Wiki FKKT - User contributions [en]

2017-bionano-seminar

2017-03-15T21:58:21Z

Maruša Prolič-Kalinšek:

= Bionanotehnologija- seminar =
doc. dr. Gregor Gunčar, K2.022

== Seznam seminarjev ==
{| {{table}}
! Ime in priimek !! Datum predstavitve !! Tema seminarja
|-
! Peter Prezelj
| 22.03.17 || Spreminjanje vsebnosti in karakteristik hranilnih snovi v živilih in pripravljeni hrani z uporabo kovalentnih modifikacij, prečnega povezovanja in encimov
|-
! Boštjan Petrič
| 22.03.17 || Reverzibilno tiskanje s peptidnimi /proteinskimi pigmenti, kovalentno vezanimi na celulozo prek amidne vezi
|-
! Ema Guštin
| 22.03.17 || Senzor za zaznavo natančne glikozilacije proteinov (npr. eritropoetina)
|-
! Tjaša Lapanja
| 29.03.17 || opis teme ali naslov
|-
! Maruša Prolič Kalinšek
| 29.03.17 || Senzor za detekcijo Legionella bakterij na osnovi polidiacetilena
|-
! Domen Klofutar
| 29.03.17 || Novi načini prenosa informacij z izrabo kapacitet DNA: Prenos šifrirne in/ali steganografske DNA v ustni votlini preko naravno prisotnih gostiteljev Lactobacillus Casei in Veillonella Parvula
|-
! Simon Bolta
| 05.04.17 || Sinteza inzulina pri sladkornih bolnikih neposredno po povišanju krvnega sladkorja
|-
! Tomaž Rozmarič
| 05.04.17 || Senzor za zaznavo natančne glikozilacije proteinov (npr. eritropoetina)
|-
! Urša Kapš
| 05.04.17 || Nanodelci za strjevanje krvi
|-
! Julija Mazej
| 12.04.17 || opis teme ali naslov
|-
! Nataša Žigante
| 12.04.17 || opis teme ali naslov
|-
! Anja Herceg
| 12.04.17 || opis teme ali naslov
|-
! Mirjam Kmetič
| 19.04.17 || Nanoprotistrup na osnovi nanodelcev, ki vsebujejo inhibitor varespladib
|-
! Mojca Kostanjevec
| 19.04.17 || Tarčno zdravljenje epitelijskih tumorjev (cepiva in si-RNA - EpCAM) z uporabo nanodiskov
|-
! Jan Rozman
| 19.04.17 || Sinteza nealergenega rekombinantnega kazeina za jedilno / biorazgradljivo embalažo
|-
! Barbara Dušak
| 03.05.17 || opis teme ali naslov
|-
! Mateja Cigoj
| 03.05.17 || Probiotik z dodatkom nanodelcev za zdravljenje celiakije. Uporaba probiotičnih bakterij, ki izločajo peptidaze za razgradnjo glutena do neimunogenih fragmentov, in nanodelcev, ki vsebujejo modificirane naravne glutenske peptide specifične za HLA-DQ2 receptorje na limfocitih T, ki zavrejo Th1 posredovan avtoimunski odziv na gluten.
|-
! Toni Nagode
| 03.05.17 || Senzor za zaznavo natančne glikozilacije proteinov (npr. eritropoetina)
|-
! Tim Božič
| 10.05.17 || Senzor za zaznavo natančne glikozilacije proteinov (npr. eritropoetina)
|-
! Darja Božič
| 10.05.17 || opis teme ali naslov
|-
! Petra Tavčar
| 10.05.17 || Odstranjevalec škodljivih E-jev in BPA iz kupljenih pijač na osnovi kovalentno pritrjenih protiteles in aptamerov
|-
! Marjeta Horvat
| 17.05.17 || FeO nanodelci za učinkovitejše odpravljanje zobnega kariesa
|-
! Danijela Jošić
| 17.05.17 || Gensko spremenjen Lactobacillus, ki izloča nanodelce z spermicidnim in protimikrobnim delovanjem za dolgotrajno zaščito pred zanositvijo in spolno prenosljivimi boleznimi.
|-
! Tina Kuhar
| 17.05.17 || Flaška za vodo z bionanosenzorjem za takojšnjo zaznavo kvalitete oziroma pitnosti nalite vode.
|-
! Nika Strašek
| 24.05.17 || Uporabniku dostopen diagnostični test za zaznavo okužbe s boreliozo in klopnim meningitisom
|-
! Eva Vidak
| 24.05.17 || Biosenzor za CO na osnovi transkripcijskega faktorja CooA iz bakterije ''Rhodospirillum rubrum''
|-
! Alja Zgonc
| 24.05.17 || Senzor za zaznavanje miRNA v urinu za diagnozo nevrodegenerativnih bolezni
|-
! Zala Gluhić
| 31.05.17 || Varnejše uživanje alkohola z uporabo odorant-binding proteina LUSH.
|-
! Judita Avbelj
| 31.05.17 || Nanonaprava iz bioloških delov, ki z absorbcijo in razgradnjo delcev iz zraka preprečuje različne alergijske reakcije.
|-
! Vid Jazbec
| 31.05.17 || Gensko spremenjene čebele odporne na insekticide.
|-
! Vita Vidmar
| 07.06.17 || 'Hot start' transglutaminaza za popravljanje razcepljenih lasnih konic
|-
! Luka Kavčič
| 07.06.17 || Senzor za zaznavo natančne glikozilacije proteinov (npr. eritropoetina)
|-
! Mojca Juteršek
| 07.06.17 || Senzor za zaznavo natančne glikozilacije proteinov (npr. eritropoetina)
|-
! Bojana Lazović
| 07.06.17 || opis teme ali naslov
|-
! Eva Korošec
| 07.06.17 || Tattoo biosenzor za raven alkohola v krvi na osnovi alkohol oksidaze, povezan s pametnim telefonom, računalnikom ali avtomobilskimi ključi.
|-
! Tajda Buh
| 07.06.17 || opis teme ali naslov
|}

== Gradivo za predavanja ==
Gradivo za predavanja najdete v [http://ucilnica.fkkt.uni-lj.si/ spletni učilnici].

==Naloga==
'''Vaša naloga je: '''
Študent pripravi projektno nalogo iz področja Bionanotehnologije. Najpomembnejša je originalna ideja za nek izvedljiv projekt.
Predlagana struktura:
* Uvod
* Predstavitev problema, znanstvena izhodišča, cilji
* Izvedba projekta, metodologija, tehnike, materiali, vprašanja, hipoteze
* Literatura

Za pripravo seminarja velja naslednje: 
* Prva stran seminarja naj vsebuje naslov projekta, avtorje, povzetek (od 130 do 160 besed) in grafični povzetek (čez približno pol strani)
* Seminar pripravite v obliki seminarske naloge (pisava 12, enojni razmak, 2,5 cm robovi). Obseg seminarja naj bo od 2000 do 2500 besed (vključno z literaturo). Seminarska naloga mora vsebovati najmanj tri slike. Slika mora imeti legendo in v besedilu mora biti na ustreznem mestu sklic na sliko. 
* Seminar oddajte do datuma oddaje, ki je naveden v tabeli v elektronski obliki z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/ tega obrazca].
* Vsi seminarji so v elektronski obliki dostopni [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/bioseminar/ tukaj].
* Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Za predstavitev je na voljo 25 minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni.
* Predstavitvi sledi razprava. Recenzenti podajo pripombe k projektu in postavijo po dve vprašanji.
* Na dan predstavitve morate docentu še pred predstavitvijo oddati končno verzijo seminarja v enem izvodu, elektronsko verzijo seminarja in predstavitev pa oddati na strežnik en dan pred predstavitvijo do polnoči.

==Imena datotek==
Prosim vas, da vse datoteke poimenujete po naslednjem receptu:
* 19_nano_Priimek1_Priimek2.doc(x) za seminar, npr. 19_nano_Craik_Venter.docx
* 19_nano_Priimek1_Priimek2.ppt(x) za prezentacijo, npr. 19_nano_Craik_Venter.pptx

==Ocenjevanje seminarjev==
Recenzenti ocenijo seminar tako, da izpolnijo [https://docs.google.com/forms/d/1WdCXoXo1zkRrVlLKIcEV1z_MyhavU-3ERBm9n2oiawI/viewform recenzentsko poročilo] na spletu. Recenzentsko poročilo morate oddati najkasneje do predstavitve seminarja.

== Mnenje o predstavitvi ==
Vsak posameznik '''mora''' oceniti seminar, tako da odda svoje [https://docs.google.com/forms/d/1ToLPn78T9W3G6Hm5hV0mLseFYghiLQMlRPGb0J5zft8/viewform mnenje] najkasneje v sedmih dneh po predstavitvi. Kdor na seminarju ni bil prisoten, mnenja '''ne sme''' oddati.
Na [http://bit.ly/bntmnenja tej strani] lahko preverite, če ste svoje mnenje za določen seminar že oddali in če je bil oddan pravočasno.

==Urejanje spletnih strani na wikiju==
Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''

==Citiranje virov==
Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se držite ene same. V seminarskih nalogah in diplomskih nalogah FKKT uprabljajte shemo citiranja, ki je pobarvana zeleno.
Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati.
Za citate v naravoslovju je najpogostejše citiranje po pravilniku ISO 690. [http://www.zveza-zotks.si/gzm/dokumenti/literatura.html Pravila], ki upoštevajo omenjeni standard, so pripravili pri ZTKS. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati. 
'''Citiranje knjig:''' 
Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica. 
Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN. 

Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005. 
Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4. 
Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.).

'''Citiranje člankov:''' 
Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani. 
Lartigue, C., Glass, J. I., Alperovich, N., Pieper, R., Parmar, P. P., Hutchison III, C. A., Smith, H. O. in Venter, J. C.
Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, 317, str. 632-638.

Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole: 
Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani. 
Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.

Revija Science uporablja skrajšani zapis: 
C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007) 

V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne). Navesti morate tudi vse avtorje dela, razen v primeru, ko jih je 10 ali več. Takrat navedite le prvih devet, za ostale pa uporabite okrajšavo in sod. (in sodelavci). Pred zadnjim avtorjem naj bo vedno besedica "in".

'''Citiranje spletnih virov:''' 
Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov 
strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life 
Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.

Encimsko združevanje DNA molekul dolgih več sto kilobaz

2017-01-09T22:40:34Z

Maruša Prolič-Kalinšek:

[http://www.nature.com/nmeth/journal/v6/n5/full/nmeth.1318.html Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases]

= '''Uvod''' =

Uporaba rekombinantne tehnologije DNA se je začela z odkritjem DNA ligaze in restrikcijskih endonukleaz. Od takrat se je razvilo več različnih metod povezovanja molekul DNA z uporabo restrikcijskih encimov in PCR. Prav tako pa obstaja tudi od ligacije neodvisno kloniranje (LIC). Slabost PCR je, da se ne more uporabiti za združevanje daljših molekul. Pri LIC ligacija poteka v celici po transformaciji že prileganih molekul. Slabost uporabe restrikcijskih encimov tipa II za združevanje molekul, je v tem da se težje zdužuje več molekul hkrati. Pri združevanju večjih molekul z uporabo IIS tipa rekstrikcijskih encimov pa se lahko zgodi, da bodo vsebovala IIS restrikcijska mesta.
Raziskovalci iz J- Craig Venter inštituta (Maryland in Kalifornija, ZDA) so razvili in vitro rekombinacijski sistem, kjer se v enem koraku lahko sestavi in popravi prekrivajoče molekule DNA. Ta pristop se lahko uporabi za združitev molekul DNA, ki so dolge tudi do 583 kb (kilobaz), v E. Coli pa se lahko klonira produkte do velikosti 300 kb. Vse kar je potrebno za uspešno združitev je zmešati zmes reagentov in encimov z prekrivajočimi molekulami DNA. Reakcijsko mešanico se inkubira 15 do 60 minut pri 50 °C. Pred to metodo so raziskovalci že razvili in vitro rekombinacijsko metodo kjer se združitev molekul DNA doseže v dveh korakih pri različnih temperaturah. Ta pristop so uporabili za združitev 101 DNA kaset v štiri četrtinske molekule M. genitalium genoma (vsaka 136-166 kb). Poleg tega pa so razvili tudi metodo. kjer se molekule DNA združi v enem koraku, vendar pa se spreminja temperaturo tekom reakcije [1].

= '''Princip termociklične metode v dveh korakih''' =

Uporabi se T4 DNA polimerazo, ki ima 3' eksonukleazno aktivnost, s katero dobimo 5' ssDNA štrleče konce, in kombinacijo Taq DNA polimeraze in Taq DNA ligaze. Reakcijo se izvede v cikličnem termostatu v dveh korakih. V prvem koraku T4 DNA polimeraza odstrani nukleotide iz 3' konca. T4 DNA polimerazo se nato inaktivira z inkubacijo pri 75 °C. Sledi počasno ohlajanje in prileganje komplementarnih delov. V drugem koraku se prilegane dele popravi s Taq DNA polimerazo in Taq DNA ligazo pri temperaturi 45 °C v prisotnosti vseh štirih dNTP-jev. Dva koraka sta tu obvezna zato, ker za eksonukleazno aktivnost T4 DNA polimeraze ne smemo imeti v sistemu dNTP-jev [1, 2].

= '''Princip termociklične metode v enem koraku''' =

Uporabi se eksonukleaza III, ki odstrani nukleotide iz 3' konca dsDNA in je aktivna v prisotnosti dNTP-jev. Ker eksonukleaza III tekmuje za vezavo na 3' konce z polimerazo, se uporabi Taq DNA polimerazo, ki ima vezano protitelo. Tako se lahko združitev molekul DNA izvede v enem koraku. Reakcija prvo poteka pri 37 °C, kjer je eksonukleaza aktivna in Tag DNA polimeraza, ki ima vezano protitelo neaktivna. Potem se dvigne temperaturo na 75 °C, kar inaktivira eksonukleazo III. Poteče prileganje in protitelo disociira od Taq DNA polimeraze, kar aktivira encim. Sledi ohlajanje na 60 °C, kjer poteče podaljševanje in ligacija [1, 2].

= '''Princip izotermne metode v enem koraku''' =

Eksonukleaze, ki režejo dvoverižno DNA iz 5' konca ne bodo tekmovale s polimerazno aktivnostjo. Vsi potrebni encimi so lahko hkrati aktivni. Metoda je uporabna tudi za pripravo krožnih produktov, saj jih nobeden od encimov ne procesira. Raziskovalci so optimizirali izotermni sistem za aktivnost 5' T5 eksonukleaze, Phusion DNA polimeraze in Taq DNA ligaze. Taq DNA polimeraza se lahko uporabi namesto Phusion DNA polimeraze. Ima pa Phusion DNA polimeraza aktivnost kontrolnega branja in lahko odstrani nekomplementarna zaporedja (npr. delna restrikcijska mesta) iz sestavljenih molekul, prav tako pa Phusion DNA polimeraza vstavlja napačne nukleotide s precej nižjo pogostostjo. Celotna reakcija poteka pri 50 °C. Potek reakcije je torej sledeč: T5 eksonukleaza odstrani nukleotide iz 5' konca dvoverižne molekule DNA, sledi prileganje komplementarni enoverižnih koncev DNA, nato Phusion DNA polimeraza zapolni vrzeli in Tag DNA ligaza dokončno združi fragmenta. T5 eksonukleaza je temperaturno labilna in se inaktivira pri 50 °C [1].

= '''Rezultati''' =

Da bi preverili učinkovitost sistema so cepili dva restrikcijska fragmenta, ki se prekrivata v 450 bp, iz 6-kb vektorja pRS415 ki so ju nato ponovno sestavili v krožni produkt. Po 6-8 minutah pri 50 °C je linearna substratna DNA popolnoma zreagirala in glavni produkt, ki je nastal je bil 6-kb krožni produkt (na agaroznem gelu so ga opazili tik pod liso za 4 kb linearni fragment). T5 eksonukleaza razgradi linearno DNA, krožne DNA pa ne. Da je bil nastali produkt res krožen so potrdili z uporabo T5 eksonukleaze. Da so še potrdili, da je nastal pravi 6 kb krožen produkt so ga cepili z NotI, ki bi moral cepiti produkt samo enkrat. Na agaroznem gelu so opazili samo eno liso za 6 kb linearen fragment. Zaključili so, da se lahko molekule DNA sestavlja in popravi v enem koraku z uporabo te izotermne metode.
Nato so določili ali se molekule DNA, ki imajo samo 40 bp dolge prekrivajoče dele lahko združi. To jim je uspelo, ko so znižali koncentracijo T5 eksonukleaze. Tri 5 kb dolge fragmente so uspešno združili v 8 kb bakterijski umetni kromosom (BAC). Ko so transformirali te fragmente v E. Coli, so v devet od desetih testiranih kolonij (dobili so jih 4,500) dobili predviden 15 kb insert.
Da bi določili, če se lahko to metodo uporabi tudi za združitev daljših fragmentov, so uporabili dva sintetična dela genoma M. genitalium (C25-49 (144 kb) in C50-77 (166kb)), ter BAC25-77 (8 kb), ki je klonirni vektor specifičen za združitev teh dveh fragmentov. Uspešno so dobili predviden 318 kb Mgen25-77 produkt. Zaključili so, da s to metodo lahko združimo molekule teh velikosti. Potrdili so tudi, da s to metodo pridobljene večje fragmente lahko kloniramo, za kar so del te reakcijske mešanice transformirali v E. Coli. Pridobili so več sto kolonij in 5 od 10 kolonij je vsebovalo insert pričakovane velikosti (310 kb). Ta sistem se torej lahko uporabi za združitev in kloniranje molekul DNA, ki so dolge več sto kb v E. Coli. V raziskavi so sestavili tudi celoten sintetičen genom M. genitalium (583 kb). Največja velikost fragmentov katerih se še lahko združi ni znana, vendar pa so opazi produkte velike tudi 900 kb.
Med in vitro rekombinacijo lahko pride do napak v na novo sestavljeni molekuli DNA. Ko so določili zaporedje 30 kloniranih molekul DNA (210 združenih stikov) po uporabi termociklične metode z dvema korakoma so določili 4 napake. To znaša približno eno napako na 50 molekul DNA združenih. Predpostavljajo da naj bi bilo napak pri izotermni metodi z enim koramok manj. Nižja stopnja napak naj bi šla predvsem na račun uporabe Phusion DNA polimeraze [1].

= '''Zaključek''' =

Izotermno metodo v enem koraku se lahko uporabi za združevanje molekul DNA katerih koli velikosti. Ta pristop bi lahko bil zelo uporaben za kloniranje večih insertov v vektor ne da bi se bilo potrebno ozirati na restrikcijska mesta. Metoda bi bila lahko uporabna tudi za hitro sestavljanje velikih molekul DNA. Npr. molekule DNA, ki so prevelike za pomnoženje s PCR, bi se lahko razdelilo v več prekrivajočih PCR amplikonov, nato pa bi se jih s to metodo združilo v eno veliko molekulo DNA. Metodo kjer se v enem koraku združi molekule DNA bi se lahko uporabilo tudi za pridobitev linearnih fragmentov. Sintezni biologi razvijajo različne genetske poti za proizvodnjo biogoriv, farmacevtskih učinkovin in industrijskih spojin. V raziskavi so predlagali učinkovito, hitro in preprosto metoda za konstruiranje teh poti iz naravne ali sintetične DNA. [1].

= '''Literatura''' =

[1] D. G. Gibson, L. Young, R.-Y, Chuang, J. C. Venter, C. A. Hutchison III in H. O. Smith, [http://www.nature.com/nmeth/journal/v6/n5/full/nmeth.1318.html Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases], Nature Methods, št. 6, str. 343-345, 2009

[2] D. G. Gibson. Methods in enzymology: [http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/B9780123851208000152 Enzymatic assembly of overlapping DNA fragments]. Št. 498, Waltham : Elsevier ,str. 349-361, 2011

[[Seminarji SB 2016/17]]

Encimsko združevanje DNA molekul dolgih več sto kilobaz

2017-01-09T22:37:32Z

Maruša Prolič-Kalinšek:

[http://www.nature.com/nmeth/journal/v6/n5/full/nmeth.1318.html Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases]

= '''Uvod''' =

Uporaba rekombinantne tehnologije DNA se je začela z odkritjem DNA ligaze in restrikcijskih endonukleaz. Od takrat se je razvilo več različnih metod povezovanja molekul DNA z uporabo restrikcijskih encimov in PCR. Prav tako pa obstaja tudi od ligacije neodvisno kloniranje (LIC). Slabost PCR je, da se ne more uporabiti za združevanje daljših molekul. Pri LIC ligacija poteka v celici po transformaciji že prileganih molekul. Slabost uporabe restrikcijskih encimov tipa II za združevanje molekul, je v tem da se težje zdužuje več molekul hkrati. Pri združevanju večjih molekul z uporabo IIS tipa rekstrikcijskih encimov pa se lahko zgodi, da bodo vsebovala IIS restrikcijska mesta.
Raziskovalci iz J- Craig Venter inštituta (Maryland in Kalifornija, ZDA) so razvili in vitro rekombinacijski sistem, kjer se v enem koraku lahko sestavi in popravi prekrivajoče molekule DNA. Ta pristop se lahko uporabi za združitev molekul DNA, ki so dolge tudi do 583 kb (kilobaz), v E. Coli pa se lahko klonira produkte do velikosti 300 kb. Vse kar je potrebno za uspešno združitev je zmešati zmes reagentov in encimov z prekrivajočimi molekulami DNA. Reakcijsko mešanico se inkubira 15 do 60 minut pri 50 °C. Pred to metodo so raziskovalci že razvili in vitro rekombinacijsko metodo kjer se združitev molekul DNA doseže v dveh korakih pri različnih temperaturah. Ta pristop so uporabili za združitev 101 DNA kaset v štiri četrtinske molekule M. genitalium genoma (vsaka 136-166 kb). Poleg tega pa so razvili tudi metodo. kjer se molekule DNA združi v enem koraku, vendar pa se spreminja temperaturo tekom reakcije [1].

= '''Princip termociklične metode v dveh korakih''' =

Uporabi se T4 DNA polimerazo, ki ima 3' eksonukleazno aktivnost, s katero dobimo 5' ssDNA štrleče konce, in kombinacijo Taq DNA polimeraze in Taq DNA ligaze. Reakcijo se izvede v cikličnem termostatu v dveh korakih. V prvem koraku T4 DNA polimeraza odstrani nukleotide iz 3' konca. T4 DNA polimerazo se nato inaktivira z inkubacijo pri 75 °C. Sledi počasno ohlajanje in prileganje komplementarnih delov. V drugem koraku se prilegane dele popravi s Taq DNA polimerazo in Taq DNA ligazo pri temperaturi 45 °C v prisotnosti vseh štirih dNTP-jev. Dva koraka sta tu obvezna zato, ker za eksonukleazno aktivnost T4 DNA polimeraze ne smemo imeti v sistemu dNTP-jev [1, 2].

= '''Princip termociklične metode v enem koraku''' =

Uporabi se eksonukleaza III, ki odstrani nukleotide iz 3' konca dsDNA in je aktivna v prisotnosti dNTP-jev. Ker eksonukleaza III tekmuje za vezavo na 3' konce z polimerazo, se uporabi Taq DNA polimerazo, ki ima vezano protitelo. Tako se lahko združitev molekul DNA izvede v enem koraku. Reakcija prvo poteka pri 37 °C, kjer je eksonukleaza aktivna in Tag DNA polimeraza, ki ima vezano protitelo neaktivna. Potem se dvigne temperaturo na 75 °C, kar inaktivira eksonukleazo III. Poteče prileganje in protitelo disociira od Taq DNA polimeraze, kar aktivira encim. Sledi ohlajanje na 60 °C, kjer poteče podaljševanje in ligacija [1, 2].

= '''Princip izotermne metode v enem koraku''' =

Eksonukleaze, ki režejo dvoverižno DNA iz 5' konca ne bodo tekmovale s polimerazno aktivnostjo. Vsi potrebni encimi so lahko hkrati aktivni. Metoda je uporabna tudi za pripravo krožnih produktov, saj jih nobeden od encimov ne procesira. Raziskovalci so optimizirali izotermni sistem za aktivnost 5' T5 eksonukleaze, Phusion DNA polimeraze in Taq DNA ligaze. Taq DNA polimeraza se lahko uporabi namesto Phusion DNA polimeraze. Ima pa Phusion DNA polimeraza aktivnost kontrolnega branja in lahko odstrani nekomplementarna zaporedja (npr. delna restrikcijska mesta) iz sestavljenih molekul, prav tako pa Phusion DNA polimeraza vstavlja napačne nukleotide s precej nižjo pogostostjo. Celotna reakcija poteka pri 50 °C. Potek reakcije je torej sledeč: T5 eksonukleaza odstrani nukleotide iz 5' konca dvoverižne molekule DNA, sledi prileganje komplementarni enoverižnih koncev DNA, nato Phusion DNA polimeraza zapolni vrzeli in Tag DNA ligaza dokončno združi fragmenta. T5 eksonukleaza je temperaturno labilna in se inaktivira pri 50 °C [1].

= '''Rezultati''' =

Da bi preverili učinkovitost sistema so cepili dva restrikcijska fragmenta, ki se prekrivata v 450 bp, iz 6-kb vektorja pRS415 ki so ju nato ponovno sestavili v krožni produkt. Po 6-8 minutah pri 50 °C je linearna substratna DNA popolnoma zreagirala in glavni produkt, ki je nastal je bil 6-kb krožni produkt (na agaroznem gelu so ga opazili tik pod liso za 4 kb linearni fragment). T5 eksonukleaza razgradi linearno DNA, krožne DNA pa ne. Da je bil nastali produkt res krožen so potrdili z uporabo T5 eksonukleaze. Da so še potrdili, da je nastal pravi 6 kb krožen produkt so ga cepili z NotI, ki bi moral cepiti produkt samo enkrat. Na agaroznem gelu so opazili samo eno liso za 6 kb linearen fragment. Zaključili so, da se lahko molekule DNA sestavlja in popravi v enem koraku z uporabo te izotermne metode.
Nato so določili ali se molekule DNA, ki imajo samo 40 bp dolge prekrivajoče dele lahko združi. To jim je uspelo, ko so znižali koncentracijo T5 eksonukleaze. Tri 5 kb dolge fragmente so uspešno združili v 8 kb bakterijski umetni kromosom (BAC). Ko so transformirali te fragmente v E. Coli, so v devet od desetih testiranih kolonij (dobili so jih 4,500) dobili predviden 15 kb insert.
Da bi določili, če se lahko to metodo uporabi tudi za združitev daljših fragmentov, so uporabili dva sintetična dela genoma M. genitalium (C25-49 (144 kb) in C50-77 (166kb)), ter BAC25-77 (8 kb), ki je klonirni vektor specifičen za združitev teh dveh fragmentov. Uspešno so dobili predviden 318 kb Mgen25-77 produkt. Zaključili so, da s to metodo lahko združimo molekule teh velikosti. Potrdili so tudi, da s to metodo pridobljene večje fragmente lahko kloniramo, za kar so del te reakcijske mešanice transformirali v E. Coli. Pridobili so več sto kolonij in 5 od 10 kolonij je vsebovalo insert pričakovane velikosti (310 kb). Ta sistem se torej lahko uporabi za združitev in kloniranje molekul DNA, ki so dolge več sto kb v E. Coli. V raziskavi so sestavili tudi celoten sintetičen genom M. genitalium (583 kb). Največja velikost fragmentov katerih se še lahko združi ni znana, vendar pa so opazi produkte velike tudi 900 kb.
Med in vitro rekombinacijo lahko pride do napak v na novo sestavljeni molekuli DNA. Ko so določili zaporedje 30 kloniranih molekul DNA (210 združenih stikov) po uporabi termociklične metode z dvema korakoma so določili 4 napake. To znaša približno eno napako na 50 molekul DNA združenih. Predpostavljajo da naj bi bilo napak pri izotermni metodi z enim koramok manj. Nižja stopnja napak naj bi šla predvsem na račun uporabe Phusion DNA polimeraze [1].

= '''Zaključek''' =

Izotermno metodo v enem koraku se lahko uporabi za združevanje molekul DNA katerih koli velikosti. Ta pristop bi lahko bil zelo uporaben za kloniranje večih insertov v vektor ne da bi se bilo potrebno ozirati na restrikcijska mesta. Metoda bi bila lahko uporabna tudi za hitro sestavljanje velikih molekul DNA. Npr. molekule DNA, ki so prevelike za pomnoženje s PCR, bi se lahko razdelilo v več prekrivajočih PCR amplikonov, nato pa bi se jih s to metodo združilo v eno veliko molekulo DNA. Metodo kjer se v enem koraku združi molekule DNA bi se lahko uporabilo tudi za pridobitev linearnih fragmentov. Sintezni biologi razvijajo različne genetske poti za proizvodnjo biogoriv, farmacevtskih učinkovin in industrijskih spojin. V raziskavi so predlagali učinkovito, hitro in preprosto metoda za konstruiranje teh poti iz naravne ali sintetične DNA. [1].

= '''Literatura''' =

[1] D. G. Gibson, L. Young, R.-Y, Chuang, J. C. Venter, C. A. Hutchison III in H. O. Smith, Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases, Nature Methods, št. 6, str. 343-345, 2009
[2] D. G. Gibson. Methods in enzymology: Enzymatic assembly of overlapping DNA fragments. Št. 498, Waltham : Elsevier ,str. 349-361, 2011

[[Seminarji SB 2016/17]]

Encimsko združevanje DNA molekul dolgih več sto kilobaz

2017-01-09T22:37:06Z

Maruša Prolič-Kalinšek:

[http://www.nature.com/nmeth/journal/v6/n5/full/nmeth.1318.html Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases]

= '''Uvod''' =

Uporaba rekombinantne tehnologije DNA se je začela z odkritjem DNA ligaze in restrikcijskih endonukleaz. Od takrat se je razvilo več različnih metod povezovanja molekul DNA z uporabo restrikcijskih encimov in PCR. Prav tako pa obstaja tudi od ligacije neodvisno kloniranje (LIC). Slabost PCR je, da se ne more uporabiti za združevanje daljših molekul. Pri LIC ligacija poteka v celici po transformaciji že prileganih molekul. Slabost uporabe restrikcijskih encimov tipa II za združevanje molekul, je v tem da se težje zdužuje več molekul hkrati. Pri združevanju večjih molekul z uporabo IIS tipa rekstrikcijskih encimov pa se lahko zgodi, da bodo vsebovala IIS restrikcijska mesta.
Raziskovalci iz J- Craig Venter inštituta (Maryland in Kalifornija, ZDA) so razvili in vitro rekombinacijski sistem, kjer se v enem koraku lahko sestavi in popravi prekrivajoče molekule DNA. Ta pristop se lahko uporabi za združitev molekul DNA, ki so dolge tudi do 583 kb (kilobaz), v E. Coli pa se lahko klonira produkte do velikosti 300 kb. Vse kar je potrebno za uspešno združitev je zmešati zmes reagentov in encimov z prekrivajočimi molekulami DNA. Reakcijsko mešanico se inkubira 15 do 60 minut pri 50 °C. Pred to metodo so raziskovalci že razvili in vitro rekombinacijsko metodo kjer se združitev molekul DNA doseže v dveh korakih pri različnih temperaturah. Ta pristop so uporabili za združitev 101 DNA kaset v štiri četrtinske molekule M. genitalium genoma(vsaka 136-166 kb). Poleg tega pa so razvili tudi metodo. kjer se molekule DNA združi v enem koraku, vendar pa se spreminja temperaturo tekom reakcije [1].

= '''Princip termociklične metode v dveh korakih''' =

Uporabi se T4 DNA polimerazo, ki ima 3' eksonukleazno aktivnost, s katero dobimo 5' ssDNA štrleče konce, in kombinacijo Taq DNA polimeraze in Taq DNA ligaze. Reakcijo se izvede v cikličnem termostatu v dveh korakih. V prvem koraku T4 DNA polimeraza odstrani nukleotide iz 3' konca. T4 DNA polimerazo se nato inaktivira z inkubacijo pri 75 °C. Sledi počasno ohlajanje in prileganje komplementarnih delov. V drugem koraku se prilegane dele popravi s Taq DNA polimerazo in Taq DNA ligazo pri temperaturi 45 °C v prisotnosti vseh štirih dNTP-jev. Dva koraka sta tu obvezna zato, ker za eksonukleazno aktivnost T4 DNA polimeraze ne smemo imeti v sistemu dNTP-jev [1, 2].

= '''Princip termociklične metode v enem koraku''' =

Uporabi se eksonukleaza III, ki odstrani nukleotide iz 3' konca dsDNA in je aktivna v prisotnosti dNTP-jev. Ker eksonukleaza III tekmuje za vezavo na 3' konce z polimerazo, se uporabi Taq DNA polimerazo, ki ima vezano protitelo. Tako se lahko združitev molekul DNA izvede v enem koraku. Reakcija prvo poteka pri 37 °C, kjer je eksonukleaza aktivna in Tag DNA polimeraza, ki ima vezano protitelo neaktivna. Potem se dvigne temperaturo na 75 °C, kar inaktivira eksonukleazo III. Poteče prileganje in protitelo disociira od Taq DNA polimeraze, kar aktivira encim. Sledi ohlajanje na 60 °C, kjer poteče podaljševanje in ligacija [1, 2].

= '''Princip izotermne metode v enem koraku''' =

Eksonukleaze, ki režejo dvoverižno DNA iz 5' konca ne bodo tekmovale s polimerazno aktivnostjo. Vsi potrebni encimi so lahko hkrati aktivni. Metoda je uporabna tudi za pripravo krožnih produktov, saj jih nobeden od encimov ne procesira. Raziskovalci so optimizirali izotermni sistem za aktivnost 5' T5 eksonukleaze, Phusion DNA polimeraze in Taq DNA ligaze. Taq DNA polimeraza se lahko uporabi namesto Phusion DNA polimeraze. Ima pa Phusion DNA polimeraza aktivnost kontrolnega branja in lahko odstrani nekomplementarna zaporedja (npr. delna restrikcijska mesta) iz sestavljenih molekul, prav tako pa Phusion DNA polimeraza vstavlja napačne nukleotide s precej nižjo pogostostjo. Celotna reakcija poteka pri 50 °C. Potek reakcije je torej sledeč: T5 eksonukleaza odstrani nukleotide iz 5' konca dvoverižne molekule DNA, sledi prileganje komplementarni enoverižnih koncev DNA, nato Phusion DNA polimeraza zapolni vrzeli in Tag DNA ligaza dokončno združi fragmenta. T5 eksonukleaza je temperaturno labilna in se inaktivira pri 50 °C [1].

= '''Rezultati''' =

Da bi preverili učinkovitost sistema so cepili dva restrikcijska fragmenta, ki se prekrivata v 450 bp, iz 6-kb vektorja pRS415 ki so ju nato ponovno sestavili v krožni produkt. Po 6-8 minutah pri 50 °C je linearna substratna DNA popolnoma zreagirala in glavni produkt, ki je nastal je bil 6-kb krožni produkt (na agaroznem gelu so ga opazili tik pod liso za 4 kb linearni fragment). T5 eksonukleaza razgradi linearno DNA, krožne DNA pa ne. Da je bil nastali produkt res krožen so potrdili z uporabo T5 eksonukleaze. Da so še potrdili, da je nastal pravi 6 kb krožen produkt so ga cepili z NotI, ki bi moral cepiti produkt samo enkrat. Na agaroznem gelu so opazili samo eno liso za 6 kb linearen fragment. Zaključili so, da se lahko molekule DNA sestavlja in popravi v enem koraku z uporabo te izotermne metode.
Nato so določili ali se molekule DNA, ki imajo samo 40 bp dolge prekrivajoče dele lahko združi. To jim je uspelo, ko so znižali koncentracijo T5 eksonukleaze. Tri 5 kb dolge fragmente so uspešno združili v 8 kb bakterijski umetni kromosom (BAC). Ko so transformirali te fragmente v E. Coli, so v devet od desetih testiranih kolonij (dobili so jih 4,500) dobili predviden 15 kb insert.
Da bi določili, če se lahko to metodo uporabi tudi za združitev daljših fragmentov, so uporabili dva sintetična dela genoma M. genitalium (C25-49 (144 kb) in C50-77 (166kb)), ter BAC25-77 (8 kb), ki je klonirni vektor specifičen za združitev teh dveh fragmentov. Uspešno so dobili predviden 318 kb Mgen25-77 produkt. Zaključili so, da s to metodo lahko združimo molekule teh velikosti. Potrdili so tudi, da s to metodo pridobljene večje fragmente lahko kloniramo, za kar so del te reakcijske mešanice transformirali v E. Coli. Pridobili so več sto kolonij in 5 od 10 kolonij je vsebovalo insert pričakovane velikosti (310 kb). Ta sistem se torej lahko uporabi za združitev in kloniranje molekul DNA, ki so dolge več sto kb v E. Coli. V raziskavi so sestavili tudi celoten sintetičen genom M. genitalium (583 kb). Največja velikost fragmentov katerih se še lahko združi ni znana, vendar pa so opazi produkte velike tudi 900 kb.
Med in vitro rekombinacijo lahko pride do napak v na novo sestavljeni molekuli DNA. Ko so določili zaporedje 30 kloniranih molekul DNA (210 združenih stikov) po uporabi termociklične metode z dvema korakoma so določili 4 napake. To znaša približno eno napako na 50 molekul DNA združenih. Predpostavljajo da naj bi bilo napak pri izotermni metodi z enim koramok manj. Nižja stopnja napak naj bi šla predvsem na račun uporabe Phusion DNA polimeraze [1].

= '''Zaključek''' =

Izotermno metodo v enem koraku se lahko uporabi za združevanje molekul DNA katerih koli velikosti. Ta pristop bi lahko bil zelo uporaben za kloniranje večih insertov v vektor ne da bi se bilo potrebno ozirati na restrikcijska mesta. Metoda bi bila lahko uporabna tudi za hitro sestavljanje velikih molekul DNA. Npr. molekule DNA, ki so prevelike za pomnoženje s PCR, bi se lahko razdelilo v več prekrivajočih PCR amplikonov, nato pa bi se jih s to metodo združilo v eno veliko molekulo DNA. Metodo kjer se v enem koraku združi molekule DNA bi se lahko uporabilo tudi za pridobitev linearnih fragmentov. Sintezni biologi razvijajo različne genetske poti za proizvodnjo biogoriv, farmacevtskih učinkovin in industrijskih spojin. V raziskavi so predlagali učinkovito, hitro in preprosto metoda za konstruiranje teh poti iz naravne ali sintetične DNA. [1].

= '''Literatura''' =

[1] D. G. Gibson, L. Young, R.-Y, Chuang, J. C. Venter, C. A. Hutchison III in H. O. Smith, Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases, Nature Methods, št. 6, str. 343-345, 2009
[2] D. G. Gibson. Methods in enzymology: Enzymatic assembly of overlapping DNA fragments. Št. 498, Waltham : Elsevier ,str. 349-361, 2011

[[Seminarji SB 2016/17]]

Encimsko združevanje DNA molekul dolgih več sto kilobaz

2017-01-09T20:53:59Z

Maruša Prolič-Kalinšek:

[http://www.nature.com/nmeth/journal/v6/n5/full/nmeth.1318.html Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases]

= '''Uvod''' =

Uporaba rekombinantne tehnologije DNA se je začela z odkritjem DNA-ligaze in restrikcijskih endonukleaz. Od takrat se je razvilo več različnih metod povezovanja molekul DNA z uporabo restrikcijskih encimov in PCR. Prav tako pa obstaja tudi od ligacije neodvisno kloniranje (LIC). PCR se ne more uporabiti za združevanje daljših molekule. Pri LIC ligacija poteka v celici po transformaciji že prileganih molekul. Slabost uporabe restrikcijskih encimov tipa II za združevanje molekul, je v tem da se težje zdužuje več molekul hkrati. Pri združevanju večjih molekul z uporabo IIS tipa rekstrikcijskih encimov se lahko zgodi, da bodo vsebovala IIS restrikcijska mesta.
Raziskovalci iz J- Craig Venter inštituta (Maryland in Kalifornija, ZDA) so razvili in vitro rekombinacijski sistem, kjer se v enem koraku lahko sestavi in popravi prekrivajoče molekule DNA. Ta pristop se lahko uporabi za združitev molekul DNA , ki so velike tudi do 583 kb (kilobaz), v E. Coli pa se lahko klonira produkte do velikosti 300 kb. Vse kar je potrebno za uspešno združitev je zmešati zmes reagentov in encimov z prekrivajočimi molekulami DNA. Reakcijsko mešanico se inkubira 15 do 60 minut pri 50 °C. Pred to metodo so raziskovalci že razvili in vitro rekombinacijsko metodo kjer se združitev molekul DNA doseže v dveh korakih pri različnih temperaturah. Ta pristop so uporabili za združitev 101 DNA kaset v štiri četrtinske molekule M. genitalium (vsaka 136-166 kb). Poleg tega pa so razvili tudi metodo. kjer se molekule DNA združi v enem koraku, vendar pa se spreminja temperaturo tekom reakcije [1].

= '''Princip termociklične metode v dveh korakih''' =

Uporabi se T4 DNA polimerazo, ki ima 3' eksonukleazno aktivnost, s katero dobimo 5' ssDNA štrleče konce, in kombinacijo Taq DNA polimeraze in Taq DNA ligaze. Reakcijo se izvede v cikličnem termostatu v dveh korakih. V prvem koraku T4 DNA polimeraza odstrani nukleotide iz 3' konca. T4 DNA polimerazo se nato inaktivira z inkubacijo pri 75 °C. Sledi počasno ohlajanje in prileganje komplementarnih delov. V drugem koraku se prilegane dele popravi s Taq DNA polimerazo in Taq DNA ligazo pri temperaturi 45 °C v prisotnosti vseh štirih dNTP-jev. Dva koraka sta tu obezna zato, ker za eksonukleazno aktivnost T4 DNA polimeraze ne smemo imeti v sistemu dNTP-jev [1].

= '''Princip termociklične metode v enem koraku''' =

Uporabi se eksonukleaza III, ki odstrani nukleotide iz 3' konca dsDNA in je aktivna v prisotnosti dNTP-jev. Ker eksonukleaza III tekmuje za vezavo na 3' konce z polimerazo, se uporabi Taq DNA polimerazo, ki ima vezano protitelo. Tako se lahko združitev molekul DNA izvede v enem koraku. Reakcija prvo poteka pri 37 °C, kjer je eksonukleaza aktivna in Tag DNA polimeraza, ki ima vezano protitelo neaktivna. Potem se dvigne temperaturo na 75 °C, kar inaktivira eksonukleazo III. Poteče prileganje in protitelo disociira of Taq DNA polimeraze, kar aktivira encim. Sledi ohlajanje na 60 °C, kjer poteče podaljševanje in ligacija [1].

= '''Princip izotermne metode v enem koraku''' =

Eksonukleaze, ki režejo dvoverižno DNA iz 5' konca ne bodo tekmovale s polimerazno aktivnostjo. Vsi potrebni encimi so lahko hkrati aktivni. Metoda je uporabna tudi za pripravo krožnih produktov, saj jih noben od encimov ne procesira. Raziskovalci so optimizirali izotermni sistem za aktivnost 5' T5 eksonukleaze, Phusion DNA polimeraze in Taq DNA ligaze. Taq DNA polimeraza se lahko uporabi namesto Phusion DNA polimeraza. Ima pa Phusion DNA polimeraza aktivnost kontrolnega branja in lahko odstrani nekomplementarna zaporedja (npr. delna restrikcijska mesta) iz sestavljenih molekul, prav tako pa Phusion DNA polimeraza vstavlja napačne nukleotide z precej nižjo pogostostjo. Celotna reakcija poteka pri 50 °C. Potek reakcije je torej sledeč: T5 eksonukleaza odstrani nukleotide iz 5' konca dvoverižne molekule DNA, sledi prileganje komplementarni enoverižnih koncev DNA, nato Phusion DNA polimeraza zapolni vrzeli in Tag DNA ligaza dokončno združi fragmenta. T5 eksonukleaza je temperaturno labilna in se inaktivira pri 50 °C [1].

= '''Rezultati''' =

Da bi preverili učinkovitost sistema so cepili dva restrikcijska fragmenta, ki se prekrivata v 450 bp, iz 6-kb vektorja pRS415 ki so ju nato ponovno sestavili v krožni produkt. Po 6-8 minutah pri 50 °C je linearna substratna DNA popolnoma zreagirala in glavni produkt, ki je nastal je bil 6-kb krožni produkt (na agaroznem gelu so ga opazili tik pod liso za 4 kb linearni fragment). T5 eksonukleaza razgradi linearno DNA, krožne DNA pa ne. Da je bil nastali produkt res krožen so potrdili z uporabo T5 eksonukleaze. Da so še potrdili, da je nastal 6 kb krožen produkt so ga cepili z NotI, ki bi moral cepiti produkt samo enkrat. Na agaroznem gelu so opazili samo eno liso za 6 kb linearen fragment. Zaključili so, da se lahko molekule DNA sestavlja in popravi v enem koraku z uporabo te izotermne metode.
Nato so določili ali se molekule DNA, ki imajo samo 40 bp dolge prekrivajoče dele lahko združi. To jim je uspelo, ko so znižali koncentracijo T5 eksonukleaze. Tri 5 kb dolge fragmente so uspešno združili v 8 kb bakterijski umetni kromosom (BAC). Ko so transformirali te fragmente v E. Coli, so v devet od desetih testiranih kolonij (dobili so jih 4,500) dobili predviden 15 kb insert.
Da bi določili, če se lahko to metodo uporabi tudi za združitev večjih fragmentov, so uporabili dva sintetična dela molekul DNA M. genitalium (C25-49 (144 kb) in C50-77 (166kb)), ter BAC25-77 (8 kb), ki je klonirni vektor specifičen za združitev teh dveh fragmentov. Uspešno so dobili predviden 318 kb Mgen25-77 produkt. Zaključili so, da s to metodo lahko združimo molekule teh velikosti. Potrdili so tudi, da s to metodo pridobljene večje fragmente lahko kloniramo, za kar so del te reakcijske mešanice transformirali v E. Coli. Pridobili so več sto kolonij in 5 od 10 kolonij je vsebovalo insert pričakovane velikosti (310 kb). Ta sistem se torej lahko uporabi za združitev in kloniranje molekul DNA, ki so dolge več sto kb v E. Coli. V raziskavi so sestavili tudi celoten sintetičen genom M. genitalium (583 kb). Največja velikost fragmentov katerih se še lahko združi ni znana, vendar pa so opazi produkte velike tudi 900 kb.
Med in vitro rekombinacijo lahko pride do napak v na novo sestavljeni molekuli DNA. Ko so določili zaporedje 30 kloniranih molekul DNA (210 združenih stikov) po uporabi termociklične metode z dvema korakoma so določili 4 napake. To znaša približno eno napako na 50 molekul DNA združenih. Predpostavljajo da naj bi bilo napak pri izotermni metodi z enim koramok manj. Nižja stopnja napak naj bi šla predvsem na račun uporabe Phusion DNA polimeraze [1].

= '''Zaključek''' =

Izotermno metodo v enem koraku se lahko uporabi za združevanje molekul DNA katerih koli velikosti. Ta pristop bi lahko bil zelo uporaben za kloniranje večih insertov v vektor ne da bi se bilo potrebno ozirati na restrikcijska mesta. Metoda bi bila lahko uporabna tudi za hitro sestavljanje velikih molekul DNA. Npr. molekule DNA, ki so prevelike za pomnoženje s PCR, bi se lahko razdelilo v več prekrivajočih PCR amplikonov, nato pa bi se jih s to metodo združilo v eno veliko molekulo DNA. Metodo kjer se v enem koraku združi molekule DNA bi se lahko uporabilo tudi za pridobitev linearnih fragmentov. Sintezni biologi razvijajo različne genetske poti za proizvodnjo biogoriv, farmacevtskih učinkovin in industrijskih spojin. V raziskavi so predlagali učinkovito, hitro in preprosto metoda za konstruiranje teh poti iz naravne ali sintetične DNA. [1].

= '''Literatura''' =

[1] D. G. Gibson, L. Young, R.-Y, Chuang, J. C. Venter, C. A. Hutchison III in H. O. Smith, Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases, Nature Methods, št. 6, str. 343-345, 2009

[[Seminarji SB 2016/17]]

Encimsko združevanje DNA molekul dolgih več sto kilobaz

2017-01-09T20:44:09Z

Maruša Prolič-Kalinšek:

[http://www.nature.com/nmeth/journal/v6/n5/full/nmeth.1318.html Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases]

= '''Uvod''' =

Uporaba rekombinantne tehnologije DNA se je začela z odkritjem DNA-ligaze in restrikcijskih endonukleaz. Od takrat se je razvilo več različnih metod povezovanja molekul DNA z uporabo restrikcijskih encimov in PCR. Prav tako pa obstaja tudi od ligacije neodvisno kloniranje (LIC). PCR se ne more uporabiti za združevanje daljših molekule. Pri LIC ligacija poteka v celici po transformaciji že prileganih molekul. Slabost uporabe restrikcijskih encimov tipa II za združevanje molekul, je v tem da se težje zdužuje več molekul hkrati. Pri združevanju večjih molekul z uporabo IIS tipa rekstrikcijskih encimov se lahko zgodi, da bodo vsebovala IIS restrikcijska mesta.
Raziskovalci iz J- Craig Venter inštituta (Maryland in Kalifornija, ZDA) so razvili in vitro rekombinacijski sistem, kjer se v enem koraku lahko sestavi in popravi prekrivajoče molekule DNA. Ta pristop se lahko uporabi za združitev molekul DNA , ki so velike tudi do 583 kb (kilobaz), v E. Coli pa se lahko klonira produkte do velikosti 300 kb. Vse kar je potrebno za uspešno združitev je zmešati zmes reagentov in encimov z prekrivajočimi molekulami DNA. Reakcijsko mešanico se inkubira 15 do 60 minut pri 50 °C. Pred to metodo so raziskovalci že razvili in vitro rekombinacijsko metodo kjer se združitev molekul DNA doseže v dveh korakih pri različnih temperaturah. Ta pristop so uporabili za združitev 101 DNA kaset v štiri četrtinske molekule M. genitalium (vsaka 136-166 kb). Poleg tega pa so razvili tudi metodo. kjer se molekule DNA združi v enem koraku, vendar pa se spreminja temperaturo tekom reakcije [1].

= '''Princip termociklične metode v dveh korakih''' =

Uporabi se T4 DNA polimerazo (3' eksonukleazna aktivnost), s katero dobimo 5' ssDNA štrleče konce, in kombinacijo Taq DNA polimeraze in Taq DNA ligaze. Reakcijo se izvede v cikličnem termostatu v dveh korakih. V prvem koraku T4 DNA polimeraza odstrani nukleotida iz 3' konca, T4 DNA polimerazo se nato inaktivira z inkubacijo pri 75 °C. Sledi počasno ohlajanje in prileganje komplementarnih delov. V drugem koraku se prilegane dele popravi s Taq DNA polimerazo in Taq DNA ligazo pri temperaturi 45 °C v prisotnosti vseh štirih dNTP-jev. Dva koraka sta tu obezna zato, ker za eksonukleazno aktivnost T4 DNA polimeraze ne smemo imeti v sistemu dNTP-jev [1].

= '''Princip termociklične metode v enem koraku''' =

Uporabi se eksonukleaza III, ki odstrani nukleotide iz 3' konca dsDNA in je aktivna v prisotnosti dNTP-jev. Ker eksonukleaza III tekmuje za vezavo na 3' konce z polimerazo, se uporabi Taq DNA polimerazo, ki ima vezano protitelo. Tako se lahko združitev molekul DNA izvede v enem koraku. Reakcija prvo poteka pri 37 °C, kjer je eksonukleaza aktivna in Tag DNA polimeraza, ki ima vezano protitelo neaktivna. Potem se dvigne temperaturo na 75 °C, kar inaktivira eksonukleazo III. Poteče prileganje in protitelo disociira of Taq DNA polimeraze, kar aktivira encim. Sledi ohlajanje na 60 °C, kjer poteče podaljševanje in ligacija [1].

= '''Princip izotermne metode v enem koraku''' =

Eksonukleaze, ki režejo dvoverižno DNA iz 5' konca ne bodo tekmovale s polimerazno aktivnostjo. Vsi potrebni encimi so lahko hkrati aktivni. Metoda je uporabna tudi za pripravo krožnih produktov, saj jih noben od encimov ne procesira. Raziskovalci so optimizirali izotermni sistem za aktivnost 5' T5 eksonukleaze, Phusion DNA polimeraze in Taq DNA ligaze. Taq DNA polimeraza se lahko uporabi namesto Phusion DNA polimeraza. Ima pa Phusion DNA polimeraza aktivnost kontrolnega branja in lahko odstrani nekomplementarna zaporedja (npr. delna restrikcijska mesta) iz sestavljenih molekul, prav tako pa Phusion DNA polimeraza vstavlja napačne nukleotide z precej nižjo pogostostjo. Celotna reakcija poteka pri 50 °C. Potek reakcije je torej sledeč: T5 eksonukleaza odstrani nukleotide iz 5' konca dvoverižne molekule DNA, sledi prileganje komplementarni enoverižnih koncev DNA, nato Phusion DNA polimeraza zapolni vrzeli in Tag DNA ligaza dokončno združi fragmenta. T5 eksonukleaza je temperaturno labilna in se inaktivira pri 50 °C [1].

= '''Rezultati''' =

Da bi preverili učinkovitost sistema so cepili dva restrikcijska fragmenta, ki se prekrivata v 450 bp, iz 6-kb vektorja pRS415 ki so ju nato ponovno sestavili v krožni produkt. Po 6-8 minutah pri 50 °C je linearna substratna DNA popolnoma zreagirala in glavni produkt, ki je nastal je bil 6-kb krožni produkt (na agaroznem gelu so ga opazili tik pod liso za 4 kb linearni fragment). T5 eksonukleaza razgradi linearno DNA, krožne DNA pa ne. Da je bil nastali produkt res krožen so potrdili z uporabo T5 eksonukleaze. Da so še potrdili, da je nastal 6 kb krožen produkt so ga cepili z NotI, ki bi moral cepiti produkt samo enkrat. Na agaroznem gelu so opazili samo eno liso za 6 kb linearen fragment. Zaključili so, da se lahko molekule DNA sestavlja in popravi v enem koraku z uporabo te izotermne metode.
Nato so določili ali se molekule DNA, ki imajo samo 40 bp dolge prekrivajoče dele lahko združi. To jim je uspelo, ko so znižali koncentracijo T5 eksonukleaze. Tri 5 kb dolge fragmente so uspešno združili v 8 kb bakterijski umetni kromosom (BAC). Ko so transformirali te fragmente v E. Coli, so v devet od desetih testiranih kolonij (dobili so jih 4,500) dobili predviden 15 kb insert.
Da bi določili, če se lahko to metodo uporabi tudi za združitev večjih fragmentov, so uporabili dva sintetična dela molekul DNA M. genitalium (C25-49 (144 kb) in C50-77 (166kb)), ter BAC25-77 (8 kb), ki je klonirni vektor specifičen za združitev teh dveh fragmentov. Uspešno so dobili predviden 318 kb Mgen25-77 produkt. Zaključili so, da s to metodo lahko združimo molekule teh velikosti. Potrdili so tudi, da s to metodo pridobljene večje fragmente lahko kloniramo, za kar so del te reakcijske mešanice transformirali v E. Coli. Pridobili so več sto kolonij in 5 od 10 kolonij je vsebovalo insert pričakovane velikosti (310kb). Ta sistem se torej lahko uporabi za združitev in kloniranje molekul DNA, ki so dolge več sto kb v E. Coli. V raziskavi so sestavili tudi celoten sintetičen genom M. genitalium (583 kb). Največja velikost fragmentov katerih se še lahko združi ni znana, vendar pa so opazi produkte velike tudi 900 kb.
Med in vitro rekombinacijo lahko pride do napak v na novo sestavljeni molekuli DNA. Ko so določili zaporedje 30 kloniranih molekul DNA (210 združenih stikov) po uporabi termociklične metode z dvema korakoma so določili 4 napake. To znaša približno eno napako na 50 molekul DNA združenih. Predpostavljajo da naj bi bilo napak pri izotermni metodi z enim koramok manj. Nižja stopnja napak naj bi šla predvsem na račun uporabe Phusion DNA polimeraze [1].

= '''Zaključek''' =

Izotermno metodo v enem koraku se lahko uporabi za združevanje molekul DNA katerih koli velikosti. Ta pristop bi lahko bil zelo uporaben za kloniranje večih insertov v vektor ne da bi se bilo potrebno ozirati na restrikcijska mesta. Metoda bi bila lahko uporabna tudi za hitro sestavljanje velikih molekul DNA. Npr. molekule DNA, ki so prevelike za pomnoženje s PCR, bi se lahko razdelilo v več prekrivajočih PCR amplikonov, nato pa bi se jih s to metodo združilo v eno veliko molekulo DNA. Metodo kjer se v enem koraku združi molekule DNA bi se lahko uporabilo tudi za pridobitev linearnih fragmentov [1].

= '''Literatura''' =

[1] D. G. Gibson, L. Young, R.-Y, Chuang, J. C. Venter, C. A. Hutchison III in H. O. Smith, Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases, Nature Methods, št. 6, str. 343-345, 2009

[[Seminarji SB 2016/17]]

Encimsko združevanje DNA molekul dolgih več sto kilobaz

2017-01-09T20:32:06Z

Maruša Prolič-Kalinšek:

[http://www.nature.com/nmeth/journal/v6/n5/full/nmeth.1318.html Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases]

= '''Uvod''' =

Uporaba rekombinantne tehnologije DNA se je začela z odkritjem DNA-ligaze in restrikcijskih endonukleaz. Od takrat se je razvilo več različnih metod povezovanja molekul DNA z uporabo restrikcijskih encimov in PCR. Prav tako pa obstaja tudi od ligacije neodvisno kloniranje (LIC). PCR se ne more uporabiti za združevanje daljših molekule. Pri LIC ligacija poteka v celici po transformaciji že prileganih molekul. Slabost uporabe restrikcijskih encimov tipa II za združevanje molekul, je v tem da se težje zdužuje več molekul hkrati. Pri združevanju večjih molekul z uporabo IIS tipa rekstrikcijskih encimov se lahko zgodi, da bodo vsebovala IIS restrikcijska mesta.
Raziskovalci iz J- Craig Venter inštituta (Maryland in Kalifornija, ZDA) so razvili in vitro rekombinacijski sistem, kjer se v enem koraku lahko sestavi in popravi prekrivajoče molekule DNA. Ta pristop se lahko uporabi za združitev molekul DNA , ki so velike tudi do 583 kb (kilobaz), v E. Coli pa se lahko klonira produkte do velikosti 300 kb. Vse kar je potrebno za uspešno združitev je zmešati zmes reagentov in encimov z prekrivajočimi molekulami DNA. Reakcijsko mešanico se inkubira 15 do 60 minut pri 50 °C. Pred to metodo so raziskovalci že razvili in vitro rekombinacijsko metodo kjer se združitev molekul DNA doseže v dveh korakih pri različnih temperaturah. Ta pristop so uporabili za združitev 101 DNA kaset v štiri četrtinske molekule M. genitalium (vsaka 136-166 kb). Poleg tega pa so razvili tudi metodo. kjer se molekule DNA združi v enem koraku, vendar pa se spreminja temperaturo tekom reakcije.

= '''Princip termociklične metode v dveh korakih''' =

Uporabi se T4 DNA polimerazo (3' eksonukleazna aktivnost), s katero dobimo 5' ssDNA štrleče konce, in kombinacijo Taq DNA polimeraze in Taq DNA ligaze. Reakcijo se izvede v cikličnem termostatu v dveh korakih. V prvem koraku T4 DNA polimeraza odstrani nukleotida iz 3' konca, T4 DNA polimerazo se nato inaktivira z inkubacijo pri 75 °C. Sledi počasno ohlajanje in prileganje komplementarnih delov. V drugem koraku se prilegane dele popravi s Taq DNA polimerazo in Taq DNA ligazo pri temperaturi 45 °C v prisotnosti vseh štirih dNTP-jev. Dva koraka sta tu obezna zato, ker za eksonukleazno aktivnost T4 DNA polimeraze ne smemo imeti v sistemu dNTP-jev.

= '''Princip termociklične metode v enem koraku''' =

Uporabi se eksonukleaza III, ki odstrani nukleotide iz 3' konca dsDNA in je aktivna v prisotnosti dNTP-jev. Ker eksonukleaza III tekmuje za vezavo na 3' konce z polimerazo, se uporabi Taq DNA polimerazo, ki ima vezano protitelo. Tako se lahko združitev molekul DNA izvede v enem koraku. Reakcija prvo poteka pri 37 °C, kjer je eksonukleaza aktivna in Tag DNA polimeraza, ki ima vezano protitelo neaktivna. Potem se dvigne temperaturo na 75 °C, kar inaktivira eksonukleazo III. Poteče prileganje in protitelo disociira of Taq DNA polimeraze, kar aktivira encim. Sledi ohlajanje na 60 °C, kjer poteče podaljševanje in ligacija.

= '''Princip izotermne metode v enem koraku''' =

Eksonukleaze, ki režejo dvoverižno DNA iz 5' konca ne bodo tekmovale s polimerazno aktivnostjo. Vsi potrebni encimi so lahko hkrati aktivni. Metoda je uporabna tudi za pripravo krožnih produktov, saj jih noben od encimov ne procesira. Raziskovalci so optimizirali izotermni sistem za aktivnost 5' T5 eksonukleaze, Phusion DNA polimeraze in Taq DNA ligaze. Taq DNA polimeraza se lahko uporabi namesto Phusion DNA polimeraza. Ima pa Phusion DNA polimeraza aktivnost kontrolnega branja in lahko odstrani nekomplementarna zaporedja (npr. delna restrikcijska mesta) iz sestavljenih molekul, prav tako pa Phusion DNA polimeraza vstavlja napačne nukleotide z precej nižjo pogostostjo. Celotna reakcija poteka pri 50 °C. Potek reakcije je torej sledeč: T5 eksonukleaza odstrani nukleotide iz 5' konca dvoverižne molekule DNA, sledi prileganje komplementarni enoverižnih koncev DNA, nato Phusion DNA polimeraza zapolni vrzeli in Tag DNA ligaza dokončno združi fragmenta. T5 eksonukleaza je temperaturno labilna in se inaktivira pri 50 °C.

= '''Rezultati''' =

Da bi preverili učinkovitost sistema so cepili dva restrikcijska fragmenta, ki se prekrivata v 450 bp, iz 6-kb vektorja pRS415 ki so ju nato ponovno sestavili v krožni produkt. Po 6-8 minutah pri 50 °C je linearna substratna DNA popolnoma zreagirala in glavni produkt, ki je nastal je bil 6-kb krožni produkt (na agaroznem gelu so ga opazili tik pod liso za 4 kb linearni fragment). T5 eksonukleaza razgradi linearno DNA, krožne DNA pa ne. Da je bil nastali produkt res krožen so potrdili z uporabo T5 eksonukleaze. Da so še potrdili, da je nastal 6 kb krožen produkt so ga cepili z NotI, ki bi moral cepiti produkt samo enkrat. Na agaroznem gelu so opazili samo eno liso za 6 kb linearen fragment. Zaključili so, da se lahko molekule DNA sestavlja in popravi v enem koraku z uporabo te izotermne metode.
Nato so določili ali se molekule DNA, ki imajo samo 40 bp dolge prekrivajoče dele lahko združi. To jim je uspelo, ko so znižali koncentracijo T5 eksonukleaze. Tri 5 kb dolge fragmente so uspešno združili v 8 kb bakterijski umetni kromosom (BAC). Ko so transformirali te fragmente v E. Coli, so v devet od desetih testiranih kolonij (dobili so jih 4,500) dobili predviden 15 kb insert.
Da bi določili, če se lahko to metodo uporabi tudi za združitev večjih fragmentov, so uporabili dva sintetična dela molekul DNA M. genitalium (C25-49 (144 kb) in C50-77 (166kb)), ter BAC25-77 (8 kb), ki je klonirni vektor specifičen za združitev teh dveh fragmentov. Uspešno so dobili predviden 318 kb Mgen25-77 produkt. Zaključili so, da s to metodo lahko združimo molekule teh velikosti. Potrdili so tudi, da s to metodo pridobljene večje fragmente lahko kloniramo, za kar so del te reakcijske mešanice transformirali v E. Coli. Pridobili so več sto kolonij in 5 od 10 kolonij je vsebovalo insert pričakovane velikosti (310kb). Ta sistem se torej lahko uporabi za združitev in kloniranje molekul DNA, ki so dolge več sto kb v E. Coli. V raziskavi so sestavili tudi celoten sintetičen genom M. genitalium (583 kb). Največja velikost fragmentov katerih se še lahko združi ni znana, vendar pa so opazi produkte velike tudi 900 kb.
Med in vitro rekombinacijo lahko pride do napak v na novo sestavljeni molekuli DNA. Ko so določili zaporedje 30 kloniranih molekul DNA (210 združenih stikov) po uporabi termociklične metode z dvema korakoma so določili 4 napake. To znaša približno eno napako na 50 molekul DNA združenih. Predpostavljajo da naj bi bilo napak pri izotermni metodi z enim koramok manj. Nižja stopnja napak naj bi šla predvsem na račun uporabe Phusion DNA polimeraze.

= '''Zaključek''' =

Izotermno metodo v enem koraku se lahko uporabi za združevanje molekul DNA katerih koli velikosti. Ta pristop bi lahko bil zelo uporaben za kloniranje večih insertov v vektor ne da bi se bilo potrebno ozirati na restrikcijska mesta. Metoda bi bila lahko uporabna tudi za hitro sestavljanje velikih molekul DNA. Npr. molekule DNA, ki so prevelike za pomnoženje s PCR, bi se lahko razdelilo v več prekrivajočih PCR amplikonov, nato pa bi se jih s to metodo združilo v eno veliko molekulo DNA. Metodo kjer se v enem koraku združi molekule DNA bi se lahko uporabilo tudi za pridobitev linearnih fragmentov.

= '''Literatura''' =

[[Seminarji SB 2016/17]]

Encimsko združevanje DNA molekul dolgih več sto kilobaz

2017-01-09T20:14:36Z

Maruša Prolič-Kalinšek:

[http://www.nature.com/nmeth/journal/v6/n5/full/nmeth.1318.html Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases]

= '''Uvod''' =

Uporaba rekombinantne tehnologije DNA se je začela z odkritjem DNA-ligaze in restrikcijskih endonukleaz. Od takrat se je razvilo več različnih metod povezovanja molekul DNA z uporabo restrikcijskih encimov in PCR. Prav tako pa obstaja tudi od ligacije neodvisno kloniranje (LIC). PCR se ne more uporabiti za združevanje daljših molekule. Pri LIC ligacija poteka v celici po transformaciji že prileganih molekul. Slabost uporabe restrikcijskih encimov tipa II za združevanje molekul, je v tem da se težje zdužuje več molekul hkrati. Pri združevanju večjih molekul z uporabo IIS tipa rekstrikcijskih encimov se lahko zgodi, da bodo vsebovala IIS restrikcijska mesta.
Raziskovalci iz J- Craig Venter inštituta (Maryland in Kalifornija, ZDA) so razvili in vitro rekombinacijski sistem, kjer se v enem koraku lahko sestavi in popravi prekrivajoče molekule DNA. Ta pristop se lahko uporabi za združitev molekul DNA , ki so velike tudi do 583 kb (kilobaz), v E. Coli pa se lahko klonira produkte do velikosti 300 kb. Vse kar je potrebno za uspešno združitev je zmešati zmes reagentov in encimov z prekrivajočimi molekulami DNA. Reakcijsko mešanico se inkubira 15 do 60 minut pri 50 °C. Pred to metodo so raziskovalci že razvili in vitro rekombinacijsko metodo kjer se združitev molekul DNA doseže v dveh korakih pri različnih temperaturah. Ta pristop so uporabili za združitev 101 DNA kaset v štiri četrtinske molekule M. genitalium (vsaka 136-166 kb). Poleg tega pa so razvili tudi metodo. kjer se molekule DNA združi v enem koraku, vendar pa se spreminja temperaturo tekom reakcije.

= '''Princip termociklične metode v dveh korakih''' =

Uporabi se T4 DNA polimerazo (3' eksonukleazna aktivnost), s katero dobimo 5' ssDNA štrleče konce, in kombinacijo Taq DNA polimeraze in Taq DNA ligaze. Reakcijo se izvede v cikličnem termostatu v dveh korakih. V prvem koraku T4 DNA polimeraza odstrani nukleotida iz 3' konca, T4 DNA polimerazo se nato inaktivira z inkubacijo pri 75 °C. Sledi počasno ohlajanje in prileganje komplementarnih delov. V drugem koraku se prilegane dele popravi s Taq DNA polimerazo in Taq DNA ligazo pri temperaturi 45 °C v prisotnosti vseh štirih dNTP-jev. Dva koraka sta tu obezna zato, ker za eksonukleazno aktivnost T4 DNA polimeraze ne smemo imeti v sistemu dNTP-jev.

= '''Princip termociklične metode v enem koraku''' =

Uporabi se eksonukleaza III, ki odstrani nukleotide iz 3' konca dsDNA in je aktivna v prisotnosti dNTP-jev. Ker eksonukleaza III tekmuje za vezavo na 3' konce z polimerazo, se uporabi Taq DNA polimerazo, ki ima vezano protitelo. Tako se lahko združitev molekul DNA izvede v enem koraku. Reakcija prvo poteka pri 37 °C, kjer je eksonukleaza aktivna in Tag DNA polimeraza, ki ima vezano protitelo neaktivna. Potem se dvigne temperaturo na 75 °C, kar inaktivira eksonukleazo III. Poteče prileganje in protitelo disociira of Taq DNA polimeraze, kar aktivira encim. Sledi ohlajanje na 60 °C, kjer poteče podaljševanje in ligacija.

= '''Princip izotermne metode v enem koraku''' =

Eksonukleaze, ki režejo dvoverižno DNA iz 5' konca ne bodo tekmovale s polimerazno aktivnostjo. Vsi potrebni encimi so lahko hkrati aktivni. Metoda je uporabna tudi za pripravo krožnih produktov, saj jih noben od encimov ne procesira. Raziskovalci so optimizirali izotermni sistem za aktivnost 5' T5 eksonukleaze, Phusion DNA polimeraze in Taq DNA ligaze. Taq DNA polimeraza se lahko uporabi namesto Phusion DNA polimeraza. Ima pa Phusion DNA polimeraza aktivnost kontrolnega branja in lahko odstrani nekomplementarna zaporedja (npr. delna restrikcijska mesta) iz sestavljenih molekul, prav tako pa Phusion DNA polimeraza vstavlja napačne nukleotide z precej nižjo pogostostjo. Celotna reakcija poteka pri 50 °C. Potek reakcije je torej sledeč: T5 eksonukleaza odstrani nukleotide iz 5' konca dvoverižne molekule DNA, sledi prileganje komplementarni enoverižnih koncev DNA, nato Phusion DNA polimeraza zapolni vrzeli in Tag DNA ligaza dokončno združi fragmenta. T5 eksonukleaza je temperaturno labilna in se inaktivira pri 50 °C.

= '''Rezultati''' =

Da bi preverili učinkovitost sistema so cepili dva restrikcijska fragmenta, ki se prekrivata v 450 bp, iz 6-kb vektorja pRS415 ki so ju nato ponovno sestavili v krožni produkt. Po 6-8 minutah pri 50 °C je linearna substratna DNA popolnoma zreagirala in glavni produkt, ki je nastal je bil 6-kb krožni produkt (na agaroznem gelu so ga opazili tik pod liso za 4 kb linearni fragment). T5 eksonukleaza razgradi linearno DNA, krožne DNA pa ne. Da je bil nastali produkt res krožen so potrdili z uporabo T5 eksonukleaze. Da so še potrdili, da je nastal 6 kb krožen produkt so ga cepili z NotI, ki bi moral cepiti produkt samo enkrat. Na agaroznem gelu so opazili samo eno liso za 6 kb linearen fragment. Zaključili so, da se lahko molekule DNA sestavlja in popravi v enem koraku z uporabo te izotermne metode.
Nato so določili ali se molekule DNA, ki imajo samo 40 bp dolge prekrivajoče dele lahko združi. To jim je uspelo, ko so znižali koncentracijo T5 eksonukleaze. Tri 5 kb dolge fragmente so uspešno združili v 8 kb bakterijski umetni kromosom (BAC). Ko so transformirali te fragmente v E. Coli, so v devet od desetih testiranih kolonij (dobili so jih 4,500) dobili predviden 15 kb insert.
Da bi določili, če se lahko to metodo uporabi tudi za združitev večjih fragmentov, so uporabili dva sintetična dela molekul DNA M. genitalium (C25-49 (144 kb) in C50-77 (166kb)), ter BAC25-77 (8 kb), ki je klonirni vektor specifičen za združitev teh dveh fragmentov. Uspešno so dobili predviden 318 kb Mgen25-77 produkt. Zaključili so, da s to metodo lahko združimo molekule teh velikosti. Potrdili so tudi, da s to metodo pridobljene večje fragmente lahko kloniramo, za kar so del te reakcijske mešanice transformirali v E. Coli. Pridobili so več sto kolonij in 5 od 10 kolonij je vsebovalo insert pričakovane velikosti (310kb). Ta sistem se torej lahko uporabi za združitev in kloniranje molekul DNA, ki so dolge več sto kb v E. Coli. V raziskavi so sestavili tudi celoten sintetičen genom M. genitalium (583 kb). Največja velikost fragmentov katerih se še lahko združi ni znana, vendar pa so opazi produkte velike tudi 900 kb.
Med in vitro rekombinacijo lahko pride do napak v na novo sestavljeni molekuli DNA. Ko so določili zaporedje 30 kloniranih molekul DNA (210 združenih stikov) po uporabi termociklične metode z dvema korakoma so določili 4 napake. To znaša približno eno napako na 50 molekul DNA združenih. Predpostavljajo da naj bi bilo napak pri izotermni metodi z enim koramok manj. Nižja stopnja napak naj bi šla predvsem na račun uporabe Phusion DNA polimeraze.

= '''Zaključek''' =

Izotermno metodo v enem koraku se lahko uporabi za združevanje molekul DNA katerih koli velikosti. Ta pristop bi lahko bil zelo uporaben za kloniranje večih insertov v vektor ne da bi se bilo potrebno ozirati na restrikcijska mesta. Metoda bi bila lahko uporabna tudi za hitro sestavljanje velikih molekul DNA. Npr. molekule DNA, ki so prevelike za pomnoženje s PCR, bi se lahko razdelilo v več prekrivajočih PCR amplikonov, nato pa bi se jih s to metodo združilo v eno veliko molekulo DNA. Metodo kjer se v enem koraku združi molekule DNA bi se lahko uporabilo tudi za pridobitev linearnih fragmentov.

= '''Literatura''' =

Encimsko združevanje DNA molekul dolgih več sto kilobaz

2017-01-09T20:13:54Z

Maruša Prolič-Kalinšek:

[http://www.nature.com/nmeth/journal/v6/n5/full/nmeth.1318.html]

= '''Uvod''' =

Uporaba rekombinantne tehnologije DNA se je začela z odkritjem DNA-ligaze in restrikcijskih endonukleaz. Od takrat se je razvilo več različnih metod povezovanja molekul DNA z uporabo restrikcijskih encimov in PCR. Prav tako pa obstaja tudi od ligacije neodvisno kloniranje (LIC). PCR se ne more uporabiti za združevanje daljših molekule. Pri LIC ligacija poteka v celici po transformaciji že prileganih molekul. Slabost uporabe restrikcijskih encimov tipa II za združevanje molekul, je v tem da se težje zdužuje več molekul hkrati. Pri združevanju večjih molekul z uporabo IIS tipa rekstrikcijskih encimov se lahko zgodi, da bodo vsebovala IIS restrikcijska mesta.
Raziskovalci iz J- Craig Venter inštituta (Maryland in Kalifornija, ZDA) so razvili in vitro rekombinacijski sistem, kjer se v enem koraku lahko sestavi in popravi prekrivajoče molekule DNA. Ta pristop se lahko uporabi za združitev molekul DNA , ki so velike tudi do 583 kb (kilobaz), v E. Coli pa se lahko klonira produkte do velikosti 300 kb. Vse kar je potrebno za uspešno združitev je zmešati zmes reagentov in encimov z prekrivajočimi molekulami DNA. Reakcijsko mešanico se inkubira 15 do 60 minut pri 50 °C. Pred to metodo so raziskovalci že razvili in vitro rekombinacijsko metodo kjer se združitev molekul DNA doseže v dveh korakih pri različnih temperaturah. Ta pristop so uporabili za združitev 101 DNA kaset v štiri četrtinske molekule M. genitalium (vsaka 136-166 kb). Poleg tega pa so razvili tudi metodo. kjer se molekule DNA združi v enem koraku, vendar pa se spreminja temperaturo tekom reakcije.

= '''Princip termociklične metode v dveh korakih''' =

Uporabi se T4 DNA polimerazo (3' eksonukleazna aktivnost), s katero dobimo 5' ssDNA štrleče konce, in kombinacijo Taq DNA polimeraze in Taq DNA ligaze. Reakcijo se izvede v cikličnem termostatu v dveh korakih. V prvem koraku T4 DNA polimeraza odstrani nukleotida iz 3' konca, T4 DNA polimerazo se nato inaktivira z inkubacijo pri 75 °C. Sledi počasno ohlajanje in prileganje komplementarnih delov. V drugem koraku se prilegane dele popravi s Taq DNA polimerazo in Taq DNA ligazo pri temperaturi 45 °C v prisotnosti vseh štirih dNTP-jev. Dva koraka sta tu obezna zato, ker za eksonukleazno aktivnost T4 DNA polimeraze ne smemo imeti v sistemu dNTP-jev.

= '''Princip termociklične metode v enem koraku''' =

Uporabi se eksonukleaza III, ki odstrani nukleotide iz 3' konca dsDNA in je aktivna v prisotnosti dNTP-jev. Ker eksonukleaza III tekmuje za vezavo na 3' konce z polimerazo, se uporabi Taq DNA polimerazo, ki ima vezano protitelo. Tako se lahko združitev molekul DNA izvede v enem koraku. Reakcija prvo poteka pri 37 °C, kjer je eksonukleaza aktivna in Tag DNA polimeraza, ki ima vezano protitelo neaktivna. Potem se dvigne temperaturo na 75 °C, kar inaktivira eksonukleazo III. Poteče prileganje in protitelo disociira of Taq DNA polimeraze, kar aktivira encim. Sledi ohlajanje na 60 °C, kjer poteče podaljševanje in ligacija.

= '''Princip izotermne metode v enem koraku''' =

Eksonukleaze, ki režejo dvoverižno DNA iz 5' konca ne bodo tekmovale s polimerazno aktivnostjo. Vsi potrebni encimi so lahko hkrati aktivni. Metoda je uporabna tudi za pripravo krožnih produktov, saj jih noben od encimov ne procesira. Raziskovalci so optimizirali izotermni sistem za aktivnost 5' T5 eksonukleaze, Phusion DNA polimeraze in Taq DNA ligaze. Taq DNA polimeraza se lahko uporabi namesto Phusion DNA polimeraza. Ima pa Phusion DNA polimeraza aktivnost kontrolnega branja in lahko odstrani nekomplementarna zaporedja (npr. delna restrikcijska mesta) iz sestavljenih molekul, prav tako pa Phusion DNA polimeraza vstavlja napačne nukleotide z precej nižjo pogostostjo. Celotna reakcija poteka pri 50 °C. Potek reakcije je torej sledeč: T5 eksonukleaza odstrani nukleotide iz 5' konca dvoverižne molekule DNA, sledi prileganje komplementarni enoverižnih koncev DNA, nato Phusion DNA polimeraza zapolni vrzeli in Tag DNA ligaza dokončno združi fragmenta. T5 eksonukleaza je temperaturno labilna in se inaktivira pri 50 °C.

= '''Rezultati''' =

Da bi preverili učinkovitost sistema so cepili dva restrikcijska fragmenta, ki se prekrivata v 450 bp, iz 6-kb vektorja pRS415 ki so ju nato ponovno sestavili v krožni produkt. Po 6-8 minutah pri 50 °C je linearna substratna DNA popolnoma zreagirala in glavni produkt, ki je nastal je bil 6-kb krožni produkt (na agaroznem gelu so ga opazili tik pod liso za 4 kb linearni fragment). T5 eksonukleaza razgradi linearno DNA, krožne DNA pa ne. Da je bil nastali produkt res krožen so potrdili z uporabo T5 eksonukleaze. Da so še potrdili, da je nastal 6 kb krožen produkt so ga cepili z NotI, ki bi moral cepiti produkt samo enkrat. Na agaroznem gelu so opazili samo eno liso za 6 kb linearen fragment. Zaključili so, da se lahko molekule DNA sestavlja in popravi v enem koraku z uporabo te izotermne metode.
Nato so določili ali se molekule DNA, ki imajo samo 40 bp dolge prekrivajoče dele lahko združi. To jim je uspelo, ko so znižali koncentracijo T5 eksonukleaze. Tri 5 kb dolge fragmente so uspešno združili v 8 kb bakterijski umetni kromosom (BAC). Ko so transformirali te fragmente v E. Coli, so v devet od desetih testiranih kolonij (dobili so jih 4,500) dobili predviden 15 kb insert.
Da bi določili, če se lahko to metodo uporabi tudi za združitev večjih fragmentov, so uporabili dva sintetična dela molekul DNA M. genitalium (C25-49 (144 kb) in C50-77 (166kb)), ter BAC25-77 (8 kb), ki je klonirni vektor specifičen za združitev teh dveh fragmentov. Uspešno so dobili predviden 318 kb Mgen25-77 produkt. Zaključili so, da s to metodo lahko združimo molekule teh velikosti. Potrdili so tudi, da s to metodo pridobljene večje fragmente lahko kloniramo, za kar so del te reakcijske mešanice transformirali v E. Coli. Pridobili so več sto kolonij in 5 od 10 kolonij je vsebovalo insert pričakovane velikosti (310kb). Ta sistem se torej lahko uporabi za združitev in kloniranje molekul DNA, ki so dolge več sto kb v E. Coli. V raziskavi so sestavili tudi celoten sintetičen genom M. genitalium (583 kb). Največja velikost fragmentov katerih se še lahko združi ni znana, vendar pa so opazi produkte velike tudi 900 kb.
Med in vitro rekombinacijo lahko pride do napak v na novo sestavljeni molekuli DNA. Ko so določili zaporedje 30 kloniranih molekul DNA (210 združenih stikov) po uporabi termociklične metode z dvema korakoma so določili 4 napake. To znaša približno eno napako na 50 molekul DNA združenih. Predpostavljajo da naj bi bilo napak pri izotermni metodi z enim koramok manj. Nižja stopnja napak naj bi šla predvsem na račun uporabe Phusion DNA polimeraze.

= '''Zaključek''' =

Izotermno metodo v enem koraku se lahko uporabi za združevanje molekul DNA katerih koli velikosti. Ta pristop bi lahko bil zelo uporaben za kloniranje večih insertov v vektor ne da bi se bilo potrebno ozirati na restrikcijska mesta. Metoda bi bila lahko uporabna tudi za hitro sestavljanje velikih molekul DNA. Npr. molekule DNA, ki so prevelike za pomnoženje s PCR, bi se lahko razdelilo v več prekrivajočih PCR amplikonov, nato pa bi se jih s to metodo združilo v eno veliko molekulo DNA. Metodo kjer se v enem koraku združi molekule DNA bi se lahko uporabilo tudi za pridobitev linearnih fragmentov.

= '''Literatura''' =

Procesiranje celičnih informacij s sintetičnimi RNA napravami

2017-01-09T20:12:27Z

Maruša Prolič-Kalinšek: Undo revision 12191 by Maruša Prolič-Kalinšek (Talk)

[http://science.sciencemag.org/content/322/5900/456 Higher-Order Cellular Information Processing with Synthetic RNA Devices]

'''Uvod'''

Inženirstvo je široka disciplina, ki zajema številne panoge med katerimi je v zadnjih nekaj letih vedno več pozornosti namenjeno biološkim sistemom. Sposobnost bioloških sistemov prenosa informacij med živimi sistemi in znotraj njih, v kombinaciji z inženirskim pristopom nudi nove načine regulacije izražanja genov in s tem povezanih potencialnih možnosti zdravljenja. Pri tem imajo ključno vlogo proteini, ki v različnih kombinacijah lahko tvorijo nekakšna biološka vezja, odgovorna za procesiranje specifične informacije. Vzporedno s proteini pa podobno funkcijo prevzemajo tudi sintetične RNA naprave.

= '''Sintetične RNA naprave''' =

Podobno kot proteini lahko tudi sintetične RNA naprave pretvarjajo vhodne informacije v izhodne signale. V celičnih sistemih vhodne informacije navadno predstavljajo endogene ali eksogene signalne molekule, ki lahko tvorijo interakcije z RNA napravo, ta pa glede na tip signalne molekule izvrši ustrezno funkcijo. Običajno sproži ali pa zavre translacijo in posledično produkcijo izhodnega signala oziroma tarčnega proteina. Glede na funkcijo delimo sintetične RNA naprave na različna logična vrata (IN, NE-ALI, NE-IN ali ALI), filtre signalov, ojačevalce signalov in logična vrata, ki izkazujejo kooperativnost [1].

Enostavnost modeliranja, visoka kompatibilnost in široke možnosti aplikacij RNA naprav so znanstvenike kalifornijskega inštituta za tehnologijo gnale k osnovanju splošnega ogrodja za pripravo sintetičnih RNA naprav z različnimi funkcijami in številom vhodnih signalov. Tako pripravljene RNA naprave so vsebovale tri osnovne, funkcionalno različne gradnike: RNA aptamer s funkcijo senzorja, ribocim v obliki kladiva s katalitično funkcijo, in RNA vmesnik, ki vsebuje tekmovalno in preklopno verigo [1]. RNA vmesnik igra zelo pomembno vlogo, saj povezuje RNA aptamer in ribocim, hkrati pa z lastno strukturo, ki jo pogojuje hibridizacijski vzorec tekmovalne in preklopne verige, določa aktivnost ribocima pred vezavo vhodne molekule. Če je ribocim pred vezavo vhodne molekule v aktivni obliki, pravimo taki napravi RNA naprava ON. V nasprotnem primeru govorimo o RNA napravi OFF [2].

Sestavljene komponente se nato lahko preko regije ribocima vežejo na 3' UTR konec transkripta specifičnega gena. Po vezavi vhodne molekule v vezavni žep RNA aptamera pride do konformacijskih sprememb tekmovalne in preklopne verige RNA vmesnika in s tem aktivacije ali inhibicije ribocima. Aktiviran ribocim katalizira cepitev mRNA tarčnega gena, kar privede do nastanka nefunkcionalnega transkripta in s tem zavrte translacije [1].

S pomočjo zgoraj opisanega splošnega ogrodja in izbire začetne konformacije ribocima je mogoče sestaviti kompleksnejše sintetične RNA naprave z več kot enim vhodnim signalom. Ena izmed takih naprav je RNA naprava SI 1, ki vsebuje dva ločena ribocima, vezana v dve regiji 3' UTR konca tarčnega gena, vsak izmed njiju pa ima vezano senzorično komponento (RNA aptamer). RNA naprava SI 1 omogoča torej vgradnjo dveh različnih začetnih konformacij ribocima (RNA naprava ON ali OFF), pod kontrolo dveh enakih ali različnih vhodnih signalnih molekul. RNA napravi SI 2 in SI 3 pa sta sestavljeni iz enega ribocima, vezanega v 3' UTR konec tarčnega gena, nanj pa sta pripeti dve senzorični komponenti. Slednji sta lahko preko RNA vmesnika vezani vzporedno (na oba konca ribocima) ali zaporedno (ena na drugo). RNA napravi SI 2 in SI 3 tako omogočata vgradnjo ene začetne konformacije ribocima pod kontrolo dveh različnih ali enakih vhodnih molekul na dva različna načina [1].

= '''Sintetične RNA naprave s funkcijo logičnih vrat''' =

Za izgradnjo sintetičnih RNA naprav je bil pripravljen univerzalni vektor pRzS z reporterskim rumenim fluorescirajočim proteinom (yEGFP) pod kontrolo močnega inducibilnega promotorja GAL1-10. Vse DNA matrice RNA gradnikov so bile pripravljene z metodo PCR in vstavljene v 3' UTR regijo reporterskega proteina preko ustreznih restrikcijskih mest. Na ta način so bila pripravljena logična vrata IN, NE-ALI, NE-IN in ALI, njihova ustreznost pa je bila testirana v posebnem sevu ''Saccharomyces cerevisiae'' [3].

== '''Logična vrata IN''' ==

Sintetična RNA naprava s funkcijo logičnih vrat IN je bila pripravljena po principu RNA naprave SI 1. Pri tem sta bila oba ribocima pred vezavo vhodne molekule v aktivni konformaciji (RNA naprava ON), senzorski komponenti pa sta omogočali vezavo dveh različnih vhodnih molekul, teofilina in tetraciklina. Ob vezavi specifične vhodne molekule pride do inaktivacije ustreznega ribocima. Ker je za cepitev in inaktivacijo transkripta tarčnega gena potreben le en aktivni ribocim, je do visoke proizvodnje yEGFP je prišlo le v primeru inaktivacije obeh ribocimov, torej ob vezavi obeh vhodnih molekul [1].

== '''Logična vrata NE-ALI''' ==

Na enak način so kot logična vrata IN je bila narejena tudi sintetična RNA naprava s funkcijo logičnih vrat NE-ALI. Razlika je le v tem, da slednja vsebujejo oba ribocima pred vezavo v neaktivni konformaciji (RNA naprava OFF). To pomeni, da je proizvodnja yEGFP visoka le v primeru odsotnosti obeh vhodnih molekul [1].

== '''Logična vrata NE-IN''' ==

Sintetična RNA naprava s funkcijo logičnih vrat NE-IN je bila pripravljena po principu RNA naprave SI 2. Pri tem je bil ribocim pred vezavo vhodne molekule v neaktivni konformaciji (RNA naprava OFF), senzorski komponenti, vezani vzporedno preko dveh RNA vmesnikov na levo in desno zanko ribocima, pa sta omogočali vezavo dveh različnih vhodnih molekul, teofilina in tetraciklina. Do aktivacije ribocima pride le v primeru vezave obeh vhodnih molekul. To pomeni, da je v odsotnosti obeh vhodnih molekul oziroma vezave le ene izmed vhodnih molekul proizvodnja yEGFP vseskozi visoka, ob vezavi obeh vhodnih molekul pa je translacija popolnoma zavrta [1].

== '''Kooperativnost vezave in logična vrata''' ==

Kooperativnost vezave je pojav med dvema zvrstema biološki molekul. Ena izmed zvrsti molekul vsebuje več vezavnih mest v katera se lahko veže molekula druge zvrsti. Pri tem nezasedena vezavna mesta z nizko afiniteto ob vezavi posamezne molekule v vezavno mesto, preidejo v stanje z visoko afiniteto. Več vezavnih mest kot je zasedenih, višja je efektivna afiniteta nezasedenega vezavnega mesta do naslednje molekule [4].

Danes poznamo več različnih teoretičnih modelov, ki bolj ali manj dobro opisujejo dejanska stanja molekul tekom kooperativne vezave. Najstarejši izmed njih je tudi Hillov model oziroma Hillova enačba, ki je bila osnovana na primeru kooperativne vezave kisika na hemoglobin. S pomočjo te in pa ustreznih eksperimentalnih kinetičnih parametrov lahko za specifično vezavo izračunamo Hillov koeficient (n), ki pove stopnjo in vrsto kooperativnosti. Če je Hillov koeficient večji od ena imamo opravka s pozitivno kooperativno vezavo (n > 1). V primeru negativne kooperativne vezave je Hillov koeficient manjši od ena (n < 1). Če pa je Hillov koeficient enak ena, potem dotična vezava ni kooperativna (n = 1). To pomeni, da so vezavna mesta neodvisna drug od drugega, ne glede na to ali so zasedena ali prosta [1,4].

Z zgornjim dejstvom v mislih so bila po principu RNA naprave SI 3 ustvarjena logična vrata IN, ki izkazujejo kooperativnost. Slednja so podobna logičnim vratom NE-IN. Razlika je v ribocimu, ki je v tem primeru pred vezavo vhodnih molekul v aktivni obliki (RNA naprava ON). Poleg tega pa sta senzorski komponenti vezani zaporedno, ena na drugo. Prva senzorična komponenta povezuje ribocim in zadnjo senzorično komponento preko dveh RNA vmesnikov. Pri tem stanje zadnje senzorske komponente regulira stanje prve senzorske komponente, RNA vmesnik med njima pa določa energijsko oviro med posameznimi stanji (pred vezavo, po vezavi ene in po vezavi dveh vhodnih molekul). Tako kot pri klasičnih je tudi pri teh logičnih vratih IN produkcija yEGFP visoka le v primeru vezave obeh vhodnih molekul (teofilina in tetraciklina) [1].

Poleg logičnih vrat IN pa kooperativnost izkazujejo tudi logična vrata, ki vsebujejo aktiven ribocim pred vezavo vhodne molekule (RNA naprava ON) in imajo dve zaporedno vezani senzorični komponenti, ki lahko vežeta dve enaki vhodni molekuli teofilina. Senzorični komponenti povezuje RNA vmesnik, katerega struktura daje večjo afiniteto do vhodne molekule zadnji senzorični komponenti. Posledično se prva molekula teofilina veže na zadnjo senzorično komponento, kar privede do povečanja efektivne afinitete v prvi senzorični komponenti, to pa olajša vezavo druge molekule teofilina. Ob vezavi obeh molekul pride do inaktivacije ribocima in visoko proizvodnjo yEGFP. Z modificiranjem posameznih senzoričnih komponent in RNA vmesnika lahko spreminjamo stopnjo kooperativnosti. Na tak način je bila pripravljena sintetična RNA naprava s pozitivno kooperativnostjo in Hillovim koeficientom, ki je znašal 1,65 [1].

= '''Zaključek''' =

Sintetične RNA naprave v zadnjih letih postajajo odmevno orodje sintezne biologije. Za pripravo poljubnih sintetičnih RNA naprav je bila osnovana univerzalna metodologija in načini sestavljanja treh osnovnih gradnikov. Sodobne RNA naprave imajo lahko funkcijo logičnih vrat (IN, NE-ALI, NE-IN ali ALI), filtriranja signalov in logičnih vrat z kooperativno vezavo vhodnih molekul. Vpliv sintetične RNA naprave na tarčni gen določajo 3 kontrolne točke. Z izbiro promotorja pod katerim je RNA naprava zapisana na plazmidu uravnavamo nivo njenega izražanja in s tem tudi izražanje tarčnega proteina. S spreminjanjem RNA vmesnika, ki povezuje ribocim, in senzorično komponento, določamo konformacijo ribocima pred vezavo vhodne molekule (RNA naprava ON ali OFF). S spreminjanjem senzoričnih komponent ter RNA vmesnika, ki povezuje zaporedno vezani senzorični komponenti pa določamo kooperativnost vezave. Širok nabor funkcij, potencialne aplikacije in nastanek patenta nakazujejo na zanimivo prihodnost sintetičnih RNA naprav.

'''Literatura'''

[1] [http://science.sciencemag.org/content/322/5900/456 M. N. Win in C. D. Smolke. “Higher-order cellular information processing with synthetic RNA devices.” ''Science'' 2008, 322, 456-460.]

[2] [http://www.pnas.org/content/104/36/14283.full M.N. Win in C.D. Smolke. “A modular and extensible RNA-based gene regulatory platform for engineering cellular function.” ''PNAS'' 2007, 104, 14283-14288.]

[3] [http://science.sciencemag.org/content/suppl/2008/10/16/322.5900.453.DC1 M. N. Win in C. D. Smolke. “Higher-order cellular information processing with synthetic RNA devices.” ''Science'' 2008, dodatno gradivo.]

[4] [https://books.google.si/books?id=wzAPgK1ulBQC&printsec=copyright&hl=sl#v=onepage&q&f=false M.N. Win in C.D. Smolke. ''The Metabolic Pathway Engineering Handbook: Regulating Gene Expression through Engineered RNA Technologies.'' London, New York: Taylor and Francis group 2009, str. 8-1-8-13.]

[[Seminarji SB 2016/17]]

Procesiranje celičnih informacij s sintetičnimi RNA napravami

2017-01-09T20:11:47Z

Maruša Prolič-Kalinšek:

[http://science.sciencemag.org/content/322/5900/456 Higher-Order Cellular Information Processing with Synthetic RNA Devices]

= '''Uvod''' =

Inženirstvo je široka disciplina, ki zajema številne panoge med katerimi je v zadnjih nekaj letih vedno več pozornosti namenjeno biološkim sistemom. Sposobnost bioloških sistemov prenosa informacij med živimi sistemi in znotraj njih, v kombinaciji z inženirskim pristopom nudi nove načine regulacije izražanja genov in s tem povezanih potencialnih možnosti zdravljenja. Pri tem imajo ključno vlogo proteini, ki v različnih kombinacijah lahko tvorijo nekakšna biološka vezja, odgovorna za procesiranje specifične informacije. Vzporedno s proteini pa podobno funkcijo prevzemajo tudi sintetične RNA naprave.

= '''Sintetične RNA naprave''' =

Podobno kot proteini lahko tudi sintetične RNA naprave pretvarjajo vhodne informacije v izhodne signale. V celičnih sistemih vhodne informacije navadno predstavljajo endogene ali eksogene signalne molekule, ki lahko tvorijo interakcije z RNA napravo, ta pa glede na tip signalne molekule izvrši ustrezno funkcijo. Običajno sproži ali pa zavre translacijo in posledično produkcijo izhodnega signala oziroma tarčnega proteina. Glede na funkcijo delimo sintetične RNA naprave na različna logična vrata (IN, NE-ALI, NE-IN ali ALI), filtre signalov, ojačevalce signalov in logična vrata, ki izkazujejo kooperativnost [1].

Enostavnost modeliranja, visoka kompatibilnost in široke možnosti aplikacij RNA naprav so znanstvenike kalifornijskega inštituta za tehnologijo gnale k osnovanju splošnega ogrodja za pripravo sintetičnih RNA naprav z različnimi funkcijami in številom vhodnih signalov. Tako pripravljene RNA naprave so vsebovale tri osnovne, funkcionalno različne gradnike: RNA aptamer s funkcijo senzorja, ribocim v obliki kladiva s katalitično funkcijo, in RNA vmesnik, ki vsebuje tekmovalno in preklopno verigo [1]. RNA vmesnik igra zelo pomembno vlogo, saj povezuje RNA aptamer in ribocim, hkrati pa z lastno strukturo, ki jo pogojuje hibridizacijski vzorec tekmovalne in preklopne verige, določa aktivnost ribocima pred vezavo vhodne molekule. Če je ribocim pred vezavo vhodne molekule v aktivni obliki, pravimo taki napravi RNA naprava ON. V nasprotnem primeru govorimo o RNA napravi OFF [2].

Sestavljene komponente se nato lahko preko regije ribocima vežejo na 3' UTR konec transkripta specifičnega gena. Po vezavi vhodne molekule v vezavni žep RNA aptamera pride do konformacijskih sprememb tekmovalne in preklopne verige RNA vmesnika in s tem aktivacije ali inhibicije ribocima. Aktiviran ribocim katalizira cepitev mRNA tarčnega gena, kar privede do nastanka nefunkcionalnega transkripta in s tem zavrte translacije [1].

S pomočjo zgoraj opisanega splošnega ogrodja in izbire začetne konformacije ribocima je mogoče sestaviti kompleksnejše sintetične RNA naprave z več kot enim vhodnim signalom. Ena izmed takih naprav je RNA naprava SI 1, ki vsebuje dva ločena ribocima, vezana v dve regiji 3' UTR konca tarčnega gena, vsak izmed njiju pa ima vezano senzorično komponento (RNA aptamer). RNA naprava SI 1 omogoča torej vgradnjo dveh različnih začetnih konformacij ribocima (RNA naprava ON ali OFF), pod kontrolo dveh enakih ali različnih vhodnih signalnih molekul. RNA napravi SI 2 in SI 3 pa sta sestavljeni iz enega ribocima, vezanega v 3' UTR konec tarčnega gena, nanj pa sta pripeti dve senzorični komponenti. Slednji sta lahko preko RNA vmesnika vezani vzporedno (na oba konca ribocima) ali zaporedno (ena na drugo). RNA napravi SI 2 in SI 3 tako omogočata vgradnjo ene začetne konformacije ribocima pod kontrolo dveh različnih ali enakih vhodnih molekul na dva različna načina [1].

= '''Sintetične RNA naprave s funkcijo logičnih vrat''' =

Za izgradnjo sintetičnih RNA naprav je bil pripravljen univerzalni vektor pRzS z reporterskim rumenim fluorescirajočim proteinom (yEGFP) pod kontrolo močnega inducibilnega promotorja GAL1-10. Vse DNA matrice RNA gradnikov so bile pripravljene z metodo PCR in vstavljene v 3' UTR regijo reporterskega proteina preko ustreznih restrikcijskih mest. Na ta način so bila pripravljena logična vrata IN, NE-ALI, NE-IN in ALI, njihova ustreznost pa je bila testirana v posebnem sevu ''Saccharomyces cerevisiae'' [3].

== '''Logična vrata IN''' ==

Sintetična RNA naprava s funkcijo logičnih vrat IN je bila pripravljena po principu RNA naprave SI 1. Pri tem sta bila oba ribocima pred vezavo vhodne molekule v aktivni konformaciji (RNA naprava ON), senzorski komponenti pa sta omogočali vezavo dveh različnih vhodnih molekul, teofilina in tetraciklina. Ob vezavi specifične vhodne molekule pride do inaktivacije ustreznega ribocima. Ker je za cepitev in inaktivacijo transkripta tarčnega gena potreben le en aktivni ribocim, je do visoke proizvodnje yEGFP je prišlo le v primeru inaktivacije obeh ribocimov, torej ob vezavi obeh vhodnih molekul [1].

== '''Logična vrata NE-ALI''' ==

Na enak način so kot logična vrata IN je bila narejena tudi sintetična RNA naprava s funkcijo logičnih vrat NE-ALI. Razlika je le v tem, da slednja vsebujejo oba ribocima pred vezavo v neaktivni konformaciji (RNA naprava OFF). To pomeni, da je proizvodnja yEGFP visoka le v primeru odsotnosti obeh vhodnih molekul [1].

== '''Logična vrata NE-IN''' ==

Sintetična RNA naprava s funkcijo logičnih vrat NE-IN je bila pripravljena po principu RNA naprave SI 2. Pri tem je bil ribocim pred vezavo vhodne molekule v neaktivni konformaciji (RNA naprava OFF), senzorski komponenti, vezani vzporedno preko dveh RNA vmesnikov na levo in desno zanko ribocima, pa sta omogočali vezavo dveh različnih vhodnih molekul, teofilina in tetraciklina. Do aktivacije ribocima pride le v primeru vezave obeh vhodnih molekul. To pomeni, da je v odsotnosti obeh vhodnih molekul oziroma vezave le ene izmed vhodnih molekul proizvodnja yEGFP vseskozi visoka, ob vezavi obeh vhodnih molekul pa je translacija popolnoma zavrta [1].

== '''Kooperativnost vezave in logična vrata''' ==

Kooperativnost vezave je pojav med dvema zvrstema biološki molekul. Ena izmed zvrsti molekul vsebuje več vezavnih mest v katera se lahko veže molekula druge zvrsti. Pri tem nezasedena vezavna mesta z nizko afiniteto ob vezavi posamezne molekule v vezavno mesto, preidejo v stanje z visoko afiniteto. Več vezavnih mest kot je zasedenih, višja je efektivna afiniteta nezasedenega vezavnega mesta do naslednje molekule [4].

Danes poznamo več različnih teoretičnih modelov, ki bolj ali manj dobro opisujejo dejanska stanja molekul tekom kooperativne vezave. Najstarejši izmed njih je tudi Hillov model oziroma Hillova enačba, ki je bila osnovana na primeru kooperativne vezave kisika na hemoglobin. S pomočjo te in pa ustreznih eksperimentalnih kinetičnih parametrov lahko za specifično vezavo izračunamo Hillov koeficient (n), ki pove stopnjo in vrsto kooperativnosti. Če je Hillov koeficient večji od ena imamo opravka s pozitivno kooperativno vezavo (n > 1). V primeru negativne kooperativne vezave je Hillov koeficient manjši od ena (n < 1). Če pa je Hillov koeficient enak ena, potem dotična vezava ni kooperativna (n = 1). To pomeni, da so vezavna mesta neodvisna drug od drugega, ne glede na to ali so zasedena ali prosta [1,4].

Z zgornjim dejstvom v mislih so bila po principu RNA naprave SI 3 ustvarjena logična vrata IN, ki izkazujejo kooperativnost. Slednja so podobna logičnim vratom NE-IN. Razlika je v ribocimu, ki je v tem primeru pred vezavo vhodnih molekul v aktivni obliki (RNA naprava ON). Poleg tega pa sta senzorski komponenti vezani zaporedno, ena na drugo. Prva senzorična komponenta povezuje ribocim in zadnjo senzorično komponento preko dveh RNA vmesnikov. Pri tem stanje zadnje senzorske komponente regulira stanje prve senzorske komponente, RNA vmesnik med njima pa določa energijsko oviro med posameznimi stanji (pred vezavo, po vezavi ene in po vezavi dveh vhodnih molekul). Tako kot pri klasičnih je tudi pri teh logičnih vratih IN produkcija yEGFP visoka le v primeru vezave obeh vhodnih molekul (teofilina in tetraciklina) [1].

Poleg logičnih vrat IN pa kooperativnost izkazujejo tudi logična vrata, ki vsebujejo aktiven ribocim pred vezavo vhodne molekule (RNA naprava ON) in imajo dve zaporedno vezani senzorični komponenti, ki lahko vežeta dve enaki vhodni molekuli teofilina. Senzorični komponenti povezuje RNA vmesnik, katerega struktura daje večjo afiniteto do vhodne molekule zadnji senzorični komponenti. Posledično se prva molekula teofilina veže na zadnjo senzorično komponento, kar privede do povečanja efektivne afinitete v prvi senzorični komponenti, to pa olajša vezavo druge molekule teofilina. Ob vezavi obeh molekul pride do inaktivacije ribocima in visoko proizvodnjo yEGFP. Z modificiranjem posameznih senzoričnih komponent in RNA vmesnika lahko spreminjamo stopnjo kooperativnosti. Na tak način je bila pripravljena sintetična RNA naprava s pozitivno kooperativnostjo in Hillovim koeficientom, ki je znašal 1,65 [1].

= '''Zaključek''' =

Sintetične RNA naprave v zadnjih letih postajajo odmevno orodje sintezne biologije. Za pripravo poljubnih sintetičnih RNA naprav je bila osnovana univerzalna metodologija in načini sestavljanja treh osnovnih gradnikov. Sodobne RNA naprave imajo lahko funkcijo logičnih vrat (IN, NE-ALI, NE-IN ali ALI), filtriranja signalov in logičnih vrat z kooperativno vezavo vhodnih molekul. Vpliv sintetične RNA naprave na tarčni gen določajo 3 kontrolne točke. Z izbiro promotorja pod katerim je RNA naprava zapisana na plazmidu uravnavamo nivo njenega izražanja in s tem tudi izražanje tarčnega proteina. S spreminjanjem RNA vmesnika, ki povezuje ribocim, in senzorično komponento, določamo konformacijo ribocima pred vezavo vhodne molekule (RNA naprava ON ali OFF). S spreminjanjem senzoričnih komponent ter RNA vmesnika, ki povezuje zaporedno vezani senzorični komponenti pa določamo kooperativnost vezave. Širok nabor funkcij, potencialne aplikacije in nastanek patenta nakazujejo na zanimivo prihodnost sintetičnih RNA naprav.

'''Literatura'''

[1] [http://science.sciencemag.org/content/322/5900/456 M. N. Win in C. D. Smolke. “Higher-order cellular information processing with synthetic RNA devices.” ''Science'' 2008, 322, 456-460.]

[2] [http://www.pnas.org/content/104/36/14283.full M.N. Win in C.D. Smolke. “A modular and extensible RNA-based gene regulatory platform for engineering cellular function.” ''PNAS'' 2007, 104, 14283-14288.]

[3] [http://science.sciencemag.org/content/suppl/2008/10/16/322.5900.453.DC1 M. N. Win in C. D. Smolke. “Higher-order cellular information processing with synthetic RNA devices.” ''Science'' 2008, dodatno gradivo.]

[4] [https://books.google.si/books?id=wzAPgK1ulBQC&printsec=copyright&hl=sl#v=onepage&q&f=false M.N. Win in C.D. Smolke. ''The Metabolic Pathway Engineering Handbook: Regulating Gene Expression through Engineered RNA Technologies.'' London, New York: Taylor and Francis group 2009, str. 8-1-8-13.]

[[Seminarji SB 2016/17]]

Encimsko združevanje DNA molekul dolgih več sto kilobaz

2017-01-09T20:10:51Z

Maruša Prolič-Kalinšek: New page: [http://www.nature.com/nmeth/journal/v6/n5/full/nmeth.1318.html] = '''Uvod''' = Uporaba rekombinantne tehnologije DNA se je začela z odkritjem DNA-ligaze in restrikcijskih endonukleaz. ...

Seminarji SB 2016/17

2017-01-09T19:49:23Z

Maruša Prolič-Kalinšek:

V študijskem letu 2016/17 študentje predstavljajo naslednje teme:

RAZISKOVALNI ČLANKI 
(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.)
# [[Učinkovito ciljanje izraženih in utišanih genov v človeških zarodnih in induciranih pluripotentnih celicah z nukleazami z motivi cinkovih prstov]]. Angelika Vižintin (22. 11. 2016)
# [[Izdelava sintetičnega genoma s pristopom sestavljanja celotnega genoma: Bakteriofag φX174 iz sintetičnih oligonukleotidov]]. Darja Božič (22.11.2016)
# [[Modeliranje sintetične večcelične ure: Represilatorji, sklopljeni z zaznavanjem celične gostote]]. Vita Vidmar (22. 11. 2016)
# [[Začetki uporabe CRISPR-Cas9 sistema]]. Tomaž Rozmarič (6.12.2016)
# [[Robusten oscilator sinteznih genov z različnimi nastavitvami periode]]. Domen Klofutar (13.12.2016)
# [[Sestavljanje TALEN-ov z metodo FLASH za visoko zmogljivostno urejanje genomov]]. Petra Tavčar (13.12.2016)
# [[Procesiranje celičnih informacij s sintetičnimi RNA napravami]]. Tim Božič (20.12.2016)
# [[Usklajeno delovanje sinteznobioloških ur z zaznavanjem celične gostote]]. Luka Kavčič (20.12.2016)
# [[Časovni in prostorski nadzor celičnega signaliziranja prek s svetlobo sprožene interakcije proteinov]]. Boštjan Petrič (3. 1. 2017)
# [[Programiranje celic s ponavljajočim večmestnim modeliranjem genoma in pospešeno evolucijo]] Jan Rozman (3. 1. 2017)
# [[Emergentne lastnosti zmanjšanega genoma E. coli]]. Eva Korošec (10. 1. 2017)
# [[Encimsko združevanje DNA molekul dolgih več sto kilobaz]] Maruša Prolič-Kalinšek (10.1.2017)
NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI 
(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.)
#[[Mezenhimske matične celice nove generacije]]. Danijela Jošić (22.11.2016)
#[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Bakterije%2C_ki_kelirajo_bakrove_ione%2C_v_boju_proti_Wilsonovi_bolezni Bakterije, ki kelirajo bakrove ione, v boju proti Wilsonovi bolezni. Simon Bolta (22. 11. 2016)]
#[["Training protein" - PETaze]]. Urša Kapš (29.11.2016)
#[[Plasticure: rešitev za učinkovitejšo razgradnjo plastike]]. Marjeta Horvat (29. 11. 2016)
#[[Quantifly]]. Ema Guštin (29. 11. 2016)
#[[Ecolibrium – razvoj ogrodja za inženiring mešanih kultur]]. Mojca Juteršek (29. 11. 2016)
#[[BeeT Beehave]]. Maja Svetličič (29.11.2016)
#[[BiotINK - nov pristop k biotiskanju tkiva]]. Mateja Cigoj (6. 12. 2016)
#[[InstaCHLAM – orodje za inženiring kloroplastov]]. Alja Zgonc (6. 12. 2016)
#[[Mos(kit)o]]. Judita Avbelj (6. 12. 2016)
#[[BioSynthAge - Kvalitetno staranje]]. Tina Kuhar (6.12.2016)
#[[PC SQUAD-Inženiring novih sistemov tarčne dostave zdravil]]. Tajda Buh (13.12.2016)
#[[Biomaterial za privzemanje urana iz okolja - "žetveni stroj" urana]]. Anja Herceg (13.12.2016)
#[[Biosenzor etilena]]. Toni Nagode (13.12.2016)
#[[aSTARice – biosinteza astaksantina v rižu]]. Eva Vidak (20. 12. 2016)
#[[PANTIDE - nov kmetijski sistem, ki ciljano uničuje določene škodljivce]]. Mirjam Kmetič (20.12.2016)
#[[Razvoj novega dostavnega sistema za gensko zdravljenje cistične fibroze]]. Bojana Lazović (20.12.2016)
#[[Z majhnimi molekulami regulirani ogrodni proteini]]. Mojca Kostanjevec (3. 1. 2017)
#[[Biobalon]] Iza Ogris (3. 1. 2017)
#[[Proizvodnja bioloških leč in laserjev za izboljšave v mikroskopiji]]. Julija Mazej (3. 1. 2017)
#[[Senzor za detekcijo spolno prenosljivih okužb]]. Nika Strašek (10.1.2017)
Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Predstavitev seminarja naj bo dolga 12 minut (10-14). Sledila bo razprava, ki praviloma ne bo daljša od 5 minut.

Kompaktiranje kromosomov

2014-04-20T21:07:33Z

Maruša Prolič-Kalinšek: /* Viri */

Evkariontska DNA je v jedru organizirana v kromatin. Podenota kromatina je nukleosom, ki ga sestavlja 145-147 bp dolga DNA ovita okoli histonskega oktamera. Vsak histon ima majhno N-končno domeno, ki je nestrukturirana in izpostavljena raztopini, preostali del strukture predstavljajo predvsem alfa vijačnice, ki tvorijo nukleosom.
==Primarna Struktura kromatina==
===Povezovanje nukleosomov===
Histon H1 je vezan na nukleosomalno DNA. Dolžina povezovalne DNA je regulirana s povezovalnimi histoni, ki so podvrsta H1. Primer podvrste je H5, ki se od H1 razlikuje v enem aminokislinskem ostanku, namesto Lys je vezan Arg. Zaradi zamenjave, H5 tesneje povezuje kromatin, to pa se odraža v transkripcijski in replikacijski neaktivnosti kromatina. Povezovalne histone sestavljata N- in C- končni roki bogati z bazičnimi ostanki. Ti izrastki interagirajo s povezovalno DNA in s tem povezujejo sosednje nukleosome, globularna domena histona pa ga veže na nukleosom.
Nizi nukleosomov so zelo dinamični. Pri nizkih koncentracijah soli nizi nukleosomov izoblikujejo konformacijo kroglic na vrvi (beads-on-a-string). Zaradi interakcij med nukleosomi, pri fizioloških pogojih, se nizi nukleosomov pričnejo kondenzirati v zvite oligomerne strukture. Ena izmed pomembnejših domen, ki pripomore k pravilnemu kondenziranju in interagira z določeno regijo imenovano kislinski obliž (acidic patch) na sosednjem nukleosomu, je domena histona H4. Ta se veže z 16-24 ostanki v kislinski obliž. Kislinski obliž ima obliko ozkega utora in na dnu tvori hidrofobni žep. Sestavlja ga 8 ostankov, 6 ostankov H2A in 2 ostanka H2B, skupaj ustvarijo negativno nabito površino. Ta regija ni samo vezavno mesto za H4 domeno, ampak je tudi vezavno mesto za nukleosom vezavne proteine, kot so citokin interlevkin-33, HMGN2, LANA…
==Sekundarna strukturna kromatina==
Sekundarna struktura je struktura premera 30 nm, ki nastane z zvitjem nukleosomskega niza (primarna struktura). Zaradi omejenih mikroskopskih pristopov ter kompleksnosti strukture, je napredek v odkrivanju sekundarne strukture počasen, poleg tega pa so interpretacije dobljenih rezultatov različne.
Povezovalna DNA zastopa različne dolžine, vse od 7 pa do 100 bp. Daljše (60 bp) omogočajo bolj odprto strukturo kromatina, krajše (20-32 bp) pa bolj kompaktno. Odstopanje nekaj bp pri daljši povezovalni DNA ne vpliva na zvijanje kromatina, pri krajši pa je vpliv večji. Poleg dolžine vpliva na kompaktiranje še internukleosomalni rotacijski kot med nukleosomoma, ki vpliva na zgoščevanje kromatina.
Na osnovi rezultatov raziskav o organiziranosti kromatina in vitro, sta bila zasnovana dva modela CikCak ter solenoid.
===CikCak===
Cikcak model predstavlja interakcijo, kjer se med seboj povežejo n in n+2. nukleosom (lihi nukleosomi in sodi nukleosomi se povežejo skupaj v snop). Ob ovitju enega snopa okoli drugega, nastaneta dve levo smerni vijačnici oz. dvo-zvezdna vijačnica, ki ima 18,9 nukleosomov na obrat. Povezovalna DNA poteka sem ter tja med nukleosomi (potuje preko sredine »vlakna«) kar je mogoče samo zaradi odsotnosti povezovalnih histonov. Zaradi primanjkljaja povezovalnih histonov, je struktura bolj ohlapna in posledično bolj dostopna histonom in drugim proteinom.
===Solenoid===
Pri solenoidnem modelu se med seboj povezujejo sosednji nukleosomi (n in n+1), ki si sledijo v enojni levo smerni vijačnici oz. eno-zvezdni vijačnici. Ta struktura je bolj kompaktna, saj vsebuje povezovalne histone, posledično pa je manj dostopna drugim proteinom.
==Terciarna struktura kromatina==
Terciarna struktura nukleosomov v metafaznih kromosomih mora biti v veliki meri omejena in nenaključna. Učbeniški pogled je, da se kromosomi tvorijo z urejenim hierarhičnim zvijanjem 30 nm filamentov v zaporedna kondenzirana stanja zankastih oblik, to so najprej 100 nm in nato 200-250 nm filamenti, ki se še naprej zvijajo ali zlagajo glede na prejšnjo obliko kromatinskega filamenta. Ugotovljeno pa je bilo, da isti nukleosomi oz. DNA sekvence niso vedno na enakem položaju v metafaznem kromosomu, kar nakazuje da se kromosomi vsaj v neki stopnji kondenziranja oblikujejo neurejeno in naključno. Raziskave kažejo tudi na to, da se kromatinski filamenti zlagajo bolj radialno stran od centra kot pa longitudialno. Kromatinske zanke izhajajo iz linearne kromosomske osi. Raziskave kažejo, da so kromatinske zanke osnovne organizacijske enote kromosoma.
===Oblikovanje zankastih domen===
Celoten proces nastanka in vzdrževanja takšnih zankastih domen je nepoznan.
Eden od možnih mehanizmov nastanka zank je tak, da se naključni polimeri prepletajo in povezujejo v zanke. Takšna razlaga odpove pri razlagi za nastanek večjih ponovljivih zank. Prav tako bi privedlo do kolapsa kromosomskih polimerov v sferično globulo. Ta t.i. polymer molt model torej ne more razložiti paličastih struktur kromatina v metafazi.
Kromonemski model predpostavlja zanke, ki so stabilizirane z vezavo na nehistonske jedrne proteine ali na kondenzirane kromatine znotraj sosednjih kromonemski filamentov. Random/walk giant loop model upošteva obsežno agregacijo kromatina v DNA žarišćih. Model predvideva naključno vezavo kromatinskih domen velikosti 3 milijonov bp na nekromatinsko jedrno strukturo. Ta model pa ne upošteva prisotnosti manjših zank, ki pa jih zato multi-loop subcompartment model.

Krio-mikroskopska opažanja pokažejo homogene, zrnaste teksture in ne urejene periodične strukture kromosomov. Predpostavlja se da se zanke nepravilno zlagajo proti anizotropnem kromosomskemu scaffold-u, ki vsebuje veliko kondenzinov. Ta kolaps zank, bi lahko bil okrepljen s privlačnimi silami ponavljajočih sekvenc, ki so razpršene po celem genomu. Kompaktni nativni kromosom bi bil tako sestavljen primarno iz nepravilneg kromatinskega omrežja, ki je zamrežen z kondenzini in so izotropni in ne radialni. Po tem modelu kondenzini vežejo določene dele kromatina in naredijo zanke. Nato kondenzini naprej zamrežijo sosednje kromatinske zanke.

===Faktorji, ki vplivajo na kompaktiranje===
Pri nastanku zank, po vsej verjetnosti sodelujejo aktivatorski proteini. To sta npr. GATA1 in GATA3. GATA3 je pomemben za vzpostavitev in/ali vzdrževanje kromatinskih interakcij dolgega obsega.
Modifikacije histonskih repov povzročijo regionalne spremembe v razporeditvi naboja v kromatinu, kar se naprej odraža v de/kondenzaciji kromatina. Višja kromosomska struktura je občutljiva na spremembe v ionski koncentraciji. Podobno bi lahko spremembe v acetilaciji, metilaciji in fosorilaciji histonskih repov spremenile interakcije med nukleosomi in/ali kromatinskimi filamenti.
ACP-ji (Architectural chromatin proteins) pripomorejo tudi k modulaciji nukleosoma in kromatinske strukture. HP1 veže nukleosome in poveča interakcijo med njimi ter formacijo kompaktiranih sekundarnih struktur kromatina. HP1 lahko poveže dva metilirana repa H3 na različnih nukleosomih. MeCP2 prinese skupaj metilirane regije DNA. Tudi Polycomb compleks lahko organizira nukleosome v kompaktne strukture.
Veliko število eksperimentov kaže na to da je kondenzacija kromosomov regulirana z fosforilacijo CDK1. Podaljšana aktivnost CDK1 vodi do hiperkondenzacije mitotskega kromosoma.
Poleg proteinskih faktorjev naj bi bili tudi kationi bistveni za kondenzacijo kromosoma. V prisotnosti kationov pride do kondenzacije DNA zaradi nevtralizacije naboja, saj vezava kationov, na fosfate v DNA, zniža skupen elektrostatski odboj med sosednjimi DNA regijami.
===Pomen SMC proteinov===
SMC (Structural maintenance of chromosomes) proteini so dimerni proteini, ki tvorijo kompleks v obliki črke V. Glavna tipa SMC proteinov pri evkariontih sta kondenzin in kohezin. Kohezini sodelujejo pri povezovanju sestrskih kromatid takoj po replikaciji in ohranjajo povezanost le-teh med kondenzacijo kromosomov do metafaze. Kohezini naj bi, še s proteinom kleizinom, tvorili obroč okoli podvojenih kromosomov in jih povezovali skupaj dokler se ne ločijo pri celični delitvi. Ko celica vstopi v mitozo se kondenzini na DNA vežejo tako, da tvorijo pozitivna superzvitja DNA. SMC proteini vežejo DNA na svojo pregibno regijo iz česar lahko nastane intramolekularni SMC obroč. Vezava ATP na SMC protein pripelje do direktne združitve in tvorbe superzvitih zank v vezani DNA. Nadaljno preurejanje takšnih združitev pripelje do tvorbe še bolj kondenzirane DNA v t.i. rozetne oblike.Ugotovljeno pa je bilo da so se v vretenčarskih celicah, ki so jim močno zmanjšali koncentracijo kondenzinov , kromosomi kljub temu formirali, a so se nenormalno raztegnili ko so bili vezani na delitveno vreteno.
==Viri==
*Moser S.C. in Swedlow J.R. How to be a mitotic chromosome, Chromosome Research, 2011, letn. 19, str. 307-319.

*Maeshima K, in Eltsov Mikhail. Packaging the Genome: the Structure of Mitotic Chromosomes, Journal of Biochemistry, 2008, letn. 143, str. 145-153

*Grigoryev, S. A. Nucleosim spacing and chromatin higher-order folding. Nucleus, 2012, letn. 3, str. 493-499.

*Kalashnikova, A. A.; et al. The role of the nucleosome acidic patch in modulating higher order chromatin. Journal of royal society Interface, 2013, 10: 20121022.

*Voet D. in Voet J.G. Biochemistry. 4. izdaja. Wiley, 2010

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Kompaktiranje kromosomov

2014-04-20T20:59:04Z

Maruša Prolič-Kalinšek:

Evkariontska DNA je v jedru organizirana v kromatin. Podenota kromatina je nukleosom, ki ga sestavlja 145-147 bp dolga DNA ovita okoli histonskega oktamera. Vsak histon ima majhno N-končno domeno, ki je nestrukturirana in izpostavljena raztopini, preostali del strukture predstavljajo predvsem alfa vijačnice, ki tvorijo nukleosom.
==Primarna Struktura kromatina==
===Povezovanje nukleosomov===
Histon H1 je vezan na nukleosomalno DNA. Dolžina povezovalne DNA je regulirana s povezovalnimi histoni, ki so podvrsta H1. Primer podvrste je H5, ki se od H1 razlikuje v enem aminokislinskem ostanku, namesto Lys je vezan Arg. Zaradi zamenjave, H5 tesneje povezuje kromatin, to pa se odraža v transkripcijski in replikacijski neaktivnosti kromatina. Povezovalne histone sestavljata N- in C- končni roki bogati z bazičnimi ostanki. Ti izrastki interagirajo s povezovalno DNA in s tem povezujejo sosednje nukleosome, globularna domena histona pa ga veže na nukleosom.
Nizi nukleosomov so zelo dinamični. Pri nizkih koncentracijah soli nizi nukleosomov izoblikujejo konformacijo kroglic na vrvi (beads-on-a-string). Zaradi interakcij med nukleosomi, pri fizioloških pogojih, se nizi nukleosomov pričnejo kondenzirati v zvite oligomerne strukture. Ena izmed pomembnejših domen, ki pripomore k pravilnemu kondenziranju in interagira z določeno regijo imenovano kislinski obliž (acidic patch) na sosednjem nukleosomu, je domena histona H4. Ta se veže z 16-24 ostanki v kislinski obliž. Kislinski obliž ima obliko ozkega utora in na dnu tvori hidrofobni žep. Sestavlja ga 8 ostankov, 6 ostankov H2A in 2 ostanka H2B, skupaj ustvarijo negativno nabito površino. Ta regija ni samo vezavno mesto za H4 domeno, ampak je tudi vezavno mesto za nukleosom vezavne proteine, kot so citokin interlevkin-33, HMGN2, LANA…
==Sekundarna strukturna kromatina==
Sekundarna struktura je struktura premera 30 nm, ki nastane z zvitjem nukleosomskega niza (primarna struktura). Zaradi omejenih mikroskopskih pristopov ter kompleksnosti strukture, je napredek v odkrivanju sekundarne strukture počasen, poleg tega pa so interpretacije dobljenih rezultatov različne.
Povezovalna DNA zastopa različne dolžine, vse od 7 pa do 100 bp. Daljše (60 bp) omogočajo bolj odprto strukturo kromatina, krajše (20-32 bp) pa bolj kompaktno. Odstopanje nekaj bp pri daljši povezovalni DNA ne vpliva na zvijanje kromatina, pri krajši pa je vpliv večji. Poleg dolžine vpliva na kompaktiranje še internukleosomalni rotacijski kot med nukleosomoma, ki vpliva na zgoščevanje kromatina.
Na osnovi rezultatov raziskav o organiziranosti kromatina in vitro, sta bila zasnovana dva modela CikCak ter solenoid.
===CikCak===
Cikcak model predstavlja interakcijo, kjer se med seboj povežejo n in n+2. nukleosom (lihi nukleosomi in sodi nukleosomi se povežejo skupaj v snop). Ob ovitju enega snopa okoli drugega, nastaneta dve levo smerni vijačnici oz. dvo-zvezdna vijačnica, ki ima 18,9 nukleosomov na obrat. Povezovalna DNA poteka sem ter tja med nukleosomi (potuje preko sredine »vlakna«) kar je mogoče samo zaradi odsotnosti povezovalnih histonov. Zaradi primanjkljaja povezovalnih histonov, je struktura bolj ohlapna in posledično bolj dostopna histonom in drugim proteinom.
===Solenoid===
Pri solenoidnem modelu se med seboj povezujejo sosednji nukleosomi (n in n+1), ki si sledijo v enojni levo smerni vijačnici oz. eno-zvezdni vijačnici. Ta struktura je bolj kompaktna, saj vsebuje povezovalne histone, posledično pa je manj dostopna drugim proteinom.
==Terciarna struktura kromatina==
Terciarna struktura nukleosomov v metafaznih kromosomih mora biti v veliki meri omejena in nenaključna. Učbeniški pogled je, da se kromosomi tvorijo z urejenim hierarhičnim zvijanjem 30 nm filamentov v zaporedna kondenzirana stanja zankastih oblik, to so najprej 100 nm in nato 200-250 nm filamenti, ki se še naprej zvijajo ali zlagajo glede na prejšnjo obliko kromatinskega filamenta. Ugotovljeno pa je bilo, da isti nukleosomi oz. DNA sekvence niso vedno na enakem položaju v metafaznem kromosomu, kar nakazuje da se kromosomi vsaj v neki stopnji kondenziranja oblikujejo neurejeno in naključno. Raziskave kažejo tudi na to, da se kromatinski filamenti zlagajo bolj radialno stran od centra kot pa longitudialno. Kromatinske zanke izhajajo iz linearne kromosomske osi. Raziskave kažejo, da so kromatinske zanke osnovne organizacijske enote kromosoma.
===Oblikovanje zankastih domen===
Celoten proces nastanka in vzdrževanja takšnih zankastih domen je nepoznan.
Eden od možnih mehanizmov nastanka zank je tak, da se naključni polimeri prepletajo in povezujejo v zanke. Takšna razlaga odpove pri razlagi za nastanek večjih ponovljivih zank. Prav tako bi privedlo do kolapsa kromosomskih polimerov v sferično globulo. Ta t.i. polymer molt model torej ne more razložiti paličastih struktur kromatina v metafazi.
Kromonemski model predpostavlja zanke, ki so stabilizirane z vezavo na nehistonske jedrne proteine ali na kondenzirane kromatine znotraj sosednjih kromonemski filamentov. Random/walk giant loop model upošteva obsežno agregacijo kromatina v DNA žarišćih. Model predvideva naključno vezavo kromatinskih domen velikosti 3 milijonov bp na nekromatinsko jedrno strukturo. Ta model pa ne upošteva prisotnosti manjših zank, ki pa jih zato multi-loop subcompartment model.

Krio-mikroskopska opažanja pokažejo homogene, zrnaste teksture in ne urejene periodične strukture kromosomov. Predpostavlja se da se zanke nepravilno zlagajo proti anizotropnem kromosomskemu scaffold-u, ki vsebuje veliko kondenzinov. Ta kolaps zank, bi lahko bil okrepljen s privlačnimi silami ponavljajočih sekvenc, ki so razpršene po celem genomu. Kompaktni nativni kromosom bi bil tako sestavljen primarno iz nepravilneg kromatinskega omrežja, ki je zamrežen z kondenzini in so izotropni in ne radialni. Po tem modelu kondenzini vežejo določene dele kromatina in naredijo zanke. Nato kondenzini naprej zamrežijo sosednje kromatinske zanke.

===Faktorji, ki vplivajo na kompaktiranje===
Pri nastanku zank, po vsej verjetnosti sodelujejo aktivatorski proteini. To sta npr. GATA1 in GATA3. GATA3 je pomemben za vzpostavitev in/ali vzdrževanje kromatinskih interakcij dolgega obsega.
Modifikacije histonskih repov povzročijo regionalne spremembe v razporeditvi naboja v kromatinu, kar se naprej odraža v de/kondenzaciji kromatina. Višja kromosomska struktura je občutljiva na spremembe v ionski koncentraciji. Podobno bi lahko spremembe v acetilaciji, metilaciji in fosorilaciji histonskih repov spremenile interakcije med nukleosomi in/ali kromatinskimi filamenti.
ACP-ji (Architectural chromatin proteins) pripomorejo tudi k modulaciji nukleosoma in kromatinske strukture. HP1 veže nukleosome in poveča interakcijo med njimi ter formacijo kompaktiranih sekundarnih struktur kromatina. HP1 lahko poveže dva metilirana repa H3 na različnih nukleosomih. MeCP2 prinese skupaj metilirane regije DNA. Tudi Polycomb compleks lahko organizira nukleosome v kompaktne strukture.
Veliko število eksperimentov kaže na to da je kondenzacija kromosomov regulirana z fosforilacijo CDK1. Podaljšana aktivnost CDK1 vodi do hiperkondenzacije mitotskega kromosoma.
Poleg proteinskih faktorjev naj bi bili tudi kationi bistveni za kondenzacijo kromosoma. V prisotnosti kationov pride do kondenzacije DNA zaradi nevtralizacije naboja, saj vezava kationov, na fosfate v DNA, zniža skupen elektrostatski odboj med sosednjimi DNA regijami.
===Pomen SMC proteinov===
SMC (Structural maintenance of chromosomes) proteini so dimerni proteini, ki tvorijo kompleks v obliki črke V. Glavna tipa SMC proteinov pri evkariontih sta kondenzin in kohezin. Kohezini sodelujejo pri povezovanju sestrskih kromatid takoj po replikaciji in ohranjajo povezanost le-teh med kondenzacijo kromosomov do metafaze. Kohezini naj bi, še s proteinom kleizinom, tvorili obroč okoli podvojenih kromosomov in jih povezovali skupaj dokler se ne ločijo pri celični delitvi. Ko celica vstopi v mitozo se kondenzini na DNA vežejo tako, da tvorijo pozitivna superzvitja DNA. SMC proteini vežejo DNA na svojo pregibno regijo iz česar lahko nastane intramolekularni SMC obroč. Vezava ATP na SMC protein pripelje do direktne združitve in tvorbe superzvitih zank v vezani DNA. Nadaljno preurejanje takšnih združitev pripelje do tvorbe še bolj kondenzirane DNA v t.i. rozetne oblike.Ugotovljeno pa je bilo da so se v vretenčarskih celicah, ki so jim močno zmanjšali koncentracijo kondenzinov , kromosomi kljub temu formirali, a so se nenormalno raztegnili ko so bili vezani na delitveno vreteno.
==Viri==
*Moser S.C. in Swedlow J.R.. How to be a mitotic chromosome, Chromosome Research, 2011, letn. 19, str. 307-319.

*Maeshima K, in Eltsov Mikhail. Packaging the Genome: the Structure of Mitotic Chromosomes, Journal of Biochemistry, 2008, letn. 143, str. 145-153

*Grigoryev, S. A. Nucleosim spacing and chromatin higher-order folding. Nucleus, 2012, letn. 3, str. 493-499.

*Kalashnikova, A. A.; et al. The role of the nucleosome acidic patch in modulating higher order chromatin. Journal of royal society Interface, 2013, 10: 20121022.

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Kompaktiranje kromosomov

2014-04-20T20:57:26Z

Maruša Prolič-Kalinšek:

Evkariontska DNA je v jedru organizirana v kromatin. Podenota kromatina je nukleosom, ki ga sestavlja 145-147 bp dolga DNA ovita okoli histonskega oktamera. Vsak histon ima majhno N-končno domeno, ki je nestrukturirana in izpostavljena raztopini, preostali del strukture predstavljajo predvsem alfa vijačnice, ki tvorijo nukleosom.
==Primarna Struktura kromatina==
===Povezovanje nukleosomov===
Histon H1 je vezan na nukleosomalno DNA. Dolžina povezovalne DNA je regulirana s povezovalnimi histoni, ki so podvrsta H1. Primer podvrste je H5, ki se od H1 razlikuje v enem aminokislinskem ostanku, namesto Lys je vezan Arg. Zaradi zamenjave, H5 tesneje povezuje kromatin, to pa se odraža v transkripcijski in replikacijski neaktivnosti kromatina. Povezovalne histone sestavljata N- in C- končni roki bogati z bazičnimi ostanki. Ti izrastki interagirajo s povezovalno DNA in s tem povezujejo sosednje nukleosome, globularna domena histona pa ga veže na nukleosom.
Nizi nukleosomov so zelo dinamični. Pri nizkih koncentracijah soli nizi nukleosomov izoblikujejo konformacijo kroglic na vrvi (beads-on-a-string). Zaradi interakcij med nukleosomi, pri fizioloških pogojih, se nizi nukleosomov pričnejo kondenzirati v zvite oligomerne strukture. Ena izmed pomembnejših domen, ki pripomore k pravilnemu kondenziranju in interagira z določeno regijo imenovano kislinski obliž (acidic patch) na sosednjem nukleosomu, je domena histona H4. Ta se veže z 16-24 ostanki v kislinski obliž. Kislinski obliž ima obliko ozkega utora in na dnu tvori hidrofobni žep. Sestavlja ga 8 ostankov, 6 ostankov H2A in 2 ostanka H2B, skupaj ustvarijo negativno nabito površino. Ta regija ni samo vezavno mesto za H4 domeno, ampak je tudi vezavno mesto za nukleosom vezavne proteine, kot so citokin interlevkin-33, HMGN2, LANA…
==Sekundarna strukturna kromatina==
Sekundarna struktura je struktura premera 30 nm, ki nastane z zvitjem nukleosomskega niza (primarna struktura). Zaradi omejenih mikroskopskih pristopov ter kompleksnosti strukture, je napredek v odkrivanju sekundarne strukture počasen, poleg tega pa so interpretacije dobljenih rezultatov različne.
Povezovalna DNA zastopa različne dolžine, vse od 7 pa do 100 bp. Daljše (60 bp) omogočajo bolj odprto strukturo kromatina, krajše (20-32 bp) pa bolj kompaktno. Odstopanje nekaj bp pri daljši povezovalni DNA ne vpliva na zvijanje kromatina, pri krajši pa je vpliv večji. Poleg dolžine vpliva na kompaktiranje še internukleosomalni rotacijski kot med nukleosomoma, ki vpliva na zgoščevanje kromatina.
Na osnovi rezultatov raziskav o organiziranosti kromatina in vitro, sta bila zasnovana dva modela CikCak ter solenoid.
===CikCak===
Cikcak model predstavlja interakcijo, kjer se med seboj povežejo n in n+2. nukleosom (lihi nukleosomi in sodi nukleosomi se povežejo skupaj v snop). Ob ovitju enega snopa okoli drugega, nastaneta dve levo smerni vijačnici oz. dvo-zvezdna vijačnica, ki ima 18,9 nukleosomov na obrat. Povezovalna DNA poteka sem ter tja med nukleosomi (potuje preko sredine »vlakna«) kar je mogoče samo zaradi odsotnosti povezovalnih histonov. Zaradi primanjkljaja povezovalnih histonov, je struktura bolj ohlapna in posledično bolj dostopna histonom in drugim proteinom.
===Solenoid===
Pri solenoidnem modelu se med seboj povezujejo sosednji nukleosomi (n in n+1), ki si sledijo v enojni levo smerni vijačnici oz. eno-zvezdni vijačnici. Ta struktura je bolj kompaktna, saj vsebuje povezovalne histone, posledično pa je manj dostopna drugim proteinom.
==Terciarna struktura kromatina==
Terciarna struktura nukleosomov v metafaznih kromosomih mora biti v veliki meri omejena in nenaključna. Učbeniški pogled je, da se kromosomi tvorijo z urejenim hierarhičnim zvijanjem 30 nm filamentov v zaporedna kondenzirana stanja zankastih oblik, to so najprej 100 nm in nato 200-250 nm filamenti, ki se še naprej zvijajo ali zlagajo glede na prejšnjo obliko kromatinskega filamenta. Ugotovljeno pa je bilo, da isti nukleosomi oz. DNA sekvence niso vedno na enakem položaju v metafaznem kromosomu, kar nakazuje da se kromosomi vsaj v neki stopnji kondenziranja oblikujejo neurejeno in naključno. Raziskave kažejo tudi na to, da se kromatinski filamenti zlagajo bolj radialno stran od centra kot pa longitudialno. Kromatinske zanke izhajajo iz linearne kromosomske osi. Raziskave kažejo, da so kromatinske zanke osnovne organizacijske enote kromosoma.
===Oblikovanje zankastih domen===
Celoten proces nastanka in vzdrževanja takšnih zankastih domen je nepoznan.
Eden od možnih mehanizmov nastanka zank je tak, da se naključni polimeri prepletajo in povezujejo v zanke. Takšna razlaga odpove pri razlagi za nastanek večjih ponovljivih zank. Prav tako bi privedlo do kolapsa kromosomskih polimerov v sferično globulo. Ta t.i. polymer molt model torej ne more razložiti paličastih struktur kromatina v metafazi.
Kromonemski model predpostavlja zanke, ki so stabilizirane z vezavo na nehistonske jedrne proteine ali na kondenzirane kromatine znotraj sosednjih kromonemski filamentov. Random/walk giant loop model upošteva obsežno agregacijo kromatina v DNA žarišćih. Model predvideva naključno vezavo kromatinskih domen velikosti 3 milijonov bp na nekromatinsko jedrno strukturo. Ta model pa ne upošteva prisotnosti manjših zank, ki pa jih zato multi-loop subcompartment model.

Krio-mikroskopska opažanja pokažejo homogene, zrnaste teksture in ne urejene periodične strukture kromosomov. Predpostavlja se da se zanke nepravilno zlagajo proti anizotropnem kromosomskemu scaffold-u, ki vsebuje veliko kondenzinov. Ta kolaps zank, bi lahko bil okrepljen s privlačnimi silami ponavljajočih sekvenc, ki so razpršene po celem genomu. Kompaktni nativni kromosom bi bil tako sestavljen primarno iz nepravilneg kromatinskega omrežja, ki je zamrežen z kondenzini in so izotropni in ne radialni. Po tem modelu kondenzini vežejo določene dele kromatina in naredijo zanke. Nato kondenzini naprej zamrežijo sosednje kromatinske zanke.

===Faktorji, ki vplivajo na kompaktiranje===
Pri nastanku zank, po vsej verjetnosti sodelujejo aktivatorski proteini. To sta npr. GATA1 in GATA3. GATA3 je pomemben za vzpostavitev in/ali vzdrževanje kromatinskih interakcij dolgega obsega.
Modifikacije histonskih repov povzročijo regionalne spremembe v razporeditvi naboja v kromatinu, kar se naprej odraža v de/kondenzaciji kromatina. Višja kromosomska struktura je občutljiva na spremembe v ionski koncentraciji. Podobno bi lahko spremembe v acetilaciji, metilaciji in fosorilaciji histonskih repov spremenile interakcije med nukleosomi in/ali kromatinskimi filamenti.
ACP-ji (Architectural chromatin proteins) pripomorejo tudi k modulaciji nukleosoma in kromatinske strukture. HP1 veže nukleosome in poveča interakcijo med njimi ter formacijo kompaktiranih sekundarnih struktur kromatina. HP1 lahko poveže dva metilirana repa H3 na različnih nukleosomih. MeCP2 prinese skupaj metilirane regije DNA. Tudi Polycomb compleks lahko organizira nukleosome v kompaktne strukture.
Veliko število eksperimentov kaže na to da je kondenzacija kromosomov regulirana z fosforilacijo CDK1. Podaljšana aktivnost CDK1 vodi do hiperkondenzacije mitotskega kromosoma.
Poleg proteinskih faktorjev naj bi bili tudi kationi bistveni za kondenzacijo kromosoma. V prisotnosti kationov pride do kondenzacije DNA zaradi nevtralizacije naboja, saj vezava kationov, na fosfate v DNA, zniža skupen elektrostatski odboj med sosednjimi DNA regijami.
===Pomen SMC proteinov===
SMC (Structural maintenance of chromosomes) proteini so dimerni proteini, ki tvorijo kompleks v obliki črke V. Glavna tipa SMC proteinov pri evkariontih sta kondenzin in kohezin. Kohezini sodelujejo pri povezovanju sestrskih kromatid takoj po replikaciji in ohranjajo povezanost le-teh med kondenzacijo kromosomov do metafaze. Kohezini naj bi, še s proteinom kleizinom, tvorili obroč okoli podvojenih kromosomov in jih povezovali skupaj dokler se ne ločijo pri celični delitvi. Ko celica vstopi v mitozo se kondenzini na DNA vežejo tako, da tvorijo pozitivna superzvitja DNA. SMC proteini vežejo DNA na svojo pregibno regijo iz česar lahko nastane intramolekularni SMC obroč. Vezava ATP na SMC protein pripelje do direktne združitve in tvorbe superzvitih zank v vezani DNA. Nadaljno preurejanje takšnih združitev pripelje do tvorbe še bolj kondenzirane DNA v t.i. rozetne oblike.Ugotovljeno pa je bilo da so se v vretenčarskih celicah, ki so jim močno zmanjšali koncentracijo kondenzinov , kromosomi kljub temu formirali, a so se nenormalno raztegnili ko so bili vezani na delitveno vreteno.
==Viri==
*Moser S.C. in Swedlow J.R.. How to be a mitotic chromosome, Chromosome Research, 2011, letn. 19, str. 307-319.

*Maeshima K, in Eltsov Mikhail. Packaging the Genome: the Structure of Mitotic Chromosomes, Journal of Biochemistry, 2008, letn. 143, str. 145-153

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Kompaktiranje kromosomov

2014-04-20T20:52:55Z

Maruša Prolič-Kalinšek:

==Primarna Struktura kromatina==
===Povezovanje nukleosomov===
==Sekundarna strukturna kromatina==
===CikCak===
===Solenoid===
==Terciarna struktura kromatina==
Terciarna struktura nukleosomov v metafaznih kromosomih mora biti v veliki meri omejena in nenaključna. Učbeniški pogled je, da se kromosomi tvorijo z urejenim hierarhičnim zvijanjem 30 nm filamentov v zaporedna kondenzirana stanja zankastih oblik, to so najprej 100 nm in nato 200-250 nm filamenti, ki se še naprej zvijajo ali zlagajo glede na prejšnjo obliko kromatinskega filamenta. Ugotovljeno pa je bilo, da isti nukleosomi oz. DNA sekvence niso vedno na enakem položaju v metafaznem kromosomu, kar nakazuje da se kromosomi vsaj v neki stopnji kondenziranja oblikujejo neurejeno in naključno. Raziskave kažejo tudi na to, da se kromatinski filamenti zlagajo bolj radialno stran od centra kot pa longitudialno. Kromatinske zanke izhajajo iz linearne kromosomske osi. Raziskave kažejo, da so kromatinske zanke osnovne organizacijske enote kromosoma.
===Oblikovanje zankastih domen===
Celoten proces nastanka in vzdrževanja takšnih zankastih domen je nepoznan.
Eden od možnih mehanizmov nastanka zank je tak, da se naključni polimeri prepletajo in povezujejo v zanke. Takšna razlaga odpove pri razlagi za nastanek večjih ponovljivih zank. Prav tako bi privedlo do kolapsa kromosomskih polimerov v sferično globulo. Ta t.i. polymer molt model torej ne more razložiti paličastih struktur kromatina v metafazi.
Kromonemski model predpostavlja zanke, ki so stabilizirane z vezavo na nehistonske jedrne proteine ali na kondenzirane kromatine znotraj sosednjih kromonemski filamentov. Random/walk giant loop model upošteva obsežno agregacijo kromatina v DNA žarišćih. Model predvideva naključno vezavo kromatinskih domen velikosti 3 milijonov bp na nekromatinsko jedrno strukturo. Ta model pa ne upošteva prisotnosti manjših zank, ki pa jih zato multi-loop subcompartment model.

Krio-mikroskopska opažanja pokažejo homogene, zrnaste teksture in ne urejene periodične strukture kromosomov. Predpostavlja se da se zanke nepravilno zlagajo proti anizotropnem kromosomskemu scaffold-u, ki vsebuje veliko kondenzinov. Ta kolaps zank, bi lahko bil okrepljen s privlačnimi silami ponavljajočih sekvenc, ki so razpršene po celem genomu. Kompaktni nativni kromosom bi bil tako sestavljen primarno iz nepravilneg kromatinskega omrežja, ki je zamrežen z kondenzini in so izotropni in ne radialni. Po tem modelu kondenzini vežejo določene dele kromatina in naredijo zanke. Nato kondenzini naprej zamrežijo sosednje kromatinske zanke.

===Faktorji, ki vplivajo na kompaktiranje===
Pri nastanku zank, po vsej verjetnosti sodelujejo aktivatorski proteini. To sta npr. GATA1 in GATA3. GATA3 je pomemben za vzpostavitev in/ali vzdrževanje kromatinskih interakcij dolgega obsega.
Modifikacije histonskih repov povzročijo regionalne spremembe v razporeditvi naboja v kromatinu, kar se naprej odraža v de/kondenzaciji kromatina. Višja kromosomska struktura je občutljiva na spremembe v ionski koncentraciji. Podobno bi lahko spremembe v acetilaciji, metilaciji in fosorilaciji histonskih repov spremenile interakcije med nukleosomi in/ali kromatinskimi filamenti.
ACP-ji (Architectural chromatin proteins) pripomorejo tudi k modulaciji nukleosoma in kromatinske strukture. HP1 veže nukleosome in poveča interakcijo med njimi ter formacijo kompaktiranih sekundarnih struktur kromatina. HP1 lahko poveže dva metilirana repa H3 na različnih nukleosomih. MeCP2 prinese skupaj metilirane regije DNA. Tudi Polycomb compleks lahko organizira nukleosome v kompaktne strukture.
Veliko število eksperimentov kaže na to da je kondenzacija kromosomov regulirana z fosforilacijo CDK1. Podaljšana aktivnost CDK1 vodi do hiperkondenzacije mitotskega kromosoma.
Poleg proteinskih faktorjev naj bi bili tudi kationi bistveni za kondenzacijo kromosoma. V prisotnosti kationov pride do kondenzacije DNA zaradi nevtralizacije naboja, saj vezava kationov, na fosfate v DNA, zniža skupen elektrostatski odboj med sosednjimi DNA regijami.
===Pomen SMC proteinov===
SMC (Structural maintenance of chromosomes) proteini so dimerni proteini, ki tvorijo kompleks v obliki črke V. Glavna tipa SMC proteinov pri evkariontih sta kondenzin in kohezin. Kohezini sodelujejo pri povezovanju sestrskih kromatid takoj po replikaciji in ohranjajo povezanost le-teh med kondenzacijo kromosomov do metafaze. Kohezini naj bi, še s proteinom kleizinom, tvorili obroč okoli podvojenih kromosomov in jih povezovali skupaj dokler se ne ločijo pri celični delitvi. Ko celica vstopi v mitozo se kondenzini na DNA vežejo tako, da tvorijo pozitivna superzvitja DNA. SMC proteini vežejo DNA na svojo pregibno regijo iz česar lahko nastane intramolekularni SMC obroč. Vezava ATP na SMC protein pripelje do direktne združitve in tvorbe superzvitih zank v vezani DNA. Nadaljno preurejanje takšnih združitev pripelje do tvorbe še bolj kondenzirane DNA v t.i. rozetne oblike.Ugotovljeno pa je bilo da so se v vretenčarskih celicah, ki so jim močno zmanjšali koncentracijo kondenzinov , kromosomi kljub temu formirali, a so se nenormalno raztegnili ko so bili vezani na delitveno vreteno.
==Viri==
*Moser S.C. in Swedlow J.R.. How to be a mitotic chromosome, Chromosome Research, 2011, letn. 19, str. 307-319.

*Maeshima K, in Eltsov Mikhail. Packaging the Genome: the Structure of Mitotic Chromosomes, Journal of Biochemistry, 2008, letn. 143, str. 145-153

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Talk:Kompaktiranje kromosomov

2014-04-20T20:50:06Z

Maruša Prolič-Kalinšek: New page: Tajda Buh: Primarna struktura kromatina, Sekundarna struktura kromatina in uvod (del besedila takoj pod naslovom) Maruša Prolič-Kalinšek: Terciarna struktura kromatina

Tajda Buh: Primarna struktura kromatina, Sekundarna struktura kromatina in uvod (del besedila takoj pod naslovom)

Maruša Prolič-Kalinšek: Terciarna struktura kromatina

Kompaktiranje kromosomov

2014-04-20T20:43:25Z

Maruša Prolič-Kalinšek:

Kompaktiranje kromosomov

2014-04-20T20:25:15Z

Maruša Prolič-Kalinšek: /* Oblikovanje zankastih domen */

Kompaktiranje kromosomov

2014-04-20T20:17:42Z

Maruša Prolič-Kalinšek: /* Terciarna struktura kromatina */

==Primarna Struktura kromatina==
===Povezovanje nukleosomov===
==Sekundarna strukturna kromatina==
===CikCak===
===Solenoid===
==Terciarna struktura kromatina==
Terciarna struktura nukleosomov v metafaznih kromosomih mora biti v veliki meri omejena in nenaključna. Učbeniški pogled je, da se kromosomi tvorijo z urejenim hierarhičnim zvijanjem 30 nm filamentov v zaporedna kondenzirana stanja zankastih oblik, to so najprej 100 nm in nato 200-250 nm filamenti, ki se še naprej zvijajo ali zlagajo glede na prejšnjo obliko kromatinskega filamenta. Ugotovljeno pa je bilo, da isti nukleosomi oz. DNA sekvence niso vedno na enakem položaju v metafaznem kromosomu, kar nakazuje da se kromosomi vsaj v neki stopnji kondenziranja oblikujejo neurejeno in naključno. Raziskave kažejo tudi na to, da se kromatinski filamenti zlagajo bolj radialno stran od centra kot pa longitudialno. Kromatinske zanke izhajajo iz linearne kromosomske osi. Raziskave kažejo, da so kromatinske zanke osnovne organizacijske enote kromosoma.
===Oblikovanje zankastih domen===
Celoten proces nastanka in vzdrževanja takšnih zankastih domen je nepoznan.
Eden od možnih mehanizmov nastanka zank je tak, da se naključni polimeri prepletajo in povezujejo v zanke. Takšna razlaga odpove pri razlagi za nastanek večjih ponovljivih zank. Prav tako bi privedlo do kolapsa kromosomskih polimerov v sferično globulo. Ta t.i. polymer molt model torej ne more razložiti paličastih struktur kromatina v metafazi.
Kromonemski model predpostavlja zanke, ki so stabilizirane z vezavo na nehistonske jedrne proteine ali na kondenzirane kromatine znotraj sosednjih kromonemski filamentov. Random/walk giant loop model upošteva obsežno agregacijo kromatina v DNA žarišćih. Model predvideva naključno vezavo kromatinskih domen velikosti 3 milijonov bp na nekromatinsko jedrno strukturo. Ta model pa ne upošteva prisotnosti manjših zank, ki pa jih zato multi-loop subcompartment model.
Krio-mikroskopska opažanja pokažejo homogene, zrnaste teksture in ne urejene periodične strukture kromosomov. Predpostavlja se da se zanke nepravilno zlagajo proti anizotropnem kromosomskemu scaffold-u, ki vsebuje veliko kondenzinov. Ta kolaps zank, bi lahko bil okrepljen s privlačnimi silami ponavljajočih sekvenc, ki so razpršene po celem genomu. Kompaktni nativni kromosom bi bil tako sestavljen primarno iz nepravilneg kromatinskega omrežja, ki je zamrežen z kondenzini in so izotropni in ne radialni. Po tem modelu kondenzini vežejo določene dele kromatina in naredijo zanke. Nato kondenzini naprej zamrežijo sosednje kromatinske zanke.
===Faktorji, ki vplivajo na kompaktiranje===
Pri nastanku zank, po vsej verjetnosti sodelujejo aktivatorski proteini. To sta npr. GATA1 in GATA3. GATA3 je pomemben za vzpostavitev in/ali vzdrževanje kromatinskih interakcij dolgega obsega.
Modifikacije histonskih repov povzročijo regionalne spremembe v razporeditvi naboja v kromatinu, kar se naprej odraža v de/kondenzaciji kromatina. Višja kromosomska struktura je občutljiva na spremembe v ionski koncentraciji. Podobno bi lahko spremembe v acetilaciji, metilaciji in fosorilaciji histonskih repov spremenile interakcije med nukleosomi in/ali kromatinskimi filamenti.
ACP-ji (Architectural chromatin proteins) pripomorejo tudi k modulaciji nukleosoma in kromatinske strukture. HP1 veže nukleosome in poveča interakcijo med njimi ter formacijo kompaktiranih sekundarnih struktur kromatina. HP1 lahko poveže dva metilirana repa H3 na različnih nukleosomih. MeCP2 prinese skupaj metilirane regije DNA. Tudi Polycomb compleks lahko organizira nukleosome v kompaktne strukture.
Veliko število eksperimentov kaže na to da je kondenzacija kromosomov regulirana z fosforilacijo CDK1. Podaljšana aktivnost CDK1 vodi do hiperkondenzacije mitotskega kromosoma.
Poleg proteinskih faktorjev naj bi bili tudi kationi bistveni za kondenzacijo kromosoma. V prisotnosti kationov pride do kondenzacije DNA zaradi nevtralizacije naboja, saj vezava kationov, na fosfate v DNA, zniža skupen elektrostatski odboj med sosednjimi DNA regijami.
===Pomen SMC proteinov===
SMC (Structural maintenance of chromosomes) proteini so dimerni proteini, ki tvorijo kompleks v obliki črke V. Glavna tipa SMC proteinov pri evkariontih sta kondenzin in kohezin. Kohezini sodelujejo pri povezovanju sestrskih kromatid takoj po replikaciji in ohranjajo povezanost le-teh med kondenzacijo kromosomov do metafaze. Kohezini naj bi, še s proteinom kleizinom, tvorili obroč okoli podvojenih kromosomov in jih povezovali skupaj dokler se ne ločijo pri celični delitvi. Ko celica vstopi v mitozo se kondenzini na DNA vežejo tako, da tvorijo pozitivna superzvitja DNA. SMC proteini vežejo DNA na svojo pregibno regijo iz česar lahko nastane intramolekularni SMC obroč. Vezava ATP na SMC protein pripelje do direktne združitve in tvorbe superzvitih zank v vezani DNA. Nadaljno preurejanje takšnih združitev pripelje do tvorbe še bolj kondenzirane DNA v t.i. rozetne oblike.Ugotovljeno pa je bilo da so se v vretenčarskih celicah, ki so jim močno zmanjšali koncentracijo kondenzinov , kromosomi kljub temu formirali, a so se nenormalno raztegnili ko so bili vezani na delitveno vreteno.

Kompaktiranje kromosomov

2014-04-20T20:15:27Z

Maruša Prolič-Kalinšek: /* Pomen SMC proteinov */

==Primarna Struktura kromatina==
===Povezovanje nukleosomov===
==Sekundarna strukturna kromatina==
===CikCak===
===Solenoid===
==Terciarna struktura kromatina==
===Oblikovanje zankastih domen===
===Faktorji, ki vplivajo na kompaktiranje===
===Pomen SMC proteinov===
SMC (Structural maintenance of chromosomes) proteini so dimerni proteini, ki tvorijo kompleks v obliki črke V. Glavna tipa SMC proteinov pri evkariontih sta kondenzin in kohezin. Kohezini sodelujejo pri povezovanju sestrskih kromatid takoj po replikaciji in ohranjajo povezanost le-teh med kondenzacijo kromosomov do metafaze. Kohezini naj bi, še s proteinom kleizinom, tvorili obroč okoli podvojenih kromosomov in jih povezovali skupaj dokler se ne ločijo pri celični delitvi. Ko celica vstopi v mitozo se kondenzini na DNA vežejo tako, da tvorijo pozitivna superzvitja DNA. SMC proteini vežejo DNA na svojo pregibno regijo iz česar lahko nastane intramolekularni SMC obroč. Vezava ATP na SMC protein pripelje do direktne združitve in tvorbe superzvitih zank v vezani DNA. Nadaljno preurejanje takšnih združitev pripelje do tvorbe še bolj kondenzirane DNA v t.i. rozetne oblike.Ugotovljeno pa je bilo da so se v vretenčarskih celicah, ki so jim močno zmanjšali koncentracijo kondenzinov , kromosomi kljub temu formirali, a so se nenormalno raztegnili ko so bili vezani na delitveno vreteno.

Kompaktiranje kromosomov

2014-04-20T20:06:41Z

Maruša Prolič-Kalinšek:

Kompaktiranje kromosomov

2014-04-20T19:52:53Z

Maruša Prolič-Kalinšek: New page: ==Primarna Struktura kromatina== ===Povezovanje nukleosomov=== ==Sekundarna strukturna kromatina== ===CikCak=== ===Solenoid=== ==Terciarna struktura kromatina== ===Faktorji, ki vplivajo na...

Struktura kromatina

2014-04-20T19:09:06Z

Maruša Prolič-Kalinšek: /* Skupine */

Seminarji pri predmetu Molekularna biologija bodo v študijskem letu 2013/14 namenjeni obravnavi strukture kromosomov oziroma kromatina, od strukturnih do regulatornih tem. Čeprav osnovno strukturo kromosomov že poznate, je sodobna molekularna biologija ves čas na sledi novim spoznanjem, ki nam omogočajo bolj podroben vpogled v delovanje in fleksibilnost kromatina.

V nadaljevanju so navedena nekatera izhodišča oz. naslovi referatov, ki jih bomo izvedli predvidoma konec aprila in v začetku maja. Naslove lahko v okviru danih izhodišč prilagodite, ne smete pa se bistveno odmakniti od tega, kar je predlagano. Preverite, ali se morebitne spremembe, ki jih želite vnesti, ne dotikajo teme koga drugega. Prekrivanja med referati naj bo čim manj.

Vsako temo obdelata dva ali največ trije študenti. Predlagate lahko tudi dodatne teme ali spremembe naslovov, če se vam to zdi smiselno. Vsaka skupina pripravi povzetek seminarja z vsaj 1000 besedami in ga objavi na tem wikiju. Povzetek ne vsebuje slikovnega gradiva, lahko pa vključuje povezave do slik in videov na spletu. Navedite do 5 ključnih virov (ti ne štejejo v vsoto 1000 besed), ki ste jih uporabili. Osredotočite se na osnovno temo, ki ste si jo izbrali in vključite čim manj splošnega uvoda. Pripravite tudi predstavitev, dolgo pribl. 15 min. Razširjenega seminarja ni treba pripraviti v pisni obliki; napišete samo povzetek na wikiju in predstavite seminar v predavalnici.

Čeprav tema do neke mere sega na področje celične biologije, je predvsem molekularnobiološka. Zato izpostavite tiste elemente, ki so biokemijski, torej katere biološke molekule sodelujejo pri vzpostavljanju strukture kromatina, njegovi plastičnosti (kondenzacija, dekondenzacija) in dinamičnosti (aktivni/neaktivni kromatin) ter uravnavanju transkripcije. Če se srečate z zanimivimi molekularnobiološkimi tehnikami, jih poskusite na kratko razložiti, predvsem če so ključne za spoznanja, ki jih boste predstavili. Izhodišče, ki ga ni treba ponovno razlagati, je nukleosomska struktura evkariontskega kromatina ter osnovne stopnje kompaktiranja kromatina in razumevanje osnov dodatnega zvitja pri bakterijskem kromosomu.

Vse skupine morajo objaviti povzetek seminarja na wikiju najkasneje '''20.4.''' opolnoči. Predstavitve seminarjev 1 - 4 bodo 23.4., 5 - 8 25.4., 9 - 12 7.5. in 13 - 16 9.5.2014. Vsaka skupina ima za predstavitev 14-18 minut časa, sledi pa razprava (~5 min.). Vsak član skupine mora predstaviti en del seminarja, pri čemer mora biti delo enakomerno razdeljeno med vse. V povzetku navedite, kdo je napisal kateri del (na wiki-strani uporabite zavihek 'discussion').

# Značilnosti bakterijskih kromosomov
# Medmolekulske interakcije znotraj nukleosomov
# Značilnosti kromosomskih ogrodij
# Kompaktiranje kromosomov
# Proteini, ki stabilizirajo kondenzirane kromosome
# Biokemijska struktura centromerov in njihove interakcije
# Biokemijska struktura telomerov
# Telomeraze
# Kromatin in replikacija genoma / nukleosomi med replikacijo
# Kromosomske domene in kontrolne regije lokusov (LCR)
# Posttranslacijske modifikacije histonov in njihov pomen
# Metilacijski vzorci na DNA: nastanek, dedovanje in pomen
# Sestava in značilnosti preurejevalnih strojčkov
# Ponavljajoča se zaporedja v genomu
# Organizacija genov v kromatinu
# Posebnosti kromosomov X in Y / bolezni, povezane s tema dvema kromosomoma

===Skupine===

Skupine za projektno nalogo - po 1 - 3 za vsako temo (skupine oblikujte do 31.3. opolnoči - imena in priimke vpišite v oklepaj za naslovom teme):

npr.: 1. Biokemijske značilnosti bakterijskih kromosomov (Janez Gorenc, Petra Novak)

# Značilnosti bakterijskih kromosomov (Matic Kovačič, Marjeta Horvat, Rok Ipšek)
# [[Medmolekulske interakcije znotraj nukleosomov]] (Boštjan Petrič, Vita Vidmar)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Zna%C4%8Dilnosti_kromosomskih_ogrodij Značilnosti kromosomskih ogrodij] (Aneja Tahirovič, Aljaž Omahna, Luka Krmpotić)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Kompaktiranje_kromosomov Kompaktiranje kromosomov] (Tajda Buh, Maruša Prolič-Kalinšek)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Proteini%2C_ki_stabilizirajo_kondenzirane_kromosome Proteini, ki stabilizirajo kondenzirane kromosome] (Toni Nagode, Simon Bolta, Tjaša Bensa)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Biokemijska_struktura_centromer_in_njihove_interakcije Biokemijska struktura centromer in njihove interakcije] (Maja Zupančič, Alja Zgonc)
# Biokemijska struktura telomerov (Tim Božič, Ema Guštin, Luka Kavčič)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Telomeraze Telomeraze] (Urša Kapš, Mojca Kostanjevec, Katjuša Triplat)
# Kromatin in replikacija genoma / nukleosomi med replikacijo (Jure Fabjan, Vid Jazbec, Mojca Juteršek)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Kromosomske_domene_in_kontrolne_regije_lokusov_(LCR) Kromosomske domene in kontrolne regije lokusov (LCR)] (Jakob Rupert, Jan Rozman, Domen Klofutar)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Posttranslacijske_modifikacije_histonov_in_njihov_pomen Posttranslacijske modifikacije histonov in njihov pomen] (Peter Prezelj, Filip Mihalič, Eva Oblak Zvonar)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Metilacijski_vzorci_na_DNA:_nastanek%2C_dedovanje_in_pomen Metilacijski vzorci na DNA: nastanek, dedovanje in pomen] (Rok Ferenc, Ana Cirnski, Vesna Radić)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sestava_in_zna%C4%8Dilnosti_preurejevalnih_stroj%C4%8Dkov Sestava in značilnosti preurejevalnih strojčkov] (Petra Tavčar, Helena Jakše, Nika Strašek)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Ponavljajo%C4%8Da_se_zaporedja_v_genomu Ponavljajoča se zaporedja v genomu] (Eva Vidak)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Organizacija_genov_v_kromatinu Organizacija genov v kromatinu] (Jan Taškar)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Posebnosti_X_in_Y_kromosomov_ter_z_njima_povezane_bolezni Posebnosti X in Y kromosomov ter z njima povezane bolezni] (Sara Košenina, Ana Krišelj, Sabina Štukelj)

Naslov teme povežite z novo wiki-stranjo, na katero napišite povzetek. Na koncu besedila (pod viri) v novo vrstico dodajte oznaki:
<nowiki>[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]</nowiki>

Kako so bili urejeni seminarji lani, si lahko ogledate na strani [[Reprogramiranje celic]].

Struktura kromatina

2014-04-20T19:08:14Z

Maruša Prolič-Kalinšek: /* Skupine */

Seminarji pri predmetu Molekularna biologija bodo v študijskem letu 2013/14 namenjeni obravnavi strukture kromosomov oziroma kromatina, od strukturnih do regulatornih tem. Čeprav osnovno strukturo kromosomov že poznate, je sodobna molekularna biologija ves čas na sledi novim spoznanjem, ki nam omogočajo bolj podroben vpogled v delovanje in fleksibilnost kromatina.

V nadaljevanju so navedena nekatera izhodišča oz. naslovi referatov, ki jih bomo izvedli predvidoma konec aprila in v začetku maja. Naslove lahko v okviru danih izhodišč prilagodite, ne smete pa se bistveno odmakniti od tega, kar je predlagano. Preverite, ali se morebitne spremembe, ki jih želite vnesti, ne dotikajo teme koga drugega. Prekrivanja med referati naj bo čim manj.

Vsako temo obdelata dva ali največ trije študenti. Predlagate lahko tudi dodatne teme ali spremembe naslovov, če se vam to zdi smiselno. Vsaka skupina pripravi povzetek seminarja z vsaj 1000 besedami in ga objavi na tem wikiju. Povzetek ne vsebuje slikovnega gradiva, lahko pa vključuje povezave do slik in videov na spletu. Navedite do 5 ključnih virov (ti ne štejejo v vsoto 1000 besed), ki ste jih uporabili. Osredotočite se na osnovno temo, ki ste si jo izbrali in vključite čim manj splošnega uvoda. Pripravite tudi predstavitev, dolgo pribl. 15 min. Razširjenega seminarja ni treba pripraviti v pisni obliki; napišete samo povzetek na wikiju in predstavite seminar v predavalnici.

Čeprav tema do neke mere sega na področje celične biologije, je predvsem molekularnobiološka. Zato izpostavite tiste elemente, ki so biokemijski, torej katere biološke molekule sodelujejo pri vzpostavljanju strukture kromatina, njegovi plastičnosti (kondenzacija, dekondenzacija) in dinamičnosti (aktivni/neaktivni kromatin) ter uravnavanju transkripcije. Če se srečate z zanimivimi molekularnobiološkimi tehnikami, jih poskusite na kratko razložiti, predvsem če so ključne za spoznanja, ki jih boste predstavili. Izhodišče, ki ga ni treba ponovno razlagati, je nukleosomska struktura evkariontskega kromatina ter osnovne stopnje kompaktiranja kromatina in razumevanje osnov dodatnega zvitja pri bakterijskem kromosomu.

Vse skupine morajo objaviti povzetek seminarja na wikiju najkasneje '''20.4.''' opolnoči. Predstavitve seminarjev 1 - 4 bodo 23.4., 5 - 8 25.4., 9 - 12 7.5. in 13 - 16 9.5.2014. Vsaka skupina ima za predstavitev 14-18 minut časa, sledi pa razprava (~5 min.). Vsak član skupine mora predstaviti en del seminarja, pri čemer mora biti delo enakomerno razdeljeno med vse. V povzetku navedite, kdo je napisal kateri del (na wiki-strani uporabite zavihek 'discussion').

# Značilnosti bakterijskih kromosomov
# Medmolekulske interakcije znotraj nukleosomov
# Značilnosti kromosomskih ogrodij
# Kompaktiranje kromosomov
# Proteini, ki stabilizirajo kondenzirane kromosome
# Biokemijska struktura centromerov in njihove interakcije
# Biokemijska struktura telomerov
# Telomeraze
# Kromatin in replikacija genoma / nukleosomi med replikacijo
# Kromosomske domene in kontrolne regije lokusov (LCR)
# Posttranslacijske modifikacije histonov in njihov pomen
# Metilacijski vzorci na DNA: nastanek, dedovanje in pomen
# Sestava in značilnosti preurejevalnih strojčkov
# Ponavljajoča se zaporedja v genomu
# Organizacija genov v kromatinu
# Posebnosti kromosomov X in Y / bolezni, povezane s tema dvema kromosomoma

===Skupine===

Skupine za projektno nalogo - po 1 - 3 za vsako temo (skupine oblikujte do 31.3. opolnoči - imena in priimke vpišite v oklepaj za naslovom teme):

npr.: 1. Biokemijske značilnosti bakterijskih kromosomov (Janez Gorenc, Petra Novak)

# Značilnosti bakterijskih kromosomov (Matic Kovačič, Marjeta Horvat, Rok Ipšek)
# [[Medmolekulske interakcije znotraj nukleosomov]] (Boštjan Petrič, Vita Vidmar)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Zna%C4%8Dilnosti_kromosomskih_ogrodij Značilnosti kromosomskih ogrodij] (Aneja Tahirovič, Aljaž Omahna, Luka Krmpotić)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Kompaktiranje_kromosomov Kompaktiranje kromosomov]Kompaktiranje kromosomov (Tajda Buh, Maruša Prolič-Kalinšek)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Proteini%2C_ki_stabilizirajo_kondenzirane_kromosome Proteini, ki stabilizirajo kondenzirane kromosome] (Toni Nagode, Simon Bolta, Tjaša Bensa)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Biokemijska_struktura_centromer_in_njihove_interakcije Biokemijska struktura centromer in njihove interakcije] (Maja Zupančič, Alja Zgonc)
# Biokemijska struktura telomerov (Tim Božič, Ema Guštin, Luka Kavčič)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Telomeraze Telomeraze] (Urša Kapš, Mojca Kostanjevec, Katjuša Triplat)
# Kromatin in replikacija genoma / nukleosomi med replikacijo (Jure Fabjan, Vid Jazbec, Mojca Juteršek)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Kromosomske_domene_in_kontrolne_regije_lokusov_(LCR) Kromosomske domene in kontrolne regije lokusov (LCR)] (Jakob Rupert, Jan Rozman, Domen Klofutar)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Posttranslacijske_modifikacije_histonov_in_njihov_pomen Posttranslacijske modifikacije histonov in njihov pomen] (Peter Prezelj, Filip Mihalič, Eva Oblak Zvonar)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Metilacijski_vzorci_na_DNA:_nastanek%2C_dedovanje_in_pomen Metilacijski vzorci na DNA: nastanek, dedovanje in pomen] (Rok Ferenc, Ana Cirnski, Vesna Radić)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sestava_in_zna%C4%8Dilnosti_preurejevalnih_stroj%C4%8Dkov Sestava in značilnosti preurejevalnih strojčkov] (Petra Tavčar, Helena Jakše, Nika Strašek)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Ponavljajo%C4%8Da_se_zaporedja_v_genomu Ponavljajoča se zaporedja v genomu] (Eva Vidak)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Organizacija_genov_v_kromatinu Organizacija genov v kromatinu] (Jan Taškar)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Posebnosti_X_in_Y_kromosomov_ter_z_njima_povezane_bolezni Posebnosti X in Y kromosomov ter z njima povezane bolezni] (Sara Košenina, Ana Krišelj, Sabina Štukelj)

Naslov teme povežite z novo wiki-stranjo, na katero napišite povzetek. Na koncu besedila (pod viri) v novo vrstico dodajte oznaki:
<nowiki>[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]</nowiki>

Kako so bili urejeni seminarji lani, si lahko ogledate na strani [[Reprogramiranje celic]].

Struktura kromatina

2014-03-24T15:09:51Z

Maruša Prolič-Kalinšek: /* Skupine */

Seminarji pri predmetu Molekularna biologija bodo v študijskem letu 2013/14 namenjeni obravnavi strukture kromosomov oziroma kromatina, od strukturnih do regulatornih tem. Čeprav osnovno strukturo kromosomov že poznate, je sodobna molekularna biologija ves čas na sledi novim spoznanjem, ki nam omogočajo bolj podroben vpogled v delovanje in fleksibilnost kromatina.

V nadaljevanju so navedena nekatera izhodišča oz. naslovi referatov, ki jih bomo izvedli predvidoma konec aprila in v začetku maja. Naslove lahko v okviru danih izhodišč prilagodite, ne smete pa se bistveno odmakniti od tega, kar je predlagano. Preverite, ali se morebitne spremembe, ki jih želite vnesti, ne dotikajo teme koga drugega. Prekrivanja med referati naj bo čim manj.

Vsako temo obdelata dva ali največ trije študenti. Predlagate lahko tudi dodatne teme ali spremembe naslovov, če se vam to zdi smiselno. Vsaka skupina pripravi povzetek seminarja z vsaj 1000 besedami in ga objavi na tem wikiju. Povzetek ne vsebuje slikovnega gradiva, lahko pa vključuje povezave do slik in videov na spletu. Navedite do 5 ključnih virov (ti ne štejejo v vsoto 1000 besed), ki ste jih uporabili. Osredotočite se na osnovno temo, ki ste si jo izbrali in vključite čim manj splošnega uvoda. Pripravite tudi predstavitev, dolgo pribl. 15 min. Razširjenega seminarja ni treba pripraviti v pisni obliki; napišete samo povzetek na wikiju in predstavite seminar v predavalnici.

Čeprav tema do neke mere sega na področje celične biologije, je predvsem molekularnobiološka. Zato izpostavite tiste elemente, ki so biokemijski, torej katere biološke molekule sodelujejo pri vzpostavljanju strukture kromatina, njegovi plastičnosti (kondenzacija, dekondenzacija) in dinamičnosti (aktivni/neaktivni kromatin) ter uravnavanju transkripcije. Če se srečate z zanimivimi molekularnobiološkimi tehnikami, jih poskusite na kratko razložiti, predvsem če so ključne za spoznanja, ki jih boste predstavili. Izhodišče, ki ga ni treba ponovno razlagati, je nukleosomska struktura evkariontskega kromatina ter osnovne stopnje kompaktiranja kromatina in razumevanje osnov dodatnega zvitja pri bakterijskem kromosomu.

Vse skupine morajo objaviti povzetek seminarja na wikiju najkasneje 17.4. opolnoči. Predstavitve seminarjev 1 - 4 bodo 23.4., 5 - 8 25.4., 9 - 12 7.5. in 13 - 16 9.5.2014. Vsaka skupina ima za predstavitev 14-18 minut časa, sledi pa razprava (~5 min.). Vsak član skupine mora predstaviti en del seminarja, pri čemer mora biti delo enakomerno razdeljeno med vse. V povzetku navedite, kdo je napisal kateri del (na wiki-strani uporabite zavihek 'discussion').

# Značilnosti bakterijskih kromosomov
# Medmolekulske interakcije znotraj nukleosomov
# Značilnosti kromosomskih ogrodij
# Kompaktiranje kromosomov
# Proteini, ki stabilizirajo kondenzirane kromosome
# Biokemijska struktura centromerov in njihove interakcije
# Biokemijska struktura telomerov
# Telomeraze
# Kromatin in replikacija genoma / nukleosomi med replikacijo
# Kromosomske domene in kontrolne regije lokusov (LCR)
# Posttranslacijske modifikacije histonov in njihov pomen
# Metilacijski vzorci na DNA: nastanek, dedovanje in pomen
# Sestava in značilnosti preurejevalnih strojčkov
# Ponavljajoča se zaporedja v genomu
# Organizacija genov v kromatinu
# Posebnosti kromosomov X in Y / bolezni, povezane s tema dvema kromosomoma

===Skupine===

Skupine za projektno nalogo - po 1 - 3 za vsako temo (skupine oblikujte do 31.3. opolnoči - imena in priimke vpišite v oklepaj za naslovom teme):

npr.: 1. Biokemijske značilnosti bakterijskih kromosomov (Janez Gorenc, Petra Novak)

# Značilnosti bakterijskih kromosomov (Matic Kovačič, Marjeta Horvat, Rok Ipšek)
# Medmolekulske interakcije znotraj nukleosomov (Boštjan Petrič, Vita Vidmar)
# Značilnosti kromosomskih ogrodij (Aneja Tahirovič, Aljaž Omahna)
# Kompaktiranje kromosomov (Tajda Buh, Maruša Prolič-Kalinšek)
# Proteini, ki stabilizirajo kondenzirane kromosome (Toni Nagode, Simon Bolta, Tjaša Bensa)
# Biokemijska struktura centromerov in njihove interakcije (Maja Zupančič, Alja Zgonc)
# Biokemijska struktura telomerov (Tim Božič, Ema Guštin, Luka Kavčič)
# Telomeraze (Urša Kapš, Mojca Kostanjevec, Katjuša Triplat)
# Kromatin in replikacija genoma / nukleosomi med replikacijo (Jure Fabjan, Vid Jazbec, Mojca Juteršek)
# Kromosomske domene in kontrolne regije lokusov (LCR) (Jakob Rupert, Jan Rozman, Domen Klofutar)
# Posttranslacijske modifikacije histonov in njihov pomen (Peter Prezelj, Filip Mihalič, Eva Oblak Zvonar)
# Metilacijski vzorci na DNA: nastanek, dedovanje in pomen (Rok Ferenc, Ana Cirnski, Vesna Radić)
# Sestava in značilnosti preurejevalnih strojčkov (Petra Tavčar, Helena Jakše, Nika Strašek)
# Ponavljajoča se zaporedja v genomu (Eva Vidak)
# Organizacija genov v kromatinu
# Posebnosti kromosomov X in Y / bolezni, povezane s tema dvema kromosomoma (Sara Košenina, Ana Krišelj, Sabina Štukelj)

Naslov teme povežite z novo wiki-stranjo, na katero napišite povzetek. Na koncu besedila (pod viri) v novo vrstico dodajte naslednji oznaki:

Kako so bili urejeni seminarji lani, si lahko ogledate na strani [[Reprogramiranje celic]].

BIO2 Povzetki seminarjev 2013

2013-11-15T22:41:23Z

Maruša Prolič-Kalinšek: /* Biokemija- Povzetki seminarjev 2013/2014 */

== Biokemija- Povzetki seminarjev 2013/2014 ==
Nazaj na osnovno [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Seminar_2013 stran]
===Tajda Buh: Mutacije izocitrat dehidrogenaze 1 in 2 pri raku===

IDH je asimetričen homodimer, ki lahko prehaja iz neaktivne odprte v aktivno zaprto konformacijo. Poznamo tri vrste izocitrat dekarboksilaze. IDH3 se nahaja v mitohondriju in katalizira prehod izocitrata v α-ketoglutarat in NAD+/NADH. IDH2 se prav tako nahaja v mitohondriju, IDH1 pa najdemo v citosolu in peroksisomih. Oba pa pretvarjata NADP+ v NADPH. Pomembno je bilo odkritje, da se mutacije pojavljajo vedno na istem mestu. Mutirana IDH lahko pridobi novo aktivnost, to je kataliziranje pretvorbe α-ketoglutarata v 2-hidroksiglutarat. Mutirana IDH pa lahko tudi izgubi aktivnost in ni več zmožna katalizirati oksidativno dekarboksilacijo izocitrata. Nova aktivnost povzroči prekomerno sintezo 2-hidroksiglutarata. Povečanje koncentracije 2-hidroksiglutarata vplivajo na α-ketoglutaratne odvisne presnovne encime. Kot so PDH, p53-iduciran α (II) kolagen prolil-4-hidroksilaza... Študije so do tega trenutka potrdile prisotnost mutacij IDH1 in IDH2 v nižjih stopnjah glioma, v sekundarnem glioblastomu, kot pa tudi v akutni mieloični levkemiji.

===Vid Jazbec: Vpliv mašobnih kislin na rakave celice===

Celice ob tvorbi rakastega obolenja spremenijo svoje delovanje. Predvsem je to vidno v metabolizmu, ki je v rakastih celicah spremenjen. Novejše raziskave dokazujejo, da je odvisnost metabolima odvisna od maščobnih kislin v večji meri, kot je bilo domnevano do sedaj. Metabolizem maščobnih kislin, predvsem beta oksidacijo, rakave celice izkoristijo ob pomanjkanju ATP, kot je pokazano pri celicah z igubo stika t izvenceličnim matriksom. Proces beta oksidacije je prav tako pomemben tudi kot proces, ki vodi v nastanek NADPH, ki se potrebuje za soočanje celice z metabolnim stresom reaktivnih kisikovih zvrsti ter rast in razvoj. Za v uvodu naštete značilnosti rakavih celic pa so poleg samega procea beta oksidacije in produktov tega procesa pomembni tudi proteini, ki spremljajo ta proces. Ti so ob nastopu rakavega obolenja deregulirani in večinoma preprečujejo prehod obolele celice v apoptozo.
Raziskave pa so pokazale tudi problem dosedajšnje dogme, pri kateri sta beta oksidacija maščobnih kislin in njihova sinteza med seboj izključujoča procesa odvisna od ACC. To zavračajo raziskave rakavih celic, pri katerih se oba procesa vršita istočasno in sta enako pomemba za delovaje in ravoj celice.
Nove raziskave na področju rakavih obolenj pa so pomembne predvsem za zdravljenje bolezni.

===Rok Ferenc: Medsebojne fizične povezave encimov TCA cikla v Bacillus subtilis===

Večina proteinov živih celic deluje v kompleksih, ne posamično. Poleg stalnih proteinskih kompleksov znanstveniki po zaslugi naprednejših eksperimentalnih tehnik odkrivajo tudi medproteinske interakcije bolj prehodne narave, značilne predvsem za metabolične poti. V raziskavi se osredotočijo na formacijo metabolona (skupka proteinov) v citratnem ciklu Bacillus subtilis, ki je zelo pomemben modelni organizem in vir proizvodnje vitaminov in encimov za pralne praške. Ta bi pripomogel k organiziranosti metabolnih poti v sicer kaotični notranjosti prokariontskih celic brez organelov.
Dokazan je bil obstoj metabolona v ciklu trikarboksilnih kislin, v katerega se povezuje tudi nekaj encimov anabolizma, katerih substrati so intermediati TCA cikla (citratni cikel). V metabolonu obstaja jedro iz treh encimov: citrat sintetaze, malat dehidrogenaze in izocitrat dehidrogenaze. Interakcija med encimi glukoneogeneze, bolj natančno med malat dehidrogenazo in fosfoenol piruvat karboksikinazo je uravnavana s strani razlik v koncentracijah intermediatov glikolize in TCA cikla, torej za formacijo metabolona ni potreben noben zunanji signal, le povečana koncentracija ustreznih substratov.

===Sara Košenina: Zdravljenje hipoksije in z njo povezanega nastanka raka preko citratnega cikla===

Hipoksija je stanje, ko celice in tkiva ne dobijo dovolj kisika, zato pride do motenj v delovanju organa ali pa celo celotnega organizma. Ljudje smo za prilagoditev na hipoksijo razvili mehanizem, ki je reguliran preko heterodimernega proteinskega kompleksa HIF-1. Glavna podenota je HIF-1α, saj je občutljiva na kisik. Aktivnost HIF-1 je regulirana z različnimi mehanizmi, eni so odvisni od hipoksije, drugi pa so od nje neodvisni. Slednji so pomembni pri razvoju in napredovanju tomorjev. Eden od hipoksije neodvisnih regulatorjev je tudi piruvat, ki je začetni substrat cikla citronske kisline. V hipoksičnih pogojih pride do motenj v elektronskem transportu, zato je proizvodnja ROS (reaktivnega kisika) povečana. To je kompenzira z uravnavanjem piruvat dehidrogenaznega kompleksa (PDH) s piruvat dehidrogenazo kinazo (PDK1). Raziskave so pokazale, da etil piruvat poveča stabilnost HIF-1 s stimulacijo proizvodnje ROS v mitohondriju in blokira s pVHL regulirano razgradnjo HIF-1. Indukcija HIF-1 z etil piruvatom je povezana s pospeševanjem citratnega cikla. Etil piruvat pospeši tako citratni cikel kot tudi proizvodnjo ROS v mitohondriju. Rezultati raziskav podpirajo obstoj regulatornega mehanizma za prilagoditev na hipoksijo, pri katerem PDK1 deaktivira PDH kompleks in inhibira cikel citronske kisline in na ta način zmanjša proizvodnjo ROS. Vse te ugotovitve bi lahko pripomogle k zdravljenju hipoksije in z njo povezanega razvoja raka. Potrebnih bo še veliko raziskav, preden se bo lahko etil piruvat uporabljalo v klinične namene.

===Tjaša Bensa: α-ketoglutarat dehidrogenazni kompleks in nevrodegenerativne bolezni===

α-ketoglutarat dehidrogenazni kompleks (KGDHC) je en izmed encimov v Krebsovem ciklu. V procesu oksidativne dekarboksilacije katalizira reakcijo α-ketoglutarat + NAD+ + CoA-SH -> NADH + H+ + CO2.
Sestavljen je iz 3 podenot: α -ketoglutarat dehidrogenaze (E1), dihidrolipoil sukcinil transferaze (E2) in dihidrolipoil dehidrogenaze (E3). E3 podenota oksidira NADH v NAD+.
Reaktivne kisikove spojine oziroma reaktivne kisikove zvrsti (ROS) so zelo reaktivni prosti radikali, snovi ali molekule s kisikom. Najpogostejši ROS sta O2- (superoksid) in H2O2 (vodikov peroksid). ROS lahko reagirajo s sestavinami celice, zelo radi pa napadejo tudi KGDHC. Oksidativni stres se pojavi v našem telesu zaradi povečane koncentracije ROS. Povzroča različne bolezni, naprimer Alzheimerjevo bolezen, Parkinsonovo bolezen, diabetes, revmatoidni artritis in nevrodegeneracijo. Po drugi strani pa tudi sam KGDHC proizvaja kisikove spojine in tako se ustvari začarn krog. Ker je vse regulirano, že ob najmanjši spremembi v metabolizmu pride do proizvodnje ROS in povzročitve oksidativnega stresa.

===Filip Mihalič: Pomen MicroRNA molekul v metabolizmu in metabolnih nepravilnostih===

MicroRNA molekule, so vrsta nekodirajočih RNA molekul dolgih približno 22 nukleotidov, in imajo celo vrsto zelo pomembnih funkcij za razvoj organizma, ter za ohranjanje metabolne homeostaze v le tem. Primarno delujejo kot zaviralec transkripcije mRNA, s tem da se nanjo vežejo, in s tem ribosomu ne pustijo prepisovanja v proteine. Prve miRNA molekule so odkrili okoli leta 1990 v glisti Caenorhabditis elegans vendar njihove vloge kot enega pomembnejših metabolnih regulatorjev niso prepoznali do začetka dvajsetega stoletja. Najdemo jih v skoraj vseh bioloških procesih povezanih z ekspresijo mRNA, od metabolizma lipidov in holesterola do inzulinske signalizacije. Njihov vpliv je velikokrat povezan z transkripcijskimi faktorji, s katerimi sodelujejo v težnji po ravno pravšnji ekspresiji genov. So dokaj pred kratkim odkrita skupina molekul, zato še niso dobro raziskane, in mehanizmi njihovega delovanja še niso povsem pojasnjeni. Najbolje sta raziskana prav vpliva na lipidno in inzulinsko homeostazo, na kateri se bom osredotočil v seminarju. Do sedanje raziskave miRNA pa so predlagale njihovo veliko uporabnost v farmaciji ter kasneje medicini, saj njihovo nepravilno delovanje privede do bolezni kot so huda predebelost, inzulinska neodzivnost (diabetes tipa 2), zamaščena jetra itd.

===Vita Vidmar: Vloga pentozafosfatne poti v metabolizmu rakavih celic===

Pentozafosfatna pot v celicah zagotavlja NADPH, ki je potreben za ohranjanje redukcijskega okolja v celici in za redukcijske biosinteze, ter riboza 5-fosfat, ki je prekurzor za sintezo nukleotidov in se po potrebi lahko reciklira nazaj v glukoza 6-fosftat. Ta v celicah poteka v majhnem obsegu, saj je skrbno regulirana, predvsem z negativnimi regulatorji.
V rakavo spremenjenih celicah zaradi poslabšane regulacije pentozafosfatna pot poteka v povečanem obsegu, kar jim omogoča pomembne prednosti. Ker proizvedejo velike količine NADPH in riboza 5-fosfata, jim to omogoča preživetje in hitrejše razmnoževanje, vpliva pa tudi na širjenje metastaz in angiogenezo (rast novih krvnih žil proti tumorju).
Poznavanje vloge pentozafosfatne poti v metabolizmu rakavih celic lahko pripomore k odkritju učinkovitejšega načina zdravljenja rakavih obolenj.

===Gregor Gunčar: Do what you want, but post your abstract here!===

Lorem ipsum dolor sit amet, consectetur adipiscing elit. Suspendisse sed justo congue, faucibus metus in, sodales tellus. Nulla nec erat in mauris condimentum rutrum. Maecenas vel scelerisque velit, at tincidunt massa. Praesent molestie euismod diam quis iaculis. Etiam non diam malesuada, pellentesque massa id, feugiat nulla. Integer eget euismod purus. Sed dignissim lectus quis fermentum ultrices. Nunc quis scelerisque ligula, nec laoreet justo. Morbi vitae felis in nibh commodo iaculis quis ac turpis. Nam feugiat a dui a faucibus.

Cras et elementum urna. Proin vel tortor sit amet urna facilisis ultrices lobortis sit amet neque. Sed luctus convallis urna, pulvinar ullamcorper sem adipiscing sit amet. Nullam fringilla ante est. Praesent viverra tortor vel felis convallis, non placerat enim condimentum. Suspendisse rutrum fermentum odio, in molestie risus consectetur ac. Sed interdum neque ultricies, fermentum tortor quis, consequat est. Sed vel faucibus felis.

===Ema Guštin: Warburgov efekt in možnosti za zdravljenje raka===

Otto Heinrich Warburg je bil začetnik kvantitativnih raziskav metabolizma rakavih celic, ukvarjal pa se je tudi s fotosintezo in s celičnim dihanjem. Okoli leta 1920 je s sodelavci pokazal, da v aerobnih pogojih tumorska tkiva v mlečno kislino oz. laktat pretvorijo približno desetkrat več glukoze kot celice normalnega tkiva. Ta pojav danes imenujemo Warburgov efekt. Vendar pa je za to povečanje aerobne glikolize v rakavih celicah pogosto napačno mišljeno, da se zgodi namesto mitohondrijskega dihanja, in je bilo napačno interpretirano kot dokaz za poškodbe dihanja, čeprav gre v resnici za poškodbe v regulaciji glikolize. Pravzaprav mnoge vrste rakov kažejo Warburgov efekt in pri tem ohranijo mitohondrijsko dihanje. Warburgova opažanja v povezavi s sedanjimi koncepti metabolizma raka tesno povezujejo s spremembami na mitohondrijski DNK, onkogeni in zaviralci tumorjev, torej bi njegovo hipotezo lahko izkoristili za zdravljenje raka.

===Maja Zupančič: Menin: ogrodni protein, ki nadzoruje eksoresijo genov in celično signalizacijo===

Z razrešitvijo kristalne strukture proteina menina, sta Huang in Murai ugotovila, da spada v skupino ogrodnih proteinov. Nahaja se v jedru, v manjših koncentracijah pa ga lahko najdemo tudi v citoplami, izražen pa je v vseh tkivih. Kristalno strukturo jedrnega proteina menina lahko opišemo z obliko zavite leve roke, kjer N-domena predstavlja β-lasnično zanko, zgornja domena palec in osrednja domena predstavlja dlan. Ko menin reagira z peptidom MLL1 ali transkripcijskim faktorjem JunD, se povežeta v globoki žep, ki ga oblikuje struktura menina. Menin reagira s številnimi proteini (JunD, MLL1, TGFβ, SUMO, β-katenin,…) in tako vpliva na espresijo genov in celično signalizacijo. Menin sodeluje tudi pri številnih signalnih poteh,, kot so signalna pot transformirajočega rastnega faktorja β, kostnega morfogenetskega proteina, kanonične poti Wnt in signalizacija jedrnega receptorja. Pri ljudeh je protein menin kodiran z genom MEN1. Če pride do mutacije tega gena, se pojavi dedna bolezen multipla endokrina neoplazija ali Wermerjev sindrom, za katerim vsako leto zboli 1 na 30 000 ljudi. Pri multipli endokrini neoplaziji pride do tvorbe številnih tumorjev v različnih endokrinih organih. Bolezen ni ozdravljiva, lahko pa zdravimo tumorje, ki nastanejo. Z zgodnjim odkritjem bolezni in primernim ter efektivnim zdravljenjem, se prognoza lahko izboljša.

===Vesna Radić: Vloga betatrofina pri zdravljenju diabetesa===

Uveljavljen način zdravljenja sladkorne bolezni tipa 2 je dnevni vnos inzulina v telo z injekcijami in do nedavnega je prevladovalo mnenje, da alternative temu ni. Nova študija o delovanju beta celic trebušne slinavke pod vplivom hormona betatrofina namiguje, da so temu šteti dnevi.
Na Harvard Stem Cell Institute so z uporabo peptida, ki se veže na inzulinske receptorje spodbudili odpornost na inzulin in tako identificirali hormon betatrofin. Je peptidni hormon, najden v jetrih in maščevju miši, pri človeku pa le v jetrih. Pri ljudeh se ga da izslediti z metodo western blottinga. Posredno naj bi zvišal stopnjo razmnoževanja beta celic pankreasa v procesu celične delitve.
Za ugotovitev, ali betatrofin res vpliva na stopnjo razmnoževanja beta celic, so uporabili injekcijo v veno repa, da bi prenesli izražanje betatrofina v jetra – eno od običajnih mest njegovega delovanja - povišana stopnja pomnoževanja je bila tako drastična, da so lahko zlahka prepoznali otočke in beta celice pri majhni povečavi
Pomembna lastnost zdravljenja s tem hormonom je ta, da je betatrofin zelo specifičen; ne vpliva na druga tkiva in tako bi prišlo do manj zapletov, saj bi telo proizvajalo lasten inzulin. Poleg tega prednost tudi ta, da je ta študija podlaga za razvoj klinično uporabnih celic z reprogramiranjem odraslih beta celic trebušne slinavke brez uporabe izvornih celic.

===Luka Kavčič: Vloga glikolitičnega regulatornega encima PKM2 v metabolizmu rakave celice===

Piruvat kinaza (PK) je encim, ki katalizira zadnjo stopnjo glikolize, pretvorbo fosfoenolpiruvata (PEP) v piruvat in s tem fosforilacijo ADP v ATP. Izocimska oblika M2 je pomembna v metabolizmu rakavih celic, saj zaradi manjše aktivnosti v primerjavi z M1 obliko omogoča manjši pretok skozi glikolizo ob enaki absorpciji glukoze iz krvi, kar vodi do akumulacije glikoliznih intermediatov. Ti so tako bolj dostopni biosinteznim potem v celici, kar ji omogoča hitro celično delitev ter razvoj tumorja. Prav tako je pomemben pri odzivu na oksidativni stres, saj z svojo oksidacijo posredno omogoča aktivacijo pentoza-fosfate poti, v kateri nastaja NADPH, kar predstavlja zadosten redukcijski potencial za vzpostavitev homeostaze.
Pod določenimi pogoji se lahko PKM2 translocira v jedro, kjer deluje kot transkripcijski regulator s svojo protein kinazno aktivnostjo ter fosforilira transkripcijske faktorje, kot so Stat3, histon 1 in histon 3. Ugotovljeno je bilo, da lahko fosforilacijo proteinov izvaja le v dimerni obliki, katera je najbolj zastopana oligomerna oblika PKM2 v jedru. Zaradi svoje prisotnosti v skoraj vseh rakavih celicah, je PKM2 atraktivna tarča zdravljenja. Zadnje raziskave kažejo na testiranje različnih aktivatorjev, ki bi z povečano aktivnostjo encima preprečile kopičenje surovin za izgradnjo ter s tem zmanjšale rast tumorja.

===Ana Krišelj: Signalna pot sfingozin-1-fosfata in njegova vloga v boleznih===

Sfingozin-1-fosfat (S1P) je signalna molekula, ključna za regulacijo mnogih celičnih procesov, med katere spadajo tudi celična rast in diferenciacija, apoptoza, migracija celic in mitoza. Nastane s fosforilacijo sfingozina, proces pa je reguliran preko sfingozin kinaze (SK), ki v celicah nastopa v dveh izooblikah – SK1 in SK2.
S1P lahko deluje znotraj ali zunajcelično - lahko se veže na proteine v celicah (HDAC1/2, TRAF2..) ali na membranske receptorje S1PR1-5, ki spadajo v družino z G-proteini sklopljenih receptorjev. Zaradi kompleksne regulacije je S1P možen povzročitelj bolezni, ki se kot le-te izrazijo zaradi napak v mehanizmu delovanja same signalne poti, bodisi zaradi SK ali S1PR receptorjev. Napake se izrazijo kot vrsta kardiovaskularnih (ateroskleroza), vnetnih (astma, multipla skleroza), rakavih in nekaterih drugih obolenjih (diabetes, ishemija).
Vloga S1P in razumevanje molekularnega mehanizma teh bolezni torej ponuja nova področja in možnost raziskovanja v smeri odkrivanja potencialnih zdravil.

===Katjuša Triplat:Signalizacija s člani TGF –ß pri žilni morfogenezi in boleznih===
TGF-β je vrsta citokina, ki uravnava proliferacijo, celično diferenciacijo in druge funkcije v večini celic. Transformirajoči rastni faktor – ß (TGF–ß) naddružina je velika skupina beljakovin, ki jo sestavlja 33 različnih članov, ki vključujejo: TGFß – proteine, kostne morfogenetične proteine (BMP), rastne diferenciacijske faktorje (GDF), aktivine, inhibine, nodalne in »lefty« proteine ter Müllerjevo inhibitorno substanco (MIS). Člani družine transformirajočih rastnih faktorjev – ß (TGF–ß) igrajo pomembno vlogo pri razvoju zarodka, homeostazi odraslega in pri različnih boleznih. Ti citokini izzovejo svoje učinke na celice preko specifičnih serin/treonin kinaznih receptorjev tipa I in II ter intracelularnih transkripcijskih foktorjev Smad in s tem povzročijo signalno kaskado. Prenos signalov lahko poteka po Smad – odvisni ali Smad – neodvisni poti. TGF-ß signalna pot kontrolira celično proliferacijo, prepoznavanje, diferenciacijo, apoptozo in specifikacijo razvojne usode med embriogenezo in v zrelih tkivih. Inaktivacija te poti tako prispeva k tumorogenezi. Genetske študije na miših in ljudeh so pokazale pomembno vlogo TGF-β signalnih elementov v žilni morfogenezi in njeni disfunkciji. Izguba TGF-β signalnih elementov privede, zaradi nepravilnega nastanka kapilar ali okvarjene diferenciacije in pridobivanja gladko mišičnih celic, do nenormalnega nastanka primitivnega žilnega pleteža in zmanjšane integritete žilnih sten.

===Urša Kapš: Uravnavanje maščob: lipidi in človeške bolezni===

Za življenje je pomembno uravnavanje metabolične energije. V mnogih organizmih so celične lipidne kapljice in trigliceridi največji shranjevalci energije. Preobilica zalog ali pomanjkanje tvorjenja in obnavljanja maščob vodijo do številnih človeških bolezni, kot so lipodistrofija (genetske okvare v lipidnih zalogah), rakava kaheksija (kompleksen metabolični sindrom, povezan z nenadno izgubo zaloge lipidov), prekomerna debelost, steatoza jeter (bolezen zamaščenih jeter) in kardiovaskularne bolezni (bolezni srca in ožilja, najpogostejša je ateroskleroza = poapnenje žil). Nevaren je tudi nastanek penastih celic (makrofagi, ki imajo nakopičeno veliko količino holesterolnih estrov), ki zamašijo žilo. Maščoba je shranjena v lipidnih kapljicah, vendar je, kljub njihovi pomembnosti za celico in fiziologijo organizma, relativno malo znano o njihovih mnogih osnovnih procesih v različnih tkivih. Pomembni proteini, ki regulirajo zalogo lipidov in številni geni, ki kodirajo proteine lipidnih kapljic, ki so povezani z metaboličnimi boleznimi, so že identificirani. Na primer BSCL2 so geni, ki kodirajo transmembranski protein seipin, katerega funkcija je izražena v lipidni biosintetski poti. V zadnjem času se je zanimanje in število raziskav na področju zalog lipidov, raznih novih pristopov za zdravljenje bolezni, povezanih s premalo ali preveliko zalogo maščob, drastično povečalo, kar nas bo pripeljalo do novih dognanj in boljšega znanja na tem področju znanosti.

===Tim Božič: Motorični protein z regulacijo serotoninskega receptorja vpliva na razpoloženje ===

Hormon serotonin nastane iz triptofana s pomočjo triptofan hidroksilaze in aktivira serotoninske receptorje, ki se nahajajo v živčnih celicah. Aktivirani, regulirajo številne druge nevrotransmitorje in hormone, ki vplivajo na naše razpoloženje. Serotoninski receptorji pravilno funkcionirajo le, kadar so izraženi na površini živčnih celic. Površinsko izražanje teh je pogojeno z motoričnimi proteini, kinezini, ki so sestavljeni iz glave, pecljatega dela in repa. Ti najprej vežejo vezikel serotoninskih receptorjev na svojo FHA domeno, nato pa se s tristopenjskim procesom, pri katerem je potrebna energija (v obliki ATP), pomikajo po mikrotubulih do plazmaleme. V primeru okvare kinezinskih transporterjev se vezikli s serotoninskimi receptorji akumulirajo v citoplazmi. Posledica je abnormalno vedenje osebkov, ki kaže na simptome tesnobe. Simptome je mogoče zdraviti z antidepresivi SSRI, kot so Prozac, Celexa, Luvox, Zoloft, Paxil, Lexapro in drugi. Ti z vezanjem na serotoninski transporter povečajo raven serotonina izven celice. Kljub temu mehanizem delovanja SSRI antidepresivov v celoti še ni poznan.

===Domen Klofutar: Lipoliza - reguliran multiencimski kompleks, ki vpliva na katabolizem zalog maščobe===

Maščobne kisline, ki v našem telesu služijo kot zaloga energije, se s pomočjo različnih encimov in transporterjev prenesejo do maščobnega tkiva, kjer se shranijo v obliki maščobnih kapljic. Maščobne kapljice so strukture obdane z enojnim lipidnim slojem, v katerih so shranjeni trigliceridi. Ko telo prejme signal, da primanjkuje energije, se njihove zaloge začnejo sproščati iz maščobnih kapljic v kri, nato pa se s serumskim albuminom prenesejo do oksidativnih tkiv, kjer se z β-oksidacijo pretvorijo v acetil CoA. Proces razgradnje trigliceridov in njihovo skladiščenje je močno reguliran proces. Njihovo razgradnjo katalizirajo različni encimi. Najpomembnejši so maščobna triglicerid lipaza, od hormonov odvisna lipaza in monoglicerid lipaza. Maščobna triglicerid lipaza ATGL je regulirana z aktivatorjem CGI-58 in inhibitorjem G0S2, aktivnost od hormonov odvisne lipaze HSL pa se uravnava s fosforilacijo. Monoglicerid lipaza MGL ima vlogo v katabolizmu trigliceridov in tudi pri endokanabinoidni signalizaciji. Če v telesu nastopi kakršnakoli okvara tega regulatornega sistema lipaz, nastopijo različne bolezni. Te bolezni so posledica kopičenja trigliceridov v celicah oziroma pomanjkanja prostih maščobnih kislin, ki se lahko prenesejo v kri.

===Aneja Tahirovič: Omega-3 maščobne kisline in njihov vpliv na človeško telo===

Esencialne maščobne kisline so tiste, ki so za telo pomembne, vendar jih ni sposobno sintetizirati samo. Mednje spadajo tudi omega-3 maščobne kisline in omega-6 maščobne kisline.
Omega-3 maščobne kisline se nahajajo v morskih živalih, školjkah in nekaterih suho-zemnih rastlinah.
Omega-6 maščobne kisline pa najdemo v oljih in hrani živalskega izvora. Pomembno je uravnavanje ravnotežja, obeh maščobnih kislin, v telesu.
V primeru presežka omega-6 maščobnih kislin, pride do sinteze eikozanoidov, ki na telo delujejo provnetno. V tem primeru pride do večjega tveganja za razvoj bolezni, kot so rak, kardiovaskularne in avtoimunske bolezni.
Ob presežku omega-3 maščobnih kislin pa pride do sinteze eikozanoidov, ki na telo delujejo protivnetno in zavirajo bolezenske procese. Ugotovljeno je bilo, da omega-3 maščobne kisline dobro delujejo kot preventiva za nastanek srčno-žilnih bolezni, rakavih obolenj, za preprečitev razvoja Alzheimerjeve bolezni ter drugih nevrodegenerativnih bolezni, zmanjšajo možnost za razvoj depresije ter povečajo absorbcijo kalcija in s tem zmanjšajo možnosti za nastanek revmatoidnega artritisa in parodontitisa.
Kolikšna količina omega-3 maščobnih kislin je za telo zdrava, je odvisno od starosti. Novorojenčki in otroci do prvega leta starosti, maščobnih kislin omega-3 še ne smejo uživati, zato je pomembno, da jih toliko več, uživajo matere že med nosečnostjo.

===Jure Fabjan: Oksidativni in nitrozativni stres v nevrotoksičnosti amonijaka===

Hiperamoniemija je stanje povišane koncentracije amonijaka v krvi. Korelacija med koncentracijo amonijaka v krvi in stopnjo HA ni dobro raziskana, saj so simptomi pri obolelih z isto koncentracijo amonijaka različni. Zdravi se jo z različnimi zdravili, odvisno od njenega vzroka. Zdravljenje deluje na principu omejevanja vnosa amonijaka ter povečanja njegovega izločanja. HA lahko nato preide v možganski edem ali hepatično encefalopatijo. Hepatična encefalopatija se zdravi z antibiotiki, intermediati cikla uree in drugimi substancami, vendar so zdravila bodisi dokaj neučinkovita, ali pa imajo stranske učinke. Pri bolnikih, katerih hepatična encefalopatija je posledica akutne odpovedi jeter, je že v začetnih stopnjah potrebna presaditev jeter.
Kakšne so poti na molekulski ravni, ki vodijo do takih posledic, je še vedno v veliki meri misterij, vendar je sedaj vsaj znano, da povišana koncentracija amonijaka povzroči tvorbo reaktivnih kisikovih in dušikovih zvrsti, te pa v veliki meri povzročajo simptome, ki so enaki simptomom hepatične encefalopatije.

===Maruša Prolič-Kalinšek: Vloga PPAR pri razgradnji maščobnih kislin===

Receptorji aktivirani s proliferatorjem periksosomov ( PPARs ) so del družine z ligandom aktiviranimi transkripcijskimi faktorji. Prvotno so jih identifirali kot receptorje, ki inducirajo proliferacijo peroksisomov v celici, od tod tudi ime. PPARs imajo pomembno vlogo pri regulaciji celične diferenciacije, razvoja, metabolizma ( maščob, ogljikovih hidratov in proteinov ), karcinogeneze in vnetja. Njihovi naravno nastopajoi ligandi so maščobne kislini in razni derivati maščobnih kislin, obstaja pa tudi že več sintetičnih ligandov. Poznamo PPAR alfa, PPAR beta in PPAR gama in imajo enak osnoven mehanizem delovanja, so aktivirani z maščobnimi kislinami in njihovimi derivati ter si delijo veliko tarčnih genov. V jedru reagirajo tako, da tvorijo heterodimerje z drugimi jedrnimi receptorji RXR ( retinoid X receptor ) in se nato vežejo na regulatorne regije DNA v bližini genov, katerim potem spremenijo hitrost transkripicije ( povečajo ali zmanjšajo ). Podtipi PPARs se razlikujejo v in vivo funkcijah. PPAR gama je največ v adipocitnem tkivu in jetrih. Ima vlogo pri vklopitvi genov potrebnih za diferenciacijo adipocitov in genov za proteine, ki so potrebni pri sintezi in shrambi lipidov. PPAR alfa je izražen v jetrih, ledvicah, srcu, skeletni mišici in BAT. V jetrih PPAR vklopi gene za vnos in beta oksidacijo maščobnih kislin ter formacijo ketonskih telesc med stradanjem. PPAR beta se odziva na spremembe v prehranskih lipidih. PPAR beta je aktiven v jetrih in mišicah in stimulira veliko genov, ki kodirajo proteine za beta oksidacijo. Povzroči kurjenje maščob, izgubo teže in termogenezo.

BIO2 Seminar 2013

2013-11-10T14:13:34Z

Maruša Prolič-Kalinšek: /* Seznam seminarjev */

= Biokemijski seminar =
Seminarje vodi doc. dr. Gregor Gunčar in so na urniku vsak petek od 13:00 do 16:00.

Ocena seminarjev predstavlja 30% končne ocene in vsebuje vse točke, ki jih študent/ka lahko zbere pri seminarju in ostalih dejavnostih, ki niso del pisnega izpita.

== Seznam seminarjev ==
{| {{table}}
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Ime Priimek'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Tema*'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Naslov seminarja'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 1'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 2'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 3'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Datum oddaje'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Datum recenzije'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Datum predstavitve'''
|-
| Triplat Katjuša||12||[http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0962892410001212 Signalizacija s člani TGF – β pri žilni morfogenezi in boleznih]||Ipšek Rok||Štukelj Sabina||Krmpotić Luka||04.11.2013||06.11.2013||08.11.2013
|-
| Krišelj Ana||12||[http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0962892411001772 Signalna pot sfingozin-1-fosfata in njegova vloga v boleznih] ||Tavčar Petra||Zgonc Alja||Petrič Boštjan||04.11.2013||06.11.2013||08.11.2013
|-
| Zupančič Maja||12||[http://www.cell.com/trends/biochemical-sciences//retrieve/pii/S0968000413000911?showall%3Dtrue&_returnURL=http%3A%2F%2Flinkinghub.elsevier.com%2Fretrieve%2Fpii%2FS0968000413000911%3Fshowall%3Dtrue Menin: ogrodni protein, ki nadzoruje ekspresijo genov in celično signalizacijo]||Guštin Ema||Jakše Helena||Bolta Simon||04.11.2013||06.11.2013||08.11.2013
|-
| Božič Tim||12||[http://www.cell.com/cell-reports/fulltext/S2211-1247%2813%2900021-1 Motorični protein z regulacijo serotoninskega receptorja vpliva na razpoloženje]||Oblak Zvonar Eva||Strašek Nika||Juteršek Mojca||04.11.2013||06.11.2013||08.11.2013
|-
| Vidmar Vita||14||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2013#Vita_Vidmar:_Vloga_pentozafosfatne_poti_v_metabolizmu_rakavih_celic Vloga pentozafosfatne poti v metabolizmu rakavih celic]||Rupert Jakob||Nagode Toni||Vidak Eva||04.11.2013||06.11.2013||08.11.2013
|-
| Radić Vesna||14||[http://www.nature.com/news/liver-hormone-offers-hope-for-diabetes-treatment-1.12878 Vloga betatrofina pri zdravljenju diabetesa]||Triplat Katjuša||Ipšek Rok||Štukelj Sabina||04.11.2013||08.11.2013||15.11.2013
|-
| Guštin Ema||14||[http://www.nature.com/nrc/journal/v11/n5/full/nrc3038.html Warburgov efekt in možnosti za zdravljenje raka]||Krišelj Ana||Tavčar Petra||Zgonc Alja||04.11.2013||08.11.2013||15.11.2013
|-
| Kapš Urša||15||[http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3721468/ Uravnavanje maščob: lipidi in človeške bolezni]||Zupančič Maja||Guštin Ema||Jakše Helena||04.11.2013||08.11.2013||15.11.2013
|-
| Kavčič Luka||15||[http://www.cell.com/trends/endocrinology-metabolism//retrieve/pii/S1043276012001166?_returnURL=http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S1043276012001166?showall=true Vloga glikolitičnega regulatornega encima PKM2 v metabolizmu rakave celice]||Božič Tim||Oblak Zvonar Eva||Strašek Nika||04.11.2013||08.11.2013||15.11.2013
|-
| Mihalič Filip||15||[http://www.nature.com/nrm/journal/v13/n4/full/nrm3313.html Pomen microRNA molekul v metabolizmu in metabolnih nepravilnostih]||Vidmar Vita||Rupert Jakob||Nagode Toni||04.11.2013||08.11.2013||15.11.2013
|-
| Košenina Sara||16||[http://www.sciencedirect.com.nukweb.nuk.uni-lj.si/science/article/pii/S0304383510001436? Zdravljenje hipoksije in z njo povezanega nastanka raka preko citratnega cikla]||Radić Vesna||Triplat Katjuša||Ipšek Rok||08.11.2013||15.11.2013||22.11.2013
|-
| Bensa Tjaša||16||[http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0925443909001926 α-ketoglutarat dehidrogenazni kompleks in nevrodegenerativne bolezni]||Horvat Marjeta||Krišelj Ana||Tavčar Petra||08.11.2013||15.11.2013||22.11.2013
|-
| Ferenc Rok||16||[http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1096717610000868 Medsebojne fizične povezave encimov TCA cikla v Bacillus subtilis]||Kapš Urša||Zupančič Maja||Guštin Ema||08.11.2013||15.11.2013||22.11.2013
|-
| Buh Tajda||16||Moj izbrani naslov||Kavčič Luka||Božič Tim||Oblak Zvonar Eva||08.11.2013||15.11.2013||22.11.2013
|-
| Jazbec Vid||17||[http://www.nature.com/nrc/journal/v13/n4/full/nrc3483.html Vpliv maščobnih kislin na rakave celice]||Mihalič Filip||Vidmar Vita||Rupert Jakob||08.11.2013||15.11.2013||22.11.2013
|-
| Tahirović Aneja||17||[http://www.nature.com/news/fish-oil-supplement-research-remains-murky-1.11484 Omega - 3 maščobne kisline in njihov vpliv na človeško telo]||Košenina Sara||Radić Vesna||Triplat Katjuša||15.11.2013||22.11.2013||29.11.2013
|-
| Klofutar Domen||17||[http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0163782710000524 Lipoliza - reguliran multiencimski kompleks, ki vpliva na katabolizem zalog maščobe]||Bensa Tjaša||Horvat Marjeta||Krišelj Ana||15.11.2013||22.11.2013||29.11.2013
|-
| Prolič - Kalinšek Maruša||17||[http://www.nature.com/cr/journal/v20/n2/abs/cr201013a.html Vloga PPAR pri razgradnji maščobnih kislin]||Ferenc Rok||Kapš Urša||Zupančič Maja||15.11.2013||22.11.2013||29.11.2013
|-
| Fabjan Jure||18||[http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0197018612003506 Oksidativni in nitrozativni stres v nevrotoksičnosti amoniaka]||Buh Tajda||Kavčič Luka||Božič Tim||15.11.2013||22.11.2013||29.11.2013
|-
| Rozman Jan||18||[http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1360138511001063 Proteini - Alternativni vir energije rastlin ob pomanjkanju ogljikovih hidratov]||Jazbec Vid||Mihalič Filip||Vidmar Vita||15.11.2013||22.11.2013||29.11.2013
|-
| Prezelj Peter||18||[http://ajcn.nutrition.org/content/83/2/500S.abstract?sid=e4e3425c-566d-4249-a604-0cfc846f1972 Aminokisline in regulacija proteinske sinteze v skeletnem mišičnem tkivu]||Tahirović Aneja||Košenina Sara||Radić Vesna||22.11.2013||29.11.2013||06.12.2013
|-
| Omahna Aljaž||18||Moj izbrani naslov||Klofutar Domen||Bensa Tjaša||Horvat Marjeta||22.11.2013||29.11.2013||06.12.2013
|-
| Taškar Jan||19||Moj izbrani naslov||Prolič - Kalinšek Maruša||Ferenc Rok||Kapš Urša||22.11.2013||29.11.2013||06.12.2013
|-
| Kašnik Urška||19||Moj izbrani naslov||Fabjan Jure||Buh Tajda||Kavčič Luka||22.11.2013||29.11.2013||06.12.2013
|-
| Kostanjevec Mojca||19||Moj izbrani naslov||Rozman Jan||Jazbec Vid||Mihalič Filip||22.11.2013||29.11.2013||06.12.2013
|-
| Krmpotić Luka||19||Moj izbrani naslov||Prezelj Peter||Tahirović Aneja||Košenina Sara||29.11.2013||06.12.2013||13.12.2013
|-
| Petrič Boštjan||19||Moj izbrani naslov||Omahna Aljaž||Klofutar Domen||Bensa Tjaša||29.11.2013||06.12.2013||13.12.2013
|-
| Bolta Simon||20||Moj izbrani naslov||Taškar Jan||Prolič - Kalinšek Maruša||Ferenc Rok||29.11.2013||06.12.2013||13.12.2013
|-
| Juteršek Mojca||20||Moj izbrani naslov||Kašnik Urška||Fabjan Jure||Buh Tajda||29.11.2013||06.12.2013||13.12.2013
|-
| Vidak Eva||20||Moj izbrani naslov||Kostanjevec Mojca||Rozman Jan||Jazbec Vid||29.11.2013||06.12.2013||13.12.2013
|-
| Štukelj Sabina||21||Moj izbrani naslov||Krmpotić Luka||Prezelj Peter||Tahirović Aneja||20.12.2013||24.12.2013||03.01.2014
|-
| Zgonc Alja||21||Moj izbrani naslov||Petrič Boštjan||Omahna Aljaž||Klofutar Domen||20.12.2013||24.12.2013||03.01.2014
|-
| Jakše Helena||21||Moj izbrani naslov||Bolta Simon||Taškar Jan||Prolič - Kalinšek Maruša||20.12.2013||24.12.2013||03.01.2014
|-
| Strašek Nika||22||[http://bloodjournal.hematologylibrary.org/content/120/23/4496.short Porfirija: napredek v diagnostiki in zdravljenju]||Juteršek Mojca||Kašnik Urška||Fabjan Jure||20.12.2013||24.12.2013||03.01.2014
|-
| Nagode Toni||22||Moj izbrani naslov||Vidak Eva||Kostanjevec Mojca||Rozman Jan||20.12.2013||24.12.2013||03.01.2014
|-
| Ipšek Rok||22||Moj izbrani naslov||Štukelj Sabina||Krmpotić Luka||Prezelj Peter||24.12.2013||03.01.2014||10.01.2014
|-
| Tavčar Petra||23||Moj izbrani naslov||Zgonc Alja||Petrič Boštjan||Omahna Aljaž||24.12.2013||03.01.2014||10.01.2014
|-
| Horvat Marjeta||23||[http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S009286741000718X Uravnavanje metabolizma železa pri sesalcih] ||Jakše Helena||Bolta Simon||Taškar Jan||24.12.2013||03.01.2014||10.01.2014
|-
| Oblak Zvonar Eva||23||Moj izbrani naslov||Strašek Nika||Juteršek Mojca||Kovačič Matic||24.12.2013||03.01.2014||10.01.2014
|-
| Rupert Jakob||23||Moj izbrani naslov||Nagode Toni||Vidak Eva||Kostanjevec Mojca||24.12.2013||03.01.2014||10.01.2014
|}

*številka v okencu za temo pomeni poglavje v Lehningerju (peta izdaja), v katerega naj izbrana tema spada

== Gradivo za predavanja ==
Gradivo za predavanja in seminarje najdete na http://bio.ijs.si/~zajec/bio2/
username: bio2
password: samozame

==Naloga==
'''Vaša naloga za seminar je: '''
Samostojno pripraviti seminar o seminarski temi, ki vam je bila dodeljena. Za osnovo morate vzeti pregledni članek iz revije, ki ima faktor vpliva nad 5 (npr. [http://www.sciencedirect.com/science/journal/09680004/ TIBS]. Poiskati morate še vsaj tri znanstvene članke, ki se nanašajo na opisano temo in jih uporabiti kot podlago za seminarsko nalogo!

Za pripravo seminarja velja naslednje: 
* [[BIO2 Povzetki seminarjev 2013|Povzetek seminarja]] opišete na wikiju v približno 200 besedah - najkasneje do dne ko morate oddati seminar recenzentom.
* Povezavo do povzetka vnesete v tabelo seminarjev tekočega letnika.
* Seminar pripravite v obliki seminarske naloge na ~5-9 straneh A4 (pisava 12, enojni razmak, 2,5 cm robovi; važno je, da je obseg od 2700 do 3000 besed), vsebovati mora najmanj tri slike. Slika mora imeti legendo in v besedilu mora biti na ustreznem mestu sklic na sliko. 
* Seminar oddajte do datuma oddaje, ki je naveden v tabeli v elektronski obliki z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/ tega obrazca].
* vsi seminarji so v elektronski obliki dostopni [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/bioseminar/ tukaj].
* Recenzenti do dneva določenega v tabeli določijo popravke (v elektronski obliki) in podajo oceno pisnega dela. Popravljen seminar oddajte z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/ tega obrazca].
* Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Za predstavitev je na voljo 25-30 minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni.
* Predstavitvi sledi razprava. Recenzenti podajo oceno predstavitve in postavijo najmanj dve vprašanji.
* Na dan predstavitve morate docentu še pred predstavitvijo oddati končno (popravljeno) in natisnjeno verzijo seminarja v enem izvodu.
* Seminarska naloga in povzetek morajo biti v slovenskem jeziku!

==Imena datotek==
Prosim vas, da vse datoteke, ki mi jih pošiljate poimenujete po naslednjem receptu:
* 312_BIO_Priimek_Ime.doc(x) za seminar, npr. 312_BIO_Guncar_Gregor.docx
* 312_BIO_Priimek_ime_final.doc(x) za končno verzijo seminarja
* 312_BIO_Priimek_Ime_rec_Priimek2.doc(x) za recenzijo, kjer je Priimek2 priimek recenzenta, npr. 312_BIO_Guncar_Gregor_rec_Scott.docx (če se pišete Scott in odajate recenzijo za seminar, ki ga je napisal Gunčar)
* 312_BIO_Priimek_Ime.ppt(x) za prezentacijo, npr 312_BIO_Guncar_Gregor.pptx

==Ocenjevanje seminarjev==
Recenzenti ocenijo seminar tako, da izpolnijo [https://docs.google.com/spreadsheet/viewform?formkey=dHc2d2pCbDBWNzl5VHZaQUk1SG1HeVE6MA recenzentsko poročilo] na spletu. Recenzentsko poročilo morate oddati najkasneje do 21:00, en dan pred predstavitvijo seminarja.

== Mnenje o predstavitvi ==
Vsak posameznik '''mora''' oceniti seminar, tako da odda svoje [https://docs.google.com/spreadsheet/viewform?formkey=dDZZOVVFNkwxb0JMeUFaMGltOVQ4aHc6MA mnenje] najkasneje v sedmih dneh po predstavitvi. Kdor na seminarju ni bil prisoten, mnenja '''ne sme''' oddati.

==Urejanje spletnih strani na wikiju==
Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''

==Citiranje virov==
Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se v seminarju držite ene same.
Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati.
Za citate v naravoslovju je najpogostejše citiranje po pravilniku ISO 690. [http://www.zveza-zotks.si/gzm/dokumenti/literatura.html Pravila], ki upoštevajo omenjeni standard, so pripravili pri ZTKS. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati. 
'''Citiranje knjig:''' 
Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica. 
Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN. 

Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005. 
Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4. 
Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.).

'''Citiranje člankov:''' 
Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani. 
Lartigue C. ''et al''. Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, letn. 317, str. 632-638.

Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole: 
Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani. 
Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.

Revija Science uporablja skrajšani zapis: 
C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007) 

V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne).

'''Citiranje spletnih virov:''' 
Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov 
strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life 
Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.

BIO1 Povzetki seminarjev

2013-03-12T19:06:44Z

Maruša Prolič-Kalinšek:

== Maruša Prolič-Kalinšek: Živčni strupi in butirilholinesteraza ==
Živčni strupi so organofosforjeve spojine, ki inhibirajo acetilholinesterazo, kar povzroči nalaganje nevrotransmitorja acetilholina v živčno sinapso in nevromišični stik. Povzročijo odpoved živčnega in respiratornega sistema. Ena izmed snovi, ki lahko nudi zaščito pred živčnimi strupi je butirilholinesteraza (BChE). To je globularen protein, ki se sintetizira v jetrih. BChE veže večino antiholinesteraz, zato ga lahko uporabimo za odstranjevanje organofosforjevih živčnih strupov. V zadnjih 10 letih je bilo razvitih več metod pridobivanja tega encima npr. iz mleka transgenih živali pridobljen BChE, z uporabo adenovirusa. V nedavni raziskavi so s kemično polisialilacijo modificirali rekombinanten BChE. Da bi izbrali najugodnejši ekspresijski vektor so zato uporabili tri. Kot najbolj učinkovit se je izkazal pBudCE/EF/BCHE. Transfekcija tega v CHO-K1 celice, je povzročila produkcijo do 3 mg/L BChE. Po optimizaciji ekspresijskih pogojev so dosegli proizvodnjo 35 mg/L rBChE. Ker je analiza pokazala da je bil encim večinoma v monomerni obliki, so dodali tetramerizacijski peptid. Nato so izvedli modifikacija z oksidirano polisialična kislino. S tem so pridobili encim, ki je imel dolg razpolovni čas, je obdržal večino svoje aktivnosti, je bil bolj stabilen in je miši obvaroval pred učinki žuvčnega strupa VR.

== Mojca Juteršek: Sekrecijski sistem tipa III pri Pseudomonas aeruginosa in vpliv metabolizma na njegovo izražanje ==
Pseudomonas aeruginosa je oportunistična Gram-negativna bakterija, ki veliko težav povzroča predvsem bolnikom s cistično fibrozo. Svojo virulentnost izraža preko sekrecijskega sistema tipa III, ki ji omogoča direkten prenos eksotoksinov v gostiteljsko celico. Ta mehanizem je dobro reguliran preko regulatornih molekul, že nekaj časa pa je znano, da na izražanje sekrecijskega sistema tipa III vplivata tudi metabolizem in omejena količina kisika v okolju. V nedavni raziskavi so ti dve dejstvi povezali in raziskali vpliv metabolizma na izražanje sekrecijskega sistema tipa III pri bakterijah, gojenih v okolju z omejeno količino kisika, kar je še posebno pomembno za bolnike s cistično fibrozo, saj so v njihovih pljučih ravno takšne razmere. Znanstvenikom je uspelo dokazati, da ima pomembno vlogo pri regulaciji izražanja sekrecijskega sistema tipa III v razmerah z omejeno količino kisika encim izocitrat-liaza, ki je pomben encim v metabolnih poteh teh bakterij. Hkrati so odkrili, da ima omenjen mehanizme vpliv tudi na količino biofilma, ki ga bakterije tvorijo, ta pa je pomemben obrambni sistem bakterij pred delovanjem antibiotikov. To odkritje tako obljublja nove možnosti v preprečevanju okužb s P. aeruginosa.

== Tjaša Bensa: Sulforafan kot potencialni kandidat za zdravljenje levkemije ==
Sulforafan spada med izotiocianate in ga najdemo v križnicah zelenjave, kot so brokoli, cvetača, ohrovt ... Znastveniki so odkrili, da sulforafan varuje pred rakom na požiralniku, želodcu, debelem črevesu, na prostati, dojkah, jajčnikih, pred rakom na materničnem vratu in tudi proti levkemiji.
Levkemija je krvni rak, za katerega je značilno nenadzorovano razraščanje rakavih belih krvničk v kostnem mozgu. Poznamo več vrst levkemije, pri otrocih pa se najpogosteje pojavlja akutna limfoblastna levkemija (ALL). Pri ALL so lahko celice pre-B ALL ali pa T-ALL. Zaenkrat še ne poznamo terapije, ki bi popolnoma ozdravila bolnike, saj imamo slabo razumevanje o diagnozi bolezni ALL.

Znastveniki na Baylor College of Medicine so naredili vrsto poskusov, da so dokazali pozitiven učinek sulforafana na levkemične celice. Sulforafan je sprožil apoptozo v celicah pre-B ALL (Nalm-6, REH, RS-4) in T-ALL celicah (Jurkat, RPMI, DND41, KOPTK1), v zdravih celicah pa ne. Ko so zdravim celicam dodali sulforafan, so bile te bolj odporne na njegovo citotoksičnost, kot pa levkemične celice.

Poskuse so naredili tudi na miših. Z bioluminiscenčnim slikanjem so dokazali, da je po treh tednih sulforafan zmanjšal število levkemičnih celic. Tudi pri miših s tumorjem je sulforafan po sedmih dnevih zdravljenja zmanjšal obseg tumorja.

Akutna limfoblastna levkemija predstavlja najpogostejšo vrsto levkemije pri otrocih, saj zanjo zboli kar 80 % otrok z levkemijo. Če bi sulforafan postal nova terapija za zdravljenje levkemije, bi to tako pomenil velik preobrat v zdravstvu in medicini.

== Petra Tavčar: Zdravljenje Huntingtonove bolezni s proteini s cinkovimi prsti ==
Huntingtonova bolezen je monogenska dedna bolezen, ki se razvije zaradi prekomernega ponavljanja zaporedja nukleotidov CAG na genu, ki nosi zapis za protein huntingtin. Pri obolelih se zaporedje ponovi od 36 do 121-krat (normalno: 10 do 29-krat). Protein huntingtin je odgovoren za zdrav embrionalni razvoj ter razvijanje in ohranjanje nevronov pri odraslih ljudeh. Pri bolnikih nastaja protein z daljšo verigo poliglutamina, ki se z ostalimi mutiranimi huntingtin proteini združuje v proteinske agregate. Le-ti tvorijo inkluzijska telesca, ki se nalagajo na aksonih, dendritih in v jedrih nekaterih možganskih živčnih celic ter motijo normalno delovanje celic. To privede do sprememb v obnašanju, demence in horee (sunkovitih nehotenih gibov).

Trenutno še ne poznamo načina, s katerim bi zdravili ali preprečevali to bolezen. V razvoju pa je zdravljenje s proteini s cinkovimi prsti. To so regulatorni proteini, ki vsebujejo motiv cinkovega prsta. Prepoznavajo in se vežejo na določene odseke DNA in s tem regulirajo izražanje gena, na katerega se vežejo. Ker je oblikovanje proteinov s cinkovimi prsti enostavno, lahko izdelamo različne proteine, ki se vežejo na različne odseke DNA. Prav tako lahko nanje pripnemo poljubne regulacijske molekule ali vezavne elemente, kar omogoča specifično vezavo na želeni mutiran gen in preprečuje represijo nemutiranih genov.

Oblikovali so protein z enajstimi cinkovimi prsti, ki prepozna in se veže na poli 5´- GC(A/T) -3´. Sposoben je prepoznati poli-CAG ter poli-GCA, poli-GCT DNA del. Z raziskavo so dokazali, da represorji s cinkovimi prsti lahko povzročijo redukcijo na nivoju RNA in na nivoju proteinov v možganih miši, kar vodi do izboljšanja v fenotipu obolelih miši. Kombiniranje represorjev s cinkovimi prsti in promotorjev CAG in WPRE lahko omogoči selektivno represijo mutiranega gena, zmanjšano količino škodljivih proteinskih agregatov in blažitev simptomov Huntingtonove bolezni.

== Rok Ferenc: Nov način zdravljenja Androgenic alopecia ==
Androgenic alopecia oz. bolj splošno "plešavost" je bolezen, sicer značilna za moške, vendar prizadene tudi ženske in najstnike. Čeprav je izjemno razširjenja in bi uspešno zdravilo nedvomno ponovilo globalni uspeh in razvpitost modre tabletke, saj ima plešavost velike psihološke učinke na prizadetega, so do sedaj znana zdravila bodisi neučinkovita, bodisi zaradi stranskih učinkov nezaželena. Nedavno odkritje kapljic za oči, ki pospešijo rast trepalnic, je znanstvenike pripeljalo do novih raziskav, ki predvsem temeljijo na novo odkriti snovi - bimatoprost, ki bi hipotetično prek receptorjev lokalno lahko vplival na lasne folikle in pospešeno rast las. Slednje jim je uspelo potrditi. Najprej so izločili zunanji vpliv na rast dlak z gojenjem foliklov v kulturi, s poskusi na miših so teorijo prenesli na žive organizme, z opazovanjem delovanja antagonista za bimatoprost pa so dokončno potrdili obstoj receptorjev. Receptorje so z gelsko elektroforezo dokazali tudi v človeku ter jih s posebnimi tehnikami locirali v dermalni pupili, ki naprej stimulacijsko vpliva na celice, ki proizvajajo pigment in keratin. Svet je tako korak bliže k zdravljenju plešavosti in hkrati dvig ogromnega bremena z ramen marsikaterega moškega... pa tudi ženske.

== Tomaž Rozmarič: Inženiring hiper katalitičnega encima ==
Dan danes je uporaba encimov v industriji zelo visoka. Bakterije gensko modificirajo in uporabljajo za sintezo najrazličnejših snovi.Zadnje
čase so bakterije postale zanimive za proizvodnjo energije, saj so sposobne sintetizirati vodik, z njimi porizvajajo bio-goriva in celo
elektriko. Te reakcije so še prepočasne, da bi bile uporabne v masovnih proizvodnjah in bi lahko bile konkurenca že obstoječim virom energije
kot so fosilna goriva(nafta) in jedrska energija. Zato so se znanstveniki začeli spraševati, kako bi lahko povečali hitrost reakcij in prav s
tem so se ukvarjali v članku, katerega sem prebral. Idejo jim je dal mehanizem reakcije v očesu. Ko svetloba pade na rodopsin povzroči vrsto
kemijskih reakcij, med drugim tudi konformacijske. To konformacijo zazna določen protein, ki jo pretvori v električni signal in pošlje do
možganov. Na podlagi tega so se odločili, da bi na nek encim pripeli neko molekulo, katera bi regulirala konformacijo encima, ko bi
to oni hoteli. To so potem naredili s pripetjem azobenzenskega mostu na encim(azobenzen pod določeno valovno dolžino spremeni konformacijo iz
cis v trans in obratno) in ugotovili, da se je hitrost reakcije znatno povečala, kar bi lahko bil velik prelom za biogoriva in druge encimsko
odvisnie reakcije.

== Ana Cirnski: TAL efektorji - proteini, ki urejajo gene ==
TAL (transcription activator – like) efektorji so regulatorni proteini, ki vplivajo na delovanje RNA polimeraze pri prepisovanju DNA. Z vezavnimi domenami se vežejo na specifična zaporedja baz na dvojni vijačnici in tako uravnavajo hitrost sinteze proteinov. Najbolj znani regulatorni proteini so motiv cinkovega prsta, motiv levcinske zadrge in motiv vijačnica – obrat – vijačnica.

TAL efektorje so odkrili v bakteriji vrste Xanthomonas, ki jih je uporabljala za reprogramiranje gostiteljskih celic, tako da so te sintetizirale proteine, ki so ustrezali bakteriji.

Domena TAL efektorja, ki se veže na DNA vsebuje 1-35 TAL ponovitev. Vsaka ponovitev je specifična za en bazni par na DNA in vsebuje 33-35 aminokislin (zadnja je okrnjena na 20 aminokislin), ki so vedno na istem mestu. Izjema sta mesti 12 in 13, znani tudi kot RVD mesti (repeat variable diresidues), ki določata specifičnost med efektorjem in DNA verigo.

TAL efektorji se med seboj ločijo po aminokislinskem zaporedju in številu njihovih ponovitev. Od teh lastnosti je odvisna specifičnost efektorja.
Za prepoznavo specifičnih mest na DNA sta odgovorni RVD mesti, ki določata, kam se bo efektor vezal. Obstaja tudi posebna koda po kateri se en par aminokislin veže na določen nukleotid. TAL ponovitve nimajo medsebojnega vpliva zato jih je lažje sestavljati in tako spremeniti efektor.
Uporabljajo se lahko kot umetni restrikcijski encimi (TALEN) za dvoverižne prekinitve DNA (DSB – [double–strand breaks]), kar povzroči v celici popravljalne mehanizme in vodi do sprememb v genskem zapisu. Lahko pa tudi kot transkripcijski faktor (dTALE) za vklapljanje in izklapljanje genov.

Čeprav je o TAL efektorjih še veliko neznanega, kažejo možnosti za široko uporabo na področju biotehnologije in genetike za izboljševanje lastnosti živil in zdravljenje nekaterih bolezni (HIV).

== Griša Prinčič: DNK nanotehnologija ==
Nanotehnologija je ustvarjanje in inženiring funkcionalnih sistemov na atomskem in molekularnem nivoju. DNK nanotehnologija je veja nanotehnologije, ki izkorišča strukturne in kemijske lastnosti DNK molekule ter iz nje sestavlja strukture, ki ne nosijo informacijskega zapisa in so v velikosti do nekaj 100 nanometrov. Najpomembnejši del pri sintezi DNK makromolekul je optimizirano zaporedje nukleinskih kislin. Sekundarno strukturo lahko tvori več različnih zaporedij baz, vendar bo velika večina teh zaporedij imela tudi negativne medsebojne interakcije, kar bi lahko privedlo do spremembe v obliki sekundarne strukture. DNK molekula ima sposobnost samosestavljanja (self-assembly). Pod določenimi pogoji lahko enotno daljšo verigo DNK pripravimo do zvijanja (folding) oz. tvorbe določene (želene) strukture.

V seminarski nalogi se bom osredotočil predvsem na razvoj tako imenovanih nanorobotov, ki služijo kot specializiran dostavni sistem signalnih molekul do celic v človeškem telesu. Ob aktivaciji receptorja se kapsula odpre in na mesto dostavi signalne ali druge molekule.

Pripravljeni so bili nanoroboti v obliki heksagonalnega »soda«, ki so sposobni prepoznati okvarjene ali rakaste celice s pomočjo aptamernega receptorja, ki služi tudi kot »ključavnični mehanizem«. Učinkovitost prepoznavanja celic in »ključavničnega mehanizma« je bila preizkušena na šestih vrstah rakastih celic. Celic Burkitt-ovega limfoma nanoroboti niso prepoznali (se niso aktivirali), pri ostalih petih vzorcih je bila aktivacija potrjena.

== Bojana Lazović: Vloga prionov pri preživetju divjih kvasovk ==
Kvasovke imajo pomembno vlogo pri odkrivanju in spoznavanju lastnosti prionov. Raziskave na njih lahko močno pomagajo tudi pri razumevanju prionskih bolezni, ki se pojavljajo pri ljudeh.
Znano je, da je velika posebnost prionov ta, da se lahko razmnožujejo brez DNK zapisa. Znanstveniki so pri raziskavah na laboratorijskih kulturah kvasovk prišli do pomembnih ugotovitev, glede vloge prionov pri dedovanju v kvasovkah. Razne konformacije proteinov v teh celicah imajo pomembno vlogo pri epigenetskem dedovanju, to je dedovanju, ki ni odvisno od zapisa na DNK verigi. S svojim delovanjem ustvarjajo dedne fenotipske lastnosti, njihova raznolikost pa spodbuja preživetje v spreminjajočih se okoljih in vpliva na razvoj novih lastnosti. Toda te lastnosti so potrdili le v laboratorijskih kulturah. Zato se je porajalo vprašanje, če enako velja tudi v naravi oz. za »divje« vrste kvasovk ali so ugotovljene značilnosti le umetno vzpodbujene v laboratoriju. Iz tega razloga so biokemično testirali okoli 700 različnih sevov vrste kvasovk Saccharomyce, da bi ugotovili če imajo prisotne prione. Rezultati so potrdili prejšnje raziskave. Tako so potrdili tezo, da prioni v splošnem urejajo nekatere dedne lastnosti v naravi, na način ki korenito poveča sposobnost prilagajanja.

== Vesna Radić: Odziv imunskega sistema z IFN-λ ==
Imunost je sposobnost obrambe telesa pred tujimi oz. škodljivimi snovmi, ki jih imenujemo tudi antigeni. Ko se ti pojavijo v telesu, jih imunski sistem prepozna in se odzove tako, da jih skuša uničiti na različne načine.
IFN lambda že dolgo veljajo kot pomembno orožje v imunskem sistemu v obrambi proti virusom, bakterija, parazitom in tudi tumorom. So namreč interferoni, saj so zmožni posegati v razmnoževanje in delovanje patogenov. Interferoni so celične beljakovine sposobne komuniciranja med celicami in tako na razne načine sprožitve delovanja imunskega sistema. IFN-λ so del razreda II citokinov. Lambda je podoben α, saj oba delujeta proti virusom. Razlika med njima je ta, da IFN-α lahko proizvedejo vse celice, ki imajo jedro, IFN-λ pa le nekaj določenih celic. Makrofagi proizvajajo IFN-λ za odziv na virusne in/ali bakterijske okužbe. Citokin IFN lambda se ustvari predvsem iz limfocita CD8+ T – spominske celice. T celice se aktivirajo ob prisotnosti že znanega antigena če ne pa živijo v neaktivnem stanju, ko se pa znova srečajo z že znanim antigenom, sprostijo IFN-λ.
Regulacija sproščanja IFN-λ še ni povsem znana; na podlagi novih študij izvemo, da se lahko sprostijo tudi brez aktivacije pri kontaktu z antigeni. Prav tako so odkrili tudi, da imajo ti interferoni pomembno vlogo pri zdravljenju hepatitisa B in C, astme in raka.
== Julija Mazej: Pretvorba HDL v LDL preko CETP molekule ==
Lipoproteini so raznovrstni delci, sestavljeni iz proteinskega in holesterolnega dela. Na podlagi deleža proteinov in holesterola v posameznem delcu ločimo 5 vrst lipoproteinov: hilomikrone, LDL,HDL,VLDL in IDS. V seminarju se bom omejila na dva, ki imata še posebej veliko vlogo pri transportu holesterola po krvni plazmi. HDL je lipoprotein visoke gostote in ima prevladujoč proteinski del. Znan je tudi kot dober holesterol, saj prenaša presežni holesterol iz celic do jeter, kjer poteče razgradnja. LDL pa je lipoprotein, ki prenaša holesterol v obratni smeri. V kolikor ima celica dovolj holesterola, se prične ta kopičiti na stenah žil, kar vodi do kardiovaskularnih bolezni. Pred kratkim so znanstveniki odkrili mehanizem pretvorbe dobrega holesterola v slab holesterol, preko majhne molekule CETP. Molekula deluje kot most med obema lipoproteinoma in prečrpa holesterol iz HDL v LDL. To odkritje daje nove perspektive na področju zdravljenja kardiovaskularnih bolezni, ki so glavni vzrok bolezni in prezgodnje smrti v Evropski Uniji in razvitem svetu. Učinkovito zdravilo, bi torej moralo inhibirati delovanje CETP molekule. Po rezultatih raziskave medicinske univerze na Dunaju, pa takšno zdravilo nebi pomagalo pacientom z ledvično odpovedjo. Pri nekaterih pacientih na dializi so namreč izsledili nefunkcionalen HDL. Spregovorila bom tudi o nastanku "<ra slabega" LDL, pri starejših in obolelih za diabetesom tipa 2.

== Ana Grom: Visokotehnološko odkrivanje rakavih celic dojk ==
Rak na dojkah je v današnjem svetu kar velik problem pri ženskah. Metode, ki se uporabljajo za zaznavo le tega, pa niso dovršene. Vsaka od njih (mamografija, ultrazvok, magnetna resonanca in druge) ima kakšno slabo lastnost. Metode, ki bi bila zdravju popolnoma neškodljiva, nezmotljiva, kratkotrajna in cenovno lahko dostopna še ni odkrita. Zato so znanstveniki prišli na idejo, da bi poizkusili z nanodelci detektirati rakave celice. Najprej so si izbrali Her2 protein (Human epidermal growth factor receptor 2), ki bo tarča teh nanodelcev. Za protein so predhodno vedeli, da se v 30% rakavih celic dojk čezmerno izraža. Da bi se magnetni nanodelci usmerili proti rakavim celicam in nanje tudi vezali, so ustvarili nanodelce povezane s protitelesi za Her2 protein. Nato, ko bi se nanodelci vezali na celice, pa bi s posebnimi občutljivimi napravami zaznavali te nanodelce in s tem tudi rakave celice v telesu. Poskusi, ki so jih izvedli, da bi potrdili svoja predvidevanja so bili zelo spodbudni. Uspelo jim je dokazati, da se nanodelci resnično v večji meri vežejo na celice, ki imajo več Her2 receptorjev (rakave celice). Nekaj izmed metod, s katerimi so prišli do teh rezultatov, bom tudi sama predstavila.

== Robert Berger: Svetlobno stikalo za bolečino ==
S podaljševanjem življenjske dobe in vse bolj tveganimi življenjskimi slogi v današnjem času ne moremo mimo bolečin, pa naj bodo akutne ali kronične, zato si medicina prizadeva, da bi jih, če jih že ne more odpraviti, vsaj lajšala. Vendar pri analgetikih in anastetikih pogosto naletimo na sistemske stranske učinke in odvisnosti, zato je odkrivanje novih vrst anastetikov in analgetikov eden pomembnejših ciljev farmacevtske industrije. Quaternary ammonium – azobenzene – quaternary ammonium oziroma QAQ je ena izmed možnih rešitev pri nadzoru bolečine. Sicer obstajajo optogenetske metode za uravnavanje aktivnosti nociceptorjev (bolečinskih receptorjev), vendar so pogosto preveč invazivne, saj zahtevajo spremembo DNK in lahko vodijo v trajne genetske spremembe, kar pa ni vedno zaželeno. QAQ s svojo strukturo omogoča blokado ionskih kanalov v nociceptorjih in tako prepreči bolečinski signal. Njegova posebnost pa je v njegovi strukturi, saj ga lahko z določenimi valovnimi dolžinami svetlobe (380 in 500 nm) spreminjamo med cis in trans izomerom, pri čemer cis izomer dovoljuje nemoten pretok Na+ in Ca2+ ionov, trans izomer pa zapre ionski kanal. Tako lahko prostorsko in tudi časovno nadzorujemo njegovo aktivnost. Pri podobnih anastetikih, kot so npr lidokain, ki deluje na podoben način kot QAQ izomerizacija in s tem tudi časovni nadzor nista možna.

== Erik Janežič:Raziskave golih krtovskih podgan (GKP) ==
Tekom zgodovine je velika večina tehnoloških iznajdb našla navdih v živalskem svetu. Danes pa morda prav živali kot so gole krtovske podgane, skrivajo odgovera na nekatera največja vprašanja človeštva kot sta zdravljenje raka in staranje. Gole krtovske podgane niso pritegnile posebne pozornosti med zannstveniki, dokler ni bil v 2. trtjini 20. stoletja pri njih odkrit eusocialen način življenja. Do danes so bile odkrite izjemna lasttnosti golih krtovskih podgan kot naprimer; odpornost na raka, na hipooksično okolje, neobčutljivost na iritacijo s kislinami ter izredno dolga življenska doba v primerjavi z drugimi glodalci. V seminarski nalogi vam bom predstavil nekaj splošnih značilnosti golih krtovskih podgan in njihove odpornosti na rakava obolenja, podrobneje pa bom predstavil raziskavo, ki se je ukvarjala z opazovanjem intracelularnega kalcija pri izpostavitvi možganskih celic GKP hipooksičnem okolju. Povečane koncentracije intracelularnega kalcija v možganskih celicah je namreč glavni razlog, da celice odmrejo oziroma imajo trajne poškodbe strukture in funkcije.

== Špela Tomaž: Specifično gibanje motornega proteina dineina ==
Za normalno delovanje celic in potek celičnih procesov, so med drugim izredno pomembne funkcije transporta, organizacije ter gibanja celičnih delov in organelov. Nalogo opravljajo tako imenovani motorni proteini, ki aktivno prenašajo tovor z enega dela celice na drugega, s svojim gibanjem omogočijo delovanje bičkov ter migetalk in so odgovorni tudi za gibanje mišic. Posebej zanimiva je mehanika njihovega premikanja, saj zaradi sprememb v konformaciji njihovih sestavnih proteinov dobesedno korakajo po svoji bazi (mikrotubuli ali aktinski filamenti). Medtem ko je kinetika gibalnih proteinov miozinov in kinezinov že raziskana, pa je premikanje tretje vrste, dineinov, še vedno slabo poznano. Dineini se v mnogih strukturnih lastnostih od ostalih vrst razlikujejo, kar posledično vpliva tudi na njihovo korakanje, ki ni urejeno in periodično, tako kot pri miozinih in kinezinih. Sposobni so različno dolgih korakov, ne le naprej in nazaj, temveč tudi vstran pod različnimi koti. Izmenično preklapljajo med koordiniranim in nekoordiniranim gibanjem in so nepredvidljivi ter dinamični, kar bi jim predvidoma lahko prinašalo mnoge ugodnosti in boljše sposobnosti prilagoditve. V seminarski nalogi bom opisala nekatere ugotovitve nedavnih raziskav ter predstavila nekatere odkrite značilnosti gibanja dineina.

== Samo Zakotnik: Telomeri in nesmrtnost celic ==

Človeštvo že odkar obstaja sanja o nesmrtnosti, o večnem življenju. Medicina je skozi človeško zgodovino uspešno podaljševala življenja z odkrivanjem vedno novih zdravil in zdi se, da je v prihodnosti možno doseči nesmrtnost, toda le, če bomo premagali staranje. Starost samih celic pa je močno povezana z dolžino telomerov. Telomer je ponavljajoče se zaporedje nukleotidov, ki ščitijo kromosome pred poškodbami. Premajhna dolžina telomerov naj bi vodila v razvoj škodljivih mutacij in razvoju onkogenov, ki vodijo v nastanek raka. Da bi lahko preprečili škodljivo krajšanje telomerov moramo podrobno preučiti mehanizme, ki zagotavljajo ohranjanje dolžin telomerov v okvirjih, ki niso potencialno škodljivi, ali celo omogočajo obnavljanje telomerov in njihovo podaljševanje, kar bi vodilo do celične nesmrtnosti. Vse to je povezano s samo zgradbo telomerov in delovanjem telomeraze, encima, ki skrbi za podaljševanje telomerov.
V drugem delu seminarja pa bom predstavil mehanizme somatskega obnavljanja telomerov in posledice inhibicije telomeraze na primeru ploskih črvov vrste Schmidtea mediterranea. Vrsta je predmet preučevanja že več kot 200 let zaradi izjemnih sposobnosti regeneracije, v sedanjem času pa postaja vse pomembnejši modelni organizem za preučevanje telomer in delovanja telomeraz. Leta 2010 so podelili Nobelovo nagrado za medicino in fizlologijo prav za odkritje, kako so konci kromosomov zaščiteni s telomeri in za odkritje encima telomeraze.

== Zala Gluhić: Rubisco aktivaza ==

Rubisco je encim, ki v temotnih reakcijah fotosinteze katalizira pretvorbo sladkorja ribuloza-1,5-bifosfat v molekuli 3-fosfoglicerata, iz katerih se nato lahko tvori glukoza. Vezava ribuloze-1,5-bifosfata na nekarboksiliran encim Rubisco inhibira. Za nemoten potek fotosinteze je potrebno sladkor odstraniti, kar v rastlinah poteka s pomočjo ATP odvisnega procesa z encimom Rubisco aktivaza. Rubisco aktivaze delimo na zeleni in rdeči tip. Struktura pri zelenem tipu je bila pojasnjena s pomočjo Rubisco aktivaze, poimenovane Rca, pri vrsti tobakovca N. tabacum. Pri rdečem tipu so bili izolirani kristali kompleksa iz rdeče alge R. sphaeroides (Rubisco aktivazo so poimenovali Cbbx). Pri obeh proteinih so odkrili podobno zgradbo. Sestavljena sta iz dveh domen - α/β poddomene ter α-vijačnica poddomene. Za svoje delovanje potrebujeta ATP, tvorita heksamerne obročaste strukture, na sredini katerih se nahaja pora. Zaenkrat mehanizem njunega delovanja še ni pojasnjen. Sklepajo, da gre pri Rca za premestitev Rubisca do centralne pore, kjer zanke destabilizirajo Rubiscovo aktivno mesto. Pri Cbbx pa verjetno sodeluje podaljšan C-konec Rubisca, ki ga aktivaza potegne v poro in s tem sprosti zanko, ki na Rubiscu veže sladkor, zato se sladkor lahko odcepi in Rubisco spet normalno deluje naprej.

== Katarina Tolar: Razvoj plastidov (kloroplastov) in Paulinella ==

Endosimbioza in posledično razvoj organelov je še vedno dokaj nepojasnjena. Čeprav je čedalje več rezultatov raziskav, ki endosimbiotsko teorijo potrjujejo in razlagajo. Najprimernejši in najuporabnejši organizem za raziskovanje in preučevanje tega dela evolucije je organizem Paulinella chromatophora. Ta organizem je najprimernejši, ker znanstveniki verjamejo, da je to najbolj izvoren še živeč fotosintetski protist. P. chromatophora naj bi bil en prvih organizmov, ki je vključil cianobakterije. Plastidi, ki so vključeni v različnih vrstah protistov se med seboj razlikujejo. Ugotovili so, da je genom plastida močno reduciran, v nekaterih vrstah plastidov bolj, v drugih manj. Vendar so med njimi velike podobnosti. Prav tako so dokazali, da so se plastidi res razvili iz cianobakterij, saj obstaja ogromna podobnost med genomi cianobakterij in genomi plastidov. Ker je genom plastidov močno zreduciran, so posledično plastidi močno odvisni od jedra. Zato so plastidi in gostiteljska celica razvili Tic in Toc premestitven sistem, ki omogoča prenos proteinov, ki so pomembni za gradnjo in razvoj plastidov iz citoplazme v sam plastid. Ta premestitveni sistem se je razvijal skupaj z rastlinami. Vendar je ohranjal tudi cianobakterijske lastnosti. To je še en dokaz, ki potrjuje endosimbiotsko teorijo.

== Barbara Dušak: Funkcionalne posledice spremenjenih podenot v RNA polimerazah ==

RNA polimeraze so encimi, ki usmerjajo transkripcijo DNA in sodelujejo pri genski regulaciji. V vseh evkariontskih organizmih so prisotne tri različne RNA polimeraze (I, II, III), rastline pa imajo še dve dodatni polimerazi RNA (IV in V). Polimeraze RNA II, IV in V so sestavljene iz 12 različnih podenot, ki imajo različne vloge. Izbrana raziskava se je osredotočila na delovanje devete podenote, ki ima dve različici, 9a in 9b, v Pol II, IV in V pri rastlini Arabidopsis thaliana. Izkazalo se je, da imata nefunkcionalni podenoti različne posledice na delovanje polimeraz. Raziskave so izvajali s križanjem rastlin divjega tipa z mutantkami 9a-1 in 9b-1, nato pa opazovali spremembe v organizmu. Heterozigoti 9a-1 niso kazali nobenih sprememb, 9b-1 pa so se fenotipsko razlikovali od divjega tipa. Homozigoti za mutirani različici obeh genov se sploh niso razvili.
Predstavila bom spremembe, ki so se pojavile na molekularnem nivoju, v povezavi s tem, kar je že znano o delovanju polimeraz RNA.

== Rok Razpotnik: Botulinum toksin v kompleksu z NTNHA (nehemaglutinirajočimi proteini) ==

Botulinum toksin je najmočnejši do sedaj odkriti nevrotoksin. Botulinum nevrotoksin je možen agent za bioterorizem, po drugi strani pa se uporablja v terapijah in kozmetični industriji, znan pod imenom botox. V obeh primerih deluje kot inhibitor acetilholina, pri čemer napade živčne celice. Preden pa uspe priti do živčnih celic, ki nadzirajo delovanje mišic, mora toksin, pri zaužitju, iti skozi dolgo pot – preko celotne prebavne poti, kjer so prisotni številni prebavni encimi in izredno močno kislinsko okolje, do črevesja, kjer je nato vsrkan v krvni obtok, kjer se prevaža vse do živčnih celic. V seminarski nalogi vam bom predstavil organizem, ki proizvaja omenjeni nevrotoksin; bolezensko stanje, ki ga povzroča kontaminacija z botulinum toksinom; strukturo ter mehanizem delovanja, ter na koncu izsledke raziskave, kjer so ugotovili mehanizem delovanja kompleksa, v katerem je nevrotoksin vezan pri poti skozi prebavni trakt. V raziskavi so ugotovili, da se botulinum toksin veže v zaprt in stabilen kompleks z netoksičnim nehemaglutinirajočim proteinom (NTNHA), ta pa ga varuje pred ekstremnimi pogoji v želodcu (nizek pH, delovanje prebavnih proteaz). Kompleks se razpusti ko ta preide v črevesje, kjer vlada nevtralna pH vrednost. Tako prosti botulinum toksin v črevesju vstopi v krvožilje, ki potuje naprej do kolinergičnih nevronov, ker povzroči inhibicijo acetilholina. To se kaže v paralizmu mišic. Ugotovili so torej, da je mehanizem vezave botulinum toksina ter NTNHA ter preživetja nevrotoksina pogojen z mehanizmom spremembe pH vrednosti.

== Erik Mršnik: Vloga Oct4 pri izražanju genov matičnih celic ==

Med sesalčevim razvojem je potrebno, da iz ene totipotentne celice nastane več kot dvesto različnih tipov celic. Inducirane pluripotentne zarodne celice (ali krajše iPSCs) je možno pridobivati tudi iz somatskih celic z ekspresijo transkripcijskih faktorjev, ki so navadno izraženi v ESCs. Pluripotentno stanje se da vzdrževati z določenimi citokini. Na primer z LIF-om ali BMP4.
Transkripcijski faktor Oct 4 (iz družine PouV) je osnoven za nastajanje in vzdrževanje iPSCs in ESCs. Če ga odstranimo, povzročimo diferenciacijo teh celic. Oct4 se izraža tudi v fazi gastrulacije matičnih celic, kjer blokira prezgodnjo diferenciacijo. Kljub mnogim raziskavam pa še vedno ni povsem znano, kako Oct4 deluje kot transkripcijski faktor pri reguliranju diferenciacije. Nekateri eksperimenti so pokazali, da lahko deluje kot aktivator ali represor genske transkripcije.
Odkrili so, da se Oct4 pri svojem delovanju združuje z nekaterimi drugimi transkripcijskimi faktorji. Predvsem z Sox2 (iz družine HMG) in Nanog. Ti naj bi istočasno kontrolirali izražanje genov in regulirali razvoj ESCs.
V tej študiji so se posvetili derivatom Oct4, ki so jih izdelali izključno kot aktivatorje ali represorje transkripcije. Vsak protein ima PouV DNA-prepoznavno sekvenco združeno z močno aktivacjsko (VP16) ali represijsko (Engrailed ali HP1) regijo transkripcije. Tekom študije so ugotovili, da pravzaprav samo aktivatorska oblika povzroči nastanek iPSCs. Aktivatorska fuzija vzdržuje rast in pluripotentnost mišjih ESCs, ki jim manjka »divjega tipa« Oct4. Oct4-aktivatorska fuzija lahko prepreči pluripotentost ne glede na pisotnost LIF-a. Predvidevajo, da delovanje Oct4 kot aktivatorja zadošča za povzročitev nastanka iPSC in vzdrževanje ESCs.

== Matej Vrhovnik: Nove spojine, ki preprečujejo širjenje in izboljšajo zdravljenje raka ==

Glioblastom je oblika agresivnega malignega raka, ki se razvije iz vezivnega tkiva v možganih. Po operaciji imajo pacienti naveč 2 leti življenja, brez zdravljena nekje do 3 mesece. Problem se pojavi po operaciji, kjer se odstrani do 99% rakastega tkiva in obsevanju, ker noben kemoterapevtik ne deluje dovolj učinkovito. Glioblastom tvori veliko metastaz, ki so zelo razširjene po zdravem tkivu in zato ne moremo z kemoterapevtiki napasti vse rakave celice, ker bi uničili tudi preveč zdravega tkiva, oziroma zdravilo ima preveč blag učinek.
Znanstveniki so zato ustvarili spojino imipramine blue. Deluje tako, da inhibira tvorjenje reaktivnih kisikovih spojin, inhibira NADPH-oksidazo in reorganizira aktin v citoskeletu. Ravno reaktivne kisiko spojine so krive za invazivno širjenje rakastih celic po zdravem tkivu, kar pa imipramine blue prepreči, posledično je rak v strjeni skupini, kjer kemoterapevtik lažje opravi svoje delo. Dokazali so, da v kombinaciji z doxorubicinom zelo podaljša življenjsko dobo podgan, ki imajo tumor RT2, ki je zelo podoben človeškemu glioblastomu. Prav tako preprečuje poškodbo krvno-možganske pregrade, kar je ponavadi eden izmed stranskih učinkov kemoterapevtikov.

== Matic Kovačič: Kronični stres vodi do poškodb DNA ==

Stres je pri ljudeh prisoten že odkar imata nadledvični žlezi sposobnost izločanja stresnih hormonov, kot sta na primer adrenalin in noradrenalin. Včasih sta se hormona izločala kratek čas med bojem in telo pripravila na lažje preživetje. Danes pa smo v moderni družbi zaradi hitrega načina življenja in obveznosti, ki jih moramo izpolniti, podvrženi stresu skoraj ves čas. Dolgoročni stres, ki se imenuje tudi kronični stres, ima na naše zdravje in počutje negativne posledice. Znanstveniki so s poskusi na miših, na katerih so simulirali kroničen stres, ugotovili, da kronični stres vodi do povečanih napak v DNA z zmanjšanjem koncentracije proteina p53. Stresni hormoni, kot je recimo adrenalin, se vežejo na β2-adrenoreceptorje, kar povzroči večji izvoz proteinov p53 iz jedra v citosol, kjer jih proteasom razgradi. Protein p53 imenujejo tudi varuh genoma, saj v primeru poškodbe DNA zaustavi celični cikel in aktivira popravljanje poškodovanih delov DNA, če pa so poškodbe DNA prevelike, p53 povzroči celično smrt. Neka druga skupina znanstvenikov pa je ugotovila, da kroničen stres tudi zelo močno pospeši rast tumorjev. Povedal bom nekaj splošnih stvari o stresu in proteinu p53, nato pa predstavil raziskave in ugotovitve znanstvenikov.

== Andreja Kukovec: Epigenetska blokada kognitivnih funkcij pri Alzheimerjevi demenci ==

Alzheimerjeva demenca je ena od najpogostejših oblik demence. Večinoma se pojavi po 65. letu starosti. Eden začetnih simptomov je poslabšanje spomina, kar posamezniki pogosto napačno interpretirajo kot posledico staranja ali stresa. Gre za nevrogenenrativno bolezen. Točen vzrok nastanka Alzheimerjeve demence še ni znan. Dandanes je v veljavi opredelitev, da je Alzheimerjeva demenca posledica akumuliranja napačno zvitih proteinov - t. i. beta amiloidni plaki. Prisotni so tudi nevrofibrilarni vozli, ki se pa, za razliko od amiloidnih plakov, nahajajo znotraj nevronov. Histoni so bazični proteini, okoli katerih se ovije DNA. Na nestabilnih aminokislinskih koncih histonov se odvijajo različne modifikacije, ki regulirajo izražanje genov. Med slednje spadata tudi acetilacija in deacetilacija, ki imata pomembno vlogo pri izražanju genov, ki so povezani s spominom in učenjem. V raziskavi so ugotovili, da je histon HDAC2 pri bolnikih z Alzheimerjevo demenco prisoten v preveliki meri, kar blokira izražanje genov, pomembnih za spomin. Ko so z inhibitorji zmanjšali nivo HDAC2 se je nevronom povrnila sinaptična plastičnost in izražanje s spominom povezanih genov. To znižanje HDAC2 pa se je pokazalo tudi kot izboljšanje kognitivnih funkcij (pri miših), kar pomeni, da bi te ugotovitve lahko imele pomembno vlogo pri zdravljenju Alzheimerjeve demence.

== Sara Bitenc: Okužba s Toxoplasmo gondii in povečana količina dopamina ==

Kljub veliki farmacevtski ponudbi cepiv in antibiotikov na tržišču se žal ne moremo izogniti nekaterim infekcijskim boleznim, katerih vzrok so mikroorganizmi. Eden izmed takšnih organizmov, ki povzroča povsem svetu razširjeno in zahrbtno bolezen t. i. toksoplazmozo, je Toxoplasma gondii, znotrajcelični zajedavec. Ta zahteva tako gostitelja kot tudi vmesnega gostitelja, da je življenjski cikel parazita sklenjen. Ciste parazita povzročajo kronično infekcijo, pri čemer se razširijo v gostiteljeve mišice in možgane (največjih delež teh se je nahajal v amygdali in nucleus accumbens – predela v možganih), v posameznih znotrajceličnih tkivnih cistah pa T. gondii tvori več sto bradiozit. Da bi znanstveniki podali zaključek v zvezi s spremembami količine dopamine, so s paraziti okužene možgane pri miših raziskovali s protitelesi dopamina in ugotovili,da parazit prevzame nadzor nad gostiteljsko celico in začne spreminjati nevrotransmitsko signalno transdukcijo, kar v organizmu izzove različne vedenjske spremembe. Glavna ugotovitev moje seminarske naloge je, da je količina sproščenega dopamina povezana s številom parazitov v gojeni kulturi. Poskusi, ki jih bom predstavila, so bili izvedeni »in vivo« in »in vitro«. Veriga interakcij med patogenom (tistim, ki povzroča bolezen – T. gondii) in njegovim gostiteljem (v našem primeru je ta žrtev naša npr. živčna celica) je torej zelo zapletena; nedolgo nazaj je znanstvenike begala povezava med parazitom in njegovim obnašanjem… Danes pa vemo, da je za spremembe v metabolizmu dopamina ključna T. gondii, ta dognanja pa bodo prispevala k razlagi razvoja bolezni pri bolnikih s toksoplazmozo in nekaterih psihovedenjskih bolezni.

== Jan Taškar: Mikrobske gorivne celice in uporaba umetnega konzorcija bakterij ==

Današnji svet se približuje energetski krizi, saj smo še vedno v preveliki meri odvisni od fosilnih goriv, ki jih bo kmalu zmanjkalo,a še vedno nimamo dovolj razvitih alternativnih virov energije, ki bi jih lahko nadomestili. Zato se stalno odkriva nove alternativne načine pridobivanja energije, kot so tudi mikrobske gorivne celice. Mikrobska gorivna celica ali MFC (microbial fuel cell), kot druge gorivne celice, proizvaja električni tok, le da za njegov nastanek izkorišča naravne procese mikroorganizmov, kjer se nek organski substrat razgradi in nastanejo elektroni. Sama ideja pridobivanja elektrike s pomočjo mikroorganizmov nam je znana že od leta 1911, vendar se je zanimanje za njih povečalo šele po sedemdesetih letih prejšnjega stoletja, ko so počasi začeli bolje razumevati mikroorganizme prisotne pri pridelavi elektrike, ter odkrivati nove načine za izboljšanje delovanja in s tem tudi potencial MFC-jev kot čisti vir energije. Dandanes je vloženo veliko truda v izboljšanje in tudi boljše razumevanje te zelo potencialne tehnologije, z namenom da bi nekegega dne lahko dosegli dovoljšen izkoristek da bi s pomočjo posebnih mikroorganizmov hkrati čistili odpadne vode, ter istočasno pridobivali dovolj elektriko za naše potrebe.

== Monika Biasizzo: Vloga TOR signalne poti pri regeneraciji tkiv ==

Regeneracija je proces obnavljanja, popravljanja in rasti, ki omogoče organizmom ustrezen odgovor na poškodbe ali motnje, ki negativno delujejo na organizem. Poškodovano ali izgubljeno tkivo morajo nadomestiti nove celice, zato sta potrebni celična rast in delitev. Celično rast in delitev sprožijo in omogočijo različne signalne poti in mehanizmi. Ena izmed pomembnih signalnih poti je TOR signalna pot. Protein TOR oziroma tarča rapamicina je glavni protein TOR signalne poti, ki vpliva na sintezo proteinov preko stimulacije mRNA translacije, transkripcije in biosinteze ribosomov. TOR signalna pot lahko sproži in zavre sintezo proteinov glede na zunanje signale, kot so dostopnost hranil, rastni hormoni in nivo celične energije. Zaradi te signalne poti celica ob premajhni količini hranil in energije ne raste in se ne deli, saj je sinteza proteinov zavrta. Ta mehanizem omogoča celicam, da rastejo in se delijo le, ko imajo na voljo dovolj snovi. Vlogo TOR signalne poti pri regeneraciji tkiv so raziskovali pri ploskih črvih rodu ''Planaria'', ker imajo izredno sposobnost regeneracije. Skupino ploskih črvov, ki so jim utišali izražanje gena za protein TOR s tehnologijo RNAi, so primerjali s kontrolno skupino med regeneracijo po amputaciji. Ugotovili so, da ima TOR signalna pot pomembno vlogo pri mitotski delitvi in tvorjenju blastem – novo tkivo, kjer se manjkajoče strukture regenerirajo. TOR signalna pot je v zadnjem času predmet raziskav za terapije proti raku in inhibicija TOR v planarijih nam lahko pokaže posledice dolgoročne inhibicije TOR signalne poti.

== Matic Urlep: Odpornost bakterij na sulfonamidne antibiotike ==

V današnjem času je vedno več bakterij, ki so postala odporna na veliko antibiotikov in to postaja vedno večji problem. V svojem seminarju bom opisal raziskavo znanstvenikov ustanove » St. Jude Children's Research Hospital «. Ti so se osredotočili na sulfonamidne antibiotike. Ti antibiotiki inhibirajo delovanje dihidropteroat sintaze, encima ki je ključen pri biosintezi folne kisline. Folat ali folna kislina pa pomaga pri sintezi DNA, popravi DNA in pri hitri celični delitvi. Sposobnost bakterij do prilagoditve je naredila te antibiotike skoraj neuporabne. Znanstveniki pod okriljem Mi-Kyung Yuna so se osredotočili na delovanje DHPS ( dihidropteroat sintaza ) in kaj se dogaja z aktivnim mestom med samo biosintezo dihidropteroata in kako sulfoamidi uničijo bakterije. Njihova odkritja odpirajo možnosti za proizvodnjo novih antibiotikov na katera bi se bakterije težje prilagodile in bi imeli manj stranskih učinkov.

== Maja Kostanjevec: Antioksidanti - spojine, ki lahko poškodujejo DNA ==

Antioksidanti so spojine, ki ščitijo celice pred škodljivimi radikali, ki nastajajo v procesu oksidacije. Njihovi učinki se danes raziskujejo v povezavi z različnimi boleznimi, saj je za njih značilno, da imajo na telo pozitivne učinke. Vendar pa je raziskava genotoksičnih spojin pokazala, da lahko nekateri v velikih koncentracijah poškodujejo DNA. Za določitev genotoksičnih spojin so raziskovalci ustvarili novo metodo analize, ki temelji na povišanju ravni proteina ATAD5. Ta se v celici pojavi ob poškodbi DNA, saj zavira genomsko nestabilnost in nastajanje tumorjev ter sodeluje pri popravljanju DNA. Za tri antioksidante (resveratrol, genisteinin in baicalein) so v raziskavi dokazali, da lahko uničijo celice, za katere je značilna hitra delitev, poleg tega pa so tudi selektivni, kar pomeni, da ne poškodujejo celic okoli njih. V celici ne povzročajo večjih preureditev in premestitev kromosomov. Te lastnosti omogočajo potencialno uporabo antioksidantov v prihodnosti pri zdravljenju raka, saj je moč njihove genotokičnosti primerljiva s trenutno uporabljajočimi kemoterapevtiki. Poleg tega pa so antioksidanti selektivni in ne povzročajo mutageneze, zaradi česar bi bili primernejši od zdajšnjih kemoterapevtikov. Vsekakor pa bo potrebno še več raziskav, ki bodo podrobneje pokazale, katere vrste rakastih celic ti antioksidanti uničujejo.

== Katja Leben: Vpliv zgradbe agregiranih proteinov na celico ==

S podaljševanjem življenske dobe postajajo vse bolj aktualne tudi nekatere bolezni, ki se pojavijo s starostjo, kot sta Alzheimerjeva in Parkinsonova bolezen. Obe sta povezani s proteinskimi agregati, ki se nalagajo v organizmu.
Preden proizvedeni protein doseže nativno stanje je kratek čas izpostavljen topilu in takrat lahko hidrofobni in polarni deli, ki tvorijo vodikove vezi, reagirajo intra ali pa intermolekularno, predvsem so k temu nagnjeni proteini, ki nimajo enotno določene sekundarne in terciarne strukture. V določenih pogojih, primer je tudi visoka koncentracija proteinov, ki je značilna za rekombinantne proteine, prevladajo intermolekularne interakcije in nastanejo agregati, kar privede do problemov pri ekspresiji rekombinantnega proteina.
Agregacija proteinov v celici je dokazano toksična, a do nedavnega je bil vpliv zgradbe proteinov, ki sestavljajo agregate, na celično kondicijo nepoznan. Izsledki raziskav kažejo, da je vpliv agregacije proteina na celico tesno povezan z aminokislinskim zaporedjem polipeptida, ki tvori agregat. Pogojuje stopnjo agregacije ter posredno strukturne in funkcionalne lastnosti agregata, od katerih je odvisen učinek šaperonov na agregate.
Ugotovitve raziskave so zagotovile osnovne podatke o vplivih mutacij v zaporedju na strukturne lastnosti agregatov, ki bodo omogočile predvidevanje vplivov proteinskih agregatov na kompleksnejše žive organizme in nadaljnje raziskave, ki bi vodile k razumevanju in posledično zdravljenju bolezni kot je Alzheimerjeva.

== Filip Mihalič: Kako lizocimi v solzah uničijo nevarne bakterije ==

Lizocimi so encimi, ki jih najdemo v človeških solzah ter smrklju in katalizirajo razcep glikozidne vezi med dvema monosaharidnima enotama v molekuli peptidoglikana, v celični steni bakterije ter s tem povzroči njen propad. Sam mehanizem kako lizocim katalizira razcep te vezi, ter njegovo spreminjanje konformacije med procesom sta bila do nedavnega še precej neraziskana, saj znanstveniki niso poznali metode s katero bi lahko opazovali posamezne molekule.
Raziskovalci z univerze "Univerza v Kaliforniji, Irvine", so pred nedavnim uporabili nov pristop za opazovanje posameznih makromolekul, in sicer so eno samo molekulo lizocima povezali z karbonsko nanocevko prek pirenskega sidrišča ter nato spremljali tresljale ki jih je sprožila molekula lizocima. ob tem so prišli do zanimivih ugotovitev, saj so lahko zelo natančno določili gibanje molekule ter njeno obnašanje v procesu cepitve glikozidne vezi. Bolj kot samo opazovanje lizocima je pomembna sama metoda s katero so opazovali molekulo, saj odpira nove možnosti na opazovanju posameznih molekul v naravnem okolju - metod ki bi omogočale opazovanje posameznih molekul je zelo malo pa še te so po večini nezanesljive, oz. neuporabne za daljše opazovanje molekul. V predstavitvi bom povedal najprej nekaj o lizocimu, nato pa se bom posvetil znanstveni raziskavi ter njenim rezultatom.

== Mirjana Malnar: Zastoji v procesu translacije ==

Translacija je prevajanje nukleotidnega zaporedja mRNA v aminokislinsko. Pri procesu translacije pride do zastojev (trenutna prekinitev translacije ali upočasnjena translacija). Ti zastoji so posledica ali določenega zaporedja baz mRNA ali interakcij med novo sintetiziranim polipeptidom in ribosomskim tunelom. V raziskavah se je izkazalo da so različni predeli ribosomskega tunela različno ugodni za določene delce (odvisno od velikosti, polarnosti, hidrofobnosti delcev). Posledično bodo polipeptidi, odvisno od svojih lastnosti čez tunel potovali različno (zastoji na različnih mestih ipd.). Raziskave so bile narejene na primeru E.coli. secA je motorni protein E.coli ki sodeluje pri prenosu proteinov čez celično membrano. Njegova sinteza je regulirana s translacijo secM proteina, katerega se kodirajoča sekvenca nahaja navzgor od kodirajoče sekvence secA (na isti mRNA). Ugotovili so da določeno zaporedje aminokislin secM tvori interakcije z ribosomskim tunelom zaradi česa pride do zastoja v translaciji. Če je ta zastoj daljši, se sintetizira več secA proteina. V drugih raziskavah so prišli do ugotovitve da do zastojev pride tudi pri translaciji kodirajoče sekvence za secA, ampak ti zastoji niso bili povezani z interakcijami z ribosomskim tunelom. Izkazalo se da sekvence podobne Shine-Dalgarno sekvencami (SD) v kodirajočem zaporedju mRNA povzročijo te zastoje zaradi interakcij z rRNA. (SD sekvenca je pomembna ker se veže z anti-Shine-Dalgarno sekvenco na rRNA in pri tem tvori mRNA-ribosom kompleks; nahaja se 8-10 baz pred start kodonom). Bolj so te sekvence podobne SD, večjo imajo afiniteto do vezave z anti-SD na rRNA in posledično povzročajo daljše zastoje.

== Ellen Malovrh: Dolgoživi jedrni proteini in njihov vpliv na celično staranje ==

Proteini sodijo med najkompleksnejše in najštevilčnejše organske molekule v celicah in omogočajo njihovo pravilno delovanje. Že med samim nastankom ali v času delovanja pa se lahko izkaže, da so proteini nefunkcionalni, zato je za celico izjemno pomemben proces razgradnje takih proteinov in sinteza novih. Proteini, ki se počasi obnavljajo oziroma imajo dolge življenjske dobe, so zato bolj izpostavljeni kopičenju škode.
Taki so tudi proteini nukleoporini, ki tvorijo kompleks jedrne pore, ki omogoča transport molekul med citoplazmo in jedrom. V raziskavi, ki sem jo predstavila v seminarski nalogi, so znanstveniki v možganih podgan odkrili nukleoporine, ki so bili stari celo več kot eno leto. Poškodbe na teh proteinih povečajo prepustnost jedrnih por, zato lahko citoplazemski proteini vdirajo v jedro. Spremeni se lahko tudi genski zapis v celici, kar je bilo opaženo predvsem pri starajočih se celicah.
Pričujoča raziskava bi tako lahko rešila eno od ključnih znanstvenih vprašanj o življenju: kako in zakaj se celice starajo ter posledično omogočila razvoj novih načinov zdravljenja starostno pogojenih bolezni. Spremembe v genskem zapisu so namreč odgovorne za staranje celic in lahko vodijo do številnih starostnih bolezni, kot sta Alzheimerjeva in Parkinsonova bolezen.

== Ana Kunšek: Proteini za zaznavanje bolečine ==

Mehanska zaznava je zelo pomembna pri vsakodnevnih opravilih. Organe, ki nam prevajajo zunanje dražljaje pa imenujemo čutila. Eno izmed pomembnejših (če ne ravno najbolj pomembno) je prav zagotovo čutilo za tip, saj z njim zaznavamo še tako majhne dražljaje, vročino, električni tok, itd. Vse to pa poteka prek električnega toka po živčnih celicah v našem živčnem sistemu. Ampak, ste se že kdaj vprašali kdo je pravzaprav odgovoren za delovanje tega oz. vseh čutil? 
Nekaj o čutilih so pravzaprav že ugotovili. Ugotovili so, kako se prenašajo dražljaji po nevronih, kako se začnejo premikati mišice in v katere dele naših možganov potujejo električni dražljaji iz različnih čutil. Nikoli pa še niso ugotovili kdo v celicah je odgovoren za zaznavo dražljajev in kaj s to zaznavo naredi.
V svojem seminarju se bom osredotočila prav na protein, ki je zanj odgovoren. Prav tako bom razložila kako (če) se spremeni delovanje, če organizmu z rezanjem eksonov iz DNA odstranimo gen za ta protein in ga potem v svojem življenju nima. 
S to študijo so si odprli nove poti za ugotavljanje kako deluje naš čutilni sistem, kar bodo v prihodnosti s pridom izkoristili za preučevanje zaznavanja zvoka, krvnega tlaku, in ostalih mehanizmih v človeškem telesu, ki s svojim delovanjem pritiskajo na celične membrane, kar bi lahko vodilo v lažje zdravljenje zdravstvenih težav.

== Aleksander Benčič: S1P₁ receptorji in njihov pomen ==

Eden od osnovnih mehanizmov v celici, ki je pogoj za delovanje vseh živih organizmov je signalizacija in sporazumevanje celice z okoljem. Zaradi tega so se v celicah razvili številni mehanizmi za komunikacijo, ki jim omogočajo opravljanje njihovih bioloških funkcij. Eden najpomembnejših tovrstnih mehanizmov so receptorji, prisotni na membrani celice. V svoji seminarski nalogi se bom osredotočil na vlogo in delovanje enega od teh receptorjev imenovanega sfingozin-1-fosfat receptor 1. V prvi raziskavi so znanstveniki preučili mehanizem delovanja novega zdravila za multiplo sklerozo fingolimod, ki je modulator S1P₁ receptorjev. Do sedaj je veljala domneva, da naj bi fingolimod preprečeval izhajanje limfocitov iz limfnih vozlov in tako blažil simptome multiple skleroze, vendar so v tej raziskavi ugotovila, da je glavni mehanizem delovanja povezan s signalnimi potmi v centralnem živčnem v katerih sodelujejo S1P₁ receptorji. Druga raziskava je bila prav tako povezana z signalnimi potmi v centralnem živčnem sistemu, ki jih uravnava sfingozin-1-fosfat. Preučili so vpliv, ki ga imajo na migracijo zarodnih živčnih celic ob poškodbi centralnega živčnega sistema v smeri poškodbe. Vse te raziskave so pokazale, da imajo S1P₁ receptorji izreden pomen na delovanje telesa vendar številni od mehanizmov delovanja še niso raziskani. Iz teh raziskav je viden velik potencial, ki ga imajo na področju zdravljenja številnih obolenj povezanih predvsem z osrednjim živčnim sistemom in poškodbami le tega.

== Jakob Gašper Lavrenčič: Uporaba fotosintetskega sistema I za bio-sončne celice ==

Zaradi naraščajoče potrebe po energiji poskuša veliko znanstvenikov odkriti učinkovit način pridobivanja energije, ne da bi dodatno obrmenili okolje. Znanih je mnogo načinov pridobivanja okolju prijazne energije, od veternic do elektrarn, ki izkoriščajo valovanje morja. Zato bom v svoji seminarski nalogi predstavil zelo obetajoč način pridobivanja energije, ki izpolnjuje naštete pogoje. Bio-sončne celice predstavljajo poceni način pridobivanja električne energije, ki izkorišča učinkovitost rastlinski beljakovin za proizvodno električne napetosti. Predvsem se izkorišča fotosintetski sistem I (PS-I), katerega lastnost je ravno prenos elektronov preko membrane, kar je bistveno za potek fotosinteze. Njihova največja prednost je ravno v tem, da lahko njihovo glavno surovino PS-I, poceni pridobivamo iz zelenih rastlinskih tkiv, tudi v industrijskem merilu. Raziskovalna skupina je sestavila dve sončni celici, s katerima so preizkušali lastnosti in učinkovitost PS-I, saj so mnoge predhodnje raziskave naletele na obilico težav, z izkoriščanjem tega sistema. Ker so te raziskave zahtevale uporabo dragih in okolju nevarnih snovi, je dolgo veljalo, da je izkoriščanje rastlinskih fotosintetskih beljakovin v sončnih celicah neučinkovito in drago. Ampak nova spoznanja in razumevanje fotosintetskih beljakovin, od stabilnosti do osnovne učinkovitosti ter primernosti različnih oblik sončnih celic, kažejo na to, da so takšne sončne celice okolju neškodljive, učinkovite in poceni.

== Sandra Zupančič: Možnosti uporabe matičnih krvnih celic pri okužbi z virusom HIV ==
Virus HIV je virus, ki ga lahko z raznimi zdravili sicer obvladamo, vendar se pa ga nikoli popolnoma ne znebimo. Ker spada v družino retrovirusov, kar pomeni da ima genski zapis v RNA, ki se potem v gostiteljski celici, prepiše v DNA. Pri prepisovanju, pri katerem sodeluje reverzna transkriptaza, pride pogosto do napak, kar pa posledično privede do tega da virus mutira in postane odporen oziroma nedovzeten za napade celic našega imunskega sistema. Ker reverzna transkriptaza pomaga pri razmnoževanju virusa HIV, lahko uporabimo zdravila, ki zavrejo delovanje te reverzne transkriptaze – s tem pa zavrejo tudi razmnoževanje virusa. Znanstveniki si prizadevajo, da bi našli čim bolj učinkovit način za zdravljenje tega virusa. Prav v tej raziskavi so z vrsto poskusov dokazali, da je možno gensko modificirati naše krvne matične celice tako, da postanejo specifične za HIV-1 Gag protein, pri tem pa ne izgubijo svoje funkcije. V raziskavi so uporabili miši, v katerih so poskušali čim bolj poustvariti človeški imunski sistem – od samega nastanka celic pa do reakcij ki potekajo ob okužbi.

== Jernej Pušnik: Zaznavanje proteinov z zlatimi nanodelci ==
Metoda zaznavanja proteinov z zlatimi nanoantenami, kot že samo ime pove, za senzor uporablja zlat nanodelec paličaste oblike. Ko tak nanodelec zazna protein, se rahlo spremeni njegova frekvenca, kar lahko z drugimi besedami opišemo kot zelo majhna sprememba barve, ki jo s prostim očesom nebi mogli zaznati, zato se uporabljajo posebni detektorji. Ti detektorji so sposobni zaznavati spremembe s izjemno visoko časovno resolucijo, vse do milisekunde, kar omogoča natančno opazovanje proteinske dinamike. Ta pridobitev odkriva povsem nova obzorja, saj je s tem omogočeno opazovanje adsorpcije proteinov, njihovo gibanje, zvijanje v terciarno obliko, sledenje spreminjanju gostote proteinov, njihova vezava na določena mesta itd. Mislim, da je to odkritje izrednega pomena in bo olajšalo pot do razlage marsikaterih pomembnih procesov v biokemiji.

== Ajda Rojc: Nematociste - najhitrejši mehanizem v naravi ==
Knidocite so eksplozivne epidermalne celice, ki vsebujejo velik sekrecijski organel nematocisto. Ob dražljaju sprožijo strup, ki se nahaja v nematocistah. To lastnost so ožigalkarji razvili za obrambo in ulov plena. Organel je sestavljen iz prožne kapusle in tubula, ki je nanjo pritrjen. Med eksocitozo se bodičast del izstreli s pospeškom, ki je 5 milijonkrat večji od gravitacijskega, proces pa se odvije v manj kot 700ns. Raziskava je razkrila do sedaj še neraziskane proteine, ki so odgovorni za biomehanske lastnosti celice. S centrifugiranjem so izolirali nepoškodovane, še neizstreljene nematociste iz organizma H.magnipapillata. Pripravek nematocist je bil raztopljen v DTT, proteine pa so ločili z eletroforezo. Razporeditev proteinov je pokazala, da je v vzorcu največ proteinov z molekulsko maso med 10 in 40 kDa. Po tej proceduri so lahko izključili 50 nepomembnih proteinov in identificirali 410 posameznih proteinskih sekvenc. 25 ostalih sekvenc iz analize celotnega proteoma so označili kot onesnažene.
Znano je, da je zunanja stena nematocist sestavljena iz globularnih proteinov, a je njihova funkcija še neznana. Notranja stena pa je sestavljena iz skupkov kolagenskih fibril, ki se nahajajo z razmikom od 50 do 100 nm in so med seboj prekrižani v intervalih 32 nm. Fibrile so sestavljene iz polimerov minikolagenov, katerih je v Hydri zelo veliko. Ta izrazit vzorec daje prožnost, ki je potrebna, da kapsula zdrži zelo velik ozmotski pritisk (150bar).

== Luka Krmpotić: Štirje geni in spomin pri odraslih ==
Problem Alzeimerjeve bolezeni še ni rešen. Ta napade hipokampus in zmanjša njegov volumen. Pri nekaterih posameznikih je hipokampus “poškodovan”, ima manj kot normalen volumen. Vzrok so majhne variacije v dednem zapisu, ki pospešijo normal proces skrčenja hipokampusa za približno štiri leta. Po 65-tem letu se nevarnost za Alzeimerjevo bolezen podvoji vsakih 5 let, torej bi posameznik s temi genskimi variacijami imel skoraj 2-kratno možnost da zboli za Alzeimerjevo. Oziroma, drugače povedano, če bi posameznik s temi genskimi variacijami zbolel za Alzeimerjevo boleznijo, bi ta napadla že “oslabljen” hipokampus, in posameznik bi trpel hujše simptome kot tisti brez teh genov.
Genoma wide association study, je dokaj nova raziskovalna metoda, ki se uporablja na področju medicine in biokemije, s katero lahko najdemo genske variacije določene bolezni ali fiziološke lastnosti. V primeru raziskave, ki je tema te raziskovalne naloge, so bile najdeni SNP-ji (variacije gena v eni DNK črki) ki vplivajo na volumen hipokampusa in SNP-ji ki vplivajo na znotrajlobanjski volumen.

== Alenka Mikuž: Pretvorba belega v rjavo maščobno tkivo ==
Dandanes, ko velja, da večino dneva presedimo in je vnos kalorij toliko večji, je debelost eden izmed največjih problemov današnje populacije. Belemu in rjavemu maščobnemu tkivu je skupno le to, da oba shranjujeta trigliceride. Belo zato, da skladišči odvečno energijo, rjavo pa zato, da ima tako prekurzorje, ki spodbujajo izražanje UCP-1. UCP-1 je protein, ki omogoča proizvodnjo toplote v rjavem maščevju in s tem porablja energijo. Prekomerno kopičenje maščobnega tkiva škoduje zdravju človeka, zato bi bilo spodbujanje nastajanja rjavega maščevja ali pa sprememba belega v rjavo maščevje nova tarča pri proizvodnji farmacevtskih zdravil, ki bi kljubovala debelosti in njenim metabolnim in srčnožilnim težavam. V raziskavi so raziskali delovanje PRDM16, ki deluje skupaj s CtBP-1 ali PGC-1α v rjavem maščevju. Kompleks PRDM16/CtBP-1 uspešno zavira izražanje genov belega maščobnega tkiva. Kompleks PRDM16/PGC-1α spodbuja izražanje genov rjavega maščobnega tkiva. Obstaja še veliko drugih transkripcijskih faktorjev, ki vplivajo na izražanje maščobnega tkiva. Odkriti morajo najbolj primernega in ga stabilizirati. Čeprav izkoriščanje nastajanja rjavega maščobnega tkiva iz belega lahko ponudi rešitve za razvoj zdravil, ki bi kljubovala metabolnim in srčnožilnim boleznim, ki so posledica debelosti, to še vedno ne nadomesti tradicionalnih pristopov proti debelosti, tj. uravnotežena prehrana in telesna aktivnost.

== Estera Merljak: Potencialna terapevtska vloga funkcionalnih inkluzijskih telesc ==
Zaradi vse večje uporabe rekombinantnih proteinov v industriji in raziskavah se povečuje tudi potreba po nizkocenovni produkciji. V ta namen se kot gostiteljski organizem najpogosteje uporablja bakterijo Escherichia Coli. Vendar pa se zaradi hiperprodukcije proteina v bakteriji oblikujejo inkluzijska telesca (ang.: Inclusion bodies oz. IB) za katere so znanstveniki domnevali, da so skupki odpadnega materiala v celici. Nedolgo nazaj pa so odkrili, da IB vsebujejo ter v določenih optimalnih pogojih tudi izločajo aktivne proteine. Tako se je porodila ideja o uporabi IB kot zdravila nanovelikosti za nekatere bolezni, ki so povzročene s strani okvarjenih ali nefunkcionalnih proteinov.
S pomočjo fluorescence so dokazali, da se GFP ncIB vežejo na membrano človeških HeLa celic ter celo prodrejo v celico in njeno jedro.
Ko so različnim kulturam okvarjenih celic dodali Hsp70, DHFR, CAT, ali LIF ncIB so opazili znatno povečanje števila preživelih celic, kar se sklada s predpostavko o terapevtskem učinku ncIB.
Ugotovili so tudi, da ob zaužitju ncIB nima toksičnega vpliva na organizem, vendar ga le-ta sprejme v omejenih količinah in nakopiči predvsem v jetrih.

== Janez Meden: α –sinuclein, amiloid prisoten pri bolnikih s Parkinsonovo boleznijo ==
α-sinuklein je majhen protein, ki se nahaja v presinaptičnih membranah dopaminergičnih nevronih. Odkar so odkrili njegove amiloidne lastnosti ter da je glavna komponenta citotoksičnih lewyjevih telesc pri bolnikih z neozdravljivo in napredujočo parkinsonovo boleznijo je postal predmet številnih znanstvenih raziskav, saj je bolnikov s to boleznijo iz leta v leto več.
Novejše raziskave kažejo na to, da je lahko sicer ta membranski protein prisoten tudi kot topen in urejen oligomer in sicer tetramer, ki je bil odkrit pred kratkim in ni škodljiv za možganske celice. Najbrž je ta oligomer v celici v ravnotežju z netopnim α-sin ter topnim monomerom. Kaj vpliva na ravnotežje še ni raziskano, mogoče pa je to omega-3 maščobna kislina –DHA.
Kar pomeni, da ima pomemben vpliv na odlaganje citotoksičnih α-sin agregatov tudi prehrana. DHA je precej propagiran prehranski dodatek (priporočajo ga predvsem doječim materam), vpliva na regulacijo α-sinukleina pri miših. Miši z več DHA v dieti so namreč bolj izpostavljene α-sin agregaciji, še posebej če je gen za α-sin mutiran (v tem primeru A53T).
Obe raziskavi sta obetajoči za nadaljni razvoj zdravilnih učinkovin za to boleznijo.

BIO1-seminar

2013-03-11T22:15:13Z

Maruša Prolič-Kalinšek: /* Seznam seminarjev */

= Temelji biokemije- seminar =

Seminarje vodi doc. dr. Gregor Gunčar in so na urniku vsak ponedeljek od 11:00 do 12:30.

Ocena seminarjev predstavlja ??% končne ocene in vsebuje vse točke, ki jih študent/ka lahko zbere pri seminarju in ostalih dejavnostih, ki niso del pisnega izpita.

Gradivo za predavanja in seminarje najdete na http://bio.ijs.si/~zajec/tbk/
username: tbk
password: samozameDD

== Seznam seminarjev ==
{| border="1" cellpadding="4" cellspacing="0" style="border:#c9c9c9 1px solid; margin: 1em 1em 1em 0; border-collapse: collapse;"
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Ime in priimek'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Naslov seminarja'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Link'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Rok za oddajo'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Rok za recenzijo'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Datum predstavitve'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 1'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 2'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 3'''
|-
| Rok Ferenc||Nov način zdravljenja Androgenic alopecia||http://www.sciencedaily.com/releases/2012/10/121026125127.htm||04.03.||07.03.||11.03.||Jure Fabjan||Marjeta Horvat||Tadej Rozman
|-
| Mojca Juteršek||Sekrecijski sistem tipa III pri Pseudomonas aeruginosa in vpliv metabolizma na njegovo izražanje||http://www.sciencedaily.com/releases/2013/01/130130083017.htm||04.03.||07.03.||11.03.||Boštjan Petrič||Maja Zupančič||Milena Jovanov
|-
| Tjaša Bensa||Sulforafan kot potencialni kandidat za zdravljenje levkemije||http://www.sciencedaily.com/releases/2012/12/121212205602.htm||04.03.||07.03.||11.03.||Peter Prezelj||Luka Kavčič||Nina Pirih
|-
| Petra Tavčar||Zdravljenje Huntingtonove bolezni s proteini s cinkovimi prsti||http://www.sciencedaily.com/releases/2012/10/121010131358.htm||04.03.||07.03.||11.03.||Ana Krišelj||Alja Zgonc||Urša Kapš
|-
| Tilen Komel||||||11.03.||14.03.||18.03.||Rok Ferenc||Jure Fabjan||Marjeta Horvat
|-
| Urška Kašnik||Propionibacterium acnes - bakterija, ki povzroča akne||http://www.sciencedaily.com/releases/2013/02/130228080135.htm||11.03.||14.03.||18.03.||Mojca Juteršek||Boštjan Petrič||Maja Zupančič
|-
| David Pignar||||||11.03.||14.03.||18.03.||Tjaša Bensa||Peter Prezelj||Luka Kavčič
|-
| Maruša Prolič - Kalinšek||Živčni strupi in butirilholinesteraza||http://www.sciencedaily.com/releases/2013/01/130111101450.htm||11.03.||14.03.||18.03.||Petra Tavčar||Ana Krišelj||Alja Zgonc
|-
| Domen Klofutar||MICU1 kot regulator koncentracije Ca2+ v mitohondrijih||http://www.sciencedaily.com/releases/2012/11/121127130025.htm||18.03.||21.03.||25.03.||Tilen Komel||Rok Ferenc||Jure Fabjan
|-
| Jakob Rupert||Vplivi na vezavo Aβ-oligomerov na nepatogene prione PrPC in povezava z nastankom Alzheimerjeve bolezni||http://www.sciencedaily.com/releases/2013/02/130205200241.htm||18.03.||21.03.||25.03.||Urška Kašnik||Mojca Juteršek||Boštjan Petrič
|-
| Helena Jakše||||http://www.sciencedaily.com/releases/2012/12/121205084419.htm||18.03.||21.03.||25.03.||David Pignar||Tjaša Bensa||Peter Prezelj
|-
| Lenka Tomešová||||||18.03.||21.03.||25.03.||Maruša Prolič - Kalinšek||Petra Tavčar||Ana Krišelj
|-
| Simon Bolta||||||25.03.||28.03.||08.04.||Domen Klofutar||Tilen Komel||Rok Ferenc
|-
| Vita Vidmar||||http://www.sciencedaily.com/releases/2013/02/130214132629.htm||25.03.||28.03.||08.04.||Jakob Rupert||Urška Kašnik||Mojca Juteršek
|-
| Sabina Štukelj||||http://www.sciencedaily.com/releases/2013/02/130218092501.htm||25.03.||28.03.||08.04.||Helena Jakše||David Pignar||Tjaša Bensa
|-
| Nika Strašek||||http://www.sciencedaily.com/releases/2012/11/121114113452.htm||25.03.||28.03.||08.04.||Lenka Tomešová||Maruša Prolič - Kalinšek||Petra Tavčar
|-
| Vid Jazbec||||||08.04.||11.04.||15.04.||Simon Bolta||Domen Klofutar||Tilen Komel
|-
| Aneta Atanasova||||||08.04.||11.04.||15.04.||Vita Vidmar||Jakob Rupert||Urška Kašnik
|-
| Rok Ipšek||||http://www.sciencedaily.com/releases/2012/10/121008083019.htm||08.04.||11.04.||15.04.||Sabina Štukelj||Helena Jakše||David Pignar
|-
| Helena Šneberger||||||08.04.||11.04.||15.04.||Nika Strašek||Lenka Tomešová||Maruša Prolič - Kalinšek
|-
| Tim Božič||||||15.04.||18.04.||22.04.||Vid Jazbec||Simon Bolta||Domen Klofutar
|-
| Sara Košenina||||http://www.sciencedaily.com/releases/2013/02/130223111356.htm||15.04.||18.04.||22.04.||Aneta Atanasova||Vita Vidmar||Jakob Rupert
|-
| Eva Krivec||||||15.04.||18.04.||22.04.||Rok Ipšek||Sabina Štukelj||Helena Jakše
|-
| Jan Rozman||||||15.04.||18.04.||22.04.||Helena Šneberger||Nika Strašek||Lenka Tomešová
|-
| Eva Vidak||||||22.04.||25.04.||06.05.||Tim Božič||Vid Jazbec||Simon Bolta
|-
| Toni Nagode||||||22.04.||25.04.||06.05.||Sara Košenina||Aneta Atanasova||Vita Vidmar
|-
| Ema Guštin||||http://www.sciencedaily.com/releases/2013/01/130117132921.htm||22.04.||25.04.||06.05.||Eva Krivec||Rok Ipšek||Sabina Štukelj
|-
| Dominik Dekleva||||||22.04.||25.04.||06.05.||Jan Rozman||Helena Šneberger||Nika Strašek
|-
| Mojca Kostanjevec||||||06.05.||09.05.||13.05.||Eva Vidak||Tim Božič||Vid Jazbec
|-
| Eva Oblak Zvonar||||||06.05.||09.05.||13.05.||Toni Nagode||Sara Košenina||Aneta Atanasova
|-
| Barbara Sopčić||||||06.05.||09.05.||13.05.||Ema Guštin||Eva Krivec||Rok Ipšek
|-
| Tadej Rozman||||||06.05.||09.05.||13.05.||Dominik Dekleva||Jan Rozman||Helena Šneberger
|-
| Milena Jovanov||||||13.05.||16.05.||20.05.||Mojca Kostanjevec||Eva Vidak||Tim Božič
|-
| Nina Pirih||||||13.05.||16.05.||20.05.||Eva Oblak Zvonar||Toni Nagode||Sara Košenina
|-
| Urša Kapš||||||13.05.||16.05.||20.05.||Barbara Sopčić||Ema Guštin||Eva Krivec
|-
| Marjeta Horvat||||http://www.sciencedaily.com/releases/2012/09/120924080253.htm||13.05.||16.05.||20.05.||Tadej Rozman||Dominik Dekleva||Jan Rozman
|-
| Maja Zupančič||||||20.05.||23.05.||27.05.||Milena Jovanov||Mojca Kostanjevec||Eva Vidak
|-
| Luka Kavčič||||||20.05.||23.05.||27.05.||Nina Pirih||Eva Oblak Zvonar||Toni Nagode
|-
| Alja Zgonc||||||20.05.||23.05.||27.05.||Urša Kapš||Barbara Sopčić||Ema Guštin
|-
| Jure Fabjan||||||20.05.||23.05.||27.05.||Marjeta Horvat||Tadej Rozman||Dominik Dekleva
|-
| Boštjan Petrič||||||27.05.||30.05.||03.06.||Maja Zupančič||Milena Jovanov||Mojca Kostanjevec
|-
| Peter Prezelj||||||27.05.||30.05.||03.06.||Luka Kavčič||Nina Pirih||Eva Oblak Zvonar
|-
| Ana Krišelj||||||27.05.||30.05.||03.06.||Alja Zgonc||Urša Kapš||Barbara Sopčić
|}

==Naloga==
* samostojno pripraviti seminar, katerega tema je novica iz področja biokemije na portalu [http://www.sciencedaily.com ScienceDaily], ki je bila objavljena kasneje kot 1. avgusta 2012. Osnova za seminar naj bo znanstveni članek, ki je podlaga za to novico. Poleg tega članka morate za seminar uporabiti še najmanj pet drugih virov, od teh vsaj še dva druga znanstvena članka, ki se navezujeta na to vsebino.
* naslov izbrane teme in link do novice vpišite v tabelo seminarjev takoj ko ste si izbrali temo, najkasneje pa en teden pred rokom za oddajo
* [[BIO1 Povzetki seminarjev|Povzetek seminarja]] opišete na wikiju v približno 200 besedah - najkasneje do dne ko morate oddati seminar recenzentom.
* Povezavo do povzetka vnesete v tabelo seminarjev tekočega letnika.
* Seminar pripravite v obliki seminarske naloge (pisava 12, enojni razmak, 2,5 cm robovi; važno je, da je obseg od 1800 do 2000 besed), vsebovati mora najmanj tri slike. Slika mora imeti legendo in v besedilu mora biti na ustreznem mestu sklic na sliko. Vse uporabljene vire citirajte v tekstu, kot npr. (Nobel, 2010), na koncu pa navedite točen seznam literature, kot je opisano spodaj!
* Seminar oddajte do roka za oddajo vsakemu od recenzentov (docentu ga pošljite po e-pošti v formatu .doc ali .docx).
* Recenzenti do dneva določenega v tabeli določijo popravke in podajo oceno pisnega dela, v predpisanem formatu elektronskega obrazca na internetu.
* Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Za predstavitev je na voljo 16 minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni. Prvi recenzent vodi predstavitve in razpravo ter skrbi za to, da vse poteka v zastavljenih časovnih okvirih.
* Predstavitvi sledi razprava- 6 minut. Recenzenti podajo oceno predstavitve in postavijo vsak vsaj dve vprašanji.
* En dan pred predstavitvijo oddajte končno verzijo doc. Gunčarju po e-mailu, v subject napišite TBK2013 in pripnite datoteko, ki ima ime v obliki TBK2013-Ime-Priimek.docx. Na dan predstavitve morate docentu oddati tudi končno (popravljeno) in natisnjeno verzijo seminarja v enem izvodu.
* Seminarska naloga in povzetek na wikiju morajo biti v slovenskem jeziku!

==Ocenjevanje seminarjev==
Recenzenti ocenijo seminar tako, da izpolnijo [[https://docs.google.com/spreadsheet/viewform?formkey=dG1aMGp5bXFlQm9SMFU0X0lOaHZpQlE6MA recenzentsko poročilo]] na spletu.

== Mnenje o predstavitvi ==
Vsak posameznik '''mora''' oceniti seminar, tako da odda svoje [https://docs.google.com/spreadsheet/viewform?formkey=dEozRlMwVDh0NDBmSmd2VnV0TUwtVGc6MA mnenje] najkasneje v enem tednu po predstavitvi. Kdor na seminarju ni bil prisoten, mnenja '''ne sme''' oddati.

==Urejanje spletnih strani na wikiju==
Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''

==Faktor vpliva==
Faktor vpliva (angl. impact factor) neke revije pove, kolikokrat so bili v poprečju citirani članki v tej reviji v dveh letih skupaj pred objavo tega faktorja. Faktorje vpliva za posamezno revijo lahko najdete v [http://www.cobiss.si/scripts/cobiss?command=CONNECT&base=JCR COBISS-u]. V polje "Naslov revije" vnesite ime revije za katero želite izvedeti faktor vpliva in pritisnite na gumb POIŠČI. V skrajnem desnem stolpcu se bodo izpisali faktorji vpliva za revije, ki ustrezajo vašim iskalnim kriterijem. Zadetkov za posamezno revijo je več zato, ker so navedeni faktorji vpliva za posamezno leto. Za leto 2011 faktorji vpliva še niso objavljeni, zato se orientirajte po faktorjih vpliva zadnjih par let. Če faktorja vpliva za vašo izbrano revijo ne najdete v bazi COBISS, potem izberite članek iz kakšne druge revije.

==Citiranje virov==
Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se v seminarju držite ene same.
Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati.
Za citate v naravoslovju je najpogostejše citiranje po pravilniku ISO 690. [http://www.google.com/url?sa=t&source=web&cd=6&sqi=2&ved=0CEUQFjAF&url=http%3A%2F%2Fwww.tre.sik.si%2Fmain%2Fpomoc%2Ffiles%2Fcitiranje_in_navajanje_virov.pdf&rct=j&q=citiranje%20po%20pravilniku%20ISO%20690&ei=jPBqTe6FC9DKswaWk-TmDA&usg=AFQjCNF8r6X9Y781sanDObaXNdCew4suUg&sig2=cTqKObSJsTicekWGRGa72g&cad=rja Pravila], ki upoštevajo omenjeni standard, so pripravili pri ZTKS. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati. 
'''Citiranje knjig:''' 
Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica. 
Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN. 

Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005. 
Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4. 
Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.).

'''Citiranje člankov:''' 
Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani. 
Lartigue C. ''et al''. Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, letn. 317, str. 632-638.

Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole: 
Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani. 
Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.

Revija Science uporablja skrajšani zapis: 
C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007) 

V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne).

'''Citiranje spletnih virov:''' 
Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov 
strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life 
Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.

BIO1-seminar

2013-03-02T16:48:23Z

Maruša Prolič-Kalinšek: /* Seznam seminarjev */

= Temelji biokemije- seminar =

Seminarje vodi doc. dr. Gregor Gunčar in so na urniku vsak ponedeljek od 11:00 do 12:30.

Ocena seminarjev predstavlja ??% končne ocene in vsebuje vse točke, ki jih študent/ka lahko zbere pri seminarju in ostalih dejavnostih, ki niso del pisnega izpita.

Gradivo za predavanja in seminarje najdete na http://bio.ijs.si/~zajec/tbk/
username: tbk
password: samozameDD

== Seznam seminarjev ==
{| border="1" cellpadding="4" cellspacing="0" style="border:#c9c9c9 1px solid; margin: 1em 1em 1em 0; border-collapse: collapse;"
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Ime in priimek'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Naslov seminarja'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Link'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Rok za oddajo'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Rok za recenzijo'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Datum predstavitve'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 1'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 2'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 3'''
|-
| Rok Ferenc||to je moj tekst||||04.03.||07.03.||11.03.||Jure Fabjan||Marjeta Horvat||Tadej Rozman
|-
| Mojca Juteršek||||http://www.sciencedaily.com/releases/2013/01/130130083017.htm||04.03.||07.03.||11.03.||Boštjan Petrič||Maja Zupančič||Milena Jovanov
|-
| Tjaša Bensa||||http://www.sciencedaily.com/releases/2012/12/121212205602.htm||04.03.||07.03.||11.03.||Peter Prezelj||Luka Kavčič||Nina Pirih
|-
| Petra Tavčar||||http://www.sciencedaily.com/releases/2012/10/121010131358.htm||04.03.||07.03.||11.03.||Ana Krišelj||Alja Zgonc||Urša Kapš
|-
| Tilen Komel||||||11.03.||14.03.||18.03.||Rok Ferenc||Jure Fabjan||Marjeta Horvat
|-
| Urška Kašnik||||||11.03.||14.03.||18.03.||Mojca Juteršek||Boštjan Petrič||Maja Zupančič
|-
| David Pignar||||||11.03.||14.03.||18.03.||Tjaša Bensa||Peter Prezelj||Luka Kavčič
|-
| Maruša Prolič - Kalinšek||||http://www.sciencedaily.com/releases/2013/01/130111101450.htm||11.03.||14.03.||18.03.||Petra Tavčar||Ana Krišelj||Alja Zgonc
|-
| Domen Klofutar||||||18.03.||21.03.||25.03.||Tilen Komel||Rok Ferenc||Jure Fabjan
|-
| Jakob Rupert||||||18.03.||21.03.||25.03.||Urška Kašnik||Mojca Juteršek||Boštjan Petrič
|-
| Helena Jakše||||||18.03.||21.03.||25.03.||David Pignar||Tjaša Bensa||Peter Prezelj
|-
| Lenka Tomešová||||||18.03.||21.03.||25.03.||Maruša Prolič - Kalinšek||Petra Tavčar||Ana Krišelj
|-
| Simon Bolta||||||25.03.||28.03.||08.04.||Domen Klofutar||Tilen Komel||Rok Ferenc
|-
| Vita Vidmar||||http://www.sciencedaily.com/releases/2013/02/130214132629.htm||25.03.||28.03.||08.04.||Jakob Rupert||Urška Kašnik||Mojca Juteršek
|-
| Sabina Štukelj||||http://www.sciencedaily.com/releases/2013/02/130218092501.htm||25.03.||28.03.||08.04.||Helena Jakše||David Pignar||Tjaša Bensa
|-
| Nika Strašek||||||25.03.||28.03.||08.04.||Lenka Tomešová||Maruša Prolič - Kalinšek||Petra Tavčar
|-
| Vid Jazbec||||||08.04.||11.04.||15.04.||Simon Bolta||Domen Klofutar||Tilen Komel
|-
| Aneta Atanasova||||||08.04.||11.04.||15.04.||Vita Vidmar||Jakob Rupert||Urška Kašnik
|-
| Rok Ipšek||||||08.04.||11.04.||15.04.||Sabina Štukelj||Helena Jakše||David Pignar
|-
| Helena Šneberger||||||08.04.||11.04.||15.04.||Nika Strašek||Lenka Tomešová||Maruša Prolič - Kalinšek
|-
| Tim Božič||||||15.04.||18.04.||22.04.||Vid Jazbec||Simon Bolta||Domen Klofutar
|-
| Sara Košenina||||http://www.sciencedaily.com/releases/2013/02/130223111356.htm||15.04.||18.04.||22.04.||Aneta Atanasova||Vita Vidmar||Jakob Rupert
|-
| Eva Krivec||||||15.04.||18.04.||22.04.||Rok Ipšek||Sabina Štukelj||Helena Jakše
|-
| Jan Rozman||||||15.04.||18.04.||22.04.||Helena Šneberger||Nika Strašek||Lenka Tomešová
|-
| Eva Vidak||||||22.04.||25.04.||06.05.||Tim Božič||Vid Jazbec||Simon Bolta
|-
| Toni Nagode||||||22.04.||25.04.||06.05.||Sara Košenina||Aneta Atanasova||Vita Vidmar
|-
| Ema Guštin||||||22.04.||25.04.||06.05.||Eva Krivec||Rok Ipšek||Sabina Štukelj
|-
| Dominik Dekleva||||||22.04.||25.04.||06.05.||Jan Rozman||Helena Šneberger||Nika Strašek
|-
| Mojca Kostanjevec||||||06.05.||09.05.||13.05.||Eva Vidak||Tim Božič||Vid Jazbec
|-
| Eva Oblak Zvonar||||||06.05.||09.05.||13.05.||Toni Nagode||Sara Košenina||Aneta Atanasova
|-
| Barbara Sopčić||||||06.05.||09.05.||13.05.||Ema Guštin||Eva Krivec||Rok Ipšek
|-
| Tadej Rozman||||||06.05.||09.05.||13.05.||Dominik Dekleva||Jan Rozman||Helena Šneberger
|-
| Milena Jovanov||||||13.05.||16.05.||20.05.||Mojca Kostanjevec||Eva Vidak||Tim Božič
|-
| Nina Pirih||||||13.05.||16.05.||20.05.||Eva Oblak Zvonar||Toni Nagode||Sara Košenina
|-
| Urša Kapš||||||13.05.||16.05.||20.05.||Barbara Sopčić||Ema Guštin||Eva Krivec
|-
| Marjeta Horvat||||||13.05.||16.05.||20.05.||Tadej Rozman||Dominik Dekleva||Jan Rozman
|-
| Maja Zupančič||||||20.05.||23.05.||27.05.||Milena Jovanov||Mojca Kostanjevec||Eva Vidak
|-
| Luka Kavčič||||||20.05.||23.05.||27.05.||Nina Pirih||Eva Oblak Zvonar||Toni Nagode
|-
| Alja Zgonc||||||20.05.||23.05.||27.05.||Urša Kapš||Barbara Sopčić||Ema Guštin
|-
| Jure Fabjan||||||20.05.||23.05.||27.05.||Marjeta Horvat||Tadej Rozman||Dominik Dekleva
|-
| Boštjan Petrič||||||27.05.||30.05.||03.06.||Maja Zupančič||Milena Jovanov||Mojca Kostanjevec
|-
| Peter Prezelj||||||27.05.||30.05.||03.06.||Luka Kavčič||Nina Pirih||Eva Oblak Zvonar
|-
| Ana Krišelj||||||27.05.||30.05.||03.06.||Alja Zgonc||Urša Kapš||Barbara Sopčić
|}

==Naloga==
* samostojno pripraviti seminar, katerega tema je novica iz področja biokemije na portalu [http://www.sciencedaily.com ScienceDaily], ki je bila objavljena kasneje kot 1. avgusta 2012. Osnova za seminar naj bo znanstveni članek, ki je podlaga za to novico. Poleg tega članka morate za seminar uporabiti še najmanj pet drugih virov, od teh vsaj še dva druga znanstvena članka, ki se navezujeta na to vsebino.
* naslov izbrane teme in link do novice vpišite v tabelo seminarjev takoj ko ste si izbrali temo, najkasneje pa en teden pred rokom za oddajo
* [[BIO1 Povzetki seminarjev|Povzetek seminarja]] opišete na wikiju v približno 200 besedah - najkasneje do dne ko morate oddati seminar recenzentom.
* Povezavo do povzetka vnesete v tabelo seminarjev tekočega letnika.
* Seminar pripravite v obliki seminarske naloge (pisava 12, enojni razmak, 2,5 cm robovi; važno je, da je obseg od 1800 do 2000 besed), vsebovati mora najmanj tri slike. Slika mora imeti legendo in v besedilu mora biti na ustreznem mestu sklic na sliko. Vse uporabljene vire citirajte v tekstu, kot npr. (Nobel, 2010), na koncu pa navedite točen seznam literature, kot je opisano spodaj!
* Seminar oddajte do roka za oddajo vsakemu od recenzentov (docentu ga pošljite po e-pošti v formatu .doc ali .docx).
* Recenzenti do dneva določenega v tabeli določijo popravke in podajo oceno pisnega dela, v predpisanem formatu elektronskega obrazca na internetu.
* Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Za predstavitev je na voljo 16 minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni. Prvi recenzent vodi predstavitve in razpravo ter skrbi za to, da vse poteka v zastavljenih časovnih okvirih.
* Predstavitvi sledi razprava- 6 minut. Recenzenti podajo oceno predstavitve in postavijo vsak vsaj dve vprašanji.
* En dan pred predstavitvijo oddajte končno verzijo doc. Gunčarju po e-mailu, v subject napišite TBK2013 in pripnite datoteko, ki ima ime v obliki TBK2013-Ime-Priimek.docx. Na dan predstavitve morate docentu oddati tudi končno (popravljeno) in natisnjeno verzijo seminarja v enem izvodu.
* Seminarska naloga in povzetek na wikiju morajo biti v slovenskem jeziku!

==Ocenjevanje seminarjev==
Recenzenti ocenijo seminar tako, da izpolnijo [[https://docs.google.com/spreadsheet/viewform?formkey=dFM2SktfM3Q4VU1wNUQzdU45OTlWVXc6MA recenzentsko poročilo]] na spletu.

== Mnenje o predstavitvi ==
Vsak posameznik '''mora''' oceniti seminar, tako da odda svoje [https://docs.google.com/spreadsheet/viewform?formkey=dEozRlMwVDh0NDBmSmd2VnV0TUwtVGc6MA mnenje] najkasneje v enem tednu po predstavitvi. Kdor na seminarju ni bil prisoten, mnenja '''ne sme''' oddati.

==Urejanje spletnih strani na wikiju==
Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''

==Faktor vpliva==
Faktor vpliva (angl. impact factor) neke revije pove, kolikokrat so bili v poprečju citirani članki v tej reviji v dveh letih skupaj pred objavo tega faktorja. Faktorje vpliva za posamezno revijo lahko najdete v [http://www.cobiss.si/scripts/cobiss?command=CONNECT&base=JCR COBISS-u]. V polje "Naslov revije" vnesite ime revije za katero želite izvedeti faktor vpliva in pritisnite na gumb POIŠČI. V skrajnem desnem stolpcu se bodo izpisali faktorji vpliva za revije, ki ustrezajo vašim iskalnim kriterijem. Zadetkov za posamezno revijo je več zato, ker so navedeni faktorji vpliva za posamezno leto. Za leto 2011 faktorji vpliva še niso objavljeni, zato se orientirajte po faktorjih vpliva zadnjih par let. Če faktorja vpliva za vašo izbrano revijo ne najdete v bazi COBISS, potem izberite članek iz kakšne druge revije.

==Citiranje virov==
Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se v seminarju držite ene same.
Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati.
Za citate v naravoslovju je najpogostejše citiranje po pravilniku ISO 690. [http://www.google.com/url?sa=t&source=web&cd=6&sqi=2&ved=0CEUQFjAF&url=http%3A%2F%2Fwww.tre.sik.si%2Fmain%2Fpomoc%2Ffiles%2Fcitiranje_in_navajanje_virov.pdf&rct=j&q=citiranje%20po%20pravilniku%20ISO%20690&ei=jPBqTe6FC9DKswaWk-TmDA&usg=AFQjCNF8r6X9Y781sanDObaXNdCew4suUg&sig2=cTqKObSJsTicekWGRGa72g&cad=rja Pravila], ki upoštevajo omenjeni standard, so pripravili pri ZTKS. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati. 
'''Citiranje knjig:''' 
Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica. 
Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN. 

Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005. 
Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4. 
Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.).

'''Citiranje člankov:''' 
Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani. 
Lartigue C. ''et al''. Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, letn. 317, str. 632-638.

Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole: 
Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani. 
Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.

Revija Science uporablja skrajšani zapis: 
C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007) 

V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne).

'''Citiranje spletnih virov:''' 
Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov 
strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life 
Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.