Wiki FKKT - User contributions [en]

Oblikovanje sintetičnega faga iz P. aeruginosa z reduciranim genomom

2021-05-16T21:02:13Z

Martina Lokar: /* Karakterizacija rekombinantnih bakteriofagov */

Povzeto po članku: [https://doi.org/10.1038/s41598-021-81580-2 D.P. Pires, R. Monteiro, D. Mil-Homens ''et al'': Designing ''P. aeruginosa'' synthetic phages with reduced genomes. ''Sci. Rep.'' '''2021''', 11(1), str. 1-10. https://doi.org/10.1038/s41598-021-81580-2]

===Uvod===
Odpornost bakterij na antibiotike postaja vedno večji problem, zato se v zadnjem času kot potencialna terapevtska učinkovina preučujejo tudi bakteriofagi. Kljub temu da je fagna terapija obetaven način zdravljenja, se sooča s številnimi izzivi, kot so varnost, stabilnost in način dostave učinkovine, sposobnost bakteriofagov, da lahko okužijo omejeno število gostiteljskih bakterij, odpornost na bakteriofage ter stranski učinki zaradi lize bakterijskih celic. Ena izmed potencialnih rešitev nekaterih izmed teh omejitev je oblikovanje genetsko spremenjenih bakteriofagov s povečano protibakterijsko učinkovitostjo. V ta namen moramo v fagni genom vstaviti dodatne gene, kar pa zaradi omejitve dolžine DNA, ki se lahko zapakira v virusno kapsido, predstavlja velik problem. Zato bi lahko iz virusnega genoma odstranili gene, ki zapisujejo proteine z neznano funkcijo, gene, ki omogočajo odpornost proti antibiotikom, kot tudi zapise za toksine in druge virulenčne faktorje. Hkrati bi torej zmanjšali verjetnost, da bi bili v genomu prisotni za človeka potencialno nevarni geni. Cilj raziskave je bil oblikovati sintetični fag z reduciranim genomom, ki bi ohranil sposobnost okužbe, razmnoževanja in lize gostiteljske celice [1].

''Pseudomonas aeruginosa'' je patogena bakterija, ki ima izjemno sposobnost razvoja odpornosti na antibiotike. Okužba se pojavi predvsem pri hospitaliziranih pacientih in je lahko smrtno nevarna za ljudi s cistično fibrozo in imunsko pomanjkljivostjo. Problematično je predvsem zdravljenje okužb z bolnišničnimi sevi, zato predstavlja fagna terapija potencialno rešitev [2, 3].

===Izolacija bakteriofaga PE3 in njegova karakterizacija===
V prvem koraku so raziskovalci iz odpadne vode pri čistilni napravi v mestu Braga na Portugalskem izolirali litični fag vB_PaeP_PE3 (okrajšano PE3), ki je sposoben okužiti bakterijo ''P. aeruginosa'' PAO1. Po izolaciji so s transmisijsko elektronsko mikroskopijo (TEM) preverili njegove strukturne lastnosti in ugotovili, da ima PE3 kratek nekontraktilni rep. Izkazalo se je, da je pridobljen fag sorazmerno specifičen, saj je bil sposoben okužiti 7 od 28 izoliranih kliničnih sevov ''P. aeruginosa''. V nadaljevanju so fagu posekvencirali celoten genom, ki je dsDNA dolžine 43.583 bp z 62,3 % deležem GC baznih parov in direktnimi končnimi ponovitvami dolžine 479 bp. S pomočjo računalniških orodij so ugotovili, da genom vključuje 55 kodirajočih zaporedij CDS (dolžine 120–4014 bp), med katerimi ima 30 CDS pripisane funkcije, 25 CDS pa zapisuje hipotetične proteine. Nadaljnja genomska analiza je pokazala, da fag najverjetneje ni virulenten, saj ne vključuje lizogenih genov [1].

===Priprava rekombinantnih bakteriofagov===
Ker velik delež genov v fagnem genomu nima pripisanih funkcij, se poraja vprašanje, če so ti geni nujno potrebni za replikacijo in protibakterijske lastnosti. V prvem delu fagnega genoma sta prisotna dva modula genov (modul gp1–gp5 in gp6–gp12), ki vključujeta zapise za hipotetične proteine in sta med seboj ločena z regulatornimi elementi. Z odstranitvijo posameznega modula so pripravili sintetična faga z reduciranim genomom vB_PaeP_PE3∆gp1-gp5 (okrajšano PE3∆gp1-gp5) in vB_PaeP_PE3∆gp6-gp12 (okrajšano PE3∆gp6-gp12).

Sintezo okrajšanega genoma so izvedli tako, da so s pomočjo reakcije PCR in uporabe ustreznih začetnih oligonukleotidov pomnožili celoten genom brez izbranega modula, pri čemer so se posamezni fragmenti v končnih regijah prekrivali. Tako so pripravili 6 prekrivajočih se PCR produktov, ki so predstavljali reduciran genom, in lineariziran YAC s terminalnimi regijami, ki so bile homologne koncema fagnega genoma. Nato so izvedli transformacijo kvasovk ''S. cerevisiae'' BY4741 s prekrivajočimi se sedmimi zaporedji DNA, kjer so se ta s pomočjo DNA popravljalnega mehanizma sestavila v ciklično strukturo fagnega genoma in umetnega kromosoma YAC (YAC-fag DNA). Ustreznost zaporedja so v nadaljevanju preverili z reakcijo PCR na osnovi ene kolonije, pri čemer so uporabili začetne oligonukleotide, ki se vežejo na regijo navzdol in navzgor od izbrisanega modula. Dolžine pomnožkov, ki so jih pri tem dobili, so bile krajše kot pri divjem tipu faga.

Da bi preverili, ali delecije v genomu vplivajo na viabilnost bakterofaga, so iz kvasovk izolirali YAC-fag DNA in z njo transformirali bakterijo ''P. aeruginosa'' PAO1, kjer so se fagni geni prepisovali in je prišlo do nastanka funkcionalnih bakteriofagov. Na ploščah s transformiranimi bakterijami so nastali plaki, ki so jih v nadaljevanju preverili s pomočjo reakcije PCR, pri kateri so uporabili že prej omenjene začetne oligonukleotide, ki se vežejo na regijo navzgor in navzdol od izbrisanega modula. S poskusom so dokazali viabilnost rekombinantnih fagov z reduciranim genomom in hkrati pokazali, da prvih 12 genov v fagnem genomu ni esencialnih za razmnoževanje in viabilnost.

Zaradi uspešne priprave dveh rekombinantnih fagov so se raziskovalci odločili pripraviti še tretji fag, pri čemer so izvedli delecijo 3194 bp oziroma vseh 12 genov (gp1–gp12) obeh začetnih modulov. Tretji rekombinantni fag vB_PaeP_PE3∆gp1-gp12 so pripravili po enakem postopku kot faga PE3∆gp1-gp5 in PE3∆gp6-gp12 [1].

===Karakterizacija rekombinantnih bakteriofagov===
Da bi bolje razumeli vpliv izbrisanih regij na lastnosti bakteriofagov, so značilnosti rekombinantnih fagov primerjali z divjim tipom PE3. Najprej so podrobneje analizirali morfologijo plakov, ki nastanejo po okužbi bakterije ''P. aeruginosa'', in ugotovili, da so rekombinantni bakteriofagi za razliko od bakteriofagov divjega tipa tvorili manjše plake. V nadaljevanju so preverili tudi specifičnost rekombinantnih fagov pri okužbi bakterijskih celic. PE3∆gp6-gp12 je bil enako kot PE3 sposoben okužiti 7 od 28 kliničnih izolatov ''P. aeruginosa'', medtem ko sta faga PE3∆gp1-gp5 in PE3∆gp1-gp12 učinkovito okužila in lizirala le 4 bakterijske seve [1].

Z nadaljnjimi poskusi so podrobneje preučili rastne parametre oziroma generacijski čas faga, ki vključuje čas adsorpcije, pritrditve in vnosa nukleinske kisline, latentno periodo in čas sproščanja virionov [4]. PE3 in PE3∆gp6-gp12, ki sta tvorila podobno rastno krivuljo, sta imela v primerjavi s PE3∆gp1-gp5 oziroma PE3∆gp1-gp12 5 min oziroma 15 min krajšo latentno fazo. Kljub temu je v bakterijskih celicah, okuženih s fagi PE3, PE3∆gp1-gp5 in PE3∆gp6-gp12, nastalo približno enako število fagnih delcev (okrog 200 PFU/okuženo celico), medtem ko je bilo v primeru PE3∆gp1-gp12 število nastalih fagnih delcev bistveno manjše (83 PFU/okuženo celico). Rezultati kažejo na to, da bi imeli lahko izbrisani geni funkcijo v zgodnjih stopnjah okužbe bakterije s fagom. Zaradi razlik v latentni fazi bi lahko sklepali, da so geni modula gp1-gp5 pomembni za interakcijo med fagom in bakterijo [1].

V procesu priprave rekombinantnih fagov bi lahko prišlo tudi do uvedbe naključnih mutacij v genomsko DNA, zato so vsem na novo pripravljenim fagom posekvencirali dedni material. Rezultate so dodatno potrdili tako, da so regije genoma, v katerih so s sekvenciranjem odkrili mutacijo, pomnožili v reakciji PCR in jim nato določili nukleotidno zaporedje s pomočjo Sangerjeve metode. V genomu PE3∆gp1-gp5 in PE3∆gp6-gp12 so odkrili 2 točkovni mutaciji, pri čemer je bila ena od teh skupna. V obeh fagih se je kot posledica uporabe istih PCR produktov za rekombinacijo v kvasovki pojavila tranzicijska mutacija na regiji gena gp47, ki zapisuje nitasti protein repa. PE3∆gp1-gp5 je vseboval tudi tiho mutacijo v genu za endolizin (gp51), medtem ko je bila v PE3∆gp6-gp12 prisotna mutacija v nitastem proteinu repa gp46. V fagnem genomu PE3∆gp1-gp12 so odkrili tri točkovne mutacije, ki so bile prisotne v ogrodnem proteinu gp37 (tiha mutacija) in v nitastima proteinoma repa gp46 in gp47 (drugačnosmiselni mutaciji).

Za konec so z ''in vivo'' in ''in vitro'' poskusom preverili, če imajo uvedene delecije v genomu PE3 morebiten učinek na protibakterijske lastnosti. V ''in vitro'' eksperimentu so v bakterijsko kulturo ''P. aeruginosa'' v logaritemski fazi rasti dodali PE3 in rekombinante bakteriofage ter v 24-urnem intervalu preverjali delež živih bakterijskih celic. V eksperimentu ni bilo opaznih znatnih razlik med fagi, saj se je v vseh primerih približno dve uri po dodatku število viabilnih celic ''P. aeruginosa'' v primerjavi s kontrolo, kjer fagi niso bili dodani, zmanjšalo za približno 5-krat. Nato je v vseh primerih začelo število živih bakterijskih celic naraščati in po 24 urah je bila gostota okuženih in neokuženih celic enaka, kar kaže na to, da so se v vseh primerih zelo hitro oblikovale bakterijske celice, odporne na okužbo s fagom. Pri ''in vivo'' eksperimentu, ki nam omogoča boljše posnemanje naravnih pogojev, so kot modelni organizem uporabili ličinke molja ''G. mellonella'', ki so jih okužili s ''P. aeruginosa'' tako, da so vanje injicirali ustrezen volumen bakterije. Pol ure po okužbi z bakterijo so v žuželke injicirali še rekombinantne fage in divji tip PE3. Kot kontrolo so uporabili pufer, s čimer so preverili delež smrti, ki je posledica poškodb ob injiciranju. Delež preživelih žuželk je bil ob dodatku fagov občutno večji kot pri kontroli, pri čemer ni bilo opaznih znatnih sprememb med rekombinantnimi fagi in divjim tipom. Rezultati torej kažejo, da prisotnost delecij v fagnem genomu ne vpliva na sposobnost okužbe bakterije ''P. aeruginosa'' [1].

===Zaključek===
Kljub temu da so fagni genomi sorazmerno majhni, izkazujejo izjemno raznolikost, zato je funkcija večine fagnih genov še nepoznana. Cilj študije je bil pripraviti rekombinantne fage z reduciranim genomom, pri čemer bi zmanjšali število genov z neznano funkcijo, ter tudi preveriti, kako uvedene delecije vplivajo na učinkovitost okužbe bakterijskih celic. V raziskavi so uspeli iz bakteriofaga PE3 odstraniti 12 neesencialnih genov, kar predstavlja 48 % genov z neznano funkcijo. Tako pripravljen fag je imel daljšo latentno fazo, proizvedel je manj virionov na celico, kljub temu pa je bila sposobnost okužbe bakterije ''P. aeruginosa'' v ''in vivo'' in ''in vitro'' študijah nespremenjena. Raziskava predstavlja manjši napredek pri razvoju novih fagnih terapij, pri katerih bi lahko v fagni genom uvedli gene s protibakterijsko učinkovitostjo in tudi zmanjšali delež genov z neznano funkcijo, ki bi imeli morebitni toksičen vpliv na človeka.

===Viri in literatura===
# D. P. Pires, R. Monteiro, D. Mil-Homens, A. Fialho, T. K. Lu in J. Azeredo: Designing ''P. aeruginosa'' synthetic phages with reduced genomes. ''Sci. Rep.'', '''2021''', ''11'', str. 1–10.
# Z. Pang, R. Raudonis, B. R. Glick, T. J. Lin in Z. Cheng: Antibiotic resistance in Pseudomonas aeruginosa: mechanisms and alternative therapeutic strategies. ''Biotechnology Advances'', '''2019''', ''37'', str. 177–192.
# CDC, HAI: Pseudomonas aeruginosa Infection. https://www.cdc.gov/hai/organisms/pseudomonas.html (citirano 23. 4. 2021).
# P. Hyman in S. T. Abedon: Chapter 18. V: Practical Methods for Determining Phage Growth Parameters. 2009, str. 175-202.

Oblikovanje sintetičnega faga iz P. aeruginosa z reduciranim genomom

2021-05-15T18:00:37Z

Martina Lokar: /* Zaključek */

Povzeto po članku: [https://doi.org/10.1038/s41598-021-81580-2 D.P. Pires, R. Monteiro, D. Mil-Homens ''et al'': Designing ''P. aeruginosa'' synthetic phages with reduced genomes. ''Sci. Rep.'' '''2021''', 11(1), str. 1-10. https://doi.org/10.1038/s41598-021-81580-2]

===Uvod===
Odpornost bakterij na antibiotike postaja vedno večji problem, zato se v zadnjem času kot potencialna terapevtska učinkovina preučujejo tudi bakteriofagi. Kljub temu da je fagna terapija obetaven način zdravljenja, se sooča s številnimi izzivi, kot so varnost, stabilnost in način dostave učinkovine, sposobnost bakteriofagov, da lahko okužijo omejeno število gostiteljskih bakterij, odpornost na bakteriofage ter stranski učinki zaradi lize bakterijskih celic. Ena izmed potencialnih rešitev nekaterih izmed teh omejitev je oblikovanje genetsko spremenjenih bakteriofagov s povečano protibakterijsko učinkovitostjo. V ta namen moramo v fagni genom vstaviti dodatne gene, kar pa zaradi omejitve dolžine DNA, ki se lahko zapakira v virusno kapsido, predstavlja velik problem. Zato bi lahko iz virusnega genoma odstranili gene, ki zapisujejo proteine z neznano funkcijo, gene, ki omogočajo odpornost proti antibiotikom, kot tudi zapise za toksine in druge virulenčne faktorje. Hkrati bi torej zmanjšali verjetnost, da bi bili v genomu prisotni za človeka potencialno nevarni geni. Cilj raziskave je bil oblikovati sintetični fag z reduciranim genomom, ki bi ohranil sposobnost okužbe, razmnoževanja in lize gostiteljske celice [1].

''Pseudomonas aeruginosa'' je patogena bakterija, ki ima izjemno sposobnost razvoja odpornosti na antibiotike. Okužba se pojavi predvsem pri hospitaliziranih pacientih in je lahko smrtno nevarna za ljudi s cistično fibrozo in imunsko pomanjkljivostjo. Problematično je predvsem zdravljenje okužb z bolnišničnimi sevi, zato predstavlja fagna terapija potencialno rešitev [2, 3].

===Izolacija bakteriofaga PE3 in njegova karakterizacija===
V prvem koraku so raziskovalci iz odpadne vode pri čistilni napravi v mestu Braga na Portugalskem izolirali litični fag vB_PaeP_PE3 (okrajšano PE3), ki je sposoben okužiti bakterijo ''P. aeruginosa'' PAO1. Po izolaciji so s transmisijsko elektronsko mikroskopijo (TEM) preverili njegove strukturne lastnosti in ugotovili, da ima PE3 kratek nekontraktilni rep. Izkazalo se je, da je pridobljen fag sorazmerno specifičen, saj je bil sposoben okužiti 7 od 28 izoliranih kliničnih sevov ''P. aeruginosa''. V nadaljevanju so fagu posekvencirali celoten genom, ki je dsDNA dolžine 43.583 bp z 62,3 % deležem GC baznih parov in direktnimi končnimi ponovitvami dolžine 479 bp. S pomočjo računalniških orodij so ugotovili, da genom vključuje 55 kodirajočih zaporedij CDS (dolžine 120–4014 bp), med katerimi ima 30 CDS pripisane funkcije, 25 CDS pa zapisuje hipotetične proteine. Nadaljnja genomska analiza je pokazala, da fag najverjetneje ni virulenten, saj ne vključuje lizogenih genov [1].

===Priprava rekombinantnih bakteriofagov===
Ker velik delež genov v fagnem genomu nima pripisanih funkcij, se poraja vprašanje, če so ti geni nujno potrebni za replikacijo in protibakterijske lastnosti. V prvem delu fagnega genoma sta prisotna dva modula genov (modul gp1–gp5 in gp6–gp12), ki vključujeta zapise za hipotetične proteine in sta med seboj ločena z regulatornimi elementi. Z odstranitvijo posameznega modula so pripravili sintetična faga z reduciranim genomom vB_PaeP_PE3∆gp1-gp5 (okrajšano PE3∆gp1-gp5) in vB_PaeP_PE3∆gp6-gp12 (okrajšano PE3∆gp6-gp12).

Sintezo okrajšanega genoma so izvedli tako, da so s pomočjo reakcije PCR in uporabe ustreznih začetnih oligonukleotidov pomnožili celoten genom brez izbranega modula, pri čemer so se posamezni fragmenti v končnih regijah prekrivali. Tako so pripravili 6 prekrivajočih se PCR produktov, ki so predstavljali reduciran genom, in lineariziran YAC s terminalnimi regijami, ki so bile homologne koncema fagnega genoma. Nato so izvedli transformacijo kvasovk ''S. cerevisiae'' BY4741 s prekrivajočimi se sedmimi zaporedji DNA, kjer so se ta s pomočjo DNA popravljalnega mehanizma sestavila v ciklično strukturo fagnega genoma in umetnega kromosoma YAC (YAC-fag DNA). Ustreznost zaporedja so v nadaljevanju preverili z reakcijo PCR na osnovi ene kolonije, pri čemer so uporabili začetne oligonukleotide, ki se vežejo na regijo navzdol in navzgor od izbrisanega modula. Dolžine pomnožkov, ki so jih pri tem dobili, so bile krajše kot pri divjem tipu faga.

Da bi preverili, ali delecije v genomu vplivajo na viabilnost bakterofaga, so iz kvasovk izolirali YAC-fag DNA in z njo transformirali bakterijo ''P. aeruginosa'' PAO1, kjer so se fagni geni prepisovali in je prišlo do nastanka funkcionalnih bakteriofagov. Na ploščah s transformiranimi bakterijami so nastali plaki, ki so jih v nadaljevanju preverili s pomočjo reakcije PCR, pri kateri so uporabili že prej omenjene začetne oligonukleotide, ki se vežejo na regijo navzgor in navzdol od izbrisanega modula. S poskusom so dokazali viabilnost rekombinantnih fagov z reduciranim genomom in hkrati pokazali, da prvih 12 genov v fagnem genomu ni esencialnih za razmnoževanje in viabilnost.

Zaradi uspešne priprave dveh rekombinantnih fagov so se raziskovalci odločili pripraviti še tretji fag, pri čemer so izvedli delecijo 3194 bp oziroma vseh 12 genov (gp1–gp12) obeh začetnih modulov. Tretji rekombinantni fag vB_PaeP_PE3∆gp1-gp12 so pripravili po enakem postopku kot faga PE3∆gp1-gp5 in PE3∆gp6-gp12 [1].

===Karakterizacija rekombinantnih bakteriofagov===
Da bi bolje razumeli vpliv izbrisanih regij na lastnosti bakteriofagov, so značilnosti rekombinantnih fagov primerjali z divjim tipom PE3. Najprej so podrobneje analizirali morfologijo plakov, ki nastanejo po okužbi bakterije ''P. aeruginosa'', in ugotovili, da so rekombinantni bakteriofagi za razliko od bakteriofagov divjega tipa tvorili manjše plake. V nadaljevanju so preverili tudi specifičnost rekombinantnih fagov pri okužbi bakterijskih celic. PE3∆gp6-gp12 je bil enako kot PE3 sposoben okužiti 7 od 28 kliničnih izolatov ''P. aeruginosa'', medtem ko sta faga PE3∆gp1-gp5 in PE3∆gp1-gp12 učinkovito okužila in lizirala le 4 bakterijske seve [1].

Z nadaljnjimi poskusi so podrobneje preučili rastne parametre oziroma generacijski čas faga, ki vključuje čas adsorpcije, pritrditve in vnosa nukleinske kisline, latentno periodo in čas sproščanja virionov [4]. PE3 in PE3∆gp6-gp12, ki sta tvorila podobno rastno krivuljo, sta imela v primerjavi s PE3∆gp1-gp5 oziroma PE3∆gp1-gp12 5 min oziroma 15 min krajšo latentno fazo. Kljub temu je v bakterijskih celicah, okuženih s fagi PE3, PE3∆gp1-gp5 in PE3∆gp6-gp12, nastalo približno enako število fagnih delcev (okrog 200 PFU/okuženo celico), medtem ko je bilo v primeru PE3∆gp1-gp12 število nastalih fagnih delcev bistveno manjše (83 PFU/okuženo celico). Rezultati kažejo na to, da bi imeli lahko izbrisani geni funkcijo v zgodnjih stopnjah okužbe bakterije s fagom. Zaradi razlik v latentni fazi bi lahko sklepali, da so geni modula gp1-gp5 pomembni za interakcijo med fagom in bakterijo [1].

V procesu priprave rekombinantnih fagov bi lahko prišlo tudi do uvedbe naključnih mutacij v genomsko DNA, zato so vsem na novo pripravljenim fagom posekvencirali dedni material. Rezultate so dodatno potrdili tako, da so regije genoma, v katerih so s sekvenciranjem odkrili mutacijo, pomnožili v reakciji PCR in jim nato določili nukleotidno zaporedje s pomočjo Sangerjeve metode. V genomu PE3∆gp1-gp5 in PE3∆gp6-gp12 so odkrili 2 točkovni mutaciji, pri čemer je bila ena od teh skupna. V obeh fagih se je kot posledica uporabe istih PCR produktov za rekombinacijo v kvasovki pojavila tranzicijska mutacija na regiji gena gp47, ki zapisuje za nitasti protein repa. PE3∆gp1-gp5 je vseboval tudi tiho mutacijo v genu za endolizin (gp51), medtem ko je bila v PE3∆gp6-gp12 prisotna mutacija v nitastem proteinu repa gp46. V fagnem genomu PE3∆gp1-gp12 so odkrili tri točkovne mutacije, ki so bile prisotne v ogrodnem proteinu gp47 (tiha mutacija) in v nitastima proteinoma repa gp46 in gp47 (drugačnosmiselni mutaciji).

Za konec so z ''in vivo'' in ''in vitro'' poskusom preverili, če imajo uvedene delecije v genomu PE3 morebiten učinek na protibakterijske lastnosti. V ''in vitro'' eksperimentu so v bakterijsko kulturo ''P. aeruginosa'' v logaritemski fazi rasti dodali PE3 in rekombinante bakteriofage ter v 24-urnem intervalu preverjali delež živih bakterijskih celic. V eksperimentu ni bilo opaznih znatnih razlik med fagi, saj se je v vseh primerih približno dve uri po dodatku število viabilnih celic ''P. aeruginosa'' v primerjavi s kontrolo, kjer fagi niso bili dodani, zmanjšalo za približno 5-krat. Nato je v vseh primerih začelo število živih bakterijskih celic naraščati in po 24 urah je bila gostota okuženih in neokuženih celic enaka, kar kaže na to, da so se v vseh primerih zelo hitro oblikovale bakterijske celice, odporne na okužbo s fagom. Pri ''in vivo'' eksperimentu, ki nam omogoča boljše posnemanje naravnih pogojev, so kot modelni organizem uporabili ličinke molja ''G. mellonella'', ki so jih okužili s ''P. aeruginosa'' tako, da so vanje injicirali ustrezen volumen bakterije. Pol ure po okužbi z bakterijo so v žuželke injicirali še rekombinantne fage in divji tip PE3. Kot kontrolo so uporabili pufer, s čimer so preverili delež smrti, ki je posledica poškodb ob injiciranju. Delež preživelih žuželk je bil ob dodatku fagov občutno večji kot pri kontroli, pri čemer ni bilo opaznih znatnih sprememb med rekombinantnimi fagi in divjim tipom. Rezultati torej kažejo, da prisotnost delecij v fagnem genomu ne vpliva na sposobnost okužbe bakterije ''P. aeruginosa'' [1].

===Zaključek===
Kljub temu da so fagni genomi sorazmerno majhni, izkazujejo izjemno raznolikost, zato je funkcija večine fagnih genov še nepoznana. Cilj študije je bil pripraviti rekombinantne fage z reduciranim genomom, pri čemer bi zmanjšali število genov z neznano funkcijo, ter tudi preveriti, kako uvedene delecije vplivajo na učinkovitost okužbe bakterijskih celic. V raziskavi so uspeli iz bakteriofaga PE3 odstraniti 12 neesencialnih genov, kar predstavlja 48 % genov z neznano funkcijo. Tako pripravljen fag je imel daljšo latentno fazo, proizvedel je manj virionov na celico, kljub temu pa je bila sposobnost okužbe bakterije ''P. aeruginosa'' v ''in vivo'' in ''in vitro'' študijah nespremenjena. Raziskava predstavlja manjši napredek pri razvoju novih fagnih terapij, pri katerih bi lahko v fagni genom uvedli gene s protibakterijsko učinkovitostjo in tudi zmanjšali delež genov z neznano funkcijo, ki bi imeli morebitni toksičen vpliv na človeka.

===Viri in literatura===
# D. P. Pires, R. Monteiro, D. Mil-Homens, A. Fialho, T. K. Lu in J. Azeredo: Designing ''P. aeruginosa'' synthetic phages with reduced genomes. ''Sci. Rep.'', '''2021''', ''11'', str. 1–10.
# Z. Pang, R. Raudonis, B. R. Glick, T. J. Lin in Z. Cheng: Antibiotic resistance in Pseudomonas aeruginosa: mechanisms and alternative therapeutic strategies. ''Biotechnology Advances'', '''2019''', ''37'', str. 177–192.
# CDC, HAI: Pseudomonas aeruginosa Infection. https://www.cdc.gov/hai/organisms/pseudomonas.html (citirano 23. 4. 2021).
# P. Hyman in S. T. Abedon: Chapter 18. V: Practical Methods for Determining Phage Growth Parameters. 2009, str. 175-202.

Oblikovanje sintetičnega faga iz P. aeruginosa z reduciranim genomom

2021-05-15T17:46:19Z

Martina Lokar: /* Priprava rekombinantnih bakteriofagov */

Povzeto po članku: [https://doi.org/10.1038/s41598-021-81580-2 D.P. Pires, R. Monteiro, D. Mil-Homens ''et al'': Designing ''P. aeruginosa'' synthetic phages with reduced genomes. ''Sci. Rep.'' '''2021''', 11(1), str. 1-10. https://doi.org/10.1038/s41598-021-81580-2]

===Uvod===
Odpornost bakterij na antibiotike postaja vedno večji problem, zato se v zadnjem času kot potencialna terapevtska učinkovina preučujejo tudi bakteriofagi. Kljub temu da je fagna terapija obetaven način zdravljenja, se sooča s številnimi izzivi, kot so varnost, stabilnost in način dostave učinkovine, sposobnost bakteriofagov, da lahko okužijo omejeno število gostiteljskih bakterij, odpornost na bakteriofage ter stranski učinki zaradi lize bakterijskih celic. Ena izmed potencialnih rešitev nekaterih izmed teh omejitev je oblikovanje genetsko spremenjenih bakteriofagov s povečano protibakterijsko učinkovitostjo. V ta namen moramo v fagni genom vstaviti dodatne gene, kar pa zaradi omejitve dolžine DNA, ki se lahko zapakira v virusno kapsido, predstavlja velik problem. Zato bi lahko iz virusnega genoma odstranili gene, ki zapisujejo proteine z neznano funkcijo, gene, ki omogočajo odpornost proti antibiotikom, kot tudi zapise za toksine in druge virulenčne faktorje. Hkrati bi torej zmanjšali verjetnost, da bi bili v genomu prisotni za človeka potencialno nevarni geni. Cilj raziskave je bil oblikovati sintetični fag z reduciranim genomom, ki bi ohranil sposobnost okužbe, razmnoževanja in lize gostiteljske celice [1].

''Pseudomonas aeruginosa'' je patogena bakterija, ki ima izjemno sposobnost razvoja odpornosti na antibiotike. Okužba se pojavi predvsem pri hospitaliziranih pacientih in je lahko smrtno nevarna za ljudi s cistično fibrozo in imunsko pomanjkljivostjo. Problematično je predvsem zdravljenje okužb z bolnišničnimi sevi, zato predstavlja fagna terapija potencialno rešitev [2, 3].

===Izolacija bakteriofaga PE3 in njegova karakterizacija===
V prvem koraku so raziskovalci iz odpadne vode pri čistilni napravi v mestu Braga na Portugalskem izolirali litični fag vB_PaeP_PE3 (okrajšano PE3), ki je sposoben okužiti bakterijo ''P. aeruginosa'' PAO1. Po izolaciji so s transmisijsko elektronsko mikroskopijo (TEM) preverili njegove strukturne lastnosti in ugotovili, da ima PE3 kratek nekontraktilni rep. Izkazalo se je, da je pridobljen fag sorazmerno specifičen, saj je bil sposoben okužiti 7 od 28 izoliranih kliničnih sevov ''P. aeruginosa''. V nadaljevanju so fagu posekvencirali celoten genom, ki je dsDNA dolžine 43.583 bp z 62,3 % deležem GC baznih parov in direktnimi končnimi ponovitvami dolžine 479 bp. S pomočjo računalniških orodij so ugotovili, da genom vključuje 55 kodirajočih zaporedij CDS (dolžine 120–4014 bp), med katerimi ima 30 CDS pripisane funkcije, 25 CDS pa zapisuje hipotetične proteine. Nadaljnja genomska analiza je pokazala, da fag najverjetneje ni virulenten, saj ne vključuje lizogenih genov [1].

===Priprava rekombinantnih bakteriofagov===
Ker velik delež genov v fagnem genomu nima pripisanih funkcij, se poraja vprašanje, če so ti geni nujno potrebni za replikacijo in protibakterijske lastnosti. V prvem delu fagnega genoma sta prisotna dva modula genov (modul gp1–gp5 in gp6–gp12), ki vključujeta zapise za hipotetične proteine in sta med seboj ločena z regulatornimi elementi. Z odstranitvijo posameznega modula so pripravili sintetična faga z reduciranim genomom vB_PaeP_PE3∆gp1-gp5 (okrajšano PE3∆gp1-gp5) in vB_PaeP_PE3∆gp6-gp12 (okrajšano PE3∆gp6-gp12).

Sintezo okrajšanega genoma so izvedli tako, da so s pomočjo reakcije PCR in uporabe ustreznih začetnih oligonukleotidov pomnožili celoten genom brez izbranega modula, pri čemer so se posamezni fragmenti v končnih regijah prekrivali. Tako so pripravili 6 prekrivajočih se PCR produktov, ki so predstavljali reduciran genom, in lineariziran YAC s terminalnimi regijami, ki so bile homologne koncema fagnega genoma. Nato so izvedli transformacijo kvasovk ''S. cerevisiae'' BY4741 s prekrivajočimi se sedmimi zaporedji DNA, kjer so se ta s pomočjo DNA popravljalnega mehanizma sestavila v ciklično strukturo fagnega genoma in umetnega kromosoma YAC (YAC-fag DNA). Ustreznost zaporedja so v nadaljevanju preverili z reakcijo PCR na osnovi ene kolonije, pri čemer so uporabili začetne oligonukleotide, ki se vežejo na regijo navzdol in navzgor od izbrisanega modula. Dolžine pomnožkov, ki so jih pri tem dobili, so bile krajše kot pri divjem tipu faga.

Da bi preverili, ali delecije v genomu vplivajo na viabilnost bakterofaga, so iz kvasovk izolirali YAC-fag DNA in z njo transformirali bakterijo ''P. aeruginosa'' PAO1, kjer so se fagni geni prepisovali in je prišlo do nastanka funkcionalnih bakteriofagov. Na ploščah s transformiranimi bakterijami so nastali plaki, ki so jih v nadaljevanju preverili s pomočjo reakcije PCR, pri kateri so uporabili že prej omenjene začetne oligonukleotide, ki se vežejo na regijo navzgor in navzdol od izbrisanega modula. S poskusom so dokazali viabilnost rekombinantnih fagov z reduciranim genomom in hkrati pokazali, da prvih 12 genov v fagnem genomu ni esencialnih za razmnoževanje in viabilnost.

Zaradi uspešne priprave dveh rekombinantnih fagov so se raziskovalci odločili pripraviti še tretji fag, pri čemer so izvedli delecijo 3194 bp oziroma vseh 12 genov (gp1–gp12) obeh začetnih modulov. Tretji rekombinantni fag vB_PaeP_PE3∆gp1-gp12 so pripravili po enakem postopku kot faga PE3∆gp1-gp5 in PE3∆gp6-gp12 [1].

===Karakterizacija rekombinantnih bakteriofagov===
Da bi bolje razumeli vpliv izbrisanih regij na lastnosti bakteriofagov, so značilnosti rekombinantnih fagov primerjali z divjim tipom PE3. Najprej so podrobneje analizirali morfologijo plakov, ki nastanejo po okužbi bakterije ''P. aeruginosa'', in ugotovili, da so rekombinantni bakteriofagi za razliko od bakteriofagov divjega tipa tvorili manjše plake. V nadaljevanju so preverili tudi specifičnost rekombinantnih fagov pri okužbi bakterijskih celic. PE3∆gp6-gp12 je bil enako kot PE3 sposoben okužiti 7 od 28 kliničnih izolatov ''P. aeruginosa'', medtem ko sta faga PE3∆gp1-gp5 in PE3∆gp1-gp12 učinkovito okužila in lizirala le 4 bakterijske seve [1].

Z nadaljnjimi poskusi so podrobneje preučili rastne parametre oziroma generacijski čas faga, ki vključuje čas adsorpcije, pritrditve in vnosa nukleinske kisline, latentno periodo in čas sproščanja virionov [4]. PE3 in PE3∆gp6-gp12, ki sta tvorila podobno rastno krivuljo, sta imela v primerjavi s PE3∆gp1-gp5 oziroma PE3∆gp1-gp12 5 min oziroma 15 min krajšo latentno fazo. Kljub temu je v bakterijskih celicah, okuženih s fagi PE3, PE3∆gp1-gp5 in PE3∆gp6-gp12, nastalo približno enako število fagnih delcev (okrog 200 PFU/okuženo celico), medtem ko je bilo v primeru PE3∆gp1-gp12 število nastalih fagnih delcev bistveno manjše (83 PFU/okuženo celico). Rezultati kažejo na to, da bi imeli lahko izbrisani geni funkcijo v zgodnjih stopnjah okužbe bakterije s fagom. Zaradi razlik v latentni fazi bi lahko sklepali, da so geni modula gp1-gp5 pomembni za interakcijo med fagom in bakterijo [1].

V procesu priprave rekombinantnih fagov bi lahko prišlo tudi do uvedbe naključnih mutacij v genomsko DNA, zato so vsem na novo pripravljenim fagom posekvencirali dedni material. Rezultate so dodatno potrdili tako, da so regije genoma, v katerih so s sekvenciranjem odkrili mutacijo, pomnožili v reakciji PCR in jim nato določili nukleotidno zaporedje s pomočjo Sangerjeve metode. V genomu PE3∆gp1-gp5 in PE3∆gp6-gp12 so odkrili 2 točkovni mutaciji, pri čemer je bila ena od teh skupna. V obeh fagih se je kot posledica uporabe istih PCR produktov za rekombinacijo v kvasovki pojavila tranzicijska mutacija na regiji gena gp47, ki zapisuje za nitasti protein repa. PE3∆gp1-gp5 je vseboval tudi tiho mutacijo v genu za endolizin (gp51), medtem ko je bila v PE3∆gp6-gp12 prisotna mutacija v nitastem proteinu repa gp46. V fagnem genomu PE3∆gp1-gp12 so odkrili tri točkovne mutacije, ki so bile prisotne v ogrodnem proteinu gp47 (tiha mutacija) in v nitastima proteinoma repa gp46 in gp47 (drugačnosmiselni mutaciji).

Za konec so z ''in vivo'' in ''in vitro'' poskusom preverili, če imajo uvedene delecije v genomu PE3 morebiten učinek na protibakterijske lastnosti. V ''in vitro'' eksperimentu so v bakterijsko kulturo ''P. aeruginosa'' v logaritemski fazi rasti dodali PE3 in rekombinante bakteriofage ter v 24-urnem intervalu preverjali delež živih bakterijskih celic. V eksperimentu ni bilo opaznih znatnih razlik med fagi, saj se je v vseh primerih približno dve uri po dodatku število viabilnih celic ''P. aeruginosa'' v primerjavi s kontrolo, kjer fagi niso bili dodani, zmanjšalo za približno 5-krat. Nato je v vseh primerih začelo število živih bakterijskih celic naraščati in po 24 urah je bila gostota okuženih in neokuženih celic enaka, kar kaže na to, da so se v vseh primerih zelo hitro oblikovale bakterijske celice, odporne na okužbo s fagom. Pri ''in vivo'' eksperimentu, ki nam omogoča boljše posnemanje naravnih pogojev, so kot modelni organizem uporabili ličinke molja ''G. mellonella'', ki so jih okužili s ''P. aeruginosa'' tako, da so vanje injicirali ustrezen volumen bakterije. Pol ure po okužbi z bakterijo so v žuželke injicirali še rekombinantne fage in divji tip PE3. Kot kontrolo so uporabili pufer, s čimer so preverili delež smrti, ki je posledica poškodb ob injiciranju. Delež preživelih žuželk je bil ob dodatku fagov občutno večji kot pri kontroli, pri čemer ni bilo opaznih znatnih sprememb med rekombinantnimi fagi in divjim tipom. Rezultati torej kažejo, da prisotnost delecij v fagnem genomu ne vpliva na sposobnost okužbe bakterije ''P. aeruginosa'' [1].

===Zaključek===
Kljub temu da so fagni genomi sorazmerno majhni, izkazujejo izjemno raznolikost, zato je funkcija večine fagnih genov še nepoznana. Cilj študije je bil pripraviti rekombinantne fage z reduciranim genomom, pri čemer bi zmanjšali število genov z neznano funkcijo, ter tudi preveriti, kako uvedene delecije vplivajo na učinkovitost okuževanja bakterijskih celic. V raziskavi so uspeli iz bakteriofaga PE3 odstraniti 12 neesencialnih genov, kar predstavlja 48 % genov z neznano funkcijo. Tako pripravljen fag je imel daljšo latentno fazo, proizvedel je manj virionov na celico, kljub temu pa je bila sposobnost okužbe bakterije ''P. aeruginosa'' v ''in vivo'' in ''in vitro'' študijah nespremenjena. Raziskava predstavlja manjši napredek pri razvoju novih fagnih terapij, pri katerih bi lahko v fagni genom uvedli gene s protibakterijsko učinkovitostjo in tudi zmanjšali delež genov z neznano funkcijo, ki bi imeli morebitni toksičen vpliv na človeka.

===Viri in literatura===
# D. P. Pires, R. Monteiro, D. Mil-Homens, A. Fialho, T. K. Lu in J. Azeredo: Designing ''P. aeruginosa'' synthetic phages with reduced genomes. ''Sci. Rep.'', '''2021''', ''11'', str. 1–10.
# Z. Pang, R. Raudonis, B. R. Glick, T. J. Lin in Z. Cheng: Antibiotic resistance in Pseudomonas aeruginosa: mechanisms and alternative therapeutic strategies. ''Biotechnology Advances'', '''2019''', ''37'', str. 177–192.
# CDC, HAI: Pseudomonas aeruginosa Infection. https://www.cdc.gov/hai/organisms/pseudomonas.html (citirano 23. 4. 2021).
# P. Hyman in S. T. Abedon: Chapter 18. V: Practical Methods for Determining Phage Growth Parameters. 2009, str. 175-202.

Oblikovanje sintetičnega faga iz P. aeruginosa z reduciranim genomom

2021-05-14T15:16:40Z

Martina Lokar: /* Karakterizacija rekombinantnih bakteriofagov */

Povzeto po članku: [https://doi.org/10.1038/s41598-021-81580-2 D.P. Pires, R. Monteiro, D. Mil-Homens ''et al'': Designing ''P. aeruginosa'' synthetic phages with reduced genomes. ''Sci. Rep.'' '''2021''', 11(1), str. 1-10. https://doi.org/10.1038/s41598-021-81580-2]

===Uvod===
Odpornost bakterij na antibiotike postaja vedno večji problem, zato se v zadnjem času kot potencialna terapevtska učinkovina preučujejo tudi bakteriofagi. Kljub temu da je fagna terapija obetaven način zdravljenja, se sooča s številnimi izzivi, kot so varnost, stabilnost in način dostave učinkovine, sposobnost bakteriofagov, da lahko okužijo omejeno število gostiteljskih bakterij, odpornost na bakteriofage ter stranski učinki zaradi lize bakterijskih celic. Ena izmed potencialnih rešitev nekaterih izmed teh omejitev je oblikovanje genetsko spremenjenih bakteriofagov s povečano protibakterijsko učinkovitostjo. V ta namen moramo v fagni genom vstaviti dodatne gene, kar pa zaradi omejitve dolžine DNA, ki se lahko zapakira v virusno kapsido, predstavlja velik problem. Zato bi lahko iz virusnega genoma odstranili gene, ki zapisujejo proteine z neznano funkcijo, gene, ki omogočajo odpornost proti antibiotikom, kot tudi zapise za toksine in druge virulenčne faktorje. Hkrati bi torej zmanjšali verjetnost, da bi bili v genomu prisotni za človeka potencialno nevarni geni. Cilj raziskave je bil oblikovati sintetični fag z reduciranim genomom, ki bi ohranil sposobnost okužbe, razmnoževanja in lize gostiteljske celice [1].

''Pseudomonas aeruginosa'' je patogena bakterija, ki ima izjemno sposobnost razvoja odpornosti na antibiotike. Okužba se pojavi predvsem pri hospitaliziranih pacientih in je lahko smrtno nevarna za ljudi s cistično fibrozo in imunsko pomanjkljivostjo. Problematično je predvsem zdravljenje okužb z bolnišničnimi sevi, zato predstavlja fagna terapija potencialno rešitev [2, 3].

===Izolacija bakteriofaga PE3 in njegova karakterizacija===
V prvem koraku so raziskovalci iz odpadne vode pri čistilni napravi v mestu Braga na Portugalskem izolirali litični fag vB_PaeP_PE3 (okrajšano PE3), ki je sposoben okužiti bakterijo ''P. aeruginosa'' PAO1. Po izolaciji so s transmisijsko elektronsko mikroskopijo (TEM) preverili njegove strukturne lastnosti in ugotovili, da ima PE3 kratek nekontraktilni rep. Izkazalo se je, da je pridobljen fag sorazmerno specifičen, saj je bil sposoben okužiti 7 od 28 izoliranih kliničnih sevov ''P. aeruginosa''. V nadaljevanju so fagu posekvencirali celoten genom, ki je dsDNA dolžine 43.583 bp z 62,3 % deležem GC baznih parov in direktnimi končnimi ponovitvami dolžine 479 bp. S pomočjo računalniških orodij so ugotovili, da genom vključuje 55 kodirajočih zaporedij CDS (dolžine 120–4014 bp), med katerimi ima 30 CDS pripisane funkcije, 25 CDS pa zapisuje hipotetične proteine. Nadaljnja genomska analiza je pokazala, da fag najverjetneje ni virulenten, saj ne vključuje lizogenih genov [1].

===Priprava rekombinantnih bakteriofagov===
Ker velik delež genov v fagnem genomu nima pripisanih funkcij, se poraja vprašanje, če so ti geni nujno potrebni za replikacijo in protibakterijske lastnosti. V prvem delu fagnega genoma sta prisotna dva modula genov (modul gp1–gp5 in gp6–gp12), ki vključujeta zapise za hipotetične proteine in sta med seboj ločena z regulatornimi elementi. Z odstranitvijo posameznega modula so pripravili sintetična faga z reduciranim genomom vB_PaeP_PE3∆gp1-gp5 (okrajšano PE3∆gp1-gp5) in vB_PaeP_PE3∆gp6-gp12 (okrajšano PE3∆gp6-gp12).

Sintezo okrajšanega genoma so izvedli tako, da so s pomočjo reakcije PCR in uporabe ustreznih začetnih oligonukleotidov pomnožili celoten genom brez izbranega modula, pri čemer so se posamezni fragmenti v končnih regijah prekrivali. Tako so pripravili 6 prekrivajočih se PCR produktov, ki so predstavljali reduciran genom, in lineariziran YAC s terminalnimi regijami, ki so bile homologne koncema fagnega genoma. Nato so izvedli transformacijo kvasovk ''S. cerevisiae'' BY4741 s prekrivajočimi se sedmimi zaporedji DNA, kjer so se ta s pomočjo DNA popravljalnega mehanizma sestavila v ciklično strukturo fagnega genoma in umetnega kromosoma YAC (YAC-fag DNA). Ustreznost zaporedja so v nadaljevanju preverili z reakcijo PCR na osnovi ene kolonije, pri čemer so uporabili začetne oligonukleotide, ki se vežejo na regijo navzdol in navzgor od izbrisanega modula. Dolžine pomnožkov, ki so jih pri tem dobili, so bile krajše kot pri divjem tipu faga.

Da bi preverili, ali delecije v genomu vplivajo na viabilnost bakterofaga, so iz kvasovk izolirali YAC-fag DNA in jo transformirali v bakterijo ''P. aeruginosa'' PAO1, kjer so se fagni geni prepisovali in je prišlo do nastanka funkcionalnih bakteriofagov. Na ploščah s transformiranimi bakterijami so nastali plaki, ki so jih v nadaljevanju preverili s pomočjo reakcije PCR, pri kateri so uporabili že prej omenjene začetne oligonukleotide, ki se vežejo na regijo navzgor in navzdol od izbrisanega modula. S poskusom so dokazali viabilnost rekombinantnih fagov z reduciranim genomom in hkrati pokazali, da prvih 12 genov v fagnem genomu ni esencialnih za razmnoževanje in viabilnost.

Zaradi uspešne priprave dveh rekombinantnih fagov so se raziskovalci odločili pripraviti še tretji fag, pri čemer so izvedli delecijo 3194 bp oziroma vseh 12 genov (gp1–gp12) obeh začetnih modulov. Tretji rekombinantni fag vB_PaeP_PE3∆gp1-gp12 so pripravili po enakem postopku kot faga PE3∆gp1-gp5 in PE3∆gp6-gp12 [1].

===Karakterizacija rekombinantnih bakteriofagov===
Da bi bolje razumeli vpliv izbrisanih regij na lastnosti bakteriofagov, so značilnosti rekombinantnih fagov primerjali z divjim tipom PE3. Najprej so podrobneje analizirali morfologijo plakov, ki nastanejo po okužbi bakterije ''P. aeruginosa'', in ugotovili, da so rekombinantni bakteriofagi za razliko od bakteriofagov divjega tipa tvorili manjše plake. V nadaljevanju so preverili tudi specifičnost rekombinantnih fagov pri okužbi bakterijskih celic. PE3∆gp6-gp12 je bil enako kot PE3 sposoben okužiti 7 od 28 kliničnih izolatov ''P. aeruginosa'', medtem ko sta faga PE3∆gp1-gp5 in PE3∆gp1-gp12 učinkovito okužila in lizirala le 4 bakterijske seve [1].

Z nadaljnjimi poskusi so podrobneje preučili rastne parametre oziroma generacijski čas faga, ki vključuje čas adsorpcije, pritrditve in vnosa nukleinske kisline, latentno periodo in čas sproščanja virionov [4]. PE3 in PE3∆gp6-gp12, ki sta tvorila podobno rastno krivuljo, sta imela v primerjavi s PE3∆gp1-gp5 oziroma PE3∆gp1-gp12 5 min oziroma 15 min krajšo latentno fazo. Kljub temu je v bakterijskih celicah, okuženih s fagi PE3, PE3∆gp1-gp5 in PE3∆gp6-gp12, nastalo približno enako število fagnih delcev (okrog 200 PFU/okuženo celico), medtem ko je bilo v primeru PE3∆gp1-gp12 število nastalih fagnih delcev bistveno manjše (83 PFU/okuženo celico). Rezultati kažejo na to, da bi imeli lahko izbrisani geni funkcijo v zgodnjih stopnjah okužbe bakterije s fagom. Zaradi razlik v latentni fazi bi lahko sklepali, da so geni modula gp1-gp5 pomembni za interakcijo med fagom in bakterijo [1].

V procesu priprave rekombinantnih fagov bi lahko prišlo tudi do uvedbe naključnih mutacij v genomsko DNA, zato so vsem na novo pripravljenim fagom posekvencirali dedni material. Rezultate so dodatno potrdili tako, da so regije genoma, v katerih so s sekvenciranjem odkrili mutacijo, pomnožili v reakciji PCR in jim nato določili nukleotidno zaporedje s pomočjo Sangerjeve metode. V genomu PE3∆gp1-gp5 in PE3∆gp6-gp12 so odkrili 2 točkovni mutaciji, pri čemer je bila ena od teh skupna. V obeh fagih se je kot posledica uporabe istih PCR produktov za rekombinacijo v kvasovki pojavila tranzicijska mutacija na regiji gena gp47, ki zapisuje za nitasti protein repa. PE3∆gp1-gp5 je vseboval tudi tiho mutacijo v genu za endolizin (gp51), medtem ko je bila v PE3∆gp6-gp12 prisotna mutacija v nitastem proteinu repa gp46. V fagnem genomu PE3∆gp1-gp12 so odkrili tri točkovne mutacije, ki so bile prisotne v ogrodnem proteinu gp47 (tiha mutacija) in v nitastima proteinoma repa gp46 in gp47 (drugačnosmiselni mutaciji).

Za konec so z ''in vivo'' in ''in vitro'' poskusom preverili, če imajo uvedene delecije v genomu PE3 morebiten učinek na protibakterijske lastnosti. V ''in vitro'' eksperimentu so v bakterijsko kulturo ''P. aeruginosa'' v logaritemski fazi rasti dodali PE3 in rekombinante bakteriofage ter v 24-urnem intervalu preverjali delež živih bakterijskih celic. V eksperimentu ni bilo opaznih znatnih razlik med fagi, saj se je v vseh primerih približno dve uri po dodatku število viabilnih celic ''P. aeruginosa'' v primerjavi s kontrolo, kjer fagi niso bili dodani, zmanjšalo za približno 5-krat. Nato je v vseh primerih začelo število živih bakterijskih celic naraščati in po 24 urah je bila gostota okuženih in neokuženih celic enaka, kar kaže na to, da so se v vseh primerih zelo hitro oblikovale bakterijske celice, odporne na okužbo s fagom. Pri ''in vivo'' eksperimentu, ki nam omogoča boljše posnemanje naravnih pogojev, so kot modelni organizem uporabili ličinke molja ''G. mellonella'', ki so jih okužili s ''P. aeruginosa'' tako, da so vanje injicirali ustrezen volumen bakterije. Pol ure po okužbi z bakterijo so v žuželke injicirali še rekombinantne fage in divji tip PE3. Kot kontrolo so uporabili pufer, s čimer so preverili delež smrti, ki je posledica poškodb ob injiciranju. Delež preživelih žuželk je bil ob dodatku fagov občutno večji kot pri kontroli, pri čemer ni bilo opaznih znatnih sprememb med rekombinantnimi fagi in divjim tipom. Rezultati torej kažejo, da prisotnost delecij v fagnem genomu ne vpliva na sposobnost okužbe bakterije ''P. aeruginosa'' [1].

===Zaključek===
Kljub temu da so fagni genomi sorazmerno majhni, izkazujejo izjemno raznolikost, zato je funkcija večine fagnih genov še nepoznana. Cilj študije je bil pripraviti rekombinantne fage z reduciranim genomom, pri čemer bi zmanjšali število genov z neznano funkcijo, ter tudi preveriti, kako uvedene delecije vplivajo na učinkovitost okuževanja bakterijskih celic. V raziskavi so uspeli iz bakteriofaga PE3 odstraniti 12 neesencialnih genov, kar predstavlja 48 % genov z neznano funkcijo. Tako pripravljen fag je imel daljšo latentno fazo, proizvedel je manj virionov na celico, kljub temu pa je bila sposobnost okužbe bakterije ''P. aeruginosa'' v ''in vivo'' in ''in vitro'' študijah nespremenjena. Raziskava predstavlja manjši napredek pri razvoju novih fagnih terapij, pri katerih bi lahko v fagni genom uvedli gene s protibakterijsko učinkovitostjo in tudi zmanjšali delež genov z neznano funkcijo, ki bi imeli morebitni toksičen vpliv na človeka.

===Viri in literatura===
# D. P. Pires, R. Monteiro, D. Mil-Homens, A. Fialho, T. K. Lu in J. Azeredo: Designing ''P. aeruginosa'' synthetic phages with reduced genomes. ''Sci. Rep.'', '''2021''', ''11'', str. 1–10.
# Z. Pang, R. Raudonis, B. R. Glick, T. J. Lin in Z. Cheng: Antibiotic resistance in Pseudomonas aeruginosa: mechanisms and alternative therapeutic strategies. ''Biotechnology Advances'', '''2019''', ''37'', str. 177–192.
# CDC, HAI: Pseudomonas aeruginosa Infection. https://www.cdc.gov/hai/organisms/pseudomonas.html (citirano 23. 4. 2021).
# P. Hyman in S. T. Abedon: Chapter 18. V: Practical Methods for Determining Phage Growth Parameters. 2009, str. 175-202.

Oblikovanje sintetičnega faga iz P. aeruginosa z reduciranim genomom

2021-05-14T15:15:20Z

Martina Lokar: /* Priprava rekombinantnih bakteriofagov */

Povzeto po članku: [https://doi.org/10.1038/s41598-021-81580-2 D.P. Pires, R. Monteiro, D. Mil-Homens ''et al'': Designing ''P. aeruginosa'' synthetic phages with reduced genomes. ''Sci. Rep.'' '''2021''', 11(1), str. 1-10. https://doi.org/10.1038/s41598-021-81580-2]

===Uvod===
Odpornost bakterij na antibiotike postaja vedno večji problem, zato se v zadnjem času kot potencialna terapevtska učinkovina preučujejo tudi bakteriofagi. Kljub temu da je fagna terapija obetaven način zdravljenja, se sooča s številnimi izzivi, kot so varnost, stabilnost in način dostave učinkovine, sposobnost bakteriofagov, da lahko okužijo omejeno število gostiteljskih bakterij, odpornost na bakteriofage ter stranski učinki zaradi lize bakterijskih celic. Ena izmed potencialnih rešitev nekaterih izmed teh omejitev je oblikovanje genetsko spremenjenih bakteriofagov s povečano protibakterijsko učinkovitostjo. V ta namen moramo v fagni genom vstaviti dodatne gene, kar pa zaradi omejitve dolžine DNA, ki se lahko zapakira v virusno kapsido, predstavlja velik problem. Zato bi lahko iz virusnega genoma odstranili gene, ki zapisujejo proteine z neznano funkcijo, gene, ki omogočajo odpornost proti antibiotikom, kot tudi zapise za toksine in druge virulenčne faktorje. Hkrati bi torej zmanjšali verjetnost, da bi bili v genomu prisotni za človeka potencialno nevarni geni. Cilj raziskave je bil oblikovati sintetični fag z reduciranim genomom, ki bi ohranil sposobnost okužbe, razmnoževanja in lize gostiteljske celice [1].

''Pseudomonas aeruginosa'' je patogena bakterija, ki ima izjemno sposobnost razvoja odpornosti na antibiotike. Okužba se pojavi predvsem pri hospitaliziranih pacientih in je lahko smrtno nevarna za ljudi s cistično fibrozo in imunsko pomanjkljivostjo. Problematično je predvsem zdravljenje okužb z bolnišničnimi sevi, zato predstavlja fagna terapija potencialno rešitev [2, 3].

===Izolacija bakteriofaga PE3 in njegova karakterizacija===
V prvem koraku so raziskovalci iz odpadne vode pri čistilni napravi v mestu Braga na Portugalskem izolirali litični fag vB_PaeP_PE3 (okrajšano PE3), ki je sposoben okužiti bakterijo ''P. aeruginosa'' PAO1. Po izolaciji so s transmisijsko elektronsko mikroskopijo (TEM) preverili njegove strukturne lastnosti in ugotovili, da ima PE3 kratek nekontraktilni rep. Izkazalo se je, da je pridobljen fag sorazmerno specifičen, saj je bil sposoben okužiti 7 od 28 izoliranih kliničnih sevov ''P. aeruginosa''. V nadaljevanju so fagu posekvencirali celoten genom, ki je dsDNA dolžine 43.583 bp z 62,3 % deležem GC baznih parov in direktnimi končnimi ponovitvami dolžine 479 bp. S pomočjo računalniških orodij so ugotovili, da genom vključuje 55 kodirajočih zaporedij CDS (dolžine 120–4014 bp), med katerimi ima 30 CDS pripisane funkcije, 25 CDS pa zapisuje hipotetične proteine. Nadaljnja genomska analiza je pokazala, da fag najverjetneje ni virulenten, saj ne vključuje lizogenih genov [1].

===Priprava rekombinantnih bakteriofagov===
Ker velik delež genov v fagnem genomu nima pripisanih funkcij, se poraja vprašanje, če so ti geni nujno potrebni za replikacijo in protibakterijske lastnosti. V prvem delu fagnega genoma sta prisotna dva modula genov (modul gp1–gp5 in gp6–gp12), ki vključujeta zapise za hipotetične proteine in sta med seboj ločena z regulatornimi elementi. Z odstranitvijo posameznega modula so pripravili sintetična faga z reduciranim genomom vB_PaeP_PE3∆gp1-gp5 (okrajšano PE3∆gp1-gp5) in vB_PaeP_PE3∆gp6-gp12 (okrajšano PE3∆gp6-gp12).

Sintezo okrajšanega genoma so izvedli tako, da so s pomočjo reakcije PCR in uporabe ustreznih začetnih oligonukleotidov pomnožili celoten genom brez izbranega modula, pri čemer so se posamezni fragmenti v končnih regijah prekrivali. Tako so pripravili 6 prekrivajočih se PCR produktov, ki so predstavljali reduciran genom, in lineariziran YAC s terminalnimi regijami, ki so bile homologne koncema fagnega genoma. Nato so izvedli transformacijo kvasovk ''S. cerevisiae'' BY4741 s prekrivajočimi se sedmimi zaporedji DNA, kjer so se ta s pomočjo DNA popravljalnega mehanizma sestavila v ciklično strukturo fagnega genoma in umetnega kromosoma YAC (YAC-fag DNA). Ustreznost zaporedja so v nadaljevanju preverili z reakcijo PCR na osnovi ene kolonije, pri čemer so uporabili začetne oligonukleotide, ki se vežejo na regijo navzdol in navzgor od izbrisanega modula. Dolžine pomnožkov, ki so jih pri tem dobili, so bile krajše kot pri divjem tipu faga.

Da bi preverili, ali delecije v genomu vplivajo na viabilnost bakterofaga, so iz kvasovk izolirali YAC-fag DNA in jo transformirali v bakterijo ''P. aeruginosa'' PAO1, kjer so se fagni geni prepisovali in je prišlo do nastanka funkcionalnih bakteriofagov. Na ploščah s transformiranimi bakterijami so nastali plaki, ki so jih v nadaljevanju preverili s pomočjo reakcije PCR, pri kateri so uporabili že prej omenjene začetne oligonukleotide, ki se vežejo na regijo navzgor in navzdol od izbrisanega modula. S poskusom so dokazali viabilnost rekombinantnih fagov z reduciranim genomom in hkrati pokazali, da prvih 12 genov v fagnem genomu ni esencialnih za razmnoževanje in viabilnost.

Zaradi uspešne priprave dveh rekombinantnih fagov so se raziskovalci odločili pripraviti še tretji fag, pri čemer so izvedli delecijo 3194 bp oziroma vseh 12 genov (gp1–gp12) obeh začetnih modulov. Tretji rekombinantni fag vB_PaeP_PE3∆gp1-gp12 so pripravili po enakem postopku kot faga PE3∆gp1-gp5 in PE3∆gp6-gp12 [1].

===Karakterizacija rekombinantnih bakteriofagov===
Da bi bolje razumeli vpliv izbrisanih regij na lastnosti bakteriofagov, so značilnosti rekombinantnih fagov primerjali z divjim tipom PE3. Najprej so podrobneje analizirali morfologijo plakov, ki nastanejo po okužbi bakterije ''P. aeruginosa'', in ugotovili, da so rekombinantni bakteriofagi za razliko od bakteriofagov divjega tipa tvorili manjše plake. V nadaljevanju so preverili tudi specifičnost rekombinantnih fagov pri okužbi bakterijskih celic. PE3∆gp6-gp12 je bil enako kot PE3 sposoben okužiti 7 od 28 kliničnih izolatov ''P. aeruginosa'', medtem ko sta faga PE3∆gp1 gp5 in PE3∆gp1-gp12 učinkovito okužila in lizirala le 4 bakterijske seve [1].

Z nadaljnjimi poskusi so podrobneje preučili rastne parametre oziroma generacijski čas faga, ki vključuje čas adsorpcije, pritrditve in vnosa nukleinske kisline, latentno periodo in čas sproščanja virionov [4]. PE3 in PE3∆gp6-gp12, ki sta tvorila podobno rastno krivuljo, sta imela v primerjavi s PE3∆gp1-gp5 oziroma PE3∆gp1-gp12 5 min oziroma 15 min krajšo latentno fazo. Kljub temu je v bakterijskih celicah, okuženih s fagi PE3, PE3∆gp1-gp5 in PE3∆gp6-gp12, nastalo približno enako število fagnih delcev (okrog 200 PFU/okuženo celico), medtem ko je bilo v primeru PE3∆gp1-gp12 število nastalih fagnih delcev bistveno manjše (83 PFU/okuženo celico). Rezultati kažejo na to, da bi imeli lahko izbrisani geni funkcijo v zgodnjih stopnjah okužbe bakterije s fagom. Zaradi razlik v latentni fazi bi lahko sklepali, da so geni modula gp1-gp5 pomembni za interakcijo med fagom in bakterijo [1].

V procesu priprave rekombinantnih fagov bi lahko prišlo tudi do uvedbe naključnih mutacij v genomsko DNA, zato so vsem na novo pripravljenim fagom posekvencirali dedni material. Rezultate so dodatno potrdili tako, da so regije genoma, v katerih so s sekvenciranjem odkrili mutacijo, pomnožili v reakciji PCR in jim nato določili nukleotidno zaporedje s pomočjo Sangerjeve metode. V genomu PE3∆gp1-gp5 in PE3∆gp6-gp12 so odkrili 2 točkovni mutaciji, pri čemer je bila ena od teh skupna. V obeh fagih se je kot posledica uporabe istih PCR produktov za rekombinacijo v kvasovki pojavila tranzicijska mutacija na regiji gena gp47, ki zapisuje za nitasti protein repa. PE3∆gp1-gp5 je vseboval tudi tiho mutacijo v genu za endolizin (gp51), medtem ko je bila v PE3∆gp6-gp12 prisotna mutacija v nitastem proteinu repa gp46. V fagnem genomu PE3∆gp1-gp12 so odkrili tri točkovne mutacije, ki so bile prisotne v ogrodnem proteinu gp47 (tiha mutacija) in v nitastima proteinoma repa gp46 in gp47 (drugačnosmiselni mutaciji).

Za konec so z ''in vivo'' in ''in vitro'' poskusom preverili, če imajo uvedene delecije v genomu PE3 morebiten učinek na protibakterijske lastnosti. V ''in vitro'' eksperimentu so v bakterijsko kulturo ''P. aeruginosa'' v logaritemski fazi rasti dodali PE3 in rekombinante bakteriofage ter v 24-urnem intervalu preverjali delež živih bakterijskih celic. V eksperimentu ni bilo opaznih znatnih razlik med fagi, saj se je v vseh primerih približno dve uri po dodatku število viabilnih celic ''P. aeruginosa'' v primerjavi s kontrolo, kjer fagi niso bili dodani, zmanjšalo za približno 5-krat. Nato je v vseh primerih začelo število živih bakterijskih celic naraščati in po 24 urah je bila gostota okuženih in neokuženih celic enaka, kar kaže na to, da so se v vseh primerih zelo hitro oblikovale bakterijske celice, odporne na okužbo s fagom. Pri ''in vivo'' eksperimentu, ki nam omogoča boljše posnemanje naravnih pogojev, so kot modelni organizem uporabili ličinke molja ''G. mellonella'', ki so jih okužili s ''P. aeruginosa'' tako, da so vanje injicirali ustrezen volumen bakterije. Pol ure po okužbi z bakterijo so v žuželke injicirali še rekombinantne fage in divji tip PE3. Kot kontrolo so uporabili pufer, s čimer so preverili delež smrti, ki je posledica poškodb ob injiciranju. Delež preživelih žuželk je bil ob dodatku fagov občutno večji kot pri kontroli, pri čemer ni bilo opaznih znatnih sprememb med rekombinantnimi fagi in divjim tipom. Rezultati torej kažejo, da prisotnost delecij v fagnem genomu ne vpliva na sposobnost okužbe bakterije ''P. aeruginosa'' [1].

===Zaključek===
Kljub temu da so fagni genomi sorazmerno majhni, izkazujejo izjemno raznolikost, zato je funkcija večine fagnih genov še nepoznana. Cilj študije je bil pripraviti rekombinantne fage z reduciranim genomom, pri čemer bi zmanjšali število genov z neznano funkcijo, ter tudi preveriti, kako uvedene delecije vplivajo na učinkovitost okuževanja bakterijskih celic. V raziskavi so uspeli iz bakteriofaga PE3 odstraniti 12 neesencialnih genov, kar predstavlja 48 % genov z neznano funkcijo. Tako pripravljen fag je imel daljšo latentno fazo, proizvedel je manj virionov na celico, kljub temu pa je bila sposobnost okužbe bakterije ''P. aeruginosa'' v ''in vivo'' in ''in vitro'' študijah nespremenjena. Raziskava predstavlja manjši napredek pri razvoju novih fagnih terapij, pri katerih bi lahko v fagni genom uvedli gene s protibakterijsko učinkovitostjo in tudi zmanjšali delež genov z neznano funkcijo, ki bi imeli morebitni toksičen vpliv na človeka.

===Viri in literatura===
# D. P. Pires, R. Monteiro, D. Mil-Homens, A. Fialho, T. K. Lu in J. Azeredo: Designing ''P. aeruginosa'' synthetic phages with reduced genomes. ''Sci. Rep.'', '''2021''', ''11'', str. 1–10.
# Z. Pang, R. Raudonis, B. R. Glick, T. J. Lin in Z. Cheng: Antibiotic resistance in Pseudomonas aeruginosa: mechanisms and alternative therapeutic strategies. ''Biotechnology Advances'', '''2019''', ''37'', str. 177–192.
# CDC, HAI: Pseudomonas aeruginosa Infection. https://www.cdc.gov/hai/organisms/pseudomonas.html (citirano 23. 4. 2021).
# P. Hyman in S. T. Abedon: Chapter 18. V: Practical Methods for Determining Phage Growth Parameters. 2009, str. 175-202.

Oblikovanje sintetičnega faga iz P. aeruginosa z reduciranim genomom

2021-05-14T15:12:48Z

Martina Lokar: /* Izolacija bakteriofaga PE3 in njegova karakterizacija */

Povzeto po članku: [https://doi.org/10.1038/s41598-021-81580-2 D.P. Pires, R. Monteiro, D. Mil-Homens ''et al'': Designing ''P. aeruginosa'' synthetic phages with reduced genomes. ''Sci. Rep.'' '''2021''', 11(1), str. 1-10. https://doi.org/10.1038/s41598-021-81580-2]

===Uvod===
Odpornost bakterij na antibiotike postaja vedno večji problem, zato se v zadnjem času kot potencialna terapevtska učinkovina preučujejo tudi bakteriofagi. Kljub temu da je fagna terapija obetaven način zdravljenja, se sooča s številnimi izzivi, kot so varnost, stabilnost in način dostave učinkovine, sposobnost bakteriofagov, da lahko okužijo omejeno število gostiteljskih bakterij, odpornost na bakteriofage ter stranski učinki zaradi lize bakterijskih celic. Ena izmed potencialnih rešitev nekaterih izmed teh omejitev je oblikovanje genetsko spremenjenih bakteriofagov s povečano protibakterijsko učinkovitostjo. V ta namen moramo v fagni genom vstaviti dodatne gene, kar pa zaradi omejitve dolžine DNA, ki se lahko zapakira v virusno kapsido, predstavlja velik problem. Zato bi lahko iz virusnega genoma odstranili gene, ki zapisujejo proteine z neznano funkcijo, gene, ki omogočajo odpornost proti antibiotikom, kot tudi zapise za toksine in druge virulenčne faktorje. Hkrati bi torej zmanjšali verjetnost, da bi bili v genomu prisotni za človeka potencialno nevarni geni. Cilj raziskave je bil oblikovati sintetični fag z reduciranim genomom, ki bi ohranil sposobnost okužbe, razmnoževanja in lize gostiteljske celice [1].

''Pseudomonas aeruginosa'' je patogena bakterija, ki ima izjemno sposobnost razvoja odpornosti na antibiotike. Okužba se pojavi predvsem pri hospitaliziranih pacientih in je lahko smrtno nevarna za ljudi s cistično fibrozo in imunsko pomanjkljivostjo. Problematično je predvsem zdravljenje okužb z bolnišničnimi sevi, zato predstavlja fagna terapija potencialno rešitev [2, 3].

===Izolacija bakteriofaga PE3 in njegova karakterizacija===
V prvem koraku so raziskovalci iz odpadne vode pri čistilni napravi v mestu Braga na Portugalskem izolirali litični fag vB_PaeP_PE3 (okrajšano PE3), ki je sposoben okužiti bakterijo ''P. aeruginosa'' PAO1. Po izolaciji so s transmisijsko elektronsko mikroskopijo (TEM) preverili njegove strukturne lastnosti in ugotovili, da ima PE3 kratek nekontraktilni rep. Izkazalo se je, da je pridobljen fag sorazmerno specifičen, saj je bil sposoben okužiti 7 od 28 izoliranih kliničnih sevov ''P. aeruginosa''. V nadaljevanju so fagu posekvencirali celoten genom, ki je dsDNA dolžine 43.583 bp z 62,3 % deležem GC baznih parov in direktnimi končnimi ponovitvami dolžine 479 bp. S pomočjo računalniških orodij so ugotovili, da genom vključuje 55 kodirajočih zaporedij CDS (dolžine 120–4014 bp), med katerimi ima 30 CDS pripisane funkcije, 25 CDS pa zapisuje hipotetične proteine. Nadaljnja genomska analiza je pokazala, da fag najverjetneje ni virulenten, saj ne vključuje lizogenih genov [1].

===Priprava rekombinantnih bakteriofagov===
Ker velik delež genov v fagnem genomu nima pripisanih funkcij, se poraja vprašanje, če so ti geni nujno potrebni za replikacijo in protibakterijske lastnosti. V prvem delu fagnega genoma sta prisotna dva modula genov (modul gp1–gp5 in gp6–gp12), ki vključujeta zapise za hipotetične proteine in sta med seboj ločena z regulatornimi elementi. Z odstranitvijo posameznega modula so pripravili sintetična faga z reduciranim genomom vB_PaeP_PE3∆gp1-gp5 (okrajšano PE3∆gp1-gp5) in vB_PaeP_PE3∆gp6-gp12 (okrajšano PE3∆gp6-gp12).

Sintezo okrajšanega genoma so izvedli tako, da so s pomočjo reakcije PCR in uporabe ustreznih začetnih oligonukleotidov pomnožili celoten genom brez izbranega modula, pri čemer so se posamezni fragmenti v končnih regijah prekrivali. Tako so pripravili 6 prekrivajočih se PCR produktov, ki so predstavljali reduciran genom, in lineariziran YAC s terminalnimi regijami, ki so bile homologne koncema fagnega genoma. Nato so izvedli transformacijo kvasovk ''S. cerevisiae'' BY4741 s prekrivajočimi se sedmimi zaporedji DNA, kjer so se ta s pomočjo DNA popravljalnega mehanizma sestavila v ciklično strukturo fagnega genoma in umetnega kromosoma YAC (YAC-fag DNA). Ustreznost zaporedja so v nadaljevanju preverili z reakcijo PCR na osnovi ene kolonije, pri čemer so uporabili začetne oligonukleotide, ki se vežejo na regijo navzdol in navzgor od izbrisanega modula. Dolžine pomnožkov, ki so jih pri tem dobili, so bile krajše kot pri divjem tipu faga.

Da bi preverili, ali delecije v genomu vplivajo na viabilnost bakterofaga, so iz kvasovk izolirali YAC-fag DNA in jo transformirali v bakterijo P. aeruginosa PAO1, kjer so se fagni geni prepisovali in je prišlo do nastanka funkcionalnih bakteriofagov. Na ploščah s transformiranimi bakterijami so nastali plaki, ki so jih v nadaljevanju preverili s pomočjo reakcije PCR, pri kateri so uporabili že prej omenjene začetne oligonukleotide, ki se vežejo na regijo navzgor in navzdol od izbrisanega modula. S poskusom so dokazali viabilnost rekombinantnih fagov z reduciranim genomom in hkrati pokazali, da prvih 12 genov v fagnem genomu ni esencialnih za razmnoževanje in viabilnost.

Zaradi uspešne priprave dveh rekombinantnih fagov so se raziskovalci odločili pripraviti še tretji fag, pri čemer so izvedli delecijo 3194 bp oziroma vseh 12 genov (gp1–gp12) obeh začetnih modulov. Tretji rekombinantni fag vB_PaeP_PE3∆gp1-gp12 so pripravili po enakem postopku kot faga PE3∆gp1-gp5 in PE3∆gp6-gp12 [1].

===Karakterizacija rekombinantnih bakteriofagov===
Da bi bolje razumeli vpliv izbrisanih regij na lastnosti bakteriofagov, so značilnosti rekombinantnih fagov primerjali z divjim tipom PE3. Najprej so podrobneje analizirali morfologijo plakov, ki nastanejo po okužbi bakterije ''P. aeruginosa'', in ugotovili, da so rekombinantni bakteriofagi za razliko od bakteriofagov divjega tipa tvorili manjše plake. V nadaljevanju so preverili tudi specifičnost rekombinantnih fagov pri okužbi bakterijskih celic. PE3∆gp6-gp12 je bil enako kot PE3 sposoben okužiti 7 od 28 kliničnih izolatov ''P. aeruginosa'', medtem ko sta faga PE3∆gp1 gp5 in PE3∆gp1-gp12 učinkovito okužila in lizirala le 4 bakterijske seve [1].

Z nadaljnjimi poskusi so podrobneje preučili rastne parametre oziroma generacijski čas faga, ki vključuje čas adsorpcije, pritrditve in vnosa nukleinske kisline, latentno periodo in čas sproščanja virionov [4]. PE3 in PE3∆gp6-gp12, ki sta tvorila podobno rastno krivuljo, sta imela v primerjavi s PE3∆gp1-gp5 oziroma PE3∆gp1-gp12 5 min oziroma 15 min krajšo latentno fazo. Kljub temu je v bakterijskih celicah, okuženih s fagi PE3, PE3∆gp1-gp5 in PE3∆gp6-gp12, nastalo približno enako število fagnih delcev (okrog 200 PFU/okuženo celico), medtem ko je bilo v primeru PE3∆gp1-gp12 število nastalih fagnih delcev bistveno manjše (83 PFU/okuženo celico). Rezultati kažejo na to, da bi imeli lahko izbrisani geni funkcijo v zgodnjih stopnjah okužbe bakterije s fagom. Zaradi razlik v latentni fazi bi lahko sklepali, da so geni modula gp1-gp5 pomembni za interakcijo med fagom in bakterijo [1].

V procesu priprave rekombinantnih fagov bi lahko prišlo tudi do uvedbe naključnih mutacij v genomsko DNA, zato so vsem na novo pripravljenim fagom posekvencirali dedni material. Rezultate so dodatno potrdili tako, da so regije genoma, v katerih so s sekvenciranjem odkrili mutacijo, pomnožili v reakciji PCR in jim nato določili nukleotidno zaporedje s pomočjo Sangerjeve metode. V genomu PE3∆gp1-gp5 in PE3∆gp6-gp12 so odkrili 2 točkovni mutaciji, pri čemer je bila ena od teh skupna. V obeh fagih se je kot posledica uporabe istih PCR produktov za rekombinacijo v kvasovki pojavila tranzicijska mutacija na regiji gena gp47, ki zapisuje za nitasti protein repa. PE3∆gp1-gp5 je vseboval tudi tiho mutacijo v genu za endolizin (gp51), medtem ko je bila v PE3∆gp6-gp12 prisotna mutacija v nitastem proteinu repa gp46. V fagnem genomu PE3∆gp1-gp12 so odkrili tri točkovne mutacije, ki so bile prisotne v ogrodnem proteinu gp47 (tiha mutacija) in v nitastima proteinoma repa gp46 in gp47 (drugačnosmiselni mutaciji).

Za konec so z ''in vivo'' in ''in vitro'' poskusom preverili, če imajo uvedene delecije v genomu PE3 morebiten učinek na protibakterijske lastnosti. V ''in vitro'' eksperimentu so v bakterijsko kulturo ''P. aeruginosa'' v logaritemski fazi rasti dodali PE3 in rekombinante bakteriofage ter v 24-urnem intervalu preverjali delež živih bakterijskih celic. V eksperimentu ni bilo opaznih znatnih razlik med fagi, saj se je v vseh primerih približno dve uri po dodatku število viabilnih celic ''P. aeruginosa'' v primerjavi s kontrolo, kjer fagi niso bili dodani, zmanjšalo za približno 5-krat. Nato je v vseh primerih začelo število živih bakterijskih celic naraščati in po 24 urah je bila gostota okuženih in neokuženih celic enaka, kar kaže na to, da so se v vseh primerih zelo hitro oblikovale bakterijske celice, odporne na okužbo s fagom. Pri ''in vivo'' eksperimentu, ki nam omogoča boljše posnemanje naravnih pogojev, so kot modelni organizem uporabili ličinke molja ''G. mellonella'', ki so jih okužili s ''P. aeruginosa'' tako, da so vanje injicirali ustrezen volumen bakterije. Pol ure po okužbi z bakterijo so v žuželke injicirali še rekombinantne fage in divji tip PE3. Kot kontrolo so uporabili pufer, s čimer so preverili delež smrti, ki je posledica poškodb ob injiciranju. Delež preživelih žuželk je bil ob dodatku fagov občutno večji kot pri kontroli, pri čemer ni bilo opaznih znatnih sprememb med rekombinantnimi fagi in divjim tipom. Rezultati torej kažejo, da prisotnost delecij v fagnem genomu ne vpliva na sposobnost okužbe bakterije ''P. aeruginosa'' [1].

===Zaključek===
Kljub temu da so fagni genomi sorazmerno majhni, izkazujejo izjemno raznolikost, zato je funkcija večine fagnih genov še nepoznana. Cilj študije je bil pripraviti rekombinantne fage z reduciranim genomom, pri čemer bi zmanjšali število genov z neznano funkcijo, ter tudi preveriti, kako uvedene delecije vplivajo na učinkovitost okuževanja bakterijskih celic. V raziskavi so uspeli iz bakteriofaga PE3 odstraniti 12 neesencialnih genov, kar predstavlja 48 % genov z neznano funkcijo. Tako pripravljen fag je imel daljšo latentno fazo, proizvedel je manj virionov na celico, kljub temu pa je bila sposobnost okužbe bakterije ''P. aeruginosa'' v ''in vivo'' in ''in vitro'' študijah nespremenjena. Raziskava predstavlja manjši napredek pri razvoju novih fagnih terapij, pri katerih bi lahko v fagni genom uvedli gene s protibakterijsko učinkovitostjo in tudi zmanjšali delež genov z neznano funkcijo, ki bi imeli morebitni toksičen vpliv na človeka.

===Viri in literatura===
# D. P. Pires, R. Monteiro, D. Mil-Homens, A. Fialho, T. K. Lu in J. Azeredo: Designing ''P. aeruginosa'' synthetic phages with reduced genomes. ''Sci. Rep.'', '''2021''', ''11'', str. 1–10.
# Z. Pang, R. Raudonis, B. R. Glick, T. J. Lin in Z. Cheng: Antibiotic resistance in Pseudomonas aeruginosa: mechanisms and alternative therapeutic strategies. ''Biotechnology Advances'', '''2019''', ''37'', str. 177–192.
# CDC, HAI: Pseudomonas aeruginosa Infection. https://www.cdc.gov/hai/organisms/pseudomonas.html (citirano 23. 4. 2021).
# P. Hyman in S. T. Abedon: Chapter 18. V: Practical Methods for Determining Phage Growth Parameters. 2009, str. 175-202.

Oblikovanje sintetičnega faga iz P. aeruginosa z reduciranim genomom

2021-05-14T15:11:31Z

Martina Lokar: /* Uvod */

Povzeto po članku: [https://doi.org/10.1038/s41598-021-81580-2 D.P. Pires, R. Monteiro, D. Mil-Homens ''et al'': Designing ''P. aeruginosa'' synthetic phages with reduced genomes. ''Sci. Rep.'' '''2021''', 11(1), str. 1-10. https://doi.org/10.1038/s41598-021-81580-2]

===Uvod===
Odpornost bakterij na antibiotike postaja vedno večji problem, zato se v zadnjem času kot potencialna terapevtska učinkovina preučujejo tudi bakteriofagi. Kljub temu da je fagna terapija obetaven način zdravljenja, se sooča s številnimi izzivi, kot so varnost, stabilnost in način dostave učinkovine, sposobnost bakteriofagov, da lahko okužijo omejeno število gostiteljskih bakterij, odpornost na bakteriofage ter stranski učinki zaradi lize bakterijskih celic. Ena izmed potencialnih rešitev nekaterih izmed teh omejitev je oblikovanje genetsko spremenjenih bakteriofagov s povečano protibakterijsko učinkovitostjo. V ta namen moramo v fagni genom vstaviti dodatne gene, kar pa zaradi omejitve dolžine DNA, ki se lahko zapakira v virusno kapsido, predstavlja velik problem. Zato bi lahko iz virusnega genoma odstranili gene, ki zapisujejo proteine z neznano funkcijo, gene, ki omogočajo odpornost proti antibiotikom, kot tudi zapise za toksine in druge virulenčne faktorje. Hkrati bi torej zmanjšali verjetnost, da bi bili v genomu prisotni za človeka potencialno nevarni geni. Cilj raziskave je bil oblikovati sintetični fag z reduciranim genomom, ki bi ohranil sposobnost okužbe, razmnoževanja in lize gostiteljske celice [1].

''Pseudomonas aeruginosa'' je patogena bakterija, ki ima izjemno sposobnost razvoja odpornosti na antibiotike. Okužba se pojavi predvsem pri hospitaliziranih pacientih in je lahko smrtno nevarna za ljudi s cistično fibrozo in imunsko pomanjkljivostjo. Problematično je predvsem zdravljenje okužb z bolnišničnimi sevi, zato predstavlja fagna terapija potencialno rešitev [2, 3].

===Izolacija bakteriofaga PE3 in njegova karakterizacija===
V prvem koraku so raziskovalci iz odpadne vode pri čistilni napravi v mestu Braga na Portugalskem izolirali litični fag vB_PaeP_PE3 (okrajšano PE3), ki je sposoben okužiti bakterijo ''P. aeruginosa'' PAO1. Po izolaciji so s transmisijsko elektronsko mikroskopijo (TEM) preverili njegove strukturne lastnosti in ugotovili, da ima PE3 kratek nekontraktilni rep. Izkazalo se je, da je izoliran fag sorazmerno specifičen, saj je bil sposoben okužiti 7 od 28 izoliranih kliničnih sevov ''P. aeruginosa''. V nadaljevanju so fagu posekvencirali celoten genom, ki je dsDNA dolžine 43.583 bp z 62,3 % deležem GC baznih parov in direktnimi končnimi ponovitvami dolžine 479 bp. S pomočjo računalniških orodij so ugotovili, da genom vključuje 55 kodirajočih zaporedij CDS (dolžine 120–4014 bp), med katerimi ima 30 CDS pripisane funkcije, 25 CDS pa zapisuje hipotetične proteine. Nadaljnja genomska analiza je pokazala, da fag najverjetneje ni virulenten, saj ne vključuje lizogenih genov [1].

===Priprava rekombinantnih bakteriofagov===
Ker velik delež genov v fagnem genomu nima pripisanih funkcij, se poraja vprašanje, če so ti geni nujno potrebni za replikacijo in protibakterijske lastnosti. V prvem delu fagnega genoma sta prisotna dva modula genov (modul gp1–gp5 in gp6–gp12), ki vključujeta zapise za hipotetične proteine in sta med seboj ločena z regulatornimi elementi. Z odstranitvijo posameznega modula so pripravili sintetična faga z reduciranim genomom vB_PaeP_PE3∆gp1-gp5 (okrajšano PE3∆gp1-gp5) in vB_PaeP_PE3∆gp6-gp12 (okrajšano PE3∆gp6-gp12).

Sintezo okrajšanega genoma so izvedli tako, da so s pomočjo reakcije PCR in uporabe ustreznih začetnih oligonukleotidov pomnožili celoten genom brez izbranega modula, pri čemer so se posamezni fragmenti v končnih regijah prekrivali. Tako so pripravili 6 prekrivajočih se PCR produktov, ki so predstavljali reduciran genom, in lineariziran YAC s terminalnimi regijami, ki so bile homologne koncema fagnega genoma. Nato so izvedli transformacijo kvasovk ''S. cerevisiae'' BY4741 s prekrivajočimi se sedmimi zaporedji DNA, kjer so se ta s pomočjo DNA popravljalnega mehanizma sestavila v ciklično strukturo fagnega genoma in umetnega kromosoma YAC (YAC-fag DNA). Ustreznost zaporedja so v nadaljevanju preverili z reakcijo PCR na osnovi ene kolonije, pri čemer so uporabili začetne oligonukleotide, ki se vežejo na regijo navzdol in navzgor od izbrisanega modula. Dolžine pomnožkov, ki so jih pri tem dobili, so bile krajše kot pri divjem tipu faga.

Da bi preverili, ali delecije v genomu vplivajo na viabilnost bakterofaga, so iz kvasovk izolirali YAC-fag DNA in jo transformirali v bakterijo P. aeruginosa PAO1, kjer so se fagni geni prepisovali in je prišlo do nastanka funkcionalnih bakteriofagov. Na ploščah s transformiranimi bakterijami so nastali plaki, ki so jih v nadaljevanju preverili s pomočjo reakcije PCR, pri kateri so uporabili že prej omenjene začetne oligonukleotide, ki se vežejo na regijo navzgor in navzdol od izbrisanega modula. S poskusom so dokazali viabilnost rekombinantnih fagov z reduciranim genomom in hkrati pokazali, da prvih 12 genov v fagnem genomu ni esencialnih za razmnoževanje in viabilnost.

Zaradi uspešne priprave dveh rekombinantnih fagov so se raziskovalci odločili pripraviti še tretji fag, pri čemer so izvedli delecijo 3194 bp oziroma vseh 12 genov (gp1–gp12) obeh začetnih modulov. Tretji rekombinantni fag vB_PaeP_PE3∆gp1-gp12 so pripravili po enakem postopku kot faga PE3∆gp1-gp5 in PE3∆gp6-gp12 [1].

===Karakterizacija rekombinantnih bakteriofagov===
Da bi bolje razumeli vpliv izbrisanih regij na lastnosti bakteriofagov, so značilnosti rekombinantnih fagov primerjali z divjim tipom PE3. Najprej so podrobneje analizirali morfologijo plakov, ki nastanejo po okužbi bakterije ''P. aeruginosa'', in ugotovili, da so rekombinantni bakteriofagi za razliko od bakteriofagov divjega tipa tvorili manjše plake. V nadaljevanju so preverili tudi specifičnost rekombinantnih fagov pri okužbi bakterijskih celic. PE3∆gp6-gp12 je bil enako kot PE3 sposoben okužiti 7 od 28 kliničnih izolatov ''P. aeruginosa'', medtem ko sta faga PE3∆gp1 gp5 in PE3∆gp1-gp12 učinkovito okužila in lizirala le 4 bakterijske seve [1].

Z nadaljnjimi poskusi so podrobneje preučili rastne parametre oziroma generacijski čas faga, ki vključuje čas adsorpcije, pritrditve in vnosa nukleinske kisline, latentno periodo in čas sproščanja virionov [4]. PE3 in PE3∆gp6-gp12, ki sta tvorila podobno rastno krivuljo, sta imela v primerjavi s PE3∆gp1-gp5 oziroma PE3∆gp1-gp12 5 min oziroma 15 min krajšo latentno fazo. Kljub temu je v bakterijskih celicah, okuženih s fagi PE3, PE3∆gp1-gp5 in PE3∆gp6-gp12, nastalo približno enako število fagnih delcev (okrog 200 PFU/okuženo celico), medtem ko je bilo v primeru PE3∆gp1-gp12 število nastalih fagnih delcev bistveno manjše (83 PFU/okuženo celico). Rezultati kažejo na to, da bi imeli lahko izbrisani geni funkcijo v zgodnjih stopnjah okužbe bakterije s fagom. Zaradi razlik v latentni fazi bi lahko sklepali, da so geni modula gp1-gp5 pomembni za interakcijo med fagom in bakterijo [1].

V procesu priprave rekombinantnih fagov bi lahko prišlo tudi do uvedbe naključnih mutacij v genomsko DNA, zato so vsem na novo pripravljenim fagom posekvencirali dedni material. Rezultate so dodatno potrdili tako, da so regije genoma, v katerih so s sekvenciranjem odkrili mutacijo, pomnožili v reakciji PCR in jim nato določili nukleotidno zaporedje s pomočjo Sangerjeve metode. V genomu PE3∆gp1-gp5 in PE3∆gp6-gp12 so odkrili 2 točkovni mutaciji, pri čemer je bila ena od teh skupna. V obeh fagih se je kot posledica uporabe istih PCR produktov za rekombinacijo v kvasovki pojavila tranzicijska mutacija na regiji gena gp47, ki zapisuje za nitasti protein repa. PE3∆gp1-gp5 je vseboval tudi tiho mutacijo v genu za endolizin (gp51), medtem ko je bila v PE3∆gp6-gp12 prisotna mutacija v nitastem proteinu repa gp46. V fagnem genomu PE3∆gp1-gp12 so odkrili tri točkovne mutacije, ki so bile prisotne v ogrodnem proteinu gp47 (tiha mutacija) in v nitastima proteinoma repa gp46 in gp47 (drugačnosmiselni mutaciji).

Za konec so z ''in vivo'' in ''in vitro'' poskusom preverili, če imajo uvedene delecije v genomu PE3 morebiten učinek na protibakterijske lastnosti. V ''in vitro'' eksperimentu so v bakterijsko kulturo ''P. aeruginosa'' v logaritemski fazi rasti dodali PE3 in rekombinante bakteriofage ter v 24-urnem intervalu preverjali delež živih bakterijskih celic. V eksperimentu ni bilo opaznih znatnih razlik med fagi, saj se je v vseh primerih približno dve uri po dodatku število viabilnih celic ''P. aeruginosa'' v primerjavi s kontrolo, kjer fagi niso bili dodani, zmanjšalo za približno 5-krat. Nato je v vseh primerih začelo število živih bakterijskih celic naraščati in po 24 urah je bila gostota okuženih in neokuženih celic enaka, kar kaže na to, da so se v vseh primerih zelo hitro oblikovale bakterijske celice, odporne na okužbo s fagom. Pri ''in vivo'' eksperimentu, ki nam omogoča boljše posnemanje naravnih pogojev, so kot modelni organizem uporabili ličinke molja ''G. mellonella'', ki so jih okužili s ''P. aeruginosa'' tako, da so vanje injicirali ustrezen volumen bakterije. Pol ure po okužbi z bakterijo so v žuželke injicirali še rekombinantne fage in divji tip PE3. Kot kontrolo so uporabili pufer, s čimer so preverili delež smrti, ki je posledica poškodb ob injiciranju. Delež preživelih žuželk je bil ob dodatku fagov občutno večji kot pri kontroli, pri čemer ni bilo opaznih znatnih sprememb med rekombinantnimi fagi in divjim tipom. Rezultati torej kažejo, da prisotnost delecij v fagnem genomu ne vpliva na sposobnost okužbe bakterije ''P. aeruginosa'' [1].

===Zaključek===
Kljub temu da so fagni genomi sorazmerno majhni, izkazujejo izjemno raznolikost, zato je funkcija večine fagnih genov še nepoznana. Cilj študije je bil pripraviti rekombinantne fage z reduciranim genomom, pri čemer bi zmanjšali število genov z neznano funkcijo, ter tudi preveriti, kako uvedene delecije vplivajo na učinkovitost okuževanja bakterijskih celic. V raziskavi so uspeli iz bakteriofaga PE3 odstraniti 12 neesencialnih genov, kar predstavlja 48 % genov z neznano funkcijo. Tako pripravljen fag je imel daljšo latentno fazo, proizvedel je manj virionov na celico, kljub temu pa je bila sposobnost okužbe bakterije ''P. aeruginosa'' v ''in vivo'' in ''in vitro'' študijah nespremenjena. Raziskava predstavlja manjši napredek pri razvoju novih fagnih terapij, pri katerih bi lahko v fagni genom uvedli gene s protibakterijsko učinkovitostjo in tudi zmanjšali delež genov z neznano funkcijo, ki bi imeli morebitni toksičen vpliv na človeka.

===Viri in literatura===
# D. P. Pires, R. Monteiro, D. Mil-Homens, A. Fialho, T. K. Lu in J. Azeredo: Designing ''P. aeruginosa'' synthetic phages with reduced genomes. ''Sci. Rep.'', '''2021''', ''11'', str. 1–10.
# Z. Pang, R. Raudonis, B. R. Glick, T. J. Lin in Z. Cheng: Antibiotic resistance in Pseudomonas aeruginosa: mechanisms and alternative therapeutic strategies. ''Biotechnology Advances'', '''2019''', ''37'', str. 177–192.
# CDC, HAI: Pseudomonas aeruginosa Infection. https://www.cdc.gov/hai/organisms/pseudomonas.html (citirano 23. 4. 2021).
# P. Hyman in S. T. Abedon: Chapter 18. V: Practical Methods for Determining Phage Growth Parameters. 2009, str. 175-202.

Oblikovanje sintetičnega faga iz P. aeruginosa z reduciranim genomom

2021-05-14T15:09:54Z

Martina Lokar: /* Uvod */

Povzeto po članku: [https://doi.org/10.1038/s41598-021-81580-2 D.P. Pires, R. Monteiro, D. Mil-Homens ''et al'': Designing ''P. aeruginosa'' synthetic phages with reduced genomes. ''Sci. Rep.'' '''2021''', 11(1), str. 1-10. https://doi.org/10.1038/s41598-021-81580-2]

===Uvod===
Odpornost bakterij na antibiotike postaja vedno večji problem, zato se v zadnjem času kot potencialna terapevtska učinkovina preučujejo tudi bakteriofagi. Kljub temu da je fagna terapija obetaven način zdravljenja, se sooča s številnimi izzivi, kot so varnost, stabilnost in način dostave učinkovine, sposobnost bakteriofagov, da lahko okužijo omejeno število gostiteljskih bakterij, odpornost na bakteriofage ter stranski učinki zaradi lize bakterijskih celic. Ena izmed potencialnih rešitev nekaterih izmed teh omejitev je oblikovanje genetsko spremenjenih bakteriofagov s povečano protibakterijsko učinkovitostjo. V ta namen moramo v fagni genom vstaviti dodatne gene, kar pa zaradi omejitve dolžine DNA, ki se lahko zapakira v virusno kapsido, predstavlja velik problem. Zato bi lahko iz virusnega genoma odstranili gene, ki zapisujejo proteine z neznano funkcijo, gene, ki omogočajo odpornost proti antibiotikom, kot tudi zapise za toksine in druge virulenčne faktorje. Hkrati bi torej zmanjšali verjetnost, da bi bili v genomu prisotni za človeka potencialno nevarni geni. Cilj raziskave je bil oblikovati sintetični fag z reduciranim genomom, ki bi ohranil sposobnost okužbe, razmnoževanja in lize gostiteljske celice [1].

''Pseudomonas aeruginosa'' je patogena bakterija, ki ima izjemno sposobnost razvoja odpornosti na antibiotike. Okužba se pojavi predvsem pri hospitaliziranih pacientih in je lahko smrtno nevarna za ljudi s cistično fibrozo in imunsko pomanjkljivostjo. Problematično je predvsem zdravljenje okužb z bolnišničnimi sevi, zato predstavlja fagna terapija potencialno rešitev [2], [3].

===Izolacija bakteriofaga PE3 in njegova karakterizacija===
V prvem koraku so raziskovalci iz odpadne vode pri čistilni napravi v mestu Braga na Portugalskem izolirali litični fag vB_PaeP_PE3 (okrajšano PE3), ki je sposoben okužiti bakterijo ''P. aeruginosa'' PAO1. Po izolaciji so s transmisijsko elektronsko mikroskopijo (TEM) preverili njegove strukturne lastnosti in ugotovili, da ima PE3 kratek nekontraktilni rep. Izkazalo se je, da je izoliran fag sorazmerno specifičen, saj je bil sposoben okužiti 7 od 28 izoliranih kliničnih sevov ''P. aeruginosa''. V nadaljevanju so fagu posekvencirali celoten genom, ki je dsDNA dolžine 43.583 bp z 62,3 % deležem GC baznih parov in direktnimi končnimi ponovitvami dolžine 479 bp. S pomočjo računalniških orodij so ugotovili, da genom vključuje 55 kodirajočih zaporedij CDS (dolžine 120–4014 bp), med katerimi ima 30 CDS pripisane funkcije, 25 CDS pa zapisuje hipotetične proteine. Nadaljnja genomska analiza je pokazala, da fag najverjetneje ni virulenten, saj ne vključuje lizogenih genov [1].

===Priprava rekombinantnih bakteriofagov===
Ker velik delež genov v fagnem genomu nima pripisanih funkcij, se poraja vprašanje, če so ti geni nujno potrebni za replikacijo in protibakterijske lastnosti. V prvem delu fagnega genoma sta prisotna dva modula genov (modul gp1–gp5 in gp6–gp12), ki vključujeta zapise za hipotetične proteine in sta med seboj ločena z regulatornimi elementi. Z odstranitvijo posameznega modula so pripravili sintetična faga z reduciranim genomom vB_PaeP_PE3∆gp1-gp5 (okrajšano PE3∆gp1-gp5) in vB_PaeP_PE3∆gp6-gp12 (okrajšano PE3∆gp6-gp12).

Sintezo okrajšanega genoma so izvedli tako, da so s pomočjo reakcije PCR in uporabe ustreznih začetnih oligonukleotidov pomnožili celoten genom brez izbranega modula, pri čemer so se posamezni fragmenti v končnih regijah prekrivali. Tako so pripravili 6 prekrivajočih se PCR produktov, ki so predstavljali reduciran genom, in lineariziran YAC s terminalnimi regijami, ki so bile homologne koncema fagnega genoma. Nato so izvedli transformacijo kvasovk ''S. cerevisiae'' BY4741 s prekrivajočimi se sedmimi zaporedji DNA, kjer so se ta s pomočjo DNA popravljalnega mehanizma sestavila v ciklično strukturo fagnega genoma in umetnega kromosoma YAC (YAC-fag DNA). Ustreznost zaporedja so v nadaljevanju preverili z reakcijo PCR na osnovi ene kolonije, pri čemer so uporabili začetne oligonukleotide, ki se vežejo na regijo navzdol in navzgor od izbrisanega modula. Dolžine pomnožkov, ki so jih pri tem dobili, so bile krajše kot pri divjem tipu faga.

Da bi preverili, ali delecije v genomu vplivajo na viabilnost bakterofaga, so iz kvasovk izolirali YAC-fag DNA in jo transformirali v bakterijo P. aeruginosa PAO1, kjer so se fagni geni prepisovali in je prišlo do nastanka funkcionalnih bakteriofagov. Na ploščah s transformiranimi bakterijami so nastali plaki, ki so jih v nadaljevanju preverili s pomočjo reakcije PCR, pri kateri so uporabili že prej omenjene začetne oligonukleotide, ki se vežejo na regijo navzgor in navzdol od izbrisanega modula. S poskusom so dokazali viabilnost rekombinantnih fagov z reduciranim genomom in hkrati pokazali, da prvih 12 genov v fagnem genomu ni esencialnih za razmnoževanje in viabilnost.

Zaradi uspešne priprave dveh rekombinantnih fagov so se raziskovalci odločili pripraviti še tretji fag, pri čemer so izvedli delecijo 3194 bp oziroma vseh 12 genov (gp1–gp12) obeh začetnih modulov. Tretji rekombinantni fag vB_PaeP_PE3∆gp1-gp12 so pripravili po enakem postopku kot faga PE3∆gp1-gp5 in PE3∆gp6-gp12 [1].

===Karakterizacija rekombinantnih bakteriofagov===
Da bi bolje razumeli vpliv izbrisanih regij na lastnosti bakteriofagov, so značilnosti rekombinantnih fagov primerjali z divjim tipom PE3. Najprej so podrobneje analizirali morfologijo plakov, ki nastanejo po okužbi bakterije ''P. aeruginosa'', in ugotovili, da so rekombinantni bakteriofagi za razliko od bakteriofagov divjega tipa tvorili manjše plake. V nadaljevanju so preverili tudi specifičnost rekombinantnih fagov pri okužbi bakterijskih celic. PE3∆gp6-gp12 je bil enako kot PE3 sposoben okužiti 7 od 28 kliničnih izolatov ''P. aeruginosa'', medtem ko sta faga PE3∆gp1 gp5 in PE3∆gp1-gp12 učinkovito okužila in lizirala le 4 bakterijske seve [1].

Z nadaljnjimi poskusi so podrobneje preučili rastne parametre oziroma generacijski čas faga, ki vključuje čas adsorpcije, pritrditve in vnosa nukleinske kisline, latentno periodo in čas sproščanja virionov [4]. PE3 in PE3∆gp6-gp12, ki sta tvorila podobno rastno krivuljo, sta imela v primerjavi s PE3∆gp1-gp5 oziroma PE3∆gp1-gp12 5 min oziroma 15 min krajšo latentno fazo. Kljub temu je v bakterijskih celicah, okuženih s fagi PE3, PE3∆gp1-gp5 in PE3∆gp6-gp12, nastalo približno enako število fagnih delcev (okrog 200 PFU/okuženo celico), medtem ko je bilo v primeru PE3∆gp1-gp12 število nastalih fagnih delcev bistveno manjše (83 PFU/okuženo celico). Rezultati kažejo na to, da bi imeli lahko izbrisani geni funkcijo v zgodnjih stopnjah okužbe bakterije s fagom. Zaradi razlik v latentni fazi bi lahko sklepali, da so geni modula gp1-gp5 pomembni za interakcijo med fagom in bakterijo [1].

V procesu priprave rekombinantnih fagov bi lahko prišlo tudi do uvedbe naključnih mutacij v genomsko DNA, zato so vsem na novo pripravljenim fagom posekvencirali dedni material. Rezultate so dodatno potrdili tako, da so regije genoma, v katerih so s sekvenciranjem odkrili mutacijo, pomnožili v reakciji PCR in jim nato določili nukleotidno zaporedje s pomočjo Sangerjeve metode. V genomu PE3∆gp1-gp5 in PE3∆gp6-gp12 so odkrili 2 točkovni mutaciji, pri čemer je bila ena od teh skupna. V obeh fagih se je kot posledica uporabe istih PCR produktov za rekombinacijo v kvasovki pojavila tranzicijska mutacija na regiji gena gp47, ki zapisuje za nitasti protein repa. PE3∆gp1-gp5 je vseboval tudi tiho mutacijo v genu za endolizin (gp51), medtem ko je bila v PE3∆gp6-gp12 prisotna mutacija v nitastem proteinu repa gp46. V fagnem genomu PE3∆gp1-gp12 so odkrili tri točkovne mutacije, ki so bile prisotne v ogrodnem proteinu gp47 (tiha mutacija) in v nitastima proteinoma repa gp46 in gp47 (drugačnosmiselni mutaciji).

Za konec so z ''in vivo'' in ''in vitro'' poskusom preverili, če imajo uvedene delecije v genomu PE3 morebiten učinek na protibakterijske lastnosti. V ''in vitro'' eksperimentu so v bakterijsko kulturo ''P. aeruginosa'' v logaritemski fazi rasti dodali PE3 in rekombinante bakteriofage ter v 24-urnem intervalu preverjali delež živih bakterijskih celic. V eksperimentu ni bilo opaznih znatnih razlik med fagi, saj se je v vseh primerih približno dve uri po dodatku število viabilnih celic ''P. aeruginosa'' v primerjavi s kontrolo, kjer fagi niso bili dodani, zmanjšalo za približno 5-krat. Nato je v vseh primerih začelo število živih bakterijskih celic naraščati in po 24 urah je bila gostota okuženih in neokuženih celic enaka, kar kaže na to, da so se v vseh primerih zelo hitro oblikovale bakterijske celice, odporne na okužbo s fagom. Pri ''in vivo'' eksperimentu, ki nam omogoča boljše posnemanje naravnih pogojev, so kot modelni organizem uporabili ličinke molja ''G. mellonella'', ki so jih okužili s ''P. aeruginosa'' tako, da so vanje injicirali ustrezen volumen bakterije. Pol ure po okužbi z bakterijo so v žuželke injicirali še rekombinantne fage in divji tip PE3. Kot kontrolo so uporabili pufer, s čimer so preverili delež smrti, ki je posledica poškodb ob injiciranju. Delež preživelih žuželk je bil ob dodatku fagov občutno večji kot pri kontroli, pri čemer ni bilo opaznih znatnih sprememb med rekombinantnimi fagi in divjim tipom. Rezultati torej kažejo, da prisotnost delecij v fagnem genomu ne vpliva na sposobnost okužbe bakterije ''P. aeruginosa'' [1].

===Zaključek===
Kljub temu da so fagni genomi sorazmerno majhni, izkazujejo izjemno raznolikost, zato je funkcija večine fagnih genov še nepoznana. Cilj študije je bil pripraviti rekombinantne fage z reduciranim genomom, pri čemer bi zmanjšali število genov z neznano funkcijo, ter tudi preveriti, kako uvedene delecije vplivajo na učinkovitost okuževanja bakterijskih celic. V raziskavi so uspeli iz bakteriofaga PE3 odstraniti 12 neesencialnih genov, kar predstavlja 48 % genov z neznano funkcijo. Tako pripravljen fag je imel daljšo latentno fazo, proizvedel je manj virionov na celico, kljub temu pa je bila sposobnost okužbe bakterije ''P. aeruginosa'' v ''in vivo'' in ''in vitro'' študijah nespremenjena. Raziskava predstavlja manjši napredek pri razvoju novih fagnih terapij, pri katerih bi lahko v fagni genom uvedli gene s protibakterijsko učinkovitostjo in tudi zmanjšali delež genov z neznano funkcijo, ki bi imeli morebitni toksičen vpliv na človeka.

===Viri in literatura===
# D. P. Pires, R. Monteiro, D. Mil-Homens, A. Fialho, T. K. Lu in J. Azeredo: Designing ''P. aeruginosa'' synthetic phages with reduced genomes. ''Sci. Rep.'', '''2021''', ''11'', str. 1–10.
# Z. Pang, R. Raudonis, B. R. Glick, T. J. Lin in Z. Cheng: Antibiotic resistance in Pseudomonas aeruginosa: mechanisms and alternative therapeutic strategies. ''Biotechnology Advances'', '''2019''', ''37'', str. 177–192.
# CDC, HAI: Pseudomonas aeruginosa Infection. https://www.cdc.gov/hai/organisms/pseudomonas.html (citirano 23. 4. 2021).
# P. Hyman in S. T. Abedon: Chapter 18. V: Practical Methods for Determining Phage Growth Parameters. 2009, str. 175-202.

Oblikovanje sintetičnega faga iz P. aeruginosa z reduciranim genomom

2021-05-14T15:08:26Z

Martina Lokar: /* Uvod */

Povzeto po članku: [https://doi.org/10.1038/s41598-021-81580-2 D.P. Pires, R. Monteiro, D. Mil-Homens ''et al'': Designing ''P. aeruginosa'' synthetic phages with reduced genomes. ''Sci. Rep.'' '''2021''', 11(1), str. 1-10. https://doi.org/10.1038/s41598-021-81580-2]

===Uvod===
Odpornost bakterij na antibiotike postaja vedno večji problem, zato se v zadnjem času kot potencialna terapevtska učinkovina preučujejo tudi bakteriofagi. Kljub temu da je fagna terapija obetaven način zdravljenja, se sooča s številnimi izzivi, kot so varnost, stabilnost in način dostave učinkovine, sposobnost bakteriofagov, da lahko okužijo omejeno število gostiteljskih bakterij, odpornost na bakteriofage ter stranski učinki zaradi lize bakterijskih celic. Ena izmed potencialnih rešitev nekaterih izmed teh omejitev je oblikovanje genetsko spremenjenih bakteriofagov s povečano protibakterijsko učinkovitostjo. V ta namen moramo v fagni genom vstaviti dodatne gene, kar pa zaradi omejitve dolžine DNA, ki se lahko zapakira v virusno kapsido, predstavlja velik problem. Zato bi lahko iz virusnega genoma odstranili gene, ki zapisujejo proteine z neznano funkcijo, gene, ki omogočajo odpornost proti antibiotikom, kot tudi zapise za toksine in druge virulenčne faktorje. Hkrati bi torej zmanjšali verjetnost, da bi bili v genomu prisotni potencialno nevarni geni. Cilj raziskave je bil oblikovati sintetični fag z reduciranim genomom, ki bi ohranil sposobnost okužbe, razmnoževanja in lize gostiteljske celice [1].

''Pseudomonas aeruginosa'' je patogena bakterija, ki ima izjemno sposobnost razvoja odpornosti na antibiotike. Okužba se pojavi predvsem pri hospitaliziranih pacientih in je lahko smrtno nevarna za ljudi s cistično fibrozo in imunsko pomanjkljivostjo. Problematično je predvsem zdravljenje okužb z bolnišničnimi sevi, zato predstavlja fagna terapija potencialno rešitev [2], [3].

===Izolacija bakteriofaga PE3 in njegova karakterizacija===
V prvem koraku so raziskovalci iz odpadne vode pri čistilni napravi v mestu Braga na Portugalskem izolirali litični fag vB_PaeP_PE3 (okrajšano PE3), ki je sposoben okužiti bakterijo ''P. aeruginosa'' PAO1. Po izolaciji so s transmisijsko elektronsko mikroskopijo (TEM) preverili njegove strukturne lastnosti in ugotovili, da ima PE3 kratek nekontraktilni rep. Izkazalo se je, da je izoliran fag sorazmerno specifičen, saj je bil sposoben okužiti 7 od 28 izoliranih kliničnih sevov ''P. aeruginosa''. V nadaljevanju so fagu posekvencirali celoten genom, ki je dsDNA dolžine 43.583 bp z 62,3 % deležem GC baznih parov in direktnimi končnimi ponovitvami dolžine 479 bp. S pomočjo računalniških orodij so ugotovili, da genom vključuje 55 kodirajočih zaporedij CDS (dolžine 120–4014 bp), med katerimi ima 30 CDS pripisane funkcije, 25 CDS pa zapisuje hipotetične proteine. Nadaljnja genomska analiza je pokazala, da fag najverjetneje ni virulenten, saj ne vključuje lizogenih genov [1].

===Priprava rekombinantnih bakteriofagov===
Ker velik delež genov v fagnem genomu nima pripisanih funkcij, se poraja vprašanje, če so ti geni nujno potrebni za replikacijo in protibakterijske lastnosti. V prvem delu fagnega genoma sta prisotna dva modula genov (modul gp1–gp5 in gp6–gp12), ki vključujeta zapise za hipotetične proteine in sta med seboj ločena z regulatornimi elementi. Z odstranitvijo posameznega modula so pripravili sintetična faga z reduciranim genomom vB_PaeP_PE3∆gp1-gp5 (okrajšano PE3∆gp1-gp5) in vB_PaeP_PE3∆gp6-gp12 (okrajšano PE3∆gp6-gp12).

Sintezo okrajšanega genoma so izvedli tako, da so s pomočjo reakcije PCR in uporabe ustreznih začetnih oligonukleotidov pomnožili celoten genom brez izbranega modula, pri čemer so se posamezni fragmenti v končnih regijah prekrivali. Tako so pripravili 6 prekrivajočih se PCR produktov, ki so predstavljali reduciran genom, in lineariziran YAC s terminalnimi regijami, ki so bile homologne koncema fagnega genoma. Nato so izvedli transformacijo kvasovk ''S. cerevisiae'' BY4741 s prekrivajočimi se sedmimi zaporedji DNA, kjer so se ta s pomočjo DNA popravljalnega mehanizma sestavila v ciklično strukturo fagnega genoma in umetnega kromosoma YAC (YAC-fag DNA). Ustreznost zaporedja so v nadaljevanju preverili z reakcijo PCR na osnovi ene kolonije, pri čemer so uporabili začetne oligonukleotide, ki se vežejo na regijo navzdol in navzgor od izbrisanega modula. Dolžine pomnožkov, ki so jih pri tem dobili, so bile krajše kot pri divjem tipu faga.

Da bi preverili, ali delecije v genomu vplivajo na viabilnost bakterofaga, so iz kvasovk izolirali YAC-fag DNA in jo transformirali v bakterijo P. aeruginosa PAO1, kjer so se fagni geni prepisovali in je prišlo do nastanka funkcionalnih bakteriofagov. Na ploščah s transformiranimi bakterijami so nastali plaki, ki so jih v nadaljevanju preverili s pomočjo reakcije PCR, pri kateri so uporabili že prej omenjene začetne oligonukleotide, ki se vežejo na regijo navzgor in navzdol od izbrisanega modula. S poskusom so dokazali viabilnost rekombinantnih fagov z reduciranim genomom in hkrati pokazali, da prvih 12 genov v fagnem genomu ni esencialnih za razmnoževanje in viabilnost.

Zaradi uspešne priprave dveh rekombinantnih fagov so se raziskovalci odločili pripraviti še tretji fag, pri čemer so izvedli delecijo 3194 bp oziroma vseh 12 genov (gp1–gp12) obeh začetnih modulov. Tretji rekombinantni fag vB_PaeP_PE3∆gp1-gp12 so pripravili po enakem postopku kot faga PE3∆gp1-gp5 in PE3∆gp6-gp12 [1].

===Karakterizacija rekombinantnih bakteriofagov===
Da bi bolje razumeli vpliv izbrisanih regij na lastnosti bakteriofagov, so značilnosti rekombinantnih fagov primerjali z divjim tipom PE3. Najprej so podrobneje analizirali morfologijo plakov, ki nastanejo po okužbi bakterije ''P. aeruginosa'', in ugotovili, da so rekombinantni bakteriofagi za razliko od bakteriofagov divjega tipa tvorili manjše plake. V nadaljevanju so preverili tudi specifičnost rekombinantnih fagov pri okužbi bakterijskih celic. PE3∆gp6-gp12 je bil enako kot PE3 sposoben okužiti 7 od 28 kliničnih izolatov ''P. aeruginosa'', medtem ko sta faga PE3∆gp1 gp5 in PE3∆gp1-gp12 učinkovito okužila in lizirala le 4 bakterijske seve [1].

Z nadaljnjimi poskusi so podrobneje preučili rastne parametre oziroma generacijski čas faga, ki vključuje čas adsorpcije, pritrditve in vnosa nukleinske kisline, latentno periodo in čas sproščanja virionov [4]. PE3 in PE3∆gp6-gp12, ki sta tvorila podobno rastno krivuljo, sta imela v primerjavi s PE3∆gp1-gp5 oziroma PE3∆gp1-gp12 5 min oziroma 15 min krajšo latentno fazo. Kljub temu je v bakterijskih celicah, okuženih s fagi PE3, PE3∆gp1-gp5 in PE3∆gp6-gp12, nastalo približno enako število fagnih delcev (okrog 200 PFU/okuženo celico), medtem ko je bilo v primeru PE3∆gp1-gp12 število nastalih fagnih delcev bistveno manjše (83 PFU/okuženo celico). Rezultati kažejo na to, da bi imeli lahko izbrisani geni funkcijo v zgodnjih stopnjah okužbe bakterije s fagom. Zaradi razlik v latentni fazi bi lahko sklepali, da so geni modula gp1-gp5 pomembni za interakcijo med fagom in bakterijo [1].

V procesu priprave rekombinantnih fagov bi lahko prišlo tudi do uvedbe naključnih mutacij v genomsko DNA, zato so vsem na novo pripravljenim fagom posekvencirali dedni material. Rezultate so dodatno potrdili tako, da so regije genoma, v katerih so s sekvenciranjem odkrili mutacijo, pomnožili v reakciji PCR in jim nato določili nukleotidno zaporedje s pomočjo Sangerjeve metode. V genomu PE3∆gp1-gp5 in PE3∆gp6-gp12 so odkrili 2 točkovni mutaciji, pri čemer je bila ena od teh skupna. V obeh fagih se je kot posledica uporabe istih PCR produktov za rekombinacijo v kvasovki pojavila tranzicijska mutacija na regiji gena gp47, ki zapisuje za nitasti protein repa. PE3∆gp1-gp5 je vseboval tudi tiho mutacijo v genu za endolizin (gp51), medtem ko je bila v PE3∆gp6-gp12 prisotna mutacija v nitastem proteinu repa gp46. V fagnem genomu PE3∆gp1-gp12 so odkrili tri točkovne mutacije, ki so bile prisotne v ogrodnem proteinu gp47 (tiha mutacija) in v nitastima proteinoma repa gp46 in gp47 (drugačnosmiselni mutaciji).

Za konec so z ''in vivo'' in ''in vitro'' poskusom preverili, če imajo uvedene delecije v genomu PE3 morebiten učinek na protibakterijske lastnosti. V ''in vitro'' eksperimentu so v bakterijsko kulturo ''P. aeruginosa'' v logaritemski fazi rasti dodali PE3 in rekombinante bakteriofage ter v 24-urnem intervalu preverjali delež živih bakterijskih celic. V eksperimentu ni bilo opaznih znatnih razlik med fagi, saj se je v vseh primerih približno dve uri po dodatku število viabilnih celic ''P. aeruginosa'' v primerjavi s kontrolo, kjer fagi niso bili dodani, zmanjšalo za približno 5-krat. Nato je v vseh primerih začelo število živih bakterijskih celic naraščati in po 24 urah je bila gostota okuženih in neokuženih celic enaka, kar kaže na to, da so se v vseh primerih zelo hitro oblikovale bakterijske celice, odporne na okužbo s fagom. Pri ''in vivo'' eksperimentu, ki nam omogoča boljše posnemanje naravnih pogojev, so kot modelni organizem uporabili ličinke molja ''G. mellonella'', ki so jih okužili s ''P. aeruginosa'' tako, da so vanje injicirali ustrezen volumen bakterije. Pol ure po okužbi z bakterijo so v žuželke injicirali še rekombinantne fage in divji tip PE3. Kot kontrolo so uporabili pufer, s čimer so preverili delež smrti, ki je posledica poškodb ob injiciranju. Delež preživelih žuželk je bil ob dodatku fagov občutno večji kot pri kontroli, pri čemer ni bilo opaznih znatnih sprememb med rekombinantnimi fagi in divjim tipom. Rezultati torej kažejo, da prisotnost delecij v fagnem genomu ne vpliva na sposobnost okužbe bakterije ''P. aeruginosa'' [1].

===Zaključek===
Kljub temu da so fagni genomi sorazmerno majhni, izkazujejo izjemno raznolikost, zato je funkcija večine fagnih genov še nepoznana. Cilj študije je bil pripraviti rekombinantne fage z reduciranim genomom, pri čemer bi zmanjšali število genov z neznano funkcijo, ter tudi preveriti, kako uvedene delecije vplivajo na učinkovitost okuževanja bakterijskih celic. V raziskavi so uspeli iz bakteriofaga PE3 odstraniti 12 neesencialnih genov, kar predstavlja 48 % genov z neznano funkcijo. Tako pripravljen fag je imel daljšo latentno fazo, proizvedel je manj virionov na celico, kljub temu pa je bila sposobnost okužbe bakterije ''P. aeruginosa'' v ''in vivo'' in ''in vitro'' študijah nespremenjena. Raziskava predstavlja manjši napredek pri razvoju novih fagnih terapij, pri katerih bi lahko v fagni genom uvedli gene s protibakterijsko učinkovitostjo in tudi zmanjšali delež genov z neznano funkcijo, ki bi imeli morebitni toksičen vpliv na človeka.

===Viri in literatura===
# D. P. Pires, R. Monteiro, D. Mil-Homens, A. Fialho, T. K. Lu in J. Azeredo: Designing ''P. aeruginosa'' synthetic phages with reduced genomes. ''Sci. Rep.'', '''2021''', ''11'', str. 1–10.
# Z. Pang, R. Raudonis, B. R. Glick, T. J. Lin in Z. Cheng: Antibiotic resistance in Pseudomonas aeruginosa: mechanisms and alternative therapeutic strategies. ''Biotechnology Advances'', '''2019''', ''37'', str. 177–192.
# CDC, HAI: Pseudomonas aeruginosa Infection. https://www.cdc.gov/hai/organisms/pseudomonas.html (citirano 23. 4. 2021).
# P. Hyman in S. T. Abedon: Chapter 18. V: Practical Methods for Determining Phage Growth Parameters. 2009, str. 175-202.

Oblikovanje sintetičnega faga iz P. aeruginosa z reduciranim genomom

2021-05-14T15:06:11Z

Martina Lokar: /* Uvod */

Povzeto po članku: [https://doi.org/10.1038/s41598-021-81580-2 D.P. Pires, R. Monteiro, D. Mil-Homens ''et al'': Designing ''P. aeruginosa'' synthetic phages with reduced genomes. ''Sci. Rep.'' '''2021''', 11(1), str. 1-10. https://doi.org/10.1038/s41598-021-81580-2]

===Uvod===
Odpornost bakterij na antibiotike postaja vedno večji problem, zato se v zadnjem času kot potencialna terapevtska učinkovina preučujejo tudi bakteriofagi. Kljub temu da je fagna terapija obetaven način zdravljenja, se sooča s številnimi izzivi, kot so varnost, stabilnost in način dostave učinkovine, sposobnost bakteriofagov, da lahko okužijo omejeno število gostiteljskih bakterij, odpornost na bakteriofage ter stranski učinki zaradi lize bakterijskih celic. Ena izmed potencialnih rešitev nekaterih izmed teh omejitev je oblikovanje genetsko spremenjenih bakteriofagov s povečano protibakterijsko učinkovitostjo. V ta namen moramo v fagni genom vstaviti dodatne gene, kar pa zaradi omejitve dolžine DNA, ki se lahko zapakira v virusno kapsido, predstavlja velik problem. Zato bi lahko iz virusnega genoma odstranili gene, ki zapisujejo proteine z neznano funkcijo, gene, ki omogočajo odpornost proti antibiotikom, kot tudi zapise za toksine in druge virulenčne faktorje. Hkrati bi torej zmanjšali verjetnost, da bi bili v genomu prisotni potencialno nevarni geni. Cilj raziskave je bil oblikovati sintetični fag z reduciranim genomom, ki ohrani sposobnost okužbe, razmnoževanja in lize gostiteljske celice [1].

''Pseudomonas aeruginosa'' je patogena bakterija, ki ima izjemno sposobnost razvoja odpornosti na antibiotike. Okužba se pojavi predvsem pri hospitaliziranih pacientih in je lahko smrtno nevarna za ljudi s cistično fibrozo in imunsko pomanjkljivostjo. Problematično je predvsem zdravljenje okužb z bolnišničnimi sevi, zato predstavlja fagna terapija potencialno rešitev [2], [3].

===Izolacija bakteriofaga PE3 in njegova karakterizacija===
V prvem koraku so raziskovalci iz odpadne vode pri čistilni napravi v mestu Braga na Portugalskem izolirali litični fag vB_PaeP_PE3 (okrajšano PE3), ki je sposoben okužiti bakterijo ''P. aeruginosa'' PAO1. Po izolaciji so s transmisijsko elektronsko mikroskopijo (TEM) preverili njegove strukturne lastnosti in ugotovili, da ima PE3 kratek nekontraktilni rep. Izkazalo se je, da je izoliran fag sorazmerno specifičen, saj je bil sposoben okužiti 7 od 28 izoliranih kliničnih sevov ''P. aeruginosa''. V nadaljevanju so fagu posekvencirali celoten genom, ki je dsDNA dolžine 43.583 bp z 62,3 % deležem GC baznih parov in direktnimi končnimi ponovitvami dolžine 479 bp. S pomočjo računalniških orodij so ugotovili, da genom vključuje 55 kodirajočih zaporedij CDS (dolžine 120–4014 bp), med katerimi ima 30 CDS pripisane funkcije, 25 CDS pa zapisuje hipotetične proteine. Nadaljnja genomska analiza je pokazala, da fag najverjetneje ni virulenten, saj ne vključuje lizogenih genov [1].

===Priprava rekombinantnih bakteriofagov===
Ker velik delež genov v fagnem genomu nima pripisanih funkcij, se poraja vprašanje, če so ti geni nujno potrebni za replikacijo in protibakterijske lastnosti. V prvem delu fagnega genoma sta prisotna dva modula genov (modul gp1–gp5 in gp6–gp12), ki vključujeta zapise za hipotetične proteine in sta med seboj ločena z regulatornimi elementi. Z odstranitvijo posameznega modula so pripravili sintetična faga z reduciranim genomom vB_PaeP_PE3∆gp1-gp5 (okrajšano PE3∆gp1-gp5) in vB_PaeP_PE3∆gp6-gp12 (okrajšano PE3∆gp6-gp12).

Sintezo okrajšanega genoma so izvedli tako, da so s pomočjo reakcije PCR in uporabe ustreznih začetnih oligonukleotidov pomnožili celoten genom brez izbranega modula, pri čemer so se posamezni fragmenti v končnih regijah prekrivali. Tako so pripravili 6 prekrivajočih se PCR produktov, ki so predstavljali reduciran genom, in lineariziran YAC s terminalnimi regijami, ki so bile homologne koncema fagnega genoma. Nato so izvedli transformacijo kvasovk ''S. cerevisiae'' BY4741 s prekrivajočimi se sedmimi zaporedji DNA, kjer so se ta s pomočjo DNA popravljalnega mehanizma sestavila v ciklično strukturo fagnega genoma in umetnega kromosoma YAC (YAC-fag DNA). Ustreznost zaporedja so v nadaljevanju preverili z reakcijo PCR na osnovi ene kolonije, pri čemer so uporabili začetne oligonukleotide, ki se vežejo na regijo navzdol in navzgor od izbrisanega modula. Dolžine pomnožkov, ki so jih pri tem dobili, so bile krajše kot pri divjem tipu faga.

Da bi preverili, ali delecije v genomu vplivajo na viabilnost bakterofaga, so iz kvasovk izolirali YAC-fag DNA in jo transformirali v bakterijo P. aeruginosa PAO1, kjer so se fagni geni prepisovali in je prišlo do nastanka funkcionalnih bakteriofagov. Na ploščah s transformiranimi bakterijami so nastali plaki, ki so jih v nadaljevanju preverili s pomočjo reakcije PCR, pri kateri so uporabili že prej omenjene začetne oligonukleotide, ki se vežejo na regijo navzgor in navzdol od izbrisanega modula. S poskusom so dokazali viabilnost rekombinantnih fagov z reduciranim genomom in hkrati pokazali, da prvih 12 genov v fagnem genomu ni esencialnih za razmnoževanje in viabilnost.

Zaradi uspešne priprave dveh rekombinantnih fagov so se raziskovalci odločili pripraviti še tretji fag, pri čemer so izvedli delecijo 3194 bp oziroma vseh 12 genov (gp1–gp12) obeh začetnih modulov. Tretji rekombinantni fag vB_PaeP_PE3∆gp1-gp12 so pripravili po enakem postopku kot faga PE3∆gp1-gp5 in PE3∆gp6-gp12 [1].

===Karakterizacija rekombinantnih bakteriofagov===
Da bi bolje razumeli vpliv izbrisanih regij na lastnosti bakteriofagov, so značilnosti rekombinantnih fagov primerjali z divjim tipom PE3. Najprej so podrobneje analizirali morfologijo plakov, ki nastanejo po okužbi bakterije ''P. aeruginosa'', in ugotovili, da so rekombinantni bakteriofagi za razliko od bakteriofagov divjega tipa tvorili manjše plake. V nadaljevanju so preverili tudi specifičnost rekombinantnih fagov pri okužbi bakterijskih celic. PE3∆gp6-gp12 je bil enako kot PE3 sposoben okužiti 7 od 28 kliničnih izolatov ''P. aeruginosa'', medtem ko sta faga PE3∆gp1 gp5 in PE3∆gp1-gp12 učinkovito okužila in lizirala le 4 bakterijske seve [1].

Z nadaljnjimi poskusi so podrobneje preučili rastne parametre oziroma generacijski čas faga, ki vključuje čas adsorpcije, pritrditve in vnosa nukleinske kisline, latentno periodo in čas sproščanja virionov [4]. PE3 in PE3∆gp6-gp12, ki sta tvorila podobno rastno krivuljo, sta imela v primerjavi s PE3∆gp1-gp5 oziroma PE3∆gp1-gp12 5 min oziroma 15 min krajšo latentno fazo. Kljub temu je v bakterijskih celicah, okuženih s fagi PE3, PE3∆gp1-gp5 in PE3∆gp6-gp12, nastalo približno enako število fagnih delcev (okrog 200 PFU/okuženo celico), medtem ko je bilo v primeru PE3∆gp1-gp12 število nastalih fagnih delcev bistveno manjše (83 PFU/okuženo celico). Rezultati kažejo na to, da bi imeli lahko izbrisani geni funkcijo v zgodnjih stopnjah okužbe bakterije s fagom. Zaradi razlik v latentni fazi bi lahko sklepali, da so geni modula gp1-gp5 pomembni za interakcijo med fagom in bakterijo [1].

V procesu priprave rekombinantnih fagov bi lahko prišlo tudi do uvedbe naključnih mutacij v genomsko DNA, zato so vsem na novo pripravljenim fagom posekvencirali dedni material. Rezultate so dodatno potrdili tako, da so regije genoma, v katerih so s sekvenciranjem odkrili mutacijo, pomnožili v reakciji PCR in jim nato določili nukleotidno zaporedje s pomočjo Sangerjeve metode. V genomu PE3∆gp1-gp5 in PE3∆gp6-gp12 so odkrili 2 točkovni mutaciji, pri čemer je bila ena od teh skupna. V obeh fagih se je kot posledica uporabe istih PCR produktov za rekombinacijo v kvasovki pojavila tranzicijska mutacija na regiji gena gp47, ki zapisuje za nitasti protein repa. PE3∆gp1-gp5 je vseboval tudi tiho mutacijo v genu za endolizin (gp51), medtem ko je bila v PE3∆gp6-gp12 prisotna mutacija v nitastem proteinu repa gp46. V fagnem genomu PE3∆gp1-gp12 so odkrili tri točkovne mutacije, ki so bile prisotne v ogrodnem proteinu gp47 (tiha mutacija) in v nitastima proteinoma repa gp46 in gp47 (drugačnosmiselni mutaciji).

Za konec so z ''in vivo'' in ''in vitro'' poskusom preverili, če imajo uvedene delecije v genomu PE3 morebiten učinek na protibakterijske lastnosti. V ''in vitro'' eksperimentu so v bakterijsko kulturo ''P. aeruginosa'' v logaritemski fazi rasti dodali PE3 in rekombinante bakteriofage ter v 24-urnem intervalu preverjali delež živih bakterijskih celic. V eksperimentu ni bilo opaznih znatnih razlik med fagi, saj se je v vseh primerih približno dve uri po dodatku število viabilnih celic ''P. aeruginosa'' v primerjavi s kontrolo, kjer fagi niso bili dodani, zmanjšalo za približno 5-krat. Nato je v vseh primerih začelo število živih bakterijskih celic naraščati in po 24 urah je bila gostota okuženih in neokuženih celic enaka, kar kaže na to, da so se v vseh primerih zelo hitro oblikovale bakterijske celice, odporne na okužbo s fagom. Pri ''in vivo'' eksperimentu, ki nam omogoča boljše posnemanje naravnih pogojev, so kot modelni organizem uporabili ličinke molja ''G. mellonella'', ki so jih okužili s ''P. aeruginosa'' tako, da so vanje injicirali ustrezen volumen bakterije. Pol ure po okužbi z bakterijo so v žuželke injicirali še rekombinantne fage in divji tip PE3. Kot kontrolo so uporabili pufer, s čimer so preverili delež smrti, ki je posledica poškodb ob injiciranju. Delež preživelih žuželk je bil ob dodatku fagov občutno večji kot pri kontroli, pri čemer ni bilo opaznih znatnih sprememb med rekombinantnimi fagi in divjim tipom. Rezultati torej kažejo, da prisotnost delecij v fagnem genomu ne vpliva na sposobnost okužbe bakterije ''P. aeruginosa'' [1].

===Zaključek===
Kljub temu da so fagni genomi sorazmerno majhni, izkazujejo izjemno raznolikost, zato je funkcija večine fagnih genov še nepoznana. Cilj študije je bil pripraviti rekombinantne fage z reduciranim genomom, pri čemer bi zmanjšali število genov z neznano funkcijo, ter tudi preveriti, kako uvedene delecije vplivajo na učinkovitost okuževanja bakterijskih celic. V raziskavi so uspeli iz bakteriofaga PE3 odstraniti 12 neesencialnih genov, kar predstavlja 48 % genov z neznano funkcijo. Tako pripravljen fag je imel daljšo latentno fazo, proizvedel je manj virionov na celico, kljub temu pa je bila sposobnost okužbe bakterije ''P. aeruginosa'' v ''in vivo'' in ''in vitro'' študijah nespremenjena. Raziskava predstavlja manjši napredek pri razvoju novih fagnih terapij, pri katerih bi lahko v fagni genom uvedli gene s protibakterijsko učinkovitostjo in tudi zmanjšali delež genov z neznano funkcijo, ki bi imeli morebitni toksičen vpliv na človeka.

===Viri in literatura===
# D. P. Pires, R. Monteiro, D. Mil-Homens, A. Fialho, T. K. Lu in J. Azeredo: Designing ''P. aeruginosa'' synthetic phages with reduced genomes. ''Sci. Rep.'', '''2021''', ''11'', str. 1–10.
# Z. Pang, R. Raudonis, B. R. Glick, T. J. Lin in Z. Cheng: Antibiotic resistance in Pseudomonas aeruginosa: mechanisms and alternative therapeutic strategies. ''Biotechnology Advances'', '''2019''', ''37'', str. 177–192.
# CDC, HAI: Pseudomonas aeruginosa Infection. https://www.cdc.gov/hai/organisms/pseudomonas.html (citirano 23. 4. 2021).
# P. Hyman in S. T. Abedon: Chapter 18. V: Practical Methods for Determining Phage Growth Parameters. 2009, str. 175-202.

Oblikovanje sintetičnega faga iz P. aeruginosa z reduciranim genomom

2021-05-14T15:03:44Z

Martina Lokar: /* Uvod */

Povzeto po članku: [https://doi.org/10.1038/s41598-021-81580-2 D.P. Pires, R. Monteiro, D. Mil-Homens ''et al'': Designing ''P. aeruginosa'' synthetic phages with reduced genomes. ''Sci. Rep.'' '''2021''', 11(1), str. 1-10. https://doi.org/10.1038/s41598-021-81580-2]

===Uvod===
Odpornost bakterij na antibiotike postaja vedno večji problem, zato se v zadnjem času kot potencialna terapevtska učinkovina preučujejo tudi bakteriofagi. Kljub temu da je fagna terapija obetaven način zdravljenja, se sooča s številnimi izzivi, kot so varnost, stabilnost in način dostave učinkovine, sposobnost bakteriofagov, da lahko okužijo omejeno število gostiteljskih bakterij, odpornost bakterij na bakteriofage ter stranski učinki zaradi lize bakterijskih celic. Ena izmed potencialnih rešitev nekaterih izmed teh omejitev je oblikovanje genetsko spremenjenih bakteriofagov s povečano protibakterijsko učinkovitostjo. V ta namen moramo v fagni genom vstaviti dodatne gene, kar pa zaradi omejitve dolžine DNA, ki se lahko zapakira v virusno kapsido, predstavlja velik problem. Zato bi lahko iz virusnega genoma odstranili gene, ki zapisujejo proteine z neznano funkcijo, gene, ki omogočajo odpornost proti antibiotikom, kot tudi zapise za toksine in druge virulenčne faktorje. Hkrati bi torej zmanjšali verjetnost, da bi bili v genomu prisotni potencialno nevarni geni. Cilj raziskave je bil oblikovati sintetični fag z reduciranim genomom, ki ohrani sposobnost okužbe, razmnoževanja in lize gostiteljske celice [1].

''Pseudomonas aeruginosa'' je patogena bakterija, ki ima izjemno sposobnost razvoja odpornosti na antibiotike. Okužba se pojavi predvsem pri hospitaliziranih pacientih in je lahko smrtno nevarna za ljudi s cistično fibrozo in imunsko pomanjkljivostjo. Problematično je predvsem zdravljenje okužb z bolnišničnimi sevi, zato predstavlja fagna terapija potencialno rešitev [2], [3].

===Izolacija bakteriofaga PE3 in njegova karakterizacija===
V prvem koraku so raziskovalci iz odpadne vode pri čistilni napravi v mestu Braga na Portugalskem izolirali litični fag vB_PaeP_PE3 (okrajšano PE3), ki je sposoben okužiti bakterijo ''P. aeruginosa'' PAO1. Po izolaciji so s transmisijsko elektronsko mikroskopijo (TEM) preverili njegove strukturne lastnosti in ugotovili, da ima PE3 kratek nekontraktilni rep. Izkazalo se je, da je izoliran fag sorazmerno specifičen, saj je bil sposoben okužiti 7 od 28 izoliranih kliničnih sevov ''P. aeruginosa''. V nadaljevanju so fagu posekvencirali celoten genom, ki je dsDNA dolžine 43.583 bp z 62,3 % deležem GC baznih parov in direktnimi končnimi ponovitvami dolžine 479 bp. S pomočjo računalniških orodij so ugotovili, da genom vključuje 55 kodirajočih zaporedij CDS (dolžine 120–4014 bp), med katerimi ima 30 CDS pripisane funkcije, 25 CDS pa zapisuje hipotetične proteine. Nadaljnja genomska analiza je pokazala, da fag najverjetneje ni virulenten, saj ne vključuje lizogenih genov [1].

===Priprava rekombinantnih bakteriofagov===
Ker velik delež genov v fagnem genomu nima pripisanih funkcij, se poraja vprašanje, če so ti geni nujno potrebni za replikacijo in protibakterijske lastnosti. V prvem delu fagnega genoma sta prisotna dva modula genov (modul gp1–gp5 in gp6–gp12), ki vključujeta zapise za hipotetične proteine in sta med seboj ločena z regulatornimi elementi. Z odstranitvijo posameznega modula so pripravili sintetična faga z reduciranim genomom vB_PaeP_PE3∆gp1-gp5 (okrajšano PE3∆gp1-gp5) in vB_PaeP_PE3∆gp6-gp12 (okrajšano PE3∆gp6-gp12).

Sintezo okrajšanega genoma so izvedli tako, da so s pomočjo reakcije PCR in uporabe ustreznih začetnih oligonukleotidov pomnožili celoten genom brez izbranega modula, pri čemer so se posamezni fragmenti v končnih regijah prekrivali. Tako so pripravili 6 prekrivajočih se PCR produktov, ki so predstavljali reduciran genom, in lineariziran YAC s terminalnimi regijami, ki so bile homologne koncema fagnega genoma. Nato so izvedli transformacijo kvasovk ''S. cerevisiae'' BY4741 s prekrivajočimi se sedmimi zaporedji DNA, kjer so se ta s pomočjo DNA popravljalnega mehanizma sestavila v ciklično strukturo fagnega genoma in umetnega kromosoma YAC (YAC-fag DNA). Ustreznost zaporedja so v nadaljevanju preverili z reakcijo PCR na osnovi ene kolonije, pri čemer so uporabili začetne oligonukleotide, ki se vežejo na regijo navzdol in navzgor od izbrisanega modula. Dolžine pomnožkov, ki so jih pri tem dobili, so bile krajše kot pri divjem tipu faga.

Da bi preverili, ali delecije v genomu vplivajo na viabilnost bakterofaga, so iz kvasovk izolirali YAC-fag DNA in jo transformirali v bakterijo P. aeruginosa PAO1, kjer so se fagni geni prepisovali in je prišlo do nastanka funkcionalnih bakteriofagov. Na ploščah s transformiranimi bakterijami so nastali plaki, ki so jih v nadaljevanju preverili s pomočjo reakcije PCR, pri kateri so uporabili že prej omenjene začetne oligonukleotide, ki se vežejo na regijo navzgor in navzdol od izbrisanega modula. S poskusom so dokazali viabilnost rekombinantnih fagov z reduciranim genomom in hkrati pokazali, da prvih 12 genov v fagnem genomu ni esencialnih za razmnoževanje in viabilnost.

Zaradi uspešne priprave dveh rekombinantnih fagov so se raziskovalci odločili pripraviti še tretji fag, pri čemer so izvedli delecijo 3194 bp oziroma vseh 12 genov (gp1–gp12) obeh začetnih modulov. Tretji rekombinantni fag vB_PaeP_PE3∆gp1-gp12 so pripravili po enakem postopku kot faga PE3∆gp1-gp5 in PE3∆gp6-gp12 [1].

===Karakterizacija rekombinantnih bakteriofagov===
Da bi bolje razumeli vpliv izbrisanih regij na lastnosti bakteriofagov, so značilnosti rekombinantnih fagov primerjali z divjim tipom PE3. Najprej so podrobneje analizirali morfologijo plakov, ki nastanejo po okužbi bakterije ''P. aeruginosa'', in ugotovili, da so rekombinantni bakteriofagi za razliko od bakteriofagov divjega tipa tvorili manjše plake. V nadaljevanju so preverili tudi specifičnost rekombinantnih fagov pri okužbi bakterijskih celic. PE3∆gp6-gp12 je bil enako kot PE3 sposoben okužiti 7 od 28 kliničnih izolatov ''P. aeruginosa'', medtem ko sta faga PE3∆gp1 gp5 in PE3∆gp1-gp12 učinkovito okužila in lizirala le 4 bakterijske seve [1].

Z nadaljnjimi poskusi so podrobneje preučili rastne parametre oziroma generacijski čas faga, ki vključuje čas adsorpcije, pritrditve in vnosa nukleinske kisline, latentno periodo in čas sproščanja virionov [4]. PE3 in PE3∆gp6-gp12, ki sta tvorila podobno rastno krivuljo, sta imela v primerjavi s PE3∆gp1-gp5 oziroma PE3∆gp1-gp12 5 min oziroma 15 min krajšo latentno fazo. Kljub temu je v bakterijskih celicah, okuženih s fagi PE3, PE3∆gp1-gp5 in PE3∆gp6-gp12, nastalo približno enako število fagnih delcev (okrog 200 PFU/okuženo celico), medtem ko je bilo v primeru PE3∆gp1-gp12 število nastalih fagnih delcev bistveno manjše (83 PFU/okuženo celico). Rezultati kažejo na to, da bi imeli lahko izbrisani geni funkcijo v zgodnjih stopnjah okužbe bakterije s fagom. Zaradi razlik v latentni fazi bi lahko sklepali, da so geni modula gp1-gp5 pomembni za interakcijo med fagom in bakterijo [1].

V procesu priprave rekombinantnih fagov bi lahko prišlo tudi do uvedbe naključnih mutacij v genomsko DNA, zato so vsem na novo pripravljenim fagom posekvencirali dedni material. Rezultate so dodatno potrdili tako, da so regije genoma, v katerih so s sekvenciranjem odkrili mutacijo, pomnožili v reakciji PCR in jim nato določili nukleotidno zaporedje s pomočjo Sangerjeve metode. V genomu PE3∆gp1-gp5 in PE3∆gp6-gp12 so odkrili 2 točkovni mutaciji, pri čemer je bila ena od teh skupna. V obeh fagih se je kot posledica uporabe istih PCR produktov za rekombinacijo v kvasovki pojavila tranzicijska mutacija na regiji gena gp47, ki zapisuje za nitasti protein repa. PE3∆gp1-gp5 je vseboval tudi tiho mutacijo v genu za endolizin (gp51), medtem ko je bila v PE3∆gp6-gp12 prisotna mutacija v nitastem proteinu repa gp46. V fagnem genomu PE3∆gp1-gp12 so odkrili tri točkovne mutacije, ki so bile prisotne v ogrodnem proteinu gp47 (tiha mutacija) in v nitastima proteinoma repa gp46 in gp47 (drugačnosmiselni mutaciji).

Za konec so z ''in vivo'' in ''in vitro'' poskusom preverili, če imajo uvedene delecije v genomu PE3 morebiten učinek na protibakterijske lastnosti. V ''in vitro'' eksperimentu so v bakterijsko kulturo ''P. aeruginosa'' v logaritemski fazi rasti dodali PE3 in rekombinante bakteriofage ter v 24-urnem intervalu preverjali delež živih bakterijskih celic. V eksperimentu ni bilo opaznih znatnih razlik med fagi, saj se je v vseh primerih približno dve uri po dodatku število viabilnih celic ''P. aeruginosa'' v primerjavi s kontrolo, kjer fagi niso bili dodani, zmanjšalo za približno 5-krat. Nato je v vseh primerih začelo število živih bakterijskih celic naraščati in po 24 urah je bila gostota okuženih in neokuženih celic enaka, kar kaže na to, da so se v vseh primerih zelo hitro oblikovale bakterijske celice, odporne na okužbo s fagom. Pri ''in vivo'' eksperimentu, ki nam omogoča boljše posnemanje naravnih pogojev, so kot modelni organizem uporabili ličinke molja ''G. mellonella'', ki so jih okužili s ''P. aeruginosa'' tako, da so vanje injicirali ustrezen volumen bakterije. Pol ure po okužbi z bakterijo so v žuželke injicirali še rekombinantne fage in divji tip PE3. Kot kontrolo so uporabili pufer, s čimer so preverili delež smrti, ki je posledica poškodb ob injiciranju. Delež preživelih žuželk je bil ob dodatku fagov občutno večji kot pri kontroli, pri čemer ni bilo opaznih znatnih sprememb med rekombinantnimi fagi in divjim tipom. Rezultati torej kažejo, da prisotnost delecij v fagnem genomu ne vpliva na sposobnost okužbe bakterije ''P. aeruginosa'' [1].

===Zaključek===
Kljub temu da so fagni genomi sorazmerno majhni, izkazujejo izjemno raznolikost, zato je funkcija večine fagnih genov še nepoznana. Cilj študije je bil pripraviti rekombinantne fage z reduciranim genomom, pri čemer bi zmanjšali število genov z neznano funkcijo, ter tudi preveriti, kako uvedene delecije vplivajo na učinkovitost okuževanja bakterijskih celic. V raziskavi so uspeli iz bakteriofaga PE3 odstraniti 12 neesencialnih genov, kar predstavlja 48 % genov z neznano funkcijo. Tako pripravljen fag je imel daljšo latentno fazo, proizvedel je manj virionov na celico, kljub temu pa je bila sposobnost okužbe bakterije ''P. aeruginosa'' v ''in vivo'' in ''in vitro'' študijah nespremenjena. Raziskava predstavlja manjši napredek pri razvoju novih fagnih terapij, pri katerih bi lahko v fagni genom uvedli gene s protibakterijsko učinkovitostjo in tudi zmanjšali delež genov z neznano funkcijo, ki bi imeli morebitni toksičen vpliv na človeka.

===Viri in literatura===
# D. P. Pires, R. Monteiro, D. Mil-Homens, A. Fialho, T. K. Lu in J. Azeredo: Designing ''P. aeruginosa'' synthetic phages with reduced genomes. ''Sci. Rep.'', '''2021''', ''11'', str. 1–10.
# Z. Pang, R. Raudonis, B. R. Glick, T. J. Lin in Z. Cheng: Antibiotic resistance in Pseudomonas aeruginosa: mechanisms and alternative therapeutic strategies. ''Biotechnology Advances'', '''2019''', ''37'', str. 177–192.
# CDC, HAI: Pseudomonas aeruginosa Infection. https://www.cdc.gov/hai/organisms/pseudomonas.html (citirano 23. 4. 2021).
# P. Hyman in S. T. Abedon: Chapter 18. V: Practical Methods for Determining Phage Growth Parameters. 2009, str. 175-202.

Oblikovanje sintetičnega faga iz P. aeruginosa z reduciranim genomom

2021-05-13T16:10:21Z

Martina Lokar: /* Viri in literatura */

Povzeto po članku: [https://doi.org/10.1038/s41598-021-81580-2 D.P. Pires, R. Monteiro, D. Mil-Homens ''et al'': Designing ''P. aeruginosa'' synthetic phages with reduced genomes. ''Sci. Rep.'' '''2021''', 11(1), str. 1-10. https://doi.org/10.1038/s41598-021-81580-2]

===Uvod===
Odpornost bakterij na antibiotike postaja vedno večji problem, zato se v zadnjem času kot potencialna terapevtska učinkovina preučujejo tudi bakteriofagi. Kljub temu da je fagna terapija obetaven način zdravljenja, se sooča s številnimi izzivi, kot so varnost, stabilnost in način dostave učinkovine, sposobnost bakteriofagov, da lahko okužijo omejeno število gostiteljskih bakterij, odpornost na bakteriofage ter stranski učinki zaradi lize bakterijskih celic. Ena izmed potencialnih rešitev nekaterih izmed teh omejitev je oblikovanje genetsko spremenjenih bakteriofagov s povečano protibakterijsko učinkovitostjo. V ta namen moramo v fagni genom vstaviti dodatne gene, kar pa zaradi omejitve dolžine DNA, ki se lahko zapakira v virusno kapsido, predstavlja velik problem. Zato bi lahko iz virusnega genoma odstranili gene, ki zapisujejo proteine z neznano funkcijo, gene, ki omogočajo odpornost proti antibiotikom, kot tudi zapise za toksine in druge virulenčne faktorje. Hkrati bi torej zmanjšali verjetnost, da bi bili v genomu prisotni potencialno nevarni geni. Cilj raziskave je bil oblikovati sintetični fag z reduciranim genomom, ki ohrani sposobnost okužbe, razmnoževanja in lize gostiteljske celice [1].

''Pseudomonas aeruginosa'' je patogena bakterija, ki ima izjemno sposobnost razvoja odpornosti na antibiotike. Okužba se pojavi predvsem pri hospitaliziranih pacientih in je lahko smrtno nevarna za ljudi s cistično fibrozo in imunsko pomanjkljivostjo. Problematično je predvsem zdravljenje okužb z bolnišničnimi sevi, zato predstavlja fagna terapija potencialno rešitev [2], [3].

===Izolacija bakteriofaga PE3 in njegova karakterizacija===
V prvem koraku so raziskovalci iz odpadne vode pri čistilni napravi v mestu Braga na Portugalskem izolirali litični fag vB_PaeP_PE3 (okrajšano PE3), ki je sposoben okužiti bakterijo ''P. aeruginosa'' PAO1. Po izolaciji so s transmisijsko elektronsko mikroskopijo (TEM) preverili njegove strukturne lastnosti in ugotovili, da ima PE3 kratek nekontraktilni rep. Izkazalo se je, da je izoliran fag sorazmerno specifičen, saj je bil sposoben okužiti 7 od 28 izoliranih kliničnih sevov ''P. aeruginosa''. V nadaljevanju so fagu posekvencirali celoten genom, ki je dsDNA dolžine 43.583 bp z 62,3 % deležem GC baznih parov in direktnimi končnimi ponovitvami dolžine 479 bp. S pomočjo računalniških orodij so ugotovili, da genom vključuje 55 kodirajočih zaporedij CDS (dolžine 120–4014 bp), med katerimi ima 30 CDS pripisane funkcije, 25 CDS pa zapisuje hipotetične proteine. Nadaljnja genomska analiza je pokazala, da fag najverjetneje ni virulenten, saj ne vključuje lizogenih genov [1].

===Priprava rekombinantnih bakteriofagov===
Ker velik delež genov v fagnem genomu nima pripisanih funkcij, se poraja vprašanje, če so ti geni nujno potrebni za replikacijo in protibakterijske lastnosti. V prvem delu fagnega genoma sta prisotna dva modula genov (modul gp1–gp5 in gp6–gp12), ki vključujeta zapise za hipotetične proteine in sta med seboj ločena z regulatornimi elementi. Z odstranitvijo posameznega modula so pripravili sintetična faga z reduciranim genomom vB_PaeP_PE3∆gp1-gp5 (okrajšano PE3∆gp1-gp5) in vB_PaeP_PE3∆gp6-gp12 (okrajšano PE3∆gp6-gp12).

Sintezo okrajšanega genoma so izvedli tako, da so s pomočjo reakcije PCR in uporabe ustreznih začetnih oligonukleotidov pomnožili celoten genom brez izbranega modula, pri čemer so se posamezni fragmenti v končnih regijah prekrivali. Tako so pripravili 6 prekrivajočih se PCR produktov, ki so predstavljali reduciran genom, in lineariziran YAC s terminalnimi regijami, ki so bile homologne koncema fagnega genoma. Nato so izvedli transformacijo kvasovk ''S. cerevisiae'' BY4741 s prekrivajočimi se sedmimi zaporedji DNA, kjer so se ta s pomočjo DNA popravljalnega mehanizma sestavila v ciklično strukturo fagnega genoma in umetnega kromosoma YAC (YAC-fag DNA). Ustreznost zaporedja so v nadaljevanju preverili z reakcijo PCR na osnovi ene kolonije, pri čemer so uporabili začetne oligonukleotide, ki se vežejo na regijo navzdol in navzgor od izbrisanega modula. Dolžine pomnožkov, ki so jih pri tem dobili, so bile krajše kot pri divjem tipu faga.

Da bi preverili, ali delecije v genomu vplivajo na viabilnost bakterofaga, so iz kvasovk izolirali YAC-fag DNA in jo transformirali v bakterijo P. aeruginosa PAO1, kjer so se fagni geni prepisovali in je prišlo do nastanka funkcionalnih bakteriofagov. Na ploščah s transformiranimi bakterijami so nastali plaki, ki so jih v nadaljevanju preverili s pomočjo reakcije PCR, pri kateri so uporabili že prej omenjene začetne oligonukleotide, ki se vežejo na regijo navzgor in navzdol od izbrisanega modula. S poskusom so dokazali viabilnost rekombinantnih fagov z reduciranim genomom in hkrati pokazali, da prvih 12 genov v fagnem genomu ni esencialnih za razmnoževanje in viabilnost.

Zaradi uspešne priprave dveh rekombinantnih fagov so se raziskovalci odločili pripraviti še tretji fag, pri čemer so izvedli delecijo 3194 bp oziroma vseh 12 genov (gp1–gp12) obeh začetnih modulov. Tretji rekombinantni fag vB_PaeP_PE3∆gp1-gp12 so pripravili po enakem postopku kot faga PE3∆gp1-gp5 in PE3∆gp6-gp12 [1].

===Karakterizacija rekombinantnih bakteriofagov===
Da bi bolje razumeli vpliv izbrisanih regij na lastnosti bakteriofagov, so značilnosti rekombinantnih fagov primerjali z divjim tipom PE3. Najprej so podrobneje analizirali morfologijo plakov, ki nastanejo po okužbi bakterije ''P. aeruginosa'', in ugotovili, da so rekombinantni bakteriofagi za razliko od bakteriofagov divjega tipa tvorili manjše plake. V nadaljevanju so preverili tudi specifičnost rekombinantnih fagov pri okužbi bakterijskih celic. PE3∆gp6-gp12 je bil enako kot PE3 sposoben okužiti 7 od 28 kliničnih izolatov ''P. aeruginosa'', medtem ko sta faga PE3∆gp1 gp5 in PE3∆gp1-gp12 učinkovito okužila in lizirala le 4 bakterijske seve [1].

Z nadaljnjimi poskusi so podrobneje preučili rastne parametre oziroma generacijski čas faga, ki vključuje čas adsorpcije, pritrditve in vnosa nukleinske kisline, latentno periodo in čas sproščanja virionov [4]. PE3 in PE3∆gp6-gp12, ki sta tvorila podobno rastno krivuljo, sta imela v primerjavi s PE3∆gp1-gp5 oziroma PE3∆gp1-gp12 5 min oziroma 15 min krajšo latentno fazo. Kljub temu je v bakterijskih celicah, okuženih s fagi PE3, PE3∆gp1-gp5 in PE3∆gp6-gp12, nastalo približno enako število fagnih delcev (okrog 200 PFU/okuženo celico), medtem ko je bilo v primeru PE3∆gp1-gp12 število nastalih fagnih delcev bistveno manjše (83 PFU/okuženo celico). Rezultati kažejo na to, da bi imeli lahko izbrisani geni funkcijo v zgodnjih stopnjah okužbe bakterije s fagom. Zaradi razlik v latentni fazi bi lahko sklepali, da so geni modula gp1-gp5 pomembni za interakcijo med fagom in bakterijo [1].

V procesu priprave rekombinantnih fagov bi lahko prišlo tudi do uvedbe naključnih mutacij v genomsko DNA, zato so vsem na novo pripravljenim fagom posekvencirali dedni material. Rezultate so dodatno potrdili tako, da so regije genoma, v katerih so s sekvenciranjem odkrili mutacijo, pomnožili v reakciji PCR in jim nato določili nukleotidno zaporedje s pomočjo Sangerjeve metode. V genomu PE3∆gp1-gp5 in PE3∆gp6-gp12 so odkrili 2 točkovni mutaciji, pri čemer je bila ena od teh skupna. V obeh fagih se je kot posledica uporabe istih PCR produktov za rekombinacijo v kvasovki pojavila tranzicijska mutacija na regiji gena gp47, ki zapisuje za nitasti protein repa. PE3∆gp1-gp5 je vseboval tudi tiho mutacijo v genu za endolizin (gp51), medtem ko je bila v PE3∆gp6-gp12 prisotna mutacija v nitastem proteinu repa gp46. V fagnem genomu PE3∆gp1-gp12 so odkrili tri točkovne mutacije, ki so bile prisotne v ogrodnem proteinu gp47 (tiha mutacija) in v nitastima proteinoma repa gp46 in gp47 (drugačnosmiselni mutaciji).

Za konec so z ''in vivo'' in ''in vitro'' poskusom preverili, če imajo uvedene delecije v genomu PE3 morebiten učinek na protibakterijske lastnosti. V ''in vitro'' eksperimentu so v bakterijsko kulturo ''P. aeruginosa'' v logaritemski fazi rasti dodali PE3 in rekombinante bakteriofage ter v 24-urnem intervalu preverjali delež živih bakterijskih celic. V eksperimentu ni bilo opaznih znatnih razlik med fagi, saj se je v vseh primerih približno dve uri po dodatku število viabilnih celic ''P. aeruginosa'' v primerjavi s kontrolo, kjer fagi niso bili dodani, zmanjšalo za približno 5-krat. Nato je v vseh primerih začelo število živih bakterijskih celic naraščati in po 24 urah je bila gostota okuženih in neokuženih celic enaka, kar kaže na to, da so se v vseh primerih zelo hitro oblikovale bakterijske celice, odporne na okužbo s fagom. Pri ''in vivo'' eksperimentu, ki nam omogoča boljše posnemanje naravnih pogojev, so kot modelni organizem uporabili ličinke molja ''G. mellonella'', ki so jih okužili s ''P. aeruginosa'' tako, da so vanje injicirali ustrezen volumen bakterije. Pol ure po okužbi z bakterijo so v žuželke injicirali še rekombinantne fage in divji tip PE3. Kot kontrolo so uporabili pufer, s čimer so preverili delež smrti, ki je posledica poškodb ob injiciranju. Delež preživelih žuželk je bil ob dodatku fagov občutno večji kot pri kontroli, pri čemer ni bilo opaznih znatnih sprememb med rekombinantnimi fagi in divjim tipom. Rezultati torej kažejo, da prisotnost delecij v fagnem genomu ne vpliva na sposobnost okužbe bakterije ''P. aeruginosa'' [1].

===Zaključek===
Kljub temu da so fagni genomi sorazmerno majhni, izkazujejo izjemno raznolikost, zato je funkcija večine fagnih genov še nepoznana. Cilj študije je bil pripraviti rekombinantne fage z reduciranim genomom, pri čemer bi zmanjšali število genov z neznano funkcijo, ter tudi preveriti, kako uvedene delecije vplivajo na učinkovitost okuževanja bakterijskih celic. V raziskavi so uspeli iz bakteriofaga PE3 odstraniti 12 neesencialnih genov, kar predstavlja 48 % genov z neznano funkcijo. Tako pripravljen fag je imel daljšo latentno fazo, proizvedel je manj virionov na celico, kljub temu pa je bila sposobnost okužbe bakterije ''P. aeruginosa'' v ''in vivo'' in ''in vitro'' študijah nespremenjena. Raziskava predstavlja manjši napredek pri razvoju novih fagnih terapij, pri katerih bi lahko v fagni genom uvedli gene s protibakterijsko učinkovitostjo in tudi zmanjšali delež genov z neznano funkcijo, ki bi imeli morebitni toksičen vpliv na človeka.

===Viri in literatura===
# D. P. Pires, R. Monteiro, D. Mil-Homens, A. Fialho, T. K. Lu in J. Azeredo: Designing ''P. aeruginosa'' synthetic phages with reduced genomes. ''Sci. Rep.'', '''2021''', ''11'', str. 1–10.
# Z. Pang, R. Raudonis, B. R. Glick, T. J. Lin in Z. Cheng: Antibiotic resistance in Pseudomonas aeruginosa: mechanisms and alternative therapeutic strategies. ''Biotechnology Advances'', '''2019''', ''37'', str. 177–192.
# CDC, HAI: Pseudomonas aeruginosa Infection. https://www.cdc.gov/hai/organisms/pseudomonas.html (citirano 23. 4. 2021).
# P. Hyman in S. T. Abedon: Chapter 18. V: Practical Methods for Determining Phage Growth Parameters. 2009, str. 175-202.

Oblikovanje sintetičnega faga iz P. aeruginosa z reduciranim genomom

2021-05-13T16:07:03Z

Martina Lokar:

Povzeto po članku: [https://doi.org/10.1038/s41598-021-81580-2 D.P. Pires, R. Monteiro, D. Mil-Homens ''et al'': Designing ''P. aeruginosa'' synthetic phages with reduced genomes. ''Sci. Rep.'' '''2021''', 11(1), str. 1-10. https://doi.org/10.1038/s41598-021-81580-2]

===Uvod===
Odpornost bakterij na antibiotike postaja vedno večji problem, zato se v zadnjem času kot potencialna terapevtska učinkovina preučujejo tudi bakteriofagi. Kljub temu da je fagna terapija obetaven način zdravljenja, se sooča s številnimi izzivi, kot so varnost, stabilnost in način dostave učinkovine, sposobnost bakteriofagov, da lahko okužijo omejeno število gostiteljskih bakterij, odpornost na bakteriofage ter stranski učinki zaradi lize bakterijskih celic. Ena izmed potencialnih rešitev nekaterih izmed teh omejitev je oblikovanje genetsko spremenjenih bakteriofagov s povečano protibakterijsko učinkovitostjo. V ta namen moramo v fagni genom vstaviti dodatne gene, kar pa zaradi omejitve dolžine DNA, ki se lahko zapakira v virusno kapsido, predstavlja velik problem. Zato bi lahko iz virusnega genoma odstranili gene, ki zapisujejo proteine z neznano funkcijo, gene, ki omogočajo odpornost proti antibiotikom, kot tudi zapise za toksine in druge virulenčne faktorje. Hkrati bi torej zmanjšali verjetnost, da bi bili v genomu prisotni potencialno nevarni geni. Cilj raziskave je bil oblikovati sintetični fag z reduciranim genomom, ki ohrani sposobnost okužbe, razmnoževanja in lize gostiteljske celice [1].

''Pseudomonas aeruginosa'' je patogena bakterija, ki ima izjemno sposobnost razvoja odpornosti na antibiotike. Okužba se pojavi predvsem pri hospitaliziranih pacientih in je lahko smrtno nevarna za ljudi s cistično fibrozo in imunsko pomanjkljivostjo. Problematično je predvsem zdravljenje okužb z bolnišničnimi sevi, zato predstavlja fagna terapija potencialno rešitev [2], [3].

===Izolacija bakteriofaga PE3 in njegova karakterizacija===
V prvem koraku so raziskovalci iz odpadne vode pri čistilni napravi v mestu Braga na Portugalskem izolirali litični fag vB_PaeP_PE3 (okrajšano PE3), ki je sposoben okužiti bakterijo ''P. aeruginosa'' PAO1. Po izolaciji so s transmisijsko elektronsko mikroskopijo (TEM) preverili njegove strukturne lastnosti in ugotovili, da ima PE3 kratek nekontraktilni rep. Izkazalo se je, da je izoliran fag sorazmerno specifičen, saj je bil sposoben okužiti 7 od 28 izoliranih kliničnih sevov ''P. aeruginosa''. V nadaljevanju so fagu posekvencirali celoten genom, ki je dsDNA dolžine 43.583 bp z 62,3 % deležem GC baznih parov in direktnimi končnimi ponovitvami dolžine 479 bp. S pomočjo računalniških orodij so ugotovili, da genom vključuje 55 kodirajočih zaporedij CDS (dolžine 120–4014 bp), med katerimi ima 30 CDS pripisane funkcije, 25 CDS pa zapisuje hipotetične proteine. Nadaljnja genomska analiza je pokazala, da fag najverjetneje ni virulenten, saj ne vključuje lizogenih genov [1].

===Priprava rekombinantnih bakteriofagov===
Ker velik delež genov v fagnem genomu nima pripisanih funkcij, se poraja vprašanje, če so ti geni nujno potrebni za replikacijo in protibakterijske lastnosti. V prvem delu fagnega genoma sta prisotna dva modula genov (modul gp1–gp5 in gp6–gp12), ki vključujeta zapise za hipotetične proteine in sta med seboj ločena z regulatornimi elementi. Z odstranitvijo posameznega modula so pripravili sintetična faga z reduciranim genomom vB_PaeP_PE3∆gp1-gp5 (okrajšano PE3∆gp1-gp5) in vB_PaeP_PE3∆gp6-gp12 (okrajšano PE3∆gp6-gp12).

Sintezo okrajšanega genoma so izvedli tako, da so s pomočjo reakcije PCR in uporabe ustreznih začetnih oligonukleotidov pomnožili celoten genom brez izbranega modula, pri čemer so se posamezni fragmenti v končnih regijah prekrivali. Tako so pripravili 6 prekrivajočih se PCR produktov, ki so predstavljali reduciran genom, in lineariziran YAC s terminalnimi regijami, ki so bile homologne koncema fagnega genoma. Nato so izvedli transformacijo kvasovk ''S. cerevisiae'' BY4741 s prekrivajočimi se sedmimi zaporedji DNA, kjer so se ta s pomočjo DNA popravljalnega mehanizma sestavila v ciklično strukturo fagnega genoma in umetnega kromosoma YAC (YAC-fag DNA). Ustreznost zaporedja so v nadaljevanju preverili z reakcijo PCR na osnovi ene kolonije, pri čemer so uporabili začetne oligonukleotide, ki se vežejo na regijo navzdol in navzgor od izbrisanega modula. Dolžine pomnožkov, ki so jih pri tem dobili, so bile krajše kot pri divjem tipu faga.

Da bi preverili, ali delecije v genomu vplivajo na viabilnost bakterofaga, so iz kvasovk izolirali YAC-fag DNA in jo transformirali v bakterijo P. aeruginosa PAO1, kjer so se fagni geni prepisovali in je prišlo do nastanka funkcionalnih bakteriofagov. Na ploščah s transformiranimi bakterijami so nastali plaki, ki so jih v nadaljevanju preverili s pomočjo reakcije PCR, pri kateri so uporabili že prej omenjene začetne oligonukleotide, ki se vežejo na regijo navzgor in navzdol od izbrisanega modula. S poskusom so dokazali viabilnost rekombinantnih fagov z reduciranim genomom in hkrati pokazali, da prvih 12 genov v fagnem genomu ni esencialnih za razmnoževanje in viabilnost.

Zaradi uspešne priprave dveh rekombinantnih fagov so se raziskovalci odločili pripraviti še tretji fag, pri čemer so izvedli delecijo 3194 bp oziroma vseh 12 genov (gp1–gp12) obeh začetnih modulov. Tretji rekombinantni fag vB_PaeP_PE3∆gp1-gp12 so pripravili po enakem postopku kot faga PE3∆gp1-gp5 in PE3∆gp6-gp12 [1].

===Karakterizacija rekombinantnih bakteriofagov===
Da bi bolje razumeli vpliv izbrisanih regij na lastnosti bakteriofagov, so značilnosti rekombinantnih fagov primerjali z divjim tipom PE3. Najprej so podrobneje analizirali morfologijo plakov, ki nastanejo po okužbi bakterije ''P. aeruginosa'', in ugotovili, da so rekombinantni bakteriofagi za razliko od bakteriofagov divjega tipa tvorili manjše plake. V nadaljevanju so preverili tudi specifičnost rekombinantnih fagov pri okužbi bakterijskih celic. PE3∆gp6-gp12 je bil enako kot PE3 sposoben okužiti 7 od 28 kliničnih izolatov ''P. aeruginosa'', medtem ko sta faga PE3∆gp1 gp5 in PE3∆gp1-gp12 učinkovito okužila in lizirala le 4 bakterijske seve [1].

Z nadaljnjimi poskusi so podrobneje preučili rastne parametre oziroma generacijski čas faga, ki vključuje čas adsorpcije, pritrditve in vnosa nukleinske kisline, latentno periodo in čas sproščanja virionov [4]. PE3 in PE3∆gp6-gp12, ki sta tvorila podobno rastno krivuljo, sta imela v primerjavi s PE3∆gp1-gp5 oziroma PE3∆gp1-gp12 5 min oziroma 15 min krajšo latentno fazo. Kljub temu je v bakterijskih celicah, okuženih s fagi PE3, PE3∆gp1-gp5 in PE3∆gp6-gp12, nastalo približno enako število fagnih delcev (okrog 200 PFU/okuženo celico), medtem ko je bilo v primeru PE3∆gp1-gp12 število nastalih fagnih delcev bistveno manjše (83 PFU/okuženo celico). Rezultati kažejo na to, da bi imeli lahko izbrisani geni funkcijo v zgodnjih stopnjah okužbe bakterije s fagom. Zaradi razlik v latentni fazi bi lahko sklepali, da so geni modula gp1-gp5 pomembni za interakcijo med fagom in bakterijo [1].

V procesu priprave rekombinantnih fagov bi lahko prišlo tudi do uvedbe naključnih mutacij v genomsko DNA, zato so vsem na novo pripravljenim fagom posekvencirali dedni material. Rezultate so dodatno potrdili tako, da so regije genoma, v katerih so s sekvenciranjem odkrili mutacijo, pomnožili v reakciji PCR in jim nato določili nukleotidno zaporedje s pomočjo Sangerjeve metode. V genomu PE3∆gp1-gp5 in PE3∆gp6-gp12 so odkrili 2 točkovni mutaciji, pri čemer je bila ena od teh skupna. V obeh fagih se je kot posledica uporabe istih PCR produktov za rekombinacijo v kvasovki pojavila tranzicijska mutacija na regiji gena gp47, ki zapisuje za nitasti protein repa. PE3∆gp1-gp5 je vseboval tudi tiho mutacijo v genu za endolizin (gp51), medtem ko je bila v PE3∆gp6-gp12 prisotna mutacija v nitastem proteinu repa gp46. V fagnem genomu PE3∆gp1-gp12 so odkrili tri točkovne mutacije, ki so bile prisotne v ogrodnem proteinu gp47 (tiha mutacija) in v nitastima proteinoma repa gp46 in gp47 (drugačnosmiselni mutaciji).

Za konec so z ''in vivo'' in ''in vitro'' poskusom preverili, če imajo uvedene delecije v genomu PE3 morebiten učinek na protibakterijske lastnosti. V ''in vitro'' eksperimentu so v bakterijsko kulturo ''P. aeruginosa'' v logaritemski fazi rasti dodali PE3 in rekombinante bakteriofage ter v 24-urnem intervalu preverjali delež živih bakterijskih celic. V eksperimentu ni bilo opaznih znatnih razlik med fagi, saj se je v vseh primerih približno dve uri po dodatku število viabilnih celic ''P. aeruginosa'' v primerjavi s kontrolo, kjer fagi niso bili dodani, zmanjšalo za približno 5-krat. Nato je v vseh primerih začelo število živih bakterijskih celic naraščati in po 24 urah je bila gostota okuženih in neokuženih celic enaka, kar kaže na to, da so se v vseh primerih zelo hitro oblikovale bakterijske celice, odporne na okužbo s fagom. Pri ''in vivo'' eksperimentu, ki nam omogoča boljše posnemanje naravnih pogojev, so kot modelni organizem uporabili ličinke molja ''G. mellonella'', ki so jih okužili s ''P. aeruginosa'' tako, da so vanje injicirali ustrezen volumen bakterije. Pol ure po okužbi z bakterijo so v žuželke injicirali še rekombinantne fage in divji tip PE3. Kot kontrolo so uporabili pufer, s čimer so preverili delež smrti, ki je posledica poškodb ob injiciranju. Delež preživelih žuželk je bil ob dodatku fagov občutno večji kot pri kontroli, pri čemer ni bilo opaznih znatnih sprememb med rekombinantnimi fagi in divjim tipom. Rezultati torej kažejo, da prisotnost delecij v fagnem genomu ne vpliva na sposobnost okužbe bakterije ''P. aeruginosa'' [1].

===Zaključek===
Kljub temu da so fagni genomi sorazmerno majhni, izkazujejo izjemno raznolikost, zato je funkcija večine fagnih genov še nepoznana. Cilj študije je bil pripraviti rekombinantne fage z reduciranim genomom, pri čemer bi zmanjšali število genov z neznano funkcijo, ter tudi preveriti, kako uvedene delecije vplivajo na učinkovitost okuževanja bakterijskih celic. V raziskavi so uspeli iz bakteriofaga PE3 odstraniti 12 neesencialnih genov, kar predstavlja 48 % genov z neznano funkcijo. Tako pripravljen fag je imel daljšo latentno fazo, proizvedel je manj virionov na celico, kljub temu pa je bila sposobnost okužbe bakterije ''P. aeruginosa'' v ''in vivo'' in ''in vitro'' študijah nespremenjena. Raziskava predstavlja manjši napredek pri razvoju novih fagnih terapij, pri katerih bi lahko v fagni genom uvedli gene s protibakterijsko učinkovitostjo in tudi zmanjšali delež genov z neznano funkcijo, ki bi imeli morebitni toksičen vpliv na človeka.

===Viri in literatura===
# D. P. Pires, R. Monteiro, D. Mil-Homens, A. Fialho, T. K. Lu in J. Azeredo: Designing ''P. aeruginosa'' synthetic phages with reduced genomes. ''Sci. Rep.'', '''2021''', ''11'', str. 1–10.
# Z. Pang, R. Raudonis, B. R. Glick, T. J. Lin in Z. Cheng: Antibiotic resistance in Pseudomonas aeruginosa: mechanisms and alternative therapeutic strategies. ''Biotechnology Advances'', '''2019''', ''37'', str. 177–192.
# Pseudomonas aeruginosa Infection | HAI | CDC. https://www.cdc.gov/hai/organisms/pseudomonas.html (dostopno 23.4. 2021).
# P. Hyman in S. T. Abedon: Chapter 18. V: Practical Methods for Determining Phage Growth Parameters. 2009, str. 175-202.

Oblikovanje sintetičnega faga iz P. aeruginosa z reduciranim genomom

2021-05-13T16:06:41Z

Martina Lokar: /* Viri in literatura */

Povzeto po članku: [https://doi.org/10.1038/s41598-021-81580-2 D.P. Pires, R. Monteiro, D. Mil-Homens ''et al'': Designing ''P. aeruginosa'' synthetic phages with reduced genomes. ''Sci. Rep.'' '''2021''', 11(1), 1-10. https://doi.org/10.1038/s41598-021-81580-2]

===Uvod===
Odpornost bakterij na antibiotike postaja vedno večji problem, zato se v zadnjem času kot potencialna terapevtska učinkovina preučujejo tudi bakteriofagi. Kljub temu da je fagna terapija obetaven način zdravljenja, se sooča s številnimi izzivi, kot so varnost, stabilnost in način dostave učinkovine, sposobnost bakteriofagov, da lahko okužijo omejeno število gostiteljskih bakterij, odpornost na bakteriofage ter stranski učinki zaradi lize bakterijskih celic. Ena izmed potencialnih rešitev nekaterih izmed teh omejitev je oblikovanje genetsko spremenjenih bakteriofagov s povečano protibakterijsko učinkovitostjo. V ta namen moramo v fagni genom vstaviti dodatne gene, kar pa zaradi omejitve dolžine DNA, ki se lahko zapakira v virusno kapsido, predstavlja velik problem. Zato bi lahko iz virusnega genoma odstranili gene, ki zapisujejo proteine z neznano funkcijo, gene, ki omogočajo odpornost proti antibiotikom, kot tudi zapise za toksine in druge virulenčne faktorje. Hkrati bi torej zmanjšali verjetnost, da bi bili v genomu prisotni potencialno nevarni geni. Cilj raziskave je bil oblikovati sintetični fag z reduciranim genomom, ki ohrani sposobnost okužbe, razmnoževanja in lize gostiteljske celice [1].

''Pseudomonas aeruginosa'' je patogena bakterija, ki ima izjemno sposobnost razvoja odpornosti na antibiotike. Okužba se pojavi predvsem pri hospitaliziranih pacientih in je lahko smrtno nevarna za ljudi s cistično fibrozo in imunsko pomanjkljivostjo. Problematično je predvsem zdravljenje okužb z bolnišničnimi sevi, zato predstavlja fagna terapija potencialno rešitev [2], [3].

===Izolacija bakteriofaga PE3 in njegova karakterizacija===
V prvem koraku so raziskovalci iz odpadne vode pri čistilni napravi v mestu Braga na Portugalskem izolirali litični fag vB_PaeP_PE3 (okrajšano PE3), ki je sposoben okužiti bakterijo ''P. aeruginosa'' PAO1. Po izolaciji so s transmisijsko elektronsko mikroskopijo (TEM) preverili njegove strukturne lastnosti in ugotovili, da ima PE3 kratek nekontraktilni rep. Izkazalo se je, da je izoliran fag sorazmerno specifičen, saj je bil sposoben okužiti 7 od 28 izoliranih kliničnih sevov ''P. aeruginosa''. V nadaljevanju so fagu posekvencirali celoten genom, ki je dsDNA dolžine 43.583 bp z 62,3 % deležem GC baznih parov in direktnimi končnimi ponovitvami dolžine 479 bp. S pomočjo računalniških orodij so ugotovili, da genom vključuje 55 kodirajočih zaporedij CDS (dolžine 120–4014 bp), med katerimi ima 30 CDS pripisane funkcije, 25 CDS pa zapisuje hipotetične proteine. Nadaljnja genomska analiza je pokazala, da fag najverjetneje ni virulenten, saj ne vključuje lizogenih genov [1].

===Priprava rekombinantnih bakteriofagov===
Ker velik delež genov v fagnem genomu nima pripisanih funkcij, se poraja vprašanje, če so ti geni nujno potrebni za replikacijo in protibakterijske lastnosti. V prvem delu fagnega genoma sta prisotna dva modula genov (modul gp1–gp5 in gp6–gp12), ki vključujeta zapise za hipotetične proteine in sta med seboj ločena z regulatornimi elementi. Z odstranitvijo posameznega modula so pripravili sintetična faga z reduciranim genomom vB_PaeP_PE3∆gp1-gp5 (okrajšano PE3∆gp1-gp5) in vB_PaeP_PE3∆gp6-gp12 (okrajšano PE3∆gp6-gp12).

Sintezo okrajšanega genoma so izvedli tako, da so s pomočjo reakcije PCR in uporabe ustreznih začetnih oligonukleotidov pomnožili celoten genom brez izbranega modula, pri čemer so se posamezni fragmenti v končnih regijah prekrivali. Tako so pripravili 6 prekrivajočih se PCR produktov, ki so predstavljali reduciran genom, in lineariziran YAC s terminalnimi regijami, ki so bile homologne koncema fagnega genoma. Nato so izvedli transformacijo kvasovk ''S. cerevisiae'' BY4741 s prekrivajočimi se sedmimi zaporedji DNA, kjer so se ta s pomočjo DNA popravljalnega mehanizma sestavila v ciklično strukturo fagnega genoma in umetnega kromosoma YAC (YAC-fag DNA). Ustreznost zaporedja so v nadaljevanju preverili z reakcijo PCR na osnovi ene kolonije, pri čemer so uporabili začetne oligonukleotide, ki se vežejo na regijo navzdol in navzgor od izbrisanega modula. Dolžine pomnožkov, ki so jih pri tem dobili, so bile krajše kot pri divjem tipu faga.

Da bi preverili, ali delecije v genomu vplivajo na viabilnost bakterofaga, so iz kvasovk izolirali YAC-fag DNA in jo transformirali v bakterijo P. aeruginosa PAO1, kjer so se fagni geni prepisovali in je prišlo do nastanka funkcionalnih bakteriofagov. Na ploščah s transformiranimi bakterijami so nastali plaki, ki so jih v nadaljevanju preverili s pomočjo reakcije PCR, pri kateri so uporabili že prej omenjene začetne oligonukleotide, ki se vežejo na regijo navzgor in navzdol od izbrisanega modula. S poskusom so dokazali viabilnost rekombinantnih fagov z reduciranim genomom in hkrati pokazali, da prvih 12 genov v fagnem genomu ni esencialnih za razmnoževanje in viabilnost.

Zaradi uspešne priprave dveh rekombinantnih fagov so se raziskovalci odločili pripraviti še tretji fag, pri čemer so izvedli delecijo 3194 bp oziroma vseh 12 genov (gp1–gp12) obeh začetnih modulov. Tretji rekombinantni fag vB_PaeP_PE3∆gp1-gp12 so pripravili po enakem postopku kot faga PE3∆gp1-gp5 in PE3∆gp6-gp12 [1].

===Karakterizacija rekombinantnih bakteriofagov===
Da bi bolje razumeli vpliv izbrisanih regij na lastnosti bakteriofagov, so značilnosti rekombinantnih fagov primerjali z divjim tipom PE3. Najprej so podrobneje analizirali morfologijo plakov, ki nastanejo po okužbi bakterije ''P. aeruginosa'', in ugotovili, da so rekombinantni bakteriofagi za razliko od bakteriofagov divjega tipa tvorili manjše plake. V nadaljevanju so preverili tudi specifičnost rekombinantnih fagov pri okužbi bakterijskih celic. PE3∆gp6-gp12 je bil enako kot PE3 sposoben okužiti 7 od 28 kliničnih izolatov ''P. aeruginosa'', medtem ko sta faga PE3∆gp1 gp5 in PE3∆gp1-gp12 učinkovito okužila in lizirala le 4 bakterijske seve [1].

Z nadaljnjimi poskusi so podrobneje preučili rastne parametre oziroma generacijski čas faga, ki vključuje čas adsorpcije, pritrditve in vnosa nukleinske kisline, latentno periodo in čas sproščanja virionov [4]. PE3 in PE3∆gp6-gp12, ki sta tvorila podobno rastno krivuljo, sta imela v primerjavi s PE3∆gp1-gp5 oziroma PE3∆gp1-gp12 5 min oziroma 15 min krajšo latentno fazo. Kljub temu je v bakterijskih celicah, okuženih s fagi PE3, PE3∆gp1-gp5 in PE3∆gp6-gp12, nastalo približno enako število fagnih delcev (okrog 200 PFU/okuženo celico), medtem ko je bilo v primeru PE3∆gp1-gp12 število nastalih fagnih delcev bistveno manjše (83 PFU/okuženo celico). Rezultati kažejo na to, da bi imeli lahko izbrisani geni funkcijo v zgodnjih stopnjah okužbe bakterije s fagom. Zaradi razlik v latentni fazi bi lahko sklepali, da so geni modula gp1-gp5 pomembni za interakcijo med fagom in bakterijo [1].

V procesu priprave rekombinantnih fagov bi lahko prišlo tudi do uvedbe naključnih mutacij v genomsko DNA, zato so vsem na novo pripravljenim fagom posekvencirali dedni material. Rezultate so dodatno potrdili tako, da so regije genoma, v katerih so s sekvenciranjem odkrili mutacijo, pomnožili v reakciji PCR in jim nato določili nukleotidno zaporedje s pomočjo Sangerjeve metode. V genomu PE3∆gp1-gp5 in PE3∆gp6-gp12 so odkrili 2 točkovni mutaciji, pri čemer je bila ena od teh skupna. V obeh fagih se je kot posledica uporabe istih PCR produktov za rekombinacijo v kvasovki pojavila tranzicijska mutacija na regiji gena gp47, ki zapisuje za nitasti protein repa. PE3∆gp1-gp5 je vseboval tudi tiho mutacijo v genu za endolizin (gp51), medtem ko je bila v PE3∆gp6-gp12 prisotna mutacija v nitastem proteinu repa gp46. V fagnem genomu PE3∆gp1-gp12 so odkrili tri točkovne mutacije, ki so bile prisotne v ogrodnem proteinu gp47 (tiha mutacija) in v nitastima proteinoma repa gp46 in gp47 (drugačnosmiselni mutaciji).

Za konec so z ''in vivo'' in ''in vitro'' poskusom preverili, če imajo uvedene delecije v genomu PE3 morebiten učinek na protibakterijske lastnosti. V ''in vitro'' eksperimentu so v bakterijsko kulturo ''P. aeruginosa'' v logaritemski fazi rasti dodali PE3 in rekombinante bakteriofage ter v 24-urnem intervalu preverjali delež živih bakterijskih celic. V eksperimentu ni bilo opaznih znatnih razlik med fagi, saj se je v vseh primerih približno dve uri po dodatku število viabilnih celic ''P. aeruginosa'' v primerjavi s kontrolo, kjer fagi niso bili dodani, zmanjšalo za približno 5-krat. Nato je v vseh primerih začelo število živih bakterijskih celic naraščati in po 24 urah je bila gostota okuženih in neokuženih celic enaka, kar kaže na to, da so se v vseh primerih zelo hitro oblikovale bakterijske celice, odporne na okužbo s fagom. Pri ''in vivo'' eksperimentu, ki nam omogoča boljše posnemanje naravnih pogojev, so kot modelni organizem uporabili ličinke molja ''G. mellonella'', ki so jih okužili s ''P. aeruginosa'' tako, da so vanje injicirali ustrezen volumen bakterije. Pol ure po okužbi z bakterijo so v žuželke injicirali še rekombinantne fage in divji tip PE3. Kot kontrolo so uporabili pufer, s čimer so preverili delež smrti, ki je posledica poškodb ob injiciranju. Delež preživelih žuželk je bil ob dodatku fagov občutno večji kot pri kontroli, pri čemer ni bilo opaznih znatnih sprememb med rekombinantnimi fagi in divjim tipom. Rezultati torej kažejo, da prisotnost delecij v fagnem genomu ne vpliva na sposobnost okužbe bakterije ''P. aeruginosa'' [1].

===Zaključek===
Kljub temu da so fagni genomi sorazmerno majhni, izkazujejo izjemno raznolikost, zato je funkcija večine fagnih genov še nepoznana. Cilj študije je bil pripraviti rekombinantne fage z reduciranim genomom, pri čemer bi zmanjšali število genov z neznano funkcijo, ter tudi preveriti, kako uvedene delecije vplivajo na učinkovitost okuževanja bakterijskih celic. V raziskavi so uspeli iz bakteriofaga PE3 odstraniti 12 neesencialnih genov, kar predstavlja 48 % genov z neznano funkcijo. Tako pripravljen fag je imel daljšo latentno fazo, proizvedel je manj virionov na celico, kljub temu pa je bila sposobnost okužbe bakterije ''P. aeruginosa'' v ''in vivo'' in ''in vitro'' študijah nespremenjena. Raziskava predstavlja manjši napredek pri razvoju novih fagnih terapij, pri katerih bi lahko v fagni genom uvedli gene s protibakterijsko učinkovitostjo in tudi zmanjšali delež genov z neznano funkcijo, ki bi imeli morebitni toksičen vpliv na človeka.

===Viri in literatura===
# D. P. Pires, R. Monteiro, D. Mil-Homens, A. Fialho, T. K. Lu in J. Azeredo: Designing ''P. aeruginosa'' synthetic phages with reduced genomes. ''Sci. Rep.'', '''2021''', ''11'', str. 1–10.
# Z. Pang, R. Raudonis, B. R. Glick, T. J. Lin in Z. Cheng: Antibiotic resistance in Pseudomonas aeruginosa: mechanisms and alternative therapeutic strategies. ''Biotechnology Advances'', '''2019''', ''37'', str. 177–192.
# Pseudomonas aeruginosa Infection | HAI | CDC. https://www.cdc.gov/hai/organisms/pseudomonas.html (dostopno 23.4. 2021).
# P. Hyman in S. T. Abedon: Chapter 18. V: Practical Methods for Determining Phage Growth Parameters. 2009, str. 175-202.

Oblikovanje sintetičnega faga iz P. aeruginosa z reduciranim genomom

2021-05-13T15:58:49Z

Martina Lokar: /* Viri in literatura */

Povzeto po članku: [https://doi.org/10.1038/s41598-021-81580-2 D.P. Pires, R. Monteiro, D. Mil-Homens ''et al'': Designing ''P. aeruginosa'' synthetic phages with reduced genomes. ''Sci. Rep.'' '''2021''', 11(1), 1-10. https://doi.org/10.1038/s41598-021-81580-2]

===Uvod===
Odpornost bakterij na antibiotike postaja vedno večji problem, zato se v zadnjem času kot potencialna terapevtska učinkovina preučujejo tudi bakteriofagi. Kljub temu da je fagna terapija obetaven način zdravljenja, se sooča s številnimi izzivi, kot so varnost, stabilnost in način dostave učinkovine, sposobnost bakteriofagov, da lahko okužijo omejeno število gostiteljskih bakterij, odpornost na bakteriofage ter stranski učinki zaradi lize bakterijskih celic. Ena izmed potencialnih rešitev nekaterih izmed teh omejitev je oblikovanje genetsko spremenjenih bakteriofagov s povečano protibakterijsko učinkovitostjo. V ta namen moramo v fagni genom vstaviti dodatne gene, kar pa zaradi omejitve dolžine DNA, ki se lahko zapakira v virusno kapsido, predstavlja velik problem. Zato bi lahko iz virusnega genoma odstranili gene, ki zapisujejo proteine z neznano funkcijo, gene, ki omogočajo odpornost proti antibiotikom, kot tudi zapise za toksine in druge virulenčne faktorje. Hkrati bi torej zmanjšali verjetnost, da bi bili v genomu prisotni potencialno nevarni geni. Cilj raziskave je bil oblikovati sintetični fag z reduciranim genomom, ki ohrani sposobnost okužbe, razmnoževanja in lize gostiteljske celice [1].

''Pseudomonas aeruginosa'' je patogena bakterija, ki ima izjemno sposobnost razvoja odpornosti na antibiotike. Okužba se pojavi predvsem pri hospitaliziranih pacientih in je lahko smrtno nevarna za ljudi s cistično fibrozo in imunsko pomanjkljivostjo. Problematično je predvsem zdravljenje okužb z bolnišničnimi sevi, zato predstavlja fagna terapija potencialno rešitev [2], [3].

===Izolacija bakteriofaga PE3 in njegova karakterizacija===
V prvem koraku so raziskovalci iz odpadne vode pri čistilni napravi v mestu Braga na Portugalskem izolirali litični fag vB_PaeP_PE3 (okrajšano PE3), ki je sposoben okužiti bakterijo ''P. aeruginosa'' PAO1. Po izolaciji so s transmisijsko elektronsko mikroskopijo (TEM) preverili njegove strukturne lastnosti in ugotovili, da ima PE3 kratek nekontraktilni rep. Izkazalo se je, da je izoliran fag sorazmerno specifičen, saj je bil sposoben okužiti 7 od 28 izoliranih kliničnih sevov ''P. aeruginosa''. V nadaljevanju so fagu posekvencirali celoten genom, ki je dsDNA dolžine 43.583 bp z 62,3 % deležem GC baznih parov in direktnimi končnimi ponovitvami dolžine 479 bp. S pomočjo računalniških orodij so ugotovili, da genom vključuje 55 kodirajočih zaporedij CDS (dolžine 120–4014 bp), med katerimi ima 30 CDS pripisane funkcije, 25 CDS pa zapisuje hipotetične proteine. Nadaljnja genomska analiza je pokazala, da fag najverjetneje ni virulenten, saj ne vključuje lizogenih genov [1].

===Priprava rekombinantnih bakteriofagov===
Ker velik delež genov v fagnem genomu nima pripisanih funkcij, se poraja vprašanje, če so ti geni nujno potrebni za replikacijo in protibakterijske lastnosti. V prvem delu fagnega genoma sta prisotna dva modula genov (modul gp1–gp5 in gp6–gp12), ki vključujeta zapise za hipotetične proteine in sta med seboj ločena z regulatornimi elementi. Z odstranitvijo posameznega modula so pripravili sintetična faga z reduciranim genomom vB_PaeP_PE3∆gp1-gp5 (okrajšano PE3∆gp1-gp5) in vB_PaeP_PE3∆gp6-gp12 (okrajšano PE3∆gp6-gp12).

Sintezo okrajšanega genoma so izvedli tako, da so s pomočjo reakcije PCR in uporabe ustreznih začetnih oligonukleotidov pomnožili celoten genom brez izbranega modula, pri čemer so se posamezni fragmenti v končnih regijah prekrivali. Tako so pripravili 6 prekrivajočih se PCR produktov, ki so predstavljali reduciran genom, in lineariziran YAC s terminalnimi regijami, ki so bile homologne koncema fagnega genoma. Nato so izvedli transformacijo kvasovk ''S. cerevisiae'' BY4741 s prekrivajočimi se sedmimi zaporedji DNA, kjer so se ta s pomočjo DNA popravljalnega mehanizma sestavila v ciklično strukturo fagnega genoma in umetnega kromosoma YAC (YAC-fag DNA). Ustreznost zaporedja so v nadaljevanju preverili z reakcijo PCR na osnovi ene kolonije, pri čemer so uporabili začetne oligonukleotide, ki se vežejo na regijo navzdol in navzgor od izbrisanega modula. Dolžine pomnožkov, ki so jih pri tem dobili, so bile krajše kot pri divjem tipu faga.

Da bi preverili, ali delecije v genomu vplivajo na viabilnost bakterofaga, so iz kvasovk izolirali YAC-fag DNA in jo transformirali v bakterijo P. aeruginosa PAO1, kjer so se fagni geni prepisovali in je prišlo do nastanka funkcionalnih bakteriofagov. Na ploščah s transformiranimi bakterijami so nastali plaki, ki so jih v nadaljevanju preverili s pomočjo reakcije PCR, pri kateri so uporabili že prej omenjene začetne oligonukleotide, ki se vežejo na regijo navzgor in navzdol od izbrisanega modula. S poskusom so dokazali viabilnost rekombinantnih fagov z reduciranim genomom in hkrati pokazali, da prvih 12 genov v fagnem genomu ni esencialnih za razmnoževanje in viabilnost.

Zaradi uspešne priprave dveh rekombinantnih fagov so se raziskovalci odločili pripraviti še tretji fag, pri čemer so izvedli delecijo 3194 bp oziroma vseh 12 genov (gp1–gp12) obeh začetnih modulov. Tretji rekombinantni fag vB_PaeP_PE3∆gp1-gp12 so pripravili po enakem postopku kot faga PE3∆gp1-gp5 in PE3∆gp6-gp12 [1].

===Karakterizacija rekombinantnih bakteriofagov===
Da bi bolje razumeli vpliv izbrisanih regij na lastnosti bakteriofagov, so značilnosti rekombinantnih fagov primerjali z divjim tipom PE3. Najprej so podrobneje analizirali morfologijo plakov, ki nastanejo po okužbi bakterije ''P. aeruginosa'', in ugotovili, da so rekombinantni bakteriofagi za razliko od bakteriofagov divjega tipa tvorili manjše plake. V nadaljevanju so preverili tudi specifičnost rekombinantnih fagov pri okužbi bakterijskih celic. PE3∆gp6-gp12 je bil enako kot PE3 sposoben okužiti 7 od 28 kliničnih izolatov ''P. aeruginosa'', medtem ko sta faga PE3∆gp1 gp5 in PE3∆gp1-gp12 učinkovito okužila in lizirala le 4 bakterijske seve [1].

Z nadaljnjimi poskusi so podrobneje preučili rastne parametre oziroma generacijski čas faga, ki vključuje čas adsorpcije, pritrditve in vnosa nukleinske kisline, latentno periodo in čas sproščanja virionov [4]. PE3 in PE3∆gp6-gp12, ki sta tvorila podobno rastno krivuljo, sta imela v primerjavi s PE3∆gp1-gp5 oziroma PE3∆gp1-gp12 5 min oziroma 15 min krajšo latentno fazo. Kljub temu je v bakterijskih celicah, okuženih s fagi PE3, PE3∆gp1-gp5 in PE3∆gp6-gp12, nastalo približno enako število fagnih delcev (okrog 200 PFU/okuženo celico), medtem ko je bilo v primeru PE3∆gp1-gp12 število nastalih fagnih delcev bistveno manjše (83 PFU/okuženo celico). Rezultati kažejo na to, da bi imeli lahko izbrisani geni funkcijo v zgodnjih stopnjah okužbe bakterije s fagom. Zaradi razlik v latentni fazi bi lahko sklepali, da so geni modula gp1-gp5 pomembni za interakcijo med fagom in bakterijo [1].

V procesu priprave rekombinantnih fagov bi lahko prišlo tudi do uvedbe naključnih mutacij v genomsko DNA, zato so vsem na novo pripravljenim fagom posekvencirali dedni material. Rezultate so dodatno potrdili tako, da so regije genoma, v katerih so s sekvenciranjem odkrili mutacijo, pomnožili v reakciji PCR in jim nato določili nukleotidno zaporedje s pomočjo Sangerjeve metode. V genomu PE3∆gp1-gp5 in PE3∆gp6-gp12 so odkrili 2 točkovni mutaciji, pri čemer je bila ena od teh skupna. V obeh fagih se je kot posledica uporabe istih PCR produktov za rekombinacijo v kvasovki pojavila tranzicijska mutacija na regiji gena gp47, ki zapisuje za nitasti protein repa. PE3∆gp1-gp5 je vseboval tudi tiho mutacijo v genu za endolizin (gp51), medtem ko je bila v PE3∆gp6-gp12 prisotna mutacija v nitastem proteinu repa gp46. V fagnem genomu PE3∆gp1-gp12 so odkrili tri točkovne mutacije, ki so bile prisotne v ogrodnem proteinu gp47 (tiha mutacija) in v nitastima proteinoma repa gp46 in gp47 (drugačnosmiselni mutaciji).

Za konec so z ''in vivo'' in ''in vitro'' poskusom preverili, če imajo uvedene delecije v genomu PE3 morebiten učinek na protibakterijske lastnosti. V ''in vitro'' eksperimentu so v bakterijsko kulturo ''P. aeruginosa'' v logaritemski fazi rasti dodali PE3 in rekombinante bakteriofage ter v 24-urnem intervalu preverjali delež živih bakterijskih celic. V eksperimentu ni bilo opaznih znatnih razlik med fagi, saj se je v vseh primerih približno dve uri po dodatku število viabilnih celic ''P. aeruginosa'' v primerjavi s kontrolo, kjer fagi niso bili dodani, zmanjšalo za približno 5-krat. Nato je v vseh primerih začelo število živih bakterijskih celic naraščati in po 24 urah je bila gostota okuženih in neokuženih celic enaka, kar kaže na to, da so se v vseh primerih zelo hitro oblikovale bakterijske celice, odporne na okužbo s fagom. Pri ''in vivo'' eksperimentu, ki nam omogoča boljše posnemanje naravnih pogojev, so kot modelni organizem uporabili ličinke molja ''G. mellonella'', ki so jih okužili s ''P. aeruginosa'' tako, da so vanje injicirali ustrezen volumen bakterije. Pol ure po okužbi z bakterijo so v žuželke injicirali še rekombinantne fage in divji tip PE3. Kot kontrolo so uporabili pufer, s čimer so preverili delež smrti, ki je posledica poškodb ob injiciranju. Delež preživelih žuželk je bil ob dodatku fagov občutno večji kot pri kontroli, pri čemer ni bilo opaznih znatnih sprememb med rekombinantnimi fagi in divjim tipom. Rezultati torej kažejo, da prisotnost delecij v fagnem genomu ne vpliva na sposobnost okužbe bakterije ''P. aeruginosa'' [1].

===Zaključek===
Kljub temu da so fagni genomi sorazmerno majhni, izkazujejo izjemno raznolikost, zato je funkcija večine fagnih genov še nepoznana. Cilj študije je bil pripraviti rekombinantne fage z reduciranim genomom, pri čemer bi zmanjšali število genov z neznano funkcijo, ter tudi preveriti, kako uvedene delecije vplivajo na učinkovitost okuževanja bakterijskih celic. V raziskavi so uspeli iz bakteriofaga PE3 odstraniti 12 neesencialnih genov, kar predstavlja 48 % genov z neznano funkcijo. Tako pripravljen fag je imel daljšo latentno fazo, proizvedel je manj virionov na celico, kljub temu pa je bila sposobnost okužbe bakterije ''P. aeruginosa'' v ''in vivo'' in ''in vitro'' študijah nespremenjena. Raziskava predstavlja manjši napredek pri razvoju novih fagnih terapij, pri katerih bi lahko v fagni genom uvedli gene s protibakterijsko učinkovitostjo in tudi zmanjšali delež genov z neznano funkcijo, ki bi imeli morebitni toksičen vpliv na človeka.

===Viri in literatura===
# D. P. Pires, R. Monteiro, D. Mil-Homens, A. Fialho, T. K. Lu in J. Azeredo: Designing ''P. aeruginosa'' synthetic phages with reduced genomes. ''Sci. Rep.'', '''2021''', ''11'', 1–10.
# Z. Pang, R. Raudonis, B. R. Glick, T. J. Lin in Z. Cheng: Antibiotic resistance in Pseudomonas aeruginosa: mechanisms and alternative therapeutic strategies. ''Biotechnology Advances'', '''2019''', ''37'', 177–192.
# Pseudomonas aeruginosa Infection | HAI | CDC. https://www.cdc.gov/hai/organisms/pseudomonas.html (dostopno 23.4. 2021).
# P. Hyman and S. T. Abedon: Chapter 18 Practical Methods for Determining Phage Growth Parameters. 2009.

Oblikovanje sintetičnega faga iz P. aeruginosa z reduciranim genomom

2021-05-13T15:57:39Z

Martina Lokar:

Povzeto po članku: [https://doi.org/10.1038/s41598-021-81580-2 D.P. Pires, R. Monteiro, D. Mil-Homens ''et al'': Designing ''P. aeruginosa'' synthetic phages with reduced genomes. ''Sci. Rep.'' '''2021''', 11(1), 1-10. https://doi.org/10.1038/s41598-021-81580-2]

===Uvod===
Odpornost bakterij na antibiotike postaja vedno večji problem, zato se v zadnjem času kot potencialna terapevtska učinkovina preučujejo tudi bakteriofagi. Kljub temu da je fagna terapija obetaven način zdravljenja, se sooča s številnimi izzivi, kot so varnost, stabilnost in način dostave učinkovine, sposobnost bakteriofagov, da lahko okužijo omejeno število gostiteljskih bakterij, odpornost na bakteriofage ter stranski učinki zaradi lize bakterijskih celic. Ena izmed potencialnih rešitev nekaterih izmed teh omejitev je oblikovanje genetsko spremenjenih bakteriofagov s povečano protibakterijsko učinkovitostjo. V ta namen moramo v fagni genom vstaviti dodatne gene, kar pa zaradi omejitve dolžine DNA, ki se lahko zapakira v virusno kapsido, predstavlja velik problem. Zato bi lahko iz virusnega genoma odstranili gene, ki zapisujejo proteine z neznano funkcijo, gene, ki omogočajo odpornost proti antibiotikom, kot tudi zapise za toksine in druge virulenčne faktorje. Hkrati bi torej zmanjšali verjetnost, da bi bili v genomu prisotni potencialno nevarni geni. Cilj raziskave je bil oblikovati sintetični fag z reduciranim genomom, ki ohrani sposobnost okužbe, razmnoževanja in lize gostiteljske celice [1].

''Pseudomonas aeruginosa'' je patogena bakterija, ki ima izjemno sposobnost razvoja odpornosti na antibiotike. Okužba se pojavi predvsem pri hospitaliziranih pacientih in je lahko smrtno nevarna za ljudi s cistično fibrozo in imunsko pomanjkljivostjo. Problematično je predvsem zdravljenje okužb z bolnišničnimi sevi, zato predstavlja fagna terapija potencialno rešitev [2], [3].

===Izolacija bakteriofaga PE3 in njegova karakterizacija===
V prvem koraku so raziskovalci iz odpadne vode pri čistilni napravi v mestu Braga na Portugalskem izolirali litični fag vB_PaeP_PE3 (okrajšano PE3), ki je sposoben okužiti bakterijo ''P. aeruginosa'' PAO1. Po izolaciji so s transmisijsko elektronsko mikroskopijo (TEM) preverili njegove strukturne lastnosti in ugotovili, da ima PE3 kratek nekontraktilni rep. Izkazalo se je, da je izoliran fag sorazmerno specifičen, saj je bil sposoben okužiti 7 od 28 izoliranih kliničnih sevov ''P. aeruginosa''. V nadaljevanju so fagu posekvencirali celoten genom, ki je dsDNA dolžine 43.583 bp z 62,3 % deležem GC baznih parov in direktnimi končnimi ponovitvami dolžine 479 bp. S pomočjo računalniških orodij so ugotovili, da genom vključuje 55 kodirajočih zaporedij CDS (dolžine 120–4014 bp), med katerimi ima 30 CDS pripisane funkcije, 25 CDS pa zapisuje hipotetične proteine. Nadaljnja genomska analiza je pokazala, da fag najverjetneje ni virulenten, saj ne vključuje lizogenih genov [1].

===Priprava rekombinantnih bakteriofagov===
Ker velik delež genov v fagnem genomu nima pripisanih funkcij, se poraja vprašanje, če so ti geni nujno potrebni za replikacijo in protibakterijske lastnosti. V prvem delu fagnega genoma sta prisotna dva modula genov (modul gp1–gp5 in gp6–gp12), ki vključujeta zapise za hipotetične proteine in sta med seboj ločena z regulatornimi elementi. Z odstranitvijo posameznega modula so pripravili sintetična faga z reduciranim genomom vB_PaeP_PE3∆gp1-gp5 (okrajšano PE3∆gp1-gp5) in vB_PaeP_PE3∆gp6-gp12 (okrajšano PE3∆gp6-gp12).

Sintezo okrajšanega genoma so izvedli tako, da so s pomočjo reakcije PCR in uporabe ustreznih začetnih oligonukleotidov pomnožili celoten genom brez izbranega modula, pri čemer so se posamezni fragmenti v končnih regijah prekrivali. Tako so pripravili 6 prekrivajočih se PCR produktov, ki so predstavljali reduciran genom, in lineariziran YAC s terminalnimi regijami, ki so bile homologne koncema fagnega genoma. Nato so izvedli transformacijo kvasovk ''S. cerevisiae'' BY4741 s prekrivajočimi se sedmimi zaporedji DNA, kjer so se ta s pomočjo DNA popravljalnega mehanizma sestavila v ciklično strukturo fagnega genoma in umetnega kromosoma YAC (YAC-fag DNA). Ustreznost zaporedja so v nadaljevanju preverili z reakcijo PCR na osnovi ene kolonije, pri čemer so uporabili začetne oligonukleotide, ki se vežejo na regijo navzdol in navzgor od izbrisanega modula. Dolžine pomnožkov, ki so jih pri tem dobili, so bile krajše kot pri divjem tipu faga.

Da bi preverili, ali delecije v genomu vplivajo na viabilnost bakterofaga, so iz kvasovk izolirali YAC-fag DNA in jo transformirali v bakterijo P. aeruginosa PAO1, kjer so se fagni geni prepisovali in je prišlo do nastanka funkcionalnih bakteriofagov. Na ploščah s transformiranimi bakterijami so nastali plaki, ki so jih v nadaljevanju preverili s pomočjo reakcije PCR, pri kateri so uporabili že prej omenjene začetne oligonukleotide, ki se vežejo na regijo navzgor in navzdol od izbrisanega modula. S poskusom so dokazali viabilnost rekombinantnih fagov z reduciranim genomom in hkrati pokazali, da prvih 12 genov v fagnem genomu ni esencialnih za razmnoževanje in viabilnost.

Zaradi uspešne priprave dveh rekombinantnih fagov so se raziskovalci odločili pripraviti še tretji fag, pri čemer so izvedli delecijo 3194 bp oziroma vseh 12 genov (gp1–gp12) obeh začetnih modulov. Tretji rekombinantni fag vB_PaeP_PE3∆gp1-gp12 so pripravili po enakem postopku kot faga PE3∆gp1-gp5 in PE3∆gp6-gp12 [1].

===Karakterizacija rekombinantnih bakteriofagov===
Da bi bolje razumeli vpliv izbrisanih regij na lastnosti bakteriofagov, so značilnosti rekombinantnih fagov primerjali z divjim tipom PE3. Najprej so podrobneje analizirali morfologijo plakov, ki nastanejo po okužbi bakterije ''P. aeruginosa'', in ugotovili, da so rekombinantni bakteriofagi za razliko od bakteriofagov divjega tipa tvorili manjše plake. V nadaljevanju so preverili tudi specifičnost rekombinantnih fagov pri okužbi bakterijskih celic. PE3∆gp6-gp12 je bil enako kot PE3 sposoben okužiti 7 od 28 kliničnih izolatov ''P. aeruginosa'', medtem ko sta faga PE3∆gp1 gp5 in PE3∆gp1-gp12 učinkovito okužila in lizirala le 4 bakterijske seve [1].

Z nadaljnjimi poskusi so podrobneje preučili rastne parametre oziroma generacijski čas faga, ki vključuje čas adsorpcije, pritrditve in vnosa nukleinske kisline, latentno periodo in čas sproščanja virionov [4]. PE3 in PE3∆gp6-gp12, ki sta tvorila podobno rastno krivuljo, sta imela v primerjavi s PE3∆gp1-gp5 oziroma PE3∆gp1-gp12 5 min oziroma 15 min krajšo latentno fazo. Kljub temu je v bakterijskih celicah, okuženih s fagi PE3, PE3∆gp1-gp5 in PE3∆gp6-gp12, nastalo približno enako število fagnih delcev (okrog 200 PFU/okuženo celico), medtem ko je bilo v primeru PE3∆gp1-gp12 število nastalih fagnih delcev bistveno manjše (83 PFU/okuženo celico). Rezultati kažejo na to, da bi imeli lahko izbrisani geni funkcijo v zgodnjih stopnjah okužbe bakterije s fagom. Zaradi razlik v latentni fazi bi lahko sklepali, da so geni modula gp1-gp5 pomembni za interakcijo med fagom in bakterijo [1].

V procesu priprave rekombinantnih fagov bi lahko prišlo tudi do uvedbe naključnih mutacij v genomsko DNA, zato so vsem na novo pripravljenim fagom posekvencirali dedni material. Rezultate so dodatno potrdili tako, da so regije genoma, v katerih so s sekvenciranjem odkrili mutacijo, pomnožili v reakciji PCR in jim nato določili nukleotidno zaporedje s pomočjo Sangerjeve metode. V genomu PE3∆gp1-gp5 in PE3∆gp6-gp12 so odkrili 2 točkovni mutaciji, pri čemer je bila ena od teh skupna. V obeh fagih se je kot posledica uporabe istih PCR produktov za rekombinacijo v kvasovki pojavila tranzicijska mutacija na regiji gena gp47, ki zapisuje za nitasti protein repa. PE3∆gp1-gp5 je vseboval tudi tiho mutacijo v genu za endolizin (gp51), medtem ko je bila v PE3∆gp6-gp12 prisotna mutacija v nitastem proteinu repa gp46. V fagnem genomu PE3∆gp1-gp12 so odkrili tri točkovne mutacije, ki so bile prisotne v ogrodnem proteinu gp47 (tiha mutacija) in v nitastima proteinoma repa gp46 in gp47 (drugačnosmiselni mutaciji).

Za konec so z ''in vivo'' in ''in vitro'' poskusom preverili, če imajo uvedene delecije v genomu PE3 morebiten učinek na protibakterijske lastnosti. V ''in vitro'' eksperimentu so v bakterijsko kulturo ''P. aeruginosa'' v logaritemski fazi rasti dodali PE3 in rekombinante bakteriofage ter v 24-urnem intervalu preverjali delež živih bakterijskih celic. V eksperimentu ni bilo opaznih znatnih razlik med fagi, saj se je v vseh primerih približno dve uri po dodatku število viabilnih celic ''P. aeruginosa'' v primerjavi s kontrolo, kjer fagi niso bili dodani, zmanjšalo za približno 5-krat. Nato je v vseh primerih začelo število živih bakterijskih celic naraščati in po 24 urah je bila gostota okuženih in neokuženih celic enaka, kar kaže na to, da so se v vseh primerih zelo hitro oblikovale bakterijske celice, odporne na okužbo s fagom. Pri ''in vivo'' eksperimentu, ki nam omogoča boljše posnemanje naravnih pogojev, so kot modelni organizem uporabili ličinke molja ''G. mellonella'', ki so jih okužili s ''P. aeruginosa'' tako, da so vanje injicirali ustrezen volumen bakterije. Pol ure po okužbi z bakterijo so v žuželke injicirali še rekombinantne fage in divji tip PE3. Kot kontrolo so uporabili pufer, s čimer so preverili delež smrti, ki je posledica poškodb ob injiciranju. Delež preživelih žuželk je bil ob dodatku fagov občutno večji kot pri kontroli, pri čemer ni bilo opaznih znatnih sprememb med rekombinantnimi fagi in divjim tipom. Rezultati torej kažejo, da prisotnost delecij v fagnem genomu ne vpliva na sposobnost okužbe bakterije ''P. aeruginosa'' [1].

===Zaključek===
Kljub temu da so fagni genomi sorazmerno majhni, izkazujejo izjemno raznolikost, zato je funkcija večine fagnih genov še nepoznana. Cilj študije je bil pripraviti rekombinantne fage z reduciranim genomom, pri čemer bi zmanjšali število genov z neznano funkcijo, ter tudi preveriti, kako uvedene delecije vplivajo na učinkovitost okuževanja bakterijskih celic. V raziskavi so uspeli iz bakteriofaga PE3 odstraniti 12 neesencialnih genov, kar predstavlja 48 % genov z neznano funkcijo. Tako pripravljen fag je imel daljšo latentno fazo, proizvedel je manj virionov na celico, kljub temu pa je bila sposobnost okužbe bakterije ''P. aeruginosa'' v ''in vivo'' in ''in vitro'' študijah nespremenjena. Raziskava predstavlja manjši napredek pri razvoju novih fagnih terapij, pri katerih bi lahko v fagni genom uvedli gene s protibakterijsko učinkovitostjo in tudi zmanjšali delež genov z neznano funkcijo, ki bi imeli morebitni toksičen vpliv na človeka.

===Viri in literatura===
# D. P. Pires, R. Monteiro, D. Mil-Homens, A. Fialho, T. K. Lu in J. Azeredo: Designing P. aeruginosa synthetic phages with reduced genomes. Sci. Rep., 2021, 11, 1–10.
# Z. Pang, R. Raudonis, B. R. Glick, T. J. Lin in Z. Cheng: Antibiotic resistance in Pseudomonas aeruginosa: mechanisms and alternative therapeutic strategies. Biotechnology Advances, 2019, 37, 177–192.
# Pseudomonas aeruginosa Infection | HAI | CDC. https://www.cdc.gov/hai/organisms/pseudomonas.html (dostopno 23.4. 2021).
# P. Hyman and S. T. Abedon: Chapter 18 Practical Methods for Determining Phage Growth Parameters. 2009.

Oblikovanje sintetičnega faga iz P. aeruginosa z reduciranim genomom

2021-05-13T15:56:49Z

Martina Lokar:

Povzeto po članku: [https://doi.org/10.1038/s41598-021-81580-2 D.P. Pires, R. Monteiro, D. Mil-Homens ''et al'': Designing ''P. aeruginosa'' synthetic phages with reduced genomes. ''Sci. Rep.'' '''2021''', 11(1), 2164. https://doi.org/10.1038/s41598-021-81580-2]

===Uvod===
Odpornost bakterij na antibiotike postaja vedno večji problem, zato se v zadnjem času kot potencialna terapevtska učinkovina preučujejo tudi bakteriofagi. Kljub temu da je fagna terapija obetaven način zdravljenja, se sooča s številnimi izzivi, kot so varnost, stabilnost in način dostave učinkovine, sposobnost bakteriofagov, da lahko okužijo omejeno število gostiteljskih bakterij, odpornost na bakteriofage ter stranski učinki zaradi lize bakterijskih celic. Ena izmed potencialnih rešitev nekaterih izmed teh omejitev je oblikovanje genetsko spremenjenih bakteriofagov s povečano protibakterijsko učinkovitostjo. V ta namen moramo v fagni genom vstaviti dodatne gene, kar pa zaradi omejitve dolžine DNA, ki se lahko zapakira v virusno kapsido, predstavlja velik problem. Zato bi lahko iz virusnega genoma odstranili gene, ki zapisujejo proteine z neznano funkcijo, gene, ki omogočajo odpornost proti antibiotikom, kot tudi zapise za toksine in druge virulenčne faktorje. Hkrati bi torej zmanjšali verjetnost, da bi bili v genomu prisotni potencialno nevarni geni. Cilj raziskave je bil oblikovati sintetični fag z reduciranim genomom, ki ohrani sposobnost okužbe, razmnoževanja in lize gostiteljske celice [1].

''Pseudomonas aeruginosa'' je patogena bakterija, ki ima izjemno sposobnost razvoja odpornosti na antibiotike. Okužba se pojavi predvsem pri hospitaliziranih pacientih in je lahko smrtno nevarna za ljudi s cistično fibrozo in imunsko pomanjkljivostjo. Problematično je predvsem zdravljenje okužb z bolnišničnimi sevi, zato predstavlja fagna terapija potencialno rešitev [2], [3].

===Izolacija bakteriofaga PE3 in njegova karakterizacija===
V prvem koraku so raziskovalci iz odpadne vode pri čistilni napravi v mestu Braga na Portugalskem izolirali litični fag vB_PaeP_PE3 (okrajšano PE3), ki je sposoben okužiti bakterijo ''P. aeruginosa'' PAO1. Po izolaciji so s transmisijsko elektronsko mikroskopijo (TEM) preverili njegove strukturne lastnosti in ugotovili, da ima PE3 kratek nekontraktilni rep. Izkazalo se je, da je izoliran fag sorazmerno specifičen, saj je bil sposoben okužiti 7 od 28 izoliranih kliničnih sevov ''P. aeruginosa''. V nadaljevanju so fagu posekvencirali celoten genom, ki je dsDNA dolžine 43.583 bp z 62,3 % deležem GC baznih parov in direktnimi končnimi ponovitvami dolžine 479 bp. S pomočjo računalniških orodij so ugotovili, da genom vključuje 55 kodirajočih zaporedij CDS (dolžine 120–4014 bp), med katerimi ima 30 CDS pripisane funkcije, 25 CDS pa zapisuje hipotetične proteine. Nadaljnja genomska analiza je pokazala, da fag najverjetneje ni virulenten, saj ne vključuje lizogenih genov [1].

===Priprava rekombinantnih bakteriofagov===
Ker velik delež genov v fagnem genomu nima pripisanih funkcij, se poraja vprašanje, če so ti geni nujno potrebni za replikacijo in protibakterijske lastnosti. V prvem delu fagnega genoma sta prisotna dva modula genov (modul gp1–gp5 in gp6–gp12), ki vključujeta zapise za hipotetične proteine in sta med seboj ločena z regulatornimi elementi. Z odstranitvijo posameznega modula so pripravili sintetična faga z reduciranim genomom vB_PaeP_PE3∆gp1-gp5 (okrajšano PE3∆gp1-gp5) in vB_PaeP_PE3∆gp6-gp12 (okrajšano PE3∆gp6-gp12).

Sintezo okrajšanega genoma so izvedli tako, da so s pomočjo reakcije PCR in uporabe ustreznih začetnih oligonukleotidov pomnožili celoten genom brez izbranega modula, pri čemer so se posamezni fragmenti v končnih regijah prekrivali. Tako so pripravili 6 prekrivajočih se PCR produktov, ki so predstavljali reduciran genom, in lineariziran YAC s terminalnimi regijami, ki so bile homologne koncema fagnega genoma. Nato so izvedli transformacijo kvasovk ''S. cerevisiae'' BY4741 s prekrivajočimi se sedmimi zaporedji DNA, kjer so se ta s pomočjo DNA popravljalnega mehanizma sestavila v ciklično strukturo fagnega genoma in umetnega kromosoma YAC (YAC-fag DNA). Ustreznost zaporedja so v nadaljevanju preverili z reakcijo PCR na osnovi ene kolonije, pri čemer so uporabili začetne oligonukleotide, ki se vežejo na regijo navzdol in navzgor od izbrisanega modula. Dolžine pomnožkov, ki so jih pri tem dobili, so bile krajše kot pri divjem tipu faga.

Da bi preverili, ali delecije v genomu vplivajo na viabilnost bakterofaga, so iz kvasovk izolirali YAC-fag DNA in jo transformirali v bakterijo P. aeruginosa PAO1, kjer so se fagni geni prepisovali in je prišlo do nastanka funkcionalnih bakteriofagov. Na ploščah s transformiranimi bakterijami so nastali plaki, ki so jih v nadaljevanju preverili s pomočjo reakcije PCR, pri kateri so uporabili že prej omenjene začetne oligonukleotide, ki se vežejo na regijo navzgor in navzdol od izbrisanega modula. S poskusom so dokazali viabilnost rekombinantnih fagov z reduciranim genomom in hkrati pokazali, da prvih 12 genov v fagnem genomu ni esencialnih za razmnoževanje in viabilnost.

Zaradi uspešne priprave dveh rekombinantnih fagov so se raziskovalci odločili pripraviti še tretji fag, pri čemer so izvedli delecijo 3194 bp oziroma vseh 12 genov (gp1–gp12) obeh začetnih modulov. Tretji rekombinantni fag vB_PaeP_PE3∆gp1-gp12 so pripravili po enakem postopku kot faga PE3∆gp1-gp5 in PE3∆gp6-gp12 [1].

===Karakterizacija rekombinantnih bakteriofagov===
Da bi bolje razumeli vpliv izbrisanih regij na lastnosti bakteriofagov, so značilnosti rekombinantnih fagov primerjali z divjim tipom PE3. Najprej so podrobneje analizirali morfologijo plakov, ki nastanejo po okužbi bakterije ''P. aeruginosa'', in ugotovili, da so rekombinantni bakteriofagi za razliko od bakteriofagov divjega tipa tvorili manjše plake. V nadaljevanju so preverili tudi specifičnost rekombinantnih fagov pri okužbi bakterijskih celic. PE3∆gp6-gp12 je bil enako kot PE3 sposoben okužiti 7 od 28 kliničnih izolatov ''P. aeruginosa'', medtem ko sta faga PE3∆gp1 gp5 in PE3∆gp1-gp12 učinkovito okužila in lizirala le 4 bakterijske seve [1].

Z nadaljnjimi poskusi so podrobneje preučili rastne parametre oziroma generacijski čas faga, ki vključuje čas adsorpcije, pritrditve in vnosa nukleinske kisline, latentno periodo in čas sproščanja virionov [4]. PE3 in PE3∆gp6-gp12, ki sta tvorila podobno rastno krivuljo, sta imela v primerjavi s PE3∆gp1-gp5 oziroma PE3∆gp1-gp12 5 min oziroma 15 min krajšo latentno fazo. Kljub temu je v bakterijskih celicah, okuženih s fagi PE3, PE3∆gp1-gp5 in PE3∆gp6-gp12, nastalo približno enako število fagnih delcev (okrog 200 PFU/okuženo celico), medtem ko je bilo v primeru PE3∆gp1-gp12 število nastalih fagnih delcev bistveno manjše (83 PFU/okuženo celico). Rezultati kažejo na to, da bi imeli lahko izbrisani geni funkcijo v zgodnjih stopnjah okužbe bakterije s fagom. Zaradi razlik v latentni fazi bi lahko sklepali, da so geni modula gp1-gp5 pomembni za interakcijo med fagom in bakterijo [1].

V procesu priprave rekombinantnih fagov bi lahko prišlo tudi do uvedbe naključnih mutacij v genomsko DNA, zato so vsem na novo pripravljenim fagom posekvencirali dedni material. Rezultate so dodatno potrdili tako, da so regije genoma, v katerih so s sekvenciranjem odkrili mutacijo, pomnožili v reakciji PCR in jim nato določili nukleotidno zaporedje s pomočjo Sangerjeve metode. V genomu PE3∆gp1-gp5 in PE3∆gp6-gp12 so odkrili 2 točkovni mutaciji, pri čemer je bila ena od teh skupna. V obeh fagih se je kot posledica uporabe istih PCR produktov za rekombinacijo v kvasovki pojavila tranzicijska mutacija na regiji gena gp47, ki zapisuje za nitasti protein repa. PE3∆gp1-gp5 je vseboval tudi tiho mutacijo v genu za endolizin (gp51), medtem ko je bila v PE3∆gp6-gp12 prisotna mutacija v nitastem proteinu repa gp46. V fagnem genomu PE3∆gp1-gp12 so odkrili tri točkovne mutacije, ki so bile prisotne v ogrodnem proteinu gp47 (tiha mutacija) in v nitastima proteinoma repa gp46 in gp47 (drugačnosmiselni mutaciji).

Za konec so z ''in vivo'' in ''in vitro'' poskusom preverili, če imajo uvedene delecije v genomu PE3 morebiten učinek na protibakterijske lastnosti. V ''in vitro'' eksperimentu so v bakterijsko kulturo ''P. aeruginosa'' v logaritemski fazi rasti dodali PE3 in rekombinante bakteriofage ter v 24-urnem intervalu preverjali delež živih bakterijskih celic. V eksperimentu ni bilo opaznih znatnih razlik med fagi, saj se je v vseh primerih približno dve uri po dodatku število viabilnih celic ''P. aeruginosa'' v primerjavi s kontrolo, kjer fagi niso bili dodani, zmanjšalo za približno 5-krat. Nato je v vseh primerih začelo število živih bakterijskih celic naraščati in po 24 urah je bila gostota okuženih in neokuženih celic enaka, kar kaže na to, da so se v vseh primerih zelo hitro oblikovale bakterijske celice, odporne na okužbo s fagom. Pri ''in vivo'' eksperimentu, ki nam omogoča boljše posnemanje naravnih pogojev, so kot modelni organizem uporabili ličinke molja ''G. mellonella'', ki so jih okužili s ''P. aeruginosa'' tako, da so vanje injicirali ustrezen volumen bakterije. Pol ure po okužbi z bakterijo so v žuželke injicirali še rekombinantne fage in divji tip PE3. Kot kontrolo so uporabili pufer, s čimer so preverili delež smrti, ki je posledica poškodb ob injiciranju. Delež preživelih žuželk je bil ob dodatku fagov občutno večji kot pri kontroli, pri čemer ni bilo opaznih znatnih sprememb med rekombinantnimi fagi in divjim tipom. Rezultati torej kažejo, da prisotnost delecij v fagnem genomu ne vpliva na sposobnost okužbe bakterije ''P. aeruginosa'' [1].

===Zaključek===
Kljub temu da so fagni genomi sorazmerno majhni, izkazujejo izjemno raznolikost, zato je funkcija večine fagnih genov še nepoznana. Cilj študije je bil pripraviti rekombinantne fage z reduciranim genomom, pri čemer bi zmanjšali število genov z neznano funkcijo, ter tudi preveriti, kako uvedene delecije vplivajo na učinkovitost okuževanja bakterijskih celic. V raziskavi so uspeli iz bakteriofaga PE3 odstraniti 12 neesencialnih genov, kar predstavlja 48 % genov z neznano funkcijo. Tako pripravljen fag je imel daljšo latentno fazo, proizvedel je manj virionov na celico, kljub temu pa je bila sposobnost okužbe bakterije ''P. aeruginosa'' v ''in vivo'' in ''in vitro'' študijah nespremenjena. Raziskava predstavlja manjši napredek pri razvoju novih fagnih terapij, pri katerih bi lahko v fagni genom uvedli gene s protibakterijsko učinkovitostjo in tudi zmanjšali delež genov z neznano funkcijo, ki bi imeli morebitni toksičen vpliv na človeka.

===Viri in literatura===
# D. P. Pires, R. Monteiro, D. Mil-Homens, A. Fialho, T. K. Lu in J. Azeredo: Designing P. aeruginosa synthetic phages with reduced genomes. Sci. Rep., 2021, 11, 1–10.
# Z. Pang, R. Raudonis, B. R. Glick, T. J. Lin in Z. Cheng: Antibiotic resistance in Pseudomonas aeruginosa: mechanisms and alternative therapeutic strategies. Biotechnology Advances, 2019, 37, 177–192.
# Pseudomonas aeruginosa Infection | HAI | CDC. https://www.cdc.gov/hai/organisms/pseudomonas.html (dostopno 23.4. 2021).
# P. Hyman and S. T. Abedon: Chapter 18 Practical Methods for Determining Phage Growth Parameters. 2009.

Oblikovanje sintetičnega faga iz P. aeruginosa z reduciranim genomom

2021-05-13T15:53:12Z

Martina Lokar:

Povzeto po članku: [https://doi.org/10.1038/s41598-021-81580-2 D.P. Pires, R. Monteiro, D. Mil-Homens ''et al'': Designing ''P. aeruginosa'' synthetic phages with reduced genomes. ''Sci. Rep.'' '''2021''', 11(1), 2164. https://doi.org/10.1038/s41598-021-81580-2]

===Uvod===
Odpornost bakterij na antibiotike postaja vedno večji problem, zato se v zadnjem času kot potencialna terapevtska učinkovina preučujejo tudi bakteriofagi. Kljub temu da je fagna terapija obetaven način zdravljenja, se sooča s številnimi izzivi, kot so varnost, stabilnost in način dostave učinkovine, sposobnost bakteriofagov, da lahko okužijo omejeno število gostiteljskih bakterij, odpornost na bakteriofage ter stranski učinki zaradi lize bakterijskih celic. Ena izmed potencialnih rešitev nekaterih izmed teh omejitev je oblikovanje genetsko spremenjenih bakteriofagov s povečano protibakterijsko učinkovitostjo. V ta namen moramo v fagni genom vstaviti dodatne gene, kar pa zaradi omejitve dolžine DNA, ki se lahko zapakira v virusno kapsido, predstavlja velik problem. Zato bi lahko iz virusnega genoma odstranili gene, ki zapisujejo proteine z neznano funkcijo, gene, ki omogočajo odpornost proti antibiotikom, kot tudi zapise za toksine in druge virulenčne faktorje. Hkrati bi torej zmanjšali verjetnost, da bi bili v genomu prisotni potencialno nevarni geni. Cilj raziskave je bil oblikovati sintetični fag z reduciranim genomom, ki ohrani sposobnost okužbe, razmnoževanja in lize gostiteljske celice [1].

''Pseudomonas aeruginosa'' je patogena bakterija, ki ima izjemno sposobnost razvoja odpornosti na antibiotike. Okužba se pojavi predvsem pri hospitaliziranih pacientih in je lahko smrtno nevarna za ljudi s cistično fibrozo in imunsko pomanjkljivostjo. Problematično je predvsem zdravljenje okužb z bolnišničnimi sevi, zato predstavlja fagna terapija potencialno rešitev [2], [3].

===Izolacija bakteriofaga PE3 in njegova karakterizacija===
V prvem koraku so raziskovalci iz odpadne vode pri čistilni napravi v mestu Braga na Portugalskem izolirali litični fag vB_PaeP_PE3 (okrajšano PE3), ki je sposoben okužiti bakterijo ''P. aeruginosa'' PAO1. Po izolaciji so s transmisijsko elektronsko mikroskopijo (TEM) preverili njegove strukturne lastnosti in ugotovili, da ima PE3 kratek nekontraktilni rep. Izkazalo se je, da je izoliran fag sorazmerno specifičen, saj je bil sposoben okužiti 7 od 28 izoliranih kliničnih sevov ''P. aeruginosa''. V nadaljevanju so fagu posekvencirali celoten genom, ki je dsDNA dolžine 43.583 bp z 62,3 % deležem GC baznih parov in direktnimi končnimi ponovitvami dolžine 479 bp. S pomočjo računalniških orodij so ugotovili, da genom vključuje 55 kodirajočih zaporedij CDS (dolžine 120–4014 bp), med katerimi ima 30 CDS pripisane funkcije, 25 CDS pa zapisuje hipotetične proteine. Nadaljnja genomska analiza je pokazala, da fag najverjetneje ni virulenten, saj ne vključuje lizogenih genov [1].

===Priprava rekombinantnih bakteriofagov===
Ker velik delež genov v fagnem genomu nima pripisanih funkcij, se poraja vprašanje, če so ti geni nujno potrebni za replikacijo in protibakterijske lastnosti. V prvem delu fagnega genoma sta prisotna dva modula genov (modul gp1–gp5 in gp6–gp12), ki vključujeta zapise za hipotetične proteine in sta med seboj ločena z regulatornimi elementi. Z odstranitvijo posameznega modula so pripravili sintetična faga z reduciranim genomom vB_PaeP_PE3∆gp1-gp5 (okrajšano PE3∆gp1-gp5) in vB_PaeP_PE3∆gp6-gp12 (okrajšano PE3∆gp6-gp12).

Sintezo okrajšanega genoma so izvedli tako, da so s pomočjo reakcije PCR in uporabe ustreznih začetnih oligonukleotidov pomnožili celoten genom brez izbranega modula, pri čemer so se posamezni fragmenti v končnih regijah prekrivali. Tako so pripravili 6 prekrivajočih se PCR produktov, ki so predstavljali reduciran genom, in lineariziran YAC s terminalnimi regijami, ki so bile homologne koncema fagnega genoma. Nato so izvedli transformacijo kvasovk ''S. cerevisiae'' BY4741 s prekrivajočimi se sedmimi zaporedji DNA, kjer so se ta s pomočjo DNA popravljalnega mehanizma sestavila v ciklično strukturo fagnega genoma in umetnega kromosoma YAC (YAC-fag DNA). Ustreznost zaporedja so v nadaljevanju preverili z reakcijo PCR na osnovi ene kolonije, pri čemer so uporabili začetne oligonukleotide, ki se vežejo na regijo navzdol in navzgor od izbrisanega modula. Dolžine pomnožkov, ki so jih pri tem dobili, so bile krajše kot pri divjem tipu faga.

Da bi preverili, ali delecije v genomu vplivajo na viabilnost bakterofaga, so iz kvasovk izolirali YAC-fag DNA in jo transformirali v bakterijo P. aeruginosa PAO1, kjer so se fagni geni prepisovali in je prišlo do nastanka funkcionalnih bakteriofagov. Na ploščah s transformiranimi bakterijami so nastali plaki, ki so jih v nadaljevanju preverili s pomočjo reakcije PCR, pri kateri so uporabili že prej omenjene začetne oligonukleotide, ki se vežejo na regijo navzgor in navzdol od izbrisanega modula. S poskusom so dokazali viabilnost rekombinantnih fagov z reduciranim genomom in hkrati pokazali, da prvih 12 genov v fagnem genomu ni esencialnih za razmnoževanje in viabilnost.

Zaradi uspešne priprave dveh rekombinantnih fagov so se raziskovalci odločili pripraviti še tretji fag, pri čemer so izvedli delecijo 3194 bp oziroma vseh 12 genov (gp1–gp12) obeh začetnih modulov. Tretji rekombinantni fag vB_PaeP_PE3∆gp1-gp12 so pripravili po enakem postopku kot faga PE3∆gp1-gp5 in PE3∆gp6-gp12 [1].

===Karakterizacija rekombinantnih bakteriofagov===
Da bi bolje razumeli vpliv izbrisanih regij na lastnosti bakteriofagov, so značilnosti rekombinantnih fagov primerjali z divjim tipom PE3. Najprej so podrobneje analizirali morfologijo plakov, ki nastanejo po okužbi bakterije ''P. aeruginosa'', in ugotovili, da so rekombinantni bakteriofagi za razliko od bakteriofagov divjega tipa tvorili manjše plake. V nadaljevanju so preverili tudi specifičnost rekombinantnih fagov pri okužbi bakterijskih celic. PE3∆gp6-gp12 je bil enako kot PE3 sposoben okužiti 7 od 28 kliničnih izolatov ''P. aeruginosa'', medtem ko sta faga PE3∆gp1 gp5 in PE3∆gp1-gp12 učinkovito okužila in lizirala le 4 bakterijske seve [1].

Z nadaljnjimi poskusi so podrobneje preučili rastne parametre oziroma generacijski čas faga, ki vključuje čas adsorpcije, pritrditve in vnosa nukleinske kisline, latentno periodo in čas sproščanja virionov [4]. PE3 in PE3∆gp6-gp12, ki sta tvorila podobno rastno krivuljo, sta imela v primerjavi s PE3∆gp1-gp5 oziroma PE3∆gp1-gp12 5 min oziroma 15 min krajšo latentno fazo. Kljub temu je v bakterijskih celicah, okuženih s fagi PE3, PE3∆gp1-gp5 in PE3∆gp6-gp12, nastalo približno enako število fagnih delcev (okrog 200 PFU/okuženo celico), medtem ko je bilo v primeru PE3∆gp1-gp12 število nastalih fagnih delcev bistveno manjše (83 PFU/okuženo celico). Rezultati kažejo na to, da bi imeli lahko izbrisani geni funkcijo v zgodnjih stopnjah okužbe bakterije s fagom. Zaradi razlik v latentni fazi bi lahko sklepali, da so geni modula gp1-gp5 pomembni za interakcijo med fagom in bakterijo [1].

V procesu priprave rekombinantnih fagov bi lahko prišlo tudi do uvedbe naključnih mutacij v genomsko DNA, zato so vsem na novo pripravljenim fagom posekvencirali dedni material. Rezultate so dodatno potrdili tako, da so regije genoma, v katerih so s sekvenciranjem odkrili mutacijo, pomnožili v reakciji PCR in jim nato določili nukleotidno zaporedje s pomočjo Sangerjeve metode. V genomu PE3∆gp1-gp5 in PE3∆gp6-gp12 so odkrili 2 točkovni mutaciji, pri čemer je bila ena od teh skupna. V obeh fagih se je kot posledica uporabe istih PCR produktov za rekombinacijo v kvasovki pojavila tranzicijska mutacija na regiji gena gp47, ki zapisuje za nitasti protein repa. PE3∆gp1-gp5 je vseboval tudi tiho mutacijo v genu za endolizin (gp51), medtem ko je bila v PE3∆gp6-gp12 prisotna mutacija v nitastem proteinu repa gp46. V fagnem genomu PE3∆gp1-gp12 so odkrili tri točkovne mutacije, ki so bile prisotne v ogrodnem proteinu gp47 (tiha mutacija) in v nitastima proteinoma repa gp46 in gp47 (drugačnosmiselni mutaciji).

Za konec so z ''in vivo'' in ''in vitro'' poskusom preverili, če imajo uvedene delecije v genomu PE3 morebiten učinek na protibakterijske lastnosti. V ''in vitro'' eksperimentu so v bakterijsko kulturo ''P. aeruginosa'' v logaritemski fazi rasti dodali PE3 in rekombinante bakteriofage ter v 24-urnem intervalu preverjali delež živih bakterijskih celic. V eksperimentu ni bilo opaznih znatnih razlik med fagi, saj se je v vseh primerih približno dve uri po dodatku število viabilnih celic ''P. aeruginosa'' v primerjavi s kontrolo, kjer fagi niso bili dodani, zmanjšalo za približno 5-krat. Nato je v vseh primerih začelo število živih bakterijskih celic naraščati in po 24 urah je bila gostota okuženih in neokuženih celic enaka, kar kaže na to, da so se v vseh primerih zelo hitro oblikovale bakterijske celice, odporne na okužbo s fagom. Pri ''in vivo'' eksperimentu, ki nam omogoča boljše posnemanje naravnih pogojev, so kot modelni organizem uporabili ličinke molja ''G. mellonella'', ki so jih okužili s ''P. aeruginosa'' tako, da so vanje injicirali ustrezen volumen bakterije. Pol ure po okužbi z bakterijo so v žuželke injicirali še rekombinantne fage in divji tip PE3. Kot kontrolo so uporabili pufer, s čimer so preverili delež smrti, ki je posledica poškodb ob injiciranju. Delež preživelih žuželk je bil ob dodatku fagov občutno večji kot pri kontroli, pri čemer ni bilo opaznih znatnih sprememb med rekombinantnimi fagi in divjim tipom. Rezultati torej kažejo, da prisotnost delecij v fagnem genomu ne vpliva na sposobnost okužbe bakterije ''P. aeruginosa'' [1].

===Zaključek===
Kljub temu da so fagni genomi sorazmerno majhni, izkazujejo izjemno raznolikost, zato je funkcija večine fagnih genov še nepoznana. Cilj študije je bil pripraviti rekombinantne fage z reduciranim genomom, pri čemer bi zmanjšali število genov z neznano funkcijo, ter tudi preveriti, kako uvedene delecije vplivajo na učinkovitost okuževanja bakterijskih celic. V raziskavi so uspeli iz bakteriofaga PE3 odstraniti 12 neesencialnih genov, kar predstavlja 48 % genov z neznano funkcijo. Tako pripravljen fag je imel daljšo latentno fazo, proizvedel je manj virionov na celico, kljub temu pa je bila sposobnost okužbe bakterije ''P. aeruginosa'' v ''in vivo'' in ''in vitro'' študijah nespremenjena. Raziskava predstavlja manjši napredek pri razvoju novih fagnih terapij, pri katerih bi lahko v fagni genom uvedli gene s protibakterijsko učinkovitostjo in tudi zmanjšali delež genov z neznano funkcijo, ki bi imeli morebitni toksičen vpliv na človeka.

===Viri in literatura===

Oblikovanje sintetičnega faga iz P. aeruginosa z reduciranim genomom

2021-05-13T15:39:21Z

Martina Lokar:

Oblikovanje sintetičnega faga iz P. aeruginosa z reduciranim genomom

2021-05-13T15:36:35Z

Martina Lokar:

2021-04-30T16:27:53Z

Martina Lokar:

===Uvod===
'''Škrob''' spada med rezervne rastlinske polisaharide in je sestavljen iz amiloze (15–30 %) ter amilopektina (70–85 %) [1-3]. Delček škroba, ki se v tankem črevesu ob delovanju prebavnih encimov ne razgradi in se ne absorbira, imenujemo odporni škrob (ang. resistant starch ali RS). RS delimo na osnovi oblike, izvora in lastnosti v pet skupin. Z retrogradacijo naravnega škroba lahko pridobimo RS3, ki ima negranularno strukturo in povečano kristaliničnost. Je tudi termično stabilen, poleg tega pa ima visoko hranilno vrednost in lastnosti prehranskih vlaknin, zato postaja vedno bolj uporaben v prehrambni industriji [1, 4].

'''Pululanaza''' je klestilni encim, ki ga, glede na katalitično specifičnost, delimo v dva tipa. Pululanaza tipa I lahko hidrolizira α-1,6-glikozidne vezi, kar ji omogoča pretvorbo amilopektina v škrobu v linearne polimere glukoze. To predstavlja prednost pri proizvodnji RS3, saj se hidrolizirani polimeri lažje in hitreje agregirajo oziroma kristalizirajo v odpornejšo obliko [1].

===Odkritje gena in postopek priprave rekombinantnega encima===

Znanstveniki so v metagenomu indijskega termalnega vrelca odkrili gen ''pulM'', ki zapisuje pululanazo tipa I, in ga prenesli v vektor pET28a(+). Kompetentne ''E. coli'' BL21[DE3] so v nadaljevanju transformirali s tako pripravljenim plazmidom in z dodatkom IPTG inducirali izražanje encima. Pululanazo so iz celičnega lizata izolirali z Ni-afinitetno kromatografijo, očiščeno frakcijo pa analizirali s PAGE in tako določili čistost (95 %) ter molsko maso encima (približno 80 kDa) [1].

===Analiza kinetičnih lastnosti encima===

Hidrolitično aktivnost pululanaze PulM pri razgradnji substrata pululana so izmerili tako, da so s pomočjo reagenta DNS (dinitrosalicilna kislina) spremljali delež reducirajočih koncev v raztopini. Pululan je linearni polisaharid, zgrajen iz maltotrioznih podenot, povezanih z α-1,6-glikozidnimi vezmi, ki jih med inkubacijo PulM cepi [1,5].

V nadaljnjih poskusih so preverjali encimsko aktivnost in stabilnost pululanaze pri različnih temperaturah (4–80 °C) ter vrednostih pH (4,5–10), poleg tega so določali tudi vpliv kovinskih ionov in drugih kemikalij (detergentov in denaturantov) na katalitične lastnosti. Maksimalna katalitična aktivnost je bila opažena pri 40 °C in pH med 6 in 7. Encim je v alkalnem manj stabilen in ima manjšo katalitično aktivnost, pri nizkih vrednostih pH pa pululanaza popolnoma izgubi katalitično aktivnost. Pri 4 °C lahko PulM razgrajuje substrat s 50 % učinkovitostjo. Poskusi so pokazali tudi izjemno stabilnost encima pri optimalni temperaturi, saj se je aktivnost po štiridesetih dneh na 40 °C zmanjšala za samo 15 %. Ključno vlogo pri ohranjanju encimske aktivnosti ima Ca2+, ki stabilizira tridimenzionalno proteinsko strukturo. Dodatek detergentov in denaturantov ni ključno vplival na encimsko aktivnost, se je pa aktivnost povišala ob dodatku reducentov [1].

===Priprava in analiza odpornega škroba===

V prvem koraku so po predhodno znanem postopku iz krompirja, ki vsebuje 13–23 % škroba, ekstrahirali belo oborino škrobnih granul. Nato so iz pridobljenega produkta s pomočjo pululanaze PulM s 45 % izkoristkom pripravili odporni škrob tipa 3 in ga v nadaljevanju še ovrednotili.

Najprej so z vrstičnim elektronskim mikroskopom (SEM) analizirali vzorec ekstrahiranega krompirjevega škroba, vzorec s pululanazo cepljenega škroba in odporni škrob. Ekstrahiran krompirjev škrob je vključeval gladke, ovalne ali okrogle granule velikosti 10–70 μm, kar se je ujemalo s podatki iz literature. Po hidrolizi s pululanazo je postal nativni škrob nepravilne, spužvaste oblike, kar je posledica agregacije okleščenih linearnih glukoznih polisaharidov. S SEM so opazili tudi, da je retrogradacija tako hidroliziranega škroba omogočila nastanek mase prepletenih vlaken s čvrsto strukturo, ki jih po retrogradaciji s pululanazo neobdelanega škroba ne opazimo. Termična stabilnost odpornega škroba je bila v primerjavi z nativnim škrobom višja, kar je posledica bolj kompaktne in trde strukture agregiranih polisaharidnih verig.

Nativnemu in odpornemu škrobu so v nadaljevanju določili tudi rentgenski difrakcijski vzorec. Rezultati so pokazali, da ima pridobljen odporni škrob višjo stopnjo kristaliničnosti od nativnega.

Za konec so določili tudi sposobnost encimske razgradnje nativnega škroba in RS3 in vitro ob dodatku α-amilaze. Pridobljen odporni škrob je bil za razliko od nativnega odporen na encimsko razgradnjo [1].

===Zaključek===

V študiji so opisali na novo odkrito, pri nizkih temperaturah aktivno pululanazo tipa I PulM, ki je sposobna učinkovite razgradnje α-1,6-glikozidne vezi krompirjevega škroba, pri čimer se poveča delež amiloze. S procesom retrogradacije encimsko obdelanega škroba jim je uspelo pridobiti odporni škrob tipa 3, ki ima v primerjavi z nativnim škrobom povišano kristaliničnost, je termično stabilen in odporen na encimsko razgradnjo. Z raziskavo so tako pokazali, da bi lahko pululanazo PulM uporabljali v industriji za proizvodnjo odpornega škroba [1].

===Viri in literatura===
# M. Thakur, N. Sharma, A. K. Rai, and S. P. Singh: A novel cold-active type I pullulanase from a hot-spring metagenome for effective debranching and production of resistant starch. Bioresour. Technol., 2021, 320, 124288.
# E. Bertoft: Understanding starch structure: Recent progress. Agronomy, 2017, 7.
# H. Omoregie Egharevba: Chemical Properties of Starch and Its Application in the Food Industry. Chemical Properties of Starch, 2020.
# D. Yi, W. Maike, S. Yi, S. Xiaoli, W. Dianxing, and S. Wenjian: Physiochemical Properties of Resistant Starch and Its Enhancement Approaches in Rice. Rice Science, 2021, 28, 31–42.
# O. Pınar, F. Yangılar, P. Oğuzhan, and F. Yangılar: Pullulan : Production and usage in food ındustry. African J. Food Sci. Technol., 2013, 4, 57–63.