev celice. Zato predvidevajo da mikrocefalija nastane, ker je ovirana normalna regulacija delitve celic v možganih.
Ugotovili so, da je protein mikrocefalin dol 835 aminokislin. Zaradi mutacije na genu mikrocefalina se ta protein skrajša na 25 aminokislin.
Znanstveniki so izvedli raziskavo ali gena mikrocefalin in ASPM vplivata na inteligenco. Na podlagi treh raziskav so zaključili, da inteligenca ni povezana z dominantnimi aleli ASPM – ja ali mikrocefalina.

== Rok Vene: A mind astray ==

Alzheimerjeva bolezen postaja vedno bolj aktualna tematika. Trenutno je na svetu več kot 26 milijonov ljudi s to obliko demence. Zaradi daljše življenjske dobe pa pričakujemo, da bo število obolelih samo še naraščalo. Alzheimerjeva bolezen prizadene centralni živčni sistem, v možganih se nalagajo snovi, ki povzročijo propad živčnih celic. Ena izmed snovi, ki se nalagajo v možganih so nefunkcionalni Tau proteini. Tau proteini sodijo v družino proteinov imenovanih microtubule-associated proteins (MAP), njihova naloga pa je je stabilizacija mikrotubulov. To dosežejo tako, da se na mikrotubule vežejo. Poleg tega predvidevajo, da imajo Tau proteini še eno nalogo. Sodelovali naj bi v kompleksu za uravnavanje vzdražnosti živčnih celic. Nefunkcionalnost Tau proteinov povezujejo z različnimi boleznimi, ki jih poznamo pod skupnim imenom tauopatije. V primeru Alzheimerjeve bolezni je Tau protein nefunkcionalen, zato ker je hiperfosforiliran, kar mu onemogoča vezavo na mikrotubule. Tau proteini zato tvorijo netopne agregate – nevrofibrilarne pentlje, ki najbrž povzročijo odmiranje živčnih celic. Pri iskanju učinkovin proti hiperfosforilaciji in agregaciji Tau proteina, so znanstveniki raziskali protein FKBP52. Ta protein ima več funkcij. Osredotočili so se predvsem na njegove šaperonske lastnosti. Ugotovili so, da se FKBP52 veže na hiperfosforiliran Tau protein, in tako prepreči agregacijo Tau proteina, ki je odgovorna za odmiranje nevronov.

== Ines Šterbal: LTP1 ==

Protein LTP1, izoliran iz ječmenovega zrna, spada v družino lipidnih prenašalnih proteinov (lipid transfer protein –LTP). Je dobro topen protein, ki se nahaja v alevronski plasti ječmenovega semena. Sestavljen je iz štirih heliksov, ki so povezani z disulfidnimi mostički. Ima dobro definiran C-terminalni konec. V razmerah in vivo je globularni protein, s stožčastim hidrofobnim jedrom, ki se razteza od enega konca molekule do drugega. Sposoben je vezati različne lipide, kot so maščobne kisline ali acetil-koencim A. LTP1 proteini so na površini aktivni proteini, so stabilni, denaturirajo šele okrog 100 °C. Vloga LTP1 proteina in vivo še ni znana. In vitro je glavni protein pri penjenju piva. Opravlja pa še številne druge funkcije, odvisno od tega, kateri ligand ima vezan. LTP1 proteini so verjetno vključeni v prenos lipidov preko membrane in celo v nastanek membrane, lahko bi imeli vlogo v transportu monomera Cutin, vlogo naj bi igrali tudi v obrambnem mehanizmu rastlin. Lipidi, ki so vezani na LTP1 bi naj imeli antibakterijsko aktivnost za bakterije in glive.
Vsi podatki kažejo, da so povezave med sladkorji in proteini, ki nastanejo kot produkt Milardove reakcije, prvi korak do nastanka pivovske pene. Kaže, da je kontrola glikacije LTP1 proteinov med slajenjem in varjenjem piva, nujna za optimalno penjenje piva.

== Mitja Crček: DSIP in spanje ==

Pred 2000 leti so ljudje verjeli, da postanemo zaspani zaradi nekakšnih želodčnih hlapov, ki gredo v možgane, se tam kondenzirajo, zamašijo pore in posledično povzročajo zaspanost. Kasneje so seveda ugotovili da temu ni tako, leta 1977 pa so odkrili majhne peptide, ki naj bi nas uspavali in jih poimenovali Delta Sleep-Inducing peptide (DSIP). DSIP je majhen peptid, sestavljen iz devetih aminokislinskih ostankov in maso 850 daltonov, prvič pa so ga odkrili pri zajcih. Sodeloval naj bi tako pri endokrini regulaciji kot pri fizioloških procesih (poveča učinkovitost oksidativne fosforilacije), pomembno vlogo pa naj bi imel tudi v medicini in pri zdravljenju bolezni. Ker naj bi podaljševal REM fazo, bi ga lahko uporabljali tudi kot dodatek pri zdravljenju alkoholizma ali ga dodajali antidepresivom in pomirjevalom, ki skrajšujejo REM fazo. Raziskave so spremljale tudi vpliv DSIP-ja na nespečnost. Ugotovili so, da DSIP rahlo povečuje kvaliteto spanja in skrajšuje latenco uspavanja, na trajanje budnosti in druge parametre pa ne vpliva, zato so si strokovnjaki enotni, da ima DSIP le rahle terapevtske učinke na nespečnost. Delovanje peptida pa še vedno ni povsem razjasnjeno in le želimo si lahko, da bodo novejše raziskave prinesle nove informacije, saj ima DSIP vsekakor velik potencial v medicini.

== Dominik Kert: FOXP2, govoreči protein ==

Ljudje in živali se razlikujejo. Za znanstvenike 19. stoletja je bilo zelo fascinantno to, da mi lahko govorimo, se sporazumevamo in pomnimo besede, medtem ko živali ne morejo. Ko se je pojavila družina KE na koncu 90. let prejšnjega stoletja, so znanstveniki ugotovili, da obstaja gen, ki kodira FOXP2. Družina KE je slovi po tem, da ima polovica njenih članov težave z govorom. Tako so ugotovili, da se mutacija prenaša avtosomno in dominantno. In verjetno na to vpliva mutacija FOXP2, FOXP2 protein pa je po vsej verjetnosti odločilen faktor pri govoru.
FOXP2 protein je sestavljen iz 715 aminokislin in spada med družino transkripcijskih faktorjev, ki se imenuje FOX (zaradi 'forkhead box' domene). Zanimivo je, da se ta gen razlikuje od gena opic (šimpanz, gorila, makaki) le za dve in od miši le za tri aminokisline. To se znanstvenikom zdi zelo zanimivo, ker je verjetno zaradi teh dve sprememb v aminokislinskem zaporedju prišlo do sprememb pri sporazumevanju. Zaradi teh dejstev so se naprej usmerili na to, ali je bil gen res pod vplivom naravne selekcije in ugotovili so, da je bil res.
FOXP2 na te spremembe vpliva v možganih, je pa prisoten tudi v pljučih, drobovju in srcu. Vendar njegova funkcija tam še ni znana.

== Petra Malavašič: Ureaza bakterije Helicobacter pylori ==

Bakterija Helicobacter pylori spada med patogene mikrobe. Znanstvenika Warren in Marshall sta leta 1987 odkrila to bakterijo ter ugotovila, da je s to bakterijo povezana razjeda na želodcu. Leta 2005 sta prejela Nobelovo nagrado. Že vsak drugi človek je okužen s to bakterijo. Naseljena je na želodčni sluznici in povzroča kronično vnetje želodčne sluznice. Bakterija se lahko naseli in se razmnožuje v prisotnosti želodčne kisline, kjer je pH okoli 2. Posebni obrambni mehanizmi omogočajo bakteriji, da lahko preživi v kislem okolju. Encim ureaza je pri tem najpomembnejši. Ureaza je encim, ki katalizira hidrolizo uree, pri čemer nastane amoniak, ki se v končni fazi veže z molekulami vode v amonijev hidroksid, ki poveča pH v neposredni okolici bakterije. Encim ureaza se nahaja v citoplazmi bakterijske celice in na njeni površini. Sam encim je zgrajen zelo kompleksno in omogoča bakteriji preživetje. Posebna kompleksna zgradba encima onemogoči, da bi kislina želodčnega soka denaturirala encim. Encim sestavljata dva kompleksa (αβ) štirih prostorsko razporejenih (αβ)3 enot.

== Matevž Merljak: CEM15, VIF in infektivnost retrovirusov ==

Ena izmed komponent obrambnega mehanizma pred retrovirusi v nekaterih človeških celicah je citidinska deaminaza CEM15 (APOBEC3G). V celicah, ki jo izražajo, se retrovirusi brez posebnega proteina (VIF, “viral infectivity factor”) ne morejo uspešno množiti, zato takim celicam pravimo “nepermisivne” celice.

CEM15 deluje tako, da med procesom reverzne transkripcije v novonastali “minus” DNA verigi številne citidinske baze pretvori v uridinske, ter s tem povzroči tako zmanjšano obstojnost z uracilom bogate DNA verige, kot tudi zamenjave gvanozinskih baz z adenozinskimi v kodirajoči (“plus”) verigi DNA. Čeprav takšna hipermutacija za nadaljno infektivnost virusa ni vedno usodna (torej lahko tako mutirana DNA v nekaterih primerih še vedno tvori funkcionalne viruse), je običajno dovolj obsežna, da onemogoči uspešno reprodukcijo virusa.

Raziskave kažejo, da CEM15 ne napade nastajajoče DNA kot lasten celični odgovor na infekcijo, pač pa se med izgradnjo novih virusov vgradi v le-te ter po infekciji nove celice povzroči omenjene spremembe v nastajajoči DNA verigi.

Že omenjen faktor VIF izhaja iz virusa HIV-1, ki primarno napada sicer nepermisivne limfocite T. Naloga VIF je preprečitev vgradnje CEM15 v nastajajoče viruse, to pa doseže tako z oteževanjem njene translacije, kot tudi z indukcijo razgradnje CEM15 v proteasomu.

== Eva Knapič: TSH3 - Kaj novorojenčkom omogoča zadihati? ==

Kaj novorojenčkom omogoča zadihati? Raziskave so pokazale, da ima eno izmed vodilnih vlog pri začetku dihanja protein teashirt homolog 3 (TSH3). To je protein, ki ga uvrščamo med transkripcijske faktorje. Po strukturi spada v družino cinkovih prstov, kjer so sekundarne strukture koordinirane s cinkovim ionom. TSH3 ima pet tako urejenih struktur in vse spadajo v Cys2His2 skupino – cinkov ion koordinira dva cisteinska in dva histidinska ostanka ßßα podenote.
Organizem brez zapisa za teashirt 3 protein se v času embrionalnega razvoja navidezno ne razlikuje od organizmov, ki ta zapis imajo. Vendar so podrobnejše raziskave pokazale, da se brez prisotnosti proteina teashirt 3 dokončno ne oblikujejo pljučni mešički, ki so funkcionalna enota pljuč, saj tam poteka izmenjava plinov. Odsotnost proteina povzroča povečano apoptozo nevronov motoričnega jedra v možganskem deblu, s tem so proteinu pripisali zmožnost inhibicije apoptoze nevronov. Prav tako so nezmožnost odziva organizma na pH spremembe okolja pripisali pomanjkanju proteina TSH3.
Iz vseh teh pomanjkljivostih, ki jih povzroča TSH3 so raziskovalci prišli do zaključka, da novorojenček brez zapisa za protein ni zmožen zadihati, ker ni sposoben odziva na spremembo okolja, predvsem pH in tako ne more vzdrževati homeostaze, ki je potreba na preživetje.

== Tjaša Goričan: Vpliv Nogo proteina na regeneracijo živčnega sistema ==

Nevroni vsebujejo mielin, ki je sestavni del mielinske ovojnice aksona in ima nalogo zagotavljanja stalnega prenosa električnih signalov. Poleg tega pa mu je dodeljena tudi nenavadna lastnost. Vsebuje namreč proteine Nogo-A, ki delujejo kot inhibirotji za rast poškodovanih aksonov. Posledično se diferencirani nevroni niso sposobni deliti. Problem se pojavi pri poškodbi živčnega sistema, saj se ni sposoben regenerirati. Bolezni, ki so povezane s poškodbami živčevja so: Poškodbe hrbtenjače, Alzheimerjeva bolezen, možganska kap, shizofrenija itd.

Nogo-A protein spada v družino proteinov retikulonov in je ena od oblik Nogo proteinov. Je transmembranski protein, ki se z domeno Nogo-66 uspešno veže na receptor in povzroči razgradnjo mikrotubulov v aksonu, kar privede do preureditve citoskeleta in posledično zaustavitve rasti aksona. Največ Nogo-A se nahaja na oligodendrocitih. Oligodendrociti so celice, ki spadajo med nevroglio in tvorijo mielinski ovoj nevronov v centralnem živčnem sistemu. Veliko več ga najdemo v centralnem živčnem sistemu v primerjavi s perifernim.

Čeprav je še veliko neznanega na področju živčnega sistema, je znanost že dosegla uspehe glede boja proti boleznimi, povezanimi z regeneracijo živčnega sistema. S protitelesi se da inhibirati protein Nogo-A in s tem preprečiti inhibicijo rasti poškodovanih nevronov.

== Marko Radojković: Fluoroscentni proteini in njihova uporaba v živčnem sistemu ==

Fluoroscentni proteini so členi družine homologih proteinov, ki se delijo skupno lastnost da svetlijo zaradi formiranja kromoforma znotraj lastnega polipeptidnega zaporedja. Prvi odkrit takšen protein je bil zeleni fluoroscentni protein ali GFP. Od tedaj do danes so kreirani različni mutanti, ki žarijo skoraj vse barve človeškega vidnega spektra. Izkazalo se je da so zelo uporabni v mnogih bioloških disciplinah, predvsem pa so popularni v spremljanju dinamike proteinov, genske ekspresije, in tudi posledično na viši ravni, dinamike organelov ter gibanja celic znotraj tkiva.
Ne tako dolgo nazaj, tim znanstvenikov je uspel skombinirati različne barvne variante GFP-ja s sofisticiranim Cre/Lox sistemom genske rekombinacije in tako omogočil njihovo izražanje v samih možganih. Tale tehnika omogoča da se vsaki posamezni nevron obarva drugače in tako loči od sosednjih, kar omogoča detajlno analizo živčnega vezja. Brainbow strategija, kakor so jo poimenovali, daje upanje znanstvenikom da z ustvarjanem celotnega ''zemljevida'' možganov, lahko izpeljejo pomembne informacije o nevronskih povezavah in njihov nadaljni vpliv na vedenje in delovanje organizma.

BIO2 Povzetki seminarjev 2011

2011-11-18T22:19:27Z

MarkoRadojkovic: /* Marko Radojković: Fluoroscentni proteini in njihova uporaba v živčnem sistemu */

== Sara Draščič: On the spur of a whim ==

Serotonin ali 5-hidroksitriptamin (5-HT) spada v skupino heterogenih biokemičnih snovi, ki prenašajo informacije po živčnem sistemu in ki jim rečemo nevrotransmiterji. Ima pomembno vlogo pri veliko najrazličnejših reakcijah v telesu. Njegovo nepravilno delovanje vpliva na počutje, apetit, slabost, spanje, telesno temperaturo, staranje, bolečino, anksioznost, agresijo, spomin, migrene in na številne druge procese v organizmu. Večina serotonina se sintetizira v prebavnem traktu, preostali del pa v centralnem živčnem sistemu in trombocitih. Kljub temu, da se sintetizira le v določenih delih telesa, je prisoten povsod. Dokaz za njegovo prisotnost pa so serotoninski receptorji. Serotonin ima veliko receptorjev, ki so jih organizirali v sedem skupin glede na njihove fiziološke in strukturne razlike. Ravno zaradi tako velikega števila raznoraznih receptorjev, je serotonin pomemben pri tolikih različnih procesih, saj je njegovo delovanje, v veliki meri, odvisno od tega, na kateri receptor se bo vezal. Veliki pomen pri delovanju serotonina ima tudi njegov transporter. To je protein, katerega struktura še ni znana, vendar vemo kje in na katerem kromosomu se nahaja. Transporter je tudi glavna tarča raznih antidepresivov in drog kot so ecstasy, kokain in LSD.

== Ula Štok: Neuregulin 1 ==

Neuregulin-1 je član proteinov iz družine neuregulinov in je kodiran s strani gena NRG1. Obstaja veliko tipov Neuregulina-1, ki se razlikujejo po funkcionalnosti ter mestu v telesu na katerem delujejo. Najpogosteje delujejo v živčnem sistemu, kjer lahko z nepravilnim delovanjem med drugimi povzročajo tudi zelo razširjeno bolezen - shizofrenijo. Delujejo pa tudi na ostalih tkivih in organih (na primer: srce, pljuča, oprsje in želodec). Generalno obstajata dve poti signaliziranja Neuregulina-1, in sicer: Običajna ter neobičajna pot. Pri običajni poti je ErbB receptor aktiviran direktno, v enem koraku z vezavo Neuregulina-1. To najpogosteje povzroči dimerizacijo ali heterodimerizacijo ErbB receptorja. Dimerizacija ali heterodimerizacija sicer nista nujno potrebni, a vendar do njiju pride na skoraj vseh receptorjih ErbB. Ta združitev povzroči avto- in trans-fosforilacijo intracelularnih domen tega receptorja, kar aktivira vse nadaljnje poti signaliziranja. V končni fazi pa NRG1/ErbB signaliziranje vpliva direktno na transkripcijo. Pri neobičajni poti je postopek podoben, a vendar poteka začetna stopnja malo drugače. Na začetku namreč sodeluje JMa oblika receptorja ErbB4, ki se pod vplivom TACE cepi. Del receptorja (ErbB4-CTF) se odcepi v notranjost celice. Ta peptid je velik približno 80 kD in ima specifično izoblikovano vezavno mesto za Neuregulin-1. Nadaljnji procesi pa potekajo zelo podobno kot pri običajni signalni poti. Neuregulin-1 lahko povzroča shizofrenijo na različne načine, saj sodeluje pri zelo pomembnih procesih, kot so: tvorba sinaps, mielinizacija aksonov, razvoj oligodendrocit itd. Shizofrenija je zelo razširjena bolezen in nihče še ni odkril direktnega postopka k popolni odpravi te bolezni. A vendar, v letu 2009 se je zgodila neke vrste prelomnica v študiju shizofrenije. Odkrili so namreč, da posamezniki, ki so imeli gen za shizofrenijo niso zboleli. Še več! Napaka se jim je odrazila kot zvišanje kreativnih sposobnosti na znanstvenem ali umetniškem področju, odvisno od posameznika. Ob tem se je pojavilo mnogo vprašanj, saj bi na ta način mogoče lahko poiskali pot, da bi shizofrenija postala popolnoma ozdravljiva. A vendar, je to področje še raziskano, saj znanstveniki ne vedo po kakšnih poteh pride do tega, da te mutacije na NRG1 genu ne izrazijo v bolezenskem stanju.

== Maša Mirković: Proteinski produkti genov za disleksijo in z disleksijo povezane motnje ==

Disleksija je motnja, ki se kaže v nesposobnosti branja oziroma razumevanja prebranega, ter napakah in težavah pri izgovarjanju besed. Disleksiki,kot imenujemo posameznike, ki trpijo za disleksijo, imajo kljub normalnim intelektualnim sposobnostim, znanjem in izobrazbo, moteni veščini pisanja in branja s tendenco, da pomešajo med seboj črke ali besede med branjem ali pisanjem. V zadnjih letih, so uspeli ugotoviti mesta na kromosomih, povezana z dovzetnostjo za disleksijo. DYX1C1,KIAA0319,DCDC2 in ROBO1, so bili označeni kot kandidati, z dovzetnostjo za disleksijo. Najbolj obetaven je protein KIAA0319. Je transmembranski protein iz desetih transmembranskih vijačnic, najden v plazemski membrani nevronov. Njegov C-terminalni konec gleda v ekstracelularni matriks, manjši N-terminalni konec pa prehaja v citoplazmo nevrona. C-terminalni konec je visoko glikoziliran in nosi 5 PKD(polycystyc kidney desease) domene in eno MANEC(motif at the N terminus with eight cysteines) domeno. KIAA0319 igra vlogo pri rasti možganov in njihovi migraciji med razvojem možganov-iz tega je razvidno, da je disleksija problem v razvoju nevronov že v zgodnjih letih. Posamezniki z disleksijo nosijo izoobliko tega proteina, ki povzroči nižjo izraženost le tega. Spremembe so v 5'-regiji, ki kodira izoobliko proteina. Najopaznejše povezave z disleksijo se kažejo v 2,3 kb regiji, ki zavzema promotor, prvi nepreveden ekson in del prvega introna – odprti kromatin. Te ugotovitve vodijo, da je 5'-regija KIAA0319 gena tista lokacija alelov, ki največ prispeva k motnji branja.

== Katra Koman: INZULIN ==

Inzulin je peptidni hormon, ki sodeluje v uravnavanju ravni glukoze v krvi. Sintetizira in skladišči se v β-celicah Langerhansovih otočkov trebušne slinavke. Sinteza poteka od prekurzorske molekule preproinzulina preko proinzulina do dokončne zrele molekule inzulina, ki se shrani v skladiščnih veziklih. Ob povišanju ravni glukoze v krvi, na primer po obroku, glukoza, ki je tudi glavni stimulator sekrecije inzulina, iz krvi preide v β-celice skozi GLUT2 transporter. Tam se fosforilira v glukozo-6-fosfat, saj tako fosforilirana ne more več iz celice, lahko pa vstopi v proces glikolize, ki mu sledita še Krebsov cikel in oksidativna fosforilacija, ki povzroči pretvorbo ADP v ATP molekule. ATP molekula stimulira zaprtje kalijevih kanalčkov, kar privede do depolarizacije celične membrane, to pa sproži na odprtje kalcijevih kanalčkov in vdor Ca2+ ionov. Povišana koncentracija kalcijevih Ca2+ ionov v celici stimulira prenos in zlitje skladiščnih veziklov z inzulinom z membrano. Inzulin se tako sprosti v krvni obtok in potuje do tarčnih celic, ki imajo na površini izražene inzulinske receptorje. Ko se veže nanj, prenese signal o povišanju ravni glukoze v krvi v celico. To povzroči kaskado reakcij znotraj celice, ki pa na koncu privedejo do translokacije veziklov z GLUT4 transporterjev na površino celice. Število teh transporterjev za glukozo se na površini celične membrane poveča in glukoza lahko prehaja v celico, posledično pa pade raven glukoze v krvi. Razgradnja inzulina poteka v jetrih in ledvicah. Okvare na katerikoli stopnji poti inzulina se odražajo v diabetesu ali drugih boleznih.

== Rok Štemberger: Protein GABAA (gama aminomaslena kislina A) - zgradba, vloga in zanimivosti ==

V svoji seminarski nalogi sem raziskoval vlogo, pomen in zanimivosti proteina GABAA (gama-aminomaslena kislina A). To je receptor, ki se nahaja predvsem v centralnem živčnem sistemu in je zadolžen zato, da opravlja funkcijo inhibitorja. Lociran je na površini nevrotičnih sinaps in prekinja elektrokemični signal, tako da omogoči prehod kloridnih ionov znotraj celice. To se zgodi takrat ko se ustrezen ligand Gama veže na aktivno mesto tega receptorja. Konformacija podenot se spremeni in to omogoči aktivacijo receptorja. Znanstveniki so ugotovili, da obstaja več vrst GABAA receptorjev, kar pa je odvisno od sestave podenot. Najbolj pogoste podenote so alfa beta in gama v razmerju 2:2:1. V primeru da do prekinitve ne pride se lahko pojavijo epileptični napadi, psihiatrične motnje itd. Stres lahko v dobi odraščanja močno vpliva na GABAA receptorje in jih tudi permanentno strukturno spremeni, kar pa lahko kasneje v našem življenju vpliva predvsem na naš spanec in njegovo kvaliteto. Absint je bila v preteklosti prepovedana pijača, saj je povzročala razna obolenja zaradi substance imenovane tujon. Le ta se je vezala na GABAA receptorje in tako onemogočila njegovo delovanje, zato ker je preprečevala prehod kloridnih ionov v membrano. Sedaj potekajo raziskave teh receptorjev, saj je ključnega pomena čim boljša ozdravitev bolezni, ki nastanejo zaradi nepravilnega delovanja GABAA receptorja.

== Veronika Jarc: Perforin ==

Perforin je protein, ki nastane iz citotoksičnih limfocitov T. S pomočjo grancimov napade tarčno celico in jo uniči. Rečemo lahko, da je pomemben člen pri imunskem odzivu in sodeluje s NK celicami. Sestavljen je iz 555 aminokislin, njegova molekulska masa pa je 62-67 kD. Sestavljen je iz dveh pomembnih domen, domene MACPF in domene C2. Za domeno C2 je značilno, da ima afiniteto do Ca2+ ionov. Saj se na lipidni dvosloj veže le ob prisotnosti kalcija. Drugače obstajata dva različna tipa C2 domene, ki sta bila izolirana iz različnih organizmov. Lahko rečemo, da sta oba tipa zelo podobna v tem, da sta pri tipu 1 N-konec in C-konec obrnjena na vrh domene, kar je nasprotno kot pri tipu 2. Poznamo tri MACPF domene: Plu-MACPF, C8a MACPF in lipokalin C8g. Vse te domene primerjamo z skupino proteinov citolizinov in ugotovimo nekaj podobnosti in nekaj razlik. Na splošno, pa lahko rečemo, da je evolucija poskrbela tako, da so sta si domena MACPF in citolizini raszlični le v nekaj aminokislinah. Poznamo tri mehanizme kako perforin preide v tarčno celico in pri tem pomaga gramcimom B uničit to celico. Prvi mehanizem je prehajanje preko perforinske pore in sicer s pomočjo veziklov preide v celico. Naslednji mehanizem je endosomolitični model, pri katerem je pomemben kompleks s pomočjo katerega prehaja v celico. Kot zadnji mehanizem pa je model prehodne perforinske pore, ki pove, da perforin tvori kanalčke s pomočjo katerih grancimi B preidejo direktno v celico. Grancimi B so serinske proteaze, ki se sintetizirajo v citotoksičnih limfocitih T in NK celicah.

== Taja Karner: Glavoboli in migrene ==

Zaradi stresnega in hitrega tempa življenja, vse več ljudi trpi za občasnimi glavoboli, ki so najpogosteje posledica utrujenosti. Prav tako je vedno več ljudi, ki trpijo za močnejšimi oblikami glavobolov imenovanih migrene. V hujših oblikah migrene lahko glavobol traja do dva dni, močno migreno lahko spremljajo še drugi simptomi kot so slabost, bruhanje, občutljivost na svetlobo in močan zvok, depresija ter nespečnost. Mutacija, ki je največji krivec za nastanek bolezni se pojavlja na kromosomu 10 na genu KCNK18. Ta zapisuje protein TRESK, ki se nahaja v hrbtenjači in deluje kot kalijev kanalček. Mutacija povzroči, da ne pride do izmenjavanja ionov, kar povzroči hude glavobole. V raziskavah so odkrili zanimivo povezavo z anestetikom. Ta namreč ne glede na mutacijo ponovno aktivira kanal. To bi lahko učinkovito pozdravilo migrene, če bi ga le uspeli spraviti v primerno obliko. Ugotovili so tudi, da zdravila, ki vsebujejo citosporin in takrolimus v večini primerov povzročajo migrene v zdravstvu pa jih še vseeno pogosto uporabljajo. Odkritje te mutacije predstavlja revolucijo v zdravstvu in verjamem, da bo kmalu vodilo do odkritja učinkovitega zdravila proti migrenam.

== Ana Dolinar: Univerzalna kri – prihodnost transfuzijske medicine? ==

α-galaktozidaza (AGAL_HUMAN) je glikozil-hidrolazni encim. Spada v GH27-D (klan D, 27. družina) in ima aktivno mesto v obliki (β/α)8 sodčka. Encim zapisuje gen GLA, ki se nahaja na kromosomu X.

Ideja o univerzalni krvi, ki bi bila primerna za transfuzijo, ne glede na krvno skupino pacienta, je med znanstveniki prisotna že približno trideset let.
Razvili so tri metode za pretvorbo različnih antigenov v antigen 0 (po sistemu AB0), ki je primeren za transfuzijo v vse krvne skupine.
:#Encimska razgradnja antigenov A in B do antigena 0. Za antigene A so uporabili α-N-acetilgalaktozaminidazo, vendar so antigeni preveč kompleksni in metoda ni bila uspešna. Pri antigenih B so dosegli popolno pretvorbo v antigen 0 z uporabo α-galaktozidaze iz bakterije ''Streptomyces griseoplanus''.
:#Prekrivanje površine eritrocitov z maleimidofenil-polietilen-glikolom (Mal-Phe-PEG). Prekrije vse antigene, ne samo A ali B, vendar metoda ni uspešna, ker polietilen-glikol povzroča imunski odziv.
:#Pridobivanje univerzalnih rdečih krvnih celic iz pluripotentnih matičnih celic. Uspeli so pridobiti zrele eritrocite, ki so popolnoma funkcionalni.
Uporaba univerzalne krvi bi zmanjšala ali celo izničila imunski odziv ob transfuziji, prav tako ne bi bilo možnosti za transfuzijo napačne krvne skupne zaradi človeške napake. Metode trenutno niso dovolj izpopolnjene, da bi bilo možno pričakovati njeno uporabo v bližnji prihodnosti.

== Maša Mohar: Moški ali ženska to je sedaj vprašanje?(SRY - faktor za določitev spola) ==

SRY gen kodira Sry protein ki je član družine Sox (Sry related HMG box) transkripcijskih faktorjev. Poznamo jih okoli 20 pri človeku in miškah ter še mnogo drugih. Sox proteini imajo zelo različne vloge v embriogenezi in pri razvoju mnogih drugih organov. Tipično delujejo tako kot nekakšna stikala v diferenciaciji celic- sprožijo razvoj določenih celic. Sry je prav tako kot ostali člani te družine karakteriziran po HMG( high mobility group). HMG je drugače skupina specifičnih transkripcijskih faktorjev, ki imajo ~ 80 AK dolge strukturalno podobne domene za vezavo na DNA. Te domene oz. domena če je samo ena se veže na zaporedje (A/T)ACAA(T/A) v majhni žleb DNA. S tem ustvari zvitje DNA za približno 60- 85 stopinj. S tem ko se DNA zvije se razkrijejo mesta za izražanje drugih genov, recimo Sox9, ki kodira Sox9 protein ki pomaga pri diferenciaciji Sertoli celic in tako pri oblikovanju testisov, s tem pa determinira moški spol. Ugotovili smo tudi da obstaja veliko genskih bolezni povezanih s Sry genom in da lahko obstaja tudi ženska z XY spolnima kromosomoma, ker se pri njej zaradi mutacij Sry protein ne izrazi, prav tako pa obstajajo tudi moški z XX spolnima koromosomoma, kjer se enem od X kromosomov lahko izrazi SRY gen ob nepravilnostih pri očetovem delu zapisa. V bistvu sem prišla do zaključka da je zelo tanka meja med moškim in ženskim oblikovanjem spola, ena majhna mutacija oz. ena majhna razlika lahko privede do nastanka ženske ali moškega.

== Urška Rauter: A Green Glow: zgradba in funkcija encima luciferaze ==
Luciferaza je encim odvisen od ATP in magnezijevih ionov. Proces bioluminiscence se začne z vezavo na substrat luciferin, tvori se adenilatni intermediat in ob prisotnosti molekularnega kisika izhaja svetloba. Luciferaza je zgrajena iz dveh ločenih domen, večja se nahaja na N-koncu in manjša na C-koncu molekule, večja domena pa ima tudi svoje poddomene. Domeni sta med seboj ločeni z razpoko, kjer naj bi se po domnevanjih nahajalo tudi aktivno mesto encima. Luciferaza predstavlja tudi nov način mehanizma tvorbe adenilatnega intermediata med encimi in ponuja razlago za marsikatero metabolično pot.
Velika dilema, ki me med znanstveniki ostaja pa je razlika v barvi svetlobe, ki jo proces oksidacije luciferina emitira. Najverjetneje je za to odločilna keto tavtomerna oblika oksiluciferina in tudi resnonančna stabilizacija njegovega fenolatnega aniona, čeprav so znanstveniki odkrili tudi veliko drugih možnih vzrokov za različne barve (različne aminokisline, polarnost okolja, pH, ...).
Luciferaza se veliko uporablja v medicini, kjer služi kot marker molekul v telesu in tako pripomore k boljšem razumevanju različnih bolezni in infekcij, kot tudi sami strukturi celic in njenih organelov.

== Mirjam Kmetič: Mint condition (limonen-3-hidroksilaza in limonen-6-hidroksilaza) ==

Klasasta meta vsebuje encim limonen-6-hidroksilazo, ki sodeluje pri pridobivanju karvona. Poprova meta pa vsebuje limonen-3-hidroksilazo, ki je udeležena pri proizvodnji mentola. Obe hidroksilazi pripadata družini citokromov P450, njeni predstavniki pomembno sodelujejo pri proizvajanju različnih oksidiranih monoterpenov, ki so vir arom eteričnih olj. Karvon in mentol sta končna produkta hidroksilacije limonena. Ta encima sta si zelo podobna in njuni vezavni mesti za substrat sta zelo omejeni. Velja pravilo, da za spremembo aktivnosti v družini citokromov P450 potrebujemo določeno število mutacij, vendar je za modifikacijo vezavne aktivnosti limonenovih hidroksilaz potrebna samo ena. Ta fenilalanin v izolevcin mutacija povzroči, da se limonen-6-hidroksilaza spremeni v limonen-3-hidroksilazo! Mutiran encim je tako sposoben sinteze mentola tako kot encim v poprovi meti! Taka mutacija kaže, da sta prav ti dve aminokislini ne le nujni, temveč tudi prav zagotovo vpleteni pri orientaciji limonena v aktivnem mestu tako, da se ta hidroksilizira na ali C3 ali C6 poziciji. Posamične mutacije, ki lahko drastično spremenijo funkcijo proteina, so znanstveno zanimive. Nakazujejo ne le na zelo specifične manjše regije v sekvenici proteina, temveč so tudi ključne za razumevanje področij, kot so vezava in orientacija substrata, funkcija encima, metabolična pot in struktura vezavnega mesta.

== Sandi Botonjić: Kokain esteraza ==

Znanstveniki so v rizosferi kokinih plantaž (Erythroxylum coca) našli sev MB1, gram pozitivne bakterije Rhodococcus sp.. Tej bakteriji kokain predstavlja glavni vir ogljika in dušika in zato so znanstveniki izolirali osrednji encim njenega metabolizma tj. kokain esterazo (v nadaljevanju cocE). Encim je sestavljen iz treh domen: DOM1, ki vsebuje nabor kanoničnih α-vijačnic in β-ploskev; DOM2 - domena le z α-vijačnicami; in DOM3 je roladi podobna struktura z β-ploskvami. CocE je serinska esteraza, katere aktivno mesto se nahaja na stičišču vseh treh domen. Ta hidrolizira kokain na ekgonil metil ester in benzojsko kislino, ki nimata psihoaktivnih učinkov. CocE je pravi Ferrari v primerjavi z drugimi esterazami, saj lahko razgradi enako količino kokaina 1000 krat hitreje. Tako lahko postane neprecenljiva pri nujnih intervencijah v primeru prevelikega odmerka, saj bi intravenozni vbrizg cocE močno zmanjšal razpolovni čas kokaina. CocE je predmet številnih raziskav, v katerih znanstveniki proučujejo njeno termostabilnost in njenih mutiranih oblik, saj njen razpolovni čas pri fiziološki temperaturi traja le nekaj minut. Znanstveniki pa na podlagi ugotovitev iz raziskav cocE razvijajo tudi učinkovita protitelesa z vsaj podobnimi katalitičnimi parametri, ki bi brez imunskega odziva odlično delovala v bioloških sistemih.

==Tjaša Flis: Parkinsonizem in Parkin protein==

Parkinsonova bolezen je vse pogostejša bolezen pri starostnikih, njeni simptomi pa so tresavica, mišična otrdelost in upočasnjena motorika. Vzrok se skriva v propadu dopamnergičnih nevronskih celic. Bolezen je lahko avtosomno dominantno dedovana, kar pomeni, da pacienti podedujejo eno normalno in eno mutirano kopijo gena. Slednja prevladuje in se deduje naprej. Pri Parkinsonovi bolezni se mutacija zgodi v Park2 genu, ki kodira Parkin protein ali E3 ubikvitin ligazo. Parkin na poškodovane ali na preveč izražene proteine pripne ubikvitin (označevalni protein), ki jih nato usmeri v proteasom, to je velik razgradni kompleks v celicah.
Če mutacija poškoduje Parkin, je pot razgradnje onemogočena, to pa pomeni, da se v celici akumulirajo odvečni proteini. Tvorijo se Lewy-eva telesca polna teh proteinov, ki nadomestijo celične organele v nevronskih celicah, kar vodi do prenehanja njihovega delovanja. Ker pa ima Parkin več kot samo en substrat ki ga ubikvitinira, je točen mehanizem bolezni še dandanes uganka.
Eden izmed najbolj poznanih substratov je transmembranski protein Pael-R. Zvitje tega proteina poteka ob prisotnosti šaperonov. Prevelika koncentracija tega receptorja lahko izzove stres v endoplazmatskem retikulumu situiranem v nevronskih celicah. V primeru da je Parkin neaktiven, Pael-R povzroči celično smrt. Vendar to je le ena izmed možnih rešitev, substratov je namreč vsaj še dvajset, raziskave pa se nadaljujejo.

== Matja Zalar: Vloga SRK in SCR proteinov pri preprečevanju incestnega razmnoževanja cvetočih rastlin ==

Rastline so za zaščito pred samooplojevanjem razvile več vrst mehanizmov prepoznavanja lastnega peloda na molekularni ravni. Pri cvetočih rastlinah je najpogostejši mehanizem tipa SSI ali sporofitične lastne inkompatibilnosti. Pri družini ''Brassicaceae'' je za aktivacijo SSI ključna interakcija med transmembranskim proteinom SRK, ki predstavlja žensko determinanto odziva, in njenim ligandom - proteinom SCR, drugače imenovanim tudi moška determinanta odziva na lastno inkompatibilnost. Specifičnost vezave je zagotovljena s polimorfizmom alel obeh determinant. V posameznih vrstah je možno najti tudi do 100 različnih S-haplotipov genov za determinanti.
Vezava liganda na receptor bo uspešna le, če oba izhajata iz istega S-haplotipa. Vezava SCR na zunajcelično, N-glikolizirano domeno SRK povzroči nastanek kompleksa treh proteinov, ki s svojo aktivnostjo sproži kaksado reakcij, kar v končni fazi pripelje do preprečitve samooploditve.
Na neugodne življenske pogoje, ki so onemogočali medsebojno opraševanje, so se nekatere rastline prilagodile s favorizacijo samooplojevanja. Pri njih so mutacije S-lokusa, ki nosi zapis za SRK in SCR, povzročile nepravilno delovanje SI ali njegovo popolno odpoved. To pa seveda vodi v neprepoznavanje lastnega peloda in rastlina se samooprašuje. Najbolj znan primer take rastline je ''Arabidopsis thaliana'', ki se zaradi svojih specifičnih lastnosti uporablja kot modelni organizem v številnih študijah lastne inkompatibilnosti.

== Matevž Ambrožič: BSX protein in debelost ==

Za primeren občutek sitosti ali lakote glede na stanje energetskih zalog v telesu in odgovarjajoč vnos hrane ter porabo energije je odgovorna zapletena pot sporočanja. Začne se s tremi hormoni: inzulin, leptin in grelin. Leptin in inzulin se sprostita, ko so maščobne in hidratne zaloge v telesu polne in morata do možganov prenesti signal za prenehanje hranjenja, grelin pa ravno nasprotno. Vsi po krvi potujejo do hipotalamusa, predela možganov, ki je odgovoren za energijsko ravnovesje. V hipotalamusu sta dva tipa živčnih celic: oreksigene in anoreksigene. Prve sproščajo NPY in AgRP, nevropeptida, ki spodbujata hranjenje in zmanjšata porabo energije, druge pa α-MSH in CART, katerih učinek je nasproten. Našteti nevropeptidi se iz nevronov sprostijo po vezavi ustreznega izmed treh hormonov in prenesejo signal naprej, do končne spremembe v vnosu ali porabi energije. Glavni protein seminarja, BSX (brain specific homeobox) protein je transkripcijski faktor, ki spodbudi ekspresijo genov za AgRP in NPY, hkrati pa je odgovoren za premik organizma v iskanju hrane. Če v opisanem sistemu pride do napake, so pojavi nepotreben občutek lakote, kar je vzrok mnogih primerov debelosti. V boju z bolezensko debelostjo so ključne raziskave na BSX proteinu, saj je osrednji člen poti, ki v možgane prenese (včasih lažen) občutek lakote.

== Kaja Javoršek: A grey matter ==

Mikrocefalin je protein, ki ga kodira enakoimenski gen. Mikrocefalin naj bi kontroliral poliferacijo in diferenciacijo nevroblastov med nevrogenezo. Odkritje, da je mikrocefalin odločilen regulator velikosti možganov, je sprožilo hipotezo, da je igral vlogo v evoluciji možganov.
Razen v možganih najdemo mikrocefalin tudi v ledvicah, srcu, pljučih, vranici in skeletnih mišicah. Vendar pomen mikrocefalina v teh organih še ni znan.
Mutacije na genu mikrocefalina vodijo do nastanka mikrocefalije. To je bolezen razvoja živčnega sistema in je definirana kot resno zmanjšana velikost možganov. Pri odraslih je normalen volumen možganov od 1200 cm3 do 1600 cm3, pri odraslih s primarno mikocefalijo pa okoli 400 cm3 . Poleg mirocefalina pa povzročajo mikrocefalijo še mutacije petih genih (ASPM, MCPH2, CDK5RAP2, MCPH4, CENPJ)
Mikrocefalin ima tri BRCT domene na C – koncu. BRCT domene so prisotne v veliko ključnih proteinih, ki kontrolirajo delitev celice. Zato predvidevajo da mikrocefalija nastane, ker je ovirana normalna regulacija delitve celic v možganih.
Ugotovili so, da je protein mikrocefalin dol 835 aminokislin. Zaradi mutacije na genu mikrocefalina se ta protein skrajša na 25 aminokislin.
Znanstveniki so izvedli raziskavo ali gena mikrocefalin in ASPM vplivata na inteligenco. Na podlagi treh raziskav so zaključili, da inteligenca ni povezana z dominantnimi aleli ASPM – ja ali mikrocefalina.

== Rok Vene: A mind astray ==

Alzheimerjeva bolezen postaja vedno bolj aktualna tematika. Trenutno je na svetu več kot 26 milijonov ljudi s to obliko demence. Zaradi daljše življenjske dobe pa pričakujemo, da bo število obolelih samo še naraščalo. Alzheimerjeva bolezen prizadene centralni živčni sistem, v možganih se nalagajo snovi, ki povzročijo propad živčnih celic. Ena izmed snovi, ki se nalagajo v možganih so nefunkcionalni Tau proteini. Tau proteini sodijo v družino proteinov imenovanih microtubule-associated proteins (MAP), njihova naloga pa je je stabilizacija mikrotubulov. To dosežejo tako, da se na mikrotubule vežejo. Poleg tega predvidevajo, da imajo Tau proteini še eno nalogo. Sodelovali naj bi v kompleksu za uravnavanje vzdražnosti živčnih celic. Nefunkcionalnost Tau proteinov povezujejo z različnimi boleznimi, ki jih poznamo pod skupnim imenom tauopatije. V primeru Alzheimerjeve bolezni je Tau protein nefunkcionalen, zato ker je hiperfosforiliran, kar mu onemogoča vezavo na mikrotubule. Tau proteini zato tvorijo netopne agregate – nevrofibrilarne pentlje, ki najbrž povzročijo odmiranje živčnih celic. Pri iskanju učinkovin proti hiperfosforilaciji in agregaciji Tau proteina, so znanstveniki raziskali protein FKBP52. Ta protein ima več funkcij. Osredotočili so se predvsem na njegove šaperonske lastnosti. Ugotovili so, da se FKBP52 veže na hiperfosforiliran Tau protein, in tako prepreči agregacijo Tau proteina, ki je odgovorna za odmiranje nevronov.

== Ines Šterbal: LTP1 ==

Protein LTP1, izoliran iz ječmenovega zrna, spada v družino lipidnih prenašalnih proteinov (lipid transfer protein –LTP). Je dobro topen protein, ki se nahaja v alevronski plasti ječmenovega semena. Sestavljen je iz štirih heliksov, ki so povezani z disulfidnimi mostički. Ima dobro definiran C-terminalni konec. V razmerah in vivo je globularni protein, s stožčastim hidrofobnim jedrom, ki se razteza od enega konca molekule do drugega. Sposoben je vezati različne lipide, kot so maščobne kisline ali acetil-koencim A. LTP1 proteini so na površini aktivni proteini, so stabilni, denaturirajo šele okrog 100 °C. Vloga LTP1 proteina in vivo še ni znana. In vitro je glavni protein pri penjenju piva. Opravlja pa še številne druge funkcije, odvisno od tega, kateri ligand ima vezan. LTP1 proteini so verjetno vključeni v prenos lipidov preko membrane in celo v nastanek membrane, lahko bi imeli vlogo v transportu monomera Cutin, vlogo naj bi igrali tudi v obrambnem mehanizmu rastlin. Lipidi, ki so vezani na LTP1 bi naj imeli antibakterijsko aktivnost za bakterije in glive.
Vsi podatki kažejo, da so povezave med sladkorji in proteini, ki nastanejo kot produkt Milardove reakcije, prvi korak do nastanka pivovske pene. Kaže, da je kontrola glikacije LTP1 proteinov med slajenjem in varjenjem piva, nujna za optimalno penjenje piva.

== Mitja Crček: DSIP in spanje ==

Pred 2000 leti so ljudje verjeli, da postanemo zaspani zaradi nekakšnih želodčnih hlapov, ki gredo v možgane, se tam kondenzirajo, zamašijo pore in posledično povzročajo zaspanost. Kasneje so seveda ugotovili da temu ni tako, leta 1977 pa so odkrili majhne peptide, ki naj bi nas uspavali in jih poimenovali Delta Sleep-Inducing peptide (DSIP). DSIP je majhen peptid, sestavljen iz devetih aminokislinskih ostankov in maso 850 daltonov, prvič pa so ga odkrili pri zajcih. Sodeloval naj bi tako pri endokrini regulaciji kot pri fizioloških procesih (poveča učinkovitost oksidativne fosforilacije), pomembno vlogo pa naj bi imel tudi v medicini in pri zdravljenju bolezni. Ker naj bi podaljševal REM fazo, bi ga lahko uporabljali tudi kot dodatek pri zdravljenju alkoholizma ali ga dodajali antidepresivom in pomirjevalom, ki skrajšujejo REM fazo. Raziskave so spremljale tudi vpliv DSIP-ja na nespečnost. Ugotovili so, da DSIP rahlo povečuje kvaliteto spanja in skrajšuje latenco uspavanja, na trajanje budnosti in druge parametre pa ne vpliva, zato so si strokovnjaki enotni, da ima DSIP le rahle terapevtske učinke na nespečnost. Delovanje peptida pa še vedno ni povsem razjasnjeno in le želimo si lahko, da bodo novejše raziskave prinesle nove informacije, saj ima DSIP vsekakor velik potencial v medicini.

== Dominik Kert: FOXP2, govoreči protein ==

Ljudje in živali se razlikujejo. Za znanstvenike 19. stoletja je bilo zelo fascinantno to, da mi lahko govorimo, se sporazumevamo in pomnimo besede, medtem ko živali ne morejo. Ko se je pojavila družina KE na koncu 90. let prejšnjega stoletja, so znanstveniki ugotovili, da obstaja gen, ki kodira FOXP2. Družina KE je slovi po tem, da ima polovica njenih članov težave z govorom. Tako so ugotovili, da se mutacija prenaša avtosomno in dominantno. In verjetno na to vpliva mutacija FOXP2, FOXP2 protein pa je po vsej verjetnosti odločilen faktor pri govoru.
FOXP2 protein je sestavljen iz 715 aminokislin in spada med družino transkripcijskih faktorjev, ki se imenuje FOX (zaradi 'forkhead box' domene). Zanimivo je, da se ta gen razlikuje od gena opic (šimpanz, gorila, makaki) le za dve in od miši le za tri aminokisline. To se znanstvenikom zdi zelo zanimivo, ker je verjetno zaradi teh dve sprememb v aminokislinskem zaporedju prišlo do sprememb pri sporazumevanju. Zaradi teh dejstev so se naprej usmerili na to, ali je bil gen res pod vplivom naravne selekcije in ugotovili so, da je bil res.
FOXP2 na te spremembe vpliva v možganih, je pa prisoten tudi v pljučih, drobovju in srcu. Vendar njegova funkcija tam še ni znana.

== Petra Malavašič: Ureaza bakterije Helicobacter pylori ==

Bakterija Helicobacter pylori spada med patogene mikrobe. Znanstvenika Warren in Marshall sta leta 1987 odkrila to bakterijo ter ugotovila, da je s to bakterijo povezana razjeda na želodcu. Leta 2005 sta prejela Nobelovo nagrado. Že vsak drugi človek je okužen s to bakterijo. Naseljena je na želodčni sluznici in povzroča kronično vnetje želodčne sluznice. Bakterija se lahko naseli in se razmnožuje v prisotnosti želodčne kisline, kjer je pH okoli 2. Posebni obrambni mehanizmi omogočajo bakteriji, da lahko preživi v kislem okolju. Encim ureaza je pri tem najpomembnejši. Ureaza je encim, ki katalizira hidrolizo uree, pri čemer nastane amoniak, ki se v končni fazi veže z molekulami vode v amonijev hidroksid, ki poveča pH v neposredni okolici bakterije. Encim ureaza se nahaja v citoplazmi bakterijske celice in na njeni površini. Sam encim je zgrajen zelo kompleksno in omogoča bakteriji preživetje. Posebna kompleksna zgradba encima onemogoči, da bi kislina želodčnega soka denaturirala encim. Encim sestavljata dva kompleksa (αβ) štirih prostorsko razporejenih (αβ)3 enot.

== Matevž Merljak: CEM15, VIF in infektivnost retrovirusov ==

Ena izmed komponent obrambnega mehanizma pred retrovirusi v nekaterih človeških celicah je citidinska deaminaza CEM15 (APOBEC3G). V celicah, ki jo izražajo, se retrovirusi brez posebnega proteina (VIF, “viral infectivity factor”) ne morejo uspešno množiti, zato takim celicam pravimo “nepermisivne” celice.

CEM15 deluje tako, da med procesom reverzne transkripcije v novonastali “minus” DNA verigi številne citidinske baze pretvori v uridinske, ter s tem povzroči tako zmanjšano obstojnost z uracilom bogate DNA verige, kot tudi zamenjave gvanozinskih baz z adenozinskimi v kodirajoči (“plus”) verigi DNA. Čeprav takšna hipermutacija za nadaljno infektivnost virusa ni vedno usodna (torej lahko tako mutirana DNA v nekaterih primerih še vedno tvori funkcionalne viruse), je običajno dovolj obsežna, da onemogoči uspešno reprodukcijo virusa.

Raziskave kažejo, da CEM15 ne napade nastajajoče DNA kot lasten celični odgovor na infekcijo, pač pa se med izgradnjo novih virusov vgradi v le-te ter po infekciji nove celice povzroči omenjene spremembe v nastajajoči DNA verigi.

Že omenjen faktor VIF izhaja iz virusa HIV-1, ki primarno napada sicer nepermisivne limfocite T. Naloga VIF je preprečitev vgradnje CEM15 v nastajajoče viruse, to pa doseže tako z oteževanjem njene translacije, kot tudi z indukcijo razgradnje CEM15 v proteasomu.

== Eva Knapič: TSH3 - Kaj novorojenčkom omogoča zadihati? ==

Kaj novorojenčkom omogoča zadihati? Raziskave so pokazale, da ima eno izmed vodilnih vlog pri začetku dihanja protein teashirt homolog 3 (TSH3). To je protein, ki ga uvrščamo med transkripcijske faktorje. Po strukturi spada v družino cinkovih prstov, kjer so sekundarne strukture koordinirane s cinkovim ionom. TSH3 ima pet tako urejenih struktur in vse spadajo v Cys2His2 skupino – cinkov ion koordinira dva cisteinska in dva histidinska ostanka ßßα podenote.
Organizem brez zapisa za teashirt 3 protein se v času embrionalnega razvoja navidezno ne razlikuje od organizmov, ki ta zapis imajo. Vendar so podrobnejše raziskave pokazale, da se brez prisotnosti proteina teashirt 3 dokončno ne oblikujejo pljučni mešički, ki so funkcionalna enota pljuč, saj tam poteka izmenjava plinov. Odsotnost proteina povzroča povečano apoptozo nevronov motoričnega jedra v možganskem deblu, s tem so proteinu pripisali zmožnost inhibicije apoptoze nevronov. Prav tako so nezmožnost odziva organizma na pH spremembe okolja pripisali pomanjkanju proteina TSH3.
Iz vseh teh pomanjkljivostih, ki jih povzroča TSH3 so raziskovalci prišli do zaključka, da novorojenček brez zapisa za protein ni zmožen zadihati, ker ni sposoben odziva na spremembo okolja, predvsem pH in tako ne more vzdrževati homeostaze, ki je potreba na preživetje.

== Tjaša Goričan: Vpliv Nogo proteina na regeneracijo živčnega sistema ==

Nevroni vsebujejo mielin, ki je sestavni del mielinske ovojnice aksona in ima nalogo zagotavljanja stalnega prenosa električnih signalov. Poleg tega pa mu je dodeljena tudi nenavadna lastnost. Vsebuje namreč proteine Nogo-A, ki delujejo kot inhibirotji za rast poškodovanih aksonov. Posledično se diferencirani nevroni niso sposobni deliti. Problem se pojavi pri poškodbi živčnega sistema, saj se ni sposoben regenerirati. Bolezni, ki so povezane s poškodbami živčevja so: Poškodbe hrbtenjače, Alzheimerjeva bolezen, možganska kap, shizofrenija itd.

Nogo-A protein spada v družino proteinov retikulonov in je ena od oblik Nogo proteinov. Je transmembranski protein, ki se z domeno Nogo-66 uspešno veže na receptor in povzroči razgradnjo mikrotubulov v aksonu, kar privede do preureditve citoskeleta in posledično zaustavitve rasti aksona. Največ Nogo-A se nahaja na oligodendrocitih. Oligodendrociti so celice, ki spadajo med nevroglio in tvorijo mielinski ovoj nevronov v centralnem živčnem sistemu. Veliko več ga najdemo v centralnem živčnem sistemu v primerjavi s perifernim.

Čeprav je še veliko neznanega na področju živčnega sistema, je znanost že dosegla uspehe glede boja proti boleznimi, povezanimi z regeneracijo živčnega sistema. S protitelesi se da inhibirati protein Nogo-A in s tem preprečiti inhibicijo rasti poškodovanih nevronov.

== Marko Radojković: Fluoroscentni proteini in njihova uporaba v živčnem sistemu ==

Fluoroscentni proteini so členi družine homologih proteinov, ki se delijo skupno lastnost da svetlijo zaradi kreiranja kromoforma znotraj lastnega polipeptidnega zaporedja. Prvi odkrit takšen protein je bil zeleni fluoroscentni protein ali GFP.

BIO2 Povzetki seminarjev 2011

2011-11-18T22:16:42Z

MarkoRadojkovic:

BIO2 Seminar 2011

2011-10-09T20:57:16Z

MarkoRadojkovic: /* Seznam seminarjev - datumi še niso dokončni, listka na katerem imam napisano kdaj kdo ne more nimam doma in bom to popravil v ponedeljek */

= Biokemijski seminar =

Seminarje vodi doc. dr. Gregor Gunčar in so na urniku vsako sredo in petek po eni uri predavanj iz Biokemije.

Ocena seminarjev predstavlja 30% končne ocene in vsebuje vse točke, ki jih študent/ka lahko zbere pri seminarju in ostalih dejavnostih, ki niso del pisnega izpita.

== Seznam seminarjev - datumi še niso dokončni, listka na katerem imam napisano kdaj kdo ne more nimam doma in bom to popravil v ponedeljek==
Vpišite svoj izbrani naslov!!!
{| {{table}}
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Ime in priimek'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Naslov seminarja'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Rok za oddajo'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Rok za recenzijo'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Datum predstavitve'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent1'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent2'''
|-
| Ula Štok||Tipping the mind||17.10.11||19.10.11||21.10.11||||
|-
| Maša Mirković||Naslov seminarja||17.10.11||19.10.11||21.10.11||||
|-
| Sara Draščič||On the spur of a whim||17.10.11||19.10.11||21.10.11||||
|-
| Katra Koman||Naslov seminarja||18.10.11||23.10.11||26.10.11||||
|-
| Iza Ogris||Naslov seminarja||21.10.11||25.10.11||28.10.11||||
|-
| Ana Remžgar||Naslov seminarja||21.10.11||25.10.11||28.10.11||||
|-
| Urška Rauter||Naslov seminarja||21.10.11||25.10.11||28.10.11||||
|-
| Taja Karner||Throb||21.10.11||26.10.11||02.11.11||||
|-
| Rok Štemberger||Forbidden fruit||21.10.11||28.10.11||04.11.11||||
|-
| Maša Mohar||The tenuous nature of sex||21.10.11||28.10.11||04.11.11||||
|-
| Veronika Jarc||Our hollow architecture||21.10.11||28.10.11||04.11.11||||
|-
| Mirjam Kmetič||Naslov seminarja||26.10.11||02.11.11||09.11.11||||
|-
| Janez Meden||Naslov seminarja||28.10.11||04.11.11||11.11.11||||
|-
| Tjaša Flis||Naslov seminarja||28.10.11||04.11.11||11.11.11||||
|-
| Sandi Botonjić||Naslov seminarja||28.10.11||04.11.11||11.11.11||||
|-
| Kaja Javoršek||Naslov seminarja||02.11.11||09.11.11||16.11.11||||
|-
| Rok Vene||Naslov seminarja||04.11.11||11.11.11||18.11.11||||
|-
| Ines Šterbal||Naslov seminarja||04.11.11||11.11.11||18.11.11||||
|-
| Andreja Bratovš||The power behind pain||04.11.11||11.11.11||18.11.11||||
|-
| Matevž Ambrožič||Naslov seminarja||09.11.11||16.11.11||23.11.11||||
|-
| Matevž Merljak||Naslov seminarja||11.11.11||18.11.11||25.11.11||||
|-
| Mitja Crček||Naslov seminarja||11.11.11||18.11.11||25.11.11||||
|-
| Dominik Kert||Naslov seminarja||11.11.11||18.11.11||25.11.11||||
|-
| Petra Malavašič||Going unnoticed||16.11.11||23.11.11||30.11.11||||
|-
| Eva Knapič||Life's first breath||18.11.11||25.11.11||02.12.11||||
|-
| Marko Radojković||Paint my thoughts||18.11.11||25.11.11||02.12.11||||
|-
| Tjaša Goričan||Nerve regrowth: nipped by a no-go||18.11.11||25.11.11||02.12.11||||
|-
| Tina Gregorič||Naslov seminarja||23.11.11||30.11.11||07.12.11||||
|-
| Tamara Marić||The dark side of RNA||25.11.11||02.12.11||09.12.11||||
|-
| Ana Dolinar||The juice of life||25.11.11||02.12.11||09.12.11||||
|-
| Maja Remškar||Naslov seminarja||25.11.11||02.12.11||09.12.11||||
|-
| Matja Zalar||Do it yourself||30.11.11||07.12.11||14.12.11||||
|-
| Urška Navodnik||Naslov seminarja||02.12.11||09.12.11||16.12.11||||
|-
| Jernej Mustar||Silent pain||02.12.11||09.12.11||16.12.11||||
|-
| Ines Kerin||A queen's dinner||02.12.11||09.12.11||16.12.11||||
|-
| Alja Zottel||Sleepless nights||07.12.11||14.12.11||21.12.11||||
|-
| Alenka Mikuž||Molecular chastity||09.12.11||16.12.11||23.12.11||||
|-
| Maja Grdadolnik||Ear of Stone||09.12.11||16.12.11||23.12.11||||
|-
| Jana Verbančič||Hidden power||09.12.11||16.12.11||23.12.11||||
|-
| Petra Gorečan||Naslov seminarja||14.12.11||21.12.11||04.01.12||||
|-
| Karmen Hrovat||Naslov seminarja||16.12.11||23.12.11||06.01.12||||
|-
| Andrej Vrankar||The things we forget||16.12.11||23.12.11||06.01.12||||
|-
| Teja Banič||Cool news||16.12.11||23.12.11||06.01.12||||
|-
| Špela Pohleven||Naslov seminarja||21.12.11||04.01.12||11.01.12||||
|-
| Sabina Mavretič ||A short story||23.12.11||06.01.12||13.01.12||||
|-
| Karmen Belšak ||Another dark horse||23.12.11||06.01.12||13.01.12||||
|-
| Ime in priimek ||Naslov seminarja||23.12.11||06.01.12||13.01.12||||
|-
| Ime in priimek ||Naslov seminarja||04.01.12||11.01.12||18.01.12||||
|-
| Ime in priimek ||Naslov seminarja||06.01.12||13.01.12||20.01.12||||
|-
| Ime in priimek ||Naslov seminarja||06.01.12||13.01.12||20.01.12||||
|-
| Ime in priimek ||Naslov seminarja||06.01.12||13.01.12||20.01.12||||
|}

== Gradivo za seminarje ==
Gradivo za predavanja in seminarje najdete na http://bio.ijs.si/~zajec/bio2/
username: bio2
password: samozame

==Naloga==
'''Vaša naloga za seminar je: '''
Samostojno pripraviti seminar o enem od proteinov opisanih v [http://web.expasy.org/spotlight/back_issues/2011/ ProteinSpotlight] Poiskati morate vsaj še tri znanstvene članke, ki se nanašajo na opisano temo in jih uporabiti kot podlago za seminarsko nalogo!
V seminarsko nalogo mora biti vključeno:
* sekvenca proteina in SwissProt oznaka proteina
* slika strukture proteina (če je le-ta znana), ki jo naredite sami s programom Pymol. Če struktura še ni znana, vključite sliko proteina, ki je vašemu najbolj podoben po sekvenci in katerega struktura je znana
* poiskati morate, na katerem kromosomu se v človeškem genu nahaja ta protein in narisati shematsko sliko gena (eksonov in intronov) tega proteina. Če protein ni človeškega izvora, poiščite protein, ki je vašemu najbolj podoben in vse navedeno opišite za ta protein.

Za pripravo seminarja velja naslednje: 
* [[BIO2 Povzetki seminarjev 2011|Povzetek seminarja]] opišete na wikiju v približno 200 besedah, besedilo naj vsebuje sliko strukture proteina, ki jo sami narišete s programom PyMol - najkasneje do dne ko morate oddati seminar recenzentom.
* Povezavo do povzetka vnesete v tabelo seminarjev tekočega letnika.
* Seminar pripravite v obliki seminarske naloge na ~5-9 straneh A4 (pisava 12, enojni razmak, 2,5 cm robovi; važno je, da je obseg od 2700 do 3000 besed), vsebovati mora najmanj tri slike. Slika mora imeti legendo in v besedilu mora biti na ustreznem mestu sklic na sliko.
* Natisnjen seminar oddajte dva tedna pred predstavitvijo vsakemu od recenzentov (docentu ga pošljite po e-pošti v formatu .doc ali .docx).
* Recenzenti do dneva določenega v tabeli določijo popravke in podajo oceno pisnega dela.
* Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Za predstavitev je na voljo 20-30 minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni.
* Predstavitvi sledi razprava. Recenzenti podajo oceno predstavitve in postavijo najmanj dve vprašanji.
* Na dan predstavitve morate docentu oddati končno (popravljeno) in natisnjeno verzijo seminarja v enem izvodu.
* Seminarska naloga in povzetek morajo biti v slovenskem jeziku!

==Ocenjevanje seminarjev==
Recenzenti ocenijo seminar tako, da izpolnijo [[https://spreadsheets.google.com/viewform?hl=en&formkey=dE1aOFU1aE1iMlBrNEJzLTRGeTdWZXc6MQ#gid=0 recenzentsko poročilo]] na spletu.

== Mnenje o predstavitvi ==
Vsak posameznik '''mora''' oceniti seminar, tako da odda svoje [https://spreadsheets.google.com/viewform?hl=en&formkey=dDlsbDlnclNrc3dIS2otRFdxUEFTNnc6MQ#gid=0 mnenje] najkasneje v treh dneh po predstavitvi. Kdor na seminarju ni bil prisoten, mnenja '''ne sme''' oddati.

==Urejanje spletnih strani na wikiju==
Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''

==Citiranje virov==
Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se v seminarju držite ene same.
Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati.
Za citate v naravoslovju je najpogostejše citiranje po pravilniku ISO 690. [http://www.zveza-zotks.si/gzm/dokumenti/literatura.html Pravila], ki upoštevajo omenjeni standard, so pripravili pri ZTKS. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati. 
'''Citiranje knjig:''' 
Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica. 
Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN. 

Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005. 
Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4. 
Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.).

'''Citiranje člankov:''' 
Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani. 
Lartigue C. ''et al''. Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, letn. 317, str. 632-638.

Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole: 
Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani. 
Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.

Revija Science uporablja skrajšani zapis: 
C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007) 

V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne).

'''Citiranje spletnih virov:''' 
Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov 
strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life 
Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.

BIO1-seminar 2011

2011-05-16T20:33:40Z

MarkoRadojkovic: /* Seznam seminarjev */

= Temelji biokemije- seminar =

Seminarje vodi doc. dr. Gregor Gunčar in so na urniku vsak ponedeljek od 10:00 do 11:30.

Ocena seminarjev predstavlja ??% končne ocene in vsebuje vse točke, ki jih študent/ka lahko zbere pri seminarju in ostalih dejavnostih, ki niso del pisnega izpita.

== Seznam seminarjev ==
{| border="1" cellpadding="4" cellspacing="0" style="border:#c9c9c9 1px solid; margin: 1em 1em 1em 0; border-collapse: collapse;"
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Ime in priimek'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Slovenski naslov članka'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Faktor vpliva revije'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Rok za oddajo'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Rok za recenzijo'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Datum predstavitve'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 1'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 2'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 3'''
|-
| BOTONJIĆ SANDI||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO1_Povzetki_seminarjev#Sandi_Botonji.C4.87:_Tioredoksinu_podoben_protein_.28TXNL2.29_.C5.A1.C4.8Diti_kancerogene_celice_pred_oksidativnim_stresom Tioredoksinu podoben protein (TXNL2) ščiti kancerogene celice pred oksidativnim stresom]
||15.387||28.02.||03.03.||07.03.||RODE URŠKA||KERIN INES||OGRIS IZA
|-
| VRANKAR ANDREJ||Število lasno-mešičnih matičnih celic se v plešastem lasišču moških z androgeno alopecijo ohranja za razliko od števila CD200-rich in CD34-positive lasno-mešičnih predniških celic||||28.02.||03.03.||07.03.||HROVAT KARMEN||BOHNEC IVO||JAVORŠEK KAJA
|-
| ZALAR MATJA||Protein p53||||28.02.||03.03.||07.03.||OGRIS IZA||CRČEK MITJA||ZOTTEL ALJA
|-
| ZOTTEL ALJA||Vloga imunskega sistema pri aterosklerozi||31.434||07.03.||10.03.||14.03.||RADOJKOVIĆ MARKO||KERT DOMINIK||HROVAT KARMEN
|-
| DOLINAR ANA||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO1_Povzetki_seminarjev#Ana_Dolinar:_Prilagojena_ali_prilagodljiva_imunost.3F_Primer_naravnih_celic_ubijalk Prirojena ali prilagodljiva imunost? Primer naravnih celic ubijalk]||28||07.03.||10.03.||14.03.||RAUTER URŠKA||MOHAR MAŠA||VERBANČIČ JANA
|-
| RAUTER URŠKA||Razvojna vloga Srf, kortikalnega citoskeleta in celične oblike v orientaciji epidermalnega vretena||19.527||07.03.||10.03.||14.03.||MUSTAR JERNEJ||JAVORŠEK KAJA||MOHAR MAŠA
|-
| MOHAR MAŠA||Sladkorna bolezen tipa 2 kot bolezen imunskega sistema||30,006||14.03.||17.03.||21.03.||VENE ROK||RAUTER URŠKA||GORIČAN TJAŠA
|-
| POHLEVEN ŠPELA||Prioni||34||14.03.||17.03.||21.03.||KEPIC LEA||RADOJKOVIĆ MARKO||DOLINAR ANA
|-
| KEPIC LEA||Agonisti adrenoreceptorjev β2||34.48||14.03.||17.03.||21.03.||VRANKAR ANDREJ||BRATOVŠ ANDREJA||MUSTAR JERNEJ
|-
| KMETIČ MIRJAM||Celična regulacija metabolizma železa||5,371||14.03.||17.03.||21.03.||MARIĆ TAMARA||REMŠKAR MAJA||KOMAN KATRA
|-
| JARC VERONIKA||Eksperimentalni modeli za študijo imunobiologije hepatitisa C||3.26||14.03.||21.03.||28.03.||REMŠKAR MAJA||MUSTAR JERNEJ||KEPIC LEA
|-
| KOMAN KATRA||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO1_Povzetki_seminarjev#Katra_Koman:_.09Pomen_dendritskih_celic_.28DCs.29_in_celic_ubijalk_.28NK.29_v_imunskem_odzivu_na_oku.C5.BEbo_z_virusom_HIV-1 Pomen dendritskih celic (DCs) in celic ubijalk (NK) v imunskem odzivu na okužbo z virusom HIV-1]||32.245||21.03.||25.03.||28.03.||ČUPOVIĆ VANA||KARNER TAJA||KMETIČ MIRJAM
|-
| OGRIS IZA||Zakaj imajo možgani glikogen?||5,125||14.03.||21.03.||28.03.||KNAPIČ EVA||BRGLEZ ŽIVA||VRANKAR ANDREJ
|-
| KERIN INES||Kanabinoidi za zdravljenje shizofrenije? Uravnotežena nevrokemična sestava za škodljive in terapevtske učinke uživanja konoplje||4.458||14.03.||21.03.||28.03.||ŠTOK ULA||ŠTEMBERGER ROK||KERT DOMINIK
|-
| VERBANČIČ JANA||Apoptozi podobna smrt v bakterijah, ki jo povzroča HAMLET, človeški mlečni lipidno-proteinski kompleks||4.351||21.03.||28.03.||04.04.||KARNER TAJA||ZOTTEL ALJA||KNAPIČ EVA
|-
| KNAPIČ EVA||Kako virusi vodijo delovanje celice.||14.101||21.03.||28.03.||04.04.||ZALAR MATJA||POHLEVEN ŠPELA||LORBEK SARA
|-
| REMŽGAR ANA||Črevesna absorpcija vitamina D ne poteka le s pasivno difuzijo: dokazi za vpletenost enakih transporterjev kot pri holesterolu||4.356||21.03.||28.03.||04.04.||BOTONJIĆ SANDI||LORBEK SARA||ČUPOVIĆ VANA
|-
| GRDADOLNIK MAJA||Jedrni in nejedrni receptorji za estrogene||5.328||21.03.||28.03.||04.04.||MOHAR MAŠA||REMŽGAR ANA||FRANKO NIK
|-
| JAVORŠEK KAJA||Potencial matičnih celic pri Parkinsonovi bolezni in molekularni faktorji za tvorbo dopaminskih nevronov||4.139||28.03.||04.04.||11.04.||GEC KARMEN||MARIĆ TAMARA||RADOJKOVIĆ MARKO
|-
| BRATOVŠ ANDREJA||Vloga GPCR v patologiji Alzheimerjeve bolezni||26||28.03.||04.04.||11.04.||ZOTTEL ALJA||ČUPOVIĆ VANA||GRDADOLNIK MAJA
|-
| CRČEK MITJA||Matične celice in njihova vloga pri zdravljenju bolezni in poškodb||7.365||28.03.||04.04.||11.04.||BOHNEC IVO||KMETIČ MIRJAM||BRATOVŠ ANDREJA
|-
| MARIĆ TAMARA||Organizacija jedra||9.58||28.03.||04.04.||11.04.||NAVODNIK URŠKA||GEC KARMEN||REMŠKAR MAJA
|-
| ŠTEMBERGER ROK||povečano izražanje in imunogenosti HIV proteinov po inaktivaciji encimske aktivnosti||3.616||04.04.||11.04.||18.04.||JAVORŠEK KAJA||VRANKAR ANDREJ||BOTONJIĆ SANDI
|-
| LORBEK SARA||Sovplivanje maščobnih kislin ter genov na adipokine in debelost||3.072||04.04.||11.04.||18.04.||POHLEVEN ŠPELA||KNAPIČ EVA||VENE ROK
|-
| REMŠKAR MAJA||Evolucijska dinamika transponibilnih elementov (TE) v majhnem RNA svetu||8.689||04.04.||11.04.||18.04.||KERIN INES||POVŠE KATJA||CRČEK MITJA
|-
| ČUPOVIĆ VANA||naslov||||04.04.||11.04.||18.04.||REMŽGAR ANA||VERBANČIČ JANA||RODE URŠKA
|-
| RODE URŠKA||vpliv c-reaktivnega proteina na patogenezo simptomov metaboličnega sindroma||6.614||03.05.||06.05.||09.05.||GRDADOLNIK MAJA||ŠTEMBERGER ROK||MARIĆ TAMARA
|-
| RADOJKOVIĆ MARKO||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO1_Povzetki_seminarjev#Marko_Radojkovi.C4.87:_Vpliv_rakastih_celic_in_sepse_na_izra.C5.BEenost_krvnega_proteina_trombina Vpliv rakastih celic in sepse na izraženost krvnega proteina trombina]||14.608||03.05.||06.05.||09.05.||FRANKO NIK||VENE ROK||POVŠE KATJA
|-
| VENE ROK||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO1_Povzetki_seminarjev#Rok_Vene:_Spremembe_nivoja_metilacije_DNA_so_sorazmerne_s_starostjo_.C4.8Dlove.C5.A1kih_mo.C5.BEganov Spremembe nivoja metilacije DNA so sorazmerne s starostjo človeških možganov]||7.386||03.05.||06.05.||09.05.||VERBANČIČ JANA||NAVODNIK URŠKA||ZALAR MATJA
|-
| FRANKO NIK||naslov||||03.05.||06.05.||09.05.||xx||HROVAT KARMEN||BOHNEC IVO
|-
| HROVAT KARMEN||Ciljanje kemokinih receptorjev v alergijskih boleznih||5,155||04.05.||09.05.||16.05.||KERT DOMINIK||JARC VERONIKA||KARNER TAJA
|-
| AMBROŽIČ MATEVŽ||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO1_Povzetki_seminarjev#Matev.C5.BE_Ambro.C5.BEi.C4.8D:_Termogene_snovi_in_regulacija_telesne_te.C5.BEe Termogene snovi in regulacija telesne teže]||4,434||04.05.||09.05.||16.05.||LORBEK SARA||KEPIC LEA||REMŽGAR ANA
|-
| NAVODNIK URŠKA||Stabilnost RNA/DNA in DNA/DNA dupleksa vpliva na mRNA transkripcijo||||04.05.||09.05.||16.05.||AMBROŽIČ MATEVŽ||ŠTOK ULA||ŠTEMBERGER ROK
|-
| BRGLEZ ŽIVA||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO1_Povzetki_seminarjev#.C5.BDiva_Brglez:_Kompleks_Mre11 Kompleks Mre11]||42.198||09.05.||16.05.||23.05.||DOLINAR ANA||BOTONJIĆ SANDI||JARC VERONIKA
|-
| KARNER TAJA||Alkohol omogoča lažje nalaganje CD1d molekul, s tem aktivira NKT celice in zmanjša pojavljanje sladkorne bolezni pri NOD miškah
||||12.05.||17.05.||23.05.||KOMAN KATRA||OGRIS IZA||NAVODNIK URŠKA
|-
| KERT DOMINIK||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO1_Povzetki_seminarjev#Dominik_Kert:_Kako_osteokalcin_vpliva_na_reprodukcijo_organizmov Kako osteokalcin vpliva na reprodukcijo organizmov]||||09.05.||16.05.||23.05.||GORIČAN TJAŠA||GRDADOLNIK MAJA||RAUTER URŠKA
|-
| MUSTAR JERNEJ||Odpornost srpastih celic na okužbo z plazmodijem||31||16.05.||23.05.||30.05.||JARC VERONIKA||AMBROŽIČ MATEVŽ||BRGLEZ ŽIVA
|-
| GEC KARMEN||Učinki vadbe in uporabe antioksidantov na izražanje endotelnih genov||3.469||16.05.||23.05.||30.05.||POVŠE KATJA||ZALAR MATJA||AMBROŽIČ MATEVŽ
|-
| GORIČAN TJAŠA||Molekulske tarče oksidativnega stresa||17,902||16.05.||23.05.||30.05.||KMETIČ MIRJAM||RODE URŠKA||POHLEVEN ŠPELA
|-
| BOHNEC IVO||naslov||||23.05.||30.05.||06.06.||CRČEK MITJA||GORIČAN TJAŠA||ŠTOK ULA
|-
| ŠTOK ULA||Mutacija mitohondrijske DNA v povezavi z rakom debelega črevesa kot posledica abnormalnega delovanja citokroma c oksidaze||||23.05.||30.05.||06.06.||BRGLEZ ŽIVA||DOLINAR ANA||KERIN INES
|-
| nihce ||naslov||||23.05.||30.05.||06.06.||BRATOVŠ ANDREJA||KOMAN KATRA||GEC KARMEN
|}

==Naloga==
* samostojno pripraviti seminar, katerega osnova je znanstveni članek s področja biokemije, ki ga po želji izberete v reviji s področja biokemije, ki ima faktor vpliva večji kot 3 in je bil objavljen v letu 2011. Poleg tega članka morate za seminar uporabiti še najmanj pet drugih virov! http://www.cobiss.si/scripts/cobiss?command=CONNECT&base=JCR
* osnovni članek in naslov pošljete meni, najkasneje pet dni pred rokom za oddajo (rok-5), da ocenim, če je primeren za predstavitev. Naslov vpišete v tabelo, takoj ko ste si ga izbrali!
* [[BIO1 Povzetki seminarjev|Povzetek seminarja]] opišete na wikiju v približno 200 besedah - najkasneje do dne ko morate oddati seminar recenzentom. Povezave do slik so dobrodošle, niso pa nujne.
* Povezavo do povzetka vnesete v tabelo seminarjev tekočega letnika.
* Seminar pripravite v obliki seminarske naloge (pisava 12, enojni razmak, 2,5 cm robovi; važno je, da je obseg od 1800 do 2000 besed), vsebovati mora najmanj eno sliko. Slika mora imeti legendo in v besedilu mora biti na ustreznem mestu sklic na sliko.
* Natisnjen seminar oddajte do roka vsakemu od recenzentov (docentu ga pošljite po e-pošti v formatu .doc ali .docx).
* Recenzenti do dneva določenega v tabeli določijo popravke in podajo oceno pisnega dela, v predpisanem formatu elektronskega obrazca na internetu.
* Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Za predstavitev je na voljo 15 minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni.
* Predstavitvi sledi razprava- 5 minut. Recenzenti podajo oceno predstavitve in postavijo vsak vsaj dve vprašanji.
* Na dan predstavitve morate docentu oddati končno (popravljeno) in natisnjeno verzijo seminarja v enem izvodu.
* Seminarska naloga in povzetek na wikiju morajo biti v slovenskem jeziku!

==Ocenjevanje seminarjev==
Recenzenti ocenijo seminar tako, da izpolnijo [[https://spreadsheets.google.com/viewform?formkey=dFM2SktfM3Q4VU1wNUQzdU45OTlWVXc6MA recenzentsko poročilo]] na spletu.

== Mnenje o predstavitvi ==
Vsak posameznik '''mora''' oceniti seminar, tako da odda svoje [https://spreadsheets.google.com/viewform?formkey=dFd3TGhLV3ZSa2xsLVlmMVVUaEFURWc6MA mnenje] najkasneje v treh dneh po predstavitvi. Kdor na seminarju ni bil prisoten, mnenja '''ne sme''' oddati.

==Urejanje spletnih strani na wikiju==
Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''

==Faktor vpliva==
Faktor vpliva (angl. impact factor) neke revije pove, kolikokrat so bili v poprečju citirani članki v tej reviji v dveh letih skupaj pred objavo tega faktorja. Faktorje vpliva za posamezno revijo lahko najdete v [http://www.cobiss.si/scripts/cobiss?command=CONNECT&base=JCR COBISS-u]. V polje "Naslov revije" vnesite ime revije za katero želite izvedeti faktor vpliva in pritisnite na gumb POIŠČI. V skrajnem desnem stolpcu se bodo izpisali faktorji vpliva za revije, ki ustrezajo vašim iskalnim kriterijem. Zadetkov za posamezno revijo je več zato, ker so navedeni faktorji vpliva za posamezno leto. Za leto 2011 faktorji vpliva še niso objavljeni, zato se orientirajte po faktorjih vpliva zadnjih par let. Če faktorja vpliva za vašo izbrano revijo ne najdete v bazi COBISS, potem izberite članek iz kakšne druge revije.

==Citiranje virov==
Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se v seminarju držite ene same.
Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati.
Za citate v naravoslovju je najpogostejše citiranje po pravilniku ISO 690. [http://www.google.com/url?sa=t&source=web&cd=6&sqi=2&ved=0CEUQFjAF&url=http%3A%2F%2Fwww.tre.sik.si%2Fmain%2Fpomoc%2Ffiles%2Fcitiranje_in_navajanje_virov.pdf&rct=j&q=citiranje%20po%20pravilniku%20ISO%20690&ei=jPBqTe6FC9DKswaWk-TmDA&usg=AFQjCNF8r6X9Y781sanDObaXNdCew4suUg&sig2=cTqKObSJsTicekWGRGa72g&cad=rja Pravila], ki upoštevajo omenjeni standard, so pripravili pri ZTKS. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati. 
'''Citiranje knjig:''' 
Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica. 
Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN. 

Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005. 
Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4. 
Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.).

'''Citiranje člankov:''' 
Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani. 
Lartigue C. ''et al''. Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, letn. 317, str. 632-638.

Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole: 
Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani. 
Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.

Revija Science uporablja skrajšani zapis: 
C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007) 

V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne).

'''Citiranje spletnih virov:''' 
Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov 
strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life 
Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.

BIO1-seminar 2011

2011-05-16T20:31:43Z

MarkoRadojkovic: /* Seznam seminarjev */

= Temelji biokemije- seminar =

Seminarje vodi doc. dr. Gregor Gunčar in so na urniku vsak ponedeljek od 10:00 do 11:30.

Ocena seminarjev predstavlja ??% končne ocene in vsebuje vse točke, ki jih študent/ka lahko zbere pri seminarju in ostalih dejavnostih, ki niso del pisnega izpita.

== Seznam seminarjev ==
{| border="1" cellpadding="4" cellspacing="0" style="border:#c9c9c9 1px solid; margin: 1em 1em 1em 0; border-collapse: collapse;"
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Ime in priimek'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Slovenski naslov članka'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Faktor vpliva revije'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Rok za oddajo'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Rok za recenzijo'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Datum predstavitve'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 1'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 2'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 3'''
|-
| BOTONJIĆ SANDI||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO1_Povzetki_seminarjev#Sandi_Botonji.C4.87:_Tioredoksinu_podoben_protein_.28TXNL2.29_.C5.A1.C4.8Diti_kancerogene_celice_pred_oksidativnim_stresom Tioredoksinu podoben protein (TXNL2) ščiti kancerogene celice pred oksidativnim stresom]
||15.387||28.02.||03.03.||07.03.||RODE URŠKA||KERIN INES||OGRIS IZA
|-
| VRANKAR ANDREJ||Število lasno-mešičnih matičnih celic se v plešastem lasišču moških z androgeno alopecijo ohranja za razliko od števila CD200-rich in CD34-positive lasno-mešičnih predniških celic||||28.02.||03.03.||07.03.||HROVAT KARMEN||BOHNEC IVO||JAVORŠEK KAJA
|-
| ZALAR MATJA||Protein p53||||28.02.||03.03.||07.03.||OGRIS IZA||CRČEK MITJA||ZOTTEL ALJA
|-
| ZOTTEL ALJA||Vloga imunskega sistema pri aterosklerozi||31.434||07.03.||10.03.||14.03.||RADOJKOVIĆ MARKO||KERT DOMINIK||HROVAT KARMEN
|-
| DOLINAR ANA||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO1_Povzetki_seminarjev#Ana_Dolinar:_Prilagojena_ali_prilagodljiva_imunost.3F_Primer_naravnih_celic_ubijalk Prirojena ali prilagodljiva imunost? Primer naravnih celic ubijalk]||28||07.03.||10.03.||14.03.||RAUTER URŠKA||MOHAR MAŠA||VERBANČIČ JANA
|-
| RAUTER URŠKA||Razvojna vloga Srf, kortikalnega citoskeleta in celične oblike v orientaciji epidermalnega vretena||19.527||07.03.||10.03.||14.03.||MUSTAR JERNEJ||JAVORŠEK KAJA||MOHAR MAŠA
|-
| MOHAR MAŠA||Sladkorna bolezen tipa 2 kot bolezen imunskega sistema||30,006||14.03.||17.03.||21.03.||VENE ROK||RAUTER URŠKA||GORIČAN TJAŠA
|-
| POHLEVEN ŠPELA||Prioni||34||14.03.||17.03.||21.03.||KEPIC LEA||RADOJKOVIĆ MARKO||DOLINAR ANA
|-
| KEPIC LEA||Agonisti adrenoreceptorjev β2||34.48||14.03.||17.03.||21.03.||VRANKAR ANDREJ||BRATOVŠ ANDREJA||MUSTAR JERNEJ
|-
| KMETIČ MIRJAM||Celična regulacija metabolizma železa||5,371||14.03.||17.03.||21.03.||MARIĆ TAMARA||REMŠKAR MAJA||KOMAN KATRA
|-
| JARC VERONIKA||Eksperimentalni modeli za študijo imunobiologije hepatitisa C||3.26||14.03.||21.03.||28.03.||REMŠKAR MAJA||MUSTAR JERNEJ||KEPIC LEA
|-
| KOMAN KATRA||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO1_Povzetki_seminarjev#Katra_Koman:_.09Pomen_dendritskih_celic_.28DCs.29_in_celic_ubijalk_.28NK.29_v_imunskem_odzivu_na_oku.C5.BEbo_z_virusom_HIV-1 Pomen dendritskih celic (DCs) in celic ubijalk (NK) v imunskem odzivu na okužbo z virusom HIV-1]||32.245||21.03.||25.03.||28.03.||ČUPOVIĆ VANA||KARNER TAJA||KMETIČ MIRJAM
|-
| OGRIS IZA||Zakaj imajo možgani glikogen?||5,125||14.03.||21.03.||28.03.||KNAPIČ EVA||BRGLEZ ŽIVA||VRANKAR ANDREJ
|-
| KERIN INES||Kanabinoidi za zdravljenje shizofrenije? Uravnotežena nevrokemična sestava za škodljive in terapevtske učinke uživanja konoplje||4.458||14.03.||21.03.||28.03.||ŠTOK ULA||ŠTEMBERGER ROK||KERT DOMINIK
|-
| VERBANČIČ JANA||Apoptozi podobna smrt v bakterijah, ki jo povzroča HAMLET, človeški mlečni lipidno-proteinski kompleks||4.351||21.03.||28.03.||04.04.||KARNER TAJA||ZOTTEL ALJA||KNAPIČ EVA
|-
| KNAPIČ EVA||Kako virusi vodijo delovanje celice.||14.101||21.03.||28.03.||04.04.||ZALAR MATJA||POHLEVEN ŠPELA||LORBEK SARA
|-
| REMŽGAR ANA||Črevesna absorpcija vitamina D ne poteka le s pasivno difuzijo: dokazi za vpletenost enakih transporterjev kot pri holesterolu||4.356||21.03.||28.03.||04.04.||BOTONJIĆ SANDI||LORBEK SARA||ČUPOVIĆ VANA
|-
| GRDADOLNIK MAJA||Jedrni in nejedrni receptorji za estrogene||5.328||21.03.||28.03.||04.04.||MOHAR MAŠA||REMŽGAR ANA||FRANKO NIK
|-
| JAVORŠEK KAJA||Potencial matičnih celic pri Parkinsonovi bolezni in molekularni faktorji za tvorbo dopaminskih nevronov||4.139||28.03.||04.04.||11.04.||GEC KARMEN||MARIĆ TAMARA||RADOJKOVIĆ MARKO
|-
| BRATOVŠ ANDREJA||Vloga GPCR v patologiji Alzheimerjeve bolezni||26||28.03.||04.04.||11.04.||ZOTTEL ALJA||ČUPOVIĆ VANA||GRDADOLNIK MAJA
|-
| CRČEK MITJA||Matične celice in njihova vloga pri zdravljenju bolezni in poškodb||7.365||28.03.||04.04.||11.04.||BOHNEC IVO||KMETIČ MIRJAM||BRATOVŠ ANDREJA
|-
| MARIĆ TAMARA||Organizacija jedra||9.58||28.03.||04.04.||11.04.||NAVODNIK URŠKA||GEC KARMEN||REMŠKAR MAJA
|-
| ŠTEMBERGER ROK||povečano izražanje in imunogenosti HIV proteinov po inaktivaciji encimske aktivnosti||3.616||04.04.||11.04.||18.04.||JAVORŠEK KAJA||VRANKAR ANDREJ||BOTONJIĆ SANDI
|-
| LORBEK SARA||Sovplivanje maščobnih kislin ter genov na adipokine in debelost||3.072||04.04.||11.04.||18.04.||POHLEVEN ŠPELA||KNAPIČ EVA||VENE ROK
|-
| REMŠKAR MAJA||Evolucijska dinamika transponibilnih elementov (TE) v majhnem RNA svetu||8.689||04.04.||11.04.||18.04.||KERIN INES||POVŠE KATJA||CRČEK MITJA
|-
| ČUPOVIĆ VANA||naslov||||04.04.||11.04.||18.04.||REMŽGAR ANA||VERBANČIČ JANA||RODE URŠKA
|-
| RODE URŠKA||vpliv c-reaktivnega proteina na patogenezo simptomov metaboličnega sindroma||6.614||03.05.||06.05.||09.05.||GRDADOLNIK MAJA||ŠTEMBERGER ROK||MARIĆ TAMARA
|-
| RADOJKOVIĆ MARKO||Vpliv rakastih celic in sepse na izraženost krvnega proteina trombina||14.608||03.05.||06.05.||09.05.||FRANKO NIK||VENE ROK||POVŠE KATJA
|-
| VENE ROK||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO1_Povzetki_seminarjev#Rok_Vene:_Spremembe_nivoja_metilacije_DNA_so_sorazmerne_s_starostjo_.C4.8Dlove.C5.A1kih_mo.C5.BEganov Spremembe nivoja metilacije DNA so sorazmerne s starostjo človeških možganov]||7.386||03.05.||06.05.||09.05.||VERBANČIČ JANA||NAVODNIK URŠKA||ZALAR MATJA
|-
| FRANKO NIK||naslov||||03.05.||06.05.||09.05.||xx||HROVAT KARMEN||BOHNEC IVO
|-
| HROVAT KARMEN||Ciljanje kemokinih receptorjev v alergijskih boleznih||5,155||04.05.||09.05.||16.05.||KERT DOMINIK||JARC VERONIKA||KARNER TAJA
|-
| AMBROŽIČ MATEVŽ||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO1_Povzetki_seminarjev#Matev.C5.BE_Ambro.C5.BEi.C4.8D:_Termogene_snovi_in_regulacija_telesne_te.C5.BEe Termogene snovi in regulacija telesne teže]||4,434||04.05.||09.05.||16.05.||LORBEK SARA||KEPIC LEA||REMŽGAR ANA
|-
| NAVODNIK URŠKA||Stabilnost RNA/DNA in DNA/DNA dupleksa vpliva na mRNA transkripcijo||||04.05.||09.05.||16.05.||AMBROŽIČ MATEVŽ||ŠTOK ULA||ŠTEMBERGER ROK
|-
| BRGLEZ ŽIVA||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO1_Povzetki_seminarjev#.C5.BDiva_Brglez:_Kompleks_Mre11 Kompleks Mre11]||42.198||09.05.||16.05.||23.05.||DOLINAR ANA||BOTONJIĆ SANDI||JARC VERONIKA
|-
| KARNER TAJA||Alkohol omogoča lažje nalaganje CD1d molekul, s tem aktivira NKT celice in zmanjša pojavljanje sladkorne bolezni pri NOD miškah
||||12.05.||17.05.||23.05.||KOMAN KATRA||OGRIS IZA||NAVODNIK URŠKA
|-
| KERT DOMINIK||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO1_Povzetki_seminarjev#Dominik_Kert:_Kako_osteokalcin_vpliva_na_reprodukcijo_organizmov Kako osteokalcin vpliva na reprodukcijo organizmov]||||09.05.||16.05.||23.05.||GORIČAN TJAŠA||GRDADOLNIK MAJA||RAUTER URŠKA
|-
| MUSTAR JERNEJ||Odpornost srpastih celic na okužbo z plazmodijem||31||16.05.||23.05.||30.05.||JARC VERONIKA||AMBROŽIČ MATEVŽ||BRGLEZ ŽIVA
|-
| GEC KARMEN||Učinki vadbe in uporabe antioksidantov na izražanje endotelnih genov||3.469||16.05.||23.05.||30.05.||POVŠE KATJA||ZALAR MATJA||AMBROŽIČ MATEVŽ
|-
| GORIČAN TJAŠA||Molekulske tarče oksidativnega stresa||17,902||16.05.||23.05.||30.05.||KMETIČ MIRJAM||RODE URŠKA||POHLEVEN ŠPELA
|-
| BOHNEC IVO||naslov||||23.05.||30.05.||06.06.||CRČEK MITJA||GORIČAN TJAŠA||ŠTOK ULA
|-
| ŠTOK ULA||Mutacija mitohondrijske DNA v povezavi z rakom debelega črevesa kot posledica abnormalnega delovanja citokroma c oksidaze||||23.05.||30.05.||06.06.||BRGLEZ ŽIVA||DOLINAR ANA||KERIN INES
|-
| nihce ||naslov||||23.05.||30.05.||06.06.||BRATOVŠ ANDREJA||KOMAN KATRA||GEC KARMEN
|}

==Naloga==
* samostojno pripraviti seminar, katerega osnova je znanstveni članek s področja biokemije, ki ga po želji izberete v reviji s področja biokemije, ki ima faktor vpliva večji kot 3 in je bil objavljen v letu 2011. Poleg tega članka morate za seminar uporabiti še najmanj pet drugih virov! http://www.cobiss.si/scripts/cobiss?command=CONNECT&base=JCR
* osnovni članek in naslov pošljete meni, najkasneje pet dni pred rokom za oddajo (rok-5), da ocenim, če je primeren za predstavitev. Naslov vpišete v tabelo, takoj ko ste si ga izbrali!
* [[BIO1 Povzetki seminarjev|Povzetek seminarja]] opišete na wikiju v približno 200 besedah - najkasneje do dne ko morate oddati seminar recenzentom. Povezave do slik so dobrodošle, niso pa nujne.
* Povezavo do povzetka vnesete v tabelo seminarjev tekočega letnika.
* Seminar pripravite v obliki seminarske naloge (pisava 12, enojni razmak, 2,5 cm robovi; važno je, da je obseg od 1800 do 2000 besed), vsebovati mora najmanj eno sliko. Slika mora imeti legendo in v besedilu mora biti na ustreznem mestu sklic na sliko.
* Natisnjen seminar oddajte do roka vsakemu od recenzentov (docentu ga pošljite po e-pošti v formatu .doc ali .docx).
* Recenzenti do dneva določenega v tabeli določijo popravke in podajo oceno pisnega dela, v predpisanem formatu elektronskega obrazca na internetu.
* Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Za predstavitev je na voljo 15 minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni.
* Predstavitvi sledi razprava- 5 minut. Recenzenti podajo oceno predstavitve in postavijo vsak vsaj dve vprašanji.
* Na dan predstavitve morate docentu oddati končno (popravljeno) in natisnjeno verzijo seminarja v enem izvodu.
* Seminarska naloga in povzetek na wikiju morajo biti v slovenskem jeziku!

==Ocenjevanje seminarjev==
Recenzenti ocenijo seminar tako, da izpolnijo [[https://spreadsheets.google.com/viewform?formkey=dFM2SktfM3Q4VU1wNUQzdU45OTlWVXc6MA recenzentsko poročilo]] na spletu.

== Mnenje o predstavitvi ==
Vsak posameznik '''mora''' oceniti seminar, tako da odda svoje [https://spreadsheets.google.com/viewform?formkey=dFd3TGhLV3ZSa2xsLVlmMVVUaEFURWc6MA mnenje] najkasneje v treh dneh po predstavitvi. Kdor na seminarju ni bil prisoten, mnenja '''ne sme''' oddati.

==Urejanje spletnih strani na wikiju==
Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''

==Faktor vpliva==
Faktor vpliva (angl. impact factor) neke revije pove, kolikokrat so bili v poprečju citirani članki v tej reviji v dveh letih skupaj pred objavo tega faktorja. Faktorje vpliva za posamezno revijo lahko najdete v [http://www.cobiss.si/scripts/cobiss?command=CONNECT&base=JCR COBISS-u]. V polje "Naslov revije" vnesite ime revije za katero želite izvedeti faktor vpliva in pritisnite na gumb POIŠČI. V skrajnem desnem stolpcu se bodo izpisali faktorji vpliva za revije, ki ustrezajo vašim iskalnim kriterijem. Zadetkov za posamezno revijo je več zato, ker so navedeni faktorji vpliva za posamezno leto. Za leto 2011 faktorji vpliva še niso objavljeni, zato se orientirajte po faktorjih vpliva zadnjih par let. Če faktorja vpliva za vašo izbrano revijo ne najdete v bazi COBISS, potem izberite članek iz kakšne druge revije.

==Citiranje virov==
Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se v seminarju držite ene same.
Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati.
Za citate v naravoslovju je najpogostejše citiranje po pravilniku ISO 690. [http://www.google.com/url?sa=t&source=web&cd=6&sqi=2&ved=0CEUQFjAF&url=http%3A%2F%2Fwww.tre.sik.si%2Fmain%2Fpomoc%2Ffiles%2Fcitiranje_in_navajanje_virov.pdf&rct=j&q=citiranje%20po%20pravilniku%20ISO%20690&ei=jPBqTe6FC9DKswaWk-TmDA&usg=AFQjCNF8r6X9Y781sanDObaXNdCew4suUg&sig2=cTqKObSJsTicekWGRGa72g&cad=rja Pravila], ki upoštevajo omenjeni standard, so pripravili pri ZTKS. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati. 
'''Citiranje knjig:''' 
Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica. 
Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN. 

Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005. 
Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4. 
Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.).

'''Citiranje člankov:''' 
Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani. 
Lartigue C. ''et al''. Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, letn. 317, str. 632-638.

Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole: 
Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani. 
Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.

Revija Science uporablja skrajšani zapis: 
C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007) 

V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne).

'''Citiranje spletnih virov:''' 
Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov 
strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life 
Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.

BIO1-seminar 2011

2011-05-16T20:31:04Z

MarkoRadojkovic: /* Seznam seminarjev */

= Temelji biokemije- seminar =

Seminarje vodi doc. dr. Gregor Gunčar in so na urniku vsak ponedeljek od 10:00 do 11:30.

Ocena seminarjev predstavlja ??% končne ocene in vsebuje vse točke, ki jih študent/ka lahko zbere pri seminarju in ostalih dejavnostih, ki niso del pisnega izpita.

== Seznam seminarjev ==
{| border="1" cellpadding="4" cellspacing="0" style="border:#c9c9c9 1px solid; margin: 1em 1em 1em 0; border-collapse: collapse;"
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Ime in priimek'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Slovenski naslov članka'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Faktor vpliva revije'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Rok za oddajo'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Rok za recenzijo'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Datum predstavitve'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 1'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 2'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 3'''
|-
| BOTONJIĆ SANDI||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO1_Povzetki_seminarjev#Sandi_Botonji.C4.87:_Tioredoksinu_podoben_protein_.28TXNL2.29_.C5.A1.C4.8Diti_kancerogene_celice_pred_oksidativnim_stresom Tioredoksinu podoben protein (TXNL2) ščiti kancerogene celice pred oksidativnim stresom]
||15.387||28.02.||03.03.||07.03.||RODE URŠKA||KERIN INES||OGRIS IZA
|-
| VRANKAR ANDREJ||Število lasno-mešičnih matičnih celic se v plešastem lasišču moških z androgeno alopecijo ohranja za razliko od števila CD200-rich in CD34-positive lasno-mešičnih predniških celic||||28.02.||03.03.||07.03.||HROVAT KARMEN||BOHNEC IVO||JAVORŠEK KAJA
|-
| ZALAR MATJA||Protein p53||||28.02.||03.03.||07.03.||OGRIS IZA||CRČEK MITJA||ZOTTEL ALJA
|-
| ZOTTEL ALJA||Vloga imunskega sistema pri aterosklerozi||31.434||07.03.||10.03.||14.03.||RADOJKOVIĆ MARKO||KERT DOMINIK||HROVAT KARMEN
|-
| DOLINAR ANA||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO1_Povzetki_seminarjev#Ana_Dolinar:_Prilagojena_ali_prilagodljiva_imunost.3F_Primer_naravnih_celic_ubijalk Prirojena ali prilagodljiva imunost? Primer naravnih celic ubijalk]||28||07.03.||10.03.||14.03.||RAUTER URŠKA||MOHAR MAŠA||VERBANČIČ JANA
|-
| RAUTER URŠKA||Razvojna vloga Srf, kortikalnega citoskeleta in celične oblike v orientaciji epidermalnega vretena||19.527||07.03.||10.03.||14.03.||MUSTAR JERNEJ||JAVORŠEK KAJA||MOHAR MAŠA
|-
| MOHAR MAŠA||Sladkorna bolezen tipa 2 kot bolezen imunskega sistema||30,006||14.03.||17.03.||21.03.||VENE ROK||RAUTER URŠKA||GORIČAN TJAŠA
|-
| POHLEVEN ŠPELA||Prioni||34||14.03.||17.03.||21.03.||KEPIC LEA||RADOJKOVIĆ MARKO||DOLINAR ANA
|-
| KEPIC LEA||Agonisti adrenoreceptorjev β2||34.48||14.03.||17.03.||21.03.||VRANKAR ANDREJ||BRATOVŠ ANDREJA||MUSTAR JERNEJ
|-
| KMETIČ MIRJAM||Celična regulacija metabolizma železa||5,371||14.03.||17.03.||21.03.||MARIĆ TAMARA||REMŠKAR MAJA||KOMAN KATRA
|-
| JARC VERONIKA||Eksperimentalni modeli za študijo imunobiologije hepatitisa C||3.26||14.03.||21.03.||28.03.||REMŠKAR MAJA||MUSTAR JERNEJ||KEPIC LEA
|-
| KOMAN KATRA||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO1_Povzetki_seminarjev#Katra_Koman:_.09Pomen_dendritskih_celic_.28DCs.29_in_celic_ubijalk_.28NK.29_v_imunskem_odzivu_na_oku.C5.BEbo_z_virusom_HIV-1 Pomen dendritskih celic (DCs) in celic ubijalk (NK) v imunskem odzivu na okužbo z virusom HIV-1]||32.245||21.03.||25.03.||28.03.||ČUPOVIĆ VANA||KARNER TAJA||KMETIČ MIRJAM
|-
| OGRIS IZA||Zakaj imajo možgani glikogen?||5,125||14.03.||21.03.||28.03.||KNAPIČ EVA||BRGLEZ ŽIVA||VRANKAR ANDREJ
|-
| KERIN INES||Kanabinoidi za zdravljenje shizofrenije? Uravnotežena nevrokemična sestava za škodljive in terapevtske učinke uživanja konoplje||4.458||14.03.||21.03.||28.03.||ŠTOK ULA||ŠTEMBERGER ROK||KERT DOMINIK
|-
| VERBANČIČ JANA||Apoptozi podobna smrt v bakterijah, ki jo povzroča HAMLET, človeški mlečni lipidno-proteinski kompleks||4.351||21.03.||28.03.||04.04.||KARNER TAJA||ZOTTEL ALJA||KNAPIČ EVA
|-
| KNAPIČ EVA||Kako virusi vodijo delovanje celice.||14.101||21.03.||28.03.||04.04.||ZALAR MATJA||POHLEVEN ŠPELA||LORBEK SARA
|-
| REMŽGAR ANA||Črevesna absorpcija vitamina D ne poteka le s pasivno difuzijo: dokazi za vpletenost enakih transporterjev kot pri holesterolu||4.356||21.03.||28.03.||04.04.||BOTONJIĆ SANDI||LORBEK SARA||ČUPOVIĆ VANA
|-
| GRDADOLNIK MAJA||Jedrni in nejedrni receptorji za estrogene||5.328||21.03.||28.03.||04.04.||MOHAR MAŠA||REMŽGAR ANA||FRANKO NIK
|-
| JAVORŠEK KAJA||Potencial matičnih celic pri Parkinsonovi bolezni in molekularni faktorji za tvorbo dopaminskih nevronov||4.139||28.03.||04.04.||11.04.||GEC KARMEN||MARIĆ TAMARA||RADOJKOVIĆ MARKO
|-
| BRATOVŠ ANDREJA||Vloga GPCR v patologiji Alzheimerjeve bolezni||26||28.03.||04.04.||11.04.||ZOTTEL ALJA||ČUPOVIĆ VANA||GRDADOLNIK MAJA
|-
| CRČEK MITJA||Matične celice in njihova vloga pri zdravljenju bolezni in poškodb||7.365||28.03.||04.04.||11.04.||BOHNEC IVO||KMETIČ MIRJAM||BRATOVŠ ANDREJA
|-
| MARIĆ TAMARA||Organizacija jedra||9.58||28.03.||04.04.||11.04.||NAVODNIK URŠKA||GEC KARMEN||REMŠKAR MAJA
|-
| ŠTEMBERGER ROK||povečano izražanje in imunogenosti HIV proteinov po inaktivaciji encimske aktivnosti||3.616||04.04.||11.04.||18.04.||JAVORŠEK KAJA||VRANKAR ANDREJ||BOTONJIĆ SANDI
|-
| LORBEK SARA||Sovplivanje maščobnih kislin ter genov na adipokine in debelost||3.072||04.04.||11.04.||18.04.||POHLEVEN ŠPELA||KNAPIČ EVA||VENE ROK
|-
| REMŠKAR MAJA||Evolucijska dinamika transponibilnih elementov (TE) v majhnem RNA svetu||8.689||04.04.||11.04.||18.04.||KERIN INES||POVŠE KATJA||CRČEK MITJA
|-
| ČUPOVIĆ VANA||naslov||||04.04.||11.04.||18.04.||REMŽGAR ANA||VERBANČIČ JANA||RODE URŠKA
|-
| RODE URŠKA||vpliv c-reaktivnega proteina na patogenezo simptomov metaboličnega sindroma||6.614||03.05.||06.05.||09.05.||GRDADOLNIK MAJA||ŠTEMBERGER ROK||MARIĆ TAMARA
|-
| RADOJKOVIĆ MARKO||[Vpliv rakastih celic in sepse na izraženost krvnega proteina trombina||14.608||03.05.||06.05.||09.05.||FRANKO NIK||VENE ROK||POVŠE KATJA
|-
| VENE ROK||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO1_Povzetki_seminarjev#Rok_Vene:_Spremembe_nivoja_metilacije_DNA_so_sorazmerne_s_starostjo_.C4.8Dlove.C5.A1kih_mo.C5.BEganov Spremembe nivoja metilacije DNA so sorazmerne s starostjo človeških možganov]||7.386||03.05.||06.05.||09.05.||VERBANČIČ JANA||NAVODNIK URŠKA||ZALAR MATJA
|-
| FRANKO NIK||naslov||||03.05.||06.05.||09.05.||xx||HROVAT KARMEN||BOHNEC IVO
|-
| HROVAT KARMEN||Ciljanje kemokinih receptorjev v alergijskih boleznih||5,155||04.05.||09.05.||16.05.||KERT DOMINIK||JARC VERONIKA||KARNER TAJA
|-
| AMBROŽIČ MATEVŽ||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO1_Povzetki_seminarjev#Matev.C5.BE_Ambro.C5.BEi.C4.8D:_Termogene_snovi_in_regulacija_telesne_te.C5.BEe Termogene snovi in regulacija telesne teže]||4,434||04.05.||09.05.||16.05.||LORBEK SARA||KEPIC LEA||REMŽGAR ANA
|-
| NAVODNIK URŠKA||Stabilnost RNA/DNA in DNA/DNA dupleksa vpliva na mRNA transkripcijo||||04.05.||09.05.||16.05.||AMBROŽIČ MATEVŽ||ŠTOK ULA||ŠTEMBERGER ROK
|-
| BRGLEZ ŽIVA||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO1_Povzetki_seminarjev#.C5.BDiva_Brglez:_Kompleks_Mre11 Kompleks Mre11]||42.198||09.05.||16.05.||23.05.||DOLINAR ANA||BOTONJIĆ SANDI||JARC VERONIKA
|-
| KARNER TAJA||Alkohol omogoča lažje nalaganje CD1d molekul, s tem aktivira NKT celice in zmanjša pojavljanje sladkorne bolezni pri NOD miškah
||||12.05.||17.05.||23.05.||KOMAN KATRA||OGRIS IZA||NAVODNIK URŠKA
|-
| KERT DOMINIK||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO1_Povzetki_seminarjev#Dominik_Kert:_Kako_osteokalcin_vpliva_na_reprodukcijo_organizmov Kako osteokalcin vpliva na reprodukcijo organizmov]||||09.05.||16.05.||23.05.||GORIČAN TJAŠA||GRDADOLNIK MAJA||RAUTER URŠKA
|-
| MUSTAR JERNEJ||Odpornost srpastih celic na okužbo z plazmodijem||31||16.05.||23.05.||30.05.||JARC VERONIKA||AMBROŽIČ MATEVŽ||BRGLEZ ŽIVA
|-
| GEC KARMEN||Učinki vadbe in uporabe antioksidantov na izražanje endotelnih genov||3.469||16.05.||23.05.||30.05.||POVŠE KATJA||ZALAR MATJA||AMBROŽIČ MATEVŽ
|-
| GORIČAN TJAŠA||Molekulske tarče oksidativnega stresa||17,902||16.05.||23.05.||30.05.||KMETIČ MIRJAM||RODE URŠKA||POHLEVEN ŠPELA
|-
| BOHNEC IVO||naslov||||23.05.||30.05.||06.06.||CRČEK MITJA||GORIČAN TJAŠA||ŠTOK ULA
|-
| ŠTOK ULA||Mutacija mitohondrijske DNA v povezavi z rakom debelega črevesa kot posledica abnormalnega delovanja citokroma c oksidaze||||23.05.||30.05.||06.06.||BRGLEZ ŽIVA||DOLINAR ANA||KERIN INES
|-
| nihce ||naslov||||23.05.||30.05.||06.06.||BRATOVŠ ANDREJA||KOMAN KATRA||GEC KARMEN
|}

==Naloga==
* samostojno pripraviti seminar, katerega osnova je znanstveni članek s področja biokemije, ki ga po želji izberete v reviji s področja biokemije, ki ima faktor vpliva večji kot 3 in je bil objavljen v letu 2011. Poleg tega članka morate za seminar uporabiti še najmanj pet drugih virov! http://www.cobiss.si/scripts/cobiss?command=CONNECT&base=JCR
* osnovni članek in naslov pošljete meni, najkasneje pet dni pred rokom za oddajo (rok-5), da ocenim, če je primeren za predstavitev. Naslov vpišete v tabelo, takoj ko ste si ga izbrali!
* [[BIO1 Povzetki seminarjev|Povzetek seminarja]] opišete na wikiju v približno 200 besedah - najkasneje do dne ko morate oddati seminar recenzentom. Povezave do slik so dobrodošle, niso pa nujne.
* Povezavo do povzetka vnesete v tabelo seminarjev tekočega letnika.
* Seminar pripravite v obliki seminarske naloge (pisava 12, enojni razmak, 2,5 cm robovi; važno je, da je obseg od 1800 do 2000 besed), vsebovati mora najmanj eno sliko. Slika mora imeti legendo in v besedilu mora biti na ustreznem mestu sklic na sliko.
* Natisnjen seminar oddajte do roka vsakemu od recenzentov (docentu ga pošljite po e-pošti v formatu .doc ali .docx).
* Recenzenti do dneva določenega v tabeli določijo popravke in podajo oceno pisnega dela, v predpisanem formatu elektronskega obrazca na internetu.
* Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Za predstavitev je na voljo 15 minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni.
* Predstavitvi sledi razprava- 5 minut. Recenzenti podajo oceno predstavitve in postavijo vsak vsaj dve vprašanji.
* Na dan predstavitve morate docentu oddati končno (popravljeno) in natisnjeno verzijo seminarja v enem izvodu.
* Seminarska naloga in povzetek na wikiju morajo biti v slovenskem jeziku!

==Ocenjevanje seminarjev==
Recenzenti ocenijo seminar tako, da izpolnijo [[https://spreadsheets.google.com/viewform?formkey=dFM2SktfM3Q4VU1wNUQzdU45OTlWVXc6MA recenzentsko poročilo]] na spletu.

== Mnenje o predstavitvi ==
Vsak posameznik '''mora''' oceniti seminar, tako da odda svoje [https://spreadsheets.google.com/viewform?formkey=dFd3TGhLV3ZSa2xsLVlmMVVUaEFURWc6MA mnenje] najkasneje v treh dneh po predstavitvi. Kdor na seminarju ni bil prisoten, mnenja '''ne sme''' oddati.

==Urejanje spletnih strani na wikiju==
Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''

==Faktor vpliva==
Faktor vpliva (angl. impact factor) neke revije pove, kolikokrat so bili v poprečju citirani članki v tej reviji v dveh letih skupaj pred objavo tega faktorja. Faktorje vpliva za posamezno revijo lahko najdete v [http://www.cobiss.si/scripts/cobiss?command=CONNECT&base=JCR COBISS-u]. V polje "Naslov revije" vnesite ime revije za katero želite izvedeti faktor vpliva in pritisnite na gumb POIŠČI. V skrajnem desnem stolpcu se bodo izpisali faktorji vpliva za revije, ki ustrezajo vašim iskalnim kriterijem. Zadetkov za posamezno revijo je več zato, ker so navedeni faktorji vpliva za posamezno leto. Za leto 2011 faktorji vpliva še niso objavljeni, zato se orientirajte po faktorjih vpliva zadnjih par let. Če faktorja vpliva za vašo izbrano revijo ne najdete v bazi COBISS, potem izberite članek iz kakšne druge revije.

==Citiranje virov==
Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se v seminarju držite ene same.
Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati.
Za citate v naravoslovju je najpogostejše citiranje po pravilniku ISO 690. [http://www.google.com/url?sa=t&source=web&cd=6&sqi=2&ved=0CEUQFjAF&url=http%3A%2F%2Fwww.tre.sik.si%2Fmain%2Fpomoc%2Ffiles%2Fcitiranje_in_navajanje_virov.pdf&rct=j&q=citiranje%20po%20pravilniku%20ISO%20690&ei=jPBqTe6FC9DKswaWk-TmDA&usg=AFQjCNF8r6X9Y781sanDObaXNdCew4suUg&sig2=cTqKObSJsTicekWGRGa72g&cad=rja Pravila], ki upoštevajo omenjeni standard, so pripravili pri ZTKS. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati. 
'''Citiranje knjig:''' 
Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica. 
Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN. 

Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005. 
Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4. 
Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.).

'''Citiranje člankov:''' 
Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani. 
Lartigue C. ''et al''. Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, letn. 317, str. 632-638.

Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole: 
Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani. 
Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.

Revija Science uporablja skrajšani zapis: 
C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007) 

V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne).

'''Citiranje spletnih virov:''' 
Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov 
strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life 
Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.