Wiki FKKT - User contributions [en]

Uporaba sesalskega RNA-vezavnega proteina Musashi-1 kot alosterično reguliranega translacijskega represorja v E. coli

2024-04-14T17:02:13Z

Markokovacic: /* Aplikacije proteina Musashi-1 */

Izhodiščni članek: [https://elifesciences.org/articles/91777 Repurposing the mammalian RNA-binding protein Musashi-1 as an allosteric translation repressor in bacteria]

== Uvod ==

Regulacija izražanja genov na potranskripcijskem nivoju se pri prokariontih in evkariontih razlikuje. Evkarionti imajo več RNA-vezavnih proteinov, ki imajo lahko številne funkcije in lahko delujejo tudi na specifičen način. Pri prokariontih stabilnost mRNA in iniciacijo translacije regulirajo predvsem majhne nekodirajoče RNA, RNA-vezavni proteini pa večinoma niso tako specifični. Pri živalih večina RNA-vezavnih proteinov vsebuje RNA-prepoznavne motive (RRM). RRM so majhne globularne domene, ki vključujejo okrog 90 aminokislinskih ostankov. Zvijejo se v 4 antiparalelne β-trakove in 2 α-vijačnici. Na enoverižno molekulo RNA se lahko vežejo z zadostno afiniteto in specifičnostjo ter tako specifično regulirajo biološke procese. Čeprav so RRM pomembni za potranskripcijsko regulacijo pri živalih, pa niso razširjeni pri vseh organizmih. Pri prokariontih je zelo malo proteinov z RRM, ki so bili odkriti predvsem z bioinformatskimi metodami, vendar pa imajo pogosto neznano funkcijo. Namen raziskave je bil odgovoriti na vprašanje, ali se živalski RRM lahko uporabijo v organizmih z enostavnejšo regulacijo izražanja genov. V kolikor bi to delovalo, bi potranskripcijska regulacija izražanja genov pri prokariontih preko specifičnih interakcij med heterolognimi RNA vezavnimi proteini z RRM in prokariontskimi mRNA ponudila številne nove možnosti za regulacijo sinteznobioloških vezij [1].

== Protein Musashi-1 lahko regulira iniciacijo translacije v ''E. coli'' ==

V raziskavi so želeli preveriti, ali sesalski RNA-vezavni protein Musashi-1 (MSI-1) lahko deluje kot potranskripcijski regulator v ''E. coli''. MSI-1 se pri sesalcih izraža predvsem v matičnih celicah živčne in epitelne linije. Ima pomembno vlogo pri diferenciaciji celic, regulaciji celičnega cikla in tumorogenezi, regulira pa tudi signalno pot Notch. Vsebuje dva RRM (RRM1 in RRM2), ki z nanomolarno afiniteto prepoznata konsenzno zaporedje RUnAGU na tarčni mRNA [1]. MSI-1 je alosterično inhibiran z nekaterimi maščobnimi kislinami, predvsem z ω-9 mononenasičenimi maščobnimi kislinami, ki vsebujejo med 18 in 22 ogljikovih atomov (npr. z oleinsko kislino) [2]. Uporabili so gen za mišji MSI-1, zato so optimizirali rabo kodonov za izražanje gena v ''E. coli''. Ker je C-končna regija mišjega MSI-1 nizko strukturno kompleksna, so z namenom povišanja topnosti proteina klonirali skrajšano obliko gena za MSI-1, ki je vključeval zapis za prvih 192 aminokislinskih ostankov. Izražanje gena za skrajšano obliko proteina (MSI-1*) je bilo pod nadzorom inducibilnega sintetičnega promotorja (poimenovan PLlac), ki je bil načrtovan na podlagi promotorja PL in reprimiran z represorjem LacI. Na transkripcijskem nivoju so z dodatkom laktoze ali β-D-1-tiogalaktopiranozida (IPTG) lahko inducirali izražanje gena za MSI-1*. Kot regulatorni element so uporabili Super folder GFP (sfGFP). Izražanje gena za sfGFP je bilo pod nadzorom konstitutivnega promotorja J23119. Zapis za sfGFP je po start kodonu vključeval dva prepoznavna motiva za MSI-1*, in sicer GUUAGU ter AUUUAGU, ki predvidoma tvorita sekundarno strukturo v obliki stebla. MSI-1* tako z vezavo na prepoznavna motiva na molekuli mRNA za sfGFP lahko zavre translacijo, saj sterično ovira vezavo ribosomalne podenote 30S na mRNA [1]. Tak način delovanja se razlikuje od tistega, ki poteka naravno pri sesalcih, saj se pri sesalcih MSI-1 veže na 3' UTR tarčne mRNA (''Numb'') in tako prepreči delovanje poli(A)-vezavnega proteina PABP ter zavre translacijo [3]. Pri tako sestavljenem sinteznobiološkem vezju sta torej vhodna signala bila laktoza (ali IPTG) in oleinska kislina, izhodni signal je bila fluorescenca sfGFP. Takšno obnašanje sistema opišejo logična vrata IMPLY, torej se sfGFP ne izraža le v primeru, da je v sistemu laktoza (ali IPTG) in v sistemu ni oleinske kisline. Delovanje sinteznobiološkega vezja so okarakterizirali s fluorimetrijo, merili so fluorescenco sfGFP (v AU) v odvisnosti od koncentracije laktoze (do 1 mM). Pri 1 mM koncentraciji laktoze je MSI-1* znižal sintezo sfGFP, in sicer za faktor 2.5. IPTG je povzročil zelo podoben odziv. Meritve celične rasti za vse indukcijske pogoje so pokazale, da ekspresija gena za mišji protein MSI-1* ni povzročila motenj v rasti bakterijskih celic [1].

== Mehanizem interakcije med MSI-1* in prepoznavnim motivom na mRNA ==

Natančnejši vpogled v mehanizem interakcije med MSI-1* in prepoznavnima motivoma na mRNA, ki zapisuje za sfGFP, je omogočil izračun disociacijske konstante Kd med mRNA in MSI-1*. Točkovna mutacija v enem prepoznavnem motivu (RUnCGU, mutanta 1) je povzročila zgolj 1.4x znižanje sinteze sfGFP v prisotnosti MSI-1* [1], s čimer so potrdili ugotovitev predhodnih raziskav, da je zaporedje UAG na prepoznavnem motivu ključno za specifično prepoznavo prepoznavnega motiva z MSI-1 [4]. Točkovni mutaciji v obeh prepoznavnih motivih (UAC namesto UAG, mutanta 5) sta povzročili zelo podoben odziv. Reporterski sistem z najkrajšim možnim konsenznim zaporedjem AUAGU ni pokazal nobene regulacije z MSI-1*, kar pomeni, da sta dve kopiji konsenznega zaporedja ključni za uspešno regulacijo izražanja gena za tarčni protein z MSI-1*. Pri ''in vitro'' eksperimentih vezavne kinetike so uporabili skrajšano obliko gena za človeški MSI-1h*. Meritve so izvajali s tehnologijo switchSENSE, ki omogoča meritve molekulske dinamike na čipu. dsDNA, imobilizirana na elektrodo iz Au v čipu, je imela fluorofor na enem koncu in prepoznavni motiv za vezavo MSI-1h* na drugem koncu. Vezava MSI-1h* (injiciran analit) na RNA povzroči spremembe v fluorescenci, ki se merijo v realnem času in omogočajo izračun kinetičnih konstant. V primeru originalnega prepoznavnega motiva na RNA (brez točkovnih mutacij) so dobili stopnjo asociacije kon = 1.1 nM-1 min-1, povprečen čas zadrževanja proteina MSI-1* na tarčni mRNA je bil 1.5 min (1/koff, koff je stopnja disociacije). Pri mutanti 1 je bila stopnja asociacije podobna kot pri nemutiranem prepoznavnem motivu, stopnja disociacije pa skoraj 4x hitrejša. Pri mutanti 5 pa sta bili moteni tako stopnja asociacije (15x manjša hitrost) kot stopnja disociacije (10x večja hitrost). Disociacijska konstanta Kd (= koff/kon) je 0.62 nM za nemutirano obliko prepoznavnega motiva in 87 nM za mutanto 5 [1].

== Spreminjanje prepoznavnega motiva na mRNA z namenom povišanja dinamičnega razpona odziva ==

Raziskovalci so želeli preveriti, ali bi s spreminjanjem prepoznavnega motiva na mRNA za vezavo MSI-1 in z dodajanjem novih prepoznavnih motivov lahko povečali dinamičen razpon odziva. Najboljše rezultate je dal reporterski sistem (redesign 3), ki je poleg obeh prepoznavnih motivov po start kodonu (sekundarna struktura v obliki zanke) vključeval še spremembe na 5' UTR zapisa za sfGFP. Na 5' UTR sta bila dodana dodatna prepoznavna motiva RUnAGU (GUUUAGU in AUUUAGU), ki sta obkrožala RBS in predvidoma nista tvorila sekundarnih struktur. Mišji MSI-1* je tako blokiral tudi vezavo RNA dela ribosomske podenote 30S. Ta reporterski sistem je povzročil približno 2x povišanje maksimalnega izražanja gena (brez laktoze) za sfGFP in 8.6x znižanje maksimalnega izražanja gena za sfGFP z MSI-1*, kar je v primerjavi z originalnim reporterskim sistemom (2 nemutirani prepoznavni zaporedji), kjer je bilo maksimalno znižanje izražanja gena 2.5x, velik napredek. Primerjava Hillovih koeficientov pri originalnem sistemu in redesign 3 (4.5 pri redesign 3, 1.7 pri originalnem sistemu) nakazuje na pozitivno kooperativnost vezave obeh molekul proteina MSI-1*, ki se lahko vežeta vsak na po 2 prepoznavni mesti [1].

== MSI-1* je alosterično inhibiran z oleinsko kislino ==

Protein MSI-1 je alosterično inhibiran z oleinsko kislino, ki se veže na domeno RRM1 na MSI-1 in preko konformacijske spremembe MSI-1 prepreči prepoznavo tarčne RNA. Z eksperimentom, ki temelji na spremenjeni mobilnosti molekul pri elektroforezi, so potrdili interakcijo med MSI-1* (koncentracija 45 µM) in RNA (koncentracija 11 µM), ki je bila popolnoma motena v prisotnosti 1 mM oleinske kisline. ''E. coli'' ima transporterja FadL in FadD za vnos maščobnih kislin iz okolja. Z meritvami fluorescence sfGFP v posameznih celicah so ugotovili, da se je pri originalnem reporterskem sistemu (nemutirani prepoznavni mesti) delež celic v stanju ON (fluorescenca sfGFP nad določeno mejo) dvignil iz 10 % (pri 1 mM laktozi) na 49 % po dodatku 20 mM oleinske kisline. Prvotnih 93 % celic v stanju ON (ko ni bilo laktoze v sistemu) se ni povrnilo, najverjetneje ker se je oleinska kislina delno razgradila po vstopu v celice [1].

== Aplikacije proteina Musashi-1 ==

Transkripcijska regulacija ima svoje omejitve pri regulaciji specifičnega gena znotraj operona. Protein Musashi-1 bi lahko reguliral izražanje specifičnega gena, ki je del policistronskega operona. To bi lahko bilo uporabno pri regulaciji izražanja genov za številne encime pri metabolnih poteh, torej pri metabolnem inženiringu. Uporaben bi bil tudi v kombinaciji s transkripcijskimi regulatorji, s čimer bi dosegli bolj raznoliko kombinirano regulacijo. Raziskovalci so z namenom potrditve teh dveh aplikacij proteina Musashi sestavili novo vezje, kjer sta ''sfGFP'' in ''mScarlet'' tvorila eno transkripcijsko enoto (bicistronski operon) pod nadzorom inducibilnega sintetičnega promotorja (PLtet), načrtovanega na podlagi promotorja PL, ki je bil reguliran s tetraciklinskim represorjem (TetR). Z dodatkom anhidrotetraciklina (aTC) so omogočili prepisovanje genov za sfGFP in mScarlet. Prepoznavni motivi na mRNA za vezavo MSI-1* so bili zgolj na začetku zapisa za sfGFP. Gen za MSI-1* je bil pod nadzorom promotorja PLlac, torej je za začetek transkripcije zapisa za MSI-1* bil potreben dodatek laktoze (ali IPTG). Obnašanje sistema opišejo logična vrata NIMPLY, pri čemer se zapis za sfGFP izraža zgolj v primeru prisotnosti aTC v sistemu in v odsotnosti laktoze v sistemu. Z dodatkom laktoze (1 mM) in aTC (100 ng/mL) v vseh kombinacijah (brez obeh, zgolj eden, oba) so pokazali specifično regulacijo izražanja gena za sfGFP v bicistronskem operonu in sposobnost kombiniranja regulatornih signalov z namenom združitve transkripcijske in potranskripcijske regulacije. Protein Musashi-1 je pokazal velik potencial pri potranskripcijski regulaciji v ''E. coli'', kar odpira možnosti za raziskave delovanja tudi drugih heterolognih RNA-vezavnih proteinov z RRM pri preprostejših organizmih [1].

== Literatura ==

[1] R. Dolcemascolo, M. Heras-Hernández, L. Goiriz, R. Montagud-Martínez, A. Requena-Menéndez, R. Ruiz, A. Pérez-Ràfols, R. A. Higuera-Rodríguez, G. Pérez-Ropero, W. F. Vranken, et al.: Repurposing the mammalian RNA-binding protein Musashi-1 as an allosteric translation repressor in bacteria. Elife 2024, 12.

[2] C. C. Clingman, L. M. Deveau, S. A. Hay, R. M. Genga, S. M. D. Shandilya, F. Massi, S. P. Ryder: Allosteric inhibition of a stem cell RNA-binding protein by an intermediary metabolite. Elife 2014, 2014.

[3] H. Kawahara, T. Imai, H. Imataka, M. Tsujimoto, K. Matsumoto, H. Okano: Neural RNA-binding protein Musashi1 inhibits translation initiation by competing with eIF4G for PABP. Journal of Cell Biology 2008, 181, 639–653.

[4] N. Ruth Zearfoss, L. M. Deveau, C. C. Clingman, E. Schmidt, E. S. Johnson, F. Massi, S. P. Ryder: A conserved three-nucleotide core motif defines musashi RNA binding specificity. Journal of Biological Chemistry 2014, 289, 35530–35541.

Uporaba sesalskega RNA-vezavnega proteina Musashi-1 kot alosterično reguliranega translacijskega represorja v E. coli

2024-04-14T17:01:36Z

Markokovacic: /* MSI-1* je alosterično inhibiran z oleinsko kislino */

Izhodiščni članek: [https://elifesciences.org/articles/91777 Repurposing the mammalian RNA-binding protein Musashi-1 as an allosteric translation repressor in bacteria]

== Uvod ==

Regulacija izražanja genov na potranskripcijskem nivoju se pri prokariontih in evkariontih razlikuje. Evkarionti imajo več RNA-vezavnih proteinov, ki imajo lahko številne funkcije in lahko delujejo tudi na specifičen način. Pri prokariontih stabilnost mRNA in iniciacijo translacije regulirajo predvsem majhne nekodirajoče RNA, RNA-vezavni proteini pa večinoma niso tako specifični. Pri živalih večina RNA-vezavnih proteinov vsebuje RNA-prepoznavne motive (RRM). RRM so majhne globularne domene, ki vključujejo okrog 90 aminokislinskih ostankov. Zvijejo se v 4 antiparalelne β-trakove in 2 α-vijačnici. Na enoverižno molekulo RNA se lahko vežejo z zadostno afiniteto in specifičnostjo ter tako specifično regulirajo biološke procese. Čeprav so RRM pomembni za potranskripcijsko regulacijo pri živalih, pa niso razširjeni pri vseh organizmih. Pri prokariontih je zelo malo proteinov z RRM, ki so bili odkriti predvsem z bioinformatskimi metodami, vendar pa imajo pogosto neznano funkcijo. Namen raziskave je bil odgovoriti na vprašanje, ali se živalski RRM lahko uporabijo v organizmih z enostavnejšo regulacijo izražanja genov. V kolikor bi to delovalo, bi potranskripcijska regulacija izražanja genov pri prokariontih preko specifičnih interakcij med heterolognimi RNA vezavnimi proteini z RRM in prokariontskimi mRNA ponudila številne nove možnosti za regulacijo sinteznobioloških vezij [1].

== Protein Musashi-1 lahko regulira iniciacijo translacije v ''E. coli'' ==

V raziskavi so želeli preveriti, ali sesalski RNA-vezavni protein Musashi-1 (MSI-1) lahko deluje kot potranskripcijski regulator v ''E. coli''. MSI-1 se pri sesalcih izraža predvsem v matičnih celicah živčne in epitelne linije. Ima pomembno vlogo pri diferenciaciji celic, regulaciji celičnega cikla in tumorogenezi, regulira pa tudi signalno pot Notch. Vsebuje dva RRM (RRM1 in RRM2), ki z nanomolarno afiniteto prepoznata konsenzno zaporedje RUnAGU na tarčni mRNA [1]. MSI-1 je alosterično inhibiran z nekaterimi maščobnimi kislinami, predvsem z ω-9 mononenasičenimi maščobnimi kislinami, ki vsebujejo med 18 in 22 ogljikovih atomov (npr. z oleinsko kislino) [2]. Uporabili so gen za mišji MSI-1, zato so optimizirali rabo kodonov za izražanje gena v ''E. coli''. Ker je C-končna regija mišjega MSI-1 nizko strukturno kompleksna, so z namenom povišanja topnosti proteina klonirali skrajšano obliko gena za MSI-1, ki je vključeval zapis za prvih 192 aminokislinskih ostankov. Izražanje gena za skrajšano obliko proteina (MSI-1*) je bilo pod nadzorom inducibilnega sintetičnega promotorja (poimenovan PLlac), ki je bil načrtovan na podlagi promotorja PL in reprimiran z represorjem LacI. Na transkripcijskem nivoju so z dodatkom laktoze ali β-D-1-tiogalaktopiranozida (IPTG) lahko inducirali izražanje gena za MSI-1*. Kot regulatorni element so uporabili Super folder GFP (sfGFP). Izražanje gena za sfGFP je bilo pod nadzorom konstitutivnega promotorja J23119. Zapis za sfGFP je po start kodonu vključeval dva prepoznavna motiva za MSI-1*, in sicer GUUAGU ter AUUUAGU, ki predvidoma tvorita sekundarno strukturo v obliki stebla. MSI-1* tako z vezavo na prepoznavna motiva na molekuli mRNA za sfGFP lahko zavre translacijo, saj sterično ovira vezavo ribosomalne podenote 30S na mRNA [1]. Tak način delovanja se razlikuje od tistega, ki poteka naravno pri sesalcih, saj se pri sesalcih MSI-1 veže na 3' UTR tarčne mRNA (''Numb'') in tako prepreči delovanje poli(A)-vezavnega proteina PABP ter zavre translacijo [3]. Pri tako sestavljenem sinteznobiološkem vezju sta torej vhodna signala bila laktoza (ali IPTG) in oleinska kislina, izhodni signal je bila fluorescenca sfGFP. Takšno obnašanje sistema opišejo logična vrata IMPLY, torej se sfGFP ne izraža le v primeru, da je v sistemu laktoza (ali IPTG) in v sistemu ni oleinske kisline. Delovanje sinteznobiološkega vezja so okarakterizirali s fluorimetrijo, merili so fluorescenco sfGFP (v AU) v odvisnosti od koncentracije laktoze (do 1 mM). Pri 1 mM koncentraciji laktoze je MSI-1* znižal sintezo sfGFP, in sicer za faktor 2.5. IPTG je povzročil zelo podoben odziv. Meritve celične rasti za vse indukcijske pogoje so pokazale, da ekspresija gena za mišji protein MSI-1* ni povzročila motenj v rasti bakterijskih celic [1].

== Mehanizem interakcije med MSI-1* in prepoznavnim motivom na mRNA ==

Natančnejši vpogled v mehanizem interakcije med MSI-1* in prepoznavnima motivoma na mRNA, ki zapisuje za sfGFP, je omogočil izračun disociacijske konstante Kd med mRNA in MSI-1*. Točkovna mutacija v enem prepoznavnem motivu (RUnCGU, mutanta 1) je povzročila zgolj 1.4x znižanje sinteze sfGFP v prisotnosti MSI-1* [1], s čimer so potrdili ugotovitev predhodnih raziskav, da je zaporedje UAG na prepoznavnem motivu ključno za specifično prepoznavo prepoznavnega motiva z MSI-1 [4]. Točkovni mutaciji v obeh prepoznavnih motivih (UAC namesto UAG, mutanta 5) sta povzročili zelo podoben odziv. Reporterski sistem z najkrajšim možnim konsenznim zaporedjem AUAGU ni pokazal nobene regulacije z MSI-1*, kar pomeni, da sta dve kopiji konsenznega zaporedja ključni za uspešno regulacijo izražanja gena za tarčni protein z MSI-1*. Pri ''in vitro'' eksperimentih vezavne kinetike so uporabili skrajšano obliko gena za človeški MSI-1h*. Meritve so izvajali s tehnologijo switchSENSE, ki omogoča meritve molekulske dinamike na čipu. dsDNA, imobilizirana na elektrodo iz Au v čipu, je imela fluorofor na enem koncu in prepoznavni motiv za vezavo MSI-1h* na drugem koncu. Vezava MSI-1h* (injiciran analit) na RNA povzroči spremembe v fluorescenci, ki se merijo v realnem času in omogočajo izračun kinetičnih konstant. V primeru originalnega prepoznavnega motiva na RNA (brez točkovnih mutacij) so dobili stopnjo asociacije kon = 1.1 nM-1 min-1, povprečen čas zadrževanja proteina MSI-1* na tarčni mRNA je bil 1.5 min (1/koff, koff je stopnja disociacije). Pri mutanti 1 je bila stopnja asociacije podobna kot pri nemutiranem prepoznavnem motivu, stopnja disociacije pa skoraj 4x hitrejša. Pri mutanti 5 pa sta bili moteni tako stopnja asociacije (15x manjša hitrost) kot stopnja disociacije (10x večja hitrost). Disociacijska konstanta Kd (= koff/kon) je 0.62 nM za nemutirano obliko prepoznavnega motiva in 87 nM za mutanto 5 [1].

== Spreminjanje prepoznavnega motiva na mRNA z namenom povišanja dinamičnega razpona odziva ==

Raziskovalci so želeli preveriti, ali bi s spreminjanjem prepoznavnega motiva na mRNA za vezavo MSI-1 in z dodajanjem novih prepoznavnih motivov lahko povečali dinamičen razpon odziva. Najboljše rezultate je dal reporterski sistem (redesign 3), ki je poleg obeh prepoznavnih motivov po start kodonu (sekundarna struktura v obliki zanke) vključeval še spremembe na 5' UTR zapisa za sfGFP. Na 5' UTR sta bila dodana dodatna prepoznavna motiva RUnAGU (GUUUAGU in AUUUAGU), ki sta obkrožala RBS in predvidoma nista tvorila sekundarnih struktur. Mišji MSI-1* je tako blokiral tudi vezavo RNA dela ribosomske podenote 30S. Ta reporterski sistem je povzročil približno 2x povišanje maksimalnega izražanja gena (brez laktoze) za sfGFP in 8.6x znižanje maksimalnega izražanja gena za sfGFP z MSI-1*, kar je v primerjavi z originalnim reporterskim sistemom (2 nemutirani prepoznavni zaporedji), kjer je bilo maksimalno znižanje izražanja gena 2.5x, velik napredek. Primerjava Hillovih koeficientov pri originalnem sistemu in redesign 3 (4.5 pri redesign 3, 1.7 pri originalnem sistemu) nakazuje na pozitivno kooperativnost vezave obeh molekul proteina MSI-1*, ki se lahko vežeta vsak na po 2 prepoznavni mesti [1].

== MSI-1* je alosterično inhibiran z oleinsko kislino ==

Protein MSI-1 je alosterično inhibiran z oleinsko kislino, ki se veže na domeno RRM1 na MSI-1 in preko konformacijske spremembe MSI-1 prepreči prepoznavo tarčne RNA. Z eksperimentom, ki temelji na spremenjeni mobilnosti molekul pri elektroforezi, so potrdili interakcijo med MSI-1* (koncentracija 45 µM) in RNA (koncentracija 11 µM), ki je bila popolnoma motena v prisotnosti 1 mM oleinske kisline. ''E. coli'' ima transporterja FadL in FadD za vnos maščobnih kislin iz okolja. Z meritvami fluorescence sfGFP v posameznih celicah so ugotovili, da se je pri originalnem reporterskem sistemu (nemutirani prepoznavni mesti) delež celic v stanju ON (fluorescenca sfGFP nad določeno mejo) dvignil iz 10 % (pri 1 mM laktozi) na 49 % po dodatku 20 mM oleinske kisline. Prvotnih 93 % celic v stanju ON (ko ni bilo laktoze v sistemu) se ni povrnilo, najverjetneje ker se je oleinska kislina delno razgradila po vstopu v celice [1].

== Aplikacije proteina Musashi-1 ==

Transkripcijska regulacija ima svoje omejitve pri regulaciji specifičnega gena znotraj operona. Protein Musashi-1 bi lahko reguliral izražanje specifičnega gena, ki je del policistronskega operona. To bi lahko bilo uporabno pri regulaciji izražanja številnih encimov pri metabolnih poteh, torej pri metabolnem inženiringu. Uporaben bi bil tudi v kombinaciji s transkripcijskimi regulatorji, s čimer bi dosegli bolj raznoliko kombinirano regulacijo. Raziskovalci so z namenom potrditve teh dveh aplikacij proteina Musashi sestavili novo vezje, kjer sta ''sfGFP'' in ''mScarlet'' tvorila eno transkripcijsko enoto (bicistronski operon) pod nadzorom inducibilnega sintetičnega promotorja (PLtet), načrtovanega na podlagi promotorja PL, ki je bil reguliran s tetraciklinskim represorjem (TetR). Z dodatkom anhidrotetraciklina (aTC) so omogočili prepisovanje genov za sfGFP in mScarlet. Prepoznavni motivi na mRNA za vezavo MSI-1* so bili zgolj na začetku zapisa za sfGFP. Gen za MSI-1* je bil pod nadzorom promotorja PLlac, torej je za začetek transkripcije zapisa za MSI-1* bil potreben dodatek laktoze (ali IPTG). Obnašanje sistema opišejo logična vrata NIMPLY, pri čemer se zapis za sfGFP izraža zgolj v primeru prisotnosti aTC v sistemu in v odsotnosti laktoze v sistemu. Z dodatkom laktoze (1 mM) in aTC (100 ng/mL) v vseh kombinacijah (brez obeh, zgolj eden, oba) so pokazali specifično regulacijo izražanja gena za sfGFP v bicistronskem operonu in sposobnost kombiniranja regulatornih signalov z namenom združitve transkripcijske in potranskripcijske regulacije. Protein Musashi-1 je pokazal velik potencial pri potranskripcijski regulaciji v ''E. coli'', kar odpira možnosti za raziskave delovanja tudi drugih heterolognih RNA-vezavnih proteinov z RRM pri preprostejših organizmih [1].

== Literatura ==

[1] R. Dolcemascolo, M. Heras-Hernández, L. Goiriz, R. Montagud-Martínez, A. Requena-Menéndez, R. Ruiz, A. Pérez-Ràfols, R. A. Higuera-Rodríguez, G. Pérez-Ropero, W. F. Vranken, et al.: Repurposing the mammalian RNA-binding protein Musashi-1 as an allosteric translation repressor in bacteria. Elife 2024, 12.

[2] C. C. Clingman, L. M. Deveau, S. A. Hay, R. M. Genga, S. M. D. Shandilya, F. Massi, S. P. Ryder: Allosteric inhibition of a stem cell RNA-binding protein by an intermediary metabolite. Elife 2014, 2014.

[3] H. Kawahara, T. Imai, H. Imataka, M. Tsujimoto, K. Matsumoto, H. Okano: Neural RNA-binding protein Musashi1 inhibits translation initiation by competing with eIF4G for PABP. Journal of Cell Biology 2008, 181, 639–653.

[4] N. Ruth Zearfoss, L. M. Deveau, C. C. Clingman, E. Schmidt, E. S. Johnson, F. Massi, S. P. Ryder: A conserved three-nucleotide core motif defines musashi RNA binding specificity. Journal of Biological Chemistry 2014, 289, 35530–35541.

Uporaba sesalskega RNA-vezavnega proteina Musashi-1 kot alosterično reguliranega translacijskega represorja v E. coli

2024-04-14T16:58:13Z

Markokovacic: /* Spreminjanje prepoznavnega motiva na mRNA z namenom povišanja dinamičnega razpona odziva */

Izhodiščni članek: [https://elifesciences.org/articles/91777 Repurposing the mammalian RNA-binding protein Musashi-1 as an allosteric translation repressor in bacteria]

== Uvod ==

Regulacija izražanja genov na potranskripcijskem nivoju se pri prokariontih in evkariontih razlikuje. Evkarionti imajo več RNA-vezavnih proteinov, ki imajo lahko številne funkcije in lahko delujejo tudi na specifičen način. Pri prokariontih stabilnost mRNA in iniciacijo translacije regulirajo predvsem majhne nekodirajoče RNA, RNA-vezavni proteini pa večinoma niso tako specifični. Pri živalih večina RNA-vezavnih proteinov vsebuje RNA-prepoznavne motive (RRM). RRM so majhne globularne domene, ki vključujejo okrog 90 aminokislinskih ostankov. Zvijejo se v 4 antiparalelne β-trakove in 2 α-vijačnici. Na enoverižno molekulo RNA se lahko vežejo z zadostno afiniteto in specifičnostjo ter tako specifično regulirajo biološke procese. Čeprav so RRM pomembni za potranskripcijsko regulacijo pri živalih, pa niso razširjeni pri vseh organizmih. Pri prokariontih je zelo malo proteinov z RRM, ki so bili odkriti predvsem z bioinformatskimi metodami, vendar pa imajo pogosto neznano funkcijo. Namen raziskave je bil odgovoriti na vprašanje, ali se živalski RRM lahko uporabijo v organizmih z enostavnejšo regulacijo izražanja genov. V kolikor bi to delovalo, bi potranskripcijska regulacija izražanja genov pri prokariontih preko specifičnih interakcij med heterolognimi RNA vezavnimi proteini z RRM in prokariontskimi mRNA ponudila številne nove možnosti za regulacijo sinteznobioloških vezij [1].

== Protein Musashi-1 lahko regulira iniciacijo translacije v ''E. coli'' ==

V raziskavi so želeli preveriti, ali sesalski RNA-vezavni protein Musashi-1 (MSI-1) lahko deluje kot potranskripcijski regulator v ''E. coli''. MSI-1 se pri sesalcih izraža predvsem v matičnih celicah živčne in epitelne linije. Ima pomembno vlogo pri diferenciaciji celic, regulaciji celičnega cikla in tumorogenezi, regulira pa tudi signalno pot Notch. Vsebuje dva RRM (RRM1 in RRM2), ki z nanomolarno afiniteto prepoznata konsenzno zaporedje RUnAGU na tarčni mRNA [1]. MSI-1 je alosterično inhibiran z nekaterimi maščobnimi kislinami, predvsem z ω-9 mononenasičenimi maščobnimi kislinami, ki vsebujejo med 18 in 22 ogljikovih atomov (npr. z oleinsko kislino) [2]. Uporabili so gen za mišji MSI-1, zato so optimizirali rabo kodonov za izražanje gena v ''E. coli''. Ker je C-končna regija mišjega MSI-1 nizko strukturno kompleksna, so z namenom povišanja topnosti proteina klonirali skrajšano obliko gena za MSI-1, ki je vključeval zapis za prvih 192 aminokislinskih ostankov. Izražanje gena za skrajšano obliko proteina (MSI-1*) je bilo pod nadzorom inducibilnega sintetičnega promotorja (poimenovan PLlac), ki je bil načrtovan na podlagi promotorja PL in reprimiran z represorjem LacI. Na transkripcijskem nivoju so z dodatkom laktoze ali β-D-1-tiogalaktopiranozida (IPTG) lahko inducirali izražanje gena za MSI-1*. Kot regulatorni element so uporabili Super folder GFP (sfGFP). Izražanje gena za sfGFP je bilo pod nadzorom konstitutivnega promotorja J23119. Zapis za sfGFP je po start kodonu vključeval dva prepoznavna motiva za MSI-1*, in sicer GUUAGU ter AUUUAGU, ki predvidoma tvorita sekundarno strukturo v obliki stebla. MSI-1* tako z vezavo na prepoznavna motiva na molekuli mRNA za sfGFP lahko zavre translacijo, saj sterično ovira vezavo ribosomalne podenote 30S na mRNA [1]. Tak način delovanja se razlikuje od tistega, ki poteka naravno pri sesalcih, saj se pri sesalcih MSI-1 veže na 3' UTR tarčne mRNA (''Numb'') in tako prepreči delovanje poli(A)-vezavnega proteina PABP ter zavre translacijo [3]. Pri tako sestavljenem sinteznobiološkem vezju sta torej vhodna signala bila laktoza (ali IPTG) in oleinska kislina, izhodni signal je bila fluorescenca sfGFP. Takšno obnašanje sistema opišejo logična vrata IMPLY, torej se sfGFP ne izraža le v primeru, da je v sistemu laktoza (ali IPTG) in v sistemu ni oleinske kisline. Delovanje sinteznobiološkega vezja so okarakterizirali s fluorimetrijo, merili so fluorescenco sfGFP (v AU) v odvisnosti od koncentracije laktoze (do 1 mM). Pri 1 mM koncentraciji laktoze je MSI-1* znižal sintezo sfGFP, in sicer za faktor 2.5. IPTG je povzročil zelo podoben odziv. Meritve celične rasti za vse indukcijske pogoje so pokazale, da ekspresija gena za mišji protein MSI-1* ni povzročila motenj v rasti bakterijskih celic [1].

== Mehanizem interakcije med MSI-1* in prepoznavnim motivom na mRNA ==

Natančnejši vpogled v mehanizem interakcije med MSI-1* in prepoznavnima motivoma na mRNA, ki zapisuje za sfGFP, je omogočil izračun disociacijske konstante Kd med mRNA in MSI-1*. Točkovna mutacija v enem prepoznavnem motivu (RUnCGU, mutanta 1) je povzročila zgolj 1.4x znižanje sinteze sfGFP v prisotnosti MSI-1* [1], s čimer so potrdili ugotovitev predhodnih raziskav, da je zaporedje UAG na prepoznavnem motivu ključno za specifično prepoznavo prepoznavnega motiva z MSI-1 [4]. Točkovni mutaciji v obeh prepoznavnih motivih (UAC namesto UAG, mutanta 5) sta povzročili zelo podoben odziv. Reporterski sistem z najkrajšim možnim konsenznim zaporedjem AUAGU ni pokazal nobene regulacije z MSI-1*, kar pomeni, da sta dve kopiji konsenznega zaporedja ključni za uspešno regulacijo izražanja gena za tarčni protein z MSI-1*. Pri ''in vitro'' eksperimentih vezavne kinetike so uporabili skrajšano obliko gena za človeški MSI-1h*. Meritve so izvajali s tehnologijo switchSENSE, ki omogoča meritve molekulske dinamike na čipu. dsDNA, imobilizirana na elektrodo iz Au v čipu, je imela fluorofor na enem koncu in prepoznavni motiv za vezavo MSI-1h* na drugem koncu. Vezava MSI-1h* (injiciran analit) na RNA povzroči spremembe v fluorescenci, ki se merijo v realnem času in omogočajo izračun kinetičnih konstant. V primeru originalnega prepoznavnega motiva na RNA (brez točkovnih mutacij) so dobili stopnjo asociacije kon = 1.1 nM-1 min-1, povprečen čas zadrževanja proteina MSI-1* na tarčni mRNA je bil 1.5 min (1/koff, koff je stopnja disociacije). Pri mutanti 1 je bila stopnja asociacije podobna kot pri nemutiranem prepoznavnem motivu, stopnja disociacije pa skoraj 4x hitrejša. Pri mutanti 5 pa sta bili moteni tako stopnja asociacije (15x manjša hitrost) kot stopnja disociacije (10x večja hitrost). Disociacijska konstanta Kd (= koff/kon) je 0.62 nM za nemutirano obliko prepoznavnega motiva in 87 nM za mutanto 5 [1].

== Spreminjanje prepoznavnega motiva na mRNA z namenom povišanja dinamičnega razpona odziva ==

Raziskovalci so želeli preveriti, ali bi s spreminjanjem prepoznavnega motiva na mRNA za vezavo MSI-1 in z dodajanjem novih prepoznavnih motivov lahko povečali dinamičen razpon odziva. Najboljše rezultate je dal reporterski sistem (redesign 3), ki je poleg obeh prepoznavnih motivov po start kodonu (sekundarna struktura v obliki zanke) vključeval še spremembe na 5' UTR zapisa za sfGFP. Na 5' UTR sta bila dodana dodatna prepoznavna motiva RUnAGU (GUUUAGU in AUUUAGU), ki sta obkrožala RBS in predvidoma nista tvorila sekundarnih struktur. Mišji MSI-1* je tako blokiral tudi vezavo RNA dela ribosomske podenote 30S. Ta reporterski sistem je povzročil približno 2x povišanje maksimalnega izražanja gena (brez laktoze) za sfGFP in 8.6x znižanje maksimalnega izražanja gena za sfGFP z MSI-1*, kar je v primerjavi z originalnim reporterskim sistemom (2 nemutirani prepoznavni zaporedji), kjer je bilo maksimalno znižanje izražanja gena 2.5x, velik napredek. Primerjava Hillovih koeficientov pri originalnem sistemu in redesign 3 (4.5 pri redesign 3, 1.7 pri originalnem sistemu) nakazuje na pozitivno kooperativnost vezave obeh molekul proteina MSI-1*, ki se lahko vežeta vsak na po 2 prepoznavni mesti [1].

== MSI-1* je alosterično inhibiran z oleinsko kislino ==

Protein MSI-1 je alosterično inhibiran z oleinsko kislino, ki se veže na domeno RRM1 na MSI-1 in preko konformacijske spremembe MSI-1 prepreči prepoznavo tarčne RNA. Z eksperimentom, ki temelji na spremenjeni mobilnosti molekul pri elektroforezi, so potrdili interakcijo med MSI-1* (koncentracija 45 µM) in RNA (koncentracija 11 µM), ki je bila popolnoma motena v prisotnosti 1 mM oleinske kisline. ''E. coli'' ima transporterje za vnos maščobnih kislin iz okolja (FadL in FadD). Z meritvami fluorescence sfGFP v posameznih celicah so ugotovili, da se je pri originalnem reporterskem sistemu (nemutirani prepoznavni mesti) delež celic v stanju ON (fluorescenca sfGFP nad določeno mejo) dvignil iz 10 % (pri 1 mM laktozi) na 49 % po dodatku 20 mM oleinske kisline. Prvotnih 93 % celic v stanju ON (ko ni bilo laktoze v sistemu) se ni povrnilo, najverjetneje ker se je oleinska kislina delno razgradila po vstopu v celice [1].

== Aplikacije proteina Musashi-1 ==

Transkripcijska regulacija ima svoje omejitve pri regulaciji specifičnega gena znotraj operona. Protein Musashi-1 bi lahko reguliral izražanje specifičnega gena, ki je del policistronskega operona. To bi lahko bilo uporabno pri regulaciji izražanja številnih encimov pri metabolnih poteh, torej pri metabolnem inženiringu. Uporaben bi bil tudi v kombinaciji s transkripcijskimi regulatorji, s čimer bi dosegli bolj raznoliko kombinirano regulacijo. Raziskovalci so z namenom potrditve teh dveh aplikacij proteina Musashi sestavili novo vezje, kjer sta ''sfGFP'' in ''mScarlet'' tvorila eno transkripcijsko enoto (bicistronski operon) pod nadzorom inducibilnega sintetičnega promotorja (PLtet), načrtovanega na podlagi promotorja PL, ki je bil reguliran s tetraciklinskim represorjem (TetR). Z dodatkom anhidrotetraciklina (aTC) so omogočili prepisovanje genov za sfGFP in mScarlet. Prepoznavni motivi na mRNA za vezavo MSI-1* so bili zgolj na začetku zapisa za sfGFP. Gen za MSI-1* je bil pod nadzorom promotorja PLlac, torej je za začetek transkripcije zapisa za MSI-1* bil potreben dodatek laktoze (ali IPTG). Obnašanje sistema opišejo logična vrata NIMPLY, pri čemer se zapis za sfGFP izraža zgolj v primeru prisotnosti aTC v sistemu in v odsotnosti laktoze v sistemu. Z dodatkom laktoze (1 mM) in aTC (100 ng/mL) v vseh kombinacijah (brez obeh, zgolj eden, oba) so pokazali specifično regulacijo izražanja gena za sfGFP v bicistronskem operonu in sposobnost kombiniranja regulatornih signalov z namenom združitve transkripcijske in potranskripcijske regulacije. Protein Musashi-1 je pokazal velik potencial pri potranskripcijski regulaciji v ''E. coli'', kar odpira možnosti za raziskave delovanja tudi drugih heterolognih RNA-vezavnih proteinov z RRM pri preprostejših organizmih [1].

== Literatura ==

[1] R. Dolcemascolo, M. Heras-Hernández, L. Goiriz, R. Montagud-Martínez, A. Requena-Menéndez, R. Ruiz, A. Pérez-Ràfols, R. A. Higuera-Rodríguez, G. Pérez-Ropero, W. F. Vranken, et al.: Repurposing the mammalian RNA-binding protein Musashi-1 as an allosteric translation repressor in bacteria. Elife 2024, 12.

[2] C. C. Clingman, L. M. Deveau, S. A. Hay, R. M. Genga, S. M. D. Shandilya, F. Massi, S. P. Ryder: Allosteric inhibition of a stem cell RNA-binding protein by an intermediary metabolite. Elife 2014, 2014.

[3] H. Kawahara, T. Imai, H. Imataka, M. Tsujimoto, K. Matsumoto, H. Okano: Neural RNA-binding protein Musashi1 inhibits translation initiation by competing with eIF4G for PABP. Journal of Cell Biology 2008, 181, 639–653.

[4] N. Ruth Zearfoss, L. M. Deveau, C. C. Clingman, E. Schmidt, E. S. Johnson, F. Massi, S. P. Ryder: A conserved three-nucleotide core motif defines musashi RNA binding specificity. Journal of Biological Chemistry 2014, 289, 35530–35541.

Uporaba sesalskega RNA-vezavnega proteina Musashi-1 kot alosterično reguliranega translacijskega represorja v E. coli

2024-04-14T16:56:41Z

Markokovacic: /* Mehanizem interakcije med MSI-1* in prepoznavnim motivom na mRNA */

Izhodiščni članek: [https://elifesciences.org/articles/91777 Repurposing the mammalian RNA-binding protein Musashi-1 as an allosteric translation repressor in bacteria]

== Uvod ==

Regulacija izražanja genov na potranskripcijskem nivoju se pri prokariontih in evkariontih razlikuje. Evkarionti imajo več RNA-vezavnih proteinov, ki imajo lahko številne funkcije in lahko delujejo tudi na specifičen način. Pri prokariontih stabilnost mRNA in iniciacijo translacije regulirajo predvsem majhne nekodirajoče RNA, RNA-vezavni proteini pa večinoma niso tako specifični. Pri živalih večina RNA-vezavnih proteinov vsebuje RNA-prepoznavne motive (RRM). RRM so majhne globularne domene, ki vključujejo okrog 90 aminokislinskih ostankov. Zvijejo se v 4 antiparalelne β-trakove in 2 α-vijačnici. Na enoverižno molekulo RNA se lahko vežejo z zadostno afiniteto in specifičnostjo ter tako specifično regulirajo biološke procese. Čeprav so RRM pomembni za potranskripcijsko regulacijo pri živalih, pa niso razširjeni pri vseh organizmih. Pri prokariontih je zelo malo proteinov z RRM, ki so bili odkriti predvsem z bioinformatskimi metodami, vendar pa imajo pogosto neznano funkcijo. Namen raziskave je bil odgovoriti na vprašanje, ali se živalski RRM lahko uporabijo v organizmih z enostavnejšo regulacijo izražanja genov. V kolikor bi to delovalo, bi potranskripcijska regulacija izražanja genov pri prokariontih preko specifičnih interakcij med heterolognimi RNA vezavnimi proteini z RRM in prokariontskimi mRNA ponudila številne nove možnosti za regulacijo sinteznobioloških vezij [1].

== Protein Musashi-1 lahko regulira iniciacijo translacije v ''E. coli'' ==

V raziskavi so želeli preveriti, ali sesalski RNA-vezavni protein Musashi-1 (MSI-1) lahko deluje kot potranskripcijski regulator v ''E. coli''. MSI-1 se pri sesalcih izraža predvsem v matičnih celicah živčne in epitelne linije. Ima pomembno vlogo pri diferenciaciji celic, regulaciji celičnega cikla in tumorogenezi, regulira pa tudi signalno pot Notch. Vsebuje dva RRM (RRM1 in RRM2), ki z nanomolarno afiniteto prepoznata konsenzno zaporedje RUnAGU na tarčni mRNA [1]. MSI-1 je alosterično inhibiran z nekaterimi maščobnimi kislinami, predvsem z ω-9 mononenasičenimi maščobnimi kislinami, ki vsebujejo med 18 in 22 ogljikovih atomov (npr. z oleinsko kislino) [2]. Uporabili so gen za mišji MSI-1, zato so optimizirali rabo kodonov za izražanje gena v ''E. coli''. Ker je C-končna regija mišjega MSI-1 nizko strukturno kompleksna, so z namenom povišanja topnosti proteina klonirali skrajšano obliko gena za MSI-1, ki je vključeval zapis za prvih 192 aminokislinskih ostankov. Izražanje gena za skrajšano obliko proteina (MSI-1*) je bilo pod nadzorom inducibilnega sintetičnega promotorja (poimenovan PLlac), ki je bil načrtovan na podlagi promotorja PL in reprimiran z represorjem LacI. Na transkripcijskem nivoju so z dodatkom laktoze ali β-D-1-tiogalaktopiranozida (IPTG) lahko inducirali izražanje gena za MSI-1*. Kot regulatorni element so uporabili Super folder GFP (sfGFP). Izražanje gena za sfGFP je bilo pod nadzorom konstitutivnega promotorja J23119. Zapis za sfGFP je po start kodonu vključeval dva prepoznavna motiva za MSI-1*, in sicer GUUAGU ter AUUUAGU, ki predvidoma tvorita sekundarno strukturo v obliki stebla. MSI-1* tako z vezavo na prepoznavna motiva na molekuli mRNA za sfGFP lahko zavre translacijo, saj sterično ovira vezavo ribosomalne podenote 30S na mRNA [1]. Tak način delovanja se razlikuje od tistega, ki poteka naravno pri sesalcih, saj se pri sesalcih MSI-1 veže na 3' UTR tarčne mRNA (''Numb'') in tako prepreči delovanje poli(A)-vezavnega proteina PABP ter zavre translacijo [3]. Pri tako sestavljenem sinteznobiološkem vezju sta torej vhodna signala bila laktoza (ali IPTG) in oleinska kislina, izhodni signal je bila fluorescenca sfGFP. Takšno obnašanje sistema opišejo logična vrata IMPLY, torej se sfGFP ne izraža le v primeru, da je v sistemu laktoza (ali IPTG) in v sistemu ni oleinske kisline. Delovanje sinteznobiološkega vezja so okarakterizirali s fluorimetrijo, merili so fluorescenco sfGFP (v AU) v odvisnosti od koncentracije laktoze (do 1 mM). Pri 1 mM koncentraciji laktoze je MSI-1* znižal sintezo sfGFP, in sicer za faktor 2.5. IPTG je povzročil zelo podoben odziv. Meritve celične rasti za vse indukcijske pogoje so pokazale, da ekspresija gena za mišji protein MSI-1* ni povzročila motenj v rasti bakterijskih celic [1].

== Mehanizem interakcije med MSI-1* in prepoznavnim motivom na mRNA ==

Natančnejši vpogled v mehanizem interakcije med MSI-1* in prepoznavnima motivoma na mRNA, ki zapisuje za sfGFP, je omogočil izračun disociacijske konstante Kd med mRNA in MSI-1*. Točkovna mutacija v enem prepoznavnem motivu (RUnCGU, mutanta 1) je povzročila zgolj 1.4x znižanje sinteze sfGFP v prisotnosti MSI-1* [1], s čimer so potrdili ugotovitev predhodnih raziskav, da je zaporedje UAG na prepoznavnem motivu ključno za specifično prepoznavo prepoznavnega motiva z MSI-1 [4]. Točkovni mutaciji v obeh prepoznavnih motivih (UAC namesto UAG, mutanta 5) sta povzročili zelo podoben odziv. Reporterski sistem z najkrajšim možnim konsenznim zaporedjem AUAGU ni pokazal nobene regulacije z MSI-1*, kar pomeni, da sta dve kopiji konsenznega zaporedja ključni za uspešno regulacijo izražanja gena za tarčni protein z MSI-1*. Pri ''in vitro'' eksperimentih vezavne kinetike so uporabili skrajšano obliko gena za človeški MSI-1h*. Meritve so izvajali s tehnologijo switchSENSE, ki omogoča meritve molekulske dinamike na čipu. dsDNA, imobilizirana na elektrodo iz Au v čipu, je imela fluorofor na enem koncu in prepoznavni motiv za vezavo MSI-1h* na drugem koncu. Vezava MSI-1h* (injiciran analit) na RNA povzroči spremembe v fluorescenci, ki se merijo v realnem času in omogočajo izračun kinetičnih konstant. V primeru originalnega prepoznavnega motiva na RNA (brez točkovnih mutacij) so dobili stopnjo asociacije kon = 1.1 nM-1 min-1, povprečen čas zadrževanja proteina MSI-1* na tarčni mRNA je bil 1.5 min (1/koff, koff je stopnja disociacije). Pri mutanti 1 je bila stopnja asociacije podobna kot pri nemutiranem prepoznavnem motivu, stopnja disociacije pa skoraj 4x hitrejša. Pri mutanti 5 pa sta bili moteni tako stopnja asociacije (15x manjša hitrost) kot stopnja disociacije (10x večja hitrost). Disociacijska konstanta Kd (= koff/kon) je 0.62 nM za nemutirano obliko prepoznavnega motiva in 87 nM za mutanto 5 [1].

== Spreminjanje prepoznavnega motiva na mRNA z namenom povišanja dinamičnega razpona odziva ==

Raziskovalci so želeli preveriti, ali bi s spreminjanjem prepoznavnega motiva na mRNA za vezavo MSI-1 in z dodajanjem novih prepoznavnih motivov lahko povečali dinamičen razpon odziva. Najboljše rezultate je dal tretji reporterski sistem (redesign 3), ki je poleg obeh prepoznavnih motivov po start kodonu (sekundarna struktura v obliki zanke) vključeval še spremembe na 5' UTR zapisa za sfGFP. Na 5' UTR sta bila dodana dodatna prepoznavna motiva RUnAGU (GUUUAGU in AUUUAGU), ki sta obkrožala RBS in predvidoma nista tvorila sekundarnih struktur. Mišji MSI-1* je tako blokiral tudi vezavo RNA dela ribosomske podenote 30S. Ta reporterski sistem je povzročil približno 2x povišanje maksimalnega izražanja gena (brez laktoze) za sfGFP in 8.6x znižanje maksimalnega izražanja gena za sfGFP z MSI-1*, kar je v primerjavi z originalnim reporterskim sistemom (2 nemutirani prepoznavni zaporedji), kjer je bilo maksimalno znižanje izražanja gena 2.5x, velik napredek. Primerjava Hillovih koeficientov pri originalnem sistemu in redesign 3 (4.5 pri redesign 3, 1.7 pri originalnem sistemu) nakazuje na pozitivno kooperativnost vezave obeh molekul proteina MSI-1*, ki se lahko vežeta vsak na po 2 prepoznavni mesti [1].

== MSI-1* je alosterično inhibiran z oleinsko kislino ==

Protein MSI-1 je alosterično inhibiran z oleinsko kislino, ki se veže na domeno RRM1 na MSI-1 in preko konformacijske spremembe MSI-1 prepreči prepoznavo tarčne RNA. Z eksperimentom, ki temelji na spremenjeni mobilnosti molekul pri elektroforezi, so potrdili interakcijo med MSI-1* (koncentracija 45 µM) in RNA (koncentracija 11 µM), ki je bila popolnoma motena v prisotnosti 1 mM oleinske kisline. ''E. coli'' ima transporterje za vnos maščobnih kislin iz okolja (FadL in FadD). Z meritvami fluorescence sfGFP v posameznih celicah so ugotovili, da se je pri originalnem reporterskem sistemu (nemutirani prepoznavni mesti) delež celic v stanju ON (fluorescenca sfGFP nad določeno mejo) dvignil iz 10 % (pri 1 mM laktozi) na 49 % po dodatku 20 mM oleinske kisline. Prvotnih 93 % celic v stanju ON (ko ni bilo laktoze v sistemu) se ni povrnilo, najverjetneje ker se je oleinska kislina delno razgradila po vstopu v celice [1].

== Aplikacije proteina Musashi-1 ==

Transkripcijska regulacija ima svoje omejitve pri regulaciji specifičnega gena znotraj operona. Protein Musashi-1 bi lahko reguliral izražanje specifičnega gena, ki je del policistronskega operona. To bi lahko bilo uporabno pri regulaciji izražanja številnih encimov pri metabolnih poteh, torej pri metabolnem inženiringu. Uporaben bi bil tudi v kombinaciji s transkripcijskimi regulatorji, s čimer bi dosegli bolj raznoliko kombinirano regulacijo. Raziskovalci so z namenom potrditve teh dveh aplikacij proteina Musashi sestavili novo vezje, kjer sta ''sfGFP'' in ''mScarlet'' tvorila eno transkripcijsko enoto (bicistronski operon) pod nadzorom inducibilnega sintetičnega promotorja (PLtet), načrtovanega na podlagi promotorja PL, ki je bil reguliran s tetraciklinskim represorjem (TetR). Z dodatkom anhidrotetraciklina (aTC) so omogočili prepisovanje genov za sfGFP in mScarlet. Prepoznavni motivi na mRNA za vezavo MSI-1* so bili zgolj na začetku zapisa za sfGFP. Gen za MSI-1* je bil pod nadzorom promotorja PLlac, torej je za začetek transkripcije zapisa za MSI-1* bil potreben dodatek laktoze (ali IPTG). Obnašanje sistema opišejo logična vrata NIMPLY, pri čemer se zapis za sfGFP izraža zgolj v primeru prisotnosti aTC v sistemu in v odsotnosti laktoze v sistemu. Z dodatkom laktoze (1 mM) in aTC (100 ng/mL) v vseh kombinacijah (brez obeh, zgolj eden, oba) so pokazali specifično regulacijo izražanja gena za sfGFP v bicistronskem operonu in sposobnost kombiniranja regulatornih signalov z namenom združitve transkripcijske in potranskripcijske regulacije. Protein Musashi-1 je pokazal velik potencial pri potranskripcijski regulaciji v ''E. coli'', kar odpira možnosti za raziskave delovanja tudi drugih heterolognih RNA-vezavnih proteinov z RRM pri preprostejših organizmih [1].

== Literatura ==

[1] R. Dolcemascolo, M. Heras-Hernández, L. Goiriz, R. Montagud-Martínez, A. Requena-Menéndez, R. Ruiz, A. Pérez-Ràfols, R. A. Higuera-Rodríguez, G. Pérez-Ropero, W. F. Vranken, et al.: Repurposing the mammalian RNA-binding protein Musashi-1 as an allosteric translation repressor in bacteria. Elife 2024, 12.

[2] C. C. Clingman, L. M. Deveau, S. A. Hay, R. M. Genga, S. M. D. Shandilya, F. Massi, S. P. Ryder: Allosteric inhibition of a stem cell RNA-binding protein by an intermediary metabolite. Elife 2014, 2014.

[3] H. Kawahara, T. Imai, H. Imataka, M. Tsujimoto, K. Matsumoto, H. Okano: Neural RNA-binding protein Musashi1 inhibits translation initiation by competing with eIF4G for PABP. Journal of Cell Biology 2008, 181, 639–653.

[4] N. Ruth Zearfoss, L. M. Deveau, C. C. Clingman, E. Schmidt, E. S. Johnson, F. Massi, S. P. Ryder: A conserved three-nucleotide core motif defines musashi RNA binding specificity. Journal of Biological Chemistry 2014, 289, 35530–35541.

Uporaba sesalskega RNA-vezavnega proteina Musashi-1 kot alosterično reguliranega translacijskega represorja v E. coli

2024-04-14T16:55:58Z

Markokovacic: /* Protein Musashi-1 lahko regulira iniciacijo translacije v E. coli */

Izhodiščni članek: [https://elifesciences.org/articles/91777 Repurposing the mammalian RNA-binding protein Musashi-1 as an allosteric translation repressor in bacteria]

== Uvod ==

Regulacija izražanja genov na potranskripcijskem nivoju se pri prokariontih in evkariontih razlikuje. Evkarionti imajo več RNA-vezavnih proteinov, ki imajo lahko številne funkcije in lahko delujejo tudi na specifičen način. Pri prokariontih stabilnost mRNA in iniciacijo translacije regulirajo predvsem majhne nekodirajoče RNA, RNA-vezavni proteini pa večinoma niso tako specifični. Pri živalih večina RNA-vezavnih proteinov vsebuje RNA-prepoznavne motive (RRM). RRM so majhne globularne domene, ki vključujejo okrog 90 aminokislinskih ostankov. Zvijejo se v 4 antiparalelne β-trakove in 2 α-vijačnici. Na enoverižno molekulo RNA se lahko vežejo z zadostno afiniteto in specifičnostjo ter tako specifično regulirajo biološke procese. Čeprav so RRM pomembni za potranskripcijsko regulacijo pri živalih, pa niso razširjeni pri vseh organizmih. Pri prokariontih je zelo malo proteinov z RRM, ki so bili odkriti predvsem z bioinformatskimi metodami, vendar pa imajo pogosto neznano funkcijo. Namen raziskave je bil odgovoriti na vprašanje, ali se živalski RRM lahko uporabijo v organizmih z enostavnejšo regulacijo izražanja genov. V kolikor bi to delovalo, bi potranskripcijska regulacija izražanja genov pri prokariontih preko specifičnih interakcij med heterolognimi RNA vezavnimi proteini z RRM in prokariontskimi mRNA ponudila številne nove možnosti za regulacijo sinteznobioloških vezij [1].

== Protein Musashi-1 lahko regulira iniciacijo translacije v ''E. coli'' ==

V raziskavi so želeli preveriti, ali sesalski RNA-vezavni protein Musashi-1 (MSI-1) lahko deluje kot potranskripcijski regulator v ''E. coli''. MSI-1 se pri sesalcih izraža predvsem v matičnih celicah živčne in epitelne linije. Ima pomembno vlogo pri diferenciaciji celic, regulaciji celičnega cikla in tumorogenezi, regulira pa tudi signalno pot Notch. Vsebuje dva RRM (RRM1 in RRM2), ki z nanomolarno afiniteto prepoznata konsenzno zaporedje RUnAGU na tarčni mRNA [1]. MSI-1 je alosterično inhibiran z nekaterimi maščobnimi kislinami, predvsem z ω-9 mononenasičenimi maščobnimi kislinami, ki vsebujejo med 18 in 22 ogljikovih atomov (npr. z oleinsko kislino) [2]. Uporabili so gen za mišji MSI-1, zato so optimizirali rabo kodonov za izražanje gena v ''E. coli''. Ker je C-končna regija mišjega MSI-1 nizko strukturno kompleksna, so z namenom povišanja topnosti proteina klonirali skrajšano obliko gena za MSI-1, ki je vključeval zapis za prvih 192 aminokislinskih ostankov. Izražanje gena za skrajšano obliko proteina (MSI-1*) je bilo pod nadzorom inducibilnega sintetičnega promotorja (poimenovan PLlac), ki je bil načrtovan na podlagi promotorja PL in reprimiran z represorjem LacI. Na transkripcijskem nivoju so z dodatkom laktoze ali β-D-1-tiogalaktopiranozida (IPTG) lahko inducirali izražanje gena za MSI-1*. Kot regulatorni element so uporabili Super folder GFP (sfGFP). Izražanje gena za sfGFP je bilo pod nadzorom konstitutivnega promotorja J23119. Zapis za sfGFP je po start kodonu vključeval dva prepoznavna motiva za MSI-1*, in sicer GUUAGU ter AUUUAGU, ki predvidoma tvorita sekundarno strukturo v obliki stebla. MSI-1* tako z vezavo na prepoznavna motiva na molekuli mRNA za sfGFP lahko zavre translacijo, saj sterično ovira vezavo ribosomalne podenote 30S na mRNA [1]. Tak način delovanja se razlikuje od tistega, ki poteka naravno pri sesalcih, saj se pri sesalcih MSI-1 veže na 3' UTR tarčne mRNA (''Numb'') in tako prepreči delovanje poli(A)-vezavnega proteina PABP ter zavre translacijo [3]. Pri tako sestavljenem sinteznobiološkem vezju sta torej vhodna signala bila laktoza (ali IPTG) in oleinska kislina, izhodni signal je bila fluorescenca sfGFP. Takšno obnašanje sistema opišejo logična vrata IMPLY, torej se sfGFP ne izraža le v primeru, da je v sistemu laktoza (ali IPTG) in v sistemu ni oleinske kisline. Delovanje sinteznobiološkega vezja so okarakterizirali s fluorimetrijo, merili so fluorescenco sfGFP (v AU) v odvisnosti od koncentracije laktoze (do 1 mM). Pri 1 mM koncentraciji laktoze je MSI-1* znižal sintezo sfGFP, in sicer za faktor 2.5. IPTG je povzročil zelo podoben odziv. Meritve celične rasti za vse indukcijske pogoje so pokazale, da ekspresija gena za mišji protein MSI-1* ni povzročila motenj v rasti bakterijskih celic [1].

== Mehanizem interakcije med MSI-1* in prepoznavnim motivom na mRNA ==

Natančnejši vpogled v mehanizem interakcije med MSI-1* in prepoznavnima motivoma na mRNA, ki zapisuje za sfGFP, je omogočil izračun disociacijske konstante KD med mRNA in MSI-1*. Točkovna mutacija v enem prepoznavnem motivu (RUnCGU, mutanta 1) je povzročila zgolj 1.4x znižanje sinteze sfGFP v prisotnosti MSI-1* [1], s čimer so potrdili ugotovitev predhodnih raziskav, da je zaporedje UAG na prepoznavnem motivu ključno za specifično prepoznavo prepoznavnega motiva z MSI-1 [4]. Točkovni mutaciji v obeh prepoznavnih motivih (UAC namesto UAG, mutanta 5) sta povzročili zelo podoben odziv. Reporterski sistem z najkrajšim možnim konsenznim zaporedjem AUAGU ni pokazal nobene regulacije z MSI-1*, kar pomeni, da sta dve kopiji konsenznega zaporedja ključni za uspešno regulacijo izražanja gena za tarčni protein z MSI-1*. Pri ''in vitro'' eksperimentih vezavne kinetike so uporabili skrajšano obliko gena za človeški MSI-1h*. Meritve so izvajali s tehnologijo switchSENSE, ki omogoča meritve molekulske dinamike na čipu. dsDNA, imobilizirana na elektrodo iz Au v čipu, je imela fluorofor na enem koncu in prepoznavni motiv za vezavo MSI-1h* na drugem koncu. Vezava MSI-1h* (injiciran analit) na RNA povzroči spremembe v fluorescenci, ki se merijo v realnem času in omogočajo izračun kinetičnih konstant. V primeru originalnega prepoznavnega motiva na RNA (brez točkovnih mutacij) so dobili stopnjo asociacije kon = 1.1 nM-1 min-1, povprečen čas zadrževanja proteina MSI-1* na tarčni mRNA je bil 1.5 min (1/koff, koff je stopnja disociacije). Pri mutanti 1 je bila stopnja asociacije podobna kot pri nemutiranem prepoznavnem motivu, stopnja disociacije pa skoraj 4x hitrejša. Pri mutanti 5 pa sta bili moteni tako stopnja asociacije (15x manjša hitrost) kot stopnja disociacije (10x večja hitrost). Disociacijska konstanta KD (= koff/kon) je 0.62 nM za nemutirano obliko prepoznavnega motiva in 87 nM za mutanto 5 [1].

== Spreminjanje prepoznavnega motiva na mRNA z namenom povišanja dinamičnega razpona odziva ==

Raziskovalci so želeli preveriti, ali bi s spreminjanjem prepoznavnega motiva na mRNA za vezavo MSI-1 in z dodajanjem novih prepoznavnih motivov lahko povečali dinamičen razpon odziva. Najboljše rezultate je dal tretji reporterski sistem (redesign 3), ki je poleg obeh prepoznavnih motivov po start kodonu (sekundarna struktura v obliki zanke) vključeval še spremembe na 5' UTR zapisa za sfGFP. Na 5' UTR sta bila dodana dodatna prepoznavna motiva RUnAGU (GUUUAGU in AUUUAGU), ki sta obkrožala RBS in predvidoma nista tvorila sekundarnih struktur. Mišji MSI-1* je tako blokiral tudi vezavo RNA dela ribosomske podenote 30S. Ta reporterski sistem je povzročil približno 2x povišanje maksimalnega izražanja gena (brez laktoze) za sfGFP in 8.6x znižanje maksimalnega izražanja gena za sfGFP z MSI-1*, kar je v primerjavi z originalnim reporterskim sistemom (2 nemutirani prepoznavni zaporedji), kjer je bilo maksimalno znižanje izražanja gena 2.5x, velik napredek. Primerjava Hillovih koeficientov pri originalnem sistemu in redesign 3 (4.5 pri redesign 3, 1.7 pri originalnem sistemu) nakazuje na pozitivno kooperativnost vezave obeh molekul proteina MSI-1*, ki se lahko vežeta vsak na po 2 prepoznavni mesti [1].

== MSI-1* je alosterično inhibiran z oleinsko kislino ==

Protein MSI-1 je alosterično inhibiran z oleinsko kislino, ki se veže na domeno RRM1 na MSI-1 in preko konformacijske spremembe MSI-1 prepreči prepoznavo tarčne RNA. Z eksperimentom, ki temelji na spremenjeni mobilnosti molekul pri elektroforezi, so potrdili interakcijo med MSI-1* (koncentracija 45 µM) in RNA (koncentracija 11 µM), ki je bila popolnoma motena v prisotnosti 1 mM oleinske kisline. ''E. coli'' ima transporterje za vnos maščobnih kislin iz okolja (FadL in FadD). Z meritvami fluorescence sfGFP v posameznih celicah so ugotovili, da se je pri originalnem reporterskem sistemu (nemutirani prepoznavni mesti) delež celic v stanju ON (fluorescenca sfGFP nad določeno mejo) dvignil iz 10 % (pri 1 mM laktozi) na 49 % po dodatku 20 mM oleinske kisline. Prvotnih 93 % celic v stanju ON (ko ni bilo laktoze v sistemu) se ni povrnilo, najverjetneje ker se je oleinska kislina delno razgradila po vstopu v celice [1].

== Aplikacije proteina Musashi-1 ==

Transkripcijska regulacija ima svoje omejitve pri regulaciji specifičnega gena znotraj operona. Protein Musashi-1 bi lahko reguliral izražanje specifičnega gena, ki je del policistronskega operona. To bi lahko bilo uporabno pri regulaciji izražanja številnih encimov pri metabolnih poteh, torej pri metabolnem inženiringu. Uporaben bi bil tudi v kombinaciji s transkripcijskimi regulatorji, s čimer bi dosegli bolj raznoliko kombinirano regulacijo. Raziskovalci so z namenom potrditve teh dveh aplikacij proteina Musashi sestavili novo vezje, kjer sta ''sfGFP'' in ''mScarlet'' tvorila eno transkripcijsko enoto (bicistronski operon) pod nadzorom inducibilnega sintetičnega promotorja (PLtet), načrtovanega na podlagi promotorja PL, ki je bil reguliran s tetraciklinskim represorjem (TetR). Z dodatkom anhidrotetraciklina (aTC) so omogočili prepisovanje genov za sfGFP in mScarlet. Prepoznavni motivi na mRNA za vezavo MSI-1* so bili zgolj na začetku zapisa za sfGFP. Gen za MSI-1* je bil pod nadzorom promotorja PLlac, torej je za začetek transkripcije zapisa za MSI-1* bil potreben dodatek laktoze (ali IPTG). Obnašanje sistema opišejo logična vrata NIMPLY, pri čemer se zapis za sfGFP izraža zgolj v primeru prisotnosti aTC v sistemu in v odsotnosti laktoze v sistemu. Z dodatkom laktoze (1 mM) in aTC (100 ng/mL) v vseh kombinacijah (brez obeh, zgolj eden, oba) so pokazali specifično regulacijo izražanja gena za sfGFP v bicistronskem operonu in sposobnost kombiniranja regulatornih signalov z namenom združitve transkripcijske in potranskripcijske regulacije. Protein Musashi-1 je pokazal velik potencial pri potranskripcijski regulaciji v ''E. coli'', kar odpira možnosti za raziskave delovanja tudi drugih heterolognih RNA-vezavnih proteinov z RRM pri preprostejših organizmih [1].

== Literatura ==

[1] R. Dolcemascolo, M. Heras-Hernández, L. Goiriz, R. Montagud-Martínez, A. Requena-Menéndez, R. Ruiz, A. Pérez-Ràfols, R. A. Higuera-Rodríguez, G. Pérez-Ropero, W. F. Vranken, et al.: Repurposing the mammalian RNA-binding protein Musashi-1 as an allosteric translation repressor in bacteria. Elife 2024, 12.

[2] C. C. Clingman, L. M. Deveau, S. A. Hay, R. M. Genga, S. M. D. Shandilya, F. Massi, S. P. Ryder: Allosteric inhibition of a stem cell RNA-binding protein by an intermediary metabolite. Elife 2014, 2014.

[3] H. Kawahara, T. Imai, H. Imataka, M. Tsujimoto, K. Matsumoto, H. Okano: Neural RNA-binding protein Musashi1 inhibits translation initiation by competing with eIF4G for PABP. Journal of Cell Biology 2008, 181, 639–653.

[4] N. Ruth Zearfoss, L. M. Deveau, C. C. Clingman, E. Schmidt, E. S. Johnson, F. Massi, S. P. Ryder: A conserved three-nucleotide core motif defines musashi RNA binding specificity. Journal of Biological Chemistry 2014, 289, 35530–35541.

Uporaba sesalskega RNA-vezavnega proteina Musashi-1 kot alosterično reguliranega translacijskega represorja v E. coli

2024-04-14T15:33:31Z

Markokovacic: /* MSI-1* je alosterično inhibiran z oleinsko kislino */

Izhodiščni članek: [https://elifesciences.org/articles/91777 Repurposing the mammalian RNA-binding protein Musashi-1 as an allosteric translation repressor in bacteria]

== Uvod ==

Regulacija izražanja genov na potranskripcijskem nivoju se pri prokariontih in evkariontih razlikuje. Evkarionti imajo več RNA-vezavnih proteinov, ki imajo lahko številne funkcije in lahko delujejo tudi na specifičen način. Pri prokariontih stabilnost mRNA in iniciacijo translacije regulirajo predvsem majhne nekodirajoče RNA, RNA-vezavni proteini pa večinoma niso tako specifični. Pri živalih večina RNA-vezavnih proteinov vsebuje RNA-prepoznavne motive (RRM). RRM so majhne globularne domene, ki vključujejo okrog 90 aminokislinskih ostankov. Zvijejo se v 4 antiparalelne β-trakove in 2 α-vijačnici. Na enoverižno molekulo RNA se lahko vežejo z zadostno afiniteto in specifičnostjo ter tako specifično regulirajo biološke procese. Čeprav so RRM pomembni za potranskripcijsko regulacijo pri živalih, pa niso razširjeni pri vseh organizmih. Pri prokariontih je zelo malo proteinov z RRM, ki so bili odkriti predvsem z bioinformatskimi metodami, vendar pa imajo pogosto neznano funkcijo. Namen raziskave je bil odgovoriti na vprašanje, ali se živalski RRM lahko uporabijo v organizmih z enostavnejšo regulacijo izražanja genov. V kolikor bi to delovalo, bi potranskripcijska regulacija izražanja genov pri prokariontih preko specifičnih interakcij med heterolognimi RNA vezavnimi proteini z RRM in prokariontskimi mRNA ponudila številne nove možnosti za regulacijo sinteznobioloških vezij [1].

== Protein Musashi-1 lahko regulira iniciacijo translacije v ''E. coli'' ==

V raziskavi so želeli preveriti, ali sesalski RNA-vezavni protein Musashi-1 (MSI-1) lahko deluje kot potranskripcijski regulator v ''E. coli''. MSI-1 se pri sesalcih izraža predvsem v matičnih celicah živčne in epitelne linije. Ima pomembno vlogo pri diferenciaciji celic, regulaciji celičnega cikla in tumorogenezi, regulira pa tudi signalno pot Notch. Vsebuje dva RRM (RRM1 in RRM2), ki z nanomolarno afiniteto prepoznata konsenzno zaporedje RUnAGU na tarčni mRNA [1]. MSI-1 je alosterično inhibiran z nekaterimi maščobnimi kislinami, predvsem z ω-9 mononenasičenimi maščobnimi kislinami, ki vsebujejo med 18 in 22 ogljikovih atomov (npr. z oleinsko kislino) [2]. Uporabili so gen za mišji MSI-1, zato so optimizirali rabo kodonov za izražanje gena v ''E. coli''. Ker je C-končna regija mišjega MSI-1 nizko strukturno kompleksna, so z namenom povišanja topnosti proteina klonirali skrajšano obliko gena za MSI-1, ki je vključeval zapis za prvih 192 aminokislinskih ostankov. Izražanje gena za skrajšano obliko proteina (MSI-1*) je bilo pod nadzorom inducibilnega sintetičnega promotorja (poimenovan PLlac), ki je bil načrtovan na podlagi promotorja PL in reprimiran z represorjem LacI. Na transkripcijskem nivoju so z dodatkom laktoze ali β-D-1-tiogalaktopiranozida (IPTG) lahko inducirali izražanje gena za MSI-1*. Kot regulatorni element so uporabili Super folder GFP (sfGFP). Izražanje gena za sfGFP je bilo pod nadzorom konstitutivnega promotorja J23119. Zapis za sfGFP je po start kodonu vključeval dva prepoznavna motiva za MSI-1*, in sicer GUUAGU ter AUUUAGU, ki predvidoma tvorita sekundarno strukturo v obliki stebla. MSI-1* tako z vezavo na prepoznavna motiva na molekuli mRNA za sfGFP lahko zavre translacijo, saj sterično ovira vezavo ribosomalne podenote 30S na mRNA [1]. Tak način delovanja se razlikuje od tistega, ki poteka naravno pri sesalcih, saj se pri sesalcih MSI-1 veže na 3' UTR tarčne mRNA (''Numb'') in tako prepreči delovanje poli(A)-vezavnega proteina PABP in zavre translacijo [3]. Pri tako sestavljenem sinteznobiološkem vezju sta torej vhodna signala bila laktoza (ali IPTG) in oleinska kislina, izhodni signal je bila fluorescenca sfGFP. Takšno obnašanje sistema opišejo logična vrata IMPLY, torej se sfGFP ne izraža le v primeru, da je v sistemu laktoza (ali IPTG) in v sistemu ni oleinske kisline. Delovanje sinteznobiološkega vezja so karakterizirali s fluorimetrijo, merili so fluorescenco sfGFP (v AU) v odvisnosti od koncentracije laktoze (do 1 mM). Pri 1 mM koncentraciji laktoze je MSI-1* znižal sintezo sfGFP, in sicer za faktor 2.5. IPTG je povzročil zelo podoben odziv. Meritve celične rasti za vse indukcijske pogoje so pokazale, da je bila pri vseh pogojih rast celic skoraj konstantna, kar pomeni, da ekspresija gena za mišji protein MSI-1* ni povzročila motenj v rasti bakterijskih celic [1].

== Mehanizem interakcije med MSI-1* in prepoznavnim motivom na mRNA ==

Natančnejši vpogled v mehanizem interakcije med MSI-1* in prepoznavnima motivoma na mRNA, ki zapisuje za sfGFP, je omogočil izračun disociacijske konstante KD med mRNA in MSI-1*. Točkovna mutacija v enem prepoznavnem motivu (RUnCGU, mutanta 1) je povzročila zgolj 1.4x znižanje sinteze sfGFP v prisotnosti MSI-1* [1], s čimer so potrdili ugotovitev predhodnih raziskav, da je zaporedje UAG na prepoznavnem motivu ključno za specifično prepoznavo prepoznavnega motiva z MSI-1 [4]. Točkovni mutaciji v obeh prepoznavnih motivih (UAC namesto UAG, mutanta 5) sta povzročili zelo podoben odziv. Reporterski sistem z najkrajšim možnim konsenznim zaporedjem AUAGU ni pokazal nobene regulacije z MSI-1*, kar pomeni, da sta dve kopiji konsenznega zaporedja ključni za uspešno regulacijo izražanja gena za tarčni protein z MSI-1*. Pri ''in vitro'' eksperimentih vezavne kinetike so uporabili skrajšano obliko gena za človeški MSI-1h*. Meritve so izvajali s tehnologijo switchSENSE, ki omogoča meritve molekulske dinamike na čipu. dsDNA, imobilizirana na elektrodo iz Au v čipu, je imela fluorofor na enem koncu in prepoznavni motiv za vezavo MSI-1h* na drugem koncu. Vezava MSI-1h* (injiciran analit) na RNA povzroči spremembe v fluorescenci, ki se merijo v realnem času in omogočajo izračun kinetičnih konstant. V primeru originalnega prepoznavnega motiva na RNA (brez točkovnih mutacij) so dobili stopnjo asociacije kon = 1.1 nM-1 min-1, povprečen čas zadrževanja proteina MSI-1* na tarčni mRNA je bil 1.5 min (1/koff, koff je stopnja disociacije). Pri mutanti 1 je bila stopnja asociacije podobna kot pri nemutiranem prepoznavnem motivu, stopnja disociacije pa skoraj 4x hitrejša. Pri mutanti 5 pa sta bili moteni tako stopnja asociacije (15x manjša hitrost) kot stopnja disociacije (10x večja hitrost). Disociacijska konstanta KD (= koff/kon) je 0.62 nM za nemutirano obliko prepoznavnega motiva in 87 nM za mutanto 5 [1].

== Spreminjanje prepoznavnega motiva na mRNA z namenom povišanja dinamičnega razpona odziva ==

Raziskovalci so želeli preveriti, ali bi s spreminjanjem prepoznavnega motiva na mRNA za vezavo MSI-1 in z dodajanjem novih prepoznavnih motivov lahko povečali dinamičen razpon odziva. Najboljše rezultate je dal tretji reporterski sistem (redesign 3), ki je poleg obeh prepoznavnih motivov po start kodonu (sekundarna struktura v obliki zanke) vključeval še spremembe na 5' UTR zapisa za sfGFP. Na 5' UTR sta bila dodana dodatna prepoznavna motiva RUnAGU (GUUUAGU in AUUUAGU), ki sta obkrožala RBS in predvidoma nista tvorila sekundarnih struktur. Mišji MSI-1* je tako blokiral tudi vezavo RNA dela ribosomske podenote 30S. Ta reporterski sistem je povzročil približno 2x povišanje maksimalnega izražanja gena (brez laktoze) za sfGFP in 8.6x znižanje maksimalnega izražanja gena za sfGFP z MSI-1*, kar je v primerjavi z originalnim reporterskim sistemom (2 nemutirani prepoznavni zaporedji), kjer je bilo maksimalno znižanje izražanja gena 2.5x, velik napredek. Primerjava Hillovih koeficientov pri originalnem sistemu in redesign 3 (4.5 pri redesign 3, 1.7 pri originalnem sistemu) nakazuje na pozitivno kooperativnost vezave obeh molekul proteina MSI-1*, ki se lahko vežeta vsak na po 2 prepoznavni mesti [1].

== MSI-1* je alosterično inhibiran z oleinsko kislino ==

Protein MSI-1 je alosterično inhibiran z oleinsko kislino, ki se veže na domeno RRM1 na MSI-1 in preko konformacijske spremembe MSI-1 prepreči prepoznavo tarčne RNA. Z eksperimentom, ki temelji na spremenjeni mobilnosti molekul pri elektroforezi, so potrdili interakcijo med MSI-1* (koncentracija 45 µM) in RNA (koncentracija 11 µM), ki je bila popolnoma motena v prisotnosti 1 mM oleinske kisline. ''E. coli'' ima transporterje za vnos maščobnih kislin iz okolja (FadL in FadD). Z meritvami fluorescence sfGFP v posameznih celicah so ugotovili, da se je pri originalnem reporterskem sistemu (nemutirani prepoznavni mesti) delež celic v stanju ON (fluorescenca sfGFP nad določeno mejo) dvignil iz 10 % (pri 1 mM laktozi) na 49 % po dodatku 20 mM oleinske kisline. Prvotnih 93 % celic v stanju ON (ko ni bilo laktoze v sistemu) se ni povrnilo, najverjetneje ker se je oleinska kislina delno razgradila po vstopu v celice [1].

== Aplikacije proteina Musashi-1 ==

Transkripcijska regulacija ima svoje omejitve pri regulaciji specifičnega gena znotraj operona. Protein Musashi-1 bi lahko reguliral izražanje specifičnega gena, ki je del policistronskega operona. To bi lahko bilo uporabno pri regulaciji izražanja številnih encimov pri metabolnih poteh, torej pri metabolnem inženiringu. Uporaben bi bil tudi v kombinaciji s transkripcijskimi regulatorji, s čimer bi dosegli bolj raznoliko kombinirano regulacijo. Raziskovalci so z namenom potrditve teh dveh aplikacij proteina Musashi sestavili novo vezje, kjer sta ''sfGFP'' in ''mScarlet'' tvorila eno transkripcijsko enoto (bicistronski operon) pod nadzorom inducibilnega sintetičnega promotorja (PLtet), načrtovanega na podlagi promotorja PL, ki je bil reguliran s tetraciklinskim represorjem (TetR). Z dodatkom anhidrotetraciklina (aTC) so omogočili prepisovanje genov za sfGFP in mScarlet. Prepoznavni motivi na mRNA za vezavo MSI-1* so bili zgolj na začetku zapisa za sfGFP. Gen za MSI-1* je bil pod nadzorom promotorja PLlac, torej je za začetek transkripcije zapisa za MSI-1* bil potreben dodatek laktoze (ali IPTG). Obnašanje sistema opišejo logična vrata NIMPLY, pri čemer se zapis za sfGFP izraža zgolj v primeru prisotnosti aTC v sistemu in v odsotnosti laktoze v sistemu. Z dodatkom laktoze (1 mM) in aTC (100 ng/mL) v vseh kombinacijah (brez obeh, zgolj eden, oba) so pokazali specifično regulacijo izražanja gena za sfGFP v bicistronskem operonu in sposobnost kombiniranja regulatornih signalov z namenom združitve transkripcijske in potranskripcijske regulacije. Protein Musashi-1 je pokazal velik potencial pri potranskripcijski regulaciji v ''E. coli'', kar odpira možnosti za raziskave delovanja tudi drugih heterolognih RNA-vezavnih proteinov z RRM pri preprostejših organizmih [1].

== Literatura ==

[1] R. Dolcemascolo, M. Heras-Hernández, L. Goiriz, R. Montagud-Martínez, A. Requena-Menéndez, R. Ruiz, A. Pérez-Ràfols, R. A. Higuera-Rodríguez, G. Pérez-Ropero, W. F. Vranken, et al.: Repurposing the mammalian RNA-binding protein Musashi-1 as an allosteric translation repressor in bacteria. Elife 2024, 12.

[2] C. C. Clingman, L. M. Deveau, S. A. Hay, R. M. Genga, S. M. D. Shandilya, F. Massi, S. P. Ryder: Allosteric inhibition of a stem cell RNA-binding protein by an intermediary metabolite. Elife 2014, 2014.

[3] H. Kawahara, T. Imai, H. Imataka, M. Tsujimoto, K. Matsumoto, H. Okano: Neural RNA-binding protein Musashi1 inhibits translation initiation by competing with eIF4G for PABP. Journal of Cell Biology 2008, 181, 639–653.

[4] N. Ruth Zearfoss, L. M. Deveau, C. C. Clingman, E. Schmidt, E. S. Johnson, F. Massi, S. P. Ryder: A conserved three-nucleotide core motif defines musashi RNA binding specificity. Journal of Biological Chemistry 2014, 289, 35530–35541.

Uporaba sesalskega RNA-vezavnega proteina Musashi-1 kot alosterično reguliranega translacijskega represorja v E. coli

2024-04-14T09:58:52Z

Markokovacic:

Izhodiščni članek: [https://elifesciences.org/articles/91777 Repurposing the mammalian RNA-binding protein Musashi-1 as an allosteric translation repressor in bacteria]

== Uvod ==

Regulacija izražanja genov na potranskripcijskem nivoju se pri prokariontih in evkariontih razlikuje. Evkarionti imajo več RNA-vezavnih proteinov, ki imajo lahko številne funkcije in lahko delujejo tudi na specifičen način. Pri prokariontih stabilnost mRNA in iniciacijo translacije regulirajo predvsem majhne nekodirajoče RNA, RNA-vezavni proteini pa večinoma niso tako specifični. Pri živalih večina RNA-vezavnih proteinov vsebuje RNA-prepoznavne motive (RRM). RRM so majhne globularne domene, ki vključujejo okrog 90 aminokislinskih ostankov. Zvijejo se v 4 antiparalelne β-trakove in 2 α-vijačnici. Na enoverižno molekulo RNA se lahko vežejo z zadostno afiniteto in specifičnostjo ter tako specifično regulirajo biološke procese. Čeprav so RRM pomembni za potranskripcijsko regulacijo pri živalih, pa niso razširjeni pri vseh organizmih. Pri prokariontih je zelo malo proteinov z RRM, ki so bili odkriti predvsem z bioinformatskimi metodami, vendar pa imajo pogosto neznano funkcijo. Namen raziskave je bil odgovoriti na vprašanje, ali se živalski RRM lahko uporabijo v organizmih z enostavnejšo regulacijo izražanja genov. V kolikor bi to delovalo, bi potranskripcijska regulacija izražanja genov pri prokariontih preko specifičnih interakcij med heterolognimi RNA vezavnimi proteini z RRM in prokariontskimi mRNA ponudila številne nove možnosti za regulacijo sinteznobioloških vezij [1].

== Protein Musashi-1 lahko regulira iniciacijo translacije v ''E. coli'' ==

V raziskavi so želeli preveriti, ali sesalski RNA-vezavni protein Musashi-1 (MSI-1) lahko deluje kot potranskripcijski regulator v ''E. coli''. MSI-1 se pri sesalcih izraža predvsem v matičnih celicah živčne in epitelne linije. Ima pomembno vlogo pri diferenciaciji celic, regulaciji celičnega cikla in tumorogenezi, regulira pa tudi signalno pot Notch. Vsebuje dva RRM (RRM1 in RRM2), ki z nanomolarno afiniteto prepoznata konsenzno zaporedje RUnAGU na tarčni mRNA [1]. MSI-1 je alosterično inhibiran z nekaterimi maščobnimi kislinami, predvsem z ω-9 mononenasičenimi maščobnimi kislinami, ki vsebujejo med 18 in 22 ogljikovih atomov (npr. z oleinsko kislino) [2]. Uporabili so gen za mišji MSI-1, zato so optimizirali rabo kodonov za izražanje gena v ''E. coli''. Ker je C-končna regija mišjega MSI-1 nizko strukturno kompleksna, so z namenom povišanja topnosti proteina klonirali skrajšano obliko gena za MSI-1, ki je vključeval zapis za prvih 192 aminokislinskih ostankov. Izražanje gena za skrajšano obliko proteina (MSI-1*) je bilo pod nadzorom inducibilnega sintetičnega promotorja (poimenovan PLlac), ki je bil načrtovan na podlagi promotorja PL in reprimiran z represorjem LacI. Na transkripcijskem nivoju so z dodatkom laktoze ali β-D-1-tiogalaktopiranozida (IPTG) lahko inducirali izražanje gena za MSI-1*. Kot regulatorni element so uporabili Super folder GFP (sfGFP). Izražanje gena za sfGFP je bilo pod nadzorom konstitutivnega promotorja J23119. Zapis za sfGFP je po start kodonu vključeval dva prepoznavna motiva za MSI-1*, in sicer GUUAGU ter AUUUAGU, ki predvidoma tvorita sekundarno strukturo v obliki stebla. MSI-1* tako z vezavo na prepoznavna motiva na molekuli mRNA za sfGFP lahko zavre translacijo, saj sterično ovira vezavo ribosomalne podenote 30S na mRNA [1]. Tak način delovanja se razlikuje od tistega, ki poteka naravno pri sesalcih, saj se pri sesalcih MSI-1 veže na 3' UTR tarčne mRNA (''Numb'') in tako prepreči delovanje poli(A)-vezavnega proteina PABP in zavre translacijo [3]. Pri tako sestavljenem sinteznobiološkem vezju sta torej vhodna signala bila laktoza (ali IPTG) in oleinska kislina, izhodni signal je bila fluorescenca sfGFP. Takšno obnašanje sistema opišejo logična vrata IMPLY, torej se sfGFP ne izraža le v primeru, da je v sistemu laktoza (ali IPTG) in v sistemu ni oleinske kisline. Delovanje sinteznobiološkega vezja so karakterizirali s fluorimetrijo, merili so fluorescenco sfGFP (v AU) v odvisnosti od koncentracije laktoze (do 1 mM). Pri 1 mM koncentraciji laktoze je MSI-1* znižal sintezo sfGFP, in sicer za faktor 2.5. IPTG je povzročil zelo podoben odziv. Meritve celične rasti za vse indukcijske pogoje so pokazale, da je bila pri vseh pogojih rast celic skoraj konstantna, kar pomeni, da ekspresija gena za mišji protein MSI-1* ni povzročila motenj v rasti bakterijskih celic [1].

== Mehanizem interakcije med MSI-1* in prepoznavnim motivom na mRNA ==

Natančnejši vpogled v mehanizem interakcije med MSI-1* in prepoznavnima motivoma na mRNA, ki zapisuje za sfGFP, je omogočil izračun disociacijske konstante KD med mRNA in MSI-1*. Točkovna mutacija v enem prepoznavnem motivu (RUnCGU, mutanta 1) je povzročila zgolj 1.4x znižanje sinteze sfGFP v prisotnosti MSI-1* [1], s čimer so potrdili ugotovitev predhodnih raziskav, da je zaporedje UAG na prepoznavnem motivu ključno za specifično prepoznavo prepoznavnega motiva z MSI-1 [4]. Točkovni mutaciji v obeh prepoznavnih motivih (UAC namesto UAG, mutanta 5) sta povzročili zelo podoben odziv. Reporterski sistem z najkrajšim možnim konsenznim zaporedjem AUAGU ni pokazal nobene regulacije z MSI-1*, kar pomeni, da sta dve kopiji konsenznega zaporedja ključni za uspešno regulacijo izražanja gena za tarčni protein z MSI-1*. Pri ''in vitro'' eksperimentih vezavne kinetike so uporabili skrajšano obliko gena za človeški MSI-1h*. Meritve so izvajali s tehnologijo switchSENSE, ki omogoča meritve molekulske dinamike na čipu. dsDNA, imobilizirana na elektrodo iz Au v čipu, je imela fluorofor na enem koncu in prepoznavni motiv za vezavo MSI-1h* na drugem koncu. Vezava MSI-1h* (injiciran analit) na RNA povzroči spremembe v fluorescenci, ki se merijo v realnem času in omogočajo izračun kinetičnih konstant. V primeru originalnega prepoznavnega motiva na RNA (brez točkovnih mutacij) so dobili stopnjo asociacije kon = 1.1 nM-1 min-1, povprečen čas zadrževanja proteina MSI-1* na tarčni mRNA je bil 1.5 min (1/koff, koff je stopnja disociacije). Pri mutanti 1 je bila stopnja asociacije podobna kot pri nemutiranem prepoznavnem motivu, stopnja disociacije pa skoraj 4x hitrejša. Pri mutanti 5 pa sta bili moteni tako stopnja asociacije (15x manjša hitrost) kot stopnja disociacije (10x večja hitrost). Disociacijska konstanta KD (= koff/kon) je 0.62 nM za nemutirano obliko prepoznavnega motiva in 87 nM za mutanto 5 [1].

== Spreminjanje prepoznavnega motiva na mRNA z namenom povišanja dinamičnega razpona odziva ==

Raziskovalci so želeli preveriti, ali bi s spreminjanjem prepoznavnega motiva na mRNA za vezavo MSI-1 in z dodajanjem novih prepoznavnih motivov lahko povečali dinamičen razpon odziva. Najboljše rezultate je dal tretji reporterski sistem (redesign 3), ki je poleg obeh prepoznavnih motivov po start kodonu (sekundarna struktura v obliki zanke) vključeval še spremembe na 5' UTR zapisa za sfGFP. Na 5' UTR sta bila dodana dodatna prepoznavna motiva RUnAGU (GUUUAGU in AUUUAGU), ki sta obkrožala RBS in predvidoma nista tvorila sekundarnih struktur. Mišji MSI-1* je tako blokiral tudi vezavo RNA dela ribosomske podenote 30S. Ta reporterski sistem je povzročil približno 2x povišanje maksimalnega izražanja gena (brez laktoze) za sfGFP in 8.6x znižanje maksimalnega izražanja gena za sfGFP z MSI-1*, kar je v primerjavi z originalnim reporterskim sistemom (2 nemutirani prepoznavni zaporedji), kjer je bilo maksimalno znižanje izražanja gena 2.5x, velik napredek. Primerjava Hillovih koeficientov pri originalnem sistemu in redesign 3 (4.5 pri redesign 3, 1.7 pri originalnem sistemu) nakazuje na pozitivno kooperativnost vezave obeh molekul proteina MSI-1*, ki se lahko vežeta vsak na po 2 prepoznavni mesti [1].

== MSI-1* je alosterično inhibiran z oleinsko kislino ==

Protein MSI-1 je alosterično inhibiran z oleinsko kislino, ki se veže na domeno RRM1 na MSI-1 in preko konformacijske spremembe MSI-1 prepreči prepoznavno tarčne RNA. Z eksperimentom, ki temelji na spremenjeni mobilnosti molekul pri elektroforezi, so potrdili interakcijo med MSI-1* (koncentracija 45 µM) in RNA (koncentracija 11 µM), ki je bila popolnoma motena v prisotnosti 1 mM oleinske kisline. ''E. coli'' ima transporterje za vnos maščobnih kislin iz okolja (FadL in FadD). Z meritvami fluorescence sfGFP v posameznih celicah so ugotovili, da se je pri originalnem reporterskem sistemu (nemutirani prepoznavni mesti) delež celic v stanju ON (fluorescenca sfGFP nad določeno mejo) dvignil iz 10 % (pri 1 mM laktozi) na 49 % po dodatku 20 mM oleinske kisline. Prvotnih 93 % celic v stanju ON (ko ni bilo laktoze v sistemu) se ni povrnilo, najverjetneje ker se je oleinska kislina delno razgradila po vstopu v celice [1].

== Aplikacije proteina Musashi-1 ==

Transkripcijska regulacija ima svoje omejitve pri regulaciji specifičnega gena znotraj operona. Protein Musashi-1 bi lahko reguliral izražanje specifičnega gena, ki je del policistronskega operona. To bi lahko bilo uporabno pri regulaciji izražanja številnih encimov pri metabolnih poteh, torej pri metabolnem inženiringu. Uporaben bi bil tudi v kombinaciji s transkripcijskimi regulatorji, s čimer bi dosegli bolj raznoliko kombinirano regulacijo. Raziskovalci so z namenom potrditve teh dveh aplikacij proteina Musashi sestavili novo vezje, kjer sta ''sfGFP'' in ''mScarlet'' tvorila eno transkripcijsko enoto (bicistronski operon) pod nadzorom inducibilnega sintetičnega promotorja (PLtet), načrtovanega na podlagi promotorja PL, ki je bil reguliran s tetraciklinskim represorjem (TetR). Z dodatkom anhidrotetraciklina (aTC) so omogočili prepisovanje genov za sfGFP in mScarlet. Prepoznavni motivi na mRNA za vezavo MSI-1* so bili zgolj na začetku zapisa za sfGFP. Gen za MSI-1* je bil pod nadzorom promotorja PLlac, torej je za začetek transkripcije zapisa za MSI-1* bil potreben dodatek laktoze (ali IPTG). Obnašanje sistema opišejo logična vrata NIMPLY, pri čemer se zapis za sfGFP izraža zgolj v primeru prisotnosti aTC v sistemu in v odsotnosti laktoze v sistemu. Z dodatkom laktoze (1 mM) in aTC (100 ng/mL) v vseh kombinacijah (brez obeh, zgolj eden, oba) so pokazali specifično regulacijo izražanja gena za sfGFP v bicistronskem operonu in sposobnost kombiniranja regulatornih signalov z namenom združitve transkripcijske in potranskripcijske regulacije. Protein Musashi-1 je pokazal velik potencial pri potranskripcijski regulaciji v ''E. coli'', kar odpira možnosti za raziskave delovanja tudi drugih heterolognih RNA-vezavnih proteinov z RRM pri preprostejših organizmih [1].

== Literatura ==

[1] R. Dolcemascolo, M. Heras-Hernández, L. Goiriz, R. Montagud-Martínez, A. Requena-Menéndez, R. Ruiz, A. Pérez-Ràfols, R. A. Higuera-Rodríguez, G. Pérez-Ropero, W. F. Vranken, et al.: Repurposing the mammalian RNA-binding protein Musashi-1 as an allosteric translation repressor in bacteria. Elife 2024, 12.

[2] C. C. Clingman, L. M. Deveau, S. A. Hay, R. M. Genga, S. M. D. Shandilya, F. Massi, S. P. Ryder: Allosteric inhibition of a stem cell RNA-binding protein by an intermediary metabolite. Elife 2014, 2014.

[3] H. Kawahara, T. Imai, H. Imataka, M. Tsujimoto, K. Matsumoto, H. Okano: Neural RNA-binding protein Musashi1 inhibits translation initiation by competing with eIF4G for PABP. Journal of Cell Biology 2008, 181, 639–653.

[4] N. Ruth Zearfoss, L. M. Deveau, C. C. Clingman, E. Schmidt, E. S. Johnson, F. Massi, S. P. Ryder: A conserved three-nucleotide core motif defines musashi RNA binding specificity. Journal of Biological Chemistry 2014, 289, 35530–35541.

Seminarji SB 2023/24

2024-04-14T09:57:58Z

Markokovacic:

V študijskem letu 2023/24 študenti in študentke pri Sintezni biologiji predstavljajo naslednje teme:

RAZISKOVALNI ČLANKI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sinteznobiološki_pristop_k_sestavljanju_in_ponovnemu_zagonu_klinično_pomembnih_fagov_Pseudomonas_aeruginosa Sinteznobiološki pristop k sestavljanju in ponovnemu zagonu klinično pomembnih fagov ''Pseudomonas aeruginosa''] (Bor Krajnik)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Optogenetsko_prostorsko_vzorčenje_kooperacije_pri_glivah_kvasovkah Optogenetsko prostorsko vzorčenje kooperacije pri glivah kvasovkah] (Martin Stanonik)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sintetična_celična_linija_za_inducibilno_pakiranje_virusa_influence_A Sintetična celična linija za inducibilno pakiranje virusa influence A] (Klara Razboršek)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Uporaba_sesalskega_RNA-vezavnega_proteina_Musashi-1_kot_alosterično_reguliranega_translacijskega_represorja_v_E._coli Uporaba sesalskega RNA-vezavnega proteina Musashi-1 kot alosterično reguliranega translacijskega represorja v ''E. coli''] (Marko Kovačić)
#

NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/PhaseOut Biološka proizvodnja bioplastike] (Sašo Jakob)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BeeYeast Inženiring kvasovk za boj proti virusnim okužbam čebel] (Mateja Milošević)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Cellect Cellect - Fenotipsko stabilne celične linije] (Lucija Voga)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/oPHAelia oPHAelia - Inovativna rešitev za zmanjšanje onesnaževanja s plastiko] (Irina Kostadinoska)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/ReMixHD ReMixHD - Recikliranje mešanih plastičnih odpadkov] (Ema Kavčič)
----

Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Povzetek je treba objaviti dva dni pred predstavitvijo do polnoči (za seminarje v sredo torej v ponedeljek). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo približno 5-minutna razprava.

Terminski razpored je razviden iz preglednice na strežniku Google Drive.

Kako je videti seznam seminarjev, lahko preverite pri lanskem letniku: [[Seminarji_SB_2022/23]].

Seminarji SB 2023/24

2024-04-14T09:57:43Z

Markokovacic:

V študijskem letu 2023/24 študenti in študentke pri Sintezni biologiji predstavljajo naslednje teme:

RAZISKOVALNI ČLANKI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sinteznobiološki_pristop_k_sestavljanju_in_ponovnemu_zagonu_klinično_pomembnih_fagov_Pseudomonas_aeruginosa Sinteznobiološki pristop k sestavljanju in ponovnemu zagonu klinično pomembnih fagov ''Pseudomonas aeruginosa''] (Bor Krajnik)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Optogenetsko_prostorsko_vzorčenje_kooperacije_pri_glivah_kvasovkah Optogenetsko prostorsko vzorčenje kooperacije pri glivah kvasovkah] (Martin Stanonik)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sintetična_celična_linija_za_inducibilno_pakiranje_virusa_influence_A Sintetična celična linija za inducibilno pakiranje virusa influence A] (Klara Razboršek)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Uporaba_sesalskega_RNA-vezavnega_proteina_Musashi-1_kot_alosterično_reguliranega_translacijskega_represorja_v_E._coli Uporaba sesalskega RNA-vezavnega proteina Musashi-1 kot alosterično reguliranega translacijskega represorja v ''E.coli''] (Marko Kovačić)
#

NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/PhaseOut Biološka proizvodnja bioplastike] (Sašo Jakob)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BeeYeast Inženiring kvasovk za boj proti virusnim okužbam čebel] (Mateja Milošević)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Cellect Cellect - Fenotipsko stabilne celične linije] (Lucija Voga)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/oPHAelia oPHAelia - Inovativna rešitev za zmanjšanje onesnaževanja s plastiko] (Irina Kostadinoska)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/ReMixHD ReMixHD - Recikliranje mešanih plastičnih odpadkov] (Ema Kavčič)
----

Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Povzetek je treba objaviti dva dni pred predstavitvijo do polnoči (za seminarje v sredo torej v ponedeljek). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo približno 5-minutna razprava.

Terminski razpored je razviden iz preglednice na strežniku Google Drive.

Kako je videti seznam seminarjev, lahko preverite pri lanskem letniku: [[Seminarji_SB_2022/23]].

Seminarji SB 2023/24

2024-04-14T09:57:27Z

Markokovacic:

V študijskem letu 2023/24 študenti in študentke pri Sintezni biologiji predstavljajo naslednje teme:

RAZISKOVALNI ČLANKI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sinteznobiološki_pristop_k_sestavljanju_in_ponovnemu_zagonu_klinično_pomembnih_fagov_Pseudomonas_aeruginosa Sinteznobiološki pristop k sestavljanju in ponovnemu zagonu klinično pomembnih fagov ''Pseudomonas aeruginosa''] (Bor Krajnik)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Optogenetsko_prostorsko_vzorčenje_kooperacije_pri_glivah_kvasovkah Optogenetsko prostorsko vzorčenje kooperacije pri glivah kvasovkah] (Martin Stanonik)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sintetična_celična_linija_za_inducibilno_pakiranje_virusa_influence_A Sintetična celična linija za inducibilno pakiranje virusa influence A] (Klara Razboršek)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Uporaba_sesalskega_RNA-vezavnega_proteina_Musashi-1_kot_alosterično_reguliranega_translacijskega_represorja_v_E._coli Uporaba sesalskega RNA-vezavnega proteina Musashi-1 kot alosterično reguliranega translacijskega represorja v E.coli] (Marko Kovačić)
#

NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/PhaseOut Biološka proizvodnja bioplastike] (Sašo Jakob)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BeeYeast Inženiring kvasovk za boj proti virusnim okužbam čebel] (Mateja Milošević)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Cellect Cellect - Fenotipsko stabilne celične linije] (Lucija Voga)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/oPHAelia oPHAelia - Inovativna rešitev za zmanjšanje onesnaževanja s plastiko] (Irina Kostadinoska)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/ReMixHD ReMixHD - Recikliranje mešanih plastičnih odpadkov] (Ema Kavčič)
----

Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Povzetek je treba objaviti dva dni pred predstavitvijo do polnoči (za seminarje v sredo torej v ponedeljek). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo približno 5-minutna razprava.

Terminski razpored je razviden iz preglednice na strežniku Google Drive.

Kako je videti seznam seminarjev, lahko preverite pri lanskem letniku: [[Seminarji_SB_2022/23]].

Seminarji SB 2023/24

2024-04-14T09:25:17Z

Markokovacic:

V študijskem letu 2023/24 študenti in študentke pri Sintezni biologiji predstavljajo naslednje teme:

RAZISKOVALNI ČLANKI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sinteznobiološki_pristop_k_sestavljanju_in_ponovnemu_zagonu_klinično_pomembnih_fagov_Pseudomonas_aeruginosa Sinteznobiološki pristop k sestavljanju in ponovnemu zagonu klinično pomembnih fagov ''Pseudomonas aeruginosa''] (Bor Krajnik)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Optogenetsko_prostorsko_vzorčenje_kooperacije_pri_glivah_kvasovkah Optogenetsko prostorsko vzorčenje kooperacije pri glivah kvasovkah] (Martin Stanonik)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sintetična_celična_linija_za_inducibilno_pakiranje_virusa_influence_A Sintetična celična linija za inducibilno pakiranje virusa influence A] (Klara Razboršek)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Uporaba_sesalskega_RNA-vezavnega_proteina_Musashi-1_kot_alosterično_reguliranega_translacijskega_represorja_v_E._coli] (Marko Kovačić)
#

NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/PhaseOut Biološka proizvodnja bioplastike] (Sašo Jakob)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BeeYeast Inženiring kvasovk za boj proti virusnim okužbam čebel] (Mateja Milošević)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Cellect Cellect - Fenotipsko stabilne celične linije] (Lucija Voga)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/oPHAelia oPHAelia - Inovativna rešitev za zmanjšanje onesnaževanja s plastiko] (Irina Kostadinoska)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/ReMixHD ReMixHD - Recikliranje mešanih plastičnih odpadkov] (Ema Kavčič)
----

Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Povzetek je treba objaviti dva dni pred predstavitvijo do polnoči (za seminarje v sredo torej v ponedeljek). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo približno 5-minutna razprava.

Terminski razpored je razviden iz preglednice na strežniku Google Drive.

Kako je videti seznam seminarjev, lahko preverite pri lanskem letniku: [[Seminarji_SB_2022/23]].

Seminarji SB 2023/24

2024-04-14T09:22:34Z

Markokovacic:

V študijskem letu 2023/24 študenti in študentke pri Sintezni biologiji predstavljajo naslednje teme:

RAZISKOVALNI ČLANKI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sinteznobiološki_pristop_k_sestavljanju_in_ponovnemu_zagonu_klinično_pomembnih_fagov_Pseudomonas_aeruginosa Sinteznobiološki pristop k sestavljanju in ponovnemu zagonu klinično pomembnih fagov ''Pseudomonas aeruginosa''] (Bor Krajnik)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Optogenetsko_prostorsko_vzorčenje_kooperacije_pri_glivah_kvasovkah Optogenetsko prostorsko vzorčenje kooperacije pri glivah kvasovkah] (Martin Stanonik)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sintetična_celična_linija_za_inducibilno_pakiranje_virusa_influence_A Sintetična celična linija za inducibilno pakiranje virusa influence A] (Klara Razboršek)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Uporaba_sesalskega_RNA-vezavnega_proteina_Musashi-1_kot_alosterično_reguliranega_translacijskega_represorja_v_E._coli#Aplikacije_proteina_Musashi-1] (Marko Kovačić)
#

NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/PhaseOut Biološka proizvodnja bioplastike] (Sašo Jakob)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BeeYeast Inženiring kvasovk za boj proti virusnim okužbam čebel] (Mateja Milošević)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Cellect Cellect - Fenotipsko stabilne celične linije] (Lucija Voga)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/oPHAelia oPHAelia - Inovativna rešitev za zmanjšanje onesnaževanja s plastiko] (Irina Kostadinoska)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/ReMixHD ReMixHD - Recikliranje mešanih plastičnih odpadkov] (Ema Kavčič)
----

Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Povzetek je treba objaviti dva dni pred predstavitvijo do polnoči (za seminarje v sredo torej v ponedeljek). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo približno 5-minutna razprava.

Terminski razpored je razviden iz preglednice na strežniku Google Drive.

Kako je videti seznam seminarjev, lahko preverite pri lanskem letniku: [[Seminarji_SB_2022/23]].

Uporaba sesalskega RNA-vezavnega proteina Musashi-1 kot alosterično reguliranega translacijskega represorja v E. coli

2024-04-14T09:20:38Z

Markokovacic: /* Aplikacije proteina Musashi-1 */

Izhodiščni članek: [https://elifesciences.org/articles/91777]

== Uvod ==

Regulacija izražanja genov na potranskripcijskem nivoju se pri prokariontih in evkariontih razlikuje. Evkarionti imajo več RNA-vezavnih proteinov, ki imajo lahko številne funkcije in lahko delujejo tudi na specifičen način. Pri prokariontih stabilnost mRNA in iniciacijo translacije regulirajo predvsem majhne nekodirajoče RNA, RNA-vezavni proteini pa večinoma niso tako specifični. Pri živalih večina RNA-vezavnih proteinov vsebuje RNA-prepoznavne motive (RRM). RRM so majhne globularne domene, ki vključujejo okrog 90 aminokislinskih ostankov. Zvijejo se v 4 antiparalelne β-trakove in 2 α-vijačnici. Na enoverižno molekulo RNA se lahko vežejo z zadostno afiniteto in specifičnostjo ter tako specifično regulirajo biološke procese. Čeprav so RRM pomembni za potranskripcijsko regulacijo pri živalih, pa niso razširjeni pri vseh organizmih. Pri prokariontih je zelo malo proteinov z RRM, ki so bili odkriti predvsem z bioinformatskimi metodami, vendar pa imajo pogosto neznano funkcijo. Namen raziskave je bil odgovoriti na vprašanje, ali se živalski RRM lahko uporabijo v organizmih z enostavnejšo regulacijo izražanja genov. V kolikor bi to delovalo, bi potranskripcijska regulacija izražanja genov pri prokariontih preko specifičnih interakcij med heterolognimi RNA vezavnimi proteini z RRM in prokariontskimi mRNA ponudila številne nove možnosti za regulacijo sinteznobioloških vezij [1].

== Protein Musashi-1 lahko regulira iniciacijo translacije v ''E. coli'' ==

V raziskavi so želeli preveriti, ali sesalski RNA-vezavni protein Musashi-1 (MSI-1) lahko deluje kot potranskripcijski regulator v ''E. coli''. MSI-1 se pri sesalcih izraža predvsem v matičnih celicah živčne in epitelne linije. Ima pomembno vlogo pri diferenciaciji celic, regulaciji celičnega cikla in tumorogenezi, regulira pa tudi signalno pot Notch. Vsebuje dva RRM (RRM1 in RRM2), ki z nanomolarno afiniteto prepoznata konsenzno zaporedje RUnAGU na tarčni mRNA [1]. MSI-1 je alosterično inhibiran z nekaterimi maščobnimi kislinami, predvsem z ω-9 mononenasičenimi maščobnimi kislinami, ki vsebujejo med 18 in 22 ogljikovih atomov (npr. z oleinsko kislino) [2]. Uporabili so gen za mišji MSI-1, zato so optimizirali rabo kodonov za izražanje gena v ''E. coli''. Ker je C-končna regija mišjega MSI-1 nizko strukturno kompleksna, so z namenom povišanja topnosti proteina klonirali skrajšano obliko gena za MSI-1, ki je vključeval zapis za prvih 192 aminokislinskih ostankov. Izražanje gena za skrajšano obliko proteina (MSI-1*) je bilo pod nadzorom inducibilnega sintetičnega promotorja (poimenovan PLlac), ki je bil načrtovan na podlagi promotorja PL in reprimiran z represorjem LacI. Na transkripcijskem nivoju so z dodatkom laktoze ali β-D-1-tiogalaktopiranozida (IPTG) lahko inducirali izražanje gena za MSI-1*. Kot regulatorni element so uporabili Super folder GFP (sfGFP). Izražanje gena za sfGFP je bilo pod nadzorom konstitutivnega promotorja J23119. Zapis za sfGFP je po start kodonu vključeval dva prepoznavna motiva za MSI-1*, in sicer GUUAGU ter AUUUAGU, ki predvidoma tvorita sekundarno strukturo v obliki stebla. MSI-1* tako z vezavo na prepoznavna motiva na molekuli mRNA za sfGFP lahko zavre translacijo, saj sterično ovira vezavo ribosomalne podenote 30S na mRNA [1]. Tak način delovanja se razlikuje od tistega, ki poteka naravno pri sesalcih, saj se pri sesalcih MSI-1 veže na 3' UTR tarčne mRNA (''Numb'') in tako prepreči delovanje poli(A)-vezavnega proteina PABP in zavre translacijo [3]. Pri tako sestavljenem sinteznobiološkem vezju sta torej vhodna signala bila laktoza (ali IPTG) in oleinska kislina, izhodni signal je bila fluorescenca sfGFP. Takšno obnašanje sistema opišejo logična vrata IMPLY, torej se sfGFP ne izraža le v primeru, da je v sistemu laktoza (ali IPTG) in v sistemu ni oleinske kisline. Delovanje sinteznobiološkega vezja so karakterizirali s fluorimetrijo, merili so fluorescenco sfGFP (v AU) v odvisnosti od koncentracije laktoze (do 1 mM). Pri 1 mM koncentraciji laktoze je MSI-1* znižal sintezo sfGFP, in sicer za faktor 2.5. IPTG je povzročil zelo podoben odziv. Meritve celične rasti za vse indukcijske pogoje so pokazale, da je bila pri vseh pogojih rast celic skoraj konstantna, kar pomeni, da ekspresija gena za mišji protein MSI-1* ni povzročila motenj v rasti bakterijskih celic [1].

== Mehanizem interakcije med MSI-1* in prepoznavnim motivom na mRNA ==

Natančnejši vpogled v mehanizem interakcije med MSI-1* in prepoznavnima motivoma na mRNA, ki zapisuje za sfGFP, je omogočil izračun disociacijske konstante KD med mRNA in MSI-1*. Točkovna mutacija v enem prepoznavnem motivu (RUnCGU, mutanta 1) je povzročila zgolj 1.4x znižanje sinteze sfGFP v prisotnosti MSI-1* [1], s čimer so potrdili ugotovitev predhodnih raziskav, da je zaporedje UAG na prepoznavnem motivu ključno za specifično prepoznavo prepoznavnega motiva z MSI-1 [4]. Točkovni mutaciji v obeh prepoznavnih motivih (UAC namesto UAG, mutanta 5) sta povzročili zelo podoben odziv. Reporterski sistem z najkrajšim možnim konsenznim zaporedjem AUAGU ni pokazal nobene regulacije z MSI-1*, kar pomeni, da sta dve kopiji konsenznega zaporedja ključni za uspešno regulacijo izražanja gena za tarčni protein z MSI-1*. Pri ''in vitro'' eksperimentih vezavne kinetike so uporabili skrajšano obliko gena za človeški MSI-1h*. Meritve so izvajali s tehnologijo switchSENSE, ki omogoča meritve molekulske dinamike na čipu. dsDNA, imobilizirana na elektrodo iz Au v čipu, je imela fluorofor na enem koncu in prepoznavni motiv za vezavo MSI-1h* na drugem koncu. Vezava MSI-1h* (injiciran analit) na RNA povzroči spremembe v fluorescenci, ki se merijo v realnem času in omogočajo izračun kinetičnih konstant. V primeru originalnega prepoznavnega motiva na RNA (brez točkovnih mutacij) so dobili stopnjo asociacije kon = 1.1 nM-1 min-1, povprečen čas zadrževanja proteina MSI-1* na tarčni mRNA je bil 1.5 min (1/koff, koff je stopnja disociacije). Pri mutanti 1 je bila stopnja asociacije podobna kot pri nemutiranem prepoznavnem motivu, stopnja disociacije pa skoraj 4x hitrejša. Pri mutanti 5 pa sta bili moteni tako stopnja asociacije (15x manjša hitrost) kot stopnja disociacije (10x večja hitrost). Disociacijska konstanta KD (= koff/kon) je 0.62 nM za nemutirano obliko prepoznavnega motiva in 87 nM za mutanto 5 [1].

== Spreminjanje prepoznavnega motiva na mRNA z namenom povišanja dinamičnega razpona odziva ==

Raziskovalci so želeli preveriti, ali bi s spreminjanjem prepoznavnega motiva na mRNA za vezavo MSI-1 in z dodajanjem novih prepoznavnih motivov lahko povečali dinamičen razpon odziva. Najboljše rezultate je dal tretji reporterski sistem (redesign 3), ki je poleg obeh prepoznavnih motivov po start kodonu (sekundarna struktura v obliki zanke) vključeval še spremembe na 5' UTR zapisa za sfGFP. Na 5' UTR sta bila dodana dodatna prepoznavna motiva RUnAGU (GUUUAGU in AUUUAGU), ki sta obkrožala RBS in predvidoma nista tvorila sekundarnih struktur. Mišji MSI-1* je tako blokiral tudi vezavo RNA dela ribosomske podenote 30S. Ta reporterski sistem je povzročil približno 2x povišanje maksimalnega izražanja gena (brez laktoze) za sfGFP in 8.6x znižanje maksimalnega izražanja gena za sfGFP z MSI-1*, kar je v primerjavi z originalnim reporterskim sistemom (2 nemutirani prepoznavni zaporedji), kjer je bilo maksimalno znižanje izražanja gena 2.5x, velik napredek. Primerjava Hillovih koeficientov pri originalnem sistemu in redesign 3 (4.5 pri redesign 3, 1.7 pri originalnem sistemu) nakazuje na pozitivno kooperativnost vezave obeh molekul proteina MSI-1*, ki se lahko vežeta vsak na po 2 prepoznavni mesti [1].

== MSI-1* je alosterično inhibiran z oleinsko kislino ==

Protein MSI-1 je alosterično inhibiran z oleinsko kislino, ki se veže na domeno RRM1 na MSI-1 in preko konformacijske spremembe MSI-1 prepreči prepoznavno tarčne RNA. Z eksperimentom, ki temelji na spremenjeni mobilnosti molekul pri elektroforezi, so potrdili interakcijo med MSI-1* (koncentracija 45 µM) in RNA (koncentracija 11 µM), ki je bila popolnoma motena v prisotnosti 1 mM oleinske kisline. ''E. coli'' ima transporterje za vnos maščobnih kislin iz okolja (FadL in FadD). Z meritvami fluorescence sfGFP v posameznih celicah so ugotovili, da se je pri originalnem reporterskem sistemu (nemutirani prepoznavni mesti) delež celic v stanju ON (fluorescenca sfGFP nad določeno mejo) dvignil iz 10 % (pri 1 mM laktozi) na 49 % po dodatku 20 mM oleinske kisline. Prvotnih 93 % celic v stanju ON (ko ni bilo laktoze v sistemu) se ni povrnilo, najverjetneje ker se je oleinska kislina delno razgradila po vstopu v celice [1].

== Aplikacije proteina Musashi-1 ==

Transkripcijska regulacija ima svoje omejitve pri regulaciji specifičnega gena znotraj operona. Protein Musashi-1 bi lahko reguliral izražanje specifičnega gena, ki je del policistronskega operona. To bi lahko bilo uporabno pri regulaciji izražanja številnih encimov pri metabolnih poteh, torej pri metabolnem inženiringu. Uporaben bi bil tudi v kombinaciji s transkripcijskimi regulatorji, s čimer bi dosegli bolj raznoliko kombinirano regulacijo. Raziskovalci so z namenom potrditve teh dveh aplikacij proteina Musashi sestavili novo vezje, kjer sta ''sfGFP'' in ''mScarlet'' tvorila eno transkripcijsko enoto (bicistronski operon) pod nadzorom inducibilnega sintetičnega promotorja (PLtet), načrtovanega na podlagi promotorja PL, ki je bil reguliran s tetraciklinskim represorjem (TetR). Z dodatkom anhidrotetraciklina (aTC) so omogočili prepisovanje genov za sfGFP in mScarlet. Prepoznavni motivi na mRNA za vezavo MSI-1* so bili zgolj na začetku zapisa za sfGFP. Gen za MSI-1* je bil pod nadzorom promotorja PLlac, torej je za začetek transkripcije zapisa za MSI-1* bil potreben dodatek laktoze (ali IPTG). Obnašanje sistema opišejo logična vrata NIMPLY, pri čemer se zapis za sfGFP izraža zgolj v primeru prisotnosti aTC v sistemu in v odsotnosti laktoze v sistemu. Z dodatkom laktoze (1 mM) in aTC (100 ng/mL) v vseh kombinacijah (brez obeh, zgolj eden, oba) so pokazali specifično regulacijo izražanja gena za sfGFP v bicistronskem operonu in sposobnost kombiniranja regulatornih signalov z namenom združitve transkripcijske in potranskripcijske regulacije. Protein Musashi-1 je pokazal velik potencial pri potranskripcijski regulaciji v ''E. coli'', kar odpira možnosti za raziskave delovanja tudi drugih heterolognih RNA-vezavnih proteinov z RRM pri preprostejših organizmih [1].

== Literatura ==

[1] R. Dolcemascolo, M. Heras-Hernández, L. Goiriz, R. Montagud-Martínez, A. Requena-Menéndez, R. Ruiz, A. Pérez-Ràfols, R. A. Higuera-Rodríguez, G. Pérez-Ropero, W. F. Vranken, et al.: Repurposing the mammalian RNA-binding protein Musashi-1 as an allosteric translation repressor in bacteria. Elife 2024, 12.

[2] C. C. Clingman, L. M. Deveau, S. A. Hay, R. M. Genga, S. M. D. Shandilya, F. Massi, S. P. Ryder: Allosteric inhibition of a stem cell RNA-binding protein by an intermediary metabolite. Elife 2014, 2014.

[3] H. Kawahara, T. Imai, H. Imataka, M. Tsujimoto, K. Matsumoto, H. Okano: Neural RNA-binding protein Musashi1 inhibits translation initiation by competing with eIF4G for PABP. Journal of Cell Biology 2008, 181, 639–653.

[4] N. Ruth Zearfoss, L. M. Deveau, C. C. Clingman, E. Schmidt, E. S. Johnson, F. Massi, S. P. Ryder: A conserved three-nucleotide core motif defines musashi RNA binding specificity. Journal of Biological Chemistry 2014, 289, 35530–35541.

Uporaba sesalskega RNA-vezavnega proteina Musashi-1 kot alosterično reguliranega translacijskega represorja v E. coli

2024-04-14T09:19:00Z

Markokovacic: /* Mehanizem interakcije med MSI-1* in prepoznavnim motivom na mRNA */

Uporaba sesalskega RNA-vezavnega proteina Musashi-1 kot alosterično reguliranega translacijskega represorja v E. coli

2024-04-14T09:18:10Z

Markokovacic: /* Mehanizem interakcije med MSI-1* in prepoznavnim motivom na mRNA */

Izhodiščni članek: [https://elifesciences.org/articles/91777]

== Uvod ==

Regulacija izražanja genov na potranskripcijskem nivoju se pri prokariontih in evkariontih razlikuje. Evkarionti imajo več RNA-vezavnih proteinov, ki imajo lahko številne funkcije in lahko delujejo tudi na specifičen način. Pri prokariontih stabilnost mRNA in iniciacijo translacije regulirajo predvsem majhne nekodirajoče RNA, RNA-vezavni proteini pa večinoma niso tako specifični. Pri živalih večina RNA-vezavnih proteinov vsebuje RNA-prepoznavne motive (RRM). RRM so majhne globularne domene, ki vključujejo okrog 90 aminokislinskih ostankov. Zvijejo se v 4 antiparalelne β-trakove in 2 α-vijačnici. Na enoverižno molekulo RNA se lahko vežejo z zadostno afiniteto in specifičnostjo ter tako specifično regulirajo biološke procese. Čeprav so RRM pomembni za potranskripcijsko regulacijo pri živalih, pa niso razširjeni pri vseh organizmih. Pri prokariontih je zelo malo proteinov z RRM, ki so bili odkriti predvsem z bioinformatskimi metodami, vendar pa imajo pogosto neznano funkcijo. Namen raziskave je bil odgovoriti na vprašanje, ali se živalski RRM lahko uporabijo v organizmih z enostavnejšo regulacijo izražanja genov. V kolikor bi to delovalo, bi potranskripcijska regulacija izražanja genov pri prokariontih preko specifičnih interakcij med heterolognimi RNA vezavnimi proteini z RRM in prokariontskimi mRNA ponudila številne nove možnosti za regulacijo sinteznobioloških vezij [1].

== Protein Musashi-1 lahko regulira iniciacijo translacije v ''E. coli'' ==

V raziskavi so želeli preveriti, ali sesalski RNA-vezavni protein Musashi-1 (MSI-1) lahko deluje kot potranskripcijski regulator v ''E. coli''. MSI-1 se pri sesalcih izraža predvsem v matičnih celicah živčne in epitelne linije. Ima pomembno vlogo pri diferenciaciji celic, regulaciji celičnega cikla in tumorogenezi, regulira pa tudi signalno pot Notch. Vsebuje dva RRM (RRM1 in RRM2), ki z nanomolarno afiniteto prepoznata konsenzno zaporedje RUnAGU na tarčni mRNA [1]. MSI-1 je alosterično inhibiran z nekaterimi maščobnimi kislinami, predvsem z ω-9 mononenasičenimi maščobnimi kislinami, ki vsebujejo med 18 in 22 ogljikovih atomov (npr. z oleinsko kislino) [2]. Uporabili so gen za mišji MSI-1, zato so optimizirali rabo kodonov za izražanje gena v ''E. coli''. Ker je C-končna regija mišjega MSI-1 nizko strukturno kompleksna, so z namenom povišanja topnosti proteina klonirali skrajšano obliko gena za MSI-1, ki je vključeval zapis za prvih 192 aminokislinskih ostankov. Izražanje gena za skrajšano obliko proteina (MSI-1*) je bilo pod nadzorom inducibilnega sintetičnega promotorja (poimenovan PLlac), ki je bil načrtovan na podlagi promotorja PL in reprimiran z represorjem LacI. Na transkripcijskem nivoju so z dodatkom laktoze ali β-D-1-tiogalaktopiranozida (IPTG) lahko inducirali izražanje gena za MSI-1*. Kot regulatorni element so uporabili Super folder GFP (sfGFP). Izražanje gena za sfGFP je bilo pod nadzorom konstitutivnega promotorja J23119. Zapis za sfGFP je po start kodonu vključeval dva prepoznavna motiva za MSI-1*, in sicer GUUAGU ter AUUUAGU, ki predvidoma tvorita sekundarno strukturo v obliki stebla. MSI-1* tako z vezavo na prepoznavna motiva na molekuli mRNA za sfGFP lahko zavre translacijo, saj sterično ovira vezavo ribosomalne podenote 30S na mRNA [1]. Tak način delovanja se razlikuje od tistega, ki poteka naravno pri sesalcih, saj se pri sesalcih MSI-1 veže na 3' UTR tarčne mRNA (''Numb'') in tako prepreči delovanje poli(A)-vezavnega proteina PABP in zavre translacijo [3]. Pri tako sestavljenem sinteznobiološkem vezju sta torej vhodna signala bila laktoza (ali IPTG) in oleinska kislina, izhodni signal je bila fluorescenca sfGFP. Takšno obnašanje sistema opišejo logična vrata IMPLY, torej se sfGFP ne izraža le v primeru, da je v sistemu laktoza (ali IPTG) in v sistemu ni oleinske kisline. Delovanje sinteznobiološkega vezja so karakterizirali s fluorimetrijo, merili so fluorescenco sfGFP (v AU) v odvisnosti od koncentracije laktoze (do 1 mM). Pri 1 mM koncentraciji laktoze je MSI-1* znižal sintezo sfGFP, in sicer za faktor 2.5. IPTG je povzročil zelo podoben odziv. Meritve celične rasti za vse indukcijske pogoje so pokazale, da je bila pri vseh pogojih rast celic skoraj konstantna, kar pomeni, da ekspresija gena za mišji protein MSI-1* ni povzročila motenj v rasti bakterijskih celic [1].

== Mehanizem interakcije med MSI-1* in prepoznavnim motivom na mRNA ==

Natančnejši vpogled v mehanizem interakcije med MSI-1* in prepoznavnima motivoma na mRNA, ki zapisuje za sfGFP, je omogočil izračun disociacijske konstante KD med mRNA in MSI-1*. Točkovna mutacija v enem prepoznavnem motivu (RUnCGU, mutanta 1) je povzročila zgolj 1.4x znižanje sinteze sfGFP v prisotnosti MSI-1* [1], s čimer so potrdili ugotovitev predhodnih raziskav, da je zaporedje UAG na prepoznavnem motivu ključno za specifično prepoznavo prepoznavnega motiva z MSI-1 [4]. Točkovni mutaciji v obeh prepoznavnih motivih (UAC namesto UAG, mutanta 5) sta povzročili zelo podoben odziv. Reporterski sistem z najkrajšim možnim konsenznim zaporedjem AUAGU ni pokazal nobene regulacije z MSI-1*, kar pomeni, da sta dve kopiji konsenznega zaporedja ključni za uspešno regulacijo izražanja gena za tarčni protein z MSI-1*. Pri ''in vitro'' eksperimentih vezavne kinetike so uporabili skrajšano obliko gena za človeški MSI-1h*. Meritve so izvajali s tehnologijo switchSENSE, ki omgooča meritve molekulske dinamike na čipu. dsDNA, imobilizirana na elektrodo iz Au v čipu, je imela fluorofor na enem koncu in prepoznavni motiv za vezavo MSI-1h* na drugem koncu. Vezava MSI-1h* (injiciran analit) na RNA povzroči spremembe v fluorescenci, ki se merijo v realnem času in omogočajo izračun kinetičnih konstant. V primeru originalnega prepoznavnega motiva na RNA (brez točkovnih mutacij) so dobili stopnjo asociacije kon = 1.1 nM-1 min-1, povprečen čas zadrževanja proteina MSI-1* na tarčni mRNA je bil 1.5 min (1/koff, koff je stopnja disociacije). Pri mutanti 1 je bila stopnja asociacije podobna kot pri nemutiranem prepoznavnem motivu, stopnja disociacije pa skoraj 4x hitrejša. Pri mutanti 5 pa sta bili moteni tako stopnja asociacije (15x manjša hitrost) kot stopnja disociacije (10x večja hitrost). Disociacijska konstanta KD (= koff/kon) je 0.62 nM za nemutirano obliko prepoznavnega motiva in 87 nM za mutanto 5 [1].

== Spreminjanje prepoznavnega motiva na mRNA z namenom povišanja dinamičnega razpona odziva ==

Raziskovalci so želeli preveriti, ali bi s spreminjanjem prepoznavnega motiva na mRNA za vezavo MSI-1 in z dodajanjem novih prepoznavnih motivov lahko povečali dinamičen razpon odziva. Najboljše rezultate je dal tretji reporterski sistem (redesign 3), ki je poleg obeh prepoznavnih motivov po start kodonu (sekundarna struktura v obliki zanke) vključeval še spremembe na 5' UTR zapisa za sfGFP. Na 5' UTR sta bila dodana dodatna prepoznavna motiva RUnAGU (GUUUAGU in AUUUAGU), ki sta obkrožala RBS in predvidoma nista tvorila sekundarnih struktur. Mišji MSI-1* je tako blokiral tudi vezavo RNA dela ribosomske podenote 30S. Ta reporterski sistem je povzročil približno 2x povišanje maksimalnega izražanja gena (brez laktoze) za sfGFP in 8.6x znižanje maksimalnega izražanja gena za sfGFP z MSI-1*, kar je v primerjavi z originalnim reporterskim sistemom (2 nemutirani prepoznavni zaporedji), kjer je bilo maksimalno znižanje izražanja gena 2.5x, velik napredek. Primerjava Hillovih koeficientov pri originalnem sistemu in redesign 3 (4.5 pri redesign 3, 1.7 pri originalnem sistemu) nakazuje na pozitivno kooperativnost vezave obeh molekul proteina MSI-1*, ki se lahko vežeta vsak na po 2 prepoznavni mesti [1].

== MSI-1* je alosterično inhibiran z oleinsko kislino ==

Protein MSI-1 je alosterično inhibiran z oleinsko kislino, ki se veže na domeno RRM1 na MSI-1 in preko konformacijske spremembe MSI-1 prepreči prepoznavno tarčne RNA. Z eksperimentom, ki temelji na spremenjeni mobilnosti molekul pri elektroforezi, so potrdili interakcijo med MSI-1* (koncentracija 45 µM) in RNA (koncentracija 11 µM), ki je bila popolnoma motena v prisotnosti 1 mM oleinske kisline. ''E. coli'' ima transporterje za vnos maščobnih kislin iz okolja (FadL in FadD). Z meritvami fluorescence sfGFP v posameznih celicah so ugotovili, da se je pri originalnem reporterskem sistemu (nemutirani prepoznavni mesti) delež celic v stanju ON (fluorescenca sfGFP nad določeno mejo) dvignil iz 10 % (pri 1 mM laktozi) na 49 % po dodatku 20 mM oleinske kisline. Prvotnih 93 % celic v stanju ON (ko ni bilo laktoze v sistemu) se ni povrnilo, najverjetneje ker se je oleinska kislina delno razgradila po vstopu v celice [1].

== Aplikacije proteina Musashi-1 ==

Transkripcijska regulacija ima svoje omejitve pri regulaciji specifičnega gena znotraj operona. Protein Musashi-1 bi lahko reguliral izražanje specifičnega gena, ki je del policistronskega operona. To bi lahko bilo uporabno pri regulaciji izražanja številnih encimov pri metabolnih poteh, torej pri metabolnem inženiringu. Uporaben bi bil tudi v kombinaciji s transkripcijskimi regulatorji, s čimer bi dosegli bolj raznoliko kombinirano regulacijo. Raziskovalci so z namenom potrditve teh dveh aplikacij proteina Musashi sestavili novo vezje, kjer sta ''sfGFP'' in ''mScarlet'' tvorila eno transkripcijsko enoto (bicistronski operon) pod nadzorom inducibilnega sintetičnega promotorja (PLtet), načrtovanega na podlagi promotorja PL, ki je bil reguliran s tetraciklinskim represorjem (TetR). Z dodatkom anhidrotetraciklina (aTC) so omogočili prepisovanje genov za sfGFP in mScarlet. Prepoznavni motivi na mRNA za vezavo MSI-1* so bili zgolj na začetku zapisa za sfGFP. Gen za MSI-1* je bil pod nadzorom promotorja PLlac, torej je za začetek transkripcije zapisa za MSI-1* bil potreben dodatek laktoze (ali IPTG). Obnašanje sistema opišejo logična vrata NIMPLY, pri čemer se zapis za sfGFP izraža zgolj v primeru prisotnosti aTC v sistemu in v odsotnosti laktoze v sistemu. Z dodatkom laktoze (1 mM) in aTC (100 ng/mL) v vseh kombinacijah (brez obeh, zgolj eden, oba) so pokazali specifično regulacijo izražanja gena za sfGFP v bicistronskem operonu in sposobnost kombiniranja regulatornih signalov z namenom združitve transkripcijske in potranskripcijske regulacije. Protein Musashi-1 je pokazal velik potencial pri potranskripcijski regulaciji v ''E. coli'', kar odpira možnosti za raziskave delovanja tudi drugih heterolognih RNA-vezavnih proteinov z RRM pri preprostejših organizmih [1].

== Literatura ==

[1] R. Dolcemascolo, M. Heras-Hernández, L. Goiriz, R. Montagud-Martínez, A. Requena-Menéndez, R. Ruiz, A. Pérez-Ràfols, R. A. Higuera-Rodríguez, G. Pérez-Ropero, W. F. Vranken, et al.: Repurposing the mammalian RNA-binding protein Musashi-1 as an allosteric translation repressor in bacteria. Elife 2024, 12.

[2] C. C. Clingman, L. M. Deveau, S. A. Hay, R. M. Genga, S. M. D. Shandilya, F. Massi, S. P. Ryder: Allosteric inhibition of a stem cell RNA-binding protein by an intermediary metabolite. Elife 2014, 2014.

[3] H. Kawahara, T. Imai, H. Imataka, M. Tsujimoto, K. Matsumoto, H. Okano: Neural RNA-binding protein Musashi1 inhibits translation initiation by competing with eIF4G for PABP. Journal of Cell Biology 2008, 181, 639–653.

[4] N. Ruth Zearfoss, L. M. Deveau, C. C. Clingman, E. Schmidt, E. S. Johnson, F. Massi, S. P. Ryder: A conserved three-nucleotide core motif defines musashi RNA binding specificity. Journal of Biological Chemistry 2014, 289, 35530–35541.

Uporaba sesalskega RNA-vezavnega proteina Musashi-1 kot alosterično reguliranega translacijskega represorja v E. coli

2024-04-14T09:12:43Z

Markokovacic: /* Mehanizem interakcije med MSI-1* in prepoznavnim motivom na mRNA */

Izhodiščni članek: [https://elifesciences.org/articles/91777]

== Uvod ==

Regulacija izražanja genov na potranskripcijskem nivoju se pri prokariontih in evkariontih razlikuje. Evkarionti imajo več RNA-vezavnih proteinov, ki imajo lahko številne funkcije in lahko delujejo tudi na specifičen način. Pri prokariontih stabilnost mRNA in iniciacijo translacije regulirajo predvsem majhne nekodirajoče RNA, RNA-vezavni proteini pa večinoma niso tako specifični. Pri živalih večina RNA-vezavnih proteinov vsebuje RNA-prepoznavne motive (RRM). RRM so majhne globularne domene, ki vključujejo okrog 90 aminokislinskih ostankov. Zvijejo se v 4 antiparalelne β-trakove in 2 α-vijačnici. Na enoverižno molekulo RNA se lahko vežejo z zadostno afiniteto in specifičnostjo ter tako specifično regulirajo biološke procese. Čeprav so RRM pomembni za potranskripcijsko regulacijo pri živalih, pa niso razširjeni pri vseh organizmih. Pri prokariontih je zelo malo proteinov z RRM, ki so bili odkriti predvsem z bioinformatskimi metodami, vendar pa imajo pogosto neznano funkcijo. Namen raziskave je bil odgovoriti na vprašanje, ali se živalski RRM lahko uporabijo v organizmih z enostavnejšo regulacijo izražanja genov. V kolikor bi to delovalo, bi potranskripcijska regulacija izražanja genov pri prokariontih preko specifičnih interakcij med heterolognimi RNA vezavnimi proteini z RRM in prokariontskimi mRNA ponudila številne nove možnosti za regulacijo sinteznobioloških vezij [1].

== Protein Musashi-1 lahko regulira iniciacijo translacije v ''E. coli'' ==

V raziskavi so želeli preveriti, ali sesalski RNA-vezavni protein Musashi-1 (MSI-1) lahko deluje kot potranskripcijski regulator v ''E. coli''. MSI-1 se pri sesalcih izraža predvsem v matičnih celicah živčne in epitelne linije. Ima pomembno vlogo pri diferenciaciji celic, regulaciji celičnega cikla in tumorogenezi, regulira pa tudi signalno pot Notch. Vsebuje dva RRM (RRM1 in RRM2), ki z nanomolarno afiniteto prepoznata konsenzno zaporedje RUnAGU na tarčni mRNA [1]. MSI-1 je alosterično inhibiran z nekaterimi maščobnimi kislinami, predvsem z ω-9 mononenasičenimi maščobnimi kislinami, ki vsebujejo med 18 in 22 ogljikovih atomov (npr. z oleinsko kislino) [2]. Uporabili so gen za mišji MSI-1, zato so optimizirali rabo kodonov za izražanje gena v ''E. coli''. Ker je C-končna regija mišjega MSI-1 nizko strukturno kompleksna, so z namenom povišanja topnosti proteina klonirali skrajšano obliko gena za MSI-1, ki je vključeval zapis za prvih 192 aminokislinskih ostankov. Izražanje gena za skrajšano obliko proteina (MSI-1*) je bilo pod nadzorom inducibilnega sintetičnega promotorja (poimenovan PLlac), ki je bil načrtovan na podlagi promotorja PL in reprimiran z represorjem LacI. Na transkripcijskem nivoju so z dodatkom laktoze ali β-D-1-tiogalaktopiranozida (IPTG) lahko inducirali izražanje gena za MSI-1*. Kot regulatorni element so uporabili Super folder GFP (sfGFP). Izražanje gena za sfGFP je bilo pod nadzorom konstitutivnega promotorja J23119. Zapis za sfGFP je po start kodonu vključeval dva prepoznavna motiva za MSI-1*, in sicer GUUAGU ter AUUUAGU, ki predvidoma tvorita sekundarno strukturo v obliki stebla. MSI-1* tako z vezavo na prepoznavna motiva na molekuli mRNA za sfGFP lahko zavre translacijo, saj sterično ovira vezavo ribosomalne podenote 30S na mRNA [1]. Tak način delovanja se razlikuje od tistega, ki poteka naravno pri sesalcih, saj se pri sesalcih MSI-1 veže na 3' UTR tarčne mRNA (''Numb'') in tako prepreči delovanje poli(A)-vezavnega proteina PABP in zavre translacijo [3]. Pri tako sestavljenem sinteznobiološkem vezju sta torej vhodna signala bila laktoza (ali IPTG) in oleinska kislina, izhodni signal je bila fluorescenca sfGFP. Takšno obnašanje sistema opišejo logična vrata IMPLY, torej se sfGFP ne izraža le v primeru, da je v sistemu laktoza (ali IPTG) in v sistemu ni oleinske kisline. Delovanje sinteznobiološkega vezja so karakterizirali s fluorimetrijo, merili so fluorescenco sfGFP (v AU) v odvisnosti od koncentracije laktoze (do 1 mM). Pri 1 mM koncentraciji laktoze je MSI-1* znižal sintezo sfGFP, in sicer za faktor 2.5. IPTG je povzročil zelo podoben odziv. Meritve celične rasti za vse indukcijske pogoje so pokazale, da je bila pri vseh pogojih rast celic skoraj konstantna, kar pomeni, da ekspresija gena za mišji protein MSI-1* ni povzročila motenj v rasti bakterijskih celic [1].

== Mehanizem interakcije med MSI-1* in prepoznavnim motivom na mRNA ==

Natančnejši vpogled v mehanizem interakcije med MSI-1* in prepoznavnima motivoma na mRNA, ki zapisuje za sfGFP, je omogočil izračun disociacijske konstante KD med mRNA in MSI-1*. Točkovna mutacija v enem prepoznavnem motivu (RUnCGU, mutanta 1) je povzročil zgolj 1.4x znižanje sinteze sfGFP v prisotnosti MSI-1* [1], s čimer so potrdili ugotovitev predhodnih raziskav, da je zaporedje UAG na prepoznavnem motivu ključno za specifično prepoznavo prepoznavnega motiva z MSI-1 [4]. Točkovni mutaciji v obeh prepoznavnih motivih (UAC namesto UAG, mutanta 5) sta povzročili zelo podoben odziv. Reporterski sistem z najkrajšim možnim konsenznim zaporedjem AUAGU ni pokazal nobene regulacije z MSI-1*, kar pomeni, da sta dve kopiji konsenznega zaporedja ključni za uspešno regulacijo izražanja gena za tarčni protein z MSI-1*. Pri ''in vitro'' eksperimentih vezavne kinetike so uporabili skrajšano obliko gena za človeški MSI-1h*. Meritve so izvajali s tehnologijo switchSENSE, ki omgooča meritve molekulske dinamike na čipu. dsDNA, imobilizirana na elektrodo iz Au v čipu, je imela fluorofor na enem koncu in prepoznavni motiv za vezavo MSI-1h* na drugem koncu. Vezava MSI-1h* (injiciran analit) na RNA povzroči spremembe v fluorescenci, ki se merijo v realnem času in omogočajo izračun kinetičnih konstant. V primeru originalnega prepoznavnega motiva na RNA (brez točkovnih mutacij) so dobili stopnjo asociacije kon = 1.1 nM-1 min-1, povprečen čas zadrževanja proteina MSI-1* na tarčni mRNA je bil 1.5 min (1/koff, koff je stopnja disociacije). Pri mutanti 1 je bila stopnja asociacije podobna kot pri nemutiranem prepoznavnem motivu, stopnja disociacije pa skoraj 4x hitrejša. Pri mutanti 5 pa sta bili moteni tako stopnja asociacije (15x manjša hitrost) kot stopnja disociacije (10x večja hitrost). Disociacijska konstanta KD (= koff/kon) je 0.62 nM za nemutirano obliko prepoznavnega motiva in 87 nM za mutanto 5 [1].

== Spreminjanje prepoznavnega motiva na mRNA z namenom povišanja dinamičnega razpona odziva ==

Raziskovalci so želeli preveriti, ali bi s spreminjanjem prepoznavnega motiva na mRNA za vezavo MSI-1 in z dodajanjem novih prepoznavnih motivov lahko povečali dinamičen razpon odziva. Najboljše rezultate je dal tretji reporterski sistem (redesign 3), ki je poleg obeh prepoznavnih motivov po start kodonu (sekundarna struktura v obliki zanke) vključeval še spremembe na 5' UTR zapisa za sfGFP. Na 5' UTR sta bila dodana dodatna prepoznavna motiva RUnAGU (GUUUAGU in AUUUAGU), ki sta obkrožala RBS in predvidoma nista tvorila sekundarnih struktur. Mišji MSI-1* je tako blokiral tudi vezavo RNA dela ribosomske podenote 30S. Ta reporterski sistem je povzročil približno 2x povišanje maksimalnega izražanja gena (brez laktoze) za sfGFP in 8.6x znižanje maksimalnega izražanja gena za sfGFP z MSI-1*, kar je v primerjavi z originalnim reporterskim sistemom (2 nemutirani prepoznavni zaporedji), kjer je bilo maksimalno znižanje izražanja gena 2.5x, velik napredek. Primerjava Hillovih koeficientov pri originalnem sistemu in redesign 3 (4.5 pri redesign 3, 1.7 pri originalnem sistemu) nakazuje na pozitivno kooperativnost vezave obeh molekul proteina MSI-1*, ki se lahko vežeta vsak na po 2 prepoznavni mesti [1].

== MSI-1* je alosterično inhibiran z oleinsko kislino ==

Protein MSI-1 je alosterično inhibiran z oleinsko kislino, ki se veže na domeno RRM1 na MSI-1 in preko konformacijske spremembe MSI-1 prepreči prepoznavno tarčne RNA. Z eksperimentom, ki temelji na spremenjeni mobilnosti molekul pri elektroforezi, so potrdili interakcijo med MSI-1* (koncentracija 45 µM) in RNA (koncentracija 11 µM), ki je bila popolnoma motena v prisotnosti 1 mM oleinske kisline. ''E. coli'' ima transporterje za vnos maščobnih kislin iz okolja (FadL in FadD). Z meritvami fluorescence sfGFP v posameznih celicah so ugotovili, da se je pri originalnem reporterskem sistemu (nemutirani prepoznavni mesti) delež celic v stanju ON (fluorescenca sfGFP nad določeno mejo) dvignil iz 10 % (pri 1 mM laktozi) na 49 % po dodatku 20 mM oleinske kisline. Prvotnih 93 % celic v stanju ON (ko ni bilo laktoze v sistemu) se ni povrnilo, najverjetneje ker se je oleinska kislina delno razgradila po vstopu v celice [1].

== Aplikacije proteina Musashi-1 ==

Transkripcijska regulacija ima svoje omejitve pri regulaciji specifičnega gena znotraj operona. Protein Musashi-1 bi lahko reguliral izražanje specifičnega gena, ki je del policistronskega operona. To bi lahko bilo uporabno pri regulaciji izražanja številnih encimov pri metabolnih poteh, torej pri metabolnem inženiringu. Uporaben bi bil tudi v kombinaciji s transkripcijskimi regulatorji, s čimer bi dosegli bolj raznoliko kombinirano regulacijo. Raziskovalci so z namenom potrditve teh dveh aplikacij proteina Musashi sestavili novo vezje, kjer sta ''sfGFP'' in ''mScarlet'' tvorila eno transkripcijsko enoto (bicistronski operon) pod nadzorom inducibilnega sintetičnega promotorja (PLtet), načrtovanega na podlagi promotorja PL, ki je bil reguliran s tetraciklinskim represorjem (TetR). Z dodatkom anhidrotetraciklina (aTC) so omogočili prepisovanje genov za sfGFP in mScarlet. Prepoznavni motivi na mRNA za vezavo MSI-1* so bili zgolj na začetku zapisa za sfGFP. Gen za MSI-1* je bil pod nadzorom promotorja PLlac, torej je za začetek transkripcije zapisa za MSI-1* bil potreben dodatek laktoze (ali IPTG). Obnašanje sistema opišejo logična vrata NIMPLY, pri čemer se zapis za sfGFP izraža zgolj v primeru prisotnosti aTC v sistemu in v odsotnosti laktoze v sistemu. Z dodatkom laktoze (1 mM) in aTC (100 ng/mL) v vseh kombinacijah (brez obeh, zgolj eden, oba) so pokazali specifično regulacijo izražanja gena za sfGFP v bicistronskem operonu in sposobnost kombiniranja regulatornih signalov z namenom združitve transkripcijske in potranskripcijske regulacije. Protein Musashi-1 je pokazal velik potencial pri potranskripcijski regulaciji v ''E. coli'', kar odpira možnosti za raziskave delovanja tudi drugih heterolognih RNA-vezavnih proteinov z RRM pri preprostejših organizmih [1].

== Literatura ==

[1] R. Dolcemascolo, M. Heras-Hernández, L. Goiriz, R. Montagud-Martínez, A. Requena-Menéndez, R. Ruiz, A. Pérez-Ràfols, R. A. Higuera-Rodríguez, G. Pérez-Ropero, W. F. Vranken, et al.: Repurposing the mammalian RNA-binding protein Musashi-1 as an allosteric translation repressor in bacteria. Elife 2024, 12.

[2] C. C. Clingman, L. M. Deveau, S. A. Hay, R. M. Genga, S. M. D. Shandilya, F. Massi, S. P. Ryder: Allosteric inhibition of a stem cell RNA-binding protein by an intermediary metabolite. Elife 2014, 2014.

[3] H. Kawahara, T. Imai, H. Imataka, M. Tsujimoto, K. Matsumoto, H. Okano: Neural RNA-binding protein Musashi1 inhibits translation initiation by competing with eIF4G for PABP. Journal of Cell Biology 2008, 181, 639–653.

[4] N. Ruth Zearfoss, L. M. Deveau, C. C. Clingman, E. Schmidt, E. S. Johnson, F. Massi, S. P. Ryder: A conserved three-nucleotide core motif defines musashi RNA binding specificity. Journal of Biological Chemistry 2014, 289, 35530–35541.

Uporaba sesalskega RNA-vezavnega proteina Musashi-1 kot alosterično reguliranega translacijskega represorja v E. coli

2024-04-14T09:11:09Z

Markokovacic:

Izhodiščni članek: [https://elifesciences.org/articles/91777]

== Uvod ==

Regulacija izražanja genov na potranskripcijskem nivoju se pri prokariontih in evkariontih razlikuje. Evkarionti imajo več RNA-vezavnih proteinov, ki imajo lahko številne funkcije in lahko delujejo tudi na specifičen način. Pri prokariontih stabilnost mRNA in iniciacijo translacije regulirajo predvsem majhne nekodirajoče RNA, RNA-vezavni proteini pa večinoma niso tako specifični. Pri živalih večina RNA-vezavnih proteinov vsebuje RNA-prepoznavne motive (RRM). RRM so majhne globularne domene, ki vključujejo okrog 90 aminokislinskih ostankov. Zvijejo se v 4 antiparalelne β-trakove in 2 α-vijačnici. Na enoverižno molekulo RNA se lahko vežejo z zadostno afiniteto in specifičnostjo ter tako specifično regulirajo biološke procese. Čeprav so RRM pomembni za potranskripcijsko regulacijo pri živalih, pa niso razširjeni pri vseh organizmih. Pri prokariontih je zelo malo proteinov z RRM, ki so bili odkriti predvsem z bioinformatskimi metodami, vendar pa imajo pogosto neznano funkcijo. Namen raziskave je bil odgovoriti na vprašanje, ali se živalski RRM lahko uporabijo v organizmih z enostavnejšo regulacijo izražanja genov. V kolikor bi to delovalo, bi potranskripcijska regulacija izražanja genov pri prokariontih preko specifičnih interakcij med heterolognimi RNA vezavnimi proteini z RRM in prokariontskimi mRNA ponudila številne nove možnosti za regulacijo sinteznobioloških vezij [1].

== Protein Musashi-1 lahko regulira iniciacijo translacije v ''E. coli'' ==

V raziskavi so želeli preveriti, ali sesalski RNA-vezavni protein Musashi-1 (MSI-1) lahko deluje kot potranskripcijski regulator v ''E. coli''. MSI-1 se pri sesalcih izraža predvsem v matičnih celicah živčne in epitelne linije. Ima pomembno vlogo pri diferenciaciji celic, regulaciji celičnega cikla in tumorogenezi, regulira pa tudi signalno pot Notch. Vsebuje dva RRM (RRM1 in RRM2), ki z nanomolarno afiniteto prepoznata konsenzno zaporedje RUnAGU na tarčni mRNA [1]. MSI-1 je alosterično inhibiran z nekaterimi maščobnimi kislinami, predvsem z ω-9 mononenasičenimi maščobnimi kislinami, ki vsebujejo med 18 in 22 ogljikovih atomov (npr. z oleinsko kislino) [2]. Uporabili so gen za mišji MSI-1, zato so optimizirali rabo kodonov za izražanje gena v ''E. coli''. Ker je C-končna regija mišjega MSI-1 nizko strukturno kompleksna, so z namenom povišanja topnosti proteina klonirali skrajšano obliko gena za MSI-1, ki je vključeval zapis za prvih 192 aminokislinskih ostankov. Izražanje gena za skrajšano obliko proteina (MSI-1*) je bilo pod nadzorom inducibilnega sintetičnega promotorja (poimenovan PLlac), ki je bil načrtovan na podlagi promotorja PL in reprimiran z represorjem LacI. Na transkripcijskem nivoju so z dodatkom laktoze ali β-D-1-tiogalaktopiranozida (IPTG) lahko inducirali izražanje gena za MSI-1*. Kot regulatorni element so uporabili Super folder GFP (sfGFP). Izražanje gena za sfGFP je bilo pod nadzorom konstitutivnega promotorja J23119. Zapis za sfGFP je po start kodonu vključeval dva prepoznavna motiva za MSI-1*, in sicer GUUAGU ter AUUUAGU, ki predvidoma tvorita sekundarno strukturo v obliki stebla. MSI-1* tako z vezavo na prepoznavna motiva na molekuli mRNA za sfGFP lahko zavre translacijo, saj sterično ovira vezavo ribosomalne podenote 30S na mRNA [1]. Tak način delovanja se razlikuje od tistega, ki poteka naravno pri sesalcih, saj se pri sesalcih MSI-1 veže na 3' UTR tarčne mRNA (''Numb'') in tako prepreči delovanje poli(A)-vezavnega proteina PABP in zavre translacijo [3]. Pri tako sestavljenem sinteznobiološkem vezju sta torej vhodna signala bila laktoza (ali IPTG) in oleinska kislina, izhodni signal je bila fluorescenca sfGFP. Takšno obnašanje sistema opišejo logična vrata IMPLY, torej se sfGFP ne izraža le v primeru, da je v sistemu laktoza (ali IPTG) in v sistemu ni oleinske kisline. Delovanje sinteznobiološkega vezja so karakterizirali s fluorimetrijo, merili so fluorescenco sfGFP (v AU) v odvisnosti od koncentracije laktoze (do 1 mM). Pri 1 mM koncentraciji laktoze je MSI-1* znižal sintezo sfGFP, in sicer za faktor 2.5. IPTG je povzročil zelo podoben odziv. Meritve celične rasti za vse indukcijske pogoje so pokazale, da je bila pri vseh pogojih rast celic skoraj konstantna, kar pomeni, da ekspresija gena za mišji protein MSI-1* ni povzročila motenj v rasti bakterijskih celic [1].

== Mehanizem interakcije med MSI-1* in prepoznavnim motivom na mRNA ==

Natančnejši vpogled v mehanizem interakcije med MSI-1* in prepoznavnima motivoma na mRNA, ki zapisuje za sfGFP, je omogočil izračun disociacijske konstante KD med mRNA in MSI-1*. Točkovna mutacija v enem prepoznavnem motivu (RUnCGU, mutanta 1) je povzročil zgolj 1.4x znižanje sinteze sfGFP v prisotnosti MSI-1* [1], s čimer so potrdili ugotovitev predhodnih raziskav, da je zaporedje UAG na prepoznavnem motivu ključno za specifično prepoznavo prepoznavnega motiva z MSI-1 [4]. Točkovni mutaciji v obeh prepoznavnih motivih (UAC namesto UAG, mutanta 5) sta povzročili zelo podoben odziv. Reporterski sistem z najkrajšim možnim konsenznim zaporedjem AUAGU ni pokazal nobene regulacije z MSI-1*, kar pomeni, da sta dve kopiji konsenznega zaporedja ključni za uspešno regulacijo izražanja gena za tarčni protein z MSI-1*. Pri ''in vitro'' eksperimentih vezavne kinetike so uporabili skrajšano obliko gena za človeški MSI-1h*. Meritve so izvajali s tehnologijo switchSENSE, ki omgooča meritve molekulske dinamike na čipu. dsDNA, imobilizirana na elektrodo iz Au v čipu, je imela fluorofor na enem koncu in prepoznavni motiv za vezavo MSI-1h* na drugem koncu. Vezava MSI-1h* (injiciran analit) na RNA povzroči spremembe v fluorescenci, ki se merijo v realnem času in omogočajo izračun kinetičnih konstant. V primeru originalnega prepoznavnega motiva na RNA (brez točkovnih mutacij) so dobili stopnjo asociacije kON = 1.1 nM-1 min-1, povprečen čas zadrževanja proteina MSI-1* na tarčni mRNA je bil 1.5 min (1/koff, koff je stopnja disociacije). Pri mutanti 1 je bila stopnja asociacije podobna kot pri nemutiranem prepoznavnem motivu, stopnja disociacije pa skoraj 4x hitrejša. Pri mutanti 5 pa sta bili moteni tako stopnja asociacije (15x manjša hitrost) kot stopnja disociacije (10x večja hitrost). Disociacijska konstanta KD (= koff/kon) je 0.62 nM za nemutirano obliko prepoznavnega motiva in 87 nM za mutanto 5 [1].

== Spreminjanje prepoznavnega motiva na mRNA z namenom povišanja dinamičnega razpona odziva ==

Raziskovalci so želeli preveriti, ali bi s spreminjanjem prepoznavnega motiva na mRNA za vezavo MSI-1 in z dodajanjem novih prepoznavnih motivov lahko povečali dinamičen razpon odziva. Najboljše rezultate je dal tretji reporterski sistem (redesign 3), ki je poleg obeh prepoznavnih motivov po start kodonu (sekundarna struktura v obliki zanke) vključeval še spremembe na 5' UTR zapisa za sfGFP. Na 5' UTR sta bila dodana dodatna prepoznavna motiva RUnAGU (GUUUAGU in AUUUAGU), ki sta obkrožala RBS in predvidoma nista tvorila sekundarnih struktur. Mišji MSI-1* je tako blokiral tudi vezavo RNA dela ribosomske podenote 30S. Ta reporterski sistem je povzročil približno 2x povišanje maksimalnega izražanja gena (brez laktoze) za sfGFP in 8.6x znižanje maksimalnega izražanja gena za sfGFP z MSI-1*, kar je v primerjavi z originalnim reporterskim sistemom (2 nemutirani prepoznavni zaporedji), kjer je bilo maksimalno znižanje izražanja gena 2.5x, velik napredek. Primerjava Hillovih koeficientov pri originalnem sistemu in redesign 3 (4.5 pri redesign 3, 1.7 pri originalnem sistemu) nakazuje na pozitivno kooperativnost vezave obeh molekul proteina MSI-1*, ki se lahko vežeta vsak na po 2 prepoznavni mesti [1].

== MSI-1* je alosterično inhibiran z oleinsko kislino ==

Protein MSI-1 je alosterično inhibiran z oleinsko kislino, ki se veže na domeno RRM1 na MSI-1 in preko konformacijske spremembe MSI-1 prepreči prepoznavno tarčne RNA. Z eksperimentom, ki temelji na spremenjeni mobilnosti molekul pri elektroforezi, so potrdili interakcijo med MSI-1* (koncentracija 45 µM) in RNA (koncentracija 11 µM), ki je bila popolnoma motena v prisotnosti 1 mM oleinske kisline. ''E. coli'' ima transporterje za vnos maščobnih kislin iz okolja (FadL in FadD). Z meritvami fluorescence sfGFP v posameznih celicah so ugotovili, da se je pri originalnem reporterskem sistemu (nemutirani prepoznavni mesti) delež celic v stanju ON (fluorescenca sfGFP nad določeno mejo) dvignil iz 10 % (pri 1 mM laktozi) na 49 % po dodatku 20 mM oleinske kisline. Prvotnih 93 % celic v stanju ON (ko ni bilo laktoze v sistemu) se ni povrnilo, najverjetneje ker se je oleinska kislina delno razgradila po vstopu v celice [1].

== Aplikacije proteina Musashi-1 ==

Transkripcijska regulacija ima svoje omejitve pri regulaciji specifičnega gena znotraj operona. Protein Musashi-1 bi lahko reguliral izražanje specifičnega gena, ki je del policistronskega operona. To bi lahko bilo uporabno pri regulaciji izražanja številnih encimov pri metabolnih poteh, torej pri metabolnem inženiringu. Uporaben bi bil tudi v kombinaciji s transkripcijskimi regulatorji, s čimer bi dosegli bolj raznoliko kombinirano regulacijo. Raziskovalci so z namenom potrditve teh dveh aplikacij proteina Musashi sestavili novo vezje, kjer sta ''sfGFP'' in ''mScarlet'' tvorila eno transkripcijsko enoto (bicistronski operon) pod nadzorom inducibilnega sintetičnega promotorja (PLtet), načrtovanega na podlagi promotorja PL, ki je bil reguliran s tetraciklinskim represorjem (TetR). Z dodatkom anhidrotetraciklina (aTC) so omogočili prepisovanje genov za sfGFP in mScarlet. Prepoznavni motivi na mRNA za vezavo MSI-1* so bili zgolj na začetku zapisa za sfGFP. Gen za MSI-1* je bil pod nadzorom promotorja PLlac, torej je za začetek transkripcije zapisa za MSI-1* bil potreben dodatek laktoze (ali IPTG). Obnašanje sistema opišejo logična vrata NIMPLY, pri čemer se zapis za sfGFP izraža zgolj v primeru prisotnosti aTC v sistemu in v odsotnosti laktoze v sistemu. Z dodatkom laktoze (1 mM) in aTC (100 ng/mL) v vseh kombinacijah (brez obeh, zgolj eden, oba) so pokazali specifično regulacijo izražanja gena za sfGFP v bicistronskem operonu in sposobnost kombiniranja regulatornih signalov z namenom združitve transkripcijske in potranskripcijske regulacije. Protein Musashi-1 je pokazal velik potencial pri potranskripcijski regulaciji v ''E. coli'', kar odpira možnosti za raziskave delovanja tudi drugih heterolognih RNA-vezavnih proteinov z RRM pri preprostejših organizmih [1].

== Literatura ==

[1] R. Dolcemascolo, M. Heras-Hernández, L. Goiriz, R. Montagud-Martínez, A. Requena-Menéndez, R. Ruiz, A. Pérez-Ràfols, R. A. Higuera-Rodríguez, G. Pérez-Ropero, W. F. Vranken, et al.: Repurposing the mammalian RNA-binding protein Musashi-1 as an allosteric translation repressor in bacteria. Elife 2024, 12.

[2] C. C. Clingman, L. M. Deveau, S. A. Hay, R. M. Genga, S. M. D. Shandilya, F. Massi, S. P. Ryder: Allosteric inhibition of a stem cell RNA-binding protein by an intermediary metabolite. Elife 2014, 2014.

[3] H. Kawahara, T. Imai, H. Imataka, M. Tsujimoto, K. Matsumoto, H. Okano: Neural RNA-binding protein Musashi1 inhibits translation initiation by competing with eIF4G for PABP. Journal of Cell Biology 2008, 181, 639–653.

[4] N. Ruth Zearfoss, L. M. Deveau, C. C. Clingman, E. Schmidt, E. S. Johnson, F. Massi, S. P. Ryder: A conserved three-nucleotide core motif defines musashi RNA binding specificity. Journal of Biological Chemistry 2014, 289, 35530–35541.

Uporaba sesalskega RNA-vezavnega proteina Musashi-1 kot alosterično reguliranega translacijskega represorja v E. coli

2024-04-14T09:06:08Z

Markokovacic:

Izhodiščni članek: [Repurposing the mammalian RNA-binding protein Musashi-1 as an allosteric translation repressor in bacteria | eLife]

== Uvod ==

Regulacija izražanja genov na potranskripcijskem nivoju se pri prokariontih in evkariontih razlikuje. Evkarionti imajo več RNA-vezavnih proteinov, ki imajo lahko številne funkcije in lahko delujejo tudi na specifičen način. Pri prokariontih stabilnost mRNA in iniciacijo translacije regulirajo predvsem majhne nekodirajoče RNA, RNA-vezavni proteini pa večinoma niso tako specifični. Pri živalih večina RNA-vezavnih proteinov vsebuje RNA-prepoznavne motive (RRM). RRM so majhne globularne domene, ki vključujejo okrog 90 aminokislinskih ostankov. Zvijejo se v 4 antiparalelne β-trakove in 2 α-vijačnici. Na enoverižno molekulo RNA se lahko vežejo z zadostno afiniteto in specifičnostjo ter tako specifično regulirajo biološke procese. Čeprav so RRM pomembni za potranskripcijsko regulacijo pri živalih, pa niso razširjeni pri vseh organizmih. Pri prokariontih je zelo malo proteinov z RRM, ki so bili odkriti predvsem z bioinformatskimi metodami, vendar pa imajo pogosto neznano funkcijo. Namen raziskave je bil odgovoriti na vprašanje, ali se živalski RRM lahko uporabijo v organizmih z enostavnejšo regulacijo izražanja genov. V kolikor bi to delovalo, bi potranskripcijska regulacija izražanja genov pri prokariontih preko specifičnih interakcij med heterolognimi RNA vezavnimi proteini z RRM in prokariontskimi mRNA ponudila številne nove možnosti za regulacijo sinteznobioloških vezij [1].

== Protein Musashi-1 lahko regulira iniciacijo translacije v ''E. coli'' ==

V raziskavi so želeli preveriti, ali sesalski RNA-vezavni protein Musashi-1 (MSI-1) lahko deluje kot potranskripcijski regulator v ''E. coli''. MSI-1 se pri sesalcih izraža predvsem v matičnih celicah živčne in epitelne linije. Ima pomembno vlogo pri diferenciaciji celic, regulaciji celičnega cikla in tumorogenezi, regulira pa tudi signalno pot Notch. Vsebuje dva RRM (RRM1 in RRM2), ki z nanomolarno afiniteto prepoznata konsenzno zaporedje RUnAGU na tarčni mRNA [1]. MSI-1 je alosterično inhibiran z nekaterimi maščobnimi kislinami, predvsem z ω-9 mononenasičenimi maščobnimi kislinami, ki vsebujejo med 18 in 22 ogljikovih atomov (npr. z oleinsko kislino) [2]. Uporabili so gen za mišji MSI-1, zato so optimizirali rabo kodonov za izražanje gena v E. coli. Ker je C-končna regija mišjega MSI-1 nizko strukturno kompleksna, so z namenom povišanja topnosti proteina klonirali skrajšano obliko gena za MSI-1, ki je vključeval zapis za prvih 192 aminokislinskih ostankov. Izražanje gena za skrajšano obliko proteina (MSI-1*) je bilo pod nadzorom inducibilnega sintetičnega promotorja (poimenovan PLlac), ki je bil načrtovan na podlagi promotorja PL in reprimiran z represorjem LacI. Na transkripcijskem nivoju so z dodatkom laktoze ali β-D-1-tiogalaktopiranozida (IPTG) lahko inducirali izražanje gena za MSI-1*. Kot regulatorni element so uporabili Super folder GFP (sfGFP). Izražanje gena za sfGFP je bilo pod nadzorom konstitutivnega promotorja J23119. Zapis za sfGFP je po start kodonu vključeval dva prepoznavna motiva za MSI-1*, in sicer GUUAGU ter AUUUAGU, ki predvidoma tvorita sekundarno strukturo v obliki stebla. MSI-1* tako z vezavo na prepoznavna motiva na molekuli mRNA za sfGFP lahko zavre translacijo, saj sterično ovira vezavo ribosomalne podenote 30S na mRNA [1]. Tak način delovanja se razlikuje od tistega, ki poteka naravno pri sesalcih, saj se pri sesalcih MSI-1 veže na 3' UTR tarčne mRNA (Numb) in tako prepreči delovanje poli(A)-vezavnega proteina PABP in zavre translacijo [3]. Pri tako sestavljenem sinteznobiološkem vezju sta torej vhodna signala bila laktoza (ali IPTG) in oleinska kislina, izhodni signal je bila fluorescenca sfGFP. Takšno obnašanje sistema opišejo logična vrata IMPLY, torej se sfGFP ne izraža le v primeru, da je v sistemu laktoza (ali IPTG) in v sistemu ni oleinske kisline. Delovanje sinteznobiološkega vezja so karakterizirali s fluorimetrijo, merili so fluorescenco sfGFP (v AU) v odvisnosti od koncentracije laktoze (do 1 mM). Pri 1 mM koncentraciji laktoze je MSI-1* znižal sintezo sfGFP, in sicer za faktor 2.5. IPTG je povzročil zelo podoben odziv. Meritve celične rasti za vse indukcijske pogoje so pokazale, da je bila pri vseh pogojih rast celic skoraj konstantna, kar pomeni, da ekspresija gena za mišji protein MSI-1* ni povzročila motenj v rasti bakterijskih celic [1].

== Mehanizem interakcije med MSI-1* in prepoznavnim motivom na mRNA ==

Natančnejši vpogled v mehanizem interakcije med MSI-1* in prepoznavnima motivoma na mRNA, ki zapisuje za sfGFP, je omogočil izračun disociacijske konstante KD med mRNA in MSI-1*. Točkovna mutacija v enem prepoznavnem motivu (RUnCGU, mutanta 1) je povzročil zgolj 1.4x znižanje sinteze sfGFP v prisotnosti MSI-1* [1], s čimer so potrdili ugotovitev predhodnih raziskav, da je zaporedje UAG na prepoznavnem motivu ključno za specifično prepoznavo prepoznavnega motiva z MSI-1 [4]. Točkovni mutaciji v obeh prepoznavnih motivih (UAC namesto UAG, mutanta 5) sta povzročili zelo podoben odziv. Reporterski sistem z najkrajšim možnim konsenznim zaporedjem AUAGU ni pokazal nobene regulacije z MSI-1*, kar pomeni, da sta dve kopiji konsenznega zaporedja ključni za uspešno regulacijo izražanja gena za tarčni protein z MSI-1*. Pri in vitro eksperimentih vezavne kinetike so uporabili skrajšano obliko gena za človeški MSI-1h*. Meritve so izvajali s tehnologijo switchSENSE, ki omgooča meritve molekulske dinamike na čipu. dsDNA, imobilizirana na elektrodo iz Au v čipu, je imela fluorofor na enem koncu in prepoznavni motiv za vezavo MSI-1h* na drugem koncu. Vezava MSI-1h* (injiciran analit) na RNA povzroči spremembe v fluorescenci, ki se merijo v realnem času in omogočajo izračun kinetičnih konstant. V primeru originalnega prepoznavnega motiva na RNA (brez točkovnih mutacij) so dobili stopnjo asociacije kON = 1.1 nM-1 min-1, povprečen čas zadrževanja proteina MSI-1* na tarčni mRNA je bil 1.5 min (1/koff, koff je stopnja disociacije). Pri mutanti 1 je bila stopnja asociacije podobna kot pri nemutiranem prepoznavnem motivu, stopnja disociacije pa skoraj 4x hitrejša. Pri mutanti 5 pa sta bili moteni tako stopnja asociacije (15x manjša hitrost) kot stopnja disociacije (10x večja hitrost). Disociacijska konstanta KD (= koff/kon) je 0.62 nM za nemutirano obliko prepoznavnega motiva in 87 nM za mutanto 5 [1].

== Spreminjanje prepoznavnega motiva na mRNA z namenom povišanja dinamičnega razpona odziva ==

Raziskovalci so želeli preveriti, ali bi s spreminjanjem prepoznavnega motiva na mRNA za vezavo MSI-1 in z dodajanjem novih prepoznavnih motivov lahko povečali dinamičen razpon odziva. Najboljše rezultate je dal tretji reporterski sistem (redesign 3), ki je poleg obeh prepoznavnih motivov po start kodonu (sekundarna struktura v obliki zanke) vključeval še spremembe na 5' UTR zapisa za sfGFP. Na 5' UTR sta bila dodana dodatna prepoznavna motiva RUnAGU (GUUUAGU in AUUUAGU), ki sta obkrožala RBS in predvidoma nista tvorila sekundarnih struktur. Mišji MSI-1* je tako blokiral tudi vezavo RNA dela ribosomske podenote 30S. Ta reporterski sistem je povzročil približno 2x povišanje maksimalnega izražanja gena (brez laktoze) za sfGFP in 8.6x znižanje maksimalnega izražanja gena za sfGFP z MSI-1*, kar je v primerjavi z originalnim reporterskim sistemom (2 nemutirani prepoznavni zaporedji), kjer je bilo maksimalno znižanje izražanja gena 2.5x, velik napredek. Primerjava Hillovih koeficientov pri originalnem sistemu in redesign 3 (4.5 pri redesign 3, 1.7 pri originalnem sistemu) nakazuje na pozitivno kooperativnost vezave obeh molekul proteina MSI-1*, ki se lahko vežeta vsak na po 2 prepoznavni mesti [1].

== MSI-1* je alosterično inhibiran z oleinsko kislino ==

Protein MSI-1 je alosterično inhibiran z oleinsko kislino, ki se veže na domeno RRM1 na MSI-1 in preko konformacijske spremembe MSI-1 prepreči prepoznavno tarčne RNA. Z eksperimentom, ki temelji na spremenjeni mobilnosti molekul pri elektroforezi, so potrdili interakcijo med MSI-1* (koncentracija 45 µM) in RNA (koncentracija 11 µM), ki je bila popolnoma motena v prisotnosti 1 mM oleinske kisline. E. coli ima transporterje za vnos maščobnih kislin iz okolja (FadL in FadD). Z meritvami fluorescence sfGFP v posameznih celicah so ugotovili, da se je pri originalnem reporterskem sistemu (nemutirani prepoznavni mesti) delež celic v stanju ON (fluorescenca sfGFP nad določeno mejo) dvignil iz 10 % (pri 1 mM laktozi) na 49 % po dodatku 20 mM oleinske kisline. Prvotnih 93 % celic v stanju ON (ko ni bilo laktoze v sistemu) se ni povrnilo, najverjetneje ker se je oleinska kislina delno razgradila po vstopu v celice [1].

== Aplikacije proteina Musashi-1 ==

Transkripcijska regulacija ima svoje omejitve pri regulaciji specifičnega gena znotraj operona. Protein Musashi-1 bi lahko reguliral izražanje specifičnega gena, ki je del policistronskega operona. To bi lahko bilo uporabno pri regulaciji izražanja številnih encimov pri metabolnih poteh, torej pri metabolnem inženiringu. Uporaben bi bil tudi v kombinaciji s transkripcijskimi regulatorji, s čimer bi dosegli bolj raznoliko kombinirano regulacijo. Raziskovalci so z namenom potrditve teh dveh aplikacij proteina Musashi sestavili novo vezje, kjer sta sfGFP in mScarlet tvorila eno transkripcijsko enoto (bicistronski operon) pod nadzorom inducibilnega sintetičnega promotorja (PLtet), načrtovanega na podlagi promotorja PL, ki je bil reguliran s tetraciklinskim represorjem (TetR). Z dodatkom anhidrotetraciklina (aTC) so omogočili prepisovanje genov za sfGFP in mScarlet. Prepoznavni motivi na mRNA za vezavo MSI-1* so bili zgolj na začetku zapisa za sfGFP. Gen za MSI-1* je bil pod nadzorom promotorja PLlac, torej je za začetek transkripcije zapisa za MSI-1* bil potreben dodatek laktoze (ali IPTG). Obnašanje sistema opišejo logična vrata NIMPLY, pri čemer se zapis za sfGFP izraža zgolj v primeru prisotnosti aTC v sistemu in v odsotnosti laktoze v sistemu. Z dodatkom laktoze (1 mM) in aTC (100 ng/mL) v vseh kombinacijah (brez obeh, zgolj eden, oba) so pokazali specifično regulacijo izražanja gena za sfGFP v bicistronskem operonu in sposobnost kombiniranja regulatornih signalov z namenom združitve transkripcijske in potranskripcijske regulacije. Protein Musashi-1 je pokazal velik potencial pri potranskripcijski regulaciji v E. coli, kar odpira možnosti za raziskave delovanja tudi drugih heterolognih RNA-vezavnih proteinov z RRM pri preprostejših organizmih [1].

== Literatura ==

[1] R. Dolcemascolo, M. Heras-Hernández, L. Goiriz, R. Montagud-Martínez, A. Requena-Menéndez, R. Ruiz, A. Pérez-Ràfols, R. A. Higuera-Rodríguez, G. Pérez-Ropero, W. F. Vranken, et al.: Repurposing the mammalian RNA-binding protein Musashi-1 as an allosteric translation repressor in bacteria. Elife 2024, 12.

[2] C. C. Clingman, L. M. Deveau, S. A. Hay, R. M. Genga, S. M. D. Shandilya, F. Massi, S. P. Ryder: Allosteric inhibition of a stem cell RNA-binding protein by an intermediary metabolite. Elife 2014, 2014.

[3] H. Kawahara, T. Imai, H. Imataka, M. Tsujimoto, K. Matsumoto, H. Okano: Neural RNA-binding protein Musashi1 inhibits translation initiation by competing with eIF4G for PABP. Journal of Cell Biology 2008, 181, 639–653.

[4] N. Ruth Zearfoss, L. M. Deveau, C. C. Clingman, E. Schmidt, E. S. Johnson, F. Massi, S. P. Ryder: A conserved three-nucleotide core motif defines musashi RNA binding specificity. Journal of Biological Chemistry 2014, 289, 35530–35541.

Uporaba sesalskega RNA-vezavnega proteina Musashi-1 kot alosterično reguliranega translacijskega represorja v E. coli

2024-04-14T09:03:18Z

Markokovacic:

Izhodiščni članek: [https://elifesciences.org/articles/91777]

== Uvod ==

Regulacija izražanja genov na potranskripcijskem nivoju se pri prokariontih in evkariontih razlikuje. Evkarionti imajo več RNA-vezavnih proteinov, ki imajo lahko številne funkcije in lahko delujejo tudi na specifičen način. Pri prokariontih stabilnost mRNA in iniciacijo translacije regulirajo predvsem majhne nekodirajoče RNA, RNA-vezavni proteini pa večinoma niso tako specifični. Pri živalih večina RNA-vezavnih proteinov vsebuje RNA-prepoznavne motive (RRM). RRM so majhne globularne domene, ki vključujejo okrog 90 aminokislinskih ostankov. Zvijejo se v 4 antiparalelne β-trakove in 2 α-vijačnici. Na enoverižno molekulo RNA se lahko vežejo z zadostno afiniteto in specifičnostjo ter tako specifično regulirajo biološke procese. Čeprav so RRM pomembni za potranskripcijsko regulacijo pri živalih, pa niso razširjeni pri vseh organizmih. Pri prokariontih je zelo malo proteinov z RRM, ki so bili odkriti predvsem z bioinformatskimi metodami, vendar pa imajo pogosto neznano funkcijo. Namen raziskave je bil odgovoriti na vprašanje, ali se živalski RRM lahko uporabijo v organizmih z enostavnejšo regulacijo izražanja genov. V kolikor bi to delovalo, bi potranskripcijska regulacija izražanja genov pri prokariontih preko specifičnih interakcij med heterolognimi RNA vezavnimi proteini z RRM in prokariontskimi mRNA ponudila številne nove možnosti za regulacijo sinteznobioloških vezij [1].

== Protein Musashi-1 lahko regulira iniciacijo translacije v ''E. coli'' ==

V raziskavi so želeli preveriti, ali sesalski RNA-vezavni protein Musashi-1 (MSI-1) lahko deluje kot potranskripcijski regulator v E. coli. MSI-1 se pri sesalcih izraža predvsem v matičnih celicah živčne in epitelne linije. Ima pomembno vlogo pri diferenciaciji celic, regulaciji celičnega cikla in tumorogenezi, regulira pa tudi signalno pot Notch. Vsebuje dva RRM (RRM1 in RRM2), ki z nanomolarno afiniteto prepoznata konsenzno zaporedje RUnAGU na tarčni mRNA [1]. MSI-1 je alosterično inhibiran z nekaterimi maščobnimi kislinami, predvsem z ω-9 mononenasičenimi maščobnimi kislinami, ki vsebujejo med 18 in 22 ogljikovih atomov (npr. z oleinsko kislino) [2]. Uporabili so gen za mišji MSI-1, zato so optimizirali rabo kodonov za izražanje gena v E. coli. Ker je C-končna regija mišjega MSI-1 nizko strukturno kompleksna, so z namenom povišanja topnosti proteina klonirali skrajšano obliko gena za MSI-1, ki je vključeval zapis za prvih 192 aminokislinskih ostankov. Izražanje gena za skrajšano obliko proteina (MSI-1*) je bilo pod nadzorom inducibilnega sintetičnega promotorja (poimenovan PLlac), ki je bil načrtovan na podlagi promotorja PL in reprimiran z represorjem LacI. Na transkripcijskem nivoju so z dodatkom laktoze ali β-D-1-tiogalaktopiranozida (IPTG) lahko inducirali izražanje gena za MSI-1*. Kot regulatorni element so uporabili Super folder GFP (sfGFP). Izražanje gena za sfGFP je bilo pod nadzorom konstitutivnega promotorja J23119. Zapis za sfGFP je po start kodonu vključeval dva prepoznavna motiva za MSI-1*, in sicer GUUAGU ter AUUUAGU, ki predvidoma tvorita sekundarno strukturo v obliki stebla. MSI-1* tako z vezavo na prepoznavna motiva na molekuli mRNA za sfGFP lahko zavre translacijo, saj sterično ovira vezavo ribosomalne podenote 30S na mRNA [1]. Tak način delovanja se razlikuje od tistega, ki poteka naravno pri sesalcih, saj se pri sesalcih MSI-1 veže na 3' UTR tarčne mRNA (Numb) in tako prepreči delovanje poli(A)-vezavnega proteina PABP in zavre translacijo [3]. Pri tako sestavljenem sinteznobiološkem vezju sta torej vhodna signala bila laktoza (ali IPTG) in oleinska kislina, izhodni signal je bila fluorescenca sfGFP. Takšno obnašanje sistema opišejo logična vrata IMPLY, torej se sfGFP ne izraža le v primeru, da je v sistemu laktoza (ali IPTG) in v sistemu ni oleinske kisline. Delovanje sinteznobiološkega vezja so karakterizirali s fluorimetrijo, merili so fluorescenco sfGFP (v AU) v odvisnosti od koncentracije laktoze (do 1 mM). Pri 1 mM koncentraciji laktoze je MSI-1* znižal sintezo sfGFP, in sicer za faktor 2.5. IPTG je povzročil zelo podoben odziv. Meritve celične rasti za vse indukcijske pogoje so pokazale, da je bila pri vseh pogojih rast celic skoraj konstantna, kar pomeni, da ekspresija gena za mišji protein MSI-1* ni povzročila motenj v rasti bakterijskih celic [1].

== Mehanizem interakcije med MSI-1* in prepoznavnim motivom na mRNA ==

Natančnejši vpogled v mehanizem interakcije med MSI-1* in prepoznavnima motivoma na mRNA, ki zapisuje za sfGFP, je omogočil izračun disociacijske konstante KD med mRNA in MSI-1*. Točkovna mutacija v enem prepoznavnem motivu (RUnCGU, mutanta 1) je povzročil zgolj 1.4x znižanje sinteze sfGFP v prisotnosti MSI-1* [1], s čimer so potrdili ugotovitev predhodnih raziskav, da je zaporedje UAG na prepoznavnem motivu ključno za specifično prepoznavo prepoznavnega motiva z MSI-1 [4]. Točkovni mutaciji v obeh prepoznavnih motivih (UAC namesto UAG, mutanta 5) sta povzročili zelo podoben odziv. Reporterski sistem z najkrajšim možnim konsenznim zaporedjem AUAGU ni pokazal nobene regulacije z MSI-1*, kar pomeni, da sta dve kopiji konsenznega zaporedja ključni za uspešno regulacijo izražanja gena za tarčni protein z MSI-1*. Pri in vitro eksperimentih vezavne kinetike so uporabili skrajšano obliko gena za človeški MSI-1h*. Meritve so izvajali s tehnologijo switchSENSE, ki omgooča meritve molekulske dinamike na čipu. dsDNA, imobilizirana na elektrodo iz Au v čipu, je imela fluorofor na enem koncu in prepoznavni motiv za vezavo MSI-1h* na drugem koncu. Vezava MSI-1h* (injiciran analit) na RNA povzroči spremembe v fluorescenci, ki se merijo v realnem času in omogočajo izračun kinetičnih konstant. V primeru originalnega prepoznavnega motiva na RNA (brez točkovnih mutacij) so dobili stopnjo asociacije kON = 1.1 nM-1 min-1, povprečen čas zadrževanja proteina MSI-1* na tarčni mRNA je bil 1.5 min (1/koff, koff je stopnja disociacije). Pri mutanti 1 je bila stopnja asociacije podobna kot pri nemutiranem prepoznavnem motivu, stopnja disociacije pa skoraj 4x hitrejša. Pri mutanti 5 pa sta bili moteni tako stopnja asociacije (15x manjša hitrost) kot stopnja disociacije (10x večja hitrost). Disociacijska konstanta KD (= koff/kon) je 0.62 nM za nemutirano obliko prepoznavnega motiva in 87 nM za mutanto 5 [1].

== Spreminjanje prepoznavnega motiva na mRNA z namenom povišanja dinamičnega razpona odziva ==

Raziskovalci so želeli preveriti, ali bi s spreminjanjem prepoznavnega motiva na mRNA za vezavo MSI-1 in z dodajanjem novih prepoznavnih motivov lahko povečali dinamičen razpon odziva. Najboljše rezultate je dal tretji reporterski sistem (redesign 3), ki je poleg obeh prepoznavnih motivov po start kodonu (sekundarna struktura v obliki zanke) vključeval še spremembe na 5' UTR zapisa za sfGFP. Na 5' UTR sta bila dodana dodatna prepoznavna motiva RUnAGU (GUUUAGU in AUUUAGU), ki sta obkrožala RBS in predvidoma nista tvorila sekundarnih struktur. Mišji MSI-1* je tako blokiral tudi vezavo RNA dela ribosomske podenote 30S. Ta reporterski sistem je povzročil približno 2x povišanje maksimalnega izražanja gena (brez laktoze) za sfGFP in 8.6x znižanje maksimalnega izražanja gena za sfGFP z MSI-1*, kar je v primerjavi z originalnim reporterskim sistemom (2 nemutirani prepoznavni zaporedji), kjer je bilo maksimalno znižanje izražanja gena 2.5x, velik napredek. Primerjava Hillovih koeficientov pri originalnem sistemu in redesign 3 (4.5 pri redesign 3, 1.7 pri originalnem sistemu) nakazuje na pozitivno kooperativnost vezave obeh molekul proteina MSI-1*, ki se lahko vežeta vsak na po 2 prepoznavni mesti [1].

== MSI-1* je alosterično inhibiran z oleinsko kislino ==

Protein MSI-1 je alosterično inhibiran z oleinsko kislino, ki se veže na domeno RRM1 na MSI-1 in preko konformacijske spremembe MSI-1 prepreči prepoznavno tarčne RNA. Z eksperimentom, ki temelji na spremenjeni mobilnosti molekul pri elektroforezi, so potrdili interakcijo med MSI-1* (koncentracija 45 µM) in RNA (koncentracija 11 µM), ki je bila popolnoma motena v prisotnosti 1 mM oleinske kisline. E. coli ima transporterje za vnos maščobnih kislin iz okolja (FadL in FadD). Z meritvami fluorescence sfGFP v posameznih celicah so ugotovili, da se je pri originalnem reporterskem sistemu (nemutirani prepoznavni mesti) delež celic v stanju ON (fluorescenca sfGFP nad določeno mejo) dvignil iz 10 % (pri 1 mM laktozi) na 49 % po dodatku 20 mM oleinske kisline. Prvotnih 93 % celic v stanju ON (ko ni bilo laktoze v sistemu) se ni povrnilo, najverjetneje ker se je oleinska kislina delno razgradila po vstopu v celice [1].

== Aplikacije proteina Musashi-1 ==

Transkripcijska regulacija ima svoje omejitve pri regulaciji specifičnega gena znotraj operona. Protein Musashi-1 bi lahko reguliral izražanje specifičnega gena, ki je del policistronskega operona. To bi lahko bilo uporabno pri regulaciji izražanja številnih encimov pri metabolnih poteh, torej pri metabolnem inženiringu. Uporaben bi bil tudi v kombinaciji s transkripcijskimi regulatorji, s čimer bi dosegli bolj raznoliko kombinirano regulacijo. Raziskovalci so z namenom potrditve teh dveh aplikacij proteina Musashi sestavili novo vezje, kjer sta sfGFP in mScarlet tvorila eno transkripcijsko enoto (bicistronski operon) pod nadzorom inducibilnega sintetičnega promotorja (PLtet), načrtovanega na podlagi promotorja PL, ki je bil reguliran s tetraciklinskim represorjem (TetR). Z dodatkom anhidrotetraciklina (aTC) so omogočili prepisovanje genov za sfGFP in mScarlet. Prepoznavni motivi na mRNA za vezavo MSI-1* so bili zgolj na začetku zapisa za sfGFP. Gen za MSI-1* je bil pod nadzorom promotorja PLlac, torej je za začetek transkripcije zapisa za MSI-1* bil potreben dodatek laktoze (ali IPTG). Obnašanje sistema opišejo logična vrata NIMPLY, pri čemer se zapis za sfGFP izraža zgolj v primeru prisotnosti aTC v sistemu in v odsotnosti laktoze v sistemu. Z dodatkom laktoze (1 mM) in aTC (100 ng/mL) v vseh kombinacijah (brez obeh, zgolj eden, oba) so pokazali specifično regulacijo izražanja gena za sfGFP v bicistronskem operonu in sposobnost kombiniranja regulatornih signalov z namenom združitve transkripcijske in potranskripcijske regulacije. Protein Musashi-1 je pokazal velik potencial pri potranskripcijski regulaciji v E. coli, kar odpira možnosti za raziskave delovanja tudi drugih heterolognih RNA-vezavnih proteinov z RRM pri preprostejših organizmih [1].

== Literatura ==

[1] R. Dolcemascolo, M. Heras-Hernández, L. Goiriz, R. Montagud-Martínez, A. Requena-Menéndez, R. Ruiz, A. Pérez-Ràfols, R. A. Higuera-Rodríguez, G. Pérez-Ropero, W. F. Vranken, et al.: Repurposing the mammalian RNA-binding protein Musashi-1 as an allosteric translation repressor in bacteria. Elife 2024, 12.

[2] C. C. Clingman, L. M. Deveau, S. A. Hay, R. M. Genga, S. M. D. Shandilya, F. Massi, S. P. Ryder: Allosteric inhibition of a stem cell RNA-binding protein by an intermediary metabolite. Elife 2014, 2014.

[3] H. Kawahara, T. Imai, H. Imataka, M. Tsujimoto, K. Matsumoto, H. Okano: Neural RNA-binding protein Musashi1 inhibits translation initiation by competing with eIF4G for PABP. Journal of Cell Biology 2008, 181, 639–653.

[4] N. Ruth Zearfoss, L. M. Deveau, C. C. Clingman, E. Schmidt, E. S. Johnson, F. Massi, S. P. Ryder: A conserved three-nucleotide core motif defines musashi RNA binding specificity. Journal of Biological Chemistry 2014, 289, 35530–35541.

Uporaba sesalskega RNA-vezavnega proteina Musashi-1 kot alosterično reguliranega translacijskega represorja v E. coli

2024-04-14T09:01:38Z

Markokovacic: Created page with "Izhodiščni članek: [https://journals.asm.org/doi/10.1128/spectrum.02897-23# A synthetic biology approach to assemble and reboot clinically relevant Pseudomonas aeruginosa tailed phages] == Uvod == Regulacija izražanja genov na potranskripcijskem nivoju se pri prokariontih in evkariontih razlikuje. Evkarionti imajo več RNA-vezavnih proteinov, ki imajo lahko številne funkcije in lahko delujejo tudi na specifičen način. Pri prokariontih stabilnost mRNA in inicia..."

Izhodiščni članek: [https://journals.asm.org/doi/10.1128/spectrum.02897-23# A synthetic biology approach to assemble and reboot clinically relevant Pseudomonas aeruginosa tailed phages]

== Uvod ==

Regulacija izražanja genov na potranskripcijskem nivoju se pri prokariontih in evkariontih razlikuje. Evkarionti imajo več RNA-vezavnih proteinov, ki imajo lahko številne funkcije in lahko delujejo tudi na specifičen način. Pri prokariontih stabilnost mRNA in iniciacijo translacije regulirajo predvsem majhne nekodirajoče RNA, RNA-vezavni proteini pa večinoma niso tako specifični. Pri živalih večina RNA-vezavnih proteinov vsebuje RNA-prepoznavne motive (RRM). RRM so majhne globularne domene, ki vključujejo okrog 90 aminokislinskih ostankov. Zvijejo se v 4 antiparalelne β-trakove in 2 α-vijačnici. Na enoverižno molekulo RNA se lahko vežejo z zadostno afiniteto in specifičnostjo ter tako specifično regulirajo biološke procese. Čeprav so RRM pomembni za potranskripcijsko regulacijo pri živalih, pa niso razširjeni pri vseh organizmih. Pri prokariontih je zelo malo proteinov z RRM, ki so bili odkriti predvsem z bioinformatskimi metodami, vendar pa imajo pogosto neznano funkcijo. Namen raziskave je bil odgovoriti na vprašanje, ali se živalski RRM lahko uporabijo v organizmih z enostavnejšo regulacijo izražanja genov. V kolikor bi to delovalo, bi potranskripcijska regulacija izražanja genov pri prokariontih preko specifičnih interakcij med heterolognimi RNA vezavnimi proteini z RRM in prokariontskimi mRNA ponudila številne nove možnosti za regulacijo sinteznobioloških vezij [1].

== Protein Musashi-1 lahko regulira iniciacijo translacije v E. coli ==

V raziskavi so želeli preveriti, ali sesalski RNA-vezavni protein Musashi-1 (MSI-1) lahko deluje kot potranskripcijski regulator v E. coli. MSI-1 se pri sesalcih izraža predvsem v matičnih celicah živčne in epitelne linije. Ima pomembno vlogo pri diferenciaciji celic, regulaciji celičnega cikla in tumorogenezi, regulira pa tudi signalno pot Notch. Vsebuje dva RRM (RRM1 in RRM2), ki z nanomolarno afiniteto prepoznata konsenzno zaporedje RUnAGU na tarčni mRNA [1]. MSI-1 je alosterično inhibiran z nekaterimi maščobnimi kislinami, predvsem z ω-9 mononenasičenimi maščobnimi kislinami, ki vsebujejo med 18 in 22 ogljikovih atomov (npr. z oleinsko kislino) [2]. Uporabili so gen za mišji MSI-1, zato so optimizirali rabo kodonov za izražanje gena v E. coli. Ker je C-končna regija mišjega MSI-1 nizko strukturno kompleksna, so z namenom povišanja topnosti proteina klonirali skrajšano obliko gena za MSI-1, ki je vključeval zapis za prvih 192 aminokislinskih ostankov. Izražanje gena za skrajšano obliko proteina (MSI-1*) je bilo pod nadzorom inducibilnega sintetičnega promotorja (poimenovan PLlac), ki je bil načrtovan na podlagi promotorja PL in reprimiran z represorjem LacI. Na transkripcijskem nivoju so z dodatkom laktoze ali β-D-1-tiogalaktopiranozida (IPTG) lahko inducirali izražanje gena za MSI-1*. Kot regulatorni element so uporabili Super folder GFP (sfGFP). Izražanje gena za sfGFP je bilo pod nadzorom konstitutivnega promotorja J23119. Zapis za sfGFP je po start kodonu vključeval dva prepoznavna motiva za MSI-1*, in sicer GUUAGU ter AUUUAGU, ki predvidoma tvorita sekundarno strukturo v obliki stebla. MSI-1* tako z vezavo na prepoznavna motiva na molekuli mRNA za sfGFP lahko zavre translacijo, saj sterično ovira vezavo ribosomalne podenote 30S na mRNA [1]. Tak način delovanja se razlikuje od tistega, ki poteka naravno pri sesalcih, saj se pri sesalcih MSI-1 veže na 3' UTR tarčne mRNA (Numb) in tako prepreči delovanje poli(A)-vezavnega proteina PABP in zavre translacijo [3]. Pri tako sestavljenem sinteznobiološkem vezju sta torej vhodna signala bila laktoza (ali IPTG) in oleinska kislina, izhodni signal je bila fluorescenca sfGFP. Takšno obnašanje sistema opišejo logična vrata IMPLY, torej se sfGFP ne izraža le v primeru, da je v sistemu laktoza (ali IPTG) in v sistemu ni oleinske kisline. Delovanje sinteznobiološkega vezja so karakterizirali s fluorimetrijo, merili so fluorescenco sfGFP (v AU) v odvisnosti od koncentracije laktoze (do 1 mM). Pri 1 mM koncentraciji laktoze je MSI-1* znižal sintezo sfGFP, in sicer za faktor 2.5. IPTG je povzročil zelo podoben odziv. Meritve celične rasti za vse indukcijske pogoje so pokazale, da je bila pri vseh pogojih rast celic skoraj konstantna, kar pomeni, da ekspresija gena za mišji protein MSI-1* ni povzročila motenj v rasti bakterijskih celic [1].

== Mehanizem interakcije med MSI-1* in prepoznavnim motivom na mRNA ==

Natančnejši vpogled v mehanizem interakcije med MSI-1* in prepoznavnima motivoma na mRNA, ki zapisuje za sfGFP, je omogočil izračun disociacijske konstante KD med mRNA in MSI-1*. Točkovna mutacija v enem prepoznavnem motivu (RUnCGU, mutanta 1) je povzročil zgolj 1.4x znižanje sinteze sfGFP v prisotnosti MSI-1* [1], s čimer so potrdili ugotovitev predhodnih raziskav, da je zaporedje UAG na prepoznavnem motivu ključno za specifično prepoznavo prepoznavnega motiva z MSI-1 [4]. Točkovni mutaciji v obeh prepoznavnih motivih (UAC namesto UAG, mutanta 5) sta povzročili zelo podoben odziv. Reporterski sistem z najkrajšim možnim konsenznim zaporedjem AUAGU ni pokazal nobene regulacije z MSI-1*, kar pomeni, da sta dve kopiji konsenznega zaporedja ključni za uspešno regulacijo izražanja gena za tarčni protein z MSI-1*. Pri in vitro eksperimentih vezavne kinetike so uporabili skrajšano obliko gena za človeški MSI-1h*. Meritve so izvajali s tehnologijo switchSENSE, ki omgooča meritve molekulske dinamike na čipu. dsDNA, imobilizirana na elektrodo iz Au v čipu, je imela fluorofor na enem koncu in prepoznavni motiv za vezavo MSI-1h* na drugem koncu. Vezava MSI-1h* (injiciran analit) na RNA povzroči spremembe v fluorescenci, ki se merijo v realnem času in omogočajo izračun kinetičnih konstant. V primeru originalnega prepoznavnega motiva na RNA (brez točkovnih mutacij) so dobili stopnjo asociacije kON = 1.1 nM-1 min-1, povprečen čas zadrževanja proteina MSI-1* na tarčni mRNA je bil 1.5 min (1/koff, koff je stopnja disociacije). Pri mutanti 1 je bila stopnja asociacije podobna kot pri nemutiranem prepoznavnem motivu, stopnja disociacije pa skoraj 4x hitrejša. Pri mutanti 5 pa sta bili moteni tako stopnja asociacije (15x manjša hitrost) kot stopnja disociacije (10x večja hitrost). Disociacijska konstanta KD (= koff/kon) je 0.62 nM za nemutirano obliko prepoznavnega motiva in 87 nM za mutanto 5 [1].

== Spreminjanje prepoznavnega motiva na mRNA z namenom povišanja dinamičnega razpona odziva ==

Raziskovalci so želeli preveriti, ali bi s spreminjanjem prepoznavnega motiva na mRNA za vezavo MSI-1 in z dodajanjem novih prepoznavnih motivov lahko povečali dinamičen razpon odziva. Najboljše rezultate je dal tretji reporterski sistem (redesign 3), ki je poleg obeh prepoznavnih motivov po start kodonu (sekundarna struktura v obliki zanke) vključeval še spremembe na 5' UTR zapisa za sfGFP. Na 5' UTR sta bila dodana dodatna prepoznavna motiva RUnAGU (GUUUAGU in AUUUAGU), ki sta obkrožala RBS in predvidoma nista tvorila sekundarnih struktur. Mišji MSI-1* je tako blokiral tudi vezavo RNA dela ribosomske podenote 30S. Ta reporterski sistem je povzročil približno 2x povišanje maksimalnega izražanja gena (brez laktoze) za sfGFP in 8.6x znižanje maksimalnega izražanja gena za sfGFP z MSI-1*, kar je v primerjavi z originalnim reporterskim sistemom (2 nemutirani prepoznavni zaporedji), kjer je bilo maksimalno znižanje izražanja gena 2.5x, velik napredek. Primerjava Hillovih koeficientov pri originalnem sistemu in redesign 3 (4.5 pri redesign 3, 1.7 pri originalnem sistemu) nakazuje na pozitivno kooperativnost vezave obeh molekul proteina MSI-1*, ki se lahko vežeta vsak na po 2 prepoznavni mesti [1].

== MSI-1* je alosterično inhibiran z oleinsko kislino ==

Protein MSI-1 je alosterično inhibiran z oleinsko kislino, ki se veže na domeno RRM1 na MSI-1 in preko konformacijske spremembe MSI-1 prepreči prepoznavno tarčne RNA. Z eksperimentom, ki temelji na spremenjeni mobilnosti molekul pri elektroforezi, so potrdili interakcijo med MSI-1* (koncentracija 45 µM) in RNA (koncentracija 11 µM), ki je bila popolnoma motena v prisotnosti 1 mM oleinske kisline. E. coli ima transporterje za vnos maščobnih kislin iz okolja (FadL in FadD). Z meritvami fluorescence sfGFP v posameznih celicah so ugotovili, da se je pri originalnem reporterskem sistemu (nemutirani prepoznavni mesti) delež celic v stanju ON (fluorescenca sfGFP nad določeno mejo) dvignil iz 10 % (pri 1 mM laktozi) na 49 % po dodatku 20 mM oleinske kisline. Prvotnih 93 % celic v stanju ON (ko ni bilo laktoze v sistemu) se ni povrnilo, najverjetneje ker se je oleinska kislina delno razgradila po vstopu v celice [1].

== Aplikacije proteina Musashi-1 ==

Transkripcijska regulacija ima svoje omejitve pri regulaciji specifičnega gena znotraj operona. Protein Musashi-1 bi lahko reguliral izražanje specifičnega gena, ki je del policistronskega operona. To bi lahko bilo uporabno pri regulaciji izražanja številnih encimov pri metabolnih poteh, torej pri metabolnem inženiringu. Uporaben bi bil tudi v kombinaciji s transkripcijskimi regulatorji, s čimer bi dosegli bolj raznoliko kombinirano regulacijo. Raziskovalci so z namenom potrditve teh dveh aplikacij proteina Musashi sestavili novo vezje, kjer sta sfGFP in mScarlet tvorila eno transkripcijsko enoto (bicistronski operon) pod nadzorom inducibilnega sintetičnega promotorja (PLtet), načrtovanega na podlagi promotorja PL, ki je bil reguliran s tetraciklinskim represorjem (TetR). Z dodatkom anhidrotetraciklina (aTC) so omogočili prepisovanje genov za sfGFP in mScarlet. Prepoznavni motivi na mRNA za vezavo MSI-1* so bili zgolj na začetku zapisa za sfGFP. Gen za MSI-1* je bil pod nadzorom promotorja PLlac, torej je za začetek transkripcije zapisa za MSI-1* bil potreben dodatek laktoze (ali IPTG). Obnašanje sistema opišejo logična vrata NIMPLY, pri čemer se zapis za sfGFP izraža zgolj v primeru prisotnosti aTC v sistemu in v odsotnosti laktoze v sistemu. Z dodatkom laktoze (1 mM) in aTC (100 ng/mL) v vseh kombinacijah (brez obeh, zgolj eden, oba) so pokazali specifično regulacijo izražanja gena za sfGFP v bicistronskem operonu in sposobnost kombiniranja regulatornih signalov z namenom združitve transkripcijske in potranskripcijske regulacije. Protein Musashi-1 je pokazal velik potencial pri potranskripcijski regulaciji v E. coli, kar odpira možnosti za raziskave delovanja tudi drugih heterolognih RNA-vezavnih proteinov z RRM pri preprostejših organizmih [1].

== Literatura ==

[1] R. Dolcemascolo, M. Heras-Hernández, L. Goiriz, R. Montagud-Martínez, A. Requena-Menéndez, R. Ruiz, A. Pérez-Ràfols, R. A. Higuera-Rodríguez, G. Pérez-Ropero, W. F. Vranken, et al.: Repurposing the mammalian RNA-binding protein Musashi-1 as an allosteric translation repressor in bacteria. Elife 2024, 12.

[2] C. C. Clingman, L. M. Deveau, S. A. Hay, R. M. Genga, S. M. D. Shandilya, F. Massi, S. P. Ryder: Allosteric inhibition of a stem cell RNA-binding protein by an intermediary metabolite. Elife 2014, 2014.

[3] H. Kawahara, T. Imai, H. Imataka, M. Tsujimoto, K. Matsumoto, H. Okano: Neural RNA-binding protein Musashi1 inhibits translation initiation by competing with eIF4G for PABP. Journal of Cell Biology 2008, 181, 639–653.

[4] N. Ruth Zearfoss, L. M. Deveau, C. C. Clingman, E. Schmidt, E. S. Johnson, F. Massi, S. P. Ryder: A conserved three-nucleotide core motif defines musashi RNA binding specificity. Journal of Biological Chemistry 2014, 289, 35530–35541.

TE kot regulatorji transkripcije

2022-04-24T12:45:57Z

Markokovacic: /* Transpozicijski elementi in njihova vloga pri regulatornih nekodirajočih molekulah RNA */

==Uvod==
Transpozicijski elementi (TE), ki sestavljajo velik del evkariontskega genoma, lahko, če se nahajajo v eksonskih predelih gostiteljevega genskega zapisa, bistveno zmanjšajo njegovo evolucijsko sposobnost preživetja, ker delujejo moteče (lahko povzročijo npr. vstavitev start in stop kodonov, premik bralnega okvirja, prehitro terminacijo transkripcije,…). S tem zmanjšajo tudi verjetnost za lasten prenos v nove generacije. Ker TE po delovanju spominjajo na parazitski organizem, so se skozi evolucijo razvile strategije, ki preprečujejo preveliko škodo na gostiteljskem organizmu. Prilagajanje je potekalo vzajemno. Gostiteljski organizmi so npr. postali sposobni utišanja transpozicijskih elementov s pomočjo metilacije DNA na CpG otočkih, TE pa so se preferenčno vključevali v intronska zaporedja, saj tam ne delujejo tako moteče. Skozi čas so gostiteljski organizmi postali sposobni uporabe TE v svojo korist. 

Vključitve transpozicijskih elementov v nekodirajoče predele genskega zapisa in njihove mutacije so v veliko primerih povzročile, da so TE izgubili sposobnost transponiranja, pridobili pa so cis in trans-regulatorno aktivnost. Cis-regulatorne regije (CRE) so nekodirajoča zaporedja nukleotidov, ki regulirajo ekspresijo genov na isti verigi DNA. Trans regulacija pa pomeni predvsem to, da npr. transkripcijski faktorji prihajajo od drugod oz. so kodirani na eni molekuli DNA, regulirajo pa ekspresijo genov na drugi molekuli DNA. Regulacija transkripcije s TE lahko poteka na več načinov: 

1. V genski zapis lahko vnašajo nova vezavna mesta za transkripcijske faktorje (TF) preko promotorjev, ojačevalcev, utiševalnih in izolatorskih zaporedij. 
2. Lahko modulirajo 3D strukturo kromatina. 
3. Zmožni so kodiranja transkripcijskih faktorjev. 
4. S povezovanjem z represorskimi transkripcijskimi faktorji vplivajo na utišanje sosednjih genov. 
5. Imajo vlogo pri regulatornih nekodirajočih molekulah RNA, ki so pomembni regulatorji transkripcije. 

==Funkcije transpozicijskih elementov v cis-regulatornih regijah ==
Regulatorne sposobnosti cis-regulatornih regij lahko izhajajo iz transpozicijskih elementov. V splošnem cis-regulatorne regije delujejo tako, da tvorijo specifična vezavna mesta za proteine povezane z iniciacijo in regulacijo transkripcije. Primeri nekaterih vrst CRE: 

1. Promotorji so kratka zaporedja DNA, ki vključujejo začetno mesto transkripcije. Ob vezavi ustreznih transkripcijskih faktorjev na promotorsko regijo omogočijo transkripcijo gena. Kot primer bi omenil transpozon AluSp v promotorju gena FCER1G, ki inducira transkripcijo visokoafinitetnega receptorja za Fc regijo IgE. 
2. Ojačevalci so zaporedja, ki jih najdemo pred ali za genom, ki ga regulirajo. Delujejo kooperativno s promotorjem, in sicer tako, da povečajo stopnjo transkripcije, omogočajo pa regulacijo tudi bolj oddaljenih genov. Kot primer bi omenil transpozon AluY v intronu gena CD8 (ta kodira glikoprotein CD8, ki je pomemben pri celičnih interakcijah znotraj imunskega sistema), za katerega so ugotovili, da deluje kot ojačevalec. 
3. Utiševalna zaporedja vežejo represorje in tako preprečujejo transkripcijo. Transpozicijski elementi so z rekrutiranjem transkripcijskih faktorjev postali sposobni delovati kot utiševalna zaporedja, ki remodelirajo kromatin. Čeprav so heterokromatinski deli revni z geni, so bogati s TE-ji, kar bi lahko pomenilo, da imajo transpozicijski elementi pomembno vlogo pri širjenju heterokromatina. Tako se npr. korepresorski protein TRIM28 veže na vezavno mesto, ki se nahaja na transpozonu ERV in s tem utiša sosednje gene. 
4. Inzulatorji ščitijo gene pred regulatornimi vplivi sosednjih genov. Lahko blokirajo promotorje, ojačevalce in utiševalce. Preprečujejo neprimerne interakcije med sosednjimi kromatinskimi regijami. Kot primer bi omenil gen za transpozon AluSq, ki deluje kot inzulator, saj njegova transkripcija ščiti človeški gen HBE1 (ki kodira za istoimenski protein) pred regulacijo z drugimi promotorji. 

TE-ji uvajajo nova vezavna mesta za TF, ki so v njih lahko prisotna takoj po inserciji v genom ali pa nastanejo de novo s postinsercijskimi mutacijami. Pogosto se mutacije pojavljajo na metiliranih CpG otočkih. Deaminacija teh povzroči zamenjavo citozina z gvaninom, kar je med drugim povzročilo nastanek številnih vezavnih mest za transkripcijska faktorja cMyc in p53. Vključitev TE-jev zraven že obstoječega vezavnega mesta za transkripcijske faktorje ter točkovne mutacije omogočijo nastanek novih mest za vezavo TF (alternativni promotorji), kar povzroča zaščito pred možnimi kasnejšimi mutacijami z redundančnostjo. Redundanca dopušča tudi kooperativno delovanje z zunanjimi promotorji, saj se lahko tako razbremenijo določena vezavna mesta za transkripcijske faktorje. 

==Vpliv transpozicijskih elementov na kromatinsko 3D strukturo==
V interfaznem jedru so deli genoma organizirani v topološko asociirajoče domene (TAD). To so večje domene kromatina, ki so med seboj ločene z izolatorskimi proteini. Ti omejujejo prostor, v katerem lahko različni deli DNA prihajajo v medsebojne stike. Njihova naloga je tudi prostorsko omejevanje interakcij med transkripcijskimi faktorji in ojačevalci ter promotorji. TAD specificirajo funkcije cis regulatornih regij z omejevanjem ojačevalcev, tako da ti aktivirajo le promotorje znotraj iste TAD. Vloga transpozicijskih elementov (TE) pri 3D arhitekturi genoma se je v zadnjih letih začela intenzivno raziskovati. Številne družine TE so namreč obogatene na mejah TAD. Določeni TE naj bi imeli preko tega tudi vlogo pri zvijanju kromosomov, prav tako pa tudi pri kompaktnosti kromatina in posledično tudi pri regulaciji procesov transkripcije. Kot primer pomena transpozicijskih elementov bi izpostavil študijo, ki je odkrila veliko HERV-H na mejah TAD v človeških embrionalnih matičnih celicah (hESCs) in delecija 2 individualnih HERV-H je vodila do izgube kompaktnosti te meje. 

Protein CTCF (11-zinc finger protein) je pomemben pri regulaciji 3D strukture kromatina in procesov transkripcije. Zelo pomemben je pri strukturi mej TAD. Vsebuje motive cinkovega prsta in deluje kot transkripcijski faktor. Sodeluje pri mediaciji nastanka kromatinskih zank in se velikokrat veže na TE. Opaženo je bilo, da so TE razpršili veliko vezavnih mest za protein CTCF in smiselno bi bilo, da bi se tudi meje TAD razpršile, vendar je bilo ugotovljeno, da so te zelo ohranjene. Odkrili so različne mehanizme preprečevanja tvorbe ektopičnih meja TAD. Tako se npr. transpozoni B2SINE, ki imajo veliko vezavnih mest za protein CTCF, lahko povežejo s kompleksom ChAHP, ki torej prepozna isti motiv kot CTCF, a z višjo afiniteto. 

==Kodiranje transkripcijskih faktorjev s transpozicijskimi elementi==
Šele nedavno so prišli do dognanj, da proteini, za katere kodirajo transpozicijski elementi, lahko vplivajo na regulacijo genov. Najdeni so bili številni primeri, v katerih gen za TE kodira transpozazo in hkrati tudi gostiteljski transkripcijski faktor. Fuzija transpozazne DNA-domene z regulatorno domeno transkripcijskega faktorja privede do tvorbe proteinskega kompleksa, ki je sposoben prepoznave ustreznega zaporedja TE na DNA, ker transpozaza prepozna transpozicijski element. Tako se lahko optimizira regulacija ekspresije genov s pomočjo TE. 

==Utišanje transpozicijskih elementov in pomen le-tega pri regulaciji transkripcije==
Organizmi so razvili zmožnost zmanjšanja aktivnosti transpozicijskih elementov, prav tako pa so transpozicijski elementi zmožni obiti gostiteljevo obrambo. Eden od načinov utišanja delovanja TE je metilacija DNA. Demetilacija TE lahko vodi do nepravilne aktivacije sosednjih genov zaradi ojačevalnega potenciala TE. Zato so gostitelji morali razviti mehanizem, ki to kontrolira. Pomemben utiševalni mehanizem TE je metilacija CpG otočkov na DNA. Primer povezave med metilacijo DNA in aktivnostjo iz TE izhajajočih cis regulatornih regij je gen Agouti. Ta daje rjavo obarvanim mišim C57BL/6J rumeno obarvanje na način, ki je odvisen od ravni metilacije promotorja, ki nadzoruje transkripcijo retrotranspozonov IAP. Retrotranspozon IAP pa nadzira ekspresijo gena Agouti in s tem obarvanje miši. 

Drug mehanizem utišanja TE so histonske modifikacije. Primer te epigenetske modifikacije je trimetilacija lizina 9 na histonu H3 (H3K9me3). Pomembno vlogo pri tem ima kompleks HUSH (human silencing hub complex). ATPaza MORC2 in HUSH se povežeta in posledično pride do trimetilacije na histonu 3 na retrotranspozonu LINE1 in tako se retrotranspoznon utiša. LINE1 se nahaja v intronih aktivnih genov. Če so ti trimetilirani, potem se RNA polimeraza II ne more pomikati naprej (motena je elongacija transkripcije), zato se geni ne prepisujejo. 

==Transpozicijski elementi in njihova vloga pri regulatornih nekodirajočih molekulah RNA==
Zaradi napredka v določanju nukleotidnega zaporedja molekul RNA se v zadnjih letih odkriva vedno več nekodirajočih molekul RNA (ncRNA). Te vključujejo tudi regulatorne RNA, med katere spadajo kratke nekodirajoče RNA (sncRNA) in dolge nekodirajoče RNA (lncRNA). Transpozicijski elementi (TE) in regulatorne RNA so tesno povezani, saj velik del nukleotidnega zaporedja regulatornih RNA in njihovih genov ter regulatornih regij predstavljajo TE. Transpozicijski elementi določajo funkcionalne lastnosti različnih tipov ncRNA, kar je ključno za njihovo regulatorno funkcijo pri transkripciji in posttranskripcijskih procesih. 

Transpozicijski elementi dajejo strukturne značilnosti lncRNA, ki jim dajejo sposobnost interakcije z drugimi biološkimi molekulami (DNA, RNA, proteini...). lncRNA imajo lahko tako cis kot tudi trans-regulatorno aktivnost. Pojavlja se veliko hipotez, da TE dajejo funkcionalne domene lncRNA. Primer, ki potrjuje to hipotezo, je interakcija med XIST lncRNA in proteinskim kompleksom PRC2 (polycomb repressive complex 2). XIST lncRNA namreč vključuje transpozicijski element ERVB5 in ravno ta regija predstavlja vezavno mesto za PRC2. PRC2 ima vlogo pri zagotavljanju kompaktnosti kromatina, in sicer tako, da ena izmed njegovih podenot EZH2 (Enhancer of zeste homolog 2) katalizira trimetilacijo lizina 27 na histonu 3 (H3K27me1/2/3), s tem pa povzroči represijo transkripcije določenih genov. Fosforilacija EZH2 in T350 (obe sta podenoti PRC2) s CDK1/2 je ključna za interakcijo PRC2 z lncRNA, ki poteka preko G-kvadrupleskne regije lncRNA, le-ta pa je bogata s transpozoni ERVB5. XIST lncRNA pripelje proteinski kompleks PRC2 do promotorske regije tarčnega gena (npr. tumor supresorskega gena), kjer EZH2 s svojo metiltransferazno aktivnostjo deluje kot represor transkripcije. 
Zanimiv primer povezave med transpozicijskimi elementi in nekodirajočo RNA je regulacija odziva na toplotni šok pri miših. Ta primer kaže tudi na trans-regulatorno vlogo nekodirajoče RNA. Mišja ncRNA, ki izhaja iz retrotranspozona B2 SINE, se v normalnih pogojih veže na regulatorne regije genov, ki se odzivajo na stres, ter tako prepreči njihovo transkripcijo. Pri toplotnem šoku se aktivira protein EZH2, ki pospeši razgradnjo te ncRNA ter tako prepreči inhibicijo transkripcije genov, povezanih s stresom (EZH2 stimulira ribocimsko aktivnost same ncRNA). 

Transpozicijski elementi imajo pomembno vlogo pri procesu transkripcije genov za nekodirajoče RNA, saj so vključeni v številna območja njihovih genov in regulatornih regij. Mesta na genomu, na katerih se nahajajo nukleotidna zaporedja, ki izhajajo iz transpozicijskih elementov, so prisotna tako v promotorjih kot tudi na poliA regijah genov za nekodirajoče RNA. Veliko so jih našli tudi na regijah genov za lncRNA, ki so pomembna za spajanje eksonov oz. izrezovanje intronov (splice donor, splice acceptor). 

Veliko molekul miRNA (spadajo med sncRNA) z vključenimi transpozicijskimi elementi interagira s 3' koncem neprevajajoče regije tarčne mRNA (3' UTR). Preko tega procesa se utiša mRNA. Tako se npr. miR-151, ki vsebuje transpozicijske elemente LINE2, veže na molekulo mRNA, ki kodira za ATPAF1 (ATP synthase mitochondrial F1 complex assembly factor 1), in sicer tako, da se poveže s transpozoni LINE2 na 3' koncu neprevajajoče regije tarčne mRNA. 

Vedno bolj se odkriva tudi vloga transpozicijskih elementov pri tvorbi stabilnejših sekundarnih struktur v nekodirajočih RNA. Raziskava, ki je primerjala lncRNA z vključenimi transpozicijskimi elementi in lncRNA brez vključenih transpozicijskih elementov, je ugotovila, da lncRNA z vključenimi transpozicijskimi elementi tvorijo stabilnejše sekundarne strukture. Analizirali so tudi mesta na lncRNA, ki so vključena v bazno parjenje pri tvorbi sekundarnih struktur in ugotovili, da je okrog 82 % teh mest lociranih v Alu regijah lncRNA. Torej, Alu regije v regulatornih RNA sodelujejo pri intramolekularnem baznem parjenju, kar privede do tvorbe stabilnejših sekundarnih struktur, s tem pa tudi do večje stabilnosti nekodirajočih RNA. To jim omogoči, da lahko bolje opravljajo svoje funkcije regulacije transkripcije. 

==Viri in literatura==

[1]R. Fueyo, J. Judd, C. Feschotte, and J. Wysocka, ‘Roles of transposable elements in the regulation of mammalian transcription’, Nat Rev Mol Cell Biol, pp. 1–17, Feb. 2022, doi: 10.1038/s41580-022-00457-y. 
[2]A. Ali, K. Han, and P. Liang, ‘Role of Transposable Elements in Gene Regulation in the Human Genome’, Life (Basel), vol. 11, no. 2, p. 118, Feb. 2021, doi: 10.3390/life11020118. 
[3]P. J. Wittkopp and G. Kalay, ‘Cis-regulatory elements: molecular mechanisms and evolutionary processes underlying divergence’, Nat Rev Genet, vol. 13, no. 1, Art. no. 1, Jan. 2012, doi: 10.1038/nrg3095. 
[4]A. Hao, Y. Wang, D. B. Stovall, Y. Wang, and G. Sui, ‘Emerging Roles of LncRNAs in the EZH2-regulated Oncogenic Network’, Int. J. Biol. Sci., vol. 17, no. 13, pp. 3268–3280, 2021, doi: 10.7150/ijbs.63488. 
[5]N. Liu et al., ‘Selective silencing of euchromatic L1s revealed by genome-wide screens for L1 regulators’, Nature, vol. 553, no. 7687, Art. no. 7687, Jan. 2018, doi: 10.1038/nature25179. 

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

TE kot regulatorji transkripcije

2022-04-24T12:45:38Z

Markokovacic: /* Utišanje transpozicijskih elementov in pomen le-tega pri regulaciji transkripcije */

==Uvod==
Transpozicijski elementi (TE), ki sestavljajo velik del evkariontskega genoma, lahko, če se nahajajo v eksonskih predelih gostiteljevega genskega zapisa, bistveno zmanjšajo njegovo evolucijsko sposobnost preživetja, ker delujejo moteče (lahko povzročijo npr. vstavitev start in stop kodonov, premik bralnega okvirja, prehitro terminacijo transkripcije,…). S tem zmanjšajo tudi verjetnost za lasten prenos v nove generacije. Ker TE po delovanju spominjajo na parazitski organizem, so se skozi evolucijo razvile strategije, ki preprečujejo preveliko škodo na gostiteljskem organizmu. Prilagajanje je potekalo vzajemno. Gostiteljski organizmi so npr. postali sposobni utišanja transpozicijskih elementov s pomočjo metilacije DNA na CpG otočkih, TE pa so se preferenčno vključevali v intronska zaporedja, saj tam ne delujejo tako moteče. Skozi čas so gostiteljski organizmi postali sposobni uporabe TE v svojo korist. 

Vključitve transpozicijskih elementov v nekodirajoče predele genskega zapisa in njihove mutacije so v veliko primerih povzročile, da so TE izgubili sposobnost transponiranja, pridobili pa so cis in trans-regulatorno aktivnost. Cis-regulatorne regije (CRE) so nekodirajoča zaporedja nukleotidov, ki regulirajo ekspresijo genov na isti verigi DNA. Trans regulacija pa pomeni predvsem to, da npr. transkripcijski faktorji prihajajo od drugod oz. so kodirani na eni molekuli DNA, regulirajo pa ekspresijo genov na drugi molekuli DNA. Regulacija transkripcije s TE lahko poteka na več načinov: 

1. V genski zapis lahko vnašajo nova vezavna mesta za transkripcijske faktorje (TF) preko promotorjev, ojačevalcev, utiševalnih in izolatorskih zaporedij. 
2. Lahko modulirajo 3D strukturo kromatina. 
3. Zmožni so kodiranja transkripcijskih faktorjev. 
4. S povezovanjem z represorskimi transkripcijskimi faktorji vplivajo na utišanje sosednjih genov. 
5. Imajo vlogo pri regulatornih nekodirajočih molekulah RNA, ki so pomembni regulatorji transkripcije. 

==Funkcije transpozicijskih elementov v cis-regulatornih regijah ==
Regulatorne sposobnosti cis-regulatornih regij lahko izhajajo iz transpozicijskih elementov. V splošnem cis-regulatorne regije delujejo tako, da tvorijo specifična vezavna mesta za proteine povezane z iniciacijo in regulacijo transkripcije. Primeri nekaterih vrst CRE: 

1. Promotorji so kratka zaporedja DNA, ki vključujejo začetno mesto transkripcije. Ob vezavi ustreznih transkripcijskih faktorjev na promotorsko regijo omogočijo transkripcijo gena. Kot primer bi omenil transpozon AluSp v promotorju gena FCER1G, ki inducira transkripcijo visokoafinitetnega receptorja za Fc regijo IgE. 
2. Ojačevalci so zaporedja, ki jih najdemo pred ali za genom, ki ga regulirajo. Delujejo kooperativno s promotorjem, in sicer tako, da povečajo stopnjo transkripcije, omogočajo pa regulacijo tudi bolj oddaljenih genov. Kot primer bi omenil transpozon AluY v intronu gena CD8 (ta kodira glikoprotein CD8, ki je pomemben pri celičnih interakcijah znotraj imunskega sistema), za katerega so ugotovili, da deluje kot ojačevalec. 
3. Utiševalna zaporedja vežejo represorje in tako preprečujejo transkripcijo. Transpozicijski elementi so z rekrutiranjem transkripcijskih faktorjev postali sposobni delovati kot utiševalna zaporedja, ki remodelirajo kromatin. Čeprav so heterokromatinski deli revni z geni, so bogati s TE-ji, kar bi lahko pomenilo, da imajo transpozicijski elementi pomembno vlogo pri širjenju heterokromatina. Tako se npr. korepresorski protein TRIM28 veže na vezavno mesto, ki se nahaja na transpozonu ERV in s tem utiša sosednje gene. 
4. Inzulatorji ščitijo gene pred regulatornimi vplivi sosednjih genov. Lahko blokirajo promotorje, ojačevalce in utiševalce. Preprečujejo neprimerne interakcije med sosednjimi kromatinskimi regijami. Kot primer bi omenil gen za transpozon AluSq, ki deluje kot inzulator, saj njegova transkripcija ščiti človeški gen HBE1 (ki kodira za istoimenski protein) pred regulacijo z drugimi promotorji. 

TE-ji uvajajo nova vezavna mesta za TF, ki so v njih lahko prisotna takoj po inserciji v genom ali pa nastanejo de novo s postinsercijskimi mutacijami. Pogosto se mutacije pojavljajo na metiliranih CpG otočkih. Deaminacija teh povzroči zamenjavo citozina z gvaninom, kar je med drugim povzročilo nastanek številnih vezavnih mest za transkripcijska faktorja cMyc in p53. Vključitev TE-jev zraven že obstoječega vezavnega mesta za transkripcijske faktorje ter točkovne mutacije omogočijo nastanek novih mest za vezavo TF (alternativni promotorji), kar povzroča zaščito pred možnimi kasnejšimi mutacijami z redundančnostjo. Redundanca dopušča tudi kooperativno delovanje z zunanjimi promotorji, saj se lahko tako razbremenijo določena vezavna mesta za transkripcijske faktorje. 

==Vpliv transpozicijskih elementov na kromatinsko 3D strukturo==
V interfaznem jedru so deli genoma organizirani v topološko asociirajoče domene (TAD). To so večje domene kromatina, ki so med seboj ločene z izolatorskimi proteini. Ti omejujejo prostor, v katerem lahko različni deli DNA prihajajo v medsebojne stike. Njihova naloga je tudi prostorsko omejevanje interakcij med transkripcijskimi faktorji in ojačevalci ter promotorji. TAD specificirajo funkcije cis regulatornih regij z omejevanjem ojačevalcev, tako da ti aktivirajo le promotorje znotraj iste TAD. Vloga transpozicijskih elementov (TE) pri 3D arhitekturi genoma se je v zadnjih letih začela intenzivno raziskovati. Številne družine TE so namreč obogatene na mejah TAD. Določeni TE naj bi imeli preko tega tudi vlogo pri zvijanju kromosomov, prav tako pa tudi pri kompaktnosti kromatina in posledično tudi pri regulaciji procesov transkripcije. Kot primer pomena transpozicijskih elementov bi izpostavil študijo, ki je odkrila veliko HERV-H na mejah TAD v človeških embrionalnih matičnih celicah (hESCs) in delecija 2 individualnih HERV-H je vodila do izgube kompaktnosti te meje. 

Protein CTCF (11-zinc finger protein) je pomemben pri regulaciji 3D strukture kromatina in procesov transkripcije. Zelo pomemben je pri strukturi mej TAD. Vsebuje motive cinkovega prsta in deluje kot transkripcijski faktor. Sodeluje pri mediaciji nastanka kromatinskih zank in se velikokrat veže na TE. Opaženo je bilo, da so TE razpršili veliko vezavnih mest za protein CTCF in smiselno bi bilo, da bi se tudi meje TAD razpršile, vendar je bilo ugotovljeno, da so te zelo ohranjene. Odkrili so različne mehanizme preprečevanja tvorbe ektopičnih meja TAD. Tako se npr. transpozoni B2SINE, ki imajo veliko vezavnih mest za protein CTCF, lahko povežejo s kompleksom ChAHP, ki torej prepozna isti motiv kot CTCF, a z višjo afiniteto. 

==Kodiranje transkripcijskih faktorjev s transpozicijskimi elementi==
Šele nedavno so prišli do dognanj, da proteini, za katere kodirajo transpozicijski elementi, lahko vplivajo na regulacijo genov. Najdeni so bili številni primeri, v katerih gen za TE kodira transpozazo in hkrati tudi gostiteljski transkripcijski faktor. Fuzija transpozazne DNA-domene z regulatorno domeno transkripcijskega faktorja privede do tvorbe proteinskega kompleksa, ki je sposoben prepoznave ustreznega zaporedja TE na DNA, ker transpozaza prepozna transpozicijski element. Tako se lahko optimizira regulacija ekspresije genov s pomočjo TE. 

==Utišanje transpozicijskih elementov in pomen le-tega pri regulaciji transkripcije==
Organizmi so razvili zmožnost zmanjšanja aktivnosti transpozicijskih elementov, prav tako pa so transpozicijski elementi zmožni obiti gostiteljevo obrambo. Eden od načinov utišanja delovanja TE je metilacija DNA. Demetilacija TE lahko vodi do nepravilne aktivacije sosednjih genov zaradi ojačevalnega potenciala TE. Zato so gostitelji morali razviti mehanizem, ki to kontrolira. Pomemben utiševalni mehanizem TE je metilacija CpG otočkov na DNA. Primer povezave med metilacijo DNA in aktivnostjo iz TE izhajajočih cis regulatornih regij je gen Agouti. Ta daje rjavo obarvanim mišim C57BL/6J rumeno obarvanje na način, ki je odvisen od ravni metilacije promotorja, ki nadzoruje transkripcijo retrotranspozonov IAP. Retrotranspozon IAP pa nadzira ekspresijo gena Agouti in s tem obarvanje miši. 

Drug mehanizem utišanja TE so histonske modifikacije. Primer te epigenetske modifikacije je trimetilacija lizina 9 na histonu H3 (H3K9me3). Pomembno vlogo pri tem ima kompleks HUSH (human silencing hub complex). ATPaza MORC2 in HUSH se povežeta in posledično pride do trimetilacije na histonu 3 na retrotranspozonu LINE1 in tako se retrotranspoznon utiša. LINE1 se nahaja v intronih aktivnih genov. Če so ti trimetilirani, potem se RNA polimeraza II ne more pomikati naprej (motena je elongacija transkripcije), zato se geni ne prepisujejo. 

==Transpozicijski elementi in njihova vloga pri regulatornih nekodirajočih molekulah RNA==
Zaradi napredka v določanju nukleotidnega zaporedja molekul RNA se v zadnjih letih odkriva vedno več nekodirajočih molekul RNA (ncRNA). Te vključujejo tudi regulatorne RNA, med katere spadajo kratke nekodirajoče RNA (sncRNA) in dolge nekodirajoče RNA (lncRNA). Transpozicijski elementi (TE) in regulatorne RNA so tesno povezani, saj velik del nukleotidnega zaporedja regulatornih RNA in njihovih genov ter regulatornih regij predstavljajo TE. Transpozicijski elementi določajo funkcionalne lastnosti različnih tipov ncRNA, kar je ključno za njihovo regulatorno funkcijo pri transkripciji in posttranskripcijskih procesih. 
Transpozicijski elementi dajejo strukturne značilnosti lncRNA, ki jim dajejo sposobnost interakcije z drugimi biološkimi molekulami (DNA, RNA, proteini...). lncRNA imajo lahko tako cis kot tudi trans-regulatorno aktivnost. Pojavlja se veliko hipotez, da TE dajejo funkcionalne domene lncRNA. Primer, ki potrjuje to hipotezo, je interakcija med XIST lncRNA in proteinskim kompleksom PRC2 (polycomb repressive complex 2). XIST lncRNA namreč vključuje transpozicijski element ERVB5 in ravno ta regija predstavlja vezavno mesto za PRC2. PRC2 ima vlogo pri zagotavljanju kompaktnosti kromatina, in sicer tako, da ena izmed njegovih podenot EZH2 (Enhancer of zeste homolog 2) katalizira trimetilacijo lizina 27 na histonu 3 (H3K27me1/2/3), s tem pa povzroči represijo transkripcije določenih genov. Fosforilacija EZH2 in T350 (obe sta podenoti PRC2) s CDK1/2 je ključna za interakcijo PRC2 z lncRNA, ki poteka preko G-kvadrupleskne regije lncRNA, le-ta pa je bogata s transpozoni ERVB5. XIST lncRNA pripelje proteinski kompleks PRC2 do promotorske regije tarčnega gena (npr. tumor supresorskega gena), kjer EZH2 s svojo metiltransferazno aktivnostjo deluje kot represor transkripcije. 
Zanimiv primer povezave med transpozicijskimi elementi in nekodirajočo RNA je regulacija odziva na toplotni šok pri miših. Ta primer kaže tudi na trans-regulatorno vlogo nekodirajoče RNA. Mišja ncRNA, ki izhaja iz retrotranspozona B2 SINE, se v normalnih pogojih veže na regulatorne regije genov, ki se odzivajo na stres, ter tako prepreči njihovo transkripcijo. Pri toplotnem šoku se aktivira protein EZH2, ki pospeši razgradnjo te ncRNA ter tako prepreči inhibicijo transkripcije genov, povezanih s stresom (EZH2 stimulira ribocimsko aktivnost same ncRNA). 
Transpozicijski elementi imajo pomembno vlogo pri procesu transkripcije genov za nekodirajoče RNA, saj so vključeni v številna območja njihovih genov in regulatornih regij. Mesta na genomu, na katerih se nahajajo nukleotidna zaporedja, ki izhajajo iz transpozicijskih elementov, so prisotna tako v promotorjih kot tudi na poliA regijah genov za nekodirajoče RNA. Veliko so jih našli tudi na regijah genov za lncRNA, ki so pomembna za spajanje eksonov oz. izrezovanje intronov (splice donor, splice acceptor). 
Veliko molekul miRNA (spadajo med sncRNA) z vključenimi transpozicijskimi elementi interagira s 3' koncem neprevajajoče regije tarčne mRNA (3' UTR). Preko tega procesa se utiša mRNA. Tako se npr. miR-151, ki vsebuje transpozicijske elemente LINE2, veže na molekulo mRNA, ki kodira za ATPAF1 (ATP synthase mitochondrial F1 complex assembly factor 1), in sicer tako, da se poveže s transpozoni LINE2 na 3' koncu neprevajajoče regije tarčne mRNA. 
Vedno bolj se odkriva tudi vloga transpozicijskih elementov pri tvorbi stabilnejših sekundarnih struktur v nekodirajočih RNA. Raziskava, ki je primerjala lncRNA z vključenimi transpozicijskimi elementi in lncRNA brez vključenih transpozicijskih elementov, je ugotovila, da lncRNA z vključenimi transpozicijskimi elementi tvorijo stabilnejše sekundarne strukture. Analizirali so tudi mesta na lncRNA, ki so vključena v bazno parjenje pri tvorbi sekundarnih struktur in ugotovili, da je okrog 82 % teh mest lociranih v Alu regijah lncRNA. Torej, Alu regije v regulatornih RNA sodelujejo pri intramolekularnem baznem parjenju, kar privede do tvorbe stabilnejših sekundarnih struktur, s tem pa tudi do večje stabilnosti nekodirajočih RNA. To jim omogoči, da lahko bolje opravljajo svoje funkcije regulacije transkripcije. 
==Viri in literatura==

[1]R. Fueyo, J. Judd, C. Feschotte, and J. Wysocka, ‘Roles of transposable elements in the regulation of mammalian transcription’, Nat Rev Mol Cell Biol, pp. 1–17, Feb. 2022, doi: 10.1038/s41580-022-00457-y. 
[2]A. Ali, K. Han, and P. Liang, ‘Role of Transposable Elements in Gene Regulation in the Human Genome’, Life (Basel), vol. 11, no. 2, p. 118, Feb. 2021, doi: 10.3390/life11020118. 
[3]P. J. Wittkopp and G. Kalay, ‘Cis-regulatory elements: molecular mechanisms and evolutionary processes underlying divergence’, Nat Rev Genet, vol. 13, no. 1, Art. no. 1, Jan. 2012, doi: 10.1038/nrg3095. 
[4]A. Hao, Y. Wang, D. B. Stovall, Y. Wang, and G. Sui, ‘Emerging Roles of LncRNAs in the EZH2-regulated Oncogenic Network’, Int. J. Biol. Sci., vol. 17, no. 13, pp. 3268–3280, 2021, doi: 10.7150/ijbs.63488. 
[5]N. Liu et al., ‘Selective silencing of euchromatic L1s revealed by genome-wide screens for L1 regulators’, Nature, vol. 553, no. 7687, Art. no. 7687, Jan. 2018, doi: 10.1038/nature25179. 

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Talk:TE kot regulatorji transkripcije

2022-04-24T12:29:13Z

Markokovacic: New page: David Valte: Uvod, Funkcije transpozicijskih elementov v cis-regulatornih regijah Nik Vidmar: Vpliv na kromatinsko 3D strukturo, Kodiranje transkripcijskih faktorjev s transpozicijskimi e...

David Valte: Uvod, Funkcije transpozicijskih elementov v cis-regulatornih regijah

Nik Vidmar: Vpliv na kromatinsko 3D strukturo, Kodiranje transkripcijskih faktorjev s transpozicijskimi elementi, Utišanje transpozicijskih elementov in pomen le-tega pri regulaciji transkripcije

Marko Kovačić: Transpozicijski elementi in njihova vloga pri regulatornih nekodirajočih molekulah RNA

TE kot regulatorji transkripcije

2022-04-24T12:23:34Z

Markokovacic: /* Utišanje transpozicijskih elementov in pomen le-tega pri regulaciji transkripcije */

==Uvod==
Transpozicijski elementi (TE), ki sestavljajo velik del evkariontskega genoma, lahko, če se nahajajo v eksonskih predelih gostiteljevega genskega zapisa, bistveno zmanjšajo njegovo evolucijsko sposobnost preživetja, ker delujejo moteče (lahko povzročijo npr. vstavitev start in stop kodonov, premik bralnega okvirja, prehitro terminacijo transkripcije,…). S tem zmanjšajo tudi verjetnost za lasten prenos v nove generacije. Ker TE po delovanju spominjajo na parazitski organizem, so se skozi evolucijo razvile strategije, ki preprečujejo preveliko škodo na gostiteljskem organizmu. Prilagajanje je potekalo vzajemno. Gostiteljski organizmi so npr. postali sposobni utišanja transpozicijskih elementov s pomočjo metilacije DNA na CpG otočkih, TE pa so se preferenčno vključevali v intronska zaporedja, saj tam ne delujejo tako moteče. Skozi čas so gostiteljski organizmi postali sposobni uporabe TE v svojo korist. Vključitve transpozicijskih elementov v nekodirajoče predele genskega zapisa in njihove mutacije so v veliko primerih povzročile, da so TE izgubili sposobnost transponiranja, pridobili pa so cis in trans-regulatorno aktivnost. Cis-regulatorne regije (CRE) so nekodirajoča zaporedja nukleotidov, ki regulirajo ekspresijo genov na isti verigi DNA. Trans regulacija pa pomeni predvsem to, da npr. transkripcijski faktorji prihajajo od drugod oz. so kodirani na eni molekuli DNA, regulirajo pa ekspresijo genov na drugi molekuli DNA. Regulacija transkripcije s TE lahko poteka na več načinov:

1. V genski zapis lahko vnašajo nova vezavna mesta za transkripcijske faktorje (TF) preko promotorjev, ojačevalcev, utiševalnih in izolatorskih zaporedij. 
2. Lahko modulirajo 3D strukturo kromatina. 
3. Zmožni so kodiranja transkripcijskih faktorjev. 
4. S povezovanjem z represorskimi transkripcijskimi faktorji vplivajo na utišanje sosednjih genov. 
5. Imajo vlogo pri regulatornih nekodirajočih molekulah RNA, ki so pomembni regulatorji transkripcije. 

==Funkcije transpozicijskih elementov v cis-regulatornih regijah ==
Regulatorne sposobnosti cis-regulatornih regij lahko izhajajo iz transpozicijskih elementov. V splošnem cis-regulatorne regije delujejo tako, da tvorijo specifična vezavna mesta za proteine povezane z iniciacijo in regulacijo transkripcije. Primeri nekaterih vrst CRE:

1. Promotorji so kratka zaporedja DNA, ki vključujejo začetno mesto transkripcije. Ob vezavi ustreznih transkripcijskih faktorjev na promotorsko regijo omogočijo transkripcijo gena. Kot primer bi omenil transpozon AluSp v promotorju gena FCER1G, ki inducira transkripcijo visokoafinitetnega receptorja za Fc regijo IgE. 
2. Ojačevalci so zaporedja, ki jih najdemo pred ali za genom, ki ga regulirajo. Delujejo kooperativno s promotorjem, in sicer tako, da povečajo stopnjo transkripcije, omogočajo pa regulacijo tudi bolj oddaljenih genov. Kot primer bi omenil transpozon AluY v intronu gena CD8 (ta kodira glikoprotein CD8, ki je pomemben pri celičnih interakcijah znotraj imunskega sistema), za katerega so ugotovili, da deluje kot ojačevalec. 
3. Utiševalna zaporedja vežejo represorje in tako preprečujejo transkripcijo. Transpozicijski elementi so z rekrutiranjem transkripcijskih faktorjev postali sposobni delovati kot utiševalna zaporedja, ki remodelirajo kromatin. Čeprav so heterokromatinski deli revni z geni, so bogati s TE-ji, kar bi lahko pomenilo, da imajo transpozicijski elementi pomembno vlogo pri širjenju heterokromatina. Tako se npr. korepresorski protein TRIM28 veže na vezavno mesto, ki se nahaja na transpozonu ERV in s tem utiša sosednje gene. 
4. Inzulatorji ščitijo gene pred regulatornimi vplivi sosednjih genov. Lahko blokirajo promotorje, ojačevalce in utiševalce. Preprečujejo neprimerne interakcije med sosednjimi kromatinskimi regijami. Kot primer bi omenil gen za transpozon AluSq, ki deluje kot inzulator, saj njegova transkripcija ščiti človeški gen HBE1 (ki kodira za istoimenski protein) pred regulacijo z drugimi promotorji. 

TE-ji uvajajo nova vezavna mesta za TF, ki so v njih lahko prisotna takoj po inserciji v genom ali pa nastanejo de novo s postinsercijskimi mutacijami. Pogosto se mutacije pojavljajo na metiliranih CpG otočkih. Deaminacija teh povzroči zamenjavo citozina z gvaninom, kar je med drugim povzročilo nastanek številnih vezavnih mest za transkripcijska faktorja cMyc in p53. Vključitev TE-jev zraven že obstoječega vezavnega mesta za transkripcijske faktorje ter točkovne mutacije omogočijo nastanek novih mest za vezavo TF (alternativni promotorji), kar povzroča zaščito pred možnimi kasnejšimi mutacijami z redundančnostjo. Redundanca dopušča tudi kooperativno delovanje z zunanjimi promotorji, saj se lahko tako razbremenijo določena vezavna mesta za transkripcijske faktorje.

==Vpliv transpozicijskih elementov na kromatinsko 3D strukturo==
V interfaznem jedru so deli genoma organizirani v topološko asociirajoče domene (TAD). To so večje domene kromatina, ki so med seboj ločene z izolatorskimi proteini. Ti omejujejo prostor, v katerem lahko različni deli DNA prihajajo v medsebojne stike. Njihova naloga je tudi prostorsko omejevanje interakcij med transkripcijskimi faktorji in ojačevalci ter promotorji. TAD specificirajo funkcije cis regulatornih regij z omejevanjem ojačevalcev, tako da ti aktivirajo le promotorje znotraj iste TAD. Vloga transpozicijskih elementov (TE) pri 3D arhitekturi genoma se je v zadnjih letih začela intenzivno raziskovati. Številne družine TE so namreč obogatene na mejah TAD. Določeni TE naj bi imeli preko tega tudi vlogo pri zvijanju kromosomov, prav tako pa tudi pri kompaktnosti kromatina in posledično tudi pri regulaciji procesov transkripcije. Kot primer pomena transpozicijskih elementov bi izpostavil študijo, ki je odkrila veliko HERV-H na mejah TAD v človeških embrionalnih matičnih celicah (hESCs) in delecija 2 individualnih HERV-H je vodila do izgube kompaktnosti te meje.

Protein CTCF (11-zinc finger protein) je pomemben pri regulaciji 3D strukture kromatina in procesov transkripcije. Zelo pomemben je pri strukturi mej TAD. Vsebuje motive cinkovega prsta in deluje kot transkripcijski faktor. Sodeluje pri mediaciji nastanka kromatinskih zank in se velikokrat veže na TE. Opaženo je bilo, da so TE razpršili veliko vezavnih mest za protein CTCF in smiselno bi bilo, da bi se tudi meje TAD razpršile, vendar je bilo ugotovljeno, da so te zelo ohranjene. Odkrili so različne mehanizme preprečevanja tvorbe ektopičnih meja TAD. Tako se npr. transpozoni B2SINE, ki imajo veliko vezavnih mest za protein CTCF, lahko povežejo s kompleksom ChAHP, ki torej prepozna isti motiv kot CTCF, a z višjo afiniteto.

==Kodiranje transkripcijskih faktorjev s transpozicijskimi elementi==
Šele nedavno so prišli do dognanj, da proteini, za katere kodirajo transpozicijski elementi, lahko vplivajo na regulacijo genov. Najdeni so bili številni primeri, v katerih gen za TE kodira transpozazo in hkrati tudi gostiteljski transkripcijski faktor. Fuzija transpozazne DNA-domene z regulatorno domeno transkripcijskega faktorja privede do tvorbe proteinskega kompleksa, ki je sposoben prepoznave ustreznega zaporedja TE na DNA, ker transpozaza prepozna transpozicijski element. Tako se lahko optimizira regulacija ekspresije genov s pomočjo TE.

==Utišanje transpozicijskih elementov in pomen le-tega pri regulaciji transkripcije==
Organizmi so razvili zmožnost zmanjšanja aktivnosti transpozicijskih elementov, prav tako pa so transpozicijski elementi zmožni obiti gostiteljevo obrambo. Eden od načinov utišanja delovanja TE je metilacija DNA. Demetilacija TE lahko vodi do nepravilne aktivacije sosednjih genov zaradi ojačevalnega potenciala TE. Zato so gostitelji morali razviti mehanizem, ki to kontrolira. Pomemben utiševalni mehanizem TE je metilacija CpG otočkov na DNA. Primer povezave med metilacijo DNA in aktivnostjo iz TE izhajajočih cis regulatornih regij je gen Agouti. Ta daje rjavo obarvanim mišim C57BL/6J rumeno obarvanje na način, ki je odvisen od ravni metilacije promotorja, ki nadzoruje transkripcijo retrotranspozonov IAP. Retrotranspozon IAP pa nadzira ekspresijo gena Agouti in s tem obarvanje miši.

Drug mehanizem utišanja TE so histonske modifikacije. Primer te epigenetske modifikacije je trimetilacija lizina 9 na histonu H3 (H3K9me3). Pomembno vlogo pri tem ima kompleks HUSH (human silencing hub complex). ATPaza MORC2 in HUSH se povežeta in posledično pride do trimetilacije na histonu 3 na retrotranspozonu LINE1 in tako se retrotranspoznon utiša. LINE1 se nahaja v intronih aktivnih genov. Če so ti trimetilirani, potem se RNA polimeraza II ne more pomikati naprej (motena je elongacija transkripcije), zato se geni ne prepisujejo.

==Transpozicijski elementi in njihova vloga pri regulatornih nekodirajočih molekulah RNA==
Zaradi napredka v določanju nukleotidnega zaporedja molekul RNA se v zadnjih letih odkriva vedno več nekodirajočih molekul RNA (ncRNA). Te vključujejo tudi regulatorne RNA, med katere spadajo kratke nekodirajoče RNA (sncRNA) in dolge nekodirajoče RNA (lncRNA). Transpozicijski elementi (TE) in regulatorne RNA so tesno povezani, saj velik del nukleotidnega zaporedja regulatornih RNA in njihovih genov ter regulatornih regij predstavljajo TE. Transpozicijski elementi določajo funkcionalne lastnosti različnih tipov ncRNA, kar je ključno za njihovo regulatorno funkcijo pri transkripciji in posttranskripcijskih procesih.

Transpozicijski elementi dajejo strukturne značilnosti lncRNA, ki jim dajejo sposobnost interakcije z drugimi biološkimi molekulami (DNA, RNA, proteini...). lncRNA imajo lahko tako cis kot tudi trans-regulatorno aktivnost. Pojavlja se veliko hipotez, da TE dajejo funkcionalne domene lncRNA. Primer, ki potrjuje to hipotezo, je interakcija med XIST lncRNA in proteinskim kompleksom PRC2 (polycomb repressive complex 2). XIST lncRNA namreč vključuje transpozicijski element ERVB5 in ravno ta regija predstavlja vezavno mesto za PRC2. PRC2 ima vlogo pri zagotavljanju kompaktnosti kromatina, in sicer tako, da ena izmed njegovih podenot EZH2 (Enhancer of zeste homolog 2) katalizira trimetilacijo lizina 27 na histonu 3 (H3K27me1/2/3), s tem pa povzroči represijo transkripcije določenih genov. Fosforilacija EZH2 in T350 (obe sta podenoti PRC2) s CDK1/2 je ključna za interakcijo PRC2 z lncRNA, ki poteka preko G-kvadrupleskne regije lncRNA, le-ta pa je bogata s transpozoni ERVB5. XIST lncRNA pripelje proteinski kompleks PRC2 do promotorske regije tarčnega gena (npr. tumor supresorskega gena), kjer EZH2 s svojo metiltransferazno aktivnostjo deluje kot represor transkripcije.
Zanimiv primer povezave med transpozicijskimi elementi in nekodirajočo RNA je regulacija odziva na toplotni šok pri miših. Ta primer kaže tudi na trans-regulatorno vlogo nekodirajoče RNA. Mišja ncRNA, ki izhaja iz retrotranspozona B2 SINE, se v normalnih pogojih veže na regulatorne regije genov, ki se odzivajo na stres, ter tako prepreči njihovo transkripcijo. Pri toplotnem šoku se aktivira protein EZH2, ki pospeši razgradnjo te ncRNA ter tako prepreči inhibicijo transkripcije genov, povezanih s stresom (EZH2 stimulira ribocimsko aktivnost same ncRNA).

Transpozicijski elementi imajo pomembno vlogo pri procesu transkripcije genov za nekodirajoče RNA, saj so vključeni v številna območja njihovih genov in regulatornih regij. Mesta na genomu, na katerih se nahajajo nukleotidna zaporedja, ki izhajajo iz transpozicijskih elementov, so prisotna tako v promotorjih kot tudi na poliA regijah genov za nekodirajoče RNA. Veliko so jih našli tudi na regijah genov za lncRNA, ki so pomembna za spajanje eksonov oz. izrezovanje intronov (splice donor, splice acceptor).

Veliko molekul miRNA (spadajo med sncRNA) z vključenimi transpozicijskimi elementi interagira s 3' koncem neprevajajoče regije tarčne mRNA (3' UTR). Preko tega procesa se utiša mRNA. Tako se npr. miR-151, ki vsebuje transpozicijske elemente LINE2, veže na molekulo mRNA, ki kodira za ATPAF1 (ATP synthase mitochondrial F1 complex assembly factor 1), in sicer tako, da se poveže s transpozoni LINE2 na 3' koncu neprevajajoče regije tarčne mRNA.

Vedno bolj se odkriva tudi vloga transpozicijskih elementov pri tvorbi stabilnejših sekundarnih struktur v nekodirajočih RNA. Raziskava, ki je primerjala lncRNA z vključenimi transpozicijskimi elementi in lncRNA brez vključenih transpozicijskih elementov, je ugotovila, da lncRNA z vključenimi transpozicijskimi elementi tvorijo stabilnejše sekundarne strukture. Analizirali so tudi mesta na lncRNA, ki so vključena v bazno parjenje pri tvorbi sekundarnih struktur in ugotovili, da je okrog 82 % teh mest lociranih v Alu regijah lncRNA. Torej, Alu regije v regulatornih RNA sodelujejo pri intramolekularnem baznem parjenju, kar privede do tvorbe stabilnejših sekundarnih struktur, s tem pa tudi do večje stabilnosti nekodirajočih RNA. To jim omogoči, da lahko bolje opravljajo svoje funkcije regulacije transkripcije.

==Viri in literatura==

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

TE kot regulatorji transkripcije

2022-04-24T12:23:20Z

Markokovacic: /* Vpliv transpozicijskih elementov na kromatinsko 3D strukturo */

==Uvod==
Transpozicijski elementi (TE), ki sestavljajo velik del evkariontskega genoma, lahko, če se nahajajo v eksonskih predelih gostiteljevega genskega zapisa, bistveno zmanjšajo njegovo evolucijsko sposobnost preživetja, ker delujejo moteče (lahko povzročijo npr. vstavitev start in stop kodonov, premik bralnega okvirja, prehitro terminacijo transkripcije,…). S tem zmanjšajo tudi verjetnost za lasten prenos v nove generacije. Ker TE po delovanju spominjajo na parazitski organizem, so se skozi evolucijo razvile strategije, ki preprečujejo preveliko škodo na gostiteljskem organizmu. Prilagajanje je potekalo vzajemno. Gostiteljski organizmi so npr. postali sposobni utišanja transpozicijskih elementov s pomočjo metilacije DNA na CpG otočkih, TE pa so se preferenčno vključevali v intronska zaporedja, saj tam ne delujejo tako moteče. Skozi čas so gostiteljski organizmi postali sposobni uporabe TE v svojo korist. Vključitve transpozicijskih elementov v nekodirajoče predele genskega zapisa in njihove mutacije so v veliko primerih povzročile, da so TE izgubili sposobnost transponiranja, pridobili pa so cis in trans-regulatorno aktivnost. Cis-regulatorne regije (CRE) so nekodirajoča zaporedja nukleotidov, ki regulirajo ekspresijo genov na isti verigi DNA. Trans regulacija pa pomeni predvsem to, da npr. transkripcijski faktorji prihajajo od drugod oz. so kodirani na eni molekuli DNA, regulirajo pa ekspresijo genov na drugi molekuli DNA. Regulacija transkripcije s TE lahko poteka na več načinov:

1. V genski zapis lahko vnašajo nova vezavna mesta za transkripcijske faktorje (TF) preko promotorjev, ojačevalcev, utiševalnih in izolatorskih zaporedij. 
2. Lahko modulirajo 3D strukturo kromatina. 
3. Zmožni so kodiranja transkripcijskih faktorjev. 
4. S povezovanjem z represorskimi transkripcijskimi faktorji vplivajo na utišanje sosednjih genov. 
5. Imajo vlogo pri regulatornih nekodirajočih molekulah RNA, ki so pomembni regulatorji transkripcije. 

==Funkcije transpozicijskih elementov v cis-regulatornih regijah ==
Regulatorne sposobnosti cis-regulatornih regij lahko izhajajo iz transpozicijskih elementov. V splošnem cis-regulatorne regije delujejo tako, da tvorijo specifična vezavna mesta za proteine povezane z iniciacijo in regulacijo transkripcije. Primeri nekaterih vrst CRE:

1. Promotorji so kratka zaporedja DNA, ki vključujejo začetno mesto transkripcije. Ob vezavi ustreznih transkripcijskih faktorjev na promotorsko regijo omogočijo transkripcijo gena. Kot primer bi omenil transpozon AluSp v promotorju gena FCER1G, ki inducira transkripcijo visokoafinitetnega receptorja za Fc regijo IgE. 
2. Ojačevalci so zaporedja, ki jih najdemo pred ali za genom, ki ga regulirajo. Delujejo kooperativno s promotorjem, in sicer tako, da povečajo stopnjo transkripcije, omogočajo pa regulacijo tudi bolj oddaljenih genov. Kot primer bi omenil transpozon AluY v intronu gena CD8 (ta kodira glikoprotein CD8, ki je pomemben pri celičnih interakcijah znotraj imunskega sistema), za katerega so ugotovili, da deluje kot ojačevalec. 
3. Utiševalna zaporedja vežejo represorje in tako preprečujejo transkripcijo. Transpozicijski elementi so z rekrutiranjem transkripcijskih faktorjev postali sposobni delovati kot utiševalna zaporedja, ki remodelirajo kromatin. Čeprav so heterokromatinski deli revni z geni, so bogati s TE-ji, kar bi lahko pomenilo, da imajo transpozicijski elementi pomembno vlogo pri širjenju heterokromatina. Tako se npr. korepresorski protein TRIM28 veže na vezavno mesto, ki se nahaja na transpozonu ERV in s tem utiša sosednje gene. 
4. Inzulatorji ščitijo gene pred regulatornimi vplivi sosednjih genov. Lahko blokirajo promotorje, ojačevalce in utiševalce. Preprečujejo neprimerne interakcije med sosednjimi kromatinskimi regijami. Kot primer bi omenil gen za transpozon AluSq, ki deluje kot inzulator, saj njegova transkripcija ščiti človeški gen HBE1 (ki kodira za istoimenski protein) pred regulacijo z drugimi promotorji. 

TE-ji uvajajo nova vezavna mesta za TF, ki so v njih lahko prisotna takoj po inserciji v genom ali pa nastanejo de novo s postinsercijskimi mutacijami. Pogosto se mutacije pojavljajo na metiliranih CpG otočkih. Deaminacija teh povzroči zamenjavo citozina z gvaninom, kar je med drugim povzročilo nastanek številnih vezavnih mest za transkripcijska faktorja cMyc in p53. Vključitev TE-jev zraven že obstoječega vezavnega mesta za transkripcijske faktorje ter točkovne mutacije omogočijo nastanek novih mest za vezavo TF (alternativni promotorji), kar povzroča zaščito pred možnimi kasnejšimi mutacijami z redundančnostjo. Redundanca dopušča tudi kooperativno delovanje z zunanjimi promotorji, saj se lahko tako razbremenijo določena vezavna mesta za transkripcijske faktorje.

==Vpliv transpozicijskih elementov na kromatinsko 3D strukturo==
V interfaznem jedru so deli genoma organizirani v topološko asociirajoče domene (TAD). To so večje domene kromatina, ki so med seboj ločene z izolatorskimi proteini. Ti omejujejo prostor, v katerem lahko različni deli DNA prihajajo v medsebojne stike. Njihova naloga je tudi prostorsko omejevanje interakcij med transkripcijskimi faktorji in ojačevalci ter promotorji. TAD specificirajo funkcije cis regulatornih regij z omejevanjem ojačevalcev, tako da ti aktivirajo le promotorje znotraj iste TAD. Vloga transpozicijskih elementov (TE) pri 3D arhitekturi genoma se je v zadnjih letih začela intenzivno raziskovati. Številne družine TE so namreč obogatene na mejah TAD. Določeni TE naj bi imeli preko tega tudi vlogo pri zvijanju kromosomov, prav tako pa tudi pri kompaktnosti kromatina in posledično tudi pri regulaciji procesov transkripcije. Kot primer pomena transpozicijskih elementov bi izpostavil študijo, ki je odkrila veliko HERV-H na mejah TAD v človeških embrionalnih matičnih celicah (hESCs) in delecija 2 individualnih HERV-H je vodila do izgube kompaktnosti te meje.

Protein CTCF (11-zinc finger protein) je pomemben pri regulaciji 3D strukture kromatina in procesov transkripcije. Zelo pomemben je pri strukturi mej TAD. Vsebuje motive cinkovega prsta in deluje kot transkripcijski faktor. Sodeluje pri mediaciji nastanka kromatinskih zank in se velikokrat veže na TE. Opaženo je bilo, da so TE razpršili veliko vezavnih mest za protein CTCF in smiselno bi bilo, da bi se tudi meje TAD razpršile, vendar je bilo ugotovljeno, da so te zelo ohranjene. Odkrili so različne mehanizme preprečevanja tvorbe ektopičnih meja TAD. Tako se npr. transpozoni B2SINE, ki imajo veliko vezavnih mest za protein CTCF, lahko povežejo s kompleksom ChAHP, ki torej prepozna isti motiv kot CTCF, a z višjo afiniteto.

==Kodiranje transkripcijskih faktorjev s transpozicijskimi elementi==
Šele nedavno so prišli do dognanj, da proteini, za katere kodirajo transpozicijski elementi, lahko vplivajo na regulacijo genov. Najdeni so bili številni primeri, v katerih gen za TE kodira transpozazo in hkrati tudi gostiteljski transkripcijski faktor. Fuzija transpozazne DNA-domene z regulatorno domeno transkripcijskega faktorja privede do tvorbe proteinskega kompleksa, ki je sposoben prepoznave ustreznega zaporedja TE na DNA, ker transpozaza prepozna transpozicijski element. Tako se lahko optimizira regulacija ekspresije genov s pomočjo TE.

==Utišanje transpozicijskih elementov in pomen le-tega pri regulaciji transkripcije==
Organizmi so razvili zmožnost zmanjšanja aktivnosti transpozicijskih elementov, prav tako pa so transpozicijski elementi zmožni obiti gostiteljevo obrambo. Eden od načinov utišanja delovanja TE je metilacija DNA. Demetilacija TE lahko vodi do nepravilne aktivacije sosednjih genov zaradi ojačevalnega potenciala TE. Zato so gostitelji morali razviti mehanizem, ki to kontrolira. Pomemben utiševalni mehanizem TE je metilacija CpG otočkov na DNA. Primer povezave med metilacijo DNA in aktivnostjo iz TE izhajajočih cis regulatornih regij je gen Agouti. Ta daje rjavo obarvanim mišim C57BL/6J rumeno obarvanje na način, ki je odvisen od ravni metilacije promotorja, ki nadzoruje transkripcijo retrotranspozonov IAP. Retrotranspozon IAP pa nadzira ekspresijo gena Agouti in s tem obarvanje miši.
Drug mehanizem utišanja TE so histonske modifikacije. Primer te epigenetske modifikacije je trimetilacija lizina 9 na histonu H3 (H3K9me3). Pomembno vlogo pri tem ima kompleks HUSH (human silencing hub complex). ATPaza MORC2 in HUSH se povežeta in posledično pride do trimetilacije na histonu 3 na retrotranspozonu LINE1 in tako se retrotranspoznon utiša. LINE1 se nahaja v intronih aktivnih genov. Če so ti trimetilirani, potem se RNA polimeraza II ne more pomikati naprej (motena je elongacija transkripcije), zato se geni ne prepisujejo.

==Transpozicijski elementi in njihova vloga pri regulatornih nekodirajočih molekulah RNA==
Zaradi napredka v določanju nukleotidnega zaporedja molekul RNA se v zadnjih letih odkriva vedno več nekodirajočih molekul RNA (ncRNA). Te vključujejo tudi regulatorne RNA, med katere spadajo kratke nekodirajoče RNA (sncRNA) in dolge nekodirajoče RNA (lncRNA). Transpozicijski elementi (TE) in regulatorne RNA so tesno povezani, saj velik del nukleotidnega zaporedja regulatornih RNA in njihovih genov ter regulatornih regij predstavljajo TE. Transpozicijski elementi določajo funkcionalne lastnosti različnih tipov ncRNA, kar je ključno za njihovo regulatorno funkcijo pri transkripciji in posttranskripcijskih procesih.

Transpozicijski elementi dajejo strukturne značilnosti lncRNA, ki jim dajejo sposobnost interakcije z drugimi biološkimi molekulami (DNA, RNA, proteini...). lncRNA imajo lahko tako cis kot tudi trans-regulatorno aktivnost. Pojavlja se veliko hipotez, da TE dajejo funkcionalne domene lncRNA. Primer, ki potrjuje to hipotezo, je interakcija med XIST lncRNA in proteinskim kompleksom PRC2 (polycomb repressive complex 2). XIST lncRNA namreč vključuje transpozicijski element ERVB5 in ravno ta regija predstavlja vezavno mesto za PRC2. PRC2 ima vlogo pri zagotavljanju kompaktnosti kromatina, in sicer tako, da ena izmed njegovih podenot EZH2 (Enhancer of zeste homolog 2) katalizira trimetilacijo lizina 27 na histonu 3 (H3K27me1/2/3), s tem pa povzroči represijo transkripcije določenih genov. Fosforilacija EZH2 in T350 (obe sta podenoti PRC2) s CDK1/2 je ključna za interakcijo PRC2 z lncRNA, ki poteka preko G-kvadrupleskne regije lncRNA, le-ta pa je bogata s transpozoni ERVB5. XIST lncRNA pripelje proteinski kompleks PRC2 do promotorske regije tarčnega gena (npr. tumor supresorskega gena), kjer EZH2 s svojo metiltransferazno aktivnostjo deluje kot represor transkripcije.
Zanimiv primer povezave med transpozicijskimi elementi in nekodirajočo RNA je regulacija odziva na toplotni šok pri miših. Ta primer kaže tudi na trans-regulatorno vlogo nekodirajoče RNA. Mišja ncRNA, ki izhaja iz retrotranspozona B2 SINE, se v normalnih pogojih veže na regulatorne regije genov, ki se odzivajo na stres, ter tako prepreči njihovo transkripcijo. Pri toplotnem šoku se aktivira protein EZH2, ki pospeši razgradnjo te ncRNA ter tako prepreči inhibicijo transkripcije genov, povezanih s stresom (EZH2 stimulira ribocimsko aktivnost same ncRNA).

Transpozicijski elementi imajo pomembno vlogo pri procesu transkripcije genov za nekodirajoče RNA, saj so vključeni v številna območja njihovih genov in regulatornih regij. Mesta na genomu, na katerih se nahajajo nukleotidna zaporedja, ki izhajajo iz transpozicijskih elementov, so prisotna tako v promotorjih kot tudi na poliA regijah genov za nekodirajoče RNA. Veliko so jih našli tudi na regijah genov za lncRNA, ki so pomembna za spajanje eksonov oz. izrezovanje intronov (splice donor, splice acceptor).

Veliko molekul miRNA (spadajo med sncRNA) z vključenimi transpozicijskimi elementi interagira s 3' koncem neprevajajoče regije tarčne mRNA (3' UTR). Preko tega procesa se utiša mRNA. Tako se npr. miR-151, ki vsebuje transpozicijske elemente LINE2, veže na molekulo mRNA, ki kodira za ATPAF1 (ATP synthase mitochondrial F1 complex assembly factor 1), in sicer tako, da se poveže s transpozoni LINE2 na 3' koncu neprevajajoče regije tarčne mRNA.

Vedno bolj se odkriva tudi vloga transpozicijskih elementov pri tvorbi stabilnejših sekundarnih struktur v nekodirajočih RNA. Raziskava, ki je primerjala lncRNA z vključenimi transpozicijskimi elementi in lncRNA brez vključenih transpozicijskih elementov, je ugotovila, da lncRNA z vključenimi transpozicijskimi elementi tvorijo stabilnejše sekundarne strukture. Analizirali so tudi mesta na lncRNA, ki so vključena v bazno parjenje pri tvorbi sekundarnih struktur in ugotovili, da je okrog 82 % teh mest lociranih v Alu regijah lncRNA. Torej, Alu regije v regulatornih RNA sodelujejo pri intramolekularnem baznem parjenju, kar privede do tvorbe stabilnejših sekundarnih struktur, s tem pa tudi do večje stabilnosti nekodirajočih RNA. To jim omogoči, da lahko bolje opravljajo svoje funkcije regulacije transkripcije.

==Viri in literatura==

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

TE kot regulatorji transkripcije

2022-04-24T12:19:57Z

Markokovacic: /* Transpozicijski elementi in njihova vloga pri regulatornih nekodirajočih molekulah RNA */

==Uvod==
Transpozicijski elementi (TE), ki sestavljajo velik del evkariontskega genoma, lahko, če se nahajajo v eksonskih predelih gostiteljevega genskega zapisa, bistveno zmanjšajo njegovo evolucijsko sposobnost preživetja, ker delujejo moteče (lahko povzročijo npr. vstavitev start in stop kodonov, premik bralnega okvirja, prehitro terminacijo transkripcije,…). S tem zmanjšajo tudi verjetnost za lasten prenos v nove generacije. Ker TE po delovanju spominjajo na parazitski organizem, so se skozi evolucijo razvile strategije, ki preprečujejo preveliko škodo na gostiteljskem organizmu. Prilagajanje je potekalo vzajemno. Gostiteljski organizmi so npr. postali sposobni utišanja transpozicijskih elementov s pomočjo metilacije DNA na CpG otočkih, TE pa so se preferenčno vključevali v intronska zaporedja, saj tam ne delujejo tako moteče. Skozi čas so gostiteljski organizmi postali sposobni uporabe TE v svojo korist. Vključitve transpozicijskih elementov v nekodirajoče predele genskega zapisa in njihove mutacije so v veliko primerih povzročile, da so TE izgubili sposobnost transponiranja, pridobili pa so cis in trans-regulatorno aktivnost. Cis-regulatorne regije (CRE) so nekodirajoča zaporedja nukleotidov, ki regulirajo ekspresijo genov na isti verigi DNA. Trans regulacija pa pomeni predvsem to, da npr. transkripcijski faktorji prihajajo od drugod oz. so kodirani na eni molekuli DNA, regulirajo pa ekspresijo genov na drugi molekuli DNA. Regulacija transkripcije s TE lahko poteka na več načinov:

1. V genski zapis lahko vnašajo nova vezavna mesta za transkripcijske faktorje (TF) preko promotorjev, ojačevalcev, utiševalnih in izolatorskih zaporedij. 
2. Lahko modulirajo 3D strukturo kromatina. 
3. Zmožni so kodiranja transkripcijskih faktorjev. 
4. S povezovanjem z represorskimi transkripcijskimi faktorji vplivajo na utišanje sosednjih genov. 
5. Imajo vlogo pri regulatornih nekodirajočih molekulah RNA, ki so pomembni regulatorji transkripcije. 

==Funkcije transpozicijskih elementov v cis-regulatornih regijah ==
Regulatorne sposobnosti cis-regulatornih regij lahko izhajajo iz transpozicijskih elementov. V splošnem cis-regulatorne regije delujejo tako, da tvorijo specifična vezavna mesta za proteine povezane z iniciacijo in regulacijo transkripcije. Primeri nekaterih vrst CRE:

1. Promotorji so kratka zaporedja DNA, ki vključujejo začetno mesto transkripcije. Ob vezavi ustreznih transkripcijskih faktorjev na promotorsko regijo omogočijo transkripcijo gena. Kot primer bi omenil transpozon AluSp v promotorju gena FCER1G, ki inducira transkripcijo visokoafinitetnega receptorja za Fc regijo IgE. 
2. Ojačevalci so zaporedja, ki jih najdemo pred ali za genom, ki ga regulirajo. Delujejo kooperativno s promotorjem, in sicer tako, da povečajo stopnjo transkripcije, omogočajo pa regulacijo tudi bolj oddaljenih genov. Kot primer bi omenil transpozon AluY v intronu gena CD8 (ta kodira glikoprotein CD8, ki je pomemben pri celičnih interakcijah znotraj imunskega sistema), za katerega so ugotovili, da deluje kot ojačevalec. 
3. Utiševalna zaporedja vežejo represorje in tako preprečujejo transkripcijo. Transpozicijski elementi so z rekrutiranjem transkripcijskih faktorjev postali sposobni delovati kot utiševalna zaporedja, ki remodelirajo kromatin. Čeprav so heterokromatinski deli revni z geni, so bogati s TE-ji, kar bi lahko pomenilo, da imajo transpozicijski elementi pomembno vlogo pri širjenju heterokromatina. Tako se npr. korepresorski protein TRIM28 veže na vezavno mesto, ki se nahaja na transpozonu ERV in s tem utiša sosednje gene. 
4. Inzulatorji ščitijo gene pred regulatornimi vplivi sosednjih genov. Lahko blokirajo promotorje, ojačevalce in utiševalce. Preprečujejo neprimerne interakcije med sosednjimi kromatinskimi regijami. Kot primer bi omenil gen za transpozon AluSq, ki deluje kot inzulator, saj njegova transkripcija ščiti človeški gen HBE1 (ki kodira za istoimenski protein) pred regulacijo z drugimi promotorji. 

TE-ji uvajajo nova vezavna mesta za TF, ki so v njih lahko prisotna takoj po inserciji v genom ali pa nastanejo de novo s postinsercijskimi mutacijami. Pogosto se mutacije pojavljajo na metiliranih CpG otočkih. Deaminacija teh povzroči zamenjavo citozina z gvaninom, kar je med drugim povzročilo nastanek številnih vezavnih mest za transkripcijska faktorja cMyc in p53. Vključitev TE-jev zraven že obstoječega vezavnega mesta za transkripcijske faktorje ter točkovne mutacije omogočijo nastanek novih mest za vezavo TF (alternativni promotorji), kar povzroča zaščito pred možnimi kasnejšimi mutacijami z redundančnostjo. Redundanca dopušča tudi kooperativno delovanje z zunanjimi promotorji, saj se lahko tako razbremenijo določena vezavna mesta za transkripcijske faktorje.

==Vpliv transpozicijskih elementov na kromatinsko 3D strukturo==
V interfaznem jedru so deli genoma organizirani v topološko asociirajoče domene (TAD). To so večje domene kromatina, ki so med seboj ločene z izolatorskimi proteini. Ti omejujejo prostor, v katerem lahko različni deli DNA prihajajo v medsebojne stike. Njihova naloga je tudi prostorsko omejevanje interakcij med transkripcijskimi faktorji in ojačevalci ter promotorji. TAD specificirajo funkcije cis regulatornih regij z omejevanjem ojačevalcev, tako da ti aktivirajo le promotorje znotraj iste TAD. Vloga transpozicijskih elementov (TE) pri 3D arhitekturi genoma se je v zadnjih letih začela intenzivno raziskovati. Številne družine TE so namreč obogatene na mejah TAD. Določeni TE naj bi imeli preko tega tudi vlogo pri zvijanju kromosomov, prav tako pa tudi pri kompaktnosti kromatina in posledično tudi pri regulaciji procesov transkripcije. Kot primer pomena transpozicijskih elementov bi izpostavil študijo, ki je odkrila veliko HERV-H na mejah TAD v človeških embrionalnih matičnih celicah (hESCs) in delecija 2 individualnih HERV-H je vodila do izgube kompaktnosti te meje.
Protein CTCF (11-zinc finger protein) je pomemben pri regulaciji 3D strukture kromatina in procesov transkripcije. Zelo pomemben je pri strukturi mej TAD. Vsebuje motive cinkovega prsta in deluje kot transkripcijski faktor. Sodeluje pri mediaciji nastanka kromatinskih zank in se velikokrat veže na TE. Opaženo je bilo, da so TE razpršili veliko vezavnih mest za protein CTCF in smiselno bi bilo, da bi se tudi meje TAD razpršile, vendar je bilo ugotovljeno, da so te zelo ohranjene. Odkrili so različne mehanizme preprečevanja tvorbe ektopičnih meja TAD. Tako se npr. transpozoni B2SINE, ki imajo veliko vezavnih mest za protein CTCF, lahko povežejo s kompleksom ChAHP, ki torej prepozna isti motiv kot CTCF, a z višjo afiniteto.

==Kodiranje transkripcijskih faktorjev s transpozicijskimi elementi==
Šele nedavno so prišli do dognanj, da proteini, za katere kodirajo transpozicijski elementi, lahko vplivajo na regulacijo genov. Najdeni so bili številni primeri, v katerih gen za TE kodira transpozazo in hkrati tudi gostiteljski transkripcijski faktor. Fuzija transpozazne DNA-domene z regulatorno domeno transkripcijskega faktorja privede do tvorbe proteinskega kompleksa, ki je sposoben prepoznave ustreznega zaporedja TE na DNA, ker transpozaza prepozna transpozicijski element. Tako se lahko optimizira regulacija ekspresije genov s pomočjo TE.

==Utišanje transpozicijskih elementov in pomen le-tega pri regulaciji transkripcije==
Organizmi so razvili zmožnost zmanjšanja aktivnosti transpozicijskih elementov, prav tako pa so transpozicijski elementi zmožni obiti gostiteljevo obrambo. Eden od načinov utišanja delovanja TE je metilacija DNA. Demetilacija TE lahko vodi do nepravilne aktivacije sosednjih genov zaradi ojačevalnega potenciala TE. Zato so gostitelji morali razviti mehanizem, ki to kontrolira. Pomemben utiševalni mehanizem TE je metilacija CpG otočkov na DNA. Primer povezave med metilacijo DNA in aktivnostjo iz TE izhajajočih cis regulatornih regij je gen Agouti. Ta daje rjavo obarvanim mišim C57BL/6J rumeno obarvanje na način, ki je odvisen od ravni metilacije promotorja, ki nadzoruje transkripcijo retrotranspozonov IAP. Retrotranspozon IAP pa nadzira ekspresijo gena Agouti in s tem obarvanje miši.
Drug mehanizem utišanja TE so histonske modifikacije. Primer te epigenetske modifikacije je trimetilacija lizina 9 na histonu H3 (H3K9me3). Pomembno vlogo pri tem ima kompleks HUSH (human silencing hub complex). ATPaza MORC2 in HUSH se povežeta in posledično pride do trimetilacije na histonu 3 na retrotranspozonu LINE1 in tako se retrotranspoznon utiša. LINE1 se nahaja v intronih aktivnih genov. Če so ti trimetilirani, potem se RNA polimeraza II ne more pomikati naprej (motena je elongacija transkripcije), zato se geni ne prepisujejo.

==Transpozicijski elementi in njihova vloga pri regulatornih nekodirajočih molekulah RNA==
Zaradi napredka v določanju nukleotidnega zaporedja molekul RNA se v zadnjih letih odkriva vedno več nekodirajočih molekul RNA (ncRNA). Te vključujejo tudi regulatorne RNA, med katere spadajo kratke nekodirajoče RNA (sncRNA) in dolge nekodirajoče RNA (lncRNA). Transpozicijski elementi (TE) in regulatorne RNA so tesno povezani, saj velik del nukleotidnega zaporedja regulatornih RNA in njihovih genov ter regulatornih regij predstavljajo TE. Transpozicijski elementi določajo funkcionalne lastnosti različnih tipov ncRNA, kar je ključno za njihovo regulatorno funkcijo pri transkripciji in posttranskripcijskih procesih.

Transpozicijski elementi dajejo strukturne značilnosti lncRNA, ki jim dajejo sposobnost interakcije z drugimi biološkimi molekulami (DNA, RNA, proteini...). lncRNA imajo lahko tako cis kot tudi trans-regulatorno aktivnost. Pojavlja se veliko hipotez, da TE dajejo funkcionalne domene lncRNA. Primer, ki potrjuje to hipotezo, je interakcija med XIST lncRNA in proteinskim kompleksom PRC2 (polycomb repressive complex 2). XIST lncRNA namreč vključuje transpozicijski element ERVB5 in ravno ta regija predstavlja vezavno mesto za PRC2. PRC2 ima vlogo pri zagotavljanju kompaktnosti kromatina, in sicer tako, da ena izmed njegovih podenot EZH2 (Enhancer of zeste homolog 2) katalizira trimetilacijo lizina 27 na histonu 3 (H3K27me1/2/3), s tem pa povzroči represijo transkripcije določenih genov. Fosforilacija EZH2 in T350 (obe sta podenoti PRC2) s CDK1/2 je ključna za interakcijo PRC2 z lncRNA, ki poteka preko G-kvadrupleskne regije lncRNA, le-ta pa je bogata s transpozoni ERVB5. XIST lncRNA pripelje proteinski kompleks PRC2 do promotorske regije tarčnega gena (npr. tumor supresorskega gena), kjer EZH2 s svojo metiltransferazno aktivnostjo deluje kot represor transkripcije.
Zanimiv primer povezave med transpozicijskimi elementi in nekodirajočo RNA je regulacija odziva na toplotni šok pri miših. Ta primer kaže tudi na trans-regulatorno vlogo nekodirajoče RNA. Mišja ncRNA, ki izhaja iz retrotranspozona B2 SINE, se v normalnih pogojih veže na regulatorne regije genov, ki se odzivajo na stres, ter tako prepreči njihovo transkripcijo. Pri toplotnem šoku se aktivira protein EZH2, ki pospeši razgradnjo te ncRNA ter tako prepreči inhibicijo transkripcije genov, povezanih s stresom (EZH2 stimulira ribocimsko aktivnost same ncRNA).

Transpozicijski elementi imajo pomembno vlogo pri procesu transkripcije genov za nekodirajoče RNA, saj so vključeni v številna območja njihovih genov in regulatornih regij. Mesta na genomu, na katerih se nahajajo nukleotidna zaporedja, ki izhajajo iz transpozicijskih elementov, so prisotna tako v promotorjih kot tudi na poliA regijah genov za nekodirajoče RNA. Veliko so jih našli tudi na regijah genov za lncRNA, ki so pomembna za spajanje eksonov oz. izrezovanje intronov (splice donor, splice acceptor).

Veliko molekul miRNA (spadajo med sncRNA) z vključenimi transpozicijskimi elementi interagira s 3' koncem neprevajajoče regije tarčne mRNA (3' UTR). Preko tega procesa se utiša mRNA. Tako se npr. miR-151, ki vsebuje transpozicijske elemente LINE2, veže na molekulo mRNA, ki kodira za ATPAF1 (ATP synthase mitochondrial F1 complex assembly factor 1), in sicer tako, da se poveže s transpozoni LINE2 na 3' koncu neprevajajoče regije tarčne mRNA.

Vedno bolj se odkriva tudi vloga transpozicijskih elementov pri tvorbi stabilnejših sekundarnih struktur v nekodirajočih RNA. Raziskava, ki je primerjala lncRNA z vključenimi transpozicijskimi elementi in lncRNA brez vključenih transpozicijskih elementov, je ugotovila, da lncRNA z vključenimi transpozicijskimi elementi tvorijo stabilnejše sekundarne strukture. Analizirali so tudi mesta na lncRNA, ki so vključena v bazno parjenje pri tvorbi sekundarnih struktur in ugotovili, da je okrog 82 % teh mest lociranih v Alu regijah lncRNA. Torej, Alu regije v regulatornih RNA sodelujejo pri intramolekularnem baznem parjenju, kar privede do tvorbe stabilnejših sekundarnih struktur, s tem pa tudi do večje stabilnosti nekodirajočih RNA. To jim omogoči, da lahko bolje opravljajo svoje funkcije regulacije transkripcije.

==Viri in literatura==

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

TE kot regulatorji transkripcije

2022-04-24T12:18:35Z

Markokovacic: /* Transpozicijski elementi in njihova vloga pri regulatornih nekodirajočih molekulah RNA */

==Uvod==
Transpozicijski elementi (TE), ki sestavljajo velik del evkariontskega genoma, lahko, če se nahajajo v eksonskih predelih gostiteljevega genskega zapisa, bistveno zmanjšajo njegovo evolucijsko sposobnost preživetja, ker delujejo moteče (lahko povzročijo npr. vstavitev start in stop kodonov, premik bralnega okvirja, prehitro terminacijo transkripcije,…). S tem zmanjšajo tudi verjetnost za lasten prenos v nove generacije. Ker TE po delovanju spominjajo na parazitski organizem, so se skozi evolucijo razvile strategije, ki preprečujejo preveliko škodo na gostiteljskem organizmu. Prilagajanje je potekalo vzajemno. Gostiteljski organizmi so npr. postali sposobni utišanja transpozicijskih elementov s pomočjo metilacije DNA na CpG otočkih, TE pa so se preferenčno vključevali v intronska zaporedja, saj tam ne delujejo tako moteče. Skozi čas so gostiteljski organizmi postali sposobni uporabe TE v svojo korist. Vključitve transpozicijskih elementov v nekodirajoče predele genskega zapisa in njihove mutacije so v veliko primerih povzročile, da so TE izgubili sposobnost transponiranja, pridobili pa so cis in trans-regulatorno aktivnost. Cis-regulatorne regije (CRE) so nekodirajoča zaporedja nukleotidov, ki regulirajo ekspresijo genov na isti verigi DNA. Trans regulacija pa pomeni predvsem to, da npr. transkripcijski faktorji prihajajo od drugod oz. so kodirani na eni molekuli DNA, regulirajo pa ekspresijo genov na drugi molekuli DNA. Regulacija transkripcije s TE lahko poteka na več načinov:

1. V genski zapis lahko vnašajo nova vezavna mesta za transkripcijske faktorje (TF) preko promotorjev, ojačevalcev, utiševalnih in izolatorskih zaporedij. 
2. Lahko modulirajo 3D strukturo kromatina. 
3. Zmožni so kodiranja transkripcijskih faktorjev. 
4. S povezovanjem z represorskimi transkripcijskimi faktorji vplivajo na utišanje sosednjih genov. 
5. Imajo vlogo pri regulatornih nekodirajočih molekulah RNA, ki so pomembni regulatorji transkripcije. 

==Funkcije transpozicijskih elementov v cis-regulatornih regijah ==
Regulatorne sposobnosti cis-regulatornih regij lahko izhajajo iz transpozicijskih elementov. V splošnem cis-regulatorne regije delujejo tako, da tvorijo specifična vezavna mesta za proteine povezane z iniciacijo in regulacijo transkripcije. Primeri nekaterih vrst CRE:

1. Promotorji so kratka zaporedja DNA, ki vključujejo začetno mesto transkripcije. Ob vezavi ustreznih transkripcijskih faktorjev na promotorsko regijo omogočijo transkripcijo gena. Kot primer bi omenil transpozon AluSp v promotorju gena FCER1G, ki inducira transkripcijo visokoafinitetnega receptorja za Fc regijo IgE. 
2. Ojačevalci so zaporedja, ki jih najdemo pred ali za genom, ki ga regulirajo. Delujejo kooperativno s promotorjem, in sicer tako, da povečajo stopnjo transkripcije, omogočajo pa regulacijo tudi bolj oddaljenih genov. Kot primer bi omenil transpozon AluY v intronu gena CD8 (ta kodira glikoprotein CD8, ki je pomemben pri celičnih interakcijah znotraj imunskega sistema), za katerega so ugotovili, da deluje kot ojačevalec. 
3. Utiševalna zaporedja vežejo represorje in tako preprečujejo transkripcijo. Transpozicijski elementi so z rekrutiranjem transkripcijskih faktorjev postali sposobni delovati kot utiševalna zaporedja, ki remodelirajo kromatin. Čeprav so heterokromatinski deli revni z geni, so bogati s TE-ji, kar bi lahko pomenilo, da imajo transpozicijski elementi pomembno vlogo pri širjenju heterokromatina. Tako se npr. korepresorski protein TRIM28 veže na vezavno mesto, ki se nahaja na transpozonu ERV in s tem utiša sosednje gene. 
4. Inzulatorji ščitijo gene pred regulatornimi vplivi sosednjih genov. Lahko blokirajo promotorje, ojačevalce in utiševalce. Preprečujejo neprimerne interakcije med sosednjimi kromatinskimi regijami. Kot primer bi omenil gen za transpozon AluSq, ki deluje kot inzulator, saj njegova transkripcija ščiti človeški gen HBE1 (ki kodira za istoimenski protein) pred regulacijo z drugimi promotorji. 

TE-ji uvajajo nova vezavna mesta za TF, ki so v njih lahko prisotna takoj po inserciji v genom ali pa nastanejo de novo s postinsercijskimi mutacijami. Pogosto se mutacije pojavljajo na metiliranih CpG otočkih. Deaminacija teh povzroči zamenjavo citozina z gvaninom, kar je med drugim povzročilo nastanek številnih vezavnih mest za transkripcijska faktorja cMyc in p53. Vključitev TE-jev zraven že obstoječega vezavnega mesta za transkripcijske faktorje ter točkovne mutacije omogočijo nastanek novih mest za vezavo TF (alternativni promotorji), kar povzroča zaščito pred možnimi kasnejšimi mutacijami z redundančnostjo. Redundanca dopušča tudi kooperativno delovanje z zunanjimi promotorji, saj se lahko tako razbremenijo določena vezavna mesta za transkripcijske faktorje.

==Vpliv transpozicijskih elementov na kromatinsko 3D strukturo==
V interfaznem jedru so deli genoma organizirani v topološko asociirajoče domene (TAD). To so večje domene kromatina, ki so med seboj ločene z izolatorskimi proteini. Ti omejujejo prostor, v katerem lahko različni deli DNA prihajajo v medsebojne stike. Njihova naloga je tudi prostorsko omejevanje interakcij med transkripcijskimi faktorji in ojačevalci ter promotorji. TAD specificirajo funkcije cis regulatornih regij z omejevanjem ojačevalcev, tako da ti aktivirajo le promotorje znotraj iste TAD. Vloga transpozicijskih elementov (TE) pri 3D arhitekturi genoma se je v zadnjih letih začela intenzivno raziskovati. Številne družine TE so namreč obogatene na mejah TAD. Določeni TE naj bi imeli preko tega tudi vlogo pri zvijanju kromosomov, prav tako pa tudi pri kompaktnosti kromatina in posledično tudi pri regulaciji procesov transkripcije. Kot primer pomena transpozicijskih elementov bi izpostavil študijo, ki je odkrila veliko HERV-H na mejah TAD v človeških embrionalnih matičnih celicah (hESCs) in delecija 2 individualnih HERV-H je vodila do izgube kompaktnosti te meje.
Protein CTCF (11-zinc finger protein) je pomemben pri regulaciji 3D strukture kromatina in procesov transkripcije. Zelo pomemben je pri strukturi mej TAD. Vsebuje motive cinkovega prsta in deluje kot transkripcijski faktor. Sodeluje pri mediaciji nastanka kromatinskih zank in se velikokrat veže na TE. Opaženo je bilo, da so TE razpršili veliko vezavnih mest za protein CTCF in smiselno bi bilo, da bi se tudi meje TAD razpršile, vendar je bilo ugotovljeno, da so te zelo ohranjene. Odkrili so različne mehanizme preprečevanja tvorbe ektopičnih meja TAD. Tako se npr. transpozoni B2SINE, ki imajo veliko vezavnih mest za protein CTCF, lahko povežejo s kompleksom ChAHP, ki torej prepozna isti motiv kot CTCF, a z višjo afiniteto.

==Kodiranje transkripcijskih faktorjev s transpozicijskimi elementi==
Šele nedavno so prišli do dognanj, da proteini, za katere kodirajo transpozicijski elementi, lahko vplivajo na regulacijo genov. Najdeni so bili številni primeri, v katerih gen za TE kodira transpozazo in hkrati tudi gostiteljski transkripcijski faktor. Fuzija transpozazne DNA-domene z regulatorno domeno transkripcijskega faktorja privede do tvorbe proteinskega kompleksa, ki je sposoben prepoznave ustreznega zaporedja TE na DNA, ker transpozaza prepozna transpozicijski element. Tako se lahko optimizira regulacija ekspresije genov s pomočjo TE.

==Utišanje transpozicijskih elementov in pomen le-tega pri regulaciji transkripcije==
Organizmi so razvili zmožnost zmanjšanja aktivnosti transpozicijskih elementov, prav tako pa so transpozicijski elementi zmožni obiti gostiteljevo obrambo. Eden od načinov utišanja delovanja TE je metilacija DNA. Demetilacija TE lahko vodi do nepravilne aktivacije sosednjih genov zaradi ojačevalnega potenciala TE. Zato so gostitelji morali razviti mehanizem, ki to kontrolira. Pomemben utiševalni mehanizem TE je metilacija CpG otočkov na DNA. Primer povezave med metilacijo DNA in aktivnostjo iz TE izhajajočih cis regulatornih regij je gen Agouti. Ta daje rjavo obarvanim mišim C57BL/6J rumeno obarvanje na način, ki je odvisen od ravni metilacije promotorja, ki nadzoruje transkripcijo retrotranspozonov IAP. Retrotranspozon IAP pa nadzira ekspresijo gena Agouti in s tem obarvanje miši.
Drug mehanizem utišanja TE so histonske modifikacije. Primer te epigenetske modifikacije je trimetilacija lizina 9 na histonu H3 (H3K9me3). Pomembno vlogo pri tem ima kompleks HUSH (human silencing hub complex). ATPaza MORC2 in HUSH se povežeta in posledično pride do trimetilacije na histonu 3 na retrotranspozonu LINE1 in tako se retrotranspoznon utiša. LINE1 se nahaja v intronih aktivnih genov. Če so ti trimetilirani, potem se RNA polimeraza II ne more pomikati naprej (motena je elongacija transkripcije), zato se geni ne prepisujejo.

==Transpozicijski elementi in njihova vloga pri regulatornih nekodirajočih molekulah RNA==
Zaradi napredka v določanju nukleotidnega zaporedja molekul RNA se v zadnjih letih odkriva vedno več nekodirajočih molekul RNA (ncRNA). Te vključujejo tudi regulatorne RNA, med katere spadajo kratke nekodirajoče RNA (sncRNA) in dolge nekodirajoče RNA (lncRNA). Transpozicijski elementi (TE) in regulatorne RNA so tesno povezani, saj velik del nukleotidnega zaporedja regulatornih RNA in njihovih genov ter regulatornih regij predstavljajo TE. Transpozicijski elementi določajo funkcionalne lastnosti različnih tipov ncRNA, kar je ključno za njihovo regulatorno funkcijo pri transkripciji in posttranskripcijskih procesih.

Transpozicijski elementi dajejo strukturne značilnosti lncRNA, ki jim dajejo sposobnost interakcije z drugimi biološkimi molekulami (DNA, RNA, proteini...). lncRNA imajo lahko tako cis kot tudi trans-regulatorno aktivnost. Pojavlja se veliko hipotez, da TE dajejo funkcionalne domene lncRNA. Primer, ki potrjuje to hipotezo, je interakcija med XIST lncRNA in proteinskim kompleksom PRC2 (polycomb repressive complex 2). XIST lncRNA namreč vključuje transpozicijski element ERVB5 in ravno ta regija predstavlja vezavno mesto za PRC2. PRC2 ima vlogo pri zagotavljanju kompaktnosti kromatina, in sicer tako, da ena izmed njegovih podenot EZH2 (Enhancer of zeste homolog 2) katalizira trimetilacijo lizina 27 na histonu 3 (H3K27me1/2/3), s tem pa povzroči represijo transkripcije določenih genov. Fosforilacija EZH2 in T350 (obe sta podenoti PRC2) s CDK1/2 je ključna za interakcijo PRC2 z lncRNA, ki poteka preko G-kvadrupleskne regije lncRNA, le-ta pa je bogata s transpozoni ERVB5. XIST lncRNA pripelje proteinski kompleks PRC2 do promotorske regije tarčnega gena (npr. tumor supresorskega gena), kjer EZH2 s svojo metiltransferazno aktivnostjo deluje kot represor transkripcije.
Zanimiv primer povezave med transpozicijskimi elementi in nekodirajočo RNA je regulacija odziva na toplotni šok pri miših. Ta primer kaže tudi na trans-regulatorno vlogo nekodirajoče RNA. Mišja ncRNA, ki izhaja iz retrotranspozona B2 SINE, se v normalnih pogojih veže na regulatorne regije genov, ki se odzivajo na stres, ter tako prepreči njihovo transkripcijo. Pri toplotnem šoku se aktivira protein EZH2, ki pospeši razgradnjo te ncRNA ter tako prepreči inhibicijo transkripcije genov, povezanih s stresom (EZH2 stimulira ribocimsko aktivnost same ncRNA).

Transpozicijski elementi imajo pomembno vlogo pri procesu transkripcije genov za nekodirajoče RNA, saj so vključeni v številna območja njihovih genov in regulatornih regij. Mesta na genomu, na katerih se nahajajo nukleotidna zaporedja, ki izhajajo iz transpozicijskih elementov, so prisotna tako v promotorjih kot tudi na poliA regijah genov za nekodirajoče RNA. Veliko so jih našli tudi na regijah genov za lncRNA, ki so pomembna za spajanje eksonov oz. izrezovanje intronov (splice donor, splice acceptor).

Veliko molekul miRNA (spadajo med sncRNA) z vključenimi transpozicijskimi elementi interagira s 3' koncem neprevajajoče regije tarčne mRNA (3' UTR). Preko tega procesa se utiša mRNA. Tako se npr. miR-151, ki vsebuje transpozicijske elemente LINE2, veže na molekulo mRNA, ki kodira za ATPAF1 (ATP synthase mitochondrial F1 complex assembly factor 1), in sicer tako, da se poveže s transpozoni LINE2 na 3' koncu neprevajajoče regije tarčne mRNA.

Vedno bolj se odkriva tudi vloga transpozicijskih elementov pri tvorbi stabilnejših sekundarnih struktur v nekodirajočih RNA. Raziskava, ki je primerjala lncRNA z vključenimi transpozicijskimi elementi in lncRNA brez vključenih transpozicijskih elementov, je ugotovila, da lncRNA z vključenimi transpozicijskimi elementi tvorijo stabilnejše sekundarne strukture. Analizirali so tudi mesta na lncRNA, ki so vključena v bazno parjenje pri tvorbi sekundarnih struktur in ugotovili, da je okrog 82 % teh mest lociranih v Alu regijah lncRNA. Torej, Alu regije v regulatornih RNA sodelujejo pri intramolekularnem baznem parjenju, kar privede do tvorbe stabilnejših sekundarnih struktur, s tem pa tudi do večje stabilnosti nekodirajočih RNA. To jim omogoči, da lahko boljše opravljajo svoje funkcije regulacije transkripcije.

==Viri in literatura==

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

TE kot regulatorji transkripcije

2022-04-24T12:18:06Z

Markokovacic: /* Transpozicijski elementi in njihova vloga pri regulatornih nekodirajočih molekulah RNA */

==Uvod==
Transpozicijski elementi (TE), ki sestavljajo velik del evkariontskega genoma, lahko, če se nahajajo v eksonskih predelih gostiteljevega genskega zapisa, bistveno zmanjšajo njegovo evolucijsko sposobnost preživetja, ker delujejo moteče (lahko povzročijo npr. vstavitev start in stop kodonov, premik bralnega okvirja, prehitro terminacijo transkripcije,…). S tem zmanjšajo tudi verjetnost za lasten prenos v nove generacije. Ker TE po delovanju spominjajo na parazitski organizem, so se skozi evolucijo razvile strategije, ki preprečujejo preveliko škodo na gostiteljskem organizmu. Prilagajanje je potekalo vzajemno. Gostiteljski organizmi so npr. postali sposobni utišanja transpozicijskih elementov s pomočjo metilacije DNA na CpG otočkih, TE pa so se preferenčno vključevali v intronska zaporedja, saj tam ne delujejo tako moteče. Skozi čas so gostiteljski organizmi postali sposobni uporabe TE v svojo korist. Vključitve transpozicijskih elementov v nekodirajoče predele genskega zapisa in njihove mutacije so v veliko primerih povzročile, da so TE izgubili sposobnost transponiranja, pridobili pa so cis in trans-regulatorno aktivnost. Cis-regulatorne regije (CRE) so nekodirajoča zaporedja nukleotidov, ki regulirajo ekspresijo genov na isti verigi DNA. Trans regulacija pa pomeni predvsem to, da npr. transkripcijski faktorji prihajajo od drugod oz. so kodirani na eni molekuli DNA, regulirajo pa ekspresijo genov na drugi molekuli DNA. Regulacija transkripcije s TE lahko poteka na več načinov:

1. V genski zapis lahko vnašajo nova vezavna mesta za transkripcijske faktorje (TF) preko promotorjev, ojačevalcev, utiševalnih in izolatorskih zaporedij. 
2. Lahko modulirajo 3D strukturo kromatina. 
3. Zmožni so kodiranja transkripcijskih faktorjev. 
4. S povezovanjem z represorskimi transkripcijskimi faktorji vplivajo na utišanje sosednjih genov. 
5. Imajo vlogo pri regulatornih nekodirajočih molekulah RNA, ki so pomembni regulatorji transkripcije. 

==Funkcije transpozicijskih elementov v cis-regulatornih regijah ==
Regulatorne sposobnosti cis-regulatornih regij lahko izhajajo iz transpozicijskih elementov. V splošnem cis-regulatorne regije delujejo tako, da tvorijo specifična vezavna mesta za proteine povezane z iniciacijo in regulacijo transkripcije. Primeri nekaterih vrst CRE:

1. Promotorji so kratka zaporedja DNA, ki vključujejo začetno mesto transkripcije. Ob vezavi ustreznih transkripcijskih faktorjev na promotorsko regijo omogočijo transkripcijo gena. Kot primer bi omenil transpozon AluSp v promotorju gena FCER1G, ki inducira transkripcijo visokoafinitetnega receptorja za Fc regijo IgE. 
2. Ojačevalci so zaporedja, ki jih najdemo pred ali za genom, ki ga regulirajo. Delujejo kooperativno s promotorjem, in sicer tako, da povečajo stopnjo transkripcije, omogočajo pa regulacijo tudi bolj oddaljenih genov. Kot primer bi omenil transpozon AluY v intronu gena CD8 (ta kodira glikoprotein CD8, ki je pomemben pri celičnih interakcijah znotraj imunskega sistema), za katerega so ugotovili, da deluje kot ojačevalec. 
3. Utiševalna zaporedja vežejo represorje in tako preprečujejo transkripcijo. Transpozicijski elementi so z rekrutiranjem transkripcijskih faktorjev postali sposobni delovati kot utiševalna zaporedja, ki remodelirajo kromatin. Čeprav so heterokromatinski deli revni z geni, so bogati s TE-ji, kar bi lahko pomenilo, da imajo transpozicijski elementi pomembno vlogo pri širjenju heterokromatina. Tako se npr. korepresorski protein TRIM28 veže na vezavno mesto, ki se nahaja na transpozonu ERV in s tem utiša sosednje gene. 
4. Inzulatorji ščitijo gene pred regulatornimi vplivi sosednjih genov. Lahko blokirajo promotorje, ojačevalce in utiševalce. Preprečujejo neprimerne interakcije med sosednjimi kromatinskimi regijami. Kot primer bi omenil gen za transpozon AluSq, ki deluje kot inzulator, saj njegova transkripcija ščiti človeški gen HBE1 (ki kodira za istoimenski protein) pred regulacijo z drugimi promotorji. 

TE-ji uvajajo nova vezavna mesta za TF, ki so v njih lahko prisotna takoj po inserciji v genom ali pa nastanejo de novo s postinsercijskimi mutacijami. Pogosto se mutacije pojavljajo na metiliranih CpG otočkih. Deaminacija teh povzroči zamenjavo citozina z gvaninom, kar je med drugim povzročilo nastanek številnih vezavnih mest za transkripcijska faktorja cMyc in p53. Vključitev TE-jev zraven že obstoječega vezavnega mesta za transkripcijske faktorje ter točkovne mutacije omogočijo nastanek novih mest za vezavo TF (alternativni promotorji), kar povzroča zaščito pred možnimi kasnejšimi mutacijami z redundančnostjo. Redundanca dopušča tudi kooperativno delovanje z zunanjimi promotorji, saj se lahko tako razbremenijo določena vezavna mesta za transkripcijske faktorje.

==Vpliv transpozicijskih elementov na kromatinsko 3D strukturo==
V interfaznem jedru so deli genoma organizirani v topološko asociirajoče domene (TAD). To so večje domene kromatina, ki so med seboj ločene z izolatorskimi proteini. Ti omejujejo prostor, v katerem lahko različni deli DNA prihajajo v medsebojne stike. Njihova naloga je tudi prostorsko omejevanje interakcij med transkripcijskimi faktorji in ojačevalci ter promotorji. TAD specificirajo funkcije cis regulatornih regij z omejevanjem ojačevalcev, tako da ti aktivirajo le promotorje znotraj iste TAD. Vloga transpozicijskih elementov (TE) pri 3D arhitekturi genoma se je v zadnjih letih začela intenzivno raziskovati. Številne družine TE so namreč obogatene na mejah TAD. Določeni TE naj bi imeli preko tega tudi vlogo pri zvijanju kromosomov, prav tako pa tudi pri kompaktnosti kromatina in posledično tudi pri regulaciji procesov transkripcije. Kot primer pomena transpozicijskih elementov bi izpostavil študijo, ki je odkrila veliko HERV-H na mejah TAD v človeških embrionalnih matičnih celicah (hESCs) in delecija 2 individualnih HERV-H je vodila do izgube kompaktnosti te meje.
Protein CTCF (11-zinc finger protein) je pomemben pri regulaciji 3D strukture kromatina in procesov transkripcije. Zelo pomemben je pri strukturi mej TAD. Vsebuje motive cinkovega prsta in deluje kot transkripcijski faktor. Sodeluje pri mediaciji nastanka kromatinskih zank in se velikokrat veže na TE. Opaženo je bilo, da so TE razpršili veliko vezavnih mest za protein CTCF in smiselno bi bilo, da bi se tudi meje TAD razpršile, vendar je bilo ugotovljeno, da so te zelo ohranjene. Odkrili so različne mehanizme preprečevanja tvorbe ektopičnih meja TAD. Tako se npr. transpozoni B2SINE, ki imajo veliko vezavnih mest za protein CTCF, lahko povežejo s kompleksom ChAHP, ki torej prepozna isti motiv kot CTCF, a z višjo afiniteto.

==Kodiranje transkripcijskih faktorjev s transpozicijskimi elementi==
Šele nedavno so prišli do dognanj, da proteini, za katere kodirajo transpozicijski elementi, lahko vplivajo na regulacijo genov. Najdeni so bili številni primeri, v katerih gen za TE kodira transpozazo in hkrati tudi gostiteljski transkripcijski faktor. Fuzija transpozazne DNA-domene z regulatorno domeno transkripcijskega faktorja privede do tvorbe proteinskega kompleksa, ki je sposoben prepoznave ustreznega zaporedja TE na DNA, ker transpozaza prepozna transpozicijski element. Tako se lahko optimizira regulacija ekspresije genov s pomočjo TE.

==Utišanje transpozicijskih elementov in pomen le-tega pri regulaciji transkripcije==
Organizmi so razvili zmožnost zmanjšanja aktivnosti transpozicijskih elementov, prav tako pa so transpozicijski elementi zmožni obiti gostiteljevo obrambo. Eden od načinov utišanja delovanja TE je metilacija DNA. Demetilacija TE lahko vodi do nepravilne aktivacije sosednjih genov zaradi ojačevalnega potenciala TE. Zato so gostitelji morali razviti mehanizem, ki to kontrolira. Pomemben utiševalni mehanizem TE je metilacija CpG otočkov na DNA. Primer povezave med metilacijo DNA in aktivnostjo iz TE izhajajočih cis regulatornih regij je gen Agouti. Ta daje rjavo obarvanim mišim C57BL/6J rumeno obarvanje na način, ki je odvisen od ravni metilacije promotorja, ki nadzoruje transkripcijo retrotranspozonov IAP. Retrotranspozon IAP pa nadzira ekspresijo gena Agouti in s tem obarvanje miši.
Drug mehanizem utišanja TE so histonske modifikacije. Primer te epigenetske modifikacije je trimetilacija lizina 9 na histonu H3 (H3K9me3). Pomembno vlogo pri tem ima kompleks HUSH (human silencing hub complex). ATPaza MORC2 in HUSH se povežeta in posledično pride do trimetilacije na histonu 3 na retrotranspozonu LINE1 in tako se retrotranspoznon utiša. LINE1 se nahaja v intronih aktivnih genov. Če so ti trimetilirani, potem se RNA polimeraza II ne more pomikati naprej (motena je elongacija transkripcije), zato se geni ne prepisujejo.

==Transpozicijski elementi in njihova vloga pri regulatornih nekodirajočih molekulah RNA==
Zaradi napredka v določanju nukleotidnega zaporedja molekul RNA se v zadnjih letih odkriva vedno več nekodirajočih molekul RNA (ncRNA). Te vključujejo tudi regulatorne RNA, med katere spadajo kratke nekodirajoče RNA (sncRNA) in dolge nekodirajoče RNA (lncRNA). Transpozicijski elementi (TE) in regulatorne RNA so tesno povezani, saj se odkriva, da velik del nukleotidnega zaporedja regulatornih RNA in njihovih genov ter regulatornih regij predstavljajo TE. Transpozicijski elementi določajo funkcionalne lastnosti različnih tipov ncRNA, kar je ključno za njihovo regulatorno funkcijo pri transkripciji in posttranskripcijskih procesih.

Transpozicijski elementi dajejo strukturne značilnosti lncRNA, ki jim dajejo sposobnost interakcije z drugimi biološkimi molekulami (DNA, RNA, proteini...). lncRNA imajo lahko tako cis kot tudi trans-regulatorno aktivnost. Pojavlja se veliko hipotez, da TE dajejo funkcionalne domene lncRNA. Primer, ki potrjuje to hipotezo, je interakcija med XIST lncRNA in proteinskim kompleksom PRC2 (polycomb repressive complex 2). XIST lncRNA namreč vključuje transpozicijski element ERVB5 in ravno ta regija predstavlja vezavno mesto za PRC2. PRC2 ima vlogo pri zagotavljanju kompaktnosti kromatina, in sicer tako, da ena izmed njegovih podenot EZH2 (Enhancer of zeste homolog 2) katalizira trimetilacijo lizina 27 na histonu 3 (H3K27me1/2/3), s tem pa povzroči represijo transkripcije določenih genov. Fosforilacija EZH2 in T350 (obe sta podenoti PRC2) s CDK1/2 je ključna za interakcijo PRC2 z lncRNA, ki poteka preko G-kvadrupleskne regije lncRNA, le-ta pa je bogata s transpozoni ERVB5. XIST lncRNA pripelje proteinski kompleks PRC2 do promotorske regije tarčnega gena (npr. tumor supresorskega gena), kjer EZH2 s svojo metiltransferazno aktivnostjo deluje kot represor transkripcije.
Zanimiv primer povezave med transpozicijskimi elementi in nekodirajočo RNA je regulacija odziva na toplotni šok pri miših. Ta primer kaže tudi na trans-regulatorno vlogo nekodirajoče RNA. Mišja ncRNA, ki izhaja iz retrotranspozona B2 SINE, se v normalnih pogojih veže na regulatorne regije genov, ki se odzivajo na stres, ter tako prepreči njihovo transkripcijo. Pri toplotnem šoku se aktivira protein EZH2, ki pospeši razgradnjo te ncRNA ter tako prepreči inhibicijo transkripcije genov, povezanih s stresom (EZH2 stimulira ribocimsko aktivnost same ncRNA).

Transpozicijski elementi imajo pomembno vlogo pri procesu transkripcije genov za nekodirajoče RNA, saj so vključeni v številna območja njihovih genov in regulatornih regij. Mesta na genomu, na katerih se nahajajo nukleotidna zaporedja, ki izhajajo iz transpozicijskih elementov, so prisotna tako v promotorjih kot tudi na poliA regijah genov za nekodirajoče RNA. Veliko so jih našli tudi na regijah genov za lncRNA, ki so pomembna za spajanje eksonov oz. izrezovanje intronov (splice donor, splice acceptor).

Veliko molekul miRNA (spadajo med sncRNA) z vključenimi transpozicijskimi elementi interagira s 3' koncem neprevajajoče regije tarčne mRNA (3' UTR). Preko tega procesa se utiša mRNA. Tako se npr. miR-151, ki vsebuje transpozicijske elemente LINE2, veže na molekulo mRNA, ki kodira za ATPAF1 (ATP synthase mitochondrial F1 complex assembly factor 1), in sicer tako, da se poveže s transpozoni LINE2 na 3' koncu neprevajajoče regije tarčne mRNA.

Vedno bolj se odkriva tudi vloga transpozicijskih elementov pri tvorbi stabilnejših sekundarnih struktur v nekodirajočih RNA. Raziskava, ki je primerjala lncRNA z vključenimi transpozicijskimi elementi in lncRNA brez vključenih transpozicijskih elementov, je ugotovila, da lncRNA z vključenimi transpozicijskimi elementi tvorijo stabilnejše sekundarne strukture. Analizirali so tudi mesta na lncRNA, ki so vključena v bazno parjenje pri tvorbi sekundarnih struktur in ugotovili, da je okrog 82 % teh mest lociranih v Alu regijah lncRNA. Torej, Alu regije v regulatornih RNA sodelujejo pri intramolekularnem baznem parjenju, kar privede do tvorbe stabilnejših sekundarnih struktur, s tem pa tudi do večje stabilnosti nekodirajočih RNA. To jim omogoči, da lahko boljše opravljajo svoje funkcije regulacije transkripcije.

==Viri in literatura==

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

TE kot regulatorji transkripcije

2022-04-24T12:17:34Z

Markokovacic: /* Naslov */

==Uvod==
Transpozicijski elementi (TE), ki sestavljajo velik del evkariontskega genoma, lahko, če se nahajajo v eksonskih predelih gostiteljevega genskega zapisa, bistveno zmanjšajo njegovo evolucijsko sposobnost preživetja, ker delujejo moteče (lahko povzročijo npr. vstavitev start in stop kodonov, premik bralnega okvirja, prehitro terminacijo transkripcije,…). S tem zmanjšajo tudi verjetnost za lasten prenos v nove generacije. Ker TE po delovanju spominjajo na parazitski organizem, so se skozi evolucijo razvile strategije, ki preprečujejo preveliko škodo na gostiteljskem organizmu. Prilagajanje je potekalo vzajemno. Gostiteljski organizmi so npr. postali sposobni utišanja transpozicijskih elementov s pomočjo metilacije DNA na CpG otočkih, TE pa so se preferenčno vključevali v intronska zaporedja, saj tam ne delujejo tako moteče. Skozi čas so gostiteljski organizmi postali sposobni uporabe TE v svojo korist. Vključitve transpozicijskih elementov v nekodirajoče predele genskega zapisa in njihove mutacije so v veliko primerih povzročile, da so TE izgubili sposobnost transponiranja, pridobili pa so cis in trans-regulatorno aktivnost. Cis-regulatorne regije (CRE) so nekodirajoča zaporedja nukleotidov, ki regulirajo ekspresijo genov na isti verigi DNA. Trans regulacija pa pomeni predvsem to, da npr. transkripcijski faktorji prihajajo od drugod oz. so kodirani na eni molekuli DNA, regulirajo pa ekspresijo genov na drugi molekuli DNA. Regulacija transkripcije s TE lahko poteka na več načinov:

1. V genski zapis lahko vnašajo nova vezavna mesta za transkripcijske faktorje (TF) preko promotorjev, ojačevalcev, utiševalnih in izolatorskih zaporedij. 
2. Lahko modulirajo 3D strukturo kromatina. 
3. Zmožni so kodiranja transkripcijskih faktorjev. 
4. S povezovanjem z represorskimi transkripcijskimi faktorji vplivajo na utišanje sosednjih genov. 
5. Imajo vlogo pri regulatornih nekodirajočih molekulah RNA, ki so pomembni regulatorji transkripcije. 

==Funkcije transpozicijskih elementov v cis-regulatornih regijah ==
Regulatorne sposobnosti cis-regulatornih regij lahko izhajajo iz transpozicijskih elementov. V splošnem cis-regulatorne regije delujejo tako, da tvorijo specifična vezavna mesta za proteine povezane z iniciacijo in regulacijo transkripcije. Primeri nekaterih vrst CRE:

1. Promotorji so kratka zaporedja DNA, ki vključujejo začetno mesto transkripcije. Ob vezavi ustreznih transkripcijskih faktorjev na promotorsko regijo omogočijo transkripcijo gena. Kot primer bi omenil transpozon AluSp v promotorju gena FCER1G, ki inducira transkripcijo visokoafinitetnega receptorja za Fc regijo IgE. 
2. Ojačevalci so zaporedja, ki jih najdemo pred ali za genom, ki ga regulirajo. Delujejo kooperativno s promotorjem, in sicer tako, da povečajo stopnjo transkripcije, omogočajo pa regulacijo tudi bolj oddaljenih genov. Kot primer bi omenil transpozon AluY v intronu gena CD8 (ta kodira glikoprotein CD8, ki je pomemben pri celičnih interakcijah znotraj imunskega sistema), za katerega so ugotovili, da deluje kot ojačevalec. 
3. Utiševalna zaporedja vežejo represorje in tako preprečujejo transkripcijo. Transpozicijski elementi so z rekrutiranjem transkripcijskih faktorjev postali sposobni delovati kot utiševalna zaporedja, ki remodelirajo kromatin. Čeprav so heterokromatinski deli revni z geni, so bogati s TE-ji, kar bi lahko pomenilo, da imajo transpozicijski elementi pomembno vlogo pri širjenju heterokromatina. Tako se npr. korepresorski protein TRIM28 veže na vezavno mesto, ki se nahaja na transpozonu ERV in s tem utiša sosednje gene. 
4. Inzulatorji ščitijo gene pred regulatornimi vplivi sosednjih genov. Lahko blokirajo promotorje, ojačevalce in utiševalce. Preprečujejo neprimerne interakcije med sosednjimi kromatinskimi regijami. Kot primer bi omenil gen za transpozon AluSq, ki deluje kot inzulator, saj njegova transkripcija ščiti človeški gen HBE1 (ki kodira za istoimenski protein) pred regulacijo z drugimi promotorji. 

TE-ji uvajajo nova vezavna mesta za TF, ki so v njih lahko prisotna takoj po inserciji v genom ali pa nastanejo de novo s postinsercijskimi mutacijami. Pogosto se mutacije pojavljajo na metiliranih CpG otočkih. Deaminacija teh povzroči zamenjavo citozina z gvaninom, kar je med drugim povzročilo nastanek številnih vezavnih mest za transkripcijska faktorja cMyc in p53. Vključitev TE-jev zraven že obstoječega vezavnega mesta za transkripcijske faktorje ter točkovne mutacije omogočijo nastanek novih mest za vezavo TF (alternativni promotorji), kar povzroča zaščito pred možnimi kasnejšimi mutacijami z redundančnostjo. Redundanca dopušča tudi kooperativno delovanje z zunanjimi promotorji, saj se lahko tako razbremenijo določena vezavna mesta za transkripcijske faktorje.

==Vpliv transpozicijskih elementov na kromatinsko 3D strukturo==
V interfaznem jedru so deli genoma organizirani v topološko asociirajoče domene (TAD). To so večje domene kromatina, ki so med seboj ločene z izolatorskimi proteini. Ti omejujejo prostor, v katerem lahko različni deli DNA prihajajo v medsebojne stike. Njihova naloga je tudi prostorsko omejevanje interakcij med transkripcijskimi faktorji in ojačevalci ter promotorji. TAD specificirajo funkcije cis regulatornih regij z omejevanjem ojačevalcev, tako da ti aktivirajo le promotorje znotraj iste TAD. Vloga transpozicijskih elementov (TE) pri 3D arhitekturi genoma se je v zadnjih letih začela intenzivno raziskovati. Številne družine TE so namreč obogatene na mejah TAD. Določeni TE naj bi imeli preko tega tudi vlogo pri zvijanju kromosomov, prav tako pa tudi pri kompaktnosti kromatina in posledično tudi pri regulaciji procesov transkripcije. Kot primer pomena transpozicijskih elementov bi izpostavil študijo, ki je odkrila veliko HERV-H na mejah TAD v človeških embrionalnih matičnih celicah (hESCs) in delecija 2 individualnih HERV-H je vodila do izgube kompaktnosti te meje.
Protein CTCF (11-zinc finger protein) je pomemben pri regulaciji 3D strukture kromatina in procesov transkripcije. Zelo pomemben je pri strukturi mej TAD. Vsebuje motive cinkovega prsta in deluje kot transkripcijski faktor. Sodeluje pri mediaciji nastanka kromatinskih zank in se velikokrat veže na TE. Opaženo je bilo, da so TE razpršili veliko vezavnih mest za protein CTCF in smiselno bi bilo, da bi se tudi meje TAD razpršile, vendar je bilo ugotovljeno, da so te zelo ohranjene. Odkrili so različne mehanizme preprečevanja tvorbe ektopičnih meja TAD. Tako se npr. transpozoni B2SINE, ki imajo veliko vezavnih mest za protein CTCF, lahko povežejo s kompleksom ChAHP, ki torej prepozna isti motiv kot CTCF, a z višjo afiniteto.

==Kodiranje transkripcijskih faktorjev s transpozicijskimi elementi==
Šele nedavno so prišli do dognanj, da proteini, za katere kodirajo transpozicijski elementi, lahko vplivajo na regulacijo genov. Najdeni so bili številni primeri, v katerih gen za TE kodira transpozazo in hkrati tudi gostiteljski transkripcijski faktor. Fuzija transpozazne DNA-domene z regulatorno domeno transkripcijskega faktorja privede do tvorbe proteinskega kompleksa, ki je sposoben prepoznave ustreznega zaporedja TE na DNA, ker transpozaza prepozna transpozicijski element. Tako se lahko optimizira regulacija ekspresije genov s pomočjo TE.

==Utišanje transpozicijskih elementov in pomen le-tega pri regulaciji transkripcije==
Organizmi so razvili zmožnost zmanjšanja aktivnosti transpozicijskih elementov, prav tako pa so transpozicijski elementi zmožni obiti gostiteljevo obrambo. Eden od načinov utišanja delovanja TE je metilacija DNA. Demetilacija TE lahko vodi do nepravilne aktivacije sosednjih genov zaradi ojačevalnega potenciala TE. Zato so gostitelji morali razviti mehanizem, ki to kontrolira. Pomemben utiševalni mehanizem TE je metilacija CpG otočkov na DNA. Primer povezave med metilacijo DNA in aktivnostjo iz TE izhajajočih cis regulatornih regij je gen Agouti. Ta daje rjavo obarvanim mišim C57BL/6J rumeno obarvanje na način, ki je odvisen od ravni metilacije promotorja, ki nadzoruje transkripcijo retrotranspozonov IAP. Retrotranspozon IAP pa nadzira ekspresijo gena Agouti in s tem obarvanje miši.
Drug mehanizem utišanja TE so histonske modifikacije. Primer te epigenetske modifikacije je trimetilacija lizina 9 na histonu H3 (H3K9me3). Pomembno vlogo pri tem ima kompleks HUSH (human silencing hub complex). ATPaza MORC2 in HUSH se povežeta in posledično pride do trimetilacije na histonu 3 na retrotranspozonu LINE1 in tako se retrotranspoznon utiša. LINE1 se nahaja v intronih aktivnih genov. Če so ti trimetilirani, potem se RNA polimeraza II ne more pomikati naprej (motena je elongacija transkripcije), zato se geni ne prepisujejo.

==Transpozicijski elementi in njihova vloga pri regulatornih nekodirajočih molekulah RNA==
Zaradi napredka v določanju nukleotidnega zaporedja molekul RNA se v zadnjih letih odkriva vedno več nekodirajočih molekul RNA (ncRNA). Te vključujejo tudi regulatorne RNA, med katere spadajo kratke nekodirajoče RNA (sncRNA) in dolge nekodirajoče RNA (lncRNA). Transpozicijski elementi (TE) in regulatorne RNA so tesno povezani, saj se odkriva, da velik del nukleotidnega zaporedja regulatornih RNA in njihovih genov ter regulatornih regij predstavljajo TE. Transpozicijski elementi določajo funkcionalne lastnosti različnih tipov ncRNA, kar je ključno za njihovo regulatorno funkcijo pri transkripciji in posttranskripcijskih procesih.
Transpozicijski elementi dajejo strukturne značilnosti lncRNA, ki jim dajejo sposobnost interakcije z drugimi biološkimi molekulami (DNA, RNA, proteini...). lncRNA imajo lahko tako cis kot tudi trans-regulatorno aktivnost. Pojavlja se veliko hipotez, da TE dajejo funkcionalne domene lncRNA. Primer, ki potrjuje to hipotezo, je interakcija med XIST lncRNA in proteinskim kompleksom PRC2 (polycomb repressive complex 2). XIST lncRNA namreč vključuje transpozicijski element ERVB5 in ravno ta regija predstavlja vezavno mesto za PRC2. PRC2 ima vlogo pri zagotavljanju kompaktnosti kromatina, in sicer tako, da ena izmed njegovih podenot EZH2 (Enhancer of zeste homolog 2) katalizira trimetilacijo lizina 27 na histonu 3 (H3K27me1/2/3), s tem pa povzroči represijo transkripcije določenih genov. Fosforilacija EZH2 in T350 (obe sta podenoti PRC2) s CDK1/2 je ključna za interakcijo PRC2 z lncRNA, ki poteka preko G-kvadrupleskne regije lncRNA, le-ta pa je bogata s transpozoni ERVB5. XIST lncRNA pripelje proteinski kompleks PRC2 do promotorske regije tarčnega gena (npr. tumor supresorskega gena), kjer EZH2 s svojo metiltransferazno aktivnostjo deluje kot represor transkripcije.
Zanimiv primer povezave med transpozicijskimi elementi in nekodirajočo RNA je regulacija odziva na toplotni šok pri miših. Ta primer kaže tudi na trans-regulatorno vlogo nekodirajoče RNA. Mišja ncRNA, ki izhaja iz retrotranspozona B2 SINE, se v normalnih pogojih veže na regulatorne regije genov, ki se odzivajo na stres, ter tako prepreči njihovo transkripcijo. Pri toplotnem šoku se aktivira protein EZH2, ki pospeši razgradnjo te ncRNA ter tako prepreči inhibicijo transkripcije genov, povezanih s stresom (EZH2 stimulira ribocimsko aktivnost same ncRNA).
Transpozicijski elementi imajo pomembno vlogo pri procesu transkripcije genov za nekodirajoče RNA, saj so vključeni v številna območja njihovih genov in regulatornih regij. Mesta na genomu, na katerih se nahajajo nukleotidna zaporedja, ki izhajajo iz transpozicijskih elementov, so prisotna tako v promotorjih kot tudi na poliA regijah genov za nekodirajoče RNA. Veliko so jih našli tudi na regijah genov za lncRNA, ki so pomembna za spajanje eksonov oz. izrezovanje intronov (splice donor, splice acceptor).
Veliko molekul miRNA (spadajo med sncRNA) z vključenimi transpozicijskimi elementi interagira s 3' koncem neprevajajoče regije tarčne mRNA (3' UTR). Preko tega procesa se utiša mRNA. Tako se npr. miR-151, ki vsebuje transpozicijske elemente LINE2, veže na molekulo mRNA, ki kodira za ATPAF1 (ATP synthase mitochondrial F1 complex assembly factor 1), in sicer tako, da se poveže s transpozoni LINE2 na 3' koncu neprevajajoče regije tarčne mRNA.
Vedno bolj se odkriva tudi vloga transpozicijskih elementov pri tvorbi stabilnejših sekundarnih struktur v nekodirajočih RNA. Raziskava, ki je primerjala lncRNA z vključenimi transpozicijskimi elementi in lncRNA brez vključenih transpozicijskih elementov, je ugotovila, da lncRNA z vključenimi transpozicijskimi elementi tvorijo stabilnejše sekundarne strukture. Analizirali so tudi mesta na lncRNA, ki so vključena v bazno parjenje pri tvorbi sekundarnih struktur in ugotovili, da je okrog 82 % teh mest lociranih v Alu regijah lncRNA. Torej, Alu regije v regulatornih RNA sodelujejo pri intramolekularnem baznem parjenju, kar privede do tvorbe stabilnejših sekundarnih struktur, s tem pa tudi do večje stabilnosti nekodirajočih RNA. To jim omogoči, da lahko boljše opravljajo svoje funkcije regulacije transkripcije.

==Viri in literatura==

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

TE kot regulatorji transkripcije

2022-04-24T12:12:18Z

Markokovacic: /* Vpliv na kromatinsko 3D strukturo */

TE kot regulatorji transkripcije

2022-04-24T12:12:00Z

Markokovacic: /* Naslov */

TE kot regulatorji transkripcije

2022-04-24T12:10:34Z

Markokovacic: /* Naslov */

TE kot regulatorji transkripcije

2022-04-24T12:09:31Z

Markokovacic: /* Naslov */

TE kot regulatorji transkripcije

2022-04-24T12:06:34Z

Markokovacic: /* Funkcije transpozicijskih elementov v cis-regulatornih regijah */

TE kot regulatorji transkripcije

2022-04-24T12:06:18Z

Markokovacic: /* Naslov */

TE kot regulatorji transkripcije

2022-04-24T12:03:37Z

Markokovacic: /* Uvod */

TE kot regulatorji transkripcije

2022-04-24T12:02:05Z

Markokovacic: /* Naslov */

BIO2 Povzetki seminarjev 2021

2021-11-12T17:09:33Z

Markokovacic: /* POVZETKI SEMINARJEV BIOKEMIJA 2021/22 */

= POVZETKI SEMINARJEV BIOKEMIJA 2021/22 =
==Marko Kovačić - Vloga citokinov poddružine IL-1 pri regulaciji glikolize in njihov vpliv na bolezni, povezane z glikolizo==

Citokini so proteini z majhno molekulsko maso (približno 5-25 kDa), ki so pomembni v celičnem signaliziranju. Delujejo tako, da se vežejo na specifične membranske receptorje in s tem regulirajo transkripcijo genov ali njihovih transkripcijskih faktorjev. Tako sprožijo imunski odziv na vnetje, infekcijo ali na druga stanja. S svojimi signalnimi mehanizmi kontrolirajo rast in aktivnost drugih celic imunskega sistema ter krvnih celic. Interlevkini so skupina citokinov, ki imajo različne funkcije, predvsem so pomembni pri komunikaciji med celicami imunskega sistema, pri vnetnih in imunomodulatornih procesih. Citokini IL-1a, IL-1β, IL-1Ra in IL-33 so zelo pomembni člani družine interlevkinov interlevkin-1 (IL-1). Številne raziskave so pokazale, da je ta poddružina interlevkinov pomembna pri regulaciji glikolize, tj. poti, ki je pomembna za pridobivanje energije v obliki ATP. Glikolizo lahko regulirajo na nivoju vnosa glukoze v celice ali pa na nivoju reguliranja glikolitičnih encimov, ker se njihove signalne poti prepletajo s signalnimi potmi, ki so ključne pri regulaciji glikolize. Disregulacija glikolize lahko vodi do številnih bolezni (rak, diabetes tipa 2, reumatoidni artritis, osteoartritis, astma), poddružina IL-1 pa z regulacijo glikolize lahko vpliva na potek le-teh. Vpliv na delovanje citokinov IL-1a, IL-1β, IL-1Ra in IL-33 tako daje številne možnosti pri zdravljenju z glikolizo povezanih bolezni in prav to je predmet številnih raziskav.

==Janja Bohte - Vloga in regulacija aerobne glikolize pri hepatocelularnem karcinomu==

Rak jeter je šesta najpogostejša oblika raka na svetu. Kar 90% primarnih rakov jeter predstavlja hepatocelularni karcinom (HCC). Za zdravljenje te bolezni se med drugim uporabljalo zdravila za zaviranje specifičnih signalnih poti, ki so odgovorne za rast tumorja. Tako zdravilo je sorafenib, zaviralec tirozin kinaze, na katerega organizem zaradi povečane aerobne glikolize v nekem časovnem obdobju razvije odpornost. Aerobna glikoliza oziroma Warburgov učinek je pojav, ko tumorske celice pretvarjajo glukozo v laktat kljub zadostni količini kisika. Prehod z metabolične poti oksidativne fosforilacije na pot glikolize pri HCC spodbuja celično proliferacijo ter ponuja ugodno mikrookolje za napredovanje tumorja. Odgovorna je za regulacijo invazije, metastaze, angiogeneze in odpornosti na zdravila pri HCC. Mehanizem Warburgovega učinka je kompleksen, pomembno vlogo pa imajo trije encimi, ki sodelujejo v sami presnovi glukoze: heksokinaza 2 (HK2), fosfofruktokinaza 1 (PFK1) in piruvat kinaza tipa M2 (PKM2). Ti so regulirani na več načinov in s številnimi transkripcijskimi faktorji ter metaboličnimi potmi, kot so AMPK, PI3K/Akt metabolična pot, HIF-1α, c-Myc ter nekodirajoče RNA. Zaradi pomembne vloge glikolize pri napredovanju tumorja, je usmerjanje na glavne dejavnike na tej poti, kot je inhibicija HK2, PFK ali PKM2, ključnega pomena za razvoj novih terapevtskih pristopov za zdravljenje HCC.

==Urša Štefan - Signalizacija STING - obseg delovanja in povezava z rakavimi obolenji==

Pojav dvovijačne DNA v citosolu je v celici največkrat pokazatelj celične abnormalnosti – virusne okužbe, poškodbe dednega materiala, oksidativnega stresa ali rakave transformacije. Celice so zato razvile načine zaznavanja prisotnosti DNA v citosolu. Eden izmed takšnih je signalna pot STING. Protein ciklična GMP-AMP sintetaza po vezavi z DNA sintetizira cGAMP, ki aktivira protein STING, vezan v membrani endoplazmatskega retikuluma. Ta se transportira do Golgijevega aparata, kjer mu vezava kinaze TBK1 omogoča aktivacijo transkripcijskih faktorjev IRF3 in NF-κB za citokine. Poleg odziva na citosolno DNA protein STING sodeluje tudi v regulaciji celičnega metabolizma, celičnega cikla, pri indukciji avtofagije, regulaciji ravni kalcija in kot senzor poškodb DNA. Zaradi svojega velikega obsega delovanja je signalna pot STING tarča razvoja številnih zdravil, ki pa je do zdaj bil le delno uspešen. Članek opiše signalno pot STING, njene funkcije v celici in na kratko povzame vlogo signalne poti pri zdravljenju rakavih obolenj.

==Hana Glavnik - S-glutationilacija proteinov kot globalni inhibitor celičnega metabolizma za zmanjšanje občutljivosti signalov vodikovega peroksida==

S-glutationilacija proteinov ima v celici pomembno vlogo. Ob zvišanju koncentracije reaktivnih kisikovih spojin (ROS), se v celici vzpostavi stanje oksidativnega stresa. Ker so za celico te spojine toksične, je razvila mehanizme, ki ji pomagajo uravnavati njihovo koncentracijo in zaščitijo ostale spojine v celici pred ireverzibilno oksidacijo. Najbolj pomembna spojina med ROS je vodikov peroksid, ki ima poleg toksičnih vplivov tudi lastnosti sekundarnega sporočevalca. Ob nastopu oksidativnega stresa v celici in povišane koncentracije vodikovega peroksida, zaznata signale encima GRX1 in GRX2, ki glutationilirata proteine z vezavo glutationa (GSH) na tiolne skupine cisteinov (-SH) in jih tako zaščitita pred poškodbami. Hkrati se s potekom S-glutationilacije aktivirajo tiste metabolične poti, pri katerih nastajajo antioksidanti, največkrat NADPH, ki pomagajo razgraditi vodikov peroksid in ostale ROS spojine. Tiste poti, pri katerih nastajajo ROS spojine so inhibirane s strani S-glutationilacije, dokler ne pride do signala, ki ga sprejmeta GRX1/2. To sproži njune deglutationilacijske aktivnosti in z deglutationilacijo encimov se stanje v celici se normalizira in metabolične poti lahko potekajo nemoteno.

==Tinkara Butara - Transmembranska signalizacija v bakterijskih kemoreceptorjih==
Kemotaksija je oblika gibanja, kjer se organizem giba k ugodnemu kemijskemu gradientu ali stran od toksičnega oziroma neugodnega. Oblika gibanja je značilna za premikajoče se bakterije in arheje. Kemotaksija igra pomembno vlogo pri iskanju hrane, oblikovanju biofilma in tudi pri patogenezi. Takšno gibanje, s prepoznavanjem različnih kemijskih zvrsti, nadzorujejo kemoreceptorji. To so transmembranski proteini, ki vežejo snovi iz okolice in tako sprožijo nadaljnjo signalizacijo znotraj celice, ta pa vodi do spremembe v rotaciji bička. Vezava ugodne signalne molekule vodi do konformacijskih sprememb v kemoreceptorju, ki preprečijo avtofosforilacijo kinaze CheA, ki omogoča fosforilacijo proteina CheY. Fosforiliran CheY se namreč veže na motor bička in tako spremeni njegovo rotacijo iz nasprotne smeri urinega kazalca v smer urinega kazalca. Ko biček rotira v smeri urinega kazalca, to spodbudi naključno gibanje v prostoru, ki na novo orientira bakterijsko celico. Če biček rotira v nasprotni smeri urinega kazalca, pa se celica giba naravnost proti ugodnemu kemijskemu gradientu. Prilagoditev na signal nadzorujejo regulatorni proteini (CheR, CheB, za zaključek signala pa je pomemben protein CheZ, ki hidrolizira CheY-P. Kemoreceptorji se nahajajo na polih bakterijske celice in se združujejo v skupke, kar predstavlja dodatno možnost prilagoditve na kemijski signal.

==David Valte - Jedrni hormonski receptorji in izražanje genov==

Jedrni hormonski receptorji (NHR) so poleg g-proteinov, receptorjev z encimsko aktivnostjo in ionskih kanalčkov le še eden od načinov biosignalizacije, ki pa se po načinu delovanja od drugih precej razlikuje. Jedrni hormonski receptorji neposredno vplivajo na transkripcijo in tako posledično tudi na izražanje genov. Z vezavo ligandov, kot so na primer vitamin d, retinoidni hormoni, tiroidni hormoni in steroidi, na receptor, pride na hormonskih receptorjih do konformacijskih sprememb. Spremembe v konformaciji receptorja pa omogočajo interakcije receptorja s specifičnimi sekvencami DNA. Te sekvence imenujemo hormonski odzivni elementi HRE/HREs, HRE se ponavadi nahajajo znotraj promotorja tarčnega gena, na teh mestih NHR delujejo kot aktivatorji transkripcije DNA. Transkripcija DNA povzroči nastanek mRNA z zapisom za nastanek proteinov, katere celica potrebuje, preko teh pa se lahko odzove na zunanje motnje. Prepoznavo zaporedij HRE in vezavo na DNA omogoča specifična sestava jedrnih receptorjev. Te so sestavljeni iz večih domen, vsaka od teh ima specifično funkcijo brez katere delovanje NR ni mogoče. Posebne domene omogočajo prepoznavo HRE, vezavo na DNA in dimerizacijo z drugimi NR. Na hormonske odzivne elemente se lahko NHR vežejo v obliki monomerov, lahko pa se NHR-ji vežejo drug z drugim, tako nastajajo dimeri. Dimeri omogočajo drugačne afinitete za vezavo z DNA.

==Alliana Kolar - Pomen upravljanja z agonisti, antagonisti in signalnimi modulatorji receptorjev abscizinske kisline (ABA) v agronomiji==
Abscizinska kislina (ABA) je naravno prisoten rastlinski hormon, katerega koncentracija se poviša, ko je rastlina pod vplivom stresa in se na stres tudi odzove. Igra vlogo pri zapiranju listnih rež, ko rastlini primanjkuje vode, inhibira kalitev, spodbuja dormanco, vpliva na cvetenje, staranje listov, zorenju plodov ipd. Ker je sintetična ABA nestabilna in ob zunanjem nanosu ne pokaže vpliva na rastlino, je potrebno z modeliranjem antagonistov oziroma agonistov sintetizirati analoge, ki bi bodisi promovirali/oponašali ali zavirali njeno delovanje. Z njimi bi agronomi lahko manipulirali na delovanje rastline in imeli nadzor nad njim, kar bi posledično prineslo večji donos zaradi večje količine in kakovosti proizvodov. Za to pa je potrebno dobro poznati molekulo in njeno biokemijsko delovanje ob signalizaciji in tudi druge spojine, s katerimi regulira procese v rastlini. Ker pa je to področje še dokaj neraziskano in nepojasnjeno, je zelo težko najti prave analoge in dodatno sintetizirati še boljše. Vendar pa po odkritju sintetične molekule pirabaktin, ki je delovala kot primeren agonist, so odkrili še 14 receptorjev ABA, imenovanih PYR (Pyrabactin Resistance)/PYR-like/(RCARs)Regulatory Components of ABA Receptors in s tem še boljše razumeli delovanje ABA in njene signalizacije.

== Gaja Starc - Medsebojni vpliv vodikovega sulfida in drugih signalnih molekul pri uravnavanju signaliziranja celic zapiralk in odzivu na abiotski oziroma biotski stres==

Vse daljša sušna obdobja, visoke temperature in nizka vlažnost, od pritrjenih organizmov zahtevajo prilagoditve, s katerimi lahko izboljšajo uporabo energije in kemijskih virov v raznovrstnih razmerah. Kot mehanizem, ki omogoča nadzor nad ravnotežjem med izgubo vode in izmenjavo plinov, so rastline v krovnih tkivih razvile aktivno regulirane odprtine – reže. Reže so ključne za fiksacijo atmosferskega ogljika pri fotosintezi, hkrati pa rastline zaradi rež izgubijo 95 % vode v ozračje. Regulacija premikanja listnih rež je ključna za uspešno rast in razvoj rastline. Premikanje rež je tesno povezano z zaporedjem kompleksnih procesov zaznavanja, prenosa in uravnavanja signalov v celicah zapiralkah. Vodikov sulfid (H2S) uravnava premikanje celic zapiralk in sodeluje pri uravnavanju in prenosu signalov v organizmih ter tako sodeluje pri prilagajanju rastline na spremembe v okolju in odzivih na abiotski oziroma biotski stres. Novejše študije pri navadnem repnjakovcu (''Arabidopsis thaliana'') so pokazale, da zunanji H2S spodbuja zapiranje listnih rež, pri čemer sodeluje s fitohormoni in signalnimi molekulami. Glavna signalna pot, pri kateri sodeluje, je persulfidacija proteinov – post-translacijska modifikacija pri kateri so tiolne skupine cisteinskih ostankov modificirane v persulfidne. Sodeluje tudi pri uravnavanju aktivnosti ionskih kanalčkov v celicah zapiralkah, ki so ključni pri nadzoru premikanja listnih rež in pomaga omiliti oksidativni stres z vplivom na koncentracijo reaktivnih kisikovih zvrsti v celicah zapiralkah.

== Andraž Rotar - Vloga signalne poti JAK/STAT in njeni inhibitorji pri človeških boleznih==
Signalna pot kinaze janus (angl. janus kinase-JAK) in signalnega prenašalca in aktivatorja transkripcije (angl. signal transducer and activator of transcription-STAT), krajše JAK/STAT, je prisotna v večini večceličnih organizmih. Mehanizem poti je eleganten in presenetljivo preprost način, s katerim zunajcelični faktorji povzročijo gensko izražanje. Prepisani geni so nujni pri bioloških procesih kot so celična rast, diferenciacija, apoptoza in imunskem odzivu. Signalizacija JAK/STAT je v celici močno regulirana. Primarni regulatorji spadajo v tri skupine, in sicer med zaviralce citokinske signalizacije (angl. suppressor of cytokine signaling-SOCS), proteinske inhibitorje aktiviranih STAT (angl. protein inhibitors of activated STAT-PIAS) in protein tirozinske fosfataze (angl. protein tyrosine phosphatase-PTP). Če se v organizmu pojavi okvara signalne poti ali njene regulacije to privede do raznih avtoimunih bolezni kot so revmatoidni artritis, Parkinsonova bolezen ter multipla skleroza. Ker pa pot nadzira tudi celični cikel, lahko mutacije genov, odgovornih za sintezo sestavnih delov poti, privedejo do rakavih obolenj. Da bi se z temi patološkimi stanji lahko spopadali, raziskovalci z veliko vnemo iščejo nove vedno boljše inhibitorje signale poti. Do ne daljnega smo poznali le inhibitorje za JAK, sedaj pa jih razvijajo tudi za STAT. V seminarski nalogi so predstavljeni vsi zgoraj našteti proteini, patološka stanja povezana z JAK/STAT, ter inhibitorji za njihovo zdravljenje.

== Pia Špehar - Integrini in njihova vloga pri vezikularnem transportu==
Integrini so adhezijski receptorski proteini, zgrajeni iz dveh podenot. Imajo mnogo različnih funkcij, in sicer povezujejo citoskelet in zunajcelični matriks, s tem posledično povežejo notranjost celice z njeno okolico. Delujejo kot prenašalci signalov in spodbujevalci celične proliferacije in preživetja. Sodelujejo pri imunskem odzivu, apoptozi, celični diferenciaciji, mnoge raziskave pa so pokazale, da so ključni tudi pri signalizaciji in regulaciji vezikularnega transporta. Ključno vlogo imajo pri eksocitozi biosintetskih in sekretornih veziklov, saj nase vežejo mikrotubule in preko njih usmerjajo vezikle do celične površine. Sodelujejo tudi pri procesu degranulacije v trombocitih in levkocitih, pri agregaciji trombocitov in posledično pri hemostazi, ki je prva stopnja celjenja ran. V citotoksičnih limfocitih prepoznava antigena na tarčni celici povzroči sidranje mikrotubulov na integrine. Ti se nato povežejo z medcelično adhezijsko molekulo in tako sprožijo prenos signala za celično smrt tarčne celice. V trombocitih pa integrin-posredovana degranulacija α-granul omogoči agregacijo trombocitov in s tem nastanek krvnega strdka, ki zaustavi krvavitev. Integrini sodelujejo tudi pri endocitozi, in sicer pri vnosu virusov in zunajceličnih veziklov v celico. V celico se lahko prenese virus, vsebina veziklov ali pa samo signal, ki sproži nadaljnje procese znotraj celice. Pomembni so tudi za prenos signalov pri endocitotskem recikliranju receptorjev tirozin kinaz (RTK).

==Tina Urh - Nevrotransmiterji, agonisti in antagonisti receptorjev kot tarča zdravljenja==
Nevrotransmiterji acetilholin, norepinefrin, dopamin, serotonin, subtanca P, GABA in glutamat posredujejo stimulatorne ali inhibitorne živčne funkcije preko vezave na specifične receptorje. Izločajo se iz avtonomnih živcev, ganglijev, nadledvične žleze, rakavih celic in celic imunskega sistema. Spremenjena komunikacija med živčnim in imunskim sistemom in uporaba receptorskih agonistov/antagonistov je vedno pogosteje tarča zdravljenja nevrodegenerativnih, imunopatoloških in avtoimunskih bolezni. E in NE sta stresna hormona in interagirata z α in β adrenergičnimi receptorji; aktivacija β2-AR (agonist izoprotenerol) spoodbuja rast tumorja. Blokira jo antagonist propranolol. GABA je pomirjevalo in antidiabetično sredstvo, stimulira rakavo proliferacijo preko GABAA; A receptorski agonist je muscimol. Vendar pa je vpliv GABA odvisen od tipa raka in receptorja. Serotonin (5-HT) ima vlogo vazokonstriktorja; proizvajajo ga imunske celice. Antagonisti 5-HT2AR imajo antipsihotične in antidepresivne lastnosti. Povečanje števila receptorjev 5-HT1A kaže na zaviranje izločanja serotonina in posledično povečano depresivnost. Dopamin oz. agonisti DA receptorjev izkazujejo inhibitorni efekt na rast tumorja. Neselektivni agonisti so učinkoviti za zdravljenje bolezni CŽS. Tudi vloge dopamin receptorjev so specifične glede na tip tumorja. Substanca P spada v družino nevropeptidov in spodbuja razvoj raka. Inhibicija receptorja NK-1 s specifičnimi antagonisti povzroči antitumorske učinke. Glutagonski agonisti lahko sprožijo smrt T celic, odvečni Glu vpliva na razvoj epilepsije in raka. Za zdravljenje bi se lahko uporabljalo inhibitorje mGluR1.

== Katja Resnik - Signalna omrežja, ki povzročajo raka ==
Normalno delovanje vsake posamezne celice in posledično organizma kot celote nam omogočajo številni procesi, kjer je ključnega pomena njihova regulacija. Tako lahko spremenjene signalne poti, ki v naših celicah uravnavajo predvsem procese celične proliferacije, diferenciacije, apoptoze in na splošno celičnega cikla privedejo do številnih bolezni, med drugim tudi do razvoja raka. Dve ključni poti, ki sta pri večini človeških oblik raka napačno regulirani sta signalni poti RAS in APC. RAS proteini so vrsta G proteinov, ki regulirajo normalen potek celičnega cikla preko povezovanja z efektorskimi proteini. Onkogene oblike RAS proteinov, ki so posledica mutacij, povzročijo njihovo nenehno aktivnost, kar vodi v transformacijo signalne poti. Ta se odraža v izražanju genov, ki se sicer naj ne bi izražali, kar lahko vodi v nenehno spodbujanje celične proliferacije. Po drugi strani pa do podobnega učinka pride tudi zaradi napak v signalni poti APC, ko okvarjen protein APC ne more več opravljati funkcije zmanjševanja koncentracije ključnega proteina za regulacijo in prehod iz faze celične proliferacije v fazo diferenciacije in staranja celic. Proučevanje takšnih signalnih poti nam omogoča spoznavanje vplivov določenih mutacij na posamezne procese in njihovo prispevanje k razvoju raka. Pomembno je le, da na signalne poti gledamo kot na prepletena omrežja, kar lahko ključno prispeva k razvoju uspešnih zdravil in metod zdravljenja omenjene bolezni.

BIO2 Seminar 2021

2021-11-03T19:26:07Z

Markokovacic: /* Seznam seminarjev */

= Biokemijski seminar =
doc. dr. Gregor Gunčar, K2.022

== Seznam seminarjev ==
{| {{table}}
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''priimek, ime'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''poglavje'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''naslov seminarja'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''recenzent 1'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''recenzent 2'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''datum oddaje'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''datum recenzije'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''datum predstavitve'''
|-
| Valte, David||12||Jedrni hormonski receptorji in izražanje genov||Mitkov, Kostadin||Brdnik, Nuša||29/10/21||01/11/21||03/11/21
|-
| Kolar, Alliana||12||Pomen upravljanja z agonisti, antagonisti in signalnimi modulatorji receptorjev abscizinske kisline (ABA) v agronomiji||Vukšinić, Ivana||Premrl, Petja||29/10/21||01/11/21||03/11/21
|-
| Glavnik, Hana||12||S-glutationilacija proteinov kot globalni inhibitor celičnega metabolizma za zmanjšanje občutljivosti signalov vodikovega peroksida||Kovač, Ela||Kavčič, Ema||29/10/21||01/11/21||03/11/21
|-
| Štefan, Urša||12||Signalizacija STING - obseg delovanja in povezava z rakavimi obolenji||Vujović, Nataša||Zajec, Tina||29/10/21||01/11/21||03/11/21
|-
| Butara, Tinkara||12||Transmembranska signalizacija v bakterijskih kemoreceptorjih||Sotlar, Špela||Žnidar, Žan||29/10/21||01/11/21||03/11/21
|-
| Špehar, Pia||12||Integrini in njihova vloga pri vezikularnem transportu||Trošt, Pia||Rus, Metka||05/11/21||08/11/21||10/11/21
|-
| Urh, Tina||12|| Nevrotransmiterji in njihovi receptorji kot vzrok in tarča zdravljenja nevrodegenerativnih, imunopatoloških in avtoimunskih bolezni ||Maučec, Ana||Loborec, Mark||05/11/21||08/11/21||10/11/21
|-
| Rotar, Andraž||12||Vloga signalne poti JAK/STAT in njeni inhibitorji pri človeških boleznih||Priveršek, Maj||Kastelic, Ana||05/11/21||08/11/21||10/11/21
|-
| Starc, Gaja||12||Medsebojni vpliv vodikovega sulfida in drugih signalnih molekul pri uravnavanju signaliziranja celic zapiralk in odzivu na abiotski oziroma biotski stres||Spruk, Teja||Možina, Gašper||05/11/21||08/11/21||10/11/21
|-
| Resnik, Katja||12||Signalna omrežja, ki povzročajo raka||Deutsch, Maja||Sotlar, Pia||05/11/21||08/11/21||10/11/21
|-
| Bohte, Janja||14-15||Vloga in regulacija aerobne glikolize pri hepatocelularnem karcinomu||Valte, David||Mitkov, Kostadin||12/11/21||15/11/21||17/11/21
|-
| Miklošič, Maja||14-15||||Kolar, Alliana||Vukšinić, Ivana||12/11/21||15/11/21||17/11/21
|-
| Kovačić, Marko||14-15||Vloga citokinov poddružine IL-1 pri regulaciji glikolize in njihov vpliv na bolezni, povezane z glikolizo||Glavnik, Hana||Kovač, Ela||12/11/21||15/11/21||17/11/21
|-
| Kolbl, Karidia||14-15||||Štefan, Urša||Vujović, Nataša||12/11/21||15/11/21||17/11/21
|-
| Kos Thaler, Nuša||14-15||||Butara, Tinkara||Sotlar, Špela||12/11/21||15/11/21||17/11/21
|-
| Ažbe, Klara||16||||Špehar, Pia||Trošt, Pia||19/11/21||22/11/21||24/11/21
|-
| Jerič, Sara||16||||Urh, Tina||Maučec, Ana||19/11/21||22/11/21||24/11/21
|-
| Mencin, Pia||16||||Rotar, Andraž||Priveršek, Maj||19/11/21||22/11/21||24/11/21
|-
| Weingerl, Zarja||16||||Starc, Gaja||Spruk, Teja||19/11/21||22/11/21||24/11/21
|-
| Kartal, Ena||16||||Resnik, Katja||Deutsch, Maja||19/11/21||22/11/21||24/11/21
|-
| Struna, Gašper||17||||Bohte, Janja||Valte, David||26/11/21||29/11/21||01/12/21
|-
| Špenko, Andrej||17||||Miklošič, Maja||Kolar, Alliana||26/11/21||29/11/21||01/12/21
|-
| Zevnik, Urša||17||Metabolizem možganskih celic med spanjem||Kovačić, Marko||Glavnik, Hana||26/11/21||29/11/21||01/12/21
|-
| Peternel, Neža||17||||Kolbl, Karidia||Štefan, Urša||26/11/21||29/11/21||01/12/21
|-
| Vidmar, Nik||17||||Kos Thaler, Nuša||Butara, Tinkara||26/11/21||29/11/21||01/12/21
|-
| Trebušak, Jan||18||||Ažbe, Klara||Špehar, Pia||03/12/21||06/12/21||08/12/21
|-
| Kores, Lana||18||||Jerič, Sara||Urh, Tina||03/12/21||06/12/21||08/12/21
|-
| Razdevšek, Miha||18||||Mencin, Pia||Rotar, Andraž||03/12/21||06/12/21||08/12/21
|-
| Javeršek, Tina||18||||Weingerl, Zarja||Starc, Gaja||03/12/21||06/12/21||08/12/21
|-
| Kočman, Klara||18||||Kartal, Ena||Resnik, Katja||03/12/21||06/12/21||08/12/21
|-
| Jošt, Lev||19||||Struna, Gašper||Bohte, Janja||10/12/21||13/12/21||15/12/21
|-
| Razboršek, Klara||19||Regulacija apoptoze v zdravju in bolezni: uravnoteženo delovanje BCL-2 proteinov ||Špenko, Andrej||Miklošič, Maja||10/12/21||13/12/21||15/12/21
|-
| Rapuš, Špela||19||||Zevnik, Urša||Kovačić, Marko||10/12/21||13/12/21||15/12/21
|-
| Mencigar, Maša||19||Reaktivne kisikove zvrsti in njihova vloga pri rakavih obolenjih||Peternel, Neža||Kolbl, Karidia||10/12/21||13/12/21||15/12/21
|-
| Ivošević, Vanja||19||||Vidmar, Nik||Kos Thaler, Nuša||10/12/21||13/12/21||15/12/21
|-
| Kogovšek, Jan||20||Karbonska anhidraza in molekularna evolucija C4 fotosinteze||Trebušak, Jan||Ažbe, Klara||||||
|-
| Brdnik, Nuša||20||||Kores, Lana||Jerič, Sara||||||
|-
| Premrl, Petja||20||||Razdevšek, Miha||Mencin, Pia||||||
|-
| Kavčič, Ema||20||||Javeršek, Tina||Weingerl, Zarja||||||
|-
| Zajec, Tina||20||||Kočman, Klara||Kartal, Ena||||||
|-
| Žnidar, Žan||21||||Jošt, Lev||Struna, Gašper||||||
|-
| Rus, Metka||21||||Razboršek, Klara||Špenko, Andrej||||||
|-
| Loborec, Mark||21||||Rapuš, Špela||Zevnik, Urša||||||
|-
| Kastelic, Ana||21||||Mencigar, Maša||Peternel, Neža||||||
|-
| Možina, Gašper||21||||Ivošević, Vanja||Vidmar, Nik||||||
|-
| Sotlar, Pia||22||||Kogovšek, Jan||Trebušak, Jan||||||
|-
| Mitkov, Kostadin||22||||Brdnik, Nuša||Kores, Lana||||||
|-
| Vukšinić, Ivana||22||||Premrl, Petja||Razdevšek, Miha||||||
|-
| Kovač, Ela||22||||Kavčič, Ema||Javeršek, Tina||||||
|-
| Vujović, Nataša||22||||Zajec, Tina||Kočman, Klara||||||
|-
| Sotlar, Špela||23||||Žnidar, Žan||Jošt, Lev||||||
|-
| Trošt, Pia||23||||Rus, Metka||Razboršek, Klara||||||
|-
| Maučec, Ana||23||||Loborec, Mark||Rapuš, Špela||||||
|-
| Priveršek, Maj||23||||Kastelic, Ana||Mencigar, Maša||||||
|-
| Spruk, Teja||23||||Možina, Gašper||Ivošević, Vanja||||||
|-
| Deutsch, Maja||23||||Sotlar, Pia||Kogovšek, Jan||||||
|}

*številka v okencu za temo pomeni poglavje v Lehningerju, v katerega naj izbrana tema spada
Razporeditev je začasna in se lahko še spremeni, načeloma pa se termini do vključno 18. poglavja ne bodo spreminjali.
Prosim, da mi sporočite morebitne napake ali če vas nisem razporedil.

== Gradivo za predavanja ==
Gradivo za predavanja in seminarje najdete na http://bio.ijs.si/~zajec/bio2/
username: bio2
password: samozame

==Naloga==
'''Vaša naloga za seminar je: '''
Samostojno pripraviti seminar o seminarski temi, ki vam je bila dodeljena. Za osnovo morate vzeti pregledni članek iz revije, ki ima faktor vpliva nad 5 (npr. [http://www.sciencedirect.com/science/journal/09680004/ TIBS]. Poiskati morate še vsaj tri znanstvene članke, ki se nanašajo na opisano temo, in jih uporabiti kot podlago za seminarsko nalogo! Članki so dostopni [https://libgen.is/ tukaj].

Za pripravo seminarja velja naslednje: 
* [[BIO2 Povzetki seminarjev 2021|Povzetek seminarja]] opišete na wikiju '''v 200 besedah''' (+- dvajset besed) - najkasneje do dne, ko morate oddati seminar recenzentom.
* Povezavo do povzetka vnesete v tabelo seminarjev tekočega letnika.
* Seminar pripravite v obliki seminarske naloge na ~5–12 straneh A4 (pisava 12, enojni razmak, 2,5 cm robovi). Obseg seminarja naj bo 2700 do 3000 besed , a ne več kot 3500 besed. Seminarska naloga mora vsebovati najmanj tri slike, bolje več. Eno sliko morate narisati sami in to pod sliko posebej označiti. Slika mora imeti legendo in v besedilu mora biti na ustreznem mestu sklic na sliko. 
* Seminar oddajte do datuma oddaje, ki je naveden v tabeli, v elektronski obliki z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/ tega obrazca].
* Vsi seminarji so v elektronski obliki dostopni [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/bioseminar/ tukaj].
* Recenzenti do dneva, določenega v tabeli, določijo popravke (v elektronski obliki) in podajo oceno pisnega dela. Popravljen seminar oddajte z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/ tega obrazca].
* Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Za predstavitev je na voljo 20–25 minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni.
* Predstavitvi sledi razprava. Recenzenti podajo oceno predstavitve in postavijo najmanj dve vprašanji. Vsi ostali morajo postaviti še dve dodatni vprašanji v okviru celega seminarskega obdobja. Vprašanja, ki ste jih postavili, vpišite na [https://docs.google.com/forms/d/e/1FAIpQLSdV9OFlNzI3XyS8FRGnuIbG89gwH_36uwz29ocigV--2CXSbQ/viewform tukaj].
* Na dan predstavitve morate docentu še pred predstavitvijo oddati končno (popravljeno) in natisnjeno verzijo seminarja v enem izvodu, elektronsko verzijo seminarja in predstavitev pa oddati na strežnik na dan predstavitve do polnoči.
* Seminarska naloga in povzetek morajo biti v slovenskem jeziku, razen za študente, katerih materni jezik ni slovenščina. Ti lahko oddajo seminar v angleškem jeziku.

==Imena datotek==
Prosim vas, da vse datoteke, ki mi jih pošiljate, poimenujete po naslednjem receptu:
* 312_BIO_Priimek_Ime.docx za seminar, npr. 312_BIO_Guncar_Gregor.docx
* 312_BIO_Priimek_ime_final.docx za končno verzijo seminarja
* 312_BIO_Priimek_Ime_rec_Priimek2.docx za recenzijo, kjer je Priimek2 priimek recenzenta, npr. 312_BIO_Guncar_Gregor_rec_Scott.docx (če se pišete Scott in odajate recenzijo za seminar, ki ga je napisal Gunčar)
* 312_BIO_Priimek_Ime.pptx za prezentacijo, npr 312_BIO_Guncar_Gregor.pptx
* 312_BIO_Priimek_ime_poprava.doc(x) za popravljeno končno verzijo seminarja, če so popravki manjši

==Ocenjevanje seminarjev==
Recenzenti ocenijo seminar tako, da izpolnijo [https://docs.google.com/forms/d/1EQDYwFO-DEzZ2R7jf8DhLqIeV4FFxRd3-ScceEASpt4/viewform recenzentsko poročilo] na spletu. Recenzentsko poročilo morate oddati najkasneje do 21:00, en dan pred predstavitvijo seminarja.

== Mnenje o predstavitvi ==
Vsak posameznik odda svoje mnenje o predstavitvi takoj po predstavitvi z online glasovanjem.

==Urejanje spletnih strani na wikiju==
Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje ... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''

==Citiranje virov==
Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se držite ene same. V seminarskih nalogah in diplomskih nalogah FKKT uprabljajte shemo citiranja, ki je pobarvana zeleno.
Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati.
Za citate v naravoslovju je najpogostejše citiranje po pravilniku ISO 690. [http://www.zveza-zotks.si/gzm/dokumenti/literatura.html Pravila], ki upoštevajo omenjeni standard, so pripravili pri ZTKS. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati. 
'''Citiranje knjig:''' 
Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica. 
Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN. 

Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005. 
Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4. 
Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.).

'''Citiranje člankov:''' 
Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani. 
Lartigue, C., Glass, J. I., Alperovich, N., Pieper, R., Parmar, P. P., Hutchison III, C. A., Smith, H. O. in Venter, J. C.
Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, 317, str. 632-638.

Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole: 
Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani. 
Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.

Revija Science uporablja skrajšani zapis: 
C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007) 

V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne). Navesti morate tudi vse avtorje dela, razen v primeru, ko jih je 10 ali več. Takrat navedite le prvih devet, za ostale pa uporabite okrajšavo in sod. (in sodelavci). Pred zadnjim avtorjem naj bo vedno besedica "in".

'''Citiranje spletnih virov:''' 
Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov 
strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life 
Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.

TBK 2022 Povzetki seminarjev

2021-04-08T16:50:56Z

Markokovacic:

=== Magdalena Ilievska:
Spomin brez možganov - Kako enocelični sluzni kalup pametno sprejema odločitve brez centralnega živčnega sistema

Seminarska naloga govori o tem, kako enocelični sluzni kalup Physarum polycephalum pametno sprejema odločitve brez centralnega živčnega sistema. Physarum polycephalum, brezcelični sluzni kalup je protist z različnimi celičnimi oblikami in široko geografsko razširjenostjo. Njegovo telo je ogromna enojna celica, sestavljena iz medsebojno povezanih cevi, ki tvorijo zapletene mreže. V zadnjih letih so raziskave Physarum polycephalum spet postale vrhunske. Leta 2000 je japonski raziskovalec Toshiyuki Nakagaki izvedel osnovni poskus, ki je pokazal, da je sluzni kalup sposoben najti najkrajšo pot skozi labirint. Od takrat se je pametno reševanje problemov Physarum polycephalum vrnilo iz sence in je danes spet v središču, ko se razpravlja o vprašanjih o izvoru inteligence in spoznanja. Raziskovalci na Inštitutu za dinamiko in samoorganizacijo Max-Planck in Tehniški univerzi v Münchnu so ugotovili, kako sluzni kalup Physarum polycephalum ohranja spomine - čeprav nima živčnega sistema. Sposobnost shranjevanja in pridobivanja informacij daje telesu očitno prednost pri iskanju hrane ali pri izogibanju škodljivih okoljih. Tradicionalno se to pripisuje organizmom, ki imajo živčni sistem. Novi študiji avtorjev Mirne Kramar in prof. Karen Alim izzivajo tega stališča z odkrivanjem neverjetnih sposobnosti zelo dinamičnega enoceličnega organizma za shranjevanje in pridobivanje informacij o svojem okolju.

=== Živa Urh: Zmanjšanje transkripcijske aktivnosti povzroči stresno pogojena jedrna kondenzacija NELF ===

V stresnih razmerah celice preklopijo iz običajnega v bolj omejen način delovanja, da se zaščitijo pred poškodbami. Pri tem si pomagajo na različne načine. Eden od načinov je varnostni program imenovan toplotni šok, ki je povezan s hitro regulacijo genske aktivnosti (zmanjšanjem transkripcije) v stresnih situacijah. Stres povzroči nastanek jedrnih kondenzatov NELF, ki nastanejo, ko NELF tvori kapljice. NELF ali negativni podaljševalni dejavnik, je proteinski kompleks iz več podenot, ki se ob jedrnem signalu oblikuje v kondenzate oz. kapljice. Vezava kompleksa NELF na promotorje vzdrževalnih genov je tista, ki povzroči slabšo mobilnost RNA polimeraze II in posledično slabše prepisovanje genov ter tako zmanjša proizvodnjo proteinov, ki niso nujni v stresnih razmerah. Mehanizem nastanka jedrnih kondenzatov je povezan z defosforilacijo NELF in nadaljnjo SUMOilacijo. Ta dva procesa spadata pod posebne post-translacijske modifikacije (PTM), ki so bistvene za kondenzacijo NELF. Pomembno vlogo pri formaciji kondenzatov NELF imajo tudi neurejene regije (IDR), ki jih najdemo pri posameznih podenotah tega proteinskega kompleksa. IDR so deli proteinov brez fiksne strukture in delujejo kot lovke. Povezave med lovkami podenot A in E med so bistvenega pomena za tvorbo kapljic oz. kondenzatov. Celice, ki zaradi pomanjkanja lovk pri podenotah ne tvorijo kondenzatov NELF tudi ne zmanjšajo transkripcije. Posledično take celice normalno prepisujejo gene in so tako bolj dovzetne za celično smrt.

=== Tinkara Butara: Kako rastline zaznajo napad herbivorov ===

Rastline niso nemočni opazovalci dogajanja okoli njih, ampak se na okoliške dražljaje tudi odzivajo. Skozi evolucijo so razvile posebne obrambne mehanizme, ki se sprožijo kot odgovor na elicitorje. Elicitorji so kemijske zvrsti, ki jih lahko izločajo herbivori ali pa rastline same. Te kemijske zvrsti se vežejo na proteinske receptorje na celični membrani in tako sprožijo odziv, na primer na objedanje. Sporočilo o nevarnosti se nato širi do lokalno poškodovanih delov rastline in sistemsko opozarja celotno rastlino na poškodbo. Rastlini lastni elicitorji so najpreprostejši tip, med katerimi je najbolj univerzalen zunajcelični ATP. Primerni elicitorji herbivorov so prebavni encimi v njihovi slini ter konjugati maščobnih kislin in aminokislin. Odziv rastline na napad herbivora pa je lahko povezan tudi s simbiotskimi organizmi herbivora. Ti lahko izločajo snovi s katerimi omogočijo lažji razvoj insekta ali pa s tem pomagajo rastlini. Pomemben sprožilec rastlinskega odziva na herbivore so tudi fizični dražljaji, ki jih ti povzročajo. Pri tem se sproščajo hlapne snovi, ki lahko služijo privabljanju naravnih sovražnikov herbivora ali pa širijo sporočilo o nevarnosti do drugih rastlin. Kot odziv na elicitorje se v večini primerov tvorita rastlinska hormona jasmonska in salicilna kislina, ki sta del obrambnih mehanizmov rastlin. Karakterizacija rastlinskih elicitorjev nam ponuja orodje za razvoj agrokemikalij, ki bodo odganjale herbivore in hkrati ščitile rastline.

=== Pia Špehar: Mehanizem delovanja proteina omogoča odpornost na zdravila proti raku ===

Leta 1986 je celični biokemik Kazumitsu Ueda odkril, da ima protein ABCB1 zmožnost, da iz rakavih celic transportira mnoge kemoterapevtike in tako telesu omogoči odpornost na kemoterapijo. ABCB1 spada med ABC-prenašalce, in sicer je eden izmed tistih prenašalcev, ki iz celic izločajo toksične hidrofobne komponente. Najdemo ga v membranah celic v jetrih, možganih, testisih in placenti. Skoraj 30 let po odkritju funkcije proteina, je Ueda s svojo ekipo lahko določil še mehanizem njegovega delovanja, in sicer z izvedbo več raziskav. Sprva so protein kristalizirali v stanju pred in po transportu substrata ter primerjali stanji med seboj, izvedli pa so tudi analizo s FRET tehniko. Ugotovili so, da substrat vstopi v osrednjo votlino skozi del proteina v notranjosti celice. Nato se veže na vrh osrednje votline proteina, kjer se nahaja hidrofobno aromatsko omrežje, ki ima pomembno vlogo pri prepoznavanju substratov. Vezava substrata na to omrežje sproži konformacijsko spremembo proteina. Za spremembo je potrebna tudi energija, ki jo priskrbi molekula ATP. Vezava ATP-ja sproži tudi nastanek omrežja, ki povzroči, da se protein začne zvijati in obračati, skrči se tudi osrednja votlina proteina. Ko se osrednja votlina skrči, se substrat izloči v zunajcelični prostor. Pri celotnem procesu je pomembna tudi hidroliza ATP, ki služi temu, da se protein vrne nazaj v prvotno stanje.

=== Pia Trošt: Barvna povezava v sposobnosti korale, da preživi višje temperature ===

Zaradi naraščajočega vpliva antropogenih dejavnikov koralni grebeni hitro propadajo in korale se morajo prilagoditi vse bolj stresnemu okolju. Acropora tenuis je ena glavnih vrst koral ob obali Okinave na Japonskem in se pojavlja v treh barvnih različicah (N, G in P), med katerimi je bila opažena različna stopnja beljenja pri povišani temperaturi. Korale živijo v sožitju z algami iz družine Symbiodiniaceae. Pri različicah N in P je bila zaznana zmanjšana fotosintetska aktivnost simbiontov, medtem ko je različica G ohranila aktivnost tudi pri povišani temperaturi. Raziskava je pokazala, da vse barvne različice gostijo isti klad simbiontov, torej različne temperaturne odpornosti ni mogoče pripisati razliki v Symbiodiniaceae. Ker je bil genom A. tenuis dekodiran, je bilo mogoče identificirati gene za fluorescenčne proteine (GFP, CFP, RFP in ChrP). Poletna raziskava profilov izražanja posameznih proteinov je pokazala, da je bilo izražanje CFP in RFP pri vseh različicah nizko, različica P je pokazala višje izražanje ChrP, različica G pa višje izražanje GFP, ki se je ohranilo tudi pri višji temperaturi. Rezultati kažejo, da imajo vse različice enak nabor genov za fluorescenco, torej so barvne različice vzrok različnega izražanja genov FP, ki povečajo odpornost koral proti beljenju.

=== Gašper Struna: Kako sistem toksin-antitoksin vpliva na odpornost bakterij na antibiotike ===

Sistemi toksin-antitoksin (TA) imajo pomembno vlogo v bakterijah. Vplivajo na stabilnost plazmida in imajo pomembno vlogo pri postsegregacijskem propadu. Če plazmida ni, antitoksin ne prepreči delovanja toksina in toksin povzroči propad celice. Poznamo sedem tipov TA sistemov, med katerimi je najpogostejši tip II. Pri tem tipu antitoksin prepreči delovanje toksina tako, da se močno veže nanj in s tem inhibira njegovo delovanje. TA sistem tipa II najdemo tudi v bakteriji Pseudoaltermonas rubra, in sicer je ta TA sistem predstavnik para ParE/PF03693. V raziskavi so ugotovili, da antitoksin (PrpA) iz tega para zmanjša delovanje toksina na več načinov, in sicer tako da se neposredno veže na toksin ali pa se veže na promotor TA operona in deluje kot represor. PrpA ima pomembno vlogo tudi pri replikaciji, saj se lahko veže na podobno mesto kot iniciatorski protein RepB in s tem onemogoči začetek replikacije. PrpA ima na N-koncu vezavno mesto za DNA, s C-koncem pa interagira s toksinom, je tudi labilen, vezava na toksin pa ga stabilizira. Pari ParE/PF03693 so tudi v nekaterih virulentnih bakterijah in njihova nadaljnja študija bi lahko pripomogla k boljšemu razumevanju odpornosti bakterij na antibiotike in njihovem virulentnem delovanju.

=== Nuša Kos Thaler: Hitra evolucija litičnih genov v enoverižnih RNA bakteriofagih ===

Levivirusi so bakteriofagi z majhnim enoverižnim RNA genomom, ki ga sestavljajo 3–4 geni. Eden od njih je gen ''sgl'' (ang. single gene lysis), ki kodira protein za sprožitev avtolize gostiteljske celice in sprostitev virionov. Za razliko od dvoverižnih DNA bakteriofagov, ki encimsko razgradijo peptidoglikan (glavno enoto celične stene bakterijskih celic), protein Sgl pri lizi po navadi deluje kot nekompetitivni inhibitor in preprečuje njegov nastanek. Geni ''sgl'' so zelo majhni, raznoliki in pogosto vstavljeni v druge gene, zaradi česar jih težko odkrijemo. V nedavnih raziskavah so našli več deset tisoč genomov levivirusov, ki jih pred kratkim še nismo poznali. V določenih so odkrili gene ''sgl'' in preizkušali njihovo aktivnost na ''E. coli'' ter ugotovili, da lahko hitro ustvarijo gen ''sgl''. Bazna zaporedja najdenih genov ''sgl'' imajo zelo malo ali celo nobene podobnosti z baznimi zaporedji že preučevanih genov ''sgl''. V genomu posameznega bakteriofaga se lahko pojavlja več genov ''sgl'', kar pomeni, da bi lahko levivirusi hkrati okužili in lizirali celice evolucijsko oddaljenih bakterijskih vrst. Zaradi svoje raznolikosti, hitre evolucije in zmožnosti spreminjanja so potencialni vir za razvoj proteinskih antibiotikov in fagne terapije.

=== Nataša Vujović: How HER2 positive breast cancer cells evade treatments that utilize T cells ===

Immunotherapy continues to show exciting promise in more effectively treating cancer especially hematologic malignancies but they have not proven effective in treating solid tumors. The T lymphocyte is of key importance to the immune system and is at the core of adaptive immunity. Their roles include directly killing infected host cells, activating other immune cells, producing cytokines and regulating the immune response. Global research efforts centering on T cell-engaging therapies like T-cell bispecific antibodies (TCBs) and chimeric antigen receptors (CARs), are conducted in hope of finding a more effective treatment for cancer. TCBs are typically designed to bind to a selected tumor-associated antigen and to a T cell receptor (TCR). CAR T cells are T cells that have been genetically engineered to produce an artificial T cell receptor for use in immunotherapy. Researchers have now found a novel mechanism of resistance to T cell therapies used by HER2 positive breast cancer cells. The resistance is obtained by disruption of interferon-gamma signaling. IFN-γ has a critical role in recognizing and eliminating pathogens. The disruption of its pathways happens by JAK2 down-modulation. The kinase JAK2 transduces the signal initiated by interferon-gamma. JAK2 was shown to be repeatedly disrupted in several resistant models.

=== Urša Zevnik: FOXO3, gen, povezan z dolgoživostjo, ščiti možganske matične celice pred stresom ===

Forkhead box O3 (FOXO3) je protein, ki sodeluje pri številnih procesih, ki podaljšujejo življenjsko dobo in zavirajo s starostjo povezane bolezni. Ugotovili so, da imajo posamezniki z določeno različico tega gena kar trikrat večjo možnost, da dočakajo sto let.
Ena izmed njegovih funkcij je tudi obramba nevralnih matičnih celic pred oksidativnim stresom. V oksidirajočih pogojih v celici pride do oksidacije cisteina na FOXO3, kar prepreči njegovo fosforilacijo. Tak protein se transportira v jedro, kjer deluje kot transkripcijski faktor. Med drugim poveča prepisovanje encima glicin-N-metiltransferaze (GNMT), ki katalizira reakcijo, pri kateri se porablja S-adenozil metionin (SAM). SAM kot metilni donor omogoča dozoritev jedrnih laminov, ker pa je zaradi več GNMT njegova razpoložljivost manjša, lamini ne dozorijo pravilno in se združujejo v skupke. To privede do prepustnosti jedrne membrane, iz jedra uhajajo fragmenti DNA, celica jih zamenja za virusne nukleotide in sproži interferonski odziv tipa I. Ta povzroči, da nevralne matične celice preidejo v dormantno stanje in se prenehajo deliti. To je ugodno, saj nevroni, nastali v stresnih razmerah, nebi preživeli, celice pa bi se pri delitvah izčrpavale. Tkivo bi torej prej izgubilo sposobnost obnavljanja in se prej postaralo.

=== Sara Borišek: Dieta z visoko vsebnostjo maščob lahko prekomerno aktivira destruktivni protein NOX-2 ===

Debelost je prisotna pri ljudeh že od nekdaj, v zadnjih letih pa je odstotek debelosti pri ljudeh kar precej narasel, predvsem pri mladih, s tem pa so narasle tudi zdravstvene težave ljudi s prekomerno težo. Predvsem je z debelostjo asociirana prehrana, ki vsebuje velik delež maščob ta pa s srčnimi obolenji. V ospredju je hipertrofija levega srčnega prekata, ki je eno izmed glavnih srčnih obolenj in povečuje tveganje za smrt. Hipertrofija levega prekata je zgostitev in povečanje sten levega prekata. Vse več pozornosti zato dobiva NADPH oksidaza 2 ali NOX-2, ki ima zaradi svojega vpliva na oksidativno škodo, povzročeno s prehrano, glavno vlogo pri ustvarjanju bioaktivnega superoksida. Znanstveniki so v raziskavi, ki je potekala na Šoli za biološko znanost Univerze v Readingu preverili ali obstaja povezava med proteinom NOX-2 in prehrano, ki vsebuje visok odstotek maščob pri hipertrofiji levega prekata. Trenutne ugotovitve so, da prehrana z visoko vsebnostjo maščob povzroči oksidativni stres, ki ga nadzira protein NOX-2, kar podpira hipertrofijo levega srčnega prekata. Zanimanje za selektivno ciljanje na protein NOX-2 kot terapevtsko strategijo je naraslo, zato so v raziskavi predlagali specifično ciljanje aktivacije srčnega proteina NOX-2, ki bi lahko bil izvedljiv pristop k ohranjanju funkcije miokarda v presnovnih pogojih.

=== Nika Ferk: Formulacije na osnovi biomaterijalov za boj proti virusnim nalezljivim boleznim ===

V seminarski nalogi si bomo podrobneje pogledali kako se človeštvo in današnja znanost spopadata z izzivi patogenih delcev in boleznimi, ki jih le te povzročajo. Z nalezljivo kužnimi boleznimi se človeštvo soča že od nekdaj. Skozi razvijanje tehnologij smo ustvarili cepiva. Običajno se klasična cepiva, pridobljena iz živih oslabljenih patogenov in inaktiviranih virusov, rekombinantnih proteinov in sintetičnih peptidov. S cepivi v telesu povzročimo imunski odziv in nastanek protiteles. Skozi napredovanje tehnologije, natančneje biotehnologije in nanotehnologije so na trg prišli biomateriali. Biomateriali imajo dober potencial za boj proti kužnim boleznim, predvsem zaradi njihovih lasnosti kot so: oblike in značilnosti površine, ki skupaj močno vplivajo na učinkovit način prenosa delcev. Še pomembneje pa je, da biomateriali omogočajo dostavo antigenov in imunsko stimulirajočih snovi, ki predstavljajo močan pristop cepljenja pri aktivaciji imunskih odzivov. Same pa lahko tudi vplivajo na zaščito materiala, ki ga nosijo in s tem lahko podaljšajo sproščanje. Raziskani in najbolj potencialni biomaterijali so sintetični in naravni polimerni delci, lipidi, samosestavljeni proteini, virusom podobni delci (VPD) in anorganski delci. Eden izmed najbolj uspešnejših biološko razgradljivih biomaterijalov je PLGA ali poli(mlečno-ko-glikolna kislina). Poleg kisline so bili tudi zelo uspešni anorganski nano delci, formulirani so bili kot sistem za dajenje cepiv zaradi njihovih ustreznih fiziokemijskih lastnosti.

=== Špela Rapuš: Kako mikobakterije tvorijo membranske vezikle ===

Mikobakterije sicer uvrščamo med Grampozitivne bakterije, vendar imajo precej bolj zapleteno celično ovojnico. Ta sestoji iz notranje membrane, sloja peptidoglikana in dodatne mikomembrane, v kateri so značilne mikolične kisline. Odkrili so, da te bakterije tvorijo membranske vezikle na dva različna načina, odvisno od zunanjih pogojev, katerim so podvržene. Če mikobakterijo izpostavimo poškodovanju DNA se bo sprožil proces, angl. bubbling cell death, pri katerem se bodo tvorili membranski vezikli iz notranje membrane. Če pa bakterijo izpostavimo stresu na celično ovojnico, se ta odzove s procesom imenovanim angl. mycomembrane blebbing, pri katerem se iz mikomembrane odcepljajo vezikli. Kot modelni organizem so pri raziskavi uporabili Corynebacterium glutamicum in jo izpostavili mitomicinu C, ki je induciral stres na DNA in penicilinu G oz. deficitu biotina, ki sta zavirala biosintezo celične stene. Pri tem so se tvorili membranski vezikli na različne načine. Preučili so tudi lipidno sestavo membranskih veziklov in z rezultati skušali dokazati njihov izvor. Do podobnih ugotovitev pa so prišli tudi pri nekaterih drugih mikobakterijah. Membranski vezikli so izrednega pomena v proizvodnji cepiv in antibiotikov, zato so njihova dognanja velikega pomena.

=== Leila Bohorč: Dokaz o obstoju različnih mehanizmov delovanja majhnih molekul, ki inhibirajo vstop filovirusov v celico ===

Virusa ebola in Marburg spadata v družino filovirusov, ki veljajo za ene najnevarnejših patogenov na svetu. Za vstop v celice uporabljajo mehanizem, ki je posredovan z enim samim glikoproteinom na površini virusa. Odkritih je bilo že mnogo potencialnih inhibitorjev, a je ravno visoka smrtnost eden izmed razlogov za slabo poznavanje mehanizmov. Majhne molekule, ki lahko inhibirajo vstop filovirusov v celico, so lahko že odobrena zdravila, ki se sicer uporabljajo pri zdravljenju drugih bolezni. Na glikoproteinu virusa ebola je primarno vezavno mesto hidrofoben žep na območju notranje fuzijske zanke. Dve izmed številnih molekul, ki se lahko vežejo tja, sta ospemifen in toremifen, ki se razlikujeta le v stranski verigi. Toremifen se lahko zaradi bazične aminske funkcionalne skupine akumulira tudi v lizosomih, kar poveča njegovo učinkovitost. Dimetilaminska stranska veriga na tej molekuli pa nima posebne vloge pri direktni vezavi molekule na hidrofoben žep. Na glikoproteinu ebole obstaja še sekundarno vezavno mesto na območju domene HR2. Na bazični žep v tej regiji se vežejo le specifične molekule kot sta fluoksetin in toremifen. Ti molekuli proti eboli delujeta sinergično, proti Marburgu pa antagonistično. Na glikoproteinu virusa Marburg je domena HR2 primarno vezavno mesto.

=== Ivana Vukšinić: Sekvestracija žvepla v času pomanjkanja hranil pospeši nastanek mnogoceličnega organizma ===

Ko je v okolju na voljo dovolj hranil, gliva sluzavka vrste Dictyostelium discoideum obstaja v obliki enoceličnega organizma, ob morebitnem nastopu stradanja pa se posamezne celice začnejo združevati in tvorijo agregat, ki se obnaša kot mnogoceličen organizem. Med kulminacijo se iz njega razvije sorokarp s sporangijem, v katerem se tvorijo spore, ki populaciji omogočijo preživetje neugodnih razmer. To sposobnost uravnava novo odkrit mehanizem, s katerim od žvepla odvisno metabolično stikalo narekuje celično diferenciacijo. V času pomanjkanja hranil pride do porasta reaktivnih kisikovih spojin (ROS), ki so v velikih količinah celici škodljive, kar privede do velike potrebe po sintezi antioksidanta glutationa (GSH). To povzroči sekvestracijo cisteina, enega izmed prekurzorjev GSH, kar omeji razpoložljivost te aminokisline za potrebe drugih procesov v celici. Cistein je namreč ena od le dveh aminokislin, ki vsebujeta žveplo, to pa ima med drugim pomembno vlogo pri sintezi večine proteinov in železo-žveplovih klastrov, ki so ključne funkcionalne skupine v metaboličnih encimih. Izkazalo se je, da sekvestracija žvepla upočasni sintezo proteinov, inhibira proliferacijo celic in tako utira pot mnogoceličnemu razvoju. Izsledke raziskave bi lahko uporabili pri preučevanju drugih proliferacijskih celic, kot so rakave celice, pri katerih bi ciljanje procesov žveplovega metabolizma lahko izboljšalo protitumorno imunost.

=== Primož Šenica Pavletič: Nov način preprečevanja širjenja malarije z gensko spremenjenimi komarji ===

Malarija je bolezen, ki vsako leto prizadene na milijone ljudi v najrevnejših državah sveta. Bolezen povzroči parazit plazmodij, glavni prenašalci pa so komarji. Za zdravljenje in preprečevanje bolezni obstaja kar nekaj zdravil, vendar so ta za večino ljudi, ki živijo v državah v razvoju nedostopna. Ena najboljših rešitev za zajezitev bolezni je genska modifikacija malaričnih komarjev. Številne študije nakazujejo na veliko učinkovitost nadzorovanja populacije z genskim inženiringom. V raziskavah so komarjem vstavili gen za rezistenco na parazit ali pa so z vstavljenimi geni povzročili zmanjšanje celotne populacije. To pomeni širjenje genov, ki povzročajo pristransko razmerje med spoloma (več moških osebkov), oziroma širjenje genov, ki bi naredili samice neplodne. Glavni cilj je preprečiti ženskim osebkom prenašati parazit plazmodij na gostitelja in s tem širiti bolezen. Za spremembo DNA se uporablja tehnika CRISPR-Cas9S. S CRISPR-Cas9S lahko spremenimo genom na kateremkoli mestu. Znanstveniki so povečali možnost, da se želena lastnost prenese na naslednje generacije tako, da so uporabili gene drive. Gene drive spodbudi celico, da prepiše želeni del gena na homologni kromosom. Gene drive je zelo učinkovit, saj se je v 5 – 7 generacijah (odvisno od števila osebkov, ki so imeli gene drive že od začetka) razširil na več kot 95% populacije.

=== Lana Bajec: Inhibicija encima 15-PGDH pomlajuje mišice in povečuje mišično moč ===

Med staranjem so skeletne mišice podvržene strukturnim in funkcijskim spremembam. Po 50. letu starosti ljudje povprečno začnejo izgubljati 15 – 30 % mišične mase na desetletje, kar se kaže kot drastična izguba mišične moči. Ta mišična distrofija in izguba moči je znana kot sarkopenija. Sarkopenija je posledica krčenja mišičnih vlaken in upadanja števila in zmogljivosti mitohondrijev v celicah mišičnih vlaken, ki mišici zagotavljajo energijo. Raziskovalci na Stanford University Shool of Medicine so s pomočjo inhibicije proteina 15-PGDH v starejših miših dosegli obnovo mišične mase in moči v mišicah živali ter njihovo vzdržljivost, kar bi lahko igralo veliko vlogo pri potencialni strategiji zdravljenja sarkopenije pri ljudeh. V mišicah starejših miših inhibicija encima 15-PGDH s tako imenovanim genetskim knockdownom ali pa z inhibitorjem SW preprečuje atrofijo mišic in znatno poveča mišično maso, moč in vzdržljivost. Dokazali so, da ima molekukla 15-PGDH velik vpliv na mišično funkcijo. Miši z inhibiranim encimom 15-PGDH so bile zmožne dalj časa teči na tekalni stezi in bile nasplošno bolj vzdržljive. Velik vpliv na to naj bi imelo znatno povečanje števila mitohondrijev in njihovih funkcij ter izboljšanje celične avtofagije pri inhibiciji encima 15-PGDH.

=== Pia Sotlar: Zdravljenje s sistemom za urejanje genoma, ki temelji na metodi CRISPR, uničuje rakave celice ===

CRISPR-Cas9 je metoda, ki lahko z uporabo encima Cas9 in sgRNA permanentno uniči točno določene gene, kar predstavlja potencialen način za zdravljenje raka. V rakavi celici bi tako izbris oziroma motnja v genu PLK1, ki nosi zapis za kinazo PLK1, ki je ključna pri procesu mitoze, povzročila celično smrt v delečih se celicah. V raziskavi so se lotili problema dostave velikega encima Cas9 in sgRNA. Nov način dostave, ki ga ne omejujeta toksičnost in majhna nosilnost so klinično odobreni nanodelci, ki zaradi svoje kationske narave omogočajo učinkovito zajemanje nukleinske kisline. Dokazali so da z uporabo le-teh lahko dosežejo učinkovito urejanje genoma tako in vitro kot in vivo. Pri tem so se osredotočili na urejanje genoma pri celicah GBM 005, izoliranih iz gliomov, in celični liniji adenokarcinoma jajčnikov (OV8). In vitro inkubacija je pri teh celičnih linijah povzročila 84 oziroma 91% genomskega urejanja. Pri sistemu in vivo, so bili te procenti malce nižji (68%), zato so za potrebe sistemskega doziranja razvili tudi sistemsko injicirane lipidne nanodelce, ki so bili premazani s protitelesi in so zagotavljali še bolj učinkovit privzem kinaze Cas9 in sgRNA. Taki tarčni lipidni nanodelci so omogočali 82% urejanje genoma in povečali preživetje miši za 80%. S tem so dokazali učinkovitost lipidnih nanodelcev za prenos in predstavili novo metoda zdravljenja raka.

=== Zarja Weingerl: Odkritje novih malih proteinov v Salmonelli in njihov vpliv na bakterijsko virulenco ===

Mali proteini so proteini sestavljeni iz manj kot 100 amonokislin. So skupina še zelo neraziskanih struktur z zelo raznolikimi vlogami v fiziologiji bakterij. Znanstveniki so se odločili podrobneje raziskati njihovo funkcijo znotraj Sallmonele Typhimurium. Želeli so odkriti ORFje (odprte bralne okvirje) sedaj še nepoznanih in nedoločenih malih proteinov. Pri tem so uporabili mnogo različnih orodji in znanstvenih metod, kot so: sPepFinder, Ribo-seq, TraDIS, Grad-seq, prenos western itd. Pridobili so 139 različnih sORF kandidatov, ki so jih poimenovali kot STsORF, čemur sledi še zaporedno število. Vseh 139 novo odkritih STsORFjev so dodali v zapis Salmonelle in tako število malih proteinov znotraj tega dvignili na 609 vnosov. Dodatno so raziskali 16 na novo odkritih STsORFjev, ki sta jih predvidela tako sPepFinder kot tudi Ribo-seq. Raziskali so tudi vpliv malih proteinov na virulentnost Salmonelle. Opazovali so izražanje sORFjev med infekcijo in ga primerjali z njihovo izraženostjo v vcepku. Ker se je v teh raziskavah mnogokrat pojavil protein MgrB so želeli dodatno proučiti njegov vpliv na virulentnost in prišli do njegove povezave z bičkom in geni povezani z gibljivostjo. Njegovo pomankanje namreč povzroči defekt v gibljivosti, ki je posledica motnje uravnavanja bička.

=== Teja Spruk: Bakterije, odporne na antibiotike: Fluorid kot rešitev ===
Zaradi vedno večje uporabe antibiotikov v medicinske in znanstvene namene, je odpornost nanje vedno večji problem. V naravnem okolju je vedno večja prisotnost antibiotikov in mikrobov, ki so nanje odporni, kar je posledica njihove uporabe pri selekciji v laboratorijih. Ta poteka tako, da celicam, za katere hočejo, da preživijo, vstavijo gen za odpornost na določen antibiotik. Nato jih dajo na gojišče s tem antibiotikom in tako preživijo le zaželene celice, ostale odmrejo. A vendar je veliko organizmov razvilo sistem, kako obiti naše antibiotike in tako je problem vedno večji. V raziskavi so razvili preprosto in učinkovito metodo za odpravo prekomerne uporabe le teh ter za omejevanje gensko spremenjenih organizmov. Ta zahteva zamenjavo antibiotikov v laboratoriju s fluoridom, ki je strupen za mikroorganizme. Ti so razvili gen FEX (angl. fluoride exporter) za zaščito celic z odstranjevanjem fluorida, ki ga najdemo v naravnem okolju. Raziskovalci so zato odstranili gen FEX in tako povzročili neodpornost na fluorid. GSO bi seveda v laboratoriju še vedno uspeval, saj tam uporabljajo destilirano vodo. Če pa bi ušel v naravo, bi umrl takoj, ko bi naletel na fluorid in s tem bi se preprečilo nadaljnje razmnoževanje.

=== Metka Rus: Zdravljenje motenj metabolizma lipidov in previsokega holesterola z genskim spreminjanjem na osnovi lipidnih nanodelcev ===
Cilj članka je optimizacija in testiranje lipidnega nanodelca, uporabljenega kot vektor za prenos sistema CRISPR-Cas9 v hematocite v jetrih. Sistem CRISPR-Cas9 je orodje za gensko spreminjanje v živih organizmih. V tem primeru je tarča genskega inženiringa gen Angptl3, ki kodira encim Angptl3. Ta encim vpliva na količino trigliceridov in holesterola v celicah, saj inhibira encim protein lipazo, ki le te razgrajuje. Z genskim inženiringom torej želimo doseči mutacijo na genu, ki bi zmanjšala koncentracijo encima Angptl3 in posledično zmanjšala koncentracijo holesterola in trigliceridov. Seveda pa ima sistem CRISPR-Cas9 svoja tveganja, na katera pa lahko delno vplivamo z vektorjem ki sistem prenaša do ciljne točke. Pojavlja se tveganje za mutacije v napačnih celicah in na napačnih lokusih, velik izziv pa je tudi doseči dovoljšno učinkovitost sistema oziroma doseči, da sistem res pride do cilja (v tem primeru do DNKja v hepatocitah). Vektorji za to nalogo že obstajajo a imajo veliko pomanjkljivosti. Primer je vektor MC-3, ki je že odobren s strani FDA. Dana raziskava skuša optimizirati in testirati lipidni nanodelec z osnovnim lipidoidom v ovojnici 306-O12B. Delovanje tega delca primerjajo z delovanjem delca MC-3 in izkaže se, da je tako specifičnost kot učinkovitost nanodelca z lipidoidom 306-O12B večja.

=== Pia Mencin: Povečana afiniteta hemoglobina do kisika ter okrepljen Bohrov učinek sta posledica prilagoditve pingvinov na vodno okolje===
Pingvini so razvili številne prilagoditve na vodno okolje, saj je to okolje v katerem si lovijo hrano. Daljši čas potopa pingvinom, poleg številnih drugih prilagoditev, omogočata povišana afiniteta hemoglobina (Hb) do kisika (O2) in okrepljen Bohrov učinek (tj. zmanjšana afiniteta Hb do O2 pri nizkem pH). Natančneje funkcionalno spremenjen Hb pingvinov omogoča da povečajo ekstrakcijo O2 iz pljuč in razkladanje O2 iz krvi, to jim zagotavlja da učinkoviteje izkoristijo svoje zaloge O2 vdihnjenega zraka in povečajo čas podvodnega iskanja hrane. Do tega odkritja so znanstveniki prišli s primerjavo Hb pingvinov in Hb najbližjih sorodnih organizmov pingvinov, ki se ne potapljajo. Rekonstruirali so Hb pingvinom najbližjega skupnega prednika (AncSphen) ter Hb starejšega prednika (AncPro), ki so si ga delili pingvini z njihovimi najbližjimi sorodniki, ki se ne potabljajo. S primerjavo prej omenjenih Hb so dokazali, da je prišlo do povečanja afinitete Hb do O2 in okrepljenega Bohrovega učinka pri pingvinih in ne do zmanjšanja afinitete ter poslabšanja Bohrovega učinka pri pingvinom sorodnim organizmom, ki se ne potapljajo. To dokazuje da se je spremenjena funkcija Hb pingvinov razvila kot posledica prilagoditve na vodno okolje. Raziskave so tudi pokazale da so funkcionalne spremembe v Hb pingvinov posledica večkratnih substitucij aminokislin, ki ustvarjajo interakcije med podenotami in stabilizirajo R-stanje Hb.

=== Ana Maučec: Retrovirusne integracije v genom zarodnih celic prispevajo k povišani verjetnosti za razvoj raka pri gostitelju ===
Endogeni retrovirusni elementi so prisotni v genomu večine sesalcev in predstavljajo ostanke okužb zarodnih celic z eksogenimi virusi pred več milijoni let. Številne raziskave so retroviruse povezale z razvojem različnih rakavih obolenj pri sesalcih. Z evolucijskih razvojem gostitelja so se spreminjali tudi endogeni virusi, zato je neposredne škodljive učinke na gostiteljev genom, kot so moteno in prekomerno izražanje genov, težko zaznati. Retrovirus koal (KoRV) je trenutno edini znani virus, ki prehaja med eksogeno in endogeno obliko. Gre za zapleten proces, ki vključuje kopičenje mutacij v virusnem nukleotidnem zaporedju in rekombinacijo. Skozi veliko generacij postanejo endogeni retrovirusi fiksirani in neaktivni. Zaradi nadpovprečne pojavnosti raka v populaciji koal iz severne Avstralije, so znanstveniki predpostavili povezavo med malignimi obolenji in KoRV. V vzorcih desetih koal so v zdravem in tumorskem tkivu določili lokacijo in število integracijskih mest (IM) endogenih retrovirusov. V izbranih genih blizu IM so zaznali moteno izražanje genov in njihovo večjo ekspresijo. Največjo gostoto IM so zaznali v bližini onkogenov in predvidevajo, da večja transkripcijska aktivnost teh genov olajša integracije virusov na teh mestih. Retrovirusne »invazije« genomov sesalcev imajo na začetku številne škodljive posledice za gostitelje, a so skozi zgodovino pomembno prispevale k oblikovanju njihovih genomov, tudi človekovega.

=== Neža Peternel: Prehrana lahko spremeni proces trimetilacije H3K4 v semenčicah in posledično vpliva na izražanje fenotipa pri potomcih ===
Znano je, kako se različne bolezni in deformacije lahko dedujejo preko genskega zapisa, v zadnjih desetletjih pa se veliko raziskav ukvarja s tematiko prenosa epigenetskih informacij na potomce. Epigenetske spremembe so za razliko od genskih reverzibilne in ne posegajo v zapis DNA, temveč z različnimi označevalci vplivajo na specifično izražanje genov. Trimetilacija lizina 4 na histonski podenoti 3 (H3K4me3) je bila v semenčicah identificirana kot pomemben člen pri prenosu informacij na potomce, saj naj bi se izognila epigenetskemu reprogramiranju pred vgnezditvijo zarodka. V nedavnih raziskavah so ugotovili, da lahko pomanjkanje folata v prehrani privede do motenj v folatnem ciklu, kar posredno vpliva na procese metilacije in demetilacije. Abnormalnosti v vzorcih metilacije so bile prisotne predvsem blizu področij, kjer se nahajajo geni za pravilno izgradnjo kosti, tako pri očetu kot tudi pri potomcih, posledice pa so se kazale pri izražanju fenotipa potomcev. Pomanjkanje folata v kombinaciji s povečano ekspresijo gena za KDM1A je privedlo do še hujših deformacij. Kot možno razlago izognitve reprogramiranja H3K4me3 so navedli pogosto sovpadanje trimetiliziranih območij H3K4 z regijami za vezavo proteinov Smc1 in CTCF. S študijo so odgovorili na mnoga vprašanja v zvezi z mehanizmi epigenetskega dedovanja, hkrati pa odprli možnosti za nadaljnjo raziskovanje, predvsem glede popravljalnih mehanizmov, ki bi lahko preprečili prenos določenih epigenetskih vzorcev na potomce.

=== Zoran Džon Ivanić: Reprogramiranje za povrnitev mladostne epigenetske informacije in vida ===
Epigenom med drugim tvorijo tudi vzorci metilacije DNA, ki opredeljujejo identiteto celice in njeno funkcijo. Informacijska teorija staranja razlaga staranje kot izgubo epigenetske informacije kamor spada sprememba vzorcev metilacije. Raziskovalce zanima, ali je s povrnitvijo mladostnega vzorca metilacije v organizmu mogoče doseči regeneracijo. Z uporabo transkripcijskih faktorjev Yamanake OCT4, SOX2 in KLF4 (OSK) so uspešno pomladili genetsko aktivnost v fibroblastu stare miši. Na modelu poškodbe vidnega živca v miši pa je izraženje OSK omogočilo regeneracijo in proliferacijo aksonov. Poškodba živca spremeni metilacijo DNA na podoben način kot staranje. To spremembo OSK prepreči s povečanjem količine TET1 in TET2, encimov, ki katalizirata demetilacijo DNA. Preizkus OSK pri zdravljenju modela glavkoma pri miših je pokazal spodbudne rezultate. Glavkom je obolenje oči, za katero je značilno povečanje tlaka v očesu, izguba ganglijskih celic mrežnice (RGC) in aksonov v vidnem živcu. Izražanje OSK je povrnilo gostoto aksonov nazaj na zdrav nivo, kar je bilo zaznati v izboljšanju ostrine vida osebkov. Med vzroki za slabši vid je tudi staranje. Zdravljenje starih miši z OSK je slab vid popravilo. Pri tem je bilo odkrito, da se nivoji mRNA 464 genov s staranjem spremenijo, 90% teh pa se s pomočjo izražanja OSK povrne v mladostno stanje. Tako je z OSK mogoče pomladiti kompleksno tkivo in povrniti njegovo funkcijo.

=== Nik Vidmar: Molekularne superstrukture zmožne vstopati v nevrone in aktivirati nevronske receptorje ===
Z hitrim staranjem prebivalstva po svetu se pojavlja vedno večje število degenerativnih obolenj, ki pa predstavljajo tako ekonomsko kot druženo obremenitev. Zato je veliko poudarka v znanstvenem svetu na alternativnih metodah regenerativne medicine, ki bodo lahko v prihodnosti pomagale pri zdravljenju in preprečevanju degenerativnih obolenj. Veliko pozornosti je bilo v zadnjih letih posvečene raziskovanju proteinskih molekularnih superstruktur predvsem takih, kjer prevladujejo gostitelj-gost interakcije. V raziskavi so raziskovali potencialne aplikacije gostitelj-gost kompleksa med β-ciklodekstrinom in adamantanom na peptidnih amfifilih in ugotavljali kako je ta hidrogel vplival na aktivnost možganskih nevronov. Izkazalo se je, da je raziskovan biomaterial ugodno vplival na aktivacijo nevronov in da so se ti dobro razraščali skozi porozni gel. Raziskovali so tudi možnosti 3D tiskanja gela in uspeli najti ugodno metodo, ki ni imela negativnega vpliva na sam gel ali njegove interakcije z nevroni. Rezultati so pokazali, da bo verjetno mogoče v prihodnosti z različnimi biomaterijali zdraviti poškodbe živčnega sistema in degenerativne bolezni, saj bodo ti pomagali pri obnavljanju nevronov in spodbudili njihovo aktivnost.

=== Marko Kovačić: Neselektivna avtofagija pospeši prilagajanje kvasovk Saccharomyces cerevisiae na aerobno dihanje v nefermentacijskem mediju ===
Raziskovalci s Tokijskega tehnološkega inštituta (Tokyo Tech) na Japonskem in univerze Monash v Avstraliji so se ukvarjali z vprašanjem, kako se uporabljajo metaboliti, pridobljeni v procesu avtofagije. Preučevali so rast kvasovk Saccharomyces Cerevisiae v glukoznem in etanolskem mediju. Po prenosu iz glukoznega v etanolski medij so kvasovke za pridobivanje energije namesto vrenja začele opravljati aerobno mitohondrijsko dihanje. Znanstveniki so ugotovili, da se mutirane kvasovke, ki niso sposobne opravljati neselektivne avtofagije, dlje prilagajajo na aerobno dihanje kot kvasovke, ki so zmožne opravljati avtofagijo. Z dodajanjem različnih hranil so ugotovili, da je aminokislina serin pomembna pri začetnem prilagajanju kvasovk na aerobno rast. Ob pomanjkanju aminokisline serin je bila poraba kisika v mitohondrijih nizka, ob dodatku serina pa se je le-ta povečala. Serin je pomemben za enoogljični metabolizem v mitohondrijih, ker zagotavlja enoogljično enoto, ki jo sprejme tetrahidrofolat (THF). Po sprejemu enoogljične enote se THF vključi v enoogljični metabolizem. Vezavo formilne skupine, pridobljene iz reakcij v enoogljičnem metabolizmu, na Met-tRNAfMet(iniciacijska tRNA) katalizira encim Fmt1. Formilacija iniciacijske tRNA poveča njeno afiniteto do mitohondrijskega iniciacijskega faktorja 2 (mIF2), ki je ključen pri povezovanju mitohondrijskih ribosomov, mRNA in fMet-tRNAfMet, torej pri procesu sinteze proteinov v mitohondrijih. Le-ti so ključni za pridobivanje energije z aerobnim dihanjem in za rast kvasovk.

Temelji biokemije 2023 - seminar

2021-04-08T14:54:25Z

Markokovacic:

[http://www.example.com link title]= Temelji biokemije- seminar =

Seminarje vodi prof. dr. Brigita Lenarčič. Seminarji so obvezni.

Ocena seminarjev (6-10) predstavlja enako število odstotkov, ki se prišteje h končni pisni oceni izpita.
Stran na strežniku s seminarskimi nalogami je zaščitena.
Uporabniško ime je: tbk, password pa: samozame## "##" sta dve številki, ki ju izveste na predavanjih.
Tudi za urejanje Wiki strani potrebujete geslo, ki se od zgornjega razlikuje. Postopek pridobitve Wiki uporabniškega imena in gesla je opisan [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Main_Page tukaj].

== Seznam seminarjev ==

{| {{table}}
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Ime in priimek'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Naslov seminarja'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Povezava'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Rok za oddajo'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Rok za recenzijo'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Datum predstavitve'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 1'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 2'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 3'''
|-
| Anna Scott||Moj naslov v slovenščini||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/02/190214100038.htm||05.03.||08.03.||11.03.||r1||r2||r3
|-
| Gašper Struna||Kako sistem toksin-antitoksin vpliva na odpornost bakterij na antibiotike ||https://www.sciencedaily.com/releases/2021/02/210201144911.htm||05.03.||08.03.||11.03.||David Valte||Klara Kolenc||Boštjan Kramberger
|-
| Pia Špehar||Mehanizem delovanja proteina omogoča odpornost na zdravila proti raku||https://www.sciencedaily.com/releases/2020/12/201229080253.htm||05.03.||08.03.||11.03.||Sofija Stevanović||Gaja Starc||Nuša Brdnik
|-
| Tinkara Butara||Kako rastline zaznajo napad herbivorov||https://www.sciencedaily.com/releases/2021/02/210216133437.htm||05.03.||08.03.||11.03.||Klara Ažbe||Mark Loborec||Ema Kavčič
|-
| Pia Trošt||Barvna povezava v sposobnosti korale, da preživi višje temperature||https://www.sciencedaily.com/releases/2021/02/210221154616.htm||05.03.||08.03.||11.03.||Mia Kobal||Vanja Ivošević||Urša Štefan
|-
| Živa Urh||Zmanjšanje transkripcijske aktivnosti povzroči stresno pogojena jedrna kondenzacija NELF ||https://www.sciencedaily.com/releases/2021/02/210210170104.htm||05.03.||08.03.||11.03.||Andraž Rotar||Petja Premrl||Maj Priveršek
|-
| Urša Zevnik||FOXO3, gen povezan z dolgoživostjo, ščiti možganske matične celice pred stresom||https://www.sciencedaily.com/releases/2021/02/210219155903.htm||12.03.||15.03.||18.03.||Gašper Struna||David Valte||Klara Kolenc
|-
| Nika Ferk||Formulacije na osnovi biomaterialov za boj proti virusnim nalezljivim boleznim||https://www.sciencedaily.com/releases/2021/02/210209113902.htm||12.03.||15.03.||18.03.||Pia Špehar||Sofija Stevanović||Gaja Starc
|-
| Nataša Vujović||Kako se HER2 pozitivne celice raka dojk izognejo terapijam, ki vključujejo T celice||https://www.sciencedaily.com/releases/2021/02/210223135516.htm
||12.03.||15.03.||18.03.||Tinkara Butara||Klara Ažbe||Mark Loborec
|-
| Thaler Nuša Kos||Hitra evolucija litičnih genov v enoverižnih RNA bakteriofagih||https://www.sciencedaily.com/releases/2021/02/210205121236.htm||12.03.||15.03.||18.03.||Pia Trošt||Mia Kobal||Vanja Ivošević
|-
| Sara Borišek||Dieta z visoko vsebnostjo maščob lahko prekomerno aktivira destruktivni protein NOX-2||https://www.sciencedaily.com/releases/2021/03/210302075358.htm||12.03.||15.03.||18.03.||Živa Urh||Andraž Rotar||Petja Premrl
|-
| Lana Bajec||Inhibicija encima 15-PGDH pomlajuje mišice in povečuje mišično moč ||https://www.sciencedaily.com/releases/2020/12/201210145751.htm||19.03.||22.03.||25.03.||Urša Zevnik||Gašper Struna||David Valte
|-
| Leila Bohorč||Dokaz o obstoju različnih mehanizmov delovanja majhnih molekul, ki inhibirajo vstop filovirusov v celico||https://www.sciencedaily.com/releases/2021/02/210208134421.htm||19.03.||22.03.||25.03.||Nika Ferk||Pia Špehar||Sofija Stevanović
|-
| Špela Rapuš||Kako mikobakterije tvorijo membranske vezikle||https://www.sciencedaily.com/releases/2021/01/210114163907.htm||19.03.||22.03.||25.03.||Nataša Vujović||Tinkara Butara||Klara Ažbe
|-
| Pavletič Primož Šenica||Nov način preprečevanja širjenja malarije z gensko spremenjenimi komarji||https://www.sciencedaily.com/releases/2020/11/201103140613.htm||19.03.||22.03.||25.03.||Thaler Nuša Kos||Pia Trošt||Mia Kobal
|-
| Ivana Vukšinić||Sekvestracija žvepla v času pomanjkanja hranil pospeši nastanek mnogoceličnega organizma||https://www.sciencedaily.com/releases/2021/02/210224143527.htm||19.03.||22.03.||25.03.||Ela Kovač||Živa Urh||Andraž Rotar
|-
| Zarja Weingerl||Odkritje novih malih proteinov v Salmonelli in njihov vpliv na bakterijsko virulenco||https://www.sciencedaily.com/releases/2020/12/201216104643.htm||26.03.||29.03.||01.04.||Lana Bajec||Urša Zevnik||Gašper Struna
|-
| Teja Spruk||Bakterije, odporne na antibiotike: Fluorid kot rešitev||https://www.sciencedaily.com/releases/2021/01/210104141521.htm||26.03.||29.03.||01.04.||Leila Bohorč||Nika Ferk||Pia Špehar
|-
| Magdalena Ilievska||Spomin brez možganov - Kako enocelični sluzni kalup pametno sprejema odločitve brez centralnega živčnega sistema. ||https://www.sciencedaily.com/releases/2021/02/210223121643.htm||26.03.||29.03.||01.04.||Špela Rapuš||Nataša Vujović||Tinkara Butara
|-
| Metka Rus||Gensko spreminjanje jetrnih celic s pomočjo proteinskih nanodelcev z namenom zniževanja holesterola||https://www.sciencedaily.com/releases/2021/03/210301151545.htm||26.03.||29.03.||01.04.||Pavletič Primož Šenica||Thaler Nuša Kos||Pia Trošt
|-
| Pia Sotlar||Zdravljenje s sistemom za urejanje genoma, ki temelji na metodi CRISPR, uničuje rakave celice||https://www.sciencedaily.com/releases/2020/11/201118161129.htm||26.03.||29.03.||01.04.||Ivana Vukšinić||Ela Kovač||Živa Urh
|-
| Nik Vidmar||Molekularne superstrukture zmožne vstopati v nevrone in aktivirati nevronske receptorje||https://www.sciencedaily.com/releases/2021/02/210223110435.htm||02.04.||05.04.||08.04.||Zarja Weingerl||Lana Bajec||Urša Zevnik
|-
| Ana Maučec||Retrovirusne integracije v genom zarodnih celic prispevajo k povišani verjetnosti za razvoj raka pri gostitelju||https://www.sciencedaily.com/releases/2021/02/210226103805.htm||02.04.||05.04.||08.04.||Teja Spruk||Leila Bohorč||Nika Ferk
|-
| Neža Peternel||Prehrana lahko spremeni proces trimetilacije H3K4 v semenčicah in posledično vpliva na izražanje fenotipa pri potomcih||https://www.sciencedaily.com/releases/2021/03/210316132129.htm||02.04.||05.04.||08.04.||Magdalena Ilievska||Špela Rapuš||Nataša Vujović
|-
| Zoran Džon Ivanić||Reprogramiranje za povrnitev mladostne epigenetske informacije in vida||https://www.sciencedaily.com/releases/2020/12/201202114531.htm||02.04.||05.04.||08.04.||Metka Rus||Pavletič Primož Šenica||Thaler Nuša Kos
|-
| Pia Mencin||Povečana afiniteta hemoglobina do kisika ter okrepljen Bohrov učinek sta posledica prilagoditve pingvinov na vodno okolje||https://www.sciencedaily.com/releases/2021/03/210323103854.htm||02.04.||05.04.||08.04.||Pia Sotlar||Ivana Vukšinić||Ela Kovač
|-
| Marko Kovačić||Neselektivna avtofagija pospeši prilagajanje kvasovk Saccharomyces cerevisiae na aerobno dihanje v nefermentacijskem mediju ||https://www.sciencedaily.com/releases/2020/12/201210112157.htm||09.04.||12.04.||15.04.||Nik Vidmar||Zarja Weingerl||Lana Bajec
|-
| Karidia Kolbl||Mutacija na genu RORB pri zajčji vrsti "''sauteur d'alfort''" povzroča okvaro v gibanju||https://www.sciencedaily.com/releases/2021/03/210325150205.htm||09.04.||12.04.||15.04.||Ana Maučec||Teja Spruk||Leila Bohorč
|-
| Klara Razboršek||Kako molekularni šaperoni Hsp70 raztapljajo proteinske agregate, povezane s Parkinsonovo boleznijo||https://www.sciencedaily.com/releases/2020/11/201111122815.htm||09.04.||12.04.||15.04.||Neža Peternel||Magdalena Ilievska||Sara Borišek
|-
| Katja Resnik||||https://www.sciencedaily.com/releases/2020/10/201022151749.htm||09.04.||12.04.||15.04.||Zoran Džon Ivanić||Metka Rus||Pavletič Primož Šenica
|-
| Simona Kocheva||||https://www.sciencedaily.com/releases/2021/01/210130092739.htm||09.04.||12.04.||15.04.||Pia Mencin||Pia Sotlar||Ivana Vukšinić
|-
| Miha Razdevšek||Epigenetske spremembe povezane z Alzheimerjevo boleznijo||https://www.sciencedaily.com/releases/2020/09/200928152907.htm||16.04.||19.04.||22.04.||Marko Kovačić||Nik Vidmar||Zarja Weingerl
|-
| Janja Bohte||Visokoločljivostno kvantitativno profiliranje številčnosti in modificiranosti tRNA z mim-tRNAseq ||https://www.sciencedaily.com/releases/2021/02/210226140455.htm||16.04.||19.04.||22.04.||Karidia Kolbl||Ana Maučec||Teja Spruk
|-
| Tea Amidović||||https://www.sciencedaily.com/releases/2021/03/210310122521.htm||16.04.||19.04.||22.04.||Klara Razboršek||Neža Peternel||Magdalena Ilievska
|-
| Patricija Kolander||||||16.04.||19.04.||22.04.||Katja Resnik||Zoran Džon Ivanić||Metka Rus
|-
| Lev Jošt||||||16.04.||19.04.||22.04.||Simona Kocheva||Pia Mencin||Pia Sotlar
|-
| Tina Zajec||||https://www.sciencedaily.com/releases/2021/03/210317141631.htm||30.04.||03.05.||06.05.||Miha Razdevšek||Marko Kovačić||Nik Vidmar
|-
| Tina Urh||||||30.04.||03.05.||06.05.||Janja Bohte||Karidia Kolbl||Ana Maučec
|-
| Žan Žnidar||||||30.04.||03.05.||06.05.||Tea Amidović||Klara Razboršek||Neža Peternel
|-
| Boštjan Kramberger||||https://www.nature.com/articles/s41467-021-21185-5?fbclid=IwAR2jbjZ3amUYlXu2j8l94OQTS7ram6kTx9ZRekmN6ncmNCUyjsRuV3DF0mk||30.04.||03.05.||06.05.||Patricija Kolander||Katja Resnik||Zoran Džon Ivanić
|-
| Nuša Brdnik||||||30.04.||03.05.||06.05.||Lev Jošt||Simona Kocheva||Pia Mencin
|-
| Ema Kavčič||||||07.05.||10.05.||13.05.||Tina Zajec||Miha Razdevšek||Marko Kovačić
|-
| Urša Štefan||||||07.05.||10.05.||13.05.||Tina Urh||Janja Bohte||Karidia Kolbl
|-
| Maj Priveršek||||||07.05.||10.05.||13.05.||Žan Žnidar||Tea Amidović||Klara Razboršek
|-
| Klara Kolenc||||||07.05.||10.05.||13.05.||Boštjan Kramberger||Patricija Kolander||Katja Resnik
|-
| Gaja Starc||||||07.05.||10.05.||13.05.||Nuša Brdnik||Lev Jošt||Simona Kocheva
|-
| Mark Loborec||||||14.05.||17.05.||20.05.||Ema Kavčič||Tina Zajec||Miha Razdevšek
|-
| Vanja Ivošević||||||14.05.||17.05.||20.05.||Urša Štefan||Tina Urh||Janja Bohte
|-
| Petja Premrl||||||14.05.||17.05.||20.05.||Maj Priveršek||Žan Žnidar||Tea Amidović
|-
| David Valte||||||14.05.||17.05.||20.05.||Klara Kolenc||Boštjan Kramberger||Patricija Kolander
|-
| Sofija Stevanović||||||14.05.||17.05.||20.05.||Gaja Starc||Nuša Brdnik||Lev Jošt
|-
| Klara Ažbe||||||21.05.||24.05.||27.05.||Mark Loborec||Ema Kavčič||Tina Zajec
|-
| Mia Kobal||||||21.05.||24.05.||27.05.||Vanja Ivošević||Urša Štefan||Tina Urh
|-
| Andraž Rotar||||||21.05.||24.05.||27.05.||Petja Premrl||Maj Priveršek||Žan Žnidar
|-
| Ela Kovač||Veganska prehrana pri otrocih preoblikuje metabolizem in vpliva na zmanjšan nivo esencialnih hranil||https://www.sciencedaily.com/releases/2021/01/210121132300.htm||21.05.||24.05.||27.05.||Sara Borišek||Špela Rapuš||Tinkara Butara
|-}

==Naloga==
* samostojno pripraviti seminar, katerega tema je novica iz področja biokemije na portalu [http://www.sciencedaily.com ScienceDaily], ki je bila objavljena kasneje kot 1. avgusta 2020. Osnova za seminar naj bo znanstveni članek, ki je podlaga za to novico. Poleg tega članka za seminar uporabite še najmanj pet drugih virov, od teh vsaj še dva druga znanstvena članka, ki se navezujeta na to vsebino.
* članke na temo lahko iščete [https://scholar.google.com/ z Google učenjakom].
* naslov izbrane teme in povezavo do novice vpišite v tabelo seminarjev takoj ko ste si izbrali temo, najkasneje pa en teden pred rokom za oddajo
* [[TBK2021 Povzetki seminarjev|Povzetek seminarja]] opišete na wikiju v približno 200 besedah - najkasneje do dne, ko morate oddati seminar recenzentom.
* Povezavo do povzetka vnesete v tabelo seminarjev tekočega letnika.
* Seminar pripravite v obliki seminarske naloge (pisava Cambria, font 11, enojni razmak, 2,5 cm robovi; tekst naj obsega okoli 1000 besed), vsebuje naj 1-2 sliki. Slika mora imeti legendo in v besedilu mora biti na ustreznem mestu sklic na sliko. Vse uporabljene vire citirajte v tekstu, kot npr. (Nobel, 2010), na koncu pa navedite točen seznam literature, kot je opisano spodaj!
*Celotni seminar naj obsega 2 strani A4 formata (po možnosti dvostransko tiskanje).
* Seminar oddajte do datuma oddaje, ki je naveden v tabeli v elektronski obliki z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/tbk/poslji/ tega obrazca].
* vsi seminarji so v elektronski obliki dostopni [http://bio.ijs.si/~zajec/tbk/poslji//bioseminar/ tukaj].
* Recenzenti do dneva določenega v tabeli določijo popravke in podajo oceno pisnega dela, v predpisanem formatu elektronskega obrazca na internetu.
* Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Za predstavitev je na voljo 10 minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni. Prvi recenzent vodi predstavitve in razpravo ter skrbi za to, da vse poteka v zastavljenih časovnih okvirih.
* Predstavitvi sledi razprava do 5 minut. Sledijo vprašanja prisotnih, recenzenti postavijo vsak vsaj dve vprašanji in na koncu podajo oceno predstavitve.
* En dan pred predstavitvijo na strežnik oddajte tudi končno verzijo. Na dan predstavitve morate oddati tudi končno (popravljeno) in natisnjeno verzijo seminarja v enem izvodu.
* Seminarska naloga in povzetek na wikiju morajo biti v slovenskem jeziku!

==Imena datotek==
Prosim vas, da vse datoteke, ki jih pošiljate, poimenujete po spodnjih pravilih. Ne uporabljajte ČŽŠčžš!
Poslati morate naslednje datoteke:
* TBK_2021_Priimek_Ime.doc(x) za seminar, npr. TBK_2021_Guncar_Gregor.docx
* TBK_2021_Priimek_ime_final.doc(x) za končno verzijo seminarja
* TBK_2021_Priimek_Ime_rec_Priimek2.doc(x) za recenzijo, kjer je Priimek2 priimek recenzenta, npr. TBK_2021_Guncar_Gregor_rec_Scott.docx (če se pišete Scott in odajate recenzijo za seminar, ki ga je napisal Gunčar)
* TBK_2021_Priimek_Ime.pdf za prezentacijo (PowerPoint -> Shrani kot PDF), npr TBK_2021_Guncar_Gregor.pdf
* TBK_2021_Priimek_Ime_clanek.pdf za datoteko PDF, ki vsebuje izvirni članek, npr. TBK_2021_Guncar_Gregor_clanek.pdf

==Ocenjevanje seminarjev==
Recenzenti ocenijo seminar tako, da izpolnijo [[https://docs.google.com/forms/d/1Hdg2OHCyG24qwLTnFt09yZTng46RIwaIiUqnKOdsJxQ/viewform recenzentsko poročilo]] na spletu.

== Mnenje o predstavitvi ==
Vsak posameznik '''mora''' oceniti seminar tako, da odda svoje [https://docs.google.com/forms/d/1VvE-jaKikfiDO5Gdybqgp9mf_0uJZfBbIK8PLXKDaS0/viewform mnenje] najkasneje v enem tednu po predstavitvi. Kdor na seminarju ni bil prisoten, mnenja '''ne sme''' oddati.

==Urejanje spletnih strani na wikiju==
Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''

==Faktor vpliva==
Faktor vpliva (angl. impact factor) neke revije pove, kolikokrat so bili v poprečju citirani članki v tej reviji v dveh letih skupaj pred objavo tega faktorja. Faktorje vpliva za posamezno revijo lahko najdete v [http://www.cobiss.si/scripts/cobiss?command=CONNECT&base=JCR COBISS-u]. V polje "Naslov revije" vnesite ime revije, za katero želite izvedeti faktor vpliva, in pritisnite na gumb POIŠČI. V skrajnem desnem stolpcu se bodo izpisali faktorji vpliva za revije, ki ustrezajo vašim iskalnim kriterijem. Zadetkov za posamezno revijo je več zato, ker so navedeni faktorji vpliva za posamezno leto. Za tekoče leto faktorji vpliva še niso objavljeni, zato se orientirajte po faktorjih vpliva zadnjih par let. Če faktorja vpliva za vašo izbrano revijo ne najdete v bazi COBISS, potem izberite članek iz kakšne druge revije.

==Citiranje virov==
Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se v seminarju držite ene same. Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati. '''Citiranje knjig:''' Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica. Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN. Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005. Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4. Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.). '''Citiranje člankov:''' Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani. Lartigue C. ''et al''. Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, letn. 317, str. 632-638.Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole: Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani. Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.Revija Science uporablja skrajšani zapis: C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007) V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne). '''Citiranje spletnih virov:''' Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.

Temelji biokemije 2023 - seminar

2021-03-06T14:58:09Z

Markokovacic: /* Seznam seminarjev */

[http://www.example.com link title]= Temelji biokemije- seminar =

Seminarje vodi prof. dr. Brigita Lenarčič. Seminarji so obvezni.

Ocena seminarjev (6-10) predstavlja enako število odstotkov, ki se prišteje h končni pisni oceni izpita.
Stran na strežniku s seminarskimi nalogami je zaščitena.
Uporabniško ime je: tbk, password pa: samozame## "##" sta dve številki, ki ju izveste na predavanjih.
Tudi za urejanje Wiki strani potrebujete geslo, ki se od zgornjega razlikuje. Postopek pridobitve Wiki uporabniškega imena in gesla je opisan [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Main_Page tukaj].

== Seznam seminarjev ==

{| {{table}}
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Ime in priimek'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Naslov seminarja'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Povezava'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Rok za oddajo'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Rok za recenzijo'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Datum predstavitve'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 1'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 2'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 3'''
|-
| Anna Scott||Moj naslov v slovenščini||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/02/190214100038.htm||05.03.||08.03.||11.03.||r1||r2||r3
|-
| Gašper Struna||Kako sistem toksin-antitoksin vpliva na odpornost bakterij na antibiotike ||https://www.sciencedaily.com/releases/2021/02/210201144911.htm||05.03.||08.03.||11.03.||David Valte||Klara Kolenc||Boštjan Kramberger
|-
| Pia Špehar||Mehanizem delovanja proteina omogoča odpornost na zdravila proti raku||https://www.sciencedaily.com/releases/2020/12/201229080253.htm||05.03.||08.03.||11.03.||Sofija Stevanović||Gaja Starc||Nuša Brdnik
|-
| Tinkara Butara||Kako rastline zaznajo napad herbivorov||https://www.sciencedaily.com/releases/2021/02/210216133437.htm||05.03.||08.03.||11.03.||Klara Ažbe||Mark Loborec||Ema Kavčič
|-
| Pia Trošt||Barvna povezava v sposobnosti korale, da preživi višje temperature||https://www.sciencedaily.com/releases/2021/02/210221154616.htm||05.03.||08.03.||11.03.||Mia Kobal||Vanja Ivošević||Urša Štefan
|-
| Živa Urh||Zmanjšanje transkripcijske aktivnosti povzroči stresno pogojena jedrna kondenzacija NELF ||https://www.sciencedaily.com/releases/2021/02/210210170104.htm||05.03.||08.03.||11.03.||Andraž Rotar||Petja Premrl||Maj Priveršek
|-
| Urša Zevnik||Gen za dolgoživost ščiti možganske matične celice pred stresom||https://www.sciencedaily.com/releases/2021/02/210219155903.htm||12.03.||15.03.||18.03.||Gašper Struna||David Valte||Klara Kolenc
|-
| Nika Ferk||Formulacije in površine na osnovi biomaterialov za boj proti virusnim nalezljivim boleznim||https://www.sciencedaily.com/releases/2021/02/210209113902.htm||12.03.||15.03.||18.03.||Pia Špehar||Sofija Stevanović||Gaja Starc
|-
| Nataša Vujović||Nov mehanizem odpornosti celica raka dojke HER2 na T-celična bispecifična protitelesa in CAR-T||https://www.sciencedaily.com/releases/2021/02/210223135516.htm
||12.03.||15.03.||18.03.||Tinkara Butara||Klara Ažbe||Mark Loborec
|-
| Thaler Nuša Kos||Evolucija litičnih genov v enoverižnih RNA bakteriofagih||https://www.sciencedaily.com/releases/2021/02/210205121236.htm||12.03.||15.03.||18.03.||Pia Trošt||Mia Kobal||Vanja Ivošević
|-
| Sara Borišek||||https://www.sciencedaily.com/releases/2021/03/210302075358.htm||12.03.||15.03.||18.03.||Živa Urh||Andraž Rotar||Petja Premrl
|-
| Lana Bajec||||||19.03.||22.03.||25.03.||Urša Zevnik||Gašper Struna||David Valte
|-
| Leila Bohorč||||https://www.sciencedaily.com/releases/2021/02/210208134421.htm||19.03.||22.03.||25.03.||Nika Ferk||Pia Špehar||Sofija Stevanović
|-
| Špela Rapuš||||https://www.sciencedaily.com/releases/2021/01/210114163907.htm||19.03.||22.03.||25.03.||Nataša Vujović||Tinkara Butara||Klara Ažbe
|-
| Pavletič Primož Šenica||||||19.03.||22.03.||25.03.||Thaler Nuša Kos||Pia Trošt||Mia Kobal
|-
| Ivana Vukšinić||Vpliv metabolizma žvepla na razvoj mnogoceličnih organizmov||https://www.sciencedaily.com/releases/2021/02/210224143527.htm||19.03.||22.03.||25.03.||Ela Kovač||Živa Urh||Andraž Rotar
|-
| Zarja Weingerl||||||26.03.||29.03.||01.04.||Lana Bajec||Urša Zevnik||Gašper Struna
|-
| Teja Spruk||||||26.03.||29.03.||01.04.||Leila Bohorč||Nika Ferk||Pia Špehar
|-
| Magdalena Ilievska||||||26.03.||29.03.||01.04.||Špela Rapuš||Nataša Vujović||Tinkara Butara
|-
| Metka Rus||||||26.03.||29.03.||01.04.||Pavletič Primož Šenica||Thaler Nuša Kos||Pia Trošt
|-
| Pia Sotlar||Zdravljenje s sistemom za urejanje genoma, ki temelji na metodi CRISPR, uničuje rakave celice||https://www.sciencedaily.com/releases/2020/11/201118161129.htm||26.03.||29.03.||01.04.||Ivana Vukšinić||Ela Kovač||Živa Urh
|-
| Nik Vidmar||||||02.04.||05.04.||08.04.||Zarja Weingerl||Lana Bajec||Urša Zevnik
|-
| Ana Maučec||||https://www.sciencedaily.com/releases/2021/02/210226103805.htm||02.04.||05.04.||08.04.||Teja Spruk||Leila Bohorč||Nika Ferk
|-
| Neža Peternel||||||02.04.||05.04.||08.04.||Magdalena Ilievska||Špela Rapuš||Nataša Vujović
|-
| Zoran Džon Ivanić||Reprogramiranje za povrnitev mladostne epigenetske informacije in povrnitev vida||https://www.sciencedaily.com/releases/2020/12/201202114531.htm||02.04.||05.04.||08.04.||Metka Rus||Pavletič Primož Šenica||Thaler Nuša Kos
|-
| Pia Mencin||||||02.04.||05.04.||08.04.||Pia Sotlar||Ivana Vukšinić||Ela Kovač
|-
| Marko Kovačić||Vpliv avtofagije na prilagajanje celic drugačnim okoljskim razmeram||https://www.sciencedaily.com/releases/2020/12/201210112157.htm||09.04.||12.04.||15.04.||Nik Vidmar||Zarja Weingerl||Lana Bajec
|-
| Karidia Kolbl||||||09.04.||12.04.||15.04.||Ana Maučec||Teja Spruk||Leila Bohorč
|-
| Klara Razboršek||||https://www.sciencedaily.com/releases/2020/11/201111122815.htm||09.04.||12.04.||15.04.||Neža Peternel||Magdalena Ilievska||Sara Borišek
|-
| Katja Resnik||||||09.04.||12.04.||15.04.||Zoran Džon Ivanić||Metka Rus||Pavletič Primož Šenica
|-
| Simona Kocheva||||||09.04.||12.04.||15.04.||Pia Mencin||Pia Sotlar||Ivana Vukšinić
|-
| Miha Razdevšek||Epigenetske spremembe povezane z Alzheimerjevo boleznijo||https://www.sciencedaily.com/releases/2020/09/200928152907.htm||16.04.||19.04.||22.04.||Marko Kovačić||Nik Vidmar||Zarja Weingerl
|-
| Janja Bohte||||https://www.sciencedaily.com/releases/2021/03/210305123802.htm||16.04.||19.04.||22.04.||Karidia Kolbl||Ana Maučec||Teja Spruk
|-
| Tea Amidović||||||16.04.||19.04.||22.04.||Klara Razboršek||Neža Peternel||Magdalena Ilievska
|-
| Patricija Kolander||||||16.04.||19.04.||22.04.||Katja Resnik||Zoran Džon Ivanić||Metka Rus
|-
| Lev Jošt||||||16.04.||19.04.||22.04.||Simona Kocheva||Pia Mencin||Pia Sotlar
|-
| Tina Zajec||||||30.04.||03.05.||06.05.||Miha Razdevšek||Marko Kovačić||Nik Vidmar
|-
| Tina Urh||||||30.04.||03.05.||06.05.||Janja Bohte||Karidia Kolbl||Ana Maučec
|-
| Žan Žnidar||||||30.04.||03.05.||06.05.||Tea Amidović||Klara Razboršek||Neža Peternel
|-
| Boštjan Kramberger||||https://www.nature.com/articles/s41467-021-21185-5?fbclid=IwAR2jbjZ3amUYlXu2j8l94OQTS7ram6kTx9ZRekmN6ncmNCUyjsRuV3DF0mk||30.04.||03.05.||06.05.||Patricija Kolander||Katja Resnik||Zoran Džon Ivanić
|-
| Nuša Brdnik||||||30.04.||03.05.||06.05.||Lev Jošt||Simona Kocheva||Pia Mencin
|-
| Ema Kavčič||||||07.05.||10.05.||13.05.||Tina Zajec||Miha Razdevšek||Marko Kovačić
|-
| Urša Štefan||||||07.05.||10.05.||13.05.||Tina Urh||Janja Bohte||Karidia Kolbl
|-
| Maj Priveršek||||||07.05.||10.05.||13.05.||Žan Žnidar||Tea Amidović||Klara Razboršek
|-
| Klara Kolenc||||||07.05.||10.05.||13.05.||Boštjan Kramberger||Patricija Kolander||Katja Resnik
|-
| Gaja Starc||||||07.05.||10.05.||13.05.||Nuša Brdnik||Lev Jošt||Simona Kocheva
|-
| Mark Loborec||||||14.05.||17.05.||20.05.||Ema Kavčič||Tina Zajec||Miha Razdevšek
|-
| Vanja Ivošević||||||14.05.||17.05.||20.05.||Urša Štefan||Tina Urh||Janja Bohte
|-
| Petja Premrl||||||14.05.||17.05.||20.05.||Maj Priveršek||Žan Žnidar||Tea Amidović
|-
| David Valte||||||14.05.||17.05.||20.05.||Klara Kolenc||Boštjan Kramberger||Patricija Kolander
|-
| Sofija Stevanović||||||14.05.||17.05.||20.05.||Gaja Starc||Nuša Brdnik||Lev Jošt
|-
| Klara Ažbe||||||21.05.||24.05.||27.05.||Mark Loborec||Ema Kavčič||Tina Zajec
|-
| Mia Kobal||||||21.05.||24.05.||27.05.||Vanja Ivošević||Urša Štefan||Tina Urh
|-
| Andraž Rotar||||||21.05.||24.05.||27.05.||Petja Premrl||Maj Priveršek||Žan Žnidar
|-
| Ela Kovač||||||21.05.||24.05.||27.05.||Sara Borišek||Špela Rapuš||Tinkara Butara
|-}

==Naloga==
* samostojno pripraviti seminar, katerega tema je novica iz področja biokemije na portalu [http://www.sciencedaily.com ScienceDaily], ki je bila objavljena kasneje kot 1. avgusta 2020. Osnova za seminar naj bo znanstveni članek, ki je podlaga za to novico. Poleg tega članka za seminar uporabite še najmanj pet drugih virov, od teh vsaj še dva druga znanstvena članka, ki se navezujeta na to vsebino.
* članke na temo lahko iščete [https://scholar.google.com/ z Google učenjakom].
* naslov izbrane teme in povezavo do novice vpišite v tabelo seminarjev takoj ko ste si izbrali temo, najkasneje pa en teden pred rokom za oddajo
* [[TBK2021 Povzetki seminarjev|Povzetek seminarja]] opišete na wikiju v približno 200 besedah - najkasneje do dne, ko morate oddati seminar recenzentom.
* Povezavo do povzetka vnesete v tabelo seminarjev tekočega letnika.
* Seminar pripravite v obliki seminarske naloge (pisava Cambria, font 11, enojni razmak, 2,5 cm robovi; tekst naj obsega okoli 1000 besed), vsebuje naj 1-2 sliki. Slika mora imeti legendo in v besedilu mora biti na ustreznem mestu sklic na sliko. Vse uporabljene vire citirajte v tekstu, kot npr. (Nobel, 2010), na koncu pa navedite točen seznam literature, kot je opisano spodaj!
*Celotni seminar naj obsega 2 strani A4 formata (po možnosti dvostransko tiskanje).
* Seminar oddajte do datuma oddaje, ki je naveden v tabeli v elektronski obliki z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/tbk/poslji/ tega obrazca].
* vsi seminarji so v elektronski obliki dostopni [http://bio.ijs.si/~zajec/tbk/poslji//bioseminar/ tukaj].
* Recenzenti do dneva določenega v tabeli določijo popravke in podajo oceno pisnega dela, v predpisanem formatu elektronskega obrazca na internetu.
* Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Za predstavitev je na voljo 10 minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni. Prvi recenzent vodi predstavitve in razpravo ter skrbi za to, da vse poteka v zastavljenih časovnih okvirih.
* Predstavitvi sledi razprava do 5 minut. Sledijo vprašanja prisotnih, recenzenti postavijo vsak vsaj dve vprašanji in na koncu podajo oceno predstavitve.
* En dan pred predstavitvijo na strežnik oddajte tudi končno verzijo. Na dan predstavitve morate oddati tudi končno (popravljeno) in natisnjeno verzijo seminarja v enem izvodu.
* Seminarska naloga in povzetek na wikiju morajo biti v slovenskem jeziku!

==Imena datotek==
Prosim vas, da vse datoteke, ki jih pošiljate poimenujete po spodnjih pravilih. Ne uporabljajte ČŽŠčžš!
Poslati morate naslednje datoteke:
* TBK_2021_Priimek_Ime.doc(x) za seminar, npr. TBK_2021_Guncar_Gregor.docx
* TBK_2021_Priimek_ime_final.doc(x) za končno verzijo seminarja
* TBK_2021_Priimek_Ime_rec_Priimek2.doc(x) za recenzijo, kjer je Priimek2 priimek recenzenta, npr. TBK_2021_Guncar_Gregor_rec_Scott.docx (če se pišete Scott in odajate recenzijo za seminar, ki ga je napisal Gunčar)
* TBK_2021_Priimek_Ime.ppt(x) za prezentacijo, npr TBK_2021_Guncar_Gregor.pptx
* TBK_2021_Priimek_Ime_clanek.pdf za datoteko PDF, ki vsebuje izvirni članek, npr. TBK_2021_Guncar_Gregor_clanek.pdf

==Ocenjevanje seminarjev==
Recenzenti ocenijo seminar tako, da izpolnijo [[https://docs.google.com/forms/d/1Hdg2OHCyG24qwLTnFt09yZTng46RIwaIiUqnKOdsJxQ/viewform recenzentsko poročilo]] na spletu.

== Mnenje o predstavitvi ==
Vsak posameznik '''mora''' oceniti seminar tako, da odda svoje [https://docs.google.com/forms/d/1VvE-jaKikfiDO5Gdybqgp9mf_0uJZfBbIK8PLXKDaS0/viewform mnenje] najkasneje v enem tednu po predstavitvi. Kdor na seminarju ni bil prisoten, mnenja '''ne sme''' oddati.

==Urejanje spletnih strani na wikiju==
Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''

==Faktor vpliva==
Faktor vpliva (angl. impact factor) neke revije pove, kolikokrat so bili v poprečju citirani članki v tej reviji v dveh letih skupaj pred objavo tega faktorja. Faktorje vpliva za posamezno revijo lahko najdete v [http://www.cobiss.si/scripts/cobiss?command=CONNECT&base=JCR COBISS-u]. V polje "Naslov revije" vnesite ime revije za katero želite izvedeti faktor vpliva in pritisnite na gumb POIŠČI. V skrajnem desnem stolpcu se bodo izpisali faktorji vpliva za revije, ki ustrezajo vašim iskalnim kriterijem. Zadetkov za posamezno revijo je več zato, ker so navedeni faktorji vpliva za posamezno leto. Za tekoče leto faktorji vpliva še niso objavljeni, zato se orientirajte po faktorjih vpliva zadnjih par let. Če faktorja vpliva za vašo izbrano revijo ne najdete v bazi COBISS, potem izberite članek iz kakšne druge revije.

==Citiranje virov==
Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se v seminarju držite ene same. Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati. '''Citiranje knjig:''' Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica. Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN. Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005. Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4. Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.). '''Citiranje člankov:''' Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani. Lartigue C. ''et al''. Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, letn. 317, str. 632-638.Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole: Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani. Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.Revija Science uporablja skrajšani zapis: C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007) V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne). '''Citiranje spletnih virov:''' Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.